CZ20022147A3 - Polypeptid příbuzný humánní heparanáze, polynukleotid, který ho kóduje, a jejich použití - Google Patents

Description

Polypeptid příbuzný humánní heparanáze, polynukleotid, který ho kóduje, a jejich použití

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nově identifikovaných polynukleotidů polypeptidů kódovaných takovými polynuklěotidy, použití těchto polypeptidů, a také přípravy takových polynukleotidů a polypeptidů. Konkrétně, polypeptid podle předkládaného vynálezu je endoglukuronidáza příbuzná heparanáze. Předkládaný vynález se dále týká vektorů a hostitelských buněk obsahujících polynukleotid podle vynálezu. A dále, vynález se týká protilátek namířených proti polypeptidu podle předkládaného vynálezu, a dále farmaceutických přípravků a diagnostických činidel obsahujících takové protilátky, polypeptidy nebo polynuklěotidy. Předkládaný vynález se dále týká způsobu změny, modifikace nebo jiné modulace hladiny exprese endoglukuronidázy příbuzné heparanáze v buňce nebo v organismu. Dalším aspektem vynálezu jsou testovací systémy užitečné pro identifikaci modulátorů, např. agonistů nebo antagonistů těchto polypeptidů.

Dosavadní stav techniky

Proteiny extracelulární matrix (ECM) a bazální membrány (BM) jsou vnořeny do vláknité sítě sestávající zejména z proteoglykanů heparansulfátu (HSPG). HSPG jsou výjimečné sloučeniny vyskytující se v krevních cévách (subendotelová bazální membrána), které podporují endotelové buňky a stabilizují strukturu stěn kapilár. Exprese heparanázy, f ·» ·· ·· ti · · · · · · ti · • ti ti · tititi ti ti ti • titi titi titi ti·· ti ti • titi·· ti·· endo-p-D-glukuronidázy, v destičkách, trofoblastech placenty a v leukocytech ukazují na to, že normální funkcí heparanázy je při embryonální morfogeneze, hojení ran, reparaci tkání a zánětech. V souladu s ECM-štěpícími proteázami heparanáza dovoluje buňkám procházet bazální membránou a uvolňovat růstové faktory vázající heparin (jako např. bFGF, VEGF), které jsou akumulovány v ECM (Finkel et al., Science 285 (1999), 33-34; Eccles, Nátuře Med. 5 (1999), 735-736).

Heparanáza, která byla v současnosti klonována nezávisle čtyřmi výzkumnými skupinami (Vlodavsky et al., Nátuře Med. 5 (1999), 793-802; Hulett et al., Nátuře Med. 5 (1999), 803-809; Toyoshima and Nakajima, J. Biol. Chem. 274 (1999); 2415324160; Kussie et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 261 (1999), 183-187), je exprimována jako prekurzorový protein velikosti 65 kDa, který je N-koncově opracován na aktivní enzymy velikosti 50 kDa. Rekombinantní exprese aktivního enzymu byla demonstrována v buňkách CHO, NIH 3T3 a COS-7. Ačkoliv již dříve bylo popsána několik zjevně odlišných heparanázových aktivit, 4 skupiny, které klonovaly heparanázovou cDNA z různých zdrojů (normální a nádorové buňky) publikovali identické cDNA sekvence.

Existuje řada důkazů, které ukazují, že ECM degradující glukuronidázy se podílejí na růstu nádorů a vytváření metastáz: (1) Bylo ukázáno, že heparanáza je přednostně exprimována v podobě mRNA a proteinu v humánních nádorových tkáních ve srovnání s odpovídající zdravou tkání, např. při invazivním duktálním karcinomu prsu, hepatocelulárním karcinomu, adenokarcinomu ovárií, skvamózním karcinomu krčku, adenokarcinomu tlustého střeva (Vlodavsky et al., supra). (2) Zvýšená hladina heparanázy byla zjištěna v séru a v moči zvířat s metastázujícími nádory i u pacientů s rakovinou

99

9 9 9

9 9

9«

99

9 9

9 999

9 9

99

9999 (Vlodavsky et al., supra). (3) Exprese mRNA heparanázy a enzymová aktivita koreluji s metastázujicim potenciálem u buněčných linii z karcinomu prsu u lidi i laboratorních potkanů (Vlodavsky et al., supra; Hulett et al., supra). (4) Slabě metastázující nádorové buněčné linie získají silně metastázující fenotyp po transfekci heparanázovou cDNA; jak bylo např. ukázáno na myším T lymfomu L5178Y a myším melanomu B16-F1 (Vlodavsky et al., supra). (5) Sulfatovaný oligosacharid PI-88 (fosfomanopentóza-SOJ, který inhibuje aktivitu heparanázy, inhibuje růst primárních nádorů, vytváření mestastáz a vaskularizaci nádorů (Parish et al., Cancer Res. 59 (1999), 3433-3441).

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje novou izolovanou molekulu nukleové kyseliny obsahující kódující sekvenci nukleotidů nebo sekvenci komplementární k sekvenci kódující polypeptid mající enzymatickou aktivitu endoglukuronidázy nebo její fragment.

Předkládaný vynález se dále týká polypeptidu kódovaného polynukleotidem nebo jeho funkčního fragmentu, funkčního derivátu nebo funkčního analogu.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu přípravy takových polypeptidů nebo polynukleotidů.

A ještě další aspekt předkládaného vynálezu se týká rekombinantních vektorů obsahujících takový polynukleotid, výhodně operativně spojený kontrolní expresní sekvencí (tj. sekvencí řídící expresi), a dále se týká hostitelských buněk transformovaných takovým rekombinantním vektorem.

