CN113396160A - 治疗对免疫检查点疗法具有抗性的癌症的方法和药物组合物 - Google Patents

Abstract

对巨噬细胞生物学理解的最新进展表明，肿瘤相关的巨噬细胞非常异质，并且在肿瘤微环境中共存几种不同的亚型。这些亚型不仅在表达谱和来源方面不同，而且在其促肿瘤或抗肿瘤功能上也不相同。在此，发明人描述了表达CD163的转移性黑色素瘤小鼠模型中的巨噬细胞亚型。使用与αCD163mAh缀合的细胞毒性脂质纳米颗粒，在抗PD‑1检查点抑制剂抗性黑色素瘤模型中特异性消耗表达CD163的细胞会导致CD4+和活化的CD8+T细胞大量浸润。此外，本发明人表明，用抗PD1抗体的联合治疗使肿瘤迅速复发。因此，本发明涉及一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向该受试者给予治疗有效的组合，该组合包含至少一种免疫检查点抑制剂和能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂。

Description

治疗对免疫检查点疗法具有抗性的癌症的方法和药物组合物

技术领域

本发明涉及用于治疗对免疫检查点疗法具有抗性的癌症的方法和药物组合物。

背景技术

肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)是实体瘤中发现的最丰富的免疫细胞，已有大量文献报道其对肿瘤进展的重要贡献¹。除了其营养功能，支持血管生成，侵袭和转移外，TAM还被提示通过免疫抑制性细胞因子IL-10²的释放以及精氨酸³和色氨酸⁴的局部消耗来抑制T细胞(T细胞高度依赖TAM)的增殖和活化。巨噬细胞与肿瘤进展有关的重要功能已经引起了人们对于开发靶向TAM的新治疗策略的重大兴趣。目前临床试验中的策略包括阻断趋化因子CCL2或其受体CCR2，该趋化因子CCL2或其受体CCR2通过中和骨髓衍生的单核细胞并靶向巨噬细胞生长因子受体CSF1R(M-CSFR；c-FMS；CD115)来抑制TAM募集⁵。CCL2/CCR2阻断仅针对单核细胞衍生的巨噬细胞的募集，而CSF1在组织驻留巨噬细胞的存活和分化以及单核细胞衍生的巨噬细胞的成熟中都起着至关重要的作用⁶。的确，尽管临床数据仍然有限，但有报道在用针对CSF1R的单克隆抗体(mAb)疗法治疗后的TAM数量减少，对腱鞘巨细胞瘤(tenosynovial giant cell tumors)具有潜在的令人感兴趣的治疗作用^7,8。

尽管在绝大多数临床研究中，TAM积累与不良的临床结果之间有着很强的联系，但某些报告还是将TAM数量或特定TAM亚组的积累与良好的预后相关联。一个实例是HLA-DR⁺TAM的频率与多项研究中的有益结果相关^9,10，这潜在地反映了它们在协调保护性免疫反应中的作用¹¹。为此，最近的研究使用配对单细胞分析通过质谱分析和RNA测序，揭示了肺腺癌和肾细胞癌(RCC)患者的肿瘤浸润性髓样细胞(TIM)分区内的空前多样性水平^12,13。在RCC的情况下，记录了17种不同的TAM表型¹²。尽管仍然缺乏对不同的TAM亚型的功能及其各自对肿瘤进展的贡献的更深入了解，但人们试图推测，选择性靶向废除肿瘤促进机制，同时保留先天免疫功能的TAM亚型可能会促进抗肿瘤免疫力，并可能提供重大的临床益处。

通过TAM表达CD163已被显示出是几种不同癌症中预后不良的特别有力的指标。CD163是一种巨噬细胞和单核细胞特异的跨膜蛋白，在血管内溶血后形成，用作触珠蛋白-血红蛋白(haptoglobin-hemoglobin)复合物的清除剂受体¹⁴。CD163的表达是由促进肿瘤的细胞因子(例如IL-6和IL-10)诱导的，而炎性刺激(包括脂多糖(LPS)，TNFα和IFNγ)会导致表达的迅速下调和膜结合的CD163通过蛋白水解脱落而去除^15,16。这与清除血红蛋白产生的抗炎血红素代谢产物一起，导致CD163⁺巨噬细胞与抗炎功能相关联¹⁵。然而，CD163+TAM积累与肿瘤进展之间的联系完全基于与临床进展的相关性，并且仍然缺乏特定肿瘤促进功能的实验证据。

免疫检查点抑制剂(ICI)(例如抗PD-1)的最新发展，对癌症疗法，特别是在恶性黑色素瘤中具有巨大影响^17,18。PD-1配体(PD-L1)在癌细胞上增加的表达抑制了表达PD-1的CD8⁺细胞毒性T细胞(CTL)的激活¹⁹。因此，使用抗PD-1或PD-L1 mAb阻断PD-1/PD-L1信号传导会导致CTL的激活增加，最终导致前所未有的肿瘤消退率²⁰。遗憾的是，只有少数患者对ICI疗法有反应，其原因目前是一个深入研究的领域。此外，ICI疗法的主要局限性是T细胞的不加区分的激活，这可能导致严重的免疫相关不良事件，从而使继续治疗变得不可能^21,22。因此，迫切需要新的治疗策略以增强抗肿瘤免疫性，该治疗策略可以克服ICI抗性或减轻严重的不良副作用。

发明内容

本发明涉及用于治疗对免疫检查点疗法具有抗性的癌症的方法和药物组合物。特别地，本发明由权利要求书限定。

具体实施方式

巨噬细胞生物学理解的最新进展表明，与肿瘤相关的巨噬细胞非常异质，并且在肿瘤微环境中共存几种不同的亚型。这些亚型不仅在表达谱和来源方面不同，而且在其促肿瘤或抗肿瘤(pro-or anti-tumoral)功能上也不同。在此，发明人描述了在转移性黑色素瘤的小鼠模型中表达CD163和免疫调节细胞因子如IL10，Ido1和Lgals1的巨噬细胞亚型。使用与αCD163 mAb缀合的细胞毒性脂质纳米颗粒，表达CD163的细胞在抗PD-1检查点抑制剂抗性黑色素瘤模型中的特异性消耗(deplete)会导致CD4+和活化的CD8+T细胞大量浸润。单独的CD163+TAM的特异性消耗会导致CD163^neg炎性巨噬细胞积累，与活化的T细胞结合，驱动抗肿瘤免疫反应和肿瘤消退。综上所述，数据表明CD163+巨噬细胞具有很强的免疫抑制功能，而CD163+巨噬细胞的丧失导致对肿瘤免疫微环境的重新教育。这表明CD163+巨噬细胞对于维持促肿瘤的肿瘤免疫微环境至关重要，并且针对这一群体的靶向可为免疫检查点抑制剂抗性肿瘤提供有吸引力的治疗靶标。

如本文所用，术语“CD163”(分化簇163)也称为M130 MM130或“SCARI1”，在本领域中具有其一般含义，并且是指在人类中由CD163基因[基因ID：9332]编码的蛋白质。CD163仅在单核细胞和巨噬细胞中表达。它起急性相调节受体的作用，参与巨噬细胞对血红蛋白/触珠蛋白复合物的清除和内吞作用，并且可由此保护组织免受游离的血红蛋白介导的氧化损伤。该蛋白还可以用作细菌的固有免疫传感器和局部炎症的诱导剂。分子大小为130kDa。该受体属于清除剂受体富含半胱氨酸的B型家族，由1048个氨基酸残基的细胞外结构域，单个跨膜片段和带有多个剪接变体的胞质尾部组成。示例性的人氨基酸序列由SEQ ID NO：1表示。CD163的细胞外结构域的范围从SEQ ID NO：1的42位氨基酸残基到1050位氨基酸残基。

SEQ ID NO：1>sp|Q86VB7|C163A_HUMAN清除剂受体富含半胱氨酸1型蛋白M130 OS＝智人OX＝9606GN＝CD163 PE＝1SV＝2。细胞外结构域显示为下划线。

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如本文所用，术语“肿瘤相关巨噬细胞”或“TAM”在本领域中具有其一般含义，并且旨在描述属于巨噬细胞谱系的细胞的类型。发现它们很接近或在肿瘤块内。TAM来源于循环单核细胞或常驻组织巨噬细胞，它们形成了许多肿瘤类型基质中发现的主要白细胞浸润物。因此，术语“CD163+肿瘤相关的巨噬细胞”是指以CD163的表达为特征的TAM的亚型。在一些实施方案中，本发明的CD163+肿瘤相关的巨噬细胞群的特征还在于诸如IL10，Ido1和Lgals1的免疫调节细胞因子的表达和免疫调节。

因此，本发明的第一个目的涉及一种在患有癌症的患者中增加肿瘤浸润性CD8+T细胞的量的方法，该方法包括向该患者给予治疗有效量的能够消耗与CD163+肿瘤相关的巨噬细胞群的药剂。

如本文所用，术语“CD8+T细胞”具有其本领域的一般含义，并且是指在其表面表达CD8的T细胞的亚型。它们是MHC I类限制性的，并用作细胞毒性T细胞。“CD8+T细胞”也称为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，T杀伤细胞，溶细胞性T细胞或杀伤性T细胞。CD8抗原是免疫球蛋白超基因家族的成员，并且是主要组织相容性复合体I类限制性相互作用中的关联识别元件。如本文所用，术语“肿瘤浸润性CD8+T细胞”是指患者的离开血流并迁移到肿瘤中的CD8+T细胞库。

如本文所用，术语“癌症”在本领域中具有其一般含义，并且包括但不限于实体瘤和血源性肿瘤。术语癌症包括皮肤，组织，器官，骨骼，软骨，血液和血管的疾病。术语“癌症”进一步涵盖原发性和转移性癌症。可以通过本发明的方法和组合物治疗的癌症的实例包括但不限于来自膀胱，血液，骨骼，骨髓，脑，乳腺，结肠，食道，胃肠道，牙龈，头部，肾脏，肝脏，肺，鼻咽，颈部，卵巢，前列腺，皮肤，胃，睾丸，舌头或子宫的癌细胞。另外，癌症可以具体地是以下组织学类型，尽管其不限于这些：肿瘤(neoplasm)，恶性；或癌(carcinoma)；癌，未分化；巨细胞和梭形细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛母质癌(pilomatrix carcinoma)；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；胃泌素瘤，恶性；胆管癌；肝细胞癌；合并肝细胞癌和胆管癌；索状腺癌(trabecular adenocarcinoma)；腺样囊性癌；腺瘤息肉中的腺癌；腺癌，家族性息肉病；实体癌；类癌肿瘤，恶性；支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；发色癌；嗜酸癌；嗜氧腺癌；嗜碱性粒细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡性腺癌；非包膜硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附件癌；顶泌腺癌；皮脂腺癌；耵聍(ceruminous)；腺癌；粘液表皮样癌；膀胱腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；佩吉特氏病，乳腺；腺泡细胞癌；腺扁平上皮癌；有鳞状化生的腺癌(adenocarcinoma w/squamous metaplasia)；胸腺瘤，恶性；卵巢间质瘤，恶性；昏迷，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；和恶性母细胞瘤；浆膜细胞癌；睾丸间质细胞瘤，恶性；脂质细胞瘤，恶性；副神经节瘤，恶性；乳腺旁神经节瘤，恶性；嗜铬细胞瘤；血管肉瘤；恶性黑色素瘤；釉质黑色素瘤；浅表扩散性黑色素瘤；色素沉着痣的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；蓝色痣，恶性；肉瘤；纤维肉瘤；纤维组织细胞瘤，恶性；黏肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；基质肉瘤；混合性肿瘤，恶性；苗勒氏混合瘤；肾母细胞瘤；肝母细胞瘤；癌肉瘤；间皮肉瘤，恶性；布伦内罗氏瘤(brenner tumor)，恶性；叶状肿瘤，恶性；滑膜肉瘤；间皮瘤，恶性；异常性肌瘤；胚胎癌；畸胎瘤，恶性；卵巢间质，恶性；绒毛膜癌；肾上腺皮质瘤，恶性；血管肉瘤；血管内皮瘤，恶性；卡波西氏肉瘤；血管内皮细胞瘤，恶性；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质骨肉瘤；软骨肉瘤；软骨母细胞瘤，恶性；间质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；牙源性肿瘤，恶性；牙釉质成牙本质肉瘤；成釉细胞瘤，恶性；釉质成纤维肉瘤；松果体瘤，恶性；脊索瘤；胶质瘤，恶性；室管膜瘤；星形细胞瘤；原生质星形细胞瘤；纤维性星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；少突胶质母细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；神经节神经母细胞瘤；成神经细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅觉神经源性肿瘤；脑膜瘤，恶性；神经纤维肉瘤；神经瘤，恶性；颗粒细胞瘤，恶性；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病；霍奇金淋巴瘤；肉芽肿恶性淋巴瘤，小淋巴细胞；恶性淋巴瘤，大细胞，弥漫性；恶性淋巴瘤，滤泡；真菌病；其他指定的非霍奇金淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤；细胞白血病；髓细胞性白血病；嗜碱性白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞白血病；肥大细胞白血病；巨核母细胞性白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。

在一些实施方案中，受试者患有黑色素瘤。如本文所用，“黑色素瘤”是指以皮肤和其他器官的黑素细胞系统引起的肿瘤生长为特征的病症。大多数黑素细胞存在于皮肤中，但也发现于脑膜，消化道，淋巴结和眼睛中。当皮肤中发生黑色素瘤时，称为皮肤黑色素瘤。黑色素瘤也可发生在眼睛中，称为眼黑色素瘤或眼内黑色素瘤。黑色素瘤很少发生在脑膜，消化道，淋巴结或发现黑素细胞的其他区域。40-60％的黑色素瘤在编码丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶B-RAF(BRAF)的基因中带有激活突变。在黑色素瘤中观察到的BRAF突变中，超过90％位于密码子600，其中90％以上是单核苷酸突变，导致谷氨酸替代缬氨酸(BRAFV600E)。

本发明的另一个目的涉及一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向该受试者给予治疗有效的组合，该组合包含至少一种免疫检查点抑制剂和一种能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂。

如本文所用，术语“治疗(名词)”或“治疗(动词)”是指预防性(prophylactic)或预防性(preventive)治疗以及治愈性或疾病改变性治疗，包括对有患疾病风险或怀疑已患疾病的患者以及生病或被诊断为患有某种疾病或医疗病况的患者的治疗，并且包括抑制临床复发。为了预防，治愈，延迟疾病的发作，减少疾病的严重性或减轻疾病或复发性疾病的一种或多种症状，可以向患有医学疾病或最终可能患有该疾病的患者给予该治疗，或者为了延长患者的生存期，使其超出在不进行此类治疗的情况下的预期生存期。“治疗方案”意指疾病的治疗方式，例如治疗期间使用的给药方式。治疗方案可以包括诱导方案和维持方案。短语“诱导方案”或“诱导期”是指用于疾病的初始治疗的治疗方案(或治疗方案的一部分)。诱导方案的总体目标是在治疗方案的初始阶段向患者提供高水平的药物。诱导方案可以(部分或全部)采用“加药方案”，该方案可以包括比维持方案期间医生会采用的剂量更大剂量的药物，比维持方案期间医生会给予药物更频繁地给予药物，或两者兼之。短语“维持方案”或“维持期”是指在疾病治疗期间用于维持患者的治疗方案(或治疗方案的一部分)，例如，以使患者长时间段(几个月或几年)处于缓解状态。维持方案可以采用连续疗法(例如，定期(例如每周，每月，每年等)给予药物)或间歇疗法(例如，中断治疗，间歇治疗，复发时治疗或达到特定的预定标准[例如，疼痛，疾病表现等]时的治疗)。

