KR101265855B1

KR101265855B1 - 2가, 이중특이적 항체

Info

Publication number: KR101265855B1
Application number: KR1020107013761A
Authority: KR
Inventors: 크리슈티안 클라인; 볼프강 섀퍼
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2008-12-16
Publication date: 2013-05-31
Also published as: BRPI0821777A2; CR11465A; CN101903406A; TWI359028B; AU2008340694B2; MA31925B1; EP2225280A1; CO6280543A2; SI2225280T1; US8242247B2; IL206108A; TW200932271A; WO2009080253A1; KR20130016397A; ES2471266T3; ZA201004300B; JP2011505848A; PT2225280E; RU2010129540A; PL2225280T3

Abstract

본 발명은 신규한, 도메인이 교환된 2가, 이중특이적 항체, 이의 제조 및 용도에 관한 것이다.

Description

2가, 이중특이적 항체 {BIVALENT, BISPECIFIC ANTIBODIES}

본 발명은 신규한 2가, 이중특이적 항체, 이의 제조 및 용도에 관한 것이다.

2 개 이상의 항원에 결합할 수 있는 이중- 또는 다중특이적 항체와 같은 조작 단백질이 당업계에 알려져 있다. 이러한 다중특이적 결합 단백질은 세포 융합, 화학적 공액, 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성될 수 있다.

최근 다양한 재조합 이중특이적 항체 형식이, 예를 들어, IgG 항체 형식 및 단일 사슬 도메인의 융합에 의한 4 가 이중특이적 항체가 예를 들어 개발되어 왔다 (예를 들어, Coloma, M.J., et al, Nature Biotech 15 (1997) 159-163; WO 2001077342; 및 Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234 참조).

또한, 항체 코어 구조 (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM) 가 더 이상 유지되지 않는 여러 기타 새로운 형식, 예컨대 2 개 이상의 항원에 결합할 수 있는 디아-, 트리아- 또는 테트라바디, 미니바디, 여러 단일 사슬 형식 (scFv, Bis-scFv) 이 개발되어 왔다 (Holliger, P., et al, Nature Biotech 23 (2005) 1126-1136; Fischer, N., Leger O., Pathobiology 74 (2007) 3-14; Shen, J., et al, Journal of Immunological Methods 318 (2007) 65-74; Wu, C., et al, Nature Biotech 25 (2007) 1290-1297).

모든 이러한 형식은 항체 코어 (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM) 를 추가의 결합 단백질 (예를 들어, scFv) 에 융합시키거나, 예를 들어, 2 개의 Fab 분절 또는 scFv 에 융합시키기 위한 링커를 사용한다 (Fischer N., Leger O., Pathobiology 74 (2007) 3-14). 링커가 이중특이적 항체의 조작에 유리하다는 것이 명백하지만, 이들은 또한 치료적 세팅에 문제를 일으킬 수 있다. 게다가, 이러한 외래 펩티드는 링커 그 자체 또는 단백질과 링커 사이의 연결 지점에 대해 면역 반응을 도출할 수 있다. 게다가, 이러한 펩티드의 유연한 특성이 이들을 열악한 항체 안정성, 응집 및 증가된 면역원성을 잠재적으로 야기하는 가수분해 분할에 더욱 노출되게 한다. 또한 자연 발생적 항체에 대해 고도의 유사성을 유지함으로써, Fc 수용체 결합을 통해 유지되는 보체-의존성 세포독성 (CDC) 또는 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC) 과 같은 효과기 작용을 유지하는 것을 원할 수 있다.

그러므로 이상적이게는, 인간 서열과 최소의 편차를 가지면서 자연 발생적 항체 (IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 등) 와 일반적으로 구조가 매우 유사한 이중특이적 항체를 개발하려는 것을 목적으로 해야만 한다.

하나의 접근법에서, 천연 항체와 매우 유사한 이중특이적 항체는 이중특이적 항체의 바람직한 특이성을 갖는 쥐과 단일클론 항체를 발현하는 2 개의 상이한 하이브리도마 세포주의 체세포 융합에 근거한 콰드로마 (quadroma) 기술 (Milstein, C. and A.C. Cuello, Nature, 305 (1983) 537-40 참조) 을 사용하여 제조되었다. 수득되는 잡종-하이브리도마 (또는 콰드로마) 세포주 내의 2 개의 상이한 항체 중쇄 및 경쇄의 랜덤 짝짓기 때문에, 10 개 이하의 상이한 항체 종이, 이 중 오직 하나만이 바람직한, 기능적 이중특이적 항체로 생성된다. 잘못 짝지워진 부산물의 존재, 및 유의하게 감소된 생산 수율로 인해, 정교한 정제 절차가 필요하다는 것을 의미한다 (예를 들어, Morrison, S.L., Nature Biotech 25 (2007) 1233-1234 참조). 일반적으로 재조합 발현 기술이 사용되는 경우, 잘못 짝지워진 부산물이라는 동일한 문제가 남아있다.

'놉-인투-홀 (knobs-into-holes)' 이라고 알려진 잘못 짝지워진 부산물이라는 문제를 피하기 위한 접근법은, 접촉 경계면을 개질하기 위해 CH3 도메인 내에 돌연변이를 도입함으로써 2 개의 상이한 항체 중쇄의 짝짓기를 유도하는 것을 목표로 한다. 하나의 사슬 상의 벌키한 아미노산을 짧은 측쇄를 갖는 아미노산으로 대체하여 '홀' 을 제작한다. 반대로, 긴 측쇄를 갖는 아미노산을 다른 CH3 도메인 내에 도입하여, '놉' 을 제작한다. 이러한 2 개의 중쇄 (및 모든 중쇄에 대해 적합하여야만 하는 2 개의 동일한 경쇄) 를 함께 발현시킴으로써, 고수율로 헤테로이량체 형성 ('놉-홀') 대 호모이량체 형성 ('홀-홀' 또는 '놉-놉') 을 관찰하였다 (Ridgway, J.B., Presta LG, Carter P; 및 WO 1996027011). 헤테로이량체의 % 는 파지 디스플레이 접근법을 사용하는 2 개의 CH3 도메인의 상호작용 표면 리모델링 및 헤테로이량체를 안정화시키기 위한 디술피드 가교의 도입에 의해 추가로 증가될 수 있을 것이다 (Merchant, A.M., et al, Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., Ridgway, J.B., Wells, J.A., Carter, P., J Mol Biol 270 (1997) 26-35). 놉-인투-홀 기술에 대한 새로운 접근법은 예를 들어, EP 1870459A1 호에 기재되어 있다. 이러한 형식이 매우 매력적으로 보이지만, 현재 이용가능한, 임상적으로 진보를 보이는 것으로 기술되는 데이터는 없다. 이러한 전략의 하나의 중요한 제약은, 2 개의 모 항체의 경쇄가 비활성 분자의 잘못 짝지워짐 및 형성을 방지하기 위해 일치하여야만 한다는 것이다. 그러므로 상기 기술은 이러한 항체의 중쇄 및/또는 일치하는 경쇄가 최적화되어야만 하므로, 제 1 및 제 2 항원에 대한 2 개의 항체로부터 시작되는 2 개의 항원에 대한 재조합, 2가, 이중특이적 항체를 쉽게 개발하기에는 적합하지 않다.

[Simon T. et al, EMBO Journal, 9 (1990) 1051-1056] 은 단일특이적 항체의 도메인 돌연변이체에 관한 것이다.

발명의 요약

본 발명은 하기를 포함하는 2가, 이중특이적 항체에 관한 것이다:

a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄; 및

b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄 (불변 도메인 CL 및 CH1 은 서로 대체됨).

본 발명의 추가 구현예는 하기 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 2가, 이중특이적 항체의 제조 방법이다:

a) 숙주 세포를,

- 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터

- 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터 (불변 도메인 CL 및 CH1 은 서로 대체됨)

로 형질전환시키는 단계;

b) 상기 항체 분자의 합성이 가능한 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및

c) 상기 배양액으로부터 상기 항체 분자를 회수하는 단계.

본 발명의 추가의 구현예는 하기를 포함하는 숙주 세포이다:

- 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터,

- 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터 (불변 도메인 CL 및 CH1 은 서로 대체됨).

본 발명의 추가의 구현예는 본 발명에 따른 항체의 조성물, 바람직하게는 약학 또는 진단 조성물이다.

본 발명의 추가의 구현예는 본 발명에 따른 항체 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물이다.

본 발명의 추가의 구현예는 본 발명에 따른 항체의 치료적 유효량을 치료요법을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 치료요법을 필요로 하는 환자의 치료 방법이다.

상세한 설명

그러므로 상기 2가, 이중특이적 항체는 하기를 포함한다:

a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제 1 경쇄 및 제 1 중쇄; 및

b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 제 2 경쇄 및 제 2 중쇄 (제 2 경쇄 및 제 2 중쇄의 불변 도메인 CL 및 CH1 은 서로 대체됨).

그러므로, 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 상기 항체의 경우에는 다음이 적용된다:

경쇄 내에서

불변 경쇄 도메인 CL 이 상기 항체의 불변 중쇄 도메인 CH1 로 대체되고;

중쇄 내에서

불변 중쇄 도메인 CH1 이 상기 항체의 불변 경쇄 도메인 CL 로 대체됨.

본원에서 사용되는 바와 같은 "항체" 라는 용어는 전체의, 단일클론 항체를 말한다. 이러한 전체 항체는 "경쇄" (LC) 및 "중쇄" (HC) (이러한 경쇄 (LC)/중쇄 (HC) 쌍은 본원에서 LC/HC 로서 약칭됨) 의 2 개 쌍으로 이루어진다. 이러한 항체의 경쇄 및 중쇄는 여러 도메인으로 이루어진 폴리펩티드이다. 전체 항체에서, 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 HCVR 또는 VH 로서 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 중쇄 불변 도메인 CH1, CH2 및 CH3 (항체 계열 IgA, IgD, 및 IgG) 및 임의로 중쇄 불변 도메인 CH4 (항체 계열 IgE 및 IgM) 를 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 도메인 VL 및 경쇄 불변 도메인 CL 을 포함한다. 하나의 자연 발생적 전체 항체인 IgG 항체의 구조는 예를 들어 도 1 에 제시되어 있다. 가변 도메인 VH 및 VL 은 좀더 보존된, 골격 영역 (FR) 이라 불리는 영역 내에 배치된 상보성 결정 영역 (CDR) 이라 불리는 과가변성 영역으로 좀더 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL 은 3 개의 CDR 및 4 개의 FR 로, 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 배열된 하기 순서: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 로 구성되어 있다 (Janeway, C.A., Jr, et al, (2001). Immunobiology., 5th ed., Garland Publishing; and Woof, J., Burton, D., Nat Rev Immunol 4 (2004) 89-99). 중쇄 및 경쇄의 2 개의 쌍 (HC/LC) 은 동일한 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 그러므로 상기 전체 항체는 2 가, 단일특이적 항체이다. 이러한 "항체" 에는 예를 들어, 마우스 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 유전 조작 항체 (변이체 또는 돌연변이체 항체) 가 그 특성이 보존되는 한 포함된다. 특히 바람직한 것은 특히 재조합 인간 또는 인간화 항체로서의 인간 또는 인간화 항체이다.

그리스 문자: α, δ, ε, γ, 및 μ 로 표시된 5 가지 유형의 포유류 항체 중쇄가 있다 (Janeway, C.A., Jr, et al, (2001). Immunobiology., 5th ed., Garland Publishing). 존재하는 중쇄의 유형이 항체의 계열을 정의한다; 이러한 사슬은 각각 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 항체에서 발견된다 (Rhoades RA, Pflanzer RG (2002). Human Physiology, 4th ed., Thomson Learning). 구별되는 중쇄는 크기 및 조성이 상이하다; α 및 γ 는 대략 450 개의 아미노산을 함유하는 반면, μ 및 ε 는 대략 550 개의 아미노산을 갖는다.

각각의 중쇄는 불변 영역과 가변 영역인 2 개의 영역을 갖는다. 불변 영역은 동일한 이소형의 모든 항체에서 일치하나, 상이한 이소형의 항체에서 상이하다. 중쇄 γ, α 및 δ 는 3 개의 불변 도메인 CH1, CH2, 및 CH3 (일렬로) 으로 구성된 불변 영역, 및 유연성을 더하기 위한 경첩 영역을 갖고 (Woof, J., Burton, D., Nat Rev Immunol 4 (2004) 89-99); 중쇄 μ 및 ε 은 4 개의 불변 도메인 CH1, CH2, CH3, 및 CH4 로 구성된 불변 영역을 갖는다 (Janeway, C.A., Jr. et al. (2001). Immunobiology., 5th ed., Garland Publishing). 중쇄의 가변 영역은 상이한 B 세포에 의해 생성되는 항체에서는 상이하나, 단일 B 세포 또는 B 세포 클론에 의해 생성되는 모든 항체에 대해서는 동일하다. 각각의 중쇄의 가변 영역은 대략 110 개의 아미노산 길이이고, 단일 항체 도메인으로 구성된다.

