KR20020062375A - 인간 헤파라나제-관련 폴리펩티드 및 핵산 - Google Patents

Abstract

본 발명은 새로이 확인된 폴리뉴클레오티드, 그 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드, 그 폴리펩티드의 용도, 그리고 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 제조에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 폴리펩티드는 헤파라나제-관련 엔도글루쿠로니다제이다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드에 대한 항체, 그리고 그 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물 및 진단 시약에 관한 것이다. 또한 본 발명은 세포 내에서 또는 생물체 내에서 헤파라나제-관련 엔도글루쿠로니다제의 발현 수준을 변화, 변형 또는 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 측면은 예를 들면 상기 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제와 같은 조절인자를 확인하는데 적합한 분석 시스템이다.

Description

인간 헤파라나제-관련 폴리펩티드 및 핵산{Human Heparanase-Related Polypeptide and Nucleic Acid}

세포외 기질 (ECM) 및 기저막 (BM) 단백질은 주로 헤파란 황산 프로테오글리칸 (HSPG)으로 구성된 섬유주에 묻혀 있다. HSPG는 내피 세포를 지지하고 모세혈관 벽의 구조를 안정화시키는 혈관 (내피하 기저막)의 주된 화합물이다. 혈소판, 태반 영양막층 및 백혈구에서의 헤파라나제, 즉 엔도-β-D-글루쿠로니다제의 발현은 배아의 형태 발생, 상처 치유, 조직 회복 및 염증에서 헤파라나제가 정상적으로 기능함을 입증하는 것이다. ECM-소화 프로테아제와 협력하여, 헤파라나제는 세포가 기저막을 통과하여 이동할 수 있게 하고, ECM 내에 저장된 헤파린-결합 성장 인자 (예를 들면 bFGF, VEGF)를 방출할 수 있게 한다[Finkel et al., Science 285 (1999), 33-34; Eccles, Nature Med. 5 (1999), 735-736].

4개의 독립적인 군 (문헌[Vlodavsky et al., Nature Med. 5 (1999), 793-802; Hulett et al., Nature Med. 5 (1999), 803-809; Toyoshima and Nakajima, J. Biol. Chem. 274 (1999), 24153-24160; Kussie et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 261 (1999), 183-187]참조)에 의해 최근에 클로닝된 헤파라나제는 65 kDa의 전구 단백질로서 발현되며, 그의 N-말단이 프로세싱되어 50 kDa의 활성 효소가 된다. 활성 효소의 재조합 발현은 CHO, NIH 3T3 및 COS-7 세포에서 입증되었다. 이전에 몇몇의 명백히 다른 헤파라나제의 활성들이 설명되었음에도 불구하고, 상이한 원천 (정상 세포 및 종양 세포)으로부터의 헤파라나제 cDNA를 클로닝하는 4개의 군은 동일한 cDNA 서열을 보고하였다.

증거의 여러 경향들은 종양 성장 및 전이 형성에 있어 ECM 분해 글루쿠로니다제의 관련성을 입증한다: (1) 헤파라나제는 예를 들면, 유방의 침습성 관상 암종, 간세포성 암종, 난소 선암종; 자궁경부의 편평 상피 암종, 결장 선암종과 같은 인간의 종양 조직에서 이에 상응하는 정상 조직에서보다 mRNA 및 단백질 수준에서 더 잘 발현됨이 밝혀졌다[Vlodavsky et al., supra]. (2) 전이성 종양을 지닌 동물의 혈청 및 소변에서 및 암환자에게서 헤파라나제의 농도 증가가나타났다[Vlodavsky et al., supra]. (3) 헤파라나제 mRNA 발현 및 효소 활성은 인간 및 쥐의 유방 종양 세포주에서의 전이 잠재성과 관련이 있다[Vlodavsky et al., supra; Hulett et al., supra]. (4) 낮은 전이성 종양 세포는 헤파라나제 cDNA의 형질 감염시에 높은 전이성 표현형을 얻게 되는데, 예를 들면 쥐의 T 림프종 L5178Y 및 쥐의 B16-F1 흑색종에서 나타났다[Vlodavsky et al., supra]. (5) 헤파라나제의 활성을 저해하는 황산화된 올리고당 PI-88 (포스포만노펜타오스 SO₄)은 원발 종양 성장, 전이 형성 및 종양의 혈관 형성을 저해한다[Parish et al., Cancer Res. 59 (1999), 3433-3441].

