ITRM20060337A1 - Gene tem8 (tumor endotelial marker 8) e sue forme di espressione ed usi diagnostici e terapeutici - Google Patents
Gene tem8 (tumor endotelial marker 8) e sue forme di espressione ed usi diagnostici e terapeutici Download PDFInfo
- Publication number
- ITRM20060337A1 ITRM20060337A1 IT000337A ITRM20060337A ITRM20060337A1 IT RM20060337 A1 ITRM20060337 A1 IT RM20060337A1 IT 000337 A IT000337 A IT 000337A IT RM20060337 A ITRM20060337 A IT RM20060337A IT RM20060337 A1 ITRM20060337 A1 IT RM20060337A1
- Authority
- IT
- Italy
- Prior art keywords
- seq
- sequences
- tem8
- tumor
- expression
- Prior art date
Links
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims description 57
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims description 45
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title claims description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 38
- 239000003550 marker Substances 0.000 title description 4
- 102100031323 Anthrax toxin receptor 1 Human genes 0.000 claims description 70
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 41
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 35
- 101000796095 Homo sapiens Anthrax toxin receptor 1 Proteins 0.000 claims description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 23
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 claims description 22
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 22
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 19
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 18
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 claims description 18
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 claims description 18
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 claims description 17
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 claims description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 17
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 12
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 12
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 7
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 7
- 230000005747 tumor angiogenesis Effects 0.000 claims description 7
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 6
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 5
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 4
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 102000054767 gene variant Human genes 0.000 claims description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims description 2
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 claims description 2
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 claims 1
- 101710125943 Anthrax toxin receptor 1 Proteins 0.000 description 96
- 239000000047 product Substances 0.000 description 32
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 17
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 101000796085 Homo sapiens Anthrax toxin receptor 2 Proteins 0.000 description 16
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 16
- 102100031325 Anthrax toxin receptor 2 Human genes 0.000 description 15
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 11
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 10
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 9
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 230000001023 pro-angiogenic effect Effects 0.000 description 7
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 6
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 5
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 108091036414 Polyinosinic:polycytidylic acid Proteins 0.000 description 4
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 4
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 4
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 3
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 3
- 102100030698 Interleukin-12 subunit alpha Human genes 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 3
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 102000014158 Interleukin-12 Subunit p40 Human genes 0.000 description 2
- 108010011429 Interleukin-12 Subunit p40 Proteins 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 2
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 2
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 2
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000182 cd11c+cd123- dc Anatomy 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000013139 quantization Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 101000981773 Arabidopsis thaliana Transcription factor MYB34 Proteins 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010055113 Breast cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 238000011238 DNA vaccination Methods 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 206010012646 Diabetic blindness Diseases 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 101000581272 Homo sapiens Midasin Proteins 0.000 description 1
- 101000651887 Homo sapiens Neutral and basic amino acid transport protein rBAT Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 102000026633 IL6 Human genes 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 102000014154 Interleukin-12 Subunit p35 Human genes 0.000 description 1
- 108010011301 Interleukin-12 Subunit p35 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 102100027666 Midasin Human genes 0.000 description 1
- 208000003788 Neoplasm Micrometastasis Diseases 0.000 description 1
- 102100027341 Neutral and basic amino acid transport protein rBAT Human genes 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 101100501691 Rattus norvegicus Erbb2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006629 SLC13A2 Proteins 0.000 description 1
- 101100283414 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GMC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 108091005906 Type I transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 108010039069 anthrax toxin receptors Proteins 0.000 description 1
- 229940124599 anti-inflammatory drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002001 anti-metastasis Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001364 causal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008619 cell matrix interaction Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001378 electrochemiluminescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 102000052461 human ANTXR1 Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000019734 interleukin-12 production Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000010309 neoplastic transformation Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 101800000857 p40 protein Proteins 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 208000008423 pleurisy Diseases 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 210000005212 secondary lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006711 vascular endothelial growth factor production Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
Description
Descrizione dell'invenzione industriale dal titolo:
" Gene TEM8 (tumor endotelial marker 8) e sue forme di espressione ed usi diagnostici e terapeutici"
DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda la modulazione dellfespressione di un gene noto come "tumor endothelial marker 8 (TEM8 ) " marcatore dellf endotelio tumorale 8, anche noto, in una sua variante di splicing, come il recettore 1 della tossina dellfantrace, e si riferisce ai livelli differenziali con cui il gene è espresso, nelle sue varianti, in cellule dotate di proprietà angiogeniche e migratorie quali le cellule dendritiche e le cellule tumorali metastatiche. La presente invenzione riguarda inoltre l'uso di sequenze geniche e polipeptidiche del TEM8 quali strumenti di diagnosi e prognostici dellfangiogenesi infiammatoria patologica e del potenziale metastatico delle cellule tumorali. L'invenzione riguarda inoltre l'uso delle stesse sequenze geniche e polipeptidiche come diretti strumenti terapeutici (es. iRNA, o peptidi che funzionino come decoy), l'uso in composizioni immunogene o in vaccini atti ad indurre una risposta immunitaria contro cellule sovraesprimenti i prodotti del gene TEM8. La presente invenzione riguarda infine i metodi di screening per l'identificazione di agonisti ed antagonisti dell'attività del TEM8 in ogni sua variante polinucleotidica e/o polipeptidica da usare in trattamenti di prevenzione o di terapia.
STATO DELLA TECNICA ANTERIORE
Molti tumori, circa il 15%' generano dai siti d'infezione e di infiammazione croniche, situazioni queste ultime ritenute in grado di iniziare il processo della trasformazione neoplastica (Kuper, H et al. ; Shacter, E. et al. ) .
Fondamentalmente, l' infiammazione può essere definita come il processo attivato in risposta a danno tissutale, come la cicatrizzazione di una ferita e l'infezione, sostenute e mantenute da una rete di segnali chimici, prodotti soprattutto da leucociti, che permettono la proliferazione e la migrazione sia di fibroblasti sia di cellule endoteliali per la ricostruzione del tessuto normale.
Mentre nella cicatrizzazione di una ferita la proliferazione delle cellule e l'infiammazione finiscono dopo il riparo, ci sono diverse condizioni patologiche in cui l'infiammazione e l'angiogenesi sono stabilmente attive.
Una angiogenesi eccessiva si verifica in malattie quali cancro, cecità diabetica, degenerazione maculare correlata allretà, artrite reurnatoide, e psoriasi, ed in più di 70 altre condizioni, alcune delle quali sono considerate causa di trasformazione maligna. L'angiogenesi contribuisce sia alla capacità invasiva delle cellule tumorali sia alla loro capacità di metastatizzare in siti distanti.
L'infiammazione cronica ed il cancro sembrano avere un rapporto causale, come sostenuto da alcuni esempi: malattia di Crohn e cancro del colon, epatite C e carcinoma epatico, infezione cronica di Elicobacter pilory e cancro dello stomaco (Ernst, P. B. & Gold, B. D), papilloma virus umano e carcinoma della cervice, Epstein-Barr virus e linfomi .
Come detto precedentemente, l'angiogenesi è parte del processo di infiammazione. Recentemente, Carson-Walter et al. (2001) hanno riportato la presenza di almeno 46 trascritti particolarmente elevati nell'endotelio associato al tumore e che per questo hanno chiamato marcatori dell'endotelio tumorale (TEMs) .
Il TEM8 fu scoperto come un gene espresso prevalentemente nell'endotelio tumorale, e il prodotto proteico di una sua variante di splicing è stato recentemente identificato come il recettore per la tossina dell'antrace (ATRXl/TEM8) . (Carson-Walter EB et al. 2001; Bradley KA et al. 2001; Bradley KA and Young JAT, 2033; Whittaker CA et al.
2002). TEM8 codifica una proteina transmembrana di tipo I, lunga 564 aminoacidi. I1 dominio intracellulare è lungo 220 aminoacidi e la regione extracellulare (aa 1-318) contiene un dominio vWFA (aa 44-205) che, nelle integrine anche, quando presente, è noto come dominio I (Dickeson SK et al.
1998).
Sono state descritte tre diverse versioni del gene TEM8, che hanno subito splicing alternativo. Le varianti del TEM8 condividono la stessa porzione extracellulare amino-terminale ma differiscono in lunghezza e nella sequenza delle loro regioni citosoliche. La variante di splicing 1 (SV1) è la più lunga ed è il cDNA originale del TEM8 che codifica una proteina di 564 aminoacidi con una lunga coda citoplasmatica ricca in prolina. La variante di splicing 2 (SV2) codifica una proteina di 368 aminoacidi con una corta coda citoplasmatica. La variante di splicing 3 (SV3) codifica una proteina identica alle altre due nella maggior parte del dominio extracellulare, ma che differisce prima della regione transmembrana così da non contenere una sequenza di ancoraggio di membrana.
angiogenesi dell'adulto.
