JP2022513708A - 多重特異性抗原結合分子 - Google Patents

多重特異性抗原結合分子 Download PDF

Info

Publication number
JP2022513708A
JP2022513708A JP2021531685A JP2021531685A JP2022513708A JP 2022513708 A JP2022513708 A JP 2022513708A JP 2021531685 A JP2021531685 A JP 2021531685A JP 2021531685 A JP2021531685 A JP 2021531685A JP 2022513708 A JP2022513708 A JP 2022513708A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
region
antigen
terminus
certain embodiments
binding molecule
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2021531685A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2020115115A5 (ja
Inventor
ビュルトマン アンドレアス
フェルデラー カリン
イェーガー ゼバスティアン
ルンツ シュテッフェン
オーバン ヨハンネス
Original Assignee
モルフォシス・アーゲー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by モルフォシス・アーゲー filed Critical モルフォシス・アーゲー
Publication of JP2022513708A publication Critical patent/JP2022513708A/ja
Publication of JPWO2020115115A5 publication Critical patent/JPWO2020115115A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

異なる結合価を有する異なる抗原を、例えば、１つの抗原を一価で及び別の抗原を二価で標的化する能力を有する新規の抗原結合分子が提供される。

Description

本開示は、少なくとも２つの異なる抗原に同時に結合できる新規の抗原結合分子を提供する。異なる結合価で２つの異なる抗原を（例えば、１つの抗原を一価で及び１つの抗原を二価で）標的化する能力は、本明細書で開示される抗原結合分子の特に有用な態様である。本明細書に記載される新規の分子は、免疫グロブリンのヘテロ二量体Ｆｃ領域を利用することが好ましい。特に、治療のためにそのような抗原結合分子及びそのようなものを含む組成物を生成し且つ使用する方法もまた記載される。
２つ以上の抗原に結合できる二重特異性抗体などの多重特異性抗原結合分子は、それらが、２つ以上の標的抗原の同時の結合及び不活性化を可能にし、そのため従来の組合せ療法に対する代替の手法となるため、治療応用のために非常に興味深い。しかしながら、そのような多重特異性形式のための共通の標的として魅力的な多くの抗原に関して、少なくとも１つの抗原に対する好ましい結合は、二価ではなく一価である。
通常の免疫グロブリン抗体の二価の結合は、ある種の細胞表面受容体を架橋し、それにより天然のリガンドの効果を模倣することが見出されている。架橋は、受容体活性化（例えば、受容体リン酸化）を引き起こすことができる。対照的に、一価の結合（例えば、同じ抗体に由来するＦａｂの）は、受容体架橋を引き起こさず、適切なエピトープが標的化される場合、天然のリガンドが結合するのを妨げる。したがって、二価抗原結合はアゴニスト活性をもたらす可能性があるが、同じ抗原に対する一価の結合は、アンタゴニスト活性をもたらす可能性がある。そのような受容体の例は、インスリン受容体（Ｋａｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．（１９７８）７５：４２０９－１３）、ＥＧＦ受容体（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．（１９８３）２５８：８４６－５３）、ＥＰＯ受容体（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｂｌｏｏｄ（１９９７）８９：４７３－８２）、ＧＨ受容体（Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．（２００３）１７：２２４０－５０）又はベータ２－アドレノセプター（Ｍｉｊａｒｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（２０００）５８：３７３－９）である。
一価で共結合することが治療上有益であるか又は必要であり得る他の例示的な抗原としては、ＣＤ３などのＴ細胞受容体複合体のメンバー、低親和性Ｆｃガンマ受容体（ＦｃｙＲ）、トール様受容体（ＴＬＲ）、サイトカイン、ケモカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体又は受容体－チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）が挙げられる。
三価ＩｇＧ一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）融合物（例えば、Ｃｏｌｏｍａ ＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５，１５９－１６３（１９９７）を参照のこと）、三価ＩｇＧ様二重可変ドメイン（ＤＶＤ）抗体（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５，１２９０－１２９７（２００７））、又は二価ラット／マウスハイブリッド二重特異性ＩｇＧ（例えば、Ｌｉｎｄｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５５，２１９－２２５（１９９５）を参照のこと）を含む多数の多重特異性抗原結合形式が近年開発された。
しかしながら、そのようなＩｇＧに基づく手法の欠点は、それらが、多価（例えば、二価）の様式で同時に標的化される抗原に結合し、したがって、潜在的な非特異的活性化及び関連する副作用を引き起こすという点である。これらのＩｇＧに基づく多重特異性コンストラクトの生成はまた、抗体重鎖のホモ二量体化並びに／又は同時発現時の異なる特異性の抗体重鎖及び軽鎖の誤対合が、正確に会合したコンストラクトの収量を減少させ、所望のコンストラクトを分離するのが困難であり得るいくつかの非機能性の副生成物をもたらすため大きなハードルである。
他方で、抗体コア構造（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭ）がもはや維持されていないいくつかの多重特異性抗原結合形式が開発された。例としては、ダイアボディ（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０，６４４４－６４４８（１９９５）を参照のこと）、タンデムｓｃＦｖ分子（例えば、Ｂａｒｇｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１、９７４－９７７（２００８）を参照のこと）、及びその様々な誘導体が挙げられる。しかしながら、ＩｇＧコア構造を欠き且つ少なくとも１つの抗原に対する一価の結合をもたらすことができる抗原結合形式は、短い半減期及びエフェクター機能（ＡＤＣＣ又はＣＤＣなど）を媒介する能力がないなどのそれらの不十分な生理学的特性及び薬物動態特性のために、不利である場合が多い。
国際公開第２０１６／０８６１８９号パンフレットは、ＩｇＧ分子のいずれか１つのＦａｂアームが一本鎖Ｆｖドメインによって置き換えられるか（「ボトルオープナー」形式）又は追加のＦｖ又は一本鎖Ｆｖドメインが、ＩｇＧ分子の一方又は両方の重鎖のＣ末端に融合される、完全ＩｇＧ分子に基づく様々な多重特異性二価及び三価抗体形式を開示している。１つの追加の理論的に記述される抗体形式は、第３の抗原結合部位を形成するためにＩｇＧの２つのＦａｂアームとＦｃ領域の間に追加のＦｖドメインを組み込む「中央－Ｆｖ」形式を指す。しかしながら、本出願は、記載されたコンストラクトが実際に機能することを実験的に証明するものではないし、２つのＦｃ領域サブユニットの効率的なヘテロ二量体化及び／又はエフェクター機能の消失に関与する、本開示の抗原結合分子で利用される特定のＦｃ改変を組み合わせることを提案するものでもない。
本明細書で開示される新規の抗原結合分子は、通常の全長免疫グロブリンによって提供される全ての望ましい特性を有する異なる抗原の同時の二価及び一価の共結合を可能にし、且つそれぞれの生産細胞株の培養上清からの精製が容易な形式を導入することによって、ＩｇＧ及び非ＩｇＧに基づく抗原結合分子の前述の欠点を解決する。
本開示は、少なくとも１つの抗原への一価の結合を可能にするが、サイズ及びＦｃ領域の存在について通常の免疫グロブリン分子の特性を保持する新規の多重特異性抗原結合分子に関する。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、１つの抗原に対する三価の結合を可能にする。そのような実施形態では、抗原結合分子は、少なくとも３つのＦｖ領域を含み、各Ｆｖ領域は、同じ抗原に結合する。そのような実施形態では、本開示による抗原結合分子は、三価の単一特異性抗原結合分子を指す。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、３つの異なる抗原に対する一価の結合を可能にする。そのような実施形態では、抗原結合分子は、少なくとも３つのＦｖ領域を含み、３つのＦｖ領域の各々は、１つの異なる抗原に結合する。そのような実施形態では、本開示による抗原結合分子は、三価の三重特異性抗原結合分子を指す。
好ましい実施形態では、本開示による抗原結合分子は、１つの抗原に対する二価の結合及び第２の抗原に対する一価の結合を可能にする。そのような実施形態では、抗原結合分子は、少なくとも３つのＦｖ領域を含み、３つのＦｖ領域のうちの２つは、２つの標的抗原のうちの１つに結合し、第３のＦｖ領域は、他の標的抗原に結合する。そのような好ましい実施形態では、本開示による抗原結合分子は、三価の二重特異性抗原結合分子を指す。
したがって、ある実施形態では、本開示は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦｖ領域を含む第１のＦａｂ、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦｖ領域及び
ｃ）第３の抗原に特異的に結合する第３のＦｖ領域を含む第２のＦａｂ、並びに
ｄ）第１及び第２のＦｃ領域サブユニットで構成されるＦｃ領域を含み；
Ｉ．第１のＦａｂの重鎖又は軽鎖のＣ末端が、第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬのＮ末端に融合され、且つ
ＩＩ．第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬのＣ末端が、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端が、第２のＦｖ領域の相補的な可変ドメインのＣ末端に融合され、且つ
ＩＩＩ．第１及び第２のＦａｂが、第２のＦｖ領域の別個の可変ドメインに融合されることを条件として、第２のＦａｂの重鎖又は軽鎖のＣ末端が、第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬのＮ末端に融合され、且つ
ＩＶ．第１のＦｃ領域サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基と置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、且つ３５４位のセリン残基がシステイン残基と置き換えられ（Ｓ３５４Ｃ）、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基と置き換えられ（Ｙ４０７Ｖ）、３６６位のスレオニン残基がセリン残基と置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基と置き換えられ（Ｌ３６８Ａ）、且つ３４９位のチロシン残基がシステイン残基と置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（ＥＵインデックスに従う付番）、抗原結合分子を提供する。
ある実施形態では、第３の抗原は、第１又は第２の抗原と同一である。ある実施形態では、第３の抗原は、第１の抗原と同一である。ある実施形態では、第１のＦａｂは、第２のＦａｂと同一である。
ある実施形態では、第２のＦａｂは、第２のＦｖ領域に融合される。ある実施形態では、第２のＦａｂのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１及び第２のＦａｂが、第２のＦｖ領域の別個の可変ドメインに融合されることを条件として、第２のＦａｂの重鎖又は軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１及び第２のＦａｂが、第２のＦｖ領域の別個の可変ドメインに融合されることを条件として、第２のＦａｂのＣＨ１又はＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬのＮ末端に融合される。
ある実施形態では、それぞれの融合は、リンカーを介して生じる。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。ある実施形態では、ペプチドリンカーは、同一であるか又は異なる。ある実施形態では、それぞれの融合は、各々が少なくとも１つのアミノ酸残基の長さを有するペプチドリンカーを介して生じる。ある実施形態では、それぞれの融合は、各々が少なくとも５つのアミノ酸残基の長さを有するペプチドリンカーを介して生じる。ある実施形態では、ペプチドリンカーは、同一の長さである。ある実施形態では、ペプチドリンカーは、異なる長さである。ある実施形態では、第１のＦａｂは、ペプチドリンカーを介して第２のＦｖ領域に融合される。
ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖又は軽鎖のＣ末端は、ペプチドリンカーを介して第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＨ１又はＣＬのＣ末端は、ペプチドリンカーを介して第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬのＮ末端に融合される。
ある実施形態では、第２のＦｖ領域は、ペプチドリンカーを介してＦｃ領域に融合される。ある実施形態では、第２のＦｖ領域は、２つのペプチドリンカーを介してＦｃ領域に融合される。ある実施形態では、第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬのＣ末端は、第１のペプチドリンカーを介して第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のペプチドリンカーを介して第２のＦｖ領域の相補的な可変ドメインのＣ末端に融合される。ある実施形態において、第１及び第２のペプチドリンカーは異なる。ある実施形態において、第１及び第２のペプチドリンカーは同一である。
ある実施形態では、第１及び第２のペプチドリンカーは、もう１つの鎖間ジスルフィド架橋を介して連結される。ある実施形態では、第１及び第２のペプチドリンカーは、第１のペプチドリンカーと第２のペプチドリンカーの間での１つ以上の鎖間ジスルフィド架橋の形成を可能にする１つ以上のシステイン残基を含む。ある実施形態では、第１及び第２のペプチドリンカーは、ジスルフィド架橋で安定化された二量体ペプチドリンカーをもたらす第１のペプチドリンカーと第２のペプチドリンカーの間での１つ以上の鎖間ジスルフィド架橋の形成を可能にする１つ以上のシステイン残基を含む。ある実施形態では、第１及び第２のペプチドリンカーは、免疫グロブリンヒンジ、好ましくはＩｇＧヒンジ、好ましくはヒトＩｇＧヒンジ、好ましくはそのフラグメントのヒトＩｇＧ１ヒンジに由来する。ある実施形態では、第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬと第１又は第２のＦｃ領域サブユニットの間の融合は、ＩｇＧヒンジ又はその部分若しくはフラグメントを含むペプチドリンカーを介して生じる。ある実施形態では、ＩｇＧヒンジは、ヒトＩｇＧヒンジである。ある実施形態では、ヒトＩｇＧヒンジは、ヒトＩｇＧ１ヒンジである。ある実施形態では、ヒトＩｇＧ１ヒンジは、アミノ配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１３）を含む。ある実施形態では、第２のＦｖ領域とＦｃ領域の間の融合は、ＩｇＧヒンジ領域又はその部分を介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂ、第２のＦｖ領域及びＦｃ領域は、ペプチドリンカーを介してそれらの融合パートナーの各々に融合される。ある実施形態では、ペプチドリンカーは、同一であるか又は異なる。ある実施形態では、ペプチドリンカーは、同一である。ある実施形態では、ペプチドリンカーは、異なる。ある実施形態では、ペプチドリンカーの各々は、少なくとも１つのアミノ酸残基の長さを有する。ある実施形態では、ペプチドリンカーの各々は、少なくとも５つのアミノ酸残基の長さを有する。ある実施形態では、ペプチドリンカーの各々は、１と７０の間のアミノ酸残基の長さを有する。ある実施形態では、ペプチドリンカーは、同一の長さである。ある実施形態では、ペプチドリンカーは、異なる長さである。
ある実施形態では、ペプチドリンカーは、ＱＰＫＡＡＰ（配列番号１２）、ＡＳＴＫＧＰ（配列番号１１）、（Ｇ４Ｓ）３（配列番号３３）、（ＧＧＳ）３（配列番号１０）、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１３）、ＱＰＫＡＡＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１５）、及びＡＳＴＫＧＰＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１４）からなる群から選択されるが、これらに限定されない。
ある実施形態では、第２のＦｖ領域のＶＨ及びＶＬは、鎖間ジスルフィド架橋を介して任意に連結される。ある実施形態では、第２のＦｖ領域のＶＨ及びＶＬは、鎖間ジスルフィド架橋を介して連結される。
ある実施形態では、ジスルフィド架橋は、Ｋａｂａｔに従う付番により以下の位置の間に導入される：
ａ．ＶＨ位置４４とＶＬ位置１００、及び／又は
ｂ．ＶＨ位置１０５とＶＬ位置４３、及び／又は
ｃ．ＶＨ位置１０１とＶＬ位置１００。
ある実施形態では、ジスルフィド架橋は、Ｋａｂａｔに従う付番により当該位置の間に導入される：ＶＨ位置４４とＶＬ位置１００。ある実施形態では、ジスルフィド架橋は、Ｋａｂａｔに従う付番により当該位置の間に導入される：ＶＨ位置１０５とＶＬ位置４３。ある実施形態では、ジスルフィド架橋は、Ｋａｂａｔに従う付番により当該位置の間に導入される：ＶＨ位置１０１とＶＬ位置１００。ある実施形態では、第２のＦａｂは、ペプチドリンカーを介して第２のＦｖ領域に融合される。
ある実施形態では、第２のＦａｂの重鎖又は軽鎖のＣ末端は、ペプチドリンカーを介して第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第２のＦａｂのＣＨ１又はＣＬのＣ末端は、ペプチドリンカーを介して第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１及び第２のＦａｂが、第２のＦｖ領域の別個の可変ドメインに融合されることを条件として、第２のＦａｂのＣＨ１又はＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬのＮ末端に融合され、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、少なくとも４つのポリペプチドで構成される。ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、少なくとも４つのポリペプチドで構成され、
ａ．第１のポリペプチドは、第１のＦａｂの軽鎖又は重鎖を含み、
ｂ．第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な軽鎖又は重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬ及び
ｉｉｉ．第１又は第２のＦｃドメインサブユニット
を含み、
ｃ．第３のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第２のＦａｂの軽鎖又は重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域の相補的なＶＨ又はＶＬ及び
ｉｉｉ．相補的な第１又は第２のＦｃドメインサブユニット
を含み、
ｄ．第４のポリペプチドは、第２のＦａｂの相補的な軽鎖又は重鎖を含む。
ある実施形態では、第１のポリペプチドは、第４のポリペプチドと同一である。ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖は、第２のＦａｂの軽鎖と同一である。ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖は、第２のＦａｂの重鎖と同一である。ある実施形態では、第１及び第２のＦａｂの重鎖及び軽鎖は、同一である。ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、図１Ｂに示されるとおりの構造を有する。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、第１、第２の抗原又は第３の抗原に対する一価の結合をもたらす。ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、第１の抗原に対する一価の結合をもたらす。ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、第２の抗原に対する一価の結合をもたらす。ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、第３の抗原に対する一価の結合をもたらす。ある実施形態では、第３の抗原は、第１又は第２の抗原と同一である。ある実施形態では、第３の抗原は、第１の抗原と同一である。ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、第１の抗原に対する一価の結合及び第２の抗原に対する二価の結合をもたらす。ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、第１の抗原に対する二価の結合及び第２の抗原に対する一価の結合をもたらす。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、二重特異性抗原結合分子である。ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、三価の二重特異性抗原結合分子である。
ある実施形態では、第１又は第２の抗原は、Ｔ細胞受容体複合体のメンバーである。ある実施形態では、第２の抗原は、Ｔ細胞受容体複合体のメンバーである。ある実施形態では、第１の抗原は、Ｔ細胞受容体複合体のメンバーである。ある実施形態では、Ｔ細胞受容体複合体のメンバーは、ＣＤ３である。ある実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ３である。ある実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３である。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、第１の抗原に対する二価の結合及び第２の抗原に対する一価の結合をもたらし、第２の抗原は、ＣＤ３である。ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、第１の抗原に対する一価の結合及び第２の抗原に対する二価の結合をもたらし、第１の抗原は、ＣＤ３である。
ある実施形態では、本開示は、抗原結合分子を提供し、Ｆｃ領域は、第１及び第２のＦｃ領域サブユニットの会合を促進する１つ以上のアミノ酸改変を含む。ある実施形態では、本開示は、抗原結合分子を提供し、各Ｆｃ領域サブユニットは、第１及び第２のＦｃ領域サブユニットの会合を促進する１つ以上のアミノ酸改変を含む。ある実施形態では、各Ｆｃ領域サブユニットは、ヘテロ二量体Ｆｃ領域がホモ二量体Ｆｃ領域より好適であるように異なるアミノ酸改変を含む。ある実施形態では、各Ｆｃ領域サブユニットは、第１及び第２のＦｃ領域サブユニットの会合が促進されるように、異なるアミノ酸改変を含む。ある実施形態では、Ｆｃ領域は、免疫グロブリンＦｃ領域である。ある実施形態では、免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ Ｆｃ領域である。ある実施形態では、ＩｇＧ Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域である。ある実施形態では、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１領域である。
ある実施形態では、第１のＦｃ領域サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基はトリプトファン残基と置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基はバリン残基と置き換えられる（Ｙ４０７Ｖ）（ＥＵインデックスに従う付番）。ある実施形態では、第２のＦｃ領域サブユニットにおいて、３６６位のスレオニン残基はセリン残基と置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、且つ３６８位のロイシン残基はアラニン残基と置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）（ＥＵインデックスに従う付番）。ある実施形態では、第１のＦｃ領域サブユニットにおいて、３５４位のセリン残基はシステイン残基と置き換えられ（Ｓ３５４Ｃ）、且つＦｃ領域の第２のＦｃ領域サブユニットにおいて、３４９位のチロシン残基はシステイン残基によって置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（ＥＵインデックスに従う付番）。
ある実施形態では、第１のＦｃ領域サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基はトリプトファン残基と置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、且つ３５４位のセリン残基はシステイン残基と置き換えられ（Ｓ３５４Ｃ）、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基はバリン残基と置き換えられ（Ｙ４０７Ｖ）、３６６位のスレオニン残基はセリン残基と置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基はアラニン残基と置き換えられ（Ｌ３６８Ａ）、且つ３４９位のチロシン残基はシステイン残基と置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（ＥＵインデックスに従う付番）。
ある実施形態では、Ｆｃ領域は、操作されていないＦｃ領域と比較するとき、Ｆｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対する改変された結合親和性を有し、且つ／又は改変されたエフェクター機能を有するように操作される。ある実施形態では、操作されたＦｃ領域は、操作されていないＦｃ領域と比較するとき、Ｆｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対するより高い結合親和性を有し、且つ／又は増大されたエフェクター機能を有する。
ある実施形態では、操作されたＦｃ領域は、操作されていないＦｃ領域と比較するとき、Ｆｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対するより低い結合親和性を有し、且つ／又は低減されたエフェクター機能を有する。ある実施形態では、操作されたＦｃ領域は、操作されていないＦｃ領域と比較するとき、Ｆｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対して実質的に結合親和性を有さず、且つ／又は実質的にエフェクター機能を有しない。ある実施形態では、操作されたＦｃ領域は、操作されていないＦｃ領域と比較するとき、Ｆｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対して結合親和性を有さず、且つ／又はエフェクター機能を有しない。
ある実施形態では、本開示は、抗原結合分子を提供し、各Ｆｃ領域サブユニットにおいて、ヒトＩｇＧ１におけるＥＵインデックスに従う付番を有する位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ａ３３０、Ｐ３３１に相当する位置における５個のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つが変異される。ある実施形態では、本開示は、抗原結合分子を提供し、各Ｆｃ領域サブユニットにおいて、ヒトＩｇＧ１におけるＥＵインデックスに従う付番を有する位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ａ３３０、Ｐ３３１に相当する位置における５個のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つが変異され、且つ操作されたＦｃ領域は、操作されていないＦｃ領域と比較するとき、Ｆｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対して実質的に結合親和性を有さず、且つ／又は実質的にエフェクター機能を有しない。ある実施形態では、本開示は、抗原結合分子を提供し、各Ｆｃ領域サブユニットにおいて、ヒトＩｇＧ１におけるＥＵインデックスに従う付番を有する位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ａ３３０、Ｐ３３１に相当する位置における５個のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つが、それぞれＡ、Ｅ、Ａ、Ｓ、及びＳに変異される。ある実施形態では、本開示は、抗原結合分子を提供し、各Ｆｃ領域サブユニットにおいて、ヒトＩｇＧ１におけるＥＵインデックスに従う付番を有する位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ａ３３０、Ｐ３３１に相当する位置における５個のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つが、それぞれＡ、Ｅ、Ａ、Ｓ、及びＳに変異され、且つ操作されたＦｃ領域は、操作されていないＦｃ領域と比較するとき、Ｆｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対して実質的に結合親和性を有さず、且つ／又は実質的にエフェクター機能を有しない。
ある実施形態では、本開示は、抗原結合分子を提供し、Ｆｃ領域サブユニットにおいて、ヒトＩｇＧ１におけるＥＵインデックスに従う付番を有する位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ａ３３０、Ｐ３３１に相当する位置における少なくとも５個のアミノ酸残基が、それぞれＡ、Ｅ、Ａ、Ｓ、及びＳに変異される。ある実施形態では、本開示は、抗原結合分子を提供し、Ｆｃ領域サブユニットにおいて、ヒトＩｇＧ１におけるＥＵインデックスに従う付番を有する位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ａ３３０、Ｐ３３１に相当する位置における少なくとも５個のアミノ酸残基が、それぞれＡ、Ｅ、Ａ、Ｓ、及びＳに変異され、且つ操作されたＦｃ領域は、操作されていないＦｃ領域と比較するとき、Ｆｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対して実質的に結合親和性を有さず、且つ／又は実質的にエフェクター機能を有しない。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、ポリクローナル又はモノクローナル抗原結合分子である。ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、モノクローナル抗原結合分子である。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、単離された抗原結合分子である。ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、組換え抗原結合分子である。ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、単離された組換え抗原結合分子である。
ある実施形態では、本開示は、本開示による抗原結合分子をコードする核酸配列又は複数の核酸配列を含む核酸組成物を提供する。ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、本開示による核酸組成物によってコードされる。ある実施形態では、本開示は、本開示による核酸組成物を含むベクター又は複数のベクターを含むベクター組成物を提供する。ある実施形態では、本開示は、本開示によるベクター組成物を含む宿主細胞又は本開示による抗原結合分子をコードする本開示による核酸組成物を提供する。ある実施形態では、本開示は、本開示による核酸組成物を含む宿主細胞又は本開示によるベクター組成物を提供する。ある実施形態では、本開示は、宿主細胞を提供し、宿主細胞は、真核細胞、特に、哺乳動物細胞である。ある実施形態では、本開示は、宿主細胞を提供し、宿主細胞は、真核細胞である。ある実施形態では、本開示は、宿主細胞を提供し、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。
ある実施形態では、本開示は、本開示による抗原結合分子を生成する方法であって、ａ）抗原結合分子の発現に好適な条件下で本開示による宿主細胞を培養する工程及びｂ）抗原結合分子を回収する工程を含む方法を提供する。ある実施形態では、本開示は、本明細書で開示される方法によって生成される抗原結合分子を提供する。
ある実施形態では、本開示は、本開示による抗原結合分子及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。ある実施形態では、本開示は、薬剤としての使用のための本開示による抗原結合分子を含む医薬組成物を提供する。ある実施形態では、本開示は、疾患の治療における使用のための本開示による抗原結合分子又は本開示による医薬組成物を提供する。ある実施形態では、本開示は、必要とする個体における疾患の治療における使用のための本開示による抗原結合分子又は本開示による医薬組成物を提供する。ある実施形態では、本開示は、薬剤の製造のための本開示による抗原結合分子の使用を提供する。ある実施形態では、本開示は、必要とする個体における疾患の治療のための薬剤の製造のための本開示による抗原結合分子の使用を提供する。ある実施形態では、本開示は、個体における疾患を治療する方法であって、前記個体に本開示による抗原結合分子を含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む方法に関する。
