JP2003518381A - ヒトヘパラナーゼ関連ポリペプチド及び核酸 - Google Patents

ヒトヘパラナーゼ関連ポリペプチド及び核酸

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規に同定したポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド、当該ポリペプチドの使用、並びに当該ポリヌクレオチド及びポリペプチドの産生、に関する。更に具体的には、本発明のポリペプチドはヘパラナーゼ関連エンドグルクロニダーゼである。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含んで成るベクター及び宿主細胞に関する。更に、本発明は本発明に従うポリペプチドに対する抗体、並びに当該抗体、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含んで成る医薬組成物及び診断用試薬に関する。本発明は更に、細胞又は生物におけるヘパラナーゼ関連エンドグルクロニダーゼの発現レベルを変化させ、修飾し、又は別の方法で変調させる方法に関する。本発明の更なる観点は、当該ポリペプチドの変調因子、例えばアゴニスト又はアンタゴニストに適したアッセイ系である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明の分野 本発明は、新規に同定したポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドによ
ってコードされるポリペプチド、当該ポリペプチドの使用、並びに当該ポリヌク
レオチド及びポリペプチドの産生、に関する。更に具体的には、本発明のポリペ
プチドはヘパラナーゼ関連エンドグルクロニダーゼである。本発明はまた、本発
明のポリヌクレオチドを含んで成るベクター及び宿主細胞に関する。更に、本発
明は本発明に従うポリペプチドに対する抗体、並びに当該抗体、ポリペプチド又
はポリヌクレオチドを含んで成る医薬組成物及び診断用試薬に関する。本発明は
更に、細胞又は生物におけるヘパラナーゼ関連エンドグルクロニダーゼの発現レ
ベルを変化させ、修飾し、又は別の方法で変調させる方法に関する。本発明の更
なる観点は、当該ポリペプチドの変調因子（modulator)、例えばアゴニスト又は
アンタゴニストに適したアッセイ系である。
【０００２】 本発明の背景 細胞外マトリックス（ＥＣＭ）及び基底膜（ＢＭ）タンパク質は、主にヘパラ
ン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）から成る線維の網目構造に包埋されている
。ＨＳＰＧは、内皮細胞を支持し、そして毛細血管壁の構造を安定化する血管（
内皮下基底膜）に顕著な化合物である。血小板、胎盤栄養芽層、及び白血球にお
けるヘパラナーゼ、エンド−β−グルクロニダーゼの発現は、胚の形態発生、創
傷治癒、組織修復、及び炎症におけるヘパラナーゼの正常な機能を証明している
。ＥＣＭ消化プロテアーゼと対照的に、ヘパラナーゼは細胞に基底膜を通過させ
、そしてＥＣＭに貯蔵されているヘパリン結合増殖因子（例えば、ｂＦＧＦ，Ｖ
ＥＧＦ）を放出する（Finkel et al., Science 285 (1999), 33-34; Eccels, Na
ture Med. 5 (1999), 735-736)。
【０００３】 最近になって４つの別のグループによってクローニングされたヘパラナーゼ（
Vlodavsky et al., Nature Med. 5 (1999), 793-802; Hulett et al., Nature M
ed. 5 (1999), 803-809; Toyoshima and Nakajima, J. Biol. Chem. 274 (1999)
, 24153-24160; Kussie et al., Biochem, Biophys. Res. Comn. 261 (1999), 1
83-187）は、Ｎ末端側でプロセシングされて５０kDa の活性酵素となる、６５kD
a の前駆体タンパク質として発現する。前記活性酵素の組換え体発現は、ＣＨＯ
，ＮＩＨ ３Ｔ３及びＣＯＳ−７細胞で証明されている。複数の見かけ上異なる
ヘパラナーゼ活性がこれまでに説明されているが、異なる起源（正常及び腫瘍細
胞）に由来するヘパラナーゼのｃＤＮＡをクローニングした４つのグループは、
同一のｃＤＮＡ配列を報告している。
【０００４】 複数の一連の証拠は、腫瘍の増殖及び転移の形成におけるＥＣＭ分解グルクロ
ニダーゼの関与を示している：（１）ヘパラナーゼは、対応する正常組織と比較
したとき、ヒトの腫瘍組織において、例えば浸潤性の乳房の腺管ガン、肝細胞ガ
ン、卵巣腺ガン；子宮頸の扁平上皮ガン、結腸腺ガンにおいて、ｍＲＮＡ及びタ
ンパク質レベルで優先的に発現することが示されている（Vlodasky et al.,上記
）。（２）ヘパラナーゼレベルの増大は転移性の腫瘍を有する動物及びガン患者
の血清及び尿において示されている（Vlodasky et al.,上記）。（３）ヘパラナ
ーゼｍＲＮＡの発現及び酵素活性は、ヒト及びラットの乳ガン細胞系の転移する
