MXPA04007583A - Variantes de anticuerpo con tasas mas rapidas de asociacion a antigeno. - Google Patents

Abstract

Se describen variantes del anticuerpo con tasas mas rapidas de asociacion a antigeno. Las variantes del anticuerpo tienen una o mas alteraciones de aminoacido en o adyacentes a al menos una region hipervariable de las mismas que incrementan la complementariedad de la carga entre la variante del anticuerpo y un antigeno al cual se enlaza.

Description

VARIANTES DE ANTICUERPO CON TASAS MÁS RÁPIDAS DE ASOCIACIÓN A ANTÍGENO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención La invención en la presente se refiere a variantes de anticuerpo con tasas más rápidas de asociación a antígeno. Las variantes de anticuerpo tienen una o más alteraciones en o adyacentes a al menos una región hipervariable de las mismas, en donde la(s) alteración (es) aumenta (n) la complementar!edad de carga entre la variante de anticuerpo y un antígeno al cual se enlaza. Descripción Detallada de la Técnica Relacionada Los anticuerpos son proteínas, que exhiben especificidad de enlace a un antígeno específico. Los anticuerpos nativos son comúnmente glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltones, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se encuentra ligada a una cadena pesada mediante un enlace de disulfuro covalente, mientras que el número de ligadores de disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina . Cada cadena pesada y ligera tiene también puentes de disulfuro dentro de la cadena regularmente separados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes.

Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se encuentra alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera se encuentra alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que residuos particulares de aminoácidos forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y pesada. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre los anticuerpos y son responsables de la especificidad de enlace de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se encuentra uniformemente distribuida a través de los dominios variables de los anticuerpos. Ésta se encuentra concentrada en tres segmentos llamados Regiones de Determinación de Complementariedad (CDRs) tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables se denominan regiones de estructura (FR) . Los dominios variables de las cadenas nativas pesada y ligera comprenden cada uno cuatro regiones FR, adoptando principalmente una configuración de hoja ß, conectadas por tres CDRs, que forman ciclos que se conectan, y en algunos casos formando parte de la estructura de hoja ß. Las CDRs en cada cadena se encuentran sujetas entre sí en cercana proximidad por las regiones FR y, con las CDRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace de antígeno de los anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Inanunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) ) - Los dominios constantes no se encuentran directamente involucrados en el enlace de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos o inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de estas pueden dividirse además en subclases (isotipos) , e.g., IgGl, IgG2 , IgG3 , e IgG4 ; IgAl e IgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan , d, e, ? y µ, respectivamente. De las varias clases de inmunoglobulinas humanas, se sabe que solo las IgGl, IgG2, IgG3 e IgM. humanas activan el complemento. El uso de anticuerpos para el tratamiento de enfermedades humanas aumenta rápidamente . Se ha construido un anticuerpo terapéuticamente relevante tal que actúa sobre el factor vascular de crecimiento endotelial (VEGF) (Chen et al., Journal of Molecular Biology 293(4): 865-81 (1999); Kim et al., Nature 362(6423): 841-4 (1993); Muller et al., Structure 5(10): 1325-38 (1997); WO 96/30046; WO 98/45331; y WO 00/29584. El VEGF da inicio específicamente a la proliferación de los vasos sanguíneos mediante su estimulación de los receptores de transmembrana, Flt-1 y KDR (Ferrara, N. Current Topics in Microbiology & Immunology 237: 1-30 (1999) ) . Se ha demostrado que los antagonistas del VEGF suprimen enfermedades, incluyendo el cáncer, en las cuales la angiogénesis no controlada contribuye al estado de enfermedad (Kim et al., Nature 362(6423): 841-4 (1993)). In vivo, la maduración por afinidad de los anticuerpos se conduce por medio de la selección del antígeno de las variantes de anticuerpo de mayor afinidad que se preparan principalmente mediante hipermutagénesis somática. También ocurre frecuentemente una "transferencia de repertorio" en la cual se observa que los genes de línea germinal predominantes de la respuesta secundaria o terciaria difieren de los de la respuesta primaria o secundaria. Varios grupos de investigación han intentado imitar el proceso de maduración de afinidad del sistema inmune, introduciendo mutaciones en genes de anticuerpo in vítro y utilizando la selección de afinidad para aislar mutantes con afinidad mejorada. Tales anticuerpos mutantes pueden exhibirse en la superficie de bacteriófagos filamentosos y los anticuerpos pueden seleccionarse por su afinidad al antígeno o por sus cinéticas de disociación (de tasa de desactivación) del antígeno. Hawkins et al., J. Mol. Biol .. 226:889-896 (1992). La mutagénesis móvil de CDR se ha empleado para madurar por afinidad los anticuerpos humanos que se enlazan a la glicoproteína humana de cubierta gpl20 del virus humano de inmunodeficiencia tipo 1 (VIH-1) (Barbas III et al., PNAS (EUA) 91: 3809-3813 (1994); y Yang et al., J. Mol. Biol. 254:392-403 (1995)), y un fragmento Fv de cadena única anti-c-erbB-2 (Schier et al., J. Mol. Biol. 263:551567 (1996)). Se utilizó recombinación de cadena de anticuerpo y mutagénesis de CDR para madurar por afinidad un anticuerpo humano de alta afinidad dirigido contra el tercer ciclo hipervariable de VIH (Thompson et al., J. Mol. Biol.. 256:77-88 (1996)). En Gene de Balint and Larrick 137:109-118 (1993) se describe una técnica que acuña la "mutagénesis parsimoniosa" que implica la mutagénesis de rastreo dirigida a oligodesoxirribonucleótidos asistida por computadora por medio de la cual todas las tres CDRs de un gen de región variable se investigan simultánea y completamente para variantes mejoradas. Wu et al., maduró por afinidad un anticuerpo humanizado Vv33-especí fico utilizando una estrategia de mutagénesis limitada inicial en la cual cada posición de todas las seis CDRs se mutó seguida por la expresión y la selección de una biblioteca combinatoria que incluye los mutantes de más alta afinidad (Wu et al., PNAS (EUA) 95:6037-6-42 (1998)). Los anticuerpos fago se revisan en Chiswell and McCafferty TIBTECH 10:80-84 (1992); y Rader and Barbas III Current Opinión in Biotech., 8:503-508 (1997). La afinidad de un par de proteína-ligando se describe por medio de la constante de disociación (Kd) y se define como la distribución de equilibrio de moléculas no enlazadas a moléculas enlazadas en solución (Eq. 1) . Esta relación también puede definirse por la proporción de la constante de tasa de disociación (constante de tasa de desactivación, k--¡_) a la constante de tasa de asociación (constante de tasa de activación, k-¡_) . k, Las diferencias de afinidad entre mutantes de muchas interacciones de proteína-proteína (Voss, E.W. Journal of Molecular Recognition 6(2): 51-8 (1993)) se definen principalmente por las diferencias en sus tasas de disociación. Esta observación es consistente con las mutaciones que aumentan la afinidad participando en contactos directos en la interfase de proteína-proteína, y encontrándose las constantes de tasa de disociación dependientes en el rompimiento de las interacciones favorables de corto rango. En contraste, las constantes de tasa de asociación (kx) son dependientes de la frecuencia de colisión entre las dos moléculas (Z) , y de la eficiencia con la cual cada colisión da como resultado la formación de un complejo. El último a su vez es dependiente de un factor estérico (p) para contar para el requerimiento de orientación de las dos moléculas y la población de moléculas con suficiente energía de activación térmica (Fersht, A.R. (1985) . Enzyme Structure and Mechanism, W.H. Freeman and Company, New York, NY) (Eq. 2) -Ea Eq .2 /(, = ?? t en donde Ea es la energía de activación para la formación del complejo, R es la constante universal del gas, y T es la temperatura (en Kelvins) . En teoría, es posible aumentar la tasa de asociación mediante mutaciones que incrementan la tasa de colisión o la eficiencia de la colisión. Se ha postulado que esto puede lograrse, sin el rompimiento de los contactos de bajo rango que comprenden la interfase de enlace, mediante residuos de mutación en la periferia de la interfase de enlace para generar las fuerzas electrostáticas de dirección favorables (Berg & von Hippel (1996) Nat. Struct. Biol .. 3:427-31; Radie et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:23265-77; Selzer et al., (2000) Nat. Struct. Biol .. 7:537-41. Las investigaciones de este fenómeno se han enfocado en simulaciones de la dinámica Browniana y en análisis computacionales del complejo para resolver la ecuación no lineal de Poisson-Boltman completa para la predicción de las tasas de asociación en soluciones de viscosidad y salinidad variable (Slagle et al., (1994) J. Bio olec . Struct. Dynam. 12:439-56; Kozac et al., (1995) Biophys . J. 68-807-14; Fogolari et al., (2000) Eur. J. Bioche . 267:4861-9; Gabdoulline & ade (2001) J\ Mol. Biol.. 306:1139-55) . Sin embargo, se ha mostrado recientemente que pueden predecirse las tasas de asociación calculando la energía electrostática de interacción con una constante dieléctrica homogénea de 80 para el complejo barnase-barstar (Schreiber & Fersht (1996) Nat. Struct. Biol.. 3:427-31; Vijayakumar et al., (1998) J. Mol. Biol.. 278:1015-24), complejo inhibidor de TEM-lactamasa-BLIP (Selzer et al., (2000) Nat. Struct. Biol.. 7:537-41) , complejo de acetilcolinesterasa-fasciculina (Radie et al., (1997) J". Biol. Chem. 272 :23265-77 , y el complejo de hirudina-trombina (Jackman et al., (1992) J. Biol. Chem. 267:15375-83; Betz et al., (1991) Biochem. J. 275:801-3) . SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para preparar una variante de anticuerpo de un anticuerpo de origen que comprende a) identificar un residuo de aminoácido objetivo dentro del dominio variable del anticuerpo de origen, siendo dicho residuo objetivo 1) un residuo expuesto en solución; 2) en o adyacente a una región hipervariable ; y 3) dentro de aproximadamente 20 ? del antígeno cuando el anticuerpo de origen se encuentra enlazado al mismo; y b) sustituyendo el residuo objetivo de la etapa a) con un residuo de aminoácido de reemplazo diferente de modo que la complementariedad de la carga entre el anticuerpo y el antígeno aumenta. En un aspecto, el método de la invención da como resultado en una variante de anticuerpo que tiene una tasa de asociación más rápida con el antígeno que el anticuerpo de origen. La invención proporciona además una variante de anticuerpo preparada de acuerdo con el método del párrafo precedente. Además, la invención proporciona una variante de anticuerpo que comprende una alteración de aminoácido en o adyacente a una región hipervariable de la misma que aumenta la complementariedad de la carga entre la variante de anticuerpo y un antígeno al cual se enlaza. Se contemplan en la presente varias formas de la variante de anticuerpo. Por ejemplo, la variante de anticuerpo puede ser un anticuerpo de longitud total (e.g., que tiene una región constante de inmunoglobulina humana) o un fragmento de anticuerpo {e.g., un Fab o F(ab')2) - Además, la variante de anticuerpo puede marcarse con una marca detectable, inmovilizarse sobre una fase sólida y/o conjugarse con un compuesto heterólogo (tal como un agente citotóxico) . Se contemplan los usos diagnósticos y terapéuticos para la variante de anticuerpo. En una aplicación diagnóstica, la invención proporciona un método para determinar la presencia de un antígeno de interés que comprende exponer una muestra que se sospecha que contiene el antígeno a la variante de anticuerpo y determinar el enlace de la variante de anticuerpo a la muestra. Para este uso, la invención proporciona un equipo que comprende la variante de anticuerpo y las instrucciones para el uso de la variante de anticuerpo para detectar el antígeno. La invención proporciona además: ácido nucleico aislado que codifica la variante de anticuerpo; un vector que comprende el ácido nucleico, opcionalmente , operablemente ligado a secuencias de control reconocidas por una célula huésped transformada con el vector; una célula huésped transformada con el ácido nucleico; un proceso para producir la variante de anticuerpo que comprende cultivar esta célula huésped de modo que el ácido nucleico se exprese y, opcionalmente, recuperar la variante de anticuerpo del cultivo de célula huésped (e.g., del medio de cultivo de la célula huésped) . La variante de anticuerpo recuperada puede conjugarse con una molécula heteróloga, tal como un agente citotóxico o marca. La invención proporciona además una composición que comprende la variante de anticuerpo y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Esta composición para uso terapéutico es estéril y puede liofilizarse . La invención proporciona además un método para tratar a un mamífero que comprende administrar una cantidad efectiva de la variante de anticuerpo al mamífero. La invención proporciona además un método para determinar la tasa de asociación a antígeno de un anticuerpo que comprende : (1) combinar el anticuerpo y el antígeno en solución, y después ; (2) determinar la formación de un complejo de anticuerpo-antígeno sobre el tiempo. Breve Descripción de los Dibujos Las Figura 1A-B ilustran las alineaciones de secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada para el anticuerpo de origen Y0101 Fab (SEQ ID NOs : 1 y 2, respectivamente) ; la secuencia alterada de cadena ligera "S26T-Q27K-D28K-S30K" (SEQ ID NO : 3 ) ; la secuencia alterada de cadena ligera "S26T-Q27K-D28K-S30T" (SEQ ID NO: 4); y la secuencia alterada de cadena pesada "T28D-S100aR" (SEQ ID NO: 5) . En las Figuras 1A-B la numeración es secuencial, en lugar de ser de acuerdo con el sistema de numeración Kabat .

De aquí que, para el mutante de cadena pesada, la mutación SlOOaR (sistema de numeración Kabat) es la mutación S105R (sistema de numeración secuencial) . La Figura 2 representa el espectro de fluorescencia. El espectro de emisión de ~10 nM de Fab Y0101 (con guiones en negro) , -120 nM de VEGF (sólido gris) , y una mezcla de 10 nM de Fab con 120 nM de VEGF (sólido negro) . La suma del espectro individual del Fab y el VEGF se muestra en guiones en gris. La Figura 3 representa los datos duros de la cinética. La tasa de formación del complejo (AFluorescencia) puede medirse como una función de tiempo con concentraciones variables de VEGF (aumentando en concentración de gris a negro) y ajustarse a una exponencial única para determinar la tasa observada {k0t,s) - La Figura 4 se refiere al cálculo de ki. La representación de la tasa observada de la formación del complejo ( obs) contra la concentración del VEGF utilizado, permite un pseudo-primer análisis de orden para determinar el kx, dado por la pendiente del trazo. Los datos mostrados en la presente son para el mutante de cadena pesada T28E. La Figura 5 revela una comparación de Jobs y kcaic para las variantes Fab Y0101. Las Figuras 6A y 6B proporcionan una alineación de las secuencias de cadena ligera y de cadena pesada de las variantes anti-VEGF "34 -TKKT+H97Y+VNERK" (SEQ ID N0s:4 y 8, respectivamente); "34-TKKT+H97Y" (SEQ ID NOs : 4 y 9, respectivamente); y "34 -TKKT+VNERK" (SEQ ID NOs:4 y 10, respectivamente) . Las secuencias del anticuerpo de origen Y0101 se proporcionan por comparación. Los residuos en negrita y subrayados indican sustituciones. La Figura 7 ilustra la dependencia de la tasa de asociación en la resistencia iónica. La tasa de asociación para Y0101 (círculos rellenos) y la variante de rápido enlace, "34-TKKT" ( (VH- (T28D, SlOOaR) +VL- (S26T, Q27K, D28K, S30T) ) (cuadrados abiertos) se midieron como una función de la concentración de sal. Las pendientes (-U/RT) son -1.4 y 6.5, respectivamente, correspondientes a U de +0.86 kcal mol"1 para Y0101 y -4.0 kcal mol"1 para la variante de enlace más rápida. La Figura 8 proporciona secuencias de aminoácidos para los dominios variables de cadena ligera y pesada del anticuerpo anti-TF humanizado D3H44. Los residuos identificados como On-RAMPS potenciales se indican en negrita y subrayados. La Figura 9 proporciona secuencias de aminoácidos para los dominios variables de cadena ligera y pesada del anticuerpo anti-HER2 humanizado 4D5. Los residuos identificados como On-RAMPS potenciales se indican en negrita y subrayados.

