NO345340B1 - Aminosyresekvens, fusjonsprotein eller konstrukt inneholdende denne aminosyresekvensen, samt fremgangsmåte for fremstilling av aminosyresekvensen. - Google Patents

Aminosyresekvens, fusjonsprotein eller konstrukt inneholdende denne aminosyresekvensen, samt fremgangsmåte for fremstilling av aminosyresekvensen. Download PDF

Info

Publication number
NO345340B1
NO345340B1 NO20161028A NO20161028A NO345340B1 NO 345340 B1 NO345340 B1 NO 345340B1 NO 20161028 A NO20161028 A NO 20161028A NO 20161028 A NO20161028 A NO 20161028A NO 345340 B1 NO345340 B1 NO 345340B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
nanobody
seq
nanobodies
Prior art date
Application number
NO20161028A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20161028A1 (no
Inventor
Els Beirnaert
Original Assignee
Ablynx Nv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=36954329&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO345340(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Publication of NO20161028A1 publication Critical patent/NO20161028A1/no
Application filed by Ablynx Nv filed Critical Ablynx Nv
Publication of NO345340B1 publication Critical patent/NO345340B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/32—Alcohol-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A61P25/36—Opioid-abuse
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A61P29/02—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID] without antiinflammatory effect
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/08—Antibacterial agents for leprosy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • A61P5/40—Mineralocorticosteroids, e.g. aldosterone; Drugs increasing or potentiating the activity of mineralocorticosteroids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/468—Immunoglobulins having two or more different antigen binding sites, e.g. multifunctional antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin

Description

AMINOSYRESEKVENS, FUSJONSPROTEIN ELLER KONSTRUKT INNEHOLDENDE DENNE AMINOSYRESEKVENSEN, SAMT FREMGANGSMÅTE FOR FREMSTILLING AV AMINOSYRESEKVENSEN.
Foreliggende oppfinnelsen angår forbedrede Nanobodies™ (nanolegemer) mot Tumor Nekrose Faktor-alfa (TNF-alfa), så vel som til polypeptider som omfatter eller essensielt består av en eller flere av slike Nanobodies. [NB: Nanobody™, Nanobodies™ og Nanoklon™ er varemerker til Ablynx N.V.]
Den foreliggende oppfinnelsen relateres også til nukleinsyrer som koder for slike Nanobodies og polypeptider; til fremgangsmåter for å fremstille slike Nanobodies og polypeptider; til vertsceller som uttrykker eller er i stand til å uttrykke slike Nanobodies eller polypeptider; til sammensetninger som omfatter slike Nanobodies, polypeptider, nukleinsyrer eller vertsceller; og til anvendelser av slike Nanobodies, slike polypeptider, slike nukleinsyrer, slike vertsceller eller slike sammensetninger, især for profylaktiske, terapeutiske eller diagnostiske formål, slik som de profylaktiske, terapeutiske eller diagnostiske formål nevnt under.
Andre aspekter, utførelsesformer, fordeler og applikasjoner av den foreliggende oppfinnelsen vil bli klart fra den videre beskrivelsen heriunder.
WO 04/041865 fra søkeren beskriver Nanobodies® rettet mot serum albumin (og spesielt mot humant serum albumin) som kan bindes til andre proteiner (så som et eller flere andre Nanobodies® rettet mot et ønsket mål) for å øke halveringstiden til nevnte protein.
For eksempel beskriver WO 91/01743, WO 01/45746 og WO 02/076489 peptidgrupper som binder seg til serum albumin som kan smeltes sammen til terapeutiske proteiner og andre terapeutiske forbindelser og grupper for å øke halveringstiden derav. Disse peptidgruppene er imidlertid av bakterielt eller syntetisk opphav , hvilket er mindre foretrukket for bruk i terapi.
