SK8882002A3

SK8882002A3 - Human heparanase-related polypeptide and nucleic acid

Info

Publication number: SK8882002A3
Application number: SK888-2002A
Authority: SK
Inventors: Gerhard Siemeister; Bertram Weiss
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 1999-12-23
Filing date: 2000-12-18
Publication date: 2002-11-06
Also published as: BG106842A; WO2001048161A2; EE200200353A; CA2392703A1; NO20023015L; ZA200205852B; CN1413249A; IL149506A0; PL362867A1; NO20023015D0; HUP0203724A2; BR0016703A; JP2003518381A; CZ20022147A3; RU2002119561A; MXPA02005077A; US20040161745A1; KR20020062375A; EP1244778A2; WO2001048161A3

Description

Predkladaný vynález sa týka novo identifikovaných polynukleotidov a polypeptidov kódovaných takýmito polynukleotidmi, použitia týchto polypeptidov a tiež prípravy takýchto polynukleotidov a polypeptidov. Konkrétne, polypeptid podľa predkladaného vynálezu je endoglukuroinidáza príbuzná heparanáze. Predkladaný vynález sa ďalej týka vektorov a hostiteľských buniek, ktoré obsahujú polynukleotid podlá vynálezu. Ďalej sa vynález týka protilátok namierených proti polypeptidu podľa predkladaného vynálezu a ďalej farmaceutických prípravkov a diagnostických činidiel obsahujúcich takéto protilátky, polypeptidy alebo polynukleotidy. Predkladaný vynález sa ďalej týka spôsobu zmeny, modifikácie alebo inej modulácie hladiny expresie endoglukuronidázy príbuznej heparanáze v bunke alebo v organizme. Ďalším aspektom vynálezu sú testovacie systémy užitočné na identifikáciu modulátorov, napr. agonistov alebo antagonistov týchto polypeptidov .

Doterajší stav techniky

Proteíny extracelulárneho matrix (ECM) a bazálnej membrány (BM) sú vnorené do vláknitej siete pozostávajúcej najmä z proteoglykánov heparansulfátu (HSPG). HSPG sú výnimočné zlúčeniny· vyskytujúce sa v krvných cievach (subendotelová bazálna membrána) , ktoré podporujú endótelové bunky a stabilizujú štruktúru stien kapilár. Expresia heparanázy, endo-p-D-glukuronidázy, v krvných doštičkách, trofoblastoch placenty a v leukocytoch demonštruje normálnu funkciu heparanázy pri embryonálnej morfogenéze, hojení rán, reparácii tkanív a zápaloch. V súlade s ECM-štiepiacimi proteázami heparanáza dovoľuje bunkám prechádzať bazálnou membránou a uvoľňovať rastové faktory viažuce heparin (ako napr. bFGF, VEGF), ktoré sú akumulované v ECM (Finkel et. al. , Science 285 (1999), 33 —34; Eccles, Náture Med.

(1999) , 735-736.) .

Heparanáza, ktorá bola v súčasnosti klonovaná nezávisle štyrmi výskumnými skupinami (Vlodavsky et al., Náture Med. 5 (1999), 793-802; Hulett et al., Náture 'Med. 5 (1999), 803-809; Toyoshima and Nakajima, J. Biol. Chem. 274 (1999); 24153-24160; Kussie et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 261 (1999), 183— 187), je exprimovaná ako prekurzorový proteín s veľkosťou 63 kDa, ktorý je N-koncovo opracovaný na aktívne enzýmy s veľkosťou 50 kDa. Rekombinantná expresia aktívneho enzýmu sa demonštrovala v bunkách CHO, NIH 3T3 a COS-7. Hoci už skôr bolo opísaných niekoľko zjavne odlišných heparanázových aktivít, 4 skupiny, ktoré klonovali heparanázovú cDNA z rôznych zdrojov (normálne a nádorové bunky) publikovali identické cDNA sekvencie.

Existuje rad dôkazov, ktoré ukazujú, že ECM degradujúce glukuronidázy sa podieľajú na raste nádorov a vytváraní metastáz:

(1) Ukázalo sa, že heparanáza je prednostne exprimovaná v podobe mRNA a proteínu v ľudských nádorových tkanivách v porovnaní so zodpovedajúcim zdravým tkanivom, napr. pri invazívnom dukcálnom karcinóme prsníka, hepatocelulárnom karcinóme, adenokarcinóme ovárii, skvamóznomkarcinóme krčka, adenokarcinóme- hrubého čreva (Vlodavsky et al., supra). (2) Zvýšená hladina heparanázy sa zistila v sére a v moči zvierat s metastázujúcimi nádormi aj u pacientov s rakovinou (Vlodavsky et al., supra). (3) Expresia mRNA heparanázy a enzýmová aktivita korelujú s metastázujúcim potenciálom v bunkových líniách z karcinómu prsníka u ľudí aj laboratórnych potkanov (Vlodavsky et al., supra; Hullet et al., supra). (4) Slabo metastázujúce nádorové bunkové línie získajú silno metastázujúci fenotyp po transfekcii heparanázovou cDNA; ako bolo napr. ukázané na myšom T lymfóme L5178Y a myšom melanóme B16-F1 (Vlodavsky et al., supra). (5) Sulfatovaný oligosacharid PI-88 (fosfomanopentóza-S04) , ktorý inhibuje aktivitu heparanázy, inhibuje rast primárnych nádorov, vytváranie metastáz a vaskularizáciu nádorov (Parish et al. , Cancer Res. 59 (1999), 34 33-34 41) .

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález poskytuje novú izolovanú molekulu nukleovej kyseliny obsahujúcu kódujúcu sekvenciu nukleotidov alebo sekvenciu komplementárnu k sekvencií kódujúcej polypeptid, ktorý má enzymatickú aktivitu,endoglukuronidázy, alebo jej fragment.

Predkladaný vynález sa ďalej týka polypeptidu kódovaného polynukleotidom alebo jeho funkčného fragmentu, funkčného derivátu alebo funkčného analógu.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka spôsobu prípravy takýchto polypeptidov alebo polynukleotidov.

A ešte jeden aspekt predkladaného vynálezu sa týka rekombinantných vektorov obsahujúcich taký polynukleotid, výhodne operatívne spojený s kontrolnou expresnou sekvenciou (t.j. sekvenciou, ktorá riadi expresiu) a ďalej sa týka hostiteľských buniek transformovaných takýmto rekombinantným vektorom.

Naviac sa·predkladaný vynález týka ďalej spôsobu .zmeny, modifikácie alebo inej modulácie hladín expresie týchto polypeptidov alebo polynukleotidov v bunke alebo v organizme.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka spôsobu diagnózy, ktorý využíva polynukleotid podľa vynálezu, alebo jeho fragment alebo derivát, alebo polypeptid podľa vynálezu alebo jeho fragment alebo derivát.

Ďalej sa predkladaný vynález týka protilátok špecificky rozpoznávajúcich a viažucich sa na také polypeptidy a ďalej sa týka diagnostických spôsobov, ktoré používajú protilátky podľa vynálezu.

