CN107135646B - 用于治疗溃疡的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗或预防具有低红细胞水平和/或血红蛋白水平（例如贫血）的受试者中的溃疡的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明的组合物可以用于治疗或预防与贫血相关的溃疡。

Description

用于治疗溃疡的方法和组合物
相关申请
本申请要求于2014年6月13日提交的美国临时申请序列号62/012,109和于2014年9月4日提交的美国临时申请序列号62/045,808的优先权权益。上述申请各自的公开内容在此以其整体并入。
发明背景
成熟的红血细胞或红细胞负责在脊椎动物的循环系统中的氧运输。红血细胞含有高浓度的血红蛋白，此类蛋白质在相对高的氧分压（pO2）下结合肺中的氧，并且以相对低的pO2将氧输送到身体区域。
成熟红血细胞在称为红细胞生成的过程中由多能造血干细胞产生。出生后红细胞生成主要在骨髓和脾的红髓中发生。不同信号途径的协同作用控制细胞增殖、分化、存活和死亡的平衡。在正常条件下，红血细胞以在体内维持恒定红细胞质量的速率产生，并且产生可响应不同刺激（包括增加或减少的氧张力或组织需求）而增加或减少。红细胞生成的过程开始于谱系定向前体细胞的形成，并且通过一系列不同的前体细胞类型进行。随着网织红细胞释放到血流中并失去其线粒体和核糖体，同时采取成熟红血细胞的形态，发生红细胞生成的最后阶段。血液中升高水平的网织红细胞或升高的网织红细胞:红细胞比率指示红血细胞生产率增加。
一般而言，贫血是当受试者的血液缺乏足够的健康红血细胞或小于正常数量的血红蛋白时发展的状况。当可能起因于一个或多个血红蛋白亚基中的畸形的红血细胞的氧结合能力减少时，也可以诊断贫血。由于人类细胞依靠氧气来存活，贫血可以导致广泛范围的临床并发症，包括例如组织损伤。例如，据报道溃疡是慢性贫血病症，特别是在溶血性贫血例如镰状细胞病和地中海贫血中的最常见的皮肤表现之一。参见例如Keast等人（2004）Ostomy Wound Manage.，50（10）：64-70；Trent等人（2004）Adv Skin Wound Care，17（8）：410-416；J.R. Eckman（1996）Hematol Oncol Clin North Am.，10（6）：1333-1344；和Rassi等人（2008）Pediatric Annals 37（5）：322-328。关于贫血患者中的溃疡形成的根本机制尚未完全定义。然而，认为多重贫血并发症促进溃疡发展，包括例如缺血、一氧化氮生物利用度减少、血管阻塞、血栓形成和缺氧。同上。
在贫血患者中的溃疡愈合通常是缓慢的过程，并且此类患者也处于复发性溃疡的高风险。参见例如Keast等人（2004）Ostomy Wound Manage.，50（10）：64-70；Trent等人（2004）Adv Skin Wound Care，17（8）：410-416；J.R. Eckman（1996）Hematol Oncol ClinNorth Am.，10（6）：1333-1344；和Rassi等人（2008）Pediatric Annals 37（5）：322-328。此外，大多数疗法在治疗贫血患者中发生的溃疡方面具有有限的成功。
因此，本发明的目的是提供用于治疗或预防与贫血相关的溃疡的替代方法。
发明概述
部分地，本发明证明ActRII拮抗剂可以用于改变患有贫血的患者中的不同血液参数（例如红血细胞水平、血红蛋白水平、铁水平、胆红素水平、氮水平等），以及治疗与贫血相关的并发症，包括例如溃疡。特别地，本发明证明施用GDF捕获（GDF Trap）多肽，其为就本SEQ ID NO:1而言在位置79处具有酸性氨基酸的ActRIIB多肽的可溶形式，增加在患有不同类型的溶血性贫血，特别是血红蛋白病性贫血、地中海贫血和镰状细胞病的患者中的红血细胞水平和/或血红蛋白水平。令人惊讶的是，除直接影响不同红血细胞参数之外，公开的ActRII拮抗剂改善了与贫血相关的其他并发症。例如，在患有地中海贫血的人类患者中，使用GDF捕获蛋白的治疗显示增加血红蛋白水平并促进皮肤（皮肤的）溃疡的伤口愈合。在一些情况下，这些相关并发症的改善对于患者健康和生活质量具有与根本性贫血的治疗相同或更大的重要性。因此，在某些实施方案中，本发明提供了使用一种或多种ActRII拮抗剂来增加有此需要的患者中的红血细胞水平和/或血红蛋白水平，并且治疗或预防与这些患者中的低红血细胞水平和/或血红蛋白水平相关的一种或多种并发症的方法。特别地，本发明提供了通过施用一种或多种ActRII拮抗剂，用于治疗或预防有此需要的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡的方法，所述受试者具有低水平的红血细胞和/或血红蛋白，或者在其他方面被分类为患有贫血的受试者[例如，遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、遗传性口形细胞增多症（hereditary stomacytosis）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、镰状细胞病、地中海贫血（α和β两者）和阵发性睡眠性血红蛋白尿症]。在一些实施方案中，本发明提供了通过施用一种或多种ActRII拮抗剂，用于治疗有此需要的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡的方法，所述受试者具有低水平的红血细胞和/或血红蛋白，或者在其他方面被分类为患有贫血的受试者[例如，遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、遗传性口形细胞增多症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、镰状细胞病、地中海贫血（α和β两者）和阵发性睡眠性血红蛋白尿症]。在一些实施方案中，本发明提供了通过施用一种或多种ActRII拮抗剂，用于预防有此需要的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡的方法，所述受试者具有低水平的红血细胞和/或血红蛋白，或者在其他方面被分类为患有贫血的受试者[例如，遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、遗传性口形细胞增多症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、镰状细胞病、地中海贫血（α和β两者）和阵发性睡眠性血红蛋白尿症]。在一些实施方案中，本发明的方法涉及通过施用一种或多种ActRII拮抗剂来治疗或预防患有溶血性贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡。在一些实施方案中，本发明的方法涉及通过施用一种或多种ActRII拮抗剂来治疗患有溶血性贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡。在一些实施方案中，本发明的方法涉及通过施用一种或多种ActRII拮抗剂来预防患有溶血性贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡。特别地，本发明的方法部分涉及通过施用一种或多种ActRII拮抗剂来治疗或预防患有血红蛋白病性贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡的方法。在一些实施方案中，本发明的方法涉及通过施用一种或多种ActRII拮抗剂来治疗患有血红蛋白病性贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡的方法。在一些实施方案中，本发明的方法涉及通过施用一种或多种ActRII拮抗剂来预防患有血红蛋白病性贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡的方法。例如，本发明部分涉及通过施用一种或多种ActRII拮抗剂来治疗或预防患有地中海贫血综合征的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡的方法。在一些实施方案中，本发明涉及通过施用一种或多种ActRII拮抗剂来治疗患有地中海贫血综合征的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡的方法。在一些实施例中，本发明涉及通过施用一种或多种ActRII拮抗剂来预防患有地中海贫血综合征的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡的方法。在一些实施方案中，本发明涉及通过施用一种或多种ActRII拮抗剂来治疗或预防患有镰状细胞病的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡的方法。在一些实施方案中，本发明涉及通过施用一种或多种ActRII拮抗剂来治疗患有镰状细胞病的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡的方法。在一些实施方案中，本发明涉及通过施用一种或多种ActRII拮抗剂来预防患有镰状细胞病的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡的方法。在某些方面，一种或多种ActRII拮抗剂可以与一种或多种现有的支持疗法组合用于治疗或预防溃疡和/或治疗贫血（例如用于治疗镰状细胞病、地中海贫血等的支持疗法）。此类支持疗法的例子是本领域众所周知的并且也在本文中描述。在一些实施方案中，受试者是具有贫血的输血依赖性受试者。在一些实施方案中，受试者是患有贫血的非输血依赖性受试者。
部分地，本发明提供了用一种或多种ActRII拮抗剂来治疗与贫血相关的溃疡，特别是治疗或预防皮肤（皮肤的）溃疡的方法。在一些实施方案中，本发明提供了用一种或多种ActRII拮抗剂来治疗与贫血相关的溃疡，特别是治疗皮肤（皮肤的）溃疡的方法。部分地，本发明提供了用一种或多种ActRII拮抗剂来预防与贫血相关的溃疡，特别是预防皮肤（皮肤的）溃疡的方法。本发明的ActRII拮抗剂包括例如可以抑制ActRII受体（例如ActRIIA和/或ActRIIB受体）介导的信号转导途径的激活（例如经由细胞内介质例如SMAD 1、2、3、5和/或8的信号转导的激活）的药物；可以抑制一种或多种ActRII配体（例如激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、BMP6、BMP7、Nodal等）例如结合和/或激活ActRII受体的药物；抑制ActRII配体和/或ActRII受体的表达（例如转录、翻译、细胞分泌或其组合）的药物；以及可以抑制ActRII信号传导途径的一种或多种细胞内介质（例如SMAD 1、2、3、5和/或8）的药物。
在某些实施方案中，本发明涉及用于在有此需要的患者中增加红血细胞水平和/或血红蛋白水平，并且治疗或预防与这些患者中的低红血细胞水平和/或血红蛋白水平相关的一种或多种并发症的方法中使用的一种或多种ActRII拮抗剂。特别地，本发明提供了用于在治疗或预防有此需要的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡中使用的ActRII拮抗剂，所述受试者具有低水平的红血细胞和/或血红蛋白，或者在其他方面被分类为患有贫血的受试者[例如，遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、遗传性口形细胞增多症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、镰状细胞病、地中海贫血（α和β两者）和阵发性睡眠性血红蛋白尿症]。在一些实施方案中，本发明提供了用于在治疗有此需要的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡中使用的ActRII拮抗剂，所述受试者具有低水平的红血细胞和/或血红蛋白，或者在其他方面被分类为患有贫血的受试者[例如，遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、遗传性口形细胞增多症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、镰状细胞病、地中海贫血（α和β两者）和阵发性睡眠性血红蛋白尿症]。在一些实施方案中，本发明提供了用于在预防有此需要的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡中使用的ActRII拮抗剂，所述受试者具有低水平的红血细胞和/或血红蛋白，或者在其他方面被分类为患有贫血的受试者[例如，遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、遗传性口形细胞增多症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、镰状细胞病、地中海贫血（α和β两者）和阵发性睡眠性血红蛋白尿症]。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂用于在治疗或预防患有溶血性贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡中使用。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂用于在治疗患有溶血性贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡中使用。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂用于在预防患有溶血性贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡中使用。特别地，本发明的ActRII拮抗剂部分用于在治疗或预防患有血红蛋白病性贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡中使用。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂用于在治疗患有血红蛋白病性贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡中使用。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂用于在预防患有血红蛋白病性贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡中使用。例如，本发明部分涉及用于在治疗或预防患有地中海贫血综合征的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡中使用的一种或多种ActRII拮抗剂。在一些实施方案中，本发明涉及用于在治疗患有地中海贫血综合征的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡中使用的一种或多种ActRII拮抗剂。在一些实施例中，本发明涉及用于在预防患有地中海贫血综合征的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡中使用的一种或多种ActRII拮抗剂。在一些实施方案中，本发明涉及用于在治疗或预防患有镰状细胞病的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡中使用的一种或多种ActRII拮抗剂。在一些实施方案中，本发明涉及用于在治疗患有镰状细胞病的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡中使用的一种或多种ActRII拮抗剂。在一些实施方案中，本发明涉及用于在预防患有镰状细胞病的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡中使用的一种或多种ActRII拮抗剂。在某些方面，一种或多种ActRII拮抗剂可以与一种或多种现有的支持疗法组合用于治疗或预防溃疡和/或治疗贫血（例如用于治疗镰状细胞病、地中海贫血等的支持疗法）。此类支持疗法的例子是本领域众所周知的并且也在本文中描述。
部分地，本发明提供了用于在治疗与贫血相关的溃疡，特别是治疗或预防皮肤（皮肤的）溃疡中使用的一种或多种ActRII拮抗剂。在一些实施方案中，本发明提供了用于在用一种或多种ActRII拮抗剂治疗与贫血相关的溃疡，特别是治疗皮肤（皮肤的）溃疡中使用的一种或多种ActRII拮抗剂。部分地，本发明提供了用于在预防与贫血相关的溃疡，特别是预防皮肤（皮肤的）溃疡中使用的一种或多种ActRII拮抗剂。本发明的ActRII拮抗剂包括例如可以抑制ActRII受体（例如ActRIIA和/或ActRIIB受体）介导的信号转导途径的激活（例如经由细胞内介质例如SMAD 1、2、3、5和/或8的信号转导的激活）的药物；可以抑制一种或多种ActRII配体（例如激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、BMP6、BMP7、Nodal等）例如结合和/或激活ActRII受体的药物；抑制ActRII配体和/或ActRII受体的表达（例如转录、翻译、细胞分泌或其组合）的药物；以及可以抑制ActRII信号传导途径的一种或多种细胞内介质（例如SMAD 1、2、3、5和/或8）的药物。
在某些实施方案中，本发明涉及一种或多种ActRII拮抗剂在制备药物中的用途，所述药剂用于增加有此需要的患者中的红血细胞水平和/或血红蛋白水平，并且用于治疗或预防与这些患者中的低红血细胞水平和/或血红蛋白水平相关的一种或多种并发症。特别地，本发明提供了一种或多种ActRII拮抗剂在制备药物中的用途，所述药剂用于治疗或预防有此需要的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡，所述受试者具有低水平的红血细胞和/或血红蛋白，或者在其他方面被分类为患有贫血的受试者[例如，遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、遗传性口形细胞增多症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、镰状细胞病、地中海贫血（α和β两者）和阵发性睡眠性血红蛋白尿症]。在一些实施方案中，本发明提供了一种或多种ActRII拮抗剂在制备药物中的用途，所述药剂用于治疗有此需要的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡，所述受试者具有低水平的红血细胞和/或血红蛋白，或者在其他方面被分类为患有贫血的受试者[例如，遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、遗传性口形细胞增多症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、镰状细胞病、地中海贫血（α和β两者）和阵发性睡眠性血红蛋白尿症]。在一些实施方案中，本发明提供了一种或多种ActRII拮抗剂在制备药物中的用途，所述药剂用于预防有此需要的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡，所述受试者具有低水平的红血细胞和/或血红蛋白，或者在其他方面被分类为患有贫血的受试者[例如，遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、遗传性口形细胞增多症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、镰状细胞病、地中海贫血（α和β两者）和阵发性睡眠性血红蛋白尿症]。在一些实施方案中，本发明提供了一种或多种ActRII拮抗剂在制备药物中的用途，所述药剂用于治疗或预防患有溶血性贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡。在一些实施方案中，本发明提供了一种或多种ActRII拮抗剂在制备药物中的用途，所述药剂用于治疗患有溶血性贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡。在一些实施方案中，本发明提供了一种或多种ActRII拮抗剂在制备药物中的用途，所述药剂用于预防患有溶血性贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡。特别地，本发明提供了一种或多种ActRII拮抗剂在制备药物中的用途，所述药剂部分用于治疗或预防患有血红蛋白病性贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡。在一些实施方案中，本发明提供了一种或多种ActRII拮抗剂在制备药物中的用途，所述药剂用于治疗患有血红蛋白病性贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡。在一些实施方案中，本发明提供了一种或多种ActRII拮抗剂在制备药物中的用途，所述药剂用于预防患有血红蛋白病性贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡。例如，本发明部分涉及一种或多种ActRII拮抗剂在制备药物中的用途，所述药剂用于治疗或预防患有地中海贫血综合征的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡。在一些实施方案中，本发明提供了一种或多种ActRII拮抗剂在制备药物中的用途，所述药剂通过施用一种或多种ActRII拮抗剂用于治疗患有地中海贫血综合征的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡。在一些实施例中，本发明提供了一种或多种ActRII拮抗剂在制备药物中的用途，所述药剂用于预防患有地中海贫血综合征的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡。在一些实施方案中，本发明提供了一种或多种ActRII拮抗剂在制备药物中的用途，所述药剂用于治疗或预防患有镰状细胞病的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡。在一些实施方案中，本发明提供了一种或多种ActRII拮抗剂在制备药物中的用途，所述药剂用于治疗患有镰状细胞病的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡。在一些实施方案中，本发明提供了一种或多种ActRII拮抗剂在制备药物中的用途，所述药剂用于预防患有镰状细胞病的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡。在某些方面，一种或多种ActRII拮抗剂可以与一种或多种现有的支持疗法组合用于治疗或预防溃疡和/或治疗贫血（例如用于治疗镰状细胞病、地中海贫血等的支持疗法）。此类支持疗法的例子是本领域众所周知的并且也在本文中描述。
部分地，本发明提供了一种或多种ActRII拮抗剂在制备药物中的用途，所述药剂用于治疗与贫血相关的溃疡，特别是治疗或预防皮肤（皮肤的）溃疡。在一些实施方案中，本发明提供了一种或多种ActRII拮抗剂在制备药物中的用途，所述药剂用于与一种或多种ActRII拮抗剂治疗与贫血相关的溃疡，特别是治疗皮肤（皮肤的）溃疡。部分地，本发明提供了一种或多种ActRII拮抗剂在制备药物中的用途，所述药剂用于预防与贫血相关的溃疡，特别是预防皮肤（皮肤的）溃疡。本发明的ActRII拮抗剂包括例如可以抑制ActRII受体（例如ActRIIA和/或ActRIIB受体）介导的信号转导途径的激活（例如经由细胞内介质例如SMAD1、2、3、5和/或8的信号转导的激活）的药物；可以抑制一种或多种ActRII配体（例如激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、BMP6、BMP7、Nodal等）例如结合和/或激活ActRII受体的药物；抑制ActRII配体和/或ActRII受体的表达（例如转录、翻译、细胞分泌或其组合）的药物；以及可以抑制ActRII信号传导途径的一种或多种细胞内介质（例如SMAD 1、2、3、5和/或8）的药物。
在某些实施方案中，根据本文公开的方法使用的ActRII拮抗剂是结合和/或抑制GDF11和/或GDF8的药物（例如抑制GDF11和/或GDF8介导的ActRIIA激活和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导的药物）。此类药物统称为GDF-ActRII拮抗剂。任选地，此类GDF-ActRII拮抗剂可以进一步抑制激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7和Nodal中的一种或多种。因此，在一些实施方案中，本发明提供了使用一种或多种ActRII拮抗剂（包括例如可溶性ActRIIA多肽、可溶性ActRIIB多肽、GDF捕获多肽、抗ActRIIA抗体、抗ActRIIB抗体、抗ActRII配体抗体（例如抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗激活素A抗体、抗激活素B抗体、抗激活素AB抗体、抗激活素C抗体、抗激活素E抗体、抗BMP6抗体、抗BMP7抗体和抗Nodal抗体）、ActRIIA的小分子抑制剂、ActRIIB的小分子抑制剂、一种或多种ActRII配体（例如激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、BMP6、BMP7、Nodal等）的小分子抑制剂、ActRIIA的抑制剂核苷酸、ActRIIB的抑制剂核苷酸、一种或多种ActRII配体（例如激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、BMP6、BMP7、Nodal等）的抑制剂核苷酸或其组合的方法，以增加有此需要的受试者中的红血细胞水平和/或血红蛋白水平，治疗或预防有此需要的受试者中的贫血，和/或治疗或预防患有贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡。在某些实施方案中，根据本文公开的方法使用的ActRII拮抗剂结合激活素A或激活素B。在某些实施方案中，根据本文公开的方法使用的ActRII拮抗剂结合激活素A。在某些实施方案中，根据本文公开的方法使用的ActRII拮抗剂结合激活素B。在某些实施方案中，根据本文公开的方法使用的ActRII拮抗剂基本上不结合和/或抑制激活素A（例如激活素A介导的ActRIIA的激活和/或ActRIIB信号传导，例如SMAD 2/3信号传导）。
部分地，本发明证明包含结合并抑制GDF11活性（例如GDF11介导的ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导）的变体/细胞外（可溶性）ActRIIB结构域的ActRII拮抗剂，可以用于增加体内的红血细胞水平，治疗起因于不同状况/病症的贫血，以及治疗患有贫血的患者中的皮肤溃疡。因此，在某些实施方案中，根据本文公开的方法使用的ActRII拮抗剂[例如，增加有此需要的受试者中的红血细胞水平的方法，治疗有此需要的受试者的贫血的方法，治疗或预防有此需要的受试者中的一种或多种贫血并发症（特别是溃疡）的方法等]是结合和/或抑制GDF11（例如GDF11介导的ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导的激活）的可溶性ActRII多肽（例如可溶性ActRIIA或ActRIIB多肽）。尽管可溶性ActRIIA和可溶性ActRIIB ActRII拮抗剂可以通过GDF11拮抗作用以外的机制影响红血细胞形成和溃疡，但是本发明仍然证明就本文公开的方法而言，可以基于GDF11拮抗作用或ActRII拮抗作用或两者选择期望的治疗剂。任选地，此类可溶性ActRII多肽拮抗剂可以进一步结合和/或抑制GDF8（例如抑制GDF8介导的ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导的激活）。在一些实施方案中，结合和/或抑制GDF11和/或GDF8的本发明的可溶性ActRIIA和ActRIIB多肽可以进一步结合和/或抑制选自下述的一种或多种另外的ActRII配体：激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7和Nodal。
在某些方面，本发明提供了其为变体ActRII多肽（例如ActRIIA和ActRIIB多肽）的GDF捕获物，包括具有氨基和羧基末端截短和/或其他序列改变（一个或多个氨基酸取代、添加、缺失或其组合）的ActRII多肽。任选地，本发明的GDF捕获物可以被设计为优先拮抗ActRII受体的一种或多种配体，例如GDF8（也称为肌肉生长抑制素）、GDF11、Nodal、BMP6和BMP7（也称为OP-1）。如本文所公开的，GDF捕获物的例子包括衍生自ActRIIB的一组变体，其具有对激活素特别是激活素A极大缩小的亲和力。这些变体显示出红血细胞的期望作用，同时对其他组织的降低作用。此类变体的例子包括在对应于SEQ ID NO: 1的位置79的位置处具有酸性氨基酸[例如天冬氨酸（D）或谷氨酸（E）]的那些。在某些实施方案中，根据本文公开的方法[例如，增加有此需要的受试者中的红血细胞水平的方法，治疗有此需要的受试者中的贫血的方法，治疗或预防有此需要的受试者中的一种或多种贫血并发症（特别是溃疡）的方法]使用的GDF捕获物结合和/或抑制GDF11。任选地，此类GDF捕获物可以进一步结合和/或抑制GDF8。在一些实施方案中，结合和/或和/或抑制GDF11和/或GDF8的GDF捕获物可以进一步结合和/或抑制一种或多种另外的ActRII配体（例如激活素B、激活素E、BMP6、BMP7和Nodal）。在一些实施方案中，根据本文公开的方法使用的GDF捕获物基本上不结合和/或抑制激活素A（例如激活素A介导的ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导的激活）。在某些实施方案中，GDF捕获物多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含下述、由下述组成或基本上由下述组成：SEQ ID NO: 36、37、41、44、45、50或51的氨基酸序列，以及与前述中的任何至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%等同的多肽。在其他实施方案中，GDF捕获物多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含下述、由下述组成或基本上由下述组成：SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、10、11、22、26、28、29、31或49的氨基酸序列，以及与前述中的任何至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%等同的多肽。在另外其他实施方案中，GDF捕获物多肽包含氨基酸序列，其包含SEQ ID NO: 2、3、4、5、6、29、31或49的氨基酸序列，以及与前述中的任何至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%等同的多肽，其中对应于SEQ ID NO: 1、4或50中的79的位置是酸性氨基酸。GDF捕获物可以包括天然ActRII多肽的功能片段，例如包含选自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、9、10、11或49的序列的至少10、20或30个氨基酸的多肽，或缺乏C末端1、2、3、4、5或10至15个氨基酸且缺乏在N末端处的1、2、3、4或5个氨基酸的SEQ ID NO: 2、5、10、11或49的序列。在一些实施方案中，多肽包含相对于SEQID NO: 2或5在N末端处2至5个氨基酸以及在C末端处不超过3个氨基酸的截短。在一些实施方案中，用于根据本文公开的方法使用的GDF捕获物由SEQ ID NO: 36的氨基酸序列组成或基本上由SEQ ID NO: 36的氨基酸序列组成。
任选地，包含改变的ActRII配体结合结构域的GDF捕获物具有关于激活素A结合的Kd与关于GDF11和/或GDF8结合的Kd的比率，其相对于关于野生型配体结合结构域的比率大至少2-、5-、10-、20、50-、100-或甚至1000倍。任选地，包含改变的配体结合结构域的GDF捕获物具有关于抑制激活素A的IC50与关于抑制GDF11和/或GDF8的IC50的比率，其相对于野生型ActRII配体结合结构域大至少2-、5-、10-、20、25-、50-、100-或甚至1000倍。任选地，包含改变的配体结合结构域的GDF捕获物以比关于抑制激活素A的IC50小至少2、5、10、20、50或甚至100倍的IC50抑制GDF11和/或GDF8。这些GDF捕获物可以是包括免疫球蛋白Fc结构域（野生型或突变型）的融合蛋白。在某些情况下，主题可溶性GDF捕获物是GDF8和/或GDF11的拮抗剂（抑制剂）。
在某些方面，本发明提供了GDF捕获物，其是包含改变的配体结合（例如GDF11结合）结构域的可溶性ActRIIB多肽。具有改变的配体结合结构域的GDF捕获物可以包含例如在人ActRIIB的氨基酸残基例如E37、E39、R40、K55、R56、Y60、A64、K74、W78、L79、D80、F82和F101（编号相对于SEQ ID NO: 1）处的一个或多个突变。任选地，相对于ActRIIB受体的野生型配体结合结构域，改变的配体结合结构域可以具有对于配体例如GDF8/GDF11增加的选择性。为了举例说明，在本文中证明这些突变增加改变的配体结合结构域对于GDF11（并且因此，推测GDF8）超过激活素的选择性：K74Y、K74F、K74I、L79D、L79E和D80I。下述突变具有逆转效应，增加激活素结合超过GDF11的比率：D54A、K55A、L79A和F82A。可通过包含“尾部”区或推测为非结构化接头区，并且还通过使用K74A突变，来增加总体（GDF11和激活素）结合活性。引起配体结合亲和力整体减少的其他突变包括：R40A、E37A、R56A、W78A、D80K、D80R、D80A、D80G、D80F、D80M和D80N。突变可以组合以实现所需效应。例如，影响GDF11:激活素结合比率的许多突变对配体结合具有总体负面作用，并且因此，这些突变可以与一般增加配体结合以产生具有配体选择性的改善结合蛋白的突变组合。在一个示例性实施方案中，GDF捕获物是包含L79D或L79E突变的ActRIIB多肽，任选与另外的氨基酸取代、添加或缺失组合。
在某些实施方案中，根据本文公开的方法使用的ActRII拮抗剂是ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽。一般而言，此类ActRIIB多肽和基于ActRIIB的GDF捕获物多肽是可溶性多肽，其包含衍生自SEQ ID NO:1、4或49的ActRIIB序列的部分/结构域，特别是衍生自SEQ ID NO:1、4或49的ActRIIB序列的细胞外、配体结合部分/结构域。在一些实施方案中，衍生自ActRIIB的部分对应于在SEQ ID NO:1或4的氨基酸21-29中的任何一个（例如21、22、23、24、25、26、27、28或29）处开始[任选地在SEQ ID NO: 1或4的22-25（例如22、23、24或25）处开始]，并且在SEQ ID NO: 1或4的氨基酸109-134中的任何一个（例如109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134）处结束的序列。在一些实施方案中，衍生自ActRIIB的部分对应于在SEQ ID NO:1或4的氨基酸20-29中的任何一个（例如20、21、22、23、24、25、26、27、28或29）处开始[任选地在SEQ ID NO: 1或4的22-25（例如22、23、24或25）处开始]，并且在SEQ IDNO: 1或4的氨基酸109-133中的任何一个（例如109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132或133）处结束的序列。在一些实施方案中，衍生自ActRIIB的部分对应于在SEQ ID NO:1或4的氨基酸20-24中的任何一个（例如20、21、22、23或24）处开始[任选地在SEQ ID NO: 1或4的22-25（例如22、23、24或25）处开始]，并且在SEQ ID NO: 1或4的氨基酸109-133中的任何一个（例如109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132或133）处结束的序列。在一些实施方案中，衍生自ActRIIB的部分对应于在SEQ ID NO:1或4的氨基酸21-24中的任何一个（例如21、22、23或24）处开始，并且在SEQID NO: 1或4的氨基酸109-134中的任何一个（例如109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134）处结束的序列。在一些实施方案中，衍生自ActRIIB的部分对应于在SEQ ID NO:1或4的氨基酸20-24中的任何一个（例如20、21、22、23或24）处开始，并且在SEQ ID NO: 1或4的氨基酸118-133中的任何一个（例如118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132或133）处结束的序列。在一些实施方案中，衍生自ActRIIB的部分对应于在SEQ IDNO:1或4的氨基酸21-24中的任何一个（例如21、22、23或24）处开始，并且在SEQ ID NO: 1或4的氨基酸118-134中的任何一个（例如118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134）处结束的序列。在一些实施方案中，衍生自ActRIIB的部分对应于在SEQ ID NO:1或4的氨基酸20-24中的任何一个（例如20、21、22、23或24）处开始，并且在SEQ ID NO: 1或4的氨基酸128-133中的任何一个（例如128、129、130、131、132或133）处结束的序列。在一些实施方案中，衍生自ActRIIB的部分对应于在SEQ ID NO:1或39的氨基酸20-24中的任一个（例如20、21、22、23或24）处开始，并且在SEQ ID NO: 1或39的氨基酸128-133中的任一个（例如128、129、130、131、132或133）处结束的序列。在一些实施方案中，衍生自ActRIIB的部分对应于在SEQ ID NO:1或4的氨基酸21-29中的任何一个（例如21、22、23、24、25、26、27、28或29）处开始，并且在SEQ ID NO: 1或4的氨基酸118-134中的任何一个（例如118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134）处结束的序列。在一些实施方案中，衍生自ActRIIB的部分对应于在SEQ ID NO:1或4的氨基酸20-29中的任何一个（例如20、21、22、23、24、25、26、27、28或29）处开始，并且在SEQ ID NO:1或4的氨基酸118-133中的任何一个（例如118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132或133）处结束的序列。在一些实施方案中，衍生自ActRIIB的部分对应于在SEQ ID NO:1或4的氨基酸21-29中的任何一个（例如21、22、23、24、25、26、27、28或29）处开始，并且在SEQ ID NO: 1或4的氨基酸128-134中的任何一个（例如128、129、130、131、132、133或134）处结束的序列。在一些实施方案中，衍生自ActRIIB的部分对应于在SEQID NO:1或4的氨基酸20-29中的任何一个（例如20、21、22、23、24、25、26、27、28或29）处开始，并且在SEQ ID NO: 1或4的氨基酸128-133中的任何一个（例如128、129、130、131、132或133）处结束的序列。令人惊讶的是，在SEQ ID NO: 1或4的22-25（例如22、23、24或25）处开始的ActRIIB和基于ActRIIB的GDF捕获物构建体具有比具有人ActRIIB的完全细胞外结构域的蛋白质更高的活性水平。在一些实施方案中，ActRIIB多肽和基于ActRIIB的GDF捕获物多肽包含下述、基本上由下述组成、或由下述组成：在SEQ ID NO: 1或4的氨基酸位置25处开始并且在SEQ ID NO: 1或4的氨基酸位置131处结束的氨基酸序列。前述ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽中的任何均可作为同二聚体产生。前述ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽中的任何可以进一步包含异源部分，其包含来自IgG重链的恒定区，例如Fc结构域。上述基于ActRIIB的GDF捕获物多肽中的任何均可包含在对应于SEQ IDNO: 1的位置79的位置处的酸性氨基酸，任选与相对于SEQ ID NO: 1的一个或多个另外的氨基酸取代、缺失或插入组合。上述ActRIIB多肽、基于ActRIIB的GDF捕获物多肽中的任何，包括其同二聚体和/或其融合蛋白，可以在基于细胞的测定中结合和/或抑制通过激活素（例如激活素A、激活素B、激活素C或激活素AB）的信号传导。上述ActRIIB多肽、基于ActRIIB的GDF捕获物多肽中的任何，包括其同二聚体和/或其融合蛋白，可以在基于细胞的测定中结合和/或抑制通过GDF11和/或GDF8的信号传导。任选地，上述ActRIIB多肽、基于ActRIIB的GDF捕获物多肽中的任何，包括其同二聚体和/或其融合蛋白，可以在基于细胞的测定中结合和/或抑制激活素B、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7和Nodal中的一种或多种的信号传导。
考虑了其他ActRIIB多肽和基于ActRIIB的GDF捕获物多肽，例如下述。包含与SEQID NO: 1或4的氨基酸29-109的序列至少80%（例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）等同的氨基酸序列的ActRIIB多肽或GDF捕获物多肽，其中对应于SEQ ID NO: 1的64的位置是R或K，并且其中ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽在基于细胞的测定中抑制通过激活素、GDF8和/或GDF11的信号传导。如上文的ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽，其中就SEQ ID NO: 1或4的序列而言的至少一个改变位于配体结合口袋外部。如上文的ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽，其中就SEQ ID NO: 1或4的序列而言的至少一个改变是位于配体结合口袋内的保守改变。如上文的ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽，其中就SEQ ID NO: 1或4的序列而言的至少一个改变是在选自K74、R40、Q53、K55、F82和L79的一个或多个位置处的改变。
考虑了其他ActRIIB多肽和基于ActRIIB的GDF捕获物多肽，例如下述。包含与SEQID NO: 1或4的氨基酸29-109的序列至少80%（例如85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%）等同的氨基酸序列的ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽，并且其中该蛋白质包含在除ActRIIB的内源性N-X-S/T序列外的位置处，以及在配体结合口袋外部的位置处的至少一个N-X-S/T序列。如上文的ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽，其中所述ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽包含在对应于SEQ ID NO: 1或4的位置24的位置处的N，以及在对应于SEQ ID NO: 1或4的位置26的位置处的S或T，并且其中所述ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽在基于细胞的测定中抑制通过激活素、GDF8和/或GDF11的信号传导。如上文的ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽，其中所述ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽包含在对应于SEQ ID NO: 1或4的位置64的位置处的R或K。如上文的ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽，其中所述ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽包含在对应于SEQ ID NO: 1或4的位置79的位置处的D或E，并且其中所述ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽在基于细胞的测定中抑制通过激活素、GDF8和/或GDF11的信号传导。如上文的ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽，其中就SEQ ID NO: 1或4的序列而言的至少一个改变是位于配体结合口袋内的保守改变。如上文的ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽，其中就SEQ ID NO: 1或4的序列而言的至少一个改变是在选自K74、R40、Q53、K55、F82和L79的一个或多个位置处的改变。如上文的ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽，其中所述ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽是进一步包含一个或多个异源部分的融合蛋白。上述ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽中的任何，或其融合蛋白可以作为同二聚体产生。上述ActRIIB融合蛋白或基于ActRIIB的GDF捕获物融合蛋白中的任何均可具有异源部分，其包含来自IgG重链的恒定区，例如Fc结构域。
在某些实施方案中，用于根据本文公开的方法使用的ActRIIB多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含下述、由下述组成或基本上由下述组成：SEQ ID NO: 2、3、5、6、29、31或49的氨基酸序列，以及与前述中的任何至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%等同的多肽。ActRIIB多肽可以包括天然ActRIIB多肽的功能片段，例如包含选自SEQ ID NO: 2、3、5、6、29、31或49的序列的至少10、20或30个氨基酸的多肽，或缺乏C末端1、2、3、4、5或10至15个氨基酸且缺乏在N末端处的1、2、3、4或5个氨基酸的SEQ ID NO: 2或5的序列。在一些实施方案中，多肽包含相对于SEQ ID NO: 2或5在N末端处2至5个氨基酸以及在C末端处不超过3个氨基酸的截短。在一些实施方案中，用于根据本文描述的方法使用的GDF捕获物由SEQID NO: 29的氨基酸序列组成或基本上由SEQ ID NO: 29的氨基酸序列组成。
关于活性（例如配体结合）ActRIIA多肽的通式是包含在SEQ ID NO: 9的氨基酸30处开始并在氨基酸110处结束的多肽的那种。相应地，本发明的ActRIIA多肽和基于ActRIIA的GDF捕获物可以包含多肽、由多肽组成或基本上由多肽组成，所述多肽与SEQ ID NO: 9的氨基酸30-110至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%等同。任选地，本发明的ActRIIA多肽和基于ActRIIA的GDF捕获物可以包含多肽、由多肽组成或基本上由多肽组成，所述多肽与SEQ ID NO:9的氨基酸12-82至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%等同，任选分别在范围为SEQ ID NO:9的1-5（例如1、2、3、4或5）或3-5（例如3、4或5）的位置处开始，并且在范围为SEQ ID NO:9的110-116（例如110、111、112、113、114、115或116）或110-115（例如110、111、112、113、114或115）的位置处结束，并且包含在配体结合口袋中的不超过1、2、5、10或15个保守氨基酸改变，以及在就SEQ ID NO:9而言的配体结合口袋中的位置40、53、55、74、79和/或82处的零个、一个或多个非保守改变。前述ActRIIA多肽或基于ActRIIA的GDF捕获物多肽中的任何均可作为同二聚体产生。前述ActRIIA多肽或基于ActRIIA的GDF捕获物多肽中的任何可以进一步包含异源部分，其包含来自IgG重链的恒定区，例如Fc结构域。上述ActRIIA多肽、基于ActRIIA的GDF捕获物多肽中的任何，包括其同二聚体和/或其融合蛋白，可以在基于细胞的测定中结合和/或抑制通过激活素（例如激活素A、激活素B、激活素C或激活素AB）的信号传导。上述ActRIIA多肽、基于ActRIIA的GDF捕获物多肽中的任何，包括其同二聚体和/或其融合蛋白，可以在基于细胞的测定中结合和/或抑制通过GDF11和/或GDF8的信号传导。任选地，上述ActRIIA多肽、基于ActRIIA的GDF捕获物多肽中的任何，包括其同二聚体和/或其融合蛋白，可以在基于细胞的测定中结合和/或抑制激活素B、激活素C、激活素E、GDF7和Nodal中的一种或多种的信号传导。
在某些实施方案中，用于根据本文公开的方法使用的ActRIIA多肽和基于ActRIIA的GDF捕获物多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含下述、由下述组成或基本上由下述组成：SEQ ID NO: 9、10、22、26或28的氨基酸序列，以及与前述中的任何至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%等同的多肽。ActRIIA多肽和基于ActRIIA的GDF捕获物多肽可以包括天然ActRIIA多肽的功能片段，例如包含选自SEQ ID NO: 9、10、22、26或28的序列的至少10、20或30个氨基酸的多肽，或缺乏C末端1、2、3、4、5或10至15个氨基酸且缺乏在N末端处的1、2、3、4或5个氨基酸的SEQ ID NO:10的序列。在一些实施方案中，多肽将包含相对于SEQID NO:10在N末端处2至5个氨基酸以及在C末端处不超过3个氨基酸的截短。在一些实施方案中，用于在本文描述的方法中使用的ActRIIA多肽由SEQ ID NO: 26或28的氨基酸序列组成或基本上由SEQ ID NO: 26或28的氨基酸序列组成。
本发明的ActRII多肽（例如ActRIIA或ActRIIB多肽）或GDF捕获物多肽可以包括相对于天然存在的ActRII多肽，在ActRII多肽（例如在配体结合结构域中）的氨基酸序列中的一个或多个改变（例如氨基酸添加、缺失、取代或其组合）。当在哺乳动物、昆虫或其他真核细胞中产生时，氨基酸序列中的改变可以例如改变多肽的糖基化，或改变多肽相对于天然存在的ActRII多肽的蛋白酶解切割。
任选地，本发明的ActRII多肽（例如ActRIIA或ActRIIB多肽）和GDF捕获物多肽包含选自下述的一个或多个经修饰的氨基酸残基：糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化的氨基酸、与脂质部分缀合的氨基酸和与有机衍生剂缀合的氨基酸。
在一些实施方案中，本发明的ActRII多肽（例如ActRIIA或ActRIIB多肽）或GDF捕获物多肽可以是融合蛋白，其具有ActRII多肽或GDF捕获物多肽作为一个结构域（例如任选地具有一个或多个序列变异的ActRII受体的配体结合结构域）以及一个或多个另外的异源结构域，所述另外的异源结构域提供所需的性质，例如改善的药物代谢动力学、更容易的纯化、对特定组织的靶向等。例如，融合蛋白的结构域可以增强体内稳定性、体内半衰期、摄取/施用、组织定位或分布、蛋白质复合物的形成、融合蛋白的多聚化和/或纯化中的一种或多种。ActRII多肽和GDF捕获物融合蛋白可以包括异源多肽结构域，例如但不限于免疫球蛋白Fc结构域（野生型或突变体）或血清白蛋白。在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域是IgG1 Fc结构域。在一些实施方案中，IgG1 Fc结构域是人IgG1 Fc结构域。在一些实施方案中，IgG1 Fc结构域是小鼠IgG1 Fc结构域。在某些实施方案中，ActRII多肽和GDF捕获物多肽融合蛋白包含位于ActRII或GDF捕获物多肽结构域和异源结构域之间的相对非结构化接头。在某些实施方案中，ActRII多肽和GDF捕获物融合蛋白包含位于Fc结构域和ActRII或GDF捕获物结构域之间的相对非结构化接头。此类非结构化接头可以对应于在ActRII或GDF捕获物的细胞外结构域的C末端（“尾部”）处的大致15个氨基酸的非结构化区域，或者它可以是相对不含二级结构的3至5、15、20、30、50或更多个氨基酸的人工序列。接头可以富含甘氨酸和脯氨酸残基，并且可以例如含有苏氨酸/丝氨酸和甘氨酸的重复序列[例如，TG4（SEQID NO:52）、SG4（SEQ ID NO:54）或TG3（SEQ ID NO:53）单峰（singlet）或重复]或一系列三个甘氨酸。融合蛋白可以包括纯化子序列，例如表位标签、FLAG标签、多组氨酸序列和GST融合物。在某些实施方案中，ActRII融合蛋白或GDF捕获物融合物包含前导序列。前导序列可以是天然ActRII前导序列（例如天然ActRIIA或ActRIIB前导序列）或异源前导序列。在某些实施方案中，前导序列是组织型纤溶酶原激活物（TPA）前导序列。在一些实施方案中，ActRII融合蛋白或GDF捕获物融合蛋白包含如式A-B-C中所示的氨基酸序列。B部分是如本文所述的N末端和C末端截短的ActRII或GDF捕获物多肽。A和C部分可以独立地是零个、一个或超过一个氨基酸，并且A和C部分两者均与B异源。A和/或C部分可以经由接头序列附着至B部分。
任选地，待根据本文公开的方法使用的ActRII多肽（例如ActRIIA和ActRIIB多肽）、GDF捕获物多肽，包括其变体和融合蛋白，结合一种或多种ActRIIB配体（例如激活素A、激活素B、激活素 AB、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、BMP6、BMP7和/或Nodal），其Kd小于10微摩尔、小于1微摩尔、小于100纳摩尔、小于10纳摩尔或小于1纳摩尔。任选地，此类ActRII多肽GDF捕获物多肽抑制ActRII信号传导，例如通过ActRII配体（例如SMAD 2/3和/或SMAD1/5/8信号传导）触发的ActRIIA和/或ActRIIB细胞内信号转导事件。
在某些方面，本发明提供了包含本发明的ActRII拮抗剂（例如ActRIIA多肽和ActRIIB多肽、GDF捕获物多肽）和药学可接受的载体的药物制剂或组合物。药物制剂或组合物还可以包括一种或多种另外的化合物，例如用于治疗本文所述的病症或状况的化合物（例如增加有此需要的受试者中的红血细胞水平和/或血红蛋白水平，治疗或预防有此需要的受试者中的贫血，治疗或预防有此需要的受试者中的溃疡特别是皮肤溃疡的另外化合物）。优选地，本发明的药物制剂或组合物基本上不含热原。
一般而言，优选在哺乳动物细胞系中表达ActRIIA多肽和ActRIIB多肽或GDF捕获物多肽，所述哺乳动物细胞系适当地介导多肽的天然糖基化，以便减小患者中的不利免疫应答的可能性。人和CHO细胞系已成功使用，并且预期其他常见的哺乳动物表达载体将是有用的。在一些实施方案中，优选的ActRIIA多肽、ActRIIB多肽和GDF捕获物多肽是糖基化的，并且具有可从哺乳动物细胞优选CHO细胞获得的糖基化模式。
在某些实施方案中，本发明提供了包含本文所述的药物制剂或组合物并且标记用于下述中的一种或多种的包装药物：增加哺乳动物（优选人）中的红血细胞水平和/或血红蛋白，治疗或预防哺乳动物（优选人）中的贫血，治疗或预防哺乳动物（优选人）中的镰状细胞病，和/或治疗或预防哺乳动物（优选人）中的一种或多种镰状细胞病并发症（例如贫血、血管阻塞危象、溃疡（例如皮肤溃疡）等）。在某些实施方案中，本发明提供了包含本文所述的药物制剂或组合物并且标记用于下述中的包装药物：治疗哺乳动物（优选人）中的贫血，治疗哺乳动物（优选人）中的镰状细胞病，和/或治疗哺乳动物（优选人）中的一种或多种镰状细胞病并发症（例如贫血、血管阻塞危象、溃疡（例如皮肤溃疡）等）。在某些实施方案中，本发明提供了包含本文所述的药物制剂或组合物并且标记用于下述中的包装药物：预防哺乳动物（优选人）中的贫血，预防哺乳动物（优选人）中的镰状细胞病，和/或预防哺乳动物（优选人）中的一种或多种镰状细胞病并发症（例如贫血、血管阻塞危象、溃疡（例如皮肤溃疡）等）。
在某些方面，本发明提供了编码ActRII多肽（例如ActRIIA或ActRIIB多肽）或GDF捕获物多肽的核酸。分离的多核苷酸可以包含关于可溶性ActRII多肽或GDF捕获物多肽的编码序列，例如如本文所述的。例如，分离的核酸可以包括编码包含具有一个或多个序列变异的ActRII多肽的细胞外结构域（例如配体结合结构域）的ActRII多肽或GDF捕获物的序列，以及编码ActRII多肽的跨膜结构域和/或细胞质结构域的部分或所有的序列，但结束密码子位于跨膜结构域或细胞质结构域内，或位于细胞外结构域和跨膜结构域或细胞质结构域之间。例如，编码GDF捕获物的分离的多核苷酸可以包含全长ActRII多核苷酸序列例如SEQ ID NO: 1、4或9，或者具有一个或多个变体或部分截短形式，所述分离的多核苷酸进一步包含在3'末端之前至少六百个核苷酸的转录结束密码子或以其他方式放置，使得多核苷酸的翻译产生任选与全长ActRII的截短部分融合的细胞外结构域。本文公开的核酸可以可操作地连接至启动子用于表达，并且本发明提供了用此类重组多核苷酸转化的细胞。优选地，细胞是哺乳动物细胞，例如CHO细胞。