WO 04/041862 av søker relateres til Nanobodies mot TNF-alfa og til fremstillingen og anvendelsen derav, spesielt for forebyggingen og/eller behandlingen av sykdommer og forstyrrelser assosiert med og/eller mediert av TNF-alfa, slik som inflammasjon, revmatoid artritt, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, inflammatorisk bowel syndrom, multippel sklerose, addisons sykdom, autoimmun hepatitt, autoimmun parotitt, diabetes type 1, epididymitt, glomerulonefritt, Graves sykdom, Guillain-Barre syndrom, Hashimotos sykdom, hemolytisk anemi, systemisk lupus erythematosus, mannlig infertilitet, multippel sklerose, myasthenia gravis, pemfigus, psoriasis, revmatisk feber, revmatoid artritt, sarkoidose, skleroderma, Sjøgrens syndrom, spondyloartropati, tyroiditt, og vaskulitt.
Anti-TNF Nanobodies i følge WO 04/041862 kan bli humanisert og kan være monovalente eller multivalente, der det sistnevnte fører til økt affinitet for TNF. Anti-TNF Nanobodies™ i følge WO 04/041862 kan også være multispesifikke, og kan spesielt være i form av et multispesifikt konstrukt som omfatter to eller flere Nanobodies mot TNF og et videre Nanobody rettet mot et serumprotein slik som humant serum albumin, som leder til et økt halv-liv in vivo.
WO 04/041862 relateres også til fremgangsmåter for fremstillingen av anti-TNF Nanobodies, til nukleinsyrer eller konstrukter som koder for anti-TNF Nanobodies, så vel som til farmasøytiske sammensetninger som omfatter anti-TNF Nanobodies, som kan være egnet for intravenøs, subkutan, oral, sublingval, topisk, nasal, vaginal eller rektal administrering, eller for administrering ved inhalasjon. Anti-TNF Nanobodies i følge WO 04/041862 kan også bli anvendt for diagnostiske formål, valgfritt i form av et kit-av-deler.
EP 0486 526 beskriver TNF-alfa bindende ligander mot en spesifikk epitop av TNF. Blant bindingsligandene, er enkeltdomene antistoffer (“dAbs”) nevnt. Reiter et al., J. Mol. Biol. (1999), 290, 685-698 beskriver enkeltdomene antistoffer mot TNF-alfa ervervet fra et randomisert fag display bibliotek som var generert ved å starte fra et VH domene skafott fra et musehybridom.
Rahbarizadeh, et al., Hybridoma and Hybridomics, Juni 2004, Vol.23, Nr.3 s. 151-159, beskriver fremstilling av nye rekombinante enkelt-domene antistoffer mot tandem repeat område MUC1 mucin.
WO 00/29004 beskriver murine enkeltdomene antistoffer (“mikrolegemer”) mot TNF-alfa.
WO 04/003019 beskriver blant annet ligander som omfatter et første bindingsdomene mot TNF-alfa og et andre bindingsdomene mot et serumprotein slik som serum albumin.
Det er en generell hensikt med den foreliggende oppfinnelsen å fremskaffe Nanobodies mot TNF-alfa, spesielt mot humant TNF-alfa.
Spesielt, er det en hensikt med den foreliggende oppfinnelsen å fremskaffe Nanobodies mot TNF-alfa, spesielt mot humant TNF-alfa, og å fremskaffe proteiner eller polypeptider som omfatter det samme, som er egnet for terapeutisk og/eller diagnostisk anvendelse, og spesielt for forebyggingen, behandlingen og/eller diagnosen av en eller flere sykdommer og forstyrrelser assosiert med og/eller mediert av TNF-alfa slik som de nevnt over, og/eller som kan bli anvendt i fremstillingen av en farmasøytisk sammensetning for forebyggingen og/eller behandlingen av en eller flere sykdommer assosiert med og/eller mediert av TNF-alfa, slik som de nevnt over.