• 0 • 0 0

0 0 • 00 • 000

0

0 0 0 0

00 0 0

000 <0 « 0 0 0 0 00 ·0

Navíc se předkládaný vynález týká dále způsobu změny, modifikace nebo jiné modulace hladin exprese těchto polypeptidů nebo polynukleotidů v buňce nebo v organismu.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu diagnózy, který využívá polynukleotid podle vynálezu, nebo jeho fragment nebo derivát, nebo polypeptid podle vynálezu, nebo jeho fragment nebo derivát.

A dále se předkládaný vynález týká protilátek specificky rozpoznávajících a vázajících se na takové polypeptidy, a dále se týká diagnostických způsobů, které užívají protilátky podle vynálezu.

Kromě toho se předkládaný vynález týká farmaceutických přípravků obsahujících polynukleotidy nebo polypeptidy nebo protilátky podle vynálezu nebo jejich fragmenty, a dále se týká léčení, kdy se podává polynukleotid nebo polypeptid nebo protilátka podle vynálezu nebo jejich fragment.

A ještě další aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu identifikace látky schopné aktivitu polypeptidů podle vynálezu, získaných způsobem podle vynálezu.

modulovat biologickou a dále se týká látek

Předkládaný vynález především poskytuje izolovanou molekulu nukleové kyseliny, která obsahuje kódující nukleotidovou sekvenci nebo sekvenci komplementární k sekvenci kódující polypeptid, který má enzymatickou aktivitu endoglukuronidázy.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu je izolovaná molekula nukleové kyseliny taková molekula nukleové kyseliny, která obsahuje (a) alespoň úsek kódující protein z nukleotidové sekvence uvedené zde jako sekvence id. č. 1, «Φ φφ »* • · φ · * φ φ φ φφφφ φ φ φ φ <

• φ ·· φφ φφ φφ φ φ φ φ φ · φ • φ φ φφφ φφ φφφφ (b) nukleotidovou sekvenci odpovídající sekvenci v (a) s ohledem na degeneraci genetického kódu, nebo (c) nukleotidovou sekvenci hybridizujici za stringentnich podmínek s nukleotidovou sekvencí (a) a/nebo (b).

Předkládaný vynález dále molekulou nukleové kyseliny Výhodně polypeptid obsahuje uvedenou zde jako sekvence id. sekvenci mající alespoň 70% identitu a ještě výhodn s aminokyselinovou sekvencí (a) poskytuje polypeptid kódovaný podle předkládaného vynálezu, (a) aminokyselinovou sekvenci č. 2, nebo (b) aminokyselinovou identitu, výhodné alespoň 85% šji alespoň 95% identitu

Kromě nukleotidové sekvence uvedené zde jako sekvence id. č.l a odpovídajících sekvencí s ohledem na degeneraci genetického kódu předkládaný vynález zahrnuje také nukleotidové sekvence, které hybridizují za stringentnich podmínek s jednou ze sekvencí definovaných výše. Termín hybridizace/hybridizovat za stringentnich podmínek je ve smyslu předkládaného vynálezu definován ve shodě se Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104. Výhodně hybridizace za stringentnich podmínek znamená, že po promývání 1 hodinu v 1 x SSC a 0,1% SDS při 50°C, výhodně 55°C, výhodněji 62 °C a nejvýhodněji při 68 °C, a zejména 1 hodinu ve 0,2 x SSC a 0,1% SDS při 50°C, výhodně 55°C, výhodněji 62°C a nejvýhodněji při 68°C, je pozorován pozitivní hybridizační signál. Nukleotidová sekvence, která hybridizuje za výše uvedených promývacích podmínek s nukleotidovou sekvencí uvedenou zde jako sekvence id. č. 1 nebo s nukleotidovou sekvencí, která jí odpovídá s ohledem na degeneraci genetického kódu, je také předmětem předkládaného vynálezu.

• · 9 9 · · 999 • 99 9* 9* *9 9* 9999

Výhodně je nukleotidové sekvence podle vynálezu DNA, tedy např. cDNA, genomová DNA nebo syntetická DNA, a může být jednořetězcová nebo dvoj řetězcová, přitom v případě jednořetězcové molekuly se může jednat o kódující řetězec nebo nekódující (anti-sense) řetězec. Může to být také RNA, např. mRNA, pre-mRNA a syntetická RNA, a to buďto kódující řetězec nebo nekódující (anti-sense) řetězec, a nebo analog nukleové kyseliny jako je např. peptidová nukleová kyselina. Zvláště výhodná nukleotidové sekvence podle vynálezu obsahuje část nukleotidové sekvence id. č. 1 kódující protein nebo sekvenci, která má se sekvencí id. č. 1 identitu vyšší než 70 %, výhodně vyšší než 85 % a zvláště výhodně vyšší než 95 %, nebo část této sekvence, která je dlouhá výhodně alespoň 20 nukleotidů, výhodněji alespoň 30 nukleotidů a nejvýhodněji alespoň 50 nukleotidů.

Identita je stanovena pokud jde o nukleotidovou sekvenci nebo protein (aminokyselinovou sekvenci) následujícím způsobem:

I = n : L, kde I je identita vyjádřená v procentech, n představuje počet nukleotidů nebo aminokyselin, které se liší mezi testovanou sekvencí a základní sekvencí, kterou je buďto nukleotidové sekvence id. č. 1 nebo aminokyselinová sekvence id. č. 2 nebo jejich úseky, a

L je délka základní sekvence srovnávaná s testovanou sekvencí

Polynukleotid podle předkládaného vynálezu může být získán ze savce, např. z humánních buněk nebo z cDNA knihovny *0 • 0 «0 • · 000 · • ·β

0* • 0 • ··· · ·

0 · • · 1 • · • · • ·

0000 nebo genomové knihovny připravené ze savce, např. s humánních buněk. Konkrétně je možné polynukleotid popsaný v předkládané přihlášce izolovat z cDNA knihoven (PENCNOT07, BLADNOT09, PROSTUT08, BRSTNOT27, MIXDNOPOl, ESOGNOT04, PENCNOT03), které jsou komerčně dostupné od firmy Incyte lne. cDNA inzert uvedený zde jako sekvence id. č. 1 má délku 3943 párů baží (bp) a obsahuje otevřený čtecí rámec kódující protein o velikosti 492 aminokyselin. Predikovaná aminokyselinová sekvence polypeptidu podle vynálezu sdílí 38% identitu aminokyselin s humánní heparanázou (Obrázek 1). 5'-konec cDNA podle vynálezu je neúplný, predikovaný zralý (maturovaný) protein je úplný, jak vyplývá z homologie s humánní heparanázou. Z elektronická analýzy exprese (Northern) vyplynulo, že polynukleotid podle předkládaného vynálezu je přednostně exprimován v nervovém systému a tkáních samčích genitálií (Obrázek 2).