２つ又は３つのＦｖ領域を含む本開示による二価又は三価の二重特異性抗原結合分子の設計。 本開示による二価の二重特異性抗原結合分子の構造。構造は、第１のＦｖ領域（Ｆｖ１）によって形成される第１の結合部位を含む通常の免疫グロブリンに由来する１つのＦａｂアーム（Ｆａｂ１）を含む。第２の抗原結合部位は、第２のＦｖ領域（Ｆｖ２）によって形成される。第２のＦｖ領域（Ｆｖ２）の各可変ドメイン（ＶＨ２及びＶＬ２）は、ペプチドリンカーを介してＦｃ領域サブユニットの１つのＣＨ２ドメインのＣ末端に融合される。２つのペプチドリンカーは、２つのリンカー（太いクロス・ストローク）間のジスルフィド架橋を安定化する構成を可能にする鎖間システインを含み得る。追加のペプチドリンカーは、第２のＦｖ領域（Ｆｖ２）のＶＨ又はＶＬ（ＶＨ２及びＶＬ２）のＮ末端を第１のＦａｂのＣＨ１又はＣＬと融合する。２つのＦｃ領域サブユニットを含むポリペプチド鎖のヘテロ二量体化は、ジスルフィド安定化及びノブ・イントゥ・ホール技術の手法による各Ｆｃ領域サブユニットにおけるＣＨ３ドメインの改変によって促進される。加えて、第２のＦｖ領域のＶＨ２／ＶＬ２界面におけるジスルフィド安定化が適用され得る（示されない）。各Ｆｃ領域サブユニットにおけるＣＨ２ドメインはさらに、Ｆｃに媒介されるエフェクター機能を促進するか又は無効にするために改変され得る（示されない）。 第１のＦａｂ（Ｆａｂ１）、第２のＦａｂ（Ｆａｂ）２及び第２のＦｖ領域（Ｆｖ２）を含む本開示による三価の二重特異性抗原結合分子の構造。分子は、第１のＦｖ領域（Ｆｖ１）及び第３のＦｖ領域（Ｆｖ３）によって形成される第１及び第３の抗原結合部位を含む通常の免疫グロブリンに由来する２つのＦａｂアームを含む。第２の抗原結合部位は、第２のＦｖ領域（Ｆｖ２）によって形成される。第２のＦｖ領域（Ｆｖ２）の各可変ドメイン（ＶＨ２及びＶＬ２）は、ペプチドリンカーを介してＦｃ領域サブユニットの１つのＣＨ２ドメインのＣ末端に融合される。ペプチドリンカーは、２つのリンカー（太いクロス・ストローク）間のジスルフィド架橋を安定化する構成を可能にする鎖間システインを含む。追加のペプチドリンカーは、第２のＦｖ領域のＶＨ２及びＶＬ２のＮ末端を、それぞれ第１のＦａｂ及び第２のＦａｂのＣＨ１又はＣＬのＮ末端と融合する。２つのＦｃ領域サブユニットを含むポリペプチド鎖のヘテロ二量体化は、ジスルフィド安定化及びノブ・イントゥ・ホール技術の手法による各Ｆｃ領域サブユニットにおけるＣＨ３ドメインの改変によって促進される。加えて、第２のＦｖ領域のＶＨ２／ＶＬ２界面におけるジスルフィド安定化が適用され得る（示されない）。各Ｆｃ領域サブユニットにおけるＣＨ２ドメインはさらに、Ｆｃに媒介されるエフェクター機能を促進するか又は無効にするために改変され得る（示されない）。 ２つ又は３つのＦｖ領域及び追加のＩｇＧ定常ドメインを含む本開示による二価又は三価の二重特異性抗原結合分子の設計。 本開示による二価の二重特異性抗原結合分子の構造。分子は、第１のＦｖ領域（Ｆｖ１）によって形成される第１の結合部位を含む通常の免疫グロブリンに由来する１つのＦａｂアームを含む。第２の抗原結合部位は、第３のＦａｂ（Ｆａｂ３）の第２のＦｖ領域（Ｆｖ２）によって形成される。第３のＦａｂの重鎖及び軽鎖（それぞれＣＨ１又はＣＬ）のＣ末端は、ペプチドリンカーを介してＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＮ末端に融合される。ペプチドリンカーは、２つのリンカー（太いクロス・ストローク）間のジスルフィド架橋を安定化する構成を可能にする鎖間システインを含む。追加のペプチドリンカーは、第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬのＮ末端を、それぞれ第１のＦａｂのＣＨ１又はＣＬのＣ末端と融合する。２つのＦｃ領域サブユニットを含むポリペプチド鎖のヘテロ二量体化は、ジスルフィド安定化及びノブ・イントゥ・ホール技術の手法による各Ｆｃ領域サブユニットにおけるＣＨ３ドメインの改変によって促進される。加えて、第２のＦｖ領域のＶＨ２／ＶＬ２界面におけるジスルフィド安定化が適用され得る（示されない）。ＣＨ２ドメインはさらに、Ｆｃに媒介されるエフェクター機能を促進するか又は無効にするために改変され得る（示されない）。 第１のＦａｂ（Ｆａｂ１）、第２の（Ｆａｂ２）及び第３のＦａｂ（Ｆａｂ３）を含む本開示による三価の二重特異性抗原結合分子の構造。分子は、第１のＦｖ領域（Ｆｖ１）及び第３のＦｖ領域（Ｆｖ３）によって形成される第１及び第３の抗原結合部位を含む通常の免疫グロブリンに由来する２つのＦａｂアーム（Ｆａｂ１及びＦａｂ２）を含む。第２の抗原結合部位は、第３のＦａｂ（Ｆａｂ３）の第２のＦｖ領域（Ｆｖ２）によって形成される。第１及び第３のＦａｂの定常ドメイン（それぞれＣＨ１又はＣＬ）のＣ末端は、ペプチドリンカーを介してＦｃ領域のそれぞれのＣＨ２ドメインのＮ末端に融合される。ペプチドリンカーは、２つのリンカー（太いクロス・ストローク）間のジスルフィド架橋を安定化する構成を可能にする鎖間システインを含む。追加のペプチドリンカーは、第２のＦｖ領域（Ｆｖ２）のＶＨ又はＶＬのＮ末端を、それぞれ第１のＦａｂ及び第２のＦａｂのＣＨ１又はＣＬのＣ末端と融合する。２つのＦｃ領域サブユニットを含むポリペプチド鎖のヘテロ二量体化は、ジスルフィド安定化及びノブ・イントゥ・ホール技術の手法による各Ｆｃ領域サブユニットにおけるＣＨ３ドメインの改変によって促進される。加えて、第２のＦｖ領域のＶＨ／ＶＬ界面におけるジスルフィド安定化が適用され得る（示されない）。ＣＨ２ドメインはさらに、Ｆｃに媒介されるエフェクター機能を促進するか又は阻害するために改変され得る（示されない）。 図１Ｂに示されるとおりの構造を有する本開示による５種の哺乳動物で生成及び精製された二重特異性三価抗原結合分子の、ＨＥＲ２への二価結合及びＣＤ３（コンストラクト１、３、４）への一価結合並びに陰性対照（コンストラクト５）による細胞結合。図３Ａは、フローサイトメトリーにより決定されたコンストラクト濃度に応じたＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞に対する細胞結合（バックグラウンドを超えるシグナル）を示す。図３Ｂは、図３Ａと同じものを示し、ＨＥＲ２陽性ヒト腺癌ＳＫＯＶ－３細胞に対する結合が示される点で異なる。 ＮＦＡＴレポーター遺伝子コンストラクトで一過的にトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞を代替のエフェクター細胞として使用するＮＦＡＴレポーター遺伝子アッセイにおける、ＨＥＲ２に対する二価の結合及びＣＤ３（コンストラクト１、３、４）に対する一価の結合を有する図１Ｂに示される構造を有する本開示による二重特異性三価抗原結合分子並びに陰性対照（コンストラクト５）の機能的活性の評価。標的細胞として、ＨＥＲ２陽性ヒト腺癌ＳＫＯＶ－３又はＨＥＲ２陰性ヒト腺癌ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞株のいずれかが使用される。図４Ａは、コンストラクト濃度に応じたＳＫＯＶ－３細胞の相対的な蛍光を示すグラフである。図４Ｂは、コンストラクト濃度に応じたＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の相対的な蛍光を示すグラフである。 ヒト由来ＰＢＭＣの存在下でのＨＥＲ２発現ＳＫＢＲ３細胞又はＨＥＲ２陰性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞のいずれかに対する、ＨＥＲ２に対する二価の結合及びＣＤ３（コンストラクト１、３、４）に対する一価の結合を有する図１Ｂに示される構造を有する本開示による二重特異性三価抗原結合分子又は陰性対照（コンストラクト５）の細胞傷害性アッセイ。ＰＢＭＣの細胞傷害活性は、組み込まれたＣｅｌｌＴｏｘＧｒｅｅｎ蛍光を測定することによって評価される。コンストラクト濃度に応じたＨＥＲ２発現ＳＫＢＲ３細胞及びＨＥＲ陰性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の相対的な蛍光を示すグラフ。
本開示は、２つ以上の抗原に同時に共結合するのに適している抗原結合分子に関する。
定義
本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「～で構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｏｆ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」若しくは「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、又は「～で構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」と同義であり、包括的又はオープンエンドであり、且つ追加の列挙されていないメンバー、要素又は方法の工程を排除しない。
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、アミノ酸残基のポリマーを指し、特定の長さの生成物を指さない。本用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。別段の指示がない限り、ポリペプチドの特定のアミノ酸配列もまた、その保存的に改変されたバリアント（例えば、アミノ酸残基を類似の構造及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸残基と置き換えることによる）を暗示的に包含する。ポリペプチドは、天然の生物学的供給源に由来してもよいし、組換え技術によって生成されてもよいが、必ずしも設計された核酸配列から翻訳されるわけではない。それは、化学合成を含む任意の様式で作製されてもよい。
本明細書で使用する場合、用語「抗原結合分子」は、最も広い意味では、少なくとも１つの抗原に特異的に結合するタンパク質性分子を指す。抗原結合分子は、１つ以上のポリペプチドで構成され得る。抗原結合分子の例は、免疫グロブリン並びにその誘導体及び／又はフラグメントである。本開示による抗原結合分子は、２つのＦａｂアームとＦｃ領域の間に追加のＦｖ領域を組み込む通常の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）構造に基づく。本明細書で開示されるとおりの抗原結合分子はまた、通常のＩｇＧの２つのＦａｂアームの１つを欠いてもよい。そのような実施形態では、追加のＦｖ領域が、通常の免疫グロブリン構造の１つのＦａｂとＦｃ領域の間に組み込まれる。他のタンパク質性抗原結合分子としては、アフィボディ（プロテインＡのＺ－ドメインを含む）などの抗体様特性を有する骨格、免疫タンパク質（ｌｍｍＥ７など）、チトクロムｂ５６２、アンキリンリピート、ＰＤＺドメイン若しくはＫｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質、昆虫デフェンシンＡ、サソリ毒（カリブドトキシン又はＣＴＬＡ－４など）、ノッチン（Ｍｉｎ－２３、ネオカルチノスタチン、ＣＢＭ４－２又はテンダミスタットなど）、アンチカリン又はアルマジロリピートタンパク質が挙げられる。
本明細書で使用される用語「抗体」分子又は「免疫グロブリン」（Ｉｇ）分子は、抗原と相互作用する、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質を指す。各重鎖（ＨＣ）は、重鎖可変ドメイン（本明細書中でＶＨと略記される）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３という３つのドメインで構成される。各軽鎖（ＬＣ）は、軽鎖可変ドメイン（本明細書中でＶＬと略記される）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、ＣＬという１つのドメインで構成される。ＶＨ及びＶＬドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存されている領域が挿入された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域にさらに細分することができる。ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、次の順でＮ末端からＣ末端に整列した、３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。重鎖及び軽鎖（ＶＨ及びＶＬ）の可変ドメインは、抗原と相互作用する「結合部位」又は「抗原結合部位」を含有する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの宿主組織への結合、又は免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む因子への結合を媒介し得る。用語「抗体」は、例えば、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体及びキメラ抗体を含む。抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスのものであり得る。軽鎖及び重鎖は両方ともに、構造的及び機能的相同性の領域に分けられる。
本明細書で使用する場合、用語「抗体フラグメント」は、抗原と（例えば、結合、立体障害、安定化空間分布によって）特異的に相互作用する能力を保持する抗体の１つ以上の部分を指す。抗体フラグメントの例としては、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂ、一価フラグメントが挙げられるが、これらに限定されず、Ｆａｂ重鎖（ＨＣ）は、ＶＨ及びＣＨ１ドメイン（ＶＨ－ＣＨ１）によって形成され、且つＦａｂ軽鎖は、相補的なＶＬ及びＣＬドメイン（ＶＬ－ＣＬ）によって形成される。したがって、Ｆａｂ重鎖及びＦａｂ軽鎖は、互いに相補的である；ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂを含むＦ（ａｂ）２、二価フラグメント；ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；１つのＶＬ及び１つのＶＨドメインの二量体からなるＦｖフラグメント又はＦｖ領域。したがって、Ｆｖフラグメント又はＦｖ領域のＶＨ及びＶＬドメインは、互いに相補的である；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４－５４６）；及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）。さらに、Ｆｖフラグメント又はＦｖ領域、ＶＬ及びＶＨの２つの可変ドメインは別々の遺伝子でコードされるが、それらは、それらがＶＬ及びＶＨ領域が一価分子（本明細書で「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」と称される；例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６；及びＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９－５８８３を参照のこと）を形成するように対をなす単一のタンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって、組換え法を用いて連結され得る。そのような一本鎖抗体はまた、用語「抗体フラグメント」の中に包含されるものとする。これらの抗体フラグメントは、当業者に知られている従来の技術を使用して得られ、フラグメントは、インタクトな抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。抗体フラグメントはまた、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ－ＮＡＲ、及びビス－ｓｃＦｖに組み込むことができる（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ，（２００５），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３：１１２６－１１３６を参照のこと）。抗体フラグメントは、ＩＩＩ型フィブロネクチン（Ｆｎ３）などのポリペプチドに基づく骨格に移植することができる（フィブロネクチンポリペプチドモノボディについて記載する米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照のこと）。抗体フラグメントは、相補的な軽鎖ポリペプチドとともに抗原結合部位の対を形成する、タンデムＦｖセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）の対を含む一本鎖分子に組み込むことができる（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８：１０５７－１０６２；及び米国特許第５，６４１，８７０号明細書）。
「Ｆｖフラグメント」又は「Ｆｖ領域」は、１つのＶＬ及び１つのＶＨドメインの二量体からなる一価抗体フラグメントである。したがって、Ｆｖフラグメント又はＦｖ領域のＶＨ及びＶＬドメインは、互いに相補的である。
「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂフラグメント」は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価抗体フラグメントである。Ｆａｂ重鎖は、１つのＶＨ及び１つのＣＨドメイン（ＶＨ－ＣＨ１）からなり、Ｆａｂ軽鎖は、１つのＶＬ及び１つのＣＬドメイン（ＶＬ－ＣＬ）からなる。したがって、Ｆａｂ重鎖及びＦａｂ軽鎖は、互いに相補的である。
本明細書で使用する場合、免疫グロブリン（Ｉｇ）「ヒンジ」という用語は、免疫グロブリンの二量体「ヒンジ領域」を形成する２つのポリペプチドの１つを指す。ヒンジは、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに結合する免疫グロブリン重鎖の部分を含む。したがって、天然に存在する免疫グロブリンは２つの同一のヒンジで構成され、これらは、２つのヒンジ中に存在する鎖間システインを通して形成される１つ以上のジスルフィド架橋を介して連結される。言い換えると、天然に存在する免疫グロブリンは、二量体のジスルフィド安定化ヒンジ領域で構成され、これは免疫グロブリンの２つのＦａｂアームをＦｃ領域に結合する。ヒンジは、３つの異なるドメイン：上部、中間、及び下部ヒンジに細分され得る（Ｒｏｕｘ ｅｔ ａｈ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８ １６１：４０８３）。
本明細書で使用する場合、用語「Ｆｃ領域」は、互いに安定な会合を可能にし、それにより免疫グロブリンの二量体Ｃ末端領域を形成する２つのＦｃ領域サブユニットを指す。したがって、２つのＦｃ領域サブユニット（例えば、第１、第２のＦｃ領域サブユニット）は互いに相補的である。通常のＩｇＧ分子の（及び本開示による抗原結合分子の）Ｆｃ領域は、二量体として存在し、その各サブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃ領域の２つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。
本明細書で使用する場合、「Ｆｃ領域サブユニット」は、本開示による免疫グロブリン又は抗原結合分子、すなわち、安定な自己会合が可能な免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドの二量体Ｆｃ領域を形成する２つのポリペプチドの１つを指す。したがって、二量体Ｆｃ領域を形成する２つのＦｃ領域サブユニット（例えば、第１、第２のＦｃ領域サブユニット）は互いに相補的である。例えば、ＩｇＧ Ｆｃ領域サブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。本用語は、天然の配列のＦｃ領域サブユニット及びバリアントＦｃ領域サブユニットを含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域サブユニットの境界は、わずかに変動する可能性があるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域サブユニットは通常、Ｃｙｓ２２６、又はＰｒｏ２３０から重鎖のＣ末端に及ぶように定義される。しかしながら、Ｆｃ領域サブユニットのＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在してもよいし、存在しなくてもよい。本明細書で別段の指定がない限り、Ｆｃ領域におけるアミノ酸残基の付番は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるとおりのＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ付番方式に従う。
本明細書で使用する場合、「ヒト抗体」又は「ヒト抗体フラグメント」は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体及び抗体フラグメントを含む。さらに、抗体が定常領域を有する場合、定常領域もそのような配列に由来する。ヒト起源は、例えば、ヒト生殖系列の配列、若しくはヒト生殖系列の配列の変異型、又は例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ，ｅｔ ａｌ．（２０００．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６，５７－８６）において記載されるとおりのヒトフレームワーク配列分析から導出されたコンセンサスフレームワーク配列を含有する抗体を含む。免疫グロブリン可変ドメイン、例えば、ＣＤＲの構造及び位置は、よく知られる付番スキーム、例えば、Ｋａｂａｔ付番キーム、Ｃｈｏｔｈｉａ付番スキーム、又はＫａｂａｔ及びＣｈｏｔｈｉａの組合せ（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（１９９１），ｅｄｓ．Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．；Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２７３：９２７－９４８）；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１－３２４２ Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３；ａｎｄ Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７－９４８を参照のこと）を使用して定義され得る。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、それぞれの系がフレームワーク及びＣＤＲ領域の両方がヒト起源の配列に由来する可変領域を有する抗体をもたらすのであれば、合成ライブラリー又はトランスジェニックマウス（例えば、ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ）から単離され得る。
用語「キメラ抗体」又は「キメラ抗体フラグメント」は、ある種において見出される配列及び別の種に由来する可変抗体領域に由来するか、又はそれに対応する定常抗体領域を有する抗体として本明細書で定義される。好ましくは、定常抗体領域は、ヒトにおいて見出される配列に由来するか、又はそれに対応し、且つ可変抗体領域（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ又はＦＲ領域）は、非ヒト動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ又はハムスターにおいて見出される配列に由来する。
「ヒト化抗体」又は「ヒト化抗体フラグメント」は、ヒト起源の配列に由来する定常抗体領域及び可変抗体領域若しくはその部分を有するか、又はＣＤＲのみが別の種に由来する抗体分子として本明細書で定義される。ヒト化は、（ａ）非ヒト（例えば、ドナー抗体）ＣＤＲをヒト（例えば、レシピエント抗体）フレームワーク及び定常領域に決定的なフレームワーク残基（例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体機能を保持するのに重要であるもの）の保持の有り無し両方でグラフトすること、（ｂ）非ヒト特異性決定領域（ＳＤＲ又はａ－ＣＤＲ；抗体－抗原相互作用に重大な意味を持つ残基）のみをヒトフレームワーク及び定常領域にグラフトすること、又は（ｃ）非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、それらを表面残基の置き換えによってヒト様区画で「覆い隠す」ことを含むが、これらに限定されない様々な方法によって達成され得る。ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ １３，１６１９－１６３３（２００８）において概説され、且つ例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２，３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６，１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５，８２１，３３７号明細書、同第７，５２７，７９１号明細書、同第６，９８２，３２１号明細書、及び同第７，０８７，４０９号明細書；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３２１，５２２－５２５（１９８６）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１，６８５１－６８５５（１９８４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｏｉ，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４４，６５－９２（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９，１５３４－１５３６（１９８８）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌｅｃ Ｉｍｍｕｎ ３１（３），１６９－２１７（１９９４）；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，２５－３４（２００５）（ＳＤＲ（ａ－ＣＤＲ）グラフティングを記載している）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２８，４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェシング」を記載している）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフリング」を記載している）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６，６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ，Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８３，２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフリングに対する「誘導型選択」手法を記載している）においてさらに記載される。
用語「単離された」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子を実質的に含まない、例えば、抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子であり得る化合物を指す。さらに、単離された抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に含み得ない。したがって、いくつかの実施形態では、提供される抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子は、異なる特異性を有する抗体又は抗原結合分子から分離された、単離された抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子である。単離された抗体又は抗原結合分子は、モノクローナル抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子であり得る。単離された抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子は、組換えモノクローナル抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子であり得る。しかしながら、標的のエピトープ、アイソフォーム又はバリアントに特異的に結合する単離された抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子は、例えば、他の種（例えば、種ホモログ）由来の他の関連抗原に対する交差反応性を有し得る。
本明細書で使用する場合、用語「組換え抗体」、「組換え抗体フラグメント」又は「組換え抗原結合分子」は、天然に存在しない手段によって調製されるか、発現されるか、作製されるか又は分離される本開示による全ての抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子を含む。例えば、抗体又は抗原結合分子を発現するように形質転換された宿主細胞から単離された抗体又は抗原結合分子、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから選択され且つ単離された抗体、及びヒト免疫グロブリン遺伝子の全て又は一部の配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製されたか、発現されたか、作製されたか又は単離された抗体、又はヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニック又はトランスクロモソームの動物（例えば、マウス）又はそれから調製されたハイブリドーマから単離された抗体。好ましくは、そのような組換え抗体又は抗原結合分子は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域がヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、ある種の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（又はヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物が使用される場合、インビボ体細胞変異誘発）にかけることができ、したがって、組換え抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖系列ＶＨ配列及びＶＬ配列に由来し、それらと関係するが、インビボにおいてヒト抗体生殖系列レパートリー内に天然に存在しない場合がある配列である。組換え抗体又は抗原結合分子は、組換えモノクローナル抗体又は組換えモノクローナル抗原結合分子であり得る。ある実施形態では、本明細書で開示される抗体及び抗体フラグメントは、両方が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１３／３２１，５６４号明細書又は米国特許第１３／２９９，３６７号明細書に開示されるとおりのＹｌａｎｔｈｉａ（登録商標）抗体ライブラリーから単離される。
本明細書で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」、「モノクローナル抗体フラグメント」又は「モノクローナル抗原結合分子」は、任意の真核生物クローン、原核生物クローン、又はファージクローンを含む単一クローンに由来する本明細書で開示される抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子を指し、それが生成される方法ではない。モノクローナル抗体又は抗体フラグメントは、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ；Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されるとおりのハイブリドーマ法によって作製され得るか又はファージライブラリーから単離され得る。クローン細胞株及びそれによって発現される本明細書で開示されるとおりのモノクローナル抗体又は抗原結合分子の調製のための他の方法は、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２００２）５ｔｈ Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにおける第１１章を参照のこと）。
用語「多重特異性」は、抗原結合分子が２つ以上の異なる抗原に特異的に結合できることを意味する。通常、多重特異性抗原結合分子は、各々が異なる抗原又はエピトープに特異的な２つ以上の抗原結合部位で構成される。用語「二重特異性」は、抗体又は抗原結合分子が２つの異なる抗原に特異的に結合できることを意味する。通常、二重特異性抗原結合分子は、各々が異なる抗原又はエピトープに特異的な２つの抗原結合部位を含む。
本明細書で使用する場合、用語「特異的に～に結合する」、「～に特異的に結合する」、「～に特異的な」又は「特異的に認識する」などは、標的抗原と本明細書で開示される抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子の間の結合などの測定可能且つ再現性のある相互作用を指し、これは、生体分子を含む分子の不均一な集団の存在下で標的抗原の存在を決定する。例えば、標的抗原（抗原又は抗原のエピトープであり得る）に特異的に結合する本明細書で開示される抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子は、それが他の標的抗原に結合するときより高い親和性、結合活性を有し、より容易に、且つ／又はより長い期間この標的に結合する抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子である。ある種の実施形態では、抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子は、異なる種に由来するタンパク質の中で保存されているタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。別の実施形態では、特異的な結合は、排他的な結合を含んでもよいが、必須ではない。本明細書で開示される抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子は、抗原に特異的に結合する。２つの分子が特異的に結合するかどうかを決定するための方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。スコア化は、標準的な発色現像（例えば、セイヨウワサビペルオキシドを有する二次抗体及び過酸化水素を有するテトラメチルベンジジン）によって実施され得る。特定のウェルにおける反応が、例えば、４５０ｎｍでの吸光度によってスコア化される。典型的なバックグラウンド（＝陰性反応）は、０．１ＯＤであり得る；典型的な陽性反応は、１ＯＤであり得る。これは、陽性／陰性の差が５倍を超え得ることを意味する。通常、結合特異性の決定は、単一の参照抗体ではなく、ミルク粉末、ＢＳＡ、トランスフェリンなどの３～５種の関連しない抗原のセットを使用して実施される。
本明細書で使用する場合、用語「親和性」は、単一の部位におけるポリペプチドとその標的抗原の間の相互作用の強度を指す。各部位内では、ポリペプチドの結合部位が、多数の部位において、弱い非共有結合性の力を介してその標的と相互作用し；相互作用が大きいほど、親和性は強くなる。
本明細書使用する場合、用語「ＫＤ」は、解離定数を指し、これはＫｄとＫａの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、且つモル濃度（Ｍ）として表される。例えば、本明細書で開示されるとおりのモノクローナル抗体又はモノクローナル抗原結合分子のような抗原結合分子に関するＫＤ値は、当該技術分野で十分に確立された方法を使用して決定され得る。例えば、本明細書で開示されるとおりのモノクローナル抗体又はモノクローナル抗原結合分子のような抗原結合分子のＫＤを決定するための方法は、ＳＥＴ（溶解平衡滴定）又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用する表面プラズモン共鳴である。本開示において、抗原に特異的な本開示による抗体又は抗原結合分子は通常、抗原に関して５ｘ１０－２Ｍ未満、１ｘ１０－２Ｍ未満、５ｘ１０－３Ｍ未満、１ｘ１０－３Ｍ未満、５ｘ１０－４Ｍ未満、１ｘ１０－４Ｍ未満、５ｘ１０－５Ｍ未満、１ｘ１０－５Ｍ未満、５ｘ１０－６Ｍ未満、１ｘ１０－６Ｍ未満、５ｘ１０－７Ｍ未満、１ｘ１０－７Ｍ未満、５ｘ１０－８Ｍ未満、１ｘ１０－８Ｍ未満、５ｘ１０－９Ｍ未満、１ｘ１０－９Ｍ未満、５ｘ１０－１０Ｍ未満、１ｘ１０－１０Ｍ未満、５ｘ１０－１１Ｍ未満、１ｘ１０－１１Ｍ未満、５ｘ１０－１２Ｍ未満、１ｘ１０－１２Ｍ未満、５ｘ１０－１３Ｍ未満、１ｘ１０－１３Ｍ未満、５ｘ１０－１４Ｍ未満、１ｘ１０－１４Ｍ未満、５ｘ１０－１５Ｍ未満、若しくは１ｘ１０－１５Ｍ未満又はそれ以下の解離速度定数（ＫＤ）（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を有する。
用語「エピトープ」は、本明細書で開示されるとおりの抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子、又はＴ細胞受容体によって特異的に認識されるか又はその他の方法で分子と相互作用するポリペプチド又はタンパク質上の部位（例えば、アミノ酸の連続した一続き又は連続的でないアミノ酸残基の異なる領域から構成される立体構造配置）を指す。一般に、エピトープは、アミノ酸又は炭水化物若しくは糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基であり、一般に、特定の三次元構造特性及び特定の電荷特性を有し得る。当業者によって理解されるとおり、事実上、抗体又は抗原結合分子が特異的に結合できるものであれば何れもエピトープになり得る。エピトープは、抗体又は抗原結合分子が結合するそれらの残基を含むことができ、且つ「線状」又は「立体構造的」であり得る。用語「線状エピトープ」は、タンパク質と相互作用分子（抗体など）の間の相互作用の点の全てが、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に生じる（連続的）エピトープを指す。用語「立体構造的エピトープ」は、非連続的なアミノ酸残基が三次的な配座で集合しているエピトープを指す。立体構造的エピトープにおいて、相互作用の点は、互いに別個になっているタンパク質上のアミノ酸残基をまたがって生じる。例えば、エピトープは、ペプチドマッピング又はＨＤＸによって示されるとおりの一続きのアミノ酸残基内の１つ以上のアミノ酸残基、又はＸ線結晶構造解析によって示されるとおりの１つ以上の個々のアミノ酸残基であり得る。
「～と同じエピトープに結合する」は、特定の抗原に結合する抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子の能力及び抗体又は抗原結合分子を比較するための同じエピトープマッピング手法を使用するときの例示される抗体又は抗原結合分子と同じエピトープへの結合を意味する。例示される抗体、抗原結合分子、他の抗体及び抗原結合分子のエピトープは、エピトープマッピング手法を使用して決定され得る。エピトープマッピング手法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、立体構造的エピトープは、例えば、水素／重水素交換、ｘ線結晶構造解析及び二次元核磁気共鳴などによってアミノ酸の空間的立体構造を決定することによって、容易に同定される。
本明細書で使用する場合、用語「操作された」又は「改変された」は、合成手段（例えば、組換え手法、インビトロペプチド合成、ペプチドの酵素的若しくは化学的カップリング又はこれらの手法のいくつかの組合せ）による核酸又はポリペプチドの操作を含む。好ましくは、本開示による抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子は、抗原結合、安定性、半減期、エフェクター機能、免疫原性、安全性などの１つ以上の特性を改善するように操作されるか又は改変される。
本明細書で使用する場合、用語「価」は、抗原結合分子中の指定された数の抗原結合部位の存在を意味する。
本明細書で使用する場合、Ｆａｂ及び／又はＦｖ領域、Ｆｃ領域サブユニットなどに関する用語「第１」及び「第２」は、構成要素の各々の種類が２つ以上存在するときに区別するために使用される。これらの用語の使用は、明示的に述べられない限り二重特異性抗原結合分子の特定の順序又は向きを与えることを意図しない。