如本文所用，术语“免疫检查点抑制剂”具有本领域的一般含义，并且是指抑制免疫抑制检查点蛋白的功能的任何化合物。如本文所用，术语“免疫检查点蛋白”在本领域中具有其一般含义，并且是指由T细胞表达的分子，其通过升高信号(刺激性检验点分子)或降低信号(抑制性检验点分子)来表达。免疫检查点分子在本领域中被认为构成类似于CTLA-4和PD-1依赖性途径的免疫检查点途径(参见例如Pardoll,2012.Nature Rev Cancer 12:252-264；Mellman et al.,2011.Nature 480:480-489)。抑制性检查点分子的实例包括A2AR，B7-H3，B7-H4，BTLA，CTLA-4，CD277，IDO，KIR，PD-1，LAG-3，TIM-3和VISTA。抑制包括功能降低和完全阻断。优选的免疫检查点抑制剂是特异性识别免疫检查点蛋白的抗体。已知许多免疫检查点抑制剂，并且与这些已知的免疫检查点蛋白抑制剂类似，在(不久的)将来可能会开发出替代的免疫检查点抑制剂。免疫检查点抑制剂包括肽，抗体，核酸分子和小分子。免疫检查点抑制剂的实例包括PD-1拮抗剂，PD-L1拮抗剂，PD-L2拮抗剂，CTLA-4拮抗剂，VISTA拮抗剂，TIM-3拮抗剂，LAG-3拮抗剂，IDO拮抗剂，KIR2D拮抗剂，A2AR拮抗剂，B7-H3拮抗剂，B7-H4拮抗剂和BTLA拮抗剂。

在一些实施方案中，PD-1(程序性死亡-1)轴拮抗剂包括PD-1拮抗剂(例如抗PD-1抗体)，PD-L1(程序性死亡配体-1)拮抗剂(例如抗PD-L1抗体)和PD-L2(程序性死亡配体2)拮抗剂(例如抗PD-L2抗体)。在一些实施方案中，抗PD-1抗体选自MDX-1106(也称为纳武利尤单抗(Nivolumab)，MDX-1106-04，ONO-4538，BMS-936558和

)，Merck 3475(也称为帕博利珠单抗(Pembrolizumab)，MK-3475，派姆单抗(Lambrolizumab)，

和SCH-900475)和CT-011(也称为Pidilizumab，hBAT和hBAT-1)。在一些实施方案中，PD-1结合拮抗剂是AMP-224(也称为B7-DCIg)。在一些实施方案中，抗PD-L1抗体选自YW243.55.S70，MPDL3280A，MDX-1105和MEDI4736的组。MDX-1105，也称为BMS-936559，是WO2007/005874中描述的抗PD-L1抗体。抗体YW243.55.S70是WO 2010/077634 A1中描述的抗PD-L1。MEDI4736是WO2011/066389和US2013/034559中描述的抗PD-L1抗体。MDX-1106，也称为MDX-1106-04，ONO-4538或BMS-936558，是美国专利号8,008,449和WO2006/121168中描述的抗PD-L1抗体。Merck 3745，也称为MK-3475或SCH-900475，是美国专利号8,345,509和WO2009/114335中描述的抗PD-L1抗体。CT-011(Pidizilumab)，也称为hBAT或hBAT-1，是WO2009/101611中描述的抗PD-1抗体。AMP-224，也称为B7-DCIg，是WO2010/027827和WO2011/066342中描述的PD-L2-Fc融合可溶性受体。阿替佐木单抗(Atezolimumab)是美国专利No.8,217,149中描述的抗PD-L1抗体。阿韦拉单抗(Avelumab)是US20140341917中描述的抗PD-L1抗体。CA-170是WO2015033301和WO2015033299中描述的PD-1拮抗剂。其他抗PD-1抗体公开于美国专利号8,609,089，US 2010028330和/或US20120114649。在一些实施方案中，PD-1抑制剂是选自纳武利尤单抗，帕博利珠单抗或Pidilizumab的抗PD-1抗体。在一些实施方案中，PD-L1拮抗剂选自包括阿韦拉单抗，BMS-936559，CA-170，杜鲁麦单抗(Durvalumab)，MCLA-145，SP142，STI-A1011，STIA1012，STI-A1010，STI-A1014，A110，KY1003和阿替佐木单抗的组，优选的是阿韦拉单抗，杜鲁麦单抗或阿替佐木单抗。

在一些实施方案中，CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞抗原-4)拮抗剂选自抗CTLA-4抗体，人抗CTLA-4抗体，小鼠抗CTLA-4抗体，哺乳动物抗CTLA-4抗体，人源化抗CTLA-4抗体，单克隆抗CTLA-4抗体，多克隆抗CTLA-4抗体，嵌合抗CTLA-4抗体，MDX-010(伊匹木单抗(Ipilimumab))，Tremelimumab，抗CD28抗体，抗CTLA-4adnectins，抗CTLA-4结构域抗体，单链抗CTLA-4片段，重链抗CTLA-4片段，轻链抗CTLA-4片段，激动共刺激途径的CTLA-4抑制剂，PCT公开号WO 2001/014424中公开的抗体，PCT公开号WO 2004/035607中公开的抗体，美国公开号2005/0201994中公开的抗体和已授权的欧洲专利号EP 1212422B中公开的抗体。另外的CTLA-4抗体描述于美国专利号5,811,097；5,855,887；6,051,227；和6,984,720；PCT公开号WO 01/14424和WO 00/37504；以及美国公开号2002/0039581和2002/086014中。可以用于本发明方法的其他抗CTLA-4抗体包括，例如，在WO 98/42752；美国专利号6,682,736和6,207,156；Hurwitz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95(17):10067-10071(1998)；Camacho et al.,J.Clin:Oncology,22(145):Abstract号2505(2004)(antibody CP-675206)；Mokyr et al.,Cancer Res.,58:5301-5304(1998)，和美国专利号5,977,318，6,682,736，7,109,003和7,132,281中公开的那些。在WO 01/14424中公开了一种优选的临床CTLA-4抗体是人单克隆抗体(也称为MDX-010和伊匹木单抗，CAS号477202-00-9，可购自Medarex，Inc.，Bloomsbury，N.J.)。关于CTLA-4拮抗剂(抗体)，这些是已知的，并且包括Tremelimumab(CP-675,206)和伊匹木单抗。

在一些实施方案中，免疫疗法由向患者给予CTLA-4拮抗剂和PD-1拮抗剂的组合组成。

其他免疫检查点抑制剂包括淋巴细胞激活基因3(LAG-3)抑制剂，例如IMP321，一种可溶性Ig融合蛋白(Brignone et al.,2007,J.Immunol.179:4202-4211)。其他免疫检查点抑制剂包括B7抑制剂，例如B7-H3和B7-H4抑制剂。特别地，抗B7-H3抗体MGA271(Loo etal.,2012,Clin.Cancer Res.July15(18)3834)。还包括TIM-3(T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3)抑制剂(Fourcade et al.,2010,J.Exp.Med.207:2175-86and Sakuishiet al.,2010,J.Exp.Med.207:2187-94)。如本文所用，术语“TIM-3”具有本领域的一般含义，并且是指T细胞免疫球蛋白和含有粘蛋白结构域的分子3。TIM-3的天然配体是半乳凝素9(Gal9)。因此，本文所用的术语“TIM-3抑制剂”是指可以抑制TIM-3的功能的化合物、物质或组合物。例如，抑制剂可以抑制TIM-3的表达或活性，调节或阻断TIM-3信号传导途径和/或阻断TIM-3与半乳糖凝集素9的结合。对TIM-3具有特异性的抗体是本领域众所周知的，并且通常描述于WO2011155607，WO2013006490和WO2010117057。

在一些实施方案中，免疫检查点抑制剂是IDO抑制剂。IDO抑制剂的实例在WO2014150677中描述。IDO抑制剂的实例包括但不限于1-甲基-色氨酸(IMT)，β-(3-苯并呋喃基)-丙氨酸，β-(3-苯并(b)噻吩基)-丙氨酸)，6-硝基色氨酸，6-氟色氨酸，4-甲基色氨酸，5-甲基色氨酸，6-甲基色氨酸，5-甲氧基色氨酸，5-羟基色氨酸，吲哚3-甲醇，3,3'-二吲哚基甲烷，表没食子儿茶素没食子酸酯，5-Br-4-Cl-吲哚基1,3-二乙酸酯，9-乙烯基咔唑，醋乙酰胺，5-溴色氨酸，5-溴吲哚基二乙酸酯，3-氨基萘甲酸，吡咯烷二硫代氨基甲酸酯，4-苯基咪唑(油菜素衍生物)，硫代乙内酰脲衍生物，β-咔啉衍生物或油菜素毒素衍生物。优选地，IDO抑制剂选自1-甲基色氨酸，β-(3-苯并呋喃基)-丙氨酸，6-硝基-L-色氨酸，3-氨基萘酸和β-[3-苯并(b)噻吩基]-丙氨酸或其衍生物或前药。

如本文所用，术语“共同给予”在此意指将能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂与免疫检查点抑制剂的组合给予同一患者的过程。可以将能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂和免疫检查点抑制剂同时、基本上同时或依次给予。如果依序进行给药，则在免疫检查点抑制剂之前先给予能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂。能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂和免疫检查点抑制剂不需要通过相同的介载体给药。可以将能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂和免疫检查点抑制剂给药一次或多次，并且组合中每种组分的给药数可以相同或不同。另外，能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂和免疫检查点抑制剂不需要在同一部位给药。

如本文所用，术语“组合”和“组合疗法”是可互换的，并且是指包括同时、分别或依次给予至少两种化合物的给药的治疗。如本文所使用，这里使用的术语“共同给予”意指至少两种化合物的组合给予同一患者的过程。所述至少两种化合物可同时、基本上同时或依次给药。至少两种化合物可以通过不同的介载体或组合物分别给药。所述至少两种化合物也可以在相同的介载体或组合物(例如药物组合物)中给药。所述至少两种化合物可以一次或多次给药，并且组合中每种组分的给药数可以相同或不同。

特别地，本发明的方法特别适用于以CD8+T细胞的低肿瘤浸润为特征的癌症的治疗。因此，本发明的另一个目的涉及一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括：i)定量从患者获得的肿瘤组织样品中的CD8+T细胞的密度；ii)将在步骤i)中定量的密度与预定参考值比较，和iii)当在步骤i)中定量的CD8+T细胞的定量的密度低于其相应的预定参考值时，向患者给予治疗有效量的能够消减CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂和免疫检查点抑制剂组合。

在一些实施方案中，本发明的方法特别适合于治疗以CD8+T细胞的低肿瘤浸润和CD163+肿瘤相关的巨噬细胞的高肿瘤浸润为特征的癌症。因此，本发明的另一个目的涉及一种在有需要的患者中治疗癌症的方法，包括：i)定量从患者获得的肿瘤组织样品中CD8+T细胞的密度和CD163+肿瘤相关巨噬细胞的密度；ii)将在步骤i)中定量的密度与其预定参考值进行比较，和iii)当在步骤i)中定量的CD163+肿瘤相关巨噬细胞的密度高于其相应的预定参考值，而在步骤i)中定量的CD8+T细胞的定量的密度低于其相应的预定参考值时，向患者给予治疗有效量的能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞的药物和免疫检查点抑制剂的组合。

如本文所用，术语“肿瘤组织样品”意指源自患者的任何组织肿瘤样品。获得所述组织样品用于体外评估的目的。在一些实施方案中，肿瘤样品可由从患者切除的肿瘤产生。在一些实施方案中，肿瘤样品可由在患者的原发肿瘤中进行的活检或在远离患者的原发肿瘤的转移性样品中进行的活检产生。例如，在受大肠癌影响的患者的肠中进行内窥镜活检。在一些实施方案中，肿瘤组织样品包括(i)整体原发性肿瘤(整体)，(ii)来自肿瘤中心的组织样品，(iii)来自直接围绕肿瘤的组织的组织样品，该组织可以更具体地称为肿瘤的“浸润性边缘”，(iv)与肿瘤紧邻的淋巴小岛，(v)位于最紧邻肿瘤的淋巴结，(vi)手术前(例如治疗后的患者随访)收集的肿瘤组织样品，以及(vii)远端转移。如本文所用，“侵入边缘”具有其在本领域中的一般含义，并且是指肿瘤周围的细胞环境。在一些实施方案中，肿瘤组织样品，无论其是否源自肿瘤中心，源自肿瘤的浸润性边缘或源自最近的淋巴结，都涵盖已经从肿瘤中心或从肿瘤周围的浸润性边缘去除的组织的碎片或切片，包括在手术切除肿瘤之后或在收集组织样本进行活检之后，用于进一步定量一种或几种生物学标记物，特别是通过组织学或免疫组织化学方法，通过流式细胞术方法以及通过基因或蛋白质表达分析的方法，包括基因组和蛋白质组学分析。肿瘤组织样品当然可以接受(be patiented to)多种众所周知的收集后制备和储存技术(例如固定，储存，冷冻等)。样品可以是新鲜的，冷冻的，固定的(例如福尔马林固定的)或包埋的(例如石蜡包埋的)。