Mer spesielt, er det en hensikt med den foreliggende oppfinnelsen å fremskaffe Nanobodies mot TNF-alfa, og å fremskaffe proteiner og polypeptider som omfatter det samme, som er enten et alternativ til Nanobodies og polypeptidene mot TNF-alfa beskrevet i WO 04/041862 og/eller som har en eller flere forbedrede egenskaper eller karakteristikker, sammenlignet med Nanobodies og polypeptidene mot TNF-alfa beskrevet i WO 04/041862.
Mer spesielt, er det et formål med den foreliggende oppfinnelsen å fremskaffe Nanobodies mot TNF-alfa, og å fremskaffe proteiner eller polypeptider som omfatter det samme, som er forbedret sammenlignet med Nanobodies og polypeptidene mot TNF-alfa beskrevet i WO 04/041862 med hensyn til en eller flere av de følgende egenskapene eller karakteristikkene:
- økt affinitet for TNF-alfa, enten i et monovalent format, i et multivalent format (for eksempel i et bivalent format) og/eller i et multispesifikt format (for eksempel et av de multispesifikke formatene beskrevet i WO 04/041862 eller heriunder);
- bedre skikkethet for formatering i et multivalent format (for eksempel i et bivalent format);
- bedre skikkethet for formatering i et multispesifikt format (for eksempel en av de multispesifikke formatene beskrevet i WO 04/041862 eller heriunder); - forbedret skikkethet eller mottakelighet for “humaniserende” substitusjoner (som definert heri); og/eller
- mindre immunogenitet, enten i et monovalent format, i et multivalent format (for eksempel i et bivalent format) og/eller i et multispesifikt format (for eksempel et av de multispesifikke formatene beskrevet i WO 04/041862 eller heriunder) i et monovalent format;
- økt stabilitet, enten i et monovalent format, i et multivalent format (for eksempel i et bivalent format) og/eller i et multispesifikt format (for eksempel et av de multispesifikke formatene beskrevet i WO 04/041862 eller heriunder) i et monovalent format;
- økt spesifisitet mot TNF-alfa, enten i et monovalent format, i et multivalent format (for eksempel i et bivalent format) og/eller i et multispesifikt format (for eksempel et av de multispesifikke formatene beskrevet i WO 04/041862 eller heriunder) i et monovalent format;
- minsket eller hvor ønsket økt kryss-reaktivitet med TNF-alfa fra forskjellige arter;
og/eller
- en eller flere andre forbedrede egenskaper ønskverdig for farmasøytisk anvendelse (inkludert profylaktisk anvendelse og/eller terapeutisk anvendelse) og/eller for diagnostisk anvendelse (inkludert men ikke begrenset til anvendelse for avbildende formål), enten i et monovalent format, i et multivalent format (for eksempel i et bivalent format) og/eller i et multispesifikt format (for eksempel et av de multispesifikke formatene beskrevet i WO 04/041862 eller heriunder).
-Disse formålene er oppnådd med Nanobodies, proteinene og polypeptidene beskrevet heri. Disse Nanobodies er også referert til heri som “Nanobodies i henhold til den foreliggende oppfinnelsen”; og disse proteinene og polypeptidene er også kollektivt referert til heri “polypeptider i henhold til den foreliggende oppfinnelsen”.
Oppfinnelsen vedrører et Nanobody («Nanobody i henhold til oppfinnelsen») mot TNF-alfa innbefattende fire rammeverkområder (FR1 til FR4) og tre komplementære bestemmende områder (CDR1 til CDR3), hvor
(i) CDR1 innbefatter eller er aminosyresekvensen SFGMS; CDR2 innbefatter eller er aminosyresekvensen SISGSGDTLYADSVKG: CDR3 innbefatter eller er aminosyresekvensen GGSLSR og hvor
(ii) aminosyresekvensen har minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med minst en av aminosyresekvensene SQ ID NO 52 og 57 til 64; og
(iii) aminosyresekvensen er sekvensen PMP6A6 i henhold til SEQ ID NO: 52, eller en humanisert variant av sekvensen PMP6A6 i henhold til SEQ ID NO: 52.
