JPWO2015046467A1 - ポリペプチド異種多量体の製造方法 - Google Patents

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Abstract

電荷反発を利用してFc領域の解離の促進及び／若しくは会合の制御を達成する、Fc領域の界面を形成するアミノ酸における改変、並びに／又は重鎖CH3領域の安定性を不安定にする改変を重鎖CH3領域に導入した複数種類のポリペプチドのホモ体を還元条件下でインキュベートすることにより、異種多量体を効率的かつ安定に製造する方法を提供する。

Description

本発明は、ポリペプチド異種多量体の製造方法及びポリペプチドのヘテロ化が促進されるようにFc領域のアミノ酸が改変されたポリペプチド異種多量体等に関する。
抗体は血中での安定性が高く、副作用も少ないことから医薬品として注目されている（非特許文献１、非特許文献２）。その中には２種類の抗原あるいはエピトープを同時に認識できる二重特異性抗体があり、これらは標的特異性の高さや複数の経路を同時に阻害する機能が期待される（非特許文献３）。例えば既に上市されているCatumaxomabは、上皮細胞接着因子のEpCAMと、T細胞に発現しているCD3に結合する二重特異性抗体であり、悪性腹水の治療薬として用いられている。
IgG型二重特異性抗体の製造は、目的とする二重特異性抗体が得られる効率の低さや、精製の難しさから難易度が高いが、効率的生産に関する知見がいくつか報告されている(非特許文献３)。例えば、２種類の可変領域をもつIgGを構成するH鎖およびL鎖の遺伝子、合計４種の遺伝子を細胞に導入し、共発現により分泌する場合、2種類のH鎖の共有結合やH鎖とL鎖の非共有結合はランダムに起こるため、目的の二重特異性抗体の比率は極めて少なくなり、生産効率が著しく低下する。これを解決する手法として、IgG H鎖のCH3領域にアミノ酸置換を施すことにより、H鎖について異種な組み合わせのIgGを優先的に分泌できることが報告されている（特許文献1および非特許文献4および5）。本手法は、一方のH鎖のCH3領域に存在するアミノ酸側鎖をより大きい側鎖(knob;突起)に置換し、もう一方のH鎖のCH3領域に存在するアミノ酸側鎖をより小さい側鎖(hole; 空隙)に置換することにより、突起が空隙内に配置されるようにして異種H鎖形成の促進および同種H鎖形成の阻害を引き起こす方法である。また、それぞれのIgG H鎖のCH3領域に異なる電荷を導入する方法も報告されている（特許文献2）。具体的には、一方のH鎖のCH3領域に存在するアミノ酸を正電荷を有するアミノ酸に置換し、もう一方のH鎖のCH3領域に存在するアミノ酸を負電荷を有するアミノ酸に置換することにより、異種H鎖形成の促進および同種H鎖形成の阻害を引き起こす方法である。一方、H鎖とL鎖の組み合わせを制御する技術も報告されている(非特許文献6)。本手法は抗体の一方のFabとして、L鎖定常領域(CL)とH鎖CH1領域を入れ替えたものを用いることで、目的とするH鎖とL鎖の組み合わせを効率的に誘起する手法である。またこの他には、両方のFabで共通するL鎖を用いる手法も存在する。これは共通のL鎖を用いることで細胞に導入するL鎖遺伝子を１種類とし、H鎖とL鎖の組み合わせを考慮する必要なく二重特異性抗体を得られるというものである。現在では異種H鎖形成技術、H鎖L鎖組み合わせ制御技術を組み合わせることにより、高い効率で二重特異性抗体が形成できる。しかしながら、H鎖とL鎖の組み合わせを完全に制御することは難しく、複雑な分子設計となる。また、共通のL鎖で２種類の抗原に対して高い親和性を維持するのは難易度が高いという問題もある。
一方、上記のような遺伝子組換え法ではなく、あらかじめ別々に調製したモノクローナル抗体同士を使用して二重特異性抗体を作製する方法としてFab Arm Exchangeと呼ばれる手法が報告されている。これは、生体内でIgG4の半分子が内因性IgG4の半分子と交換して二重特異性抗体（Bispecific抗体；BiAb）を生成するという知見（非特許文献7）に基づいて開発された技術であり、in vitroで２種類の天然型ヒトIgG4を混合することにより、二重特異性抗体が産生されること（特許文献3）、さらには還元条件下においてより効率良く反応が起こることが報告されている(非特許文献8)。また、IgG4に特徴的なヒンジ領域の228番目とCH3領域の409番目の2箇所がこの反応に重要なアミノ酸残基であることが特定され、IgG1であってもこの2箇所をIgG4型のアミノ酸に置換することで、IgG4と同等の効率で反応が起こることが見出されている(特許文献4)。Fab Arm Exchangeは、一般的な方法で作製されたモノクローナル抗体同士をin vitroで混合するだけで目的とする二重特異性抗体が得られるため、汎用性が高い。しかしながら半分子交換反応はランダムに起こるため、２種類の抗体を混合して得られる二重特異性抗体は理論上、系内に存在する全抗体量の50%となる。そのため、二重特異性抗体生成率を改善する方法が検討され、２種類の抗体に非対称なアミノ酸改変、すなわち、一方のH鎖にK409Rの改変、および、もう一方のH鎖にF405Lの改変を導入することで反応効率が大きく向上することが報告されているが反応効率は95%程度にとどまっている（特許文献5、非特許文献9）。二重特異性抗体の効率的かつ安定な製造においては精製の簡便さやロット間の不均一性を可能な限り低減することが必要不可欠であるため、より高い反応効率を実現する優れた手法の開発が望まれる。
WO1996/027011 WO2006/106905 WO2005/062916 WO2008/119353 WO2011/131746
Nat Biotechnol., 23, 1073-1078, 2005 Eur J Pharm Biopharm, 59(3), 389-396, 2005 mAbs, 4, 653-663, 2012 Protein Engineering, 9, 617-621, 1996 Nature Biotechnol., 16, 677-681, 1998 Proc. Natl. Acad. Sci., 108, 11187-11192, 2011 Immunology, 97, 693-698, 1999 Science, 317, 1554-1557, 2007 Proc. Natl. Acad. Sci., 110, 5145-5150, 2013
本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その目的は、異種多量体の効率的かつ安定な製造のために、還元状況下においてポリペプチドのヘテロ化を促進し所望の異種多量体を得る、より反応効率の高い優れた手法を提供することである。
本発明者らは、異種多量体に供するポリペプチドとしてFc領域を有するポリペプチドを選択し、Fc領域の解離及び会合を制御する方法について鋭意研究を行った。その結果、重鎖CH3領域に存在する特定のアミノ酸を置換することにより、還元状況下においてFc領域の解離の促進及び会合の制御をすることができ、従来技術と比較して効率よく所望のヘテロ分子が形成されることを見出した。
本発明はこのような知見に基づくものであり、具体的には以下[1]から[25]を提供する。
[１] a) 第1の抗原結合活性を有し、Fc領域を含む第1のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
b) 該第1の抗原結合活性と異なる第2の抗原結合活性を有し、Fc領域を含む第2のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
c) ヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にする還元条件下で、該第1のポリペプチドのホモ体および該第2のポリペプチドのホモ体を共にインキュベートする段階、ならびに
d) 第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を得る段階
を含み、
前記第1及び／又は第2のポリペプチドのFc領域に含まれるCH3領域において、
(1) EUナンバリングによる 356 位および 439位のアミノ酸残基
(2) EUナンバリングによる 357 位および 370位のアミノ酸残基
(3) EUナンバリングによる 399 位および 409位のアミノ酸残基
に示すアミノ酸残基の組から選択される1組ないし3組のアミノ酸残基が同種の電荷を有し、
前記第1のポリペプチドのCH3領域及び前記第2のポリペプチドのCH3領域の両方において、前記（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組のうち同じ組のアミノ酸残基がそれぞれ同種の電荷を有する場合、前記第2のポリペプチドのCH3領域における当該組のアミノ酸残基が、前記第1のポリペプチドのCH3領域における当該組のアミノ酸残基とは反対の電荷を有する、
異種多量体を製造するための方法。
[２] [1]の段階a)において、第1のポリペプチドと多量体を形成する第3のポリペプチドを提供する段階を含み、かつ段階b)において、第2のポリペプチドと多量体を形成する第4のポリペプチドを提供する段階を含む、[1]記載の製造方法。
[３] 前記同種の電荷を有するアミノ酸残基が、以下の（A)または(B)いずれかの群に含まれる1つ以上のアミノ酸残基から選択される、[1]または[2]に記載の製造方法：
(A)グルタミン酸 (E)、アスパラギン酸 (D)；
(B)リジン（K)、アルギニン（R)、ヒスチジン（H)。
[４] 第1及び第2のポリペプチドにおいてそれぞれ同種の電荷を有するアミノ酸残基の組が、以下の(1)〜(4)のいずれか1組のアミノ酸残基の組である、[1]〜[3]のいずれか一項記載の製造方法：
(1) EUナンバリングによる 356 位および 439位のアミノ酸残基
(2) EUナンバリングによる 357 位および 370位のアミノ酸残基
(3) EUナンバリングによる 399 位および 409位のアミノ酸残基
(4)(i) EUナンバリングによる 399 位および 409位のアミノ酸残基、並びに
(ii) EUナンバリングによる 356 位および 439位のアミノ酸残基。
[５] 第1及び第2のポリペプチドにおいてそれぞれ同種の電荷を有するアミノ酸残基の組が、以下の組のアミノ酸残基の組である、[1]〜[4]のいずれか一項記載の製造方法：
(i) EUナンバリングによる 399 位および 409位のアミノ酸残基、並びに
(ii) EUナンバリングによる 356 位および 439位のアミノ酸残基。
[６] 第1及び／又は第2のポリペプチドにおいて、第1及び／又は第2のポリペプチドのCH3領域の安定性が不安定になるようにアミノ酸が改変されている、[1]〜[5]のいずれか一項記載の製造方法。
[７] 第1及び／又は第2のポリペプチドにおいて、EUナンバリングによる397位及び／又は392位のアミノ酸が改変されている、[1]〜[6]のいずれか一項記載の製造方法。
[８] 第1及び／又は第2のポリペプチドのFc領域がIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4タイプである、[1]〜[7]のいずれか一項記載の製造方法。
[９] 第1及び／又は第2のポリペプチドのFc領域がマウス由来のFc領域である、[1]〜[7]のいずれか一項記載の製造方法。
[１０] 前記第1及び／又は第2のポリペプチドのFc領域に含まれるCH3領域において、
(1) EUナンバリングによる 356 位および 439位のアミノ酸残基
(2) EUナンバリングによる 360 位および 371位のアミノ酸残基
(3) EUナンバリングによる 399 位および 409位のアミノ酸残基
に示すアミノ酸残基の組から選択される1組ないし3組のアミノ酸残基が同種の電荷を有し、
前記第1のポリペプチドのCH3領域及び前記第2のポリペプチドのCH3領域の両方において、前記（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組のうち同じ組のアミノ酸残基がそれぞれ同種の電荷を有する場合、前記第2のポリペプチドのCH3領域における当該組のアミノ酸残基が、前記第1のポリペプチドのCH3領域における当該組のアミノ酸残基とは反対の電荷を有する、
[９]記載の異種多量体を製造するための方法。
[１１] a) 第1の抗原結合活性を有し、Fc領域を含む第1のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
b) 該第1の抗原結合活性と異なる第2の抗原結合活性を有し、Fc領域を含む第2のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
c) ヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にする還元条件下で、該第1のポリペプチドのホモ体および該第2のポリペプチドのホモ体を共にインキュベートする段階、ならびに
d) 第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を得る段階
を含み、
前記第1及び／又は第2のポリペプチドのFc領域に含まれるCH3領域におけるEUナンバリングによる397位及び／又は392位のアミノ酸が改変されている、
異種多量体を製造するための方法。
[１２] 第1及び／又は第2のポリペプチドにおいて、
EUナンバリングによる397位がMet(M)、Phe(F)若しくはTyr(Y)に改変されており、かつ／又は
EUナンバリングによる392位がAsp(D)、Glu(E)、Thr(T)、Val(V)若しくはIle(I)に改変されている
[1]〜[11]のいずれか一項記載の製造方法。
[１３] 第1及び／又は第2のポリペプチドにおいて、EUナンバリングによる397位がPhe(F)又はTyr(Y)に改変されている、[1]〜[12]のいずれか一項記載の製造方法。
[１４] 第１のポリペプチドにおいて、EUナンバリングによる356位がLys(K)に改変されておりかつEUナンバリングによる397位がPhe(F)又はTyr(Y)に改変されており、第２のポリペプチドにおいて、EUナンバリングによる397位がPhe(F)又はTyr(Y)に改変されておりかつEUナンバリングによる439位がGlu(E)に改変されている、[1]〜[13]のいずれか一項記載の製造方法。
[１５] 前記段階a)およびb)が、第一のポリペプチドのホモ体を産生する細胞株と第二のポリペプチドのホモ体を産生する細胞株を混合することにより実施され、前記段階c)が、当該培養上清中で実施される、[1]〜[14]のいずれか一項記載の製造方法。
[１６] 前記異種多量体が多重特異性抗体又はヘテロFc融合タンパク質である、[1]〜[15]のいずれか一項記載の製造方法。
[１７] 前記異種多量体が二重特異性抗体である、[1]〜[16]のいずれか一項記載の製造方法。
[１８] [1]又は[11]記載の段階c)が還元剤との接触を含む、[1]〜[17]のいずれか一項記載の製造方法。
[１９] 段階c)が、グルタチオン、L-システイン、ジチオスレイトール、β-メルカプト-エタノール、TCEPおよび2-MEAからなる群より選択される作用物質の添加を含む、[18]記載の製造方法。
[２０] 段階c)が、グルタチオン、2-MEAより選択される作用物質の添加を含む、[19]記載の製造方法。
[２１] [1]〜[20]のいずれか一項記載の方法によって製造された異種多量体。
[２２] 二重特異性抗体である、[21]に記載の異種多量体。
[２３] [21]または[22]に記載の異種多量体及び医薬的に許容される担体を含む組成物。
[２４] 第1の抗原結合活性を有しかつ第1のFc領域を含む第1のポリペプチドと、該第1の抗原結合活性とは異なる第2の抗原結合活性を有しかつ第2のFc領域を含む第2のポリペプチドとを含む異種多量体であって、
該第1のポリペプチドのホモ体および該第2のポリペプチドのホモ体を、ヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にする還元条件下で共にインキュベートすることによって該異種多量体が得られ、
前記第1及び／又は第2のポリペプチドのFc領域に含まれるCH3領域において、
(1) EUナンバリングによる 356 位および 439位のアミノ酸残基
(2) EUナンバリングによる 357 位および 370位のアミノ酸残基
(3) EUナンバリングによる 399 位および 409位のアミノ酸残基
に示すアミノ酸残基の組から選択される1組ないし3組のアミノ酸残基が同種の電荷を有し、
前記第1のポリペプチドのCH3領域及び前記第2のポリペプチドのCH3領域の両方において、前記（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組のうち同じ組のアミノ酸残基がそれぞれ同種の電荷を有する場合、前記第2のポリペプチドのCH3領域における当該組のアミノ酸残基が、前記第1のポリペプチドのCH3領域における当該組のアミノ酸残基とは反対の電荷を有し、
前記第1及び／又は第2のポリペプチドにおいて、前記第１及び／又は第２のポリペプチドのCH3領域の安定性が不安定になるようにアミノ酸が改変されている、
前記異種多量体。
[２５] a) 第1の抗原結合活性を有し、Fc領域を含む第1のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
b) 該第1の抗原結合活性と異なる第2の抗原結合活性を有し、Fc領域を含む第2のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
c) ヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にする還元条件下で、該第1のポリペプチドのホモ体および該第2のポリペプチドのホモ体を共にインキュベートする段階、ならびに
d) 第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を得る段階
を含む方法によって製造された異種多量体であって、前記第1及び／又は第2のポリペプチドのFc領域に含まれるCH3領域において、
(1) EUナンバリングによる 356 位および 439位のアミノ酸残基
(2) EUナンバリングによる 357 位および 370位のアミノ酸残基
(3) EUナンバリングによる 399 位および 409位のアミノ酸残基
に示すアミノ酸残基の組から選択される1組ないし3組のアミノ酸残基が同種の電荷を有し、
前記第1のポリペプチドのCH3領域及び前記第2のポリペプチドのCH3領域の両方において、前記（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組のうち同じ組のアミノ酸残基がそれぞれ同種の電荷を有する場合、前記第2のポリペプチドのCH3領域における当該組のアミノ酸残基が、前記第1のポリペプチドのCH3領域における当該組のアミノ酸残基とは反対の電荷を有し、
前記第1及び／又は第2のポリペプチドにおいて、前記第１及び／又は第２のポリペプチドのCH3領域の安定性が不安定になるようにアミノ酸が改変されている、
前記異種多量体。
本発明では、重鎖CH3領域に存在する特定のアミノ酸を置換することにより、還元状況下においてFc領域の解離の促進及び会合の制御をすることができ、従来技術と比較して効率よく所望のヘテロ分子が形成される製造方法が提供された。
本発明の方法を利用することにより、従来技術と比較して二重特異性抗体の精製の際の簡便さの向上やロット間の不均一性を可能な限り低減することが可能になった。
本発明の異種多量体の製造方法は、重鎖CH3領域のアミノ酸残基を改変することを特徴とする。これらの領域に本発明のアミノ酸残基の改変を導入することによって、ポリペプチド間の解離及び会合が促進され、従来技術と比較して効率よく所望の異種多量体を得る事が出来る。
イオン交換クロマトグラフィーによるFab Arm Exchange反応産物の解析結果を示す図である。図中の「BiAb」は精製したBispecific抗体（二重特異性抗体）を、「H54 homo」はH54/L28の可変領域を有するモノクローナル抗体を、「MRA homo」はMRAH/MRALの可変領域を有するモノクローナル抗体を示す。図中に百分率で示した数値はBispecific抗体生成率を示し、Bispecific抗体に対応するピークの面積を、系中に存在する全抗体の面積で割り、100を掛けて算出したものである。 イオン交換クロマトグラフィーによるFab Arm Exchange反応産物の解析結果を示す図である。MRAH-G1drP1/MRAL-k0とH54-G1drN1/L28-k0をホモ体として用い、3種類の還元条件下で反応させた結果を示す図である。図中に百分率で示した数値はBispecific抗体生成率を示し、Bispecific抗体に対応するピークの面積を、系中に存在する全抗体の面積で割り、100を掛けて算出したものである。 5mM GSHを還元剤として用いた際のFab Arm ExchangeにおけるBispecific抗体生成率と、用いたホモ体のCH3の安定性の相関を示す図である。図中の「二種類のホモ体のうちCH3のTmが高い方の値」とは、反応に用いる二つのホモ体のうち、CH3のTmが高い、つまりCH3がより安定なホモ体のCH3のTmを意味する。 ヒトIgG1のV397周辺の立体構造(PDB code 3DO3)を示す図である。 25mM 2MEAを還元剤として用いた際のFab Arm ExchangeにおけるBispecific抗体生成率と、用いたホモ体のCH3の安定性の相関を示す図である。図中の「二種類のホモ体のうちCH3のTmが高い方の値」とは、反応に用いる二つのホモ体のうち、CH3のTmが高い、つまりCH3がより安定なホモ体のCH3のTmを意味する。 イオン交換クロマトグラフィーによるFab Arm Exchange反応産物の解析結果を示す図である。MRAH-G1dP17/MRAL-k0とH54-G1dN17/L28-k0をホモ体として用い、異なる反応時間で反応させた結果を示す図である。図中に百分率で示した数値はBispecific抗体生成率を示し、Bispecific抗体に対応するピークの面積を、系中に存在する全抗体の面積で割り、100を掛けて算出したものである。 イオン交換クロマトグラフィーによるFab Arm Exchange反応産物の解析結果を示す図である。MRAH-G1mrP1/MRAL-k0とH54-G1mrN1/L28-k0をホモ体として用い、細胞培養上清中で反応させた結果を示す図である。図中に百分率で示した数値はBispecific抗体生成率を示し、Bispecific抗体に対応するピークの面積を、系中に存在する全抗体の面積で割り、100を掛けて算出したものである。 マウスIgG1のCH3ドメインの相互作用界面周辺の立体構造を示す図である（PDB code 1IGY）。 CE-IEFによるマウスIgG型Fab Arm Exchange反応産物の解析結果を示す図である。図中に百分率で示した数値はBispecific抗体生成率を示し、Bispecific抗体に対応するピークの面積を、系中に存在する全抗体の面積で割り、100を掛けて算出したものである。 抗ヒトグリピカン３/抗ヒトCD３二重特異性抗体の細胞傷害活性を比較した図である。図１０−１はヒトIgG型Fab Arm Exchangeを用いて、図１０−２はマウスIgG型Fab Arm Exchangeを用いて作製した二重特異性抗体と、CrossMab技術により作製した二重特異性抗体を比較したものである。 ヒトIgG型Fab Arm Exchangeにより作製した抗ヒトグリピカン３/抗ヒトCD3二重特異性抗体およびKnobs-into-Holes技術により作製した二重特異性抗体のノーマルマウスにおける血中濃度推移を示した図である。 マウスIgG型Fab Arm Exchangeにより作製した抗ヒトIL-6レセプター抗体と、天然型マウスIgG１の配列をもつ抗ヒトIL-6レセプター抗体の血中濃度推移を示した図である。
本発明は、還元条件下で、第１の抗原結合活性を有するポリペプチド及び該第１の抗原結合活性と異なる第２の抗原結合活性を有するポリペプチドの各ホモ体の解離を促進し、ヘテロ体の会合を制御するために、重鎖CH3領域のアミノ酸残基を改変することによって所望の異種多量体を製造する方法に関する。さらに、本発明は所望の異種多量体を選択する方法に関する。
用語の定義
本発明における「ポリペプチド」とは、アミノ酸配列中に重鎖Fc領域を含む、ポリペプチド（Fc領域含有ポリペプチド）およびタンパク質（Fc領域含有タンパク質）を指す。また、通常、生物由来のポリペプチドであるが、特に限定されず、例えば、人工的に設計された配列からなるポリペプチドであってもよい。また、天然ポリペプチド、あるいは合成ポリペプチド、組換えポリペプチド等のいずれであってもよい。さらに、上記のポリペプチドの断片もまた、本発明のポリペプチドに含まれる。
本明細書において、「抗体」とは、天然のものであるかまたは部分的もしくは完全合成により製造された免疫グロブリンをいう。抗体はそれが天然に存在する血漿や血清等の天然資源や抗体を産生するハイブリドーマ細胞の培養上清から単離され得るし、または遺伝子組換え等の手法を用いることによって部分的にもしくは完全に合成され得る。抗体の例としては免疫グロブリンのアイソタイプおよびそれらのアイソタイプのサブクラスが好適に挙げられる。ヒトの免疫グロブリンとして、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgMの9種類のクラス（アイソタイプ）が知られている。マウスの免疫グロブリンとして、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3の4種類のクラスが知られている。本発明の抗体には、これらのアイソタイプのうちヒトの免疫グロブリンとしてはIgG1、IgG2、IgG3、IgG4が、マウスの免疫グロブリンとしてはIgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3が含まれ得る。マウスの免疫グロブリンとしては、IgG1が好ましい。ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、ヒトIgG4定常領域としては、遺伝子多形による複数のアロタイプ配列がSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242 に記載されているが、本発明においてはそのいずれであっても良い。特にヒトIgG1の配列としては、EUナンバリングで表される356-358位のアミノ酸配列がDELであってもEEMであってもよい。また、ヒトIgκ (Kappa)定常領域とヒトIgλ (Lambda)定常領域としては、遺伝子多形による複数のアロタイプ配列がSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242に記載されているが、本発明においてはそのいずれであってもよい。