在一些实施方案中，细胞密度的定量通过免疫组织化学(IHC)确定。例如，通过使组织肿瘤组织样品与对所述细胞的细胞表面标志物特异性的结合伴侣(例如抗体)接触来进行细胞密度的定量。通常，通过使组织肿瘤组织样品与对CD8+细胞的CD8和对CD163+肿瘤相关的巨噬细胞的CD163具有特异性的结合伴侣(例如抗体)接触来进行细胞密度的定量。通常，细胞的密度表示为每单位组织样品表面积，例如每单位表面积所计数的这些细胞的数目，例如表示为每cm²或mm²肿瘤组织样本表面积所计数的细胞数。在一些实施方案中，细胞的密度还可以表示为每一个体积单位的样品的细胞数，例如，表示为每cm3肿瘤组织样本中的细胞数。在一些实施方案中，细胞密度也可以由特定细胞占总细胞(设定为100％)的百分比组成。免疫组织化学通常包括以下步骤：i)用福尔马林固定肿瘤组织样品，ii)将所述肿瘤组织样品包埋在石蜡中，iii)将所述肿瘤组织样品切成切片进行染色，iv)将所述切片与对标记特异性的结合伴侣一起温育；v)冲洗所述切片，vi)将所述切片与通常被生物素化的第二抗体一起温育，以及vii)通常用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物展示抗原-抗体复合物。因此，首先将肿瘤组织样品孵育结合伴侣。洗涤后，取决于标记物所携带的标记物的种类，例如放射性，荧光或酶标记，可以通过适当的技术揭示与目标标记物结合的标记的抗体。可以同时进行多个标记。备选地，本发明的方法可以使用与扩增系统和酶分子缀合的二抗(以增强染色信号)。这样的缀合的二抗是可商购的，例如来自Dako,EnVision系统。可以使用复染,例如H&E，DAPI，Hoechst。可以使用对本领域技术人员显而易见的任何合适的方法或系统来完成其他染色方法，包括自动、半自动或手动系统。例如，可以将一种或多种标记物结合于抗体，从而允许检测靶蛋白(即标记物)。示例性标记包括放射性同位素，荧光团，配体，化学发光剂，酶及其组合。在一些实施方案中，标记是量子点。可以缀合至一级和/或二级亲和配体的标记物的非限制性实例包括荧光染料或金属(例如荧光素，罗丹明，藻红蛋白，荧光胺)，发色染料(例如视紫红质)，化学发光化合物(例如鲁米那(luminal)，咪唑)和生物发光蛋白(例如荧光素，荧光素酶)，半抗原(例如生物素)。StryerL(1968)Science 162:526-533和Brand L and Gohlke J R(1972)Annu.Rev.Biochem.41:843-868中描述了多种其他有用的荧光剂和发色团。亲和配体也可以用酶(例如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-内酰胺酶)，放射性同位素(例如³H，¹⁴C，³²P，³⁵S或¹²⁵I)和颗粒(例如金)标记。可以使用多种化学方法(例如胺反应或硫醇反应)将不同类型的标记物缀合至亲和配体。然而，可以使用除胺和硫醇以外的其他反应性基团，例如醛，羧酸和谷氨酰胺。用于检测目的蛋白的各种酶染色方法是本领域已知的。例如，可以使用不同的酶(例如过氧化物酶，碱性磷酸酶)或不同的生色团(例如DAB，AEC或Fast Red)可视化酶促相互作用。在其他实例中，抗体可以与可以通过标记的结合伴侣或抗体被检测的肽或蛋白质缀合。在间接IHC测定中，第二抗体或第二结合伴侣对于检测第一结合伴侣的结合是必需的，因为它没有被标记。使用用于查看可检测信号并获取图像(例如染色的数字图像)的系统分别对所得的染色样本成像。图像获取的方法是本领域技术人员众所周知的。例如，一旦样品被染色，任何光学或非光学成像设备都可用于检测染色或生物标记物，例如，如直立或倒置的光学显微镜，扫描共聚焦显微镜，照相机，扫描仪或隧道电子显微镜，扫描(canning)探针显微镜和成像红外探测器。在一些实例中，图像可以被数字地捕获。然后，所获得的图像可以用于定量或半定量确定样品中标记物的量。适用于免疫组织化学的各种自动化的样品处理，扫描和分析系统是本领域可用的。这样的系统可以包括自动染色和显微镜扫描，计算机图像分析，连续切片比较(以控制样品的方向和大小的变化)，数字报告生成以及样品的存档和跟踪(例如在其上放置组织切片上的载玻片)。细胞成像系统是可商购的，其将常规光学显微镜与数字图像处理系统结合在一起，可以对包括免疫染色样品在内的细胞和组织进行定量分析。参见例如CAS-200系统(Becton，Dickinson&Co.)。特别地，可以手动进行检测或通过涉及计算机处理器和软件的图像处理技术进行检测。使用这样的软件，例如，可以使用本领域技术人员已知的程序，基于包括例如染色质量或染色强度在内的因素来配置，校准，标准化和/或验证图像(参见例如公开的美国专利公开号US20100136549)。可以基于样品的染色强度对图像进行定量或半定量分析和评分。定量或半定量组织化学是指对经过组织化学的样品进行扫描和评分以鉴定和定量指定生物标志物(即标志物)的存在的方法。定量或半定量方法可以使用成像软件来检测染色密度或染色量，或是采用人眼检测染色的方法，其中训练有素的操作员会对结果进行数字排名。例如，可以使用像素计数算法(例如Aperio Spectrum软件，自动定量分析平台(

平台))和其他测量或定量或半定量染色程度的标准方法对图像进行定量分析；参见例如美国专利号8,023714；美国专利号7,257,268；美国专利号7,219,016；美国专利号7,646,905；已公开的美国专利公开号US20100136549和20110111435；Camp et al.(2002)Nature Medicine,8:1323-1327；Bacus et al.(1997)Analyt Quant Cytol Histol,19:316-328)。可以计算出强阳性染色(例如棕色染色)与总染色面积之和的比值并进行评分。定量检测到的生物标志物(即标志物)的量，并以阳性像素和/或分数的百分比给出。例如，该量可以定量为阳性像素的百分比。在一些示例中，该量被定量为被染色的面积的百分比，例如，阳性像素的百分比。例如，样品可以相较于总染色面积具有至少或大约至少或大约0、1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多的阳性像素。在一些实施方案中，对样品给出分数，该分数是样品的组织化学染色的强度或量的数字表示，并且代表样品中存在的靶标生物标志物(例如，标志物)的量。可以给光学密度或百分比面积值一个标度分数，例如以整数标度。因此，在一些实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：i)通过使用能够与标记物选择性相互作用的结合伴侣(例如，如上所述的抗体)提供由自动载玻片染色系统获得的组织切片的一个或多个免疫染色切片，ii)通过高分辨率扫描捕获，进行步骤a的载玻片的数字化，iii)在数字图片上检测组织切片的切片iv)提供尺寸参考栅格，该栅格具有均匀分布的具有相同表面的单元，该栅格适合于待分析的组织切片的大小，和v)检测，定量和测量每个单元中被染色细胞的强度，从而评估每个单元被染色的细胞的数量或密度。

在一些实施例中，预定值是阈值或截止值。通常，可以通过实验、经验或理论确定“阈值”或“截止值”。如本领域普通技术人员将认识到的，还可以基于现有的实验和/或临床病症来任意选择阈值。例如，在适当存储的历史患者样品中的细胞密度的回顾性测量可以用于建立预定参考值。必须确定阈值，以便根据测试功能和收益/风险平衡(假阳性和假阴性的临床后果)获得最佳的敏感性和特异性。通常，可以使用基于实验数据的接收器操作特性(ROC)曲线确定最佳灵敏度和特异性(因此也需要确定阈值)。例如，在对一组参照中的细胞密度进行定量之后，可以使用算法分析对待测样品中的测量密度进行统计学处理，从而获得对样品分类具有重要意义的分类标准。ROC曲线的全称是接收器操作员特性曲线，也称为接收器操作特性曲线。它主要用于临床生化诊断测试。ROC曲线是反映真实阳性率(敏感性)和阴性阳性率(1-特异性)的连续变量的综合指标。用图像合成方法揭示了敏感性和特异性之间的关系。将一系列不同的截止值(阈值或临界值，诊断测试的正常和异常结果之间的边界值)设置为连续变量，以计算一系列灵敏度和特异性值。然后将灵敏度用作垂直坐标，将特异性用作水平坐标来绘制曲线。曲线下面积(AUC)越高，诊断的准确性越高。在ROC曲线上，最靠近坐标图左上角的点是同时具有高灵敏度和高特异性值的临界点。ROC曲线的AUC值在1.0到0.5之间。当AUC>0.5时，随着AUC接近1，诊断结果会越来越好。当AUC在0.5到0.7之间时，准确性较低。当AUC在0.7到0.9之间时，精度是中等的。当AUC高于0.9时，精度很高。该算法方法优选地由计算机来完成。可以使用现有技术中的现有软件或系统来绘制ROC曲线，例如：MedCalc 9.2.0.1医疗统计软件，SPSS9.0，ROCPOWER.SAS，DESIGNROC.FOR，MULTIREADER POWER.SAS，CREATE-ROC.SAS，GB STAT VI0.0(Dynamic Microsystems,Inc.Silver Spring,Md.,USA)等。在一些实施方案中，预定参考值与患者的生存时间相关。本领域技术人员将认识到，OS存活时间通常基于并表示为在特定类型的癌症中存活特定时间量的人的百分比。癌症统计数据通常使用五年总生存率。总的来说，OS率不能说明癌症存活者是否在五年时仍在接受治疗，或者是否已经达到无癌症(已实现缓解)。DSF提供了更具体的信息，是实现消退的特定癌症的特定人数。此外，无进展生存率(PFS)(仍然患有癌症，但其疾病没有进展的人数)包括可能在治疗上取得了一些成功，但癌症尚未完全消失的人。如本文所用，表述“短生存时间”表示患者将具有比在患有所述癌症的患者的一般人群中观察到的中值(或平均值)低的生存时间。如果患者的生存时间短，则意味着患者将具有“不良的预后”。相反，表述“长生存时间”表示该患者将具有高于在患有所述癌症的一般患者群体中观察到的中值(或平均值)的生存时间。当患者的生存时间较长时，意味着患者将具有“良好的预后”。

本发明的另一个目的涉及一种在有需要的受试者中治疗对免疫检查点疗法具有抗性的癌症的方法，包括向该受试者给予治疗有效量的能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂。

如本文所用，术语“对免疫检查点疗法具有抗性的”在其最广泛的语境中用于指至少一种免疫检查点抑制剂(例如PD-1拮抗剂)抑制细胞生长、杀死细胞或抑制一种或多种细胞功能的有效性降低，以及使细胞在暴露于旨在抑制细胞生长、杀死细胞或抑制一种或多种细胞功能的药剂中存活下来的能力。细胞显示出的抗性可以例如通过事先暴露于药剂而获得，或者可以是固有的或天生的。细胞表现出的抗性可以是完全的，即该药剂对细胞完全无效，或者可以是部分的，即该药剂的有效性降低。因此，术语“抗性”是指反复发作的癌症或癌症的进展，而与疾病是否在所述发作或进展之前被治愈无关。

本发明的另一个目的涉及用于作为治疗方案的一部分增强给予患有癌症的受试者的免疫检查点抑制剂的效力/功效的方法，该方法包括向受试者给予药学有效量的能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂与至少一种免疫检查点抑制剂的组合。

如本文所用，表述“增强免疫检查点的效力”是指能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂增加免疫检查点抑制剂增强CD8+T细胞的增殖、迁移、持久性和/或细胞毒性的能力。免疫检查点抑制剂增强T CD8细胞杀伤活性的能力可以通过本领域众所周知的任何测定来确定。通常，所述测定是体外测定，其中使CD8+T细胞与靶细胞(例如，被CD8+T细胞识别和/或裂解的靶细胞)接触。例如，可以选择本发明的免疫检查点抑制剂以使CD8+T细胞的特异性裂解比用同一效应子：靶细胞比率通过本发明的免疫检查点抑制剂接触的CD8+T细胞或CD8T细胞系获得的特异性裂解增加超过约20％，优选至少约30％，至少约40％，至少约50％或更高的能力。经典细胞毒性测定的方案的实例是常规的。

如本文所用，相对于癌症的表述“增强的治疗功效”是指癌细胞或实体瘤的生长减慢或减小，或癌细胞总数或总肿瘤负荷减少。因此，“改善的治疗结果”或“增强的治疗功效”意指根据任何临床可接受的标准，患者的状况得到改善，包括例如减小的肿瘤大小，增加的肿瘤进展时间，增加的无进展生存，增加的总生存时间，预期寿命的增加或生活质量的改善。特别地，“改善”或“增强”是指任何临床上可接受的治疗结果或功效的1％，5％，10％，25％，50％，75％，100％或大于100％的改善或增强。如本文所用，表达“相对于”当在比较包含免疫检查点抑制剂与能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的组合的活性和/或功效和单独的免疫检查点抑制剂的活性和/或功效的语境中使用时，是指使用根据本领域技术人员已知可比较的量进行的比较。

本发明的另一个目的涉及在患有癌症的受试者中预防对给予的免疫检查点抑制剂的抗性的方法，包括向该受试者给予治疗有效量的能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂。

如本文所用，术语“能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂”是指能够消耗所述群体的任何化合物。如本文所用，关于CD163+肿瘤相关巨噬细胞的术语“消耗”是指受试者肿瘤中CD163+TAM数目的可测量的减少。减少可以是至少约10％，例如，至少约20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％，96％，97％，98％，99％或更高。在一些实施方案中，该术语是指受试者肿瘤中CD163+TAM的数量减少到可检测限以下的量。

在一些实施方案中，该药剂是对CD163具有结合亲和力的抗体，其导致受试者的肿瘤中CD163+TAM的消耗。特别地，抗体结合如上所定义的CD163的细胞外结构域。

如本文所用，术语“抗体”因此用于指具有抗原结合区的任何抗体样分子，并且该术语包括抗体片段，所述抗体片段包含抗原结合结构域如Fab'，Fab，F(ab')2，单域抗体(DAB)，TandAbs二聚体，Fv，scFv(单链Fv)，dsFv，ds-scFv，Fd，线性抗体，小抗体，双抗体，双特异性抗体片段，双抗体，三抗体(scFv-Fab融合蛋白，分别是双特异性或三特异性)；sc-双抗体；κ(lamda)体(scFv-CL融合)；BiTE(双特异性T细胞Engager，scFv-scFv串联以吸引T细胞)；DVD-Ig(双可变结构域抗体，双特异性格式)；SIP(小免疫蛋白，一种微抗体)；SMIP(“小型模块化免疫药物”scFv-Fc二聚体；DART(ds稳定的双抗体“Dual AffinityReTargeting”)；包含一个或多个CDR等的小型抗体模拟物。用于制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的技术是本领域公知的(参见Kabat et al.,1991，尤其通过引用并入本文)。尤其是双抗体，在EP404,097和WO 93/1 1161中有进一步的描述；而线性抗体在Zapataet al.(1995)中有进一步的描述。可以使用常规技术对抗体进行片段化。例如，可以通过用胃蛋白酶处理抗体来生成F(ab')2片段。可以对所得的F(ab’)2片段进行处理以还原二硫键产生Fab'片段。木瓜蛋白酶消化可以导致Fab片段的形成。Fab，Fab'和F(ab’)2，scFv，Fv，dsFv，Fd，dAbs，TandAbs，ds-scFv，二聚体，小抗体，双抗体，双特异性抗体片段和其他片段也可以通过重组技术进行合成，或者也可以化学合成。产生抗体片段的技术是众所周知的，并且在本领域中已有描述。例如，Beckman et al.,2006；Holliger&Hudson,2005；Le Gallet al.,2004；Reff&Heard,2001；Reiter et al.,1996；和Young et al.,1995各自进一步描述并使得有效抗体片段的产生成为可能。在一些实施方案中，本发明的抗体是单链抗体。如本文所用，术语“单结构域抗体”在本领域中具有其一般含义，并且是指可以在骆驼属哺乳动物中自然缺乏轻链的类型的抗体的单重链可变结构域。这样的单结构域抗体也是

对于(单个)结构域抗体的一般描述，还参考上文引用的现有技术以及EP 0368 684，Ward et al.(Nature1989 Oct 12；341(6242):544-6),Holt et al.,TrendsBiotechnol.,2003,21(11):484-490；和WO 06/030220,WO 06/003388。

如本文所用，术语“结合”表示抗体对表面分子具有亲和力。如本文所用，术语“亲和力”是指抗体与表位的结合强度。抗体的亲和力由解离常数Kd定义，解离常数Kd定义为[Ab]x[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度，[Ab]是未结合的抗体的摩尔浓度，[Ag]是未结合的抗原的摩尔浓度。亲和常数Ka由1/Kd定义。确定mAb亲和力的优选方法可见于Harlow,et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988),Coligan et al.,eds.,CurrentProtocols in Immunology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993),和Muller,Meth.Enzymol.92:589-601(1983)，其参考文献通过引用整体并入本文。用于确定mAb的亲和力的一种本领域公知的优选且标准方法是使用Biacore仪器。