Okrem toho sa predkladaný vynález týka farmaceutických kompozícií obsahujúcich polynukleotidy alebo polypeptidy alebo protilátky podľa vynálezu alebo ich fragmenty a ďalej sa týka liečenia, keď sa podáva polynukleotid alebo polypeptid alebo protilátka podľa vynálezu alebo ich fragment.

Ešte ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka spôsobu identifikácie látky schopnej modulovať biologickú aktivitu polypeptidov podľa vynálezu a ďalej sa týka látok získaných spôsobom podľa vynálezu.

Predkladaný vynález predovšetkým poskytuje izolovanú molekulu nukleovej kyseliny, ktorá obsahuje kódujúcu nukleotidovú sekvenciu alebo sekvenciu komplementárnu k sekvencii kódujúcej polypeptid, ktorý má enzymatickú aktivitu endoglukuronidázy.

Vo výhodnom uskutočnení predkladaného vynálezu je izolovaná molekula nukleovej kyseliny taká molekula nukleovej kyseliny, ktorá obsahuje (a) aspoň úsek kódujúci proteín z nukleotidovej sekvencie, ktorá je uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 1, (b) nukleotidovú sekvenciu, ktorá zodpovedá sekvencii v (a) vzhľadom na degeneráciu genetického kódu alebo (c) nukleotidovú sekvenciu, ktorá hybridizuje v stringentných podmienkach s nukleotidovou sekvenciou (a) a/alebo (b).

Predkladaný vynález ďalej poskytuje polypeptid kódovaný molekulou nukleovej kyseliny podľa predkladaného vynálezu. Výhodne polypeptid obsahuje (a) aminokyselinovú sekvenciu, ktorá je uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 2, alebo (b) aminokyselinovú sekvenciu, ktorá má aspoň 70% identitu, výhodne aspoň 85% identitu a ešte výhodnejšie aspoň 95% identitu s aminokyselinovou sekvenciou (a).

Okrem nukleotidovej sekvencie, ktorá je uvedená ako sekvencia SEQ ID NO: 1 a zodpovedajúcich sekvencií vzhľadom na degeneráciu genetického kódu predkladaný vynález zahŕňa tiež nukleotidové sekvencie, ktoré hybridizujú v stringentných podmienkach s jednou zo sekvencií, ktoré už boli definované. Termín „hybridizácia/hybridizovať v stringentných podmienkach je v zmysle predkladaného vynálezu definovaný v zhode so Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor

Laboratory Press (1989), 1.101-1.104. Výhodne hybridizácia v stringentných podmienkach znamená, že po premývaní 1 hodinu v 1 x ‘SSC a 0,1% SDS pri 50°C, výhodne 55°C, výhodnejšie 62°C a najvýhodnejšie pri 68°C, a najmä 1 hodinu v 0,2 x SSC a 0,1% SDS pri 50°C, výhodne 55°C, výhodnejšie 62°C a najvýhodnejšie pri 68°C, je pozorovaný pozitívny hybridizačný signál. Nukleotidová sekvencia, ktorá hybridizuje v uvedených podmienkach na premývanie s nukleotidovou sekvenciou uvedenou ako sekvencia SEQ ID NO: 1 alebo s nukleotidovou sekvenciou, ktorá zodpovedá vzhľadom na degeneráciu genetického kódu, je tiež predmetom predkladaného vynálezu.

Výhodne je nukleotidová sekvencia podlá vynálezu DNA, teda napr. cDNA, genómová DNA alebo syntetická DNA a môže byť jedno reťazcová alebo dvojreťazcová, pritom v prípade jednoreťazcovej molekuly sa môže jednať o kódujúci reťazec alebo nekódujúci reťazec (antisense) reťazec'. Môže to byť tiež RNA, napr. mRNA, pre-mRNA a syntetická RNA a to buď kódujúci reťazec alebo nekódujúci (antísense) reťazec alebo analóg nukleovej kyseliny ako je napr. peptidová nukleová kyselina. Zvlášť výhodná nukleotidová sekvencia podľa vynálezu obsahuje časť nukleotidovej sekvencie SEQ ID NO: 1, ktorá kóduje protein alebo sekvenciu, ktorá má so sekvenciou SEQ ID NO: 1 identitu vyššiu než 70%, výhodne vyššiu než 85% a zvlášť výhodne vyššiu než 95%, alebo časť tejto sekvencie, ktorá je dlhá výhodne aspoň 20 nukleotidov, výhodnejšie aspoň 30 nukleotidov a najvýhodnejšie aspoň 50 nukleotidov.

Identita je stanovená, pokiaľ ide o nukleotidovú sekvenciu alebo protein (aminokyselinovú sekvenciu), nasledujúcim spôsobom:

I = n : L, kde I je identita vyjadrená v percentách, n predstavuje počet nukleotidov alebo aminokyselín, ktoré sa líšia medzi testovanou sekvenciou a základnou sekvenciou, ktorou je buď nukleotidová sekvencia SEQ ID NO: 1 alebo aminokyselinová sekvencia SEQ ID NO: 2 alebo ich úseky, a

L je dlžka základnej sekvencie porovnávaná s testovanou sekvenciou

Polynukleotid podľa predkladaného vynálezu sa môže získať z cicavca, napr. z ľudských buniek, alebo z cDNA knižnice, alebo genómovej knižnice pripravenej z cicavca, napr. z ľudských buniek. Konkrétne je možné polynukleotid opísaný v predkladanej prihláške izolovať z cDNA knižníc (PENCNOT07, BLADNOT09, PROSTUT08, BRSTNOT27, MIXDNOPOl, ESOGNOT04, PENCNOT03), ktoré sú komerčne dostupné od firmy Incyte Inc. cDNA inzert, ktorý je uvedený ako sekvencia SEQ ID NO: 1 má dĺžku 3943 bázových párov (bp) a obsahuje otvorený čítací rámec, ktorý kóduje proteín s veľkosťou 492 aminokyselín. Predpovedaná aminokyselinová sekvencia polypeptidu podľa vynálezu zdieľa 38% identitu aminokyselín s ľudskou heparanázou (Obrázok 1). 5'- koniec cDNA podľa vynálezu je neúplný, predpovedaný zrelý (maturovaný) proteín je úplný, ako vyplýva z homológie s ľudskou heparanázou. Z elektronickej analýzy expresie (Northern) vyplynulo, že polynukleotid podľa predkladaného vynálezu je prednostne exprimovaný v nervovom systéme a tkanivách samčích genitálií (Obrázok 2).

Predkladaný vynález sa ďalej týka variantov opísaných polynukleotidov, ktoré kódujú fragmenty, analógy a deriváty polypep tidu, ktorý má dedukovanú aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO: 2. Predkladaný vynález sa tiež týka polynukleotidových sond skonštruovaných z polynukleotidovej sekvencie SEQ ID NO: 1 alebo segmentu sekvencie SEQ ID NO: 1. K variantom opísaných polynukleotidov patria delečné varianty, substitučné varianty, adičné

I alebo inzerčné varianty.