Předkládaný vynález se dále týká variant zde popsaných polynukleotidů, které kódují fragmenty, analogy a deriváty polypeptidu majícího dedukovanou aminokyselinovou sekvenci id. č. 2. Předkládaný vynález se také týká polynukleotidových sond konstruovaných z polynukleotidové sekvence id. č. 1 nebo segmentu sekvence id. č. 1. K variantám zde popsaných polynukleotidů patří deleční varianty, substituční varianty, adiční a nebo inzerční varianty.

Předkládaný vynález se dále týká polynukleotidů, kde kódující sekvence polypeptidu, nebo její segment, je fúzována ve shodném čtecím rámci s polynukleotidovou sekvencí, která napomáhá expresi nebo sekreci polypeptidu z hostitelských buněk, nebo která usnadňuje purifikaci polypeptidu podle vynálezu (jako je např. poly-histidinová značka, hemaglutininová značka nebo tzv. GST-značka).

Dalším aspektem předkládaného vynálezu je způsob přípravy polynukleotidu podle vynálezu. Tento způsob zahrnuje chemickou syntézu, techniku rekombinantní DNA, polymerázovou řetězovou reakci nebo jakoukoliv kombinaci těchto metod. Výhodně je polynukleotid podle vynálezu získán z vhodného výše uvedeného zdroje užitím amplifikační reakce, např. pomocí PCR s využitím sekvenčně-specifických oligonukleotidových primerů.

Polypeptid podle předkládaného vynálezu může být rekombinantní polypeptid, přirozený polypeptid nebo také syntetický polypeptid. Funkční fragment, derivát nebo analog polypeptidů podle vynálezu je takový polypeptid, kde jedna nebo více aminokyselin bylo substituováno jinými aminokyselinami, nebo jedna nebo více aminokyselin obsahují substituované skupiny, nebo je polypeptid fúzován s další sloučeninou (jako je např. polyethylenglykol), nebo jsou k polypeptidů navázány (fúzovány) další aminokyseliny (jako je např. tzv. vedoucí sekvence, sekretorická sekvence nebo purifikační značka).

Předkládaný vynález se také týká rekombinantního vektoru, který obsahuje polynukleotid podle vynálezu. Výhodně je tento vektor expresním vektorem, t j. vektorem obsahujícím polynukleotid podle předkládaného vynálezu operativně spojený s vhodnou expresní kontrolní sekvencí. Vektor je prokaryotický nebo eukaryotický vektor. K příkladům prokaryotických vektorů patří chromozómový vektor, jako je např. bakteriofág, a mimochromozómový vektor, jako je např. plazmid, přičemž zvláště výhodné jsou kruhové plazmidové vektory. Vhodné prokaryotické vektory byly popsány např. v Sambrook et al., supra, kapitoly 1-4. Na druhé straně se může jednat o eukaryotický vektor, jako je např. kvasinkový vektor nebo vektor vhodný pro expresi v buňkách vyšších organizmů, např.

v hmyzích buňkách, rostlinných buňkách nebo buňkách obratlovců, zejména savčích buňkách. Výhodnými příklady eukaryotických vektorů jsou plazmidové nebo virové vektory. Vhodné eukaryotické vektory byly popsány v Sambrook et al., supra, kapitola 16.

A dále se předkládaný vynález týká buňky, která obsahuje alespoň jednu heterologní kopii polynukleotidů nebo vektor, jak byly definovány výše. Polynukleotid nebo vektor jsou vloženy do buňky, a to způsoby, které jsou odborníkům známy, jako je např. transformace (tento termín zahrnuje metody jako je transfekce, elektroporace, lipofekce, infekce atd.). Buňka je eukaryotická nebo prokaryotická buňka. Způsoby transformace buněk nukleovými kyselinami jsou obecně známé, a proto není třeba je podrobné vysvětlovat. K příkladům výhodných buněk patří eukaryotické buňky, zejména buňky obratlovců a zvláště pak buňky savců.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká rekombinantního způsobu přípravy polypeptidů podle vynálezu, který zahrnuje kultivaci hostitelských buněk transformovaných polynukleotidem nebo vektorem, které byly popsány výše, a to za podmínek, které umožňují expresi polypeptidů, a dále zahrnuje izolaci takto exprimovaného polypeptidů z buněk nebo ze supernatantu buněčné kultury. Hostitelské buňky lze kultivovat v obvyklých živných médiích vhodně modifikovaných pro selekci transformant, amplifikaci polynukleotidů nebo vektoru nebo purifikaci polypeptidů.

Takto éxprimovaný polypeptid podle předkládaného vynálezu se izoluje a purifikuje z rekombinantních buněčných kultur způsoby k tomu určenými, které jsou odborníkům známy, jako je např. homogenizace s detergenty, chromatografie na heparin-

• 0

- 10 Sepharose, kationtová výměnná chromatografe, chromatografie na Con-A-Sepharose, gelová filtrační chromatografie, Ni-chelatační chromatografie, chromatografie na glutathionsepharose (agaróze), chromatografie s hydrofobní interakcí a afinitní chromatografie s protilátkou.