「第１及び第２のＦｃ領域サブユニットの会合を促進する改変」は、ホモ二量体を形成する同一のポリペプチドを有するＦｃ領域サブユニットを含むポリペプチドの会合を低減するか又は妨げるＦｃ領域サブユニットのポリペプチド骨格又は翻訳後修飾の操作である。本明細書で使用されるとおりの会合を促進する改変は、特に、会合することが望まれる２つのＦｃ領域サブユニット（すなわち、第１及び第２のＦｃ領域サブユニット）の各々に対してなされる別々の改変を含み、改変は、２つのＦｃ領域サブユニットの会合を促進するために互いに相補的である。例えば、会合を促進する改変は、Ｆｃ領域サブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変えて、それらの会合をそれぞれ立体的又は静電気的に有利にし得る。したがって、ヘテロ二量体化は、サブユニットの各々に融合されたさらなる構成要素（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ）が同じではないという意味で異なる可能性がある第１のＦｃ領域サブユニットを含むポリペプチドと第２のＦｃ領域サブユニットを含むポリペプチドの間で生じる。
本明細書で使用する場合、「アミノ酸残基」又は「アミノ酸」は、それらの完全な名称によって又は標準的な３文字若しくは１文字のアミノ酸コードに従って示されることになる。「天然に存在するアミノ酸」は、以下のアミノ酸を意味する。
Figure 2022513708000001
本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸変異」は、アミノ酸置換、欠失、挿入、及び修飾を包含することを意味する。置換、欠失、挿入、及び修飾の任意の組合せは、最終コンストラクトが所望の特徴、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の減少、又は別のペプチドとの会合の増加を有する限りなされてもよい。アミノ酸配列の欠失及び挿入は、アミノ酸残基のアミノ及び／又はカルボキシ末端での欠失及び挿入を含む。特定のアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。アミノ酸置換は、天然に存在しないアミノ酸によるか又は２０種の標準アミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体による置き換えを含む。アミノ酸変異は、当該技術分野でよく知られる遺伝的又は化学的方法を使用して作製され得る。遺伝的方法は、部位特異的変異導入、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含んでもよい。化学修飾など、遺伝子工学以外の方法によってアミノ酸残基の側鎖基を変化させる方法も有用であると考えられる。本明細書では、様々な名称を使用して、同じアミノ酸変位を示す場合がある。例えば、Ｆｃ領域の３２７位でのグリシン（ｇｌｙｉｎｃｅ）からアラニンへの置換は、２３７Ａ、Ｇ３３７、Ｇ３３７Ａ、又はＧｌｙ３２９Ａｌａと示され得る。
用語「ベクター」は、連結されている別のポリヌクレオチドを輸送できるポリヌクレオチド分子を指す。好ましいベクターは、それらが連結される核酸の自律複製及び／又は発現が可能なものである。ベクターの１つの型は、追加のＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す「プラスミド」である。ベクターの別の型は、ウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントは、ウイルスゲノムにライゲートされ得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞における自律複製が可能である（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクター及び哺乳動物ベクター）。他のベクターは、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得るが、それにより宿主ゲノムとともに複製される。ベクターは、原核又は真核細胞に適合し得る。原核生物ベクターは通常、原核生物レプリコンを含み、これは、それとともに形質転換されたエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの細菌宿主細胞においてペプチドの発現（転写及び翻訳）を誘導できる原核生物プロモーターを含み得る。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの結合及び転写が起こることを可能にするＤＮＡ配列によって形成される発現制御エレメントである。細菌宿主と適合するプロモーター配列は通常、ＤＮＡセグメントの挿入のために便利な制限部位を含有するプラスミドベクター中に提供される。そのようなベクタープラスミドの例としては、市販のｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２、並びにｐＢＲ３２９、ｐＰＬ及びｐＫＫ２２３が挙げられる。「発現ベクター」は、それらが作動可能に連結される核酸の発現を誘導できるそれらのベクターであり、且つ同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターのそのような他の形態を含むことが意図される。発現ベクターは、本開示による抗原結合分子をコードする核酸配列（すなわち、コード領域）が、プロモーター及び／又は他の転写若しくは翻訳制御エレメントと作動可能な会合においてクローン化される発現カセットを含む。本明細書で使用する場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、又はＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、それは、存在する場合、コード領域の一部であると考えられる場合がある一方で、いずれかの隣接配列、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’非翻訳領域などは、コード領域の一部ではない。
本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」は、本開示による抗原結合分子を生成するように操作され得るあらゆる種類の細胞系を指し、且つ（組換え発現）ベクターが導入されている細胞を指す。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も指すことが意図されることを理解すべきである。一定の改変が変異又は環境的影響のいずれかに起因して後続世代において生じ得るため、そのような子孫は、事実上、親細胞と同一であり得ないが、依然として本明細書において使用される用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。典型的な宿主細胞は、原核（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含むがこれに限定されない細菌性など）又は真核（酵母、哺乳動物細胞などを含む）である。細菌細胞は、好ましい原核宿主細胞であり、通常、例えば、Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄから入手可能なＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５などのエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ））の株である。好ましい真核宿主細胞は、酵母並びにネズミ科及び齧歯類を含む哺乳動物細胞、好ましくは、マウス、ラット、サル又はヒト細胞株、例えば、ＨＫＢ１１細胞、ＰＥＲＣ．６細胞、又はＣＨＯ細胞に由来するものなどの脊椎動物細胞を含む。
本明細書で使用する場合、用語「ＥＣ５０」は、アッセイにおける反応をベースラインと最大値の間の中間に誘導する本明細書で開示されるとおりの抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子の濃度を指す。したがって、それは、最大効果の５０％が観察される抗体又は抗原結合分子濃度を表す。
用語「阻害」又は「阻害する」又は「低減」又は「低減する」又は「中和」又は「中和する」は、任意の表現型の特徴（結合、生物活性又は機能など）の減少若しくは休止又はその特徴の発生、程度、若しくは可能性の減少若しくは休止を指す。「阻害」、「低減」又は「中和」は、それが適切なアッセイを使用して検出可能である限り完全である必要はない。いくつかの実施形態では、「低減する」又は「阻害する」は、２０％以上の減少をもたらす能力を意味する。別の実施形態では、「低減する」又は「阻害する」は、５０％以上の減少をもたらす能力を意味する。さらに別の実施形態では、「低減する」又は「阻害する」は、７５％、８５％、９０％、９５％以上の全体的な減少をもたらす能力を意味する。
用語「増加させる」又は「増強する」は、任意の表現型の特徴（結合、生物活性又は機能など）の増加又はその特徴の発生、程度、若しくは可能性の増加を指す。「増加させる」、「増強する」は、それが適切なアッセイを使用して検出可能である限り最大効果である必要はない。いくつかの実施形態では、「増加させる」又は「増強する」は、２０％以上の増加をもたらす能力を意味する。別の実施形態では、「増加させる」又は「増強する」は、５０％以上の増加をもたらす能力を意味する。さらに別の実施形態では、「増加させる」又は「増強する」は、７５％、８５％、９０％、９５％以上の全体的な増加をもたらす能力を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「アンタゴニストの」抗原結合分子は、抗原と相互作用し、且つ標的抗原の生物活性又は機能又は任意の他の表現型の特徴を部分的に又は完全に阻害するか又は中和する抗原結合分子を指す。
本明細書で使用する場合、用語「アゴニストの」抗原結合分子は、抗原と相互作用し、且つ標的抗原の生物活性又は機能又は任意の他の表現型の特徴を増加させるか又は増強する抗原結合分子を指す。
薬剤、例えば、医薬組成物の「有効量」は、投与される細胞又は組織における生理学的変化をもたらすのに必要な量を指す。
薬剤、例えば、医薬組成物の「治療有効量」は、所望の治療又は予防結果を達成するために必要な投与量及び期間で有効な量を指す。治療有効量の薬剤は、例えば、疾患の有害作用を消失させるか、減少させるか、遅らせるか、最小化するか又は予防する。
用語「個体」又は「対象」は、哺乳動物を指す。
用語「医薬組成物」は、その中に含有される活性成分の生物活性を有効にするような形態であり、その製剤が投与されることになる対象に許容できない毒性のある追加の成分を含有しない製剤を指す。
用語「薬学的に許容される担体」は、対象に対して非毒性である活性成分以外の医薬組成物中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝液、賦形剤、安定剤、又は保存剤が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で使用する場合、「治療」、「治療する」又は「治療すること」などは、治療されている個体の疾患の自然経過を変化させようとする臨床的介入を指し、予防のため又は臨床病理の経過中のいずれかで実施され得る。治療の望ましい効果としては、疾患の発生又は再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的病理学的帰結の減少、転移の予防、疾患進行の速度の低下、疾患状態の回復又は緩和、及び寛解又は改善された予後が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本開示による抗原結合分子は、疾患の発症を遅らせるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
用語「エフェクター機能」は、本開示による抗体又は抗原結合分子のＦｃ領域に起因する生物活性を指し、これらは抗体アイソタイプとともに変化する。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；貪食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御；並びにＢ細胞活性化が挙げられる。
「抗体依存性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ＮＫ細胞、好中球、及びマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）上に結合した本開示による抗体又は抗原結合分子が、これらの細胞傷害性エフェクター細胞の抗原保有標的細胞に対して特異的に結合することを可能にし、その後標的細胞を細胞毒素で死滅させる細胞傷害性の一形態を指す。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、一方で、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。
「補体依存性細胞傷害」又は「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的補体経路の活性化は、同族抗原に結合される本開示の（適切なサブクラスの）抗体又は抗原結合分子に対する補体系（Ｃ１ｑ）の第一成分の結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２０２：１６３（１９９６）に記載されるとおりのＣＤＣアッセイが実施され得る。改変されたＦｃ領域サブユニットアミノ酸配列（バリアント又は改変されたＦｃ領域サブユニットを有するポリペプチド）及びＣ１ｑ結合能の増大又は低減を有するポリペプチドバリアントは、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号明細書及び国際公開第１９９９／５１６４２号パンフレットにおいて記載される。例えば、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８－４１８４（２０００）を参照されたい。
実施形態
本開示は、２つ以上の（異なる）抗原に同時に共結合するのに適している抗原結合分子に関する。異なる結合価で２つ以上の異なる抗原を（例えば、１つの抗原を一価で及び１つの抗原を二価で）標的化する能力は、本明細書で開示される抗原結合分子の特に有用な態様である。
本開示による抗原結合分子の個々の成分は、様々な構成で相互に使用され得る。例示的な構成は、図１及び２において示される。
一般に、２つの主要なタイプの本明細書に記載されるとおりの抗原結合分子が存在する：
ａ．２つのＦｖ領域を利用するタイプ。このタイプは、（Ｉ）２つの（異なる）抗原に対する同時の一価の結合又は（ＩＩ）１つの抗原に対する二価の結合を可能にする。
ｂ．３つのＦｖ領域を利用するタイプ。このタイプは、（Ｉ）１の抗原に対する同時の二価の結合及び第２の抗原に対する一価の結合又は（ＩＩ）１つの抗原に対する三価の結合を可能にする。
多重特異性抗原結合分子
本開示による抗原結合分子は、２つ以上、好ましくは３つのＦｖ領域で構成され得る。したがって、本分子は、二価又は三価の抗原結合分子として作用し得る。本開示による抗原結合分子の基本的な構造は、図１及び２において示される。
二価抗原結合分子
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、２つのＦｖ領域で構成される。これは、免疫グロブリン構造の保持されたＦａｂアームとＦｃ部分の間に追加のＦｖ領域を組み込む通常の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）抗体構造（２つのＦａｂアームのうちの１つを欠く）を使用することによって得られる。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、２つの異なる抗原に対する一価の結合を可能にする。そのような実施形態では、抗原結合分子は、少なくとも２つのＦｖ領域を含み、１つのＦｖ領域は第１の抗原に結合し、且つ他のＦｖ領域は第２の抗原に結合する。そのような実施形態では、本開示による抗原結合分子は、二価の二重特異性抗原結合分子を指す。
ある実施形態では、本開示は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦｖ領域を含む第１のＦａｂ、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦｖ領域及び
ｃ）第１及び第２のＦｃ領域サブユニットで構成されるＦｃ領域を含み；
Ｉ．第１のＦａｂの重鎖又は軽鎖のＣ末端が、第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬのＮ末端に融合され、且つ
ＩＩ．第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬのＣ末端が、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端が、第２のＦｖ領域の相補的な可変ドメインのＣ末端に融合される、抗原結合分子に関する。
ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＨ１のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合される。ある実施形態では、融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＨ１のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合される。ある実施形態では、融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合される。
ある実施形態では、融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合される。
ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合される。ある実施形態では、融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。ある実施形態では、第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。ある実施形態では、第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。ある実施形態では、第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。ある実施形態では、第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端に融合される。ある実施形態では、融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。ある実施形態では、第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端に融合される。ある実施形態では、融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端に融合される。ある実施形態では、融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。ある実施形態では、第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端に融合される。ある実施形態では、融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＨ１のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＨ１のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＨ１のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＨ１のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＨ１のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＨ１のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＨ１のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＨ１のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＨ１のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＨ１のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＨ１のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＨ１のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第１のＦｃドメインサブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＨ１のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＨ１のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＨ１のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＨ１のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂのＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｖ領域のＶＬのＣ末端は、第２のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＣ末端に融合される。ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、少なくとも３つのポリペプチドで構成され、
ａ．第１のポリペプチドは、第１のＦａｂの軽鎖又は重鎖を含み、
ｂ．第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な軽鎖又は重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬ及び
ｉｉｉ．第１又は第２のＦｃ領域サブユニット
を含み、
ｃ．第３のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第２のＦｖ領域の相補的なＶＨ又はＶＬ及び
ｉｉ．相補的な第１又は第２のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第１のポリペプチドは、第１のＦａｂの軽鎖を含む。ある実施形態では、第１のポリペプチドは、第１のＦａｂの重鎖を含む。
ある実施形態では、第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＨ及び
ｉｉｉ．第１のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＬ及び
ｉｉｉ．第１のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＨ及び
ｉｉｉ．第２のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＬ及び
ｉｉｉ．第２のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な軽鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＨ及び
ｉｉｉ．第１のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な軽鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＬ及び
ｉｉｉ．第１のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な軽鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＨ及び
ｉｉｉ．第２のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な軽鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＬ及び
ｉｉｉ．第２のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第３のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第２のＦｖ領域の相補的なＶＨ及び
ｉｉ．相補的な第１のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第３のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第２のＦｖ領域の相補的なＶＨ及び
ｉｉ．相補的な第２のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第３のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第２のＦｖ領域の相補的なＶＬ及び
ｉｉ．相補的な第１のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第３のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第２のＦｖ領域の相補的なＶＬ及び
ｉｉ．相補的な第２のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、少なくとも３つのポリペプチドで構成され、
ａ．第１のポリペプチドは、第１のＦａｂの軽鎖を含み、
ｂ．第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＬ及び
ｉｉｉ．第１のＦｃ領域サブユニット
を含み、
ｃ．第３のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第２のＦｖ領域の相補的なＶＨ及び
ｉｉ．相補的な第２のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、少なくとも３つのポリペプチドで構成され、
ａ．第１のポリペプチドは、第１のＦａｂの軽鎖を含み、
ｂ．第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＨ及び
ｉｉｉ．第１のＦｃ領域サブユニット
を含み、
ｃ．第３のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第２のＦｖ領域の相補的なＶＬ及び
ｉｉ．相補的な第２のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、３つのポリペプチドで構成される。
前述の実施形態によれば、第１のＦｖ領域及び第２のＦｖ領域は、異なる抗原特異性であってもよく、当該技術分野で知られる二重特異性抗体形式のものとは異なる２つのＦｖ領域の間の結合構造及び距離を可能にする配置で互いに融合される。
本開示による抗原結合分子は、それが結合する抗原の少なくとも１つに対する一価の結合をもたらす。一価の結合は、標的抗原の内部移行が抗原結合分子の二価の結合後に生じる状況において、望ましいか又は必要となる場合がある。そのような場合において、１つの標的抗原に対する二価の結合は、抗原の内部移行を増強し、それによりその利用可能性を低減する可能性がある。さらに、一価の結合は、標的抗原の架橋が望ましくない場合に必須である。例えば、受容体チロシンキナーゼなどのある種の標的クラスに対する二価の結合は、受容体活性化というよりも不活性化を引き起こす天然のリガンドの機能を模倣する場合がある。
本開示による抗原結合分子に存在する配置は、二重特異性抗原結合分子がＴ細胞結合及びリダイレクションのために使用されることになる場合、必要に応じて、Ｔ細胞と標的細胞の間の免疫シナプスを模倣するのに特に適している。活性化Ｔ細胞抗原（ＣＤ３など）に対する一価の結合を確実にすることは、標的細胞の非存在下での前記Ｔ細胞の活性化のリスクを最小化する。
しかしながら、標的抗原に対する二価の結合はまた、ある種の状況において、例えば、結合親和性を増大させ且つ標的化を最適化するために望ましい場合がある。
三価抗原結合分子
ある好ましい実施形態では、本開示による抗原結合分子は、３つのＦｖ領域で構成される。これは、通常の免疫グロブリン構造の２つのＦａｂアームとＦｃ部分の間に追加のＦｖ領域を組み込む通常の免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）抗体構造（２つのＦｖ領域を形成する会合した２つの軽鎖を伴う２つの重鎖）を使用することによって得られる。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、第３の抗原に特異的に結合する第３のＦｖ領域を含む第２のＦａｂを含む。
ある実施形態では、第３の抗原は、第１又は第２の抗原と同一である。ある実施形態では、第３の抗原は、第１の抗原と同一である。ある実施形態では、第３の抗原は、第２の抗原と同一である。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、第１又は第２の抗原に特異的に結合する第３のＦｖ領域を含む第２のＦａｂを含む。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、第１の抗原に特異的に結合する第１のＦｖ領域を含む第１のＦａｂ、第３の抗原に特異的に結合する第３のＦｖ領域及び第２の抗原に特異的に結合する第２のＦｖ領域を含む第２のＦａｂを含む。ある実施形態では、第３の抗原は、第１又は第２の抗原と同一である。ある実施形態では、第３の抗原は、第１の抗原と同一である。
ある実施形態では、第２のＦａｂは、第２のＦｖ領域に融合される。ある実施形態では、第２のＦａｂのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＮ末端に融合される。ある実施形態では、第２のＦａｂは、ペプチドリンカーを介して第２のＦｖ領域に融合される。
ある実施形態では、本開示は、
ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦｖ領域を含む第１のＦａｂ、
ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦｖ領域及び
ｃ）第３の抗原に特異的に結合する第３のＦｖ領域を含む第２のＦａｂ、並びに
ｄ）第１及び第２のＦｃ領域サブユニットで構成されるＦｃ領域を含み；
Ｉ．第１のＦａｂの重鎖又は軽鎖のＣ末端が、第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬのＮ末端に融合され、且つ
ＩＩ．第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬのＣ末端が、第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ第２のＦｃドメインサブユニットのＮ末端が、第２のＦｖ領域の相補的な可変ドメインのＣ末端に融合され、且つ
ＩＩＩ．第１及び第２のＦａｂが、第２のＦｖ領域の別個の可変ドメインに融合されることを条件として、第２のＦａｂの重鎖又は軽鎖のＣ末端が、第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬのＮ末端に融合される、抗原結合分子を提供する。
ある実施形態では、それぞれの融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、３つ以下のＦｖドメインを含む。ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、３つのＦｖ領域からなる。
ある実施形態では、第１及び第２のＦａｂが、第２のＦｖ領域の別個の可変ドメインに融合されることを条件として、第２のＦａｂのＣＨ１又はＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬのＮ末端に融合される。
ある実施形態では、第１及び第２のＦａｂが、第２のＦｖ領域の別個の可変ドメインに融合されることを条件として、第２のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１及び第２のＦａｂが、第２のＦｖ領域の別個の可変ドメインに融合されることを条件として、第２のＦａｂのＣＨ１のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合される。ある実施形態では、融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１及び第２のＦａｂが、第２のＦｖ領域の別個の可変ドメインに融合されることを条件として、第２のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１及び第２のＦａｂが、第２のＦｖ領域の別個の可変ドメインに融合されることを条件として、第２のＦａｂのＣＨ１のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合される。ある実施形態では、融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１及び第２のＦａｂが、第２のＦｖ領域の別個の可変ドメインに融合されることを条件として、第２のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１及び第２のＦａｂが、第２のＦｖ領域の別個の可変ドメインに融合されることを条件として、第２のＦａｂのＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合される。ある実施形態では、融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１及び第２のＦａｂが、第２のＦｖ領域の別個の可変ドメインに融合されることを条件として、第２のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１及び第２のＦａｂが、第２のＦｖ領域の別個の可変ドメインに融合されることを条件として、第２のＦａｂのＣＬのＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合される。ある実施形態では、融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合される。
ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合される。ある実施形態では、融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合され、且つ第２のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合される。ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＨのＮ末端に融合され、且つ第２のＦａｂの重鎖のＣ末端は、第２のＦｖ領域のＶＬのＮ末端に融合される。ある実施形態では、融合は、ペプチドリンカーを介して生じる。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、少なくとも４つのポリペプチドで構成され、
ａ．第１のポリペプチドは、第１のＦａｂの軽鎖又は重鎖を含み、
ｂ．第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な軽鎖又は重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬ及び
ｉｉｉ．第１又は第２のＦｃドメインサブユニット
を含み、
ｃ．第３のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第２のＦａｂの軽鎖又は重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域の相補的なＶＨ又はＶＬ及び
ｉｉｉ．相補的な第１又は第２のＦｃドメインサブユニット
を含み、
ｄ．第４のポリペプチドは、第２のＦａｂの相補的な軽鎖又は重鎖を含む。
ある実施形態では、第１のポリペプチドは、第１のＦａｂの軽鎖を含む。ある実施形態では、第１のＦａｂの軽鎖は、第１のＦａｂのＶＬ及びＣＬを含む。ある実施形態では、第１のポリペプチドは、第１のＦａｂの重鎖を含む。ある実施形態では、第１のＦａｂの重鎖は、第１のＦａｂのＶＨ及びＣＨ１を含む。
ある実施形態では、第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＨ及び
ｉｉｉ．第１のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＬ及び
ｉｉｉ．第１のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＨ及び
ｉｉｉ．第２のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＬ及び
ｉｉｉ．第２のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な軽鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＨ及び
ｉｉｉ．第１のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な軽鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＬ及び
ｉｉｉ．第１のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な軽鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＨ及び
ｉｉｉ．第２のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な軽鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＬ及び
ｉｉｉ．第２のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第３のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第２のＦａｂの重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域の相補的なＶＨ及び
ｉｉｉ．相補的な第１のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第３のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第２のＦａｂの重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域の相補的なＶＨ及び