포유류에는 람다 (λ) 및 카파 (κ) 로 불리는 오직 2 가지 종류의 경쇄가 있다. 경쇄는 1 개의 불변 도메인 CL 및 1 개의 가변 도메인 VL 의 2 개의 연속 도메인을 갖는다. 경쇄의 대략적인 길이는 211 내지 217 개의 아미노산이다. 바람직하게는 경쇄는 카파 (κ) 경쇄이고, 불변 도메인 CL 은 바람직하게는 C 카파 (κ) 이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "모노클론 항체" 또는 "모노클론 항체 조성물" 이라는 용어는 단일 아미노산 조성의 항체 분자 제제를 말한다.

본 발명에 따른 "항체" 는 임의의 계열 (예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 바람직하게는 IgG 또는 IgE), 또는 서브계열 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2, 바람직하게는 IgG1) 일 수 있으며, 본 발명에 따른 2가, 이중특이적 항체를 유도하게 되는 모든 항체는 동일한 서브계열 (예를 들어, IgG1, IgG4 등, 바람직하게는 IgG1) 의 Fc 부분, 바람직하게는 동일한 동종이형 (예를 들어, 코카시안종) 의 Fc 부분을 갖는다.

"항체의 Fc 부분" 은 당업자에게는 잘 알려진 용어이고, 항체의 파파인 소화에 근거하여 정의된다. 본 발명에 따른 항체는 Fc 부분, 바람직하게는 인간 기원 유래의 Fc 부분 및 바람직하게는 인간 불변 영역의 모든 기타 부분을 함유한다. 항체의 Fc 부분은 보체 활성화, C1q 결합, C3 활성화 및 Fc 수용체 결합에 직접적으로 관여한다. 보체계에 대한 항체의 영향이 특정 조건에 따라 다른 반면, C1q 에 대한 결합은 Fc 부분 내의 정의된 결합 부위에 의해 야기된다. 이러한 결합 부위는 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, 문헌 [Lukas, T.J., et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560; Brunhouse, R., and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Burton, D.R., et al., Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., et al., J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., et al., J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., et al., Immunology 86 (1995) 319-324; 및 EP 0 307 434] 에 기재되어 있다. 이러한 결합 부위는 예를 들어, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 및 P329 (Kabat 의 EU 인덱스에 따른 넘버링, 하기 참조) 이다. 서브계열 IgG1, IgG2 및 IgG3 의 항체는 통상 보체 활성화, C1q 결합 및 C3 활성화를 나타내는 반면, IgG4 는 보체계를 활성화시키지 않고, C1q 에 결합하지 않고, C3 을 활성화시키지 않는다. 바람직하게는 Fc 부분은 인간 Fc 부분이다.

"키메라 항체" 라는 용어는 통상적으로 재조합 DNA 기술에 의해 제조되는, 하나의 원천 또는 종으로부터의 가변 영역, 즉, 결합 영역, 및 상이한 원천 또는 종 유래의 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 항체를 말한다. 쥐과 가변 영역 및 인간 불변 영역을 포함하는 키메라 항체가 바람직하다. 본 발명에 포함되는 "키메라 항체" 의 기타 바람직한 유형은 불변 영역이 본래 항체의 불변 영역으로부터 개질되거나 변화되어, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체 (FcR) 결합과 관련된 본 발명에 따른 특성을 발생시키는 유형들이다. 이러한 키메라 항체는 또한 "계열-스위칭 항체" 로서 언급된다. 키메라 항체는 면역글로불린 가변 영역을 코딩하는 DNA 분절 및 면역글로불린 불변 영역을 코딩하는 DNA 분절을 포함하는 발현된 면역글로불린 유전자의 산물이다. 키메라 항체의 제조 방법에는 통상적인 재조합 DNA 및 유전자 트랜스펙션 기술이 포함되고, 이는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, [Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855]; US 5,202,238 호 및 US 5,204,244 호를 참조한다.

"인간화 항체" 라는 용어는 골격 또는 "상보성 결정 영역" (CDR) 이 모 면역글로불린의 것과 비교하여 상이한 특이성의 면역글로불린의 CDR 을 포함하도록 개질된 항체를 말한다. 바람직한 구현예에서, 쥐과 CDR 을 인간 항체의 골격 영역 내에 그래프트시켜 "인간화 항체" 를 제조한다. 예를 들어, [Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988) 323-327; 및 Neuberger, M.S., et al., Nature 314 (1985) 268-270] 를 참조한다. 특히 바람직한 CDR 은 키메라 항체에 대해 상기 주목된 항원을 인지하는 서열을 나타내는 것에 상응한다. 본 발명에 포함되는 "인간화 항체" 의 기타 형태는 불변 영역이 본래 항체의 불변 영역으로부터 부가적으로 개질되거나 변화되어, 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체 (FcR) 결합과 관련된 본 발명에 따른 특성을 발생시키는 형태들이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "인간 항체" 라는 용어는, 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 인간 항체는 당업계에 잘 알려져 있다 (van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374). 인간 항체는 또한 면역화 시, 내생 면역글로불린 생성 부재시에도 인간 항체의 전체 레퍼토아 또는 셀렉션을 생성할 수 있는 유전자 도입 동물 (예를 들어, 마우스) 에서 생성될 수 있다. 이러한 생식선 돌연변이체 마우스에서의 인간 생식선 면역글로불린 유전자 어레이의 이동은 항원 접종시 인간 항체 제조라는 결과를 낳을 것이다 (예를 들어, Jakobovits, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 2551-2555; Jakobovits, A., et al., Nature 362 (1993) 255-258; Bruggemann, M., et al., Year Immunol. 7 (1993) 33-40 참고). 인간 항체는 또한 파지 디스플레이 라이브러리에서 생성될 수 있다 (Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597). [Cole et al. 및 Boerner et al.] 의 기술은 또한 인간 모노클론 항체의 제조에 이용가능하다 (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); 및 Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). 본 발명에 따른 키메라 및 인간화 항체에 대해 이미 언급된 바와 같이, 본원에서 사용되는 바와 같은 "인간 항체" 라는 용어는 또한 불변 영역에 개질이 일어나, 예를 들어, "계열 스위칭" 즉, Fc 부분의 변화 또는 돌연변이 (예를 들어, IgG1 에서 IgG4 및/또는 IgG1/IgG4 돌연변이로) 에 의해, 특히 C1q 결합 및/또는 FcR 결합과 관련된 본 발명에 따른 특성을 발생시키는 그러한 항체를 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "재조합 인간 항체" 라는 용어는 재조합 수단에 의해 제조되고, 발현되고, 제작되거나 단리되는 모든 인간 항체, 예컨대 NS0 또는 CHO 세포와 같은 숙주 세포로부터, 또는 숙주 세포 내로 트랜스펙션된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 인간 면역글로불린 유전자 또는 항체에 대해 유전자 도입된 동물 (예를 들어, 마우스) 로부터 단리된 항체가 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 가변 및 불변 영역을 재배열된 형태로 갖는다. 본 발명에 따른 재조합 인간 항체는 생체 내 체세포 과돌연변이에 적용된다. 그러므로, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되는 서열인 반면, 생체 내 인간 항체 생식선 레퍼토아 내에 자연적으로 존재할 수 없는 서열이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "가변 도메인" (경쇄 (VL) 의 가변 도메인, 중쇄 (VH) 의 가변 영역) 은 항원에 대한 항체 결합에 직접 관여하는 경쇄 및 중쇄의 각각의 쌍을 나타낸다. 가변 인간 경쇄 및 중쇄의 도메인은 동일한 일반적 구조를 가지며, 각각의 도메인은 3 개의 "과가변 영역" (또는 상보성 결정 영역, CDR) 에 의해 연결된, 그 서열이 널리 보존되는 4 개의 골격 (FR) 영역을 포함한다. 골격 영역은 β-시트 형태를 취하며, CDR 은 β-시트 구조와 연결되는 루프를 형성할 수 있다. 각각의 사슬 내의 CDR 은 골격 영역에 의해 그들의 3 차원 구조를 유지하며, 다른 사슬로부터의 CDR 과 함께 항원 결합 부위를 형성한다. 항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역은 본 발명에 따른 항체의 결합 특이성/친화성에 특히 중요한 역할을 하므로, 본 발명의 추가의 목적을 제공한다.

본원에서 사용되는 경우 "과가변 영역" 또는 "항체의 항원-결합 부분" 이라는 용어는 항원-결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 과가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR" 로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "골격" 또는 "FR" 영역은 본원에 정의된 바와 같은 과가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 영역이다. 그러므로, 항체의 경쇄 및 중쇄는 N- 에서 C-말단까지 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4 를 포함한다. 각각의 사슬 상의 CDR 은 이러한 골격 아미노산에 의해 분리된다. 특히, 중쇄의 CDR3 은 항원 결합에 가장 기여하는 영역이다. CDR 및 FR 영역은 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 의 표준 정의에 따라 결정된다.

중쇄 및 경쇄의 "불변 도메인" 은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관여하지 않으나, 다양한 효과기 기능을 나타낸다. 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 항체 또는 면역글로불린은 다음 계열로 나뉜다:

본원에서 사용되는 바와 같은 "2가, 이중특이적 항체" 라는 용어는, 중쇄 및 경쇄의 2 개 쌍 (HC/LC) 각각이 상이한 항원에 특이적으로 결합하고, 즉, 제 1 중쇄 및 제 1 경쇄 (제 1 항원에 대한 항체로부터 기원함) 가 제 1 항원에 함께 특이적으로 결합하고, 제 2 중쇄 및 제 2 경쇄 (제 2 항원에 대한 항체로부터 기원함) 가 제 2 항원에 함께 특이적으로 결합하는 (도 2 에 도식화된 바와 같이) 상기 기재된 바와 같은 항체를 말하고; 이러한 2가, 이중특이적 항체는 2 개의 상이한 항원에 동시에 특이적으로 결합할 수 있고, 2 개 초과의 항원에는 결합할 수 없으나, 이와 대조적으로 한편으로는 오직 하나의 항원에만 결합할 수 있는 단일특이적 항체, 다른 한편으로는, 예를 들어 4 개의 항원 분자에 동시에 결합할 수 있는 4 가, 사중특이적 항체가 있다.

본 발명에 따르면, 원치않는 부산물에 대한 바람직한 2가, 이중특이적 항체의 비는 오직 하나의 중쇄 및 경쇄의 쌍 (HC/LC) 에서 특정 도메인을 대체하여 향상될 수 있다. 첫번째 2 개의 HC/LC 쌍이 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체로부터 기원하고 본질적으로 불변으로 남아있는 반면, 두번째 2 개의 HC/LC 쌍이 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체로부터 기원하고 하기 대체물에 의해 변형된다:

- 경쇄: 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 상기 항체의 불변 중쇄 도메인 CH1 에 의한 불변 경쇄 도메인 CL 의 대체, 및

- 중쇄: 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 상기 항체의 불변 경쇄 도메인 CL 에 의한 불변 중쇄 도메인 CH1 의 대체.

그러므로 수득되는 2가, 이중특이적 항체는 하기를 포함하는 인공 항체이다:

b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄;

(제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의) 상기 경쇄는 CL 대신 불변 도메인 CH1 을 함유하고,

(제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의) 상기 중쇄는 CH1 대신 불변 도메인 CL 을 함유함.

본 발명의 부가적인 양상에서, 원치않는 부산물에 대한 바람직한 2가, 이중특이적 항체의 향상된 비는 하기 2 가지 대안 중 하나에 의해 추가로 향상될 수 있다:

A) 제 1 대안 (도 3 참조):

본 발명에 따른 상기 2가, 이중특이적 항체의 CH3 도메인은 예를 들어 [WO　96/027011, Ridgway J.B., et al, Protein Eng 9 (1996) 617-621; 및 Merchant, A.M., et al, Nat Biotechnol 16 (1998) 677-681] 에서 여러 예로 상세히 기재되는 "놉-인투-홀" 기술에 의해 변형될 수 있다. 이러한 방법에서 두 CH3 도메인의 상호작용 표면은 이들 두 CH3 도메인을 포함하는 모든 중쇄의 헤테로이량체화가 증가되도록 변형된다. (두 중쇄의) 각각의 두 CH3 도메인은 "놉" 일 수 있고, 다른 하나는 "홀" 이다. 디술피드 가교의 도입으로 헤테로이량체가 안정화되고 (Merchant, A..M., et al, Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., Ridgway, J.B., Wells, J.A., Carter, P., J MoI Biol 270 (1997) 26-35) 수율이 증가된다.

