CN116723860A - 用于在治疗nlrc4-gof炎性体病变中使用的双特异性抗体 - Google Patents

用于在治疗nlrc4-gof炎性体病变中使用的双特异性抗体 Download PDF

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CN116723860A CN202180076807.1A CN202180076807A CN116723860A CN 116723860 A CN116723860 A CN 116723860A CN 202180076807 A CN202180076807 A CN 202180076807A CN 116723860 A CN116723860 A CN 116723860A
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G·容格
M·基夫
J·科瓦里克
R·斯坦
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Abstract

本发明涉及二价双特异性单克隆抗体(bbmAb)或其变体，用于在有需要的受试者中治疗或减轻NLRC4炎性体病变，如NLRC4‑GOF炎性体病变的症状中使用。本发明还涉及二价双特异性单克隆抗体(bbmAb)或其变体，用于在有需要的受试者中治疗或减轻AIFEC的症状中使用。

Description

用于在治疗NLRC4-GOF炎性体病变中使用的双特异性抗体
技术领域
本发明涉及二价双特异性单克隆抗体(bbmAb)或其变体的治疗，用于在有需要的患者的NLRC4-GOF炎性体病变的治疗中使用。在一些情况下，bbmAb(或变体)用于在具有NLRC4-GOF炎性体病变和/或NLRC4-GOF突变的患者中治疗婴儿小肠结肠炎。本披露还涉及通过采用同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体治疗NLRC4-GOF炎性体病变的方法和治疗方案。
背景技术
炎性体是通常对病原体或危险相关分子模式(PAMP/DAMP)产生应答而形成和激活的细胞内多蛋白复合物。炎性体病变是由单个炎性体过度激活导致分化的临床表型(取决于产生的效应细胞因子和组织特异性表达)而产生的一组机制相关的疾病。目前描述最多的炎性体病变是与NLRP3功能获得(GOF)相关的炎症综合征，也命名为隐热蛋白相关周期性综合征(CAPS)，其通过增加IL-1β的产生导致全身性(通常包括反复发热和疲劳、皮疹)以及局部性炎症反应(涉及眼、内耳、骨、关节、和脑膜)。对于CAPS，中和IL-1β(例如卡那吉努单抗(canakinumab))是已确立并获批用于成人和儿童患者的临床疗法(Booshehri和Hoffman2019)。核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族含CARD结构域蛋白4(NLRC4)是NLRC4炎性体的主要组分。NLRC4炎性体对于激活革兰氏阴性胞内细菌(包括铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)和肠炎沙门氏菌(Salmonellaenterica))的炎症性应答至关重要，这些细菌均表达鞭毛蛋白(Miao等人2010，Kofoed和Vance 2011，Zhao等人2011)。
在NLRC4炎性体病变的患者中，编码这种蛋白的NLRC4基因中的GOF突变可能促进NLRC4炎性体的自发形成。临床上，这导致了以促炎性炎性体效应细胞因子IL-1β和IL-18升高为特征的多系统自身炎症性疾病，尽管临床表型和表现不同(取决于效应细胞因子的基因型和特征)。参见图1。
已经描述了三种NLRC4炎性体病变临床表型。NLRC4-GOF炎性体病变的特征可能在于极早发型婴儿小肠结肠炎伴重度腹泻、短暂性斑丘疹和荨麻疹性皮疹、发热、血细胞减少、肝功能障碍和凝血病，并且典型地在具有种系新发或遗传性NLRC4-GOF突变的患者中发现。新生儿发病的多系统炎症性疾病(NOMID)的特征可能在于发热、皮疹、炎症性骨病变、感觉神经听力丧失和脑结构缺陷，并且典型地在呈现NLRC4突变的体细胞嵌合的患者中发现。家族性冷性自身炎症综合征4(FACS4)的特征可能在于发热、突出的寒冷引起的荨麻疹、关节痛、和轻度肠道炎症，并且在具有种系NLRC4突变的单个家族中有报道。NLRC4-GOF炎性体病变患者典型地具有过度升高的IL-1β和IL-18，并且研究性治疗包括IL-1受体阻断疗法(例如，施用阿那白滞素(anakinra))和IL-1受体阻断疗法组合抗IL-18疗法(例如，施用IL-18BP)(Romberg等人2017；Canna等人,2014)。NOMID患者典型地具有升高的IL-1β，并且研究性治疗包括抗IL-1疗法。FCAS4患者典型地具有升高的IL-18，并且研究性治疗包括施用一种或多种非甾体抗炎药(NSAID)。
如上所解释，受NLRC4-GOF相关自身炎症性疾病影响的患者通常具有明显升高的IL-1β和IL-18水平。这些升高的效应细胞因子驱动MAS特征(发热、皮疹、心动过速、血细胞减少、肝功能障碍和凝血病)和以重度难治性新生儿腹泻为特征的小肠结肠炎的快速早期发展，该新生儿腹泻将NLRC4-GOF与其他NLRC4临床表型区分开来。本发明人认为，在数量有限的婴儿病例中，只有抗IL-1受体(例如，阿那白滞素)和重组IL-18结合蛋白(例如，IL-18BP)的组合被报告为临床有效。
因此，除了支持性医疗护理和在这种群体中获益有限的免疫抑制外，尚无获批的治疗剂直接并特异性靶向潜在的IL-1β和IL-18驱动的自身炎症性过程以改善NLRC4-GOF炎性体病变儿童患者的总体临床结果。因此，对于NLRC4-GOF炎性体病变治疗的改善，本领域存在长期未满足的需求。
发明内容
描述了同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体或其功能片段，用于在受试者中预防或治疗NLRC4-GOF炎性体病变中使用。在一些情况下，该同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体或其功能片段用于在受试者中治疗自身炎症伴婴儿小肠结肠炎(AIFEC)。本文还描述了通过向有需要的受试者施用治疗有效量的同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体来预防或治疗NLRC4-GOF炎性体病变的方法。在一些情况下，该方法包括通过施用治疗有效量的双特异性抗体来在有需要的受试者中治疗AIFEC。
本文进一步提供了用于本文所述的同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如，bbmAb1)的方法或用途的特定给药方案。
本文另外描述了药物组合和药物组合物，这些药物组合和药物组合物包含a)同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如，bbmAb1)，和b)至少一种另外的治疗剂，任选地存在药学上可接受的载剂，用于在治疗或预防NLRC4-GOF炎性体病变中使用，如用于在治疗AIFEC中使用。所述的方法和用途的另外的特征和优点将从以下详细的描述中变得明显。
在第一方面，本披露涉及用于治疗或预防NLRC4炎性体病变的症状的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的双特异性抗体，其中该抗体包含
a.第一部分，所述第一部分是免疫球蛋白，所述免疫球蛋白具有第一可变轻链(VL1)和第一可变重链(VH1)以及带有异二聚化修饰的第一恒定重链(CH1)，所述VH1与IL1β特异性结合，以及
b.第二部分，所述第二部分是免疫球蛋白，所述免疫球蛋白具有第二可变轻链(VL2)和第二可变重链(VH2)以及带有与所述第一恒定重链的异二聚化修饰互补的异二聚化修饰的第二恒定重链(CH2)，所述VH2与IL-18特异性结合。
在第二方面，本披露涉及用于在有需要的受试者中减慢、停滞、或减轻NLRC4炎性体病变的症状的严重程度的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的双特异性抗体，其中该抗体包含
a.第一部分，所述第一部分是免疫球蛋白，所述免疫球蛋白具有第一可变轻链(VL1)和第一可变重链(VH1)以及带有异二聚化修饰的第一恒定重链(CH1)，所述VH1与IL1β特异性结合，以及
b.第二部分，所述第二部分是免疫球蛋白，所述免疫球蛋白具有第二可变轻链(VL2)和第二可变重链(VH2)以及带有与所述第一恒定重链的异二聚化修饰互补的异二聚化修饰的第二恒定重链(CH2)，所述VH2与IL-18特异性结合。
在第三方面，本披露涉及双特异性抗体，该双特异性抗体包含
a.第一部分，所述第一部分是免疫球蛋白，所述免疫球蛋白具有第一可变轻链(VL1)和第一可变重链(VH1)以及带有异二聚化修饰的第一恒定重链(CH1)，所述VH1与IL1β特异性结合，以及
b.第二部分，所述第二部分是免疫球蛋白，所述免疫球蛋白具有第二可变轻链(VL2)和第二可变重链(VH2)以及带有与所述第一恒定重链的异二聚化修饰互补的异二聚化修饰的第二恒定重链(CH2)，所述VH2与IL-18特异性结合，用于如在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变中使用。
在第四方面，本披露涉及第一、第二和第三方面的方法和治疗，其中向该受试者施用约1mg/kg至约35mg/kg的同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体。在第四方面的优选实施例中，向该治疗的受试者施用约10mg/kg的双特异性抗体。
在本披露的一个方面，向该受试者静脉内或皮下施用同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体。
在又一优选的实施例中，以约10mg/kg的剂量向治疗的受试者静脉内施用同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体。
在一个实施例中，仅在第1天向该患者静脉内施用一次10mg/kg剂量的同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体。在另一实施例中，在第1天和第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天和/或第14天向该患者静脉内施用10mg/kg剂量的同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体。在另外的实施例中，在第1天和第14天向该患者静脉内施用10mg/kg剂量的同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体。在另外的实施例中，每2周一次向该患者静脉内施用10mg/kg剂量的同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体。在一个实施例中，在长达28周的时间段内每2周一次向该患者静脉内施用10mg/kg剂量的同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体。在一个实施例中，在长达24周的时间段内每2周一次向该患者静脉内施用10mg/kg剂量的同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体。
在一个实施例中，在长达3年的时间段内每2周一次向该患者静脉内施用10mg/kg剂量的同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体。在一个实施例中，每2周一次向该患者静脉内施用10mg/kg剂量的同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体，持续2周。在一个实施例中，每2周一次向该患者静脉内施用10mg/kg剂量的同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体，持续8周。在一个实施例中，每2周一次向该患者静脉内施用10mg/kg剂量的同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体，持续14周。在一个实施例中，每2周一次向该患者静脉内施用10mg/kg剂量的同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体，持续24周。在一个实施例中，每2周一次向该患者静脉内施用10mg/kg剂量的同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体，持续至少2周。在一个实施例中，每2周一次向该患者静脉内施用10mg/kg剂量的同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体，持续至少8周。在一个实施例中，每2周一次向该患者静脉内施用10mg/kg剂量的同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体，持续至少14周。在一个实施例中，每2周一次向该患者静脉内施用10mg/kg剂量的同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体，持续至少24周。
在优选的实施例中，每两周例如像以10mg/kg或约10mg/kg的剂量向患者例如静脉内施用同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体。
在本披露的前述方面的另一实施例中，该靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体与至少一种另外的治疗剂组合施用。
在本披露的前述方面中的任一方面的特定的实施例中，该双特异性抗体的第一和第二恒定重链是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，优选IgD、IgE或IgG，如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，优选IgG1。
在本披露的前述方面中的任一方面的另一实施例中，该双特异性抗体的第一和第二恒定重链是IgG1，并且
a.所述第一恒定重链具有产生杵结构的点突变，并且所述第二恒定重链具有产生臼结构的点突变，或
b.所述第一恒定重链具有产生臼结构的点突变，并且所述第二恒定重链具有产生杵结构的点突变，并且任选地
c.所述第一和第二恒定重链具有导致二硫桥的突变。
在第一和第二方面的特别优选的实施例中，该双特异性抗体的第一免疫球蛋白VH1结构域包含：
i.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:76，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:77，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:78；或
ii.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:79，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:80，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:81；并且
所述双特异性抗体的第一免疫球蛋白VL1结构域包含：
iii.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:92，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:93，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:94或
iv.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:95，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:96，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:97；并且
所述双特异性抗体的第二免疫球蛋白VH2结构域包含：
v.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:44，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:45，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:46；或
vi.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:47，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:48，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:49；并且所述双特异性抗体的第二免疫球蛋白VL2结构域包含：
vii.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:60，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:62或
viii.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:63，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:64，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:65。
在本披露的另一优选实施例中，在根据前述方面中任一项所述的方法中使用的抗体包含：
a.氨基酸序列SEQ ID NO:85的第一免疫球蛋白VH1结构域，
b.氨基酸序列SEQ ID NO:101的第一免疫球蛋白VL1结构域，
c.氨基酸序列SEQ ID NO:53的第二免疫球蛋白VH2结构域，以及
d.氨基酸序列SEQ ID NO:69的第二免疫球蛋白VL2结构域。
在本披露的另一优选实施例中，在根据前述方面中任一项所述的方法中使用的抗体包含
e.氨基酸序列SEQ ID NO:87的第一免疫球蛋白重链，
f.氨基酸序列SEQ ID NO:103的第一免疫球蛋白轻链，
g.氨基酸序列SEQ ID NO:55的第二免疫球蛋白重链，以及
h.氨基酸序列SEQ ID NO:71的第二免疫球蛋白轻链。
在本披露的前述方面的另一实施例中，该治疗的受试者具有NLRC4-GOF炎性体病变。在本披露的前述方面的另一实施例中，该治疗的受试者具有NLRC4突变，如NLRC4-GOF突变。在一些情况下，该受试者具有种系NLRC4突变，如种系NLRC4-GOF突变。在一些情况下，该受试者具有遗传性NLRC4突变，如遗传性NLRC4-GOF突变。在一些情况下，该受试者展现出NLRC4突变，如NLRC4-GOF突变的体细胞嵌合。
在一些情况下，与未展现出NLRC4炎性体病变的对照受试者群体相比，需要进行NLCR4炎性体病变治疗的受试者具有过度升高的IL-18、IL-1β水平，或过度升高的IL-18和IL-1β血清水平。在一些情况下，与未展现出NLRC4炎性体病变的对照受试者群体相比，需要进行NLCR4炎性体病变治疗的受试者具有过度升高的IL-18和IL-1β血清水平。在一些情况下，该过度升高的血清IL-18水平是过度升高的总IL-18血清水平。在一些情况下，该过度升高的血清IL-18水平是过度升高的游离IL-18血清水平。在一些情况下，与对照群体相比，该受试者具有高血清C反应蛋白(CRP)水平。在一些情况下，与对照相比，该受试者具有高血清铁蛋白水平。
在优选的实施例中，与未展现出NLRC4炎性体病变的对照受试者群体相比，需要进行NLCR4炎性体病变治疗的受试者具有过度升高的总IL-18血清水平。在一些情况下，该过度升高的总IL-18血清水平是大于1000pg/mL的水平。在一些情况下，该过度升高的总IL-18血清水平是大于5000pg/mL的水平。在一些情况下，该过度升高的总IL-18血清水平是大于10,000pg/mL的水平。在一些情况下，该过度升高的总IL-18血清水平是在约1000pg/mL与约20000pg/mL之间的水平。在一些情况下，该过度升高的总IL-18血清水平是在约5000pg/mL与约20000pg/mL之间的水平。在一些情况下，该过度升高的总IL-18血清水平是在约10000pg/mL与约20000pg/mL之间的水平。在一些情况下，该过度升高的总IL-18血清水平是在约1000pg/mL与约25000pg/mL之间的水平。在一些情况下，该过度升高的总IL-18血清水平是在约5000pg/mL与约25000pg/mL之间的水平。在一些情况下，该过度升高的总IL-18血清水平是在约10000pg/mL与约25000pg/mL之间的水平。
在一些情况下，与未展现出NLRC4炎性体病变的对照受试者群体相比，需要进行NLCR4炎性体病变治疗的受试者具有过度升高的游离IL-18血清水平。在一些情况下，该过度升高的游离IL-18血清水平是大于5000pg/mL的水平。
在一些情况下，该过度升高的血清IL-1β水平是大于5pg/mL的水平。在一些情况下，该过度升高的血清IL-1β水平是大于10pg/mL的水平。在一些情况下，该过度升高的血清IL-1β水平是在约5pg/mL与约25pg/mL之间的水平。在一些情况下，该过度升高的血清IL-1β水平是在约10pg/mL与约25pg/mL之间的水平。
在一些情况下，该需要进行NLCR4炎性体病变治疗的受试者年龄在17岁以下并且重量至少3kg。在一些情况下，该需要进行NLCR4炎性体病变治疗的受试者年龄在10岁以下并且重量至少3kg。在一些情况下，该需要进行NLCR4炎性体病变治疗的受试者年龄在5岁以下并且重量至少3kg。在一些情况下，该需要进行NLCR4炎性体病变治疗的受试者是重量至少3kg的婴儿并且其中该受试者具有婴儿小肠结肠炎和过度升高的总IL-18血清水平两者。在一些情况下，该需要进行NLCR4炎性体病变治疗的受试者是重量至少3kg的婴儿并且其中该受试者具有婴儿小肠结肠炎和过度升高的游离IL-18血清水平两者。
在本披露的前述方面的特别优选的实施例中，该治疗的受试者具有AIFEC。在进一步优选的实施例中，该治疗的受试者具有AIFEC和过度升高的总IL-18血清水平。在另一实施例中，该治疗的受试者具有AIFEC和过度升高的游离IL-18血清水平。
在本披露的前述方面的特别优选的实施例中，该治疗的受试者的NLRC4基因包含选自由以下组成的组的一个或多个点突变：S171F、T177A、I343N、T337S/N、V341A、H443P、S445P、W665C。在一个实施例中，包含在该治疗的受试者的NLRC4基因中的点突变是S171F。在一个实施例中，包含在该治疗的受试者的NLRC4基因中的点突变是T177A。在一个实施例中，包含在该治疗的受试者的NLRC4基因中的点突变是I343N。在一个实施例中，包含在该治疗的受试者的NLRC4基因中的点突变是T337S/N。在一个实施例中，包含在该治疗的受试者的NLRC4基因中的点突变是V341A。在一个实施例中，包含在该治疗的受试者的NLRC4基因中的点突变是H443P。在一个实施例中，包含在该治疗的受试者的NLRC4基因中的点突变是S445P。在一个实施例中，包含在该治疗的受试者的NLRC4基因中的点突变是W665C。
在一个实施例中，该需要进行NLCR4炎性体病变治疗的受试者具有高于20mg/L的血清C反应蛋白(CRP)水平。在另一实施例中，该需要进行NLCR4炎性体病变治疗的受试者具有高于600μg/L的血清铁蛋白水平。在进一步优选的实施例中，该需要进行NLCR4炎性体病变治疗的受试者具有高于20mg/L的血清CRP水平和高于600μg/L的血清铁蛋白水平。
在前述方面的一个实施例中，与护理标准治疗相比，用该靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体进行的治疗延长了患者的寿命。在另一实施例中，在14天的治疗后，与护理标准(SoC)相比，用该靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体进行的治疗降低了血清CRP和/或血清铁蛋白水平。在另一实施例中，在28天的治疗后，与护理标准(SoC)相比，用该靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体进行的治疗降低了血清CRP和/或血清铁蛋白水平。
在另一实施例中，在7天的治疗后，与护理标准相比，用该靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体进行的治疗降低了患者的血清CRP水平。在另一实施例中，在14天的治疗后，与护理标准相比，用该靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体进行的治疗降低了患者的血清CRP水平。在另一实施例中，在28天的治疗后，与护理标准相比，用该靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体进行的治疗降低了患者的血清CRP水平。在另一实施例中，在7天的治疗后，与护理标准相比，用该靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体进行的治疗降低了患者的血清铁蛋白水平。在另一实施例中，在14天的治疗后，与护理标准相比，用该靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体进行的治疗降低了患者的血清铁蛋白水平。在另一实施例中，在28天的治疗后，与护理标准相比，用该靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体进行的治疗降低了患者的血清铁蛋白水平。
在一个实施例中，本文提供了在有需要的受试者中降低血清C反应蛋白(CRP)水平的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体，例如bbmAb1。在一个实施例中，本文提供了靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体，例如bbmAb1，用于在具有NLRC4炎性体病变的受试者中降低血清C反应蛋白(CRP)水平。在一些实施例中，本文提供了靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如bbmAb1)用于制造药物的用途，该药物用于在具有NLRC4炎性体病变的受试者中降低血清C反应蛋白(CRP)水平。在一些实施例中，该受试者的血清CRP水平降低至少1mg/l、至少2mg/l、至少3mg/l、至少4mg/l或至少5mg/l。在一些实施例中，与未接受相同治疗的患者(例如，已接受护理标准(SOC)的患者)相比，具有NLRC4炎性体病变并已接受靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如bbmAb1)的受试者的血清CRP水平较基线降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％。在一些实施例中，血清CRP水平的降低发生在施用靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如bbmAb1)后2天、3天、4天、5天、6天或7天后。在一些实施例中，血清CRP水平的降低发生在施用靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如bbmAb1)后14天、或28天后。
在一个实施例中，本文提供了在具有NLRC4炎性体病变的受试者中降低铁蛋白水平的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体，例如bbmAb1。在一个实施例中，本文提供了靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体，例如bbmAb1，用于在具有NLRC4炎性体病变的受试者中降低血清铁蛋白水平。在一些实施例中，本文提供了靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如bbmAb1)用于制造药物的用途，该药物用于在具有NLRC4炎性体病变的受试者中降低血清铁蛋白水平。在一些实施例中，该受试者的血清铁蛋白水平降低至少100ng/l、至少200ng/l、至少300ng/l、至少400ng/l或至少500ng/l。在一些实施例中，与未接受相同治疗的患者(例如，已接受护理标准(SOC)的患者)相比，已接受靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如bbmAb1)的受试者的血清铁蛋白水平较基线降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％。在一些实施例中，血清铁蛋白水平的降低发生在施用靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如bbmAb1)后2天、3天、4天、5天、6天或7天后。在一些实施例中，血清铁蛋白水平的降低发生在施用靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如bbmAb1)后14天或28天后。
在一个实施例中，本文提供了在具有NLRC4炎性体病变的受试者中降低选自由CXCL9、CXCL10(IP-10)、IL-6、和sIL2R组成的组的生物标志物的血清水平的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体，例如bbmAb1。在一个实施例中，本文提供了靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体，例如bbmAb1，用于在具有NLRC4炎性体病变的受试者中降低选自由CXCL9、CXCL10(IP-10)、IL-6、和sIL2R组成的组的生物标志物的血清水平。在一些实施例中，本文提供了靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如bbmAb1)用于制造药物的用途，该药物用于在具有NLRC4炎性体病变的受试者中降低选自由CXCL9、CXCL10(IP-10)、IL-6、和sIL2R组成的组的生物标志物的血清水平。在一些实施例中，与未接受相同治疗的患者(例如，已接受护理标准(SOC)的患者)相比，已接受靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如bbmAb1)的受试者的选自由CXCL9、CXCL10(IP-10)、IL-6、和sIL2R组成的组的生物标志物的血清水平较基线降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、或至少50％。在一些实施例中，选自由CXCL9、CXCL10(IP-10)、IL-6、和sIL2R组成的组的生物标志物的血清水平的降低发生在施用靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如bbmAb1)后2天、3天、4天、5天、6天或7天后。
在本披露的第八方面，提供了用于在具有NLRC4炎性体病变的受试者中预防或减少发热的发生或严重程度的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体，例如bbmAb1。在一个实施例中，本文提供了靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体，例如bbmAb1，用于在具有NLRC4炎性体病变的受试者中预防或减少发热的发生或严重程度。在一些实施例中，本文提供了靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如bbmAb1)用于制造药物的用途，该药物用于在具有NLRC4炎性体病变的受试者中预防或减少发热的发生或严重程度。
在本披露的第九方面，提供了用于在具有NLRC4炎性体病变的受试者中预防或减少腹泻的发生或严重程度的方法，该方法包括向所述受试者施用治疗有效量的靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体，例如bbmAb1。在一个实施例中，本文提供了靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体，例如bbmAb1，用于在具有NLRC4炎性体病变的受试者中预防或减少腹泻的发生或严重程度。在一些实施例中，本文提供了靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如bbmAb1)用于制造药物的用途，该药物用于在具有NLRC4炎性体病变的受试者中预防或减少腹泻的发生或严重程度。
前述方面的各种实施例可在有需要的受试者中与NLCR4炎性体病变的其他治疗有益地组合。例如，此类疗法可以是针对正在治疗的疾病、障碍、病症、或综合征的任何已知疗法。作为一组非限制性实例，该至少一种另外的治疗剂可选自由以下组成的列表：非甾体抗炎药、环孢素、糖皮质激素、IL-18结合蛋白(IL-18BP)、及其组合。
在一些情况下，用本文所述的双特异性抗体进行的治疗减少或消除治疗受试者所需的糖皮质激素的维持剂量。在一些情况下，该治疗包括施用本文所述的双特异性抗体并停止糖皮质激素的剂量。在一些情况下，该治疗包括施用本文所述的双特异性抗体并停止环孢素的剂量。
在一些情况下，该治疗包括施用本文所述的双特异性抗体并逐渐减少另外的治疗剂的剂量。在一些情况下，该治疗包括施用本文所述的双特异性抗体并逐渐减少糖皮质激素的剂量。在一些实施例中，该治疗包括在施用糖皮质激素和双特异性抗体的受试者中减少、逐渐减少、或停止糖皮质激素的施用。在一些情况下，该治疗包括将剂量减少或逐渐减少至小于或等于相当于0.2mg/kg/天剂量的泼尼松(prednisone)的剂量。在一些情况下，该治疗包括将剂量减少或逐渐减少至小于或等于0.2mg/kg/天泼尼松的剂量。在一些情况下，在逐渐减少至相当于0.2mg/kg/天剂量的泼尼松的剂量后，施用该治疗的受试者维持对双特异性抗体的至少部分或完全应答持续至少2周。在一些实施例中，该治疗包括在施用双特异性抗体、糖皮质激素、和环孢素的受试者中减少、逐渐减少、或停止糖皮质激素的施用并停止环孢素。
在一些实施例中，该有需要的受试者已经或正在施用环孢素、抗TNFα、皮质类固醇、抗IFNγ、抗IL-1β或抗IL-18疗法、或其组合。在一些实施例中，该有需要的受试者未通过施用环孢素、抗TNFα、皮质类固醇、抗IFNγ、抗IL-1β或抗IL-18疗法、或其组合实现对NLRC4-GOF炎性体病变的充分控制。在一些实施例中，该有需要的受试者的NLRC4-GOF炎性体病变对环孢素、抗TNFα、皮质类固醇、抗IFNγ、抗IL-1β或抗IL-18疗法、或其组合具有抗性。在一些情况下，该NLRC4-GOF炎性体病变对环孢素、抗TNFα、皮质类固醇、抗IFNγ、抗IL-1β或抗IL-18疗法、或其组合无应答。在一些情况下，抗性和/或不充分的控制通过未能达到如本文所述小于2的PPGA评分来指示。在一些情况下，抗性和/或不充分的控制通过未能达到如本文所述小于1的PPGA评分来指示。在一些情况下，无应答通过未能减少如本文所述的PPGA评分来指示。
在一些实施例中，在治疗7或14或21或29天后，与护理标准(SoC)相比，该治疗减少或预防有需要的受试者的疾病发作的发生。在一些实施例中，减少或预防受试者的疾病发作的发生是减少或预防至少约一周、两周、或三周、或约四周。
在一些实施例中，该治疗减少或预防受试者的一个或多个MAS特征的发生，其中这些MAS特征选自由发热、皮疹、心动过速、血细胞减少、肝功能障碍和凝血病组成的组。在一些情况下，该治疗减少或预防受试者的小肠结肠炎。在一些情况下，该治疗减少或预防受试者的重度难治性新生儿腹泻。在一些情况下，该治疗逆转患者的胃肠道病理。
在一些实施例中，该治疗增加了患者首次发作的时间，例如，增加约(或至少约)一周、一个月、两个月、三个月、六个月、或一年。在一些实施例中，该治疗进一步包括诱导患者的血清学缓解。血清学缓解可以通过充分抑制血清IL-18至不可检测的水平或至健康个体中发现的水平(例如，低于500pg/mL、低于1000pg/mL、或低于5000pg/mL)来指示。
在一些实施例中，该患者具有在NLRC4基因的核苷酸结合结构域或翼状螺旋结构域中的NLRC4-GOF突变。在一些实施例中，该患者具有在NLRC4基因的氨基酸443或445处的NLRC4-GOF突变。在一些实施例中，该患者具有选自由NLRC4基因的H443P和S445P组成的组的NLRC4-GOF突变。
在一些实施例中，该患者是新生儿。在一些实施例中，该患者是儿童患者(<18岁)。在一些实施例中，该患者小于1岁。在一些实施例中，该患者在1周与1岁之间。在一些实施例中，该患者在一个月与1岁之间。在一些实施例中，该患者为至少一周。在一些实施例中，该患者为至少一个月。
附图说明
图1是NLRC4蛋白的功能结构域的示意图。翼状螺旋结构域(WHD)中的H443P和S445P突变在临床上与主要的皮肤表型相关。体细胞突变导致的T177A变体呈现出与NOMID类似的临床表型。发生在核苷酸结合结构域(NBD)和相邻螺旋结构域1(HD1)的NLRC4-GOF突变可在生命早期呈现出突出的危及生命的胃肠道表型(从(Romberg等人2017)修改)。
图2是用靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如，bbmAb1)治疗NLCR4-GOF炎性体病变的临床研究的治疗方案的示意图。A：总体研究设计。B：研究设计第1阶段。C：研究设计第2阶段。D.研究设计第3阶段。
图3描绘了如所预测的(线)和如所测量的(数据点)，来自首次人类健康志愿者研究的bbmAb1血清浓度随时间变化的曲线。
图4描绘了相对于重组IL-18BP和卡那吉努单抗治疗(灰色阴影)，以10mg/kg i.v.施用靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如，bbmAb1)后预测的游离IL-18和IL-1β浓度。虚线是指定量下限(LLOQ)。
具体实施方式
已经描述了NLRC4种系新发和遗传突变(p.S171F、p.T337S、p.T337S、PT337N、pV341A)-2014年，美国的两个独立临床研究团队在两个不相关的家族中对NLRC4-GOF突变患者进行了基因分型和临床表型分型。尽管临床表现几乎相同(MAS和婴儿小肠结肠炎)，在相同的HD1结构域中发现功能性突变，并有IL-1β和IL-18两者过度升高的细胞因子谱的证据，但一组将该疾病称为NLRC4 GOF，而另一组则将其称为与NLRC4突变相关的小肠结肠炎和自身炎症综合征(SCAN4)，后来命名为AIFEC(OMIM，#616050，*606831)。如本文所用，将使用统称NLRC4-GOF炎性体病变，因其最能反映疾病的潜在病因。