Polypeptid podle předkládaného vynálezu je purifikovaný produkt přirozeně exprimovaný z buněčné linie s vysokou expresí, nebo je to produkt chemické syntézy a nebo je produkován rekombinantní technikou v prokaryotickém nebo eukaryotickém hostiteli. V závislosti na tom, jaký hostitel byl užit pro rekombinantní produkci, polypeptid podle vynálezu může být glykosylován nebo nemusí.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká oligonukleotidu nebo jeho derivátu, který hybridizuje za stringentních podmínek s nukleotidovou sekvencí uvedenou zde jako sekvence id. č. 1. Takový oligonukleotid má délku např. 5, výhodně 15 až 100 nebo dokonce i několik set nukleosidových jednotek nebo jejich analogů, v závislosti na zamýšleném použití.

Oligonukleotid podle vynálezu se užívá jako klonovací primer nebo jako PCR primer nebo jako sekvenační primer nebo jako hybridizační sonda. Další použití se týká stimulace nebo inhibice exprese polypeptidu podle předkládaného vynálezu in vivo využitím sense nebo anti-sense techniky. Tato technika může být využita k řízení genové exprese protřednictvím vytváření trojšroubovicových struktur na dvojřetězcové DNA nebo anti-sense mechanismem na RNA, přičemž oba tyto způsoby jsou založeny na tom, že oligonukleotid se váže na DNA nebo RNA. Ještě další použití oligonukleotidů, zejména RNA oligonukleotidu, se týká řízení exprese užitím ribozymové technologie. Oligonukleotidy mohou být vneseny do buněk postupy, které jsou v oboru známy, buďto přímo, nebo tak, že anti-sense nebo ribozymová RNA nebo DNA jsou exprimovány in vivo, čímž je inhibována produkce polypeptidů podle předkládaného vynálezu. Anti-sense konstrukty nebo ribozymy k polynukleotidu podle vynálezu inhibují působení polypeptidů podle vynálezu a mohou se využít k léčení některých nemocí jako je např. rakovina nebo metastázy.

Dále oligonukleotidy podle vynálezu mohou být využity k detekci přítomnosti nebo absence polynukleotidu podle vynálezu a hladiny exprese tohoto polynukleotidu. A dále tyto oligonukleotidy mohou být užity k detekci mutací v genu, který kóduje polypeptid podle předkládaného vynálezu. Mutace v genu mohou korelovat s výskytem nemoci nebo s prognózou nemoci. Proto jsou tyto oligonukleotidy užitečné jako diagnostické markéry pro diagnostiku nemocí jako je rakovina, metastázy, a aberantní (nenormální) angiogeneze. Polypeptidy, jejich funkční fragmenty, deriváty nebo analogy, a nebo buňky, které je exprimují, nebo polynukleotidy nebo jejich fragmenty, mohou být využity jako imunogeny pro produkci příslušných protilátek. Takže předkládaný vynález se týká také protilátky, která specificky rozpoznává a váže polypeptid podle vynálezu.

Tyto protilátky jsou např. polyklonální nebo monoklonální protilátky. Předkládaný vynález se také týká chimérických, jednořetězových a humanizovaných protilátek, a také Fab fragmentů. Pro přípravu takových protilátek a jejich fragmentů se mohou užít různé metody, které jsou odborníkům známy.

Polyklonální protilátky lze získat imunizací experimentálních zvířat vhodným polypeptidovým nebo peptidovým antigenem, který je případně navázán na nosič, a pak izolací

- 12 protilátky z těchto imunizovaných zvířat. Monoklonální protilátky mohou být připraveny metodou hybridomů, kterou vyvinuli Kohler a Milstein. Způsoby přípravy polyklonáíních a monoklonálních protilátek jsou obecně známy a není třeba je podrobně vysvětlovat (viz např. Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

Tyto protilátky mohou být využity k izolaci polypeptidů z tkáně exprimující tento polypeptid. protilátka specifická k polypeptidů podle předkládaného vynálezu se dále může využít k inhibici biologického účinku polypeptidů tím, že se naváže na polypeptid. Tímto způsobem se protilátky podle vynálezu mohou využít v terapii, např. k léčení rakoviny. Léčení rakoviny lze provádět postupy, které byly popsány např. Weinerem (Semin. Oncol. 26 (1999), 41-50) nebo v publikacích, které jsou v uvedené publikaci citovány.

Dále takové protilátky mohou detekovat přítomnost nebo absenci polypeptidů podle předkládaného vynálezu a jeho koncentraci, tudíž jsou užitečné jako diagnostické markéry pro diagnostiku nemocí jako je rakovina, metastázy nebo aberantní angiogeneze.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu identifikace látky schopné modulovat biologickou aktivitu nebo expresi polypeptidů podle předkládaného vynálezu. Takže předkládaný vynález se týká také způsobu identifikace antagonistů a inhibitorů, a také agonistů a stimulátorů funkce nebo aktivity nebo exprese polypeptidů podle předkládaného vynálezu.

Tak např. antagonista může vázat polypeptid podle vynálezu a inhibovat tak nebo eliminovat jeho funkci. Antagonistou může být např. protilátka nebo oligonukleotid • · ··

- 13 s vysokou afinitou nebo peptide proti polypeptidů, který eliminuje glukuronidázovou aktivitu polypeptidů tím, že se na polypeptid naváže. Příkladem inhibitoru je molekula s nízkou molekulovou hmotností, která inaktivuje polypeptid navázáním na katalytická místa a jejich obsazením, čímž se katalytická místa stanou nepřístupnými pro substrát, takže biologická aktivita polypeptidů se neprojeví.

