CN106282376A - 一种用于检测bmp9基因表达的反义rna探针 - Google Patents

一种用于检测bmp9基因表达的反义rna探针 Download PDF

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葛盛芳
范先群
张赫
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation

Abstract

本发明公开了一种利用原位杂交检测BMP9基因mRNA表达的反义RNA探针，该反义RNA探针长318bp，信号强、特异性强。本发明制备的地高辛标记的BMP9基因反义mRNA探针，为进一步探究BMP9基因的性质和细胞亚群定位打下了基础。

Description

一种用于检测BMP9基因表达的反义RNA探针
技术领域
本发明属于分子检测领域，涉及一种用于检测BMP9基因表达的反义RNA探针。
背景技术
BMP9分子是一个相对分子质量为32000的蛋白，主要由肝脏表达。国内外研究发现BMP9和多种生物学现象相关，如异位骨形成，糖和脂肪代谢，肿瘤增殖等。但是，BMP9分子在小鼠中胚胎早期时空表达模式、BMP9mRNA在不同疾病中表达水平变化、BMP9的细胞表达来源定位等研究目前尚未阐明，原因之一是相关研究工具的缺乏，因为常用的寡核苷酸探针不适合于检测BMP9基因表达的原位杂交(ISH，in situ hybridization)，而免疫组织化学(IHC)检测受蛋白表达滞后性和无商品化抗体的影响，应用也受到限制。为此本研究目的是构建制备地高辛标记的小鼠BMP9分子的反义mRNA探针，可用于上述领域研究，为进一步探究BMP9基因的性质和细胞亚群定位打下基础。
原位杂交探针有双链DNA探针、单链cDNA探针和RNA探针。其中RNA探针制作过程要求很高，因为要防止RNA酶污染，但是RNA探针与靶序列的结合里是最强的，阳性信号比较可信，特异性高。RNA探针一般都是单链，它具有单链DNA探针的优点，又具有许多DNA单链探针所没有的优点，主要是：RNA：DNA杂交体比DNA：DNA杂交体有更高的稳定性，所以在杂交反应中RNA探针比相同比活性的DNA探针所产生信号要强。RNA：RNA杂交体用RNA酶A酶切比S1酶切DNA：RNA杂交体容易控制，所以用RNA探针进行RNA结构分析比用DNA探针效果好。而DNA探针虽然合成简单不易降解，但是杂交之前标本需要变性，制作过程中还需注意探针之间又复性变成双链的问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种利用原位杂交法检测BMP9基因表达的反义RNA探针，该反义RNA探针信号强、特异性强，是理想的原位基因mRNA表达的检测工具。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了一种用于检测BMP9基因表达的反义RNA探针，所述反义RNA探针序列如SEQ ID NO.7所示。
进一步，所述反义RNA探针上结合了标记物。
进一步，所述标记物包括放射性标记物、非放射性标记物。放射性标志物包括但不限于32P、35S、3H；非放射性标志物包括但不限于半抗原、酶类、荧光物质、化学发光物质。
所述半抗原包括生物素、地高辛。在本发明的具体实施方案中，所述半抗原采用的是地高辛。
所述酶类包括辣根过氧化物酶(HRP)、半乳糖苷酶或碱性磷酸酶(AKP)。
所述荧光物质包括异硫氰酸荧光素、四甲基异硫氰酸罗丹明、四乙基罗丹明得克萨斯红、藻红蛋白、花青类染料(cy3/cy5)、新型荧光素如量子点(半导体纳米晶体)。
本发明还提供了一种检测BMP9基因表达的工具，所述工具包括前面所述的反义RNA探针。
进一步，所述工具包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。其中，高通量测序平台是一类比较特殊的检测工具，通过基因的RNA探针大批量的检测目标基因mRNA的表达量。
本发明提供了一种检测BMP9基因表达的原位杂交方法，所述方法包括以下步骤：将前面所述的反义RNA探针与组织试样中表达的BMP9基因mRNA杂交；通过检测结合在所述反义RNA探针上的标记物来鉴定BMP9基因mRNA的存在。
进一步，所述组织试样是从哺乳动物分离的组织。在本发明的具体实施方案中，所述哺乳动物是小鼠。
本发明所述的原位杂交体系和条件为本领域技术人员所熟知。
本发明还提供了一种前面所述的反义RNA探针在制备上述检测BMP9基因表达的工具中的应用。
进一步，所述工具是利用原位杂交的方法来检测组织试样中BMP9基因表达。
进一步，所述组织试样是从哺乳动物组织分离的组织。
本发明的反义RNA标记的方法为本领域技术人员所熟知的方法。在现有技术中，RNA探针标记的方法包括直接标记法、加尾标记法、基于逆转录反应的标记方法、基于RNA克隆扩增的标记方法。