Tuttavia, sebbene i trascritti ATRXl/TEM8 siano stati trovati sovra-regolati selettivamente nei capillari di nuova formazione dell'angiogenesi tumorale, il confronto dei modelli di espressione tessuto-specifici del TEM8 dalla bioinformatica , suggerisce che questo presunto marker endoteliale tumore-specifico, sia più generalmente espresso in altri tipi di cellule, coinvolte nel rimodellamento della matrice extracellulare e nei processi di migrazione, come per esempio i leucociti e cellule endoteliali.
A sostegno delle previsioni della bioinformatica, è stato riportato (K.A. Hotchkiss et al.) in sperimenti in vitro, che l'espressione del TEM8 in cellule endoteliali stimola l'adesione e la migrazione di queste sul collagene, mediante regolazione delle interazioni cellula-matrice.
La migrazione delle cellule è una proprietà specifica delle cellule metastatiche, delle cellule endoteliali coinvolte nei processi angiogenetici, ma anche di cellule emopoietiche come le cellule dendritiche (DC) , le più importanti cellule professionali del processamento e della presentazione degli antigeni al sistema immunitario, e la cui migrazione agli organi linfoidi secondari è essenziale perché esse esercitino i loro effetti regolatori immuni.
Recentemente, la proteina 2 della
ca (CMG2), più simile al TEM,8,è stato identificato come un secondo recettore per la tossina dell'antrace (ATR2) (Scobie HM et al.
2003) CMG2 condivide un'identità del 51% in aminoacidi con ATRl/TEM8, nel dominio I, ed è stata originariamente identificata in un pannello per geni differentemente regolati durante l'induzione capillare in vitro, ed è stato visto che la proteina CMG2 si lega agli ultimi due componenti della matrice extracellulare (ECM) , collagene IV e laminina.
Allo stato attuale delle conoscenze non esistono strumenti per l'individuazione di una molecola legata ai processi pro-angiogenetici e migratori tipici ad esempio delle cellule dendritiche e di quelle metastatiche e che per questo sia utile nella diagnosi dell'angiogenesi infiammatoria patologica in generale e del potenziale metastatico dei tumori, né esistono strumenti per la profilassi e terapie anti-infiammatorie e antimetastatiche. Tampoco esistono strumenti per il rilevamento dell'angiogenesi infiammatoria patologica al fine di monitorare l'efficacia di trattamenti antinfiammatori in uso e in sviluppo clinico.
SOMMARIO DELL' INVENZIONE.
La presente invenzione si fonda sulla scoperta che i processi pro-angiogenici e migratori tipici delle le cellule metastatiche tumorali e delle cellule dendritiche sono accompagnati da espressione o sopra-espressione del gene TEM8 nelle sue varianti. L'invenzione risponde quindi alle sopra indicate esigenze, individuando nel gene TEM8 un marker specifico dell' angiogenesi infiammatoria patologica, dello stato e del destino delle cellule dendritiche (DC) in relazione all'angiogenesi infiammatoria patologica e delle proprietà migratorie e metastatiche delle cellule cancerose. La presente invenzione fornisce acidi nucleici derivanti dal TEM8 compresi i suoi prodotti di splicing alternativi e prodotti dovuti a modificazione post-triscrizionale, nonché le relative sequenze dei trascritti di mRNA e sequenze amminoacidiche, le quali proteine e/o mRNA sono associate i) ad una attività proangiogenica al sito dell'infiammazione; ii) ad un'attività proangiogenetica e migratoria delle cellule dendritiche; iii) con le proprietà migratorie delle cellule tumorali.
Pertanto oggetto principale dell' invenzione è un metodo di diagnosi di forme tumorali o di stati collegati all'insorgere di forme tumorali scelti tra angiogenesi infiammatoria patologica, dell'angiogenesi tumorale, elevata capacità metastatica e/o migratoria delle cellule tumorali e delle cellule dendritiche comprendente le fasi in cui si rileva in un campione biologico la attivazione e l'entità dell'espressione del gene TEM8 o sue regioni, in una qualsiasi delle sue varianti dovute a differente splicing o modificazione post-trascrizionale.
Un secondo oggetto dell'invenzione è un metodo di prognosi di stati tumorali o di stati infiammatori in cui durante o a seguito del trattamento terapeutico antitumorale o antinfiammatorio si determina in un campione biologico la presenza e l'entità dell'espressione del gene TEM8 o sue regioni, in una qualsiasi delle sue varianti.
Un terzo oggetto dell'invenzione sono sonde genetiche capaci di ibridizzare con regioni specifiche del gene TEM8 in tutte le sue varianti o con sequenze aventi almeno 95% di omologia con queste, e primer per PCR per la determinazioni di varianti del gene TEM8 legate a forme tumorali.
Un quarto oggetto dell'invenzione sono i prodotti di espressione del gene TEM8 dovuto ad ogni differente variante di splicing o di processamento post-trascrizionale o loro sequenze omologhe aventi almeno 90% di omologia per uso come agenti diagnostici o terapeutici.
Ulteriori oggetti dell'invenzione sono composizioni immunogene comprendenti il gene TEM8 posto in un vettore plasmidico idoneo alla immunizzazione genetica, o uno o più prodotti di espressione del gene TEM8, capaci di indurre una risposta immunitaria contro cellule sovra-esprimenti il gene TEM8, anticorpi poli o monoclonali specifici per i prodotti di espressione del gene TEM8, specificamente nel trattamento terapeutico di inibizione della angiogenesi infiammatoria patologica, della neoangiogenesi tumorale, della capacità metastatica e/o migratoria delle cellule tumorali e delle cellule dendritiche e come reagenti diagnostici.
Altri oggetti dell'invenzione saranno evidenti alla luce della descrizione dettagliata che segue.
I vantaggi implicati dall'invenzione sono quelli d'offrire informazioni di valore diagnostico, prognostico e terapeutico, tramite il rilevamento dell'espressione del TEM8 nelle forme dei suoi trascritti e/o dei suoi polipeptidi da reperti patologici di angiogenesi infiammatoria. Ulteriore vantaggio è quello di rilevare la presenza di cellule metastatiche in reperti tumorali da tessuti primari, e le micrometastasi da linfonodi.
BREVE DESCRIZIOONE DELLE FIGURE
Fiqura 1: La figura illustra i risultati del saggio ELICA per la determinazione del VEGF nelle isoforme 165 e 121 secreto da cellule dendritiche: immature, iDC; maturate con cocktail di citochine (IL-6, IL-lPI TNF-a) in presenza di PGE2, mDC; maturate in assenza di PGE2, mDC - PGE2; maturate in presenza di Poly I:C in sostituzione di PGE2, mDC+PolyIC. I1 rilevamento è stato effettuato mediante kit della Pierce Biotechnology, seguendo le istruzioni della azienda fornitrice.
Figura 2: La messaggero illustra i risultati dell'analisi RT-PCR di trascritti di CMG2 (pannello A) e di TEM8 (pannello B) su cellule dendritiche immature (iDC) e maturate con cocktail contenente PGE2 (mDC) . Mw rappresenta i pesi molecolari di riferimento.
I numeri indicano i diversi pazienti da cui provengono le cellule dendritiche. La lettera C indica il controllo in assenza di templato.
Nella parte inferiore di ciascun pannello sono evidenziati i prodotti di PCR di un gene di riferimento GADPH.
Le frecce indicano le posizioni di corsa elettroforetica dei frammenti GMC2 per il pannello A e del TEM8 per il pannello B.
Figura 3; La figura illustra i risultati del Rea1 time RT-PCR per la determinazione dei livelli di espressione del TEM8 e del CMG2 in relazione alla maturazione da monociti precursori (Mo) a cellule DC mature (mDC) e in relazione al cocktail di maturazione (CTK) usato (citochine+ PGE2 o citochine Poly IC) .
1) trascritti TEM8 delle iDC vs Mo; 2) trascritti TEM8 delle mDC (citochine PGE2) vs cellule dentritiche immature (iDC) ; 3) trascritti CMG2 delle mDC (citochine PGE2) vs iDC; 4) trascritti TEM8 delle mDC (citochine+PolyI:C) vs iDCs.
Calibratori; Mo(1) e iDC (2,3 e 4) .Le barre indicano i valori medi di 5 determinazioni e le linee indicano il valore minimo e massimo delle determinazioni per ciascun gruppo.