Antagonisté a inhibitory se mohou využít při léčení rakoviny, metastáz nebo aberantní angiogeneze tak, že se zabrání tomu, aby polypeptid působil rozpad heparansulfátového proteoglykanu z extracelulární matrix. Antagonisté a inhibitory identifikované způsobem výše popsaným nebo jejich deriváty mohou být využity v přípravcích společně s farmaceuticky přijatelnými nosiči.

Předkládaný vynález se konkrétně týká testů k identifikaci výše popsaných látek, např. nízkomolekulárních inhibitorů, které jsou specifické k polypeptidů podle předkládaného vynálezu a zabraňují jeho funkci nebo zabraňují jeho expresi. Buď přírodní nebo syntetické sacharidy mohou být užity jako substráty pro test endo-glukuronidázové aktivity polypeptidů.

Další aspekt vynálezu se týká polynukleotid nebo polypeptidů podle předkládaného vynálezu pro použití v lékařství. Konkrétně se vynález týká použití polypeptidů nebo polynukleotidu podle vynálezu pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení nemocí, které jsou důsledkem nedostatečného nebo chybějícího polypeptidů, jak byl popsán výše. Místo polynukleotidu nebo polypeptidů podle vynálezu nebo navíc k němu se může k léčení užít agonista polypeptidů nebo induktor nebo enhancer exprese tohoto polypeptidů.

·· ·· • ♦ * · • · · • · · • · « •9 ···· • ·

• · • · ·· • · · · • · » ··

- 14 Nemoci, které je možné léčit, jsou např. úrazy, autoimunitni nemoci, kožní nemoci, kardiovaskulární nemoci a nemoci nervového systému. Polynukleotidy podle předkládaného vynálezu mohou být využity také v genové terapii. Genovou terapii lze provádět postupy, které byly popsány v publikacích Beutler (Biol. Blood Marrow Transplant 5 (1999), 273-276) nebo GomezNavarro et al., (Eur. J. Cancer 35 (1999), 867-885) nebo tam citovaných publikacích.

Další aspekt vynálezu se týká protilátky podle vynálezu nebo jejího fragmentu pro použití v medicíně. Konkrétně se vynález týká použití protilátky podle předkládaného vynálezu pro výrobu farmaceutického přípravku k léčení nemocí, které jsou důsledkem nadměrné aktivity nebo nadměrné exprese (overexpression) polypeptidů podle vynálezu. Místo protilátky podle předkládaného vynálezu může být v medicíně užit antagonista nebo inhibitor nebo inhibitor exprese polypeptidů. K nemocem, které mohou být léčeny, patří rakovina, metastázy, aberantní angiogeneze a zánětlivá onemocnění včetně artritidy.

A dále se vynález týká farmaceutických přípravků vhodných pro podávání teplokrevným živočichům včetně člověka, kteří trpí nemocemi v důsledku nedostatku nebo úplné nepřítomnosti nebo inaktivace polypeptidů podle vynálezu, nebo trpí nemocí, která je důsledkem nadměrné aktivity nebo nadměrné exprese polypeptidů podle předkládaného vynálezu.

Jelikož je polynukleotid podle předkládaného vynálezu přednostně exprimován ve tkáních samčích genitálií, modulace exprese a/nebo aktivity kódovaného polypeptidů může být využito pro lékařský zásah do funkce mužských genitálií (např. při ovlivňování fertility, erektilní dysfunkci).

♦ 9 * ···

- 15 Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Identifikace polynukleotidu podle vynálezu

S využitím publikované sekvence humánní heparanázy (AAD 54941.1) byly identifikovány tři templáty od firmy Incyte (tj. soubory EST od firmy Incyte), které sdílely významnou homologií s humánní heparanázou. Některé z těchto EST každého templátu byly objednány od firmy Incyte. Stanovení nukleotidové sekvence 3'- a 5'-konce každého EST klonu odhalilo další nové sekvenční informace, které vedly k dalším dvěma souborům klonů firmy Incyte. Kombinací těchto sekvenčních informací a sekvenčních informací získaných vlastním sekvencováním těchto Incyte klonů bylo možné sestavit nový paralog humánní heparanázy, tj. polypeptid příbuzný humánní heparanáze. Tato nová sekvence obsahuje 3943 bp a identifikovaná kódující sekvence zahrnuje úsek bp 1 až 1479 (včetně STOP kodonu). 5'-konec je stále ještě otevřený, jak ukazuje analýza kódujícího úseku (provedená programem ESTSCAN) tak i homologie s humánní heparanázou.

Příklad 2

Elektronická analýza exprese

Na základě počtu EST pro danou tkáň je možné určit nebo predikovat míru in vivo exprese daného genu ve tkáni.

Elektronická northernová analýza je bioinformatická metoda, která umožňuje nejdříve identifikovat celkový počet všech EST pro danou tkáň (tzv. velikost poolu, pool-size) z této tkáně, • ·♦ ·« · · • * · · (NCBI BLAST v.

přítomných v databázi a pak počet EST odpovídající pouze zadané sekvenci.

Tato analýza se provádí programem BLAST

2.0.10; Altschul et al., Nucleic Acid Res. (1997) 25, 33893402) s využitím cDNA požadovaného genu jakožto zadanou sekvencí a jako zdroj dat se analyzovala humánní databáze EST klonů (LifeSeqGold od firmy Incyte). Prohledávací parametry byly E=le-30. Dotaz SQL v databázi poskytl pro každý vyhledaný EST informaci o zdrojové tkáni a velikosti poolu pro danou tkáň.

Obecně se věří, že tato data korelují expresní hladinou in vivo. Statistická analýza (normalizace k velikosti poolu a stanovení intervalu spolehlivosti) pomohla určit spolehlivost dat a srovnat hladiny exprese pro různé tkáně. Spolehlivost takové predikční metody se obvykle zvyšuje s počtem nálezů/tkáň a velikostí poolu pro tkáň.