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas I. Definiciones El término "anticuerpo" se utiliza en el más amplio sentido y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonales de longitud total) , anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecífieos (e.g., anticuerpos biespecíficos) , y fragmentos de anticuerpo mientras que exhiban la actividad biológica deseada. El término "región hipervariable" al utilizarse en la presente se refiere a las regiones de un dominio variable del anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman ciclos estructuralmente definidos. La región hipervariable comprende los residuos de aminoácido de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (i.e., los residuos 24-34 ("CDR Ll"), 50-56 ("CDR L2") y 89-97 ("CDR L3") en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 ("CDR Hl"), 50-65 ("CDR H2") y 95-102 ("CDR H3") en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Im unological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) ) y/o aquellos residuos de un "ciclo hipervariable" (i.e., residuos 26-32 ("ciclo Ll"), 50-52 ("ciclo L2") y 91-96 ("ciclo L3") en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 ("ciclo Hl"), 53-55 ("ciclo H2") y 96-101 ("ciclo H3") en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol.

Biol. 196:901-917 (1987)). En ambos casos, los residuos del dominio variable se encuentran numerados de acuerdo con Kabat et al., supra. Los residuos de "estructura" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable como se definen en la presente . La expresión "numeración del residuo de dominio variable como en Kabat" se refiere al sistema de numeración utilizado para los dominios variables de cadena pesada o a los dominios variables de cadena ligera de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) . Al utilizar este sistema de numeración, la secuencia lineal de aminoácidos real puede contener menos aminoácidos o adicionales correspondientes a un acortamiento de, o una inserción dentro de, una FR o CDR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir un solo inserto de aminoácido (el residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de la CDR H2 y residuos insertados (e.g., los residuos 82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del residuo FR de cadena pesada 82. La numeración Kabat de residuos puede determinarse para un anticuerpo dado mediante el alineamiento en las regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada "estándar" de Kabat . Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo de longitud total, generalmente el enlace de antígeno o la región variable de los mismos. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab' , F(ab' ) 2f y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena única; y anticuerpos multiespecífieos formados de fragmentos de anticuerpo. El término "anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, i.e., los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que se presentan en forma natural que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, estando dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones convencionales (policlonales) de anticuerpos que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse que requiere la producción del anticuerpo mediante un método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que van a utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden prepararse mediante el método de hibridoma primeramente descrito por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinantes (ver, e.g., la Patente de E.U. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas fago de anticuerpos utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpo, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de tales anticuerpos, mientras que exhiban la actividad biológica deseada (Patente de E.U. No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Scí . USA 81:6851-6855 (1984)). Las formas "humanizadas" de anticuerpos no-humanos (e.g., murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una mínima secuencia derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales los residuos de una región hipervariable del receptor se reemplazan por los residuos de una región hipervariable de una especie no-humana (anticuerpo donante) tal como de ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos Fv (FR) de región de estructura de la inmunoglobulina humana se reemplazan por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y típicamente dos dominios variables en los cuales todos o sustancialmente todos los ciclos variables corresponden a los de la inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, ver, Jones et al., Nature 321:522 525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr.

Op. Struct. Biol . 2:593-596 (1992). Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena única" o "sFv" comprenden los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios se encuentran presentes en una sola cadena de polipéptidos . Generalmente, el polipeptido Fv comprende además un ligador de polipeptido entre los dominios VH y VL que permite que el sFv forme la estructura deseada para el enlace de antígeno. Para revisión del sFv ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol . 113, Rosenburg y Moore edic . Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) . El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de enlace de antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectados a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipeptido (VH - VL) . Al utilizar un ligador que es demasiado corto para permitir el aparej amiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se fuerzan a aparejarse con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de enlace de antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en la EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 90:6444-6448 (1993). La expresión "anticuerpos lineales" al utilizarse a lo largo de toda esta solicitud se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al., Protein Eng. 8 (10) : 1057-1062 (1995) . Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd en serie (VH-CH1-VH-CH1) que forman un par de regiones de enlace de antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecífieos o monoespecífieos . Un "anticuerpo de origen" es un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que carece de una o más alteraciones de secuencia de aminoácidos en comparación con una variante de anticuerpo como se describe en la presente. De este modo, el anticuerpo de origen tiene generalmente una región hipervariable que difiere en la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la región hipervariable correspondiente de una variante de anticuerpo como se describe en la presente. El polipéptido de origen puede comprender un anticuerpo de secuencia nativa (i.e., uno que se presenta de manera natural) (incluyendo una variante alélica que se presenta de manera natural), o un anticuerpo con modificaciones pre-existentes de la secuencia de aminoácidos (tales como inserciones, supresiones y/u otras alteraciones) de una secuencia que se presenta de manera natural . Pre erentemente el anticuerpo de origen es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. Como se utiliza en la presente, "variante de anticuerpo" se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de origen. Preferentemente, la variante de anticuerpo comprende un dominio variable de cadena pesada o un dominio variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que no se encuentra en la naturaleza. Tales variantes tienen necesariamente menos del 100% de identidad o similitud de la secuencia con el anticuerpo de origen. En una modalidad preferida, la variante de anticuerpo tendrá una secuencia de aminoácidos de desde aproximadamente 75% a menos del 100% de identidad o similitud de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos del dominio variable ya sea de cadena pesada o ligera del anticuerpo de origen, más preferentemente desde aproximadamente 80% a menos de 100%, más preferentemente desde aproximadamente 85% a menos de 100%, más preferentemente desde aproximadamente 90% a menos de 100%, y de mayor preferencia desde aproximadamente 95% a menos de 100%. La identidad o similitud con respecto a esta secuencia se define en la presente como el porcentaje de residuos de aminoácido en la secuencia candidato que es idéntica (í.e., el mismo residuo) con los residuos del anticuerpo de origen, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de identidad de secuencia. Ningún N-terminal, C-terminal, o extensiones, supresiones o inserciones internas en la secuencia de anticuerpo fuera del dominio variable debe interpretarse que afecta la identidad o similitud de secuencia. La variante de anticuerpo es generalmente la que comprende una o más alteraciones de aminoácido en o adyacentes a una o más de sus regiones hipervariables . Una "alteración de aminoácidos" se refiere a un cambio en la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos predeterminada. Las alteraciones ej emplificativas incluyen las inserciones, sustituciones y supresiones . Una "sustitución de aminoácidos" se refiere al reemplazo de un residuo de aminoácido existente en una secuencia de aminoácidos predeterminada; con otro residuo de aminoácido diferente. Un residuo de aminoácido de "reemplazo" se refiere a un residuo de aminoácido que reemplaza o sustituye otro residuo de aminoácido en una secuencia de aminoácidos. El residuo de reemplazo puede ser un residuo de aminoácido que se presenta de manera natural o que no se presenta de manera natural . Una "inserción de aminoácidos" se refiere a la introducción de uno o más residuos de aminoácido en una secuencia de aminoácidos predeterminada. La inserción de aminoácidos puede comprender una "inserción de péptido" en cuyo caso un péptido que comprende dos o más residuos de aminoácido unidos por enlace (s) de péptido se introduce dentro de la secuencia de aminoácidos predeterminada. Cuando la inserción de aminoácidos implica la inserción de un péptido, el péptido insertado puede generarse mediante mutagénesis aleatoria de tal modo que tiene una secuencia de aminoácidos que no existe en la naturaleza . Una alteración de aminoácidos "adyacente a una región hipervariable" se refiere a la introducción o sustitución de uno o más residuos de aminoácido en el extremo N-terminal y/o C-terminal de una región hipervariable, de modo que al menos uno de los residuos de aminoácido insertados de reemplazo forma un enlace de péptido con el residuo de aminoácido N-terminal o C-terminal de la región hipervariable en cuestión. Un "residuo de aminoácido que se presenta de manera natural" es el codificado por el código genético, generalmente seleccionado del grupo que consiste de: alanina (Ala) ; arginina (Arg) , asparagina (Asn) ; ácido aspártico (Asp) ; cisteína (Cys) ; glutamina (Gln) ; ácido glutámico (Glu) ; glicina (Gly) histidina (His) ; isoleucina (lie) ; leucina (Leu) ; lisina (Lys) ; metionina (Met) ; fenilalanina (Phe) ; prolina (Pro) ; serina (Ser) ; treonina (Thr) , triptofán (Trp) ; tirosina (Tyr) ; y valina (Val) . Un "residuo de aminoácido que no se presenta de manera natural" en la presente es un residuo de aminoácido diferente a los residuos de aminoácido que se presentan de manera natural anteriormente enlistados, que es capaz de enlazarse de manera covalente a el (los) residuo (s) de aminoácido adyacente (s) en una cadena de polipéptido. Ejemplos de residuos de aminoácido que no se presentande manera natural incluyen norleucina, ornitina, norvalina, homoserina, y otros análogos de residuos de aminoácido tales como los descritos en Ellman et al., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991) . Para generar tales residuos de aminoácido que no se presentan de manera natural, pueden utilizarse los procedimientos de Noren et al., Science 244:182 (1989) y Ellman et al., supra. Brevemente, estos procedimientos implican activar químicamente un supresor de ARNt con un residuo de aminoácido que no se presenta de manera natural seguido por la trascripción y traslación in vitro del AR . Un residuo de aminoácido "expuesto" es en el cual al menos parte de su superficie se encuentra expuesta, hasta cierto punto, al solvente cuando se encuentra presente en un polipéptido (e.gr., un antígeno de anticuerpo o polipéptido) en solución. Preferentemente, el residuo de aminoácido expuesto es uno en el cual al menos aproximadamente un tercio de su área de superficie de cadena lateral se encuentra expuesto al solvente. Se encuentran disponibles varios métodos para determinar si un residuo se encuentra expuesto o no, incluyendo un análisis de un modelo o estructura molecular del polipéptido. Un residuo de aminoácido "cargado" es el que contiene una carga neta total positiva o una carga neta total negativa. Los residuos de aminoácido positivamente cargados incluyen arginina, lisina e histidina. Los residuos de aminoácido negativamente cargados incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. El término "antígeno objetivo" en la presente se refiere a un antígeno predeterminado al cual se enlazan tanto un anticuerpo de origen como una variante de anticuerpo como se define en la presente. El antígeno objetivo puede ser polipéptido, carbohidrato, ácido nucleico, lípido, hapteno u otro compuesto que se presenta de manera natural o sintético. Preferentemente, el antígeno objetivo es un polipéptido. Aunque la variante de anticuerpo generalmente se enlaza al antígeno objetivo con mejor afinidad de enlace que el anticuerpo de origen, el anticuerpo de origen comúnmente tiene un valor de afinidad de enlace (¾) para el antígeno objetivo de no más de aproximadamente 1 x 10~5 , y preferentemente de no más de aproximadamente 1 x 10"6M. Por "tasa de asociación" se entiende en la presente la constante de la tasa de activación (k^) con la cual un anticuerpo forma un complejo con el antígeno en solución. En la presente, "tasa de disociación" se refiere a la constante de tasa de desactivación (k-i) o el rompimiento de las interacciones de corto rango entre el anticuerpo y el antígeno . Por "complementariedad de la carga" se entiende en la presente la interacción electrostática entre el (los) residuo (s) de aminoácido del anticuerpo y el (los) residuo (s) de aminoácido del antígeno. La carga en la presente se refiere a la carga local del antígeno en la cercanía de el (los) residuo (s) de aminoácido del anticuerpo cuando el anticuerpo se enlaza al antígeno. Para incrementar la complementariedad de la carga, por ejemplo, de un anticuerpo cargado positivamente a un antígeno negativamente cargado, cierto (s) residuo (s) de aminoácido negativamente cargado (s) en el anticuerpo (e.gr., D o E) se reemplaza (n) ya sea con residuo(s) neutral (es) (e.g., N o T) o residuos positivamente cargados (R o K) a fin de neutralizar o revertir la carga negativa para complementar mejor el antígeno cargado negativamente . Un anticuerpo "aislado" es el que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con los usos diagnósticos y terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos . En modalidades preferidas, el anticuerpo se purificará (1) a más de 95% por peso de anticuerpo como lo determina el método Lowry, y de mayor preferencia más de 99% por peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta la homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Comassie o, preferentemente, tintura de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in si tu dentro de las células recombinantes debido a que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no se encontrará presente. Sin embargo, comúnmente, el anticuerpo aislado se preparará mediante al menos una etapa de purificación. "Tratamiento" se refiere tanto a medidas de tratamiento terapéutico como profiláctico o preventivo. Aquellos que necesitan el tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno así como aquellos en los cuales va a prevenirse el trastorno. Un "trastorno" es cualquier condición que se beneficia del tratamiento con la variante de anticuerpo. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas incluyendo aquellas condiciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. "Mamífero", para propósitos de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, primates no humanos, y animales de zoológico, para deportes o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y se separa de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual se asocia comúnmente en la fuente natural de ácido nucleico del anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada es diferente a la forma o colocación en la que se encuentra en la naturaleza. Por tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que expresan comúnmente el anticuerpo cuando, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico se encuentra en una localización cromosómica diferente a la de las células naturales. La expresión "secuencias de control" se refiere a las secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación operablemente ligada en un organismo huésped particular. Las secuencias de control adecuadas para procariotos, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de enlace de ribosoma . Se sabe que las células eucarióticas utilizan promotores, señales de poliadenilación e intensificadores .