在天然抗体中，两条重链通过二硫键相互连接，每条重链通过二硫键连接至轻链。轻链有两种类型，lambda(1)和kappa(k)。有五种主要的重链类别(或同种型)，它们决定了抗体分子的功能活性：IgM，IgD，IgG，IgA和IgE。每条链含有不同的序列结构域。轻链包括两个结构域，可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域，可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CHI，CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区决定了对抗原的结合识别和特异性。轻链(CL)和重链(CH)的恒定区结构域具有重要的生物学特性，例如抗体链缔合，分泌，胎盘跨膜移动性，补体结合以及与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白的Fab片段的N-末端部分，并且由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变或互补决定区(CDR)的残基组成。有时，来自高变区或框架区(FR)的残基可以参与抗体结合位点或影响整体结构域结构，进而影响结合位点。互补决定区或CDR是指一起限定天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个CDR，分别称为L-CDR1，L-CDR2，L-CDR3和H-CDR1，H-CDR2，H-CDR3。因此，抗原结合位点通常包括六个CDR，其包含来自重链和轻链V区中每一个的CDR组。构架区(FR)是指插入CDR之间的氨基酸序列。抗体可变结构域中的残基通常根据Kabat et al.设计的系统编号。该系统在美国国立卫生研究院(NIH)的美国卫生与人类服务部，Kabat et al.,1987,Sequences of Proteins of Immunological Interest(以下称为“Kabat et al.”)中提出。在本说明书中使用该编号系统。Kabat残基的名称并不总是直接与SEQ ID序列中氨基酸残基的线性编号相对应。实际的线性氨基酸序列可以含有比在严格的Kabat编号中更少或额外的氨基酸，其对应于基本可变结构域结构的结构组分(框架或互补决定区(CDR))的缩短或插入。可以通过将抗体序列中的同源残基与“标准”Kabat编号序列进行比对来确定给定抗体的残基的正确Kabat编号。根据Kabat编号系统，重链可变结构域的CDR位于残基31-35B(H-CDR1)，残基50-65(H-CDR2)和残基95-102(H-CDR3)。根据Kabat编号系统，轻链可变结构域的CDR位于残基24-34(L-CDR1)，残基50-56(L-CDR2)和残基89-97(L-CDR3)。

在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。如本文所用，“人源化”描述了抗体，其中CDR区外的一些、大部分或全部氨基酸被衍生自人免疫球蛋白分子的相应氨基酸替代。人源化方法包括但不限于美国专利号4,816,567，5,225,539，5,585,089，5,693,761，5,693,762和5,859,205中描述的那些，其通过引用并入本文。

在一些实施方案中，抗体是完全人抗体。也可以通过免疫大部分人免疫球蛋白重链和轻链基因座的转基因小鼠来制备完全人单克隆抗体。参见，例如，美国专利号5,591,669，5,598,369，5,545,806，5,545,807，6,150,584和其中引用的参考文献，其内容通过引用并入本文。

在一些实施方案中，适合于消耗CD163+TAM的抗体介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。如本文所用，术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞介导的反应，其中非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别在靶细胞上的结合的抗体，随后引起靶细胞裂解。尽管不希望限于任何特定的作用机制，然而这些介导ADCC的细胞毒性细胞通常表达Fc受体(FcR)。

如本文所用，“Fc区”包括包含除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的抗体的恒定区的多肽。因此，Fc是指IgA，IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，以及这些结构域的N末端柔性铰链。对于IgA和IgM，Fc可包括J链。对于IgG，Fc包含免疫球蛋白结构域Cgamma2和Cgamma3(Cγ2和Cγ3)以及Cgamma1(Cγ1)和Cgamma2(Cγ2)之间的铰链。尽管Fc区的边界可以变化，然而人IgG重链Fc区通常被定义为在其羧基末端包含残基C226或P230，其中编号是根据Kabat et al.的EU索引(1991,NIH Publication 91-3242,National Technical Information Service,Springfield,Va.)。“Kabat中列出的EU索引”是指如Kabat et al.中所述的人IgG1 EU抗体的残基编号，上文。Fc可以单独地指该区域，或者在抗体，抗体片段或Fc融合蛋白的语境中指该区域。Fc变体蛋白可以是抗体，Fc融合体或包含Fc区的任何蛋白或蛋白结构域。特别优选的是包含变体Fc区的蛋白质，其是Fc区的非天然存在的变体。与野生型氨基酸序列相比，非天然存在的Fc区(在本文中也称为“变异Fc区”)的氨基酸序列包含至少一个氨基酸残基的取代、插入和/或缺失。由于插入或取代而在变体Fc区的序列中出现的任何新的氨基酸残基可被称为非天然存在的氨基酸残基。注意：已经在许多Fc位置上观察到了多态性，包括但不限于Kabat 270、272、312、315、356和358，因此可能存在所呈现的序列与现有技术中的序列之间的细微差异。

术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体的Fc区结合的受体。介导ADCC的主要细胞NK细胞表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI，FcγRII，FcγRIII和/或FcγRIV。Ravetchand Kinet,Annu.Rev.Immunol.,9:457-92(1991)总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，例如可以执行美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的那些。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地，可以在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在诸如Clyneset al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),95:652-656(1998)中公开的动物模型中。如本文所用，术语“效应细胞”是表达一种或多种FcR并执行效应子功能的白细胞。所述细胞至少表达FcγRI，FCγRII，FcγRIII和/或FcγRIV，并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)，自然杀伤(NK)细胞，单核细胞，细胞毒性T细胞和嗜中性白细胞。

在一些实施方案中，适合于消耗CD163+TAM的抗体是全长抗体。在一些实施方案中，全长抗体是IgG1抗体。在一些实施方案中，全长抗体是IgG3抗体。

在一些实施方案中，适合于消耗CD163+TAM的抗体包含对FcγRIA，FcγRIIA，FcγRIIB，FcγRIIIA，FcγRIIIB和FcγRIV具有增加的亲和力的变体Fc区。在一些实施方案中，本发明的抗体包含具有至少一个氨基酸取代、插入或缺失的Fc区变体，其中所述至少一个氨基酸残基的取代、插入或缺失导致对FcγRIA，FcγRIIA，FcγRIIB的亲和力增加。在一些实施方案中，本发明的抗体包含具有至少一个氨基酸取代、插入或缺失的变体Fc区，其中所述至少一个氨基酸残基选自：残基239、330和332，其中氨基酸残基按照EU索引编号。在一些实施方案中，本发明的抗体包含Fc区变体，该Fc区变体包含至少一个氨基酸取代，其中所述至少一个氨基酸取代选自：S239D，A330L，A330Y和1332E，其中氨基酸残留物按照EU索引编号。

在一些实施方案中，适合于消耗CD163+TAM的抗体的糖基化被修饰。例如，可以制备无糖基化的抗体(即，该抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。这样的碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点的一个或多个氨基酸取代，从而消除该位点的糖基化。这种无糖基化可以增加抗体对抗原的亲和力。Co et al.在美国专利号5,714,350和6,350,861中进一步详细描述了这种方法。另外地或备选地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，例如具有减少的岩藻糖基残基量或没有岩藻糖基残基的次岩藻糖基化或非岩藻糖基化的抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经证明这种改变的糖基化模式增加了抗体的ADCC能力。这样的碳水化合物修饰可以通过例如在宿主细胞中以改变的糖基化机制表达抗体来实现。具有改变的糖基化机制的细胞已在本领域中描述，并且可以用作表达本发明的重组抗体从而产生具有改变的糖基化的抗体的宿主细胞。例如，Hang et al.的EP 1176195描述了具有功能中断的FUT8基因的细胞系，该基因编码岩藻糖基转移酶，使得在这种细胞系中表达的抗体表现出岩藻糖基化低或没有岩藻糖基残基。因此，在一些实施方案中，本发明的人单克隆抗体可以通过在表现出岩藻糖基化低或非岩藻糖基化模式的细胞系中，例如在编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因表达不足的哺乳动物细胞系中重组表达而产生。Presta的PCT公开WO 03/035835描述了一种变体CHO细胞系Lecl3细胞，具有降低的将岩藻糖与Asn(297)连接的碳水化合物连接的能力，还导致该宿主细胞中表达的抗体的岩藻糖基化(另见Shields,R.L.et al,2002J.Biol.Chem.277:26733-26740)。Umana et al.的PCT公开WO 99/54342描述了工程改造以表达修饰糖蛋白的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N乙酰氨基葡萄糖氨基转移酶III(GnTIII))的细胞系，使得在工程改造的细胞系中表达的抗体表现出增加的二等分GlcNac结构，这导致细胞的ADCC活性增加。抗体(也参见Umana et al,1999Nat.Biotech.17:176-180)。Eureka Therapeutics进一步描述了基因工程改造的CHO哺乳动物细胞，该细胞能够产生具有改变的哺乳动物糖基化模式、没有岩藻糖基残基的抗体(http://www.eurekainc.com/a&boutus/companyoverview.html)。备选地，本发明的人单克隆抗体可以在酵母或丝状真菌中产生，所述酵母或丝状真菌被工程改造为哺乳动物样糖基化模式，并能够产生缺乏岩藻糖的抗体作为糖基化模式(参见例如EP1297172B1

在一些实施方案中，适合于消耗CD163+TAM的抗体介导补体依赖性细胞毒性。“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指分子在补体存在下引发补体激活并裂解靶标的能力。补体激活途径是通过补体系统的第一组分(C1q)与和关联抗原复合的分子(例如抗体)的结合而启动的。为了评估补体的激活，可进行CDC测定，例如，如Gazzano-Santaro et al.,J.Immunol.Methods,202:163(1996)所述。

在一些实施方案中，适合于消耗CD163+TAM的抗体介导抗体依赖性吞噬作用。如本文所用，术语“抗体依赖性吞噬作用”或“调理作用(opsonisation)”是指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并随后引起靶细胞的吞噬作用。

在一些实施方案中，适合于消耗CD163+TAM的抗体是多特异性抗体，其包含针对CD163的第一抗原结合位点和针对效应细胞的至少一个第二抗原结合位点，如上所述。在所述实施方案中，第二抗原结合位点用于募集杀伤机制，例如通过将抗原结合在人效应细胞上。在一些实施方案中，效应细胞能够诱导ADCC，例如天然杀伤细胞。例如，表达FcR的单核细胞，巨噬细胞参与靶细胞的特异性杀伤并向免疫系统的其他组分呈递抗原。在一些实施方案中，效应细胞可以吞噬靶抗原或靶细胞。特定FcR在效应细胞上的表达可以通过体液因子例如细胞因子来调节。效应细胞可以吞噬靶抗原或吞噬或裂解靶细胞。合适的细胞毒性剂和第二种治疗剂在下面举例说明，并且包括毒素(例如放射性标记的肽)，化学治疗剂和前药。在一些实施方案中，第二结合位点结合如上所定义的Fc受体。在一些实施方案中，第二结合位点结合至NK细胞的表面分子，使得所述细胞可以被激活。在一些实施方案中，第二结合位点结合至NKp46。本发明的多特异性抗体分子的示例性形式包括但不限于(i)通过化学异缀合交联的两种抗体，一种对ILC的特定表面分子具有特异性，而另一种对第二抗原具有特异性；(ii)包含两个不同抗原结合区的单一抗体；(iii)单链抗体，其包含两个不同的抗原结合区，例如，通过额外的肽接头串联连接的两个scFv；(iv)双可变结构域抗体(DVD-Ig)，其中每个轻链和重链包含通过短肽键串联在一起的两个可变结构域(Wu et al.,Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin(DVD-Ig^TM)Molecule,见:Antibody Engineering,Springer Berlin Heidelberg(2010))；(v)化学连接的双特异性(Fab')2片段；(vi)Tandab，其是两个单链双抗体的融合体，产生四价双特异性抗体，该四价双特异性抗体对每个靶抗原具有两个结合位点；(vii)柔性抗体，其是scFv与双抗体的组合，产生多价分子；(viii)一种基于蛋白质激酶A中“二聚化和对接结构域”的所谓“对接和锁定”分子，当将其应用于Fab时，可以产生由两个相同的Fab片段连接至不同的Fab片段组成的三价双特异性结合蛋白；(ix)所谓的蝎子分子，其包含例如与人Fab臂的两个末端融合的两个scFv；和(x)双抗体。双特异性抗体的另一种示例性形式是具有互补CH3结构域以迫使异二聚化的IgG样分子。可以使用已知技术制备此类分子，例如，已知为Triomab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biotech)，Knob-into-Hole(Genentech)，CrossMAb(Roche)和静电匹配(Amgen)，LUZ-Y(Genentech)，链交换工程改造的结构域体(SEEDbody)(EMD Serono)，Biclonic(Merus)和DuoBody(Genmab A/S)技术。

在一些实施方案中，将适合于消耗CD163+TAM的抗体缀合至治疗部分，即药物。治疗部分可以是例如细胞毒素，化学治疗剂，细胞因子，免疫抑制剂，免疫刺激剂，裂解肽或放射性同位素。此类缀合物在本文中称为“抗体-药物缀合物”或“ADC”。

在一些实施方案中，将适合于消耗CD163+TAM的抗体缀合至细胞毒性部分。细胞毒性部分可以例如选自由紫杉醇；细胞松弛素B；短杆菌肽D；溴化乙锭；吐根碱；丝裂霉素；依托泊苷；Tenoposide；长春新碱；长春碱；秋水仙素；阿霉素；柔红霉素；二羟基蒽醌二酮；微管蛋白抑制剂，例如美登素或其类似物或衍生物；抗有丝分裂剂，例如单甲基澳瑞他汀E或F或其类似物或衍生物；dolastatin 10或15或其类似物；伊立替康或其类似物；米托蒽醌；光辉霉素；放线菌素D；1-脱氢睾酮；糖皮质激素；普鲁卡因；丁卡因；利多卡因；普萘洛尔；嘌呤霉素；加利车霉素或其类似物或衍生物；抗代谢药，例如甲氨蝶呤，6巯基嘌呤，6硫鸟嘌呤，阿糖胞苷，氟达拉宾，5氟尿嘧啶，去卡巴嗪，羟基脲，天冬酰胺酶，吉西他滨或克拉屈滨；烷基化剂，如甲氧乙胺，噻硫磷，苯丁酸氮芥，美法仑，卡莫司汀(BSNU)，洛莫司汀(CCNU)，环磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，链脲霉素，达卡巴嗪(DTIC)，前卡巴嗪，丝裂霉素C；铂衍生物，例如顺铂或卡铂；杜卡霉素A，杜卡霉素SA，雷切霉素(CC-1065)或其类似物或衍生物；抗生素，如放线菌素，博来霉素，柔红霉素，阿霉素，伊达比星，米拉霉素，丝裂霉素，米托蒽醌，普卡霉素，蒽霉素(AMC)；吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂((PDB)；白喉毒素和相关分子，例如白喉A链及其活性片段和杂种分子，蓖麻毒素，例如蓖麻毒素A或去糖基化的蓖麻蛋白A链毒素，霍乱毒素，志贺样毒素，例如SLT I，SLT II，SLT IIV，LT毒素，C3毒素，志贺氏毒素，百日咳毒素，破伤风毒素，大豆Bowman-Birk蛋白酶抑制剂，假单胞菌外毒素，阿洛林，皂草毒素(saporin)，莫迪素(modeccin)，gelanin，abrin A链，莫迪素A链，帚曲霉素(α-sarcin)，油桐(Aleurites fordii)蛋白，香石竹毒(dianthin)蛋白，美洲疫霉菌蛋白(例如PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜抑制因子，姜黄素，巴豆菌素，红景天抑制剂，白树毒素(Gelonin)，米托格林，局限曲菌素(restrictocin)，酚霉素(phenomycin)和伊诺霉素毒素；核糖核酸酶(RNase)；DNase I，葡萄球菌肠毒素A；商陆抗病毒蛋白；白喉毒素；和假单胞菌内毒素。

在一些实施方案中，适合于消耗CD163+TAM的抗体与澳瑞他汀(auristatin)或其肽类似物、衍生物或前药缀合。已显示澳瑞他汀类药物干扰微管动力学，GTP水解以及核和细胞分裂(Woyke et al(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584)并具有抗癌作用(US5663149)和抗真菌活性(Pettit et al.,(1998)Antimicrob.Agents andChemother.42:2961-2965。例如，可使澳瑞他汀E与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰基戊酸反应分别生成AEB和AEVB。其他典型的澳瑞他汀衍生物包括AFP，MMAF(单甲基澳瑞他汀F)和MMAE(单甲基澳瑞他汀E)。合适的澳瑞他汀和澳瑞他汀类似物、衍生物和前药，以及合适的用于将澳瑞他汀与Ab缀合的接头描述于例如美国专利号5,200,000，5,635,483，5,780,588和6,214,345以及国际专利申请公开WO02088172，WO2004010957，WO2005081711，WO2005084390，WO2006132670，WO03026577，WO200700860，WO207011968和WO205082023。

