KR20240023123A

KR20240023123A - 화농성 한선염의 치료에 사용하기 위한 이중특이적 항체

Info

Publication number: KR20240023123A
Application number: KR1020247001682A
Authority: KR
Inventors: 사빈 베크; 미하엘 키페; 이리 코파리크; 크리스티안 뢰셰; 마르가리다 로드리게스; 리하르트 슈타인; 유 탕; 프랑크 발드론-린치
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2021-06-22
Filing date: 2022-06-20
Publication date: 2024-02-20
Also published as: CA3219360A1; TW202306989A; WO2022269451A1; JP2023535884A; IL308134A; US20240294626A1; EP4359436A1

Abstract

본 발명은 대상체에서 화농성 한선염의 증상의 치료에 사용하거나 완화에 사용하기 위한 2가 이중특이적 단클론성 항체(bbmAb) 또는 이의 변이체에 관한 것이다.

Description

화농성 한선염의 치료에 사용하기 위한 이중특이적 항체

본 발명은 화농성 한선염을 앓고 있는 환자의 치료에 사용하기 위한, 2가 이중특이적 단클론성 항체(bbmAb), 또는 이의 변이체에 관한 것이다. 본 개시내용은 또한 IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 동시에 표적화하는 이중특이적 항체를 이용함으로써 화농성 한선염을 치료하기 위한 방법 및 치료 섭생(regimen)에 관한 것이다.

"전위 여드름(acne inversa)" 또는 "베르뇌유병(maladie de Verneuilh)"으로도 불리는 화농성 한선염(HS)은 전형적으로 신체의 아포크린샘 보유 부분에 심층성, 염증성, 통증성 병변이 나타나는 만성, 재발성의 쇠약하게 하는 염증성 피부 질병이다. 영향을 받는 가장 일반적인 부위는 겨드랑이, 서혜부, 및 항문생식기 영역이다(문헌[Jemec 2012; Fimmel and Zouboulis 2010]).

HS는 현재 유전적으로 취약한 개체에서 발생하는 근본적인 면역계 불균형이 있는 모피지 모낭(pilosebaceous follicle)의 염증성 질환으로 간주된다(문헌[Kelly et al 2014]). 주로 모낭 폐쇄에 의해 유발되는 질환으로 간주되지만, HS는 염증성 병변에서 다수의 호중구 및 대식세포를 특징으로 하는 염증성 피부 질환이다(문헌[Lima et al 2016, Shah et al 2017]). HS 병태생리는 여전히 대부분 알려지지 않았지만, 종양 괴사 인자 알파(TNFα) 차단의 이점은 대규모 연구에서 기재된 바 있다(문헌[Kimball et al 2016]).

항-IL1 치료(문헌[Tzanetakou et al 2016]) 및 IL-17A 차단(문헌[Thorlacius et al 2017, Schuch et al 2018, Giuseppe et al 2018, Jørgensen et al 2018]) 또는 항 IL-23 치료(문헌[Sharon et al 2012, Blok et al 2016])의 효능의 증거는 더 작은 규모의 연구 및/또는 사례 보고에서도 관찰된 바 있다. 보다 최근에는, 경구 PDE4 저해제인 아프레밀라스트(문헌[Weber et al 2017]) 또는 항-보체 5a 화합물(문헌[Kanni et al 2018])을 사용한 연구용 접근법이 기재된 바 있다.

이 질환은 사춘기 후 시작되며 여성이 남성보다 더 자주 영향을 받는다(3:1). 위험 인자는 비만 및 흡연을 포함한다. 역학적 유병률 추정치는 매우 다양하고(0.03 내지 4.3%; 문헌[Jemec 2012, Jemec and Kimball 2015]) 지리적 차이가 존재하지만, 과학계에서는 대략 0.1 내지 1%의 유병률이 받아들여진다(문헌[Garg et al 2018]).

HS의 임상 소견은 이질적이지만, 질환은 만성 재발성, 심층성, 통증성, 염증성 피부 병변, 대부분 염증성 결절 및 농양으로 나타나는 경향이 있으며, 이는 배농 및 화농으로 이어질 가능성이 있다. 염증성 병변은 누공 형성 및 누관 발생에 의해 질환 진행 동안 악화되며, 기능적 사용에 영향을 미칠 가능성이 있는 비후성 흉터 형성으로 이어질 수 있다.

HS는 통증, 상처로부터의 악취성 분비물, 및 흉터 형성과 연관되어 있으며, 흔히 파괴적인 심리사회적 영향을 갖는다. HS는 삶의 질(QoL)에 높은 부정적인 영향을 미치는, 극심하게 쇠약하게 하는 질환이며, 다수의 연구가 그 영향이 다른 피부 질환에서 보이는 것보다 더 크다는 것을 확인시켜 주었다(문헌[Deckers and Kimball 2016]). 또한, HS가 있는 환자는 대개 우울증, 사회적 고립으로 고통받고, 손상된 성 건강을 가지며, 그들의 작업을 수행하는 데 어려움을 겪을 수 있다(문헌[Esmann and Jemec 2011, Fimmel and Zouboulis 2010, Janse et al 2017]).

HS는 치료하기 어렵다. 공식적인 유럽 치료 지침은 2015년에야 개발되었는데, 환자에게 아쥬반트, 의료 및 수술 요법이 제공되어야 한다고 제안한다(문헌[Zouboulis et al 2015]).

경증 사례의 경우에는 국소 항생제가 사용될 수 있지만, 중등도 내지 중증의 HS의 경우에는 장기간의 다중 전신 항균 요법이 선호되고, 일반적으로 테트라사이클린 또는 클린다마이신과 리팜피신의 조합을 이용하는데, 이에는 수 개월 또는 심지어 수 년 동안의 만성 항생제 치료를 이용한 유지가 이어질 수 있다(문헌[Bettoli et al 2016, Dessinioti et al 2016, Zouboulis et al 2015]).

그러나, HS는 감염성 질환이 아니라 만성 염증성 질병으로 널리 인식되고 있다(문헌[Jemec 2012]). 그러므로, 항-염증제는 항생제의 대안이고 아마도 항생제보다 더 적절한 접근법이거나, 항생제를 보완할 수 있다. 시간이 지남에 따라, 만성, 재발성의 불충분하게 치료된 염증의 결과는 회복 불가능한 섬유증이며, 이는 흉터 형성 및 관(tunnel), 또는 누공으로서 나타나며, 이들은 대개 의료 요법에 반응하지 않는다. 일단 지속적인 해부학적 변화가 발생하면, 섬유성 조직의 부피를 감소시키고 영향을 받은 피부 부위의 기능을 개선할 유일한 치료적 옵션은 수술이다(문헌[Andersen and Jemec 2017]). 미래의 치료 목표 중 하나는 지속적인 흉터 형성을 감소시키고 수술을 피하는 것이어야 하는데, 이는 염증성 병변의 예방에 의해 달성될 수 있거나 특이적인 치료를 필요로 할 수 있다.

2015년에는, 가용성 및 막 결합 TNF-α에 대한 재조합 인간 단클론성 면역글로불린 G1(IgG1) 항체인 아달리무맙(Humira®)이 중등도 내지 중증의 HS 치료에 대해 규제 승인을 받았다. PIONEER I 및 II 연구에서 각각 보고된 바와 같이(문헌[Kimball et al 2016]), 아달리무맙을 이용한 효능은 HiSCR(화농성 한선염 임상 반응) 반응률이 위약에 비해 대략 16%(41.8% 아달리무맙 대 26% 위약) 및 31%(58.9% 아달리무맙 대 27.6% 위약)인 것으로 보였다. 아달리무맙 라벨에 나와 있는 바와 같이, 아달리무맙은 결핵, 침습성 진균 감염 및 기타 기회 감염을 포함하는 심각한 감염에 대한 증가된 안전성 위험과 연관되어 있다. 또한, 아달리무맙 이용 시 악성종양의 발생률 증가가 보고된 바 있다.

그러므로, 중등도 내지 중증의 HS를 앓고 있는 환자에게 유리한 안전성 프로파일을 갖는 동시에 염증을 효과적으로 감소시키는 전신 요법에 대한 충족되지 않은 요구가 존재한다.

HS에서, 사이토카인 IL-1ß 및 IL-18 둘 모두 상향조절되며(문헌[Kelly et al. 2015]), 따라서 이의 발병기전의 원인일 수 있다. IL-1ß 시그니처는 HS 병변 내에 존재하며 IL-1 수용체 길항제의 적용에 의해 역전될 수 있다(문헌[Witte-Handel et al. 2019]). 재조합 IL-1R 길항제인 아나킨라는 소규모 연구에서 위약 대비 유망한 임상 효능 결과를 나타낸 동시에(문헌[Tzanetakou et al. 2016]), 사례 보고가 이들 발견을 확인시켜 준 바 있다(문헌[Leslie et al 2014, Zarchi et al 2013,

et al 2019]). 사례 보고는 항 IL-1ß 항체인 카나키누맙 단독을 사용한 IL-1ß 차단이 중등도 내지 중증의 HS(문헌[Houriet et al 2017]) 또는 연관된 증후군, 예컨대 PASH(괴저성 농피증, 여드름 및 화농성 땀샘염(suppurative hidradenitis)(문헌[Jaeger et al 2013])에 유익할 수 있음을 나타낸 바 있다. 그러나, 카나키누맙 이용 시(문헌[Sun et al 2017, Tekin et al 2017]) 및 아나킨라 이용 시(문헌[van der Zee and Prens 2013, Russo and Alikhan 2016]) HS에서 일부 관찰된 실패는 하위집단만이 항-IL-1 차단에 반응성일 수 있거나 이 차단 단독으로는 대부분의 환자에서 결과를 달성하기에 충분하지 않을 수 있다는 사실을 암시할 가능성이 있다.

따라서, 본 개시내용의 목적은 인플라마솜 이펙터 사이토카인인 IL-1ß 및 IL-18 둘 모두를 표적화하는 것이며, 그러므로 이는 (자가)-염증성 질병에서 또는 IL-1β 및 IL-18 둘 모두가 독립적으로 질환 병태생리에 기여하는 경우, 예컨대 HS에서 우수한 임상 효능을 제공할 수 있다. 본 개시내용의 추가의 목적은 이중특이적 항-IL-1β/18 길항제가 IL-1β 및 IL-18의 인플라마솜 의존적 공급원뿐만 아니라 인플라마솜 독립적 공급원을 신속하게 중화할 수 있다는 것이다.

이에 따라, IL-1ß 및 IL-18 둘 모두를 저해할 수 있는 임의의 길항제, 예컨대 이중특이적 항-IL-1β/18 항체 또는 이의 단편이 HS의 치료에 적합할 수 있다.

대상체에서 화농성 한선염(HS)을 예방 또는 치료하는 데 사용하기 위한, IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 동시에 표적화하는 이중특이적 항체 또는 이의 기능적 단편이 본원에 기재된다. 바람직한 구현예에서, 항-IL-1β/18 항체는 ADCC 활성을 침묵시키는 중쇄 CH3 돌연변이, 예컨대 lgG1 Fc 아미노산 서열에 L234A 및 L235A 돌연변이를 포함하는 소위 LALA 돌연변이체를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 항-IL-1β/18 항체는 상보적 중쇄 CH3 노브-인-홀(knob-in-hole) 돌연변이, 예를 들어, (EU 넘버링에 따라) 노브-유형 돌연변이인 S354C 및 T366W를 갖는 제1 중쇄, 및 홀-유형 돌연변이인 Y349C, T366S, L368A, Y407V를 갖는 제2 중쇄를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 항-IL-1β/18 항체는 우선적으로 제1 중쇄와 회합하는 제1 경쇄를 포함하고 카파 경쇄, 예를 들어, Vk6, 및 우선적으로 제2 중쇄와 회합하는 제2 경쇄를 포함하며 람다 경쇄, 예를 들어, Vλ1을 포함한다. 보다 더 바람직한 구현예에서, 항-IL-1β/18 항체는 i) 하나 이상의 ADCC 침묵 돌연변이(예를 들어, LALA), ii) 하나 이상의 노브-인-홀 중쇄 변형, iii) 및/또는 카파 및 람다 경쇄의 조합을 포함한다. 보다 더 바람직한 구현예에서, 항-IL-1β/18 항체는 전술한 특징 i) 내지 iii) 모두를 포함하며, 바람직하게는 항체는 Vk6 및 Vλ1 경쇄를 포함한다.

또한, 화농성 한선염(HS)의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 동시에 표적화하는 이중특이적 항체의 치료적 유효량을 투여함으로써 화농성 한선염(HS)을 예방 또는 치료하는 방법이 본원에 기재된다.

추가로 본원에 기재된 IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 동시에 표적화하는 이중특이적 항체(예를 들어, bbmAb1)의 방법 또는 용도에 대한 특이적인 투약 섭생이 본원에서 제공된다.

추가적으로 HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, a) IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 동시에 표적화하는 이중특이적 항체(예를 들어, bbmAb1), 및 b) 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체의 존재 하에서 적어도 하나의 추가의 치료제를 포함하는 약제학적 조합 및 약제학적 조성물이 본원에 기재된다. 기재된 방법 및 용도의 추가의 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.

제1 양태에서, 본 개시내용은 HS의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 HS를 예방 또는 치료하기 위한 방법에 관한 것이며, 방법은 상기 대상체에 이중특이적 항체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 항체는

a. IL1β에 특이적으로 결합하는, (VL1)의 제1 가변 경쇄 및 제1 가변 중쇄(VH1), 및 이종-이량체화 변형이 있는 제1 불변 중쇄(CH1)가 있는 면역글로불린인 제1 부분, 및

b. IL-18에 특이적으로 결합하는, 제2 가변 경쇄(VL2) 및 제2 가변 중쇄(VH2), 및 제1 불변 중쇄의 이종-이량체화 변형에 대해 상보적인 이종-이량체화 변형이 있는 제2 불변 중쇄(CH2)가 있는 면역글로불린인 제2 부분을 포함한다.

제2 양태에서, 본 개시내용은 HS의 발달을 늦추거나, 저지하거나, 감소시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 HS의 발달을 늦추거나, 저지하거나, 감소시키는 방법에 관한 것이며, 방법은 상기 대상체에 이중특이적 항체의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 항체는

본 개시내용의 제1 및 제2 양태의 특정한 구현예에서, 이중특이적 항체의 제1 및 제2 불변 중쇄는 인간 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM, 바람직하게는 IgD, IgE, 또는 IgG, 예컨대 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4, 바람직하게는 IgG1이다.

본 개시내용의 또 다른 구현예에서, 이중특이적 항체의 제1 및 제2 불변 중쇄는 IgG1이고,

a. 제1 불변 중쇄는 노브 구조를 생성하는 점 돌연변이를 갖고 제2 불변 중은 홀 구조를 생성하는 점 돌연변이를 갖거나,

b. 제1 불변 중쇄는 홀 구조를 생성하는 점 돌연변이를 갖고 제2 불변 중은 노브 구조를 생성하는 점 돌연변이를 갖고, 선택적으로

c. 제1 및 제2 불변 중쇄는 디설피드 가교를 초래하는 돌연변이를 갖는다.

제1 및 제2 양태를 포함하는, 본 개시내용의 구체적으로 바람직한 구현예에서, 이중특이적 항체의 제1 면역글로불린 VH1 도메인은

i. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:76을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:77을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:78을 가짐); 또는

ii. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:79를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:80을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:81을 가짐)을 포함하고;

이중특이적 항체의 제1 면역글로불린 VL1 도메인은

iii. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:92를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:93을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:94를 가짐) 또는

iv. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:95를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:96을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:97을 가짐)을 포함하고;

이중특이적 항체의 제2 면역글로불린 VH2 도메인은

v. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:44를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:45를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:46을 가짐); 또는

vi. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:47을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:48을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:49를 가짐)을 포함하고; 이중특이적 항체의 제2 면역글로불린 VL2 도메인은

vii. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:60을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:61을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:62를 가짐) 또는

viii. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:63을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:64를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:65를 가짐)을 포함한다.

본 개시내용의 또 다른 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 방법, 조성물, 및 용도에서 사용되는 항체는

a. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 85의 제1 면역글로불린 VH1 도메인,

b. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 101의 제1 면역글로불린 VL1 도메인,

c. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 53의 제2 면역글로불린 VH2 도메인, 및

d. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 69의 제2 면역글로불린 VL2 도메인을 포함한다.

본 개시내용의 또 다른 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 방법, 조성물, 또는 용도에서 사용되는 항체는

e. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 87의 제1 면역글로불린 중쇄,

f. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 103의 제1 면역글로불린 경쇄,

g. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 55의 제2 면역글로불린 중쇄, 및

h. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 71의 제2 면역글로불린 경쇄를 포함한다.

본 개시내용의 구체적으로 바람직한 구현예에서, 치료되는 대상체는 HS를 갖는다.

제3 양태에서, 본 개시내용은, HS의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 HS를 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한, 하기를 포함하는 이중특이적 항체에 관한 것이다:

b. IL-18에 특이적으로 결합하는, 제2 가변 경쇄(VL2) 및 제2 가변 중쇄(VH2), 및 제1 불변 중쇄의 이종-이량체화 변형에 대해 상보적인 이종-이량체화 변형이 있는 제2 불변 중쇄(CH2)가 있는 면역글로불린인 제2 부분.

제4 양태에서, 본 개시내용은 제1, 제2, 및 제3 양태의 방법 및 치료에 관한 것이며, 여기서 IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 동시에 표적화하는 이중특이적 항체의 약 1 mg/kg 내지 약 35 mg/kg이 대상체에 투여된다. 제4 양태의 바람직한 구현예에서, 치료되는 대상체에는 이중특이적 항체의 약 10 mg/kg이 투여된다.

본 개시내용의 일 양태에서, IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 동시에 표적화하는 이중특이적 항체는 대상체에 정맥내로 또는 피하로 투여된다. 일 구현예에서, 투여 경로는 피하 또는 정맥내의 조합, 예를 들어, 정맥내 로딩 용량 후 피하 유지 용량이다.

구현예에서, IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 동시에 표적화하는 이중특이적 항체는, 예를 들어, 정맥내로, 인간 대상체의 킬로그램당 약 1.5 mg 내지 약 15 mg의 활성 성분의 용량으로, 치료되는 대상체에 투여된다. 구현예에서, IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 동시에 표적화하는 이중특이적 항체는, 예를 들어, 정맥내로, 인간 대상체의 킬로그램당 약 2 mg, 4 mg, 또는 5 mg의 활성 성분의 용량으로, 치료되는 대상체에 투여된다. 구현예에서, IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 동시에 표적화하는 이중특이적 항체는, 예를 들어, 정맥내로, 인간 대상체의 킬로그램당 약 4 mg의 활성 성분의 용량으로, 치료되는 대상체에 투여된다. 예를 들어, 인간 대상체의 킬로그램당 약 1.5 mg 내지 약 15 mg의 활성 성분의 용량은 매주, 2주마다 또는 4주마다, 또는 이의 조합으로 주어질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 예를 들어, 인간 대상체의 킬로그램당 약 1.5 mg 내지 약 15 mg의 활성 성분의 용량은 2주마다 또는 4주마다, 또는 이의 조합일 수 있다.

일 구현예에서, 용량은 약 75 mg 내지 약 600 mg의 활성 성분, 바람직하게는 약 150 mg 내지 약 300 mg의 활성 성분이거나, 약 150 mg 또는 300 mg의 활성 성분, 바람직하게는 300 mg의 활성 성분이다. 용량은 매주, 2주마다 또는 4주마다, 또는 이의 조합으로 주어질 수 있다. 바람직한 구현예에서, 고정 용량(예를 들어, 비-체중 기반 용량)은 피하로 또는 근육내로, 바람직하게는 피하로 투여된다.

일 구현예에서, 용량은 약 300 mg의 활성 성분이다.

바람직한 일 구현예에서, 용량은 150 mg의 활성 성분이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 용량은 300 mg의 활성 성분이다. 추가로 또 다른 바람직한 구현예에서, 용량은 600 mg의 활성 성분이다. 추가로 또 다른 구현예에서, 용량은 약 150 mg의 활성 성분 내지 약 600 mg의 활성 성분이다.

일 구현예에서, 항체는 로딩 투약 및 유지 투약을 통해 투여된다. 일 구현예에서, 로딩 투약은 제1 용량의 1회 이상의 정맥내 주사를 통해 시행되고, 유지 투약은 제2 용량의 피하 주사를 통해 시행된다. 일 구현예에서, 로딩 투약은 제1 용량의 피하 주사를 통해 시행되고, 유지 투약은 제2 용량의 피하 주사를 통해 시행된다.

일 구현예에서, 로딩 투약은 제1 용량 섭생의 피하 주사를 통해 시행되고, 유지 투약은 제2 용량 섭생의 피하 주사를 통해 시행된다. 제1 용량 섭생량은 제2 용량 섭생량과 동일하거나 제2 용량 섭생량보다 높을 수 있다. 제1 용량 섭생 기간은 제2 용량 섭생 기간과 동일하거나 제2 용량 섭생 기간보다 더 빈번할 수 있다.

일 구현예에서, 제1 용량은 약 150 mg 내지 약 600 mg의 활성 성분, 예컨대 약 300 mg의 활성 성분이고, 제2 용량은 약 150 mg 내지 약 600 mg의 활성 성분, 예컨대 약 300 mg의 활성 성분이다.

일 구현예에서, 제1 용량은 150 mg, 300 mg 또는 600 mg의 활성 성분이고, 제2 용량은 150 mg, 300 mg 또는 600 mg의 활성 성분이다. 일 구현예에서, 제1 용량은 300 mg의 활성 성분이고, 제2 용량은 300 mg의 활성 성분이다.

일 구현예에서, 로딩 투약은 적어도 2회의 투여를 포함하고, 유지 투약은 매주(Q1W), 바람직하게는 격주(Q2W), 또는 매월(Q4W) 투여로 이루어진다. 일 구현예에서, 로딩 투약은 2회의 투여로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 로딩 투약은 3회의 투여로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 로딩 투약은 4회의 투여로 이루어진다. 일부 사례에서, 로딩 투약은 1일차부터 29일차까지의 3회 용량으로 이루어지는 격주 로딩 용량이다.

일 구현예에서, 로딩 투약은 적어도 2회의 피하 주사, 바람직하게는 3회의 피하 주사를 포함하고, 유지 투약은 매주(Q1W), 격주(Q2W), 또는 바람직하게는 매월(Q4W) 피하 주사로 이루어진다. 일 구현예에서, 로딩 투약은 2회의 피하 주사로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 로딩 투약은 3회의 피하 주사, 예를 들어, 3회의 격주(Q2W) 150 mg 또는 300 mg 피하 주사로 이루어진다. 또 다른 구현예에서, 로딩 투약은 4회의 피하 주사로 이루어진다. 일부 사례에서, 로딩 투약은 1일차부터 29일차까지의 3회 피하 주사 용량으로 이루어지는 격주 로딩 용량이다. 일부 사례에서, 유지 투약은 57일차에, 예를 들어, 3회의 격주(Q2W) 150 mg 또는 300 mg 피하 주사 후에 시작하는 피하 Q4W 주사 용량을 포함하는 매월(Q4W) 유지 용량이다. 일부 사례에서, 로딩 투약은 1일차, 15일차, 및 29일차의 3회 피하 주사 용량으로 이루어지는 격주 로딩 용량이고, 유지 투약은 57일차에 시작하는 피하 Q4W 주사 용량을 포함하는 매월(Q4W) 유지 용량이다. 일부 사례에서, 로딩 투약은 1일차, 15일차, 및 29일차의 3회 피하 주사 용량으로 이루어지는 격주(예를 들어, 150 mg 또는 300 mg) 로딩 용량이고, 유지 투약은 57일차에 시작하는 피하 Q4W 주사 용량을 포함하는 매월(Q4W)(예를 들어, 150 mg 또는 300 mg) 유지 용량이다.

일 구현예에서, 로딩 투약은 1일차부터 29일차까지의 3회 용량으로 이루어지는 격주 로딩 용량이며, 여기서 용량의 양은 활성 성분 1 킬로그램당 약 1.5 mg 내지 약 15 mg이고, 예를 들어, 여기서 로딩 용량은 정맥내로, 피하로, 또는 정맥내 또는 피하의 조합으로 투여된다. 일 구현예에서, 로딩 투약은 1일차부터 29일차까지의 3회 용량으로 이루어지는 격주 로딩 용량이며, 여기서 용량의 양은 활성 성분 1 킬로그램당 약 4 mg이고, 예를 들어, 여기서 로딩 용량은 정맥내로, 피하로, 또는 정맥내 또는 피하의 조합으로 투여된다.

일 구현예에서, 로딩 투약은 1일차부터 29일차까지의 3회 용량으로 이루어지는 격주 로딩 용량이며, 여기서 용량의 양은 약 150 mg 또는 약 300 mg의 활성 성분, 바람직하게는 300 mg의 활성 성분이며, 예를 들어, 여기서 로딩 용량은 피하로, 또는 정맥내 또는 피하의 조합으로 투여된다. 일 구현예에서, 로딩 투약은 1일차부터 29일차까지의 3회 용량으로 이루어지는 격주 로딩 용량이며, 여기서 용량의 양은 약 300 mg의 활성 성분이고, 여기서 로딩 용량은 피하로 투여된다.

일부 구현예에서, 로딩 용량은 로딩 용량 기간(예를 들어, 1주, 2주, 또는 3주 이내 또는 1회, 2회, 또는 3회 로딩 용량 주사 후) 동안 적어도 약 20 μg/mL 내지 약 60 μg/mL의 혈장 농도를 달성하도록 선택되거나 예측된 용량이다. 일부 구현예에서, 유지 용량은 유지 투약 기간, 또는 이의 실질적인 일부분(예를 들어, 적어도 약 29일차부터 85일차까지) 동안 약 20 μg/mL 내지 약 60 μg/mL의 지속적인 혈장 농도를 제공하도록 선택되거나 예측된 용량이다.

일 구현예에서, 로딩 투약의 피하 주사는 상이한 용량이다. 또 다른 구현예에서, 로딩 투약의 피하 주사는 동일한 용량이다.

HS 환자는 다음의 기준 중 하나에 따라 선택될 수 있다:

환자는 중등도 내지 중증의 HS를 가짐;

환자는 성인임;

환자는 청소년임;

IL-1β 및 IL-18 길항제(예를 들어, IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 표적화하는 이중특이적 항체)를 이용한 치료에 앞서, 환자는 3 이상의 HS-PGA 점수를 가짐;

IL-1β 및 IL-18 길항제(예를 들어, IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 표적화하는 이중특이적 항체)를 이용한 치료에 앞서, 환자는 적어도 3개의 염증성 병변을 가짐; 또는

IL-1β 및 IL-18 길항제(예를 들어, IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 표적화하는 이중특이적 항체)를 이용한 치료에 앞서, 환자는 HS의 결과로서 광범위한 흉터 형성을 갖지 않는다(10개 미만의 누관).

일 구현예에서, 치료 16주차까지, HS 환자는 다음 중 적어도 하나를 달성한다:

단순화된 HiSCR;

HS 악화(flare)의 감소;

NRS30;

DLQI에 의해 측정될 시, 6 이하의 감소; 및/또는

DLQI의 개선.

일 구현예에서, 치료 16주차까지, 상기 환자의 적어도 40%가 단순화된 HiSCR을 달성하거나; 상기 환자의 적어도 25%가 NRS30 반응을 달성하거나; 상기 환자의 15% 미만이 HS 악화를 경험한다.

일 구현예에서, 환자는 이르면 IL-1β 및 IL-18 길항제의 제1 용량 후 1주일째에 다음 중 적어도 하나를 갖는다:

VAS 또는 NRS에 의해 측정될 시, 신속한 통증 감소, 및

표준 hsCRP 검정을 이용하여 측정될 시 신속한 CRP 감소.