ｉｉｉ．相補的な第２のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第３のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第２のＦａｂの重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域の相補的なＶＬ及び
ｉｉｉ．相補的な第１のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第３のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第２のＦａｂの重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域の相補的なＶＬ及び
ｉｉｉ．相補的な第２のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第３のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第２のＦａｂの軽鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域の相補的なＶＨ及び
ｉｉｉ．相補的な第１のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第３のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第２のＦａｂの軽鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域の相補的なＶＨ及び
ｉｉｉ．相補的な第２のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第３のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第２のＦａｂの軽鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域の相補的なＶＬ及び
ｉｉｉ．相補的な第１のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第３のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第２のＦａｂの軽鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域の相補的なＶＬ及び
ｉｉｉ．相補的な第２のＦｃ領域サブユニット
を含む。
ある実施形態では、第４のポリペプチドは、第２のＦａｂの相補的な軽鎖を含む。ある実施形態では、第４のポリペプチドは、第２のＦａｂの相補的な重鎖を含む。ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、４つのポリペプチドで構成される。ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、少なくとも４つのポリペプチドで構成され、
ａ．第１のポリペプチドは、第１のＦａｂの軽鎖を含み、
ｂ．第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＬ及び
ｉｉｉ．第１のＦｃドメインサブユニット
を含み、
ｃ．第３のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第２のＦａｂの重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域の相補的なＶＨ及び
ｉｉｉ．相補的な第２のＦｃドメインサブユニット
を含み、
ｄ．第４のポリペプチドは、第２のＦａｂの相補的な軽鎖を含む。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、少なくとも４つのポリペプチドで構成され、
ａ．第１のポリペプチドは、第１のＦａｂの軽鎖を含み、
ｂ．第２のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第１のＦａｂの相補的な重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域のＶＨ及び
ｉｉｉ．第１のＦｃドメインサブユニット
を含み、
ｃ．第３のポリペプチドは、そのＮ末端からそのＣ末端に
ｉ．第２のＦａｂの重鎖、
ｉｉ．第２のＦｖ領域の相補的なＶＬ及び
ｉｉｉ．相補的な第２のＦｃドメインサブユニット
を含み、
ｄ．第４のポリペプチドは、第２のＦａｂの相補的な軽鎖を含む。
ある実施形態では、第１又は第２のＦａｂの軽鎖は、それぞれ第１又は第２のＦａｂのＶＬ及びＣＬを含む。ある実施形態では、第１又は第２のＦａｂの軽鎖は、それぞれ第１又は第２のＦａｂのＶＬ及びＣＬからなる。
ある実施形態では、第３の抗原は、第１の抗原と同一である。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、第１の抗原に対する二価の結合及び第２の抗原に対する一価の結合をもたらす。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、三価の二重特異性抗原結合分子である。
ある実施形態では、第１の抗原は、腫瘍関連抗原である。ある実施形態では、第１の抗原は、腫瘍細胞上で発現される腫瘍関連抗原である。
ある実施形態では、第２の抗原は、免疫細胞関連抗原である。ある実施形態では、第２の抗原は、免疫細胞上で発現される。ある実施形態では、第２の抗原は、免疫エフェクター細胞上で発現される。ある実施形態では、第２の抗原は、細胞傷害性Ｔ細胞上で発現される。ある実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３である。
ある実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。ある実施形態では、前記ＩｇＧ１ Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。ある実施形態では、Ｆｃ領域は、第１及び第２のＦｃ領域サブユニットの会合を促進する１つ以上のアミノ酸改変を含む。
ある実施形態では、第１のＦｃ領域サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基はトリプトファン残基と置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、且つ３５４位のセリン残基はシステイン残基と置き換えられ（Ｓ３５４Ｃ）、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基はバリン残基と置き換えられ（Ｙ４０７Ｖ）、３６６位のスレオニン残基はセリン残基と置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基はアラニン残基と置き換えられ（Ｌ３６８Ａ）、且つ３４９位のチロシン残基はシステイン残基と置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（ＥＵインデックスに従う付番）。
ある実施形態では、各Ｆｃ領域サブユニットにおいて、ヒトＩｇＧ１におけるＥＵインデックスに従う付番を有する位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ａ３３０、Ｐ３３１に相当する位置における少なくとも５個のアミノ酸残基が、それぞれＡ、Ｅ、Ａ、Ｓ、及びＳに変異される。
抗体
本開示による抗原結合分子において使用される抗体若しくは抗体フラグメント、又は重鎖及び軽鎖可変領域は、マウス、ラット、ヒト又は非ヒト霊長類などの任意の動物種起源のものであり得る。好ましくは、起源はヒトであるか又はヒト化手法によって得られてもよい。
したがって、本開示による抗原結合分子において使用されるＦａｂ及び／又はＦｖ領域は、ヒト又はヒト化されたものである。ある実施形態では、Ｆｖ領域は、ヒトである。ある実施形態では、Ｆｖ領域は、ヒト化される。ある実施形態では、Ｆａｂは、ヒトである。ある実施形態では、Ｆａｂは、ヒト化される。さらに別の実施形態では、Ｆａｂは、ヒト重鎖及び軽鎖定常領域を含む。
リンカー
本開示による抗原結合分子は、その個々の構成要素（例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ領域、Ｆｃ領域、可変ドメイン、定常ドメイン）が、互いに直接的に又はリンカーを介して間接的に融合されるように設計され得る。
ある種の実施形態では、本開示による抗原結合分子の個々の構成要素は、互いに遺伝的に融合される。そのような融合は、ポリペプチドのＮ末端とＣ末端の間のポリペプチド融合、ジスルフィド結合を介する融合、及び化学的架橋試薬を介する融合を含むが、これらに限定されないいくつかの戦略によって達成され得る。
様々なリンカーは、本明細書に記載される実施形態において、本開示による抗原結合分子の個々の構成要素をその目的の融合パートナーに共有結合的に融合するために使用され得る。リンカーの構成要素及び長さは、当該技術分野でよく知られる方法に従って決定され得るし、有効性について試験され得る。好ましくは、リンカーは、非免疫原性である。ある実施形態では、リンカーは、ペプチドリンカーである。ある実施形態では、リンカーは、当該技術分野で知られるペプチド結合によって結合された１つ以上のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーである。ペプチドリンカードは、２つのポリペプチド（又は構成要素）を、それらが互いに対して妥当な立体構造をとり、その結果、所望の活性を保持するか又は得るように融合するのに十分な長さを有するべきである。
ある実施形態では、本開示によるペプチドリンカーは、１～７０アミノ残基長、１～５０アミノ酸残基長、１～４０アミノ残基長、１～３０アミノ酸残基長、１～２０アミノ酸残基長、１～１０アミノ酸残基長、１～５アミノ酸残基長である。
ある実施形態では、本開示によるペプチドリンカーは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０アミノ酸残基の長さを有する。ある実施形態では、本開示によるペプチドリンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、又は７０アミノ酸残基の長さを有する
ペプチドリンカーは、以下のアミノ酸残基を主に含み得る：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、又はＴｈｒ。好適な非免疫原性ペプチドリンカーは、グリシン－セリンポリマー、例えば、（ＧＳ）ｎ（配列番号３４）、（Ｇ４Ｓ）ｎ（配列番号３５）、（ＳＧ４）ｎ（配列番号３６）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３７）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３８）又はＧ４（ＳＧ４）ｎ（配列番号３９）を含み、ｎは、１と１０の間、典型的には２と４の間の整数である。本明細書で使用される非免疫原性ペプチドリンカーは、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び他のフレキシブルなペプチドリンカーを含み得る。第１のＦａｂ及び／又は第２のＦａｂを第２のＦｖ領域に融合するための好適なペプチドリンカーは、（ＧＧＳ）３（配列番号１０）などのグリシン－セリンポリマーである。
ペプチドリンカーはまた、ＣＬκ又はＣＬλドメイン又はＣＨ１ドメインであるが、そのような定常ドメインの全ての残基ではない、例えば、最初の５～１２アミノ酸残基などの免疫グロブリン軽鎖又は重鎖定常ドメインに由来し得る。ある実施形態では、ペプチドリンカーは、免疫グロブリン軽鎖又は重鎖定常ドメインではない。ある実施形態では、ペプチドリンカーは、ＣＬκ、ＣＬλ、ＣＨ１、ＣＨ２又はＣＨ３ドメインではない。
抗原結合分子において使用され得る例示的なペプチドリンカーは、免疫グロブリン軽鎖又は重鎖定常ドメインに由来するＱＰＫＡＡＰ（配列番号１２）又はＡＳＴＫＧＰ（配列番号１１）である。一般に、ペプチドリンカーは、例えば、Ｃｙ１、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ４、Ｃａ１、Ｃａ２、Ｃ８、Ｃｓ、及びＯμを含む任意のアイソタイプの免疫グロブリン重鎖に由来し得る。
ペプチドリンカーはまた、免疫グロブリンヒンジ（例えば、ヒトＩｇＧ１ヒンジ又はその部分）又はそのようなヒンジに由来する任意のペプチドを含んでもよい。好ましくは、免疫グロブリンヒンジの一部又は部分のみが使用される場合、トランケートされたヒンジは依然としてその鎖間システインの１つ以上を含み得る。鎖間システインの存在は、そのようなヒンジペプチドリンカーのうちの２つが使用される状況において、ジスルフィド架橋によって二量体ペプチドリンカー（又はヒンジ領域）の形成を可能にする。そのようなジスルフィドで安定化された二量体ペプチドリンカーの使用のための好ましい状況は、第２のＦｖ領域の可変ドメインのＦｃドメインサブユニットへの融合である。二量体ペプチドリンカー又はヒンジ領域の存在はさらに、本開示による抗原結合分子中に存在する２つのＦｃ領域サブユニットの二量体化を促進し、且つ安定化する。二量体化に適した例示的なヒトＩｇＧヒンジに由来するペプチドリンカーは、ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１３）である。
本明細書で使用されるペプチドリンカーは、前述の及び例示的なペプチドリンカーのうちの１つのみに限定されないが、互いに融合される２つ以上のそのようなリンカーの任意の組合せを含んでもよいことが理解される。例えば、本明細書で使用されるペプチドリンカーは、グリシン－セリンポリマー及び所望の活性を保持するか又は得るための免疫グロブリンヒンジに由来する配列から構築され得る。
或いは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーを含むがこれらに限定されない様々非タンパク質合性ポリマーが、リンカーとして使用され得る。
Ｆｃ領域
本開示による抗原結合分子のＦｃ領域は、通常の免疫グロブリンの重鎖ドメインを含むポリペプチドの対からなる。通常のＩｇＧ分子のＦｃ領域は、二量体として存在し、その各サブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。２つのＦｃ領域サブユニットは、互いに安定な会合が可能である。したがって、ある実施形態では、本開示による抗原結合分子の２つのＦｃ領域サブユニットは、互いに安定な会合が可能である。ある実施形態では、本開示による抗原結合分子のＦｃ領域は、ＩｇＧ Ｆｃ領域である。ある実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。ある実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトである。ある実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。
ヘテロ二量体Ｆｃ領域
本開示による抗原結合分子の２つのＦｃ領域サブユニットは通常、２つの同一ではないポリペプチド鎖で構成される。組換え生成における分子の収量及び純度を向上させるため、Ｆｃ領域サブユニットを形成する２つの同一ではないポリペプチドの会合を促進する１つ以上の改変をＦｃ領域において導入することが有利である。したがって、ある種の実施形態では、本開示は、自己会合してヘテロ二量体分子を形成することになる２つの異なるバリアントＦｃ領域サブユニットの使用に依拠するヘテロ二量体抗原結合分子を提供する。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子のＦｃ領域は、第１及び第２のＦｃ領域サブユニットの会合を促進する１つ以上の改変を含む。ある実施形態では、本開示による抗原結合分子の第１及び第２のＦｃ領域サブユニットは、第１及び第２のＦｃ領域サブユニットの会合を促進する１つ以上の改変を含む。ある実施形態では、第１のＦｃ領域サブユニット及び第２のＦｃ領域サブユニットは、同じＦｃ領域サブユニットを含む２つの同一のポリペプチド鎖間のホモ二量体化を減少させるか又はホモ二量体形成を減少させる１つ以上の改変を含む。
改変は、第１のＦｃ領域サブユニット及び／又は第２のＦｃ領域サブユニット中に存在し得る。好ましい実施形態では、改変は、第１及び第２のＦｃ領域サブユニット中に存在する。一実施形態では、前記改変は、Ｆｃ領域サブユニットのＣＨ３ドメイン中に生じる。改変は、例えば、部位特異的変異導入によってポリペプチドをコードする核酸を改変することによって、又はペプチド合成によってなされ得る。ヘテロ二量体化を促進するためのＣＨ３改変に関するいくつかの手法は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第９６／２７０１１号パンフレット、国際公開第９８／０５０４３１号パンフレット、欧州特許第１８７０４５９号明細書、国際公開第２００７／１１０２０５号パンフレット、国際公開第２００７／１４７９０１号パンフレット、国際公開第２００９／０８９００４号パンフレット、国際公開第２０１０／１２９３０４号パンフレット、国際公開第２０１１／９０７５４号パンフレット、国際公開第２０１１／１４３５４５号パンフレット、国際公開第２０１２／０５８７６８号パンフレット、国際公開第２０１３／１５７９５４号パンフレット、国際公開第２０１３／０９６２９１号パンフレットにおいて記載されている。
通常、当該技術分野で知られるヘテロ二量体化手法において、一方のポリペプチド鎖（例えば、免疫グロブリン重鎖）のＣＨ３ドメイン及び他方のポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインは両方ともに、１つの操作されたＣＨ３ドメインを含むポリペプチドが同じ構造の別のポリペプチド鎖ともはやホモ二量体化できないように相補的な様式で操作される。それによって、１つの操作されたＣＨ３ドメインを含むポリペプチドは、相補的な様式で操作されるＣＨ３ドメインを含む他のポリペプチドとヘテロ二量体化させられる。
当該技術分野で知られる１つのヘテロ二量体化手法は、例えば、参照により組み込まれる国際公開第９６／０２７０１１号パンフレット、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１９９６）６１７－６２１；Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１９９８）６７７－６８１；米国特許第５，７３１，１６８号明細書；米国特許第７，６９５，９３６号明細書；国際公開第９８／０５０４３１号パンフレット，Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８，７－１５（２００１）においていくつかの例を提供して詳細に記載される、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール」技術である。「ノブ・イントゥ・ホール」技術は、（１）各Ｆｃ領域サブユニットにおいてヘテロ二量体化を促進するためにＣＨ３ドメインを変異させること；及び（２）ヘテロ二量体化を促進する条件下で変異されたＦｃ領域サブユニットを合わせることを広く含む。「ノブ」又は「突起」は通常、親抗体における小さいアミノ酸をより大きいアミノ酸（例えば、Ｔ３６６Ｙ又はＴ３６６Ｗ）で置き換えることによって作製され；「ホール」又は「空洞」は、親抗体におけるより大きい残基をより小さいアミノ酸（例えば、Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及び／又はＹ４０７Ｖ）と置き換えることによって作製され、付番はＥＵインデックスに従う。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子のＦｃ領域中に存在する改変は、２つのＦｃ領域サブユニットのうちの１つにおける「ノブ変異」及び他の相補的なＦｃ領域サブユニットにおける「ホール変異」を含む「ノブ・イントゥ・ホール」改変である。ノブ改変及びホール改変は、例えば、部位特異的変異導入によってポリペプチドをコードする核酸を改変することによって、又はペプチド合成によってなされ得る。ある実施形態では、各Ｆｃ領域サブユニットのＣＨ３ドメインは、ノブ・イントゥ・ホール技術に従って改変される。
ある実施形態では、第１のＦｃ領域サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基はトリプトファン残基と置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基はバリン残基と置き換えられる（Ｙ４０７Ｖ）（ＥＵインデックスに従う付番）。ある実施形態では、第２のＦｃ領域サブユニットのＣＨ３において、３６６位のスレオニン残基はセリン残基と置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、且つ３６８位のロイシン残基はアラニン残基と置き換えられる（Ｌ３６８Ａ）（ＥＵインデックスに従う付番）。
ある実施形態では、第１のＦｃ領域サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３５４位のセリン残基はシステイン残基と置き換えられ（Ｓ３５４Ｃ）、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３４９位のチロシン残基はシステインン残基と置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（ＥＵインデックスに従う付番に基づく）。これらの２つのシステイン残基の導入は、２つのＦｃ領域サブユニットの間にジスルフィド架橋の形成をもたらし、二量体をさらに安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。
さらなる特定の実施形態では、本開示は、第１のＦｃ領域サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基はトリプトファン残基と置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、且つ３５４位のセリン残基はシステイン残基と置き換えられ（Ｓ３５４Ｃ）、且つ第２のＦｃ領域サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基はバリン残基と置き換えられ（Ｙ４０７Ｖ）、３６６位のスレオニン残基はセリン残基と置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基はアラニン残基と置き換えられ（Ｌ３６８Ａ）、且つ３４９位のチロシン残基はシステイン残基と置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（ＥＵインデックスに従う付番）抗原結合分子を提供する。
代替的な実施形態では、第１及び第２のＦｃ領域サブユニットの会合を促進する改変は、例えば、ＰＣＴ公開国際公開第２００９／０８９００４号パンフレットにおいて記載されるとおり、静電ステアリング作用を媒介する改変を含む。一般に、この方法は、荷電アミノ酸残基による２つのＦｃ領域サブユニットの界面での１つ以上のアミノ酸残基の置換を含み、その結果、ホモ二量体形成は静電気的に不利になるが、ヘテロ二量体化は静電気的に有利になる。
Ｆｃ結合
免疫グロブリンのＦｃ領域は一般に、血清中での半減期の延長及び細胞上で発現されるＦｃ受容体に対する結合を介してエフェクター機能を媒介する能力などの抗体の有利な薬物動態特性を与える。他方で、Ｆｃ受容体に対する結合はまた、全身投与時の望まれないサイトカイン放出及び重篤な副作用を引き起こすある種の細胞表面受容体の望ましくない活性化を引き起こし得る。
したがって、ある種の実施形態では、本開示による抗原結合分子のＦｃ領域は、操作されていないＦｃ領域と比較して、Ｆｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対する結合親和性の改変を有するか又はエフェクター機能の改変を有するように操作される。
エフェクター機能の改変は、以下のうちの１つ以上を含むことができるが、これらに限定されない：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の改変、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の改変、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の改変、サイトカイン分泌の改変、抗原提示細胞による免疫複合体に媒介される抗原取込みの改変、ＮＫ細胞に対する結合の改変、マクロファージに対する結合の改変、単球に対する結合の改変、多形核細胞に対する結合の改変、アポトーシスを誘導する直接的なシグナル伝達の改変、標的結合抗体の架橋の改変、樹状細胞成熟の改変、又はＴ細胞プライミングの改変。特定の実施形態では、エフェクター機能の改変は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰからなる群から選択される１つ以上である。ある実施形態では、エフェクター機能の改変は、ＡＤＣＣである。ある実施形態では、エフェクター機能の改変は、ＣＤＣである。ある実施形態では、エフェクター機能の改変は、ＡＤＣＰである。ある実施形態では、エフェクター機能の改変は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰである。
エフェクター機能の改変は通常、親Ｆｃドメインサブユニットの少なくとも１つ、好ましくは両方を変異させることによって達成される。結合の増加及び結合の減少をもたらす置換が有用であり得る。Ｆｃ領域の結合特性を改変するために、非保存的アミノ酸置換、すなわち、１つのアミノ酸を異なる構造及び／又は化学的特徴を有する別のアミノ酸と置き換えることが好ましい。
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能の低減
ある種の治療的状況のために、Ｆｃ領域のＦｃ受容体の１つ以上若しくは全てに対する通常の結合及び／又はＣ１ｑなどの補体成分に対する結合を低減するか又は阻害することが望ましい場合がある。例えば、Ｆｃ領域のＦｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ）の１つ以上又は全てに対する結合を低減するか又は妨げることが望ましい場合がある。
特に、抗原結合分子が免疫エフェクター細胞の受容体に共結合するとき、ＡＤＣＣ活性を消失させるか若しくは著しく低減するＦｃγＲＩＩＩａ結合を妨げ、且つ／又はＣＤＣ活性を消失させるか若しくは著しく低減するＣ１ｑ結合を妨げることが望ましい。
エフェクター機能の低減又は消失は、以下のうちの１つ以上を含むことができるが、これらに限定されない：補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減若しくは消失、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）の低減若しくは消失、サイトカイン分泌の低減若しくは消失、抗原提示細胞による免疫複合体に媒介される抗原取込みの低減若しくは消失、ＮＫ細胞に対する結合の低減若しくは消失、マクロファージに対する結合の低減若しくは消失、単球に対する結合の低減若しくは消失、多形核細胞に対する結合の低減若しくは消失、アポトーシスを誘導する直接的なシグナル伝達の低減若しくは消失、標的結合抗体の架橋の低減若しくは消失、樹状細胞成熟の低減若しくは消失、又はＴ細胞プライミングの低減若しくは消失。ある種の実施形態では、エフェクター機能の低減又は消失は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰからなる群から選択される１つ以上である。ある実施形態では、エフェクター機能の低減又は消失は、ＡＤＣＣである。ある実施形態では、エフェクター機能の低減又は消失は、ＣＤＣである。ある実施形態では、エフェクター機能の低減又は消失は、ＡＤＣＰである。ある実施形態では、エフェクター機能の低減又は消失は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰである。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子のＦｃ領域は、操作されていないＦｃ領域と比較して、Ｆｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対する結合親和性の低減を有し、且つ／又はエフェクター機能の低減を有するように操作される。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子のＦｃ領域は、操作されていないＦｃ領域と比較したとき、エフェクター機能の低減を有するように操作される。ある実施形態では、本開示による抗原結合分子のＦｃ領域は、Ｆｃ領域のＦｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対する結合親和性を低減し、且つ／又はエフェクター機能を低減する１つ以上のアミノ酸変異を含む。一般に、同じ１つ以上のアミノ酸変異は、Ｆｃ領域を形成する２つのＦｃ領域サブユニットの各々において存在する。ある実施形態では、１つ以上のアミノ酸変異は、Ｆｃ領域のＦｃ受容体に対する結合親和性を低減する。Ｆｃ領域のＦｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対する結合親和性を低減する１つのみのアミノ酸変異が存在する場合、１つのアミノ酸変異は、操作されていないＦｃ領域と比較したとき、Ｆｃ領域のＦｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対する結合親和性を少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍低減し、且つ／又はエフェクター機能を少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍低減する。Ｆｃ領域のＦｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対する結合親和性を低減する２つ以上のアミノ酸変異が存在する場合、これらのアミノ酸変異の組合せは、操作されていないＦｃ領域と比較したとき、Ｆｃ領域のＦｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対する結合親和性を少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、又は少なくとも５０倍低減し得るし、且つ／又はエフェクター機能を少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、又は少なくとも５０倍低減し得る。
ある実施形態では、操作されたＦｃ領域は、Ｆｃ受容体及び／又はＣ１ｑに実質的に結合せず、且つ／又はエフェクター機能を実質的に誘導しない。ある実施形態では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。ある実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。ある実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、より特定するとヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａ、最も特定するとヒトＦｃγＲＩＩＩａである。
ある実施形態では、Ｆｃ領域の補体成分に対する結合親和性、特に、Ｃ１ｑに対する結合親和性は、低減されるか又は消失される。ある実施形態では、エフェクター機能の低減又は消失は、ＣＤＣの低減又は消失、ＡＤＣＣの低減又は消失及びＡＤＣＰの低減又は消失の群から選択される１つ以上である。特定の実施形態では、エフェクター機能の低減又は消失は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及びＡＤＣＰの低減である。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子のＦｃ領域は、Ｆｃ領域のＦｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対する結合親和性を低減し、且つ／又はエフェクター機能を低減する１つ以上のアミノ酸変異を含む。
ある実施形態では、アミノ酸変異は、アミノ酸置換である。ある実施形態では、本開示による抗原結合分子のＦｃ領域は、Ｆｃ領域のＦｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対する結合親和性を低減し、且つ／又はエフェクター機能を低減する１つ以上のアミノ酸変異を含み、各Ｆｃ領域サブユニットは、ＥＵインデックスに従う付番による２３４、２３５、２３７、３３０及び３３１の群から選択される位置でアミノ酸置換を含む。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子の各Ｆｃ領域サブユニットは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＧ２３７（ＥＵインデックスに従う付番）の群から選択される位置でアミノ酸置換を含む。ある実施形態では、各Ｆｃサブユニットは、ＥＵインデックスに従う付番を有するアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ｅを含む。ある実施形態では、各Ｆｃ領域サブユニットは、ＥＵインデックスに従う付番を有するアミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ及びＧ２３７Ａを含む。ある実施形態では、各Ｆｃ領域サブユニットは、ＥＵインデックスに従う付番を有する３３０及び３３１の群から選択される位置でアミノ酸置換を含む。ある実施形態では、各Ｆｃ領域サブユニットは、ＥＵインデックスに従う付番を有する位置３３０及び３３１でのアミノ酸置換を含む。ある実施形態では、アミノ酸置換は、Ａ３３０Ｓ又はＰ３３１Ｓである。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子のＦｃ領域は、Ｆｃ領域のＦｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対する結合親和性を低減し、且つ／又はエフェクター機能を低減する各Ｆｃ領域サブユニット中の１つ以上のアミノ酸変異を含み、前記１つ以上のアミノ酸変異は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓである。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子のＦｃ領域は、Ｆｃ領域のＦｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対する結合親和性を低減し、且つ／又はエフェクター機能を低減する各Ｆｃ領域サブユニット中の１つ以上のアミノ酸変異からなり、１つ以上のアミノ酸変異は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ａ３３０Ｓ及びＰ３３１Ｓである。ある実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、特に、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である。
変異体Ｆｃ領域又はＦｃ領域サブユニットは、当該技術分野でよく知られる遺伝的又は化学的方法を使用してアミノ酸欠失、置換、挿入又は改変によって作製され得る。遺伝的方法は、ＤＮＡ配列をコードする部位特異的変異導入、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含んでもよい。正確なヌクレオチド変化は、例えば、配列決定によって検証され得る。
Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能の増大
ある種の状況では、本開示による抗原結合分子のＦｃ受容体結合及び／若しくはＣ１ｑ結合並びに／又はエフェクター機能を増強するか又は増大させることが望ましい場合がある。
ある実施形態では、エフェクター機能の増大又は増強は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰの群から選択される１つ以上である。ある実施形態では、エフェクター機能の増大又は増強は、ＡＤＣＣである。ある実施形態では、エフェクター機能の増大又は増強は、ＣＤＣである。ある実施形態では、エフェクター機能の増大又は増強は、ＡＤＣＰである。ある実施形態では、エフェクター機能の増大又は増強は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣである。したがって、ある種の実施形態では、本開示による抗原結合分子のＦｃ領域は、操作されていないＦｃ領域と比較したとき、Ｆｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対する結合親和性の増大を有し、且つ／又はエフェクター機能の増大を有するように操作される。
したがって、ある実施形態では、本開示による抗原結合分子のＦｃ領域は、操作されていないＦｃ領域と比較したとき、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の増大を有するように操作される。ある実施形態では、本開示による抗原結合分子のＦｃ領域は、操作されていないＦｃ領域と比較したとき、Ｃ１ｑに対する結合親和性の増大を有するように操作される。ある種の実施形態では、本開示による抗原結合分子のＦｃ領域は、操作されていないＦｃ領域と比較したとき、エフェクター機能の増加を有するように操作される。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子のＦｃ領域は、Ｆｃ領域のＦｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対する結合親和性を増大させ、且つ／又はエフェクター機能を増大させる各Ｆｃ領域サブユニット中の１つ以上のアミノ酸変異を含む。結合親和性の増大は、操作されていないＦｃ領域と比較したとき、Ｆｃ領域のＦｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対する結合親和性における少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍の増大であり得る。通常、同じアミノ酸変異は、２つのＦｃ領域サブユニットの各々において存在する。ある実施形態では、１つ以上のアミノ酸変異は、操作されていないＦｃ領域と比較したとき、Ｆｃ領域のＦｃ受容体に対する結合親和性を増大させる。ある実施形態では、１つ以上のアミノ酸変異は、操作されていないＦｃ領域と比較したとき、Ｆｃ領域のＣ１ｑに対する結合親和性を増大させる。Ｆｃ領域のＦｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対する結合親和性を増大させるアミノ酸変異の例は、参照により組み込まれる国際公開第２０００／０４２０７２号パンフレット又は国際公開第２００４／０９９２４９号パンフレットに記載される。