在某些方面，本发明提供了用于制备ActRII多肽或GDF捕获物的方法。此类方法可以包括在合适的细胞，例如中国仓鼠卵巢（CHO ）细胞中表达本文公开的核酸中的任何（例如SEQ ID NO: 8、13、27、32、39、42、46或48）。此类方法可以包括：a）在适合于表达GDF捕获物多肽的条件下培养细胞，其中所述细胞用GDF捕获物表达构建体转化；和b）回收如此表达的GDF捕获物多肽。GDF捕获物多肽可以使用用于从细胞培养物获得蛋白质的众所周知技术中的任何作为粗制、部分纯化或高度纯化的级分回收。
在某些方面，本发明涉及拮抗ActRII活性（例如抑制ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3和/或SMAD 1/5/8信号传导）的抗体或抗体组合。特别地，本发明提供了使用抗体ActRII拮抗剂或抗体ActRII拮抗剂组合来例如增加有此需要的受试者中的红血细胞水平，治疗或预防有此需要的受试者中的贫血，和/或治疗或预防患有贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用抗体ActRII拮抗剂或抗体ActRII拮抗剂组合来治疗患有贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用抗体ActRII拮抗剂或抗体ActRII拮抗剂组合来预防患有贫血的受试者中的溃疡，特别是皮肤溃疡的方法。
在某些实施方案中，本发明的抗体ActRII拮抗剂是结合和/或抑制至少GDF11的活性（例如GDF11介导的ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导的激活）的抗体或抗体组合。任选地，抗体或抗体组合进一步结合和/或抑制GDF8的活性（例如GDF8介导的ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导的激活），特别是在对于GDF11和GDF8两者具有结合亲和力的多特异性抗体的情况下，或者在一种或多种抗GDF11抗体和一种或多种抗GDF8抗体的组合的上下文中。任选地，本发明的抗体或抗体组合基本上不结合和/或抑制激活素A的活性（例如激活素A介导的ActRIIA或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导的激活）。在一些实施方案中，结合和/或抑制GDF11和/或GDF8活性的本发明的抗体或抗体组合进一步结合和/或抑制激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7和Nodal中的一种或多种的活性（例如ActRIIA或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3和/或SMAD 1/5/8信号传导的激活），特别是在对于多重ActRII配体具有结合亲和力的多特异性抗体的情况下，或在各自具有对于不同ActRII配体的结合亲和力的组合多重抗体的上下文中。
部分地，本发明证明ActRII拮抗剂可以与EPO受体激活剂组合使用（例如在相同时间或不同时间施用，但一般以实现重叠药理效应的方式），以增加红血细胞水平（红细胞生成）或治疗有此需要的患者中的贫血。部分地，本发明证明GDF捕获物可以与EPO受体激活剂组合施用，以协同增加患者特别是镰状细胞患者中的红血细胞形成。因此，当以其各自的剂量分别施用时，该组合治疗的效应可以显著大于ActRII拮抗剂和EPO受体激活剂的效应总和。在某些实施方案中，此类协同作用可能是有利的，因为它使得能够用更低剂量的EPO受体激活剂获靶水平的红血细胞，从而避免潜在的不良反应或与更高水平的EPO受体激活相关的其他问题。相应地，在某些实施方案中，本发明的方法（例如增加有此需要的受试者中的红血细胞水平和/或血红蛋白，治疗或预防有此需要的受试者中的贫血，和/或治疗或预防患有贫血的受试者中的溃疡的方法）包括给有此需要的患者施用与一种或多种EPO受体激活剂组合的一种或多种ActRII拮抗剂（例如ActRIIA多肽，ActRIIB多肽和/或GDF捕获物多肽）。
EPO受体激活剂可以通过直接接触且激活EPO受体来刺激红细胞生成。在某些实施方案中，EPO受体激活剂是基于天然EPO的165氨基酸序列并且一般称为促红细胞生成刺激剂（ESA）的一类化合物之一，其例子是依泊汀α（epoetin alfa）、依泊汀β（NeoRecormon®）、依泊汀δ（Dynepo™）和依泊汀ω。在其他实施方案中，ESA包括具有赋予期望的药物代谢动力学性质（延长的循环半衰期）的非肽修饰的合成EPO蛋白质（SEP）和EPO衍生物，其例子是达贝泊汀α（darbepoetin alfa）（Aranesp®）和甲氧基-聚乙二醇依泊汀β（Mircera®）。在某些实施方案中，EPO受体激活剂可以是不掺入EPO多肽主链或一般不分类为ESA的EPO受体激动剂。此类EPO受体激动剂可以包括但不限于EPO的肽和非肽模拟物、靶向EPO受体的激动性抗体、包含EPO模拟结构域的融合蛋白、以及促红细胞生成素受体延长持续时间受限激动剂（EREDLA）。
在某些实施方案中，EPO受体激活剂可以通过增强内源性EPO的产生而间接刺激红细胞生成，而不接触EPO受体本身。例如，缺氧诱导型转录因子（HIF）是EPO基因表达的内源性刺激物，其在含氧量正常条件下通过细胞调节机制被压制（去稳定化）。部分地，本发明通过用GDF捕获物和具有HIF稳定性质的间接EPO受体激活剂（例如脯氨酰羟化酶抑制剂）的组合治疗，在患者中提供增加的红细胞生成。
ActRII拮抗剂，特别是ActRII多肽和GDF捕获物多肽，也可以用于治疗或预防其他病症和状况，例如促进肌肉生长和/或治疗或预防肌肉相关病症，促进骨生长和/或治疗或预防骨相关病症，治疗或预防癌症（特别是多发性骨髓瘤和/或乳腺癌）。参见例如美国专利号：7,612,041；8,173,601；7,842,663以及美国专利申请公开号U.S. 2009/0074768。在某些情况下，当施用用于这些其他治疗适应症的GDF捕获物多肽时，可能期望在施用ActRII拮抗剂期间监测对红血细胞的作用，或者测定或调节ActRII拮抗剂的给药，以便减少对红血细胞的不期望的效应。例如，红血细胞水平、血红蛋白水平或血细胞比容水平的增加可以导致血压的升高。
附图简述
该专利或专利申请文件含有至少一个彩色图。具有彩色附图的该专利或专利申请公开的副本将由专利局根据请求并支付必要的费用而提供。
图1显示了基于多个ActRIIB和ActRIIA晶体结构的复合分析，具有本文推导残基的人ActRIIA（SEQ ID NO: 56）和人ActRIIB的细胞外结构域的比对，以直接接触用框指示的配体（SEQ ID NO: 57-64）。
图2显示了不同脊椎动物ActRIIB蛋白和人ActRIIA的多重序列比对。
图3A和3B显示了在CHO细胞中表达的ActRIIA-hFc的纯化。如通过筛分柱（上图）和考马斯染色的SDS-PAGE（下图）（左泳道：分子量标准品；右泳道：ActRIIA-hFc）显现的，蛋白质纯化为单个明确限定的峰。
图4A和4B显示了通过BiacoreTM测定测量的ActRIIA-hFc与激活素和GDF-11的结合。
图5A和5B显示了ActRIIA-hFc对雌性非人灵长类动物（NHP）中的红血细胞计数的作用。在第0天、第7天、第14天和第21天时，用安慰剂或1mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg的ActRIIA-hFc处理雌性食蟹猴（各五只猴的四组）。图5A显示了红血细胞（RBC）计数。图5B显示了血红蛋白水平。统计学显著性相对于每个治疗组的基线。在第57天时，在每组中保留两只猴。
图6A和6B显示了ActRIIA-hFc对雄性非人灵长类动物中的红血细胞计数的作用。在第0天、第7天、第14天和第21天时，用安慰剂或1mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg的ActRIIA-hFc处理雄性食蟹猴（各五只猴的四组）。图6A显示了红血细胞（RBC）计数。图6B显示了血红蛋白水平。统计学显著性相对于每个治疗组的基线。在第57天时，在每组中保留两只猴。
图7A和7B显示了ActRIIA-hFc对雌性非人灵长类动物中的网织红细胞计数的作用。在第0天、第7天、第14天和第21天时，用安慰剂或1 mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg的ActRIIA-hFc处理食蟹猴（各五只猴的四组）。图7A显示了绝对网织红细胞计数。图7B显示了相对于RBC的网织红细胞百分比。统计学显著性相对于每组的基线。在第57天时，在每组中保留两只猴。
图8A和8B显示了ActRIIA-hFc对雄性非人灵长类动物中的网织红细胞计数的作用。在第0天、第7天、第14天和第21天时，用安慰剂或1 mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg的ActRIIA-hFc处理食蟹猴（各五只猴的四组）。图8A显示了绝对网织红细胞计数。图8B显示了相对于RBC的网织红细胞百分比。统计学显著性相对于每组的基线。在第57天时，在每组中保留两只猴。
图9显示了来自实施例5中描述的人临床试验的结果，其中ActRIIA-hFc的曲线下面积（AUC）和施用剂量具有线性相关性，与ActRIIA-hFc是静脉内（IV）施用还是皮下施用（SC）无关。
图10显示了IV或SC施用的患者中的ActRIIA-hFc血清水平的比较。
图11显示了响应不同剂量水平的ActRIIA-hFc的骨碱性磷酸酶（BAP）水平。BAP是合成代谢骨生长的标记物。
图12描绘了来自实施例5中描述的人临床试验的血细胞比容水平相对于基线的中值变化。ActRIIA-hFc在指示剂量下进行静脉内（IV）施用。
图13描绘了来自实施例5中描述的人临床试验的血红蛋白水平相对于基线的中值变化。ActRIIA-hFc在指示剂量下进行静脉内（IV）施用。
图14描绘了来自实施例5中描述的人临床试验的RBC（红血细胞）计数相对于基线的中值变化。ActRIIA-hFc在指示剂量下进行静脉内（IV）施用。
图15描绘了来自实施例5中描述的人临床试验的网织红细胞计数相对于基线的中值变化。ActRIIA-hFc在指示剂量下进行静脉内（IV）施用。
图16显示了关于GDF捕获物ActRIIB（L79D 20-134）-hFc的完全氨基酸序列（SEQID NO: 38），包括TPA前导序列（加双下划线的）、ActRIIB细胞外结构域（SEQ ID NO: 1中的残基20-134；加下划线的）和hFc结构域。在天然序列中的位置79处取代的天冬氨酸是加双下划线并突出显示的，如通过测序揭示的甘氨酸是成熟融合蛋白中的N末端残基。
图17A和17B显示了编码ActRIIB（L79D 20-134）-hFc的核苷酸序列。SEQ ID NO:39对应于有义链，并且SEQ ID NO:40对应于反义链。TPA前导区（核苷酸1-66）是加双下划线的，并且ActRIIB细胞外结构域（核苷酸76-420）是加下划线的。
图18显示了关于截短的GDF捕获物ActRIIB（L79D 25-131）-hFc的完全氨基酸序列（SEQ ID NO:41），包括TPA前导区（加双下划线的）、截短的ActRIIB细胞外结构域（SEQ IDNO: 1中的残基25-131；加下划线的）和hFc结构域。在天然序列中的位置79处取代的天冬氨酸是加双下划线并突出显示的，如通过测序揭示的谷氨酸盐是成熟融合蛋白中的N末端残基。
图19A和19B显示了编码ActRIIB（L79D 25-131）-hFc的核苷酸序列。SEQ ID NO:42对应于有义链，并且SEQ ID NO:43对应于反义链。TPA前导区（核苷酸1-66）是加双下划线的，并且截短的ActRIIB细胞外结构域（核苷酸76-396）是加下划线的。还显示了关于ActRIIB细胞外结构域的氨基酸序列（SEQ ID NO: 1中的残基25-131）。
图20显示了关于不含前导区的截短的GDF捕获物ActRIIB（L79D 25-131）-hFc的氨基酸序列（SEQ ID NO:44）。截短的ActRIIB细胞外结构域（SEQ ID NO: 1中的残基25-131）是加下划线的。在天然序列中的位置79处取代的天冬氨酸是加双下划线并突出显示的，如通过测序揭示的谷氨酸是成熟融合蛋白中的N末端残基。
图21显示了关于不含前导区、hFc结构域和接头的截短的GDF捕获物ActRIIB（L79D25-131）-hFc的氨基酸序列（SEQ ID NO:45）。在天然序列中的位置79处取代的天冬氨酸是加下划线并突出显示的，如通过测序揭示的谷氨酸是成熟融合蛋白中的N末端残基。
图22A和22B显示了编码ActRIIB（L79D 25-131）-hFc的替代核苷酸序列。SEQ IDNO: 46对应于有义链，并且SEQ ID NO: 47对应于反义链。TPA前导区（核苷酸1-66）是加双下划线的，截短的ActRIIB细胞外结构域（核苷酸76-396）是加下划线的，并且细胞外结构域的野生型核苷酸序列中的取代是加双下划线和突出显示的（与SEQ ID NO:42相比较，图19）。还显示了关于ActRIIB细胞外结构域的氨基酸序列（SEQ ID NO:1中的残基25-131）。
图23显示了图22中所示的替代核苷酸序列（SEQ ID NO:46）的核苷酸76-396（SEQID NO:48）。图22中指示的相同核苷酸取代也是加下划线并突出显示的。SEQ ID NO:48仅编码具有L79D取代的截短的ActRIIB细胞外结构域（对应于SEQ ID NO:1中的残基25-131），例如ActRIIB（L79D 25-131）。
图24显示了用ActRIIB（L79D 20-134）-hFc（灰色）或ActRIIB（L79D 25-131）-hFc（黑色）处理对食蟹猴相对于基线的红血细胞浓度中的绝对变化的作用。VEH = 媒介物。数据为平均值±SEM。n = 4-8只/组。
图25显示了用ActRIIB（L79D 20-134）-hFc（灰色）或ActRIIB（L79D 25-131）-hFc（黑色）处理对食蟹猴相对于基线的血细胞比容中的绝对变化的作用。VEH = 媒介物。数据为平均值±SEM。n = 4-8只/组。
图26显示了用ActRIIB（L79D 20-134）-hFc（灰色）或ActRIIB（L79D 25-131）-hFc（黑色）处理对食蟹猴相对于基线的血红蛋白浓度中的绝对变化的作用。VEH = 媒介物。数据为平均值±SEM。n = 4-8只/组。
图27显示了用ActRIIB（L79D 20-134）-hFc（灰色）或ActRIIB（L79D 25-131）-hFc（黑色）处理对食蟹猴相对于基线的循环网织红细胞浓度中的绝对变化的作用。VEH = 媒介物。数据为平均值±SEM。n = 4-8只/组。
图28显示了用促红细胞生成素（EPO）和ActRIIB（L79D 25-131）-hFc组合处理72小时对小鼠中的血细胞比容的作用。数据为平均值±SEM（n = 4只/组），并且彼此显著不同的平均值（p <0.05，未配对t检验）由不同字母指定。组合处理与媒介物相比较使血细胞比容增加23%，大于EPO和ActRIIB（L79D 25-131）-hFc的分别效应总和的协同增加。
图29显示了用EPO和ActRIIB（L79D 25-131）-hFc组合处理72小时对小鼠中的血红蛋白浓度的作用。数据为平均值±SEM（n = 4只/组），并且彼此显著不同的平均值（p <0.05）由不同字母指定。组合处理与媒介物相比较使血红蛋白浓度增加23%，这也是协同效应。
图30显示了用EPO和ActRIIB（L79D 25-131）-hFc组合处理72小时对小鼠中的红血细胞浓度的作用。数据为平均值±SEM（n = 4只/组），并且彼此显著不同的平均值（p <0.05）由不同字母指定。组合处理与媒介物相比较使红血细胞浓度增加20%，这也是协同效应。
图31显示了用EPO和ActRIIB（L79D 25-131）-hFc组合处理72小时对小鼠脾中的红细胞生成前体细胞数目的作用。数据为平均值±SEM（n = 4只/组），并且彼此显著不同的平均值（p <0.01）由不同的字母指定。虽然EPO单独以晚期前体成熟为代价使嗜碱性成红细胞（BasoE）的数目急剧增加，组合处理使BasoE数目增加至较小但仍然显著的程度，同时支持未减少的晚期前体成熟。
图32A-C比较了β地中海贫血的Hbb -/-小鼠模型中的RBC参数与野生型（WT）小鼠中的RBC参数。分析来自未经处理的2-6月龄小鼠的血样以测定红血细胞数目（RBC；A）、血细胞比容（HCT；B）和血红蛋白浓度（Hgb；C）。数据为平均值±SEM（n = 4只/组），***，p <0.001。Hbb -/-小鼠被证实严重贫血。
图33显示了ActRIIB（L79D 25-131）-mFc对β地中海贫血的Hbb -/-小鼠模型中RBC数目的作用。在治疗4周后收集血样。数据是2只/组的平均值，其中条指示范围。用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理使Hbb -/-小鼠中存在的RBC缺陷降低一半。
图34显示了ActRIIB（L79D 25-131）-mFc对β地中海贫血的Hbb -/-小鼠模型中的RBC形态的作用。在100x放大率下获得来自处理4周的小鼠的吉姆萨染色的血涂片的图像。注意来自媒介物处理的Hbb -/-小鼠的血液中的溶血、细胞碎片和许多小的或不规则形状的RBC。相比之下，ActRIIB（L79D 25-131）-mFc治疗极大降低了溶血、碎片和不规则形状的RBC的发生，同时增加了正常形状的RBC的数目。
图35显示了ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理2个月对β地中海贫血的Hbb -/-小鼠模型中的RBC数目的作用，其中包括来自媒介物给药的野生型小鼠的数据用于比较。数据为平均值±SEM；n = 7只/组。**，P <0.01相对于媒介物处理的Hbb -/-小鼠。用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理使Hbb -/-小鼠中的平均RBC缺陷降低超过50%。
图36显示了ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理2个月对β地中海贫血的Hbb -/-小鼠模型中的血清胆红素水平的作用，其中包括来自媒介物给药的野生型小鼠的数据用于比较。数据为平均值±SEM；n = 7只/组。# # #，P <0.001相对于媒介物处理的野生型小鼠；*，P <0.05相对于媒介物处理的Hbb -/-小鼠。用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理显著降低Hbb -/-小鼠中的总胆红素水平。
图37显示了ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理2个月对β地中海贫血的Hbb -/-小鼠模型中的血清EPO水平的作用，其中包括来自媒介物给药的野生型小鼠的数据用于比较。数据为平均值±SEM；n = 7只/组。# # #，P <0.001相对于媒介物处理的野生型小鼠；*，P <0.05相对于媒介物处理的Hbb -/-小鼠。用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理使Hbb -/-小鼠中的平均循环EPO水平降低超过60%。
图38A和38B显示了ActRIIB（L79D 25-131）-mFc对β地中海贫血的Hbb -/-小鼠模型中的脾肿大的作用，其中包括来自媒介物给药的野生型小鼠的数据用于比较。A. 用1 mg/kg每周两次处理2个月后，来自在3月龄时开始的小鼠的平均值±SEM。＃＃＃，P <0.001，相对于媒介物处理的野生型小鼠；*，P < 0.05相对于媒介物处理的Hbb -/-小鼠。B. 代表性脾大小，如在用1 mg/kg每周两次处理3个月后在6-8月龄时开始的小鼠中的分别研究中观察到的。用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理显著降低Hbb -/-小鼠中的脾重量。
图39显示了ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理2个月对β地中海贫血的Hbb -/-小鼠模型中的骨矿物质密度的作用，其中包括来自媒介物给药的野生型小鼠的数据用于比较。平均值±SEM基于股骨分析。＃，P < 0.05相对于媒介物处理的野生型小鼠；*，P < 0.05相对于媒介物处理的Hbb -/-小鼠。用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理使Hbb -/-小鼠中的骨矿物质密度标准化。
图40A-C显示了ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理2个月对β地中海贫血的Hbb -/-小鼠模型中的铁稳态参数的作用。关于血清铁（A）、血清铁蛋白（B）和转铁蛋白饱和（C）的平均值±SEM。*，P < 0.05；**，P < 0.01相对于媒介物处理的Hbb -/-小鼠。用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理显著降低Hbb -/-小鼠中的铁过载的每个量度。
图41显示了ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理2个月对β地中海贫血的Hbb -/-小鼠模型中的组织铁过载的作用。通过用Perl的普鲁士蓝染色测定来自脾（A-C）、肝（D-F）和肾（G-I）的组织切片（200 μm）中的铁水平。野生型脾（A）中的铁染色在红髓（箭头）中丰富，但在白髓（*）中不存在。Hbb -/-小鼠脾中增加的铁染色（B）反映了由于髓外红细胞生成的红髓区的扩张。Hbb -/-小鼠中的ActRIIB（L79D 25-131）-mFc减少脾红细胞生成并恢复脾铁染色的野生型模式（C）。另外，Hbb -/-小鼠的肝枯否细胞（H，箭头）和肾皮质（E，箭头）中的异常铁染色通过ActRIIB（L79D 25-131）-mFc（F和I）标准化。放大率，200x。
图42显示ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理2个月对β地中海贫血的Hbb -/-小鼠模型中的铁调素mRNA肝脏水平的作用。平均值±SEM；*，P <0.05相对于媒介物处理的Hbb -/-小鼠。用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理显著增加Hbb -/-小鼠中的铁调素mRNA的表达。
图43显示了ActRIIB（L79D 25-131）-mFc对β地中海贫血的Hbb -/-小鼠模型中的活性氧（ROS）的循环水平的作用，其中包括来自媒介物给药的野生型小鼠的数据用于比较。数据为几何平均值±SEM；n = 7只/组。# # #，P <0.001相对于媒介物处理的野生型小鼠；***，P < 0.001相对于媒介物处理的Hbb -/-小鼠。用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理显著降低Hbb -/-小鼠中的ROS。
图44显示了ActRIIB（L79D 25-131）-mFc对镰状细胞病（SCD）小鼠中的红血细胞浓度的绝对变化的作用。数据为平均值±SEM（n = 5只/组）。Wt = 野生型小鼠，其为无症状复合杂合子（β/βS）小鼠。ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理导致与对照小鼠（仅施用媒介物的镰状细胞小鼠）相比较，镰状细胞小鼠中的红血细胞水平的显著增加（P≤0.001）。
图45显示了ActRIIB（L79D 25-131）-mFc对镰状细胞小鼠中的红血细胞水平、血细胞比容水平和血红蛋白水平的作用。数据是相对于镰状细胞对照小鼠经过4周相对于基线的平均变化（±SEM）。ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理导致与对照小鼠相比较，镰状细胞小鼠中的红血细胞水平、血细胞比容水平和血红蛋白水平的显著增加。
图46显示了ActRIIB（L79D 25-131）-mFc对不同血液参数（即镰状细胞小鼠中的平均细胞容积、红血细胞（RDC）分布宽度、网织红细胞和活性氧）的作用。数据是相对于镰状细胞对照小鼠经过4周相对于基线的平均变化（±SEM）。ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理导致与对照小鼠相比较，镰状细胞小鼠中的平均细胞容积、红血细胞（RDC）分布宽度、网织红细胞和活性氧的显著增加。
发明详述
1. 概述
转化生长因子-β（TGF-β）超家族含有共享共同序列元件和结构基序的各种生长因子。已知这些蛋白质对脊椎动物和无脊椎动物两者中的多种细胞类型施加生物效应。超家族的成员在模式形成和组织特化中在胚胎发育期间执行重要功能，并且可以影响各种分化过程，包括脂肪生成、肌生成、软骨形成、心脏发生、造血、神经发生和上皮细胞分化。通过操纵TGF-β家族成员的活性，通常可能在生物中引起显著的生理变化。例如，皮埃蒙特牛和比利时蓝牛品种携带在GDF8（也称为肌肉生长抑制素）基因中的功能缺失突变，其导致肌肉质量中的显著增加。参见例如Grobet等人（1997）Nat Genet. 17（1）:71-4。此外，在人中，GDF8的无活性等位基因与增加的肌肉质量相关，并且据报道，具有异常的强度。参见例如Schuelke等人（2004）N Engl J Med，350:2682-8。
TGF-β信号由I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体的异聚复合物介导，其在配体刺激后磷酸化并激活下游SMAD蛋白（例如SMAD蛋白1、2、3、5和8）。参见例如Massagué（2000）Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169-178。这些I型和II型受体是跨膜蛋白，由具有富含半胱氨酸区域的配体结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸特异性的细胞质结构域组成。I型受体是信号传导所必需的。II型受体是结合配体和I型受体表达所需的。I型和II型激活素受体在配体结合后形成稳定的复合物，导致I型受体被II型受体磷酸化。
两种相关的II型受体（ActRII），ActRIIA和ActRIIB已被鉴定为关于激活素的II型受体。参见例如Mathews和Vale（1991）Cell 65:973-982；和Attisano等人（1992）Cell 68：97-108。除激活素之外，ActRIIA和ActRIIB可以与几种其他TGF-β家族蛋白质包括例如BMP6、BMP7、Nodal、GDF8和GDF11生物化学相互作用。参见例如Yamashita等人（1995）J.Cell Biol. 130:217-226；Lee和McPherron（2001）Proc. Natl. Acad. Sci. 98:9306-9311；Yeo和Whitman（2001）Mol. Cell 7：949-957；和Oh等人（2002）Genes Dev. 16:2749-54。ALK4是关于激活素，特别是激活素A的主要I型受体，并且ALK-7也可以充当关于其他激活素，特别是激活素B的受体。在某些实施方案中，本发明涉及用本文公开的一种或多种抑制剂药物，特别是可以拮抗GDF11和/或GDF8的抑制剂药物来拮抗ActRII受体的配体（也称为ActRII配体）。
激活素是属于TGF-β超家族的二聚多肽生长因子。存在三个主要激活素形式（A、B和AB），其是两个紧密相关的β亚基的同二聚体/异二聚体（分别为βAβA、βBβB和βAβB）。人类基因组还编码激活素C和激活素E，其主要在肝中表达，并且含有βC或βE的异二聚体形式也是已知的。
在TGF-β超家族中，激活素是独特的多功能因子，其可以刺激卵巢和胎盘细胞中的激素产生，支持神经元细胞存活，取决于细胞类型正面或负面影响细胞周期进展，并且至少在两栖动物胚胎中诱导中胚层分化。DePaolo等人（1991）Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512；Dyson等人（1997）Curr Biol. 7:81-84；和Woodruff（1998）Biochem Pharmacol.55:953-963。此外，从刺激的人单核细胞白血病细胞分离的红细胞样分化因子（EDF）被发现与激活素A等同。Murata等人（1988）PNAS，85：2434。已提出激活素A促进骨髓中的红细胞生成。在几种组织中，激活素信号传导被其相关的异二聚体抑制素拮抗。例如，在从垂体释放卵泡刺激激素（FSH）期间，激活素促进FSH分泌和合成，而抑制素阻止FSH分泌和合成。可以调节激活素生物活性和/或结合激活素的其他蛋白质包括卵泡抑素（FS）、卵泡抑素相关蛋白（FSRP，也称为FLRG或FSRL3）和α2-巨球蛋白。
如本文描述的，结合“激活素A”的药物是无论是在分离的βA亚基的背景下还是作为二聚体复合物（例如βAβA同二聚体或βAβB异二聚体）均特异性结合βA亚基的药物。在异二聚体复合物（例如βAβB异二聚体）的情况下，结合“激活素A”的药物对存在于βA亚基内的表位是特异性的，但不结合存在于复合物的非βA亚基中的表位（例如复合物的βB亚基）。类似地，本文公开的拮抗（抑制）“激活素A”的药物是抑制由βA亚基介导的一种或多种活性的药物，无论是在分离的βA亚基的背景下还是作为二聚体复合物（例如βAβA同二聚体或βAβB异二聚体）。在βAβB异二聚体的情况下，抑制“激活素A”的药物是特异性抑制βA亚基的一种或多种活性但不抑制复合物的非βA亚基的活性的药物（例如复合物的βB亚基）。该原理也适用于结合和/或抑制“激活素B”、“激活素C”和“激活素E”的药物。本文公开的拮抗“激活素AB”的药物是抑制如由βA亚基介导的一种或多种活性和由βB亚基介导的一种或多种活性的药物。
Nodal蛋白在中胚层和内胚层诱导和形成中以及在早期胚胎发生中的轴向结构例如心脏和胃组织的后续组构具有功能。已证明发育中的脊椎动物胚胎中的背部组织占优势地促成脊索和脊索前板的轴向结构，同时它募集周围细胞以形成非轴向胚胎结构。Nodal看起来通过I型和II型受体两者以及称为SMAD蛋白的细胞内效应物发信号。研究支持ActRIIA和ActRIIB充当Nodal的II型受体的观点。参见例如Sakuma等人（2002）Genes Cells. 2002，7:401-12。提出Nodal配体与其辅因子（例如cripto）相互作用，以激活磷酸化SMAD2的激活素I型和II型受体。Nodal蛋白质牵涉对早期脊椎动物胚胎关键的许多事件，包括中胚层形成、前模式形成和左右轴特化。实验证据已证明Nodal信号传导激活pAR3-Lux，先前显示对激活素和TGF-β特异性应答的荧光素酶报道分子。然而，Nodal不能诱导pTlx2-Lux，对骨形态发生蛋白特异性响应的报告分子。近期结果提供了直接的生化证据：Nodal信号传导由激活素-TGF-β途径SMAD、SMAD2和SMAD3介导。进一步的证据已显示细胞外cripto蛋白是Nodal信号传导所需的，使其不同于激活素或TGF-β信号传导。
生长和分化因子-8（GDF8）也称为肌肉生长抑制素。GDF8是骨骼肌质量的负调节剂。GDF8在发育中的骨骼肌和成人骨骼肌中高度表达。转基因小鼠中的GDF8无效突变的特征在于骨骼肌的明显肥大和增生。McPherron等人，Nature（1997）387：83-90。骨骼肌质量的类似增加在牛中 [参见例如Ashmore等人（1974）Growth，38:501-507；Swatland和Kieffer（1994）J. Anim. Sci. 38:752-757；McPherron和Lee（1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA94:12457-12461；和Kambadur等人（1997）Genome Res. 7:910-915]，并且显著地，在人类中[参见例如Schuelke等人（2004）N Engl J Med 350:2682-8]的GDF8的天然存在的突变中是明显的。研究还显示与人中的HIV感染相关的肌肉萎缩伴随着GDF8蛋白质表达的增加。参见例如Gonzalez-Cadavid等人（1998）PNAS 95：14938-43。另外，GDF8可以调节肌肉特异性酶（例如肌酸激酶）的产生且调节成肌细胞增殖。参见例如国际专利申请公开号WO 00/43781。GDF8前肽可以非共价地结合成熟的GDF8结构域二聚体，使其生物活性失活。参见例如Miyazono等人（1988）J.Biol.Chem。，263：6407-6415；Miyazono等人（1988）J. Biol.Chem.，263：6407-6415；Wakefield等人（1988）J. Biol. Chem.，263：7646-7654；和Brown等人（1990）Growth Factors，3：35-43]。结合GDF8或结构相关蛋白并抑制其生物活性的其他蛋白质包括卵泡抑素、以及潜在的卵泡抑素相关蛋白。参见例如Gamer等人（1999）Dev.Biol.，208：222-232。
生长和分化因子-11（GDF11），也称为BMP11，是分泌蛋白。McPherron等人（1999）Nat. Genet. 22：260-264。GDF11在小鼠发育期间在尾芽、肢芽、上颌和下颌弓以及背根神经节中表达。参见例如Nakashima等人（1999）Mech. Dev. 80：185-189。GDF11在中胚层和神经组织两者的模式形成中起独特作用。参见例如Gamer等人（1999）Dev Biol.，208:222-32。GDF11显示为发育中的鸡肢体中的软骨形成和肌生成的负调节剂。参见例如Gamer等人（2001）Dev Biol. 229:407-20。GDF11在肌肉中的表达还提示其以类似于GDF8的方式调节肌肉生长的作用。另外，GDF11在脑中的表达提示GDF11也可以具有与神经系统的功能相关的活性。有趣的是，发现GDF11抑制嗅上皮中的神经发生。参见例如Wu等人（2003）Neuron.37:197-207。
骨形态发生蛋白（BMP7），也称为成骨蛋白-1（OP-1），众所周知诱导软骨和骨形成。另外，BMP7调节广泛的生理过程。例如，BMP7可以是负责上皮骨生成的骨诱导因子。还发现BMP7在钙调节和骨稳态中起作用。如同激活素，BMP7结合II型受体，ActRIIA和ActRIIB。然而，BMP7和激活素将不同的I型受体募集成异聚受体复合物。观察到的主要BMP7 I型受体是ALK2，而激活素专一地结合ALK4（ActRIIB）。BMP7和激活素引起不同的生物应答且激活不同的SMAD途径。参见例如Macias-Silva等人（1998）J Biol Chem. 273:25628-36。
如本文所证明的，ActRII多肽（例如ActRIIA和ActRIIB多肽）可以用于增加体内红血细胞水平。在某些例子中，显示与野生型（未经修饰的）ActRII多肽的相应样品相比较，GDF捕获物多肽（特别是变体ActRIIB多肽）的特征在于独特的生物学性质。此类GDF捕获物的特征部分在于对于激活素A的结合亲和力的基本丧失，并且因此显著缩小拮抗激活素A活性的能力，但保留接近野生型水平的GDF11的结合和抑制。在体内，与野生型ActRII多肽相比较，GDF捕获物在增加红血细胞水平方面更有效，并且在患有贫血的患者包括例如患有镰状细胞病的患者和患有地中海贫血的患者中具有有益效应。例如，本文显示GDF捕获物疗法导致患有地中海贫血的人类患者中的血红蛋白水平增加。除改善红血细胞参数之外，还观察到某些地中海贫血患者在GDF捕获物疗法过程期间具有腿部溃疡（这是贫血特别是溶血性贫血如地中海贫血和镰状细胞病中的常见皮肤并发症）的基本消解。这些数据指示除了对红血细胞参数的正面作用之外，ActRII拮抗剂在治疗贫血病症的不同并发症中的更广泛用途。
相应地，一般而言，本发明的方法涉及本文所述的一种或多种ActRII拮抗剂药物（任选与一种或多种支持疗法组合）增加有此需要的受试者中的红血细胞水平，治疗或预防有此需要的受试者中的贫血，和/或治疗或预防一种或多种贫血并发症，包括例如溃疡，特别是皮肤溃疡的用途。
此外，本发明的数据指示观察到的就红血细胞参数和溃疡而言的ActRII多肽的生物活性不依赖于激活素A抑制。然而，应当注意保留激活素A结合的未经修饰的ActRIIB多肽仍证明在体内增加红血细胞的能力。此外，与具有缩小的对于激活素A的结合亲和力的GDF捕获物相比较，保留激活素A抑制的ActRIIB或ActRIIA多肽可以更好地适合于一些应用，其中红血细胞水平中更适度的增加是期望的，和/或其中一定水平的脱靶活性是可接受的（或甚至是期望的）。
应当注意，造血是复杂的过程，由各种因子包括促红细胞生成素、G-CSF和铁稳态调节。术语“增加的红血细胞水平”和“促进红血细胞形成”指临床上可观察的量度，例如血细胞比容、红血细胞计数和血红蛋白测量，并且预期对于此类变化通过其发生的机制是中性的。
EPO是涉及红系祖细胞生长和成熟为红细胞的糖蛋白激素。EPO通过在胎儿寿命期间的肝和通过成人中的肾产生。通常在成年人中由于肾衰竭而发生的EPO的产生减少导致贫血。EPO已通过基于来自用EPO基因转染的宿主细胞的蛋白质的表达和分泌的遗传工程技术产生。此类重组EPO的施用已在治疗贫血中有效。例如，Eschbach等人（1987，N Engl JMed 316:73）描述了EPO校正由慢性肾衰竭引起的贫血的用途。
EPO的效应通过其结合和激活属于细胞因子受体超家族并称为EPO受体的细胞表面受体来介导。人和鼠EPO受体已得到克隆和表达。参见例如D’Andrea等人（1989）Cell 57:277；Jones等人（1990）Blood 76:31；Winkelman等人（1990）Blood 76:24；以及美国专利号5,278,065。人EPO受体基因编码483氨基酸跨膜蛋白，其包含约224个氨基酸的细胞外结构域，并且显示出与鼠EPO受体大约82%的氨基酸序列同一性。参见例如美国专利号6,319,499。在哺乳动物细胞中表达的克隆的全长EPO受体（66-72kDa）以类似于红系祖细胞上的天然受体的那种的亲和力（KD = 100-300nM）结合EPO。因此，此类形式被认为含有主要的EPO结合决定簇，并被称为EPO受体。通过与其他密切相关的细胞因子受体类比，EPO受体被认为在激动剂结合时二聚化。然而，可以是多聚体复合物的EPO受体的详细结构及其具体的激活机制尚未完全理解。参见例如美国专利号6,319,499。
EPO受体的激活导致几种生物效应。这些包括增加未成熟红细胞的增殖，增加未成熟成红细胞的分化，并且减少红系祖细胞中的细胞凋亡。参见例如Liboi等人（1993）ProcNatl Acad Sci USA 90:11351-11355；Koury等人（1990）Science 248:378-381。介导增殖和分化的EPO受体信号转导途径看起来是不同的。参见例如Noguchi等人（1988）Mol CellBiol 8:2604；Patel等人（1992）J Biol Chem，267:21300；和Liboi等人（1993）Proc NatlAcad Sci USA 90:11351-11355）。一些结果提示可能需要辅助蛋白用于介导分化信号。参见例如Chiba等人（1993）Nature 362:646；和Chiba等人（1993）Proc Natl Acad Sci USA90:11593。然而，关于辅助蛋白在分化中的作用存在争议，因为受体的组成型激活形式可以刺激增殖和分化两者。参见例如Pharr等人（1993）Proc Natl Acad Sci USA 90:938。
EPO受体激活剂包括小分子红细胞生成刺激剂（ESA）以及基于EPO的化合物。前者的一个例子是与聚乙二醇（专有名称Hematide™和Omontys®）共价连接的基于二聚肽的激动剂，其在健康志愿者和具有慢性肾疾病和内源性抗EPO抗体两者的患者中显示红细胞生成刺激性质。参见例如Stead等人（2006）Blood 108:1830-1834；和Macdougall等人（2009）NEngl J Med 361:1848-1855。其他例子包括基于非肽的ESAs。参见例如Qureshi等人（1999）Proc Natl Acad Sci USA 96:12156-12161。
EPO受体激活剂还包括通过增强内源性EPO的产生间接刺激红细胞生成而不接触EPO受体本身的化合物。例如，缺氧诱导型转录因子（HIF）是EPO基因表达的内源性刺激物，其在含氧量正常条件下通过细胞调节机制被压制（去稳定化）。因此，正研究HIF脯氨酰羟化酶的抑制剂在体内的EPO诱导活性。EPO受体的其他间接激活剂包括增强抑制EPO基因表达的GATA-2转录因子的抑制剂[参见例如Nakano等人（2004）Blood 104:4300-4307]，以及充当EPO受体信号转导的负调节剂的造血细胞磷酸酶（HCP或SHP-1）抑制剂[参见例如Klingmuller等人（1995）Cell 80:729-738。
在本发明的上下文中以及在使用每个术语的特定上下文中，在本说明书中使用的术语一般具有其在本领域中的普通含义。某些术语在下文或说明书中的其他地方讨论，以对实践者提供对描述本发明的组合物和方法以及如何制备和使用它们的另外指导。术语的任何使用的范围或含义由使用它们的具体上下文中显而易见。
“同源的”，在其所有的语法形式和拼写变化中，指具有“共同进化起源”的两种蛋白质之间的关系，包括来自相同生物物种中的超家族的蛋白质，以及来自不同生物物种的同源蛋白质。此类蛋白质（及其编码核酸）具有序列同源性，如通过它们的序列相似性所反映的，无论是根据百分比同一性还是通过特定残基或基序和保守位置的存在。
术语“序列相似性”以其所有语法形式指可以共享或不共享共同进化起源的核酸或氨基酸序列之间的同一性或对应性程度。
然而，在通常使用和本申请中，当用副词如“高度”修饰时，术语“同源的”可以指序列相似性，并且可以涉及或不涉及共同的进化起源。
就参考多肽（或核苷酸）序列而言的“序列同一性百分比（%）”定义为在比对序列和必要时引入缺口以实现最大序列同一性百分比后，并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的部分，候选序列中与参考多肽（核苷酸）序列中的氨基酸残基（或核酸）相同的氨基酸残基（或核酸）的百分比。用于测定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可以以本领域技术内的不同方式实现，例如使用公众可获得的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign（DNASTAR）软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在待比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，为了本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成%氨基酸（核酸）序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech，Inc.撰写，并且源代码已在美国版权局，Washington D.C.，20559中提交用户文档，其中它在美国版权注册号TXU510087下注册。ALIGN-2程序可从Genentech，Inc.，South SanFrancisco，Calif.公开获得，或可以从源代码编译。ALIGN-2程序应当编译用于在UNIX操作系统上使用，包括数位UNIX V4.0D。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置并且不变。
如本文所使用的，“基本上不与X结合”意指药物具有对于“X”大于约10-7、10-6、10-5、10-4或更大的KD（例如通过用于测定KD的测定无法检测的结合）。
2. ActRII拮抗剂
本文呈现的数据证明ActRII的拮抗剂（抑制剂）（例如ActRIIA和/或ActRIIB SMAD2/3和/或SMAD 1/5/8信号传导的拮抗剂）可以用于增加体内红血细胞水平。特别地，此类ActRII拮抗剂在本文中显示有效治疗不同贫血以及不同的贫血并发症（例如病症/状况），包括例如皮肤溃疡。相应地，本发明部分提供了不同的ActRII拮抗剂药物，其可以单独或与一种或多种红细胞生成刺激剂（例如EPO）或其他支持疗法[例如用羟基脲治疗、输血、铁螯合疗法和/或疼痛管理（例如用一种或多种阿片类镇痛剂、非甾体抗炎药和/或皮质类固醇治疗）组合使用，以治疗或预防有此需要的受试者中的贫血和/或治疗或预防患有贫血的患者中的皮肤溃疡。
在某些实施方案中，待根据本文公开的方法使用的ActRII拮抗剂是GDF-ActRII拮抗剂（例如GDF介导的ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导的拮抗剂），特别是GDF11- 和/或GDF8介导的ActRII信号传导。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂是可溶性ActRII多肽（例如可溶性ActRIIA和ActRIIB多肽）和GDF捕获物多肽，例如ActRIIA-Fc融合蛋白、ActRIIB-Fc融合蛋白和GDF捕获物-Fc融合蛋白。
虽然本发明的可溶性ActRII多肽和GDF捕获物多肽可以通过除GDF（例如GDF11和/或GDF8）拮抗作用外的机制影响红血细胞水平和/或皮肤溃疡[例如，GDF11和/或GDF8抑制可以是药物抑制一系列另外药物包括可能的TGF-β超家族的其他成员（例如激活素B、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7和/或Nodal）活性的倾向的指示剂，并且此类集中抑制可以导致对例如造血的所需效应]，预期其他类型的GDF-ActRII拮抗剂是有用的，包括例如抗GDF11抗体；抗GDF8抗体；抗ActRIIA抗体；抗ActRIIB抗体；反义、RNAi或核酶核酸，其抑制GDF11、GDF8、ActRIIA和/或ActRIIB中的一种或多种的产生；GDF8、ActRIIA和/或ActRIIB中的一种或多种的其他抑制剂（例如小分子抑制剂），特别是破坏GDF11和/或GDF8-ActRIIA结合和/或GDF11和/或GDF8-ActRIIB结合的药物，以及抑制GDF11、GDF8、ActRIIA和/或ActRIIB中的一种或多种的表达的药物。任选地，本发明的GDF-ActRII拮抗剂可以结合和/或抑制其他ActRII配体的活性（或表达），包括例如激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7 和/或Nodal。任选地，本发明的GDF-ActRII拮抗剂可以与结合和/或抑制一种或多种另外的ActRII配体的活性（或表达）的至少一种另外的ActRII拮抗剂药物组合使用，所述另外的ActRII配体包括例如激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7和/或Nodal。在一些实施方案中，待根据本文公开的方法使用的ActRII拮抗剂基本上不结合和/或抑制激活素A（例如激活素A介导的ActRIIA和/或ActRIIB信号传导，例如SMAD 2/3信号传导的激活）。
A. ActRII多肽和GDF捕获物
在某些方面，本发明涉及ActRII多肽。特别地，本发明提供了使用ActRII多肽以例如治疗或预防有此需要的受试者中的贫血和/或治疗或预防一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡的方法。如本文使用的，术语“ActRII”指II型激活素受体家族。该家族包括激活素受体IIA型和激活素受体IIB型两者。在一些实施方案中，本发明提供了使用ActRII多肽以治疗有此需要的受试者中的贫血和/或治疗患有贫血的受试者中的一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用ActRII多肽以预防有此需要的受试者中的贫血和/或预防患有贫血的受试者中的一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡的方法。在一些实施方案中，ActRII多肽是ActRIIA多肽。在一些实施方案中，ActRII多肽是ActRIIB多肽。
如本文使用的，术语“ActRIIB”指来自任何物种的激活素受体IIB型（ActRIIB）蛋白家族和通过诱变或其他修饰衍生自此类ActRIIB蛋白的变体。本文中对ActRIIB的提及应理解为对目前鉴定的形式中的任一种的提及。ActRIIB家族的成员一般是跨膜蛋白，由包含富含半胱氨酸的区域的配体结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞质结构域组成。
术语“ActRIIB多肽”包括包含ActRIIB家族成员的任何天然存在的多肽以及其保留有用活性的任何变体（包括突变体、片段、融合物和拟肽形式）的多肽。此类变体ActRIIA多肽的例子在本发明中以及国际专利申请公开号WO 2006/012627中提供，所述参考文献以引用的方式整体并入本文。任选地，本发明的ActRIIB多肽可以用于增加受试者中的红血细胞水平。除非另有具体说明，否则本文所述的所有ActRIIB相关多肽的氨基酸编号均基于下文提供的人ActRIIB前体蛋白序列（SEQ ID NO:1）的编号。
人ActRIIB前体蛋白序列如下：
Figure 347027DEST_PATH_IMAGE001
信号肽用单下划线指示；细胞外结构域以粗体字体指示；并且潜在的内源N联糖基化位点用双下划线指示。
经加工的可溶性（细胞外）人ActRIIB多肽序列如下：
Figure 264167DEST_PATH_IMAGE002
Figure 981588DEST_PATH_IMAGE003
。
在一些实施方案中，可以产生在N末端处具有“SGR ...”序列的蛋白质。细胞外结构域的C末端“尾部”由单下划线指示。缺失“尾部”的序列（Δ15序列）如下：
Figure 376797DEST_PATH_IMAGE004
Figure 191169DEST_PATH_IMAGE005
。
在文献中还报道了在SEQ ID NO:1的位置64处具有丙氨酸（A64）的ActRIIB形式。参见例如Hilden等人（1994）Blood，83（8）：2163-2170。申请人已确定包含具有A64取代的ActRIIB的细胞外结构域的ActRIIB-Fc融合蛋白对于激活素和GDF11具有相对低的亲和力。相比之下，在位置64处具有精氨酸（R64）的相同ActRIIB-Fc融合蛋白对于激活素和GDF11具有在低纳摩尔至高皮摩尔范围内的亲和力。因此，在本发明中，具有R64的序列用作人类ActRIIB的“野生型”参考序列。
在位置64处具有丙氨酸的ActRIIB的形式如下：
Figure 748052DEST_PATH_IMAGE006
Figure 15086DEST_PATH_IMAGE007
。
信号肽由单下划线指示，并且细胞外结构域由粗体字体指示。
替代A64形式的经加工的可溶性（细胞外）ActRIIB多肽序列如下：
Figure 213986DEST_PATH_IMAGE008
Figure 23810DEST_PATH_IMAGE009
。
在一些实施方案中，可以产生在N末端处具有“SGR ...”序列的蛋白质。细胞外结构域的C末端“尾部”由单下划线指示。缺失“尾部”的序列（Δ15序列）如下：
Figure 17174DEST_PATH_IMAGE010
Figure 771503DEST_PATH_IMAGE011
。
编码人ActRIIB前体蛋白的核酸序列如下所示（SEQ ID NO: 7），其由Genbank参考序列NM_001106.3的核苷酸25-1560组成，其编码ActRIIB前体的氨基酸1-513。如所示的序列在位置64处提供精氨酸，并且可以被修饰以提供丙氨酸代替。信号序列是加下划线的。
Figure 242936DEST_PATH_IMAGE012
Figure 766321DEST_PATH_IMAGE013
编码经加工的可溶性（细胞外）人ActRIIB多肽的核酸序列如下（SEQ ID NO: 8）。如所示的序列在位置64处提供精氨酸，并且可以被修饰以提供丙氨酸代替。
Figure 196165DEST_PATH_IMAGE014
在某些实施方案中，本发明涉及ActRIIA多肽。如本文使用的，术语“ActRIIA”指来自任何物种的激活素受体IIB型（ActRIIA）蛋白家族和通过诱变或其他修饰衍生自此类ActRIIA蛋白的变体。本文中对ActRIIA的提及应理解为对目前鉴定的形式中的任一种的提及。ActRIIA家族的成员一般是跨膜蛋白，由包含富含半胱氨酸的区域的配体结合细胞外结构域、跨膜结构域和具有预测的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的细胞质结构域组成。
术语“ActRIIA多肽”包括包含ActRIIA家族成员的任何天然存在的多肽以及其保留有用活性的任何变体（包括突变体、片段、融合物和拟肽形式）的多肽。此类变体ActRIIA多肽的例子在本发明中以及国际专利申请公开号WO 2006/012627中提供，所述参考文献以引用的方式整体并入本文。任选地，本发明的ActRIIA多肽可以用于增加受试者中的红血细胞水平。除非另有具体说明，否则本文所述的所有ActRIIA相关多肽的氨基酸编号均基于下文提供的人ActRIIA前体蛋白序列（SEQ ID NO:9）的编号。
人ActRIIA前体蛋白序列如下：
Figure 437791DEST_PATH_IMAGE015
信号肽由单下划线指示；细胞外结构域以粗体字体指示；并且潜在的内源N联糖基化位点由双下划线指示。
经加工的可溶性（细胞外）人ActRIIA多肽序列如下：
Figure 853860DEST_PATH_IMAGE016
Figure 497331DEST_PATH_IMAGE017
。
细胞外结构域的C末端“尾部”由单下划线指示。缺失“尾部”的序列（Δ15序列）如下：
Figure 832497DEST_PATH_IMAGE018
。
编码人ActRIIA前体蛋白的核酸序列如下所示（SEQ ID NO: 12），如Genbank参考NM_001616.4的下述核苷酸159-1700。信号序列是加下划线的。
Figure 499102DEST_PATH_IMAGE019
Figure 577916DEST_PATH_IMAGE020
编码经加工的可溶性（细胞外人ActRIIA多肽的核酸序列如下：
Figure 75894DEST_PATH_IMAGE021
Figure 579032DEST_PATH_IMAGE022
。
人ActRIIB可溶性细胞外结构域和人ActRIIA可溶性细胞外结构域的氨基酸序列的比对在图1中示出。该比对指示被认为直接接触ActRII配体的两种受体内的氨基酸残基。图2描述了不同脊椎动物ActRIIB蛋白和人ActRIIA的多重序列比对。从这些比对中可以预测配体结合结构域内对于正常ActRII-配体结合活性重要的关键氨基酸位置，以及预测可能耐受取代而不显著改变正常的ActRII- 配体结合活性的氨基酸位置。
在其他方面，本发明涉及GDF捕获物多肽（也称为“GDF捕获物”）。特别地，本发明提供了使用GDF捕获物多肽以例如治疗或预防有此需要的受试者中的贫血，治疗有此需要的受试者中的镰状细胞病和/或治疗或预防一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用GDF捕获物多肽以治疗有此需要的受试者中的贫血和/或治疗患有贫血的受试者中的一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用GDF捕获物多肽以预防有此需要的受试者中的贫血和/或预防患有贫血的受试者中的一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡的方法。
在一些实施方案中，本发明的GDF捕获物是可溶性变体ActRII多肽（例如ActRIIA和ActRIIB多肽），其包含在ActRII多肽（例如“野生型”ActRII多肽）的细胞外结构域（也称为配体结合结构域）中的一个或多个突变（例如氨基酸添加、缺失、取代及其组合），使得变体ActRII多肽具有与相应的野生型ActRII多肽相比较的一种或多种改变的配体结合活性。在一些实施方案中，本发明的GDF捕获物多肽保留与相应的野生型ActRII多肽（例如ActRIIA或ActRIIB多肽）的至少一种相似活性。例如，GDF捕获物可以结合和/或抑制（例如拮抗）一种或多种ActRII配体的功能（例如抑制ActRII配体介导的ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3和/或SMAD 1/5/8信号传导途径的激活）。在一些实施方案中，本发明的GDF捕获物结合和/或抑制激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、Nodal、GDF8、GDF11、BMP6和/或BMP7）中的一种或多种。
在某些实施方案中，本发明的GDF捕获物多肽对于一种或多种特异性ActRII配体（例如GDF8、GDF11、BMP6、Nodal和/或BMP7）具有提高的结合亲和力。在其他实施方案中，本发明的GDF捕获物多肽对于一种或多种特异性ActRII配体（例如激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C和/或激活素E）具有减少的结合亲和力。在另外其他实施方案中，本发明的GDF捕获物多肽对于一种或多种特异性ActRII配体具有提高的结合亲和力，并且对于一种或多种不同/其他ActRII配体具有减少的结合亲和力。因此，本发明提供了对于一种或多种ActRII配体具有改变的结合特异性的GDF捕获物多肽。
在某些实施方案中，例如，与野生型ActRII多肽相比较，本发明的GDF捕获物被设计为优先结合并拮抗GDF11和/或GDF8（也称为肌肉生长抑制素）。任选地，此类GDF11和/或GDF8结合捕获物可以进一步结合和/或拮抗Nodal、GDF8、GDF11、BMP6和/或BMP7中的一种或多种。任选地，此类GDF11和/或GDF8结合捕获物可以进一步结合和/或拮抗激活素B、激活素C、激活素E、Nodal、GDF8、GDF11、BMP6和/或BMP7中的一种或多种。任选地，此类GDF11和/或GDF8结合捕获物可以进一步结合和/或拮抗激活素A、激活素A/B、激活素B、激活素C、激活素E、Nodal、GDF8、GDF11、BMP6和/或BMP7中的一种或多种。在某些实施方案中，例如与野生型ActRII多肽相比较，本发明的GDF捕获物对于激活素（例如激活素A、激活素A/B、激活素B、激活素C、激活素E）具有缩小的结合亲和力。在某些实施方案中，本发明的GDF捕获物多肽减对于激活素A具有缩小的结合亲和力。
