MX2012000620A - Metodos diagnostico y composiciones para tratamiento de cancer. - Google Patents

Metodos diagnostico y composiciones para tratamiento de cancer.

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Abstract

Se revelan en la presente métodos y composiciones útiles para la diagnosis y tratamiento de alteraciones angiogénicas, incluyendo por ejemplo, cáncer.

Description

MÉTODOS DIAGNÓSTICO Y COMPOSICIONES PARA TRATAMIENTO DE CÁNCER CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente con métodos de diag/nóstico y composiciones útiles en el tratamiento de 5 alteraciones angiogénicas incluyendo, por ejemplo, cáncer.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las alteraciones angiogénicas tales como cáncer son una de las amenazas más mortales a la salud humana. En los ^ Estados Unidos de América solamente, el cáncer afecta casi a 1.3 millones de nuevos pacientes cada año y es la segunda causa principal de muerte después de enfermedad cardiovascular, contando con aproximadamente 1 en 4 muertes. Los tumores sólidos son responsables por la ma'yoria de aquellas muertes. !5 Aunque ha habido avances significativos en el tratamiento médico de ciertos cánceres, la proporción de supervivencia global de 5 años para todos los cánceres ha mejorado solo por aproximadamente 10% en los pasados 20 años. Los cánceres o tumores malignos, experimentan metástasis y crecen rápidamente 20 de manera incontrolada, haciendo la detección oportuna y tratamiento extremadamente difíciles.
Dependiendo del tipo de cáncer, los pacientes tienen comúnmente varias opciones de tratamiento disponibles para ellos incluyendo quimioterapia, radiación y fármacos a base de 25 anticuerpo. Métodos de diagnóstico útiles para predecir resultados clínicos de los diferentes regímenes de tratamiento se beneficiarían extensamente del manejo clínico de estos pacientes. Varios estudios han explorado la correlación de expresión genética con la identificación de tipos de cáncer específicos, por ejemplo, mediante análisis mutación-específicos, análisis de microarreglos , qPCR, etc. Tales métodos pueden ser útiles para la identificación y clasificación del cáncer presentado por un paciente. Sin embargo, se sabe mucho menos acerca del valor predictivo o de prognóstico de expresión genética con el resultado clínico.
Así, hay necesidad de métodos objetivos, reproducibles para el régimen de tratamiento óptimo para cada paciente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los métodos de la presente invención pueden ser utilizados en una variedad de instalaciones, incluyendo por ejemplo, en la selección del curso del tratamiento óptimo para un paciente, en la predicción de la probabilidad de éxito cuando se trata un paciente' individual con un régimen de tratamiento particular, en determinar el avance de la enfermedad, en el monitoreo y la eficacia de tratamiento, en la determinación de prognosis para pacientes individuales y en la determinación de la predisposición de un individuo a beneficiarse de una terapia particular, por ejemplo, una terapia anti-angiogénica que incluye, por ejemplo, una terapia anti-cáncer)'.
La presente invención está basada en parte, en el uso de biomarcadores indicadores de eficacia de la terapia (por ¦ ejemplo, terapia anti-angiogénica que incluye por ejemplo, una terapia anti-cáncer) . Más en particular, la invención está basada en la medición de un incremento o disminución en el (los) nivel (es) de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: 18S rRNA, ACTB, RPS13, VEGFA, VEGFC, VEGFD, Bv8, P1GF, VEGFRl/Fltl, VEGFR2, VEGFR3, NRP1, sNRPl, Podoplanin, Proxl, VE-Cadherina (CD144, CDH5) , robo4, FGF2, IL8/CXCL8, HGF, THBS1/TSP1, Egfl7, NG3/Egf18 , ANG1, GM-CSF/CSF2, G-CSF/CSF3, FGF9, CXCL12/SDF1, TGF i , TNFOÍ,. Alkl, BMP9, BMP10, HSPG2/perlecan, ESM'l, Sema3a, Sema3b, Sema3c, Sema3e, Sema3f, NG2, ITGa5, ICAM1, CXCR4 , LGALSl/Galectinl , LGALS7B/Galectin7 , Fibronectina, TMEM100, PECAM/CD31 , PDGF , PDGFRp, RGS5, CXCL1, CXCL2, robo4, LyPD6, VCAMl, colágeno IV, Spred-1, Hhex, ITGa5, LGALSl/Galectinl, LGALS7 /Galectin7 , TMEM100 , ¦ MFAP5, Fibronectina, fibulin2, fibulin /Efemp2 , HMBS, SDHA, UBC, NRP2, CD34, DLL4 , CLECSF5 /CLEC5a , CCL2/MCP1, CCL5, CXCL5/ENA-78 , ANG2, FGF8, FGF8b, PDGFC, cMet, JAG1, CD105/Endoglin, Notchl, EphB4, EphA3, EFNB2, TIE2/TEK, LAMA4 , NID2, Map4k4, Bcl2Al, IGFBP4, VIM/vimentina, FGFR4 , FRAS1, ANTXR2, CLECSF5/CLEC5a y Mincle/CLEC4E/CLECSF9 para predecir la eficacia de terapia (por ejemplo, terapia anti-angiogénica que incluye por ejemplo, una terapia anti-cáncer) .
Una modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer diferente de o además de un antagonista de VEGF. Los métodos comprenden determinar niveles de expresión de por lo menos un gen resumido en la Tabla 1 en una muestra obtenida del paciente, en donde un nivel de expresión incrementado del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con la terapia anti-cáncer diferente de o además de un antagonista de VEGF.
Otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer diferente de o además de un antagonista de VEGF. Los métodos comprenden: determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen resumido en la Tabla 1 en una muestra obtenida del paciente, en donde un nivel de expresión disminuido del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con la terapia anti-cáncer diferente de o además de un antagonista de VEGF.
Una modalidad adicional de la invención · provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con una terapia anti-cáncer diferente de o además de un antagonista de VEGF. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen resumido en la Tabla 1 en una muestra obtenida del paciente, en donde un nivel de expresión incrementado del por lo menos un gen en la muestra en comparación con una muestra de referencia indica que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con la terapia anti-cáncer diferente de o además de un antagonista de VEGF.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un 'paciente que sufre de cáncer al tratamiento con una terapia anti-cáncer diferente de o además de un antagonista de VEGF. Los métodos comprenden: determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen resumido en la Tabla 1 en una muestra obtenida del paciente, en donde un nivel de expresión disminuido del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia indica que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con la terapia anti-cáncer diferente de o además de un antagonista de VEGF.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente con cáncer exhibirá beneficio de la terapia anti-cáncer diferente de o además de un antagonista de VEGF. Los métodos comprenden: determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen resumido en la Tabla 1 en una muestra obtenida del paciente, en donde un nivel de expresión incrementado del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia indica que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer diferente de o además de un antagonista de VEGF.
Otra modalidad de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente con cáncer exhibirá beneficio de la terapia anti-cáncer diferente de o además de un antagonista de " VEGF. Los métodos comprenden: determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen resumido en la Tabla 1 en una muestra obtenida del paciente, en donde un nivel de expresión disminuido del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia indica que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer diferente de o además de un antagonista de VEGF.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para el tratamiento de cáncer en un paciente. Los métodos comprenden: determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión incrementados, en comparación con una muestra de referencia, de por lo menos un gen resumido en la Tabla 1 y administrar una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer diferente de o además de un antagonista de VEGF al paciente, mediante lo cual el paciente es tratado.
Otra modalidad de la invención provee métodos para el tratamiento de cáncer en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión disminuidos, en comparación con una' muestra de referencia, de por lo menos un gen resumido en la Tabla 1 y administrar una cantidad éfectiva de una terapia anti-cáncer diferente de o además de un antagonista de VEGF al paciente, mediante lo cual el cáncer es tratado.
En algunas modalidades de la invención, la muestra obtenida del paciente es seleccionada de: tejido, sangre entera, células derivadas de la sangre, plasma, suero y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades de la invención, el nivel de expresión es nivel de expresión de mARN. En algunas modalidades de la invención, el nivel de expresión es nivel de expresión de proteina.
En algunas modalidades de la invención, los métodos comprenden además detectar la expresión de por lo menos un segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto, séptimo octavo, noveno, décimo, undécimo, duodécimo, décimo tercero, décimo cuarto, décimo quinto, décimo sexto, décimo séptimo, décimo octavo, décimo noveno o vigésimo gen resumido en la Tabla 1.
En algunas modalidades de la invención, los métodos comprenden además administrar la terapia anti-cáncer diferente a un antagonista de VEGF al paciente. En algunas modalidades de la invención, la terapia anti-cáncer es seleccionada de: un anticuerpo, una molécula pequeña y un siARN. En algunas modalidades de la invención, la terapia anti-cáncer es un miembro · seleccionado de: un antagonista de EGFL7, un antagonista de NRP1 y un antagonista de VEGF-C. En algunas modalidades de la invención, el antagonista de EGFL7 es un anticuerpo. En algunas modalidades de la invención, el antagonista de NRP1 es un anticuerpo. En algunas modalidades -de la invención, el antagonista de VEGF-C es un anticuerpo.
En algunas modalidades de la invención, los métodos comprenden- además administrar el antagonista de VEGF al paciente. En algunas modalidades de la invención, el antagonista de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF. En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab. En algunas modalidades de la invención, la terapia anti-cáncer y el antagonista de . VEGF son administrados concurrentemente. En algunas modalidades de la invención, la terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF son administrados secuencialmente .
Aún otra modalidad de la invención provee kits para determinar si un paciente se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer diferente de o además de un antagonista de VEGF. Los kits comprenden un arreglo que comprenden polinucleótidos aptos de hibridizarse específicamente a por lo menos un gen resumido en la Tabla 1 e instrucciones para usar dicho arreglo para determinar los niveles de expresión ' del por lo menos un gen para predecir la sensibilidad de un paciente al tratamiento con una terapia anti-cáncer además de un antagonista de VEGF, en donde un incremento en el nivel de expresión del por lo menos un gen en comparación con el nivel de expresión del por lo menos un gen 5 en una muestra de referencia indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con la terapia anti-cáncer además de un antagonista de VEGF.
Una modalidad adicional de la invención provee kits para determinar si un paciente se puede beneficiar del ^ tratamiento con una terapia anti-cáncer diferente de o además de un antagonista de VEGF. Los kits comprenden un arreglo que comprende polinucleótidos aptos de hibridizarse específicamente a por lo menos un gen resumido en la Tabla 1 e instrucciones para usar dicho arreglo para . determinar los niveles de ^ expresión del por lo menos un gen para predecir la sensibilidad de un paciente al tratamiento con una terapia anti-cáncer además de un antagonista de VEGF, en donde una disminución en el nivel de expresión del por lo menos un gen, en comparación con el nivel de expresión del por lo menos un gen en una 20 muestra de referencia indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer además de un antagonista de VEGF.
Otra modalidad de la invención provee conjuntos de compuestos para detectar niveles de expresión de por lo menos 25 un gen resumido en la Tabla 1 para determinar los niveles de expresión del por lo menos un gen en una muestra obtenida de un paciente con cáncer. Los conjuntos comprenden por lo menos un compuesto apto de hibridizarse específicamente a por lo menos un gen resumido en la Tabla 1, en donde un incremento en el nivel de expresión del por lo menos un gen, en comparación con el nivel de expresión del por lo menos un gen en una muestra de referencia indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer además de un antagonista de VEGF. En algunas modalidades de la invención, los compuestos son polinucleótidos . En algunas modalidades de la invención, los polinucleótidos comprenden tres secuencias resumidas en la Tabla 2. En algunas modalidades de la invención, los compuestos son proteínas, tales como por ejemplo, anticuerpos.
Todavía otra modalidad de la invención provee conjuntos de compuestos para detectar niveles de expresión de por lo menos un gen resumido en la Tabla 1 para determinar los niveles de expresión del por lo menos un gen en una muestra obtenida de un paciente con cáncer. Los conjuntos comprenden por lo menos un compuesto apto de hibridizarse específicamente a por lo menos un gen resumido en la Tabla 1, en donde un incremento en el nivel de expresión del por lo menos un gen, en comparación con el nivel de expresión del por lo menos un gen en una muestra de referencia, indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer además de un antagonista de VEGF. En algunas modalidades de la invención, los compuestos son polinucleótidos . En algunas modalidades de la invención, los polinucleótidos comprenden tres secuencias resumidas en la Tabla 2. En algunas modalidades de la invención, los compuestos son proteínas, tales como por ejemplo, anticuerpos.
Una modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de neuropilin-l (NRP1) . Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: TGFpi, Bv8, Sema3A, P1GF, LGALS1, ITGa5, CSF2, Vimentin, CXCL5, CCL2, CXCL2 , Alkl y FGF8 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de NRPl .
Otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de neuropilin-l (NRPl) . Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: Proxl, RGS5, HGF, Sema3B, Sema3F, LGALS7, FGRF , PLC, IGFB4 y TSP1 en una muestra obtenida del paciente, en donde niveles de expresión disminuidos del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de NRP1.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de NRP1. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: TGFpi, Bv8 , Sema3A, P1GF, LGALS1, ITGa5, CSF2, Vimentin, CXCL5, CCL2 , CXCL2, Alkl y FGF8 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de NRP1.
Aún otra modalidad adicional de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de NRP1. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: Proxl, RGS5, HGF, Sema3B, Sema3F, LGALS7, FGRF4 , PLC, IGFB4 y TSP1 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos del por lo menos un gen en la muestra, . en comparación con una muestra de referencia, indican que el a paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de NRP1.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de NRPl. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: TGFpi, Bv8, Sema3A, P1GF, LGALS1, ITGa5, CSF2, Vimentin, CXCL5, CCL2 , CXCL2, Alkl y FGF8 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de NRPl.
Otra modalidad de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de NRPl. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: Proxl, RGS5, HGF, Sema3B, Sema3F, LGALS7, FGRF4, PLC, IGFB4 y TSPl en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de NRPl.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de NRPl. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: ?T?ß?, Bv8, Sema3A, P1GF, LGALS1 , ITGa5 , CSF2 , Vimentin, CXCL5, CCL2, CXCL2, Alkl y FGF8 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de NRPl.
Otra modalidad de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de NRPl. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: Proxl, RGS5, HGF, Sema3B, Sema3F, LGALS7, FGRF , PLC, IGFB4 y TSP1 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de NRPl.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión incrementados, en comparación con una muestra de referencia, de por lo menos un gen seleccionado de: ?ß?ß?, Bv8, Sema3A, P1GF, LGALS1, ITGa5, CSF2, Vimentin, CXCL5, CCL2, CXCL2, Alkl y FGF8 y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de NRP1, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión disminuidos, en comparación con una muestra de referencia, de por lo menos un gen seleccionado de: Proxl, RGS5, HGF, Sema3B, Sema3F, LGALS7, FGRF4, PLC, IGFB4 y TSP1 y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de NRP1, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
En algunas modalidades de la invención, la muestra obtenida del paciente es un miembro seleccionado de: tejido, sangre entera, células derivadas de la sangre, plasma, suero y combinaciones de los -mismos. En algunas modalidades de la invención, el nivel de expresión es el nivel de expresión de mARN . En algunas modalidades de la invención, el · nivel de expresión es el nivel de expresión de proteína. En algunas modalidades de la invención, el antagonista de NRP1 es un anticuerpo anti-NRPl.
En algunas modalidades de la invención, los métodos comprenden además administrar un antagonista de VEGF al paciente. En algunas modalidades de la invención, el antagonista de VEGF y el antagonista de NRP1 son administrados concurrentemente. En algunas modalidades de la invención, el antagonista de VEGF y el antagonista de NRPl son administrados secuencialmente . En algunas modalidades de la invención, el antagonista de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF. En algunas modalidades de la · invención, el anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab.
Otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de NRPl. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de P1GF en una muestra obtenida' del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de P1GF en la muestra en comparación con una muestra de referencia, indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de NRPl.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de NRPl. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de P1GF en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de P1GF en la muestra en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de NRPl.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de NRPl. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de P1GF en una muestra obtenida del paciente, en .donde los niveles de expresión incrementados de P1GF en la muestra en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de NRPl.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de NRPl. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de P1GF en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de P1GF en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de NRPl.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión incrementados de P1GF en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de NRPl, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Aún una modalidad adicional de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de neuropilin-1 (NRPl). Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de Sema3A en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de Sema3A en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de NRPl.
Todavía una modalidad adicional de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de NRPl. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de Sema3A en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de Sema3A en la muestra en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más0 probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de NRPl.
Otra modalidad de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de NRPl. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de Sema3A en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de Sema3A en la muestra en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de NRPl.
Otra modalidad de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de NRP1. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de Sema3A en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de Sema3A en la muestra en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de NRP1.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión incrementados de Sema3A en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una' cantidad efectiva de un antagonista de NRP1, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de neuropilin-1 (NRP.l) . Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de TGFpi en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de G pi en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de NRP1.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de NRPl. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de TGFPl en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de TGF i en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de NRPl. En algunas modalidades de la invención, los métodos comprenden además administrar una cantidad efectiva de un antagonista de NRPl al paciente.
Aún una modalidad adicional de la invención provee métodos p-ara determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de NRPl. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de TG^l en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de TGß? en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de NRPl.
Aún una modalidad adicional de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de NRPl. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de ?TGß? en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de TGF 1 en la muestra en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de NRP1.
Todavía una modalidad adicional de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión incrementados de TGF i en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de NRP1, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
En algunas modalidades de la invención, el antagonista de NRP1 es un' anticuerpo anti-NRPl. En algunas modalidades de la invención, los métodos comprenden además administrar un antagonista de VEGF-A al paciente. En algunas modalidades de la invención, el antagonista de VEGF-A y el antagonista de NRP1 son administrados concurrentemente. En algunas modalidades de la invención, el antagonista de VEGF-A y el antagonista de NRP1 son administrados secuencialmente . En algunas modalidades de la invención, el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo anti-VEGF-A. En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo anti-VEGF-A es bevacizumab.
Otra modalidad de la invención provee kits para determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: TGF i, Bv8, Sema3A, P1GF, LGALS1, ITGa5, CSF2, Vimentin, CXCL5 , CCL2, CXCL2, Alkl y FGF8. Los kits comprenden un arreglo que comprende polinucleotidos aptos de hibridizarse específicamente a por lo menos un gen seleccionado de: TGFpi, Bv8, Sema3A, P1GF, LGALS1 , ITGa5, CSF2 , Vimentin, CXCL5, CCL2 , CXCL2, Alkl y FGF8 e instrucciones para usar el arreglo para determinar los niveles de expresión del por lo menos un gen para predecir la sensibilidad de un paciente al tratamiento con un antagonista de NRPl, en donde un incremento en el nivel de expresión del por lo menos un gen, en comparación con el nivel de expresión del por lo menos un gen en una muestra de referencia, indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de NRPl.
Aún otra modalidad de la invención provee kits para determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: Proxl, RGS5, HGF, Sema3B, Sema3F, LGALS7, FGRF4, PLC, IGFB4 y TSP1. Los kits comprenden un arreglo que comprende polinucleotidos aptos de hibridizarse específicamente a por lo menos un gen seleccionado de: Proxl, RGS5, HGF, Sema3B, Sema3F, LGALS7, FGRF4 , PLC, IGFB4 y TSP1 e instrucciones para usar el arreglo para determinar los niveles de expresión del por lo menos un gen para predecir la sensibilidad de un paciente al tratamiento con un antagonista de NRPl, en donde una disminución en el nivel de expresión del por lo menos un gen, en comparación con el nivel de expresión del por lo menos un gen en una muestra de referencia indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de NRP1.
Todavía otra modalidad de la invención provee conjuntos de compuestos, aptos de detectar niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: TGFpi, Bv8, Sema3A, P1GF, LGALS1, ITGa5 , CSF2 , Vimentin, CXCL5 , CCL2, CXCL2 , Alkl y FGF8 para determinar los niveles de expresión del por lo menos un gen en una muestra obtenida de un paciente con cáncer. Los conjuntos comprenden por lo menos un compuesto apto de hibridizarse específicamente a por lo menos un gen seleccionado de: TGF i, Bv8, Sema3A, P1GF, LGALS1, ITGa5, CSF2 , Vimentin, CXCL5, CCL2, CXCL2, Alkl y FGF8, en donde un incremento en el nivel de expresión del por lo menos un gen, en comparación con el nivel de expresión del por lo menos un gen en una muestra de referencia indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de NRP1. En algunas modalidades de la invención, los compuestos son polinucleótidos . En algunas modalidades de la invención, los polinucleótidos comprenden tres secuencias resumidas en la Tabla 2. En algunas modalidades de la invención, los compuestos son proteínas, incluyendo por ejemplo, anticuerpos.
Una modalidad adicional de la invención provee conjuntos de compuestos aptos de detectar niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: Proxl, RGS5, HGF, Sema3B, Sema3F, LGALS7, FGRF4, PLC, IGFB4 y TSP1 para determinar los niveles de expresión del por lo menos un gen en una muestra obtenida de un paciente con cáncer. Los conjuntos comprenden por lo menos un compuesto apto de hibridizarse específicamente a por lo menos un gen seleccionado de: Proxl, RGS5, HGF, Sema3B, Sema3F, LGALS7 , FGRF4 , PLC, IGFB4 y TSP1, en donde una disminución en el nivel de expresión del por lo menos gen, en comparación con el nivel de expresión del por lo menos un gen en una muestra de referencia indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de NRP1. En algunas modalidades de la invención, los compuestos son polinucleótidos . En algunas modalidades de la invención, los polinucleótidos comprenden tres secuencias resumidas en la Tabla' 2. En algunas modalidades de la invención, los compuestos son proteínas, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos.
Otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista del factor C de crecimiento endotelial vascular (VEGF-C) . Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-.C, VEGF-D, VEGFR3, FGF2, RGS5/CDH5, IL-8, CXCL1 y CXCL2 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-A, CSF2, Proxl, ICAM1, ESM1, P1GF, ITGa5, TGFp, Hhex, Col4al, Col4a2 y Alkl en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-C, VEGF-D, VEGFR3, FGF2 , RGS5/CDH5, IL-8, CXCL1 y CXCL2 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indica que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-A, CSF2, Proxl, ICAM1, ESM1, P1GF, ITGa5, TGFfi , Hhex, Col4al, Col4a2 y Alkl en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Aún una modalidad adicional de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-C, VEGF-D, VEGFR3, FGF2, RGS5/CDH5, IL-8, CXCL1 y CXCL2 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Todavía una modalidad adicional de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-A, CSF2, Proxl, ICA l, ESM1, P1GF, ITGa5, TGFp,. Hhex, Col4al, Col4a2 y Alkl en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos del por 'lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficio de tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Aún una modalidad adicional de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-C, VEGF-D, VEGFR3, FGF2, RGS5/CDH5, IL-8, CXCL1 y CXCL2 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican qu'e el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Todavía una modalidad adicional de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-A, CSF2, Proxl, ICAM1, ESMl, P1GF, ITGa5, TGF , Hhex, Col4al, Col4a2 y Alkl en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Otra modalidad de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión incrementados, en comparación con una muestra de referencia, de por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-C, VEGF-D, VEGFR3 , FGF2, RGS5/CDH5, IL-8, CXCL1 y CXCL2 y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de VEGF-C, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión disminuidos, en comparación con una muestra de referencia, de por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-A, CSF2, Proxl,¦ ICAM1, ESM1, P1GF, ITGa5, TGF , Hhex, Col4al, Col4a2 y Alkl y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de VEGF-C, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
En algunas modalidades de la invención, la muestra obtenida del paciente es seleccionada de: tejido, sangre entera, células derivadas de sangre, plasma, suero y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades de la invención, el nivel de expresión es el nivel de expresión de mAR . En algunas modalidades de la invención, el nivel de expresión es el nivel de expresión de proteina. En algunas modalidades de la invención, el antagonista de VEGF-C es un anticuerpo anti-VEGF- En algunas modalidades de la invención, los métodos comprenden además administrar un antagonista de VEGF-A al paciente. En algunas modalidades de la invención, el antagonista de VEGF-A y el antagonista de VEGF-C son administrados concurrentemente. En algunas modalidades de la invención, el antagonista de VEGF-A y el antagonista de VEGF-C son administrados secuencialmente . En algunas modalidades de la invención, el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo anti-VEGF-A. En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo anti-VEGF-A es bevacizumab.
Otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de . cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de VEGF-C en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de VEGF-C en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de VEGF-C en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de VEGF-C en la muestra, .en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antaqonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de VEGF-C en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de VEGF-C en la muestra en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de VEGF-C en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de VEGF-C en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para tratar una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión incrementados de VEGF-C en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de VEGF-C, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Aún una modalidad adicional de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de. VEGF-D en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de VEGF-D en la muestra, en ¦ comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento. con el antagonista de VEGF-C.
Todavía una modalidad adicional de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de VEGF-D en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de VEGF-D en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Otra modalidad de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de VEGF- D en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de VEGF-D en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Otra modalidad de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de VEGF-D en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de VEGF-D en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que ' el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión incrementados de VEGF-D en comparación con ' una muestra de referencia y administrar' al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de VEGF-C, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de VEGFR3 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de VEGFR3 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de VEGF-C. 5 Una modalidad adicional de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de VEGFR3 en una muestra obtenida del paciente, en donde los ^ niveles de expresión incrementados de VEGFR3 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el. antagonista de VEGF-C.
Aún una modalidad adicional de la invención provee ^ métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de VEGFR3 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de VEGFR3 en la 20 muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un 25 antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de VEGFR3 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de VEGFR3 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Todavía una modalidad adicional ' de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión incrementados de VEGFR3 en comparación con una muestra, de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de VEGF-C, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de FGF2 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de FGF2 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de FGF2 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de FGF2 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de FGF2 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de FGF2 en la. muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de FGF2 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de FGF2 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene una probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de . expresión incrementados de FGF2 en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de VEGF-C, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Aún una modalidad adicional de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de VEGF-A en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de VEGF-A en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Todavía una modalidad adicional de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de VEGF-A en una muestra obtenida del paciente, en donde ' los niveles de expresión disminuidos de VEGF-A en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Otra modalidad de la invención provee métodos para determinar la . probabilidad de' que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de VEGF-A en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de VEGF-A en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Otra modalidad de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de VEGF-A en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de VEGF-A en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión disminuidos de VEGF-A en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de VEGF-C, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de P1GF en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de P1GF en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de P1GF en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de P1GF en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Aún una modalidad adicional de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de P1GF en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de P1GF en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Aún una modalidad adicional de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de VEGF-C. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de PIGF en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de PIGF en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Todavía una modalidad adicional de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión disminuidos de PIGF en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de VEGF-C, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
En algunas modalidades de la invención, el antagonista de VEGF-C es un anticuerpo anti-VEGF-C. En algunas modalidades de la invención, los métodos comprenden además administrar un antagonista de VEGF-A al paciente. En algunas modalidades de la invención, el antagonista de VEGF-A y el antagonista de VEGF-C son administrados concurrentemente. En algunas modalidades de la invención, el antagonista de VEGF-A y el antagonista de VEGF-C son administrados secuencialmente . En algunas modalidades de la invención, el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo anti-VEGF-A. En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo anti-VEGF-A es bevacizumab.
Otra modalidad de la invención provee kits para determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-C, VEGF-D, VEGFR3, FGF2, RGS5./CDH5, IL-8, CXCL1 y CXCL2. Los kits comprenden un arreglo que comprende polinucleotidos aptos de hibridizarse específicamente a por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-C, VEGF-D, VEGFR3, FGF2, RGS5/CDH5, IL-8, CXCL1 y CXCL2, e instrucciones para usar el arreglo para determinar los niveles de expresión del por lo menos un gen para predecir la sensibilidad de un paciente al tratamiento con un antagonista de VEGF-C, en donde un incremento en el nivel de expresión del por lo menos un gen en comparación con el nivel de expresión del por lo menos un gen en una muestra de referencia, indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
Otra modalidad de la invención provee kits para determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-A, CSF2, Proxl, ICAM1, ESM1, P1GF, ITGa5, TGFfi, Hhex, Col4al, Col4a2 y Alkl. Los kits comprenden un arreglo que comprende polinucleotidos aptos de hibridizarse específicamente a por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-A, CSF2, Proxl, ICAM1, ESM1, P1GF, ITGa5, TGF , Hhex, Col4al, Col4a2 y Alkl e instrucciones para . usar el arreglo para determinar los niveles de expresión del por lo menos un gen para predecir la sensibilidad de un paciente al tratamiento con un antagonista de VEGF-C, en donde una disminución en el nivel de expresión del por lo menos un gen, en comparación con el nivel de expresión del por lo menos un gen en una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de VÉGF-C.
Una modalidad adicional de la invención provee conjuntos de compuestos aptos de detectar niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-C, VEGF-D, VEGFR3, FGF2, RGS5/CDH5, IL-8, CXCL1 y CXCL2 para determinar los niveles de expresión del por lo menos un gen en una muestra obtenida de un paciente con cáncer. Los conjuntos comprenden por lo menos un compuesto apto de hibridizarse específicamente a por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-C, VEGF-D, VEGFR3, FGF2, RGS5/CDH5, IL-8, CXCL1 y CXCL2, en donde un incremento en el nivel de expresión_ del por lo menos un gen, en comparación con el nivel de expresión del por lo menos un gen en una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de VEGF-C. En algunas modalidades de ' la invención, los compuestos son polinucleótidos . En algunas modalidades de la invención, los compuestos son proteínas, tal como por ejemplo, anticuerpos.
Aún otra modalidad de la invención provee conjuntos de compuestos aptos de detectar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-A, CSF2, Proxl, ICAM1, ESM1, P1GF, ITGa5, TGF , Hhex, Col4al, Col4a2 y Alkl para determinar los niveles de expresión del por lo menos un gen en una muestra obtenida de un paciente con cáncer. Los conjuntos comprenden por lo menos un compuesto apto de hibridizarse específicamente a por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-A, CSF2, Proxl, ICAM1, ESM1, P1GF, ITGa5, TGF , Hhex, Col4al, Col4a2 y Alkl, en donde una disminución en el nivel de expresión del por lo menos gen en comparación con el nivel de expresión del por lo menos un gen en una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de VEGF-C. En algunas modalidades de la invención, los compuestos son polinucleótidos . En algunas • modalidades de la invención, los compuestos son proteínas, tales como por ejemplo, anticuerpos.
Una modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista múltiplo 7 de dominio semejante a EGF (EGFL7). Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-C, BV8, CSF2, TNFOÍ, CXCL2, PDGF-C y Mínele en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede •beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: Sema3B, FGF9, HGF, RGS5, NRP1, FGF2, CXCR , cMet, FN1, Fibulin 2, Fibulin /EFE P2 , MFAP5, PDGF-C, Sema3F y FN1 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-C, BV8, CSF2, TNFa, CXCL2, PDGF-C y Mínele en una muestra obtenida del paciente, en donde los' niveles de expresión incrementados del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre' de cáncer al tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: Sema3B, FGF9, HGF, RGS5, NRP1, FGF2 , CXCR4, cMet, FNl, Fibulin 2, Fibulin4 /EFEMP2 , MFAP5, PDGF-C, Sema3F y FNl en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos del -por lo menos un gen en la 5 muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un ^ beneficio del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-C, BV8, CSF2, TNFa, CXCL2 , PDGF-C y Mínele en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados del por lo menos un gen ^ en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Todavía una modalidad adicional de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un 20 paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión 'de por lo menos un gen seleccionado de: Sema3B, FGF9, HGF, RGS5, NRP1, FGF2, CXCR4 , cMet, FNl, Fibulin 2, Fibulin4/EFEMP2, MFAP5, PDGF-C, Sema3F y FNl en una muestra 25 obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-C, BV8, CSF2, T Fa, CXCL2, PDGF-C y Mínele en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Todavía una modalidad adicional de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: Sema3B, FGF9, HGF, RGS5, NRP1, FGF2, CXCR4 , cMet, FN1, Fibulin 2, Fibulin4/EFEMP2, MFAP5, PDGF-C, Sema3F y FN1 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Otra modalidad de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión incrementados, en comparación con una muestra de referencia, de por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-C, BV8, CSF2, TNFa, CXCL2, PDGF-C y Mínele y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión disminuidos, en comparación con una muestra de¦ referencia, de por lo menos un gen seleccionado de: Sema3B, FGF9, HGF, RGS5, NRP1, FGF2, CXCR , cMet, FN1, Fibulin 2, Fibulin4 /EFEMP2 , MFAP5 , PDGF-C, Sema3F y FN1 y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
En algunas modalidades de la invención, la muestra obtenida del paciente es seleccionada de: tejido, sangre entera, células derivadas de la sangre, plasma, suero y combinaciones de los mismos. En algunas modalidades de la invención, el nivel de expresión es el nivel de expresión de mARN. En algunas modalidades de la invención, el nivel de expresión es el nivel de expresión de proteina. En algunas modalidades de la invención, el antagonista de EGFL7 es un anticuerpo anti-EGFL7.
En algunas modalidades de la invención, los métodos comprenden además administrar un antagonista de° VEGF-A al paciente. En algunas modalidades de la invención, el antagonista de VEGF-A y el antagonista de. EGFL7 son administrados concurrentemente. En algunas modalidades de la invención, el antagonista de VEGF-A y el antagonista de EGFL7 son administrados secuencialmente . En algunas modalidades de la invención, el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo anti-VEGF-A. En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo anti-VEGF-A es bevacizumab.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de VEGF-C en una muestra obtenida del paciente, en donde los ¦niveles de expresión incrementados de VEGF-C en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Otra modalidad de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de VEGF-C en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de VEGF-C en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de EGFL7. 5 Aún otra modalidad de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de VEGF- C en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de ^ expresión incrementados de VEGF-C en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos ^ para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de VEGF-C en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de VEGF-C en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican 20 que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que 25 una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión incrementados de VEGF-C en comparación con una ' muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de BV8 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de BV8 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que él paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Otra modalidad de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de BV8 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de BV8 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de BV8 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de BV8 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de BV8 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de BV8 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL .
Todavía una modalidad adicional de la invención provee métodos para tratar una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión incrementados de BV8 en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de CSF2 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de CSF2 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de 'un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de CSF2 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de CSF2 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de CSF2 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de CSF2 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para " optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de CSF2 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de CSF2 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGF-L7.
Todavía una modalidad adicional provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión incrementados de CSF2 en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de TNFa en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de TNFa en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de TNFa en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de TNFa en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos •para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de TNFa en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de TNFa en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de TNFa en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados de TNFa en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión ¦incrementados de TNFa en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo cual la alteración 5 proliferativa celular es tratada.
Aún una modalidad adicional de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de ^ Sema3B en . una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de Sema3B en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
^ Todavía una modalidad adicional de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de Sema3B en una muestra obtenida del paciente, en donde los 20 niveles de expresión disminuidos de Sema3B-en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Otra modalidad de la invención provee métodos para 25 determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de Sema3B en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de Sema3B en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Otra modalidad de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de ÉGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de Sema3B en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de Sema3B en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene, niveles de expresión disminuidos de Sema3B en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de FGF9 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de FGF9 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de FGF9 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de FGF9 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún una modalidad adicional de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de FGF9 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de FGF9 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún una modalidad adicional de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de EGFL . Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de FGF9 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de FGF9 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Otra modalidad de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión disminuidos de FGF9 en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada Aún otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de HGF en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de HGF en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de HGF en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de HGF en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de HGF en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de HGF en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de HGF en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de HGF en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún una modalidad adicional de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión disminuidos de HGF en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de RGS5 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de RGS5 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de EGFL . Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de RGS5 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de RGS5 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de RGS5 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de RGS5 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia,, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista 'de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de RGS5 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de RGS5 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Todavía una modalidad adicional de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una mue-stra obtenida del paciente tiene niveles de expresión disminuidos de RGS5 en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo .cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Aún una modalidad adicional de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de NRPl en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de NRPl en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Otra modalidad de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de NRPl en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de NRPl en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que él paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de EGFL7.1 Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de NRPl en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de NRPl en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de NRP1 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de NRP1 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión disminuidos de NRP1 en comparación con una muestra de refer.encia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de FGF2 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de FGF2 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de FGF2 en una-muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de FGF2 en la muestra, en comparación' con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de FGF2 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de FGF2 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos -para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de EGFL . Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de FGF2 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de FGF2 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Todavía una modalidad adicional de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión disminuidos de FGF2 en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Aún una modalidad adicional de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de CXCR4 en una muestra obtenida del. paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de CXCR4 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Otra modalidad de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de CXCR4 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de CXCR4 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de CXCR4 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de CXCR4 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de CXCR4 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de CXCR4 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión disminuidos de CXCR4 en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de cMet en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión .disminuidos de cMet en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de cMet en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de cMet en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de cMet en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de cMet en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos 'para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de cMet en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de cMet en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EG.FL7.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión disminuidos de cMet en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Todavía una modalidad adicional de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de FN1 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de FN1 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, . indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún una modalidad adicional de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de FNl en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de FNl en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Otra modalidad de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de FNl en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de FNl en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Otra modalidad de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de FNl en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de FNl en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión disminuidos de FNl en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de-Fibulin 2 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de Fibulin 2 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para predecir la¦ sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de Fibulin 2 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de Fibulin 2 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún una modalidad adicional de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de Fibulin 2 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de Fibulin 2 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún una modalidad adicional de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de Fibulin 2 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de Fibulin 2 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Todavía una modalidad adicional de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente, tiene niveles de expresión disminuidos de Fibulin 2 en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de Fibulin4 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de Fibulin4 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de. expresión de Fibulin4 en una muestra obtenida del paciente, en' donde los niveles, de expresión disminuidos de Fibulin4 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de Fibulin4 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de Fibulin4 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de Fibulin4 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de Fibulin4 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún una modalidad adicional de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión disminuidos de Fibulin4 en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Todavía una modalidad adicional de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de MFAP5 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de MFAP5 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Otra modalidad de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de MFAP5 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de MFAP5 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de MFAP5 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de MFAP5 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de MFAP5 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de MFAP5 en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión disminuidos de MFAP5 en comparación con una muestra ' de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de PDGF-C en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de PDGF-C en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún una modalidad adicional de la · invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de PDGF-C en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de PDGF-C en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Todavía una modalidad adicional de la invención provee métodos para' determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de PDGF-C en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de PDGF-C en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Todavía una modalidad adicional de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de PDGF-C en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de PDGF-C en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Otra modalidad de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión disminuidos de PDGF-C en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
Aún otra modalidad de la invención provee métodos para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de Sema3F en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de Sema3F en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Todavía otra modalidad de la invención provee métodos para predecir la sensibilidad de un paciente que sufre de cáncer al tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de Sema3F en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de Sema3F en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es más probable de ser sensible al tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Una ' modalidad adicional de la invención provee métodos para determinar la probabilidad de que un paciente exhibirá un beneficio del tratamiento con un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de Sema3F en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de Sema3F en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Una modalidad adicional de la invención provee métodos para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de EGFL7. Los métodos comprenden determinar los niveles de expresión de Sema3F en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos de Sema3F en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún una modalidad adicional de la invención provee métodos para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente. Los métodos comprenden determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión disminuidos de Sema3F en comparación con una muestra de referencia y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
En algunas modalidades de la invención, el antagonista de EGFL7 es un anticuerpo anti-EGFL7. En algunas modalidades de la invención, los métodos comprenden además administrar un antagonista de VEGF-A al paciente. En algunas modalidades de la invención, el antagonista de VEGF-A y el antagonista de EGFL7 son administrados concurrentemente. En algunas modalidades de la invención, el antagonista de VEGF-A y el antagonista de EGFL7 son administrados secuencialmente . En algunas modalidades de la invención, el antagonista de VEGF-A. es ún anticuerpo anti-VEGF-A. En algunas modalidades de la invención, el anticuerpo anti-VEGF-A es bevacizumab.
Otra modalidad de la invención provee kits para determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-C, BV8, CSF2, TNFa, CXCL2, PDGF-C y Mínele. Los kits comprenden un arreglo que comprende polinucleótidos aptos de hibridizarse específicamente a por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-C, BV8, CSF2, TNFa, CXCL2, PDGF-C y Mínele, e instrucciones para usar el arreglo para determinar los niveles de expresión del por lo menos un gen para predecir la sensibilidad de un paciente al tratamiento con un antagonista de EGFL7, en donde un incremento en el nivel de expresión del por lo menos un gen en comparación con el nivel de expresión del por lo menos un gen en una muestra de referencia indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Aún otra modalidad de la invención provee kits para determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: Sema3B, FGF9 , HGF, RGS5 , NRP1, FGF2, CXCR4 , cMet, FN1, Fibulin 2, Fibulin /EFEMP2 , MFAP5, PDGF-C, Sema3F y FN1. Los kits comprenden un arreglo que comprende polinucleótidos aptos de hibridizarse específicamente a por lo menos un gen seleccionado de: Sema3B, FGF9, HGF,' RGS5, NRP1, FG 2 , CXCR4, cMet, FN1, Fibulin 2, Fibulin4 /EFEMP2 , FAP5, PDGF-C, Sema3F y FNl- e instrucciones para usar el arreglo para determinar los niveles de expresión del por lo menos un gen para predecir la sensibilidad de un paciente al tratamiento con un antagonista de EGFL7, en donde una disminución en el nivel de expresión del por lo menos un gen en comparación con el nivel de expresión del por lo menos un gen en una muestra de referencia, indican que el paciente se ' puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
Todavía otra modalidad de la invención provee conjuntos de compuestos aptos de detectar niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-C, BV8 , CSF2, TNFa, CXCL2, PDGF-C y Mínele. Los conjuntos comprenden por lo menos un compuesto apto de hibridizarse específicamente a por lo menos un gen seleccionado de: VEGF-C, BV8, CSF2, TNFa, CXCL2, PDGF-C y Mínele, en donde un incremento en el nivel de expresión del por lo menos un gen, en .comparación' con el nivel de expresión del por lo menos un gen en una muestra dé referencia, indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7. En algunas modalidades de la invención, los compuestos son polinucleótidos . En algunas modalidades' de la invención, los polinucleótidos comprenden tres secuencias resumidas en la Tabla 2. En algunas modalidades de la invención, los compuestos son proteínas, tales como por ejemplo, anticuerpos.
Una modalidad adicional de la invención provee conjuntos de compuestos aptos de detectar niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado de: Sema3B, FGF9, HGF, RGS5, NRP1, FGF2, CXCR4 , cMet, FN1, Fibulin 2, Fibulin4 /EFEMP2 , MFAP5, PDGF-C, Sema3F y FN1. Los conjuntos comprenden por lo menos un ' compuesto que se hibridiza específicamente a por lo menos un gen seleccionado de: Sema3B, FGF9, HGF, RGS5, NRP1, FGF2, CXCR , cMet, FN1, Fibulin 2, Fibulin4/EFEMP2 , FAP5, PDGF-C, Sema3F y FN1, en donde una disminución en el nivel de expresión de el por lo menos gen, en comparación con el nivel de expresión del por lo menos un gen en una muestra de referencia, indica que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7. En algunas modalidades de la invención, los compuestos son polinucleótidos. En algunas modalidades de la invención, los polinucleótidos comprenden tres secuencias resumidas en la Tabla 2. En algunas modalidades de la invención, los compuestos son proteínas, tales como por ejemplo, anticuerpos.
Estas y otras modalidades de la invención son descritas adicionalmente en la descripción detallada que sigue.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una tabla que muestra la eficacia del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl para inhibir el crecimiento de tumor en varios modelos de xenoinjerto de tumor.
La Figura 2 es una tabla que muestra valores p- y r-para la correlación de la expresión del marcador de ARN (qPCR) y eficacia de tratamiento de combinación con el anticuerpo anti-VEGF y el anticuerpo anti-NRPl.
La Figura 3 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada de tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de ??Gß? (factor de crecimiento transformante ß?) .
La Figura 4 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada de tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de Bv8/Procineticina 2.
La Figura 5 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de Sema3A (semaphorin3A) .
La Figura 6 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti- VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de P1GF (factor de crecimiento placental) .
La Figura 7 es una gráfica que muestra la eficacia ' mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti- VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de LGALS1 (Galectin-1) .
La Figura 8 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti- VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de ITGa5 (integrina alfa 5).
La Figura 9 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti- VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de CSF2/GM-CSF (factor 2 estimulante de colonia / factor estimulante de colonia de macrófago de granulocito) .
La Figura 10 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti- VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de Proxl (homeobox 1 próspero-relacionado) .
La Figura 11 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti- VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de RGS5 (regulador de señalización de proteina G5) .
La Figura 12 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de HGF (factor de ' crecimiento de hepatocito) .
La Figura 13 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de Sema3B (semaforina 3B)'.
La Figura 14 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de Sema3F (semaphorin 3F) .
La Figura 15 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de LGALS7 (Galectin-7) .
La Figura 16 es una tabla que muestra la eficacia de tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C para inhibir el crecimiento del tumor en varios modelos de xenoinjerto de tumor.
La Figura 17 es una tabla que muestra los valores p-y r- para la correlación la expresión de marcador de ARN (qPCR) y eficacia de tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C.
La Figura 18 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti- VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de VEGF-A.
La Figura 19 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti- 5 VEGF-A y anticuerpo anti.-VEGF-C versus la expresión relativa de VEGF-C.
La Figura 20 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti- VEGF-A y anti- VEGF-C anticuerpo - versus la expresión relativa 10 de VEGF-D .
La Figura 21 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti- VEGF-A y anticuerpo antirVEGF-C versus la expresión relativa de VEGFR3.
I-* La Figura 22 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti- VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de FGF2.
La Figura 23 es una gráfica que muestra la eficacia 20 mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti- VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de CSF2 (factor estimulante de colonia 2) .
La Figura 24 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-25 VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de ICAM1.
La Figura 25 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de RGS5 (regulador de señalización de proteina G 5) .
La Figura 26 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de ESM1.
La Figura 27 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de Proxl (prospero-relacionado homeobox 1) .
La Figura 28 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de P1GF.
La Figura 29 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VE<3F-C versus la expresión relativa de ITGa5.
La Figura 30 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo, anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de TGF-ß .
La Figura 31 es una tabla que muestra la eficacia de tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 para inhibir el crecimiento de tumor en varios modelos de xenoinjerto de tumor.
La Figura 32 es una tabla que muestra valores p- y r-para la correlación de- la expresión de marcador de ARN (qPCR) y la eficacia del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7.
La Figura 33 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de Sema3B.
Figura 34 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de FGF9.
La Figura 35 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de HGF.
La Figura 36 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de VEGF-C.
La Figura 37 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de RGS5.
La Figura 38 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de NRP1.
La Figura 39 es una gráfica que muestra la' eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de FGF2.
La Figura 40 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de CSF2.
La Figura 41 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de Bv8.
La Figura 42 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de CXCR4.
La Figura 43 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de TNFa.
La Figura 44 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de cMet .
La Figura 45 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de FN1.
La Figura 46 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de Fibulin2.
La Figura 47 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de Fibulin4.
La Figura 48 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo aríti-EGFL7 versus la expresión relativa de MFAP5.
La Figura 49 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de PDGF-C.
La Figura 50 es una tabla que muestra la eficacia del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl para inhibir el crecimiento de tumor en varios modelos de xenoinjerto de tumor.
La Figura 51 es una tabla que muestra los valores p-y r- para la correlación de la expresión del marcador de ARN (qPCR) y eficacia del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl.
.La Figura 52 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de Sema3B.
La Figura 53 es una _gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de TGF .
La Figura 54 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de FGFR4.
La Figura 55 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de Vimectin.
La Figura 56 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de Sema3A.
La Figura 57 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de PLC La Figura 58 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de CXCL5.
La Figura 59 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de ITGa5.
La Figura 60 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de P1GF.
La Figura 61 es una gráfica qué muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de CCL2.
La Figura 62 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de • IGFB4.
La Figura 63 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de LGALS1.
La Figura 64 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de HGF La Figura 65 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de TSP1.
La Figura 66 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de CXCL1.
La Figura 67 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de CXCL2.
La Figura 68 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de Alkl.
La Figura 69 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF y anticuerpo anti-NRPl versus la expresión relativa de FGF8.
La Figura 70 es una tabla que muestra la eficacia de tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C para inhibir el crecimiento de tumor en varios modelos de xenoinjerto de tumor.
La Figura 71 es una tabla que muestra valores para la correlación de la expresión del ARN marcador (qPCR) y eficacia del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C.
La Figura 72 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de VEGF-A.
La Figura 73 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de VEGF-C.
La Figura 74 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de VEGF-C.
La Figura 75 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de VEGF-D.
La Figura 76 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de VEGFR3.
La Figura 77 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con el anticuerpo anti-VEGF-A y el anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de ESM1..
La Figura 78 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de ESM1.
La Figura 79 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de P1GF.
La Figura 80 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de IL-8.
Figura 81 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de IL-8.
La Figura 82 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de CXCL1.
La Figura 83 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de CXCL1.
La Figura 84 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de CXCL2.
La Figura 85 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de CXCL2.
La Figura 86 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de Hhex .
La Figura 87 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de Hhex.
La Figura 88 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de Col4al y Col4a2.
La Figura 89 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de Col4al y Col4a2.
La Figura 90 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de Alkl.