地高辛标记RNA探针最常用的方法是：将DIG与UTP共价结合形成DIG-UTP，以DIG-UTP、ATP、CTP、GTP为底物通过RNA聚合酶T7、SP6经体外转录合成标记RNA。此法多用于RNA探针的制备，一般每20-25个核苷酸可引入一个地高辛分子。
制备本发明的RNA探针的常用方法是构建含探针标记模板的重组质粒，将克隆子的转录区下游进行限制性酶切线性化后，进行体外转录的探针合成反应。当然，采用的质粒上必须含有SP6，T3或T7RNA聚合酶的启动子序列。体外转录法合成的探针量很大，通常情况下，1μg的DNA模板进行反应，将得到20μg的标记RNA探针。
另一种更加直接的体外转录标记法，是先通过PCR方法制备DNA探针模板。扩增引物需要特殊设计，包含SP6，T3或T7RNA聚合酶的启动子序列。
本发明的优点和有益效果：
本发明公开了一种可用于原位杂交的反义RNA探针，该反义RNA探针在通过原位杂交方法进行BMP9基因表达检测时具有特异性强，灵敏度强的优点。
本发明将BMP9基因原位表达的情况转变成可见的底物显色的信号，达到直观、良好的原位检测效果。
本发明的反义RNA探针使用了地高辛标记，具有较高的灵敏度。与同位素标记比较，使用不需要特殊的设备和人员培训，操作简单安全。标记好的探针由于不受放射衰变的影响，可以较长时间保存，使用方便。
附图说明
图1显示利用琼脂糖凝胶电泳检测BMP9基因片段的PCR产物；
图2显示利用琼脂糖凝胶电泳分离出作为探针合成模板的线性化质粒；
图3显示利用琼脂糖凝胶电泳检测反义RNA探针和正义RNA探针；
图4显示利用原位杂交的方法验证RNA探针检测BMP9基因mRNA表达的效果；
其中，A：444bp反义RNA探针；B：444bp正义RNA探针；C：318bp反义RNA探针；D：318bp正义RNA探针。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实验动物、试剂及仪器：
C57小鼠购自南方模式动物中心；RNA提取用TRIZOL、Ladder、DEPC-Treat-Water，Premix Taq酶，Power SYBR Green PCR Master Mix kit购自Life Technologies公司；DIGRNA Labeling Kit(SP6/T7)购自Roche公司；限制性内切酶NcoI，SpeI购自AEB公司；pGM-Teasy克隆试剂盒、质粒提取试剂盒及DNA纯化试剂盒购自Promega；PCR引物合成由上海生工公司完成；其他试剂均为国产分析纯试剂；台式高速低温离心机(Beckman)；紫外/可见光分光光度计(Backman DU530)；PCR扩增仪(PE9600)；凝胶成像分析系统(EDAS120，KODAK)；多功能恒温恒压恒流电泳系统(BioRad)，Nanodrop2000(Thermo)；生物安全柜(Frontline)。
实施例1 RNA探针模板的制备
1、小鼠肝组织RNA提取
使用液相法进行小鼠肝组织总RNA提取，具体步骤如下：
剪取液氮冻存的小鼠肝脏组织约50mg放入5ml离心管中，加入1ml TRIZOL试剂，用组织匀浆器Pro200研磨，研磨30秒，置于冰30秒降温，反复三次，使组织充分破碎。加入氯仿200μl，充分振荡15秒，室温条件下静置5分钟，12000g，4℃离心15分钟，小心吸取上层水相放入一个新的1.5ml Eppendorf离心管内，加入500μl异丙醇，上下颠倒混匀，于-20℃放置1小时。12000g，4℃离心10分钟，弃去上清，用70％乙醇(DEPC水配制)洗涤RNA沉淀一次，8000g，4℃离心5min。打开管盖，在生物安全柜内静置几分钟，晾干管壁使残余乙醇挥发完毕，用20μl DEPC水溶解RNA沉淀。用NanoDrop2000 260nm波长紫外吸收光测值测定RNA浓度，并根据OD260/OD280判断RNA的纯度(接受标准为比值在1.8-2.0之间)。调整RNA浓度为2000ng/μl，进行RT-PCR反应。在2000ng/μl总RNA中，加入DNase 1μl，37℃孵育30分钟后，80℃孵育10分钟灭活DNase。
2、逆转录合成cDNA
使用TAKARA逆转录试剂盒(PrimeScript RT reagent kit)，取上述灭活过DNase的2000ng/μl总RNA溶液1μl，加超纯水调整体积为10μl，再依次加入试剂盒内组分5×PrimeScript逆转录缓冲液2μl，PrimeScript RT enzyme mix 1μl，Oligo dT primer 1μl，Radom 6mers 1μl，在PCR仪(ABI 9700)中按如下参数进行逆转录：37℃孵育15min，85℃孵育15秒，4℃保存。
3、PCR扩增
3.1按照以下序列合成PCR引物：
第一对引物:上游引物5’-ctccaacatcgtgcggagct-3’(SEQ ID NO.1)，
下游引物5’-ctggtgatctgctcgtgcct-3’(SEQ ID NO.2)；