El ácido nucleico se encuentra "operablemente ligado" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para un guía de presecuencia o secretor se encuentra operablemente ligado al ADN para un polipéptido si se expresa como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia de codificación si afecta la trascripción de la secuencia; o un sitio de enlace de ribosoma se encuentra operablemente ligado a una secuencia de codificación si se encuentra colocada a modo de facilitar la traslación. Generalmente, "operablemente ligado" significa que las secuencias de ADN que se encuentran ligadas son contiguas, y, en el caso de un guía secretora, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen que encontrarse contiguos. La ligación se logra mediante la ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores o ligadores de oligonucleótidos sintéticos se utilizan de acuerdo con la práctica convencional. Como se utiliza en la presente, las expresiones "célula", "línea celular", y "cultivo celular" se utilizan de manera intercambiable y todas dichas designaciones incluyen la progenie. De este modo, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula objetivo principal y los cultivos derivados de la misma sin tener en cuenta el número de transferencias. También se entiende que toda la progenie puede no ser precisamente idéntica en el contenido de ADN, debido a las deliberadas o inadvertidas mutaciones. Se incluye la progenie mutante que tiene la misma función o actividad biológica que se selecciona en la célula originalmente transformada. Cuando se pretenden designaciones distintas, será claro a partir del contexto. II . Modos para Llevar a Cabo la Invención La invención en la presente se refiere, al menos en parte, a un método para preparar una variante de anticuerpo. El anticuerpo de origen o anticuerpo de inicio puede prepararse utilizando técnicas disponibles en la técnica para generar tales anticuerpos. Los métodos ejemplificativos para generar anticuerpos se describen en más detalle en las siguientes secciones. Además, la presente solicitud no requiere la producción física real del anticuerpo de origen, debido a que puede utilizarse la información disponible (e.gr., datos de la secuencia de aminoácidos) para un anticuerpo de interés para generar las variantes de anticuerpo en la presente. El anticuerpo de origen se dirige contra un antígeno objetivo de interés. Preferentemente, el antígeno objetivo es un polipéptido biológicamente importante y la administración del anticuerpo a un mamífero que sufre de una enfermedad o trastorno puede dar como resultado un beneficio terapéutico en ese mamífero. Sin embargo, también se contemplan los anticuerpos dirigidos contra antígenos no polipéptido (tales como antígenos de glicolípidos asociados a tumor; ver la Patente de EU 5,091,178). Cuando el antígeno es un polipéptido, puede ser una molécula de transmembrana (e.g., receptora) o ligando tal como el factor de crecimiento. Los antígenos ejemplificativos incluyen moléculas tales como renina; una hormona del crecimiento, incluyendo la hormona humana del crecimiento y la hormona bovina del crecimiento; el factor de liberación de la hormona del crecimiento; la hormona paratiroidea ; la hormona estimulante de la tiroides; lipoproteínas ; alfa- 1 -antitripsina ; cadena A de insulina; cadena B de insulina; proinsulina; hormona estimulante del folículo; calcitonina; hormona luteinizante ; glucagon; factores de coagulación tales como el factor VIIIC, el factor IX, el factor del tejido, y el factor de von Willebrands; factores anti -coagulantes tales como la Proteína C; factor natriurético atrial; surfactante pulmonar; un activador plasminógeno, tal como urocinasa u orina humana o un activador de plasminógeno tipo tejido (t-PA) ; bombesina; trombina,- factor hemopoyético de crecimiento; factor de necrosis de tumor -alfa y -beta; encefalinasa; RANTES (activación regulada normalmente expresada y secretada en célula T) ; proteína humana de macrófago por inflamación (MIP-1-alfa) ; una albúmina de suero tal como la albúmina humana de suero; sustancia inhibidora de uellerian; cadena A de relajación; cadena B de relajación; prorrelaxina; péptido asociado a la gonadotropina de ratón; una proteína microbial, tal como beta-lactamasa; DNasa; IgE; un antígeno citotóxico asociado al linfocito T (CTLA) , tal como CTLA-4; inhibina; activina; factor vascular de crecimiento endotelial (VEGF) ; receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como el factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF) , neurotrofina-3 , -4, -5, o -6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT-6) , o un factor de crecimiento del nervio; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ; factor de crecimiento de fibroblasto tal como aFGF y bFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF) ; factor de crecimiento de transformación (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-beta; factor de crecimiento similar a insulina -I y -II (IGF-I e IGF-II) ; des (1-3) -IGF-I (IGF-I cerebral) , proteínas de enlace del factor de crecimiento similares a insulina; proteínas CD tales como CD3. CD4 , CD8, CD19 y CD20; eritropoyetina ; factores osteoinductivos ; inmunotoxinas ; una proteína ósea morfogénica (BMP) ; un interferon tal como interferon-alfa, -beta, y -gama; factores estimulantes de colonia (CSFs) , e.g., M-CSF, GM-CSF, y G-CSF; interleucinas (ILs) , e.g., IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de célula T; proteínas de membrana de superficie; factor de aceleración de degradación; antígeno viral tal como, por ejemplo, una porción del recubrimiento del SIDA; proteínas de transporte; receptores de autodirección; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas tales como CDlla, CDllb, CDllc. CD18, un ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado al tumor tal como el receptor HER2 , HER3 o HER4 ; y fragmentos de cualquiera de los polipéptidos antes enlistados. Los objetivos moleculares preferidos para los anticuerpos abarcados por la presente invención incluyen proteínas CD tales como CD3 , CD4 , CD8, CD19, CD20 y CD34 : miembros de la familia del receptor ErbB tales como el receptor EGF, el receptor HER2, HER3 o HER4 ; moléculas de adhesión celular tales como LFA-1, Macl, pl50,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM y Vv/B3 integrina incluyendo ya sea sus subunidades alfa o beta {e.g. , anticuerpos anti-CDlla, anti-CD18 o anti-CDllb) ; factores de crecimiento tales como VEGF y TF; IgE; antígenos de grupo sanguíneo; receptor flk2/flt3; receptor de obesidad (OB) ; receptor mpl ; CTLA-4; proteína C etc . El antígeno utilizado para generar un anticuerpo puede aislarse de una de sus fuentes naturales, o puede producirse de manera recombinante o prepararse utilizando otros métodos sintéticos. Alternativamente, las células que comprenden antígeno nativo o recombinante pueden utilizarse como inmunógenos para preparar anticuerpos. El anticuerpo de origen puede tener una fuerte afinidad de enlace pre-existente para el antígeno objetivo. Por ejemplo, el anticuerpo de origen puede enlazarse al antígeno de interés con un valor de afinidad de enlace (¾) de no más que aproximadamente 1 x 10"7 M, preferentemente no más de aproximadamente 1 X 1CT8 M y de mayor preferencia no más de aproximadamente 1 x 10"9 M. El anticuerpo de origen es de preferencia un anticuerpo quimérico (e.g., humanizado) o humano. El anticuerpo quimérico, humanizado o humano es también opcionalmente un anticuerpo "madurado por afinidad" . Las técnicas para la maduración por afinidad de un anticuerpo se refieren en la sección bajo el encabezado "Descripción de la Técnica Relacionada" en la presente. En una modalidad, el anticuerpo de origen es un fragmento de anticuerpo, o se prepara un fragmento de anticuerpo de un anticuerpo completo {e.g., un fragmento Fab) para facilitar la exploración de las variantes recombinantemente producidas. Preferentemente, el anticuerpo de origen y la variante de anticuerpo enlazan el factor vascular de crecimiento endotelial (VEGF) . Un anticuerpo de origen ejemplificativo comprende los dominios variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo anti-VEGF tal como Y0101 (Figuras 1A-B en la presente) ; Y0317 (W098/45331, expresamente incorporada en la presente mediante referencia); anti-VEGF F(ab)-12 humanizado (W098/45331, expresamente incorporada en la presente mediante la referencia); Y0192 (W098/45331, expresamente incorporada en la presente mediante la referencia); Y0238-3 (W098/45331, expresamente incorporada en la presente mediante la referencia); Y0239-19 ( O00/29584, expresamente incorporada en la presente mediante la referencia); Y0313-2 (WO00/29584, expresamente incorporada en la presente mediante la referencia) o mutante VNE K (WO00/29584, expresamente incorporada en la presente mediante la referencia) . La variante de anticuerpo en la presente despliega preferentemente una tasa más rápida de asociación de antígeno en comparación con el anticuerpo de origen. La tasa de asociación puede determinarse por cualquier método en el cual la formación del complejo puede observarse como una función de tiempo. El método más ampliamente utilizado es el análisis BIAcore®, en el cual se mide la asociación del anticuerpo a un antígeno que se ha inmovilizado en una superficie de biosensor (revisada por Rich & Myszka, Curr. Opin. Biotechnol . 11:54-61 (2000)). Alternativamente, la tasa de asociación se mide en solución (en lugar de en una superficie sólida) mezclando antígeno y anticuerpo y midiendo la tasa de formación del complejo como una función de la concentración de antígeno como en el Ejemplo en la presente.

En este caso, son posibles varios métodos de detección, incluyendo las mediciones de fluorescencia mediante fluoróforos intrínsecos o artificiales (revisados por Linthicum et al., Comb. Chem. High Throughput Screen 4:439-449 (2001) ) . Preferentemente la tasa de asociación se determina de acuerdo con la metodología en el Ejemplo en la presente. De mayor preferencia, la tasa de asociación de la variante de anticuerpo es de aproximadamente 5 veces o de aproximadamente diez veces (e.g., hasta aproximadamente 1000 veces, o hasta aproximadamente 10,000 veces) más rápida que la del anticuerpo de origen. La variante de anticuerpo además generalmente tiene una más fuerte afinidad de enlace para el antígeno objetivo que el anticuerpo de origen. La "afinidad de enlace" del anticuerpo puede determinarse mediante métodos de equilibrio {e.g., ensayo inmunoabsorbente ligado a la enzima (ELISA) o radioinmunoensayo (RIA)), o cinéticos (e.g., análisis BIACORE™) , por ejemplo. La variante de anticuerpo tiene preferentemente una afinidad de enlace para el antígeno objetivo que es al menos aproximadamente dos veces más fuerte, preferentemente al menos aproximadamente cinco veces más fuerte, y preferentemente al menos aproximadamente diez veces o 100 veces más fuerte (e.g., una afinidad de enlace hasta aproximadamente 1000 veces o hasta aproximadamente 10,000 veces más fuerte), que la afinidad de enlace del anticuerpo de origen para el antígeno. El aumento en la afinidad de enlace deseado o requerido puede depender de la afinidad de enlace inicial del anticuerpo de origen. También, el anticuerpo puede someterse a otros "análisis de actividad biológica", e.g., a fin de evaluar su "potencia" o actividad farmacológica y eficacia potencial como un agente terapéutico. Tales ensayos se conocen en la técnica y dependen del antígeno objetivo y el uso pretendido para el anticuerpo. Los ejemplos incluyen el ensayo de adhesión de capa única de queratinocito y el ensayo de la respuesta de linfocito mezclado (MLR) para CDlla (ver W098/23761) ; ensayos de inhibición del crecimiento de tumor celular (como se describe en la WO 89/06692, por ejemplo); ensayos de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y de citotoxicidad mediada por complemento (CDC) (Patente de EU 5,500,362); ensayos de actividad agonística o hematopoyesis (ver WO 95/27062) ; ensayo de incorporación de timidina tritiada; y ensayo azul de alamar para medir la actividad metabólica de las células en respuesta a una molécula tal como VEGF. La variante de anticuerpo tiene preferentemente una potencia en el ensayo de actividad biológica de elección que es al menos aproximadamente dos veces mayor (e.g., de aproximadamente dos veces a aproximadamente 1000 veces o incluso hasta aproximadamente 10,000 veces de potencia aumentada), preferentemente al menos aproximadamente 20 veces mayor, más preferentemente al menos aproximadamente 50 veces mayor, y algunas veces al menos aproximadamente 100 veces o 200 veces mayor, que la actividad biológica del anticuerpo de origen en ese ensayo. La presente invención proporciona un método sistemático para preparar variantes de anticuerpo que pueden seleccionarse para una función mejorada (e.gr., para una tasa y/o afinidad de asociación mejorada) . Preferentemente, se evaluará la información disponible referente al anticuerpo-antígeno para determinar la(s) alteración (es) de aminoácidos candidato en el anticuerpo que incrementen la complementariedad de la carga entre el anticuerpo y el antígeno. El modelo molecular puede obtenerse de una estructurra de cristal de rayos X o de resonancia magnética nuclear (NMR) de este complejo. Ver, e.g., Amit et al., Science 233:747-753 (1986); y Muller et al., Structure 6(9): 1153-1167 (1998)). Alternativamente, pueden utilizarse programas de computadora para crear modelos moleculares de complejos de anticuerpo/antígeno (ver, e.g., Levy et al., Biochemistry 28 : 7168-7175 (1989); Bruccoleri et al., Nature 335:564-568 (1998); y Chothia et al., Science 233:755-758 (1986)), e.g., cuando no se encuentra disponible una estructura de cristal. En una modalidad, la alteración implica la inserción de uno o más residuos de aminoácido cargados en o adyacentes a una o más regiones hipervariables del anticuerpo de origen. En esta modalidad, el (los) residuo (s) insertado (s) comúnmente no se enlazan al antígeno como se determina al analizar el complejo anticuerpo-antígeno . Generalmente, pueden insertarse desde aproximadamente uno hasta aproximadamente veinte, o hasta aproximadamente cuarenta, residuos de aminoácido que incrementan la complementariedad de la carga. En la modalidad de mayor preferencia, la alteración implica la sustitución de uno o más residuos objetivo en o adyacentes a una o más regiones hipervariables. De acuerdo con esta modalidad de la invención, los residuos objetivo pueden seleccionarse como sigue: 1) Preferentemente el residuo se expone en solución, e.g. , tiene al menos un tercio de su área de superficie de cadena lateral expuesta al solvente. Sin unirse a ninguna teoría, se piensa que esto evita la posible desestabilización del anticuerpo mediante la mutación de residuos enmascarados. 2) Deseablemente, el residuo se encuentra dentro de al menos aproximadamente 20 Á (preferentemente dentro de aproximadamente 16 Á) del antígeno en estado enlazado, dado que las fuerzas electrostáticas de atracción pueden declinar como una función de distancia. 3) Preferentemente, el residuo no se encuentra en contacto directo con el antígeno en estado enlazado, dado que la mutación de los residuos en contacto directo puede posiblemente desestabilizar el complejo enlazado. 4) Se da preferencia a aquellos residuos que se encuentran dentro de las regiones hipervariables o de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) sobre aquellas que no se encuentran, dado que existen indicaciones de que es menos problable que tales regiones induzcan una respuesta inmunogénica en los pacientes . 5) Generalmente, solo aquellos residuos para los cuales es posible aumentar la complementariedad de la carga entre el anticuerpo y el antígeno se consideran para la alteración. De aquí que, de acuerdo con la modalidad preferida de la invención que se ilustra adicionalmente en el Ejemplo, se identifica uno o más residuos de aminoácido expuestos de la región hipervariable dentro de aproximadamente 20 ñ del antígeno cuando el anticuerpo de origen se encuentra enlazado a el (los) mismo (s), y se sustituye uno o más de los residuos expuestos con un residuo de aminoácido de reemplazo neutral o cargado opuestamente. Aunque la presente invención contempla sustituciones únicas de aminoácido de acuerdo al criterio en la presente, preferentemente se combinan dos o más sustituciones, e.g., desde aproximadamente dos hasta aproximadamente diez o aproximadamente veinte sustituciones por dominio variable (i.e., hasta aproximadamente veinte o aproximadamente cuarenta sustituciones de aminoácido, respectivamente, para ambos dominios variables) . Las alteraciones en la presente que aumentan la complementariedad de la carga entre el anticuerpo y el antígeno, pueden combinarse con otras alteraciones a la secuencia de aminoácidos en las regiones hipervariables o alteraciones a la secuencia de aminoácidos en otras regiones del anticuerpo. En una modalidad, la región hipervariable con alteración (es) de acuerdo con la invención en la presente se selecciona del grupo que consiste de la CDR Ll , CDR L2 , ciclo Hl y CDR H3 , y de mayor preferencia la CDR Ll . Además, pueden combinarse las alteraciones en dos o más regiones hipervariables, e.g., en dos o más de la CDR Ll , CDR L2 , ciclo Hl y CDR H3. Por ejemplo, la variante del anticuerpo puede comprender un dominio variable de cadena ligera con una o más alteraciones en la CDR Ll y un dominio variable de cadena pesada con una o más alteraciones en el ciclo Hl y/o en la CDR H3. De acuerdo con un aspecto de la invención, la variante del anticuerpo o dominio variable del anticuerpo tiene una o más sustituciones de acuerdo con la invención en la presente en una o más de las posiciones de aminoácido 26L, 27L, 28L, 30L, 31L, 32L, 49L, 50L, 52L, 53L, 54L, 56L, 93L o 94L de un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo y/o en una o más de las posiciones de aminoácido 25H, 28H, 30H, 54H, 56H, 61H, 62H, 64H, 97H, 98H, 99H y/o lOOaH de un dominio variable de cadena pesada del anticuerpo. Además, las sustituciones en estas posiciones pueden combinarse. Por ejemplo, pueden combinarse las sustituciones en dos, tres o cuatro posiciones de aminoácido 26L, 27L, 28L, o 30L de un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo. Puede combinarse un dominio variable de cadena pesada modificado (e.g., con sustituciones en las posiciones 28H y/o lOOaH) con el dominio variable de cadena ligera modificado (e.g., con sustituciones en las posiciones 26L, 27L, 28L y/o 30L) . La numeración del residuo aquí es de acuerdo con Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunologícal Interest, 5 a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) . La invención proporciona también una variante del anticuerpo o un dominio variable de anticuerpo modificado que puede obtenerse de acuerdo con el método descrito en la presente. Preferentemente, la variante del anticuerpo o dominio variable de anticuerpo modificado comprende alteración (es) de aminoácido en o adyacente (s) a su(s) región (es) hipervariable (s) que aumenta (n) la complementariedad de la carga entre la variante del anticuerpo y un antígeno al cual se enlaza. Ejemplos de tales dominios variables modificados incluyen un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia CDR Ll seleccionada de SATKKIKNYLN (SEQ ID NO: 6) o SATKKITNYLN (SEQ ID N0:7), e.g., un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4; y un dominio variable de cadena pesada que comprende las sustituciones de T28D y SlOOaR, e.g., la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10. Opcionalmente , estas secuencias de dominio variable de cadena ligera y pesada se combinan en una variante del anticuerpo, e.g., la que comprende la secuencia del dominio variable de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4 y la secuencia del dominio variable de cadena pesada de la SEQ ID NO: 5, 8, 9 o 10. Preferentemente, la variante del anticuerpo comprende la secuencia CDR Ll de la SEQ ID NO : 7 en su dominio variable de cadena ligera y la sustitución (T28D, SlOOaR) en su dominio variable de cadena pesada, tal combinación de sustituciones se refiere como la variante "34-TKKT" en el presente Ejemplo. Tales sustituciones (VH- (T28D, SlOOaR) +VL-(S26T, Q27K, D28K, S30T) ) pueden hacerse en varios anticuerpos de origen, incluyendo pero sin limitarse al anticuerpo anti-VEGF seleccionado del grupo que consiste de Y0101, Y0317, anti-VEGF humanizado F(ab)-12, Y0192, Y0238-3, Y0239-19, Y0313-2 y mutante VNERK. Por ejemplo, una variante "3 -TK T+VNERK+H97Y" se genera combinando las alteraciones de las variantes "34-TKKT", la "H97Y" y VNERK (SEQ ID NOS : 4 y 8 para los dominios variables de cadena ligera y pesada, respectivamente) . Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoácidos se preparan mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis mediada por oligonucleótido (o sitio-dirigida) , mutagénesis PCR, y mutagénesis de cásete de una variante preparada anteriormente o de una versión no variante del anticuerpo de origen. El método preferido para preparar variantes es la mutagénesis dirigida al sitio (ver, e.g., Kunkel, Proc . Nati. Acad. Sci. USA 82:488 (1985)) . Además una secuencia de ácido nucleico puede prepararse sintéticamente, una vez que se llega conceptualmente a la secuencia de aminoácidos deseada. También puede prepararse la variante del anticuerpo mediante síntesis de péptido, ligación de péptido u otros métodos. Siguiendo a la producción de la variante del anticuerpo, puede determinarse la actividad de esa molécula en relación al anticuerpo de origen. Como se anotó anteriormente, esto puede implicar la determinación de la tasa de asociación, y/o la afinidad de enlace, y/o otras actividades biológicas del anticuerpo. En una modalidad preferida de la invención, se prepara un panel de las variantes del anticuerpo y se explora para la tasa de asociación y/o la afinidad de enlace para el antígeno y/o la potencia en uno o más ensayos. Una o más de las variantes del anticuerpo seleccionadas de una selección inicial se someten opcionalmente a uno o más ensayos funcionales adicionales para confirmar que la(s) variante (s) del anticuerpo tiene (n) actividad aumentada en más de un ensayo. Además de la(s) alteración (es) anterior (es) en la(s) región (es) hipervariable (s) del anticuerpo de origen, pueden hacerse alteraciones en las secuencias de aminoácidos de una o más de las regiones hipervariables . Por ejemplo, las alteraciones de aminoácido anteriores pueden combinarse con supresiones, inserciones, o sustituciones de otros residuos de la región hipervariable. Además, pueden introducirse una o más alteraciones (e.g., sustituciones) de los residuos FR en el anticuerpo de origen en donde éstas dan como resultado una mejora en la afinidad de enlace de la variante del anticuerpo para el antígeno. Ejemplos de los residuos de región de estructura para modificar incluyen aquellos que no se enlazan directamente al antígeno de manera covalente (Amit et al., Science 233:747-753 (1986)); interactúan con/efectúan la conformación de una CDR (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); y/o participan en la interfase VL - VH (EP 239 400B1) . Tales alteraciones a la secuencia de aminoácidos pueden presentarse en el anticuerpo de origen, pueden hacerse simultáneamente con la(s) inserción (es) de aminoácido en la presente, o pueden hacerse después de generar una variante con una(s) alteración (es) de aminoácido de acuerdo con la presente invención. Las alteraciones en la(s) secuencia (s) de dominio constante del anticuerpo de origen o la variante del anticuerpo también se contemplan en la presente, e.g., aquellas que mejoran, o disminuyen, la (s) función (es) efectoras del anticuerpo. Ver, e.g., la patente de EU NO. 6,194,551131; O 99/51642; Idusogie et al., J". Immunol. 164:4178-4184 (2000); WO00/42072 (Presta); y Shields et al., J. Biol . Che . 9 (2) : 6591-6604 (2001) , expresamente incorporadas en la presente mediante la referencia. Las variantes del anticuerpo pueden someterse a otras modificaciones, frecuentemente dependiendo del uso pretendido del anticuerpo. Tales modificaciones pueden implicar la alteración adicional de la secuencia de aminoácidos, la fusión a el (los) polipéptido (s) heterólogo (s) y/o la modificación covalente. Con respecto a las alteraciones a la secuencia de aminoácidos, se elaboraron anteriormente modificaciones ej emplificativas . Por ejemplo, cualquier residuo de cisteína no involucrado en mantener la conformación apropiada de la variante del anticuerpo también puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad de oxidación de la molécula y evitar el enlace cruzado aberrante. Contrariamente, el (los) enlace (s) de cisteína pueden agregarse al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv) . Otro tipo de variante de aminoácido tiene un patrón de glicosilación alterado. Esto puede lograrse suprimiendo uno o más de los residuos de carbohidrato encontrados en el anticuerpo, y/o agregando uno o más sitios de glicosilación que no se encuentran presentes en el anticuerpo. La glicosilación de anticuerpos es típicamente N-enlazada u O-enlazada. N-enlazada se refiere a la unión del residuo de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripeptidos asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son secuencias de reconocimiento para la unión enzimática del residuo de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio potencial de glicosilación. La glicosilación O-enlazada se refiere a la unión de uno de los azúcares de N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un ácido de hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque puede utilizarse también 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina . La adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de tal modo que contenga una o más de las secuencias de tripéptidos anteriormente descritas (para los sitios de glicosilación N-enlazada) . La alteración también puede hacerse mediante la adición, o sustitución, de uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para los sitios de glicosilación O-enlazada) . Las técnicas para la producción de anticuerpos, que pueden ser el anticuerpo de origen y en consecuencia requerir modificación de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente, siguen a continuación: A. Preparación, de Anticuerpos (i) Preparación de antígenos Los antígenos solubles o sus fragmentos, ópticamente conjugados a otras moléculas, pueden utilizarse como inmunógenos para generar anticuerpos. Para las moléculas de transmembrana, tales como los receptores, pueden utilizarse los fragmentos de éstos (e.g., del dominio extracelular de un receptor), como el inmunógeno. Alternativamente, las células que expresan la molécula de transmembrana pueden utilizarse como el inmunógeno. Tales células pueden derivarse de una fuente natural (e.g., líneas celulares de cáncer) o pueden ser células que se han transformado mediante técnicas recombinantes para expresar la molécula de transmembrana. Otros antígenos y formas de los mismos útiles para la preparación de anticuerpos serán aparentes para aquellos en la técnica. (ii) Anticuerpos policlonales Los anticuerpos policlonales se cultivan preferentemente en animales mediante múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante a una proteína que sea inmunógena en las especies que van a inmunizarse, e.g., hemocianina de lapa Californiana, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soya utilizando un agente bifuncional o de derivación, por ejemplo, éster de maleidoimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación mediante residuos de cisteína) , N-hidroxisuccinimida (mediante residuos de lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12, o R1N=C=NR, en donde R y R1 son diferentes grupos alquilo . Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunógenos, o derivados combinando, e.g., 100 µg o 5 µg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución intradérmicamente en sitios múltiples. Un mes después los animales se refuerzan con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en sitios múltiples. De siete a 14 días más tarde los animales se sangran y el suero se analiza para título de anticuerpos. Los animales se refuerzan hasta las placas del título. Preferentemente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de enlace cruzado diferente. Los conjugados también pueden prepararse en un cultivo celular recombinante como fusiones de proteína. También, los agentes de agregación tales como alumbre se utilizan adecuadamente para aumentar la respuesta inmune. (iii) Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse utilizando el método de hibridoma primeramente descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o pueden prepararse mediante métodos de ADN recombinantes (Patente de EU No. 4, 816, 567) . En el método de hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster o mono macaco, se inmuniza como se describió anteriormente para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se enlazarán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vi tro. Los linfocitos se fusionan entonces con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol , para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, p . 59-103 (Academic Press, 1986)). Las células de hibridoma así preparadas se siembran y se cultivan en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma de origen no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma de origen carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , cuyas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT. Las células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la producción estable a alto nivel de anticuerpos mediante las células seleccionadas de producción de anticuerpos, y son sensitivas a un medio tal como el medio HAT. Entre estas, las líneas preferidas de células de mieloma son las líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y PC-11 disponibles del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California EUA, y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EUA. Las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. I unol . , 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) ) .