La Figura 91 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de Alkl.
La Figura 92 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C versus la expresión relativa de Mínele .
La Figura 93 es una tabla que muestra la eficacia del tratamiento de combinación con el anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 para inhibir el crecimiento de tumor en varios modelos de xenoinjerto de tumor.
La Figura 94 es una tabla que muestra valores p- y r-para la correlación de la expresión ARN marcador (qPCR) y eficacia del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7.
La Figura 95 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de Sema3B.
La Figura 96 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de FGF9.
La Figura 97 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de HGF.
La Figura 98 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de VEGF-C.
La Figura 99 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de FGF2.
La Figura 100 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de Bv8.
La Figura 101 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de TNFa.
La Figura 102 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión -relativa de cMet .
La Figura 103 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de FN1.
La Figura 104 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de Fibulin 2.
La Figura 105 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de EFEMP2 /fibulin 4.
La Figura 106 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de MFAP5.
La Figura 107 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de PDGF-C.
La Figura 108 es una gráfica. que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de Frasl .
La Figura 109 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de CXCL2, La Figura 110 es una gráfica que muestra la eficacia mejorada del tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 versus la expresión relativa de Mincle .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN I . Introducción La presente invención provee métodos y composiciones para identificar pacientes que se pueden beneficiar del tratamiento con una terapia anti-angiogénica, incluyendo, por ejemplo, terapia anti-cáncer, diferente de o además de un antagonista de VEGF. La invención está basada en el descubrimiento de que la medición de un incremento o disminución en la expresión de por lo menos un gen seleccionado de 18S rRNA, ACTB, RPS13 , VEGFA, VEGFC, VEGFD, Bv8, P1GF, VEGFRl/Fltl, VEGFR2 , VEGFR3, NRP1, sNRPl, Podoplanin, Proxl, VE-Cadherin (CD144, CDH5 ) , robo4, FGF2 , IL8/CXCL8, HGF, THBS1/TSP1, Egfl7, NG3/Egf18 , ANG1, GM-CSF/CSF2, G-CSF/CSF3, FGF9, CXCL12/SDF1, TGFpl, TNFa, Alkl, BMP9, BMP10, HSPG2/perlecan, ESM1, Sema3a, Sema3b, Sema3c, Sema3e, Sema3f, NG2, ITGa5, ICAMl, CXCR , LGALSl/Galectinl, LGALS7B/Galectin7 , Fibronectina, TMEM100, PECAM/CD31, ????ß, ???G?ß, RGS5, CXCL1, CXCL2, robo4, LyPD6, VCAM1, colágeno IV (al), colágeno IV (a2), colágeno IV (a3), Spred-1, Hhex, ITGa5, LGALSl/Galectinl, LGALS7 /Galectin7 , TME 100, FAP5, Fibronectina, fibulin2 y fibulin4/Efemp2 es útil- para monitorear la sensibilidad o responsividad del paciente al tratamiento con una terapia anti-angiogénica diferente de o además de un antagonista de VEGF o para determinar la probabilidad de que un paciente se beneficiará o exhibirá beneficio del tratamiento con una terapia anti-angiogénica diferente de o además de un antagonista de VEGF. Terapias anti-angiogénicas apropiadas incluyen tratamiento con, por ejemplo, un antagonista de NRP1, un antagonista de VEGF-C o un antagonista de EGFL7.
II . Definiciones Las técnicas y procedimientos descrito o a los que se hace referencia en la presente son en general bien entendidos y empleados comúnmente utilizando metodología convencional por aquellos experimentados en el arte, tales como por ejemplo, las metodologías ampliamente utilizadas descritas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N . Y . CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. . Ausubel, et al. eds., (2003)); la serie METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames and G. R. Taylor eds. - (1995)), Harlow and Lañe, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, and ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait,- ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullís et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.
E. Coligan et al., eds . , 1991); Short Protocole in Molecular Biology ( iley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies : A Practical Approach (P. Shepherd and C. Dean, eds. Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow and D. Lañe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999) ; The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); and Cáncer: Principies and Practice of Oncology (V. T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).
A no ser que sean definidos de otra manera, los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entienden comúnmente por aquel de habilidad ordinaria en el arte con el cual esta invención esta invención es concerniente. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), and March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed. , John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992), provee al experimentado- en el arte una guía general a muchos de los términos usados en la presente solicitud. Todas las referencias citadas en la presente, incluyendo solicitudes de patente, publicaciones de patente y números de acceso Genbank son incorporados en la presente por referencia, como si cada referencia individual fuera indicada especifica e individualmente para ser incorporada por referencia .
Por propósitos de interpretar esta especificación, las siguientes definiciones se aplicarán y siempre que sea apropiado, los términos usados en singular también incluirán el plural y viceversa. En el caso de que cualquier definición resumida a continuación entre en- conflicto con cualquier documento incorporado en la presente por referencia, la definición resumida a continuación controlará.
Un. "individuo", "sujeto" o "paciente" es un vertebrado. En ciertas modalidades., el vertebrado es un mamífero. Los mamíferos incluyen, pero no están limitados a, animales de granja (tales como vacas) , animales deportivos, mascotas (tales como gatos, perros y caballos) , primates, ratones y ratas. En ciertas modalidades, un mamífero es un humano .
El término "muestra" o "muestra de prueba" como se usa en la presente, se refiere a una composición que es obtenida o derivada de un sujeto de interés que contiene una entidad celular y/u otra entidad molecular que va a ser caracterizada y/o identificada, por ejemplo en base a características físicas, bioquímicas, químicas y/o fisiológicas En' una modalidad, la definición abarca sangre y otras muestras líquidas de origen biológico y muestras de tejido tales como un espécimen de biopsia o cultivos de. tejido o células derivados de los mismos. La fuente de la muestra de tejido puede ser tejido sólido como de una muestra de órgano o tejido nuevo, congelado y/o conservado biopsia o aspirado; sangre o cualesquier constituyentes de sangre; fluidos corporales; y células de cualquier tiempo en gestación o desarrollo del sujeto o plasma.
El término "muestra" o "muestra de prueba" incluye muestras biológicas que han sido manipuladas de alguna manera después de su procuración, tal como mediante tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento por ciertos componentes, tales como proteínas o polinucleótidos o imbibición en una matriz sólida o semi-sólida por propósitos de seccionamiento. Para los propósitos de la presente, una "sección" de una muestra de tejido significa una sola parte o pieza de una muestra de tejido, por ejemplo una rebanada delgada de tejido o células cortadas de una muestra de tejido.
Muestras incluyen, pero no están limitadas a, células primarias o cultivadas o líneas celulares, sobrenadantes celulares, lisados celulares, plaquetas, suero, plasma, fluido vitreo, fluido linfático, fluido sinovial, fluido folicular, fluido seminal, fluido amniótico, leche, sangre entera, células derivadas de la sangre orina, fluido cerebro-espinal, saliva, esputo, lágrimas, transpiración, moco, lisados de tumor y medio de cultivo de tejido, extractos de tejido tales como tejido homogenizado, tejido de tumor, extractos celulares y combinaciones de los mismos..
En una modalidad, la muestra es una muestra clínica. En otra modalidad, la muestra es usada en un análisis de diagnóstico. En algunas modalidades, la muestra es obtenida de un tumor primario o metastático. La biopsia de tejido es frecuentemente usada para obtener una pieza representativa de tejido de tumor. Alternativamente, las células de tumor pueden ser obtenidas indirectamente en forma de tejidos o fluidos que se sabe o piensa que contienen las células de tumor' de interés. Por ejemplo, muestras de lesiones de cáncer de pulmón pueden ser obtenidas mediante resección, broncoscopía, aspiración de aguja fina, cepillados bronquiales o de esputo, fluido pleural o sangre.
En una modalidad, una muestra es obtenida de un sujeto o paciente antes de la terapia anti-angiogénica . En otra modalidad, una muestra es obtenida de un sujeto o paciente antes de la terapia con antagonista de VEGF. En todavía otra modalidad, una muestra es obtenida de un sujeto o paciente antes de la terapia de anticuerpo anti-VEGF. En aún otra modalidad, una muestra es obtenida de un sujeto o paciente enseguida por lo menos un tratamiento con terapia de antagonista de VEGF.
En una modalidad, una muestra es obtenida de un sujeto o paciente después por lo menos un tratamiento con una terapia anti-angiogénica. En todavía otra modalidad, una muestra es obtenida de un sujeto o paciente enseguida de por lo menos un tratamiento con un anticuerpo anti-VEGF. En algunas modalidades, una muestra es obtenida de un paciente antes de que el cáncer ha metastatizado .· En ciertas modalidades, una muestra es obtenida de un paciente después que el cáncer ha experimentado metástasis.
Una "muestra de referencia", como se usa en la presente, se refiere a cualquier muestra, estándar o nivel que es usado por propósitos de comparación. En una modalidad, una muestra de referencia es obtenida de una parte saludable y/o, no enferma del cuerpo (por ejemplo, tejido o células) del mismo sujeto o paciente. En otra modalidad, una muestra de referencia es obtenida de un tejido y/o célula sin tratar del cuerpo del mismo sujeto o paciente. En todavía otra modalidad, una muestra de referencia es obtenida de una parte saludable y/o no enferma del cuerpo (por ejemplo, tejidos o células) de un individuo que no es el sujeto o paciente. En aún otra modalidad, una muestra de referencia es obtenida de una parte de tejido y/o célula sin tratar del cuerpo de un individuo que no es el sujeto o paciente.
En ciertas modalidades, una muestra de referencia es una sola muestra o múltiples muestras combinadas del mismo sujeto o paciente que son obtenidas en uno o más puntos en el tiempo diferentes que cuando la muestra de prueba es obtenida. Por ejemplo, una muestra de referencia es obtenida en un punto en el tiempo más temprano del mismo sujeto o paciente que cuando la muestra de prueba es obtenida. Tal muestra de referencia puede ser útil si la muestra de referencia es obtenida durante la diagnosis inicial de cáncer y de muestra de prueba es obtenida más tarde cuando el cáncer se vuelve metastático.
En ciertas modalidades, una muestra de referencia incluye todos los tipos de muestras biológicas como se define anteriormente bajo el término "muestra" que es obtenida de uno o más individuos que no son el mismo sujeto o paciente. En ciertas modalidades, una muestra de referencia es obtenida de uno o más individuos con una alteración angiogénica (por ejemplo, cáncer) que no es el sujeto o paciente.
En ciertas modalidades, una muestra de referencia consiste de múltiples muestras combinadas de uno o más individuos saludables que no son el sujeto o paciente. En ciertas modalidades, una muestra de referencia consiste de múltiples muestras combinadas de uno o más individuos con una enfermedad o alteración (por ejemplo, una alteración angiogénica, tal como por ejemplo cáncer) que no son el sujeto o paciente. En ciertas modalidades, una muestra de referencia consiste de muestras de ARN acumuladas de tejidos normales o plasma acumulado o muestras de suero de uno o más individuos que no son el sujeto o paciente. En ciertas modalidades, una muestra de referencia consiste de muestras de ARN acumuladas de tejidos de tumor o muestras de plasma o suero acumuladas de uno o más individuos con una enfermedad o alteración (por ejemplo, una alteración angiogénica, tal como por ejemplo cáncer) que no son el sujeto o paciente.
Los niveles/cantidad de expresión de un gen o biomarcador pueden ser determinados cualitativa y/o cuantitativamente en base a cualquier criterio apropiado conocido en el arte, incluyendo pero no limitados a mARN, cADN, proteínas, fragmentos de proteína y/o número de copia de gen. En ciertas modalidades, la expresión/cantidad de un gen o biomarcador en una primera muestra es incrementada, en comparación con la expresión/cantidad en una segunda muestra. En ciertas modalidades, la expresión/cantidad de un gen o biomarcador en una primera muestra es disminuida en comparación con la expresión/cantidad en una segunda muestra. En ciertas modalidades, la segunda muestra es la muestra' de referencia. Revelaciones adicionales para determinar el nivel/cantidad de expresión de un gen son descritos posteriormente en la presente en métodos de la invención y en los Ejemplos 1 y 2.
En ciertas modalidades, el término "incremento" se refiere a un incremento global de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor, en el nivel de proteína o ácido nucleico, detectado mediante métodos conocidos en el arte estándar tales como aquellos descritos en la presente, en comparación con una muestra de referencia. En ciertas modalidades, el término incremento se refiere al incremento en el nivel/cantidad de expresión de un gen o biomarcador en la muestra, en donde el incremento es por lo menos aproximadamente 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X o 100X el nivel/cantidad de expresión del gen o biomarcador respectivo en la muestra de referencia .
En ciertas modalidades, el término "disminución" en la presente se refiere a una reducción global de 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor, en el nivel de proteína o ácido nucleico, . O detectado mediante métodos conocidos en el arte estándar tales como aquellos descritos en la presente, en comparación con una muestra de referencia. En ciertas modalidades, el término disminución se refiere a la disminución en nivel/cantidad de expresión de un gen o biomarcador en la muestra, en donde la disminución es por lo menos aproximadamente 0.9X, 0.8X, 0.7X, 0.6X, 0.5X, 0.4X, 0.3X, 0.2X, 0.1X, 0.05X o 0.01X el nivel/cantidad de expresión del gen o biomarcador respectivo en la muestra de referencia.
"Detección" incluye cualesquier medios de detección, incluyendo detección directa e indirecta.
En ciertas modalidades, "correlacionar" o "correlación" significa comparar, de alguna manera, el desempeño y/o resultados de un primer análisis o protocolo con el desempeño y/o resultados de un segundo análisis o protocolo. Por ejemplo, se pueden usar los resultados de un primer análisis o protocolo para llevar a cabo segundos protocolos y/o se pueden usar los resultados de un primer análisis o protocolo para determinar si se debe efectuar un segundo análisis o protocolo. Con respecto a la modalidad de análisis o protocolo de expresión genética, se pueden usar los resultados del análisis o protocolo de expresión genética para determinar si se debe efectuar un régimen terapéutico especifico.
"Neuropilin" o "NRP" se refiere colectivamente a neuropilin-1 (NRP1) , neuropilin-2 (NRP2) y sus isoformas y variantes, como se describe en Rossignol et al. (2000) Genomics 70:211-222. Las neuropilinas son receptores de cinasa sin tirosina de 120 a 130 kDa. Hay múltiples variantes de empalme de NRP-1 y NRP-2 e isoformas solubles. La estructura básica de las neuropilinas comprende cinco dominios: tres dominios extracelulares (ala2, blb2 y e), un dominio de transmembrana y un dominio citoplásmico . El dominio ala2 es homólogo a los componentes de complemento Clr y Cls (CUB) , que contienen en general cuatro residuos de cisteína que forman dos puentes de disulfuro. El dominio de blb2 es homólogo a los factores de coagulación V y VIII. La porción central del dominio c es designada como MAM debido a su homología a meprina, A5 y proteínas de receptor de tirosina fosfatasa µ. Los dominios ala2 y blb2 son responsables por el enlace de ligando, mientras que el dominio c es critico para la homodimerización o heterodimerización. Gu et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:18069-76; He and Tessier-Lavigne (1997) Cell 90:739-51.
"Actividad biológica moderada por neuropilina" o "actividad biológica moderada por NRP" se refiere en general a eventos fisiológicos o patológicos en los cuales neuropilina-1 y/o n'europilina-2 juega un papel sustancial. Ejemplos no limitantes de tales actividades son guía del axón durante el desarrollo del sistema nervioso embriónico o regeneración de neuronas, angiogénesis (incluyendo modelado vascular), tumorgénesis y metástasis de tumor.
Un "antagonista de NRP1" o "antagonista NRP1-específico" se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con actividades biológicas moderadas por NRP incluyendo pero no limitados a su enlace a uno o más ligandos de NRP, por ejemplo, VEGF, P1GF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, Sema3A, Sema3B, Sema3C, HGF, FGF1, FGF2, Galectin-1. Los antagonistas de NRP1 incluyen, sin limitación, anticuerpos anti-NRPl y fragmentos de enlace de antígeno de los mismos e inhibidores de molécula pequeña de NRPl. El término "antagonista de NRP1", como se usa en la presente, incluye específicamente moléculas, incluyendo anticuerpos, fragmentos de anticuerpo otros polipéptidos de enlace, péptidos y moléculas pequeñas sin péptido, que se enlazan a NRPl y son aptos de neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con las actividades de NRPl. Asi, el término "actividades de NRPl" incluyen específicamente actividades biológicas moderadas por NRPl de NRPl. En ciertas modalidades, el antagonista de NRPl reduce o inhibe, por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más, el nivel de expresión o actividad biológica de NRPl.
Un "anticuerpo anti-NRPl" es un anticuerpo que se enlaza a NRPl con suficiente afinidad y especificidad. Un "anticuerpo anti-NRPlB" es un anticuerpo que se enlaza a los dominios del factor de coagulación V/VIII (blb2) de NRPl. En ciertas modalidades, el anticuerpo seleccionado tendrá normalmente una afinidad de enlace suficientemente por NRPl, por ejemplo, el anticuerpo se puede enlazar a NRPl con humano con un valor Kd de entre 100 nM-1 pM. Las afinidades de anticuerpo pueden ser determinadas por un análisis a base de resonancia de plasmón superficial (tal como el análisis BIAcore como se describe en publicación de solicitud de PCT No. WO2005/012359) ; análisis inmunoabsorbente enzima-enlazado (ELISA) ; y análisis de competencia (por ejemplo, RIA) , por ejemplo. En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-NRPl puede ser usado como un agente terapéutico en el apuntamiento e interferencia con enfermedades o condiciones en donde la actividad de NRPl está involucrada. También, el anticuerpo puede ser sometido a otros análisis de actividad biológica, por ejemplo, con el fin de evaluar su efectividad como terapéutico.
Tales análisis son conocidos en el arte y dependen del antigeno objetivo y uso pretendido para el anticuerpo. Ejemplos incluyen el análisis de imbibición de HUVEC análisis de inhibición de crecimiento de célula de tumor (como se describe en O 89/06692, por ejemplo); análisis de citotoxicidad celular- anticuerpo-dependiente (ADCC) y análisis de citotoxicidad complemento-moderada (CDC) (patente estadounidense 5,500,362); y análisis de actividad agonista o hematopoyesis (véase WO 95/27062). Un anticuerpo anti-NRPl usualmente no se enlazará a otras neuropilinas tales como NRP2. En una modalidad el anticuerpo anti-NRPlB de la invención comprende preferiblemente un dominio variable de cadena ligera que comprende las siguientes secuencias de aminoácido de CDR: CDRL1 (RASQYFSSYLA) , CDRL2 (GASSRAS) y CDRL3 (QQYLGSPPT) . Por ejemplo, el anticuerpo anti-NRPl5 comprende una secuencia de dominio variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 5 de la publicación de PCT No. WO2007/056470. El anticuerpo anti-NRPlB de la invención comprende preferiblemente un dominio variable de cadena pesada que comprende las siguientes secuencias de aminoácidos de CDR: CDRH1 (GFTFSSYAMS) , CDRH2 ( SQISPAGGYTNYADSVKG) y CDRH3 (ELPYYRMSKVMDV) . Por ejemplo, el anticuerpo anti-NRPlB comprende una secuencia de dominio variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 6 de la publicación de PCT No. WO2007/056470. En otra modalidad el anticuerpo anti-NRPlB es generado de acuerdo con publicación de PCT No. WO2007/056470 o publicación estadounidense No. US2008/213268.
Los términos "EGFL7" o "dominio semejante a EGF, múltiplos 7" son usados intercambiablemente en la presente para referirse a cualquier polipéptido de EGFL7 natural o variante (ya sea natural o sintético) . El término "secuencia natural" abarca específicamente formas truncadas o secretadas que se presentan naturalmente (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular ) , formas variantes que ocurren naturalmente (por ejemplo, formas empalmadas alternativamente) y variantes alélicas que ocurre ocurren naturalmente. El término "EGFL7 tipo silvestre" se refiere en general a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de una proteina de EGFL7 que ocurre naturalmente. El término "secuencia de EGFL7 tipo silvestre" se refiere en general a una secuencia de aminoácidos encontrada en un EGFL7 que ocurre naturalmente.
Un "antagonista de EGFL7" o "antagonista EGFL7-específico" se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con actividades biológicas moderadas por EGFL7 incluyendo pero no limitados a, adhesión celular de HUVEC moderada por EGFL7 o migración celular de HUVEC moderada por EGFL7. Los antagonistas de EGFL7 incluyen, sin limitación, anticuerpos anti-EGFL7 y fragmentos de enlace de antígeno de los mismos e inhibidores de molécula pequeña de EGFL7. El término "antagonista de EGFL7", como se usa en la presente, incluye específicamente moléculas, incluyendo anticuerpos, fragmentos de anticuerpo otros polipéptidos de enlace, péptidos y moléculas pequeñas sin péptido, . que se enlazan a EGFL7 y son aptas de neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con actividades de EGFL7. Asi, el término "actividades de EGFL7" incluye específicamente actividades biológicas moderadas por EGFL7 de EGFL7. En ciertas modalidades, el antagonista de EGFL7 reduce o inhibe, por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más, el nivel de expresión o actividad biológica de EGFL7.
Un "anticuerpo anti-EGFL7" es un anticuerpo que se enlaza a EGFL7 con suficiente afinidad y especificidad. En ciertas modalidades, el anticuerpo seleccionado tendrá normalmente una afinidad de enlace suficiente por EGFL7, por ejemplo, el anticuerpo se puede enlazar a EGFL7 humano con un valor de Kd de entre 100 nM-1 pM. Las afinidades de anticuerpo pueden ser determinadas mediante un análisis a base de resonancia de plasmón superficial (tal como el análisis BIAcore como se describe en publicación de solicitud de PCT No. O2005/012359) ; análisis inmunoabsorbente enzima-enlazado (ELISA) ; y análisis de competencia (por ejemplo, RIA) , por ejemplo. En ciertas modalidades, el anticuerpo antÍ-EGFL7 puede ser usado como agente terapéutico en el apuntamiento e interferencia con enfermedades o condiciones en donde la actividad de EGFL7 está involucrada. También, el anticuerpo puede ser sometido a otros análisis de actividad biológica, por ejemplo, con el fin de evaluar su efectividad como terapéutico. Tales análisis son conocidos en el arte y dependen del antigeno objetivo y uso propuesto para el anticuerpo. Ejemplos incluyen inhibición de adhesión y/o migración de células de HUVEC; análisis de inhibición de crecimiento de tumor (como se describe en O 89/06692, por ejemplo); análisis de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y análisis de citotoxicidad moderada por complemento (CDC) (patente estadounidense 5,500,362); y análisis de actividad agonista o hematopoyesis (véase WO 95/27062). En algunas modalidades, el anticuerpo anti-EGFL7 de la invención comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende las siguientes secuencias de aminoácidos de CDR: CDRL1 (KASQSVDYSGDSYMS) , CDRL2 (GASYRES) y CDRL3 (QQNNEEPYT) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-EGFL7 de la invención comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende las siguientes secuencias de aminoácidos de CDR: CDRL1 (RTSQSLVHINAITYLH) , CDRL2 (RVSNRFS) y CDRL3 (GQSTHVPLT) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-EGFL7 de la invención comprende preferiblemente un dominio variable de cadena pesada que comprende las siguientes secuencias de aminoácidos de CDR: CDRH1 (GHTFTTYG S) , CDRH2 (GWINTHSGVPTYADDFKG) y CDRH3 (LGSYAVDY) . En algunas modalidades, el anticuerpo anti-EGFL7 de la invención comprende preferiblemente un dominio variable de cadena pesada que comprende las siguientes secuencias de aminoácidos de CDR: CDRH1 (GYTFIDYYMN) , CDRH2 (GDINLDNSGTHYNQKFKG) y CDRH3 (AREGVYHDYDDYA DY) .
Los términos "factor C de crecimiento endotelial vascular", "VEGF-C", "VEGFC" , "proteína VEGF-relacionada", "VRP", "VEGF2 " y "VEGF-2" son usados intercambiablemente y se refieren a un miembro de la familia de VEGF, que se sabe que se enlaza a por lo menos dos familias de receptor de superficie celular, los receptores de VEGF de cinasa de tirosina y los receptores de neuropilina (Nrp) . De los tres receptores de VEGF, VEGF-C se puede enlazar a VEGFR2 (receptor de KDR) y VEGFR3 (receptor de Flt-4) conduciendo a dimerización del receptor (Shinkai et al., J Biol Chem 273, 31283-31288 (1998)), activación de cinasa y autofosforilación (Heldin, Cell 80, 213-223 (1995); Waltenberger et al., J. Biol Chem 269, 26988-26995 (1994) ) . El receptor fosforilado induce la activación de múltiples' sustratos conduciendo a angiogénesis y linfangiogénesis (Ferrara et al., Nat Med 9, 669-676 (2003)). La sobreexpresión de VEGF-C en células de tumor demostró promover la linfangiogénesis tumor-asociada, dando como resultado metástasis mejorada a nodos linfáticos regionales (Karpanen et al., Faseb J 20, 1462-1472 (2001); Mandriota et al., EMBO J 20, 672-682 (2001); Skobe et al., Nat Med 7, 192-198 (2001); Stacker -et al., Nat Rev Cáncer 2, 573-583' (2002); Stacker et al., Faseb J 16, 922-934 (2002)). La expresión de VEGF-C también ha sido correlacionada con linfangiogénesis tumor-asociada y metástasis de nodo linfático para un número de cánceres humanos (revisado en Achen et al., 2006, supra. Además, se ha demostrado que el bloqueo de la señalización VEGF-C-moderada suprime la linfangiogénesis de tumor y metástasis de nodo linfático en ratones (Chen et al., Cáncer Res 65, 9004-9011 (2005); He et al., J. Natl Cáncer Inst 94, 8190825 (2002); Krishnan et al., Cáncer Res 63, 713-722 (2003); Lin et al., Cáncer Res 65, 6901-6909 (2005)).
"Factor C de crecimiento endotelial vascular", "VEGF-C", "VEGFC", "proteína VEGF-relacionada" , "VRP", "VEGF2" y "VEGF-2" se refieren al polipéptido de plena longitud y/o los fragmentos activos del polipéptido de plena longitud. En una modalidad, los fragmentos activos incluyen cualesquier porciones de la secuencia de aminoácidos de plena longitud que tienen menos de los plenos 419 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de plena longitud como se muestra en SEQ ID NO: 3 de la patente estadounidense No. 6,451,764, toda la revelación de la cual es incorporada expresamente en la presente por referencia. Tales fragmentos activos contienen actividad biológica de VEGF-C e incluyen, pero no limitados a VEGF-C maduro. En una modalidad, ^.el polipéptido de VEGF-C de plena longitud es procesado proteolíticamente para producir una forma madura de polipéptido de VEGF-C, también denominado como VEGF-C maduro. Tal procesamiento incluye la escisión de un péptido de señal y escisión de un péptido amino-terminal y escisión de un péptido carboxilo-terminal para producir una forma madura plenamente procesada. La evidencia experimental demuestra que el VEGF-C de plena longitud, formas parcialmente procesadas de VEGF-C y formas maduras plenamente procesadas de VEGF-C son aptas de enlazarse a VEGFR3 (receptor de Flt-4) . Sin embargo, una alta afinidad de enlace a VEGFR2 ocurre solamente con las formas maduras plenamente procesadas de VEGF-C.
El término "actividad biológica" y "biológicamente activo" con respecto a un polipéptido de VEGF-C se refieren a propiedades fisicas/quimicas y función biológica asociadas con VEGF-C de plena longitud y/o maduro. En algunas modalidades, "actividad biológica" de VEGF-C significa tener la habilidad de enlazarse a y estimular la fosforilación del receptor de Flt-4 (VEGFR3) . En general, VEGF-C se enlazará al dominio extracelular del receptor de Flt-4 y mediante esto activará o inhibirá el dominio de cinasa de tirosina intracelular del mismo. Consecuentemente, el enlace de VEGF-C al receptor puede dar como resultado mejora o inhibición de proliferación y/o diferenciación y/o activación de células que tienen el receptor de Flt-4 para el VEGF-C in vivo o in vitro. El enlace de VEGF-C al receptor de Flt-4 puede ser determinado utilizando técnicas convencionales, incluyendo métodos de enlace competitivos, tales como RIA, ELISA y otros análisis de enlace competitivos. Complejos de ligando/receptor pueden ser identificados utilizando tales métodos de separación como filtración, centrifugación, citometria de flujo (véase, por ejemplo, Lyman et al., Cell, 75:1157-1167
[1993]; Urdal et al., J. Biol. Chem. , 263:2870-2877
[1988]; and Gearing et al., EMBO J. , 8:3667-3676
[1989]) y los semejantes. Los resultados de los estudios de enlace pueden ser analizados utilizando cualquier representación gráfica convencional de los datos de enlace, tales como análisis de Scatchard (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. , 51: 660-672
[1949]; Goodwin et al., Cell, 73:447-456
[1993]) y los semejantes. . Puesto que VEGF-C induce la fosforilación del receptor de Flt-4, análisis de fosforilación de tirosina convencionales pueden también ser usados como indicación de la formación del receptor de receptor de Flt-4 /VEGF-C. En otra modalidad, "actividad biológica" de VEGF-C significa tener la habilidad de enlazarse al receptor de KDR (VEGFR2) . La permeabilidad vascular, también como la migración y proliferación de células endoteliales . En ciertas modalidades, el enlace de VEGF-C al receptor de KDR puede dar como resultado mejora o inhibición de permeabilidad vascular, también como migración y/o proliferación y/o diferenciación y/o activación de células endoteliales que tienen el receptor de KDR por el VEGF-C in vivo o in vitro.
El término "antagonista de VEGF-C" es usado en la presente para referirse a una molécula apta de neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con las actividades de VEGF-C. En ciertas modalidades, el antagonista de VEGF-C se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con la habilidad de VEGF-C para modular la angiogénesis , migración de célula endotelial linfática (EC) , proliferación o linfangiogénesis adulta, especialmente linfangiogénesis tumoral y metástasis de tumor. Los antagonistas de VEGF-C incluyen, sin limitación, anticuerpos anti-VEGF-C y fragmentos de enlace de antigeno de los mismos, moléculas de receptor y derivados que se enlazan específicamente a VEGF-C, secuestrando mediante esto su enlace a uno o más receptores, anticuerpos del receptor de anti-VEGF-C y antagonistas del receptor de VEGF-C tales como inhibidores de molécula pequeña del VEGFR2 y VEGFR3. El término "antagonista de VEGF-C", como se usa en la presente, incluye específicamente moléculas, incluyendo anticuerpos, fragmentos de anticuerpo otros polipéptidos de enlace, péptidos y moléculas pequeñas sin péptido, que se enlazan a VEGF-C y son capaces de neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con las actividades de VEGF-C. Así, el término "actividades de VEGF-C" incluyen específicamente actividades biológicas moderadas por VEGF-C (como se define anteriormente en la presente) de VEGF-C.
El término "anticuerpo anti-VEGF-C" o "un anticuerpo que se enlaza a VEGF-C" se refiere a un anticuerpo que es apto de enlazarse a VEGF-C con suficiente afinidad, de tal manera que el anticuerpo es útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico en el apuntamiento de VEGF-C. Anticuerpos anti-VEGF-C son descritos, por ejemplo, en el Documento del Abogado PR4291, todo el contenido de la solicitud de patente es incorporado expresamente en la presente por referencia. En una modalidad, la extensión de enlace de un anticuerpo anti-VEGF-C a una proteina sin VEGF-C no relacionada es menor de aproximadamente 10% del enlace del anticuerpo a VEGF-C tal como es medido por ejemplo, mediante un radioinmunoanálisis (RIA) . En ciertas modalidades, un anticuerpo que se enlaza a VEGF-C tiene una constante de disociación (Kd) de <1µ?, =100 nM, <10 nM, =1 nM o =0.1 nM. En ciertas modalidades, un anticuerpo anti-VEGF-C se enlaza a un epitopo de VEGF-C que es conservado entre VEGF-C de diferentes especies.
El término "VEGF" o "VEGF-A" como se usa en la presente, se refiere al factor de crecimiento de célula endotelial vascular humana de 165 aminoácidos y factores de crecimiento celular endotelial vascular humanos de 121-, 189- y 206-aminoácidos, como se describe por Leung et al. (1989) Science 246:1306, and Houck et al. (1991) Mol. Endocrin, 5:1806, junto con las formas alélicas y procesadas que se presentan naturalmente de los mismos. El término "VEGF" también se refiere a VEGF de especies no humanas tales como ratón, rata o primate. Algunas veces, el VEGF de una especie especifica son indicados por términos tales como hVEGF para VEGF humano, mVEGF para VEGF muri.no, etc. El término "VEGF" es también usado para referirse a formas truncadas del polipéptido que comprenden los aminoácidos 8 a 109 ó 1 a 109 del factor de crecimiento de célula epitelial vascular humano de 165 aminoácidos. La referencia a cualesquiera de tales formas de VEGF puede ser identificada en la presente solicitud, por ejemplo, por "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" o "VEGF165" . Las posiciones de aminoácido para, un VEGF natural "truncado" son numeradas como se indica en la secuencia de VEGF natural. Por ejemplo, la posición de aminoácido 17 (metionina) en VEGF natural truncado es también la posición 17 (metionina) en VEGF natural. El VEGF natural truncado tiene afinidad de enlace por los receptores KDR y Flt-1 comparable con VEGF natural. "actividad biológica de VEGF" incluye el enlace a cualquier receptor de VEGF o cualquier actividad de señalización de VEGF tal como regulación de angiogénesis y vasculogénesis normal y anormal (Ferrara and Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18:4-25; Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77:527-543); promoción de vasculogénesis y angiogénesis embriónica (Carmeliet et al. (1996) Nature 380:435-439; Ferrara et al. (1996) Nature 380:439-442); y modulación de la proliferación de vaso sanguíneo cíclica en el sistema reproductor femenino y para el crecimiento de huesos y formación de cartílagos (Ferrara et al. (1998) Nature Med. 4:336-340; Gerber et al. (1999) Nature Med. 5:623-628). Además de ser un factor angiogénico en angiogénesis y vasculogénesis , VEGF, como un factor de crecimiento pleiotrópico, exhibe múltiples efectos biológicos en otros procesos fisiológicos, tales como sobrevivencia de célula endotelial, permeabilidad de vaso y vasodilatación, quimiotaxis de monocito y afluencia de calcio (Ferrara -and Davis-Smyth (1997), supra and Cebe-Suarez et al. Cell. Mol. Life Sci . 63:601-615 (2006)). Además, estudios recientes han reportado efectos mitogénicos de VEGF sobre unos pocos tipos de células no endoteliales , tales como células epiteliales de pigmento retinal, células de ducto pancreático y células de Schwann. Guerrin et al. (1995) J. Cell Physiol. 164:385-394; Oberg-Welsh et al. (1997) Mol. Cell Endocrinol. 126:125-132; Sondell et al. (1999) J. Neurosci. 19:5731-5740.
Un "antagonista de VEGF" o "antagonista VEGF-especifico" se refiere a una molécula apta de enlazarse. a VEGF, reducir lps niveles de expresión de VEGF o neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con las actividades biológicas de VEGF, incluyendo pero no limitado a enlace de VEGF a uno o más receptores de VEGF y angiogénesis moderada por VEGF y supervivencia o proliferación de célula endotelial. Incluidos como antagonista VEGF-especificos útiles en los métodos de la invención están polipéptidos que se enlazan específicamente a VEGF, anticuerpos anti-VEGF y fragmentos de enlace de antígeno de los mismos, moléculas de receptor y derivados que se enlazan específicamente a VEGF secuestrando mediante esto su enlace a uno o más receptores, proteínas de fusión (por ejemplo, VEGF-Trampa (Regeneron) ) y VEGFi2i-gelonina (Peregrine) . Antagonista VEGF-específieos también incluyen variantes antagonistas de polipéptidos de VEGF oligómeros de nucleobase de antisentido dirigidos a VEGF, moléculas de ARN pequeñas dirigidas a VEGF, aptámeros de ARN, pepticuerpos y ribozimas contra VEGF. Antagonistas- de VEGF-específicos también incluyen moléculas pequeñas sin péptido que se enlazan a VEGF y son aptas de bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con las actividades biológicas de VEGF. Así, el término "actividades de VEGF" incluye específicamente actividades biológicas moderadas por VEGF de VEGF. En ciertas modalidades, el antagonista de VEGF reduce o inhibe, por al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más, el nivel de expresión o actividad biológica de VEGF.
Un "anticuerpo anti-VEGF" es un anticuerpo que se enlaza a VEGF con suficiente afinidad y especificidad. En ciertas modalidades, el anticuerpo seleccionado tendrá normalmente una afinidad de enlace suficiente por VEGF, por ejemplo, el anticuerpo se puede enlazar a hVEGF con un valor de Kd de entre 100 nM-1 pM. Las afinidades de anticuerpo pueden ser determinadas mediante un análisis a base de resonancia de plasmon superficial (tales como el análisis BIAcore como se describe en la publicación de solicitud de PCT No.
WO2005/012359) ; análisis inmunoabsorbente enzima-enlazado (ELISA); y análisis de competencia (por ejemplo, RIA), por e emplo.
En ciertas modalidades, el anticuerpo anti-VEGF puede ser usado como agente terapéutico en el apuntamiento e interferencia con enfermedades o condiciones en donde la actividad de VEGF está involucrada. También, el anticuerpo puede ser sometido a otros análisis de actividad biológica, por ejemplo, con el fin de evaluar su efectividad como terapéutico. Tales análisis son conocidos en el arte y dependen del antigeno objetivo y uso pretendido para el anticuerpo. Ejemplos incluyen el análisis de inhibición de HUVEC; análisis de inhibición de crecimiento de célula de tumor (como se describe en.WO 89/06692, por ejemplo); análisis de citotoxicidad celular anticuerpo-dependiente (ADCC) y citotoxicidad moderada por complemento (CDC) (patente estadounidense 5,500,362); y análisis de actividad agonista o hematopoyesis (véase WO 95/27062) . Un anticuerpo anti-VEGF usualmente no se enlazará a otros homólogos de VEGF tales como VEGF-B o VEGF-C, ni otros factores de crecimiento tales como P1GF, PDGF o bFGF. En una modalidad, el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo monoclonal que se enlaza al mismo epitopo como el anticuerpo anti-VEGF monoclonal A4.6.1 producido por el hibridoma HB 10709 de ATCC . En otra modalidad, el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta et al. (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599, incluyendo pero no limitado al anticuerpo conocido como bevacizumab (BV; AVASTIN®) .
El anticuerpo anti-VEGF "Bevacizumab (BV)", también conocido como "rhuMAb VEGF" o "AVASTIN®", es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta et al. (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599. Comprende reacciones de estructura de IgGl humana mutada y regiones que determinan la complementareidad de enlace de antigeno del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF murino A.4.6.1 que bloquea el enlace de VEGF humano a sus receptores. Aproximadamente el 93% de la secuencia de aminoácidos de Bevacizumab, incluyendo la mayoría de las regiones de estructura, son derivados de IgGl humanó y aproximadamente 7% de la secuencia es derivada del anticuerpo murino A4.6.1. Bevacizumab tiene una masa molecular de aproximadamente 149,000 daltons y está glicosilado. Bevacizumab y otros anticuerpos anti-VEGF humanizados son descritos adicionalmente en la patente estadounidense No. 6,884,879 expedida el 26 de febrero de 2005, toda la revelación de la cual es incorporada expresamente en la presente por referencia.
Los dos receptores de VEGF mejor caracterizados son VEGFR1 (también conocidos como Flt-1) y VEGFR2 (también conocidos como KDR y FLK-1 para el homólogo murino) . La especificidad de cada receptor por cada miembro de la familia de VEGF varia pero VEGF-A se enlaza a ambos de Flt-1 y KDR. El receptor de Flt-1 de plena longitud incluye un dominio extracelular que tiene siete dominios de Ig, un dominio de transmembrana y un dominio intracelular con actividad de cinasa de tirosina. El dominio extracelular está involucrado en el enlace de VEGF y el dominio intracelular está involucrado en la' transducción de señal.
Las moléculas del receptor de VEGF o fragmentos de las mismas, que se enlazan específicamente a VEGF pueden ser usadas como inhibidores de VEGF que se enlazan a y secuestran la proteína de VEGF, impidiendo mediante esto su señalización. En ciertas modalidades, la molécula de receptor de VEGF o fragmento de enlace de VEGF de 1-a misma, es una forma soluble tal como sFlt-1. Una forma soluble del receptor ejerce un efecto inhibidor sobre la actividad biológica de la proteína de ¦ VEGF al enlazarse a VEGF, impidiendo mediante esto que se enlace a sus receptores naturales presentes sobre la superficie de las células objetivo. También incluidas están las proteínas de fusión de receptor de' VEGF, ejemplos de las cuales son descritos posteriormente en la presente.
Una proteína del receptor de. VEGF quimérica es una molécula de receptor que tiene secuencias de aminoácidos derivadas de por lo menos dos proteínas diferentes, por lo menos una de los cuales es una proteína del receptor de VEGF (por ejemplo, el receptor de flt-1 o KDR) , que es apto de enlazarse a e inhibir la actividad biológica de VEGF. En ciertas modalidades, las proteínas del receptor de VEGF quiméricas de la presente invención consisten de secuencias de aminoácidos derivadas de solamente dos moléculas de receptor de VEGF diferentes; sin embargo, secuencias de aminoácidos que comprenden uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o todos los siete dominios semejantes a Ig de la región de enlace de ligando extracelular del receptor de flt-1 y/o KDR pueden ser enlazados a secuencias de aminoácidos de otras proteínas no relacionadas, por ejemplo, secuencias de inmunoglobulina . Otras secuencias de aminoácidos a las cuales los dominios semejantes a Ig son combinadas serán fácilmente evidentes para aquellos de habilidad ordinaria en el arte. Ejemplos de proteínas del receptor de VEGF quiméricas incluyen pero no limitadas a, Flt-1/Fc solubles, KDR/Fe o Flt-1/KDR/Fc (también conocido como trampa de VEGF) . (Véase por ejemplo la publicación de solicitud de PCT No. W097/44453) .
Una proteína del receptor de VEGF soluble o proteínas del receptor de VEGF quiméricas incluye proteínas del receptor de VEGF que no se fijan a la superficie de células vía un dominio de transmembrana. Como tal, formas solubles del receptor de VEGF, incluyendo proteínas de receptor quiméricas, en tanto que son aptas de enlace a y de desactivar VEGF, no comprenden un dominio de , transmembraná y así en general no se asocian con la membrana celular de células en las cuales la molécula es expresada.
Inhibidores de VEGF adicionales son descritos por ejemplo en WO 99/24440, solicitud internacional de PCT PCT/IB99/00797, en WO 95/21613, WO 99/61422, patente estadounidense No. 6,534,524, patente estadounidense No. 5,834,504, WO 98/50356, patente estadounidense No. 5,883,113, patente estadounidense No. 5,886,020, patente estadounidense No. 5,792,783, patente estadounidense No. 6,653,308, WO 99/10349, WO 97/32856, WO 97/22596, WO 98/54093, WO 98/02438, WO 99/16755 y WO 98/02437, todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad.
El término "polipéptido de serie B20" como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido, incluyendo un anticuerpo que se enlaza a VEGF. Polipéptidos de serie B20 incluyen pero no están limitados a, anticuerpos derivados de una secuencia del anticuerpo B20 o un anticuerpo B20-derivado descrito en la publicación estadounidense No. 20060280747, publicación estadounidense No. 20070141065 y/o publicación estadounidense No. 20070020267, el contenido de estas solicitudes de patente es incorporado expresamente en la presente por referencia. En una modalidad, el polipéptido de la serie B20 es B20-4.1 como se describe en publicación de solicitud de patente estadounidense No. 20060280747, publicación estadounidense No. 20070141065 y/o publicación estadounidense No. 20070020267. En otra modalidad, el polipéptido de serie B20 es B20-4.1.1 descrito en la solicitud de patente estadounidense 60/991,302, toda la revelación de la cual es incorporada expresamente en la presente por referencia. El término "polipéptido de serie G6" como se usa en la presente, se refiere a un polipéptido, incluyendo un anticuerpo que se enlaza a VEGF. Los polipéptidos de la serie G6 incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos derivados de una secuencia de anticuerpo G6 o un anticuerpo G6-derivado descrito en la publicación de patente estadounidense . No. 20060280747, publicación de patente estadounidense No. 20070141065 y/o publicación de patente estadounidense No. 20070020267. Los polipéptidos de serie G6, como' se describen en la publicación de solicitud de estadounidense No. 20060280747, publicación de solicitud estadounidense No. 20070141065 y/o publicación de solicitud estadounidense No. 20070020267 incluyen, pero no están limitados a, G6-8, G6-23 y G6-31.
Para anticuerpos adicionales, véanse patentes estadounidenses Nos. 7,060,269, 6,582,959, 6,703,020; 6,054,297; W098/45332; WO 96/30046; ' WO94/10202; EP 0666868B1; publicación de solicitud de patente estadounidense Nos. 2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 20030203409 y 20050112126; y Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004). En ciertas modalidades otros anticuerpos incluyen aquellos que se enlazan a un epitopo funcional sobre VEGF humano que comprende los residuos F17, M18, D19 y21 y25, Q89, 191, K101, E103 y C104 o, alternativamente, que comprende los residuos F17 y21, Q22 y25, D63, 183 y Q89.
Otros anticuerpos anti-VEGF y anticuerpos anti-NRPl son también conocidos y descritos, por ejemplo, en Liang et al., J Mol Biol 366, 815-829 (2007) y Liang et al., J Biol Chem 281, 951-961 (2006), No. de publicación de PCT WO2007/056470 y solicitud de PCT No. PCT/US2007/069179, el contenido de estas solicitudes de patente es incorporado expresamente en la presente por referencia.
El término "marcador" cuando se usa en la presente, se refiere a un compuesto o composición que es conjugada o fusionada directa o indirectamente a un reactivo, tal como una sonda de ácido nucleico o un anticuerpo y que facilita la detección del reactivo al cual es conjugado o fusionado. El marcador puede en si mismo ser detectable (por ejemplo, marcadores de radioisótopo o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable . una "molécula pequeña" es definida en la presente por tener un peso molecular menor de aproximadamente 500 Daltons.
"Polinucleótido" o "ácido nucleico", como se usan intercambiablemente en la presente, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser desoxiribonucleótidos , ribonucleótidos , nucleotidos modificados o bases y/o sus análogos o cualquier sustrato que puede ser incorporado a un polímero mediante ADN o ARN polimerasa o mediante una reacción de síntesis. Un polinucleótido puede comprender nucleotidos modificados, tales 5 como nucleotidos metilados y sus análogos.
"Oligonucleótido" , como se usa en la presente, se refiere en general a polinucleótidos cortos, en general de una sola hebra, en general sintéticos, que son en general, pero no necesariamente, menores de alrededor de 200 nucleotidos de í0 longitud. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son mutuamente exclusivos. La descripción anterior para polinucleótidos es igual y plenamente aplicable a oligonucleótidos .
En ciertas modalidades, los polinucleótidos son aptos l-5 de hibridizarse específicamente a un gen bajo varias condiciones de severidad. "Severidad" de reacciones de hibridización es fácilmente determinable por aquel de habilidad ordinaria en el arte y en general es un cálculo empírico dependiente de la longitud de sonda, temperatura de lavado y 20 concentración de sal. En general, las sondas más largas requieren temperaturas más altas para un recocido apropiado, mientras que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridización depende en general de la habilidad de ADN desnaturalizado al recocido cuando hebras complementarias 25 están presentes en un medio ambiente debajo de su temperatura de fusión. Mientras más alto es el grado de homología deseada entre la sonda y secuencia hibridizable, más alta es la temperatura relativa que puede ser usada. Como resultado, se sigue que temperaturas relativas más altas tenderán a hacer las condiciones de reacción más severas, mientras que las temperaturas más bajas menores. Para detalles adicionales y explicación de la severidad de las reacciones de hibridización, véase Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).
Las condiciones de severidad o condiciones de alta severidad pueden ser identificadas por aquellas que: (1) emplean baja fuerza iónica y alta temperatura para el lavado, por ejemplo cloruro de sodio 0.015 M/citrato de sodio 0.0015 M/dodecil sulfato de sodio al 0.1% a 50°C; (2) emplean durante la hibridización un agente desnaturalizante, tal como formamida, por ejemplo, formamida al 50% (v/v) con albúmina de suero bovino al 0.1%/Ficoll al 0.1% /polivinilpirrolidona al 0.1%/solución reguladora del pH de fosfato de sodio 50 mM a pH 6.5 con cloruro de sodio 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 °C; o (3) emplean formamida al 50%, 5 x SSC (NaCl 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio al 0.1%, solución de Denhardt 5 x, ADN de esperma de salmón sónificado, (50 ug/ml) , SDS al 0.1% y sulfato de dextrana al 10% a 42°C, con lavados a 42°C en SSC 0.2 x (cloruro de sodio/citrato de sodio) y formamida al 50% a 55°C, seguido por un lavado de alta severidad que consiste de SSC al 0.1 x que contiene EDTA a 55°C.