NLRC4-GOF炎性体病变的特征在于极早发型小肠结肠炎、短暂性斑丘疹和荨麻疹性皮疹、MAS和最常见的儿童期过早死亡。受影响的个体可具有明显升高的IL-1β和IL-18水平，效应细胞因子驱动MAS特征(发热、皮疹、心动过速、血细胞减少、肝功能障碍和凝血病)和以重度难治性新生儿腹泻为特征的小肠结肠炎的快速早期发展，该新生儿腹泻将NLRC4-GOF与其他NLRC4临床表型区分开来。在皮肤中，斑丘疹和荨麻疹性皮疹与皮肤活检中的淋巴组织细胞浸润有关，这个相对不寻常的发现在临床上可以提供快速的诊断信息。通过临床特征、炎症标志物(如升高的血清IL-18浓度、铁蛋白和C反应蛋白(CRP))、和诊断性基因测序的组合，现在可以快速诊断NLRC4-GOF病例(Romberg等人2017)。
在受试者(例如，婴儿)中，假设MAS样特征和小肠结肠炎的早期治疗可以预防疾病进展至通常导致致命结果的不可逆终末器官损伤(Romberg等人2014，Moghaddas等人2018)。在危重儿童群体中，发现该疾病对组合或单独的环孢素、抗TNFα治疗、全身性糖皮质激素和抗IL-1β疗法具有抗性。自2014年以来，文献已报告了全球约40名患者具有NLRC4炎性体病变以及在NLRC4基因中确认的突变。其中，八名患者具有NLRC4-GOF炎性体病变临床表型，有极早发型婴儿小肠结肠炎伴严重腹泻、短暂性斑丘疹和荨麻疹性皮疹、发热、血细胞减少、肝功能障碍和凝血病。大多数病例(8例中有6例)在2岁以下(年龄从出生后第一周至18个月)呈现。存在与NLRC4 GOF炎性体病变的发展相关的显著死亡率，其中3/5的病例在诊断的数周内具有致死性，或生长和发育不良的发病率(基于可用数据)(Canna等人2014，Romberg等人2014，Baracaglia等人2015，Liang等人2017，Barsalou等人2018，Moghaddas等人2018，Chear等人2020)。已报告单个病例已存活至成年期，即NLRC4 GOF先证者的父亲。该先证者报告为在出生后第23天死亡。患者身材矮小且贫血，并且终生有周期性发热史。在婴儿期，患者因发热、呕吐、非血性腹泻和发育停滞而长期住院，但当时未做出具体诊断(Romberg等人2014)。目前，除了支持性医疗护理和在这种群体中获益有限的免疫抑制外，尚无获批的治疗剂直接并特异性靶向潜在的IL-1β和IL-18驱动的自身炎症性过程以改善NLRC4-GOF炎性体病变儿童患者的总体临床结果。
本文描述了通过向有需要的受试者施用治疗有效量的同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如，bbmAb1)或其功能片段来治疗或预防NLRC4-GOF炎性体病变的方法。因此，在一个方面，提供了预防或治疗AIFEC的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如，bbmAb1)。
本披露涉及用于治疗具有过度升高的IL-1β和/或IL-18的NLRC4-GOF炎性体病变患者的单克隆抗体(bbmAb)或其变体，例如同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如，bbmAb1)。本披露还涉及通过采用同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体治疗NLRC4-GOF炎性体病变的方法、治疗方案、用途、试剂盒和疗法。
数据如本文所述的数据表明，与通过抗IL-1或抗IL-18mAb进行IL-1β或IL-18的单独中和相比，同时中和IL-1β和IL-18的组合可更有力地减弱IFN-γ(和其他促炎性细胞因子)的产生。因此，本披露尤其基于以下出乎意料的发现：与单独的单个IL-1β或IL-18中和相比，同时中和IL-1β和IL-18的某些抗体更有力地减弱IFN-γ(和其他促炎性细胞因子)的产生，诸位发明人认为这是对尤其是具有NLRC4-GOF突变的患者的(i)NLRC4炎性体病变或(ii)AIFEC的有效治疗。
此外，诸位发明人假设，与更复杂的研究性组合需要抗IL-1β(卡那吉努单抗每两周一次或阿那白滞素每天一次)和可能的糖皮质激素、环孢素和IL-18BP(每两天一次)相比，用同时中和IL-1β和IL-18的抗体(例如，bbmAb1)进行治疗可以允许NLRC4-GOF炎性体病变患者的给药频率显著降低，每2周施用一次并且用单种药剂治疗。
1.定义
出于解释本说明书的目的，将应用下面的定义，并且在适宜的情况下，以单数形式使用的术语还包括复数形式，并且反之亦然。另外的定义在整个具体实施方式中陈述。所有参考文献、出版物、专利和数据库登录号，包括GenBank和OMIM及其中的内容，均通过引用以全文并入本文，并且用于所有目的。
在治疗NLRC4炎性体病变(例如，NLRC4-GOF炎性体病变)的上下文中，术语“发作”是指：
·如本文所述，在疾病活动度的医师整体评估中，疾病活动度的增加从无或极轻微至大于极轻微；
·在治疗的患者中，血清铁蛋白和/或C反应蛋白(CRP)从归一化水平增加60％，其中归一化水平指示NLRC4炎性体疾病活动度极轻微或不存在(例如，CRP<20mg/L；铁蛋白<600ng/L)；或
·血清铁蛋白水平增加>2500ng/mL和/或CRP升高>20mg/mL。
术语“IL-18”是IL-18多肽、白介素-18多肽、IFN-γ诱导因子或干扰素-γ诱导因子或INF-γ诱导因子的同义词。除非另有说明，否则术语“IL-18”是指人IL-18。IL-18是本领域技术人员众所周知的，并且例如可以从国际公司(/>InternationalCorporation)在产品编号#B001-5下获得。在整个说明书中，术语IL-18可互换地涵盖前-IL-18(成熟的IL-18在蛋白酶切割之前的前体)和成熟的IL-18(在蛋白酶切割后)，除非具体地说明意思是前-或成熟形式。
术语“IL-1β”或“IL-1b”是IL-1β多肽和白介素-1β多肽的同义词。除非另有说明，否则术语“IL-1β”是指人IL-1β。IL-1β是本领域技术人员众所周知的，并且例如可以从义翘神州公司(Sino Biological)在产品编号#10139-HNAE-5下获得。
术语“抗体”是指完整的免疫球蛋白或其功能片段。天然存在的抗体典型地包含四聚体，其通常由至少两条重(H)链和至少两条轻(L)链构成。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区(通常由三个结构域(CH1、CH2和CH3)构成)构成。重链可以属于任何同种型，包括IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4亚型)、IgA(IgA1和IgA2亚型)、IgM和IgE。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为VL)和轻链恒定区(CL)构成。轻链包括κ(kappa)链和λ(lambda)链。重链和轻链可变区通常负责抗原识别，而重链和轻链恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。VH区和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间穿插有称为框架区(FR)的较保守区。每个VH和VL由从氨基末端排到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗原部分”)是指全长抗体或抗体的一个或多个片段，这些片段保留特异性结合至IL-18或IL-1β抗原的能力。已经显示，全长抗体的片段可以执行抗体的抗原结合功能。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，其是包含在铰链区通过二硫桥连接的两个单价Fab片段的片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；dAb片段(Ward等人,(1989)Nature[自然]；341:544-546)，其由VH结构域组成；以及分离的互补决定区(CDR)。
此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法将这两个结构域通过使它们能够形成为单一蛋白链的柔性接头来相连，其中VL区和VH区配对形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426；和Huston等人,(1988)Proc Natl Acad Sc[美国国家科学院院刊]；.85:5879-5883)。此类单链抗体也旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用来筛选这些片段。
在整个说明书中，术语“分离的”意指免疫球蛋白、抗体或多核苷酸(视情况而定)存在于与自然环境中不同的物理环境中。
在整个说明书中，互补决定区(“CDR”)是根据卡巴特(Kabat)定义来定义的，除非指明CDR是根据另一定义来定义的。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任一种来确定，这些方案包括由以下文献描述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest”[具有免疫学重要性的蛋白序列]，第5版,美国国立卫生研究院(National Institutes of Health),公共卫生事业部(Public Health Service),马里兰州贝塞斯达市(Bethesda,MD)(“卡巴特”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB[微生物学和生物技术杂志]273,927-948(“乔西亚(Chothia)”编号方案)和ImMunoGenTics(IMGT)编号(Lefranc,M.-P.,The Immunologist[免疫学者],7,132-136(1999)；Lefranc,M.-P.等人,Dev.Comp.Immunol.[发育免疫学与比较免疫学],27,55-77(2003)(“IMGT”编号方案)。例如，对于经典形式，根据卡巴特，将重链可变结构域(VH)中的CDR氨基酸残基编号为31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并将轻链可变结构域(VL)中的CDR氨基酸残基编号为24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。根据乔西亚，将VH中的CDR氨基酸编号为26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；并将VL中的氨基酸残基编号为26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。通过结合卡巴特和乔西亚的CDR定义，CDR由人VH中的氨基酸残基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的氨基酸残基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)组成。根据IMGT，将VH中的CDR氨基酸残基编号为约26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，并将VL中的CDR氨基酸残基编号为约27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)(根据“卡巴特”编号)。根据IMGT，可以使用程序IMGT/DomainGap Align确定抗体的CDR区。
按照惯例，重链中的CDR区通常称为H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，轻链中的CDR区通常称为L-CDR1、LCDR2和L-CDR3。它们在从氨基末端到羧基末端的方向上顺序编号。
如本文所用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组合物的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
如本文所用，术语“人抗体”旨在包括具有框架区和CDR区二者都衍生自人来源的序列的可变区的抗体。此外，如果抗体含有恒定区，则恒定区也衍生自此类人序列，例如人种系序列，或人种系序列的突变形式或含有衍生自人框架序列分析的共有框架序列的抗体，例如，如Knappik等人,(2000),J Mol Biol[分子生物学杂志]；296:57-86所述。
本发明的人抗体可以包括不是由人序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机诱变或位点特异性诱变或通过在体内体细胞突变来引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括衍生自另一种哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已经移植到人框架序列上的抗体。
术语“人单克隆抗体”是指具有可变区的展现出单一结合特异性的抗体，其中框架区和CDR区两者均衍生自人序列。
如本文所用的术语“重组人抗体”包括通过重组方式制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如从动物(例如，小鼠)(该动物对于人免疫球蛋白基因是转基因的或转染色体的)或由其制备的杂交瘤中分离的抗体，从转化以表达人抗体的宿主细胞中(例如，从转染瘤中)分离的抗体，从重组组合的人抗体文库中分离的抗体，以及通过任何其他方式(其涉及全部或部分的人免疫球蛋白基因的剪接)制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有可变区，其中框架区和CDR区两者均衍生自人种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施例中，可以对此类重组人抗体进行体外诱变(或，当使用转基因人Ig序列的动物时，进行体内体细胞诱变)，并因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是衍生自人种系VH和VL序列的和与其相关的序列，这些序列在体内可能不天然存在于人抗体种系库中。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原有特异性的抗体”在本文中与术语“与抗原特异性结合的抗体”可互换使用。
如本文所用，“特异性结合IL-18”的结合分子旨在指以100nM或更小、10nM或更小、1nM或更小的KD结合人IL-18的结合分子。
如本文所用，“特异性结合IL-1β”的结合分子旨在指以100nM或更小、10nM或更小、1nM或更小的KD结合人IL-1β的结合分子。
如本文所用，术语“拮抗剂”旨在指在活化化合物存在下抑制信号传导活性的结合分子。例如，在IL-18的情况下，IL-18拮抗剂将是在人细胞测定(如IL-18依赖性干扰素-γ(IFN-γ)产生测定)中存在IL-18时在人血细胞中抑制信号传导活性的结合分子。人血细胞中IL-18依赖性IFN-γ产生测定的实例在以下实例中更详细地描述。
术语二价双特异性抗体或多个二价双特异性抗体是指与两个不同靶标(如IL-18和IL-1β)结合的抗体。典型地，该二价双特异性抗体以单价结合每个靶标。
双特异性抗体是“异二聚体”，这意味着一部分来自对第一靶标具有特异性的第一抗体，并且另一部分来自对第二靶标具有特异性的第二抗体。“异二聚化修饰”是对形成异二聚双特异性抗体的抗体的一个或两个部分的修饰，旨在促进这种形成。旨在形成双特异性抗体的两个IgG1部分的Fc结构域的异二聚化修饰的实例是在第一重链中具有大氨基酸(aa)侧链(S354C、T366W)的“杵”和在第二重链中引入了小氨基酸侧链(Y349C、T366S、L368A、Y407V)的“臼”以及在CH3区中连接两条重链的另外的二硫桥(Merchant等人,Nat.Biotechnol.[自然生物技术],16:677-681(1998),第678页,表1)。
如本文所用，术语“KD”旨在指解离常数，其获得自Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)并且表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域中充分确立的方法确定抗体的KD值。用于确定抗体的KD的方法是通过使用表面等离子共振，如系统。
如本文所用，术语“亲和力”是指结合分子和抗原在单个抗原位点处的相互作用强度。
如本文所用，针对抗体的术语“高亲和力”是指针对靶抗原的KD为1nM或更小的抗体。
如本文所用，术语“受试者”包括接受如目前所述的双特异性抗体的任何人受试者。术语受试者可以另外地或可替代地包括呈现例如如上文所定义的NLRC4炎性体病变、NLRC4-GOF炎性体病变、或AIFEC的症状或处于例如如上文所定义的NLRC4炎性体病变、NLRC4-GOF炎性体病变、或AIFEC的风险的任何人受试者。
如本文所用，术语“优化的核苷酸序列”意指核苷酸序列已被改变为使用在产生细胞或生物体(通常为真核细胞，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)的细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或人细胞)中优选的密码子编码氨基酸序列。将优化的核苷酸序列工程化以完全保留最初由起始核苷酸序列编码的氨基酸序列，该起始核苷酸序列也称为“亲本”序列。本文优化的序列已被工程化以具有在CHO哺乳动物细胞中优选的密码子；然而，本文还设想了这些序列在其他真核细胞中的优化表达。
术语“同一性”是指至少两个不同序列之间的相似性。这种同一性可表示为同一性百分比，并通过标准比对算法确定，例如，基本局部比对工具(Basic Local alignmentTool)(BLAST)(Altshul等人,(1990)JMoI Biol[分子生物学杂志]；215:403-410)；Needleman等人,(1970)J MoI Biol[分子生物学杂志]；48:444-453的算法或Meyers等人,(1988)Comput Appl Biosci[生物科学中的计算机应用]；4:11-17的算法)。一组参数可以是具有空位罚分12、空位延伸罚分4、以及移码空位罚分5的Blosum62评分矩阵。两个氨基酸或核苷酸序列之间的同一性百分比也可以使用已并入ALIGN程序(版本2.0)的E.Meyers和W.Miller,(1989)CABIOS[生物科学中的计算机应用]；4(1):1-17的算法，使用PAM 120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4来确定。通常通过比较相似长度的序列来计算同一性百分比。
术语“免疫应答”是指例如上述细胞或肝脏产生的淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，其导致对入侵的病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞(或在自身免疫或病理性炎症的情况下，正常的人细胞或组织)的选择性损害、破坏或从人体中消除。
“信号转导途径”或“信号传导活性”是指通常通过蛋白质-蛋白质相互作用(如生长因子与受体的结合)引起的生物化学因果关系，导致信号从细胞的一部分传递至细胞的另一部分。通常，该传递涉及引起信号转导的系列反应中一种或多种蛋白质上的一个或多个酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸残基的特异性磷酸化。倒数第二个过程典型地包括细胞核事件，导致基因表达发生变化。
在整个说明书中，术语“中和”及其语法变化是指，视情况而定，在结合蛋白或抗体存在下，靶标的生物学活性全部或部分降低。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物。除非特别限定，否则该术语涵盖含有已知的天然核苷酸类似物的核酸，该核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然存在的核苷酸相似的方式进行代谢。除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直向同源物、SNP和互补序列以及明确指明的序列。具体地，简并密码子取代可以通过产生如下序列而获得，在这些序列中，一个或多个所选的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人,Nucleic Acid Res.[核酸研究]19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes[分子与细胞探针]8:91-98(1994))。
“多核苷酸”或“核酸”中的核苷酸可以包含修饰，包括碱基修饰，如溴尿苷和肌苷衍生物；核糖修饰，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、酰基苯胺磷酸酯(phosphoraniladate)和氨基磷酸酯。
术语“载体”意指适合于转化或转染宿主细胞并且含有指导和/或控制(与宿主细胞结合)一个或多个与其可操作地连接的异源编码区的表达的核酸序列的任何分子或实体(例如核酸、质粒、噬菌体或病毒)。
编码结合分子、抗体或其片段的序列的“保守变体”是指包含保守氨基酸修饰的序列。“保守氨基酸修饰”旨在指不显著地影响或改变包含该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。此类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基的家族已在本领域中进行了定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。可以通过本领域中已知的标准技术将修饰引入本发明的结合蛋白中，这些标准技术是如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸取代还可以涵盖典型地通过化学肽合成而非通过生物系统中的合成而并入的非天然存在的氨基酸残基。非天然存在的氨基酸包括但不限于肽模拟物(氨基酸部分的反向或倒向形式)。
术语“表位”是免疫系统(如抗体或其片段)识别的抗原的一部分。在本说明书中，术语“表位”可互换地用于构象表位和线性表位。构象表位由抗原氨基酸序列的不连续部分组成，而线性表位由抗原的氨基酸连续序列形成。
术语“治疗(treat、treating、treatment)”、“预防(prevent、preventing、prevention)”包括治疗性治疗、预防性治疗和应用，其中可降低受试者发展为障碍的风险或其他风险因素。治疗不需要完全治愈障碍，并且涵盖减轻症状或潜在的风险因素。
术语“治疗或预防”包括施用化合物，例如靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如，bbmAb1)，其任选地与至少一种另外的治疗剂组合，以预防或延迟疾病、病症、障碍或综合征(例如，NLRC4炎性体病变、NLRC4-GOF炎性体病变、AIFEC)的症状、并发症或生化指标的发作，减轻症状或停滞或抑制疾病、病症、障碍或综合征的进一步发展。治疗可以是预防性的(以预防或延迟疾病、病症、障碍或综合征的发作，或以防止其临床或亚临床症状的显现)或在疾病、病症、障碍或综合征显现后对症状的治疗性抑制或减轻。
如本文所用，关于疾病、病症、障碍或综合征的术语“预防(prevent、preventing或prevention)”是指对处于发展病症(例如，特定的疾病、病症、障碍或综合征或其临床症状如NLRC4-GOF炎性体病变或AIFEC)风险中的受试者进行预防性治疗，导致该受试者发展病症的可能性降低。
术语“治疗(treat、treating和treatment)”是指治疗性治疗和预防性或预防措施，其中目的是通过减轻或改善至少一个身体参数(包括患者可能无法辨别的那些)来改善疾病、病症、障碍或综合征(即，减缓或停滞或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。术语“治疗(treat、treating或treatment)”也指物理地(例如，稳定可辨别的症状)、生理地(例如，稳定物理参数)或两者调节疾病或障碍和/或预防或延迟疾病或障碍的发生或发展或进展。
例如，“治疗NLRC4-GOF炎性体病变”或“治疗AIFEC”可以指改善、减轻或调节与NLRC4-GOF炎性体病变或AIFEC相关的至少一种症状或病理特征；例如，升高的血清炎症标志物(如血清CRP、血清铁蛋白、血清IL-18、血清总IL-18、血清游离IL-18、血清IL-1β、血清总IL-1β、血清游离IL-1β中的一种或多种)、发热、腹泻、皮疹、心动过速、血细胞减少、肝功能障碍和/或凝血病；例如，可以指减缓进展、减少或终止与NLRC4-GOF炎性体病变或AIFEC相关的至少一种症状或病理特征；例如，升高的血清炎症标志物(如血清CRP、血清铁蛋白、血清IL-18中的一种或多种)、发热、腹泻、皮疹、心动过速、血细胞减少、肝功能障碍和/或凝血病。它还可指预防或延迟一种或多种所述症状，例如，减缓、停止或逆转疾病、病症、障碍或综合征进展的进展以及改善临床结果(例如，预防AIFEC的致死性进展以及改善存活)。
血清中的总IL-18可以通过将抗人IL-18抗体(例如，克隆125-2H，MBL国际公司(MBL International))与Bio-plex COOH磁珠(伯乐公司(Bio-Rad,Inc.))缀合来测量，使用生物素化的抗人IL-18(克隆159-12B，MBL公司)进行检测，并使用第II组细胞因子标准曲线(伯乐公司)中含有的IL-18计算浓度。游离IL-18可如Girard等人Rheumatology[风湿病学](牛津).2016年12月；55(12):2237-2247所述进行测量。
血清IL-1β可以使用可商购的ELISA试剂盒(88-7261-88，电子生物科学公司(eBioscience))(按照制造商的说明使用)进行测量。
在一些实施例中，与未接受相同治疗的患者(例如已接受护理标准(SOC)的患者)相比，通过施用同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体或其功能片段而导致的一个或多个升高的血清炎症标志物的降低可以是较基线降低至少10％。在一些实施例中，与未接受相同治疗的患者(例如已接受护理标准(SOC)的患者)相比，通过施用同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体或其功能片段而导致的一个或多个升高的血清炎症标志物的降低可以是较基线降低至少20％。在一些实施例中，与未接受相同治疗的患者(例如已接受护理标准(SOC)的患者)相比，通过施用同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体或其功能片段而导致的一个或多个升高的血清炎症标志物的降低可以是较基线降低至少30％。在一些实施例中，与未接受相同治疗的患者(例如已接受护理标准(SOC)的患者)相比，通过施用同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体或其功能片段而导致的一个或多个升高的血清炎症标志物的降低可以是较基线降低至少40％。在一些实施例中，与未接受相同治疗的患者(例如已接受护理标准(SOC)的患者)相比，通过施用同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体或其功能片段而导致的一个或多个升高的血清炎症标志物的降低可以是较基线降低至少50％。
作为一个实例，适用于用本文所述的组合物和方法治疗的NLRC4-GOF炎性体病变包括由NLCRC4的核苷酸结合结构域或相邻螺旋结构域1中的突变引起或与之相关的那些。在一些实施例中，适当的受试者或有需要的受试者具有选自由S171F、T177A、T337S、T337N和V341A突变组成的组的NLRC4突变。在一些实施例中，适当的受试者或有需要的受试者具有选自由H443P和S445P突变组成的组的NLRC4突变。
“治疗”还可以指减缓、停止或逆转疾病、病症、障碍或综合征进展以及改善临床结果，例如，在如下5类顺序量表上从较高的数字移动到较低的数字：
等级编号 NLRC4-GOF炎性体病变相关症状的临床状态
0 无
1 极轻微
2 轻度
3 中度
4 重度
如本文所用，术语本文所述的化合物的“治疗有效量”是指将引起受试者生物学或医学应答(例如，改善症状，减轻病症，减缓或延迟疾病进展，或预防疾病、病症、障碍或综合征等)的化合物的量。在一个非限制性实施例中，术语“治疗有效量”是指本文所述的化合物的如下量，当施用至受试者时，该量有效地至少部分减轻、抑制、预防和/或改善NLRC4-GOF炎性体病变。在一个非限制性实施例中，术语“治疗有效量”是指本文所述的化合物的如下量，当施用至受试者时，该量有效地至少部分减轻、抑制、预防和/或改善呈现升高的IL-18和IL-1β水平的NLRC4炎性体病变。在一个非限制性实施例中，术语“治疗有效量”是指本文所述的化合物的如下量，当施用至受试者时，该量有效地至少部分减轻、抑制、预防和/或改善AIFEC。
如本文所用，人抗体或其片段包含作为特定种系序列“的产物”或“衍生自”特定种系序列的重链或轻链可变区或全长重链或轻链，如果该抗体的可变区或全长链是从使用人种系免疫球蛋白基因的系统获得的话。此类系统包括用目的抗原对携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行免疫或用目的抗原筛选展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库。作为人种系免疫球蛋白序列“的产物”或“衍生自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体或其片段可以通过以下方式来照此鉴定：比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列，并且选择序列中与人抗体的序列最接近(即，最高同一性％)的人种系免疫球蛋白序列。作为特定人种系免疫球蛋白序列“的产物”或“衍生自”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体可以由于例如天然存在的体细胞突变或有意引入定点突变而含有与种系序列相比的氨基酸差异。然而，所选人抗体的氨基酸序列典型地与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90％相同，并且含有在与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠类种系序列)相比时将该人抗体鉴定为属于人的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体的氨基酸序列可以与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少60％、70％、80％、90％或至少95％或甚至至少96％、97％、98％或99％相同。典型地，衍生自特定人种系序列的人抗体将展示与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列的不超过10个氨基酸的差异。在某些情况下，人抗体可以展示与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列的不超过5个或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸的差异。
人抗体可以通过本领域技术人员已知的许多方法产生。人抗体可以通过杂交瘤方法使用人骨髓瘤或小鼠-人异种骨髓瘤细胞系制备(Kozbor,J Immunol[免疫学杂志]；(1984)133:3001；Brodeur,Monoclonal Isolated Antibody Production Techniques andApplications[单克隆分离抗体生产技术及应用],第51-63页,马塞尔·德克尔公司(Marcel Dekker Inc),1987)。可替代的方法包括使用噬菌体文库或转基因小鼠，两者均使用人可变区库(Winter G；(1994)Annu Rev Immunol[免疫学年度评论]12:433-455，GreenLL,(1999)J Immunol Methods[免疫学方法杂志]231:11-23)。
现在可获得若干个转基因小鼠品系，其中它们的小鼠免疫球蛋白基因座已被人免疫球蛋白基因区段置换(Tomizuka K,(2000)Proc Natl Acad Sci[美国国家科学院院刊],97:722-727；Fishwild DM(1996)Nature Biotechnol[自然生物技术]14:845-851；MendezMJ,(1997)Nature Genetics[自然遗传学]15:146-156)。在抗原激发后，此类小鼠能够产生人抗体库，可以从中选择目的抗体。特别值得注意的是TrimeraTM系统(Eren R等人,(1988)Immunology[免疫学]93:154-161)，其中将人淋巴细胞移植到了受辐照的小鼠中；选择性淋巴细胞分离抗体系统(SLAM，Babcook等人,Proc Natl Acad Sci[美国国家科学院院刊](1996)93:7843-7848)，其中有效地使人(或其他物种)淋巴细胞通过大量汇集的体外分离抗体生成程序，然后进行解卷积，有限稀释和选择程序以及XenomouseTM(Abgenix公司)。可从Morphotek公司使用MorphodomaTM技术获得可替代的方法。
噬菌体展示技术可用于产生人抗体及其片段(McCafferty；(1990)Nature[自然],348:552-553和Griffiths AD等人(1994)EMBO[欧洲分子生物学学会杂志]13:3245-3260)。根据该技术，将分离的抗体可变结构域基因框内克隆到丝状噬菌体(如M13或fd)的蛋白基因的主要或次要外壳中，并作为功能分离的抗体片段展示(通常在辅助噬菌体的帮助下)在噬菌体颗粒的表面。基于分离的抗体的功能特性的选择导致选择编码表现出这些特性的分离的抗体的基因。噬菌体展示技术可用于从人B细胞制备的文库中选择抗原特异性抗体，该人B细胞取自患有疾病或障碍的个体，或者可替代地取自未免疫的人供体(Marks；J MolBio[分子生物学杂志](1991)222:581-591)。当需要包含Fc结构域的完整的人分离的抗体时，必须将噬菌体展示的衍生片段重新克隆到包含所需恒定区并建立稳定表达细胞系的哺乳动物表达载体中。
亲和力成熟的技术(Marks；Biotechnol[生物技术](1992)10:779-783)可用于提供结合亲和力，其中通过用天然存在的变体顺序地置换H和L链可变区并在改善的结合亲和力的基础上进行选择来改善初级人分离抗体的亲和力。现在也提供了这种技术的变体，如“表位压印”(WO 93/06213；Waterhouse；Nucl Acids Res[核酸研究](1993)21:2265-2266)。
当在纯化的双特异性抗体的上下文中使用时，术语“纯”涉及不同的双特异性抗体组合和构建体在所选细胞中在其中细胞表达双特异性抗体的条件下共表达后和使用完整的UPLC-MS质量筛选方法的蛋白A纯化之后的纯度和同一性。纯或纯度是指形成的异二聚体和同二聚体bbmAb的相对定量。使用本发明的方法，可以观察到正确形成的异二聚体bbmAb1和bbmAb2，基于完整的质量信号强度，其相对纯度超过85％。
2.IL-18抗体
在披露的方法中使用的特别优选的IL-18抗体或其抗原结合片段是人抗体。
为便于参考，下表1中提供了基于卡巴特定义和乔西亚定义的特异性IL-18抗体(称为mAb1)高变区的、以及VL和VH结构域以及完整的重链和轻链的氨基酸序列。
表1.mAb1的高变区(CDR)、可变结构域(VH和VL)和全链的氨基酸序列。编码mAb1的VL的DNA列出在SEQ ID NO:18中。编码mAb1的VH的DNA列出在SEQ ID NO:8中。
在一个实施例中，该IL-18抗体或其抗原结合片段包含至少一个含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变结构域(VH)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:1，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:2，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:3。在一个实施例中，该IL-18抗体或其抗原结合片段包含至少一个含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变结构域(VH)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:4，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:5，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:6。
在一个实施例中，该IL-18抗体或其抗原结合片段包含至少一个含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:11，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:12并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:13。在一个实施例中，该IL-18抗体或其抗原结合片段包含至少一个含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:14，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:15并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:16。
在一个实施例中，该IL-18抗体或其抗原结合片段包含至少一个免疫球蛋白VH结构域和至少一个免疫球蛋白VL结构域，其中：a)该免疫球蛋白VH结构域包含(例如依次)：i)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:1，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:2，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:3；或ii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:4，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:5，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:6；并且b)该免疫球蛋白VL结构域包含(例如依次)：i)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:11，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:12，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:13或ii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:14，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:15，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:16。