Aminosyresekvensen er fortrinnsvis en humanisert variant av sekvensen PMP6A6 i henhold til SEQ ID NO: 52.
Aminosyresekvens er fortrinnsvis valgt fra gruppen bestående av klonene ALB 3 i henhold til SEQ ID NO: 57; ALB4 i henhold til SEQ ID NO: 58; ALB5 i henhold til SEQ ID NO: 59; ALB6 i henhold til SEQ ID NO: 60; ALB7 i henhold til SEQ ID NO: 61; ALB8 i henhold til SEQ ID NO: 62; ALB9 i henhold til SEQ ID NO: 63; og ALB10 i henhold til SEQ ID NO: 64.
Aminosyresekvensen er fortrinnsvis ALB8 i henhold til SEQ ID NO: 62.
Aminosyresekvensen kan være et enkeltdomene antistoff eller et nanolegeme.
Oppfinnelsen omfatter også et fusjonsprotein eller konstrukt, som innbefatter nevnte aminosyresekvens og minst en terapeutisk gruppe, hvor aminosyresekvensen fortrinnsvis er enten direkte koblet til minst en terapeutisk gruppe eller er koblet med minst en terapeutisk gruppe via en linker eller spacer.
Den terapeutiske gruppen innbefatter fortrinnsvis en immunoglobulin sekvens eller et fragment derav, hvor den terapeutiske gruppen innbefatter et domene antistoff, fortrinnsvis et enkeltdomene antistoff.
Oppfinnelsen omfatter også et multivalent og multispesifikt nanolegeme konstrukt, innbefattende minst en av de ovennevnte aminosyresekvensen, som er et nanolegeme og minst et ytterligere nanolegeme.
Det multivalente og multispesifikke nanolegeme konstruktet i henhold til krav 10, hvor aminosyresekvensen, som er et nanolegeme som fortrinnsvis er enten direkte koblet til minst et ytterligere nanolegeme eller er koblet til det minst ene nanolegeme via en linker eller spacer.
Det multivalente og multispesifikke nanolegeme konstruktet, hvor aminosyresekvensen, som er et nanolegeme, er koblet til minst et ytterligere nanolegeme via en linker eller spacer, og hvor linkeren er en aminosyresekvens.
Videre omfatter oppfinnelsen en nukleotid sekvens eller nukleinsyre som koder nevnte aminosyresekvens, fusjonsprotein eller konstrukt
Oppfinnelsen omfatter også en vert eller vertsceller som inneholder en nukleotid sekvens eller nukleinsyre over, og/eller som uttrykker eller i stand til å utrykke, en aminosyresekvens, fusjonsprotein eller konstrukt i ovenstående.
Videre omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av en aminosyresekvens, fusjonsprotein eller konstrukt, hvilken fremgangsmåte innbefatter kultivering eller opprettholdelse av en vertscelle som beskrevet her under betingelser slik at nevnte vertsceller produserer eller uttrykker en aminosyresekvens, fusjonsprotein eller konstrukt i henhold til ovenstående, og eventuelt ytterligere innbefatter isolering av aminosyresekvensen, fusjonsproteinet eller konstruktet fremstilt slik.
Oppfinnelsen omfatter også farmasøytisk sammensetning som innbefatter minst en aminosyresekvens, fusjonsprotein eller konstrukt i henhold til hovenstående, og eventuelt minst en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel eller eksipient.
Oppfinnelsen omfatter også en aminosyresekvens i henhold til ovenstående anvendelse som en fusjonspartner for å øke halveringstiden til terapeutiske grupper.