일 구현예에서, 환자는 염증성 병변 수, HS 임상 반응(HiSCR), 점수식 평정 척도(NRS), 변형 사르토리우스 HS 점수(modified Sartorius HS score), 화농성 한선염 - 의사 종합 평가(HS-PGA: Hidradenitis Suppurativa - Physician Global Assessment), 또는 피부 삶의 질 지수(DLQI: Dermatology Life Quality Index)에 의해 측정될 시, 치료 종료 후 3개월째에 지속적인 반응을 달성한다.

일 구현예에서, 환자는 단순화된 HiSCR(sHiSCR)에 의해 측정될 시, 치료 종료 후 3개월째에 지속적인 반응을 달성한다.

제2 양태에 따르면, 인간 대상체에서 HS를 치료하는 방법으로서, 치료적 유효 용량의 IL-1β 및 IL-18 길항제를 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 제공된다.

본 개시내용의 또 다른 구현예에서, IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 표적화하는 이중특이적 항체는 적어도 하나의 추가의 치료제와 조합되어 투여된다.

본 개시내용의 또 다른 양태는 대상체에서 HS의 발달을 치료하거나, 늦추거나, 저지하거나, 감소시키기 위한 의약의 제조를 위한, IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 표적화하는 이중특이적 항체(예를 들어 bbmAb1)의 용도에 관한 것이다.

일 구현예에서, HS의 치료를 필요로 하는 대상체에서 HS를 치료하는 방법으로서, IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 표적화하는 이중특이적 항체, 예를 들어 bbmAb1의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에서 제공된다. 일 구현예에서, HS의 치료를 필요로 하는 대상체에서 HS를 치료하는 데 사용하기 위한, IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 표적화하는 이중특이적 항체, 예를 들어 bbmAb1이 본원에서 제공된다. 일부 구현예에서, HS 치료용 의약의 제조를 위한, IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 표적화하는 이중특이적 항체, 예를 들어 bbmAb1의 용도가 본원에서 제공된다.

일 구현예에서, HS의 발달을 치료하거나, 늦추거나, 저지하거나, 감소시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 HS의 발달을 치료하거나, 늦추거나, 저지하거나, 감소시키기 위한 방법으로서, IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 표적화하는 이중특이적 항체, 예를 들어 bbmAb1의 치료적 유효량을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법이 본원에서 제공된다. 일 구현예에서, 치료적 유효량은 다음을 포함하는 이중특이적 항체의 양이다:

a. 이중특이적 항체의 제1 면역글로불린 VH1 도메인은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 85를 포함하고,

b. 이중특이적 항체의 제1 면역글로불린 VL1 도메인은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 101을 포함하고,

c. 이중특이적 항체의 제2 면역글로불린 VH2 도메인은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 53을 포함하고,

d. 이중특이적 항체의 제2 면역글로불린 VL2 도메인은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 69를 포함함.

또 다른 양태에 따르면, 본 개시내용은 IL-18 및 IL-1β 둘 모두를 특이적으로 표적화하는 이중특이적 항체를 포함하는 액체 약제학적 조성물, 방법 또는 액체 약제학적 조성물의 용도를 제공하며, 여기서 액체 약제학적 제형은 완충액, 안정화제 및 가용화제를 포함한다. 일 구현예에서, 본 개시내용은 HS를 갖는 환자에 이중특이적 항체를 투여하거나 피하로 투여하기 위한 수단을 제공하거나 추가로 제공한다. 일 구현예에서, 용도는 HS 치료용 의약의 제조를 위한 것이다.

본 개시내용의 구체적으로 바람직한 구현예에서, 액체 약제학적 조성물의 이중특이적 항체의 제1 면역글로불린 VH1 도메인은

이중특이적 항체의 제1 면역글로불린 VL1 도메인은

이중특이적 항체의 제2 면역글로불린 VH2 도메인은

본 개시내용의 또 다른 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 액체 약제학적 조성물의 항체는

a. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 85의 제1 면역글로불린 VH1 도메인,

b. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 101의 제1 면역글로불린 VL1 도메인,

e. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 87의 제1 면역글로불린 중쇄,

f. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 103의 제1 면역글로불린 경쇄,

g. 아미노산 서열 SEQ ID NO: 55의 제2 면역글로불린 중쇄, 및

일부 구현예에서, 액체 약제학적 조성물은 약 50 mg/mL 내지 약 120 mg/mL의 이중특이적 항체(예를 들어, bbmAb1), 완충액, 안정화제(예를 들어, 비-이온성 안정화제, 예컨대 당), 및 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80)를 포함한다. 일부 구현예에서, 액체 약제학적 조성물은 약 5.5 내지 약 6.5의 pH에서, 바람직하게는 약 5.5 내지 약 6.0의 pH에서, 바람직하게는 약 6.0의 pH에서 완충액 중의 약 50 mg/mL 내지 약 120 mg/mL의 이중특이적 항체를 포함한다.

일부 구현예에서, 액체 약제학적 조성물은 약 100 mg/mL의 이중특이적 항체(예를 들어, bbmAb1), 완충액, 안정화제(예를 들어, 비-이온성 안정화제, 예컨대 당), 및 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80)를 포함한다. 일부 구현예에서, 액체 약제학적 조성물은, 약 5.5 내지 약 6.5, 바람직하게는 약 5.5 내지 약 6.0, 보다 바람직하게는 약 6.0의 pH에서, 약 50 mg/mL 내지 약 120 mg/mL의 이중특이적 항체(예를 들어, bbmAb1), 약 1 mM 내지 약 50 mM의 히스티딘/히스티딘-클로라이드, 약 50 mM 내지 약 400 mM의 당(예를 들어, 수크로스, 트레할로스, 또는 만니톨), 약 0.01% 내지 약 0.5%의 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20)를 포함한다. 일부 사례에서, 액체 약제학적 조성물은, 약 6.0의 pH에서, 약 50 mg/mL 내지 약 120 mg/mL의 bbmAb1(바람직하게는 약 100 mg/mL의 bbmAb1), 약 20 mM의 히스티딘/히스티딘-클로라이드, 약 220 mM의 수크로스, 약 0.04%의 폴리소르베이트 20 (w/v)을 포함한다.

도 1은 비-병변 또는 건강한 조직의 수준과 비교된, HS 병변에서의 AIM2, NLRC4, NLRP7 및 NLRP3 인플라마솜의 mRNA 수준의 그래프 도면이다.
도 2는 건강한 피부 또는 병변, HS 환자로부터의 병변-주위 및 병변 피부의 생검에서 IL-18, IL-12 및 IL-1β(단독 또는 조합됨) 또는 CRS 신호전달 시그니처의 유전자/구성원의 평균 발현 수준을 나타내는 TIBCO 스폿파이어 히트 맵(spotfire heat map)이다. 각각의 IL-18, IL-12 및 IL-1β 신호전달 시그니처의 유전자/구성원의 식별은 6시간 동안(각각의 사이토카인에 의해 유도된 유전자에 제한됨 = UP) 자극된 건강한 공여자로부터의 PBMC를 사용하여 별도의 실험에서 행하거나 간행물로부터 인용하였다(카나키누맙 반응 시그니처 CRS; 문헌[Brachat et al 2017]).
도 3은 비처리 대조군과 비교된, 시험관내 배양 후 24시간째에 HS 피부 생검의 상층액 내로 생산된 분석물 IFNγ, TNFα, IL-1β 및 IL-2의 수준에 대한 bbmAb1(100 μg/ml) 및 아달리무맙(100 μg/ml) 인큐베이션 둘 모두의 효과를 나타낸다. 각각의 점은 단일 생검을 나타낸다. 각각의 분석물의 가장 좌측 열은 비처리 대조군이고, 각각의 분석물의 중간 열은 bbmAb1이며, 각각의 분석물의 가장 우측 열은 아달리무맙이다. 9명의 상이한 HS 환자로부터 수득된, IFNγ, IL-1β 및 TNFα에 대해 n=54, n=36 및 n=26의 개별적인 생검 및 IL-2에 대해 n=43, n=20 및 n=10의 생검으로부터의 값이 나타나 있다.
도 4는 IL-1β 수준에 대한 bbmAb1 투약의 효과의 예측에 관한 그래프 도면이다. 파선은 정량 하한을 나타낸다. 예측은 1일차, 15일차, 29일차, 57일차 및 85일차의 300 mg의 피하 용량을 가정하여 모델링되었다.
도 5는 건강한 대조군 대상체에서의 기준선에서의 변화에 비한 IL-18 수준에 대한 bbmAb1 투약의 효과의 예측에 관한 그래프 도면이다. 파선은 건강한 대조군 대상체에서의 수준을 나타낸다. 예측은 1일차, 15일차, 29일차, 57일차 및 85일차의 300 mg의 피하 용량을 가정하여 모델링되었다.
도 6은 10 mg/kg i.v의 단회 용량과 비교하여 피하로 투여된 bbmAb1의 약동학의 예측에 관한 그래프 도면이다. 예측은 1일차, 15일차, 29일차, 57일차 및 85일차의 300 mg의 피하 용량을 가정하여 모델링되었다.

주요 인플라마솜 이펙터 사이토카인인 인터류킨-1 베타(IL-1ß) 및 인터류킨-18(IL-18)을 동시에 중화하는 이종이량체 Fc 부분을 함유하는 IgG-유사 이중특이적 단클론성 항체(예를 들어, bbmAb1)가 본원에 기재된다. 특정한 양태에서, 이중특이적 항체는 두 사이토카인 모두에 대한 피코몰(pM)의 친화도를 갖고 세포 시험관내 검정에서 나노몰-미만(nM) 농도에서 IL-1β 및 IL-18 신호전달을 저해한다. IL-1β 및 IL-18은 손상 연관 분자 패턴(DAMP) 및 병원체 연관 분자 패턴(PAMP)의 인식에 반응하여 인플라마솜 활성화 후 분비되는 2개의 전-염증성 사이토카인이다. 본원에 기재된 바와 같이, IL-1β 및 IL-18의 조합된 저해는 어느 사이토카인 단독의 저해와 비교해도, 인플라마솜-유발 전-염증성 반응의 보다 효과적인 하향-조절을 초래할 수 있다.

이에 따라, IL-1β 및 IL-18 활성을 동시에 차단할 수 있는 임의의 길항제, 예컨대 ADCC 활성이 침묵화된 이중특이적 항-IL-1β 및 항-IL-18 항체가 HS의 치료에 적합할 수 있다.

이론에 얽매이지 않고, 본 발명자들은 IL-1β 및/또는 IL-18 수준이 강화되어 치료의 시작 시 보다 높은 용량 또는 보다 빈번한 섭생을 필요로 하는 질병이 있는 이들 환자에서, 로딩 섭생이 치료의 시작 시 이중특이적 항체 결합 부위(IL-1β 및/또는 IL-18)를 적어도 부분적으로, 또는 완전히 포화시키는 데 유익할 수 있다는 것을 식별한 바 있다. 이에 따라, 영향을 받은 조직에서의 IL-1β 및/또는 IL-18 발현이 강화될 상황(질병의 중증도)에서, 치료 시작 시(2 내지 3주) 항원의 신속한 포화를 제공하는 로딩 투약 섭생, 이어서 치료 기간 전체에 걸쳐 지속된 치료적 혈장 농도를 제공하는 유지 투약 섭생은 치료적 효과를 위한 것으로 간주된다.

적절한 투여량은, 예를 들어, 이용될 특정한 이중특이적 IL-1β 및 IL-18 길항제, 예를 들어, 이중특이적 항-IL-1β 및 항-IL-18 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, bbmAb1), 치료의 대상체, 투여 방식 및 치료되는 질병의 특성 및 중증도, 및 환자가 겪은 사전 치료의 특성에 따라 다를 수 있다. 궁극적으로, 주치의인 건강 관리 제공자는 각각의 개별적인 환자를 치료하기 위한 이중특이적 IL-1β 및 IL-18 길항제의 양을 결정할 것이다. 일부 구현예에서, 주치의인 건강 관리 제공자는 낮거나 심지어 단회 용량의 이중특이적 IL-1β 및 IL-18 길항제를 투여하고 환자의 반응을 관찰할 수 있다. 다른 구현예에서, 환자에 투여되는 이중특이적 IL-1β 및 IL-18 길항제의 초기 용량(들)은 높고, 그 후의 재발의 징후가 발생할 때까지 낮추어 적정된다. 더 큰 용량의 이중특이적 IL-1β 및 IL-18 길항제는 환자에 대해 최적의 치료적 효과가 수득될 때까지 투여될 수 있고, 투여량은 일반적으로 추가로 증가되지 않는다.

일 구현예에서, 본 개시내용은 상기에 기재된 바와 같이 본 개시내용의 양태 또는 구현예 중 임의의 것에 따른 용도를 위한 이중특이적 항-IL-1β 및 항-IL-18 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 관한 것이며, 여기서 이중특이적 항-IL-1β 및 항-IL-18 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, bbmAb1)의 로딩 용량 및 유지 용량은 항체의 혈장 또는 혈청 농도가 치료적 수준에 있도록 조정된다.

본 개시내용의 치료 방법 또는 용도 중 일부의 실시에서, 치료적 유효량의 이중특이적 IL-1β 및 항-IL-18 길항제, 예를 들어, 이중특이적 항-IL-1β 및 항-IL-18 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, bbmAb1)은 환자, 예를 들어, 포유류(예를 들어, 인간)에 투여된다. 개시된 방법이 이중특이적 IL-1β 및 IL-18 길항제(예를 들어, bbmAb1)를 사용하여 HS 환자의 치료를 제공한다는 것이 이해되지만, 이는 환자가 궁극적으로 길항제로 치료되면, 이러한 요법이 반드시 단일요법이라는 점을 배제하지는 않는다. 실제로, 환자가 이중특이적 IL-1β 및 IL-18 길항제를 이용한 치료를 위해 선택되는 경우, 길항제(예를 들어, bbmAb1)는 단독으로 또는 다른 제제 및 요법과 조합되어 본 개시내용의 방법에 따라 투여될 수 있다.

섭생 변화는 특정한 HS 환자, 예를 들어, 이중특이적 IL-1β 및 IL-18 길항제, 예를 들어, 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, bbmAb1)을 이용한 치료에 대해 불충분한 반응을 나타내는 환자에게 적절할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 이에 따라, 투여는 매월 투약, 예를 들어, 격주 투약(2주마다) 또는 매주 투약보다 더 빈번할 수 있다.

일부 환자는 로딩 섭생(예를 들어, 수 주 동안의 매주 투여[예를 들어, 1 내지 4주, 예를 들어, 0주차, 1주차, 2주차, 및/또는 3주차의, 예컨대 3주의 투약, 1주차, 2주차 및 3주차의 로딩 투약 섭생]), 이어서, 이중특이적 항체(예를 들어, bbmAb1)가 적어도 수 주 동안 매주, 격주, 또는 바람직하게는 4주마다 투여될 수 있는, 예를 들어 5주차, 6주차 또는 7주차에 시작되는 유지 섭생으로부터 이익을 얻을 수 있다.

예를 들어, bbmAb1에 대한 적절한 섭생은 수 주 동안의 격주 투약[예를 들어, 1 내지 5주, 예를 들어, 1주차, 3주차 및 5주차의 투약], 이어서, 이중특이적 항체(예를 들어, bbmAb1)가 적어도 수 주 동안 투여될 수 있는, 예를 들어, 8주차 또는 9주차, 바람직하게는 9주차의 매월 Q4W 유지 섭생일 수 있다.

또한, 투여는 매월 투약보다 덜 빈번한 투약, 예를 들어 6주마다, 8주마다(2개월마다), 분기마다(3개월마다) 등의 투약일 수 있다는 것이 이해될 것이다.

용량 증량은 질환의 중증도에 기반하여, 특정한 HS 환자, 예를 들어, 본원에 기재된 이중특이적 길항제, 예를 들어, bbmAb1 또는 이의 항원-결합 단편을 이용한 치료에 대해 불충분한 반응을 나타내는 환자에게 적절할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 이에 따라, 피하(s.c.) 투여량(로딩 또는 유지 용량)은 약 150 mg 초과 내지 약 900 mg s.c., 예를 들어 약 75 mg, 약 100 mg, 약 125 mg, 약 175 mg, 약 200 mg, 약 250 mg, 약 350 mg, 약 400 mg, 약 450 mg, 약 500 mg, 약 600 mg 등일 수 있고; 유사하게, 정맥내(i.v.) 투여량은 약 5 mg/kg 또는 10 mg/kg 초과, 예를 들어 약 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg 등일 수 있다. 또한, 용량 감량은 특정한 HS 환자, 예를 들어 이중특이적 길항제(예를 들어, bbmAb1 또는 이의 항원-결합 단편)를 이용한 치료에 대해 유해 사례 또는 유해 반응을 나타내는 환자에게 적절할 수 있다는 것도 이해될 것이다. 이에 따라, 길항제의 투여량은 약 150 mg 미만 내지 약 900 mg s.c., 예를 들어, 약 25 mg, 약 50 mg, 약 75 mg, 약 100 mg, 약 125 mg, 약 175 mg, 약 200 mg, 약 250 mg, 약 350 mg, 약 400 mg, 약 450 mg, 약 500 mg, 약 600 mg 등일 수 있다.

일부 구현예에서, 이중특이적 길항제, 예를 들어, bbmAb1 또는 이의 항원-결합 단편은 s.c. 전달되는 300 mg의 초기 용량으로 환자에 투여될 수 있으며, 그 후에 용량은 의사의 결정에 따라, 필요한 경우 s.c. 전달되는 150 mg 또는 600 mg으로 조정될 수 있다.

이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 bbmAb1, 이의 기능적 유도체 또는 이의 바이오시밀러일 수 있다.

본원에서 정의되는 바와 같이, "단위 용량"은 약 75 mg 내지 900 mg, 예를 들어, 약 150 mg 내지 약 600 mg, 예를 들어 약 150 mg 내지 약 600 mg, 예를 들어 약 300 mg 내지 약 600 mg, 또는 예를 들어, 약 150 mg 내지 약 300 mg으로 구성될 수 있는 s.c. 용량을 지칭한다. 예를 들어, 단위 s.c. 용량은 약 75 mg, 약 150 mg, 약 300 mg, 약 350 mg, 약 400 mg, 약 450 mg, 약 500 mg, 약 550 mg, 약 600 mg이다.

본 개시내용은, 특히, IL-1β 및 IL-18을 동시에 중화시키는 특정한 항체가, 단일 IL-1β 또는 IL-18 중화 단독과 비교하여 IFN-γ(및 기타 전-염증성 사이토카인) 생산을 보다 강력하게 약화시킨다는 뜻밖의 발견에 기반하는 것이며, 이는 HS의 효과적인 치료인 것으로 본 발명자들에 의해 고려된다.

1. 정의

본 명세서를 해석하기 위해, 다음의 정의가 적용될 것이며, 적절할 때마다, 단수로 사용된 용어는 복수도 포함할 것이고, 그 반대도 가능하다. 추가적인 정의는 상세한 설명 전체에 걸쳐 제시된다.

수치값 x와 관련된 용어 "약"은, 예를 들어, +/-10%를 의미한다. 수치 범위 또는 숫자의 목록의 앞에 사용될 때, 용어 "약"은 일련의 각 숫자에 적용되고, 예를 들어, 어구 "약 1 내지 5"는 "약 1 내지 약 5"로 해석되어야 하거나, 예를 들어, 어구 "약 1, 2, 3, 4"는 "약 1, 약 2, 약 3, 약 4 등"으로 해석되어야 한다.

단어 "실질적으로"는 "완전히"를 배제하지 않고, 예를 들어, Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 개시내용의 정의로부터 생략될 수 있다.

용어 "포함하는(comprising)"은 "포함하는(including)"뿐만 아니라 "이루어지는(consisting)"을 포괄하고, 예를 들어, X를 "포함하는(comprising)" 조성물은 X만으로 이루어질 수 있거나, 추가적인 어떤 것, 예를 들어 X + Y를 포함할 수 있다.

용어 "IL-18"은 IL-18 폴리펩티드, 인터류킨-18 폴리펩티드, IFN-감마 유도 인자 또는 인터페론-감마-유도-인자 또는 INF-γ 유도 인자의 동의어이다. 용어 "IL-18"은 또 다른 종이 지시되지 않는 한 인간 IL-18을 지칭한다. IL-18은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 제품 참조번호 #B001-5로 MBL® International Corporation으로부터 수득 가능하다. 본 명세서 전반에 걸쳐, IL-18이라는 용어는 프로- 또는 성숙형을 의미함을 명시하지 않는 한 프로-IL-18(프로테아제 절단에 앞선 성숙 IL-18의 전구체) 및 성숙 IL-18(프로테아제 절단 이후) 둘 모두를 상호교환적으로 포괄한다.

용어 "IL-1β" 또는 "IL-1b"는 IL-1β 폴리펩티드 및 인터류킨-1β 폴리펩티드의 동의어이다. 용어 "IL-1β"는 또 다른 종이 지시되지 않는 한 인간 IL-1β를 지칭한다. IL-1β는 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 제품 참조번호 #10139-HNAE-5로 Sino Biological로부터 수득 가능하다.

용어 "항체"는 온전한 면역글로불린 또는 이의 기능적 단편을 지칭한다. 자연 발생적 항체는 보통 적어도 2개의 중쇄(H) 및 적어도 2개의 경쇄(L)로 구성된 사량체를 전형적으로 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 VH로 약칭됨), 및 보통 3개의 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)으로 구성된 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄는 IgG(IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 아형), IgA(IgA1 및 IgA2 아형), IgM 및 IgE를 포함하는 임의의 이소형일 수 있다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된다. 경쇄는 카파(κ) 쇄 및 람다(λ) 쇄를 포함한다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 전형적으로 항원 인식에 관여하는 데 반하여, 중쇄 및 경쇄 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체계의 첫 번째 구성요소(C1q)를 포함하는, 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 불리는 초가변성의 영역들로 추가로 세분될 수 있으며, 이들 사이에는 프레임워크 영역(FR)으로 불리는 더 보존된 영역들이 산재되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음의 순서로 아미노 말단으로부터 카복시 말단으로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 항체의 "항원-결합 부분"(또는 간단히 "항원 부분")이라는 용어는 IL-18 또는 IL-1β 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 전장 또는 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 나타난 바 있다. 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가 단편인 Fab 단편; 힌지 영역에서 디설피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab)2 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어지는 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어지는 dAb 단편(문헌[Ward et al., (1989) Nature; 341:544-546]); 및 단리된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.

추가로, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH는 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 사용하여 가요성 링커에 의해 이어질 수 있으며, 이러한 링커는 이들을 VL 영역 및 VH 영역이 짝을 이루어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 만들어질 수 있게 한다(단일쇄 Fv(scFv)로 공지되어 있음; 예를 들어, 문헌[Bird et al., (1988) Science 242:423-426]; 및 문헌[Huston et al., (1988) Proc Natl Acad Sc;. 85:5879-5883] 참조). 이러한 단일쇄 항체는 또한 항체의 "항원-결합 부분"이라는 용어 내에 포괄되는 것으로 하고자 한다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기법을 사용하여 수득되며, 이들 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성을 위해 스크리닝된다.

용어 "단리된"은 본 명세서 전반에 걸쳐, 면역글로불린, 항체, 또는 폴리뉴클레오티드가 경우에 따라 자연계에서 발생할 수 있는 것과는 다른 물리적 환경에 존재함을 의미한다.

본 명세서 전반에 걸쳐, 상보성 결정 영역("CDR")은 CDR이 또 다른 정의에 따라 정의된다고 명시되지 않는 한 카바트(Kabat) 정의에 따라 정의된다. 주어진 CDR의 정확한 아미노산 서열 경계는 문헌[Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD]("카바트" 넘버링 체계), 문헌[Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948]("초티아" 넘버링 체계) 및 ImMunoGenTics(IMGT) 넘버링(문헌[Lefranc, M.-P., The Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M.-P. et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)]("IMGT" 넘버링 체계)에 기재된 것들을 포함하는, 많은 잘 공지된 체계 중 임의의 것을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 고전적인 형식의 경우, 카바트 하에서, 중쇄 가변 도메인(VH) 내의 CDR 아미노산 잔기는 31 내지 35(HCDR1), 50 내지 65(HCDR2), 및 95 내지 102(HCDR3)로 넘버링되고; 경쇄 가변 도메인(VL) 내의 CDR 아미노산 잔기는 24 내지 34(LCDR1), 50 내지 56(LCDR2), 및 89 내지 97(LCDR3)로 넘버링된다. 초티아 하에서, VH 내의 CDR 아미노산은 26 내지 32(HCDR1), 52 내지 56(HCDR2), 및 95 내지 102(HCDR3)로 넘버링되고; VL 내의 아미노산 잔기는 26 내지 32(LCDR1), 50 내지 52(LCDR2), 및 91 내지 96(LCDR3)으로 넘버링된다. 카바트 및 초티아 둘 모두의 CDR 정의를 조합함으로써, CDR은 인간 VH 내의 아미노산 잔기 26 내지 35(HCDR1), 50 내지 65(HCDR2), 및 95 내지 102(HCDR3) 및 인간 VL 내의 아미노산 잔기 24 내지 34(LCDR1), 50 내지 56(LCDR2), 및 89 내지 97(LCDR3)로 이루어진다. IMGT 하에서, VH 내의 CDR 아미노산 잔기는 대략 26 내지 35(CDR1), 51 내지 57(CDR2), 및 93 내지 102(CDR3)로 넘버링되고, VL 내의 CDR 아미노산 잔기는 대략 27 내지 32(CDR1), 50 내지 52(CDR2), 및 89 내지 97(CDR3)로 넘버링된다("카바트"에 따른 넘버링). IMGT 하에서, 항체의 CDR 영역은 IMGT/DomainGap Align 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다.

관례상, 중쇄 내의 CDR 영역은 전형적으로 H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3으로 지칭되고, 경쇄 내의 CDR 영역은 L-CDR1, LCDR2, 및 L-CDR3으로 지칭된다. 이들은 아미노 말단으로부터 카복시 말단의 방향으로 순차적으로 넘버링된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "단클론성 항체" 또는 "단클론성 항체 조성물"은 단일 분자 조성의 항체 분자의 조제품(preparation)을 지칭한다. 단클론성 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 모두가 인간 기원의 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 하고자 한다. 추가로, 항체가 불변 영역을 함유하는 경우에, 불변 영역은 또한 이러한 인간 서열, 예를 들어 인간 생식계열 서열, 또는 인간 생식계열 서열의 돌연변이 버전, 또는 예를 들어 문헌[Knappik, et al., (2000) J Mol Biol; 296:57-86)]에 기재된 바와 같은, 인간 프레임워크 서열 분석으로부터 유래된 공통 프레임워크 서열을 함유하는 항체로부터 유래된다.

본 발명의 인간 항체는 인간 서열에 의해 인코딩되지 않는 아미노산 잔기(예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "인간 항체"는, 또 다른 포유류 종, 예컨대 마우스의 생식계열로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식된 항체를 포함하고자 하는 것은 아니다.

용어 "인간 단클론성 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 모두가 인간 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성, 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 인간 면역글로불린 유전자 또는 이로부터 제조된 하이브리도마에 대해 유전자이식 또는 염색체이식된 동물(예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체, 인간 항체를 발현시키도록 형질전환된 숙주 세포로부터, 예를 들어 트랜스펙토마(transfectoma)로부터 단리된 항체, 재조합형 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 인간 면역글로불린 유전자 모두 또는 그 일부분을 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성, 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 프레임워크 및 CDR 영역이 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 구현예에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는, 인간 Ig 서열에 대한 유전자이식된 동물이 사용될 때는 생체내 체세포 돌연변이유발)을 거칠 수 있고, 이에 따라, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 생식계열 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만 생체내 인간 항체 생식계열 레퍼토리 내에 본래 존재하지 않을 수 있는 서열이다.