在一个实施例中，该IL-18抗体或其抗原结合片段包含：a)包含SEQ ID NO:7中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变结构域(VH)；b)包含SEQ ID NO:17中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)；c)包含SEQ ID NO:7中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和包含SEQ ID NO:17中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域；d)包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中所列出的高变区的免疫球蛋白VH结构域；e)包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13中所列出的高变区的免疫球蛋白VL结构域；f)包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中所列出的高变区的免疫球蛋白VH结构域；g)包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16中所列出的高变区的免疫球蛋白VL结构域；h)包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中所列出的高变区的免疫球蛋白VH结构域以及包含SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13中所列出的高变区的免疫球蛋白VL结构域；i)包含SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中所列出的高变区的免疫球蛋白VH结构域以及包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16中所列出的高变区的免疫球蛋白VL结构域；j)包含SEQ ID NO:19的轻链；k)包含SEQ ID NO:9的重链；或l)包含SEQ ID NO:19的轻链和包含SEQ ID NO:9的重链。
在一些实施例中，该IL-18抗体或其抗原结合片段(例如mAb1)包含SEQ ID NO:7的三个CDR。在其他实施例中，该IL-18抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:17的三个CDR。在其他实施例中，该IL-18抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:7的三个CDR和SEQ IDNO:17的三个CDR。在一些实施例中，该IL-18抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:9的三个CDR。在其他实施例中，该IL-18抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:19的三个CDR。在其他实施例中，该IL-18抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:9的三个CDR和SEQ ID NO:19的三个CDR。
在一个实施例中，该IL-18抗体或其抗原结合片段(例如mAb1)选自人IL-18抗体，该人IL-18抗体至少包含：a)免疫球蛋白重链或其片段，该免疫球蛋白重链或其片段包含可变结构域以及人重链的恒定部分或其片段，该可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:1，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:2，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:3；和b)免疫球蛋白轻链或其片段，该免疫球蛋白轻链或其片段包含可变结构域以及人轻链的恒定部分或其片段，该可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:11，所述CDR2具有氨基酸序列SEQID NO:12，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:13。
在一个实施例中，该IL-18抗体或其抗原结合片段(例如mAb1)选自人IL-18抗体，该人IL-18抗体至少包含：a)免疫球蛋白重链或其片段，该免疫球蛋白重链或其片段包含可变结构域以及人重链的恒定部分或其片段，该可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:4，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:5，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:6；和b)免疫球蛋白轻链或其片段，该免疫球蛋白轻链或其片段包含可变结构域以及人轻链的恒定部分或其片段，该可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:14，所述CDR2具有氨基酸序列SEQID NO:15，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:16。
在一个实施例中，该IL-18抗体或其抗原结合片段选自包含抗原结合位点的单链抗体或其抗原结合片段，该抗原结合位点包含：a)依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一结构域，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:1，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:2，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:3；和b)依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3的第二结构域，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:11，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:12，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:13；以及c)结合第一结构域的N端末端和第二结构域的C端末端或结合第一结构域的C端末端和第二结构域的N端末端的肽接头。
在一个实施例中，该IL-18抗体或其抗原结合片段(例如mAb1)选自包含抗原结合位点的单链抗体或其抗原结合片段，该抗原结合位点包含：a)依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一结构域，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:4，所述CDR2具有氨基酸序列SEQID NO:5，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:6；和b)依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3的第二结构域，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:14，所述CDR2具有氨基酸序列SEQID NO:15，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:16；以及c)结合第一结构域的N端末端和第二结构域的C端末端或结合第一结构域的C端末端和第二结构域的N端末端的肽接头。
在所披露的方法中使用的IL-18抗体或其抗原结合片段的VH或VL结构域可以具有与在SEQ ID NO:7和17中列出的VH或VL结构域基本上相同的VH和/或VL结构域。本文披露的人IL-18抗体可包含与SEQ ID NO:9所列出的重链基本上相同的重链和/或与SEQ ID NO:19所列出的轻链基本上相同的轻链。本文披露的人IL-18抗体可包含：含有SEQ ID NO:9的重链和含有SEQ ID NO:19的轻链。本文披露的人IL-18抗体可以包含：a)一条重链，其包含具有与SEQ ID NO:7中所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的可变结构域以及人重链的恒定部分；和b)一条轻链，其包含具有与SEQ ID NO:17中所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的可变结构域以及人轻链的恒定部分。
用于披露的方法、试剂盒和方案的其他优选的IL-18拮抗剂(例如抗体)是以下列出的那些：美国专利号：9,376,489，将其通过引用以其整体并入本文。
3.IL-1β抗体
在披露的方法中使用的特别优选的IL-1β抗体或其抗原结合片段是人抗体。
为便于参考，下表2中提供了基于卡巴特定义和乔西亚定义的特异性IL-1β抗体(称为mAb2)高变区的、以及VL和VH结构域以及完整的重链和轻链的氨基酸序列。
表2.mAb2的高变区(CDR)、可变结构域(VH和VL)和全链的氨基酸序列。编码mAb2的VL的DNA列出在SEQ ID NO:38中。编码mAb2的VH的DNA列出在SEQ ID NO:27中。
在一个实施例中，该IL-1β抗体或其抗原结合片段包含至少一个含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变结构域(VH)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:21，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:22，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:23。在一个实施例中，该IL-1β抗体或其抗原结合片段包含至少一个含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白重链可变结构域(VH)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:24，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:25，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:26。
在一个实施例中，该IL-1β抗体或其抗原结合片段包含至少一个含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:31，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:32并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:33。在一个实施例中，该IL-1β抗体或其抗原结合片段包含至少一个含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:34，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:35并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:36。
在一个实施例中，该IL-1β抗体或其抗原结合片段包含至少一个免疫球蛋白VH结构域和至少一个免疫球蛋白VL结构域，其中：a)该免疫球蛋白VH结构域包含(例如依次)：i)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:21，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:22，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:23；或ii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:24，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:25，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:26；并且b)该免疫球蛋白VL结构域包含(例如依次)：i)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:31，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:32，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:33或ii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:34，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ IDNO:35，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:36。
在一个实施例中，该IL-1β抗体或其抗原结合片段包含：a)包含SEQ ID NO:27中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白重链可变结构域(VH)；b)包含SEQ ID NO:37中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链可变结构域(VL)；c)包含SEQ ID NO:27中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白VH结构域和包含SEQ ID NO:37中所列出的氨基酸序列的免疫球蛋白VL结构域；d)包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23中所列出的高变区的免疫球蛋白VH结构域；e)包含SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33中所列出的高变区的免疫球蛋白VL结构域；f)包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26中所列出的高变区的免疫球蛋白VH结构域；g)包含SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36中所列出的高变区的免疫球蛋白VL结构域；h)包含SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23中所列出的高变区的免疫球蛋白VH结构域以及包含SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33中所列出的高变区的免疫球蛋白VL结构域；i)包含SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQID NO:26中所列出的高变区的免疫球蛋白VH结构域以及包含SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36中所列出的高变区的免疫球蛋白VL结构域；j)包含SEQ ID NO:37的轻链；k)包含SEQ ID NO:29的重链；或l)包含SEQ ID NO:39的轻链和包含SEQ ID NO:29的重链。
在一些实施例中，该IL-1β抗体或其抗原结合片段(例如mAb2)包含SEQ ID NO:37的三个CDR。在其他实施例中，该IL-1β抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:27的三个CDR。在其他实施例中，该IL-1β抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:37的三个CDR和SEQID NO:27的三个CDR。在一些实施例中，该IL-1β抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的三个CDR。在其他实施例中，该IL-1β抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:29的三个CDR。在其他实施例中，该IL-1β抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO:39的三个CDR和SEQID NO:29的三个CDR。
在一个实施例中，该IL-1β抗体或其抗原结合片段(例如mAb2)选自人IL-1β抗体，该人IL-1β抗体至少包含：a)免疫球蛋白重链或其片段，该免疫球蛋白重链或其片段包含可变结构域以及人重链的恒定部分或其片段，该可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:21，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:22，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:23；和b)免疫球蛋白轻链或其片段，该免疫球蛋白轻链或其片段包含可变结构域以及人轻链的恒定部分或其片段，该可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:31，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:32，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:33。
在一个实施例中，该IL-1β抗体或其抗原结合片段(例如mAb2)选自人IL-1β抗体，该人IL-1β抗体至少包含：a)免疫球蛋白重链或其片段，该免疫球蛋白重链或其片段包含可变结构域以及人重链的恒定部分或其片段，该可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:24，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:25，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:26；和b)免疫球蛋白轻链或其片段，该免疫球蛋白轻链或其片段包含可变结构域以及人轻链的恒定部分或其片段，该可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:34，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:35，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:36。
在一个实施例中，该IL-1β抗体或其抗原结合片段选自包含抗原结合位点的单链抗体或其抗原结合片段，该抗原结合位点包含：a)依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一结构域，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:21，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:22，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:23；和b)依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3的第二结构域，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:31，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:32，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:33；以及c)结合第一结构域的N端末端和第二结构域的C端末端或结合第一结构域的C端末端和第二结构域的N端末端的肽接头。
在一个实施例中，该IL-1β抗体或其抗原结合片段(例如mAb2)选自包含抗原结合位点的单链抗体或其抗原结合片段，该抗原结合位点包含：a)依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一结构域，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:24，所述CDR2具有氨基酸序列SEQID NO:25，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:26；和b)依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3的第二结构域，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:34，所述CDR2具有氨基酸序列SEQID NO:35，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:36；以及c)结合第一结构域的N端末端和第二结构域的C端末端或结合第一结构域的C端末端和第二结构域的N端末端的肽接头。
在所披露的方法中使用的IL-1β抗体或其抗原结合片段的VH或VL结构域可以具有与在SEQ ID NO:27和37中列出的VH或VL结构域基本上相同的VH和/或VL结构域。本文披露的人IL-1β抗体可包含与SEQ ID NO:29所列出的重链基本上相同的重链和/或与SEQ ID NO:39所列出的轻链基本上相同的轻链。本文披露的人IL-1β抗体可包含：含有SEQ ID NO:29的重链和含有SEQ ID NO:39的轻链。本文披露的人IL-1β抗体可以包含：a)一条重链，其包含具有与SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的可变结构域以及人重链的恒定部分；和b)一条轻链，其包含具有与SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的可变结构域以及人轻链的恒定部分。
用于披露的方法、试剂盒和方案的其他优选的IL-1β拮抗剂(例如抗体)是以下列出的那些：美国专利号：7,446,175或7,993,878或8,273,350，将其通过引用以其整体并入本文。
4.Fc修饰
除了在框架或CDR区内进行的修饰之外或作为在框架或CDR区内进行的修饰的可替代方案，可以将本发明的抗体工程化以包括Fc区内的修饰，典型地是为了改变抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，本发明的抗体可以被化学修饰(例如，一个或多个化学部分可以附接至抗体)或被修饰以改变其糖基化，从而再次改变抗体的一种或多种功能特性。以下更详细地描述了这些实施例中的每一个。Fc区中的残基编号是Edelman等人,PNAS[美国国家科学院院刊],1969年五月,63(1):78-85的EU编号方案的编号。
在一个实施例中，修饰CH1的铰链区，使得铰链区中半胱氨酸残基的数目改变，例如增加或减少。该方法在Bodmer等人的美国专利号5,677,425中进一步描述。改变CH1铰链区中半胱氨酸残基的数目，以便例如促进轻链和重链的组装或增加或降低抗体的稳定性。
在另一实施例中，使抗体的Fc铰链区突变以缩短抗体的生物半衰期。更具体地，将一个或多个氨基酸突变引入到Fc铰链片段的CH2-CH3结构域界面区中，使得抗体具有相对于天然Fc铰链结构域SpA结合而言受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。该方法在Ward等人的美国专利号6,165,745中进一步详细描述。
在另一实施例中，修饰抗体以增加其生物半衰期。可以采用各种方法。例如，可以引入以下突变中的一种或多种：如在美国专利号6,277,375中由Ward所述的T252L、T254S、T256F。可替代地，为了增加生物半衰期，可以在CH1或CL区内改变抗体，以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如Presta等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。
在又其他实施例中，通过用不同的氨基酸残基置换至少一个氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应子功能。例如，可以用不同的氨基酸残基置换一个或多个氨基酸，使得抗体对效应配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。改变亲和力的效应配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。该方法在Winter等人的美国专利号5,624,821和5,648,260中进一步详细描述。
在另一实施例中，选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸可以用不同的氨基酸残基置换，使得抗体具有改变的C1q结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。该方法在Idusogie等人的美国专利号6,194,551中进一步详细描述。
在另一实施例中，改变一个或多个氨基酸残基，从而改变抗体固定补体的能力。该方法在Bodmer等人的PCT公开WO 94/29351中进一步描述。
在又另一实施例中，修饰Fc区以增加抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或通过修饰一个或多个氨基酸来增加抗体对Fcγ受体的亲和力。该方法由Presta在PCT公开WO 00/42072中进一步描述。此外，已经定位了人IgG1上的FcγRl、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点并且已经描述了具有改良的结合的变体(参见Shields,R.L.等人,(2001)J.Biol Chem[生物化学杂志]276:6591-6604)。
在某些实施例中，使用IgG1同种型的Fc结构域。在一些特定的实施例中，使用了IgG1 Fc片段的突变变体，例如沉默的IgG1 Fc，其可降低或消除融合多肽介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或与Fcγ受体结合的能力。IgG1同种型沉默突变体的实例，其中如Hezareh等人,J.Virol[病毒学杂志](2001)；75(24):12161-8所述，在氨基酸位置234和235处亮氨酸残基被丙氨酸残基置换。
在某些实施例中，Fc结构域是防止Fc结构域的位置297糖基化的突变体。例如，Fc结构域在位置297处含有天冬酰胺残基的氨基酸取代。这种氨基酸取代的实例是用甘氨酸或丙氨酸置换N297。
沉默的效应子功能可以通过抗体Fc区的突变获得，并且在本领域已有描述：LALA和N297A(Strohl,W.,2009,Curr.Opin.Biotechnol.[当前生物技术观点]卷20(6):685-691)；和D265A(Baudino等人,2008,J.Immunol.[免疫学杂志]181:6664-69；Strohl,W.,同上)；以及DAPA(D265A和P329A)(Shields RL.,J Biol Chem.[生物化学杂志]2001；276(9):6591-604；美国专利公开US 2015/0320880)。沉默Fc lgG1抗体的实例包含所谓的LALA突变体，该突变体在lgG1 Fc氨基酸序列中包含L234A和L235A突变。沉默lgG1抗体的另一实例包含D265A突变。沉默lgG1抗体的另一实例是所谓的DAPA突变体，该突变体包含IgG1Fc氨基酸序列中的D265A和P329A突变。另一沉默lgG1抗体包含N297A突变，该突变产生无糖基化/非糖基化的抗体。用于提供沉默的效应子功能的另外的Fc突变描述于PCT公开号WO 2014/145806(例如，在WO 2014/145806的图7中)，将其通过引用以其整体并入本文。来自WO2014/145806的沉默IgG1抗体的一个实例包含E233P、L234V、L235A和S267K突变以及G236的缺失(G236del)。来自WO 2014/145806的沉默IgG1抗体的另一实例包含E233P、L234V和L235A突变，以及G236缺失(G236del)。来自WO 2014/145806的沉默IgG1抗体的另一实例包含S267K突变。
在仍另一实施例中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即，抗体缺乏糖基化)。可以改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。此类糖类修饰可以通过以下方式来完成：例如，改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，这导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点，从而消除该位点的糖基化。这种无糖基化可以增加抗体对于抗原的亲和力。这种方法更详细地描述于Co等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中。
另外地或可替代地，可以制备具有改变的糖基化类型的抗体，如具有减少量的岩藻糖基残基的低岩藻糖基化抗体或具有增加的二等分GlcNac结构的抗体。已经证明此类改变的糖基化模式增加了抗体的ADCC能力。此类糖类修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来完成。具有改变的糖基化机制的细胞已在本领域中描述，并且可用作宿主细胞，在这些宿主细胞中表达本发明的重组抗体，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，Hang等人的EP 1,176,195描述了具有功能破坏的FUT8基因的细胞系，该基因编码岩藻糖基转移酶，使得在这种细胞系中表达的抗体表现出低岩藻糖基化。因此，在一个实施例中，本发明的抗体通过在表现出岩藻糖基化模式的细胞系(例如，编码岩藻糖基转移酶的FUT8基因表达缺陷的哺乳动物细胞系)中的重组表达而产生。Presta在PCT公开WO03/035835中描述了变体CHO细胞系Lecl3细胞，其将岩藻糖附接至Asn(297)连接的糖类的能力降低，还导致在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化(还参见Shields,R.L.等人,2002J.Biol.Chem.[生物化学杂志]277:26733-26740)。Umana等人的PCT公开WO 99/54342描述了如下细胞系，这些细胞系被工程化以表达糖蛋白修饰糖基转移酶(例如，β(1,4)-N乙酰基葡糖胺基转移酶III(GnTIII))，使得在工程化细胞系中表达的抗体显示出增加的二等分GlcNac结构，这些二等分GlcNac结构导致抗体的ADCC活性增加(还参见Umana等人,1999Nat.Biotech.[自然生物技术]17:176-180)。可替代地，本发明的抗体可以在酵母或丝状真菌中产生，该酵母或丝状真菌针对哺乳动物样糖基化模式工程化，并且能够产生缺乏作为糖基化模式的岩藻糖的抗体(参见例如EP 1297172 B1)。
本发明考虑的本文抗体的另一修饰是聚乙二醇化。可以将抗体聚乙二醇化以例如增加抗体的生物学(例如血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，典型地在一个或多个PEG基团附接至该抗体或抗体片段的条件下使该抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应。聚乙二醇化可以通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水可溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已用于衍生其他蛋白质的任何形式的PEG，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施例中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。使蛋白聚乙二醇化的方法是本领域已知的并且可以应用于本发明的抗体。参见例如，Nishimura等人的EP 0 154 316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。
本发明考虑的抗体的另一修饰是至少本发明的抗体的抗原结合区与血清蛋白(如人血清白蛋白或其片段)的缀合物或蛋白融合物以增加所得分子的半衰期。这样的方法例如在Ballance等人EP 0322094中描述。
本发明考虑的抗体的另一修饰是一种或多种修饰，以增加异二聚双特异性抗体的形成。本领域可用的多种方法可用于增强双特异性抗体例如bbmAb的两个重链结构域的二聚化，如例如以下中披露的：EP 1870459A1；美国专利号5,582,996；美国专利号5,731,168；美国专利号5,910,573；美国专利号5,932,448；美国专利号6,833,441；美国专利号7,183,076；美国专利申请公开号2006204493A1；和PCT公开号WO 2009/089004A1，将其内容以其整体并入本文。
例如，在PCT公开号WO 1996/027011、Ridgway等人,(1996)和Merchant等人(1998)中披露了使用杵臼结构产生双特异性抗体。
在实施本披露的一些治疗方法或用途时，必须向有需要的受试者施用治疗有效量的同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体，例如bbmAb1。应当理解，方案改变可适用于某些患者。因此，施用(例如bbmAb1)可以更频繁，例如每日一次、每两周一次给药或每周一次给药。
一些患者可以受益于负荷方案(例如，每日一次施用持续数天[例如1至4天，例如在第0天、第1天、第2天和/或第3天给药])然后是维持方案，例如在第3周或第4周开始，其中bbmAb1可以每周、每两周或每4周一次施用持续数周。在一些实施例中，施用同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如bbmAb1)的时间段持续1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天。在一些实施例中，施用同时靶向IL-1β和IL-18两者的双特异性抗体(例如bbmAb1)的时间段持续8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、或更长。
应当理解，基于疾病的严重程度，剂量递增可适用于某些患者(例如患者)，例如对用bbmAb1进行的治疗应答不充分的患者。因此，剂量(静脉内(i.v.))可大于约10mg/kg，例如约11mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg等。此外，皮下(s.c.)剂量(负荷剂量或维持剂量)可大于约50mg至约900mg s.c.，例如约75mg、约100mg、约125mg、约175mg、约200mg、约250mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约600mg等；
还应当理解，剂量降低还可适用于某些患者(如患者)，例如对用bbmAb1进行的治疗展示不良事件或不良应答的患者。因此，剂量可以低于约10mg/kg，例如约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg、约7mg/kg、约8mg/kg或约9mg/kg。在一些实施例中，bbmAB1剂量可以如由医师确定的进行调整。
在一些实施例中，该bbmAB1抗体可以i.v.递送的10mg/kg的单次剂量向该患者施用，其中如果需要，该剂量可以如由医师确定的调整至更高或更低的剂量，例如，约1mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约4mg/kg、约5mg/kg、约6mg/kg，约7mg/kg、约8mg/kg或约9mg/kg或例如约11mg/kg、12mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg等。
在一些实施例中，该bbmAB1抗体可以i.v.递送的10mg/kg的初始剂量向该患者施用，并且如果需要，则该剂量可以如由医师确定的调整至更高或更低的剂量。
在特定的实施例中，在第1天施用10mg/kg的bbmAB1。
在特定的实施例中，在第1天(D1)和在第2天(D2)、D3、D4、D5、D6、D7、D8、D9、D10、D11、D12、D13和/或D14施用10mg/kg bbmAB1
在另一特定的实施例中，在第1天i.v.施用10mg/kg的bbmAB1。
实例1：
bbmAb1的产生已在专利申请WO/2018/229612的实例1至5中详细描述。WO/2018/229612的实例1包括(1)载体构建、(2)宿主细胞系和转染、(3)细胞选择和分选、(4)细胞扩增、(5)克隆稳定性、(6)制造、(7)分析性表征和纯度评估、(8)分析结果，通过引用以其整体并入本文。
bbmAb1是双特异性IgG1，具有LALA沉默突变，同时与两个不同的靶标IL-1β和IL-18结合。该抗体结合两个不同的抗原结合臂(Fab片段)，而针对IL-1β的Fab基于mAb2，并包含κ轻链(Vk6)。针对IL-18的Fab基于mAb1，并由λ轻链(Vλ1)构成。为了在表达过程中驱动Fc结构域的异二聚化，在mAb1重链中带有大氨基酸(aa)侧链(S354C和T366W)的“杵”和带有小aa侧链(Y349C、T366S、L368A、Y407V)的“臼”被引入mAb2重链。
为便于参考，下表3中提供了基于卡巴特定义和乔西亚定义的bbmAb1高变区的、以及VL和VH结构域以及完整的重链和轻链的氨基酸序列。
表3.bbmAb1的高变区(CDR)、可变结构域(VH和VL)和全链的氨基酸序列。编码第一VL的DNA在SEQ ID NO:102中列出，编码第二VL的DNA在SEQ ID NO:70中列出。编码第一VH的DNA在SEQ ID NO:86中列出，编码第二VH的DNA在SEQ ID NO:54中列出。