그러므로 바람직한 구현예에서는, 제 1 CH3 도메인 및 제 2 CH3 도메인이 각각, 항체 CH3 도메인 사이의 본래 경계면을 포함하는 경계면에서 접촉하는 2가, 이중특이적 항체의 CH3 도메인이, CH3 도메인 내의 디술피드 가교의 도입에 의한 추가적 안정화를 포함하는 "놉-인투-홀" 기술에 의해 변형되어 (WO 96/027011, Ridgway, J.B., et al, Protein Eng 9 (1996) 617-621; Merchant. A.M, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; and Atwell, S., Ridgway, J.B., Wells, J.A., Carter P., J MoI Biol 270 (1997) 26-35 에 기재됨) 2가, 이중특이적 항체의 형성이 촉진된다.

따라서 본 발명의 하나의 양상에서 상기 2가, 이중특이적 항체는,

하나의 중쇄의 CH3 도메인 및 다른 중쇄의 CH3 도메인이 각각, 항체 CH3 도메인 사이의 본래 경계면을 포함하는 경계면에서 접촉하고; 상기 경계면이 2가, 이중특이적 항체의 형성이 촉진되도록 변형되는 것을 특징으로 하며, 상기 변형은 하기를 특징으로 한다:

a) 하나의 중쇄의 CH3 도메인이 변형되어,

2가, 이중특이적 항체 내의 다른 중쇄의 CH3 도메인의 본래 경계면과 접촉하는 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 본래 경계면 내에서, 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체됨으로써, 다른 중쇄의 CH3 도메인의 경계면 내의 공간 내에 배치가능한, 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 경계면 내 융기가 생성되고,

b) 다른 중쇄의 CH3 도메인이 변형되어,

2가, 이중특이적 항체 내의 제 1 CH3 도메인의 본래 경계면과 접촉하는 제 2 CH3 도메인의 본래 경계면 내에서, 아미노산 잔기가 더 적은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체됨으로써, 제 1 CH3 도메인의 경계면 내의 융기가 배치가능한, 제 2 CH3 도메인의 경계면 내 공간이 생성됨.

바람직하게는, 더 큰 측쇄 부피를 갖는 상기 아미노산 잔기는 아르기닌 (R), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W) 으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

바람직하게는, 더 작은 측쇄 부패를 갖는 상기 아미노산 잔기는 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T), 발린 (V) 으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

본 발명의 하나의 양상에서는 CH3 도메인 모두가 추가로 변형되어, 각각의 CH3 도메인의 상응하는 위치에 아미노산으로서 시스테인 (C) 을 도입함으로써 두 CH3 도메인 사이에 디술피드 가교가 형성될 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서는 예를 들어, EP　1870459A1 에 기재된 놉 잔기의 경우 R409D; K370E (K409D), 홀 잔기의 경우 D399K; E357K 를 사용하여 CH3 도메인 모두가 변형된다.

또는

B) 제 2 대안 (도 4 참조):

하나의 불변 중쇄 도메인 CH3 은 불변 중쇄 도메인 CH1 로 대체되고; 다른 불변 중쇄 도메인 CH3 은 불변 경쇄 도메인 CL 로 대체된다.

중쇄 도메인 CH3 으로 대체된 불변 중쇄 도메인 CH1 은 임의의 Ig 계열 (예를 들어 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM), 또는 서브계열 (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 의 것일 수 있다. 중쇄 도메인 CH3 으로 대체된 불변 경쇄 도메인 CL 은 람다 (λ) 또는 카파 (κ) 유형, 바람직하게는 카파 (κ) 유형의 것일 수 있다.

따라서 본 발명의 하나의 바람직한 구현예는 하기를 포함하는, 2가, 이중특이적 항체이다:

b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄 (불변 도메인 CL 및 CH1 은 서로 대체됨),

및 임의로,

c) 각각, 항체 CH3 도메인 사이의 본래 경계면을 포함하는 경계면에서 접촉하는 하나의 중쇄의 CH3 도메인 및 다른 중쇄의 CH3 도메인;

상기 경계면은 2가, 이중특이적 항체의 형성이 촉진되도록 변형되며, 상기 변형은 하기를 특징으로 함:

ca) 하나의 중쇄의 CH3 도메인이 변형되어,

cb) 다른 중쇄의 CH3 도메인이 변형되어,

2가, 이중특이적 항체 내의 제 1 CH3 도메인의 본래 경계면과 접촉하는 제 2 CH3 도메인의 본래 경계면 내에서, 아미노산 잔기가 더 적은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체됨으로써, 제 1 CH3 도메인의 경계면 내의 융기가 배치가능한, 제 2 CH3 도메인의 경계면 내 공간이 생성됨;

또는

d) 하나의 불변 중쇄 도메인 CH3 이 불변 중쇄 도메인 CH1 로 대체되고; 다른 불변 중쇄 도메인 CH3 이 불변 경쇄 도메인 CL 로 대체됨.

본원에 사용되는 바와 같은 "항원" 또는 "항원 분자" 라는 용어는 상호교환가능하게 사용되며, 항체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 모든 분자를 말한다. 2가, 이중특이적 항체는 제 1 항원 및 별개의 제 2 항원에 특이적으로 결합한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "항원" 이라는 용어에는 예를 들어 단백질, 단백질 상의 상이한 에피토프 (본 발명의 의미 내에서 상이한 항원으로서) 및 다당류가 포함된다. 박테리아, 바이러스 및 기타 미생물의 일부 (껍질, 캡슐, 세포벽, 편모, 섬모 및 독소) 가 주로 포함된다. 지질 및 핵산은 오직 단백질 및 다당류와 조합될 때만 항원성이다. 비-미생물 외생 (비-자가) 항원은 꽃가루, 달걀 흰자, 및 이식된 조직 및 기관으로부터의, 또는 수혈된 혈액 세포의 표면 상의 단백질을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항원은 사이토카인, 세포 표면 단백질, 효소 및 수용체로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

종양 항원은 종양 세포의 표면 상에서 MHC I 또는 MHC II 분자에 의해 제시되는 항원이다. 이들 항원은 때때로 종양 세포에 의해 제시될 수 있으며 결코 정상 세포에 의해 제시되지 않는다. 이러한 경우, 이는 종양-특이적 항원 (TSA) 으로 불리며, 전형적으로 종양 특이적 돌연변이로부터 야기된다. 보다 통상적인 것은 종양 세포 및 정상 세포에 의해 제시되는 항원이며, 이는 종양-관련 항원 (TAA) 으로 불린다. 이들 항원을 인지하는 세포독성 T 림프구는 이의 증식 또는 전이 전에 종양 세포를 파괴할 수 있다. 종양 항원은 또한, 예를 들어 돌연변이된 수용체의 형태로 종양의 표면 상에 있을 수 있는데, 이러한 경우 이는 B 세포에 의해 인지될 것이다.

하나의 바람직한 구현예에서, 2가, 이중특이적 항체가 특이적으로 결합하는 두 가지 상이한 항원 (제 1 및 제 2 항원) 중 하나 이상이 종양 항원이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 2가, 이중특이적 항체가 특이적으로 결합하는 두 가지 상이한 항원 (제 1 및 제 2 항원) 모두가 종양 항원이며; 이러한 경우 제 1 및 제 2 항원은 또한 동일한 종양 특이적 단백질에서의 2 개의 상이한 에피토프일 수 있다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 2가, 이중특이적 항체가 특이적으로 결합하는 두 가지 상이한 항원 (제 1 및 제 2 항원) 중 하나가 종양 항원이며, 다른 것은 T-세포 수용체, CD3, CD16 등과 같은 효과기 세포 항원이다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 2가, 이중특이적 항체가 특이적으로 결합하는 두 가지 상이한 항원 (제 1 및 제 2 항원) 중 하나가 종양 항원이며, 다른 것은 독소 또는 키나아제 억제제와 같은 항암 물질이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "특이적 결합" 또는 "~ 에 특이적으로 결합하는" 이라는 용어는 항체가 항원에 특이적으로 결합한다는 것을 말한다. 바람직하게는 이러한 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 결합 친화성은 10^-9 mol/ℓ 이하 (예를 들어 10^-10 mol/ℓ) 의 KD-값, 바람직하게는 10^-10 mol/ℓ 이하 (예를 들어 10^-12 mol/ℓ) 의 KD-값이다. 결합 친화성은 표면 플라스몬 공명 기술 (Biacore^®)과 같은 표준 결합 검정법으로 측정된다.

"에피토프" 라는 용어는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 폴리펩티드 결정소를 포함한다. 특정 구현예에서, 에피토프 결정소에는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹이 포함되며, 특정 구현예에서는 특이적 3 차원 구조 특성 및/또는 특이적 전하 특성을 가질 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다. 특정 구현예에서는, 단백질 및/또는 거대분자의 복합체 혼합물에서 표적 항원을 우선적으로 인지하는 경우 상기 항체가 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 언급된다.

본 발명의 추가의 구현예는 하기 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 2가, 이중특이적 항체의 제조 방법이다:

a) 숙주 세포를,

로 형질전환시키는 단계;

c) 상기 배양액으로부터 상기 항체 분자를 회수하는 단계.

일반적으로 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 상기 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 2 개의 벡터, 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 상기 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 추가적인 2 개의 벡터가 존재한다. 2 개의 벡터 중 하나는 각각의 경쇄를 코딩하며, 2 개의 벡터 중 다른 것은 각각의 중쇄를 코딩한다. 그러나 본 발명에 따른 2가, 이중특이적 항체의 대안적 제조 방법에서는, 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 오직 하나의 제 1 벡터, 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 오직 하나의 제 2 벡터가 숙주 세포를 형질전환하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 항체 분자의 합성이 가능한 조건 하에서 상응하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 예를 들어 하기를 발현시켜 상기 배양물로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법을 포함한다:

- 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄를 코딩하는 제 1 핵산 서열;

- 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 상기 항체의 중쇄를 코딩하는 제 2 핵산 서열;

- 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄를 코딩하는 제 3 핵산 서열 (불변 경쇄 도메인 CL 은 불변 중쇄 도메인 CH1 로 대체됨); 및

- 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 상기 항체의 중쇄를 코딩하는 제 4 핵산 서열 (불변 중쇄 도메인 CH1 은 불변 경쇄 도메인 CL 로 대체됨).

- 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및

본 발명의 추가적인 구현예는 하기를 포함하는 숙주 세포이다:

a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및

b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터 (불변 도메인 CL 및 CH1 은 서로 대체됨).

본 발명의 추가적인 구현예는 본 발명에 따른 2가, 이중특이적 항체의 조성물, 바람직하게는 약학 또는 진단 조성물이다.

본 발명의 추가적인 구현예는 본 발명에 따른 2가, 이중특이적 항체, 및 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물이다.

본 발명의 추가적인 구현예는, 본 발명에 따른 2가, 이중특이적 항체의 치료적 유효량을 치료요법을 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 특징으로 하는, 치료요법을 필요로 하는 환자의 치료 방법이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "핵산 또는 핵산 분자" 라는 용어는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA 이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물" 이라는 표현은 상호교환가능하게 사용되며 상기 모든 지정물은 자손을 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포" 라는 표현은 1차 대상 세포, 및 전달 수를 고려하지 않고 그로부터 유래된 배양물을 포함한다. 또한, 계획적인 또는 부주의한 돌연변이로 인해 모든 자손의 DNA 내용이 정확히 일치하지 않을 수 있다는 것으로 이해된다. 본래의 형질전환된 세포에서 스크리닝되는 바와 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 변이체 자손이 포함된다. 별개의 지정물이 의도되는 경우, 이는 문맥으로부터 명백할 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "형질전환" 이라는 용어는 벡터/핵산을 숙주 세포 내에 전달하는 방법을 말한다. 강력한 세포 벽 방해물이 없는 세포가 숙주 세포로서 사용된다면, 예를 들어 [Graham and Van der Eh, Virology 52 (1978) 546ff]에 기재된 바와 같은 인산칼슘 침전법에 의해 트랜스펙션을 실시한다. 그러나 핵 주입, 또는 원형질체 융합에 의한 것과 같은, 세포 내에 DNA 를 도입하기 위한 다른 방법이 또한 사용될 수 있다. 원핵 세포 또는 실질적인 세포벽 구조를 함유하는 세포가 사용된다면, 예를 들어 트랜스펙션의 한 방법은 [Cohen, F. N, et al, PNAS. 69 (1972) 7110ff] 에 기재된 바와 같은 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리법이다.

