JP2021080260A - ポリペプチド異種多量体の製造方法 - Google Patents

ポリペプチド異種多量体の製造方法 Download PDF

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Abstract

【課題】異種多量体の効率的かつ安定な製造のために、還元状況下においてポリペプチドのヘテロ化を促進し所望の異種多量体を得る、より反応効率の高い優れた手法を提供する。【解決手段】抗原結合活性の異なる複数種類の重鎖定常領域含有ポリペプチドのホモ体を、コアヒンジ領域外のシステイン残基同士がポリペプチド間ジスルフィド結合を再編成する還元条件下でインキュベートすることにより、異種多量体を効率的かつ安定に製造する方法。本製造方法は、コアヒンジ領域内のアミノ酸残基がジスルフィド結合を形成しないことを特徴とする。【選択図】図３

Description

本発明は、ポリペプチド異種多量体の製造方法及びポリペプチドのヘテロ化が促進されるように重鎖定常領域のアミノ酸が改変されたポリペプチド異種多量体等に関する。
抗体は血中での安定性が高く、副作用も少ないことから医薬品として注目されている（非特許文献１、非特許文献２）。その中には二種類の抗原あるいはエピトープを同時に認識できる二重特異性抗体があり、これらは標的特異性の高さや複数の経路を同時に阻害する機能が期待される（非特許文献３）。例えば既に上市されているCatumaxomabは、上皮細胞接着因子のEpCAMと、T細胞に発現しているCD3に結合する二重特異性抗体であり、悪性腹水の治療薬として用いられている。
IgG型二重特異性抗体の製造は、目的とする二重特異性抗体が得られる効率の低さや、精製の難しさから難易度が高いが、効率的生産に関する知見がいくつか報告されている(非特許文献３)。例えば、二種類の可変領域をもつIgGを構成するH鎖およびL鎖の遺伝子、合計４種の遺伝子を細胞に導入し、共発現により分泌する場合、2種類のH鎖の共有結合やH鎖とL鎖の非共有結合はランダムに起こるため、目的の二重特異性抗体の比率は極めて少なくなり、生産効率が著しく低下する。これを解決する手法として、IgG H鎖のCH3領域にアミノ酸置換を施すことにより、H鎖について異種な組み合わせのIgGを優先的に分泌できることが報告されている（特許文献1および非特許文献4および5）。本手法は、一方のH鎖のCH3領域に存在するアミノ酸側鎖をより大きい側鎖(knob；突起)に置換し、もう一方のH鎖のCH3領域に存在するアミノ酸側鎖をより小さい(hole；空隙)に置換することにより突起が空隙内に配置されるようにして異種H鎖形成の促進および同種H鎖形成の阻害を引き起こす方法である。またそれぞれのIgG H鎖のCH3領域に異なる電荷を導入する方法も報告されている（特許文献2）。具体的には、一方のH鎖のCH3領域に存在するアミノ酸を正電荷を有するアミノ酸に置換し、もう一方のH鎖のCH3領域に存在するアミノ酸を負電荷を有するアミノ酸に置換することにより、異種H鎖形成の促進および同種H鎖形成の阻害を引き起こす方法である。一方H鎖とL鎖の組み合わせを制御する技術も報告されている(非特許文献6)。本手法は抗体の一方のFabとして、軽鎖定常領域(CL)とH鎖CH1領域を入れ替えたものを用いることで、目的とするH鎖とL鎖の組み合わせを効率的に誘起する手法である。またこの他には、両方のFabで共通するL鎖を用いる手法も存在する。これは共通のL鎖を用いることで細胞に導入するL鎖遺伝子を一種類とし、H鎖とL鎖の組み合わせを考慮する必要なく二重特異性抗体を得られるというものである。現在では異種H鎖形成技術、H鎖L鎖組み合わせ制御技術を組み合わせることにより、高い効率で二重特異性抗体が形成できる。しかしながら、H鎖とL鎖の組み合わせを完全に制御することは難しく、複雑な分子設計となる。また共通のL鎖で二種類の抗原に対して高い親和性を維持するのは難易度が高いという問題もある。
一方、上記のような遺伝子組換え法ではなく、あらかじめ別々に調製したモノクローナル抗体同士を使用して二重特異性抗体を作製する方法としてFab Arm Exchangeと呼ばれる手法が報告されている。これは、生体内でIgG4が内因性IgG4と交換してBispecific抗体を生成するという知見（非特許文献7）に基づいて開発された技術であり、in vitroで二種類のIgG4を混合することにより、二重特異性抗体が産生されること（特許文献3）、さらには還元条件下においてより効率良く反応が起こることが報告されている(非特許文献8)。またIgG4に特徴的なヒンジ領域の228番目とCH3領域の409番目の2箇所がこの反応に重要なアミノ酸残基であることが特定され、IgG1であってもこの2箇所をIgG4型のアミノ酸に置換することで、IgG4と同等の効率で反応が起こることが見出されている(特許文献4)。Fab Arm Exchangeは一般的な方法で作製されたモノクローナル抗体同士をin vitroで混合するだけで目的とする二重特異性抗体が得られるため汎用性が高い。しかしながら半分子交換反応はランダムに起こるため、二種類の抗体を混合して得られる二重特異性抗体は理論上、系内に存在する全抗体量の50%となる。そのため、二重特異性抗体生成率を改善する方法が検討され、二種類の抗体に非対称なアミノ酸改変、すなわち、一方のH鎖にK409Rの改変、および、もう一方のH鎖にF405Lを導入することで反応効率が大きく向上することが報告されている（特許文献5、非特許文献9および10）。本手法ではこれまでの反応効率を大幅に向上させることに成功しているものの、Fab Arm Exchangeでは抗体を還元条件下で反応させることから、目的とするヒンジ領域以外のジスルフィド結合の開裂、糖鎖やアミノ酸が還元されることによる不均一性の増加、またこれらの物性変化に伴う結合活性の低下が懸念される。実際に還元剤存在下37℃, 24時間の条件でFab Arm Exchangeを行うとイオン交換クロマトグラフィーにおいて副生成物に由来するピークが増加することが報告されている（非特許文献9）。二重特異性抗体の効率的かつ安定な製造においては精製の簡便さやロット間差の不均一性を可能な限り低減することが必要不可欠であるため、より穏やかな還元条件であっても高い反応効率を実現する優れた手法の開発が望まれる。
WO1996/027011 WO2006/106905 WO2005/062916 WO2008/119353 WO2011/131746
Nat Biotechnol., 23, 1073-1078, 2005 Eur J Pharm Biopharm, 59(3), 389-396, 2005 mAbs, 4, 653-663, 2012 Protein Engineering, 9, 617-621, 1996 Nature Biotechnol., 16, 677-681, 1998 Proc. Natl. Acad. Sci., 108, 11187-11192, 2011 Immunology, 97, 693-698, 1999 Science, 317, 1554-1557, 2007 Proc. Natl. Acad. Sci., 110, 5145-5150, 2013 Nature Protocols, 9, 2450-2463, 2014
本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その目的は、異種多量体の効率的かつ安定な製造のために、還元状況下においてポリペプチドのヘテロ化を促進し所望の異種多量体を得る、より反応効率の高い優れた手法を提供することである。
本発明者らは、異種多量体に供するポリペプチドとして重鎖定常領域を有するポリペプチドを選択し、重鎖定常領域同士の解離及び会合を制御する方法について鋭意研究を行った。その結果、重鎖定常領域に存在する特定のアミノ酸を置換することにより、還元状況下において重鎖定常領域の解離の促進及び会合の制御をすることができ、従来技術と比較して効率よく所望のヘテロ分子が形成されることを見出した。またこの時、一般的な抗体で形成されるコアヒンジ領域でのジスルフィド結合を排除し、L鎖間、あるいはCH3領域間でジスルフィド結合を形成させることで安定なヘテロ分子を形成させる方法を見出した。
本発明はこのような知見に基づくものであり、具体的には以下[１]から[３２]を提供する。
〔１〕a) 第1の抗原結合活性を有し、重鎖定常領域を含む第1のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
b) 該第1の抗原結合活性とは異なる第2の抗原結合活性を有し、重鎖定常領域を含む第2のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
c) コアヒンジ領域外のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にする還元条件下で、該第1のポリペプチドのホモ体および該第2のポリペプチドのホモ体を共にインキュベートする段階、ならびに
d) 第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を得る段階
を含み、
コアヒンジ領域内のアミノ酸残基がジスルフィド結合を形成しない、
異種多量体を製造するための方法。
〔２〕〔1〕の段階a)において、第1のポリペプチドと多量体を形成する第3のポリペプチドを提供する段階を含み、かつ段階b)において、第2のポリペプチドと多量体を形成する第4のポリペプチドを提供する段階を含む、〔1〕に記載の製造方法。
〔３〕第3のポリペプチド及び第4のポリペプチドが抗体軽鎖である、〔２〕に記載の製造方法。
〔４〕コアヒンジ領域外が軽鎖定常領域である、〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の製造方法。
〔５〕前記第1及び／又は第2のポリペプチドの重鎖定常領域において、EUナンバリングによる131位及び／又は220位のシステイン残基が他のアミノ酸残基に改変されている、〔４〕に記載の製造方法。
〔６〕コアヒンジ領域外が重鎖定常領域に含まれるCH3領域である、〔１〕〜〔３〕のいずれか一項に記載の製造方法。
〔７〕前記第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域に含まれるCH3領域のそれぞれにおいて、EUナンバリングによる349位、351位、354位、356位、394位及び407位のアミノ酸残基から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基がシステインである、〔6〕に記載の製造方法。
〔８〕前記第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域に含まれるCH3領域においてそれぞれシステインである組が、以下の(1)〜(5)のいずれか1組である、〔7〕に記載の製造方法：
(1) EUナンバリングによる349位および356位のアミノ酸残基
(2) EUナンバリングによる394位および394位のアミノ酸残基
(3) EUナンバリングによる351位および351位のアミノ酸残基
(4) EUナンバリングによる407位および407位のアミノ酸残基
(5) EUナンバリングによる349位および354位のアミノ酸残基。
〔９〕EUナンバリングによる226位および／または229位のシステイン残基が他のアミノ酸残基に改変されている若しくは欠損している、又はコアヒンジ領域が欠損している、〔１〕〜〔8〕のいずれか一項に記載の製造方法。
〔１０〕さらにEUナンバリングによる220位から225位がTyr(Y)−Gly(G)−Pro(P)−Pro(P)に置換され、又はEUナンバリングによる219位から229位が欠損している、〔9〕に記載の製造方法。
〔１１〕第1及び／又は第2のポリペプチドにおいて、第1及び／又は第2のポリペプチドのCH3領域の安定性が不安定になるようにアミノ酸が改変されている、〔1〕〜〔10〕のいずれか一項に記載の製造方法。
〔１２〕前記第1及び／又は第2のポリペプチドにおいて、EUナンバリングによる392位、397位及び409位のアミノ酸残基のうち少なくとも一つが改変されている、〔11〕に記載の製造方法。
〔１３〕前記第1及び／又は第2のポリペプチドの重鎖定常領域に含まれるCH3領域において、
(1) EUナンバリングによる356位および439位のアミノ酸残基
(2) EUナンバリングによる357位および370位のアミノ酸残基
(3) EUナンバリングによる399位および409位のアミノ酸残基
に示すアミノ酸残基の組から選択される1組ないし3組のアミノ酸残基が同種の電荷を有し、
前記第1のポリペプチドのCH3領域及び前記第2のポリペプチドのCH3領域の両方において、前記（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組のうち同じ組のアミノ酸残基がそれぞれ同種の電荷を有する場合、前記第2のポリペプチドのCH3領域における当該組のアミノ酸残基が、前記第1のポリペプチドのCH3領域における当該組のアミノ酸残基とは反対の電荷を有する、
〔1〕〜〔12〕のいずれか一項に記載の製造方法。
〔１４〕前記同種の電荷を有するアミノ酸残基が、以下の（A)または(B)いずれかの群に含まれる1つ以上のアミノ酸残基から選択される、〔13〕に記載の製造方法：
(A)グルタミン酸 (E)、アスパラギン酸 (D)；
(B)リジン（K)、アルギニン（R)、ヒスチジン（H)。
〔１５〕第1及び第2のポリペプチドにおいてそれぞれ同種の電荷を有するアミノ酸残基の組が、以下の(1)〜(4)のいずれか1組のアミノ酸残基の組である、〔13〕または〔14〕に記載の製造方法：
(1) EUナンバリングによる356位および439位のアミノ酸残基
(2) EUナンバリングによる357位および370位のアミノ酸残基
(3) EUナンバリングによる399位および409位のアミノ酸残基
(4)(i) EUナンバリングによる399位および409位のアミノ酸残基、並びに
(ii) EUナンバリングによる356位および439位のアミノ酸残基。
〔１６〕第1及び／又は第2のポリペプチドの重鎖定常領域がIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4タイプである、〔1〕〜〔15〕のいずれか一項に記載の製造方法。
〔１７〕第1及び／又は第2のポリペプチドの重鎖定常領域がマウス由来の重鎖定常領域である、〔1〕〜〔12〕のいずれか一項に記載の製造方法。
〔１８〕前記第1及び／又は第2のポリペプチドの重鎖定常領域に含まれるCH3領域において、
(1) EUナンバリングによる356位および439位のアミノ酸残基
(2) EUナンバリングによる360位および371位のアミノ酸残基
(3) EUナンバリングによる399位および409位のアミノ酸残基
に示すアミノ酸残基の組から選択される1組ないし3組のアミノ酸残基が同種の電荷を有し、
前記第1のポリペプチドのCH3領域及び前記第2のポリペプチドのCH3領域の両方において、前記（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組のうち同じ組のアミノ酸残基がそれぞれ同種の電荷を有する場合、前記第2のポリペプチドのCH3領域における当該組のアミノ酸残基が、前記第1のポリペプチドのCH3領域における当該組のアミノ酸残基とは反対の電荷を有する、
〔17〕に記載の異種多量体を製造するための方法。
〔１９〕第1及び／又は第2のポリペプチドにおいて、
EUナンバリングによる397位がMet(M)、Phe(F)若しくはTyr(Y)に改変されており、かつ／又は
EUナンバリングによる392位がAsp(D)、Glu(E)、Thr(T)、Val(V)若しくはIle(I)に改変されており、かつ／又は
EUナンバリングによる409位がArg(R)に改変されている、
〔1〕〜〔18〕のいずれか一項に記載の製造方法。
〔２０〕a) 第1の抗原結合活性を有し、重鎖定常領域を含む第1のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
b) 該第1の抗原結合活性とは異なる第2の抗原結合活性を有し、重鎖定常領域を含む第2のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
c) 第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を得る段階
を含む、
異種多量体を製造するための方法であって、
第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（５）のいずれかに記載のように改変されている、当該製造方法：
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び356位がCys(C)である；
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び394位がCys(C)である；
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び351位がCys(C)である；
（４）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び407位がCys(C)である；
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び354位がCys(C)である。
〔２１〕a) 第1の抗原結合活性を有し、重鎖定常領域を含む第1のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
b) 該第1の抗原結合活性とは異なる第2の抗原結合活性を有し、重鎖定常領域を含む第2のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
c) 第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を得る段階
を含む、
異種多量体を製造するための方法であって、
段階a)において、第1のポリペプチドと多量体を形成する第3のポリペプチドである抗体軽鎖を提供する段階を含み、かつ段階b)において、第2のポリペプチドと多量体を形成する第4のポリペプチドである抗体軽鎖を提供する段階を含み、
第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに記載のように改変されている、当該製造方法：
（１）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基である；
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基である；
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基である；
（４）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失している；
（５）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失している；
（６）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)である。
〔２２〕〔1〕、〔20〕及び〔21〕に記載の段階c)が還元剤との接触を含む、〔1〕〜〔21〕のいずれか一項に記載の製造方法。
〔２３〕段階c)が、グルタチオン、L-システイン、ジチオスレイトール、β-メルカプト-エタノール、TCEPおよび2-MEAからなる群より選択される作用物質の添加を含む、〔22〕に記載の製造方法。
〔２４〕前記異種多量体が多重特異性抗体又はヘテロFc融合タンパク質である、〔1〕〜〔23〕のいずれか一項に記載の製造方法。
〔２５〕前記異種多量体が二重特異性抗体である、〔1〕〜〔24〕のいずれか一項に記載の製造方法。
〔２６〕〔1〕〜〔25〕のいずれか一項に記載の方法によって製造された異種多量体又は二重特異性抗体。
〔２７〕抗体重鎖である第１のポリペプチドと抗体軽鎖である第３のポリペプチドで２量体を形成し、抗体重鎖である第２のポリペプチドと抗体軽鎖である第４のポリペプチドで２量体を形成している、第１、第２、第３および第４のポリペプチドを構成要素として含む二重特異性抗体であって、
第1及び／又は第2のポリペプチドの重鎖定常領域に含まれるCH3領域のそれぞれにおいて、EUナンバリングによる349位、351位、354位、356位、394位及び407位のアミノ酸残基から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基がシステインである、
二重特異性抗体。
〔２８〕抗体重鎖である第１のポリペプチドと抗体軽鎖である第３のポリペプチドで２量体を形成し、抗体重鎖である第２のポリペプチドと抗体軽鎖である第４のポリペプチドで２量体を形成している、第１、第２、第３および第４のポリペプチドを構成要素として含む二重特異性抗体であって、
第1及び第2のポリペプチドが、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、
二重特異性抗体：
（１）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基である；
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基である；
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基である；
（４）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失している；
（５）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失している；
（６）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)である。
〔２９〕〔26〕〜〔28〕のいずれか一項に記載の異種多量体又は二重特異性抗体、及び医薬的に許容される担体を含む組成物。
〔３０〕〔27〕または〔28〕に記載の二重特異性抗体を製造する方法。
〔３１〕〔1〕に記載の段階d)の後にさらに以下の段階を行う、異種多量体をスクリーニングする方法：
e) 異種多量体の活性を測定する段階、
f) 所望の活性を有する異種多量体を選択する段階。
〔３２〕〔31〕に記載の段階f)の後にさらに以下の段階を行う、異種多量体を製造する方法：
g) 〔31〕に記載の段階f)で選択した異種多量体の第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、第３のポリペプチド及び第４のポリペプチドのCDR又は可変領域を取得する段階、
h) 取得したCDR又は可変領域を別の異種多量体に移植する段階。
本発明では、重鎖定常領域に存在する特定のアミノ酸を置換することにより、還元状況下において重鎖定常領域の解離の促進及び会合の制御をすることができ、従来技術と比較して効率よく所望のヘテロ分子が形成される製造方法が提供された。
本発明の方法を利用することにより、従来技術と比較して二重特異性抗体の精製の際の簡便さの向上やロット間の不均一性を可能な限り低減することが可能になった。
本発明の異種多量体の製造方法は、重鎖定常領域のアミノ酸残基を改変することを特徴とする。これらの領域に本発明のアミノ酸残基の改変を導入することによって、ポリペプチド間の解離及び会合が促進され、従来技術と比較して効率よく所望の異種多量体を得る事が出来る。
イオン交換クロマトグラフィーによるFab Arm Exchange反応産物の解析結果を示す図である。図中の「BiAb」は精製したBispecific抗体（二重特異性抗体）を、「H54 homo」はH54/L28の可変領域を有するモノクローナル抗体を、「MRA homo」はMRAH/MRALの可変領域を有するモノクローナル抗体を示す。図中に百分率で示した数値はBispecific抗体生成率を示し、Bispecific抗体に対応するピークの面積を、系中に存在する全抗体の面積で割り、100を掛けて算出したものである。 イオン交換クロマトグラフィーによるFab Arm Exchange反応産物の解析結果を示す図である。MRAH-G1drP1/MRAL-k0とH54-G1drN1/L28-k0をホモ体として用い、3種類の還元条件下で反応させた結果を示す図である。図中に百分率で示した数値はBispecific抗体生成率を示し、Bispecific抗体に対応するピークの面積を、系中に存在する全抗体の面積で割り、100を掛けて算出したものである。 重鎖-軽鎖間のジスルフィド結合を欠失したIgG改変体のFab Arm Exchange反応を模式的に示す図である。図中の（+）および（-）は、CH3領域に導入された会合界面制御改変部位の電荷を示す。 天然型ヒトIgG1のヒンジ領域周辺の立体構造を示す図である。 実施例３における、CE-IEFによるFab Arm Exchange反応産物の解析結果を示す図である。図中に百分率で示した数値はBispecific抗体生成率を示し、Bispecific抗体に対応するピークの面積を、系中に存在する全抗体の面積で割り、100を掛けて算出したものである。 図５−１の続きを示す図である。 実施例３における、Fab Arm Exchange反応産物とそれらの元になるホモ体を非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により解析した結果を示す図である。 実施例４における、イオン交換クロマトグラフィーによるFab Arm Exchange反応産物の解析結果を示す図である。図中に百分率で示した数値はBispecific抗体生成率を示し、Bispecific抗体に対応するピークの面積を、系中に存在する全抗体の面積で割り、100を掛けて算出したものである。 図７−１の続きを示す図である。 実施例４における、Fab Arm Exchange反応産物を非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により解析した結果を示す図である。 実施例５における、イオン交換クロマトグラフィーによるFab Arm Exchange反応産物の解析結果を示す図である。 実施例５におけるFab Arm Exchange反応産物およびそれらの元になるホモ体を非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により解析した結果を示す図である。 実施例６における、イオン交換クロマトグラフィーによるFab Arm Exchange反応産物の解析結果を示す図である。 実施例７における、Fab Arm Exchange反応産物およびそれらの元になるホモ体をIEFにより解析した結果を示す図である。 図１２−１の続きを示す図である。 実施例７における、Fab Arm Exchange反応産物を非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により解析した結果を示す図である。 実施例７における、Fab Arm Exchange反応産物の元になるホモ体を非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により解析した結果を示す図である。
本発明は、還元条件下で、第１の抗原結合活性を有するポリペプチド及び該第１の抗原結合活性とは異なる第２の抗原結合活性を有するポリペプチドの各ホモ体の解離を促進し、ヘテロ体の会合を制御するために、重鎖定常領域のアミノ酸残基を改変することによって所望の異種多量体を製造する方法に関する。さらに、本発明は、所望の異種多量体を選択する方法に関する。
用語の定義
本発明における「ポリペプチド」とは、アミノ酸配列中に重鎖定常領域を含む、ポリペプチド（重鎖定常領域含有ポリペプチド）およびタンパク質（重鎖定常領域含有タンパク質）を指す。また、通常、生物由来のポリペプチドであるが、特に限定されず、例えば、人工的に設計された配列からなるポリペプチドであってもよい。また、天然ポリペプチド、あるいは合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれであってもよい。さらに、上記のポリペプチドの断片もまた、本発明のポリペプチドに含まれる。また、本発明のポリペプチドは単量体であっても多量体であってもよく、特に「ポリペプチド多量体」と明記していない場合、「ポリペプチド」なる記載は単量体または（ホモもしくはヘテロ）多量体のいずれかの状態で存在し得る。尚、本願においては「ポリペプチド」または「ポリペプチド多量体」は抗体であってもよい。
本明細書において、「抗体」とは、天然のものであるかまたは部分的もしくは完全合成により製造された免疫グロブリンをいう。抗体はそれが天然に存在する血漿や血清等の天然資源や抗体を産生するハイブリドーマ細胞の培養上清から単離され得るし、または遺伝子組換え等の手法を用いることによって部分的にもしくは完全に合成され得る。抗体の例としては免疫グロブリンのアイソタイプおよびそれらのアイソタイプのサブクラスが好適に挙げられる。ヒトの免疫グロブリンとして、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgMの9種類のクラス（アイソタイプ）が知られている。マウスの免疫グロブリンとして、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3の4種類のクラスが知られている。本発明の抗体には、これらのアイソタイプのうちヒトの免疫グロブリンとしてはIgG1、IgG2、IgG3、IgG4が、マウスの免疫グロブリンとしてはIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3が含まれ得る。マウスの免疫グロブリンとしては、IgG1が好ましい。ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、ヒトIgG4定常領域としては、遺伝子多形による複数のアロタイプ配列がSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242 に記載されているが、本発明においてはそのいずれであっても良い。特にヒトIgG1の配列としては、EUナンバリングで表される356-358位のアミノ酸配列がDELであってもEEMであってもよい。また、ヒトIgκ (Kappa)定常領域とヒトIgλ (Lambda)定常領域としては、遺伝子多形による複数のアロタイプ配列がSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242に記載されているが、本発明においてはそのいずれであってもよい。
本明細書において、「第1の抗原結合活性とは異なる第2の抗原結合活性」とは第一の抗原と第二の抗原が異なる場合に限られず、第一の抗原と第二の抗原は同じであるが、結合部位やエピトープが異なる場合も含まれる。
「Fc領域」なる用語は、天然配列Fc領域及び変異型Fc領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は変化するかも知れないが、抗体分子中の、ヒンジ部若しくはその一部、CH2、CH3ドメインからなる領域のことをいう。通常、ヒトＩｇＧ重鎖Fc領域はＣｙｓ２２６の位置のアミノ酸残基からFc領域のカルボキシル末端まで伸長すると定義されるが、これに限定されない。イムノグロブリンのＦｃ領域は、２つの定常領域、CH2及びCH3を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２」ドメインは通常アミノ酸２３１からアミノ酸３４０まで伸展する。「ＣＨ３」ドメインは、Ｆｃ領域におけるカルボキシル末端からＣＨ２領域まで伸展する。すなわち、ＩｇＧのアミノ酸３４１からおおよそアミノ酸４４７まで伸展する。
Fc領域は、IgGモノクローナル抗体等をペプシン等の蛋白質分解酵素にて部分消化した後に、プロテインAあるいはプロテインGカラムに吸着された画分を再溶出することによって好適に取得され得る。かかる蛋白分解酵素としてはpH等の酵素の反応条件を適切に設定することにより制限的にFabやF(ab')2を生じるように全長抗体を消化し得るものであれば特段の限定はされず、例えば、ペプシンやパパイン等が例示できる。