Predkladaný vynález sa ďalej týka polynukleotidov, kde kódujúca sekvencia polypeptidu alebo jej segment, je fúzovaná v zhodnom · čítacom rámci s polynukleotidovou sekvenciou, ktorá napomáha expresii alebo sekrécii polypeptidu z hostiteľských buniek, alebo ktorá uľahčuje purifikáciu polypeptidu podľa vynálezu (ako je napr. polyhistidínová značka, hemaglutinínová značka alebo tzv. GST-značka).

Ďalším aspektom predkladaného vynálezu je spôsob prípravy polynukleotidu podľa vynálezu. Tento spôsob zahŕňa chemickú syntézu, techniku rekombinantnej DNA, polymerázovú reťazovú reakciu alebo akúkoľvek kombináciu týchto metód. Výhodne je polynukleotid podľa vynálezu získaný z vhodného už uvedeného zdroja použitím amplifikačnej reakcie, napr. pomocou PCR využitím sekvenčnešpecifických oligonukleotidových primérov.

Polypeptid podľa predkladaného vynálezu môže byť rekombinantný polypeptid, prirodzený polypeptid alebo tiež syntetický polypeptid. Funkčný fragment, derivát alebo analóg polypeptidu podľa <vynálezu' je taký polypeptid, kde 'sa jedna· alebo viaceré, aminokyseliny substituovali inými aminokyselinami, alebo jedna alebo viaceré aminokyseliny obsahujú substituované skupiny, alebo je polypeptid fúzovaný s ďalšou zlúčeninou (ako je napr. polyetylénglykol) , alebo sú na polypeptid naviazané (fúzované) ďalšie aminokyseliny (ako je napr. tzv. vedúca sekvencia, sekretorická sekvencia alebo purifikačná značka).

Predkladaný vynález sa tiež týka rekombinantného vektora, ktorý obsahuje polynukleotid podľa vynálezu. Výhodne je tento vektor expresným vektorom, t.j. vektorom, ktorý obsahuje polynukleotid podľa predkladaného vynálezu operatívne spojený s vhodnou expresnou kontrolnou sekvenciou. Vektor je prokaryotický alebo eukaryotický vektor. K príkladom prokaryotických vektorov patrí chromozómový vektor, ako je napr. bakteriofág a mimochromozómový vektor, ako je napr. plazmid, pričom zvlášť výhodné sú kruhové plazmidové vektory. Vhodné prokaryotické vektory boli opísané napr. v Sambrook et al., supra, kapitoly 1-4. Na druhej strane sa môže jednať o eukaryotický vektor ako je napr. kvasinkový vektor alebo vektor vhodný na expresiu v bunkách vyšších organizmov, napr. v bunkách hmyzu, rastlinných bunkách alebo bunkách stavovcov, najmä bunkách cicavcov. Výhodnými príkladmi eukaryotických vektorov sú plazmidové alebo vírusové vektory. Vhodné eukaryotické vektory boli opísané v Sambrook et al., supra, kapitola 16.

Ďalej sa predkladaný vynález týka bunky, ktorá obsahuje aspoň jednu heterológnu kópiu polynukleotidu alebo vektor, ako bol definovaný. Polynukleotid alebo vektor sú vložené do bunky a to spôsobmi, ktoré sú odbprníkom známe, ako je napr. transformácia (tento termín zahŕňa metódy ako je transfekcia, elektroporácia, lipofekcia, infekcia atď.). Bunka je eukaryotická alebo prokaryotická bunka. Spôsoby transformácie buniek nukleovými kyselinami sú všeobecne známe a preto nie je potrebné ich podrobne vysvetľovať. K príkladom výhodných buniek patria eukaryotické bunky, najmä bunky . stavovcov a zvlášť potom bunky cicavcov.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka rekombinantného spôsobu prípravy polypeptidu podľa vynálezu, ktorý zahŕňa kultiváciu hostiteľských buniek transformovaných polynukleotidom alebo vektorom, ktoré boli opísané a to za podmienok, ktoré umožňujú expresiu polypeptidu, a ďalej zahŕňa izoláciu takto exprimovaného polypeptidu z buniek alebo zo supernatantu bunkovej kultúry. Hostiteľské bunky je možné kultivovať v obvyklých živných médiách vhodne modifikovaných na selekciu transformantov, amplifikáciou polynukleotidu alebo vektora alebo purifikáciou polypeptidu.

Takto exprimovaný polypeptid podľa predkladaného vynálezu sa izoluje a purifikuje z rekombinantných bunkových kultúr spôsobmi, ktoré sú na to určené, a ktoré sú odborníkom známe, ako je napr. homogenizácia s detergentami, chromatografia na heparin-Sepharóze, katiónová výmenná chromatografia, chromatografia na Con-A-Sepharóze, gélová filtračná chromatografia, Ni-chelatačná chromatografia, chromatografia na glutatiónsefaróze (agaróze), chromatografia s hydrofóbnou interakciou a afinitná chromatografia s protilátkou.

Polypeptid podľa predkladaného vynálezu je puŕifikovaný produkt prirodzene exprimovaný z bunkovej línie s vysokou expresiou alebo je to produkt chemickej syntézy alebo je produkovaný rekombinantnou technikou v prokaryotickom alebo eukaryotickom hostiteľovi. V závislosti od toho, aký hostiteľ sa použil na rekombinantnú produkciu, polypeptid podľa vynálezu môže alebo nemusí byť glykozylovaný.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka oligonukleotidu alebo jeho derivátu, ktorý hybridizuje v stringentných podmienkach s nukleotidovou sekvenciou uvedenou ako sekvencia SEQ ID NO: 1. Takýto oligonukleotid má dĺžku napr. 5, výhodne 15 až 100 alebo dokonca aj niekoľko sto nukleôzi'dových jednotiek alebo ich analógov, v závislosti od zamýšľaného použitia.

Oligonukleotid podľa vynálezu sa používa ako klonovaci primér alebo ako PCR primér alebo ako sekvenčný primér alebo ako hybridizačná sonda. Ďalšie použitie sa týka stimulácie alebo inhibicie expresie poľypeptidu podľa predkladaného vynálezu in vivo využitím sense alebo antisense techniky. Táto technika sa môže využiť na riadenie génovej expresie prostredníctvom vytvárania trojzávitnicových štruktúr na dvojreťazcovej DNA alebo antisense mechanizmom na RNA, pričom oba tieto spôsoby sú založené na tom, že oligonukleotid sa viaže na DNA alebo RNA. Ešte ďalšie použitie oligonukleotidov, najmä RNA oligonukleotidov, sa týka riadenia expresie použitím ribozýmovej technológie. Oligonukleotidy môžu byť vnesené do buniek postupmi, ktoré sú v odbore známe, buď priamo, alebo tak, že antisense alebo ribozýmová RNA alebo DNA sú exprimované in vivo, čim sa inhibuje produkcia polypeptidu podía predkladaného vynálezu. Antisense konštrukty alebo ribozýmy na polynukleotid podía vynálezu inhibujú pôsobenie polypeptidu podía vynálezu a môžu sa využiť na liečenie niektorých ochorení, ako je napr. rakovina alebo metastázy.