可能性と相関している（Vlodasky et al.,上記；Hulett et al.,上記）。（４）
転移性の低い腫瘍細胞は、ヘパラナーゼｃＤＮＡのトランスフェクションによる
高度に転移する表現型を獲得し、これは、例えばマウスのＴリンパ腫Ｌ５１７８
Ｙ及びマウスＢ１６−Ｆ１黒色腫で示されている（Vlodasky et al.,上記）。（
５）硫酸化したオリゴ糖ＰＩ−８８（ホスフォマンノペンタオースＳＯ4 ）は、
ヘパラナーゼ活性を阻害し、原発腫瘍の増殖、転移の形成、及び腫瘍の血管新生
を阻害する（Parish et al., Cancer Res. 59 (1999), 3433-3441）。
【０００５】 本発明の要約 本発明は、エンドグルクロニダーゼの酵素活性を有するポリペプチド又はその
フラグメントをコードするヌクレオチド配列、あるいはそれと相補的なものを含
んで成る、新規の単離核酸分子を提供する。
【０００６】 本発明は更に、前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチド、その機能的
フラグメント又は機能的誘導体又は機能的類似体、に関する。
【０００７】 本発明の別の観点は、前記ポリペプチド又は前記ポリヌクレオチドを産生する
ための方法に関する。
【０００８】 本発明の更なる観点は、好ましくは発現調節配列と作用可能に連結した前記ポ
リヌクレオチドを含んで成る組換えベクター、及び当該組換えベクターで形質転
換した宿主細胞、に関する。
【０００９】 更に、本発明は、細胞又は生物において前記ポリペプチド又は前記ポリヌクレ
オチドの発現レベルを変化させ、修飾し、又は他の方法で変調させる方法に関す
る。
【００１０】 本発明の別の観点は、前記ポリヌクレオチド、又はそのフラグメント若しくは
誘導体、あるいはポリペプチド、又はそのフラグメント若しくは誘導体を利用す
る診断方法に関する。
【００１１】 更に、本発明は前記ポリペプチドを特異的に認識し、そして結合する抗体、及
び当該抗体を利用する診断方法に関する。
【００１２】 更に、本発明は前記ポリヌクレオチド又は前記ポリペプチド又は前記抗体、あ
るいはそれらのフラグメントを含んで成る医薬組成物、並びに前記ポリヌクレオ
チド又は前記ポリペプチド又は前記抗体、あるいはそれらのフラグメントの投与
を含んで成る処置方法に関する。
【００１３】 本発明のより更なる観点は、前記ポリペプチドの生物活性を変調させうる物質
を同定するための方法、及び当該方法によって得られる物質に関する。
【００１４】 本発明の詳細な説明 エンドグルクロニダーゼの酵素活性を有するポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列又はそれをコードする配列と相補的なものを含んで成る、単離された
核酸分子を提供する。
【００１５】 それらの好ましい態様において、本発明に従う、単離された核酸分子は、（ａ
）配列番号１に記載のヌクレオチド配列の、少なくともタンパク質をコードする
部分、（ｂ）遺伝子暗号の縮重の範囲にある（ａ）の配列に対応するヌクレオチ
ド配列、又は（ｃ）ストリンジェントな条件下で、（ａ）及び／又は（ｂ）のヌ
クレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列、を含んで成る核酸分子
である。
【００１６】 本発明は更に、本発明に従う核酸分子によってコードされるポリペプチドを提
供する。好ましくは、前記ポリペプチドは、（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸
配列又は（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくと
も８５％、そして更に好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配
列を含んで成る。
【００１７】 配列番号１に記載のヌクレオチド配列及び遺伝暗号の縮重の範囲内でそれに対
応する核酸配列に加えて、本発明はまた、上文で定義した配列のうちの１つとス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を包含する。本
発明に従う、用語「ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション」は
、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring H
arbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104に従い定義される。好ましくは、
ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションは、１×ＳＳＣ及び０．
１％ＳＤＳによる５０℃、好ましくは５５℃、更に好ましくは６２℃、そして最
も好ましくは６８℃での１時間の洗浄、特に０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ
による５０℃、好ましくは５５℃、更に好ましくは６２℃、そして最も好ましく