在一些实施方案中，将适合消耗CD163+TAM的抗体缀合至吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮卓(PDB)或其类似物、衍生物或前药。合适的PDB和PDB衍生物以及相关技术描述于例如Hartley J.A.et al.,Cancer Res 2010；70(17):6849-6858；Antonow D.et al.,CancerJ 2008；14(3):154-169；Howard P.W.et al.,Bioorg Med Chem Lett 2009；19:6463-6466和Sagnou et al.,Bioorg Med Chem Lett 2000；10(18):2083-2086。在一些实施方案中，如WO2017059289中典型描述的，抗体与吡咯并苯并二氮卓(PBD)缀合。

在一些实施方案中，将适合于消耗CD163+TAM的抗体缀合至细胞毒性部分，所述细胞毒性部分选自蒽环类，美登素，加利车霉素，杜卡霉素，雷切霉素(CC-1065)，多拉司他汀10，多拉司他汀15，伊立替康，单甲基澳瑞他汀E，单甲基澳瑞他汀F，PDB或其任何类似物、衍生物或前药。

在一些实施方案中，将适合于消耗CD163+TAM的抗体缀合至蒽环类或其类似物、衍生物或前药。在一些实施方案中，抗体与美登素或其类似物、衍生物或前药缀合。在一些实施方案中，抗体与加利车霉素或其类似物、衍生物或前药缀合。在一些实施方案中，抗体与杜卡霉素或其类似物、衍生物或前药缀合。在一些实施方案中，抗体与雷切霉素(CC-1065)或其类似物、衍生物或前药缀合。在一些实施方案中，抗体缀合至多拉司他汀10或其类似物、衍生物或前药。在一些实施方案中，抗体缀合至多拉司他汀15或其类似物、衍生物或前药。在一些实施方案中，抗体与单甲基澳瑞他汀E或其类似物、衍生物或前药缀合。在一些实施方案中，抗体与单甲基澳瑞他汀F或其类似物、衍生物或前药缀合。在一些实施方案中，抗体与吡咯并[2,1-c][1,4]-苯并二氮杂或其类似物、衍生物或前药缀合。在一些实施方案中，抗体与伊立替康或其类似物、衍生物或前药缀合。

在一些实施方案中，将适合于消耗CD163+TAM的抗体缀合至核酸或核酸相关分子。在一个这样的实施方案中，缀合的核酸是细胞毒性核糖核酸酶(RNase)或脱氧核糖核酸酶(例如DNase I)，反义核酸，抑制性RNA分子(例如siRNA分子)或免疫刺激性核酸(例如，含有免疫刺激性CpG基序的DNA分子)。在一些实施方案中，抗体缀合至适体或核酶。

使分子与抗体缀合的技术是本领域众所周知的(参见，例如，

Arnon et al.,“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy,”见Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy(Reisfeld etal.eds.,Alan R.Liss,Inc.,1985)；Hellstrom et al.,“Antibodies For DrugDelivery,”见Controlled Drug Delivery(Robinson et al.eds.,Marcel Deiker,Inc.,2nd ed.1987)；Thorpe,“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:AReview,”见Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications(Pinchera et al.eds.,1985)；“Analysis,Results,and Future Prospective of theTherapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,”见MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy(Baldwin et al.eds.,AcademicPress,1985)；and Thorpe et al.,1982,Immunol.Rev.62:119-58.也参见，李良如PCT公开WO 89/12624。通常，核酸分子通过N-羟基琥珀酰亚胺酯或马来酰亚胺官能团分别共价结合于抗体上的赖氨酸或半胱氨酸。有报道使用工程改造的半胱氨酸进行缀合或掺入非天然氨基酸的方法改善了缀合物的均一性(Axup,J.Y.,Bajjuri,K.M.,Ritland,M.,Hutchins,B.M.,Kim,C.H.,Kazane,S.A.,Halder,R.,Forsyth,J.S.,Santidrian,A.F.,Stafin,K.,etal.(2012).Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnaturalamino acids.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109,16101-16106.；Junutula,J.R.,Flagella,K.M.,Graham,R.A.,Parsons,K.L.,Ha,E.,Raab,H.,Bhakta,S.,Nguyen,T.,Dugger,D.L.,Li,G.,et al.(2010)。Engineered thio-trastuzumab-DM1 conjugate with an improvedtherapeutic index to target humanepidermal growth factor receptor 2-positivebreast cancer.Clin.Cancer Res.16,4769-4778.)。Junutula et al.(2008)开发了基于半胱氨酸的位点特异性结合物，称为“THIOMAB”(TDC)，与传统的缀合方法相比，该缀合显示出改善的治疗指数。对于ADC，也正在探索与已掺入抗体的非天然氨基酸的缀合。然而，这种方法的普遍性尚待确定(Axup等人，2012)。特别地，本领域技术人员还可以设想用含酰基供体谷氨酰胺的标签(例如，含Gin的肽标签或Q标签)或通过多肽工程改造(例如，通过多肽上的氨基酸缺失，插入，取代或突变)而使之具有反应性的内源性谷氨酰胺进行工程改造的含Fc的多肽。然后，转谷氨酰胺酶可以与胺供体药剂(例如，包含或结合于反应性胺的小分子)共价交联，以形成稳定且均质的工程改造的含Fc多肽缀合物，其中胺供体药剂是位点特异性地通过含酰基供体谷氨酰胺的标签或可接近/暴露/反应性内源性谷氨酰胺与含Fc的多肽缀合(WO 2012059882)。

通常，以治疗有效量向患者给予能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂和免疫检查点抑制剂。如本文所用，术语“治疗有效量”是指在所需的剂量和时间段内有效达到期望的治疗结果的量。活性剂的治疗有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及活性剂在个体中引起期望的反应的能力等因素而变化。治疗有效量也是抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用均被治疗有益作用所抵消的量。活性剂的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症，并且可以由本领域技术人员确定。本领域普通技术人员可以容易地确定所需药物组合物的有效量并开处方。例如，医师可以在药物组合物中使用的活性剂的剂量开始于低于达到期望的治疗效果所需的水平，并逐渐增加剂量直至达到期望的效果。通常，本发明组合物的合适剂量将是该化合物根据特定剂量方案有效产生治疗效果的最低剂量的量。这样的有效剂量通常将取决于上述因素。例如，可以通过其稳定疾病进展的能力来测量用于治疗用途的治疗有效量。通常，可以例如在预测人肿瘤功效的动物模型系统中评估化合物抑制癌症的能力。治疗有效量的治疗化合物可减小肿瘤大小，或减轻患者的症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如患者的身材，患者症状的严重程度以及所选择的特定组合物或给药途径之类的因素来确定所述量。治疗有效量的本发明抑制剂的示例性非限制性范围是约0.1-100mg/kg，例如约0.1-50mg/kg，例如约0.1-20mg/kg，例如约0.1-10mg/kg，例如约0.5，约0.3，约1，约3mg/kg，约5mg/kg或约8mg/kg。治疗有效量的本发明抑制剂的示例性非限制性范围是0.02-100mg/kg，例如约0.02-30mg/kg，例如约0.05-10mg/kg或0.1-3mg/kg，例如约0.5-2mg/kg。给药可以例如是静脉内，肌内，腹膜内或皮下给药，并且例如在靶部位附近给药。调整上述治疗方法和用途中的剂量方案以提供最佳的所需反应(例如治疗反应)。例如，可以给予单次推注，可以随时间给予数个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。在一些实施方案中，在治疗期间监测治疗的功效，例如在预定义的时间点。在一些实施方案中，可以通过疾病区域的可视化或通过本文进一步描述的其他诊断方法来监测功效，例如，通过例如使用本发明的标记的抑制剂，源自本发明的抑制剂的片段或微型抗体进行一次或多次PET-CT扫描。如果需要的话，药物组合物的有效日剂量可以全天以适当间隔分别以两个，三个，四个，五个，六个或更多个亚剂量给予，任选地以单位剂量形式给予。在一些实施方案中，本发明的人单克隆抗体通过长时间(例如超过24小时)的缓慢连续输注给予，以使任何不希望的副作用最小化。有效剂量的本发明的抑制剂也可以使用每周、每两周或每三周的给药期进行给药。给药期可以限制为例如8周，12周或直到已经确定临床进展。作为非限制性实例，根据本发明的治疗可以以本发明的抑制剂的日剂量提供，所述剂量的量约0.1-100mg/kg，例如0.2、0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg，每天，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一天，或者替代地，在治疗开始后的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、15、16、17、18、19或20周中的至少一周或其任何组合，每24、12、8、6、4或2小时使用单次或分次剂量或其任意组合。

通常，将活性剂以包含药学上可接受的载体的药物组合物的形式给予患者。可用于这些组合物中的药学上可接受的载体包括但不限于离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白(例如人血清白蛋白)，缓冲物质(例如磷酸盐，甘氨酸，山梨酸，山梨酸钾)，饱和植物脂肪酸，水，盐或电解质的部分甘油酯混合物，例如鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶体二氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素基物质，聚乙烯乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。为了向患者给药，将组合物配制成对患者给药。本发明的组合物可以口服，胃肠外，通过吸入喷雾，局部，直肠，鼻，颊，阴道或经植入的储库给药。本文使用的包括皮下，静脉内，肌内，关节内，滑膜内，胸骨内，鞘内，肝内，病变内和颅内注射或输注技术。本发明组合物的无菌注射形式可以是水性或油性悬浮液。可以根据本领域已知的技术，使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制这些悬浮液。无菌注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的介载体和溶剂是水，林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物可以天然药学上可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，特别是其聚氧乙烯化形式用于制备注射剂。这些油溶液或悬浮液还可以包含长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或类似的分散剂，其通常用于配制药学上可接受的剂型，包括乳剂和悬浮液。为了配制的目的，也可以使用其他通常使用的表面活性剂，例如吐温，司盘和其他乳化剂或生物利用度增强剂，其通常用于制造药学上可接受的固体，液体或其他剂型。本发明的组合物可以任何口服可接受的剂型口服给药，包括但不限于胶囊剂，片剂，水性悬剂或溶液剂。在口服片剂的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还添加润滑剂，例如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服给药，有用的稀释剂包括例如乳糖。当需要口服水性悬剂时，将活性成分与乳化剂和助悬剂混合。如果需要，也可以添加某些甜味剂，调味剂或着色剂。备选地，本发明的组合物可以栓剂的形式用于直肠给药。这些可以通过将药剂与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，该赋形剂在室温下为固体，而在直肠温度下为液体，因此将在直肠中融化以释放药物。这些材料包括可可脂，蜂蜡和聚乙二醇。本发明的组合物也可以局部给药，特别是当治疗的靶标包括局部施用容易达到的区域或器官时，包括眼，皮肤或下肠道疾病。对于这些区域或器官中的每一个，容易制备合适的局部制剂。对于局部应用，可以将组合物配制成合适的软膏剂，该软膏剂含有悬浮或溶解在一种或多种载体中的活性组分。用于本发明化合物的局部给药的载体包括但不限于矿物油，液体凡士林，白凡士林，丙二醇，聚氧乙烯，聚氧丙烯化合物，乳化蜡和水。备选地，可以将组合物配制成含有悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的载体中的活性成分的合适的洗剂或乳膏。合适的载体包括但不限于矿物油，脱水山梨醇单硬脂酸酯，聚山梨酯60，鲸蜡酯蜡，鲸蜡硬脂醇，2-辛基十二烷醇，苄醇和水。下肠道的局部应用可以直肠栓剂(见上文)或合适的灌肠剂形式实施。也可以使用贴剂。本发明的组合物也可通过鼻喷雾或吸入给药。此类组合物是根据药物制剂领域中众所周知的技术制备的，并且可以使用苯甲醇或其他合适的防腐剂，增强生物利用度的吸收促进剂，碳氟化合物和/或其他常规的增溶剂或分散剂，以盐溶液的形式制备。例如，本发明药物组合物中存在的抗体可以以在100mg(10mL)或500mg(50mL)一次性瓶中10mg/mL的浓度提供。将该产品配制为在9.0mg/mL氯化钠，7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物，0.7mg/mL聚山梨酯80和无菌注射用水中进行IV给药。将pH调节至6.5。在本发明的药物组合物中，抗体的示例性合适剂量范围可以在约1mg/m²至500mg/m²之间。然而，应当理解，这些时间表是示例性的，并且可以考虑必须在临床试验中确定的药物组合物中特定抗体的亲和力和耐受性来调整最佳时间表和方案。可以制备本发明的用于注射的药物组合物(例如，肌肉内，静脉内)，以含有无菌缓冲水(例如，对于肌肉内为1ml)，并且在约1ng至约100mg之间，例如约50ng至约30mg或更优选约5mg至约25mg的本发明的抑制剂。

通过以下附图和实施例将进一步说明本发明。然而，这些示例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。

附图

图1.用靶向的脂质纳米颗粒消耗CD163+TAM促进肿瘤消退。(A)αCD163 mAb缀合脂质纳米颗粒(LNP)的示意图。(B)在患有黑色素瘤的小鼠中CD163+TAM的治疗消耗。在小鼠(每组n＝6)右侧腹s.c.注射1x10⁶YUMM1.7细胞。当肿瘤是约5mm x 5mm，小鼠每隔第2天接受αCD163-dxrLNP((αCD163-dxr))或ctrlIgG-dxrLNP(ctrlIgG-dxr)(2mg/kg dxr)治疗，持续2周。对照使用PBS(介载体)或空的αCD163-LNP(αCD163-ctl)。(C)通过流式细胞术分析TAM和CD163+TAM的终点水平，并计算活细胞的频率。结果代表3个独立实验。(D)将在右侧腹接种了1x10⁶个YUMMER1.7细胞的小鼠随机分组，并从第10天开始用2mg/kg dxr或每隔第2天用对照治疗2周。使用Mann-Whitney t检验计算统计学上的显著差异；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。

图2.CD163+TAM消耗促进抗PD-1抗性CTL反应。(A)用αCD163-dxrLNP或介载体与aPD-1mAb或同种型对照IgG的组合治疗荷瘤小鼠。(B)每隔第2天用αCD163-dxrLNP或介载体治疗小鼠10天，之后小鼠每周两次接受aPD-1mAb。对于每组，n＝6。**p＜0.01。

图3.比较使用αCSF1阻断抗体的CD163+TAM消耗与全巨噬细胞消耗的疗效的治疗研究。(A)将带有可触知肿瘤的小鼠随机分组并用αCD163-dxr(n＝6)或PBS(n＝4)每2天连续2周i.v.治疗或使用αCSF1(n＝6)或对照组(CtrlIgG，n＝6或PBS，n＝6)每5天i.v.治疗。使用双向方差分析(ANOVA)，然后进行Tukey事后检验，计算出统计学上的显著差异；***p<0.001和****p<0.0001。在终点，通过流式细胞术分析mTAM，iTAM和Mn(B)或CD4+TIL和IFNγ+CD8+TIL(C)的总数，并根据活细胞的频率进行计算。数据表示为n＝6的平均值+/-SEM。