Příklad 3

Exprese polynukleotidů

Kódující úsek polynukleotidů uvedeného zde jako sekvence id. č. 1 byl amplifikován pomocí PCR užitím 5’-primerů HepRl:

(5’-GAC AGG AGA CCC TTG CCT GTA GAC-3') a 3'-primerů HepR2:

(5'-ATA GTC GAG TTA TCG GTA GCG GCA GGC CAA AGC-3') a templátové DNA izolované z klonů #3207535Hl a #3385824H1 databáze LifeSeqGold od firmy Incyte Inc.

z říjen/listopad 1999. Získaný DNA fragment velikosti 1488 bp byl fosforylován užitím T4 polynukleotidkinázy a pak následovalo štěpení restriktázou Xhol. Fragment byl pak ligován ve shodě se čtecím rámcem do vektoru pISP-myc, který poskytl N-koncovou imunoglobulinovou signální sekvenci následovanou značkovacím epitopem myc-tag. Po naštěpení restriktázami HindlII a Xhol byl fragment ligován do vhodných míst expresního vektoru pCEP4 (Invitrogen), čímž byl připraven expresní vektor HepR-pCEP. HepR-pCEP byl trvale transfekován do buněčných linií karcinomu prsu MCF7, MBA-231 a MBA-468 a také do buněk CHO. Rekombinantní protein byl detekován pomocí protilátky namířené proti epitopu myc.

Pro expresi v hmyzích buňkách byl PCR-fragment vyštěpen z vektoru pISP-myc restriktázami EcoRI a Xbal. Fragment byl klonován do vektoru pVLl392 pro přenos do bakulovirů, čímž byl připraven vektor HepR-pVL a ten byl transfekován do hmyzích buněk Sf9.

Příklad 4

Produkce protilátek

Polypeptid purifikovaný z infikovaných hmyzích buněk Sf9 pomocí expresního vektoru HepR-pVL z příkladu 3 byl použit k imunizaci myší a králíků standardními postupy, které jsou odborníkům známy (Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) .

• 9

9 • ♦

Μ ·

- 18 SEZNAM SEKVENCÍ

Sekvence id. č. 1:

Sekvence cDNA kódující polypeptid podobný humánní heparanáze

Délka: 3943 bp

Kódující úsek: 1-1476 bp

STOP kodon: 1477-1479 bp

Dvě předpokládaná polyadenylační místa jsou znázorněna podtrženými písmeny

1	gacaggagac	ccttgcctgt	agacagagct	gcaggtttga	aggaaaagac
51	cctgattcta	cttgatgtga	gcaccaagaa	cccagtcagg	acagtcaatg
101	agaacttcct	ctctctgcag	ctggatccgt	ccatcattca	tgatggctgg
151	ctcgatttcc	taagctccaa	gcgcttggtg	accctggccc	ggggactttc
201	gcccgccttt	ctgcgcttcg	ggggcaaaag	gaccgacttc	ctgcagttcc
251	agaacctgag	gaacccggcg	aaaagccgcg	ggggcccggg	cccggattac
301	tatctcaaaa	actatgagga	tgacattgtt	cgaagtgatg	ttgccttaga
351	taaacagaaa	ggctgcaaga	ttgcccagca	ccctgatgtt	atgctggagc
401	tccaaaggga	gaaggcagct	cagatgcatc	tggttcttct	aaaggagcaa
451	ttctccaata	cttacagtaa	tctcatatta	acagagccaa	ataactatcg
501	gaccatgcat	ggccgggcag	taaatggcag	ccagttggga	aaggattaca
551	tccagctgaa	gagcctgttg	cagcccatcc	ggatttattc	cagagccagc
601	ttatatggcc	ctaatattgg	gcggccgagg	aagaatgtca	tcgccctcct
651	agatggatte	atgaaggtgg	caggaagtac	agtagatgca	gttacctgge
701	aacattgcta	cattgatggc	cgggtggtca	aggtgatgga	cttcctgaaa
751	actcgcctgt	tagacacact	ctctgaccag	attaggaaaa	ttcagaaagt
801	ggttaataca	tacactccag	gaaagaagat	ttggcttgaa	ggtgtggtga
851	ccacctcagc	tggaggcaca	aacaatctat	ccgattccta	tgctgcagga
901	ttcttatggt	tgaacacttt	aggaatgctg	gccaatcagg	gcattgatgt
951	cgtgatacgg	cactcatttt	ttgaccatgg	atacaatcac	ctcgtggacc
1001	agaattttaa	cccattacca	gactactggc	tctctctcct	ctacaagcgc
1051	ctgatcggcc	ccaaagtctt	ggctgtgcat	gtggctgggc	tccagcggaa
1101	accacggcct	ggccgagtga	tccgggacaa	actaaggatt	tatgctcact
1151	gcacaaacca	ccacaaecac	aactacgtte	gagggtccat	tacacttttt
1201	atcatcaact	tgcatcgakc	aagaaagaaa	atcaagctgg	ctgggactct
1251	cagagacaag	ctggttcacc	agtacctgct	gcagccctat	gggcaggagg
1301	gcctaaagtc	caagtcagtg	caactgaatg	gccagccctt	agtgatggtg
1351	gacgacggga	ccctcccaga	attgáagccc	cgcccccttc	gggccggccg
1401	gacattggtc	atccctccag	tcaccatggg	cttttatgtg	gtcaagaatg