Ďalej oligonukleotidy podía vynálezu sa môžu využiť na detekciu prítomnosti alebo absenciu polynukleotidu podía 'vynálezu a hladiny expresie tohto polynukleotidu. A ďalej sa tieto oligonukleotidy môžu použiť na detekciu mutácii v géne, ktorý kóduje polypeptid podía predkladaného vynálezu. Mutácie v géne môžu korelovať s výskytom ochorení alebo s prognózou ochorenia. Preto sú tieto oligonukleotidy užitočné ako diagnostické markery na diagnostiku ochorení ako je rakovina, metastázy a aberačná angiogenéza.

Polypeptidy, ich funkčné fragmenty, deriváty alebo analógy alebo bunky, ktoré ich exprimujú, alebo polynukleotidy alebo ich fragmenty, sa môžu 'využiť ako imunogény. na produkciu príslušných protilátok. Takže predkladaný vynález sa týka tiež protilátky, ktorá špecificky rozpoznáva a viaže polypeptid podía vynálezu.

Tieto protilátky sú napr. polyklonálne alebo monoklonálne protilátky. Predkladaný vynález sa tiež týka chimérických, jednoreťazcových a humanizovaných protilátok a tiež Fab fragmentov. Na prípravu takýchto protilátok a ich fragmentov sa môžu použiť rôzne metódy, ktoré sú odborníkom známe.

Polyklonálne protilátky je možné získať imunizáciou experi11 mentálnych zvierat vhodným polypeptidovým alebo peptidovým antigénom, ktorý je prípadne naviazaný na nosič, a potom izoláciou protilátky z týchto imunizovaných zvierat. Monoklonálne protilátky sa môžu pripraviť metódou hybridómov, ktorú vyvinuli Kohler a Milstein. Spôsoby prípravy polyklonálnych a monoklonálnych protilátok sú všeobecne známe a nie je potrebné ich podrobne vysvetľovať (pozri napr. Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

Tieto protilátky sa môžu využiť na izoláciu polypeptidu z tkaniva, ktoré exprimuje tento polypeptid. Protilátka špecifická na polypeptid podľa predkladaného vynálezu sa ďalej môže využiť na inhibíciu biologického účinku polypeptidu tým, že sa naviaže na polypeptid. Týmto spôsobom sa protilátky podľa vynálezu môžu využiť v terapii, napr. na liečenie rakoviny. Liečenie rakoviny je možné uskutočňovať postupmi, ktoré boli opísané napr. Weinerom (Semin. Oncol. 26 (1999), 41-50) alebo v publikáciách, ktoré sú v uvedenej publikácii citované.

Ďalej takéto protilátky môžu detegovať prítomnosť alebo absenciu polypeptidu podlá predkladaného vynálezu a jeho koncentráciu, teda sú užitočné ako diagnostické markery na diagnostiku ochorení ako je rakovina, metastázy alebo aberačná angiogenéza.

Ďalší aspekt predkladaného vynálezu sa týka spôsobu identifikácie látky schopnej modulovať biologickú aktivitu alebo exprešiu polypeptidu podľa predkladaného vynálezu. Takže predkladaný vynález sa týka tiež spôsobu identifikácie antagonistov a inhibitorov a tiež antagonistov a stimulátorov funkcie alebo aktivity alebo expresie polypeptidu podľa predkladaného vynálezu .

Tak napr. antagonista môže viazať polypeptid podľa vynálezu a inhibovať tak alebo eliminovať jeho funkciu. Antagonistom môže byť napr. protilátka alebo oligonukleotid s vysokou afinitou alebo peptid proti polypeptidu, ktorý eliminuje glukuronidázovú aktivitu polypeptidu tým, že sa na polypeptid naviaže. Príkladom

inhibítora	je molekula s nízkou molekulovou hmotnosťou, ktorá
inaktivuj e	polypeptid naviazaním na katalytické miesta a ich
obsadením,	čím sa katalytické miesta stanú neprístupnými pre

substrát, takže biologická aktivita polypeptidu sa neprejaví.

Antagonisty a inhibítory sa môžu využiť pri liečení rakoviny, metastáz alebo aberačnej angiogenézy tak, že sa zabráni tomu, aby polypeptid spôsobil rozpad heparansulfátového proteoglykánu z extracelulárneho matrix. Antagonisty a inhibítory identifikované opísaným spôsobom alebo ich deriváty sa môžu využiť v kompozícii spoločne s farmaceutický prijateľným nosičom.

Predkladaný vynález sa konkrétne týka testov na identifikáciu opísaných látok, napr. nízkomolekulových inhibítorov, ktoré sú špecifické na polypeptid podľa predkladaného vynálezu a zabraňujú jeho funkcii alebo zabraňujú jeho expresii. Buď prírodné alebo syntetické sacharidy sa môžu použiť ako substráty na test endoglukuronidázovej aktivity polypeptidu.

Ďalší aspekt vynálezu sa týka polynukleotidu alebo polypeptidu podľa predkladaného vynálezu na použitie v lekárstve. Konkrétne sa vynález týka použitia polypeptidu alebo polynukleotidu podľa vynálezu na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie ochorení, ktoré sú dôsledkom nedostatočného alebo chýbajúceho polypeptidu, ako už bolo opísané. Namiesto polynukleotidu alebo polypeptidu podía vynálezu alebo naviac k nemu sa môže na liečenie použiť agonista polypeptidu alebo induktor či zosilňovač expresie tohto polypeptidu. Ochorenia, ktoré je možné liečiť, sú napr. úrazy, autoimunitné ochorenia, kožné ochorenia, kardiovaskulárne ochorenia a ochorenia nervového systému. Polynukleotidy podía predkladaného vynálezu sa môžu využiť tiež v génovej terapii. Génovú terapiu je možné uskutočňovať postupmi, ktoré sú opísané v publikáciách Beutler (Biol. Blood Marrow Transplant 5 (1999), 273-276) alebo Gomez-Navarro et al., (Eur. J. Cancer 35 (1999), 867-885) alebo tam citovaných publikáciách.

Ďalší aspekt vynálezu sa týka protilátky podlá vynálezu alebo jej fragmentu na použitie v medicíne. Konkrétne sa vynález týka .použitia protilátky podlá predkladaného vynálezu na výrobu farmaceutickej kompozície na liečenie ochorení, ktoré sú dôsledkom nadmernej aktivity alebo nadmernej expresie (overexpression) polypeptidu podlá vynálezu. Namiesto protilátkypodľa predkladaného vynálezu sa môže v medicíne použiť antagonista alebo inhibítor expresie polypeptidu. Medzi ochorenia, ktoré sa môžu liečiť, patrí rakovina, metastázy, aberačná angiogenéza a zápalové ochorenia vrátane artritídy.

Ďalej sa vynález týka farmaceutických kompozícií, vhodných na podávanie teplokrvným živočíchom vrátane· človeka, ktorí trpia ochoreniami v dôsledku nedostatku alebo úplnej neprítomnosti alebo inaktivácie polypeptidu podľa vynálezu, alebo trpia ochorením, ktoré je dôsledkom nadmernej aktivity alebo nadmernej expresie polypeptidu podľa predkladaného vynálezu.