형질전환을 사용하는, 항체의 재조합체 생성은 당업계에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 [Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R.G., et al., Arzneimittelforschung 48 (1998) 870-880] 의 검토 논문 뿐 아니라 US 6,331,415 호 및 US 4,816,567 호에도 기재되어 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "발현" 은, 핵산이 mRNA 로 전사되는 방법 및/또는 전사된 mRNA (또한 전사체로서 나타냄) 가 이어서 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 방법을 말한다. 전사체 및 코딩된 폴리펩티드를 총체적으로 유전자 생성물로서 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA 로부터 유래한다면, 진핵 세포에서의 발현은 mRNA 의 스플라이싱 (splicing) 을 포함할 수 있다.

"벡터" 는 핵산 분자, 특히 삽입된 핵산 분자를 숙주 세포 내에 및/또는 숙주 세포 사이로 이동시키는 자가-스플라이싱하는 핵산 분자이다. 상기 용어는, 주로 DNA 또는 RNA 를 세포 내에 삽입 (예를 들어 염색체 통합) 하는 기능을 하는 벡터, 주로 DNA 또는 RNA 를 복제하는 기능을 하는 복제 벡터, 및 DNA 또는 RNA 의 전사 및/또는 번역을 위한 기능을 하는 발현 벡터를 포함한다. 기재한 바와 같은 기능 중 하나 이상을 제공하는 벡터가 또한 포함된다.

"발현 벡터" 는 적절한 숙주 세포 내에 도입되는 경우 폴리펩티드로 전사 및 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. "발현 시스템" 은 통상 원하는 발현 생성물이 수득되도록 기능할 수 있는 발현 벡터를 포함하는 적합한 숙주 세포를 말한다.

본 발명에 따른 2가, 이중특이적 항체는 바람직하게는 재조합 수단에 의해 생성된다. 이러한 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 원핵 및 진핵 세포에서의 단백질 발현, 항체 폴리펩티드의 후속적 단리, 및 통상적으로는 약학적으로 허용가능한 순도로의 정제를 포함한다. 단백질 발현을 위해, 경쇄 및 중쇄 또는 이의 절편을 코딩하는 핵산이 표준 방법에 의해 발현 벡터 내에 삽입된다. 발현은 CHO 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK293 세포, COS 세포, 효모 또는 E. 콜라이 (E. coli) (E. coli) 세포와 같은 적절한 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 수행되며, 항체는 이러한 세포 (용해 후 상청액 또는 세포) 로부터 회수된다. 2가, 이중특이적 항체는 전체 세포, 세포 용해물, 또는 일부 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태 내에 존재할 수 있다. 기타 세포 성분 또는 기타 오염물 (예를 들어 기타 세포 핵산 또는 단백질) 을 제거하기 위해, 알칼리/SDS 처리, 컬럼 크로마토그래피 및 기타 당업계에 잘 공지된 방법을 비롯한 표준 기술에 의해 정제를 수행한다. [Ausubel, F., et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)] 을 참조한다.

NS0 세포에서의 발현은, 예를 들어 [Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000) 109-123; 및 Barnes, L.M., et al., Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270] 에 기재되어 있다. 일시적 발현은, 예를 들어 [urocher, Y., et al., Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9] 에 기재되어 있다. 가변 도메인의 클로닝은 [Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; 및 Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87] 에 기재되어 있다. 바람직한 일시적 발현 시스템 (HEK 293) 은 [Schlaeger, E.-J., 및 Christensen, K., in Cytotechnology 30 (1999) 71-83] 및 [Schlaeger, E.-J., in J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199] 에 기재되어 있다.

원핵 생물에 적합한 조절 서열은 예를 들어 프로모터, 임의로는 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 진핵 세포는 프로모터, 인핸서 및 폴리아데닐화 신호를 이용하는 것으로 알려져 있다.

핵산은 또 다른 핵산 서열과의 기능적 관계에 놓이는 경우 "작동가능하게 연결된다". 예를 들어, 폴리펩티드의 분비에 참여하는 예비단백질로서 발현된다면 예비서열 또는 분비 선도자에 대한 DNA 는 폴리펩티드에 대한 DNA 에 작동적으로 연결되고; 서열의 전사에 영향을 준다면 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 번역을 용이하게 하기 위해 배치된다면 리보솜 결합 부위는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결되는" 은 연결되는 DNA 서열이 연속적이고, 분비 선도자의 경우 연속적이고 해독 프레임 내에 있는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 연속적일 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는다면, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적 실시에 따라 사용된다.

2가, 이중특이적 항체는 예를 들어, 단백질 A-세파로오스, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적 면역글로불린 정제 절차에 의해 배양 배지로부터 적절히 분리된다. 모노클론 항체를 코딩하는 DNA 및 RNA 는 통상적 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA 및 RNA 의 원천으로서 역할을 할 수 있다. 단리되고 나면, DNA 는 발현 벡터 내에 삽입될 수 있고, 이는 이후 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 HEK 293 세포, CHO 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내에 트랜스펙션되어, 상기 숙주 세포에서 재조합 모노클론 항체가 합성된다.

항체 DNA 내에 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하거나, 또는 뉴클레오티드를 합성하여 2가, 이중특이적 항체의 아미노산 서열 변이체 (또는 돌연변이체) 를 제조한다. 이러한 개질이 수행될 수 있으나, 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 오직 매우 한정된 범위에서만 수행될 수 있다. 예를 들어, 개질은 IgG 이소형 및 항원 결합과 같은 상기 언급된 항체 특성을 변형시키지 않으나, 재조합 생성 수율, 단백질 안정성을 개선시키거나 또는 정제를 용이하게 할 수 있다.

하기의 실시예, 서열 목록 및 도면을 제공하여 본 발명의 이해를 돕고자하며, 본 발명의 진정한 범주를 첨부된 특허청구범위에서 설명한다. 본 발명의 취지를 벗어나지 않으면서 절차에 변형이 가해질 수 있는 것으로 이해된다.

서열 목록

SEQ ID NO :1 - 야생형 <IGF-1R> 항체 중쇄의 아미노산 서열

SEQ ID NO :2 - 야생형 <IGF-1R> 항체 경쇄의 아미노산 서열

SEQ ID NO :3 - <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체의 중쇄** (HC**) 의 아미노산 서열로서, 중쇄 도메인 CH1 은 경쇄 도메인 CL 로 대체된다.

SEQ ID NO :4 - <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체의 경쇄** (LC**) 의 아미노산 서열로서, 경쇄 도메인 CL 은 중쇄 도메인 CH1 로 대체된다.

SEQ ID NO :5 - IGF-1R 엑토도메인 His-스트렙타비딘 결합 펩티드-태그 (IGF-1R-His-SBP ECD) 의 아미노산 서열

SEQ ID NO :6 - 야생형 ANGPT2 <ANGPT2> 항체 중쇄의 아미노산 서열

SEQ ID NO :7 - 야생형 ANGPT2 <ANGPT2> 항체 경쇄의 아미노산 서열

SEQ ID NO :8 - 놉-인투-홀 기술에 사용하기 위한, T366W 교환을 갖는 CH3 도메인 (놉) 의 아미노산 서열

SEQ ID NO :9 - 놉-인투-홀 기술에 사용하기 위한, T366S, L368A, Y407V 교환을 갖는 CH3 도메인 (홀) 의 아미노산 서열

SEQ ID NO :10 - IGF-1R 엑토도메인 His-스트렙타비딘 결합 펩티드-태그 (IGF-1R-His-SBP ECD) 의 아미노산 서열

도 1 - 가변 및 불변 도메인을 전형적인 순서로 포함하는 두 쌍의 중쇄 및 경쇄를 갖는 하나의 항원에 특이적인, 자연 발생적 전체 항체인 IgG 의 도식.
도 2 - 하기를 포함하는, 2가, 이중특이적 항체의 도식: a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄; 및 b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄 (불변 도메인 CL 및 CH1 은 서로 대체됨).
도 3 - 하기를 포함하는, 2가, 이중특이적 항체의 도식: a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄; 및 b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄 (불변 도메인 CL 및 CH1 은 서로 대체되고, 두 중쇄의 CH3 도메인은 놉-인투-홀 기술에 의해 변형됨).
도 4 - 하기를 포함하는, 2가, 이중특이적 항체의 도식: a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄; 및 b) 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄 (불변 도메인 CL 및 CH1 은 서로 대체되고, 두 중쇄의 불변 중쇄 도메인 CH3 중 하나는 불변 중쇄 도메인 CH1 로 대체되고, 다른 불변 중쇄 도메인 CH3 은 불변 경쇄 도메인 CL 로 대체됨).
도 5 - (카파 불변 경쇄 도메인 CL 을 갖는) <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체의 중쇄** <IGF-1R> HC** 의 단백질 서열 도식
도 6 - <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체의 경쇄** <IGF-1R> LC** 의 단백질 서열 도식
도 7 - 중쇄** <IGF-1R> HC** 발현 벡터 pUC-HC**-IGF-1R 의 플라스미드 맵
도 8 - 경쇄** <IGF-1R> LC** 발현 벡터 pUC-LC**-IGF-1R 의 플라스미드 맵
도 9 - 4700-Hyg-OriP 발현 벡터의 플라스미드 맵
도 10 - 기능적 이중특이적 <ANGPT2-IGF-1R> CL-CH1 교환 항체의 존재를 검출하기 위한 I24 IGF-1R 발현 세포 상에서의 세포 FACS IGF-1R-ANGPT2 가교 검정법의 검정법 원리
도 11 - IGF-1R ECD Biacore 도식
도 12 - HEK293-F 세포의 일시적 트랜스펙션 후 세포 배양물 상청액으로부터 단리된 HC** 및 LC** 를 갖는 정제된 단일특이적, 2가 <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체 (IgG1**) 의 SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피
도 13 - ELISA-기반 결합 검정법에서의, 단일특이적 <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체 및 야생형 <IGF-1R> 항체의 IGF-1R ECD 에 대한 결합
도 14 - 일시적으로 트랜스펙션된 HEK293-F 세포로부터의 세포 배양물 상청액으로부터 정제된 <ANGPT2-IGF-1R> CL-CH1 교환 항체 믹스의 SDS-PAGE 및 크기 배제 크로마토그래피
도 15 - 정제된 항체 믹스 내에서의 기능적 이중특이적 <ANGPT2-IGF-1R> CL-CH1 교환 항체의 존재를 검출하기 위한 I24 IGF-1R 발현 세포 상에서의 세포 FACS IGF-1R-ANGPT2 가교 검정법의 샘플 A 내지 F 에 대한 결과: 정제된 단백질 샘플 A 내지 F:
A = 미처리된 I24
B = I24 + 2 ㎍/mL hANGPT2 + hIgG 이소형
C = I24 + 2 ㎍/mL hANGPT2 + 이중특이적 <ANGPT2-IGF-1R> CL-CH1 교환 항체를 포함하는 <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체 및 <ANGPT2> 야생형 항체의 공동-발현으로부터의 믹스
D: 존재하지 않음
E = I24 + 2 ㎍/mL hANGPT2 + <ANGPT2> 야생형 항체
F = I24 + 2 ㎍/mL hANGPT2 + <IGF-1R> 야생형 항체

실시예

재료 & 일반적인 방법

인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열과 관련된 일반적인 정보는 하기에 제시되어 있다: Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). 항체 사슬의 아미노산은 EU 넘버링에 따라 숫자가 매겨지고 언급된다 (Edelman, G.M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)).

재조합 DNA 기술

[Sambrook, J. et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989] 에 기재된 바와 같이 DNA 를 조작하기 위해 표준 방법을 사용하였다. 분자 생물학 시약을 제조자의 지침에 따라 사용하였다.

유전자 합성

바람직한 유전자 분절을 화학 합성에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드로부터 제조하였다. 단수 제한 엔도뉴클레아제 분할 부위에 의해 플랭킹된 600 - 1800 bp 길이의 유전자 분절을, PCR 증폭을 비롯한 올리고뉴클레오티드의 어닐링 및 라이게이션에 의해 어셈블리하고 이어서, 표시된 제한 부위, 예를 들어, KpnI/SacI 또는 AscI/PacI 를 통해 pGA4 클로닝 벡터에 기초를 둔 pPCRScript (Stratagene) 내로 클로닝하였다. 서브클로닝된 유전자 절편의 DNA 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 유전자 합성 절편은 Geneart (Regensburg, Germany) 에서 제시된 설명서에 따라 주문하였다.

DNA 서열 결정

DNA 서열을 MediGenomix GmbH (Martinsried, Germany) 또는 Sequiserve GmbH (Vaterstetten, Germany) 에서 수행된 이중 가닥 서열분석에 의해 결정하였다.

DNA 및 단백질 서열 분석 및 서열 데이터 관리

GCG's (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) 소프트웨어 패키지 버전 10.2 및 Infomax's Vector NT1 Advance 슈트 버전 8.0 을 서열 생성, 맵핑, 분석, 주석 및 실례에 사용하였다.