改変箇所番号については、EUナンバリング（Kabat EA et al． 1991． Sequences of Proteins of Immunological Interest．NIH）を採用した。
本発明におけるポリペプチドの「会合（association）」とは、例えば、２以上のポリペプチド領域が相互作用する状態を指すものと換言することができる。
本発明において「会合を制御する」とは、所望の会合状態になるように制御することを言い、より具体的には、ポリペプチド間における望ましくない会合（好ましくは、同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド同士の会合）を形成されにくくするように制御することを言う。
本発明における「界面（interface）」とは、通常、会合（相互作用）する際の会合面を指し、界面を形成するアミノ酸残基とは、通常、その会合に供されるポリペプチド領域に含まれる１もしくは複数のアミノ酸残基であって、より好ましくは、会合の際に接近し相互作用に関与するアミノ酸残基を言う。該相互作用には、具体的には、会合の際に接近するアミノ酸残基同士が水素結合、静電的相互作用、塩橋を形成している場合等が含まれる。
本発明におけるポリペプチドの「ホモ体」とは、同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド同士が会合しているポリペプチド多量体をいう。
本発明におけるポリペプチドの「ヘテロ体」とは、第１のポリペプチドと、アミノ酸配列において第１のポリペプチドとは少なくとも1個のアミノ酸残基が異なる第２のポリペプチドとが会合しているポリペプチド多量体をいう。
本発明におけるポリペプチドの「解離」とは、ポリペプチドのホモ体において、2以上のポリペプチドが会合した状態から、各ポリペプチド単体へ分離した状態をいう。
本発明において「異種多量体 (ヘテロマルチマー）」とは、複数種のポリペプチドから構成され、該ポリペプチドが互いに会合し得るポリペプチド多量体を言う。より詳細には、「異種多量体」は、少なくとも第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを有し、ここにおいて第２のポリペプチドはアミノ酸配列において第１のポリペプチドとは少なくとも1個のアミノ酸残基が異なる分子である。また、特に限定されないが、該異種多量体は、少なくとも2種の異なるリガンド、抗原、レセプター、または基質等に対して抗原結合活性を有することが好ましいが、これに限定されず、同じリガンド、抗原、レセプター、または基質等の異なる部位やエピトープに結合活性を有するものも含まれる。該異種多量体は、第１および第２のポリペプチドにより形成される「異種２量体」に加えて、さらに別の種のポリペプチドが存在していてもよい。即ち、本発明の「異種多量体」は、異種２量体に制限されず、例えば、異種3量体、異種4量体等も含まれる。
本発明の第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、及び１つ又は２つの第３のポリペプチドを含むポリペプチド多量体において、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドはそれぞれ、第３のポリペプチドと多量体（2量体）を形成することが出来る。また形成された2量体同士が多量体（４量体）を形成することが出来る。２つの第３のポリペプチドは完全に同一のアミノ酸配列を有していてもよい（同じ抗原に対して結合活性を有していてもよい）。あるいは同一のアミノ酸配列でありながら、２以上の活性があってもよい（例えば、２以上の異なる抗原に対して結合活性を有していてもよい）。また、第３のポリペプチドが１つの場合は、第３のポリペプチドは、第１のポリペプチドあるいは第２のポリペプチドのいずれか一方と2量体を形成し、ポリペプチド多量体を形成することが出来る。
本発明のポリペプチド多量体において、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは異なる抗原に対して結合活性を有することが好ましいが、特にこれに限定されず、同じ抗原の異なる部位・エピトープに対して結合活性を有していてもよい。一方、第３のポリペプチドは、第１のポリペプチドや第２のポリペプチドのいずれか又は両方と同じ抗原に対して結合活性を有するポリペプチドであってもよい。あるいは、第１のポリペプチドや第２のポリペプチドとは異なる抗原に対して結合活性を有するポリペプチドであってもよい。
あるいは本発明のポリペプチド多量体は、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、第３のポリペプチド、及び第４のポリペプチドを含むポリペプチド多量体とすることも出来る。このようなポリペプチド多量体において、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドはそれぞれ、第３のポリペプチド及び第４のポリペプチドと多量体（2量体）を形成することが出来る。例えば、第１のポリペプチドと第３のポリペプチド、第２のポリペプチドと第４のポリペプチドの間でジスルフィド結合を形成することにより、2量体を形成することができる。尚、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドは同一であってもよい。
本発明のポリペプチド多量体においては、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは異なる抗原に対して結合活性を有することが好ましいが、特にこれに限定されず、同じ抗原の異なる部位・エピトープに対して結合活性を有していてもよい。。一方、第３のポリペプチドは、第１のポリペプチドや第２のポリペプチドのいずれか又は両方と同じ抗原に対して結合活性を有するポリペプチドであってもよい。あるいは、第１のポリペプチドや第２のポリペプチドとは異なる抗原に対して結合活性を有するポリペプチドであってもよい。また第４のポリペプチドは、第１のポリペプチドや第２のポリペプチドのいずれかと同じ抗原に対して結合活性を有するポリペプチドであってもよい。あるいは、第１のポリペプチドや第２のポリペプチドとは異なる抗原に対して結合活性を有するポリペプチドであってもよい。また、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドは同一であってもよい。
本発明における「異種多量体」が二重特異性抗体であるとき、例えば、第1のポリペプチドと第２のポリペプチドがそれぞれ抗原Aに対する抗体重鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチド、抗原Bに対する抗体重鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチドである場合、第３のポリペプチドを抗原Aに対する抗体軽鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチド、第４のポリペプチドを抗原Bに対する抗体軽鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチドとすることができる。尚、第３のポリペプチドと第４のポリペプチドは同一であってもよい。
本発明において「抗原結合活性を有するポリペプチド」とは、抗体重鎖あるいは軽鎖の可変領域、レセプター、レセプターとFc領域の融合ペプチド、Scaffold及びこれらの断片など、抗原、リガンドなどのタンパク質やペプチドに対して結合可能なドメイン（領域）を有する5アミノ酸以上の長さを有するペプチド及びタンパク質を指す。すなわち抗原結合活性を有するポリペプチドは、抗体可変領域、レセプター、レセプターとFc領域の融合ペプチド、Scaffold、又はこれらの断片のアミノ酸配列を含むことが出来る。
Scaffoldとしては、少なくとも１つの抗原に結合することができる立体構造的に安定なポリペプチドであれば、どのようなポリペプチドであっても用いることができる。そのようなポリペプチドとしては、例えば、抗体可変領域断片、フィブロネクチン、Protein Aドメイン、LDL受容体Aドメイン、リポカリン等のほか、Nygrenら(Current Opinion in Structural Biology, 7:463-469(1997)、Journal of Immunol Methods, 290:3-28(2004))、Binzら(Nature Biotech 23:1257-1266(2005))、Hosseら(Protein Science 15:14-27(2006))に記載の分子が挙げられるがこれらに限定されない。
抗体の可変領域、レセプター、レセプターとFc領域の融合ペプチド、Scaffold及びこれらの断片の取得方法は当業者に周知である。重鎖定常領域のアミノ酸配列と軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドを用いることも出来る。
本発明における「還元条件」とは、重鎖ヒンジ領域内の重鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基、あるいは軽鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基、あるいはCH3間でジスルフィド結合を形成することを目的として導入されたシステイン残基が、酸化されるより還元された状態になる可能性が高い条件または環境を指し、好ましくは、これらのシステイン残基がジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にする条件または環境を指し、特に好ましくは、これら以外のシステイン残基はジスルフィド結合の有意な異性化を起こさないが、重鎖ヒンジ領域内のシステイン残基あるいは軽鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基、あるいはCH3間でジスルフィド結合を形成することを目的として導入されたシステイン残基がジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にする条件または環境を指す。例えば、本発明において，還元条件下で、重鎖定常領域を含む第一のポリぺプチドのホモ体と重鎖定常領域を含む第二のポリペプチドのホモ体を共にインキュベートする時間は、当業者が適宜設定することが出来る。
本発明における「還元剤」とは、その環境において分子を還元する化合物、すなわち、その環境において分子をより還元した状態に、およびより還元しつつある状態に変える化合物を指す。還元剤は、電子を供与することにより作用し、それによって、基質の還元後にそれ自体は酸化された状態になる。したがって、還元剤とは電子を供与する作用物質である。還元剤の例には、ジチオスレイトール（DTT）、メルカプトエタノール、システイン、チオグリコール酸、システアミン（2-メルカプトエチルアミン：2-MEA）、グルタチオン（GSH）、TCEP（トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン）および水素化ホウ素ナトリウムが含まれる。
本発明における「ジスルフィド結合の異性化」とは、異なるポリぺプチドに含まれるシステイン間でのジスルフィド結合の交換、すなわちジスルフィド結合の再編成を指す。例えば、重鎖における「ジスルフィド結合の異性化」とは、異なる重鎖に含まれるシステイン間でのジスルフィド結合の交換、すなわちジスルフィド結合の再編成を指す。また、例えば、軽鎖における「ジスルフィド結合の異性化」とは、異なる軽鎖に含まれるシステイン間でのジスルフィド結合の交換、すなわちジスルフィド結合の再編成を指す。
「ジスルフィド結合形成」とは、１つまたは２つのポリペプチド中に存在する２つのシステイン間で共有結合を形成する過程を指し、この結合は「-S--S-」として図式化される。
「ジスルフィド結合の還元」とは、ジスルフィド結合の切断によって、２つのチオール基(-SH基)が生じる過程を指す。
本発明における「FcγR」または「FcgR」とは、Fcγ受容体であり、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4モノクローナル抗体のFc領域に結合し得る受容体をいい、実質的にFcγ受容体遺伝子にコードされるタンパク質のファミリーのいかなるメンバーをも意味する。ヒトでは、このファミリーには、例えば、アイソフォームFcγRIa、FcγRIbおよびFcγRIcを含むFcγRI（CD64）；アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131（H型）およびR131（R型）を含む）、FcγRIIb（FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む）およびFcγRIIcを含むFcγRII（CD32）；およびアイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158およびF158を含む）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む）を含むFcγRIII（CD16）、並びにいかなる未発見のヒトFcγR類またはFcγRアイソフォームまたはアロタイプも含まれる。FcγRは、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサル由来のものが含まれるが、これらに限定されず、いかなる生物由来でもよい。マウスFcγR類には、例えば、FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）およびFcγRIII-2（CD16-2）、FcγRIV並びにいかなる未発見のマウスFcγR類またはFcγRアイソフォームまたはアロタイプも含まれる。
本発明における「改変」又は「置換」なる用語は、改変前後又は置換前後のアミノ酸が同じである場合でも、「改変」又は「置換」を意味し得る。また「改変」には「置換」も含みうる。
重鎖定常領域のアミノ酸改変による異種多量体の製造方法
本発明のポリペプチド間の解離及び／又は会合制御方法の好ましい態様にあっては、当該方法は、抗体重鎖定常領域のアミノ酸残基の変異を導入することを特徴とする方法である。当該方法は、任意で、下記電荷反発等を利用した界面制御に係るアミノ酸改変を導入する段階、重鎖CH3領域の安定性が不安定になるようなアミノ酸改変を導入する段階をさらに含んでもよい。
一つの態様にあっては、当該方法は、以下の段階を含む、異種多量体を製造するための方法である。
a) 第1の抗原結合活性を有し、重鎖定常領域を含む第1のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
b) 該第1の抗原結合活性とは異なる第2の抗原結合活性を有し、重鎖定常領域を含む第2のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
c)コアヒンジ領域外のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にする還元条件下で、該第1のポリペプチドのホモ体および該第2のポリペプチドのホモ体を共にインキュベートする段階、ならびに
d) 第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を得る段階
を含み、
コアヒンジ領域内のアミノ酸残基がジスルフィド結合を形成しない。
「ヒンジ領域」あるいは「ヒンジ部」なる用語は、抗体重鎖におけるEUナンバリング216番目から230番目のアミノ酸で構成される領域を意味する。
「コアヒンジ領域」なる用語は、ヒンジ領域において重鎖間ジスルフィド結合を形成している少なくとも２つのシステイン残基によって挟まれる領域であり、IgG1及びIgG4では、例えば抗体重鎖におけるEUナンバリング226番目から229番目のアミノ酸で構成される領域が挙げられる。例として、ヒトIgG1におけるコアヒンジ領域とは、抗体重鎖でEUナンバリング226番目のCys、227番目のPro、228番目のPro、229番目のCysからなる領域を指す。
「ヒンジ領域外」なる用語は、ヒンジ領域以外の領域や個所を意味し、例えば重鎖可変領域、CH1領域、CH2領域、CH3領域、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域などを意味する。また、「コアヒンジ領域外」なる用語は、上記ヒンジ領域外として表される領域に、ヒンジ領域中のコアヒンジ領域以外の領域を加えた領域を意味する。
「コアヒンジ領域内のアミノ酸残基がジスルフィド結合を形成しない」なる用語は、コアヒンジ領域ではジスルフィド結合を形成していないため、例えば第1のポリペプチドはコアヒンジ領域ではホモ体を形成できないこと、第２のポリペプチドはコアヒンジ領域ではホモ体を形成できないこと、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドはコアヒンジ領域ではヘテロ体を形成しないことを意味する。
具体的には、例えば、EUナンバリングによる226位および／または229位のシステイン残基が他のアミノ酸残基に改変されている若しくは欠損している、又はコアヒンジ領域が欠損していることを意味するがこれに限定されない。また、EUナンバリングによる226位および229位のシステイン残基が他のアミノ酸残基に改変されている若しくは欠損している、又はコアヒンジ領域が欠損していてもよい。ここで、他のアミノ酸とは、システイン残基以外であれば特に限定されず、ジスルフィド結合を形成しないアミノ酸残基であればよい。さらに、EUナンバリングによる220位から225位がTyr(Y)−Gly(G)−Pro(P)−Pro(P)に置換され、又はEUナンバリングによる219位から229位が欠損していてもよい。
Fab Arm Exchange反応によるCH3領域間のジスルフィド結合再形成（CH3-FAE）
一つの態様にあっては、本発明は、抗体重鎖定常領域を含むポリペプチドのCH3にあるシステインのジスルフィド結合（CH3領域間のジスルフィド結合）の異性化を利用した異種多量体を製造するための方法である。本方法に用いるシステインとしては、CH3に存在するシステインであれば特に限定されないが、好ましくはEUナンバリングによる349位、351位、354位、356位、394位及び407位の一カ所以上をシステインに改変して用いることができる。また、EUナンバリングによる349位、351位、354位、356位、394位及び407位の一カ所以上がシステインであるCH3を含むポリペプチドを用いてもよい。尚、重鎖定常領域がIgG1の場合、さらにEUナンバリングによる355位、356位、409位、419位及び445位の一つ以上が改変されていてもよく、例えば355位はGln(Q)に、356位はGlu(E)に、409位はArg(R)に、419位はGlu(E)に、又は445位はLeu(L)に改変されていてもよい。
具体的には、第1及び／又は第2のポリペプチドの重鎖定常領域に含まれるCH3領域のそれぞれにおいて、EUナンバリングによる349位、351位、354位、356位、394位及び407位のアミノ酸残基から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基がシステインである、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
より具体的には、第1及び第2のポリペプチドにおいてそれぞれシステインである組が、以下の(1)〜(5)のいずれか1組である、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
(1) EUナンバリングによる349位および356位のアミノ酸残基
(2) EUナンバリングによる394位および394位のアミノ酸残基
(3) EUナンバリングによる351位および351位のアミノ酸残基
(4) EUナンバリングによる407位および407位のアミノ酸残基
(5) EUナンバリングによる349位および354位のアミノ酸残基
コアヒンジ領域にはシステインを含まないことが好ましく、例えばEUナンバリングによる226位及び／又は229位のシステインが他のアミノ酸に改変されており、またEUナンバリングによる226位〜229位のアミノ酸残基はSPPS、SPSSであってよいが、特にこれらに限定されるわけではない。また、EUナンバリングによる226位及び／又は229位のシステインが欠損していてもよい。
ヒンジ領域に含まれる他のアミノ酸残基が改変、欠損していてもよく、他のアミノ酸が挿入されていてもよい。例えば、IgG1においてはEUナンバリング220位がセリンに置換されていてもよく、あるいはEUナンバリング220〜225位がIgG4の配列に置換されていてもよいが、特にこれらに限定されるわけではない。IgG1あるいはIgG4においてはEUナンバリング219位〜229位が欠失していてもよいが、特にこれらに限定されるわけではない。
また、ヒンジ領域の一部または全部が欠損していてもよい。例えば、IgG1あるいはIgG4においてEUナンバリング216〜230位が欠損していてもよい。
さらにより具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（５）のいずれかに示すアミノ酸残基である、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び356位がCys(C)である。
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び394位がCys(C)である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び351位がCys(C)である。
（４）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び407位がCys(C)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び354位がCys(C)ある。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（５）のいずれかに示すアミノ酸残基である、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び356位がCys(C)である。
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び394位がCys(C)である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び351位がCys(C)である。
（４）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び407位がCys(C)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び354位がCys(C)ある。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（５）のいずれかに示すアミノ酸残基である、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び356位がCys(C)である。
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び394位がCys(C)である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び351位がCys(C)である。
（４）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び407位がCys(C)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び354位がCys(C)ある。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（５）のいずれかに示すアミノ酸残基である、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び356位がCys(C)である。
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び394位がCys(C)である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び351位がCys(C)である。
（４）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び407位がCys(C)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び354位がCys(C)ある。
さらにより具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基である、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び349位がCys(C)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び356位がCys(C)あり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、349位がCys(C)及び397位がTyr(Y)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、356位がCys(C)及び397位がTyr(Y)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び394位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、354位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（５）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、351位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（６）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び407位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
またより具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基である、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び349位がCys(C)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び356位がCys(C)あり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、349位がCys(C)及び397位がTyr(Y)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、356位がCys(C)及び397位がTyr(Y)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び394位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、354位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（５）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、351位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（６）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び407位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基である、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び349位がCys(C)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び356位がCys(C)あり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、349位がCys(C)及び397位がTyr(Y)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、356位がCys(C)及び397位がTyr(Y)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び394位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、354位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（５）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、351位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（６）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び407位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基である、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び349位がCys(C)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び356位がCys(C)あり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、349位がCys(C)及び397位がTyr(Y)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、356位がCys(C)及び397位がTyr(Y)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び394位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、354位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（５）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、351位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（６）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び407位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
さらにより具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基である、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、349位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、356位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、349位がCys(C)、356位がLys(K)及び397位がTyr(Y)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、356位がCys(C)、397位がTyr(Y)及び439位はGlu(E)である。