Figura 4: la figura illustra i risultati di espressione in Real-Time RT-PCR del TEM8 e del CMG2 in cellule MDA-MB231 relative a quella in cellule ZR75 - 1 pesa come calibratore normalizzazione rispetto al GADPH.
Le barre in grigio scuro e in grigio chiaro non bordate si riferiscono all'espressione del TEM8 nelle cellule MDA-MD231 e ZR75-1 tenute per 48h in condizioni di crescita in terreno completo o in assenza di siero, rispettivamente; le barre bordate si riferiscono all'espressione del CMG2 per le stesse cellule e nelle stesse condizioni di coltura.
Figura 5: La figura illustra la reattività degli anticorpi anti-TEM8 prodotti via vaccinazione a DNA con differenti plasmidi integranti le sequenze nucleotidiche SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6. La produzione di anticorpi specifici per le proteine ricombinanti del TEM8 sono state evidenziate con analisi western blotting contro la proteina ricombinnte del TEM8 seq ID ....
DESCRIZIONE DETTAGLIATA
I1 gene "Tumor endotelial marker 8 (TEM8) umano è descritto in letteratura e di esso si conoscono tre diverse varianti dovute ad alternativo modo di splicing.
Le varianti del TEM8 umano condividono la stessa porzione extracellulare amino-terminale differiscono in lunghezza e nella sequenza delle loro regioni citosoliche.
La variante di splicing 1 (SV1) è la più lunga ed è il cDNA originale del TEM8 che codifica una proteina di 564 aminoacidi, con una lunga coda citoplasmatica ricca in prolina. La sequenza nucleotidica tra le posizioni 144 e 1950 di SV1 è riportata di seguito come SEQ ID NO: 1 (Gene Bank accession number AF -279145), mentre la corrispondente sequenza di 564 amino acidi è riportata come SEQ ID NO: lbis.
La variante di splicing 2 (SV2) codifica una proteina di 368 aminoacidi con una corta coda citoplasmatica. La sequenza nucleotidica tra le posizioni 144 e 1454 del cDNA è riportata di seguito come SEQ ID NO: 2 (Gene Bank accession number NM -053' 34) , mentre la corrispondente sequenza di 368 amino acidi codificati è riportata come SEQ ID NO: 2bis.
La variante di splicing 3 (SV3) codifica una proteina identica alle altre due nella maggior parte del dominio extracellulare, e che non contiene una sequenza di ancoraggio alla membrana. La sequenza di cDNA della variante SV3 tra le posizioni 144 e 2143 è riportata di seguito come SEQ ID NO:: 3 (Gene an accession number NM -018153), mentre la corrispondente sequenza di 317 amino acidi codificati è riportata come SEQ ID NO: 3bis.
In accordo con la presente invenzione sono state inoltre evidenziate nel gene TEM8 zone di alta variabilità che comprendono le porzioni del gene SV1 limitate tra le posizioni 901-1040 e 1387-1950, e la porzione della variante SV3 limitata dalle posizioni 901 e 1145.
Queste zone sono state amplificate operando su differenti cellule tumorali attraverso RT-PCT utilizzando le copie di primer di sequenza SEQ ID NO: 7 (FW) e SEQ ID NO:8 (RV) ovvero SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO:10 ovvero SEQ ID NO:11 (FW) e SEQ ID NO:12 (RV)
Sono state così individuate nuove forme varianti del gene TEM8 che presentano nella zone 1387 a 1950 della SV1 e 901 1145 della SV3 importanti delezioni e/o mutazioni di sequenza precedentemente mai osservate. Tra queste sono state isolate nuove varianti che presentano nella regione che inizia dalla posizione 1387 della SEQ ID NO:1 tre nuove sequenze indicate come SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO:6. I prodotti di amplificazione così ottenuti codificano prodotti di espressione aventi sequenza polipeptidica comprendenti le sequenze indicate come SEQ ID NO: 4bis, SEQ ID NO:5bis e SEQ ID N0:Gbis.
Senza voler legare l'invenzioni a teorie scientifiche non ancora del tutto comprovate, si sottolinea che le nuove varianti del gene TEM8 sono state osservate ed isolate in cellule tumorali. È probabile quindi che queste varianti possano essere legate a situazioni tumorali specifiche di una certa tipologia cellulare o di una certa fase di sviluppo del processo di insorgenza tumorale. Per questo le sequenze nucleiche della presente invenzione non solo sono genericamente utilizzabili come marker tumorali, ma possono essere utilizzate nella diagnosi puntuale di specifiche forme tumorali o di situazioni pre-tumorali collegate all' insorgere di tumori quali sono l' angiogenesi infiammatoria patologica, l'angiogenesi tumorale, la capacità metastatica e/o migratoria delle cellule tumorali e la capacità migratoria delle cellule dendritiche.
I1 metodo diagnostico secondo l' invenzione si basa quindi sulla rilevazione della presenza e/o dell' espressione o della sovra-espressione del gene TEM8 in tutte le sue varianti dovute a differente tipo di splicing o dovute a differente processamento post-trascrizionale. Forme di realizzazione specifiche dell'invenzione sono metodi diagnostici capaci di riconoscere in campioni biologici la presenza di cDNA comprendenti le specifiche sequenze indicate come SEQ ID N0:l; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3.
Tuttavia qualsiasi sequenza alternativa di cDNA differente dalla quelle sopra viste, ma ottenuta come prodotto di amplificazione del dominio (o porzione) extracellulare oppure del dominio intracellulare del gene TEM8, in particolare delle porzioni di cDNA delimitate dalle posizione 901 e 1040 oppure 1387 e 1950 della sequenza SEQ ID NO:1, o 901 e 1145 della sequenza SEQ ID NO:3 sono ugualmente utilizzabili in un metodo diagnostico secondo l'invenzione. Esempio di tali sequenze alternative sono le sequenze SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6, così come qualsiasi altro prodotto di amplificazione ottenuto per RT-PCR utilizzando le copie di primer aventi sequenze SEQ ID NO:7 (FW) e SEQ ID NO:8 (RV) oppure SEQ ID NO:9 (FW) e SEQ ID NO:10 (RV) oppure SEQ ID NO:11 (FW) e SEQ ID NO:12 (RV) .
Infine sono utilizzabili nei metodi dell'invenzione tutte quelle sequenze di acidi nucleici aventi almeno il 95% di omologia e/o la capacità di ibridizzare sotto condizioni di alta stringenza, con il TEM8 e con ogni sua variante o frammento sopra indicato, per esempio un DNA a singolo filamento, un mRNA o un RNAi interferente.
La valutazione della presenza e del livello di espressione del gene TEM8 nelle sue varianti è effettuata attraverso sonde genetiche o attraverso agenti in grado di rilevare i corrispondenti prodotti di espressione.
RILEVAZIONE CON SONDE GENETICHE
Sonde genetiche sono sequenze di DNA o RNA, normalmente in singolo filamento, in grado di ibridizzare in determinate condizioni di stringenza con il cDNA del gene TEM8, in particolare con le porzioni che identificano gli esoni del gene. Sonde preferite sono quelle in grado di ibridizzare in condizioni di alta stringenza, come definite negli esempi, con le sequenze nucleotidiche SEQ ID N0:l; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6, oppure con qualsiasi sequenza del gene TEP118 amplificate per PCR utilizzando le copie di primer aventi sequenze SEQ ID NO:7 (FW) e SEQ ID NO:8 (RV) oppure SEQ ID NO:9 (FW) e SEQ ID NO:10 (RV) oppure SEQ ID NO:11 (FW) e SEQ ID NO:12 (RV) oppure con i corrispondenti trascritti di RNA. Tali sonde sono normalmente marcate con molecole o elementi reporter in grado di evidenziare il complesso di ibridazione ed introdotte nella sonda mediante tecniche note quali PCR, ricombinazione o tecniche enzimatiche. Idonee sostanze marcanti sono nucleotidi contenenti elementi radioattivi quali p32 - dNTP o S35 - dNDP oppure sostanze fluorescenti o chemioluminescenti.
Alternativamente le sonde possono essere evidenziate dopo formazione del complesso di ibridazione mediante opportuni anticorpi specifici per la sonda.