발현 벡터

기재된 항체 변이체의 발현을 위해, CMV-Intron A 프로모터를 가진 cDNA 구성 또는 CMV 프로모터를 가진 게놈 구성에 기초한 일시적 발현 (예를 들어, HEK293 EBNA 또는 HEK293-F) 세포에 대한 발현 플라스미드를 적용하였다.

항체 발현 카세트 외에, 벡터는 하기를 함유한다:

- E. 콜라이 (E. coli) 에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 복제 기원, 및

- E. 콜라이 (E. coli) 에 암피실린 내성을 부여하는 β-락타마아제 유전자.

항체 유전자의 전사 단위는 하기 요소로 구성된다:

- 5' 말단에 독특한 제한 부위(들),

- 인간 사이토메갈로바이러스로부터의 즉각적인 초기 인핸서 및 프로모터,

- cDNA 구성의 경우 뒤따른 Intron A 서열,

- 인간 항체 유전자의 5' 미번역 영역,

- 면역글로불린 중쇄 신호 서열,

- 면역글로불린 엑손-인트론 구성을 갖는 게놈 구성 또는 cDNA 로서의 인간 항체 사슬 (야생형 또는 도메인 교환을 가짐)

- 폴리아데닐화 신호 서열을 갖는 3' 미번역 영역, 및

- 3' 말단에 독특한 제한 부위(들).

하기에 기재되는 바와 같은 기재된 항체 사슬을 포함하는 융합 유전자는 PCR 및/또는 유전자 합성에 의해 생성되고, 예를 들어, 각각의 벡터 내에 독특한 제한 부위를 사용하는 핵산 분절에 따른 연결에 의한 공지된 재조합 방법 및 기술로 어셈블링된다. 서브클로닝된 핵산 서열은 DNA 서열분석에 의해 입증되었다. 일시적 트랜스펙션의 경우에는, 형질전환된 E. 콜라이 (E. coli) 배양물로부터의 플라스미드 제조 (Nucleobond AX, Macherey-Nagel) 에 의해 더 많은 양의 플라스미드가 제조되었다.

세포 배양 기술

[Current Protocols in Cell Biology (2000), Bonifacino, J.S., Dasso, M., Harford, J.B., Lippincott-Schwartz, J. and Yamada, K.M. (eds.), John Wiley & Sons, Inc.] 에 기재되는 바와 같은 표준 세포 배양 기술을 사용하였다.

하기에 기재되는 바와 같이 부착 성장하는 HEK293-EBNA 또는 부유 성장하는 HEK29-F 세포에서 각각의 발현 플라스미드의 일시적 공동-트렌스펙션에 의해 이중특이적 항체를 발현시켰다.

HEK293 - EBNA 시스템에서의 일시적 트렌스펙션

10% 울트라 로우 (Ultra Low) IgG FCS (우태 혈청, Gibco), 2 mM L-글루타민 (Gibco), 및 250 ㎍/ml 게네티신 (Geneticin) (Gibco) 이 보충된 DMEM (둘베코 변형 이글 배지: Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco) 에서 배양되는 부착 성장하는 HEK293-EBNA 세포 (엡스테인-바르-바이러스 (Epstein-Barr-Virus) 핵 항원을 발현하는 인간 배아 신장 세포주 293; 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American type culture collection) 수탁 번호 ATCC # CRL-10852, Lot. 959 218) 에서 각각의 발현 플라스미드 (예를 들어, 중쇄 및 개질된 중쇄 뿐 아니라, 상응하는 경쇄 및 개질된 경쇄를 코딩하는) 의 일시적 공동-트렌스펙션에 의해 이중특이적 항체를 발현시켰다. 트랜스펙션을 위해, FuGENE™ 6 트랜스펙션 시약 (Roche Molecular Biochemicals) 을 FuGENE™ 시약 (㎕) 대 DNA (㎍) 를 4:1 (3:1 내지 6:1 의 범위) 의 비율로 사용하였다. (개질형 및 야생형) 경쇄 및 중쇄 코딩 플라스미드를 각각 1:2 내지 2:1 의 범위의 1:1 (등몰) 의 몰 비로 사용하여 각각의 플라스미드로부터 단백질을 발현시켰다. 제 3 일에 세포에 L-글루타민 4 mM, 글루코오스 [Sigma] 및 NAA [Gibco] 를 공급하였다. 트랜스펙션 후 제 5 일 내지 제 11 일로부터 원심분리에 의해 이중특이적 항체를 함유하는 세포 배양 상청액을 수집하고, -20℃ 에 저장하였다. 예를 들어, HEK293 세포에서의 인간 면역글로불린의 재조합 발현과 관련된 일반적인 정보는 [Meissner, P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75 (2001) 197-203] 에 기재되어 있다.

HEK293 -F 시스템에서의 일시적 트랜스펙션

제조자의 지침에 따라 HEK293-F 시스템 (Invitrogen) 을 사용하여 각각의 플라스미드 (예를 들어, 중쇄 및 개질된 중쇄 뿐 아니라, 상응하는 경쇄 및 개질된 경쇄를 코딩하는) 의 일시적 트랜스펙션에 의해 이중특이적 항체를 발생시켰다. 간략하게는, 진탕 플라스크 또는 교반 발효기에서, 무혈청 FreeStyle 293 발현 배지 (Invitrogen) 중의 부유 성장하는 HEK293-F 세포 (Invitrogen) 를 4 개의 발현 플라스미드 및 293펙틴 (fectin) 또는 펙틴 (fectin) (Invitrogen) 의 혼합물로 트랜스펙션하였다. 2 L 진탕 플라스크 (Corning) 의 경우, HEK293-F 세포를 600 mL 중 1.0E*6 세포/mL 의 밀도로 파종하고, 120 rpm, 8% CO2 에서 인큐베이션하였다. 하루 후, 세포를 약 1.5E*6 세포/mL 의 세포 밀도에서 A) 등몰 비로, 중쇄 또는 개질된 중쇄를 각각 및 상응하는 경쇄를 코딩하는 600 ㎍ 총 플라스미드 DNA (1 ㎍/mL) 를 함유하는 20 mL Opti-MEM (Invitrogen) 및 B) 20 ml Opti-MEM + 1.2 mL 293 펙틴 또는 펙틴 (2 ㎕/mL) 의 약 42 mL 믹스로 트랜스펙션시켰다. 글루코오스 소비에 따라, 글루코오스 용액을 발효 과정 동안 첨가하였다. 5 ~ 10 일 후에, 분비된 항체를 함유하는 상청액을 수확하고, 항체를 상청액으로부터 직접 정제하거나 상청액을 동결 및 보관하였다.

단백질 측정

[Pace et al., Protein Science, 1995, 4, 2411-1423] 에 따라 아미노산 서열에 근거하여 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm 에서의 흡광도 (OD) 를 측정함으로써 정제된 항체 및 유도체의 단백질 농도를 측정하였다.

상청액 중의 항체 농도 측정

세포 배양 상청액 중의 항체 및 유도체의 농도를 단백질 A 아가로오스-비이드 (Protein A Agarose-bead) (Roche) 로의 면역침전에 의해 추정하였다. 60 ㎕ 단백질 A 아가로오스 비이드를 TBS-NP40 (50 mM Tris, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Nonidet-P40) 로 3 회 세정하였다. 이어서, 1 ~ 15 mL 세포 배양 상청액을 TBS-NP40 로 미리 평형화된 단백질 A 아가로오스 비이드에 적용하였다. 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션 후, 비이드를 Ultrafree-MC-필터 컬럼 (Amicon) 에서 0.5 mL TBS-NP40 으로 1 회, 0.5 mL 2x 인산염 완충 식염수 (2xPBS, Roche) 로 2 회, 0.5 mL 100 mM Na-시트레이트 pH 5.0 로 간략하게 4 회 세정하였다. 35 ㎕ NuPAGE® LDS 샘플 완충액 (Invitrogen) 를 첨가하여 결합된 항체를 용리하였다. 샘플 절반을 NuPAGE® 샘플 환원제와 조합시키거나 비환원된 채로 두고, 각각 70℃ 에서 10 분 동안 가열하였다. 그 결과, 5 ~ 30 ㎕ 을 4 ~ 12% NuPAGE® Bis-Tris SDS-PAGE (Invitrogen) (비환원된 SDS-PAGE 의 경우 MOPS 를 사용, 및 환원된 SDS-PAGE 의 경우 NuPAGE® 항산화제 러닝 완충액 첨가제 (Invitrogen) 가 함유된 MES 완충액을 사용) 에 적용하고, 코마시 블루 (Coomassie Blue) 로 염색하였다.

세포 배양 상청액 중의 항체 및 유도체의 농도를 친화성 HPLC 크로마토그래피에 의해 정량적으로 측정하였다. 간략하게는, 단백질 A 에 결합하는 항체 및 유도체를 함유하는 세포 배양 상청액을 200 mM KH₂PO₄, 100 mM 나트륨 시트레이트, pH 7.4 중의 Applied Biosystems Poros A/20 컬럼에 적용하고, Agilent HPLC 1100 시스템 상의 200 mM NaCl, 100 mM 시트르산, pH 2.5 로 매트릭스로부터 용출하였다. 용리된 단백질을 UV 흡수 및 피크 영역 통합에 의해 정량화하였다. 정제된 표준 IgG1 항체가 표준 역할을 하였다.

대안적으로는, 세포 배양 상청액 중의 항체 및 유도체의 농도를 샌드위치-IgG-ELISA 에 의해 측정하였다. 간략하게는, StreptaWell High Bind Strepatavidin A-96 웰 마이크로타이터 플레이트 (Roche) 를 100 ㎕/웰 비오티닐화 항-인간 IgG 포획 분자 F(ab')2<h-Fcγ> BI (Dianova), 0.1 ㎍/mL 로 실온에서 1 시간 동안 또는 대안적으로는 4℃ 에서 밤새 코팅하고, 이어서 200 ㎕/웰 PBS, 0.05% Tween (PBST, Sigma) 으로 3 회 세정하였다. PBS (Sigma) 중 100 ㎕/웰의 희석 연속물의 각각의 항체 함유 세포 배양 상청액을 웰에 첨가하고, 마이크로타이터플레이트 쉐이커 상의 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 인큐베이션하였다. 200 ㎕/웰 PBST 로 웰을 3 회 세정하고, 결합된 항체를 마이크로타이터플레이트 쉐이커 상의 실온에서 1 ~ 2 시간 동안 검출 항체로서 100 ㎕ F(ab')2<hFcγ>POD (Dianova), 0.1 ㎍/mL 로 검출하였다. 미결합된 검출 항체를 200 ㎕/웰 PBST 로 3 회 세정하여 제거하고, 결합된 검출 항체는 100 ㎕ ABTS/웰을 첨가하여 검출하였다. Tecan Fluor Spectrometer 로 405 nm 의 측정 파장 (참조 파장 492 nm) 에서 흡광도 측정을 수행하였다.

단백질 정제

표준 프로토콜을 참조하여 여과된 세포 배양 상청액으로부터 단백질을 정제하였다. 간략하게는, 단백질 A 세파로오스 컬럼 (Protein A Sepharose column) (GE healthcare) 에 항체를 적용하고 PBS 로 세정하였다. pH 2.8 에서 항체 용리를 달성한 후 즉각적인 샘플의 중화를 진행하였다. 응집된 단백질을 PBS 또는 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl pH 6.0 중에서 크기 배제 크로마토그래피 (Superdex 200, GE Healthcare) 에 의해 단량체성 항체로부터 분리하였다. 단량체성 항체 분획을 모으고, 필요한 경우 예를 들어, MILLIPORE Amicon Ultra (30 MWCO) 원심분리 농축기를 사용하여 농축시키고, -20℃ 또는 -80℃ 에서 동결 및 저장하였다. 샘플 일부를 후속 단백질 분석 및 분석적 특성화 예를 들어, SDS-PAGE, 크기 배제 크로마토그래피 또는 질량 분석에 제공하였다.

SDS - PAGE

NuPAGE® Pre-Cast 젤 시스템 (Invitrogen) 을 제조자의 지침에 따라 사용하였다. 특히, 10% 또는 4 ~ 12% NuPAGE® Novex® Bis-TRIS Pre-Cast 젤 (pH 6.4) 및 NuPAGE® MES (환원젤, NuPAGE® Antioxidant 러닝 완충액 첨가제 함유) 또는 MOPS (비-환원젤) 러닝 완충액을 사용하였다.