实施例

材料与方法

小鼠饲养和小鼠黑色素瘤模型的建立

为了诱导自发性黑色素瘤的形成²³，将携带条件等位基因BRAF^CA/+，PTEN^{lox4-5/lox4-5}和Tyr::CreER^T2+/-的小鼠剃毛并将5周龄小鼠的右侧腹局部暴露于1μL的7.8mg/mL 4-羟基他莫昔芬(4-HT)。为了诱导同基因肿瘤，将8周龄的雄性或雌性小鼠在右后腹皮下注射在100μl无菌PBS pH 7.4中的1x10⁶耶鲁大学小鼠黑色素瘤(YUMM1.7)²⁵细胞。使用数字卡尺在x，y和z中测量肿瘤大小，并使用椭圆体体积方程(体积＝0.5233xyz)计算肿瘤体积。所有小鼠均自由饮水和进食，并在12h/12h夜间/日光周期下饲养在马赛-鲁米尼免疫中心(Centred’immunologie Marseille-Luminy)的动物设施中。所有动物实验均已根据在测试中使用动物的限制原则(3R，替代，减少和精制)获得批准和实施，并获得了法国高等教育和研究部的批准。

肿瘤消化，流式细胞仪和细胞分选

将用于流式细胞术和FACS分选的肿瘤切碎并在RPMI1640中用1mg/ml胶原酶II(Sigma)，50μg/ml DNAseI(Roche)和0.1％(w/v)BSA在37℃下轻轻搅拌消化30min。随后将单细胞悬液通过70μm细胞过滤器，并通过离心收集。对于RBC裂解，将细胞悬液与0.85％NH₄Cl于室温孵育2min，通过离心收集并重悬于FACS缓冲液(1xPBS pH 7.4、1mM EDTA pH8.0、3％FCS和0.1％NaN₃)中。为了进行流式细胞术和FACS分选，将来自肿瘤的单细胞悬液与2.4.G2抗体在4℃孵育10min，然后与特定抗体(有关详细信息，参见补充表1)在4℃孵育30min。在分析之前，将细胞与Sytox Blue(Thermo Fischer Scientific)孵育以区分死细胞。对于IFNγ细胞内染色，将表面染色的细胞与活/死固定紫罗兰在PBS中孵育20min以区分死细胞，然后固定，透化，并用BD Perm/Wash缓冲液(BD Biosciences)洗涤，然后与在Perm/Wash缓冲液中稀释的IFNγ抗体一起于4℃孵育30min。在配备350nm激光(BDBiosciences)的LSR-2或Fortessa X-20流式细胞仪上进行分析。随后的数据分析是使用用于Mac的FlowJo软件V10.4(Tree Star)进行的。进行了免疫表型分析……。(抗体补充表2)

脂质体制备

基本上已经制备了包封阿霉素的长循环脂质体³⁰，并如先前所述²⁶对其进行了针对CD163靶向的修饰。简而言之，脂质体制剂是通过乙醇注射法由HSPC，mPEG2000-PE和胆固醇(摩尔比为55：40：5)(Lipoid GmBH,Ludwigshafen,Germany and Sigma Aldrich A/S,Glostrup,Denmark)的混合物形成的。将脂质在65℃的EtOH中溶解15min，然后在65℃的水性缓冲液中水合(至10％EtOH)1h，以用于进一步的下游应用。使用Avanti微型挤出机套件(Avanti Polar Lipids,AL,US)，通过0.1μm过滤器将脂质体挤出25次，然后在150mM NaCl(0.9％NaCl)中透析两次，第二次透析在4℃过夜。钙黄绿素(calLNP)的封装是通过在200mM钙黄绿素(pH 7.4)溶液中水合脂质，并重复透析5次以去除多余的钙黄绿素来完成的。为了远程装载阿霉素，将脂质在300m的(MNH₄)₁HPO₃中水合。挤出并透析后，将含℃的脂质体与阿霉素.HCl在65℃下以阿霉素：脂质比为1：5混合30min。随后，使用配备有Ascentis C18柱(Sigma Aldrich A/S)的Dionex Ultimate3000 HPLC系统(Thermo Scientific,Hvidovre,Denmark)，通过高压尺寸排阻色谱法(UV吸光度210nm)估算脂质含量，药物含量和包封效率。使用动态光散射和DynaPro NanoStar系统(Wyatt Technology Europe GmbH,Dernbach,Germany)估算脂质体的大小。如前所述，使用αCD163抗体克隆3E10B10^26,31或同种型对照IgG(BioXcell)的插入后方法完成了针对CD163靶向的脂质体修饰。

体内治疗

当肿瘤达到约5mm x 5mm的可测量的大小时，小鼠通过眼眶后注射接受2mg/kg包裹在脂质纳米颗粒(dxrLNP)中的阿霉素，该脂质纳米颗粒与抗CD163 IgG(αCD163-dxrLNP)缀合。作为对照，小鼠组接受2mg/kg与同种型对照IgG(CtrlIgG-dxrLNP)缀合的dxrLNP中的阿霉素或等效量的与αCD163(αCD163-LNP)缀合的空LNP或介载体(无菌PBS pH 7.4)。每2天治疗小鼠，持续约14天。对于用钙黄绿素负载的LNP进行的体内实验，小鼠接受单次注射100μl的0.67mM脂质溶液的注射。对于CD4+和CD8+T细胞消耗研究和抗PD-1mAb治疗，小鼠接受250μg腹腔注射aCD4(克隆GK1.5)，aCD8b(克隆53-5.8)，aPD-1(克隆RMP1-14)或同种型对照IgG(IgG1或IgG2a)(所有BioXcell)，每周两次，第一次注射是用αCD163-dxrLNP治疗前1天。

免疫组织化学和免疫荧光

将5mm的完整肿瘤或背面皮肤切片固定在4％福尔马林中，然后包埋在琼脂糖中进行振动器切片，包埋在OCT中进行低温恒温器切片或包埋在石蜡中进行组织学检查。为了对振动器切片和低温恒温器切片进行免疫荧光分析，分别切下200μm或10μm厚的切片，并与pAb兔抗CD163-ATTO56532，CD146-Alexa647(克隆ME-9F1；BD Bioscience)，CD3e-APC(克隆145-2C11；BD Bioscience)和CD8b-FITC(53-5.8；BD Bioscience)以及抗FITC A488(A11096；Life Technologies)一起，在0.1M Tris pH 7.2、1％Triton X-100、0.5％BSA中用于振荡器切片或在1xPBS，2％BSA中用于低温恒温器切片。细胞核用Hoechst 33342(Sigma Aldrich)可视化。图像是在Zeiss LSM780共焦显微镜上使用光谱解混和20倍物镜采集的。对于IHC切片，用H&E和pAb兔抗CD163染色。

高通量基因表达分析

使用RNeasy Micro Kit(Qiagen)从分选的群体中纯化总RNA，并使用Quant-ITRiboGreen RNA分析试剂盒(Thermo Fischer)确定浓度。使用High Capacity cDNAReverse Transcriptase Kit(Applied Biosystems)完成第一条cDNA合成，然后使用Fluidigm PreAmp Master Mix(Fluidigm Corporation)使用2.5ng总RNA并按照制造商的说明进行目标基因的预扩增。使用Primer-Blast计算设计用于扩增目标基因的跨外显子引物(有关详细信息，参见补充表3)。将目的基因的正向和反向引物结合起来以获得基因特异性测定。为了提高灵敏度，使用汇集的测定法，通过14个PCR循环对目的基因进行预扩增，然后进行核酸外切酶I处理(New England Biolabs)以去除未掺入的引物。将最终的预扩增cDNA在TE缓冲液中以1：5稀释。根据生产商的说明和标准设置，使用96.96动态阵列和来自Fluidigm(Fluidigm Europe B.V.)的Biomark HD系统进行高通量基因表达分析。使用实时PCR分析软件(Fluidigm Europe B.V.)分析获得的数据，并将得到的CT值标准化为Cph以获得dCT值。使用Morpheus(https://software.broadinstitute.org/morpheus/)生成使用One减去皮尔逊相关性的热图，Z分数和层次聚类。使用Qlucore Omics(Qlucore AB,Lund,Sweden)生成PCA图。

统计分析

对于治疗研究，使用双向ANOVA和随后的Tukey事后检验进行统计分析。为了进行组之间的比较，在适当的情况下使用非参数检验(例如，Mann-Whitney或Kruskal-Wallis)进行统计检验。当p＜0.05时，数据被认为是统计学显著的。p值表示为*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001和****p<0.0001。所有统计分析均在Mac的Graphpad Prism 7中完成。

结果

表达CD163的巨噬细胞浸润自发性Braf^V600E驱动的黑色素瘤

BRAF中的激活突变在人类黑色素瘤中最为普遍，通常伴随着肿瘤抑制基因(如PTEN和CDKN2A)的缺失。基于适当的致癌驱动子突变的基因工程小鼠(GEM)模型的可用性增加，大大改善了小鼠肿瘤模型与人类疾病的相关性。Tyr::CreER；Braf^CA；转移性黑色素瘤的Pten^f/f小鼠模型利用黑素细胞限制性酪氨酸酶(Tyr)启动子来驱动他莫昔芬诱导的Cre重组酶(CreER^T2)的表达，后者进而触发组成型活性Braf^V600E(Braf^CA)的表达和斑点状的Pten等位基因(Pten^f/f)²³的缺失。在这些小鼠中，皮下(sc)给予4-羟基他莫昔芬(4-HT)最初会在第20天左右导致色素沉着的小病变，并在第40天左右进展为牙釉质肿瘤，随后呈现指数增长(数据未示出)。在未经治疗的小鼠中，CD163+巨噬细胞均匀分布在整个真皮和脂肪组织中(数据未示出)。然而，经过4-HT处理后，CD163+巨噬细胞聚集在真皮中色素沉着的、黑色素瘤前病变的边界处(数据未示出)。当色素沉着的病变转变为快速生长的腺瘤性肿瘤时，CD163+巨噬细胞聚集在侵入性前沿，而肿瘤内仅存在少量CD163+巨噬细胞(数据未示出)。为了进一步检查Braf^V600E肿瘤中的肿瘤浸润性髓样细胞(TIM)区室，对肿瘤组织的单细胞悬液进行了流式细胞术。门控CD45阴性肿瘤细胞，淋巴细胞和粒细胞(CD45.2⁺，CD19^-，CD5^-，NK1.1^-，SiglecF^-，Ly6G^-和CD11b⁺)后，发现了基于F4/80和CD169表达的两个主要单核细胞/巨噬细胞群。如先前在其他模型中所述，F4/80^-CD169^-群体主要由Ly6C⁺单核细胞(MN)和Ly6C⁺MHCII+不成熟巨噬细胞(intTAM)组成。较大的F4/80+CD169+群体对Ly6C阴性，并显示CD163和MHCII的异质表达，表明存在成熟的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)表型(数据未示出)。总的来说，TAM是迄今为止最丰富的细胞类型，占CD11b⁺部分(fraction)的60％(数据未示出)。平均而言，所有肿瘤浸润性白细胞中有20％是TAM，这是肿瘤浸润性CD8+T细胞数量的100倍(数据未示出)。CD163+巨噬细胞仅占所有TAM的<25％，并且可以分为更丰富的MHCII-群和少数的MHCII+细胞群。

正交性Braf^V600E驱动的黑色素瘤中表达CD163的TAM的表征。

使用源自Braf^V600E驱动的小鼠模型的细胞系来模拟肿瘤生长的变态阶段²⁵，试图确定植入的具有类似驱动子突变的正交异性肿瘤是否会引起在自发变态性肿瘤中发现的相似TAM群体。YUMM1.7细胞系(耶鲁大学小鼠黑色素瘤)源自Braf^V600E激活和失活Pten和Cdkn2a驱动的自发黑色素瘤。YUMM1.7细胞产生具有与自发性Braf^V600E肿瘤相似的生长特征(数据未示出)的肿瘤。YUMM1.7肿瘤的流式细胞仪分析显示，与自发性Braf^V600E肿瘤相似，基于F4/80和CD169表达，不同的肿瘤相关单核细胞/巨噬细胞群。然而，尽管在两个模型中F4/80-CD169+和F4/80+CD169+群体似乎相同，但在正交各向异性肿瘤中也存在明显的F4/80-CD169+群体(数据未示出)。除少数Ly6C+MN(数据未示出)外，该群体主要由intTAM组成，如自发模型中所述(数据未示出)。因此，早期肿瘤中存在较高比例的MN(F4/80-CD169-)和intTAM，而成熟TAM(F4/80+CD169+)的比例稳定增加，成为晚期肿瘤中最丰富的(数据未示出)。有趣的是，正交异性肿瘤同时被CD163^hi和CD163^lo TAM浸润，它们大多是MHCII阴性的(数据未示出)。免疫组织学(IHC)分析表明CD163^hi/lo TAM的空间分布有所不同。CD163^hi细胞主要位于肿瘤边缘，而CD163^lo细胞位于肿瘤组织内部(数据未示出)。此外，MHCII-CD163lo TAM的比例随肿瘤进展而增加，而MHCII-CD163^hi细胞的比例保持恒定(数据未示出)。

为了进一步表征这种黑色素瘤模型中不同的单核细胞/巨噬细胞群，通过流式细胞术分离MN，intTAM和四个成熟的TAM群体，并使用Fluidigm Biomark系统对基因表达进行高密度定量PCR(qPCR)分析(数据未示出)。分析了CD163^hi/lo TAM(MHCII-CD163^lo；MHCII-CD163^hi)和CD163阴性TAM(MHCII-CD163-；MHCII+CD163-)以及MN和intTAM群体(数据未示出)。基因表达数据通过层次聚类和主成分分析进行分析，揭示了一组主要与M2巨噬细胞相关的基因簇在表达CD163的TAM亚型(簇III)中上调，包括：Il4ra，Mrc1，Stab1，Slco2b1(数据未示出)。有趣的是，尤其是在CD163^hi亚型中，已知与对CD8+T细胞功能起作用相关的基因也有上调，包括Il10，Ido1和Lgals1(数据未示出)。

还观察到在与肿瘤相关的单核细胞(MN)(簇I；包括Cxcl10，Il1b，Irf5，Ccr2，Il18)和intTAM(簇II；包括Cxcl9，Ciita，Irf7)中上调的炎性基因的独特簇，这些基因在成熟的TAM中被下调，与M2样表型(集群III)上的获得相吻合。簇I和簇II中代表的许多基因都是IFN反应性的，反映出通常与免疫刺激活性相关的M1样表型。结合主成分和网络分析(数据未示出)，这表明募集的MN逐渐偏向M2样TAM表型。该分析还显示Nr4a1在肿瘤浸润的MN中高表达。核受体Nr4a1(Nur77)通常被视为所谓的巡逻或非经典单核细胞的标志物，因为通常仅在循环中的Ly6C-单核细胞上检测到高表达(数据未示出)。为了进一步调查与肿瘤相关的MN中Nr4a1的表达，分析了来自Tg(Nr4a1-GFP)小鼠的YUMM1.7肿瘤；流式细胞仪分析显示血液中Ly6C+肿瘤相关MN和巡逻(Ly6C^lo)单核细胞中GFP表达水平相当(数据未示出)，其分别在intTAM和成熟TAM中逐渐减少(数据未示出)。提示与肿瘤相关的MN可能源自循环中的非经典单核细胞群，当它们分化为成熟的TAM时，Nr4a1的表达下调。