<발명의 개요>

본 발명은 엔도글루쿠로니다제의 효소적 활성을 지닌 폴리펩티드 또는 그의 단편을 코딩하는 서열을 코딩하는 또는 그에 상보적인 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 새로이 단리된 핵산 분자를 제공한다.

추가로 본 발명은 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드, 그의 기능적 단편, 기능적 유도체 또는 기능적 유사체에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 상기 폴리펩티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 측면은 바람직하게는 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 그 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주 세포에 관한 것이다.

또한 본 발명은 세포 내에서 또는 생물체 내에서 상기 폴리펩티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 변화, 변형 또는 조절하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 다른 측면은 상기 폴리뉴클레오티드, 그의 단편 또는 유도체, 또는 상기 폴리펩티드, 그의 단편 또는 유도체를 사용하는 진단 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 폴리펩티드를 특이적으로 인식하여 결합하는 항체 및 그 항체를 사용하는 진단 방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리펩티드 또는 상기 항체, 또는 그들의 단편을 포함하는 제약 조성물과 상기 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 항체, 또는 그들의 단편을 투여하는 것을 포함하는 처치 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 측면은 상기 폴리펩티드의 생물학적 활성을 조절할 수 있는 물질을 확인하는 방법과 그 방법에 의해 수득 가능한 물질에 관한 것이다.

본 발명은 새로이 확인된 폴리뉴클레오티드, 그 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드, 그 폴리펩티드의 용도, 그리고 그 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 제조에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 폴리펩티드는 헤파라나제-관련 엔도글루쿠로니다제이다. 본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드에 대한항체, 및 그 항체, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물 및 진단 시약에 관한 것이다. 또한 본 발명은 세포 내에서 또는 생물체 내에서 헤파라나제-관련 엔도글루쿠로니다제의 발현 수준을 변화, 변형 또는 조절하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 측면은 예를 들면 상기 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제와 같은 조절인자 (modulator)를 확인하는데 적합한 분석 시스템이다.

엔도글루쿠로니다제의 효소적 활성을 지닌 폴리펩티드를 코딩하는 서열을 코딩하는 또는 그와 상보적인 뉴클레오티드의 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자가 제공된다.

그의 바람직한 실시양태에서 본 발명에 따른 단리된 핵산 분자는 ⒜ 적어도 서열 1에 기재된 뉴클레오티드 서열의 단백질 코딩 부분, ⒝ 유전자 코드의 동의성 (degeneracy) 범위 내에서 ⒜의 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열, ⒞ 엄격한 조건 하에서 ⒜ 및(또는) ⒝의 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자이다.

또한 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 제공한다. 바람직하게, 폴리펩티드는 ⒜ 서열 2에 기재된 아미노산 서열 또는 ⒝ ⒜의 아미노산 서열에 70 ％ 이상, 바람직하게는 85 ％ 이상, 그리고 더 바람직하게는 95 ％ 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함한다.

서열 1에 기재된 뉴클레오티드 서열 및 유전자 코드의 동의성 범위 내에서 그에 상응하는 핵산 서열 이외에, 본 발명은 또한 엄격한 조건 하에서 상기 서열 중 하나와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명에 따른 "엄격한 조건 하의 혼성화"라는 용어는 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1,101-1,104]에 따라 정의된다. 바람직하게 엄격한 조건 하의 혼성화는 50 ℃, 바람직하게는 55 ℃, 더 바람직하게는 62 ℃, 그리고 가장 바람직하게는 68 ℃에서 1시간 동안 1 ×SSC 및 0.1 ％ SDS로, 특히 50 ℃, 바람직하게는 55 ℃, 더 바람직하게는 62 ℃ 그리고 가장 바람직하게는 68 ℃에서 1시간 동안 0.2 ×SSC 및 0.1 ％ SDS로 세척한 후, 혼성화 양성 신호가 관찰되는 것을 의미한다. 상기 세척 조건 하에서 서열 1에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 유전자 코드의 동의성 범위 내에서 그에 상응하는 뉴클레오티드 서열과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열은 본 발명에 포함된다.