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、394位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、394位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、349位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、354位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、351位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、351位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、407位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、407位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
またより具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基である、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、349位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、356位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、349位がCys(C)、356位がLys(K)及び397位がTyr(Y)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、356位がCys(C)、397位がTyr(Y)及び439位はGlu(E)である。
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、394位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、394位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、349位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、354位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、351位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、351位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、407位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、407位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基である、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、349位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、356位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、349位がCys(C)、356位がLys(K)及び397位がTyr(Y)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、356位がCys(C)、397位がTyr(Y)及び439位はGlu(E)である。
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、394位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、394位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、349位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、354位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、351位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、351位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、407位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、407位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基である、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、349位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、356位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、349位がCys(C)、356位がLys(K)及び397位がTyr(Y)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、356位がCys(C)、397位がTyr(Y)及び439位はGlu(E)である。
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、394位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、394位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、349位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、354位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、351位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、351位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、407位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、407位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
本発明の別の一態様として、抗体重鎖である第１のポリペプチドと抗体軽鎖である第３のポリペプチドで２量体を形成し、抗体重鎖である第２のポリペプチドと抗体軽鎖である第４のポリペプチドで２量体を形成している、第１、第２、第３および第４のポリペプチドを構成要素として含む二重特異性抗体であって、第1及び／又は第2のポリペプチドの重鎖定常領域に含まれるCH3領域における所定の位置のアミノ酸残基がシステインである、二重特異性抗体を提供する。
具体的には、第1及び／又は第2のポリペプチドの重鎖定常領域に含まれるCH3領域のそれぞれにおいて、EUナンバリングによる349位、351位、354位、356位、394位及び407位のアミノ酸残基から選択される少なくとも一つのアミノ酸残基がシステインである二重特異性抗体を提供する。
より具体的には、第1及び第2のポリペプチドにおいてそれぞれシステインである組が、以下の(1)〜(5)のいずれか1組である二重特異性抗体を提供する。
(1) EUナンバリングによる349位および356位のアミノ酸残基
(2) EUナンバリングによる394位および394位のアミノ酸残基
(3) EUナンバリングによる351位および351位のアミノ酸残基
(4) EUナンバリングによる407位および407位のアミノ酸残基
(5) EUナンバリングによる349位および354位のアミノ酸残基
さらにより具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（５）のいずれかに示すアミノ酸残基である二重特異性抗体を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び356位がCys(C)である。
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び394位がCys(C)である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び351位がCys(C)である。
（４）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び407位がCys(C)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び354位がCys(C)ある。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（５）のいずれかに示すアミノ酸残基である二重特異性抗体を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び356位がCys(C)である。
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び394位がCys(C)である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び351位がCys(C)である。
（４）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び407位がCys(C)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び354位がCys(C)ある。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（５）のいずれかに示すアミノ酸残基である二重特異性抗体を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び356位がCys(C)である。
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び394位がCys(C)である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び351位がCys(C)である。
（４）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び407位がCys(C)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び354位がCys(C)ある。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（５）のいずれかに示すアミノ酸残基である二重特異性抗体を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び356位がCys(C)である。
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び394位がCys(C)である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び351位がCys(C)である。
（４）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び407位がCys(C)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び354位がCys(C)ある。
さらにより具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基である二重特異性抗体を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び349位がCys(C)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び356位がCys(C)あり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、349位がCys(C)及び397位がTyr(Y)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、356位がCys(C)及び397位がTyr(Y)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び394位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、354位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（５）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、351位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（６）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び407位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
またより具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基である二重特異性抗体を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び349位がCys(C)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び356位がCys(C)あり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、349位がCys(C)及び397位がTyr(Y)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、356位がCys(C)及び397位がTyr(Y)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び394位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、354位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（５）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、351位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（６）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)及び407位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基である二重特異性抗体を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び349位がCys(C)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び356位がCys(C)あり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、349位がCys(C)及び397位がTyr(Y)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、356位がCys(C)及び397位がTyr(Y)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び394位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、354位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（５）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、351位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（６）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び407位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基である二重特異性抗体を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び349位がCys(C)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び356位がCys(C)あり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、349位がCys(C)及び397位がTyr(Y)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、356位がCys(C)及び397位がTyr(Y)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び394位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、349位がCys(C)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、354位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（５）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、351位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
（６）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び407位がCys(C)であり、一方のポリペプチドはEUナンバリングによる356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、他方のポリペプチドはEUナンバリングによる439位がGlu(E)又はAsp(D)である。
さらにより具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基である二重特異性抗体を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、349位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、356位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、349位がCys(C)、356位がLys(K)及び397位がTyr(Y)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、356位がCys(C)、397位がTyr(Y)及び439位はGlu(E)である。
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、394位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、394位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、349位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、354位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、351位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、351位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、407位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、407位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
またより具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基である二重特異性抗体を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、349位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、356位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、349位がCys(C)、356位がLys(K)及び397位がTyr(Y)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、356位がCys(C)、397位がTyr(Y)及び439位はGlu(E)である。
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、394位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、394位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、349位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、354位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、351位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、351位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、407位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、407位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基である二重特異性抗体を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、349位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、356位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、349位がCys(C)、356位がLys(K)及び397位がTyr(Y)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、356位がCys(C)、397位がTyr(Y)及び439位はGlu(E)である。
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、394位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、394位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、349位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、354位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、351位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、351位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、407位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、407位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基である二重特異性抗体を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、349位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、356位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、349位がCys(C)、356位がLys(K)及び397位がTyr(Y)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、356位がCys(C)、397位がTyr(Y)及び439位はGlu(E)である。
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、394位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、394位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、349位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、354位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、351位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、351位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、407位がCys(C)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)、407位がCys(C)及び439位はGlu(E)である。
Fab Arm Exchange反応によるL鎖間のジスルフィド結合再形成（L-FAE）
別の一つの態様にあっては、本発明は、抗体軽鎖定常領域にあるシステインのジスルフィド結合（L鎖間のジスルフィド結合）の異性化を利用した異種多量体を製造するための方法である。本方法に用いるシステインとしては抗体軽鎖定常領域に存在するシステインであれば特に限定されないが、例えばL鎖C末端（214位）のシステインが挙げられる。抗体軽鎖定常領域にあるシステインのジスルフィド結合の異性化を利用するには、例えばIgG4抗体の場合、抗体重鎖定常領域のEUナンバリングによる131位のシステインを他のアミノ酸、例えばSer(S)に改変するが、特にこの改変に限定されるものではない。また、IgG1抗体の場合、抗体重鎖定常領域のEUナンバリングによる220位のシステインを他のアミノ酸、例えばSer(S)に改変するが、特にこの改変に限定されるものではない。また、EUナンバリングによる131位がシステイン以外のアミノ酸であるIgG4抗体重鎖定常領域を含むポリペプチドや、EUナンバリングによる220位がシステイン以外のアミノ酸であるIgG1抗体重鎖定常領域を含むポリペプチドを用いてもよい。
コアヒンジ領域にはシステインを含まないことが好ましく、例えばEUナンバリングによる226位及び／又は229位のシステインが他のアミノ酸に改変されており、またEUナンバリングによる226位〜229位のアミノ酸残基はSPPS、SPSSであってよいが、特にこれらに限定されるわけではない。また、EUナンバリングによる226位及び／又は229位のシステインが欠損していてもよい。
ヒンジ領域に含まれる他のアミノ酸残基が改変されかつ／又は欠損していてもよく、他のアミノ酸が挿入されていてもよい。例えば、IgG1においてはEUナンバリング220位がセリンに置換されていてもよく、あるいはEUナンバリング220〜225位がIgG4の配列に置換されていてもよいが、特にこれらに限定されるわけではない。IgG1あるいはIgG4においてはEUナンバリング219位〜229位が欠失していてもよいが、特にこれらに限定されるわけではない。
また、ヒンジ領域の一部または全部が欠損していてもよい。例えば、IgG1あるいはIgG4において、EUナンバリングによる216位〜230位が欠損していてもよい。
具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（２）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基である。
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基である。
好ましくは（１）はIgG4であり、（２）はIgG1である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（２）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)である。
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)である。
好ましくは（１）はIgG4であり、（２）はIgG1である。
さらに具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基である。
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基である。
（４）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失している。
（５）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失している。
（６）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、229位がSer(S)である。
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)、226位がSer(S)、229位がSer(S)である。
（４）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、219位〜229位が欠失している。
（５）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失している。
（６）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
さらに具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基である。
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び409位がArg(R)である。
（４）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失している。
（５）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、409位がArg(R)である。