例如，本发明提供了相对于激活素A优先结合和/或拮抗GDF8/GDF11的GDF捕获物多肽。如本发明的实施例所证明的，与保留对于激活素A的高结合亲和力的ActRII多肽相比较，此类GDF捕获物多肽是体内红细胞生成的更有力激活剂。此外，这些非激活素A结合GDF捕获物多肽证明对其他组织的作用减少。因此，此类GDF捕获物可以用于增加受试者中的红血细胞水平，同时降低与结合/拮抗激活素A相关的潜在脱靶效应。然而，此类选择性GDF捕获物多肽在一些应用中可能较不期望，其中可能需要红血细胞水平中的更适度的增益用于疗效，并且其中一定水平的脱靶效应是可接受的（或甚至是期望的）。
ActRIIB蛋白的氨基酸残基（例如E39、K55、Y60、K74、W78、L79、D80和F101）在ActRIIB配体结合口袋中，并帮助介导与其配体包括例如激活素A、GDF11和GDF8的结合。因此，本发明提供了包含ActRIIB受体的改变的配体结合结构域（例如GDF8/GDF11结合结构域）的GDF捕获物多肽，其包含在那些氨基酸残基处的一个或多个突变。
任选地，相对于ActRIIB受体的野生型配体结合结构域，改变的配体结合结构域可以对于配体例如GDF11和/或GDF8具有增加的选择性。为了举例说明，可以选择增加改变的配体结合结构域对于GDF11和/或GDF8的选择性超过一种或多种激活素（激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C和/或激活素A），特别是激活素A的一个或多个突变。任选地，改变的配体结合结构域具有关于激活素结合的Kd与关于GDF11和/或GDF8结合的Kd的比率，其相对于关于野生型配体结合结构域的比率大至少2-、5-、10-、20、50-、100-或甚至1000倍。任选地，改变的配体结合结构域具有关于抑制激活素的IC50与关于抑制GDF11和/或GDF8的IC50的比率，其相对于野生型配体结合结构域大至少2-、5-、10-、20、50-、100-或甚至1000倍。任选地，改变的配体结合结构域以比关于抑制激活素的IC50小至少2、5、10、20、50、100或甚至1000倍的IC50抑制GDF11和/或GDF8。
作为具体例子，ActRIIB的配体结合结构域的带正电荷的氨基酸残基Asp（D80）可以突变为不同的氨基酸残基，以产生优先结合GDF8而不是结合激活素的GDF捕获物多肽。优选地，就SEQ ID NO:1而言的D80残基改变为选自下述的氨基酸残基：不荷电氨基酸残基、负性氨基酸残基和疏水性氨基酸残基。作为进一步的具体例子，SEQ ID NO:1的疏水性残基L79可以改变，以赋予改变的激活素-GDF11/GDF8结合性质。例如，L79P取代比激活素结合更大程度地降低GDF11结合。相比之下，用酸性氨基酸取代L79 [天冬氨酸或谷氨酸；L79D或L79E取代]极大降低激活素A结合亲和力，同时保留GDF11结合亲和力。在示例性实施方案中，本文所述的方法利用GDF捕获物多肽，其为在对应于SEQ ID NO: 1的位置79的位置处包含酸性氨基酸（例如D或E）的变体ActRIIB多肽，任选与一个或多个另外的氨基酸取代、添加或缺失组合。
如本领域技术人员将认识到的，本文描述的所述突变、变体或修饰中的大多数可以在核酸水平上，或在一些情况下通过翻译后修饰或化学合成进行制备。此类技术是本领域众所周知的，其中一些在本文中描述。
在某些实施方案中，本发明涉及其为可溶性ActRII多肽的ActRII多肽（ActRIIA和ActRIIB多肽）。如本文所述的，术语“可溶性ActRII多肽”一般指包含ActRII蛋白的细胞外结构域的多肽。如本文使用的，术语“可溶性ActRII多肽”包括ActRII蛋白的任何天然存在的细胞外结构域以及其保留有用活性的任何变体（包括突变体，片段和拟肽形式）（例如如本文所述的GDF捕获物多肽）。可溶性ActRII多肽的其他例子还包含除ActRII或GDF捕获蛋白的细胞外结构域之外的信号序列。例如，信号序列可以是ActRIIA或ActRIIB蛋白的天然信号序列，或来自另一种蛋白质的信号序列，包括例如组织型纤溶酶原激活物（TPA）信号序列或蜜蜂蜂毒素（HBM）信号序列。
部分地，本发明鉴定了ActRII多肽的功能活性部分和变体，其可以用作在本文所述方法的范围内生成且使用ActRIIA多肽、ActRIIB多肽和GDF捕获物多肽的指导。
ActRII蛋白已在本领域中根据结构和功能特征，特别是就配体结合而言进行表征。参见例如Attisano等人（1992）Cell 68（1）:97-108；Greenwald等人（1999）NatureStructural Biology 6（1）：18-22；Allendorph等人（2006）PNAS 103（20：7643-7648；Thompson等人（2003）The EMBO Journal 22（7）：1555-1566；以及美国专利号7,709,605、7,612,041和7,842,663。
例如，Attisano等人显示在ActRIIB的细胞外结构域的C末端处的脯氨酸结缺失降低受体对于激活素的亲和力。包含本文SEQ ID NO:1的氨基酸20-119的ActRIIB-Fc融合蛋白，“ActRIIB（20-119）-Fc”，相对于包括脯氨酸结区和完整的近膜结构域的ActRIIB（20-134）-Fc，具有降低的与GDF-11和激活素的结合。参见例如美国专利号7,842,663。然而，即使脯氨酸结区被破坏，ActRIIB（20-129）-Fc蛋白仍保留相对于野生型相似但稍微降低的活性。因此，在氨基酸134、133、132、131、130和129（就本文的SEQ ID NO:1而言）处结束的ActRIIB细胞外结构域都预期是有活性的，但在134或133处结束的构建体可能是最活跃的。类似地，在残基129-134（就SEQ ID NO:1而言）中的任一个处的突变预期不通过大边缘改变配体结合亲和力。为了支持这一点，P129和P130（就SEQ ID NO:1而言）的突变基本上不减少配体结合。因此，本发明的ActRIIB多肽或基于ActRIIB的GDF捕获物多肽可以早在氨基酸109（最终的半胱氨酸）结束，然而，在109和119处或在109和119之间结束的形式（例如109、110、111、112、113、114、115、116、117、118或119）预期具有降低的配体结合。氨基酸119（就本文的SEQ ID NO:1而言）是较差保守的，并且因此容易被改变或截短。在128（就本文的SEQID NO:1而言）或以后处结束的ActRIIB多肽和基于ActRIIB的GDF捕获物应当保留配体结合活性。就SEQ ID NO:1而言，在119和127处或在119和127处之间（例如119、120、121、122、123、124、125、126或127）结束的ActRIIB多肽和基于ActRIIB的GDF捕获物将具有中间结合能力。取决于临床或实验设置，这些形式中的任何均可能是期望使用的。
在ActRIIB的N末端处，预期在氨基酸29（就本文的SEQ ID NO:1而言）处或之前开始的蛋白质将保留配体结合活性。氨基酸29表示起始半胱氨酸。在位置24（就本文的SEQ IDNO:1而言）处的丙氨酸至天冬酰胺突变引入N联糖基化序列，而基本上不影响配体结合。参见例如美国专利号7,842,663。这证实了对应于氨基酸20-29的信号切割肽和半胱氨酸交联区之间的区域中的突变是良好耐受的。特别地，在位置20、21、22、23和24（就本文的SEQ IDNO:1而言）处开始的ActRIIB多肽和基于ActRIIB的GDF捕获物应当保留一般的配体结合活性，并且在位置25、26、27、28和29（就本文的SEQ ID NO:1而言）处开始的ActRIIB多肽和基于ActRIIB的GDF捕获物也预期保留配体结合活性。本文以及例如美国专利号7,842,663中显示的数据证明，令人惊讶地，在22、23、24或25处开始的ActRIIB构建体将具有最大的活性。
总之，ActRIIB的活性部分（例如配体结合活性）包含SEQ ID NO:1的氨基酸29-109。因此，本发明的ActRIIB多肽和基于ActRIIB的GDF捕获物可以例如包含氨基酸序列，其与在对应于SEQ ID NO: 1的氨基酸20-29的残基处开始（例如在氨基酸20、21、22、23、24、25、26、27、28或29处开始），并且在对应于SEQ ID NO: 1的氨基酸109-134的位置处结束（例如在氨基酸109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134处结束）的ActRIIB部分至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%等同。在一些实施方案中，本发明的基于ActRIIB的GDF捕获物多肽不包含SEQ ID NO:1的氨基酸29-109或由SEQ ID NO:1的氨基酸29-109组成。其他例子包括在来自SEQ ID NO: 1的20-29（例如位置20、21、22、23、24、25、26、27、28或29）或21-29（例如位置21、22、23、24、25、26、27、28或29）的位置处开始，并且在来自119-134（例如（例如119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134）、119-133（例如119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132或133）、129-134（例如129、130、131、132、133或134）、或129-133（例如129、130、131、132或133）处结束的多肽。其他例子包括在来自SEQ IDNO: 1的20-24（例如20、21、22、23或24）、21-24（例如21、22、23或24）、或22-25（例如22、22、23或25）的位置处开始，并且在来自109-134（例如109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134）、119-134（例如119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133或134）或129-134（例如129、130、131、132、133或134）的位置处结束的构建体。还考虑了在这些范围内的变体，特别是与SEQ ID NO: 1的相应部分具有至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的变体。在一些实施方案中，ActRIIB多肽和基于ActRIIB的GDF捕获物包含具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO: 1的氨基酸残基25-131至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%等同。在某些实施方案中，基于ActRIIB的GDF捕获物多肽不包含SEQ ID NO: 1的氨基酸25-131或由SEQ ID NO: 1的氨基酸25-131组成。
本发明包括图1中所示的复合ActRIIB结构的分析结果，证明配体结合口袋部分地由残基Y31、N33、N35、L38直到T41，E47、E50、Q53直到K55，L57、H58、Y60、S62、K74、W78直到N83，Y85、R87、A92和E94直到F101限定。在这些位置处，预期保守突变将被耐受，尽管K74A突变是良好耐受的，如R40A，K55A，F82A和在位置L79处的突变。R40是非洲爪蟾中的K，指示在该位置处的碱性氨基酸将被耐受。Q53在牛ActRIIB中为R，并且在非洲爪蟾ActRIIB中为K，并且因此包括R、K、Q、N和H的氨基酸在该位置处将被耐受。因此，关于本发明的ActRIIB多肽和基于ActRIIB的GDF捕获物多肽的通式是包含氨基酸序列的那种，所述氨基酸序列与SEQID NO: 1的氨基酸29-109至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%等同，任选在范围为20-24（例如20、21、22、23或24）或22-25（例如22、23、24或25）的位置处开始，并且在范围为129-134（例如129、130、131、132、133或134）的位置处结束，并且包含在配体结合口袋中的不超过1、2、5、10或15个保守氨基酸变化，以及在配体结合口袋中的位置40、53、55、74、79和/或82处的零个、一个或多个非保守改变。在其处变应性可以特别良好地耐受的在结合口袋外部的位点包括细胞外结构域的氨基末端和羧基末端（如上所述），以及位置42-46和65-73（就SEQ ID NO:1而言）。在位置65处的天冬酰胺至丙氨酸改变（N65A）实际上改善了在A64背景下的配体结合，并且因此预期在R64背景下对配体结合没有有害影响。参见例如美国专利号7,842,663。此类变化很可能消除了在A64背景下的N65糖基化，因此证明该区域中的显著变化可能是可耐受的。尽管R64A变化耐受不良，但R64K耐受良好，因此另一种碱性残基例如H在位置64处可以耐受。参见例如美国专利号7,842,663。
ActRIIB在几乎所有脊椎动物中均良好保守，其中细胞外结构域的大片段完全保守。结合ActRIIB的配体中的许多也是高度保守的。相应地，来自不同脊椎动物生物的ActRIIB序列的比较提供了可被改变的残基的见识。因此，根据目前公开的方法有用的活性人类ActRIIB变体多肽和基于ActRIIB的GDF捕获物可以包括在来自另一种脊椎动物ActRIIB的序列的相应位置处的一个或多个氨基酸，或者可以包括类似于在人或其他脊椎动物序列中的那种的残基。下述例子举例说明了限定活性ActRIIB变体的此类方法。L46在非洲爪蟾ActRIIB中是缬氨酸，因此该位置可以被改变，并且任选地可以改变为另一种疏水性残基例如V、I或F，或者非极性残基例如A。E52在非洲爪蟾中是K，指示该位点可以耐受广泛多样的变化，包括极性残基例如E、D、K、R、H、S、T、P、G、Y和可能的A。T93在非洲爪蟾中是K，指示广泛的结构变化在这个位置处是被耐受的，其中极性残基是有利的，例如S、K、R、E、D、H、G、P、G和Y。F108在非洲爪蟾中是Y，并且因此Y或其他疏水基团，例如I、V或L应当是耐受的。E111在非洲爪蟾中是K，指示荷电残基在该位置处将是耐受的，包括D、R、K和H以及Q和N。R112在非洲爪蟾中是K，指示碱性残基在该位置处是耐受的，包括R和H。在位置119处的A是相对弱保守的，并且在啮齿动物中表现为P，并且在非洲爪蟾中表现为V，因此基本上任何氨基酸在该位置都应当是耐受的。
先前已证明相对于ActRIIB（R64）-Fc形式，进一步的N联糖基化位点（N-X-S/T）的添加是良好耐受的。参见例如美国专利号7,842,663。因此，N-X-S/T序列一般可以在本发明的ActRIIB多肽和基于ActRIIB的GDF捕获物中的在图1中定义的配体结合口袋外部的位置处引入。用于引入非内源性N-X-S/T序列的特别合适的位点包括氨基酸20-29、20-24、22-25、109-134、120-134或129-134（就SEQ ID NO:1而言）。也可以将N-X-S/T序列引入ActRIIB序列和Fc结构域或其他融合组分之间的接头内。可以通过在就预先存在的S或T而言的正确位置中引入N，或通过在对应于预先存在的N的位置处引入S或T，以最低限度的努力引入此类位点。因此，将产生N联糖基化位点的期望改变为：A24N、R64N、S67N（可能与N65A改变组合），E105N、R112N、G120N、E123N、P129N、A132N、R112S和R112T（就SEQ ID NO:1而言）。预测为糖基化的任何S均可改变为T而不产生免疫原性位点，因为通过糖基化提供的保护。同样地，预测为糖基化的任何T均可改变为S。因此，考虑了改变S67T和S44T（就SEQ ID NO:1而言）。同样地，在A24N变体中，可以使用S26T改变。因此，本发明的ActRIIB多肽和基于ActRIIB的GDF捕获物多肽可以是具有如上所述的一个或多个另外的非内源性N联糖基化共有序列的变体。
本文描述的变型可以以不同方式组合。另外，本文所述的诱变程序的结果指示在ActRIIB中存在通常有利于保守的氨基酸位置。就SEQ ID NO:1而言，这些包括位置64（碱性氨基酸）、位置80（酸性或疏水性氨基酸）、位置78（疏水性且特别是色氨酸）、位置37（酸性且特别是天冬氨酸或谷氨酸 ）、位置56（碱性氨基酸）、位置60（疏水性氨基酸，特别是苯丙氨酸或酪氨酸）。因此，在本文公开的ActRIIB多肽和基于ActRIIB的GDF捕获物中，本发明提供了可以是保守的氨基酸构架。可能期望保守的其他位置如下：位置52（酸性氨基酸）、位置55（碱性氨基酸）、位置81（酸性）、98（极性或荷电的，特别是E、D、R或K），所有均就SEQ ID NO:1而言。
关于活性（例如配体结合）ActRIIA多肽的通式是包含在SEQ ID NO:9的氨基酸30处开始并在氨基酸110处结束的多肽的通式。因此，本发明的ActRIIA多肽和基于ActRIIA的GDF捕获物可以包含与SEQ ID NO:9的氨基酸30-110至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%等同的多肽。在一些实施方案中，本发明的基于ActRIIA的GDF捕获物不包含SEQ ID NO:9的氨基酸30-110或不由SEQ ID NO:9的氨基酸30-110组成。任选地，本发明的ActRIIA多肽和基于ActRIIA的GDF捕获物多肽包含此类多肽，其与SEQ ID NO:9的氨基酸12-82至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%等同，任选地分别在范围为1-5（例如1、2、3、4或5）或3-5（例如3、4或5） 的位置处开始，并且在范围为110-116（例如110、111、112、113、114、115或116）或110-115（例如110、111、112、113、114或115）的位置处结束，并且包含在配体结合口袋中的不超过1、2、5、10或15个保守氨基酸变化，以及就SEQ ID NO:9而言在配体结合口袋中的位置40、53、55、74、79和/或82的零个、一个或多个非保守改变。
在某些实施方案中，本发明的ActRII多肽（例如ActRIIA和ActRIIB多肽）和GDF捕获物多肽的功能活性片段可以通过筛选由编码ActRII多肽或GDF捕获物多肽的核酸的相应片段重组产生的多肽（例如SEQ ID NO: 7、8、12、13、27、32、39、40、42、46和48）而获得。另外，可以使用本领域已知的技术，例如常规的Merrifield固相f-Moc或t-Boc化学，来化学合成片段。片段可以（重组或通过化学合成）被产生并测试，以鉴定可以充当ActRII受体和/或一种或多种ActRII配体（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7和/或Nodal）的拮抗剂（抑制剂）的那些肽基片段。
在一些实施方案中，本发明的ActRIIA多肽是包含与选自SEQ ID NO: 9、10、11、22、26和28的氨基酸序列至少75%等同的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，ActRIIA多肽包含与选自SEQ ID NO: 9、10、11、22、26和28的氨基酸序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%等同的氨基酸序列。在某些实施方案中，ActRIIA多肽基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO: 9、10、11、22、26和28的氨基酸序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%等同。
在一些实施方案中，本发明的ActRIIB多肽是包含与选自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、29、31和49的氨基酸序列至少75%等同的氨基酸序列的多肽。在某些实施方案中，ActRIIB多肽包含与选自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、29、31和49的氨基酸序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%等同的氨基酸序列。在某些实施方案中，ActRIIB多肽基本上由氨基酸序列组成或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、29、31和49的氨基酸序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%等同。
在一些实施方案中，本发明的GDF捕获物多肽是变体ActRIIB多肽，其包含与选自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、29、30、31、36、37、38、41、44、45、49、50和51的氨基酸序列至少75%等同的氨基酸序列。在某些实施方案中，GDF捕获物多肽包含与选自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、29、30、31、36、37、38、41、44、45、49、50和51的氨基酸序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%等同的氨基酸序列。在某些实施方案中，GDF捕获物包含与选自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、29、30、31、36、37、38、41、44、45、49、50和51的氨基酸序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%等同的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:1、4或49的L79的位置是酸性氨基酸（D或E氨基酸残基）。在某些实施方案中，GDF捕获物基本上由氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与选自SEQ IDNO: 36、37、38、41、44、45、50和51的氨基酸序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%等同。在某些实施方案中，GDF捕获物不包含选自SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、29和31的氨基酸序列，或由选自SEQ IDNO: 1、2、3、4、5、6、29和31的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明的GDF捕获物多肽是变体ActRIIA多肽，其包含与选自SEQ ID NO: 9、10、11、22、26、28、29和31的氨基酸序列至少75%等同的氨基酸序列。在某些实施方案中，GDF捕获物多肽包含与选自SEQ ID NO: 9、10、11、22、26、28、29和31的氨基酸序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%等同的氨基酸序列。在某些实施方案中，GDF捕获物基本上由氨基酸序列或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列与选自SEQ ID NO: 9、10、11、22、26、28、29和31的氨基酸序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%等同。在某些实施方案中，GDF捕获物不包含选自SEQ ID NO:9、10、11、22、26、28、29和31的氨基酸序列，或不由选自SEQ ID NO: 9、10、11、22、26、28、29和31的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明考虑通过修饰ActRII多肽（例如和ActRIIA或ActRIIB多肽）或GDF捕获物的结构来制备功能变体，用于此类目的如增强治疗功效或稳定性（例如保存期限和对蛋白酶解降解的抗性）。变体可以通过氨基酸取代、缺失、添加或其组合产生。例如，可以合理地预期分别用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸盐取代天冬氨酸盐、用丝氨酸取代苏氨酸、或用结构相关的氨基酸类似地取代氨基酸（例如保守突变）不会对所得到的分子的生物活性具有主要作用。保守取代是在其侧链中相关的氨基酸家族内发生的那些。本发明的多肽的氨基酸序列的变化是否导致功能同源物可以通过评价变体多肽以类似于野生型多肽的方式在细胞中产生应答的能力来容易地测定，或者与未经修饰的或野生型多肽相比较，结合一种或多种配体，例如GDF11、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、GDF8、BMP6和BMP7。
在某些实施方案中，本发明考虑本发明的ActRII多肽和GDF捕获物多肽的特异性突变，以便改变多肽的糖基化。可以选择此类突变以便引入或消除一个或多个糖基化位点，例如O联或N联糖基化位点。天冬酰胺连接的糖基化识别位点一般包含被适当的细胞糖基化酶特异性识别的三肽序列，天冬酰胺-X-苏氨酸或天冬酰胺-X-丝氨酸（其中“X”是任何氨基酸）。该改变也可以通过给多肽序列添加或取代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基（对于O联糖基化位点）来进行。在糖基化识别位点的第一个或第三个氨基酸位置中的一个或两个处的各种氨基酸取代或缺失（和/或在第二个位置处的氨基酸缺失）导致在经修饰的三肽序列上的非糖基化。增加多肽上的碳水化合物部分数目的另一种方法是通过糖苷与多肽的化学或酶偶联。取决于所使用的偶联模式，糖可以附着至（a）精氨酸和组氨酸；（b）游离羧基；（c）游离巯基，例如半胱氨酸的游离巯基；（d）游离羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的游离羟基；（e）芳族残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族残基；或（f）谷氨酰胺的酰胺基。存在于多肽上的一个或多个碳水化合物部分的去除可以化学和/或酶促实现。化学去糖基化可以涉及例如使多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等价化合物。此类处理导致除了连接糖（N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺）之外的大多数或所有糖的切割，同时保留氨基酸序列完整。多肽上的碳水化合物部分的酶促切割可以通过使用各种内切和外切糖苷酶来实现，如Thotakura等人[Meth. Enzymol.（1987）138:350]所述。多肽的序列可以取决于所使用的表达系统的类型适当地调整，因为哺乳动物、酵母、昆虫和植物细胞都可以引入可以受肽的氨基酸序列影响的不同糖基化模式。一般而言，用于在人中使用的本发明的ActRII多肽和GDF捕获物多肽可以在提供适当糖基化的哺乳动物细胞系例如HEK293或CHO细胞系中表达，尽管其他哺乳动物表达细胞系预期也是有用的。
本发明进一步考虑生成突变体，特别是本发明的ActRII多肽和GDF捕获物多肽的组合突变体组以及截短突变体的方法。组合突变体的库对于鉴定ActRII和GDF捕获物序列尤其有用。筛选此类组合文库的目的可以是生成例如具有改变的性质的多肽变体，所述改变的性质例如改变的药物代谢动力学或改变的配体结合。下文提供了各种筛选测定，并且此类测定可以用于评估变体。例如，可以就下述能力筛选ActRII多肽和GDF捕获物多肽：结合ActRII受体，阻止ActRII配体（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP7、BMP6和/或Nodal）与ActRII多肽的结合，或干扰由ActRII配体引起的信号传导。
还可以在基于细胞或体内测定中测试ActRII多肽或GDF捕获物多肽的活性。例如，可以评价ActRII多肽或GDF捕获物多肽对涉及造血的基因的表达的作用。这可以根据需要在一种或多种重组ActRII配体蛋白（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP7、BMP6和/或Nodal）的存在下进行，并且可以转染细胞以便产生ActRII多肽或GDF捕获物多肽，以及任选的ActRII配体。同样地，可以给小鼠或其他动物施用ActRII多肽或GDF捕获物多肽，并且可以使用领域公认的方法来评价一种或多种血细胞计数测量（例如RBC计数、血红蛋白或网织红细胞）或皮肤溃疡参数。
可以生成组合衍生的变体，其相对于参考ActRII多肽或GDF捕获物多肽具有选择性或一般增加的效力。当从重组DNA构建体表达时，此类变体可以用于基因治疗方案中。同样地，诱变可以产生具有与相应的未经修饰的ActRII多肽或GDF捕获物多肽显著不同的细胞内半衰期的变体。例如，改变的蛋白质可以致使对蛋白酶解降解或其他细胞过程更稳定或更不稳定，其导致未经修饰的多肽的破坏或以其他方式失活。此类变体和编码其的基因可以通过调节多肽的半衰期用于改变ActRII多肽或GDF Trap多肽水平。例如，短半衰期可以产生更瞬时的生物效应，并且当是可诱导表达系统的一部分时，可以允许更严格地控制细胞内的重组ActRII多肽或GDF捕获物多肽水平。在Fc融合蛋白中，可以在接头（如果有的话）和/或Fc部分中进行突变以改变蛋白的半衰期。
可以通过编码多肽文库的基因的简并文库产生组合文库，所述多肽各自包括潜在的ActRII或GDF捕获物序列的至少一部分。例如，合成寡核苷酸的混合物可以酶促连接到基因序列中，使得潜在的ActRII或GDF捕获物多肽编码核苷酸序列的简并集合可作为单个多肽表达，或者作为一组较大的融合蛋白（例如对于噬菌体展示）表达。
存在通过其由简并寡核苷酸序列生成潜在同源物文库的许多方法。简并基因序列的化学合成可以在自动DNA合成仪中进行，并且随后将合成基因连接到适当的载体内用于表达。简并寡核苷酸的合成是本领域众所周知的。参见例如Narang，SA（1983）Tetrahedron39:3；Itakura等人（1981）Recombinant DNA，Proc. 3rd Cleveland Sympos.Macromolecules，编辑AG Walton，Amsterdam：Elsevier 第273-289页；Itakura等人（1984）Annu. Rev. Biochem. 53:323；Itakura等人（1984）Science 198:1056；Ike等人（1983）Nucleic Acid Res. 11:477。此类技术已用于其他蛋白质的定向进化中。参见例如Scott等人，（1990）Science 249:386-390；Roberts等人（1992）PNAS USA 89:2429-2433；Devlin等人（1990）Science 249：404-406；Cwirla等人，（1990）PNAS USA 87：6378-6382；以及美国专利号5,223,409、5,198,346和5,096,815）。
可替代地，可以利用其他形式的诱变来生成组合文库。例如，可以通过使用例如丙氨酸扫描诱变[参见例如Ruf等人（1994）Biochemistry 33:1565-1572；Wang等人（1994）J.Biol. Chem. 269:3095-3099；Balint等人（1993）Gene 137:109-118；Grodberg等人（1993）Eur. J. Biochem. 218:597-601；Nagashima等人（1993）J. Biol. Chem. 268:2888-2892；Lowman等人（1991）Biochemistry 30:10832-10838；和Cunningham等人（1989）Science244:1081-1085]，通过接头扫描诱变（参见例如Gustin等人（1993）Virology 193:653-660；和Brown等人（1992）Mol. Cell Biol. 12:2644-2652；McKnight等人（1982）Science 232:316），通过饱和诱变[参见例如Meyers等人，（1986）Science 232:613]；通过PCR诱变[参见例如Leung等人（1989）Method Cell Mol Biol 1:11-19]；或通过随机诱变，包括化学诱变[参见例如Miller等人（1992）A Short Course in Bacterial Genetics，CSHL Press，ColdSpring Harbor，NY；和Greener等人（1994）Strategies in Mol Biol 7:32-34]，来生成且分离本发明的ActRII多肽或GDF捕获物多肽。接头扫描诱变特别是在组合设置中是用于鉴定ActRII多肽的截短（生物活性）形式的有吸引力的方法。
广泛技术是本领域已知的，用于筛选通过点突变和截短制备的组合文库的基因产物，并且就此而言，用于筛选具有某种性质的基因产物的cDNA文库。此类技术一般适用于快速筛选通过本发明的ActRII多肽或GDF捕获物多肽的组合诱变生成的基因文库。用于筛选大型基因文库的最广泛使用的技术通常包括将基因文库克隆到可复制的表达载体中，用所得到的的载体文库转化适当细胞，并在其中所需活性的检测促进编码检测其产物的基因的载体的相对容易分离的条件下表达组合基因。在一些实施方案中，测定包括ActRII配体（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP7、BMP6和/或Nodal）结合测定和/或ActRII配体介导的细胞信号传导测定。
在某些实施方案中，本发明的ActRII多肽或GDF捕获物多肽还可以包含除天然存在于ActRII（例如ActRIIA或ActRIIB多肽）或GDF捕获物多肽中的任何之外的翻译后修饰。此类修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。因此，ActRII多肽或GDF捕获物多肽可以含有非氨基酸要素，例如聚乙二醇、脂质、多糖或单糖和磷酸盐。此类非氨基酸要素对配体捕获物多肽的功能性的作用可以如本文对于其他ActRII或GDF Trap变体所述的进行测试。当通过切割多肽的新生形式在细胞中产生本发明的多肽时，翻译后加工对于蛋白质的正确折叠和/或功能也可能是重要的。不同的细胞（例如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38、NIH-3T3或HEK293）具有用于此类翻译后活性的特异性细胞机制和特征性机制，并且可以选择以确保ActRII多肽或GDF捕获物多肽的正确修饰和加工。
在某些方面，本发明的ActRII多肽或GDF捕获物多肽包括融合蛋白，其具有ActRII多肽（例如ActRIIA或ActRIIB多肽）或GDF捕获物多肽的至少一部分（结构域）和一个或多个异源部分（结构域）。此类融合结构域的众所周知例子包括但不限于多组氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽S转移酶（GST）、硫氧还蛋白、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链Fc区、麦芽糖结合蛋白（MBP）或人血清白蛋白。可以选择融合结构域以便赋予所需性质。例如，一些融合结构域对于通过亲和层析分离融合蛋白特别有用。为了亲和纯化的目的，使用用于亲和层析的相关基质，例如谷胱甘肽、淀粉酶和镍或钴缀合的树脂。许多此类基质以“药物盒”形式可获得，例如与（HIS6）融合配偶体可一起使用的Pharmacia GST纯化系统和QIAexpressTM系统（Qiagen）。作为另一个例子，可以选择融合结构域以便促进配体捕获物多肽的检测。此类检测结构域的例子包括不同的荧光蛋白（例如GFP）以及“表位标签”，其通常是对于其可获得特异性抗体的短肽序列。对于其可容易获得特异性单克隆抗体的众所周知的表位标签包括FLAG、流感病毒血凝素（HA）和c-myc标签。在一些情况下，融合结构域具有例如关于因子Xa或凝血酶的蛋白酶切割位点，其允许相关蛋白酶部分消化融合蛋白，从而从其中释放重组组合物。随后可以通过后续层析分离从融合结构域中分离释放的蛋白质。在某些实施方案中，ActRII多肽或GDF捕获物多肽与在体内稳定多肽的结构域（“稳定剂”结构域）融合。“稳定”意指增加血清半衰期的任何物质，不管这是否是由于减少的破坏，减少的通过肾的清除或其他药物代谢动力学效应。已知具有免疫球蛋白的Fc部分的融合物对广泛范围的蛋白质赋予期望的药物代谢动力学性质。同样地，与人血清白蛋白的融合可以赋予期望性质。可以选择的其他类型的融合结构域包括多聚化（例如二聚化、四聚化）结构域和功能结构域（其赋予另外的生物学功能，例如进一步刺激肌肉生长）。
在某些实施方案中，本发明提供了包含免疫球蛋白Fc结构域的ActRII或GDF捕获物融合蛋白。在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域是哺乳动物免疫球蛋白结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域是人免疫球蛋白结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域是小鼠免疫球蛋白结构域。在某些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM Fc结构域。在某些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2 Fc结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白Fc结构域是人IgG1 Fc结构域或人IgG2 Fc结构域。
在某些实施方案中，本发明提供了包含下述IgG1 Fc结构域序列的ActRII或GDFTrap融合蛋白：
Figure 529670DEST_PATH_IMAGE023
Figure 412176DEST_PATH_IMAGE024
。
在其他实施方案中，本发明提供了包含IgG1 Fc结构域的下述变体的ActRII或GDF捕获物融合蛋白：
Figure 764660DEST_PATH_IMAGE025
Figure 848153DEST_PATH_IMAGE026
。
任选地，IgG1 Fc结构域具有在诸如Asp-265、赖氨酸322和Asn-434的残基处的一个或多个突变。在某些情况下，具有这些突变（例如Asp-265突变）中的一个或多个的突变型IgG1 Fc结构域相对于野生型Fc结构域具有降低的与Fcγ受体结合的能力。在其他情况下，具有这些突变（例如Asn-434突变）中的一个或多个的突变型Fc结构域具有相对于野生型IgG1 Fc结构域增加的结合MHC I类相关Fc受体（FcRN）的能力。
在某些其他实施方案中，本发明提供了包含IgG2 Fc结构域的变体的ActRII或GDF捕获物融合蛋白，包括下述：
Figure 286088DEST_PATH_IMAGE027
Figure 706705DEST_PATH_IMAGE028
。
应理解融合蛋白的不同要素可以以与所需功能性一致的任何方式排列。例如，ActRII多肽结构域或GDF捕获物多肽结构域可以位于异源结构域的C末端，或可替代地，异源结构域可以位于ActRII多肽结构域或GDF捕获物多肽结构域的C末端。ActRII多肽结构域或GDF捕获物多肽结构域和异源结构域无需在融合蛋白中相邻，并且另外的结构域或氨基酸序列可以包括在任一结构域的C或N末端或结构域之间。
例如，ActRII或GDF捕获物融合蛋白可以包含如式A-B-C中所示的氨基酸序列。B部分对应于ActRII多肽结构域或GDF捕获物多肽结构域。A和C部分可以独立地为零个、一个或超过一个氨基酸，并且A和C部分两者当存在时对于B是异源的。A和/或C部分可以经由接头序列附着至B部分。示例性接头包括短的多肽接头，例如2-10、2-5、2-4、2-3个甘氨酸残基，例如Gly-Gly-Gly接头。其他合适的接头在上文描述[例如，TGGG接头（SEQ ID NO:53）]。在某些实施方案中，ActRII或GDF捕获物融合蛋白包含如式A-B-C中所示的氨基酸序列，其中A是前导（信号）序列，B由ActRII或GDF多肽结构域组成，并且C是增强体内稳定性、体内半衰期、摄取/施用、组织定位或分布、蛋白质复合物的形成和/或纯化中的一种或多种的多肽部分。在某些实施方案中，ActRII或GDF捕获物融合蛋白包含如式A-B-C中所示的氨基酸序列，其中A是TPA前导序列，B由ActRII或GDF多肽结构域组成，并且C是免疫球蛋白Fc结构域。在一些实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID NO: 22、26、29、31、36、38、41、44和51中的任何一个中所示的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本发明的ActRII多肽或GDF捕获物多肽含有能够稳定多肽的一种或多种修饰。例如，此类修饰增强多肽的体外半衰期，增强多肽的循环半衰期和/或减降低多肽的蛋白酶解降解。此类稳定修饰包括但不限于融合蛋白（包括例如包含ActRII多肽结构域或GDF捕获物多肽结构域和稳定结构域的融合蛋白）、糖基化位点的修饰（包括例如糖基化位点对本发明的多肽的添加）、以及碳水化合物部分的修饰（包括例如从本发明的多肽中去除碳水化合物部分）。如本文使用的，术语“稳定剂结构域”不仅指如在融合蛋白的情况下的融合结构域（例如免疫球蛋白Fc结构域），还包括非蛋白质修饰例如碳水化合物部分或非蛋白质部分例如聚乙二醇。
在一些实施方案中，待根据本文所述的方法使用的ActRII多肽和GDF捕获物是分离的多肽。如本文所用，分离的蛋白质或多肽是与其天然环境的组分分开的蛋白质或多肽。在一些实施方案中，本发明的多肽纯化至大于95%、96%、97%、98%或 99%的纯度，如通过例如电泳（例如SDS-PAGE、等电聚焦（IEF）、毛细管电泳）或层析（例如离子交换或反相HPLC）测定的。用于评价抗体纯度的方法是本领域众所周知的。参见例如Flatman等人，（2007）J.Chromatogr. B 848:79-87。
在某些实施方案中，本发明的ActRII多肽和GDF捕获物可以通过各种本领域已知的技术产生。例如，本发明的多肽可以使用标准蛋白质化学技术合成，例如在Bodansky，M.Principles of Peptide Synthesis，Springer Verlag，Berlin（1993）和Grant G. A.（编辑），Synthetic Peptides：A User's Guide，W. H. Freeman and Company，New York（1992）中所述的技术。另外，自动化肽合成仪是商购可得的（参见例如Advanced ChemTechModel 396；Milligen/Biosearch 9600）。可替代地，本发明的多肽，包括其片段或变体，可以使用如本领域众所周知的各种表达系统重组产生（例如大肠杆菌（E. coli）、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、COS细胞、杆状病毒）。在一个进一步的实施方案中，本发明的经修饰的或未经修饰的多肽可以通过使用例如蛋白酶（例如胰蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶或配对的碱性氨基酸转化酶（PACE）），通过消化重组产生的全长ActRII或GDF捕获物多肽来产生。计算机分析（使用商购可得的软件，例如MacVector，Omega，PCGene，MolecularSimulation，Inc.）可以用于鉴定蛋白酶解切割位点。可替代地，可以使用化学切割（例如溴化氰、羟胺等）由重组产生的全长ActRII或GDF捕获物多肽产生此类多肽。
本文公开的ActRII多肽（例如ActRIIA或ActRIIB多肽）中的任何均可与本发明的一种或多种另外的ActRII拮抗剂药物组合，以实现所需效应（例如治疗或预防贫血，治疗或预防一种或多种贫血并发症，例如皮肤溃疡等）。在一些实施方案中，所需效应是治疗一种或多种贫血并发症，例如皮肤溃疡。在一些实施方案中，所需效应是预防一种或多种贫血并发症，例如皮肤溃疡。例如，本文公开的ActRII多肽可以与下述组合使用：i）本文公开的一种或多种另外的ActRII多肽，ii）本文公开的一种或多种GDF捕获物；iii）本文公开的一种或多种ActRII拮抗剂抗体（例如抗激活素A抗体、抗激活素B抗体、抗激活素C抗体、抗激活素E抗体、抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗BMP6抗体、抗BMP7抗体、抗ActRIIA抗体和/或抗ActRIIB抗体）；iv）本文公开的一种或多种小分子ActRII拮抗剂（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和/或ActRIIB中的一种或多种的小分子拮抗剂）；v）本文公开的多核苷酸ActRII拮抗剂中的一种或多种（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和/或ActRIIB中的一种或多种的多核苷酸拮抗剂）；vi）本文公开的一种或多种卵泡抑素多肽；和/或vii）本文公开的一种或多种FLRG多肽。
类似地，本文公开的GDF捕获物中的任何均可与本发明的一种或多种另外的ActRII拮抗剂药物组合，以实现所需效应（例如治疗或预防贫血，治疗或预防一种或多种贫血并发症，例如皮肤溃疡等）。在一些实施方案中，所需效应是治疗一种或多种贫血并发症，例如皮肤溃疡。在一些实施方案中，所需效应是预防一种或多种贫血并发症，例如皮肤溃疡。例如，本文公开的GDF捕获物可以与下述组合使用：i）本文公开的一种或多种另外的GDF捕获物，ii）本文公开的一种或多种ActRII多肽（例如ActRIIA或ActRIIB多肽）；iii）本文公开的一种或多种ActRII拮抗剂抗体（例如抗激活素A抗体、抗激活素B抗体、抗激活素C抗体、抗激活素E抗体、抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗BMP6抗体、抗BMP7抗体、抗ActRIIA抗体和/或抗ActRIIB抗体）；iv）本文公开的一种或多种小分子ActRII拮抗剂（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和/或ActRIIB中的一种或多种的小分子拮抗剂）；v）本文公开的多核苷酸ActRII拮抗剂中的一种或多种（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和/或ActRIIB中的一种或多种的多核苷酸拮抗剂）；vi）本文公开的一种或多种卵泡抑素多肽；和/或vii）本文公开的一种或多种FLRG多肽。
B. 编码ActRII多肽和GDF捕获物的核酸
在某些实施方案中，本发明提供了编码本文公开的ActRII多肽和GDF捕获物多肽（包括其片段、功能变体和融合蛋白）的分离的和/或重组的核酸。例如，SEQ ID NO:12编码天然存在的人ACTRIIA前体多肽，而SEQ ID NO:13编码ActRIIA的经加工的细胞外结构域。另外，SEQ ID NO:7编码天然存在的人ActRIIB前体多肽（上述R64变体），而SEQ ID NO:8编码ActRIIB的经加工的细胞外结构域（上述R64变体）。主题核酸可以是单链或双链的。此类核酸可以是DNA或RNA分子。这些核酸可以用于例如制备本发明的基于ActRII的配体捕获物多肽的方法中。
如本文使用的，分离的核酸指已与其天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括包含在通常含有核酸分子的细胞中的核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或存在于与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
在某些实施方案中，编码本发明的ActRII多肽和GDF捕获物的核酸应理解为包括其为SEQ ID NO: 7、8、12、13、27、32、39、40、42、43、46、47和48中的任何一个的变体的核酸。变体核苷酸序列包括通过一个或多个核苷酸取代、添加或缺失（包括等位基因变体）而不同的序列，并且因此将包括与SEQ ID NO: 7、8、12、13、27、32、39、40、42、43、46、47和48中的任何一个中指定的核苷酸序列不同的编码序列。
在某些实施方案中，本发明的ActRII多肽和GDF捕获物由分离的或重组的核酸序列编码，所述分离的或重组的核酸序列与SEQ ID NO: 7、8、12、13、27、32、39、40、42、43、46、47和48至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%等同。在一些实施方案中，本发明的GDF捕获物不由核酸序列编码，所述核酸序列包含对应于SEQ ID NO: 7、8、12、13、27和32中的任何一个的核苷酸序列中的任何一个，或由对应于SEQ ID NO: 7、8、12、13、27和32中的任何一个的核苷酸序列中的任何一个组成。本领域普通技术人员将了解与SEQ ID NO: 7、8、12、13、27、32、39、42、47和48互补的序列至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%等同的核酸序列或其变体也在本发明的范围内。在进一步的实施方案中，本发明的核酸序列可以与异源核苷酸序列或在DNA文库中分离、重组和/或融合。
在其他实施方案中，本发明的核酸还包括在高度严格条件下与SEQ ID NO: 7、8、12、13、27、32、39、40、42、43、46、47和48中指定的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，SEQ IDNO: 7、8、12、13、27、32、39、40、42、43、46、47和48的互补序列或其片段。如上文讨论的，本领域普通技术人员将容易地理解，可以改变促进DNA杂交的合适的严格条件。本领域普通技术人员将容易地理解，可以改变促进DNA杂交的合适的严格条件。例如，可以在约45℃下在6.0x 氯化钠/柠檬酸钠（SSC）下执行杂交，随后为在50℃下2.0 x SSC的洗涤。例如，洗涤步骤中的盐浓度可以选自在50℃下约2.0 x SSC的低严格性至在50℃下约0.2 x SSC的高严格性。另外，洗涤步骤中的温度可以从在室温、约22℃下的低严格条件增加到在约65℃下的高严格条件。温度和盐两者均可改变，或者温度或盐浓度可以保持恒定，而另一个变量改变。在一个实施方案中，本发明提供了在室温下在6 x SSC的低严格条件下杂交，随后在室温下在2 x SSC下洗涤的核酸。
由于遗传密码中的简并性而与SEQ ID NO: 7、8、12、13、27、32、39、40、42、43、46、47和48中所示的核酸不同的分离的核酸也在本发明的范围内。例如，许多氨基酸由超过一个三联体指定。指定相同氨基酸或同义词（例如CAU和CAC是组氨酸的同义词）的密码子可以导致不影响蛋白质的氨基酸序列的“沉默”突变。然而，预期导致主题蛋白质的氨基酸序列中的变化的DNA序列多态性将存在于哺乳动物细胞中。本领域技术人员将了解由于天然等位基因变异，编码特定蛋白质的核酸的一个或多个核苷酸（高达约3-5%的核苷酸）中的这些变化可存在于给定物种的个体中。任何和所有此类核苷酸变化和所得到的氨基酸多态性在本发明的范围内。
在某些实施方案中，本发明的重组核酸可以可操作地连接到表达构建体中的一种或多种调节核苷酸序列。调节核苷酸序列一般适合于用于表达的宿主细胞。众多类型的合适的表达载体和合适的调节序列在本领域中对于各种宿主细胞是已知的。通常，所述一种或多种调节核苷酸序列可以包括但不限于启动子序列、前导序列或信号序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列、以及增强子或激活子序列。本发明考虑了如本领域已知的组成型或诱导型启动子。启动子可以是天然存在的启动子，或组合超过一个启动子元件的杂合启动子。表达构建体可以存在于细胞中的附加体（例如质粒）上，或表达构建体可以插入染色体中。在一些实施方案中，表达载体含有可选择标记物基因以允许选择转化的宿主细胞。可选择标记物基因是本领域众所周知的，并且将随所使用的宿主细胞而变。
在本发明的某些方面，主题核酸在包含编码ActRII多肽或GDF捕获物的核苷酸序列的表达载体中提供，并可操作地连接于至少一种调节序列。调节序列是本领域公认的，并被选择以指导ActRII或GDF捕获物多肽的表达。因此，术语调节序列包括启动子、增强子和其他表达控制元件。示例性调节序列在Goeddel；Gene Expression Technology： Methods in Enzymology，Academic Press，San Diego，CA（1990）中描述。例如，当可操作地连接到DNA序列时，控制DNA序列表达的广泛多样的表达控制序列中的任何均可用于这些载体中，以表达编码ActRII或GDF捕获物多肽的DNA序列。此类有用的表达控制序列包括例如SV40的早期和晚期启动子、tet启动子、腺病毒或巨细胞病毒立即早期启动子、RSV启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、其表达由T7 RNA聚合酶指导的T7启动子、噬菌体λ的主要操纵子和启动子区、关于fd外壳蛋白的控制区、关于3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子例如Pho5、酵母α-交配因子的启动子、杆状病毒系统的多角体启动子以及已知控制原核或真核细胞或其病毒的基因表达的其他序列、及其各种组合。应当理解表达载体的设计可以取决于此类因素如待转化的宿主细胞的选择和/或期望表达的蛋白质的类型等。此外，还应考虑载体的拷贝数、控制该拷贝数的能力和由载体编码的任何其他蛋白质例如抗生素标记物的表达。
本发明的重组核酸可以通过将克隆的基因或其部分连接到适合于在原核细胞、真核细胞（酵母、鸟类、昆虫或哺乳动物）或两者中表达的载体内来产生。用于产生重组ActRII或GDF捕获物多肽的表达载体包括质粒和其他载体。例如，合适的载体包括下述类型的质粒：pBR322衍生的质粒、pEMBL衍生的质粒、pEX衍生的质粒、pBTac衍生的质粒和pUC衍生的质粒，用于在原核细胞例如大肠杆菌中表达。
一些哺乳动物表达载体含有促进载体在细菌中增殖的原核序列，以及在真核细胞中表达的一个或多个真核转录单位两者。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo和pHyg衍生载体是适合于转染真核细胞的哺乳动物表达载体的例子。这些载体中的一些用来自细菌质粒（例如pBR322）的序列进行修饰，以促进在原核和真核细胞两者中的复制和药物抗性选择。可替代地，病毒例如牛乳头瘤病毒（BPV-1）或EB病毒（pHEBo、pREP衍生的和p205）的衍生物可以用于在真核细胞中瞬时表达蛋白质。其他病毒（包括逆转录病毒）表达系统的例子可以在下文的基因治疗递送系统的描述中找到。在质粒的制备和宿主生物体的转化中采用的各种方法是本领域众所周知的。对于用于原核和真核细胞两者的其他合适的表达系统，以及一般重组程序。参见例如Molecular Cloning A Laboratory Manual，第3版，由Sambrook、Fritsch和Maniatis编辑（Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001）。在一些情况下，可能期望通过使用杆状病毒表达系统来表达重组多肽。此类杆状病毒表达系统的例子包括pVL衍生的载体（例如pVL1392、pVL1393和pVL941）、pAcUW衍生的载体（例如pAcUW1）和pBlueBac衍生的载体（例如含有βgal的pBlueBac III）。
在一些实施方案中，载体将设计用于在CHO细胞中生产主题ActRII或GDF Trap多肽，例如Pcmv-Script载体（Stratagene，La Jolla，Calif.）、pcDNA4载体（Invitrogen，Carlsbad，Calif.）、和pCI-neo载体（Promega，Madison，Wisc.）。显而易见的是，主题基因构建体可以用于引起主题ActRII多肽在培养中繁殖的细胞中的表达，例如以产生用于纯化的蛋白质，包括融合蛋白或变体蛋白质。
本发明还涉及用包括一种或多种主题ActRII或GDF捕获物多肽的编码序列的重组基因转染的宿主细胞。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。例如，本发明的ActRII或GDF捕获物多肽可以在细菌细胞例如大肠杆菌、昆虫细胞（例如使用杆状病毒表达系统）、酵母或哺乳动物细胞 [例如，中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系]中表达。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
相应地，本发明进一步涉及产生主题ActRII和GDF捕获物多肽的方法。例如，用编码ActRII或GDF捕获物多肽的表达载体转染的宿主细胞可以在适当的条件下培养，以允许ActRII或GDF捕获物多肽的表达发生。多肽可以从含有多肽的细胞和培养基的混合物中分泌且分离。可替代地，ActRII或GDF捕获物多肽可以保留在细胞质中或膜部分中，并且将细胞收获、裂解并分离蛋白质。细胞培养物包括宿主细胞、培养基和其他副产物。用于细胞培养的合适培养基是本领域众所周知的。使用本领域已知的用于纯化蛋白质的技术，包括离子交换层析、凝胶过滤层析、超滤、电泳、使用对于ActRII或GDF捕获物多肽的特定表位的特异性抗体的免疫亲和纯化、以及用结合融合至ActRII或GDF捕获物多肽的结构域的药物的亲和纯化（例如蛋白A柱可以用于纯化ActRII-Fc或GDF捕获物-Fc融合蛋白），可以从细胞培养基，宿主细胞或两者中分离主题多肽。在一些实施方案中，ActRII或GDF捕获物多肽是含有促进其纯化的结构域的融合蛋白。
在一些实施方案中，纯化通过一系列柱层析步骤实现，包括例如以任何次序的下述中的三种或更多种：蛋白A层析、Q琼脂糖层析、苯基琼脂糖层析、尺寸排阻层析和阳离子交换层析。纯化可以用病毒过滤和缓冲液交换完成。ActRII-Fc或GDF捕获物-Fc蛋白可以纯化至如通过尺寸排阻层析测定的>90%、>95%、>96%、>98%或>99%的纯度，或者如通过SDSPAGE测定的>90%、>95%、>96%、>98%或>99%的纯度。纯度的靶水平应当是足以在哺乳动物系统，特别是非人灵长类动物、啮齿动物（小鼠）和人中实现期望结果的水平。
在另一个实施方案中，编码纯化前导序列的融合基因，例如在重组ActRII或GDF捕获物多肽的所需部分的N末端处的聚（His）/肠激酶裂解位点序列，可允许通过使用Ni2+金属树脂的亲和层析来纯化表达的融合蛋白。随后可以通过用肠激酶处理后续去除纯化前导序列，以提供纯化的ActRII或GDF捕获物多肽。参见例如Hochuli等人（1987）J. Chromatography 411:177；和Janknecht等人（1991）PNAS USA 88:8972。