El medio de cultivo en el cual están creciendo las células de hibridoma se ensaya para la producción de los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por un ensayo de enlace in vitro, tal como el radioinmunoensayo (RIA) o el ensayo inmunoabsorbente enlazado a la enzima (ELISA) . Después de identificar las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad, y/o actividad deseada, los clones pueden subclonarse limitando los procedimientos de dilución y cultivando mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). El medio de cultivo adecuado para este propósito incluye, por ejemplo, el medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden cultivarse in vivo como tumores de ascitis en un animal . Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, fluido de ascitos, o suero mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina tales como, por ejemplo, proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita , electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla y se secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (e.g., utilizando sondas de oligonucleótido que son capaces de enlazarse específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales) . Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, que entonces se transfectan en células huésped tales como las células de E. coli, células COS de simio, células Ováricas de Hámster Chino (CHO) , o células de mieloma que de otra manera no producen proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes . La producción recombinante de anticuerpos se describirá aba o en más detalle. En una modalidad adicional, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden aislarse a partir de bibliotecas fago de anticuerpos generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990) . Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas fago. Subsecuentes publicaciones describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) mediante redistribución de cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas muy grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)). Así, estas técnicas son alternativas viables para las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpo monoclonal para aislar anticuerpos monoclonales . El ADN también puede modificase, por ejemplo, sustituyendo la secuencia de codificación para los dominios constantes humanos de cadena pesada y ligera en lugar de las secuencias murinas homologas (Patente de EU No. 4,816,567; Morrison et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 81:6851 (1984)), o al unirse de manera covalente a toda o parte de la secuencia de codificación de inmonoglobulina de la secuencia de codificación para un polipéptido no de inmunoglobulina . Típicamente tales polipéptidos no de inmunoglobulina se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo, o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo quimérico bivalente que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente. (iv) Anticuerpos humanizados y humanos Un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en el mismo de una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácido no humanos se refieren f ecuentemente como residuos de "importación" , que se toman típicamente de un dominio variable de "importación" . La humanización puede llevarse a cabo esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo CDRs de roedor o secuencias CDR para las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De acuerdo con esto, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de EU No. 4,816,567) en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos FR se sustituyen por residuos de sitios análogos en los anticuerpos de roedor . La elección de los dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que van a utilizarse para preparar los anticuerpos humanizados es muy importante reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método llamado "mejor adaptado", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se selecciona contra la biblioteca completa de secuencias conocidas de dominio variable humano. La secuencia humana que se encuentra más cercana a la de roedor se acepta entonces como la FR humana para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol . ,196:901 (1987)). Otro método utiliza una estructura de "consenso" en base a un subgrupo particular de secuencias de anticuerpo humano. La misma estructura de consenso puede utilizarse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)). Es además importante que los anticuerpos se humanicen con retención de alta afinidad para el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, de acuerdo con un método preferido, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de las secuencias de origen y varios productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias de origen y humanizada. Los modelos tridimensionales de inmunoglobulina se encuentran comúnmente disponibles y son familiares para los expertos en la técnica. Se encuentran disponibles programas de computadora que ilustran y despliegan estructuras tridimensionales de conformación probables de secuencias candidato de inmunoglobulina seleccionadas. La inspección de estas imágenes permite el análisis del probable papel de los residuos en la función de la secuencia candidato de inmunoglobulina, i.e., el análisis de los residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidato a enlazarse a su antígeno. De esta manera, los residuos FR pueden seleccionarse y combinarse a partir del receptor y las secuencias de importación de modo que se logra la característica deseada del anticuerpo, tal como una afinidad mejorada para el (los) antígeno(s) objetivo. En general, los residuos de CDR se encuentran directamente y más sustancialmente involucrados en la influencia en el enlace de antígeno . Alternativamente, ahora es posible producir animales transgénicos (e.gr., ratones) que son capaces, al inmunizarse, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de la producción endógena de inmunoglobulina. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigótica del gen de la región de unión de cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da como resultado la completa inhibición de la producción endógena de anticuerpo. La transferencia de la disposición del gen de inmunoglobulina de línea germinal humana en tales ratones mutantes de línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos al reto con antígenos. Ver, e.g., Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al . , Year in Inmuno., 7:33 (1993); y Duchosal et al . , Nature 355:258 (1992) . Los anticuerpos humanos también pueden derivarse de bibliotecas de despliegue fago (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol . , 222:581-597 (1991); Vaughan et al., Nature Biotech 14:309 (1996)). (v) Fragmentos de anticuerpo Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron a través de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver e.g., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden ahora producirse directamente mediante células huésped recombinantes . Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse a partir de las bibliotecas de fago de anticuerpos tratadas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab' -SH pueden recuperarse directamente a partir de E. coli y acoplarse químicamente para formar los fragmentos F(ab' ) 2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro procedimiento, los fragmentos F(ab' )2 pueden aislarse directamente a partir del cultivo de la célula huésped recombinante . Serán aparentes para los practicantes expertos otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de una sola cadena (scFv) . Ver la WO 93/16185. (vi) Anticuerpos Muí tiespecífieos Los anticuerpos multiespecíficos tienen especificidades de unión para al menos dos diferentes antígenos. Mientras que tales moléculas normalmente unirán solamente dos antígenos (i.e., anticuerpos biespecí fieos , BsAbs) , los anticuerpos con especificidades adicionales tales como los anticuerpos triespecífieos se abarcan por esta expresión cuando se utilizan en la presente. Ejemplos de BsAbs incluyen aquellos con un miembro dirigido contra un antígeno de célula de tumor y el otro miembro dirigido contra una molécula desencadenante citotóxica tal como anti-Fc (Rl/anti-CD15, anti-pl85HER2/Fc (RUI (CD16), anti -CD3 /anti -células B malignas (1D10) , anti-CD3/anti-pl85 HER2, anti-CD3/anti-p97 , anti -CD3 /anti -carcinoma de célula renal, anti-CD3/anti-OVCAR-3 , anti -CD3 /L-Dl (anti -carcinoma de colon), anti-CD3/anti-análogo de hormona que estimula el melanocito, anti-receptor EGF/anti -CD3 , anti-CD3/anti-CAMAl , anti-CD3/anti-CD19 , anti -CD3 /M0VI8 , anti -molécula de adhesión celular neural (NCAM) /ant i - CD3 , anti -proteína de unión a folato (FBP) /anti -CD3 , anti-antígeno asociado al carcinoma pan (AMOC-31 ) /anti-CD3 ; BsAbs con un miembro que se une específicamente a un antígeno de tumor y un miembro que se une a una toxina tal como anti-saporina/anti-Id-1, anti-CD22/anti-saporina, anti-CD7/anti-saporina, anti-CD38/anti-saporina, anti-CEA/anti-cadena A de ricina, anti-CEA/anti-alcaloide vinca; BsAbs para convertir la enzima que activa las prodrogas tales como anti-CD30/anti-fosfatasa alcalina (que cataliza la conversión de la prodroga de fosfato de mitomicina hacia el alcohol de mitomicina) ; los BsAbs que pueden utilizarse como agentes fibrinolíticos tales como el activador plasminógeno de anti-fibrina/anti-tej ido (tPA) , el activador plaminógeno de anti-fibrina/anti -tipo urosinasa (uPA) ; los BsAbs para objetivar los complejos inmunes hacia los receptores de superficie celular tales como anti-lipoproteína de baja densidad (LDL) /anti -receptor Fe {e.g., Fc(RI, Fc(RII o Fc(RIII); los BsAbs para utilizarse en la terapia de enfermedades infecciosas tales como anti-CD3/anti-virus de herpes simples (HSV) ; anti-receptor de la célula T: complejo CD3/anti-influenza, anti-Fc (R/anti-HIV; BsABs para la detección de tumor in vi tro o in vivo tales como an i-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-pl85HER2/anti-hapteno; BsAbs como adyuvantes de vacunas; y BsAbs como herramientas de diagnóstico tales como IgG anti-conejo/anti-ferritina, peroxidasa de anti-rábano picante (HRP) /antihormona, anti -somatostatina/anti -sustancia P, anti -HRP/anti -FITC. Ejemplos de anticuerpos triespecífieos incluyen anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 y anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37. Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud total o fragmentos de anticuerpo (e.g., anticuerpos biespecíficos F(ab')2). Se conocen en la técnica los métodos para elaborar anticuerpos biespecíficos . La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud total se basan en la co-expresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina , en donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature , 305:537-539 (1983)) . Debido a la clasificación aleatoria de las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpo, de lo cual solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que se da usualmente por las etapas de cromatogra ía por afinidad, es un poco molesto y los rendimientos del producto son bajos. Procedimientos similares se describen en la WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J. , 10:3655-3659 (1991). De acuerdo con un diferente procedimiento, los dominios de variable de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan a las secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión preferentemente es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la articulación, las regiones CH2 y CH3. Se prefiere tener la primer región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión a la cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y si se desea, las de cadena ligera de inmunoglobulina se insertan en los vectores de expresión separados y se co-transfectan en un organismo huésped adecuado. Esto se proporciona para mayor flexibilidad al ajustar las proporciones mutuas, de los tres fragmentos de polipeptido en modalidades cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptido utilizadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todos las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptido en proporciones iguales da como resultado en altos rendimientos o cuando las proporciones no son de particular importancia. En una modalidad preferida de este procedimiento, los anticuerpos biespecífieos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primer especificidad de unión en un miembro y el par cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (proporcionando una segunda especificidad de unión) en el otro miembro. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecifico deseado a partir de las combinaciones de cadena de inmunoglobulina no deseadas como la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica proporciona una fácil forma de separación. Este procedimiento se describe en la WO 94/04690. Para mayores detalles de la generación de anticuerpos biespecíficos ver por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986). De acuerdo con otro procedimiento descrito en la WO 96/27011, puede diseñarse la interface entre un par de moléculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan a partir del cultivo de la célula recombinante . La interface preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, se reemplazan una o más cadenas laterales de aminoácido pequeñas a partir de la interface de la primer molécula de anticuerpo con cadenas laterales mayores (e.gr., tirosina o triptofano) . De manera compensatoria las "cavidades" de tamaño idéntico o similar al de la(s) cadena (s) lateral (es) grandes se crean en la interface de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar las cadenas laterales de aminoácido grandes con unas mas pequeñas [e.g., alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados tales como los homodímeros . Los anticuerpos biespecífieos incluyen anticuerpos de enlace cruzado o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir células del sistema inmune hacia células no deseadas (Patente de EU No. 4,676,980), y para el tratamiento de la infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089), Los anticuerpos heteroconjugados pueden prepararse utilizando cualquier método de enlace cruzado conveniente. Los agentes de enlace cruzado adecuados son muy conocidos en la técnica, y se describen en la Patente de EU No. 4,676,980, junto con un número de técnicas de enlace cruzado. Las técnicas para generar anticuerpos biespecífieos de fragmentos de anticuerpo también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecífieos pueden prepararse utilizando ligamiento químico. Brennan et al., Science, 229:81 (1985) describe un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se desdoblan proteolíticamente para generar fragmentos F(ab' > 2. Estos fragmentos se reducen en presencia del agente formador de complejos de ditiol arsenita de sodio para estabilizar ditioles vecunales y evitar la formación intermoleculare de disulfuro. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab' -TNB se reconvierte entonces en el Fab' -tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico . Los anticuerpos biespecífieos producidos pueden utilizarse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de los fragmentos Fab' -SH a partir de E. coli que pueden acoplarse químicamente para formar los anticuerpos biespecíficos . Shalaby et al., J. Exp. Med. , 175:217-225 (1992) describe la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífica totalmente humanizada. Cada fragmento Fab' se secretó por separado a partir de E. coli y se sometió a acoplamiento químico directo in vitro para formar el anticuerpo biespecífico . El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de enlazarse a células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y a células T humanas normales, así como de disparar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos de tumor de seno humano . También se han descrito varias técnicas para preparar y aislar los fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente a partir del cultivo celular recombinante . Por ejemplo, los anticuerpos biespecífieos se han producido utilizando cierres de leucina. ostelny et al., J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos de cierre de leucina de las proteínas FOs y Jun se ligaron a las porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos mediante fusión del gen. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región de articulación para formar monómeros y después re-oxidarse para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros del anticuerpo. La tecnología del "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por medio de un ligador que es demasiado corto para permitir el aparej amiento entre los dos dominios en la misma cadena. De acuerdo con esto, los dominios VH y VL de un fragmento se fuerzan a aparejarse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, con lo cual forman dos sitios de enlace de antígeno. También se ha reportado otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante el uso de dimeros Fv (sFv) de cadena única. Ver, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Se contemplan los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos triespecíficos . Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991). (vii) Anticuerpos Ejamplificativos Los anticuerpos preferidos dentro del alcance de la presente invención incluyen los anticuerpos anti-HER2 incluyendo rhuMAb 4D5 (HERCEPTIN®) (Cárter et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA , 89:4285-4289 (1992), Patente de EU No. 5,725,856); anticuerpos anti-CD20 tales como el quimérico anti-CD20 "C2B8" como en la Patente de EU No. 5,736,137 (RITUXAN®) , una variante quimérica o humanizada del anticuerpo 2H7 como en la Patente de EU No. 5,721,108, Bl o Tositumomab (BEXXAR®) ; anti-IL-8 (St . John et al., Chest, 103:932 (1993), y la Publicación Internacional No. WO 95/23865) ; anticuerpos anti-VEGF incluyendo anticuerpos anti-VEGF humanizados y/o madurados por afinidad tales como el anticuerpo anti-VEGF humanizado huA4.6.1 AVASTIN™ (Kim et al., Growth Factors, 7:53-64 (1992), Publicación Internacional No. WO 96/30046, y WO 98/45331, publicada en Octubre 15 de 1998); anticuerpos anti-Factor del Tejido (TF) (Patente Europea No. 0420937B1 concedida en Noviembre 9 de 1994) incluyendo anticuerpos anti-BEGF humanizados y/o madurados por afinidad tales como D3H44 (WO01/70984) ; anticuerpos anti-PSCA (WO 01/40309) ; anticuerpos anti-CD40, incluyendo S2C6 y sus variantes humanizadas (WO00/75348) ; anti-CDlla (Patente de EU No. 5,622,700, O 98/23761, Steppe et al., Transplant Intl. 4:3-7 (1991), y Hourmant et al., Transplantation 58:377-380 (1994)); anti-CD18 (Patente de EU No. 5,622,700, expedida en Abril 22 de 1997, o como en la WO 97/26912, publicada en Julio 31 de 1997); anti-IgE (Patente de EU No. 5,714,338, expedida en Febrero 3 de 1998 o la Patente de EU No. 5,091,313, expedida en Febrero 25 de 1992, WO 93/04173 publicada en Marzo 4 de 1993, Solicitud Internacional No. OCT/US98/13410 presentada en Junio 30 de 1998, Patente de EU No. 5,714,338, Presta et al., J. Inmuno1. 151:2623-2632 (1993), y la Publicación Internacional No. WO 95/19181) ) ; anticuerpo anti-receptor Apo-2 (WO 98/51793 publicada en Noviembre 19 de 1998) ; anticuerpos anti-TNF-V incluyendo cA2 (REMICADE®) , CDP571 y MAK-195 (Ver, Patente de EU No. 5,672,347 expedida en Septiembre 30 de 1997, Lorenz et al., J. Immunol. 156 (4) : 1646-1653 (1996), y Dhainaut et al., Crit. Care Med. 23 (9) : 1461-1469 (1995)); integrina anti-V4B7 humano (WO 98/06248 publicada en Febrero 19 de 1998) ; anti-EGFR (anticuerpo 225 quimerizado o humanizado como en la WO 96/40210 publicada en Diciembre 19 de 1996) ; anticuerpos anti-CD3 tales como OKT3 (Patente de EU No.4, 515, 893 expedida en Mayo 7 de 1985) ; anticuerpos anti-CD25 o anti-tac tales como CHI-621 (SIMULECT®) y (ZENAPAX®) (Ver, la Patente de EU No. 5,693,762 expedida en Diciembre 2 de 1997); anticuerpos anti-CD4 tales como el anticuerpo cM-7412 (Choy et al., Artr is Rheum 39(l):52-56 (1996)); anticuerpos anti-CD52 tales como CAMPATH-1H (Riechmann et al., Nature 332:323-337 (1988)); anticuerpos anti-receptor Fe tales como el anticuerpo M22 dirigido contra Fc(RI como en Graciano et al., J. Iwmunol. 155 ( 10 ): 4996 - 5002 (1995); anticuerpos anti-antígeno carcinoembriónico (CEA) tales como hM -14 (Sharkey et al., Cáncer Res. 55(23Suppl): 5935s-5945s (1995)); anticuerpos dirigidos contra células epiteliales de seno incluyendo huBrE-3, hu-Mc3 y CHL6 (Ceriani et al., Cáncer Res. 55(23) : 5852s-5856s (1995); y Richman et al.. Cáncer Res 55(23 Supp) : 5916s-5920s (1995)); anticuerpos que se enlazan a células de carcinoma de colon tales como C242 (Litton et al., Eur J. Immunol. 26(1) :l-9 (1996)); anticuerpos anti-CD38, e.g., AT 13/15 (Ellis et al., J. Immunol. 155(2) :925-937 (1995)); anticuerpos anti-CD33 tales como Hu M195 (Jurcic et al., Cáncer Res 55 (23 Suppl) :5908s-5910s (1995)) y CMA-676 o CDP771; anticuerpos anti-CD22 tales como LL2 o LymphoCide (Juweid et al., Cáncer Res 55 (23 Suppl) :5899s-5907s (1995)); anticuerpos anti-EpCAM tales como 17-1A (PA OREX®) ; anticuerpos anti-GpIIb/HIa tales como abciximab o c7E3 Fab (REOPRO®) ; anticuerpos anti-RSV tales como MEDI -493 (SYNAGIS®) ; anticuerpos anti-CMV tales como PROTOVIR®; anticuerpos anti-HIV tales como PR0542; anticuerpos antihepatitis tales como el anticuerpo anti-Hep B OSTAVIR®; anticuerpo anti-CA 125 OvaRex; anticuerpo anti-epítope GD3 idiotípico BEC2 ; anticuerpo anti-Vv33 VITAXIN®; anticuerpo anti -carcinoma humano de célula renal tal como ch-G250; ING-1; anticuerpo anti-17-?? humano (3622W94) ; anticuerpo antitumor colorrectal humano (A33) ; anticuerpo anti-melanoma humano R24 dirigido contra el gangliósido GD3 ; los anticuerpos anti -carcinoma humano de célula escamosa (SF-25) ; y anti -antígeno de leucocito humano (HLA) tales como Smart ID10 o el anticuerpo anti-HLA DR Oncolym (Lym-1) . (viii) Inmunoconjugados La invención también se refiere a inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo descrito en la presente conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (e.g., una toxina enzimáticamente activa de origen bacterial, funga1 , de planta o animal, o sus fragmentos), o un isótopo radiactivo (i.e., un radioconj ugado) . Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados se han descrito anteriormente. Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden utilizarse incluyen cadena A de difteria, fragmentos activos de no enlace de la toxina de difteria, cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena A de ricina, cadena A de abrina, cadena A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina , fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Una variedad de radionúclidos se encuentran disponibles para la producción de los anticuerpos radioconjugados . Los ejemplos incluyen 212Bi , 131I, 131In, 90Y y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se preparan utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N-succinimidil-3- (2 -piridilditiol) propionato (SPDP) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCL) , ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil ) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil ) -etilenodiamina) , diisocianatos (tales como tolieno 2 , 6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse como se describe en Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). El ácido 1 - isotiocianatobencil -3 -metildietileno triaminapentaacético marcado con Carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplificativo para la conjugación del radionucleótido al anticuerpo. Ver, O94/11026.