Siden Nanobodies og polypeptidene beskrevet heri hovedsakelig er ment for terapeutisk og/eller diagnostisk anvendelse, er de rettet mot (som definert heri) humant TNF-alfa. Det er imidlertid ikke utelukket (men også ikke krevet) at Nanobodies og polypeptider beskrevet heri viser kryss-reaktivitet med TNF-alfa fra en eller flere andre arter av varmblodige dyr, for eksempel med TNF-alfa fra en eller flere andre arter av primater og/eller med TNF-alfa fra en eller flere arter av dyr som ofte er anvendt i dyremodeller for sykdommer (for eksempel mus, rotte, kanin, gris eller hund), og spesielt i dyremodeller for sykdommer og forstyrrelser assosiert med TNF-alfa (slik som artene og dyremodellene nevnt heri). I dette henseende, vil det være klart for den faglærte personen at slik kryss-reaktivitet, når foreliggende, kan ha fordeler fra et legemiddel utviklingssynspunkt, siden det tillater Nanobodies og polypeptidene mot humant TNF-alfa å bli testet i slike sykdomsmodeller.
Den foreliggende oppfinnelsen er i sin videste forstand også ikke spesielt begrenset til eller definert av en spesifikk antigen determinant, epitop, del, domene, subenhet eller konfirmasjon (hvor anvendelig) av TNF-alfa som Nanobodies og polypeptidene til den foreliggende oppfinnelsen er rettet mot.
Likevel, i en foretrukket utførelsesform, er Nanobodies, proteinene eller polypeptidene beskrevet heri rettet mot og/eller kan binde til en epitop av TNF-alfa som ligger i og/eller danner en del av TNF reseptor bindingssetet(setene) (f.eks. bindingssetene for TNF-RI, THF-RII, også kjent som p55 eller p75). Som er godt kjent i faget, omfatter en TNF trimer tre reseptor bindingsseter, som essensielt er ekvivalente og som er dannet av/ved kontaktflaten av to TNF monomerer inne i TNF trimeren. For eksempel, er Nanobodies, proteinene eller polypeptidene beskrevet heri fortrinnsvis rettet mot og/eller kan binde til en epitop av TNF-alfa som omfatter de følgende aminosyreresidiene til TNF-alfa: Gln i posisjon 88, Lys i posisjon 90, og/eller Glu i posisjon 146).
Spesielt, er Nanobodies, proteinene eller polypeptidene beskrevet heri rettet mot og/eller kan binde til en epitop av TNF-alfa trimeren, som ligger i og/eller danner en del av TNF reseptor bindingssetet(setene). For eksempel, kan Nanobodies, proteinene eller polypeptidene beskrevet heri være rettet mot og/eller kan binde til en epitop av TNF-alfa trimeren som omfatter de følgende aminosyreresidiene: Gln i posisjon 88 og Lys i posisjon 90 på en første TNF monomer (referert til heri som “monomer A”), og Glu i posisjon 146 på en annen TNF monomer (referert til heri som “monomer B”) (der Monomer A og Monomer B sammen, i TNF trimeren, danner TNF reseptor bindingssetet(setene)).
Mer spesielt, kan Nanobodies, proteinene eller polypeptidene beskrevet heri være rettet mot og/eller kan binde til en epitop av TNF-alfa trimeren som omfatter de ovennevnte aminosyrene (Gln i posisjon 88 i monomer A; Lys i posisjon 90 i monomer A og Glu i posisjon 146 i monomer B), og i tillegg minst en, fortrinnsvis to eller flere, mer foretrukket 5 eller flere, og fortrinnsvis alle eller essensielt alle, av de følgende aminosyreresidiene til TNF-alfa monomer A: Gly i posisjon 24, Gln i posisjon 25, Thr i posisjon 72, His i posisjon 73, Val i posisjon 74, Leu i posisjon 75, Thr i posisjon 77, Thr i posisjon 79, Ile i posisjon 83, Thr i posisjon 89, Val i posisjon 91. Asn i posisjon 92, Ile i posisjon 97, Arg i posisjon 131, Glu i posisjon 135, Ile i posisjon 136, Asn i posisjon 137, Arg i posisjon 138, Pro i posisjon 139, Asp i posisjon 140 og de følgende residiene i monomer B: Pro i posisjon 20, Arg i posisjon 32, Lys i posisjon 65, Lys i posisjon 112, Tyr i posisjon 115, Ala i posisjon 145, Ser i posisjon 147.