분석적 크기 배제 크로마토그래피

항체의 응집 및 올리고머성 상태의 측정을 위한 크기 배제 크로마토그래피를 HPLC 크로마토그래피에 의해 수행하였다. 간략하게는, Protein A 로 정제된 항체를 Agilent HPLC 1100 시스템 상의 300 mM NaCl, 50 mM KH₂PO₄/K₂HPO₄, pH 7.5 중의 Tosoh TSKgel G3000SW 컬럼 또는 Dionex HPLC-System 상의 2 x PBS 중의 Superdex 200 컬럼 (GE Healthcare) 에 적용하였다. 용리된 단백질을 UV 흡수 및 피크 영역 통합에 의해 정량화하였다. BioRad Gel Filtration Standard 151-1901 이 표준 역할을 하였다.

질량 분석

교차 항체의 총 탈글리코실화 질량을 전기분사 이온화 질량 분석 (ESI-MS) 를 통해 측정하고 확인하였다. 간략하게는, 100 ㎍ 의 정제된 항체를 100 mM KH₂PO₄/K₂HPO₄, pH 7 중의 50 mU N-Glycosidase F (PNGaseF, ProZyme) 로, 37℃ 에서 12 ~ 24 시간 동안 2 mg/ml 이하의 단백질 농도까지 탈글리코실화시키고, 이어서 Sephadex G25 컬럼 (GE Healthcare) 상에서 HPLC 를 통해 탈염시켰다. 탈글리코실화 및 환원 후 각각의 중쇄 및 경쇄의 질량을 ESI-MS 에 의해 측정하였다. 간략하게는, 115 ㎕ 중의 50 ㎍ 항체를 60 ㎕ 1M TCEP 및 50 ㎕ 8M 구아니딘-히드로클로라이드로 인큐베이션하고 이어서 탈염시켰다. 총 질량 및 환원된 중쇄 및 경쇄의 질량을 NanoMate 공급원이 장착된 Q-Star Elite MS 시스템 상의 ESI-MS 를 통해 측정하였다.

IGF -1R ECD 결합 ELISA

생성된 항체의 결합 특성을 IGF-1R 세포외 도메인 (ECD) 으로의 ELISA 검정법에서 평가하였다. 이를 위해, N-말단 His-스트렙타비딘 결합 펩티드-태그 (His-SBP) 에 융합된 알파 사슬의 인간 IGF-1R 엑토도메인의 LI-시스테인 풍부-12 도메인 및 본래의 선도자 서열을 포함하는 IGF-1R 의 세포외 도메인 (잔기 1~462) (McKern et al., 1997; Ward et al, 2001 에 따름) 을 pcDNA3 벡터 유도체 내에 클로닝하고 HEK293F 세포에서 일시적으로 발현시켰다. IGF-1R-His-SBP ECD 의 단백질 서열을 SEQ ID NO:10 에 제시하였다. StreptaWell High Bind 스트렙타비딘 A-96 웰 마이크로타이터 플레이트 (Roche) 를, 4℃ 에서 밤새 가용성 IGF-1R-ECD-SBP 융합 단백질을 함유하는 100 ㎕/웰 세포 배양물 상청액으로 코팅하고, 200 ㎕/웰 PBS, 0.05% Tween (PBST, Sigma) 으로 3 회 세척하였다. 이어서, 각각의 항체, 및 참조로서 1% BSA (분획 V, Roche) 를 포함하는 PBS 중의 야생형 <IGF-1R> 항체 (Sigma) 의 연속 희석물 100 ㎕/웰을 상기 웰에 첨가하고 실온에서 마이크로타이터플레이트 쉐이커에서 1~2시간 동안 인큐베이션하였다. 연속 희석을 위해, 동량의 정제된 항체를 상기 웰에 적용하였다. 200 ㎕/웰 PBST 로 상기 웰을 3 회 세척하고, 마이크로타이터플레이트 쉐이커 상의 실온에서 1~2시간 동안 검출 항체로서 0.1 ㎍/mL (1:8000) 의 F(ab')2<hFcγ>POD (Dianova) 100 ㎕/웰로 결합된 항체를 검출하였다. 200 ㎕/웰 PBST 로 3 회 세척하여 미결합 검출 항체를 제거하고 100 ㎕ ABTS/웰을 첨가하여, 결합된 검출 항체를 검출하였다. Tecan Fluor 분광계로 405 nm 의 측정 파장 (참조 파장 492 nm) 에서 흡광도를 측정하였다.

IGF -1R ECD Biacore

또한 생성된 항체의 인간 IGF-1R ECD 에 대한 결합을, BIACORE T100 장치 (GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Sweden) 를 사용하는 표면 플라스몬 공명에 의해 조사하였다. 간략하게는, 친화성 측정을 위해, 태그된 인간 IGF-1R ECD-Fc 에 대한 항체의 제시를 위한 아민 커플링을 통해 염소-항-인간 IgG, JIR 109-005-098 항체를 CM5 칩 상에 고정시켰다. HBS 완충액 (HBS-P (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.005% Tween 20, pH 7.4), 25℃ 에서 결합을 측정하였다. IGF-1R ECD (R&D Systems 또는 자체 정제된) 를 용액 중 다양한 농도로 첨가하였다. 80 초 내지 3 분의 IGF-1R ECD 주입에 의해 결합을 측정하고; HBS 완충액으로 3 ~ 10 분 동안 칩 표면을 세척하여 해리를 측정하고, 1:1 랭뮤어 (Langmuir) 결합 모델을 사용하여 KD 값을 추정하였다. <IGF-1R> 항체의 낮은 로딩 밀도 및 포획 수준으로 인해, 1가 IGF-1R ECD 결합이 수득되었다. 시스템 고유의 기준선 이동의 보정, 및 노이즈 신호 감소를 위해, 음성 대조군 데이터 (예를 들어 완충액 곡선) 를 샘플 곡선에서 뺐다. Biacore T100 평가 소프트웨어 버전 1.1.1 을, 센서그램의 분석 및 친화성 데이터의 계산에 사용하였다. 도 11 은 Biacore 검정법 도식을 보여준다.

실시예 1

단일특이적, 2가 < IGF -1R> 항체의 생성, 발현, 정제 및 특성분석, 가변 도메인 CL 및 CH1 은 서로 대체됨 (본원에서 < IGF -1R> CL - CH1 교환 항체로서 약칭됨).

실시예 1A

단일특이적, 2가 < IGF -1R> CL - CH1 교환 항체를 위한 발현 플라스미드의 제조

본 실시예에서 기재된 각각의 선도자 서열을 포함하는 단일특이적, 2가 <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 대한 서열은 WO　2005/005635 에 기재된 인간 <IGF-1R> 항체 중쇄 (SEQ ID NO: 1, 플라스미드 4843-pUC-HC-IGF-1R) 및 경쇄 (SEQ ID NO: 2, 플라스미드 4842-pUC-LC-IGF-1R) 로부터 유래하며, 중쇄 및 경쇄 불변 도메인은 인간 항체 (C-카파 및 IgG1) 로부터 유래한다.

<IGF-1R> 항체 선도자 서열, 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 인간 카파-경쇄 도메인 (CL) 을 코딩하는 유전자 분절은 인간 γ1-중쇄 불변 도메인 (경첩-CH2-CH3) 의 Fc 도메인의 5'-말단에 연결되고 융합되었다. CL 도메인에 의한 CH1 도메인의 교환 (CH1-CL 교환) 으로부터 생성되는 각각의 융합 단백질에 대한 DNA 코딩은 유전자 합성에 의해 생성되었으며, 하기에서 <IGF-1R> HC** (SEQ ID NO:3) 로 나타내었다.

<IGF-1R> 항체 선도자 서열, 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 인간-γ1-중쇄 불변 도메인 (CH1) 에 대한 유전자 분절은 독립적 사슬로서 연결되었다. CH1 도메인에 의한 CL 도메인의 교환 (CL-CH1 교환) 으로부터 생성되는 각각의 융합 단백질에 대한 DNA 코딩은 유전자 합성에 의해 생성되었으며, 하기에서 <IGF-1R> LC** (SEQ ID NO:4) 로 나타내었다.

도 5 및 도 6 은 개질된 <IGF-1R> HC** 중쇄 및 개질된 <IGF-1R> LC** 경쇄 의 단백질 서열의 도식을 나타낸다.

하기에 각각의 발현 벡터를 간략히 기재한다:

벡터 pUC - HC **- IGF -1R

벡터 pUC-HC**-IGF-1R 은, 예를 들어 CL-CH1 교환 <IGF-1R> 중쇄 HC** 의 HEK293 (EBNA) 세포에서의 일시적 발현 또는 CHO 세포에서의 안정적 발현을 위한 발현 플라스미드이다 (cDNA 구성 발현 카세트; CMV-인트론 A 를 가짐).

< IGF -1R> HC ** 발현 카세트 외에 상기 벡터는 하기를 함유한다:

- E. 콜라이 (E. coli) 에서 상기 플라스미드의 복제를 허용하는 벡터 pUC18 로부터의 복제 기원, 및

<IGF-1R> HC** 유전자의 전사 단위는 하기 요소로 구성된다:

- 5' 말단에 AscI 제한 부위(들),

- 뒤따른 Intron A 서열,

- 인간 항체 유전자의 5' 미번역 영역,

- 면역글로불린 경쇄 신호 서열,

- 인간 γ1-중쇄 불변 도메인 (경첩-CH2-CH3) 의 Fc 도메인의 5'-말단에 융합된 인간 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 인간 카파-경쇄 불변 도메인 (CL) 의 융합을 코딩하는 인간 <IGF-1R> 성숙 HC** 사슬,

- 폴리아데닐화 신호 서열을 갖는 3' 미번역 영역, 및

- 3' 말단에 제한 부위 SgrAI.

중쇄** CL-CH1 교환 <IGF-1R> HC** 발현 벡터 pUC-HC**-IGF-1R 의 플라스미드 맵을 도 7 에 나타내었다. <IGF-1R> HC** 의 아미노산 서열 (신호 서열 포함) 을 SEQ ID NO:3 에 나타내었다.

벡터 pUC - LC **- IGF -1R

벡터 pUC-LC**-IGF-1R 은, 예를 들어 CL-CH1 교환 <IGF-1R> 경쇄 LC** 의 HEK293 (EBNA) 세포에서의 일시적 발현 또는 CHO 세포에서의 안정적 발현을 위한 발현 플라스미드이다 (cDNA 구성 발현 카세트; CMV-인트론 A 를 가짐).

< IGF -1R> LC ** 발현 카세트 외에 상기 벡터는 하기를 함유한다:

< IGF -1R> LC ** 유전자의 전사 단위는 하기 요소로 구성된다:

- 5' 말단에 제한 부위 Sse8387I,

- 뒤따른 Intron A 서열,

- 인간 항체 유전자의 5' 미번역 영역,

- 면역글로불린 중쇄 신호 서열,

- 인간 경쇄 가변 도메인 (VL) 및 인간 γ1-중쇄 불변 도메인 (CH1) 의 융합을 코딩하는 인간 <IGF-1R> 성숙 LC** 사슬,

- 폴리아데닐화 신호 서열을 갖는 3' 미번역 영역, 및

- 3' 말단에 제한 부위 SaiI 및 FseI.

경쇄** CL-CH1 교환 <IGF-1R> LC** 발현 벡터 pUC-LC**-IGF-1R 의 플라스미드 맵을 도 8 에 나타내었다. <IGF-1R> LC** 의 아미노산 서열 (신호 서열 포함) 을 SEQ ID NO:4 에 나타내었다.

플라스미드 pUC-HC**-IGF-1R 및 pUC-LC**-IGF-1R 은, 예를 들어 HEK293, HEK293 EBNA 또는 CHO 세포 내로의 일시적 또는 안정적 공동-트랜스펙션 (2-벡터 시스템) 에 사용될 수 있다. 비교를 위해, 야생형 <IGF-1R> 항체를 본 실시예에 기재되는 것들과 유사한 플라스미드 4842-pUC-LC-IGF-1R (SEQ ID NO: 2) 및 4843-pUC-HC-IGF-1R (SEQ ID NO: 1) 로부터 일시적으로 발현시켰다.

HEK293 EBNA 세포에서의 일시적 발현에 있어서 더 높은 발현 수준을 달성하기 위해서, <IGF-1R> HC** 발현 카세트는 AscI, SgrAI 부위를 통해, <IGF-1R> LC** 발현 카세트는 Sse8387I 및 FseI 부위를 통해, 하기를 포함하는 4700 pUC-Hyg_OriP 발현 벡터 내로 서브클로닝될 수 있다:

- OriP 요소, 및

- 선별 마커로서 하이그로마이신 내성 유전자.