어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 특이적인 항체"는 본원에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"와 상호교환적으로 사용된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "IL-18에 특이적으로 결합하는" 결합 분자는 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하의 K_D로 인간 IL-18에 결합하는 결합 분자를 지칭하는 것으로 하고자 한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "IL-1β에 특이적으로 결합하는" 결합 분자는 100 nM 이하, 10 nM 이하, 1 nM 이하의 K_D로 인간 IL-1β에 결합하는 결합 분자를 지칭하는 것으로 하고자 한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "길항제"는 활성화 화합물의 존재 하에서 신호전달 활성을 저해하는 결합 분자를 지칭하는 것으로 하고자 한다. 예를 들어, IL-18의 경우, IL-18 길항제는 인간 세포 검정, 예컨대 인간 혈액 세포에서의 IL-18 의존적 인터페론-감마(IFN-γ) 생산 검정에서 IL-18의 존재 하에서의 신호전달 활성을 저해하는 결합 분자일 것이다. 인간 혈액 세포에서의 IL-18 의존적 IFN-γ 생산 검정의 예는 하기의 실시예에서 보다 상세히 기재된다.

2가 이중특이적 항체 또는 2가 이중특이적 항체들이라는 용어는 2개의 상이한 표적, 예컨대 IL-18 및 IL-1β에 결합하는 항체를 지칭한다. 이러한 2가 이중특이적 항체는 이중특이적 항체로도 본원에서 지칭된다.

이중특이적 항체는 "이종-이량체"이며, 이는 한 부분은 제1 표적에 특이적인 제1 항체로부터 유래하며, 또 다른 부분은 제2 표적에 특이적인 제2 항체로부터 유래함을 의미한다. "이종-이량체화 변형"은 이러한 형성을 촉진하기 위한, 이종-이량체 이중특이적 항체를 형성하는 항체의 한 부분 또는 두 부분 모두에 대한 변형이다. 이중특이적 항체를 형성하기 위한 항체의 2개의 IgG1 부분의 Fc 도메인의 이종-이량체화 변형의 예는 제1 중쇄에 부피가 큰 아미노산(aa) 측쇄(S354C, T366W)가 있는 "노브"이고, 작은 aa 측쇄(Y349C, T366S, L368A, Y407V)를 갖는 "홀"은 제2 중쇄뿐만 아니라, 두 중쇄 모두를 연결하는 CH3 영역 내의 추가적인 디설피드 가교에 도입된다(문헌[Merchant et al., Nat. Biotechnol., 16:677-681 (1998), 678 페이지], 표 1).

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "K_D"는 해리 상수를 지칭하는 것으로 하고자 하며, 이는 K_a에 대한 K_d의 비(즉, K_d/K_a)로부터 수득되고 몰 농도(M)로서 표현된다. 항체에 대한 K_D값은 당해 분야에서 잘 확립된 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 항체의 K_D를 결정하는 방법은 표면 플라스몬 공명, 예컨대 Biacore® 시스템을 사용함으로써 이루어진다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "친화도"는 단일 항원 부위에서의 결합 분자와 항원 사이의 상호작용의 세기를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 항체에 대한 "고친화도"라는 용어는 표적 항원에 대해 1 nM 이하의 KD를 갖는 항체를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는, 현재 기재된 바와 같이 HS의 증상을 나타낼 수 있거나 이의 위험이 있을 수 있는, 이중특이적 항-IL-18 및 IL-1β 길항제를 제공받는 임의의 인간 대상체를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "최적화된 뉴클레오티드 서열"은 뉴클레오티드 서열이, 생산 세포 또는 유기체, 일반적으로 진핵 세포, 예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris)의 세포, 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 또는 인간 세포에서 바람직한 코돈을 사용하여 아미노산 서열을 인코딩하도록 변경되었음을 의미한다. 최적화된 뉴클레오티드 서열은 "모체" 서열로도 공지된 시작 뉴클레오티드 서열에 의해 원래 인코딩되는 아미노산 서열을 완전히 보유하도록 조작된다. 본원에서 최적화된 서열은 CHO 포유류 세포에서 바람직한 코돈을 갖도록 조작되지만; 다른 진핵 세포에서의 이들 서열의 최적화된 발현도 본원에서 구상된다.

용어 "동일성"은 적어도 2개의 상이한 서열 사이에서의 유사성을 지칭한다. 이 동일성은 동일성 퍼센트로서 표현될 수 있고, 표준 정렬 알고리즘, 예를 들어, BLAST(Basic Local Alignment Tool)(문헌[Altshul et al., (1990) J MoI Biol; 215:403-410)]; 문헌[Needleman et al., (1970) J MoI Biol; 48:444-453]의 알고리즘 또는 문헌[Meyers et al., (1988) Comput Appl Biosci; 4:11-17)]의 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 일련의 파라미터는 12의 갭 페널티, 4의 갭 연장 페널티, 및 5의 프레임쉬프트 갭 페널티를 갖는 Blosum 62 점수화 매트릭스일 수 있다. 2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성 퍼센트는 또한 PAM 120 가중 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티, 및 4의 갭 페널티를 사용하는, ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 문헌[E. Meyers and W. Miller, (1989) CABIOS; 4(1):1-17)]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 동일성 퍼센트는 보통 유사한 길이의 서열을 비교함으로써 계산된다.

용어 "면역 반응"은, 예를 들어, 침입 병원체, 병원체로 감염된 세포 또는 조직, 암세포, 또는 자가면역 또는 병리학적 염증의 사례에서의 정상 인간 세포 또는 조직의 선택적 손상, 파손, 또는 인체로부터의 제거를 초래하는, 림프구, 항원 제시 세포, 포식세포, 과립구, 및 상기 세포 또는 간에 의해 생산된 가용성 거대분자(항체, 사이토카인 및 보체를 포함함)의 작용을 지칭한다.

"신호 전달 경로" 또는 "신호전달 활성"은 단백질-단백질 상호작용, 예컨대 수용체에 대한 성장 인자의 결합에 의해 일반적으로 개시되는 생화학적 인과관계를 지칭하며, 이는 세포의 한 일부분으로부터 세포의 또 다른 부분으로의 신호의 전송을 초래한다. 일반적으로, 전송은 신호 전달을 야기하는 일련의 반응에서 하나 이상의 단백질 상의 하나 이상의 티로신, 세린, 또는 트레오닌 잔기의 특이적 인산화를 수반한다. 끝에서 두 번째 프로세스는 전형적으로 유전자 발현의 변화를 초래하는 핵 사건을 포함한다.

용어 "중화한다" 및 이의 문법적 변형은 본 명세서 전반에 걸쳐 표적의 생물학적 활성이, 경우에 따라 결합 단백질 또는 항체의 존재 하에서 전체적으로 또는 부분적으로 감소됨을 의미한다.

용어 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA) 및 이의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는 한, 이 용어는 기준 핵산과 유사한 결합 특성을 갖고 자연 발생적 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포괄한다. 달리 지시되지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 이의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴 코돈 치환), 대립유전자, 병렬상동체, SNP, 및 상보성 서열뿐만 아니라 명시적으로 지시된 서열을 함축적으로 포괄한다. 구체적으로, 축퇴 코돈 치환은 하나 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다(문헌[Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)]; 문헌[Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)]; 및 문헌[Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)]).

"폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"에서의 뉴클레오티드는 염기 변형, 예컨대 브로모우리딘 및 이노신 유도체, 리보스 변형, 예컨대 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐라데이트 및 포르포로아미데이트를 포함하는 변형을 포함할 수 있다.

용어 "벡터"는 숙주 세포의 형질전환 또는 형질감염에 적합하며, 그에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 이종 코딩 영역의 발현을 (숙주 세포와 함께) 지시 및/또는 제어하는 핵산 서열을 함유하는 임의의 분자 또는 엔티티(entity)(예를 들어 핵산, 플라스미드, 박테리오파지, 또는 바이러스)를 의미한다.

결합 분자, 항체, 또는 이의 단편을 인코딩하는 서열의 "보존적 변이체"는 보존적 아미노산 변형을 포함하는 서열을 지칭한다. "보존적 아미노산 변형"은 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의하게 영향을 미치거나 이를 유의하게 변경하지 않는 아미노산 변형을 지칭하는 것으로 하고자 한다. 이러한 보존적 변형은 아미노산 치환, 부가, 및 결실을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당해 분야에서 정의된 바 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지형 측쇄(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)가 있는 아미노산을 포함한다. 변형은 당해 분야에 공지된 표준 기법, 예컨대 부위-지정 돌연변이유발 및 PCR-매개 돌연변이유발에 의해 본 발명의 결합 단백질 내로 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 또한 생물학적 시스템에서 합성에 의해서가 아닌 화학적 펩티드 합성에 의해 전형적으로 통합되는 비-자연 발생적 아미노산 잔기를 포괄할 수 있다. 비-자연 발생적 아미노산은, 비제한적으로 아미노산 모이어티의 펩티도미메틱(peptidomimetic), 역전, 또는 반전 형태를 포함한다.

용어 "에피토프"는 면역계에 의해 인식되는 항원의 부분, 예컨대 항체 또는 이의 단편이다. 본 명세서 내에서, 용어 "에피토프"는 입체형태 에피토프 및 선형 에피토프 둘 모두에 대해 상호교환적으로 사용된다. 입체형태 에피토프는 항원의 아미노산 서열의 불연속 구간으로 구성되는 반면에, 선형 에피토프는 항원으로부터의 아미노산의 연속 서열에 의해 형성된다.

인간 항체 또는 이의 단편은, 항체의 가변 영역 또는 전장 쇄가 인간 생식계열 면역글로불린 유전자를 사용하는 시스템으로부터 수득되는 경우에, 특정한 생식계열 서열"의 산물"이거나 "이로부터 유래된" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함할 수 있다. 이러한 시스템은 인간 면역글로불린 유전자를 보유하는 유전자이식 마우스를 관심 항원을 이용하여 면역화시키는 것, 또는 파지 상에 나타난 인간 면역글로불린 유전자 라이브러리를 관심 항원을 이용하여 스크리닝하는 것을 포함한다.

인간 생식계열 면역글로불린 서열"의 산물"이거나 "이로부터 유래된" 인간 항체 또는 이의 단편은, 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식계열 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교하고, 서열에서 인간 항체의 서열에 가장 가까운(즉, 가장 큰 동일성%) 인간 생식계열 면역글로불린 서열을 선택함으로써 그와 같이 식별될 수 있다. 특정한 인간 생식계열 면역글로불린 서열"의 산물"이거나 "이로부터 유래된" 인간 항체는, 예를 들어, 자연 발생적 체세포 돌연변이, 또는 부위-지정 돌연변이의 의도적 도입으로 인해, 생식계열 서열과 비교하여 아미노산 차이를 함유할 수 있다.

그러나, 선택된 인간 항체는 전형적으로 아미노산 서열에서, 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고, 다른 종의 생식계열 면역글로불린 아미노산 서열(예를 들어, 뮤린 생식계열 서열)과 비교할 때 인간인 인간 항체를 식별하는 아미노산 잔기를 함유한다. 특정한 사례에서, 인간 항체는, 아미노산 서열에서, 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 적어도 95%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일할 수 있다. 전형적으로, 특정한 인간 생식계열 서열로부터 유래되는 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩되는 아미노산 서열과 10개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 것이다. 특정한 사례에서, 인간 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 5개 이하, 또는 심지어 4개, 3개, 2개, 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 나타낼 수 있다.

인간 항체는 당업자에게 공지된 많은 방법에 의해 생산될 수 있다. 인간 항체는 인간 골수종 또는 마우스-인간 이종골수종 세포주를 사용하는 하이브리도마 방법에 의해 만들어질 수 있다(문헌[Kozbor, J Immunol; (1984) 133:3001; Brodeur, Monoclonal Isolated Antibody Production Techniques and Applications, pp51-63, Marcel Dekker Inc, 1987]). 대안적인 방법은 둘 모두 인간 가변 영역 레퍼토리를 활용하는 파지 라이브러리 또는 유전자이식 마우스의 사용을 포함한다(문헌[Winter G; (1994) Annu Rev Immunol 12:433-455, Green LL, (1999) J Immunol Methods 231:11-23]).

마우스 면역글로불린 유전자좌가 인간 면역글로불린 유전자 절편으로 대체된 몇몇 계통의 유전자이식 마우스가 현재 이용 가능하다(문헌[Tomizuka K, (2000) Proc Natl Acad Sci , 97:722-727; Fishwild DM (1996) Nature Biotechnol 14:845-851; Mendez MJ, (1997) Nature Genetics 15:146-156]). 항원 시험감염(antigen challenge) 시, 이러한 마우스는 관심 항체가 선택될 수 있는 인간 항체의 레퍼토리를 생산할 수 있다. 인간 림프구가 조사된 마우스에 이식되는 Trimera™ 시스템(문헌[Eren R et al, (1988) Immunology 93:154-161]), 대규모의 풀링된 시험관내 단리된 항체 생성 절차, 이어서 디컨볼루션, 한계 희석, 및 선택 절차를 통해 인간(또는 다른 종) 림프구가 효과적으로 통과하는 선택된 림프구 단리된 항체 시스템(Selected Lymphocyte Isolated antibody System)(SLAM, 문헌[Babcook et al, Proc Natl Acad Sci (1996) 93:7843-7848]) 및 Xenomouse™(Abgenix Inc.)가 특히 주목된다. 대안적인 접근법은 Morphodoma™ 기술을 사용하는 Morphotek Inc로부터 이용 가능하다.

인간 항체 및 이의 단편을 생산하기 위해 파지 디스플레이 기술이 사용될 수 있다(문헌[McCafferty; (1990) Nature, 348:552-553] 및 문헌[Griffiths AD et al (1994) EMBO 13:3245-3260]). 이 기법에 따르면, 단리된 항체 가변 도메인 유전자는 사상 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 단백질 유전자의 주요 또는 소수 코트(coat)에 인프레임(in frame) 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능 단리된 항체 단편으로서 (보통 헬퍼 파지의 보조 하에서) 디스플레이된다. 단리된 항체의 기능 특성에 기반한 선택은 이들 특성을 나타내는 단리된 항체를 인코딩하는 유전자의 선택을 초래한다. 파지 디스플레이 기법은 질환 또는 장애에 시달리는 개체로부터 또는 대안적으로 비면역화된 인간 공여자로부터 취한 인간 B 세포로 만들어진 라이브러리로부터 항원 특이적 항체를 선택하기 위해 사용될 수 있다(문헌[Marks; J Mol Bio (1991) 222:581-591,]). Fc 도메인을 포함하는 온전한 인간 단리된 항체가 바람직한 경우에, 파지 디스플레이된 유래 단편을, 바람직한 불변 영역을 포함하고 안정적인 발현 세포주를 확립한 포유류 발현 벡터 내로 재클로닝하는 것이 필수적이다.

친화도 성숙의 기법(문헌[Marks; Biotechnol (1992) 10:779-783])은 결합 친화도를 제공하기 위해 사용할 수 있는데, 여기서 1차 인간 단리된 항체의 친화도는 자연 발생적 변이체를 이용한 H 및 L 쇄 가변 영역의 순차적 대체 및 개선된 결합 친화도에 기반한 선택에 의해 개선된다. 이 기법의 변이형, 예컨대 '에피토프 각인'도 현재 이용 가능하다(WO 93/06213호; 문헌[Waterhouse; Nucl Acids Res (1993) 21:2265-2266]).

용어 "순수한"은, 정제된 이중특이적 항체의 맥락에서 사용될 때, 세포가 이중특이적 항체를 발현시키는 조건 하에서 선택된 세포에서 공동-발현 후 및 온전한 UPLC-MS 질량 스크리닝 접근법을 사용한 단백질-A 정제 후의 상이한 이중특이적 항체 조합 및 작제물의 순도 및 동일성에 관한 것이다. 순수한 또는 순도는 형성된 이종- 및 동종이량체 bbmAb의 상대적 양을 지칭한다. 본 발명의 방법을 사용하여 정확하게 형성된 이종이량체 bbmAb1은 온전한 질량 신호 강도를 기반으로 하여 85% 초과의 상대적 순도로 관찰될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "저해한다", "저해", 또는 "저해하는"은 주어진 질병, 증상, 또는 장애, 또는 질환의 감소 또는 억제, 또는 생물학적 활성 또는 프로세스의 기준선 활성의 유의한 감소를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 임의의 질환 또는 장애를 "치료한다", "치료하는" 또는 이의 "치료"라는 용어는 일 구현예에서, 질환 또는 장애를 호전시키는 것(즉, 질환 또는 이의 임상적 증상 중 적어도 하나의 발달 또는 진행을 늦추거나, 저지하거나, 감소시키는 것)을 지칭한다. 또 다른 구현예에서, "치료한다", "치료하는" 또는 "치료"는 환자에 의해 식별 불가능할 수 있는 것들을 포함하는 적어도 하나의 신체적 파라미터의 완화 또는 호전을 지칭한다. 추가로 또 다른 구현예에서, "치료한다", "치료하는" 또는 "치료"는 신체적으로(예를 들어, 식별 가능한 증상의 안정화), 생리적으로(예를 들어, 신체적 파라미터의 안정화), 또는 두 가지 측면 모두에서 질환 또는 장애를 조절하는 것을 지칭한다. 보다 구체적으로, 질환 HS를 "치료하는"이라는 용어는 HS 환자에서 염증성 병변을 치료하는 것(수 또는 질적으로 또는 이들의 부피 및 크기를 감소시키는 것), 및/또는 HS 환자에서 농양 및 염증성 결절 및/또는 배농 누관을 치료하는 것, 및/또는 흉터 형성의 양을 감소시키는 것 및/또는 흉터 형성과 연관된 기능적 제한을 경감시키는 것을 지칭한다. 질환 HS를 치료하는 것은 또한 HS와 연관된 통증, 피로 및/또는 가려움증을 완화하는 것, 고름 분비를 감소시키고 고름 분비와 연관된 냄새를 감소시키는 것, 및/또는 HS 환자의 삶의 질을 개선하는 것 및/또는 작업 손실을 감소시키는 것을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "예방"은 질환 또는 장애의 발병 또는 발달 또는 진행을 지연시키는 것을 지칭한다. 보다 구체적으로, 질환 HS를 "예방하는"이라는 용어는 HS 악화 및/또는 새로운 병변이 나타나는 것을 예방하는 것; 흉터 형성을 예방하는 것 및 흉터 형성과 연관된 기능적 제한을 예방하는 것 및/또는 특히 HS에 대한 외과 처치를 예방하는 것을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 대상체가 치료로부터 생물학적으로, 의학적으로, 또는 삶의 질에 있어서 이익을 얻을 경우에 이러한 대상체는 이러한 치료"를 필요로 한다".

본원에서 사용되는 바와 같이, "치료적 유효량"은 환자(예컨대, 인간)에게 단회 또는 다회 용량 투여 시, 장애 또는 재발성 장애의 적어도 하나의 증상의 치료, 예방, 발병의 예방, 치유, 지연, 중증도 감소, 호전에 효과적이거나, 이러한 치료의 부재 시 예상되는 것 이상으로 환자의 생존을 연장시키는 데 효과적인, IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 동시에 표적화하는 이중특이적 항체(예를 들어, bbmAb1) 또는 이의 항원 결합 단편의 양을 지칭한다. 단독으로 투여된 개별적인 활성 성분(예를 들어, bbmAb1)에 적용될 때, 이 용어는 그 성분을 단독으로 지칭한다. 조합에 적용될 때, 이 용어는 조합하여, 연속적으로, 또는 동시에 투여되는지에 관계없이, 치료적 효과를 초래하는 활성 성분을 합한 양을 지칭한다.

어구 "치료적 섭생"은 병을 치료하는 데 사용되는 섭생, 예를 들어, HS의 치료 동안 사용되는 투약 프로토콜을 의미한다. 치료적 섭생은 로딩 섭생(또는 로딩 투약), 이어서 유지 섭생(또는 유지 투약)을 포함할 수 있다.

어구 "로딩 섭생" 또는 "로딩 기간"은 질환의 초기 치료를 위해 사용되는 치료 섭생(또는 치료 섭생의 일부분)을 지칭한다. 일부 구현예에서, 개시된 방법, 용도, 키트, 프로세스 및 섭생(예를 들어, HS의 치료 방법)은 로딩 섭생(또는 로딩 투약)을 이용한다. 일부 사례에서, 로딩 기간은 최대 효능이 달성될 때까지의 기간이다. 로딩 섭생의 일반적인 목표는 치료 섭생의 초기 기간 동안 환자에게 높은 수준의 약물을 제공하는 것이다. 로딩 섭생은 의사가 유지 섭생 동안 이용할 용량보다 더 큰 용량의 약물을 투여하는 것, 의사가 유지 섭생 동안 약물을 투여할 빈도보다 더 자주 약물을 투여하는 것, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 로딩 섭생 동안 또는 후에 용량 증량이 발생할 수 있다.

어구 "유지 섭생" 또는 "유지 기간"은 로딩 섭생 또는 기간 후에, 병의 치료 동안 환자의 유지를 위해, 예를 들어, 오랜 기간(수 개월 또는 수 년) 동안 환자를 관해 상태로 유지하기 위해 사용되는 치료 섭생(또는 치료 섭생의 일부분)을 지칭한다. 일부 구현예에서, 개시된 방법, 용도, 및 섭생은 유지 섭생을 이용한다. 유지 섭생은 연속 요법(예를 들어, 약물을 정기적인 간격으로, 예를 들어 매주, 격주로, 또는 매월(4주마다), 매년 투여하는 것 등) 또는 간헐적 요법(예를 들어, 단속적 치료, 간헐적 치료, 재발 시 치료, 또는 특정한 사전결정된 기준[예를 들어, 통증, 질환 소견 등] 달성 시 치료)을 이용할 수 있다. 유지 섭생 동안 용량 증량이 발생할 수 있다.

어구 "투여하기 위한 수단"은, 비제한적으로 사전 충전형 시린지, 바이알 및 시린지, 주사 펜, 자동주사기, i.v. 드립 및 백, 펌프, 패치 펌프 등을 포함하는, 환자에게 약물을 전신적으로 투여하기 위해 이용 가능한 임의의 도구를 나타내기 위해 사용된다. 이러한 물품을 이용하여, 환자가 약물을 자가-투여(즉, 그들 스스로 약물을 투여)할 수 있거나, 의사가 약물을 투여할 수 있다.

2. IL-18 항체

개시된 방법에서 사용되는 특히 바람직한 IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 항체이다.

참조의 편의를 위해, 카바트 정의 및 초티아 정의에 기반한, mAb1로 불리는, 특이적 IL-18 항체의 초가변 영역, 뿐만 아니라, V_L및 V_H도메인 및 전체 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열이 하기 표 1에 제공되어 있다.

[표 1]

mAb1의 초가변 영역(CDR), 가변 도메인(VH 및 VL) 및 전체 쇄의 아미노산 서열. mAb1의 VL을 인코딩하는 DNA는 SEQ ID NO:18에 제시되어 있다. mAb1의 VH을 인코딩하는 DNA는 SEQ ID NO:8에 제시되어 있다.

일 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(V_H)을 포함하고, 상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:1을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:2를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:3을 갖는다. 일 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(V_H)을 포함하고, 상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:4를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:5를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:6을 갖는다.

일 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(V_L)을 포함하고, 상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:11을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:12를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:13을 갖는다. 일 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(V_L)을 포함하고, 상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:14를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:15를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:16을 갖는다.

일 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 면역글로불린 V_H도메인 및 적어도 하나의 면역글로불린 V_L도메인을 포함하며, 여기서, a) 면역글로불린 V_H도메인은 (예를 들어, 서열에서) i) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:1을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:2를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:3을 가짐); 또는 ii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:4를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:5를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:6을 가짐)을 포함하고, b) 면역글로불린 V_L도메인은 (예를 들어, 서열에서) i) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:11을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:12를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:13을 가짐); 또는 ii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:14를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:15를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:16을 가짐)을 포함한다.

일 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 a) SEQ ID NO:7로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(V_H); b) SEQ ID NO:17로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(V_L); c) SEQ ID NO:7로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 V_H도메인 및 SEQ ID NO:17로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 V_L도메인; d) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 및 SEQ ID NO:3으로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 V_H도메인; e) SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, 및 SEQ ID NO:13으로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 V_L도메인; f) SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, 및 SEQ ID NO:6으로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 V_H도메인; g) SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, 및 SEQ ID NO:16으로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 V_L도메인; h) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, 및 SEQ ID NO:3으로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 V_H도메인 및 SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, 및 SEQ ID NO:13으로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 V_L도메인; i) SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, 및 SEQ ID NO:6으로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 V_H도메인 및 SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, 및 SEQ ID NO:16으로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 V_L도메인; j) SEQ ID NO:19를 포함하는 경쇄; k) SEQ ID NO:9를 포함하는 중쇄; 또는 l) SEQ ID NO:19를 포함하는 경쇄 및 SEQ ID NO:9를 포함하는 중쇄를 포함한다.

일부 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, mAb1)은 SEQ ID NO:7의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:17의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:7의 3개의 CDR 및 SEQ ID NO:17의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:9의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:19의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:9의 3개의 CDR 및 SEQ ID NO:19의 3개의 CDR을 포함한다.

일 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, mAb1)은 적어도 다음을 포함하는 인간 IL-18 항체로부터 선택된다: a) 서열에서, 인간 중쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:1을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:2를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:3을 가짐); 및 b) 서열에서, 인간 경쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:11을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:12를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:13을 가짐).

일 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, mAb1)은 적어도 다음을 포함하는 인간 IL-18 항체로부터 선택된다: a) 서열에서, 인간 중쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:4를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:5를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:6을 가짐); 및 b) 서열에서, 인간 경쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:14를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:15를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:16을 가짐).

일 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는 단일쇄 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 선택된다: a) 서열에서, 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 도메인(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:1을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:2를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:3을 가짐); 및 b) 서열에서, 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 도메인(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:11을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:12를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:13을 가짐); 및 c) 제1 도메인의 N-말단 맨 끝 및 제2 도메인의 C-말단 맨 끝 또는 제1 도메인의 C-말단 맨 끝 및 제2 도메인의 N-말단 맨 끝에 결합되는 펩티드 링커.

일 구현예에서, IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, mAb1)은 다음을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는 단일쇄 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 선택된다: a) 서열에서, 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 도메인(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:4를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:5를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:6을 가짐); 및 b) 서열에서, 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 도메인(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:14를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:15를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:16을 가짐); 및 c) 제1 도메인의 N-말단 맨 끝 및 제2 도메인의 C-말단 맨 끝 또는 제1 도메인의 C-말단 맨 끝 및 제2 도메인의 N-말단 맨 끝에 결합되는 펩티드 링커.

개시된 방법에서 사용되는 IL-18 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 V_H또는 V_L도메인은 SEQ ID NO:7 및 17에 제시된 V_H또는 V_L도메인과 실질적으로 동일한 V_H및/또는 V_L도메인을 가질 수 있다. 본원에 개시된 인간 IL-18 항체는 SEQ ID NO:9로서 제시된 것과 실질적으로 동일한 중쇄 및/또는 SEQ ID NO:19로서 제시된 것과 실질적으로 동일한 경쇄를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 인간 IL-18 항체는 SEQ ID NO:9를 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:19를 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 인간 IL-18 항체는 a) 인간 중쇄의, SEQ ID NO:7에 나타난 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 불변 부분을 포함하는 하나의 중쇄; 및 b) 인간 경쇄의, SEQ ID NO:17에 나타난 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 불변 부분을 포함하는 하나의 경쇄를 포함할 수 있다.

개시된 방법, 키트 및 섭생에서 사용하기 위한 다른 바람직한 IL-18 길항제(예를 들어, 항체)는 미국 특허 제9,376,489호에 제시되어 있는 것들이며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

3. IL-1β 항체

개시된 방법에서 사용되는 특히 바람직한 IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 항체이다.