用于制备融合基因的技术是众所周知的。基本上，编码不同多肽序列的不同DNA片段的连接根据常规技术执行，采用用于连接的平端或交错末端，限制酶消化以提供合适的末端，适当地填充粘性末端，碱性磷酸酶处理以避免不期望的连接，以及酶连接。在另一个实施方案中，融合基因可以通过常规技术包括自动化DNA合成仪合成。可替代地，可以使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物在两个连续的基因片段之间产生互补突出端，随后可以使所述互补突出端退火以生成嵌合基因序列。参见例如Current Protocolsin Molecular Biology，编辑Ausubel等人，John Wiley & Sons：1992。
C. 抗体拮抗剂
在某些方面，本发明涉及拮抗ActRII活性（例如抑制ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3和/或SMAD 1/5/8信号传导）的抗体或抗体组合。特别地，本发明提供了使用抗体ActRII拮抗剂或抗体ActRII拮抗剂组合来例如治疗或预防有此需要的受试者中的贫血，和/或治疗或预防一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用抗体ActRII拮抗剂或抗体ActRII拮抗剂组合来治疗有此需要的受试者中的贫血，和/或治疗患有贫血的受试者中的一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用抗体ActRII拮抗剂或抗体ActRII拮抗剂组合来预防有此需要的受试者中的贫血，和/或预防患有贫血的受试者中的一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡的方法。
在某些实施方案中，本发明的抗体ActRII拮抗剂是结合和/或抑制至少GDF11的活性（例如GDF11介导的ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导的激活）的抗体或抗体组合。任选地，抗体或抗体组合进一步结合和/或抑制GDF8的活性（例如GDF8介导的ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导的激活），特别是在对于GDF11和GDF8两者具有结合亲和力的多特异性抗体的情况下，或者在一种或多种抗GDF11抗体和一种或多种抗GDF8抗体的组合的上下文中。任选地，本发明的抗体或抗体组合基本上不结合和/或抑制激活素A的活性（例如激活素A介导的ActRIIA或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导的激活）。在一些实施方案中，结合和/或抑制GDF11和/或GDF8活性的本发明的抗体或抗体组合进一步结合和/或抑制激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7和Nodal中的一种或多种（例如ActRIIA或ActRIIB、SMAD 2/3和/或SMAD 1/5/8信号传导的激活），特别是在对于多重ActRII配体具有结合亲和力的多特异性抗体的情况下，或在各自具有对于不同ActRII配体的结合亲和力的多重抗体组合的上下文中。
在某些方面，本发明的ActRII拮抗剂是结合和/或抑制至少GDF8的活性（例如GDF8介导的ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导的激活）的抗体或抗体组合。任选地，抗体或抗体组合进一步结合和/或抑制GDF11的活性（例如GDF11介导的ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导的激活），特别是在对于GDF8和GDF11两者具有结合亲和力的多特异性抗体的情况下，或者在一种或多种抗GDF8抗体和一种或多种抗GDF11抗体的组合的上下文中。任选地，本发明的抗体或抗体组合基本上不结合和/或抑制激活素A的活性（例如激活素A介导的ActRIIA或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导的激活）。在一些实施方案中，结合和/或抑制GDF8和/或GDF11活性的本发明的抗体或抗体组合进一步结合和/或抑制激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7和Nodal中的一种或多种（例如ActRIIA或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3和/或SMAD 1/5/8信号传导的激活），特别是在对于多重ActRII配体具有结合亲和力的多特异性抗体的情况下，或在各自具有对于不同ActRII配体的结合亲和力的组合多重抗体的上下文中。
在另一个方面，本发明的ActRII拮抗剂是结合和/或抑制ActRII受体（例如ActRIIA或ActRIIB受体）活性的抗体或抗体组合。在一些实施方案中，本发明的抗ActRII受体抗体（例如抗ActRIIA或抗ActRIIB受体抗体）或抗体组合结合ActRII受体并阻止通过至少GDF11的ActRII受体的结合和/或激活（例如GDF11介导的ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导的激活）。任选地，本发明的抗ActRII受体抗体或抗体组合进一步阻止通过GDF8的ActRII受体结合和/或激活。任选地，本发明的抗ActRII受体抗体或抗体组合基本上不抑制激活素A结合和/或激活ActRII受体。在一些实施方案中，结合ActRII受体并阻止通过GDF11和/或GDF8的ActRII受体结合和/或激活的本发明的抗ActRII受体抗体或抗体组合进一步阻止通过激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7和Nodal中的一种或多种的ActRII受体结合和/或激活。
术语抗体在本文中以最广泛的含义使用，并且涵盖不同抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体）和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性。抗体片段指除完整抗体外的分子，其包含结合完整抗体与之结合的抗原的完整抗体的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F（ab'）2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子（例如scFv）；和由抗体片段形成的多特异性抗体。参见例如Hudson等人（2003）Nat. Med. 9:129-134；Plückthun，The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑（Springer-Verlag，New York），第269-315页（1994）；WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894、5,587,458和5,869,046。本文公开的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。在某些实施方案中，本发明的抗体包含附着于其并能够被检测的标记（例如标记可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子）。在一些实施方案中，本发明的抗体是分离的抗体。
双抗体是具有可以是二价或双特异性的两个抗原结合位点的抗体片段。参见例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人（2003）Nat. Med. 9:129-134（2003）；和Hollinger等人（1993）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90：6444-6448。三抗体和四抗体也在Hudson等人（2003）Nat. Med. 9:129-134中描述。
单结构域抗体是包含抗体的重链可变结构域的全部或部分或者轻链可变结构域的全部或部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。参见例如美国专利号6,248,516。
抗体片段可以通过不同技术进行制备，所述技术包括但不限于完整抗体的蛋白酶解消化以及通过重组宿主细胞（例如大肠杆菌或噬菌体）的产生，如本文描述的。
本文的抗体可以是任何类别。抗体的类别指由其重链具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几个可以进一步分为亚类（同种型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域称为α，δ，ε，γ和μ。
一般而言，用于本文公开的方法中的抗体特异性结合其靶抗原，优选具有高结合亲和力。亲和力可以表示为KD值并反映固有的结合亲和力（例如具有最低限度的亲合力效应）。通常，在体外测量结合亲和力，无论是在无细胞还是细胞相关设置中。本领域已知的多种测定法中的任何，包括本文公开的那些，可以用于获得结合亲和力测量，包括例如表面等离子体共振（Biacore™测定）、放射性标记的抗原结合测定（RIA）和ELISA。在一些实施方案中，本发明的抗体结合其靶抗原（例如GDF11、GDF8、ActRIIA、ActRIIB等），其具有至少1x10-7或更强、1x10-8或更强、1x10-9或更强、1x10-10或更强、1x10-11或更强、1x10-12或更强、1x10-13或更强、或者1x10-14或更强的KD。
在某些实施方案中，通过用Fab形式的目的抗体及其靶抗原执行的RIA测量KD，如通过下述测定所述。通过在滴定系列的未标记抗原的存在下用最低限度浓度的放射性标记的抗原（例如125I标记的）平衡Fab，随后用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原，来测量Fab对于抗原的溶液结合亲和力。参见例如Chen等人（1999）J. Mol. Biol. 293:865-881。为了建立用于测定的条件，用捕获抗Fab抗体（例如来自Cappel Labs）包被（例如过夜）多孔板（例如来自Thermo Scientific的MICROTITER®），并且随后用牛血清白蛋白封闭，优选在室温（大约23℃）下。在非吸附板中，将放射性标记的抗原与目的Fab的系列稀释物混合（例如与Presta等人，（1997）Cancer Res. 57:4593-4599中的抗VEGF抗体，Fab-12的评价一致]。随后温育目的Fab，优选过夜，但温育可以持续更长的时期（例如约65小时），以确保达到平衡。其后，将混合物转移至捕获板用于温育，优选在室温下约一小时。随后去除溶液，将板洗涤几次，优选用聚山梨醇酯20和PBS混合物。当板已干燥时，加入闪烁剂（例如来自Packard的MICROSCINT®），并在γ计数器（例如来自Packard的TOPCOUNT®）上计数板。
根据另一个实施方案，使用例如具有以约10个响应单位（RU）的固定化抗原CM5芯片的BIACORE® 2000或BIACORE® 3000（Biacore，Inc.，Piscataway，N.J.），使用表面等离子体共振测定测量KD。简言之，根据供应商的说明书，用N-乙基-N' -（3-二甲基氨基丙基）-碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）激活羧甲基化右旋糖酐生物传感器芯片（CM5，Biacore Inc.）。例如，可以在以5 μl/分钟的流速注射以实现大约10个响应单位（RU）的偶联蛋白前，用10 mM乙酸钠，pH 4.8将抗原稀释至5 μg/ml（约0.2 μM）。在注射抗原后，注射1 M乙醇胺以封闭未反应的基团。对于动力学测量，将Fab（0.78 nM至500 nM）的两倍系列稀释物以大约25 μl/分钟的流速注射到具有0.05%聚山梨醇酯20（TWEEN-20®）表面活性剂的PBS（PBST）中。使用例如简单的一对一兰米尔结合模型（BIACORE® EvaluationSoftware版本3.2），通过同时拟合结合和解离传感图，来计算结合速率（kon）和解离速率（kon）。平衡解离常数（KD）计算为比率koff/kon。参见例如Chen等人，（1999）J. Mol. Biol.293:865-881。如果结合速率通过上述表面等离子体共振测定超过例如106 M-1 s-1，则结合速率可以通过使用荧光淬灭技术进行测定，所述荧光淬灭技术测量在增加浓度的抗原的存在下在PBS中的20 nM抗抗原抗体（Fab形式）的荧光发射强度（例如激发= 295 nm；发射=340 nm，16 nm带通）中的增加或降低，如在光谱仪中测量的，所述光谱仪例如装备有截止流量的分光光度计（Aviv Instruments ）或具有搅拌比色杯的8000系列SLM-AMINCO分光光度计®（ThermoSpectronic）。
如本文使用的，抗GDF11抗体一般指能够以足够的亲和力结合GDF11的抗体，使得抗体可用作靶向GDF11的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗GDF11抗体与不相关的非GDF11蛋白的结合程度小于约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于1%的抗体与GDF11的结合，如例如通过放射性免疫测定（RIA）测量。在某些实施方案中，抗GDF11抗体结合来自不同物种的在GDF11中保守的GDF11表位。在某些实施方案中，本发明的抗GDF11抗体是可以抑制GDF11活性的拮抗剂抗体。例如，本发明的抗GDF11抗体可以抑制GDF11与同源受体（例如ActRIIA或ActRIIB受体）的结合，和/或抑制GDF11介导的同源受体的信号转导（激活）例如通过ActRIIA和/或ActRIIB受体的SMAD2/3信号传导。在一些实施方案中，本发明的抗GDF11抗体基本上不结合和/或抑制激活素A的活性。应当注意GDF11与GDF8具有高序列同源性，并且因此结合和/或结合GDF11的抗体在一些情况下还可以结合和/或抑制GDF8。
抗GDF8抗体指能够以足够的亲和力结合GDF8的抗体，使得抗体可用作靶向GDF8的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗GDF8抗体与不相关的非GDF8蛋白的结合程度小于约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于1%的抗体与GDF8的结合，如例如通过放射性免疫测定（RIA）测量。在某些实施方案中，抗GDF8抗体结合来自不同物种的在GDF8中保守的GDF8表位。在某些实施方案中，本发明的抗GDF8抗体是可以抑制GDF8活性的拮抗剂抗体。例如，本发明的抗GDF8抗体可以抑制GDF8与同源受体（例如ActRIIA或ActRIIB受体）的结合，和/或抑制GDF8介导的同源受体的信号转导（激活）例如通过ActRIIA和/或ActRIIB受体的SMAD2/3信号传导。在一些实施方案中，本发明的抗GDF8抗体基本上不结合和/或抑制激活素A的活性。应当注意GDF8与GDF11具有高序列同源性，并且因此结合和/或结合GDF8的抗体在许多情况下还可以结合和/或抑制GDF11。
抗ActRIIA 抗体指能够以足够的亲和力结合ActRIIA 的抗体，使得抗体可用作靶向ActRIIA 的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗ActRIIA 抗体与不相关的非ActRIIA 蛋白的结合程度小于约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于1%的抗体与ActRIIA 的结合，如例如通过放射性免疫测定（RIA）测量。在某些实施方案中，抗ActRIIA抗体结合来自不同物种的在ActRIIA 中保守的ActRIIA 表位。在某些实施方案中，本发明的抗ActRIIA 抗体是可以抑制ActRIIA 活性的拮抗剂抗体。例如，本发明的抗ActRIIA 抗体可以抑制选自激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、激活素A、BMP6和BMP7中的一种或多种ActRIIA配体结合ActRIIA受体，和/或抑制这些配体之一激活ActRIIA信号传导（例如SMAD2/3和/或SMAD 1/5/8 ActRIIA信号传导）。在一些实施方案中，本发明的抗ActRIIA抗体抑制GDF11结合ActRIIA受体和/或抑制GDF11激活ActRIIA信号传导。任选地，本发明的抗ActRIIA抗体进一步抑制GDF8结合ActRIIA受体和/或抑制GDF8激活ActRIIA信号传导。任选地，本发明的抗ActRIIA抗体基本上不抑制激活素A与ActRIIA受体的结合和/或基本上不抑制激活素A介导的ActRIIA信号传导的激活。在一些实施方案中，抑制GDF11和/或GDF8结合和/或激活ActRIIA受体的本发明的抗ActRIIA抗体进一步抑制激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、激活素A、GDF8、BMP6和BMP7中的一种或多种结合和/或激活ActRIIA受体。
抗ActRIIB 抗体指能够以足够的亲和力结合ActRIIB 的抗体，使得抗体可用作靶向ActRIIB 的诊断剂和/或治疗剂。在某些实施方案中，抗ActRIIB 抗体与不相关的非ActRIIB 蛋白的结合程度小于约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或小于1%的抗体与ActRIIB 的结合，如例如通过放射性免疫测定（RIA）测量。在某些实施方案中，抗ActRIIB抗体结合来自不同物种的在ActRIIB 中保守的ActRIIB 表位。在某些实施方案中，本发明的抗ActRIIB 抗体是可以抑制ActRIIB 活性的拮抗剂抗体。例如，本发明的抗ActRIIB 抗体可以抑制选自激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、GDF11、GDF8、激活素A、BMP6和BMP7中的一种或多种ActRIIB配体结合ActRIIB受体，和/或抑制这些配体之一激活ActRIIB信号传导（例如SMAD2/3和/或SMAD 1/5/8 ActRIIB信号传导）。在一些实施方案中，本发明的抗ActRIIB抗体抑制GDF11结合ActRIIB受体和/或抑制GDF11激活ActRIIB信号传导。任选地，本发明的抗ActRIIB抗体进一步抑制GDF8结合ActRIIB受体和/或抑制GDF8激活ActRIIB信号传导。任选地，本发明的抗ActRIIB抗体基本上不抑制激活素A与ActRIIB受体的结合和/或基本上不抑制激活素A介导的ActRIIB信号传导的激活。在一些实施方案中，抑制GDF11和/或GDF8结合和/或激活ActRIIB受体的本发明的抗ActRIIB抗体进一步抑制激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、激活素A、GDF8、BMP6和BMP7中的一种或多种结合和/或激活ActRIIB受体。
人GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、GDF8、BMP6、BMP7、ActRIIB和ActRIIA的核酸和氨基酸序列是本领域众所周知的，并且因此用于根据本发明使用的抗体拮抗剂可以通过技术人员基于本领域的知识和本文提供的教导照常规进行制备。
在某些实施方案中，本文提供的抗体（例如抗GDF11抗体，抗GDF8抗体，抗ActRIIA抗体或抗ActRIIB抗体）是嵌合抗体。嵌合抗体指其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分衍生自不同来源或物种的抗体。某些嵌合抗体例如在美国专利4,816,567；和Morrison等人，（1984）Proc. Natl. Acad. Sci. USA，81:6851-6855中描述。在一些实施方案中，嵌合抗体包含非人可变区（例如衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物例如猴的可变区）和人恒定区。在一些实施方案中，嵌合抗体是其中类别或亚类已从亲本抗体的类别或亚类改变的“类别转换”抗体。一般而言，嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，本文提供的嵌合抗体（例如抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗ActRIIA抗体或抗ActRIIB抗体）是人源化抗体。人源化抗体指包含来自非人高变区（HVR）的氨基酸残基和来自人构架区（FR）的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少一个且通常为两个可变结构域的基本上全部，其中HVR（例如CDR）的全部或基本上全部对应于非人抗体的那些，并且FR的全部或基本上全部对应于人抗体的FR。人源化抗体任选可以包含衍生自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。抗体例如非人抗体的“人源化形式”指已经历人源化的抗体。
人源化抗体及其制备方法例如在Almagro和Fransson（2008）Front. Biosci. 13:1619-1633中综述，并且例如在Riechmann等人，（1988）Nature 332:323-329；Queen等人（1989）Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，（2005）Methods 36:25-34 [描述SDR（a-CDR）移植]；Padlan，Mol. Immunol.（1991）28:489-498（描述“表面重建”）；Dall'Acqua等人（2005）Methods 36:43-60（描述“FR改组”）；Osbourn等人（2005）Methods 36：61-68；和Klimka等人Br. J. Cancer（2000）83:252-260（描述FR改组的“引导选择”方法）中进一步描述。
可以用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的构架区[参见例如Sims等人（1993）J. Immunol. 151:2296]；衍生自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的构架区[参见例如Carter等人（1992）Proc. Natl. Acad. Sci.USA，89:4285；和Presta等人（1993）J. Immunol.，151:2623]；人成熟（体细胞突变）构架区或人种系构架区[参见例如Almagro和Fransson（2008）Front. Biosci. 13:1619-1633]；以及衍生自筛选FR文库的构架区（参见例如Baca等人，（1997）J. Biol. Chem. 272:10678-10684；和Rosok等人，（1996）J. Biol. Chem. 271:22611-22618）。
在某些实施方案中，本文提供的抗体（例如抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗ActRIIA抗体或抗ActRIIB抗体）是人抗体。人抗体可以使用本领域已知的不同技术产生。人抗体一般在van Dijk和van de Winkel（2001）Curr. Opin. Pharmacol. 5：368-74和Lonberg（2008），Curr. Opin. Immunol. 20:450-459中描述。
人抗体可以通过将免疫原（例如GDF11多肽、GDF8多肽、ActRIIA多肽或ActRIIB多肽）施用于转基因动物进行制备，所述转基因动物已进行修饰以响应抗原攻击产生完整的人抗体或具有人可变区的完整抗体。此类动物通常含有人免疫球蛋白基因座的全部或一部分，其替换内源性免疫球蛋白基因座，或者存在于染色体外或随机整合到动物的染色体内。在此类转基因动物中，内源性免疫球蛋白基因座一般已失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见例如Lonberg（2005）Nat. Biotechnol. 23:1117-1125；美国专利号6,075,181和6,150,584（描述XENOMOUSE™技术）；美国专利号5,770,429（描述HuMab®技术）；美国专利号7,041,870（描述K-M MOUSE®技术）；和美国专利申请公开号2007/0061900（描述VelociMouse®技术）。来自由此类动物生成的完整抗体的人可变区可以例如通过与不同的人恒定区组合进一步进行修饰。
本文提供的人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法进行制备。已描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系。参见例如Kozbor J. Immunol.,（1984）133：3001；Brodeur等人（1987）Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications，第51-63页，Marcel Dekker，Inc.，New York；和Boerner等人（1991）J.Immunol.，147：86；经由人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体也在Li等人，（2006）Proc. Natl.Acad. Sci. USA，103:3557-3562中描述。另外的方法包括例如在美国专利号7,189,826（描述了从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体）和Ni，Xiandai Mianyixue（2006）26（4）:265-268（2006）（描述人-人杂交瘤）中描述的那些。人杂交瘤技术（三源杂交瘤技术）也在Vollmers和Brandlein（2005）Histol. Histopathol.，20（3）:927-937（2005）以及Vollmers和Brandlein（2005）Methods Find Exp. Clin. Pharmacol.，27（3）:185-91中描述。
本文提供的人抗体（例如抗GDF11抗体、抗激活素B抗体、抗ActRIIA抗体或抗ActRIIB抗体）也可以通过分离选自人衍生的噬菌体显示文库的Fv克隆可变结构域序列来生成。随后可以将此类可变结构域序列与所需的人恒定结构域组合。本文描述了用于从抗体文库中选择人抗体的技术。
例如，本发明的抗体可以通过在组合文库中筛选具有所需活性的抗体进行分离。本领域已知用于生成噬菌体展示文库并在此类文库中筛选具有所需结合特征的抗体的各种方法。此类方法例如在Hoogenboom等人（2001）Methods in Molecular Biology 178:1-37，O'Brien等人，编辑，Human Press，Totowa，N.J.中综述，并且进一步例如在下述中描述：McCafferty等人（1991）Nature 348:552-554；Clackson等人，（1991）Nature 352：624-628；Marks等人（1992）J. Mol. Biol. 222:581-597；Marks和Bradbury（2003）in Methods inMolecular Biology 248:161-175，Lo，编辑，Human Press，Totowa，N.J.；Sidhu等人（2004）J. Mol. Biol. 338（2）:299-310；Lee等人（2004）J. Mol. Biol. 340（5）:1073-1093；Fellouse（2004）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101（34）:12467-12472；和Lee等人（2004）J. Immunol. Methods 284（1-2）：119-132。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链反应（PCR）分开克隆VH和VL基因的储库，并在噬菌体文库中随机重组，随后可以在所述噬菌体文库中筛选抗原结合噬菌体，如Winter等人（1994）Ann. Rev. Immunol.，12：433-455中所述。噬菌体通常展示作为单链Fv（scFv）片段或Fab片段的抗体片段。来自免疫来源的文库提供了针对免疫原（例如GDF11、激活素B、ActRIIA或ActRIIB）的高亲和力抗体，而无需构建杂交瘤。可替代地，可以克隆（例如来自人）天然储库，以提供针对广泛范围的非自身抗体以及自身抗原的单一抗体来源，而无需任何免疫接种，如通过Griffiths等人（1993）EMBO J，12：725-734描述的。最后，也可以通过克隆来自干细胞的未重排的V基因区段并使用含有随机序列的PCR引物来合成制备天然文库，以编码高度可变的CDR3区并在体外完成重排，如通过Hoogenboom和Winter（1992）J.Mol. Biol.，227：381-388描述的。描述人抗体噬菌体文库的专利出版物包括例如：美国专利号5,750,373和美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体（通常为单克隆抗体）对于在一种或多种（例如两种、三种、四种、五种、六种或更多种）抗原上的至少两个不同表位（例如两个、三个、四个、五个、或者六个或更多个）具有结合特异性。
在某些实施方案中，本发明的多特异性抗体包含两种或更多种结合特异性，其中所述结合特异性中的至少一种针对GDF11表位，并且任选地一种或多种另外的结合特异性针对不同ActRII配体（例如GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6BMP7和/或Nodal）和/或ActRII受体（例如ActRIIA和/或ActRIIB受体）上的表位。在某些实施方案中，多特异性抗体可以结合GDF11的两个或更多个不同表位。优选地，本发明的多特异性抗体（其部分地对于GDF11表位具有结合亲和力）可以用于抑制GDF11活性（例如结合和/或激活ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力），并且任选地抑制一种或多种不同的ActRII配体（例如GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7和/或Nodal）和/或ActRII受体（例如ActRIIA和/或ActRIIB受体）的活性。在某些实施方案中，结合和/或抑制GDF11的本发明的多特异性抗体进一步结合和/或抑制至少GDF8。任选地，结合和/或抑制GDF11的本发明的多特异性抗体基本上不结合和/或基本上不抑制激活素A。在一些实施方案中，结合和/或抑制GDF11和GDD8的本发明的多特异性抗体进一步结合和/或抑制激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7和/或Nodal中的一种或多种。
在某些实施方案中，本发明的多特异性抗体包含两种或更多种结合特异性，其中所述结合特异性中的至少一种针对GDF8表位，并且任选地一种或多种另外的结合特异性针对不同ActRII配体（例如GDF11、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6 BMP7和/或Nodal）和/或ActRII受体（例如ActRIIA和/或ActRIIB受体）上的表位。在某些实施方案中，多特异性抗体可以结合GDF8的两个或更多个不同表位。优选地，本发明的多特异性抗体（其部分地对于GDF8表位具有结合亲和力）可以用于抑制GDF8活性（例如结合和/或激活ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力），并且任选地抑制一种或多种不同的ActRII配体（例如GDF11、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7和/或Nodal）和/或ActRII受体（例如ActRIIA和/或ActRIIB受体）的活性。在某些实施方案中，结合和/或抑制GDF8的本发明的多特异性抗体进一步结合和/或抑制至少GDF11。任选地，结合和/或抑制GDF8的本发明的多特异性抗体基本上不结合和/或基本上不抑制激活素A。在一些实施方案中，结合和/或抑制GDF8和GDD11的本发明的多特异性抗体进一步结合和/或抑制激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7和/或Nodal中的一种或多种。
本文还包括具有三个或更多个功能抗原结合位点的经工程改造的抗体，包括“章鱼抗体（Octopus antibodies）”。参见例如US 2006/0025576A1。
在某些实施方案中，本文公开的抗体（例如抗GDF11抗体、抗激活素B抗体、抗ActRIIA抗体或抗ActRIIB抗体）是单克隆抗体。单克隆抗体指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即群体包含的单个抗体是等同的和/或结合相同的表位，除了例如含有天然存在或在单克隆抗体制剂生产期间出现的突变的可能变体抗体之外，此类变体一般以少量存在。与通常包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂形成对比，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单个表位。因此，修饰语“单克隆”指示如从基本上同质的抗体群体中获得的抗体特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，待根据本文方法使用的单克隆抗体可以通过各种技术进行制备，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，此类方法和用于制备单克隆抗体的其他示例性方法在本文中描述。
例如，通过使用衍生自GDF11或GDF8的免疫原，可以通过标准方案制备抗蛋白/抗肽抗血清或单克隆抗体。参见例如Antibodies：A Laboratory Manual（1988）由Harlow和Lane编辑，Cold Spring Harbor Press：1988。可以用免疫原性形式的GDF11或GDF8多肽、能够引发抗体应答的抗原性段或融合蛋白来免疫哺乳动物，例如小鼠、仓鼠或兔。用于对蛋白质或肽赋予免疫原性的技术包括与载体缀合或本领域众所周知的其他技术。GDF11或GDF8多肽的免疫原性部分可以在佐剂的存在下进行施用。可以通过检测血浆或血清中的抗体滴度来监测免疫接种的进展。标准ELISA或其他免疫测定可以与作为抗原的免疫原一起使用，以评价抗体产生的水平和/或结合亲和力的水平。
在用GDF11或GDF8的抗原制剂给动物免疫接种后，可以获得抗血清，并且如果需要，则可以从血清中分离多克隆抗体。为了产生单克隆抗体，可以从免疫动物中收获抗体产生细胞（淋巴细胞），并通过标准体细胞融合程序与永生化细胞（例如骨髓瘤细胞）融合以产生杂交瘤细胞。此类技术是本领域众所周知的，并且包括例如杂交瘤技术[参见例如Kohler和Milstein（1975）Nature，256：495-497]、人B细胞杂交瘤技术[参见例如Kozbar等人（1983）Immunology Today，4:72]和EBV杂交瘤技术来产生人单克隆抗体[Cole等人（1985）Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R. Liss，Inc.第77-96页]。可以免疫化学筛选杂交瘤细胞用于产生与GDF11或GDF8多肽特异性反应的抗体，和从包含此类杂交瘤细胞的培养物中分离的单克隆抗体。
在某些实施方案中，可以将一种或多种氨基酸修饰引入本文提供的抗体（例如抗GDF11抗体、抗激活素B抗体、抗ActRIIA抗体或抗ActRIIB抗体 ）的Fc区内，从而生成Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰（例如取代，、缺失和/或添加）的人Fc区序列（例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区）。
例如，本发明考虑了具有一些但不是全部效应子功能的抗体变体，这使其成为应用的期望候选物，在所述应用中抗体的体内半衰期是重要的，但对于其某些效应子功能[例如补体依赖性细胞毒性（CDC）和抗体依赖性细胞毒性（ADCC）]是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以证实CDC和/或ADCC活性的降低/耗尽。例如，可以进行Fc受体（FcR）结合测定，以确保抗体缺乏FcγR结合（因此可能缺乏ADCC活性），但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达在例如Ravetch和Kinet（1991）Annu. Rev.Immunol. 9:457-492中概括。评价目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性例子在美国专利号5,500,362；Hellstrom，I.等人（1986）Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063]；Hellstrom，I等人（1985）Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502；美国专利号5,821,337；和Bruggemann，M.等人（1987）J. Exp. Med. 166:1351-1361中描述。可替代地，可以采用非放射性测定方法（例如ACTI™，用于流式细胞术的非放射性细胞毒性测定；CellTechnology，Inc. Mountain View，Calif.；和CytoTox 96®非放射性细胞毒性测定，Promega，Madison，Wis.）。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞（PBMC）和自然杀伤（NK）细胞。可替代地或另外，可以例如在动物模型中，例如在Clynes等人（1998）Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656中公开的动物模型中，在体内评价目的分子的ADCC活性。还可以进行C1q结合测定，以证实抗体不能结合C1q并因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评价补体激活，可以执行CDC测定。参见例如Gazzano-Santoro等人（1996）J. Immunol. Methods 202:163；Cragg，M. S.等人（2003）Blood 101:1045-1052；和Cragg，M. S,和M. J. Glennie（2004）Blood103:2738-2743。FcRn结合和体内清除/半衰期测定也可以使用本领域已知的方法执行。参见例如Petkova，S. B.等人（2006）Int'l. Immunol. 18（12）:1759-1769。
具有降低的效应子功能的本发明的抗体（例如抗GDF11抗体、抗激活素B抗体、抗ActRIIA抗体或抗ActRIIB抗体）包括具有Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中的一个或多个的取代的那些（美国专利号6,737,056）。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个位置处具有取代的Fc突变体，包括残基265和297取代为丙氨酸的所谓“DANA” Fc突变体（美国专利号7,332,581）。
在某些实施方案中，可能期望产生半胱氨酸经工程改造的抗体，例如“thioMAb”，其中抗体的一个或多个残基被半胱氨酸残基取代。在特定实施方案中，取代的残基在抗体的可接近位点处出现。通过用半胱氨酸取代那些残基，反应性硫醇基团因此位于抗体的可接近位点处，并且可以用于将抗体与其他部分（例如药物部分或接头-药物部分）缀合以产生免疫缀合物，如本文进一步描述的。在某些实施方案中，下述残基中的任何一个或多个可以被半胱氨酸取代：轻链的V205（Kabat编号）；重链的A118（EU编号）；和重链Fc区的S400（EU编号）。半胱氨酸改造的抗体可以如例如在美国专利号7,521,541中所述生成。
另外，用于筛选抗体以便鉴定所需抗体的技术可以影响所获得的抗体的性质。例如，如果抗体用于结合溶液中的抗原，则可能期望测试溶液结合。各种不同的技术可用于测试抗体和抗原之间的相互作用以鉴定特别期望的抗体。此类技术包括ELISA、表面等离子体共振结合测定（例如Biacore™结合测定，Bia-core AB，Uppsala，瑞典）、夹心测定（例如IGEN International，Inc.，Gaithersburg，Maryland的顺磁性珠系统）、蛋白质印迹，免疫沉淀测定和免疫组织化学。
在某些实施方案中，考虑了本文提供的抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体。例如，可能期望改善抗体和/或结合多肽的结合亲和力和/或其他生物性质。抗体和/或结合多肽的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码抗体和/或结合多肽的核苷酸序列，或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如在抗体和/或结合多肽的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以制备缺失、插入和取代的任何组合以得到最终构建体，条件是最终构建体具有所需特征，例如靶结合（GDF11、GDF8、ActRIIA和/或ActRIIB结合）。
可以在HVR中制备改变（例如取代），例如，以改善抗体亲和力。此类改变可以在HVR“热点”中进行，所述热点即由在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子编码的残基（参见例如Chowdhury（2008）Methods Mol. Biol. 207:179-196（2008））和/或SDR（a-CDR），其中所得到的变体VH或VL就结合亲和力进行测试。通过构建二级文库且从二级文库中重新选择的亲和力成熟已在本领域中得到描述。参见例如Hoogenboom等人，Methods inMolecular Biology 178:1-37，O'Brien等人，编辑，Human Press，Totowa，N.J.,（2001）。在亲和力成熟的一些实施方案中，将多样性引入通过各种方法（例如易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变）中的任何选择用于成熟的可变基因内。随后创建二级文库。随后筛选文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。引入多样性的另一种方法涉及HVR指导的方法，其中几个HVR残基（例如一次4-6个残基）被随机化。例如使用丙氨酸扫描诱变或建模，可以特异性鉴定涉及抗原结合的HVR残基。CDR-H3和CDR-L3特别是通常靶向的。
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可以在一个或多个HVR内出现，只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变（例如本文提供的保守取代）。此类改变可以在HVR“热点”或SDR外部。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR是未改变的，或含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
用于鉴定可以被靶向用于诱变的抗体和/或结合多肽的残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如通过Cunningham和Wells（1989）Science，244:1081-1085描述的。在该方法中，残基或靶残基组（例如荷电残基例如Arg、Asp、His、Lys和Glu）被鉴定并且取代为中性或带负电的氨基酸（例如丙氨酸或聚丙氨酸），以测定是否影响相互作用。可以在证明对初始取代的功能敏感性的氨基酸位置处引入进一步的取代。可替代地或另外，抗原-抗体复合物的晶体结构可以用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。此类接触残基和邻近残基可以作为替代的候选物被靶向或消除。可以筛选变体以测定它们是否含有所需性质。
氨基酸序列插入包括长度范围为一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基末端和/或羧基末端融合物，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入变体包括抗体的N-或C末端与酶（例如用于ADEPT）或增加抗体的血清半衰期的多肽的融合。
在某些实施方案中，本文提供的抗体和/或结合多肽可以进一步进行修饰，以含有本领域已知的且容易获得的另外的非蛋白质部分。适合于抗体和/或结合多肽衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇（PEG）、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸（均聚物或无规共聚物）和右旋糖酐或聚（n-乙烯吡咯烷酮）聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇（例如甘油）、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性可以在制造中具有优势。聚合物可以是任何分子量，并且可以是支化或非支化的。附着至抗体和/或结合多肽的聚合物数目可以变化，并且如果附着超过一个聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。一般而言，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于考虑进行测定，所述考虑包括但不限于待改善的抗体和/或结合多肽的特定性质或功能，抗体衍生物和/或结合多肽衍生物是否用于在限定条件下的疗法。
本文公开的ActRII拮抗剂抗体中的任何（例如抗激活素A抗体、抗激活素B抗体、抗激活素C抗体、抗激活素E抗体、抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗BMP6抗体、抗BMP7抗体、抗ActRIIA抗体和/或抗ActRIIB抗体）均可与本发明的一种或多种另外的ActRII拮抗剂药物组合，以实现所需效应（例如治疗或预防有此需要的受试者中的贫血和/或治疗或预防一种或多种贫血并发症，包括例如皮肤溃疡）。例如，本文公开的ActRII拮抗剂抗体（例如抗GDF11抗体、抗激活素B抗体、抗激活素C抗体、抗激活素E抗体、抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗BMP6抗体、抗BMP7抗体、抗ActRIIA抗体或抗ActRIIB抗体）可以与下述组合使用：i）本文公开的一种或多种另外的ActRII拮抗剂抗体，ii）本文公开的一种或多种ActRII多肽（例如ActRIIA和/或ActRIIB多肽），iii）本文公开的一种或多种GDF捕获物；iv）本文公开的一种或多种小分子ActRII拮抗剂（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和/或ActRIIB中的一种或多种的小分子拮抗剂）；v）本文公开的一种或多种多核苷酸ActRII拮抗剂（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和/或ActRIIB中的一种或多种的多核苷酸拮抗剂）；vi）本文公开的一种或多种卵泡抑素多肽；和/或vii）本文公开的一种或多种FLRG多肽。
D. 小分子拮抗剂
在另一个方面，本发明涉及拮抗ActRII活性（例如抑制ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3和/或SMAD 1/5/8信号传导）的小分子或小分子组合。特别地，本发明提供了使用ActRII的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合，以例如治疗或预防有此需要的受试者中的贫血和/或治疗或预防一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用ActRII的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合，以治疗有此需要的受试者中的贫血和/或治疗患有贫血的受试者中的一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用ActRII的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合，以预防有此需要的受试者中的贫血和/或预防患有贫血的受试者中的一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡的方法。
在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂是直接或间接抑制至少GDF11活性的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合。任选地，此类小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合可以进一步直接或间接抑制GDF8。任选地，本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合基本上不抑制激活素A活性。在一些实施方案中，直接或间接抑制GDF11和/或GDF8活性的本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合进一步直接或间接抑制激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和ActRIIB中的一种或多种的活性。
在某些实施方案中，本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合是GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、Nodal、ActRIIA和ActRIIB中的一种或多种的间接抑制剂。例如，本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合可以抑制至少GDF11的表达（例如转录、翻译、细胞分泌或其组合）。任选地，此类小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合可以进一步抑制GDF8的表达。任选地，本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合基本上不抑制激活素A的表达。在一些实施方案中，抑制GDF11和/或GDF8表达的本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合可以进一步抑制激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和ActRIIB中的一种或多种的表达。
在其他实施方案中，本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合是GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和ActRIIB中的一种或多种的直接抑制剂。例如，本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合直接结合并抑制至少GDF11活性（例如抑制GDF11结合ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力；抑制GDF11介导的ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导的激活）。任选地，本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合可以进一步结合并抑制GDF8活性（例如抑制GDF8结合ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力；抑制GDF8介导的ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导的激活）。任选地，本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合基本上不结合或抑制激活素A活性（例如激活素A结合ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力；激活素A介导的ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导途径的激活）。在一些实施方案中，结合并抑制GDF11和/或GDF8活性的本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合进一步结合并抑制激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和ActRIIB中的一种或多种活性。
在一些实施方案中，本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合直接结合并抑制至少GDF8 活性（例如抑制GDF8 结合ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力；抑制GDF8 介导的ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导的激活）。任选地本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合可以进一步结合并抑制GDF11活性（例如抑制GDF11结合ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力；抑制GDF11 介导的ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导的激活）。任选地，本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合基本上不结合或抑制激活素A活性（例如激活素A结合ActRIIA和/或ActRIIB受体的能力；激活素A介导的ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，SMAD 2/3信号传导的激活）。在一些实施方案中，结合并抑制GDF8和/或GDF11的本发明小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合进一步结合并抑制激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和ActRIIB中的一种或多种的活性。
在一些实施方案中，本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合直接结合并抑制至少ActRIIA活性（例如ActRII配体介导的ActRIIA信号转导，例如SMAD 2/3信号传导激活）。例如，本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合结合ActRIIA受体并且抑制至少GDF11结合和/或激活ActRIIA受体。任选地，此类小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合可以进一步抑制GDF8结合和/或激活ActRIIA受体。任选地，本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合基本上不抑制激活素A结合和/或激活ActRIIA受体。在一些实施方案中，抑制GDF11和/或GDF8结合和/或激活ActRIIA受体的本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合进一步抑制激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7和Nodal中的一种或多种结合/激活ActRIIA受体。
在一些实施方案中，本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合直接结合并抑制至少ActRIIB活性（例如ActRII配体介导的ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3信号传导激活）。例如，本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合结合ActRIIB受体并且抑制至少GDF11结合和/或激活ActRIIB受体。任选地，此类小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合可以进一步抑制GDF8结合和/或激活ActRIIB受体。任选地，本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合基本上不抑制激活素A结合和/或激活ActRIIB受体。在一些实施方案中，抑制GDF11和/或GDF8结合和/或激活ActRIIB受体的本发明的小分子拮抗剂或小分子拮抗剂组合进一步抑制激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7和Nodal中的一种或多种结合/激活ActRIIB受体。