바람직하게, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열은 DNA 예를 들면, cDNA, 게놈 DNA, 합성 DNA로, 이중 가닥 또는 단일 가닥이고, 단일 가닥이면 코딩 또는 비(非)코딩 (안티센스) 가닥일 수 있다. 그러나 코딩 또는 비코딩 (안티센스) 가닥 또는 펩티드성 핵산 같은 핵산 유사체인 RNA 예를 들면, mRNA, pre-mRNA 및 합성RNA도 포함할 수 있다. 특히 바람직하게, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열은 서열 1의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 1에 나타난 뉴클레오티드 서열과 70 % 이상, 바람직하게는 85 % 이상 및 특히 바람직하게는 95 % 이상의 동일성을 가진 서열의 단백질 코딩 부분, 또는 길이가 바람직하게는 20개 이상의 뉴클레오티드, 특히 30개 이상의 뉴클레오티드, 그리고 가장 바람직하게는 50개 이상의 뉴클레오티드인 그의 부분을 포함한다.

동일성은 뉴클레오티드 또는 단백질 수준에서 다음과 같이 결정된다.

I = n :L

식 중, I는 동일성 (％)을 나타내고, n은 서열 1의 뉴클레오티드 서열, 서열 2의 아미노산 서열 또는 그의 부분으로부터 각각 선택된 시험 서열 및 기본 서열 간의 상이한 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수를 나타내고, L은 시험 서열에 대한 기본 서열의 상대적인 길이이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들면 인간 세포와 같은 포유 동물로부터 얻거나, 또는 예를 들면 인간 세포와 같은 포유 동물에서 유래된 cDNA 라이브러리 또는 게놈 라이브러리로부터 얻을 수 있다. 특히 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 인시트사 (Incyte Inc.)에서 시판 중인 cDNA 라이브러리 (PENCNOTO7, BLADNOTO9, PROSTUTO8, BRSTNOT27, MIXDNOPO1, ESOGNOTO4, PENCNOTO3)로부터 단리될 수 있다. 서열 1에 나타난 cDNA 삽입체는 길이가 3943 염기쌍 (bp)이고, 492개 아미노산 길이의 단백질을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 본 발명 폴리펩티드의 예측된 아미노산 서열은 인간 헤파라나제와 38 %의 동일한 아미노산을 공유한다 (도 1). 본 발명의 cDNA의 5'-말단은 불완전하다; 예측된 성숙 단백질은 인간 헤파라나제와의 상동성으로부터 추론되어 완전하다. 전자 발현 (노던) 분석 결과, 신경계 및 남성의 생식 조직에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드가 선택적으로 발현됨이 드러났다.

본 발명은 또한 서열 2의 추론된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드의 단편, 유사체 및 유도체를 코딩하는 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 서열 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열 1의 세그먼트로부터 구성된 폴리뉴클레오티드 프로브에 관한 것이다. 본원에 기재된 폴리뉴클레오티드의 변이체에는 결실 변이체, 치환 변이체 및 첨가 또는 삽입 변이체가 포함된다.

본 발명은 또한 폴리펩티드 또는 그의 절편에 대한 코딩 서열이 동일 리딩 프레임 내에서 숙주 세포로부터 폴리펩티드의 발현 및 분비를 돕거나 본 발명의 폴리펩티드를 정제를 가능케 하는 폴리뉴클레오티드 서열 (예, 폴리-히스티딘-태그, 헤마글루티닌 태그, GST-태그)에 융합된 폴리뉴클레오티드를 포함한다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 제조 방법은 본 발명의 한 측면을 대표한다. 그 방법은 화학적 합성, 재조합 DNA 기술, 중합효소 연쇄 반응 또는 이들의 조합을 포함한다. 바람직하게 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 상기 적당한 원천으로부터의 서열-특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하는 PCR과 같은 증폭 반응을 이용하여 얻을 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 기능적 단편, 유도체 또는 유사체는 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 것, 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 것, 폴리펩티드가 다른 화합물 (예, 폴리에틸렌글리콜)과 융합된 것 또는 추가의 아미노산이 폴리펩티드 (예, 리더 서열, 분비 서열, 정제 태그)에 융합된 것일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 바람직하게 그 벡터는 발현 벡터 즉, 적합한 발현 제어 서열에 작동 가능하게 연결된 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다. 벡터는 원핵 또는 진핵 벡터일 수 있다. 원핵 벡터의 예에는 박테리오파지 같은 염색체 벡터 및 플라스미드 같은 염색체외 벡터가 있으며, 환형 플라스미드 벡터가 특히 바람직하다. 적합한 원핵 벡터는 예를 들면, 문헌[Sambrook et al., supra, Chapter 1-4]에 기재되어 있다. 한편으로 벡터는 예를 들면, 효모 벡터 또는 예를 들면 곤충세포, 식물 세포, 척추 동물 세포, 특히 포유 동물 세포와 같은 고등 동물에서의 발현에 적합한 벡터인 진핵 벡터일 수 있다. 진핵 벡터의 예에는 플라스미드 또는 바이러스성 벡터가 바람직하다. 적합한 진핵 벡터는 문헌[Sambrook et al., supra, Chapter 16]에 기재되어 있다.

