CN109828114A - MFAP5蛋白作为筛选α干扰素治疗肝癌敏感人群的试剂盒中的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于免疫学和生物技术领域，具体涉及MFAP5蛋白作为筛选α干扰素治疗肝癌敏感人群的试剂盒中方法及应用。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测MFAP5蛋白在α干扰素治疗肝癌敏感人群血清中的表达水平，本发明的MFAP5蛋白的ELISA检测试剂盒，包括包被有MFAP5抗体的ELISA酶标板，检测MFAP5抗原的抗体，酶标二抗、标准蛋白等。且本发明提供MFAP5蛋白ELISA试剂盒的检测方法和应用。本发明操作简单，准确和高灵敏，为临床检验和基础研究提供了一种新的手段和方法。

Description

MFAP5蛋白作为筛选α干扰素治疗肝癌敏感人群的试剂盒中的 方法及应用

技术领域

本发明属于免疫学和生物技术领域，涉及MFAP5蛋白作为筛选α干扰素治疗肝癌敏感人群的试剂盒中的方法及应用。

背景技术

据报道，原发性肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)居全球恶性肿瘤发病率第六位，死亡率第二位，是我国第二大肿瘤致死原因。经过几十年的努力，我国肝癌研究已经取得显著进展，但其根治性切除术后5年转移复发率仍然高于60％。术后复发转移仍是进一步改善肝癌患者预后的主要障碍。迄今为止临床可用的能有效抑制肝癌术后转移复发的药物仍很少。

α干扰素作为一个多用途的细胞因子，一直被列为慢性乙型肝炎的一线用药。近些年的研究逐渐发现其在实体肿瘤中具有抑制肿瘤生长及转移复发的作用。在众多抗癌药物中，α干扰素是少数对肝癌有效的药物之一，具有巨大的临床应用价值。但不同荷瘤个体对药物敏感性存在差异，导致α干扰素对肝癌患者的总体疗效目前还不能完全满足临床要求；业内认为，其疗效能否进一步提高主要依赖于寻找有效的识别α干扰素治疗敏感人群的分子标志物进行临床筛选。

现有技术公开了MFAP5是一种多功能蛋白，在弹性微纤维组装和调节内皮细胞行为中起重要作用，因此被认为是细胞存活的新型调节剂，然而MFAP5在癌症中的作用仍有待阐明。关于MFAP5蛋白作为有效的识别敏感人群的分子标志指标以及进一步用于制备α干扰素治疗肝癌敏感人群的ELISA检测试剂盒及检测方法及应用尚未见相关报道。

发明内容

本发明的目的在于基于现有技术的现状，针对肝癌术后不同荷瘤个体对药物敏感性存在差异，导致α干扰素对肝癌患者的总体疗效不能满足临床要求的现状，提供一种用于有效的识别敏感人群的分子标志指标，尤其涉及MFAP5在用于制备筛选α干扰素治疗肝癌敏感人群标志物的制剂中的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

ELISA法进行肝癌细胞系HCCLM3加入干扰素处理后检测，将HCCLM3加入不同浓度的α干扰素处理后，采用ELISA试验，结果显示，随着α干扰素浓度的降低MFAP5阳性率也随之降低，且MFAP5阳性的肝癌患者与MFAP5阴性患者的总生存率存在显著差异，MFAP5阴性肝癌患者经α干扰素干预后能明显改善预后，MFAP5作为α干扰素干预肝癌患者敏感人群筛选的评判标准，具有显著性差异。

本发明的另一目的是，提供一种用于筛选鉴定α干扰素干预肝癌敏感人群的检测试剂盒及检测方法。

本发明的一种用于筛选鉴定α干扰素干预肝癌敏感人群的检测试剂盒，所述的试剂盒包含检测MFAP5蛋白含量的试剂。

更具体的，所述的试剂盒包含检测MFAP5蛋白，HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG，DAB显色液和苏木素复染液。

本发明采用ELISA进行检测，结果表明，MFAP5在肝癌患者与健康人外周静脉血中存在明显差异，其中，MFAP5在肝癌细胞HCCLM3处理α干扰素后，显示加入不同浓度的α干扰素后随着浓度的升高检测效率增加，灵敏度可以达到0.1μg/mL；同时，结果显示在肝癌患者中MFAP5的表达与健康人相比有明显的差异，具有统计学意义P<0.001，MFAP5阳性的肝癌患者与MFAP5阴性患者的总生存率存在显著差异；MFAP5阴性肝癌患者经α干扰素治疗后能明显改善预后；MFAP5是α干扰素治疗肝癌过程中的关键分子，可用于筛选α干扰素治疗肝癌敏感人群，且识别的准确度高，进一步，MFAP5可以作为α干扰素干预肝癌患者敏感人群筛选的标志物。