通常、Ｆｃ領域のＦｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対する結合親和性を増加させ、且つ／又はエフェクター機能を増加させるアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。
実施形態において、Ｆｃ領域のＦｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対する結合親和性を増大させる１つのみのアミノ酸変異が存在する場合、１つのアミノ酸変異は、操作されていないＦｃ領域と比較したとき、Ｆｃ領域のＦｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対する結合親和性を少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍増大させ得るし、且つ／又はエフェクター機能を少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍増大させ得る。実施形態において、Ｆｃ領域のＦｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対する結合親和性を増大させる２つ以上のアミノ酸変異が存在する場合、これらのアミノ酸変異の組合せは、操作されていないＦｃ領域と比較したとき、Ｆｃ領域のＦｃ受容体及び／又はＣ１ｑに対する結合親和性を少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、又は少なくとも５０倍増大させ得るし、且つ／又はエフェクター機能を少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、又は少なくとも５０倍増大させ得る。
ある実施形態では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。ある実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。ある実施形態では、Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体である。ある実施形態では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体、より特定するとヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａである。ある実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ及びＦｃγＲＩＩａの群から選択される。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体である。
ある実施形態では、エフェクター機能の増大は、ＡＤＣＣの増大、ＣＤＣの増大及びＡＤＣＰの増大の群から選択される１つ以上である。ある実施形態では、エフェクター機能の増大は、ＡＤＣＣの増大である。
Ｆｃ受容体に対する結合を評価するか又は免疫エフェクター機能を評価するためのインビトロでの方法
Ｆｃ領域のＦｃ受容体に対する結合は、例えば、ＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な計測手段を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって容易に決定することができ、且つＦｃ受容体は、組換え発現によって得てもよい。或いは、Ｆｃ領域の結合親和性は、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するＮＫ細胞などの特定のＦｃ受容体を発現することが知られる細胞株を使用して評価され得る。Ｆｃ領域のエフェクター機能は、当該技術分野で知られる方法によって測定され得る。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するための好適なインビトロアッセイは、例えば、国際公開第２０１２１３０８３１号パンフレットにおいて記載される。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。或いは又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボにおいて、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６（１９９８）において開示されるものなどの動物モデルにおいて評価され得る。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイが実施され得る（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２，１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１，１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３，２７３８－２７４３（２００４）を参照のこと）。Ｃ１ｑ結合アッセイ（ＥＬＩＳＡなど）は、抗原結合分子がＣ１ｑに結合することができ、したがって、ＣＤＣ活性を有するかどうかを決定するために実行され得る（国際公開第２００６／０２９８７９号パンフレット及び国際公開第２００５／１００４０２号パンフレット）。
標的抗原
本開示による新規の抗原結合分子は、様々な抗原を標的化するのに適しており、且つ異なる抗原を同時に標的化するのに特に適している。
本明細書で使用する場合、「抗原」又は「標的抗原」は、本開示による抗原結合結合分子中に存在するＦｖ領域の１つに特異的に結合する目的の任意の分子を指す。通常、抗原は、ペプチド、タンパク質又は任意の他のタンパク質性分子である。或いは、抗原は、炭水化物、脂肪酸、脂質、色素又はフルオロフォア（ｆｌｏｕｒｏｐｈｏｒ）などの任意の他の有機又は無機分子であってもよい。
標的抗原に特異的に結合する本開示による抗原結合分子の能力は、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られる他の手法、例えば、表面プラズモン共鳴手法（ＢＩＡＣＯＲＥ Ｔ１００システム上で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ Ｊ １７，３２３－３２９（２０００））、及び従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｓ ２８，２１７－２２９（２００２））のいずれかを介して測定され得る。
競合アッセイは、特定の抗原又はエピトープに対する結合のための参照抗体と交差競合する抗体、抗体フラグメント、抗原結合ドメイン又は可変ドメインを特定するために使用され得る。「交差競合する」は、標準的な競合的結合アッセイにおいて特定の抗原に対する他の抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子の結合を妨害する抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子の能力を意味する。抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子が、特定の抗原に対する別の抗体、抗体フラグメント又は抗原結合分子の結合を妨害できる能力又は程度、及びしたがって、それが本開示に従って交差競合すると呼ばれ得るかどうかは、標準的な競合的結合アッセイを使用して決定され得る。１つの好適なアッセイは、Ｂｉａｃｏｒｅ技術（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ ３０００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用することによる）の使用を含み、これは表面プラズモン共鳴技術を使用して相互作用の程度を測定することができる。交差競合を測定するための別のアッセイは、ＥＬＩＳＡに基づく手法を使用する。それらの交差競合に基づいて抗体を「エピトープビニング」するためのハイスループットなプロセスは、国際公開第２００３／４８７３１号パンフレットにおいて記載される。ある種の実施形態では、そのような競合抗体又は抗原結合分子は、参照抗体又は抗原結合分子によって結合される同じエピトープ（例えば、線状又は立体構造的エピトープ）に結合する。
したがって、本開示による抗原結合分子は、好ましくは、２つ以上、さらにより好ましくは、２つの異なる抗原（例えば、第１及び第２の抗原）を標的化する。２つの抗原は、１つの細胞の表面上で発現され得るか又は異なる細胞の表面上で発現され得る。異なる結合価で２つの異なる抗原を（例えば、１つの抗原を一価で及び１つの抗原を二価で）標的化する能力は、本開示による抗原結合分子の特に有用な態様である。前に概説したとおり、いくつかの免疫受容体（Ｔ細胞上のＣＤ３シグナル伝達受容体など）に関して、共通標的（例えば、腫瘍関連抗原）に対する結合時にのみ受容体活性化が望まれるが、それは、臨床現場における非特異的な架橋が、重篤なサイトカインストームを引き起こす可能性があるためである。そのような免疫受容体を一価で結合することによって、受容体活性化は、共通標的に対する架橋に応答してのみ起こることになる。
ある実施形態では、第１及び／又は第２の抗原は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞上に提示される抗原、又は炎症の部位で発現される抗原などの病的状況と関連する抗原である。ある実施形態では、第１又は第２の抗原は、好ましくは、Ｔ細胞などの免疫細胞上に発現される抗原である。他の好適な抗原としては、細胞表面抗原（細胞表面受容体など）、血清中に遊離している抗原、及び／又は細胞外マトリックス中の抗原が挙げられる。ある実施形態では、抗原は、ヒト抗原である。
ある実施形態では、第１の抗原は、腫瘍関連抗原、特に、腫瘍細胞又は腫瘍間質の細胞上で提示される抗原である。ある実施形態では、第１の抗原は、ＨＬＡ限定ペプチドである。ある実施形態では、第１の抗原は、ペプチド／ＨＬＡ－Ａ０２０１複合体である。用語「ＨＬＡ－Ａ０２０１」は、特定のＨＬＡ血清型（ｓｅｒｏｙｔｙｐｅ）を指す。ＨＬＡ－Ａ０２０１は、アルファ鎖及びベータ鎖を含むヘテロ二量体タンパク質である。ある実施形態では、ペプチド／ＨＬＡ－Ａ０２０１複合体は、癌細胞上で発現される。ある実施形態では、ペプチド／ＨＬＡ－Ａ０２０１複合体は、癌細胞に特異的である。ある実施形態では、第１の抗原は、癌細胞の表面上で発現される癌特異的ＨＬＡ限定ペプチドである。
（腫瘍関連）抗原の非限定的な例としては、ＡＲ、ＡＧＲ２、Ａ１Ｇ１、ＡＫＡＰ１、ＡＫＡＰ２、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＰＥＰ、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＰＯＣ１、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＩＴＧＡＶ、ＡＺＧＰ１、ＢＭＰ６、ＢＲＣＡ１、ＢＡＤ、ＢＡＧ１、ＢＣＬ２、ＢＬ６Ｒ、ＢＡ２、ＢＰＡＧ１、ＣＤＫ２、ＣＤ５２、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６４、ＣＤＫＮ１Ａ、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＫＮ３、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＤＫ９、ＣＬＤＮ３、ＣＬＮ３、ＣＹＢ５、ＣＹＣ１、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ９、ＣＨＧＢ、ＣＤＨ２０、ＣＤＨ７、ＣＤＨ８、ＣＤＨ９、ＣＤ４４、ＣＤＨ１、ＣＤＨ１０、ＣＤＨ１９、ＣＤＨ２０、ＣＤＨ７、ＣＤＨ９、ＣＤＨ１３、ＣＤＨ１８、ＣＤＨ１９、ＣＡＮＴ１、ＣＡＶ１、ＣＤＨ１２、ＣＤ１６４、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＣＬ２、ＣＤＨ５、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＨＧＡ、ＣＨＧＢ、ＣＬＵ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＥ２、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＴＮＮＢ１、ＣＴＳＢ、ＣＬＤＮ７、ＣＬＵ、ＣＤ４４ＡＰＣ、ＣＯＬ４Ａ３、ＤＳｆＨＡ、ＤＡＢ２ＪＰ、ＤＥＳ、ＤＮＣＬ１、ＤＤ２、ＤＬ２、ＥＬ２４、ＥＧＦ、Ｅ２Ｆ１、ＥＧＦＲ、ＥＮＯ１、ＥＲＢＢ２、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＥＬ２、ＥＳｔＨＡ、ＥＬＡＣ２、ＥＮＯ２、ＥＮＯ３、ＥＲＢＢ２、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＥＤＧ１、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ３、ＥＦＮＢ２、ＥＰＨＢ４、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＥＧＦ、ＥＲＫ８、ＥＬ１２Ａ、ＥＬ１Ａ、ＥＬ２４、ＥＮΗＡ、ＥＬＫ、ＥＣＧＦ１、ＥＲＥＧ、ＥＤＧ１、ＥＮＧ、Ｅ－カドヘリン、ＦＧＦ１、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＡＳＮ、ＦＬＪ１２５８４、ＦＬＪ２５５３０、Ｆ１ＧＦ、ＦＬＴ１、ＦＧＦＲ３、Ｆ３、ＦＯＳＬ１、ＦＬＲＴ１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＩＮＨＡ、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＩＮＨＡ、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＬ２、ＩＧＦＢＰ６、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ６、ＩＮＳＬ４、ＩＬ６ＳＴ、ＩＴＧＡ６、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮＧ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ６、ＩＧＦＢＰ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ６、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ６、ＩＴＧＡ１、ＩＧＦ１、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４、ＩＬ２９、ＩＬ８、ＩＴＧＢ３、ＧＲＰ、ＧＮＲＨ１、ＧＡＧＥＢ１、ＧＡＧＥＣ１、ＧＧＴ１、ＧＳＴＰ１、ＧＡＴＡ３、ＧＡＢＲＰ、ＧＮＡＳ１、ＧＳＮ、Ｈ１Ｐ１、ＨＵＭＣＹＴ２Ａ、ＨＧＦ、ＪＡＧ１、ＪＵＮ、ＬＡＭＡ５、Ｓ１００Ａ２、ＳＣＧＢ１Ｄ２、ＳＣＧＢ２Ａ１、ＳＣＧＢ２Ａ２、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＳＨＢＧ、ＳＥＲＰ１ＮＡ３、ＳＨＢＧ、ＳＬＣ２Ａ２、ＳＬＣ３３Ａ１、ＳＬＣ４３Ａ１、ＳＴＥＡＰ、ＳＴＥＡＰ２、ＳＥＲＰ１ＮＦ１、ＳＥＲＰＩＮＢ５、ＳＥＲＰＩＮＥ１、ＳＴＡＢ１、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＮＦ、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＧＦＢ１Ｉ１、ＴＰ５３、ＴＰＭ１、ＴＰＭ２、ＴＲＰＣ６、ＴＧＦＡ、ＴＨＢＳ、ＴＥＥ、ＴＮＦＲＳＦ６、ＴＮＦＳＦ６、ＴＯＰ２Ａ、ＴＰ５３、ＴＨＢＳ１、ＴＨＢＳ２、ＴＨＢＳ４、ＴＮＦＡＩＰ２、ＴＰ５３、ＴＥＫ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＦＡ、ＴＥＶ１Ｐ３、ＴＧＦＢ３、ＴＮＦＡ１Ｐ２、１ＴＧＢ３、ＴＨＢＳ１、ＴＨＢＳ２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＣ、ＯＤＺ１、ＰＡＷＲ、ＰＬＧ、ＰＡＰ、ＰＣＮＡ、ＰＲＫＣＱ、ＰＲＫＤ１、ＰＲＬ、ＰＥＣＡＭ１、ＰＦ４、ＰＲＯＫ２、ＰＲＬ、ＰＡＰ、ＰＬＡＵ、ＰＲＬ、ＰＳＡＰ、ＰＡＲＴ１、ＰＡＴＥ、ＰＣＡ３、Ｐ１ＡＳ２、ＰＧＦ、ＰＧＲ、ＰＬＡＵ、ＰＧＲ、ＰＬＸＤＣｌ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２、ＰＤＧＦ、ＭＹＣ、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＳＭＢ、ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ、ＭＴ３、ＭＵＣ１、ＭＡＰ２Ｋ７、ＭＫｉ６７、ＭＴＳＳ１、Ｍ１Ｂ１、ＭＤＫ、ＮＯＸ５、ＮＲ６Ａ１、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｉ３、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲ４Ａ３、ＮＲ１Ｈ２、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲ１Ｉ２、ＮＲ２Ｃ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ６Ａ１、ＮＲＯＢ１、ＮＲＯＢ２、ＮＲ１Ｄ２、ＮＲ１Ｄ１、ＮＴＮ４、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＮＧＦＢ、ＮＧＦＲ、ＮＭＥ１、ＫＬＫ６、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ＫＬＫ１５、ＫＬＫ３、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ９、Ｋ６ＨＦ、ＫＡ２、ＫＲＴ２Ａ、ＫＬＫ６、ＫＬＫ３、ＫＲＴ１、ＫＤＲ、ＫＬＫ５、ＫＲＴ１９、ＫＬＦ５、ＫＲＴ１９、ＫＲＴＨＢ６、ＲＡＲＢ、ＲＡＣ２、及びＲＯＢＯ２などの抗原が挙げられる。
ある実施形態では、第１又は第２の抗原は、ＨＥＲ２及びＣＤ３の群から選択される。ある実施形態では、第１の抗原は、ＨＥＲ２、特に、ヒトＨＥＲ２である。ある実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ３、特に、ヒトＣＤ３である。ある実施形態では、第２の抗原は、ＨＥＲ２、特に、ヒトＨＥＲ２である。ある実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３、特に、ヒトＣＤ３である。ある実施形態では、第１及び／又は第３のＦｖ領域は、ＨＥＲ２のエピトープに対する結合に関してモノクローナル抗体トラスツズマブと競合し得る。
ある実施形態では、第１及び／又は第３のＦｖ領域は、ＨＥＲ２に特異的に結合し、且つ配列番号８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ配列及び配列番号９と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＬ配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
ある実施形態では、第１又は第２の抗原は、免疫細胞上で発現される。ある実施形態では、第２の抗原は、Ｔ細胞上で発現される。ある実施形態では、第１の抗原は、Ｔ細胞上で発現される。
ある実施形態では、第１又は第２の抗原は、ＣＤ１３７及びＣＤ３からなる群から選択される。ある実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ１３７及びＣＤ３からなる群から選択される。ある実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ１３７及びＣＤ３からなる群から選択される。ある実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ３、特に、ヒトＣＤ３である。ある実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３、特に、ヒトＣＤ３である。ある実施形態では、ＣＤ３は、本開示の抗原結合分子によって一価で結合される。
ＣＤ３は、治療に関連すると証明されているＴ細胞刺激抗原である。ＣＤ３に対する結合は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を模倣して、Ｔ細胞活性化につながる。標的細胞及びＴ細胞が、多重特異性抗原結合分子を介して架橋されて免疫シナプスの形成をもたらすように多重特異性抗原結合分子においてＣＤ３結合分子を使用して、エフェクターＴ細胞は、標的細胞を直接的に死滅させることができる。ＣＤ３の共結合を有するそのような分子の有効性及び安全性は、結合価、特異性及び使用される形式の両方の親和性によって主に促進されることが知られている。この結合形式は、前に論じられたとおりの副作用の潜在的なリスクを低減する中程度から低い程度の結合親和性を有してＣＤ３に一価で結合するはずである。親和性を増大させるための必要性を伴わずに有効性を増大させるために、標的抗原（例えば、第１の抗原）及びＣＤ３（例えば、第２の抗原）のエピトープは、非常に近接して免疫シナプスを有効にするはずである（Ｂｌｕｅｍｅｌ Ｃ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２０１０ Ａｕｇ；５９（８）：１１９７－２０９）。加えて、その形式はさらに、通常のＩｇＧ薬物動態が、例えば、Ｆｃ領域を介して得られるように低頻度の投薬を支持するはずである。
本開示のある実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３、特に、ヒト又はカニクイザルＣＤ３、最も特定するとヒトＣＤ３である。ある実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３のイプシロンサブユニットである。ある実施形態では、第２の抗原は、配列番号１を含むＣＤ３のイプシロンサブユニットである。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子の第２のＦｖ領域は、ＣＤ３、特に、ヒト又はカニクイザルＣＤ３、最も好ましくはヒトＣＤ３に特異的に結合する。ある実施形態では、ＣＤ３は、本開示による抗原結合分子によって一価で結合される。ある実施形態では、第２のＦｖ領域は、ＣＤ３のエピトープに対する結合に関してＣＤ３に特異的なモノクローナル抗体と競合し得る。ある実施形態では、第２のＦｖ領域は、ＣＤ３のエピトープに対する結合に関して表３～５において記載されるとおりのＣＤ３に特異的な抗体のいずれか１つと競合し得る。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子中に存在する第２のＦｖ領域は、ＣＤ３のエピトープに対する結合に関して配列番号４のＶＨ及び配列番号５のＶＬを含むモノクローナル抗体と競合し得る。
ある実施形態では、第２のＦｖ領域は、ＣＤ３のエピトープに対する結合に関して配列番号２のＶＨ及び配列番号３のＶＬを含むモノクローナル抗体と競合し得る。
ある実施形態では、第２のＦｖ領域は、ＣＤ３のエピトープに対する結合に関して配列番号６のＶＨ及び配列番号７のＶＬを含むモノクローナル抗体と競合し得る。
さらなる実施形態では、ＣＤ３に特異的な第２のＦｖ領域は、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ及び配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＬ配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
さらなる実施形態では、ＣＤ３に特異的な第２のＦｖ領域は、配列番号４と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ配列及び配列番号５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＬ配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
さらなる実施形態では、ＣＤ３に特異的な第２のＦｖ領域は、配列番号６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＨ配列及び配列番号７と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＶＬ配列、又は機能性を保持するそのバリアントを含む。
本開示のある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、標的細胞抗原、特に、癌細胞上で発現される腫瘍関連抗原及び免疫エフェクター細胞上で発現されるＣＤ３に対する同時の結合の能力がある。１つのそのような実施形態では、標的抗原は二価で結合され、ＣＤ３は一価で結合される。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子は、標的細胞抗原及びＣＤ３に対する同時の結合によるＴ細胞と標的細胞の架橋の能力がある。ある実施形態では、そのような同時の結合は、標的細胞の溶解、特に、腫瘍細胞の溶解をもたらす。一実施形態では、そのような同時の結合は、Ｔ細胞の活性化をもたらす。ある実施形態では、同時の結合は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現の群から選択されるＴリンパ球、特に、細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答をもたらす。ある実施形態では、標的細胞抗原に対する同時の結合を伴わないＣＤ３に対する本開示による抗原結合分子の結合は、Ｔ細胞活性化をもたらさない。ある実施形態では、抗原結合分子は、標的細胞に対するＴ細胞のリダイレクト細胞傷害活性の能力がある。特定の実施形態では、リダイレクションは、標的細胞によるＭＨＣに媒介されるペプチド抗原提示及び／又はＴ細胞の特異性に依存しない。特に、本開示による実施形態のいずれかによるＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞、特に、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
本開示の抗原結合分子において実現される形式は、第１の抗原に対する二価の結合及び第２の抗原に対する一価の結合を可能にし、そのため第１の抗原のために高親和性の結合及び結合活性効果を合わせて、ＣＤ３と標的抗原の間の結合親和性において著しい差をもたらす。
本開示による抗原結合分子は、異なる抗原を標的化するのに特に有益である。しかしながら、いくつかの場合において、それは、１つのみの抗原を標的化し、そのため同じ抗原に関して特異性を有することが有益である場合がある。
核酸
本開示は、本開示による抗原結合分子をコードする核酸配列又は複数の核酸配列を含む核酸組成物を提供する。本開示による抗原結合分子は、１、２、３、４、又はそれ以上のポリペプチドからなり得る。前記ポリペプチドの各々は、同じ又は異なる核酸配列によってコードされ得る。同様に、本発明による抗原結合分子の前記の個々のポリペプチドをコードする核酸配列は、同じ又は異なるベクター上に存在し得る。
ある実施形態では、本開示は、本開示による抗原結合分子をコードする核酸配列又は複数の核酸配列を含む核酸組成物を提供する。ある実施形態では、本開示は、表９～１３に記載される抗原結合分子のいずれかをコードする核酸配列又は複数の核酸配列を含む核酸組成物を提供する。ある実施形態では、核酸組成物は、単離された核酸組成物である。
ある実施形態では、第１の核酸配列は、Ｎ末端からＣ末端に第１のＦａｂの重鎖又は軽鎖、第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬ及び第１のＦｃ領域サブユニットを含むポリペプチドをコードする。１つのそのような実施形態では、第２の核酸は、第１のＦａｂの相補的な重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドをコードする。１つのそのような実施形態では、第３の核酸は、Ｎ末端からＣ末端に第２のＦｖ領域の相補的なＶＨ又はＶＬ及び第２のＦｃ領域サブユニットを含むポリペプチドをコードする。代替的な実施形態では、第３の核酸は、Ｎ末端からＣ末端に第２のＦａｂの重鎖又は軽鎖、第２のＦｖ領域の相補的なＶＨ又はＶＬ及び第２のＦｃ領域サブユニットを含むポリペプチドをコードする。１つのそのような実施形態では、第４の核酸配列は、第２のＦａｂの相補的な軽鎖又は重鎖を含むポリペプチドをコードする。
核酸配列又は複数の核酸配列によってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は本明細書に記載されるとおりの機能的な抗原結合分子を形成する他の手段を介して、発現後に会合し得る。例えば、第１のＦａｂの軽鎖は、第１のＦａｂの重鎖を含む抗原結合分子の部分とは別々の核酸配列によってコードされ得る。共発現されるとき、第１のＦａｂの軽鎖は、第１のＦｖ領域を含む第１のＦａｂを形成する第１のＦａｂの重鎖と会合することになる。別の例において、第１のＦｃ領域サブユニットを含む抗原結合分子の部分は、第２のＦｃ領域サブユニットを含む抗原結合分子の部分とは別々の核酸配列によってコードされ得る。共発現されるとき、２つのＦｃ領域サブユニットは、本開示による抗原結合分子の二量体Ｆｃ領域を形成するために会合することになる。
ある実施形態では、本開示は、本開示による抗原結合分子をコードする核酸配列又は複数の核酸配列に向けられ、核酸配列又は複数の核酸配列は、抗原結合分子の個々のポリペプチドをコードする。本開示による例示された抗原結合分子を形成するポリペプチドは、表９～１３において記載される。
ベクター
ある実施形態では、本開示は、本開示による核酸配列組成物を含むベクター又は複数ベクターを含むベクター組成物を提供する。ある実施形態では、本開示は、本開示による抗原結合分子をコードする核酸配列又は複数の核酸配列を含むベクター又は複数のベクターを含むベクター組成物を提供する。ある実施形態では、本開示は、表９～１３に記載されるとおりの抗原結合分子をコードする核酸配列又は複数の核酸配列を含むベクター又は複数のベクターを含むベクター組成物を提供する。ある種の実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。
宿主細胞
ある種の実施形態では、本開示は、本開示による抗原結合分子をコードする核酸配列又は複数の核酸配列を含む核酸組成物を含むベクター又は複数のベクターを含むベクター組成物を含む宿主細胞を提供する。ある実施形態では、本開示は、表９～１３に記載されるとおりの抗原結合分子をコードする核酸配列又は複数の核酸配列を含む核酸組成物を含むベクター又は複数のベクターを含むベクター組成物を含む宿主細胞を指す。
本開示による抗原結合分子の発現を複製し且つ支持するのに好適な宿主細胞は、当該技術分野でよく知られている。そのような宿主細胞は、特定の発現ベクターで適宜トランスフェクト又は形質導入されてもよく、且つ大量のベクター含有細胞が、臨床適用のために十分な量のそのような抗原結合分子を得るための大規模な発酵を起こさせる有機体を供給するために増殖され得る。これらのシステムにおいて外来遺伝子を発現させる標準的な技術は、当該技術分野で知られている。一般に、そのような工程は通常、好適な宿主細胞を、本開示による抗原結合分子の個々のポリペプチドをコードする核酸組成物又はベクター組成物で形質転換又はトランスフェクトすることを含む。さらに、そのような工程は通常、宿主細胞の増殖（増加、成長）に好適な条件下で宿主細胞を培養すること及びコードされたポリペプチドの生成（発現、合成）に好適な条件下で培養する工程を含む。
生成
本明細書で開示されるとおりの抗体又は抗原結合分子を生成する方法は、当該技術分野でよく知られている（例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと）。本開示による抗原結合分子は、例えば、固相ペプチド合成又は組換え生成によって得てもよい。組換え生成のために、本開示による抗原結合分子をコードする１つ以上の核酸配列が単離され、且つさらなるクローニング及び／又は宿主細胞における発現のための１つ以上のベクターに挿入される。
当業者によく知られる方法を使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルとともに本開示による抗原結合分子のためのコード化配列を含有する発現ベクターを構築することができる。そのような方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ手法、合成手法及びインビボ組換え／遺伝的組換えが挙げられる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ（１９８９）において記載される手法を参照されたい。ベクターは、当該技術分野でよく知られる方法によって原核（例えば、細菌）又は真核（例えば、酵母又は哺乳動物）細胞などの適切な宿主細胞に導入され得る（例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９及び１９９２を参照のこと）。多数のクローニングベクターが当業者に知られており、且つ適切なクローニングベクターの選択は、選択の問題である。コード化配列は、プロモーター、リボソーム結合部位（細菌発現用）及び、任意に、オペレーターの制御下に置かれてもよく、その結果、所望のタンパク質又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、この発現コンストラクトを含有するベクター又はベクター（複数）によって形質転換された宿主細胞においてＲＮＡに転写される。コード化配列は、シグナルペプチド又はリーダー配列を含有してもよいし、含有しなくてもよい。選択された発現系及び宿主細胞に応じて、本開示による抗原結合分子は、前述の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を、目的のタンパク質が発現される条件下で培養することにより生成される。次に、タンパク質は、宿主細胞から単離され、且つ精製される。発現系が増殖培地中にタンパク質を分泌する場合、タンパク質は、培地から直接的に精製され得る。タンパク質が分泌されない場合、それは細胞可溶化物から単離されるか又は細胞膜画分から回収される。適切な増殖条件及び回収方法の選択は、当該技術分野の範囲内である。
本開示による抗原結合分子は天然に存在するタンパク質ではないことが留意されるべきである。通常、本開示による抗原結合分子は、組換え合成又は半合成タンパク質である。
ある実施形態では、本開示による抗原結合分子を生成する方法が提供され、方法は、抗原結合分子の発現に好適な条件下で本開示による抗原結合分子をコードする核酸配列又は複数の核酸配列を含むベクター又は複数のベクターを含むベクター組成物を含む宿主細胞を培養すること、及び宿主細胞又は宿主細胞培養培地から抗原結合分子を回収することを含む。
実施形態では、本開示による抗原結合分子の生成のための方法はさらに、宿主細胞又は培地から生成された抗原結合分子を単離する工程を含む。本明細書に記載されるとおりに回収された抗原結合分子は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの当該技術分野で知られる手法により精製され得る。特定のタンパク質を精製するために使用される条件は、実効電荷、疎水性、親水性などの因子に部分的に依存することになり、且つ当業者に明らかであろう。アフィニティークロマトグラフィー精製のために、抗原結合分子が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用され得る。例えば、本開示による抗原結合分子のアフィニティークロマトグラフィー精製のために、プロテインＡ又はプロテインＧを伴うマトリックスが使用され得る。抗原結合分子の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーなどを含む様々なよく知られる分析方法のいずれかによって決定され得る。
融合タンパク質
本開示による抗原結合分子は、１つ以上の他の部分に融合されてもよいし、融合されなくてもよい。そのような融合タンパク質は、遺伝的又は化学的手法を含む任意の好適な様式で調製され得る。前記の連結された部分は、分泌若しくはリーダー配列、検出、発現、分離若しくは精製を助ける配列、又は例えば、組換え生成の間に、タンパク質安定性の増大を与える配列を含有し得る。可能な部分の非限定的な例としては、ベータ－ガラクトシダーゼ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、Ｔ７ポリメラーゼフラグメント、分泌シグナルペプチド、抗体若しくは抗体フラグメント、毒素、レポーター酵素、ポリ－ヒスチジンタグのような金属イオンに結合できる部分、検出及び／若しくは精製に好適なタグ、ホモ若しくはヘテロ会合ドメイン、タンパク質の安定性を増大させる部分、又は酵素切断部位を含む部分が挙げられる。したがって、本開示による抗原結合分子は、任意に、他の標的又は目的の標的タンパク質に対する結合のための１つ以上の部分を含有し得る。そのようなさらなる部分はさらに、本開示による抗原結合分子に機能性をもたらしてもよいし、もたらさなくてもよく、且つ本開示による抗原結合分子の特性を修飾してもよいし、修飾しなくてもよい。本開示によるポリペプチドは、本明細書で定義されるとおりのリンカーによって融合され得る。
機能性