「Fc領域」なる用語は、天然配列Fc領域及び変異型Fc領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のFc領域の境界は変化するかも知れないが、抗体分子中の、ヒンジ部若しくはその一部、CH2、CH3ドメインからなる領域のことをいう。通常、ヒトＩｇＧ重鎖Fc領域はＣｙｓ２２６の位置のアミノ酸残基からFc領域のカルボキシル末端まで伸長すると定義されるが、これに限定されない。イムノグロブリンのＦｃ領域は、２つの定常領域、CH2及びCH3を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２」ドメインは通常アミノ酸２３１からアミノ酸３４０まで伸展する。「ＣＨ３」ドメインは、Ｆｃ領域におけるカルボキシル末端からＣＨ２領域まで伸展する。すなわち、ＩｇＧのアミノ酸３４１からおおよそアミノ酸４４７まで伸展する。
Fc領域は、IgGモノクローナル抗体等をペプシン等の蛋白質分解酵素にて部分消化した後に、プロテインAあるいはプロテインGカラムに吸着された画分を再溶出することによって好適に取得され得る。かかる蛋白分解酵素としてはpH等の酵素の反応条件を適切に設定することにより制限的にFabやF(ab')2を生じるように全長抗体を消化し得るものであれば特段の限定はされず、例えば、ペプシンやパパイン等が例示できる。
改変箇所番号については、EUナンバリング（Kabat EA et al． 1991． Sequences of Proteins of Immunological Interest．NIH）を採用した。
本発明におけるポリペプチドの「会合（association）」とは、例えば、２以上のポリペプチド領域が相互作用する状態を指すものと換言することができる。
本発明において「会合を制御する」とは、所望の会合状態になるように制御することを言い、より具体的には、ポリペプチド間における望ましくない会合（好ましくは、同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド同士の会合）を形成されにくくするように制御することを言う。
本発明における「界面（interface）」とは、通常、会合（相互作用）する際の会合面を指し、界面を形成するアミノ酸残基とは、通常、その会合に供されるポリペプチド領域に含まれる１もしくは複数のアミノ酸残基であって、より好ましくは、会合の際に接近し相互作用に関与するアミノ酸残基を言う。該相互作用には、具体的には、会合の際に接近するアミノ酸残基同士が水素結合、静電的相互作用、塩橋を形成している場合等が含まれる。
本発明におけるポリペプチドの「ホモ体」とは、同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド同士が会合している状態をいう。
本発明におけるポリペプチドの「ヘテロ体」とは、第１のポリペプチドと、アミノ酸配列において第１のポリペプチドとは少なくとも1個のアミノ酸残基が異なる第２のポリペプチドとが会合している状態をいう。
本発明におけるポリペプチドの「解離」とは、ポリペプチドのホモ体において、2以上のポリペプチドが会合した状態から、各ポリペプチド単体へ分離した状態をいう。
本発明において「異種多量体 (ヘテロマルチマー）」とは、複数種のポリペプチドから構成され、該ポリペプチドが互いに会合し得るタンパク質の多量体を言う。より詳細には、「異種多量体」は、少なくとも第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを有し、ここにおいて第２のポリペプチドはアミノ酸配列において第１のポリペプチドとは少なくとも1個のアミノ酸残基が異なる分子である。また、特に限定されないが、該異種多量体は、少なくとも 2種の異なるリガンド、抗原、レセプター、または基質等に対して抗原結合活性を有することが好ましい。該異種多量体は、第１および第２のポリペプチドにより形成される「異種２量体」に加えて、さらに別の種のポリペプチドが存在していてもよい。即ち、本発明の「異種多量体」は、異種２量体に制限されず、例えば、異種3量体、異種4量体等も含まれる。
本発明の第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、及び１つ又は２つの第３のポリペプチドを含むポリペプチド多量体において、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドはそれぞれ、第３のポリペプチドと多量体（2量体）を形成することが出来る。また形成された2量体同士が多量体（４量体）を形成することが出来る。２つの第３のポリペプチドは完全に同一のアミノ酸配列を有していてもよい（同じ抗原に対して結合活性を有していてもよい）。あるいは同一のアミノ酸配列でありながら、２以上の活性があってもよい（例えば、２以上の異なる抗原に対して結合活性を有していてもよい）。また、第３のポリペプチドが１つの場合は、第３のポリペプチドは、第１のポリペプチドあるいは第２のポリペプチドのいずれか一方と2量体を形成し、ポリペプチド多量体を形成することが出来る。
本発明のポリペプチド多量体において、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは異なる抗原に対して結合活性を有することが好ましい。一方、第３のポリペプチドは、第１のポリペプチドや第２のポリペプチドのいずれか又は両方と同じ抗原に対して結合活性を有するポリペプチドであってもよい。あるいは、第１のポリペプチドや第２のポリペプチドとは異なる抗原に対して結合活性を有するポリペプチドであってもよい。
あるいは本発明のポリペプチド多量体は、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、第３のポリペプチド、及び第４のポリペプチドを含むポリペプチド多量体とすることも出来る。このようなポリペプチド多量体において、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドはそれぞれ、第３のポリペプチド及び第４のポリペプチドと多量体（2量体）を形成することが出来る。例えば、第１のポリペプチドと第３のポリペプチド、第２のポリペプチドと第４のポリペプチドの間でジスルフィド結合を形成することにより、2量体を形成することができる。
本発明のポリペプチド多量体においては、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドは異なる抗原に対して結合活性を有することが好ましい。一方、第３のポリペプチドは、第１のポリペプチドや第２のポリペプチドのいずれか又は両方と同じ抗原に対して結合活性を有するポリペプチドであってもよい。あるいは、第１のポリペプチドや第２のポリペプチドとは異なる抗原に対して結合活性を有するポリペプチドであってもよい。また第４のポリペプチドは、第１のポリペプチドや第２のポリペプチドのいずれかと同じ抗原に対して結合活性を有するポリペプチドであってもよい。あるいは、第１のポリペプチドや第２のポリペプチドとは異なる抗原に対して結合活性を有するポリペプチドであってもよい。
本発明における「異種多量体」が二重特異性抗体であるとき、例えば、第1のポリペプチドと第２のポリペプチドがそれぞれ抗原Aに対する抗体重鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチド、抗原Bに対する抗体重鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチドである場合、第３のポリペプチドを抗原Aに対する抗体軽鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチド、第４のポリペプチドを抗原Bに対する抗体軽鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチドとすることができる。
本発明において「抗原結合活性を有するポリペプチド」とは、抗体重鎖あるいは軽鎖の可変領域、レセプター、レセプターとFc領域の融合ペプチド、Scaffold及びこれらの断片など、抗原、リガンドなどのタンパク質やペプチドに対して結合可能なドメイン（領域）を有する5アミノ酸以上の長さを有するペプチド及びタンパク質を指す。すなわち抗原結合活性を有するポリペプチドは、抗体可変領域、レセプター、レセプターとFc領域の融合ペプチド、Scaffold、又はこれらの断片のアミノ酸配列を含むことが出来る。
Scaffoldとしては、少なくとも１つの抗原に結合することができる立体構造的に安定なポリペプチドであれば、どのようなポリペプチドであっても用いることができる。そのようなポリペプチドとしては、例えば、抗体可変領域断片、フィブロネクチン、Protein Aドメイン、LDL受容体Aドメイン、リポカリン等のほか、Nygrenら(Current Opinion in Structural Biology, 7:463-469(1997)、Journal of Immunol Methods, 290:3-28(2004))、Binzら(Nature Biotech 23:1257-1266(2005))、Hosseら(Protein Science 15:14-27(2006))に記載の分子が挙げられるがこれらに限定されない。
抗体の可変領域、レセプター、レセプターとFc領域の融合ペプチド、Scaffold及びこれらの断片の取得方法は当業者に周知である。領域のアミノ酸配列と抗体軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含むポリペプチドを用いることも出来る。
本発明における「還元条件」とは、重鎖ヒンジ領域内の重鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基が、酸化されるより還元された状態になる可能性が高い条件または環境を指し、好ましくは、重鎖間のヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にする条件または環境を指し、特に好ましくは、ヒンジ領域外のシステインはジスルフィド結合の有意な異性化を起こさないが（すなわち、重鎖と軽鎖の間のジスルフィド結合を保存したまま）、重鎖ヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にする条件または環境を指す。例えば、本発明において，還元条件下で、Fc領域を含む第一のポリぺプチドのホモ体とFc領域を含む第二のポリペプチドを共にインキュベートする時間は、当業者が適宜設定することが出来る。
本発明における「還元剤」とは、その環境において分子を還元する化合物、すなわち、その環境において分子をより還元した状態に、およびより還元しつつある状態に変える化合物を指す。還元剤は、電子を供与することにより作用し、それによって、基質の還元後にそれ自体は酸化された状態になる。したがって、還元剤とは電子を供与する作用物質である。還元剤の例には、ジチオスレイトール（DTT）、メルカプトエタノール、システイン、チオグリコール酸、システアミン（2-メルカプトエチルアミン：2-MEA）、グルタチオン（GSH）、TCEP（トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン）および水素化ホウ素ナトリウムが含まれる。
本発明における「重鎖間ジスルフィド結合の異性化」とは、異なる重鎖に含まれるシステイン間でのジスルフィド結合の交換、すなわちジスルフィド結合の再編成を指す。
「ジスルフィド結合形成」とは、１つまたは２つのポリペプチド中に存在する２つのシステイン間で共有結合を形成する過程を指し、この結合は「-S--S-」として図式化される。
「ジスルフィド結合の還元」とは、ジスルフィド結合の切断によって、２つのチオール基(-SH基)が生じる過程を指す。
本発明における「FcγR」または「FcgR」とは、Fcγ受容体であり、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4モノクローナル抗体のFc領域に結合し得る受容体をいい、実質的にFcγ受容体遺伝子にコードされるタンパク質のファミリーのいかなるメンバーをも意味する。ヒトでは、このファミリーには、例えば、アイソフォームFcγRIa、FcγRIbおよびFcγRIcを含むFcγRI（CD64）；アイソフォームFcγRIIa（アロタイプH131（H型）およびR131（R型）を含む）、FcγRIIb（FcγRIIb-1およびFcγRIIb-2を含む）およびFcγRIIcを含むFcγRII（CD32）；およびアイソフォームFcγRIIIa（アロタイプV158およびF158を含む）およびFcγRIIIb（アロタイプFcγRIIIb-NA1およびFcγRIIIb-NA2を含む）を含むFcγRIII（CD16）、並びにいかなる未発見のヒトFcγR類またはFcγRアイソフォームまたはアロタイプも含まれる。FcγRは、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサル由来のものが含まれるが、これらに限定されず、いかなる生物由来でもよい。マウスFcγR類には、例えば、FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）およびFcγRIII-2（CD16-2）、FcγRIV並びにいかなる未発見のマウスFcγR類またはFcγRアイソフォームまたはアロタイプも含まれる。
アミノ酸残基の電荷反発を利用した改変による異種多量体の製造方法
上記方法の好ましい態様においては、本発明は、2種以上の多量体を形成し得る異種多量体について、第１及び第２のポリペプチドのホモ体の解離を促進し、1種以上の多量体を形成するポリペプチド間の会合を制御するために、ポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基を改変し、所望のポリペプチドのヘテロ体を製造する方法である。
また、本発明の第１の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第２の抗原結合活性を有するポリペプチドは、抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列あるいは抗体Fc領域のアミノ酸配列を含むことが出来る。抗体Fc領域又は抗体重鎖定常領域のアミノ酸配列としては、ヒトIgGタイプの定常領域あるいはFc領域のアミノ酸配列が挙げられるがこれらに限定されない。IgGタイプの定常領域あるいはFc領域としては、天然型IgG1、IgG2、IgG3、IgG4のアイソタイプのいずれであってもよい。あるいはこれらの改変体であってもよい。Fc領域のEUナンバリング４４７位のリジン及びEUナンバリング４４６位のグリシンが、これらをコードする核酸を組み換え遺伝子操作することによって、取り除かれてもよい。
また、本発明の第３の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第４の抗原結合活性を有するポリペプチドは、抗体軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含むことが出来る。抗体軽鎖定常領域のアミノ酸配列としては、ヒトkappa、ヒトlambdaタイプの定常領域のアミノ酸配列を挙げることが出来るが、これらに限定されない。あるいは、これらの改変体であってもよい。
また、本発明の抗原結合活性を有するポリペプチドは、抗体可変領域のアミノ酸配列（例えばCDR1、CDR2、CDR3、FR1、FR2、FR3、FR4のアミノ酸配列）を含むことが出来る。
また、本発明のポリペプチド間の解離及び／又は会合制御方法の好ましい態様にあっては、当該方法として、重鎖の定常領域の界面に電荷的な反発を導入して重鎖同士の会合を抑制させる方法が挙げられる。重鎖定常領域の界面で接触するアミノ酸残基としては、例えばCH3領域における356位と439位、357位と370位、399位と409位に相対する領域を挙げることができる。重鎖定常領域についてはEUナンバリングによって表示した。
後述の実施例で示すように、これらアミノ酸残基を改変し、本発明の方法を実施することにより、ポリペプチド間の重鎖の解離及び／又は会合を制御し、所望の異種多量体を優先的に取得することができる。即ち、好ましい態様において、本発明は、2種以上の重鎖Fc領域を含む抗体および Fc領域含有蛋白質（例えば、IgG型抗体、minibody(Alt M et al. FEBS Letters 199 9; 454: 90-94)、イムノアドへシン (非特許文献2)等)であって、第1の重鎖Fc領域における以下の（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組から選択される1組ないし3組のアミノ酸残基が同種の電荷を有するポリペプチドを提供する。
(1) EUナンバリングによる356位および439位のアミノ酸残基
(2) EUナンバリングによる357位および370位のアミノ酸残基(3) EUナンバリングによる399位および409位のアミノ酸残基
さらに、本発明は、上記第1の重鎖Fc領域とは異なる第2の重鎖Fc領域における前記（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組から選択される1組ないし3組のアミノ酸残基であって、前記第1の重鎖Fc領域における前記（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組のうち同種の電荷を有する組と同じ位置のアミノ酸残基が、前記第1の重鎖Fc領域におけるアミノ酸残基とは反対の電荷を有するポリペプチドを提供する。
上記ポリペプチドにおいて、「電荷を有するアミノ酸残基」は、例えば、以下の（a)または (b) のいずれかの群に含まれるアミノ酸残基から選択されることが好ましい。
(a)グルタミン酸（E)、アスパラギン酸（D)；
(b)リジン（K)、アルギニン（R)、ヒスチジン（H)。
上記ポリペプチドにおいて、「同種の電荷を有する」とは、例えば、2つ以上のアミノ酸残基のいずれもが、上記(a)または(b)のいずれか1の群に含まれるアミノ酸残基を有することを意味する。「反対の電荷を有する」とは、例えば、2つ以上のアミノ酸残基のなかの少なくとも1つのアミノ酸残基が上記(a)または(b)のいずれか1つの群に含まれるアミノ酸残基を有する場合に、残りのアミノ酸残基が異なる群に含まれるアミノ酸残基を有することを意味する。
好ましい態様において、上記ポリペプチドは、第1の重鎖CH3領域と第2の重鎖CH3領域がジスルフィド結合により架橋されていてもよい。
本発明における「会合界面制御改変」として、例えば、以下の改変が挙げられる：
(1) 第1の重鎖Fc領域におけるEUナンバリングによる356位のAsp(D)の、Lys(K)、Arg(R)又はHis(H)への改変、及び第2の重鎖Fc領域におけるEUナンバリングによる439位のLys(K)の、Glu(E)又はAsp(D)への改変；
(2) 第1の重鎖Fc領域におけるEUナンバリングによる357位のGlu(E)の、Lys(K)、Arg(R)又はHis(H)への改変、及び第2の重鎖Fc領域におけるEUナンバリングによる370位のLys(K)の、Glu(E)又はAsp(D)への改変；
(3) 第1の重鎖Fc領域におけるEUナンバリングによる399位のAsp(D)の、Lys(K)、Arg(R)又はHis(H)への改変、及び第2の重鎖Fc領域におけるEUナンバリングによる409位のLys(K)の、Glu(E)又はAsp(D)への改変。
本発明の非限定の一態様として、マウス異種多量体の製造方法に関するポリペプチド間の解離及び／又は会合制御方法の好ましい態様にあっては、当該方法として、重鎖の定常領域の界面に電荷的な反発を導入して重鎖同士の会合を抑制させる方法が挙げられる。当該方法においては、重鎖定常領域の界面で接触するアミノ酸残基としては、例えばCH3領域における356位と439位、360位と371位、399位と409位に相対する領域を挙げることができる。重鎖定常領域についてはEUナンバリングによって表示した。
後述の実施例で示すように、これらマウス由来のCH3領域におけるアミノ酸残基を改変し、本発明の方法を実施することにより、ポリペプチド間の重鎖の解離及び／又は会合を制御し、所望の異種多量体を優先的に取得することができる。即ち、好ましい態様において、本発明は、2種以上の重鎖Fc領域を含む抗体および Fc領域含有蛋白質（例えば、IgG型抗体、minibody(Alt M et al. FEBS Letters 199 9; 454: 90-94)、イムノアドへシン (非特許文献2)等)であって、第1の重鎖Fc領域における以下の（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組から選択される1組ないし3組のアミノ酸残基が同種の電荷を有するポリペプチドを提供する。
(1) EUナンバリングによる 356 位および 439位のアミノ酸残基
(2) EUナンバリングによる 360 位および 371位のアミノ酸残基
(3) EUナンバリングによる 399 位および 409位のアミノ酸残基
さらに、本発明は、上記第1の重鎖Fc領域とは異なる第2の重鎖Fc領域における前記（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組から選択される1組ないし3組のアミノ酸残基であって、前記第1の重鎖Fc領域における前記（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組のうち同種の電荷を有する組と同じ位置のアミノ酸残基が、前記第1の重鎖Fc領域におけるアミノ酸残基とは反対の電荷を有するポリペプチドを提供する。
上記ポリペプチドにおいて、「電荷を有するアミノ酸残基」は、例えば、以下の（a)または (b) のいずれかの群に含まれるアミノ酸残基から選択されることが好ましい。
(a)グルタミン酸（E)、アスパラギン酸（D)；
(b)リジン（K)、アルギニン（R)、ヒスチジン（H)。
上記ポリペプチドにおいて、「同種の電荷を有する」とは、例えば、2つ以上のアミノ酸残基のいずれもが、上記(a)または(b)のいずれか1の群に含まれるアミノ酸残基を有することを意味する。「反対の電荷を有する」とは、例えば、2つ以上のアミノ酸残基のなかの少なくとも1つのアミノ酸残基が上記(a)または(b)のいずれか1つの群に含まれるアミノ酸残基を有する場合に、残りのアミノ酸残基が異なる群に含まれるアミノ酸残基を有することを意味する。
好ましい態様において、上記ポリペプチドは、第1の重鎖CH3領域と第2の重鎖CH3領域がジスルフィド結合により架橋されていてもよい。
本発明における「会合界面制御改変」として、例えば、以下の改変が挙げられる：
(1) 第1の重鎖Fc領域におけるEUナンバリングによる356位のAsp(D)の、Lys(K)、Arg(R)又はHis(H)への改変、及び第2の重鎖Fc領域におけるEUナンバリングによる439位のLys(K)の、Glu(E)又はAsp(D)への改変；
(2) 第1の重鎖Fc領域におけるEUナンバリングによる360位のGlu(E)の、Lys(K)、Arg(R)又はHis(H)への改変、及び第2の重鎖Fc領域におけるEUナンバリングによる371位のLys(K)の、Glu(E)又はAsp(D)への改変；
(3) 第1の重鎖Fc領域におけるEUナンバリングによる399位のAsp(D)の、Lys(K)、Arg(R)又はHis(H)への改変、及び第2の重鎖Fc領域におけるEUナンバリングによる409位のLys(K)の、Glu(E)又はAsp(D)への改変
本発明において「改変」に供するアミノ酸残基としては、ポリペプチドの定常領域のアミノ酸残基に限られない。当業者であれば、ポリペプチド変異体または異種多量体について、市販のソフトウェアを用いたホモロジーモデリング等により、界面を形成するアミノ酸残基を見出すことができ、会合を制御するように、該部位のアミノ酸残基を改変に供することが可能である。
本発明の方法におけるアミノ酸残基の「改変」とは、具体的には、元のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換すること、元のアミノ酸残基を欠失させること、新たなアミノ酸残基を付加すること等を指すが、好ましくは、元のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基へ置換することを指す。
397位及び／又は392位のアミノ酸改変による異種多量体の製造方法
本発明のポリペプチド間の解離及び／又は会合制御方法のさらに好ましい態様にあっては、当該方法は、重鎖CH3領域の安定性が不安定になるように、重鎖Fc領域にアミノ酸残基の変異を導入することを特徴とする方法である。当該方法は、任意で、上記電荷反発等を利用した界面制御に係るアミノ酸改変を導入する工程をさらに含んでもよい。
本発明における「CH3領域の安定性が不安定」とは、Fc領域のアミノ酸残基に少なくとも1以上の改変を加えたポリペプチドのホモ体が、未改変のポリペプチドのホモ体に比べて、各ポリペプチド単体へ分離し易くなっている状態をいう。
本発明における「CH3領域の安定性が不安定」とは、好ましくは、pH 7.4における重鎖CH3領域の熱変性中間温度(Tm)が72.5℃以下、72.0℃以下、71.5℃以下、71.0℃以下、70.5℃以下になるように、CH3領域のアミノ酸残基に改変を導入した状態をいい、さらに好ましくは、70.4℃以下、70.3℃以下、70.2℃以下、70.1℃以下、70.0℃以下、69.9℃以下、69.8℃以下、69.7℃以下、69.6℃以下、69.5℃以下、69.0℃以下、68.5℃以下、68.0℃以下、67.5℃以下になるようにCH3領域のアミノ酸残基に改変を導入した状態をいう。
例えば、重鎖CH3領域のTmは、本明細書の参考例３に記載の方法で測定することができ、測定に使用する緩衝液等は適宜選択することが出来る。
本発明のポリペプチド間の解離及び／又は会合制御方法のさらに好ましい態様にあっては、当該方法は、重鎖CH3領域のEUナンバリング397位及び／又は392位にアミノ酸残基の変異を導入することを特徴とする方法である。当該方法は、任意で、上記電荷反発等を利用した界面制御に係るアミノ酸改変を導入する工程をさらに含んでもよい。