·· » · • ♦ ··

- 19 1451 tcaatgcttt ggcctgccgc taccgaTAAg ctatcctcac actcacggct 1501 accagtgggc ctgctgggct gcttccactc ctccactcca gtagtatcct 1551 ctgttttcag acatcctagc aaccagcccc tgctgcccca tcctgctgga 1601 atcaacacag acttgctctc caaagagact aaatgtcata gcgtgatctt 1651 agcctaggta ggccacatcc atcccaaagg aaaatgtaga catcacctgt 1701 acctatataa ggataaaggc atgtgtatag agcagaatgt ttcccttcat 1751 gtgcactatg aaaacgagct gacagcacac tcccaggaga aatgtttcca 1801' gacaactccc catgatcctg tcacacagca ttataaccac aaatccaaac 1851 cttagcctgc tgctgctgct gccctcagag gaagatgagg aaggaaaaaa 1901 actgggtgga cctacaaaaa cccatcctct cccaactcct tcttctctgc 1951 ctctttcttg ctgctgccct gagttttttg acacatctct ttccataggg 2001 gagtaatggg tgtgtcagcc ctggcctgct gggagagctg tttgtatgat 2051 ttcccggctg atgtatgagc gtgcgcatct gggttcctga cagtggcatc 2101 catcactggc agttcttctg agaagcgggt gcttcaaaag taaaattaca 2151 atcacactcc agatttggta agaaggttct attcctctgt gaatccagat 2201 tcccccagag ttgtaatggg agtcaagtaa caatattcat tgagtggaga 2251 gcagtttatt aggcacaaca aaaagtaatc atcattcttc atgttgctat 2301 gagggagagt ttgagtacaa agagaaagca tactgaaaca tcaggtacac 2351 acacacaccc caactggaca aagcaaatta gacctctcca aaattaagag 2401 aatattaggg gctctatagg gtaagccttt aattgtttgg ttaactcaaa 2451 tcattatttt taaaaaagaa gaaaaaagtg tgaatcaagg tcatcactgg 2501 aagacacaac tgaatctaac ctttttgcct cttcccaagt agcctatttg 2551 agctagaaca aaactttgtt agccattttg ggagagaata gggaatctag 2601 agaatgaaga tctgcccaaa actatggaat ggtaggtagg aagcttctga 2651 gttgggcagg tgtgaagtgg gggatgagga cgttctatat gattcaaggg 2701 gcatgagggt ctttgccaat gagctacagc tgaaatgact ttcttttctg 2751 gggatgtgat tttctttctc aggataaatg acaggaatga tgcttttgtt 2801 agaaggagga gagatttgac actgttccaa gtgagacagt gatacaattt 2851 ctgctgtttg tgaaaggaca ggaatggggy gggggcaagg cagggttgcc 2901 tagggcagag actagggagg ctgcctaaga cgcacacgga gttaaggatt 2951 tgggccaagt ctgcaaagtg agagatggaa gggagattag accaaagagg 3001 agggagagaa ttctgagctt ggagaacggt ggatttggga gagggaagct 3051 gactacctaa ttccaggaag cgaggggacc gggttttgac atgcttatca 3101 ttaagcacag gaggaacagc atacagcaga tgtactacag cgagcaagaa 3151 agggagagcc cgaggaccag gctgcaccag gtcagtggct gtgctcagca 3201 tggaagcaac tggagagaga ggggcagacc ctgagacygc cctgcaaggc 3251 tgcccagaag ggacccgttt ctctgggacc aggcacctcc cactgaggct *· *♦ « ♦ · * • * * • » * ·· » · » » ···

- 20 3301

3351

3401

3451

3501

3551

3601

3651

3701

3751

3801

3851

3901 tcagctctga gagggcagga aagtgaagta ccaagatggg ggcggggcgg ggggtaggaa ataagagaaa gaagaaacag attgacaggc caaagtgagg aaaagagagg aaaagagaaa tgagactaaa aggtcgttcc cccaactgtt. aaaaatgtgt gcagatatca acgtctcttc tacatactgg tacaggtgcg actgcagggc cccctgatat aacaagagta accaaaggtc cctaagagcc tggccctggg gacctatggt ttgctttgcg tccttagtaa ccccatgata aaggggtact actgttatcc ccatttttcc tacgaggcat ggagaggatc catggctcgc cccaggggca cccggggaaa tgggttgccg agcgcgaaat aatccagagc ctgcccactc agccacaagg ctcagcggct ccacaggtcc agacacctcc ttcacatctt tgtaggttct gctcattcag aacagccaga actccactca aacacacttt ctctaaataa gtgttgattt ttttttacta aaccttgcag aatatgggta attcctgctt cttttatctt tctctgtgta ttaaatgctg ctctcačgag atttaagttt tgtttatttt tta • a a a •

• 4«* aa a ♦ a · a · a ·

- 21 • a ♦

• · • · • a ♦ ♦ aa •

aaa • a a a a a

Sekvence id. č. 2

Aminokyselinová sekvence polypeptidu příbuzného humánní heparanáze

Translační produkt

Délka:	492
1	DRRPLPVDRA AGLKEKTLIL
51	LDFLSSKRLV TLARGLSPAF
101	YLKNYEDDIV RSDVALDKQK
151	FSNTYSNLIL TEPNNYRTMH
201	LYGPNIGRPR KNVIALLDGF
251	TRLLDTLSDQ IRKIQKWNT
301	FLWLNTLGML ANQGIDWIR
351	LIGPKVLAVH VAGLQRKPRP
401	IINLHRXRKK IKLAGTLRDK
451	DDGTLPELKP RPLRAGRTLV

LDVSTKNPVR TVNENFLSLQ LDPSIXHDGW LRFGGKRTDF LQFQNLRNPA KSRGGPGPDY GCKIAQHPDV MLELQREKAA QMHLVLLKEQ GRAVNGSQLG KDYIQLKSLL QPIRIYSRAS MKVAGSTVDA VTWQHCYIDG RWKVMDFLK YTPGKKIWLE GWTTSAGGT NNLSDSYAAG HSFFDKGYNH LVDQNFNPLP DYWLSLLYKR GRVIRDKLRI YAHCTNHKNH NYVRGSITLF LVHQYLLQPY GQEGLKSKSV QLNGQPLVMV IPPVTMGFYV VKNVNALACR YR

Claims (21)

1. Polynukleotid kódující polypeptid, který má biologickou aktivitu endo-glukuronidázy, obsahující (a) sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí jako sekvence id. č.l nebo alespoň její část kódující protein, (b) nukleotidovou sekvenci odpovídající sekvenci podle bodu (a) s ohledem na degeneraci genetického kódu, nebo (c) nukleotidovou sekvenci hybridizující za stringentních podmínek se sekvencí podle bodu (a) a/nebo (b).