B. Vectores, Células Huésped y Métodos Recombinantes La invención proporciona también ácido nucleico aislado que codifica una variante de anticuerpo como se describe en la presente, vectores y células huésped que comprenden el ácido nucleico, y técnicas recombinantes para la producción de la variante de anticuerpo. Para la producción recombinante de la variante del anticuerpo, el ácido nucleico que la codifica puede aislarse e insertarse dentro de un vector replicable para la posterior clonación (amplificación del ADN) o para la expresión. El ADN que codifica la variante del anticuerpo se aisla y se secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (e.g., utilizando sondas de oligonucleótido que son capaces de enlazarse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesada y ligera de la variante del anticuerpo) . Muchos vectores se encuentran disponibles . Los componentes del vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento mejorador, un promotor, y una secuencia de terminación de trascripción. Tales componentes del vector se describen en la WO00/29584, expresamente incorporada en la presente mediante la referencia. Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN en los vectores en la presente son las células de procarioto, levadura o eucarioto mayor descritas anteriormente. Los procariotos adecuados para este propósito incluyen eubacterias, tales como los organismos Gram-negativo o Gram-positivo, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escherichia, e.g., E. coli, En.teroba.cter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, e.g., Salmonella typhi uriu , Serratia, e.g., Serratia arcescans, y Shigella, así como Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis {e.g., B. licheniformis 41P descrita en la DD 266,710 publicada el 12 de Abril, 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa y Streptomyces . Un huésped de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31,446), aunque son adecuadas otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATTC 31,537), y E. coli W3110 (ATCC 27,325). Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes. Además a los procariotos, los microbios eucarióticos tales como los hongos filamentosos o la levadura son huéspedes adecuados de clonación o expresión para los vectores que codifican anticuerpos. Saccharomyces cerevisiae, o levadura común para repostería, es lo más comunmente utilizado entre los microorganismos huésped eucarióticos inferiores. Sin embargo, un número de otros géneros, especies y cepas se encuentran comunmente disponibles y útiles en la presente, tales como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes de Kluyveromyces tales como, e.g., K.lactis, K. fragilis (ATCC 12,424). K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. Wickera ii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. t ermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwannio yces occidentalis ; y hongos filamentosos tales como e.g., Neurospora, Penícillum, Tolypocladiu y huéspedes Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger. Las células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen las células de planta e insecto. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovirales y las correspondientes células huésped de insecto permisivas tales como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), y Bombix mori . Una variedad de cepas virales para la transfeccion se encuentran públicamente disponibles, e.g., la variante L-1 de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombix mori NPV, y tales virus pueden utilizarse como el virus de la presente de acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfeccion de células de Spodoptera frugiperda . Los cultivos celulares de plantas de algodón, maíz, patata, soya, petunia, tomate, y tabaco pueden utilizarse también como huéspedes. Sin embargo, ha sido mayor el interés en células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo en tejido) se ha convertido en un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas celulares huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; línea de riñon embriónico humano (293 o células 293 subclonadas para su crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10) ; células ováricas de hámster Chino/ -DHFG (CHO, Urlaub et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70) ; células de riñon de mono verde Africano (VERO- 76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2) ; células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34) ; células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de pulmón humano (Hep G2 , HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCCCCL51) ; células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci .383 : 44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 ; y línea de hepatoma humano (Hep G2) . Las células huésped se transforman con la expresión anteriormente descrita o clonando vectores para la producción de anticuerpos y cultivados en un medio nutriente convencional modificado según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Las células huésped utilizadas para producir la variante del anticuerpo de esta invención pueden cultivarse en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como el FIO de Ham (Sigma) , Medio Mínimo Esencial ( (MEM) , (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), y Medio Modificado de Águilas de Dulbecco ( (DMEM) (Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz . 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), Pats. de EU Nos 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; o la Patente de EU Re. 30,985 pueden utilizarse como medio de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede suplementarse según sea necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , amortiguadores (tales como HEPES) , nucleótidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (tales como la droga GENTAMYCIN™) , elementos trazas (definidos como compuestos inorgánicos comúnmente presentes en las concentraciones finales en el rango micromolar) , y glucosa o una fuente equivalente de energía. Cualquier otro suplemento necesario puede también incluirse en concentraciones apropiadas que serán conocidas por los expertos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, y lo similar, son las que se utilizaron previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y serán aparentes para el técnico ordinariamente experto . Al utilizar técnicas recombinantes , la variante del anticuerpo puede producirse intracelularmente , en el espacio periplásmico, o secretarse directamente en el medio. Si la variante del anticuerpo se produce intracelularmente, como una primera etapa, el desecho particulado, ya sea de células huésped o fragmentos lisados, se retira, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Cuando la variante del anticuerpo se secreta en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión generalmente se concentran primero utilizando un filtro para concentración de proteína comercialmente disponible, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Puede incluirse un inhibidor de proteasa tal como PMSF en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteolisis y pueden incluirse antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes accidentales.