扩增产物126bp。
第二对引物:上游引物5’-ggtggatttcctacgcagcct-3’(SEQ ID NO.3)，
下游引物5’-cttccttccagcccatgagtg-3’(SEQ ID NO.4)；
扩增产物318bp。
第三对引物：上游引物5’-gtggatttcctacgcagcct-3’(SEQ ID NO.5)，
下游引物5’-cacggcactcgatacttctaa-3’(SEQ ID NO.6)；
扩增产物444bp。
3.2以cDNA为模板扩增探针模板片段，反应体系如表1所示。
表1 PCR反应体系
试剂 体积(μl)
上游引物 1
下游引物 1
cDNA模板 1
Premix Taq酶 25
去离子补足 50
反应条件：反应混合物在ABI 7500PCR仪中进行扩增反应，反应参数如下：95℃变性5分钟，30次循环：95℃变性30秒，58℃退火30秒,72℃延伸30秒。最后72℃延伸10分钟。
4、PCR产物鉴定
用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增片段大小，如图1所示，从左至右，第一泳道为Marker，第二泳道PCR产物为126bp，第三泳道PCR产物为318bp，第四泳道PCR产物为444bp。
5、PCR产物回收
电泳后在琼脂糖凝胶正确位置上切下DNA条带，用Promega Gel and PCR Cleanup System试剂盒回收DNA。将切下的琼脂糖凝胶放入1.5ml EP管，按照每10毫克胶加10μl膜结合液(Member binding solution)比例加入结合液，涡旋混匀，65℃孵育直至融化。溶液加入离心柱中，室温静置1分钟，12000g离心1分钟，弃洗脱液。再用膜洗脱液700μl洗两遍，每次12000g离心1分钟，弃洗脱液。换干净收集管，加50μl去离子水洗脱DNA，用nanodrop2000检测回收DNA的浓度和纯度。
6、将PCR扩增片段克隆入promega pGEM-T easy载体
将载体与纯化后PCR片段按照1∶5摩尔比混合，在干净的1.5ml离心管中加入2×快速连接缓冲液5μl，pGEM-T easy载体(50ng)1μl，PCR产物(250ng)1μl，T4DNA连接酶1μl，去离子水补足10μl，移液器吹打混匀后，室温孵育1分钟。
取2μl质粒连接产物，加到装有100μl DH5α感受态细胞的EP管中，轻弹管壁使之混匀，冰浴30秒，42℃水浴5分钟，再次冰浴30秒，42℃水浴5分钟，在生物安全柜内向离心管加1ml LB液体培养基，37℃摇床震荡培养45分钟，使菌体复苏，取50μl菌液滴加到含氨苄/IPTG/X-Gal的LB固体琼脂培养基的平皿上，用三角棒涂布均匀，待平板表面干燥后转移至37℃温箱，倒置培养16h，经过蓝白斑筛选、随机选择20个白色菌落，在含氨苄抗生素的液体LB培养基中摇菌扩增后，送上海生物工程公司做菌液测序。
根据测序返回的结果，选择BMP9基因片段的序列和连接方向正确的T载质粒，在含氨苄抗生素的液体LB培养基中过夜扩增后，按照天根生化公司质粒提取试剂盒说明抽提质粒，用Nanodrop2000测定质粒浓度和纯度。取每种质粒分为两份，置于2个干净EP管中，按照Takara和NEB试剂说明，分别进行NcoI和SpeI限制性内切酶单酶切，酶切体系见表2、表3。
表2 NcoI酶切体系
试剂 用量
Nco I酶 1μl
10×K Buffer 2μl
0.1％BSA 2μl
DNA ≤1μg
灭菌水 补足至50μl
反应条件：37℃在50μl反应液中，反应1小时。
表3 SpeI酶切体系
反应条件：37℃在50μl反应液中，反应5-15分钟。
经过纯化获得线性化的质粒，以此作为RNA探针合成的模板，其中，NcoI单酶切得到反义RNA探针模板、SpeI单酶切得到正义RNA探针模板，结果如图2所示。
实施例2 地高辛偶联RNA探针合成
以实施例1制备的线性化质粒为模板，用体外转录方法合成地高辛标记的RNA探针。体外转录体系如表4所示。
表4 体外转录体系
试剂 用量
纯化的线性化模板 1μl
10×NTP labeling混合物 2μl
10×体外转录缓冲液 2μl
RNase抑制剂 1μl
RNA聚合酶SP6或T7 2μl
灭菌水 12μl