참조의 편의를 위해, 카바트 정의 및 초티아 정의에 기반한, mAb2로 불리는, 특이적 IL-1β 항체의 초가변 영역, 뿐만 아니라, V_L및 V_H도메인 및 전체 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열이 하기 표 2에 제공되어 있다.

[표 2]

mAb2의 초가변 영역(CDR), 가변 도메인(VH 및 VL) 및 전체 쇄의 아미노산 서열. mAb2의 VL을 인코딩하는 DNA는 SEQ ID NO:38에 제시되어 있다. mAb2의 VH을 인코딩하는 DNA는 SEQ ID NO:27에 제시되어 있다.

일 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(V_H)을 포함하고, 상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:21을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:22를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:23을 갖는다. 일 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(V_H)을 포함하고, 상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:24를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:25를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:26을 갖는다.

일 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(V_L)을 포함하고, 상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:31을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:32를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:33을 갖는다. 일 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 적어도 하나의 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(V_L)을 포함하고, 상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:34를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:35를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:36을 갖는다.

일 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 적어도 하나의 면역글로불린 V_H도메인 및 적어도 하나의 면역글로불린 V_L도메인을 포함하며, 여기서, a) 면역글로불린 V_H도메인은 (예를 들어, 서열에서) i) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:21을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:22를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:23을 가짐); 또는 ii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:24를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:25를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:26을 가짐)을 포함하고, b) 면역글로불린 V_L도메인은 (예를 들어, 서열에서) i) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:31을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:32를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:33을 가짐); 또는 ii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:34를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:35를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:36을 가짐)을 포함한다.

일 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 a) SEQ ID NO:27로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(V_H); b) SEQ ID NO:37로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(V_L); c) SEQ ID NO:27로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 V_H도메인 및 SEQ ID NO:37로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 면역글로불린 V_L도메인; d) SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, 및 SEQ ID NO:23으로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 V_H도메인; e) SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, 및 SEQ ID NO:33으로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 V_L도메인; f) SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, 및 SEQ ID NO:26으로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 V_H도메인; g) SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, 및 SEQ ID NO:36으로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 V_L도메인; h) SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, 및 SEQ ID NO:23으로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 V_H도메인 및 SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, 및 SEQ ID NO:33으로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 V_L도메인; i) SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, 및 SEQ ID NO:26으로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 V_H도메인 및 SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, 및 SEQ ID NO:36으로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 면역글로불린 V_L도메인; j) SEQ ID NO:37을 포함하는 경쇄; k) SEQ ID NO:29를 포함하는 중쇄; 또는 l) SEQ ID NO:39를 포함하는 경쇄 및 SEQ ID NO:29를 포함하는 중쇄를 포함한다.

일부 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, mAb2)은 SEQ ID NO:37의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:27의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:37의 3개의 CDR 및 SEQ ID NO:27의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:39의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:29의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 SEQ ID NO:39의 3개의 CDR 및 SEQ ID NO:29의 3개의 CDR을 포함한다.

일 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, mAb2)은 적어도 다음을 포함하는 인간 IL-1β 항체로부터 선택된다: a) 서열에서, 인간 중쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:21을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:22를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:23을 가짐); 및 b) 서열에서, 인간 경쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:31을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:32를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:33을 가짐).

일 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, mAb2)은 적어도 다음을 포함하는 인간 IL-1β 항체로부터 선택된다: a) 서열에서, 인간 중쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:24를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:25를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:26을 가짐); 및 b) 서열에서, 인간 경쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:34를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:35를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:36을 가짐).

일 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는 단일쇄 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 선택된다: a) 서열에서, 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 도메인(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:21을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:22를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:23을 가짐); 및 b) 서열에서, 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 도메인(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:31을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:32를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:33을 가짐); 및 c) 제1 도메인의 N-말단 맨 끝 및 제2 도메인의 C-말단 맨 끝 또는 제1 도메인의 C-말단 맨 끝 및 제2 도메인의 N-말단 맨 끝에 결합되는 펩티드 링커.

일 구현예에서, IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편(예를 들어, mAb2)은 다음을 포함하는 항원-결합 부위를 포함하는 단일쇄 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터 선택된다: a) 서열에서, 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 도메인(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:24를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:25를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:26을 가짐); 및 b) 서열에서, 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 도메인(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:34를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:35를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:36을 가짐); 및 c) 제1 도메인의 N-말단 맨 끝 및 제2 도메인의 C-말단 맨 끝 또는 제1 도메인의 C-말단 맨 끝 및 제2 도메인의 N-말단 맨 끝에 결합되는 펩티드 링커.

개시된 방법에서 사용되는 IL-1β 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 V_H또는 V_L도메인은 SEQ ID NO:27 및 37에 제시된 V_H또는 V_L도메인과 실질적으로 동일한 V_H및/또는 V_L도메인을 가질 수 있다. 본원에 개시된 인간 IL-1β 항체는 SEQ ID NO:29로서 제시된 것과 실질적으로 동일한 중쇄 및/또는 SEQ ID NO:39로서 제시된 것과 실질적으로 동일한 경쇄를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 인간 IL-1β 항체는 SEQ ID NO:29를 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:39를 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 인간 IL-1β 항체는 a) 인간 중쇄의, SEQ ID NO:27에 나타난 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 불변 부분을 포함하는 하나의 중쇄; 및 b) 인간 경쇄의, SEQ ID NO:37에 나타난 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 불변 부분을 포함하는 하나의 경쇄를 포함할 수 있다.

개시된 방법, 키트 및 섭생에서 사용하기 위한 다른 바람직한 IL-1β 길항제(예를 들어, 항체)는 미국 특허 제7,446,175호 또는 제7,993,878호 또는 제8,273,350호에 제시된 것들이며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

4. Fc 변형

프레임워크 또는 CDR 영역 내에서 이루어진 변형 외에도, 또는 그에 대한 대안으로서, 본 발명의 항체는 전형적으로 항체의 하나 이상의 기능적 특성, 예컨대 혈청 반감기, 보체 고정, Fc 수용체 결합, 및/또는 항원-의존적 세포독성을 변경하기 위해 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록 조작될 수 있다. 추가로, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형될 수 있거나(예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있음), 그의 글리코실화를 변경하기 위해, 다시 항체의 하나 이상의 기능적 특성을 변경하기 위해 변형될 수 있다. 이들 구현예 각각은 하기에서 추가로 상세히 기재된다. Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 문헌[Edelman et al., PNAS, 1969 May, 63(1):78-85]의 EU 넘버링 체계의 넘버링이다.

일 구현예에서, CH1의 힌지 영역은, 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수가 변경되도록, 예를 들어, 증가되거나 감소되도록 변형된다. 이 접근법은 Bodmer 등의 미국 특허 제5,677,425호에 추가로 기재되어 있다. CH1의 힌지 영역 내의 시스테인 잔기의 수는, 예를 들어, 경쇄 및 중쇄의 조립을 용이하게 하거나 항체의 안정성을 증가 또는 감소시키도록 변경된다.

또 다른 구현예에서, 항체의 Fc 힌지 영역은 항체의 생물학적 반감기를 감소시키도록 돌연변이된다. 보다 구체적으로, 항체가 천연 Fc-힌지 도메인 스타필로코커스 단백질 A(SpA) 결합에 비해 손상된 SpA 결합을 갖도록 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc-힌지 단편의 CH2-CH3 도메인 계면(interface) 영역 내로 도입된다. 이 접근법은 Ward 등의 미국 특허 제6,165,745호에 추가로 상세히 기재되어 있다.

또 다른 구현예에서, 항체는 그의 생물학적 반감기를 증가시키도록 변형된다. 다양한 접근법이 가능하다. 예를 들어, 다음의 돌연변이 중 하나 이상이 도입될 수 있다: Ward의 미국 특허 제6,277,375호에 기재된 바와 같은 T252L, T254S, T256F. 대안적으로, 생물학적 반감기를 증가시키기 위해, 항체는 Presta 등의 미국 특허 제5,869,046호 및 제6,121,022호에 기재된 바와 같은, IgG의 Fc 영역의 CH2 도메인의 2개의 루프(loop)로부터 취한 샐비지 수용체(salvage receptor) 결합 에피토프를 함유하도록 CH1 또는 CL 영역 내에서 변경될 수 있다.

추가로 다른 구현예에서, Fc 영역은 항체의 이펙터 기능을 변경하기 위해 적어도 하나의 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 대체함으로써 변경된다. 예를 들어, 항체가 이펙터 리간드에 대해 변경된 친화도를 갖지만 모체 항체의 항원-결합 능력을 보유하도록 하나 이상의 아미노산이 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 친화도가 변경된 이펙터 리간드는, 예를 들어, Fc 수용체 또는 보체의 C1 구성요소일 수 있다. 이 접근법은 Winter 등의 미국 특허 제5,624,821호 및 제5,648,260호 둘 모두에 추가로 상세히 기재되어 있다.

또 다른 구현예에서, 아미노산 잔기로부터 선택된 하나 이상의 아미노산은, 항체가 변경된 C1q 결합 및/또는 감소 또는 소멸된 보체 의존적 세포독성(CDC)을 갖도록 상이한 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 이 접근법은 Idusogie 등의 미국 특허 제6,194,551호에 추가로 상세히 기재되어 있다.

또 다른 구현예에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 변경됨으로써, 보체를 고정하는 항체의 능력을 변경한다. 이 접근법은 Bodmer 등의 PCT 공보 WO 94/29351호에 추가로 기재되어 있다.

추가로 또 다른 구현예에서, Fc 영역은 하나 이상의 아미노산을 변형시킴으로써, 항체가 항체 의존적 세포독성(ADCC)을 매개하는 능력을 증가시키고/시키거나 Fcγ 수용체에 대한 항체의 친화도를 증가시키도록 변형된다. 이 접근법은 Presta의 PCT 공보 WO 00/42072호에 추가로 기재되어 있다. 또한, FcγRl, FcγRII, FcγRIII 및 FcRn에 대한 인간 IgG1 상의 결합 부위가 맵핑되었으며, 결합이 개선된 변이체가 기재된 바 있다(문헌[Shields, R.L. et al, (2001) J Biol Chem 276:6591-6604] 참조).

특정 구현예에서, IgG1 이소형의 Fc 도메인이 사용된다. 일부 구체적인 구현예에서, IgG1 Fc 단편의 돌연변이 변이체, 예를 들어, 융합 폴리펩티드가 항체 의존적 세포독성(ADCC)을 매개하고/하거나 Fcγ 수용체에 결합하는 능력을 감소시키거나 제거하는 침묵 IgG1 Fc가 사용된다. 문헌[Hezareh et al, J. Virol (2001); 75(24):12161-8]에 기재된 바와 같은, 아미노산 위치 234번 및 235번에서 류신 잔기가 알라닌 잔기에 의해 대체된 IgG1 이소형 침묵 돌연변이체의 예.

특정 구현예에서, Fc 도메인은 Fc 도메인의 위치 297번에서의 글리코실화를 예방하는 돌연변이체이다. 예를 들어, Fc 도메인은 위치 297번에서 아스파라긴 잔기의 아미노산 치환을 함유한다. 이러한 아미노산 치환의 예는 N297을 글리신 또는 알라닌에 의해 대체하는 것이다.

침묵화된 이펙터 기능은 항체의 Fc 영역의 돌연변이에 의해 수득될 수 있고, 당해 분야에 기재된 바 있다: LALA 및 N297A (문헌[Strohl, W., 2009, Curr. Opin. Biotechnol. vol. 20(6):685-691]); 및 D265A(문헌[Baudino et al., 2008, J. lmmunol. 181:6664-69]; 위의 Strohl, W.); 및 DAPA (D265A 및 P329A)(문헌[Shields RL., J Biol Chem. 2001;276(9):6591-604]; 미국 특허 공보 US2015/0320880호). 침묵 Fc lgG1 항체의 예는 lgG1 Fc 아미노산 서열에 L234A 및 L235A 돌연변이를 포함하는 소위 LALA 돌연변이체를 포함한다. 침묵 lgG1 항체의 또 다른 예는 D265A 돌연변이를 포함한다. 침묵 lgG1 항체의 또 다른 예는 IgG1 Fc 아미노산 서열에 대한 D265A 및 P329A 돌연변이를 포함하는 소위 DAPA 돌연변이체이다. 또 다른 침묵 lgG1 항체는 아글리코실화/비-글리코실화 항체를 초래하는 N297A 돌연변이를 포함한다. 침묵화된 이펙터 기능을 제공하기 위한 추가적인 Fc 돌연변이는 PCT 공보 제WO2014/145806호에(예를 들어, WO2014/145806호의 도 7에) 기재되어 있으며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 침묵 IgG1 항체의 WO2014/145806호로부터의 하나의 예는 E233P, L234V, L235A, 및 S267K 돌연변이, 및 G236의 결실(G236del)을 포함한다. 침묵 IgG1 항체의 WO2014/145806호로부터의 또 다른 예는 E233P, L234V, 및 L235A 돌연변이, 및 G236의 결실(G236del)을 포함한다. 침묵 IgG1 항체의 WO2014/145806호로부터의 또 다른 예는 S267K 돌연변이를 포함한다.

여전히 또 다른 구현예에서, 항체의 글리코실화는 변형된다. 예를 들어, 아글리코실화된 항체가 만들어질 수 있다(즉, 항체에 글리코실화가 결여됨). 글리코실화는, 예를 들어, 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시키기 위해 변경될 수 있다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 항체 서열 내의 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거함으로써 해당 부위에서 글리코실화 제거를 초래하는 하나 이상의 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 이러한 아글리코실화는 항원에 대한 항체의 친화도를 증가시킬 수 있다. 이러한 접근법은 Co 등의 미국 특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호에 추가로 상세히 기재되어 있다.

추가적으로 또는 대안적으로, 변경된 유형의 글리코실화를 갖는 항체, 예컨대 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 하이포푸코실화 항체(hypofucosylated antibody) 또는 증가된 이등분면(bisecting) GlcNac 구조를 갖는 항체가 만들어질 수 있다. 이러한 변경된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 입증되었다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어, 변경된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시킴으로써 달성될 수 있다. 변경된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당해 분야에 기재된 바 있고, 본 발명의 재조합 항체를 발현시킴으로써 변경된 글리코실화를 갖는 항체를 생산하는 숙주 세포로서 사용될 수 있다. 예를 들어, Hang 등의 EP 1,176,195호는 세포주가, 푸코실 트랜스퍼라제를 인코딩하는 기능적으로 방해된 FUT8 유전자를 가짐으로써 이러한 세포주에서 발현된 항체가 하이포푸코실화를 나타낸다는 것을 기재하고 있다. 그러므로, 일 구현예에서, 본 발명의 항체는 하이포푸코실화 패턴을 나타내는 세포주, 예를 들어, 푸코실트랜스퍼라제를 인코딩하는 FUT8 유전자의 발현이 결핍된 포유류 세포주에서 재조합 발현에 의해 생산된다. Presta의 PCT 공보 WO 03/035835호는 푸코스를 Asn(297)-연결된 탄수화물에 부착하는 능력이 감소되어, 해당 숙주 세포에서 발현되는 항체의 하이포푸코실화도 초래하는 변이체 CHO 세포주, Lecl3 세포를 기재하고 있다(또한 문헌[Shields, R.L. et al., 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740] 참조). Umana 등의 PCT 공보 WO 99/54342호는, 당단백질-변형 글리코실 트랜스퍼라제(예를 들어, 베타(1,4)-N 아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III(GnTIII))를 발현시키도록 조작되어, 조작된 세포주에서 발현된 항체가 항체의 증가된 ADCC 활성을 초래하는 증가된 이등분면 GlcNac 구조를 나타내는 세포주를 기재하고 있다(또한 문헌[Umana et al., 1999 Nat. Biotech. 17:176-180] 참조). 대안적으로, 본 발명의 항체는 포유류-유사 글리코실화 패턴에 대해 조작되고, 글리코실화 패턴으로서 푸코스가 결여된 항체를 생산할 수 있는 효모 또는 사상 진균에서 생산될 수 있다(예를 들어, EP1297172B1호 참조).

본 발명에 의해 고려되는 본원에서의 항체의 또 다른 변형은 페길화이다. 항체는, 예를 들어, 항체의 생물학적(예를 들어, 혈청) 반감기를 증가시키기 위해 페길화될 수 있다. 항체를 페길화하기 위해, 항체, 또는 이의 단편을, 전형적으로, 하나 이상의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 기가 항체 또는 항체 단편에 부착되는 조건 하에서, PEG, 예컨대 PEG의 반응성 에스테르 또는 알데히드 유도체와 반응시킨다. 페길화는 반응성 PEG 분자(또는 유사한 반응성 수용성 중합체)를 이용하여 아실화 반응 또는 알킬화 반응에 의해 수행될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리에틸렌 글리콜"은, 다른 단백질을 유도체화하는 데 사용되었던 임의의 형태의 PEG, 예컨대 모노 (C1-C10) 알콕시- 또는 아릴옥시-폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜-말레이미드를 포괄하는 것으로 하고자 한다. 특정 구현예에서, 페길화될 항체는 아글리코실화된 항체이다. 단백질을 페길화하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 본 발명의 항체에 적용될 수 있다. 예를 들어, Nishimura 등의 EP 0 154 316호 및 Ishikawa 등의 EP 0 401 384호를 참조한다.

본 발명에 의해 고려되는 항체의 또 다른 변형은 생성된 분자의 반감기를 증가시키기 위한, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민 또는 이의 단편에 대한 본 발명의 항체의 적어도 항원-결합 영역의 접합체 또는 단백질 융합체이다. 이러한 접근법은, 예를 들어, Ballance 등의 EP0322094호에 기재되어 있다.

본 발명에 의해 고려되는 항체의 또 다른 변형은 이종이량체 이중특이적 항체의 형성을 증가시키기 위한 하나 이상의 변형이다. 예를 들어, EP 1870459A1호; 미국 특허 제5,582,996호; 미국 특허 제5,731,168호; 미국 특허 제5,910,573호; 미국 특허 제5,932,448호; 미국 특허 제6,833,441호; 미국 특허 제7,183,076호; 미국 특허 출원 공보 제2006204493A1호; 및 PCT 공보 제WO2009/089004A1호에 개시된 바와 같이, 당해 분야에서 이용 가능한 다양한 접근법이 이중특이적 항체, 예를 들어, bbmAb의 2개 중쇄 도메인의 이량체화를 강화하는 데 사용될 수 있으며, 이의 내용은 그 전문이 본원에 통합된다.

노브-인투-홀을 사용한 이중특이적 항체의 생성은, 예를 들어, PCT 공보 제WO1996/027011호, 문헌[Ridgway et al., (1996)], 및 문헌[Merchant et al. (1998)]에 개시되어 있다.

본 개시내용의 치료 방법 또는 용도 중 일부를 실시함에 있어서, IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 동시에 표적화하는 이중특이적 항체, 예를 들어 bbmAb1의 치료적 유효량은 이를 필요로 하는 대상체에 투여되어야 한다. 특정한 환자의 경우 섭생 변화가 적절할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 이에 따라, (예를 들어, bbmAb1의) 투여는, 예를 들어, 매일, 격주 투약, 또는 매주 투약처럼 보다 빈번할 수 있다.

일부 환자는 로딩 섭생(예를 들어, 며칠 동안의 매일 투여[예를 들어, 1 내지 4일, 예를 들어, 0일차, 1일차, 2일차, 및/또는 3일차에 투약], 이어서, bbmAb1이 수 주 동안 매주, 격주, 또는 4주마다 투여될 수 있는, 예를 들어, 3주차 또는 4주차에 시작하는 유지 섭생으로부터 이익을 얻을 수 있다. 일부 구현예에서, IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 동시에 표적화하는 이중특이적 항체, 예를 들어, bbmAb1의 투여 기간은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 동안이다. 일부 구현예에서, IL-1β 및 IL-18 둘 모두를 동시에 표적화하는 이중특이적 항체, 예를 들어, bbmAb1의 투여 기간은 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 또는 이를 초과하는 기간이다.

용량 증량은 질환의 중증도에 기반하여, 특정한 환자, 예를 들어, 환자, 예를 들어, bbmAb1을 이용한 치료에 대해 불충분한 반응을 나타내는 환자에게 적절할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 이에 따라, 투여량(정맥내(i.v.))은 약 10 mg/kg 초과, 예를 들어, 약 11 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg 등일 수 있다. 추가로, 피하(s.c.) 투여량(로딩 또는 유지 용량)은 약 50 mg 초과 내지 약 900 mg s.c., 예를 들어, 약 75 mg, 약 100 mg, 약 125 mg, 약 175 mg, 약 200 mg, 약 250 mg, 약 350 mg, 약 400 mg, 약 450 mg, 약 500 mg, 약 600 mg 등일 수 있다.

또한, 특정한 환자, 예컨대 환자, 예를 들어 bbmAb1을 이용한 치료에 대해 유해 사례 또는 유해 반응을 나타내는 환자에게는 용량 감량 또한 적절할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 이에 따라, 의 투여량은 약 10 mg/kg 미만, 예를 들어, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 또는 약 9 mg/kg일 수 있다. 일부 구현예에서, bbmAB1 용량은 의사의 결정에 따라 조정될 수 있다.

일부 구현예에서, bbmAB1 항체는 i.v.로 전달되는 10 mg/kg의 단회 용량으로서 환자에 투여될 수 있으며, 여기서 용량은, 필요한 경우, 의사의 결정에 따라, 더 높거나 더 낮은 용량, 예를 들어 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 또는 약 9 mg/kg 또는 예를 들어, 약 11 mg/kg, 12 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 35 mg/kg 등으로 조정될 수 있다.

일부 구현예에서, bbmAB1 항체는 i.v.로 전달되는 10 mg/kg의 초기 용량으로 환자에 투여될 수 있으며, 그 후에 용량은 의사의 결정에 따라, 필요한 경우 더 높거나 더 낮은 용량으로 조정될 수 있다.

구체적인 구현예에서, 10 mg/kg의 bbmAB1이 1일차에 투여된다.

구체적인 구현예에서, 10 mg/kg의 bbmAB1이 1일차(D1)에 및 2일차(D2), D3, D4, D5, D6, D7, D8, D9, D10, D11, D12, D13, 및/또는 D14에 투여된다.

또 다른 구체적인 구현예에서, 10 mg/kg bbmAB1이 1일차에 i.v.로 투여된다.

실시예 1: 다수의 인플라마솜이 HS에 관여될 가능성이 있다

환자로부터의 HS 전사체의 분석은 비-병변 또는 건강한 조직의 수준과 비교하여 HS 병변에서 AIM2, NLRC4, NLRP7 및 NLRP3 인플라마솜의 mRNA 수준의 증가를 나타낸다(도 1). 모든 이들 인플라마솜 유전자의 발현 수준은 HS 비-병변 샘플 및 건강한 샘플보다 HS 병변 샘플에서 명확하게 더 높은데, 이는 다수의 인플라마솜이 HS 병태생리에 관여될 가능성이 있다는 것을 나타낸다.

실시예 2: IL-1β 및 IL-18 신호전달 경로 둘 모두는 HS에서 활성이다

(a) 피부 생검의 전사체학

18개의 병변 HS 생검, 6개의 병변-주위 및 7개의 비-병변 생검 대 건강한 피부 공여자로부터의 8개의 생검의 전사체학 분석은 다음과 같이 도출하였다: 급속 동결된 피부 조직으로부터, Qiagen RNeasy 미니 키트로부터의 권장 완충액을 사용하여 균질액을 제조하였다. 세포의 총 RNA를 제조업자의 프로토콜에 따라 추출하였다. 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 동일한 시작 양의 RNA로부터 샘플의 cDNA를 제조하였다. 샘플을 Affymetrix HG_U133_Plus2 마이크로어레이 상에서 CiToxLAB France에 의해 처리하였다. RMA 정규화 데이터를 GeneSpring 11.5.1(Agilent Technologies, 산타 클라라, CA)을 사용하여 분석하였다. 처음에는, 데이터가 CiToxLAB에 의해, 및 GeneSpring(PCA, 혼성화 대조군)에서 표준 QC 제어를 거치도록 하였다. 후속하여, 추가의 분석 전에 조건 중 임의의 하나에서 샘플의 100%에서의 20번째 백분위수를 초과하는 프로브세트에 대한 발현 수준에 대해 필터링하였다. 데이터세트는 NCBI GEO 데이터베이스에 기탁되었다(GSE148027). 결과를 TIBCO 스포르파이어 아날리스트(Sporfire Analyst)를 사용하여 시각화하였다.

(b) (건강한 공여자로부터의) 사이토카인 자극된 PBMC의 전사체학

재조합 사이토카인을 이용한 PBMC의 자극은, RPMI 배지 중의 1.5 ml 최종 부피의 12-웰 플레이트의 웰당 7x106개 PBMC를 이용하여 수행함으로써 수행하였다. 재조합 사이토카인을 다음의 최종 농도로 첨가하였다: 10 ng/ml의 재조합 IL-1β, 3 nM의 재조합 IL-18, 및 1 ng/ml의 재조합 IL-12. 37℃ 및 5% CO2에서의 세포 배양물에서 6시간의 자극 후 세포를 수집하였다.

RNA 단리를 위해, 세포를 펠렛화하고 펠렛을 2% β-머캅토에탄올이 있는 350 μl의 Qiagen RTL 완충액 중에 용해시키고, 연구의 모든 샘플이 수집될 때까지 -20℃ 또는 -80℃에서 동결시켰다. Qiagen 표준 프로토콜을 사용하여 RNA 단리를 수행하였다. 상기에 기재된 바와 같이 Affymetrix HG_U133_Plus2 마이크로어레이 상에서 CiToxLAB France에 의해 상이한 RNA 샘플을 처리하였다. 실험 조건 중 임의의 하나에서 적어도 100 퍼센트의 샘플이 20번째 백분위수를 초과하는 값을 갖는 경우 엔티티(프로브세트)를 유지하였다. GeneSpring의 "필터 온 볼케이노 플롯(filter on volcano plot)" 기능을 사용하여 차별 발현 유전자(DEG)를 식별하였다. 독립표본 T-검정과 함께 필터링된 유전자(20.0 내지 100.0번째 백분위수의 발현)를 사용하여 0.05 미만의 보정된 p-값 및 2.0 초과의 배수 변화가 있는 프로브세트를 차별적으로 발현된 것으로 간주하였다. 가능한 경우, 벤자미니-호치버그(Benjamini-Hochberg) 다중 검정 보정을 사용하였다.

생성된 유전자 목록을 "사이토카인 신호전달 시그니처"로서 사용하였고, 정의된 시그니처의 발현 수준을 원래의 실험으로부터의 임의의 연관된 값을 사용하지 않고 HS 전사체학 데이터세트에서 얻었다.

(c) 스폿파이어 전사체학 히트 맵의 생성

사이토카인 자극된 PBMC로부터 수득된 차별적으로 상향조절된 유전자의 발현 수준을 모든 단일 피부 생검에 대해 평균하였고 색상 강도가 증가한 색상 코딩은 각각의 PBMC 시그니처의 증가된 평균 발현 수준에 기인하였다(도 2).

이는 IL-1b뿐만 아니라 IL-18 신호전달 둘 모두가 HS 환자의 병변 피부 내에 존재하고 그 병변 피부에서 활성이며 이 두 사이토카인이 HS 병태생리의 원인일 가능성이 있다는 증거를 제공한다.