用靶向脂质纳米颗粒特异性消耗表达CD163的TAM促进肿瘤消退。

为了消耗CD163+TAM，从Cd163-IRES-iCre转录本(CD163-iCre)生成表达iCre重组酶的敲入小鼠，并将其与Csf1r-LSL-DTR小鼠杂交，该小鼠在cre介导的LSL缺失后，在Csf1r启动子的控制下具有DTR表达。24小时后，单次注射4ng/kg的白喉毒素(DT)特异性地消耗了接近50％的CD163+TAM(数据未示出)。除了募集的单核细胞有少量增加外，在其余的髓样区室没有观察到任何作用(数据未示出)。接下来，尝试通过重复的DT注射来实现CD163+TAM的持续消耗。尽管与Csf1r-LSL-DTR野生型小鼠相比，CD163-iCre+/-，Csf1r-LSL-DTR+/-小鼠的肿瘤生长显著降低(数据未示出)，但CD163+巨噬细胞的持续消耗会引起严重的副作用，并被证明不适合连续使用(数据未示出)。

先前开发了一种使用抗CD163 mAb缀合的脂质纳米颗粒(LNP)特异性靶向表达CD163的细胞的方法²⁶(图1A)。这些LNP含有5％的聚乙二醇(PEG；2000mw)，可最小化非特异性吞噬细胞的摄取并提高靶向CD163+细胞的特异性。抗CD163 mAb通过聚乙烯(3400mw)脂质锚定物掺入LNP中，该锚定物共价结合于抗体的赖氨酸侧链(αCD163-LNP)。为了说明αCD163-LNP的特异性，使用了表达小鼠CD163的重组CHO K1细胞(数据未示出)和小鼠巯基乙酸盐诱导的巨噬细胞(数据未示出)。αCD163-LNPs装有自淬灭浓度的钙黄绿素(αCD163-cal-LNP；αCD163-cal)以监测细胞摄取，对照包括单独的钙化负荷LNPs(cal-LNP)和与同种型对照Ab缀合的LNP(ctrl-IgG-cal-LNP；IgG-cal)。由于钙黄绿素的自身猝灭浓度的封装，仅当装载有钙黄绿素的LNP通过内吞作用被摄取且LNP在靶细胞的溶酶体区室中降解时才观察到荧光。当非靶向LNP(cal-LNP或ctrl-IgG-cal-LNP)与表达CD163的CHO K1细胞一起孵育时，未观察到钙黄绿素荧光增加(数据未示出)，而在原代小鼠巨噬细胞中用ctrl-IgG-cal-LNP仅观察到少量增加(数据未示出)。这些分析表明，与calCD163-cal-LNP一起孵育后，高钙黄绿素荧光对表达CD163的细胞具有特异性。为了在黑色素瘤模型中评估αCD163-LNP对表达CD163的TAM的靶向作用，将αCD163-LNP和非靶向的对照LNP静脉内(i.v.)注入荷瘤小鼠体内，然后进行体内荧光成像；注射后4小时，在肿瘤区域可检测到αCD163靶向的LNP和非靶向的LNP的荧光(数据未示出)。然而，通过流式细胞术分析肿瘤组织显示，与非靶向的LNPs相比，在给予αCD163-LNP后，CD163+TAM中钙离子的摄取增加(数据未示出)。接下来，产生细胞毒性LNP，以测试靶向CD163的LNP在体内特异性消耗CD163+巨噬细胞的能力。用DNA破坏剂阿霉素(dxr)加载LNPs并以单一剂量的介载体，空αCD163-LNP(αCD163-ctrl)或载有dxr的靶向和非靶向LNP(分别为αCD163-dxr或IgG-dxr)随机i.v.注射小鼠组，在24小时后，通过流式细胞术测量对脾脏中的CD163+红浆巨噬细胞(RPM)的影响；与对照相比，单次注射αCD163-dxr使CD163+RPM的数量特异性地减少约50％(数据未示出)。接下来，测试了CD163+TAM消耗对荷黑色素瘤小鼠肿瘤生长的影响。为实现CD163+TAM的有效且持续的消耗，将具有可触及肿瘤的小鼠随机分组，并每2天用αCD163-dxr或适当的对照治疗2周。尽管用非靶向的细胞毒性LNPs(IgG-dxr)治疗能够减缓肿瘤生长，但用αCD163-dxr治疗的小鼠在2周后显示出几乎完全的肿瘤消退(图1B和1D)。有趣的是，随后对肿瘤进行的流式细胞术分析显示，用IgG-dxr治疗的小鼠中总TAM数量减少(图1C)，这表明TAM亚组的全靶向性是不加区别的。然而，靶向CD163的LNP仅消耗CD163+TAM的一小部分，对总TAM数量几乎没有影响(图1C)。鉴于与非靶向LNP相比，靶向CD163的LNP对肿瘤消退的深远影响，这意味着TAM亚型的全靶向实际上消除了CD163+TAM消耗所带来的治疗效果。提示在CD163+TAM消耗后，其他TAM亚型也有助于肿瘤消退。

CD163+TAM的靶向消耗可重新教育肿瘤浸润性骨髓细胞。

为了进一步分析CD163+TAM消耗对肿瘤免疫微环境(TME)的影响，与空的靶向CD163的LNP(αCD163-ctrl)和介载体治疗的小鼠相比，在用αCD163-dxr治疗后，通过流式细胞术对肿瘤进行了高含量免疫分型。CD163+TAM的消耗与肿瘤浸润性白细胞区室的高度显著整体扩张有关，从所有细胞的5％增加到30％(数据未示出)。对不同免疫细胞类型的分析表明，这主要是由于CD4+和CD8+，尤其是Ly6C+单核细胞的肿瘤浸润性T细胞(TIL)数量增加(数据未示出)。为了进一步表征CD163+TAM消耗后的肿瘤浸润性骨髓(TIM)细胞区室，使用先前建立的门控策略进行流式细胞仪分析(数据未示出)。在经CD163-dxr处理的小鼠中，与肿瘤相关的MN和intTAM的募集显著增加，合计构成每克组织中超过3亿个细胞(数据未示出)，因此，成熟TAM的比例大幅降低(数据未示出)。有趣的是，与来自对照肿瘤的intTAM(数据未示出)相比，在CD163+TAM消耗后浸润肿瘤的intTAMs显示CD11c表达显著增加(数据未示出)并显示出独特的基因表达谱，包括增加的Cxcl9和Cxcl9表达(数据未示出)，表明活化的单核细胞衍生的树突状细胞(moDC)具有典型的免疫刺激表型。重要的是，来自αCD163-dxrLNP处理的小鼠的intTAMs显示出通常与巡逻或非经典单核细胞(如Nr4a1和Cx3cr1)相关的基因的表达显著降低，而Cxcr4的表达未改变，并且与经典Ly6C^hi单核细胞相关的Fcgr2b升高(数据未示出)。此外，来自αCD163-dxrLNP处理的小鼠的intTAMs还显示Pdl2和CD209d以及T细胞趋化因子Cxcl9和Ccl17的表达增加(数据未示出)。来自CD163+TAM消耗小鼠的intTAM中与非经典单核细胞相关的基因表达降低，表明通过募集经典的炎性单核细胞亚型，对浸润肿瘤的髓样细胞进行再教育。

炎性单核细胞(Ly6C+，Nr4a1-，Cx3cr1^lo)的动员高度依赖趋化因子受体CCR2的表达，并且在CCR2缺陷小鼠(Ccr2^-/-)中严重受损。相反，在Ccr2^-/-小鼠中，巡逻单核细胞(Ly6C^lo，Nr4a1+，Cx3cr1^hi)的分布仅受到轻微影响²⁷。为了评估CC163依赖性单核细胞募集对CD163+TAM消耗后Ly6C+MN和intTAM积累的贡献，产生了野生型(WT)和携带黑色素瘤的Ccr2^-/-小鼠队列，并用αCD163-dxr或介载体处理，如上所述。有趣的是，介载体治疗的小鼠中的肿瘤进展不受CCR2缺陷的影响(数据未示出)。此外，在接受介载体治疗的Ccr2^-/-小鼠中，与肿瘤相关的MN和intTAM的积累仅略有减少，而成熟的TAM则不受影响(数据未示出)。然而，在Ccr2^-/-小鼠中，αCD163-dxr处理对肿瘤生长的抑制作用已被消除(数据未示出)，伴随有CD163+TAM消耗引起的intTAM募集的完全逆转(数据未示出)。这些数据表明，在携带黑色素瘤的小鼠中CD163+TAM的消耗导致CCR2依赖的新鲜Ly6C+单核细胞募集以及具有M1样表型的免疫刺激性巨噬细胞的积累，这显著有助于抑制肿瘤进展。

CD163+TAM消耗促进抗PD-1抗性CTL反应

消耗CD163+TAM后黑色素瘤的免疫分型分析显示肿瘤浸润性T细胞(TIL)显著增加(数据未示出)。为了进一步分析CD163+TAM消耗对TIL募集和激活的影响，进行额外的流式细胞仪分析。在TIL(CD45.2+，CD19-，NK1.1-，SiglecF-，Ly6G-和CD11b-，CD3e+，CD5+)上进行门控，证实了与介载体或空的αCD163-LNP(αCD163-ctrl)相比(数据未示出)，在接受αCD163-dxr治疗的黑色素瘤小鼠中CD4+和CD8+TIL均显著增加。在对照治疗的小鼠中，CD8+TIL表现出IFNγ和PD-1的异质表达(数据未示出)，然而，在用αCD163-dxr治疗的小鼠中，大多数CD8+TIL表达高水平的IFNγ，而没有PD-1(数据未示出)。通过共聚焦显微镜在肿瘤切片中证实黑色素瘤中CD8+TIL的浸润增加(数据未示出)，这与CD163+TAM的消耗有关(数据未示出)。随着激活的CTL浸润的增加，CD163+TAM消耗后，肿瘤中IFNγ(Ifng)的组织表达显著增加(数据未示出)，并伴随着其他炎性细胞因子(包括TNFα，IL-11(IL1b)和IL-18(IL18))的表达增加(数据未示出)，以及记忆T细胞吸引趋化因子CXCL9(Cxcl9)的表达增加(数据未示出)。

CD163+TAM消耗后，Cxcl9表达在组织范围内增加，与新募集的intTAM中Cxcl9表达的平行增加相关(数据未示出)。CXCL9是记忆CD8+T细胞的有效化学引诱剂，并且表明T细胞衍生的IFNγ诱导抗原呈递细胞(APC)Cxcl9表达对CTL反应的传播至关重要。这导致调查由CD163+TAM消耗诱导的CCR2依赖性intTAM募集(数据未示出)是否与TIL区室中观察到的变化有关。通过流式细胞术分析了αCD163-dxr或单独使用介载体治疗的WT和Ccr2^-/-小鼠的黑色素瘤中的TIL。WT和Ccr2^-/-小鼠的CD163+TAM消耗导致CD4+和CD8+TIL升高(数据未示出)，然而与WT小鼠相比，在Ccr2^-/-小鼠中，CD4+TIL并且尤其是生产IFNγ的CD8+TIL的数量显著降低(数据未示出)。这些数据表明，CD163+TAM消耗后，依赖CCR2的intTAM募集分别有助于CD4+和CD8+TIL的募集和激活。

为了确定CD163+TAM消耗后CD4+和CD8+TIL对肿瘤消退的贡献，在用αCD163-dxr治疗期间给予αCD4和αCD8b mAb来消耗CD4+和CD8+TIL。CD4+和CD8+T细胞的消耗都完全消除了通过αCD163-dxr处理对荷黑色素瘤小鼠的肿瘤生长的控制(数据未示出)。清楚地表明，CD163+TAM消耗对肿瘤进展的抑制是由TIL的激活所驱动的。有趣的是，单独消耗CD4+TIL显著减少消耗CD163+TAM后浸润的intTAM和产生IFN+的CD8+TIL的数量(数据未示出)。此外，基因表达分析表明，CD4+和CD8+T细胞的消耗都降低了整体Ifng表达，而Cxcl9和Il1b的整体表达仅在消耗CD4+T细胞的小鼠中降低(数据未示出)。

鉴于在αCD163-dxr治疗后，YUMM1.7细胞²⁸上PD-L1的表达和intTAM上PD-L2的表达增加(数据未示出)，试图调查观察到的治疗效果是否受到PD-1检查点抑制的影响。将αPD-1mAb或对照mAb单独的或与αCD163-dxr组合(图2A)或在αCD163-dxr治疗后(图2B)向荷瘤小鼠给药10天。如先前的研究所示，单独的αPD-1mAb治疗对YUMM1.7肿瘤的生长没有影响(图 2A)。此外，尽管αCD163-dxr可以有效控制肿瘤的生长，无论有或没有用αPD-1同时治疗(图 2A)，当用αCD163-dxr代替αPD-1单独治疗时，肿瘤迅速复发(图2B)。

比较CD163+TAM消耗与使用αCSF1阻断抗体的全巨噬细胞消耗的疗效的治疗研究

为了比较CD163+TAM消耗与使用αCSF1阻断抗体的全巨噬细胞消耗的疗效，每两天用αCD163-dxr治疗带有可触及肿瘤的小鼠，持续5天或每5天用2CSF1(n＝6)i.p.治疗。与CD163+TAM的特异性靶向相比，使用抗CSF1的TAM亚型的全消耗导致对肿瘤生长不那么明显的抑制(图3A)。有趣的是，抗CSF1治疗与所有TAM亚型(包括骨髓衍生的单核细胞(MNs))的强烈减少有关(图3B)。此外，与CD163+TAM的特异性消耗相比，抗CSF1治疗后iTAM的减少与肿瘤浸润性CD4+和产生IFNγ的CD8+T细胞数量减少相关(图3B和3C)。

讨论：

现在有大量的实验和临床证据强调了肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的许多重要的疾病促进功能，强调了它们在癌症进展中的关键作用。因此，对于开发靶向TAM的新型治疗策略的兴趣正在增加。迄今为止，大多数策略都集中在调节巨噬细胞分化和存活的CSF-1/CSF1R信号或调节单核细胞动员和募集的CCL2/CCR2轴上。然而，这些策略在实验模型和临床试验中显示出有限的效果。最近的研究揭示了人类癌症中TAM亚型之间的广泛异质性，这可能对临床进展具有重要意义。实际上，一些临床研究表明，某些TAM亚型可以与患者的良好预后相关。因此，需要更多的数据来进一步了解特定TAM亚型的功能，以帮助将来开发更具针对性的疗法。

尽管TAM具有内在的免疫刺激潜力，但它们的主要促进肿瘤功能之一被认为是免疫抑制。已经提出，肿瘤微环境(TME)使巨噬细胞偏向另一种激活状态，与抑制肿瘤浸润T细胞(TIL)功能而非激活有关。触发TIL激活的免疫检查点抑制剂(ICI)对某些癌症，尤其是恶性黑色素瘤的治疗产生了前所未有的影响。然而，大多数患者仍对现有的ICI疗法无反应，这通常与原发性肿瘤中TIL水平低有关。

选择调查TAM在临床上相关的黑色素瘤小鼠模型中的作用，该模型对当前领先的ICI疗法(抗PD-1)有抗性。首先表征了在本地和原位黑色素瘤中的肿瘤浸润性髓样(TIM)区室；TAM占肿瘤中CD11b+白细胞的60％，平均所有肿瘤浸润白细胞中的20％是TAM，这是CD8+肿瘤浸润T细胞(TIL)数量的100倍。临床数据已将通过TAM的CD163表达与包括黑色素瘤在内的一系列癌症的不良预后紧密联系起来。然而，这些细胞在肿瘤进展中的功能相关性仍不清楚。CD163+TAM仅代表小鼠黑色素瘤中所有TAM的一小部分(<25％)。CD163+TAM的基因表达分析揭示了与M2样巨噬细胞(包括Il4ra，Mrc1，Stab1，Slco2b1)相关的一组基因簇的上调。有趣的是，已知抑制T细胞活化的基因(包括Il10，Ido1和Lgals1)也有特定的上调。这与在肿瘤浸润性单核细胞(MN)(例如Cxcl10，Il1b，Irf5，Ccr2，Il18)和未成熟TAM(intTAM；Cxcl9，Ciita，Irf7)中上调的炎性基因的独特簇形成鲜明对比，这些基因在CD163+TAM中共下调，与在M2样表型中的获得相吻合。在MN和intTAM中上调的许多基因是IFN反应性的，并且反映出通常与免疫刺激活性和抗肿瘤功能有关的M1样表型。这表明募集的MN向M2样TAM表型逐渐极化。