は６８℃での１時間の洗浄の後、ポジティブなハイブリダイゼーションシグナル
が観察されることを意味する。上文の洗浄条件で、配列番号１に記載のヌクレオ
チド配列又は遺伝暗号の縮重の範囲内でそれに対応するヌクレオチド配列とハイ
ブリダイズするヌクレオチド配列を、本発明は包含する。
【００１８】 好ましくは、本発明に従うヌクレオチド配列はＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ、ゲノ
ムＤＮＡ又は合成ＤＮＡであり、これは二本鎖又は一本鎖であってもよく、一本
鎖の場合、コード又は非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。しかし、そ
れはＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ及び、コード又は非コード（アンチ
センス）鎖のいずれかである合成ＲＮＡ、又は核酸類似体、例えばペプチド核酸
を含んで成ることがある。特に好ましくは、本発明に従うヌクレオチド配列は、
配列番号１で示すヌクレオチド配列、あるいは配列番号１で示すヌクレオチド配
列又は、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、特に少なくとも３０ヌクレオ
チド、そして最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有するその一
部の７０％以上、好ましくは８５％以上、そして特に好ましくは９５％以上の同
一性を有する配列のタンパク質コード部分を含んで成る。
【００１９】 同一性は、ヌクレオチド又はタンパク質レベルで以下の様に決定される： Ｉ＝ｎ：Ｌ （ここで、 Ｉは同一性（％）を表し、 ｎは、試験配列と、配列番号１のヌクレオチド配列、配列番号２のアミノ酸配
列又はその一部からそれぞれ選択される基準配列との間の異なるヌクレオチド又
はアミノ酸の数を表し、そして Ｌは試験配列と比較される基準配列の長さである）
【００２０】 本発明のポリヌクレオチドは哺乳類、例えばヒト細胞から、あるいは哺乳類、
例えばヒト細胞由来のｃＤＮＡライブラリー又はゲノムライブラリーから得るこ
とができる。特に、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、Incyte Inc. から入
手可能なｃＤＮＡライブラリー（ＰＥＮＣＮＯＴＯ７，ＢＬＡＤＮＯＴＯ９，Ｐ
ＲＯＳＴＵＴＯ８，ＢＲＳＴＮＯＴ２７，ＭＩＸＤＮＯＰＯ１，ＥＳＯＧＮＯＴ
Ｏ４，ＰＥＮＣＮＯＴＯ３）から単離され得る。配列番号１に示すｃＤＮＡイン
サートは、長さが３９４３塩基対（bp）であり、そして４９２アミノ酸の長さの
タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。本発明のポリペ
プチドの推定されるアミノ酸配列は、ヒトヘパラナーゼと３８％同一のアミノ酸
を共有する（図１）。本発明のｃＤＮＡの５′末端は不完全であり；推定される
成熟タンパク質は、ヒトヘパラナーゼに対する相同性から推測した場合、完全な
ものである。電子的な発現（ノーザン）解析は、神経系及び雄性の生殖器組織に
おける本発明のポリヌクレオチドの優先的な発現を示している（図２）。
【００２１】 本発明は更に、推定される配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドの
フラグメント、類似体及び誘導体をコードする、本明細書に記載のポリヌクレオ
チドの変異体に関する。本発明はまた、配列番号１又は配列番号１のセグメント
のポリヌクレオチド配列から構築したポリヌクレオチドプローブに関する。本明
細書に記載のポリヌクレオチドの変異体は、欠失変異体、置換変異体及び付加又
は挿入変異体を含む。
【００２２】 本発明はまた、前記ポリペプチドについてのコード配列、又はそのセグメント
が、宿主細胞からのポリペプチドの発現又は分泌を保護し、又は本発明のポリペ
プチドの精製を可能にする（すなわちポリヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ
、ＧＳＴタグ）ポリヌクレオチド配列と、同一のリーディングフレームで融合さ
れ得るポリヌクレオチドを含む。
【００２３】 本発明に従うポリヌクレオチドの調製方法は、本発明の観点を表す。その様な
方法は、化学合成、組換えＤＮＡ技術、ポリメラーゼ連鎖反応又はこれらの方法
の組み合わせを含んで成ることもある。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、
増幅反応、例えば配列特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲに
よって、上述した様な適当な供給源から得られる。
【００２４】 本発明のポリペプチドは組換えポリペプチド、天然ポリペプチド又は合成ポリ
ペプチドであってもよい。本発明の機能的フラグメント、誘導体又は類似体は、
１又は複数のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されたもの、あるいは１又は複数の
アミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは前記ポリペプチドが別の化合物（す
なわち、ポリエチレングリコール）と融合されたもの、あるいは追加のアミノ酸
が前記ポリペプチドに融合したもの（すなわち、リーダー配列、分泌配列、精製
タグ）、であってもよい。
【００２５】 本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含んで成る組換えベクターに関す
る。好ましくは、当該ベクターは発現ベクター、すなわち適当な発現調節配列と
作用可能に連結した本発明のポリヌクレオチドを含んで成るベクターである。当
該ベクターは原核生物又は真核生物のベクターであってもよい。真核生物のベク
ターの例は、染色体ベクター、例えばバクテリオファージ及び染色体外ベクター
、例えばプラスミドであり、その中でも、環状プラスミドベクターが特に好まし
い。適当な真核生物ベクターは、例えば上記のSambrook et al., Chapters 1-4
において開示されている。一方、当該ベクターは原核生物ベクター、例えば酵母
ベクター又は高等細胞、例えば昆虫細胞、植物細胞又は脊椎動物細胞、特に哺乳
類細胞での発現に適したベクターであってもよい。原核生物ベクターの好ましい
例は、プラスミド又はウイルスベクターである。適当な原核生物ベクターは、上
記のSambrook et al., Chapter 16 において開示されている。
【００２６】 更に、本発明は、上文で定義したポリヌクレオチド又はベクターの、少なくと
も１つの異種のコピーを含む細胞に関する。当該ポリヌクレオチド又はベクター
は、既知の手段、例えば形質転換（この用語は、トランスフェクション、エレク
トロポレーション、リポフェクション、感染なども含む）によって細胞に挿入さ
れ得る。当該細胞は、原核細胞又は真核細胞であってもよい。核酸で細胞を形質
転換する方法は一般的に知られており、詳細に説明する必要なないだろう。好ま
しい細胞の例は、真核細胞、特に脊椎動物、そして更に具体的には哺乳類細胞で
ある。
【００２７】 本発明の別の観点は、本発明のポリペプチドの産生のための組換え方法であっ
て、上述したポリヌクレオチド又はベクターで形質転換した宿主細胞の、前記ポ
リペプチドの発現の実施に適した条件下での培養、及びその結果として発現した
ポリペプチドの前記細胞又は培養上清からの単離を含んで成る方法に関する。宿
主細胞は、形質転換体の選択、前記ポリヌクレオチド又はベクターの増幅、ある
いは前記ポリペプチドの精製に適する様に修飾された常用の栄養培地中で培養さ
れ得る。
【００２８】 結果として発現した本発明のポリペプチドは、これまでに使用されている方法
、例えば洗剤ホモジェネート、ヘパリンセファロースクロマトグラフィー、陽イ
オン交換クロマトグラフィー、Ｃｏｎ Ａ−セファロースクロマトグラフィー、
ゲル濾過クロマトグラフィー、Ｎｉキレートクロマトグラフィー、グルタチオン
セファロース（アガロース）クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラ
フィー、及び抗体親和性クロマトグラフィーによって、組換え細胞培養物から回
収され、そして精製され得る。
【００２９】 本発明のポリペプチドは、高度に発現する細胞系から天然に発現した精製産物
、又は化学合成産物であってもよく、あるいは原核生物又は真核生物の宿主から
組換え技術によって産生され得る。組換え体産生方法で利用される宿主に依存し
て、本発明のポリペプチドはグリコシル化されることもあり、又はグリコシル化
されないこともある。
【００３０】 本発明の別の観点は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１に記載のヌク
レオチド配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド又はその誘導体に関する
。その様なオリゴヌクレオチドは、意図される使用に依存して、例えば約５、好
ましくは約１５〜約１００、又は数百のヌクレオチド単位の長さ又はそれに類似
するものであってもよい。
【００３１】 本発明のオリゴヌクレオチドは、クローニングベクター、又はＰＣＲプライマ
ー、又は配列決定プライマー、又はハイブリダイゼーションプローブとして使用
され得る。別の使用は、センス又はアンチセンス技術の使用によって、ｉｎ ｖ
ｉｖｏで本発明のポリペプチドの発現を刺激し、又は阻害することに関する。こ
れらの技術は、二本鎖ＤＮＡ上での三重らせんの形成又はＲＮＡ上でのアンチセ
ンス機構を介して遺伝子の発現を調節するために使用されることがあり、これら
の方法は共に、ＤＮＡ又はＲＮＡに対するその様なオリゴヌクレオチドの結合に
基づいている。オリゴヌクレオチド、特にＲＮＡオリゴヌクレオチドの更に別の
使用は、リボザイム技術を用いる発現の調節に関する。前記オリゴヌクレオチド
は、直接的に、あるいはアンチセンス又はリボザイムＲＮＡ又はＤＮＡがｉｎ
ｖｉｖｏで発現し、本発明のポリペプチドの産生を阻害する様に、当業界の方法
によって細胞に送達され得る。本発明のポリヌクレオチドに対するアンチセンス
コンストラクト又はリボザイムは、本発明のポリペプチドの作用を阻害し、そし