실시예 3:

bbmAb1의 생성은 특허 출원 WO/2018/229612호의 실시예 1 내지 5에 상세히 기재된 바 있다. (1) 벡터 작제, (2) 숙주 세포주 및 형질감염, (3) 세포 선택 및 분류, (4) 세포 증식, (5) 클론 안정성, (6) 제작, (7) 분석적 특징규명 및 순도 평가, (8) 분석 결과를 포함하는, WO/2018/229612호의 실시예 1은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

bbmAb1은 2개의 별개의 표적인 IL-1β과 IL-18에 동시에 결합하는, LALA 침묵 돌연변이가 있는 이중특이적 IgG1이다. 이 항체는 2개의 별개의 항원 결합 아암(Fab 단편)을 조합하지만, IL-1β에 대한 Fab는 mAb2를 기반으로 하며 카파 경쇄(Vk6)를 함유한다. IL-18에 대한 Fab는 mAb1을 기반으로 하며 람다 경쇄(Vλ1)로 구성된다. 발현 동안 Fc 도메인의 이종-이량체화를 유발하기 위해, mAb1 중쇄 내에 부피가 큰 아미노산(aa) 측쇄(S354C 및 T366W)가 있는 "노브", 및 작은 aa 측쇄(Y349C, T366S, L368A, Y407V)가 있는 "홀"을 mAb2 중쇄에 도입하였다.

참조의 편의를 위해, 카바트 정의 및 초티아 정의에 기반한, bbmAb1의 초가변 영역, 뿐만 아니라, V_L및 V_H도메인 및 전체 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열이 하기 표 3에 제공되어 있다.

[표 3]

bbmAb1의 초가변 영역(CDR), 가변 도메인(VH 및 VL) 및 전체 쇄의 아미노산 서열. 의 제1 VL을 인코딩하는 DNA는 SEQ ID NO:102에 제시되어 있고, 제2 VL을 인코딩하는 DNA는 SEQ ID NO: 70에 제시되어 있다. 제1 VH를 인코딩하는 DNA는 SEQ ID NO:86에 제시되어 있고, 제2 VH를 인코딩하는 DNA는 SEQ ID NO: 54에 제시되어 있다.

일 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(V_H1)을 포함하며, 상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:76을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:77을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:78을 갖는다. 일 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(V_H1)을 포함하며, 상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:79를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:80을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:81을 갖는다. 일 구현예에서, (i) HS의 개시된 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(V_H1)을 포함하며, 상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:82를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:83을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:84를 갖는다.

일 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(V_H2)을 포함하며, 상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:44를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:45를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:46을 갖는다. 일 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(V_H2)을 포함하며, 상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:47을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:48을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:49를 갖는다. 일 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(V_H2)을 포함하며, 상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:50을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:51을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:52를 갖는다.

일 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(V_L1)을 포함하며, 상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:92를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:93을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:94를 갖는다. 일 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(V_L1)을 포함하며, 상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:95를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:96을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:97를 갖는다. 일 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(V_L1)을 포함하며, 상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:98을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:99를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:100을 갖는다.

일 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(V_L2)을 포함하며, 상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:60을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:61을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:62를 갖는다. 일 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(V_L2)을 포함하며, 상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:63을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:64를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:65를 갖는다. 일 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(V_L2)을 포함하며, 상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:66을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:67을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:68을 갖는다.

일 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 제1 면역글로불린 V_H1도메인 및 제1 면역글로불린 V_L1도메인을 포함하고, 여기서, a) 제1 면역글로불린 V_H1도메인은 (예를 들어, 서열에서) i) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:76을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:77을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:78을 가짐); 또는 ii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:79을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:80을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:81을 가짐) 또는; iii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:82를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:83을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:84를 가짐)을 포함하고, b) 제1 면역글로불린 V_L1도메인은 (예를 들어, 서열에서) i) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:92를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:93을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:94를 가짐) 또는 ii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:95를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:96를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:97을 가짐) 또는 iii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:98을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:99를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:100을 가짐)을 포함한다.

일 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 제2 면역글로불린 V_H2도메인 및 제2 면역글로불린 V_L2도메인을 포함하고, 여기서, a) 제2 면역글로불린 V_H2도메인은 (예를 들어, 서열에서) i) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:44를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:45를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:46을 가짐); 또는 ii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:47을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:48을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:49를 가짐) 또는; iii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:50을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:51을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:52를 가짐)을 포함하고, b) 제2 면역글로불린 V_L2도메인은 (예를 들어, 서열에서) i) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:60을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:61을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:62를 가짐) 또는 ii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:63을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:64를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:65를 가짐) 또는 iii) 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:66을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:67을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:68을 가짐)을 포함한다.

일 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 a) SEQ ID NO:85로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제1 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH1); b) SEQ ID NO:101로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(V_L1); c) SEQ ID NO:85로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제1 면역글로불린 V_H1도메인 및 SEQ ID NO:101로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제1 면역글로불린 V_L1도메인; d) SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, 및 SEQ ID NO:78로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 제1 면역글로불린 V_H1도메인; e) SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, 및 SEQ ID NO:94로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 제1 면역글로불린 V_L1도메인; f) SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, 및 SEQ ID NO:81로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 제1 면역글로불린 V_H1도메인; g) SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 및 SEQ ID NO:97로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 제1 면역글로불린 V_L1도메인; h) SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, 및 SEQ ID NO:78로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 제1 면역글로불린 V_H1도메인 및 SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:93, 및 SEQ ID NO:94로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 제1 면역글로불린 V_L1도메인; i) SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, 및 SEQ ID NO:81로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 제1 면역글로불린 V_H1도메인 및 SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, 및 SEQ ID NO:97로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 제1 면역글로불린 V_L1도메인; j) SEQ ID NO:103을 포함하는 제1 경쇄; k) SEQ ID NO:87을 포함하는 제1 중쇄; 또는 l) SEQ ID NO:103을 포함하는 제1 경쇄 및 SEQ ID NO:87을 포함하는 제1 중쇄를 포함한다.

일 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 a) SEQ ID NO:53으로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제2 면역글로불린 중쇄 가변 도메인(VH2); b) SEQ ID NO:69로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인(V_L2); c) SEQ ID NO:53으로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제2 면역글로불린 V_H2도메인 및 SEQ ID NO:69로서 제시된 아미노산 서열을 포함하는 제2 면역글로불린 V_L2도메인; d) SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, 및 SEQ ID NO:46으로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 제2 면역글로불린 V_H2도메인; e) SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:62로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 제2 면역글로불린 V_L2도메인; f) SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, 및 SEQ ID NO:49로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 제2 면역글로불린 V_H2도메인; g) SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, 및 SEQ ID NO:65로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 제2 면역글로불린 V_L2도메인; h) SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, 및 SEQ ID NO:46으로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 제2 면역글로불린 V_H2도메인 및 SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:62로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 제2 면역글로불린 V_L2도메인; i) SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, 및 SEQ ID NO:49로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 제2 면역글로불린 V_H2도메인 및 SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, 및 SEQ ID NO:65로서 제시된 초가변 영역을 포함하는 제2 면역글로불린 V_L2도메인; j) SEQ ID NO:81을 포함하는 제2 경쇄; k) SEQ ID NO:55를 포함하는 제2 중쇄; 또는 l) SEQ ID NO:81을 포함하는 제2 경쇄 및 SEQ ID NO:55를 포함하는 제2 중쇄를 포함한다.

일부 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 SEQ ID NO:53의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 SEQ ID NO:69의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 SEQ ID NO:53의 3개의 CDR 및 SEQ ID NO:69의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 SEQ ID NO:85의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 SEQ ID NO:101의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 SEQ ID NO:85의 3개의 CDR 및 SEQ ID NO:101의 3개의 CDR을 포함한다.

일부 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 SEQ ID NO:85의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 SEQ ID NO:101의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 SEQ ID NO:85의 3개의 CDR 및 SEQ ID NO:101의 3개의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 SEQ ID NO:53의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 SEQ ID NO:69의 3개의 CDR을 포함한다. 다른 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 SEQ ID NO:53의 3개의 CDR 및 SEQ ID NO:69의 3개의 CDR을 포함한다. 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 L-18/IL-1β 이중특이적 항체는 SEQ ID NO:85의 3개의 CDR, SEQ ID NO:101의 3개의 CDR, SEQ ID NO:53의 3개의 CDR 및 SEQ ID NO:69의 3개의 CDR을 포함한다.

일 구현예에서, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체의 제1 부분은 적어도 다음을 포함하는 인간 IL-18 항체로부터 선택된다: a) 서열에서, 인간 중쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:76을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:77을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:78을 가짐); 및 b) 서열에서, 인간 경쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:92를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:93을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:94를 가짐). 추가로, IL-18/IL-1β 이중특이적 항체의 제2 부분은 적어도 다음을 포함하는 인간 IL-1β 항체로부터 선택된다: a) 서열에서, 인간 중쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 중쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:44를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:45를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:46을 가짐); 및 b) 서열에서, 인간 경쇄의 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 가변 도메인 및 불변 부분 또는 이의 단편을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 이의 단편(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:60을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:61을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:62를 가짐).

개시된 방법에서 사용되는 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체의 제1 V_H1또는 V_L1도메인은 SEQ ID NO:85 및 101에 제시된 V_H또는 V_L도메인과 실질적으로 동일한 제1 V_H1및/또는 제1 V_L1도메인을 가질 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 SEQ ID NO:87로서 제시된 것과 실질적으로 동일한 제1 중쇄 및/또는 SEQ ID NO:103으로서 제시된 것과 실질적으로 동일한 제1 경쇄를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 SEQ ID NO:87을 포함하는 제1 중쇄 및 SEQ ID NO:103을 포함하는 제1 경쇄를 포함할 수 있다. HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 a) 이종-이량체화 변형을 갖는 인간 중쇄의, SEQ ID NO:85에 나타난 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 불변 부분을 포함하는 제1 중쇄; 및 b) 인간 경쇄의, SEQ ID NO:101에 나타난 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 불변 부분을 포함하는 제1 경쇄를 포함할 수 있다. 인간 중쇄의 불변 부분은 IgG1일 수 있다. 일 구현예에서, IgG1은 이펙터 돌연변이가 없는 인간 IgG1이다. 일 구현예에서, 침묵 돌연변이 N297A, D265A, 또는 L234A와 L235A의 조합을 포함하는 인간 중쇄 IgG1. 하나의 구체적인 구현예에서, 인간 중쇄 IgG1은 SEQ ID NO:87에 따라, L234A와 L235A의 조합인 침묵 돌연변이를 포함한다.

개시된 방법에서 사용되는 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체의 제2 V_H2또는 V_L2도메인은 SEQ ID NO:53 및 69에 제시된 V_H또는 V_L도메인과 실질적으로 동일한 제2 V_H2및/또는 제1 V_L2도메인을 가질 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 SEQ ID NO:55로서 제시된 것과 실질적으로 동일한 제2 중쇄 및/또는 SEQ ID NO:71로서 제시된 것과 실질적으로 동일한 제2 경쇄를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 SEQ ID NO:53을 포함하는 제2 중쇄 및 SEQ ID NO:69를 포함하는 제2 경쇄를 포함할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, HS의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 IL-18/IL-1β 이중특이적 항체는 a) 제1 중쇄의 이종-이량체화에 대해 상보적인 이종-이량체화 변형을 갖는 인간 중쇄의, SEQ ID NO:53에 나타난 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 불변 부분을 포함하는 제2 중쇄; 및 b) 인간 경쇄의, SEQ ID NO:69에 나타난 것과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 가변 도메인 및 불변 부분을 포함하는 제2 경쇄를 포함할 수 있다. 인간 중쇄의 불변 부분은 IgG1일 수 있다. 일 구현예에서, IgG1은 이펙터 돌연변이가 없는 인간 IgG1이다. 일 구현예에서, 침묵 돌연변이 N297A, D265A, 또는 L234A와 L235A의 조합을 포함하는 인간 중쇄 IgG1. 하나의 구체적인 구현예에서, 인간 중쇄 IgG1은 SEQ ID NO:55에 따라, L234A와 L235A의 조합인 침묵 돌연변이를 포함한다.

개시된 방법, 키트 및 섭생에서 이중특이적 항체의 제1 부분으로서 사용하기 위한 다른 바람직한 IL-18 길항제(예를 들어, 항체)는 미국 특허 제9,376,489호에 제시되어 있는 것들이며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

개시된 방법, 키트 및 섭생에서 이중특이적의 제2 부분으로서 사용하기 위한 다른 바람직한 IL-1β 길항제(예를 들어, 항체)는 미국 특허 제7,446,175호 또는 제7,993,878호 또는 제8,273,350호에 제시된 것들이며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. .

실시예 4: bbmAb1의 시험관내 활성

bbmAb1의 결합 활성을 여러 상이한 세포 검정에서 시험하였다.

(1) 재료 및 방법

(a) 용액 평형 적정(solution equilibrium titration, SET) 검정의 경우

다음의 재료를 사용하였다:

재조합 인간 IL-18, 비오틴화됨(BTP25828)

재조합 시노몰구스 원숭이 IL-1β(Novartis)

항-인간 IgG 항체, 설포-태그(SULFO-TAG) 라벨 부착형(Meso Scale discovery (MSD) # R32AJ-5). 염소 항-인간 Fab 특이적, MSD 설포-태그 NHS 에스테르와 접합됨(Jackson Immuno Research # 109-005-097, MSD #R91AN-1) BSA(Sigma # A-9647)

계면활성제가 있는 MSD 판독 완충액 T(MSD #R92TC-1)

인산염-완충 식염수(PBS) 10x(Teknova #P0195) 트리스-완충 식염수, pH 7.5(TBS) 10x(Teknova #T1680) 트윈-20(Fluka #93773)

폴리프로필렌 미세적정 플레이트(MTP)(Greiner #781280)

384-웰 플레이트, 표준(MSD #L21XA)

(b) 세포 검정 및 SET 검정의 경우

IL-1β 항체 섹션에 기재된 바와 같은 mAb2.

IL-18 항체 섹션에 기재된 바와 같은 mAb1.

실시예 1에 기재된 바와 같은 bbmAb1.

MBL Int. Corp.로부터 구입한 재조합 인간 IL-18(BTP 25829)(#B001-5)

재조합 마모셋 IL-1β(Novartis)

재조합 마모셋 IL-18(Novartis)

재조합 인간 IL-12(#573008)는 Biolegend KG-1 세포주(ATCC #CCL-246)로부터 구입

정상 인간 진피 섬유모세포(#CC-2509)는 Lonza로부터 구입

마모셋 피부 섬유모세포(#42637F (510))

HEK-Blue™ IL-18/IL-1β 세포(#hkb-il18)는 InvivoGen으로부터 구입

PBMC는 Blutspendezentrum Bern으로부터 수득된 백혈구 연층으로부터 단리

마모셋 혈액은 SILABE(Niederhausbergen)로부터 수득

IL-6 ELISA: 인간(BioLegend, #430503); 마모셋(U-CyTech biosciences, CT974-5)

IFNγ ELISA: 인간(BD555142) 및 마모셋(U-CyTech biosciences #CT340A)

SEAP의 검출을 위한 QUANTI-Blue™ 검정(#rep-qb1)은 InvivoGen으로부터 구입

세포 배지: 10% 소 태아 혈청(Invitrogen #10108-157), 1% L-글루타민(Invitrogen #25030-03), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen #15140-148), 10 μM 2-머캅토에탄올(Gibco #31350-010), 5 mM 헤페스(Hepes)(Gibco #15630-080)가 보충된 RPMI 1640(Invitrogen #31870)

둥근-바닥의, 조직-배양 처리된 96-웰 플레이트(Costar #3799)

넓적-바닥의, 조직-배양 처리된 96-웰 플레이트(Costar #3596)

Ficoll-Pacque™ Plus(GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02) PBS 1X, 칼슘 및 마그네슘 없음(Gibco #14190094)

다공성 장벽이 있는 Leucosep 튜브, 50 ml, 폴리프로필렌(Greiner bio-one #227290) Falcon 15 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브(BD#352096)

Falcon 50 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브(BD #352070)

(c) SET에 의한 친화도 측정

SET 개별 표적 결합 검정

항원의 22회 연속 1.6n 희석물(최고 농도: huIL-18, 5 nM; marIL-18, 10 nM; huIL-1β, 0.5 nM; marIL-1β, 0.5 nM)을 샘플 완충액(0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 및 0.02% 트윈-20을 함유하는 PBS) 중에서 제조하고, 일정한 농도의 항체를 첨가하였다(IL-18 판독의 경우 10 pM, IL-1β 판독의 경우 1 pM). 60 μl/웰 부피의 각각의 항원-항체 혼합물을 384-웰 폴리프로필렌 미세적정 플레이트(MTP)에 2회 반복으로 분배하였다. 샘플 완충액은 음성 대조군으로서, 그리고 항체만을 함유하는 샘플은 양성 대조군(항원이 없는 최대 전기화학발광 신호, B_max)으로서의 역할을 하였다. 플레이트를 밀봉하고 진탕기에서 실온(RT)에서 밤새(o/n, 적어도 16시간) 인큐베이션시켰다.

IL-18 판독: 스트렙타비딘 코팅된 384-웰 MSD 어레이 MTP를 30 μl/웰의 비오틴화된 huIL-18(0.1 μg/ml, PBS)로 코팅하고 진탕기에서 RT에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다.

IL-1β 판독: 표준 384-웰 MSD 어레이 MTP를 포집제로서 PBS 중에 희석된 30 μl/웰의 huIL-1(3 μg/ml, PBS)로 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다.

플레이트를 실온(RT)에서 1시간(h) 동안 50 μl/웰의 차단 완충액(5% BSA를 함유하는 PBS)으로 차단시켰다. 세척(TBST, 0.05% 트윈 20을 함유하는 TBS) 후, 30 μl/웰의 부피의 평형화된 항원-항체 혼합물을 폴리프로필렌 MTP로부터 코팅된 MSD 플레이트로 옮기고 RT에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 추가적인 세척 단계 후, 샘플 완충액 중에 희석된 30 μl의 설포 태그-라벨 부착형 항-IgG 검출 항체(0.5 μg/ml)를 각각의 웰에 첨가하고, 진탕기에서 RT에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. MSD 플레이트를 세척하고 35 μl/웰의 MSD 판독 완충액을 첨가하고 RT에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 전기화학발광(ECL) 신호를 MSD 섹터 이미저 6000에 의해 생성하고 측정하였다.

SET 동시 표적 결합 검정

검정 A를 제외하고, 상기에 기재된 바와 같이 SET 검정을 수행하였다: 과량의 한 표적(500 pM의 IL18 또는 IL-1β)의 존재 하에서 평형화 프로세스(항체/항원 혼합)를 수행하면서 다른 표적의 K_D를 평가하였다.

검정 B: 한 혼합물 내의 연속 희석물 중 두 표적 모두를 이용하여 평형화 프로세스(항체/항원 혼합)를 동시에 수행하였다(일정한 농도의 항체 10 pM, 최고 항원 농도. 상기 참조). 그 후에, 동일한 혼합물을 상기에 기재된 바와 같이 IL18 및 IL-1β 코팅된 플레이트 상에서 그의 유리 항체 농도에 대해 분석하였다.

SET 데이터를 MS Excel 애드-인 소프트웨어인 Xlfit로 내보내기 하였다. 각각의 검정 내의 2회 반복 측정으로부터 평균 ECL-신호를 계산하였다. 모든 데이터 점에서 가장 낮은 값을 뺌으로써 데이터를 기준선으로 조정하고, 상응하는 항원 농도에 대해 플롯팅하여 적정 곡선을 생성하였다. K_D값은 다음을 이용하여 도표를 적합화함으로써 결정하였다:

단일특이적 Ab의 경우 1:2 결합 모델

노브 인 홀 이중특이적 Ab의 경우 1:1 결합 모델

상기 식에서,

y: ECL 신호를 뺀 블랭크

B_max: 0의 항원 농도에서의 최대 ECL 신호

[IgG]: 적용된 항체 농도

[Fab]: 적용된 총 Fab 농도

K_D: 해리 평형 상수

x: 적용된 항원 농도

(d) 세포 배양

KG-1 세포를 10% 소 태아 혈청, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI 1640에서 2x10⁵내지 1x10⁶개 생존 세포/mL의 밀도로 성장시켰다.

정상 인간 섬유모세포 및 마모셋 섬유모세포를 bFGF(1 ng/ml, CC-4065), 인슐린(5 μg/ml, CC-4021), 및 2% FCS(CC-4101)를 포함하는 FBM(Clonetics, CC-3131)에서 성장시켰다. 기아 배지로서, 섬유모세포 기본 배지(LONZA # CC-3131)를 사용하였다.

HEK-Blue™ IL-18/IL-1β 세포를 성장 배지(DMEM, 4.5 g/l 글루코스, 10% (v/v) 소 태아 혈청, 50 U/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 100 mg/ml Normocin™; 30 μg/ml의 블라스티시딘, 200 μg/ml의 HygroGold™ 및 100 μg/ml의 Zeocin™이 보충된 2 mM L-글루타민)에서 성장시켰다.

인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 제조업자의 지시에 따라 LeucoSep 튜브를 사용하여 백혈구 연층으로부터 신선하게 단리하였다. 요약하면, 1,000 × g에서 30초 동안 원심분리함으로써 14 ml LeucoSep 튜브에 13 ml의 Ficoll-Paque를 사전로딩하였다. 헤파린첨가 전혈 샘플을 동일한 부피의 PBS로 희석하고, 25 ml의 희석된 혈액을 LeucoSep 튜브에 첨가하였다. 세포 분리 튜브를 실온에서 중단 없이 800 × g에서 15분 동안 원심분리하였다. 세포 현탁액 층을 수집하고, 세포를 PBS 중에서 2회(2회 연속 세척에 대해 각각 640 및 470 × g에서 10분 동안) 세척하고, 계수 전 배양 배지 중에 재현탁시켰다.

마모셋 혈액을 헤파린첨가 튜브에 수집하고 70 μm 세포 여과기를 사용하여 필터링하였다(BD Biosciences #352350).

(e) IL-1β 중화 검정

섬유모세포에서의 IL-1β 유도성 IL-6 생산 검정은 약간만 변형하여, 본질적으로는 기재된 바와 같이(문헌[Gram 2000]) 수행하였다. 간략하게는, 섬유모세포를 96 웰 넓적 바닥 조직 배양 플레이트에 웰당 5x103개 세포의 밀도(100 μl 중)로 시딩하였다. 다음 날, 재조합 IL-1β/화합물 용액 혼합물(표에 표시된 IL-1β 농도)의 첨가 전 기아 배지에서 세포를 5시간 동안 굶겼다. IL-1β/화합물 용액 혼합물은 37℃에서 30분 동안 소정의 농도 범위의 화합물과 재조합 IL-1β를 인큐베이션시킴으로써 사전에 제조하였다. 37℃에서 o/n 인큐베이션 후 세포 상층액을 수집하고, 방출된 IL-6의 양을 ELISA에 의해 결정하였다. PBMC에서 IL-1β 유도성 IL-6 생산 검정은 다음에 따라 수행하였다. PBMC를 96 웰 조직 배양 플레이트에 웰당 3x10⁵개 세포(100 μl 중)로 시딩하고 37℃에서 24시간 동안 재조합 IL-1β/화합물 용액 혼합물(표에 표시된 IL-1β 농도)과 인큐베이션시켰다. IL-1β/화합물 용액 혼합물은 37℃에서 30분 동안 소정의 농도 범위의 화합물과 재조합 IL-1β를 인큐베이션시킴으로써 사전에 제조하였다. 24시간의 자극 후 세포 상층액을 수집하고, 방출된 IL-6의 양을 ELISA에 의해 결정하였다.

(f) IL-18 중화 검정

검정을 본질적으로 다음에 따라 수행하였다. KG-1 세포(사전에 PBS + 1 % FCS에서 1시간 동안 굶김) 또는 PBMC를 웰당 3x10⁵개의 밀도로 둥근 바닥의 96-웰 세포 배양 플레이트 내로 시딩하고 소정의 농도 범위의 화합물과 함께 재조합 IL-18/IL-12의 용액 혼합물(표에 표시된 IL-18/IL-12 농도)과 인큐베이션시켰다. 37℃에서 24시간 인큐베이션시킨 후, 상층액을 수집하고 방출된 IFNγ의 양을 ELISA에 의해 결정하였다. 마모셋 혈액을 이용한 검정을 위해 웰당 85 μl의 혈액을 사용하였다.

(g) HEK-Blue™ 세포에서 이중 IL1β/IL-18 중화

본질적으로 제조업자의 취급 절차에 기재된 바와 같이 검정을 수행하였다. 간략하게는, HEK-Blue™ 세포를 96-웰 세포 배양 플레이트 내로 웰당 4x10⁴개의 밀도로 시딩하고, 소정의 농도 범위의 화합물과 함께 (1:1 SEAP 신호를 생산하기 위해) 재조합 IL-1β 및 IL-18의 용액 혼합물과 인큐베이션시켰다. 37℃에서 24시간 인큐베이션시킨 후, 상층액을 수집하고 제조업자의 지시에 따라 QUANTI-Blue™ 방법을 사용함으로써 방출된 SEAP의 양을 결정하였다.

모든 데이터를 EXCEL 소프트웨어로 내보내기 하고, EXCEL/XLfit4 또는 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 로지스틱 곡선 적합화 함수에 대해 용량-반응 곡선을 플롯팅함으로써 IC50 값을 계산하였다.

(2) 결과

(a) 재조합 인간 및 마모셋 IL1β 및 IL-18에 대한 친화도

인간 및 마모셋 재조합 IL-1β 및 IL-18 단백질에 대한 bbmAb1의 결합 친화도를 용액 평형 적정(SET) 적정에 의해 측정하고, 생성된 K_D값을 IL-1β에 대한 mAb2 및 IL-18 결합에 대한 mAb1과 비교하였다.

개별 표적 결합 검정에서 결합 친화도를 비교한 결과, bbmAb1은 인간 및 마모셋 IL-18에 대한 mAb1과 비교하여 유사한 평균 KD를 나타내었다(표 7). 인간 IL-1β 결합의 경우, 평균 KD 값은 mAb2(0.6 pM)와 비교하여 bbmAb1(2.6 pM)의 경우 약간 더 높았으나, 여전히 동일한 낮은 pM 범위에 있었다. 동시적 이중 표적 결합 검정(표 8)에서의 후속 측정은 IL-1β에 대한 bbmAb1 결합 KD 값이 전-임상뿐만 아니라 임상 등급 재료의 mAb2의 값과 유사하다는 것을 확인시켜 주었다. 이에 따라, bbmAb1은 인간 및 마모셋에서 두 표적 모두에 대해 각각 mAb2 및 mAb1과 유사한 결합 친화도를 지닌다.

[표 7]

SET(개별 표적 결합 결정)에 의해 측정된 재조합 인간(hu) 및 마모셋(mar) IL-1β 및 IL-18에 대한 친화도

개별 표적 결합 결과 외에도, 다른 표적의 결합 K_D값을 평가하는 동안 과량의 한 표적을 적용하거나(검정 A) 연속 희석에서 두 표적 모두의 혼합물을 적용함으로써(검정 B) bbmAb1의 동시적 이중 표적 결합 친화도를 조사하였다(표 8). 동시적 IL-1β/IL-18 친화도 결정은 검정 A(과량의 한 항원) 및 검정 B(연속 희석에서 두 항원 모두의 혼합물) 사이에 유의한 차이를 나타내지 않았는데, 이는 두 표적 모두가 다른 표적의 결합에 영향을 미치지 않으면서 동시에 결합됨을 증명하였다. 추가로, 동시적 이중 결합 검정으로 수득된 K_D값은 표준 검정으로 수득된 K_D값(표 7); 제2 항원의 부재 하)과 유사하였으며, 이는 bbmAb1이 두 항원 모두에 독립적으로 결합할 수 있음을 증명하였다. 이에 따라, bbmAb1은 인간 IL-1β 및 IL-18 둘 모두와 동시에, 그리고 독립적으로 결합하며, 상응하는 마모셋 단백질과 완전히 교차-반응한다.