La composición de anticuerpo preparada a partir de las células puede purificarse utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La adaptabilidad de la proteína A como un ligando de afinidad depende de las especies e isotipo de cualquier dominio Fe de inmunoglobulina que se encuentre presente en la variante de anticuerpo. La Proteína A puede utilizarse para purificar los anticuerpos en base a las cadenas pesadas humanas (1, (2, o (4 (Lindmark et al., J". Immunol . Meth. 62:1-13 (1983)) . Se recomienda la proteína G para todos los isotipos de ratón y para el (3 humano (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la cual se une el ligando de afinidad es más frecuentemente agarosa, pero se encuentran disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de porosidad controlada o poli (estirenodivinil) benceno permiten tasas de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que pueden lograrse con agarosa. Cuando la variante del anticuerpo comprende un dominio CH , la resina Bakerbond ABX™ (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para la purificación de proteína tales como el fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol , HPLC de Fase Inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico) , cromatoenfoque , SDS-PAGE, y precipitación en sulfato de amonio también se encuentran disponibles dependiendo de la variante del anticuerpo que va a recuperarse. C. Formulaciones Farmacéuticas Las formulaciones terapéuticas de la variante del anticuerpo se preparan para almacenamiento mezclando la variante del anticuerpo que tiene el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores (Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), opcionales fisiológicamente aceptables en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes, o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butílico, o bencílico; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y M-cresol) ; polipéptido de bajo peso molecular (menos que aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina, o inmunoglobulinas ; polímeros hidrófilicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos , disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sucrosa, mannitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; complejos metálicos (e.g., complejos de Zn-proteína) ; y/o surfactantes no iónicos tales como T EEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG) . La formulación en la presente también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular que va a tratarse, preferentemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar además un agente inmunosupresor . Tales moléculas se encuentran adecuadamente presentes en combinación en cantidades efectivas para el propósito que se pretende . Los ingredientes activos también pueden encontrarse atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsula de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsula de poli- (metilmetacrilato) , respec ivamente, en sistemas de suministro de droga coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington' s Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980) . Las formulaciones que van a utilizarse para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas estériles de filtración. Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la variante del anticuerpo, cuyas matrices se encuentran en forma de artículos conformados, e.g., películas o microcápsulas . Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2 -hidroxietil -metacrilato) , o poli (vinilalcohol ) ) , polilactidas (Pat. de EU No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinil no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) , y ácido poli-D- ( - ) -3 -hidroxibutírico .