可以使用已知的方法鉴定且化学合成本发明的结合有机小分子拮抗剂（参见例如PCT公开号WO 00/00823和WO 00/39585）。一般而言，本发明的小分子拮抗剂通常大小小于约2000道尔顿，可替代地大小小于约1500、750、500、250或200道尔顿，其中此类有机小分子能够结合优选特异性结合如本文所述的多肽（例如GDF11、GDF8、ActRIIA和ActRIIB）。此类小分子拮抗剂可以使用众所周知的技术而无需过度实验进行鉴定。在这方面，注意到用于在有机小分子文库中筛选能够结合多肽靶的分子的技术是本领域众所周知的。参见例如国际专利公开号WO00/00823和WO00/39585。
本发明的结合有机小分子可以是例如醛、酮、肟、腙、缩氨基脲、卡巴肼、伯胺、仲胺、叔胺、N-取代的肼、酰肼、醇、醚、硫醇、硫醚、二硫化物、羧酸、酯、酰胺、脲、氨基甲酸酯、碳酸酯、缩酮、硫缩酮、缩醛、硫缩醛、芳基卤、芳基磺酸酯、烷基卤、烷基磺酸酯、芳族化合物、杂环化合物、苯胺、烯烃、炔、二醇、氨基醇、噁唑烷、噁唑啉、噻唑烷、噻唑啉、烯胺、磺酰胺、环氧化物、氮丙啶、异氰酸酯、磺酰氯、重氮化合物和酰基氯。
本文公开的小分子ActRII拮抗剂中的任何（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和/或ActRIIB中的一种或多种的小分子拮抗剂）均可与本发明的一种或多种另外的ActRII拮抗剂药物组合，以实现所需效应（例如增加有此需要的受试者中的红血细胞水平和/或血红蛋白，治疗或预防贫血，治疗镰状细胞病，治疗或预防一种或多种镰状细胞病并发症）。例如，本文公开的小分子ActRII拮抗剂（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和/或ActRIIB中的一种或多种的小分子拮抗剂）可以与下述组合使用：i）本文公开的一种或多种另外的小分子ActRII拮抗剂，ii）本文公开的一种或多种ActRII多肽（例如ActRIIA和/或ActRIIB多肽），iii）本文公开的一种或多种GDF捕获物；iv）本文公开的一种或多种ActRII拮抗剂抗体（例如抗GDF11抗体、抗激活素B抗体、抗激活素C抗体、抗激活素E抗体、抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗BMP6抗体、抗BMP7抗体、抗ActRIIA抗体或抗ActRIIB抗体）；v）本文公开的一种或多种多核苷酸ActRII拮抗剂（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和/或ActRIIB中的一种或多种的多核苷酸拮抗剂）；vi）本文公开的一种或多种卵泡抑素多肽；和/或vii）本文公开的一种或多种FLRG多肽。
E. 拮抗剂多核苷酸
在另一个方面，本发明涉及拮抗ActRII活性（例如抑制ActRIIA和/或ActRIIB信号转导，例如SMAD 2/3和/或SMAD 1/5/8信号传导）的多核苷酸或多核苷酸组合。特别地，本发明提供了使用多核苷酸ActRII拮抗剂或多核苷酸ActRII拮抗剂组合，以例如治疗或预防有此需要的受试者中的贫血和/或治疗或预防一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用多核苷酸ActRII拮抗剂或多核苷酸ActRII拮抗剂组合，以治疗有此需要的受试者中的贫血和/或治疗患有贫血的受试者中的一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用多核苷酸ActRII拮抗剂或多核苷酸ActRII拮抗剂组合，以预防有此需要的受试者中的贫血和/或预防患有贫血的受试者中的一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡的方法。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸ActRII拮抗剂或多核苷酸ActRII拮抗剂组合可以用于抑制GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和/或ActRIIB的一种或多种的活性和/或表达。在某些实施方案中，本发明的多核苷酸ActRII拮抗剂或多核苷酸ActRII拮抗剂组合是GDF-ActRII拮抗剂。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂组合抑制至少GDF11的活性和/或表达（例如转录、翻译、分泌或其组合）。任选地，此类多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂组合可以进一步抑制GDF8的活性和/或表达。任选地，本发明的多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂组合基本上不抑制激活素A的活性和/或表达。在一些实施方案中，抑制GDF11和/或GDF8的活性和/或表达的本发明的多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂组合可以进一步抑制激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和/或ActRIIB中的一种或多种的活性和/或表达。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂组合抑制至少GDF8的活性和/或表达（例如转录、翻译、分泌或其组合）。任选地，此类多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂组合可以进一步抑制GDF11的活性和/或表达。任选地，本发明的多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂组合基本上不抑制激活素A的活性和/或表达。在一些实施方案中，抑制GDF8和/或GDF11的活性和/或表达的本发明的多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂组合可以进一步抑制激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和/或ActRIIB中的一种或多种的活性和/或表达。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂组合抑制至少ActRIIA的活性和/或表达（例如转录、翻译、分泌或其组合）。任选地，本发明的多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂组合基本上不抑制激活素A的活性和/或表达。在一些实施方案中，抑制ActRIIA的活性和/或表达的本发明的多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂组合可以进一步抑制激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal和/或ActRIIB中的一种或多种的活性和/或表达。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂组合抑制至少ActRIIB的活性和/或表达（例如转录、翻译、分泌或其组合）。任选地，本发明的多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂组合基本上不抑制激活素A的活性和/或表达。在一些实施方案中，抑制ActRIIB的活性和/或表达的本发明的多核苷酸拮抗剂或多核苷酸拮抗剂组合可以进一步抑制激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal和/或ActRIIA中的一种或多种的活性和/或表达。
本发明的多核苷酸拮抗剂可以是反义核酸、RNAi分子（例如小干扰RNA（siRNA）、小发夹RNA（shRNA）、微小RNA（miRNA））、适体和/或核酶。人GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和ActRIIB的核酸和氨基酸序列是本领域已知的，并且因此用于根据本发明的方法使用的多核苷酸拮抗剂可以通过技术人员基于本领域的知识和本文提供的教导照常规进行制备。
例如，反义技术可以用于通过反义DNA或RNA或者通过三螺旋形成来控制基因表达。反义技术例如在Okano（1991）J. Neurochem. 56:560；Oligodeoxynucleotides asAntisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，Fla.（1988）中讨论。三螺旋形成在例如Cooney等人（1988）Science 241:456；和Dervan等人，（1991）Science251:1300中讨论。该方法基于多核苷酸与互补DNA或RNA的结合。在一些实施方案中，反义核酸包含与本文公开的基因（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素C、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和ActRIIB）的RNA转录物的至少一部分互补的单链RNA或DNA序列。然而，不需要绝对互补性。
本文提及的“与RNA的至少一部分互补的”序列意指具有足够的互补性以能够与RNA杂交，形成稳定双链体的序列；在本文公开的基因（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和ActRIIB）的双链反义核酸的情况下，因此可以测试双链DNA的单链，或可以测定三链体形成。杂交的能力将取决于互补性程度和反义核酸的长度。一般地，杂交核酸越大，与其可以含有并且仍形成稳定双链体（或三链体，视情况而定）的RNA的碱基错配越多。本领域技术人员可以通过使用标准程序来确定可容许的错配程度，以测定杂交复合物的熔点。
与信使的5'端互补的多核苷酸，例如，直至并包括AUG起始密码子的5'非翻译序列，应当在抑制翻译方面最有效地起作用。然而，与mRNA的3'非翻译序列互补的序列已显示同样有效抑制mRNA的翻译。参见例如Wagner，R.,（1994）Nature 372:333-335。因此，与本发明的基因（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和ActRIIB）的5'-或3'-非翻译非编码区互补的寡核苷酸可以用于反义方法中，以抑制内源mRNA的翻译。与mRNA的5'非翻译区互补的多核苷酸应当包括AUG起始密码子的互补体。与mRNA编码区互补的反义多核苷酸是较不有效的翻译抑制剂，但可以根据本发明的方法使用。无论是设计为与本发明的mRNA（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和ActRIIB mRNA）的5'-非翻译区、3'非翻译区还是编码区杂交，反义核酸应当为长度至少6个核苷酸，并且优选为长度6至约50个核苷酸的寡核苷酸。在具体方面，寡核苷酸为至少10个核苷酸、至少17个核苷酸、至少25个核苷酸或至少50个核苷酸。
在一个实施方案中，本发明的反义核酸（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA或ActRIIB反义核酸）通过从外源序列转录细胞内产生。例如，转录载体或其一部分，产生本发明的基因的反义核酸（RNA）。此类载体将含有编码所需反义核酸的序列。此类载体可以保持游离或变得染色体整合，只要它可以转录以产生所需的反义RNA。此类载体可以通过本领域标准的重组DNA技术方法进行构建。载体可以是用于在脊椎动物细胞中复制和表达的质粒、病毒或本领域已知的其他。编码本发明的所需基因的序列或其片段的表达可以通过本领域已知的在脊椎动物，优选人细胞中起作用的任何启动子。此类启动子可以是诱导型或组成型的。此类启动子包括但不限于SV40早期启动子区[参见例如Benoist和Chambon（1981）Nature 29:304-310]、包含在劳斯肉瘤病毒的3'长末端重复中的启动子（参见例如Yamamoto等人（1980）Cell 22:787-797、疱疹胸苷启动子[参见例如Wagner等人（1981）Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445]、以及金属硫蛋白基因的调节序列（参见例如Brinster等人（1982）Nature 296:39-42。
在一些实施方案中，多核苷酸拮抗剂是靶向下述中的一种或多种的表达的干扰RNA或RNAi分子：GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和ActRIIB。RNAi指干扰靶mRNA的表达的RNA的表达。具体地，RNAi通过siRNA（小干扰RNA）经由与特异性mRNA相互作用使靶基因沉默。ds RNA复合物随后被靶向用于通过细胞降解。siRNA分子是长度10至50个核苷酸的双链RNA双链体，其干扰足够互补的靶基因的表达（例如与基因的至少80%同一性）。在一些实施方案中，siRNA分子包含与靶基因的核苷酸序列至少85、90、95、96、97、98、99或100%等同的核苷酸序列。
另外的RNAi分子包括短发夹RNA（shRNA）；以及短干扰发夹和微小RNA（miRNA）。shRNA分子含有通过环连接的来自靶基因的有义和反义序列。shRNA从核转运到细胞质内，并且它连同mRNA一起降解。Pol III或U6启动子可以用于表达关于RNAi的RNA。Paddison等人[Genes & Dev.（2002）16:948-958，2002]已使用折叠成发夹的小RNA分子作为实现RNAi的手段。相应地，此类短发夹RNA（shRNA）分子也有利地用于本文所述的方法中。功能shRNA的茎和环的长度不同；茎长度的范围可为约25至约30 nt的任何地方，并且环大小的范围可为4至约25nt，而不影响沉默活性。尽管不希望受任何特定理论的束缚，但认为这些shRNA类似DICER RNA酶的双链RNA（dsRNA）产物，并且在任何情况下，具有用于抑制特定基因表达的相同能力。shRNA可以由慢病毒载体表达。miRNA是长度约10至70个核苷酸的单链RNA，其最初转录为特征在于“茎-环”结构的前体miRNA，并且在通过RISC进一步加工后后续加工为成熟miRNA。
介导RNAi的分子，包括但不限于siRNA，可以通过下述在体外产生：化学合成（Hohjoh，FEBS Lett 521:195-199，2002）、dsRNA水解（Yang等人，Proc Natl Acad Sci USA99:9942-9947，2002）、用T7 RNA聚合酶的体外转录（Donzeet等人，Nucleic Acids Res 30:e46，2002；Yu等人，Proc Natl Acad Sci USA 99:6047-6052，2002）、以及使用核酸酶例如大肠杆菌RNA酶III的双链RNA水解（Yang等人，Proc Natl Acad Sci USA 99:9942-9947，2002）。
根据另一个方面，本发明提供了多核苷酸拮抗剂，包括但不限于诱饵DNA、双链DNA、单链DNA、复合DNA、封装DNA、病毒DNA、质粒DNA、裸露RNA、封装RNA、病毒RNA、双链RNA、能够生成RNA干扰的分子或其组合。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸拮抗剂是适体。适体是核酸分子，包括双链DNA和单链RNA分子，其结合并形成特异性结合靶分子的三级结构，所述靶分子例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和ActRIIB多肽。适体的生成和治疗用途在本领域中是充分确定的。参见例如美国专利号5,475,096。关于适体的另外的信息可以在美国专利申请公开号20060148748中找到。使用本领域已知的方法，例如指数富集的配体系统进化（Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment）（SELEX）过程来选择核酸适体。SELEX是用于与靶分子具有高度特异性结合的核酸分子的体外进化的方法，如例如美国专利号5,475,096、5,580,737、5,567,588、5,707,796、5,763,177、6,011,577和6,699,843中所述。美国专利号5,270,163中描述了鉴定适体的另一种筛选方法。SELEX过程基于核酸形成各种二维和三维结构的能力，以及核苷酸单体内可用的化学多功能性，以充当无论是单体还是聚合的几乎任何化学化合物包括其他核酸分子和多肽的配体（形成特异性结合对）。任何大小或组成的分子均可用作靶。SELEX方法涉及从候选寡核苷酸的混合物中选择，并使用相同的一般选择方案逐步重复结合、分隔和扩增，以实现所需的结合亲和力和选择性。从可以包含随机化序列区段的核酸混合物开始，SELEX方法包括下述步骤：在有利于结合的条件下使混合物与靶接触；使未结合的核酸与已特异性结合靶分子的那些核酸分隔；使核酸-靶复合物解离；扩增与核酸-靶复合物解离的核酸，以获得富含配体的核酸混合物。结合、分隔、解离和扩增的步骤通过所需的多个循环重复，以获得针对靶分子的高度特异性的高亲和力核酸配体。
通常，将此类结合分子分开施用于动物[参见例如O'Connor（1991）J. Neurochem.56:560]，但此类结合分子也可以在体内由多核苷酸表达，所述多核苷酸由宿主细胞摄取并在体内表达。参见例如Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of GeneExpression，CRC Press，Boca Raton，Fla.（1988）。
本文公开的多核苷酸ActRII拮抗剂中的任何（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和/或ActRIIB中的一种或多种的多核苷酸拮抗剂）均可与本发明的一种或多种另外的ActRII拮抗剂药物组合，以实现所需效应（例如治疗或预防有此需要的受试者中的贫血，和/或治疗或预防一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡）。例如，本文公开的多核苷酸ActRII拮抗剂（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和/或ActRIIB中的一种或多种的多核苷酸拮抗剂）可以与下述组合使用：i）本文公开的一种或多种另外的多核苷酸ActRII拮抗剂，ii）本文公开的一种或多种ActRII多肽（例如ActRIIA和/或ActRIIB多肽），iii）本文公开的一种或多种GDF捕获物；iv）本文公开的一种或多种ActRII拮抗剂抗体（例如抗GDF11抗体、抗激活素B抗体、抗激活素C抗体、抗激活素E抗体、抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗BMP6抗体、抗BMP7抗体、抗ActRIIA抗体或抗ActRIIB抗体）；v）本文公开的一种或多种小分子ActRII拮抗剂（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和/或ActRIIB中的一种或多种的小分子拮抗剂）；vi）本文公开的一种或多种卵泡抑素多肽；和/或vii）本文公开的一种或多种FLRG多肽。
F. 其他拮抗剂
在其他方面，用于根据本文公开的方法（例如治疗或预防有此需要的受试者中的贫血的方法，和/或治疗或预防一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡的方法）使用的药物是卵泡抑素多肽。术语“卵泡抑素多肽”包括包含任何天然存在的卵泡抑素多肽及其保留有用活性的任何变体（包括突变体、片段、融合物和拟肽形式）的多肽，并且进一步包括卵泡抑素的任何功能单体或多聚体。在某些实施方案中，本发明的卵泡抑素多肽结合和/或抑制激活素活性，特别是激活素A（例如激活素介导的ActRIIA和/或ActRIIB SMAD 2/3信号传导的激活）。保留激活素结合性质的卵泡抑素多肽的变体可以基于涉及卵泡抑素和激活素相互作用的先前研究来鉴定。例如，WO2008/030367公开了显示对于激活素结合重要的特异性卵泡抑素结构域（“FSD”）。如下文SEQ ID NO: 18-20中所示，卵泡抑素N末端结构域（“FSND”SEQ ID NO: 18）、FSD2（SEQ ID NO: 20）和较小程度的FSD1（SEQ ID NO: 19 ）代表卵泡抑素内对于激活素结合重要的示例性结构域。另外，用于制备和测试多肽文库的方法在上文ActRII多肽的上下文中描述，并且此类方法也涉及制备和测试卵泡抑素的变体。卵泡抑素多肽包括衍生自任何已知卵泡抑素的序列的多肽，所述任何已知卵泡抑素具有的序列与卵泡抑素多肽的序列至少约80%等同，以及任选至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更大的同一性。卵泡抑素多肽的例子包括成熟卵泡抑素多肽或者人卵泡抑素前体多肽（SEQ IDNO: 16）的更短同种型或的其他变体，如例如WO2005/025601中所述。
人卵泡抑素前体多肽同种型FST344如下：
Figure 116958DEST_PATH_IMAGE029
（SEQ ID NO: 16；NCBI参考号NP_037541.1卵泡抑素同种型FST344）
信号肽是加下划线的；还在上文加下划线的是最后27个残基，其中代表使该卵泡抑素同种型区别于如下所示的较短的卵泡抑素同种型FST317的C端延伸。
人卵泡抑素前体多肽同种型FST317如下：
Figure 230407DEST_PATH_IMAGE030
Figure 155638DEST_PATH_IMAGE031
Figure 317629DEST_PATH_IMAGE032
（SEQ ID NO: 17；NCBI参考号NP_006341.1）
信号肽是加下划线的。
卵泡抑素N末端结构域（FSND）序列如下：
Figure 379126DEST_PATH_IMAGE033
。
FSD1和FSD2序列如下：
Figure 663477DEST_PATH_IMAGE034
Figure 76003DEST_PATH_IMAGE035
。
在其他方面，用于根据本文公开的方法（例如治疗或预防有此需要的受试者中的贫血的方法和/或治疗或预防贫血并发症包括例如皮肤溃疡的方法）使用的药物是卵泡抑素样相关基因（FLRG），也称为卵泡抑素相关蛋白3（FSTL3）。在一些实施方案中，该药物用于治疗贫血并发症，包括例如皮肤溃疡。在一些实施方案中，该药物用于预防贫血并发症，包括例如皮肤溃疡。术语“FLRG多肽”包括包含FLRG的任何天然存在的多肽以及其保留有用活性的任何变体（包括突变体、片段、融合物和拟肽形式）的多肽。在某些实施方案中，本发明的FLRG多肽结合和/或抑制激活素活性，特别是激活素A（例如激活素介导的ActRIIA和/或ActRIIB SMAD 2/3信号传导的激活）。保留激活素结合性质的FLRG多肽的变体可以使用测定FLRG和激活素相互作用的常规方法来鉴定。参见例如US 6,537,966。另外，用于制备和测试多肽文库的方法在上文ActRII多肽的上下文中描述，并且此类方法也涉及制备和测试FLRG的变体。FLRG多肽包括衍生自任何已知FLRG的序列的多肽，所述任何已知FLRG具有的序列与FLRG多肽的序列至少约80%相同，以及任选至少85%、90%、95%、97%、99%或更大的同一性。
人FLRG（卵泡抑素相关蛋白3前体）多肽如下：
Figure 41685DEST_PATH_IMAGE036
Figure 223268DEST_PATH_IMAGE037
（SEQ ID NO:21；NCBI参考号NP_005851.1）
信号肽是加下划线的。
在某些实施方案中，卵泡抑素多肽和FLRG多肽的功能变体或修饰形式包括具有卵泡抑素多肽或FLRG多肽的至少一部分和一个或多个融合结构域的融合蛋白，所述一个或多个融合结构域例如促进多肽的分离、检测、稳定化或多聚化的结构域。合适的融合结构域在上文中就ActRII多肽而言详细讨论。在一些实施方案中，本发明的拮抗剂药物是融合蛋白，其包含与Fc结构域融合的卵泡抑素多肽的激活素结合部分。在另一个实施方案中，本发明的拮抗剂药物是融合蛋白，其包含与Fc结构域融合的FLRG多肽的激活素结合部分。
本文公开的卵泡抑素多肽中的任何均可与本发明的一种或多种另外的ActRII拮抗剂药物组合，以实现所需效应（例如治疗或预防有此需要的受试者中的贫血，和/或治疗或预防一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡）。例如，本文公开的卵泡抑素多肽可以与下述组合使用：i）本文公开的一种或多种另外的卵泡抑素多肽，ii）本文公开的一种或多种ActRII多肽（例如ActRIIA和/或ActRIIB多肽），iii）本文公开的一种或多种GDF捕获物；iv）本文公开的一种或多种ActRII拮抗剂抗体（例如抗GDF11抗体、抗激活素B抗体、抗激活素C抗体、抗激活素E抗体、抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗BMP6抗体、抗BMP7抗体、抗ActRIIA抗体或抗ActRIIB抗体）；v）本文公开的一种或多种小分子ActRII拮抗剂（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和/或ActRIIB中的一种或多种的小分子拮抗剂）；vi）本文公开的一种或多种多核苷酸ActRII拮抗剂（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和/或ActRIIB中的一种或多种的多核苷酸拮抗剂）；和/或本文公开的一种或多种FLRG多肽。
类似地，本文公开的FLRG多肽中的任何均可与本发明的一种或多种另外的ActRII拮抗剂药物组合，以实现所需效应（例如治疗或预防有此需要的受试者中的贫血，和/或治疗或预防一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡）。例如，本文公开的FLRG多肽可以与下述组合使用：i）本文公开的一种或多种另外的FLRG多肽，ii）本文公开的一种或多种ActRII多肽（例如ActRIIA和/或ActRIIB多肽），iii）本文公开的一种或多种GDF捕获物；iv）本文公开的一种或多种ActRII拮抗剂抗体（例如抗GDF11抗体、抗激活素B抗体、抗激活素C抗体、抗激活素E抗体、抗GDF11抗体、抗GDF8抗体、抗BMP6抗体、抗BMP7抗体、抗ActRIIA抗体或抗ActRIIB抗体）；v）本文公开的一种或多种小分子ActRII拮抗剂（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和/或ActRIIB中的一种或多种的小分子拮抗剂）；vi）本文公开的一种或多种多核苷酸ActRII拮抗剂（例如GDF11、GDF8、激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、激活素E、BMP6、BMP7、Nodal、ActRIIA和/或ActRIIB中的一种或多种的多核苷酸拮抗剂）；和/或本文公开的一种或多种卵泡抑素多肽。
4. 筛选测定
在某些方面，本发明涉及主题ActRII多肽（例如ActRIIA和ActRIIB多肽）和GDF捕获物多肽鉴定其为ActRIIB多肽的激动剂或拮抗剂的化合物（药物）的用途。通过该筛选鉴定的化合物可以进行测试，以评价其调节红血细胞、血红蛋白和/或网织红细胞水平以及影响皮肤溃疡的能力。这些化合物可以例如在动物模型中进行测试。
存在筛选治疗剂的许多方法，所述治疗剂通过靶向ActRII信号传导（例如ActRIIA和/或ActRIIB SMAD 2/3和/或SMAD 1/5/8信号传导）用于增加红血细胞或血红蛋白水平。在某些实施方案中，可以进行化合物的高通量筛选，以鉴定干扰ActRII介导的对所选细胞系的作用的药物。在某些实施方案中，进行测定以筛选且鉴定特异性抑制或降低ActRII多肽或GDF捕获物多肽与其结合配偶体结合的化合物，所述结合配偶体例如ActRII配体（例如激活素A、激活素B、激活素AB、激活素C、Nodal、GDF8、GDF11或BMP7）。可替代地，该测定可以用于鉴定增强ActRII多肽或GDF捕获物多肽与其结合配偶体（例如ActRII配体）的结合的化合物。在进一步的实施方案中，化合物可以通过其与ActRII多肽或GDF捕获物多肽相互作用的能力来鉴定。
各种测定形式将是足够的，并且根据本发明，本领域普通技术人员将理解本文中未明确描述的那些。如本文描述的，本发明的测试化合物（药物）可以通过任何组合化学方法产生。可替代地，主题化合物可以是在体内或体外合成的天然存在的生物分子。待测试其充当组织生长调节剂的能力的化合物（药物）可以例如通过细菌、酵母、植物或其他生物产生（例如天然产物），化学产生（例如小分子，包括拟肽），或重组产生。由本发明考虑的测试化合物包括非肽基有机分子、肽、多肽、拟肽、糖、激素和核酸分子。在某些实施方案中，测药物是具有小于约2,000道尔顿的分子量的小有机分子。
本发明的测试化合物可以作为单个离散的实体提供，或者在例如通过组合化学制备的具有更大复杂性的文库中提供。这些文库可以包含例如醇、烷基卤、胺、酰胺、酯、醛、醚和其他类别的有机化合物。测试化合物对测试系统的呈递可以是分离形式或作为化合物的混合物，尤其是在初始筛选步骤中。任选地，化合物可以任选用其他化合物衍生化，并具有促进化合物分离的衍生基团。衍生基团的非限制性例子包括生物素、荧光素、地高辛、绿色荧光蛋白、同位素、多组氨酸、磁珠、谷胱甘肽S转移酶（GST）、可光激活的交联剂或其任何组合。
在测试化合物和天然提取物的文库的许多药物筛选程序中，期望高通量测定以使在给定时间段内调查的化合物数目达到最大。在无细胞系统（例如可以用纯化或半纯化的蛋白质衍生的）中执行的测定通常优选作为“初级”筛选，因为它们可以生成以允许分子靶中的改变的快速发展和相对容易检测，所述分子靶中的改变由测试化合物介导。此外，在体外系统中一般可以忽略测试化合物的细胞毒性或生物利用度的效应，相反该测定主要集中于药物对分子靶的作用，如可以在ActRII多肽或GDF捕获物多肽及其结合配偶体（例如ActRII配体）之间的结合亲和力中的改变方面体现的。
仅举例说明，在本发明的示例性筛选测定中，使目的化合物与分离和纯化的ActRIIB多肽接触，所述ActRIIB多肽通常能够结合ActRIIB配体，如对于测定目的适当的。随后将化合物和ActRIIB多肽的混合物加入含有ActRIIB配体（例如GDF11）的组合物中。ActRIIB/ActRIIB配体复合物的检测和定量提供了用于测定化合物在抑制（或增强）ActRIIB多肽及其结合蛋白之间的复合物形成方面的功效的手段。可以通过从使用不同浓度的测试化合物获得的数据生成剂量反应曲线来评估化合物的功效。此外，还可以执行对照测定以提供用于比较的基线。例如，在对照测定中，将分离和纯化的ActRIIB配体加入含有ActRIIB多肽的组合物中，并且在不存在测试化合物的情况下，定量ActRIIB/ActRIIB配体复合物的形成。应理解，一般而言，在其中反应物可以混合的次序可以改变，并且可以同时混合。此外，代替纯化的蛋白质，细胞提取物和裂解产物可以用于形成合适的无细胞测定系统。
可以通过各种技术检测ActRII多肽或GDF捕获物多肽与其结合蛋白之间的复合物形成。例如，可以通过免疫测定或通过层析检测，使用可检测标记的蛋白质例如放射性标记的（例如32P、35S、14C或3H）、荧光标记的（例如FITC）或酶促标记的ActRII多肽或GDF和/或其结合蛋白，来定量复合物形成的调节。
在某些实施方案中，本发明考虑了测定在直接或间接测量GDF捕获物多肽的ActRII多肽及其结合蛋白之间的相互作用程度中使用荧光偏振测定和荧光共振能量转移（FRET）。进一步地，其他检测模式，例如基于光波导（参见例如PCT公开WO 96/26432和美国专利号5,677,196）、表面等离子体共振（SPR）、表面电荷传感器和表面力传感器的那些与本发明的许多实施方案兼容。
此外，本发明考虑了使用相互作用捕获测定（也称为“双杂交测定”），用于鉴定破坏或加强ActRII多肽或GDF捕获物多肽与其结合配偶体之间的相互作用的药物。参见例如美国专利号5,283,317；Zervos等人（1993）Cell 72:223-232；Madura等人（1993）J BiolChem 268:12046-12054；Bartel等人（1993）Biotechniques 14:920-924；和Iwabuchi等人（1993）Oncogene 8:1693-1696）。在具体实施方案中，本发明考虑了使用反向双杂交系统来鉴定化合物（例如小分子或肽），所述化合物解离ActRII多肽或GDF捕获物及其结合蛋白之间的相互作用。参见例如Vidal和Legrain,（1999）Nucleic Acids Res 27:919-29；Vidal和Legrain,（1999）Trends Biotechnol 17:374-81；以及美国专利号5,525,490；5,955,280；和5,965,368。
在某些实施方案中，主题化合物通过其与ActRII多肽或GDF捕获物多肽相互作用的能力来鉴定。化合物和ActRII多肽或GDF捕获物多肽之间的相互作用可以是共价或非共价的。例如，可以使用体外生物化学方法，包括光交联、放射性标记的配体结合和亲和层析，在蛋白质水平上鉴定此类相互作用。参见例如Jakoby WB等人（1974）Methods inEnzymology 46:1。在某些情况下，可以在基于机制的测定中筛选化合物，例如检测结合GDF捕获物多肽的ActRII多肽的化合物的测定。这可以包括固相或流体相结合事件。可替代地，编码ActRII多肽或GDF捕获物多肽的基因可以用报道系统（例如β半乳糖苷酶、荧光素酶或绿色荧光蛋白）转染到细胞内，并优选通过高通量筛选或用文库的个别成员针对文库进行筛选。可以使用其他基于机制的结合测定，例如，检测自由能中的变化的结合测定。结合测定可以用固定至孔、珠或芯片的靶执行，或通过固定的抗体捕获或通过毛细管电泳分辨。结合的化合物通常可以使用比色终点或荧光或表面等离子体共振来检测。
5. 示例性治疗用途
在某些方面，本发明的ActRII拮抗剂药物或ActRII拮抗剂药物组合可以用于增加有此需要的受试者（例如患者），特别是哺乳动物例如啮齿类动物、灵长类动物和人中的红血细胞水平。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物或ActRII拮抗剂药物组合可以用于治疗或预防有此需要的受试者（例如患者）中的贫血和/或一种或多种贫血并发症包括例如溃疡，特别是皮肤溃疡。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物或ActRII拮抗剂药物组合可以用于治疗有此需要的受试者（例如患者）中的贫血和/或一种或多种贫血并发症包括例如溃疡，特别是皮肤溃疡。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物或ActRII拮抗剂药物组合可以用于预防有此需要的受试者（患者）中的贫血和/或一种或多种贫血并发症包括例如溃疡，特别是皮肤溃疡。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物或ActRII拮抗剂药物组合可以用于治疗或预防患有贫血的受试者（例如患者），特别是哺乳动物例如啮齿类动物、灵长类动物和人中的溃疡。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物或ActRII拮抗剂药物组合可以用于治疗或预防有此需要的受试者（例如患者），特别是哺乳动物例如啮齿类动物、灵长类动物和人中与贫血相关的溃疡。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物或ActRII拮抗剂药物组合可以用于治疗或预防患有贫血的受试者（例如患者），特别是哺乳动物例如啮齿类动物、灵长类动物和人中的皮肤（例如皮肤的）溃疡。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物或ActRII拮抗剂药物组合可以用于治疗或预防有此需要的受试者（例如患者），特别是哺乳动物例如啮齿类动物、灵长类动物和人中与贫血相关的皮肤溃疡。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物或ActRII拮抗剂药物组合可以用于治疗或预防患有溶血性贫血的受试者（例如患者），特别是哺乳动物例如啮齿类动物、灵长类动物和人中的溃疡（例如皮肤溃疡）。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物或ActRII拮抗剂药物组合可以用于治疗或预防患有血红蛋白病性贫血的受试者（例如患者），特别是哺乳动物例如啮齿类动物、灵长类动物和人中的溃疡（例如皮肤溃疡）。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物或ActRII拮抗剂药物组合可以用于治疗或预防患有地中海贫血综合征（例如β地中海贫血综合征、β中间型地中海贫血等）的受试者（患者），特别是哺乳动物例如啮齿类动物、灵长类动物和人中的溃疡（例如皮肤溃疡）。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物或ActRII拮抗剂药物组合可以用于治疗或预防患有镰状细胞病的受试者（患者），特别是哺乳动物例如啮齿类动物、灵长类动物和人中的溃疡（例如皮肤溃疡）。在前述实施方案的一些中，本发明的ActRII拮抗剂药物或ActRII拮抗剂药物组合用于治疗患有贫血（例如溶血性贫血、血红蛋白病性贫血、地中海贫血综合征（例如β地中海贫血综合征、β中间型地中海贫血等）、镰状细胞病等）的受试者（例如患者）中的溃疡（例如皮肤溃疡）。在前述实施方案的一些中，本发明的ActRII拮抗剂药物或ActRII拮抗剂药物组合用于预防患有贫血（例如溶血性贫血、血红蛋白病性贫血、地中海贫血综合征（例如β地中海贫血综合征、β中间型地中海贫血等）、镰状细胞病等）的受试者（例如患者）中的溃疡（例如皮肤溃疡）中的溃疡（例如皮肤溃疡）。在一些实施方案中，患有贫血的受试者患有镰状细胞病。在一些实施方案中，患有贫血的受试者患有地中海贫血综合征（例如β地中海贫血综合征、β中间型地中海贫血等）。在一些实施方案中，患有贫血的受试者具有皮肤溃疡。在一些实施方案中，皮肤溃疡是皮肤溃疡。在一些实施方案中，溃疡出现在腿或肛门上。
如本文使用的，“预防”病症或状况的治疗剂指这样的化合物，其在统计样品中相对于未经处理的对照样品降低经处理的样品中病症或病症的出现，或者相对于未经处理的对照样品延迟病症或状况的一种或多种症状的发作或降低病症或状况的一种或多种症状的严重性。例如，使用本发明的ActRII拮抗剂来预防患有贫血的受试者中的溃疡（例如皮肤溃疡）指相对于未接受ActRII拮抗剂的患有贫血的受试者，降低受试者中溃疡的出现或延迟受试者中溃疡的发作或降低受试者中溃疡的严重性。
如本文使用的，术语“治疗”包括状况在确定后的改善或消除。在任一情况下，可以在由医生或其他保健提供者提供的诊断和治疗剂的预期施用结果中区分预防或治疗。在一些实施方案中，治疗溃疡指促进溃疡组织的伤口愈合。
一般而言，通过以有效量施用本发明的ActRII拮抗剂（例如ActRIIA和/或ActRIIB拮抗剂）中的一种或多种，来实现本发明中所述的疾病或状况的治疗或预防。药物的有效量指在必需的剂量和时间段内有效实现所需治疗或预防结果的量。本发明的药物的“治疗有效量”可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及药物在个体中引发所需应答的能力等因素而变化。“预防有效量”指在必需的剂量和时间段内有效达到所需预防结果的量。
溃疡和贫血
溃疡是皮肤或粘膜上的疮，其伴随着组织的分解。皮肤（皮肤的）溃疡可导致表皮以及通常真皮甚至皮下脂肪的一部分的完全丧失。皮肤溃疡在下肢皮肤上最常见，但确实出现在身体的其他部位上。通常，溃疡表现为开放的坑，通常是圆形的，具有已被侵蚀的皮肤层，并且此类损害对于感染高度敏感。溃疡周围的皮肤可能是红色、肿胀和/或柔嫩的。一般而言，溃疡倾向于比其他类型的皮肤损伤更缓慢愈合，并且对治疗有抗性。
溃疡分阶段发展。在阶段1中，皮肤是红色的，具有柔软的下层组织。在第二阶段，皮肤的发红变得更显著，出现肿胀，并且可能存在一些水泡和外皮层的丧失。在下一阶段期间，皮肤可能向下穿过皮肤的深层坏死，并且下面的脂肪可能变得暴露。在最后两个阶段，疮可能促使脂肪的更深丧失和肌肉的坏死 - 在严重的情况下，它可以延伸至骨的破坏并引起脓毒病。鉴于溃疡病理的分期进展，医生已采用分级系统来分类溃疡。Wagner分级系统将溃疡分成5类：i）浅表溃疡指定为1级；ii）更深入皮下组织暴露软组织的（但没有脓肿或骨髓炎）的溃疡指定为2级；iii）具有脓肿形成和/或骨髓炎的溃疡指定为3级；iv）在组织或肢体的部分上具有相关坏疽的溃疡指定为4级；和v）在大面积或整个肢体具有广泛性坏疽的溃疡指定为5级。
溃疡，特别是皮肤溃疡，作为许多贫血的并发症出现。在大多数患者中，这些溃疡出现在腿或脚踝中，但可能出现在身体的其他部分上。贫血和溃疡形成之间的关系是多因素的，但一般预期升高的溶血、氧化性应激、弱组织氧合作用和血管充血可能全部促成溃疡的形成。升高的溶血引起游离血红蛋白释放到血清内，这促使氧化性损伤并消耗维持适当血管紧张度所需的一氧化氮。溃疡与许多遗传性和获得性贫血相关，包括遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、遗传性口形细胞增多症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、镰状细胞病、地中海贫血（α和β两者）、阵发性睡眠性血红蛋白尿症。镰状细胞病和地中海贫血特别因引起溃疡而著名，这可能是因为所有的危险因素均存在于这些疾病中。溃疡与许多溶血性贫血有关，所述溶血性贫血描述由红血细胞过度破坏引起的贫血状况。溶血性贫血可起因于感染，例如肝炎、巨细胞病毒（CMV）、EB病毒（EBV）、伤寒、大肠杆菌（大肠埃希杆菌）、支原体肺炎或链球菌，药剂例如青霉素、抗疟药剂、磺胺药剂或对乙酰氨基酚，癌症例如白血病或淋巴瘤和不同类型的实体瘤、自身免疫病症例如系统性红斑狼疮（SLE或狼疮）、类风湿性关节炎、维奥二氏综合征或溃疡性结肠炎、脾功能亢进和自身免疫溶血性贫血，其中身体的免疫系统产生针对其自身血细胞的抗体。微血管病性溶血性贫血和血栓性血小板减少性紫癜也与贫血和溃疡形成有关。
在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物或ActRII拮抗剂药物组合可以用于治疗或预防患有选自下述的贫血的受试者（患者）中的溃疡（例如皮肤溃疡）：包括遗传性球形红细胞增多症、遗传性椭圆形红细胞增多症、遗传性口形细胞增多症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症、溶血性贫血、血红蛋白病性贫血、镰状细胞病、地中海贫血（α和β两者）、β地中海贫血综合征、β中间型地中海贫血、阵发性睡眠性血红蛋白尿症、微血管病性溶血性贫血、血栓性血小板减少性紫癜，与感染（例如肝炎、巨细胞病毒（CMV）、EB病毒（EBV）、伤寒、大肠杆菌（大肠埃希杆菌）、支原体肺炎或链球菌）相关的贫血、与药剂施用（例如青霉素、抗疟药剂、磺胺药剂或对乙酰氨基酚）相关的贫血、与癌症（例如白血病或淋巴瘤和不同类型的实体瘤）相关的贫血、以及与自身免疫病症（例如系统性红斑狼疮（SLE或狼疮）、类风湿性关节炎、维奥二氏综合征或溃疡性结肠炎、脾功能亢进和自身免疫溶血性贫血，其中身体的免疫系统产生针对其自身血细胞的抗体）相关的贫血。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物或ActRII拮抗剂药物组合可以用于治疗或预防患有溶血性贫血的受试者（患者）中的溃疡（例如皮肤溃疡）。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物或ActRII拮抗剂药物组合可以用于治疗或预防患有血红蛋白病性贫血的受试者（患者）中的溃疡（例如皮肤溃疡）。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物或ActRII拮抗剂药物组合可以用于治疗或预防患有地中海贫血综合征的受试者（患者）中的溃疡（例如皮肤溃疡）。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物或ActRII拮抗剂药物组合可以用于治疗或预防患有β地中海贫血综合征的受试者（患者）中的溃疡（例如皮肤溃疡）。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物或ActRII拮抗剂药物组合可以用于治疗或预防患有β中间型地中海贫血的受试者（患者）中的溃疡（例如皮肤溃疡）。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物或ActRII拮抗剂药物组合可以用于使溃疡（例如皮肤溃疡）的级别分类（例如Wager分级系统）改善至少一个等级（例如至少一个、两个、三个、四个或五个等级）。
在某些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）可以与用于溃疡的支持疗法组合使用。皮肤溃疡的常规护理涉及伤口的清创和清洁，随后为封闭敷料的施用。参见例如Marti-Carvajal等人（2012）The Cochrane Collaboration，由Wiley＆Sons，Ltd出版。另外的干预一般可以分为两个主要治疗组：药物干预（全身和局部药物）和非药物干预。系统性药物干预包括例如血管药物（例如己酮可可碱、盐酸异舒普林和烟酸占替诺）、抗氧化剂（例如L-肉毒碱）、EPO和EPO刺激剂、生长因子（例如波生坦）、矿物质（例如硫酸锌）、HbF合成的激动剂（例如丁酸精氨酸）和抗生素。局部药物干预包括例如抗生素、抗菌药、生长因子（例如GM-CSF、RGD肽基质、Solcoseryl®）、类固醇（例如可的松）和疼痛缓解剂（例如阿片类物质）。非药物干预包括例如重建手术、细胞疗法、激光疗法和高压氧。
溃疡和镰状细胞病
众多基因促成经典镰状细胞病（SCD；镰状细胞病（drepanocytosis）；镰状细胞性贫血）。主要地，SCD是由β珠蛋白基因中的突变（在密码子6处的谷氨酸盐突变为缬氨酸）引起的遗传性病症。参见例如Kassim等人（2013）Annu Rev Med，64：451-466。镰状细胞性贫血是SCD的最常见形式，具有在β S 等位基因（HbSS）中的纯合突变，影响60%至70%的SCD患者。
由于β珠蛋白基因中的突变，产生具有疏水基序的异常血红蛋白分子，当其处于脱氧状态时，所述疏水基序暴露。参见例如Eaton等人（1990）Adv Protein Chem，40：63-279；Steinberg，MH（1999）N Engl J Med 340（13）：1021-1030；和Ballas等人（1992）Blood，79（8）2154-63。一旦暴露，分离的血红蛋白分子的链就聚合，这导致对红血细胞膜的损害和细胞脱水。膜损害部分地通过膜脂质的再分布体现，导致在红细胞膜的外小叶上的磷脂酰丝氨酸表达。参见例如（2002）Blood 99（5）：1564-1571。外化的磷脂酰丝氨酸促进对巨噬细胞和激活的内皮细胞两者的粘附，其促进血管（血管的）闭塞。因此，在低氧状态下，红血细胞的血红蛋白沉淀成长晶体，使其延长，从形态上转变为“镰状”红血细胞。基因型以及脱氧范围和程度两者均促成血红蛋白聚合的严重性。已证明胎儿血红蛋白的存在成比例地降低病理性血红蛋白聚合物的量，并且使免于血管闭塞性危象。
大多数镰状细胞病患者经历称为疼痛危象的疼痛发作。镰状细胞疼痛危象指持续至少1小时（例如至少1、2、3、4、5、6或10小时）的急性镰状细胞形成相关疼痛，并且任选地需要疼痛管理治疗，例如施用一种或多种麻醉剂和/或非甾体抗炎剂。疼痛危象通常导致患者进入用于疼痛管理治疗的医疗机构。患有SCD的患者中的急性疼痛在性质上一般是缺血性的，并且可以起因于微血管床的闭塞。临床数据至少患有SCD的一些患者每年有三至十次疼痛危象。在许多患者中，疼痛危象发作通常在约一周内消退。在一些情况下，严重发作可以持续数周或甚至数月。SCD疼痛管理通常需要施用一种或多种阿片类镇痛药（例如氢吗啡酮、哌替啶等）、非甾体抗炎药（例如酮咯酸氨丁三醇）和皮质类固醇。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防患有SCD的患者中的疼痛危象。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于降低SCD患者中的疼痛管理的频率（例如用一种或多种麻醉剂、非甾体抗炎药和/或皮质类固醇治疗）。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于降低SCD患者中的一种或多种疼痛管理药物（例如麻醉剂、非类固醇抗炎药和/或皮质类固醇）的剂量。
血管闭塞性危象是SCD的临床标志之一。参见例如Rees等人（2010）Lancet，376：2018-2031。缺氧、酸中毒、炎症应激和内皮细胞激活促进刚性、聚合的镰状红细胞和白细胞在小血管内的截留。镰状红血细胞阻塞毛细血管并限制血液流向器官，导致缺血、疼痛、组织坏死和对各种器官的损害。这可以引起血管阻塞，导致组织缺血。虽然聚合和早期膜损害最初是可逆的，但重复的镰状细胞形成发作导致不可逆镰状红血细胞，其可以影响各种器官系统并导致死亡。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD患者中的血管闭塞性危象。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD患者中的血管闭塞。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD患者中的血管闭塞的并发症。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD患者中的血管闭塞性疼痛。
如同血管闭塞性并发症，溶血性贫血导致SCD患者的显著发病率。参见例如Pakbaz等人（2014）Hematol Oncol Clin N Am 28：355-374；Kassim等人（2013）Annu Rev Med 64：451-466。多重因素促成SCD中的慢性贫血。随着红细胞变得变形，产生针对暴露抗原的抗体，这导致红细胞的破坏增加，平均寿命为17天而不是110至120天。在溶血期间的血红蛋白释放抑制一氧化氮信号传导，导致内皮细胞功能障碍并促成高凝状态。慢性溶血促成贫血连同由激素和维生素缺乏引起的受损的红细胞代偿机制。进行性肾疾病在SCD中是常见的，导致促红细胞生成素减少，从而导致受损的刺激红细胞生成。叶酸和铁缺乏是常见的，因为来自红细胞生产的更高需求和尿铁损失增加。所有这些因素均促成SCD患者中的慢性贫血。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD患者中的贫血。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗镰状细胞病的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD患者中的贫血并发症。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗SCD患者的贫血。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗SCD患者的贫血并发症。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于预防SCD患者中的贫血。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于预防SCD患者中的贫血并发症。
急性贫血可以是严重和潜在致命的，与SCD患者中的10%至15%的死亡率相关。一般而言，严重发作由三个主要原因引起：脾隔离危象、再生障碍性危象或高溶血性危象。参见例如Ballas等人（2010）Am J Hematol，85：6-13。
脾隔离危象由于脾内的红细胞血管闭塞而出现，其中红细胞的汇集促使其快速扩大。像这样，存在循环血红蛋白（例如减少2 g/dL）和有效循环体积的减少，这可能导致低血容量性休克。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD患者中的脾隔离危机。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD患者中红血细胞的脾隔离。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD患者中的脾肿大。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗SCD患者中的脾肿大。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于预防SCD患者中的脾肿大。
再生障碍性危象当红细胞生成受损时出现。由于红细胞的不断过量产生，再生障碍性危象可以迅速导致严重的贫血。感染，例如细小病毒B19、链球菌、沙门氏菌和EB病毒，是红细胞生成的瞬时停滞的常见原因。循环红细胞和网织红细胞两者在再生障碍性危象期间均减少。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD患者中的再生障碍性危象。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD患者中的再生障碍性贫血。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗SCD患者中的再生障碍性危象。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于预防SCD患者中的再生障碍性危象。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗SCD患者的再生障碍性贫血。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于预防SCD患者中的再生障碍性贫血。
高度溶血当存在伴随网织红细胞增多症的贫血的突然恶化时出现，而无脾隔离的证据。高溶血性危象已在具有多次输血的患者或接受静脉内免疫球蛋白治疗的患者中得到记录。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD患者中的高溶血性危象。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD患者中的高溶血性贫血。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗SCD患者中的高溶血性危象。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于预防SCD患者中的高溶血性危象。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗SCD患者中的高溶血性贫血。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于预防SCD患者中的高溶血性贫血。
在某些方面，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD的心脏并发症。通常，SCD中的慢性贫血引起代偿性心输出量增加。这依次又导致心脏肥大和左心室肥大伴左心室功能障碍。参见例如Adebayo等人（2002）Niger J Med，11：145-152；Sachdev等人（2007）J Am Coll Cardiol，49：472-279；和Zilberman等人（2007）Am J Hematol 82：433-438。急性心肌梗塞可能出现，甚至无需冠状动脉疾病，并且因此在SCD中诊断不足。参见例如Pannu等人（2008）CritPathw Cardio，7：133-138。心律失常和充血性心力衰竭也与SCD患者中的早死联系。参见例如Fitzhugh等人（2010）Am J Hematol 85：36-40。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD的一种或多种心脏并发症，包括例如心输出量增加、心脏肥大、心肌病、左心室肥大、急性心肌梗塞、心律失常和充血性心力衰竭。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗SCD的一种或多种心脏并发症。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于预防SCD的一种或多种心脏并发症。
在某些方面，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD的肺部并发症。SCD频繁导致急性和慢性肺部并发症两者。参见例如Rucknagel，DL（2001）Pediatr Pathol MOl Med，20：137-154；Haynes等人（1986）Am J Med 80：833-840。急性并发症可以包括感染、来自血栓的肺栓塞、骨髓梗塞和脂肪栓塞。肺功能障碍可能由于来自肋骨的局部疼痛和胸骨梗塞而发生，导致肺换气不足和伴有低氧血症的肺不张。慢性并发症包括镰状细胞慢性肺病和肺动脉高压。急性胸部综合征（ACS）是患有镰状病的人所特有的，并且被定义为涉及至少1个完整的肺段、胸痛和高于38.5℃的温度的新的肺浸润，连同呼吸急促、喘息或咳嗽。参见例如Vichinsky等人（2000）N Engl J Med，342：1855-1865。肺梗塞、脂肪栓塞和感染的发展可能都促成ACS。感染是ACS患者中的发病率和死亡率的主要原因。
肺动脉高压是目前SCD中的发病率和死亡率的主要原因。参见例如De Castro等人（2008）Am J Hematol，83：19-25；Gladwin等人（2004）N Engl J Med 350：886-895。肺动脉高压已在32%的患有SCD的成人中得到记录，并且与血管闭塞性危象和溶血有关。参见例如Machado等人（2010）Chest，137（6 supple）：30S-38S。来自溶血的无细胞血红蛋白被认为减少一氧化氮，促成血管闭塞的肺血管扩张剂。参见例如Wood等人（2008）Free Radic BiolMed 44：1506-1528。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD的一种或多种肺部并发症，包括例如脂肪或骨髓栓塞、肺水肿、镰状细胞肺病、肺动脉高压、血栓栓塞和急性胸部综合征。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗SCD的一种或多种肺部并发症。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于预防SCD的一种或多种肺部并发症。