중쇄 및 경쇄 전사 단위는 공동-트랜스펙션 (2-벡터 시스템) 을 위해 두 가지 독립적 4700-pUC-Hyg-OriP 벡터 내로 서브클로닝될 수 있거나, 또는 생성된 벡터로의 후속적 일시적 또는 안정적 트랜스펙션을 위해 하나의 공통 4700-pUC-Hyg-OriP 벡터 (1-벡터 시스템) 내로 클로닝될 수 있다. 도 9 는 기본 벡터 4700-pUC-OriP 의 플라스미드 맵을 나타낸다.

실시예 1B

단일특이적, 2가 < IGF -1R> CL - CH1 교환 항체 발현 플라스미드의 제조

야생형 <IGF-1R> 항체의 교환된 Fab 서열을 포함하는 <IGF-1R> 융합 유전자 (HC** 및 LC** 융합 유전자) 를 핵산 분절에 따른 연결에 의한 공지된 재조합 방법 및 기술로 어셈블링시켰다.

IGF-1R HC** 및 LC** 를 코딩하는 핵산 서열을, 각각 화학적 합성으로 합성한 후 Geneart (Regensburg, Germany) 의 pGA4 클로닝 벡터에 기초한 pPCRScript (Stratagene) 내로 클로닝하였다. IGF-1R HC** 를 코딩하는 발현 카세트를 PvuII 및 BmgBI 제한 부위를 통해 각각의 E. 콜라이 (E. coli) 플라스미드 내로 라이게이션하여 최종 벡터 pUC-HC**-IGF-1R 을 산출하였고; 각각의 IGF-1R LC** 를 코딩하는 발현 카세트를 PvuII 및 SalI 제한 부위를 통해 각각의 E. 콜라이 (E. coli) 플라스미드 내로 라이게이션하여 최종 벡터 pUC-LC**-IGF-1R 을 산출하였다. 서브클로닝된 핵산 서열을 DNA 서열분석으로 확인하였다. 일시적 및 안정적 트랜스펙션을 위해서, 형질전환된 E. 콜라이 (E. coli) 배양물로부터의 플라스미드 제조 (Nucleobond AX, Macherey-Nagel) 에 의해 다량의 플라스미드를 제조하였다.

실시예 1C

단일특이적, 2가 < IGF -1R> CL - CH1 교환 항체의 일시적 발현, 정제 및 질량 분석에 의한 정체 확인

재조합 <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체를, 상기 기재된 바와 같이 HEK293-F 부유 세포 내에 플라스미드 pUC-HC**-IGF-1R 및 pUC-LC**-IGF-1R 의 일시적 공동-트랜스펙션에 의해 발현시켰다.

발현되고 분비된 단일특이적, 2가 <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체를 상기 기재된 방법에 따라 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해, 여과된 세포 배양물 상청액으로부터 정제하였다. 간략하게는, 일시적 트랜스펙션으로부터 <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체를 함유하는 세포 배양물 상청액을 원심분리 및 여과에 의해 정화시키고, PBS 완충액 (10 mM Na₂HPO₄, 1 mM KH₂PO₄, 137 mM NaCl 및 2.7 mM KCl, pH 7.4) 으로 평형화된 단백질 A HiTrap MabSelect Xtra 컬럼 (GE Healthcare) 에 적용하였다. PBS 평형 완충액, 이어서 0.1 M 나트륨 시트레이트 완충액 (pH 5.5) 으로 세척하여 미결합된 단백질을 제거하고, PBS 로 세척하였다. 100 mM 나트륨 시트레이트 (pH 2.8) 로 항체를 용리한 후, 2 ml 분획 당 2 M 트리스 (pH 9.0) 300 ㎕ 로 샘플을 즉각적으로 중화하였다. 응집된 단백질을 20 mM 히스티딘, 150 mM NaCl (pH 6.0) 중의 HiLoad 26/60 Superdex 200 정제 등급 컬럼 (GE Healthcare) 상에서 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단량체성 항체로부터 분리하고, 이어서 단량체적 항체 분획을 MILLIPORE Amicon Ultra-15 원심분리 농축기를 사용하여 농축하였다. <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체를 -20℃ 또는 -80℃ 에서 동결 및 보관하였다. 환원제의 존재 또는 부재 하에서 SDS-PAGE 에 의해 <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체의 온전성을 분석하고, 이어서 상기 기재된 바와 같이 코마시 브릴리언트 블루로 염색하였다. <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체의 단량체성 상태를 분석적 크기 배제 크로마토그래피에 의해 확인하였다 (도 12). 특징분석된 샘플을 후속 단백질 분석법 및 기능적 특징분석에 제공하였다. ESI 질량 분석으로, 완전히 탈글리코실화된 <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체의 이론적 분자량을 확인하였다.

실시예 1D

IGF -1R ECD 결합 ELISA 및, Biacore 에 의한 단일특이적, 2가 < IGF -1R> CL-CH1 교환 항체의 IGF -1R 결합 특성의 분석

단일특이적, 2가 <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체의 결합 특성을, 상기 기재한 바와 같은 IGF-1R 세포외 도메인 (ECD) 으로의 ELISA 검정법에서 평가하였다. 이를 위해, N-말단 His-스트렙타비딘 결합 펩티드-태그 (His-SBP) 에 융합된 알파 사슬의 인간 IGF-1R 엑토도메인의 LI-시스테인 풍부-12 도메인 및 본래의 선도자 서열을 포함하는 IGF-1R 의 세포외 도메인 (잔기 1~462) (McKern et al., 1997; Ward et al, 2001 에 따름) 을 pcDNA3 벡터 유도체 내에 클로닝하고 HEK293F 세포에서 일시적으로 발현시켰다. IGF-1R-His-SBP ECD 의 단백질 서열은 상기를 참조하하여 제시한다. 수득된 적정 곡선은 <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체가 기능을 했다는 것을 나타내었고, 방법의 오차 내에서 야생형 <IGF-1R> 항체에 필적할만한 결합 특성 및 동역학을 보이므로, 완전하게 기능을 했다는 것을 나타내었다 (도 13).

이러한 발견은 KD 값이 3.7 pM 인 단일특이적, 2가 <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체가 KD 값이 3.2 nM 인 본래의 야생형 <IGF-1R> 항체와, IGF-1R ECD 에 대해 필적할만한 친화성 및 결합 동역학을 갖는다는 것을 보여주는 각각의 정제된 항체로의 Biacore 데이터를 확증시켜 주었다:

실시예 1G

IGF -1R 과발현 I24 세포를 사용하는 FACS 에 의한 단일특이적, 2가 < IGF -1R> CL-CH1 교환 항체의 IGF -1R 결합 특성의 분석

I24 세포 (재조합 인간 IGF-1R 을 발현하는 NIH3T3 세포, Roche) 의 표면 상에서 과발현된 IGF-1R 에 대한 <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체의 결합 활성을 확인하기 위해, FACS 로 연구하였다. 간략하게는, FACS 튜브 당 5x10E5 I24 세포를 정제된 <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체, 및 참조로서 야생형 <IGF-1R> 항체의 희석물과 함께 인큐베이션하고, 1 시간 동안 빙상에서 인큐베이션하였다. 4 ml 빙냉 PBS (Gibco) + 2% FCS (Gibco) 로 세척하여 미결합된 항체를 제거하였다. 이후 세포를 원심분리 (400 g 에서 5 분) 하고, 결합된 항체를 F(ab')2<hFcγ>PE 접합체 (Dianova) 로, 차광하여 1 시간 동안 빙상에서 검출하였다. 4 ml 빙냉 PBS + 2% FCS 로 세척하여 미결합된 검출 항체를 제거하였다. 이후 세포를 원심분리 (400 g 에서 5 분) 하고, 300 ~ 500 ㎕ PBS 에 재현탁시키고, 결합된 검출 항체를 FACSCalibur 또는 FACS Canto (BD (FL2 채널, 획득량 당 10,000 세포) 상에서 정량하였다. 상기 실험 동안 각각의 이소형 대조군을 포함시켜, 임의의 비특이적 결합 사건을 제외시켰다. I24 세포 상의 IGF-1R 에 대한 <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체 및 야생형 <IGF-1R> 참조 항체의 결합은 필적할만한, 평균 형광 세기의 농도 의존적 이동이라는 결과를 보였다.

실시예 2:

단일특이적, 2가 < ANGPT2 > 야생형 항체의 설명

실시예 2A

단일특이적, 2가 < ANGPT2 > 야생형 항체에 대한 발현 플라스미드의 제조

본 실시예에 기재되는 각각의 선도자 서열을 포함하는 단일특이적, 2가 ANGPT2 <ANGPT2> 야생형 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 대한 서열은 WO　2006/045049에 기재된 인간 <ANGPT2> 항체 중쇄 (SEQ ID NO: 6) 및 경쇄 (SEQ ID NO: 7) 로부터 유래하고, 중쇄 및 경쇄 불변 도메인은 인간 항체 (C-카파 및 IgG1) 로부터 유래한다.

야생형 <ANGPT2> 항체를 상기 실시예 1A 에 기재된 벡터와 유사한 플라스미드 SB04-pUC-HC-ANGPT2 (SEQ ID NO: 6) 및 SB06-pUC-LC-ANGPT2 (SEQ ID NO: 7) 내로 클로닝하였다.

비교 및 공동-발현 실험 (실시예 3 참조) 을 위해, 야생형 <ANGPT2> 항체를 플라스미드 SB04-pUC-HC-ANGPT2 및 SB06-pUC-LC-ANGPT2 로부터 일시적으로 (공동-)발현시켰다.

실시예 2B

단일특이적, 2가 < ANGPT2 > 야생형 항체 발현 플라스미드의 제조

<ANGPT2> HC 및 LC 를 코딩하는 핵산 서열을, 각각 화학적 합성으로 합성한 후 Geneart (Regensburg, Germany) 의 pGA4 클로닝 벡터에 기초한 pPCRScript (Stratagene) 내로 클로닝하였다. <ANGPT2> HC 를 코딩하는 발현 카세트를 각각의 E. 콜라이 (E. coli) 플라스미드 내로 클로닝하여 최종 벡터 SB04-pUC-HC-ANGPT2 를 산출하였고; 각각의 <ANGPT2> LC 를 코딩하는 발현 카세트를 각각의 E. 콜라이 (E. coli) 플라스미드 내로 클로닝하여 최종 벡터 SB06-pUC-LC-ANGPT2 를 산출하였다. 서브클로닝된 핵산 서열을 DNA 서열분석으로 확인하였다. 일시적 및 안정적 트랜스펙션을 위해서, 형질전환된 E. 콜라이 (E. coli) 배양물로부터의 플라스미드 제조 (Nucleobond AX, Macherey-Nagel) 에 의해 다량의 플라스미드를 제조하였다.

실시예 3

이중특이적 , 2가 < ANGPT2 - IGF -1R> 항체의 발현, IGF -1R 에 특이적으로 결합하는 중쇄 및 경쇄에서 , 불변 도메인 CL 및 CH1 은 서로 대체됨 (본원에서 <ANGPT2-IGF-1R> CL - CH1 교환 항체로 약칭됨)

실시예 3A

이중특이적 < ANGPT2 - IGF -1R> CL - CH1 교환 항체를 수득하기 위한, HEK293 EBNA 세포에서의 < ANGPT2 > 야생형 항체 및 < IGF -1R> CL - CH1 교환 항체의 일시적 공동-발현 및 정제

하나의 면 상의 <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체 Fab 부위를 통해 IGF-1R 를 인지하고, 다른 하나의 면 상의 <ANGPT2> 야생형 Fab 영역을 통해 <ANGPT2> 를 인지하는 기능적 이중특이적 항체를 생성하기 위해, <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체를 코딩하는 두 가지 발현 플라스미드 (실시예 1A) 를 <ANGPT2> 야생형 항체를 코딩하는 두 가지 발현 플라스미드 (실시예 2A) 와 함께 공동-발현시켰다. 야생형 중쇄 HC 및 CL-CH1 교환 중쇄 HC** 의 통계적 연관성을 가정하여, 이는 이중특이적 및 2가 <IGF-1R-ANGPT2> CL-CH1 교환 항체의 생성을 야기하였다. 두 항체가 모두 동등하게 잘 발현되고 부산물을 고려하지 않는다는 가정하에서, 세 가지 주요 생성물 A) <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체, B) 이중특이적 <IGF-1R-ANGPT2> CL-CH1 교환 항체, 및 C) <ANGPT2> 야생형 항체가 1:2:1 비율로 산출되어야만 한다. 여러 부산물이 예기될 수 있다. 그러나, 오직 CL-CH1 도메인의 교환으로 인해, 부산물의 빈도는 완전한 Fab 교차에 비해 감소될 것이다. <ANGPT2> 야생형 항체가 <IGF-1R> 야생형 및 <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체보다 높은 발현 일시적 발현 수율을 보였기 때문에 <ANGPT2> 야생형 항체 플라스미드 및 <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체 플라스미드의 비는 <ANGPT2> 야생형 항체의 발현을 선호하는 쪽으로 이동하였다는 것을 유념하도록 한다.