Aunque los polímeros tales como acetato de etilen-vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante aproximadamente 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante largo tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37°c, dando como resultado una pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad . Pueden desarrollarse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo involucrado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es de una formación intermolecular de enlace S-S mediante intercambio de tio-sulfuro, la estabilización puede lograrse modificando los residuos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones acídicas, controlando el contenido de humedad, utilizando los aditivos apropiados, y desarrollando composiciones específicas de matriz de polímero. D. Usos No terapéuticos para la Variante del Anticuerpo Las variantes del anticuerpo de la invención pueden utilizarse como agentes de purificación de afinidad. En este proceso, los anticuerpos se inmovilizan en una fase sólida tal como resina Sephadex o papel filtro, utilizando métodos muy conocidos en la técnica. La variante del anticuerpo inmovilizada se pone en contacto con una muestra que contiene el antígeno que va a purificarse, y enseguida el soporte se lava con un solvente adecuado que retirará sustancialmente todo el material en la muestra excepto el antígeno que va a purificarse, que se enlaza a la variante del anticuerpo inmovilizada. Finalmente, el soporte se lava con otro solvente adecuado, tal como amortiguador de glicina, pH 5.0, que liberará el antígeno de la variante del anticuerpo. Los anticuerpos variantes también pueden ser útiles en ensayos diagnósticos, e.g., para detectar la expresión de un antígeno de interés en células, tejidos o suero específicos . Para aplicaciones diagnósticas, la variante del anticuerpo típicamente se marcará con un residuo detectable. Se encuentran disponibles numerosas marcas que generalmente pueden agruparse en las siguientes categorías : (a) Radioisótopos, tales como 35S, 1C, 125I, 3H, y 131I . La variante del anticuerpo puede marcarse con el radioisótopo utilizando las técnicas descritas en Current Protocole in Immunology, Volúmenes 1 y 2, Coligen et al., Ed. iley-Interscience, New York, New York, Pubis. (1991) por ejemplo y la radiactividad puede medirse utilizando conteo por centelleo. (b) Se encuentran disponibles marcas fluorescentes tales como quelatos de tierra rara (quelatos de europio) o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansil, Lissamine, ficoeritrina y Rojo de Texas. Las marcas fluorescentes pueden conjugarse a la variante del anticuerpo utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Immunology, supra, por ejemplo. La fluorescencia puede cuantificarse utilizando un fluorímetro . (c) Varias marcas de enzima-sustrato se encuentran disponibles y la Patente de EU No. 4,275,149 proporciona una revisión de algunas de estas. La enzima generalmente cataliza una alteración química del sustrato cromógeno que puede medirse utilizando varias técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que puede medirse espectrofotométricamente . Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Las técnicas para cuantificar un cambio en la fluorescencia se describieron anteriormente. El sustrato quimioluminiscente se vuelve electrónicamente excitado mediante una reacción química y entonces puede emitir luz que puede medirse (utilizando un quimioluminómetro, por ejemplo) o donar energía a un aceptor fluorescente. Ejemplos de marcas enzimáticas incluyen luciferasas {e.g., luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacterial; Patente de EU No. 4,737,456), luciferina, 2 , 3-dihidroftalazinodiones , malato dehidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (HRPO) , fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa , glucoamilasa, lisozima, oxidasas de sacárido (e.g., oxidasa de glucosa, oxidasa de galactosa y dehidrogenasa de glucosa-6-fosfato) , oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa) , lactoperoxidasa, micro peroxidasa y lo similar. Las técnicas para conjugar enzimas a anticuerpos se describen en O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay, (Métodos para la Preparación de Conjugados de Enzima-Anticuerpo para su uso en Inmunoensayos de Enzimas) , en Methods in Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis) , Academic press, New York, 73:147-166 (1981) . Ejemplos de combinaciones de enzima- sustrato incluyen, por ejemplo: (i) Peroxidasa de rábano picante (HRPO) con peroxidasa de hidrógeno como sustrato, en donde la peroxidasa de hidrógeno oxida un precursor de tinte (e.g., diammina de ortofenileno (OPD) o hidrocloruro de 3 , 3 ' , 5 , 5 ' -tetrametil bencidina (TMB) ) ; (ii) fosfatasa alcalina (AP) con fosfato de para-Nitrofenilo como sustrato cromógeno; y (iii) beta-D-galactosidasa (beta-D-Gal) con un sustrato cromógeno (e.g., p-nitrofenil-beta-D-galactosidasa) o un sustrato fluorógeno 4 -metilumbeliferil -beta-D-galactosidasa . Otras numerosas combinaciones de enzima-sustrato se encuentran disponibles para los expertos en la técnica. Para una revisión general de éstas, ver las Patentes de EU Nos. 4 , 275, 149 y 4, 318, 980. Algunas veces, la marca se conjuga indirectamente con la variante del anticuerpo. El técnico experto se percatará de varias técnicas para logar esto. Por ejemplo, la variante del anticuerpo puede conjugarse con biotina y cualquiera de las tres amplias categorías de marcas antes mencionadas puede conjugarse con avidina, o viceversa. La biotina se enlaza selectivamente a avidina y de este modo, la marca puede conjugarse con la variante del anticuerpo de esta manera indirecta. Alternativamente, para lograr la conjugación indirecta de la marca con la variante del anticuerpo, la variante del anticuerpo se conjuga con un pequeño hapteno (e.g., digoxina) y uno de los diferentes tipos de marcas mencionados anteriormente se conjuga con una variante anti-hapteno del anticuerpo (e.g., anticuerpo anti-digoxina) . De este modo, puede lograrse la conjugación indirecta de la marca con la variante del anticuerpo. En otra modalidad de la invención, la variante del anticuerpo no necesita marcarse, y su presencia puede detectarse utilizando un anticuerpo marcado que se enlaza a la variante del anticuerpo. Los anticuerpos de la presente invención pueden emplearse en cualquier método de ensayo conocido, tal como los ensayos de enlace competitivo, ensayos intercalados directos e indirectos, y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987) . Los ensayos de enlace competitivo se basan en la capacidad de un estándar de marcado para competir con el analizador de la muestra de prueba para enlazarse con una cantidad limitada de la variante del anticuerpo. La cantidad de antígeno en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad del estándar que se enlaza a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad del estándar que se enlaza, los anticuerpos generalmente se insolubilizan antes o después de la competencia, de modo que el estándar y el analizador que se enlazan a los anticuerpos pueden separarse convenientemente del estándar y analizador a los que permanecen enlazados. Los ensayos de intercalados implican el uso de dos anticuerpos, cada uno capaz de enlazarse a una porción inmunogénica diferente, o epítope, de la proteína que va a detectarse. En un ensayo de intercalado, el analizador de la muestra de prueba se enlaza por medio de un primer anticuerpo que se inmoviliza en un soporte sólido, y enseguida un segundo anticuerpo se enlaza al analizador, formando así un complejo insoluble en tres partes. Ver, e.g., Pat . de EU No. 4,376,110. El segundo anticuerpo puede marcarse por sí mismo con un residuo detectable (ensayos de intercalado directo) o puede medirse utilizando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que se marca con un residuo detectable (ensayo de intercalado indirecto) . Por ejemplo, un tipo de ensayo de intercalado es un ensayo ELISA, en cuyo caso el residuo detectable es una enzima . Para la inmunohistoquímica , la muestra de tumor puede ser fresca o congelada o puede encontrarse embebida en parafina o fijada con un conservador tal como formalina, por ejemplo. Los anticuerpos también pueden utilizarse para ensayos de diagnóstico in vivo. Generalmente, la variante del anticuerpo se marca con un radionúclido (tal como i:L1In, "Te, 1C, 131I, 125I, 3H, 32P O 35S) de modo que el tumor pueda localizarse utilizando inmunocentellografía . E. Equipos de Diagnóstico Por conveniencia, la variante del anticuerpo de la presente invención puede proporcionarse en un equipo, i.e., una combinación de reactivos empacada en cantidades predeterminadas con instrucciones para llevar a cabo el ensayo diagnóstico. Cuando la variante del anticuerpo se marca con una enzima, el equipo incluirá los sustratos y cofactores requeridos por la enzima (e.g., un precursor del sustrato que proporcione el cromóforo o fluoróforo detectable) . Además, pueden incluirse otros aditivos tales como estabilizadores, amortiguadores (e.gr., un amortiguador en bloque o un amortiguador de lisis) y lo similar. Las cantidades relativas de los varios reactivos pueden variar ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimizan sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Particularmente, los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, comúnmente liof ilizados, incluyendo excipientes que en disolución proporcionarán una solución reactiva que tiene la concentración apropiada. F. Usos In vivo para la Variante del Anticuerpo Para aplicaciones terapéuticas, las variantes del anticuerpo de la invención se administran a un mamífero, preferentemente a un humano, en una forma de dosis farmacéuticamente aceptable tal como las tratadas anteriormente, incluyendo las que pueden administrarse a un humano de manera intravenosa o como bolo o mediante infusión continua durante un período de tiempo, mediante las vías intramuscular, intraperitoneal , intra-cerebroespinal , subcutánea, intra-articular , intrasinovial , intratecal, oral, tópica o inhalación. Los anticuerpos también se administran adecuadamente mediante vias intra- tumoral , peri - tumoral , intra-lesional , o peri-lesional, para ejercer efectos locales así como terapéuticos sistémicos. Se espera que la vía intra-peritoneal sea particularmente útil, por ejemplo, en el tratamiento de tumores ováricos. Además, la variante del anticuerpo se administra adecuadamente mediante infusión de impulso, particularmente con dosis declinadas de la variante del anticuerpo. Preferentemente la dosificación se da por inyecciones, de mayor preferencia en inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte de si la administración es breve o crónica. Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada de la variante del anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad que va a tratarse, la severidad y el curso de la enfermedad, ya sea que la variante del anticuerpo se administre para propósitos preventivos o terapéuticos, la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta a la variante del anticuerpo, y la discreción del médico que la atiende. La variante del anticuerpo se administra adecuadamente al paciente en una vez o sobre una serie de tratamientos. El ejemplo en la presente se refiere a un anticuerpo anti-VEGF. Los anticuerpos anti-VEGF son útiles en el tratamiento de varias enfermedades y trastornos neoplásicos y no neoplásicos. Los neoplasmas y las condiciones relacionadas dispuestas para el tratamiento incluyen carcinomas de seno, carcinomas pulmonares, carcinomas gástricos, carcinomas esofagales, carcinomas colorrectales , carcinomas hepáticos, carcinomas ováricos, tecomas, arhenoblastomas , carcinomas cervicales, carcinomas endometriales , hiperplasia endometrial, endometriosis, fibrosarcomas , coriocarcinoma , cáncer de cabeza y cuello, carcinoma nasofaríngeo, carcinomas laríngeos, hepatoblastoma, sarcoma de Kaposi, melanoma, carcinomas de piel, hemangioma, hemangioma cavernoso, hemangioblastoma, carcinomas de páncreas, retinoblastoma, astrocitoma, glioblastoma, Schwannoma, oligodendroglioma, meduloblastoma, neuroblastomas , rabdomiosarcoma, sarcoma osteogénico, leiomiosarcomas , carcinomas del tracto urinario, carcinomas de tiroides, tumor de Wilm, carcinoma de célula renal, carcinoma de próstata, proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores cerebrales), y síndrome de Meigs. Las condiciones neoplásticas dispuestas para el tratamiento incluyen artritis reumatoide, psoriasis, arteroesclerosis, retinopatías diabéticas y otras proliferativas incluyendo retinopatía de prematuridad, fibroplastia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular relacionada con la edad, hiperplasias de tiroides (incluyendo enfermedad de Grave) , transplate córneo y de otros tejidos, inflamación crónica, inflamación pulmonar, síndrome nefrótico, preeclampsia, ascitis, efusión pericardial (tal como la asociada con pericarditis) , y efusión pleural. La degeneración macular relacionada con la edad (AMD) es una causa principal de pérdida visual severa en la población anciana. La forma exudativa de AMD se caracteriza por la neovascularización coroidal y el desprendimiento del pigmento retinal de la célula epitelial. Debido a que la neovascularización coroidal se asocia con un empeoramiento dramático en la prognosis, se espera que los anticuerpos VEGF de la presente invención sean especialmente útiles en la reducción de la severidad de AMD. Dependiendo del tipo y la severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 mg/kg a 15 mg/kg {e.g., 0.1-20mg/kg) de la variante del anticuerpo es una dosis candidato inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosis diaria típica puede fluctuar desde aproximadamente 1 mg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores antes mencionados. Para administraciones repetidas durante varios días o más largas, dependiendo de la condición, el tratamiento se mantiene hasta que se presenta una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosis. El progreso de esta terapia se monitorea fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales. Debido a la tasa de asociación mejorada de la variante del anticuerpo, se contempla que pueden administrarse dosis más bajas de la variante del anticuerpo (comparado con el anticuerpo de origen) . La composición de variante del anticuerpo se formulará, dosificará y administrará de una manera consistente con la buena práctica médica. Los factores para consideración en este contexto incluyen el trastorno particular que se trata, el mamífero particular al que se trata, la condición clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, el programa de administración y otros factores conocidos para los practicantes de la medicina. La "cantidad terapéuticamente efectiva" de la variante del anticuerpo que va a administrarse se gobernará por tales consideraciones y es la cantidad mínima necesaria para evitar, aminorar o tratar una enfermedad o trastorno. La variante del anticuerpo, no necesariamente, pero se formula opcionalmente con uno o más agentes actualmente utilizados para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad efectiva de tales otros agentes depende de la cantidad de la variante del anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores anteriormente tratados. Estos se utilizan generalmente en las mismas dosis y con las vías de administración que se utilizaron anteriormente en la presente o aproximadamente desde 1 hasta 99% de las dosis empleadas hasta ahora. G. Artículos de Manufactura En otra modalidad de la invención, se proporciona un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento de los trastornos anteriormente descritos. El artículo de manufactura comprende un envase y una etiqueta. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los envases pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El envase contiene una composición que es efectiva para tratar la condición y puede tener una entrada de acceso estéril (por ejemplo el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja para inyección hipodérmica) . El agente activo en la composición es la variante del anticuerpo. La etiqueta en, o asociada con, el envase indica que la composición se utiliza para tratar la condición seleccionada. El artículo de manufactura puede comprender además un segundo envase que comprende un amortiguador farmacéuticamente aceptable, tal como salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos de empaque con instrucciones para su uso. H. Ensayo de Tasa de Asociación a Antígeno La presente solicitud describe también un método de ensayo que puede utilizarse para medir la tasa de asociación a antígeno de un anticuerpo (e.g., una variante de anticuerpo tal como la descrita en la presente) . El método se adapta particularmente para anticuerpos con tasas de asociación lentas (e.g., aquellas con una constante de asociación para antígeno más lenta que aproximadamente 105 M"1 seg1, o más lenta que aproximadamente 106 M"1 seg"1) de modo que esa formación del complejo anticuerpo-antígeno puede cuantificarse a través del tiempo. Un ejemplo de un anticuerpo con una constante lenta de asociación a antígeno es un anticuerpo anti-VEGF que se enlaza a VEGF, ejemplificado por los varios anticuerpos anti-VEGF referidos en la presente. El método de ensayo en la presente comprende: (1) combinar anticuerpo y antígeno en solución, y después; (2) determinar la formación del complejo anticuerpo-antígeno a través del tiempo. De aquí que la medición de la formación del complejo se presenta después de que el anticuerpo y el antígeno se han combinado. La formación del complejo a través del tiempo puede determinarse utilizando varios métodos tales como la determinación de la fluorescencia o adsorbción del complejo o utilizando NMR. Sin embargo, de acuerdo con la modalidad preferida, la segunda etapa del método comprende la medición de la intensidad de emisión de fluorescencia del complejo anticuerpo-antígeno a través del tiempo. Esto puede lograrse cuando el anticuerpo o el antígeno comprenden un residuo de triptofano en la interfase de enlace del antígeno-anticuerpo, de modo que puede medirse la intensidad de la emisión de fluorescencia del residuo de triptofano (que cambia cuando el residuo de triptofano se enmascara en la interfase de enlace) . La intensidad de emisión de fluorescencia puede determinarse utilizando una longitud de onda de excitación de aproximadamente 280-310nm (e.gr., 295nm) y detectando la emisión en una longitud de onda de aproximadamente 330-360nm {e.g., aproximadamente 340nm) . Los siguientes ejemplos pretenden meramente ilustrar la práctica de la presente invención y no se proporcionan como limitación. Las descripciones de todas las literaturas de patente y científicas citadas en la presente se incorporan expresamente en su totalidad mediante la referencia . EJEMPLO 1 El presente ejemplo demuestra que pueden aplicarse los principios de dirección electrostática para incrementar la tasa de activación del enlace de un anticuerpo a su antígeno, sin cálculos extensos, identificando los sitios potenciales de amplificación de la tasa de activación a través de una serie de criterios que reducen la lista de sitios objetivo a un número experimentalmente manejable. Un ejemplo particular es la modificación del fragmento Fab del anticuerpo Y0101 anti-VEGF (Figuras 1A-B) . Los Fab Y0101 con mutaciones hechas en sitios objetivo identificados, caracterizados por un ensayo en base a la fluorescencia, mostraron tasas de asociación mejoradas por casi un orden de magnitud. Además, las tasas de asociación observadas para el complejo Fab-VEGF no mostraron ninguna correlación con aquellas predichas por el cálculo de la energía de interacción Debye-Huckel . Se espera que las variantes de los Fab Y0101 con tasas en ascenso más rápidas sean antagonistas más potentes de VEGF debido a su más alta afinidad, pero también más eficaces debido a su más rápido enlace. La importancia de este último no debe subestimarse, dado que las tasas de asociación y disociación del complejo Fab Y0101-VEGF son de órdenes de magnitud más lentas que las interacciones proteína-proteína típicas (Chen et al., Journal of Molecular Biology 293(4) : 865-81 (1999); Gabdoulline et al., Journal of Molecular Biology 306(5): 1139-55 (2001)). El criterio descrito en la presente para la identificación de los 0N-RAMPS es suficiente para guiar el re-diseño de un fragmento de anticuepo para una asociación mejorada y una afinidad total de enlace con su antígeno. MATERIALES Y MÉTODOS Identficación de los Sitios de Amplificación de la tasa de activación (On-RAMPS) Dado que existen aproximadamente 445 residuos en un fragmento de anticuerpo (Fab) , una etapa en el mejoramiento de su tasa de asociación con el ligando implica la identificación de los residuos, que al mutar para incrementar la complementariedad de la carga, alterarán significativamente la energía electrostática de interacción entre las dos proteínas. El siguiente criterio se aplicó para identificar estos "Sitios de Amplificación de Tasa de activación" (On-RAMPS) . 1) El residuo tuvo al menos un tercio de su área de superficie de cadena lateral expuesta al solvente, dado que la mutación de los residuos enmascarados puede desestabilizar el Fab. 2) El residuo se encontró dentro de al menos 16 Á de VEGF en estado de enlace, dado que las fuerzas electrostáticas de atracción pueden declinar como una función de distancia. 3) El residuo no tiene contacto directamente con VEGF en estado de enlace, dado que la mutación de los residuos de contacto directo puede desestabilizar el complejo enlazado. 4) Se dio preferencia a aquellos residuos que se encontraron dentro de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) sobre aquellos que no, dado que existen indicaciones de que tienen menos probabilidades de inducir respuestas inmunógenas en los pacientes. 5) Solo se consideraron aquellos residuos para los cuales fue posible aumentar la complementariedad de la carga entre el Fab y el antígeno. Por ejemplo, el VL-D28 de Y0101 puede mutarse ya sea para neutralizar (D28N) o revertir (D28K) su carga para complementar mejor el antígeno cargado negativamente, mientras que el residuo VH-K64 no puede mutarse para incrementar su carga positiva. Mutagénesis, expresión y purificación de proteínas La isoforma corta de VEGF (8-109) se produjo como se describió previamente (Christinger et al., Proteins 26(3):353-7 (1996)). El método para construir y purificar las variantes mutantes del Fab se ha descrito previamente (Muíler et al., Structure 6(9):1153-67 (1998)). Brevemente, se prepararon mutaciones de punto mediante mutagénesis dirigida al oligonucleótido por medio de los métodos desarrollados por Kunkel (Kunkel T.A. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 82(2):488-92 (1985)). El Fab se expresa al inducirse en la línea celular de E. coli no supresora 34B8 (Baca et al., Journal of Biological Chemistry 272 (16) : 10678-84 (1997)) y se purificó mediante cromatografía de afinidad con resina de proteína G (Amersham) después del choque osmótico de las células cosechadas. Los rendimientos típicos son de 2 nmoles de Fab por 1 litro de crecimiento . Ensayo de tasa de asociación En los experimentos descritos en la presente, la intensidad de emisión de fluorescencia (8excitación = 295 nm; 8emisión = 340 ??t?, paso de banda 16 nm) se midió utilizando un espectrofotómetro SLM-Aminco serie 8000 (THERMOSPECTRONIC®) mientras se agregó VEGF a una cubeta agitada conteniendo aproximadamente 10 nM de Fab en 25 nM de Tris, pH 7.2, mantenido a 37°C. Ensayo de tasa de disociación Las tasas de disociación se midieron mediante resonancia de plasmón de superficie en un instrumento BIACORE-2000® (BIAcore, Inc.) como se describió previamente (Muller et al., Structure 6(9): 1153-67 (1998)). VEGF se inmovilizó mediante acoplamiento de amina a un chip Bl a aproximadamente 10 unidades de resonancia-respuesta. El enlace de Fab se midió a ?µ?, 500 nM, 250 nM, 125 nM, 62.5 nM y 31.3 nM. La disociación se calculó asumiendo un modelo de enlace de uno-a-uno. Todos los experimentos se llevaron a cabo a 37°C en solución salina amortiguada de fosfato, pH 7.2 conteniendo 0.05% Tween-20, 0.01% NaN3 y a una tasa de flujo de 20 µ? min"1. RESULTADOS Desarrollo del ensayo de tasa de asociación Aunque la tecnología de resonancia de plasmón de superficie ha demostrado ser adecuada para mediciones de afinidad, pueden pasar inadvertidas sutiles diferencias entre las variantes de una interacción de enlace particular por múltiples razones, que varían desde las complejidades de la dinámica de flujo (Fivash et al., Current Opinión in Biotechnology 9(1) : 97-101 (1998)) y acoplamiento de amina no específico (Kortt et al., Analytical Biochemistry 253(1) :103-11 (1997)) hasta una simple inhabilidad para determinar exactamente las concentraciones de las proteínas apropiadamente plegadas y activas. Debido a que el trabajo presentado en la presente se refiere a las diferencias en las tasas de enlace entre las variantes del Fab anti-VEGF, se desarrolló un ensayo suficientemente sensitivo para detectar las diferencias sutiles en las tasas en ascenso, representativas de la inserción en solución, e independientes de la concentración de varias variantes de Fab. Las propiedades de fluorescencia de los residuos de triptofano son sensitivas a su ambiente local (Lakowicz, J.R. (1999) . Principies of fluorescence spectroscopy, 2a. edic. Kluwer Academic Press, New York, N.Y.). Como se reveló por medio de la co-estructura de VEGF y del Fab anti-VEGF utilizados en este estudio (Muller et al., Structure 6(9):1152-67 (1998)), existen tres triptofanos en el Fab que forman un contacto directo con el VEGF en estado de enlace y cuyas propiedades de fluorescencia puede esperarse que cambien al ir de un estado no enlazado a un estado enlazado. No existen triptofanos en VEGF, pero existen dos tirosinas y una fenilalanina que forman la interfase de enlace con el Fab (Muller et al., Structure 6(9): 1153-67 (1998)) que pueden contribuir al espectro de fluorescencia si se excitan. Para eliminar esta fuente potencial de error, el ensayo de fluorescencia se lleva a cabo con una longitud de onda de excitación de 295 nm, que mínimamente se sobrepone al espectro de excitación de tirosina y fenilalanina (Lakowicz, J.R. Principies of fluorescence spectroscopy, 2a. edic . Kluwer Academic Press, New York, N.Y. (1999)). La intensidad de fluorescencia del complejo Fab-VEGF es mayor que la suma de las intensidades de fluorescencia individuales de los componentes (Figura 2) . La tasa de incremento de la intensidad de fluorescencia puede ajustarse a una sola curva exponencial (Figura 3) . El diagrama de la tasa observada como una función de la concentración de VEGF permite el análisis de pseudo-primer-orden, siendo Jx la pendiente para la reacción, siendo J_i la intersección-y (Figura 4) (Jhonson, K.A. Transient-state kinetic analysis of enzyme reaction pathways. En The Enzymes, Vol. 20:pp. 1-61. Academic Press, Inc. (1992)). Identificación de On-RAMPS Al aplicar los criterios señalados anteriormente, el número de los sitios potenciales para la mutagénesis se redujo de 445 residuos a 22 (Tabla 1) . El primer criterio, estando expuesto al solvente, reduce el número a 173. El segundo, encontrándose dentro de 16 Á de VEGF, reduce el número a 47. El tercero, que no hace contacto directamente con VEGF, reduce el número a 31. El cuarto, en que el residuo descansa dentro de las CDRs, reduce ese a 23. Finalmente, un residuo adicional (VH-K64) se elimina por medio del criterio final, dado que su complementariedad con el VEGF cargado negativamente no puede incrementarse. La tasa de activación predicha para la mutación de cada uno de estos residuos a un residuo cargado positivamente se calculó de acuerdo con el método de Schreiber et al., (2000) Nat. Struct. Biol. 7:537-41. Tabla 1. ON-RAMPS Potenciales de Fab Y0101 Los residuos se encuentran numerados de acuerdo con el sistema Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Inununological Interest, 5a. Edición, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). SASA % calculado utilizando un radio de sonda de 1.4 Á. Tasas de asociación observadas Debido a que la carga neta formal en VEGF es -10 (calculada asignando +1 a las N- terminales , lisinas y argininas y -1 a las C-terminales , aspartatos y glutamatos), se hicieron mutaciones para incrementar la carga neta positiva en el Fab (tipo silvestre = +2) en la periferia de la interfase de enlace. La mutación de estos residuos da como resultado un incremento en la tasa de asociación tan grande como de dos veces en relación a Y0101 (Tabla 2) . Por otra parte, las mutaciones de los residuos que se encuentran expuestos al solvente, pero no dentro de 16 Á de VEGF (Tabla 2, no calificada), muestran poco cambio, ilustrando por tanto la utilidad de los criterios ON-RAMPS. Se lograron incrementos adicionales en la tasa de asociación del Fab anti-VEGF mutando múltiples residuos (Tabla 3) , con la más rápida variante de enlace, "34-TKKT" (VH- (T28D, SlOOaR) + VL-(S26T, Q27K, D28K, S30T) ) teniendo una tasa de asociación 6 veces más alta que la de Y0101. Contrariamente, las mutaciones que dieron surgimiento a la repulsión de la carga dieron como resultado tasas de asociación disminuidas (Tabla 3: VL-S26E mutante, Q27E, D28E, S30E y VL-T51E mutante, S52E, S53E, L54E) . Tabla 2 : Constantes de Enlace de mutaciones únicas Mutación kx Jc-i(x 10"4 k-x (x 10"4 seg" (x 105 M"1 seg"1) x) 0.15 M (x 10"9 M) seg"1) 0 M NaCl NaCl Y0101 (tipo 5.4 ± 0.3 3.9 ± 1.1 1.3 ± 0.5 0.7 silvestre) Cadena Ligera R18Q* 4.8 3.8 ± 0.5 0.9 ± 0.3 0.8 R18E* 5.2 2.6 ± 0.7 0.9 ± 0.2 0.5 S26K 7.4 3.3 ± 0.5 0.6 ± 0.3 0.4 Q27K 6.7 4.0 ± 0.4 0.7 ± 0.4 0.6 D28K 7.0 3.3 ± 0.2 0.9 ± 0.4 0.5 D28N 6.5 2.8 ± 0.8 0.9 ± 0.3 0.4 S30K 9.7 3.3 ± 0.5 0.3 ± 0.1 0.3 S30N 5.5 3.3 ± 0.4 0.9 ± 0.3 0.6 N31K 6.9 3.3 + 0.5 0.3 ± 0.2 0.5 N31R 7.8 3.8 ± 0.2 0.4 ± 0.2 0.5 Y32K 7.3 2.5 ± 0.4 0.4 ± 0.2 0.3 Y32R 7.1 LE LE - S52K 6.2 3.8 ± 0.2 0.6 ± 0.2 0.6 S53K 8.0 3.8 ± 0.2 0.5 ± 0.2 0.5 L54K 4.4 LE LE - V94E 1.3 10.1 + 1.0 4.4 ± 0.8 7.8 E195R* 4.9 BG LE - E195Q* 5.9 5.3 ± 2.5 1.5 ± 0.7 0.9 E195L* 7.3 BG 0.6 ± 0.2 - Cadena Pesada T28K 3.6 LE LE - T28R 4.0 4.8 ± 0.4 LE 1.2 T28E 7.8 4.8 + 0.3 1.0 ± 0.1 0.6 T28D 10. 2.9 ± 0.2 0.8 ± 0.3 0.3 T30D 6.0 2.6 + 1.4 1.0 ± 0.1 0.4 T30E 4.8 7.2 ± 0.3 1.4 ± 0.2 1.5 E56K 4.8 4.4 ± 0.3 LE 0.9 Y99K 3.8 1.5 ± 1.2 1.4 ± 0.3 0.4 Y99R 6.0 1.4 + 1.3 1.6 ± 0.3 0.2 SlOOaR 8.7 2.4 ± 0.8 0.7 ± 0.1 0.3 D218N* 4.9 BG 0.8 ± 0.2 - D218K* 5.3 BG 0.6 ± 0.4 - Los residuos se enumeran de acuerdo al sistema Kabat (Kabat efc al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Edición, National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991)) . kx determinado por el ensayo en base a la fluorescencia (+ la desviación estándar de tres experimentos, solo tipo silvestre) . J_i determinado por la resonancia de plasmón de superficie (+ desviación estándar de 12 experimentos) . Los experimentos de kx y (0 M NaCl) se llevaron a cabo en 25 mM de Tris, pH 7.2 a 37°C. Los experimentos de k-? (0.15 M NaCl) se llevaron a cabo en 25 mM de Tris, 150 mM de NaCl, a 25°C. ¾ se calcula de los datos de 0 M NaCl. *, residuos que no cumplen con los criterios de ON-RAMPS; LE, baja expresión del análisis limitado de Fab; BG, enlace de respaldo para controlar el análisis limitado de la célula de flujo de los datos SPR.