또한 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 하나 이상의 이종 카피를 포함하는 세포에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 공지된 방법, 예를 들면 형질 전환 (이 용어는 또한 형질 감염, 전기 천공법, 리포펙션, 감염 등을 포함함)을 이용하여 세포 내로 삽입될 수 있다. 세포는 진핵 또는 원핵 세포일 수있다. 핵산으로 세포를 형질 전환시키는 방법은 일반적으로 잘 알려져 있어 상세히 설명할 필요가 없다. 바람직한 세포의 예는 진핵 세포인데 특히 척추 동물, 그리고 더 특히 포유동물의 세포이다.

본 발명의 다른 측면은 폴리펩티드를 발현시키는데 적합한 조건 하에서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 형질 전환된 숙주 세포의 배양 및 세포로부터 또는 배양 상청액으로부터의 상기-발현된 폴리펩티드의 단리를 포함하는 본 발명의 폴리펩티드의 재조합적 제조 방법에 관한 것이다. 숙주 세포는 형질 전환체의 선택, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 증폭, 또는 폴리펩티드의 정제에 적합하도록 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양될 수 있다.

본 발명의 상기-발현된 폴리펩티드는 디터전트 균질화, 헤파린-세파로스 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, Con A-세파로스 크로마토그래피, 겔-여과 크로마토그래피, 니켈-킬레이팅 크로마토그래피, 글루타티온-세파로스 (아가로스) 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 항체 친화성 크로마토그래피를 포함하는 통상 사용되는 방법에 의하여 재조합 세포 배양액으로부터 회수 및 정제될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 고도로 발현되는 세포주로부터 자연적으로 발현된 정제된 생성물 또는 화학적 합성의 생성물이거나, 원핵 또는 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생성될 수 있다. 재조합 생성 방법에 사용된 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 글리코실화될 수도 글리코실화되지 않을 수도 있다.

본 발명의 다른 측면은 엄격한 조건 하에서 서열 1에 기재된 뉴클레오티드서열과 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 유도체에 관한 것이다. 상기 올리고뉴클레오티드는 의도된 용도에 따라, 예를 들면 약 5개 내지, 바람직하게는 약 15개 내지 약 100개 또는 심지어 수백개 길이의 뉴클레오시드 단위 또는 그의 유사체일 수 있다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 클로닝 프라이머로서, 또는 PCR 프라이머로서, 또는 시퀀싱 프라이머로서, 또는 혼성화 프로브로서 사용될 수 있다. 다른 용도는 생체 내에서 센스 또는 안티센스 기술의 사용에 의한 본 발명의 폴리펩티드 발현의 촉진 또는 저해에 관한 것이다. 이 기술은 이중 가닥 DNA 상에 삼중 나선의 형성 또는 RNA 상에서 안티센스 기작을 통한 유전자 발현의 제어에 사용가능하며, 상기 두 기술은 상기 올리고뉴클레오티드가 DNA 또는 RNA에 결합하는 것에 기초한 방법이다. 올리고뉴클레오티드, 특히 RNA 올리고뉴클레오티드의 또 다른 용도는 리보자임 기술을 이용한 발현 제어에 관한 것이다. 올리고뉴클레오티드는 당업계내 방법에 의해 직접 세포로 수송되거나 본 발명의 폴리펩티드의 생성을 저해하는 안티센스 또는 리보자임 RNA 또는 DNA가 생체 내에서 발현되도록 수송된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 구조물 또는 리보자임은 본 발명의 폴리펩티드의 작용을 저해하고, 예를 들면 암 및 암 전이증과 같은 특정 장애의 치료에 이용될 수 있다.