本発明の非限定の一態様として、マウス由来のポリペプチド間の解離及び／又は会合制御方法においても重鎖CH3領域のEUナンバリング397位及び／又は392位にアミノ酸残基の変異を導入することができる。当該方法は、任意で、上記電荷反発等を利用した界面制御に係るアミノ酸改変を導入する工程をさらに含んでもよい。
397位に変異を導入するアミノ酸残基としては、側鎖が嵩高いアミノ酸又は側鎖分岐型のアミノ酸に改変することが好ましい。
392位に変異を導入するアミノ酸残基としては、負電荷を有するアミノ酸、側鎖が嵩高いアミノ酸又は側鎖分岐型のアミノ酸に改変することが好ましい。
本発明における「側鎖が嵩高いアミノ酸」として、Met(M), Phe(F)，Tyr(Y)，Val(V)，Leu(L)，Ile(I)，Trp(W), Arg(R), His(H), Glu(E), Lys(K), Gln(Q), Asp(D), Asn(N), Cys(C), Thr(T)などが挙げられ、好ましくはMet(M), Phe(F), Thr(T)及びTyr(Y)が挙げられる。
本発明における「側鎖分岐型のアミノ酸」として、Val(V)，Ile(I)，Leu(L)が挙げられ、好ましくはVal(V)及びIle(I)などが挙げられる。
本発明における「負電荷を有するアミノ酸」として、Asp(D)及びGlu(E)が挙げられる。
本発明における「異種多量体」として、好ましくは多重特異性抗体及びヘテロ融合タンパク質等を挙げることができる。
本発明の非限定の一態様としては，FcγRへの結合が増強される異種多量体のアミノ酸改変を提供することである。好ましいアミノ酸改変部位としては、EUナンバリング397位のアミノ酸の改変が挙げられるが，これに限定されることはない。397位に変異を導入するアミノ酸残基としては、側鎖が嵩高いアミノ酸又は側鎖分岐型のアミノ酸に改変することが好ましい。
本発明において、さらに好ましくは多重特異性抗体として、IgG type、scFv-IgG、Tandem scFv-Fc、DVD-Ig、Diabody-Fc、Single chain Diabody-Fc、IgG-scFv、sVD-IgG、Tandemab、scFv light chain C-terminal fusion、Tri-specific C-terminal fusion、Tri-specific N-terminal fusion、IgG-Fab等が挙げられる(Bispecific Antibodies, Roland E. Kontermann, 2011,WO2010034441, WO2010145792)。
本発明において、「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体変異体（キメラ抗体、ヒト化抗体、低分子化抗体（抗体断片も含む）、多重特異性抗体等）が含まれる。また、本発明において「抗体」は、ポリペプチドあるいは異種多量体のいずれであってもよい。好ましい抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び抗体断片等の低分子化抗体である。本発明においては、これら抗体の取得 (作成）の際に、好適に本発明の解離及び／又は会合制御方法を用いることができる。
本発明の方法に供される好ましいポリペプチドもしくは異種多量体としては、例えば、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有するポリペプチドもしくは異種多量体を挙げることができる。また、より好ましくは、本発明の好ましい態様として、本発明のポリペプチドもしくは異種多量体が2種以上の重鎖可変領域と2種以上の軽鎖可変領域を含む際の、当該ポリペプチドもしくは異種多量体の解離及び／又は会合制御方法を挙げることができる。
本発明の抗原結合活性を有するポリペプチドは、抗体重鎖のアミノ酸配列又は抗体軽鎖のアミノ酸配列を含むことが出来る。より具体的には、第１の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第２の抗原結合活性を有するポリペプチドは、抗体重鎖のアミノ酸配列を含むことが出来、第３の抗原結合活性を有するポリペプチド及び第４の抗原結合活性を有するポリペプチドは、抗体軽鎖のアミノ酸配列を含むことが出来る。
また、目的のポリペプチド多量体が、第１のポリペプチドと第３のポリペプチドで２量体を形成し、第２のポリペプチドと第４のポリペプチドで2量体を形成し、さらにこれら2量体同士が多量体を形成するような4量体である場合には、本発明のポリペプチド多量体として、例えば、第１と第２の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体重鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、第３と第４の抗原結合活性を有するポリペプチドが抗体軽鎖のアミノ酸配列を含むポリペプチドであるポリペプチド多量体を用いることもできる。
本発明においてさらに好ましくは、多重特異性抗体として二重特異性抗体を挙げることができる。
即ち、本発明の好ましい態様においては、本発明は、例えば、2種の重鎖（本発明におけるポリペプチド多量体の第１のポリペプチドと第２のポリペプチド）と、2種の軽鎖（本発明におけるポリペプチド多量体の第３のポリペプチドと第４のポリペプチド）から構成される二重特異性抗体について解離及び／又は会合を制御する方法に関する。
本発明の好ましい態様の「二重特異性抗体」についてさらに詳述すれば、上記「第１のポリペプチド及び第2のポリペプチド」とは、抗体を形成する2つの重鎖（H鎖）のうちの一方のH鎖（第１のH鎖）、及び当該H鎖とは異なるもう一方のH鎖（第２のH鎖）のことをいう。つまり、2つのH鎖のうち任意にどちらか一方を第１のH鎖とし、他方を第２のH鎖とすることができる。同様に、「第３のポリペプチド及び第４のポリペプチド」とは、二重特異性抗体を形成する2つの軽鎖（L鎖）のうちの一方のL鎖（第１のL鎖）、及び当該L鎖とは異なるもう一方のL鎖（第２のL鎖）のことを指し、2つのL鎖のうちどちらか一方を任意に第１のL鎖とし、他方を第２のL鎖とすることができる。通常、第１のL鎖と第１のH鎖は或る抗原(又はエピトープ)を認識する同一の抗体より由来し、第２のL鎖と第２のH鎖も或る抗原(又はエピトープ)を認識する同一の抗体より由来する。ここで、第１のH鎖・L鎖で形成されるL鎖-H鎖対を第１の対（又は第１のHL分子）、第２のH鎖・L鎖で形成されるL鎖-H鎖対を第２の対（又は第２のHL分子）と呼ぶ。第１の対と第２の対が認識する抗原は同じでもよいが、好ましくは異なるエピトープを認識する。この場合、第１の対及び第２の対のH鎖とL鎖は互いに異なるアミノ酸配列を有していることが好ましい。第１の対と第２の対が異なるエピトープを認識する場合、該第１の対と第２の対は全く異なる抗原を認識してもよいし、同一抗原上の異なる部位(異なるエピトープ)を認識してもよい（例えば、抗原がヘテロ受容体の場合には、多重特異性抗体はへテロ受容体を構成する異なるドメインを認識する、あるいは、抗原がモノマーの場合には、多重特異性抗体はモノマー抗原の複数箇所を認識する)。通常、このような分子は2個の抗原と結合するものであるが、それ以上の（例えば、3種類の)抗原に対して特異性を有していてもよい。又、一方がタンパク質、ペプチド、遺伝子、糖などの抗原を認識し、他方が放射性物質、化学療法剤、細胞由来トキシン等の細胞傷害性物質などを認識してもよい。しかしながら、特定のH鎖とL鎖の組合せで形成される対を有する抗体を作製したいと考えた場合には、その特定のH鎖とL鎖を第１の対及び第２の対として任意に決定することができる。
本発明における「融合タンパク質」は、２つ以上の同一の又は実質的に類似したタンパク質分子がＩｇヒンジ領域アミノ酸配列リンカーを介して接合したタンパク質を説明する。１種を超えるタンパク質を含有した融合タンパク質を説明する場合、「ヘテロ」の接頭語を用いる。例えば、「ヘテロ融合タンパク質」は、１以上の残部タンパク質と異なる１以上のタンパク質をともに接合した２つ以上のタンパク質を含有する。
本発明における「抗体」には、上述の抗体に対してさらにアミノ酸の置換、欠失、付加及び／若しくは挿入、またはキメラ化やヒト化等により、そのアミノ酸配列が改変されたものが含まれる。アミノ酸の置換、欠失、付加及び／又は挿入、並びにヒト化、キメラ化などのアミノ酸配列の改変は、当業者に公知の方法により行うことが可能である。同様に、本発明における抗体を組換え抗体として作製する際に利用する抗体の可変領域及び定常領域も、アミノ酸の置換、欠失、付加及び／若しくは挿入、またはキメラ化やヒト化等によりそのアミノ酸配列を改変してもよい。
本発明における抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ラクダ抗体など、どのような動物由来の抗体でもよい。さらに、例えば、キメラ抗体、中でもヒト化抗体などのアミノ酸配列を置換した改変抗体でもよい。また、各種分子を結合させた抗体修飾物、抗体断片、低分子化抗体などいかなる抗体でもよい。
「キメラ抗体」とは、異なる動物由来の配列を組合わせて作製される抗体である。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変（V）領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常（C）領域からなる抗体を例示することができる。キメラ抗体の作製は公知であり、例えば、抗体V領域をコードするDNAを、ヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることによりキメラ抗体を得ることができる。
「ヒト化抗体」とは、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される、ヒト以外の哺乳動物由来の抗体、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR;complementarity determining region）をヒト抗体のCDRへ移植したものである。CDRを同定するための方法は公知である（Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877）。また、その一般的な遺伝子組換え手法も公知である（欧州特許出願公開番号EP 125023号公報、WO 96/02576 号公報参照）。そこで公知の方法により、例えば、マウス抗体のCDRを決定し、該CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（framework region；FR）とが連結された抗体をコードするDNAを取得し、ヒト化抗体を通常の発現ベクターを用いた系により産生することができる。このようなDNAは、CDR及びFR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCR法により合成することができる(WO98/13388号公報に記載の方法を参照)。CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、CDRが良好な抗原結合部位を形成するように選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるFRのアミノ酸を改変してもよい（Sato et al., Cancer Res. (1993) 53: 851-6）。改変できるFR中のアミノ酸残基には、抗原に直接、非共有結合により結合する部分（Amit et al., Science (1986) 233: 747-53）、CDR構造に影響または作用する部分（Chothia et al., J. Mol. Biol. (1987) 196: 901-17）及びVH-VL相互作用に関連する部分（EP239400号特許公報）が含まれる。
本発明における抗体がキメラ抗体またはヒト化抗体である場合には、これらの抗体のC領域には、好ましくはヒト抗体由来のものが使用される。例えばH鎖では、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4を、L鎖ではCκ、Cλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を必要に応じ修飾してもよい。本発明におけるキメラ抗体は、好ましくはヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト化抗体は、好ましくはヒト以外の哺乳動物由来抗体のCDRと、ヒト抗体由来のFRおよびC領域とからなる。ヒト抗体由来の定常領域は、IgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）、IgM、IgA、IgD及びIgE等のアイソタイプごとに固有のアミノ酸配列を有する。本発明におけるヒト化抗体に用いられる定常領域は、どのアイソタイプに属する抗体の定常領域であってもよい。好ましくは、ヒトIgGの定常領域が用いられるが、これに限定されるものではない。また、ヒト化抗体に利用されるヒト抗体由来のFRも特に限定されず、どのアイソタイプに属する抗体のものであってもよい。
本発明におけるキメラ抗体及びヒト化抗体の可変領域及び定常領域は、元の抗体の結合特異性を示す限り、欠失、置換、挿入及び/または付加等により改変されていてもよい。
ヒト由来の配列を利用したキメラ抗体及びヒト化抗体は、ヒト体内における抗原性が低下しているため、治療目的などでヒトに投与する場合に有用と考えられる。
等電点改変技術等との組み合わせ
本発明のさらなる好ましい態様としては、ポリペプチドの等電点（pI値）を改変するアミノ酸変異を、本発明のポリペプチドに導入することによって、目的の第１〜第４のポリペプチドを有するポリペプチド多量体をより高純度に且つ効率的に精製あるいは製造することが可能である（WO2007114325、US20130171095）。ポリペプチドの会合を促進するために導入されるアミノ酸変異としては、Protein Eng. 1996 Jul;9(7):617-21.、Protein Eng Des Sel. 2010 Apr;23(4):195-202.、J Biol Chem. 2010 Jun 18;285(25):19637-46.、WO2009080254、US20130195849等に記載された、重鎖定常領域のCH3ドメインの改変により２種類の重鎖定常領域を含むポリペプチドをヘテロ会合化する方法、および、WO2009080251、WO2009080252、WO2009080253等に記載された、重鎖と軽鎖の特定の組み合わせの会合化を促進する方法等を用いることも可能である。
標的組織特異的抗原結合分子に関する技術との組み合わせ
本発明の非限定の実施態様としては、標的組織特異的に存在する分子の濃度依存的に抗原から解離・結合する抗体技術(WO2013/180200)との組み合わせが挙げられる。
他の定常領域及び／又は可変領域改変技術との組み合わせ
本発明の非限定の実施態様としては、FcγRへの結合増強を目的とした定常領域改変技術（WO2013047752）との組み合わせが挙げられる。
本発明と他の定常領域改変技術のその他の組み合わせの態様として、補体への結合を制御する技術との組み合わせが挙げられる。補体としては、補体カスケードを形成するポリペプチドであればいずれの補体成分も使用され得るが、好ましい補体としては、オプソニンの結合に関与するC1q、C1rまたはC1sの補体成分が好適に挙げられる。Fc領域の補体に対する結合活性が補体に対する天然型Fc領域の結合活性よりも高いFc領域は、天然型Fc領域のアミノ酸を改変することによって作製され得る。ここでいう天然型Fc領域とは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4で表されるFc領域を指す。Fc領域の補体に対する結合活性が、天然型Fc領域の補体に対する結合活性より高いか否かは、FACS、ELISA等の公知の免疫学的方法を用いて適宜実施され得る。Fc領域の「アミノ酸の改変」または「アミノ酸改変」とは、出発Fc領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列に改変することを含む。出発Fc領域の修飾改変体がpH中性域において補体に結合することができる限り、いずれのFc領域も出発ドメインとして使用され得る。また、既に改変が加えられたFc領域を出発Fc領域としてさらなる改変が加えられたFc領域も本発明のFc領域として好適に使用され得る。出発Fc領域とは、ポリペプチドそのもの、出発Fc領域を含む組成物、または出発Fc領域をコードするアミノ酸配列を意味し得る。出発Fc領域には、抗体の項で概説された組換えによって産生された公知のIgG抗体のFc領域が含まれ得る。出発Fc領域の起源は、限定されないが非ヒト動物の任意の生物またはヒトから取得され得る。好ましくは、任意の生物としては、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ネコ、ウサギ、イヌ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ラクダ、および非ヒト霊長類から選択される生物が好適に挙げられる。別の態様において、出発Fc領域はまた、カニクイザル、マーモセット、アカゲザル、チンパンジー、またはヒトから取得され得る。好ましくは、出発Fc領域は、ヒトIgG1から取得され得るが、IgGの特定のクラスに限定されるものでもない。このことは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域を出発Fc領域として適宜用いることができることを意味する。同様に、本明細書において、前記の任意の生物からのIgGの任意のクラスまたはサブクラスのFc領域を、好ましくは出発Fc領域として用いることができることを意味する。天然に存在するIgGのバリアントまたは操作された型の例は、公知の文献（Curr. Opin. Biotechnol. (2009) 20 (6), 685-91、Curr. Opin. Immunol. (2008) 20 (4), 460-470、Protein Eng. Des. Sel. (2010) 23 (4), 195-202、WO2009086320、WO2008092117、WO2007041635、およびWO2006105338）に記載されるがそれらに限定されない。
アミノ酸の改変は、補体に対する結合活性を有する、もしくは補体結合に対する結合活性を高められるかぎり、いかなる位置のアミノ酸も改変され得る。抗原結合分子が、ヒトFc領域としてヒトIgG1のFc領域を含んでいる場合、補体に対する結合が、ヒトIgG1の出発Fc領域の結合活性より増強する効果をもたらす改変が含まれていることが好ましい。補体に対する結合活性を改変するためのアミノ酸としては、例えばDuncanら（Nature (1988) 332, 738-740）、Taoら（J. Exp. Med.(1993) 178, 661-667）、Brekkeら（Eur. J. Immunol. (1994) 24, 2542-2547）、Xuら（Immunol. (1993) 150, 152A）、WO1994029351、WO2000042072およびWO2011091078等において報告されているC1qに対する結合活性が改変されたFc領域のアミノ酸が例示される。
そのようなC1qに対する結合活性が増強される改変が可能なアミノ酸として、例えば、EUナンバリングで表される231位から238位、318位から337位から選択される少なくとも一つ以上のアミノ酸が挙げられる。当該アミノ酸の非限定な一例として235位、237位、267位、268位、276位、318位、320位、322位、324位、327位、331位、および333位の群から選択される少なくともひとつ以上のアミノ酸が挙げられる。これらのアミノ酸の改変によって、IgG型免疫グロブリンのFc領域の補体に対する結合が増強される。
特に好ましい改変としては、例えば、Fc領域のEUナンバリングで表される；
267位のアミノ酸がGlu、
268位のアミノ酸がPheまたはTyrのいずれか、
276位のアミノ酸がArg、
324位のアミノ酸がThr、
327位のアミノ酸がGly、
331位のアミノ酸がPro、もしくは
333位のアミノ酸がAla、Asp、Gly、SerまたはValのいずれか、
が挙げられる。また、改変されるアミノ酸の数は特に限定されず、一箇所のみのアミノ酸が改変され得るし、これらが任意に組み合わせられた二箇所以上のアミノ酸が改変され得る
本発明と他の定常領域改変技術のその他の組み合わせの態様として、酸性pHでのFcRn結合増強改変Fc技術（WO2002060919、WO2004035752、WO2000042072）、中性pHでのFcRn結合増強改変Fc技術(WO2011122011、WO2012133782)、抑制型Fcγ受容体選択的結合増強技術（WO2012115241、WO2013125667）、活性型Fcγ受容体選択的結合増強技術（ADCC活性増強技術）（WO2013002362）、Rheumatoid factorへの結合活性を低下させる技術(WO2013046704) 等の抗体改変技術との組み合わせが挙げられる。
本発明と可変領域改変技術との非限定の組み合わせの態様としては、pH依存性抗体（WO2009125825）、カルシウム依存性抗体（WO2012073992）等の改変技術との組み合わせが挙げられる。
抗体ライブラリー、免疫及びハイブリドーマ作製
本発明の方法における変異導入前の抗体（本明細書においては、単に「本発明の抗体」と記載する場合あり）のH鎖又はL鎖をコードする遺伝子として既知の配列を用いることも可能であり、又、当業者に公知の方法で取得することもできる。例えば、抗体ライブラリーから取得することも可能であるし、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子をクローニングして取得することも可能である。
抗体ライブラリーについては既に多くの抗体ライブラリーが公知になっており、又、抗体ライブラリーの作製方法も公知であるので、当業者は適宜抗体ライブラリーを入手することが可能である。例えば、抗体ファージライブラリーについては、Clackson et al., Nature 1991, 352: 624-8、Marks et al., J. Mol. Biol. 1991, 222: 581-97、Waterhouses et al., Nucleic Acids Res. 1993, 21: 2265-6、Griffiths et al., EMBO J. 1994, 13: 3245-60、Vaughan et al., Nature Biotechnology 1996, 14: 309-14、及び特表平20−504970号公報等の文献を参照することができる。その他、真核細胞をライブラリーとする方法(WO95/15393号パンフレット)やリボソーム提示法等の公知の方法を用いることが可能である。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を１本鎖抗体(scFv)としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするDNA配列を決定することができる。抗原に結合するscFvのDNA配列が明らかになれば、当該配列を元に適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に周知であり、WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388を参考にすることができる。
ハイブリドーマから抗体をコードする遺伝子を取得する方法は、基本的には公知技術を使用し、所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞(ハイブリドーマ)をスクリーニングし、得られたハイブリドーマのmRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域(V領域)のcDNAを合成し、これを所望の抗体定常領域(C領域)をコードするDNAと連結することにより得ることができる。
より具体的には、特に以下の例示に限定される訳ではないが、上記のH鎖及びL鎖をコードする抗体遺伝子を得るための感作抗原は、免疫原性を有する完全抗原と、免疫原性を示さないハプテン等を含む不完全抗原の両方を含む。例えば、目的タンパク質の全長タンパク質、又は部分ペプチドなどを用いることができる。その他、多糖類、核酸、脂質等から構成される物質が抗原となり得ることが知られており、本発明の抗体の抗原は特に限定されるものではない。抗原の調製は、当業者に公知の方法により行うことができ、例えば、バキュロウィルスを用いた方法(例えば、WO98/46777など)などに準じて行うことができる。ハイブリドーマの作製は、たとえば、ミルステインらの方法(G. Kohler and C. Milstein, Methods Enzymol. 1981, 73: 3-46)等に準じて行うことができる。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と結合させ、免疫を行えばよい。また、必要に応じ抗原を他の分子と結合させることにより可溶性抗原とすることもできる。受容体のような膜貫通分子を抗原として用いる場合、受容体の細胞外領域部分を断片として用いたり、膜貫通分子を細胞表面上に発現する細胞を免疫原として使用することも可能である。