Condiciones de moderada severidad pueden ser identificadas como se describe por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de solución de lavado y condiciones de hibridización (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % de SDS) menos severas que aquellas descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente severas consiste de incubación de la noche a la mañana a 37 °C en una solución que comprende: formamida al 20%, SSC 5 x (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), soluciones de Denhardt 5 x, sulfato de dextrana al 10% y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón sometido a esfuerzo cortante desnaturalizado, seguido por lavado de los filtros en SSC 1 x a aproximadamente 37-50°C. El experimentado en el arte reconocerá como ajusfar la temperatura, fuerza iónica, etc. como sea necesario para compensar ' factores tales como longitud de sonda y los semejantes.
Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que es identificada y separada de por lo menos una molécula de. ácido nucleico contaminante con la cual está ordinariamente asociada en la fuente natural del ácido nucleico del polipéptido. Una molécula de ácido nucleico aislada es diferente de la forma o instalación en la cual es encontrada en la naturaleza. Las moléculas de ácido nucleico aisladas son distinguidas de la molécula de ácido nucleico como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que expresan ordinariamente el polipéptido en donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en un sitio cromosomal diferente de aquel de las células naturales.
Un "cebador" es en general un polipéptido de una sola hebra corto, en general con un grupo 3' -OH libre, que se enlaza a un objetivo " potencialmente presente en una muestra de interés mediante hibridización con una secuencia objetivo y después de esto promueve la polimerización de un polinucleótido complementario al objetivo.
El término "gen de mantenimiento" se refiere a un grupo de genes que codifican por proteínas cuyas actividades son esenciales para el mantenimiento de la función celular. Estos genes son comúnmente expresados similarmente en todos los tipos de células.
El término "biomarcador", como se usa en la presente, se refiere en general a una molécula, incluyendo un gen, proteína, estructura de carbohidrato o glicolípido, la expresión del cual en un tejido o célula mamífera puede ser detectada mediante métodos estándar (o métodos revelados en la presente) y es predictiva, de diagnóstico y/o prognóstico por la sensibilidad de la célula o tejido mamífero a regímenes de tratamiento basados en la inhibición de angiogénesis , por ejemplo un agente anti-angiogénico tal como un inhibidor VEGF-especifico. En ciertas modalidades, la expresión de tal biomarcador es determinada ser más alta o más baja que aquella observada para una muestra de referencia. La expresión de tales biomarcadores puede ser determinada utilizando un inmunoanálisis multiplexado de alto rendimiento tales como aquellos disponibles comercialmente de Rules Based Medicine, Inc. o Meso Scale Discovery. La expresión de los biomarcadores puede también ser determinada utilizando, por ejemplo, análisis de PCR o FACS, un análisis inmunohistoquímico o un análisis a base de chip o gen.
El término "arreglo" o "microarreglo" , como se usa en la presente, se refiere a un arreglo ordenado de elementos de arreglo ' hibridizables, preferiblemente sondas de polinucleótidos (por ejemplo oligonucleótidos) , sobre un sustrato. El sustrato puede ser un sustrato sólido, tal como un portaobjetos de vidrio o un sustrato semi-sólido, tal. como membrana de nitrocelulosa . Las secuencias de nucleótidos pueden ser ADN, ARN o cualesquxer permutaciones de los mismos.
Un "gen", "gen objetivo", "biomarcador objetivo", "secuencia objetivo", "ácido nucleico objetivo" o "proteína objetivo", - como se usa ß?· la presente, es un polinucleótido o proteína de interés,' la detección de la cual es' deseada. En general, una "plantilla", como se usa en la presente, es un polinucleótido que contiene la secuencia de nucleótidos objetivo. En algunas instancias, los términos "secuencia objetivo", "ADN plantilla", "polinucleótido de plantilla", "ácido nucleico objetivo", "polinucleótido objetivo" y variaciones de los mismos, son usados intercambiablemente.
"Amplificación", como se usa en la presente, se refiere en general al proceso de producir múltiples copias de una secuencia deseada. "Múltiples copias" indica por lo menos 2 copias. Una "copia" no significa necesariamente complementareidad de secuencia o identidad de secuencia perfecta a la secuencia de plantilla. Por ejemplo, copias, pueden incluir análogos de nucleótido tales como desoxirosina, alteraciones de secuencia intencionales (tales como alteraciones de secuencia introducidas por medio de un cebador que comprende una secuencia que es hibridizable, pero no complementaria a la plantilla) y/o errores de secuencia que ocurren durante la amplificación.
Un polipéptido de "secuencia natural" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos como un polipéptido derivado de la naturaleza. Asi, un polipéptido de secuencia natural puede tener la secuencia de aminoácidos del polipéptido que ocurre naturalmente de cualquier mamífero. Tal polipéptido de secuencia natural puede ser aislado de la naturaleza o puede ser producido mediante medios recombinantes o sintéticos. El término polipéptido de "secuencia natural" abarca específicamente formas truncadas o secretadas que se presentan naturalmente del polipéptido (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelula ) , formas variantes que ocurren naturalmente (por ejemplo, formas empalmadas alternativamente) y variantes alélicas que se presentan naturalmente del polipéptido.
Un polipéptido "aislado" o anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Componentes contaminantes de su medio' ambiente natural son materiales que interferirían con los usos de diagnóstico o terapéutico para el polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En ciertas modalidades, el polipéptido será purificado (1) a mayor de 95% en peso del polipéptido, tal como se determina por el método de Lowry o más de 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa de centrifugación o (3) a la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando teñido de azul de Coomassie o plata. El polipéptido aislado incluye el polipéptido in situ dentro de células recombinantes , puesto que por lo menos un componente del medio ambiente natural del polipéptido no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el polipéptido aislado será preparado mediante por lo menos una etapa de purificación.
Una "variante" de polipéptido significa un polipéptido biológicamente activo que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de secuencia natural. Tales variantes incluyen, por ejemplo, polipéptidos en donde uno o más residuos de aminoácidos son agregados o cancelados, en el término N- o C del polipéptido. Ordinariamente, una variante tendrá por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de aminoácidos y aún más preferiblemente por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con el polipéptido de secuencia natural .
El término "anticuerpo" es usado en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de plena longitud) , anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos bisespecífieos ) y fragmentos de ¦anticuerpos en tanto que exhiban la actividad biológica deseada El .término "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones que se presentan naturalmente, que pueden estar presentes en cantidades menores. Asi, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo por no ser una mezcla de anticuerpos discretos. En ciertas modalidades, tal anticuerpo monoclonal incluye comúnmente un anticuerpo que comprende una secuencia de polipéptidos que se enlaza a un objetivo, en donde la secuencia de polipéptidos de enlace objetivo fue obtenida mediante un proceso que incluye la ¦ selección de una sola secuencia de polipéptido de enlace objetivo de una pluralidad de secuencias de polipéptidos. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un clon único de una pluralidad de clones, tal como un fondo de clones de hibridoma, clones de fago o clones de ADN recombinantes . Se debe entender que una secuencia de enlace objetivo seleccionada puede ser alterada adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad por el objetivo, para humanizar la secuencia de enlace objetivo, para mejorar su producción en cultivo celular, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecifico , etc. y que un anticuerpo que comprende la secuencia de enlace objetivo alterada es también un anticuerpo monoclonal de esta invención. En contraste con preparaciones de anticuerpo policlonales, que incluyen comúnmente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos) , cada anticuerpo monoclonal de una preparación de anticuerpo monoclonal está dirigido contra un solo determinante sobre un antigeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpo monoclonal son ' ventajosas en que están comúnmente sin contaminar por otras inmunoglobulinas .
El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo por ser obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no se interpretará que requiere producción del anticuerpo por algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser usados de acuerdo con la presente invención pueden ser elaborados mediante una variedad de técnicas, incluyendo, por ejemplo, el método de hibridoma (por ejemplo, Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antij odies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodíes and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo,, patente estadounidense No. 4,816,567), tecnologías de despliegue de fago (véase, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004) y tecnologías para producir anticuerpos humanos o semejantes a humanos en animales que tienen partes o todos los sitios o genes de inmunoglobulina humanos que codifican secuencias de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Na ture 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al. year in Immunol. 7:33 (1993); patentes estadounidenses Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; y 5,661,016; Marks et al., Bio/'Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); y Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).
Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa con secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntico con u homologa con secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase de subclase de anticuerpo, también como fragmentos de tales anticuerpos, en tanto que exhiban la actividad biológica deseada (véase, por ejemplo, patente estadounidense No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Anticuerpos quiméricos incluyen anticuerpos PRIMATIZED®, en donde la región de enlace de antígeno del anticuerpo es derivada de un anticuerpo producido mediante por ejemplo, inmunización de monos macaco con el antigeno de interés.
A no ser que se indique de otra manera, la expresión "anticuerpo multivalente" denota un anticuerpo que comprende tres o más sitios de enlace de antigeno. En ciertas modalidades, el anticuerpo multivalente es diseñado para tener los tres o más sitios de enlace de antigeno y no es en general un anticuerpo de IgM o IgA de secuencia natural.
Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En una modalidad, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la cual residuos de una HVR del receptor son reemplazados por residuos de una HVR de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas. En algunas instancias, residuos de FR de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no son encontrados en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se pueden hacer para refinar adicionalmente el desempeño de anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de por lo menos uno y comúnmente dos, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos los FR son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , comúnmente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase, por ejemplo, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Véase también, por ejemplo, Vaswani and Hamilton, ' Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem.' Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); y patentes' estadounidenses Nos. 6,982,321 and 7,087,409. Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a aquella de un anticuerpo producido por un humano y/o ha sido elaborada utilizando cualquiera de las técnicas para elaborar anticuerpos humanos como se revela en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de enlace de antigeno no humanos. Anticuerpos humanos pueden ser producidos utilizando varias técnicas conocidas en el arte, incluyendo bibliotecas de despliegue, de fago. Hoogenboom and Winter, J.
Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). También disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos están métodos descritos en Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R.
Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(l):86-95 (1991). Véase también van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol . , 5: 368-74 (2001). Anticuerpos humanos pueden ser preparados al administrar el antigeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir tales anticuerpos en respuesta al ataque antigénico, pero cuyos sitios endógenos han sido deshabilitados, por ejemplo, xenoratones inmunizados (véase, por ejemplo, patentes estadounidenses Nos. 6,075,181 y 6, 150, 584 con respecto a la tecnología de XENOMOUSE™) . Véase también, por ejemplo, Li et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) con respecto a anticuerpos humanos generados vía una tecnología de hibridoma de célula B humana.
La "región variable" o "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios amino-terminales de la cadena pesada o ligera del anticuerpo. El dominio variable de la cadena pesada puede ser denominado como "VH". El dominio variable de la cadena ligera puede ser denominado como "VL". Estos dominios son en general las partes más variables de un anticuerpo y contiene los sitios de enlace de antígeno. Él término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y son usadas en el enlace y especificidad de cada anticuerpo particular por su antigeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida igualmente en todos los dominios variables de anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos llamados regiones hipervariables (HVR) tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de dominios variables son llamadas las regiones de estructura (FR). Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras naturales comprenden cada uno cuatro regiones de FR, que adoptan extensamente una configuración de hoja beta, unido mediante tres HVR, que forman bucles que unen y en algunos casos forman parte de la estructura de hoja beta. Las HVR en cada cadena son retenidas conjuntamente en proximidad estrecha por las regiones de FR y, con las HVR de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace de antigeno de anticuerpos (véase Kabat et al., Seguetees of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, · National Institute of Health, Bethesda, D (1991)). Los dominios constantes no están involucrados directamente en el enlace de un anticuerpo a un antigeno, pero exhiben varias funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en toxicidad celular dependiente de anticuerpo.
"Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de anticuerpo intacto, preferiblemente comprende la región de enlace de antigeno de los mismos. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos de Fab, Fab", F(ab')2 y Fvs ; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de una sola cadena; y anticuerpos multiespecificos formados de fragmentos de anticuerpo.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de enlace de antígeno completo. En una modalidad, una especie de Fv de dos cadenas consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y de cadena ligera en fuerte asociación no covalente. En una especie de Fv de una sola cadena (scFv) , un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera pueden ser enlazados covalentemente por un enlazador de péptido flexible, de tal manera que las cadenas ligeras o pesadas se pueden asociar en una estructura "dimérica" análoga a aquella en una especie de Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres HVR de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace de antígeno sobre la superficie del dímero de VH-VL. Colectivamente, las seis HVR confieren especificidad del enlace de. antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aún un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres HVR específicas para un antígeno) tiene la habilidad para reconocer y enlazarse al antígeno, aunque a una afinidad más baja que todo el sitio de enlace.
El fragmento de Fab contiene los dominios variables de cadena pesada y ligera y también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CHl) de la cadena pesada. Los fragmentos de Fab' difieren de los fragmentos de Fab por la adición de unos pocos- residuos en el término carboxi del dominio de CHl de cadena pesada incluyendo una o más cisteinas de la región de engozne de anticuerpo. Fab' -SH es la designación en la presente para Fab' en la cual el (los) residuo (s) de cisteina de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente fueron producidos como pares de fragmentos de Fab' que tienen cisteinas de engozne entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo son también conocidos.
El término "región hipervariable", "HVR" o "HV", cuando es usado en la presente, se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. En general, los anticuerpos comprenden seis HVR; tres en la VH (Hl, H2, H3) y tres en la VL (Ll, L2, L3) . En anticuerpos naturales, H3 y L3 muestran la mayor diversidad de los seis HVR y H3 en particular se cree que juega un papel único en conferir especificidad fina a anticuerpos. Véase, por ejemplo, Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, en Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003) . Por supuesto, anticuerpos camélidos que se presentan naturalmente que consisten de una cadena pesada solamente son funcionales y estables en ausencia de cadena ligera. Véase, por ejemplo, Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).
Los residuos de "estructura" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los residuos de HVR como se define en la presente.
Un anticuerpo "madurado por afinidad" es uno con una o más alteraciones en una o más HVR del mismo que da como resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antigeno, en comparación con un anticuerpo padre que no posee aquella(s) alteración (es ) . En una modalidad, un anticuerpo madurado por afinidad tiene afinidades nanomolares o aún picomolares por el antigeno objetivo. Los anticuerpos madurados por afinidad pueden ser producidos utilizando ciertos procedimientos conocidos en el arte. Por ejemplo, arks et al. Bio/Technology 10:779-783 .(1992) describe la maduración por afinidad mediante entremezcla de dominio de VH y VL. La mutagénesis aleatoria de HVR y/o residuos de estructura es descrita por, por ejemplo, Barbas et al. Proc Wat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154 ( 7 ): 3310-9 (1995); and Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).
El término "región de Fe" en la presente es usado para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo regiones de Fe de secuencia natural y regiones de Fe variantes. Aunque las fronteras de la región de Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina podrían variar, la región de Fe de cadena pesada de IgG humana es usualmente definida para estirarse desde un residuo de aminoácido en posición Cys226 o de Pro230, al término carboxilo de la misma. La lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración de EU) de la región de Fe puede ser removido, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo o mediante diseño recombinantemente del ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Así, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los residuos de K447 removidos, poblaciones de anticuerpo sin residuos K447 residuos y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo de K447.
Una "región de Fe funcional" posee una "función efectora" de una región de Fe de secuencia natural. "Funciones efectoras" ejemplares incluyen enlace de Clq; CDC; enlace de receptor de Fe; ADCC; fagocitosis; regulación descendente de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B; BCR) , etc. Tales funciones efectoras requieren en general que la región de Fe sea combinada con un dominio de enlace (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpo) y pueden ser determinadas utilizando varios análisis como se revela por ejemplo en las definiciones de la presente.
Una "región de Fe de secuencia natural" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región de Fe encontrada en la naturaleza. Regiones de Fe humana de secuencia natural incluyen una región de Fe de IgGl humana de secuencia natural (sin alotipos A y de alotipos A); región de Fe de IgG2 humana de secuencia natural; región de Fe de IgG3 humana de secuencia natural; y región de Fe de IgG4 humana de secuencia natural también como variantes que se presentan naturalmente de las mismas.
Una "región de Fe variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de aquella de una región de Fe de secuencia natural en virtud de por lo menos una modificación de aminoácido, preferiblemente una o más sustitución (es) de aminoácido. Preferiblemente, la región de Fe variante tiene por lo menos una sustitución de aminoácido en comparación con una región de Fe de secuencia natural o a la región de Fe de un polipéptido padre, por ejemplo de aproximadamente uno a aproximadamente diez sustituciones de aminoácido y preferiblemente de alrededor de uno a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácido en una región de Fe de secuencia natural o en la región de Fe del polipéptido padre. La región de Fe variante en la presente poseerá preferiblemente por lo menos aproximadamente 80% de homología con una región de Fe de secuencia natural y/o con una región de Fe de un polipéptido padre y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 90% de homología en la misma, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 95% de homología con la misma.
"Receptor de Fe" o "FcR" describe un receptor que se enlaza a la región de Fe de un anticuerpo. En algunas modalidades, un FcR es un FcR humano natural. En algunas modalidades, un FcR es uno que se enlaza a un anticuerpo de IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluyendo variantes alélicas y formas empalmadas alternativamente de aquellos receptores. Receptores de FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor") , que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplásmicos de los mismos. El receptor de activación FcyRIIA contiene una porción de activación a base de tirosina inmunoreceptora (ITAM) en su dominio citoplásmico . El receptor inhibidor FcyRIIB contiene una porción de inhibición a base de tirosina inmunoreceptora (ITIM) en su dominio citoplásmico. (véase, por ejemplo, Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcR son revisados, por ejemplo, en Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et ai-, Immunomethods 4:25-34 (1994); and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcR, incluyendo aquellos a ser identificados en el futuro, son abarcados por el término "FcR" en la presente.
El término "receptor de Fe" o "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable por la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) y regulación de homeostasis de inmunoglobulinas . Métodos para medir el enlace a FcRn son conocidos (véase, por ejemplo, Ghetie and Ward., Immunol. Today 18 ( 12 ): 592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15 ( 7 ): 637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279 (8) : 6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.) .
El enlace a FcRn humano In vivo y la vida media en el suero de polipéptidos de enlace de alta afinidad de FcRn humano pueden ser analizados, por ejemplo, en ratones transgénicos o lineas celulares humanas transfectadas que expresan FcRn humano o en primates a los cuales los polipéptidos con una región de Fe variante son administrados. WO 2000/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpo con enlace mejorado o disminuido a FcR. Véase también, por ejemplo, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) .
"Células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y efectúan funciones efectoras. En ciertas modalidades, las células expresan por lo menos FcyRIII y efectúan función (es) efectora de ADCC . Ejemplos de leucocitos humanos que moderan ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , células asesinas naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos. Las células efectoras pueden ser aisladas de una fuente natural, por ejemplo sangre.
"Citotoxicidad moderada por la célula dependiente de anticuerpo" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la cual la Ig secretada enlazada sobre receptores de Fe (FcR) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células NK, neutrófilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas se enlacen específicamente a una célula objetivo portadora de antígeno y subsecuentemente asesinen la célula objetivo con citotoxinas. Las células primarias para moderar ADCC, células NK, expresan FcyRIII solamente, mientras que los monocitos express FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas es resumida en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para determinar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede efectuar un análisis de ADCC in vitro, tal como aquel descrito en las patentes estadounidenses No. 5,500,362 ó 5,821,337 o patente estadounidense No. 6,737,056 (Presta) . Células efectoras útiles para tales análisis incluyen PBMC y células NK. Alternativamente o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede ser determinada in vivo, por ejemplo, en un modelo de animal tal como aquel revelado en Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998) .
"Citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula objetivo en presencia de complemento. La activación de la ruta de complemento clásica es iniciada por el enlace del primer componente del sistema de complemento (Clq) a anticuerpos (de la subclase apropiada) , que son enlazados a su antigeno cognato. Para determinar la activación de complemento, se puede efectuar un análisis de CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Las variantes de polipéptido con secuencias de aminoácido de región de Fe alterada (polipéptidos con una región de Fe variante) y capacidad de enlace, de Clq incrementada o disminuida son descritas, por ejemplo, en la patente estadounidense No. 6,194,551 Bl y O 1999/51642. Véase también, por ejemplo, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
El término "anticuerpo que comprende región de Fe" se refiere a un anticuerpo que comprende una región de Fe. La linea C-terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración de EU) de la región de Fe puede ser removida, por ejemplo, durante la purificación del anticuerpo o mediante diseño recombinante del ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Así, una composición que comprende un anticuerpo que tiene una región de Fe de acuerdo con esta invención puede comprender un anticuerpo con K447, con todo K447 removido o una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo de K447.
Un anticuerpo de "bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es uno que inhibe o reduce la actividad biológica del antigeno al que se enlaza. Por ejemplo, un anticuerpo antagonista VEGF-especifico se enlaza a VEGF e inhibe la habilidad de VEGF para inducir la proliferación de célula endotelial vascular o permeabilidad vascular. Ciertos anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antigeno.
Como se usa en la presente, "tratamiento" (y variaciones tales como "tratar" o "tratamiento") se refiere a la intervención clínica en un intento por alterar el curso natural del individuo o célula que es tratada y puede ser efectuado ya sea para profilaxis o durante el curso de patología clínica. Los efectos deseables de tratamiento incluyen impedir la presencia o recurrencia de una enfermedad, alivio de síntomas, disminución de cualesquier consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, impedir la metástasis, disminuir la velocidad de avance de enfermedad, mejora o alivio del estado de la enfermedad y remisión o prognosis mejorada. En algunas modalidades, los métodos y composiciones de la invención son usados para retardar el desarrollo de una enfermedad o alteración o para frenar el avance de una enfermedad o alteración.
Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad efectiva a dosificaciones y por periodos de tiempo necesario para obtener el resultado terapéutico o profiláctico deseado.
Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de una sustancia/molécula de la invención puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo y la habilidad de la sustancia/molécula, para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva abarca una cantidad en la cual cualesquier efectos tóxicos o perjudiciales de la sustancia/molécula son superados por los efectos terapéuticamente benéficos. Una cantidad terapéuticamente efectiva también abarca una cantidad suficiente para conferir beneficio, por ejemplo, beneficio clínico.
Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y por períodos de tiempo necesarios, para obtener el resultado profiláctico deseado. Comúnmente, aunque no necesariamente, puesto que una dosis profiláctica es usada en sujetos antes de o en una etapa anterior de enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva sería menor que la cantidad terapéuticamente efectiva. Una cantidad profilácticamente efectiva abarca una cantidad suficiente para conferir beneficio, por ejemplo, beneficio clínico .
En el caso de tumores pre-cancerosos, benignos, de etapa temprana o tardía, la cantidad terapéuticamente efectiva del inhibidor angiogénico puede reducir el número de células de cáncer; reducir el tamaño de tumor primario; inhibir (esto es, frenar a alguna extensión y preferiblemente detener) la infiltración de célula de cáncer a órganos periféricos; inhibir (esto es, frenar a alguna extensión y preferiblemente detener) la metástasis de tumor; inhibir o retardar, a alguna extensión, el crecimiento del tumor o avance del tumor; y/o aliviar a alguna extensión uno o más de los síntomas asociados con la alteración. A la extensión que el fármaco puede impedir el crecimiento y/o asesinar células de cáncer, puede ser citostático y/o citotóxico. Para -terapia de cáncer, la eficacia in vivo puede, por ejemplo, ser medida al determinar la duración de la supervivencia, tiempo, al avance de la enfermedad (TTP) , , las velocidades de respuesta (RR) , duración de respuesta y/o calidad de vida.
"Reducir" o "inhibir" es disminuir o reducir una actividad, función y/o cantidad en comparación con una referencia. En ciertas modalidades, "reducir" o "inhibir" significa la capacidad de provocar una disminución global del 20% o mayor. En otra modalidad, "reducir" o "inhibir" significa la habilidad de provocar una disminución global del 50% o mayor En todavía otra modalidad, "reducir" o "inhibir" significa la habilidad de provocar una disminución global de 75%, 85%, 90%, 95% o mayor. Reducir o inhibir se puede referir a los síntomas de la alteración que es tratada, la presencia o tamaño de metástasis, el tamaño del tumor primario o el tamaño o número de los vasos sanguíneos en alteraciones angiogénicas .
Una "alteración" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento, incluyendo pero no limitado a alteraciones o enfermedades crónicas y agudas incluyendo aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero a la alteración en cuestión. Las alteraciones incluyen alteraciones angiogénicas. "Alteración angiogénica" como se usa en la presente se refiere a cualquier condición que involucra angiogénesis anormal o permeabilidad vascular anormal o fuga vascular anormal. Ejemplos no limitantes de alteraciones angiogénicas a ser tratadas en la presente incluyen tumores malignos y benignos; malignidades sin leucemia y malignidades linfoides; y en particular, metástasis de tumor (cáncer).
La "angiogénesis anormal" ocurre cuando nuevos vasos sanguíneos crecen ya sea excesivamente o de otra manera inapropiadamente (por ejemplo, la ubicación, sincronización, grado o inicio de la angiogénesis es indeseable desde un punto de vista médico) en un estado enfermo de tal manera que provoca un estado enfermo. En algunos casos, la angiogénesis excesiva, incontrolada o de otra manera inapropiada ocurre cuando hay un crecimiento de vaso sanguíneo nuevo que contribuye al empeoramiento de estado de enfermedad o causa de un estado enfermo. Los nuevos vasos sanguíneos pueden alimentar los tejidos enfermos, destruir los tejidos normales y en el caso de cáncer, los nuevos vasos pueden permitir que células de tumor escapen a la circulación y se alojen en otros órganos (metástasis de tumor) . Ejemplos de alteraciones que involucran angiogénesis anormal incluyen, pero no están limitadas a cáncer, 5 especialmente tumores sólidos vascularizados y tumores metastáticos (incluyendo cáncer de colon, cáncer de pulmón (especialmente cáncer de pulmón de célula pequeña) o cáncer de próstata),, enfermedades provocadas por neovascularización ocular, especialmente ceguera diabética, retinopatías , ^ principalmente retinopatia diabética o degeneración macular relacionada con la edad, neovascularización coroidal (CNV) , edema macular diabético, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo oclusión de vena retinal central (CRVO) , neovascularización corneal, neovascularización *5 retinal y rubeosis; psoriasis, artritis psoriática, haemangioblastoma tal como haemangioma; enfermedades renales inflamatorias, tales como glomerulonefritis , especialmente glomerulonefritis mesangioproliferativa , síndrome edémico hemolítico, nefropatía diabética o nefrosclerosis hipertensiva; 20 varias enfermedades inflamatorias, tales como artritis, especialmente artritis reumatoide, enfermedad de intestino inflamatorio, psoriasis, sarcoidosis, arteriosclerosis arterial y enfermedades que ocurren después de trasplantes, endometriosis o asma crónico y otras condiciones. 5 "Permeabilidad vascular anormal" ocurre cuando el flujo de fluidos, moléculas (esto es, iones y nutrientes) y células (por ejemplo, linfocitos) entre los compartimientos vasculares y extravasculares es excesivo o de otra manera inapropiado (por ejemplo, la ubicación, temporización, grado o inicio de la permeabilidad vascular es indeseable desde un punto de vista médico) en un estado enfermo o de tal manera que provoca un estado enfermo. Permeabilidad vascular puede conducir a "fugas" excesivas o de otra manera inapropiada de iones, agua, nutrientes o células a través de la vasculatura. En algunos casos, la permeabilidad vascular excesiva, incontrolada o de otra manera inapropiada o fugas vasculares 'exacerban o inducen estados de enfermedad en los que se incluyen por ejemplo, edema asociado con tumores en los que se incluyen, por ejemplo, tumores de cerebro; ascitis asociados con malignidades; síndrome de Meigs; inflamación de pulmón; síndrome nefrótico; efusión pericardial; efusión pleural; permeabilidad asociada con enfermedades cardiovasculares tales como la condición que sigue a infartos miocardiacos y accidentes cerebrovasculares y los semejantes. La presente invención contempla el tratamiento de aquellos pacientes que han desarrollado o están en riesgo de desarrollar las enfermedades y alteraciones asociadas con permeabilidad vascular anormal o fuga vascular anormal.
Los términos "alteración proliferativa celular" y "alteración proliferativa" se refieren a alteraciones que están asociadas con algún grado de proliferación celular anormal. En una modalidad, la alteración proliferativa celular es cáncer. En una modalidad, la alteración proliferativa celular es un tumor.
"Tumor", como se usa en la presente, se refiere a todo el crecimiento de célula neoplásica y proliferación de célula neoplásica ya sea maligna o benigna y todas las células y tejidos pre-cancerosos y cancerosos. Los términos "cáncer", "canceroso", "alteración proliferativa celular", "alteración proliferativa" y "tumor" no son mutuamente exclusivos como se hace referencia en la presente.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se refiere a o describen la condición fisiológica en mamíferos que es caracterizada comúnmente por el crecimiento celular sin regular. Ejemplos de cáncer incluyen pero no están limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o malignidades linfoides. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen, pero no limitados a, cáncer de célula escamosa . (por ejemplo, cáncer de célula escamosa epitelial) , cáncer de pulmón incluyendo cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer pulmonar de célula no pequeña, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago incluyendo cáncer gastrointestinal y cáncer estromal gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del sistema urinario, hepatoma, cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer vulval, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, ¦ carcinoma penil, melanoma, melanoma de esparcimiento superficial, melanoma de lentigo maligna, melanomas acral lentiginoso, melanomas nodulares, mieloma múltiple y linforna de célula B (incluyendo linforna de grado bajo/linfoma no de Hodgkin folicular (NHL) ; NHL linfocitico pequeño (SL); NHL grado intermediario/folicular; NHL difuso de grado intermediario; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; NHL de célula no escindida pequeña de grado alto; NHL de enfermedad voluminosa; linfoma de célula de manto; linfoma SIDA-relacionado; y macroglobulinemia de aldenstrom) ; leucemia linfocitico crónica (CLL) ; leucemia linfoblástico agudo (ALL) ; leucemia de célula vellosa; leucemia mieloblástica crónica; y alteración linfoproliferativa posttrasplante (PTLD), también - como proliferación vascular 'anormal asociada con facomatoses, edema (tal como aquel asociado con tumores del cerebro) , síndrome de Meigs, cáncer de cerebro, también como cáncer de cabeza y cuello y metástasis asociadas. En ciertas modalidades, los cánceres que son propensos a tratamiento por los anticuerpos de la invención incluyen cáncer de pecho, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de pulmón de célula no pequeña, glioblastoma, linfoma no de Hodgkin (NHL) , cáncer de célula renal, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer pancreático, sarcoma de tejido blando, sarcoma de kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de ovario, mesotelioma y mieloma múltiple. En algunas modalidades, el cáncer es seleccionado de: cáncer de pulmón de célula pequeña, gliblastoma, neuroblastomas , melanoma, carcinoma de pecho, cáncer gástrico, cáncer colorrectal (CRC) y carcinoma hepatocelular . Aún, en algunas modalidades, el cáncer es seleccionado de: cáncer de pulmón de célula no pequeña, cáncer colorrectal, glioblastoma y carcinoma de pecho, incluyendo formas metastáticas de aquellos cánceres.
El' término "terapia anti-cáncer" se refiere a una terapia útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes terapéuticos anti-cáncer incluyen, pero no están limitados a, por ejemplo, agentes quimioterapéuticos , agentes inhibidores de crecimiento, agentes citotóxicos, agentes usados en terapia de radiación, agentes anti-angiogénicos, agentes apoptóticos, agentes anti-tubulina y otros agentes para tratar cáncer, tales como anticuerpos anti-HER-2, anticuerpos anti-CD20, un antagonista del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (por ejemplo, un inhibidor de cinasa de tirosina) , inhibidor de HER1/EGFR (por ejemplo, erlotinib (Tarceva™) , inhibidores de factor de crecimiento derivados de plaquetas (por ejemplo, Gleevec™ (Imatinib esylate) ) , un inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib) , interferones , citocinas, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que se enlazan a uno o más de los siguientes objetivos ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BlyS, APRIL, BC A o receptor de VEGF, TRAIL/Apo2 y otros agentes bioactivos y agentes químicos orgánicos, etc. Combinaciones de los mismos también están incluidas en la invención.
Un "factor o agente angiogénico" es un factor de crecimiento o su receptor que está involucrado en estimular el desarrollo de vasos sanguíneos, por ejemplo, promover angiogénesis , crecimiento de célula endotelial, estabilidad de vasos sanguíneos y/o vasculogenesis , etc. Por ejemplo, factores angiogénicos, incluyen, pero no están limitados a, por ejemplo, VEGF y miembros de la familia de VEGF y sus receptores (VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGFRl, VEGFR2 y VEGFR3) , P1GF, familia de PDGF, familia de factor de crecimiento de fibroblasto (FGF) , ligandos TIE (angiopoyetinas, ANGPT1, ANGPT2) , TIE1, TIE2, efrinas, Bv8, ligando 4 semejante a Delta (DLL4), Del-1, factores de crecimiento de fibroblastos: (aFGF) ácido y (bFGF) básico, FGF4, FGF9, BMP9, BMP10, Folistatina, factor, estimulador de colonia de granulocito (G-CSF) , GM-CSF, factor de crecimiento de hepatocito (HGF) / factor de dispersión (SF) , interleucina-8 (IL-8), CXCL12, leptina, midcina, neuropilinas , NRP1, NRP2, factor de crecimiento placental, factor de crecimiento de célula endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF) , factor de crecimiento derivado de plaquetas, especialmente PDGF-BB, PDGFR-alfa o PDGFR-beta, pleiotropina (PTN) , progranulina, proliferina, factor-alfa de crecimiento transformante (TGF-alfa) , factor-beta de crecimiento transformante (TGF-beta) , factor-alfa de necrosis de tumor (TNF-alfa) , Alkl, CXCR4, Notchl, Notch4, Sema3A, Sema3C, Sema3F, Robo , etc. Incluirla además factores que promueven angiogénesis, tales como ESM1 y Perlecan. También incluiría factores que aceleran la cicatrización de heridas, tales como hormona de crecimiento, factor-I de crecimiento semejante a insulina (IGF-I), VIGF, factor de crecimiento epidérmico (EGF) , dominio semejante a EGF, múltiplo 7 (EGFL7), CTGF y miembros de su familia y TGF-alfa y TGF-beta. Véase, por ejemplo, Klagsbrun y D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39; Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179; Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5 (12) : 1359-1364; Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (por ejemplo, la Tabla 1 enlista factores angiogénicos conocidos); y, Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206.
Un "agente anti-angiogénico" o "inhibidor angiogénico" se refiere a una sustancia de peso molecular pequeño, un polinucleótido (incluyendo, por ejemplo, un ARN inhibidor (ARNi o siARN) ) , un polipéptido, una proteína aislada, una proteína recombinante, un anticuerpo o conjugados o proteínas de fusión de los mismos, que inhiben la angiogénesis, vasculogenesis o permeabilidad vascular indeseable ya sea directa o indirectamente. Se debe entender que el agente anti-angiogénico incluye aquellos agentes que se enlazan y bloquean la actividad, angiogénica del factor angiogénico o su receptor. Por ejemplo, un agente anti-angiogénico es un anticuerpo u otro antagonista a un agente angiogénico como se define anteriormente, por ejemplo, anticuerpos a VEGF-A o al receptor de VEGF-A (por ejemplo, receptor de KDR o receptor de Flt-1), inhibidores anti-PDGFR, moléculas pequeñas que bloquean la señalización del receptor de VEGF (por ejemplo, PTK787/ZK2284 , SU6668, SUTENT®/SU11248 (sunitinib malate) , AMG706 o aquellos descritos en, por ejemplo, la solicitud de patente internacional WO 2004/113304). Agentes anti-angiogénicos incluyen, pero no están limitados a los siguientes agentes: inhibidores de VEGF tales como un antagonista VEGF-especifico, inhibidor de EGF, inhibidores de EGFR, Erbitux® (cetuximab, ImClon Systems, Inc., Branchburg, N.J.), Vectibix® (panitumumab, Amgen, Thousand Oaks, CA) , inhibidores de TIE2, inhibidores de IGF1R, inhibidores de COX-II (ciclooxigenasa II) , inhibidores de MP-2 (metaloproteinasa de matriz 2) , e inhibidores de MP-9 (metaloproteinasa de matriz 9), CP-547,632 (Pfizer Inc., NY, EUA) , Axitinib (Pfizer Inc.; AG-013736) , ZD-6474 (AstraZeneca) , AEE788 (Novartis), AZD-2171), VEGF Trap (Regeneron/Aventis ) , Vatalanib (también conocido como PTK-787, ZK-222584: Novartis & Schering A G) , Macugen (pegaptanib octasodio, NX-1838, EYE-001, Pfizer Inc. /Gilead/Eyetech) , I 862 (Cytran Inc. de Kirkland, Washington, EUA) ; y angiozima, una ribozima sintética de Ribozyme (Boulder, Coló.) y Chiron (Emeryville, Calif.) y combinaciones de los mismos. Otros inhibidores de angiogénesis incluyen trombospondinal , trombospondina2 , colágeno IV y colágeno XVIII. Inhibidores · de VEGF son revelados en las patentes estadounidenses Nos. 6,534,524 y 6,235,764, ambas de las cuales son incorporadas en su totalidad para todos los propósitos. Agentes anti-angiogénicos también incluyen inhibidores de angiogénesis naturales, por ejemplo, angiostatina, endostatina, etc. Véase, por ejemplo, Klagsbrun y D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39; Streit y Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179 (por ejemplo, la Tabla 3 enlista terapia anti-angiogénica en melanoma maligno) ; Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5 ( 12 ): 1359-1364 ; Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (por ejemplo, la Tabla 2 enlista factores antiangiogénicos conocidos); y, Sato (2003) Jnt. J. Clin. Oncol. 8:200-206 (por ejemplo, la Tabla 1 enlista agentes anti-angiogénicos usados en pruebas clínicas).
El término "terapia anti-angiogénica" se refiere a una terapia útil para inhibir angiogénesis que comprende la administración de un agente anti-angiogénico .
El término "agente citotóxico" como se usa en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o impide una función celular y/o provoca muerte celular o destrucción celular. El término ' pretende incluir isótopos radioactivos (por eje^m^p^l? ^o, A7\ -t1-211, tI131, It125 y,,90, DR^e186, RD^e1^ , Smm153, 0Bi-;212 , DP32 , P?b212 e„ isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, metotrexato, adriamicina, vinca alcaloides (vincristina, vinblastina, etoposide) , doxorubicina, melfalana, mitomicina C, clorambucilo, daunorubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de los mismos tales como enzimas nucleoliticas, antibióticos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, de planta o animal, incluyendo fragmentos y/o variantes de los mismos y los varios agentes antitumor o anticáncer revelados posteriormente en la presente. Otros agentes citotóxicos son descritos posteriormente en la presente. Un agente tumoricida provoca destrucción de células de tumor .
Una "toxina" es cualquier sustancia capaz de tener un efecto perjudicial sobre el crecimiento o proliferación de una célula.
Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXAN®) ; alquil sulfonatos tales como busulfana, improsulfana y piposulfana ; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilmelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolmelamina; acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinnona) ; delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®) ; beta-lapacona ; lapacol; colchicinas; ácido betulinico una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecana (HYCAMTIN®) , CPT-11 ( irinotecana, CAMPTOSAR®) , acetilcamptotecina, escopolectina y 9-aminocamptotecina) ; briostatina; calistatina; CC-1.065 (incluyendo sus análogos sintéticos de adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; podofilotoxina; ácido podofilinico;¦ teniposide; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos, K -2189 y CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina ; una sarcodictina ; espongistatina ; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, clorhidrato de óxido de mecloretamina, melfalana, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosoureas tales como carmustina, clorozotocina , fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina ; antibióticos tales como los antibióticos de enedina (por ejemplo, calicheamicina, especialmente calicheamicina ??? y calicheamicina omegall (véase, por ejemplo, Nicolaou et al., Ange . Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); CDP323, una inhibidor de alfa-4 integrina oral; dinemicina, incluyendo dinemicina A; una esperamicina; también como cromóforo de neocarzinostatina y cromóforos antibióticos de enedina cromoproteína relacionado) , aclacinomisinas , actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (incluyendo ADRIAMYCIN®, morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina, inyección de liposoma de doxorubicina HC1 (DOXIL®) , doxorubicina liposomal TLC D-99 (MYOCET®) , doxorubicina liposomal PEG-ilada (CAELYX®) y desoxidoxorubicina ) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina , rodorubicina , estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina anti-metabolitos tales como metotrexato, gemcitabina (GEMZAR®) , tegafur (UFTORAL®) , capecitabina (XELODA®) , epotilona y 5-fluorouracilo (5-FU) ; combretastatina ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, ' metotrexato, pteropterina , trimetrexato; análogos de purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolinico; aceglatona; aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulinico; eniluracilo; amsacrina; bestrabucilo; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de' galio; hidroxiurea; lentinana; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ' ansamitocinas ; mitoguazona; mitoxantrona ; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo ' de polisacárido de PSK® ( JHS Natural Products, Eugene oR) ; razoxano; rizoxina; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; ' 2 , 2 ' , 2 ' -triclorotrietilamina ; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) ; dacarbazina; manomustina ; mitobronitol ; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosuro ("Ara-C") ; tiotepa; taxoide, por ejemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), formulación de nanoparticulas albúmina-diseñada de paclitaxel (ABRAXANE™) y docetaxel (TAXOTERE®, Rhóme-Poulene ' Rorer, Antony, Francia) ; cloranbucilo; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; agentes de platino tales como cisplatino oxaliplatina (por ejemplo, ELOXATIN®) y carboplatino; vincas, que impiden la polimerización de tubulina de formar microtúbulos, especialmente vinblastina (VELBAN®) , vincristina (ONCOVIN®) , vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) y vinorelbina (NAVELBINE®) ; etoposide (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; leucovorina; novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides tales como ácido retinoico, incluyendo bexaroteno (TARGRETIN®) ; bisfosfonatos tales como clodronato (por ejemplo, BONEFOS® o OSTAC®) , etidronato (DIDROCAL®) , NE-58095, ácido zoledrónico/zoledronato (ZOMETA®) , alendronato (FOSAMAX®), pamidronato · (AREDIA®) , tiludronato (SKELID®) o risedronato (ACTONEL®) ; troxacitabina (un análogo de citocina del nucleósido de 1 , 3-dioxolano) ; oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en proliferación de célula aberrante, tal como por ejemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras y receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) (por ejemplo, erlotinib (Tarceva™) ) ; y VEGF-A que reducen la proliferación celular; vacunas tales como vacuna de THERATOPE® y vacunas de terapia genética, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; inhibidor de topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®) ; rmRH (por ejemplo, ABARELIX®) ; BAY439006 (sorafenib; Bayer) ; SU-11248 (sunitinib, SUTENT®, Pfizer); perifosine, inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib o etoricoxib) , inhibidor de proteosoma (por ejemplo, PS341); bortezomib (VELCADE®) ; CCI-779; tipifarnib (R11577); orafenib, ABT510; inhibidor de Bcl-2 tal como oblimersen sodio (GENASENSE®) pixantrona; inhibidores de EGFR; inhibidores de cinasa de tirosina; inhibidores de cinasa de serina-treonina tales como rapamicina (sirolimus, RAPAMUNE®) ; inhibidores de farnesiltransferasa tales como lonafarnib (SCH 6636, SARASART ) ; y sales, ácidos o derivados aceptables farmacéuticamente de cualquiera de los anteriores; también como combinaciones de dos o más de los anteriores tales como CHOP, una abreviatura para una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisolona ; y FOLFOX, una abreviatura para un régimen de tratamiento con oxaliplatina (ELOXATIN™) combinada con 5-FU y leucovor.ina y sales, ácidos o derivados aceptables farmacéuticamente de cualquiera de los anteriores; también como combinaciones de dos o más de los anteriores .
Agentes quimioterapéuticos como se define en la presente incluyen "agentes anti-hormonales" o "terapéuticos endocrinos" que actúa para regular, reducir, bloquear o inhibir los efectos de hormonas que pueden promover el crecimiento de cáncer. Pueden ser hormonas por si mismos, incluyendo, pero no limitados a: anti-estrógenos y moduladores de receptor de estrógeno selectivos (SERM) , en los que se incluyen, por ejemplo, tamoxifen (incluyendo tamoxifen de NOLVADEX®) , raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018 onapristona y FARESTON* toremifeno; inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como por ejemplo, 4 ( 5 ) -imidazoles, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, AROMASIN® exemest-ano, formestanie, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozól FEMARA® y anastrozol ARIMIDEX®; y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolato y goserelina; también como troxacitabina (un análogo de citocina de nucleósido de 1,3-dioxolanó) ; oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en proliferación de célula aberrante, tal como por ejemplo, PKC-alfa, Raf y H-Ras; ribozimas tales como un inhibidor de expresión de VEGF (por ejemplo, ribozima ANGIOZYME®) y un inhibidor de expresión de HER2 ; vacunas tales como vacunas de terapia genética, por « ejemplo, vacuna ALLOVECTI ®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; PROLEUKIN® rlL-2; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; vinorelbina y esperamicinas (véase patente estadounidense No. 4,675,187) y sales, ácidos o derivados aceptables farmacéuticamente de cualquiera de los anteriores; también como combinaciones de dos o más de los anteriores.
Un "agente inhibidor de crecimiento" cuando se usa en la presente, se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula ya sea in vitro o ín vivo. En una modalidad, el agente inhibidor de crecimiento es anticuerpo inhibidor de crecimiento que impide o reduce la proliferación de una célula que expresa un antígeno al cual el anticuerpo se enlaza. En otra ' modalidad, el agente inhibidor de crecimiento puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células en fase S. Ejemplos de agentes inhibidores de crecimiento incluyen agentes que bloquean el avance del ciclo celular (en un lugar diferente a la fase S) , tales como agentes que inducen la detención de Gl y detención de fase M. Bloqueadores de fase clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) , taxanos, e inhibidores de topoisomerasa II tales como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposide y bleomicina. Aquellos agentes que detienen 'Gl también se de derraman sobre la detención de fase S, por ejemplo agentes alquilantes de ADN tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Información adicional se puede encontrar en Mendelsohn and Israel, eds . , The Molecular Basis of Cáncer, capitulo 1, intitulado "Cell cycle regulation oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (W.B. Saunders, Philadelphia, 1995), por ejemplo, p. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetaxel) son fármacos anticáncer ambos derivados del árbol de yew. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer) , derivado del árbol de yew europeo, es un análogo semisintético de paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb) . Paclitaxel y docetaxel promueven el ensamble de microtúbulos a partir de dimeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos al impedir la despolimerización, que da como resultado la inhibición de mitosis en las células.
"Terapia de radiación" significa el uso de rayos ? o rayos beta dirigidos para inducir daño suficiente a una célula para limitar su habilidad para funcionar normalmente o para destruir la célula por completo. Se apreciará que habrá muchas maneras conocidas en el arte para determinar la dosificación y duración del tratamiento. Los tratamientos típicos son dados como administración de una vez y las dosificaciones típicas varían de 10 a 200 unidades (Grays) por día.
El término "formulación farmacéutica" se refiere a una preparación que está en tal forma para permitir la actividad biológica del ingrediente activo sea efectiva y que no contiene componentes adicionales que son inaceptablemente tóxicos a un sujeto al cual la formulación sería administrada. Tales formulaciones pueden ser estériles.
Una formulación "estéril" es aséptica o libre de todos los microorganismos vivientes y sus esporas.
Administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluyen 'la administración simultánea (concurrente) y consecutiva o secuencial en cualquier orden.
El término "concurrentemente" es usado en la presente para referirse a la administración de dos o más agentes terapéuticos, en donde por lo menos parte de la administración se superpone en el tiempo. Así, la administración concurrente incluye un régimen de dosificación cuando la administración de uno o más agentes continúa después de discontinuar la administración de uno o más de otros agentes.
La . administración "crónica" se refiere a la administración del (los) agente (s) en un modo continuo, en contraposición a un modo agudo, para mantener el efecto (actividad) terapéutico inicial por un periodo de tiempo extenso. La administración "intermitente" es tratamiento que no se hace consecutivamente sin interrupción, sino que más bien es cíclico por naturaleza.
"Portadores" como se usa en la presente incluyen portadores, excipientes o estabilizadores aceptables farmacéuticamente que no son tóxicos a la célula o mamífero al que es expuesto a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Frecuentemente, el portador aceptable fisiológicamente es una solución de pH regulado acuosa. Ejemplos de portadores aceptables fisiológicamente incluyen soluciones reguladoras del pH tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílieos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o. lisina; monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN™, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS™.
Un "liposoma" es una. vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o sur'factante que es útil para administración de un fármaco (tal como un anticuerpo anti-VEGF o anticuerpo anti-NRPl) a un mamífero. Los componentes del liposoma están dispuestos comúnmente en una formación de bicapa, similar a la disposición de lípido de membranas biológicas.
El término "diagnosis" es usado en la presente para referirse a la identificación de un estado, enfermedad o condición molecular o patológica, tal como la identificación de' cáncer o para referirse a la identificación de un paciente con cáncer que se puede beneficiar de un régimen de tratamiento particular.
El término "prognosis" es usado en la presente para referirse a la predicción de la probabilidad de beneficio de terapia anti-cáncer.
El término "predicción" o "predecir" es usado en la presente para referirse a la probabilidad de que un paciente responderá ya sea favorable o desfavorablemente a una terapia anti-cáncer particular. En una modalidad, la predicción o que predice se relaciona con la extensión de aquellas respuestas.