RILEVAZIONE DEI PRODOTTI DI ESPRESSIONE
In una ulteriore forma di realizzazione dellfinvenzione lfespressione del gene TEM8 nelle sue varianti è determinata attraverso rilevazione sul campione biologico della presenza dei prodotti di espressione dei cDNA sopra visti. Tali prodotti di espressione sono polipeptidi aventi sequenze scelte tra: SEQ ID NO:lbis; SEQ ID NO:2bis; SEQ ID NO:3bis; SEQ ID NO:4bis; SEQ ID NO:5bis; SEQ ID N0:Gbis oppure scelte tra tutte le sequenze polipeptidiche corrispondenti ai prodotti di amplificazione per PCR del gene TEM8 utilizzando le copie di primer aventi sequenze SEQ ID NO:7 (FW) e SEQ I D NO:8 (RV) oppure SEQ ID NO: 9 (FW) e SEQ ID NO: 10 (RV) oppure SEQ ID NO:11 (FW) e SEQ ID NO: 12
Va da sé che i metodi fin qui visti non sono utilizzabili per la sola finalità diagnostica, ma anche con finalità prognostica e di valutazione dellf efficacia trattamenti terapeutici finalizzati alla cura di stati tumorali e/o antinfiammatori e quindi alla prognosi di tali stati. accordo con questo aspetto dell'invenzione, si determina, una o più volte durante il trattamento terapeutico o a termine, su un campione biologico del paziente, la presenza e l'entità dell'espressione del gene TEM8 o sue regioni, in una qualsiasi delle varianti dovute a differente o a modificazione posttrascrizionale, controllando nel tempo le variazioni dei risultati osservati.
I campioni biologici sui quali si conducono i metodi diagnostici dellfinvenzione sono prelievi umani ematici, sinoviali, pleuriti, bioptici o prelievi di tessuto tumorale o campioni di cellule dendritiche in vivo ed ex vivo.
Le proteine espresse dalle varianti del gene TEM8, nonché i loro frammenti e loro derivati sono utili come immunogeni per la produzione di anticorpi poli o monoclonali o frammenti funzionali di anticorpo.
ANTICORPI
Gli anticorpi secondo l'invenzione sono utilizzati tanto in metodi diagnostici per il riconoscimento in campioni biologici dei prodotti di espressione del gene TEM8 nelle sue varianti che in metodi di trattamento terapeutico.
Gli anticorpi utilizzabili nei metodi dell'invenzione legano direttamente le sequenze polipeptidiche del TEM8, eliminandone o alterandone le funzioni sia per azione biochimica diretta sia per azione immunologica effettrice via complemento o via cellule citotossiche. Tali funzioni sono la funzione nei processi di neoangiogenesi, la funzione immunologica delle cellule dendritiche o la funzione migratoria e metastatica delle cellule tumorali. Tra gli anticorpi anti-TEM8 forniti dalla presente invenzione sono compresi quelli che legando il TEM8 agiscono come strumento analitico o diagnostico per la rilevazione del TEM8 in vitro e in vivo
Anticorpi specifici per i vari prodotti di espressione sono ottenibili con le tecniche convenzionali ben note all'esperto attraverso irnmunizzazione di animali con la proteina intera, porzioni della proteina o peptidi, preferibilmente legati a proteine carrier che ne potenzino l'attività imrnunogenica. L'ottenimento di anticorpi monoclonali attraverso produzione di linee di ibridoma è effettuato in accordo a metodi dettagliatamente descritti in letteratura. Alternativamente animali da laboratorio possono essere immunizzati con vaccini a DNA comprendenti un plasmide o un vettore virale di espressione che contenga una delle sequenze nucleotidiche TEM8 dell' invenzione, opzionalmente legata ad una seconda sequenza che codifica una proteina carrier. I1 plasmide o vettore una volta introdotto nella cellula ospite esprimerà la proteina o proteina ibrida capace di stimolare la formazione di anticorpi. come descritto negli esempi.
PRIMER
Ulteriori aspetti dell' invenzione sono gli specifici Primer per PCR o RT-PCR che permettono di amplificare domini delle variabili di splicing SV1, SV2 e SV3 del gene TEM8 caratterizzate da elevata variabilità. Esempi di tali primer sono rappresentati dalle sequenze SEQ ID NO:7 (FW) e SEQ ID NO:8 (RV) che amplificano la sequenza 901-1040 di SV1 oppure dalle sequenze SEQ ID NO:9 (FW) e SEQ ID NO:10 (RV) che amplificano la sequenza 1387-1950 di SV1, oppure dalle sequenze SEQ ID NO 11 (FW) e SEQ ID NO: 12 (RV) che amplifica la sequenza 901 a 1145 di SV3.
VETTORI DI CLONAGGI O ESPRESSIONE
In accordo a metodi esaurientemente descritti in letteratura, tutte le sequenze nucleotidiche dell'invenzione possono essere introdotte in opportuni vettori di clonaggio e di espressione per la produzione dei corrispondente prodotti ricombinanti in cellule ospiti, come descritto negli esempi. Le sequenze nucleotidiche del TEM8 sono fiancheggiate da idonee sequenze di controllo che ne dirigono e regolano la trascrizione e la traduzione. Opportune cellule ospiti sono cellula procariotica o eucariotica, in particolare cellule animali o umane trasformate attraverso il vettore contenete le sequenze di interesse.
TRATTAMENTI TERAPEUTICI
Infine i materiali nucleotidici e polipeptidici dell'invenzione derivati dalle differenti varianti e gene , nonc corr spon en an corp trovano applicazione come medicamenti nel trattamento di forme tumorali o di stati collegati all'insorgere di forme tumorali quali l'angiogenesi infiammatoria patologica, lfangiogenesi tumorale, la capacità metastatica e/o migratoria delle cellule tumorali e la capacità migratoria delle cellule dendritiche.
Vengono utilizzati come principi attivi nucleotidici RNA interferenti, RNA antisenso, o altro materiale nucleico capace di inibire o modulare l'espressione del gene TEM8 così come peptidi che funzionino come decoy.
Alternativamente sono usati come principi attivi assieme ad eccipienti farmacologicamente accettabili prodotti polipeptidici di espressione in composizioni immunogene capaci di indurre una risposta immunitaria contro cellule sovraesprimenti i prodotti del gene TEM8.
In conclusione la presente invenzione trova applicazione nella caratterizzazione di cellule tumorali mammarie umane, al fine di valutarne il potenziale metastatico. e la loro capacità di espressione del gene TEM8 sia in vivo sia in reperti ex vivo.
Inoltre, l'invenzione trova applicazione nella caratterizzazione di cellule dendritiche umane particolarmente ma non esclusivamente destinate alla produzione di vaccini cellulari.
A questo scopo l'invenzione fornisce gli strumenti necessari per il rilevamento dell'espressione differenziale di sequenze polinucleotidiche e polipeptidiche del gene TEM8 e suoi prodotti di splicing, nelle cellule dendritiche umane, in relazione al loro stato di sviluppo e funzionale. L'invenzione trova inoltre applicazione nella caratterizzazione dello stato di propagazione del processo dell'infiammazione cronica e del potenziale evolutivo della stessa. In questo ambito essa trova applicazione anche come indicatore della efficacia terapeutica dei farmaci antinfiamrnatori attualmente in uso e sviluppo in terapia.
In una ulteriore applicazione la presente invenzione fornisce la formulazione e i metodi per l'uso di polipeptidi e/o polinucleotidi del TEM8 in composizioni immunogeniche per l'induzione di immunità contro le cellule bersaglio quali le cellule tumorali, le cellule endoteliali ed ogni altra cellula che sovraesprima i prodotti del TEM8 Sono anche forniti metodi diagnostici per il rilevamento di malattie associate alla sovraespressione del gene TEM8 in tutte le sue varianti o dei polipeptidi correlati, compreso l'uso di tale rilevamento come metodo di marcatura prognostica nei tumori, ed in ogni altra malattia caratterizzata da infiammazione cronica, e sono altresì forniti metodi per il trattamento di tali patologie.
L'invenzione permette infine lo sviluppo di metodi di screening per l'identificazione di nuove molecole ligandi del TEM8, principalmente ma non esclusivamente per uso farmacologico.
L'invenzione è di seguito illustrata con tutti i dettagli sperimentali nei seguenti esempi.
Esempio 1: Assegnazione del fenotipo proangiogenetico delle cellule dendritiche.
I1 potenziale pro-angiogenetico delle cellule dendritiche maturate, in condizioni "clinica1 grade", con i più comuni cocktail usati nelle trials cliniche, cioè ILlP, IL6, TNFa e PGE2 o con lo stesso cocktail sostituendo il PGE2 con il Poli I:C, è stato valutato mediante analisi ELISA misurando i livelli di VEGF secreto nel mezzo di coltura.