抗体産生細胞は、上述の適当な感作抗原を用いて動物を免疫化することにより得ることができる。または、抗体を産生し得るリンパ球をin vitroで免疫化して抗体産生細胞とすることもできる。免疫化する動物としては、各種哺乳動物を使用できるが、ゲッ歯目、ウサギ目、霊長目の動物が一般的に用いられる。マウス、ラット、ハムスター等のゲッ歯目、ウサギ等のウサギ目、カニクイザル、アカゲザル、マントヒヒ、チンパンジー等のサル等の霊長目の動物を例示することができる。その他、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物も知られており、このような動物を使用することによりヒト抗体を得ることもできる(WO96/34096; Mendez et al., Nat. Genet. 1997, 15: 146-56参照)。このようなトランスジェニック動物の使用に代えて、例えば、ヒトリンパ球をin vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現する細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えばU266と融合させることにより、抗原への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる(特公平1-59878号公報参照)。また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を所望の抗原で免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる(WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO96/34096、WO96/33735参照)。
動物の免疫化は、例えば、感作抗原をPhosphate-Buffered Saline(PBS)または生理食塩水等で適宜希釈、懸濁し、必要に応じてアジュバントを混合して乳化した後、動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。その後、好ましくは、フロイント不完全アジュバントに混合した感作抗原を4〜21日毎に数回投与する。抗体の産生の確認は、動物の血清中の目的とする抗体力価を慣用の方法により測定することにより行われ得る。
ハイブリドーマは、所望の抗原で免疫化した動物またはリンパ球より得られた抗体産生細胞を、慣用の融合剤(例えば、ポリエチレングリコール)を使用してミエローマ細胞と融合して作成することができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986, 59-103)。必要に応じハイブリドーマ細胞を培養・増殖し、免疫沈降、放射免疫分析(RIA)、酵素結合免疫吸着分析(ELISA)等の公知の分析法により該ハイブリドーマより産生される抗体の結合特異性を測定する。その後、必要に応じ、目的とする特異性、親和性または活性が測定された抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等の手法によりサブクローニングすることもできる。
続いて、選択された抗体をコードする遺伝子をハイブリドーマまたは抗体産生細胞(感作リンパ球等)から、抗体に特異的に結合し得るプローブ(例えば、抗体定常領域をコードする配列に相補的なオリゴヌクレオチド等)を用いてクローニングすることができる。また、mRNAからRT-PCRによりクローニングすることも可能である。免疫グロブリンは、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMの5つの異なるクラスに分類される。さらに、これらのクラスは幾つかのサブクラス(アイソタイプ)(例えば、IgG-1、IgG-2、IgG-3、及びIgG-4;IgA-1及びIgA-2等)に分けられる。本発明において抗体の製造に使用するH鎖及びL鎖は、これらいずれのクラス及びサブクラスに属する抗体に由来するものであってもよく、特に限定されないが、IgGは特に好ましいものである。
ここで、H鎖及びL鎖をコードする遺伝子を遺伝子工学的手法により改変することも可能である。例えば、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ハムスター抗体、ヒツジ抗体、ラクダ抗体等の抗体について、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体等を適宜作製することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス抗体のH鎖、L鎖の可変領域とヒト抗体のH鎖、L鎖の定常領域からなる抗体であり、マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ることができる。ヒト化抗体は、再構成(reshaped)ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、たとえばマウス抗体の相補性決定領域(CDR; complementary determining region) を連結するように設計したDNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからPCR法により合成する。得られたDNAをヒト抗体定常領域をコードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる(EP239400; WO96/02576参照)。CDRを介して連結されるヒト抗体のFRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい(K. Sato et al., Cancer Res. 1993, 53: 851-856)。
上述のヒト化以外に、例えば、抗原との結合性等の抗体の生物学的特性を改善するために改変を行うことも考えられる。このような改変は、部位特異的突然変異(例えば、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488参照)、PCR変異、カセット変異等の方法により行うことができる。一般に、生物学的特性の改善された抗体変異体は70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上(例えば、95％以上、97％、98％、99％等)のアミノ酸配列相同性及び/または類似性を元となった抗体の可変領域のアミノ酸配列に対して有する。本明細書において、配列の相同性及び/または類似性は、配列相同性が最大の値を取るように必要に応じ配列を整列化、及びギャップ導入した後、元となった抗体残基と相同(同じ残基)または類似(一般的なアミノ酸の側鎖の特性に基き同じグループに分類されるアミノ酸残基)するアミノ酸残基の割合として定義される。通常、天然のアミノ酸残基は、その側鎖の性質に基づいて(1)疎水性：アラニン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、メチオニン及びロイシン；(2)中性親水性：アスパラギン、グルタミン、システイン、スレオニン及びセリン；(3)酸性：アスパラギン酸及びグルタミン酸；(4)塩基性：アルギニン、ヒスチジン及びリシン；(5)鎖の配向に影響する残基：グリシンおよびプロリン；ならびに(6)芳香族性：チロシン、トリプトファン及びフェニルアラニンのグループに分類される。
通常、H鎖及びL鎖の可変領域中に存在する全部で6つの相補性決定領域(超可変部;CDR)が相互作用し、抗体の抗原結合部位を形成している。このうち1つの可変領域であっても全結合部位を含むものよりは低い親和性となるものの、抗原を認識し、結合する能力があることが知られている。従って、本発明のH鎖及びL鎖をコードする抗体遺伝子は、該遺伝子によりコードされるポリペプチドが所望の抗原との結合性を維持していればよく、H鎖及びL鎖の各々の抗原結合部位を含む断片部分をコードしていればよい。
ポリペプチドの活性及び抗原の例示
本発明の解離及び／又は会合制御方法を利用することにより、例えば、活性を有する抗体もしくはポリペプチドを効率的に作成することができる。該活性としては、例えば、結合活性、中和活性、細胞傷害活性、アゴニスト活性、アンタゴニスト活性、酵素活性等を挙げることができる。アゴニスト活性とは、受容体などの抗原に抗体が結合することにより、細胞内にシグナルが伝達される等して、何らかの生理的活性の変化を誘導する活性である。生理的活性としては、例えば、増殖活性、生存活性、分化活性、転写活性、膜輸送活性、結合活性、タンパク質分解活性、リン酸化／脱リン酸化活性、酸化還元活性、転移活性、核酸分解活性、脱水活性、細胞死誘導活性、アポトーシス誘導活性等を挙げることができるが、これらに限定されない。
また本発明の方法によって、所望の抗原を認識する、または所望の受容体と結合する抗体もしくはポリペプチドを効率的に作成することができる。
本明細書において抗原は特に限定されず、どのような抗原でもよい。抗原の例としては、例えば、リガンド（サイトカイン、ケモカインなど）、受容体、癌抗原、MHC抗原、分化抗原、免疫グロブリンおよび免疫グロブリンを一部に含む免疫複合体が好適に挙げられる。
サイトカインの例としては、インターロイキン１〜１８、コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ、Ｍ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦなど）、インターフェロン（ＩＦＮ-α、ＩＦＮ-β、ＩＦＮ-γ、など）、成長因子（ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ、ＨＧＦなど）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β）、リンホトキシン、エリスロポエチン、レプチン、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＭＣＡＦ、ＢＭＰを挙げることができる。
ケモカインの例としては、ＣＣＬ１〜ＣＣＬ２８などのＣＣケモカイン、ＣＸＣＬ１〜ＣＸＣＬ１７などのＣＸＣケモカイン、ＸＣＬ１〜ＸＣＬ２などのＣケモカイン、ＣＸ３ＣＬ１などのＣＸ３Ｃケモカインを挙げることができる。
受容体の例としては、例えば、造血因子受容体ファミリー、サイトカイン受容体ファミリー、チロシンキナーゼ型受容体ファミリー、セリン／スレオニンキナーゼ型受容体ファミリー、TNF受容体ファミリー、Gタンパク質共役型受容体ファミリー、GPIアンカー型受容体ファミリー、チロシンホスファターゼ型受容体ファミリー、接着因子ファミリー、ホルモン受容体ファミリー、等の受容体ファミリーに属する受容体などを挙げることができる。これら受容体ファミリーに属する受容体、及びその特徴に関しては、多数の文献、例えば、Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehesive Biochemistry Vol.18B "Hormones and their Actions Part II"pp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV.、Patthy（Cell (1990) 61 (1), 13-14）、Ullrichら（Cell (1990) 61 (2), 203-212）、Massague（eにはアキュート・アクセント記号が付く）（Cell (1992) 69 (6), 1067-1070）、Miyajimaら（Annu. Rev. Immunol. (1992) 10, 295-331）、Tagaら（FASEB J. (1992) 6, 3387-3396）、Fantlら（Annu. Rev. Biochem. (1993), 62, 453-481）、Smithら（Cell (1994) 76 (6) 959-962）、Flower DR.（Biochim. Biophys. Acta (1999) 1422 (3) 207-234）等に記載されている。
上記受容体ファミリーに属する具体的な受容体としては、例えば、ヒト又はマウスエリスロポエチン（EPO）受容体（Blood (1990) 76 (1), 31-35、Cell (1989) 57 (2), 277-285）、ヒト又はマウス顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）受容体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1990) 87 (22), 8702-8706、mG-CSFR、Cell (1990) 61 (2), 341-350）、ヒト又はマウストロンボポイエチン（TPO）受容体（Proc Natl Acad Sci U S A. (1992) 89 (12), 5640-5644、EMBO J. (1993) 12(7), 2645-53）、ヒト又はマウスインスリン受容体（Nature (1985) 313 (6005), 756-761）、ヒト又はマウスFlt-3リガンド受容体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1994) 91 (2), 459-463）、ヒト又はマウス血小板由来増殖因子（PDGF）受容体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85 (10) 3435-3439）、ヒト又はマウスインターフェロン（IFN）-α、β受容体（Cell (1990) 60 (2), 225-234.及びCell (1994) 77 (3), 391-400）、ヒト又はマウスレプチン受容体、ヒト又はマウス成長ホルモン（GH）受容体、ヒト又はマウスインターロイキン（IL）-10受容体、ヒト又はマウスインスリン様増殖因子（IGF）-I受容体、ヒト又はマウス白血病抑制因子（LIF）受容体、ヒト又はマウス毛様体神経栄養因子（CNTF）受容体等が好適に例示される。
癌抗原は細胞の悪性化に伴って発現する抗原であり、腫瘍特異性抗原とも呼ばれる。又、細胞が癌化した際に細胞表面やタンパク質分子上に現れる異常な糖鎖も癌抗原であり、癌糖鎖抗原とも呼ばれる。癌抗原の例としては、例えば、上記の受容体としてGPIアンカー型受容体ファミリーに属するが肝癌を初めとする幾つかの癌において発現しているGPC3（Int J Cancer. (2003) 103 (4), 455-65）、肺癌を初めとする複数の癌で発現するEpCAM（Proc Natl Acad Sci U S A. (1989) 86 (1), 27-31）、CA19-9、CA15-3、シリアルSSEA-1（SLX）等が好適に挙げられる。
MHC抗原は、主にMHC class I抗原とMHC class II抗原に分類され、MHC class I抗原には、HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G、-Hが含まれ、MHC class II抗原には、HLA-DR、-DQ、-DPが含まれる。
分化抗原には、CD1、CD2、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD71、CD73、CD95、CD102、CD106、CD122、CD126、CDw130が含まれ得る。
免疫グロブリンにはIgA、IgM、IgD、IgG、IgEが含まれる。また免疫複合体は少なくとも免疫グロブリンのいずれかの成分を含む。
その他の抗原としては下記のような分子；17-IA、4-1BB、4Dc、6-ケト-PGF1a、8-イソ-PGF2a、8-オキソ-dG、A1 アデノシン受容体、A33、ACE、ACE-2、アクチビン、アクチビンA、アクチビンAB、アクチビンB、アクチビンC、アクチビンRIA、アクチビンRIA ALK-2、アクチビンRIB ALK-4、アクチビンRIIA、アクチビンRIIB、ADAM、ADAM10、ADAM12、ADAM15、ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、アドレシン、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、アルファ-1-アンチトリプシン、アルファ−V/ベータ-1アンタゴニスト、ANG、Ang、APAF-1、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、アルテミン、抗Id、ASPARTIC、心房性ナトリウム利尿因子、av/b3インテグリン、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-リンパ球刺激因子（BlyS）、BACE、BACE-1、Bad、BAFF、BAFF-R、Bag-1、BAK、Bax、BCA-1、BCAM、Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BIM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2 BMP-2a、BMP-3（オステオゲニン（Osteogenin））、BMP-4 BMP-2b、BMP-5、BMP-6 Vgr-1、BMP-7（OP-1）、BMP-8（BMP-8a、OP-2）、BMPR、BMPR-IA（ALK-3）、BMPR-IB（ALK-6）、BRK-2、RPK-1、BMPR-II（BRK-3）、BMP、b-NGF、BOK、ボンベシン、骨由来神経栄養因子、BPDE、BPDE-DNA、BTC、補体因子3（C3）、C3a、C4、C10、CA125、CAD-8、カルシトニン、cAMP、癌胎児性抗原（CEA）、癌関連抗原、カテプシンA、カテプシンB、カテプシンC/DPPI、カテプシンD、カテプシンE、カテプシンH、カテプシンL、カテプシンO、カテプシンS、カテプシンV、カテプシンX/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCL1、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCR1、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33（p67タンパク質）、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80（B7-1）、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、ボツリヌス菌毒素、ウェルシュ菌毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMV UL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret、CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF、CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、サイトケラチン腫瘍関連抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、補体制御因子（Decay accelerating factor）、des（1-3）-IGF-I（脳IGF-1）、Dhh、ジゴキシン、DNAM-1、Dnase、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-A1、EDA-A2、EDAR、EGF、EGFR（ErbB-1）、EMA、EMMPRIN、ENA、エンドセリン受容体、エンケファリナーゼ、eNOS、Eot、エオタキシン1、EpCAM、エフリンB2/EphB4、EPO、ERCC、E-セレクチン、ET-1、ファクターIIa、ファクターVII、ファクターVIIIc、ファクターIX、線維芽細胞活性化タンパク質（FAP）、Fas、FcR1、FEN-1、フェリチン、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、フィブリン、FL、FLIP、Flt-3、Flt-4、卵胞刺激ホルモン、フラクタルカイン、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF、GDF-1、GDF-3（Vgr-2）、GDF-5（BMP-14、CDMP-1）、GDF-6（BMP-13、CDMP-2）、GDF-7（BMP-12、CDMP-3）、GDF-8（ミオスタチン）、GDF-9、GDF-15（MIC-1）、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-1、GFR-アルファ1、GFR-アルファ2、GFR-アルファ3、GITR、グルカゴン、Glut4、糖タンパク質IIb/IIIa（GPIIb/IIIa）、GM-CSF、gp130、gp72、GRO、成長ホルモン放出因子、ハプテン（NP-capまたはNIP-cap）、HB-EGF、HCC、HCMV gBエンベロープ糖タンパク質、HCMV gHエンベロープ糖タンパク質、HCMV UL、造血成長因子（HGF）、Hep B gp120、ヘパラナーゼ、Her2、Her2/neu（ErbB-2）、Her3（ErbB-3）、Her4（ErbB-4）、単純ヘルペスウイルス（HSV） gB糖タンパク質、HSV gD糖タンパク質、HGFA、高分子量黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、HIV gp120、HIV IIIB gp 120 V3ループ、HLA、HLA-DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、ヒト心臓ミオシン、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV）、ヒト成長ホルモン（HGH）、HVEM、I-309、IAP、ICAM、ICAM-1、ICAM-3、ICE、ICOS、IFNg、Ig、IgA受容体、IgE、IGF、IGF結合タンパク質、IGF-1R、IGFBP、IGF-I、IGF-II、IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、インターフェロン（INF）-アルファ、INF-ベータ、INF-ガンマ、インヒビン、iNOS、インスリンA鎖、インスリンB鎖、インスリン様増殖因子1、インテグリンアルファ2、インテグリンアルファ3、インテグリンアルファ4、インテグリンアルファ4/ベータ1、インテグリンアルファ4/ベータ7、インテグリンアルファ5（アルファV）、インテグリンアルファ5/ベータ1、インテグリンアルファ5/ベータ3、インテグリンアルファ6、インテグリンベータ1、インテグリンベータ2、インターフェロンガンマ、IP-10、I-TAC、JE、カリクレイン2、カリクレイン5、カリクレイン6、カリクレイン11、カリクレイン12、カリクレイン14、カリクレイン15、カリクレインL1、カリクレインL2、カリクレインL3、カリクレインL4、KC、KDR、ケラチノサイト増殖因子（KGF）、ラミニン5、LAMP、LAP、LAP（TGF-1）、潜在的TGF-1、潜在的TGF-1 bp1、LBP、LDGF、LECT2、レフティ、ルイス−Y抗原、ルイス−Y関連抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo、LIF、LIGHT、リポタンパク質、LIX、LKN、Lptn、L-セレクチン、LT-a、LT-b、LTB4、LTBP-1、肺表面、黄体形成ホルモン、リンホトキシンベータ受容体、Mac-1、MAdCAM、MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP、M-CSF、MDC、Mer、メタロプロテアーゼ、MGDF受容体、MGMT、MHC（HLA-DR）、MIF、MIG、MIP、MIP-1-アルファ、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、ムチン（Muc1）、MUC18、ミュラー管抑制物質、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-Cアドヘリン、NCA 90、NCAM、NCAM、ネプリライシン、ニューロトロフィン-3、-4、または-6、ニュールツリン、神経成長因子（NGF）、NGFR、NGF−ベータ、nNOS、NO、NOS、Npn、NRG-3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG、OPN、OSM、OX40L、OX40R、p150、p95、PADPr、副甲状腺ホルモン、PARC、PARP、PBR、PBSF、PCAD、P-カドヘリン、PCNA、PDGF、PDGF、PDK-1、PECAM、PEM、PF4、PGE、PGF、PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤性アルカリホスファターゼ（PLAP）、PlGF、PLP、PP14、プロインスリン、プロレラキシン、プロテインC、PS、PSA、PSCA、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、PTEN、PTHrp、Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL、RANTES、RANTES、レラキシンA鎖、レラキシンB鎖、レニン、呼吸器多核体ウイルス（RSV）F、RSV Fgp、Ret、リウマイド因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-1、SERINE、血清アルブミン、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-1、SLAM、SLPI、SMAC、SMDF、SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、TAG-72（腫瘍関連糖タンパク質−72）、TARC、TCA-3、T細胞受容体（例えば、T細胞受容体アルファ/ベータ）、TdT、TECK、TEM1、TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸PLAP様アルカリホスファターゼ、TfR、TGF、TGF-アルファ、TGF-ベータ、TGF-ベータ Pan Specific、TGF-ベータRI（ALK-5）、TGF-ベータRII、TGF-ベータRIIb、TGF-ベータRIII、TGF-ベータ1、TGF-ベータ2、TGF-ベータ3、TGF-ベータ4、TGF-ベータ5、トロンビン、胸腺Ck-1、甲状腺刺激ホルモン、Tie、TIMP、TIQ、組織因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-アルファ、TNF-アルファベータ、TNF-ベータ2、TNFc、TNF-RI、TNF-RII、TNFRSF10A（TRAIL R1 Apo-2、DR4）、TNFRSF10B（TRAIL R2 DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B）、TNFRSF10C（TRAIL R3 DcR1、LIT、TRID）、TNFRSF10D（TRAIL R4 