（６）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、409位がArg(R)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、229位がSer(S)である。
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)、226位がSer(S)、229位がSer(S)及び409位がArg(R)である。
（４）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、219位〜229位が欠失している。
（５）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、409位がArg(R)である。
（６）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、409位がArg(R)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
さらに具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び229位がCys(C)以外のアミノ酸残基であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び229位がCys(C)以外のアミノ酸残基であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)及び229位がCys(C)以外のアミノ酸残基であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)及び229位がCys(C)以外のアミノ酸残基であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び229位がCys(C)以外のアミノ酸残基であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び229位がCys(C)以外のアミノ酸残基であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失しており、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失しており、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
さらに具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び229位がCys(C)以外のアミノ酸残基であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び229位がCys(C)以外のアミノ酸残基であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)及び229位がCys(C)以外のアミノ酸残基であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)及び229位がCys(C)以外のアミノ酸残基であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び409位がArg(R)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び409位がArg(R)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失しており、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失しており、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、409位がArg(R)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、409位がArg(R)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、409位がArg(R)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、409位がArg(R)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)及び229位がSer(S)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)及び229位がSer(S)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、228位がPro(P)及び229位がSer(S)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、228位がPro(P)及び229位がSer(S)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)、226位がSer(S)及び229位がSer(S)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)、226位がSer(S)及び229位がSer(S)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、219位〜229位が欠失しており、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、219位〜229位が欠失しており、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)及び229位がSer(S)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)及び229位がSer(S)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、228位がPro(P)及び229位がSer(S)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、228位がPro(P)及び229位がSer(S)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)、226位がSer(S)、229位がSer(S)及び409位がArg(R)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)、226位がSer(S)、229位がSer(S)及び409位がArg(R)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、219位〜229位が欠失しており、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、219位〜229位が欠失しており、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、409位がArg(R)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、409位がArg(R)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、409位がArg(R)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、409位がArg(R)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
さらに具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び439位はGlu(E)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び439位はGlu(E)である。
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基又はTyr(Y)、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び439位はGlu(E)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失し、356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失し、439位はGlu(E)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、439位はGlu(E)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、439位はGlu(E)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
さらに具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び439位はGlu(E)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び439位はGlu(E)である。
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、409位がArg(R)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基又はTyr(Y)、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、409位がArg(R)及び439位はGlu(E)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失し、356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失し、439位はGlu(E)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、409位がArg(R)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、409位がArg(R)及び439位はGlu(E)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、409位がArg(R)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、409位がArg(R)及び439位はGlu(E)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、229位がSer(S)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、229位がSer(S)及び439位はGlu(E)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び439位はGlu(E)である。
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)、226位がSer(S)、229位がSer(S)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)、226位がSer(S)、229位がSer(S)及び439位はGlu(E)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、219位〜229位が欠失し、356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、219位〜229位が欠失し、439位はGlu(E)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、439位はGlu(E)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、439位はGlu(E)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を製造する方法を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、229位がSer(S)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、229位がSer(S)及び439位はGlu(E)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び439位はGlu(E)である。
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)、226位がSer(S)、229位がSer(S)、409位がArg(R)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)、226位がSer(S)、229位がSer(S)、409位がArg(R)及び439位はGlu(E)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、219位〜229位が欠失し、356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、219位〜229位が欠失し、439位はGlu(E)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、409位がArg(R)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、409位がArg(R)及び439位はGlu(E)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、409位がArg(R)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、409位がArg(R)及び439位はGlu(E)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
本発明の別の一態様して、抗体重鎖である第１のポリペプチドと抗体軽鎖である第３のポリペプチドで２量体を形成し、抗体重鎖である第２のポリペプチドと抗体軽鎖である第４のポリペプチドで２量体を形成している、第１、第２、第３および第４のポリペプチドを構成要素として含む二重特異性抗体であって、第1及び／又は第2のポリペプチドが以下に示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体を提供する。
具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（２）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体を提供する。
（１）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基である。
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基である。
好ましくは（１）はIgG4であり、（２）はIgG1である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（２）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体を提供する。
（１）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)である。
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)である。
好ましくは（１）はIgG4であり、（２）はIgG1である。
さらに具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体を提供する。
（１）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基である。
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基である。
（４）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失している。
（５）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失している。
（６）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体を提供する。
（１）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、229位がSer(S)である。
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)、226位がSer(S)、229位がSer(S)である。
（４）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、219位〜229位が欠失している。
（５）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失している。
（６）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
さらに具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体を提供する。
（１）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基である。
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び409位がArg(R)である。
（４）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失している。
（５）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、409位がArg(R)である。
（６）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、409位がArg(R)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体を提供する。
（１）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、229位がSer(S)である。
（２）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)である。
（３）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)、226位がSer(S)、229位がSer(S)及び409位がArg(R)である。
（４）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、219位〜229位が欠失している。
（５）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、409位がArg(R)である。
（６）第1及び第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、409位がArg(R)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
さらに具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び229位がCys(C)以外のアミノ酸残基であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び229位がCys(C)以外のアミノ酸残基であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)及び229位がCys(C)以外のアミノ酸残基であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)及び229位がCys(C)以外のアミノ酸残基であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び229位がCys(C)以外のアミノ酸残基であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び229位がCys(C)以外のアミノ酸残基であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失しており、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失しており、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
さらに具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び229位がCys(C)以外のアミノ酸残基であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び229位がCys(C)以外のアミノ酸残基であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)及び229位がCys(C)以外のアミノ酸残基であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)及び229位がCys(C)以外のアミノ酸残基であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び409位がArg(R)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び409位がArg(R)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失しており、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失しており、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、409位がArg(R)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、409位がArg(R)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、409位がArg(R)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、409位がArg(R)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)及び229位がSer(S)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)及び229位がSer(S)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、228位がPro(P)及び229位がSer(S)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、228位がPro(P)及び229位がSer(S)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)、226位がSer(S)及び229位がSer(S)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)、226位がSer(S)及び229位がSer(S)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、219位〜229位が欠失しており、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、219位〜229位が欠失しており、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)及び229位がSer(S)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)及び229位がSer(S)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、228位がPro(P)及び229位がSer(S)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、228位がPro(P)及び229位がSer(S)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)、226位がSer(S)、229位がSer(S)及び409位がArg(R)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)、226位がSer(S)、229位がSer(S)及び409位がArg(R)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、219位〜229位が欠失しており、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、219位〜229位が欠失しており、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、409位がArg(R)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、409位がArg(R)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、409位がArg(R)であり、かつ、356位がLys(K)、Arg（R）及びHis(H)のいずれかであり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、409位がArg(R)であり、かつ、439位はGlu(E)又はAsp(D)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
さらに具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び439位はGlu(E)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び439位はGlu(E)である。
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基又はTyr(Y)、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び439位はGlu(E)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失し、356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失し、439位はGlu(E)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、439位はGlu(E)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、439位はGlu(E)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
さらに具体的には、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び439位はGlu(E)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、228位がPro(P)、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基及び439位はGlu(E)である。
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、409位がArg(R)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がCys(C)以外のアミノ酸残基又はTyr(Y)、226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、409位がArg(R)及び439位はGlu(E)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失し、356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がCys(C)以外のアミノ酸残基、219位〜229位が欠失し、439位はGlu(E)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、409位がArg(R)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、409位がArg(R)及び439位はGlu(E)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がCys(C)以外のアミノ酸残基、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、409位がArg(R)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がCys(C)以外のアミノ酸残基、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、409位がArg(R)及び439位はGlu(E)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、229位がSer(S)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、229位がSer(S)及び439位はGlu(E)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び439位はGlu(E)である。
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)、226位がSer(S)、229位がSer(S)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)、226位がSer(S)、229位がSer(S)及び439位はGlu(E)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、219位〜229位が欠失し、356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、219位〜229位が欠失し、439位はGlu(E)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、439位はGlu(E)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、439位はGlu(E)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
また、第1及び第2のポリペプチドの重鎖定常領域が、それぞれ以下の（１）〜（６）のいずれかに示すアミノ酸残基を有する、第1及び第2のポリペプチドを含む二重特異性抗体を提供する。