I1 VEGF è prodotto per splicing alternativo di un singolo gene in isoforme multiple, tra le quali le più comuni sono la VEGF 121 e la VEGF 165. La Fig.1 illustra la produzione del VEGF (le forme 165 e 121 sono entrambe riconosciute dagli anticorpi forniti con il kit della Pierce Biotechnology Inc., Endogen human VEGF ELISA Kit) nei supernatanti delle DC in coltura. L'analisi è stata eseguita come segue: i supernatanti delle DC immature, delle DC maturate con il cocktail di citochine completo e delle cellule tumorali non trattate e trattate con il cocktail completo, vengono raccolti e utilizzati per la quantizzazione del VEGF, secondo il protocollo fornito dal kit. A questo scopo, alla piastra da 96 pozzetti viene fatto aderire 1' anticorpo anti-human VEGF 165, il quale cattura il VEGF presente nei campioni aggiunti alla piastra. L'aggiunta nei pozzetti di 50 p1 di campione è seguita da 2 ore di incubazione a temperatura ambiente. Dopo 3 lavaggi con Wash Buffer vengono aggiunti 100 1-11 di anticorpo biotinilato ad ogni pozzetto; tale incubazione di 1 ora è seguita da 3 lavaggi e da 30 minuti di incubazione con Streptavidin-HRP Reagent . L'aggiunta successiva di 100 p1 di substrato permette di effettuare la misura dellfassorbanza a 450 nm.
La Fig.1 mostra la produzione del VEGF da parte delle cellule dendritiche maturate in cocktail completo (citochine PGE2). Una trascurabile produzione di VEGF è osservata nelle cellule dendritiche immature o nelle cellule dendritiche maturate con Poli 1:C.
Esempio 2: Inibizione della produzione del fattore anti-angiogenetico IL-12 in DC maturate con Poli I:C
Poiché è stato riportato che il VEGF inibisce la produzione di IL-12 e la differenziazione della risposta immunitaria Thl, è stata valutata la capacità delle DC maturate con il cocktail contenente PGE2 , di produrre IL-12 biologicamente attiva.
L' interleuchina 12 p70 (IL-12p70 ,) un etrodimero composto dalle subunità p35 e p40, è la principale citochina della induzione di una risposta TH-1 e di una potente attività anti-angiogenetica. Di contro, in assenza di espressione di p35, il monomero e l'omodimero di IL-12~40, secreti dalle DC, agiscono da antagonisti della IL-12.
La determinazione di IL-12p40 e IL-12p35 viene effettuata tramite real-time RT-PCR, secondo le seguenti procedure: dopo 48 ore, i supernatanti vengono raccolti e conservati a - 20 " ~fino a che non vengono eseguiti saggi per le misurazioni delle citochine. Dopo eliminazione del mezzo di coltura, viene effettuata l'estrazione dellrRNA.
Le cellule vengono lisate mediante incubazione con un buffer di lisi che inattiva immediatamente lfRNAsi e crea appropriate condizioni di legame che favoriscono l'assorbimento dellfRNA alla membrana di silice. I1 DNA contaminante viene rimosso mediante una soluzione di DNasi I che viene direttamente applicata sopra la membrana di silice durante la preparazione. Passaggi di semplice lavaggio con due diversi buffer rimuovono sali, metaboliti e componenti cellulari macromolecolari. L'RNA puro è eluito in condizioni di bassa forza ionica con acqua RNasi-free.
La concentrazione di RNA viene determinata spettrofotometricamente misurando lfassorbanza a 260nm e l' integrità dell' RNA viene confermata mediante elettroforesi su un gel d' agarosio a11' 1,2%.
lpg di RNA totale viene successivamente utilizzato per sintetizzare un singolo filamento di DNA complementare (cDNA) mediante RevertAid H Minus First Strand cDNA Syntesys Kit (Fermentas, Life Sciences) .
L'RNA (1 pg) viene incubato con H20 e lpl di Oligo dT Primer ( 0 5 g ) per 5 minuti a 70"~. Alla reazione vengono aggiunti 2p1 di 10x Reaction Buffer, 2p1 di inibitore delle RNAsi e 2p1 di dNTPs mix (10nM). La mix di reazione viene scaldata a 37°C per 5 minuti.
Alla reazione viene poi aggiunto 1p1 di RevertAid H Minus M-MuLV Reverse Transcriptase (200u/pl) (volume finale di 20 p1) e incubata per 60 minuti a 42°C. La reazione viene scaldata a 70°C per 10 minuti per inattivare la Trascrittasi Inversa.
I1 cDNA risultante viene utilizzato per determinare l'espressione del TEM8 e del CMG2 mediante Realtime .
La RT-PCR real-time viene eseguita utilizzando MX3000P Real-time PCR system (Stratagene) e BRILLIANT SYB Green QPCR Master mix secondo il protocollo fornito dalla ditta. Dopo denaturazione iniziale per 10 minuti a 95 ° C ,vengono eseguiti 40 cicli con passaggi di 94°C per 48 secondi, 60 " p~er 48 secondi, e 7 2 " ~per 48 secondi, con lettura della fluorescenza al termine di ciascun ciclo.
I seguenti ologonucleotidi vengono usati come primers Per la PCR: Per TEM8, FW : ACAgggTCCTCTgCAgCTTCAA e Rev : gTCAgAACAgTgTgTggTggTgAT; Per FW: gTgTTTATTgTgTTggTgTCCTTg e Rev : gACAATCTgAAATTCCTCCCC. 1 primers amplificano una porzione di 200 bp nel dominio extracellulare del TEM8 e del CMG2. Le analisi vengono eseguite con MxPro QPCR Software versione 3.00 per MX3000P. I valori ottenuti sono all'interno del range lineare di una curva standard e vengono normalizzati per produrre la stessa quantità di RNA messaggero (mRNA) della gliceraldeide fosfato deidrogenasi (GAPDH) (Fw GADPH: CAACAgCgACACCCACTCCT e Rev GADPH: AggCCATgTgggCCATgA). Tutti i prodotti di PCR vengono analizzati mediante determinazione delle curve di melting come pure mediante elettroforesi su gel d'agarosio. I risultati riportati nella (Tabella A) indicano che le DC maturate in cocktail con PGE2 producono alti livelli di mRNA di IL-12p40 ma non p35, inibendo quindi la produzione di IL12p70, e spostando così il bilancio tra i fattori pro e anti-angiogenetici a favore dell'angiogenesi.
La stessa indicazione viene dalla misurazione della proteina p40 mediante saggio Elisa.
Tabella A: Analisi ELISA dei sopranatanti delle colture di DC immature e maturate in cocktail completo.
pgx 106 cellulle/ml; *, * *, * * * si riferiscono a tre diversi kit
I supernatanti delle DC immature e delle DC maturate con il cocktail di citochine vengono raccolti e utilizzati per la quantizzazione dellfIL-12 p40 mediante saggio ELISA (Biosource, Nivelles, Belgium) secondo il protocollo fornito dal kit.
100 p1 dei supernatanti vengono aggiunti nei pozzetti della piastra pre-cotata e incubati per 2 ore a temperatura ambiente e in agitazione. Ai 3 lavaggi con Working Wash Buffer segue unfincubazione di 2 ore a temperatura ambiente e in agitazione con l'anticorpo anti-IL-12p40 HRP-coniugato. Dopo 3 lavaggi con Working Wash Buffer vengono aggiunti 200 p1 della soluzione cromogenica; la piastra viene incubata per 30 minuti a temperatura ambiente, al buio. Successivamente vengono aggiunti 50 p1 di Stop Solution ed effettuata la lettura a 450 nm. I risultati del saggio sono riportati nella tabella A.
Esempio 3: Espressione del gene TEM8 in relazione al differenziamento monociti/DC mature.
Analisi convenzionali di RT-PCR mostrano (Fig2) che, mentre il gene CMG2 è abbondantemente ed uniformemente espresso nei monociti (Mo) , nelle DC immature e in quelle maturate con coktail contenente PGE2, l'espressione del TEM8 è ristretta alle DC matura con PGE2.
La quantificazione relativa dell'espressione dei geni operata mediante Real-Time PCR quantitativa (Q-RT-PCR) , conferma che tanto le DC immature quanto i Mo precursori, accumulano quantità più grandi di trascritti CMG2 rispetto a quelle dei trascritti del TEM8 (Tabella B, linea 1 e 2), mentre non si hanno variazioni significative delle attività trascrizionali dei due geni nel passaggio dai Mo precursori a DC immature (Tabella B, linea 3 e 4).
Al contrario, le DC trattate con cocktail contenente PGE2, aumentano in modo selettivo l'espressione del TEM8 di oltre 15 volte rispetto alle cellule immature o ai Mo precursori o alle DC maturate con Poli I:C (Fig 3 e Tabella B linea 5)' indicando con ciò che l'aumento di trascrizione del TEM8 è strettamente PGE2-dipendente.