Tabla 3. Constantes de enlace de mutaciones múltiples S26T, Q27K, D28K, 29 ± 2.9 BG 0.6 ± 0.1 - S30T T51E, S52E, S53E, 3.3 4.4 ± 1.0 40.8 ± 14.7 1.3 L54E S52K, S53K, L54T 13 BG LE - S26K, Q27K, D28K, 24 7.8 ± 1.1 0.9 ± 0.2 0.3 S30K, T51K, S52K, S53K, L54K Cadena Pesada T28D, SlOOaR 14 BG 1.1 ± 0.3 - Variante de Enlace Más Rápida 34-TKKT 33 ± 3.9 2.6 ± 1.2 0.2 ± 0.1 0.08 Los residuos se enumeran de acuerdo con el sistema Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Edición, National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991)). k determinado por el ensayo en base a la fluorescencia (± la desviación estándar de tres experimentos) . -i determinado por la resonancia de plasmón de superficie (+ desviación estándar de 12 experimentos) . Los experimentos de k± y k.x (0 M NaCl) se llevaron a cabo en 25 m de Tris, pH 7.2 a 37°C. Los experimentos de k.i (0.15 M NaCl) se llevaron a cabo en 25 mM de Tris, 150 mM de NaCl, a 25°C. J¾ se calcula de los datos de 0 M NaCl. 34-TKKT, VH-(T28, SlOOaR) + VL- (S26T, Q27K, D28K, S30T) mutante. LE, baja expresión del análisis limitado de Fab; BG, enlace de respaldo para controlar el análisis limitado de la célula de flujo de los datos SPR.

Comparación de las tasas de asociación observadas y calculadas Se ha sugerido que el cálculo de la energía Debye-Huckel de la interacción electrostática es un predictor poderoso y exacto de la tasa de asociación (Selzer, T. & Schreiber, G. Journal of Molecular Biology 287(2) : 409-19 (1999) ) . El programa utilizado por Selzer & Schreiber se encuentra disponible para el uso público en su dirección de internet (http : //www. weizmann . ac . il/home/bcges/PARE . html) . Utilizando este programa y siguiendo sus guías, se calcularon las tasas de asociación de las diferentes variantes construidas en este trabajo para la comparación con los valores experimentalmente determinados. El diagrama de k0bs contra kcaic indica una pobre correlación, con un valor R de 0.46 (Figura 5) . Dependencia salina de las tasas de asociación Para ilustrar que la diferencia en las tasas de asociación entre las variantes es atribuible a la interacción electrostática entre los Fabs y VEGF, en lugar de una redisposición estructural general de la interfase de enlace, medimos las tasas de asociación de Fab Y0101 y 34-TKKT de tipo silvestre a diferentes concentraciones de sal (Figura 7) . La diferencia en la tasa de asociación entre la variante de más rápido enlace y Y0101 en 150 nM de NaCl es menor que 2 veces.

De manera importante, la energía electrostática de interacción entre el Fab y VEGF calculada a partir de la estructura del complejo (Y0101 = 0.28 kcal mol"1, 34-TKKT = -1.07 kcal mol"1) es del signo correcto (aunque difiere en magnitud) con el valor determinado de la pendiente de la Figura 7. (Y0101 = 0.86 kcal mol"1, 34-TKKT = -4.0 kcal mol" x) · Combinación de las variantes rápidas de la tasa de activación con otras variantes de afinidad maduradas Las variantes rápidas de la tasa de activación descritas anteriormente pueden combinarse con otras variantes identificadas para lograr afinidades de enlace incluso mayores. Por ejemplo, la variante de enlace más rápida "34-TKKT" puede combinarse con variantes anti-VEGF conocidas tales como Fab-12, VNERK o Y0317. Pueden hacerse alteraciones de secuencia adicionales para optimizar adicionalmente la afinidad de enlace así como otras propiedades físicas o químicas de la molécula. Las Figuras 6A y 6B proporcionan alineaciones de tres de tales variantes de "combinación", en las cuales las sustituciones de la "34-TKKT" se preparan ya sea junto con la inserción VNERK o la sustitución H97Y, o tanto con la inserción VNERK como con la sustitución H97Y. Se espera que las variantes resultantes posean mayores afinidades de enlace a VEGF y por tanto mejor eficacia al utilizarse como antagonistas terapéuticos para VEGF. EJEMPLO 2 Los principios para identificar On-RAMPS y generar las variantes más rápidas de la tasa de activación anteriormente descritas, en el contexto de los anticuerpos anti-VEGF, pueden aplicarse de manera similar a otras variantes del anticuerpo también, incluyendo pero sin limitarse a las variantes del anticuerpo anti-TF y anti-HER2. Como etapas iniciales, se utilizó un anticuerpo anti-TF de origen D3H44 (Figura 8; SEQ ID NOS 11 y 12 para los dominios variables de cadena ligera y pesada, respectivamente) y un anticuerpo anti-HER2 de origen 4D5 (Figura 9; SEQ ID NOS 13 y 14 para los dominios variables de cadena ligera y pesada, respectivamente) para identificar ON-RAMPS potenciales, utilizando criterios y cálculos similares como se describieron en el Ejemplo 1. La Tabla 4 y Tabla 5 enlistan el primer grupo de residuos como ON-RAMPS potenciales del anti-TF D3H44 y del anti-HER2 4D5, respectivamente, así como mutaciones únicas para cada uno de estos residuos junto con la tasa de activación calculada relativa al tipo silvestre. La tasa de activación calculada se calculó de acuerdo al método de Schreiber et al., (2000) Nat . Struct . Biol. 7:537-41. Se llevan a cabo refinamientos adicionales, mutaciones e identificación de ON-RAMPS adicionales utilizando métodos y cálculos similares.

Tabla 4. ON-RAMPS Potenciales de D3H44 y Mutaciones Unicas Los residuos se enumeran de acuerdo con el sistema Kabat (Kabat et al., Seguences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Edición, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Tabla 5. ON-RAMPS Potenciales de D3H44 y Mutaciones Únicas Los residuos se enumeran de acuerdo con el sistema Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Edición, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991) ) . Siguiendo la identificación de ON-RAMPS y el diseño de mutaciones únicas o múltiples de acuerdo con esto, las tasas de asociación, disociación y las afinidades de enlace totales de las variantes resultantes pueden observarse y calcularse de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1. Sin embargo, particularmente para las variantes anti-TF, debido a que la asociación de TF y an i-TF es demasiado rápida para observarla en una cubeta agitada, la intensidad de emisión de fluorescencia (XexCitación = 280 nm, 2 nm paso de banda; Aemisión > 320 nm) se midió utilizando un epectrofotómetro de flujo obstruido (AVIV) . 50 µ? de una solución de 100 nM de anti-TF en 10 nM de HEPES, ph 7.0, 25°C, se mezclaron rápidamente con 50 µ? de una solución conteniendo ya sea 0 nM, 100 nM, 200 nM, 300 nM, 400 nM, 500 nM, 600 nM, 700 nM, 800 nM, o 900 nM de TF y el cambio en fluorescencia se observó durante un período de 2 segundos. La tasa de cambio en la intensidad de fluorescencia se ajustó a una sola curva exponencial . La tasa de asociación se determinó trazando la tasa observada como una función de la concentración de TF . La pendiente de esa línea es la tasa de asociación (en M"1 seg"1) . aminoácido 26L, 27L, 28L, o 30L de un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo de origen, utilizando el sistema de numeración de residuos de acuerdo con Kabat . 20. El método de la reivindicación 19 en donde la sustitución se encuentra en tres o cuatro de las posiciones de aminoácido 26L, 27L, 28L o 30L de un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo de origen, utilizando el sistema de nueraeración de residuos de acuerdo con Kabat. 21. El método de la reivindicación 16 en donde la sustitución se encuentra en una o más de las posiciones de aminoácido 25H, 28H, 30H, 54H, 56H, 61H, 62H, 99H o lOOaH de un dominio variable de cadena pesada del anticuerpo de origen, utilizando el sistema de numeración de residuos de acuerdo con Kabat . 22. El método de la reivindicación 1, en donde el antígeno es el factor de tejido (TF) . 23. El método de la reivindicación 22, en donde el anticuerpo de origen comprende los dominios variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo anti-TF humanizado. 24. El método de la reivindicación 23, en donde el anticuerpo anti-TF humanizado es D3H44. 25. El método de la reivindicación 23, en donde la sustitución se encuentra al menos en una o más de las posiciones de aminoácido 30L, 49L, 50L, 53L de un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo de origen,

Claims (1)

1. - 113 - REIVINDICACIONES 1. Un método para preparar una variante de anticuerpo de un anticuerpo de origen específico para un antigeno, comprendiendo las siguientes etapas: a) identificar un residuo de aminoácido objetivo dentro del dominio variable del anticuerpo de origen, siendo dicho residuo objetivo 1) un residuo expuesto en solución; 2) en o adyacente a una región hipervariable; y 3) dentro de aproximadamente 20 ? del antígeno cuando el anticuerpo de origen se enlaza al mismo; y b) sustituir el residuo objetivo de la etapa a) con un residuo de aminoácido de reemplazo diferente de modo que aumente la complementariedad de la carga entre el anticuerpo y el antígeno. 2. El método de la reivindicación 1 en donde el residuo objetivo no tiene contacto directamente con el antígeno al enlazarse al mismo. 3. El método de la reivindicación 1 en donde el residuo objetivo tiene al menos aproximadamente un tercio de su área de superficie de cadena lateral expuesto al solvente. 4. El método de la reivindicación 1 en donde el residuo objetivo se encuentra dentro de al menos 16 Á del antígeno al enlazarse al mismo. 5. El método de la reivindicación 1 en donde el anticuerpo de origen es un anticuerpo humanizado, humano o - 114 - quimérico . 6. El método de la reivindicación 1 en donde el anticuerpo de origen es un fragmento de anticuerpo. 7. El método de la reivindicación 6 en donde el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab. 8. El método de la reivindicación 1 en donde la variante del anticuerpo tiene una más fuerte afinidad de enlace para el antígeno que el anticuerpo de origen. 9. El método de la reivindicación 8 en donde la afinidad de enlace de la variante del anticuerpo es al menos dos veces más fuerte que la afinidad de enlace del anticuerpo de origen. 10. El método de la reivindicación 1 en donde la variante del anticuerpo tiene una tasa de asociación más rápida con el antígeno que el anticuerpo de origen. 11. El método de la reivindicación 10 en donde la tasa de asociación de la variante del anticuerpo es al menos aproximadamente cinco veces más rápida que la tasa de asociación del anticuerpo de origen. 12. El método de la reivindicación 10 en donde la tasa de asociación de la variante del anticuerpo es al menos aproximadamente diez veces más rápida que la tasa de asociación del anticuerpo de origen. 13. El método de la reivindicación 1 en donde la variante del anticuerpo tiene de aproximadamente una a - 115 - aproximadamente veinte sustituciones en sus regiones hipervariables en comparación con el anticuerpo de origen. 14. El método de la reivindicación 13 en donde cada una de las sustituciones incrementa la complementariedad de carga entre el anticuerpo y el antígeno. 15. El método de la reivindicación 1 en donde el antígeno es el factor vascular de crecimiento endotelial (VEGF) . 16. El método de la reivindicación 15 en donde el anticuerpo de origen comprende los dominios variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo anti-VEGF humanizado seleccionado del grupo que consiste de Y0101, Y0317, F(ab)-12, Y0192, Y0238-3, Y0239-19, Y0313-2 y V ERK. 17. El método de la reivindicación 1 en donde la sustitución se encuentra en una región hipervariable seleccionada del grupo que consiste de CDR Ll, CDR L2 , ciclo Hl y CDR H3. 18. El método de la reivindicación 16 en donde la sustitución se encuentra en una o más de las posiciones de aminoácido 26L, 27L, 28L, 30L, 31L, 32L, 50L, 52L, 53L, 54L, 56L, 93L o 94L de un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo de origen, utilizando el sistema de numeración de residuos de acuerdo con Kabat . 19. El método de la reivindicación 18 en donde la sustitución se encuentra en dos o más posiciones de utilizando el sistema de numeración de residuos de acuerdo con Kabat . 26. El método de la reivindicación 25, en donde el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo de origen es de la SEQ ID NO: 11. 27. El método de la reivindicación 23, en donde la sustitución se encuentra al menos en una o más de las posiciones de aminoácido 30H, 54H, 56H, 62H, 64H o 97H de un dominio variable de cadena pesada del anticuerpo de origen utilizando el sistema de numeración de residuos de acuerdo con Kaba . 28. El método de la reivindicación 27, en donde el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo de origen es de la SEQ ID NO: 12. 29. El método de la reivindicación 1, en donde el antígeno es HER2. 30. El método de la reivindicación 29, en donde el anticuerpo de origen comprende los dominios variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo anti-HER2 humanizado. 31. El método de la reivindicación 30, en donde el anticuerpo anti-HER2 humanizado es el rhuMAb 4D5. 32. El método de la reivindicación 30, en donde la sustitución se encuentra al menos en una o más de las posiciones de aminoácido 27L, 28L, 52L, o 56L de un dominio variable de cadena ligera del anticuerpo de origen, utilizando el sistema de numeración de residuos de acuerdo con Kabat . 33. El método de la reivindicación 32, en donde el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo de origen es de la SEQ ID NO: 13. 34. El método de la reivindicación 30 en donde la sustitución se encuentra al menos en la posición de aminoácido 98H de un dominio variable de cadena pesada del anticuerpo de origen, utilizando el sistema de numeración de residuos de acuerdo con Kabat. 35. El método de la reivindicación 34, en donde el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo de origen es de la SEQ ID NO: 14. 36. El método de la reivindicación 1 que comprende producir la variante del anticuerpo en una célula huésped que comprende ácido nucleico que codifica la variante del anticuerpo. 37. El método de la reivindicación 36 que comprende conjugar la variante del anticuerpo producida por la célula huésped con una molécula heteróloga. 38. Una variante del anticuerpo hecha de acuerdo con el método de la reivindicación 36. 39. La variante del anticuerpo de un anticuerpo de origen que comprende una alteración del aminoácido en o adyacente a una región hipervariable del anticuerpo de origen que aumenta la complementariedad de la carga entre la variante del anticuerpo y un antígeno al cual se enlaza. 40. La variante del anticuerpo de la reivindicación 39 en donde la alteración es una sustitución de aminoácido en una región hipervariable del anticuerpo de origen . 41. La variante del anticuerpo de la reivindicación 39 en donde la alteración es una inserción de aminoácido en o adyacente a una región hipervariable del anticuerpo de origen, en donde el aminoácido insertado no se enlaza al antígeno. 42. La variante del anticuerpo de la reivindicación 39 en donde el antígeno es el factor vascular de crecimiento endotelial (VEGF) . 43. La variante del anticuerpo de la reivindicación 42 que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende una secuencia COR Ll seleccionada de SATKKIK YLN (SEQ ID NO: 6) o SATKKITNYLN (SEQ ID NO: 7) . 44. La variante del anticuerpo de la reivindicación 43 que comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO : 4. 45. La variante del anticuerpo de la reivindicación 42 que comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO:5, SEQ ID NO : 8 , SEQ ID NO : 9 o SEQ ID NO: 10. 46. La variante del anticuerpo de la reivindicación 39 en donde el antígeno es el factor de tejido (TF) . 47. La variante del anticuerpo de la reivindicación 46 en donde el anticuerpo de origen es D3H44. 48. La variante del anticuerpo de la reivindicación 39 en donde el antígeno es HER2. 49. La variante del anticuerpo de la reivindicación 48 en donde el anticuerpo de origen es 4D5. 50. Una composición que comprende la variante del anticuerpo de la reivindicación 39 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 51. El ácido nucleico aislado que codifica la variante del anticuerpo de la reivindicación 39. 52. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 51. 53. Una célula huésped transformada con el ácido nucleico de la reivindicación 51. 54. Un proceso para producir una variante del anticuerpo que comprende cultivar la célula huésped de la reivindicación 53 de modo que se exprese el ácido nucleico. 55. El proceso de la reivindicación 54 que comprende además recuperar la variante del anticuerpo del cultivo de la célula huésped. 56. El proceso de la reivindicación 55 en donde la variante del anticuerpo se recupera del medio de cultivo de la célula huésped. 57. Un método para determinar la tasa de asociación a antígeno de un anticuepo que comprende: (1) combinar un anticuerpo y un antígeno en solución, y después ; (2) determinar la formación de un complejo anticuerpo-antígeno a través del tiempo. 58. El método de la reivindicación 57 en donde la etapa (2) comprende medir la intensidad de la emisión de fluorescencia del complejo de anticuerpo . an ígeno . 59. El método de la reivindicación 57 en donde el anticuerpo o el antígeno comprende un residuo de triptofano en la interfase de enlace de antígeno-anticuerpo, y la etapa (2) mide la intensidad de la emisión de fluorescencia del residuo de triptofano que cambia cuando se enmascara el residuo de triptofano. 60. El método de la reivindicación 57 en donde el antígeno es el factor vascular de crecimiento endotelial. 61. El método de la reivindicación 57 en donde el anticuerpo tiene una constante de asociación para el antígeno más lenta que 105 M"1 seg"1.