（１）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、229位がSer(S)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、229位がSer(S)及び439位はGlu(E)である。
（２）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、226位がSer(S)、228位がPro(P)、229位がSer(S)及び439位はGlu(E)である。
（３）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)、226位がSer(S)、229位がSer(S)、409位がArg(R)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる220位がSer(S)又はTyr(Y)、226位がSer(S)、229位がSer(S)、409位がArg(R)及び439位はGlu(E)である。
（４）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、219位〜229位が欠失し、356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる131位がSer(S)、219位〜229位が欠失し、439位はGlu(E)である。
（５）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、409位がArg(R)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる219位〜229位が欠失し、409位がArg(R)及び439位はGlu(E)である。
（６）第1のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、409位がArg(R)及び356位がLys(K)であり、第２のポリペプチドはEUナンバリングによる226位がSer(S)、229位がSer(S)、220位〜225位がTyr(Y)-Gly(G)-Pro(P)-Pro(P)、409位がArg(R)及び439位はGlu(E)である。
好ましくは（１）、（２）及び（４）はIgG4であり、（３）、（５）及び（６）はIgG1である。
アミノ酸残基の電荷反発を利用した改変
本発明の製造方法では、第１及び第２のポリペプチドのホモ体の解離を促進し、1種以上の多量体を形成するポリペプチド間の会合を制御するために、ポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基を改変する段階をさらに加えてもよい。
また、本発明の第１の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第２の抗原結合活性を有するポリペプチドは、抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列あるいは抗体Fc領域のアミノ酸配列を含むことが出来る。抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列としては、ヒトIgGタイプの定常領域あるいはFc領域のアミノ酸配列が挙げられるがこれらに限定されない。IgGタイプの定常領域あるいはFc領域としては、天然型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4のアイソタイプのいずれであってもよい。あるいはこれらの改変体であってもよい。Fc領域のEUナンバリング４４７位のリジン及びEUナンバリング４４６位のグリシンが、これらをコードする核酸を組み換え遺伝子操作することによって、取り除かれてもよい。
また、本発明の第３の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第４の抗原結合活性を有するポリペプチドは、抗体軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含むことが出来る。抗体軽鎖定常領域のアミノ酸配列としては、ヒトkappa、ヒトlambdaタイプの定常領域のアミノ酸配列を挙げることが出来るが、これらに限定されない。あるいは、これらの改変体であってもよい。
また、本発明の抗原結合活性を有するポリペプチドは、抗体可変領域のアミノ酸配列（例えばCDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3、FR4のアミノ酸配列）を含むことが出来る。
好ましい態様にあっては、当該段階として、重鎖同士の会合を抑制するために、重鎖の定常領域の界面に電荷的な反発を導入する段階が挙げられる。重鎖定常領域の界面で接触するアミノ酸残基の組み合わせとしては、例えばCH3領域における356位と439位、357位と370位、399位と409位に相対する領域を挙げることができる。重鎖定常領域についてはEUナンバリングによって表示した。
実施例で示すように、当該段階を追加することにより、ポリペプチド間の重鎖の解離及び／又は会合を制御し、所望の異種多量体をより優先的に製造することができる。即ち、好ましい態様において、本発明は、2種以上の重鎖可変領域を含む抗体およびFc領域含有蛋白質（例えば、IgG型抗体、minibody(Alt M et al. FEBS Letters 199 9; 454: 90-94)、イムノアドへシン (非特許文献2)等)であって、第1の重鎖定常領域における以下の（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組から選択される1組ないし3組のアミノ酸残基が同種の電荷を有するポリペプチドを提供する。
(1) EUナンバリングによる356位および439位のアミノ酸残基
(2) EUナンバリングによる357位および370位のアミノ酸残基
(3) EUナンバリングによる399位および409位のアミノ酸残基
さらに、本発明は、上記第1の重鎖定常領域とは異なる第2の重鎖定常領域における前記（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組から選択される1組ないし3組のアミノ酸残基であって、前記第1の重鎖定常領域における前記（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組のうち同種の電荷を有する組と同じ位置のアミノ酸残基が、前記第1の重鎖定常領域におけるアミノ酸残基とは反対の電荷を有するポリペプチドを提供する。
上記ポリペプチドにおいて、「電荷を有するアミノ酸残基」は、例えば、以下の（a)または (b) のいずれかの群に含まれるアミノ酸残基から選択されることが好ましい。
(a)グルタミン酸（E)、アスパラギン酸（D)；
(b)リジン（K)、アルギニン（R)、ヒスチジン（H)。
上記ポリペプチドにおいて、「同種の電荷を有する」とは、例えば、2つ以上のアミノ酸残基のいずれもが、上記(a)または(b)のいずれか1の群に含まれるアミノ酸残基を有することを意味する。「反対の電荷を有する」とは、例えば、2つ以上のアミノ酸残基のなかの少なくとも1つのアミノ酸残基が上記(a)または(b)のいずれか1つの群に含まれるアミノ酸残基を有する場合に、残りのアミノ酸残基が異なる群に含まれるアミノ酸残基を有することを意味する。
好ましい態様において、上記ポリペプチドは、第1の重鎖CH3領域と第2の重鎖CH3領域がジスルフィド結合により架橋されていてもよい。
本発明における「会合界面制御改変」として、例えば、以下の改変が挙げられる：
(1) 第1の重鎖定常領域におけるEUナンバリングによる356位のAsp(D)の、Lys(K)、Arg(R)又はHis(H)への改変、及び第2の重鎖定常領域におけるEUナンバリングによる439位のLys(K)の、Glu(E)又はAsp(D)への改変；
(2) 第1の重鎖定常領域におけるEUナンバリングによる357位のGlu(E)の、Lys(K)、Arg(R)又はHis(H)への改変、及び第2の重鎖定常領域におけるEUナンバリングによる370位のLys(K)の、Glu(E)又はAsp(D)への改変；
(3) 第1の重鎖定常領域におけるEUナンバリングによる399位のAsp(D)の、Lys(K)、Arg(R)又はHis(H)への改変、及び第2の重鎖定常領域におけるEUナンバリングによる409位のLys(K)の、Glu(E)又はAsp(D)への改変。
本発明の非限定の一態様として、マウス異種多量体の製造方法では、第１及び第２のポリペプチドのホモ体の解離を促進し、1種以上の多量体を形成するポリペプチド間の会合を制御するために、ポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基を改変する段階をさらに加えてもよい。重鎖定常領域の界面で接触するアミノ酸残基の組み合わせとしては、例えばCH3領域における356位と439位、360位と371位、399位と409位に相対する領域を挙げることができる。重鎖定常領域についてはEUナンバリングによって表示した。
マウス由来のCH3領域におけるアミノ酸残基を改変する当該段階を追加することで、ポリペプチド間の重鎖の解離及び／又は会合を制御し、所望の異種多量体をより優先的に製造することができる。即ち、好ましい態様において、本発明は、2種以上の重鎖定常領域を含む抗体およびFc領域含有蛋白質（例えば、IgG型抗体、minibody(Alt M et al. FEBS Letters 199 9; 454: 90-94)、イムノアドへシン (非特許文献2)等)であって、第1の重鎖定常領域における以下の（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組から選択される1組ないし3組のアミノ酸残基が同種の電荷を有するポリペプチドを提供する。
(1) EUナンバリングによる356位および439位のアミノ酸残基
(2) EUナンバリングによる360位および371位のアミノ酸残基
(3) EUナンバリングによる399位および409位のアミノ酸残基
さらに、本発明は、上記第1の重鎖定常領域とは異なる第2の重鎖定常領域における前記（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組から選択される1組ないし3組のアミノ酸残基であって、前記第1の重鎖定常領域における前記（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組のうち同種の電荷を有する組と同じ位置のアミノ酸残基が、前記第1の重鎖定常領域におけるアミノ酸残基とは反対の電荷を有するポリペプチドを提供する。
上記ポリペプチドにおいて、「電荷を有するアミノ酸残基」は、例えば、以下の（a)または (b) のいずれかの群に含まれるアミノ酸残基から選択されることが好ましい。
(a)グルタミン酸（E)、アスパラギン酸（D)；
(b)リジン（K)、アルギニン（R)、ヒスチジン（H)。
上記ポリペプチドにおいて、「同種の電荷を有する」とは、例えば、2つ以上のアミノ酸残基のいずれもが、上記(a)または(b)のいずれか1の群に含まれるアミノ酸残基を有することを意味する。「反対の電荷を有する」とは、例えば、2つ以上のアミノ酸残基のなかの少なくとも1つのアミノ酸残基が上記(a)または(b)のいずれか1つの群に含まれるアミノ酸残基を有する場合に、残りのアミノ酸残基が異なる群に含まれるアミノ酸残基を有することを意味する。
好ましい態様において、上記ポリペプチドは、第1の重鎖CH3領域と第2の重鎖CH3領域がジスルフィド結合により架橋されていてもよい。
本発明における「会合界面制御改変」として、例えば、以下の改変が挙げられる：
(1) 第1の重鎖定常領域におけるEUナンバリングによる356位のAsp(D)の、Lys(K)、Arg(R)又はHis(H)への改変、及び第2の重鎖定常領域におけるEUナンバリングによる439位のLys(K)の、Glu(E)又はAsp(D)への改変；
(2) 第1の重鎖定常領域におけるEUナンバリングによる360位のGlu(E)の、Lys(K)、Arg(R)又はHis(H)への改変、及び第2の重鎖定常領域におけるEUナンバリングによる371位のLys(K)の、Glu(E)又はAsp(D)への改変；
(3) 第1の重鎖定常領域におけるEUナンバリングによる399位のAsp(D)の、Lys(K)、Arg(R)又はHis(H)への改変、及び第2の重鎖定常領域におけるEUナンバリングによる409位のLys(K)の、Glu(E)又はAsp(D)への改変
本発明において「改変」に供するアミノ酸残基としては、ポリペプチドの定常領域のアミノ酸残基に限られない。当業者であれば、ポリペプチド変異体または異種多量体について、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリング等により、界面を形成するアミノ酸残基を見出すことができ、会合を制御するように、該部位のアミノ酸残基を改変に供することが可能である。
本発明の方法におけるアミノ酸残基の「改変」とは、具体的には、元のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換すること、元のアミノ酸残基を欠失させること、新たなアミノ酸残基を付加すること等を指すが、好ましくは、元のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換することを指す。
重鎖CH3領域の安定性が不安定になるようなアミノ酸改変による異種多量体の製造方法
本発明の製造方法では、重鎖CH3領域の安定性が不安定になるように、重鎖定常領域にアミノ酸残基の変異を導入する段階をさらに加えてもよい。
本発明における「CH3領域の安定性が不安定」とは、Fc領域のアミノ酸残基に少なくとも1以上の改変を加えたポリペプチドのホモ体が、未改変のポリペプチドのホモ体に比べて、各ポリペプチド単体へ分離し易くなっている状態をいう。
本発明における「CH3領域の安定性が不安定」とは、好ましくは、pH 7.4における重鎖CH3領域の熱変性中間温度(Tm)が72.5℃以下、72.0℃以下、71.5℃以下、71.0℃以下、70.5℃以下になるように、CH3領域のアミノ酸残基に改変を導入した状態をいい、さらに好ましくは、70.4℃以下、70.3℃以下、70.2℃以下、70.1℃以下、70.0℃以下、69.9℃以下、69.8℃以下、69.7℃以下、69.6℃以下、69.5℃以下、69.0℃以下、68.5℃以下、68.0℃以下、67.5℃以下になるようにCH3領域のアミノ酸残基に改変を導入した状態をいう。
例えば、重鎖CH3領域のTmは、本明細書の参考例６に記載の方法で測定することができ、測定に使用する緩衝液等は適宜選択することが出来る。
重鎖CH3領域の安定性が不安定になるように、重鎖定常領域にアミノ酸残基の変異を導入する段階とは、重鎖CH3領域のEUナンバリング397位及び／又は392位にアミノ酸残基の変異を導入することを特徴とする段階である。当該段階は、任意で、上記電荷反発等を利用した界面制御に係るアミノ酸改変を導入する段階をさらに組み合わせてもよい。
本発明の非限定の一態様として、マウス由来の重鎖CH3領域の安定性が不安定になるように重鎖定常領域にアミノ酸残基の変異を導入する段階においても重鎖CH3領域のEUナンバリング397位及び／又は392位にアミノ酸残基の変異を導入することができる。当該段階は、任意で、上記電荷反発等を利用した界面制御に係るアミノ酸改変を導入する段階をさらに組み合わせてもよい。
397位に変異を導入するアミノ酸残基としては、側鎖が嵩高いアミノ酸又は側鎖分岐型のアミノ酸に改変することが好ましい。
392位に変異を導入するアミノ酸残基としては、負電荷を有するアミノ酸、側鎖が嵩高いアミノ酸又は側鎖分岐型のアミノ酸に改変することが好ましい。
本発明における「側鎖が嵩高いアミノ酸」として、Met(M), Phe(F)，Tyr(Y)，Val(V)，Leu(L)，Ile(I)，Trp(W), Arg(R), His(H), Glu(E), Lys(K), Gln(Q), Asp(D), Asn(N), Cys(C), Thr(T)などが挙げられ、好ましくはMet(M), Phe(F), Thr(T)及びTyr(Y)が挙げられる。
本発明における「側鎖分岐型のアミノ酸」として、Val(V)，Ile(I)，Leu(L)が挙げられ、好ましくはVal(V)及びIle(I)などが挙げられる。
本発明における「負電荷を有するアミノ酸」として、Asp(D)及びGlu(E)が挙げられる。
別の一態様において、重鎖CH3領域の安定性が不安定になるように重鎖定常領域にアミノ酸残基の変異を導入する段階において、例えば抗体重鎖定常領域がIgG1タイプの場合、EUナンバリングによる355位、356位、409位、419位及び445位の一つ以上が改変されていてもよく、例えば355位はGln(Q)に、356位はGlu(E)、409位はArg(R)、419位はGlu(E)、445位はLeu(L)に改変されていてもよい。
本発明における「異種多量体」として、好ましくは多重特異性抗体及びヘテロ融合タンパク質等を挙げることができる。
本発明の非限定の一態様としては、FcγRへの結合が増強される異種多量体のアミノ酸改変を提供することである。好ましいアミノ酸改変部位としては、EUナンバリング397位のアミノ酸の改変が挙げられるが，これに限定されることはない。397位に変異を導入するアミノ酸残基としては、側鎖が嵩高いアミノ酸又は側鎖分岐型のアミノ酸に改変することが好ましい。
本発明において、さらに好ましくは多重特異性抗体として、IgG type、scFv-IgG、Tandem scFv-Fc、DVD-Ig、Diabody-Fc、Single chain Diabody-Fc、IgG-scFv、sVD-IgG、Tandemab、scFv light chain C-terminal fusion、Tri-specific C-terminal fusion、Tri-specific N-terminal fusion、IgG-Fab等が挙げられる(Bispecific Antibodies, Roland E. Kontermann, 2011,WO2010034441, WO2010145792)。
本発明において、「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体変異体（キメラ抗体、ヒト化抗体、低分子化抗体（抗体断片も含む）、多重特異性抗体等）が含まれる。また、本発明において「抗体」は、ポリペプチドあるいは異種多量体のいずれであってもよい。好ましい抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び抗体断片等の低分子化抗体である。本発明においては、これら抗体の取得 (作製）の際に、好適に本発明の解離及び／又は会合制御方法を用いることができる。
本発明の方法に供される好ましいポリペプチドもしくは異種多量体としては、例えば、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有するポリペプチドもしくは異種多量体を挙げることができる。また、より好ましくは、本発明の好ましい態様として、本発明のポリペプチドもしくは異種多量体が2種以上の重鎖可変領域と2種以上の軽鎖可変領域を含む際の、当該ポリペプチドもしくは異種多量体の解離及び／又は会合制御方法を挙げることができる。
本発明の抗原結合活性を有するポリペプチドは、抗体重鎖のアミノ酸配列又は抗体軽鎖のアミノ酸配列を含むことが出来る。より具体的には、第１の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第２の抗原結合活性を有するポリペプチドは、抗体重鎖のアミノ酸配列を含むことが出来、第３の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第４の抗原結合活性を有するポリペプチドは、抗体軽鎖のアミノ酸配列を含むことが出来る。
また、目的のポリペプチド多量体が、第１のポリペプチドと第３のポリペプチドで２量体を形成し、第２のポリペプチドと第４のポリペプチドで2量体を形成し、さらにこれら2量体同士が多量体を形成するような4量体である場合には、本発明のポリペプチド多量体として、例えば、第１と第２の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体重鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、第３と第４の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体軽鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチドであるポリペプチド多量体を用いることもできる。
本発明においてさらに好ましくは、多重特異性抗体として二重特異性抗体を挙げることができる。
即ち、本発明の好ましい態様においては、本発明は、例えば、2種の重鎖（本発明におけるポリペプチド多量体の第１のポリペプチドと第２のポリペプチド）と、2種の軽鎖（本発明におけるポリペプチド多量体の第３のポリペプチドと第４のポリペプチド）から構成される二重特異性抗体について解離及び／又は会合を制御する方法に関する。
本発明の好ましい態様の「二重特異性抗体」についてさらに詳述すれば、上記「第１のポリペプチド及び第2のポリペプチド」とは、抗体を形成する2つの重鎖（H鎖）のうちの一方のH鎖（第１のH鎖）、及び当該H鎖とは異なるもう一方のH鎖（第２のH鎖）のことをいう。つまり、2つのH鎖のうち任意にどちらか一方を第１のH鎖とし、他方を第２のH鎖とすることができる。同様に、「第３のポリペプチド及び第４のポリペプチド」とは、二重特異性抗体を形成する2つの軽鎖（L鎖）のうちの一方のL鎖（第１のL鎖）、及び当該L鎖とは異なるもう一方のL鎖（第２のL鎖）のことを指し、2つのL鎖のうちどちらか一方を任意に第１のL鎖とし、他方を第２のL鎖とすることができる。通常、第１のL鎖と第１のH鎖は或る抗原(又はエピトープ)を認識する同一の抗体より由来し、第２のL鎖と第２のH鎖も或る抗原(又はエピトープ)を認識する同一の抗体より由来する。ここで、第１のH鎖・L鎖で形成されるL鎖-H鎖対を第１の対（又は第１のHL分子）、第２のH鎖・L鎖で形成されるL鎖-H鎖対を第２の対（又は第２のHL分子）と呼ぶ。第１の対と第２の対が認識する抗原は同じでもよいが、好ましくは異なるエピトープを認識する。この場合、第１の対及び第２の対のH鎖とL鎖は互いに異なるアミノ酸配列を有していることが好ましい。第１の対と第２の対が異なるエピトープを認識する場合、該第１の対と第２の対は全く異なる抗原を認識してもよいし、同一抗原上の異なる部位(異なるエピトープ)を認識してもよい（例えば、抗原がヘテロ受容体の場合には、多重特異性抗体はへテロ受容体を構成する異なるドメインを認識する、あるいは、抗原がモノマーの場合には、多重特異性抗体はモノマー抗原の複数箇所を認識する)。通常、このような分子は2個の抗原と結合するものであるが、それ以上の（例えば、3種類の)抗原に対して特異性を有していてもよい。又、一方がタンパク質、ペプチド、遺伝子、糖などの抗原を認識し、他方が放射性物質、化学療法剤、細胞由来トキシン等の細胞傷害性物質などを認識してもよい。しかしながら、特定のH鎖とL鎖の組合せで形成される対を有する抗体を作製したいと考えた場合には、その特定のH鎖とL鎖を第１の対及び第２の対として任意に決定することができる。
本発明における「融合タンパク質」は、２つ以上の同一の又は実質的に類似したタンパク質分子がＩｇヒンジ領域アミノ酸配列リンカーを介して接合したタンパク質を説明する。１種を超えるタンパク質を含有した融合タンパク質を説明する場合、「ヘテロ」の接頭語を用いる。例えば、「ヘテロ融合タンパク質」は、１以上の残部タンパク質と異なる１以上のタンパク質をともに接合した２つ以上のタンパク質を含有する。
本発明における「抗体」には、上述の抗体に対してさらにアミノ酸の置換、欠失、付加及び／若しくは挿入、またはキメラ化やヒト化等により、そのアミノ酸配列が改変されたものが含まれる。アミノ酸の置換、欠失、付加及び／又は挿入、並びにヒト化、キメラ化などのアミノ酸配列の改変は、当業者に公知の方法により行うことが可能である。同様に、本発明における抗体を組換え抗体として作製する際に利用する抗体の可変領域及び定常領域も、アミノ酸の置換、欠失、付加及び／若しくは挿入、またはキメラ化やヒト化等によりそのアミノ酸配列を改変してもよい。
本発明における抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ラクダ抗体など、どのような動物由来の抗体でもよい。さらに、例えば、キメラ抗体、中でもヒト化抗体などのアミノ酸配列を置換した改変抗体でもよい。また、各種分子を結合させた抗体修飾物、抗体断片、低分子化抗体などいかなる抗体でもよい。
「キメラ抗体」とは、異なる動物由来の配列を組合わせて作製される抗体である。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変（V）領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常（C）領域からなる抗体を例示することができる。キメラ抗体の作製は公知であり、例えば、抗体V領域をコードするDNAを、ヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることによりキメラ抗体を得ることができる。
「ヒト化抗体」とは、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される、ヒト以外の哺乳動物由来の抗体、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR;complementarity determining region）をヒト抗体のCDRへ移植したものである。CDRを同定するための方法は公知である（Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877）。また、その一般的な遺伝子組換え手法も公知である（欧州特許出願公開番号EP 125023号公報、WO 96/02576 号公報参照）。そこで公知の方法により、例えば、マウス抗体のCDRを決定し、該CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）とが連結された抗体をコードするDNAを取得し、ヒト化抗体を通常の発現ベクターを用いた系により産生することができる。このようなDNAは、CDR及びFR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCR法により合成することができる(WO98/13388号公報に記載の方法を参照)。CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、CDRが良好な抗原結合部位を形成するように選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるFRのアミノ酸を改変してもよい（Sato et al., Cancer Res. (1993) 53: 851-6）。改変できるFR中のアミノ酸残基には、抗原に直接、非共有結合により結合する部分（Amit et al., Science (1986) 233: 747-53）、CDR構造に影響または作用する部分（Chothia et al., J. Mol. Biol. (1987) 196: 901-17）及びVH-VL相互作用に関連する部分（EP239400号特許公報）が含まれる。
本発明における抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体である場合には、これらの抗体のC領域には、好ましくはヒト抗体由来のものが使用される。例えばH鎖では、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4を、L鎖ではCκ、Cλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を必要に応じ修飾してもよい。本発明におけるキメラ抗体は、好ましくはヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、好ましくはヒト以外の哺乳動物由来抗体のCDRと、ヒト抗体由来のFRおよびC領域とからなる。ヒト抗体由来の定常領域は、IgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、IgM、IgA、IgD及びIgE等のアイソタイプごとに固有のアミノ酸配列を有する。本発明におけるヒト化抗体に用いられる定常領域は、どのアイソタイプに属する抗体の定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトIgGの定常領域が用いられるが、これに限定されるものではない。また、ヒト化抗体に利用されるヒト抗体由来のFRも特に限定されず、どのアイソタイプに属する抗体のものであってもよい。
本発明におけるキメラ抗体及びヒト化抗体の可変領域及び定常領域は、元の抗体の結合特異性を示す限り、欠失、置換、挿入及び/または付加等により改変されていてもよい。
ヒト由来の配列を利用したキメラ抗体及びヒト化抗体は、ヒト体内における抗原性が低下しているため、治療目的などでヒトに投与する場合に有用と考えられる。
等電点改変技術等との組み合わせ
本発明のさらなる好ましい態様としては、ポリペプチドの等電点（pI値）を改変するアミノ酸変異を、本発明のポリペプチドに導入することによって、目的の第１〜第４のポリペプチドを有するポリペプチド多量体をより高純度に且つ効率的に精製あるいは製造することが可能である（WO2007114325、US20130171095）。ポリペプチドの会合を促進するために導入されるアミノ酸変異としては、Protein Eng. 1996 Jul;9(7):617-21.、Protein Eng Des Sel. 2010 Apr;23(4):195-202.、J Biol Chem. 2010 Jun 18;285(25):19637-46.、WO2009080254、US20130195849等に記載された、重鎖定常領域のCH3ドメインの改変により２種類の重鎖定常領域を含むポリペプチドをヘテロ会合化する方法、および、WO2009080251、WO2009080252、WO2009080253等に記載された、重鎖と軽鎖の特定の組み合わせの会合化を促進する方法等を用いることも可能である。
標的組織特異的抗原結合分子に関する技術との組み合わせ
本発明の非限定の実施態様としては、標的組織特異的に存在する分子の濃度依存的に抗原から解離・結合する抗体技術(WO2013/180200)との組み合わせが挙げられる。
他の定常領域及び／又は可変領域改変技術との組み合わせ
本発明の非限定の実施態様としては、FcγRへの結合増強を目的とした定常領域改変技術（WO2013047752）との組み合わせが挙げられる。