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在一个实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一免疫球蛋白重链可变结构域(VH1)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:76，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:77，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:78。在一个实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一免疫球蛋白重链可变结构域(VH1)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:79，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:80，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:81。在一个实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一免疫球蛋白重链可变结构域(VH1)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:82，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ IDNO:83，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:84。
在一个实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第二免疫球蛋白重链可变结构域(VH2)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:44，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:45，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:46。在一个实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第二免疫球蛋白重链可变结构域(VH2)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:47，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:48，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:49。在一个实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第二免疫球蛋白重链可变结构域(VH2)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:50，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ IDNO:51，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:52。
在一个实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一免疫球蛋白轻链可变结构域(VL1)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:92，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:93，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:94。在一个实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一免疫球蛋白轻链可变结构域(VL1)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:95，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:96，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:97。在一个实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第一免疫球蛋白轻链可变结构域(VL1)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:98，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ IDNO:99，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:100。
在一个实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第二免疫球蛋白轻链可变结构域(VL2)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:60，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:62。在一个实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第二免疫球蛋白轻链可变结构域(VL2)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:63，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:64，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:65。在一个实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含含有高变区CDR1、CDR2和CDR3的第二免疫球蛋白轻链可变结构域(VL2)，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:66，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ IDNO:67，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:68。
在一个实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含第一免疫球蛋白VH1结构域和第一免疫球蛋白VL1结构域，其中：a)该第一免疫球蛋白VH1结构域包含(例如依次)：i)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:76，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:77，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:78；或ii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:79，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:80，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:81；或iii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:82，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:83，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:84并且b)该第一免疫球蛋白VL1结构域包含(例如依次)：i)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:92，所述CDR2具有氨基酸序列SEQID NO:93，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:94或ii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:95，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:96，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:97或iii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:98，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:99，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:100。
在一个实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含第二免疫球蛋白VH2结构域和第二免疫球蛋白VL2结构域，其中：a)该第二免疫球蛋白VH2结构域包含(例如依次)：i)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:44，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:45，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:46；或ii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:47，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:48，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:49；或iii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:50，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:51，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:52并且b)该第二免疫球蛋白VL2结构域包含(例如依次)：i)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:60，所述CDR2具有氨基酸序列SEQID NO:61，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:62或ii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:63，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:64，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:65或iii)高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:66，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:67，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:68。
在一个实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含：a)包含SEQ ID NO:85中所列出的氨基酸序列的第一免疫球蛋白重链可变结构域(VH1)；b)包含SEQ ID NO:101中所列出的氨基酸序列的第一免疫球蛋白轻链可变结构域(VL1)；c)包含SEQ ID NO:85中所列出的氨基酸序列的第一免疫球蛋白VH1结构域和包含SEQ ID NO:101中所列出的氨基酸序列的第一免疫球蛋白VL1结构域；d)包含SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78中所列出的高变区的第一免疫球蛋白VH1结构域；e)包含SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94中所列出的高变区的第一免疫球蛋白VL1结构域；f)包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81中所列出的高变区的第一免疫球蛋白VH1结构域；g)包含SEQ ID NO:95、SEQID NO:96和SEQ ID NO:97中所列出的高变区的第一免疫球蛋白VL1结构域；h)包含SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:77和SEQ ID NO:78中所列出的高变区的第一免疫球蛋白VH1结构域以及包含SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93和SEQ ID NO:94中所列出的高变区的第一免疫球蛋白VL1结构域；i)包含SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:80和SEQ ID NO:81中所列出的高变区的第一免疫球蛋白VH1结构域以及包含SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:97中所列出的高变区的第一免疫球蛋白VL1结构域；j)包含SEQ ID NO:103的第一轻链；k)包含SEQ ID NO:87的第一重链；或l)包含SEQ ID NO:103的第一轻链和包含SEQ ID NO:87的第一重链。
在一个实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含：a)包含SEQ ID NO:53中所列出的氨基酸序列的第二免疫球蛋白重链可变结构域(VH2)；b)包含SEQ ID NO:69中所列出的氨基酸序列的第二免疫球蛋白轻链可变结构域(VL2)；c)包含SEQ ID NO:53中所列出的氨基酸序列的第二免疫球蛋白VH2结构域和包含SEQ ID NO:69中所列出的氨基酸序列的第二免疫球蛋白VL2结构域；d)包含SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46中所列出的高变区的第二免疫球蛋白VH2结构域；e)包含SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62中所列出的高变区的第二免疫球蛋白VL2结构域；f)包含SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49中所列出的高变区的第二免疫球蛋白VH2结构域；g)包含SEQ ID NO:63、SEQID NO:64和SEQ ID NO:65中所列出的高变区的第二免疫球蛋白VL2结构域；h)包含SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46中所列出的高变区的第二免疫球蛋白VH2结构域以及包含SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:62中所列出的高变区的第二免疫球蛋白VL2结构域；i)包含SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49中所列出的高变区的第二免疫球蛋白VH2结构域以及包含SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64和SEQ ID NO:65中所列出的高变区的第二免疫球蛋白VL2结构域；j)包含SEQ ID NO:81的第二轻链；k)包含SEQ ID NO:55的第二重链；或l)包含SEQ ID NO:81的第二轻链和包含SEQ ID NO:55的第二重链。
在一些实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:53的三个CDR。在其他实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:69的三个CDR。在其他实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:53的三个CDR和SEQ ID NO:69的三个CDR。在一些实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:85的三个CDR。在其他实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:101的三个CDR。在其他实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:85的三个CDR和SEQ ID NO:101的三个CDR。
在一些实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:85的三个CDR。在其他实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:101的三个CDR。在其他实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:85的三个CDR和SEQ ID NO:101的三个CDR。在一些实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:53的三个CDR。在其他实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:69的三个CDR。在其他实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:53的三个CDR和SEQ ID NO:69的三个CDR。在实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的L-18/IL-1β双特异性抗体包含SEQ ID NO:85的三个CDR、SEQ ID NO:101的三个CDR、SEQ ID NO:53的三个CDR和SEQ ID NO:69的三个CDR。
在一个实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体的第一部分选自人IL-18抗体，其至少包含：a)免疫球蛋白重链或其片段，该免疫球蛋白重链或其片段包含可变结构域以及人重链的恒定部分或其片段，该可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:76，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:77，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:78；和b)免疫球蛋白轻链或其片段，该免疫球蛋白轻链或其片段包含可变结构域以及人轻链的恒定部分或其片段，该可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:92，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ IDNO:93，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:94。此外，IL-18/IL-1β双特异性抗体的第二部分选自人IL-1β抗体，其至少包含：a)免疫球蛋白重链或其片段，该免疫球蛋白重链或其片段包含可变结构域以及人重链的恒定部分或其片段，该可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:44，所述CDR2具有氨基酸序列SEQID NO:45，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:46；和b)免疫球蛋白轻链或其片段，该免疫球蛋白轻链或其片段包含可变结构域以及人轻链的恒定部分或其片段，该可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:60，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:62。
在一个实施例中，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体的第一部分选自人IL-18抗体，其至少包含：a)免疫球蛋白重链或其片段，该免疫球蛋白重链或其片段包含可变结构域以及人重链的恒定部分或其片段，该可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:76，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:77，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:78；和b)免疫球蛋白轻链或其片段，该免疫球蛋白轻链或其片段包含可变结构域以及人轻链的恒定部分或其片段，该可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:92，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ IDNO:93，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:94。此外，IL-18/IL-1β双特异性抗体的第二部分选自人IL-1β抗体，其至少包含：a)免疫球蛋白重链或其片段，该免疫球蛋白重链或其片段包含可变结构域以及人重链的恒定部分或其片段，该可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3；所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:44，所述CDR2具有氨基酸序列SEQID NO:45，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:46；和b)免疫球蛋白轻链或其片段，该免疫球蛋白轻链或其片段包含可变结构域以及人轻链的恒定部分或其片段，该可变结构域依次包含高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:60，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:62。
在所披露的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体的第一VH1或VL1结构域可以具有与在SEQ ID NO:85和101中列出的VH或VL结构域基本上相同的第一VH1和/或第一VL1结构域。如本文所披露的，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体可包含与SEQ ID NO:87所列出的第一重链基本上相同的第一重链和/或与SEQ ID NO:103所列出的第一轻链基本上相同的第一轻链。如本文所披露的，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体可包含含有SEQ ID NO:87的第一重链和含有SEQ ID NO:103的第一轻链。如本文所披露的，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体可包含：a)第一重链，其包含具有与SEQ ID NO:85中所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的可变结构域和具有异二聚化修饰的人重链的恒定部分；和b)第一轻链，其包含具有与SEQ ID NO:101中所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的可变结构域和人轻链的恒定部分。人重链的恒定部分可以是IgG1。在一个实施例中，IgG1是没有效应子突变的人IgG1。在一个实施例中，人重链IgG1包含沉默突变N297A、D265A或L234A和L235A的组合。在一个特定的实施例中，根据SEQ ID NO:87，人重链IgG1包含沉默突变，该沉默突变是L234A和L235A的组合。
在所披露的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体的第二VH2或VL2结构域可以具有与在SEQ ID NO:53和69中列出的VH或VL结构域基本上相同的第二VH2和/或第一VL2结构域。如本文所披露的，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体可包含与SEQ ID NO:55所列出的第二重链基本上相同的第二重链和/或与SEQ ID NO:71所列出的第二轻链基本上相同的第二轻链。如本文所披露的，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体可包含含有SEQ ID NO:53的第二重链和含有SEQ ID NO:69的第二轻链。如本文所披露的，用于在(i)披露的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的治疗或预防中使用的或(ii)用于在披露的用于治疗或预防细胞因子释放综合征或细胞因子风暴综合征的方法中使用的IL-18/IL-1β双特异性抗体可包含：a)第二重链，其包含具有与SEQ ID NO:53中所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的可变结构域和具有异二聚化修饰的人重链的恒定部分(其与第一重链的异二聚化互补)；和b)第二轻链，其包含具有与SEQ ID NO:69中所示的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的可变结构域和人轻链的恒定部分。人重链的恒定部分可以是IgG1。在一个实施例中，IgG1是没有效应子突变的人IgG1。在一个实施例中，人重链IgG1包含沉默突变N297A、D265A或L234A和L235A的组合。在一个特定的实施例中，根据SEQ ID NO:55，人重链IgG1包含沉默突变，该沉默突变是L234A和L235A的组合。
用于在披露的方法、试剂盒和方案中用作双特异性抗体的第一部分的其他优选的IL-18拮抗剂(例如抗体)是以下列出的那些：美国专利号：9,376,489，将其通过引用以其整体并入本文。
用于在披露的方法、试剂盒和方案中用作双特异性抗体的第二部分的其他优选的IL-1β拮抗剂(例如抗体)是以下列出的那些：美国专利号：7,446,175或7,993,878或8,273,350，将其通过引用以其整体并入本文。
实例2：bbmAb1的体外活性
bbmAb1的结合活性在各种不同的细胞测定中进行了测试。
(1)材料与方法
(a)用于溶液平衡滴定(SET)测定
使用了以下材料：
生物素化的重组人IL-18(BTP25828)
重组食蟹猴IL-1β(诺华公司(Novartis))
SULFO-TAG标记的抗人IgG抗体(细观发现公司(Meso Scale discovery，MSD)#R32AJ-5)。与MSD SULFO-TAG NHS酯缀合的山羊抗人Fab特异性抗体(杰克森免疫研究公司(Jackson Immuno Research)#109-005-097，MSD#R91AN-1)，BSA(西格玛公司(Sigma)#A-9647)
具有表面活性剂的MSD读取缓冲液T(MSD#R92TC-1)
磷酸盐缓冲盐水(PBS)10x(技术创新公司(Teknova)#P0195)Tris缓冲盐水pH 7.5(TBS)10x(技术创新公司#T1680)Tween-20(弗卢卡公司(Fluka)#93773)
聚丙烯微量滴定板(MTP)(葛莱娜公司(Greiner)#781280)
384孔板，标准(MSD#L21XA)
(b)用于细胞测定和SET测定
如IL-1β抗体部分所述的mAb2。
如IL-18抗体部分所述的mAb1。
如实例1中所述的bbmAb1。
购自MBL国际公司(MBL Int.Corp.)的重组人IL-18(BTP 25829)(#B001-5)
重组绒猴IL-1β(诺华公司)
重组绒猴IL-18(诺华公司)
重组人IL-12(#573008)购自博奇公司(Biolegend)KG-1细胞系(ATCC#CCL-246)
正常人皮肤成纤维细胞(#CC-2509)购自龙沙公司(Lonza)
绒猴皮肤成纤维细胞(#42637F(510))
HEK-BlueTMIL-18/IL-1β细胞(#hkb-il18)购自InvivoGen公司
从血沉棕黄层(得自Blustspendezentrum Bern公司)中分离PBMC
绒猴血是从SILABE，Niederhausbergen获得
IL-6ELISA：人(博奇公司，#430503)；绒猴(U-CyTech生物科学公司(U-CyTechbiosciences)，CT974-5)
IFNγELISA：人(BD555142)和绒猴(U-CyTech生物科学公司#CT340A)
用于检测SEAP的QUANTI-BlueTM测定(#rep-qb1)购自InvivoGen公司
细胞培养基：RPMI 1640(英杰公司(Invitrogen)#31870)，其补充了10％胎牛血清(英杰公司#10108-157)、1％ L-谷氨酰胺(英杰公司#25030-03)、1％青霉素/链霉素(英杰公司#15140-148)、10μM 2-巯基乙醇(Gibco公司#31350-010)、5mM Hepes(Gibco公司#15630-080)
圆底组织培养处理的96孔板(Costar公司#3799)
平底组织培养处理的96孔板(Costar公司#3596)
Ficoll-PacqueTMPlus(GE医疗健康生命科学公司(GE Healthcare LifeSciences)#17-1440-02)PBS 1X，不含钙和镁(Gibco公司#14190094)
带有多孔屏障的Leucosep管，50ml，聚丙烯(Greiner bio-one公司#227290)Falcon 15ml聚丙烯锥形管(BD公司#352096)
Falcon 50ml聚丙烯锥形管(BD公司#352070)
(c)通过SET进行亲和力测量
SET单个靶标结合测定
抗原的22个连续1.6n稀释液(最高浓度：huIL-18，5nM；marIL-18，10nM；huIL-1β，0.5nM；marIL-1β，0.5nM)在样品缓冲液(含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)和0.02％ Tween-20的PBS)中制备，并添加了恒定浓度的抗体(对于IL-18读数为10pM，对于IL-1β读数1pM)。将体积为60μl/孔的每种抗原-抗体混合物一式两份分配到384孔聚丙烯微量滴定板(MTP)中。样品缓冲液作为阴性对照，仅包含抗体的样品作为阳性对照(无抗原的最大电化学发光信号，Bmax)。将板密封并在室温(RT)下在振荡器上孵育过夜(o/n，至少16小时)。
IL-18读数：用30μl/孔生物素化的huIL-18(0.1μg/ml，PBS)包被链霉亲和素包被的384孔MSD阵列MTP，并在振荡器上于室温孵育1h。
IL-1β读数：将标准384孔MSD阵列MTP用在PBS中稀释的30μl/孔的huIL-1(3μg/ml，PBS)(作为捕获剂)包被，并在4℃孵育过夜。
在室温(RT)下，用50μl/孔的封闭缓冲液(含5％ BSA的PBS)封闭板1小时(h)。洗涤(TBST，含有0.05％Tween 20的TBS)后，将体积为30μl/孔的平衡抗原-抗体混合物从聚丙烯MTP转移到包被的MSD板上，并在室温下孵育20min。另外的洗涤步骤后，将在样品缓冲液中稀释的30μl磺基标签标记的抗IgG检测抗体(0.5μg/ml)添加至每个孔中，并在振荡器上于室温孵育30min。洗涤MSD板，并添加35μl/孔的MSD读取缓冲液，并在室温下孵育5min。电化学发光(ECL)信号由MSD Sector Imager 6000生成并测量。
SET同时靶标结合测定
测定A除外，如上所述进行SET测定：平衡过程(抗体/抗原混合物)在一个靶标过量(500pM的IL18或IL-1β)存在下进行，同时评估另一个靶标的KD。
测定B：平衡过程(抗体/抗原混合物)是用连续稀释的两个靶标在一种混合物中同时进行(恒定浓度的抗体10pM，最高抗原浓度见上文)。然后如上所述分析相同混合物在IL18和IL-1β包被的板上的游离抗体浓度。
SET数据已导出到MS Excel加载项软件Xlfit。从每次测定中的重复测量来计算平均ECL信号。通过从所有数据点减去最低值对数据进行基线调整，并针对相应的抗原浓度作图以生成滴定曲线。KD值通过将图用以下拟合来确定：
单特异性Ab的1:2结合模型
杵臼结构双特异性Ab的1:1结合模型
其中
y：减去空白的ECL信号
Bmax：抗原浓度为零时的最大ECL信号
[IgG]：应用的抗体浓度
[Fab]：应用的总Fab浓度
KD：解离平衡常数
x：应用的抗原浓度
(d)细胞培养
KG-1细胞在补充有10％胎牛血清、1％ L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的RPMI1640中生长，密度为2x 105至1x 106个活细胞/mL。
正常人成纤维细胞和狨猴成纤维细胞在包括bFGF(1ng/ml，CC-4065)、胰岛素(5μg/ml，CC-4021)和2％ FCS(CC-4101)的FBM(Clonetics公司，CC-3131)中生长。使用成纤维细胞基础培养基(龙沙公司#CC-3131)作为饥饿培养基。
HEK-BlueTMIL-18/IL-1β细胞在生长培养基(DMEM、4.5g/l葡萄糖、10％(v/v)胎牛血清、50U/ml青霉素、50mg/ml链霉素、100mg/ml NormocinTM、2mM L-谷氨酰胺，补充有30μg/ml的杀稻瘟菌素、200μg/ml的HygroGoldTM和100μg/ml的ZeocinTM)中生长。
根据制造商的说明，使用LeucoSep管从血沉棕黄层中新鲜分离出人外周血单核细胞(PBMC)。简而言之，通过以1,000×g离心30s将13ml的Ficoll-Paque预装在14ml的LeucoSep管中。用等体积的PBS稀释肝素化的全血样品，并将25ml稀释的血液添加到LeucoSep管中。将细胞分离管在室温下以800×g不间断离心15min。收集细胞悬浮液层，将细胞在PBS中洗涤两次(分别以640×g和470×g进行10min，两次连续洗涤)并重悬于培养基中，然后计数。
将狨猴血液收集在肝素化试管中，并使用70μm细胞过滤器(BD生物科学公司(BDBiosciences)#352350)过滤
(e)IL-1β中和测定
基本上如(Gram 2000)所述进行成纤维细胞中的IL-1β诱导的IL-6产生测定，仅进行少量修改。简而言之，将成纤维细胞以5x 103个细胞/孔(100μl中)的密度接种在96孔平底组织培养板中。第二天，在添加重组IL-1β/化合物溶液混合物(表中所示的IL-1β浓度)之前，将细胞在饥饿培养基中饥饿5h。通过将重组IL-1β与浓度范围的化合物在37℃孵育30min来预先制备IL-1β/化合物溶液混合物。在37℃下o/n孵育后收集细胞上清液，并通过ELISA确定释放的IL-6的量。根据以下进行PBMC中IL-1β诱导的IL-6产生测定。将PBMC以3x105个细胞/孔(100μl中)接种在96孔组织培养板中，并与重组IL-1β/化合物溶液混合物在37℃下孵育24h(表中所示的IL-1β浓度)。通过将重组IL-1β与浓度范围的化合物在37℃孵育30min来预先制备IL-1β/化合物溶液混合物。刺激24h后收集细胞上清液，并通过ELISA确定释放的IL-6的量。
(f)IL-18中和测定
基本上根据以下进行该测定。将密度为3x 105/孔的KG-1细胞(预先在PBS+1％FCS中饥饿1h)或PBMC接种到圆底96孔细胞培养板中，并与重组IL-18/IL-12的溶液混合物以及浓度范围的化合物(表中所示的IL-18/IL-12浓度)一起孵育。在37℃下孵育24h后，收集上清液，并通过ELISA确定释放的IFNγ的量。对于用狨猴血液进行的测定，使用85μl血液/孔。
(g)HEK-BlueTM细胞中双重IL1β/IL-18中和
该测定基本上按照制造商的处理程序中所述进行。简而言之，将HEK-BlueTM细胞以4x 104/孔的密度接种到96孔细胞培养板中，并与重组IL-1β和IL-18的溶液混合物(以产生1:1SEAP信号)以及浓度范围的化合物一起孵育。在37℃下孵育24h后，收集上清液，并根据制造商的说明使用QUANTI-BlueTM方法确定释放的SEAP的量。
将所有数据导出到EXCEL软件，并通过使用EXCEL/XLfit4或GraphPad Prism软件绘制针对逻辑曲线拟合函数的剂量应答曲线来计算IC50值。
(2)结果
(a)对重组人和狨猴IL1β和IL-18的亲和力
通过溶液平衡滴定(SET)滴定测量bbmAb1对人和狨猴重组IL-1β和IL-18蛋白的结合亲和力，并将产生的KD值与mAb2对IL-1β和mAb1对IL-18结合的KD值进行比较。在单个靶标结合测定中比较结合亲和力，与mAb1对人和狨猴IL-18相比，bbmAb1对二者显示出相似的平均KD(表4)。对于人IL-1β结合，与mAb2(0.6pM)相比，bbmAb1(2.6pM)的平均KD值略高，但仍在相同的低pM范围内。在同时双重靶标结合测定中的后续测量(表5)证实，bbmAb1对IL-1β的结合KD值与临床前以及临床级材料情况下的mAb2值相似。因此，bbmAb1对人和狨猴中的靶标都具有结合亲和力，其分别类似于mAb2和mAb1。
表4.通过SET测量的对重组人(hu)和狨猴(mar)IL-1β和IL-18的亲和力(单个靶标结合测定)
除了单个靶标结合结果外，还通过应用在评估结合KD值过程中一个靶标相对于另一个靶标过量(测定A)或通过应用以连续稀释的两个靶标的混合物(测定B)，来研究bbmAb1的同时双重靶标结合亲和力(表5)。同时进行IL-1β/IL-18亲和力测定显示，测定A(一种抗原过量)和测定B(以连续稀释的两种抗原的混合物)之间无显著差异，这证明两个靶标同时结合而不会影响另一个靶标的结合。此外，同时双重结合测定获得的KD值与标准测定获得的KD值相似(表4；在没有第二抗原的情况下)，这证明bbmAb1可以独立结合两种抗原。因此，bbmAb1同时且独立地结合人IL-1β和IL-18两者，并与对应的狨猴蛋白完全交叉反应。
表5.通过SET测量的对重组人(hu)和狨猴(mar)IL-1β和IL-18的亲和力(同时靶标结合测定)
(b)bbmAb1在人和绒猴细胞测定中的中和活性
评估了bbmAb1对两种细胞因子(IL1β和IL-18)的中和活性(mAb2mAb1)。另外，评估了使用绒猴细胞测定系统的bbmAb1中和绒猴IL-1β和IL-18的效力(参见d部分)。
(c)人细胞中的单独和同时的IL-1β和IL-18中和