Keďže je polynukleotid podľa predkladaného vynálezu prednostne exprimovaný v tkanivách samčích genitálií, modulácia expresie a/alebo aktivity kódovaného polypeptidu sa môže využiť na lekársky zásah do funkcie mužských genitálií (napr. pri ovplyvňovaní fertility, erektilnej dysfunkcie).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Identifikácia polynukleotidu podľa vynálezu

Využitím publikovanej sekvencie ľudskej heparanázy (ADD 54941.1) sa identifikovali tri templáty od firmy Incyte (t. j. súbory EST od firmy Incyte), ktoré zdieľali významnú- homológiu s ľudskou heparanázou. Niektoré z týchto EST každého templátu boli objednané od firmy Incyte. Stanovenie nukleotidovej sekvencie 3'- a 5'-konca každého EST klonu odhalilo ďalšie nové sekvenčné informácie, ktoré viedli k ďalším dvom súborom klonov firmy Incyte. Kombináciou týchto sekvenčných informácií a sekvenčných informácií získaných vlastným sekvenovaním týchto Incyte klonov bolo možné zostaviť nový paralóg ľudskej heparanázy, t. j. polypeptid príbuzný ľudskej heparanáze. Táto nová sekvencia obsahuje 3943 bp a identifikovaná kódujúca sekvencia zahŕňa úsek bp 1 až 1479 (vrátane STOP kodónu). 5'- koniec je stále ešte otvorený, ako ukazuje analýza kódujúceho úseku (uskutočnená programom ESTSCAN) tak aj homológie s ľudskou heparanázou .

Príklad 2

Elektronická analýza expresie

Na základe počtu EST pre dané tkanivo je možné určiť alebo predpovedať mieru in vivo expresie daného génu v tkanive.

„Elektronická northernová analýza je bioinformatická metóda, ktorá umožňuje najskôr identifikovať celkový počet všetkých EST pre dané tkanivo (tzv. veľkosť poolu, „pool-size) prítomných v databáze a potom počet EST z tohto tkaniva, zodpovedajúceho iba zadanej sekvencií.

Táto analýza sa uskutočňuje programom BLAST (NCBI BLAST v. 2.0.10; Altschul et al., Nucleic Acid Res. (1997) 25, 3389-3402) využitím cDNA požadovaného génu ako zadanou sekvenciou, a ako zdroj dát sa analyzovala ľudská databáza EST klonov (LifeSeqGold od firmy Incyte). Prehľadávajúce parametre boli E=le-30. Otázka SQL v databáze poskytla pre každý vyhľadaný EST informáciu o zdrojovom tkanive a veľkosti poolu pre dané tkanivo.

Všeobecne sa verí, že tieto dáta korelujú s hladinou expre15 sie in vivo. Štatistická analýza (normalizácia na veľkosť poolu a stanovenie intervalu spoľahlivosti) pomohla určiť spoľahlivosť dát a porovnať hladiny expresie pre rôzne tkanivá. Spoľahlivosť takejto predpovednej metódy sa obvykle zvyšuje s počtom nálezôv/tkanivo a veľkosťou poolu pre tkanivo.

Príklad 3

Exp'resia polynukleotidu

Kódujúci úsek polynukleotidu uvedeného ako sekvencia SEQ ID NO: 1 sa amplifikoval pomocou PCR použitím 5'-priméru HepRl:

(5'-GAC AGG AGA CCC TTG CCT GTA GAC-3') a 3'-priméru HepR2:

(5'-ATA GTC GAG TTA TCG GTA GCG GCA GGC CAA AGC-3') a templátovej DNA izolovanej z klonov #3207535Hl a #3385824H1 databázy LifeSeqGold od firmy Incyte Inc. z október/november 1999. Získaný DNA fragment veľkosti 1488 bp sa fosforyloval použitím T4 polynukleotidkinázy a potom nasledovalo štiepenie restriktázou Xhol. Fragment sa potom ligoval v zhode s čítacím rámcom do vektora pISP-myc, ktorý poskytol N-koncovú imunoglobulínovú signálnu sekvenciu nasledovanú „značkovacím epitopom myc-tag. Po naštiepení restriktázami HindlII a Xhol sa fragment ligoval do vhodných' · miest expresného vektora pCEP4 (Invitrogen), čim sa pripravil expresný vektor HepR-pCEP. HepR-pCEP sa trvalo transfekoval do bunkových línií karcinómu prsníka MCF7, MBA—231 a MBA-468 a tiež do buniek CHO. Rekombinantný proteín sa detegoval pomocou protilátky namierenej proti epitopu myc.

Na expresiu v bunkách hmyzu sa PCR-fragment vyštiepil z vektora' pISP-myc restriktázami EcoRI a Xbal. Fragment sa klonoval do bakulovirusového transferového vektora pVL1392, čim sa pri16 pravil vektor HepR-pVL a ten sa transfekoval do buniek hmyzu Sf9.

Príklad 4

Produkcia protilátok

Polypeptid purifikovaný z infikovaných buniek hmyzu Sf9 pomocou expresného vektora HepR-pVL z príkladu 3 sa použil na imunizáciu myší a králikov štandardnými postupmi, ktoré sú odborníkom známe (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