Tabella B: Dati real-time RT-PCR dell'espressione relativa di trascritti di CMG2 rispetto al TEM8 nella maturazione da monociti a cellule dendritiche mature.
Esempio 4: Analisi della espressione del TEM8 e del CMG2 in cellule tumorali.
Linee cellulari di carcinoma mammario metastatico umano ZR75-1 e MDA-MB231, vengono mantenute in coltura in ambiente umidificato al 5% di C02 in terreno Dulbecco's modified Eagles medium (D-MEM) (Cambrex) integrato con 10% di siero fetale bovino (FBS) (Cambrex), 1% di L-glutamina, 1% di penicillina/streptomicina.
Le procedure per la determinazione della espressione del TEM8 e del CMG2 in real-time RT-PCR sono le stesse riportate nell'esempio 2.
Utilizzando le ZR75-1 come calibratore si rileva un livello di espressione del TEM8 di almeno 150 volte più alto nelle MDA-MB231 in assenza o in presenza di siero. L'espressione del CMG2 nelle MDA-MB231 aumenta di sole 30 volte (Fig. 4 ) .
Esempio 5: Varianti del TEM8 nelle cellule tumorali mammarie
Utilizzando i primers delle ID seq 3 e 10 è stata amplificata per PCR la regione corrispondente sulla Seq ID n 1 e in seguito a clonaggio in pGEM T easy vector e successivo sequenziamento die cloni, sono state trovate 3 varianti trascrizionali portanti variazioni di delezione e frameship le cui sequenze sono indicate come SEQ ID n 4, 5 e 6 rispettivamente.
Esempio 6: Costruzione del vettore di espressione eucariota per il TEM8
I1 vettore d'espressione pcDNA3.1 (Invitrogen) è stato scelto per clonare la porzione extracellulare e il dominio transmembrana del gene TEM8 fusa con il dominio extracellulare del gene Flt-3 per la porzione di sequenza del TEM8 (Gene Bank accession number: 010229).
La porzione del gene TEM8 è stata ottenuta tramite PCR utilizzando come DNA stampo un cDNA ottenuto da un RNA totale estratto da tumori di topi FVB/233 transgenici per l'oncogene neu di ratto (Charles River)
Per l'amplificazione sono stati utilizzati i primers :
FWm8F13 - gggggTACCggCCgCCgCgAggATgggggA RVEcoRIm8 - ggTggAATTCCTAgCACAgCAAATAAgTgTCTTC con le seguenti condizioni di PCR:
La porzione del gene Flt-3 è stata ottenuta mediante PCR utilizzando come templato il plasmide pNGVL-mFL (Michigan, University) esattamente come descritto in Hung et al 2001.
Successivamente i due prodotti di PCR ed il vettore sono stati doppio digeriti con gli enzimi di restrizione (Fermentas) HindIII/KPNi (per il Flt-
3), KpnI/EcoRI (per il TEM8), HindIII/EcoRI (per il vettore) e dopo purificazione, effettuata con il Kit NucleoSpin Extract (Macherey-Nagel), sono stati clonati utilizzando una T4ligasi (Fermentas) . I1 prodotto di ligation è stato quindi trasformato tramite elettroporazione (1 pulse a 2,5kV per 2,5msec) (Micropulser Electroporetion Apparatus Bio-Rad) delle cellule procariotiche DH5a (Takara). Il plasmide, dopo verifica tramite sequenziamento, è stato prodotto in larga scala usando il kit Qiagen Plasmid Giga kit (Qiagen) .
Il plasmide così ottenuto è stato utilizzato per l'immunizzazione di animali ed produzione di anticorpi anti TEM8.
Esempio 7: Immunizzazione dei topi e prelievo sieri Topi Balb/c mantenuti in condizioni "pathogen free" e in accordo alle linee guida del Ministero della Salute, presso lo stabulario del Dipartimento di Ricerca INRCA di Ancona.
La scheda di immunizzazione consiste di tre somrninistrazioni nel muscolo femorale di 100pg in 100p1 di DNA plasmidico descritto all'esempio 6 in soluzione fisiologica a distanza di 15 gg. l'una dall'altra.
Un prelievo di sangue viene effettuato dal plesso retrooculare in tutti i topi prima (sieropreimmune) e dopo 15 giorni dall'ultimo richiamo (siero immune).
Esempio 8: Produzione e purificazione proteina TEM8 ricombinate
Parte del gene per il TEM8 (13-375 Gene Bank accession number NM 010229) è stato inserito nel plasmide pGEM-T Easy Vector (Promega) attraverso ligation; quindi, il prodotto di ligation è stato usato per trasformare cellule elettrocompetenti (ceppo D H 5 a di E . c o l i , TAKARA) con Biorad Micropulser.
Le cellule sono state seminate su terreno Luria Broth Agar (LB contenente l' antibiotico ampicillina. Dalle colonie formatesi, il DNA è stato estratto secondo la metodica del Kit Miniprep Qiagen e quindi sequenziato.
L'amplificazione e il trasferimento del DNA del TEM8 sono stati effettuati mediante Gateway Cloning Techonology. I1 DNA estratto dalle cellule (plasmide pGEM-TEM8) è stato linearizzato con l'enzima di restrizione SalI. I1 pGEM-TEM8 linearizzato è stato amplificato tramite PCR usando specifici primers: AttBlbis e AttB2bis fondamentali per ottenere un prodotto di PCR con siti attB1 e attB2 alle estremità.
Programma PCR mTEM8:
Primers:
attBlbisggggACAAgTTTgTACAAAAAAgCAggCTTgATgggCCgCCgCgAggATgg gggA
attB2bisggggACCACTTTgTACAAgAAAgCTgggTCgCACAgCAAATAAgTgTCTTC
Dopo purificazione del prodotto mediante eluizione da gel sono state effettuate le due reazioni BP ed LR della Gateway. in accordo alle istruzioni della ditta fornitrice (GIBCO) . Pertanto, è stata fatta una trasformazione mediante elettroporazione (Micropulser, BioRad) di cellule TAKARA DH5a elettrocompetenti con il prodotto della BP Reaction; l'Entry Clone, è risultato corretto al sequenziamento.
I primers utilizzati sono stati:
* ATTL1- TCgCgTTAACgCTAgCATggATCTC
* ATTL2- gTAACATCAgAgATTTTgAgACAC
Le condizioni per il sequenziamento sono state:
L'Expression Vector ottenuto come risultato della Gateway è stato usato per trasfettare il ceppo BL21 Star di E.coli. Le cellule trasfettate sono state messe a crescere in coltura O.N. a 3 7 " ~e indotte con IPTG 0,5M .
Dopo induzione, le colture sono state lisate; il campione ottenuto è stato caricato su colonnina HiTrap Chelating HP (Pharmacia) in tampone sodiofosfato 20mM NaCl 0,5M a p H 7.8.
L'eluizione è stata condotta per steps decrescenti di unfunità di pH, fino a pH4.0. La proteina ricornbinante è stata eluita a pH c6.0.
Un ulteriore passaggio di purificazione è stato effettuato su FPLC, con colonna Mono Q in SodioFosfato 20 mM pH 8.00 con gradiente continuo di NaCl da O a 0.3M. La proteina ricornbinante eluisce alla concentrazione di circa 0,lM NaC1 con un picco simmetrico che ne denota l'alto grado di omogeneità, confermata in SDS-PAGE al 12,5% in cui la proteina sovraccaricata nel gel era evidenziata da unfunica banda elettroforetica.
Esempio 9: Specificità degli anticorpi anti-TEM8 Per valutare la specificità degli anticorpi ottenuti in seguito a imrnunizzazione genetica anti.TEM8,la proteina ricombinante TEM8è stata corsa in un gel di poliacrilamide al 12,5% e successivamente trasferita su membrana di nitrocellulosa. Dopo incubazione con i sieri diluiti 1:30 per lh temperatura ambiente la membrana è stata lavata con PBST per 5min 3xf quindi incubata con un anticorpo anti-mouse perossidasi-coniugato (Calbiochem) diluizionel:3000 per lh a temperatura ambiente. La reazione èstata evidenziata su lastra fotografica Kodac, impressionata dalla chemiluminescenza e sviluppata al buio per 1-3 min con il kit "enhanced chemiluminescence, Amersham Life Scienze". I risultati mostrati in Fig 5 mostrano la specificità verso il TEM8 degli anticorpiprodotti.