bbmAb1对IL-1β的中和活性是通过抑制人皮肤成纤维细胞(IL-1β以6pM使用)和人PBMC(IL-1β以60pM使用)中重组IL-1β诱导的IL-6产生来评估的。通过抑制KG-1细胞和人PBMC(两种细胞均被3nM重组人IL-18和1ng/ml重组人IL-12激活)中的重组IL-18诱导的IFN-γ产生来测量bbmAb1对IL-18的中和活性。始终将bbmAb1对IL-1β和IL-18的抑制效力分别与mAb2或mAb1进行比较。取决于测定，bbmAb1的平均IC50值在亚nM或个位数nM范围内，而直接比mAb2(对于IL-1β)和mAb1(对于IL-18)分别多达2至4倍高(表6和表7)。与mAb2/mAb1的二价形式相比，bbmAb1的单价形式但也可能是KiH突变可以是bbmAb1效力存在细微差异的原因。
表6.在人皮肤成纤维细胞和人PBMC中与mAb2相比，bbmAb1中和IL-1β的平均IC50值。*在重组人IL-1β(针对皮肤成纤维细胞为6pM，针对PBMC为60pM)刺激的人皮肤成纤维细胞或PBMC中IL-6的产生的抑制。显示的是平均值±SEM(n＝3PBMC和n＝6人皮肤成纤维细胞)
表7.在KG-1细胞和人PBMC中与mAb1相比，bbmAb1中和IL-18的平均IC50值。**重组人IL-18(3nM)和人IL-12(1ng/ml)刺激的KG-1细胞或PBMC中的IFNγ的产生的抑制。显示的是平均值±SEM(n＝3KG-1和n＝4PBMC)
bbmAb1能够同时中和IL-1β和IL-18两者的生物活性，如HEK BlueTM报告细胞(其应答重组IL-1β和IL-18的1+1刺激产生SEAP)所表明(表8)。只有通过mAb2和mAb1的组合才能在该测定系统中实现对SEAP的类似抑制，而不能通过使用单个抗体来实现。
表8.根据HEK BlueTM细胞中SEAP报告子活性，同时中和IL-1β和IL-18的平均IC50值。显示的是n＝5个实验的平均值±SEM。
(d)bbmAb1在绒猴细胞测定中对绒猴IL-1β和绒猴IL-18的中和活性
为了证明bbmAb1在绒猴中的抑制活性，用绒猴细胞和人细胞进行了相似的体外测定，但是使用重组绒猴IL-1β和IL-18进行刺激。当评估对绒猴皮肤成纤维细胞中重组绒猴IL-1β诱导的IL-6产生的抑制作用时，bbmAb1表现出亚nM效力，其IC50值比mAb2高2至3倍(表9)。用绒猴IL-1β刺激的人皮肤成纤维细胞测试bbmAb1产生与用人IL-6相似的抑制谱。
表9.bbmAb1在绒猴和人成纤维细胞中抑制重组绒猴IL-1β诱导的IL-6的产生。*重组绒猴IL-1β(18pM)刺激的绒猴或人皮肤成纤维细胞中IL-6的产生的抑制。显示了3个单独实验(A、B和C)的结果。
bbmAb1的单位数至两位数nM IC50值证实了bbmAb1对用绒猴血细胞进行的IFNγ产生测定中测试的绒猴IL-18的中和活性(表3-7)。当测量人IFNγ的产生时，用绒猴IL-18刺激的人PBMC测试bbmAb1产生了类似的抑制谱。
因此，在使用绒猴应答细胞的功能测定中，bbmAb1显示与绒猴IL-1β和绒猴IL-18完全交叉反应。
表10.绒猴全血或人PBMC中重组绒猴IL-18诱导的IFNγ产生的抑制的平均IC50值。**用重组绒猴IL-18(所示浓度)和人IL-12(10ng/ml)刺激的绒猴全血(每种化合物/条件n＝3)或人PBMC(n＝6)中IFNγ产生的抑制。显示的是平均值±SEM
已证明，与原始mAb(mAb2和mAb1)相比，在多种不同的细胞测定中，bbmAb1(KiH型IL-1β/IL-18双特异性mAb)保留了对两个单独靶标IL-1β和IL-18的高亲和力结合以及细胞因子中和效力。不仅针对人细胞因子/细胞证明了bbmAb1的双重IL-1β和IL-18中和特性，而且针对相应的绒猴细胞因子/细胞也证明了bbmAb1的双重IL-1β和IL-18中和特性，从而促进了适当的毒理学研究。在一些针对IL-1β和IL-18中和的细胞测定中产生的高达2至4倍更高的IC50值可能是bbmAb1单价结合而不是mAb2和mAb1分别二价结合的结果。但是，bbmAb1对细胞因子的双重中和可导致体内的累加或协同抑制活性，这在我们的体外细胞系统中可能无法充分体现。
实例3：IL-1β和IL-18组合刺激和阻断在PBMC中的影响
效应细胞因子IL-1β和IL-18的炎性体激活依赖性切割导致诱导继发性促炎介质，不仅在全身而且在炎症部位促进免疫细胞募集/活化。在两种不同的致死性全身炎症小鼠模型(a)LPS注射模型和(b)FCAS小鼠(激活NLRP3中的错义突变)中，与单一IL-1β或单一IL-18不存在/抑制相比，同时不存在/抑制IL-1β和IL-18两者对致死性更具保护作用，证明免疫激活的累加或协同机制(Brydges 2013，van den Berghe 2014)。bbmAb1是人/狨猴IL-1β/IL-18反应性双特异性mAb，无啮齿动物交叉反应性，因此不能在小鼠模型中进行测试。因此，我们使用LPS/IL-12体外模拟炎性体依赖性途径激活来刺激人PBMC，以揭示bbmAb1中和组合的IL-1β/IL-18的累加或协同抑制作用，并使用微阵列进行了无偏向基因表达分析。作为补充活动，我们还比较了来自用重组IL-1β和重组IL-18的组合或单独的单一细胞因子刺激的不同供体的PBMC的基因表达谱。
(3)材料与方法
(a)细胞培养和ELISA
RPMI 1640(英杰公司#31870或Gibco公司#61870-010)，其补充了10％胎牛血清(英杰公司#10108-157)、1％ L-谷氨酰胺(英杰公司#25030-03)、1％青霉素/链霉素(英杰公司#15140-148)、10μM 2-巯基乙醇(Gibco公司#31350-010)、5mM Hepes(Gibco公司#15630-080)
重组人IL-1β购自义翘神州公司(#10139-HNAE-5)
重组人IL-18购自MBL(#B001-5)
重组人IL-12购自博奇公司(#573008)
IFNγELISA：MAX标准套装，博奇公司，#430103或BD OptEIA人IFNγELISA套装，BD#555142
IL-6ELISA：MAX标准套装，博奇公司，#430503
IL-26ELISA：云克隆公司(Cloud Clone Corp)#SEB695Hu
如IL-1β抗体部分所述的mAb2。
如IL-18抗体部分所述的mAb1。
如实例1中所述的bbmAb1。
LPS来自肠炎沙门氏菌血清型肠炎沙门菌，西格玛公司#L7770
从血沉棕黄层(得自Blustspendezentrum Bern公司)中分离PBMC圆底组织培养处理的96孔板(Costar公司#3799)平底组织培养处理的96孔板(Costar公司#3596)Ficoll-PacqueTMPlus(GE医疗健康生命科学公司#17-1440-02)PBS 1X，不含钙和镁(Gibco公司#14190094)
Falcon 15ml聚丙烯锥形管(BD公司#352096)Falcon 50ml聚丙烯锥形管(BD公司#352070)
具有多孔屏障的LeucosepTM管，50ml，Greiner bio-one公司#227290
细胞过滤器70μM，BD生物科学公司#352350
台盼蓝，西格玛公司#T8154
RNA分离，数量和质量测量以及qPCR：
无核酸酶的水，Ambion公司#AM9938
Rnase Zap，Ambion公司#AM9780
1.5ml Eppendorf管，无菌，无核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶
RLT缓冲液，凯杰公司(Qiagen)#1015762
Rneasy小型试剂盒，凯杰公司#74104
不含核糖核酸酶的脱氧核糖核酸酶套装，凯杰公司#79254
安捷伦公司RNA 6000Nano试剂盒，安捷伦公司(Agilent)#5067-1511
芯片引发站，安捷伦公司#5065-4401
IKA涡旋混合器
Ambion公司#9780
安捷伦公司2100生物分析仪
高容量cDNA逆转录试剂盒，应用生物系统公司(Applied Biosystems)，#PN4374966
无Nase薄壁带盖的0.2ml PCR管，Ambion公司#AM12225
MicroAmp Optical 384孔反应板，应用生物系统公司#4309849
TaqMan GenEx预混液，应用生物系统公司#4369514
PCR引物(应用生物系统公司)
靶标 测定ID Taqman 颜色/淬灭剂
IFNγ Hs00989291_m1 FAM-MGB
IL-26 Hs00218189_m1 FAM-MGB
RPL27 Hs03044961_g1 FAM-MGB
HPRT1 Hs02800695_m1 FAM-MGB
PBMC制备：根据制造商的说明，通过在Leucosep管中进行菲科帕克(Ficoll-Paque)梯度离心，从血沉棕黄层中分离出PBMC。简而言之，将15mL的Histopaque放入50mL的LeucosepTM管中，并在室温下以1300rpm离心30秒。用移液器将血沉棕黄层的30mL稀释悬浮液添加到Histopaque溶液的顶部，并在室温下以1000g不间断离心15min。弃去血浆(约20ml)，收集界面环(＝人PBMC)并转移到50ml falcon管中。管中充满50mL无菌PBS，并在室温下以1200rpm离心5min一次。将该离心重复2次。轻轻弃去上清液，将细胞重悬于50mL PBS中，其中PBS中含2％ FCS和2mM EDTA。使用70μm细胞过滤器过滤细胞悬浮液，并使用台盼蓝染色(500μL台盼蓝+200μL细胞+300μL PBS)对细胞计数。
LPS/IL-12刺激PBMC：根据以下方法准备在上清液中的细胞因子产生。将250`000个细胞/孔(最终体积为100μl)分配到96孔圆底板中。使用浓度在0.3μg/ml至3000μg/ml之间的LPS，连同10ng/ml的重组IL-12。在37℃和10％ CO2下24h后收获上清液。
根据以下从细胞沉淀物中进行RNA提取。将3x 106个细胞/孔以1000μl终体积分配到平底24孔板中。使用3μg/ml的LPS连同10ng/ml的重组IL-12。在37℃和10％ CO2下24h后，收获细胞。
用重组细胞因子刺激PBMC：将12孔板的每孔的7x 106个PBMC用于1.5ml最终的完全RPMI培养基中。以如下终浓度添加重组细胞因子：10ng/ml重组IL-1β、3nM重组IL-18、1ng/ml重组IL-12。在37℃和10％ CO2下在4h和24h后收集上清液和细胞两者。
RNA分离，数量和质量评估：沉淀细胞，将沉淀物在含2％β-巯基乙醇的350μl凯杰公司RTL缓冲液中裂解，并在-20℃或-80℃下冷冻，直到收集到所有研究样品。使用凯杰公司标准方案进行RNA分离。简而言之，在所有样品中添加350μl 70％乙醇，然后转移到RNeasy离心柱，并在8000g离心15s。弃去流过液后，添加350μl缓冲液RW1，将柱在8000g下离心15s，以洗涤离心柱膜。根据制造商的说明制备脱氧核糖核酸酶I孵育混合溶液，并将其添加到RNeasy离心柱中，并在室温下孵育15min。用350μl和500μl缓冲液RW1洗涤后，将RNeasy离心柱放入新的2ml收集管中，并全速离心1min。最终通过将35μl无核糖核酸酶的水直接添加到离心柱膜并以8000g离心1min以洗脱RNA来收集RNA。使用Nanodrop ND-1000测量RNA的量，并将RNA储存在-20℃。根据制造商的说明进行RIN测量以评估RNA质量。简而言之，将1μlRNA或梯度移液到安捷伦公司RNA 6000Nano芯片中，并使用安捷伦公司2100生物分析仪进行测量。
通过qPCR分析细胞因子基因表达：
按照制造商的说明执行该方法。简而言之，使用高容量cDNA逆转录试剂盒根据说明将400ng的RNA逆转录。将cDNA溶液在无RNA/DNA的水中稀释1/10，然后将1μl cDNA转移到384孔反应板中，然后与1μl 20X基因表达测定靶标FAM基因和10μl 2x基因表达预混液和10μl无RNA/DNA的水混合。将板加载到应用生物系统公司ViiATM7实时PCR系统上，并使用以下仪器设置：/>
用于这项研究的看家基因是HPRT1和RLP27。使用以下公式计算靶基因的相对表达水平：
1)Ct[参考]＝(Ct[HPRT1]+Ct[RLP27])/2
2)dCt[参考]＝40-Ct[参考]
3)dCt[靶标]＝Ct[靶标]-Ct[参考]
4)ddCt＝dCt[参考]-dCt[靶标]
5)相对靶基因表达＝2^ddCt
根据以下方法进行微阵列。样品由CiToxLAB France在Affymetrix HG_U133_Plus2微阵列上处理。在GeneSpring 11.5.1(安捷伦技术公司(Agilent Technologies)，加利福尼亚州圣克拉拉(Santa Clara,CA))中对它们进行了RMA归一化和分析。途径分析是使用独创性途径分析(Ingenuity Pathway Analysis，IPA)和Nextbio(依诺米那公司(Illumina))进行的。这两个数据集被独立地处理。
最初，数据由CiToxLAB进行标准质量控制(QC)，使用在Rstudio套件和GeneSpring(PCA，杂交对照)中的R脚本(MA_AffyQC.R)进行内部QC。随后，将其过滤以消除不可靠的表达水平：保留实体(探针组)，其中在任何1个实验条件中至少100％的样品具有高于20百分位的值。
使用GeneSpring中的“火山图过滤器(filter on volcano plot)”功能鉴定了差异表达基因(DEG)。使用具有未配对的T检验的过滤基因(表达在20.0-100.0百分位之间)，校正p值低于0.05且倍数变化高于2.0的探针组被认为是差异表达的。在可能的情况下，即在LPS(NUID-0000-0202-4150)的研究中，使用了Benjamini-Hochberg多重测试校正。
对于细胞因子刺激实验，使用以下公式计算协同作用：信号A+B/(信号A+信号B-对照)≥1.5。
各自的特征(或DEG列表)用于计算Fisher精确检验情况下的p值，该值代表观察该特征与公共数据集的“疾病基因列表”(病灶相比于非病灶)之间重叠的统计显著性。为此，将列表上载到依诺米那公司基础空间关联引擎(以前的Nextbio)中，并使用元分析(Meta-Analysis)功能和针对疾病的关键字搜索进行比较。
将所有数据导出到EXCEL软件，并通过使用EXCEL/XLfit4或GraphPad Prism软件绘制针对逻辑曲线拟合函数的剂量应答曲线来计算IC50值。使用GraphPad Prism软件通过单因素方差分析，然后进行邓尼特(Dunnett)多重比较来分析治疗组之间的差异，并认为结果在p<0.05时具有统计显著性。
(4)结果
(a)bbmAb1在抑制全血中LPS/IL-12诱导的IFNγ产生方面非常有效
将人全血暴露于补充有10ng/ml IL-12的LPS导致IFNγ应答，该应答很大程度上(但不完全)取决于血细胞产生的“天然”IL-18。IL-12的添加可能通过上调应答细胞上的IL-18受体来增强LPS诱导的IFNγ应答。
在使用的实验条件下，使用mAb1的IL-18中和只会导致不完全的IFNγ产生抑制，而IL-1β阻断(使用mAb2)对IFNγ应答只产生很小的影响。有趣的是，与单个细胞因子中和相比，bbmAb1或mAb2和mAb1的组合对IL-1β和IL-18的组合性抑制更加深刻和完全地抑制了IFNγ的产生。
在我们的细胞测定中，除IFNγ外，没有其他被测试的细胞因子(IL-2、-4、-6、-8、-10、-13和TNFα)被IL-1β和IL-18的组合性中和累加地抑制(数据未显示)。考虑到双特异性分子的单价形式，bbmAb1的效力与mAb2和mAb1的组合(combo)处于相同范围。
(b)在LPS/IL-12激活的人PBMC中，与单一IL-1β或IL-18抑制相比，IFNγ被bbmAb1(即组合的IL-1β/IL-18抑制)累加抑制
需要进行无偏转录组学评估，以便使用bbmAb1通过组合的IL-1β/IL-18抑制来揭示另外的累加作用(IFNγ除外)。由于全血不是用于转录组学分析的最佳材料，因此我们将LPS/IL-12刺激测定条件(如上文材料与方法部分所述)适应到人PBMC样品。通过使用来自总共9个供体的PBMC，我们可以证实bbmAb1累加地抑制IFNγ蛋白分泌到PBMC上清液。与全血实验相比，IFNγ产生被抑制，比所使用的各个mAb低约10倍浓度。重要的是，在IFNγ的mRNA水平上显示了相似的抑制模式，这证实了样品适用于基于无偏微阵列的基因表达分析。数据显示了在人PBMC中，bbmAb1、mAb2和mAb1(浓度各为10nM)对LPS(0.3μg/ml)/IL-12诱导的IFNγ蛋白产生和IFNγ基因表达的抑制。
Affymetrix微阵列是用来自PBMC的n＝5个单个供体进行的，这些供体从上述材料与方法部分所述的LPS/IL-12刺激实验中取样。不巧的是，基因表达谱的总体评估证实了强烈的LPS/IL-12刺激作用，PCA显示每个供体聚簇，而不是受刺激或未受刺激的组内的化合物。但是，将LPS/IL-12刺激的样品与受刺激加bbmAb1的样品针对差异表达基因进行比较，揭示了被使用bbmAb1的组合的IL-1β/IL-18阻断所下调的基因名单(表11)。除了IFNγ基因的强烈下调(其重新确认我们的微阵列数据)外，与单一IL-1β抑制(通过mAb2)或IL-18抑制(通过mAb1)相比，IL-26基因也是另一种被bbmAb1累加抑制的细胞因子基因。观察到微阵列数据得出的IFNγ和IL-26的基因表达水平，以及在LPS(0.3μg/ml)/IL-12刺激的PBMC中在24h时bbmAb1、mAb2和mAb1(每个10nM)的抑制作用。
表11.差异表达的基因(仅在LPS/IL-12刺激的样品中bbmAb1和对照组之间下调的基因)。FC＝倍数变化。
(c)IL-26是另一种在LPS/IL-12刺激的PBMC中被bbmAb1累加抑制的促炎性细胞因子
为了进一步证实使用bbmAb1通过组合的IL-1β/IL-18阻断最有效地抑制LPS/IL-12驱动的IL-26基因表达和蛋白产生，该研究扩展到总共n＝9个PBMC供体，并通过qPCR研究IL-26基因表达，通过ELISA研究IL-26蛋白产生。结果在很大程度上证实了通过微阵列方法获得的IL-26基因表达的抑制。有趣的是，通过添加mAb，上清液中IL-26蛋白的水平在24h时仅部分降低。造成这种差异的原因尚不清楚，但可能与IL-26基因表达和蛋白产生之间的动力学差异以及与IFNγ相比IL-26的消耗差异有关。但是，与mAb2和mAb1相比，bbmAb1在降低PBMC上清液中的IL-26蛋白水平方面表现出优势。结果表明了在人PBMC中，bbmAb1、mAb2和mAb1(各10nM)对LPS(0.3μg/ml)/IL-12诱导的IL-26基因表达(通过qPCR)和IL-26蛋白水平的抑制。
(d)与疾病相关的IL1β/IL18信号传导特征
将先前确立的PBMC培养条件(其中重组IL-1β刺激导致IL-6产生或重组IL-18/IL-12刺激导致IFNγ产生)组合起来，以揭示累加或协同的下游靶基因或特征(数据未显示)。在两个不同的时间点(6h和24h)对来自n＝4个供体的PBMC进行采样，进行Affymetrix微阵列评估，以进行基因表达谱的无偏评估。揭示了在IL-1β和IL-18组合的刺激下在6h和24h协同上调的基因(数据未显示)。在IL-1β/IL-18组合中添加IL-12大大提高了一系列上调基因的协同作用。单一或组合的IL-1β/IL-18途径刺激(仅上调的基因)产生的信号传导特征被用于询问遍及几种自身免疫性疾病患者的数据集。例如，观察到与公共结节病数据集的相关性。P值(通过Fisher精确检验计算得出)显示出与几种比较健康组织和结节病患者患病组织的公共研究的显著相关性。组织包括皮肤以及肺、泪腺和眼眶前部。在所有数据集中，IL1β/IL18信号传导的组合显示出与疾病的最佳相关性，其次是IL-1β和IL-18。与5种结节病组织“患病相对健康”DEG相比，PBMC中的IL-1β/IL-18差异上调基因(DEG)(x轴)。P值(y轴)代表观察到特征与“疾病基因列表”之间的重叠的统计显著性。黑色条柱是来自皮肤结节病病灶的皮肤相对于来自健康患者的皮肤。浅灰色条柱是来自皮肤结节病病灶的皮肤相对于非病灶的皮肤。白色条柱是来自结节病患者的泪腺相对于来自正常人的泪腺。深灰色条柱是来自结节病患者的眼眶前组织对于来自正常人的眼眶前组织。条纹条柱是进行性纤维化、肺结节病的肺样品相对于结节性自限性肺结节病的肺样品。
(e)结论
LPS和重组IL-12用于在体外培养的前24h内模拟病原体相关分子模式(PAMP)依赖性的NLRP3炎性体激活。其证明，通过使用bbmAb1，IL-1β和IL-18的组合性抑制累加地作用以减少/抑制LPS/IL-12刺激的PBMC中IFNγ的产生。先前描述了IL-12与IL-18协同作用以诱导T、B、NK细胞，巨噬细胞和树突状细胞中的IFNγ产生(如Nakanishi，2001年所综述)，但现在可以在所使用的实验条件下证明IL-1β对IFNγ产生了另外的刺激作用。因此，PBMC与LPS/IL-12的共孵育有效地驱动了“天然”IL-1β和IL-18(这两者均有助于强烈的IFNγ应答)的产生。通过使用无偏微阵列转录组学，鉴定到另外的基因，相对于单一IL-1β或IL-18阻断，该基因被组合的IL-1β/IL-18中和累加地下调。其中包括IL-26，其是IL-20细胞因子亚家族(IL-19、IL-20、IL-22、IL-24和IL-26)的成员，IL-26在大多数脊椎动物物种中都保守，但在大多数啮齿动物品系(包括小鼠和大鼠)中却不存在(Donnelly 2010)。它通过由IL-20R1和IL-10R2链组成的异二聚体受体复合物传递信号。IL-26受体主要在非造血细胞类型上表达，特别是在上皮细胞上。据报道，血清中以及尤其是RA患者的滑液中，IL-26水平升高，其中IL-26可能作为促进Th17细胞生长和分化的因子起作用。不巧的是，LPS/IL-12刺激PBMC样品的强烈作用阻碍了由IL-1β和IL-18的组合性阻断所诱导的另外的基因/途径的发现。然而，IFNγ和IL-26两者以及IL-22在一定程度上也在通过重组IL-1β和IL-18在PBMC中组合的刺激而协同上调的基因中，这证实了这两个因素是这个激活途径的下游效应子。因此，细胞因子的IL-20亚家族(包括IL-26和IL-22)似乎强烈依赖于来自IL-1β和IL-18的同时信号。在充分注意单个信号传导特征的选择性以及阻断的潜在功效的前提下，这些比较有助于表明各个途径在各种炎症性疾病中均具有活性。
实例4：治疗用途
三阶段多中心研究，其中第2阶段为随机退出、双盲、安慰剂对照设计，以评价NLRC4-GOF患者的bbmAb1的临床功效、安全性和耐受性
方案汇总
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1.介绍
1.1.背景
在出生后六周急性出现NLRC4-GOF的婴儿中，抗IL-1β(10mg/kg/天的IL-1受体拮抗剂阿那白滞素)和重组IL-18BP(他金尼α(tadekinigalfa)，在FDA的紧急同情使用研究性新药授权下施用)的组合被报告为临床有效。婴儿在48-72小时内的临床改善与循环中游离IL-18和CRP的减少(指示IL-1β的中和)相关，这强调了中和游离IL-18和IL-1β两者以治疗疾病的重要性。开始组合治疗后大约11天，患者恢复肠道喂养，并成功逐渐停止环孢素和糖皮质激素。据报告，患者在11个月的组合IL-1β和IL-18阻断后状况良好，已接种疫苗(活疫苗除外)，对典型的儿童感染耐受良好(Canna等人2017)。
另一名NLRC4-GOF患者在11天龄时出现发热、荨麻疹样皮疹和CRP升高，经过10周时间段的多重免疫抑制治疗，无应答，仅当用阿那白滞素(IL-1受体拮抗剂)和rhIL-18BP组合治疗时，才有临床改善，尽管终末器官损伤限制了进一步治疗，但表明患者的早期治疗对预防不可逆器官损伤的重要性(Moghaddas等人2018)。
概要
这些婴儿病例促进了在正在进行的NLRC4-GOF儿童患者(年龄从出生至17岁)的临床试验(NCT03113760)中对IL-18BP(他金尼α)治疗与护理标准(包括阿那白滞素或卡那吉努单抗)的组合的评价。相比之下，与更复杂的研究性组合需要抗IL-1β(卡那吉努单抗每两周一次或阿那白滞素每天一次)和可能的糖皮质激素、环孢素和IL-18BP(每两天一次)相比，同时靶向IL-18和IL-1β的双特异性抗体预期允许NLRC4-GOF儿童患者的给药频率显著降低，每2周施用一次并且用单种药剂治疗。此外，对于bbmAb1，本发明人假设，与通过抗IL-1或抗IL-18mAb进行IL-1β或IL-18的单独中和相比，同时中和IL-1β和IL-18的组合可更有力地减弱IFN-γ(和其他促炎性细胞因子)的产生。
BBMAB1
BBMAB1是异二聚体Fc、单价形式的双特异性IgG1单克隆抗体(mAb)，由诺华公司临床阶段的抗IL-1β(ACZ885)和抗IL-18mAb以单分子形式组成。通过同时靶向并中和炎性体效应细胞因子IL-1β和IL-18两者，BBMAB1有潜力在炎性体过度激活以及IL-1β和IL-18两者直接促进疾病病理生理的自身炎症性病症中(如在NLRC4-GOF炎性体病变中)取得优越的临床功效。
非临床数据
非临床药理学
在大多数细胞测定中，BBMAB1以单位数至两位数pM亲和力同时与IL-1β和IL-18两者结合，导致细胞因子信号的亚nM抑制。尽管BBMAB1与IL-1β和IL-18具有单价结合，但BBMAB1中和人IL-1β和IL-18的体外效力与二价卡那吉努单抗和CMK389的范围相同，对原代狨猴细胞的抑制活性类似。
临床数据
临床人体药代动力学
正在健康志愿者(HV)中进行的FIH试验的初步药代动力学数据与基于狨猴数据和模型(即，典型的人IgG1免疫球蛋白)的预测一致。具体地，BBMAB1的终末半衰期为大约20天。i.v.输注结束后不久(大约3.5小时)观察到BBMAB1的峰浓度。对初步数据的评价显示，BBMAB1在0.1至10mg/kg的测试剂量范围内表现出线性PK特性，其中暴露量(Cmax和AUC)与剂量成比例，并且清除率恒定。BBMAB1以100mg的剂量皮下(s.c)施用时，在人体中的生物利用度估计为70％。未观察到对BBMAB1应答的免疫原性。
2.目标和终点
表0-12目标和相关终点
主要估计量
关注的主要临床问题是：
在尽管停止糖皮质激素但BBMAB1治疗大约28周后已达到完全临床应答的NLRC4-GOF患者中，继续BBMAB1治疗在24周内对疾病发作有什么影响？
主要估计量包括以下组分：
1.群体：BBMAB1治疗约28周后已达到完全应答并已停止环孢素和糖皮质激素或正在接受糖皮质激素的维持/置换剂量(<0.2mg/kg/天)的NLRC4-GOF患者。
2.终点：24周内疾病发作的发生。
3.目的治疗：随机分配的研究治疗(BBMAB1或安慰剂的研究性治疗)。
4.并发事件的处理：主要分析将采用治疗政策策略，因此，因发生疾病发作以外的任何原因导致的治疗停止将被忽略。将以与按计划继续治疗的患者相同的方式分析在第2阶段提前停止治疗(不是由于疾病发作)的患者。
5.概述：治疗组之间疾病发作的患者比例的差异。
3.研究设计
如图2所描绘，这是三阶段研究，其中第1阶段为开放标签、单组积极治疗，然后第2阶段为随机退出、安慰剂对照、双盲设计，并且第3阶段为开放标签、长期安全性随访。研究的第1阶段将并入大约8名确诊为NLRC4-GOF的患者，以便在研究的第2阶段随机分配大约8名患者。从筛选至研究结束(EoS)的总研究持续时间预期在3-4年之间。
这项三阶段研究包括：
筛选：
大约30天的阶段，以确认符合研究纳入和排除标准。筛选阶段还允许在第1阶段安全停止或稳定化允许药物的剂量。如果出于患者的最大利益或交通安排原因，可在数天内进行所需的评估。如果结果可用，作为患者常规护理的一部分在筛选前多天完成的实验室测试可用于避免从患者采集另外的血液样品。
在以下情况下，可以延长筛选窗口(如果已获得了知情同意)：
·以便有足够的时间证明停止如纳入和排除标准中列出的当前治疗后存在活动性疾病。
·对于无NLRC4突变的分子诊断记录的患者，允许来自NLRC4突变的分子诊断的结果可用。所有其他筛选评估(知情同意除外)应在分子诊断可用后且在筛选窗口内进行。
基线：
符合资格标准的患者将入院(如果尚未住院)，并在基线访视时进行评估；这可以在第-1天进行，或者可以在给药前与第1天组合进行。
为了减轻患者中潜在的SARS-CoV-2感染，将遵循当地监管机构或当地研究中心特定SOP提供的指南和要求(例如，按照当地研究中心特定SOP，在进入研究/医院研究中心作任何过夜停留之前，可通过PCR或类似获批的方法对患者进行SARS-CoV-2筛选)。
所有基线安全性评估结果必须在给药前获得。如果结果可用，作为患者常规护理的一部分在基线前多天完成的实验室测试可用于避免从患者采集另外的血液样品。
第1阶段，开放标签治疗阶段：
第1阶段是开放标签治疗阶段，以鉴定BBMAB1治疗的应答者，并允许这些患者逐渐减少其糖皮质激素剂量和/或停止环孢素治疗。第1阶段分为3个子部分(第1a、1b和1c阶段)。
符合资格标准的患者将进入第1阶段，并在第1a阶段第1天i.v.输注接受其首剂BBMAB1(10mg/kg)。由于疾病的性质，预料患者可能在第1阶段的持续时间内仍然住院，然而，这不是强制性的，并且研究者应基于患者的病症判断患者何时可以出院。在第1阶段期间，患者将经历如评估时间表(表8-1)中所列出的功效、PK和PD评估。
第1a阶段
第1a阶段的持续时间为4周，其中BBMAB1每2周给药一次。
对于目前接受稳定剂量的糖皮质激素和/或环孢素的患者，这些剂量将在整个第1a阶段保持稳定。不允许逐渐减少糖皮质激素或环孢素。
第29天(第4周)时，将使用PGA、CRP和铁蛋白完成应答评估，并且至少达到部分应答的那些患者将继续进入研究的第1b阶段。在第1a阶段期间未达到部分应答的患者将退出研究。
如果患者在第1a阶段期间停止，患者应在停止后大约1个月内返回以完成第1阶段结束评估(即评估时间表中的第1c阶段第28周)，作为治疗结束访视。
部分和完全应答标准参见第8.3.5部分。
第1b阶段(糖皮质激素逐渐减少和环孢素停止)
第1b阶段的持续时间最长为20周，其中BBMAB1每2周给药一次。患者将在成功完成第1a阶段后进入第1b阶段。
在随机退出阶段(第2阶段)开始时在随机分配前，接受稳定剂量的糖皮质激素的患者将逐渐减少至可能的最低剂量持续4周。类似地，接受稳定剂量的糖皮质激素的任何患者将减少剂量，目的是在随机退出阶段(第2阶段)开始时在随机分配前达到停止环孢素持续4周。逐渐减少糖皮质激素、停止环孢素和患者进入第1c阶段和第2阶段的资格的指南在第6.2.1.1部分给出。
对于在第1b阶段期间未住院的患者，将每周在研究中心致电患者/父母/护理人员，以监测糖皮质激素逐渐减少期间的应答。
在第24周之前符合进入第1c阶段资格标准的患者可以提前进入第1c阶段，但必须在进入第1c阶段之前完成如评估时间表中详述的针对第24周列出的评估。
对于进入研究时(第1a阶段)无糖皮质激素和环孢素(即在第1b阶段无需糖皮质激素逐渐减少或环孢素停止)的患者，在完成第1a阶段后，患者将进入第1b阶段，并且仅完成如针对第1b阶段第22周和第24周列出的评估和治疗，然后进入第1c阶段。这将确保所有患者在研究的第1阶段接受至少12周的BBMAB1治疗。
到第24周时不能减少糖皮质激素剂量或停止环孢素治疗的患者可停止研究。如果患者在第1b阶段期间停止，患者应在停止后大约1个月内返回以完成第1阶段结束评估(即评估时间表中的第1c阶段第28周)，作为治疗结束访视。如在第1阶段结束访视时所评估，已达到部分应答(有或没有糖皮质激素逐渐减少，但已停止环孢素)的患者可由研究者和家属自行决定直接进入第3阶段的开放标签治疗。
部分和完全应答标准参见第8.3.5部分。
第1c阶段
第1c阶段的持续时间为4周，其中BBMAB1每2周给药一次。
患者将在成功完成第1b阶段后，在下一次计划的BBMAB1给药时进入第1c阶段。
继续糖皮质激素治疗的任何患者必须在第1c阶段的整个持续时间内维持稳定的剂量。第1c阶段不允许逐渐减少糖皮质激素，第1c阶段不允许环孢素治疗。
第1c阶段的目的是确保已停止环孢素治疗和/或逐渐减少糖皮质激素并维持低剂量的糖皮质激素的所有患者在进入第2阶段前临床稳定至少4周。
在第1c阶段结束时(第197天，第28周)，将使用PGA、CRP和铁蛋白完成应答评估，并且完全应答的那些患者将随机分配进入研究的第2阶段。不符合完全应答标准但达到部分应答(有或没有糖皮质激素逐渐减少，但已停止环孢素)的患者可由研究者和家属自行决定直接进入第3阶段的开放标签治疗。
如果患者在第1c阶段期间停止，患者应在停止后大约1个月内返回以完成第1阶段结束评估(即评估时间表中的第1c阶段第28周)，作为治疗结束访视。
部分和完全应答标准参见第8.3.5部分。
第2阶段，随机退出阶段：
第2阶段由24周的安慰剂对照、双盲、随机退出阶段组成，主要评估与安慰剂相比，BBMAB1的功效。在第2阶段开始时，BBMAB1应答者(在第1阶段开放标签治疗结束时对治疗完全应答)将以1:1的比率随机分配至BBMAB1治疗(即继续10mg/kg)或安慰剂。
第2阶段随机分配后的首次计划设盲给药将在第1c阶段末次给药后2周，并将继续每2周给药一次，直至发生疾病发作或第2阶段已过去24周。预料患者可能在第2阶段的持续时间内仍然住院，然而，这不是强制性的，并且研究者应基于患者的病症判断患者何时可以出院。
如果患者在第2阶段符合发作标准，则应如评估时间表中详述的进行非预定的访视，停止设盲治疗，并且将患者转移至开放标签BBMAB1治疗，以在第2阶段的剩余时间继续治疗。
如果患者在第2阶段期间停止，患者应在停止后大约1个月内返回以完成第2阶段结束评估(即评估时间表中的第2阶段第24周)，作为治疗结束访视。
完全应答标准和发作标准在第8.3.5部分列出。
第3阶段，长期安全性、开放标签治疗：
第3阶段由3年的长期安全性阶段组成，使用开放标签BBMAB1治疗(10mg/kg)。
第3阶段的首次计划给药将在第1阶段或第2阶段末次给药后2周进行，并继续每2周给药一次。
第3阶段的计划访视频率降低，但继续每2周给药一次。照此，在评估时间表中列出的计划访视之间(第一年每12周一次，然后每26周一次)，在可能的情况下可以使用流动护士在家给药，以在家中施用BBMAB1剂量。在这种情况下，可使用前一个给药日的重量来计算剂量。预料患者在第3阶段期间不会住院，但如果研究者认为有必要，可能适应访视和给药时间表。
对于接受维持剂量的糖皮质激素的患者，建议考虑进一步逐渐减少糖皮质激素，以在可能的情况下完全停止。所有未维持最低部分应答的患者均可停止，除非认为其应答丧失是糖皮质激素逐渐减少的结果。
如果患者在第3阶段期间停止，患者应在停止后大约1个月内返回以完成第3阶段结束评估(即评估时间表中的第3阶段第152周)，作为治疗结束访视。
筛选和基线访视将用于确认符合研究纳入和排除标准，并进行基线临床观察和生物学采样。进入这项研究的患者可以已用阿那白滞素、卡那吉努单抗、依玛鲁单抗和/或研究性IL-18/IL-1/IFN-□□结合或阻断疗法治疗，并可进行筛选。将在筛选大约30天内进入研究，一旦符合活动性疾病的标准，就施用BBMAB1治疗。与经典设计相比，先前治疗过的患者的这种导入期缩短了清除时间，但由于其他治疗选择失败后受试者可能需要紧急进入BBMAB1，因此认为这种做法是合理的。
第1阶段是开放标签、积极治疗阶段，用以鉴定对BBMAB1治疗应答的NLRC4-GOF患者，然后允许接受糖皮质激素和/或环孢素的患者逐渐减少/停止这些疗法。第1a阶段患者最初用两剂BBMAB1治疗，以确保他们在第29天对治疗产生应答，特别是在数周内实现MAS的同时控制和肠道临床表现(小肠结肠炎)的消退。在第1b阶段，接受环孢素和糖皮质激素的明显BBMAB1应答者将停止环孢素，并在最长20周的持续时间内逐渐减停或减少糖皮质激素至维持/置换剂量，以避免在儿童群体中与两种治疗相关的长期发病。第1c阶段确保在第1阶段结束时评估对BBMAB1治疗的应答前，停止糖皮质激素或接受维持/置换剂量的患者临床稳定至少4周。
在随机退出阶段(第2阶段)开始时，对BBMAB1完全应答并已停止糖皮质激素或接受维持/置换剂量的患者将以双盲方式按1:1的比率随机分配以接受BBMAB1或匹配的安慰剂治疗。这种设计允许已退出BBMAB1治疗的患者(安慰剂患者)在达到研究终点(发生疾病发作)后立即重新开始BBMAB1治疗，从而通过最小化患者接受潜在无效疗法的时间来解决临床问题和患者对安慰剂分配的偏好问题。在第2阶段期间任何时间发作的所有患者，将停止设盲治疗，并且将患者转移至开放标签BBMAB1治疗，以便由研究者和家属自行决定是否在第2阶段的剩余时间继续治疗。考虑到病症的罕见性，选择1:1的随机分配比率以使主要分析的统计功效最大化，同时使总体样品量最小化。设盲是合理的，以防止研究设计中以及进行方式的有意或无意偏倚。研究的随机退出阶段的持续时间基于发作的临床试验经验，该发作是在用卡那吉努单抗(例如CAPS和SJIA)治疗的自身炎症性病症的类似儿童群体中以及来自游离IL-18的建模(其中预料水平升高以在缺乏有效疗法的情况下导致NLRC4-GOF发作)。
已对BBMAB1产生应答的患者的长期安全性、开放标签治疗(第3阶段)将允许他们继续BBMAB1治疗并提供长期安全性数据。
剂量/方案的基本原理
目前，在FIH单次给药剂量递增研究中，在健康志愿者和某些具有炎症性障碍且无任何药物相关SAE的患者中对高达10mg/kg i.v.的BBMAB1进行了评价；BBMAB1在人体内的PK如对典型的IgG1抗体与可溶性配体细胞因子靶标结合的预期一样。在能够实现皮下给药的FIH研究的预先计划的PK分析中，BBMAB1显示出与预测的人体PK相匹配的暴露剂量成比例增加。i.v.输注后不久观察到BBMAB1的峰值血清浓度。中位Tmax为从输注开始大约0.146天、或大约3.5小时。Cmax和AUC0-inf以与剂量成比例的方式随剂量递增而增加。BBMAB1浓度呈指数下降，其中平均终末消除半衰期(T1/2)的范围为从21.1至26.3天。分布体积低，平均Vz在0.066与0.083L/kg之间。另外地，BBMAB1以100mg的剂量皮下施用，在给药后约9天观察到Cmax为大约7μg/mL。通过将AUCinf除以100mg s.c.的剂量与AUCinf除以1mg/kg i.v.的剂量进行比较，估计生物利用度为70％(图3)。未观察到对BBMAB1应答的免疫原性。
4.基本原理
剂量/方案的基本原理
具有NLRC4-GOF炎性体病变的儿童患者的血清中具有明显和长期升高的游离IL-18。游离IL-18的动力学潜在地限制了双特异性抗体的功效，并且因此指导NLRC4-GOF患者的给药原则。在正常生理条件下，几乎所有循环IL-18与其结合蛋白(IL-18BP)结合均无生物学活性，然而，在严重的炎症性病症(如NLRC4-GOF炎性体病变)中，IL-18的水平超过可用的IL-18BP，导致较高比例的游离/生物活性IL-18以驱动病理学。通过使用来自NLRC4-GOF突变儿童患者的总IL-18、IL-18BP和游离IL-18(平均38.8pg/ml)测量值(Weiss等人2018)，预期10mg/kg i.v.的BBMAB1剂量快速且持续降低NLRC4-GOF儿童患者的游离IL-18。
用于预测血清中抗IL-18/IL-1β双特异性抗体及其靶标的动力学的模型由描述IL-18组的游离和总IL-18动力学的一般竞争性结合模型(Yan等人2012)和先前公布的卡那吉努单抗模型(Chakraborty等人2012)(对于IL-1β组，参数适用于BBMAB1)组成。使用遍及几种自身免疫性疾病(包括NLRC4-GOF)的患者血清中游离IL-18、总IL-18和IL-18BP的基线值(Weiss等人2018)和内部测量值的参数进行模型调整，并假设新生儿患者的体重为3kg。基于静脉内给药时BBMAB1对游离IL-18影响的模拟，预料在10mg/kg的剂量下完全控制(中和)游离IL-18持续大约14天，同时还中和IL-1β以完全控制炎症综合征，以允许在治疗期间逆转NLRC4-GOF儿童患者的胃肠道病理并控制MAS。
在NLRC4-GOF患者中模拟10mg/kg BBMAB1对游离IL-18和IL-1β的影响，表明立即和持久的应答。相比之下，2mg/kg q2d剂量的rhIL-18BP(他金尼α)(Tak等人2006)的治疗范围以灰色阴影显示(图4)，据报告其在NLRC4-GOF婴儿中临床有效(Canna等人2017，Moghaddas等人2018)并且目前正在第3期研究(NCT03113760)中进行评估，预计10mg/kgq2W剂量的BBMAB1在2周时等效中和游离IL-18，然后在后续多周内将游离/生物活性IL-18完全抑制至与健康个体类似的不可检测水平。