또한 상기 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 존재 또는 부재 및 그 폴리뉴클레오티드의 발현 수준을 검출하는데 사용될 수 있다. 또한 상기 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 내에서의 돌연변이를 검출하는 데에도 사용될 수 있다. 유전자내 돌연변이는 질병 또는 질병의 예후와 상관관계가 있을 수 있다. 그러므로, 상기 올리고뉴클레오티드는 암, 암 전이증 및 이상 혈관 형성과 같은 장애의 진단을 위한 진단 마커로서 유용하다.

폴리펩티드, 그의 기능적 단편, 그의 유도체 또는 유사체, 또는 그들을 발현하는 세포, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편은 거기에 대한 항체가 생성되는 면역원으로서 사용될 수 있다. 즉, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 특이적으로 인식하여 결합하는 항체에 관한 것이다.

예를 들면 상기 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 본 발명은 또한 Fab 단편 뿐만 아니라 키머릭, 단쇄 및 인간화된 항체를 포함한다. 당업계에 공지된 다양한 방법이 상기 항체 및 단편의 생성에 사용될 수 있다.

폴리클로날 항체는 경우에 따라 담체에 연결된 적합한 폴리펩티드 또는 펩티드 항원으로 실험용 동물을 면역화하고, 면역화된 동물으로부터 항체를 단리하여 얻을 수 있다. 모노클로날 항체는 쾰러 (Koehler) 및 밀스타인 (Milstein)에 의해 개발된 하이브리도마 기술에 의해 얻을 수 있다. 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 생성시키는 각각의 방법은 잘 알려져 있어 상세히 설명할 필요가 없다[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988].

상기 항체는 그 폴리펩티드를 발현하는 조직으로부터 폴리펩티드를 단리하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 특이적인 항체는 또한 폴리펩티드에 결합함으로써 폴리펩티드의 생물학적 작용을 저해하는데 사용될 수 있다. 이런 방식으로, 항체는 예를 들면 암 치료와 같은 치료에 사용될 수 있다. 암 치료는 문헌[Weiner Semin. Oncol. 26 (1999), 41-50] 또는 그에 언급된 참조 문헌에 기재된 프로토콜에 따라 수행될 수 있다.

또한 상기 항체는 본 발명의 폴리펩티드의 존재 또는 부재와 상기 폴리펩티드의 농도 수준을 검출할 수 있어, 암, 암 전이증 및 이상 혈관 형성과 같은 장애의 진단을 위한 진단 마커로서 유용하다.

추가의 측면에서 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 생물학적 활성 또는 발현을 조절할 수 있는 물질을 확인하는 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 기능, 활성 또는 발현의 아고니스트 또는 자극인자 뿐만 아니라 길항제 및 저해인자를 확인하는 방법에 관한 것이다.

예를 들면 길항제는 본 발명의 폴리펩티드에 결합하여 그의 기능을 저해 또는 제거할 수 있다. 길항제는 예를 들면, 폴리펩티드에 결합함으로써 폴리펩티드의 글루쿠로니다제 활성을 떨어뜨리는 폴리펩티드에 대한 항체 또는 높은 친화력을 지닌 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드일 수 있다. 저해인자의 예는 촉매 부위에 결합하고 점령하여 촉매 부위가 기질에 접근하기 어렵게 함으로써 폴리펩티드의 생물학적 활성을 방해하는, 폴리펩티드와 상호작용하는 저분자량의 분자이다.

길항제 및 저해제는 폴리펩티드의 기능을 막아 세포외 기질로부터 황산 헤파란 프로테오글리칸을 파괴함으로써 암, 암 전이증 및 이상 혈관 형성의 치료에 사용될 수 있다.

상기 방법에 의해 확인된 길항제 및 저해제 또는 그의 유도체는 제약학상 허용가능한 담체와 함께 조성물로 사용될 수 있다.