LISTATO DI SEQUENZE
SEQ. ID no: 1 hTEM8 SV1 cDNA -Gene Bank-accession number AF279145 (nts 144- 1950)
SEQ. ID NO: 1 bis
hTEM8 SV1 polypeptide (564 aa -accession Gene Bank-accession number AF279145)
SEQ. ID NO: 2 BIS
hTEM8 SV2 polypeptide (368aa -Gene Bank-accession number NM-053034)
SEQ.IDNO: 3
hTEM8 SV3 cDNA -Gene Bank-accession number NM-O18153 Nts 144- 2143
SEQ. ID NO: 3 BIS
<TEM8 SV3 polypeptide (317 aa>,<Gene Bank-accession number NM-018153)>
SEQ. ID NO: 4
TEM8 HBC-1 (cDNA -reference SEQ ID NO: l )
SEQ. ID NO: 4 BIS
TEM8 HBC-1 polypeptide
SEQ. ID NO: 5
TEM8 HBC-2 (cDNA- reference sequence SEQ ID NO 1)
SEQ. ID NO: 5 BIS
TEM8 HBC-1 polypeptide
SEQ. ID NO: 6
TEM8 HBC-3 (cDNA-reference SEQ ID N0:I)
SEQ. ID NO: 6 BIS
TEM8 HBC-1 polipeptide
Primers di amplificazione PCR:
Dominio Extracellulare (ECD) (SV of TEM8)
Questa coppia di primers amplifica la regione 901-1040 SEQ ID NO:1 SEQ. ID NO: 7
<hT8-ECD FW>:
SEQ. ID NO: 8
<hT8-ECD RV>
Dominio Intracellulare (ICD). (Detect SV1 and SV2, no SV3)
Questa coppia di primers amplifica la regione 1387-1950 SEQ ID NO:1 SEQ. ID NO: 9
SEQ. ID NO: 10
Dominio extracellulare (ECD) SV3
Questa coppia di primer amplifica la regione 901-1145 della sequenza SEQ ID NO:3
SEQ ID NO: 11
SEQ ID NO: 12
Claims (23)
- RIVENDICAZIONI 1. Metodo di diagnosi di forme tumorali o di stati collegati allfinsorgere di forme tumorali scelti tra angiogenesi infiammatoria patologica, dell'angiogenesi tumorale, capacità metastatica e/o migratoria delle cellule tumorali e delle cellule dendritiche comprendente le fasi in cui: si rileva in un campione biologico la attivazione e l'entità dell'espressione del gene TEM8 o sue regioni, in una qualsiasi delle sue varianti dovute a differente splicing a modificazione posttrascrizionale.
- 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui l'espressione del gene TEM8 è rilevata attraverso determinazione sul campione biologico della presenza delle sequenze di cDNA scelte tra: SEQ ID N0:l; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6, oppure di qualsiasi sequenza del gene TEM8 amplificate per PCR utilizzando le copie di primer aventi sequenze: SEQ ID NO:7 (FW) e SEQ ID NO:8 (RV) oppure SEQ ID NO:9 (FW) e SEQ ID NO:10 (RV) oppure SEQ ID NO: 11 (FW) e SEQ ID NO:12 (RV) oppure della presenza dei corrispondenti trascritti di RNA, o dei corrispondenti prodotti di espressione polipeptidica.
- 3. Metodo secondo la rivendicazione 2 in cui l'espressione del gene TEM8 è determinata attraverso rilevazione sul campione biologico della presenza prodotti di espressione aventi sequenze peptidiche scelte tra: SEQ ID N0:lbis; SEQ ID NO:2bis; SEQ ID NO:3bis; SEQ ID NO:4bis; SEQ ID NO:5bis; SEQ ID N0:Gbis oppure scelte tra le sequenze pepetidiche corrispondenti ai prodotti di amplificazione per PCR del gene TEM8 utilizzando le copie di primer aventi sequenze SEQ ID NO:7 (FW) e SEQ ID NO:8 (RV) oppure SEQ ID NO:9 (FW) e SEQ ID NO:10 (RV) oppure SEQ ID NO:11 (FW) e SEQ ID NO:12 (RV).
- 4. Metodo secondo la rivendicazione 2 in cui l'espressione del gene TEM8 è rilevata attraverso una o più sonde genetiche capaci di ibridizzare (in condizioni di alta stringenza) con una sequenza nucleotidica scelta tra: SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6, oppure con sequenze del gene TEM8 amplificate per PCR utilizzando le copie di primer aventi sequenze SEQ ID NO:7 (FW) e SEQ ID NO:8 (RV) oppure SEQ ID NO:9 (FW) e SEQ ID NO:10 (RV) oppure SEQ ID N0:ll (FW) e SEQ ID NO:12 (RV) o con sequenze aventi almeno 95% di omologia con queste.
- 5. Metodo secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4 in cui il campione biologico è un prelievo ematico, sinoviale, pleurico, bioptico o un prelievo di tessuto tumorale o un campione di cellula dendritica.
- 6. Metodo di prognosi di stati tumorali o di stati infiammatori in cui durante o a seguito del trattamento terapeutico antitumorale o antinfiammatorio si determina in un campione biologico la presenza e l'entità dellfespressione del gene TEM8 o sue regioni, in una qualsiasi delle sue varianti dovute a differente splicing o a modificazione post-trascrizionale.
- 7. Sonda genetica per la determinazione della presenza e dellrentità di espressione del gene TEM8 capace di ibridizzare (in condizioni di alta stringenza) con regioni del gene TEM8 aventi sequenza nucleotidica scelta tra: SEQ ID N0:l; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6, oppure con sequenze del gene TEM8 amplificate per PCR utilizzando le copie di primer aventi sequenze SEQ ID NO:7 (FW) e SEQ ID NO:8 (RV) oppure SEQ ID NO:9 (FW) e SEQ ID NO:10 (RV) oppure SEQ ID N0:ll (FW) e SEQ ID NO:12 (RV) o con sequenze aven a meno omo og a con ques e.
- 8. Primer per PCR per la determinazioni di varianti del gene TEM8 legate a forme tumorali aventi le seguenti sequenze: SEQ ID NO:7 (FW) e SEQ ID NO:8 (RV) oppure SEQ ID NO:9 (FW) e SEQ ID NO:10 (RV) oppure SEQ ID NO:11 (FW) e SEQ ID NO:12 (RV) .
- 9. Vettore di clonaggio o espressione contenete una sequenza nucleotidica scelta tra: SEQ ID N0:l; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6 oppure una qualsiasi dalle sequenze del gene TEM8 amplificate per PCR utilizzando le copie di primer aventi sequenze SEQ ID NO:7 (FW) e SEQ ID NO:8 (RV) oppure SEQ ID NO:9 (FW) e SEQ ID NO:10 (RV) oppure SEQ ID N0:ll (FW) e SEQ ID NO:12 (RV), fiancheggiate da idonee sequenze che ne regolino la trascrizione e la traduzione.
- 10. cellula ospite procariotica o eucariotica modificata attraverso il vettore secondo la rivendicazione 9.
- 11. Polipeptide di espressione del gene TEM8 ottenuto in cellula ospite secondo la rivendicazione 10.
- 12. Polipeptide di espressione del gene TEM8 comprendente sequenze polipetidiche scelte tra SEQ ID N0:lbis; SEQ ID NO:2bis; SEQ ID NO:3bis; SEQ ID NO:4bis; SEQ ID NO:5bis; SEQ ID N0:Gbis oppure polipeptidi corrispondenti alle sequenze del gene TEM8 amplificate per PCR utilizzando le copie di primer aventi sequenze SEQ ID NO:7 (FW) e SEQ ID NO:8 (RV) oppure SEQ ID NO:9 (FW) e SEQ ID NO:10 (RV) oppure SEQ ID N0:ll (FW) e SEQ ID NO:12 (RV) o loro sequenze omologhe aventi almeno 90% di omologia.
- 13. Prodotto espressione secondo le rivendicazioni 11 o 12 per uso come agente diagnostico o terapeutico.
- 14. Prodotto secondo la rivendicazione 13 nella diagnosi o nel trattamento terapeutico di forme tumorali o di stati collegati alltinsorgere di forme tumorali scelti tra angiogenesi infiammatoria patologica, dell'angiogenesi tumorale, capacità metastatica e/o migratoria delle cellule tumorali e delle cellule dendritiche.
- 15. Composizione immunogena comprendente uno o più prodotti di espressione secondo le rivendicazioni 11 o 12 capaci di indurre una risposta immunitaria contro cellule sovra-esprimenti i prodotti del gene TEM8 e un eccipiente farmacologicamente accettabile.