てある疾患、例えばガン及びガンの転移を処置するために使用され得る。
【００３２】 更に、前記オリゴヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの存在又は不在
及び前記ポリヌクレオチドの発現レベルを検出するために使用され得る。更に、
前記オリゴヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードする遺伝子内の突然
変異の検出に使用され得る。前記遺伝子内の突然変異は疾患又は疾患の予後と関
連づけられることがある。従って、前記オリゴヌクレオチドは、疾患、例えばガ
ン、ガンの転移、及び異常な血管形成の診断のための診断用マーカーとして有用
である。
【００３３】 前記ポリペプチド、それらの機能的フラグメント、それらの誘導体又は類似体
、あるいはそれらを発現する細胞、あるいは前記ポリヌクレオチド又はそのフラ
グメントは、免疫原としてそれらの抗体を産生するために使用され得る。従って
、本発明は、本発明のポリペプチドを特異的に認識し、そしてそれに結合する抗
体に関する。
【００３４】 前記抗体は、例えばポリクローナル又はモノクローナル抗体であってもよい。
本発明はまた、キメラ抗体、一本鎖抗体及びヒト化抗体、並びにＦａｂフラグメ
ントを含む。当業界で知られている種々の方法が、前記抗体及びフラグメントの
産生に使用され得る。
【００３５】 ポリクローナル抗体は、任意に担体とカップリングした適当なポリペプチド又
はペプチド抗原で実験動物を免疫化し、そして免疫化した動物から抗体を単離す
ることによって得ることができる。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭ
ｉｌｓｔｅｉｎによって開発されたハイブリドーマ技術によって得られる。ポリ
クローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生するための方法は、それぞれ一般
的に知られており、詳細に説明する必要はない（Harlow and Lane, Antibodies
: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。
【００３６】 前記抗体は、前記ポリペプチドを発現している組織から、当該ポリペプチドを
単離するために使用され得る。本発明のポリペプチドに特異的な抗体は更に、前
記ポリペプチドに結合することによって前記ポリペプチドの生物学的作用を阻害
するために使用され得る。その様に、当該抗体は治療、例えばガンの処置におい
て使用され得る。ガンの治療は、Ｗｅｉｎｅｒによって記述されたプロトコール
（Semin. Oncol. 26 (1999), 41-50）又は本明細書で引用されている参考文献に
従い実施され得る。
【００３７】 更に、前記抗体は本発明のポリペプチドの存在又は不在及び当該ポリペプチド
の濃度のレベルを検出することができ、従って疾患、例えばガン、ガンの転移、
及び異常な血管形成の診断の診断用マーカーとして有用である。
【００３８】 更なる観点において、本発明は本発明のポリペプチドの生物活性又は発現を変
調させ得る物質を同定するための方法に関する。従って、本発明は、本発明のポ
リペプチドの機能又は活性又は発現のアンタゴニスト及び阻害剤、並びにアゴニ
スト及び刺激因子を同定するための方法に関する。
【００３９】 例えば、アンタゴニストは本発明のポリペプチドと結合し、そしてその機能を
阻害し、又は排除し得る。前記アンタゴニストは、例えば、前記ポリペプチドに
結合することによって、当該ポリペプチドのグルクロニダーゼ活性を排除したポ
リペプチドに対する抗体又は高親和性オリゴヌクレオチド又はペプチドであって
もよい。阻害剤の例は、触媒部位に結合し、そして占有することによって、前記
ポリペプチドの生物学的活性が妨害される様に、前記触媒部位を基質から接触不
可能にすることによって前記ポリペプチドを不活性化する低分子量の分子である
。
【００４０】 アンタゴニスト及び阻害剤は、細胞外マトリックスからヘパラン硫酸プロテオ
グリカンが分解する様に機能することから前記ポリペプチドを妨害することによ
って、ガン、ガンの転移、及び異常な血管形成を処置するために使用され得る。
【００４１】 上述の方法によって同定したアンタゴニスト及び阻害剤又はそれらの誘導体は
、医薬として許容される担体と一緒に組成物において利用され得る。
【００４２】 特に、本発明は上述の物質、例えば低分子量の阻害剤を同定するためのアッセ
イに関するものであり、前記物質は本発明のポリペプチドに特異的であり、そし
れそれらが機能するのを防ぎ、そしてそれらの発現を防ぐ。天然又は合成、その
いずれかの炭水化物基質が、前記ポリペプチドのエンドグルクロニダーゼ活性を
評価するために使用され得る。
【００４３】 更なる観点は、医薬における使用のための本発明に従うポリヌクレオチド又は
ポリペプチドに関する。特に、本発明は、前記ポリペプチドの不足又は欠損から
生じる疾患の処置のための医薬組成物の調製における、本発明に従うポリペプチ
ド又はポリヌクレオチドの使用に関する。本発明のポリヌクレオチド又はポリペ