[표 8]

SET(동시 표적 결합 결정)에 의해 측정된 재조합 인간(hu) 및 마모셋(mar) IL-1β 및 IL-18에 대한 친화도

(b) 인간 및 마모셋 세포 검정에서 bbmAb1의 중화 활성

두 사이토카인(IL1β 및 IL-18) 모두에 대한 bbmAb1의 중화 활성을 평가하였다(mAb2mAb1). 추가로, 마모셋 세포 검정 시스템을 사용하여 마모셋 IL-1β 및 IL-18의 중화에 대한 bbmAb1의 효력을 평가하였다(섹션 d 참조).

(c) 인간 세포에서 개별적 및 동시적 IL-1β 및 IL-18 중화

IL-1β에 대한 bbmAb1의 중화 활성은 인간 진피 섬유모세포(6 pM에서 사용된 IL-1β) 및 인간 PBMC(60 pM에서 사용된 IL-1β)에서의 재조합 IL-1β-유도성 IL-6 생산의 저해에 의해 평가하였다. IL-18에 대한 bbmAb1의 중화 활성은 KG-1 세포 및 인간 PBMC(두 세포 모두 1 ng/ml의 재조합 인간 IL-12와 함께 3 nM 재조합 인간 IL-18을 이용하여 활성화됨)에서 재조합 IL-18-유도성 IFN-γ 생산의 저해에 의해 측정하였다. IL-1β 및 IL-18에 대한 bbmAb1의 저해 효력을 항상 각각 mAb2 또는 mAb1과 비교하였다. 검정에 따라, bbmAb1의 평균 IC50 값은 nM-미만 또는 한 자릿수 nM 범위 내에 있었고 직접 비교 시 각각 mAb2(IL-1β의 경우) 및 mAb1(IL-18의 경우)보다 최대 2 내지 4배 높았다(표 9 및 표 10). mAb2/mAb1의 2가 형식과 비교하여 bbmAb1의 1가 형식뿐만 아니라 잠재적으로 KiH 돌연변이도 bbmAb1의 효력의 이러한 약간의 차이의 원인일 수 있다.

[표 9]

인간 진피 섬유모세포 및 인간 PBMC에서 mAb2와 비교한, bbmAb1에 의한 IL-1β 중화에 대한 평균 IC50 값. ^*재조합 인간 IL-1β(진피 섬유모세포의 경우 6 pM, PBMC의 경우 60 pM)로 자극된 인간 진피 섬유모세포 또는 PBMC에서 IL-6 생산의 저해. 평균값 ± SEM으로 나타남(n=3 PBMC 및 n=6 인간 진피 섬유모세포)

[표 10]

KG-1 세포 및 인간 PBMC에서 mAb1과 비교한, bbmAb1에 의한 IL-18 중화에 대한 평균 IC50 값. ^**재조합 인간 IL-18(3 nM) 및 인간 IL-12(1 ng/ml)로 자극된 KG-1 세포 또는 PBMC에서의 IFNγ 생산의 저해. 평균값 ± SEM으로 나타남(n=3 KG-1 및 n=4 PBMC)

재조합 IL-1β 및 IL-18을 이용한 1+1 자극에 반응하여 SEAP를 생산하는 HEK Blue™ 리포터 세포를 이용하여 입증된 바와 같이, bbmAb1은 IL-1β 및 IL-18 둘 모두의 생물활성을 동시에 중화시킬 수 있었다(표 11). 이 검정 시스템에서 SEAP의 유사한 저해는 개별적인 항체의 사용에 의해서가 아니라 mAb2와 mAb1의 조합에 의해서만 달성할 수 있었다.

[표 11]

HEK Blue™ 세포에서 SEAP 리포터 활성에 대한 IL-1β 및 IL-18의 동시적인 중화에 대한 평균 IC50 값. n=5 실험의 평균 ± SEM으로 나타남.

(d) 마모셋 세포 검정에서의 마모셋 IL-1β 및 마모셋 IL-18에 대한 bbmAb1의 중화 활성

마모셋에서의 bbmAb1의 저해 활성을 입증하기 위해, 인간 세포와 유사하게 마모셋 세포를 이용하여 시험관내 검정을 수행하였으나, 단, 자극을 위해 재조합 마모셋 IL-1β 및 IL-18을 사용하였다. 마모셋 진피 섬유모세포에서 재조합 마모셋 IL-1β-유도성 IL-6 생산의 저해를 평가할 때, bbmAb1은 nM-미만의 효력을 나타내었고, mAb2와 비교하여 2 내지 3배 더 높은 IC50 값을 나타내었다(표 12). 마모셋 IL-1β로 자극된 인간 진피 섬유모세포를 이용한 bbmAb1 시험은 인간 IL-6과 유사한 저해 프로파일을 생성하였다.

[표 12]

bbmAb1에 의한 마모셋 및 인간 섬유모세포에서의 재조합 마모셋 IL-1β 유도성 IL-6 생산의 저해. ^*재조합 마모셋 IL-1β(18 pM)로 자극된 마모셋 또는 인간 진피 섬유모세포에서의 IL-6 생산의 저해. 3가지 개별 실험(A, B 및 C)의 결과가 나타나 있다.

bbmAb1의 한 자릿수 내지 두 자릿수 nM IC50 값은 마모셋 혈액 세포를 이용한 IFNγ 생산 검정에서 시험된 마모셋 IL-18에 대한 bbmAb1의 중화 활성을 확인시켜 주었다(표 13). 마모셋 IL-18로 자극된 인간 PBMC를 이용한 bbmAb1 시험은 인간 IFNγ의 생산을 측정할 때 유사한 저해 프로파일을 생성하였다.

이에 따라, bbmAb1은 마모셋 반응 세포를 사용하는 기능 검정에서 마모셋 IL-1β 및 마모셋 IL-18에 대해 완전히 교차-반응성인 것으로 나타났다.

[표 13]

마모셋 전혈 또는 인간 PBMC에서의 재조합 마모셋 IL-18 유도성 IFNγ 생산의 저해에 대한 평균 IC50 값. ^**재조합 마모셋 IL-18(표시된 농도) 및 인간 IL-12(10 ng/ml)로 자극된 마모셋 전혈(n=3 각각의 화합물/조건) 또는 인간 PBMC(n=6)에서의 IFNγ 생산의 저해. 평균값 ± SEM으로 나타남

KiH 형식 IL-1β/IL-18 이중-특이적 mAb인 bbmAb1은 여러 상이한 세포 검정에서 원래의 mAb인 mAb2 및 mAb1과 비교할 때, 2개의 개별적인 표적인 IL-1β 및 IL-18에 대한 사이토카인 중화 효력뿐만 아니라 높은 친화도 결합을 보유한다는 것이 입증되었다. bbmAb1의 이중 IL-1β 및 IL-18 중화 특성은 인간 사이토카인/세포뿐만 아니라 상응하는 마모셋 사이토카인/세포에 대해서도 입증되었고, 이는 적절한 독성학 연구를 용이하게 하였다. IL-1β 및 IL-18 중화에 대한 세포 검정 중 일부에서 생성된 최대 2배 내지 4배 더 높은 IC50 값은, 각각 mAb2 및 mAb1의 2가 결합과 대조적으로, bbmAb1의 1가 결합의 결과일 수 있다. 그럼에도 불구하고, bbmAb1에 의한 이중 사이토카인 중화는 본 발명자들의 시험관내 세포 시스템에서 충분히 표현되지 않을 수 있는 생체내 부가적 또는 상승적 저해 활성을 초래할 수 있다.

실시예 5: PBMC에서의 조합된 IL-1β 및 IL-18 자극 및 차단의 효과

이펙터 사이토카인 IL-1β 및 IL-18의 인플라마솜 활성화-의존적 절단은 2차 전-염증성 매개체의 유도로 이어지고, 면역 세포 동원/활성화를 전신적으로, 뿐만 아니라 염증 부위에서도 촉진시킨다. 치명적인 전신 염증에 대한 2가지 상이한 마우스 모델인 (a) LPS 주사 모델 및 (b) FCAS 마우스(NLRP3에서 미스센스 돌연변이를 활성화함)에서, IL-1β 및 IL-18 둘 모두의 동시 부재/저해는 단일 IL-1β 또는 단일 IL-18 부재/저해와 비교하여 치사로부터 더욱 보호적이었으며, 이는 면역 활성화에 대한 부가적 또는 상승적 메커니즘을 입증하였다(문헌[Brydges 2013, van den Berghe 2014]). bbmAb1은 설치류 교차-반응성이 없는 인간/마모셋 IL-1β/IL-18 반응성 이중-특이적 mAb이며 이에 따라 마우스 모델에서 시험할 수 없다. 그러므로, 본 발명자들은 bbmAb1에 의한 조합된 IL-1β/IL-18 중화의 부가적 또는 상승적 저해 효과를 밝혀내기 위해 인간 PBMC의 자극에 대해 시험관내에서 인플라마솜-의존적 경로 활성화를 모방하는 LPS/IL-12를 사용하였고, 마이크로어레이를 이용하여, 편향되지 않은 유전자 발현 분석을 수행하였다. 상보적 활동으로서, 본 발명자들은 또한 재조합 IL-1β와 재조합 IL-18의 조합 또는 단일 사이토카인 단독으로 자극된 상이한 공여자로부터의 PBMC의 유전자 발현 프로파일을 비교하였다.

(3) 재료 및 방법

(a) 세포 배양 및 ELISA

10% 소 태아 혈청(Invitrogen #10108-157), 1% L-글루타민(Invitrogen #25030-03), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Invitrogen #15140-148), 10 μM 2-머캅토에탄올(Gibco #31350-010), 5 mM 헤페스(Gibco #15630-080)가 보충된 RPMI 1640(Invitrogen #31870 또는 Gibco #61870-010)

재조합 인간 IL-1β(#10139-HNAE-5)는 Sino Biological Inc.로부터 구입

재조합 인간 IL-18(#B001-5)은 MBL로부터 구입

재조합 인간 IL-12(#573008)는 Biolegend로부터 구입

IFNγ ELISA: MAX 표준물질 세트, BioLegend, #430103 또는 BD OptEIA 인간 IFNγ ELISA 세트, BD #555142

IL-6 ELISA: MAX 표준물질 세트, BioLegend, #430503

IL-26 ELISA: Cloud Clone Corp #SEB695Hu

IL-1β 항체 섹션에 기재된 바와 같은 mAb2.

IL-18 항체 섹션에 기재된 바와 같은 mAb1.

실시예 1에 기재된 바와 같은 bbmAb1.

살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 혈청형 엔테리티디스(enteritidis)로부터의 LPS, Sigma #L7770

둥근-바닥의, 조직-배양 처리된 96-웰 플레이트(Costar #3799) 넓적-바닥의, 조직-배양 처리된 96-웰 플레이트(Costar #3596) Ficoll-Pacque ™Plus(GE Healthcare Life Sciences #17-1440-02) PBS 1X, 칼슘 및 마그네슘 없음(Gibco #14190094)

Falcon 15 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브(BD#352096) Falcon 50 ml 폴리프로필렌 원뿔형 튜브(BD #352070)

다공성 장벽이 있는 LeucosepTM 튜브, 50 ml, Greiner bio-one #227290

세포 여과기 70 μM, BD Biosciences #352350

트리판블루, Sigma # T8154

RNA 단리, 양 및 품질 측정 및 qPCR:

뉴클레아제-무함유 물, Ambion #AM9938

Rnase Zap, Ambion #AM9780

1.5 ml 에펜도르프 튜브, 멸균, Rnase 및 Dnase 무함유

RLT 완충액, Qiagen #1015762

Rneasy 미니 키트, Qiagen #74104

RNase-무함유 DNase 세트, Qiagen #79254

Agilent RNA 6000 나노 키트, Agilent #5067-1511

칩 프라이밍 스테이션(Chip priming station), Agilent #5065- 4401

IKA 볼텍스 믹서

RNaseZAP®, Ambion #9780

Agilent 2100 바이오애널라이저(Bioanalyzer)

고용량 cDNA 역전사 키트, Applied Biosystems, # PN4374966

Nase-무함유, 박막이 있는, 반투명 뚜껑 0.2 ml PCR 튜브, Ambion #AM12225

MicroAmp Optical 384 웰 반응 플레이트, Applied Biosystems #4309849

TaqMan GenEx 마스터 믹스(Master Mix), Applied Biosystems #4369514

PCR 프라이머(Applied Biosystems)

PBMC 제조: PBMC를 제조업자의 지시에 따라 Leucosep 튜브에서 Ficoll-Paque 구배 원심분리에 의해 백혈구 연층으로부터 단리하였다. 간략하게는, 15 mL의 히스토페이크(Histopaque)를 50 mL LeucosepTM 튜브에 넣고 RT에서 1300 rpm으로 30초 동안 원심분리하였다. 피펫을 이용하여, 백혈구 연층의 희석된 현탁액 30 mL를 히스토페이크 용액의 상단에 첨가하고, 중단 없이 1000 g에서 RT에서 15분 동안 원심분리하였다. 혈장(대략 20 ml)을 버리고 경계면 고리(interface ring)(=인간 PBMC)를 수집하고 50 ml 팔콘 튜브(falcon tube)에 옮겼다. 튜브를 50 mL의 멸균 PBS로 충전하고 RT에서 5분 동안 1200 rpm으로 1회 원심분리하였다. 이 원심분리를 2회 반복하였다. 상층액을 부드럽게 버리고 세포를 2% FCS 및 2 mM EDTA가 있는 50 mL의 PBS에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 70 μm 세포 여과기를 사용하여 필터링하고, 트리판 블루 염색(500 μL의 트리판 블루 + 200 μL의 세포 + 300 μL의 PBS)을 사용하여 세포를 계수하였다.

PBMC의 LPS/IL-12 자극: 상층액에서의 사이토카인 생산은 다음에 따라 제조하였다. 최종 부피 100 ul의 웰당 250'000개 세포를 96-웰 둥근 바닥 플레이트에 분배하였다. LPS는 10 ng/ml의 재조합 IL-12와 함께 0.3 ug/ml 내지 3000 ug/ml의 농도로 사용하였다. 상층액을 37℃ 및 10% CO₂에서 24시간 후 수확하였다.

세포 펠렛으로부터 RNA 추출을 다음에 따라 수행하였다. 최종 부피 1000 ul의 웰당 3x10⁶개 세포를 넓적 바닥 24-웰 플레이트에 분배하였다. LPS는 10 ng/ml의 재조합 IL-12와 함께 3 ug/ml로 사용하였다. 세포를 37℃ 및 10% CO₂에서 24시간 후 수확하였다.

재조합 사이토카인을 이용한 PBMC의 자극: 12-웰 플레이트의 웰당 7x10⁶개 PBMC를 최종 1.5 ml의 완전 RPMI 배지에서 사용하였다. 재조합 사이토카인을 다음의 최종 농도로 첨가하였다: 10 ng/ml의 재조합 IL-1β, 3 nM의 재조합 IL-18, 1 ng/ml의 재조합 IL-12. 37℃ 및 10% CO₂에서 4시간 및 24시간 후 상층액뿐만 아니라 세포 둘 모두를 수집하였다.

RNA 단리, 양 및 품질 평가: 세포를 펠렛화하고 펠렛을 2% β-머캅토에탄올이 있는 350 μl의 Qiagen RTL 완충액 중에 용해시키고, 연구의 모든 샘플이 수집될 때까지 -20℃ 또는 -80℃에서 동결시켰다. Qiagen 표준 프로토콜을 사용하여 RNA 단리를 수행하였다. 간략하게는, RNeasy 스핀 컬럼으로 옮기기에 앞서 350 μl의 70% 에탄올을 모든 샘플에 첨가하고, 8000 g에서 15초 동안 원심분리하였다. 통과액을 버린 후, 350 μl의 완충액 RW1을 첨가하고 컬럼을 8000 g에서 15초 동안 원심분리하여 스핀 컬럼 막을 세척하였다. DNase I 인큐베이션 혼합 용액을 제조업자의 지시에 따라 제조하고 RNeasy 스핀 컬럼에 첨가하고 RT에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 350 μl 및 500 μl의 완충액 RW1로 세척한 후, RNeasy 스핀 컬럼을 새로운 2 ml 수집 튜브에 넣고 1분 동안 최고 속도로 원심분리하였다. 35 μl의 RNase-무함유 물을 스핀 컬럼 막에 직접 첨가하고 8000 g에서 1분 동안 원심분리하여 RNA를 용출시킴으로써 RNA를 최종적으로 수집하였다. RNA의 양을 Nanodrop ND-1000을 사용하여 측정하였고, RNA를 -20℃에서 저장하였다. 제조업자의 지시에 따라 RNA 품질 평가를 위해 RIN 측정을 수행하였다. 간략하게는, 1 μl의 RNA 또는 래더(ladder)를 Agilent RNA 6000 나노 칩 내로 피펫팅하고 Agilent 2100 바이오애널라이저를 사용함으로써 측정하였다.

qPCR에 의한 사이토카인 유전자 발현 분석:

이 방법은 제조업자의 지시에 부합하도록 수행하였다. 간략하게는, 400 ng의 RNA를 고용량 cDNA 역전사 키트를 사용하여 지시에 따라 역전사시켰다. cDNA 용액을 RNA/DNA 무함유 물 중에 1/10로 희석하고 1 μl의 cDNA를 384-웰 반응 플레이트로 옮기고, 그 후에 1 μl의 20X TaqMan® 유전자 발현 검정 표적 FAM 유전자 및 10 μl의 2x TaqMan® 유전자 발현 마스터 믹스 및 10 μl의 RNA/DNA 무함유 물과 혼합하였다. 플레이트를 Applied Biosystems ViiA™ 7 실시간 PCR 시스템 상에 로딩하고, 다음과 같은 기기 설정을 사용하였다:

이 연구에 사용된 하우스키핑 유전자는 HPRT1 및 RLP27이었다. 다음의 식을 사용하여 표적 유전자의 상대적 발현 수준을 계산하였다:

1) Ct [기준] = (Ct [HPRT1] + Ct [RLP27]) /2

2) dCt [기준] = 40 - Ct [기준]

3) dCt [표적] = Ct [표적] - Ct [기준]

4) ddCt = dCt [기준] - dCt [표적]

5) 상대적 표적 유전자 발현 = 2^ddCt

마이크로어레이를 다음에 따라 수행하였다. 샘플을 Affymetrix HG_U133_Plus2 마이크로어레이 상에서 CiToxLAB France에 의해 처리하였다. 이들을 GeneSpring 11.5.1(Agilent Technologies, 산타클라라, CA)에서 RMA 정규화하고 분석하였다. 인제뉴어티 경로 분석(Ingenuity Pathway Analysis; IPA) 및 Nextbio(Illumina)를 사용하여 경로 분석을 행하였다. 2개의 데이터세트를 독립적으로 처리하였다.

처음에는, 데이터가 RStudio suite 및 GeneSpring(PCA, 혼성화 대조군)에서 R 스크립트(MA_AffyQC.R)를 사용하여 사내(in-house) QC인 CiToxLAB에 의해 표준 품질 제어(QC)를 거치도록 하였다. 후속하여, 신뢰할 수 없는 발현 수준을 제거하기 위해 이를 필터링하였다: 실험 조건 중 임의의 하나에서 적어도 100 퍼센트의 샘플이 20번째 백분위수를 초과하는 값을 갖는 경우 엔티티(프로브세트)를 유지하였다.

GeneSpring의 "필터 온 볼케이노 플롯" 기능을 사용하여 차별 발현 유전자(DEG)를 식별하였다. 독립표본 T-검정과 함께 필터링된 유전자(20.0 내지 100.0번째 백분위수의 발현)를 사용하여 0.05 미만의 보정된 p-값 및 2.0 초과의 배수 변화가 있는 프로브세트를 차별적으로 발현된 것으로 간주하였다. 가능한 경우, 즉, LPS(NUID-0000-0202-4150)를 이용한 연구에서, 벤자미니-호치버그 다중 검정 보정을 사용하였다.

사이토카인 자극 실험의 경우에, 다음의 식을 사용하여 상승 작용을 계산하였다: 신호 A+B / (신호 A + 신호 B - 대조군) ≥1.5

각각의 시그니처(또는 DEG 목록)를 사용하여 시그니처와 공개 데이터세트의 '질환 유전자 목록'(병변 대 비-병변) 사이의 중복을 관찰하는 통계적 유의성을 나타내는 피셔의 정확도 검정(Fisher's exact test)으로 p-값을 계산하였다. 이를 위해, 목록을 Illumina Base Space Correlation Engine(전 Nextbio)에 업로드하고, 메타-분석 기능 및 질환에 대한 키워드 검색을 사용하여 비교하였다.

모든 데이터를 EXCEL 소프트웨어로 내보내기 하고, EXCEL/XLfit4 또는 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 로지스틱 곡선 적합화 함수에 대해 용량-반응 곡선을 플롯팅함으로써 IC₅₀값을 계산하였다. 처리군 사이의 차이를 일원 ANOVA, 이어서 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용한 던네트(Dunnett)의 다중 비교에 의해 분석하였으며, 결과는 p < 0.05에서 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

(4) 결과

(a) bbmAb1은 전혈에서 LPS/IL-12 유도성 IFNγ 생산을 저해하는 데 고도로 효과적이다

10 ng/ml의 IL-12가 보충된 LP S에 대한 인간 전혈의 노출은 혈액 세포에 의해 생산된 "천연" IL-18에 주로 좌우되나 전적으로는 좌우되지 않는 IFNγ 반응을 초래한다. IL-12의 첨가는, 아마도 반응 세포에서 IL-18 수용체를 상향-조절함으로써, LPS 유도성 IFNγ 반응을 강화한다.

사용된 실험 조건에서, mAb1를 이용한 IL-18 중화는 오직 IFNγ 생산의 불완전한 저해를 야기하는 반면, (mAb2를 사용하는) IL-1β 차단은 IFNγ 반응에 대한 단지 작은 효과를 가졌다. 흥미롭게도, bbmAb1 또는 mAb2와 mAb1의 조합에 의한 IL-1β 및 IL-18의 조합된 저해는 단일 사이토카인 중화와 비교하여 IFNγ 생산을 보다 극심하게 그리고 완전히 저해하였다. bbmAb1, mAb2, mAb1 또는 조합된 mAb2 및 mAb1(콤보)에 의한 전혈에서의 LPS(0.3 μg/ml)/IL-12 유도성 IFNγ의 저해.

IFNγ 외에도, 시험된 다른 사이토카인(IL-2,-4,-6,-8,-10,-13 및 TNFα) 중 어느 것도 본 발명자들의 세포 검정에서 IL-1β와 IL-18의 조합된 중화에 의해 부가적으로 저해되지 않았다. bbmAb1의 효력은 이중특이적 분자의 1가 형식을 고려할 때, mAb2 및 mAb1의 조합(콤보)과 동일한 범위에 있었다.

(b) IFNγ는 LPS/IL-12 활성화된 인간 PBMC에서 단일 IL-1β 또는 IL-18 저해와 비교하여 bbmAb1(즉, 조합된 IL-1β/IL-18 저해)에 의해 부가적으로 저해된다

bbmAb1을 사용하여 조합된 IL-1β/IL-18 저해에 의한 추가의 부가 효과(IFNγ 이외)를 밝혀내기 위해, 비편향 전사체학 평가가 필요하였다. 전혈은 전사체학 분석에 최적이 아니므로, 본 발명자들은 상기 재료 및 방법 섹션에 기재된 LPS/IL-12 자극 검정 조건을 인간 PBMC 샘플에 대해 조정하였다. 총 9명의 공여자로부터의 PBMC를 사용함으로써, 본 발명자들은 bbmAb1이 PBMC의 상층액으로의 IFNγ 단백질 분비를 부가적으로 저해함을 확인할 수 있었다. 전혈 실험과 비교하여, 사용된 각각의 mAb의 대략 10배 더 낮은 농도에서 IFNγ 생산이 저해되었다. 중요하게도, IFNγ에 대한 mRNA 수준에서 유사한 저해 패턴이 입증되었으며, 이는 편향되지 않은 마이크로어레이 기반 유전자 발현 분석에 대한 샘플의 적합성을 확인시켜 주었다. 인간 PBMC에서 (각각 10 nM 농도에서) bbmAb1, mAb2 및 mAb1에 의한 LPS(0.3 μg/ml)/IL-12 유도성 IFNγ 단백질 생산 및 IFNγ 유전자 발현의 저해가 입증되었다.

Affymetrix 마이크로어레이를 상기 재료 및 방법 섹션에 기재된 LPS/IL-12 자극 실험으로부터 샘플링된 PBMC로부터의 n=5의 개별적인 공여자를 이용하여 수행하였다. 유감스럽게도, 유전자 발현 프로파일의 전반적인 평가는 강한 LPS/IL-12 자극 효과를 증명하였고, PCA는 자극되거나 자극되지 않은 군 내의 화합물 대신에 공여자당 클러스터링(clustering)을 나타내었다. 그럼에도 불구하고, 차별 발현 유전자에 대해 LPS/IL-12 자극된 샘플을 자극 + bbmAb1과 비교함으로써, bbmAb1을 이용한 조합된 IL-1β/IL-18 차단에 의해 하향조절되는 유전자의 최종 후보자 목록을 밝혀냈다(표 14). 본 발명자들의 마이크로어레이 데이터를 재검증한 IFNγ 유전자의 강한 하향조절 외에, IL-26 유전자 또한 (mAb2에 의한) 단일 IL-1β 저해 또는 (mAb1에 의한) IL-18 저해와 비교하여 bbmAb1에 의해 부가적으로 저해된 추가의 사이토카인 유전자였다.

[표 14]

차별 발현 유전자(LPS/IL-12 자극된 샘플에서 bbmAb1과 대조군 사이에서만 하향조절된 유전자). FC= 배수 변화.

(c) IL-26은 LPS/IL-12 자극된 PBMC에서 bbmAb1에 의해 부가적으로 저해되는 또 다른 전-염증성 사이토카인이다

bbmAb1을 사용하여 LPS/IL-12 유발 IL-26 유전자 발현 및 단백질 생산이, 조합된 IL-1β/IL-18 차단에 의해 가장 효율적으로 저해됨을 추가로 확인하기 위해, 이 연구를 총 n=9의 PBMC 공여자로 확대하고, qPCR에 의해 IL-26 유전자 발현을, 그리고 ELISA에 의해 IL-26 단백질 생산을 조사하였다. ELISA는 마이크로어레이 접근법을 이용하여 수득된 IL-26 유전자 발현의 저해를 충분히 확인시켜 주었다. 흥미롭게도, mAb의 추가에 의해 상층액 중의 IL-26 단백질 수준은 24시간째에 단지 부분적으로만 감소하였다. 이러한 차이에 대한 이유는 알려져 있지 않지만, IL-26 유전자 발현과 단백질 생산 사이의 동역학적 차이뿐만 아니라 IFNγ와 비교된 IL-26의 소비의 차이와 관련이 있을 수 있다. 그럼에도 불구하고, bbmAb1은 mAb2 및 mAb1과 비교하여 PBMC 상층액에서 IL-26 단백질 수준을 감소시킴에 있어 우수하였다.