本開示による抗原結合分子は、目的の標的抗原が関与する生物学的経路によって媒介される疾患の予防及び治療のために使用され得る。これは、例えば、標的抗原とその同族の受容体又は天然の結合パートナーの間の相互作用を阻害することによって達成され得る。本開示による抗原結合分子の生物活性は、本明細書で開示される実施例３～４に記載されるものを含む当該技術分野で知られる様々なアッセイによって測定され得る。機能活性をアッセイするための方法は、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）及び当該技術分野でよく知られる他の方法などの結合アッセイを利用してもよい（Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９０；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ Ｐａｕｌ，ＭＮ）及びＭａｄｄｏｘ，Ｄ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．（１９８３；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１－１２１６）を参照のこと）。或いは、アッセイは、インビボ又はインビトロのいずれかにおいて、生物学的標的抗原に対する結合に起因して生物学的応答を誘発する際の抗原結合分子の能力を試験し得る。生物活性は、例えば、Ｔ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞におけるシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞における活性化マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞又は腫瘍間質の細胞などの標的細胞におけるシグナル伝達の阻害、標的細胞の増殖の阻害、標的細胞の溶解の誘導、及び腫瘍退縮の誘導並びに／又は生存の改善を含んでもよい。
ある実施形態では、本開示は、癌細胞の溶解を誘導するための方法であって、細胞傷害性Ｔ細胞の存在下で前記癌標的細胞を本開示による抗原結合分子と接触させることを含む方法を提供する。
ある実施形態では、本開示は、癌細胞におけるシグナル伝達の阻害のための方法であって、細胞傷害性Ｔ細胞の存在下で前記癌細胞を本開示による抗原結合分子と接触させることを含む方法を提供する。
ある実施形態では、本開示は、癌細胞の増殖の阻害のための方法であって、細胞傷害性Ｔ細胞の存在下で前記癌細胞を本開示による抗原結合分子と接触させることを含む方法を提供する。
ある実施形態では、本開示は、癌抗原を高度に発現する細胞を死滅させるが、癌抗原を低度に発現する細胞を死滅させないための方法であって、細胞傷害性Ｔ細胞の存在下で前記癌抗原を高度に発現する細胞を本開示による抗原結合分子と接触させることを含む方法を提供する。
ある実施形態では、本開示は、細胞傷害性Ｔ細胞における細胞応答を誘導するための方法であって、癌細胞の存在下で前記細胞傷害性Ｔ細胞を本開示による抗原結合分子と接触させることを含む方法を提供する。ある実施形態では、前記細胞応答は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性、及び活性化マーカーの発現からなる群から選択される。
ある実施形態では、本開示は、癌細胞の存在下でヒトＴ細胞増殖を誘導するための方法であって、Ｔ細胞の存在下で前記癌細胞を本開示による抗原結合分子と接触させることを含む方法を提供する。
ある実施形態では、本開示は、癌細胞の存在下で初代Ｔ細胞の応答を刺激するための方法であって、前記Ｔ細胞の存在下で前記癌細胞を本開示による抗原結合分子と接触させることを含む方法を提供する。
ある実施形態では、本開示は、Ｔ細胞の細胞傷害活性を癌細胞にリダイレクトするための方法であって、前記Ｔ細胞の存在下で前記癌細胞を本開示による抗原結合分子と接触させることを含む方法を提供する。
ある実施形態では、本開示は、対象における癌関連抗原について陽性である癌の治療のための本開示による抗原結合分子の使用であって、
（ａ）癌で苦しめられる対象を選択すること、
（ｂ）対象から１つ以上の生体試料を回収すること、
（ｃ）１つ以上の試料において癌関連抗原を発現する癌細胞を同定すること；及び
（ｄ）有効量の本開示による抗原結合分子を対象に投与することを含む使用を提供する。
診断法
ある実施形態では、本開示は、疾患の診断のための本開示による抗原結合分子の使用を提供する。ある実施形態では、本開示は、抗原の検出のための本開示による抗原結合分子の使用を提供する。ある実施形態では、本開示は、対象又は試料において抗原を検出するための方法であって、前記対象又は試料を本開示による抗原結合分子を接触させる工程を含む方法を提供する。ある実施形態では、本開示は、対象における疾患を診断するための方法であって、前記対象又は試料を本開示による抗原結合分子と接触させる工程を含む方法を提供する。
治療方法
本開示による抗原結合分子は、治療方法において使用され得る。本開示による抗原結合分子は、癌の治療のために使用され得る。ある実施形態では、本開示は、疾患の治療のための方法を提供する。ある実施形態では、本開示は、疾患の治療のための本開示による抗原結合分子を提供する。ある実施形態では、本開示は、疾患の治療における使用のための本開示による抗原結合分子を提供する。ある実施形態では、本開示は、必要とする個体における疾患の治療における使用のための本開示による抗原結合分子を提供する。ある実施形態では、本開示は、薬剤の製造のための本開示による抗原結合分子の使用を提供する。ある実施形態では、本開示は、薬剤としての使用のための本開示による抗原結合分子を提供する。ある実施形態では、本開示は、必要とする個体における疾患の治療のための薬剤としての使用のための本開示による抗原結合分子を提供する。ある実施形態では、疾患は、抗原の望まれない存在と関連する。ある実施形態では、治療されることになる疾患は、増殖性疾患である。特定の実施形態では、疾患は、癌である。
癌の非限定的な例としては、膀胱癌、脳癌、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、胃癌、前立腺癌、血液癌、皮膚癌、扁平上皮癌、骨癌、及び腎臓癌が挙げられる。
ある実施形態では、本開示は、治療有効量の本開示による抗原結合分子を対象に投与することを含む、疾患を有する対象又は個体を治療する方法における使用のための本開示による抗原結合分子を提供する。ある実施形態では、方法はさらに、個体に治療有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を投与することを含む。治療を必要とする対象又は個体は通常、哺乳動物、より具体的にはヒトである。治療方法における使用のために、本開示による抗原結合分子は、良好な医療行為と一致する方法で製剤化、服用、及び投与されることになる。
ある実施形態では、本開示は、癌を有する患者における腫瘍退縮の誘導のための方法であって、前記対象に治療有効量の本開示による抗原結合分子を投与することを含む方法を提供する。
ある実施形態では、本開示は、癌を有する対象の生存を向上させるための方法であって、前記対象に治療有効量の本開示による抗原結合分子を投与することを含む方法を提供する。
ある実施形態では、本開示は、癌を有する対象において免疫応答を誘発するか、刺激するか又は誘導するための方法であって、前記対象に治療有効量の本開示による抗原結合分子を投与することを含む方法を提供する。
ある実施形態では、本開示は、癌を有する対象において抗癌免疫を増強するか又は誘導するための方法であって、前記対象に治療有効量の本開示による抗原結合分子を投与することを含む方法を提供する。
医薬組成物
ある実施形態では、本開示は、本開示による抗原結合分子及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物はさらに、少なくとも１つの他の薬学的に活性な化合物を含んでもよい。本開示による医薬組成物は、目的の標的抗原と関連する疾患の診断、予防及び／又は治療において使用され得る。
特に、本開示は、哺乳動物、より具体的にはヒトにおける予防的、治療的且つ／又は診断的使用に好適な本開示による抗原結合分子を含む医薬組成物を提供する。一般に、本開示による抗原結合分子は、少なくとも１つの本開示による抗原結合分子及び少なくとも１つの薬学的に許容される担体、希釈剤若しくは賦形剤及び／又はアジュバント、並びに任意に１つ以上のさらなる薬学的に活性な化合物を含む医薬組成物として製剤化され得る。そのような製剤は、経口、非経口、局所投与又は吸入による投与に好適であり得る。
特に、本開示による抗原結合分子は、相乗効果が得られる場合があるか又は得られない場合がある結果として、目的の標的抗原が関与する疾患の予防及び／又は治療のために使用されるか又は使用され得る１つ以上の薬学的に活性な化合物との組合せにおいて使用され得る。そのような化合物、並びにそれらを投与するための経路、方法及び医薬製剤又は組成物の例は、臨床医にとって明らかであろう。ある実施形態では、本開示は、標的抗原の望まれない存在と特異的に関連する疾患の予防及び／又は治療における使用のための本開示による抗原結合分子を含む医薬組成物を提供する。ある実施形態では、本開示は、薬剤としての使用のための本開示による抗原結合分子を含む医薬組成物を提供する。ある実施形態では、本開示は、自己免疫疾患、炎症性疾患、癌、血管疾患、感染性疾患、血栓症、心筋梗塞、及び／又は糖尿病の予防及び／又は治療における使用のための本開示による抗原結合分子を含む医薬組成物を提供する。
ある実施形態では、本開示は、本開示による抗原結合分子を含む医薬組成物を使用する必要とする対象における自己免疫疾患、炎症性疾患、癌、血管疾患、感染性疾患、血栓症、心筋梗塞及び／又は糖尿病の治療のための方法を提供する。
さらに、インビボでの投与に好適な形態において本開示による抗原結合分子を生成する方法であって、（ａ）本開示による方法によって抗原結合分子を得ること、及び（ｂ）前記抗原結合分子を少なくとも１つの薬学的に許容される担体と製剤化することであって、それによって抗原結合分子の調製が、インビボでの投与のために製剤化されることを含む方法が提供される。
本開示による医薬組成物は、薬学的に許容される担体中で溶解された治療有効量の本開示による１つ以上の抗原結合分子を含む。
ある実施形態では、本開示は、本開示による抗原結合分子又は本開示による抗原結合分子を含む医薬組成物を含むキットを提供する。
ある実施形態では、本開示は、本開示による抗原結合分子又は本開示による抗原結合分子を含む医薬組成物、及びそれを必要とする対象における癌の進行を治療するか若しくは遅らせるか又は腫瘍増殖を低減するか若しくは阻害するための本開示による結合分子の投与のための指示書を含む添付文書を含むキットを提供する。
投与量
疾患の予防又は治療に関して、本開示による抗原結合分子の適切な投与量は、治療されることになる疾患の種類、投与経路、個体の体重、抗原結合分子の特定の種類、疾患の重症度及び経過、抗原結合分子が予防又は治療目的で投与されるかどうか、以前又は同時の治療介入、個体の臨床歴及び抗原結合分子に対する応答、並びに主治医の判断に依存することになる。本開示による抗原結合分子は、１回又は一連の治療にわたって患者に好適に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の本開示による抗原結合分子は、例えば、１回以上の別々の投与によるか、又は持続注入によるかにかかわらず、個体への投与のための初回の投与量であり得る。１つの典型的な１日の投与量は、上述の因子に応じて、１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であり得る。数日以上におよぶ反復投与に関して、条件に応じて、治療は一般に、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続されることになる。本開示による抗原結合分子のための１つの例示的な投与量は、０．００５ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の非限定的な例において、用量はまた、１回の投与当たり１μｇ／ｋｇ体重、５μｇ／ｋｇ体重、１０μｇ／ｋｇ体重、５０μｇ／ｋｇ体重、１００μｇ／ｋｇ体重、２００μｇ／ｋｇ体重、３５０μｇ／ｋｇ体重、５００μｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｋｇ体重、５０ｍｇ／ｋｇ体重、１００ｍｇ／ｋｇ体重、２００ｍｇ／ｋｇ体重、３５０ｍｇ／ｋｇ体重、５００ｍｇ／ｋｇ体重、～１０００ｍｇ／ｋｇ体重以上、及びそこから導かれる任意の範囲を含み得る。本明細書に列挙される数から導かれる範囲の非限定的な例において、５ｍｇ／ｋｇ体重～１００ｍｇ／ｋｇ体重、５μｇ／ｋｇ体重～５００ｍｇ／ｋｇ体重などの範囲が、上記の数に基づいて投与され得る。したがって、０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はその任意の組合せ）の１つ以上の用量が、個体に投与され得る。そのような用量は、例えば、１週毎又は３週毎（例えば、個体が２から２０、又は例えば、６用量の抗原結合分子を受容するように）に断続的に投与され得る。初回の高い負荷用量に続いて、１回以上のより低い用量が投与され得る。本開示による抗原結合分子は一般に、意図される目的を達するのに有効な治療量において使用されることになる。
併用療法
本開示による抗原結合分子は、１つ以上の他の治療剤と組み合わせて投与され得る。「治療剤」は、そのような治療を必要とする個体における症状又は疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。ある種の実施形態では、追加の治療剤は、免疫調節性薬剤、細胞分裂阻害剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性薬剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘発因子に対する細胞の感受性を増大させる薬剤である。そのような他の治療剤は、意図する目的のために有効な量で組み合わされて好適に存在する。併用療法は、合わせた投与（２つ以上の治療剤が、同じ又は別々の組成物中に含まれる）、及び別々の投与を包含し、その場合、本開示による抗原結合分子の投与は、追加の治療剤の投与の前、それと同時、及び／又はその後に行われ得る。本開示による抗原結合分子は、放射線療法と組み合わせて使用され得る。
配列
Figure 2022513708000002
Figure 2022513708000003
Figure 2022513708000004
Figure 2022513708000005
Figure 2022513708000006
Figure 2022513708000007
Figure 2022513708000008
Figure 2022513708000009
Figure 2022513708000010
Figure 2022513708000011
Figure 2022513708000012
Figure 2022513708000013
以下は、本開示による分子及び方法の例である。本明細書で提供される一般的な説明から、様々な他の実施形態が実践され得ることが理解される。
標準的な方法を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９において記載されるとおりにＤＮＡを操作した。ヒト免疫グロブリン軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２において与えられる。
実施例１：三価の二重特異性抗原結合分子の調製、生成及び特徴付け
本明細書で例示されるとおりの抗原結合分子は、通常のヒトＩｇＧ１分子のＦｃ領域と２つのＦａｂアームの間に追加のＦｖ領域（Ｆｖ２）を組み込んでいるアグリコシル化モノクローナルヒトＩｇＧ１鋳型抗体から構築された。そのような分子の基本構造は、図１Ｂにおいて提供される。
２つのＦａｂアームとＦｃ領域の間の融合は、２つのＦａｂ重鎖のＣ末端と組み込まれた追加のＦｖ領域の可変ドメイン（ＶＨ２及びＶＬ２）のＮ末端の間のグリシン－セリンリンカー（（ＧＧＳ）３）（配列番号１０）を使用することによって達成された。第２のＦｖ領域（Ｆｖ２）の可変ドメインと２つのＦｃ領域サブユニットの間の融合は、ＣＬλの最初の５アミノ酸残基（ＱＰＫＡＡＰ（配列番号１２））又はＣＨ１（ＡＳＴＫＧＰ（配列番号１１）定常ドメイン及びヒトＩｇＧ１ヒンジ配列の部分（ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１３））から構築されたペプチドリンカーを使用することによって達成された。ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列の使用は、２つの利用されるペプチドリンカーの間の鎖間ジスルフィド架橋の形成を介してヘテロ二量体分子のさらなる安定化を可能にした。Ｆｃ領域は、「ノブ・イントゥ・ホール」技術に従って変異を各Ｆｃ領域サブユニットのＣＨ３ドメインに導入することによって改変された。それによって、１つの変異されたＣＨ３ドメインを含むポリペプチドは、相補的な様式で操作される他のＣＨ３ドメインを含む他のポリペプチドとヘテロ二量体化させられる。
下に例示される二重特異性三価コンストラクトにおいて、抗原結合分子の２つのＦａｂアームに存在する２つのＦａｂ（Ｆａｂ１及びＦａｂ２）は、二価の様式で癌関連標的ＨＥＲ２に特異的に結合するが、組み込まれた第２のＦｖ領域（Ｆｖ２）は、一価の様式でヒトＣＤ３イプシロンに特異的に結合する。
ＨＥＲ２結合に関して、Ｂａｓｅｌｇａ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５８（１３）：２８２５－２８３１）によって記載されるとおりの「トラスツズマブ」（ハーセプチン（登録商標））に由来するＶＨ及びＶＬドメインをコードするヌクレオチド配列が使用された。トラスツズマブ及びその調製の方法は、米国特許第５，８２１，３３７号明細書に記載される。
ＣＤ３結合に関して、以下のＣＤ３抗体のＶＨ及びＶＬドメインをコードする以下のヌクレオチド配列が使用された：
・ＳＰ３４：Ｙｏｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（Ｅｘｐ．Ａｎｉｍ．４９（２），９７－１１０，２０００）によって記載されるモノクローナル抗体
・Ｉ２Ｃ：国際公開第２００８／１１９５６６号パンフレット（ＭＩＣＲＯＭＥＴ ＡＧ）に記載されるモノクローナル抗体
・抗体「Ｒｏｃｈｅ」として本明細書で参照される国際公開第２０１６／０２０３０９号パンフレット（Ｆ．ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＧ）に開示されるモノクローナルＣＤ３抗体
・ニワトリリゾチームに関する特異性を有する内製の陰性対照抗体。
本明細書に記載される実施例に従って作製される本開示により生成された二重特異性三価抗原結合分子（本明細書でコンストラクト１～５と呼ばれる）の個々の構成要素（Ｆａｂ、リンカー、Ｆｖ領域、Ｆｃ領域など）の概説は、表３～１３に記載される。
遺伝子合成
全ての核酸配列又は所望の遺伝子セグメントは、内製又は外部の提供者によって、適切な鋳型を使用するＰＣＲによって作製されたか、又は適切な隣接領域（例えば、好適な制限酵素認識部位、リンカー配列）を有する線状ＤＮＡフラグメントとして遺伝子合成された。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する核酸配列又は遺伝子セグメントは、標準的な分子生物学の方法を使用して、それぞれの発現ベクター（例えば、哺乳動物ＩｇＧ発現ベクター）又は配列決定ベクターにクローン化された。哺乳動物発現ベクターにおける使用が意図されるとき、全てのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的化するリーダーペプチドをコードする５’末端ＤＮＡ配列とともに設計された。サブクローニングされた遺伝子フラグメントのＤＮＡ配列は、二本鎖によるＤＮＡの配列決定によって確認された。
生成
コンストラクト１～５の発現に関して、指数関数的に増殖している真核ＨＥＫ２９３細胞は、それぞれＦｃ領域サブユニットを含む２つのポリペプチドと第１及び第２のＦａｂの軽鎖を含むポリペプチドの１：１：２の比をもたらす、コンストラクトの全ての構成要素をコードする哺乳動物の２つのベクター発現系でトランスフェクトされた。
細胞培養液上清は、トランスフェクション後の６日目に収集され、標準的なプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳＵＲＥ│ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけられた。緩衝液交換は、１×ダルベッコＰＢＳ（ｐＨ７．２｜ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対して実施され、試料は滅菌濾過（０．２μｍ孔径）された。タンパク質濃度は、ＵＶ－分光光度法によって決定され、コンストラクトの純度は、ＣＥ－ＳＤＳ（ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ│Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ│ＵＳＡ）を使用して変性、還元及び非還元条件下で分析された。ＨＰ－ＳＥＣは、天然状態においてＩｇＧ製剤を分析するために実施された。
生成結果
表１４は、生成されたコンストラクトに関して得られた異なる製剤の収量及び最終単量体含量を要約している。一般に、コンストラクトを、２９～７５ｍｇ／Ｌの収量及び６５～９０％の単量体含量を有して記載される生成及び精製方法によって作製することができた。コンストラクト２における第２のＦｖ領域のＶＨとＶＬドメインの間の安定化ジスルフィド架橋（ＶＨ－Ｇ４４Ｃ／ＶＬ－Ｇ１００Ｃ）の使用は、安定化ジスルフィド架橋を欠く対応するコンストラクト１と比較したとき、収量及び単量体含量の著しい減少をもたらした。
Figure 2022513708000014
実施例２：細胞上で発現されるＣＤ３及びＨＥＲ２に対する三価の二重特異性抗原結合分子の結合。
標的細胞：
ＨＥＲ２に対する二価の結合及びＣＤ３に対する一価の結合を有する二重特異性三価コンストラクト１、３、４及び５のＨＥＲ２標的化の評価のために、以下の腫瘍細胞株が使用された：ＨＥＲ２陽性ヒト腺癌ＳＫＯＶ－３［ＳＫＯＶ３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－７７（商標））細胞株及びＨＥＲ２陰性ヒト腺癌ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－１３２（商標））細胞株。加えて、ヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞白血病細胞株、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ ＃ＴＩＢ－１５２）を使用して、ヒトＣＤ３に対する結合を評価した。
方法：
Ｊｕｒｋａｔ又はＳＫＯＶ－３細胞は再懸濁され、洗浄緩衝液（カルシウム及びマグネシウム（Ｇｉｂｃｏ，＃１４０４０１７４）とともに３％ＦＢＳ及び０．０２％ナトリウム酸が補充されたＤＰＢＳ）中で計数された。ウェル当たり６Ｅ＋０４個の細胞が、３８４ウェルＶ底プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ，＃７８１２８０）中に播種され、段階希釈されたコンストラクト（滴定範囲５００ｎＭ～０．５ｎＭ）と氷上で１時間インキュベートされた。細胞は、洗浄緩衝液中で２回洗浄された。結合したコンストラクトは、ヒトＦ（ａｂ’）２フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃１０９－６０６－０９７）に対して向けられるＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７がコンジュゲートされた検出抗体を使用して検出された。コンストラクトの染色は、ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ ｉＱｕｅフローサイトメーターを使用して測定され、ＦｏｒｅＣｙｔ（バージョン４．１．５３７９、ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ）ソフトウェアにおいて分析された。ＥＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．、バージョン５．０４）における４パラメーター非線形回帰分析を使用して計算された。
結果：
実験の結果は、表１５並びに図３Ａ（Ｊｕｒｋａｔ細胞）及び図３Ｂ（ＳＫＯＶ－３細胞）において要約され、二重特異性三価コンストラクト１、３及び４が、用量依存的な様式において細胞上で発現されるＨＥＲ２及びＣＤ３に特異的に結合することを明らかにしている。さらに、ＨＥＲ２及びＣＤ３陰性細胞株に対する結合は、試験されたコンストラクトについては観察できない（データは示さず）。陰性対照コンストラクト５は、いずれの細胞株を使用しても結合活性を示さない。
Figure 2022513708000015
実施例３：レポーター遺伝子アッセイ－ＮＦＡＴレポーター遺伝子でトランスフェクトされたＳＫＯＶ－３及びＪｕｒｋａｔ細胞に対する三価の二重特異性抗原結合分子の試験
標的及びエフェクター細胞：
二重特異性三価コンストラクト１、３、４及び５の機能活性の評価に関して、ＮＦＡＴレポーター遺伝子コンストラクトで一過的にトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ ＃ＴＩＢ－１５２）が、代替のエフェクター細胞として使用された。標的細胞として、以下の腫瘍細胞株が使用された：ＨＥＲ２陽性ヒト腺癌ＳＫＯＶ－３［ＳＫＯＶ３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－７７（商標））細胞株及びＨＥＲ２陰性ヒト腺癌ＭＤＡ－ＭＢ－４６８（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－１３２（商標））細胞株。
以下の増殖培地が、細胞株の維持のために使用された：（ａ）Ｊｕｒｋａｔ：１０％ ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｆ７５２４）が補充されたＲＰＭＩ－１６４０＋Ｌ－グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃２１８７５－０３４）；（ｂ）ＳＫＯＶ－３：１０％ ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｆ７５２４）が補充されたＭｃＣｏｙｓ ５ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃１０９３８）（ｃ）ＭＤＡ－ＭＢ－４６８：１ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃３５０５０－０６１）、１ｘピルビン酸ナトリウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃１１３６０－０３９）及び１０％ ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ ＃Ｆ７５２４）が補充されたＤＭＥＭ－Ｌ－グルタミン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃１０９３８）。
方法：
ＳＫＯＶ－３及びＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞は、４Ｅ＋０５細胞／ｍｌの密度まで増殖培地中で希釈された。４０，０００細胞に相当する１００μｌの細胞懸濁液が、組織培養処理された９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３９１７）の各ウェル中に播種され、加湿されたインキュベーター中において３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートされた。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、２，５Ｅ＋０５細胞／ｍｌの濃度まで増殖培地中で再懸濁された。トランスフェクション成分ｐＧＬ４．３０［ｌｕｃ２Ｐ／ＮＦＡＴ－ＲＥ／Ｈｙｇｒｏ］レポーター遺伝子ベクター、ＯｐｔｉＭＥＭ－Ｉ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃３１９８５－０４７）及びＴｒａｎｓＩＴ－ＬＴ１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ、＃ＭＩＲ２３０４）が、室温で１５分間インキュベートされ、続いてＪｕｒｋａｔ細胞懸濁液に加えられ、加湿されたインキュベーター中において３７℃及び５％ＣＯ２で１７時間インキュベートされた。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、収集され、１，２Ｅ＋０６細胞／ｍｌの濃度で増殖培地中において再懸濁された。培地は、覆われた標的細胞から除去され、ウェル当たり６０，０００細胞に相当する５０μｌのＪｕｒｋａｔ細胞懸濁液によって置き換えられた。コンストラクト１、３、４及び天然の対照コンストラクト５は、Ｊｕｒｋａｔ増殖培地中で段階的に希釈された。５０μｌのコンストラクト希釈物が各ウェルに加えられて、３１ｎＭ～０．１２ｎＭの最終濃度範囲をもたらした。アッセイプレートは、加湿されたインキュベーター中において３７℃及び５％ＣＯ２で５時間インキュベートされた。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ２６２０）は、製造業者の指示書に従って再構成された。アッセイプレート及び試薬は、室温で平衡化された。１００μｌのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）試薬が、アッセイプレートの各ウェルに加えられ、混合された。発光は、ＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００ Ｐｒｏプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ）を使用して測定された。
結果：
実験の結果は、表１６並びに図４Ａ（ＳＫＯＶ－３細胞）及び図４Ｂ（ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞）において要約される。コンストラクト１、３、４は、０．７ｎＭ～１．８ｎＭの範囲のＥＣ５０濃度を有してＨＥＲ２発現標的細胞株ＳＫＯＶ－３の存在下で用量依存的なルシフェラーゼ活性を誘導する。コンストラクト１は、それぞれＥＣ５０及び最大ルシフェラーゼ活性レベルによって示されるとおり最も高い有効性及び効力を示す。ＨＥＲ２陰性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８標的細胞の存在下で、コンストラクト１は、高濃度で弱いルシフェラーゼ活性を誘導する。コンストラクト３、４は、ＨＥＲ２の非存在下で不活性である。陰性対照コンストラクト５は、いずれの標的細胞株を使用しても活性を示さない。
Figure 2022513708000016
実施例４：三価の二重特異性抗原結合分子によって媒介されるリダイレクトされたＴ細胞の細胞傷害性
二重特異性三価コンストラクト１、３、４及び５は、ＣＤ３及びＨＥＲ２への結合時の腫瘍細胞のＴ細胞に媒介される死滅を誘導するそれらの潜在力について分析された。
方法
健常ドナー由来のヒト全血が、Ｌｉ－ヘパリン含有Ｓ－Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅ容器（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）中に回収された。血液は５０ｍｌコニカルチューブに移され、２％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ、＃Ｆ７５２４）及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含有する等体積のＰＢＳと混合された。希釈された血液は、１５ｍｌのＢｉｏｃｏｌｌ溶液（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、＃Ｌ６１１５）を含有するＳｅｐＭｅｔｅ－５０チューブ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃８６４５０）に移され、１２００ｘｇで１０分間遠心分離された。上清が、５０ｍｌのコニカルチューブに移され、ＰＢＳで４５ｍｌに希釈され、３００ｘｇで８分間遠心分離された。上清は捨てられ、細胞ペレットは１ｍｌのＰＢＳ中で再懸濁され、細胞はＮｅｕｂａｕｅｒチャンバーを使用して計数された。
５，０００個のＨＥＲ２発現ＳＫＢＲ３細胞及びＨＥＲ２陰性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞が、培養培地（ＳＫＢＲ３：マッコイ５Ａ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃２６６００）、１０％ ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ、＃Ｆ７５２４）；ＭＤＡ－ＭＢ－４６８：ＤＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃１０９３８）、１ｘＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃３５０５０－０６１）、１ｘピルビン酸ナトリウム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃１１３６０－０３９）、１０％ＦＣＳ）中で懸濁され、黒色９６ウェルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃３３４０）に播種され、３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートされた。全てがＲＰＭＩ １６４０ ｗ／ｏフェノールレッド（Ｇｉｂｃｏ、＃３２４０４－０１４）、ＧｌｕｔａＭＡＸ及び１０％ウシ胎仔血清を含むアッセイ培地中で希釈されたＣｅｌｌＴｏｘＧｒｅｅｎ色素（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ８７３１）、１００ｎＭに希釈された二重特異性抗原結合分子及び１００，０００個の精製されたＰＢＭＣが細胞に加えられ、３７℃及び５％ＣＯ２で４８時間インキュベートされた。細胞傷害活性は、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ５００デバイスを使用して４８５ｎｍ励起及び５３５ｎｍ発光にて組み込まれたＣｅｌｌＴｏｘＧｒｅｅｎ蛍光を測定することによって評価された。
結果：
実験の結果は、図５において示される。ＰＢＭＣとコンストラクト１、３及び４の共培養は、１００ｎＭの試験されたコンストラクト濃度でＨＥＲ２発現ＳＫＢＲ３標的細胞の死滅を誘導する。ＨＥＲ２陰性ＭＤＡ－ＭＢ－４６８細胞の非存在下において、試験されたコンストラクトのうちで細胞傷害活性を刺激するものはない。陰性対照コンストラクト５は、いずれの標的細胞株を使用しても活性を誘導しない。
実施例５：親和性の判定
方法
ヒトＣＤ３イプシロンとＣＤ３に関する一価の特異性及びＨＥＲ２に関する二価の特異性を有する抗原結合分子（コンストラクト１及び３）の間の相互作用の動力学的特徴付けは、抗原結合分子捕捉形式において実施され、抗原は、溶液中の分析物としてアプライされた。大容量捕捉表面は、ビオチン化ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅリガンド（非ビオチン化リガンド：ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２８－４０１８－６０）をいくつかのストレプトアビジンセンサー（ｆｏｒｔｅｂｉｏ、パート１８－５０２１）上にローディングすることによって作製された。動力学的実験の各サイクルは、捕捉工程（並行して使用されるいくつかのセンサー上の１つのリガンドの）に続く分析物結合工程（会合期、異なる分析物濃度及びアッセイ緩衝液、すなわち、ブランク減算については抗原濃度０）からなった。結合の後、結合した抗原の解離がモニターされた（アッセイ緩衝液に曝されたセンサー）。各サイクルの最後に、結合したリガンド及び／又はリガンド－抗原複合体は、１０ｍＭ グリシン／ＨＣｌ ｐＨ１．５（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ１００３５４）による２０秒の２回の連続した再生工程によりセンサー表面から除去されたが、捕捉表面の完全性は維持された。
捕捉されたリガンドによりセンサー上で記録されたシグナルは、結合の間抗原の代わりにアッセイ緩衝液に曝されたが、例えば、捕捉されたリガンドの解離の可能性を補正するために、抗原濃度がゼロではないセンサーグラムから差し引かれた。１０００ｒｐｍの軌道振盪速度で、会合は３００秒間、解離は３００秒間記録された。０．０５％（ｖ／ｖ）ポリソルベート２０（Ｍｅｒｃｋ、８．２２１８４．０５００）及び０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、Ａ７９０６）が補充されたＤＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ、Ｃａ２＋なし、Ｍｇ２＋なし；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｃａｔ．Ｎｏ．１４１９０）が、アッセイ緩衝液として使用された。リガンドの捕捉レベルは、およそ２ｎｍに調整されて、ｈＣＤ３ｅ分析物によっておよそ０．３ｎｍの飽和レベルＲｍａｘに達した。いくつかの異なる分析物濃度が、動力学的実験の間に分析のために使用された（ｐＭＡＸ＿ｈＣＤ３ｅ（１－１１８）＿Ｆ－ｃｈＬｙｓ＿ａｖｉ；アプライされたモル濃度 １５．６２５～１０００ｎＭ、２倍の段階希釈系列）。
センサーグラムは、データ分析ソフトウェアｖ１０（Ｏｃｔｅｔ／ｆｏｒｔｅｂｉｏ）で評価された。全てのセンサーグラムは、１：１結合モデルにフィッティングされて、ｋｏｎ及びｋｏｆｆ速度定数を決定し、これはＫＤ値を計算するために使用された。予測される１：１結合から逸脱している動力学的プロファイルについては、センサーグラムは、一価の動力学への最適な近似を使用して評価され、結果は、「不均一な結合」の所見をつけて記された。これらの結果は、予測される一価の結合動力学に完全に従う動力学プロファイルより厳密ではないと考えられるが、ＫＤについての十分な近似であると想定される。さらに、リガンドとＣＤ３タンパク質のそれぞれの分子量を考慮して、得られたリガンドの捕捉レベルに外挿した飽和レベル（Ｒｍａｘ）を関連付け、観察される結合事象が予測される化学量論及び一価の結合で説明できるかどうかを評価した。
結果：ヒトＣＤ３イプシロンに対する結合
実験の結果は、表１７において要約される。観察される結合を使用して、飽和レベルのＣＤ３を外挿し、リガンドの捕捉レベルに関連付けた。実験的飽和Ｒｍａｘは、ＣＤ３の完全に活性な一価抗体への一価の結合に関して理論的に予測される範囲（１００±１５％）内に見出された。
結果は、ＣＤ３に対する特異性を有する第２のＦｖ領域の相対的な位置が、使用されるＣＤ３に特異的な抗体の結合活性にとって好ましくないわけではないことを明らかにしている。
Figure 2022513708000017