プチドの代わりに、又はそれらに加えて、前記ポリペプチドのアゴニスト又は前
記ポリペプチドの発現誘導因子／増強因子が、医学的な目的のために使用され得
る。前記疾患は、外傷、自己免疫疾患、皮膚病、心臓血管疾患、及び神経系の病
気である。本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子治療において使用され得る。当
該遺伝子治療は、Beutler (Biol. Blood Marrow Transplant 5 (1999), 273-276
）又はGomez-Navarro等（Eur. J. Cancer 35 (1999), 867-885）によって記述さ
れたプロトコール又は本明細書で引用された参考文献に従い実施され得る。
【００４４】 別の観点は、医薬における使用のための本発明に従う抗体又はそのフラグメン
トに関する。特に、本発明は、本発明のポリペプチドの過剰な活性又は過剰発現
から生じる疾患の処置のための医薬組成物の調製における、本発明に従う抗体の
使用に関する。本発明の抗体の代わりに、前記ポリペプチドのアンタゴニスト又
は阻害剤又は発現阻害剤が薬用の目的のために使用され得る。その様な疾患は、
例えばガン、ガンの転移、血管形成及び関節炎を含む炎症である。
【００４５】 更に、本発明は、本発明のポリペプチドの不足又は欠損又は不活性から生じる
疾患に苦しむ、あるいは本発明のポリペプチドの過剰な活性又は過剰発現から生
じる疾患に苦しむ、ヒトを含む温血動物への投与に適した医薬組成物に関する。
【００４６】 本発明のポリペプチドが雄性の生殖器で妨害されて発現するので、コードされ
たポリペプチドの発現及び／又は活性の変調は、雄性の生殖器機能（すなわち、
雄性の避妊法、勃起障害）における薬品の処置に使用され得る。
【００４７】 例例１： 本発明のポリヌクレオチドの同定 公開されているヒトヘパラナーゼ（ＡＡＤ５４９４１．１）の配列を用いて、
３つのＩｎｃｙｔｅの鋳型（すなわちＩｎｃｙｔｅ ＥＳＴのアセンブリー）は
、ヒトヘパラナーゼに対する有意な相同性を有するものが同定され得る。各鋳型
のこれらのＥＳＴのうちのいくつかは、Ｉｎｃｙｔｅから発注された。各ＥＳＴ
クローンの３′及び５′末端のヌクレオチド配列の決定は、Ｉｎｃｙｔｅのクロ
ーンに由来する更に２つのアセンブリーを導く更に新規な情報を明らかにした。
この配列情報と、我々のこれらのＩｎｃｙｔｅクローンの配列決定の努力による
配列情報とを組み合わせることで、ヒトヘパラナーゼの、新規なパラログである
ヒトヘパラナーゼ関連ポリペプチドの構築を可能にした。当該新規配列は３９４
３bpを含んで成り、そして同定されたコード配列は１bp〜１４７９bpに及ぶ（終
止コドンを含む）。５′末端は、コード領域の解析（プログラムＥＳＴＳＣＡＮ
によって決定される）及びヒトヘパラナーゼに対する相同性が共に示している様
に、まだ確定していない。
【００４８】例２： 電子的発現解析 所定の組織のＥＳＴの数に基づき、所定の組織における所定の遺伝子のｉｎ
ｖｉｖｏでの発現レベルについての測定値が推定又は予測され得る。
【００４９】 「エレクトロニックノーザン」は、データベース内にある所定の組織について
の全てのＥＳＴに関する合計数（いわゆる「プールサイズ」）を最初に同定し、
そして次に照会配列にのみ対応する、その組織に由来するＥＳＴの数を同定する
、バイオインフォマティックな方法である。
【００５０】 このことは、照会するものとして注目の遺伝子のｃＤＮＡ、そしてデータソー
スとしてヒトＥＳＴデータベース（ＩｎｃｙｔｅのＬｉｆｅＳｅｑＧｏｌｄ）を
用いるＢＬＡＳＴ（NCBI BLAST V.2.0.10; Altschul et al., Nucleic Acid Res
. (1997) 25, 3389-3402）サーチによって行われる。当該サーチのパラメーター
は、Ｅ＝１ｅ−３０であった。データベース中のＳＱＬ−ｑｕｅｒｙは、当該サ
ーチからその組織源を生じさせる各ＥＳＴ及び各組織についてのプールサイズを
検索する。
【００５１】 このデータベースは、ｉｎ ｖｉｖｏでの発現レベルと相関すると思われる。
統計解析（プールサイズに対する正規化及び信頼区間の決定）は当該データベー
スの信頼性を推定し、そして異なる組織間の発現レベルを比較するのに役立つ。
この予測方法の信頼性は、通常ヒット／組織の数及び組織のプールサイズと共に
増大する。
【００５２】例３： ポリヌクレオチドの発現 配列番号１で示されているポリヌクレオチドのコード領域は、５′プライマー
ＨｅｐＲ１（５′−ＧＡＣ ＡＧＧ ＡＧＡ ＣＣＣ ＴＴＧ ＣＣＴ ＧＴＡ
ＧＡＣ−３′）及び３′−プライマーＨｅｐＲ２（５′−ＡＴＡ ＧＴＣ Ｇ
ＡＧ ＴＴＡ ＴＣＧ ＧＴＡ ＧＣＧ ＧＣＡ ＧＧＣ ＣＡＡ ＡＧＣ−３
′）並びに鋳型ＤＮＡとしてクローン＃３２０７５３５Ｈ１及び＃３３８５８２
４Ｈ１（Ｉｎｃｙｔｅ Ｉｎｃ．のデータベースＬｉｆｅＳｅｇＧｏｌｄ、１９
９９年１０／１１月発表）を用いるＰＣＲによって増幅した。１４８８bpのＤＮ
ＡはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化され、引き続いてＸｈｏＩ
を用いて制限消化された。当該フラグメントは、Ｎ末端の免疫グロブリンシグナ