2. Rekombinantní vektor obsahující alespoň jednu kopii polynukleotidu podle nároku 1.

3. Vektor podle nároku 2, který je expresním expresním vektorem.

4. Buňka transformovaná polynukleotidem podle nároku 1 nebo vektorem podle kteréhokoliv z nároků 2 až 3.

5. Polypeptid kódovaný polynukleotidem podle nároku 1.

6. Polypeptid podle nároku 5, který má aktivitu endoglukuronidázy, obsahující (a) aminokyselinovou sekvenci uvedenou v seznamu sekvencí jako sekvence id. č. 2, nebo • to ·· to · · · ·· · • · ♦ • · to ·· ·♦*♦ • ♦ · ♦ to * to • · · • ♦·· * • · ··♦ ♦* ♦ ♦ *· • · * to * ··· • ·· · to · · · «· toto (b) aminokyselinovou sekvenci mající alespoň s aminokyselinovou sekvencí podle bodu (a).

70% identitu

7. Polypeptid podle nároku 6, který je schopen indukovat tvorbu specifických protilátek.

8. Způsob přípravy polypeptidů podle kteréhokoliv z nároků 6 až 7 vyznačující se tím, že zahrnuje chemickou syntézu, technologii rekombinantní DNA nebo kombinaci těchto způsobů.

9. Způsob přípravy polynukleotidu podle nároku 1 vyznačující se tím, že zahrnuje zahrnuje chemickou syntézu, technologii rekombinantní DNA, polymerázovou řetězovou reakci nebo kombinaci těchto způsobů.

10. Protilátka nebo oligopeptid nebo odpovídající oligonukleotid, které specificky rozpoznávají a váží se na polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7.

11. Polynukleotid podle nároku 1 nebo polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7 pro použití jako léčivo.

12. Použití polynukleotidu podle nároku 1 nebo polypeptidů podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7 pro výrobu farmaceutického přípravku pro léčení rakoviny a rakovinných metastáz, angiogeneze, zánětů, artritidy, úrazů, autoimunitních onemocnění, kožních nemocí, kardiovaskulárních nemocí a onemocnění nervového systému.

k 0«

0 0

0 *·» « 0

0« 000· ··

- 24

13. Způsob léčení rakoviny a rakovinných metastáz, angiogeneze, zánětů, artritidy, úrazů, autoimunitních onemocnění, kožních nemocí, kardiovaskulárních nemocí a onemocnění nervového systému vyznačující se tím, že zahrnuje podávání vhodného množství polynukleotidu podle nároku 1 nebo polypeptidů podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7.

14. Způsob angiogeneze, onemocnění, léčení rakoviny a rakovinných metastáz, zánětů, artritidy, úrazů, autoimunitních kožních nemocí, kardiovaskulárních nemocí a onemocnění nervového systému vyznačující se tím, že zahrnuje podávání vhodného množství protilátky nebo oligopeptidu nebo odpovídajícího oligonukleotidu jak jsou definovány v nároku 1.

15. Způsob identifikace látky schopné modulovat v buňce biologickou aktivitu nebo expresi polypeptidů podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7 vyznačující se tím, že zahrnuje krok, kdy se přivede do kontaktu polypeptid nebo jeho funkční derivát, funkční fragment nebo funkční analog, nebo buňka schopná exprimovat tento polypeptid, s alespoň jednou sloučeninou nebo činidlem, jejichž schopnost modulovat biologickou aktivitu nebo expresi polypeptidů, jeho funkčního derivátu, funkčního fragmentu nebo funkčního analogu je testována, a kdy se stanoví změna biologické aktivity nebo exprese polypeptidů, jeho derivátu, fragmentu nebo analogu způsobená látkou.

16. Způsob podle nároku 15 vyznačující se tím, že dále zahrnuje formulaci farmaceutického přípravku, který obsahuje φφ φ* φ» « φ • · « φφφ • · ·· · ·♦ φφ »» φ· • · · • φφφφ • · · · • φ * · »· φφ φφ φ φ φ • φ φ φ φ φ φφφφ jako účinnou složku takovou látku, která byla identifikována jako modulátor, nebo její derivát.

17. Testovací systém pro testování látky na její schopnost vázat se na polypeptid podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7 nebo ho funkčně ovlivnit vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid nebo jeho funkční analog nebo buňku schopnou exprimovat polypeptid nebo jeho funkční analog, a volitelné dále obsahuje prostředky ke stanovení reakce způsobené látkou.

18. Látka získaná způsobem podle kteréhokoliv z nároků 15 nebo 16, která je agonistou nebo antagonistou polypeptidů podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7.

19. Použití polynukleotidu podle nároku 1 při modulaci exprese polypeptidů podle kteréhokoliv z nároků 5 až 7 v buňce.

20. Použití polynukleotidu podle nároku 1 při genové terapii.

21. Použití protilátky nebo oligopeptidu nebo odpovídajícího oligonukleotidu nebo jejich derivátu podle nároku 10 nebo polynukleotidu podle nároku 1 při diagnostice rakoviny a rakovinných metastáz, angiogeneze, zánětů, artritidy, úrazů, autoimunitních onemocnění, kožních nemocí, kardiovaskulárních nemocí a onemocnění nervového systému.