Claims (15)

  1. 抗原結合分子であって、
    ａ）第１の抗原に特異的に結合する第１のＦｖ領域を含む第１のＦａｂ、
    ｂ）第２の抗原に特異的に結合する第２のＦｖ領域及び
    ｃ）第３の抗原に特異的に結合する第３のＦｖ領域を含む第２のＦａｂ、並びに
    ｄ）第１及び第２のＦｃ領域サブユニットで構成されるＦｃ領域を含み；
    ｉ．前記第１のＦａｂの重鎖又は軽鎖のＣ末端が、前記第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬのＮ末端に融合され、且つ
    ｉｉ．前記第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬのＣ末端が、前記第１のＦｃ領域サブユニットのＮ末端に融合され、且つ前記第２のＦｃサブユニットのＮ末端が、前記第２のＦｖ領域の相補的な可変ドメインのＣ末端に融合され、且つ
    ｉｉｉ．前記第１及び第２のＦａｂが、前記第２のＦｖ領域の別個の可変ドメインに融合されることを条件として、前記第２のＦａｂの重鎖又は軽鎖のＣ末端が、前記第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬのＮ末端に融合され、且つ
    ｉｖ．前記第１のＦｃ領域サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のスレオニン残基がトリプトファン残基と置き換えられ（Ｔ３６６Ｗ）、且つ３５４位のセリン残基がシステイン残基と置き換えられ（Ｓ３５４Ｃ）、且つ前記第２のＦｃ領域サブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基と置き換えられ（Ｙ４０７Ｖ）、３６６位のスレオニン残基がセリン残基と置き換えられ（Ｔ３６６Ｓ）、３６８位のロイシン残基がアラニン残基と置き換えられ（Ｌ３６８Ａ）、且つ３４９位のチロシン残基がシステイン残基と置き換えられる（Ｙ３４９Ｃ）（ＥＵインデックスに従う付番）、抗原結合分子。
  2. 各融合が、ペプチドリンカーを介して生じる、請求項１に記載の抗原結合分子。
  3. 前記抗原結合分子が、少なくとも４つのポリペプチドで構成され、
    ａ．第１のポリペプチドが、前記第１のＦａｂの軽鎖又は重鎖を含み、
    ｂ．第２のポリペプチドが、そのＮ末端からそのＣ末端に
    ｉ．前記第１のＦａｂの相補的な軽鎖又は重鎖、
    ｉｉ．前記第２のＦｖ領域のＶＨ又はＶＬ及び
    ｉｉｉ．前記第１又は第２のＦｃ領域サブユニット
    を含み、
    ｃ．第３のポリペプチドが、そのＮ末端からそのＣ末端に
    ｉ．前記第２のＦａｂの軽鎖又は重鎖、
    ｉｉ．前記第２のＦｖ領域の相補的なＶＨ又はＶＬ及び
    ｉｉｉ．相補的な第１又は第２のＦｃ領域サブユニット
    を含み、
    ｄ．第４のポリペプチドが、前記第２のＦａｂの相補的な軽鎖又は重鎖を含む、請求項１又は２に記載の抗原結合分子。
  4. 前記第３の抗原が、前記第１の抗原と同一である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
  5. 前記抗原結合分子が、前記第１の抗原に対する二価の結合及び前記第２の抗原に対する一価の結合をもたらす、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
  6. 前記抗原結合分子が、三価の二重特異性抗原結合分子である、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
  7. 前記第２の抗原が、免疫エフェクター細胞上で発現される、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
  8. 前記第１の抗原が、Ｔ細胞受容体複合体のメンバーである、請求項１～７のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
  9. 前記第２の抗原が、ＣＤ３である、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
  10. 前記Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域である、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
  11. 前記Ｆｃ領域が、前記第１及び第２のＦｃ領域サブユニットの会合を促進する１つ以上のアミノ酸改変を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
  12. 前記Ｆｃ領域サブユニットの各々において、ヒトＩｇＧ１におけるＥＵインデックスに従う付番を有する位置Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ａ３３０、Ｐ３３１に相当する位置における少なくとも５個のアミノ酸残基が、それぞれＡ、Ｅ、Ａ、Ｓ、及びＳに変異される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗原結合分子。
  13. 請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗原結合分子及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物。
  14. 医薬における使用のための請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗原結合分子又は請求項１３に記載の医薬組成物。
  15. Ｔ細胞の細胞傷害活性を癌細胞にリダイレクトするための方法であって、Ｔ細胞の存在下で前記癌細胞を請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗原結合分子と接触させることを含む方法。
JP2021531685A 2018-12-05 2019-12-04 多重特異性抗原結合分子 Pending JP2022513708A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18210328.3 2018-12-05
EP18210328 2018-12-05
PCT/EP2019/083638 WO2020115115A1 (en) 2018-12-05 2019-12-04 Multispecific antigen-binding molecules