En una modalidad, la predicción o que predice se relaciona a si y/o la probabilidad de que un paciente sobrevivirá o mejorará enseguida del tratamiento, por ejemplo tratamiento con un agente terapéutico particular y por un cierto periodo de tiempo sin recurrencia de enfermedad. Los métodos predictivos de la invención pueden ser usados clínicamente para tomar decisiones de tratamiento al escoger las modalidades de tratamiento más apropiadas para algún paciente particular. Los métodos predictivos de la presente invención son herramientas valiosas para predecir si un paciente es probable que responda favorablemente a un régimen de tratamiento, tal como un régimen terapéutico dado, incluyendo por ejemplo, administración de un agente terapéutico dado o combinación, intervención quirúrgica, tratamiento de esteroides, etc. o si es probable la supervivencia a largo plazo del paciente, enseguida de un régimen terapéutico.
La sensibilidad de un paciente puede ser determinada utilizando cualquier punto final que indica un beneficio al paciente, incluyendo, sin limitación, (1) inhibición, a alguna extensión, de avance de enfermedad, incluyendo frenado y cese completo; (2) reducción en tamaño de lesión; ' (3) inhibición (esto es, reducción, frenado o cese completo) de infiltración de células enfermas a órganos y/o tejidos periféricos adyacentes; (4) inhibición (esto es reducción, frenado o cese completo) de esparcimiento de la enfermedad; (5) . alivio, a alguna extensión, de uno o más síntomas asociados con la alteración; (6) incremento en la duración de presentación libre de enfermedad enseguida de tratamiento; y/o (8) mortalidad disminuida en un punto en el tiempo dado enseguida del tratamiento.
El término "beneficio" es usado en el sentido más amplio y se refiere a cualquier efecto deseable e incluye específicamente beneficio clínico como se define en la presente El beneficio clínico puede ser medido al determinar varios puntos finales, por ejemplo, inhibición, a alguna extensión, de avance de enfermedad, incluyendo frenado y cese completo; reducción en el número de episodios y/o síntomas de enfermedad; reducción en tamaño de lesión; inhibición (esto es, reducción, frenado o cese completo) de infiltración de células enfermas a órganos y/o tejidos periféricos adyacentes; inhibición (esto es, reducción, frenado o cese completo) de esparcimiento de la enfermedad; disminución de respuesta autoinmune, que puede, pero no tiene que dar como resultado la regresión o ablación de la lesión enferma; alivio, a alguna extensión, de uno o más síntomas asociados con la alteración; incremento en la duración de presentación- libre de enfermedad enseguida del tratamiento, por ejemplo, supervivencia libre de avance; supervivencia global incrementada; velocidad de respuesta más alta y/o mortalidad disminuida en un punto del tiempo enseguida del tratamiento.
El término "cáncer resistente o "tumor resistente" se refiere a cáncer, células cancerosas o un tumor que no responde completamente o pierde o muestra una respuesta reducida en el curso de terapia de cáncer a una terapia de cáncer que comprende por lo menos un antagonista de VEGF. En ciertas modalidades, tumor resistente es un tumor que es resistente a la terapia de anticuerpo anti-VEGF. En una modalidad, el anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab. En ciertas modalidades, un tumor resistente es un tumor que es improbable, que responda a una terapia de cáncer que comprende por lo menos un antagonista de VEGF.
"Recaída" se refiere a la regresión de la enfermedad del paciente de regreso a su estado enfermo anterior, especialmente el retorno de síntomas enseguida de una recuperación aparente o recuperación parcial. A no ser que se indique de otra manera, el estado de recaída se refiere al proceso de regresar a o al retorno de enfermedad antes de tratamiento previo incluyendo pero no limitado a, tratamientos de antagonista de VEGF y tratamientos de quimioterapia. En ciertas modalidades, el antagonista de VEGF es un anticuerpo anti-VEGF.
III. Métodos de la invención La presente invención está basada parcialmente en el uso de genes o biomarcadores específicos que se correlacionan con la eficacia de la terapia o tratamiento anti-angiogénico diferente de o además de un antagonista de VEGF. Terapia o tratamiento apropiado diferente de o además de un antagonista de VEGF incluyen, pero no están limitados a un antagonista de 5 NRP1, un antagonista de EGFL7 o un antagonista de VEGF-C. Asi, los métodos revelados proporcionan medios convenientes, eficientes y potencialmente efectivos en costo para obtener datos e información útiles para determinar terapias apropiadas o efectivas para tratar pacientes. Por ejemplo, un paciente con 10 cáncer podría tener una biopsia efectuada para obtener una muestra de tejido o célula y la muestra podría ser examinada mediante varios análisis in vitro para determinar si el nivel de expresión de uno o más biomarcadores se ha incrementado o disminuido, en comparación con el nivel de expresión en una l-> muestra de referencia. Si los niveles de expresión de por lo menos.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,· 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 20 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 ó 94 de los genes enlistados en la Tabla 1 son incrementados o disminuidos, entonces es probable que el paciente se beneficie de tratamiento con una terapia o tratamiento diferente de o además 5 de un antagonista de VEGF.
Los niveles/cantidad de expresión de un gen o un biomarcador pueden ser determinados en base a cualquier criterio apropiado conocido en el arte, incluyendo pero no limitado a mARN, cADN, proteínas, fragmentos de proteína y/o número de copia genética.
La expresión de varios genes o biomarcadores en una muestra puede ser analizada mediante un número de metodologías, muchas de las cuales son conocidas en el arte y entendidas por el técnico experimentado, incluyendo pero no limitado a, análisis inmunohistoquímico y/o análisis Western blot, inmunoprecipitación, análisis de enlace molecular, ELISA, ELIFA, clasificación de células activado por fluorescencia (FACS) y los semejantes, análisis a base de sangre cuantitativos (como por ejemplo ELISA de suero) (para examinar, por ejemplo, niveles de expresión de proteína) , análisis de actividad enzimática bioquímicos, hibridización in situ, análisis Northern y/o análisis de PCR de mARN, también como cualquiera de la amplia variedad de análisis que puede ser efectuados mediante análisis de arreglo de gen y/o tejido. Protocolos típicos para evaluar el estatus de genes y productos genéticos son encontrados, por ejemplo en Ausubel et al. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting) , 4 (Southern Blotting) , 15 ( Immunoblotting) and 18 (PCR Analysis) . Inmunoanálisis multiplexados tales como aquellos disponibles de Rules Based Medicine o Meso Scale Discovery (MSD) pueden también ser usados.
En ciertas modalidades, la expresión/cantidad de un gen o biomarcador en una muestra es incrementada en comparación con la expresión/cantidad en una muestra de referencia si el nivel de expresión/cantidad del gen o biomarcador en la muestra es mayor que el nivel de expresión/cantidad del gen o biomarcador en la muestra de referencia. Similarmente, la expresión/cantidad de un gen o biomarcador en una muestra es disminuida en comparación con la expresión/cantidad en una muestra de referencia si el nivel de expresión/cantidad del gen o biomarcador en la muestra es menor que el nivel de expresión/cantidad del gen o biomarcador en la muestra de referencia .
En ciertas modalidades, las muestras son normalizadas en cuanto a diferencias en la cantidad de ARN o proteina analizada como la variabilidad en la calidad de las muestras de ARN o proteina usadas y variabilidad entre corridas de análisis Tal normalización puede ser efectuada al medir e incorporar la expresión de ciertos genes de normalización, incluyendo genes de mantenimiento bien conocidos, tales como ACTB. Alternativamente, la normalización puede estar basada en la señal media o mediana de todos los genes analizados o un subconjunto grande de los mismos (procedimiento de normalización global) . En una base de gen en gen, la cantidad normalizada medida de un mARN o proteina de tumor de paciente es comparada con la cantidad encontrada en un conjunto de referencia. Niveles de expresión normalizados para cada mARN o proteina por tumor probado por paciente pueden ser expresados como un porcentaje del nivel de expresión medido en el conjunto de referencia. El nivel de expresión medido en una muestra de paciente particular a ser analizada caerá en algún percentil dentro de este intervalo, lo que puede ser determinado mediante métodos bien conocidos en el arte.
En ciertas modalidades, el nivel de expresión relativo de un gen es determinado como sigue: Expresión relativa de genlmuestrai = 2 exp (Ct gen de mantenimiento ~ Ct genei) con Ct determinada en una muestra.
Expresión relativa de genel ARN de referencia ' = 2 exp (Ct g n de mantenimiento ~ Ct genei) con Ct determinada en la muestra de referencia .
La expresión relativa normalizada del geni muestrai = (expresión relativa de geni muestrai / expresión relativa de genel ARN de referencia) x 100 Ct es el ciclo de umbral. El Ct es el número de ciclo al cual la fluorescencia generada dentro de una reacción cruza la linea de umbral.
Todos los experimentos son normalizados a un ARN de referencia, que es una mezcla extensa de ARN de varias fuentes de tejido (por ejemplo, ARN de referencia #636538 de Clontech, ountain View, CA) . ARN de referencia idéntico es incluido en cada corrida de qRT-PCR, permitiendo la comparación de los resultados entre diferentes corridas experimentales.
Una muestra que comprende un gen o biomarcador objetivo puede ser obtenida mediante métodos bien conocidos en el arte y que son apropiados para el tipo y ubicación particular del cáncer de interés. Véase en Definiciones. Por ejemplo, muestras de lesiones cancerosas pueden ser obtenidas mediante resección, broncoscopia, aspiración de aguja fina, cepillados bronquiales o de esputo, fluido pleural o sangre. Los genes o productos genéticos pueden ser detectados de cáncer o tejido de tumor o de otras muestras corporales tales como orina, esputo, suero o plasma. Las mismas técnicas discutidas anteriormente para detección de genes o productos genéticos objetivos en muestras cancerosas pueden ser aplicadas a otras muestras corporales. Las células de cáncer pueden ser desprendidas de lesiones de cáncer y aparecer en tales muestras corporales. Mediante la selección de tales muestras corporales, una diagnosis prematura simple puede ser obtenida para estos cánceres. Además, el avance de terapia puede ser monitoreado más fácilmente al probar tales muestras corporales en cuanto a genes o productos genéticos objetivo.
Medios para enriquecer una preparación de tejido por células de cáncer son conocidos en el arte. Por ejemplo, el tejido puede ser aislado de parafina o secciones de cryostat. Las células de cáncer pueden también ser separadas de las células normales mediante citometría de flujo o microdisección de captura de láser. Estas, también como otras técnicas para separar células cancerosas de células normales, son bien conocidas en el arte. Si el tejido de cáncer está altamente contaminado con células normales, la detección del perfil de gen de firma o perfil de expresión de proteina puede ser más difícil, aunque técnicas para minimizar la contaminación y/o resultados falso positivo/negativo son conocidos, algunos de los_ cuales son descritos- posteriormente en la presente. Por ejemplo, una muestra puede también ser determinada en cuanto a la presencia de un biomarcador que se sabe que está asociado con una célula de cáncer de interés pero no una célula normal correspondiente o viceversa.
En ciertas modalidades, la expresión de proteínas en una muestra es examinada utilizando inmunohistoquímica ("IHC") y protocolos de teñido. El teñido inmunohistoquímico de secciones de tejido ha mostrado ser un' método confiable para determinar o detectar la presencia de proteínas en una muestra. Las técnicas de inmunohistoquímica utilizan un anticuerpo para sondear y visualizar antígenos celulares in situ, en general mediante métodos cromogénicos o fluorescentes.
La muestra de tejido se puede fijar (esto es, conservada) mediante metodología convencional (véase por ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology, " 3rd edition (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston División McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.). Aquel de habilidad en el arte apreciará que la elección de un agente de fijación es determinada por el propósito para el cual la muestra va a ser teñida histológicamente o de otra manera analizada. Aquel de habilidad en el arte también apreciará que la duración de fijación depende del tamaño de la muestra de tejido y el agente de fijación usado. A manera de ejemplo, formalina de pH regulado neutro, Bouin o paraformaldehído, pueden ser usados para fijar una muestra.
En general, la muestra es primero fijada y es luego deshidratada por medio de una serie ascendente de alcoholes, infiltrada e imbibida con parafina u otro medio de seccionamiento, de tal manera que la muestra de tejido puede ser seccionada. Alternativamente, se puede seccionar el tejido y fijar las secciones obtenidas. A manera de ejemplo, la muestra de tejido puede ser embebida y procesada en parafina mediante metodología convencional (véase por ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", supra) . Ejemplos de parafina que puede ser usada incluyen, pero no están limitados a, Paraplast, Broloid y Tissuemay. Una vez que la muestra de tejido está imbibida, la • muestra puede ser seccionada por un microtomo o los semejantes (véase por ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", supra) . A manera de ejemplo para este procedimiento, las secciones pueden variar de aproximadamente tres mieras a aproximadamente cinco mieras de espesor. Una vez seccionadas, las secciones pueden ser anexadas a portaobjetos mediante varios métodos estándar. Ejemplos de adhesivos de portaobjetos incluyen, pero no están limitados a, silano, gelatina, poli-L-lisina y los semejantes. A manera de ejemplo, las secciones embebidas con parafina pueden ser anexadas a portaobjetos cargados positivamente y/o portaobjetos recubiertos con poli-L-lisina.
Si se ha usado parafina usado como el material de imbibición, las secciones de tejido son en general desparafinizadas y rehidratadas a agua. Las secciones de tejido pueden ser desparafinizadas mediante varias metodologías estándar convencionales. Por ejemplo, xilenos y una serie descendiente gradualmente de alcoholes pueden ser usados (véase por ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", sup a) . Alternativamente, agentes no orgánicos desparafinizantes disponible comercialmente tales como Hemo-De7 (CMS, Houston, Texas) pueden ser usados.
En ciertas modalidades, subsecuente a la preparación de muestra, una sección de tejido puede ser analizada utilizando IHC. IHC puede ser efectuado en combinación con técnicas adicionales tales como teñido morfológico y/o hibridización in-situ de fluorescencia. Dos métodos generales de IHC están disponibles; análisis directos e indirectos. De acuerdo con el primer análisis, el enlace del anticuerpo al antígeno objetivo es determinado directamente. Este análisis directo utiliza un reactivo marcado, tal como una etiqueta fluorescente o un anticuerpo primario enzima-marcado, que puede ser visualizado sin interacción adicional de anticuerpo. En un análisis indirecto típico, el anticuerpo primario sin conjugar se enlaza al anticuerpo y luego un anticuerpo secundario marcado se enlaza al anticuerpo primario. En donde el anticuerpo secundario es conjugado a un marcador enzimático, un sustrato cromogénico o fluorogénico es agregado para proveer visualización del antígeno. La amplificación de señal ocurre debido a que varios anticuerpos secundarios pueden reaccionar con diferente epitopos sobre el anticuerpo primario.
El anticuerpo primario y/o secundario usado para inmunohistoquímica comúnmente será marcado con una porción detectable. Numerosos marcadores están disponibles que pueden ser en general agrupados en las siguientes categorías: (a) Radioisótopos, tales como 35S, 14C, 125I, 3H y 131I . El anticuerpo puede ser marcado con el radioisótopo utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., .Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991) por ejemplo y la radioactividad puede ser medida utilizando conteo de centelleo. (b) Partículas de oro coloidal. (c) Marcadores fluorescentes que incluyen, pero no están limitados a, quelatos de tierras raras (quelatos de europio) , rojo de Texas, rodamina, fluoresceina, dansil, Lisamina, umbeliferona, ficocriterina, ficocianina o fluoróforos disponibles comercialmente tales SPECTRUM 0RANGE7 y SPECTRUM GREEN7 y/o derivados de cualquiera de uno o más de los anteriores. Los marcadores fluorescentes pueden ser conjugados al anticuerpo utilizando las técnicas reveladas en Current Protocole in Immunology, supra, por ejemplo. La fluorescencia puede ser cuantificada utilizando un fluorimetro. (d) Varios marcadores de enzima-sustrato están disponibles y la patente estadounidense No. 4,275,149 provee una revisión de algunos de estos. La enzima en general cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que puede ser medida utilizando varias técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un «sustrato, que puede ser medido espectrofotométricamente . Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Técnicas para cuantificar un cambio en fluorescencia son descritos anteriormente. El sustrato quimioluminiscente es excitado electrónicamente mediante una reacción química y puede luego emitir luz que puede ser medida (utilizando un quimioluminómetro, por ejemplo) o dona energía a un aceptor fluorescente. Ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y' luciferasa bacteriana; patente estadounidense No. 4,737,456), luciferina, 2 , 3-dihidroftalazindionas , malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano (HRPO) , fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima oxidasas de sacárido (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa) oxidasas heterocíclicas (tal como uricasa y xantina oxidasa) , lactoperoxidasa, microperoxidasa y los semejantes. Técnicas para conjugar enzimas a anticuerpos son descritas en O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981) .
Ejemplos de combinaciones de enzima-sustrato incluyen, por ejemplo: (i) Peroxidasa de rábano (HRPO) con hidrógeno peroxidasa como sustrato, en donde el hidrógeno peroxidasa oxida un precursor de tinte (por ejemplo ortofenilen diamina (OPD) o clorhidrato de 3, 3' , 5, 5' -tetrametil ' bencimida (T B) ) ; (ii) fosfatasa alcalina (AP) con. para-nitrofenil fosfato como sustrato cromogénico; y (iii) ß-D-galactosidasa (ß-D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil-p-D-galactosidasa ) o sustrato fluorogénico (por ejemplo, 4-metilumbeliferil-p-D-galactosidasa) .
Numerosas otras combinaciones de enzima-sustrato están disponibles para aquellos experimentados en el arte. Para una revisión general de estas, véase patentes estadounidenses Nos. 4,275,149 y 4,318,980. Algunas veces, el marcador es conjugado indirectamente con el anticuerpo. El técnico experimentado estará consciente de varias técnicas para obtener esto. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser conjugado con biotina y cualquiera de las cuatro amplias categorías de marcadores mencionados anteriormente pueden ser conjugados con avidina o viceversa. Biotina se enlaza selectivamente a avidina y así, el marcador puede ser conjugado con el anticuerpo de esta manera indirecta. Alternativamente, para obtener conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo, el anticuerpo es conjugado con un hapteno pequeño y uno de los tipos diferentes de marcadores mencionados anteriormente es conjugado con un anticuerpo anti-hapteno . Así, se puede obtener la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo.
Además de los procedimientos de preparación de muestra discutidos anteriormente, el tratamiento adicional de la sección de tejido antes de o durante o enseguida de IHC puede ser deseable. Por ejemplo, métodos de recuperación de epitope, tal como calentamiento de la muestra de tejido en solución reguladora del pH de citrato se pueden llevar a cabo (véase, por ejemplo, Leong et al. Appl . Immunohistochem.
Enseguida de una etapa de bloqueo opcional, la sección de tejido es expuesta al anticuerpo primario por un periodo de tiempo suficiente y bajo condiciones ' apropiadas de tal manera que el anticuerpo primario se enlaza al antigeno de proteína objetivo en la muestra de tejido. Condiciones apropiadas para obtener esto pueden ser determinadas mediante experimentación de rutina. La extensión de enlace de anticuerpo a la muestra es determinada al usar cualquiera de los marcadores detectables discutidos anteriormente. En ciertas modalidades, el marcador es un marcador enzimático (por ejemplo, HRPO) que cataliza una alteración química del sustrato cromogénico tal como cromógeno de 3 , 3' -diaminobencidina . En .una modalidad, el marcador enzimático es conjugado al anticuerpo que se enlaza específicamente al anticuerpo primario (por ejemplo, el anticuerpo primario es anticuerpo policlonal de conejo y anticuerpo secundario es anticuerpo anti-cone o de cabra) .
Los especímenes así preparados pueden ser montados y cubiertos con cubreo jetos. La evaluación del portaobjetos es luego determinada, por ejemplo, utilizando un microscopio y criterios de intensidad de teñido, usado sistemáticamente en el arte, pueden ser empleados. Los criterios de intensidad de teñido pueden ser evaluados como sigue: Patrón de teñido Puntuación No se observa ningún teñido en las células. 0 Teñido débil/escasamente perceptible es detectado en más del 1+ 10% de las células.
Se observa teñido débil a moderado en más del 10% de las 2+ células.
Se observa teñido moderado a fuerte en más del 10% de las 3+ células.
En algunas modalidades, una puntuación del patrón de teñido de aproximadamente 1+ o más alto es diagnóstico y/o prognóstico. En ciertas modalidades, una puntuación de patrón de teñido de aproximadamente 2+ o más alto en un análisis de IHC es diagnóstico y/o prognóstico. En otras modalidades, una puntuación del patrón de teñido de aproximadamente 3 o más alto es diagnóstico y/o prognóstico. En una modalidad, se comprenderá que cuando las células y/o tejido de un tumor o adenoma de colon son examinados utilizando IHC, el teñido es en general déterminado o indagado en la célula y/o te ido de tumor (en contraposición al tejido estromal o de los alrededores que puede esta presente en la muestra) .
En métodos alternativos, la muestra se puede poner en contacto con un anticuerpo especifico por dicho biomarcador bajo condiciones suficientes para que se forme un complejo de anticuerpo-biomarcador y luego detectar dicho complejo. La presencia del biomarcador puede ser detectada en una diversidad de maneras, tal como Western blot y procedimientos de ELISA para analizar una amplia variedad de tejidos y muestras, incluyendo plasma o suero. Un amplio intervalo de técnicas de inraunoanálisis que utilizan tal formato de análisis están disponibles, véase, por ejemplo, patentes estadounidenses Nos. 4,016,043, 4,424,279 y 4,018,653. Estos incluyen tanto análisis de un solo sitio como de dos sitios o "emparedado" de los tipos no competitivos, también como en los análisis de enlace competitivos tradicionales. Estos análisis también incluyen enlace directo de un anticuerpo marcado a un biomarcador objetivo.
Los análisis de emparedado están entre los más útiles y análisis usados comúnmente. Un número de variaciones de la técnica de análisis de emparedado existen y se pretende que todas sean abarcadas por la presente invención. Brevemente, en un análisis directo típico, un anticuerpo sin marcar es inmovilizado sobre un sustrato sólido y la muestra a ser probada traída en contacto con la molécula enlazada. Después de un período de incubación apropiado, por un período de tiempo suficiente para permitir la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno, un segundo anticuerpo específico al antígeno, marcado con una molécula reportero capaz de producir una señal detectable es luego agregado e incubado, permitiendo tiempo suficiente para la formación de otro complejo del anticuerpo marcado con anticuerpo-antígeno. Cualquier material sin reaccionar es lavado y la presencia del antigeno es determinada mediante observación de una señal producida por la molécula reportero. Los resultados pueden ser ya sea cualitativos, mediante simple observación de la señal visible o pueden ser cuantificados al comparar con una muestra testigo que contiene cantidades conocidas de biomarcador.
Variaciones en el análisis directo incluyen un análisis simultáneo, en el cual tanto la muestra como el anticuerpo marcado son agregados simultáneamente al anticuerpo enlazado. Estas técnicas son bien conocidas para aquellos experimentados en el arte, incluyendo cualesquier variaciones menores como serán fácilmente evidentes. En un análisis de emparedado directo típico, un primer anticuerpo que tiene especificidad por el biomarcador es ya sea enlazado covalente o pasivamente a una superficie sólida. La superficie sólida es comúnmente vidrio o un polímero, los polímeros más comúnmente usados son celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno, cloruro de polivinilo o polipropileno. Los soportes sólidos pueden estar en forma de tubos, perlas, discos de microplacas o cualquier otra superficie apropiada para llevar a cabo un inmunoanálisis . Los procesos de enlace son bien conocidos en el arte y consisten en general de reticulación de enlace covalente o absorción física, el complejo de polímero-anticuerpo es lavado en preparación para la muestra de prueba. Una alícuota de la muestra a ser probada es luego agregada al complejo de fase sólida e incubada por un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo, .2-40 minutos o de la noche a la mañana si es más conveniente) y bajo condiciones apropiadas (por ejemplo, de temperatura ambiente a 40°C tal como entre 25°C y 32°C inclusive) para permitir el enlace de cualquier subunidad presente en el anticuerpo. Enseguida del periodo de incubación, la fase sólida de subunidad de anticuerpo es lavada y secada e incubada con un segundo anticuerpo especifico por una porción del biomarcador. El segundo anticuerpo es enlazado a una molécula reportero que es usada para indicar el enlace del segundo anticuerpo al marcador molecular.
Un método alternativo involucra inmovilización de los biomarcadores objetivo en la muestra y luego exponer el objetivo inmovilizado al .anticuerpo especifico que puede o puede no estar marcado con una molécula reportero. Dependiendo de la cantidad de objetivo y la intensidad de la señal de molécula reportero, un objetivo enlazado puede ser detectado mediante marcación directa con el anticuerpo. Alternativamente, un segundo anticuerpo marcado, especifico al primer anticuerpo es expuesto al complejo de ob etivo-primer anticuerpo para formar un complejo terciario de objetivo-primer anticuerpo-segundo anticuerpo. El complejo es detectado por la señal emitida por la molécula reportero. "Molécula reportero", como se usa en la presente especificación, significa una molécula que, por su naturaleza química, provee una señal identificable analíticamente que permite la detección del anticuerpo antígeno-enlazado . Las moléculas reportero más usadas comúnmente en este tipo de análisis son ya sea enzimas, fluoróforos o moléculas que contienen radionúclido (esto es, radioisótopos) y moléculas quimioluminiscentes .
En el caso de un inmunoanálisis de enzima, una enzima es conjugada al segundo anticuerpo, en general por medio de glutaraldehído o peryodato. Como se reconocerá fácilmente, sin embargo, una amplia variedad de diferentes técnicas de conjugación existen, que están fácilmente disponibles para el técnico experimentado. Enzimas usadas comúnmente incluyen peroxidása de rábano, glucosa oxidasa, -galactosidasa y fosfatasa alcalina, entre otras. Los sustratos a ser usados con las enzimas específicas son en general escogidos para la producción, después de la hidrólisis por la enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. Ejemplos de enzimas apropiadas incluyen fosfatasa alcalina y peroxidása. También es posible emplear sustratos fluorogénicos que producen un producto fluorescente en lugar de los sustratos cromogénicos indicados anteriormente. En todos los casos, el anticuerpo enzima-marcado es agregado al complejo primer anticuerpo-marcador molecular, se permite que se enlace y luego el reactivo en exceso es lavado. Una solución que. contiene el sustrato apropiado es luego agregada al complejo de anticuerpo-antígeno-anticuerpo . El sustrato reaccionará con la enzima enlazada al segundo anticuerpo, dando una señal visual cualitativa, que puede ser cuantificada adicionalmente, usualmente de manera . espectrofotométrica , para' dar una indicación de la cantidad de biomarcador que estaba presente en la muestra. Alternativamente, compuestos fluorescentes, tales como fluoresceina y rodamina, pueden ser acoplados químicamente a anticuerpos sin alterar su capacidad de enlace. Cuando son activados mediante iluminación con luz de una longitud de onda particular, el anticuerpo fluorocromo-marcado absorbe la energía de luz, induciendo un estado a excitabilidad en la molécula, seguido por emisión de la luz a un color característico visualmente detectable con un microscopio de luz. Como en el EIA, se permite que el anticuerpo marcado fluorescente se enlace al complejo de primer anticuerpo-marcador molecular. Después del lavado del reactivo sin enlazar, el complejo terciario restante es luego expuesto a la luz de la longitud de onda apropiada, la fluorescencia observada indica la presencia del marcador molecular de interés. Técnicas de inmunofluorescencia y EIA son ambas muy bien establecidas en el arte. Sin embargo otras moléculas reportero, tales, como radioisótopo, moléculas quimioluminiscentes o bioluminiscentes pueden también ser usadas.
Se contempla que las técnicas descritas anteriormente pueden también ser empleadas para detectar la expresión de por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, -44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 ó 94 de los genes objetivo, en donde los genes objetivos son los genes resumidos en la Tabla 1.
Métodos de la invención incluyen además protocolos que examinan la presencia y/o expresión de mARN de por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, ,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65', 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 ó 94 de los genes objetivos resumidos en la Tabla 1, en una muestra de tejido o célula. Métodos para la evaluación de mARN en células son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, análisis de hibridización utilizando sondas de ADN complementarias (tal como hibridización in situ utilizando ribosondas marcadas específicas para el uno o más genes, técnicas de Northern blot y técnicas relacionadas) y varios análisis de amplificación de ácido nucleico (tales como RT-PCR utilizando cebadores complementarios específicos para uno o más de los genes y otros métodos de detección tipo amplificación, tal como por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y los semejantes) .
Las muestras de tejido o células de mamíferos pueden ser analizadas convenientemente en cuanto a mARN utilizando análisis Northern, inmunoabsorción o PCR. Por ejemplo, análisis de RT-PCR, tales como análisis de PCR cuantitativos son bien conocidos en el arte. En una modalidad ilustrativa de la invención, (un método para detectar un mARN objetivo en una muestra biológica comprende producir cADN de la muestra mediante transcripción inversa utilizando por lo menos un cebador; amplificar el cADN así producido utilizando un polinucleótido objetivo como cebadores de sentido y antisentido para amplificar cADN objetivo en los mismos; y detectar la presencia del cADN objetivo amplificado utilizando sondas de polinucleótido. En algunas modalidades, cebadores y sondas que comprenden las secuencias resumidas en la Tabla 2 son usados para detectar la expresión de por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 ó 94 de los genes objetivos resumidos en la Tabla 1. Además, tales métodos pueden incluir una o más etapas que permiten determinar los niveles de mARN objetivo en una muestra biológica (por ejemplo, al examinar simultáneamente los niveles de una secuencia de mARN testigo comparativa de un -. gen de "mantenimiento" tal como un miembro de la familia de actina) . Opcionalmente, la secuencia del cADN objetivo amplificado puede ser determinada.
Métodos opcionales de la invención incluyen protocolos que examinan o detectan mARN, tales como mARN objetivo, en una muestra de tejido o célula mediante tecnología de microarreglo . Utilizando microarreglos de ácido nucleico, muestras de mARN de prueba y testigo de muestras de tejido de prueba y testigo son transcritas de manera inversa y marcados para generar sondas de cADN. Las sondas son luego hibridizadas a un arreglo de ácidos nucleicos inmovilizados sobre un soporte sólido. El arreglo es configurado de tal manera que la secuencia y posición de cada miembro del arreglo es conocida. Por ejemplo, una selección de genes cuya expresión se correlaciona con el beneficio clínico incrementado o reducido de terapia anti-angiogénica pueden ser arreglados sobre un soporte sólido. La hibridización de una sonda marcadá con un miembro de arreglo particular indica que la muestra de la cual la sonda fue derivada expresa aquel gen. Análisis de expresión de gen diferencial de tejido enfermo puede proveer información valiosa. La tecnología de microarreglo utiliza técnicas de hibridización de ácido nucleico y tecnología de cómputo para evaluar el perfil de expresión de mARN de miles de genes en un solo experimento. (Véase, por ejemplo, WO 01/75166 publicada el 11 de octubre de 2001; (véase, por ejemplo, patentes estadounidenses 5,700,637, 5,445,934 y 5,807,522, Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Cheung, V.G. et al., Nature Genetics 21 ( Suppl ): 15-19 (1999) para una discusión de fabricación de arreglo) . Los microarreglos de ADN son arreglos en miniatura que contienen fragmentos de gen que son ya sea sintetizados directamente sobre o apuntados sobre sustratos de vidrio u otros sustratos. Miles de genes son usualmente representados en un solo arreglo. Un experimento de microarreglo típico involucra las siguientes etapas: 1) preparación del objetivo marcado fluorescentemente de ARN aislado de la muestra, 2) hibridización del objetivo marcado al microarreglo, 3) lavado, teñido y exploración del arreglo, 4) análisis de la imagen explorada y 5) generación de perfiles de expresión de gen. Actualmente dos tipos principales de microarreglos de ADN son usados: arreglo de oligonucleótidos (usualmente 25 a 70 mers) y arreglos de expresión de gen que contiene productos de PCR preparados a partir de cADN. Al formar un arreglo, los oligonucleótidos pueden ser ya sea prefabricados y apuntados a la superficie o sintetizado directamente sobre la superficie (in situ) .
El sistema GeneChip® de Affymetrix es un sistema de microarreglo disponible comercialmente que comprende arreglos fabricados mediante síntesis directa de oligonucleótidos sobre una superficie de vidrio. Arreglos de sonda/gen: oligonucleótidos , usualmente de 25 mers, son sintetizados directamente sobre una oblea de vidrio mediante una combinación de fotolitografía a base de semiconductor y tecnología de síntesis química de fase sólida. Cada arreglo contiene hasta 400,000 oligos diferentes y cada oligo está presente en millones de copias. Puesto que las sondas de oligonucleótido son sintetizadas en sitios conocidos sobre el arreglo, Los patrones de hibridización e intensidades de señal pueden ser interpretados en términos de identidad de gen y niveles de expresión relativos por los elementos de programación Affymetrix Microarray Suite. Cada gen es representado sobre el arreglo mediante una serie de diferentes sondas de oligonucleótido. Cada par de sonda consiste de un oligonucleótido de coincidencia perfecta y un oligonucleótido de desajuste. La sonda de coincidencia perfecta tiene una secuencia exactamente complementaria al gen particular y así mide la expresión del gen. La sonda de desajuste difiere de la sonda de coincidencia perfecta por una sola sustitución de base en la posición base central, alterando el enlace del transcripto de gen objetivo. Esto ayuda a determinar el fondo e hibridización no específica que contribuye a la señal medida para el oligo de coincidencia perfecta. Los elementos de programación Microarray Suite resta las intensidades de hibridización de las sondas de desajuste de aquellas de la sonda de coincidencia perfecta para determinar el valor de intensidad absoluto o especifico para cada conjunto de sondas. Las sondas son escogidas en base a información actual de Genbank y otros depósitos de nucleótidos. Se cree que las secuencias reconocen regiones únicas del extremo 3' del gen. Un horno de hibridización de GeneChip (horno de "rosticeria" ) es usado para llevar a cabo la hibridización de hasta 64 arreglos a la vez. La estación de fluidos efectúa el lavado y teñido de los arreglos de sonda. Es completamente automatizado y contiene cuatro módulos, con cada módulo contiene un arreglo de sonda. Cada módulo es controlado independientemente por los elementos de programación Microarray Suite utilizando protocolos de fluidos pre-reprogramados . El escáner es un escáner de fluorescencia de láser confocal que mide la intensidad de fluorescencia emitida por el cARN marcado enlazado a los arreglos de sonda.
La estación de trabajo de computadora con elementos de programación de Microarray Suite controla la estación de fluidos y el- escáner.. Los elementos de programación Microarray Suite pueden controlar hasta ocho estaciones de fluidos utilizando protocolos de hibridización, lavado y teñido pre-programados para el arreglo de sonda. Los elementos de programación también adquieren y convierten los datos de intensidad de hibridización a una llamada.de presencia/ausencia por cada gen utilizando algoritmos apropiados. Finalmente, los elementos de programación detectan cambios en la expresión genética entre experimentos mediante análisis de comparación y dar formato a la salida en archivos .txt, que pueden ser usados con otros programas de elementos de programación para análisis de datos adicionales.
La expresión de un gen o biomarcador seleccionado en una muestra de tejido o célula puede también ser examinada por medio de análisis funcionales o análisis a base de actividad. Por ejemplo, si el biomarcador es una enzima, se pueden llevar a cabo análisis conocidos en el arte para determinar o detectar la presencia de la actividad enzimática dada en el muestra de tejido o célula.
Los kits de la invención tienen un número de modalidades. En ciertas modalidades, un kit comprende un recipiente, una etiqueta sobre el recipiente y una composición contenida dentro del recipiente; en donde ' la composición incluye uno o más anticuerpos primarios que se enlazan a una o más secuencias de polipéptidos objetivo correspondientes a por lo menos 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 , 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 ó 94 genes resumidos en la Tabla 1, la etiqueta sobre el recipiente indica que la composición puede ser usada para evaluar la presencia de una o más proteínas objetivo en por lo menos un tipo de célula mamífera, e instrucciones para usar los anticuerpos para evaluar la presencia de una o más proteínas objetivo en por lo menos un tipo de célula mamífera. El kit puede comprender además un conjunto de instrucciones y materiales para preparar una muestra de tejido y aplicar anticuerpo y sonda a la misma sección de una muestra de tejido. El kit puede incluir tanto un anticuerpo primario como secundario, en donde el anticuerpo secundario es conjugado a un marcador, por ejemplo, un marcador enzimático.
Otra modalidad es un kit que comprende un recipiente, una etiqueta sobre el recipiente y una composición contenida dentro del recipiente; en donde la composición incluye uno o más polinucleotidos que se hibridizan a la secuencia de polinucleotidos del por lo menos 1, 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,' 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 , 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 ó 94 genes resumidos en la Tabla 1, bajo condiciones severas, la etiqueta en el recipiente indica que la composición puede ser usada para evaluar la presencia de y/o niveles de expresión de uno o más genes objetivo en por lo menos un tipo de célula mamífera, e instrucciones para usar el polinucleótido para evaluar la presencia de y/o niveles de expresión de una o más ARN o ADN objetivo en por lo menos un tipo de célula mamifera. En algunas modalidades, los kits comprenden cebadores de polinucleótido y sondas que comprende las secuencias resumidas en la Tabla 2.
Otros componentes opcionales en el kit incluyen una o más soluciones reguladoras del pH (por ejemplo, solución reguladora del pH de bloqueo, solución reguladora del pH de lavado, solución reguladora del pH de sustrato, etc.) otros reactivos tales como sustrato (por ejemplo, cromógeno) que es alterado químicamente mediante un marcador enzimático, solución de recuperación de epitope, ' muestras testigo (testigos positivos y/o negativos), portaobj eto ( s ) testigo, etc.
IV. Formulaciones farmacéuticas Para los métodos de la invención, formulaciones terapéuticas del anti-NRPl, anticuerpo anti-EGFL7, anticuerpo anti-VEGF-C o anticuerpo anti-VEGF son preparadas para almacenamiento al mezclar el anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes o estabilizadores aceptables fisiológicamente opcionales {Remington ' s Pharmaceutical Sciences 16th edition osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos a los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen soluciones reguladoras del pH tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de 5 hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butilico o bencílico; alquil parabenes tales como metilo o propil paraben; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); ^ proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o ^ dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) ; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG) . 20 La formulación en la presente puede también contener más de un compuesto activo como sea necesario para la indicación particular que es tratada, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser .deseable proveer además un 5 agente inmunosupresor . Tales moléculas están apropiadamente presentes en combinación en cantidades que son efectivas por el propósito planeado.
Los ingredientes activos pueden también ser atrapados en microcápsula preparada por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsula de gelatina y microcápsula de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nano-particulas y nanocápsulas ) o en macroemulsiones . Tales técnicas son reveladas en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition osol, A. Ed. (1980) .
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos apropiados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, tales matrices están en forma de artículos formados, por ejemplo, películas o microcápsulas . Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) o poli (alcohol vinílico) ) , polilacturos (patente estadounidense No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y ? etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolato) y ácido poli- · D- ( - ) -3-hidroxibutírico . Mientras que los polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permite la liberación de moléculas por más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas por períodos de tiempo más cortos. Cuando anticuerpos permanecen en el cuerpo por un tiempo largo, se pueden desnaturalizar o agregar como resultado de exposición a humedad a 3 °C, dando como resultado pérdida de actividad biológica y posibles cambios en inmunogenicidad . Estrategias racionales pueden ser ideadas para la estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlace S-S intermolecular por medio de intercambio de tio-disulfuro, la estabilización puede ser obtenida al modificar los residuos de sulfhidrilo, liofilización de soluciones ácidas, control de contenido de humedad, uso de aditivos apropiados y desarrollo de composiciones de matriz poliméricas específicas.
V. Usos Terapéuticos La presente invención contempla un método para el tratamiento de una alteración angiogénica (por ejemplo, una alteración caracterizada por angiogénesis anormal o fuga vascular anormal) en un paciente que comprende las. etapas de determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión incrementados o disminuidos de por lo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, -75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93 ó 94 genes resumidos en la Tabla 1 y administrar al paciente una cantidad efectiva de una terapia anti-cáncer, mediante lo cual el tumor, cáncer o alteración proliferativa celular es tratada. La terapia anticáncer puede ser por ejemplo, un antagonista de NRP1, un antagonista de EGFL7 o un antagonista de VEGF-C.
Ejemplos de alteraciones angiogénicas a ser tratadas en la presente incluyen, pero no están limitadas a cáncer, especialmente tumores sólidos vascularizados y tumores metastáticos (incluyendo cáncer de colon, cáncer de pulmón (especialmente cáncer de pulmón de célula pequeña) o cáncer de próstata) , enfermedades provocadas por neovascularización ocular, especialmente ceguera diabética, retinopatias , principalmente retinopatia diabética o degeneración macular relacionada con la edad, neovascularización coroidal (CNV) , edema macular diabético, miopía patológica, enfermedad de von Hippel-Lindau, histoplasmosis del ojo oclusión de vena retinal central. (CRVO) , neovascularización corneal, neovascularización retinal y rubeosis; psoriasis, artritis psoriática, hemangioblastoma tal como hemangioma; enfermedades renales inflamatorias, tales como glomerulonefritis , especialmente glomerulonefritis mesangioproliferativa, síndrome urémico hemolítico, nefropatía diabética o nefrosclerosis hipertensiva; varias enfermedades inflamatorias, tales como artritis, especialmente artritis reumatoide, enfermedad de intestino inflamatorio, psoriasis, sarcoidosis, arteriosclerosis arterial y enfermedades que ocurren después de trasplantes, endometriosis o asma crónico y otras condiciones; estados de enfermedad que incluyen, por ejemplo, edema asociado con tumores que incluyen, por ejemplo, tumores de cerebro; ascitis asociado con malignidades; síndrome de Meigs; inflamación del pulmón; síndrome nefrótico; efusión pericardial ;. efusión pleural; permeabilidad asociada con enfermedades cardiovasculares tales como la condición que sigue a infartos miocardiacos y accidentes cerebrovasculares y los semejantes.
Ejemplos de cáncer a ser tratado en la presente incluyen, pero no están limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de célula escamosa, cáncer de pulmón (incluyendo cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón) , cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal) , cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñon o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulval, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, también como linfoma de célula B (incluyendo linfoma no de Hodgkin de grado bajo/folicular (NHL); NHL linfocítico pegueño (SL) ; NHL de grado intermedio/folicular; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; NHL de célula no escindida pequeña de alto grado; NHL de enfermedad voluminosa; linfoma de célula de manto; linfoma relacionado con el SIDA; y 14:27 macroglobulinemia de aldenstrom) ; leucemia linfocítico crónico (CLL) ; leucemia linfoblástico agudo (ALL) ; leucemia de célula vellosa; leucemia mieloblástica crónica; y alteración linfoproliferativa posttrasplante (PTLD) , también como proliferación vascular anormal asociada con facomatoses, edema (tal como aquel asociado con tumores de cerebro) y síndrome de eigs. Más particularmente, cánceres que son propensos al tratamiento por los anticuerpos de la invención incluyen cáncer de pecho, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer de pulmón de célula no pequeña, linfoma no de Hodgkins (NHL) , cáncer de célula renal, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer pancreático, sarcoma de tejido blando, sarcoma de Kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovario, mesotelioma y mieloma múltiple. En algunas modalidades, el cáncer puede ser un cáncer resistente. En algunas modalidades, el cáncer puede ser un cáncer de recaída.
Se contempla que cuando se usan para tratar varias enfermedades tales como tumores, el antagonista de . NRPl, antagonista de EGFL7 o antagonista de VEGF-C pueden ser combinados con uno o más otros ' agentes terapéuticos apropiados para la misma enfermedad o enfermedades similares. Por ejemplo, cuando se usan para el tratamiento de cáncer, el antagonista de NRP1, antagonista de EGFL7 o antagonista de VEGF-C pueden ser usados en combinación con terapias anti-cáncer convencionales, tales como cirugía, radioterapia, quimioterapia o combinaciones de los mismos.
En ciertos aspectos otros agentes terapéuticos útiles para terapia de cáncer de combinación con el antagonista de NRPl, antagonista de EGFL7 o antagonista de VEGF-C incluyen otros agentes anti-angiogénicos . Muchos agentes anti-angiogénicos han sido identificados y son conocidos en el arte, incluyendo aquellos enlistados por Carmeliet and Jain (2000) Nature 407 (6801) :249-57.
En un aspecto, el antagonista de NRPl, antagonista de EGFL7 o antagonista de VEGF-C es usado en combinación con un antagonista de VEGF o un antagonista del receptor de VEGF tales como anticuerpos anti-VEGF, variantes de VEGF, fragmentos de receptor de VEGF solubles, aptámeros aptos de bloquear VEGF o VEGFR, neutralizar anticuerpos anti-VEGFR, inhibidores de cinasas de tirosina de VEGF y cualesquier combinaciones de los mismos. Alternativamente o además, dos o más antagonistas de NRP1, antagonistas de EGFL7 o antagonistas de VEGF-C pueden ser co-administrados al paciente. En una modalidad preferida, un anticuerpo anti-NRPl es usado en combinación con un anticuerpo anti-VEGF para generar efectos aditivos o sinergisticos . En otra modalidad preferida, se usa un anticuerpo anti-EGFL7 en combinación con un anticuerpo anti-VEGF para generar efectos aditivos o sinergistas. En una modalidad preferida adicional, un anticuerpo anti-VEGF-C es usado en combinación con un anticuerpo anti-VEGF para generar efectos aditivo o sinergistas Anticuerpos anti-VEGF preferidos incluyen aquellos que se enlazan al mismo epitope como el anticuerpo anti-hVEGF A4.6.1. Más preferiblemente, el anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab o ranibizumab.
En algunos otros aspectos de los métodos de la invención otros agentes terapéuticos útiles para terapia de tumor de combinación con el antagonista de NRP1, antagonista de EGFL7 o antagonista de VEGF-C, incluyen antagonistas de otros factores que están involucrados en el crecimiento del tumor, tales como EGFR, ErbB2 (también conocido como Her2) ErbB3, ErbB4 o TNF. Preferiblemente, el anticuerpo anti-NRPl, anticuerpo antÍ-EGFL7 o VEGF-C anticuerpo de la invención puede ser usado en combinación con inhibidores de cinasa de tirosina de receptor de molécula pequeña (RTKI) que apuntan a uno o más receptores de cinasa de tirosina tales como receptores de VEGF, receptores de FGF, receptores de EGF y receptores de PDGF, Muchos RTKI de molécula pequeña terapéuticos son conocidos en el arte, incluyendo, pero no limitados a, vatalanib (PTK787), erlotinib (TARCEVA®) oSI-7904, ZD6474 (ZACTIMA®) , ZD6126 (ANG453), ZD1839, sunitinib (SUTENT®) , semaxanib (SU5416) , AMG706, AG013736, Imatinib (GLEEVEC®) , MLN-518, CEP-701, PKC-412, Lapatinib (GSK572016) , VELCADE®, AZD2171, sorafenib (NEXAVAR®) , XL880 y CHIR-265.
Los métodos de la invención pueden también incluir el uso del antagonista de NRP1, antagonista de EGFL7 o antagonista de VEGF-C ya sea solo o en combinación con un segundo agente terapéutico (tal como un anticuerpo anti-VEGF) y además en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos. Una variedad de agentes quimioterapéuticos pueden ser usados en los métodos de tratamiento combinados de la invención. Una lista ejemplar y no limitante de agentes quimioterapéuticos contemplados es provista anteriormente en la presente.
Para los métodos de la¦ invención, cuando el antagonista de NRP1, antagonista de EGFL7 o antagonista de VEGF-C es co-administrado con un segundo agente terapéutico, el segundo agente terapéutico puede ser administrado primero, seguido por el antagonista de NRP1, antagonista de EGFL7 o antagonista de VEGF-C. Sin embargo, la administración simultánea o administración . del antagonista de NRP1, antagonista de EGFL7 o antagonista de VEGF-C primero es también contemplada. Dosificaciones apropiadas para el segundo agente terapéutico son aquellas usadas actualmente y pueden ser disminuidas debido a la acción combinada (sinergia) del agente y antagonista de NRP1, antagonista de EGFL7 o antagonista de VEGF-C.
En donde el método de la invención contempla la administración de un anticuerpo a un paciente, dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 µg/kg a 50 mg/kg (por ejemplo, 0.1-20mg/kg) de anticuerpo es una dosificación candidata inicial para administración al paciente, si, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosificación diaria típica podría variar de aproximadamente 1 µg/kg a aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas en varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento es .sostenido hasta que ocurre una supresión deseada de síntomas de la enfermedad. Sin embargo otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. En un aspecto preferido, el anticuerpo es administrado cada dos a tres semanas, a una 'dosis que varía de aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg. En un aspecto, el anticuerpo es administrado cada dos a tres semanas a una dosis de aproximadamente 5 mg/kg, 7.5 mg/kg, 10 mg/kg o 15 mg/kg. Tal régimen de dosificación puede ser usado en combinación con un régimen de quimioterapia. En algunos aspectos, el régimen de quimioterapia involucra la administración intermitente de alta dosis tradicional. En algunos otros aspectos, los agentes quimioterapéuticos son administrados utilizando dosis más pequeñas y más frecuentes sin descansos programados ("quimioterapia metronómica" ) . El avance de la terapia de la invención es monitoreado fácilmente mediante técnicas análisis convencionales.