(d) IL1 β/IL18 신호전달 시그니처는 질환과 상관관계가 있다

재조합 IL-1β 자극이 IL-6 생산을 초래하거나 재조합 IL-18/IL-12 자극이 IFNγ 생산을 초래하는 이전에 확립된 PBMC 배양 조건을 조합하여, 부가적 또는 상승적 하류 표적 유전자 또는 시그니처를 밝혀냈다(데이터는 도시하지 않음). 두 상이한 시점(6시간 및 24시간째)에 샘플링된 n=4 공여자로부터의 PBMC를 이용하여, 유전자 발현 프로파일의 비편향 평가를 위한 Affymetrix 마이크로어레이 평가를 수행하였다. IL-1β 및 IL-18에 의한 조합된 자극을 이용하여 6시간째 및 24시간째에 상승적으로 상향조절된 유전자를 밝혀냈다(데이터는 도시하지 않음). IL-1β/IL-18 조합에 대한 IL-12 첨가는 일련의 상향조절된 유전자에 대한 상승작용을 크게 증가시켰다. 단일 또는 조합된 IL-1β/IL-18 경로 자극(상향-조절된 유전자만)의 생성된 신호전달 시그니처를 사용하여, 몇몇 자가면역 질환에 걸쳐 환자로부터 데이터세트를 얻었다. 예를 들어, 공개 사르코이드증 데이터세트와의 상관관계를 식별하였다. (피셔의 정확도 검정으로 계산된) p-값은 사르코이드증 환자로부터의 건강한 조직을 병든 조직과 비교하는 몇몇 공개 연구에 대하여 유의한 상관관계를 나타낸다. 조직은 피부뿐만 아니라 폐, 눈물샘 및 앞 안와를 포함한다. 모든 데이터세트에 걸쳐, IL1 β/IL18 신호전달의 조합이 질환과의 가장 좋은 상관관계를 나타내고, IL-1β 및 IL-18이 그 뒤를 잇는다. IL-1β/IL-18은 PBMC에서 유전자(DEG)를, 5종의 상이한 사르코이드증 조직 '병든 대 건강한' DEG와 비교하여 차별적으로 상향-조절하였다.

(e) 결론

LPS 및 재조합 IL-12를 사용하여 시험관내 배양의 첫 24시간 이내의 병원체 연관 분자 패턴(PAMP)-의존적 NLRP3 인플라마솜 활성화를 모방하였다. bbmAb1을 사용함으로써 IL-1β 및 IL-18의 조합된 저해가 부가적으로 작용하여 LPS/IL-12로 자극된 PBMC에서 IFNγ 생산을 감소시킨다는 것/저해한다는 것이 입증되었다. (문헌[Nakanishi, 2001]에 의해 검토된 바와 같이) IL-12는 IL-18과 상승적으로 작용하여 T, B, NK 세포, 대식세포 및 수지상 세포에서 IFNγ 생산을 유도하는 것으로 이전에 기재되었지만, 이제는 IFNγ 생산에 대한 IL-1β의 추가적인 자극 효과가, 사용된 실험 조건 하에서 입증될 수 있었다. 이에 따라, PBMC와 LPS/IL-12의 공동-인큐베이션은, 둘 모두 강한 IFNγ 반응에 기여하는 "천연" IL-1β 및 IL-18의 생산을 효율적으로 유발한다. 비편향 마이크로어레이 전사체학을 사용함으로써, 단일 IL-1β 또는 IL-18 차단에 비해 조합된 IL-1β/IL-18 중화에 의해 부가적으로 하향-조절된 추가적인 유전자를 식별하였다. 그 중에는 대부분의 척추동물 종에서는 보존되지만 (마우스와 랫트를 포함하는) 대부분의 설치류 품종에는 부재하는 IL-20 사이토카인 서브패밀리(IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, 및 IL-26)의 구성원인 IL-26이 있었다(문헌[Donnelly 2010]). 이것은 IL-20R1 및 IL-10R2 쇄로 구성된 이종이량체 수용체 복합체를 통해 신호를 전달한다. IL-26 수용체는 주로 비-조혈 세포 유형, 특히 상피 세포 상에서 발현된다. IL-26의 증가된 수준은 RA 환자의 혈청 및 특히 활액에서 보고되었는데, 여기서 이것은 Th17 세포 성장 및 분화를 촉진하는 인자로서 작용할 수 있었다. 유감스럽게도, IL-1β 및 IL-18의 조합된 차단에 의해 유도된 추가의 유전자/경로의 발견은 PBMC 샘플의 LPS/IL-12 자극의 강한 효과에 의해 방해를 받았다. 그럼에도 불구하고, IFNγ 및 IL-26 둘 모두 및 어느 정도까지는 IL-22 또한, PBMC에서 재조합 IL-1β 및 IL-18과의 조합된 자극에 의해 상승적으로 상향조절된 유전자 중 하나였으며, 이는 이들 두 인자가 이 활성화 경로에서 하류 이펙터임을 확인시켜 주었다. 이에 따라, (IL-26 및 IL-22를 포함하는) 사이토카인의 IL-20 서브패밀리는 IL-1β 및 IL-18로부터의 동시적 신호에 강하게 좌우되는 것으로 보인다. 개별적인 신호전달 시그니처의 선택성뿐만 아니라 차단의 잠재적 효능에 대해 모든 적절한 주의를 기울일 경우, 이러한 비교는 각각의 경로가 사르코이드증과 같은 질환에서 활성임을 나타내는 데 유용하다.

실시예 6: bbmAb1에 의한 자발적인 IFNγ, TNFα 및 IL-2 생산의 저해

펀치 생검(2 mm)을 9명의 상이한 HS 환자로부터의 수술에 의해 절개된 피부로부터 취하고, 비처리 대조군으로서 배양 배지에서(도 3, 가장 좌측 열), 또는 100 ug/ml의 농도의 bbmAb1(도 3, 중간 열) 또는 아달리무맙(도 3, 가장 우측 열)의 존재 하에서, 96 웰 세포 배양 플레이트(넓적 바닥의, 조직 배양 처리; Costar) 중의 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 80 μL의 배양 배지(10% 넉아웃 혈청 대체물(KnockOut Serum Replacement)(Gibco) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 이스코프 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium))에서 배양하였다. 플레이트 원심분리 후, 상층액을 개별적인 HS 생검으로부터 수집하였고 멀티플렉스 MSD(중규모 디스커버리 플랫폼(Meso Scale Discovery Platform)) 사이토카인 전-염증성 패널 1(단백질) 어레이를 MSD 플레이트 판독기를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 데이터를 개별적인 생검 중량으로 정규화하고 블롯팅 도면을 위해 GraphPad Prims 소프트웨어로 내보내기하였다. 도 3은 bbmAb1이 HS 생검의 상층액에서 자발적인 IFNγ, TNFα 및 IL-2 생산을 감소시킴을 입증한다.

실시예 7: 독성 연구

이중특이적 항체 bbmAb1은 마모셋 원숭이에 26주 동안 매주 2회, 최대 100 mg/kg까지 s.c. 투여될 때 잘 관용되었으며(100 mg/kg의 무관찰 효과 수준(No Observed Effect Level; NOEL); 3,110 μg/mL의 Cmax,ss, 218,000 μ·h/mL의 AUC0-72h,ss) 임의의 안전성 약리학(중추신경계, 심혈관계 및 호흡기계), 독성학(남성 생식계 및 정자 운동성을 포함함) 또는 국소적 내약성 효과를 나타내지 않았다. 또한 26주 동안 100 mg/kg으로 매주 2회 정맥내(i.v.)로 투약한 후에도 아무 효과도 나타나지 않았다(4570 μg/mL의 Cmax,ss, 261,000 μg·h/mL의 AUC0-72h,ss). 추가로, 말초 혈액 중 면역 세포뿐만 아니라 외래 항원 시험감염 시 1차 및 2차 체액성 면역 반응에 대한 치료-관련 효과가 나타나지 않았다. bbmAb1의 단회 상승 용량(SAD) 연구, 총 48명의 대상체(이 중 12명은 위약 치료 대상체)에서의 0.1, 0.3, 1, 3, 10 mg/kg i.v.의 증가된 용량뿐만 아니라 100 mg s.c를 이용한 제1 6개 코호트(A1 내지 B1)에서의 데이터에서, bbmAb1은 일반적으로 최대 10 mg/kg의 용량에서 잘 관용되었다. bbmAb1의 Cmax 및 AUC는 i.v. 투여의 전체 범위(0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg) 내에서 용량-비례 방식으로 증가하였다. bbmAb1의 평균 반감기는 대략 21일 내지 26일이었다. s.c. 용량의 생체이용률은 70%로 추정되었다.

실시예 8: 치료적 용도

중등도 내지 중증의 화농성 한선염이 있는 환자에서 bbmAb1의 효능 및 안전성을 평가하기 위한 무작위 배정, 대상체 및 조사자 맹검, 위약-대조 및 다기관 플랫폼 연구

이중특이적 항-IL-1β 항-IL-18 항체 bbmAb1의 효능을 입증하기 위한 임상 시험 설계의 상세한 사항이 하기에 제공된다.

대상체 및 조사자의 맹검은 주관적 판독, 예컨대 HS의 병변 수 또는 종합 HS-PGA 점수, 뿐만 아니라 유해 사례의 비편향 평가를 가능하게 한다.

중등도 내지 중증의 HS가 있는 대상체에서, 몇몇 활성 치료 화합물, 예컨대 이중특이적 항-IL-1β 항-IL-18 항체 bbmAb1의 효능, 안전성 및 내약성을 평가하기 위해, 무작위 배정, 대상체 및 조사자 맹검, 위약-대조, 다기관 및 병행군 연구가 실행된다. 대략 5주의 스크리닝 기간 후, 16주 동안의 치료 기간이 계획되고, 이어서 대략 12주의 안전성 추적검사가 뒤따른다. 대상체에게는 300 mg의 bbmAb1(1.5 mL의 3회 주사; 격주로 1일차, 15일차, 및 29일차에, 그 후에 매월(Q4W) 57일차 및 85일차에) s.c. 또는 이의 상응하는 위약(2 x 1.5 mL) s.c.가 주어졌다.

이 연구에 포함된 대상체는 적어도 12개월 동안 재발성 염증성 병변으로 진단된 중등도 내지 중증의 HS를 나타내는 18세 내지 65세(18세 및 65세 포함)의 성인 남성 및 여성 대상체이다. 무작위 배정 시(1일차의 투여-전(pre-dose)), 대상체는 포함될 적어도 2개의 해부 부위 내에 적어도 5개의 염증성 병변(농양 및 결절)을 가질 필요가 있다. 코호트 및 각각의 아암에 대한 무작위 배정은 집중화된 대화형 응답 기술(centralized Interactive Response Technology; IRT) 시스템을 사용하여 행할 것이다.

1차 임상 종점은 16주의 치료 후의 단순화된 HiSCR(화농성 한선염 임상 반응)이다.

113일차(17주차)에, 안전성 및 기타 평가가 수행된 후, 모든 대상체는 추적검사 기간에 들어갈 것이며 임의의 추가의 연구 약물 투여를 제공받지 않을 것이다. 의학적으로 정당화되는 경우, 및 잠재적인 안전성 문제가 식별되지 않은 경우에(후원자와 논의 후), 대상체는 이 추적검사 기간 동안 이전에는 금지되었던 약제를 제공받을 수 있다.

안전성 및 효능 평가는 평가 스케줄에 명시된 바와 같이 추적검사 방문 시에 수행될 것이다. 약동학(PK), 약력학(PD), 및 바이오마커 샘플도 수집할 것이다. 연구 종료(EOS) 방문은 197일차(29주차)에 발생할 것이며, 연구 완료 평가, 이어서 연구로부터의 해방을 포함할 것이다. 맹검은 연구가 완료될 때까지 조사자 및 대상체에 대해 유지할 것이다.

대략 40명의 대상체가 무작위 배정되고, 30명의 대상체는 임상시험용 치료를 제공받을 것이고 10명의 대상체는 일치하는 위약을 제공받을 것이다.

- 1일차에, 300 mg의 bbmAb1 또는 이의 상응하는 위약(1.5 mL의 2회 주사)이 훈련된 현장 직원에 의해 피하 주사(s.c.)로 투여될 것이다. PK, 표적 참여(target engagement), 면역원성, 경로 및 질환 바이오마커 및 안전성 평가뿐만 아니라 임상 평가가 수행될 것이다. 안전성 문제가 없다면, 모든 평가를 완료한 후, 같은 날 현장에서 대상체를 퇴원시킬 것이다. 첫 투여 다음에, 현장에서 적어도 1시간 동안 또는 조사자의 재량에 따라 그를 초과하는 시간 동안 즉각적인 주사 부위 반응에 대해 대상체를 관찰해야 한다.

- 대상체는 연구의 로딩 단계(1일차(1주차)부터 29일차(5주차)까지) 동안 연구 센터로 돌아가 격주로 bbmAb1을 s.c로 제공받을 것이다 (Q2W; 3회 용량).

- 그 후에 연구의 유지 단계 동안(29일차(5주차)부터 85일차(13주차)까지), bbmAb1을 4주마다 300 mg s.c.로 투여할 것이다(Q4W; 2회 용량).

이러한 방문 중에 안전성 및 선택된 효능 평가를 수행할 것이며, PK, 표적 참여, 면역원성 및 경로/질환 바이오마커 샘플을 수집할 것이다.

1차 목적은 위약과 비교하여 16주의 치료 후 HS 대상체에서 이중특이적 항체 bbmAb1을 이용한 치료의 예비 효능을 보여주는 것이다. 16주의 치료 기간 후, 12주 동안의 추적검사 기간을 포함시켜 효과의 지속성을 관찰하며, 효과의 지속성은 16주의 치료 후에 지속 또는 증가될 수 있다.

이 연구를 위해, 단순화된 HiSCR(문헌[Kimball 2014]으로부터 수정됨)을 1차 종점으로 선택하였다. 단순화된 HiSCR은 배농 누관의 어떤 증가도 없이 농양 + 염증성 결절의 총 수의 50%의 감소로 정의한다.

HS의 염증성 병변은 전형적인 해부 부위에서 개별적인 병변(염증성 결절, 농양 및 배농 누관)으로 계수할 것이다. 계수 외에도, 종합 평가 척도(화농성 한선염-의사 종합 평가 또는 HS-PGA)뿐만 아니라 복합 점수(화농성 한선염의 중증도 평가 점수 또는 SAHS)를 사용할 것이다.

피부 삶의 질 지수(DLQI)를 포함하는 몇몇 환자 보고 결과를 사용할 것이다. 마지막으로, 대상체의 관점에서는 피부 관련 통증이 가장 중요한 증상이므로, 통증에 대한 점수식 평정 척도(NRS)가 포함된다.

임상 평가에 대한 추가적인 정보:

HS-PGA(화농성 한선염 - 의사 종합 평가): 점수는 HS를 평가하기 위한 탐색적 목적으로 사용할 것이며, 문헌[Kimball AB, Kerdel F, Adams D, et al (2012)]에서 사용되고 기재되었다.

SAHS 점수는 복합 점수이며(문헌[Hessam S, Scholl L, Sand M, et al (2018)]), 염증성 병변 수, 누관 수, 및 NRS 통증에 대해 수집된 정보로부터 도출될 것이다. 추가로, 해부 부위 및 새로운 또는 악화된 기존 종기를 두 코호트 모두에서 수집할 것이다.

피부 통증 - NRS(통증에 대한 점수식 평정 척도): 피부 관련 통증에 대한 NRS는 아달리무맙 연구에서 사용되었고(문헌[Kimball et al. (2016)]), 피부로서 사용될 것이거나, HS 관련 통증은 환자에게 가장 큰 부담 중 하나이다(문헌[Matusiak et al (2017)]). HS와 관련된 통증은 지난 24시간 내에서의 평균으로, 그리고 (지난 24시간 내에서) 최악인 것에 대해 기록할 것이다.

기타 환자 보고 결과(PRO)는 가려움증, 피로 및 작업 손실로서의 양태뿐만 아니라, 여러 국가에서 및 여러 언어로 이용 가능한 검증된 점수가 있는 피부 삶의 질 지수(DLQI) 및 피부 관련 삶의 질(QoL) 도구를 포함할 것이다. 이는 환자 종합 평가를 포함한다.

목적 및 관련된 종점

주요 포함 기준:

● 스크리닝에 앞서 적어도 12개월 동안 임상적으로 HS로 진단된, 18세 내지 65세(18세 및 65세 포함)의 남성 및 여성 대상체

● 스크리닝 및 무작위 배정(1일차의 투여-전) 시 평가에 따른, 중등도 내지 중증의 HS가 있는 환자

● 총 적어도 5개의 염증성 병변, 즉, 농양 및/또는 염증성 결절, 및

● 15개 이하의 누관, 및

● 적어도 2개의 해부 부위가 HS 병변과 관련될 필요가 있음

● 스크리닝 시 50 kg의 최소 몸무게(50 kg 포함)

조사자와 잘 소통할 수 있고 연구의 요구사항을 이해하고 준수할 수 있으며, 연구 스케줄에 따라 연구 방문을 수행할 능력 및 의지가 있음.

주요 배제 기준:

● 스크리닝 시, 또는 무작위 배정 후 30일 또는 5 반감기 이내 중 더 오랜 기간 이내에; 또는 현지 규정에 의해 요구되는 경우 더 오랫동안의 다른 임상시험용 약물의 사용.

● WOCBP(생리학적으로 임신할 수 있는 모든 여성으로 정의됨)는 임신 테스트가 수행될, 첫 약물 투여 전 적어도 3개월째부터 최종 용량 후 5개월째까지(225일차에서 253일차) 고도로 효과적인 피임을 준수하도록 요구될 것이다.

● 스크리닝 또는 무작위 배정 시 임신 중 또는 수유(젖분비) 중인 여성(여기서 임신은 양성 hCG 실험실 시험에 의해 확인되는, 수태 후 및 잉태 기간 종료까지의 여성의 상태로 정의됨).

연구 치료 및 지속기간

bbmAb1 아암에 할당된 환자는 다음과 같이 bbmAb1, 300 mg, s.c, 또는 일치하는 위약을 제공받을 것이다: 격주로(Q2W) 1일차(1주차)부터 29일차(5주차)까지, 및 그 후에 매월 85일차(85일차 포함)(13주차)까지.

효능 평가

● 단순화된 및 원래의 화농성 한선염 임상 반응(HiSCR) 비율

● 국제 화농성 한선염 중증도 점수 시스템(International Hidradenitis Suppurativa Severity Score System; IHS4)

● 화농성 한선염 - 의사 종합 평가(HS-PGA) 점수 및 반응자 비율

● HS 염증성 병변 수

● 화농성 한선염의 중증도 평가(SAHS)

bbmAb1의 경우에, 공급된 약물의 투여형은 "즉시 사용 가능한" 수성 완충 멸균 수용액이다. 용액은 100 mg/ml의 bbmAb1 및 부형제인 L-히스티딘, 수크로스, 및 폴리소르베이트 20, pH 6.0을 함유한다. 이 연구를 위해 선택된 위약 대조군은 비활성 부형제의 조성이 일치하는 용액이다.

IL-1β 및 유리 IL-18에 대한 bbmAb1 용량의 예측된 효과

항-IL-1β/IL-18 이중특이적 항체 및 이의 혈청 내 표적의 역학을 예측하는 데 사용되는 모델은 IL-18 아암에 대한 일반적인 경쟁적 결합 모델(문헌[Yan et al 2012]), 및 유리 및 총 IL-18 역학을 기재하는 신규한 모델과 함께 IL-1β 아암에 대한 bbmAb1에 대해 조정된 카나키누맙의 이전에 공개된 모델(문헌[Chakraborty et al 2012])로 이루어진다. bbmAb1의 적용에 대한 반응 시의 IL-1β의 역학을 예측하기 위해, 임상 카나키누맙 연구에서 확립된 모델을 사용하였고(문헌[Chakraborty et al 2012]), 그에 따라 bbmAb1-특이적 PK 파라미터 및 결합 친화도를 업데이트하였다. CAPS 환자에서 IL-1β 농도를 조정하기 위해, 본 발명자들은 카나키누맙 임상 연구에서 나열된 이 인터류킨의 합성 및 클리어런스 파라미터를 사용하였다(문헌[Chakraborty et al 2012]). 모델은 몇몇 자가면역 질환에 걸친 환자로부터의 유리 및 총 IL-18 혈청 농도로부터의, 사내 시험관내 및 공개된 인간 데이터에 기반한다(문헌[Weiss et al 2018]).

이에 기반하여, 300 mg Q2W/Q4W s.c.의 투약 스케줄이 혈청 내의 IL-1β 및 IL-18 수준 둘 모두의 동시적 감소를 초래할 것으로 예측되며 IL-1β뿐만 아니라 IL-18의 효과적인 중화가 기대된다(도 4 및 도 5).

bbmAb1의 약동학

bbmAb1을 임의의 약물 관련 SAE가 없는 건강한 자원자에서의 최대 10 mg/kg i.v.의 FiH 단회 용량 상승 연구에서 평가한다. 인간에서의 bbmAb1의 약동학(PK)은 마모셋 원숭이 데이터에 기반한 인간 예측을 따르며 가용성 리간드 사이토카인 표적(들)에 대한 전형적인 IgG1 항체 결합에 대해 예측된 바와 같다. bbmAb1은 예측된 인간 PK와 일치하는 노출의 용량 선형 증가를 나타내었다(최대 10 mg/kg i.v.까지 평가됨). bbmAb1의 예측된 인간 PK 파라미터는 다음과 같다: 클리어런스(CL) = 0.158 L/d, 분포 용적(V_d) = 5.586 L(70-kg 인간 대상체의 경우) 또는 0.08 L/kg; 반감기(T_1/2) = 24.5일. FiH 연구로부터의 PK 프로파일의 예비 분석은 항-약물 항체(ADA)의 형성으로 인해, bbmAb1의 클리어런스가 가속화되었다는 증거를 제공하지 못했다.

이들 발견으로 인해, FiH 연구로부터의 최근 피하 데이터를 기반으로 생체이용률 및 흡수율 상수를 조정하고 피하 PK의 예측에 사용하였다.

300 mg Q2W/Q4W s.c.의 bbmAb1 용량은 모든 전신 유리 IL-1β 및 IL-18의 신속하고 동시적인 중화를 야기할 것으로 예측된다. 300 mg s.c. 후의 노출은 단회 용량 후 100일 초과 동안 IL-1β 및 IL-18에 대한 시험관내 IC90을 초과할 것이다(도 6).

참조문헌

실시예 9: bbmAb1의 고농도 제형(100 내지 120 mg/mL)의 개발

처음에는 8가지 상이한 제형을 고속대량 플레이트-기반 검정에서 시험하였다.

● F1(120 mg/mL bbmAb1, 20 mM 숙신산나트륨, pH 5.0, 220 mM 수크로스, 0.04% 폴리소르베이트 20);

● F2(120 mg/mL bbmAb1, 20 mM 히스티딘/히스티딘-Cl, pH 5.0, 220 mM 수크로스, 0.04% 폴리소르베이트 20);

● F3(120 mg/mL bbmAb1, 20 mM 히스티딘/히스티딘-Cl, pH 5.5, 220 mM 수크로스, 0.04% 폴리소르베이트 20);

● F4(120 mg/mL bbmAb1, 20 mM 히스티딘/히스티딘-Cl, pH 6.0, 220 mM 수크로스, 0.04% 폴리소르베이트 20);

● F5(120 mg/mL bbmAb1, 20 mM 히스티딘/히스티딘-Cl, pH 6.5, 220 mM 수크로스, 0.04% 폴리소르베이트 20);

● F6(120 mg/mL bbmAb1, 20 mM 인산칼륨, pH 7.0, 220 mM 수크로스, 0.04% 폴리소르베이트 20);

● F7(50 mg/mL bbmAb1, 20 mM 히스티딘/히스티딘-Cl, pH 5.5, 220 mM 수크로스, 0.04% 폴리소르베이트 20);

● F8(50 mg/mL bbmAb1, 20 mM 인산칼륨, pH 7.0, 220 mM 수크로스, 0.04% 폴리소르베이트 20);

제형 F1 내지 F8을 40℃에서 2주 또는 4주 후 크기 배제 크로마토그래피에 의해, 응집체 형성에 대해 시험하였다. 결과는 pH가 5에서 7로 증가함에 따라 응집이 증가하는 경향을 나타냈으며, pH 7.0 제형 F6 및 F8은 유의한 응집을 나타내었다. 도 7을 참조한다.

제형 F1 내지 F8을 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분해 산물 형성에 대해서도 시험하였다. 결과는 시험 조건(25℃, 4주) 하에서 시험된 모든 제형에서 단백질이 안정함을 나타내었다. 그러나, 비-환원 조건 하에서의 LabChip 분석은 보다 낮은 pH에서 분해 산물 형성의 명확한 경향을 나타내었으며, pH 5.0 제형은 유의한 분해 산물 형성을 나타내었다. 도 8을 참조한다.

제형 F1 내지 F8을 전하 존 전기영동(charge zone electrophoresis; CZE)에 의해 열적 스트레스(25℃, 4W)에 반응한 산성 및 염기성 변이체 형성에 대해 시험하였다. 유의한 산성 변이체 형성은 높은 pH(F8)에서 관찰되었으며, 유의한 염기성 변이체 형성은 낮은 pH(F1 및 F2)에서 관찰되었다. 도 9a 및 도 9b를 참조한다.

상기 제형을 또한 동결해동 및 기계적 스트레스(교반)에 대한 저항성에 대해서도 시험하였으며, 결과는 부형제(예를 들어, 당, 예컨대 수크로스) 및 계면활성제(예를 들어, 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20)와 함께 50 내지 120 mg/mL의 bbmAb1(바람직하게는 100 mg/mL의 bbmAb1)을 갖는, pH 5.5, 바람직하게는 6.0의 성공적인 안정한 제형을 추가로 뒷받침한다.

추가적인 시험 양식은 시각적 시험, 탁도(A405 nm), 동적 광산란, 마이크로플로우 이미징, 및 액체 크로마토그래피 질량 분석법에 의한 LysC 펩티드 맵핑을 포함하였다.

서열 표

본 발명을 실시하기에 유용한 아미노산 및 뉴클레오티드 서열이 표 15에 개시되어 있다.

[표 15]

본 발명의 구현예에 따른 서열

본 출원의 본문 전체에 걸쳐, 본 명세서의 본문(예를 들어, 표 15)과 서열 목록 사이에 불일치가 존재할 경우, 본 명세서의 본문이 우선할 것이다.