Alternativt, kan Nanobodies, proteinene eller polypeptidene beskrevet heri være rettet mot og/eller kan binde til en epitop av TNF-alfa som omfatter de ovennevnte aminosyrene (Gln i posisjon 88 i monomer A; Lys i posisjon 90 i monomer A og Glu i posisjon 146 i monomer B), og i tillegg minst en, fortrinnsvis to eller flere, mer foretrukket 5 eller flere og fortrinnsvis alle eller essensielt alle, av de følgende aminosyreresidiene til TNF-alfa monomer A: Leu i posisjon 75, Thr i posisjon 77, Thr i posisjon 79, lle i posisjon 80, Ser i posisjon 81, Tyr i posisjon 87, Thr i posisjon 89, Val i posisjon 91, Asn i posisjon 92, Ser i posisjon 95, Ile i posisjon 97, Glu i posisjon 135, Ile i posisjon 136, Asn i posisjon 137 og de følgende residiene i monomer B: Ala i posisjon 33, Ala i posisjon 145, Ser i posisjon 147.
Slik epitop kan be tegnet fra strukturell analyse av Nanobodiet krystallisert i kompleks med TNF molekylet, eller fra andre tilnærminger slik som epitopkartlegging via pepscan analyse.
Til sammenligning, kan det fra krystallografiske data (ikke vist), bli sett at Nanobodiet 3E fra WO 04/041862 binder til en forskjellig epitop (dvs. en epitop som omfatter Tyr i posisjon 141, Asp i posisjon 140, Gln i posisjon 67, Gly i posisjon 24 og Glu i posisjon 23) enn den foretrukne epitopen til den foreliggende oppfinnelsen.
Således, i et annet aspekt, relateres den foreliggende oppfinnelsen til et immunoglobulin variabelt domene (eller et egnet fragment derav) som kan binde til en epitop av TNF-alfa som ligger i og/eller danner en del av TNF reseptor bindingssetet, og fortrinnsvis til en epitop som omfatter minst en, fortrinnsvis to eller flere, og fortrinnsvis alle, av de følgende aminosyreresidiene til TNF-alfa: Gln i posisjon 88; Lys i posisjon 90 og Glu i posisjon 146. Et slikt immunoglobulin variabelt domene er fortrinnsvis et tungkjede variabelt domene eller et lettkjede variabelt domene, og spesielt et tungkjede variabelt domene, som kan være et hvilket som helst pattedyr tungkjede variabelt domene, inkludert men ikke begrenset til humane tungkjede variable domener, mus tungkjede variable domener og Camelid tungkjede variable domener (slik som de tungkjede variable domenene fra Camelid 4-kjede immunoglobuliner eller de tungkjede variable domenene (VHH domenene) fra såkalte tungkjede antistoffer). Det immunoglobulin variable domenet er fortrinnsvis et domene antistoff eller enkelt domene antistoff eller egnet for anvendelse som et (enkelt) domene antistoff. Mest foretrukket, er det immunoglobulin variable domenet et Nanobody (som definert heri), og noen foretrukne, men ikke-begrensende eksempler på Nanobodies som er egnet for anvendelse i dette aspektet til den foreliggende oppfinnelsen er PMP1C2 (TNF1, SEQ ID NO:52) og PMP5F10 (TNF3, SEQ ID NO: 60), så vel som humaniserte og andre varianter derav (som videre beskrevet heri).