DcR2、TRUNDD）、TNFRSF11A（RANK ODF R、TRANCE R）、TNFRSF11B（OPG OCIF、TR1）、TNFRSF12（TWEAK R FN14）、TNFRSF13B（TACI）、TNFRSF13C（BAFF R）、TNFRSF14（HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2）、TNFRSF16（NGFR p75NTR）、TNFRSF17（BCMA）、TNFRSF18（GITR AITR）、TNFRSF19（TROY TAJ、TRADE）、TNFRSF19L（RELT）、TNFRSF1A（TNF RI CD120a、p55-60）、TNFRSF1B（TNF RII CD120b、p75-80）、TNFRSF26（TNFRH3）、TNFRSF3（LTbR TNF RIII、TNFC R）、TNFRSF4（OX40 ACT35、TXGP1 R）、TNFRSF5（CD40 p50）、TNFRSF6（Fas Apo-1、APT1、CD95）、TNFRSF6B（DcR3 M68、TR6）、TNFRSF7（CD27）、TNFRSF8（CD30）、TNFRSF9（4-1BB CD137、ILA）、TNFRSF21（DR6）、TNFRSF22（DcTRAIL R2 TNFRH2）、TNFRST23（DcTRAIL R1 TNFRH1）、TNFRSF25（DR3 Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1）、TNFSF10（TRAIL Apo-2リガンド、TL2）、TNFSF11（TRANCE/RANKリガンド ODF、OPGリガンド）、TNFSF12（TWEAK Apo-3リガンド、DR3リガンド）、TNFSF13（APRIL TALL2）、TNFSF13B（BAFF BLYS、TALL1、THANK、TNFSF20）、TNFSF14（LIGHT HVEMリガンド、LTg）、TNFSF15（TL1A/VEGI）、TNFSF18（GITRリガンド AITRリガンド、TL6）、TNFSF1A（TNF-a コネクチン（Conectin）、DIF、TNFSF2）、TNFSF1B（TNF-b LTa、TNFSF1）、TNFSF3（LTb TNFC、p33）、TNFSF4（OX40リガンド gp34、TXGP1）、TNFSF5（CD40リガンド CD154、gp39、HIGM1、IMD3、TRAP）、TNFSF6（Fasリガンド Apo-1リガンド、APT1リガンド）、TNFSF7（CD27リガンド CD70）、TNFSF8（CD30リガンド CD153）、TNFSF9（4-1BBリガンド CD137リガンド）、TP-1、t-PA、Tpo、TRAIL、TRAIL R、TRAIL-R1、TRAIL-R2、TRANCE、トランスフェリン受容体、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、腫瘍関連抗原CA125、腫瘍関連抗原発現ルイスY関連炭水化物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、ウロキナーゼ、VCAM、VCAM-1、VECAD、VE-カドヘリン、VE-カドヘリン-2、VEFGR-1（flt-1）、VEGF、VEGFR、VEGFR-3（flt-4）、VEGI、VIM、ウイルス抗原、VLA、VLA-1、VLA-4、VNRインテグリン、フォン・ヴィレブランド因子、WIF-1、WNT1、WNT2、WNT2B／13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCR1、XCR1、XEDAR、XIAP、XPD、HMGB1、IgA、Aβ、CD81、CD97、CD98、DDR1、DKK1、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、酸化LDL、PCSK9、プレカリクレイン、RON、TMEM16F、SOD1、クロモグラニン A、クロモグラニン B、tau、VAP1、高分子キニノーゲン、IL-31、IL-31R、Nav1.1、Nav1.2、Nav1.3、Nav1.4、Nav1.5、Nav1.6、Nav1.7、Nav1.8、Nav1.9、EPCR、C1、C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、ファクター B、ファクター D、ファクター H、プロペルジン、スクレロスチン、フィブリノゲン、フィブリン、プロトロンビン、トロンビン、組織因子、ファクター V、ファクター Va、ファクター VII、ファクター VIIa、ファクター VIII、ファクター VIIIa、ファクター IX、ファクター IXa、ファクター X、ファクター Xa、ファクター XI、ファクター XIa、ファクター XII、ファクター XIIa、ファクター XIII、ファクター XIIIa、TFPI、アンチトロンビン III、EPCR、トロンボモデュリン、TAPI、tPA、プラスミノゲン、プラスミン、PAI-1、PAI-2、GPC3、シンデカン-1、シンデカン-2、シンデカン-3、シンデカン-4、LPA、S1Pならびにホルモンおよび成長因子のための受容体が例示され得る。
さらに、本発明における非限定の一実施態様では、二重特異性抗体の１つの特異性は癌抗原を標的とし、他方の特異性はCTL（Cytotoxic T lymphocyte）に発現する抗原、例えばCD3やTNFRSF(Tumor Necrosis Factor Receptor Super Family)を標的とすることが出来るが、この組み合わせに限られるわけではない。TNFRSFの例としては、TNFRSF9 (CD137)、TNFRSF5 (CD40)およびTNFRSF4 (OX40)等が挙げられる。
核酸の改変
また、本発明の製造方法の別の態様においては、本発明は、ポリペプチド間の解離及び／又は会合が制御されるように、ポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基（例えば、EUナンバリングによる356位及び439位、357位及び370位、並びに399位及び409位のアミノ酸残基）、並びに／又はEUナンバリング397位及び／若しくは392位のアミノ酸残基に変異を有する異種多量体の製造方法であって、（ａ）ポリペプチド間の解離及び会合が制御されるように、当該ポリペプチド間の界面等を形成するアミノ酸残基をコードする核酸を元の核酸から改変する工程、（ｂ）当該ポリペプチドを発現するように、当該核酸を有する宿主細胞を培養する工程、（ｃ）当該宿主細胞の培養物から当該ポリペプチドを回収する工程、及び（ｄ）還元条件下、各ポリペプチドをインキュベートし、所望のポリペプチドのヘテロ体を回収する工程を含む、異種多量体の製造方法を提供する。
また、本発明の上述の解離及び／又は会合制御方法を利用して、ポリペプチド間の会合が阻害されるように、当該ポリペプチド間の界面を形成するアミノ酸残基をコードする核酸を元の核酸から改変する工程を含む方法もまた、本発明の上記製造方法の好ましい態様の１つである。
本発明の上記方法において「核酸を改変する」とは、本発明における「改変」によって導入されるアミノ酸残基に対応するように核酸を改変することを言う。より具体的には、元（改変前）のアミノ酸残基をコードする核酸について、改変によって導入されるアミノ酸残基をコードする核酸へ改変することを言う。通常、目的のアミノ酸残基をコードするコドンとなるように、元の核酸に対して、少なくとも1塩基を挿入、欠失または置換するような遺伝子操作もしくは変異処理を行うことを意味する。即ち、元のアミノ酸残基をコードするコドンは、改変によって導入されるアミノ酸残基をコードするコドンによって置換される。このような核酸の改変は、当業者においては公知の技術、例えば、部位特異的変異誘発法、PCR変異導入法等を用いて、適宜実施することが可能である。
また、本発明における核酸は、通常、適当なベクターへ担持（挿入）され、宿主細胞へ導入される。該ベクターとしては、挿入した核酸を安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしてはpBluescriptベクター(Stratagene社製）などが好ましいが、市販の種々のベクターを利用することができる。本発明のポリペプチドを生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内でポリペプチドを発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であればpBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であればpETベクター（Invitrogen社製）、培養細胞であればpME18S-FL3ベクター（GenBank Accession No. AB009864）、生物個体であればpME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8:466-472(1988)）などが好ましい。ベクターへの本発明のDNAの挿入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 11.4-11.11）。
上記宿主細胞としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主細胞が用いられる。ポリペプチドを発現させるための細胞としては、例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフィロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、アスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフィラS2、スポドプテラSF9）、動物細胞（例：CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes メラノーマ細胞）および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons．Section 9.1-9.9）、リポフェクタミン法（GIBCO-BRL社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。
宿主細胞において発現したポリペプチドを小胞体の内腔に、細胞周辺腔に、または細胞外の環境に分泌させるために、適当な分泌シグナルを目的のポリペプチドに組み込むことができる。これらのシグナルは目的のポリペプチドに対して内因性であっても、異種シグナルであってもよい。
上記製造方法におけるポリペプチドの回収は、本発明のポリペプチドが培地に分泌される場合は、培地を回収する。本発明のポリペプチドが細胞内に産生される場合は、その細胞をまず溶解し、その後にポリペプチドを回収する。
組換え細胞培養物から本発明のポリペプチドを回収し精製するには、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法を用いることができる。
本発明の非限定の実施態様として、それぞれ第一及び第ニのポリペプチドのホモ体を産生する各細胞株を培養し、当該培養上清を精製後に精製抗体を使ってFAE(Fab Arm Exchange)反応を起こす方法、それぞれ第一及び第ニのポリペプチドのホモ体を産生する各細胞株を培養し、当該培養上清を精製せずに混合し、混合培養上清中でFAE反応を起こし、その後精製する方法、第一のポリペプチドのホモ体を産生する細胞株と第二のポリペプチドのホモ体を産生する細胞株を混ぜて培養し、当該培養上清を精製後に精製抗体を使ってFAE反応を起こす方法、第一のポリペプチドのホモ体を産生する細胞株と第二のポリペプチドのホモ体を産生する細胞株を混ぜて培養し、当該培養上清中でFAE反応を起こし、その後精製する方法が挙げられる。
本発明は、非限定の実施態様として、以下のa)〜c)の工程；
a) 第一のポリペプチドのホモ体を産生する細胞株と第二のポリペプチドのホモ体を産生する細胞株を混合する段階、
b) 当該培養上清中で、ヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすように、該第1のポリペプチドのホモ体および該第2のポリペプチドのホモ体を共にインキュベートする段階、ならびに
c) 第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を得る段階
を含む、異種多量体の製造方法を提供する。
本発明は、非限定の実施態様として、以下のa)〜c)の工程；
a) それぞれ第一及び第二のポリペプチドのホモ体を産生する細胞株を培養する段階、
b) 各細胞株の培養上清を混合し、ヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすように、該第1のポリペプチドのホモ体および該第2のポリペプチドのホモ体を共にインキュベートする段階、ならびに
c) 第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を得る段階
を含む、異種多量体の製造方法を提供する。
所望の異種多量体を選択する方法
さらに本発明は、所望の異種多量体を選択する方法を提供する。好ましい態様としては、当該方法は、以下の段階を含む、所望の特性を有する異種多量体を選択する方法である：
a) 第１のポリペプチドの組及び第２のポリペプチドの組を提供する段階であって、第１の組を構成する各ポリペプチドが第２の組を構成する各ポリペプチドと異なる標的特異性を有し、かつ第１及び第２の組を構成する各ポリペプチドが、上記電荷反発を利用した界面制御に係るアミノ酸改変及び／又はCH3領域の安定性を不安定するアミノ酸改変を含む、段階、
b) 還元条件下で、該第１の組を構成する各ポリペプチドを該第２の組を構成する各ポリペプチドと共にインキュベートし、それによって複数種の異種多量体の混合物を作製する段階、
c) 結果として得られた複数種の異種多量体の混合物を所与の所望の特性についてアッセイする段階、および
d) 所望の特性を有する異種多量体を選択する段階。
医薬組成物
また本発明は、本発明の異種多量体、および医薬的に許容される担体を含む組成物（薬剤）に関する。
本発明において医薬組成物とは、通常、疾患の治療もしくは予防、あるいは検査・診断のための薬剤を言う。
本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は、指示された範囲の適当な容量が得られるように設定する。
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬（例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム）を含む等張液が挙げられる。適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート80（TM）、HCO-50等）を併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル及び／またはベンジルアルコールを併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液及び酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩酸プロカイン）、安定剤（例えば、ベンジルアルコール及びフェノール）、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填する。
本発明の医薬組成物は、好ましくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の組成物とすることができる。例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
投与方法は、患者の年齢、症状により適宜選択することができる。抗体または抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量は、例えば、１回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲に設定することが可能である。または、例えば、患者あたり0.001〜100000mgの投与量とすることもできるが、本発明はこれらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量及び投与方法は、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投与量及び投与方法を設定することが可能である。
本発明においては、上記本発明の異種多量体は、癌に対する治療剤又は予防剤の有効成分として有用である。癌は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌および肺扁平上皮癌を含む）、大腸癌、直腸癌、結腸癌、乳癌、肝癌、胃癌、膵癌、腎癌、前立腺癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆管癌、腹膜癌、中皮腫、扁平上皮癌、子宮頸癌、子宮体癌、膀胱癌、食道癌、頭頚部癌、鼻咽頭癌、唾液腺腫瘍、胸腺腫、皮膚癌、基底細胞腫、悪性黒色腫、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、ウィルムス腫瘍、急性骨髄性白血病（急性骨髄球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病および急性単球性白血病を含む）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、毛様細胞白血病形質細胞腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫および成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫）、ランゲルハンス細胞組織球症、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、脳腫瘍（神経膠腫、星細胞腫、グリア芽細胞腫、髄膜腫および上衣腫を含む）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、骨肉腫、カポジ肉腫、ユーイング肉腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫。
また、必要に応じ本発明のポリペプチドもしくは異種多量体を、その他の医薬成分と組み合わせて製剤化することもできる。
また本発明は、少なくとも本発明の製造方法により製造された異種多量体、または本発明の医薬組成物を含む、本発明の治療方法または予防方法に用いるためのキットを提供する。該キットには、その他、薬学的に許容される担体、媒体、使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。また本発明は、本発明のポリペプチドもしくは本発明の製造方法により製造されたポリペプチドの、免疫炎症性疾患の治療剤または予防剤の製造における使用に関する。また本発明は、本発明の治療方法または予防方法に使用するための、本発明のポリペプチドまたは本発明の製造方法により製造されたポリペプチドに関する。
なお、本明細書で用いられているアミノ酸の3文字表記と1文字表記の対応は以下の通りである。
アラニン：Ala：A
アルギニン：Arg：R
アスパラギン：Asn：N
アスパラギン酸：Asp：D
システイン：Cys：C
グルタミン：Gln：Q
グルタミン酸：Glu：E
グリシン：Gly：G
ヒスチジン：His：H
イソロイシン：Ile：I
ロイシン：Leu：L
リジン：Lys：K
メチオニン：Met：M
フェニルアラニン：Phe：F
プロリン：Pro：P
セリン：Ser：S
スレオニン：Thr：T
トリプトファン：Trp：W
チロシン：Tyr：Y
バリン：Val：V
なお、本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
〔実施例１〕抗体の会合界面制御改変の導入によるFab Arm Exchange効率の向上検討
Fab Arm Exchangeでは、２種類のホモ抗体を還元剤存在下で混合し、生じた4本の抗体分子片腕（半分子またはHL分子と称する、一本の重鎖および一本の軽鎖からなる分子）が再結合することによって、Bispecific抗体が生じる。HL分子の再結合はランダムに起こるため、目的のBispecific抗体は理論上、系中に存在する全抗体量の50%しか得られない。しかしながら、２種類のホモ抗体にあらかじめ異なる電荷を導入しておくことで、生じたHL分子同士が再結合する際にホモ２量化よりもヘテロ２量化がより優先的に起こり、高効率にBispecific抗体を作製できる可能性がある。そこでWO2006/106905で報告されている抗体のCH3領域における会合界面を制御する改変（2種類のH鎖をCH3領域の電荷的相互作用および反発を利用してヘテロ会合化させる改変）を用いることで、Fab Arm Exchangeの反応効率（Bispecific抗体生成率）が向上するかどうかを検証した。
抗体H鎖可変領域には、WO2009/125825に開示されているヒトインターロイキン6レセプターに対する抗体のH鎖可変領域であるWT(H)(配列番号１：以後MRAHと記載)およびH54(配列番号２)を用いた。これらのH鎖可変領域に対し、抗体H鎖定常領域としてヒトIgG1のH鎖定常領域のC末端のGlyおよびLysを除去したG1dを有するMRAH-G1d（配列番号３）およびH54-G1d(配列番号４)、ならびにヒトIgG4のH鎖定常領域のC末端のGlyおよびLysを除去したwtG4dを有するMRAH-wtG4d（配列番号５）およびH54-wtG4d（配列番号６）を作製した。次に、MRAH-G1dとH54-G1dに対し、IgG4型のヒンジ配列、CH3ドメイン配列となるよう、P228SおよびK409Rの改変を導入したMRAH-G1dsr（配列番号７）、H54-G1dsr（配列番号８）を作製した。さらに会合界面制御改変として、MRAH-G1dsrにD356Kを導入したMRAH-G1dsrP1（配列番号９）、H54-G1dsrにK439Eを導入したH54-G1dsrN1（配列番号１０）、MRAH-wtG4dにE356Kを導入したMRAH-wtG4dP1(配列番号１１)、H54-wtG4dにK439Eを導入したH54-wtG4dN1(配列番号１２)を作製した。H鎖可変領域がMRAHの場合はMRAL-k0（配列番号１３）を、H54の場合はL28-k0（配列番号１４）を抗体L鎖として用いた。参考例１の方法に従ってMRAH-G1dsr/MRAL-k0、H54-G1dsr/L28-k0、MRAH-G1dsrP1/MRAL-k0、H54-G1dsrN1/L28-k0、MRAH-wtG4d/MRAL-k0、H54-wtG4d/L28-k0、MRAH-wtG4dP1/MRAL-k0、H54-wtG4dN1/L28-k0を発現、精製した。
次に、得られたホモ体2種類を以下に示す組み合わせで混合し、反応産物を参考例２の方法に従って評価した。
(1) MRAH-wtG4d/MRAL-k0とH54-wtG4d/L28-k0
(2) MRAH-wtG4dP1/MRAL-k0とH54-wtG4dN1/L28-k0
(3) MRAH-G1dsr/MRAL-k0とH54-G1dsr/L28-k0
(4) MRAH-G1dsrP1/MRAL-k0とH54-G1dsrN1/L28-k0
反応条件： PBS(Sigma, pH7.4)中、[各mAb] = 0.2 mg/ml、[GSH(Sigma)] = 0.5 mM、0.05% Tween 20 (Junsei)、37℃、24時間。
本検討で用いた二種類の抗体可変領域MRAH/MRALとH54/L28は、pIが大きく異なるため、イオン交換クロマトグラフィーによりそれぞれのホモ体、および生成したBispecific抗体に対応するピークが容易に分離され、反応効率を評価することができる。図１はイオン交換クロマトグラフィーにより反応産物を評価した結果である。会合界面制御改変を導入しないMRAH-wtG4d/MRAL-k0とH54-wtG4d/L28-k0を反応させたwtG4d、あるいはMRAH-G1dsr/MRAL-k0とH54-G1dsr/L28-k0を反応させたG1dsrのBispecific抗体生成率はそれぞれ50.5%、52.7%であった。一方で会合界面制御改変を導入したMRAH-wtG4dP1/MRAL-k0とH54-wtG4dN1/L28-k0を反応させたwtG4dP1/N1のBispecific抗体生成率は99.0%、またMRAH-G1dsrP1/MRAL-k0とH54-G1dsrN1/L28-k0を反応させたG1dsrP1/N1では98.5%と極めて高い効率でBispecific抗体が生成されていることが明らかとなった。以上の結果から、WO2006/106905で報告されている会合界面制御改変を導入した２種類のホモ体を還元剤存在下で混合することにより、極めて高い効率でBispecific抗体を作製できることが示された。
〔実施例２〕ヒト天然型IgG1のヒンジ配列を有するホモ体でのFab Arm Exchange
実施例１ではヒンジ領域の配列を天然型ヒトIgG4型にするため、IgG1に対してP228S改変を導入し、Fab-Arm Exchangeを行った。しかしながら生体内に投与された天然型IgG4は、内因性IgG4との半分子交換が起こることが報告されている。またその原因はヒンジ領域のうち、EUナンバリング228番目に位置するSerであり、これをIgG1型のProとすることで安定性が向上し、生体内での交換が起こらなくなることが報告されている(Labrijn AF et al. Nat. Biotechnol. 2009, 27, 767-771)。従って生体内に投与することを考えた場合、作製したBispecific抗体のヒンジ配列は226C-227P-228P-229Cとなっていることが望ましい。そこで本検討では、会合界面制御改変が導入されていることにより、天然型ヒトIgG1のヒンジ配列であっても効率よくFab Arm Exchangeが起こるかどうかについて検証した。