특히 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 특이적이며 폴리펩티드가 기능하지 못하게 하거나 그의 발현을 방해하는 상기 물질 예를 들면, 저분자량의 저해인자를 확인하는 분석에 관한 것이다. 폴리펩티드의 엔도-글루쿠로니다제 활성을 평가하는데 천연 또는 합성 탄수화물 기질이 사용될 것이다.

추가의 측면은 의약 용도에 있어서 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 특히 본 발명은 상기 폴리펩티드의 부족 또는 결핍에 기인한 질환의 치료를 위한 제약 조성물의 제조에 있어서 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 대신하여 또는 부가하여, 폴리펩티드의 아고니스트 또는 상기 폴리펩티드의 발현 유도인자/인핸서가 의약 용도로 사용될 수 있다. 그러한 질환은 예를 들면, 외상, 자가면역성 질환, 피부 질환, 심혈관 질환 및 신경계 질환이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 유전자 치료법에 사용될 수 있다. 유전자 치료법은 문헌[Beutler Biol. Blood Marrow Transplant 5 (1999), 273-276] 또는 문헌[Gomez-Navarro et al., Eur. J. Cancer 35 (1999), 867-885] 또는 그에 인용된 참조 문헌에 기재된 프로토콜에 따라 수행될 수 있다.

다른 측면은 의약 용도에 있어서 본 발명에 따른 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 특히 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 과도한 활성 또는 과발현에 기인한 질환의 치료를 위한 제약 조성물의 제조에 있어서 본 발명에 따른 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 항체를 대신하여, 길항제 또는 저해인자 또는 상기 폴리펩티드의 발현 저해인자가 의약 용도로 사용될 수 있다. 그러한 질환은 예를 들면 암, 암 전이증, 혈관 형성, 및 관절염을 비롯한 염증이다.

또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 부족, 결핍 또는 불활성에 기인한 또는 본 발명의 폴리펩티드의 과활성 또는 과발현에 기인한 질환으로 고통받는 인간을 비롯한 온혈 동물에 대한 투여에 적합한 제약 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 주로 수컷 생식 조직에서 발현되기 때문에 발현 및(또는) 코딩된 폴리펩티드의 활성에 대한 조절을 수컷 생식 기능 (즉, 수컷의 수정력 조절, 발기 부전)에 대한 의약적 조절을 위해 사용할 수 있다.

실시예 1:본 발명의 폴리뉴클레오티드의 확인

인간 헤파라나제의 공개된 서열 (AAD 54941.1)을 이용하여, 인시트사의 세 개의 주형(예를 들면 인시트사의 EST 집합체)이 인간 헤파라나제에 대한 상당한 상동성을 공유하는 것을 확인할 수 있었다. 각각의 주형의 이 EST 중 일부는 인시트사로부터 주문된 것이다. 각각의 EST 클론의 3'- 및 5'-말단의 뉴클레오티드 서열을 결정한 결과, 보다 신규한 서열 정보가 드러났으며 이것은 인시트 클론으로부터 추가의 두 개의 집합체이다. 본 출원인은 이 서열 정보와 본 출원인이 시퀀싱으로부터 얻은 이 인시트 클론의 서열 정보를 합하여 인간 헤파라나제의 신규 파라로그로서 인간 헤파라나제-관련 폴리펩티드를 모을 수 있었다. 신규한 서열은 3943 bp 및 1 bp 내지 1479 bp (중지 코돈을 포함함)의 확인된 코딩 서열 범위를 포함한다. 5' 말단은 코딩 영역 분석 (ESTSCAN 프로그램에 의해 결정) 및 인간 헤파라나제와의 상동성 둘 다로 알 수 있듯이 여전히 결정되지 않았다.

실시예 2:전자 발현 분석

주어진 조직의 EST 개수를 토대로, 주어진 조직에서 주어진 유전자의 생체 내 발현 수준 값을 구하거나 추정할 수 있다.

"전자적-노던"법은 우선 데이타베이스내에 있는 주어진 조직에 대한 모든 EST의 전체 수를 확인하고 (소위 "풀-사이즈 (pool-size)"), 다음으로 그 조직에서 검색하려는 서열 (query sequence)에 일치하는 EST 수 만을 확인하는 생물정보학적 방법이다.