Det ovennevnte immunoglobulin variable domenet kan også være humanisert (som for eksempel, og uten begrensning) beskrevet heri med hensyn til Nanobodies. Den foreliggende oppfinnelsen relateres også til proteiner og polypeptider som omfatter eller essensielt består av slike immunoglobulin variable domener, som for eksempel kan være som definert heri. Alternativt, kan slike variable domener danne en del av ScFv konstrukter, todelt-spesifikke konstrukter, kimært antistoff eller antistoffstrukturer og andre immunoglobulinkonstrukter, som for eksempel gjennomgått av Hoogenboom (Nature Biotechnology (1997), 15:125-126). Fortrinnsvis, imidlertid, er de immunoglobulin variable domenene rettet mot epitopen over Nanobodies, i hvilket tilfelle proteinene og polypeptidene som omfatter slike Nanobodies kan være som videre beskrevet heri.
Derfor, relateres noen foretrukne aspekter av den foreliggende oppfinnelsen til:
I) Et Nanobody som er rettet mot den samme epitopen på trimeren til TNF-alfa som Nanobody TNF1 (SEQ ID NO: 52).
II) Et Nanobody som er rettet mot den samme epitopen på trimeren til TNF-alfa som Nanobody TNF3 (SEQ ID NO: 60).
III) Et Nanobody som er rettet mot en epitop av trimeren til TNF-alfa som minst omfatter de følgende aminosyreresidiene: Gln i posisjon 88 i monomer A; Lys i posisjon 90 i monomer A og Glu i posisjon 146 i monomer B.
IV) Et Nanobody som er rettet mot en epitop av trimeren til TNF-alfa som omfatter de følgende aminosyreresidiene: Gln i posisjon 88 i monomer A; Lys i posisjon 90 i monomer A og Glu i posisjon 146 i monomer B; og som videre omfatter minst en, fortrinnsvis to eller flere, mer foretrukket 5 eller fler, og fortrinnsvis alle eller essensielt alle, av de følgende aminosyreresidiene til TNF-alfa monomer A: Gly i posisjon 24, Gln i posisjon 25, Thr i posisjon 72, His i posisjon 73, Val i posisjon 74, Leu i posisjon 75, Thr i posisjon 77, Thr i posisjon 79, Ile i posisjon 83, Thr i posisjon 89, Val i posisjon 91. Asn i posisjon 92, Ile i posisjon 97, Arg i posisjon 131, Glu i posisjon 135, Ile i posisjon 136, Asn i posisjon 137, Arg i posisjon 138, Pro i posisjon 139, Asp i posisjon 140 og de følgende residiene i monomer B: Pro i posisjon 20, Arg i posisjon 32, Lys i posisjon 65, Lys i posisjon 112, Tyr i posisjon 115, Ala i posisjon 145, Ser i posisjon 147.
V) Et Nanobody som er rettet mot en epitop av trimeren til TNF-alfa som omfatter de følgende aminosyreresidiene: Gln i posisjon 88 i monomer A; Lys i posisjon 90 i monomer A og Glu i posisjon 146 i monomer B; og som videre omfatter minst en, fortrinnsvis to eller flere, mer foretrukket 5 eller flere, og fortrinnsvis alle eller essensielt alle, av de følgende aminosyreresidiene til TNF-alfa monomer A Leu i posisjon 75, Thr i posisjon 77, Thr i posisjon 79, Ile i posisjon 80, Ser i posisjon 81, Tyr i posisjon 87, Thr i posisjon 89, Val i posisjon 91, Asn i posisjon 92, Ser i posisjon 95, Ile i posisjon 97, Glu i posisjon 135, Ile i posisjon 136, Asn i posisjon 137 og de følgende residiene i monomer B: Ala i posisjon 33, Ala i posisjon 145, Ser i posisjon 147.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, som har en Koff rate for TNF på bedre enn 2.10<-3 >(1/s), fortrinnsvis bedre enn 1.10<-3>.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet som anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn EC50 verdien til Nanobody VHH 3E (SEQ ID NO:4) av WO 04/041862 i det samme assayet; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet som anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn 12nM; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet som anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn 5nM; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet som anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn 3nM; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, som er et humanisert Nanobody.