Zoznam sekvencii

Sekvencia SEQ ID NO: 1

Sekvencia cDNA kódujúca polypeptid podobný ľudskej heparanáze

Dĺžka: 3943 bp

Kódujúci úsek: 1-1476 bp

STOP kodón: 1477-1479 bp

Dve predpokladané polyadenylačné miesta sú znázornené podčiarknutými písmenami

1	gacaggagac ccttgcctgt agacagagct gcaggtttga aggaaaagac
51	cctgattcta cttgatgtga gcaccaagaa cccagtcagg acagtcaatg
101	agaacttcct ctctctgcag ctggatccgt ccatcattca tgatggctgg
151	ctcgatttcc taagctccaa gcgcttggtg accctggccc ggggactttc
201	gcccgccttt ctgcgcttcg ggggcaaaag gaccgacttc ctgcagttcc
251	agaacctgag gaacccggcg aaaagccgcg ggggcccggg cccggattac
301	tatctcaaaa actatgagga tgacattgtt cgaagtgatg ttgccttaga
351	taaacagaaa ggctgcaaga ttgcccagca ccctgatgtt atgctggagc
401	tccaaaggga gaaggcagct cagatgcatc tggttcttct aaaggagcaa
451	ttctccaata cttacagtaa tctcatatta acagagccaa ataactatcg
501	gaccatgcat ggccgggcag taaatggcag ccagttggga aaggattaca
551	tccagctgaa gagcctgttg cagcccatcc ggatttattc cagagccagc
601	ttatatggcc ctaatattgg gcggccgagg aagaatgtca tcgccctcct
651	agatggattc atgaaggtgg caggaagtac agtagatgca gttacctggc
701	aacattgcta cattgatggc cgggtggtca aggtgatgga cttcctgaaa
751	actcgcctgt tagacacact ctctgaccag attaggaaaa ttcagaaagt
801	ggttaataca tacactccag gaaagaagat ttggcttgaa ggtgtggtga
851	ccacctcagc tggaggcaca aacaatctat ccgattccta tgctgcagga
901	ttcttatggt tgaacacttt aggaatgctg gccaatcagg gcattgatgt
951	cgtgatacgg cactcatttt ttgaccatgg atacaatcac ctcgtggacc
1001	agaattttaa cccattacca gactactggc tctctctcct ctacaagcgc
1051	ctgatcggcc ccaaagtctt ggctgtgcat gtggctgggc tccagcggaa
1101	accacggcct ggccgagtga tccgggacaa actaaggatt tatgctcact
1151	gcacaaacca ccacaaccac aactacgttc gagggtccat tacacttttt
1201	atcatcaact tgcatcgakc aagaaagaaa atcaagctgg ctgggactct
1251	cagagacaag ctggttcacc agtacctgct gcagccctat gggcaggagg
1301	gcctaaagtc caagtcagtg caactgaatg gccagccctt agtgatggtg
1351	gacgacggga ccctcccaga attgaagccc cgcccccttc gggccggccg
1401	gacattggtc atccctccag tcaccatggg cttttatgtg gtcaagaatg'

1451	tcaatgcttt	ggcctgccgc	taccgaTAAg	ctatcctcac	actcacggct
1501	accagtgggc	ctgctgggct	gcttccactc	ctccactcca	gtagtatcct
1551	ctgttttcag	acatcctagc	aaccagcccc	tgctgcccca	tcctgctgga
1601	atcaacacag	acttgctctc	caaagagact	aaatgtcata	gcgtgatctt
1651	agcctaggta	ggccacatcc	atcccaaagg	aaaatgtaga	catcacctgt
1701	acctatataa	ggataaaggc	atgtgtatag	agcagaatgt	ttcccttcat
1751	gtgcactatg	aaaacgagct	gacagcacac	tcccaggaga	aatgtttcca
1801	gacaactccc	catgatcctg	tcacacagca	ttataaccac	aaatccaaac
1851	cttagcctgc	tgctgctgct	gccctcagag	gaagatgagg	aaggaaaaaa
1901	actgggtgga	cctacaaaaa	cccatcctct	cccaactcct	tcttctctgc
1951	ctctttcttg	ctgctgccct	gagttttttg	acacatctct	ttccataggg
2001	gagtaatggg	tgtgtcagcc	ctggcctgct	gggagagctg	tttgtatgat
2051	ttcccggctg	atgtatgagc	gtgcgcatct	gggttcctga	cagtggcatc
2101	catcactggc	agttcttctg	ggaagcgggt	gcttcaaaag	taaaattaca
2151	atcacactcc	agatttggta	agaaggttct	attcctctgt	gaatccagat
2201	tcccccagag	ttgtaatggg	agtcaagtaa	caatattcat	tgagtggaga
2251	gcagtttatt	aggcacaaca	aaaagtaatc	atcattcttc	atgttgctat
2301	gagggagagt	ttgagtacaa	agagaaagca	tactgaaaca	tcaggtacac
2351	acacacaccc	caactggaca	aagcaaatta	gacctctcca	aaattaagag
2401	aatattaggg gctctatagg	gtaagccttt	aattgtttgg	ttaactcaaa
2451	tcattatttt	taaaaaagaa	gaaaaaagtg	tgaatcaagg	tcatcactgg
2501	aagacacaac	tgaatctaac	ctttttgcct	cttcccaagt	agcctatttg
2551	agctagaaca	aaactttgtt	agccattttg	ggagagaata	gggaatctag
2601	agaatgaaga	tctgcccaaa	actatggaat	ggtaggtagg	aagcttctga
2651	gttgggcagg	tgtgaagtgg	gggatgagga	cgttctatat	gattcaaggg
2701	gcatgagggt	ctttgccaat	gagctacagc	tgaaatgact	ttcttttctg
2751	gggatgtgat	tttctttctc	aggataaatg	acaggaatga	tgcttttgtt
2801	agaaggagga	gagatttgac	actgttccaa	gtgagacagt	gatacaattt
2851	ctgctgtttg	tgaaaggaca	ggaatggggy	gggggcaagg	cagggttgcc
2901	tagggcagag	actagggagg	ctgcctaaga	cgcacacgga	gttaaggatt
2951	tgggccaagt	ctgcaaagtg	agagatggaa	gggagattag	accaaagagg
3001	agggagagaa	ttctgagctt	ggagaacggt	ggatttggga	gagggaagct
3051	gáctacctaa	ttccaggaag	cgaggggacc	gggttttgac	atgcttatca
3101	ttaagcacag	gaggaacagc	atacagcaga	tgtactacag	cgagcaagaa
3151	agggagagcc	cgaggaccag	gctgcaccag	gtcagtggct	gtgctcagca
3201	tggaagcaac	tggagagaga	ggggcagacc	ctgagacygc	cctgcaaggc
3251	tgcccagaag	ggacccgttt	ctctgggacc	aggcacctcc	cactgaggct
3301	.tcagctctga	gagggcagga	aagtgaagta	ccaagatggg	ggcggggcgg
3351	ggggtaggaa	ataagagaaa	gaagaaacag	attgacaggc	caaagtgagg
3401	aaaagagagg	aaaagagaaa	tgagactaaa	aggtcgttcc	cccaactgtt
3451	aaaaatgtgt	gcagatatca	acgtctcttc	tacatactgg	tacaggtgcg
3501	actgcagggc	cccctgatat	aacaagagta	accaaaggtc	cctaagagcc
3551	tggccctggg	gacctatggt	ttgctttgcg	tccttagtaa	ccccatgata
3601	aaggggtact	actgttatcc	ccatttttcc	tacgaggcat	ggagaggatc
3651	catqqctcqc	cccaqqqqca	cccqqqqaaa	tgggttgccg	aqcgcqaaat

3701

3751

3801

3851

3901 aatccagagc agacacctcc actccactca aaccttgcag ttaaatgctg ctgcccactc ttcacatctt aacacacttt aatatgggta ctctcačgag agccacaagg tgtaggttct ctgtaaataa attcctgctt atttaagttt ctcagcggct gctcattcag gtgttgattt cttttatctt tgtttatttt ccacaggtcc aacagccaga ttttttacta tctctgtgta t.ta sekvencia SEQ ID NO 2:

Aminokyselinová sekvencia polypeptidu príbuzného ľudskej heparanáze

Translačný produkt

Dĺžka: 492

DRRPLPVDRA AGLKEKTLIL LDVSTKNPVR TVNENFLSLQ LDPSIIHDGW

LDFLSSKRLV TLARGLSPAF LRFGGKRTDF LQFQNLRNPA KSRGGPGPDY

101 YLKNYEDDIV RSDVALDKQK GCKIAQHPDV MLELQREKAA QMHLVLLKEQ

151 FSNTYSNLIL TEPNNYRTMH GRAVNGSQLG KDYIQLKSLL QPIRIYSRAS 201 LYGPNIGRPR KNVIALLDGF MKVAGSTVDA VTWQHCYIDG RWKVMDFLK 2 51 TRLĽDTLSDQ IRKIQKWNT YTPGKKIWLE GWTTSAGGT NNLSDSYAAG 301 FLWLNTLGML ANQGIDWIR HSFFDHGYNH LVDQNFNPLP DYWLSLLYKR 351 LIGPKVLAVH VAGLQRKPRP GRVIRDKLRI YAHCTNHHNH NYVRGSITLF 401 IINLHRXRKK IKLAGTLRDK LVHQYLLQPY GQEGLKSKSV QLNGQPLVMV 451 DDGTLPELKP RPLRAGRTLV IPPVTMGFYV VKNVNALACR YR

Porovnanie aminokyselinových sekvencii polypeptidu podľa predkladaného vynálezu s ľudskou heparanázou.