La composición de anticuerpo será formulada, dosificada y administrada de una manera consistente con la buena práctica médica. Factores para consideración en este contexto incluyen la alteración particular que es tratada, el mamífero particular que es tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa de la alteración, el sitio de administración del agente, el método de administración, la programación de administración y otros factores conocidos a los prácticos médicos. La "cantidad terapéuticamente efectiva" del anticuerpo a ser administrada será determinada por consideraciones tales y es la cantidad mínima necesaria para impedir, mejorar o tratar una enfermedad o alteración. El anticuerpo necesita ser, pero es formulado opcionalmente con uno o más agentes usados actualmente para impedir o tratar la alteración en cuestión. La cantidad efectiva de tales otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de alteración o tratamiento y otros factores discutidos anteriormente. Son en general usados en las mismas dosificaciones y con rutas de administración como se usa anteriormente en la presente o alrededor de 1 a 99% de las dosificaciones hasta ahora empleadas. En general, el alivio o tratamiento de una enfermedad o alteración involucra la disminución de uno o más síntomas de problemas médicos asociados con la enfermedad o alteración. En el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco puede llevar a cabo uno o una combinación de los siguientes: reducir el número de células de cáncer; reducir el tamaño del tumor; inhibir (esto es, disminuir a alguna extensión y/o detener) la infiltración de células de cáncer a órganos periféricos; inhibir la metástasis del tumor; inhibir, a alguna extensión, el crecimiento del tumor; y/o aliviar a alguna extensión uno o más de los síntomas asociados con el cáncer. A la extensión que el fármaco puede impedir el crecimiento y/o asesinar células de cáncer existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. En algunas modalidades, una composición de esta invención puede ser usada para impedir el inicio o reocurrencia de la enfermedad o alteración en un sujeto o mamífero.
Aunque en la descripción anterior la invención es ilustrada con referencia a ciertas modalidades, no está limitada de esta manera. Por supuesto, varias modificaciones de la invención, además de aquellas mostradas y descritas en la presente serán evidentes para aquellos experimentados en el arte a partir de la descripción anterior y caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Todas las referencias citadas en toda la especificación de referencias citadas en la misma, son incorporadas expresamente en la presente por referencia en su totalidad para todos los propósitos.
EJEMPLOS Ejemplo 1. Identificación de Agentes con Actividades Inhibidoras de Tumor Todos los estudios se llevan a cabo de acuerdo con la guia para el cuidado y el uso de animales de laboratorio, publicada por la NIH (Publicación NIH 85—23, revisada en 1985) . Un comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) aprobó todos los protocolos de animales.
Los estudios se llevan a cabo con modelos de tumor apropiados, que incluyen por ejemplo, modelos de cáncer dé pecho tales como, por ejemplo, MDA- B231, ???,- BT474, MCF7, KPL-4, 66cl4, Fo5 y MÁXF583; modelos de cáncer de colon tales como, por ejemplo, LS174t, DLD-1, HT29, SW620, SW480, HCT116, colo205, HM7 , LoVo, LS180, CXF243 y CXF260; modelos de cáncer de pulmón tales como, por ejemplo, A549, H460, SKMES , H1299, V522, Calu-6, carcinoma de pulmón de Lewis, H520, NCI-H2122, LXFE409, LXFL1674, LXFA629, LXFA737, LXFA1335 y 1050489; modelos de cáncer de ovario tales como, por ejemplo oVCAR3, A2780, SK0V3 y IGROV-1; modelos de cáncer pancreático tales como, por ejemplo, BxPC3, PANC1, MiaPaCa-2, KP4 y SU8686; modelos de cáncer de próstata tales como, por ejemplo, PC3, DU145; modelos de cáncer de cerebro tales como, por ejemplo, U87 G (glioblastoma) , SF295 (glioblastoma) y SKNAS (neuroblastoma) ; modelos de cáncer de hígado tales como, por ejemplo, Hep3B, Huh-7 y JHH-7; modelos de melanoma tales como, por ejemplo, A2058, A375, SKMEL-5, A2058 y MEXF989; modelos de cáncer renal tales como, por ejemplo, Caki-1, Caki-2 y 786-0; sarcoma de- Ewing y cáncer de hueso tales como, por ejemplo, MHH-ES-1; modelos de cáncer gástrico tales como, por ejemplo, SNU5; modelos de rabdomiosarcoma tales como, por ejemplo, A673 y SXF463; modelos de mieloma tales como, por ejemplo oP 2-FcRH5; y linfoma de cé^la B tales como, por ejemplo, WSU-DLCL2; y modelos de cáncer de vejiga urinaria tales como, por ejemplo, BXF1218 y BXF1352 utilizando técnicas estandarizadas. Brevemente, células de tumor humanas son implantadas subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón de prueba. En el día de implante de tumor, células de tumor son cosechadas y resuspendidas en PBS a una concentración de 5 x 107 células/ml. Cada ratón de prueba recibe 1 x 107 células de tumor implantadas subcutáneamente en el flanco derecho y el crecimiento del tumor es monitoreado.
El crecimiento del tumor es monitoreado a medida que el tamaño promedio se aproximó a 120-180 mm3. En el día de estudio 1, los ratones son clasificadas por' tamaño de tumor en tres grupos de prueba (un grupo testigo y dos grupos de tratamiento) . El volumen del tumor es calculado utilizando la fórmula: Volumen de tumor (mm3) = = (w2 x 1) /2 en donde w = ancho y 1 = longitud en mm del tumor. Todos los tratamientos son administrados intra-peritonealmente . Los ratones son tratados dos veces a la semana por hasta 10-20 semanas con 5-10 mg/kg cada uno de anticuerpo testigo, un agente que bloquea la actividad de VEGF o la combinación de un agente que bloquea la actividad de VEGF y un agente de prueba. Para el grupo de tratamiento de combinación, el agente anti-angiogénico es administrado concurrentemente con el anticuerpo anti-VEGF o secuencialmente con el anticuerpo anti-VEGF. Si el agente de prueba y el anticuerpo anti-VEGF son administrados secuencialmente, el agente de prueba es administrado no más antes de 30 minutos antes de la administración del anticuerpo anti-VEGF o no más tarde de treinta minutos después de la administración del anticuerpo anti-VEGF. Cada dosis es administrada en un volumen de 0.2 mi por 20 gramos de peso corporal (10 ml/kg) y es escalada al peso corporal del animal.
El volumen del tumor es registrado dos veces a la semana utilizando calibradores. Cada animal fue eutanizado cuando su tumor alcanzó el tamaño de punto final (en general 1000 mm3) o en la conclusión del estudio, lo que ocurra primero. El tumor son cosechado y ya sea fijado de la noche a la mañana en NBF al 10%, seguido por etanol al 70% y subsecuente imbibición en parafina o en el transcurso de dos minutos congelado en nitrógeno liquido para almacenamiento subsecuente a -80°C.
El tiempo al punto final (TTE) es calculado de la siguiente ecuación: TTE (días) = (logio (volumen de punto final, mm3 - b) , / m en donde b es la intersección y m es la pendiente de la linea obtenida mediante regresión lineal de un conjunto de datos de crecimiento de tumor transformados a logaritmo.
Los animales que llegan al punto final son asignados a un valor de TTE igual al último dia del estudio. Los animales clasificados como muertes NTR (no relacionadas con el tratamiento) debido a accidente (NTRa) o debido a causas desconocidas (NTRu) son excluidos de los cálculos de TTE (y de todos los análisis adicionales) . Los animales clasificados como muertes de TR (relacionadas con el tratamiento) o NTRm _ (muerte no relacionada con el tratamiento debida a metástasis) son asignados a un valor de TTE igual al dia de la muerte.
El resultado de tratamiento es evaluado por el retardo de crecimiento de tumor (TGD) , que es definido como el incremento en el tiempo promedio al punto final (TTE) en un grupo de tratamiento comparado con el grupo de control, que es calculado como sigue: TGD = T - C, expresado en días o como porcentaje del TTE promedio del grupo testigo, que es calculado como sigue: %TGD = [ (T - C) / C] x.100, en donde T = TTE promedio para un grupo de tratamiento y C = TTE promedio para el grupo testigo.
El A%TGD es calculado como antes, con C = grupo testigo que es el grupo que recibe el tratamiento . anti-VEGF-A solo y T = grupo de tratamiento que es el grupo que recibe la combinación de anti-VEGF y un agente de prueba. La prueba logrank es empleada para analizar el significado de la diferencia entre los valores de TTE de dos grupos. Análisis estadísticos de dos colas son llevados a cabo a un nivel significativo p= 0.05. Un valor de "1" indica que el tratamiento dio como resultado retardo adicional en avance del tumor. Un valor de "0" indica que el tratamiento no dio como resultado un retardo adicional en el avance del tumor.
Ejemplo 2 Identificación de Biomarcadores por Eficacia de Tratamiento Análisis de expresión genética de por lo menos un gen resumido en la Tabla 1 a continuación es llevado a cabo utilizando qRT-PCR en muestras de tumor obtenidas de los experimentos de modelo de tumor descritos anteriormente en el Ejemplo 1 Tabla 1 Gen 18S rRNA ACTB RPS13 VEGFA VEGFC VEGFD Bv8 P1GF VEGFRl/Fltl VEGFR2 VEGFR3 NRP1 (transmembrana y soluble) Podoplanxna Proxl VE-Cadherin (CD144, CDH5] FGF2 IL8/CXCL8 HGF THBS1/TSP1 Egfl7 N.G3/Egfl8 ANG1 G -CSF/CSF2 G-CSF/CSF3 FGF9 CXCL12/SDF1 TGFbl TNFa Alkl BMP9 BMP10 HSPG2/perlecan ESM1 Sema3a Sema3b Sema3c Sema3e Sema3f ÑG2 ICAM1 CXCR4 TMEM100 PECAM/CD31 PDGFb PDGFRb RGS5 CXCL1 CXCL2 VCAM1 Robo4 LyPD6 VCAM1 colágeno IV (al, a2 ó a3) Spred-1 Hhex ITGa5 LGALSl/Galectinl LGALS7/Galectin7 MFAP5 Fibronectina fibulin2 fibulin4/Efemp2 HMBS SDHA ÜBC NRP2 CD34 DLL4 CLECSF5/CLEC5a CCL2/MCP1 CCL5 CXCL5/ENA-78 ANG2 FGF8 FGF8b PDGFC cMet JAG1 CD105/Endoglin Notchl EphB4 EphA3 EFNB2 TIE2/TEK LAMA4 NID2 Map4k4 Bcl2Al IGFBP4 VIM/vimentin FGFR4 FRAS1 ANTXR2 CLECSF5/CLEC5a Mincle/CLEC4E/CLECSF9 PTGS2 PDGFA Del material congelado, cubos pequeños de longitud lateral máxima de 3 ni son solubilizado utilizando reactivos y equipo disponibles coraercialmente (RNeasy®, Tissuelyzer, ambos de Qiagen Inc, Alemania) . Después de la purificación en columna, el ARN es eluido con H2O, precipitado con etanol después de la adición de glicógeno y acetato de sodio. El ARN es aglomerado o transformado en pelotillas mediante centrifugación por al menos 30 minutos, lavado dos veces con etanol al 80% y la pelotilla resuspendida en H20 después de secado. Las concentraciones de ARN son determinadas utilizando un espectrofotómetro o bioanalizador (Agilent, Foster City, CA) y se usan 50 ng de ARN total por reacción en los análisis de expresión genética subsecuentes. Los conjuntos de cebador especifico de gen y sonda fueron designados para análisis de expresión de qRT-PCR. Las secuencias de conjunto de cebador y sonda son resumidas en la Tabla 2 a continuación.
Tabla 2 SEQ ID NO: 18S rRNA humano cebador delantero AGT CCC TGC CCT TTG TAC ACA 1 cebador inverso CCG AGG GCC TCA CTA AAC C 2 sonda CGC CCG TCG CTA CTA CCG ATT GG 3 ACTB humano cebador delantero GAAGGCTTTTGGTCTCCCTG 4 cebador inverso GGTGTGCACTTTTATTCAACTGG 5 sonda AGGGCTTACCTGTACACTG 6 ACTB murino cebador delantero CCA TGA AAT AAG TGG TTA CAG GAA GTC 7 cebador inverso CAT GGA CGC GAC CAT CCT 8 . sonda TCC CAA AAG CCA CCC CCA CTC CTA AG 9 RPS13 humano cebador delantero CACCGTTTGGCTCGATATTA 10 cebador inverso GGCAGAGGCTGTAGATGATTC 1 1 sonda ACCAAGCGAGTCCTCCCTCCC 12 RPS13 murino cebador delantero CACCGATTGGCTCGATACTA 13 cebador inverso TAGAGCAGAGGCTGTGGATG 14 sonda CGGGTGCTCCCACCTAATTGGA 15 VEGF-A humano cebador delantero ATC ACC ATG CAG ATT ATG CG 16 cebador inverso TGC ATT CAC ATT TGT TGT GC 17 sonda TCA AAC CTC ACC AAG GCC AGC A 18 VEGF-A murino cebador delantero GCAGAAGTCCCATGAAGTGA 19 cebador inverso CTCAATCGGACGGCAGTAG 20 sonda TCAAGTTCATGGATGTCTACCAGCGAA 21 VEGF-C humano cebador delantero CAGTGTCAGGCAGCGAACAA 22 cebador inverso CTTCCTGAGCCAGGCATCTG 23 sonda CTGCCCCACCAATTACATGTGGAATAATCA 24 VEGF-C murino cebador delantero AAAGGGAAGAAGTTCCACCA 25 cebador inverso CAGTCCTGGATCACAATGCT 26 sonda TCAGTCGATTCGCACACGGTCTT 27 VEGF-D humano cebador delantero CTGCCAGAAGCACAAGCTAT 28 cebador inverso ACATGGTCTGGTATGAAAGGG 29 sonda CACCCAGACACCTGCAGCTGTG 30 VEGF-D murino cebador delantero TTG ACC TAG TGT CAT GGT AAA GC 31 cebador inverso TCA GTG AAC TGG GGA ATC AC 32 sonda ACA TTT CCA TGC AAT GGC GGC T 33 Bv8 humano cebador delantero ATG GCA CGG AAG CTA GGA 34 cebador inverso GCA GAG CTG AAG TCC TCT TGA 35 sonda TGC TGC TGG ACC CTT CCT AAA CCT 36 Bv8 murino cebador delantero CGG AGG ATG CAC CAC ACC 37 cebador inverso CCG GTT GAA AGA AGT CCT TAA ACA 38 sonda CCC CTG CCT GCC AGG CTT GG 39 P1GF humano todas las isoformas cebador delantero CAGCAGTGGGCCTTGTCT 40 cebador inverso AAGGGTACCACTTCCACCTC 41 sonda TGACGAGCCGTTCCCAGC 42 P1GF humano, isoformas 1 y 2 cebador delantero GAGCTGACGTTCTCTCAGCA 43 cebador inverso CTTTCCGGCTTCATCTTCTC 44 sonda CTGCGAATGCCGGCCTCTG 45 P1GF humano cebador delantero TGCTTCTTACAGGTCCTAGCTG 46 cebador inverso AAAGGCACCACTTCCACTTC 47 sonda CCCTGGGAATGCACAGCCAA 48 VEGFRl/Fltl humano cebador delantero CCGGCTTTCAGGAAGATAAA 49 cebador inverso TCCATAGTGATGGGCTCCTT 50 sonda AACCGTCAGAATCCTCCTCTTCCTCA 51 VEGFRl/Flt (ECD) murino cebador delantero GGCACCTGTACCAGACAAACTAT 52 cebador inverso GGCGTATTTGGACATCTAGGA 53 sonda TGACCCATCGGCAGACCAATACA 54 VEGFRl/Fltl murino (dominio de cinasa IC) cebador delantero CGGAAACCTGTCCAACTACC 55 cebador inverso TGGTTCCAGGCTCTCTTTCT 56 sonda CAACAAGGACGCAGCCTTGCA 57 VEGFR2 humano cebador delantero GGTCAGGCAGCTCACAGTCC 58 cebador inverso ACTTGTCGTCTGATTCTCCAGGTT 59 sonda AGCGTGTGGCACCCACGATCAC 60 VEGFR2 murino cebador delantero TCATTATCCTCGTCGGCACTG 61 cebador inverso CCTTCATTGGCCCGCTTAA 62 sonda TTCTGGCTCCTTCTTGTCATTGTCCTACGG 63 VEGFR3 humano cebador delantero ACAGACAGTGGGATGGTGCTGGCC 64 cebador inverso CAAAGGCTCTGTGGACAACCA 65 sonda TCTCTATCTGCTCAAACTCCTCCG 66 VEGFR3 murino cebador delantero AGGAGCTAGAAAGCAGGCAT 67 cebador inverso CTGGGAATATCCATGTGCTG 68 sonda CAGCTTCAGCTGTAAAGGTCCTGGC 69 NRP1 humano (transmembrana y soluble) cebador delantero CGGACCCATACCAGAGAATTA 70 cebador inverso CCATCGAAGACTTCCACGTA 71 sonda TCAACCCTCACTTCGATTTGGAGGA 72 NRP1 humano (transmembrana) cebador delantero AAACCAGCAGACCTGGATAAA 73 cebador inverso CACCTTCTCCTTCACCTTCG 74 sonda TCCTGGCGTGCTCCCTGTTTC . 75 NRP1 rriurino (transmembrana y soluble) cebador delantero TTTCTCAGGAAGACTGTGCAA 76 cebador inverso TGGCTTCCTGGAGATGTTCT 77 sonda CCTGGAGTGCTCCCTGTTTCATCA 78 NRP1 murino (transmembrana) cebador delantero CTGGAGATCTGGGATGGATT 79 cebador inverso TTTCTGCCCACAATAACGC 80 sonda CCTGAAGTTGGCCCTCACATTGG 81 RP1 humano (soluble, isoforma 12) cebador delantero CCACAGTGGAACAGGTGATG 82 cebador inverso CTGTCACATTTCGTATTTTATTTGA 83 sonda GAAAAGCCCACGGTCATAGA 84 NRP1 humano (soluble, isoforma 11) cebador delantero CCACAGTGGAACAGGTGATG ¦ 85 cebador inverso ATGGTACAGCAATGGGATGA 86 sonda CCAGCTCACAGGTGCAGAAACCA 87 NRP1 humano (soluble, isoforma IV) cebador delantero GACTGGGGCTCAGAATGG 88 cebador inverso CTATGACCGTGGGCTTTTCT 89 sonda TGAAGTGGAAGGTGGCACCAC 90 Podoplanina humana cebador delantero CCGCTATAAGTCTGGCTTGA 91 cebador inverso GATGCGAATGCCTGTTACAC 92 sonda AACTCTGGTGGCAACAAGTGTCAACA 93 Podoplanina murina cebador delantero GGATGAAACGCAGACAACAG 94 cebador inverso GACGCCAACTATGATTCCAA 95 sonda TGGCTTGCCAGTAGTCACCCTGG 96 Proxl humano cebador delantero ACAAAAATGGTGGCACGGA 97 cebador inverso CCT GAT GTA CTT CGG AGC CTG 98 sonda CCCAGTTTCCAAGCCAGCGGTCTCT 99 Proxl murino cebador delantero GCTGAAGACCTACTTCTCGGA 100 cebador inverso ACGGAAATTGCTGAACCACT 101 sonda TTCAACAGATGCATTACCTCGCAGC 102 VE-Cadherina humana (CD144, CDH5) cebador delantero GAACAACTTTACCCTCACGGA 103 cebador inverso GGTCAAACTGCCCATACTTG 104 sonda CACGATAACACGGCCAACATCACA 105 VE-Cadherina humana (CD144, CDH5) cebador delantero TGAAGAACGAGGACAGCAAC 106 cebador inverso CCCGATTAAACTGCCCATAC 107 sonda CACCGCCAACATCACGGTCA 108 robo4 humano cebador delantero GGGACCCACTAGACTGTCG 109 cebador inverso AGTGCTGGTGTCTGGAAGC 110 sonda TCGCTCCTTGCTCTCCTGGGA 1 1 1 ICAM1 humano cebador delantero AACCAGAGCCAGGAGACACT 112 cebador inverso CGTCAGAATCACGTTGGG 113 sonda TGACCATCTACAGCTTTCCGGCG 114 ICAM1 murino cebador delantero CACGCTACCTCTGCTCCTG 115 cebador inverso CTTCTCTGGGATGGATGGAT 116 sonda CACCAGGCCCAGGGATCACA 117 ESM1 humano cebador delantero TTCAGTAACCAAGTCTTCCAACA 118 cebador inverso TCACAATATTGCCATCTCCAG 119 sonda TCTCACGGAGCATGACATGGCA 120 ESM1 murino cebador delantero CAGTATGCAGCAGCCAAATC 121 cebador inverso CTCTTCTCTCACAGCGTTGC 122 sonda TGCCTCCCACACAGAGCGTG 123 NG2 humano cebador delantero AGGCAGCTGAGATCAGAAGG 124 cebador inverso GATGTCTGCAGGTGGCACT 125 sonda CTCCTGGGCTGCCTCCAGCT 126 NG2 murino cebador delantero ACAGTGGGCTTGTGCTGTT 127 cebador inverso AGAGAGGTCGAAGTGGAAGC 128 sonda TCCTTCCAGGGCTCCTCTGTGTG 129 FGF2 humano cebador delantero ACCCCGACGGCCGA 130 cebador inverso TCTTCTGCTTGAAGTTGTAGCTTGA 131 sonda TCCGGGAGAAGAGCGACCCTCAC 132 FGF2 murino cebador delantero ACCTTGCTATGAAGGAAGATGG 133 cebador inverso TTCCAGTCGTTCAAAGAAGAAA 134 sonda AACACACTTAGAAGCCAGCAGCCGT 135 IL8/CXCL8 humano cebador delantero GGCAGCCTTCCTGATTTCT 136 cebador inverso TTCTTTAGCACTCCTTGGCA 137 sonda AAACTGCACCTTCACACAGAGCTGC 138 HGF humano cebador delantero TGGGACAAGAACATGGAAGA 139 cebador inverso GCATCATCATCTGGATTTCG 140 sonda TCAGCTTACTTGCATCTGGTTCCCA 141 HGF murino cebador delantero GGACCAGCAGACACCACA 142 cebador inverso TATCATCAAAGCCCTTGTCG 143 sonda CCGGCACAAGTTCTTGCCAGAA 144 THBS1/TSP1 humano cebador delantero TTTGGAACCACACCAGAAGA 145 cebador inverso GTCAAGGGTGAGGAGGACAC 146 sonda CCTCAGGAACAAAGGCTGCTCCA 147 THBS1/TSP1 murino cebador delantero CGATGACAACGACAAGATCC 148 cebador inverso TCTCCCACATCATCTCTGTCA 149 sonda CCATTCCATTACAACCCAGCCCA 150 ANG1 humano cebador delantero AGTTAATGGACTGGGAAGGG 151 cebador inverso GCTGTCCCAGTGTGACCTTT 152 sonda ACCGAGCCTATTCACAGTATGACAGA 153 GM-CSF/CSF2 humano cebador delantero TGCTGCTGAGATGAATGAAA 154 cebador inverso CCCTGCTTGTACAGCTCCA 155 sonda CTCCAGGAGCCGACCTGCCT 156 GM-CSF/CSF2 murino cebador delantero AGCCAGCTACTACCAGACATACTG 157 cebador inverso GAAATCCGCATAGGTGGTAAC 158 sonda AACTCCGGAAACGGACTGTGAAACAC 159 G-CSF/CSF3 humano cebador delantero GTCCCACCTTGGACACACT 160 cebador inverso TCCCAGTTCTTCCATCTGCT 161 sonda CTGGACGTCGCCGACTTTGC 162 G-CSF/CSF3 murino cebador delantero GAGTGGCTGCTCTAGCCAG 163 cebador inverso GACCTTGGTAGAGGCAGAGC 164 sonda TGCAGCAGACACAGTGCCTAAGCC 165 FGF9 humano cebador delantero TATCCAGGGAACCAGGAAAG 166 cebador inverso CAGGCCCACTGCTATACTGA 167 sonda CACAGCCGATTTGGCATTCTGG 168 CXCL12/SDF1 humano cebador delantero ACACTCCAAACTGTGCCCTT 169 cebador inverso GGGTCAATGCACACTTGTCT 170 sonda TGTAGCCCGGCTGAAGAACAACA 171 CXCL12/SDF1 murino cebador delantero CCAACGTCAAGCATCTGAAA 172 cebador inverso GGGTCAATGCACACTTGTCT 173 sonda TGCCCTTCAGATTGTTGCACGG 174 TGFbl humano cebador delantero CGTCTGCTGAGGCTCAAGT 175 cebador inverso GGAATTGTTGCTGTATTTCTGG 176 sonda CAGCTCCACGTGCTGCTCCA 177 TGFbl murino cebador delantero CCCTATATTTGGAGCCTGGA 178 cebador inverso CGGGTTGTGTTGGTTGTAGA 179 sonda CACAGTACAGCAAGGTCCTTGCCC 180 TNFa humano cebador delantero TCAGATCATCTTCTCGAACCC 181 cebador inverso CAGCTTGAGGGTTTGCTACA 182 sonda CGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATG 183 TNFa murino cebador delantero AGTTCTATGGCCCAGACCCT 184 cebador inverso TCCACTTGGTGGTTTGCTAC 185 sonda TCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCA 186 BMP9 humano cebador delantero CAACATTGTGCGGAGCTT 187 cebador inverso GAGCAAGATGTGCTTCTGGA 188 sonda CAGCATGGAAGATGCCATCTCCA 189 BMP 10 humano cebador delantero CCTTGGTCCACCTCAAGAAT 190 cebador inverso GGAGATGGGCTCTAGCTTTG 191 sonda CCAAAGCCTGCTGTGTGCCC 192 Sema3a humano cebador delantero GAGGTTCTGCTGGAAGAAATG 193 cebador inverso CTGCTTAGTGGAAAGCTCCAT 194 sonda CGGGAACCGACTGCTATTTCAGC 195 Sema3a murino cebador delantero TCCTCATGCTCACGCTATTT 196 cebador inverso AGTCAGTGGGTCTCCATTCC 197 sonda CGTCTTGTGCGCCTCTTTGCA 198 Sema3b humano cebador delantero ACCTGGACAACATCAGCAAG 199 cebador inverso GCCCAGTTGCACTCCTCT 200 sonda CCGGCCAGGCCAGCTTCTT 201 Sema3b murino cebador delantero AGCTGCCGATGGACACTAC 202 cebador inverso GGGACTGAGATCACTTTCAGC 203 sonda TGTGCCCACATCTGTACCAATGAAGA 204 Sema3c humano cebador delantero CAGGGCAGAATTCCATATCC 205 cebador inverso CGCATATTGGGTGTAAATGC 206 sonda CGCCCTGGAACTTGTCCAGGA 207 Sema3c murino cebador delantero ATGTGAGACATGGAAACCCA 208 cebador inverso TTCAGCTGCATTTCTGTATGC 209 sonda TTGAACCCTCGGCATTGTGTCA 210 Sema3e humano cebador delantero GCTCACGCAATTTACACCAG 21 1 cebador inverso TTCTCTGCCCTCCTACATCA 212 sonda TTCACACAGAGTCGCCCGACC 213 Sema3e murino cebador delantero CCACTGGTCACTATATGAAGGAA 214 cebador inverso CTTGCCTCCGTTTACTTTGC 215 sonda CAAGGCCTGGTTCCTGTGCCA 216 Sema3f humano cebador delantero GGAACCCTGTCATTTACGCT 217 cebador inverso GTAGACACACACGGCAGAGC 218 sonda CCTCTGGCTCCGTGTTCCGA 219 Sema3f murino cebador delantero CGTCAGGAACCCAGTCATTT 220 cebador inverso AGACACACACTGCAGACCCT 221 sonda CTTTACCTCTTCAGGCTCTGTGTTCCG 222 LGALSl/Galectinl humano cebador delantero CTCAAACCTGGAGAGTGCCT 223 cebador inverso GGTTCAGCACGAAGCTCTTA 224 sonda CGTCAGGAGCCACCTCGCCT 225 LGALSl/Galectinl humano cebador delantero AATCATGGCCTGTGGTCTG 226 cebador inverso CCCGAACTTTGAGACATTCC 227 sonda TCGCCAGCAACCTGAATCTCA 228 LG ALS 7B/Galectin7 humano cebador delantero CCTTCGAGGTGCTCATCATC 229 cebador inverso GGCGGAAGTGGTGGTACT 230 sonda ACCACGGCCTTGAAGCCGTC 231 LGALS7B/Galectin7 murino cebador delantero GAGAATTCGAGGCATGGTC 232 cebador inverso ATCTGCTCCTTGCTCCTCAC 233 sonda CATGGAACCTGCCAGCCTGG 234 TMEM100 humano cebador delantero TGGTAATGGATTGCCTCTCTC 235 cebador inverso CAGTGCTTCTAAGCTGGGTTT 236 sonda CGAGCTTTCACCCTGGTGAGACTG 237 TMEM 100 murino cebador delantero AGTCAAGTGGCCTCTCTGGT 238 cebador inverso CGCTTCACAGGCTAGATTTG 239 sonda TGAGCTTGCATCCTGACCAGGC 240 Alkl humano cebador delantero AGGTGGTGTGTGTGGATCAG 241 cebador inverso CCGCATCATCTGAGCTAGG 242 sonda CTGGCTGCAGACCCGGTCCT 243 Alkl murino cebador delantero CTTTGGCCTAGTGCTATGGG 244 cebador inverso GAAAGGTGGCCTGTAATCCT 245 sonda CGGCGGACCATCATCAATGG 246 ITGa5 humano cebador delantero GCCTCAATGCTTCTGGAAA 247 cebador inverso CAGTCCAGCTGAAGTTCCAC 248 sonda CGTTGCTGACTCCATTGGTTTCACA 249 ITGa5 murino cebador delantero ACCGTCCTTAATGGCTCAGA 250 cebador inverso CCACAGCATAGCCGAAGTAG 251 sonda CAACGTCTCAGGAGAACAGATGGCC 252 CXCR4 humano cebador delantero CTTCCTGCCCACCATCTACT 253 cebador inverso CATGACCAGGATGACCAATC 254 sonda CATCTTCTTAACTGGCATTGTGGGCA 255 Egfl7 humano cebador delantero GTGTACCAGCCCTTCCTCAC 256 cebador inverso CGGTCCTATAGATGGTTCGG 257 sonda ACCGGGCCTGCAGCACCTA 258 Egfl7 murino cebador delantero GGCAGCAGATGGTACTACTGAG 259 cebador inverso GATGGAACCTCCGGAAATC 260 sonda CCCACAGTACACACTCTACGGCTGG 261 NG3/Egfl8 humano cebador delantero AAGCCCTACCTGACCTTGTG 262 cebador inverso ATAACGCGGTACATGGTCCT 263 sonda AGTGCTGCAGATGCGCCTCC 264 NG3/Egfl8 murino cebador delantero CTGTCAGGGCTGGAAGAAG 265 cebador inverso CACCTCCATTAAGACAAGGCT 266 sonda TCACCTGTGATGCCATCTGCTCC 267 HSPG2/perlecana humana cebador delantero CGGCCATGAGTCCTTCTACT 268 cebador inverso GGAGAGGGTGTATCGCAACT 269 sonda CCGTAGGCCGCCACCTTGTC . 270 Fibronectina humana cebador delantero GGTTCGGGAAGAGGTTGTTA 271 cebador inverso TCATCCGTAGGTTGGTTCAA 272 sonda CCGTGGGCAACTCTGTCAACG 273 Fibronectina humana cebador delantero AGAACCAGAGGAGGCACAAG 272 cebador inverso CATCTGTAGGCTGGTTCAGG 275 sonda CCTTCGCTGACAGCGTTGCC 276 LyPD6 murino cebador delantero CTCAGTCCCGAGACTTCACA 277 cebador inverso AAACACTTAAACCCACCAGGA 278 sonda CCTCCACCCTTCAACCACTCCG 279 Spred-1 murino cebador delantero CGAGGCATTCGAAGAGCTA 280 cebador inverso TCCTCCTTCAGCCTCAGTTT 281 sonda TCTCTAGGGTGCCCAGCGTCAA 282 MFAP5 murino cebador delantero CATCGGCCAGTCAGACAGT 283 cebador inverso AGTCGGGAACAGATCTCATTATT 284 sonda CTGCTTCACCAGTTTACGGCGC 285 MFAP5 murino cebador delantero GACACACTCAGCAGCCAGAG 286 cebador inverso CCAAGAACAGCATATTGTCTACAG 287 sonda CCGGCAGACAGATCGCAGCT 288 fibulin2 murino cebador delantero AGAATGGTGCCCAGAGTGA 289 cebador inverso TTCTCTTTCAAGTAGGAGATGCAG 290 sonda CATTGCCTCTGGGCTATCCTACAGATG 291 fibulin4/Efemp2 murino cebador delantero CACCTGCCCTGATGGTTAC 292 cebador inverso CAATAGCGGTAACGACACTCA 293 sonda TGTCCACACATTCGGGTCCAATTT 294 collageno IV murino (al) cebador delantero CGGCAGAGATGGTCTTGAA 295 cebador inverso TCTCTCCAGGCTCTCCCTTA 296 sonda CCTTGTGGACCCGGCAATCC 297 collageno IV murino (a2) cebador delantero TTCATTCCTCATGCACACTG 298 cebador inverso GCACGGAAGTCCTCTAGACA 299 sonda ACTGGCCACCGCCTTCATCC 300 collageno IV murino (a3) cebador delantero TTACCCTGCTGCTACTCCTG 301 cebador inverso GCATTGTCCTTTGCCTTTG 302 sonda CACAGCCCTTGCTAGCCACAGG 303 Hhex murino cebador delantero GGCCAAGATGTTACAGCTCA 304 cebador inverso TTGCTTTGAGGATTCTCCTG 305 sonda CCTGGTTTCAGAATCGCCGAGC 306 robo4 murino cebador delantero CCTTTCTCTTCGTGGAGCTT 307 cebador inverso GTCAGAGGAGGGAGCTTGG 308 sonda TCCACACACTGGCTCTGTGGGTC 309 PDGFb murino cebador delantero CATCTCGAGGGAGGAGGAG 310 cebador inverso CACTCGGCGATTACAGCA 311 sonda TGCTGCTGCCAGGGACCCTA 312 • PDGFRb murino cebador delantero CTTATGATAACTATGTCCCATCTGC 313 cebador inverso CTGGTGAGTCGTTGATTAAGGT 314 sonda CCCTGAAAGGACCTATCGCGCC 315 RGS5 murino cebador delantero GAGGAGGTCCTGCAGTGG 316 cebador inverso TGAAGCTGGCAAATCCATAG 317 sonda CGCCAGTCCCTGGACAAGCTT 318 CXCL1 murino cebador delantero CCGAAGTCATAGCCACACTC 319 cebador inverso TTTCTGAACCAAGGGAGCTT 320 sonda AAGGCAAGCCTCGCGACCAT 321 CXCL2 murino cebador delantero AAAGGCAAGGCTAACTGACC 322 cebador inverso CTTTGGTTCTTCCGTTGAGG 323 sonda CAGCAGCCCAGGCTCCTCCT 324 PECAM/CD31 murino cebador delantero TCC CCG AAG CAG CAC TCT T 325 cebador inverso ACC GCA ATG AGC CCT TTC T 326 sonda CAG TCA GAG TCT TCC TTG CCC CAT GG 327 VCAM1 murino cebador delantero AACCCAAACAGAGGCAGAGT 328 cebador inverso CAGATGGTGGTTTCCTTGG 329 sonda CAGCCTCTTTATGTCAACGTTGCCC 330 HMBS humano cebador delantero CTTGATGACTGCCTTGCCTC 331 cebador inverso GGTTACATTCAAAGGCTGTTGCT 332 sonda TCTTTAGAGAAGTCC 333 SDHA humano cebador delantero GGGAGCGTGGCACTTACCT 334 cebador inverso TGCCCAGTTTTATCATCTCACAA 335 sonda TGTCCCTTGCTTCATT 336 UBC humano cebador delantero TGCACTTGGTCCTGCGCTT 337 cebador inverso GGGAATGCAACAACTTTATTGAAA 338 sonda TGTCTAAGTTTCCCCTTTTA 339 VEGFD humano cebador delantero ATTGACATGCTATGGGATAGCAACA 340 cebador inverso CTGGAGATGAGAGTGGTCTTCT 341 sonda TGTGTTTTGCAGGAGGAAAATCCACTTGCTGGA 342 VEGFR1 humano, cebador delantero CTGGCAAGCGGTCTTACC 343 cebador inverso GCAGGTAACCCATCTTTTAACCATAC 344 sonda AAGTGAAGGCATTTCCCTCGCCGGAA 345 VEGFR2 humano cebador delantero AGG GAG TCT GTG GCA TCT G 346 cebador inverso GGA GTG ATA TCC GGA CTG GTA 347 sonda AGG CTC AAA CCA GAC AAG CGG C 348 NRP2 humano cebador delantero AGGACTGGATGGTGTACCG 350 cebador inverso TTCAGAACCACCTCAGTTGC 351 sonda CCACAAGGTATTTCAAGCCAACAACG 352 Proxl humano cebador delantero TCAGATCACATTACGGGAGTTT 352 cebador inverso CAGCTTGCAGATGACCTTGT 353 sonda TCAATGCCATTATCGCAGGCAAA 354 VE-Cadherina humano (CD144, CDH5) cebador delantero ACA ATG TCC AAA CCC ACT CAT G 355 cebador inverso GAT GTG ACA ACA GCG AGG TGT AA 356 sonda TGC ATG ACG GAG CCG AGC CAT 357 CD3l/Pecam humano cebador delantero AGAAGCAAAATACTGACAGTCAGAG 358 cebador inverso GAG CAA TGA TCA CTC CGA TG 359 sonda CTGCAATAAGTCCTTTCTTCCATGG 360 Col4al humano cebador delantero CTGG AGG AC AGG G ACC AC 361 cebador inverso GGGAAACCCTTCTCTCCTTT 362 sonda CCAGGAGGGCCTGACAACCC 363 Col4a2 humano cebador delantero GCTACCCTGAGAAAGGTGGA 364 cebador inverso GGGAATCCTTGTAATCCTGGT 365 sonda CACTGGCCCAGGCTGACCAC 366 Col4a3 humano cebador delantero AGGAATCCCAGGAGTTGATG 367 cebador inverso CCTGGGATATAAGGGCACTG 368 sonda CCCAAAGGAGAACCAGGCCTCC 369 Hhex humano cebador delantero CTCAGCGAGAGACAGGTCAA 370 cebador inverso TTTATTGCTTTGAGGGTTCTCC 371 sonda TCTCCTCCATTTAGCGCGTCGA 372 DLL4 humano cebador delantero AGGCCTGTTTTGTGACCAAGA 373 cebador inverso GAGCACGTTGCCCCATTCT 374 sonda ACTGCACCCACCACT 375 PDGFRb humano cebador delantero CGGAAACGGCTCTACATCTT 376 cebador inverso AGTTCCTCGGCATCATTAGG 377 sonda CCAGATCCCACCGTGGGCTT 378 RGS5 humano cebador delantero ACCAGCCAAGACCCAGAAA 379 cebador inverso GCAAGTCCATAGTTGTTCTGC 380 sonda CACTGCAGGGCCTCGTCCAG 381 - CCL2/MCP1 humano cebador delantero GAAGATCTCAGTGCAGAGGCT 382 cebador inverso TGAAGATCACAGCTTCTTTGG 383 sonda CGCGAGCTATAGAAGAATCACCAGCA 384 CCL5 humano cebador delantero TACACCAGTGGCAAGTGCTC 385 cebador inverso CACACTTGGCGGTTCTTTC 386 sonda CCCAGCAGTCGTCTTTGTCACCC 387 CXCL5/ENA-78 humano cebador delantero GACGGTGGAAACAAGGAAA 388 cebador inverso TCTCTGCTGAAGACTGGGAA 389 sonda TCCATGCGTGCTCATTTCTCTTAATCA 390 FGF8 humano cebador delantero GGCCAACAAGCGCATCA 391 cebador inverso AAGGTGTCCGTCTCCACGAT 392 sonda CCTTCGCAAAGCT 393 FGF8b humano cebador delantero GCTGGTCCTCTGCCTCCAA 394 cebador inverso TCCCTCACATGCTGTGTAAAATTAG 395 sonda CCCAGGTAACTGTTCAGT 396 CXCL12/SDF1 humano cebador delantero TCTCAACACTCCAAACTGTGC 397 cebador inverso GGGTCAATGCACACTTGTCT 170 sonda CCTTCAGATTGTAGCCCGGCTGA 398 TGFbl humano cebador delantero TTTGATGTCACCGGAGTTGT 399 cebador inverso GCGAAAGCCCTCAATTTC 400 sonda TCCACGGCTCAACCACTGCC 401 BMP9 humano cebador delantero GGAGTAGAGGGAAGGAGCAG 402 cebador inverso CTGGGTTGTGGGAAATAACA 403 sonda CCGCGTGTCACACCCATCATT 404 Sema3c humano cebador delantero GCCATTCCTGTTCCAGATTC 405 cebador inverso TCAGTGGGTTTCCATGTCTC 406 sonda TCGGCTCCTCCGTTTCCCAG 407 cMet humano cebador delantero CACCATAGCTAATCTTGGGACAT 408 cebador inverso TGATGGTCCTGATCGAGAAA 409 sonda CCACAACCTGCATGAAGCGACC 410 JAG1 humano cebador delantero CGGGAACATACTGCCATGAA 41 1 cebador inverso GCAAGTGCCACCGTTTCTACA 412 sonda ATGACTGTGAGAGCAAC 413 Notchl humano cebador delantero CACCTGCCTGGACCAGAT 414 cebador inverso GTCTGTGTTGACCTCGCAGT 415 sonda TCTGCATGCCCGGCTACGAG 416 EphB4 humano cebador delantero TCTGAAGTGGGTGACATTCC 417 cebador inverso CTGTGCTGTTCCTCATCCAG 418 sonda CTCCCACTGCCCGTCCACCT 419 EFNB2 humano cebador delantero ATCCAGGTTCTAGCACAGACG 420 cebador inverso TGAAGCAATCCCTGCAAATA 421 sonda TCCTCGGTTCCGAAGTGGCC 422 FN1 EIIIA humano cebador delantero GAATCCAAGCGGAGAGAGTC 423 cebador inverso ACATCAGTGAATGCCAGTCC 424 sonda TGCAGTAACCAACATTGATCGCCC 425 EFEMP2 humano cebador delantero GATCAGCTTCTCCTCAGGATTC 426 cebador inverso TGTCTGGGTCCCACTCATAG 427 sonda CCCGACAGCTACACGGAATGCA 428 FBLN2 humano cebador delantero GAGCCAAGGAGGGTGAGAC 429 cebador inverso CCACAGCAGTCACAGCATT 430 sonda ACGACAGCTGCGGCATCTCC 431 MFAP5 humano cebador delantero AGGAGATCTGCTCTCGTCTTG 432 cebador inverso AGCCATCTGACGGCAAAG 433 sonda CTCATCTTTCATAGCTTCGTGTTCCTT 434 LyPD6 humano cebador delantero AGAGACTCCGAGCATGAAGG 435 cebador inverso GGGCAGTGGCAAGTTACAG 436 sonda CCACAAGGTCTGCACTTCTTGTTGTG 437 Map4k4 humano cebador delantero TTCTCCATCTAGCGGAACAACA 438 cebador inverso GGTCTCATCCCATCACAGGAA 439 sonda TGACATCTGTGGTGGGAT 440 - FRAS1 humano cebador delantero TACTTGGAGAGCACTGGCAT 441 cebador inverso CTGTGCAGTTATGTGGGCTT 442 sonda TGTGAAGCTTGCCACCAGTCCTG 443 ACTB murino cebador delantero GCAAGCAGGAGTACGATGAG 444 cebador inverso TAACAGTCCGCCTAGAAGCA 445 sonda CCTCCATCGTGCACCGCAAG 446 HMBS murino cebador delantero CTCCCACTCAGAACCTCCTT 447 cebador inverso AGCAGCAACAGGACACTGAG 448 sonda CCCAAAGCCCAGCCTGGC 449 SDHA murino cebador delantero CTACAAGGGACAGGTGCTGA 450 cebador inverso GAGAGAATTTGCTCCAAGCC 451 sonda CCTGCGCCTCAGTGCATGGT 452 VEGFD murino cebador delantero ATG CTG TGG GAT AAC ACC AA 453 cebador inverso GTG GGT TCC TGG AGG TAA GA 454 sonda CGA GAC TCC ACT GCC.TGG GAC A 455 Bv8 murino cebador delantero AAAGTCATGTTGCAAATGGAAG 456 cebador inverso AATGGAACCTCCTTCTTCCTC 457 sonda TCTTCGCCCTTCTTCTTTCCTGC 458 NRP1 murino cebador delantero CTCAGGTGGAGTGTGCTGAC 459 cebador inverso TTGCCATCTCCTGTATGGTC 460 sonda CTGAATCGGCCCTGTCTTGCTG 461 NRP1 murino cebador delantero CTACTGGGCTGTGAAGTGGA 462 cebador inverso CACACTCATCCACTGGGTTC 463 sonda CAGCTGGACCAACCACACCCA 464 NRP2 murino cebador delantero GCATTATCCTGCCCAGCTAT 465 cebador inverso GATCGTCCCTTCCCTATCAC 466 sonda TCCCTCGAACACGATCTGATACTCCA 467 Proxl murino cebador delantero CGGACGTGAAGTTCAACAGA 468 cebador inverso ACGCGCATACTTCTCCATCT 469 sonda CGCAGCTCATCAAGTGGTTCAGC 470 · CD34 murino cebador delantero CCTGGAAGTACCAGCCACTAC 471 cebador inverso GGGTAGCTGTAAAGTTGACCGT 472 sonda ACCACACCAGCCATCTCAGAGACC 473 FGF8 murino cebador delantero CAGGTCTCTACATCTGCATGAAC 474 cebador inverso AATACGCAGTCCTTGCCTTT 475 sonda AAGCTAATTGCCAAGAGCAACGGC 476 FGF8b murino CTGCCTGCTGTTGCACTT 477 cebador delantero TTAGGTGAGGACTGAACAGTTACC 478 cebador inverso CTGGTTCTCTGCCTCCAAGCCC 479 sonda CXCL2 murino cebador delantero ACATCCAGAGCTTGAGTGTGA 480 cebador inverso GCCCTTGAGAGTGGCTATG 481 sonda CCCACTGCGCCCAGACAGAA 482 CCL5 murino cebador delantero GCCCACGTCAAGGAGTATTT 483 cebador inverso TCGAGTGACAAACAGGACTG 484 sonda . CACCAGCAGCAAGTGCTCCAATC 485 TNFa murino cebador delantero CAGACCCTCACACTCAGATCA 486 cebador inverso TCCACTTGGTGGTTTGCTAC 185 sonda TCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCA 186 Sema3b murino cebador delantero AGTACCTGGAGTTGAGGGTGA 487 cebador inverso GTCTCGGGAGGACAGAAGG 488 sonda CACCCACTTTGACCAACTTCAGGATG 489 PDGFC murino cebador delantero CCATGAGGTCCTTCAGTTGAG 490 cebador inverso TCCTGCGTTTCCTCTACACA 491 sonda CCTCGTGGTGTTCCAGAGCCA 492 Angl murino , cebador delantero CACGAAGGATGCTGATAACG 493 cebador inverso ACCACCAACCTCCTGTTAGC 494 sonda CAACTGTATGTGCAAATGCGCTCTCA 495 Ang2 murino cebador delantero CACAAAGGATTCGGACAATG 496 cebador inverso AAGTTGGAAGGACCACATGC 497 sonda CAAACCACCAGCCTCCTGAGAGC 498 BMP9 murino cebador delantero CTTCAGCGTGGAAGATGCTA 499 cebador inverso TGGCAGGAGACATAGAGTCG 500 sonda CGACAGCTGCCACGGAGGAC 501 BMP 10 murino cebador delantero CCATGCCGTCTGCTAACAT 502 cebador inverso GATATTTCCGGAGCCCATTA 503 sonda CAGATCTTCGTTCTTGAAGCTCCGG 504 cMet murino cebador delantero ACGTCAGAAGGTCGCTTCA 505 cebador inverso ACATGAGGAGTGAGGTGTGC 506 sonda TGTTCGAGAGAGCACCACCTGCA 507 CXCR4 murino cebador delantero TGTAGAGCGAGTGTTGCCA 508 cebador inverso CCAGAACCCACTTCTTCAGAG 509 sonda TGTATATACTCACACTGATCGGTTCCA 510 DLL4 murino cebador delantero ATGCCTGGGAAGTATCCTCA 511 cebador inverso GGCTTCTCACTGTGTAACCG 512 sonda TGGCACCTTCTCTCCTAAGCTCTTGTC 513 JAG1 murino cebador delantero ACATAGCCTGTGAGCCTTCC 514 cebador inverso CTTGACAGGGTTCCCATCAT 515 sonda CGTGGCCATCTCTGCAGAAGACA 516 • EFNB2 murino cebador delantero GTCCAACAAGACGTCCAGAG 517 cebador inverso CGGTGCTAGAACCTGGATTT 518 sonda TCAACAACAAGTCCCTTTGTGAAGCC 519 EFNB2 murino cebador delantero TTGGACAAGATGCAAGTTCTG 520 cebador inverso TCTCCCATTTGTACCAGCTTC 521 sonda TCAGCCAGGAATCACGGTCCA 522 Notchl murino cebador delantero CACTGCATGGACAAGATCAA 523 cebador inverso TCATCCACATCATACTGGCA 524 sonda CCCAAAGGCTTCAACGGGCA 525 TIE2 murino cebador delantero CACGAAGGATGCTGATAACG 526 cebador inverso ACCACCAACCTCCTGTTAGC 527 sonda CAACTGTATGTGCAAATGCGCTCTCA 528 EphA3 murino cebador delantero TTGCAATGCTGGGTATGAAG 529 cebador inverso AGCCTTGTAGAAGCCTGGTC 530 sonda AACGAGGTTTCATATGCCAAGCTTGTC 531 Bcl2Al murino cebador delantero CAGAATTCATAATGAATAACACAGGA 532 cebador inverso CAGCCAGCCAGATTTGG 533 sonda GAATGGAGGTTGGGAAGATGGCTTC 534 Map4k4 murino cebador delantero TTGCCACGTACTATGGTGCT 535 cebador inverso CCATAACAAGCCAGAGTTGG 536 sonda TCATCATGTCCTGGAGGGCTCTTCT 537 ANTXR2 murino cebador delantero TGGGAAGTCTGCTGTCTCAA 538 cebador inverso AATAGCTACGATGGCTGCAA 539 sonda CACAGCCACAGAATGTACCAATGGG 540 IGFBP4 murino cebador delantero CCCTGCGTACATTGATGC 541 cebador inverso GCTCTCATCCTTGTCAGAGGT 542 * sonda ACAGCTCCGTGCACACGCCT 543 FGFR4 murino cebador delantero GAGGCATGCAGTATCTGGAG 544 cebador inverso CTCGGTCACCAGCACATTT 545 sonda CTCGGAAGTGCATCCACCGG 546 CLECSF5/CLEC5a murino cebador delantero GTACGTCAGCCTGGAGAGAA 547 cebador inverso ATTGGTAACATTGCCATTGAAC 548 sonda AAAGTGGCGCTGGATCAACAACTCT 549 Mincle/CLECSF9 murino cebador delantero GAATGAATTCAACCAAATCGC 550 cebador inverso CAGGAGAGCACTTGGGAGTT 551 sonda TCCCACCACACAGAGAGAGGATGC 552 FBLN2/fibulin2 murino cebador delantero TTGTCCACCCAACTATGTCC 553 cebador inverso CGTGATATCCTGGCATGTG 554 sonda TGCGCTCGCACTTCGTTTCTG 555 Egfl7 murino cebador delantero AGCCTTACCTCACCACTTGC 556 cebador inverso ATAGGCAGTCCGGTAGATGG 557 sonda CGGACACAGAGCCTGCAGCA 558 LAMA4 murino cebador delantero ATTCCCATGAGTGCTTGGAT 559 cebador inverso CACAGTGCTCTCCTGTTGTGT 560 sonda CTGTCTGCACTGCCAGCGGA 561 NID2 murino cebador delantero GCAGATCACTTCTACCACACG 562 cebador inverso CTGGCCACTGTCCTTATTCA 563 sonda TGATATAACACCATCCCTCCGCCA 564 FRAS1 murino cebador delantero GGC AAT AAA CCG AGG ACT TC 565 cebador inverso TCA AGT GCT GCT CTG TGA TG 566 sonda CGT GCT ACG GAC CCT GCT GAA A 567 PLC/HSPG2 murino cebador delantero GAGACAAGGTGGCAGCCTAT 568 cebador inverso TGTTATTGCCCGTAATCTGG 569 sonda CGGGAAGCTGCGGTACACCC 570 hPTGS2 humano cebador delantero GCTGGAACATGGAATTACCC 571 cebador inverso GTACTGCGGGTGGAACATT 572 sonda ACCAGCAACCCTGCCAGCAA 573 PDGFA humano cebador delantero GTCCATGCCACTAAGCATGT 574 cebador inverso ACAGCTTCCTCGATGCTTCT 575 sonda CCCTGCCCATTCGGAGGAAG 576 Ejemplo 3 Análisis Inhibidoras de Tumor de Anticuerpos Anti-NRPl Todos los estudios fueron se llevaron a cabo de acuerdo con la guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, publicada por la NIH (Publicación NIH 85—23, revisada en 1985) . Un Comité Institucional del Cuidado y Uso de Animales (IACUC) aprobó todos los protocolos de animales.