이것은 검색 서열로 관심있는 유전자의 cDNA를 이용하고 데이타원으로 인간 EST 데이타베이스 (인시트사의 라이프세크골드 (LifeSeqGold))를 이용한 블라스트 (BLAST, 문헌[NCBI BLAST v. 2.0 10; Altschul et al., Nucleic Acid Res. (1997) 25, 3389-3402]참조) 검색에 의해 수행된다. 검색 파라미터는 E = 1e-30이었다. 데이터베이스 내에서 SQL-검색은 각각의 조직에 대한 조직 기원 및 풀-사이즈의 검색으로부터 나타난 각각의 EST를 검색한다.

이러한 데이타는 생체 내에서 발현 수준과 관계가 있다고 생각된다. 통계학적 분석 (풀-사이즈의 정규화 및 신뢰 구간 결정)을 통해 여기서 데이타의 신뢰도를 구할 수 있고, 상이한 조직들 간의 발현 수준을 비교할 수 있다. 이 추정 방법의 신뢰도는 보통 히트수/조직 및 조직의 풀 사이즈 수에 따라 증가한다.

실시예 3:폴리뉴클레오티드의 발현

서열 1에 주어진 폴리뉴클레오티드의 코딩 영역을 5'-프라이머 HepR1 (5'-GAC AGG AGA CCC TTG CCT GTA GAC-3') 및 3'-프라이머 HepR2 (5'-ATA GTC GAG TTA TCG GTA GCG GCA GGC CAA AGC-3')와 DNA 주형으로서의 클론 제3207535H1호 및 제3385824H1호로부터 단리된 DNA (인시트사의 라이프세크골드 데이타베이스, 1999년 10월, 11월 발행)를 이용한 PCR에 의해 증폭하였다. T4 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 1488 bp의 DNA를 인산화하고, XhoI을 이용하여 제한 효소 분해하였다. 단편을 프레임 내에 pISP-myc 벡터내로 라이게이션하여 N-말단 면역 글로불린 신호 서열과 myc-태그 에피토프를 제공하였다. HindIII 및 XhoI을 이용한 제한 효소 분해 후에, 발현 벡터 pCEP4 (인비트로겐사, Invitrogen)의 적절한 부위에 단편을 라이게이션하여 발현 벡터 HepR-pCEP를 생성하였다. HepR-pCEP는 CHO 세포 뿐만 아니라 MCF7, MBA-231 및 MBA-468 유방 암종 세포주 내로 안정하게 형질 감염되었다. 재조합 단백질은 항-myc-태그 에피토프 항체를 사용하여 검출하였다.

곤충 세포에서의 발현을 위해, EcoRI 및 XbaI을 사용하여 pISP-myc벡터로부터 PCR-단편을 방출시켰다. 단편을 pVL1392 배큘로바이러스 수송 벡터 내로 클로닝하여 HepR-pVL 벡터를 생성하였고, Sf9 곤충 세포 내로 형질 감염시켰다.

실시예 4:항체의 생성

실시예 3의 발현 벡터 HepR-pVL을 사용하여 감염된 Sf9 곤충 세포로부터 정제된 폴리펩티드를 표준 방법(문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988])을 사용하여 쥐 및 토끼의 면역화에 각각 사용하였다.

Claims (25)

1. ⒜ 서열 1에 기재된 서열 또는 적어도 그의 단백질 코딩 부분,

   ⒝ 유전자 코드의 동의성 (degeneracy) 범위 내에서 ⒜의 서열에 상응하는 뉴클레오티드 서열 또는

   ⒞ 엄격한 조건 하에서 ⒜ 및(또는) ⒝의 서열과 혼성화하는 뉴클레오티드 서열

   을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
2. 제1항에 있어서, 엔도-글루쿠로니다제의 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
3. 제1항 또는 2항에 있어서, 서열 1에 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 그의 단편과 70 ％ 이상의 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드.
4. 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, DNA, RNA 또는 핵산 유사체인 폴리뉴클레오티드.
5. 제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피를 포함하는 재조합 벡터.
6. 제5항에 있어서, 발현 벡터인 벡터.
7. 제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드로 또는 제5항 또는 6항 중 어느 한 항의 벡터로 형질 전환된 세포.
8. 제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드.
9. 제8항에 있어서,