本发明通过大量探索性实验研究，制备了一种能够检测筛选α干扰素治疗肝癌敏感人群的标志物的试剂盒，通过MFAP5在肝癌α干扰素治疗肝癌敏感人群筛选方面提高临床依据。与现有技术相比，本发明涉及的MFAP5试剂盒具有如下优点和显著性进步：

1、敏感性：本发明的试剂盒敏感性极高，该MFAP5抗体与市面上其它的肝癌标志物相比，阳性强度可以达到++++，符合临床监测标准。

2、准确性：本发明的试剂盒准确性极高，MFAP5抗体与市面上其它的肝癌标志物相比，准确率较高，符合临床监测标准。

附图说明

图1.MFAP5蛋白ELISA检测试剂盒示意图。

图2.ELISA检测MFAP5在肝癌细胞HCCLM3处理α干扰素后的检测结果，结果显示加入不同浓度的α干扰素后随着浓度的升高检测效率增加，最高灵敏度可以达到0.1μg/mL，因此，MFAP5可以作为α干扰素治疗肝癌患者敏感人群筛选的标志物，具有显著性差异。

图3.ELISA检测肝癌病人血清的中MFAP5的表达统计图，其中显示在肝癌患者中MFAP5的表达与健康人相比有明显的差异，具有统计学意义P<0.001，MFAP5可以作为α干扰素治疗肝癌患者敏感人群筛选的标志物。

图4.肝癌患者MFAP5表达与预后的关系：MFAP5可以作为α干扰素治疗肝癌患者敏感人群筛选的标志物。

下面结合实施例和附图对本发明作详细说明，但本发明的实施并不仅限于此。

具体实施方式

本发明使用的能够检测人外周静脉血MFAP5表达量的试剂盒，由人源性MFAP5抗原的抗体，HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG，DAB显色液和苏木素复染液组成。

实施例1

试剂盒组成：

肝癌α干扰素治疗敏感人群筛选诊断试剂盒(10人份)

试剂盒的使用方法：

(1)烤片：91.7℃，30min；取出后置入二甲苯I中。

(2)脱蜡：先后置入二甲苯I和II各10min。

(3)酒精水化：依次置入不同浓度的酒精(100％、95％、80％、75％)各5min。

(4)用PBS洗片，5min，3次。灭活内源性过氧化物酶：每片予以200ul H₂O₂(6％)，置于湿盒15min。用PBS洗片，5min，3次。

(5)热修复：在1×EDTA修复液中置入切片。煮沸，微波炉低火10min。冷却3min后，再低火7min。切片抗原予以5％BSA封闭，放入湿盒20min。弃除BSA，按抗体说明书指示加入一抗。4℃，放入湿盒孵育18hrs。用PBS洗片，5min，3次。

(6)常温下，加入A液湿盒中孵育30min。再次用PBS洗片，5min，3次。置入DAB工作液后，即刻在显微镜下观察，适时加入PBS中终止反应。苏木精复染后，摇匀，PBS冲洗。加HCl脱色。

(7)脱水：各级酒精，浓度由低至高(75％、80％、％％、100％)各5min；二甲苯各5min。

(8)封片：二甲苯中拿出切片，风干。加少许中性树胶，予洁净盖玻片封片。(如图1所示)。

实施例2

ELISA进行肝癌细胞系HCCLM3加入干扰素处理后的检测

将HCCLM3加入不同浓度的α干扰素处理后，采用ELISA试验，结果显示随着α干扰素浓度的降低MFAP5阳性率也随之降低，最大灵敏度可以检测到0.1μg/mL(如图2所示)。

实施例3

ELISA进行肝癌临床样本的检测

将收集的50例肝癌患者及正常病人(各5例)血液标本(取自复旦大学附属肿瘤医院试验检测用标本)，采用ELISA试验检测，结果显示肝癌患者MFAP5阳性(如图3所示)。

实施例4

根据实施例2和实施例3所得数据与复旦大学附属肿瘤医院提供的预后数据比对后显示，MFAP5阳性的肝癌患者与MFAP5阴性患者的总生存率存在显著差异，MFAP5阴性肝癌患者经α干扰素干预后能明显改善预后，差异具有显著性；表明MFAP5可以作为α干扰素干预肝癌患者敏感人群筛选的评判标准，(如图4所示)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.MFAP5在制备筛选α干扰素干预肝癌敏感人群标志物的制剂中的用途。

2.按权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的MFAP5在α干扰素干预与未干预的人肝癌组织中具有显著表达差异。

3.一种用于筛选鉴定α干扰素干预肝癌敏感人群的检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含检测MFAP5蛋白含量的试剂。

4.按权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含检测MFAP5蛋白，辣根过氧化物酶HRP，标记的羊抗鼠IgG，DAB显色液和苏木素复染液。