ル配列、続いてｍｙｃ−タグエピトープを提供するｐＩＳＰ−ｍｙｃベクターに
インフレームでライゲーションされた。ＨｉｎｄIII 及びＸｈｏＩを用いる制限
消化によって、当該フラグメントは発現ベクターｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ）の適当な部位にライゲーションされ、発現ベクターＨｅｐＲ−ｐＣＥＰが
生成した。ＨｅｐＲ−ｐＣＥＰはＭＣＦ７，ＭＢＡ−２３１、及びＭＢＡ−４６
８乳ガン細胞系、並びにＣＨＯ細胞に安定してトランスフェクションされた。組
換えタンパク質は、抗ｍｙｃタグエピトープ抗体を用いて検出された。
【００５３】 昆虫細胞における発現のために、ＰＣＲフラグメントはＥｃｏＲＩ及びＸｂａ
Ｉを用いてｐＩＳＰ−ｍｙｃベクターから放出された。当該フラグメントはｐＶ
Ｌ１３９２バキュロウイルストランスファーベクター内にクローニングされ、Ｈ
ｅｐＲ−ｐＶＬベクターを生成せしめ、そしてＳｆ９昆虫細胞にトランスフェク
ションされた。
【００５４】例４： 抗体の産生 例３の発現ベクターＨｅｐＲ−ｐＶＬを用いて感染したＳｆ９昆虫細胞から精
製したポリペプチドは、標準的な方法（Harlow and Lane, Antibodies : A Labo
ratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）を用いて、マウス及び
ウサギ、それぞれの免疫化に使用された。
【配列表】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１２月４日（２００１．１２．４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 29/00 ４Ｃ０８６ Ａ６１Ｐ 15/00 35/00 ４Ｈ０４５ 29/00 Ｃ０７Ｋ 16/40 35/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 16/40 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/24 1/21 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 Ａ 9/24 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA11 CA04 DA02 EA02 FA02 GA11 HA01 4B050 CC03 DD11 LL01 LL03 4B065 AA90X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA31 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA22 DC01 NA14 ZA811 ZB111 ZB261 4C085 AA13 AA14 BB11 DD22 DD23 EE01 4C086 AA01 AA02 EA16 MA04 NA14 ZA81 ZB11 ZB26 4H045 AA11 CA40 DA75 EA51 FA74

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）配列番号１に記載の配列又は少なくともそのタンパク
    質コード部分、 （ｂ）遺伝暗号の縮重の範囲で（ａ）の配列に対応するヌクレオチド配列、あ
    るいは （ｃ）ストリンジェントな条件下で（ａ）及び／又は（ｂ）由来の配列とハイ
    ブリダイズするヌクレオチド配列、 を含んで成るポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 エンドグルクロニダーゼの生物活性を有するポリペプチドを
    コードする、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 【請求項３】 配列番号１に記載のヌクレオチド配列又はそのフラグメント
    に対して少なくとも７０％の同一性を有する、請求項１又は２に記載のポリヌク
    レオチド。
  4. 【請求項４】 ＤＮＡ，ＲＮＡ又は核酸類似体である、請求項１〜３のいず
    れか１項に記載のポリヌクレオチド。
  5. 【請求項５】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの少
    なくとも１つのコピーを含んで成る組換えベクター。
  6. 【請求項６】 発現ベクターである、請求項５に記載のベクター。
  7. 【請求項７】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は
    請求項５若しくは６に記載のベクターで形質転換する細胞。
  8. 【請求項８】 請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドによ
    ってコードされるポリペプチド。
  9. 【請求項９】 （ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は （ｂ）（ａ）のアミノ酸配列又はそのフラグメントに対して少なくとも７０％