Los estudios se llevaron a cabo con los siguientes modelos de tumor humanos utilizando técnicas estandarizadas: LS174t, A549, H1299, MV522, MDA-MB231, HT29, SK ES. Células de tumor humano fueron implantadas subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón de prueba. Por ejemplo, para H1299, xenoinjertos fueron iniciados de células de carcinoma de pulmón de célula no pequeña humana H1299 cultivadas (cultivadas a fase logarítmica media en medio RPMI-1640 que contiene suero bovino fetal desactivado térmicamente al 10%, 100 unidades/ml de penicilina G, 100 pg/ml de sulfato de estreptomicina, 0.25 yg/ml de anfotericina B,' piruvato de sodio 1 mM, glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, bicarbonato de sodio al 0.075% y 25 pg/ml de gentamicina) o de células de adenocarcinoma de pulmón humanos A549 (cultivadas en medio F12 de Ham modificado por Kaighn que contiene suero bovino fetal desactivado térmicamente al 10%, 100 unidades/ml de penicilina G, 100 ug/ml de sulfato de estreptomicina, 0.25 µ?/ml de anfotericina B, glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM y gentamicina de 25 ug/ml) . En el día de implante del tumor, células H1299' fueron cosechadas y resuspendidas en PBS a una concentración de 5 x 107 células/ml . Cada ratón de prueba recibió 1 x 107 células H1299 implantadas subcutáneamente en el flanco derecho. Para tumores A549, células A549 fueron resuspendidas en matriz Matrigel™ al 100% (BD Biosciences, San José, CA) a una concentración de 5 x 107 células/ml. Células A549 (1 x 107 en 0.2 mi) fueron implantadas subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón de prueba y el crecimiento del tumor fue monitoreado. Como un ejemplo alternativo, un fragmento de un tumor LXFA629 fue implantado al flanco derecho de cada ratón de prueba y el crecimiento del tumor fue monitoreado.
El crecimiento del tumor fue monitoreado a medida que el tamaño promedio se aproximó a 120-180 mm3. En el dia de estudio 1, los tamaños de tumor individuales variaron de 126 a 196 mm3 y los animales fueron clasificados por tamaño de tumor en tres grupos de prueba (un grupo testigo y dos grupos de tratamiento) . El volumen del tumor fue calculado utilizando la fórmula : Volumen de tumor (mm3) = = (w2 x 1)72 en donde w = ancho y 1 = longitud en mm del tumor. Todos los tratamientos fueron administrados intra-peritonealmente . Los tumores fueron tratados dos veces a la semana por hasta 10-20 semanas con 5-10 mg/kg cada uno de anticuerpo testigo, un agente que bloquea la actividad VEGF-A (anticuerpo anti-VEGF-A B20-4.1 a 5 mg/kg) o la combinación de un agente que bloquea la actividad de VEGF-A y un agente que bloque la actividad de NRP1 (anticuerpo anti-NRPl a 10 mg/kg) . Para el grupo de tratamiento de combinación, el anticuerpo anti-NRPl fue administrado no más tarde de treinta minutos después de la administración del anticuerpo anti-VEGF-A. Cada dosis fue administrada en un volumen de 0.2 mi por 20 gramos de peso corporal (10 ml/kg) y fue escalada al peso corporal del animal .
El volumen del tumor fue registrado dos veces a la semana utilizando calibradores. Cada animal fue sometido a eutanasia cuando su tumor llegó al tamaño de punto final (en general 1000 mm3) o en la conclusión del estudio, lo que suceda primero.
El tiempo al punto final (TTE) fue calculado de la siguiente ecuación: TTE (días) = (logio (volumen de punto final, mm3 - b) / m en donde b es la intersección y m es la pendiente de la linea obtenida mediante regresión lineal de conjuntos de datos de crecimiento de tumor transformados a logaritmo: Se asignó a los animales que alcanzaron el punto final un valor de TTE igual al último día del estudio. Los animales clasificados como muertes NTR (no relacionadas con el tratamiento) debido a accidente (NTRa) o debido a causas desconocidas (NTRu) fueron excluidos de los cálculos de TTE (y todos los análisis adicionales) . Se asignó a los animales clasificados como muertes TR (relacionadas con el tratamiento) o NTRm (muerte no relacionada con el tratamiento debida a metástasis) un valor de TTE igual al día de la muerte. Los tumores fueron cosechados y ya sea fijados de la noche a la mañana en NBF al 10%, seguido por etanol al 70% y subsecuente imbibición en parafina o en el transcurso de dos minutos congelados en nitrógeno liquido para almacenamiento subsecuente a -80°C.
El resultado de tratamiento fue evaluado mediante retardo del crecimiento del tumor retardo (TGD) , que es definido como el incremento en el tiempo medio al punto final (TTE) en un grupo de tratamiento en comparación con el grupo testigo, que fue calculado como sigue: TGD = T - C, expresado en dias o como porcentaje del TTE medio del grupo de control, que fue calculado como sigue: %TGD = [ (T - C) / C] x 100, en donde T = TTE promedio para un grupo de tratamiento y C = TTE promedio para el grupo testigo.
El A%TGD fue calculado como antes, con C = grupo testigo siendo el grupo que recibe el tratamiento anti-VEGF-A solo y T = grupo de tratamiento siendo el grupo que recibe la combinación de tratamiento anti-VEGF-? y anti-NRPl. La prueba logrank fue empleada para analizar el significado de la diferencia entre los valores de TTE de dos grupos. Análisis estadísticos de dos colas se llevaron a cabo a un nivel significativo p = 0.05. Un valor de "1" indica que el tratamiento dio como resultado un retardo adicional en avance del tumor. Un valor de "0" indica que el tratamiento no dio como resultado retardo adicional en avance del tumor.
El tratamiento con la combinación de anticuerpo anti-NRPl y anticuerpo anti-VEGF-A dio como resultado retardo adicional en avance del tumor en tumores DA-MB231, HT29, SKMES y H1299, en comparación con el tratamiento anti-VEGF solo ( Figura 1 ) .
Ejemplo 4. Identificación de biomarcadores en cuanto a eficacia de tratamiento de anticuerpo anti-NRPl El análisis . de expresión genética fue efectuado utilizando qRT-PCR en muestras de tumor congeladas obtenidas de los experimentos de modelo de tumor descritos anteriormente en el Ejemplo 3. Del material congelado, pequeños cubos de longitud lateral de 3 mm máximo fueron solubilizados utilizando reactivos y equipo disponible comercialmente (RNeasy®, Tissuelyzer, ambos de Qiagen Inc, Alemania) . Después de purificación de columna, el ARN fue eluido con H20, precipitado con etanol después de la adición de glicógeno y acetato de sodio. El ARN fue aglomerado o convertido en pelotillas mediante centrifugación por al menos 30 minutos, lavado dos veces con etanol al 80% y la pelotilla resuspendida en H20 después del secado. Las concentraciones de ARN fueron determinadas utilizando un espectrofotómetro o un bioanalizador (Agilent, Foster City, CA) y 50 ng de ARN total usados por reacción en el análisis de expresión genética subsecuente.
Conjuntos de cebador y sonda específicos de gen resumidos en el Ejemplo 1 anteriormente fueron usados para el análisis de expresión de qRT-PCR de 18SrRNA, humano y de ratón RPS13 (gen de mantenimiento), NRPl (forma de transmembrana solamente y forma de transmembrana y soluble) , Sema3A, Sema3B, Sema3F, P1GF, TGFpi, HGF, Bv8 , RGS5 , Proxl, CSF2, · LGALS1 , LGALS7 y ITGa5.
Los niveles de expresión relativos de NRPl, Sema3A, Sema3B, Sema3F, P1GF, TGFpl, HGF, Bv8, RGS5, Proxl, CSF2, LGALS1, LGALS7 y ITGa5 fueron determinados. Por ejemplo, el nivel de expresión relativo de NRPl fue calculado como sigue: Expresión relativa de NRPl muestra = 2 exp (Ct i dBsrRN +RPsi3) 2] - Ct RPi ) con Ct determinado en la muestra, en donde Ct es el ciclo de umbral. El Ct es el número de ciclo al cual la fluorescencia generada dentro de una reacción cruza la línea de umbral..
Para permitir la comparación de resultados de diferentes platos de reacción, la expresión relativa fue luego calculada como fracción a la expresión relativa a un ARN de referencia interno que fue idéntico en todas las corridas experimentales, multiplicada por 100: Expresión relativa normalizada de NRP1 muestra = (expresión relativa de NRP1 muestra / expresión relativa de NRP1 ftR de referencia) x 100, en donde la expresión relativa de NRPl ARN de referencia — 2 exp (Ct [(18SrR A+RPsi3) /2] _ Ct NRPI ) con Ct determinado en el ARN de referencia.
Utilizando este cálculo, las muestras que tuvieron cualquier señal en la reacción de qRT-PCR tuvieron valores mayores de "1", muestras con valores menores de "1" fueron clasificadas como "negativas" para el analito particular.
Los valores p- y r- para la correlación de la expresión de ARN de marcador (qPCR) y eficacia de tratamiento de combinación son mostrados en la Figura 2.
Los resultados del análisis de expresión genética son mostrados en las Figuras 3-15. En cada una de las Figuras 3-15, la expresión relativa del gen analizado es comparada con el porcentaje de cambio en retardo de crecimiento del tumor (A%TGD) exhibido por los siete modelos de tumor diferentes examinados .
Los modelos de tumor que respondieron al tratamiento con el anticuerpo anti-NRPl en combinación con el anticuerpo anti-VEGF-A expresaron niveles más altos de ???ß?, Bv8, Sema3A, P1GF, LGALS1, ITGa5 y CSF2 en comparación con modelos de tumor que no respondieron al tratamiento de combinación (véanse Figuras 3-9) .
Los modelos de tumor sensibles al tratamiento de combinación con anticuerpo anti-NRPl y anticuerpo anti-VEGF-A también expresaron niveles más bajos de Proxl, RGS5, HGF, Sema3B, Sema3F y LGALS7 en comparación con los modelos de tumor que no respondieron al tratamiento de combinación (véanse Figuras 10-15) .
Ejemplo 5 Actividades inhibidoras de tumor de anticuerpos anti-VEGF-C Todos los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con la guia para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, publicada por la NIH (Publicación de NIH 85—23, revisada en 1985) . Un Comité Institucional del Cuidado y Uso de Animales (IACUC) aprobó todos los protocolos de animales.
Los estudios se llevaron a cabo con los siguientes modelos, de tumor humanos utilizando técnicas estandarizadas: A549, MDA-MB231, H460, BxPC3, DLD-1, HT29, SK ES, MV522 y.PC3. Células de tumor humano fueron implantadas subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón de prueba. Por ejemplo, para A549, xenoinjertos fueron iniciados de células de carcinoma de pulmón de célula no pequeña humana A549 cultivadas (cultivadas a la fase media logarítmica en medio RPMI-1640 que contiene suero bovino fetal desactivado térmicamente al 10%, 100 unidades/ml de penicilina G, 100 yg/ml de sulfato de estreptomicina, 0.25 µg ml de anfotericina B, piruvato de sodio 1 m , glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, bicarbonato de sodio al 0.075% y 25 µg/ml de gentamicina) o de células de carcinoma de pulmón humano A549 (cultivadas en medio de Ham F12 modificado por Kaighn que contiene suero bovino fetal desactivado térmicamente al 10%, 100 unidades/ml de penicilina G, 100 ug/ml de sulfato de estreptomicina, 0.25 pg/ml de anfotericina B, glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM y 25 g/ml de gentamicina). En el día de implante del tumor, células A549 fueron cosechadas y resuspendidas en PBS a una concentración de 5 x 107 células/ml. Cada ratón de prueba recibió 1 x 107 células de tumor A549 implantadas subcutáneamente en el flanco derecho. Para tumores A549, células A549 fueron resuspendida en matriz de Matrigel™ al 100% (BD Biosciences, San José, CA) a una concentración de 5 x 107 células/ml. Células A549 (1 x 107 en 0.2 mi) fueron implantadas subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón de prueba y el crecimiento del tumor fue monitoreado .
El crecimiento del tumor fue monitoreado a medida que el tamaño promedio se aproximó a 120-180 mm3. En el dia de estudio 1, los tamaños de tumores individuales variaron de 126 a 196 mm3 y los animales fueron clasificados por tamaño de tumor en tres grupos de prueba (un grupo testigo y dos grupos de tratamiento) . El volumen de tumor fue calculado utilizando la fórmula: Volumen de tumor (mm3) = = (w2 x 1) /2 en donde w = ancho y 1 = longitud en 'mm del tumor.
Todos ¦ los tratamientos fueron administrados' intra-peritonealmente . Los tumores fueron tratados dos veces a la semana por hasta 10-20 semanas con 5-10 mg/kg cada uno de anticuerpo testigo, un agente que bloquea la actividad VEGF-A (anticuerpo anti-VEGF-A B20-4.1 a 5 mg/kg) o la combinación de un agente que bloquea la actividad de VEGF-A y un agente que bloquea la actividad de VEGF-C (anticuerpo anti-VEGF-C a 10 mg/kg) . Para el grupo de tratamiento combinado, el anticuerpo anti-VEGF-C fue administrado no más tarde de treinta minutos después de la administración del anticuerpo anti-VEGF-A. Cada dosis fue administrada en un volumen de 0.2 mi por 20 gramos de peso corporal (10 ml/kg) y fue escalada al peso corporal del animal .
El volumen del tumor fue registrado dos veces a la semana utilizando calibradores. Cada animal fue eutanizado cuando su tumor llegó a su tamaño de punto final (en general 1000 mm3) o en la conclusión del estudio, lo que ocurra primero Los tumores fueron cosechados y ya sea fijados de la noche a la mañana en NBF al 10%, seguido por etanol al 70% y subsecuente imbibición en parafina o en el transcurso de dos minutos congelados en nitrógeno líquido para almacenamiento subsecuente a -80°C. ' El tiempo al punto final (TTE) fue calculado de la siguiente ecuación: TTE (días) = (log10 (volumen de punto final, mm3 - b) / m en donde b es la intersección y m es la pendiente de la línea obtenida mediante regresión lineal de un conjunto de datos de crecimiento de tumor transformados a logaritmo.
Se asignó a los animales que llegaron al punto final un valor de TTE igual al último día del estudio. Los animales clasificados como muertes NTR (no relacionadas con el tratamiento) debido a accidente (NTRa) o debido a causas desconocidas (NTRu) fueron excluidos de los cálculos de TTE (y todos los análisis adicionales). Se asignó a los animales clasificados como muerte TR (relacionada con el tratamiento) o NTRm (muerte no relacionada con el tratamiento debida a metástasis) un valor de TTE igual al día de la muerte.
El resultado del tratamiento fue evaluado mediante el retardo del crecimiento del tumor (TGD) , que es definido como el incremento en el tiempo promedio al punto final (TTE) en un grupo de tratamiento en comparación el grupo testigo, que fue calculado como sigue: TGD = T - C, expresado en días o como porcentaje del TTE promedio del grupo testigo, que fue calculado como sigue: %TGD = [ (T - C) / C] x 100, en donde T = TTE medio para un grupo de tratamiento y C = TTE promedio para el grupo testigo.
El A%TGD fue calculado como antes, con C = grupo testigo siendo el grupo que recibe el tratamiento de anticuerpo anti-VEGF-A solo y T = grupo de tratamiento siendo el grupo que recibe la combinación de anticuerpo anti-VEGF-A y tratamiento de anticuerpo anti-VEGF-C. La prueba logrank fue empleada para analizar el significado de la diferencia entre los valores de TTE de dos grupos. Análisis estadísticos de dos colas se llevaron a cabo a un nivel significado p = 0.05. Un valor de "1" indica que el tratamiento dio como resultado retardo adicional en avance del tumor. Un valor de "0" indica que el tratamiento no dio como resultado retardo adicional en avance del tumor.
El tratamiento con la combinación de anticuerpo anti-VEGF-C y anticuerpo anti-VEGF-A dio como resultado retardo adicional en avance del tumor en tumores A549 y H460, en comparación con el tratamiento de anticuerpo anti-VEGF-A solo (Figura 16) .
Ejemplo 6. Identificación de biomarcadores para la eficacia de tratamiento de anticuerpo anti-VEGF-C El análisis de expresión genética fue efectuado utilizando qRT-PCR en muestras de tumor congeladas obtenidas de los experimentos de modelo de tumor descritos anteriormente en el Ejemplo 5. Del material congelado, cubos pequeños de 3 mm de longitud lateral máxima fueron solubilizados utilizando reactivos y equipo disponibles comercialmente (RNeasy®, Tissuelyzer, ambos de Qiagen Inc., Alemania) . Después de la purificación de columna el ARN fue eluido con H20, precipitado con etanol después de la adición de glicógeno y acetato de sodio. El ARN fue aglomerado o convertido en pelotillas mediante centrifugación por al menos 30 minutos, lavado dos veces con etanol al 80% y la pelotilla resuspendida en H20 después del secado. Las concentraciones de ARN fueron determinadas utilizando un espectrofotómetro o un bioanalizador (Agilent, Foster City, CA) y 50 ng de ARN total usados por reacción en el análisis de expresión genética subsecuente.
Conjuntos de cebador y sonda específicos de gen fueron designados para análisis de expresión de qRT-PCR de 18SrRNA, RPS13 humano y de ratón (gen de mantenimiento) , VEGF-C, VEGF-A, VEGF-D, VEGFR3 , FGF2, CSF2, ICAM1, RGS5/CDH5, ESM1, Proxl, P1GF, ITGa5 y TGF-ß. Las secuencias de conjunto de cebador y sonda son enlistadas en la Tabla 2.
Los niveles de expresión relativos de VEGF-C, VEGF-A, VEGF-D, VEGFR3, FGF2, CS-F2 , ICAM1, RGS5/CDH5 , ESM1, Proxl, P1GF, ITGa5 y TGF-ß fueron determinados. Por ejemplo, el nivel de expresión relativo de VEGF-C fue calculado como sigue: Expresión relativa de VEGF-C muestra = 2 exp (Ct [ <i8srR A+RPsi3) /2] ~ Ct VEGF-C) con Ct determinado en la muestra, en donde Ct es el ciclo de umbral. Ct es el número de ciclo al cual la fluorescencia generada dentro de una reacción cruza la línea de umbral.
Para permitir la comparación de resultados de diferentes placas de reacción, la expresión relativa fue luego calculada como una fracción a la expresión relativa a un ARN de referencia interno que fue idéntico en todas las corridas experimentales, multiplicado por 100: Expresión relativa normalizada de VEGF-C muestra = (expresión relativa de VEGF-C muestra / expresión relativa de VEGF-C ARN de referencia) 100, en donde la expresión relativa de VEGF-C ARN de referencia = 2 exp (Ct [ (18SrRNA+RPS13) /2] ~ Ct VEGF-c) COn Ct determinado en el ARN de referencia.
Utilizando este cálculo, las muestras que tuvieron cualquier señal en la reacción de qRT-PCR tuvieron valores mayores de "1", las muestras con valores menores de "1" fueron clasificadas como "negativas" para el analito particular.
Los valores p- y r- para la correlación de la expresión de ARN marcador (qPCR) y eficacia de tratamiento de combinación son mostrados en la Figura 17.
Los resultados del análisis de expresión genética son mostrados en las Figuras 18-30. En cada una de las Figuras 18-30, la expresión relativa del gen analizado es comparada con el porcentaje de cambio en el retardo de crecimiento del tumor (A%TGD) exhibido por los siete modelos de tumor diferente examinados. Los modelos de tumor que respondieron al tratamiento con el anticuerpo anti-VEGF-C en combinación con el anticuerpo anti-VEGF-A expresaron niveles más altos de VEGF-C, VEGF-D, VEGFR3, FGF2 y RGS5/CDH5 en comparación con modelos de tumor que no respondieron al tratamiento de combinación (véanse Figuras 19-22 y 25) .
Los modelos de tumor sensibles al tratamiento de combinación con el anticuerpo anti-VEGF-C y anticuerpo anti-VEGF-A también expresaron niveles más bajos de VEGF-A, CSF2, Proxl, ICAM1, ESM1, PlGF, ITGa5 y TGFp en comparación con los modelos de tumor que no respondieron al tratamiento de combinación (véanse Figuras 18, 23-24 y 26-30).
Ejemplo 7. Actividades Inhibidoras de Tumor de Anticuerpos Anti-EGFL7 Todos los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con la guia para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, publicada por la NIH (Publicación NIH 85-23, revisada en 1985) . Un Comité Institucional del Cuidado y Uso de Animales (IACUC) aprobó todos los protocolos de animales.
Los estudios se llevaron a cabo con los siguientes modelos de tumor humano utilizando técnicas estandarizadas: A549, MDA-MB231, H460, BxPC3, SKMES, SW620, H1299, MV522 y PC3. Células de tumor humano fueron implantadas subcutáneamente en él flanco derecho de cada ratón de prueba. Por ejemplo, para A549, xenoinjertos fueron iniciados de células de carcinoma de pulmón de célula no pequeña humana A549 cultivadas (cultivadas a la fase media logarítmica en. medio RP I-1640 qué contiene suero bovino fetal desactivado térmicamente al 10%, 100 unidades/ml de penicilina G, 100 g/ml de sulfato de estreptomicina, 0.25 g/ml de anfotericina B, piruvato de sodio 1 m , glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, bicarbonato de sodio al 0.075% y 25 µ?/??? de gentamicina) o de células de adenocarcinoma de pulmón humano A549 (cultivadas en medio de Ham F12 modificado por Kaighn que contiene suero bovino fetal desactivado térmicamente al 10%, 100 unidades/ml de penicilina G, 100 g/ml de sulfato de estreptomicina, 0.25 g/ml de anfotericina B, glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM y 25 ug/ml de gentamicina) . En el día de implante del tumor, células A549 fueron cosechadas y resuspendidas en PBS a una concentración de 5 x 107 células/ml. Cada ratón de prueba recibió 1 x 107 células de tumor A549 implantadas subcutáneamente en el flanco derecho. Para tumores A549, células A549 fueron resuspendidas en matriz de Matrigel™ al 100% (BD Biosciences, San José, CA) a una concentración de 5 x 107 células/ml. células A549 (1 x 107 en' 0.2 mi) fueron implantadas subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón de prueba y el crecimiento del tumor fue monitoreado.
El crecimiento del tumor fue monitoreado a medida que el tamaño promedio se aproximó a 120-180 mm3. En el día de estudio 1, los tamaños de tumor individuales variaron de 126 a 196 mm3 y los animales fueron clasificados por tamaño de tumor en tres grupos de prueba (un grupo testigo y dos grupos de tratamiento) . El volumen de tumor fue calculado utilizando la fórmula : Volumen de tumor (rara3) = (w2. x l)/2 en donde w = ancho y 1 = longitud en mm del tumor.
Todos los tratamientos fueron administrados intra-peritonealmente . Los tumores fueron tratados dos veces, a la semana por hasta 10-20 semanas con 5-10 mg/kg cada uno de anticuerpo testigo, un agente que bloquea la actividad de VEGF-A (anticuerpo anti-VEGF-A B20-4.1 a 5 mg/kg) o la combinación de un agente que bloquea la actividad de VEGF-A y un agente que bloquea la actividad de EGFL7 (anticuerpo anti-EGFL7 a 10 mg/kg) . Para el grupo de tratamiento de combinación, el anticuerpo anti-EGFL7 fue administrado no más tarde de treinta minutos después de administración del anticuerpo anti-VEGF-A. Cada dosis fue administrada en un volumen de 0.2 mi por 20 gramos de peso corporal (10. ml/kg) y fue escalada el peso corporal del animal.
El volumen de tumor fue registrado dos veces a la semana utilizando calibradores. Cada animal fue eutanizado cuando su tumor llegó al tamaño de punto final (en general 1000 mm3) o en la conclusión del estudio, lo que ocurra primero. Los tumores fueron cosechados y fijados ya sea de la noche a la mañana en NBF al 10%, seguido por etanol al 70% e imbibición subsecuente en parafina o en el transcurso de de dos minutos congelados en nitrógeno líquido para almacenamiento subsecuente a -80°C.
El tiempo al punto final (TTE) fue calculado de la siguiente ecuación: TTE (días) = (logio (volumen de punto final, mm3 - b) / m · en donde b es la intersección y m es la pendiente de la linea obtenida mediante regresión lineal de un conjunto de datos de crecimiento de tumor transformados a logaritmo.
Se asignó a los animales que llegaron al punto final un valor de TTE igual al último dia del estudio. Los animales clasificados como muertes NTR (no relacionadas con el tratamiento) debido a accidente (NTRa) o debido a causas desconocidas (NTRu) fueron excluidos de los cálculos de TTE (y de todos, los análisis adicionales). Se asignó a los animales clasificados como muertes TR (relacionadas con el tratamiento) o NTRm (muerte no relacionada con el tratamiento debida a metástasis) un valor de TTE igual al día de la muerte.
El resultado del tratamiento fue evaluado por retardo del crecimiento del tumor (TGD) , que es definido como el incremento en el tiempo promedio al punto final (TTE) en un grupo de tratamiento en comparación con el grupo testigo, que fue calculado como sigue: TGD = T - C, expresado en días o como porcentaje de TTE promedio del grupo testigo, que fue calculado como sigue: %TGD = [ (T - C) / C] x 100, en donde T = TTE promedio para un grupo de tratamiento y C = TTE promedio para el grupo testigo.
El A%TGD fue calculado como anteriormente, con C = grupo testigo siendo el grupo que recibe el tratamiento de anticuerpo anti-VEGF-A solo y T = grupo de tratamiento siendo el grupo que recibe la combinación de tratamiento de anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C. La prueba de logrank fue empleada para analizar el significado de la diferencia entre los valores de TTE de dos grupos. Se llevaron a cabo análisis estadísticos de dos colas a un nivel significado p= 0.05. Un valor de "1" indica que el tratamiento dio como resultado retardo adicional en avance del tumor. Un valor de "0" indica que el tratamiento no dio como resultado retardo adicional en avance del tumor.
El tratamiento con la combinación de anticuerpo anti-EGFL7 y anticuerpo anti-VEGF-A dio como resultado retardo adicional en avance del tumor en tumores MDA-MB231, H460 y H1299, en comparación con el tratamiento de anticuerpo anti-VEGF-A solo (Figura 31) .
Ejemplo 8. Identi icación de biomarcadores en cuanto a eficacia de tratamiento de anticuerpo anti-EGFL7 El análisis de expresión genética fue efectuado utilizando qRT-PCR sobre muestras de tumor congeladas obtenidas de los experimentos de modelo de tumor descritos anteriormente en el Ejemplo 7. Del material congelado, cubos pequeños de longitud lateral máxima de 3 mm fueron solubilizados utilizando reactivos y equipo disponibles comercialmente (RNeasy®, TrssueLyzer, ambos de Qiagen Inc., Alemania). Después de purificación en columna el ARN fue eluido con H20, precipitado con etanol después de la adición- de glicógeno y acetato de sodio. El ARN fue aglomerado o convertido en pelotillas mediante centrifugación por al menos 30 minutos, lavado dos veces con etanol al 80% y la pelotilla resuspendida .en H20 después del secado. Las concentraciones de ARN fueron determinadas utilizando un espectrofotómetro o bioanalizador (Agilent, Foster City, · CA) y 50 ng de ARN total usados por reacción en el análisis de expresión genética subsecuenté.
Los conjuntos de cebador y sonda específicos de gen fueron designados para análisis de expresión de qRT-PCR de 18SrRNA, RPS13 humano y de ratón (gen de mantenimiento) , c et, Sema3B, FGF9, FN1, HGF, MFAP5, EFEMP2 / fibulin4 , VEGF-C, RGS5 , NRP1, FBLN2, FGF2, CSF2, PDGF-C, BV8, CXCR4 y TNFa. Las secuencias del conjunto de cebador y sonda son enlistadas en la Tabla 2.
Niveles de expresión relativa de cMet, Sema3B, FGF9, FN1, HGF, MFAP5, EFEMP2/fibulin , VEGF-C, RGS5, NRP1, FBLN2, FGF2, CSF2, PDGF-C, BV8 , CXCR4 y TNFa fueron determinados. Por ejemplo, el nivel de expresión relativa de VEGF-C fue calculado como sigue: Expresión relativa de VEGF-C muestra = 2 exp (Ct [d8SrRNA+RPsi3) 2] - Ct vEGF-c) con Ct determinado en la muestra, en donde Ct es el ciclo de umbral. El Ct es el número de ciclo al cual la fluorescencia generada dentro de una reacción cruza la linea de umbral.
Para permitir la comparación de resultados de diferentes placas de reacción, la expresión . relativa fue luego calculada como una fracción a la expresión relativa a un ARN de referencia interno que fue idéntico en todas las corridas experimentales, multiplicado por 100: Expresión relativa normalizada VEGF-C muestra (expresión relativa de VEGF-C muestra / expresión relativa de VEGF-C ARN de referencia) x 100, en donde la expresión relativa de VEGF-C AR de referencia = 2 exp (Ct [ (18SrRN¾+RPS13) /2] ~ Ct VEGF-C) COn Ct determinado en el ARN de referencia.
Utilizando este cálculo, las muestras que tuvieron alguna señal en la reacción de qRT-PCR tuvieron valores mayores de "1", muestras con valores menores de "1" fueron clasificadas como "negativas" para el analito particular.
Los valores de p- y r- para la correlación de expresión de ARN marcador (qPCR) y eficacia de tratamiento de combinación son mostrados en la Figura 32.
Los resultados del análisis de expresión genética son mostrados en las Figuras 33-49. En cada una de las Figuras 33-49, la expresión relativa del gen analizado es comparada con el porcentaje de cambio en retardo de crecimiento del tumor (A%TGD) exhibido por los nueve modelos de tumor diferentes examinados. Los modelos de tumor que respondieron al tratamiento con anticuerpo anti-EGFL7 en combinación con anticuerpo anti-VEGF-A expresaron niveles más altos de VEGF-C, BV8, CSF2 y TNFa en comparación con modelos de tumor que no respondieron al tratamiento de combinación (véanse Figuras 36, 40, 41 y 43) .
Los modelos de tumor sensibles al tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-C y anticuerpo anti-EGFL7 también expresaron niveles más bajos de Sema3B, FGF9, HGF, RGS5 , NRP1, FGF2, CXCR4 , cMet, F 1 , Fibulin 2, Fibulin4, MFAP5, PDGF-C y Sema3F en comparación con los modelos de tumor que no respondieron al tratamiento de combinación (véanse Figuras 33-35, 37-39, 42 y 44-49) .
Ejemplo 9. Actividades Inhibidoras de Tumor de Anticuerpos Anti-NRPl Todos los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con la guia del Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, publicada por la NIH (Publicación NIH 85-23, revisada en 1985) . Un Comité Institucional del Cuidado y Uso de Animales (IACUC) aprobó todos los protocolos de animales Los estudios se llevaron a cabo con los siguientes modelos de tumor humanos utilizando técnicas estandarizadas: MDA-MB231, H1299, SKMES, HT29, 1050489, A2780, U87MG, MV522, LS174t, A549 y Caki-2. Las células de tumor humano fueron implantadas subcutáneamente en. el flanco derecho de cada ratón de prueba. Por ejemplo, para H1299, xenoinjertos fueron iniciados de células de carcinoma de pulmón de célula no pequeña humanas H1299 cultivadas (cultivadas a la fase media logarítmica en medio RPMI-1640 que contiene suero bovino fetal desactivado térmicamente al 10%, 100 unidades/ml de penicilina G, 100 g/ml de sulfato de estreptomicina, 0.25 µ?/p?? de anfotericina B, piruvato de sodio 1 mM, glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, bicarbonato de sodio al 0.075% y 25 µ9/p?1 de gentamicina) o de células de adenocarcinoma de pulmón humano A549 (cultivadas en medio de Ham F12 modificado por Kaighn que contiene suero bovino fetal desactivado térmicamente al 10%, 100 unidades/ml de penicilina G, 100 g/ml de sulfato de estreptomicina, 0.25 µg/ml de anfotericina B, glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM y 25 yg/ml de gentamicina) . En el día de implante del tumor, células H1299 fueron cosechados y resuspendidas en PBS a una concentración de 5 x 107 células/ml. Cada ratón de prueba recibió 1 x 107 células de tumor H1299 implantadas subcutáneamente en el flanco derecho. Para tumores A549, células A549 fueron resuspendida en matriz de Matrigel™ al 100% (BD Biosciences, San José, CA) a una concentración de 5 x 107 células/ml. Células A549 (1 x 107 en 0.2 mi) fueron implantadas subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón de prueba y el crecimiento del tumor fue monitoreado . Como otro ejemplo, un fragmento de un tumor 1050489 fue implantado al flanco derecho de cada ratón de prueba y el crecimiento del tumor fue monitoreado.
El crecimiento del tumor fue monitoreado a medida que el tamaño promedio se aproximó a 120-180 mm3. En el dia de estudio 1, los tamaños de tumor individuales variaron de 126 a 196 mm3 y los animales fueron clasificados por tamaño de tumor en tres grupos de prueba (un grupo testigo y dos grupos de tratamiento) . El volumen de tumor fue calculado utilizando la fórmula : Volumen del tumor (mm3) = - (w2 x l)/2 en donde w = ancho y 1 = longitud en mm del tumor. Todos los tratamientos fueron administrados intra-peritonealmente . Los tumores fueron tratados dos veces a. la semana por hasta 10-20 semanas con 5-10 mg/kg cada uno de anticuerpo testigo, un agente que bloquea la actividad de VEGF-A (anticuerpo . anti-VEGF-A B20-4.1 a 5 mg/kg) o la combinación de un agente que bloquea la actividad de VEGF-A y un agente que bloquea la actividad de NRP1 (anticuerpo anti-NRPl a 10 mg/kg) . Para el grupo de tratamiento de combinación, el anticuerpo anti-NRPl fue administrado no más tarde de treinta minutos después de la administración del anticuerpo anti-VEGF-A. Cada dosis fue administrada en un volumen de 0.2 mi por 20 gramos de peso corporal (10 ml/kg) y fue escalada al peso corporal del animal .
El volumen del tumor fue registrado dos veces a la semana utilizando calibradores. Cada animal fue eutanizado cuando su tumor llegó al tamaño de punto final (en general 1000 mm ) o en la conclusión del estudio, lo que ocurra primero.
El tiempo al punto final (TTE) fue calculado de la' siguiente ecuación: TTE (días) = (logio (volumen de punto final, mm3 - b) en donde b es la intersección y m es la pendiente de la linea obtenida mediante regresión lineal de un conjunto de datos de crecimiento de tumor transformados a logaritmo.
Se asignó a los animales que llegaron al punto final fueron un valor de TTE igual al último dia del estudio. Los animales clasificados como muertes NTR (no relacionadas con el tratamiento) debido a accidente (NTRa) o debido a causas desconocidas (NTRu) fueron excluidos de los cálculos de TTE (y todos los análisis adicionales) . Se asignó a los animales clasificados como muertes TR (relacionadas con el tratamiento) o NTRm (muerte no relacionada con el tratamiento debida a metástasis) un valor de TTE igual al dia de la muerte. Los tumores fueron cosechados y ya sea fijados de la noche a la mañana en NBF al 10%, seguido por etanol al 70% y subsecuente imbibición en parafina o en el transcurso de dos minutos congelados en nitrógeno liquido para almacenamiento subsecuente a -80°C.
El resultado del tratamiento fue evaluado mediante retardo de crecimiento del tumor (TGD) , que es definido como el incremento en el tiempo promedio al punto final (TTE) en un grupo de tratamiento en comparación con el grupo testigo, que fue calculado como sigue: TGD = T - C, expresado en días o como porcentaje del TTE promedio del grupo testigo, que fue calculado como sigue: %TGD = [ (T - C) / C] x 100, en donde T = TTE promedio para un grupo de tratamiento y C = TTE promedio para el grupo testigo.
El A%TGD fue calculado como antes, con C = grupo testigo siendo el grupo que recibe el tratamiento anti-VEGF-A solo y T = grupo de tratamiento siendo el grupo que recibe la combinación de tratamiento anti-VEGF-A y anti-NRPl. La prueba de logrank fue empleada para analizar el significado de la diferencia entre los valores de TTE de dos grupos. Análisis estadísticos de dos colas se llevaron a cabo a un nivel significado p = 0.05. Un valor de "1" indica que el tratamiento dio como resultado un retardo adicional en avance del tumor. Un valor de "0" indica que el tratamiento no dio como resultado retardo adicional en avance del tumor.
El tratamiento con la combinación de anticuerpo anti-NRPl y anticuerpo anti-VEGF-A dio como resultado retardo adicional en el avance del tumor en tumores MDA-MB231, H1299, SKMES, HT29, 1050489, A2780 y U87MG, en comparación con el tratamiento anti-VEGF solo (Figura 50).
Ejemplo 10. Identificación de biomarcadores en cuanto a eficacia del tratamiento de anticuerpo anti-NRPl El análisis de expresión genética fue efectuado utilizando qRT-PCR sobre muestras de tumor congeladas obtenidas de los experimentos de modelo de tumor descritos anteriormente en el Ejemplo 9. Del material congelado, cubos pequeños de longitud lateral máxima de 3 mm fueron solubilizados utilizando reactivos y equipos disponibles comercialmente (RNeasy®, Tissuelyzer, ambos de Qiagen Inc, Alemania) . Después de purificación de columna el ARN fue eluido con H20, precipitado con etanol después de la adición de glicógeno y acetato de sodio. El ARN fue aglomerado o convertido en pelotillas mediante centrifugación por al menos 30 minutos, lavado dos veces con etanol al 80% y la pelotilla resuspendida en H20 después del secado. Las concentraciones de ARN fueron determinadas utilizando un espectrofotómetro o un bioanalizador (Agilent, Foster City, CA) y 50 ng de ARN total usados por reacción en el análisis de expresión genética subsecuente.
Conjuntos de cebador y sonda especifico de gen resumidos en el Ejemplo 1 anteriormente fueron usados para el análisis de expresión de qRT-PCR de 18SrRNA, RPS13, HMBS, ACTB y SDHA (genes de mantenimiento) y SEMA3B, TGFBl, FGFR4, Vimentin, SE A3A, PLC, CXCL5 , ITGa5 , PLGF, CCL2, IGFBP4, LGALS1, HGF, TSP1, CXCL1, CXCL2 , Alkl y FGF8.
Los niveles de expresión relativa de SEMA3B, TGFB1, FGFR , Vimentin, SE A3A, PLC, CXCL5, ITGa5, PLGF, CCL2, IGFBP4 , LGALS1 , HGF, TSP1, CXCL1, CXCL2, Alkl y FGF8 fueron determinados. Por ejemplo, el nivel de expresión relativa de SEMA3B fue calculado como sigue: Expresión relativa de SEMA3B muestra = 2 exp (Ct [(??? + HK2 +HKX)/X] - Ct SEMA3B) ; en donde HK es un gen de mantenimiento (por ejemplo, 18sRNA, ACTB, RPS13, HMBS, SDHA oR UBC) y x es el' total número de genes de mantenimiento usados para normalizar los datos con Ct determinado en la. muestra, en donde Ct es el ciclo de umbral. El Ct es el número de ciclo al cual la fluorescencia generada dentro de una reacción cruza la linea de umbral.
Para permitir la comparación de resultados de diferentes placas de reacción, la expresión relativa fue luego calculada como fracción a la expresión relativa a un ARN de referencia interno que fue idéntico en todas las corridas experimentales: Expresión relativa normalizada de SEMA3B muestra = (expresión relativa SEMA3B muestra / expresión relativa de SEMA3B ARN de referencia) , en donde la expresión relativa de SEMA3B muestra = 2 exp (Ct [ (HKI+HK2 +HKX)/X] - Ct SEMA3B) con Ct determinada en el ARN de referencia.
Los valores p- y r- para la correlación de la expresión de ARN marcador (qPCR) y eficacia de tratamiento de combinación son mostrados en la Figura 51.
Los resultados del análisis de expresión genética son mostrados en las Figuras 52-69. En cada una de las Figuras 52-69, la expresión relativa del gen analizado es comparada con el porcentaje de cambio en el retardo de crecimiento dél tumor (A%TGD) exhibido por los siete modelos de tumor diferentes examinados .
Los modelos de tumor que respondieron al tratamiento con el anticuerpo anti-NRPl en combinación con anticuerpo anti-VEGF-A expresaron niveles más altos de TGF 1, Vimentin, Sema3A, CXCL5, ITGa5,. P1GF, CCL2 , LGALS1, CXCL2 , Alkl y FGF& en comparación con modelos de tumor que no respondieron al tratamiento de combinación (véanse Figuras 53, 55-56, 58-61, 63 y 66-69) .
Los modelos de tumor sensibles al tratamiento de combinación con anticuerpo anti-NRPl y anticuerpo anti-VEGF-A también expresaron niveles más bajos de Sema3B, FGRF4 , PLC, IGFB4, HGF y TSP1 en comparación con los modelos de tumor que no respondieron al tratamiento de combinación (véanse Figuras 52, 54, 57, 62 y.64-65 ) .
Ejemplo 11. Actividades de Inhibidoras de Tumor de Anticuerpos Anti-VEGF-C Todos los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con la guia para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, publicada por la NIH (Publicación NIH 85—23,' revisada en 1985) ·. Un Comité Institucional del Cuidado y Uso de Animales (IACUC) aprobó todos los protocolos de animales.
Se llevaron a cabo estudios con los siguientes modelos de tumor humanos utilizando técnicas estandarizadas: A549, MDA-MB231, H460, BxPC3, DLD-1 , HT29, SK ES, MV522, PC3, LXFE409, LXFL1674, LXFA629, LXFA737, LXFA1335, CXF243, CXF260, MAXF583, MEXF989, BXF1218, BXF1352 y SXF463. Células de tumor humanas fueron implantadas subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón de prueba. Por ejemplo, para A549, xenoinjertos fueron iniciados de células de carcinoma de pulmón de célula no pequeña humanas A549 cultivadas (cultivadas a la fase logarítmica en medio RPMI-1640 que contiene suero bovino fetal desactivado térmicamente al 10%, 100 unidades/ml de penicilina G, 100 g/ml de sulfato de estreptomicina, 0.25 g/ml de anfotericina B, piruvato de sodio 1 mM, glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, bicarbonato de sodio al 0.075% y 25 g/ml de gentamicina) o de células de adenocarcinoma de pulmón humanas A549 (cultivadas en medio de Ham F12 modificado por Kaighn que contiene suero bovino fetal desactivado térmicamente al 10%, 100 unidades/ml de penicilina G, 100 g/ml de sulfato de estreptomicina, 0.25 µ9/??1 de anfotericina B, glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM y 25 µg/ml de gentamicina) . En el día del implante del tumor, células A549 fueron cosechados y resuspendida en PBS a una concentración de 5 x 107 células/ml. 7 Cada ratón de prueba recibió 1 x 10 células de tumor A549 implantadas subcutáneamente en el flanco derecho. Para tumores A549, células A549 fueron resuspendidas en matriz de Matrigel™ al 100% (BD Biosciences, San José, CA) a una concentración de 5 x 107 células/ml. Células A549 (1 x 107 en 0.2 mi) fueron implantadas subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón de prueba y el crecimiento del tumor fue monitoreado. Como otro ejemplo, un fragmento de un tumor LXFA629 fue implantado al flanco derecho de cada ratón de prueba y el crecimiento del tumor fue monitoreado.
El crecimiento de tumor fue monitoreado a medida que el tamaño promedio se aproximó a 120-180 mm3. En el día de estudio 1, los tamaños de tumores individuales variaron de 126 a 196 mm3 y los animales fueron clasificados por tamaño de tumor en tres grupos de prueba (un grupo testigo y dos grupos de tratamiento) . El volumen del tumor fue calculado utilizando la fórmula: Volumen de tumor (mm3) = = (w2 x l)/2 en donde w = ancho y 1 = longitud en mm del tumor.
Todos los tratamientos fueron administrados intra-peritonealmente . Los tumores fueron tratados dos veces a la semana por hasta 10-20 semanas con 5-10 mg/kg cada uno de anticuerpo testigo, un agente que bloquea la actividad de VEGF-A (anticuerpo anti-VEGF-A B20-4.1 a 5 mg/kg) o la combinación de un agente que bloquea la actividad de VEGF-A y un agente que bloquea la actividad de VEGF-C (anticuerpo .anti-VEGF-C a 10 mg/kg. Para el grupo de tratamiento de combinación, el anticuerpo anti-VEGF-C fue administrado no más tarde de treinta minutos después de la administración del anticuerpo anti-VEGF-A Cada dosis fue administrada en un volumen de 0.2 mi por 20 gramos de peso corporal (10 ml/kg) y fue escalada al peso corporal del animal.
El volumen del tumor fue registrado dos veces a la semana utilizando calibradores. Cada animal fue eutanizado cuando su tumor llegó al tamaño de punto final (en general 1000 MI3) o en la conclusión del estudio, lo que ocurra primero. Los tumores fueron cosechados y ya sea fijados de la noche a la mañana en NBF al 10%, seguido por etanol al 70% e imbibición subsecuente en parafina o en el transcurso de dos minutos congelados en nitrógeno liquido para almacenamiento subsecuente a -80°C.