まず、MRAH-G1dに対してK409RおよびD356Kを導入したMRAH-G1drP1（配列番号１５）、H54-G1dに対してK409RおよびK439Eを導入したH54-G1drN1（配列番号１６）を作製した。H鎖可変領域がMRAHの場合はMRAL-k0を、H54の場合はL28-k0を抗体L鎖として用い、参考例１の方法に従ってMRAH-G1drP1/MRAL-k0、H54-G1drN1/L28-k0を発現、精製した。次に、得られたホモ体2種類を以下の反応条件下で混合し、反応産物を参考例２の方法に従って評価した。
反応条件： TBS(Takara, pH7.6)中、[各mAb] = 0.2 mg/ml、0.05% Tween 20 (Junsei)、37℃、24時間。還元剤は[GSH(Sigma)] = 0.5 mMもしくは5 mMまたは[2-MEA(Sigma)] = 25 mMの3条件で検討した。
参考例２の方法に従って反応産物を解析した結果を図２に示す。実施例１と同じGSH(0.5 mM)の条件下では、Bispecific抗体生成率は21.8%となり、EUナンバリング228番目のアミノ酸残基がSerの場合と比較して大幅に効率が低下した。しかしながら、2-MEA(25 mM)およびGSH(5 mM)の還元条件下では、Bispecific抗体の生成率が99%以上となった。以上の結果から、ヒンジの配列がヒト天然型IgG1の配列であったとしても、会合界面制御改変を導入し、適切な還元条件を用いることによって高効率にBispecific抗体を作製できることが明らかとなった。
〔実施例３〕ヒト天然型IgG1のCH3を用いたFab Arm Exchange
ここまでの検討において、ヒトIgG1に対し、CH3をIgG4型にするK409R改変と、会合界面制御改変（D356KおよびK439E）を導入してFab Arm Exchangeを行うことにより、極めて高効率で目的のBispecific抗体が得られることが示された。
一方、409番目のアミノ酸残基がArgであると抗体の酸性条件下における安定性が低下することが知られている（WO/2009/041613）。医薬品としての抗体の製造のためには、酸性条件下に抗体を暴露するウイルス不活化工程が必須であり、その際に抗体の品質を保つために抗体の酸性条件下における安定性が高いことが望ましい。よって409番目のアミノ酸残基はArgではないことが望ましい。一方、Fab Arm Exchange反応を効率的に起こすことができると報告されている改変はK409Rの改変を用いており、409番目のアミノ酸残基がArgであることから酸性条件下における安定性に課題があると考えられる。そこで次に、K409R改変を含まない完全にヒト天然型IgG1の抗体に対して、WO2006/106905で報告されている会合界面制御改変のみでFab Arm Exchangeが誘起されるかどうかを検証した。
検討した会合界面制御改変の組み合わせを表１に示す。
Figure 2015046467
H鎖可変領域がMRAHの場合はMRAL-k0を、H54の場合はL28-k0を抗体L鎖として用いた。参考例１の方法に従ってMRAH-G1dP1/MRAL-k0、H54-G1dN1/L28-k0、MRAH-G1dP3/MRAL-k0、H54-G1dN3/L28-k0、MRAH-G1dP4/MRAL-k0、H54-G1dN4/L28-k0、MRAH-G1dP5/MRAL-k0、H54-G1dN5/L28-k0、MRAH-G1dP6/MRAL-k0、H54-G1dN6/L28-k0を発現、精製した。
次に、得られたホモ体2種類を以下に示す組み合わせで混合し、反応産物を参考例２の方法に従って評価した。
(1) MRAH-G1dP1/MRAL-k0とH54-G1dN1/L28-k0
(2) MRAH-G1dP3/MRAL-k0とH54-G1dN3/L28-k0
(3) MRAH-G1dP4/MRAL-k0とH54-G1dN4/L28-k0
(4) MRAH-G1dP5/MRAL-k0とH54-G1dN5/L28-k0
(5) MRAH-G1dP6/MRAL-k0とH54-G1dN6/L28-k0
反応条件： TBS(Takara, pH7.6)中、[各mAb] = 0.2 mg/ml、0.05% Tween 20 (Junsei)、[GSH(Sigma)] = 5 mM、37℃、24時間。
得られた結果を表２に示す。
Figure 2015046467
表中の「略称」とは、反応に用いたホモ体の組み合わせの略称を示すものである。例えば略称がG1dP1/N1となっていた場合、MRAH-G1dP1/MRAL-k0とH54-G1dN1/L28-k0を反応させたことを示す。また「用いたMoAb1のH鎖定常領域名」とは、MRAHの可変領域を有する抗体の定常領域名を示したものであり、「用いたMoAb2のH鎖定常領域名」とは、H54の可変領域を有する抗体の定常領域名を示したものである。「導入した改変」とは、MRAH-G1dもしくはH54-G1dに対して導入した改変を示す。
片方のホモ体にD356Kを、もう片方のホモ体にK439Eを導入したG1dP1/N1ではBispecific抗体生成率が1.7%であった。図２において同じ反応条件下(5mM GSH)でK409R改変と会合界面制御改変(D356KおよびK439E)を有するG1drP1/N1のBispecific抗体生成率は99.3%であったのに対し、EUナンバリング409番目のアミノ酸残基がLysとなったG1dP1/N1で反応効率が大幅に低下することが示された。しかしながら、片方のホモ体に会合界面制御改変D399Kを、もう片方のホモ体にK409Dを導入したG1dP3/N3、片方のホモ体にD356K/D399Kを、もう片方のホモ体にK409D/K439Eを導入したG1dP5/N5は、それぞれ93.4%、98.1%と非常に高いBispecific抗体生成率を示した。従って、CH3ドメインをIgG4型とするK409R改変を用いることなく、会合界面制御改変のみで高効率にFab Arm Exchangeを誘起できることが示された。
次に、反応効率の高かったG1dP3/N3とG1dP5/N5について3種類の還元条件下で反応効率を比較した。このとき比較対象として、実施例２で用いたG1drP1/N1および、Fab Arm Exchangeによる効率的なBispecific抗体作製改変としてLabrijnらによって報告されている、一方の抗体にK409Rをもう一方のホモ体にF405Lを導入した改変体の組み合わせについても検証した(Labrijn AF et al. Proc. Natl., Acad. Sci., 2013. 110. 5145-5150)。
MRAH-G1dに対してK409Rを導入したMRAH-G1dr（配列番号２７）、H54-G1dに対してF405Lを導入したH54-G1dl（配列番号２８）を作製した。H鎖可変領域がMRAHの場合はMRAL-k0を、H54の場合はL28-k0を抗体L鎖として用いた。参考例１の方法に従ってMRAH-G1drP1/MRAL-k0、H54-G1drN1/L28-k0、MRAH-G1dP3/MRAL-k0、H54-G1dN3/L28-k0、MRAH-G1dP5/MRAL-k0、H54-G1dN5/L28-k0、MRAH-G1dr/MRAL-k0、H54-G1dl/L28-k0を発現、精製した。
次に、得られたホモ体2種類を以下に示す組み合わせで混合し、反応産物を参考例２の方法に従って評価した。
(1) MRAH-G1drP1/MRAL-k0とH54-G1drN1/L28-k0
(2) MRAH-G1dP3/MRAL-k0とH54-G1dN3/L28-k0
(3) MRAH-G1dP5/MRAL-k0とH54-G1dN5/L28-k0
(4) MRAH-G1dr/MRAL-k0とH54-G1dl/L28-k0
反応条件： TBS(Takara, pH7.6)中、[各mAb] = 0.2 mg/ml、0.05% Tween 20 (Junsei)、37℃、24時間。還元剤は[GSH(Sigma)] = 0.5 mMもしくは5 mMまたは[2-MEA(Sigma)] = 25 mMの3条件で検討した。
得られた結果を表３に示す。
Figure 2015046467
表中の「略称」とは、反応に用いたホモ体の組み合わせの略称を示すものである。例えば略称がG1dP1/N1となっていた場合、MRAH-G1dP1/MRAL-k0とH54-G1dN1/L28-k0を反応させたことを示す。また「用いたMoAb1のH鎖定常領域名」とは、MRAHの可変領域を有する抗体の定常領域名を示したものであり、「用いたMoAb2のH鎖定常領域名」とは、H54の可変領域を有する抗体の定常領域名を示したものである。「導入した改変」とは、MRAH-G1dまたはH54-G1dに対して導入した改変を示す。
5mM GSHの還元条件下では、Labrijnらによって報告されている既存のFab Arm Exchange効率向上改変を用いたG1dr/lのBispecific抗体生成率は87.3%であった。このとき片方のホモ体にD399Kを、もう片方のホモ体にK409Dを導入したG1dP3/N3では85.2%、片方のホモ体にD356K/D399Kを、もう片方のホモ体にK409D/K439Eを導入したG1dP5/N5では99.1%であった。またIgG4型のK409R改変に加えて、片方のホモ体にD356Kをもう片方のホモ体にK439Eを有するG1drP1/N1のBispecific抗体生成率は99.3%であった。
25mM 2MEAの還元条件下では、Labrijnらによって報告されている既存のFab Arm Exchange効率向上改変を用いたG1dr/lのBispecific抗体生成率は95.6%であった。このとき、片方のホモ体にD399Kを、もう片方のホモ体にK409Dを導入したG1dP3/N3では92.8%、片方のホモ体にD356K/D399Kをもう片方のホモ体にK409D/K439Eを導入したG1dP5/N5では100%、またIgG4型のK409R改変に加えて、片方のホモ体にD356Kをもう片方のホモ体にK439Eを有するG1drP1/N1のBispecific抗体生成率は99.7%であった。
0.5mM GSHの還元条件下では、既存のFab Arm Exchange効率向上改変を用いたG1dr/lのBispecific抗体生成率は9.5%であった。このとき、片方のホモ体にD399Kを、もう片方のホモ体にK409Dを導入したG1dP3/N3では4.8%、片方のホモ体にD356K/D399Kをもう片方のホモ体にK409D/K439Eを導入したG1dP5/N5では75.4%、またIgG4型のK409R改変に加えて、片方のホモ体にD356Kをもう片方のホモ体にK439Eを有するG1drP1/N1のBispecific抗体生成率は21.8%となり、いずれも他の還元条件と比較して大幅に低下した。
以上の結果から、いずれの反応条件下においても、片方のホモ体にD356K/D399Kを、もう一方のホモ体にK409D/K439Eを導入したG1dP5/N5はLabrijnらによって報告されている既存のFab Arm Exchange効率向上改変よりも高いBispecific抗体生成率を示すことが明らかとなった。高いBispecific抗体生成率は、実際に医薬品としての二重特異性抗体の製造において非常に重要であり、本改変は既存の改変と比較して有用性が高いと考えられる。
〔実施例４〕CH3ドメイン不安定化改変を利用した高効率なFab Arm Exchangeの開発
ここまでの実施例において、会合界面制御改変により、それぞれのホモ体に異なるチャージの電荷を導入することで、還元剤により生じた半分子が優先的に異なるホモ体由来の半分子と結合し、高効率でBispecific抗体が生成することが示された。一方、Fab Arm ExchangeによってBispecific抗体が生成される過程においては、２種類のホモ体が還元剤で開裂した後にCH3ドメインが解離して半分子（HL分子）を生じる過程が律速段階となることが報告されている(Rispens T et al. J. Am. Chem. Soc., 2011. 133. 10302-10311)。つまり、それぞれのホモ体のCH3ドメインを適度に不安定化することでCH3ドメインの解離を促進することができれば、より効率良くFab Arm Exchangeを誘起できると期待される。そこでまず、表２、表３に示した5 mM GSH存在下でのBispecific抗体生成率と、それぞれのホモ体のCH3ドメインの安定性との関係を評価した。CH3ドメインの安定性は、参考例３の方法に従って測定したTm（熱変性中間温度）を指標とした。
Bispecific抗体生成率と用いた二種類のホモ体のうちCH3のTmが高い方の値との関係を図３に示す。Bispecific抗体生成率が低かったG1dP1/N1やG1dP4/N4ではCH3のTmが76℃以上と高かった一方で、反応効率の高いG1dP5/N5、G1dP3/N3、G1drP1/N1でのホモ体のCH3のTmはそれぞれ65.1℃、69.6℃、69.5℃であった。以上の結果からFab Arm ExchangeでのBispecific抗体生成率と、ホモ体のCH3の安定性には明らかに相関があることが示された。また、高い反応効率を達成するためには、用いる二種類のホモ体のうち、安定な方のホモ体のCH3のTmが70℃などを下回るようにCH3領域の安定性を不安定にすることが好ましいことが示された。ここで、同条件で測定した天然型ヒトIgG1の配列を有するMRAH-G1d/MRAL-k0のCH3領域のTmは83.6℃であったことから、Fab Arm Exchangeにおいて高い反応効率を達成するためには天然型ヒトIgG1からCH3領域のTmを例えば13℃以上低下させるように、CH3領域の安定性を不安定にする必要があることが分かった。
そこで次に、用いるホモ体のCH3ドメインのTmを低下させることによってBispecific抗体生成率が向上するかどうかについて検討した。CH3の安定性を低下させる改変としては、IgG2型の改変であるV397Mを用いた。IgG2ではEUナンバリング397番目のアミノ酸残基がMetになっており、これをIgG1型のValに置換する改変を導入することでCH3領域の安定性（Tm）が向上することが報告されている(WO2009/041613)。従って、IgG1型のCH3ドメインに対し、V397M改変を導入することでCH3ドメインが不安定化し、解離しやすくなることが期待された。
そこで、表２においてBispecific抗体生成率が低かったG1dP1/N1、G1dP4/N4、G1dP6/N6に対して両方のホモ体にV397M改変を導入したG1dP8/N8、G1dP9/N9、G1dP10/N10を検討した。具体的には、MRAH-G1dP1、MRAH-G1dP4、MRAH-G1dP6、H54-G1dN1、H54-G1dN4、H54-G1dN6に対してV397Mを導入したMRAH-G1dP8(配列番号２９)、MRAH-G1dP9(配列番号３０)、MRAH-G1dP10(配列番号３１)、H54-G1dN8(配列番号３２)、H54-G1dN9(配列番号３３)、H54-G1dN10(配列番号３４)を作製した。H鎖可変領域がMRAHの場合はMRAL-k0を、H54の場合はL28-k0を抗体L鎖として用い、参考例１の方法に従ってMRAH-G1dP8/MRAL-k0、H54-G1dN8/L28-k0、MRAH-G1dP9/MRAL-k0、H54-G1dN9/L28-k0、MRAH-G1dP10/MRAL-k0、H54-G1dN10/L28-k0を発現、精製した。また参考例３の方法に従って得られた抗体のTmを測定した。
次に、得られたホモ体2種類を以下に示す組み合わせで混合し、反応産物を参考例２の方法に従って評価した。
(1) MRAH-G1dP8/MRAL-k0とH54-G1dN8/L28-k0
(2) MRAH-G1dP9/MRAL-k0とH54-G1dN9/L28-k0
(3) MRAH-G1dP10/MRAL-k0とH54-G1dN10/L28-k0
(4) MRAH-G1dr/MRAL-k0とH54-G1dl/L28-k0
反応条件： TBS(Takara, pH7.6)中、[各mAb] = 0.2 mg/ml、0.05% Tween 20 (Junsei)、[GSH(Sigma)] = 5 mM、37℃、24時間。
得られた結果を表４に示す。
Figure 2015046467
表中の「MoAb1のCH3のTm」とは、MRAHの可変領域を持つホモ体のCH3のTmを、「MoAb2のCH3のTm」とは、H54の可変領域を持つホモ体のCH3のTmを示す。
G1dP1/N1の両方のホモ体にV397M改変を導入したG1dP8/N8ではMoAb1のCH3のTmが6.6℃低下して70.1℃に、MoAb2では4.2℃低下して70.5℃になり、Bispecific抗体が1.7%から73.2%に向上した。G1dP4/N4の両方のホモ体にV397M改変を導入したG1dP9/N9ではMoAb1のCH3のTmが1.5℃低下して67℃に、MoAb2では5.5℃低下して71℃になり、Bispecific抗体が4.4%から67.3%に向上した。G1dP6/N6の両方のホモ体にV397M改変を導入したG1dP10/N10ではMoAb2のCH3のTmに変化はなかったものの、MoAb1のCH3のTmが2.2℃低下して63.8℃になり、Bispecific抗体が29.3%から96.9%に向上した。以上の結果から、V397M改変を加えてホモ体のCH3のTmを低下させることによって、Fab Arm ExchangeでのBispecific抗体生成効率を向上させられることが示された。またこのとき既存のFab Arm Exchange効率向上改変を用いたG1dr/lのBispecific抗体生成率は88.1%であり、G1dP10/N10はこれよりも優れたBispecific抗体生成率を示した。
そこで次に、効果のあったEUナンバリング397番目周辺に対して、より大きなCH3不安定化効果が期待される改変を導入し、さらにBispecific抗体生成率が向上するかどうかを検討した。図４は報告されているIgG1のX線結晶構造解析データ(PDB:3DO3)を用い、CH3ドメインのEUナンバリング397番目周辺を示したものである。
まず、A鎖のD399はB鎖のK392と静電相互作用していると考えられるため、V397M改変に加えてK392をAspもしくはGluに置換することで両鎖の静電反発がおこり、両鎖の相互作用をより不安定化できる可能性がある。また、K392を側鎖分岐型のアミノ酸に置換することでM397との立体障害により両鎖の会合をより不安定化できることも期待される。さらに、EUナンバリング397番目のアミノ酸残基をより嵩高いアミノ酸に置換することで、V397M改変よりもさらにCH3の会合を抑制できる可能性も期待された。以上のような観点から、MRAH-G1dP1およびH54-G1dN1をベースとして、表５に示した７種類の抗体H鎖遺伝子を新たに作製した。
Figure 2015046467
H鎖可変領域がMRAHの場合はMRAL-k0を、H54の場合はL28-k0を抗体L鎖として用いた。参考例１の方法に従ってMRAH-G1dP14/MRAL-k0、H54-G1dN14/L28-k0、MRAH-G1dP15/MRAL-k0、H54-G1dN15/L28-k0、MRAH-G1dP16/MRAL-k0、H54-G1dN16/L28-k0、MRAH-G1dP17/MRAL-k0、H54-G1dN17/L28-k0、MRAH-G1dP18/MRAL-k0、H54-G1dN18/L28-k0、MRAH-G1dP19/MRAL-k0、H54-G1dN19/L28-k0、MRAH-G1dP20/MRAL-k0、H54-G1dN20/L28-k0を発現、精製した。また参考例３の方法に従って得られた抗体のTmを測定した。
次に、得られたホモ体2種類を以下に示す組み合わせで混合し、反応産物を参考例２の方法に従って評価した。
(1) MRAH-G1dP14/MRAL-k0とH54-G1dN14/L28-k0
(2) MRAH-G1dP15/MRAL-k0とH54-G1dN15/L28-k0
(3) MRAH-G1dP16/MRAL-k0とH54-G1dN16/L28-k0
(4) MRAH-G1dP17/MRAL-k0とH54-G1dN17/L28-k0
(5) MRAH-G1dP18/MRAL-k0とH54-G1dN18/L28-k0
(6) MRAH-G1dP19/MRAL-k0とH54-G1dN19/L28-k0
(7) MRAH-G1dP20/MRAL-k0とH54-G1dN20/L28-k0
(8) MRAH-G1dr/MRAL-k0とH54-G1dl/L28-k0
(9) MRAH-G1dP1/MRAL-k0とH54-G1dN1/L28-k0
(10) MRAH-G1dP8/MRAL-k0とH54-G1dN8/L28-k0
反応条件： TBS(Takara, pH7.6)中、[各mAb] = 0.2 mg/ml、0.05% Tween 20 (Junsei)、[2-MEA(Sigma)] = 25 mM、37℃、24時間。
得られた結果を表６に示す。
Figure 2015046467
G1dP1/N1の両方のホモ体にV397M改変を導入したG1dP8/N8ではBispecific抗体が73.2%であったのに対し、これの両鎖にK392Dを導入したG1dP14/N14では96.5%、K392Eを導入したG1dP15/N15では96.9%、K392Tを導入したG1dP18/N18では98.9%と大きくBispecific抗体生成率が向上した。またG1dP1/N1に対してV397Mの代わりにV397Fを導入したG1dP16/N16で96.5%、V397Yを導入したG1dP17/N17では98%と、V397MよりもBispecific抗体生成率が向上した。これは、V397Mを含むG1dP8/N8のMoAb1とMoAb2のCH3のTmがそれぞれ70.1℃と70.5℃であるのに対し、G1dP16/N16では69.1℃と69.7℃、G1dP17/N17では69.2℃と69.8℃であることから、狙い通りV397M改変よりもホモ体のCH3ドメインの相互作用が弱められ、解離しやすくなったためであると考えられる。このとき既存のFab Arm Exchange効率向上改変を用いたG1dr/lのBispecific抗体生成率は91.7%であり、G1dP14/N14、G1dP15/N15、G1dP16/N16、G1dP17/N17、G1dP18/N18はこれよりも優れたBispecific抗体生成率を示した。
医薬品製造への応用性を考えた場合、既存のFab Arm Exchange効率向上改変よりもBispecific抗体生成率が高く、ヘテロ成分が少ないG1dP16/N16（D356K/V397FおよびV397F/K439E）ならびにG1dP17/N17（D356K/V397YおよびV397Y/K439E）は極めて有用である。
また、表３および表６で検討した改変体のCH3の安定性と25mMの2MEAを還元剤として用いた際のBispecific抗体生成率の関係を図５に示す。図５に示すように、用いるホモ体のCH3の安定性とFab Arm Exchangeにおける効率は明らかに相関し、用いる二種類のホモ体のうちCH3の安定性が高い方のホモ体のTmが70℃などを下回るようにCH3領域の安定性を不安定とすることで、高いBispecific抗体生成率が達成される。
〔実施例５〕反応時間の検討
実施例４において見出されたG1dP17/N17を用いて反応時間と反応効率の関係を検討した。
反応条件：TBS(Takara, pH7.6)中、[各mAb] = 1.0 mg/ml、[2-MEA(Sigma)] = 25 mM、37℃、全量50μl。
９０分、３時間、２４時間で4℃に冷却した25 mM MES緩衝液(pH5.0)を450μl添加し、さらに4℃に保存することで反応を停止した。その後参考例２の方法に従って反応効率を評価した（図６）。
図６に示されるように、G1dP17/N17のBispecific抗体生成率は、25mM 2-MEA存在下、90分で94.6%、3時間で95.2%、24時間で97.4%となり、９０分間の反応時間で約95%であった。この結果から、片鎖にK409Rの改変をもう一方の片鎖にF405Lの改変を導入したG1dr/lのBispecific抗体生成率と比べて(表６)、十分に高い反応効率を示すことが明らかとなった。
〔実施例６〕高効率なFab Arm Exchangeを示す改変体のヒトFcgRおよびヒトFcRnへの結合評価
実施例４において高効率なFAE効率を示した改変体G1dP17/N17について、ヒトFcgRおよびヒトFcRnへの結合評価を実施した。まず、天然型IgG1の配列をもつMRAH-G1d/MRAL-k0およびFab-Arm Exchange後の改変体MRAH-G1dP17/MRAL-k0//H54-G1dN17/L28-k0のヒトFcRnとの結合を参考例５の方法に従って実施した。ヒトFcRnへの結合解析結果を表７に示す。
Figure 2015046467
表７に示した結果よりFab-Arm Exchangeで作製した改変体MRAH-G1dP17/MRAL-k0//H54-G1dN17/L28-k0は、ヒトFcRnに対して天然型IgG1と同等の結合活性をもつことが明らかとなった。
次に、ヒトFcgRに対する結合活性を参考例４の方法に従って評価した。ここでは天然型IgG1の配列をもつMRAH-G1d/MRAL-k0、Fab-Arm Exchange後の改変体MRAH-G1dP17/MRAL-k0//H54-G1dN17/L28-k0に加えて、Fab-Arm Exchange反応前の２種類のホモ体(MRAH-G1dP17/MRAL-k0とH54-G1dN17/L28-k0)およびCH3ドメインを不安定化する改変であるV397Yを抜いた２種類のホモ体（MRAH-G1dP1/MRAL-k0とH54-G1dN1/L28-k0）についても合わせて評価した。表８においてKD fold hFcgRIa、KD fold hFcgRIIaR、KD fold hFcgRIIaH、KD fold hFcgRIIb、KD fold hFcgRIIIaVとは、G1dのそれぞれのFcgRに対するKDを1とした場合の各改変体の相対的結合活性を示した値である。
Figure 2015046467
天然型と比較してFab-Arm Exchange後の改変体G1dP17/N17は、hFcgRIaへの結合が1.1倍、hFcgRIIaRへの結合が2.7倍、hFcgRIIaHへの結合が2.3倍、hFcgRIIbへの結合が2.5倍、hFcgRIIIaVへの結合が2.5倍増強されていた。ここで、CH3ドメインを不安定化するV397Yを導入する前のホモ体G1dP1およびG1dN1ではいずれのFcgRに対しても天然型と同等であること、またここにV397Yが導入されたホモ体(G1dP17およびG1dN17)では、各FcgRに対する結合が増強されていることから、V397Y改変によってhFcgRへの結合が増強されたことが分かる。