与NLRC4-GOF临床最相关的炎性体病变是CAPS，其由NLRP3-GOF突变引起，这些突变导致IL-1β水平明显升高，可用卡那吉努单抗有效治疗。BBMAB1中和IL-1β的有效剂量已根据用卡那吉努单抗对成人和儿童CAPS患者进行的治疗作了估计。治疗重度CAPS儿童患者所施用的临床有效剂量3mg/kg s.c.q2w的稳态范围作为参考以灰色阴影显示(图4)。
这项研究中BBMAB1剂量10mg/kg i.v.q2w进一步由以下证明是合理的：
·预计该剂量导致游离IL-18和IL-1β的快速和同时中和，从而在NLRC4-GOF患者中并且预期在进入这项研究的儿童患者中快速诱导临床应答，在这些NLRC4-GOF患者中已测量到IL-1β和IL-18的过度升高的水平。
·在FIH中向健康志愿者施用10mg/kg i.v单次剂量，以确立这个剂量的安全性，从而能够治疗具有导致IL-1β和IL-18过表达的功能获得突变(例如，NLRC4突变)的患者(Romberg等人2014)。这个剂量在健康志愿者中已提供了几个月的IL-18和IL-1β组合抑制，并且目前向COVID-19患者施用，未发现安全性问题。
·对NLRC4-GOF儿童患者的IL-18BP治疗建模以估计临床有效BBMAB1剂量，其表明患者应在10mg/kg i.v.q2w下达到持续的临床应答，中和游离IL-18持续大约14天-较低剂量和较长剂量间隔可能无法达到完全应答并且患者会因治疗不充分而存在发作的风险。
·根据卡那吉努单抗治疗重度CAPS儿童患者的临床经验，其中这些患者(尤其是2岁以下儿童患者)可能需要高于通常的剂量(大于卡那吉努单抗8mg/kg)才能达到完全临床应答，并且与成人相比可能需要更频繁的剂量滴定。
·将BBMAB1的pop-PK参数从70kg人到3kg新生儿进行异速缩放预测新生儿和幼小婴儿的每体重清除率更高。因此，预期每剂量较低的暴露量为儿童群体的高剂量提供了合理性，以最大化临床应答。这个群体多次给药后，在拟定剂量10mg/kg i.v.q2w下预料无显著累积。类似地，在较年幼儿童患者中发现基于体重的清除率(L/天/kg)增加并且卡那吉努单抗的暴露量降低(Zhung等人2019)。
·预期研究中的全身暴露量大幅低于26周狨猴研究中达到的暴露量，其中对于3kg的新生儿，AUC的预测暴露量与非临床NOEL暴露量的比率为14.4倍，并且Cmax为14.4倍。
·在NHP 26周毒理学研究中，100mg/kg、每周两次无不良事件(未观察到作用水平)。
总之，由于表型(孤儿)的罕见性和新颖性以及迄今为止BBMAB1的临床经验，基于可用数据并考虑到单个NLRC4-GOF儿童患者的细胞因子水平明显升高，已将10mg/kg q2w的剂量鉴定为可能有效，同时在儿童群体中具有最低的风险。
进入这项研究的儿童患者诊断为NLRC4-GOF，具有活动性疾病的临床证据，有小肠结肠炎、短暂性斑丘疹和/或荨麻疹性皮疹、发热、血细胞减少、肝功能障碍和凝血病的病史。目前，除了支持性医疗护理和在这种人群中获益有限的非特异性免疫抑制外，尚无获批的治疗剂直接并特异性靶向潜在的炎症性过程以改善总体临床结果。
5.研究群体
纳入标准
有资格纳入本研究的患者必须符合以下所有标准：
1.筛选时年龄≤17岁、重量至少3kg的男性和女性患者。
2.在进行任何研究特定评估之前，必须获得儿童患者的父母/法定监护人的书面知情同意书和儿童患者的同意(取决于当地要求)。
3.基因诊断为NLRC4-GOF的患者(如果尚未获得，这种分析可作为筛选程序的一部分进行)。
4.与自身炎症和婴儿小肠结肠炎(AIFEC/NLRC4-GOF)一致的临床史和调查，包括IL-18水平升高(如果尚未获得，这种分析可作为筛选程序的一部分进行)。
5.在首次治疗时(第1阶段的第1天)，存在如通过以下评估的活动性疾病的证据：
a.疾病活动度的PGA>极轻微
以及
b.铁蛋白>600ng/ml
或
c.CRP升高>20mg/l。
排除标准
符合以下任一标准的患者不具有纳入本研究的资格：
1.对任一研究药物或对类似化学分类的药物或对任一赋形剂具有超敏反应史。
2.研究者判断为具有临床意义的全身复发体征和症状和/或活动性细菌、真菌、或病毒感染的证据。如果已经开始适当的疗法，并且在筛选时没有出现感染进展的体征，则认为感染受到控制。感染进展定义为可归因于败血症的血流动力学不稳定性、新症状、恶化的身体体征或可归因于感染的放射学发现。无其他体征或症状的持续发热不视为进展性感染。
3.COVID-19特异性：如果符合卫生和政府机构指南，强烈建议在首次给药前1周内完成COVID-19的PCR或类似获批的方法。如果进行测试，则在进入研究前要求测试结果为阴性。另外的测试可由研究医师自行决定。对于儿童患者，应经由鼻拭子或咽拭子或其他获批的途径完成COVID-19测试。如果不进行测试，则研究者必须在源文件中记录其与患者/父母/护理人员关于测试的讨论以及不进行测试的基本原理。如果研究中心所在国家宣布大流行结束，则可以忽略这个要求，并且如果大流行复发，则恢复这个要求。
4.研究者认为患者接受BBMAB1疗法存在不可接受的风险的任何病症或重大医学问题(在不确定的情况下，可与诺华公司逐例讨论)。
5.BBMAB1治疗前，在过去28天内或免疫调节治疗抗体(或如6.2.2禁止的治疗部分列出的)的5个半衰期内(以较长者为准)，使用抗排斥和/或免疫调节药物进行先前治疗。
6.例外情况是：
7.BBMAB1治疗前，稳定的糖皮质激素剂量≤1.0mg/kg/天(60kg以上儿童最大为60mg/天)，以1-2次剂量的口服泼尼松(或等效药物)持续至少3天
8.BBMAB1治疗前稳定的环孢素剂量<5mg/kg/天持续至少3天
9.必须停止阿那白滞素、卡那吉努单抗、依玛鲁单抗和/或研究性IL-18/IL-1/IFN-γ结合或阻断疗法(参见第6.2.2部分)。一旦符合活动性疾病的证据标准，患者就可以接受BBMAB1治疗(根据纳入7)。
10.给药前4周内或如果当地法规要求的更长时间内参与任何其他研究性试验，用阿那白滞素、卡那吉努单抗、依玛鲁单抗和/或研究IL-18/IL-1/IFN-γ结合或阻断疗法治疗除外。
11.筛选时阳性的HIV测试结果(ELISA和蛋白质印迹)。3个月内的事先测试证据充分。
12.阳性的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)或丙型肝炎测试结果。3个月内的事先测试证据充分。
13.筛选时存在如由阳性TB测试所定义的结核感染。3个月内的事先测试证据充分。
14.BBMAB1治疗前1个月内、试验期间、和末次给药后3个月内接种活疫苗。
15.在过去5年内已治疗的或未治疗的任何器官系统的恶性肿瘤史(局部皮肤基底细胞癌或原位宫颈癌除外)(无论是否存在局部复发或转移的证据)。
16.孕妇或哺乳(哺乳期)女性，其中妊娠被定义为女性受孕后直到妊娠终止的状态，如通过阳性hCG实验室测试证实。
17.有生育潜能(或坦纳氏2期或以上)且性活跃或可能性活跃的女性患者必须被告知BBMAB1的潜在致畸风险，以及需要并同意在接受BBMAB1疗法时使用高效避孕方法预防妊娠；
必须在研究期间和停止BBMAB1治疗后5个月内使用高效避孕(禁欲，口服、注射或植入激素避孕方法或放置宫内节育器(IUD)或宫内节育系统(IUS)或具有相似功效的其他形式的激素避孕(失败率<1％)，例如激素阴道环或透皮激素避孕)，此时预计IL-18和IL-1β不会被BBMAB1中和。应至少每3个月回顾避孕方法的决定，以评价个体需求和所选方法的相容性。
6.治疗
6.1.研究治疗
研究治疗物的储存和管理要求的细节以及患者编号、开处方/分配和服用研究治疗物所依据的说明书在药房手册中进行了概述。
6.1.1.研究药物和对照药物
BBMAB1仍在开发中，研究药物和对照药物将以与1期研究和2期研究中相同的方式施用。研究药物BBMAB1和匹配的安慰剂将由诺华公司制备，并作为开放标签的散装药物提供给不设盲的研究中心的药剂师(表6-1)。要求不设盲的药剂师或授权的指定人员分发研究药物。由研究人员按照指定的研究程序在临床中心在大约120min内以i.v.输注来施用药物。
在限制或阻止在研究中心进行研究访视的流行病或大流行(例如COVID-19大流行)期间，可安排研究中心工作人员到患者家中访视，以便如当地法规所允许的按照方案继续研究治疗。
表0-13研究药物
6.1.2.另外的研究治疗
本试验中不包括研究药物之外的其他治疗。研究中心将提供除研究治疗之外的支持性治疗施用。
6.1.3.治疗组(arm/group)
第1阶段——开放标签治疗阶段
患者将在第1天分配至BBMAB1 10mg/kg q2w i.v.的剂量。
第2阶段——随机退出阶段
应答性患者将在第1阶段结束时以1:1的比率随机分配到以下治疗组之一：
·BBMAB1 10mg/kg i.v.q2w
·匹配的安慰剂i.v.q2w
第3阶段——长期安全性
患者将在第2阶段结束时分配至BBMAB1 10mg/kg q2w i.v.的剂量。
6.1.4.试验后访问
只要存在对患者有临床益处的证据，诺华公司将按当地法律的要求或允许，向完成参与研究的患者提供BBMAB1，或提供BBMAB1直至：
·研究者停止治疗，
·产品或可替代治疗可商购。
6.2.一种或多种其他治疗
6.2.1.伴随疗法
应将患者进入研究前六个月内用于治疗NLRC4-GOF而施用的所有关键药物、程序和重要的非药物疗法(包括物理疗法和输血)(如可获得)记录在适当的病例报告表中。
在患者进入研究后所施用的所有药物、程序和重要的非药物疗法(包括物理疗法和输血)必须记录在适当的案例报告表中。
必须针对所有排除标准/禁止的药物对每种伴随药物进行单独评估。如有疑问，研究者应在让患者进入或允许开始新药治疗之前联系诺华公司的医学监测员。如果患者已经进入，请联系诺华公司以确定患者是否应继续参与研究。
在研究过程期间并且还在筛选前，患者可以接受胃保护、叶酸、对乙酰氨基酚、NSAID、镇痛药、抗生素、血管加压剂和营养补充剂(例如维生素、液体补充剂、肠内营养、全胃肠外营养)和其他药剂/治疗，其中这些形成患者参与研究中心NLRC4-GOF支持性治疗的一部分(根据医学判断)。
6.2.1.1.需要谨慎和/或采取行动的允许的伴随疗法
第1阶段——糖皮质激素逐渐减少
在第1a阶段的4周治疗期间，为了稳定接受BBMAB1的患者，允许接受稳定剂量的糖皮质激素的患者进入研究，并接受首剂BBMAB1(10mg/kg)的i.v.给药。应在第1a阶段的整个持续时间内维持糖皮质激素的剂量，直至至少第29天。
第29天后，在随机退出阶段(第2阶段)开始时，研究者应逐渐减少糖皮质激素以逐渐降低该剂量，目的是在随机分配前达到停止糖皮质激素(根据医学判断)或达到<0.2mg/kg/天的糖皮质激素(泼尼松或等效药物)的稳定维持剂量持续4周。
·如果患者达到至少部分应答，则可在第29天后开始逐渐减少类固醇(第8.3.5部分)。
表6-14糖皮质激素逐渐减少指南
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·如果出现以下情况，可进一步逐渐减少：
1.在每周研究中心致电期间的研究访视之间，基于对电话脚本问卷的回答，患者/父母未报告任何应答丧失。
2.在研究中心访视期间，患者对BBMAB1维持至少部分应答。
·糖皮质激素逐渐减少将继续至以下情况之一首先发生：
1.患者达到了停止糖皮质激素并且未使用类固醇。
2.患者糖皮质激素逐渐减少的最长持续时间已达到20周。
3.患者三次糖皮质激素逐渐减少尝试均失败。
·未能维持对BBMAB1至少部分应答的所有患者均可停止研究，除非认为应答丧失是糖皮质激素逐渐减少的结果。
1.如果患者在逐渐减少糖皮质激素的同时丧失对BBMAB1的应答，则将糖皮质激素的剂量增加到先前的水平并允许患者留在第1b阶段；将维持增加的类固醇剂量持续至少2周。如果患者在增加到先前的类固醇剂量后，在初始事件后超过2周仍无应答，则患者可停止研究。
2.对于逐渐减少期间丧失应答的患者，只有当患者已接受稳定的类固醇剂量至少2周且患者至少具有部分应答时，才可随后尝试逐渐减少类固醇。
如果符合下列情况之一，则患者有资格直接进入研究的第2阶段：
1.达到了停止糖皮质激素并且持续4周未使用类固醇的任何患者。
2.达到稳定维持剂量≤0.2mg/kg/天的糖皮质激素(泼尼松或等效药物)持续4周的患者。
根据当地指南，长期接受糖皮质激素治疗的患者可偶尔需要应激剂量的类固醇(例如，用于儿童期感染或医疗程序)，与NLRC4-GOF无关。研究者应在病例报告表中记录其施用应激剂量的类固醇的临床基本原理，并且如有疑问，请联系诺华公司医学监测员(第6.2.1部分)。
如果患者在第1阶段期间停止，应完成第1阶段结束评估(即评估时间表中的第1c阶段第28周)作为治疗结束访视。如在第1阶段结束访视时所评估，已达到部分应答(有或没有糖皮质激素逐渐减少，但已停止环孢素)的患者可由研究者和家属自行决定直接进入第3阶段的开放标签治疗。
第2阶段——糖皮质激素(随机退出阶段)
在第2阶段期间，在第1c阶段中达到稳定维持剂量≤0.2mg/kg/天的糖皮质激素(泼尼松或等效药物)的患者应维持该剂量，并且在第2阶段中不允许逐渐减少糖皮质激素。
救援药物-糖皮质激素
根据医学判断和当地指南，允许发作的患者(见第8.3.5部分)在有限的时间段内接受增加的糖皮质激素维持剂量或间歇性糖皮质激素治疗作为救援药物持续有限的时间段。
第1阶段——环孢素停止
在第1a阶段的4周治疗期间，为了稳定接受BBMAB1的患者，允许接受稳定剂量的环孢素的患者接受BBMAB1治疗。研究者应维持环孢素的剂量稳定，持续第1a阶段的整个持续时间直至至少第29天。
第29天后，研究者应逐渐减少环孢素的剂量(根据医学判断)，目的是在随机退出阶段(第2阶段)开始时在随机分配前达到停止环孢素持续4周。
·如果患者达到至少部分应答，则可在开始减少环孢素(第8.3.5部分)。
·环孢素剂量减少将继续至以下情况之一首先发生：
·患者达到了环孢素停止。
·患者环孢素停止的最长持续时间已达到20周。
·患者三次环孢素停止尝试均失败。
如果患者已停止环孢素持续4周，则这些患者有资格直接进入研究的第2阶段。
未能对BBMAB1维持至少部分应答并停止环孢素的所有患者均可停止研究。如在第1阶段结束访视时所评估，已达到部分应答(有或没有糖皮质激素逐渐减少，但已停止环孢素)的患者可由研究者和家属自行决定直接进入第3阶段的开放标签治疗。
如果患者在第1阶段期间停止，应完成第1阶段结束评估(即评估时间表中的第1c阶段第28周)作为治疗结束访视。如在第1阶段结束访视时所评估，已达到部分应答(有或没有糖皮质激素逐渐减少，但已停止环孢素)的患者可由研究者和家属自行决定直接进入第3阶段的开放标签治疗。
避孕
接受BBMAB1治疗时允许使用口服、注射或植入激素避孕方法。
6.2.2.禁止的药物
第1天之前(第1天前的时间间隔详见下文)和整个研究期间不允许以下治疗：
·第1天之前4周内的依那西普(Etanercept)
·第1天之前8周内的阿达木单抗(Adalimumab)
·第1天之前12周内的英夫利昔单抗(Infliximab)
·第1天之前8周内的托珠单抗(Tocilizumab)
·第1天之前12周内的维多利珠单抗(Vedolizumab)
·第1天之前8周内的i.v.免疫球蛋白(i.v.Ig)
ο第1天之前的过去30天内或5个半衰期内(以时间较长者为准)的任何其他研究性或非研究性免疫调节治疗抗体
·第1天之前4周内的来氟米特(Leflunomide)
·第1天之前4周内的沙利度胺(Thalidomide)
·第1天之前12周内的6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、环磷酰胺或苯丁酸氮芥
·第1天之前4周内的他克莫司(Tacrolimus)
·第1天之前4周内的秋水仙碱、氨苯砜、霉酚酸酯
·第1天之前4周内的鲁索替尼(Ruxolitinib)和其他JAK抑制剂
ο第1天之前过去28天内的任何其他研究性或非研究性抗排斥和免疫调节药物
·根据患者的临床病症，接受糖皮质激素治疗的患者可按需要继续。在BBMAB1治疗前，糖皮质激素的剂量应稳定至少3天(第1阶段期间糖皮质激素的逐渐减少参见第6.2.1.1部分)。
·根据患者的临床病症，接受环孢素治疗的患者可按需要继续。在BBMAB1治疗前，环孢素的剂量应稳定至少3天(第1阶段期间环孢素的停止参见第6.2.1.1部分)。
·接受阿那白滞素、卡那吉努单抗、依玛鲁单抗和/或研究性IL-18/IL-1/IFN-γ结合或阻断疗法治疗的患者需要停止该治疗。一旦符合活动性疾病的证据标准(5.1纳入标准部分)，患者就可以接受BBMAB1治疗。这种导入期将经典的清除期缩短至具有医学意义的时间，并避免患者在根据方案预先定义的清除期对于个体患者太长的情况下遭受不必要的痛苦。
·第1阶段第1天之前4个月内、试验期间、和末次给药后3个月内没有接种活疫苗。根据研究者的判断和按照当地指南，可允许获批的杀死的疫苗、灭活的疫苗、肽疫苗、DNA疫苗和RNA疫苗。
诺华公司认定合格的医疗人员将可以为研究者提供关于伴随疗法和禁止的药物的与试验相关的医疗问题的建议
6.2.3.救援药物
可使用增加的糖皮质激素维持剂量或间歇性类固醇治疗作为救援治疗。关于向研究患者施用糖皮质激素的信息见第6.2.1.1部分，其中描述了本研究期间糖皮质激素的使用和逐渐减少。
必须在CRF的伴随药物页面中记录救援药物的使用。
治疗后无改善、在第1阶段第29天不符合部分应答标准、或不是由于第1c阶段期间糖皮质激素逐渐减少而导致发作的患者可停止研究，并根据医学判断和当地实践进行治疗。已获得至少部分应答并停止环孢素的患者可以有资格进入第3部分，在那里他们将接受BBMAB1。
处方和接受研究治疗的说明
表0-15剂量和治疗时间表
8.访视时间表和评估
评估时间表(表8-1)列出了进行评估时的所有评估。从这些评估中获得的所有数据必须有患者源文件的支持。
应按照评估时间表(表8-1)或尽可能接近指定日期/时间，对患者进行所有访视/评估。
错过或重新安排的访视不应导致自动停止。出于任何原因过早停止研究的患者应尽快安排访视，在此时进行最终访视列出的所有评估。在最终访视时，应调停所有分配的研究产品，并在CRF上记录不良事件和伴随药物。
在第3阶段，为了在如表8-1中列出的计划研究访视之间维持q2w给药，根据当地法规和能力，可能由流动护士进行家庭给药访视。每次给药时，将测量重量并评价任何AE(由研究者或适当的指定研究团队成员基于从流动护士处获得的信息进行AE评估)。先前给药日的重量可用于家庭给药访视的剂量计算。
如果流行病或大流行(例如，COVID-19大流行)限制或阻止了在研究中心进行研究访视，可实施提供持续护理的可替代方法。在大流行期间，根据当地法规和能力，致电、与患者虚拟接触(例如远程会诊)、或由研究中心工作人员到患者家中进行访视可以替代在研究中心进行研究访视，直至患者再次访问研究中心是安全的。
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8.1.筛选
筛选
如果患者初始筛选失败，允许重新筛选；但是，每个病例都必须与赞助商个案处理的基础上讨论并达成一致。重新筛选的患者必须重新签署知情同意书，并且必须完成重新筛选CRF。
如果筛选时的安全性实验室评估超出排出标准中指定的范围，则可以在进入治疗之前重复评估一次。如果重复值保持在指定范围之外，则必须将患者排除在本研究之外。
8.1.1.合格性筛选
8.1.1.1.肝炎筛选、HIV筛选
适当时，可对患者进行乙型肝炎表面抗原(HBsAg)筛选，并且在标准地方惯例(standard local practice)下，进行乙型肝炎核心抗原(HBcAg)筛选。丙型肝炎筛选将基于HCV抗体，并且如果为阳性，应确定HCV RNA的水平。如果可用，可以使用先前3个月的阴性测试结果。
将对HIV血清阳性进行评价，并且如果为阳性，将通过实验室中心可用的第二种技术(例如蛋白质印迹)进行确认。在确认性测试为阳性的情况下，研究者将提供可用的适当咨询。研究者负责按照法律的要求通知州和联邦机构。如果可用，可以使用先前3个月的阴性测试结果。
8.1.2.结核(TB)测试
为了评价患者的TB状态，可在筛选时根据当地法规/指南使用以下方法之一进行TB测试：
·-TB测定
·胸部x射线
如果可用，可以使用先前3个月的阴性测试结果。
如有必要，将在eCRF的相关病史/当前医学病症部分记录任何重大的发现。
8.1.3.筛选失败时收集的信息
签署知情同意/赞同书的患者(或父母/法定监护人)在随后发现患者不合格的情况下将被视为筛选失败。应在适用的病例报告表(处置表)中输入筛选失败的原因。筛选失败患者还必须完成访视信息、人口统计信息、知情同意书、纳入/排除、NLRC4-GOF病史和处置页。对于筛选失败的患者，不会将其他数据录入临床数据库，除非患者在筛选期期间经历严重不良事件。研究者将对不属于SAE的不良事件进行随访，并且仅记录在患者的源数据中。
签署知情同意/赞同书的患者(或父母/法定监护人)在患者被认为合格但出于任何原因而未能开始治疗的情况下将被视为提前终止者。应在适当的处置病例报告表(处置页)中记录提前终止的原因。如果患者(或父母/法定监护人)在筛选期自愿退出参与研究，则必须完成访视信息、人口统计信息、知情同意书、NLRC4-GOF病史、纳入/排除页、撤回知情同意书和处置。
8.2.患者人口统计/其他基线特征
人口统计信息
对于人口统计和基线特征的收集，应考虑与CRF一致的国家特定法规。收集并分析患者人种和民族，以鉴定这些因素导致的安全性或功效变化，以及按卫生机构的要求评估研究群体的多样性。
患者人口统计：将在eCRF中记录出生年份(年龄)、性别、人种、主要民族(如果允许)和相关病史/当前医学病症(直至签署知情同意书的日期)。在可能的情况下，应记录诊断而非症状。应记录疫苗接种状态，作为病史/当前医学病症收集的一部分。
NLRC4-GOF病史和诊断
应在eCRF中记录患者病症的详细病史，以表明患者的病症是如何管理和诊断的。细节(包括评估日期)应包括：
·表现的症状
·NLRC4-GOF的分子诊断(如果尚无，可在筛选时由研究中心根据当地获批的诊断程序进行)
·IL-18的测定水平(如果尚无，可在筛选时由研究中心根据当地获批的诊断程序进行)
·治疗干预和结果/应答
·发作的时间和次数
·具有临床意义的实验室值，例如细胞因子、CRP、铁蛋白
·营养支持
·住院
·家族史
·任何其他研究
·被认为具有临床相关性的任何其他临床相关信息，以支持对疾病或诊断的更广泛理解
如在6.2.1伴随疗法部分所列出，在可能的情况下应记录患者进入研究前六个月内用于治疗NLRC4-GOF而施用的所有关键药物、程序和重要的非药物疗法(包括物理疗法和输血)。
关于必须记录在eCRF的适当页面上的信息的另外的细节，参见方案6.2.1伴随疗法部分。
8.3.功效
将在评估时间表(表8-1)中定义的时间点进行功效评估。
如果流行病或大流行(例如，COVID-19大流行)限制或阻止了在研究中心进行研究访视，可实施提供持续护理以及收集功效评估的可替代方法。
8.3.1.疾病活动度的医师整体评估(PGA)
将在评估时间表(表8-1)中列出的时间点评估医师对疾病的整体评估(PGA)(附录4)。
PGA将在当地实验室提供CRP结果之前进行，以防止评价偏倚。鼓励一位研究者在整个研究期间评估同一患者，以确保评估之间的一致性。
医师的整体评估将基于5分量表：
·0＝缺乏(无)疾病相关临床体征和症状
·1＝极轻微的疾病相关体征和症状
·2＝轻度疾病相关体征和症状
·3＝中度疾病相关体征和症状
·4＝重度疾病相关体征和症状
8.3.2.疾病体征和症状的医师严重程度评估
将在评估时间表(表8-1)中列出的时间点评估关键疾病特定体征和症状的医师严重程度评估(附录5)。
鼓励一位研究者在整个研究期间评估同一患者，以确保评估之间的一致性。将评估以下体征和症状：
·腹痛
·腹泻
·皮肤疾病
·发热
·心动过速
关键疾病特定体征和症状的医师严重程度评估将基于5分量表：
·0＝无
·1＝极轻微
·2＝轻度
·3＝中度
·4＝重度
8.3.3.炎症标志物
CRP和铁蛋白将由当地实验室如表8-1所示进行测量。在可能的情况下，应包括分析作为常规安全性实验室监测的一部分，以避免另外的样品采集。
8.3.4.疾病活动度的患者/父母整体评估(PPGA)
将在纸质CRF上收集疾病活动度的患者评估(PPGA)，以转录至电子CRF中(附录6)。
PPGA应在任何给定访视的任何临床评估之前完成。根据当地指南，取决于患者的年龄，该文件需要由患者或父母/护理人员在表8-1中列出的时间点填写。在可能的情况下，父母/护理人员可以提供帮助。但是，为了保持一致性，整个研究期间应由同一评价者(相同的患者或父母/护理人员)进行评估。
将指导患者或父母/护理人员完成PPGA。
研究者或研究中心工作人员不应给予影响PPGA回答的口头或非口头提示。研究者或研究中心工作人员仅允许检查文件的完整性。
PPGA基于5分量表：
·0＝缺乏(无)疾病相关临床体征和症状
·1＝极轻微的疾病相关体征和症状
·2＝轻度疾病相关体征和症状
·3＝中度疾病相关体征和症状
·4＝重度疾病相关体征和症状
8.3.5.对治疗的应答标准
对治疗的应答将通过PGA(第8.3.1部分)和炎症标志物(第8.3.3部分)收集。
第1阶段
完全应答：如果出现以下情况(将在同一天评估)，则认为患者具有完全应答：
·疾病活动度的医师整体评估为极轻微或更佳并且
·铁蛋白和/或CRP较基线降低60％或以上或铁蛋白(<400ng/mL)和/或CRP(<10mg/L)正常化。
部分应答标准：如果出现以下情况(将在同一天评估)，则认为患者具有不完全(部分)应答：
·疾病活动度的医师整体评估较基线改善一步并且
·铁蛋白或CRP较基线降低30％或以上。
第2阶段
发作标准：如果出现以下情况(将在同一天评估)，则认为患者具有发作：
·疾病活动度的医师整体评估>极轻微并且
·铁蛋白和/或CRP水平较第2阶段进入水平升高60％或以上或水平正常化的患者铁蛋白升高>2500ng/mL和/或CRP升高>20mg/L。
研究者在获取用于对治疗应答的标准的炎症标志物时，应根据医学判断排除该儿童研究群体中CRP或铁蛋白变化的可替代的常见原因(例如，儿童期感染、补充铁、输血)。
表0-17临床实验室安全性评估(当地)*
9.功效和/或一个或多个药效学终点
本部分将使用各研究阶段的FAS进行分析。
将分析以下次要功效终点：
·第29天、第1阶段和第2阶段结束时的应答
·第29天、第1阶段和第2阶段结束时的血清学缓解
·第1阶段中糖皮质激素疗法至<0.2mg/kg/天
·第2阶段中首次发作的时间
·NLRC4 GOF疾病体征和症状的医师严重程度评估
·NLRC4 GOF疾病活动度的患者/父母整体评估
·NLRC4 GOF疾病活动度的医师整体评估
将计算第29天和此后直至第1阶段结束时对BBMAB1治疗有应答的患者比例。BBMAB1治疗完全应答者的定义在方案的第8.3.5部分给出。还将在第2阶段结束时评价完全应答的患者比例。
炎症标志物(CRP和铁蛋白)将通过治疗和访视汇总。
将在第29天、第1阶段和第2阶段结束时评价达到血清学缓解的患者比例。
将计算第29天后直至第1阶段结束时达到糖皮质激素逐渐减少和环孢素减少的患者比例。糖皮质激素逐渐减少和环孢素减少的定义在方案的第6.2.1.1部分给出。
发作
将如方案的第8.3.5部分中发作标准给出的，通过疾病活动度的医师整体评估、铁蛋白和/或CRP对发作进行评估。
将按第2阶段的治疗汇总首次发作的时间。将提供治疗组的具有单独的线的卡普兰迈耶(Kaplan Meier)图，用于图形化表示。
其他功效终点
将按治疗和访视提供疾病体征和症状的医师严重程度评估、疾病活动度的患者/父母整体评估和疾病活动度的医师整体评估的绝对值和较基线变化的汇总统计。将按访视呈现由医师和患者/父母评估的每种症状的频率表。将按治疗和访视计算严重程度评分(无、极轻微、轻度、中度、重度)的频率分布。
10.参考文献
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Zhao Y,Yang J,Shi J et al(2011)The NLRC4 inflammasome receptors forbacterial flagellin and type III secretion apparatus.Nature；477:596-600.附录
附录1：临床明显的实验室值和生命体征
研究者将在向诺华公司提供以下定义的明显实验室或生命体征异常的同时告知诺华公司。诺华公司将确定与一个或多个研究者进一步协商是否适当。
儿童患者(<16岁)中新发生的选择的明显实验室异常：
·白蛋白：<LLN
·AST、ALT、以及ALT或AST*升高>3x-、5x-、10x-、和20x ULN
·胆红素的任何升高；胆红素升高至>1.5x ULN、以及至>2xULN*
·任何ALP升高>1.5x ULN*
·ALT和/或AST升高(>3x ULN)伴胆红素升高(>1.5x ULN、>2x ULN)*
·γ-谷氨酰转移酶(GGT)：>3x ULN
·肌酐(血清)：≥1.5x ULN
·钾：≥5.5mmol/L、或≤3.5mmol/L
·镁：≥1.2mmol/L、或≤0.7mmol/L
·钠：≥150mmol/L、或≤130mmol/L
·血红蛋白：较基线降低≥2g/dL、或<8.5g/dL
·血小板计数：<正常下限(LLN)
·白细胞计数：≤0.8x LLN或≥1.2x ULN
·中性粒细胞：≤0.9x LLN或≥1.2x ULN
·嗜酸性粒细胞：≥1.1x ULN
·淋巴细胞：<LLN或≥1.1x ULN
·尿蛋白试纸：阳性(痕量，≥+)
儿童患者(<16岁)中明显的生命体征异常：
·收缩/舒张期血压1：
·高：≥年龄和身高组的第95个百分位数
·低：≤年龄和身高组的第5个百分位数
·口腔体温(℃)
·高：≥38.4℃
·低：≤35.0℃
·脉搏(bpm)：参考表16-1
表0-18儿童群体的异常脉搏率(bpm)2
·重量：
·高：较基线3增加≥2年龄BMI百分位数类别4
·低：较基线3降低≥2年龄BMI百分位数类别4
·呼吸速率：参考表16-2
表0-19儿童群体的异常呼吸速率(次/分钟)2，5
1使用The Fourth Report on the Diagnosis,Evaluation and Treatment ofHigh Blood Pressure in Children and Adolescents[儿童和青少年高血压诊断、评价和治疗的第四次报告](Anon 2004)附录B中描述的方法计算每个血液BP记录的血压百分位数。
2Fleming S等人2011。
3基线年龄BMI重量状态类别为体重过轻(小于第5百分位数)、健康体重(第5百分位数至小于第85百分位数)、超重(第85百分位数至小于第95百分位数)和肥胖(等于或大于第95百分位数)；
4从WHO生长图表(www.who.int/childgrowth/en/)(WHO 2020)中获得年龄BMI百分位数类别(P3、P5、P10、P25、P50、P75、P85、P90、P95、P97)；
注意：对于小于2岁的患者，生长图表是基于卧位长度而不是身高；
5Kou R和Shuei L 2009。
注意：仅基线后值将被标记为明显异常
成人患者(≥16岁)中新发生的选择的明显实验室异常：
·白蛋白：<LLN
·AST、ALT、以及ALT或AST*升高3x-、5x-、10x-、和20x ULN
·胆红素的任何升高；胆红素升高至>1.5x ULN、以及至>2xULN*
·任何ALP升高>1.5x ULN*
·AST和/或ALT升高(>3x ULN)伴胆红素升高(>1.5x ULN、>2x ULN)*
·γ-谷氨酰转移酶(GGT)：>3x ULN
·肌酐(血清)：≥1.5x ULN
·肌酐清除率：(Cockroft-Gault公式)§：较基线降低≥25％
·钾：≥5.5mmol/L、或≤3.0mmol/L
·镁：≥1.5mmol/L、或≤0.5mmol/L
·钠：≥150mmol/L、或≤130mmol/L
·钙：≥1.2x ULN或<正常下限(LLN)
·血红蛋白：较基线降低≥2g/dL、或<10.0g/dL
·血小板计数：<LLN
·白细胞计数：≤0.8x LLN或≥1.2x ULN
·中性粒细胞：≤0.9x LLN或≥1.2x ULN
·嗜酸性粒细胞：≥1.1x ULN
·淋巴细胞：<LLN或≥1.1x ULN
·尿蛋白试纸：≥++
成人患者(≥16岁)中新发生的选择的明显生命体征异常：
·收缩/舒张期血压：较基线降低≥25％或升高≥25％或达到≥140/90
·脉搏：≥110bpm且较基线变化≥15％，或<50bpm且较基线变化≥15％
*来源：Draft October 2007FDA Guidance for Industry Drug-Induced LiverInjury:Premarketing Clinical Evaluation[2007年10月FDA行业指南草案药物诱发的肝损伤：上市前临床评价](FDA 2007)
Cockroft-Gault公式(男性)：肌酐清除率(mL/min)＝[((140-年龄(岁))x重量(kg))/(血清肌酐(μmol/L)/88.4)(mg/dL)x 72]
Cockroft-Gault公式(妇女)：肌酐清除率(mL/min)＝[((140-年龄(岁))x重量(kg))/(血清肌酐(μmol/L)/88.4)(mg/dL)x 72]x 0.85
注意：仅基线后值将被标记为明显异常
表0-20血压袖带气囊的推荐尺寸
来源：Feld和Corey Pediatrics in review[儿科学评论](2007)
附录2：过敏反应
当满足以下3项标准中的任一项时，极有可能发生过敏反应：
1.涉及皮肤、粘膜组织、或两者的疾病急性发作(数分钟至几个小时)(例如，泛发性荨麻疹、瘙痒或潮红、唇-舌-悬雍垂肿胀)
且符合以下至少一项：
a.呼吸受损(例如，呼吸困难、喘息-支气管痉挛、喘鸣、PEF降低、低氧血症)
b.BP降低或相关终末器官功能障碍症状(例如，张力减退[虚脱]、晕厥、失禁)
2.患者暴露于可能的过敏原后迅速出现以下两种或多种情况(数分钟至几个小时)：
a.皮肤黏膜组织受累(例如，泛发性荨麻疹、瘙痒或潮红、唇-舌-悬雍垂肿胀)
b.呼吸受损(例如，呼吸困难、喘息-支气管痉挛、喘鸣、PEF降低、低氧血症)
c.BP降低或相关症状(例如，张力减退[虚脱]、晕厥、失禁)
d.持续性胃肠道症状(例如，腹部绞痛、呕吐)
3.患者暴露于已知过敏原后BP降低(数分钟至几个小时)：
a.成人：收缩BP低于90mm Hg或较基线降低大于30％。
附录3：多伦多病童医院研究伦理委员会(The Toronto Hospital for SickChildren Research Ethics Board)(REB)采血指南
多伦多病童医院研究伦理委员会的以下建议将用于指导研究者在研究期间采集的最大血量。研究者应密切监测总采血量，以确保遵守指南中列出的限度或IRB/EC的当地限制。
对于婴儿、儿童和青少年的研究，该指南允许在八周的时间段内单次或分次抽取总血量为患者总血量的最多5％。
表0-21血量随年龄变化，因此每kg的可用量为：
改编自The Hospital for Sick Children Research Ethics Board BloodSampling Guide[病童医院研究伦理委员会血液采样指南](Anon 2017)。
附录4：疾病的医师整体评估(PGA)
NLRC4-GOF疾病活动度的医师整体评估
(PGA)
NLRC4-GOF的医师整体评估
附录5：疾病体征和症状的医师严重程度评估
NLRC4-GOF疾病体征和症状的医师严重程度评估
1.腹痛的评估
2.腹泻的评估
3.皮肤疾病的评估
4.发热的评估
5.心动过速的评估
附录6：疾病活动度的患者/父母整体评估(PPGA)
NLRC4-GOF疾病活动度的患者/父母整体评估
(PPGA)
患者/父母整体评估
请对您/您孩子今天的NLRC4-GOF相关症状的整体严重程度进行评级
实例5
一名成人患者和一名婴儿患者(各表现出NLRC4-GOF的体征和症状)静脉内施用同时靶向IL-1b和IL-18两者的bbMab1双特异性抗体，剂量为10mg/kg，每两周一次。如上所述，通过PGA评价临床应答。两名患者均表现出临床和血清学应答。观察到血清学缓解。两名患者均表现出炎症标志物减少。例如，两名患者均表现出血清CRP降低。一名患者表现出血清铁蛋白降低。
序列表
表22中披露了用于实施本发明的有用的氨基酸和核苷酸序列。
表22.根据本发明的实施例的序列
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
在本申请的全文中，如果说明书文本(例如，表22)与序列表之间存在差异，则以说明书文本为准。
序列表
<110> 诺华股份有限公司（NOVARTIS AG）
<120> 用于在治疗NLRC4-GOF炎性体病变中使用的双特异性抗体
<130> PAT058994-US-PSP
<140>
<141>
<150>
<151>
<160> 104
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 1
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 2
Asn Ile Ile Pro Met Thr Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 3
Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 4
Gly Gly Thr Phe Lys Ser Tyr
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 5
Ile Pro Met Thr Gly Gln
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 6
Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 7
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Lys Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Ile Pro Met Thr Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 356
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 8
gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcagcag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcgg caccttcaag agctacgcca tcagctgggt gaggcaggcc 120
cccggccagg gcctggagtg gatgggcaac atcatcccca tgaccggcca gacctactac 180
gcccagaagt tccagggcag ggtgaccatc accgccgacg agagcaccag caccgcctac 240
atggagctga gcagcctgag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggccgcc 300
taccaccccc tggtgttcga caactgggcc agggcaccct ggtgaccgtg agcagc 356
<210> 9
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Lys Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Ile Pro Met Thr Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 10
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 10