为了评估CD163+TAM对肿瘤进展的特定贡献，开发了靶向CD163的细胞毒性脂质纳米颗粒(LNP)。靶向CD163的LNP仅消耗CD163+TAM的一小部分，对总TAM数量几乎没有影响。然而，CD163+TAM的选择性消耗大大降低肿瘤的生长。有趣的是，观察到非靶向的细胞毒性LNPs(其显著降低TAM总数)在减少肿瘤生长方面不如CD163靶向的LNPs有效。这暗示着，TAM亚型的全靶向实际上消除了CD163+TAM的特异性消耗所赋予的治疗效果。这表明在CD163+TAM消耗后，其他TAM亚型也可能有助于肿瘤消退。为了探讨这一假设，评估了CD163+TAM消耗对黑色素瘤中的TIM区室的影响。观察到在CD163+TAM消耗后浸润肿瘤的intTAM是CD11c^hi，并且增加了Ciita，Cxcl9和CD209d的表达，表明单核细胞衍生的树突状细胞(moDC)具有典型的免疫刺激表型²⁹。在CCR2缺陷型小鼠中，CD11c^hi intTAM的募集被阻断，这消除了由CD163+TAM消耗诱导的肿瘤生长的减少。因此，动员CCR2依赖性炎性单核细胞显著促进了肿瘤的消退。CD163+TAM消耗也增加了黑色素瘤中CD4+和CD8+TIL的数量，这两者都是控制肿瘤生长所必需的。有趣的是，CD4+和CD8+TIL募集都是CCR2依赖性的，这表明需要募集炎性单核细胞，并且可能需要CD11c^hi intTAM的积累。这可能是由于这些细胞中CXCL9的表达增加所介导的，CXCL9是记忆性T细胞募集的关键趋化因子，并与通过Ciita引起MHC II表达增加有关的抗原呈递细胞(APC)活性增强有关。如预期的那样，在CD163+TAM消耗后，对CD4+TIL积累的阻断显著减少了产生IFNγ的CD8+TIL的数量-与CD4+T细胞帮助CD8+TIL激活的作用保持一致。然而，CD4+TIL的消耗，而不是CD8+TIL的消耗，也显著减少了浸润CD11c^hi intTAM的数量。表明CD4+TIL特异性地有助于炎症性单核细胞动员，这进而可促进CD8+TIL的募集和激活。

总而言之，研究证明了黑色素瘤中CD163+TAM具有很强的免疫抑制功能。此外，CD163+TAM的特异性消耗可以使肿瘤浸润性单核细胞向免疫刺激功能和肿瘤消退重编程。这些数据不仅提出了基于TAM亚型特异性靶向的新治疗策略，而且还解释了不加选择地靶向单核细胞衍生的巨噬细胞的治疗方法缺乏疗效。因此，对于炎性单核细胞传播TIL募集和激活的需求可能会限制全单核细胞/巨噬细胞靶向疗法的实用性。

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在整个本申请中，各参考文献描述了本发明所属的技术水平。这些参考文献的公开内容通过引用结合到本公开中。

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序列表

<110> 国家医疗保健研究所

<120> 治疗对免疫检查点疗法具有抗性的癌症的方法和药物组合物

<130> BIO18291 LAWRENCE / MC

<160> 1

<170> PatentIn 3.3版

<210> 1

<211> 1156

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Ser Lys Leu Arg Met Val Leu Leu Glu Asp Ser Gly Ser Ala Asp

1 5 10 15

Phe Arg Arg His Phe Val Asn Leu Ser Pro Phe Thr Ile Thr Val Val

20 25 30

Leu Leu Leu Ser Ala Cys Phe Val Thr Ser Ser Leu Gly Gly Thr Asp

35 40 45

Lys Glu Leu Arg Leu Val Asp Gly Glu Asn Lys Cys Ser Gly Arg Val

50 55 60

Glu Val Lys Val Gln Glu Glu Trp Gly Thr Val Cys Asn Asn Gly Trp

65 70 75 80

Ser Met Glu Ala Val Ser Val Ile Cys Asn Gln Leu Gly Cys Pro Thr

85 90 95

Ala Ile Lys Ala Pro Gly Trp Ala Asn Ser Ser Ala Gly Ser Gly Arg

100 105 110

Ile Trp Met Asp His Val Ser Cys Arg Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp

115 120 125

Asp Cys Lys His Asp Gly Trp Gly Lys His Ser Asn Cys Thr His Gln

130 135 140

Gln Asp Ala Gly Val Thr Cys Ser Asp Gly Ser Asn Leu Glu Met Arg

145 150 155 160

Leu Thr Arg Gly Gly Asn Met Cys Ser Gly Arg Ile Glu Ile Lys Phe

165 170 175

Gln Gly Arg Trp Gly Thr Val Cys Asp Asp Asn Phe Asn Ile Asp His

180 185 190

Ala Ser Val Ile Cys Arg Gln Leu Glu Cys Gly Ser Ala Val Ser Phe

195 200 205

Ser Gly Ser Ser Asn Phe Gly Glu Gly Ser Gly Pro Ile Trp Phe Asp

210 215 220

Asp Leu Ile Cys Asn Gly Asn Glu Ser Ala Leu Trp Asn Cys Lys His

225 230 235 240

Gln Gly Trp Gly Lys His Asn Cys Asp His Ala Glu Asp Ala Gly Val

245 250 255

Ile Cys Ser Lys Gly Ala Asp Leu Ser Leu Arg Leu Val Asp Gly Val

260 265 270

Thr Glu Cys Ser Gly Arg Leu Glu Val Arg Phe Gln Gly Glu Trp Gly

275 280 285

Thr Ile Cys Asp Asp Gly Trp Asp Ser Tyr Asp Ala Ala Val Ala Cys

290 295 300

Lys Gln Leu Gly Cys Pro Thr Ala Val Thr Ala Ile Gly Arg Val Asn

305 310 315 320

Ala Ser Lys Gly Phe Gly His Ile Trp Leu Asp Ser Val Ser Cys Gln

325 330 335

Gly His Glu Pro Ala Ile Trp Gln Cys Lys His His Glu Trp Gly Lys

340 345 350

His Tyr Cys Asn His Asn Glu Asp Ala Gly Val Thr Cys Ser Asp Gly

355 360 365

Ser Asp Leu Glu Leu Arg Leu Arg Gly Gly Gly Ser Arg Cys Ala Gly

370 375 380

Thr Val Glu Val Glu Ile Gln Arg Leu Leu Gly Lys Val Cys Asp Arg

385 390 395 400

Gly Trp Gly Leu Lys Glu Ala Asp Val Val Cys Arg Gln Leu Gly Cys

405 410 415

Gly Ser Ala Leu Lys Thr Ser Tyr Gln Val Tyr Ser Lys Ile Gln Ala

420 425 430

Thr Asn Thr Trp Leu Phe Leu Ser Ser Cys Asn Gly Asn Glu Thr Ser

435 440 445

Leu Trp Asp Cys Lys Asn Trp Gln Trp Gly Gly Leu Thr Cys Asp His

450 455 460

Tyr Glu Glu Ala Lys Ile Thr Cys Ser Ala His Arg Glu Pro Arg Leu

465 470 475 480

Val Gly Gly Asp Ile Pro Cys Ser Gly Arg Val Glu Val Lys His Gly

485 490 495

Asp Thr Trp Gly Ser Ile Cys Asp Ser Asp Phe Ser Leu Glu Ala Ala

500 505 510

Ser Val Leu Cys Arg Glu Leu Gln Cys Gly Thr Val Val Ser Ile Leu

515 520 525

Gly Gly Ala His Phe Gly Glu Gly Asn Gly Gln Ile Trp Ala Glu Glu

530 535 540

Phe Gln Cys Glu Gly His Glu Ser His Leu Ser Leu Cys Pro Val Ala

545 550 555 560

Pro Arg Pro Glu Gly Thr Cys Ser His Ser Arg Asp Val Gly Val Val

565 570 575

Cys Ser Arg Tyr Thr Glu Ile Arg Leu Val Asn Gly Lys Thr Pro Cys

580 585 590

Glu Gly Arg Val Glu Leu Lys Thr Leu Gly Ala Trp Gly Ser Leu Cys

595 600 605

Asn Ser His Trp Asp Ile Glu Asp Ala His Val Leu Cys Gln Gln Leu

610 615 620

Lys Cys Gly Val Ala Leu Ser Thr Pro Gly Gly Ala Arg Phe Gly Lys

625 630 635 640

Gly Asn Gly Gln Ile Trp Arg His Met Phe His Cys Thr Gly Thr Glu

645 650 655

Gln His Met Gly Asp Cys Pro Val Thr Ala Leu Gly Ala Ser Leu Cys

660 665 670

Pro Ser Glu Gln Val Ala Ser Val Ile Cys Ser Gly Asn Gln Ser Gln

675 680 685

Thr Leu Ser Ser Cys Asn Ser Ser Ser Leu Gly Pro Thr Arg Pro Thr

690 695 700

Ile Pro Glu Glu Ser Ala Val Ala Cys Ile Glu Ser Gly Gln Leu Arg

705 710 715 720

Leu Val Asn Gly Gly Gly Arg Cys Ala Gly Arg Val Glu Ile Tyr His

725 730 735

Glu Gly Ser Trp Gly Thr Ile Cys Asp Asp Ser Trp Asp Leu Ser Asp

740 745 750

Ala His Val Val Cys Arg Gln Leu Gly Cys Gly Glu Ala Ile Asn Ala

755 760 765

Thr Gly Ser Ala His Phe Gly Glu Gly Thr Gly Pro Ile Trp Leu Asp

770 775 780

Glu Met Lys Cys Asn Gly Lys Glu Ser Arg Ile Trp Gln Cys His Ser

785 790 795 800

His Gly Trp Gly Gln Gln Asn Cys Arg His Lys Glu Asp Ala Gly Val

805 810 815

Ile Cys Ser Glu Phe Met Ser Leu Arg Leu Thr Ser Glu Ala Ser Arg

820 825 830

Glu Ala Cys Ala Gly Arg Leu Glu Val Phe Tyr Asn Gly Ala Trp Gly

835 840 845

Thr Val Gly Lys Ser Ser Met Ser Glu Thr Thr Val Gly Val Val Cys

850 855 860

Arg Gln Leu Gly Cys Ala Asp Lys Gly Lys Ile Asn Pro Ala Ser Leu

865 870 875 880

Asp Lys Ala Met Ser Ile Pro Met Trp Val Asp Asn Val Gln Cys Pro

885 890 895

Lys Gly Pro Asp Thr Leu Trp Gln Cys Pro Ser Ser Pro Trp Glu Lys

900 905 910

Arg Leu Ala Ser Pro Ser Glu Glu Thr Trp Ile Thr Cys Asp Asn Lys

915 920 925

Ile Arg Leu Gln Glu Gly Pro Thr Ser Cys Ser Gly Arg Val Glu Ile

930 935 940

Trp His Gly Gly Ser Trp Gly Thr Val Cys Asp Asp Ser Trp Asp Leu

945 950 955 960

Asp Asp Ala Gln Val Val Cys Gln Gln Leu Gly Cys Gly Pro Ala Leu

965 970 975

Lys Ala Phe Lys Glu Ala Glu Phe Gly Gln Gly Thr Gly Pro Ile Trp

980 985 990

Leu Asn Glu Val Lys Cys Lys Gly Asn Glu Ser Ser Leu Trp Asp Cys

995 1000 1005

Pro Ala Arg Arg Trp Gly His Ser Glu Cys Gly His Lys Glu Asp

1010 1015 1020

Ala Ala Val Asn Cys Thr Asp Ile Ser Val Gln Lys Thr Pro Gln

1025 1030 1035

Lys Ala Thr Thr Gly Arg Ser Ser Arg Gln Ser Ser Phe Ile Ala

1040 1045 1050

Val Gly Ile Leu Gly Val Val Leu Leu Ala Ile Phe Val Ala Leu

1055 1060 1065

Phe Phe Leu Thr Lys Lys Arg Arg Gln Arg Gln Arg Leu Ala Val

1070 1075 1080

Ser Ser Arg Gly Glu Asn Leu Val His Gln Ile Gln Tyr Arg Glu

1085 1090 1095

Met Asn Ser Cys Leu Asn Ala Asp Asp Leu Asp Leu Met Asn Ser

1100 1105 1110

Ser Glu Asn Ser His Glu Ser Ala Asp Phe Ser Ala Ala Glu Leu

1115 1120 1125

Ile Ser Val Ser Lys Phe Leu Pro Ile Ser Gly Met Glu Lys Glu

1130 1135 1140

Ala Ile Leu Ser His Thr Glu Lys Glu Asn Gly Asn Leu

1145 1150 1155

Claims (15)

1.一种增加患有癌症的患者中的肿瘤浸润性CD8+T细胞的量的方法，包括向所述患者给予治疗有效量的能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂。

2.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向所述受试者给予治疗有效的组合，所述组合包含至少一种免疫检查点抑制剂和能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述癌症是黑色素瘤。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂选自PD-1拮抗剂，PD-L1拮抗剂，PD-L2拮抗剂，CTLA-4拮抗剂，VISTA拮抗剂，TIM-3拮抗剂，LAG-3拮抗剂，IDO拮抗剂，KIR2D拮抗剂，A2AR拮抗剂，B7-H3拮抗剂，B7-H4拮抗剂和BTLA拮抗剂组成的组。

5.根据权利要求2所述的方法，包括：i)定量从患者获得的肿瘤组织样品中的CD8+T细胞的密度；ii)将在步骤i)中定量的密度与预定参考值进行比较；和iii)当在步骤i)中的CD8+T细胞的密度低于其相应的预定参考值时，向患者给予治疗有效量的能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂和免疫检查点抑制剂的组合。

6.根据权利要求2所述的方法，包括：i)定量从患者获得的肿瘤组织样品中CD8+T细胞的密度和CD163+肿瘤相关巨噬细胞的密度；ii)将在步骤i)中定量的密度与其预定参考值进行比较；和iii)当在步骤i)中定量的CD163+肿瘤相关巨噬细胞的密度高于其相应的预定参考值和在步骤i)中定量的CD8+T细胞的定量密度低于其相应的预定参考值时，向患者给予治疗有效量的能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂和免疫检查点抑制剂的组合。

7.一种在有需要的受试者中治疗对免疫检查点疗法具有抗性的癌症的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂。

8.一种用于作为治疗方案的一部分增强向患有癌症的受试者给予的免疫检查点抑制剂的效力/功效的方法，所述方法包括向所述受试者给予药学有效量的能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂联合至少一种免疫检查点抑制剂。

9.一种在患有癌症的受试者中预防对所给予的免疫检查点抑制剂的抗性的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的能够消耗CD163+肿瘤相关巨噬细胞群的药剂。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药剂是对CD163具有结合亲和力并且导致所述受试者的肿瘤中CD163+TAM的消耗的抗体。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗体结合CD163的细胞外结构域。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗体介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。

13.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗体是包含针对CD163的第一抗原结合位点的多特异性抗体。

14.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗体是抗体-药物缀合物。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述抗体与细胞毒性部分缀合。

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