本発明と他の定常領域改変技術のその他の組み合わせの態様として、補体への結合を制御する技術との組み合わせが挙げられる。補体としては、補体カスケードを形成するポリペプチドであればいずれの補体成分も使用され得るが、好ましい補体としては、オプソニンの結合に関与するC1q、C1rまたはC1sの補体成分が好適に挙げられる。Fc領域の補体に対する結合活性が補体に対する天然型Fc領域の結合活性よりも高いFc領域は、天然型Fc領域のアミノ酸を改変することによって作製され得る。ここでいう天然型Fc領域とは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4で表されるFc領域を指す。Fc領域の補体に対する結合活性が、天然型Fc領域の補体に対する結合活性より高いか否かは、FACS、ELISA等の公知の免疫学的方法を用いて適宜実施され得る。Fc領域の「アミノ酸の改変」または「アミノ酸改変」とは、出発Fc領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列に改変することを含む。出発Fc領域の修飾改変体がpH中性域において補体に結合することができる限り、いずれのFc領域も出発ドメインとして使用され得る。また、既に改変が加えられたFc領域を出発Fc領域としてさらなる改変が加えられたFc領域も本発明のFc領域として好適に使用され得る。出発Fc領域とは、ポリペプチドそのもの、出発Fc領域を含む組成物、または出発Fc領域をコードするアミノ酸配列を意味し得る。出発Fc領域には、抗体の項で概説された組換えによって産生された公知のIgG抗体のFc領域が含まれ得る。出発Fc領域の起源は、限定されないが非ヒト動物の任意の生物またはヒトから取得され得る。好ましくは、任意の生物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ネコ、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、および非ヒト霊長類から選択される生物が好適に挙げられる。別の態様において、出発Fc領域はまた、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、チンパンジー、またはヒトから取得され得る。好ましくは、出発Fc領域は、ヒトIgG1から取得され得るが、IgGの特定のクラスに限定されるものでもない。このことは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域を出発Fc領域として適宜用いることができることを意味する。同様に、本明細書において、前記の任意の生物からのIgGの任意のクラスまたはサブクラスのFc領域を、好ましくは出発Fc領域として用いることができることを意味する。天然に存在するIgGのバリアントまたは操作された型の例は、公知の文献（Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 685-91、Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470、Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4), 195-202、WO2009086320、WO2008092117、WO2007041635、およびWO2006105338）に記載されるがそれらに限定されない。
アミノ酸の改変は、補体に対する結合活性を有する、もしくは補体結合に対する結合活性を高められるかぎり、いかなる位置のアミノ酸も改変され得る。抗原結合分子が、ヒトFc領域としてヒトIgG1のFc領域を含んでいる場合、補体に対する結合が、ヒトIgG1の出発Fc領域の結合活性より増強する効果をもたらす改変が含まれていることが好ましい。補体に対する結合活性を改変するためのアミノ酸としては、例えばDuncanら（Nature (1988) 332, 738-740）、Taoら（J. Exp. Med.(1993) 178, 661-667）、Brekkeら（Eur. J. Immunol. (1994) 24, 2542-2547）、Xuら（Immunol. (1993) 150, 152A）、WO1994029351、WO2000042072およびWO2011091078等において報告されているC1qに対する結合活性が改変されたFc領域のアミノ酸が例示される。
そのようなC1qに対する結合活性が増強される改変が可能なアミノ酸として、例えば、EUナンバリングで表される231位から238位、318位から337位から選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸が挙げられる。当該アミノ酸の非限定な一例として235位、237位、267位、268位、276位、318位、320位、322位、324位、327位、331位、および333位の群から選択される少なくともひとつ以上のアミノ酸が挙げられる。これらのアミノ酸の改変によって、IgG型免疫グロブリンのFc領域の補体に対する結合が増強される。
特に好ましい改変としては、例えば、Fc領域のEUナンバリングで表される；
267位のアミノ酸がGlu、
268位のアミノ酸がPheまたはTyrのいずれか、
276位のアミノ酸がArg、
324位のアミノ酸がThr、
327位のアミノ酸がGly、
331位のアミノ酸がPro、もしくは
333位のアミノ酸がAla、Asp、Gly、SerまたはValのいずれか、
が挙げられる。また、改変されるアミノ酸の数は特に限定されず、一箇所のみのアミノ酸が改変され得るし、これらが任意に組み合わせられた二箇所以上のアミノ酸が改変され得る
本発明と他の定常領域改変技術のその他の組み合わせの態様として、酸性pHでのFcRn結合増強改変Fc技術（WO2002060919、WO2004035752、WO2000042072）、中性pHでのFcRn結合増強改変Fc技術(WO2011122011、WO2012133782)、抑制型Fcγ受容体選択的結合増強技術（WO2012115241、WO2013125667）、活性型Fcγ受容体選択的結合増強技術（ADCC活性増強技術）（WO2013002362）、Rheumatoid factorへの結合活性を低下させる技術(WO2013046704) 等の抗体改変技術との組み合わせが挙げられる。
本発明と可変領域改変技術との非限定の組み合わせの態様としては、pH依存性抗体（WO2009125825）、カルシウム依存性抗体（WO2012073992）等の改変技術との組み合わせが挙げられる。
抗体ライブラリー、免疫及びハイブリドーマ作製
本発明の方法における変異導入前の抗体（本明細書においては、単に「本発明の抗体」と記載する場合あり）のH鎖又はL鎖をコードする遺伝子として既知の配列を用いることも可能であり、又、当業者に公知の方法で取得することもできる。例えば、抗体ライブラリーから取得することも可能であるし、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子をクローニングして取得することも可能である。
抗体ライブラリーについては既に多くの抗体ライブラリーが公知になっており、又、抗体ライブラリーの作製方法も公知であるので、当業者は適宜抗体ライブラリーを入手することが可能である。例えば、抗体ファージライブラリーについては、Clackson et al., Nature 1991, 352: 624-8、Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222: 581-97、Waterhouses et al., Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2265-6、Griffiths et al., EMBO J. 1994, 13: 3245-60、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14: 309-14、及び特表平20−504970号公報等の文献を参照することができる。その他、真核細胞をライブラリーとする方法(WO95/15393号パンフレット)やリボソーム提示法等の公知の方法を用いることが可能である。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を１本鎖抗体(scFv)としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を元に適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388を参考にすることができる。
ハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子を取得する方法は、基本的には公知技術を使用し、所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞(ハイブリドーマ)をスクリーニングし、得られたハイブリドーマのmRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域(V領域)のcDNAを合成し、これを所望の抗体定常領域(C領域)をコードするDNAと連結することにより得ることができる。
より具体的には、特に以下の例示に限定される訳ではないが、上記のH鎖及びL鎖をコードする抗体遺伝子を得るための感作抗原は、免疫原性を有する完全抗原と、免疫原性を示さないハプテン等を含む不完全抗原の両方を含む。例えば、目的タンパク質の全長タンパク質、又は部分ペプチドなどを用いることができる。その他、多糖類、核酸、脂質等から構成される物質が抗原となり得ることが知られており、本発明の抗体の抗原は特に限定されるものではない。抗原の調製は、当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、バキュロウィルスを用いた方法(例えば、WO98/46777など)などに準じて行うことができる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法(G. Kohler and C. Milstein, Methods Enzymol. 1981, 73: 3-46)等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。また、必要に応じ抗原を他の分子と結合させることにより可溶性抗原とすることもできる。受容体のような膜貫通分子を抗原として用いる場合、受容体の細胞外領域部分を断片として用いたり、膜貫通分子を細胞表面上に発現する細胞を免疫原として使用することも可能である。
抗体産生細胞は、上述の適当な感作抗原を用いて動物を免疫化することにより得ることができる。または、抗体を産生し得るリンパ球をin vitroで免疫化して抗体産生細胞とすることもできる。免疫化する動物としては、各種哺乳動物を使用できるが、ゲッ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が一般的に用いられる。マウス、ラット、ハムスター等のゲッ歯目、ウサギ等のウサギ目、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等のサル等の霊長目の動物を例示することができる。その他、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物も知られており、このような動物を使用することによりヒト抗体を得ることもできる(WO96/34096; Mendez et al., Nat. Genet. 1997, 15: 146-56参照)。このようなトランスジェニック動物の使用に代えて、例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させることにより、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる(特公平1-59878号公報参照)。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる(WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO96/34096、WO96/33735参照)。
動物の免疫化は、例えば、感作抗原をPhosphate-Buffered Saline(PBS)または生理食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じてアジュバントを混合して乳化した後、動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。その後、好ましくは、フロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を4〜21日毎に数回投与する。抗体の産生の確認は、動物の血清中の目的とする抗体力価を慣用の方法により測定することにより行われ得る。
ハイブリドーマは、所望の抗原で免疫化した動物またはリンパ球より得られた抗体産生細胞を、慣用の融合剤(例えば、ポリエチレングリコール)を使用してミエローマ細胞と融合して作製することができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, 59-103)。必要に応じハイブリドーマ細胞を培養・増殖し、免疫沈降、放射免疫分析(RIA)、酵素結合免疫吸着分析(ELISA)等の公知の分析法により該ハイブリドーマより産生される抗体の結合特異性を測定する。その後、必要に応じ、目的とする特異性、親和性または活性が測定された抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等の手法によりサブクローニングすることもできる。
続いて、選択された抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマまたは抗体産生細胞(感作リンパ球等)から、抗体に特異的に結合し得るプローブ(例えば、抗体定常領域をコードする配列に相補的なオリゴヌクレオチド等)を用いてクローニングすることができる。また、mRNAからRT-PCRによりクローニングすることも可能である。免疫グロブリンは、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMの5つの異なるクラスに分類される。さらに、これらのクラスは幾つかのサブクラス(アイソタイプ)(例えば、IgG-1、IgG-2、IgG-3、及びIgG-4;IgA-1及びIgA-2等)に分けられる。本発明において抗体の製造に使用するH鎖及びL鎖は、これらいずれのクラス及びサブクラスに属する抗体に由来するものであってもよく、特に限定されないが、IgGは特に好ましいものである。
ここで、H鎖及びL鎖をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法により改変することも可能である。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ハムスター抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体等の抗体について、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等を適宜作製することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体のH鎖、L鎖の可変領域とヒト抗体のH鎖、L鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成(reshaped)ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域(CDR; complementary determining region) を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる(EP239400; WO96/02576参照)。CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい(K. Sato et al., Cancer Res. 1993, 53: 851-856)。
上述のヒト化以外に、例えば、抗原との結合性等の抗体の生物学的特性を改善するために改変を行うことも考えられる。このような改変は、部位特異的突然変異(例えば、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488参照)、PCR変異、カセット変異等の方法により行うことができる。一般に、生物学的特性の改善された抗体変異体は70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上(例えば、95％以上、97％、98％、99％等)のアミノ酸配列相同性及び/または類似性を元となった抗体の可変領域のアミノ酸配列に対して有する。本明細書において、配列の相同性及び/または類似性は、配列相同性が最大の値を取るように必要に応じ配列を整列化、及びギャップ導入した後、元となった抗体残基と相同(同じ残基)または類似(一般的なアミノ酸の側鎖の特性に基づき同じグループに分類されるアミノ酸残基)するアミノ酸残基の割合として定義される。通常、天然のアミノ酸残基は、その側鎖の性質に基づいて(1)疎水性：アラニン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、メチオニン及びロイシン；(2)中性親水性：アスパラギン、グルタミン、システイン、スレオニン及びセリン；(3)酸性：アスパラギン酸及びグルタミン酸；(4)塩基性：アルギニン、ヒスチジン及びリシン；(5)鎖の配向に影響する残基：グリシンおよびプロリン；ならびに(6)芳香族性：チロシン、トリプトファン及びフェニルアラニンのグループに分類される。
通常、H鎖及びL鎖の可変領域中に存在する全部で6つの相補性決定領域(超可変部;CDR)が相互作用し、抗体の抗原結合部位を形成している。このうち1つの可変領域であっても全結合部位を含むものよりは低い親和性となるものの、抗原を認識し、結合する能力があることが知られている。従って、本発明のH鎖及びL鎖をコードする抗体遺伝子は、該遺伝子によりコードされるポリペプチドが所望の抗原との結合性を維持していればよく、H鎖及びL鎖の各々の抗原結合部位を含む断片部分をコードしていればよい。
ポリペプチドの活性及び抗原の例示
本発明の解離及び／又は会合制御方法を利用することにより、例えば、活性を有する抗体もしくはポリペプチドを効率的に作製することができる。該活性としては、例えば、結合活性、中和活性、細胞傷害活性、アゴニスト活性、アンタゴニスト活性、酵素活性等を挙げることができる。アゴニスト活性とは、受容体などの抗原に抗体が結合することにより、細胞内にシグナルが伝達される等して、何らかの生理的活性の変化を誘導する活性である。生理的活性としては、例えば、増殖活性、生存活性、分化活性、転写活性、膜輸送活性、結合活性、タンパク質分解活性、リン酸化／脱リン酸化活性、酸化還元活性、転移活性、核酸分解活性、脱水活性、細胞死誘導活性、アポトーシス誘導活性等を挙げることができるが、これらに限定されない。
また本発明の方法によって、所望の抗原を認識する、または所望の受容体と結合する抗体もしくはポリペプチドを効率的に作製することができる。
本明細書において抗原は特に限定されず、どのような抗原でもよい。抗原の例としては、例えば、リガンド（サイトカイン、ケモカインなど）、受容体、癌抗原、MHC抗原、分化抗原、免疫グロブリンおよび免疫グロブリンを一部に含む免疫複合体が好適に挙げられる。
サイトカインの例としては、インターロイキン１〜１８、コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ、Ｍ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦなど）、インターフェロン（ＩＦＮ-α、ＩＦＮ-β、ＩＦＮ-γ、など）、成長因子（ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ、ＨＧＦなど）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β）、リンホトキシン、エリスロポエチン、レプチン、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＭＣＡＦ、ＢＭＰを挙げることができる。
ケモカインの例としては、ＣＣＬ１〜ＣＣＬ２８などのＣＣケモカイン、ＣＸＣＬ１〜ＣＸＣＬ１７などのＣＸＣケモカイン、ＸＣＬ１〜ＸＣＬ２などのＣケモカイン、ＣＸ３ＣＬ１などのＣＸ３Ｃケモカインを挙げることができる。
受容体の例としては、例えば、造血因子受容体ファミリー、サイトカイン受容体ファミリー、チロシンキナーゼ型受容体ファミリー、セリン／スレオニンキナーゼ型受容体ファミリー、TNF受容体ファミリー、Gタンパク質共役型受容体ファミリー、GPIアンカー型受容体ファミリー、チロシンホスファターゼ型受容体ファミリー、接着因子ファミリー、ホルモン受容体ファミリー、等の受容体ファミリーに属する受容体などを挙げることができる。これら受容体ファミリーに属する受容体、及びその特徴に関しては、多数の文献、例えば、Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehesive Biochemistry Vol.18B "Hormones and their Actions Part II"pp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV.、Patthy（Cell (1990) 61 (1), 13-14）、Ullrichら（Cell (1990) 61 (2), 203-212）、Massague（eにはアキュート・アクセント記号が付く）（Cell (1992) 69 (6), 1067-1070）、Miyajimaら（Annu. Rev. Immunol. (1992) 10, 295-331）、Tagaら（FASEB J. (1992) 6, 3387-3396）、Fantlら（Annu. Rev. Biochem. (1993), 62, 453-481）、Smithら（Cell (1994) 76 (6) 959-962）、Flower DR.（Biochim. Biophys. Acta (1999) 1422 (3) 207-234）等に記載されている。
上記受容体ファミリーに属する具体的な受容体としては、例えば、ヒト又はマウスエリスロポエチン（EPO）受容体（Blood (1990) 76 (1), 31-35、Cell (1989) 57 (2), 277-285）、ヒト又はマウス顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）受容体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1990) 87 (22), 8702-8706、mG-CSFR、Cell (1990) 61 (2), 341-350）、ヒト又はマウストロンボポイエチン（TPO）受容体（Proc Natl Acad Sci U S A. (1992) 89 (12), 5640-5644、EMBO J. (1993) 12(7), 2645-53）、ヒト又はマウスインスリン受容体（Nature (1985) 313 (6005), 756-761）、ヒト又はマウスFlt-3リガンド受容体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1994) 91 (2), 459-463）、ヒト又はマウス血小板由来増殖因子（PDGF）受容体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85 (10) 3435-3439）、ヒト又はマウスインターフェロン（IFN）-α、β受容体（Cell (1990) 60 (2), 225-234.及びCell (1994) 77 (3), 391-400）、ヒト又はマウスレプチン受容体、ヒト又はマウス成長ホルモン（GH）受容体、ヒト又はマウスインターロイキン（IL）-10受容体、ヒト又はマウスインスリン様増殖因子（IGF）-I受容体、ヒト又はマウス白血病抑制因子（LIF）受容体、ヒト又はマウス毛様体神経栄養因子（CNTF）受容体等が好適に例示される。
癌抗原は細胞の悪性化に伴って発現する抗原であり、腫瘍特異性抗原とも呼ばれる。又、細胞が癌化した際に細胞表面やタンパク質分子上に現れる異常な糖鎖も癌抗原であり、癌糖鎖抗原とも呼ばれる。癌抗原の例としては、例えば、上記の受容体としてGPIアンカー型受容体ファミリーに属するが肝癌を初めとする幾つかの癌において発現しているGPC3（Int J Cancer. (2003) 103 (4), 455-65）、肺癌を初めとする複数の癌で発現するEpCAM（Proc Natl Acad Sci U S A. (1989) 86 (1), 27-31）、CA19-9、CA15-3、シリアルSSEA-1（SLX）等が好適に挙げられる。
MHC抗原は、主にMHC class I抗原とMHC class II抗原に分類され、MHC class I抗原には、HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G、-Hが含まれ、MHC class II抗原には、HLA-DR、-DQ、-DPが含まれる。
分化抗原には、CD1、CD2、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD71、CD73、CD95、CD102、CD106、CD122、CD126、CDw130が含まれ得る。
免疫グロブリンにはIgA、IgM、IgD、IgG、IgEが含まれる。また免疫複合体は少なくとも免疫グロブリンのいずれかの成分を含む。
その他の抗原としては下記のような分子；17-IA、4-1BB、4Dc、6-ケト-PGF1a、8-イソ-PGF2a、8-オキソ-dG、A1 アデノシン受容体、A33、ACE、ACE-2、アクチビン、アクチビンA、アクチビンAB、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンRIA、アクチビンRIA ALK-2、アクチビンRIB ALK-4、アクチビンRIIA、アクチビンRIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、アドレシン、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、アルファ-1-アンチトリプシン、アルファ−V/ベータ-1アンタゴニスト、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、アルテミン、抗Id、ASPARTIC、心房性ナトリウム利尿因子、av/b3インテグリン、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-リンパ球刺激因子（BlyS）、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2 BMP-2a、BMP-3（オステオゲニン（Osteogenin））、BMP-4 BMP-2b、BMP-5、BMP-6 Vgr-1、BMP-7（OP-1）、BMP-8（BMP-8a、OP-2）、BMPR、BMPR-IA（ALK-3）、BMPR-IB（ALK-6）、BRK-2、RPK-1、BMPR-II（BRK-3）、BMP、b-NGF、BOK、ボンベシン、骨由来神経栄養因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、補体因子3（C3）、C3a、C4、C10、CA125、CAD-8、カルシトニン、cAMP、癌胎児性抗原（CEA）、癌関連抗原、カテプシンA、カテプシンB、カテプシンC/DPPI、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンH、カテプシンL、カテプシンO、カテプシンS、カテプシンV、カテプシンX/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33（p67タンパク質）、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80（B7-1）、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、ボツリヌス菌毒素、ウェルシュ菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、サイトケラチン腫瘍関連抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、補体制御因子（Decay accelerating factor）、des（1-3）-IGF-I（脳IGF-1）、Dhh、ジゴキシン、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR（ErbB-1）、EMA、EMMPRIN、ENA、エンドセリン受容体、エンケファリナーゼ、eNOS、Eot、エオタキシン1、EpCAM、エフリンB2/EphB4、EPO、ERCC、E-セレクチン、ET-1、ファクターIIa、ファクターVII、ファクターVIIIc、ファクターIX、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、Fas、FcR1、FEN-1、フェリチン、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、フィブリン、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、卵胞刺激ホルモン、フラクタルカイン、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3（Vgr-2）、GDF-5（BMP-14、CDMP-1）、GDF-6（BMP-13、CDMP-2）、GDF-7（BMP-12、CDMP-3）、GDF-8（ミオスタチン）、GDF-9、GDF-15（MIC-1）、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-アルファ1、GFR-アルファ2、GFR-アルファ3、GITR、グルカゴン、Glut4、糖タンパク質IIb/IIIa（GPIIb/IIIa）、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、成長ホルモン放出因子、ハプテン（NP-capまたはNIP-cap）、HB-EGF、HCC、HCMV gBエンベロープ糖タンパク質、HCMV gHエンベロープ糖タンパク質、HCMV UL、造血成長因子（HGF）、Hep B gp120、ヘパラナーゼ、Her2、Her2/neu（ErbB-2）、Her3（ErbB-3）、Her4（ErbB-4）、単純ヘルペスウイルス（HSV） gB糖タンパク質、HSV gD糖タンパク質、HGFA、高分子量黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、HIV gp120、HIV IIIB gp 120 V3ループ、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、ヒト心臓ミオシン、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）、ヒト成長ホルモン（HGH）、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受容体、IgE、IGF、IGF結合タンパク質、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、インターフェロン（INF）-アルファ、INF-ベータ、INF-ガンマ、インヒビン、iNOS、インスリンA鎖、インスリンB鎖、インスリン様増殖因子1、インテグリンアルファ2、インテグリンアルファ3、インテグリンアルファ4、インテグリンアルファ4/ベータ1、インテグリンアルファ4/ベータ7、インテグリンアルファ5（アルファV）、インテグリンアルファ5/ベータ1、インテグリンアルファ5/ベータ3、インテグリンアルファ6、インテグリンベータ1、インテグリンベータ2、インターフェロンガンマ、IP-10、I-TAC、JE、カリクレイン2、カリクレイン5、カリクレイン6、カリクレイン11、カリクレイン12、カリクレイン14、カリクレイン15、カリクレインL1、カリクレインL2、カリクレインL3、カリクレインL4、KC、KDR、ケラチノサイト増殖因子（KGF）、ラミニン5、LAMP、LAP、LAP（TGF-1）、潜在的TGF-1、潜在的TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、レフティ、ルイス−Y抗原、ルイス−Y関連抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、リポタンパク質、LIX、LKN、Lptn、L-セレクチン、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、黄体形成ホルモン、リンホトキシンベータ受容体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、メタロプロテアーゼ、MGDF受容体、MGMT、MHC（HLA-DR）、MIF、MIG、MIP、MIP-1-アルファ、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、ムチン（Muc1）、MUC18、ミュラー管抑制物質、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-Cアドヘリン、NCA 