以上の結果から、高いFab-Arm Exchange効率を実現するG1dP17/N17は、天然型と比較してヒトFcRn、ヒトFcgRに対する結合を損なわないことが示された。
〔実施例７〕培養上清中におけるFab-Arm Exchangeの検討
Fab-Arm ExchangeによるBispecific抗体の製造では、二種類のホモ体を別々に培養、精製した後にFab-Arm Exchangeを行うことが想定されるが、もし培養上清中で反応を起こすことができればホモ体の精製段階を省略することができるため大きな利点となる。そこで二種類のホモ体を培養上清中で還元剤と共に混合し、Fab-Arm Exchangeが高効率で起こるかどうかを検証した。
まず、MRAH-G1dおよびH54-G1dの356番目のアミノ酸残基をEに358番目のアミノ酸残基をMに置換したMRAH-G1m(配列番号４９)、H54-G1m(配列番号５０)をそれぞれ作製した。次に、MRAH-G1mに対してE356KおよびK409Rを導入したMRAH-G1mrP1(配列番号５１)、H54-G1mに対してK439EおよびK409Rを導入したH54-G1mrN1(配列番号５２)を作製した。H鎖可変領域がMRAHの場合はMRAL-k0を、H54の場合はL28-k0を抗体L鎖として用いた。参考例１の方法に従ってMRAH-G1mrP1/MRAL-k0、H54-G1mrN1/L28-k0を発現、精製した。
またFreeStyle293細胞(Invitrogen)をFreeStyle 293 Expression mediumで培養した後、遠心して上清を回収し0.22μmのろ過膜でろ過したものをMocK CMとしてFab-Arm Exchangeに使用した。
反応条件： Mock CM(pH7.6)中、[各mAb] = 1.0 mg/ml、[2-MEA(Sigma)] = 25 mM、37℃、90分
反応後の反応溶液にrProtein A Sepharose Fast Flow（GEヘルスケア）を添加して精製した後に、参考例２の方法に従って反応効率を評価した（図７）。
図７に示したように、培養上清中であっても25mM 2-MEA存在下、37℃、90分間反応させることで98%以上の反応効率でBispecific抗体が生成されることが明らかとなった。
〔実施例８〕マウスIgG1でのFab-Arm Exchangeの開発
ここまでの実施例において、ヒトIgG1あるいはヒトIgG4で効率良くFab-Arm Exchangeが誘起されることが示された。次に、マウスIgG1でも同様にFab-Arm ExchangeによりBispecific抗体が生成されるかどうかを検証した。
報告されている結晶構造(Harris LJ et al. J. Mol. Biol., 1998. 275. 861-872)から、EUナンバリング399番目のDと409番目のKがCH3ドメインの鎖間相互作用に寄与していると推測された（図８）。そこでこの部位に対してヒトIgG1同様にヘテロ二量化を促進するための電荷を導入し、Fab-Arm Exchangeが誘起されるかどうかを検証した。
抗体H鎖可変領域には、WO2009/125825に開示されているヒトインターロイキン6レセプターに対する抗体のH鎖可変領域であるWT(H)(配列番号１：以後MRAHと記載)およびH54(配列番号２)を用いた。これらのH鎖可変領域に対し、抗体H鎖定常領域としてマウスIgG1のH鎖定常領域を有するMRAH-mIgG1（配列番号５３）およびH54-mIgG1(配列番号５４)を作製した。さらに会合界面制御改変として、MRAH-mIgG1にD399Kを導入したMRAH-mIgG1mP3（配列番号５５）、D399Rを導入したMRAH-mIgG1mP4(配列番号５６)、H54-mIgG1にK409Dを導入したH54-mIgG1mN3（配列番号５７）、K409Eを導入したH54-mIgG1mN4(配列番号５８)を作製した。L鎖としてマウスκ鎖定常領域の配列をもつMRAL-mk1（配列番号５９）およびL28-mk1(配列番号６０)を作製し、H鎖可変領域がMRAHの場合はMRAL-mk1を、H54の場合はL28-mk1を抗体L鎖として用いた。参考例１の方法に従ってMRAH-mIgG1mP3/MRAL-mk1、MRAH-mIgG1mP4/MRAL-mk1、H54-mIgG1mN3/L28-mk1、H54-mIgG1mN4/L28-mk1を発現、精製した。
次に、以下の組み合わせでFab-Arm Exchangeを実施した。
(1) MRAH-mIgG1mP3/MRAL-mk1とH54-mIgG1mN3/L28-mk1
(2) MRAH-mIgG1mP4/MRAL-mk1とH54-mIgG1mN4/L28-mk1
反応条件： TBS(Takara, pH7.6)中、[各mAb] = 2 mg/ml、[2-MEA(Sigma)] = 25 mM、37℃、19時間。
反応後、参考例５の方法に従ってCE-IEFにより反応効率を決定した（図９）。
その結果、MRAH-mIgG1mP3/MRAL-mk1とH54-mIgG1mN3/L28-mk1を反応させた場合では89.2%、MRAH-mIgG1mP4/MRAL-mk1とH54-mIgG1mN4/L28-mk1では89.9%といずれも高い効率でBispecific抗体が生成していることが確認された。ヒトIgG1あるいはヒトIgG4を用いたFab-Arm Exchangeと比較して反応効率が若干低下するのは、マウスIgG1ではヒンジ領域のジスルフィド結合が3本存在しヒトIgG1あるいはヒトIgG4のヒンジよりも二本の重鎖がより強固に結合しているためであると予想される(Harris LJ et al. J. Mol. Biol., 1998. 275. 861-872)。
〔実施例９〕マウスIgG1のFab Arm Exchangeで作製したBispecific抗体のマウスFcgRおよびマウスFcRnに対する結合活性の評価
参考例４−３に従って、マウスIgG型Fab-Arm Exchangeで作製した2種類のBispecific抗体（MRAH-mIgG1mP3/MRAL-mk1//H54-mIgG1mN3/L28-mk1および
MRAH-mIgG1mP4/MRAL-mk1//H54-mIgG1mN4/L28-mk1）のマウスFcgRおよびマウスFcRnへの結合を評価した。またMRAH-mIgG1/MRAL-mk1を参考例１に従って作製し、比較対象として測定した。測定結果を表９に示す。
Figure 2015046467
作製した二種類のBispecific抗体はいずれも天然型mIgG1と同様の結合プロファイルを示した。具体的には、mFcgRIおよびmFcgRIVには結合せず、mFcgRIIおよび、mFcgRIIIに対しては天然型mIgG1と比較して1.2倍の結合活性を示した。
次に参考例４−４に従ってmFcRnへの結合を評価した結果を表１０に示す。
Figure 2015046467
作製した二種類のBispecific抗体はいずれもmFcRnに対して天然型mIgG1と同等の結合を維持していることが示された。
〔実施例１０〕細胞傷害活性の測定
Fab-Arm Exchangeにより作製されたヒトIgG型二重特異性抗体、マウスIgG型二重特異性抗体が、既存の手法により作製された二重特異性抗体と同等の機能を保持しているかどうかを、抗ヒトグリピカン３および抗ヒトCD3の二重特異性抗体による細胞傷害活性を測定することで評価した。まずコントロールとして、Schaeferらによって報告されているCrossMab技術（Proc Natl Acad Sci, 2011, 108, 11187-11192）によりヒト IgG4の定常領域を有する抗ヒトGPC3/抗ヒトCD３二重特異性抗体が作製された。CrossMab技術により作製された本分子はWO2012/073985に記載されているヒトGPC3に対するFabのVHドメインとVLドメインが置換された分子となっている。また抗体H鎖定常領域には、ヘテロ会合を促進するために、Knobs-into-Holes技術を用いた。Knobs-into-Holes技術は一方のH鎖のCH3領域に存在するアミノ酸側鎖をより大きい側鎖（Knob;突起）に置換し、もう一方のH鎖のCH3領域に存在するアミノ酸側鎖をより小さい側鎖（Hole;空隙）に置換することで突起が空隙内に配置されるようにしてH鎖のヘテロ二量化を促進し、目的のヘテロ二量化抗体を効率的に取得できる技術である(Nature, 1994, 372, 379-383)。また、FcgRに対する結合を減弱させる改変として、WO2011/108714に記載されている改変が用いられた。具体的には、EUナンバリング234番目、235番目、297番目のアミノ酸残基をAlaに置換する改変が導入された。抗体H鎖のC末端からはEUナンバリング446番目のGlyおよび447番目のLysを除去し、そこに対してさらに抗体発現後の精製を容易にするため、抗ヒトGPC3側のH鎖のC末端にヒスチジンタグを、抗ヒトCD３側のH鎖のC末端にFLAGタグを付加した。以上の改変を導入した抗ヒトGPC3側H鎖として、GC33(2)H-G4dKnHS（配列番号６１）が作製された。また、抗ヒトCD3側のH鎖として、rCE115H-G4dHlFS（配列番号６２）が作製された。抗体L鎖としては、抗ヒトGPC3側としてGC33(2)L-k0（配列番号６３）を、抗ヒトCD3側としてrCE115L-k0（配列番号６４）を用いた。これらの抗体の発現は参考例１に従いFreeStyle293細胞で一過性発現させた。得られた培養上清がMabSelect SuReカラム（GE Healthcare社）に添加され、当該カラムの洗浄の後、50 mM酢酸による溶出が実施された。抗体を含む画分がHisTrap HPカラム（GE Healthcare社）もしくはNi Sepharose FFカラム（GE Healthcare社）に添加され、当該カラムの洗浄の後、イミダゾールによる溶出が実施された。抗体を含む画分が限外ろ過膜で濃縮された後、濃縮液がSuperdex 200カラム（GE Healthcare社）に添加され、その溶出液の単量体の抗体のみを回収することにより精製抗体GPC3 ERY22-rCE115が得られた。
次に、Fab Arm ExchangeによりヒトIgG1型、ヒトIgG4型、マウスIgG1型の定常領域を有し、可変領域が抗ヒトGPC3/抗ヒトCD3の二重特異性抗体が作製された。ヒトIgG1型およびヒトIgG4型のH鎖定常領域には、Fab Arm Exchange用改変を含むG1dP17、G1dN17、G1drP1、G1drN1、G4dP1、G4dN1に対してFcgR結合低減改変としてEUナンバリング235番目のアミノ酸残基をArgに239番目のアミノ酸残基をLysに置換する改変を導入したF760P17、F760N17、F760G1drP1、F760G1drN1、F760G4dP1、F760G4dN1がそれぞれ作製された。マウスIgG1型のH鎖定常領域には、実施例８で用いたmIgG1mP4、mIgG1mN4に対してFcgR結合低減改変としてEUナンバリング235番目、239番目のアミノ酸残基をLysに置換する改変を導入したmF18mP4、mF18mN4が作製された。可変領域としてはWO2012/073985に記載されている抗ヒトGPC3の配列を用い、H0000-F760N17(配列番号６５)、H0000-F760G1drN1(配列番号６６)、H0000-F760G4dN1(配列番号６７)、H0000-mF18mN4(配列番号６８)が作製された。一方、ヒトCD3側H鎖としてrCE115H-F760P17(配列番号６９)、rCE115H-F760G1drP1(配列番号７０)、rCE115H-F760G4dP1(配列番号７１)、rCE115H-mF18mP4(配列番号７２)が作製された。ヒトIgG1型およびヒトIgG4型の抗体L鎖としては、抗ヒトGPC3側としてGL4-k0（配列番号７９）を、抗ヒトCD3側としてrCE115L-k0（配列番号６４）を共通して用いた。また、マウスIgG1型の抗体L鎖としては抗ヒトGPC3側としてGL4-mk1（配列番号８０）を、抗ヒトCD3側としてrCE115L-mk1（配列番号８１）を用いた。これらのホモ体を参考例１の方法に従って発現、精製し、rCE115H-F760P17/rCE115L-k0、H0000-F760N17/GL4-k0、rCE115H-F760G1drP1/rCE115L-k0、H0000-F760G1drN1/GL4-k0、rCE115H-F760G4dP1/rCE115L-k0、H0000-F760G4dN1/GL4-k0、rCE115H-mF18mP4/rCE115L-mk1、H0000-mF18mP4/GL4-mk1を得た。
次に、得られたホモ体2種類を以下に示す組み合わせで混合し、FAE反応を起こした。

(1) rCE115H-F760P17/rCE115L-k0とH0000-F760N17/GL4-k0
(2) rCE115H-F760G1drP1/rCE115L-k0とH0000-F760G1drN1/GL4-k0
(3) rCE115H-F760G4dP1/rCE115L-k0とH0000-F760G4dN1/GL4-k0
(4) rCE115H-mF18mP4/rCE115L-mk1とH0000-mF18mP4/GL4-mk1

反応条件： TBS(Takara, pH7.6)中、[各mAb] = 0.36 mg/ml、[2-MEA(Sigma)] = 25 mM、37℃、18時間。

反応後の産物をPBSに透析し、細胞傷害活性の評価に用いた。
細胞傷害活性の評価は参考例６に記載の方法で実施された。結果を図１０−１、図１０−２に示す。
図１０−１に示した通り、ヒトIgG1型およびヒトIgG4型のFab Arm Exchangeで作製された二重特異性抗体はいずれも既存のBispecific抗体作製技術で作製されたコントロール抗体（GPC3 ERY22-rCE115）と同等の細胞傷害活性を示した。また図１０−２に示した通り、マウスIgG型Fab Arm Exchangeで作製された二重特異性抗体も既存のBispecific抗体作製技術で作製されたコントロール抗体（GPC3 ERY22-rCE115）と同等の細胞傷害活性を示した。
〔実施例１１〕ノーマルマウスPK試験
（１１−１）ノーマルマウスを用いたin vivo 試験
ヒトIgG型およびマウスIgG型Fab Arm Exchangeにより作製された抗体が既存の手法により作製された抗体と同等の血中濃度推移を示すかどうかについてノーマルマウスを用いたin vivo試験により評価した。
ヒトIgG型抗体としては3種類の抗ヒトグリピカン３/抗ヒトCD3二重特異性抗体：TR-G1drP1/N1、TR-G1dP17/N17、TR-G4dP1/N1をヒトIgG型Fab Arm Exchangeにより作製した。またコントロール抗体としては、可変領域は上記同様、抗ヒトグリピカン３/抗ヒトCD3を有し、定常領域としては、MRAH-G1d(配列番号３)のEUナンバリング118番目のAlaから始まる定常領域G1dおよびMRAH-wtG4d(配列番号５)のEUナンバリング118番目のAlaから始まる定常領域wtG4dからさらに228番目のアミノ酸残基をSerからProに置換してIgG1型のヒンジとしたG4dに対し、Knobs-into-Holes改変（Nature, 1994, 372, 379-383）を導入して作製した二重特異性抗体TR-G1dKiH、TR-G4dKiHを用いた。ここで定常領域名G1dKiHおよびG4dKiHとは、定常領域G1dあるいはG4dに対してKnob改変（349番目のアミノ酸残基をCysに、366番目のアミノ酸残基をTrpに置換する改変）を導入したKnob鎖と、G1dあるいはG4dに対してHole改変（356番目のアミノ酸残基をCysに、366番目のアミノ酸残基をSerに、368番目のアミノ酸残基をAlaに、407番目のアミノ酸残基をValに置換する改変）を導入したHole鎖を用い、それぞれのKnob鎖とHole鎖の組み合わせで発現した定常領域を示す。
一方、マウスIgG型抗体としては、WO2009/125825に記載されている抗ヒトIL-6レセプター抗体のH鎖可変領域であるH237の配列を有し、定常領域は天然型mIgG1の配列であるH237-mIgG1（配列番号７３）に対し、Fab-Arm Exchange用の改変を導入したH237-mIgG1mP3（配列番号７４）、H237-mIgG1mN3（配列番号７５）、H237-mIgG1mP4（配列番号７６）、H237-mIgG1mN4（配列番号７７）を作製した。抗体L鎖としては抗ヒトIL-6レセプターL鎖可変領域であるL104の配列を用い、これとマウスκ鎖の定常領域であるmk1からなるL104-mk1（配列番号：７８）を用いた。参考例１の方法に従って発現し、H237-mIgG1mP3/L104-mk1、H237-mIgG1mN3/L104-mk1、H237-mIgG1mP4/L104-mk1、H237-mIgG1mN4/L104-mk1を得た。得られたホモ体を用いてFab Arm Exchangeを行い、SA-mIgG1mP3/mN3（H237-mIgG1mP3/L104-mk1とH237-mIgG1mN3/L104-mk1の組み合わせ）、SA-mIgG1mP4/mN4（H237-mIgG1mP4/L104-mk1とH237-mIgG1mN4/L104-mk1の組み合わせ）を得た。またコントロール抗体としてはH237-mIgG1とL104-mk1を用いて発現したSA-mIgG1を用いた。
Fab Arm Exchangeはいずれも以下の反応条件で行い、反応後PBSに透析してin vivo試験に用いた。
反応条件： TBS(Takara, pH7.6)中、[各mAb] = 0.225 mg/ml、[2-MEA(Sigma)] = 25 mM、37℃、17時間。
ノーマルマウス（C57BL/6J mouse、Charles River Japan）に、ヒトIgG型抗ヒトグリピカン3/抗ヒトCD3二重特異性抗体（TR-G1dKiH、TR-G1drP1/N1、TR-G1dP17/N17、TR-G4dKiH、TR-G4dP1/N1）、抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体（SA-mIgG1、SA-mIgG1mP3/mN3およびSA-mIgG1mP4/mN4）を投与した後の各抗体の体内動態を評価した。抗体は、0.1mg/mLに調製されたものを10 mL/kgで尾静脈に投与した。抗体投与後5分、2時間、1日、2日、3日、7日、14日、21日、28日が経過した後に当該マウスから採血が行なわれた。採取された血液を直ちに4℃、15,000 rpmで15分間遠心分離することによって、血漿が得られた。分離した血漿は、測定を実施するまで-20℃以下に設定された冷凍庫に保存された。
（１１−２）ECLIA法による血漿中Bispecific抗体濃度の測定
マウス血漿中の二重特異性抗体濃度はECLIA法にて測定された。まず、可溶型ヒトグリピカン３をMULTI - ARRAY 96well Plate （Meso Scale Discovery）に分注し、4℃で１晩静置することによって、可溶型ヒトグリピカン３固相化プレートが作成された。血漿中濃度として200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 ng/mLの二重特異性抗体を含む検量線試料と100倍以上希釈されたマウス血漿測定試料が調製された。これらの検量線試料および血漿測定試料100μLが各ウェルに分注された可溶型ヒトグリピカン３固相化プレートを室温で2時間撹拌させた。続いて、抗ヒトCD3抗体に対するウサギ型イディオタイプ抗体を室温で1時間撹拌させた。その後、Anti-Rabbit IgG-Sulfotag antibody (Meso Scale Discovery) を室温で1時間反応させ、Read Buffer T (Meso Scale Discovery) を添加後の発光がSECTOR Imager 2400 (Meso Scale Discovery) で測定された。マウス血漿中の抗体濃度は検量線の発光シグナルから解析ソフトウェアSOFTmax PRO（Molecular Devices）を用いて算出された。その結果を図１１に示した。またPKパラメータを表１１に示す。図１１および表１１に示された結果から、ヒトIgG型Fab Arm Exchangeにより作製された二重特異性抗体はいずれも既存の二重特異性抗体作製技術であるKnobs-into-Holes技術を用いて作製されたコントロール抗体と同等の血中濃度推移を示すことが明らかとなった。
Figure 2015046467
（１１−3）ELISA法による血漿中抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体濃度の測定
マウス血漿中の抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体濃度はELISA法にて測定された。まず、可溶型ヒトIL-6レセプター をNunc-Immuno Plate, MaxiSoup（Nalge nunc International）に分注し、4℃で１晩静置することによって可溶型ヒトIL-6レセプター固相化プレートが作成された。血漿中濃度として2.50、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039μg/mLの抗ヒトIL-6レセプターマウス抗体を含む検量線試料と100倍以上希釈されたマウス血漿測定試料が調製された。これらの検量線試料および血漿測定試料100μLが各ウェルに分注された可溶型ヒトIL-6レセプター固相化プレートを室温で2時間撹拌させた。その後Anti-Mouse IgG-Peroxidase antibody（SIGMA）を室温で2時間反応させた反応液の発色反応が、TMB One Component HRP Microwell Substrate（BioFX Laboratories）を基質として用いて行われた。1N-Sulfuric acid（Showa Chemical）を添加することによって反応が停止された各ウェルの反応液の450 nmの吸光度が、マイクロプレートリーダーにて測定された。マウス血漿中の抗体濃度は検量線の吸光度から解析ソフトウェアSOFTmax PRO（Molecular Devices）を用いて算出された。その結果を図１２に示し、その抗体パラメータを表１２に示す。図１２および表１２に示された結果から、マウスIgG型Fab Arm Exchangeで作製された抗体は天然型mIgG1の配列を有するコントロール抗体と同等の血中濃度推移を示すことが明らかとなった。
Figure 2015046467
〔参考例１〕抗体の発現ベクターの作製および抗体の発現と精製
抗体のH鎖およびL鎖の塩基配列をコードする全長の遺伝子の合成は、Assemble PCR等を用いて、当業者公知の方法で作製した。アミノ酸置換の導入はPCR等を用いて当業者公知の方法で行った。得られたプラスミド断片を動物細胞発現ベクターに挿入し、H鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。作製したプラスミドをヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株（Invitrogen社）、またはFreeStyle293細胞（Invitrogen社）に、一過性に導入し、抗体の発現を行った。得られた培養上清を回収した後、0.22μmフィルターMILLEX(R)-GV（Millipore）、または0.45μmフィルターMILLEX(R)-GV（Millipore）を通して培養上清を得た。得られた培養上清から、rProtein A Sepharose Fast Flow（GEヘルスケア）またはProtein G Sepharose 4 Fast Flow（GEヘルスケア）を用いて当業者公知の方法で、抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE等の方法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423）。
〔参考例２〕イオン交換クロマトグラフィーによるBispecific抗体生成率の評価
Priminence UFLC(島津製作所)を用いたイオン交換クロマトグラフィー精製法において、各検体の分離が評価された。移動相には25 mM MES緩衝液、pH5.0ならびに500 mMの塩化ナトリウムを含む25 mM MES緩衝液、pH5.0を、カラムはProPac WCX-10 (Thermo Scientific)を用い、2液混合グラジエント法によりBispecific抗体が分離された。データの取得は215 nmの波長で実施し、Empower2(Waters)を用いて溶出結果が評価された。
Bispecific抗体生成率(%)は、Bispecific抗体の面積値を系中に存在する全抗体の面積値で除し、100をかけた値を用いた。片方のホモ体の回収率が悪い場合には、もう片方のホモ体の面積の2倍値をBispecific抗体の面積値と合わせた値を全抗体の面積値として計算した。
〔参考例３〕Tmの測定
CH3ドメインのTmの測定は、Rotor-gene Q (QIAGEN) を用いて当業者公知の方法で行った。抗体濃度0.1mg/mL、SYPRO orange濃度10X concentrateで混合したサンプルを30度から99度まで昇温し、蛍光強度（励起波長470nm、蛍光波長555nm）を0.4度毎に測定した。測定はPBS（Sigma, pH7.4）中で行った。解析はRotor-gene Q series software を用いて行い、蛍光強度の一次微分によって求めた変曲点をTmとした。MRAHのTmはCH2が70℃付近、Fabが95℃付近、H54のTmはCH2が70℃付近、Fabが90℃付近であることを利用してCH3ドメインのTmが算出された。
〔参考例４〕SPRによる相互作用解析
（４−１）FcγRの調製方法および改変抗体とFcγRとの相互作用解析方法
FcγRの細胞外ドメインを以下の方法で調製した。まずFcγRの細胞外ドメインの遺伝子の合成を当業者公知の方法で実施した。その際、各FcγRの配列はNCBIに登録されている情報に基づき作製した。具体的には、FcγRIについてはNCBIのアクセッション番号NM_000566.3の配列、FcγRIIaについてはNCBIのアクセッション番号NM_001136219.1の配列、FcγRIIbについてはNCBIのアクセッション番号NM_004001.3の配列、FcγRIIIaについてはNCBIのアクセッション番号NM_001127593.1の配列、FcγRIIIbについてはNCBIのアクセッション番号NM_000570.3の配列に基づいて作製し、C末端にHisタグを付加した。またFcγRIIa、FcγRIIIa、FcγRIIIbについては多型が知られているが、多型部位についてはFcγRIIaについてはJ. Exp. Med., 1990, 172: 19-25、FcγRIIIaについてはJ. Clin. Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070, FcγRIIIbについてはJ. Clin. Invest., 1989, 84, 1688-1691を参考にして作製した。