주요 생성물 A) <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체, B) 이중특이적 <ANGPT2-IGF-1R> CL-CH1 교환 항체, 및 C) <ANGPT2> 야생형 항체의 믹스를 생성하기 위해, 4 개의 플라스미드 pUC-HC**-IGF-1R 및 pUC-LC**-IGF-1R 및 플라스미드 SB04-pUC-HC-ANGPT2 및 SB06-pUC-LC-ANGPT2 를 상기 기재한 바와 같이 부유 HEK293-F 세포에서 일시적으로 공동-트랜스펙션시켰다. 수확된 상청액에는 주요 생성물 A) <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체, B) 이중특이적 <ANGPT2-IGF-1R> CL-CH1 교환 항체, 및 C) <ANGPT2> 야생형 항체의 믹스가 함유되어 있고, 이를 "이중특이적 CL-CH1 교환 믹스" 라고 표시한다. 이중특이적 CL-CH1 교환 믹스를 함유하는 세포 배양물 상청액을 상기 기재된 바와 같이 원심분리로 수확하고 이어서 정제하였다 (도 14).

항체 믹스의 온전성을 상기 기재된 바와 같이 환원제의 존재 및 부재하에서 SDS-PAGE 에 의해 분석한 후 코마시 브릴리언트 블루로 염색하였다. SDS-PAGE 는 예상되는 바와 같이 2 개의 상이한 중쇄 및 경쇄가 제제 내에 존재한다는 것을 보여주었다 (환원젤). 항체 믹스의 단량체성 상태를 크기 배제 크로마토그래피에 의해 확인하였고, 정제된 항체 종류가 단량체성 상태로 있었다는 것을 보여주었다. 특징분석된 샘플을 후속 단백질 분석법 및 기능적 특징분석에 제공하였다.

실시예 3B

I24 IGF -1R 발현 세포 상의 세포 FACS 가교 검정법으로의 기능적 이중특이적 <ANGPT2-IGF-1R> CL - CH1 교환 항체의 검출

실시예 3A 에 기재된 일시적 공동-발현으로부터의 주요 생성물 A) <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체, B) 이중특이적 <ANGPT2-IGF-1R> CL-CH1 교환 항체, 및 C) <ANGPT2> 야생형 항체의 정제된 이중특이적 VL-VH/CL-CH1 교환 믹스 중의 기능적 이중특이적 <ANGPT2-IGF-1R> CL-CH1 교환 항체의 존재를 확인하기 위하여, I24 세포 (재조합 인간 IGF-1R 을 발현하는 NIH3T3 세포, Roche) 에서의 세포 FACS IGF-1R-ANGPT2 가교 검정법을 수행하였다. 검정 원리를 도 10 에 나타내었다. 정제된 항체 믹스 중에 존재하는 이중특이적 <ANGPT2-IGF-1R> CL-CH1 교환 항체는 I24 세포 중의 IGF-1R, 및 ANGPT2 에 동시에 결합할 수 있으므로; 이것의 두 표적 항원과 두 반대 Fab 영역을 연결할 것이다.

간략하게는, FACS 튜브 당 5x10E5 I24 세포를 총 정제된 항체 믹스와 함께 인큐베이션하고, 1 시간 동안 빙상에서 인큐베이션하였다 (적정 160 ㎍/ml 믹스). 각각의 정제된 항체 야생형 <IGF-1R> 및 <ANGPT2> 를 대조군으로서 I24 세포에 적용하였다. 4 ml 빙냉 PBS (Gibco) + 2% FCS (Gibco) 로 세척하여 미결합된 항체를 제거하고, 세포를 원심분리하고 (400 g 에서 5 분), 결합된 이중특이적 항체를 2 ㎍/mL 인간 ANGPT2 (R&D Systems) 50 ㎕ 로 1 시간 동안 빙상에서 검출하였다. 이후, 미결합된 ANGPT2 를 4 ml 빙냉 PBS (Gibco) + 2% FCS (Gibco) 로 1회 세척하여 제거하고, 세포를 원심분리하고 (400 g 에서 5 분), 결합된 ANGPT2 를 5 ㎍/mL <ANGPT2>mIgG1-바이오틴 항체 (BAM0981, R&D Systems) 50 ㎕ 로 45 분 동안 빙상에서 검출하고; 대안적으로는, 세포를 5 ㎍/mL mIgG1-바이오틴-이소형 대조군 (R&D Systems) 50 ㎕ 과 함께 인큐베이션하였다. 4 ml 빙냉 PBS (Gibco) + 2% FCS (Gibco) 로 세척하여 미결합된 검출 항체를 제거하고, 세포를 원심분리하고 (400 g 에서 5 분), 결합된 검출 항체를 50 ㎕ 1:400 스트렙타비딘-PE 접합체 (Invitrogen/Zymed) 로, 차광하여 45 분 동안 빙상에서 검출하였다. 4 ml 빙냉 PBS + 2% FCS 로 세척하여 미결합된 스트렙타비딘-PE 접합체를 제거하였다. 이후, 세포를 원심분리하고 (400 g 에서 5 분), PBS 300 ~ 500 ㎕ 에 재현탁시키고, 결합된 스트렙타비딘-PE 접합체를 FACSCalibur 또는 FACS Canto (BD (FL2 채널, 획득량 당 10,000 세포) 상에서 정량화하였다. 상기 실험 동안 각각의 이소형 대조군을 포함시켜, 임의 비특이적 결합 사건을 제외시켰다. 또한, 정제된 단일특이적, 2가 IgG1 항체 <IGF-1R> 및 <ANGPT2> 를 대조군으로서 포함시켰다.

도 15 에서의 결과는, 교차 항체 (<IGF-1R> CL-CH1 교환 항체) 와 야생형 항체 (<ANGPT2> 야생형 항체) 와의 공동-발현으로부터의, 정제된 항체 교차 믹스 (<ANGPT2-IGF-1R> CL-CH1 교환 항체) 와 함께 한 인큐베이션을 통해, I24 세포 중의 IGF-1R 및, ANGPT2 에 동시에 결합할 수 있어, 이것의 두 표적 항원과 두 반대 Fab 영역을 연결하는 기능적 이중특이적 <ANGPT2-IGF-1R> CL-CH1 교환 항체가 존재한다는 것을 나타내는 형광에서의 유의한 이동을 야기하였다는 것을 보여준다. 반대로 상기 각각의 <IGF-1R> 및 <Ang-2> 대조군 항체는 FACS 가교 검정법에서 형광 이동을 보이지 않았다.

이들 데이터를 취합하면 각각의 야생형 및 교차 플라스미드를 공동-발현시킴으로써, 기능적 이중특이적 항체가 발생될 수 있다는 것을 알 수 있다. 올바른 이중특이적 항체의 수율은, 예를 들어 (놉-인투-홀) 기술 뿐 아니라 디술피드 안정화를 사용하여 야생형 및 개질 교차 중쇄의 올바른 헤테로이량체화를 촉진함으로써 증가될 수 있다 (실시예 4 참조).

실시예 4

개질 CH3 도메인 (놉- 인투 -홀) 을 갖는 2가, 이중특이적 < ANGPT2 - IGF -1R> CL-CH1 교환 항체의 발현

이중특이적 <ANGPT2-IGF-1R> CL-CH1 교환 항체의 수율을 추가로 향상시키기 위해, <IGF-1R> CL-CH1 교환 및 야생형 <ANGPT2> 항체의 공동-발현에 놉-인투-홀 기술을 적용하여, 상동 및 기능적 이중특이적 항체 제제를 수득하였다. 이러한 목적을 위해, <IGF-1R> CL-CH1 교환 항체의 중쇄* HC* 중의 CH3 도메인을 T366W 교환을 갖는 SEQ ID NO:8 의 CH3 도메인 (놉) 으로 대체하고, 야생형 <ANGPT2> 항체의 중쇄 중의 CH3 도메인을 T366S, L368A, Y407V 교환을 갖는 SEQ ID NO:9 의 CH3 도메인 (홀) 으로 대체한다 (또는 반대로). 또한, 안정성 및 수율을 증가시키기 위해 디술피드 뿐 아니라, 이온 결합을 형성하고 헤테로이량체화 수율을 증가시키는 부가적 잔기가 포함될 수 있다 (EP 1870459A1).

개질된 CH3 도메인 (놉-인투-홀) 을 갖는 생성된 2가, 이중특이적 <ANGPT2-IGF-1R> CL-CH1 교환 항체의 일시적 공동-발현, 및 정제를 실시예 3 에 기재된 바와 같이 수행하였다.

헤테로이량체화의 최적화는 예를 들어, EP 1870459A1 에 기재되는 바와 같이 부가적인 디술피드 가교를 CH3 도메인 내로, 예를 들어 Y349C 를 "놉 사슬" 내로 D356C 를 "홀 사슬" 내로 도입하는 기술, 및/또는 놉 잔기의 경우 잔기 R409D; K370E (K409D), 및 홀 잔기의 경우 D399K; E357K 를 함께 사용하는 기술과 같은 상이한 놉-인투-홀 기술을 사용함으로써 달성될 수 있다는 것을 유념해야만 한다.

실시예 4 와 유사하게, ANGPT2 및 또다른 표적 항원 (기타 표적에 대한 항체의 상기 기재된 ANGPT2 중쇄 및 경쇄 및 CH1-CL 교환 중쇄 및 경쇄** HC** 및 LC** 를 사용함, 두 중쇄는 "놉-인투-홀" 에 의해 개질됨) 에 대한, 또는 IGF-1R 및 또다른 표적 (상기 또다른 표적에 대한 항체의 중쇄 및 경쇄, 및 상기 기재된 IGF-1R CH1-CL 교환 중쇄 및 경쇄** HC** 및 LC** 를 사용함, 두 중쇄는 "놉-인투-홀" 에 의해 개질됨) 에 대한 개질된 CH3 도메인 (놉-인투-홀) 을 갖는 추가의 2가, 이중특이적 CH1-CL 교환 항체를 제조할 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

하기를 포함하는 2가, 이중특이적 항체:
a) 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄; 및
b) 불변 도메인 CL 및 CH1 이 서로 대체되는, 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄.
제 1 항에 있어서, 하나의 중쇄의 CH3 도메인 및 다른 중쇄의 CH3 도메인이 각각, 항체 CH3 도메인 사이의 본래 경계면을 포함하는 경계면에서 접촉하고; 상기 경계면이 2가, 이중특이적 항체의 형성이 촉진되도록 변형되는 것을 특징으로 하며, 상기 변형은 하기를 특징으로 하는 항체:
a) 하나의 중쇄의 CH3 도메인이 변형되어,
2가, 이중특이적 항체 내의 다른 중쇄의 CH3 도메인의 본래 경계면과 접촉하는 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 본래 경계면 내에서, 아미노산 잔기가 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체됨으로써, 다른 중쇄의 CH3 도메인의 경계면 내의 공간 내에 배치가능한, 하나의 중쇄의 CH3 도메인의 경계면 내 융기가 생성되고,
b) 다른 중쇄의 CH3 도메인이 변형되어,
2가, 이중특이적 항체 내의 제 1 CH3 도메인의 본래 경계면과 접촉하는 제 2 CH3 도메인의 본래 경계면 내에서, 아미노산 잔기가 더 적은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체됨으로써, 제 1 CH3 도메인의 경계면 내의 융기가 배치가능한, 제 2 CH3 도메인의 경계면 내 공간이 생성됨.
제 2 항에 있어서, 상기 더 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기가 아르기닌 (R), 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체.
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 더 적은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기가 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T), 발린 (V) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체.
제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 두 CH3 도메인이, 각 CH3 도메인의 상응하는 위치에 아미노산으로서 시스테인 (C) 을 도입함으로써 추가로 변형되는 것을 특징으로 하는 항체.
삭제
하기 단계를 포함하는, 제 1 항에 따른 2가, 이중특이적 항체의 제조 방법:
a) 숙주 세포를,
- 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터
- 불변 도메인 CL 및 CH1 이 서로 대체되는, 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터
로 형질전환시키는 단계;
b) 상기 항체 분자의 합성이 가능한 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
c) 단계 b) 에서 배양된 숙주 세포로부터 상기 항체 분자를 회수하는 단계.
하기를 포함하는 숙주 세포:
- 제 1 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터,
- 불변 도메인 CL 및 CH1 이 서로 대체되는, 제 2 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터.
삭제
삭제
제 4 항에 있어서, 상기 두 CH3 도메인이, 각 CH3 도메인의 상응하는 위치에 아미노산으로서 시스테인 (C) 을 도입함으로써 추가로 변형되는 것을 특징으로 하는 항체.