移液器吹打混匀，37℃孵育2小时。加入2μl DNase 37℃孵育15分钟去除残余模板DNA，最后加入0.2M EDTA 2μl终止反应。体外转录的探针产物用1.5％琼脂糖胶电泳检测，Gelred染色观察。结果如图3所示，黑色方框中的条带为目的条带，第2、3泳道分别为318bp模板的反义RNA探针和正义RNA探针；第4、5泳道分别为444bp模板的反义RNA探针和正义RNA探针，其中318bp模板反义RNA探针的序列为：5’-gguggauuuccuacgcagccuuaaccucagcggcauucccucccaggacaaaaccagagcggagccaccccaguacaugaucgacuuguacaacagauacacaacggacaaaucgucuacgccugccuccaacaucgugcggagcuucagcguggaagaugcuauaucgacagcugccacggaggacuuccccuuucagaagcacauccugaucuucaacaucuccaucccgaggcacgagcagaucaccagggcugagcuccgacucuaugucuccugccaaaaugauguggacuccacucaugggcuggaaggaag-3’(SEQ ID NO.7)，正义RNA探针的序列与反义RNA探针的序列互补。
实施例3 反义RNA探针在小鼠肝组织切片ISH中的效果研究
步骤如下：
(1)使用制备的不同地高辛标记BMP9RNA探针和敏感性加强型原位杂交检测试剂盒Ⅱ(碱性磷酸酶)对小鼠肝脏组织进行原位杂交检测。标本离体后，固定液为固定液为4％多聚甲醛/0.1M PBS(pH7.0-7.4)，含有1/1000DEPC。标本固定2小时进行ISH检测。
(2)固定的标本做常规脱水、浸蜡、包埋处理，切片厚度6μm，所用玻片经多聚赖氨酸处理。石蜡切片常规脱蜡至水，经3％H2O2室温浸泡10分钟，蒸馏水洗涤2次。
(3)蛋白孵育暴露mRNA核酸片段：新鲜配制胃蛋白酶稀释液，用1ml 3％柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶混匀，将新鲜制备的胃蛋白酶溶液滴加到切片上，室温孵育10分钟。0.5MTBS重复洗3次，每次浸泡5分钟。蒸馏水洗1次。
(4)原位杂交：将地高辛标记的BMP9RNA探针用杂交液稀释至1μg/ml，按每张切片滴加20μl杂交液。盖上盖玻片后置于恒温箱37℃杂交过夜。
(5)封闭：揭掉盖玻片，35℃的2×SSC溶液洗涤切片5分钟，重复洗涤2次；0.5×SSC溶液浸泡洗涤15分钟；0.2×SSC溶液洗涤15分钟。在切片上滴加封闭液覆盖标本，37℃孵育30分钟，甩去切片上多余溶液。
(6)切片上滴加生物素化鼠抗地高辛试剂，37℃孵育60分钟，0.5M TBS浸泡5分钟，洗涤重复4次。
(7)切片上滴加SABC-AP试剂，37℃孵育30分钟。0.5M TBS浸泡5分钟，洗涤重复4次。
(8)BCIP/NBT显色：用0.01M TBS(pH9.5)稀释BCIP/NBT(20×)，混合均匀制备显色应用液。将显色液加至切片上覆盖标本，35℃显色20分钟，用去离子水冲洗，封片剂封片。
结果：
如图4所示，444bp DIG-BMP9反义RNA探针检测鼠肝BMP9表达信号微弱，而318bpDIG-BMP9反义RNA探针检测鼠肝BMP9表达信号明显要强。上述结果表明318bp DIG-BMP9反义RNA探针比444bpDIG-BMP9反义RNA探针在利用原位杂交方法检测BMP9基因mRNA表达时效果好，其中正义RNA探针作为反义RNA探针的对照探针。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于检测BMP9基因表达的反义RNA探针，其特征在于，所述反义RNA探针序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的反义RNA探针，其特征在于，所述反义RNA探针上结合了标记物。
3.根据权利要求2所述的反义RNA探针，其特征在于，所述标记物包括放射性标记物、非放射性标记物。
4.一种检测BMP9基因表达的工具，其特征在于，所述工具包括权利要求1-3中任一项所述的反义RNA探针。
5.根据权利要求4所述的工具，其特征在于，所述工具包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。
6.一种检测BMP9基因表达的原位杂交方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将权利要求1-3中任一项所述的反义RNA探针与组织试样中表达的BMP9基因mRNA杂交；通过检测结合在所述反义RNA探针上的标记物来鉴定BMP9基因mRNA的存在。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述组织试样是从哺乳动物分离的组织。
8.权利要求1-3中任一项所述的反义RNA探针在制备权利要求4或5所述的检测BMP9基因表达的工具中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述工具是利用原位杂交的方法来检测组织试样中BMP9基因表达。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述组织试样是从哺乳动物组织分离的组织。
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