본원에서 언급된 모든 특허 및 간행물은 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG <120> BISPECIFIC ANTIBODIES FOR USE IN TREATMENT OF HIDRADENITIS SUPPURATIVA <130> PAT059148 <140> <141> <150> 63/213686 <151> 2021-06-22 <150> 63/223479 <151> 2021-07-19 <160> 104 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Asn Ile Ile Pro Met Thr Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn 1 5 10 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 Gly Gly Thr Phe Lys Ser Tyr 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 5 Ile Pro Met Thr Gly Gln 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 6 Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn 1 5 10 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 7 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Lys Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Ile Pro Met Thr Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 356 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 8 gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcagcag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcgg caccttcaag agctacgcca tcagctgggt gaggcaggcc 120 cccggccagg gcctggagtg gatgggcaac atcatcccca tgaccggcca gacctactac 180 gcccagaagt tccagggcag ggtgaccatc accgccgacg agagcaccag caccgcctac 240 atggagctga gcagcctgag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggccgcc 300 taccaccccc tggtgttcga caactgggcc agggcaccct ggtgaccgtg agcagc 356 <210> 9 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 9 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Lys Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Ile Pro Met Thr Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 10 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 10 gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcagcag cgtgaaggtg 60 agctgcaagg ccagcggcgg caccttcaag agctacgcca tcagctgggt gaggcaggcc 120 cccggccagg gcctggagtg gatgggcaac atcatcccca tgaccggcca gacctactac 180 gcccagaagt tccagggcag ggtgaccatc accgccgacg agagcaccag caccgcctac 240 atggagctga gcagcctgag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggccgcc 300 taccaccccc tggtgttcga caactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagcgcc 360 agcaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcccccagca gcaagagcac cagcggcggc 420 accgccgccc tgggctgcct ggtgaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgagctgg 480 aacagcggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttccccg ccgtgctgca gagcagcggc 540 ctgtacagcc tgagcagcgt ggtgaccgtg cccagcagca gcctgggcac ccagacctac 600 atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagggt ggagcccaag 660 agctgcgaca agacccacac ctgccccccc tgccccgccc ccgaggccgc cggcggcccc 720 agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag gacccccgag 780 gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac gaggaccccg aggtgaagtt caactggtac 840 gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagccca gggaggagca gtacaacagc 900 acctacaggg tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960 tacaagtgca aggtgagcaa caaggccctg cccgccccca tcgagaagac catcagcaag 1020 gccaagggcc agcccaggga gccccaggtg tacaccctgc cccccagcag ggaggagatg 1080 accaagaacc aggtgagcct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccccgtgctg 1200 gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc aagctgaccg tggacaagag caggtggcag 1260 cagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1320 aagagcctga gcctgagccc cggcaag 1347 <210> 11 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 11 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His Tyr Val Asn 1 5 10 <210> 12 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 12 Arg Asn Asn His Arg Pro Ser 1 5 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 13 Gln Ser Trp Asp Tyr Ser Gly Phe Ser Thr Val 1 5 10 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 14 Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His Tyr 1 5 <210> 15 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 15 Arg Asn Asn 1 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 16 Trp Asp Tyr Ser Gly Phe Ser Thr 1 5 <210> 17 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 17 Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His 20 25 30 Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Tyr Ser Gly 85 90 95 Phe Ser Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 18 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 18 gatatcgtcc tgactcagcc ccctagcgtc agcggcgctc ccggtcagag agtgactatt 60 agctgtagcg gctctagctc taatatcggt aatcactacg tgaactggta tcagcagctg 120 cccggcaccg cccctaagct gctgatctat agaaacaatc accggcctag cggcgtgccc 180 gataggttta gcggatctaa gtcaggcact agcgctagtc tggctatcac cggactgcag 240 tcagaggacg aggccgacta ctactgtcag tcctgggact atagcggctt tagcaccgtg 300 ttcggcggag gcactaagct gaccgtgctg 330 <210> 19 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 19 Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His 20 25 30 Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Tyr Ser Gly 85 90 95 Phe Ser Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 20 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 20 gatatcgtcc tgactcagcc ccctagcgtc agcggcgctc ccggtcagag agtgactatt 60 agctgtagcg gctctagctc taatatcggt aatcactacg tgaactggta tcagcagctg 120 cccggcaccg cccctaagct gctgatctat agaaacaatc accggcctag cggcgtgccc 180 gataggttta gcggatctaa gtcaggcact agcgctagtc tggctatcac cggactgcag 240 tcagaggacg aggccgacta ctactgtcag tcctgggact atagcggctt tagcaccgtg 300 ttcggcggag gcactaagct gaccgtgctg ggtcagccta aggctgcccc cagcgtgacc 360 ctgttccccc ccagcagcga ggagctgcag gccaacaagg ccaccctggt gtgcctgatc 420 agcgacttct acccaggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ccgacagcag ccccgtgaag 480 gccggcgtgg agaccaccac ccccagcaag cagagcaaca acaagtacgc cgccagcagc 540 tacctgagcc tgacccccga gcagtggaag agccacaggt cctacagctg ccaggtgacc 600 cacgagggca gcaccgtgga aaagaccgtg gccccaaccg agtgcagc 648 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 21 Val Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 22 Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 23 Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr 1 5 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 24 Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr 1 5 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 25 Trp Tyr Asp Gly Asp Asn 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 26 Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr 1 5 <210> 27 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 27 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 28 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 28 caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctg 60 agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc gtgtacggca tgaactgggt gaggcaggcc 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtggccatc atctggtacg acggcgacaa ccagtactac 180 gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acggcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggacctg 300 aggaccggcc ccttcgacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354 <210> 29 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 29 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys 355 360 365 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 30 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 30 caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctg 60 agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc gtgtacggca tgaactgggt gaggcaggcc 120 cccggcaagg gcctggagtg ggtggccatc atctggtacg acggcgacaa ccagtactac 180 gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acggcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggacctg 300 aggaccggcc ccttcgacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagcgccagc 360 accaagggcc ccagcgtgtt ccccctggcc cccagcagca agagcaccag cggcggcacc 420 gccgccctgg gctgcctggt gaaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gagctggaac 480 agcggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttccccgccg tgctgcagag cagcggcctg 540 tacagcctga gcagcgtggt gaccgtgccc agcagcagcc tgggcaccca gacctacatc 600 tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagggtgga gcccaagagc 660 tgcgacaaga cccacacctg ccccccctgc cccgcccccg agctgctggg cggccccagc 720 gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac accctgatga tcagcaggac ccccgaggtg 780 acctgcgtgg tggtggacgt gagccacgag gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg 840 gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc aagcccaggg aggagcagta caacagcacc 900 tacagggtgg tgagcgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 960 aagtgcaagg tgagcaacaa ggccctgccc gcccccatcg agaagaccat cagcaaggcc 1020 aagggccagc ccagggagcc ccaggtgtac accctgcccc ccagcaggga ggagatgacc 1080 aagaaccagg tgagcctgac ctgcctggtg aagggcttct accccagcga catcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc cgtgctggac 1200 agcgacggca gcttcttcct gtacagcaag ctgaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260 ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1320 agcctgagcc tgagccccgg caag 1344 <210> 31 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 31 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser Leu His 1 5 10 <210> 32 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 32 Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 33 His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe Thr 1 5 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 34 Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 1 5 <210> 35 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 35 Tyr Ala Ser 1 <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 36 Ser Ser Ser Leu Pro Phe 1 5 <210> 37 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 37 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 38 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 38 gagatcgtgc tgacccagtc acccgacttt cagtcagtga cccctaaaga aaaagtgact 60 atcacctgta gggcctccca gtctatcggc tctagcctgc actggtatca gcagaagccc 120 gatcagtcac ctaagctgct gattaagtac gcctctcagt cctttagcgg cgtgccctct 180 aggtttagcg gctcaggctc aggcaccgac ttcaccctga ctatcaatag cctggaagcc 240 gaggacgccg ctgcctacta ctgtcatcag tcaagtagcc tgcccttcac cttcggccct 300 ggcactaaag tggatattaa g 321 <210> 39 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 39 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 40 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 40 gagatcgtgc tgacccagtc acccgacttt cagtcagtga cccctaaaga aaaagtgact 60 atcacctgta gggcctccca gtctatcggc tctagcctgc actggtatca gcagaagccc 120 gatcagtcac ctaagctgct gattaagtac gcctctcagt cctttagcgg cgtgccctct 180 aggtttagcg gctcaggctc aggcaccgac ttcaccctga ctatcaatag cctggaagcc 240 gaggacgccg ctgcctacta ctgtcatcag tcaagtagcc tgcccttcac cttcggccct 300 ggcactaaag tggatattaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttccccccc 360 agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420 ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtca ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcataag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc 642 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 41 Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr Gly Met Asn 1 5 10 <210> 42 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 42 Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 43 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 43 Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr 1 5 <210> 44 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 44 Val Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 45 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 45 Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 46 Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr 1 5 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 47 Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr 1 5 <210> 48 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 48 Trp Tyr Asp Gly Asp Asn 1 5 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 49 Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr 1 5 <210> 50 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 50 Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr Gly 1 5 <210> 51 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 51 Ile Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gln 1 5 <210> 52 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 52 Ala Arg Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 53 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 53 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 54 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 54 caggtgcagc tggtggaatc aggcggcgga gtggtgcagc ctggtagatc actgagactg 60 agctgcgctg ctagtggctt cacctttagc gtctacggaa tgaactgggt ccgacaggcc 120 cctgggaaag gcctggagtg ggtggcaatt atctggtacg acggcgataa tcagtactac 180 gccgatagcg tgaagggacg gttcactatc tctagggata actctaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acggcctgag agccgaggac accgccgtct actactgcgc tagggacctg 300 agaaccggcc ccttcgacta ctggggacag ggcaccctgg tcaccgtgtc tagc 354 <210> 55 <211> 448 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 55 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro 115 120 125 Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly 130 135 140 Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn 145 150 155 160 Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 165 170 175 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser 195 200 205 Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr 210 215 220 His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser 225 230 235 240 Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg 245 250 255 Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro 260 265 270 Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala 275 280 285 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val 290 295 300 Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 305 310 315 320 Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 330 335 Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu 340 345 350 Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys 355 360 365 Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser 370 375 380 Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp 385 390 395 400 Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 405 410 415 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala 420 425 430 Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 <210> 56 <211> 1344 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 56 caggtgcagc tggtggaatc aggcggcgga gtggtgcagc ctggtagatc actgagactg 60 agctgcgctg ctagtggctt cacctttagc gtctacggaa tgaactgggt ccgacaggcc 120 cctgggaaag gcctggagtg ggtggcaatt atctggtacg acggcgataa tcagtactac 180 gccgatagcg tgaagggacg gttcactatc tctagggata actctaagaa caccctgtac 240 ctgcagatga acggcctgag agccgaggac accgccgtct actactgcgc tagggacctg 300 agaaccggcc ccttcgacta ctggggacag ggcaccctgg tcaccgtgtc tagcgcctct 360 actaagggcc caagcgtgtt ccccctggcc cctagctcta agtctactag cggaggcacc 420 gccgctctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt cagctggaat 480 agcggcgctc tgactagcgg agtgcacacc ttccccgccg tgctgcagtc tagcggcctg 540 tatagcctgt ctagcgtcgt gaccgtgcct agctctagcc tgggcactca gacctatatc 600 tgtaacgtga accacaagcc ctctaacact aaggtggaca agcgggtgga acctaagtcc 660 tgcgataaga ctcacacctg tcctccctgc cctgcccctg aggctgccgg aggacctagc 720 gtgttcctgt tcccacctaa gcctaaagac accctgatga tctctaggac ccccgaagtg 780 acctgcgtgg tggtggacgt ctcacacgag gaccctgaag tgaagtttaa ttggtacgtg 840 gacggcgtgg aagtgcacaa cgctaagact aagcctagag aggaacagta taactctacc 900 tatagggtcg tcagcgtgct gacagtgctg caccaggact ggctgaacgg gaaagagtat 960 aagtgtaaag tgtctaacaa ggccctgcca gcccctatcg aaaagactat ctctaaggct 1020 aaggggcagc ctagagaacc ccaagtgtgc actctgcccc ctagtagaga agagatgact 1080 aagaatcagg tgtcactgag ctgtgccgtg aagggcttct accctagcga tatcgccgtg 1140 gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc agtgctggac 1200 agcgacggca gcttcttcct ggtgagcaag ctgaccgtgg acaagtccag gtggcagcag 1260 ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1320 tccctgagcc tgagccccgg caag 1344 <210> 57 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 57 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser Leu His 1 5 10 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 58 Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser 1 5 <210> 59 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 59 His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe Thr 1 5 <210> 60 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 60 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser Leu His 1 5 10 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 61 Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser 1 5 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 62 His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe Thr 1 5 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 63 Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 1 5 <210> 64 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 64 Tyr Ala Ser 1 <210> 65 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 65 Ser Ser Ser Leu Pro Phe 1 5 <210> 66 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 66 Gln Ser Ile Gly Ser Ser 1 5 <210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 67 Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro 1 5 10 <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 68 His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe Thr 1 5 <210> 69 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 69 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 70 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 70 gagatcgtgc tgacccagtc acccgacttt cagtcagtga cccctaaaga aaaagtgact 60 atcacctgta gggcctccca gtctatcggc tctagcctgc actggtatca gcagaagccc 120 gatcagtcac ctaagctgct gattaagtac gcctctcagt cctttagcgg cgtgccctct 180 aggtttagcg gctcaggctc aggcaccgac ttcaccctga ctatcaatag cctggaagcc 240 gaggacgccg ctgcctacta ctgtcatcag tcaagtagcc tgcccttcac cttcggccct 300 ggcactaaag tggatattaa g 321 <210> 71 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 71 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala 65 70 75 80 Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 72 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 72 gagatcgtgc tgacccagtc acccgacttt cagtcagtga cccctaaaga aaaagtgact 60 atcacctgta gggcctccca gtctatcggc tctagcctgc actggtatca gcagaagccc 120 gatcagtcac ctaagctgct gattaagtac gcctctcagt cctttagcgg cgtgccctct 180 aggtttagcg gctcaggctc aggcaccgac ttcaccctga ctatcaatag cctggaagcc 240 gaggacgccg ctgcctacta ctgtcatcag tcaagtagcc tgcccttcac cttcggccct 300 ggcactaaag tggatattaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttccccccc 360 agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420 ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtca ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcataag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc 642 <210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 73 Gly Gly Thr Phe Lys Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 10 <210> 74 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 74 Asn Ile Ile Pro Met Thr Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 75 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 75 Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn 1 5 10 <210> 76 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 76 Ser Tyr Ala Ile Ser 1 5 <210> 77 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 77 Asn Ile Ile Pro Met Thr Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 78 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 78 Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn 1 5 10 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 79 Gly Gly Thr Phe Lys Ser Tyr 1 5 <210> 80 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 80 Ile Pro Met Thr Gly Gln 1 5 <210> 81 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 81 Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn 1 5 10 <210> 82 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 82 Gly Gly Thr Phe Lys Ser Tyr Ala 1 5 <210> 83 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 83 Ile Ile Pro Met Thr Gly Gln Thr 1 5 <210> 84 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 84 Ala Arg Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn 1 5 10 <210> 85 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 85 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Lys Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Ile Pro Met Thr Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 86 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 86 gaggtgcagc tggtgcagtc aggcgccgaa gtgaagaaac ccggctctag cgtgaaagtc 60 agctgtaaag ctagtggcgg caccttcaag tcctacgcta ttagctgggt cagacaggcc 120 ccaggtcagg gcctggagtg gatgggcaat attatcccta tgaccggtca gacctactac 180 gctcagaaat ttcagggtag agtgactatc accgccgacg agtctactag caccgcctat 240 atggaactgt ctagcctgag atcagaggac accgccgtct actactgcgc tagagccgcc 300 tatcaccccc tggtgttcga taactggggt cagggcaccc tggtcaccgt gtctagc 357 <210> 87 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 87 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Lys Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Asn Ile Ile Pro Met Thr Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 88 <211> 1347 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 88 gaggtgcagc tggtgcagtc aggcgccgaa gtgaagaaac ccggctctag cgtgaaagtc 60 agctgtaaag ctagtggcgg caccttcaag tcctacgcta ttagctgggt cagacaggcc 120 ccaggtcagg gcctggagtg gatgggcaat attatcccta tgaccggtca gacctactac 180 gctcagaaat ttcagggtag agtgactatc accgccgacg agtctactag caccgcctat 240 atggaactgt ctagcctgag atcagaggac accgccgtct actactgcgc tagagccgcc 300 tatcaccccc tggtgttcga taactggggt cagggcaccc tggtcaccgt gtctagcgct 360 agcactaagg gcccctcagt gttccccctg gcccctagct ctaagtctac tagcggcggc 420 accgccgctc tgggctgcct ggtgaaagac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcatgg 480 aatagcggcg ctctgactag cggagtgcac accttccccg ccgtgctgca gtctagcggc 540 ctgtatagcc tgtctagcgt ggtgaccgtg cctagctcta gcctgggcac tcagacctac 600 atctgtaacg tgaaccacaa gccctctaac actaaggtgg acaagcgggt ggaacctaag 660 tcctgcgata agactcacac ctgtcccccc tgccctgccc ctgaggctgc cggaggacct 720 agcgtgttcc tgttcccacc taagcctaag gacaccctga tgatctctag gacccccgaa 780 gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcac gaggaccctg aagtgaagtt caattggtac 840 gtggacggcg tggaagtgca caacgctaag actaagccta gagaggaaca gtataactcc 900 acctatagag tggtgtcagt gctgaccgtg ctgcatcagg actggctgaa cggcaaagag 960 tataagtgta aagtctctaa caaggccctg ccagccccta tcgaaaagac tatctctaag 1020 gctaagggcc agcctagaga acctcaggtg tacaccctgc ccccctgtag agaagagatg 1080 actaagaatc aggtgtccct gtggtgtctg gtgaaaggct tctaccctag cgatatcgcc 1140 gtggaatggg agtctaacgg ccagcccgag aacaactata agactacccc ccctgtgctg 1200 gatagcgacg gctcattctt cctgtactct aagctgaccg tggacaagtc taggtggcag 1260 cagggcaatg tgtttagctg tagcgtgatg cacgaggccc tgcataatca ctacactcag 1320 aagtcactga gcctgagccc cggcaag 1347 <210> 89 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 89 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His Tyr Val Asn 1 5 10 <210> 90 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 90 Arg Asn Asn His Arg Pro Ser 1 5 <210> 91 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 91 Gln Ser Trp Asp Tyr Ser Gly Phe Ser Thr Val 1 5 10 <210> 92 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 92 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His Tyr Val Asn 1 5 10 <210> 93 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 93 Arg Asn Asn His Arg Pro Ser 1 5 <210> 94 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 94 Gln Ser Trp Asp Tyr Ser Gly Phe Ser Thr Val 1 5 10 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 95 Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His Tyr 1 5 <210> 96 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 96 Arg Asn Asn 1 <210> 97 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 97 Trp Asp Tyr Ser Gly Phe Ser Thr 1 5 <210> 98 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 98 Ser Ser Asn Ile Gly Asn His Tyr 1 5 <210> 99 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 99 Arg Asn Asn 1 <210> 100 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 100 Gln Ser Trp Asp Tyr Ser Gly Phe Ser Thr Val 1 5 10 <210> 101 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 101 Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His 20 25 30 Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Tyr Ser Gly 85 90 95 Phe Ser Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 102 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 102 gatatcgtcc tgactcagcc ccctagcgtc agcggcgctc ccggtcagag agtgactatt 60 agctgtagcg gctctagctc taatatcggt aatcactacg tgaactggta tcagcagctg 120 cccggcaccg cccctaagct gctgatctat agaaacaatc accggcctag cggcgtgccc 180 gataggttta gcggatctaa gtcaggcact agcgctagtc tggctatcac cggactgcag 240 tcagaggacg aggccgacta ctactgtcag tcctgggact atagcggctt tagcaccgtg 300 ttcggcggag gcactaagct gaccgtgctg 330 <210> 103 <211> 216 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 103 Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His 20 25 30 Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Asn Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Tyr Ser Gly 85 90 95 Phe Ser Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 210 215 <210> 104 <211> 648 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 104 gatatcgtcc tgactcagcc ccctagcgtc agcggcgctc ccggtcagag agtgactatt 60 agctgtagcg gctctagctc taatatcggt aatcactacg tgaactggta tcagcagctg 120 cccggcaccg cccctaagct gctgatctat agaaacaatc accggcctag cggcgtgccc 180 gataggttta gcggatctaa gtcaggcact agcgctagtc tggctatcac cggactgcag 240 tcagaggacg aggccgacta ctactgtcag tcctgggact atagcggctt tagcaccgtg 300 ttcggcggag gcactaagct gaccgtgctg ggtcagccta aggctgcccc cagcgtgacc 360 ctgttccccc ccagcagcga ggagctgcag gccaacaagg ccaccctggt gtgcctgatc 420 agcgacttct acccaggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ccgacagcag ccccgtgaag 480 gccggcgtgg agaccaccac ccccagcaag cagagcaaca acaagtacgc cgccagcagc 540 tacctgagcc tgacccccga gcagtggaag agccacaggt cctacagctg ccaggtgacc 600 cacgagggca gcaccgtgga aaagaccgtg gccccaaccg agtgcagc 648

Claims

화농성 한선염(HS)의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 화농성 한선염(HS)을 치료 또는 예방하기 위한 방법으로서, 특이적으로 결합하여 IL-18 및 IL-1β의 활성을 저해하는 이중특이적 항체 길항제의 치료적 유효량을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 항체는
a. IL1β에 특이적으로 결합하는, (VL1)의 제1 가변 경쇄 및 제1 가변 중쇄(VH1), 및 이종-이량체화 변형이 있는 제1 불변 중쇄(CH1)가 있는 면역글로불린인 제1 부분, 및
b. IL-18에 특이적으로 결합하는, 제2 가변 경쇄(VL2) 및 제2 가변 중쇄(VH2), 및 제1 불변 중쇄의 이종-이량체화 변형에 대해 상보적인 이종-이량체화 변형이 있는 제2 불변 중쇄(CH2)가 있는 면역글로불린인 제2 부분을 포함하는, 방법.
HS의 발달을 늦추거나, 저지하거나, 감소시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 HS의 발달을 늦추거나, 저지하거나, 감소시키는 방법으로서, 특이적으로 결합하여 IL-18 및 IL-1β의 활성을 저해하는 이중특이적 항체 길항제의 치료적 유효량을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제3항에 있어서, 항체는
a. IL1β에 특이적으로 결합하는, (VL1)의 제1 가변 경쇄 및 제1 가변 중쇄(VH1), 및 이종-이량체화 변형이 있는 제1 불변 중쇄(CH1)가 있는 면역글로불린인 제1 부분, 및
b. IL-18에 특이적으로 결합하는, 제2 가변 경쇄(VL2) 및 제2 가변 중쇄(VH2), 및 제1 불변 중쇄의 이종-이량체화 변형에 대해 상보적인 이종-이량체화 변형이 있는 제2 불변 중쇄(CH2)가 있는 면역글로불린인 제2 부분을 포함하는, 방법.
제2항 또는 제4항에 있어서, 이중특이적 항체의 제1 및 제2 불변 중쇄는 인간 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM, 바람직하게는 IgD, IgE, 또는 IgG, 예컨대 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4, 바람직하게는 IgG1인, 방법.
제2항 또는 제4항에 있어서, 이중특이적 항체의 제1 및 제2 불변 중쇄는 IgG1이고,
a. 제1 불변 중쇄는 노브 구조를 생성하는 점 돌연변이를 갖고 제2 불변 중은 홀 구조를 생성하는 점 돌연변이를 갖거나,
b. 제1 불변 중쇄는 홀 구조를 생성하는 점 돌연변이를 갖고 제2 불변 중은 노브 구조를 생성하는 점 돌연변이를 갖고, 선택적으로
c. 제1 및 제2 불변 중쇄는 디설피드 가교를 초래하는 돌연변이를 갖는, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
a. 이중특이적 항체의 제1 면역글로불린 VH1 도메인은
i. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:76을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:77을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:78을 가짐); 또는
ii. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:79를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:80을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:81을 가짐)을 포함하고;
b. 이중특이적 항체의 제1 면역글로불린 VL1 도메인은
iii. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:92를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:93을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:94를 가짐) 또는
iv. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:95를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:96을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:97을 가짐)을 포함하고;
c. 이중특이적 항체의 제2 면역글로불린 VH2 도메인은
v. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:44를 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:45를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:46을 가짐); 또는
vi. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:47을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:48을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:49를 가짐)을 포함하고;
d. 이중특이적 항체의 제2 면역글로불린 VL2 도메인은
vii. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:60을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:61을 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:62를 가짐) 또는
viii. 초가변 영역 CDR1, CDR2 및 CDR3(상기 CDR1은 아미노산 서열 SEQ ID NO:63을 갖고, 상기 CDR2는 아미노산 서열 SEQ ID NO:64를 가지며, 상기 CDR3은 아미노산 서열 SEQ ID NO:65를 가짐)을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
a. 이중특이적 항체의 제1 면역글로불린 VH1 도메인은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 85를 포함하고,
b. 이중특이적 항체의 제1 면역글로불린 VL1 도메인은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 101을 포함하고,
c. 이중특이적 항체의 제2 면역글로불린 VH2 도메인은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 53을 포함하고,
d. 이중특이적 항체의 제2 면역글로불린 VL2 도메인은 아미노산 서열 SEQ ID NO: 69를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
a. 이중특이적 항체의 제1 면역글로불린 중쇄는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 87을 포함하고,
b. 이중특이적 항체의 제1 면역글로불린 경쇄는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 103을 포함하고,
c. 이중특이적 항체의 제2 면역글로불린 중쇄는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 55를 포함하고,
d. 이중특이적 항체의 제2 면역글로불린 경쇄는 아미노산 서열 SEQ ID NO: 71을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 경로가 피하 또는 정맥내, 또는 피하 또는 정맥내의 조합인, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 용량이 인간 대상체의 킬로그램당 약 1.5 mg 내지 약 15 mg의 활성 성분인, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 용량이 인간 대상체의 킬로그램당 약 5 mg 또는 10 mg의 활성 성분인, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 용량이 약 150 mg 내지 약 600 mg의 활성 성분, 예컨대, 약 300 mg의 활성 성분인, 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 로딩 투약 및 유지 투약을 통해 투여되는, 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 로딩 투약은 제1 용량의 피하 주사를 통해 시행되고, 유지 투약은 제2 용량의 피하 주사를 통해 시행되는, 방법.
제15항에 있어서, 제1 용량은 약 150 mg 내지 약 600 mg의 활성 성분, 예컨대 약 300 mg의 활성 성분이고, 제2 용량은 약 150 mg 내지 약 600 mg의 활성 성분, 예컨대 약 300 mg의 활성 성분인, 방법.
제15항 또는 제16항에 있어서, 제1 용량은 150 mg, 300 mg 또는 600 mg의 활성 성분이고, 제2 용량은 150 mg, 300 mg 또는 600 mg의 활성 성분인, 방법.
제17항에 있어서, 로딩 투약은 격주로 1일차, 15일차, 및 29일차에 적어도 3회 피하로 주사하는 것을 포함하고, 유지 투약은 57일차에 시작하는 매월(Q4W) 피하 주사로 이루어지는, 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 화농성 한선염 환자는 다음의 기준 중 하나에 따라 선택되는, 방법:
a. 환자는 중등도 내지 중증의 HS를 가짐;
b. 환자는 성인임;
c. 환자는 청소년임;
d. CD40 길항제를 이용한 치료에 앞서, 환자는 3 이상의 HS-PGA 점수를 가짐;
e. CD40 길항제를 이용한 치료에 앞서, 환자는 적어도 3개의 염증성 병변을 가짐; 또는
f. CD40 길항제를 이용한 치료에 앞서, 환자는 HS의 결과로서 광범위한 흉터 형성을 갖지 않음(10개 미만의 누관).
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 16주차까지 화농성 한선염 환자는 다음 중 적어도 하나를 달성하는, 방법:
a. 단순화된 HiSCR;
b. HS 악화(flare)의 감소;
c. NRS30;
d. DLQI에 의해 측정될 시, 6 이하의 감소; 및/또는
e. DLQI의 개선.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 16주차까지, 상기 환자의 적어도 40%가 단순화된 HiSCR을 달성하거나; 상기 환자의 적어도 25%가 NRS30 반응을 달성하거나; 상기 환자의 15% 미만이 HS 악화를 경험하는, 방법.
환자가 이르면 이중특이적 IL-18 및 IL-1β 길항제의 제1 용량 후 1주일째에 다음 중 적어도 하나를 갖는, 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 용도를 위한 항체:
a. VAS 또는 NRS에 의해 측정될 시, 신속한 통증 감소, 및
b. 표준 CRP 검정을 이용하여 측정될 시 신속한 CRP 감소.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 염증성 병변 수, 화농성 한선염 임상 반응(HiSCR), 점수식 평정 척도(NRS), 변형 사르토리우스 HS 점수(modified Sartorius HS score), 화농성 한선염 - 의사 종합 평가(HS-PGA: Hidradenitis Suppurativa - Physician Global Assessment), 또는 피부 삶의 질 지수(DLQI: Dermatology Life Quality Index)에 의해 측정될 시, 치료 종료 후 3개월째에 지속적인 반응을 달성하는, 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 환자는 단순화된 HiSCR(sHiSCR)에 의해 측정될 시, 치료 종료 후 3개월째에 지속적인 반응을 달성하는, 방법.
치료적 유효량의 이중특이적 항-IL-18 및 항-IL-1 β 항체(예를 들어, bbmAb1) 및 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.