90、NCAM、NCAM、ネプリライシン、ニューロトロフィン-3、-4、または-6、ニュールツリン、神経成長因子（NGF）、NGFR、NGF−ベータ、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、副甲状腺ホルモン、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-カドヘリン、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤性アルカリホスファターゼ（PLAP）、PlGF、PLP、PP14、プロインスリン、プロレラキシン、プロテインC、PS、PSA、PSCA、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、レラキシンA鎖、レラキシンB鎖、レニン、呼吸器多核体ウイルス（RSV）F、RSV Fgp、Ret、リウマイド因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清アルブミン、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72（腫瘍関連糖タンパク質−72）、TARC、TCA-3、T細胞受容体（例えば、T細胞受容体アルファ/ベータ）、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP様アルカリホスファターゼ、TfR、TGF、TGF-アルファ、TGF-ベータ、TGF-ベータ Pan Specific、TGF-ベータRI（ALK-5）、TGF-ベータRII、TGF-ベータRIIb、TGF-ベータRIII、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータ3、TGF-ベータ4、TGF-ベータ5、トロンビン、胸腺Ck-1、甲状腺刺激ホルモン、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-アルファ、TNF-アルファベータ、TNF-ベータ2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A（TRAIL R1 Apo-2、DR4）、TNFRSF10B（TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B）、TNFRSF10C（TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID）、TNFRSF10D（TRAIL R4 DcR2、TRUNDD）、TNFRSF11A（RANK ODF R、TRANCE R）、TNFRSF11B（OPG OCIF、TR1）、TNFRSF12（TWEAK R FN14）、TNFRSF13B（TACI）、TNFRSF13C（BAFF R）、TNFRSF14（HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2）、TNFRSF16（NGFR p75NTR）、TNFRSF17（BCMA）、TNFRSF18（GITR AITR）、TNFRSF19（TROY TAJ、TRADE）、TNFRSF19L（RELT）、TNFRSF1A（TNF RI CD120a、p55-60）、TNFRSF1B（TNF RII CD120b、p75-80）、TNFRSF26（TNFRH3）、TNFRSF3（LTbR TNF RIII、TNFC R）、TNFRSF4（OX40 ACT35、TXGP1 R）、TNFRSF5（CD40 p50）、TNFRSF6（Fas Apo-1、APT1、CD95）、TNFRSF6B（DcR3 M68、TR6）、TNFRSF7（CD27）、TNFRSF8（CD30）、TNFRSF9（4-1BB CD137、ILA）、TNFRSF21（DR6）、TNFRSF22（DcTRAIL R2 TNFRH2）、TNFRST23（DcTRAIL R1 TNFRH1）、TNFRSF25（DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1）、TNFSF10（TRAIL Apo-2リガンド、TL2）、TNFSF11（TRANCE/RANKリガンド ODF、OPGリガンド）、TNFSF12（TWEAK Apo-3リガンド、DR3リガンド）、TNFSF13（APRIL TALL2）、TNFSF13B（BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20）、TNFSF14（LIGHT HVEMリガンド、LTg）、TNFSF15（TL1A/VEGI）、TNFSF18（GITRリガンド AITRリガンド、TL6）、TNFSF1A（TNF-a コネクチン（Conectin）、DIF、TNFSF2）、TNFSF1B（TNF-b LTa、TNFSF1）、TNFSF3（LTb TNFC、p33）、TNFSF4（OX40リガンド gp34、TXGP1）、TNFSF5（CD40リガンド CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP）、TNFSF6（Fasリガンド Apo-1リガンド、APT1リガンド）、TNFSF7（CD27リガンド CD70）、TNFSF8（CD30リガンド CD153）、TNFSF9（4-1BBリガンド CD137リガンド）、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、トランスフェリン受容体、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、腫瘍関連抗原CA125、腫瘍関連抗原発現ルイスY関連炭水化物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、ウロキナーゼ、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-カドヘリン、VE-カドヘリン-2、VEFGR-1（flt-1）、VEGF、VEGFR、VEGFR-3（flt-4）、VEGI、VIM、ウイルス抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNRインテグリン、フォン・ヴィレブランド因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B／13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81、CD97、CD98、DDR1、DKK1、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、酸化LDL、PCSK9、プレカリクレイン、RON、TMEM16F、SOD1、クロモグラニン A、クロモグラニン B、tau、VAP1、高分子キニノーゲン、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、ファクター B、ファクター D、ファクター H、プロペルジン、スクレロスチン、フィブリノゲン、フィブリン、プロトロンビン、トロンビン、組織因子、ファクター V、ファクター Va、ファクター VII、ファクター VIIa、ファクター VIII、ファクター VIIIa、ファクター IX、ファクター IXa、ファクター X、ファクター Xa、ファクター XI、ファクター XIa、ファクター XII、ファクター XIIa、ファクター XIII、ファクター XIIIa、TFPI、アンチトロンビン III、EPCR、トロンボモデュリン、TAPI、tPA、プラスミノゲン、プラスミン、PAI-1、PAI-2、GPC3、シンデカン-1、シンデカン-2、シンデカン-3、シンデカン-4、LPA、S1Pならびにホルモンおよび成長因子のための受容体が例示され得る。
さらに、本発明における非限定の一実施態様では、二重特異性抗体の１つの特異性は癌抗原を標的とし、他方の特異性はCTL（Cytotoxic T lymphocyte）に発現する抗原、例えばCD3やTNFRSF(Tumor Necrosis Factor Receptor Super Family)を標的とすることが出来るが、この組み合わせに限られるわけではない。TNFRSFの例としては、TNFRSF9 (CD137)、TNFRSF5 (CD40)およびTNFRSF4 (OX40)等が挙げられる。
核酸の改変
また、本発明の製造方法の別の態様においては、本発明は、ポリペプチド間の解離及び／又は会合が制御されるように、コアヒンジ領域外のシステインを介してジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にするアミノ酸残基の改変（例えば、EUナンバリングによる131位、220位、349位、356位、394位、351位、354位、及び407位のアミノ酸残基における改変）を有する異種多量体の製造方法であって、（ａ）ポリペプチド間の解離及び会合が制御されるように、コアヒンジ領域外のシステインを介してジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にするアミノ酸残基をコードする核酸を元の核酸から改変する段階、（ｂ）当該ポリペプチドを発現するように、当該核酸を有する宿主細胞を培養する段階、（ｃ）当該宿主細胞の培養物から当該ポリペプチドを回収する段階、及び（ｄ）還元条件下、各ポリペプチドをインキュベートし、所望のポリペプチドのヘテロ体を回収する段階を含む、異種多量体の製造方法を提供する。
本発明の上記方法において「核酸を改変する」とは、本発明における「改変」によって導入されるアミノ酸残基に対応するように核酸を改変することを言う。より具体的には、元（改変前）のアミノ酸残基をコードする核酸について、改変によって導入されるアミノ酸残基をコードする核酸へ改変することを言う。通常、目的のアミノ酸残基をコードするコドンとなるように、元の核酸に対して、少なくとも1塩基を挿入、欠失または置換するような遺伝子操作もしくは変異処理を行うことを意味する。即ち、元のアミノ酸残基をコードするコドンは、改変によって導入されるアミノ酸残基をコードするコドンによって置換される。このような核酸の改変は、当業者においては公知の技術、例えば、部位特異的変異誘発法、PCR変異導入法等を用いて、適宜実施することが可能である。
また、本発明における核酸は、通常、適当なベクターへ担持（挿入）され、宿主細胞へ導入される。該ベクターとしては、挿入した核酸を安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター(Stratagene社製）などが好ましいが、市販の種々のベクターを利用することができる。本発明のポリペプチドを生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であればpETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であればpME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864）、生物個体であればpME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)）などが好ましい。ベクターへの本発明のDNAの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 11.4-11.11）。
上記宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。ポリペプチドを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラS2、スポドプテラSF9）、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクタミン法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。
宿主細胞において発現したポリペプチドを小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であっても、異種シグナルであってもよい。
上記製造方法におけるポリペプチドの回収は、本発明のポリペプチドが培地に分泌される場合は、培地を回収する。本発明のポリペプチドが細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する。
組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。
本発明の非限定の実施態様として、それぞれ第一及び第ニのポリペプチドのホモ体を産生する各細胞株を培養し、当該培養上清を精製後に精製抗体を使ってFAE(Fab Arm Exchange)反応を起こす方法；それぞれ第一及び第ニのポリペプチドのホモ体を産生する各細胞株を培養し、当該培養上清を精製せずに混合し、混合培養上清中でFAE反応を起こし、その後精製する方法；第一のポリペプチドのホモ体を産生する細胞株と第二のポリペプチドのホモ体を産生する細胞株を混ぜて培養し、当該培養上清を精製後に精製抗体を使ってFAE反応を起こす方法；第一のポリペプチドのホモ体を産生する細胞株と第二のポリペプチドのホモ体を産生する細胞株を混ぜて培養し、当該培養上清中でFAE反応を起こし、その後精製する方法が挙げられる。
本発明は、非限定の実施態様として、以下のa)〜c)の段階；
a) それぞれ第一及び第二のポリペプチドのホモ体を産生する細胞株を培養する段階、
b) 各細胞株の培養上清を混合し、コアヒンジ領域外において重鎖間もしくは軽鎖間でジスルフィド結合を形成するシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすように、該第1のポリペプチドのホモ体および該第2のポリペプチドのホモ体を共にインキュベートする段階、ならびに
c) 第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を得る段階
を含む、異種多量体の製造方法を提供する。
本発明は、非限定の実施態様として、以下のa)〜c)の段階；
a) それぞれ第一及び第二のポリペプチドのホモ体を産生する細胞株を培養する段階、
b) 各細胞株の培養上清を混合し、コアヒンジ領域外のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすように、該第1のポリペプチドのホモ体および該第2のポリペプチドのホモ体を共にインキュベートする段階、ならびに
c) 第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を得る段階
を含む、異種多量体の製造方法を提供する。
所望の異種多量体を選択する方法（異種多量体のスクリーニング方法）
さらに本発明は、所望の異種多量体を選択する（スクリーニングする）方法を提供する。好ましい態様としては、当該方法は、以下の段階を含む、所望の特性（活性）を有する異種多量体を選択する方法である：
a) 第１のポリペプチドの組及び第２のポリペプチドの組を提供する段階であって、第１の組を構成する各ポリペプチドが第２の組を構成する各ポリペプチドとは異なる標的特異性を有し、かつ第１及び第２の組を構成する各ポリペプチドが、コアヒンジ領域外において重鎖間もしくは軽鎖間でジスルフィド結合を形成するシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にするアミノ酸改変を含む、段階、
b) 還元条件下で、該第１の組を構成する各ポリペプチドを該第２の組を構成する各ポリペプチドと共にインキュベートし、それによって複数種の異種多量体の混合物を作製する段階、
c) 結果として得られた複数種の異種多量体の混合物を所与の所望の特性（活性）についてアッセイする段階、および
d) 所望の特性（活性）を有する異種多量体を選択する段階。
また、本発明は、本発明の異種多量体の製造方法の後にさらに
- 異種多量体の活性を測定する段階、および
- 所望の活性を有する異種多量体を選択する段階
を行う、異種多量体をスクリーニングする方法を提供する。
すなわち、当該スクリーニング方法は、以下の段階を含む。
a) 第1の抗原結合活性を有し、重鎖定常領域を含む第1のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
b) 該第1の抗原結合活性とは異なる第2の抗原結合活性を有し、重鎖定常領域を含む第2のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
c) コアヒンジ領域外のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にする還元条件下で、該第1のポリペプチドのホモ体および該第2のポリペプチドのホモ体を共にインキュベートする段階、ならびに
d) 第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を得る段階、
e) 段階d)で得た異種多量体の活性を測定する段階、
f) 所望の活性を有する異種多量体を選択する段階。
本発明の方法において、所望の特性（活性）は、特に限定されるものではないが、例えば、結合活性、中和活性、細胞傷害活性、アゴニスト活性、アンタゴニスト活性、酵素活性等を挙げることができる。アゴニスト活性とは、受容体などの抗原に抗体が結合することにより、細胞内にシグナルが伝達される等して、何らかの生理的活性の変化を誘導する活性である。生理的活性としては、例えば、増殖活性、生存活性、分化活性、転写活性、膜輸送活性、結合活性、タンパク質分解活性、リン酸化／脱リン酸化活性、酸化還元活性、転移活性、核酸分解活性、脱水活性、細胞死誘導活性、アポトーシス誘導活性等を挙げることができるが、これらに限定されない。
さらに本発明は、本発明のスクリーニング方法の後にさらに
- 選択した異種多量体の第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、第３のポリペプチド及び第４のポリペプチドの所望の領域（例えば、CDR、可変領域、定常領域等）を取得する段階、ならびに
- 取得した領域を別の異種多量体に移植する段階
を行う、異種多量体を製造する方法を提供する。
すなわち、当該製造方法は、以下の段階を含む。
a) 第1の抗原結合活性を有し、重鎖定常領域を含む第1のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
b) 該第1の抗原結合活性とは異なる第2の抗原結合活性を有し、重鎖定常領域を含む第2のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
c) コアヒンジ領域外のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にする還元条件下で、該第1のポリペプチドのホモ体および該第2のポリペプチドのホモ体を共にインキュベートする段階、ならびに
d) 第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を得る段階、
e) 段階d)で得た異種多量体の活性を測定する段階、
f) 所望の活性を有する異種多量体を選択する段階
g) 段階f)で選択した異種多量体の第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、第３のポリペプチド及び第４のポリペプチドの所望の領域（例えば、CDR、可変領域、定常領域等）を取得する段階、
h) 取得した領域を別の異種多量体に移植する段階。
医薬組成物
また本発明は、本発明の異種多量体、および医薬的に許容される担体を含む組成物（薬剤）に関する。
本発明において医薬組成物とは、通常、疾患の治療もしくは予防、あるいは検査・診断のための薬剤を言う。
本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるように設定する。
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム）を含む等張液が挙げられる。適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80（TM）、HCO-50等）を併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル及び／またはベンジルアルコールを併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液及び酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン）、安定剤（例えば、ベンジルアルコール及びフェノール）、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填する。
本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の組成物とすることができる。例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。抗体または抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量は、例えば、１回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲に設定することが可能である。または、例えば、患者あたり0.001〜100000mgの投与量とすることもできるが、本発明はこれらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量及び投与方法は、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投与量及び投与方法を設定することが可能である。
本発明においては、上記本発明の異種多量体は、癌に対する治療剤又は予防剤の有効成分として有用である。癌は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌を含む）、大腸癌、直腸癌、結腸癌、乳癌、肝癌、胃癌、膵癌、腎癌、前立腺癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆管癌、腹膜癌、中皮腫、扁平上皮癌、子宮頸癌、子宮体癌、膀胱癌、食道癌、頭頚部癌、鼻咽頭癌、唾液腺腫瘍、胸腺腫、皮膚癌、基底細胞腫、悪性黒色腫、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、ウィルムス腫瘍、急性骨髄性白血病（急性骨髄球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病および急性単球性白血病を含む）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、毛様細胞白血病形質細胞腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫および成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫）、ランゲルハンス細胞組織球症、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、脳腫瘍（神経膠腫、星細胞腫、グリア芽細胞腫、髄膜腫および上衣腫を含む）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、骨肉腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫。
また、必要に応じ本発明のポリペプチドもしくは異種多量体を、その他の医薬成分と組み合わせて製剤化することもできる。
また本発明は、本発明の異種多量体、本発明の製造方法により製造された異種多量体、または本発明の医薬組成物を投与する段階を含む、免疫・炎症性疾患等の疾患（例えば癌）を治療または予防する方法に関する。また本発明は、少なくとも本発明の異種多量体、本発明の製造方法により製造された異種多量体、または本発明の医薬組成物を含む、本発明の治療方法または予防方法に用いるためのキットを提供する。該キットには、その他、薬学的に許容される担体、媒体、使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。また本発明は、本発明の異種多量体または本発明の製造方法により製造された異種多量体の、医薬（例えば、免疫・炎症性疾患の治療剤または予防剤）の製造における使用に関する。また本発明は、本発明の治療方法または予防方法に使用するための、本発明の異種多量体または本発明の製造方法により製造された異種多量体に関する。
なお、本明細書で用いられているアミノ酸の3文字表記と1文字表記の対応は以下の通りである。
アラニン：Ala：A
アルギニン：Arg：R
アスパラギン：Asn：N
アスパラギン酸：Asp：D
システイン：Cys：C
グルタミン：Gln：Q
グルタミン酸：Glu：E
グリシン：Gly：G
ヒスチジン：His：H
イソロイシン：Ile：I
ロイシン：Leu：L
リジン：Lys：K
メチオニン：Met：M
フェニルアラニン：Phe：F
プロリン：Pro：P
セリン：Ser：S
スレオニン：Thr：T
トリプトファン：Trp：W
チロシン：Tyr：Y
バリン：Val：V
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
〔実施例１〕抗体の会合界面制御改変の導入によるFab Arm Exchange効率の向上検討
Fab Arm Exchangeでは、２種類のホモ抗体を還元剤存在下で混合し、生じた4本の抗体分子片腕（半分子またはHL分子と称する、一本の重鎖および一本の軽鎖からなる分子）が再結合することによって、Bispecific抗体（二重特異性抗体）が生じる。HL分子の再結合はランダムに起こるため、目的のBispecific抗体は理論上、系中に存在する全抗体量の50%しか得られない。しかしながら、２種類のホモ抗体にあらかじめ異なる電荷を導入しておくことで、生じたHL分子同士が再結合する際にホモ２量化よりもヘテロ２量化がより優先的に起こり、高効率にBispecific抗体を作製できる可能性がある。そこでWO2006/106905で報告されている抗体のCH3領域における会合界面を制御する改変（2種類のH鎖をCH3領域の電荷的相互作用および反発を利用してヘテロ会合化させる改変）を用いることで、Fab Arm Exchangeの反応効率（Bispecific抗体生成率）が向上するかどうかを検証した。
抗体重鎖可変領域には、WO2009/125825に開示されているヒトインターロイキン6レセプターに対する抗体の重鎖可変領域であるWT(H)(配列番号１：以後MRAHと記載)およびH54(配列番号２)を用いた。これらの重鎖可変領域に対し、抗体重鎖定常領域としてヒトIgG1の重鎖定常領域のC末端のGlyおよびLysを除去したG1dを有するMRAH-G1d（配列番号３）およびH54-G1d(配列番号４)、ならびにヒトIgG4の重鎖定常領域のC末端のGlyおよびLysを除去したwtG4dを有するMRAH-wtG4d（配列番号５）およびH54-wtG4d（配列番号６）を作製した。次に、MRAH-G1dとH54-G1dに対し、IgG4型のヒンジ配列、CH3ドメイン配列となるよう、P228SおよびK409Rの改変を導入したMRAH-G1dsr（配列番号７）、H54-G1dsr（配列番号８）を作製した。さらに会合界面制御改変として、MRAH-G1dsrにD356Kを導入したMRAH-G1dsrP1（配列番号９）、H54-G1dsrにK439Eを導入したH54-G1dsrN1（配列番号１０）、MRAH-wtG4dにE356Kを導入したMRAH-wtG4dP1(配列番号１１)、H54-wtG4dにK439Eを導入したH54-wtG4dN1(配列番号１２)を作製した。重鎖可変領域がMRAHの場合はMRAL-k0（配列番号１３）を、H54の場合はL28-k0（配列番号１４）を抗体L鎖として用いた。参考例１の方法に従ってMRAH-G1dsr/MRAL-k0、H54-G1dsr/L28-k0、MRAH-G1dsrP1/MRAL-k0、H54-G1dsrN1/L28-k0、MRAH-wtG4d/MRAL-k0、H54-wtG4d/L28-k0、MRAH-wtG4dP1/MRAL-k0、H54-wtG4dN1/L28-k0を発現、精製した。
次に、得られたホモ体2種類を以下に示す組み合わせ、反応条件下で混合し、反応産物を参考例２の方法に従って評価した。
(1) MRAH-wtG4d/MRAL-k0とH54-wtG4d/L28-k0
(2) MRAH-wtG4dP1/MRAL-k0とH54-wtG4dN1/L28-k0
(3) MRAH-G1dsr/MRAL-k0とH54-G1dsr/L28-k0
(4) MRAH-G1dsrP1/MRAL-k0とH54-G1dsrN1/L28-k0
反応条件： PBS(Sigma, pH7.4)中、[各mAb] = 0.2 mg/ml、[GSH(Sigma)] = 0.5 mM、0.05% Tween 20 (Junsei)、37℃、24時間。
本検討で用いた二種類の抗体可変領域MRAH/MRALとH54/L28は、pIが大きく異なるため、イオン交換クロマトグラフィーによりそれぞれのホモ体、および生成したBispecific抗体に対応するピークが容易に分離され、Fab Arm Exchangeの反応効率を評価することができる。図１はイオン交換クロマトグラフィーにより反応産物を評価した結果である。会合界面制御改変を導入しないMRAH-wtG4d/MRAL-k0とH54-wtG4d/L28-k0を反応させたwtG4d、あるいはMRAH-G1dsr/MRAL-k0とH54-G1dsr/L28-k0を反応させたG1dsrのBispecific抗体生成率はそれぞれ50.5%、52.7%であった。一方で会合界面制御改変を導入したMRAH-wtG4dP1/MRAL-k0とH54-wtG4dN1/L28-k0を反応させたwtG4dP1/N1のBispecific抗体生成率は99.0%、またMRAH-G1dsrP1/MRAL-k0とH54-G1dsrN1/L28-k0を反応させたG1dsrP1/N1では98.5%と極めて高い効率でBispecific抗体が生成されていることが明らかとなった。以上の結果から、WO2006/106905で報告されている会合界面制御改変を導入した２種類のホモ体を還元剤存在下で混合することにより、極めて高い効率でBispecific抗体を作製できることが示された。
〔実施例２〕ヒト天然型IgG1のヒンジ配列を有するホモ体でのFab Arm Exchange