Porovnanie

(priradením sekvencii) sekvencie ľudskej heparanázy

AAD54941.1 (543 aminokyselín) a sekvencie polypeptidu podobného ľudskej heparanáze HUMAN-HEPARANASE-LIKE171199 (492 aminokyselina) uvedené nižšie ukazuje takmer 38% identitu v prekrývajúcom sa úseku 529 aminokyselín.

Z porovnania vyplýva, že chýba iba signálny peptid. Tučné vyznačené písmená v sekvencii ľudskej heparanázy (t.j. horná sekvencia) označujú predpovedaný signálny peptid (najpravdepodobnejšie štiepne miesto signálneho peptidu ľudskej heparanázy je medzi pozíciami 35 a 36: AQA-QD)

Smith-Watermanovo skóre: 1155; 38,563% identita v úseku 529 aminokyselín aad54941.1 = publikovaná sekvencia ľudskej heparanázy

novel.conl orfl	= sekvencia nového polypeptidu príbuzného heparanáze
aad54941.1	MLLRSKPALPPPLMLLLLGPLGPLSPGALPRPA. .QAQDWDLEFFTQEPLHLVSPSFLS

novel. conl orf 1---------------------DRRPLPtTRAAGLKEKTLIL.l.DVSTKNFVRrVNENPúS

aad54941.1

VTIľ?ANLATľ.-PRtILl,G.PKtRTI_:.AP.GLS?AYú:-:FGGTKTnpLl='DPKKESTFEERSYW

novel.conl_orfl LQLDPSIIHĽ.GWLDFLSEKRLVTLÄRGLSPAFLRFGGKRTDFLQF.........

aad54941.1

qsqvnqdickygsippdvee.<lri.ewpyqeqlllrshyqkxf?:nstysrssvdvlytfan

novel .conl orfl . QNLRNPAKSRí’GPGPiJYYLK.....NYEDDIVRSDVALDKQKGCKIAQHPDVML

aad54941.1

CSGLDLIFGLNALLRTADLGWNSSNAQLLLDYCSSKGYNISWELGNEPviSFLKKADIFin

novel .conl orfl.................ΕΤΛ^ΕΚΑΑΟΜΗ^νΏΒΚΕΟεεΝΤΥίΙΝΙ,ΙΙ,ΤΞΡΓίΝΥΚΤΜΗαΕΑνϊ·;

aad54941.1

ΰ.'ΐςΕ-ΤΕΕΕΪύΕΗΚΙΕΗΚ.εΤΕΚΝ,ΑΚΕι^ΡΟνΰΰΡΕΗΚΤΑΚΜΕΚεΡΏΓ'ΛΟ^ΕνΣΟΞ'νΤ'/ϊΗ;··

novel. conl_orfl GSQLGKDYZQLKSLL-QPIRIYSR.ASLYGPNIGRPP.KNVIALLDGFMKVAGSTVDAVTWQi:

aadS4941.1

ΥΥω^ΕΤΑΤΕΕΖΓΕΝΡΟν^ΙΓίεενΟΙΓ.ΤΟννΕΒΤΕΡσΚΚνΗΙζαΕΤεδΑΥάσΟΑΡϋΙ.εΣ:

novel. conl orfl CTIDGEWKVMÚFl.KTRLLôTLSDQIRríIQKVVNTYTFúKK.IWLEGWTTSAGGTNNiS;

aad54941.1

TFAÄGzMľíLDKl;GLSÄRMClEVVMRQVFŕGAGNYHl_;vľ?E>;FDPl.PľjiNLSA.l.FKKLV.'TK

novel .conl orfl SYF_iAG¥LH;JíTLÚML/J»C}GID’/7IRHSF7DHGYNHÚVnQ:<FNPL?l??Wi..SLLYiíRI_iXGPK

aad54941.1

FLMASVQGSKRR........, Γ^νϊηΗΟ^ΠΌ^ΡΗΥΚΕσΟΕΙΧΥΑΙίΙΙ,ΗΝνΤΚΥΕΗΙ,ΡΥ

novel.conl_orfl Vi-AVH’.'AGLQRKPRPGRVIRDKLRIYAKCí’NHH.’íHNVVRGSITbFIÍNLHRXRK.KXKÍAG

aad54941.1

PFSN'.ÍQvTSKYLLRPLGPHGLLSiľSVQLIsGLTLIG'ľvODQTLPPLMEKPLRPGSSLGLPAFS·

novel. conl_orf 1 TLRDftL\^Q':LiQPYGQEGLKS?'5',.VLI.;GQPLV7?ľ';G’ľL?ELKP=PLAAGRTLVI?PVT

aad54941.1

YSFFVIRHAKVAACI—-

novel.conl orflMGFYVVKKVNALACRYR

22.

O br-A

Výsledky elektronickej analýzy expresie

Pozitívne nálezy špecifické pre kategóriu tkanív	Polynukleotid príbuzný ľudskej heparanáze 38 cieľových sekvencií mapovaných v 26 klonoch
Kardiovaskulárny systém:	3/229661
Spojivové tkanivo:	0/112794
Tráviaci systém:	4/349101
Embryonálne štruktúry:	2/84199
Endokrinný systém:	0/179602
Exokrinné žľazy:	1/236109
Genitálie ženské:	4/299477
Genitálie mužské:	10/380251
Zárodočné bunky:	0/15257
Krvný a imunitný systém:	2/604773
Pečeň:	0/78335
Svalovina kostry:	0/131798
Nervový systém:	7/612689
Pankreas:	0/85915
Respiračný systém:	0/312810
Zmyslové orgány:	0/19264
Koža: .	0/60395 -
Zuby:	0/10997
Nezaradené/zmiešané:	1/63078
Urinárny trakt:	4/212571