   ⒜ 서열 2에 기재된 아미노산 서열 또는

   ⒝ ⒜의 아미노산 서열 또는 그의 단편과 70 ％ 이상의 동일성을 가지는 아미노산 서열

   을 포함하는 폴리펩티드.
10. 제8항 또는 9항에 있어서 엔도-글루쿠로니다제 활성을 가지는 폴리펩티드.
11. 제8항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 특이적 항체를 유도할 수 있는 폴리펩티드 또는 그의 단편.
12. 화학적 합성, 재조합 DNA 기술 또는 이 방법들의 조합을 포함하는, 제8항 내지 11항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드의 제조 방법.
13. 화학적 합성, 재조합 DNA 기술, 중합효소 연쇄 반응 또는 이 방법들의 조합을 포함하는, 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드의 제조 방법.
14. 제8항 내지 11항에서 정의된 폴리펩티드를 특이적으로 인식하고 결합하는 항체, 올리고펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 그들의 유도체.
15. 의약으로 사용되는 제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제8항 내지 11항 중 어느 한 항의 폴리펩티드.
16. 상기 폴리펩티드의 부족, 결핍 또는 불활성에 기인한 질환의 치료를 위한 제약 조성물의 제조에 있어서 제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제8항 내지 11항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 용도.
17. 제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 제8항 내지 11항 중 어느 한 항의 폴리펩티드의 적정량을 투여하는 것을 포함하는, 제8항 내지 11항에 정의된 상기 폴리펩티드의 부족, 결핍 또는 불활성에 기인한 질환의 치료 방법.
18. 제14항에서 정의된 항체, 올리고펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 그들의 유도체의 적정량을 투여하는 것을 포함하는, 제8항 내지 11항에서 정의된 폴리펩티드의 과활성 또는 과발현에 기인한 질환의 치료 방법.
19. 제8항 내지 11항 중 어느 한 항에 정의된 폴리펩티드, 그의 기능적 유도체, 기능적 단편 또는 기능적 유사체, 또는 상기 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포를, 상기 폴리펩티드, 기능적 유도체, 기능적 단편 또는 기능적 유사체의 생물학적 활성 또는 발현을 조절하는 능력 여부를 조사하려는 1종 이상의 화합물 또는 시약과 접촉시키고, 상기 물질에 의해 유발된 상기 폴리펩티드, 유도체 또는 단편의 생물학적 활성 또는 발현의 변화를 측정하는 것을 포함하는, 세포 내에서 제8항 내지 11항에서 정의된 폴리펩티드의 생물학적 활성 또는 발현을 조절할 수 있는 물질을 확인하는 방법.
20. 제19항에 있어서, 조절인자 또는 그의 유도체로 확인된 물질을 활성 물질로 포함하는 제약 조성물의 제제화를 추가로 포함하는 방법.
21. 제8항 내지 11항 중 어느 한 항에 정의된 폴리펩티드, 그의 기능적 유도체, 기능적 단편 또는 기능적 유사체, 또는 폴리펩티드 또는 기능적 유도체, 기능적 단편 또는 기능적 유사체를 발현할 수 있는 세포, 및 임의로 물질에 의해 유발된 반응을 측정하기 위한 수단을 포함하는, 소정의 물질이 제8항 내지 11항에 정의된 폴리펩티드에 결합하는 능력 또는 기능적 작용을 갖는지 여부를 시험하기 위한 분석 시스템.
22. 제8항 내지 11항에 정의된 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제인, 제19항 또는 20항에서 정의된 방법에 의해 수득 가능한 물질.
23. 세포 내에서 제8항 내지 11항에 기재된 폴리펩티드의 발현을 조절하는 제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드, 그의 단편 또는 유도체의 용도.
24. 유전자 치료법에 있어서 제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드의 용도.
25. 제14항에 정의된 항체, 올리고펩티드, 올리고뉴클레오티드 또는 그들의 유도체, 또는 제1항 내지 4항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편 또는 유도체의, 제8항 내지 11항에 정의된 폴리펩티드의 부족 또는 과발현에 기인한 질환의 진단에 있어서의 용도.