El tiempo al punto final (TTE) fue calculado de la siguiente ecuación: TTE (días) = (logio (volumen de punto final, mm3 - b) / m en donde b es la intersección y m es la pendiente de la línea obtenida mediante regresión lineal de un conjunto de datos de crecimiento del tumor transformados a logaritmo.
Se' asignó a los animales que llegaron al punto final un valor de TTE igual al último día del estudio. Los animales clasificados como muertes NTR (no relacionadas con el tratamiento) debido a accidente (NTRa) o debido a causas desconocidas (NTRu) fueron excluidos de los cálculos de TTE (y todos los análisis adicionales) . Se asignó a los animales clasificados como muertes TR (relacionada con el tratamiento) o NTRm (muerte no relacionada con el tratamiento debida a metástasis) un valor de TTE igual al día de la muerte.
El resultado del tratamiento fue evaluado por el retardo de crecimiento del tumor (TGD) , que es definido como el incremento en el tiempo promedio al punto final (TTE) en un grupo de tratamiento, en comparación con el grupo testigo, que fue calculado como sigue: TGD = T - C, expresado en días o como porcentaje del TTE promedio del grupo testigo, que fue calculado como sigue: %TGD = [ (T - C) / C] x 100,¦ en donde T = TTE promedio para, un grupo de tratamiento y C = TTE promedio para el grupo testigo.
El A%TGD fue calculado como antes, con C = grupo testigo siendo el grupo que recibe el tratamiento de anticuerpo anti-VEGF-A solo y T = grupo de tratamiento que es el grupo que recibe la combinación del tratamiento de anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C. La prueba logrank fue empleada para analizar el significado de la diferencia entre los valores de TTE de dos grupos. Análisis estadísticos de dos colas fueron llevados a cabo a un nivel significativo p = 0.05. Un valor de "1" indica que el tratamiento dio como resultado retardo adicional en avance del tumor. Un valor de "0" indica que el tratamiento no dio como resultado un retardo adicional en avance del tumor.
El tratamiento con la combinación de anticuerpo anti-VEGF-C y anticuerpo anti-VEGF-A dio como resultado retardo adicional en avance del tumor en tumores A549, H460, LXFA629, CXF243, BXF1218 y BXF1352, en comparación con el tratamiento de anticuerpo anti-VEGF-A solo (Figura 70) .
Ejemplo 12. Identificación de biomarcadores para eficacia de tratamiento de anticuerpo anti-VEGF-C El análisis de expresión genética fue efectuado utilizando qRT-PCR sobre muestras de tumor congeladas obtenidas de los experimentos de modelo de tumor descritos anteriormente en el Ejemplo 11. Del material congelado, cubos pequeños de longitud lateral máxima de 3 mm fueron solubilizados utilizando reactivos y equipo disponibles comercialmente (RNeasy®, Tissuelyzer, ambos de Qiagen Inc., Alemania). Después de la purificación de' columna el ARN fue eluido con H20, precipitado con etanol después de la adición de glicógeno y acetato de sodio. El ARN fue aglomerado o convertido en pelotillas mediante centrifugación por al menos 30 minutos, lavado dos veces con etanol al 80% y la pelotilla resuspendida en H20 después del secado. Las concentraciones de ARN fueron determinadas utilizando un espectrofotómetro o un bioanalizador (Agilent, Foster City, CA) y 50 ng de ARN total usados por reacción en el análisis de expresión genética subsecuente.
Conjuntos de cebador y sonda específicos de gen fueron designados para el análisis de expresión de qRT-PCR de 18SrRNA, RPS13 , HMBS, ACTB y SDHA (genes de mantenimiento) y VEGF-A, PLGF, VEGF-C, VEGF-D, VEGFR3, IL-8, CXCL1, CXCL2 , Hhex, Col4al, Col4a2, Alkl, ESM1 y Mínele. Las secuencias del conjunto de cebador y sonda son enlistadas en la Tabla 2.
Los niveles de expresión relativos de VEGF-A, PLGF, VEGF-C, VEGF-D, VEGFR3 , IL-8, CXCL1, CXCL2, Hhex, Col4al, Col4a2, Alkl, ESM1 y Mínele fueron de-terminados. Por ejemplo, el nivel de expresión relativo de VEGF-C fue calculado como sigue: Expresión relativa de VEGF-C muestra = 2 exp (Ct [ (HK1+HK2+HKX) /x] _ Ct VEGF-C ) en donde HK es un gen de mantenimiento (por ejemplo, 18SrRNA, RPS13, HMBS, ACTB y SDHA) y x es el total número de genes de mantenimiento usados para normalizar los datos, con Ct determinado en la muestra, en donde Ct es el ciclo de umbral. El Ct es el número de ciclo al cual la fluorescencia generada dentro de una reacción cruza la línea de umbral .
Para permitir la comparación de resultados de diferentes placas de reacción, la expresión relativa fue luego calculada como fracción a la expresión relativa a un ARN de referencia interno que fue idéntico en todas las corridas experimentales: Expresión relativa normalizada de VEGF-C muestra = (expresión relativa de VEGF-C muest a / expresión relativa de VEGF-C ARN de referencia) , en donde la expresión relativa de VEGF-C muestra = 2 exp (Ct [ (HKI+HK2+HKX) /x] ] ~ Ct VEGF-C) con Ct determinado en el ARN de referencia Los valores para la correlación de la expresión de ARN marcador (qPCR) y eficacia de tratamiento de combinación son mostrados en la Figura 71.
Los resultados del análisis de expresión genética son mostrados en las Figuras 72-92. En cada una de las Figuras 72-92, la expresión relativa del gen analizado es comparada con el por ciento de cambio en retardo de crecimiento del tumor (A TGD) exhibido por los siete modelos de tumor diferentes examinados. Los modelos de tumor que respondieron al tratamiento con el anticuerpo anti-VEGF-C en combinación con el anticuerpo anti-VEGF-A expresaron niveles más altos de VEGF-C, VEGF-D, VEGFR3, IL-8, CXCL1 y CXCL2 en comparación con los modelos de tumor que no respondieron al tratamiento de combinación (véanse Figuras 73-76 y 80-85) .
Los modelos de tumor sensibles al tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-C y anticuerpo anti-VEGF-A también expresaron niveles más bajos de VEGF-A, P1GF, Hhex, Col4al, Col4a2, Alkl y ESMl en comparación con los modelos de tumor que no respondieron al tratamiento de combinación (véanse Figuras 72, 77-79 y 86-92) .
Ejemplo 13. Actividades Inhibidoras de Tumor de Anticuerpos A ti-EGFL7 Todos los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con la guia para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, publicada por la NIH (Publicación NIH 85-23, revisada en 1985) . Un Comité Institucional para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) aprobó todos los protocolos de animales.
Los estudios se llevaron a. cabo con los siguientes modelos de tumor humanos utilizando técnicas estandarizadas: A549, MDA-MB231, H460, BxPC3, SKMES, S 620, H1299, V522 y PC3. Células de tumor humano fueron implantadas subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón de prueba. Por ejemplo, para A549, xenoinjertos fueron iniciados de células de carcinoma de pulmón de célula no pequeña humanas A549 cultivadas (cultivadas a fase media-logaritmica en medio RPMI-1640 que contiene suero bovino fetal desactivado térmicamente al 10%, 100 unidades/ml de penicilina G, 100 g/ml de sulfato de estreptomicina, 0.25 g/ml de anfotericina B, piruvato de sodio 1 mM, glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, bicarbonato de sodio al 0.075% y 25 ]ig/ l de gentamicina) o de células de adenocarcinoma de pulmón humano A549 (cultivadas en medio de Ham F12 modificado por Kaighn que contiene suero bovino fetal desactivado térmicamente al 10%, 5 100 unidades/ml de penicilina G, 100 yg/ml de sulfato de estreptomicina, 0.25 g/ml de anfotericina B, glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM y 25 g/ml de gentamicina) . En el dia de implante del tumor, células A549 fueron cosechadas y resuspendidas en PBS a una concentración de 5 x 107 células/ml. 10 7 Cada ratón de prueba recibió 1 x 10 células de tumor A549 implantadas subcutáneamente en el flanco derecho. Para tumores A549, células A549 fueron resuspendidas en matriz Matrigel™ al 100% (BD Biosciences, San José, CA) a una concentración de 5 x 107 células/ml. células A549 (1 x 107 en 0.2 mi) fueron l-> implantadas subcutáneamente en el flanco derecho de cada ratón de prueba y el crecimiento del tumor fue monitoreado.
El crecimiento del tumor fue monitoreado a medida que el promedio tamaño se aproximó a 120-180 mm3. En el dia de estudio 1, los tamaños de tumores individuales variaron de 126 20 a 196 mm3 y los animales fueron clasificados por tamaño de tumor en tres grupos de prueba (un grupo testigo y dos grupos de tratamiento) . El volumen del tumor fue calculado utilizando la fórmula: Volumen de tumor (mm3) = (w2 x 1) /2 5 en donde w = ancho y 1 = longitud en mm del tumor.
Todos los tratamientos fueron administrados intra-peritonealmente . Los tumores fueron tratados dos veces a la semana por hasta 10-20 semanas con 5-10 mg/kg cada uno de anticuerpo testigo, un agente que bloquea la actividad de VEGF- A (anticuerpo anti-VEGF-A B20-4.1 a 5 mg/kg) o la combinación de un agente que bloquea la actividad de VEGF-A y un agente que bloquea la actividad de EGFL7 (anticuerpo anti-EGFL7 a 10 mg/kg) . Para el grupo de tratamiento de combinación, el anticuerpo anti-EGFL7 fue administrado no más tarde de treinta minutos después de la administración del anticuerpo anti-VEGF-A. Cada dosis fue administrada en un volumen de 0.2 mi por 20 gramos de peso corporal (10 ml/kg) y fue escalada al peso corporal del animal.
El volumen del tumor fue registrado dos veces a la semana utilizando calibradores. Cada animal fue eutanizado cuando su tumor llegó al tamaño del punto final (en general 1000 itun3) o en la conclusión del estudio, lo que ocurra primero. Los tumores fueron cosechados y ya sea fijados de la noche a la mañana en NBF al 10%, seguido por etanol al 70% e imbibición subsecuente en parafina o en el transcurso de dos minutos congelados en nitrógeno liquido para almacenamiento subsecuente a -80°C.
El tiempo al punto final (TTE) fue calculado de la siguiente ecuación: TTE (días) = (log10 (volumen de punto final, mm3 - b) / m en donde b es la intersección y ra es la pendiente de la linea obtenida mediante regresión lineal de un conjunto de datos de crecimiento del tumor transformados en logaritmos.
Se asignó a los animales que llegaron al punto final un valor de TTE igual al último día del estudio. Los animales clasificados como muertes NTR (no relacionadas con el tratamiento) debido a accidente (NTRa) o debido a causas desconocidas (NTRu) fueron excluidos de los cálculos de TTE (y todos los análisis adicionales). Se asignó a los animales clasificados como muertes TR (relacionadas con el tratamiento) o NTRm (muerte no relacionada con el tratamiento debido a metástasis) un valor de TTE igual al día de la muerte.
El resultado de tratamiento fue evaluado por el retardo de crecimiento del tumor (TGD) , que es definido como el incremento en el tiempo promedio al punto final (TTE) en un grupo de tratamiento, en comparación con el grupo testigo, que fue calculado como sigue: TGD = T - C, expresado en días o como porcentaje del TTE promedio del grupo testigo, que fue calculado como sigue: %TGD = [ (T - C) / C] x 100, en donde T = TTE promedio para un grupo de tratamiento y C = TTE promedio para el grupo testigo.
El A%TGD fue calculado como antes, con C = grupo testigo siendo el grupo que recibe el tratamiento de anticuerpo anti-VEGF-A solo y T = grupo de tratamiento siendo el grupo que recibe la combinación de tratamiento de anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-VEGF-C. La prueba de logrank fue empleada para analizar el significado de la diferencia entre los valores de TTE de dos grupos. Análisis estadísticos de dos colas se llevaron a cabo a un nivel significativo de p = 0.05. Un valor de "1" indica que el tratamiento dio como resultado retardo adicional en avance del tumor. Un valor de "0" indica que el tratamiento no dio como resultado retardo adicional en avance del tumor.
El tratamiento con la combinación de anticuerpo anti-EGFL7 y anticuerpo anti-VEGF-A dio como resultado retardo adicional en avance del tumor en tumores MDA- B231, H460 y H1299, en comparación con el tratamiento de anticuerpo anti-VEGF-A solo (Figura 93) .
Ejemplo 14. Identificación de biomarcadores en cuanto a eficacia del tratamiento de anticuerpo anti-E6FL7 El análisis de expresión genética fue efectuado utilizando qRT-PCR en muestras de tumor congeladas obtenidas de los experimentos de modelo de tumor descritos anteriormente en el Ejemplo 13. Del material congelado, cubos pequeños de longitud lateral máxima de 3 m fueron solubilizado utilizando reactivos y equipo disponibles. comercialmente (RNeasy®, TissueLyzer, ambos de Qiagen Inc., Alemania). Después de la purificación de columna el ARN fue eluido con H20, precipitado con etanol después de la adición de glicógeno y acetato de sodio. El ARN fue aglomerado o convertido en pelotillas mediante centrifugación por al menos 30 minutos, lavado dos veces con etanol al 80% y la pelotilla resuspendida en H20 después del secado. Las concentraciones de ARN fueron determinadas utilizando un espectrofotómetro o un bioanalizador (Agilent, Foster City, CA) y 50 ng de ARN total usados por reacción en el análisis de expresión genética subsecuente.
Conjuntos de cebador y sonda específicos de gen fueron designados para el análisis de expresión de qRT-PCR de 18SrRNA, RPS13, ACTB, HNBS y SDHA (genes de mantenimiento) y FRAS1, cMet, Sema3B, FGF9, FN1, HGF, MFAP5, EFEMP2/fibulin4 , VEGF-C, CXCL2, FBLN2, FGF2, PDGF-C, BV8 , TNFa y Mínele. Las secuencias de conjuntos de cebador y sonda son enlistadas en la Tabla 2.
Los niveles de expresión relativa de FRAS1, cMet, Sema3B, FGF9, FN1, HGF, MFAP5, EFEMP2/Íibulin4 , VEGF-C, CXCL2, FBLN2, FGF2, PDGF-C, BV8, TNFa y Mínele fueron determinados. Por ejemplo, el nivel de expresión relativa de VEGF-C fue calculado como sigue: Expresión relativa de VEGF-C muestra = 2 exp (Ct [ (HKI+HK2+ HKX)/X] - Ct vEGF-c) en donde HK es un gen de mantenimiento (por ejemplo, 18SrRNA, RPS13, HMBS, ACTB y SDHA) y x es el número total de genes de mantenimiento usados para normalizar los datos, con Ct determinado en la muestra, en donde Ct es el ciclo de umbral. El Ct es el número de ciclo al cual la fluorescencia generada dentro de una reacción cruza la linea de umbral.
Para permitir la comparación de resultados de diferentes placas de reacción, la expresión relativa fue luego calculada como una fracción a la expresión relativa a un ARN de referencia interno que fue idéntico en todas las corridas experimentales, multiplicado por 100: Expresión relativa normalizada de VEGF-C muestra = (expresión relativa de VEGF-C muestra / expresión relativa de VEGF-C AR de referencia) x 100, en donde la expresión relativa de VEGF-C muestra = 2 e p (Ct [ (HKl+HK2+HKx) /x] ~ Ct VEGF-C) COn Ct determinado en el ARN de referencia.
Los valores de p- y r- para la correlación de la expresión de ARN marcador (qPCR) y la eficacia del tratamiento de combinación son mostrados en la Figura 94.
Los resultados del- análisis de expresión genética son mostrados en las Figuras 95-110. En cada una de las Figuras 95-110, la expresión relativa del gen analizado es comparada con el por ciento de cambio en retardo de crecimiento del tumor (A%TGD) exhibido por nueve diferentes modelos de tumor examinados. Los modelos de tumor que respondieron al tratamiento con el anticuerpo anti-EGFL7 en combinación con anticuerpo anti-VEGF-A expresaron niveles más altos de VEGF-C, CXCL2, PDGF-C, BV8 , TNFa y Mínele en comparación con los modelos de tumor que no respondieron al tratamiento de combinación (véanse Figuras 98, 100, 101, 107, 109-110).
Modelos de tumor sensibles al tratamiento de combinación con anticuerpo anti-VEGF-A y anticuerpo anti-EGFL7 también expresaron niveles más bajos de FRAS1, cMet, Sema3B, FGF9, FN1, HGF, MFAP5, EFEMP2 /fibulin , Fibulin 2 y FGF2 en comparación con los modelos de tumor que no respondieron al tratamiento de combinación (véanse Figuras 95-97, 99, 102-106 y 108) .
LISTADO DE SECUENCIAS INFORMAL SEQ ID NO: 1 cebador delantero de ácido nucleico 18S RARN humano AGT CCC TGC CCT TTG TAC ACA SEQ ID NO:2 cebador inverso de ácido nucleico 18S CCG AGG GCC TCA CTA AAC C SEQ ID NO: 3 sonda de ácido nucleico RARN 18S humano CGC CCG TCG CTA CTA CCG ATT GG SEQ ID NO:4 cebador delantero de ácido nucleico ACTB humano GAAGGCTTTTGGTCTCCCTG SEQ ID NO: 5 cebador inverso de ácido nucleico ACTB humano GGTGTGCACTTTTATTCAACTGG SEQ ID NO: 6 sonda de acido nucleico ACTB humano AGGGCTTACCTGTACACTG SEQ ID NO: 7 cebador delantero de ácido nucleico ACTB murino CCA TGA AAT AAG TGG TTA CAG GAA GTC SEQ ID NO: 8 cebador inverso de ácido nucleico ACTB murino CAT GGA CGC GAC CAT CCT SEQ ID NO: 9 sonda de ácido nucleico ACTB murino TCC CAA AAG CCA CCC CCA CTC CTA AG SEQ ID NO: 10 cebador delantero de ácido nucleico RPS13 humano CACCGTTTGGCTCGATATTA SEQ ID NO: 11 cebador inverso de ácido nucleico RPS13 humano GGCAGAGGCTGTAGATGATTC SEQ ID NO: 12 sonda de ácido nucleico RPS13 humano ACCAAGCGAGTCCTCCCTCCC SEQ ID NO: 13 cebador delantero de ácido nucleico RPS13 murino CACCGATTGGCTCGATACTA SEQ ID NO: 14 cebador inverso de ácido nucleico RPS13 murino TAGAGCAGAGGCTGTGGATG SEQ ID NO: 15 sonda de ácido nucleico RPS13 murino CGGGTGCTCCCACCTAATTGGA SEQ ID NO: 16 cebador delantero de ácido nucleico VEGF-A humano ATC ACC ATG CAG ATT ATG CG SEQ ID NO: 17 cebador inverso de ácido nucleico VEGF-A humano TGC ATT CAC ATT TGT TGT GC SEQ ID NO: 18 sonda de ácido nucleico VEGF-A humano TCA AAC CTC ACC AAG GCC AGC A SEQ ID NO: 19 cebador delantero de ácido nucleico VEGF-A murino GCAGAAGTCCCATGAAGTGA SEQ ID NO:20 cebador inverso de ácido nucleico VEGF-A murino CTCAATCGGACGGCAGTAG SEQ ID NO: 21 sonda de ácido nucleico VEGF-A murino TCAAGTTCATGGATGTCTACCAGCGAA SEQ ID NO:22 cebador delantero de ácido nucleico VEGF-C humano CAGTGTCAGGCAGCGAACAA SEQ ID NO:23 cebador inverso de ácido nucleico VEGF-C humano CTTCCTGAGCCAGGCATCTG SEQ ID NO:24 sonda de ácido nucleico VEGF-C humano CTGCCCCACCAATTACATGTGGAATAATCA SEQ ID NO:25 cebador delantero de ácido nucleico VEGF-C murino AAAGGGAAGAAGTTCCACCA SEQ ID NO:26 cebador inverso de ácido nucleico VEGF-C murino CAGTCCTGGATCACAATGCT SEQ ID NO: 27 sonda de ácido nucleico VEGF-C murino TCAGTCGATTCGCACACGGTCTT SEQ ID NO:28 cebador delantero de ácido nucleico VEGF-D humano CTGCCAGAAGCACAAGCTAT SEQ ID NO:29 cebador inverso de ácido nucleico VEGF-D humano ACATGGTCTGGTATGAAAGGG SEQ ID NO: 30 sonda de ' ácido nucleico VEGF-D humano CACCCAGACACCTGCAGCTGTG SEQ ID NO: 31 cebador delantero de ácido nucleico VEGF-D murino TTG ACC TAG TGT CAT GGT AAA GC SEQ ID NO: 32 cebador inverso de ácido nucleico VEGF-D murino TCA GTG AAC TGG GGA ATC AC SEQ ID NO: 33 sonda de ácido nucleico VEGF-D murino ACA TTT CCA TGC AAT GGC GGC T SEQ ID NO: 34 cebador delantero de ácido nucleico Bv8 humano ATG GCA CGG AAG CTA GGA SEQ ID NO:35 cebador inverso de ácido nucleico Bv8 humano GCA GAG CTG AAG TCC TCT TGA SEQ ID NO:36 sonda de ácido nucleico Bv8 humano TGC 'TGC TGG ACC CTT CCT AAA CCT SEQ ID NO: 37 cebador delantero de ácido nucleico Bv8 murino CGG AGG ATG CAC CAC ACC SEQ ID NO: 38 cebador- inverso de ácido nucleico Bv8 murino CCG GTT GAA AGA AGT CCT TAA ACA SEQ ID NO:39 sonda de ácido nucleico Bv8 murino CCC CTG CCT GCC AGG CTT GG SEQ ID NO:40 cebador delantero de ácido nucleicoPIGF humano CAGCAGTGGGCCTTGTCT SEQ ID NO:41 cebador inverso de ácido nucleico P1GF humano AAGGGTACCACTTCCACCTC SEQ ID NO: 2 sonda de ácido nucleico P1GF humano TGACGAGCCGTTCCCAGC SEQ ID NO:43 cebador delantero de ácido nucleico P1GF humano GAGCTGACGTTCTCTCAGCA SEQ ID NO:44 cebador inverso de ácido nucleico P1GF humano CTTTCCGGCTTCATCTTCTC SEQ ID NO: 45 sonda de ácido nucleico P1GF humano CTGCGAATGCCGGCCTCTG SEQ ID NO: 46 cebador delantero de ácido nucleico P1GF murino TGCTTCTTACAGGTCCTAGCTG SEQ ID NO:47 cebador inverso de ácido nucleico P1GF murino AAAGGCAC.CACTTCCACTTC SEQ ID NO: 8 sonda de ácido nucleico P1GF murino CCCTGGGAATGCACAGCCAA SEQ ID NO: 49 cebador delantero de ácido nucleicoVEGFRl/Fltl humano CCGGCTTTCAGGAAGATAAA SEQ ID NO: 50 cebador inverso de ácido nucleico VEGFRl/Fltl humano TCCATAGTGATGGGCTCCTT SEQ ID NO: 51 sonda de ácido nucleico VEGFRl/Fltl humano AACCGTCAGAATCCTCCTCTTCCTCA SEQ ID NO:52 cebador delantero de ácido nucleico VEGFRl murino GGCACCTGTACCAGACAAACTAT SEQ ID NO: 53 cebador inverso de ácido- nucleico VEGRF1 murino GGCGTATTTGGACATCTAGGA SEQ ID NO: 54 sonda de ácido nucleico VEGFRl murino TGACCCATCGGCAGACCAATACA SEQ ID NO: 55 cebador delantero de ácido nucleico VEGFRl/Fltl murino CGGAAACCTGTCCAACTACC SEQ ID NO:56 cebador inverso de ácido nucleico VEGFRl/Fltl murino TGGTTCCAGGCTCTCTTTCT SEQ ID NO: 57 sonda de ácido nucleico VEGFRl/Fltl murino CAACAAGGACGCAGCCTTGCA SEQ ID NO: 58 cebador delantero de ácido nucleico VEGFR2 humano GGTCAGGCAGCTCACAGTCC SEQ ID NO:59 cebador inverso de ácido nucleico VEGFR2 humano ACTTGTCGTCTGATTCTCCAGGTT SEQ ID NO: 60 sonda de ácido nucleico VEGFR2 humano AGCGTGTGGCACCCACGATCAC SEQ ID NO: 61 cebador delantero de ácido nucleico VEGFR2 murino TCATTATCCTCGTCGGCACTG SEQ ID NO: 62 cebador inverso de ácido nucleico VEGFR2 murino CCTTCATTGGCCCGCTTAA SEQ ID NO: 63 sonda de ácido nucleico VEGFR2 murino TTCTGGCTCCTTCTTGTCATTGTCCTACGG SEQ ID NO: 64 cebador delantero de ácido nucleico VEGFR3 humano ACAGACAGTGGGATGGTGCTGGCC SEQ ID NO: 65 cebador inverso de ácido nucleico VEGFR3 humano CAAAGGCTCTGTGGACAACCA SEQ ID NO: 66 sonda de ácido nucleico VEGFR3 humano TCTCTATCTGCTCAAACTCCTCCG SEQ ID NO: 67 cebador delantero de ácido nucleico VEGFR3 murino AGGAGCTAGAAAGCAGGCAT SEQ ID NO: 68 cebador inverso de ácido nucleico VEGFR3 murino CTGGGAATATCCATGTGCTG SEQ ID NO: 69 sonda de ácido nucleico VEGFR3 murino CAGCTTCAGCTGTAAAGGTCCTGGC SEQ ID NO: 70 cebador delantero de ácido nucleico NRPl humano CGGACCCATACCAGAGAATTA SEQ ID NO:71 cebador inverso de ácido nucleico NRPl humano CCATCGAAGACTTCCACGTA SEQ ID NO: 72 sonda de ácido nucleico NRPl humano TCAACCCTCACTTCGATTTGGAGGA SEQ ID NO: 73 cebador delantero de ácido nucleico NRPl humano AAACCAGCAGACCTGGATAAA SEQ ID NO:74 cebador inverso de ácido nucleico NRPl humano CACCTTCTCCTTCACCTTCG SEQ ID NO: 75 sonda de ácido nucleico NRPl humano TCCTGGCGTGCTCCCTGTTTC SEQ ID NO: 76 cebador delantero de ácido nucleico NRPl murino TTTCTCAGGAAGACTGTGCAA SEQ ID NO: 77 cebador inverso de ácido nucleico NRPl murino TGGCTTCCTGGAGATGTTCT SEQ ID NO:78 sonda de ácido nucleico NRPl murino CCTGGAGTGCTCCCTGTTTCATCA SEQ ID NO: 79 cebador delantero de ácido nucleico NRPl murino CTGGAGATCTGGGATGGATT SEQ ID NO:80 cebador inverso de ácido nucleico NRPl murino TTTCTGCCCACAATAACGC SEQ ID NO:81 sonda de ácido nucleico NRPl murino CCTGAAGTTGGCCCTCACATTGG SEQ ID NO: 82 cebador delantero de ácido nucleico NRPl humano CCACAGTGGAACAGGTGATG SEQ ID NO:83 cebador inverso de ácido nucleico NRPl humano CTGTCACATTTCGTATTTTATTTGA SEQ ID NO: 84 sonda de ácido nucleico NRPl humano GAAAAGCCCACGGTCATAGA SEQ ID NO: 85 cebador delantero de ácido nucleico NRPl humano CCACAGTGGAACAGGTGATG SEQ ID NO: 86 cebador inverso de ácido nucleico NPR1 humano ATGGTACAGCAATGGGATGA SEQ ID NO:87 sonda de ácido nucleico NRP1 humano CCAGCTCACAGGTGCAGAAACCA SEQ ID NO:88 cebador delantero de ácido nucleico NRP1 humano GACTGGGGCTCAGAATGG SEQ ID NO:89 cebador inverso de ácido nucleico NPR1 humano CTATGACCGTGGGCTTTTCT SEQ ID NO: 90 sonda de ácido nucleico NRP1 humano TGAAGTGGAAGGTGGCACCAC SEQ ID NO: 91 cebador delantero de ácido nucleico Podoplanina humano CCGCTATAAGTCTGGCTTGA SEQ ID NO: 92 cebador inverso de ácido nucleico Podoplanina humano ' GATGCGAATGCCTGTTACAC SEQ ID NO: 93 sonda de ácido nucleico Podoplanina humano AACTCTGGTGGCAACAAGTGTCAACA SEQ ID NO: 94 cebador delantero de ácido nucleico Podoplanin murino GGATGAAACGCAGACAACAG SEQ ID NO: 95 cebador inverso de ácido nucleico Podoplanina murino GACGCCAACTATGATTCCAA SEQ ID NO: 96 sonda de ácido nucleico Podoplanina murino TGGCTTGCCAGTAGTCACCCTGG SEQ ID NO: 97 cebador delantero de ácido nucleico Proxl humano ACAAAAATGGTGGCACGGA SEQ ID NO: 98 cebador inverso de ácido nucleico Proxl humano CCT GAT GTA CTT CGG AGC CTG SEQ ID NO: 99 sonda de ácido nucleico Proxl humano CCCAGTTTCCAAGCCAGCGGTCTCT SEQ ID NO: 100 cebador delantero de ácido nucleico Proxl murino GCTGAAGACCTACTTCTCGGA SEQ ID NO: 101 cebador inverso de ácido nucleico Proxl murino ACGGAAATTGCTGAACCACT1 SEQ ID NO:102 sonda de ácido nucleico Proxl murino TTCAACAGATGCATTACCTCGCAGC SEQ ID NO: 103 cebador delantero de ácido nucleico VE-Cadherina humano GAACAACTTTACCCTCACGGA SEQ ID NO: 104 cebador inverso de ácido nucleico VE-Cadherina humano GGTCAAACTGCCCATACTTG SEQ ID NO: 105 sonda de ácido nucleico VE-Cadherina humano CACGATAACACGGCCAACATCACA SEQ ID NO:106 cebador delantero de ácido nucleico VE-Cadherina murino TGAAGAACGAGGACAGCAAC SEQ ID NO: 107 cebador inverso de ácido nucleico VE-Cadherina murnio CCCGATTAAACTGCCCATAC SEQ ID NO: 108 sonda de ácido nucleico VE-Cadherina murino CACCGCCAACATCACGGTCA SEQ ID NO:109 cebador delantero de ácido nucleico robo4 humano GGGACCCACTAGACTGTCG SEQ ID NO: 110 cebador inverso de ácido nucleico robo4 humano AGTGCTGGTGTCTGGAAGC SEQ ID NO.lll sonda de ácido nucleico robo4 humano TCGCTCCTTGCTCTCCTGGGA SEQ ID NO: 112 cebador delantero de ácido nucleico ICAM1 humano AACCAGAGCCAGGAGACACT SEQ ID NO: 113 cebador inverso de ácido nucleico ICAM1 humano CGTCAGAATCACGTTGGG SEQ ID NO: 114 sonda de ácido nucleico ICA 1 humano TGACCATCTACAGCTTTCCGGCG SEQ ID NO: 115 cebador delantero de ácido nucleico ICAM1 murino CACGCTACCTCTGCTCCTG SEQ ID NO:116 cebador inverso de ácido nucleico ICAM1 murino CTTCTCTGGGATGGATGGAT SEQ ID NO: 117 sonda de á.cido nucleico ICAMl murino CACCAGGCCCAGGGATCACA SEQ ID NO: 118 cebador delantero de ácido nucleico ESM1 humano TTCAGTAACCAAGTCTTCCAACA SEQ ID NO: 119 cebador inverso de ácido nucleico ESM1 humano TCACAATATTGCCATCTCCAG SEQ ID NO: 120 sonda de ácido nucleico ESM1 hunano TCTCACGGAGCATGACATGGCA SEQ ID NO: 121 cebador delantero de ácido nucleico ES 1 murino CAGTATGCAGCAGCCAAATC SEQ ID NO: 122 cebador inverso de ácido nucleico ESM1 murino CTCTTCTCTCACAGCGTTGC SEQ ID NO: 123 sonda de ácido nucleico ESM1 murino TGCCTCCCACACAGAGCGTG SEQ ID NO: 124 cebador delantero de ácido nucleico NG2 humano ¦ AGGCAGCTGAGATCAGAAGG SEQ ID NO: 125 cebador inverso de ácido nucleico NG2 humano GATGTCTGCAGGTGGCACT SEQ ID NO:126 sonda de ácido nucleico NG2 humano CTCCTGGGCTGCCTCCAGCT SEQ ID NO: 127 cebador delantero de ácido nucleico NG2 murino ACAGTGGGCTTGTGCTGTT SEQ ID NO: 128 cebador inverso de ácido nucleico NG2 murino AGAGAGGTCGAAGTGGAAGC SEQ ID NO: 129 sonda de ácido nucleico NG2 murino TCCTTCCAGGGCTCCTCTGTGTG SEQ ID NO: 130 cebador delantero de ácido nucleico FGF2 humano ACCCCGACGGCCGA SEQ ID NO: 131 cebador inverso de ácido nucleico FGF2 humano TCTTCTGCTTGAAGTTGTAGCTTGA SEQ ID NO: 132 sonda de ácido nucleico FGF2 humano TCCGGGAGAAGAGCGACCCTCAC SEQ ID NO: 133 cebador delantero de ácido nucleico FGF2 murino ACCTTGCTATGAAGGAAGATGG SEQ ID NO: 134 cebador inverso de ácido nucleico FGF2 murino TTCCAGTCGTTCAAAGAAGAAA SEQ ID NO: 135 sonda de ácido nucleico FGF2 murino AACACACTTAGAAGCCAGCAGCCGT SEQ ID NO: 136 cebador delantero de ácido nucleico IL8/CXCL8 humano GGCAGCCTTCCTGATTTCT SEQ ID NO: 137 cebador inverso, de ácido nucleico IL8/CXCL8 humano TTCTTTAGCACTCCTTGGCA SEQ ID NO: 138 sonda de ácido nucleico IL8/CXCL8 humano AAACTGCACCTTCACACAGAGCTGC SEQ ID NO: 139 cebador delantero de ácido nucleico HGF humano TGGGACAAGAACATGGAAGA SEQ ID NO: 140 ¦ cebador inverso de ácido nucleico HGF humano GCATCATCATCTGGATTTCG SEQ ID N0.141 sonda de ácido nucleico HGF humano TCAGCTTACTTGCATCTGGTTCCCA SEQ ID NO:142 cebador delantero de ácido nucleico HGF murino GGACCAGCAGACACCACA SEQ ID NO: 1 3 cebador inverso de ácido nucleico HGF murino TATCATCAAAGCCCTTGTCG SEQ ID NO: 144 sonda de ácido nucleico HGF murino CCGGCACAAGTTCTTGCCAGAA SEQ ID NO:145 cebador delantero de ácido nucleico THBSl/TSPl humano TTTGGAACCACACCAGAAGA SEQ ID NO:146 cebador inverso de ácido nucleico THBSl/TSPl humano GTCAAGGGTGAGGAGGACAC SEQ ID NO: 147 sonda de ácido nucleico THBSl/TSPl humano CCTCAGGAACAAAGGCTGCTCCA SEQ ID NO:148 cebador delantero de ácido nucleico THBSl/TSPl murino CGATGACAACGACAAGATCC SEQ ID NO: 149 cebador inverso de ácido nucleico THBSl/TSPl murino TCTCCCACATCATCTCTGTCA SEQ ID NO:150 sonda de ácido nucleico THBSl/TSPl murino CCATTCCATTACAACCCAGCCCA SEQ ID NO:151 cebador delantero de ácido nucleico ANG1 humano AGTTAATGGACTGGGAAGGG SEQ ID NO: 152 cebador inverso de ácido nucleico ANG1 humano GCTGTCCCAGTGTGACCTTT SEQ ID NO: 153 sonda de ácido nucleico ANG1 humano ACCGAGCCTATTCACAGTATGACAGA SEQ ID NO: 154 cebador delantero de ácido nucleico G -CSF/CSF2 humano TGCTGCTGAGATGAATGAAA SEQ ID NO:155 cebador inverso de ácido nucleico GM-CSF/CSF2 humano CCCTGCTTGTACAGCTCCA SEQ ID NO: 156 sonda de ácido nucleico G -CSF/CSF2 humano CTCCAGGAGCCGACCTGCCT SEQ ID NO: 157 cebador delantero de ácido nucleico GM-CSF/CSF2 murino AGCCAGCTACTACCAGACATACTG SEQ ID NO: 158 cebador inverso de ácido nucleico GM-CSF/CSF2 murino GAAATCCGCATAGGTGGTAAC SEQ ID NO: 159 sonda de ácido nucleico GM-CSF/CSF2 murino AACTCCGGAAACGGACTGTGAAACAC SEQ ID NO: 160 cebador delantero de ácido nucleico G-CSF/CSF3 humano GTCCCACCTTGGACACACT SEQ ID NO: 161 cebador inverso de ácido nucleico G-CSF/CSF3 humano TCCCAGTTCTTCCATCTGCT SEQ ID NO: 162 sonda de ácido nucleico G-CSF/CSF3 humano CTGGACGTCGCCGACTTTGC SEQ ID NO: 163 cebador delantero de ácido nucleico G-CSF/CSF3 murino GAGTGGCTGCTCTAGCCAG SEQ ID NO: 164 cebador inverso de ácido nucleico G-CSF/CSF3 murino GACCTTGGTAGAGGCAGAGC SEQ ID NO: 165 sonda de ácido nucleico G-CSF/CSF3 murino TGCAGCAGACACAGTGCCTAAGCC SEQ ID NO:166 cebador delantero de ácido nucleico FGF9 humano TATCCAGGGAACCAGGAAAG SEQ ID NO: 167 cebador inverso de ácido nucleico FGF9 humano CAGGCCCACTGCTATACTGA SEQ ID NO: 168 sonda de ácido nucleico FGF9 humano CACAGCCGATTTGGCATTCTGG SEQ ID NO: 169 cebador delantero de ácido nucleico CXCL12/SDF1 humano ACACTCCAAACTGTGCCCTT SEQ ID NO: 170 cebador inverso de ácido nucleico CXCL12/SDF1 humano GGGTCAATGCACACTTGTCT SEQ ID N0:171 sonda de ácido nucleico CXCL12/SDF1 humano TGTAGCCCGGCTGAAGAACAACA SEQ ID NO: 172 cebador delantero de ácido nucleico CXCL12/SDF1 murino CCAACGTCAAGCATCTGAAA SEQ ID NO:173 cebador inverso de ácido nucleico CXCL12/SDF1 murino GGGTCAATGCACACTTGTCT SEQ ID NO: 174 sonda de ácido nucleico CXCL12/SDF1 murino TGCCCTTCAGATTGTTGCACGG SEQ ID NO: 175 cebador delantero de ácido nucleico TGFbl humano CGTCTGCTGAGGCTCAAGT SEQ ID NO: 176 cebador inverso de ácido nucleico TGFbl humano GGAATTGTTGCTGTATTTCTGG SEQ ID NO: 177 sonda de ácido nucleico TGFbl humano CAGCTCCACGTGCTGCTCCA SEQ ID NO: 178 cebador delantero de ácido nucleico TGFbl murino CCCTATATTTGGAGCCTGGA, SEQ ID NO:179 cebador inverso de ácido nucleico TGFbl murino CGGGTTGTGTTGGTTGTAGA SEQ ID NO:180 sonda de ácido nucleico TGFbl murino CACAGTACAGCAAGGTCCTTGCCC SEQ ID NO:181 cebador delantero de ácido nucleico TNFa humano TCAGATCATCTTCTCGAACCC SEQ ID NO:182 cebador inverso de ácido nucleico TNFa humano CAGCTTGAGGGTTTGCTACA SEQ ID NO: 183 sonda de ácido nucleico TNFa humano CGAGTGACAAGCCTGTAGCCCATG SEQ ID NO:184 cebador delantero de ácido nucleico TNFa murino AGTTCTATGGCCCAGACCCT SEQ ID NO: 185 cebador inverso de ácido nucleico TNFa murino TCCACTTGGTGGTTTGCTAC SEQ ID NO:186 sonda de ácido nucleico TNFa murino TCGAGTGACAAGCCTGTAGCCCA SEQ ID NO:187 cebador delantero de ácido nucleico BMP9 humano CAACATTGTGCGGAGCTT SEQ ID NO: 188 cebador inverso de ácido nucleico BMP9 humano GAGCAAGATGTGCTTCT.GGA SEQ ID NO: 189 sonda de ácido nucleico BMP9 humano CAGCATGGAAGATGCCATCTCCA SEQ ID NO: 190 cebador delantero de ácido nucleico BMP10 humano CCTTGGTCCACCTCAAGAAT SEQ ID NO: 191 cebador inverso de ácido nucleico BMP10 humano GGAGATGGGCTCTAGCTTTG SEQ ID NO: 192 sonda de ácido nucleico BMP10 humano CCAAAGCCTGCTGTGTGCCC SEQ ID NO: 193 cebador delantero de ácido nucleico Sema3a humano GAGGTTCTGCTGGAAGAAATG SEQ ID NO:194 cebador inverso de ácido nucleico Sema3a humano CTGCTTAGTGGAAAGCTCCAT SEQ ID NO:195 sonda de ácido nucleico Sema3a humano CGGGAACCGACTGCTATTTCAGC SEQ ID NO:196 cebador delantero de ácido nucleico Sema3a murino TCCTCATGCTCACGCTATTT SEQ ID NO: 197 cebador inverso de ácido nucleico Sema3a murino AGTCAGTGGGTCTCCATTCC SEQ ID NO:198 sonda de ácido nucleico Sema3a murino CGTCTTGTGCGCCTCTTTGCA .SEQ ID NO: 199 cebador delantero de ácido nucleico Sema3b humano ACCTGGACAACATCAGCAAG SEQ ID NO:200 cebador inverso de ácido nucleico Sema3b humano GCCCAGTTGCACTCCTCT SEQ ID NO:201 sonda de ácido nucleico Sema3b humano CCGGCCAGGCCAGCTTCTT SEQ ID NO: 202 cebador delantero de ácido nucleico Sema3b murino AGCTGCCGATGGACACTAC SEQ ID NO:203 cebador inverso de ácido nucleico Sema3b murino GGGACTGAGATCACTTTCAGC SEQ ID NO: 204 sonda de ácido nucleico Sema3b murino TGTGCCCACATCTGTACCAATGAAGA SEQ ID NO: 205 cebador delantero de ácido nucleico Sema3c humano CAGGGCAGAATTCCATATCC SEQ ID NO:206 cebador inverso de ácido nucleico Sema3c humano CGCATATTGGGTGTAAATGC SEQ ID NO: 207 sonda de ácido nucleico Sema3c humano CGCCCTGGAACTTGTCCAGGA SEQ ID NO:208 cebador delantero de ácido nucleico Sema3c murino ATGTGAGACATGGAAACCCA SEQ ID NO: 209 cebador inverso de ácido nucleico Sema3c murino TTCAGCTGCATTTCTGTATGC SEQ ID NO: 210 sonda de ácido nucleico Sema3c murino TTGAACCCTCGGCATTGTGTCA SEQ ID NO:211 cebador delantero de ácido nucleico Sema3e humano GCTCACGCAATTTACACCAG SEQ ID NO:212 cebador inverso de ácido nucleico Sema3e humano TTCTCTGCCCTCCTACATCA SEQ ID NO: 213 sonda de ácido nucleico Sema3e humano TTCACACAGAGTCGCCCGACC SEQ ID NO:214 cebador delantero de ácido nucleico Sema3e murino CCACTGGTCACTATATGAAGGAA SEQ ID NO:215 cebador inverso de ácido nucleico Sema3e murino CTTGCCTCCGTTTACTTTGC SEQ ID NO: 216 sonda de ácido nucleico Sema3e murino CAAGGCCTGGTTCCTGTGCCA SEQ ID NO:217 cebador delantero de ácido nucleico Sema3f humano GGAACCCTGTCATTTACGCT SEQ ID NO:218 cebador inverso de ácido nucleico Sema3f humano GTAGACACACACGGCAGAGC SEQ ID NO:219 sonda de ácido nucleico Sema3f humano CCTCTGGCTCCGTGTTCCGA SEQ ID NO:220 cebador delantero de ácido nucleico Sema3f murino CGTCAGGAACCCAGTCATTT SEQ ID NO:221 cebador inverso de ácido nucleico Sema3f murino AGACACACACTGCAGACCCT SEQ ID NO:222 sonda de ácido nucleico Sema3f murino CTTTACCTCTTCAGGCTCTGTGTTCCG SEQ ID NO: 223 cebador delantero de ácido nucleico LGALSl/Galectinl humano CTCAAACCTGGAGAGTGCCT SEQ ID NO:224 cebador inverso de ácido nucleico LGALSl/Galectinl humano GGTTCAGCACGAAGCTCTTA SEQ ID NO:225 sonda de ácido nucleico LGALSl/Galectinl humano CGTCAGGAGCCACCTCGCCT SEQ. ID NO:226 cebador delantero de ácido nucleico LGALSl/Galectinl murino AATCATGGCCTGTGGTCTG SEQ ID NO:227 cebador inverso de ácido nucleico LGALSl/Galectinl murino CCCGAACTTTGAGACATTCC SEQ ID NO:228 sonda de ácido nucleico LGALSl/Galectinl murino TCGCCAGCAACCTGAATCTCA SEQ ID NO:229 cebador delantero de ácido nucleicoLGALS7B/Galectin7 humano CCTTCGAGGTGCTCATCATC SEQ ID NO:230 cebador inverso de ácido nucleico LGALS7B/Galectin7 humano GGCGGAAGTGGTGGTACT SEQ ID NO:231 sonda de ácido nucleico LGALS7B/Galectin7 humano ACCACGGCCTTGAAGCCGTC SEQ ID NO:232 cebador delantero de ácido nucleico LGALS7B/Galectin7 murino GAGAATTCGAGGCATGGTC SEQ ID NO:233 cebador inverso de ácido nucleico LGALS7B/Galectin7 murino ATCTGCTCCTTGCTCCTCAC SEQ ID NO:234 sonda de ácido nucleico LGALS7B/Galectin7 murino CATGGAACCTGCCAGCCTGG SEQ ID NO:235 cebador delantero de ácido nucleico TMEMIOO humano TGGTAATGGATTGCCTCTCTC SEQ ID NO: 236 cebador inverso de ácido nucleico TMEMIOO humano CAGTGCTTCTAAGCTGGGTTT SEQ ID NO:237 sonda de ácido nucleico TMEMIOO humano CGAGCTTTCACCCTGGTGAGACTG SEQ ID NO:238 cebador delantero de ácido nucleico TMEMIOO murino AGTCAAGTGGCCTCTCTGGT SEQ ID NO:239 cebador inverso de ácido nucleico TMEMIOO murino CGCTTCACAGGCTAGATTTG SEQ ID NO:240 sonda de ácido nucleico TMEM100 mu'rino TGAGCTTGCATCCTGACCAGGC SEQ ID O:241 cebador delantero de ácido nucleico Alkl humano AGGTGGTGTGTGTGGATCAG SEQ ID NO:242 cebador inverso de ácido nucleico Alkl humano CCGCATCATCTGAGCTAGG SEQ ID NO: 243 sonda de ácido nucleico Alkl humano CTGGCTGCAGACCCGGTCCT SEQ ID NO:244 cebador delantero de ácido nucleico Alkl murino CTTTGGCCTAGTGCTATGGG SEQ ID NO:245 cebador inverso de ácido nucleico Alkl murino GAAAGGTGGCCTGTAATCCT SEQ ID NO:246 sonda de ácido nucleico Alkl murino CGGCGGACCATCATCAATGG SEQ ID NO:247 cebador delantero de ácido nucleico ITGa5 humano GCCTCAATGCTTCTGGAAA " SEQ ID NO: 248 cebador inverso de ácido nucleico ITGa5 humano CAGTCCAGCTGAAGTTCCAC SEQ ID NO:249 sonda de ácido nucleico ITGa5 humano CGTTGCTGACTCCATTGGTTTCACA SEQ ID NO:250 cebador delantero de ácido nucleico ITGa5 murino ACCGTCCTTAATGGCTCAGA SEQ ID NO:251 cebador inverso de ácido nucleico ITGa5 murino CCACAGCATAGCCGAAGTAG SEQ ID N0..252 sonda de ácido nucleico ITGa5 murino CAACGTCTCAGGAGAACAGATGGCC SEQ ID NO:253 cebador delantero de ácido nucleico CXCR4 humano CTTCCTGCCCACCATCTACT SEQ ID NO: 254 cebador inverso de ácido nucleico CXCR4 humano CATGACCAGGATGACCAATC SEQ ID NO: 255 sonda de ácido nucleico CXCR4 humano CATCTTCTTAACTGGCATTGTGGGCA SEQ ID ??:25ß cebador delantero de ácido nucleico Egfl7 humano GTGTACCAGCCCTTCCTCAC SEQ ID NO:257 cebador inverso de ácido nucleico Egfl7 humano CGGTCCTATAGATGGTTCGG SEQ ID NO:258 sonda de ácido nucleico Egfl7 humano ACCGGGCCTGCAGCACCTA SEQ ID NO:259 cebador delantero de ácido nucleico Egfl7 murino GGCAGCAGATGGTACTACTGAG SEQ ID NO:260 cebador inverso de ácido nucleico Egfl7 murino GATGGAACCTCCGGAAATC SEQ ID NO:261 sonda de ácido nucleico Egfl7 murino CCCACAGTACACACTCTACGGCTGG SEQ ID NO: 262 cebador delantero de ácido nucleico NG3/Egf18 humano AAGCCCTACCTGACCTTGTG SEQ ID NO:263 cebador inverso de ácido nucleico NG3/Egf18 humano ATAACGCGGTACATGGTCCT SEQ ID NO:264 sonda de ácido nucleico NG3/Egf18 humano AGTGCTGCAGATGCGCCTCC SEQ ID NO:265 cebador delantero de ácido nucleico NG3/Egf18 murino CTGTCAGGGCTGGAAGAAG SEQ ID NO:266 cebador inverso de ácido nucleico NG3/Egfl8 murino CACCTCCATTAAGACAAGGCT SEQ ID NO: 267 sonda de ácido nucleico NG3/Egf18 murino TCACCTGTGATGCCATCTGCTCC SEQ ID NO: 268 cebador delantero de ácido nucleico HSPG2/perlecana humano CGGCCATGAGTCCTTCTACT SEQ ID NO:269 cebador inverso de ácido nucleico HSPG2/perlecana humano GGAGAGGGTGTATCGCAACT SEQ ID NO:270 sonda de ácido nucleico HSPG2/perlecana humano CCGTAGGCCGCCACCTTGTC SEQ ID NO: 271 cebador delantero de ácido nucleico Fibronectina humano GGTTCGGGAAGAGGTTGTTA SEQ ID NO:272 cebador inverso de ácido nucleico Fibronectina humano TCATCCGTAGGTTGGTTCAA SEQ ID NO:273 sonda de ácido nucleico Fibronectina humano CCGTGGGCAACTCTGTCAACG SEQ ID NO:274 cebador delantero de ácido nucleico Fibronectina humano AGAACCAGAGGAGGCACAAG SEQ ID NO:275 cebador inverso de ácido nucleico Fibronectina humano CATCTGTAGGCTGGTTCAGG SEQ ID NO:276 sonda de ácido nucleico Fibronectina humano CCTTCGCTGACAGCGTTGCC SEQ ID NO: 277 cebador delantero de ácido nucleico LyPD6 murino CTCAGTCCCGAGACTTCACA SEQ ID NO:278 cebador inverso de ácido nucleico LyPD6 murino AAACACTTAAACCCACCAGGA SEQ ID NO:279 sonda de ácido nucleico LyPD6 murino CCTCCACCCTTCAACCACTCCG SEQ ID NO:280 ' cebador delantero de ácido nucleico Spred-1 murino CGAGGCATTCGAAGAGCTA SEQ ID NO:281 cebador inverso de ácido nucleico Spred-1 murino TCCTCCTTCAGCCTCAGTTT SEQ ID NO:282 sonda de ácido nucleico Spred-1 murino TCTCTAGGGTGCCCAGCGTCAA SEQ ID NO:283 cebador delantero de ácido nucleico MFAP5 murino CATCGGCCAGTCAGACAGT SEQ ID NO:284 cebador inverso de ácido nucleico FAP5 murino AGTCGGGAACAGATCTCATTATT SEQ ID NO:285 sonda de ácido nucleico MFAP5 murino CTGCTTCACCAGTTTACGGCGC SEQ ID NO:286 cebador delantero de ácido nucleico MFAP5 murino GACACACTCAGCAGCCAGAG SEQ ID NO:287 cebador' inverso de ácido nucleico MFAP5 murino CCAAG ACAGCA ATTGTCTACAG SEQ ID NO:288 sonda de ácido nucleico MFAP5 murino CCGGCAGACAGATCGCAGCT SEQ ID NO:289 cebador delantero de ácido nucleico fibulin2 murinó AGAATGGTGCCCAGAGTGA SEQ ID NO:290 cebador inverso de ácido nucleico fibulin2 murino TTCTCTTTCAAGTAGGAGATGCAG SEQ ID NO:291 sonda de ácido nucleico fibulin2 murino CATTGCCTCTGGGCTATCCTACAGATG SEQ ID NO:292 cebador delantero de ácido nucleico fibulin /Efemp2 murino CACCTGCCCTGATGGTTAC SEQ ID NO:293 cebador inverso de ácido nucleico fibulin4/Efemp2 murino CAATAGCGGTAACGACACTCA SEQ ID NO: 294 sonda de ácido nucleico fibulin /Efemp2 murino TGTCCACACATTCGGGTCCAATTT SEQ ID NO:295 cebador delantero de ácido nucleico colágeno IV (al) murino CGGCAGAGATGGTCTTGAA SEQ ID NO:296 cebador inverso de ácido nucleico colágeno IV (al) murino TCTCTCCAGGCTCTCCCTTA SEQ ID NO:297 sonda de ácido nucleico colágeno IV (al) murino CCTTGTGGACCCGGCAATCC SEQ ID NO:298 cebador delantero de ácido nucleico colágeno IV (al) murino TTCATTCCTCATGCACACTG SEQ ID NO:299 cebador inverso de ácido nucleico colágeno IV (a2) murino GCACGGAAGTCCTCTAGACA SEQ ID NO: 300 sonda de ácido nucleico colágeno IV (a2) murino ACTGGCCACCGCCTTCATCC SEQ ID NO:301 cebador delantero de ácido nucleico colágeno IV (a3) murino TTACCCTGCTGCTACTCCTG SEQ ID NO: 302 cebador inverso de ácido nucleico colágeno IV (a3) murino GCATTGTCCTTTGCCTTTG SEQ ID NO: 303 sonda de ácido nucleico colágeno IV (a3) murino CACAGCCCTTGCTAGCCACAGG SEQ ID NO: 304 cebador delantero de ácido nucleico Hhex murino GGCCAAGATGTTACAGCTCA ' .