    の同一性を有するアミノ酸配列、 を含んで成る、請求項８に記載のポリペプチド。
  10. 【請求項１０】 エンドグルクロニダーゼ活性を有する、請求項８又は９に
    記載のポリペプチド。
  11. 【請求項１１】 特異的抗体を誘発し得る、請求項８〜１０のいずれか１項
    に記載のポリペプチド又はそのフラグメント。
  12. 【請求項１２】 請求項８〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチドの産
    生方法であって、化学合成、組換えＤＮＡ技術又はそれらの方法の組み合わせを
    含んで成る方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドの
    産生方法であって、化学合成、組換えＤＮＡ技術、ポリメラーゼ連鎖反応又はこ
    れらの方法の組み合わせを含んで成る方法。
  14. 【請求項１４】 請求項８〜１１で定義したポリペプチドを特異的に認識し
    、そして結合する抗体又はオリゴペプチド又はオリゴヌクレオチド又はそれらの
    誘導体。
  15. 【請求項１５】 医薬における使用のための、請求項１〜４のいずれか１項
    に記載のポリヌクレオチド又は請求項８〜１１のいずれか１項に記載のポリペプ
    チド。
  16. 【請求項１６】 前記ポリペプチドの不足又は欠如又は不活性から生じる疾
    患の処置のための医薬組成物の製造における、請求項１〜４のいずれか１項に記
    載のポリヌクレオチド又は請求項８〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチド
    の使用。
  17. 【請求項１７】 請求項８〜１１で定義したポリペプチドの不足又は欠如、
    又は不活性から生じる疾患の処置の方法であって、適当量の、請求項１〜４のい
    ずれか１項に記載のポリヌクレオチド又は請求項８〜１１のいずれか１項に記載
    のポリペプチドの投与を含んで成る方法。
  18. 【請求項１８】 請求項８〜１１で定義したポリペプチドの過度の活性又は
    過剰発現から生じる疾患の処置の方法であって、適当量の、請求項１４で定義し
    た様な抗体又はオリゴペプチド又はオリゴヌクレオチド又はそれらの誘導体の投
    与を含んで成る方法。
  19. 【請求項１９】 細胞において、請求項８〜１１で定義したポリペプチドの
    生物活性又は発現を修飾し得る物質を同定する方法であって、前記ポリペプチド
    あるいはその機能的誘導体、機能的フラグメント又は機能的類似体、あるいは前
    記ポリペプチドを発現し得る細胞を、前記ポリペプチド、機能的誘導体、機能的
    フラグメント又は機能的類似体の生物活性又は発現を修飾する能力が研究のため
    に求められている少なくとも１つの化合物又は薬剤と接触させ、そして前記物質
    によって生じた前記ポリペプチド、誘導体又はフラグメントの生物活性又は発現
    の変化を決定すること、を含んで成る方法。
  20. 【請求項２０】 変調因子又はその誘導体として同定されている物質を活性
    剤として含んで成る医薬組成物を調製することを更に含んで成る、請求項１９に
    記載の方法。
  21. 【請求項２１】 請求項８〜１１で定義したポリペプチドに対して結合し、
    又は機能的な効果を有する能力について物質を試験するためのアッセイ系であっ
    て、前記ポリペプチド、あるいはその機能的誘導体、機能的フラグメント又は機
    能的類似体、あるいは前記ポリペプチド又は機能的誘導体、機能的フラグメント
    若しくは機能的類似体を発現し得る細胞、及び任意として、前記物質によって生
    じた応答を決定するための手段、を含んで成るアッセイ系。
  22. 【請求項２２】 請求項１９又は２０で定義した方法によって得られる物質
    であって、請求項８〜１１で定義したポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニ
    ストである物質。
  23. 【請求項２３】 細胞において、請求項８〜１１で定義したポリペプチドの
    発現を修飾するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド
    あるいはそのフラグメント又は誘導体の使用。
  24. 【請求項２４】 遺伝子治療における、請求項１〜４のいずれか１項に記載
    のポリヌクレオチドの使用。
  25. 【請求項２５】 請求項８〜１１で定義したポリペプチドの不足的な発現又
    は過剰発現から生じる疾患の診断のための、請求項１４で定義した抗体又はオリ
    ゴペプチド又はオリゴヌクレオチド又はそれらの誘導体、あるいは請求項１〜４
    のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド又はそのフラグメント若しくは誘導体
    の使用。
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