- 16. Composizione immunogena comprendente un vettore secondo la rivendicazioni 9 capace di indurre una risposta immunitaria contro cellule sovraesprimenti i prodotti del gene TEM8 e un eccipiente farmacologicamente accettabile.
- 17. Anticorpo poli o monoclonale specifico per prodotti di espressione secondo le rivendicazioni 11 o 12.
- 18. Anticorpo secondo la rivendicazione 16 per uso nel trattamento terapeutico di inibizione di forme tumorali o di stati collegati all'insorgere di forme tumorali scelte tra: la angiogenesi infiammatoria patologica, la neo-angiogenesi tumorale, la capacità metastatica e/o migratoria delle cellule tumorali e delle cellule dendritiche.
- 19. Anticorpo secondo la rivendicazione 16 per uso come reagente diagnostico per la diagnosi della angiogenesi infiammatoria patologica, dell' (neo?)angiogenesi tumorale, della capacità metastatica e/o migratoria delle cellule tumorali e delle cellule dendritiche.
- 20. Metodo di screening di agonisti o antagonisti dell'attività del gene TEM8 in cui: si trattano le cellule che esprimono il gene TEM8 con il candidato agonista o antagonista e si valutano i livelli dei trascritti di RNA o dei prodotti di espressione corrispondenti alle sequenze SEQ ID N0:l; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO: 6.
- 21. Sequenza di cDNA scelta tra: SEQ ID N0:l; SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6, oppure di qualsiasi sequenza del gene TEM8 amplificate per PCR utilizzando le copie di primer aventi sequenze: SEQ ID NO:7 (FW) e SEQ ID NO:8 (RV) oppure SEQ ID NO:9 (FW) e SEQ ID NO:10 (RV) oppure SEQ ID NO: 11 (FW) e SEQ ID NO:12 (RV) oppure corrispondenti trascritti di mRNA o iRNA, presa singolarmente o in miscela per uso in un trattamento terapeutico.
- 22. Sequenze secondo la rivendicazione 21 nel trattamento terapeutico di forme tumorali o di stati collegati allfinsorgere di forme tumorali scelti tra angiogenesi infiammatoria patologica, dellfangiogenesi tumorale, capacità metastatica e/o migratoria delle cellule tumorali e delle cellule dendritiche.
- 23. Sequenza di cDNA scelta tra SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 oppure sequenza del gene TEM8 comprendente una di queste sequenze, loro trascritti di RNA e loro prodotti di espressione.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT000337A ITRM20060337A1 (it) | 2006-06-27 | 2006-06-27 | Gene tem8 (tumor endotelial marker 8) e sue forme di espressione ed usi diagnostici e terapeutici |
| EP07786842A EP2046983A1 (en) | 2006-06-27 | 2007-06-26 | Tem8 gene, expression forms and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| PCT/EP2007/056357 WO2008000734A1 (en) | 2006-06-27 | 2007-06-26 | Tem8 gene, expression forms and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| US12/306,182 US20090304728A1 (en) | 2006-06-27 | 2007-06-26 | Tem8 gene, expression forms and diagnostic and therapeutic uses thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT000337A ITRM20060337A1 (it) | 2006-06-27 | 2006-06-27 | Gene tem8 (tumor endotelial marker 8) e sue forme di espressione ed usi diagnostici e terapeutici |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ITRM20060337A1 true ITRM20060337A1 (it) | 2007-12-28 |
Family
ID=38626708
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| IT000337A ITRM20060337A1 (it) | 2006-06-27 | 2006-06-27 | Gene tem8 (tumor endotelial marker 8) e sue forme di espressione ed usi diagnostici e terapeutici |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20090304728A1 (it) |
| EP (1) | EP2046983A1 (it) |
| IT (1) | ITRM20060337A1 (it) |
| WO (1) | WO2008000734A1 (it) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TW201425333A (zh) * | 2007-04-11 | 2014-07-01 | Oncotherapy Science Inc | 腫瘤血管內皮標誌８胜肽及包含此胜肽之疫苗 |
| JP6095367B2 (ja) * | 2009-07-13 | 2017-03-15 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | 癌治療のための診断方法および組成物 |
| US8557777B2 (en) | 2010-07-09 | 2013-10-15 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Methods for treating cancer using prostate specific antigen and tumor endothelial marker peptides |
| US9309322B2 (en) * | 2010-11-12 | 2016-04-12 | Scott & White Healthcare (Swh) | Antibodies to tumor endothelial marker 8 |
| WO2012172495A1 (en) * | 2011-06-14 | 2012-12-20 | Novartis Ag | Compositions and methods for antibodies targeting tem8 |
| US9181340B2 (en) | 2011-06-14 | 2015-11-10 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | TEM8 antibodies, conjugates thereof, and their use |
| JP6502931B2 (ja) | 2013-10-11 | 2019-04-17 | アメリカ合衆国 | Ｔｅｍ８抗体およびその使用 |
| ES2923782T3 (es) | 2015-12-02 | 2022-09-30 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Oncoterapia dirigida al receptor celular del virus del Valle de Séneca (SVV) |
| CN106084026B (zh) * | 2016-06-19 | 2019-10-25 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 肿瘤血管内皮细胞标志物8突变体、其融合蛋白及应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1395657B1 (en) * | 2000-12-05 | 2007-04-18 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Receptor for bacillus anthracis toxin |
| US20080171058A1 (en) * | 2003-11-13 | 2008-07-17 | Polly Gregor | Compositions and Methods For Synergistic Induction of Antitumor Immunity |
-
2006
- 2006-06-27 IT IT000337A patent/ITRM20060337A1/it unknown
-
2007
- 2007-06-26 EP EP07786842A patent/EP2046983A1/en not_active Withdrawn
- 2007-06-26 WO PCT/EP2007/056357 patent/WO2008000734A1/en active Application Filing
- 2007-06-26 US US12/306,182 patent/US20090304728A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20090304728A1 (en) | 2009-12-10 |
| WO2008000734A1 (en) | 2008-01-03 |
| EP2046983A1 (en) | 2009-04-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210292407A1 (en) | Cancer targets and uses thereof | |
| ITRM20060337A1 (it) | Gene tem8 (tumor endotelial marker 8) e sue forme di espressione ed usi diagnostici e terapeutici | |
| EP2890815B1 (en) | Methods for diagnosis and treatment of cancer | |
| DK2894162T3 (en) | Identification of tumor-associated antigens for diagnosis and therapy | |
| KR101828290B1 (ko) | 자궁내막암 마커 | |
| JP2018102299A (ja) | 膀胱癌の処置および診断のための方法および組成物 | |
| KR20140057354A (ko) | 결장직장암의 치료 및 진단을 위한 방법 및 조성물 | |
| US20110262464A1 (en) | Compositions, Kits, and Methods for the Diagnosis, Prognosis, and Monitoring of Cancer Using GOLPH3 | |
| JP2002533056A (ja) | 肺癌の治療および診断のための化合物および方法 | |
| WO2013141266A1 (ja) | 新規ｒｅｔ融合体の検出法 | |
| Evans et al. | C35 (C17orf37) is a novel tumor biomarker abundantly expressed in breast cancer | |
| AU2012272662A1 (en) | Methods and compositions for the treatment and diagnosis of cancer | |
| WO2021162981A2 (en) | Methods and compositions for identifying castration resistant neuroendocrine prostate cancer | |
| JPWO2016152352A1 (ja) | メラノーマ特異的バイオマーカー及びその利用 | |
| TW201128190A (en) | Identification of a novel gastric cancer biomarker and uses thereof | |
| US8969020B2 (en) | Peptide sequence that promotes tumor invasion | |
| CA2807104C (en) | Bard1 isoforms in lung and colorectal cancer and use thereof | |
| JP2004187620A (ja) | 腎疾患の疾患マーカーおよびその利用 | |
| JP2003518381A (ja) | ヒトヘパラナーゼ関連ポリペプチド及び核酸 | |
| CA2681360A1 (en) | Deletion bearing bard1 isoforms and use thereof | |
| JP2017135985A (ja) | Ｂ前駆細胞性急性リンパ芽球性白血病新規キメラ遺伝子 | |
| CA2773614A1 (en) | Method of treating cancer by inhibiting trim59 expression or activity | |
| CN109593771B (zh) | 一种人类map2k5第1100位碱基突变基因及其检测试剂盒 | |
| JP2009095343A (ja) | 前立腺癌の検出方法及び前立腺癌の術後再発の可能性の判定方法並びに前立腺癌の治療及び／若しくは予防剤 | |
| CN106702003B (zh) | Hsdl1在诊治骨肉瘤中的应用 |