得られた遺伝子断片を動物細胞発現ベクターに挿入し、発現ベクターを作製した。作製した発現ベクターをヒト胎児腎癌細胞由来FreeStyle293細胞（Invitrogen社）に、一過性に導入し、目的タンパク質を発現させた。培養し、得られた培養上清を回収した後、0.22μmフィルターを通して培養上清を得た。得られた培養上清は原則として次の4ステップで精製した。第1ステップは陽イオン交換カラムクロマトグラフィー（SP Sepharose FF）、第2ステップはHisタグに対するアフィニティカラムクロマトグラフィー（HisTrap HP）、第3ステップはゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Superdex200）、第4ステップは無菌ろ過、を実施した。ただし、FcγRIについては、第1ステップにQ sepharose FFを用いた陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを実施した。精製したタンパク質については分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE等の方法により算出された吸光係数を用いて精製タンパク質の濃度を算出した（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423）。
Biacore T100（GEヘルスケア）、Biacore T200（GEヘルスケア）、Biacore A100、Biacore 4000を用いて、各改変抗体と上記で調製したFcγレセプターとの相互作用解析を行った。ランニングバッファーにはHBS-EP+（GEヘルスケア）を用い、測定温度は25℃とした。Series S Sensor Chip CM5（GEヘルスケア）またはSeries S sensor Chip CM4（GEヘルスケア）に、アミンカップリング法により抗原ペプチド、ProteinA（Thermo Scientific）、Protein A/G（Thermo Scientific）、Protein L（ACTIGENまたはBioVision）を固定化したチップ、あるいはSeries S Sensor Chip SA（certified）（GEヘルスケア）に対して予めビオチン化しておいた抗原ペプチドを相互作用させ、固定化したチップを用いた。
これらのセンサーチップに目的の抗体をキャプチャーさせ、ランニングバッファーで希釈したFcγレセプターを相互作用させ、抗体に対する結合量を測定し、抗体間で比較した。ただし、Fcγレセプターの結合量はキャプチャーした抗体の量に依存するため、各抗体のキャプチャー量でFcγレセプターの結合量を除した補正値で比較した。また、10 mM glycine-HCl、pH1.5を反応させることで、センサーチップにキャプチャーした抗体を洗浄し、センサーチップを再生して繰り返し用いた。
また、各改変抗体のFcγRに対するKD値を算出するため速度論的な解析は以下の方法にしたがって実施した。まず、上記のセンサーチップに目的の抗体をキャプチャーさせ、ランニングバッファーで希釈したFcγレセプターを相互作用させ、得られたセンサーグラムに対してBiacore Evaluation Softwareにより測定結果を1:1 Langmuir binding modelでglobal fittingさせることで結合速度定数ka (L/mol/s)、解離速度定数kd(1/s)を算出し、その値から解離定数KD (mol/L) を算出した。
（４−２）FcRnの調製方法および改変抗体とFcRnとの相互作用解析方法
FcRnは、FcRnとβ2-ミクログロブリンとの複合体である。公表されているヒトFcRn遺伝子配列に基づいてオリゴDNAプライマーを調製した（J Exp Med. 1994 Dec 1; 180(6): 2377-81）。遺伝子全体をコードするDNA断片は、調製したプライマーおよび鋳型としてヒトcDNA（Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech）を用いてPCRによって調製した。得られたDNA断片を鋳型として用い、シグナル領域（Met1〜Leu290）を含有する細胞外ドメインをコードするDNA断片をPCRによって増幅し、哺乳動物細胞発現ベクターに挿入した。同様に、公表されているヒトβ2-ミクログロブリン遺伝子配列（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (26): 16899-16903 (2002)）に基づいてオリゴDNAプライマーを調製した。遺伝子全体をコードするDNA断片は、調製したプライマーおよび鋳型としてヒトcDNA（Human Placenta Marathon-Ready cDNA, Clontech）を用いてPCRによって調製した。得られたDNA断片を鋳型として用い、シグナル領域（Met1〜Met119）を含有するタンパク質全体をコードするDNA断片をPCRによって増幅し、哺乳動物細胞発現ベクターに挿入した。
可溶型ヒトFcRnを以下の手順により発現させた。ヒトFcRn（配列番号：30）およびβ2-ミクログロブリン（配列番号：31）を発現させるために構築したプラスミドを、PEI（Polyscience）を用いたリポフェクション法によって、ヒト胎児腎癌由来細胞株HEK293H（Invitrogen）の細胞に導入した。得られた培養上清を回収して、IgG Sepharose 6 Fast Flow（Amersham Biosciences）を用いて精製した後にHiTrap Q HP（GE Healthcare）（J Immunol. 2002 Nov 1; 169(9): 5171-80）を用いることによってFcRnをさらに精製した。
Biacoreを用いた抗体とFcRnの相互作用を評価する測定系として、J Immunol. 2009;182(12):7663-71.に記されたセンサーチップへ抗体を固定化しヒトFcRnをアナライトとする系が報告されている。この目的のために、ヒトFcRnを参考例4に記載のように調製した。本系を用いて、Fv4-IgG1、Fv4-IgG1-v1およびFv4-IgG1-v2のpH6.0およびpH7.4におけるヒトFcRnへの結合活性（解離定数KD）の評価を行った。被験物質である抗体は、Series SセンサーチップCM5に直接固定化して試験に供した。センサーチップへの抗体の固定化は、ランニングバッファーとして50 mmol/Lリン酸ナトリウム/150 mmol/L NaCl, 0.05% (v/v%) Surfactant P20 pH6.0を用い、アミンカップリングキットを使用してメーカーのマニュアルに従って固定化量500RUを目指して実施した。
ランニングバッファーとして、50 mmol/Lリン酸ナトリウム/150 mmol/L NaCl, 0.05% Surfactant P20 pH6.0、あるいは50 mmol/Lリン酸ナトリウム/150 mmol/L NaCl, 0.05% Surfactant P20 pH7.4を使用し、作成したセンサーチップを使用して測定を実施した。測定は全て25℃で行った。ヒトFcRn希釈液とランニングバッファー（対照溶液として）とを流速5 μL/minで10分間インジェクトし、センサーチップ上の抗体にヒトFcRnを相互作用させた。その後流速5 μL/minで1分間ランニングバッファーを流しFcRnを解離を観察した後、20 mmol/L Tris-HCl/150 mmol/L NaCl, pH8.1を流速30 μL/minで15秒間インジェクトを2回繰り返してセンサーチップを再生した。
また、各改変抗体のFcRnに対するKD値を算出するため速度論的な解析は以下の方法にしたがって実施した。まず、上記のセンサーチップに目的の抗体をキャプチャーさせ、ランニングバッファーで希釈したFcRnを相互作用させ、得られたセンサーグラムに対してBiacore Evaluation Softwareにより測定結果を1:1 Langmuir binding modelでglobal fittingさせることで結合速度定数ka (L/mol/s)、解離速度定数kd(1/s)を算出し、その値から解離定数KD (mol/L) を算出した。
〔４−３〕mFcγRの調製方法および改変抗体とmFcγRとの相互作用解析方法
マウスのFcγRの細胞外ドメインを以下の方法で調製した。まずFcγRの細胞外ドメインの遺伝子の合成を当業者公知の方法で実施した。その際、各FcγRの配列はNCBIに登録されている情報に基づき作製した。具体的には、mFcγRIについてはNCBI Reference Sequence: NP_034316.1、mFcγRIIについてはNCBI Reference Sequence: NP_034317.1、mFcγRIIIについてはNCBI Reference Sequence: NP_034318.2、mFcγRIVについてはNCBI Reference Sequence: NP_653142.2の配列に基づいて作製し、C末端にHisタグを付加した。
得られた遺伝子断片を動物細胞発現ベクターに挿入し、発現ベクターを作製した。作製した発現ベクターをヒト胎児腎癌細胞由来FreeStyle293細胞（Invitrogen社）に、一過性に導入し、目的タンパク質の発現を行った。得られた培養上清を回収した後、0.22μmフィルターを通して培養上清を得た。得られた培養上清は原則として次の4ステップで精製した。第1ステップはイオン交換カラムクロマトグラフィー、第2ステップはHisタグに対するアフィニティカラムクロマトグラフィー（HisTrap HP）、第3ステップはゲルろ過カラムクロマトグラフィー（Superdex200）、第4ステップは無菌ろ過を実施した。第1ステップのイオン交換カラムクロマトグラフィーについて、mFcγRIはQ Sepharose HP、mFcγRIIおよびmFcγRIVはSP Sepharose FF、mFcγRIIIはSP Sepharose HPを用いた。また第3ステップ以降で用いた溶媒はD-PBS(-)としたが、mFcγRIIIについては0.1M Arginineを含むD-PBS(-)とした。精製したタンパク質については分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE等の方法により算出された吸光係数を用いて精製タンパク質の濃度を算出した（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423）。
Biacore T100（GEヘルスケア）、Biacore T200（GEヘルスケア）、Biacore A100、Biacore 4000を用いて、各改変抗体と上記で調製したFcγレセプターとの相互作用解析を行った。ランニングバッファーにはHBS-EP+（GEヘルスケア）を用い、測定温度は25℃とした。Series S Sensor Chip CM5（GEヘルスケア）またはSeries S sensor Chip CM4（GEヘルスケア）に、アミンカップリング法により抗原ペプチド、ProteinA（Thermo Scientific）、Protein A/G（Thermo Scientific）、Protein L（ACTIGENまたはBioVision）を固定化したチップ、あるいはSeries S Sensor Chip SA（certified）（GEヘルスケア）に対して予めビオチン化しておいた抗原ペプチドを相互作用させ、固定化したチップを用いた。
これらのセンサーチップに目的の抗体をキャプチャーさせ、ランニングバッファーで希釈したmFcγRを相互作用させ、抗体に対する結合量を測定し、抗体間で比較した。ただし、mFcγRの結合量はキャプチャーした抗体の量に依存するため、各抗体のキャプチャー量でmFcγRの結合量を除した補正値で比較した。また、10 mM glycine-HCl、pH1.5を反応させることで、センサーチップにキャプチャーした抗体を洗浄し、センサーチップを再生して繰り返し用いた。
また、各改変抗体のFcγRに対するKD値を算出するため速度論的な解析は以下の方法にしたがって実施した。まず、上記のセンサーチップに目的の抗体をキャプチャーさせ、ランニングバッファーで希釈したmFcγRを相互作用させ、得られたセンサーグラムに対してBiacore Evaluation Softwareにより測定結果を1:1 Langmuir binding modelでglobal fittingさせることで結合速度定数ka (L/mol/s)、解離速度定数kd(1/s)を算出し、その値から解離定数KD (mol/L) を算出した。
〔４−４〕mFcRnの調製方法および改変抗体とmFcRnとの相互作用解析方法
Biacore T100、Biacore T200、Biacore A100、Biacore 4000 (GE Healthcare) を用いて、マウスFcRnと抗体との速度論的解析を行った。センサーチップCM4 (GE Healthcare) 上にアミンカップリング法でプロテインL (ACTIGEN) を適当量固定化し、そこへ目的の抗体を捕捉させた。次に、FcRn希釈液とランニングバッファー（対照溶液として）とをインジェクトし、センサーチップ上に捕捉させた抗体にマウスFcRnを相互作用させた。ランニングバッファーには50 mmol/Lリン酸ナトリウム、150 mmol/L NaCl、0.05% (w/v) Tween20、pH6.0を用い、FcRnの希釈にもそれぞれのバッファーを使用した。チップの再生には10 mmol/Lグリシン-HCl, pH1.5を用いた。測定は全て25 ℃で実施した。測定で得られたセンサーグラムから、カイネティクスパラメーターである結合速度定数 ka (1/Ms)、および解離速度定数 kd (1/s) を算出し、その値をもとに各抗体のマウスFcRnに対する KD (M) を算出した。各パラメーターの算出には Biacore Evaluation Software (GE Healthcare)を用いた。
〔参考例５〕CE-IEF
CE-IEFの測定は、PA800 Plus(Beckman Coulter)を用いて同業者公知の方法で行った。Pharmalyteはbroad rangeが5-8と8-10.5のものを等量混合して、pI range 5-10.5で分析を行った。4mg/mLの抗体溶液を用いて分析し、結果は32 karat software(Beckman Coulter)を用いて解析した。Bispecific抗体生成率(%)は、Bispecific抗体の面積値を系中に存在する全抗体の面積値で除し、100をかけた値を用いた。
〔参考例６〕細胞傷害活性の測定
（６−１）ヒト末梢血単核球（PBMC）溶液の調製
1,000単位/mLのヘパリン溶液（ノボ・ヘパリン注5千単位，ノボ・ノルディスク社）をあらかじめ100μL注入した注射器を用い、健常人ボランティア（成人）より末梢血50 mLが採取された。PBS（-）で2倍希釈した後に4等分された末梢血が、15 mLのFicoll-Paque PLUSをあらかじめ注入して遠心操作が行なわれたLeucosepリンパ球分離管（Cat. No. 227290、Greiner bio-one社）に加えられた。当該分離管の遠心分離（2,150 rpm、10分間、室温）の後、単核球画分層が分取された。10%FBSを含むDulbecco's Modified Eagle's Medium（SIGMA社、以下10%FBS/D-MEM）で1回単核球画分の細胞が洗浄された後、当該細胞は10%FBS/D-MEMを用いてその細胞密度が4×106 /mLに調製された。このように調製された細胞溶液がヒトPBMC溶液として以後の試験に用いられた。
（６−２）細胞傷害活性の測定
細胞傷害活性はxCELLigenceリアルタイムセルアナライザー（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いた細胞増殖抑制率で評価された。標的細胞にはSK-HEP-1細胞株にヒトGPC3を強制発現させて樹立したSK-pca13a細胞株が用いられた。SK-pca13aをディッシュから剥離し、1×104 cells/wellとなるようにE-Plate 96（ロシュ・ダイアグノスティックス社）プレートに100μL/wellで播き、xCELLigenceリアルタイムセルアナライザーを用いて生細胞の測定が開始された。翌日xCELLigenceリアルタイムセルアナライザーからプレートを取り出し、当該プレートに各濃度（0.004、0.04、0.4、4 μg/ml）に調製した各抗体50μLが添加された。室温にて15分間反応させた後に（６−１）で調製されたヒトPBMC溶液50μL（2×104 cells/well）が加えられ、xCELLigenceリアルタイムセルアナライザーに当該プレートを再セットすることによって、生細胞の測定が開始された。反応は5%炭酸ガス、37℃条件下にて行われ、ヒトPBMC添加72時間後のCell Index値から、下式により細胞増殖抑制率（％）が求められた。なお計算に用いたCell Index値は、抗体添加直前のCell Index値が1となるようにノーマライズした後の数値が用いられた。
細胞増殖抑制率（％）＝(A-B)×100/(A-1)
Aは抗体を添加していないウェルにおけるCell Index値の平均値（標的細胞とヒトPBMCのみ）、Bは各ウェルにおけるCell Index値の平均値を示す。
本発明の方法を用いることにより、還元条件下において、従来技術より高い効率で二重特異性抗体を作製することが可能である。

Claims (23)

  1. a) 第1の抗原結合活性を有し、Fc領域を含む第1のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
    b) 該第1の抗原結合活性と異なる第2の抗原結合活性を有し、Fc領域を含む第2のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
    c) ヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にする還元条件下で、該第1のポリペプチドのホモ体および該第2のポリペプチドのホモ体を共にインキュベートする段階、ならびに
    d) 第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を得る段階
    を含み、
    前記第1及び／又は第2のポリペプチドのFc領域に含まれるCH3領域において、
    (1) EUナンバリングによる 356 位および 439位のアミノ酸残基
    (2) EUナンバリングによる 357 位および 370位のアミノ酸残基
    (3) EUナンバリングによる 399 位および 409位のアミノ酸残基
    に示すアミノ酸残基の組から選択される1組ないし3組のアミノ酸残基が同種の電荷を有し、
    前記第1のポリペプチドのCH3領域及び前記第2のポリペプチドのCH3領域の両方において、前記（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組のうち同じ組のアミノ酸残基がそれぞれ同種の電荷を有する場合、前記第2のポリペプチドのCH3領域における当該組のアミノ酸残基が、前記第1のポリペプチドのCH3領域における当該組のアミノ酸残基とは反対の電荷を有する、
    異種多量体を製造するための方法。
  2. 請求項1の段階a)において、第1のポリペプチドと多量体を形成する第3のポリペプチドを提供する段階を含み、かつ段階b)において、第2のポリペプチドと多量体を形成する第4のポリペプチドを提供する段階を含む、請求項1記載の製造方法。
  3. 前記同種の電荷を有するアミノ酸残基が、以下の（A)または(B)いずれかの群に含まれる1つ以上のアミノ酸残基から選択される、請求項1または2に記載の製造方法：
    (A)グルタミン酸 (E)、アスパラギン酸 (D)；
    (B)リジン（K)、アルギニン（R)、ヒスチジン（H)。
  4. 第1及び第2のポリペプチドにおいてそれぞれ同種の電荷を有するアミノ酸残基の組が、以下の(1)〜(4)のいずれか1組のアミノ酸残基の組である、請求項1〜3のいずれか一項記載の製造方法：
    (1) EUナンバリングによる 356 位および 439位のアミノ酸残基
    (2) EUナンバリングによる 357 位および 370位のアミノ酸残基
    (3) EUナンバリングによる 399 位および 409位のアミノ酸残基
    (4)(i) EUナンバリングによる 399 位および 409位のアミノ酸残基、並びに
    (ii) EUナンバリングによる 356 位および 439位のアミノ酸残基。
  5. 第1及び第2のポリペプチドにおいてそれぞれ同種の電荷を有するアミノ酸残基の組が、以下の組のアミノ酸残基の組である、請求項1〜4のいずれか一項記載の製造方法：
    (i) EUナンバリングによる 399 位および 409位のアミノ酸残基、並びに
    (ii) EUナンバリングによる 356 位および 439位のアミノ酸残基。
  6. 第1及び／又は第2のポリペプチドにおいて、第1及び／又は第2のポリペプチドのCH3領域の安定性が不安定になるようにアミノ酸が改変されている、請求項1〜5のいずれか一項記載の製造方法。
  7. 第1及び／又は第2のポリペプチドにおいて、EUナンバリングによる397位及び／又は392位のアミノ酸が改変されている、請求項1〜6のいずれか一項記載の製造方法。
  8. 第1及び／又は第2のポリペプチドのFc領域がIgG1、IgG2、IgG3又はIgG4タイプである、請求項1〜7のいずれか一項記載の製造方法。
  9. 第1及び／又は第2のポリペプチドのFc領域がマウス由来のFc領域である、請求項1〜7のいずれか一項記載の製造方法。
  10. 前記第1及び／又は第2のポリペプチドのFc領域に含まれるCH3領域において、
    (1) EUナンバリングによる 356 位および 439位のアミノ酸残基
    (2) EUナンバリングによる 360 位および 371位のアミノ酸残基
    (3) EUナンバリングによる 399 位および 409位のアミノ酸残基
    に示すアミノ酸残基の組から選択される1組ないし3組のアミノ酸残基が同種の電荷を有し、
    前記第1のポリペプチドのCH3領域及び前記第2のポリペプチドのCH3領域の両方において、前記（1)〜（3)に示すアミノ酸残基の組のうち同じ組のアミノ酸残基がそれぞれ同種の電荷を有する場合、前記第2のポリペプチドのCH3領域における当該組のアミノ酸残基が、前記第1のポリペプチドのCH3領域における当該組のアミノ酸残基とは反対の電荷を有する、
    請求項９記載の異種多量体を製造するための方法。
  11. a) 第1の抗原結合活性を有し、Fc領域を含む第1のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
    b) 該第1の抗原結合活性と異なる第2の抗原結合活性を有し、Fc領域を含む第2のポリペプチドのホモ体を提供する段階、
    c) ヒンジ領域内のシステインがジスルフィド結合の異性化を起こすことを可能にする還元条件下で、該第1のポリペプチドのホモ体および該第2のポリペプチドのホモ体を共にインキュベートする段階、ならびに
    d) 第1及び第2のポリペプチドを含む異種多量体を得る段階
    を含み、
    前記第1及び／又は第2のポリペプチドのFc領域に含まれるCH3領域におけるEUナンバリングによる397位及び／又は392位のアミノ酸が改変されている、
    異種多量体を製造するための方法。
  12. 第1及び／又は第2のポリペプチドにおいて、
    EUナンバリングによる397位がMet(M)、Phe(F)若しくはTyr(Y)に改変されており、かつ／又は
    EUナンバリングによる392位がAsp(D)、Glu(E)、Thr(T)、Val(V)若しくはIle(I)に改変されている
    請求項1〜11のいずれか一項記載の製造方法。
  13. 第1及び／又は第2のポリペプチドにおいて、EUナンバリングによる397位がPhe(F)又はTyr(Y)に改変されている、請求項1〜12のいずれか一項記載の製造方法。
  14. 第１のポリペプチドにおいて、EUナンバリングによる356位がLys(K)に改変されておりかつEUナンバリングによる397位がPhe(F)又はTyr(Y)に改変されており、第２のポリペプチドにおいて、EUナンバリングによる397位がPhe(F)又はTyr(Y)に改変されておりかつEUナンバリングによる439位がGlu(E)に改変されている、請求項1〜13のいずれか一項記載の製造方法。
  15. 前記段階a)およびb)が、第一のポリペプチドのホモ体を産生する細胞株と第二のポリペプチドのホモ体を産生する細胞株を混合することにより実施され、前記段階c)が、当該培養上清中で実施される、請求項1〜14のいずれか一項記載の製造方法。
  16. 前記異種多量体が多重特異性抗体又はヘテロFc融合タンパク質である、請求項1〜15のいずれか一項記載の製造方法。
  17. 前記異種多量体が二重特異性抗体である、請求項1〜16のいずれか一項記載の製造方法。
  18. 請求項1又は請求項11記載の段階c)が還元剤との接触を含む、請求項1〜17のいずれか一項記載の製造方法。
  19. 段階c)が、グルタチオン、L-システイン、ジチオスレイトール、β-メルカプト-エタノール、TCEPおよび2-MEAからなる群より選択される作用物質の添加を含む、請求項18記載の製造方法。
  20. 段階c)が、グルタチオン、2-MEAより選択される作用物質の添加を含む、請求項19記載の製造方法。
  21. 請求項1〜20のいずれか一項記載の方法によって製造された異種多量体。
  22. 二重特異性抗体である、請求項21に記載の異種多量体。
  23. 請求項21または22に記載の異種多量体及び医薬的に許容される担体を含む組成物。
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