gaggtgcagc tggtgcagag cggcgccgag gtgaagaagc ccggcagcag cgtgaaggtg 60
agctgcaagg ccagcggcgg caccttcaag agctacgcca tcagctgggt gaggcaggcc 120
cccggccagg gcctggagtg gatgggcaac atcatcccca tgaccggcca gacctactac 180
gcccagaagt tccagggcag ggtgaccatc accgccgacg agagcaccag caccgcctac 240
atggagctga gcagcctgag gagcgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggccgcc 300
taccaccccc tggtgttcga caactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagcgcc 360
agcaccaagg gccccagcgt gttccccctg gcccccagca gcaagagcac cagcggcggc 420
accgccgccc tgggctgcct ggtgaaggac tacttccccg agcccgtgac cgtgagctgg 480
aacagcggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttccccg ccgtgctgca gagcagcggc 540
ctgtacagcc tgagcagcgt ggtgaccgtg cccagcagca gcctgggcac ccagacctac 600
atctgcaacg tgaaccacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagggt ggagcccaag 660
agctgcgaca agacccacac ctgccccccc tgccccgccc ccgaggccgc cggcggcccc 720
agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag gacccccgag 780
gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccac gaggaccccg aggtgaagtt caactggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagccca gggaggagca gtacaacagc 900
acctacaggg tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 960
tacaagtgca aggtgagcaa caaggccctg cccgccccca tcgagaagac catcagcaag 1020
gccaagggcc agcccaggga gccccaggtg tacaccctgc cccccagcag ggaggagatg 1080
accaagaacc aggtgagcct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccccgtgctg 1200
gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc aagctgaccg tggacaagag caggtggcag 1260
cagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1320
aagagcctga gcctgagccc cggcaag 1347
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 11
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His Tyr Val Asn
1 5 10
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 12
Arg Asn Asn His Arg Pro Ser
1 5
<210> 13
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 13
Gln Ser Trp Asp Tyr Ser Gly Phe Ser Thr Val
1 5 10
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 14
Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His Tyr
1 5
<210> 15
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 15
Arg Asn Asn
1
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 16
Trp Asp Tyr Ser Gly Phe Ser Thr
1 5
<210> 17
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"
<400> 17
Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His
20 25 30
Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Tyr Ser Gly
85 90 95
Phe Ser Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 18
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 18
gatatcgtcc tgactcagcc ccctagcgtc agcggcgctc ccggtcagag agtgactatt 60
agctgtagcg gctctagctc taatatcggt aatcactacg tgaactggta tcagcagctg 120
cccggcaccg cccctaagct gctgatctat agaaacaatc accggcctag cggcgtgccc 180
gataggttta gcggatctaa gtcaggcact agcgctagtc tggctatcac cggactgcag 240
tcagaggacg aggccgacta ctactgtcag tcctgggact atagcggctt tagcaccgtg 300
ttcggcggag gcactaagct gaccgtgctg 330
<210> 19
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"
<400> 19
Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His
20 25 30
Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Tyr Ser Gly
85 90 95
Phe Ser Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 20
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 20
gatatcgtcc tgactcagcc ccctagcgtc agcggcgctc ccggtcagag agtgactatt 60
agctgtagcg gctctagctc taatatcggt aatcactacg tgaactggta tcagcagctg 120
cccggcaccg cccctaagct gctgatctat agaaacaatc accggcctag cggcgtgccc 180
gataggttta gcggatctaa gtcaggcact agcgctagtc tggctatcac cggactgcag 240
tcagaggacg aggccgacta ctactgtcag tcctgggact atagcggctt tagcaccgtg 300
ttcggcggag gcactaagct gaccgtgctg ggtcagccta aggctgcccc cagcgtgacc 360
ctgttccccc ccagcagcga ggagctgcag gccaacaagg ccaccctggt gtgcctgatc 420
agcgacttct acccaggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ccgacagcag ccccgtgaag 480
gccggcgtgg agaccaccac ccccagcaag cagagcaaca acaagtacgc cgccagcagc 540
tacctgagcc tgacccccga gcagtggaag agccacaggt cctacagctg ccaggtgacc 600
cacgagggca gcaccgtgga aaagaccgtg gccccaaccg agtgcagc 648
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 21
Val Tyr Gly Met Asn
1 5
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 22
Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 23
Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr
1 5
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 24
Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr
1 5
<210> 25
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 25
Trp Tyr Asp Gly Asp Asn
1 5
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 26
Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr
1 5
<210> 27
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 28
caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctg 60
agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc gtgtacggca tgaactgggt gaggcaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtggccatc atctggtacg acggcgacaa ccagtactac 180
gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acggcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggacctg 300
aggaccggcc ccttcgacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354
<210> 29
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"
<400> 29
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 30
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 30
caggtgcagc tggtggagag cggcggcggc gtggtgcagc ccggcaggag cctgaggctg 60
agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc gtgtacggca tgaactgggt gaggcaggcc 120
cccggcaagg gcctggagtg ggtggccatc atctggtacg acggcgacaa ccagtactac 180
gccgacagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca acagcaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acggcctgag ggccgaggac accgccgtgt actactgcgc cagggacctg 300
aggaccggcc ccttcgacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagcgccagc 360
accaagggcc ccagcgtgtt ccccctggcc cccagcagca agagcaccag cggcggcacc 420
gccgccctgg gctgcctggt gaaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt gagctggaac 480
agcggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttccccgccg tgctgcagag cagcggcctg 540
tacagcctga gcagcgtggt gaccgtgccc agcagcagcc tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga accacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agagggtgga gcccaagagc 660
tgcgacaaga cccacacctg ccccccctgc cccgcccccg agctgctggg cggccccagc 720
gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac accctgatga tcagcaggac ccccgaggtg 780
acctgcgtgg tggtggacgt gagccacgag gaccccgagg tgaagttcaa ctggtacgtg 840
gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc aagcccaggg aggagcagta caacagcacc 900
tacagggtgg tgagcgtgct gaccgtgctg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac 960
aagtgcaagg tgagcaacaa ggccctgccc gcccccatcg agaagaccat cagcaaggcc 1020
aagggccagc ccagggagcc ccaggtgtac accctgcccc ccagcaggga ggagatgacc 1080
aagaaccagg tgagcctgac ctgcctggtg aagggcttct accccagcga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc cgtgctggac 1200
agcgacggca gcttcttcct gtacagcaag ctgaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260
ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1320
agcctgagcc tgagccccgg caag 1344
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 31
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser Leu His
1 5 10
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 32
Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 33
His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe Thr
1 5
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 34
Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser
1 5
<210> 35
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 35
Tyr Ala Ser
1
<210> 36
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 36
Ser Ser Ser Leu Pro Phe
1 5
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"
<400> 37
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 38
gagatcgtgc tgacccagtc acccgacttt cagtcagtga cccctaaaga aaaagtgact 60
atcacctgta gggcctccca gtctatcggc tctagcctgc actggtatca gcagaagccc 120
gatcagtcac ctaagctgct gattaagtac gcctctcagt cctttagcgg cgtgccctct 180
aggtttagcg gctcaggctc aggcaccgac ttcaccctga ctatcaatag cctggaagcc 240
gaggacgccg ctgcctacta ctgtcatcag tcaagtagcc tgcccttcac cttcggccct 300
ggcactaaag tggatattaa g 321
<210> 39
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"
<400> 39
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 40
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 40
gagatcgtgc tgacccagtc acccgacttt cagtcagtga cccctaaaga aaaagtgact 60
atcacctgta gggcctccca gtctatcggc tctagcctgc actggtatca gcagaagccc 120
gatcagtcac ctaagctgct gattaagtac gcctctcagt cctttagcgg cgtgccctct 180
aggtttagcg gctcaggctc aggcaccgac ttcaccctga ctatcaatag cctggaagcc 240
gaggacgccg ctgcctacta ctgtcatcag tcaagtagcc tgcccttcac cttcggccct 300
ggcactaaag tggatattaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gagagcgtca ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcataag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc 642
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 41
Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr Gly Met Asn
1 5 10
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 42
Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 43
Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr
1 5
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 44
Val Tyr Gly Met Asn
1 5
<210> 45
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 45
Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 46
Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr
1 5
<210> 47
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 47
Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr
1 5
<210> 48
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 48
Trp Tyr Asp Gly Asp Asn
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 49
Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr
1 5
<210> 50
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 50
Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr Gly
1 5
<210> 51
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 51
Ile Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gln
1 5
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 52
Ala Arg Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 53
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 54
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 54
caggtgcagc tggtggaatc aggcggcgga gtggtgcagc ctggtagatc actgagactg 60
agctgcgctg ctagtggctt cacctttagc gtctacggaa tgaactgggt ccgacaggcc 120
cctgggaaag gcctggagtg ggtggcaatt atctggtacg acggcgataa tcagtactac 180
gccgatagcg tgaagggacg gttcactatc tctagggata actctaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acggcctgag agccgaggac accgccgtct actactgcgc tagggacctg 300
agaaccggcc ccttcgacta ctggggacag ggcaccctgg tcaccgtgtc tagc 354
<210> 55
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Asp Asn Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Leu Arg Thr Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 56
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 56
caggtgcagc tggtggaatc aggcggcgga gtggtgcagc ctggtagatc actgagactg 60
agctgcgctg ctagtggctt cacctttagc gtctacggaa tgaactgggt ccgacaggcc 120
cctgggaaag gcctggagtg ggtggcaatt atctggtacg acggcgataa tcagtactac 180
gccgatagcg tgaagggacg gttcactatc tctagggata actctaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga acggcctgag agccgaggac accgccgtct actactgcgc tagggacctg 300
agaaccggcc ccttcgacta ctggggacag ggcaccctgg tcaccgtgtc tagcgcctct 360
actaagggcc caagcgtgtt ccccctggcc cctagctcta agtctactag cggaggcacc 420
gccgctctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgagc ccgtgaccgt cagctggaat 480
agcggcgctc tgactagcgg agtgcacacc ttccccgccg tgctgcagtc tagcggcctg 540
tatagcctgt ctagcgtcgt gaccgtgcct agctctagcc tgggcactca gacctatatc 600
tgtaacgtga accacaagcc ctctaacact aaggtggaca agcgggtgga acctaagtcc 660
tgcgataaga ctcacacctg tcctccctgc cctgcccctg aggctgccgg aggacctagc 720
gtgttcctgt tcccacctaa gcctaaagac accctgatga tctctaggac ccccgaagtg 780
acctgcgtgg tggtggacgt ctcacacgag gaccctgaag tgaagtttaa ttggtacgtg 840
gacggcgtgg aagtgcacaa cgctaagact aagcctagag aggaacagta taactctacc 900
tatagggtcg tcagcgtgct gacagtgctg caccaggact ggctgaacgg gaaagagtat 960
aagtgtaaag tgtctaacaa ggccctgcca gcccctatcg aaaagactat ctctaaggct 1020
aaggggcagc ctagagaacc ccaagtgtgc actctgcccc ctagtagaga agagatgact 1080
aagaatcagg tgtcactgag ctgtgccgtg aagggcttct accctagcga tatcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac aactacaaga ccaccccccc agtgctggac 1200
agcgacggca gcttcttcct ggtgagcaag ctgaccgtgg acaagtccag gtggcagcag 1260
ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac gaggccctgc acaaccacta cacccagaag 1320
tccctgagcc tgagccccgg caag 1344
<210> 57
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 57
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser Leu His
1 5 10
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 58
Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 59
His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe Thr
1 5
<210> 60
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 60
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser Leu His
1 5 10
<210> 61
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 61
Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 62
His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe Thr
1 5
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 63
Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser
1 5
<210> 64
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 64
Tyr Ala Ser
1
<210> 65
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 65
Ser Ser Ser Leu Pro Phe
1 5
<210> 66
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 66
Gln Ser Ile Gly Ser Ser
1 5
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 67
Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro
1 5 10
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 68
His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe Thr
1 5
<210> 69
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"
<400> 69
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 70
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 70
gagatcgtgc tgacccagtc acccgacttt cagtcagtga cccctaaaga aaaagtgact 60
atcacctgta gggcctccca gtctatcggc tctagcctgc actggtatca gcagaagccc 120
gatcagtcac ctaagctgct gattaagtac gcctctcagt cctttagcgg cgtgccctct 180
aggtttagcg gctcaggctc aggcaccgac ttcaccctga ctatcaatag cctggaagcc 240
gaggacgccg ctgcctacta ctgtcatcag tcaagtagcc tgcccttcac cttcggccct 300
ggcactaaag tggatattaa g 321
<210> 71
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"
<400> 71
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 72
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 72
gagatcgtgc tgacccagtc acccgacttt cagtcagtga cccctaaaga aaaagtgact 60
atcacctgta gggcctccca gtctatcggc tctagcctgc actggtatca gcagaagccc 120
gatcagtcac ctaagctgct gattaagtac gcctctcagt cctttagcgg cgtgccctct 180
aggtttagcg gctcaggctc aggcaccgac ttcaccctga ctatcaatag cctggaagcc 240
gaggacgccg ctgcctacta ctgtcatcag tcaagtagcc tgcccttcac cttcggccct 300
ggcactaaag tggatattaa gcgtacggtg gccgctccca gcgtgttcat cttccccccc 360
agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480
gagagcgtca ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540
ctgagcaagg ccgactacga gaagcataag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 600
ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac aggggcgagt gc 642
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成
肽"
<400> 73
Gly Gly Thr Phe Lys Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5 10
<210> 74
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 74
Asn Ile Ile Pro Met Thr Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 75
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 75
Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 76
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 76
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 77
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 77
Asn Ile Ile Pro Met Thr Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 78
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 78
Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 79
Gly Gly Thr Phe Lys Ser Tyr
1 5
<210> 80
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 80
Ile Pro Met Thr Gly Gln
1 5
<210> 81
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 81
Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 82
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 82
Gly Gly Thr Phe Lys Ser Tyr Ala
1 5
<210> 83
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 83
Ile Ile Pro Met Thr Gly Gln Thr
1 5
<210> 84
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 84
Ala Arg Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn
1 5 10
<210> 85
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"
<400> 85
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Lys Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Ile Pro Met Thr Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 86
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 86
gaggtgcagc tggtgcagtc aggcgccgaa gtgaagaaac ccggctctag cgtgaaagtc 60
agctgtaaag ctagtggcgg caccttcaag tcctacgcta ttagctgggt cagacaggcc 120