実施例１ではヒンジ領域の配列を天然型ヒトIgG4型にするため、ヒトIgG1に対してP228S改変を導入し、Fab Arm Exchangeを行った。しかしながら生体内に投与された天然型IgG4は、内因性IgG4との半分子交換が起こることが報告されている。またその原因はヒンジ領域のうち、EUナンバリング228番目に位置するSerであり、これをIgG1型のProとすることで安定性が向上し、生体内での交換が起こらなくなることが報告されている(Labrijn AF et al. Nat. Biotechnol. 2009, 27, 767-771)。従って生体内に投与することを考えた場合、作製したBispecific抗体のヒンジ配列は226C-227P-228P-229Cとなっていることが望ましい。そこで本検討では、会合界面制御改変が導入されていることにより、天然型ヒトIgG1のヒンジ配列であっても効率よくFab Arm Exchangeが起こるかどうかについて検証した。
まず、MRAH-G1dに対してK409RおよびD356Kを導入したMRAH-G1drP1（配列番号１５）、H54-G1dに対してK409RおよびK439Eを導入したH54-G1drN1（配列番号１６）を作製した。重鎖可変領域がMRAHの場合はMRAL-k0を、H54の場合はL28-k0を抗体L鎖として用い、参考例１の方法に従ってMRAH-G1drP1/MRAL-k0、H54-G1drN1/L28-k0を発現、精製した。次に、得られたホモ体2種類を以下の反応条件下で混合し、反応産物を参考例２の方法に従って評価した。
反応条件： TBS(Takara, pH7.6)中、[各mAb] = 0.2 mg/ml、0.05% Tween 20 (Junsei)、37℃、24時間。還元剤は[GSH(Sigma)] = 0.5 mMもしくは5 mMまたは[2-MEA(Sigma)] = 25 mMの3条件で検討した。
参考例２の方法に従って反応産物を解析した結果を図２に示す。実施例１と同じGSH(0.5 mM)の条件下では、Bispecific抗体生成率は21.8%となり、EUナンバリング228番目のアミノ酸残基がSerの場合と比較して大幅に効率が低下した。しかしながら、2-MEA(25 mM)およびGSH(5 mM)の還元条件下では、Bispecific抗体の生成率が99%以上となった。以上の結果から、ヒンジの配列がヒト天然型IgG1の配列であったとしても、会合界面制御改変を導入し、適切な還元条件を用いることによって高効率にBispecific抗体を作製できることが明らかとなった。
〔実施例３〕重鎖-軽鎖間のジスルフィド結合を欠失した改変体でのFab arm exchange
前述のように、FAE反応では、還元剤によるヒンジ領域のジスルフィド結合の切断によって生じるHL分子が再結合する。したがってこのHL分子を効率的に生み出すことができれば、より穏やかな還元条件でFAE反応を進行させることができると考えられる。天然型ヒトIgG4はC131S改変を導入することによってH鎖-L鎖間に形成されていたジスルフィド結合がL鎖間で形成されることが報告されている(Schuurman J et al. Mol. Immunol. 2001, 38, 1-8)。このL鎖間のジスルフィド結合は1ヶ所でのみ形成されるため、コアヒンジで形成される2本のジスルフィド結合と比較して還元されやすいと考えられる。還元剤添加によりL鎖間のジスルフィド結合を開裂させ、効率的にHL分子を生み出すことができれば図３に示すようにBispecific抗体を高効率で作製できる可能性がある。そこでC131S改変を有する改変体にCH3領域における会合界面を制御する改変を加えることで、Fab Arm Exchange反応（Bispecific抗体生成率）を高効率で行うことができるか検証した。
ヒトIgG1においては、H鎖-L鎖間のジスルフィド結合はH鎖の220CとL鎖との間で形成される。そこでヒトIgG1でも同様の検討を行う目的で、C220S改変を有する改変体にCH3領域における会合界面を制御する改変を加えることで、Fab Arm Exchange反応（Bispecific抗体生成）を高効率で行うことができるか検証した。
MRAH-wtG4dおよびH54-wtG4dの重鎖定常領域のヒンジ部にS228Pを導入してG1型のヒンジ構造にしたMRAH-G4d（配列番号１７）およびH54-G4d(配列番号１８)を作製した。次に、MRAH-G4dとH54-G4dに対し、H鎖-L鎖間のジスルフィド結合を削るための改変としてC131Sを導入したMRAH-G4dv1（配列番号１９）、H54-G4dv1（配列番号２０）を作製した。さらにMRAH-G4dv1とH54-G4dv1に対し、ヒンジ部のジスルフィド結合を削るための改変であるC226S, C229SおよびCH3界面制御改変としてそれぞれE356KあるいはK439Eを導入したMRAH-G4dv2P1（配列番号２１）、H54-G4dv2N1（配列番号２２）を作製した。ヒト天然型IgG4に関してもMRAH-wtG4dおよびH54-wtG4dに対して、H鎖-L鎖間のジスルフィド結合を削るための改変としてC131S、ヒンジ部のジスルフィド結合を削るための改変であるC226S, C229SおよびCH3界面制御改変としてそれぞれE356KあるいはK439Eを導入したMRAH-wtG4dv2P1(配列番号４６)、H54-wtG4dv2N1(配列番号４７)を作製した。ヒトIgG1での検討に関しては、MRAH-G1dとH54-G1dに対し、H鎖-L鎖間のジスルフィド結合を削るための改変としてC220Sを導入したMRAH-G1dv1（配列番号２３）、H54-G1dv1（配列番号２４）を作製した。さらにMRAH-G1dv1とH54-G1dv1に対し、ヒンジ部のジスルフィド結合を削るための改変であるC226S, C229SならびにCH3界面制御改変としてK409RおよびそれぞれE356KあるいはK439Eを導入したMRAH-G1dv2rP1（配列番号２５）、H54-G1dv2rN1（配列番号２６）を作製した。また図４に示す通り天然型ヒトIgG1は天然型ヒトIgG4と比較してヒンジ領域が長い。そのためL鎖C末端同士の距離が遠く、ジスルフィド結合が形成しにくいと考えられることから、G1dv2rP1およびG1dv2rN1に対してヒンジ領域のEUナンバリング220から225をヒト天然型IgG4の配列であるYGPPに置換したMRAH-G1dv3rP1（配列番号２７）、H54-G1dv3rN1（配列番号２８）を作製した。作製した改変体を下記の表１および表２に示す。参考例１の方法に従ってMRAH-wtG4dP1/MRAL-k0、H54-wtG4dN1/L28-k0、MRAH-wtG4dv2P1/MRAL-k0、H54-wtG4dv2N1/L28-k0、MRAH-G4dv2P1/MRAL-k0、H54-G4dv2N1/L28-k0、MRAH-G1drP1/MRAL-k0、H54-G1drN1/L28-k0、MRAH-G1dv2rP1/MRAL-k0、H54-G1dv2rN1/L28-k0、MRAH-G1dv3rP1/MRAL-k0、H54-G1dv3rN1/L28-k0を発現、精製した。
Figure 2021080260
Figure 2021080260
次に、得られたホモ体2種類を以下に示す組み合わせ、反応条件下で混合し、反応産物を参考例２および４の方法に従って評価した。
(1) MRAH-wtG4dP1/MRAL-k0とH54-wtG4dN1/L28-k0
(2) MRAH-wtG4dv2P1/MRAL-k0とH54-wtG4dv2N1/MRAL-k0
(3) MRAH-G4dv2P1/MRAL-k0とH54-G4dv2N1/L28-k0
(4) MRAH-G1drP1/MRAL-k0とH54-G1drN1/L28-k0
(5) MRAH-G1dv2rP1/MRAL-k0とH54-G1dv2rN1/L28-k0
(6) MRAH-G1dv3rP1/MRAL-k0とH54-G1dv3rN1/L28-k0
反応条件： TBS(TAKARA, pH7.4)中、[各mAb] = 2 mg/ml、[2-MEA(Sigma)] = 25 mM、37℃、90min
本検討で用いた二種類の抗体可変領域MRAH/MRALとH54/L28は、pIが大きく異なるため、キャピラリー等電点電気泳動(CE-IEF)によりそれぞれのホモ体、および生成されたBispecific抗体に対応するピークが容易に分離され、反応効率を評価することができる。図５−１、図５−２はCE-IEFにより反応産物を評価した結果である。MRAH-wtG4dP1/MRAL-k0とH54-wtG4dN1/L28-k0を反応させたwtG4dP1//N1、あるいはMRAH-G4dv2P1/MRAL-k0とH54-G4dv2N1/L28-k0を反応させたG4dv2P1//N1のBispecific抗体生成率はそれぞれ94.3%、96.2%であった。一方、MRAH-G1drP1/MRAL-k0とH54-G1drN1/L28-k0を反応させたG1drP1//N1、MRAH-G1dv2rP1/MRAL-k0とH54-G1dv2rN1/L28-k0を反応させたG1dv2rP1//N1およびMRAH-G1dv3rP1/MRAL-k0とH54-G1dv3rN1/L28-k0を反応させたG1dv3rP1//N1のBispecific抗体生成率はそれぞれ94.4%、87.7%、84.1%であった。MRAH-wtG4dv2P1/MRAL-k0とH54-wtG4dv2N1/L28-k0を反応させたwtG4dv2P1//N1に関しては、CE-IEFで回収率が低下していた(データは省略)。以上の結果から、L鎖間のジスルフィド結合を有する２種類のホモ体を還元剤存在下で混合する方法でも、極めて高い効率でBispecific抗体を作製できることが示された。
次に、FAE反応産物とそれらの元になるホモ体を非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により評価した結果を図６に示す。MRAH-wtG4dP1/MRAL-k0、H54-wtG4dN1/L28-k0およびMRAH-G1drP1/MRAL-k0、H54-G1drN1/L28-k0はH鎖-L鎖間およびヒンジ部のジスルフィド結合の存在によりHL分子のホモ二量体として泳動された。一方、H鎖L鎖間のジスルフィド結合を欠失させたMRAH-G4dv2P1/MRAL-k0、H54-G4dv2N1/L28-k0、MRAH-G1dv2rP1/MRAL-k0、H54-G1dv2rN1/L28-k0、MRAH-G1dv3rP1/MRAL-k0、H54-G1dv3rN1/L28-k0、は、H鎖、L鎖、およびL鎖がジスルフィド結合によって会合したL鎖二量体(図中のL2)が観察された。FAE反応後のwtG4dP1//N1およびG1drP1//N1は、H鎖およびL鎖が２つずつ会合したHL分子二量体として観察され、還元剤によって切断されたヒンジ部のジスルフィド結合が、FAE反応に伴うヘテロ二量化の際に再結合していることが示唆される。一方でFAE反応後のG4dv2P1//N1、G1dv2rP1//N1、G1dv3rP1//N1では、H鎖とL鎖の単量体のみが観察され、L鎖二量体が観察されなかった。
以上の結果から以下のように考えることができる。H鎖-L鎖間およびヒンジ部のジスルフィド結合を欠失することにより、MRAH-G4dv2P1/MRAL-k0、H54-G4dv2N1/L28-k0、MRAH-G1dv2rP1/MRAL-k0、H54-G1dv2rN1/L28-k0、MRAH-G1dv3rP1/MRAL-k0およびH54-G1dv3rN1/L28-k0は、L鎖間にジスルフィド結合を形成する。還元剤存在下でこれらの抗体を混合することによりL鎖間のジスルフィド結合は切断され、生成されたHL分子が会合することによってbispecific抗体を精製する。しかしながらこのヘテロ二量化に伴ってL鎖間のジスルフィド結合は再結合できていないと考えられる。
〔実施例４〕L鎖間ジスルフィド結合形成のための還元剤の検討
還元剤は種類によってその還元電位や反応様式が異なるが、2-MEAおよびDTTを用いた反応では、還元剤がジスルフィド結合を切断する際にタンパク質のチオール基に付加したのち、溶媒置換によって脱離すると考えられる。この脱離のしやすさは、還元剤の構造や濃度によって異なると考えられる。当然のことではあるが、還元剤が脱離していない状態ではジスルフィド結合を再形成することはできない。実施例３においてG4dv2P1//N1、G1dv2rP1//N1、G1dv3rP1//N1のL鎖間にジスルフィド結合が形成されなかった理由の一端として、還元条件による影響があるのではないかと考え、2-MEA,DTT,TCEPを用いて還元条件の検討を行った。
ホモ体2種類を以下に示す組み合わせ、反応条件下で混合し、反応産物を参考例２および４の方法に従って評価した。
(1) MRAH-G1drP1/MRAL-k0とH54-G1drN1/L28-k0
(2) MRAH-G1dv2rP1/MRAL-k0とH54-G1dv2rN1/L28-k0
(3) MRAH-G1dv3rP1/MRAL-k0とH54-G1dv3rN1/L28-k0
(4) MRAH-G4dv2P1/MRAL-k0とH54-G4dv2N1/L28-k0
反応条件： TBS(TAKARA)中、[各mAb] = 0.45 mg/ml、[2-MEA] = 25 mM or [DTT] = 1 mM or [TCEP] = 1 mM、37℃、90min。
イオン交換クロマトグラフィーにより反応産物を評価した結果を図７−１、図７−２示す。25 mM 2-MEAで反応させた結果、G1drP1//N1、G1dv2rP1//N1、G1dv3rP1//N1、G4dv2P1//N1の反応効率はそれぞれ97.9％、79.0％、80.4％、91.40％であった。1 mM DTTで反応させた結果、G1drP1//N1、G1dv2rP1//N1、G1dv3rP1//N1、G4dv2P1//N1の反応効率はそれぞれ93.3%、76.6%、71.8%、87.3%であった。1mM TCEPで反応させた結果、G1drP1//N1、G1dv2rP1//N1、G1dv3rP1//N1、G4dv2P1//N1の反応効率はそれぞれ91.9%、80.0%、71.2%、81.5%であった。次に、反応に用いた各Homo体および反応産物を非還元SDS-PAGEにより評価した結果を図８に示す。1 mM DTTまたは1 mM TCEPで反応させた場合、G1dv2rP1//N1、G1dv3rP1//N1、G4dv2P1//N1（それぞれ図中のG1dv2r、G1dv3r、G4dv2）はいずれも、25 mM 2-MEAで反応させた条件に比較してL鎖間のジスルフィド結合の形成率が増加した。以上の結果から、DTTやTCEPを用いることで、高効率でFAE反応を進行させることができるとともに、G1dv2rP1//N1、G1dv3rP1//N1およびG4dv2P1//N1のL鎖C末端間にジスルフィドを形成させることができると考えられた。
〔実施例５〕ヒンジ領域を欠失したヒト天然型IgG4でのFab arm exchange
図４に示したヒトIgG1のヒンジ部の結晶構造を見ると、各L鎖C末端はヒンジ部の構造によって距離が遠くなっている。実施例３において、FAE反応後のG4dv2P1//N1のL鎖間にジスルフィド結合が形成されなかったのは、この距離によるのではないかと考えられた。そこで、ヒンジ領域を欠失することによってL鎖C末端の距離を近づけることにより、FAE反応後のL鎖間にジスルフィド結合を形成できるか検証した。
MRAH-G4dv1/MRAL-k0およびH54-G4dv1/L28-k0、MRAH-G4dv2P1/MRAL-k0およびH54-G4dv2N1/L28-k0のEUナンバリング219から229までのYGPPCPPC配列又はYGPPSPPS配列を欠失したMRAH-G4dv4/MRAL-k0（配列番号２９）、H54-G4dv4/L28-k0（配列番号３０）、MRAH-G4dv4P1/MRAL-k0（配列番号３１）およびH54-G4dv4N1/L28-k0（配列番号３２）を作製した。参考例１の方法に従ってMRAH-G4dv4/MRAL-k0、H54-G4dv4/L28-k0、MRAH-G4dv4P1/MRAL-k0およびH54-G4dv4N1/L28-k0を発現および精製し、以下の反応条件で混合して、反応産物を参考例３および４の方法に従って評価した。
反応条件： TBS(Sigma, pH7.4)中、[各mAb] = 0.45 mg/ml、[2-MEA(Sigma)] = 25 mM、37℃、90min。
イオン交換クロマトグラフィーにより反応産物を評価した結果を図9に示す。MRAH-G4dv4P1/MRAL-k0とH54-G4dv4N1/L28-k0を混合して得られたG4dv4P1//N1の反応効率は95.4％であった。次に、反応に用いた各ホモ体および反応産物を非還元SDS-PAGEにより評価した結果を図10に示す。ヒンジ領域を欠失したMRAH-G4dv4P1/MRAL-k0はMRAH-G4dv2P1/MRAL-k0に比較してL鎖二量体の量が増加した。一方、反応後の検体に関してはG4dv4P1//N1はG4dv2P1//N1に比較してL鎖間のジスルフィド結合形成率が増加した。以上の結果から、ヒンジ領域を欠失することでL鎖C末端部の距離が近くなり、FAE反応産物のL鎖間のジスルフィド結合が形成できたと考えられる。
〔実施例６〕ヒンジ領域を欠失したヒトIgG4でのFab arm exchange
ここまでの実施例において、ヒンジ領域を欠失したMRAH-G4dv4P1/MRAL-k0およびH54-G4dv4N1/L28-k0をDTTやTCEPを用いることでL鎖間のジスルフィド結合を還元したのちに異なるHL分子が会合して、L鎖間のジスルフィド結合が再形成されることが示された。WO2011131746には、2種類の抗体分子の片方に405Lを、もう片方に409Rを持つ抗体分子を用いてFAE反応を行うことにより効率的にFAE反応を起こすことができると開示されている。この分子はヒンジ領域が通常の天然型IgG1であることから、FAE反応過程におけるHL分子の生成には2本のジスルフィド結合を還元する必要がある。一方、上記のMRAH-G4dv4P1/MRAL-k0およびH54-G4dv4N1/L28-k0を用いたFAE反応では、HL分子生成のために還元する必要のあるジスルフィド結合はL鎖間の1本となるため、より穏やかな還元条件でFAE反応を進行させることができる可能性があると考えられた。そこで次に、WO2011131746に開示されている抗体分子とMRAH-G4dv4P1/MRAL-k0およびH54-G4dv4N1/L28-k0とを、より穏やかな還元条件でのFAE反応効率について比較した。
ここで、既存のFab Arm Exchange技術を比較対照として用いた。具体的にはMRAH-G1d/MRAL-k0にK409Rを加えたMRAH-G1dr/MRAL-k0（配列番号３３）、H54-G1d/L28-k0にF405Lを加えたH54-G1dl/MRAL-k0（配列番号３４）を作製した。参考例１の方法に従ってMRAH-G1dr/MRAL-k0、H54-G1dl/L28-k0、MRAH-G4dv4P1/MRAL-k0、H54-G4dv4N1/L28-k0を発現および精製した。
ホモ体2種類を以下に示す組み合わせ、反応条件下で混合し、反応産物を参考例３の方法に従って評価した。
(1) MRAH-G1dr/MRAL-k0とH54-G1dl/L28-k0
(2) MRAH-G4dv4P1/MRAL-k0とH54-G4dv4N1/L28-k0
反応条件： TBS(TAKARA)中、[各mAb] = 0.45 mg/ml、[GSH] = 5 mM or 0.5mM、37℃、90min。
イオン交換クロマトグラフィーにより反応産物を評価した結果を図11に示す。MRAH-G1dr/MRAL-k0とH54-G1dl/L28-k0を5 mMあるいは0.5 mM GSHで混合して得られたG1dr//dlの反応効率は8.5%、0.4%であった。一方、MRAH-G4dv4P1/MRAL-k0とH54-G4dv4N1/L28-k0を5 mMあるいは0.5 mM GSHで混合して得られたG4dv4P1//N1の反応効率は94.5%、65.6%であった。以上の結果から、Ｌ鎖間のジスルフィド結合を還元して行うFAE反応を用いることで、より穏やかな還元条件においても高効率で反応を進行させることができることが示された。
〔実施例７〕CH3領域間にジスルフィド結合を形成させたヒト天然型IgG4でのFab arm exchange
実施例６で示された通り、L鎖間のジスルフィド結合を還元してHL分子を生成するFAE反応では、天然型IgG1のヒンジ領域のジスルフィド結合を還元してHL分子を生成するFAE反応に比べてより穏やかな還元条件で高効率に反応を進行させることができる。これは還元すべきジスルフィド結合が１本であり、通常のヒンジ領域を還元する場合と比較して少ないことが要因であると考えられる。このジスルフィド結合を形成する部位はヒンジ領域に特に限定されるわけではなく、抗体のどの領域であってもよいと考えられる。そこで次に、CH3領域間に1ヶ所ジスルフィド結合を形成させた分子でのFAE反応を検討した。
MRAH-G4dおよびH54-G4d/L28-k0にヒンジ領域のジスルフィド結合をなくすためにC226S、C229Sを加え、さらにCH3界面制御の電荷改変と、CH3間ジスルフィド結合形成のための改変とを加えて、MRAH-G4dNX010P（配列番号３５）、MRAH-G4dNX010N（配列番号３６）、MRAH-G4dNX011P（配列番号３７）、MRAH-G4dNX011N（配列番号３８）、MRAH-G4dNX012P（配列番号３９）、MRAH-G4dNX012N（配列番号４０）、MRAH-G4dNX013N（配列番号４１）、MRAH-G4dNX014P（配列番号４２）、MRAH-G4dNX014N（配列番号４３）、MRAH-G4dNX015P（配列番号４４）、MRAH-G4dNX015N（配列番号４５）をそれぞれ作製した。加えた改変に関しては下記の表３に示した。
参考例１の方法に従ってMRAH-G4dNX010P/MRAL-k0、H54-G4dNX010N/L28-k0、MRAH-G4dNX011P/MRAL-k0、H54-G4dNX011N/L28-k0、MRAH-G4dNX012P/MRAL-k0、H54-G4dNX012N/L28-k0、H54-G4dNX013N/L28-k0、MRAH-G4dNX014P/MRAL-k0、H54-G4dNX014N/L28-k0、MRAH-G4dNX015P/MRAL-k0、H54-G4dNX015N/L28-k0を発現および精製した。
Figure 2021080260
ホモ体2種類を以下に示す組み合わせ、反応条件下で混合し、反応産物を参考例４および５の方法に従って評価した。
(1) MRAH-G4dNX010P/MRAL-k0とH54-G4dNX010N/L28-k0
(2) MRAH-G4dNX011P/MRAL-k0とH54-G4dNX011N/L28-k0
(3) MRAH-G4dNX012P/MRAL-k0とH54-G4dNX012N/L28-k0
(4) MRAH-G4dNX010P/MRAL-k0とH54-G4dNX013N/L28-k0
(5) MRAH-G4dNX014P/MRAL-k0とH54-G4dNX014N/L28-k0
(6) MRAH-G4dNX015P/MRAL-k0とH54-G4dNX015N/L28-k0
反応条件： TBS(Sigma, pH7.4)中、[各mAb] = 0.2 mg/ml又は0.225 mg/mL、[2-MEA(Sigma)] = 25 mM 37℃、90min。
IEFにより反応産物を評価した結果を図１２−１、図１２−２に示す。MRAH-G4dNX010P/MRAL-k0とH54-G4dNX010N/L28-k0を反応させたG4dNX010P//010N、MRAH-G4dNX011P/MRAL-k0とH54-G4dNX011N/L28-k0を反応させたG4dNX011P//011N、G4dNX010P/MRAL-k0とH54-G4dNX013N/L28-k0を反応させたG4dNX010P//013NおよびMRAH-G4dNX014P/MRAL-k0とH54-G4dNX014N/L28-k0を反応させたG4dNX014P//014Nでは、反応産物のpIが各ホモ体の中間になっていることから、FAE反応が進行してbispecific抗体（図中のbiAb）が生成されたと考えられる。
非還元SDS-PAGEにより反応産物およびそのホモ体を評価した結果をそれぞれ図１３−１、１３−２に示す。FAE反応の進行したG4dNX010P//010N、G4dNX011P//011N、G4dNX010P//013N、G4dNX014P//014Nでは、反応後の抗体分子がHL分子二量体（図中のH2L2）を形成しており、CH3間のジスルフィド結合が再形成されたと考えられる。一方、これらの分子のホモ体では、MRAH-G4dNX014P/MRAL-k0およびH54-G4dNX014N/L28-k0では抗体分子がHL分子二量体（図中のH2L2）を形成しており、CH3間のジスルフィド結合を形成していると考えられたが、MRAH-G4dNX010P/MRAL-k0、H54-G4dNX010N/L28-k0、MRAH-G4dNX011P/MRAL-k0、H54-G4dNX011N/L28-k0およびH54-G4dNX013N/L28-k0ではHL分子が主成分となっており、CH3間のジスルフィド結合は形成されていないと考えられる。
以上の結果は次のように考えることができる。CH3間にジスルフィド結合を形成したMRAH-G4dNX014P/MRAL-k0およびH54-G4dNX014N/L28-k0は、還元剤によってCH3間のジスルフィド結合が還元されてHL分子となり、このHL分子が会合する際にCH3間にジスルフィド結合が再形成されたと考えられる。一方、ホモ体ではCH3間のジスルフィド結合を形成しなかったMRAH-G4dNX010P/MRAL-k0とH54-G4dNX010N/L28-k0、MRAH-G4dNX011P/MRAL-k0とH54-G4dNX011N/L28-k0あるいはMRAH-G4dNX010P/MRAL-k0とMRAH-G4dNX013N/MRAL-k0に関しては、それぞれ加えているY349C改変同士の距離、E356C改変同士の距離、あるいはY349CとS354Cの距離がジスルフィド結合を形成するには遠いが、HL分子が会合したのちに生成されるbispecific抗体においては、Y349CおよびE356Cの距離あるいはY349CとS354Cの距離が近接しているためジスルフィド結合を形成できると考えられる。以上の結果から、CH3間にジスルフィド結合を有する抗体２種類を還元剤存在下で混合することによってもFAE反応を進行させることができることが示された。
〔参考例１〕抗体の発現ベクターの作製および抗体の発現と精製
抗体のH鎖およびL鎖の塩基配列をコードする全長の遺伝子の合成は、Assemble PCR等を用いて、当業者公知の方法で作製した。アミノ酸置換の導入はPCR等を用いて当業者公知の方法で行った。得られたプラスミド断片を動物細胞発現ベクターに挿入し、H鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。作製したプラスミドをヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株（Invitrogen社）、またはFreeStyle293細胞（Invitrogen社）に、一過性に導入し、抗体の発現を行った。得られた培養上清を回収した後、0.22μmフィルターMILLEX(R)-GV（Millipore）、または0.45μmフィルターMILLEX(R)-GV（Millipore）を通して培養上清を得た。得られた培養上清から、rProtein A Sepharose Fast Flow（GEヘルスケア）またはProtein G Sepharose 4 Fast Flow（GEヘルスケア）を用いて当業者公知の方法で、抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE等の方法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423）。
〔参考例２〕CE-IEF
CE-IEFの測定は、PA800 Plus(Beckman Coulter)を用いて当業者公知の方法で行った。Pharmalyteはbroad rangeが5〜8と8〜10.5のものを等量混合して、pI range 5〜10.5で分析を行った。4 mg/mLの抗体溶液を用いて分析し、結果は32 karat software(Beckman Coulter)を用いて解析した。Bispecific抗体生成率(%)は、Bispecific抗体の面積値を系中に存在する全抗体の面積値で除し、100をかけた値を用いた。
〔参考例３〕イオン交換クロマトグラフィーによるBispecific抗体生成率の評価
Priminence UFLC(島津製作所)を用いたイオン交換クロマトグラフィー精製法において、各検体の分離が評価された。移動相には25 mM MES緩衝液、pH5.0ならびに500 mMの塩化ナトリウムを含む25 mM MES緩衝液、pH5.0を、カラムはProPac WCX-10 (Thermo Scientific)を用い、2液混合グラジエント法によりBispecific抗体が分離された。データの取得は215 nmの波長で実施し、Empower2(Waters)を用いて溶出結果が評価された。
Bispecific抗体生成率(%)は、Bispecific抗体の面積値を系中に存在する全抗体の面積値で除し、100をかけた値を用いた。片方のホモ体の回収率が悪い場合には、もう片方のホモ体の面積の2倍値をBispecific抗体の面積値と合わせた値を全抗体の面積値として計算した。
〔参考例４〕非還元SDS-PAGE
Mini-PROTEAN Tetra system(BIO-RAD)を用いたSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法により、ジスルフィド結合が評価された。Power SupplyにはPower Pac 3000 (BIO-RAD)またはPOWER SUPPLY KS-7510 (MARYSOL)を、泳動ゲルにはMini-PROTEAN TGX Gel(4-20%, BIO-RAD)を用い、Tris-Glycine SDS Sample Buffer(2x, TEFCO）で抗体含有液を希釈したのちに95℃で2min加熱処理したサンプルを電気泳動した。電気泳動後のゲルはCBB Stain One（ナカライテスク）を用いて染色した。染色後のゲルはTyphoon FLA 9500（GE Healthcare）を用いて画像化した。
〔参考例５〕IEF
Phastsystem（GE Healthcare）を用いた等電点電気泳動法により、FAE反応後の生成物を評価した。メーカーのプロトコールに従い、PhastGel Dry IEF（GE Healthcare）をPharmalyte 5-8（GE Healthcare）、Pharmalyte 8-10.5（GE Healthcare）を等量混合したアンフォライト溶液で膨潤させたのち、サンプルを電気泳動した。電気泳動後のゲルは、PlusOne Silver Staining Kit, Protein（GE Healthcare）を用いて銀染色した。染色後のゲルは乾燥後にスキャナを用いて画像化した。
〔参考例６〕Tmの測定
CH3ドメインのTmの測定は、Rotor-gene Q (QIAGEN) を用いて当業者公知の方法で行った。抗体濃度0.1 mg/mL、SYPRO orange濃度10X concentrateで混合したサンプルを30℃から99℃まで昇温し、蛍光強度（励起波長470nm、蛍光波長555nm）を0.4℃毎に測定した。測定はPBS（Sigma, pH7.4）中で行った。解析はRotor-gene Q series software を用いて行い、蛍光強度の一次微分によって求めた変曲点をTmとした。MRAHのTmはCH2が70℃付近、Fabが95℃付近、H54のTmはCH2が70℃付近、Fabが90℃付近であることを利用してCH3ドメインのTmが算出された。
本発明の方法を用いることにより、還元条件下において、従来技術より高い効率で二重特異性抗体を作製することが可能である。

Claims (1)

  1. 本明細書に記載の発明。
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