在某些方面，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD的肝并发症。肝病理状况在SCD中是常见的，在~90%的尸检病例中观察到肝肿大。参见例如Bauer等人（1980）Am J med 69：833-837；Mills等人（1988）Arch Pathol Lab Med 112：290-294。镰状细胞性贫血对肝的作用包括具有近端窦状扩张的窦内镰状细胞形成，伴有红细胞增多症的枯否细胞增生和含铁血黄素沉着症。局灶性坏死、再生性结节和肝硬化也已在验尸检查中得到描述。血管闭塞可以导致窦性闭塞和缺血，导致急性镰状肝肝象。与脾隔离相似，红细胞可以在肝内被隔离，导致急性贫血。参见例如Lee等人（1996）Postgrad Med J 72：487-488。肝隔离也可以导致肝内胆汁淤积。参见例如Shao等人（1995）Am J Gastroenterol 90：2045-2050。来自镰状细胞形成发作的肝细胞内的缺血还导致红细胞的气胀和小管内胆汁淤积。用于治疗SCD的一些疗法也促成肝病理状况。例如，频繁输血导致枯否细胞内的铁沉积增加（这可能导致铁过载），并增加感染血源性疾病如病毒性肝炎的风险。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD的一种或多种肝并发症，包括例如肝衰竭、肝肿大、肝隔离、肝内胆汁淤积、胆石病和铁过载。
在某些方面，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD的脾并发症。如前文讨论的，脾隔离由于脾内的红细胞血管闭塞而出现。急性加重导致脾肿大以及偶尔的脾梗塞。更常见的是，亚临床脾隔离可以导致脾功能的逐渐丧失，导致功能性脾功能减退和无脾。这依次又可以导致由于封装的细菌对脓毒病的易感性增加。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD的一种或多种脾并发症，包括例如急性或慢性脾隔离、脾肿大、脾功能减退、无脾和脾梗塞。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗SCD的一种或多种脾并发症。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于预防SCD的一种或多种脾并发症。
在某些方面，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD的肾并发症。大约十二百分比的患有SCD的患者发展肾衰竭。参见例如Powars等人（2205）Medicine 84：363-376；Scheinman，JI（2009）Nat Clin Pract Nephrol 5：78-88。直肠血管毛细血管内的血管闭塞导致微血栓性梗塞和红细胞外渗到肾髓质内。由于低氧张力、低pH和高渗透压，血液在肾髓质中变得更粘稠，并且如果严重的话，则可以促成缺血、梗塞和乳头坏死。反复性肾小球缺血导致肾小球硬化。缺血性损害的临床后果包括血尿、蛋白尿、浓缩能力下降、肾小管性酸中毒、近端肾小管功能异常、急性和慢性肾衰竭和泌尿道感染。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD的一种或多种肾并发症，包括例如急性和/或慢性肾衰竭、肾盂肾炎和肾髓质癌。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗SCD的一种或多种肾并发症。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于预防SCD的一种或多种肾并发症。
在某些方面，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD的骨和/或关节并发症。骨和关节并发症是SCD患者中的常见并发症。参见例如Hernigou等人（1991）J Bone Join Surg Am，73：81-92。来自手和脚中的小骨的疼痛，指（趾）炎，在患有SCD的婴儿中频繁出现。在骨髓中的血管闭塞的长期后果包括梗死、坏死和最终的退行性变化。由于脾功能减退，细菌感染在SCD中更常见。梗塞的骨和骨髓是常见的感染部位，导致骨髓炎和脓毒性关节炎。骨坏死或无血管坏死在伴随骨髓和骨髓的梗塞后出现。梗塞在长骨例如肱骨、胫骨和股骨内最常见。长期负重会对异常股骨头造成压力，并导致进行性关节破坏和关节炎。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD的一种或多种骨和/或关节并发症，包括梗塞、坏死、骨髓炎、脓毒性关节炎、骨坏死和骨质减少。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗SCD的一种或多种骨和/或关节并发症。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于预防SCD的一种或多种骨和/或关节并发症。
在某些方面，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD的神经性并发症。大约25百分比的患有SCD的个体受神经损伤的影响。参见例如Ohene-Frempong等人（1998）Blood，91：288-294；Verduzco等人（2009）Blood 114：5117-5125。损伤可以是急性或慢性的。脑血管意外在成人中最常见，但依赖基因型。患有HbSS的人具有最高的脑血管风险，具有在45岁之前患有临床中风的24百分比可能性。缺血性中风在9岁下述的儿童中更常见，而出血性中风在成年人中更常见。缺血性中风由于大颅内动脉的闭塞而出现，导致缺血。缺血继发于通过刚性红细胞的较小血管闭塞，由于慢性贫血、高凝状态和对动脉内皮的流动相关血液动力学损伤而加剧，进一步增加红细胞粘附的可能性。相比之下，出血性中风可以在脑室内、实质内和蛛网膜下腔中出现。参见例如Anson等人（1991）J Neurosurg，75：552-558。脑室内出血可能与大脑前动脉动脉瘤的破裂或实质内出血直接蔓延到外侧或第三脑室内有关。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD的一种或多种神经性并发症，例如动脉瘤、缺血性中风、实质内出血、蛛网膜下腔出血和脑室内出血。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗SCD的一种或多种神经性并发症。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于预防SCD的一种或多种神经性并发症。
在某些方面，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD的眼部并发症。SCD的眼并发症主要影响视网膜。参见例如Downes等人（2005）Opthalmology，112：1869-1875；Fadugbagbe等人（2010）AnnTrop Paediatr 30：19-26。由于血管闭塞性危象，出现周围性视网膜缺血。新血管（海扇形成）主要接近动静脉交叉点形成，并且被称为增殖性镰状视网膜病变。这些新血管可以容易地出血，引起牵拉性视网膜脱离和最终失明。非增殖性视网膜变化在SCD中也更常见。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD的一种或多种眼部并发症，包括例如外周视网膜缺血、增殖性镰状视网膜病变、玻璃体出血、视网膜脱离和非增殖性视网膜变化。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗SCD的一种或多种眼部并发症。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于预防SCD的一种或多种眼部并发症。
在某些方面，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD的皮肤（皮肤的）并发症。SCD的常见皮肤并发症之一是溃疡的表现。参见例如Keast等人（2004）Ostomy Wound Manage.，50（10）：64-70；Trent等人（2004）Adv Skin Wound Care，17（8）：410-416；J.R. Eckman（1996）HematolOncol Clin North Am.，10（6）：1333-1344；和Chung等人（1996）Advances in Wound Care，9（5）：46-50。尽管SCD患者中的溃疡发展机制尚未完全阐明，但认为它是受SCD的各个方面影响的多因素过程，包括例如血管闭塞，增加的静脉和毛细血管压，异常血液流变学，组织缺氧，以及通过静脉停滞、静脉压升高或两者引起的细菌侵入的易感性增加。已发现溃疡愈合的速率比患有SCD的患者中的速率慢三至16倍。溃疡可以持续数月至数年，并且SCD患者中存在复发的高发生率。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防SCD的一种或多种皮肤并发症，包括例如溃疡。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗SCD的一种或多种皮肤并发症，例如溃疡。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗SCD的药物和/或支持疗法组合，可以用于预防SCD的一种或多种皮肤并发症，例如溃疡。
在某些方面，本发明的ActRII拮抗剂可以与一种或多种另外的药物（例如羟基脲、EPO拮抗剂、EPO、阿片类镇痛药、非甾体抗炎药、皮质类固醇、铁螯合剂）或支持疗法（例如红血细胞输血）组合施用于有此需要的受试者，用于治疗镰状细胞病或镰状细胞病的一种或多种并发症（例如皮肤并发症，例如皮肤溃疡）。
大多数SCD患者的主要治疗是支持性的。对于患有镰状细胞病的患者的目前治疗选项包括抗生素、疼痛管理、静脉注射液、输血、手术和化合物例如羟基脲。
羟基脲（例如Droxia®）是用于治疗镰状细胞病的批准药物。羟基脲是S期细胞毒性药物，并且用于长期治疗。它被认为增加血红蛋白F的水平，所述血红蛋白F防止S-聚合物的形成和红血细胞镰形化形成。它还被认为增加NO产生。羟基脲在患有镰状细胞病的成人中的多中心试验显示羟基脲使疼痛发作的发生率降低近一半。然而，目前羟基脲仅用于患有SCD的严重并发症并且能够遵循每日剂量方案的患者。一般认为羟基脲疗法仅在具有高依从性潜力的结构化环境中给予时才是有效的。不幸的是，许多SCD患者对羟基脲抗拒。在一些实施方案中，本发明的方法涉及通过施用本发明的ActRII拮抗剂和羟基脲的组合，来治疗有此需要的受试者中的镰状细胞病。在一些实施方案中，本发明的方法涉及通过施用本发明的ActRII拮抗剂和羟基脲的组合，来治疗或预防有此需要的受试者中的一种或多种镰状细胞病并发症（例如皮肤并发症，例如皮肤溃疡）。
定期红血细胞输血也是SCD患者的常见疗法。然而，几个问题使得其不适合于长期使用。虽然定期输血已显示预防中风、ACS和血管闭塞性疼痛危象，但它们不能阻止无症状性梗死的发展或烟雾病的发展，所述烟雾病是其中某些动脉收缩并且代偿性侧支血管易于出血的脑循环病症。参见例如Bishop等人（2011）Blood Cells，Molecules & Disease，47：125-128；DeBaun等人（2012）Blood，119：4787-4596。此外，SCD患者可能由于红血细胞输血而发展铁过载，所述铁过载与其自身的发病率相关。定期红血细胞输血需要暴露于各种供体单位的血液，并且因此具有更高的同种异体免疫的风险。血管通路的困难、铁螯合的可用性和顺应性以及高成本是为何定期输血并非普遍疗法的最佳选择的一些原因。Wayne等人（2000）Blood，96：2369-2372。在一些实施方案中，本发明的方法涉及通过施用本发明的ActRII拮抗剂和一种或多种血细胞输注的组合，来治疗有此需要的受试者中的镰状细胞病。在一些实施方案中，本发明的方法涉及通过施用本发明的ActRII拮抗剂和一种或多种红血细胞输注的组合，来治疗或预防有此需要的受试者中的一种或多种镰状细胞病并发症。在一些实施方案中，用本发明的一种或多种ActRII拮抗剂的治疗有效减少SCD患者中的输血需求，例如降低有效治疗SCD或一种或多种SCD并发症所需的输血频率和/或输血量。
在某些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）可以与用于SCD的支持疗法组合使用。此类疗法包括用红血细胞或全血输血以治疗贫血。在SCD患者中，关于铁稳态的正常机制被反复输血压制，最终导致在活组织例如心脏、肝和内分泌腺中的毒性和潜在致命的铁积累。因此，用于SCD患者的支持疗法还包括用一种或多种铁螯合分子的治疗，以促进尿和/或粪便中的铁排泄，并且从而预防或逆转组织铁过载。有效的铁螯合剂应当能够选择性结合且中和三价铁，氧化形式的非转铁蛋白结合铁，其通过羟基自由基和氧化产物的催化生产可能负责大多数铁毒性。参见例如Esposito等人（2003）Blood 102:2670-2677。这些药物在结构上是多样的，但是都具有能够与以1:1（六齿药物）、2:1（三齿）或3:1（双齿）的化学计量学的各个铁原子形成中和八面体配位络合物的氧或氮供体原子。Kalinowski等人（2005）PharmacolRev 57:547-583。一般而言，有效的铁螯合剂也具有相对低的分子量（例如小于700道尔顿），其中在水和脂质两者中的溶解性能够接近受累组织。铁螯合分子的具体例子包括去铁胺（也称为去铁敏B、去铁胺B、DFO-B、DFOA、DFB或Desferal®），需要每日肠胃外施用的细菌来源的六齿药物，以及经口活性的合成药物去铁酮（也称为Ferriprox®）（双齿）和地拉罗司（也称为双-羟基苯基-三唑、ICL670或Exjade®）（三齿）。由同一天施用两种铁螯合剂组成的组合疗法在对螯合单一疗法无应答的患者中显示出前景，并且还克服了患者对单独的去铁胺（dereroxamine）的弱顺应性的问题。Cao等人（2011）Pediatr Rep 3（2）:e17；和Galanello等人（2010）Ann NY Acad Sci 1202:79-86。
无效红细胞生成和溃疡
在某些方面，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防有此需要的受试者中的无效红细胞生成。最初基于铁动力学研究（Ricketts等人，1978，Clin Nucl Med 3：159-164）区别于再生障碍性贫血、出血或外周溶血，无效红细胞生成描述了不同组的贫血，其中成熟RBC的产生少于骨髓中存在的红系前体（成红细胞）的数目（Tanno等人，2010，Adv Hematol 2010：358283）。在此类贫血中，尽管由于成熟RBC的无效生产导致促红细胞生成素水平升高，组织缺氧仍然存在。最终发展为恶性循环，其中升高的促红细胞生成素水平驱动成红细胞的大量扩增，潜在导致由于髓外红细胞生成的脾肿大（脾扩大）（Aizawa等人，2003，Am J Hematol 74：68-72）、成红细胞诱导的骨病理状态（Di Matteo等人，2008，J Biol Regul Homeost Agents 22：211-216）和组织铁过载，即使在不存在治疗性RBC输血的情况下（Pippard等人，1979，Lancet 2：819-821）。因此，通过提高红细胞生成效力，本发明的ActRII拮抗剂可以打破上述循环，并且不仅可以缓解潜在的贫血，还可以缓解促红细胞生成素水平升高、脾肿大、骨病理状态和组织铁过载的相关并发症。ActRII拮抗剂可以治疗无效红细胞生成，包括贫血和EPO水平升高，以及并发症例如脾肿大、成红细胞诱导的骨病理状态和铁过载、皮肤溃疡及其伴随的病理状态。对于脾肿大，这种病理状态包括胸部或腹部疼痛和网状内皮增生。髓外造血不仅可以在脾中出现，还潜在地可以在其他组织中以髓外造血假瘤的形式出现（Musallam等人，2012，ColdSpring Harb Perspect Med 2:a013482）。对于成红细胞诱导的骨病理状态，伴随的病理状态包括低骨矿物质密度、骨质疏松和骨痛（Haidar i.，2011，Bone 48:425-432）。对于铁过载，伴随的病理状态包括铁调素压制和膳食铁的过度吸收（Musallam等人，2012，Blood Rev26（Suppl 1）:S16-S19）、多发性内分泌病和肝纤维化/肝硬化（Galanello等人，2010，Orphanet J Rare Dis 5:11）和铁过载心肌病（Lekawanvijit等人，2009，Can J Cardiol25:213-218）。
无效红细胞生成的最常见原因是地中海贫血综合征，遗传性血红蛋白病，其中完整的α-和β血红蛋白链的产生中的不平衡导致在成红细胞成熟期间的细胞凋亡增加（Schrier，2002，Curr Opin Hematol 9:123-126）。地中海贫血是共同的全世界最频繁的遗传病症，其中不断变化的流行病学模式预测会促成美国和全球日益严重的公共卫生问题（Vichinsky，2005，Ann NY Acad Sci 1054:18-24）。地中海贫血综合征根据其严重性来命名。因此，α地中海贫血包括α-轻型地中海贫血（也称为α地中海贫血性状；两种受影响的α珠蛋白基因）、血红蛋白H疾病（三种受影响的α珠蛋白基因）和α-重型地中海贫血（也称为胎儿水肿 ；四种受影响的α珠蛋白基因）。β地中海贫血包括β轻型地中海贫血（也称为β地中海贫血性状；一种影响β珠蛋白基因）、β中间型地中海贫血（两种受影响的β珠蛋白基因）、血红蛋白E地中海贫血（两种受影响的β珠蛋白基因）和β重型地中海贫血（也称为库利氏贫血；两种受影响的β珠蛋白基因，导致β珠蛋白蛋白质的完全不存在）。β地中海贫血影响多重器官，与相当大的发病率和死亡率相关，并且目前需要终身护理。虽然患有β地中海贫血的患者中的预期寿命近年来由于使用与铁螯合组合的定期输血而增加，但起因于输血和铁的过量胃肠吸收两者而导致的铁过载可以引起严重的并发症，例如心脏病、血栓形成、性腺机能减退、甲状腺功能减退、糖尿病、骨质疏松和骨质减少（Rund等人，2005，N Engl J Med 353:1135-1146）。如本文用β地中海贫血的小鼠模型证明的，任选与EPO受体激活剂组合的ActRIIa拮抗剂可以用于治疗地中海贫血综合征。此外，本文公开的数据证明GDF捕获物多肽可以用于促进对人类地中海贫血患者中的红血细胞参数（例如血清血红蛋白水平升高）的正面作用以及治疗地中海贫血的并发症（例如皮肤溃疡）。
在某些方面，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗无效红细胞生成病症（例如地中海贫血综合征）的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防无效红细胞生成的皮肤（皮肤的）并发症。无效红细胞生成特别是地中海贫血的常见皮肤并发症是溃疡的表现。虽然关于地中海贫血患者中的溃疡发展的机制尚未完全阐明，但认为它是受地中海贫血的各个方面影响的多因素过程，包括例如和组织缺氧。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗无效红细胞生成（例如地中海贫血）的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗或预防无效红细胞生成（例如地中海贫血）的一种或多种皮肤并发症，包括例如溃疡。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂，任选与一种或多种用于治疗无效红细胞生成（例如地中海贫血）的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗无效红细胞生成（例如地中海贫血）的一种或多种皮肤并发症，包括例如溃疡。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗无效红细胞生成（例如地中海贫血）的药物和/或支持疗法组合，可以用于预防无效红细胞生成（例如地中海贫血）的一种或多种皮肤并发症，包括例如溃疡。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗β地中海贫血（例如β中间型地中海贫血）的药物和/或支持疗法组合，可以用于治疗β地中海贫血（例如β中间型地中海贫血）的一种或多种皮肤并发症，包括例如溃疡。在一些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物，任选与一种或多种用于治疗β地中海贫血（例如β中间型地中海贫血）的药物和/或支持疗法组合，可以用于预防β地中海贫血（例如β中间型地中海贫血）的一种或多种皮肤并发症，包括例如溃疡。
其他贫血适应症
本发明的ActRII拮抗剂，任选与一种或多种支持疗法组合，可以用于治疗除地中海贫血综合征之外的无效红细胞生成的病症。此类病症包括铁粒幼红细胞贫血（遗传性或获得性）；红细胞生成异常性贫血（I型和II型）；镰状细胞性贫血；遗传性球形红细胞增多症；丙酮酸激酶缺乏症；可能由诸如叶酸缺乏症（由于先天性疾病、摄入减少或需求增加）、钴胺素缺乏症（由于先天性疾病、恶性贫血、吸收受损、胰腺功能不全或摄入减少）的状况、某些药物或不明原因（先天性红细胞生成异常性水肿、难治性巨幼红细胞性贫血或红白血病）而引起的巨幼红细胞性贫血；骨髓性贫血，包括骨髓纤维化（髓样化生）和骨髓痨；先天性红细胞生成性卟啉症；和铅中毒。
如本文所示，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等），任选与EPO受体激活剂和一种或多种另外的支持疗法组合，可以用于增加健康个体和所选择的患者群体中的红血细胞、血红蛋白或网织红细胞水平。适当的患者群体的例子包括具有不期望的低红血细胞或血红蛋白水平的那些，例如患有贫血的患者、镰状细胞患者、以及处于发展不期望的低红血细胞或血红蛋白水平的风险中的那些，例如即将经历可能导致大量失血的大手术或其他手术的那些患者。在一些实施方案中，具有足够红血细胞水平的患者用一种或多种ActRII拮抗剂药物进行治疗以增加红血细胞水平，并且随后抽取血液并储存用于以后在输血中使用。
本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等），任选与EPO受体激活剂和/或其他一种或多种另外的支持疗法组合，可以用于增加患有贫血的患者（例如镰状细胞患者、地中海贫血患者等）中的红血细胞水平、血红蛋白水平和/或血细胞比容水平。当观察人中的血红蛋白和/或血细胞比容水平时，小于对于适当年龄和性别类别正常水平的水平可以指示贫血，尽管考虑了个体差异。例如，10-12.5 g/dl且通常为约11.0 g/dl的血红蛋白水平视为在健康成人中的正常范围内，尽管就治疗而言，较低的靶水平可能引起较少的心血管副作用。参见例如Jacobs等人（2000）Nephrol Dial Transplant 15，15-19。可替代地，血细胞比容水平（由细胞占据的血样体积的百分比）可以用作贫血的量度。健康个体的血细胞比容水平对于成年男性范围为约41-51%，并且对于成年女性范围为35-45%。在某些实施方案中，可以用预期使患者恢复至红血细胞、血红蛋白和/或血细胞比容的靶水平的给药方案治疗患者。由于血红蛋白和血细胞比容水平因人而异，最佳地，靶血红蛋白和/或血细胞比容水平可以针对每个患者进行个体化。
在具有组织损伤、感染和/或慢性疾病特别是癌症的患者中频繁观察到贫血。在一些受试者中，贫血通过低促红细胞生成素水平和/或对骨髓中促红细胞生成素的不充分应答加以区别。参见例如Adamson，2008，Harrison’s Principles of Internal Medicine，第17版；McGraw Hill，New York，第628-634页。贫血的潜在原因包括例如失血、营养缺乏（例如蛋白质的饮食摄入降低）、药物反应、与骨髓有关的不同问题和许多疾病。更特别地，贫血与各种病症和状况相关，所述病症和状况包括例如骨髓移植；实体瘤（例如乳腺癌、肺癌和结肠癌）；淋巴系统肿瘤（例如慢性淋巴细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤）；造血系统肿瘤（例如白血病、骨髓增生异常综合征和多发性骨髓瘤）；放射疗法；化学疗法（例如含铂方案）；炎性和自身免疫性疾病，包括但不限于类风湿性关节炎、其他炎性关节炎、系统性红斑狼疮（SLE）、急性或慢性皮肤病（例如牛皮癣）、炎性肠病（例如克罗恩氏病和溃疡性结肠炎）；急性或慢性肾疾病或衰竭，包括特发性或先天性状况；急性或慢性肝病；急性或慢性出血；由于患者同种异体或自身抗体和/或宗教原因（例如一些耶和华见证人（Jehovah's Witnesses）），其中红血细胞不能输血的情况；感染（例如疟疾和骨髓炎）；血红蛋白病，包括例如镰状细胞病（贫血）、地中海贫血；药物使用或滥用（例如酒精滥用）；出于避免输血的任何原因的具有贫血的儿科患者；以及老年患者或具有潜在的伴有贫血的心肺疾病的患者，其由于担心循环过载而不能接受输血。参见例如Adamson（2008）Harrison’sPrinciples of Internal Medicine，第17版；McGraw Hill，New York，第628-634页。在一些实施方案中，任选与EPO受体激活剂组合的本发明的一种或多种ActRII拮抗剂（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等），可以用于治疗或预防与一种或多种本文公开的病症或状况相关的贫血。在一些实施方案中，任选与EPO受体激活剂组合的本发明的一种或多种ActRII拮抗剂（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等），可以用于治疗与一种或多种本文公开的病症或状况相关的贫血。在一些实施方案中，任选与EPO受体激活剂组合的本发明的一种或多种ActRII拮抗剂（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等），可以用于预防与一种或多种本文公开的病症或状况相关的贫血。
许多因素可以促成癌症相关性贫血。一些与疾病过程本身和炎症细胞因子例如白细胞介素-1、干扰素-γ和肿瘤坏死因子的生成相关。Bron等人（2001）Semin Oncol 28（Suppl 8）:1-6。在其效应中，炎症诱导关键的铁调节肽铁调素，从而抑制来自巨噬细胞的铁输出，并且一般限制用于红细胞生成的铁利用度。参见例如Ganz（2007）J Am SocNephrol 18:394-400。通过各种途径的失血也可以促成癌症相关性贫血。由于癌症进展的贫血患病率随着癌症类型而变，范围从前列腺癌中的5%直到多发性骨髓瘤中的90%。癌症相关性贫血对患者具有深刻后果，包括疲劳和生活质量降低、治疗功效降低和死亡率增加。在一些实施方案中，任选与EPO受体激活剂组合的本发明的一种或多种ActRII拮抗剂（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等），可以用于治疗或预防癌症相关性贫血。在一些实施方案中，任选与EPO受体激活剂组合的本发明的一种或多种ActRII拮抗剂（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等），可以用于治疗癌症相关性贫血。在一些实施方案中，任选与EPO受体激活剂组合的本发明的一种或多种ActRII拮抗剂（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等），可以用于预防癌症相关性贫血。
低增殖性贫血可起因于原发性功能障碍或骨髓的衰竭。低增殖性贫血包括：慢性疾病贫血、肾疾病贫血、与代谢减退状态相关的贫血和与癌症相关的贫血。在这些类型的每一种中，内源性促红细胞生成素水平对于观察到的贫血程度不适当地低。其他低增殖性贫血包括：早期铁缺乏性贫血和由骨髓损伤引起的贫血。在这些类型中，内源性促红细胞生成素水平对于观察到的贫血程度适当升高。突出的例子是由癌症和/或化学治疗药物或癌症放射疗法引起的骨髓抑制。临床试验的广泛综述发现轻度贫血可以在化学治疗后的100%患者中出现，而更严重的贫血可以在高达80%的此类患者中出现。参见例如Groopman等人（1999）J Natl Cancer Inst 91:1616-1634。骨髓抑制药包括例如：1）烷化剂，例如氮芥（例如美法仑）和亚硝基脲（例如链佐星）；2）抗代谢药例如叶酸拮抗剂（例如氨甲蝶呤）、嘌呤类似物（例如硫鸟嘌呤）和嘧啶类似物（例如吉西他滨）；3）细胞毒性抗生素，例如蒽环类（例如多柔比星）；4）激酶抑制剂（例如吉非替尼）；5）有丝分裂抑制剂，例如紫杉烷（例如紫杉醇）和长春花生物碱（例如长春瑞滨）；6）单克隆抗体（例如利妥昔单抗）；和7）拓扑异构酶抑制剂（例如拓扑替康和依托泊苷）。另外，导致代谢减退速率的状况可以产生轻度至中度的低增殖性贫血。在这些状况中有内分泌缺乏状态。例如，贫血可在阿狄森氏病、甲状腺功能减退、甲状旁腺功能亢进、或者阉割或用雌激素治疗的男性中出现。在一些实施方案中，任选与EPO受体激活剂组合的本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等），可以用于治疗或预防过度增殖性贫血。
慢性肾疾病有时与低增殖性贫血有关，贫血的程度随着肾受损的水平在严重性中不同。此类贫血主要是由于促红细胞生成素的生产不足和红血细胞的存活降低。慢性肾疾病通常经过数年或数十年的时期逐渐进展到终末期（5期）疾病，在该时间点需要透析或肾移植用于患者存活。贫血通常在该过程早期发展，并且随着疾病进展而恶化。肾疾病的贫血的临床后果得到充分记录，并且包括左心室肥大、认知功能受损、生活质量降低和免疫功能改变。参见例如Levin等人（1999）Am J Kidney Dis 27:347-354；Nissenson（1992）Am JKidney Dis 20（Suppl 1）:21-24；Revicki等人（1995）Am J Kidney Dis 25:548-554；Gafter等人，（1994）Kidney Int 45:224-231。在一些实施方案中，任选与EPO受体激活剂组合的本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等），可以用于治疗或预防与急性或慢性肾疾病或衰竭相关的贫血。在一些实施方案中，任选与EPO受体激活剂组合的本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等），可以用于治疗与急性或慢性肾疾病或衰竭相关的贫血。在一些实施方案中，任选与EPO受体激活剂组合的本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等），可以用于预防与急性或慢性肾疾病或衰竭相关的贫血。
起因于足够体积的急性失血的贫血，例如来自创伤或产后出血的贫血，被称为急性出血后贫血。急性失血最初引起无贫血的血容量减少，因为RBC连同其他血液组成成分一起按比例耗尽。然而，血容量减少将迅速触发将流体从血管外转移到血管腔隙的生理机制，这导致血液稀释和贫血。如果慢性，则失血逐渐耗尽身体铁储存，并且最终导致铁缺乏。在一些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）可以用于治疗起因于急性失血的贫血。
缺铁性贫血是增加铁缺乏症的分级进展的最后阶段，所述铁缺乏症包括作为中间阶段的负铁平衡和铁缺乏红细胞生成。铁缺乏症可以起因于铁需求增加、铁摄入减少或铁损失增加，如在诸如怀孕、饮食不足、肠道吸收不良、急性或慢性炎症和急性或慢性失血的状况中例证。对于这种类型的轻度至中度贫血，骨髓保持低增殖，且RBC形态大部分正常；然而，即使轻度贫血也以可导致一些小红细胞低色素性RBC，并且向严重铁缺乏性贫血的过渡伴随着骨髓的过度增殖和越来越普遍的小红细胞和低色素性RBC。参见例如Adamson（2008）Harrison’s Principles of Internal Medicine，第ed版；McGraw Hill，New York，第628-634页。缺铁性贫血的适当治疗取决于其原因和严重性，其中经口铁制剂、肠胃外铁制剂和RBC输血作为主要常规选项。在一些实施方案中，任选与EPO受体激活剂组合的本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等），可以用于治疗慢性铁缺乏。
骨髓增生异常综合征（MDS）是血液学状况的多样化集合，所述血液学状况的特征在于髓样血细胞的无效产生和转化为急性髓性白血病的风险。在MDS患者中，血液干细胞不成熟为健康的红血细胞、白血细胞或血小板。MDS病症包括例如难治性贫血、难治性贫血伴环状铁粒幼红细胞、难治性贫血伴原始细胞过多、难治性贫血伴转化中原始细胞过多、难治性血细胞减少伴多系发育不良、以及与孤立的5q染色体异常相关的骨髓增生异常综合征。由于这些病症在造血细胞的数量和质量两者中表现为不可逆的缺陷，大多数MDS患者患有慢性贫血。因此，MDS患者最终需要输血和/或用生长因子（例如促红细胞生成素或G-CSF）治疗以增加红血细胞水平。然而，由于此类疗法的频率，许多MDS患者产生副作用。例如，接受频繁红血细胞输血的患者可能由于额外铁的积聚而具有组织和器官损伤。相应地，任选与EPO受体激活剂组合的本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等），可以用于治疗患有MDS的患者。在某些实施方案中，可以使用任选与EPO受体激活剂组合的本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）治疗患有MDS的患者。在其他实施方案中，可以使用本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）和一种或更多用于治疗MDS的另外治疗剂（包括例如沙利度胺、来那度胺、阿扎胞苷、地西他滨、促红细胞生成素、去铁胺、抗胸腺细胞球蛋白和非格司亭（G-CSF））治疗患有MDS的患者。
如本文使用的，“与...组合”或“组合施用”指任何形式的施用，使得第二疗法在体内仍有效（例如两种药物或化合物在患者中同时有效，其可以包括两种药物或化合物的协同作用）。有效性可能与血液、血清或血浆中药物的可测量浓度不关联。例如，不同的治疗剂或化合物可以在相同制剂或分开制剂中，同时或序贯地，且在不同的时间表上施用。因此，接受此类治疗的个体可以受益于不同疗法的组合效应。本发明的一种或多种GDF11和/或激活素B拮抗剂药物（任选地，GDF8、激活素A、激活素C、激活素E和BMP6中的一种或多种的进一步拮抗剂）可以与一种或多种其他的另外药物或支持疗法同时、之前或之后施用。一般而言，每种治疗剂以对于该特定药物确定的剂量和/或时间表施用。在方案中采用的特定组合将考虑到本发明的拮抗剂与疗法和/或待实现的所需疗效的相容性。
在某些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）可以与铁调素或铁调素激动剂组合用于治疗镰状细胞病，特别是与铁过载相关的镰状细胞病并发症。主要在肝中产生的循环多肽，铁调素视为铁代谢的主要调节剂，由于其诱导铁转运蛋白的降解的能力，所述铁转运蛋白是局限于吸收性肠细胞、肝细胞和巨噬细胞上的铁输出蛋白。广泛地说，铁调素降低细胞外铁的可用性，因此铁调素激动剂可能有益于治疗镰状细胞病，特别是与铁过载相关的镰状细胞病并发症。
任选与EPO受体激活剂组合的本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）也适用于治疗紊乱RBC成熟的贫血，其特征部分在于由小尺寸（小红细胞）、超尺寸（大红细胞）、畸形或异常着色（低色素性）RBC。
在某些实施方案中，本发明提供了通过给个体施用治疗有效量的本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂，ActRIIA 多肽，ActRIIB多肽，GDF捕获物等）和EPO受体激活剂，来治疗或预防有此需要的个体中的贫血的方法。在某些实施方案中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）可以与EPO受体激活剂组合使用，以降低这些激活剂在易受EPO的不良反应的患者中的剂量。这些方法可以用于患者的治疗性和预防性处理。
本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）可以与EPO受体激活剂组合使用，以实现红血细胞的增加，特别是在较低剂量范围。这可能有益于降低已知的脱靶效应和与高剂量的EPO受体激活剂相关的风险。EPO的主要不良反应包括例如血细胞比容或血红蛋白水平中的过度增加和红细胞增多症。升高的血细胞比容水平可以导致高血压（更特别地，高血压的恶化）和血管血栓形成。已报道的EPO的其他不良反应（其中一些涉及高血压）是头痛、流感样综合征、分流闭塞、心肌梗塞以及由于血栓形成、高血压性脑病和红血细胞血液细胞发育不全的脑痉挛。参见例如Singibarti（1994）J. Clin Investig 72（suppl 6），S36-S43；Horl等人（2000）Nephrol Dial Transplant 15（suppl 4），51-56；Delanty等人（1997）Neurology 49，686-689；和Bunn（2002）N Engl J Med 346（7），522-523）。
如果本发明的拮抗剂通过与EPO不同的机制起作用，则这些拮抗剂可以用于增加对EPO并未良好应答的患者中的红血细胞和血红蛋白水平。例如，本发明的ActRII拮抗剂可以有益于其中施用正常至增加（>300 IU/kg/周）剂量的EPO不导致血红蛋白水平增加至靶水平的患者。对于所有类型的贫血发现具有不足够的EPO应答的患者，但在患有癌症的患者和患有终末期肾疾病的患者中特别频繁地观察到更高数目的无应答者。对EPO的不足够应答可以是组成性（用EPO首次治疗后观察到的）或获得性的（用EPO反复治疗后观察到的）。
在某些实施方案中，本发明提供了通过测量患者中的一种或多种血液学参数用于管理的方法，所述患者已用本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）治疗，或是用其治疗的候选者。血液学参数可以用于评估用于患者的适当剂量，所述患者是待用本发明的拮抗剂治疗的候选者，以监测在治疗期间的血液学参数，评估在用本发明的一种或多种拮抗剂治疗期间是否调整剂量，和/或评估本发明的一种或多种拮抗剂的适当维持剂量。如果一种或多种血液学参数在正常水平之外，则可以降低、延迟或终止用本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）的给药。
使用领域公认的方法，可以根据本文提供的方法测量的血液学参数包括例如红血细胞水平、血压、铁储存和在体液中发现的与增加的红血细胞水平关联的其他药物。此类参数可以使用来自患者的血样进行测定。红血细胞水平、血红蛋白水平和/或血细胞比容水平中的增加可以引起血压升高。
在一个实施方案中，如果一种或多种血液学参数在患者的正常范围之外或正常的高侧上，所述患者是待用本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）治疗的候选者，则可以延迟本发明的一种或多种拮抗剂的施用开始，直到血液学参数自然地或经由治疗干预恢复到正常或可接受的水平。例如，如果候选患者是高血压或高血压前期，则可以用降血压剂治疗患者以降低患者的血压。可以使用适合于个体患者状况的任何降血压剂，包括例如利尿剂、肾上腺素能抑制剂（包括α阻断剂和β阻断剂）、血管扩张剂、钙通道阻断剂、血管紧张素转化酶（ACE）抑制剂或血管紧张素II受体阻断剂。可以可替代地使用饮食和运动方案来治疗血压。类似地，如果候选患者具有低于正常或在正常的低侧上的铁储存，则可以用适当的饮食方案和/或铁补充剂治疗患者，直到患者的铁储存已恢复到正常或可接受的水平。对于具有高于正常红血细胞水平和/或血红蛋白水平的患者，则可以延迟本发明的一种或多种拮抗剂的施用，直到水平已恢复到正常或可接受的水平。
在某些实施方案中，如果一种或多种血液学参数在患者的正常范围之外或正常的高侧上，所述患者是待用本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）治疗的候选者，则施用的开始可以不被延迟。然而，本发明的一种或多种拮抗剂的给药剂量或频率可以设定为降低施用本发明的一种或多种拮抗剂后出现的血液学参数中不可接受的增加的风险的量。可替代地，可以开发用于患者的治疗方案，所述治疗方案将本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）与解决血液学参数的不期望水平的治疗剂组合。例如，如果患者具有升高的血压，则可以设计涉及本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）和血压降低剂的施用的治疗方案。对于具有低于所需铁储存的患者，可以开发涉及本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）和铁补充的施用的治疗方案。
在一个实施方案中，可以对于患者建立关于一种或多种血液学参数的基线参数，所述患者是待用本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）治疗的候选者，并且基于基线值对于该患者建立合适的给药方案。可替代地，基于患者病史建立的基线参数可以用于告知用于患者的适当拮抗剂给药方案。例如，如果健康患者具有高于限定的正常范围的确定的基线血压读数，则在用本发明的一种或多种拮抗剂治疗之前，可能不需要使患者的血压达到对于一般群体视为正常的范围内。在用本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）治疗之前，关于一种或多种血液学参数的患者基线值也可以用作用于在用本发明的一种或多种拮抗剂治疗期间监测血液学参数的任何变化的相关比较值。
在某些实施方案中，在用本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）治疗的患者中测量一种或多种血液学参数。血液学参数可以用于在治疗期间监测患者，并允许调整或终止用本发明的一种或多种拮抗剂的给药或用另一种治疗剂的另外给药。例如，如果本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）的施用导致血压、红血细胞水平或血红蛋白水平中的增加或铁储存中的减少，则本发明的一种或多种拮抗剂的剂量可以在量或频率中降低，以便减少本发明的一种或多种拮抗剂对一种或多种血液学参数的作用。如果本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）的施用导致对患者不利的一种或多种血液学参数变化，则可以暂时终止本发明的一种或多种拮抗剂的给药，直到血液参数恢复到可接受的水平，或永久终止。类似地，如果在降低本发明的一种或多种拮抗剂的施用剂量或频率后，一种或多种血液学参数未达到可接受的范围内，则可以终止给药。作为降低或终止用本发明的一种或多种拮抗剂给药的替代或补充，患者可以用解决了血液学参数中的不期望水平的另外治疗剂给药，所述另外治疗剂例如降血压剂或铁补充剂。例如，如果待用本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）治疗的患者具有升高的血压，则用本发明的一种或多种拮抗剂的给药可以以相同的水平继续，并且将降血压剂加入治疗方案中，用本发明的一种或多种拮抗剂的给药可以降低（例如在量和/或频率方面），并且将降血压剂加入治疗方案中，或者可以终止用本发明的一种或多种拮抗剂的给药，并且可以用降血压剂治疗患者。
6. 药物组合物
在某些方面，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）可以单独或作为药物制剂（也称为治疗组合物或药物组合物）的组分施用。药物形成是指以这样的形式的制剂，使得允许在其中包含的活性成分（例如本发明的药物）的生物活性是有效的，并且不含有对制剂将施用于其的受试者不可接受的毒性的另外组分。主题ActRII拮抗剂药物可以配制用于以任何方便的方式施用用于在人或兽医学中使用。例如，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物可以与药学可接受的载体一起配制。药学可接受的载体指药物制剂中除活性成分外的成分，其一般对受试者无毒。药学可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂和/或防腐剂。一般而言，当施用于受试者时，用于在本发明中使用的药物制剂是无热原、生理学可接受的形式。可以任选包括在如上所述的制剂中的除本文所述那些外的治疗有用药物可以与本发明的方法中的主题ActRII拮抗剂药物组合施用。
在某些方面，本发明提供了使用包含ActRII拮抗剂和药学可接受的载体的药物组合物，来治疗或预防有此需要的受试者中的贫血和/或治疗或预防一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用包含ActRII拮抗剂或ActRII拮抗剂组合和药学可接受的载体的药物组合物，来治疗有此需要的受试者中的贫血和/或治疗患有贫血的受试者中的一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡的方法。在一些实施方案中，本发明提供了使用包含ActRII拮抗剂或ActRII拮抗剂组合和药学可接受的载体的药物组合物，来预防有此需要的受试者中的贫血和/或预防患有贫血的受试者中的一种或多种贫血并发症包括例如皮肤溃疡的方法。在前述实施方案的一些中，包含本发明的ActRII拮抗剂或ActRII拮抗剂组合和药学可接受的载体的药物组合物用于治疗患有贫血（例如溶血性贫血、血红蛋白病性贫血、地中海贫血综合征（例如β地中海贫血综合征、β中间型地中海贫血等）、镰状细胞病等）的受试者（例如患者）中的溃疡（例如皮肤溃疡）。在前述实施方案的一些中，包含本发明的ActRII拮抗剂或ActRII拮抗剂组合和药学可接受的载体的药物组合物用于预防患有贫血（例如溶血性贫血、血红蛋白病性贫血、地中海贫血综合征（例如β地中海贫血综合征、β中间型地中海贫血等）、镰状细胞病等）的受试者（例如患者）中的溃疡（例如皮肤溃疡）。在一些实施方案中，患有贫血的受试者患有镰状细胞病。在一些实施方案中，患有贫血的受试者患有地中海贫血综合征（例如β地中海贫血综合征、β中间型地中海贫血等）。在一些实施方案中，患有贫血的受试者患有皮肤溃疡。在一些实施方案中，皮肤溃疡是皮肤的溃疡。在一些实施方案中，溃疡出现在腿或踝（anke）上。
在某些实施方案中，肠胃外施用[例如通过静脉内（I.V.）注射、动脉内注射、骨内注射、肌内注射、鞘内注射、皮下注射或皮内注射]本发明的ActRII拮抗剂药物或药物组合物。适合于肠胃外施用的药物组合物可以包含本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物，与一种或多种药学可接受的无菌等渗水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳剂或无菌粉末组合，所述无菌粉末可以紧在使用前重构成无菌可注射溶液或分散体。可注射溶液或分散体可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、悬浮剂、增稠剂或使制剂与预期接受者的血液等渗的溶质。可以用于本发明的药物制剂中的合适的水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等）、植物油（例如橄榄油）、可注射有机酯（例如油酸乙酯）及其合适的混合物。可以例如通过使用包衣材料（例如卵磷脂），在分散体的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。在某些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物或药物组合物将皮下（例如皮下注射）施用。在某些实施方案中，本发明的ActRII拮抗剂药物或药物组合物将局部施用。
在一些实施方案中，本发明的治疗方法包括从植入物或装置全身或局部地施用本发明的药物组合物。进一步地，本发明的药物组合物可以以用于递送至靶组织部位（例如骨髓或肌肉）的形式封装或注射。在某些实施方案中，本发明的药物组合物可以包括能够将本发明的药物中的一种或多种递送至靶组织部位（例如骨髓或肌肉）的基质，提供用于发育中组织的结构且最佳地能够被再吸收到身体内。例如，基质可以提供本发明的一种或多种药物的缓释。此类基质可以由目前用于其他植入医疗应用中的材料形成。
基质材料的选择可以基于下述中的一种或多种：生物相容性、生物可降解性、机械性质、美容外观和界面性质。主题组合物的特定应用将限定适当制剂。用于组合物的潜在基质可以是生物可降解和化学成分确定的硫酸钙、磷酸三钙、羟磷灰石、聚乳酸和聚酐。其他潜在材料是生物可降解和生物学定义明确的，包括例如骨或真皮胶原。进一步的基质由纯蛋白或细胞外基质组分组成。其他潜在的基质是生物不可降解和化学成分确定的，包括例如烧结羟磷灰石、生物玻璃、铝酸盐或其他陶瓷。基质可以由上述材料类型中的任何的组合组成，包括例如聚乳酸和羟磷灰石或胶原和磷酸三钙。生物陶瓷可以在组成（例如磷酸铝酸钙）和加工中改变，以改变孔径、粒度、颗粒形状和生物可降解性中的一种或多种。
在某些实施方案中，本发明的药物组合物可以局部施用。“局部应用”或“局部地”意指药物组合物与体表包括例如皮肤、伤口部位、溃疡部位和粘膜的接触。局部药物组合物可以具有不同的应用形式，并且通常包含含药物层，其适于在局部施用组合物后置于组织附近或与组织直接接触。适合于局部施用的药物组合物可以包含配制为液体、凝胶、乳膏、洗剂、软膏、泡沫、糊剂、腻子、半固体或固体的本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物（例如GDF-ActRII拮抗剂、ActRIIA多肽、ActRIIB多肽、GDF捕获物等）。以液体、凝胶、乳膏、洗剂、软膏、泡沫、糊剂或腻子形式的药物组合物可以通过在靶组织上铺展、喷雾、涂抹、擦拭或滚动组合物来应用。药物组合物还可以被浸渍到无菌敷料、透皮贴剂、膏药和绷带内。腻子、半固体或固体形式的药物组合物可以是可变形的。它们可以是弹性或非弹性的（例如柔性或刚性的）。在某些方面，药物组合物形成复合材料的部分，并且可包括具有相同或不同组成的纤维、微粒或多层。
以液体形式的局部组合物可以包括药学可接受的溶液、乳剂、微乳剂和悬浮液。除活性成分之外，液体剂型可以含有本领域常用的惰性稀释剂，包括例如水或其他溶剂、增溶剂和/或乳化剂[例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇或1,3-丁二醇、油（例如棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油）、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇、脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物]。
局部凝胶、乳膏、洗剂、软膏、半固体或固体组合物可以包括一种或多种增稠剂，例如多糖、合成聚合物或基于蛋白质的聚合物。在本发明的一个实施方案中，本文的胶凝剂是适当无毒的并且产生所需粘度的胶凝剂。增稠剂可以包括下述的聚合物、共聚物和单体：乙烯基吡咯烷酮、甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺N-乙烯基咪唑、羧基乙烯基、乙烯酯、乙烯醚、聚硅氧烷、聚环氧乙烷、聚乙二醇、乙烯醇、丙烯酸钠、丙烯酸酯、马来酸、NN-二甲基丙烯酰胺、双丙酮丙烯酰胺、丙烯酰胺、丙烯酰吗啉、普朗尼克、胶原、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚亚乙烯基、聚乙烯硅酸盐、用糖（例如蔗糖、葡萄糖、葡萄糖胺、半乳糖、海藻糖、甘露糖或乳糖）取代的丙烯酸酯、酰基酰胺基丙烷磺酸、四甲氧基正硅酸盐、甲基三甲氧基正硅酸盐、四烷氧基正硅酸盐、三烷氧基正硅酸盐、二醇、丙二醇、丙三醇、多糖、海藻酸盐、右旋糖酐、环糊精、纤维素、改性纤维素、氧化纤维素、壳聚糖、壳多糖、瓜尔胶、角叉菜胶、透明质酸、菊粉、淀粉、改性淀粉、琼脂糖、甲基纤维素、植物树胶、透明质烷（hylaronan）、水凝胶、明胶、糖胺聚糖、羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、果胶、低甲氧基果胶、交联右旋糖酐、淀粉-丙烯腈接枝共聚物、聚丙烯酸淀粉钠、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟乙酯、聚亚乙烯基、聚乙基乙烯基醚、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、聚氨基甲酸酯、聚烷酸酯、聚乳酸、聚乳酸酯、聚（3-羟基丁酸酯）、磺化水凝胶、AMPS（2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸）、SEM（甲基丙烯酸磺基乙酯）、SPM（甲基丙烯酸磺丙酯）、SPA（丙烯酸磺丙酯）、N,N-二甲基-N-甲基丙烯酰氧基乙基-N-（3-磺丙基）铵甜菜碱、甲基丙烯酰胺基丙基-二甲基铵磺基甜菜碱、SPI（衣康酸双（1-丙基磺酸（sulfonizacid）-3）酯二钾盐）、衣康酸、AMBC（3-丙烯酰胺基-3-甲基丁酸）、丙烯酸β羧乙酯（丙烯酸二聚体）和马来酸酐-甲基乙烯醚聚合物、其衍生物、其盐、其酸及其组合。在某些实施方案中，本发明的药物组合物可以经口施用，例如以胶囊、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂（使用调味基质，例如蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶）、粉末、颗粒剂、在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液、水包油或油包水液体乳剂、或酏剂或糖浆、或软锭剂（使用惰性基质，例如明胶和丙三醇、或蔗糖和阿拉伯胶）和/或漱口剂的形式，各自含有预定量的本发明的ActRII拮抗剂药物和任选的一种或多种其他活性成分。本发明的ActRII拮抗剂药物和任选的一种或多种其他活性成分也可以作为大丸剂、药糖剂或糊剂施用。
在用于经口施用的固体剂型（例如胶囊、片剂、丸剂、糖衣丸、粉剂和颗粒剂）中，本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物可以与一种或多种药学可接受的载体混合，所述药学可接受的载体包括例如柠檬酸钠、磷酸二钙、填充剂或膨胀剂（例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸）、粘合剂（例如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶）、保湿剂（例如甘油）、崩解剂（例如琼脂-琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、硅酸盐和碳酸钠）、溶液阻滞剂（例如石蜡）、吸收促进剂（例如季铵化合物）、湿润剂（例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯）、吸收剂（例如高岭土和膨润土）、润滑剂（例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠）、着色剂及其混合物。在胶囊、片剂和丸剂的情况下，药物制剂（组合物）还可以包含缓冲药物。相似类型的固体组合物也可以用作使用一种或多种赋形剂（包括例如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇）的软和硬填充的明胶胶囊中的填充剂。
用于本发明的药物组合物的经口施用的液体剂型可以包括药学可接受的乳剂、微乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性成分之外，液体剂型可以含有本领域常用的惰性稀释剂，包括例如水或其他溶剂、增溶剂和/或乳化剂[例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇或1,3-丁二醇、油（例如棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油）、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇、脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物]。除惰性稀释剂之外，经口制剂还可以包括佐剂，包括例如湿润剂、乳化和悬浮剂、甜味剂、调味剂、着色剂、芳香剂、防腐剂及其组合。
除活性ActRII拮抗剂药物之外，悬浮液还可以含有悬浮剂，包括例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇、脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂-琼脂、黄蓍胶及其组合。
可以通过包括不同抗细菌剂和抗真菌剂（包括例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇和苯酚山梨酸）来确保微生物的作用和/或生长的预防。
在某些实施方案中，可能期望在药物组合物内包括等渗剂，包括例如糖或氯化钠。另外，可注射药物形式的延长吸收可以通过包括延迟吸收的药物（包括例如单硬脂酸铝和明胶）来实现。
应理解剂量方案将由主治医师考虑修饰本发明的药物中的一种或多种的作用的不同因素来确定。不同因素包括但不限于患者的红血细胞计数、血红蛋白水平、所需靶红血细胞计数、患者的年龄、患者的性别、患者的饮食、可能促成抑制的红血细胞水平的任何疾病的严重性、施用时间和其他临床因素。向最终组合物中加入其他已知的活性剂也可以影响剂量。可以通过定期评估红血细胞水平、血红蛋白水平、网织红细胞水平和造血过程的其他指示剂中的一种或多种来监测进展。
在某些实施方案中，本发明还提供了用于体内产生本发明的一种或多种ActRII拮抗剂药物的基因疗法。此类疗法将通过将药物序列引入细胞或组织内来实现其疗效，所述细胞或组织具有如上文列出的病症中的一种或多种。可以例如通过使用重组表达载体例如嵌合病毒或胶体分散系统来实现药物序列的递送。在一些实施方案中，本发明的药物序列中的一种或多种的治疗递送是使用靶向脂质体。
可以用于如本文教导的基因疗法的不同病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、牛痘病毒或RNA病毒（例如逆转录病毒）。逆转录病毒载体可以是鼠或禽逆转录病毒的衍生物。单个外源基因可以插入其中的逆转录病毒载体的例子包括但不限于：莫洛尼鼠白血病病毒（MoMuLV）、哈维鼠肉瘤病毒（HaMuSV）、鼠乳腺肿瘤病毒（MuMTV）和劳斯肉瘤病毒（RSV）。许多另外的逆转录病毒载体可以掺入多重基因。所有这些载体均可转移或掺入关于可选择标记物的基因，使得可以鉴定且生成转导的细胞。通过附着例如糖、糖脂或蛋白质，可以使逆转录病毒载体成为靶特异性的。在一些实施方案中，靶向通过使用抗体来实现。本领域技术人员将认识到，特异性多核苷酸序列可以插入逆转录病毒基因组内或附着至病毒包膜，以允许靶向特异性递送含有本发明的药物中的一种或多种的逆转录病毒载体。