SEQ ID NO: 305 cebador inverso de ácido nucleico Hhex murino TTGCTTTGAGGATTCTCCTG SEQ ID NO:306 sonda de ácido nucleico Hhex murino CCTGGTTTCAGAATCGCCGAGC SEQ ID NO: 307 cebador delantero de ácido nucleico robo4 murino CCTTTCTCTTCGTGGAGCTT SEQ ID NO: 308 cebador inverso de ácido nucleico robo4 murino GTCAGAGGAGGGAGCTTGG SEQ ID NO: 309 sonda de ácido nucleico robo4 murino TCCACACACTGGCTCTGTGGGTC SEQ ID NO:310 cebador delantero de ácido nucleico PDGFb murino CATCTCGAGGGAGGAGGAG SEQ ID NO: 311 cebador inverso de ácido nucleico PDGFb murino CACTCGGCGATTACAGCA SEQ ID NO:312 sonda de ácido nucleico PDGFb murino TGCTGCTGCCAGGGACCCTA SEQ ID NO:313 cebador delantero de ácido nucleico PDGFRb murino CTTATGATAACTATGTCCCATCTGC SEQ ID NO: 314 cebador inverso de ácido nucleico PDGFRb murino CTGGTGAGTCGTTGATTAAGGT SEQ ID NO: 315 PDGFRb sonda de ácido nucleico PDGFRb murino CCCTGAAAGGACCTATCGCGCC SEQ ID NO: 316 cebador delantero de ácido nucleico RGS5 murino GAGGAGGTCCTGCAGTGG SEQ ID NO: 317 cebador inverso de ácido nucleico RGS5 murino TGAAGCTGGCAAATCCATAG SEQ ID NO: 318 sonda de ácido nucleico RGS5 murino CGCCAGTCCCTGGACAAGCTT SEQ ID NO:319 cebador delantero de ácido nucleico CXCL1 murino CCGAAGTCATAGCCACACTC SEQ ID NO:320 cebador inverso de ácido nucleico CXCLl murino TTTCTGAACCAAGGGAGCTT SEQ ID NO: 321 sonda de ácido nucleico CXCLl murino AAGGCAAGCCTCGCGACCAT SEQ ID NO: 322 cebador delantero de ácido nucleico CXCL2 murino AAAGGCAAGGCTAACTGACC SEQ ID NO: 323 cebador inverso de ácido nucleico CXCL2 murino CTTTGGTTCTTCCGTTGAGG SEQ ID NO: 324 sonda de ácido nucleico CXCL2 murino CAGCAGCCCAGGCTCCTCCT SEQ ID NO: 325 cebador delantero de ácido nucleico PECAM/CD31 murino TCC CCG AAG CAG CAC TCT T SEQ ID NO: 326 cebador inverso de ácido nucleico PECAM/CD31 murino ACC GCA ATG AGC CCT TTC T SEQ ID NO: 327 sonda de ácido nucleico PECAM/CD31 murino CAG TCA GAG TCT TCC TTG CCC CAT GG SEQ ID NO:328 cebador delantero de ácido nucleico VCAM1 murino AACCCAAACAGAGGCAGAGT SEQ ID NO:329 cebador inverso de ácido nucleico VCAMl murino CAGATGGTGGTTTCCTTGG SEQ ID NO:330 sonda de ácido nucleico VCAMl murino CAGCCTCTTTATGTCAACGTTGCCC SEQ ID NO:331 cebador delantero de ácido nucleico HMBS humano CTTGATGACTGCCTTGCCTC SEQ ID NO: 332 cebador inverso de ácido nucléico HMBS humano GGTTACATTCAAAGGCTGTTGCT SEQ ID NO:333 sonda de ácido nucleico HMBS humano TCTTTAGAGAAGTCC SEQ ID NO: 334 cebador delantero de ácido nucleico SDHA humano GGGAGCGTGGCACTTACCT SEQ ID NO:335 cebador inverso de ácido nucléico SDHA humano TGCCCAGTTTTATCATCTCACAA SEQ ID NO: 336 sonda de ácido nucleico SDHA humano TGTCCCTTGCTTCATT SEQ ID NO:337 cebador delantero de ácido nucleico UBC humano TGCACTTGGTCCTGCGCTT SEQ ID NO: 338 cebador inverso de ácido nucléico UBC humano GGGAATGCAACAACTTTATTGAAA SEQ ID NO: 339 sonda de ácido nucleico UBC humano TGTCTAAGTTTCCCCTTTTA SEQ ID NO:340 cebador delantero de ácido nucleico VEGFD humano ATTGACATGCTATGGGATAGCAACA SEQ ID NO:341 cebador inverso de ácido nucléico VEGFD humano CTGGAGATGAGAGTGGTCTTCT SEQ ID NO:342 sonda de ácido nucleico VEGFD humano TGTGTTTTGCAGGAGGAAAATCCACTTGCTGGA SEQ ID NO:343 cebador delantero de ácido nucleico VEGFRl humano CTGGCAAGCGGTCTTACC SEQ ID NO:344 cebador inverso de ácido nucléico VEGFRl humano GCAGGTAACCCATCTTTTAACCATAC SEQ ID NO:345 sonda de ácido nucleico VEGFRl humano AAGTGAAGGCATTTCCCTCGCCGGAA SEQ ID NO:346 cebador delantero de ácido nucleico VEGFR2 humano AGG GAG TCT GTG GCA TCT G SEQ ID NO: 347 cebador inverso de ácido nucléico VEGFR2 humano GGA GTG ATA TCC GGA CTG GTA SEQ ID NO:348 sonda de ácido nucleico VEGFR2 humano AGG CTC AAA CCA GAC AAG CGG C SEQ ID NO: 349 cebador delantero de ácido nucleico NRP2 humano AGGACTGGATGGTGTACCG SEQ ID NO:350 cebador inverso de ácido nucléico NRP2 humano TTCAGAACCACCTCAGTTGC SEQ ID NO:351 sonda de ácido nucleico NRP2 humano CCACAAGGTATTTCAAGCCAACAACG SEQ ID NO: 352 cebador delantero de ácido nucleico Proxl humano TCAGATCACATTACGGGAGTTT SEQ ID NO: 353 cebador inverso de ácido nucléico Proxl humano CAGCTTGCAGATGACCTTGT SEQ ID NO: 354 sonda de ácido nucleico Proxl humano TCAATGCCATTATCGCAGGCAAA SEQ ID NO:355 cebador delantero de ácido nucleico VE-Cadherina (CD144, CDH5) humano ACA ATG TCC AAA CCC¦ ACT CAT G SEQ ID NO:356 cebador inverso de ácido nucléico VE-Cadherina (CD144, CDH5) humano GAT GTG ACA ACA GCG AGG TGT AA SEQ ID NO:357 sonda de ácido nucleico VE-Cadherina (CD144, CDH5) humano TGC ATG ACG GAG CCG AGC CAT SEQ ID NO:358 cebador delantero de ácido nucleico CD31/Pecam humano AGAAGCAAAATACTGACAGTCAGAG SEQ ID NO:359 cebador inverso de ácido nucléico CD31/Pecam humano GAG CAA TGA TCA CTC CGA TG SEQ ID NO: 360 sonda de ácido nucleico CD31/Pecam humano CTGCAATAAGTCCTTTCTTCCATGG SEQ ID NO:361 cebador delantero de ácido nucleico Col4al humano CTGGAGGACAGGGACCAC SEQ ID NO: 362 cebador inverso de ácido nucléico Col4al humano GGGAAACCCTTCTCTCCTTT SEQ ID NO: 363 sonda de ácido nucleico Col4al humano CCAGGAGGGCCTGACAACCC SEQ ID NO: 364 cebador delantero de ácido nucleico Col4al humano GCTACCCTGAGAAAGGTGGA 5 SEQ ID NO:365 cebador inverso de ácido nucléico Col4al humano GGGAATCCTTGTAATCCTGGT SEQ ID NO: 366 J Q sonda de ácido nucleico Col4a2 humano CACTGGCCCAGGCTGACCAC SEQ ID NO: 367 cebador delantero de ácido nucleico Col4a3 humano AGGAATCCCAGGAGTTGATG 15 SEQ ID NO:368 cebador inverso de ácido nucléico Col4a3 humano CCTGGGATATAAGGGCACTG SEQ ID NO:369 sonda de ácido nucleico Col4a3 humano 0 CCCAAAGGAGAACCAGGCCTCC SEQ ID NO: 370 cebador delantero de ácido nucleico Hhex humano ' CTCAGCGAGAGACAGGTCAA 5 SEQ ID NO: 371 cebador inverso de ácido nucléico Hhex humano TTTATTGCTTTGAGGGTTCTCC SEQ ID NO:372 sonda de ácido nucleico Hhex humano TCTCCTCCATTTAGCGCGTCGA SEQ ID NO:373 cebador delantero de ácido nucleico DLL4 humano AGGCCTGTTTTGTGACCAAGA SEQ ID NO: 374 cebador inverso de ácido nucléico DLL4 humano GAGCACGTTGCCCCATTCT SEQ ID NO:375 sonda de ácido nucleico DLL4 humano ACTGCACCCACCACT SEQ ID NO:376 cebador delantero de ácido nucleico PDGFRb humano CGGAAACGGCTCTACATCTT SEQ ID NO: 377 cebador inverso de ácido nucléico PDGFRb humano AGTTCCTCGGCATCATTAGG SEQ ID NO:378 sonda de ácido nucleico PDGFRb humano CCAGATCCCACCGTGGGCTT SEQ ID NO:379 cebador delantero de ácido nucleico RGS5 ACCAGCCAAGACCCAGAAA SEQ ID NO: 380 cebador inverso de ácido nucléico RGS5 humano GCAAGTCCATAGTTGTTCTGC SEQ ID NO:381 sonda de ácido nucleico RGS5 humano CACTGCAGGGCCTCGTCCAG SEQ ID NO:382 cebador delantero de ácido nucleico CCL2/ CP1 humano GAAGATCTCAGTGCAGAGGCT SEQ ID NO:383 cebador inverso de ácido nucléico CCL2/MCP1 humano TGAAGATCACAGCTTCTTTGG SEQ ID NO: 384 sonda de ácido nucleico CCL2/MCP1 humano CGCGAGCTATAGAAGAATCACCAGCA SEQ ID NO: 385 cebador delantero de ácido nucleico CCL5 humano TACACCAGTGGCAAGTGCTC SEQ ID NO:386 cebador inverso de ácido nucléico CCL5 humano CACACTTGGCGGTTCTTTC SEQ ID NO:387 sonda de ácido nucleico CCL5 humano CCCAGCAGTCGTCTTTGTCACCC SEQ ID NO:388 cebador delantero de ácido nucleico CXCL5/ENA-78 humano GACGGTGGAAACAAGGAAA SEQ ID NO:389 cebador inverso de ácido nucléico CXCL5/ENA-78 humano TCTCTGCTGAAGACTGGGAA SEQ ID NO:390 sonda de ácido nucleico CXCL5/ENA-78 humano TCCATGCGTGCTCATTTCTCTTAATCA SEQ ID NO:391 cebador delantero de ácido nucleico FGF8 humano GGCCAACAAGCGCATCA SEQ ID NO:392 cebador inverso de ácido nucléico FGF8 humano AAGGTGTCCGTCTCCACGAT · SEQ ID NO: 393 sonda de ácido nucleico FGF8 humano CCTTCGCAAAGCT SEQ ID NO: 394 cebador delantero de ácido nucleico FGF8 humano GCTGGTCCTCTGCCTCCAA SEQ ID NO: 395 cebador inverso de ácido nucléico FGF8 humano TCCCTCACATGCTGTGTAAAATTAG SEQ ID NO:396 sonda de ácido nucleico FGF8 humano CCCAGGTAACTGTTCAGT SEQ ID NO: 397 cebador delantero de ácido nucleico CXCL12/SDF1 humano TCTCAACACTCCAAACTGTGC SEQ ID NO: 398 sonda de ácido nucleico CXCL12 /SDF1 humano CCTTCAGATTGTAGCCCGGCTGA SEQ ID NO: 399 cebador delantero de ácido nucleico TGFbl humano TTTGATGTCACCGGAGTTGT SEQ ID NO:400 cebador inverso de ácido nucléico TGFbl humano GCGAAAGCCCTCAATTTC SEQ ID NO: 401 sonda de ácido nucleico TGFbl humano TCCACGGCTCAACCACTGCC SEQ ID NO: 402 cebador delantero de ácido nucleico BMP9 humano GGAGTAGAGGGAAGGAGCAG SEQ ID NO:403 cebador inverso de ácido nucléico BMP9 humano CTGGGTTGTGGGAAATAACA SEQ ID NO:404 sonda de ácido nucleico B P9 humano CCGCGTGTCACACCCATCATT SEQ "ID NO: 405 cebador delantero de ácido nucleico Sema3c humano GCCATTCCTGTTCCAGATTC SEQ ID NO:406 cebador inverso de ácido nucléico Sema3c humano TCAGTGGGTTTCCATGTCTC SEQ ID NO:407 sonda de ácido nucleico Sema3c humano TCGGCTCCTCCGTTTCCCAG SEQ ID NO:408 cebador delantero de ácido nucleico cMet humano CACCATAGCTAATCTTGGGACAT SEQ ID NO: 409 cebador inverso de ácido nucléico cMet humano TGATGGTCCTGATCGAGAAA SEQ ID NO:410 sonda de ácido nucleico cMet humano CCACAACCTGCATGAAGCGACC SEQ ID NO: 11 cebador delantero de ácido nucleico JAG1 humano CGGGAACATACTGCCATGAA SEQ ID NO:412 cebador inverso de ácido nucléico JAG1 humano GCAAGTGCCACCGTTTCTACA SEQ ID NO:413 sonda de ácido nucleico JAG1 humano ATGACTGTGAGAGCAAC SEQ ID NO:414 cebador delantero de ácido nucleico Notchl humano CACCTGCCTGGACCAGAT SEQ ID NO:415 cebador inverso de ácido nucléico Notchl humano · GTCTGTGTTGACCTCGCAGT SEQ ID NO: 416 sonda de ácido nucleico Notchl humano TCTGCATGCCCGGCTACGAG SEQ ID NO:417 cebador delantero de ácido nucleico EphB4 humano TCTGAAGTGGGTGACATTCC SEQ ID NO:418 cebador inverso de ácido nucléico EphB4 humano CTGTGCTGTTCCTCATCCAG SEQ ID NO:419 sonda de ácido nucleico EphB4 humano CTCCCACTGCCCGTCCACCT SEQ ID NO: 420 cebador delantero de ácido nucleico EFNB2 humano ATCCAGGTTCTAGCACAGACG SEQ ID NO:421 cebador inverso de ácido nucléico EFNB2 humano TGAAGCAATCCCTGCAAATA SEQ ID NO:422 sonda de ácido nucleico EFNB2 humano TCCTCGGTTCCGAAGTGGCC SEQ ID NO: 423 cebador delantero de ácido nucleico FN1_EIIIA humano GAATCCAAGCGGAGAGAGTC SEQ ID NO:424 cebador inverso de ácido nucléico FN1_EIIIA humano ACATCAGTGAATGCCAGTCC SEQ ID NO:425 sonda de ácido nucleico FN1 EIIIA humano TGCAGTAACCAACATTGATCGCCC SEQ ID NO:426 cebador delantero de ácido nucleico EFEMP2 humano GATCAGCTTCTCCTCAGGATTC SEQ ID NO:427 cebador inverso de ácido nucléico EFEMP2 humano TGTCTGGGTCCCACTCATAG SEQ ID NO:428 sonda de ácido nucleico EFEMP2 humano CCCGACAGCTACACGGAATGCA SEQ ID NO:429 cebador delantero de ácido nucleico FBLN2 humano GAGCCAAGGAGGGTGAGAC SEQ ID NO: 430 cebador inverso de ácido nucléico FBLN2 humano CCACAGCAGTCACAGCATT SEQ ID NO: 31 sonda de ácido nucleico FBLN2 humano ACGACAGCTGCGGCATCTCC SEQ ID NO:432 cebador delantero de ácido nucleico MFAP5 humano AGGAGATCTGCTCTCGTCTTG SEQ ID NO: 433 cebador inverso de ácido nucléico MFAP5 humano AGCCATCTGACGGCAAAG SEQ ID NO:434 sonda de ácido nucleico MFAP5 humano CTCATCTTTCATAGCTTCGTGTTCCTT SEQ ID NO: 435 cebador delantero de ácido nucleico LyPD6 humano AGAGACTCCGAGCATGAAGG SEQ ID NO:436 cebador inverso de ácido nucléico LyPD6 humano GGGCAGTGGCAAGTTACAG SEQ ID NO:437 sonda de ácido nucleico LyPD6 humano CCACAAGGTCTGCACTTCTTGTTGTG SEQ ID NO: 438 cebador delantero de ácido nucleico Map4k4 humano TTCTCCATCTAGCGGAACAACA SEQ ID NO:439 cebador inverso de ácido nucléico Map4k4 humano GGTCTCATCCCATCACAGGAA SEQ ID NO:440 sonda de ácido nucleico Map4k4 humano TGACATCTGTGGTGGGAT SEQ ID NO:441 cebador delantero de ácido nucleico FRAS1 humano TACTTGGAGAGCACTGGCAT SEQ ID NO: 442 cebador inverso de ácido nucléico FRAS1 humano CTGTGCAGTTATGTGGGCTT SEQ ID NO:443 sonda de ácido nucleico FRAS1 humano TGTGAAGCTTGCCACCAGTCCTG SEQ ID NO:444 cebador delantero de ácido nucleico ACTB murino GCAAGCAGGAGTACGATGAG SEQ ID NO: 445 cebador inverso de ácido nucléico ACTB murino TAACAGTCCGCCTAGAAGCA SEQ ID NO:446 sonda de ácido nucleico ACTB murino CCTCCATCGTGCACCGCAAG SEQ ID NO: 447 cebador delantero de ácido nucleico HMBS murino CTCCCACTCAGAACCTCCTT SEQ ID NO:448 cebador inverso de ácido nucléico HMBS murino AGCAGCAACAGGACACTGAG SEQ ID NO:449 sonda de ácido nucleico HMBS murino CCCAAAGCCCAGCCTGGC SEQ ID NO:450 cebador delantero de ácido nucleico SDHA murino CTACAAGGGACAGGTGCTGA SEQ ID NO:451 cebador inverso de ácido nucléico SDHA murino GAGAGAATTTGCTCCAAGCC' SEQ ID NO:452 sonda de ácido nucleico SDHA murino CCTGCGCCTCAGTGCATGGT SEQ ID NO: 453 cebador delantero de ácido nucleico VEGFD murino ATG CTG TGG GAT AAC ACC AA SEQ ID NO:454 cebador inverso de ácido nucléico VEGFD murino GTG GGT TCC TGG AGG .TAA GA SEQ ID NO:455 sonda de ácido nucleico VEGFD murino CGA GAC TCC ACT GCC TGG GAC A SEQ ID NO:4b6 cebador delantero de ácido nucleico Bv8 murino AAAGTCATGTTGCAAATGGAAG SEQ ID NO:457 cebador inverso de ácido nucléico Bv8 murino AATGGAACCTCCTTCTTCCTC SEQ ID NO:458 sonda de ácido nucleico Bv8 murino TCTTCGCCCTTCTTCTTTCCTGC SEQ ID NO:459 cebador delantero de ácido nucleico NRPl murino CTCAGGTGGAGTGTGCTGAC SEQ ID NO: 460 cebador inverso de ácido nucléico NRPl murino TTGCCATCTCCTGTATGGTC SEQ ID NO: 461 sonda de ácido nucleico NRPl murino CTGAATCGGCCCTGTCTTGCTG ' SEQ ID NO: 62 cebador delantero de ácido nucleico NRPl murino CTACTGGGCTGTGAAGTGGA SEQ ID NO: 463 cebador inverso de ácido nucléico NRPl murino CACACTCATCCACTGGGTTC SEQ ID NO: 464 sonda de ácido nucleico NRP1 raurino CAGCTGGACCAACCACACCCA SEQ ID NO:465 cebador delantero de ácido nucleico NRP2 murino GCATTATCCTGCCCAGCTAT SEQ ID NO:466 cebador inverso de ácido nucléico NRP2 murino GATCGTCCCTTCCCTATCAC SEQ ID NO:467 sonda de ácido nucleico NRP2 murino TCCCTCGAACACGATCTGATACTCCA SEQ ID NO:468 cebador delantero de ácido nucleico Proxl murino CGGACGTGAAGTTCAACAGA SEQ ID NO:469 cebador inverso de ácido nucléico Proxl murino ACGCGCATACTTCTCCATCT SEQ ID NO:470 sonda de ácido nucleico Proxl murino CGCAGCTCATCAAGTGGTTCAGC SEQ ID NO:471 cebador delantero de ácido nucleico CD34 murino murino CCTGGAAGTACCAGCCACTAC SEQ ID NO: 472 cebador inverso de ácido nucléico CD34 murino murino GGGTAGCTGTAAAGTTGACCGT SEQ ID NO: 473 CD34 sonda de ácido nucleico CD34 murino murino ACCACACCAGCCATCTCAGAGACC SEQ ID NO:474 cebador delantero de ácido nucleico FGF8b murino CAGGTCTCTACATCTGCATGAAC SEQ ID NO:475 cebador inverso de ácido nucléico FGF8b murino AATACGCAGTCCTTGCCTTT SEQ ID NO:476 sonda de ácido nucleico FGF8b murino AAGCTAATTGCCAAGAGCAACGGC SEQ ID NO:477 cebador delantero de ácido nucleico FGF8b murino CTGCCTGCTGTTGCACTT SEQ ID NO: 478 cebador inverso de ácido nucléico FGF8b murino TTAGGTGAGGACTGAACAGTTACC SEQ ID NO:479 'sonda de ácido nucleico FGF8b murino CTGGTTCTCTGCCTCCAAGCCC SEQ ID NO:480 cebador delantero de ácido nucleico CXCL2 murino ACATCCAGAGCTTGAGTGTGA SEQ ID NO: 81 cebador inverso de ácido nucléico CXCL2 murino GCCCTTGAGAGTGGCTATG SEQ ID NO:482 sonda de ácido nucleico CXCL2 murino CCCACTGCGCCCAGACAGAA SEQ ID NO:483 cebador delantero de ácido nucleico CCL5 murino GCCCACGTCAAGGAGTATTT SEQ ID NO:484 cebador inverso de ácido nucléico CCL5 murino TCGAGTGACAAACACGACTG SEQ ID NO:485 sonda de ácido nucleico CCL5 murino CACCAGCAGCAAGTGCTCCAATC SEQ ID NO:486 cebador delantero de ácido nucleico TNFa murino CAGACCCTCACACTC GATCA SEQ ID NO: 487 cebador delantero de ácido nucleico Sema3b murino AGTACCTGGAGTTGAGGGTGA ,SEQ ID NO: 488 cebador inverso de ácido nucléico Sema3b murino GTCTCGGGAGGACAGAAGG SEQ ID NO:489 sonda de ácido nucleico Sema3b murino CACCCACTTTGACCAACTTCAGGATG SEQ ID NO:490 cebador delantero de ácido nucleico PDGFC murino CCATGAGGTCCTTCAGTTGAG SEQ ID NO:491 cebador inverso de ácido nucléico PDGFC murino TCCTGCGTTTCCTCTACACA SEQ ID NO:492 sonda de ácido nucleico PDGFC murino CCTCGTGGTGTTCCAGAGCCA SEQ ID NO: 493 cebador delantero de ácido nucleico Angl murino CACGAAGGATGCTGATAACG SEQ ID NO:494 cebador inverso de ácido nucléico Angl murino ACCACCAACCTCCTGTTAGC SEQ ID NO: 495 sonda de ácido nucleico Angl murino CAACTGTATGTGCAAATGCGCTCTCA SEQ ID NO:496 cebador delantero de ácido nucleico Ang2 murino CACAAAGGATTCGGACAATG SEQ ID NO:497 cebador inverso de ácido nucléico Ang2 murino AAGTTGGAAGGAGCACATGC SEQ ID NO: 498 sonda de ácido nucleico Ang2 murino CAAACCACCAGCCTCCTGAGAGC SEQ ID NO:499 cebador delantero de ácido nucleico BMP9 murino CTTCAGCGTGGAAGATGCTA .
SEQ ID NO:500 cebador inverso de ácido nucléico BMP9 murino TGGCAGGAGACATAGAGTCG SEQ ID NO: 501 sonda de ácido nucleico BMP9 murino CGACAGCTGCCACGGAGGAC SEQ ID NO: 502 cebador delantero de ácido nucleico BMP10 murino CCATGCCGTCTGCTAACAT SEQ ID NO:503 cebador inverso de ácido nucléico BMP10 murino GATATTTCCGGAGCCCATTA SEQ ID NO: 504 sonda de ácido nucleico BMP10 murino CAGATCTTCGTTCTTGAAGCTCCGG SEQ ID NO:505 cebador delantero de ácido nucleico cMet murino ACGTCAGAAGGTCGCTTCA SEQ ID NO:506 cebador inverso de ácido nucléico cMet murino ACATGAGGAGTGAGGTGTGC SEQ ID NO:507 sonda de ácido nucleico cMet murino TGTTCGAGAGAGCACCACCTGCA SEQ ID NO: 508 cebador delantero de ácido nucleico CXCR4 murino TGTAGAGCGAGTGTTGCCA SEQ ID NO: 509 cebador inverso de ácido nucléico CXCR4 murino CCAGAACCCACTTCTTCAGAG SEQ ID NO: 510 sonda de ácido nucleico CXCR4 murino TGTATATACTCACACTGATCGGTTCCA SEQ ID NO: 511 cebador delantero de ácido nucleico DLL4 murino ATGCCTGGGAAGTATCCTCA SEQ ID NO: 512 cebador inverso de ácido nucleico DLL4 murino GGCTTCTCACTGTGTAACCG SEQ ID NO: 513 sonda de ácido nucleico DLL4 murino TGGCACCTTCTCTCCTAAGCTCTTGTC SEQ ID NO:514 cebador delantero de ácido nucleico JAG1 murino ACATAGCCTGTGAGCCTTCC SEQ ID NO:515 cebador inverso de ácido nucléico JAG1 murino CTTGACAGGGTTCCCATCAT SEQ ID NO:516 sonda de ácido nucleico JAG1 murino CGTGGCCATCTCTGCAGAAGACA SEQ ID NO: 517 cebador delantero de ácido nucleico EFNB2 murino GTCCAACAAGACGTCCAGAG SEQ ID NO: 518 cebador inverso de ácido nucléico EFNB2 murino CGGTGCTAGAACCTGGATTT SEQ ID NO:519 sonda de ácido nucleico EFNB2 murino TCAACAACAAGTCCCTTTGTGAAGCC SEQ ID NO: 520 cebador delantero de ácido nucleico EFNB2 murino TTGGACAAGATGCAAGTTCTG SEQ ID NO:521 cebador inverso de ácido nucléico EFNB2 murino TCTCCCATTTGTACCAGCTTC SEQ ID NO:522 sonda de ácido nucleico EFNB2 murino TCAGCCAGGAATCACGGTCCA SEQ ID NO:523 cebador delantero de ácido nucleico Notchl murino CACTGCATGGACAAGA CAA SEQ ID NO: 524 Notchl cebador inverso de ácido nucléico Notchl murino TCATCCACATCATACTGGCA SEQ ID NO: 525 sonda de ácido nucleico Notchl murino CCCAAAGGCTTCAACGGGCA SEQ ID NO:526 cebador delantero de ácido nucleico TIE2 murino CACGAAGGATGCTGATAACG SEQ ID NO: 527 cebador inverso de ácido nucléico TIE2 murino ACCACCAACCTCCTGTTAGC SEQ ID NO:528 sonda de ácido nucleico TIE2 murino CAACTGTATGTGCAAATGCGCTCTCA SEQ ID NO:529 cebador delantero de ácido nucleico EphA3 murino TTGCAATGCTGGGTATGAAG SEQ ID NO: 530 cebador inverso de ácido nucléico EphA3 AGCCTTGTAGAAGCCTGGTC SEQ ID NO:531 sonda de ácido nucleico EphA3 murino AACGAGGTTTCATATGCCAAGCTTGTC SEQ ID NO: 532 cebador delantero de ácido nucleico Bcl2Al murino CAGAATTCATAATGAATAACACAGGA SEQ ID NO: 533 cebador inverso de ácido nucléico Bcl2Al murino CAGCCAGCCAGATTTGG SEQ ID NO:534 sonda de ácido nucleico Bcl2Al murino GAATGGAGGTTGGGAAGATGGCTTC SEQ ID NO: 535 cebador delantero de ácido nucleico ap4k4 murino TTGCCACGTACTATGGTGCT SEQ ID NO:536 cebador inverso de ácido nucléico ap4k4 murino CCATAACAAGCCAGAGTTGG SEQ ID NO: 5437 sonda de ácido nucleico ap4k4 murino TCATCATGTCCTGGAGGGCTCTTCT SEQ ID NO: 538 cebador delantero de ácido nucleico ANTXR2 murino TGGGAAGTCTGCTGTCTCAA SEQ ID NO: 539 cebador inverso de ácido nucléico ANTXR2 murino AATAGCTACGATGGCTGCAA SEQ ID NO:540 sonda de ácido nucleico ANTXR2 murino CACAGCCACAGAATGTACCAATGGG SEQ ID NO:541 cebador delantero de ácido nucleico IGFBP4 murino CCCTGCGTACATTGATGC SEQ ID NO: 542 cebador inverso de ácido nucléico IGFBP4 murino GCTCTCATCCTTGTCAGAGGT SEQ ID NO:543 sonda de ácido nucleico IGFBP4 murino ACAGCTCCGTGCACACGCCT SEQ ID NO:544 cebador delantero de ácido nucleico FGFR4 murino GAGGCATGCAGTATCTGGAG SEQ ID NO:545 cebador inverso de ácido nucléico FGFR4 murino CTCGGTCACCAGCACATTT SEQ ID NO: 546 sonda de ácido nucleico FGFR4 murino CTCGGAAGTGCATCCACCGG SEQ ID NO: 547 cebador delantero de ácido nucleico CLECSF5/CLEC5a murino GTACGTCAGCCTGGAGAGAA SEQ ID NO: 548 cebador inverso de ácido nucléico CLECSF5/CLEC5a murino ATTGGTAACATTGCCATTGAAC SEQ ID NO: 549 sonda de ácido nucleico CLECSF5/CLEC5a murino AAAGTGGCGCTGGATCAACAACTCT SEQ ID NO: 550 cebador delantero de ácido nucleico Mincle/CLECSF9 murino GAATGAATTCAACCAAATCGC SEQ ID NO:551 cebador inverso de ácido nucléico Mincle/CLECSF9 murino CAGGAGAGCACTTGGGAGTT SEQ ID NO: 552 sonda de ácido nucleico Mincle/CLECSF9 murino TCCCACCACACAGAGAGAGGATGC SEQ ID NO:553 cebador delantero de ácido nucleico FBLN2/fibulin2 murino TTGTCCACCCAACTATGTCC SEQ ID NO:554 cebador inverso de ácido nucléico FBLN2/fibulin2 murino CGTGATATCCTGGCATGTG SEQ ID NO: 555 sonda de ácido nucleico FBLN2/fibulin2 murino TGCGCTCGCACTTCGTTTCTG SEQ ID NO:556 cebador delantero de ácido nucleico Egfl7 murino AGCCTTACCTCACCACTTGC SEQ ID NO: 557 cebador inverso de ácido nucléico Egfl7 murino ATAGGCAGTCCGGTAGATGG SEQ ID NO: 558 sonda de ácido nucleico Egfl7 raurino CGGACACAGAGCCTGCAGCA SEQ ID NO:559 cebador delantero de ácido nucleico LAMA murino ATTCCCATGAGTGCTTGGAT SEQ ID NO:560 cebador inverso de ácido nucléico LAMA4 murino CACAGTGCTCTCCTGTTGTGT SEQ ID NO:561 sonda de ácido nucleico LAMA murino CTGTCTGCACTGCCAGCGGA SEQ ID NO: 562 cebador delantero de ácido nucleico NID2 murino GCAGATCACTTCTACCACACG SEQ ID NO: 563 cebador inverso de ácido nucléico NID2 murino CTGGCCACTGTCCTTATTCA SEQ ID NO: 564 sonda de ácido nucleico NID2 murino TGATATAACACCATCCCTCCGCCA SEQ ID NO: 565 cebador delantero de ácido nucleico FRAS1 murino GGC AAT AAA CCG AGG ACT TC SEQ ID NO: 566 cebador inverso de ácido nucléico FRAS1 murino TCA AGT GCT GCT CTG TGA TG SEQ ID NO: 567 sonda de ácido nucleico FRAS1 murino CGT GCT ACG GAC CCT GCT GAA A SEQ ID NO: 568 cebador delantero de ácido nucleico PLC/HSPG2 murino GAGACAAGGTGGCAGCCTAT SEQ ID NO: 569 cebador inverso de ácido nucléico PLC/HSPG2 murino TGTTATTGCCCGTAATCTGG SEQ ID NO: 570 sonda de ácido nucleico PLC/HSPG2 murino CGGGAAGCTGCGGTACACCC SEQ ID NO:571 cebador delantero de ácido nucleico hPTGS2 humano GCTGGAACATGGAATTACCC SEQ ID NO: 572 hPTGS2 cebador inverso de ácido nucléico hPTGS2 humano GTACTGCGGGTGGAACATT SEQ ID NO:573 sonda de ácido nucleico hPTGS2 humano ACCAGCAACCCTGCCAGCAA SEQ ID NO: 574 cebador delantero de ácido nucleico PDGFA humano GTCCATGCCACTAAGCATGT SEQ ID NO:575 cebador inverso de ácido nucléico PDGFA humano ACAGCTTCCTCGATGCTTCT SEQ ID NO:576 sonda de ácido nucleico PDGFA humano CCCTGCCCATTCGGAGGAAG

Claims (45)

REIVINDICACIONES
1. Un método para identificar un paciente que se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer diferente de o además de un antagonista de VEGF-A, el método está caracterizado porque comprende: determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen resumido en la Tabla 1 en una muestra obtenida del paciente, en donde un nivel de expresión incrementado del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con la terapia anti-cáncer.
2. Un método para identificar un paciente que se puede beneficiar del tratamiento con una terapia anti-cáncer diferente de o además de un antagonista de VEGF-A, el método está caracterizado porque comprende: determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen resumido en la Tabla 1 en una muestra obtenida del paciente, en donde un nivel de expresión disminuido del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con la terapia anti-cáncer.
3. Un método para optimizar la eficacia terapéutica para tratamiento de cáncer, el método está caracterizado porque comprende : determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen resumido en la Tabla 1 en una muestra obtenida del paciente, en donde un nivel de expresión incrementado del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de la terapia anti-cáncer diferente de o además de un antagonista de VEGF-A.
4. Un método para optimizar la eficacia terapéutica para tratamiento de cáncer, el método está caracterizado porque comprende : determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen resumido en la Tabla 1 en una muestra obtenida del paciente, en donde un nivel de expresión disminuido del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse .de la terapia anti-cáncer diferente de o además de un antagonista de VEGF-A.
5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la muestra obtenida del paciente es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: tejido, sangre entera, células derivadas de la sangre, plasma, suero y combinaciones de los mismos.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el nivel de expresión es seleccionado del nivel de expresión de mARN, nivel de expresión de proteina y combinaciones de los mismos.
7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque además detectar la expresión de por lo menos un segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto, séptimo octavo, noveno o décimo gen resumido en la Tabla 1.
8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque comprende además administrar una cantidad efectiva de la terapia anti-cáncer diferente de un antagonista de VEGF-A al paciente.
9. El método de la reivindicación 8, caracterizado porque la terapia anti-cáncer es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: un anticuerpo, una molécula pequeña y un siARN.
10. El método de la reivindicación 8, caracterizado porque la terapia anti-cáncer es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: un antagonista de EGFL7, un antagonista de NRP1 y un antagonista de VEGF-C.
11. El método de la reivindicación 10, caracterizado porque el antagonista de EGFL7 es un anticuerpo.
12. El método de la reivindicación 10, caracterizado porque el antagonista de NRP1 es un anticuerpo.
13. El método de la reivindicación 10, caracterizado porque el antagonista de VEGF-C es un anticuerpo.
14. El método de la reivindicación 8, caracterizado porque comprende además administrar el antagonista de VEGF-A al paciente.
15. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque el antagonista de VEGF-A es un anticuerpo anti-VEGF-A. ¦
16. El método de la reivindicación 15, caracterizado porque el anticuerpo anti-VEGF-A es bevacizumab.
17. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque la terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados concurrentemente.
18. El método de la reivindicación 14, caracterizado porque la terapia anti-cáncer y el antagonista de VEGF-A son administrados secuencialmente .
19. Un método para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista del múltiplo 7 de dominio semejante a EGF (EGFL7), el método está caracterizado porque comprende: determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de VEGF-C, BV8 , CSF2, TNF , CXCL2, PDGF-C y Mínele en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
20. Un método para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de EGFL7, el método está caracterizado porque comprende : determinarlos niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de: Sema3B, FGF9, HGF, RGS5, NRP1, FGF2 , CXCR , cMet, FN1, Fibulin 2, Fibulin4/EFEMP2, MFAP5, PDGF-C, Sema3F y FN1 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
21. Un método para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de EGFL7, el método está caracterizado porque comprende : determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de: VEGF-C, BV8, CSF2, TNFa, CXCL2, PDGF-C y Mínele en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de ' beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
22. Un método para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de EGFL7, el método está caracterizado porque comprende : determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de: Sema3B, FGF9, HGF, RGS5, NRP1, FGF2 , CXCR4 , cMet, FN1, Fibulin 2, Fibulin /EFE P2 , MFAP5, PDGF-C, Sema3F y FN1 en una muestra obtenida de un paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos del por lo menos un. gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tienen probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de EGFL7.
23. Un método para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente, el método está caracterizado porque comprende: determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión incrementados, en comparación con una muestra de referencia, del por lo menos un gen seleccionado ' del grupo que consiste de VEGF-C, BV8 , CSF2, TNFOÍ, CXCL2, PDGF- C y Mínele y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
24. Un método para tratamiento de una alteración proliferativa · celular en un paciente, el método está caracterizado porque comprende: determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión disminuidos, en comparación con una muestra de referencia, de por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de: Sema3B, FGF9, HGF, RGS5, NRP1, FGF2, CXCR4, cMet, FN1, Fibulin 2, Fibulin4 /EFE P2 , MFAP5 , PDGF-C, Sema3F y FN1 y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de EGFL7, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 19, 20, 21 ó 22, caracterizado porque comprende además administrar un antagonista de EGFL7 al paciente.
26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 23, 24 ó 25, caracterizado porque el antagonista de EGFL7 es un anticuerpo anti-EGFL7.
27. El método de la reivindicación 23, 24 ó 25, caracterizado porque el método comprende además administrar un antagonista de VEGF-A al paciente.
28. Un método para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista del factor C de crecimiento endotelial vascular (VEGF-C) , el método está caracterizado porque comprende: determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de VEGF-C, VEGF-D, VEGFR3, FGF2, RGS5/CDH5, IL-8, CXCL1 y CXCL2 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, · indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
29. Un método para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de VEGF-C, el método está caracterizado porque comprende: determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de: VEGF-A, CSF2, Proxl, ICAM1, ES 1, P1GF, ITGa5, 7GF , Hhex, Col4al, Col4a2 y Alkl en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con antagonista de VEGF-C.
30. Un método para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de VEGF-C, el método está caracterizado porque comprende: determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de: VEGF-C, VEGF-D, VEGFR3, FGF2, RGS5/CDH5, IL-8, CXCL1 y CXCL2 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse de tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
31. Un método para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de VEGF-C, el método está caracterizado porque comprende: determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de: VEGF-A, CSF2, Proxl, ICAM1, ESM1, P1GF, ITGa5, GF , Hhex, Col4al, Col4a2 y Alkl en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de VEGF-C.
32. Un método para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente, el método está caracterizado porque comprende: determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión incrementados, en comparación con una muestra de referencia, de por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de: VEGF-C, VEGF-D, VEGFR3 , FGF2, RGS5/CDH5, IL-8, CXCL1 y CXCL2 y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de VEGF-C, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
33. Un método para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente, el método está caracterizado porque comprende: determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión disminuidos, en comparación con una muestra de referencia, de por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de: VEGF-A, CSF2, Proxl, ICA 1, ESM1, P1GF, ITGa5 , TGF , Hhex, Col4al, Col4a2 y Alkl y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de VEGF-C, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
34. El método de cualquiera de las reivindicaciones 28, 29, 30 ó 31, caracterizado porque comprende además administrar un antagonista de VEGF-C al paciente.
35. El método de cualquiera de las reivindicaciones 32, 33 ó 34, caracterizado porque el antagonista de VEGF-C es un anticuerpo anti-VEGF-C.
36. El método de la reivindicación 32, 33 ó 34, caracterizado porque el método comprende además administrar un antagonista de VEGF-A al paciente.
37. Un método para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de , neuropilin-1 (NRP1), el método está caracterizado porque comprende: determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de: TGF l, Bv8 , Sema3A, P1GF, LGALS1, ITGa5, CSF2, Vimentin, CXCL5, CCL2, CXCL2, Alkl y FGF8 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con el antagonista de NRP1.
38. Un método para identificar un paciente que sufre de cáncer que se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de. neüropilin-1 (NRP1), el método está caracterizado porque comprende: determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de: Proxl, RGS5, HGF, Sema3B, Sema3F, LGALS7, FGRF4 , PLC, IGFB4 y TSP1 en una obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente se puede beneficiar del tratamiento con un antagonista de NRP1.
39. Un método para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de NRP1, el método está caracterizado porque comprende : determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de: TGFpi, Bv8, Sema3A, P1GF, LGALS1, ITGa5, CSF2, Vi entin, CXCL5, CCL2, CXCL2, Alkl y FGF8 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión incrementados del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de NRPl.
40. Un método para optimizar la eficacia terapéutica de un antagonista de NRPl, el método está caracterizado porque comprende : determinar los niveles de expresión de por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de: Proxl, RGS5, HGF, Sema3B, Sema3F, LGALS7, FGRF4 , PLC, IGFB4 y TSP1 en una muestra obtenida del paciente, en donde los niveles de expresión disminuidos del por lo menos un gen en la muestra, en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente tiene probabilidad incrementada de beneficiarse del tratamiento con el antagonista de NRPl.
41. Un método para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente, el método está caracterizado porque comprende: determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión incrementados, en comparación con una muestra de referencia, de por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de: TGFpl, Bv8, Sema3A, P1GF, LGALS1, ITGa5, CSF2, Vimentin, CXCL5, CCL2, CXCL2, Alkl y FGF8, y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de NRPl, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
42. Un método para el tratamiento de una alteración proliferativa celular en un paciente, el método está caracterizado porque comprende: determinar que una muestra obtenida del paciente tiene niveles de expresión disminuidos, en comparación con una muestra de referencia, de por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de: Proxl, RGS5, HGF, Sema3B, Sema3F, LGALS7, FGRF4, PLC, IGFB4 y TSP1 y administrar al paciente una cantidad efectiva de un antagonista de NRPl, mediante lo cual la alteración proliferativa celular es tratada.
43. El método de cualquiera de las reivindicaciones 37, 38, 39 ó 40, caracterizado porque comprende además administrar un antagonista de NRPl al paciente.
44. El método de cualquiera de las reivindicaciones 41, 42 ó 43, caracterizado porque el antagonista de NRPl es un anticuerpo anti-NRPl.
45. El método de la reivindicación 41, 42 ó 43, caracterizado porque el método comprende además administrar un antagonista de VEGF-A al paciente.
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