ccaggtcagg gcctggagtg gatgggcaat attatcccta tgaccggtca gacctactac 180
gctcagaaat ttcagggtag agtgactatc accgccgacg agtctactag caccgcctat 240
atggaactgt ctagcctgag atcagaggac accgccgtct actactgcgc tagagccgcc 300
tatcaccccc tggtgttcga taactggggt cagggcaccc tggtcaccgt gtctagc 357
<210> 87
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"
<400> 87
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Lys Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Ile Pro Met Thr Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ala Ala Tyr His Pro Leu Val Phe Asp Asn Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 88
<211> 1347
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 88
gaggtgcagc tggtgcagtc aggcgccgaa gtgaagaaac ccggctctag cgtgaaagtc 60
agctgtaaag ctagtggcgg caccttcaag tcctacgcta ttagctgggt cagacaggcc 120
ccaggtcagg gcctggagtg gatgggcaat attatcccta tgaccggtca gacctactac 180
gctcagaaat ttcagggtag agtgactatc accgccgacg agtctactag caccgcctat 240
atggaactgt ctagcctgag atcagaggac accgccgtct actactgcgc tagagccgcc 300
tatcaccccc tggtgttcga taactggggt cagggcaccc tggtcaccgt gtctagcgct 360
agcactaagg gcccctcagt gttccccctg gcccctagct ctaagtctac tagcggcggc 420
accgccgctc tgggctgcct ggtgaaagac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcatgg 480
aatagcggcg ctctgactag cggagtgcac accttccccg ccgtgctgca gtctagcggc 540
ctgtatagcc tgtctagcgt ggtgaccgtg cctagctcta gcctgggcac tcagacctac 600
atctgtaacg tgaaccacaa gccctctaac actaaggtgg acaagcgggt ggaacctaag 660
tcctgcgata agactcacac ctgtcccccc tgccctgccc ctgaggctgc cggaggacct 720
agcgtgttcc tgttcccacc taagcctaag gacaccctga tgatctctag gacccccgaa 780
gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcac gaggaccctg aagtgaagtt caattggtac 840
gtggacggcg tggaagtgca caacgctaag actaagccta gagaggaaca gtataactcc 900
acctatagag tggtgtcagt gctgaccgtg ctgcatcagg actggctgaa cggcaaagag 960
tataagtgta aagtctctaa caaggccctg ccagccccta tcgaaaagac tatctctaag 1020
gctaagggcc agcctagaga acctcaggtg tacaccctgc ccccctgtag agaagagatg 1080
actaagaatc aggtgtccct gtggtgtctg gtgaaaggct tctaccctag cgatatcgcc 1140
gtggaatggg agtctaacgg ccagcccgag aacaactata agactacccc ccctgtgctg 1200
gatagcgacg gctcattctt cctgtactct aagctgaccg tggacaagtc taggtggcag 1260
cagggcaatg tgtttagctg tagcgtgatg cacgaggccc tgcataatca ctacactcag 1320
aagtcactga gcctgagccc cggcaag 1347
<210> 89
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 89
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His Tyr Val Asn
1 5 10
<210> 90
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 90
Arg Asn Asn His Arg Pro Ser
1 5
<210> 91
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 91
Gln Ser Trp Asp Tyr Ser Gly Phe Ser Thr Val
1 5 10
<210> 92
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 92
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His Tyr Val Asn
1 5 10
<210> 93
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 93
Arg Asn Asn His Arg Pro Ser
1 5
<210> 94
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 94
Gln Ser Trp Asp Tyr Ser Gly Phe Ser Thr Val
1 5 10
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 95
Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His Tyr
1 5
<210> 96
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 96
Arg Asn Asn
1
<210> 97
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 97
Trp Asp Tyr Ser Gly Phe Ser Thr
1 5
<210> 98
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 98
Ser Ser Asn Ile Gly Asn His Tyr
1 5
<210> 99
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 99
Arg Asn Asn
1
<210> 100
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成肽"
<400> 100
Gln Ser Trp Asp Tyr Ser Gly Phe Ser Thr Val
1 5 10
<210> 101
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"
<400> 101
Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His
20 25 30
Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Tyr Ser Gly
85 90 95
Phe Ser Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 102
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 102
gatatcgtcc tgactcagcc ccctagcgtc agcggcgctc ccggtcagag agtgactatt 60
agctgtagcg gctctagctc taatatcggt aatcactacg tgaactggta tcagcagctg 120
cccggcaccg cccctaagct gctgatctat agaaacaatc accggcctag cggcgtgccc 180
gataggttta gcggatctaa gtcaggcact agcgctagtc tggctatcac cggactgcag 240
tcagaggacg aggccgacta ctactgtcag tcctgggact atagcggctt tagcaccgtg 300
ttcggcggag gcactaagct gaccgtgctg 330
<210> 103
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多肽"
<400> 103
Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn His
20 25 30
Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Arg Asn Asn His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Trp Asp Tyr Ser Gly
85 90 95
Phe Ser Thr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln
100 105 110
Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu
115 120 125
Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr
130 135 140
Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys
145 150 155 160
Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr
165 170 175
Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His
180 185 190
Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys
195 200 205
Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210 215
<210> 104
<211> 648
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 来源
<223> /注释="人工序列的描述：合成多核苷酸"
<400> 104
gatatcgtcc tgactcagcc ccctagcgtc agcggcgctc ccggtcagag agtgactatt 60
agctgtagcg gctctagctc taatatcggt aatcactacg tgaactggta tcagcagctg 120
cccggcaccg cccctaagct gctgatctat agaaacaatc accggcctag cggcgtgccc 180
gataggttta gcggatctaa gtcaggcact agcgctagtc tggctatcac cggactgcag 240
tcagaggacg aggccgacta ctactgtcag tcctgggact atagcggctt tagcaccgtg 300
ttcggcggag gcactaagct gaccgtgctg ggtcagccta aggctgcccc cagcgtgacc 360
ctgttccccc ccagcagcga ggagctgcag gccaacaagg ccaccctggt gtgcctgatc 420
agcgacttct acccaggcgc cgtgaccgtg gcctggaagg ccgacagcag ccccgtgaag 480
gccggcgtgg agaccaccac ccccagcaag cagagcaaca acaagtacgc cgccagcagc 540
tacctgagcc tgacccccga gcagtggaag agccacaggt cctacagctg ccaggtgacc 600
cacgagggca gcaccgtgga aaagaccgtg gccccaaccg agtgcagc 648

Claims (53)

1.一种用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的双特异性抗体，其中所述抗体包含
a.第一部分，所述第一部分是免疫球蛋白，所述免疫球蛋白具有第一可变轻链(VL1)和第一可变重链(VH1)以及带有异二聚化修饰的第一恒定重链(CH1)，所述VH1与IL1β特异性结合，以及
b.第二部分，所述第二部分是免疫球蛋白，所述免疫球蛋白具有第二可变轻链(VL2)和第二可变重链(VH2)以及带有与所述第一恒定重链的异二聚化修饰互补的异二聚化修饰的第二恒定重链(CH2)，所述VH2与IL-18特异性结合。
2.一种用于在有需要的受试者中减慢、停滞、或减轻NLRC4炎性体病变的发展的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的双特异性抗体，其中所述抗体包含
a.第一部分，所述第一部分是免疫球蛋白，所述免疫球蛋白具有第一可变轻链(VL1)和第一可变重链(VH1)以及带有异二聚化修饰的第一恒定重链(CH1)，所述VH1与IL1β特异性结合，以及
b.第二部分，所述第二部分是免疫球蛋白，所述免疫球蛋白具有第二可变轻链(VL2)和第二可变重链(VH2)以及带有与所述第一恒定重链的异二聚化修饰互补的异二聚化修饰的第二恒定重链(CH2)，所述VH2与IL-18特异性结合。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述双特异性抗体的第一和第二恒定重链是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，优选IgD、IgE或IgG，如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，优选IgG1。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述双特异性抗体的第一和第二恒定重链是IgG1，并且其中
a.所述第一恒定重链具有产生杵结构的点突变，并且所述第二恒定重链具有产生臼结构的点突变，或
b.所述第一恒定重链具有产生臼结构的点突变，并且所述第二恒定重链具有产生杵结构的点突变，并且任选地
c.所述第一和第二恒定重链具有导致二硫桥的突变。
5.根据权利要求1-4所述的方法，其中：
a.所述双特异性抗体的第一免疫球蛋白VH1结构域包含
i.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:76，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:77，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:78；或
ii.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:79，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:80，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:81；并且
b.所述双特异性抗体的第一免疫球蛋白VL1结构域包含
i.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:92，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:93，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:94或
ii.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:95，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:96，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:97；并且
c.所述双特异性抗体的第二免疫球蛋白VH2结构域包含
i.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:44，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:45，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:46；或
ii.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:47，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:48，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:49；并且
d.所述双特异性抗体的第二免疫球蛋白VL2结构域包含
i.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:60，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:62或
ii.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:63，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:64，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:65。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：
a.所述双特异性抗体的第一免疫球蛋白VH1结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:85，
b.所述双特异性抗体的第一免疫球蛋白VL1结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:101，
c.所述双特异性抗体的第二免疫球蛋白VH2结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:53，并且
d.所述双特异性抗体的第二免疫球蛋白VL2结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:69。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中：
a.所述双特异性抗体的第一免疫球蛋白重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:87，
b.所述双特异性抗体的第一免疫球蛋白轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:103，
c.所述双特异性抗体的第二免疫球蛋白重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55，并且
d.所述双特异性抗体的第二免疫球蛋白轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:71。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者具有NLRC4-GOF炎性体病变。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者具有在NLRC4基因的核苷酸结合结构域或翼状螺旋结构域中的NLRC4-GOF突变。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者患有巨噬细胞活化综合征(MAS)。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者患有自身炎症伴婴儿小肠结肠炎(AIFEC)。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中与不具有NLRC4炎性体病变的对照受试者群体相比，所述受试者具有过度升高的血清IL-18和血清IL-1β水平。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述受试者具有>600ng/mL的血清铁蛋白水平或>20mg/L的血清C反应蛋白(CRP)。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述NLRC4炎性体病变对用环孢素、抗TNFα治疗、全身性糖皮质激素和抗IL-1β疗法作为单一疗法或作为其组合的治疗具有抗性。
15.一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含
a.第一部分，所述第一部分是免疫球蛋白，所述免疫球蛋白具有第一可变轻链(VL1)和第一可变重链(VH1)以及带有异二聚化修饰的第一恒定重链(CH1)，所述VH1与IL1β特异性结合，以及
b.第二部分，所述第二部分是免疫球蛋白，所述免疫球蛋白具有第二可变轻链(VL2)和第二可变重链(VH2)以及带有与所述第一恒定重链的异二聚化修饰互补的异二聚化修饰的第二恒定重链(CH2)，所述VH2与IL-18特异性结合，用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变中使用。
16.根据权利要求15所述的用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变中使用的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体的第一和第二恒定重链是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，优选IgD、IgE或IgG，如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，优选IgG1。
17.根据权利要求15或16所述的用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变中使用的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体的第一和第二恒定重链是IgG1，并且其中
a.所述第一恒定重链具有产生杵结构的点突变，并且所述第二恒定重链具有产生臼结构的点突变，或
b.所述第一恒定重链具有产生臼结构的点突变，并且所述第二恒定重链具有产生杵结构的点突变，并且任选地
c.所述第一和第二恒定重链具有导致二硫桥的突变。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变中使用的双特异性抗体，其中：
a.所述双特异性抗体的第一免疫球蛋白VH1结构域包含
i.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:76，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:77，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:78；或
ii.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:79，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:80，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:81；并且
b.所述双特异性抗体的第一免疫球蛋白VL1结构域包含
iii.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:92，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:93，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:94或
iv.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:95，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:96，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:97；并且
c.所述双特异性抗体的第二免疫球蛋白VH2结构域包含
v.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:44，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:45，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:46；或
vi.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:47，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:48，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:49；并且
d.所述双特异性抗体的第二免疫球蛋白VL2结构域包含
vii.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:60，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:61，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:62或
viii.高变区CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1具有氨基酸序列SEQ ID NO:63，所述CDR2具有氨基酸序列SEQ ID NO:64，并且所述CDR3具有氨基酸序列SEQ ID NO:65。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变中使用的双特异性抗体，其中：
a.所述双特异性抗体的第一免疫球蛋白VH1结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:85，
b.所述双特异性抗体的第一免疫球蛋白VL1结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:101，
c.所述双特异性抗体的第二免疫球蛋白VH2结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:53，并且
d.所述双特异性抗体的第二免疫球蛋白VL2结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:69。
20.根据权利要求15-19中任一项所述的用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变中使用的双特异性抗体，其中：
a.所述双特异性抗体的第一免疫球蛋白重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:87，
b.所述双特异性抗体的第一免疫球蛋白轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:103，
c.所述双特异性抗体的第二免疫球蛋白重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:55，并且
d.所述双特异性抗体的第二免疫球蛋白轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:71。
21.根据权利要求15-20中任一项所述的用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变中使用的双特异性抗体，其中所述受试者具有NLRC4-GOF炎性体病变。
22.根据权利要求15-21中任一项所述的用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变中使用的双特异性抗体，其中所述受试者具有在NLRC4基因的核苷酸结合结构域或翼状螺旋结构域中的NLRC4-GOF突变。
23.根据权利要求15-22中任一项所述的用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变中使用的双特异性抗体，其中所述受试者患有巨噬细胞活化综合征(MAS)。
24.根据权利要求15-23中任一项所述的用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变中使用的双特异性抗体，其中所述受试者患有自身炎症伴婴儿小肠结肠炎(AIFEC)。
25.根据权利要求15-24中任一项所述的用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变中使用的双特异性抗体，其中与不具有NLRC4炎性体病变的对照受试者群体相比，所述受试者具有过度升高的血清IL-18和血清IL-1β水平。
26.根据权利要求15-25中任一项所述的用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变中使用的双特异性抗体，其中所述受试者具有>600ng/mL的血清铁蛋白水平或>20mg/L的血清C反应蛋白(CRP)。
27.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用约1mg/kg至约35mg/kg的所述双特异性抗体。
28.根据权利要求27所述的方法，所述方法包括向所述受试者施用约10mg/kg的所述双特异性抗体。
29.根据权利要求28所述的方法，其中静脉内或皮下施用所述双特异性抗体。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述施用的双特异性抗体的剂量为静脉内施用约10mg/kg，任选地其中所述双特异性抗体隔周施用。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述施用的双特异性抗体的剂量为皮下施用约50mg至约900mg。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中在第1天向所述患者静脉内或皮下施用所述双特异性抗体；或其中隔周静脉内施用所述双特异性抗体。
33.根据权利要求26-31中任一项所述的方法，所述方法包括施用至少一种另外的治疗剂。
34.根据权利要求15-26中任一项所述的用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变中使用的双特异性抗体，所述使用包括向所述受试者施用1mg/kg至35mg/kg的所述双特异性抗体。
35.根据权利要求34所述的用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变中使用的双特异性抗体，所述使用包括向所述受试者静脉内施用10mg/kg的所述双特异性抗体。
36.根据权利要求15-26中任一项所述的用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变中使用的双特异性抗体，其中以约50mg至约900mg的剂量皮下施用所述双特异性抗体。
37.根据权利要求34-36中任一项所述的用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变中使用的双特异性抗体，其中在第1天向所述患者静脉内或皮下施用所述双特异性抗体；或其中隔周静脉内施用所述双特异性抗体。
38.根据权利要求34-37中任一项所述的用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变中使用的双特异性抗体，所述使用包括施用至少一种另外的治疗剂。
39.根据权利要求34-38中任一项所述的用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变(例如，NLRC4-GOF炎性体病变)中使用的双特异性抗体，其中与具有NLRC4炎性体病变(例如，NLRC4-GOF炎性体病变)并接受护理标准(SoC)的对照受试者相比，所述治疗延长所述受试者的寿命。
40.根据权利要求34-39中任一项所述的用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变(例如，NLRC4-GOF炎性体病变)中使用的双特异性抗体，其中在14天的治疗后，与SoC相比，所述治疗降低或预防疾病发作的发生例如持续至少1周。
41.根据权利要求34-40中任一项所述的用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变(例如，NLRC4-GOF炎性体病变)中使用的双特异性抗体，其中与护理标准相比，在7天的治疗后，患者的血清CRP水平降低。
42.根据权利要求41所述的用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变(例如，NLRC4-GOF炎性体病变)中使用的双特异性抗体，其中所述血清CRP水平降低至少1mg/L、至少2mg/L、至少3mg/L、至少4mg/L或至少5mg/L。
43.根据权利要求41所述的用于在有需要的受试者中治疗或预防NLRC4炎性体病变(例如，NLRC4-GOF炎性体病变)中使用的双特异性抗体，其中在7天或在14天的治疗后，所述血清CRP水平降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
44.一种在有需要的受试者中降低血清C反应蛋白(CRP)水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含
a.所述双特异性抗体的第一免疫球蛋白VH1结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:85，
b.所述双特异性抗体的第一免疫球蛋白VL1结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:101，
c.所述双特异性抗体的第二免疫球蛋白VH2结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:53，以及
d.所述双特异性抗体的第二免疫球蛋白VL2结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:69。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述血清CRP水平降低至少1mg/l、至少2mg/l、至少3mg/l、至少4mg/l或至少5mg/l。
46.根据权利要求44所述的方法，其中在7天、14天、3周、或29天的治疗后，所述血清CRP水平降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
47.根据权利要求44-46中任一项所述的方法，其中在施用双特异性抗体至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少14天、至少3周或至少29天后，所述血清C反应蛋白降低。
48.根据权利要求44-46中任一项所述的方法，其中所述受试者具有NLRC4炎性体病变，例如，NLCR4-GOF炎性体病变。
49.一种在有需要的受试者中降低血清铁蛋白水平的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的双特异性抗体，所述双特异性抗体包含
a.所述双特异性抗体的第一免疫球蛋白VH1结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:85，
b.所述双特异性抗体的第一免疫球蛋白VL1结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:101，
c.所述双特异性抗体的第二免疫球蛋白VH2结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:53，以及
d.所述双特异性抗体的第二免疫球蛋白VL2结构域包含氨基酸序列SEQ ID NO:69。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述血清铁蛋白水平降低至少100ng/L、至少200ng/L、至少300ng/L、至少400ng/l或至少500ng/l。
51.根据权利要求49所述的方法，其中在7天、14天、3周、或29天的治疗后，所述血清铁蛋白水平降低至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少50％。
52.根据权利要求49-51中任一项所述的方法，其中在施用双特异性抗体至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少14天、至少3周或至少29天后，所述血清铁蛋白降低。
53.根据权利要求49-51中任一项所述的方法，其中所述受试者具有NLRC4炎性体病变，例如，NLCR4-GOF炎性体病变。
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