可替代地，可以通过常规的磷酸钙转染，用编码逆转录病毒结构基因（gag、pol和env）的质粒直接转染组织培养细胞。随后用含有目的基因的载体质粒转染这些细胞。所得到的细胞将逆转录病毒载体释放到培养基内。
用于本发明的药物中的一种或多种的另一种靶向递送系统是胶体分散系统。胶体分散系统包括例如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。在某些实施方案中，本发明的胶体系统是脂质体。脂质体是可用作体外和体内递送媒介物的人工膜囊泡。RNA、DNA和完整病毒例子可以封装在水性内部中，并以生物活性形式递送至细胞。参见例如Fraley等人（1981）Trends Biochem. Sci.，6:77。关于使用脂质体媒介物的有效基因转移的方法是本领域已知的。参见例如Mannino等人（1988）Biotechniques，6:682，1988。
脂质体的组成通常是磷脂的组合，其可以包括类固醇（例如胆固醇）。脂质体的物理特征取决于pH、离子强度和二价阳离子的存在。也可以使用其他磷脂或其他脂质，包括例如磷脂酰化合物（例如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂）、卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。基于例如器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性，脂质体的靶向也是可能的，并且是本领域已知的。
范例
现在对本发明进行一般性描述，通过参考下述实施例它将更易于理解，所述实施例仅为了举例说明本发明的某些实施方案和实施方案的目的而包括的，而不意图限制本发明。
实施例1：ActRIIa-Fc融合蛋白
申请人构建了可溶性ActRIIA融合蛋白，其具有与人或小鼠Fc结构域融合的人ActRIIa的细胞外结构域，其间具有最低限度接头。构建体分别被称为ActRIIA-hFc和ActRIIA-mFc。
ActRIIA-hFc在下文显示为由CHO细胞系纯化（加下划线的Fc部分）（SEQ ID NO:22）：
Figure 412941DEST_PATH_IMAGE038
ActRIIA-hFc和ActRIIA-mFc蛋白在CHO细胞系中表达。考虑了三种不同的前导序列：
（i）蜜蜂蜂毒素（HBML）：MKFLVNVALVFMVVYISYIYA（SEQ ID NO:23）
（ii）组织纤溶酶原激活剂（TPA）：MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP（SEQ ID NO:24）
（iii）天然的：MGAAAKLAFAVFLISCSSGA（SEQ ID NO:25）。
所选形式采用TPA前导区并具有下述未经加工的氨基酸序列：
Figure 47185DEST_PATH_IMAGE039
Figure 613295DEST_PATH_IMAGE040
。
该多肽由下述核酸序列编码：
Figure 914963DEST_PATH_IMAGE041
Figure 416483DEST_PATH_IMAGE042
Figure 803602DEST_PATH_IMAGE043
。
ActRIIA-hFc和ActRIIA-mFc两者均显著顺应重组表达。如图3A和3B中所示，将蛋白质纯化为单一的明确限定的蛋白质峰。N末端测序揭示ILGRSETQE（SEQ ID NO:34）的单一序列。纯化可以通过一系列柱层析步骤来实现，包括例如以任何次序的下述中的三种或更多种：蛋白A层析、Q琼脂糖层析、苯基琼脂糖层析、尺寸排阻层析和阳离子交换层析。纯化可以用病毒过滤和缓冲液交换来完成。将ActRIIA-hFc蛋白纯化至如通过尺寸排阻层析测定的>98%的纯度，以及如通过SDS PAGE测定的>95%的纯度。
ActRIIA-hFc和ActRIIA-mFc显示对于配体特别是激活素A的高亲和力。使用标准胺偶联程序，将GDF-11或激活素A固定在Biacore™ CM5芯片上。将ActRIIA-hFc和ActRIIA-mFc蛋白装载到系统上，并测量结合。ActRIIA-hFc以5x10-12的解离常数（KD）结合激活素，并以9.96x10-9的KD结合GDF11。参见图4A和4B。ActRIIA-mFc表现类似。
ActRIIA-hFc在药物代谢动力学研究中非常稳定。大鼠用1 mg/kg、3 mg/kg或10mg/kg的ActRIIA-hFc蛋白给药，并在24，48，72，144和168小时测量蛋白质的血浆水平。在分开的研究中，大鼠以1 mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg给药。在大鼠中，ActRIIA-hFc具有11-14天的血清半衰期，并且药物的循环水平在两周后相当高（对于1 mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg的初始施用，分别为11 μg/ml、110 μg/ml或304 μg/ml）。在食蟹猴中，血浆半衰期基本上大于14天，并且药物的循环水平对于1 mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg的初始施用，分别为25μg/ml、304 μg/ml或1440 μg/ml。
实施例2：ActRIIA-hFc蛋白的表征
使用SEQ ID NO:24的组织纤溶酶原前导序列，在由pAID4载体（SV40 ori/增强子、CMV启动子）稳定转染的CHO-DUKX B11细胞中表达ActRIIA-hFc融合蛋白。如上文实施例1中所述纯化的蛋白质具有SEQ ID NO:22的序列。Fc部分是人IgG1 Fc序列，如SEQ ID NO: 22中所示。蛋白质分析揭示ActRIIA-hFc融合蛋白形成为具有二硫键合的同二聚体。
实施例3. ActRIIA-hFc增加非人灵长类动物中的红血细胞水平
研究采用各5只雄性和5只雌性食蟹猴的四组，其中每组每性别三只预定在第29天时终止，并且每组每性别两只预定在第57天时终止。经由在第1、8、15和22天时的静脉内（IV）注射，每只动物施用媒介物（组I ）或以1、10或30 mg/kg剂量（分别为组2、3和4）的ActRIIA-Fc。剂量体积维持在3 mL/kg。在第一次施用前两天以及在第一次施用后第15、29和57天（对于剩余的两只动物），评价红血细胞水平的不同测量。
在研究自始至终的所有剂量水平和时间点，ActRIIA-hFc引起关于雄性和雌性的平均红血细胞参数[红血细胞计数（RBC、血红蛋白（HGB）和血细胞比容（HCT）]中的统计学显著的增加，伴随绝对和相对网织红细胞计数（ARTC；RTC）中的升高。参见图5-8。
相对于在基线时关于处理组的平均值，对于每个处理组计算统计显著性。
值得注意的是，红血细胞计数和血红蛋白水平的增加在量级中与由促红细胞生成素报道的效应大致相等。这些效应的发作对于ActRIIA-Fc比促红细胞生成素更快。
用大鼠和小鼠观察到类似的结果。
实施例4：ActRIIA-hFc增加人患者中的红血细胞水平和骨形成的标记物
实施例1中所述的ActRIIA-hFc融合蛋白在随机化、双盲、安慰剂对照研究中施用于人患者，进行该研究主要用于评估该蛋白质在健康的绝经后妇女中的安全性。四十八名受试者以6个队列随机化，以接受单一剂量的ActRIIA-hFc或安慰剂（5个活性：1个安慰剂）。剂量水平范围为静脉内（IV）0.01至3.0 mg/kg，以及皮下（SC）0.03至0.1 mg/kg。所有受试者随访120天。除药物代谢动力学（PK）分析之外，还通过测量骨形成和再吸收的生化标记物以及FSH水平来评价ActRIIA-hFc的生物活性。
为了寻找潜在的变化，在研究过程中对于所有受试者详细检查血红蛋白和RBC数目，并与基线水平进行比较。血小板计数经过与对照相同的时间进行比较。对于血小板计数，随着时间过去不存在与基线值的临床显著变化。
ActRIIA-hFc的PK分析揭示随着剂量的线性概况，以及大约25-32天的平均半衰期。关于ActRIIA-hFc的曲线下面积（AUC）与剂量线性相关，并且在SC给药后的吸收基本上完全。参见图9和10。这些数据指示SC是期望的给药方法，因为它提供了关于药物的等效生物利用度和血清半衰期，同时避免了与IV给药的最初几天相关的药物的血清浓度中的尖峰。参见图10。ActRIIA-hFc引起骨特异性碱性磷酸酶（BAP）（其是合成代谢性骨生长的标记物）的血清水平中的快速、持续的剂量依赖性增加，以及C末端1型胶原端肽和酒石酸盐抗性酸性磷酸酶5b水平（其是骨吸收的标记物）中的剂量依赖性减少。其他标记物例如P1NP显示不确定的结果。BAP水平在药物的最高剂量下显示接近饱和的效应，指示在0.3 mg/kg的剂量下可以达到对这种合成代谢性骨生物标记物的半最大效应，其中增加范围高达3 mg/kg。计算为关于药物的药效学效应与AUC的关系，EC 50为51,465（天*ng/ml）。参见图11。这些骨生物标记物变化在所测试的最高剂量水平下持续大约120天。还存在与激活素的抑制一致的血清FSH水平中的剂量依赖性减少。
总之，经过研究的第一周，血红蛋白中的极小的非药物相关的降低很可能与0.01和0.03 mg/kg组中的研究静脉切开术有关，无论是IV还是SC给予。0.1 mg/kg SC和IV血红蛋白结果到第8-15天时是稳定的或显示适度的增加。在0.3 mg/kg IV剂量水平下，早在第2天时可见HGB水平中的明确增加，并且经常在第15-29天时达到峰值，这在安慰剂治疗的受试者中没有看到。在1.0 mg/kg IV剂量和3.0 mg/kg IV剂量下，响应单一剂量观察到大于1g/dl的血红蛋白中的平均增加，伴随RBC计数和血细胞比容中的相应增加。这些血液学参数在剂量后约60天时达到峰值，并到第120天时基本上减少。这指示如果以小于120天的间隔完成（即在恢复到基线之前），则用于增加红血细胞水平目的的给药可能更有效，其中90天或更短或60天或更短的给药间隔可能是期望的。对于血液学变化的概括，参见图12-15。
总之，ActRIIA-hFc显示对红血细胞计数和网织红细胞计数的剂量依赖性作用。
实施例5：用ActRIIA-hFc治疗贫血患者
设计了临床研究，以0.1 mg/kg、0.3 mg/kg和1.0 mg/kg的30个剂量水平，用ActRIIA-hFc的多重剂量治疗患者，其中给药每三十天发生。试验中的正常健康患者显示出血红蛋白和血细胞比容中的增加，这与实施例4中报道的I期临床试验中可见的增加一致，除了在一些情况下之外，血红蛋白（Hg）和血细胞比容（Hct）升高超出正常范围。具有大约7.5 g/dL血红蛋白水平的贫血患者也接受以1 mg/kg水平的两个剂量，导致在两个月后大约10.5 g/dL的血红蛋白水平。患者的贫血是小红细胞性贫血，被认为由慢性铁缺乏症引起。
已进一步证明ActRIIA-Fc融合蛋白在增加不同贫血模型中的红血细胞水平中是有效的，包括例如化学疗法诱导的贫血和与慢性肾疾病相关的贫血。参见例如美国专利申请公开号2010/0028331。
实施例6：可替代的ActRIIA-Fc蛋白
可以根据本文所述的方法使用的各种ActRIIA变体在作为WO2006/012627（参见例如第59-60页）公开的国际专利申请中描述，所述专利通过引用整体并入本文。可替代构建体可以具有C末端尾部（ActRIIA的细胞外结构域的最后15个氨基酸）的缺失。关于此类构建体的序列在下文呈现（Fc部分加下划线）（SEQ ID NO:28）：
Figure 173404DEST_PATH_IMAGE044
实施例7： ActRIIB-Fc融合蛋白的生成
申请人构建了可溶性ActRIIB融合蛋白，其具有与人或小鼠Fc结构域融合的人ActRIIB的细胞外结构域，其间具有最低限度接头（三个甘氨酸氨基酸）。构建体分别被称为ActRIIB-hFc和ActRIIB-mFc。
ActRIIB-hFc在下文显示为由CHO细胞系纯化（SEQ ID NO:29）
Figure 1682DEST_PATH_IMAGE045
ActRIIB-hFc和ActRIIB-mFc蛋白在CHO细胞系中表达。考虑了三种不同的前导序列：
（i）蜜蜂蜂毒素（HBML）：MKFLVNVALVFMVVYISYIYA（SEQ ID NO:23）
（ii）组织纤溶酶原激活剂（TPA）：MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP（SEQ ID NO:24）
（iii）天然的：MGAAAKLAFAVFLISCSSGA（SEQ ID NO:30）。
所选形式采用TPA前导区并具有下述未经加工的氨基酸序列（SEQ ID NO: 31）：
Figure 798737DEST_PATH_IMAGE046
Figure 407573DEST_PATH_IMAGE047
该多肽由下述核酸序列（SEQ ID NO:32）编码：
Figure 581065DEST_PATH_IMAGE048
CHO细胞产生的材料的N末端测序揭示-GRGEAE（SEQ ID NO:33）的主要多肽序列。值得注意的是，文献中报道的其他构建体以-SGR ...序列开始。
纯化可以通过一系列柱层析步骤来实现，包括例如以任何次序的下述中的三种或更多种：蛋白A层析、Q琼脂糖层析、苯基琼脂糖层析、尺寸排阻层析和阳离子交换层析。纯化可以用病毒过滤和缓冲液交换来完成。
ActRIIB-Fc融合蛋白也在HEK293细胞和COS细胞中表达。尽管来自所有细胞系和合理的培养条件的材料在体内提供具有肌肉构建活性的蛋白质，但观察到效力的可变性，可能与细胞系选择和/或培养条件有关。
申请人在ActRIIB的细胞外结构域中生成一系列突变，并产生这些突变蛋白作为细胞外ActRIIB和Fc结构域之间的可溶性融合蛋白。本底ActRIIB-Fc融合物具有SEQ IDNO:29的序列。
将不同突变（包括N端和C端截短）引入本底ActRIIB-Fc蛋白内。基于实施例1中呈现的数据，预期这些构建体如果用TPA前导区表达，则缺乏N末端丝氨酸。通过PCR诱变在ActRIIB细胞外结构域中生成突变。在PCR后，片段通过Qiagen柱纯化，用SfoI和AgeI消化并凝胶纯化。将这些片段连接到表达载体pAID4（参见WO2006/012627）内，使得在连接后，它产生具有人IgG1的融合嵌合体。在转化到大肠杆菌DH5α内之后，挑取菌落并分离DNA。对于鼠构建体（mFc），用鼠IgG2a取代人IgG1。验证所有突变体的序列。
所有突变体通过瞬时转染在HEK293T细胞中产生。总的来说，在500ml旋转器中，将HEK293T细胞以6x105细胞/ ml设置在250ml体积的Freestyle（Invitrogen）培养基中，并生长过夜。第二天，这些细胞用以0.5 ug/ml最终DNA浓度的DNA:PEI（1:1）复合物进行处理。在4小时后，加入250 ml培养基，并且使细胞生长7天。通过将细胞向下旋转来收获并浓缩条件培养基。
突变体使用各种技术包括例如蛋白A柱进行纯化，并用低pH（3.0）甘氨酸缓冲液进行洗脱。在中和后，这些针对PBS进行透析。
还通过类似的方法在CHO细胞中产生突变体。
在通过引用并入本文的WO 2008/097541和WO 2006/012627中描述的结合测定和/或生物测定中测试突变体。在一些情况下，用条件培养基而不是纯化的蛋白质执行测定。ActRIIB的另外变异在美国专利号7,842,663中描述。
实施例8： ActRIIB-Fc刺激非人灵长类动物中的红细胞生成
将食蟹猴分成七组（6只/性别/组），并且经过9周时期，每2周或每4周以0.6、3或15mg/kg的剂量作为皮下注射施用ActRIIB（20-134）-hFc。对照组（6只/性别/组）接受以与ActRIIB（20-134）-hFc处理的动物相同剂量体积（0.5 ml/kg/剂量）的媒介物。监测动物的一般临床病理学参数（例如血液学、临床化学、凝血和尿分析）的变化。在给药起始前以及在第59、143、199、227天和在第267天（对于每4周给药的组）或第 281天（对于每2周给药的组）时评估血液学、凝血和临床化学参数（包括铁参数、脂肪酶和淀粉酶）两次。在第267/281天时的评估在施用最终剂量后2周发生。
ActRIIB（20-134）-hFc的施用导致雄性和雌性猴中的血液学参数的非不利的剂量相关变化。这些变化包括增加的红血细胞计数、网织红细胞计数和红血细胞分布宽度，以及减少的平均红细胞容积、平均红细胞血红蛋白和血小板计数。在雄性中，RBC计数在所有剂量水平下均增加，并且增加的量级一般是可比较的，无论ActRIIB（20-134）-hFc是每2周还是每4周施用。在第59天和第267/281天之间的所有时间点，平均RBC计数增加（除了在第281天时组2雄性[每2周0.6 mg/kg]中的RBC计数未增加之外）。在雌性中，RBC计数每2周在≥ 3mg/kg时增加，并且在第143天和第281天之间出现变化；每4周在15mg/kg时，在第59天和第267天之间平均RBC计数增加。
这些效应与ActRIIB（20-134）-hFc对刺激红细胞生成的正面作用一致。
实施例9： GDF捕获物的生成
申请人构建了如下的GDF捕获物。相对于GDF11和/或肌肉生长抑制素具有极大降低的激活素A结合（由于在SEQ ID NO:1中的位置79处的亮氨酸至天冬氨酸盐取代）的ActRIIB的经修饰的细胞外结构域（SEQ ID NO:1的氨基酸20-134，具有L79D置换）的多肽与人或小鼠Fc结构域融合，其间具有最低限度接头（三个甘氨酸氨基酸）。构建体分别被称为ActRIIB（L79D 20-134）-hFc和ActRIIB（L79D 20-134）-mFc。类似地执行在位置79处具有谷氨酸盐而不是天冬氨酸盐的替代形式（L79E）。还生成了就SEQ ID NO:36而言在位置226处具有丙氨酸而不是缬氨酸的替代形式，并且在所有测试方面等价地执行。在位置79（相对于SEQ ID NO: 1，或相对于SEQ ID NO:36的位置60）处的天冬氨酸盐用下文的加双下划线指示。在相对于SEQ ID NO:36的位置226处的缬氨酸也用下文的加双下划线指示。
GDF捕获物ActRIIB（L79D 20-134）-hFc在下文显示为由CHO细胞系纯化（SEQ IDNO:36）。
Figure 526500DEST_PATH_IMAGE049
GDF捕获物的ActRIIB衍生部分具有下文所示的氨基酸序列（SEQ ID NO: 37），并且该部分可以用作单体或非Fc融合蛋白作为单体、二聚体或更高级复合物。
Figure 494456DEST_PATH_IMAGE050
GDF捕获物蛋白在CHO细胞系中表达。考虑了三种不同的前导序列：
（i）蜜蜂蜂毒素（HBML）：MKFLVNVALVFMVVYISYIYA（SEQ ID NO:23）
（ii）组织纤溶酶原激活剂（TPA）：MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP（SEQ ID NO:24）
（iii）天然的：MTAPWVALALLWGSLCAGS（SEQ ID NO:30）。
所选形式采用TPA前导区并具有下述未经加工的氨基酸序列：
Figure 590588DEST_PATH_IMAGE051
Figure 239875DEST_PATH_IMAGE052
该多肽由下述核酸序列（SEQ ID NO:39）编码：
Figure 105063DEST_PATH_IMAGE053
纯化可以通过一系列柱层析步骤来实现，包括例如以任何次序的下述中的三种或更多种：蛋白A层析、Q琼脂糖层析、苯基琼脂糖层析、尺寸排阻层析和阳离子交换层析。纯化可以用病毒过滤和缓冲液交换来完成。在纯化方案的例子中，使细胞培养基通过蛋白A柱，在150 mM Tris/NaCl（pH 8.0）中洗涤，随后在50 mM Tris/NaCl（pH 8.0）中洗涤，并用0.1M甘氨酸，pH 3.0洗脱。将低pH洗脱液在室温下保持30分钟作为病毒清除步骤。随后将洗脱液中和并通过Q琼脂糖离子交换柱，并且在50 mM Tris pH 8.0，50 mM NaCl中洗涤，并在50mM Tris pH 8.0中洗脱，其中NaCl浓度在150 mM和300 mM之间。随后将洗脱液变成50 mMTris pH 8.0，1.1 M硫酸铵，并通过苯基琼脂糖柱，洗涤，并在具有150至300mM的硫酸铵的50 mM Tris pH 8.0中洗脱。将洗脱液透析并过滤用于使用。
在通过引用并入本文的WO 2008/097541和WO 2006/012627中描述了另外的GDF捕获物（ActRIIB-Fc融合蛋白，其被这样修饰以便降低激活素A结合相对于肌肉生长抑制素或GDF11结合的比率）。
实施例10：用于GDF-11和激活素介导的信号传导的生物测定
A-204报道基因测定用于评估ActRIIB-Fc蛋白和GDF捕获物对通过GDF-11和激活素A的信号传导的作用。细胞系：人横纹肌肉瘤（衍生自肌肉）。报道载体：pGL3（CAGA）12（在Dennler等人，1998，EMBO 17：3091-3100中描述）。CAGA12基序存在于TGF-β响应基因（例如PAI-1基因）中，因此该载体一般用于通过SMAD2和3的信号传导因子。
第1天：将A-204细胞拆分到48孔板内。
第2天：用10 ug pGL3（CAGA）12或pGL3（CAGA）12（10 ug）+ pRLCMV（1 µg）和Fugene转染A-204细胞。
第3天：加入因子（稀释到培养基+ 0.1 % BSA内）。在加入细胞之前，抑制剂需要与因子预温育1小时。六小时后，细胞用PBS漂洗并裂解。
这随后为萤光素酶测定。在不存在任何抑制剂的情况下，激活素A显示报道基因表达的10倍刺激和ED50 ~ 2 ng/ml。GDF-11：16倍刺激，ED 50：~ 1.5 ng/ml。
在该测定中，ActRIIB（20-134）是激活素A、GDF-8和GDF-11活性的有力抑制剂。如下文描述的，在该测定中还测试了ActRIIB变体。
实施例11： ActRIIB-Fc变体，基于细胞的活性
如上文描述的，在基于细胞的测定中测试ActRIIB-Fc蛋白和GDF捕获物的活性。结果在下表中概括。在不同的C末端截短构建体中测试了一些变体。如上文讨论的，五个或十五个氨基酸的截短引起活性降低。GDF捕获物（L79D和L79E变体）显示激活素A抑制的大量损失，同时保留GDF-11的几乎野生型抑制。
可溶性ActRIIB-Fc与GDF11和激活素A的结合：
Figure 243920DEST_PATH_IMAGE054
+ 弱活性（大致 1x10-6 KI）
++ 中等活性（大致1x10-7 KI）
+++ 良好（野生型）活性（大致1x10-8 KI）
++++ 大于野生型活性。
已评估了几种变体在大鼠中的血清半衰期。ActRIIB（20-134）-Fc具有大约70小时的血清半衰期。ActRIIB（A24N 20-134）-Fc具有大约100-150小时的血清半衰期。A24N变体在基于细胞的测定（上文）和体内测定（下文）中具有等价于野生型分子的活性。与更长的半衰期偶联，这意味着随着时间过去，A24N变体将给予比野生型分子更大的效应/单位蛋白质。A24N变体和上文测试的其他变体中的任何可以与GDF捕获物分子例如L79D或L79E变体组合。
实施例12： GDF-11和激活素A结合
在BiacoreTM测定中测试某些ActRIIB-Fc蛋白和GDF捕获物与配体的结合。
使用抗hFc抗体将ActRIIB-Fc变体或野生型蛋白捕获到系统上。配体被注射并流经捕获的受体蛋白。结果在下表中概括。
配体结合特异性IIB变体。
Figure 765031DEST_PATH_IMAGE055
从无细胞测定获得的这些数据证实基于细胞的测定数据，证明A24N变体保留与ActRIIB（20-134）-hFc分子的那种类似的配体结合活性，并且L79D或L79E分子保留肌肉生长抑制素和GDF11结合，但显示显著减少的（不可定量的）与激活素A的结合。
已生成并测试了其他变体，如WO2006/012627（通过引用整体并入本文）中报道的。参见例如第59-60页，使用与装置偶联的配体和使受体流动经过偶联的配体。值得注意的是，相对于野生型K74分子，K74Y、K74F、K74I（以及在K74处的可能的其他疏水取代，例如K74L）和D80I引起激活素A（ActA）与GDF11结合的比率中的减少。就这些变体而言的数据表在下文再现：
与GDF11和激活素A结合的可溶性ActRIIB-Fc变体（BiaCore测定）
Figure 14747DEST_PATH_IMAGE056
* 未观察到结合
-- < 1/5 WT结合
- ~ 1/2 WT结合
+ WT
++ < 2x增加的结合
+++ ~5x增加的结合
++++ ~10x增加的结合
+++++ ~ 40x增加的结合。
实施例13：GDF捕获物在体内增加红血细胞水平
将十二周龄的雄性C57BL/6NTac小鼠分配到两个治疗组之一（N = 10）。通过以10mg/kg每周两次的皮下注射（SC），用媒介物或变体ActRIIB多肽（“GDF捕获物”）[ActRIIB（L79D 20-134）-hFc]向小鼠给药4周。在研究终止时，通过心脏穿刺将全血收集到含有EDTA的试管中，并使用HM2血液分析仪（Abaxis，Inc）分析细胞分布。
组指定
组 N 小鼠 注射 剂量（mg/kg） 途径 频率
1 10 C57BL/6 PBS 0 SC 两次/周
2 10 C57BL/6 GDF捕获物 [ActRIIB（L79D 20-134）-hFc] 10 SC 两次/周
与媒介物对照相比较，使用GDF捕获物的处理对白血细胞（WBC）的数目没有统计学显著的作用。相对于对照，红血细胞（RBC）数目在处理组中增加（参见下表）。由于另外的红血细胞，血红蛋白含量（HGB）和血细胞比容（HCT）两者也增加。红血细胞的平均宽度（RDWc）在处理的动物中较高，指示未成熟红血细胞库中的增加。因此，用GDF捕获物的处理导致红血细胞增加，对白血细胞群体没有可区别的作用。
血液学结果
Figure 21DEST_PATH_IMAGE057
*=p<0.05，**= p<0.01。
实施例14：对于增加体内的红血细胞水平GDF捕获物优于ActRIIB-Fc。
将十九周龄的雄性C57BL/6NTac小鼠随机分配到三个组之一。通过每周两次共三周的皮下注射，用媒介物（10 mM Tris缓冲盐水，TBS）、野生型ActRIIB（20-134）-mFc或GDF捕获物ActRIIB（L79D 20-134）-hFc向小鼠给药。在基线和给药三周后收集面颊出血，并使用血液分析仪（HM2，Abaxis，Inc.）分析细胞分布。
与载体对照相比较，用ActRIIB-Fc或GDF捕获物的处理对白血细胞（WBC）数目没有显著作用。与对照或野生型构建体相比较，红血细胞计数（RBC）、血细胞比容（HCT）和血红蛋白水平在用GDF捕获物处理的小鼠中都升高（参见下表）。因此，在直接比较中，GDF捕获物促进红血细胞增加至明显大于野生型ActRIIB-Fc蛋白的程度。事实上，在该实验中，野生型ActRIIB-Fc蛋白质不引起红血细胞中的统计学显著的增加，提示需要更长或更高的剂量来揭示这种效应。
给药三周后的血液学结果
Figure 247462DEST_PATH_IMAGE058
**=p<0.01。
实施例15：具有截短的ActRIIB细胞外结构域的GDF捕获物的生成
如实施例9中所述，通过TPA前导区与含有亮氨酸至天冬氨酸盐取代（SEQ ID NO:1中的残基79处）的ActRIIB细胞外结构域（SEQ ID NO:1中的残基20-134）的N末端融合，以及具有最低限度接头（三个甘氨酸残基）的人Fc结构域的C端融合，来生成称为ActRIIB（L79D20-134）-hFc的GDF捕获物（图16）。对应于该融合蛋白的核苷酸序列显示于图17A和17B中。
通过TPA前导区与含有亮氨酸至天冬氨酸盐取代（SEQ ID NO:1中的残基79处）的截短的细胞外结构域（SEQ ID NO:1中的残基25-131）的N末端融合，以及具有最低限度接头（三个甘氨酸残基）的人Fc结构域的C端融合，来生成称为ActRIIB（L79D 25-131）-hFc的具有截短的ActRIIB细胞外结构域的GDF捕获物（图18）。对应于该融合蛋白的核苷酸序列显示于图19A和19B中。
实施例16：通过具有双重截短的ActRIIB细胞外结构域的GDF捕获物的选择性配体 结合
用Biacore™仪器在体外评估GDF捕获物和其他ActRIIB-hFc蛋白对于几种配体的亲和力。结果在下表中概括。由于复合物的非常快速的结合和解离，通过稳态亲和力拟合获得Kd值，这阻止了kon和koff的准确测定。
ActRIIB-hFc变体的配体选择性：
融合构建体 激活素A （Kd e-11） 激活素B （Kd e-11） GDF11 （Kd e-11）
ActRIIB（L79 20-134）-hFc 1.6 1.2 3.6
ActRIIB（L79D 20-134）-hFc 1350.0 78.8 12.3
ActRIIB（L79 25-131）-hFc 1.8 1.2 3.1
ActRIIB（L79D 25-131）-hFc 2290.0 62.1 7.4
具有截短的细胞外结构域的GDF捕获物，ActRIIB（L79D 25-131）-hFc，等于或超过由较长变体ActRIIB（L79D 20-134）-hFc展示的配体选择性，与缺乏L79D替代的ActRIIB-hFc配对物相比较，具有激活素A结合的显著丧失、激活素B结合的部分丧失以及GDF11结合的几乎完全保留。注意到单独的截短（不含L79D取代）不改变此处展示的配体中的选择性[比较ActRIIB（L79 25-131）-hFc与ActRIIB（L79 20-134）-hFc]。
实施例17：用可替代核苷酸序列生成ActRIIB（L79D 25-131）-hFc
为了生成ActRIIB（L79D 25-131）-hFc，在天然位置79（SEQ ID NO:1）处具有天冬氨酸盐取代以及具有N末端和C末端截短（SEQ ID NO: 1中的残基25-131）的人ActRIIB细胞外结构域与TPA前导序列而不是天然ActRIIB前导区N末端融合，并经由最低限度接头（三个甘氨酸残基）与人Fc结构域C末端融合（图18）。编码该融合蛋白的一个核苷酸序列显示于图19（SEQ ID NO: 42）中，并且编码完全相同的融合蛋白的可替代核苷酸序列显示于图22A和22B（SEQ ID NO:46）中。使用实施例9中所述的方法表达且纯化该蛋白质。
实施例18：具有截短的ActRIIB细胞外结构域的GDF捕获物增加小鼠中的红系祖细 胞的增殖
评估ActRIIB（L79D 25-131）-hFc以测定其对红系祖细胞增殖的作用。在第1天和第4天时，用ActRIIB（L79D 25-131）-hFc（10mg/kg，sc；n = 6）或媒介物（TBS；n = 6）处理雄性C57BL/6小鼠，并且随后在第8天时实施安乐死，用于收集脾、胫骨、股骨和血液。分离脾和骨髓的细胞，在含有5%胎牛血清的Iscove改良的达尔贝科培养基中稀释，悬浮于专门的基于甲基纤维素的培养基中，并且培养2或12天，以评价在集落形成单位红细胞（CFU-E）和爆发形成单位红细胞（BFU-E）阶段时的克隆形成祖细胞水平。用于BFU-E测定的基于甲基纤维素的培养基（MethoCult M3434，Stem Cell Technologies）包括重组鼠干细胞因子、白细胞介素-3和白细胞介素-6，其不存在于用于CFU-E测定的甲基纤维素培养基（MethoCultM3334，Cell Technologies）中，而在其他组成成分中，这两种培养基均含有促红细胞生成素。对于BFU-E和CFU-E，在衍生自每个组织样品的一式两份的培养板中测定集落数目，并且结果的统计分析基于每个处理组的小鼠数目。
来自用ActRIIB（L79D 25-131）-hFc处理的小鼠的脾衍生培养物具有来自对照小鼠的相应培养物的CFU-E集落数目的两倍（P < 0.05），而BFU-E集落数目对于体内处理并无显著不同。来自骨髓培养物的CFU-E或BFU-E集落数目与治疗也没有显著不同。如预期的，与对照相比较，在用ActRIIB（L79D 25-131）-hFc处理的小鼠中在安乐死时，脾衍生的培养物中的CFU-E集落数目的增加伴随红血细胞水平（11.6%增加）、血红蛋白浓度（12%增加）和血细胞比容水平（11.6%增加）中高度显著的变化（P < 0.001）。这些结果指示具有截短的ActRIIB细胞外结构域的GDF捕获物的体内施用可以刺激红系祖细胞的增殖，作为其增加红血细胞水平的总体效应的部分。
已进一步证明GDF捕获物融合蛋白在增加不同贫血模型中的红血细胞水平中是有效的，包括例如化学疗法诱导的贫血、肾切除术诱导的贫血和失血性贫血。参见例如国际专利申请公开号WO 2010/019261。
实施例19：具有截短的ActRIIB细胞外结构域的GDF捕获物增加非人灵长类动物中 的红血细胞水平
就其刺激食蟹猴中的红血细胞产生的能力评估两种GDF捕获物，ActRIIB（L79D20-134）-hFc和ActRIIB（L79D 25-131）-hFc。在第1天和第8天时，用GDF捕获物（10mg/kg；n= 4只雄性/ 4只雌性）或媒介物（n = 2只雄性/ 2只雌性）皮下处理猴。在第1（处理前基线）、3、8、15、29和44天时收集血样，并分析红血细胞水平（图24）、血细胞比容（图25）、血红蛋白水平（图26）和网织红细胞水平（图27）。媒介物处理的猴在所有后处理时间点显示出红血细胞、血细胞比容和血红蛋白的水平减少，这是反复血液取样的预期效应。相比之下，用ActRIIB（L79D 20-134）-hFc或ActRIIB（L79D 25-131）-hFc的处理到第一后处理时间点（第3天）时增加这些参数，并且对于研究的持续时间将其维持在基本上升高的水平（图24-26）。重要的是，与媒介物相比较，用ActRIIB（L79D 20-134）-hFc或ActRIIB（L79D 25-131）-hFc处理的猴中的网织红细胞水平在第8、15和29天时基本上增加（图27）。该结果证明GDF捕获物处理增加红系前体的产生，导致红血细胞水平升高。
总之，这些数据证明截短的GDF捕获物以及全长变体可以用作GDF11和潜在相关配体的选择性拮抗剂，以增加体内红血细胞形成。
实施例20：衍生自ActRIIB5的GDF捕获物
其他人已报道了可替代的可溶形式的ActRIIB（命名为ActRIIB5），其中外显子4包括ActRIIB跨膜结构域已替换为不同的C末端序列。参见例如WO 2007/053775。
不含其前导区的天然人ActRIIB5的序列如下：
Figure 318187DEST_PATH_IMAGE059
可以如所述的在天然位置79（加下划线）处执行亮氨酸至天冬氨酸盐取代或其他酸性取代，以构建具有下述序列的变体ActRIIB5（L79D）：
Figure 371593DEST_PATH_IMAGE060
该变体可以用TGGG接头（加单下划线的）连接至人Fc（加双下划线的），以生成具有下述序列的人ActRIIB5（L79D）-hFc融合蛋白：
Figure 149056DEST_PATH_IMAGE061
Figure 629716DEST_PATH_IMAGE062
Figure 859840DEST_PATH_IMAGE063
。
该构建体可以在CHO细胞中表达。
实施例21：用EPO和具有截短的ActRIIB细胞外结构域的GDF捕获物的组合处理在 小鼠中的效应
EPO通过增加红系前体的增殖诱导红血细胞的形成，而GDF捕获物可能以补充或增强EPO的效应的方式影响红血细胞的形成。因此，申请人调查了用EPO和ActRIIB（L79D 25-131）-hFc的组合处理对红细胞生成参数的作用。雄性C57BL/6小鼠（9周龄）给予单独的重组人EPO（依伯汀α，1800单位/ kg）、单独的ActRIIB（L79D 25-131）-hFc（10 mg/kg）、EPO和ActRIIB（L79D 25-131）-hFc两者或媒介物（Tris缓冲盐水）的单次i.p.注射。小鼠在给药后72小时实施安乐死，用于收集血液、脾和股骨。
加工脾和股骨以获得用于流式细胞术分析的红系前体细胞。在取出后，将脾在含有5%胎牛血清的Iscove改良的达尔贝科培养基中切碎，并通过用来自无菌1-mL注射器的柱塞推动通过70-μm细胞滤器进行机械解离。将股骨清除任何残余肌肉或结缔组织，并修剪末端以允许通过与3-mL注射器连接的21号针头，用含有5%胎牛血清的Iscove改良的达尔贝科培养基冲洗剩余的轴来收集骨髓。将细胞悬浮液离心（2000rpm共10分钟），并且将细胞团块重悬浮于含有5%胎牛血清的PBS中。将来自每种组织的细胞（106）与抗小鼠IgG一起温育以阻断非特异性结合，随后与针对小鼠细胞表面标记物CD71（转铁蛋白受体）和Ter119（与细胞表面血型糖蛋白A相关的抗原）的荧光标记的抗体一起温育，洗涤，并通过流式细胞术分析。通过用碘化丙啶复染从分析中排除样品中的死细胞。通过在分化过程中减少的CD71标记的程度，以及在从原红血细胞阶段开始的末期红细胞分化期间增加的Ter119标记，来评估脾或骨髓中的红细胞分化（Socolovsky等人，2001，Blood 98:3261-3273；Ying等人，2006，Blood 108:123-133）。因此，如所述的，流式细胞术用于测定原红血细胞（CD71高Ter119低）、嗜碱性成红细胞（CD71高Ter119高）、多色性+正色性成红细胞（CD71中Ter119高）和晚期正色性成红细胞+网织红细胞（CD71低Ter119高）。
用EPO和ActRIIB（L79D 25-131）-hFc的组合处理导致红血细胞中令人惊讶的剧烈增加。在该实验的72小时时间范围，与媒介物相比较，EPO和ActRIIB（L79D 25-131）-hFc单独均未显著增加血细胞比容，而用两种药物的组合处理导致血细胞比容中接近25%的增加，这是出乎意料的协同作用，即大于其单独效应的总和（图28）。这种类型的协同作用一般视为个别药物通过不同的细胞机制起作用的证据。对于血红蛋白浓度（图29）和红血细胞浓度（图30）也观察到类似的结果，其中各自也通过组合处理协同增加。
红系前体水平的分析揭示更复杂的模式。在小鼠中，脾视为负责诱导（“应激”）红细胞生成的主要器官。与媒介物相比较，在72小时的脾组织的流式细胞术分析揭示EPO显著改变红系前体概况，以减少超过三分之一的晚期前体（晚期正色性成红细胞+网织红细胞）为代价，使嗜碱性成红细胞的数目增加超过170%（图31）。重要的是，与媒介物相比较，组合处理显著增加嗜碱性成红细胞，但至比单独的EPO更小的程度，同时支持晚期前体的未缩小的成熟（图31）。因此，用EPO和ActRIIB（L79D 25-131）-hFc的组合处理通过前体增殖和成熟的平衡增强来增加红细胞生成。与脾形成对比，组合处理后骨髓中的前体细胞概况与单独的EPO后的那种并无明显不同。申请人由脾前体概况预测，如果实验延长超过72小时，则组合处理将导致增加的网织红细胞水平，并且伴随成熟红血细胞水平的持续升高。
总之，这些发现证明具有截短的ActRIIB细胞外结构域的GDF捕获物可以与EPO组合施用，以在体内协同增加红血细胞形成。通过互补但未明确的机制起作用，GDF捕获物可以缓和单独的EPO受体激活剂的强增殖效应，并且仍允许用较低剂量的EPO受体激活剂获得靶水平的红血细胞，从而避免潜在的不良反应或与更高水平的EPO受体激活相关的其他问题。
实施例22：具有截短的ActRIIB细胞外结构域的GDF捕获物对β地中海贫血的小鼠 模型中的RBC水平和形态的作用
在代表无效红细胞生成的最常见原因的地中海贫血综合征中，α-和β珠蛋白链表达中的不平衡导致由于成红细胞成熟期间细胞凋亡的增加的贫血。RBC输血目前是地中海贫血中的关键维持疗法，但随着时间过去在某些组织中引起潜在的致死性铁积累（Tanno等人，2010，Adv Hematol 2010:358283）。例如，与铁过载相关的心脏病在患有重型地中海贫血的患者中可以占50%的死亡率（Borgna-Pignatti等人，2005，Ann NY Acad Sci 1054:40-47）。重要的是，内源性EPO水平通常升高，并且促成地中海贫血综合征以及无效红细胞生成的其他病症中的疾病病因；因此，重组EPO的治疗用途可能是不适当的。因此，需要用于地中海贫血和无效红细胞生成的其他病症的可替代疗法，其将增加RBC水平而无伴随伴随长期输血的铁过载。
申请人调查了在β地中海贫血的小鼠模型中ActRIIB（L79D 25-131）-mFc对RBC形成的作用，在所述小鼠模型中β主要珠蛋白编码基因的整个编码区已缺失。对于该Hbb th-1等位基因纯合的小鼠显示出在高比例的循环RBC中具有包涵体的低色素性、小红细胞性贫血（Skow等人，1983，Cell 1043:1043-1052）。在初步实验中，2-5月龄的Hbb -/- β地中海贫血小鼠（C57BL/6J-Hbb d3th /J）被随机分配为接受通过每周两次的皮下注射的ActRIIB（L79D 25-131）-mFc（10 mg/kg）或媒介物（Tris缓冲盐水）。用媒介物给药的野生型同窝幼仔充当另外的对照。在给药开始之前以及其后以定期间隔通过颊部出血收集血样（100 μl），用于CBC分析。在基线时血液学参数的表征证实Hbb -/- β地中海贫血小鼠严重贫血（图32A-C），并且与媒介物处理的Hbb -/-小鼠相比较，用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理Hbb -/-小鼠4周显著增加RBC数目，从而使在该模型中观察到的贫血降低一半（图33）。还可见处理相关的血细胞比容和血红蛋白浓度中的增加。重要的是，与媒介物处理的Hbb -/-小鼠相比较，用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理Hbb -/-小鼠也导致改善的RBC形态和降低的溶血和红血细胞碎片，从而指示红细胞生成中的基本改善。因此，具有截短的ActRIIB细胞外结构域的GDF捕获物多肽可以通过增加RBC数目和形态两者，提供用于β地中海贫血的鼠模型中的贫血的治疗益处。通过促进成红细胞成熟同时降低贫血，GDF捕获物多肽可以治疗无效红细胞生成。与固有的外源性铁来源的输血不同，GDF捕获物多肽可以通过促进经由红细胞生成的内源性铁储存的使用来提高RBC水平，从而避免铁过载及其负面后果。
实施例23：具有截短的ActRIIB细胞外结构域的GDF捕获物对β地中海贫血的小鼠 模型中EPO水平、脾肿大、骨密度和铁过载的作用
与无效红细胞生成相关的缺氧促使升高的EPO水平，其可以驱动骨髓内和骨髓外两者的成红细胞的大量扩增，导致脾肿大（脾扩大）、成红细胞诱导的骨病理状态和组织铁过载，即使在不存在治疗性RBC 输血的情况下。未治疗的铁过载导致组织铁沉积、多器官功能障碍和过早死亡（Borgna-Pignatti等人，2005，Ann NY Acad Sci 1054:40-47；Borgna-Pignatti等人，2011，Expert Rev Hematol 4:353-366），最通常是由于严重形式的地中海贫血中的心肌病（Lekawanvijit等人，2009，Can J Cardiol 25:213-218）。通过增加红细胞生成效率，GDF捕获物多肽不仅可以减轻潜在的贫血和升高的EPO水平，还可以减轻脾肿大、骨病理状态和铁过载的相关并发症。
申请人研究了实施例21中研究的β中间型地中海贫血的相同小鼠模型中GDF捕获物多肽对这些参数的作用。将3月龄的Hbb -/- β地中海贫血小鼠（C57BL/6J-Hbb d3th /J）随机分配，以接受通过每周两次皮下注射共2个月的ActRIIB（L79D 25-131）-mFc（1 mg/kg，n =7）或媒介物（Tris 缓冲盐水，n = 7）。用媒介物给药的野生型同窝幼仔（n = 13）充当另外的对照。在研究终止时收集血样（100 μl）用于CBC分析。在研究终止时，通过双能量x射线吸收测定法（DEXA）测定骨矿物质密度，通过ELISA测定血清EPO水平，用2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯和流式细胞术定量活性氧（ROS）（Suragani等人，2012，Blood 119:5276-5284），并通过定量聚合酶链反应测定铁调素mRNA水平。
这种GDF捕获物多肽发挥与减少无效红细胞生成一致的多重血液学效应。与媒介物给药的Hbb -/-小鼠相比较，用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理Hbb -/-小鼠2个月使RBC计数增加25%（图35）。在Hbb -/-小鼠中，与媒介物对照相比较，ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理在2个月时也显著增加血红蛋白浓度和血细胞比容。这些变化伴随循环网织红细胞水平的降低（对于用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc或媒介物处理的Hbb -/-小鼠，分别为31.3 ± 2.3%相对于44.8 ± 5.0%），这与贫血的减轻一致。如在实施例21中，与媒介物给药的Hbb -/- 小鼠相比较，用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理Hbb -/-小鼠导致改善的RBC形态和降低的红血细胞碎片。与健康个体相比较，患有地中海贫血的患者显示出RBC破坏的速率增加和胆红素的血清水平升高，所述胆红素是血红素分解代谢的产物和溶血的标记物（Orten，1971，AnnClin Lab Sci 1:113-124）。在Hbb -/-小鼠中，与媒介物相比较，用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理使在2个月时的血清胆红素水平降低近一半（图36），从而提供ActRIIB（L79D 25-131）-mFc可以出乎意料地改善成熟RBC的结构/功能完整性的证据，因为其促进RBC形成。重要的是，与相同模型中的媒介物相比较，用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理Hbb -/-小鼠使在2个月时的血清EPO水平降低超过60%（图37）。由于升高的EPO水平是β地中海贫血中的无效红细胞生成的标志，此类水平的降低在此处是下述的强有力证据：ActRIIB（L79D 25-131）-mFc在地中海贫血的这种鼠模型中减轻无效红细胞生成本身，而不仅是其引起的贫血。
该GDF捕获物多肽还在代表无效红细胞生成的主要并发症的终点中产生有益的变化。在地中海贫血患者中，脾肿大和骨退化两者均由EPO刺激的红血细胞增生和髓外红细胞生成引起。在Hbb -/-小鼠中，与媒介物相比较，用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理2个月显著降低脾重量（图38A和38B），并且使骨矿物质密度完全恢复至野生型值（图39）。通过用该GDF捕获物多肽处理，铁稳态也显著改善。血清铁由未结合的（游离的）铁和结合原转铁蛋白的铁（形成转铁蛋白）组成，所述原转铁蛋白是用于在循环中转运元素铁的专门蛋白质。血清铁构成全身铁的相对小且不稳定的组分，而铁蛋白（主要在细胞内发现的另一种铁储存形式）的血清水平代表较大和较不稳定的组分。铁负荷的第三个量度是转铁蛋白饱和度，转铁蛋白的铁结合能力被占据的程度。在Hbb -/-小鼠中，与媒介物相比较，ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理2个月显著降低铁过载的这些指示剂中的每一种（图40A-C）。除其对铁稳态的这些不同参数的作用之外，如通过脾、肝和肾中的组织化学分析测定的，ActRIIB（L79D 25-131）-mFc使Hbb -/-小鼠中的组织铁过载归一化（图41）。此外，该GDF捕获物多肽对铁调素（视为铁稳态的主调节物的肝脏蛋白质（Gantz，2011，Blood 117:4425-4433））的表达发挥有益的作用，所述铁调素的水平与膳食铁摄入相反变化。用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理逆转了Hbb -/-小鼠的肝中的铁调素的异常低表达（图42）。最后，执行具有相似设计的另一项研究，以测定该GDF捕获物对活性氧（ROS）的作用，所述活性氧被认为介导铁超载的毒性效应中的许多（Rund等人，2005，N Engl J Med 353:1135-1146）。在3月龄Hbb -/-小鼠中，用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc以1 mg/kg每周两次处理2个月几乎标准化ROS水平（图43），并且因此预测将极大降低地中海贫血和特征在于无效红细胞生成的其他疾病中由ROS介导的组织损害。
总之，上文发现证明GDF捕获物多肽可以治疗无效红细胞生成，包括贫血和EPO水平升高，以及并发症例如脾肿大、成红细胞诱导的骨病理状态和铁过载及其伴随的病理状态。对于脾肿大，这种病理状态包括胸部或腹部疼痛和网状内皮增生。髓外造血不仅可以在脾中出现，还潜在地可以在其他组织中以髓外造血假瘤的形式出现（Musallam等人，2012，Cold Spring Harb Perspect Med 2:a013482）。对于成红细胞诱导的骨病理状态，伴随的病理状态包括低骨矿物质密度、骨质疏松和骨痛（Haidar等人，2011，Bone 48:425-432）。对于铁过载，伴随的病理状态包括铁调素压制和膳食铁的过度吸收（Musallam等人，2012，Blood Rev 26（Suppl 1）:S16-S19）、多发性内分泌病和肝纤维化/肝硬化（Galanello等人，2010，Orphanet J Rare Dis 5:11）和铁过载心肌病（Lekawanvijit等人，2009，Can JCardiol 25:213-218）。与用于无效红细胞生成的现有疗法形成对比，GDF捕获物多肽例如ActRIIB（L79D 25-131）-mFc能够降低鼠模型中的铁过载，同时增加RBC水平。这种新型能力区别GDF捕获物多肽与输血，所述输血在治疗贫血的过程中固有地用外源性铁负载身体，并且实现这点而不减轻无效红细胞生成的根本条件。
实施例24：GDF捕获物增加血红蛋白水平，并且使地中海贫血患者中的皮肤溃疡基 本上消退。
设计临床研究，以用ActRIIB（L79D 25-131）-hFc的多重剂量治疗地中海贫血患者（β中间型和重型地中海贫血患者）。该研究包括非输血依赖性患者（< 4单位/8周，血红蛋白< 10 g/dL）和输血（血液）依赖性患者（≥ 4单位/8周，经过6个月证实）。将患者分到四个治疗组之一内：i）通过每三周的皮下注射施用0.2 mg/kg ActRIIB（L79D 25-131）-hFc；ii）通过每三周的皮下注射施用0.4 mg/kg ActRIIB（L79D 25-131）-hFc；iii）通过每三周的皮下注射施用0.6 mg/kg ActRIIB（L79D 25-131）-hFc；和iv）通过每三周的皮下注射施用0.8mg/kg ActRIIB（L79D 25-131）-hFc。经过三个月的治疗过程，观察到患者具有血红蛋白水平中的显著的剂量依赖性增加。此外，ActRIIB（L79D 25-131）-hFc治疗在减少输血依赖性方面是有效的，即所有输血依赖性患者在研究过程中均经历输血负荷> 50%的降低。
具有大约9.2 g/dL的基线血红蛋白水平的一个患者接受以0.4 mg/kg水平的ActRIIB（L79D 25-131）-hFc的4个剂量，导致在三个月的治疗后大约10.6 g/dL的血红蛋白水平。患者的地中海贫血是β中间型地中海贫血，并且患者是非输血依赖性的。在本研究前大约三年，该患者已患有下肢中的复发性皮肤溃疡。此类溃疡是地中海贫血的常见皮肤并发症。参见例如Rassi等人（2008）Pediatric Annals 37（5）：322-328。在ActRIIB（L79D 25-131）-hFc治疗之前，该患者被诊断患有腿部溃疡。在施用第一个ActRIIB（L79D 25-131）-hFc剂量后两周观察到溃疡愈合。在ActRIIB（L79D 25-131）-hFc处理6周后，腿部溃疡测定为基本上消退。第二个非输血依赖患者开始关于腿部溃疡的研究。在用以1.25 mg/kg的几个剂量的ActRIIB（L79D 25-131）-hFc处理后，腿部溃疡基本上消退。另外，输血依赖性患者开始关于在左踝上的溃疡的研究。在以1.0 mg/kg的五个剂量的ActRIIB（L79D 25-131）-hFc后，溃疡基本上消退，并且对于研究的持续时间保持如此。因此，ActRIIB（L79D 25-131）-hFc可以用于有效治疗在非输血和输血依赖性地中海贫血患者中表现的溃疡。
相应地，这些数据证明ActRIIB（L79D 25-131）-hFc治疗有效增加血红蛋白水平，并且可以用于降低人地中海贫血患者中的输血依赖性。除对疾病的贫血的正面作用之外，腿部溃疡愈合中的显著改善指示ActRIIB（L79D 25-131）-hFc可以用于有效治疗地中海贫血的其他非贫血并发症，这与来自上述β地中海贫血的小鼠模型的数据一致。
实施例25：GDF捕获物增加镰状细胞病模型中的红血细胞水平且改善红血细胞形 态
申请人调查了在镰状细胞病（SCD）的小鼠模型中ActRIIB（L79D 25-131）-mFc对红血细胞（RBC）形成的作用，其中小鼠血红蛋白基因（α/α和β/β）已替换为人镰状血红蛋白基因（α/α、γ/γ和βS/βS）。对于人βS等位基因纯合的小鼠显示出在患有SCD的人中发现的主要特点（例如，严重溶血性贫血、不可逆镰状红细胞、血管（血管的）闭塞和多器官病理状态）。参见例如Wu等人，（2006）Blood，108（4）：1183-1188；Ryan等人（1997）Science 278：873-876。
通过每周两次的皮下注射， SCD小鼠（βS/βS）在3月龄时被随机分配，以接受ActRIIB（L79D 25-131）-mFc（1 mg/kg）或媒介物[Tris缓冲盐水（TBS）]。用媒介物给药的无症状复合杂合子（βS/βS）同窝幼仔充当另外的对照（Wt动物）。在基线时，与复合杂合子小鼠相比较，SCD小鼠具有降低的RBC水平（-28%，P<0.01）和血红蛋白水平（-14.5%，P<0.05）以及增加的网织红细胞水平，证明SCD小鼠严重贫血。
在一个月的处理后，就不同红血细胞参数中的变化评估受试者。与媒介物处理的SCD小鼠相比较，用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理SCD小鼠4周显著增加RBC水平（+15.2%，p<0.01），从而降低在该模型中观察到的贫血（图44和45）。还观察到ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理相关的血细胞比容和血红蛋白浓度中的增加（图45），以及平均细胞容积、RDC分布宽度、网织红细胞数目和活性氧中的显著减少（图46），这都与改善的红血细胞半衰期一致。令人惊讶的是，用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理SCD小鼠6周导致外周血细胞中的磷脂酰丝氨酸（PS）暴露的基本减少（-14%，P=0.08），如通过爬行酶（scramblase）测定和膜联蛋白-V测定所测定的，指示与媒介物治疗的受试者相比较朝向改善的膜磷脂不对称的趋势。
在三个月的处理后，观察到受试者具有另外的血液化学参数中的改善。特别地，与媒介物处理的SCD小鼠相比较，用ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理SCD小鼠12周显著降低胆红素（总）水平（-17.0%，p<0.05）、血尿素氮水平（-19.2%，p<0.05）以及细胞游离血红蛋白（-30.7%，p = 0.06）。这些数据指示与媒介物处理的受试者相比较，GDF捕获物处理的受试者具有红血细胞溶血水平的减少，这与早在ActRIIB（L79D 25-131）-mFc疗法开始后一个月观察到的红血细胞水平的增加一致。与媒介物处理的受试者相比较，膜联蛋白-V测定证明在三个月的治疗后外周血细胞中的磷脂酰丝氨酸（PS）暴露中的显著减少（-13.4%，p =0.06）。此外，与用媒介物单独处理的小鼠相比较，在处理三个月后执行的血涂片显示在ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理的小鼠中较少的不可逆镰状形成的红血细胞（-66.5%，p<0.0001；由每组大约2000个细胞计数）。这些数据指示在ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理后的红血细胞形态中的定性改善，这与在一个月和三个月的ActRIIB（L79D 25-131）-mFc处理后获得的爬行酶测定和膜联蛋白-V测定数据一致。此外，与媒介物处理的SCD小鼠相比较，用GDF捕获物处理SCD小鼠三个月也导致脾重量中的显著减少（-20.5%，p<0.05）。这些数据指示ActRIIB（L79D 25-131）-mFc可以用于治疗与SCD相关的其他并发症，包括例如红血细胞的脾隔离，其可导致脾隔离危象和/或脾肿大。
总之，这些数据指示包含截短的ActRIIB细胞外结构域的GDF捕获物可以在SCD的鼠模型中提供不同的治疗益处。除增加RBC水平和改善不同的血液参数之外，数据证明RBC形态中的改善。这种观察到的RBC形态中的改善指示除贫血之外，GDF捕获物治疗可以用于治疗或预防SCD的不同的其他并发症（例如起于血管闭塞的并发症）。这通过ActRIIB（L79D25-131）-mFc处理的受试者中观察到的脾大小减少得到进一步支持。
相应地，本文呈现的数据提示GDF捕获物多肽可以用于治疗镰状细胞病的各种并发症。与固有的外源性铁来源的红血细胞输注不同，GDF捕获物多肽可以通过促进经由红细胞生成的内源性铁储存的使用来提高RBC水平，并因此避免铁过载及其负面后果。
如在地中海贫血患者中观察到的，皮肤溃疡是镰状细胞病的最常见的皮肤并发症之一。参见例如Keast等人（2004）Ostomy Wound Manage.，50（10）：64-70；Trent等人（2004）Adv Skin Wound Care，17（8）：410-416；和J.R. Eckman（1996）Hematol Oncol Clin NorthAm.，10（6）：1333-1344。关于贫血患者中的溃疡形成的根本机制尚未完全确定。然而，认为贫血的多重并发症促成溃疡发展，包括例如缺血、一氧化氮生物利用度减少、血管闭塞（特别是在镰状细胞贫血和地中海贫血的情况下）、血栓形成、高水平的循环网织红细胞和缺氧。同上。如上文讨论的，本发明证明ActRIIB（L79D 25-131）-Fc处理减轻了这些镰状细胞病相关状况中的许多。相应地，本文公开的数据提示如在上述地中海贫血患者中观察到的，ActRII拮抗剂可以用于治疗和预防患有镰状细胞病的患者中的溃疡。
通过引用并入
本文提及的所有出版物和专利均通过引用整体并入本文，如同每个个别出版物或专利具体且个别地指示通过引用并入。
虽然已讨论了主题的具体实施例，但上文说明书是举例说明性的而不是限制性的。在审阅本说明书和下文权利要求后，许多变化对于本领域技术人员将变得显而易见。本发明的完全范围应当通过参考权利要求连同其等同物的完全范围，以及说明书连同这些变化来确定。
序列表
<110> ACCELERON PHARMA, INC.