ΰiť

Orgánovo špecifické pozitívne nálezy v klonoch

Nadoblička:	0/62919
Močový mechúr:	3/58862
Krv:	2/282429
Krvné cievy:	3/130510
Kostná dreň:	0/45994
Kosti:	0/41311
Mozog:	3/479254
Prsník:	1/236109
Priedušky:	0/32669
Chrupavka:	0/21947
Spojivové tkanivo:	0/133893
Ucho:	0/3156
Embryo:	0/2993
Pažerák:	2/15236
Ucho:	0/13632
Vajcovody:	0/4432
Fétus:	2/24184
Žlčník:	0/21391
Zárodočné bunky:	0/15257
Srdce:	0/99151
Črevo:	0/3164
Hrubé črevo: ‘	1/193491
Tenké črevo:	0/86067
Obličky:	1/149891
Larynx:	0/5513
Pečeň:	0/88010
Pľúca:	0/267484
Lymfatické tkanivo:	0/35954
Zmiešané tkanivá	1/145333
Svalovina:	0/39730

Obr- 2-j*ot/aČb
Nervové tkanivo:	0/98790
Nos:	0/8612
Ováriá:	0/115176
Pankreas:	0/102662
Prištitne telieska:	0/25033.
Penis:	7/40938
Epifýza:	0/3607
Hypofýza:	0/12271
Placenta:	0/57022
Prostata:	3/233994
Slinné žľazy:	0/3951
Semenné vačky:	0/14055
Koža:	0/60395
Miecha:	4/2393?
Slezina:	0/54556
Žalúdok:	1/29752
Synoviálne membrány:	0/36053
Semenníky:	0/90864
Týmus:	0/50982
Štítna žľaza:	0/45573
Jazyk:	0/3351
Mandle/nosné mandle:	0/55437
Močová trubica:	0/3818
Uterus:	4/167760

2Í

Claims

1. Polynukleotid kódujúci polypeptid, ktorý má biologickú aktivitu endoglukuronidázy, obsahujúci (a) sekvenciu uvedenú v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID

NO: 1 alebo aspoň jej časť kódujúcu proteín (b) nukleotidovú sekvenciu zodpovedajúcu sekvencii podlá bodu (a) vzhľadom na degeneráciu genetického kódu, alebo (c) nukleotidovú sekvenciy hybridizujúcu v stringentných podmienkach so sekvenciou podľa bodu (a) a/alebo (b).

2* podlá nároku 1 alebo polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 7.

2. Rekombinantný vektor obsahujúci aspoň jednu kópiu polynukleotidu podľa nároku 1.

3. Vektor podľa nároku 2, ktorý je expresným vektorom.

4. Bunka transformovaná polynukleotidom podľa nároku 1 alebo vektorom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 2 až 3.

5. Polypeptid kódovaný polynukleotidom podľa nároku ’l.

6. Polypeptid podľa nároku 5, ktorý má aktivitu endoglukuronidá- zy. obsahuj úci (a) aminokyselinovú sekvenciu uvedenú v zozname sekvencii ako sekvencia SEQ ID NO: 2, alebo (b) aminokyselinovú sekvenciu, ktorá má aspoň 70% identitu

2j£ s aminokyselinovou sekvenciou podľa bodu (a).

7. Polypeptid podľa nároku 6, ktorý je schopný indukovať tvorbu špecifických protilátok.

I ,

8. Spôsob prípravy polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 7 vyznačujúci sa tým, že zahŕňa chemickú syntézu, technológiu rekombinantných DNA alebo kombináciou týchto metód.

9. Spôsob prípravy polynukleotidu podľa nároku 1 vyznačujúci sa tým, že zahŕňa chemickú syntézu, technológiu rekombinantnej DNA, polymerázovú reťazovú reakciu alebo kombináciu týchto metód.

10. Protilátka alebo oligopeptid alebo zodpovedajúci oligonukleotid, ktoré špecificky rozpoznávajú a viažu sa na polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 7.

11. Polynukleotid podľa nároku 1 alebo polypeptid podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 7 na použitie ako liečivo.

12. Použitie polynukleotidu podľa nároku 1 alebo polypeptidu podľa ktoréhokolvek z nárokov 5 až 7 na prípravu farmaceutickej kompozície na liečenie rakoviny a rakovinových metastáz, angiogenézy, zápalov, artritídy, úrazov, autoimunitných ochorení, kožných ochorení, kardiovaskulárnych ochorení a ochorení nervového systému.

13. Spôsob liečenia rakoviny a rakovinových metastáz, angiogenézy, zápalov, artritídy, úrazov, autoimunitných ochorení, kožných ochorení, kardiovaskulárnych ochorení a ochorení nervového systému, ktorý zahŕňa podávanie vhodného množstva polynukleotidu

14. Spôsob liečenia rakoviny a rakovinových metastáz, anaiogenézy, zápalov, artritídy, úrazov, autoimunitných ochorení, kožných ochorení, kardiovaskulárnych ochorení a ochorení nervového systému, ktorý zahŕňa podávanie vhodného množstva protilátky alebo oligopeptidu alebo zodpovedajúceho oligonukleotidu ako sú definované v nároku 1.

15. Spôsob identifikácie látky, ktorá je schopná modulovať biologickú aktivitu alebo- expresiu polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 7 v bunke, ktorý zahŕňa krok, keď sa privedie do kontaktu polypeptid alebo jeho funkčný derivát,, funkčný fragment alebo funkčný analóg alebo bunka schopná exprimovať tento polypeptid s aspoň jednou zlúčeninou alebo činidlom, ktorých schopnosť modulovať biologickú aktivitu alebo expresiu uvedeného polypeptidu, jeho funkčného derivátu, funkčného fragmentu alebo funkčného analógu sa testuje a stanoví sa zmena biologickej aktivity alebo expresie polypeptidu, jeho derivátu, fragmentu alebo analógu spôsobená touto látkou.

16. Spôsob podľa nároku 15, ktorý ďalej zahŕňa formuláciu farmaceutickej kompozície, ktorá obsahuje ako účinnú zložku takú látku, ktorá bola identifikovaná ako modulátor alebo jej derivát.

17. Testovací systém na testovanie látky na jej schopnosť viazať sa na polypeptid definovaný v nárokoch 5 až 7 alebo ho funkčne ovplyvniť, pričom uvedený testovací systém obsahuje polypeptid, jeho funkčný analóg alebo bunku schopnú exprimovať polypeptid alebo jeho funkčný analóg a prípadne ďalej obsahuje prostriedky na stanovenie reakcie spôsobenej látkou.

18. Látka, ktorá sa dá získať spôsobom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 15 alebo 16, a ktorá je agonistom alebo antagonistom polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 7.

19. Použitie polynukleotidu podľa nároku 1 na moduláciu expresie polypeptidu podľa ktoréhokoľvek z nárokov 5 až 7 v bunke.

20. Použitie polynukleotidu podľa nároku 1 v génovej terapii.

21. Použitie protilátky alebo ’oligopeptidu alebo zodpovedajúceho oligonukleotidu alebo ich derivátu podľa nároku 10 alebo polynukleotidu podľa nároku 1 na diagnostiku ochorenia spôsobeného rakovinou a rakovinovými metastázami, angiogenézy, zápalov, artritídy, úrazov, autoimunitných ochorení, kožných ochorení, kardiovaskulárnych ochorení a ochorení nervového systému.