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022513708A true JP2022513708A (ja) 2022-02-09
JPWO2020115115A5 JPWO2020115115A5 (ja) 2022-11-24

Family

ID=64650138

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021531685A Pending JP2022513708A (ja) 2018-12-05 2019-12-04 多重特異性抗原結合分子

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20220041719A1 (ja)
EP (1) EP3891186A1 (ja)
JP (1) JP2022513708A (ja)
AU (1) AU2019392711A1 (ja)
CA (1) CA3121699A1 (ja)
WO (1) WO2020115115A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4217391A1 (en) 2020-09-24 2023-08-02 MorphoSys AG Novel human antibodies binding to human cd3 epsilon
CA3227537A1 (en) * 2021-07-27 2023-02-02 Morphosys Ag Combinations of antigen binding molecules
WO2023180346A1 (en) 2022-03-22 2023-09-28 Morphosys Ag Deimmunized antibodies specific for cd3

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
LU91067I2 (fr) 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
DK0979281T3 (da) 1997-05-02 2005-11-21 Genentech Inc Fremgangsmåde til fremstilling af multispecifikke antistoffer med heteromultimere og fælles bestanddele
US6673901B2 (en) 1997-06-12 2004-01-06 Research Corporation Technologies, Inc. Artificial antibody polypeptides
IL136544A0 (en) 1997-12-05 2001-06-14 Scripps Research Inst Humanization of murine antibody
CA2323757C (en) 1998-04-02 2011-08-02 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
EP1141024B1 (en) 1999-01-15 2018-08-08 Genentech, Inc. POLYPEPTIDE COMPRISING A VARIANT HUMAN IgG1 Fc REGION
WO2003048731A2 (en) 2001-12-03 2003-06-12 Abgenix, Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
CN1961003B (zh) 2004-03-31 2013-03-27 健泰科生物技术公司 人源化抗TGF-β抗体
SG172616A1 (en) 2004-04-13 2011-07-28 Hoffmann La Roche Anti-p-selectin antibodies
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
EP3050963B1 (en) 2005-03-31 2019-09-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
AR060070A1 (es) 2006-03-24 2008-05-21 Merck Patent Gmbh Dominios proteicos heterodimericos obtenidos por ingenieria
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
WO2008119566A2 (en) 2007-04-03 2008-10-09 Micromet Ag Cross-species-specific bispecific binders
ES2400107T3 (es) * 2007-10-22 2013-04-05 Merck Serono S.A. IFN-beta sencillo fusionado a un fragmento Fc de lgG mutado
DK2235064T3 (en) 2008-01-07 2016-01-11 Amgen Inc A process for the preparation of heterodimeric Fc molecules using electrostatic control effects
EP2424567B1 (en) 2009-04-27 2018-11-21 OncoMed Pharmaceuticals, Inc. Method for making heteromultimeric molecules
WO2011030107A1 (en) * 2009-09-10 2011-03-17 Ucb Pharma S.A. Multivalent antibodies
CN103124743A (zh) 2009-12-29 2013-05-29 新兴产品开发西雅图有限公司 Ron结合构建物及其使用方法
WO2011143545A1 (en) 2010-05-14 2011-11-17 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
DK2635607T3 (da) 2010-11-05 2019-11-18 Zymeworks Inc Stabilt heterodimert antistofdesign med mutationer i fc-domænet
AU2012234335B2 (en) 2011-03-29 2016-09-01 Roche Glycart Ag Antibody Fc variants
PL3424953T3 (pl) * 2011-06-06 2021-01-25 Novo Nordisk A/S Lecznicze przeciwciała
JP6541974B2 (ja) 2011-12-20 2019-07-10 メディミューン，エルエルシー 二重特異的抗体足場用改変ポリペプチド
US9248181B2 (en) 2012-04-20 2016-02-02 Merus B.V. Methods and means for the production of Ig-like molecules
US9701759B2 (en) * 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
UA117289C2 (uk) * 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
KR102317315B1 (ko) 2014-08-04 2021-10-27 에프. 호프만-라 로슈 아게 이중특이적 t 세포 활성화 항원 결합 분자
LT3223845T (lt) 2014-11-26 2021-08-25 Xencor, Inc. Heterodimeriniai antikūnai, kurie suriša cd3 ir cd20

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020115115A1 (en) 2020-06-11
US20220041719A1 (en) 2022-02-10
CA3121699A1 (en) 2020-06-11
EP3891186A1 (en) 2021-10-13
AU2019392711A1 (en) 2021-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019204841B2 (en) Novel heterodimeric proteins
JP7323659B2 (ja) ヘテロ二量体タンパク質
US20240092871A1 (en) Heterodimeric proteins
RU2711485C2 (ru) Конъюгированные соединения, содержащие сконструированные с цистеином антитела
AU2018200008A1 (en) Modulation of T Cells with Bispecific Antibodies and FC Fusions
KR20200014379A (ko) 비대칭 ch2-ch3 영역 돌연변이를 갖는 조작된 다중특이성 항체 및 다른 다량체 단백질
KR20100058509A (ko) 다중특이적 에피토프 결합 단백질 및 이의 용도
JP2022513708A (ja) 多重特異性抗原結合分子
WO2023006809A1 (en) Combinations of antigen binding molecules
RU2804031C2 (ru) Сконструированные мультиспецифические антитела и другие мультимерные белки с асимметричными мутациями в области ch2-ch3

Legal Events

Date Code Title Description
RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20210726

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20210730

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220531

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20221026

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20231002