<120> 用于治疗溃疡的方法和组合物
<130> PHPH-079-WO1
<140> PCT/US2015/035706
<141> 2015-06-12
<150> 62/045,808
<151> 2014-09-04
<150> 62/012,109
<151> 2014-06-13
<160> 69
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 512
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
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Leu Met Asn Asp Phe Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Leu Gln Asp Lys
210 215 220
Gln Ser Trp Gln Ser Glu Arg Glu Ile Phe Ser Thr Pro Gly Met Lys
225 230 235 240
His Glu Asn Leu Leu Gln Phe Ile Ala Ala Glu Lys Arg Gly Ser Asn
245 250 255
Leu Glu Val Glu Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Asp Lys Gly Ser
260 265 270
Leu Thr Asp Tyr Leu Lys Gly Asn Ile Ile Thr Trp Asn Glu Leu Cys
275 280 285
His Val Ala Glu Thr Met Ser Arg Gly Leu Ser Tyr Leu His Glu Asp
290 295 300
Val Pro Trp Cys Arg Gly Glu Gly His Lys Pro Ser Ile Ala His Arg
305 310 315 320
Asp Phe Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Ser Asp Leu Thr Ala Val
325 330 335
Leu Ala Asp Phe Gly Leu Ala Val Arg Phe Glu Pro Gly Lys Pro Pro
340 345 350
Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro Glu
355 360 365
Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg Ile
370 375 380
Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Val Ser Arg Cys
385 390 395 400
Lys Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu Glu
405 410 415
Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Glu Leu Gln Glu Val Val Val
420 425 430
His Lys Lys Met Arg Pro Thr Ile Lys Asp His Trp Leu Lys His Pro
435 440 445
Gly Leu Ala Gln Leu Cys Val Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His Asp
450 455 460
Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Glu Glu Arg Val Ser Leu
465 470 475 480
Ile Arg Arg Ser Val Asn Gly Thr Thr Ser Asp Cys Leu Val Ser Leu
485 490 495
Val Thr Ser Val Thr Asn Val Asp Leu Pro Pro Lys Glu Ser Ser Ile
500 505 510
<210> 5
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 5
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Ala Asn Ser Ser
35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105 110
Ala Pro Thr
115
<210> 6
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 6
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Ala Asn Ser Ser
35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala
100
<210> 7
<211> 1536
<212> DNA
<213> 智人
<400> 7
atgacggcgc cctgggtggc cctcgccctc ctctggggat cgctgtgcgc cggctctggg 60
cgtggggagg ctgagacacg ggagtgcatc tactacaacg ccaactggga gctggagcgc 120
accaaccaga gcggcctgga gcgctgcgaa ggcgagcagg acaagcggct gcactgctac 180
gcctcctggc gcaacagctc tggcaccatc gagctcgtga agaagggctg ctggctagat 240
gacttcaact gctacgatag gcaggagtgt gtggccactg aggagaaccc ccaggtgtac 300
ttctgctgct gtgaaggcaa cttctgcaac gaacgcttca ctcatttgcc agaggctggg 360
ggcccggaag tcacgtacga gccacccccg acagccccca ccctgctcac ggtgctggcc 420
tactcactgc tgcccatcgg gggcctttcc ctcatcgtcc tgctggcctt ttggatgtac 480
cggcatcgca agccccccta cggtcatgtg gacatccatg aggaccctgg gcctccacca 540
ccatcccctc tggtgggcct gaagccactg cagctgctgg agatcaaggc tcgggggcgc 600
tttggctgtg tctggaaggc ccagctcatg aatgactttg tagctgtcaa gatcttccca 660
ctccaggaca agcagtcgtg gcagagtgaa cgggagatct tcagcacacc tggcatgaag 720
cacgagaacc tgctacagtt cattgctgcc gagaagcgag gctccaacct cgaagtagag 780
ctgtggctca tcacggcctt ccatgacaag ggctccctca cggattacct caaggggaac 840
atcatcacat ggaacgaact gtgtcatgta gcagagacga tgtcacgagg cctctcatac 900
ctgcatgagg atgtgccctg gtgccgtggc gagggccaca agccgtctat tgcccacagg 960
gactttaaaa gtaagaatgt attgctgaag agcgacctca cagccgtgct ggctgacttt 1020
ggcttggctg ttcgatttga gccagggaaa cctccagggg acacccacgg acaggtaggc 1080
acgagacggt acatggctcc tgaggtgctc gagggagcca tcaacttcca gagagatgcc 1140
ttcctgcgca ttgacatgta tgccatgggg ttggtgctgt gggagcttgt gtctcgctgc 1200
aaggctgcag acggacccgt ggatgagtac atgctgccct ttgaggaaga gattggccag 1260
cacccttcgt tggaggagct gcaggaggtg gtggtgcaca agaagatgag gcccaccatt 1320
aaagatcact ggttgaaaca cccgggcctg gcccagcttt gtgtgaccat cgaggagtgc 1380
tgggaccatg atgcagaggc tcgcttgtcc gcgggctgtg tggaggagcg ggtgtccctg 1440
attcggaggt cggtcaacgg cactacctcg gactgtctcg tttccctggt gacctctgtc 1500
accaatgtgg acctgccccc taaagagtca agcatc 1536
<210> 8
<211> 345
<212> DNA
<213> 智人
<400> 8
gggcgtgggg aggctgagac acgggagtgc atctactaca acgccaactg ggagctggag 60
cgcaccaacc agagcggcct ggagcgctgc gaaggcgagc aggacaagcg gctgcactgc 120
tacgcctcct ggcgcaacag ctctggcacc atcgagctcg tgaagaaggg ctgctggcta 180
gatgacttca actgctacga taggcaggag tgtgtggcca ctgaggagaa cccccaggtg 240
tacttctgct gctgtgaagg caacttctgc aacgaacgct tcactcattt gccagaggct 300
gggggcccgg aagtcacgta cgagccaccc ccgacagccc ccacc 345
<210> 9
<211> 513
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala Val Phe Leu Ile Ser Cys
1 5 10 15
Ser Ser Gly Ala Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe
20 25 30
Phe Asn Ala Asn Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu
35 40 45
Pro Cys Tyr Gly Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp
50 55 60
Lys Asn Ile Ser Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu
65 70 75 80
Asp Asp Ile Asn Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp
85 90 95
Ser Pro Glu Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu
100 105 110
Lys Phe Ser Tyr Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn
115 120 125
Pro Val Thr Pro Lys Pro Pro Tyr Tyr Asn Ile Leu Leu Tyr Ser Leu
130 135 140
Val Pro Leu Met Leu Ile Ala Gly Ile Val Ile Cys Ala Phe Trp Val
145 150 155 160
Tyr Arg His His Lys Met Ala Tyr Pro Pro Val Leu Val Pro Thr Gln
165 170 175
Asp Pro Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Leu Gly Leu Lys Pro Leu
180 185 190
Gln Leu Leu Glu Val Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys Val Trp Lys
195 200 205
Ala Gln Leu Leu Asn Glu Tyr Val Ala Val Lys Ile Phe Pro Ile Gln
210 215 220
Asp Lys Gln Ser Trp Gln Asn Glu Tyr Glu Val Tyr Ser Leu Pro Gly
225 230 235 240
Met Lys His Glu Asn Ile Leu Gln Phe Ile Gly Ala Glu Lys Arg Gly
245 250 255
Thr Ser Val Asp Val Asp Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Glu Lys
260 265 270
Gly Ser Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ala Asn Val Val Ser Trp Asn Glu
275 280 285
Leu Cys His Ile Ala Glu Thr Met Ala Arg Gly Leu Ala Tyr Leu His
290 295 300
Glu Asp Ile Pro Gly Leu Lys Asp Gly His Lys Pro Ala Ile Ser His
305 310 315 320
Arg Asp Ile Lys Ser Lys Asn Val Leu Leu Lys Asn Asn Leu Thr Ala
325 330 335
Cys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ala Leu Lys Phe Glu Ala Gly Lys Ser
340 345 350
Ala Gly Asp Thr His Gly Gln Val Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro
355 360 365
Glu Val Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg
370 375 380
Ile Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu Val Leu Trp Glu Leu Ala Ser Arg
385 390 395 400
Cys Thr Ala Ala Asp Gly Pro Val Asp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu
405 410 415
Glu Glu Ile Gly Gln His Pro Ser Leu Glu Asp Met Gln Glu Val Val
420 425 430
Val His Lys Lys Lys Arg Pro Val Leu Arg Asp Tyr Trp Gln Lys His
435 440 445
Ala Gly Met Ala Met Leu Cys Glu Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His
450 455 460
Asp Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys Val Gly Glu Arg Ile Thr
465 470 475 480
Gln Met Gln Arg Leu Thr Asn Ile Ile Thr Thr Glu Asp Ile Val Thr
485 490 495
Val Val Thr Met Val Thr Asn Val Asp Phe Pro Pro Lys Glu Ser Ser
500 505 510
Leu
<210> 10
<211> 115
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly
20 25 30
Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser
35 40 45
Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr
85 90 95
Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro
100 105 110
Lys Pro Pro
115
<210> 11
<211> 100
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 11
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly
20 25 30
Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser
35 40 45
Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr
85 90 95
Phe Pro Glu Met
100
<210> 12
<211> 1539
<212> DNA
<213> 智人
<400> 12
atgggagctg ctgcaaagtt ggcgtttgcc gtctttctta tctcctgttc ttcaggtgct 60
atacttggta gatcagaaac tcaggagtgt cttttcttta atgctaattg ggaaaaagac 120
agaaccaatc aaactggtgt tgaaccgtgt tatggtgaca aagataaacg gcggcattgt 180
tttgctacct ggaagaatat ttctggttcc attgaaatag tgaaacaagg ttgttggctg 240
gatgatatca actgctatga caggactgat tgtgtagaaa aaaaagacag ccctgaagta 300
tatttttgtt gctgtgaggg caatatgtgt aatgaaaagt tttcttattt tccggagatg 360
gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc caccctatta caacatcctg 420
ctctattcct tggtgccact tatgttaatt gcggggattg tcatttgtgc attttgggtg 480
tacaggcatc acaagatggc ctaccctcct gtacttgttc caactcaaga cccaggacca 540
cccccacctt ctccattact aggtttgaaa ccactgcagt tattagaagt gaaagcaagg 600
ggaagatttg gttgtgtctg gaaagcccag ttgcttaacg aatatgtggc tgtcaaaata 660
tttccaatac aggacaaaca gtcatggcaa aatgaatacg aagtctacag tttgcctgga 720
atgaagcatg agaacatatt acagttcatt ggtgcagaaa aacgaggcac cagtgttgat 780
gtggatcttt ggctgatcac agcatttcat gaaaagggtt cactatcaga ctttcttaag 840
gctaatgtgg tctcttggaa tgaactgtgt catattgcag aaaccatggc tagaggattg 900
gcatatttac atgaggatat acctggccta aaagatggcc acaaacctgc catatctcac 960
agggacatca aaagtaaaaa tgtgctgttg aaaaacaacc tgacagcttg cattgctgac 1020
tttgggttgg ccttaaaatt tgaggctggc aagtctgcag gcgataccca tggacaggtt 1080
ggtacccgga ggtacatggc tccagaggta ttagagggtg ctataaactt ccaaagggat 1140
gcatttttga ggatagatat gtatgccatg ggattagtcc tatgggaact ggcttctcgc 1200
tgtactgctg cagatggacc tgtagatgaa tacatgttgc catttgagga ggaaattggc 1260
cagcatccat ctcttgaaga catgcaggaa gttgttgtgc ataaaaaaaa gaggcctgtt 1320
ttaagagatt attggcagaa acatgctgga atggcaatgc tctgtgaaac cattgaagaa 1380
tgttgggatc acgacgcaga agccaggtta tcagctggat gtgtaggtga aagaattacc 1440
cagatgcaga gactaacaaa tattattacc acagaggaca ttgtaacagt ggtcacaatg 1500
gtgacaaatg ttgactttcc tcccaaagaa tctagtcta 1539
<210> 13
<211> 345
<212> DNA
<213> 智人
<400> 13
atacttggta gatcagaaac tcaggagtgt cttttcttta atgctaattg ggaaaaagac 60
agaaccaatc aaactggtgt tgaaccgtgt tatggtgaca aagataaacg gcggcattgt 120
tttgctacct ggaagaatat ttctggttcc attgaaatag tgaaacaagg ttgttggctg 180
gatgatatca actgctatga caggactgat tgtgtagaaa aaaaagacag ccctgaagta 240
tatttttgtt gctgtgaggg caatatgtgt aatgaaaagt tttcttattt tccggagatg 300
gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc caccc 345
<210> 14
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 14
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
20 25 30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
35 40 45
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
50 55 60
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
65 70 75 80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
85 90 95
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys
100 105 110
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
115 120 125
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
145 150 155 160
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
165 170 175
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
180 185 190
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
Lys
225
<210> 15
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (43)..(43)
<223> Asp或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (100)..(100)
<223> Lys或Ala
<220>
<221> MOD_RES
<222> (212)..(212)
<223> Asn或Ala
<400> 15
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
20 25 30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Xaa Val Ser His Glu Asp
35 40 45
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
50 55 60
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
65 70 75 80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
85 90 95
Tyr Lys Cys Xaa Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys
100 105 110
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
115 120 125
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
145 150 155 160
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
165 170 175
Asp Ser Asp Gly Pro Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
180 185 190
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Xaa His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
Lys
225
<210> 16
<211> 344
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys
20 25 30
Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr
35 40 45
Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser
50 55 60
Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile
65 70 75 80
Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu
85 90 95
Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn
100 105 110
Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys
115 120 125
Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala
130 135 140
Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr
145 150 155 160
Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser
165 170 175
Ser Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys
180 185 190
Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Cys Gly
195 200 205
Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr
210 215 220
Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys Ile
225 230 235 240
Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys
245 250 255
Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu
260 265 270
Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn
275 280 285
Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser
290 295 300
Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn Ser Ile Ser
305 310 315 320
Glu Asp Thr Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Gln Asp Tyr Ser Phe
325 330 335
Pro Ile Ser Ser Ile Leu Glu Trp
340
<210> 17
<211> 317
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Met Val Arg Ala Arg His Gln Pro Gly Gly Leu Cys Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Cys Gln Phe Met Glu Asp Arg Ser Ala Gln Ala Gly Asn Cys
20 25 30
Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu Tyr Lys Thr
35 40 45
Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu Ser Thr Ser
50 55 60
Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys Trp Met Ile
65 70 75 80
Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys Glu Thr Cys Glu
85 90 95
Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met Asn Lys Lys Asn
100 105 110
Lys Pro Arg Cys Val Cys Ala Pro Asp Cys Ser Asn Ile Thr Trp Lys
115 120 125
Gly Pro Val Cys Gly Leu Asp Gly Lys Thr Tyr Arg Asn Glu Cys Ala
130 135 140
Leu Leu Lys Ala Arg Cys Lys Glu Gln Pro Glu Leu Glu Val Gln Tyr
145 150 155 160
Gln Gly Arg Cys Lys Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser
165 170 175
Ser Thr Cys Val Val Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr Cys
180 185 190
Asn Arg Ile Cys Pro Glu Pro Ala Ser Ser Glu Gln Tyr Leu Cys Gly
195 200 205
Asn Asp Gly Val Thr Tyr Ser Ser Ala Cys His Leu Arg Lys Ala Thr
210 215 220
Cys Leu Leu Gly Arg Ser Ile Gly Leu Ala Tyr Glu Gly Lys Cys Ile
225 230 235 240
Lys Ala Lys Ser Cys Glu Asp Ile Gln Cys Thr Gly Gly Lys Lys Cys
245 250 255
Leu Trp Asp Phe Lys Val Gly Arg Gly Arg Cys Ser Leu Cys Asp Glu
260 265 270
Leu Cys Pro Asp Ser Lys Ser Asp Glu Pro Val Cys Ala Ser Asp Asn
275 280 285
Ala Thr Tyr Ala Ser Glu Cys Ala Met Lys Glu Ala Ala Cys Ser Ser
290 295 300
Gly Val Leu Leu Glu Val Lys His Ser Gly Ser Cys Asn
305 310 315
<210> 18
<211> 63
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 18
Gly Asn Cys Trp Leu Arg Gln Ala Lys Asn Gly Arg Cys Gln Val Leu
1 5 10 15
Tyr Lys Thr Glu Leu Ser Lys Glu Glu Cys Cys Ser Thr Gly Arg Leu
20 25 30
Ser Thr Ser Trp Thr Glu Glu Asp Val Asn Asp Asn Thr Leu Phe Lys
35 40 45
Trp Met Ile Phe Asn Gly Gly Ala Pro Asn Cys Ile Pro Cys Lys
50 55 60
<210> 19
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 19
Glu Thr Cys Glu Asn Val Asp Cys Gly Pro Gly Lys Lys Cys Arg Met
1 5 10 15
Asn Lys Lys Asn Lys Pro Arg Cys Val
20 25
<210> 20
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 20
Lys Thr Cys Arg Asp Val Phe Cys Pro Gly Ser Ser Thr Cys Val Val
1 5 10 15
Asp Gln Thr Asn Asn Ala Tyr Cys Val Thr
20 25
<210> 21
<211> 263
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Met Arg Pro Gly Ala Pro Gly Pro Leu Trp Pro Leu Pro Trp Gly Ala
1 5 10 15
Leu Ala Trp Ala Val Gly Phe Val Ser Ser Met Gly Ser Gly Asn Pro
20 25 30
Ala Pro Gly Gly Val Cys Trp Leu Gln Gln Gly Gln Glu Ala Thr Cys
35 40 45
Ser Leu Val Leu Gln Thr Asp Val Thr Arg Ala Glu Cys Cys Ala Ser
50 55 60
Gly Asn Ile Asp Thr Ala Trp Ser Asn Leu Thr His Pro Gly Asn Lys
65 70 75 80
Ile Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gly Leu Val His Cys Leu Pro Cys Lys
85 90 95
Asp Ser Cys Asp Gly Val Glu Cys Gly Pro Gly Lys Ala Cys Arg Met
100 105 110
Leu Gly Gly Arg Pro Arg Cys Glu Cys Ala Pro Asp Cys Ser Gly Leu
115 120 125
Pro Ala Arg Leu Gln Val Cys Gly Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Arg Asp
130 135 140
Glu Cys Glu Leu Arg Ala Ala Arg Cys Arg Gly His Pro Asp Leu Ser
145 150 155 160
Val Met Tyr Arg Gly Arg Cys Arg Lys Ser Cys Glu His Val Val Cys
165 170 175
Pro Arg Pro Gln Ser Cys Val Val Asp Gln Thr Gly Ser Ala His Cys
180 185 190
Val Val Cys Arg Ala Ala Pro Cys Pro Val Pro Ser Ser Pro Gly Gln
195 200 205
Glu Leu Cys Gly Asn Asn Asn Val Thr Tyr Ile Ser Ser Cys His Met
210 215 220
Arg Gln Ala Thr Cys Phe Leu Gly Arg Ser Ile Gly Val Arg His Ala
225 230 235 240
Gly Ser Cys Ala Gly Thr Pro Glu Glu Pro Pro Gly Gly Glu Ser Ala
245 250 255
Glu Glu Glu Glu Asn Phe Val
260
<210> 22
<211> 344
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 22
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly
20 25 30
Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser
35 40 45
Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr
85 90 95
Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro
100 105 110
Lys Pro Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
115 120 125
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
130 135 140
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
145 150 155 160
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
165 170 175
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
180 185 190
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
195 200 205
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
210 215 220
Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
225 230 235 240
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
245 250 255
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
260 265 270
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
275 280 285
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
290 295 300
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
305 310 315 320
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
325 330 335
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340
<210> 23
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 23
Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile
1 5 10 15
Ser Tyr Ile Tyr Ala
20
<210> 24
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 24
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro
20
<210> 25
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 25
Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala Val Phe Leu Ile Ser Cys
1 5 10 15
Ser Ser Gly Ala
20
<210> 26
<211> 369
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 26
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ala Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr
20 25 30
Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn
35 40 45
Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly Asp Lys Asp Lys Arg Arg His
50 55 60
Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys
65 70 75 80
Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys
85 90 95
Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly
100 105 110
Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr Phe Pro Glu Met Glu Val Thr
115 120 125
Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro Lys Pro Pro Thr Gly Gly Gly
130 135 140
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
145 150 155 160
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
165 170 175
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
180 185 190
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
195 200 205
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
210 215 220
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
225 230 235 240
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys
245 250 255
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
260 265 270
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
275 280 285
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
290 295 300
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
305 310 315 320
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
325 330 335
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
340 345 350
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
355 360 365
Lys
<210> 27
<211> 1114
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 27
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg ccgctatact tggtagatca gaaactcagg agtgtctttt tttaatgcta 120
attgggaaaa agacagaacc aatcaaactg gtgttgaacc gtgttatggt gacaaagata 180
aacggcggca ttgttttgct acctggaaga atatttctgg ttccattgaa tagtgaaaca 240
aggttgttgg ctggatgata tcaactgcta tgacaggact gattgtgtag aaaaaaaaga 300
cagccctgaa gtatatttct gttgctgtga gggcaatatg tgtaatgaaa agttttctta 360
ttttccggag atggaagtca cacagcccac ttcaaatcca gttacaccta agccacccac 420
cggtggtgga actcacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc 480
agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt 540
cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt 600
ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac 660
gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta 720
caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agtccccatc gagaaaacca tctccaaagc 780
caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg aggagatgac 840
caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt 900
ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga 960
ctccgacggc tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca 1020
ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa 1080
gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatgaga attc 1114
<210> 28
<211> 329
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 28
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly
20 25 30
Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser
35 40 45
Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr
85 90 95
Phe Pro Glu Met Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
100 105 110
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
115 120 125
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
130 135 140
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
145 150 155 160
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
165 170 175
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
180 185 190
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
195 200 205
Ala Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
210 215 220
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
225 230 235 240
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
245 250 255
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
260 265 270
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
275 280 285
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
290 295 300
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
305 310 315 320
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325
<210> 29
<211> 343
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 29
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser
35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105 110
Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
115 120 125
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
130 135 140
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
145 150 155 160
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
165 170 175
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
180 185 190
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
195 200 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
210 215 220
Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
225 230 235 240
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
245 250 255
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
260 265 270
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
275 280 285
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
290 295 300
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
325 330 335
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340
<210> 30
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 30
Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ser
<210> 31
<211> 368
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 31
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr
20 25 30
Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn
35 40 45
Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His
50 55 60
Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys
65 70 75 80
Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys
85 90 95
Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly
100 105 110
Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro
115 120 125
Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr
130 135 140
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
145 150 155 160
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
165 170 175
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
180 185 190
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
195 200 205
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
210 215 220
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
225 230 235 240
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr
245 250 255
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
260 265 270
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
275 280 285
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
290 295 300
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
305 310 315 320
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
325 330 335
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
340 345 350
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 32
<211> 1107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 32
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg cctctgggcg tggggaggct gagacacggg agtgcatcta ctacaacgcc 120
aactgggagc tggagcgcac caaccagagc ggcctggagc gctgcgaagg cgagcaggac 180
aagcggctgc actgctacgc ctcctggcgc aacagctctg gcaccatcga gctcgtgaag 240
aagggctgct ggctagatga cttcaactgc tacgataggc aggagtgtgt ggccactgag 300
gagaaccccc aggtgtactt ctgctgctgt gaaggcaact tctgcaacga gcgcttcact 360
catttgccag aggctggggg cccggaagtc acgtacgagc cacccccgac agcccccacc 420
ggtggtggaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 480
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 540
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 600
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 660
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 720
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gtccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 780
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 840
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 900
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 960
tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1020
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1080
agcctctccc tgtctccggg taaatga 1107
<210> 33
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 33
Gly Arg Gly Glu Ala Glu
1 5
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 34
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu
1 5
<210> 35
<400> 35
000
<210> 36
<211> 343
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 36
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser
35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105 110
Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
115 120 125
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
130 135 140
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
145 150 155 160
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
165 170 175
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
180 185 190
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
195 200 205
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
210 215 220
Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
225 230 235 240
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
245 250 255
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
260 265 270
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
275 280 285
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
290 295 300
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
305 310 315 320
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
325 330 335
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340
<210> 37
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 37
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser
35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105 110
Ala Pro Thr
115
<210> 38
<211> 368
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 38
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr
20 25 30
Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn
35 40 45
Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His
50 55 60
Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys
65 70 75 80
Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys
85 90 95
Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly
100 105 110
Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro
115 120 125
Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Ala Pro Thr Gly Gly Gly Thr
130 135 140
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
145 150 155 160
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
165 170 175
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
180 185 190
Glu Ala Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
195 200 205
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
210 215 220
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
225 230 235 240
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro Ile Glu Lys Thr
245 250 255
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
260 265 270
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
275 280 285
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
290 295 300
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
305 310 315 320
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
325 330 335
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
340 345 350
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360 365
<210> 39
<211> 1107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 39
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg cctctgggcg tggggaggct gagacacggg agtgcatcta ctacaacgcc 120
aactgggagc tggagcgcac caaccagagc ggcctggagc gctgcgaagg cgagcaggac 180
aagcggctgc actgctacgc ctcctggcgc aacagctctg gcaccatcga gctcgtgaag 240
aagggctgct gggatgatga cttcaactgc tacgataggc aggagtgtgt ggccactgag 300
gagaaccccc aggtgtactt ctgctgctgt gaaggcaact tctgcaacga gcgcttcact 360
catttgccag aggctggggg cccggaagtc acgtacgagc cacccccgac agcccccacc 420
ggtggtggaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 480
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 540
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 600
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 660
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 720
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 780
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 840
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 900
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 960
tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1020
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1080
agcctctccc tgtccccggg taaatga 1107
<210> 40
<211> 1107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 40
tcatttaccc ggggacaggg agaggctctt ctgcgtgtag tggttgtgca gagcctcatg 60
catcacggag catgagaaga cgttcccctg ctgccacctg ctcttgtcca cggtgagctt 120
gctatagagg aagaaggagc cgtcggagtc cagcacggga ggcgtggtct tgtagttgtt 180
ctccggctgc ccattgctct cccactccac ggcgatgtcg ctgggataga agcctttgac 240
caggcaggtc aggctgacct ggttcttggt catctcctcc cgggatgggg gcagggtgta 300
cacctgtggt tctcggggct gccctttggc tttggagatg gttttctcga tgggggctgg 360
gagggctttg ttggagacct tgcacttgta ctccttgcca ttcagccagt cctggtgcag 420
gacggtgagg acgctgacca cacggtacgt gctgttgtac tgctcctccc gcggctttgt 480
cttggcatta tgcacctcca cgccgtccac gtaccagttg aacttgacct cagggtcttc 540
gtggctcacg tccaccacca cgcatgtgac ctcaggggtc cgggagatca tgagggtgtc 600
cttgggtttt ggggggaaga ggaagactga cggtcccccc aggagttcag gtgctgggca 660
cggtgggcat gtgtgagttc caccaccggt gggggctgtc gggggtggct cgtacgtgac 720
ttccgggccc ccagcctctg gcaaatgagt gaagcgctcg ttgcagaagt tgccttcaca 780
gcagcagaag tacacctggg ggttctcctc agtggccaca cactcctgcc tatcgtagca 840
gttgaagtca tcatcccagc agcccttctt cacgagctcg atggtgccag agctgttgcg 900
ccaggaggcg tagcagtgca gccgcttgtc ctgctcgcct tcgcagcgct ccaggccgct 960
ctggttggtg cgctccagct cccagttggc gttgtagtag atgcactccc gtgtctcagc 1020
ctccccacgc ccagaggcgc cgggcgaaac gaagactgct ccacacagca gcagcacaca 1080
gcagagccct ctcttcattg catccat 1107
<210> 41
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 41
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr
20 25 30
Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu
35 40 45
Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp
65 70 75 80
Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu
85 90 95
Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu
100 105 110
Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu
115 120 125
Pro Pro Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
130 135 140
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
145 150 155 160
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
165 170 175
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
180 185 190
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
195 200 205
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
210 215 220
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
225 230 235 240
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
245 250 255
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr
260 265 270
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
275 280 285
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
290 295 300
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
305 310 315 320
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
325 330 335
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
340 345 350
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
355 360
<210> 42
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 42
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg ccgctgagac acgggagtgc atctactaca acgccaactg ggagctggag 120
cgcaccaacc agagcggcct ggagcgctgc gaaggcgagc aggacaagcg gctgcactgc 180
tacgcctcct ggcgcaacag ctctggcacc atcgagctcg tgaagaaggg ctgctgggac 240
gatgacttca actgctacga taggcaggag tgtgtggcca ctgaggagaa cccccaggtg 300
tacttctgct gctgtgaagg caacttctgc aacgagcgct tcactcattt gccagaggct 360
gggggcccgg aagtcacgta cgagccaccc ccgacaggtg gtggaactca cacatgccca 420
ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 480
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 540
cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 600
aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 660
gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 720
ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 780
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 840
ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 900
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctat 960
agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1020
atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa 1080
tga 1083
<210> 43
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 43
tcatttaccc ggggacaggg agaggctctt ctgcgtgtag tggttgtgca gagcctcatg 60
catcacggag catgagaaga cgttcccctg ctgccacctg ctcttgtcca cggtgagctt 120
gctatagagg aagaaggagc cgtcggagtc cagcacggga ggcgtggtct tgtagttgtt 180
ctccggctgc ccattgctct cccactccac ggcgatgtcg ctgggataga agcctttgac 240
caggcaggtc aggctgacct ggttcttggt catctcctcc cgggatgggg gcagggtgta 300
cacctgtggt tctcggggct gccctttggc tttggagatg gttttctcga tgggggctgg 360
gagggctttg ttggagacct tgcacttgta ctccttgcca ttcagccagt cctggtgcag 420
gacggtgagg acgctgacca cacggtacgt gctgttgtac tgctcctccc gcggctttgt 480
cttggcatta tgcacctcca cgccgtccac gtaccagttg aacttgacct cagggtcttc 540
gtggctcacg tccaccacca cgcatgtgac ctcaggggtc cgggagatca tgagggtgtc 600
cttgggtttt ggggggaaga ggaagactga cggtcccccc aggagttcag gtgctgggca 660
cggtgggcat gtgtgagttc caccacctgt cgggggtggc tcgtacgtga cttccgggcc 720
cccagcctct ggcaaatgag tgaagcgctc gttgcagaag ttgccttcac agcagcagaa 780
gtacacctgg gggttctcct cagtggccac acactcctgc ctatcgtagc agttgaagtc 840
atcgtcccag cagcccttct tcacgagctc gatggtgcca gagctgttgc gccaggaggc 900
gtagcagtgc agccgcttgt cctgctcgcc ttcgcagcgc tccaggccgc tctggttggt 960
gcgctccagc tcccagttgg cgttgtagta gatgcactcc cgtgtctcag cggcgccggg 1020
cgaaacgaag actgctccac acagcagcag cacacagcag agccctctct tcattgcatc 1080
cat 1083
<210> 44
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 44
Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg
1 5 10 15
Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg
20 25 30
Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu
35 40 45
Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln
50 55 60
Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys
65 70 75 80
Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly
85 90 95
Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr Gly Gly Gly Thr His
100 105 110
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
130 135 140
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
145 150 155 160
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
165 170 175
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
180 185 190
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
195 200 205
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
210 215 220
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
225 230 235 240
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
245 250 255
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
260 265 270
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
275 280 285
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
290 295 300
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
305 310 315 320
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330 335
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 45
Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg
1 5 10 15
Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg
20 25 30
Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu
35 40 45
Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln
50 55 60
Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys
65 70 75 80
Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly
85 90 95
Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro Pro Pro Thr
100 105
<210> 46
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 46
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg ccgccgaaac ccgcgaatgt atttattaca atgctaattg ggaactcgaa 120
cggacgaacc aatccgggct cgaacggtgt gagggggaac aggataaacg cctccattgc 180
tatgcgtcgt ggaggaactc ctccgggacg attgaactgg tcaagaaagg gtgctgggac 240
gacgatttca attgttatga ccgccaggaa tgtgtcgcga ccgaagagaa tccgcaggtc 300
tatttctgtt gttgcgaggg gaatttctgt aatgaacggt ttacccacct ccccgaagcc 360
ggcgggcccg aggtgaccta tgaacccccg cccaccggtg gtggaactca cacatgccca 420
ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 480
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 540
cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 600
aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 660
gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 720
ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 780
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 840
ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 900
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctat 960
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atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa 1080
tga 1083
<210> 47
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 47
tcatttaccc ggggacaggg agaggctctt ctgcgtgtag tggttgtgca gagcctcatg 60
catcacggag catgagaaga cgttcccctg ctgccacctg ctcttgtcca cggtgagctt 120
gctatagagg aagaaggagc cgtcggagtc cagcacggga ggcgtggtct tgtagttgtt 180
ctccggctgc ccattgctct cccactccac ggcgatgtcg ctgggataga agcctttgac 240
caggcaggtc aggctgacct ggttcttggt catctcctcc cgggatgggg gcagggtgta 300
cacctgtggt tctcggggct gccctttggc tttggagatg gttttctcga tgggggctgg 360
gagggctttg ttggagacct tgcacttgta ctccttgcca ttcagccagt cctggtgcag 420
gacggtgagg acgctgacca cacggtacgt gctgttgtac tgctcctccc gcggctttgt 480
cttggcatta tgcacctcca cgccgtccac gtaccagttg aacttgacct cagggtcttc 540
gtggctcacg tccaccacca cgcatgtgac ctcaggggtc cgggagatca tgagggtgtc 600
cttgggtttt ggggggaaga ggaagactga cggtcccccc aggagttcag gtgctgggca 660
cggtgggcat gtgtgagttc caccaccggt gggcgggggt tcataggtca cctcgggccc 720
gccggcttcg gggaggtggg taaaccgttc attacagaaa ttcccctcgc aacaacagaa 780
atagacctgc ggattctctt cggtcgcgac acattcctgg cggtcataac aattgaaatc 840
gtcgtcccag caccctttct tgaccagttc aatcgtcccg gaggagttcc tccacgacgc 900
atagcaatgg aggcgtttat cctgttcccc ctcacaccgt tcgagcccgg attggttcgt 960
ccgttcgagt tcccaattag cattgtaata aatacattcg cgggtttcgg cggcgccggg 1020
cgaaacgaag actgctccac acagcagcag cacacagcag agccctctct tcattgcatc 1080
cat 1083
<210> 48
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 48
gaaacccgcg aatgtattta ttacaatgct aattgggaac tcgaacggac gaaccaatcc 60
gggctcgaac ggtgtgaggg ggaacaggat aaacgcctcc attgctatgc gtcgtggagg 120
aactcctccg ggacgattga actggtcaag aaagggtgct gggacgacga tttcaattgt 180
tatgaccgcc aggaatgtgt cgcgaccgaa gagaatccgc aggtctattt ctgttgttgc 240
gaggggaatt tctgtaatga acggtttacc cacctccccg aagccggcgg gcccgaggtg 300
acctatgaac ccccgcccac c 321
<210> 49
<211> 141
<212> PRT
<213> 智人
<400> 49
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser
35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp Asp Phe Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Gly Pro Trp Ala Ser Thr Thr Ile
100 105 110
Pro Ser Gly Gly Pro Glu Ala Thr Ala Ala Ala Gly Asp Gln Gly Ser
115 120 125
Gly Ala Leu Trp Leu Cys Leu Glu Gly Pro Ala His Glu
130 135 140
<210> 50
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 50
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser
35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Gly Pro Trp Ala Ser Thr Thr Ile
100 105 110
Pro Ser Gly Gly Pro Glu Ala Thr Ala Ala Ala Gly Asp Gln Gly Ser
115 120 125
Gly Ala Leu Trp Leu Cys Leu Glu Gly Pro Ala His Glu
130 135 140
<210> 51
<211> 370
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 51
Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg Cys Glu Gly
20 25 30
Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg Asn Ser Ser
35 40 45
Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Asp Asp Asp Phe Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn Pro Gln Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg Phe Thr His
85 90 95
Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Gly Pro Trp Ala Ser Thr Thr Ile
100 105 110
Pro Ser Gly Gly Pro Glu Ala Thr Ala Ala Ala Gly Asp Gln Gly Ser
115 120 125
Gly Ala Leu Trp Leu Cys Leu Glu Gly Pro Ala His Glu Thr Gly Gly
130 135 140
Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
145 150 155 160
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
165 170 175
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
180 185 190
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
195 200 205
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
210 215 220
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
225 230 235 240
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
245 250 255
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
260 265 270
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
275 280 285
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
290 295 300
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
305 310 315 320
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
325 330 335
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
340 345 350
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
355 360 365
Gly Lys
370
<210> 52
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 52
Thr Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 53
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 53
Thr Gly Gly Gly
1
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<400> 54
Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 55
<400> 55
000
<210> 56
<211> 116
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn
1 5 10 15
Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly
20 25 30
Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser
35 40 45
Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn
50 55 60
Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val
65 70 75 80
Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr
85 90 95
Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro Val Thr Pro
100 105 110
Lys Pro Pro Thr
115
<210> 57
<211> 150
<212> PRT
<213> 家鼠属
<400> 57
Met Thr Ala Pro Trp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
20 25 30
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg
35 40 45
Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Pro
50 55 60
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp
65 70 75 80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
85 90 95
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Pro Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu
130 135 140
Pro Ile Gly Gly Leu Ser
145 150
<210> 58
<211> 150
<212> PRT
<213> 猪属
<400> 58
Met Thr Ala Pro Trp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Val Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
20 25 30
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg
35 40 45
Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg
50 55 60
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp
65 70 75 80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
85 90 95
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu
130 135 140
Pro Ile Gly Gly Leu Ser
145 150
<210> 59
<211> 150
<212> PRT
<213> 鼠属
<400> 59
Met Thr Ala Pro Trp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
20 25 30
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg
35 40 45
Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg
50 55 60
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp
65 70 75 80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
85 90 95
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Pro Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu
130 135 140
Pro Ile Gly Gly Leu Ser
145 150
<210> 60
<211> 150
<212> PRT
<213> 智人
<400> 60
Met Thr Ala Pro Trp Val Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
20 25 30
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg
35 40 45
Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg
50 55 60
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp
65 70 75 80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
85 90 95
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu
130 135 140
Pro Ile Gly Gly Leu Ser
145 150
<210> 61
<211> 150
<212> PRT
<213> 牛属
<400> 61
Met Thr Ala Pro Trp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr Tyr
20 25 30
Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu Arg
35 40 45
Cys Glu Gly Glu Arg Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser Trp Arg
50 55 60
Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp Leu Asp
65 70 75 80
Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu Glu Asn
85 90 95
Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn Glu Arg
100 105 110
Phe Thr His Leu Pro Glu Ala Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr Glu Pro
115 120 125
Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr Ser Leu Leu
130 135 140
Pro Val Gly Gly Leu Ser
145 150
<210> 62
<211> 150
<212> PRT
<213> 爪蟾属
<400> 62
Met Gly Ala Ser Val Ala Leu Thr Phe Leu Leu Leu Leu Ala Thr Phe
1 5 10 15
Arg Ala Gly Ser Gly His Asp Glu Val Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr
20 25 30
Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Lys Thr Asn Gln Ser Gly Val Glu
35 40 45
Arg Leu Val Glu Gly Lys Lys Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Arg Asn Asn Ser Gly Phe Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp
65 70 75 80
Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Ile Ala Lys Glu
85 90 95
Glu Asn Pro Gln Val Phe Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Tyr Cys Asn
100 105 110
Lys Lys Phe Thr His Leu Pro Glu Val Glu Thr Phe Asp Pro Lys Pro
115 120 125
Gln Pro Ser Ala Ser Val Leu Asn Ile Leu Ile Tyr Ser Leu Leu Pro
130 135 140
Ile Val Gly Leu Ser Met
145 150
<210> 63
<211> 150
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala Val Phe Leu Ile Ser Cys
1 5 10 15
Ser Ser Gly Ala Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe
20 25 30
Phe Asn Ala Asn Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu
35 40 45
Pro Cys Tyr Gly Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp
50 55 60
Lys Asn Ile Ser Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu
65 70 75 80
Asp Asp Ile Asn Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp
85 90 95
Ser Pro Glu Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu
100 105 110
Lys Phe Ser Tyr Phe Pro Glu Met Glu Val Thr Gln Pro Thr Ser Asn
115 120 125
Pro Val Thr Pro Lys Pro Pro Tyr Tyr Asn Ile Leu Leu Tyr Ser Leu
130 135 140
Val Pro Leu Met Leu Ile
145 150
<210> 64
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 64
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
20 25 30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
35 40 45
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
50 55 60
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
65 70 75 80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
85 90 95
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
100 105 110
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
115 120 125
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
145 150 155 160
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
165 170 175
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
180 185 190
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
Lys
225
<210> 65
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多肽
<400> 65
Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val
1 5 10 15
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
20 25 30
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
35 40 45
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
50 55 60
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser
65 70 75 80
Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
85 90 95
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
100 105 110
Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
115 120 125
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
145 150 155 160
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser
165 170 175
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
180 185 190
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
195 200 205
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210> 66
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成6xHis标签
<400> 66
His His His His His His
1 5
<210> 67
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成肽
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(10)
<223> 可以涵盖2至10个"Gly"残基；关于取代和优选实施方案的详述，参见如提交的说明书
<400> 67
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 68
<211> 1107
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成多核苷酸
<400> 68
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg cctctgggcg tggggaggct gagacacggg agtgcatcta ctacaacgcc 120
aactgggagc tggagcgcac caaccagagc ggcctggagc gctgcgaagg cgagcaggac 180
aagcggctgc actgctacgc ctcctggcgc aacagctctg gcaccatcga gctcgtgaag 240
aagggctgct gggacgatga cttcaactgc tacgataggc aggagtgtgt ggccactgag 300
gagaaccccc aggtgtactt ctgctgctgt gaaggcaact tctgcaacga gcgcttcact 360
catttgccag aggctggggg cccggaagtc acgtacgagc cacccccgac agcccccacc 420
ggtggtggaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 480
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 540
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 600
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 660
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 720
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gtccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 780
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc 840
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 900
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 960
tccgacggct ccttcttcct ctatagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1020
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1080
agcctctccc tgtctccggg taaatga 1107
<210> 69
<211> 154
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的描述：合成共有多肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (8)..(8)
<223> Thr、Ala或不存在
<220>
<221> MOD_RES
<222> (121)..(121)
<223> Pro、Ala、Val或Met
<400> 69
Met Thr Ala Pro Trp Ala Ala Xaa Leu Ala Leu Leu Trp Gly Ser Leu
1 5 10 15
Cys Ala Gly Ser Gly Arg Gly Glu Ala Glu Thr Arg Glu Cys Ile Tyr
20 25 30
Tyr Asn Ala Asn Trp Glu Leu Glu Arg Thr Asn Gln Ser Gly Leu Glu
35 40 45
Arg Leu Cys Glu Gly Glu Gln Asp Lys Arg Leu His Cys Tyr Ala Ser
50 55 60
Trp Arg Asn Ser Ser Gly Thr Ile Glu Leu Val Lys Lys Gly Cys Trp
65 70 75 80
Leu Asp Asp Phe Asn Cys Tyr Asp Arg Gln Glu Cys Val Ala Thr Glu
85 90 95
Glu Asn Pro Gln Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Phe Cys Asn
100 105 110
Glu Arg Phe Thr His Leu Pro Glu Xaa Gly Gly Pro Glu Val Thr Tyr
115 120 125
Glu Pro Lys Pro Pro Thr Ala Pro Thr Leu Leu Thr Val Leu Ala Tyr
130 135 140
Ser Leu Leu Pro Ile Gly Gly Leu Ser Met
145 150

Claims (34)

1.ActRII拮抗剂在制备用于治疗或预防患有贫血的受试者中的皮肤溃疡的药物中的用途，其中所述ActRII拮抗剂是在SEQ ID NO:1的位置20、21、22、23、24或25处开始；且在SEQ ID NO:1的位置128、129、130、131、132、133或134处结束的ActRII多肽，其中所述多肽包含在对应于SEQ ID NO:1的位置79的位置处的酸性氨基酸，且其中所述多肽结合GDF11、GDF8和/或激活素。
2.权利要求1的用途，其中所述受试者患有溶血性贫血。
3.权利要求1的用途，其中所述受试者患有血红蛋白病性贫血。
4.权利要求1的用途，其中所述受试者患有镰状细胞病。
5.权利要求1的用途，其中所述受试者患有地中海贫血综合征。
6.权利要求5的用途，其中所述受试者患有β地中海贫血综合征。
7.权利要求5的用途，其中所述受试者患有β中间型地中海贫血。
8.权利要求1-7中任一项的用途，其中所述ActRII多肽选自：
a）在SEQ ID NO:1的位置25处开始；且在位置131处结束的多肽；或
b）由SEQ ID NO:44的氨基酸序列组成的多肽。
9.权利要求8的用途，其中所述ActRII多肽包含就SEQ ID NO:1而言在位置79处的酸性氨基酸。
10.权利要求1-7和9中任一项的用途，其中所述多肽是融合蛋白，除ActRII多肽结构域之外，所述融合蛋白还包含增强下述的一种或多种的一个或多个异源多肽结构域：体内半衰期、体外半衰期、施用、组织定位或分布、蛋白质复合物的形成，和纯化。
11.权利要求10的用途，其中所述融合蛋白包含选自下述的异源多肽结构域：免疫球蛋白Fc结构域和血清白蛋白。
12.权利要求11的用途，其中所述免疫球蛋白Fc结构域是IgG1 Fc结构域。
13.权利要求11的用途，其中所述免疫球蛋白Fc结构域包含选自SEQ ID NO: 15和64的氨基酸序列。
14.权利要求11-13中任一项的用途，其中所述融合蛋白进一步包含位于所述ActRII多肽结构域和所述免疫球蛋白Fc结构域之间的接头结构域。
15.权利要求14的用途，其中所述接头结构域是TGGG接头。
16.权利要求10的用途，其中所述多肽是由SEQ ID NO:29的氨基酸序列组成的融合蛋白。
17.权利要求10的用途，其中所述多肽是多肽-Fc融合蛋白，其包含选自下述的多肽：
a）由SEQ ID NO:36的氨基酸序列组成的多肽；或
b）由SEQ ID NO:41的氨基酸序列组成的多肽。
18.权利要求17的用途，其中所述多肽-Fc融合蛋白包含就SEQ ID NO: 1而言在位置79处的酸性氨基酸。
19.权利要求8的用途，其中所述多肽包含选自下述的一种或多种氨基酸修饰：糖基化氨基酸、聚乙二醇化氨基酸、法尼基化氨基酸、乙酰化氨基酸、生物素化的氨基酸、与脂质部分缀合的氨基酸和与有机衍生剂缀合的氨基酸。
20.权利要求8的用途，其中所述多肽是糖基化的，并且具有哺乳动物糖基化模式。
21.权利要求8的用途，其中所述多肽是糖基化的，并且具有可从中国仓鼠卵巢细胞系获得的糖基化模式。
22.权利要求8的用途，其中所述多肽结合GDF11。
23.权利要求8的用途，其中所述多肽结合GDF8。
24.权利要求8的用途，其中所述多肽结合激活素。
25.权利要求24的用途，其中所述多肽结合激活素A。
26.权利要求1-7、9、11-13和15-25中任一项的用途，其中所述用途进一步包括施用用于溃疡、贫血、镰状细胞病和/或地中海贫血综合征的一种或多种支持疗法。
27.权利要求26的用途，其中所述支持疗法是用红血细胞输血。
28.权利要求26的用途，其中所述支持疗法包括施用铁螯合剂或多重铁螯合剂。
29.权利要求28的用途，其中所述铁螯合剂或多重铁螯合剂选自：
a）去铁胺；
b）去铁酮；和
c）地拉罗司。
30.权利要求26的用途，其中所述支持疗法包括施用EPO受体激活剂。
31.权利要求30的用途，其中所述EPO受体激活剂选自：EPO、依泊汀α、依泊汀β、依泊汀δ、依泊汀ω、达贝泊汀α、甲氧基-聚乙二醇依泊汀β和合成的红细胞生成蛋白。
32.权利要求26的用途，其中所述支持疗法包括施用羟基脲。
33.权利要求26的用途，其中所述支持疗法包括施用铁调素。
34.权利要求1-7、9、11-13、15-25和27-33中任一项的用途，其中所述ActRII拮抗剂局部施用。
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