og noen foretrukne aspekter av denne utførelsesformen relateres til:
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, som er et GLEW-klasse Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, som er et humanisert GLEW-klasse Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, som inneholder et argininresidie (R) i posisjon 103.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, som inneholder et argininresidie (R) i posisjon 103, og som er humanisert.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, som er et GLEW-klasse Nanobody, og som inneholder et argininresidie (R) i posisjon 103, og som er humanisert.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, som inneholder et leucinresidie (L) i posisjon 108.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av aminosyresekvensene til SEQ ID NO 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) eller 96 (TNF30)
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der
a) CDR1 omfatter:
- aminosyresekvensen DYWMY; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen DYWMY; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen DYWMY;
og
b) CDR2 omfatter:
- aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG;
og
c) CDR3 omfatter:
- aminosyresekvensen SPSGFN; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen SPSGFN; eller - en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der CDR1 omfatter aminosyresekvensen DYWMY.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der CDR2 omfatter aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der CDR3 omfatter aminosyresekvensen SPSGFN
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der:
- CDR1 omfatter aminosyresekvensen DYWMY; og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SPSGFN; eller
- CDR1 omfatter aminosyresekvensen DYWMY; og CDR2 omfatter aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- CDR2 omfatter aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SPSGFN
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der CDR1 omfatter aminosyresekvensen DYWMY; og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der CDR1 omfatter aminosyresekvensen DYWMY; CDR2 omfatter aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SPSGFN. - Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der
a) CDR1 er:
- aminosyresekvensen DYWMY; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen DYWMY; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen DYWMY;
og der:
b) CDR2 er:
- aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG;
og der
c) CDR3 er:
- aminosyresekvensen SPSGFN; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen SPSGFN; eller - en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der CDR1 er aminosyresekvensen DYWMY.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der CDR2 er aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der CDR3 er aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der:
- CDR1 er aminosyresekvensen DYWMY; og CDR3 er aminosyresekvensen SPSGFN; eller
- CDR1 er aminosyresekvensen DYWMY; og CDR2 er aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- CDR2 er aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; og CDR3 er aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der CDR1 er aminosyresekvensen DYWMY; og CDR3 er aminosyresekvensen SPSGFN. - Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der CDR1 er aminosyresekvensen DYWMY; CDR2 er aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG og CDR3 er aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der
- En hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon; og/eller
- ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(e) over. og noen andre foretrukne aspekter av denne utførelsesformen relateres til:
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, som er et KERE-klasse Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, som er et humanisert KERE-klasse Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av aminosyresekvensene til SEQ ID NO 50 (TNF3), 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) eller 98 (TNF33).
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der
a) CDR1 er:
- aminosyresekvensen NYYMG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen NYYMG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen NYYMG;
og
b) CDR2 er:
- aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG;
og
c) CDR3 er:
- aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der CDR1 er aminosyresekvensen NYYMG.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der CDR2 er aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der CDR3 er aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der:
- CDR1 er aminosyresekvensen NYYMG; og CDR3 er aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY; eller
- CDR1 er aminosyresekvensen NYYMG; og CDR2 er aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; eller
- CDR2 er aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; og CDR3 er aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der CDR1 er aminosyresekvensen NYYMG; CDR2 er aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY og CDR3 er aminosyresekvensen ILPLSDDPGWNTY. - Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, der
- En hvilken som helst aminosyresubstitusjon er fortrinnsvis en konservativ aminosyresubstitusjon; og/eller
- ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(e) over. og med ytterligere noen andre spesielt foretrukne aspekter som er:
VI) Et protein eller polypeptid, som omfatter et eller essensielt består av et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over .
VII) Et protein eller polypeptid, som omfatter eller essensielt består av minst ett Nanobody i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over.
VIII) Et protein eller polypeptid, som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over.
IX) Et protein eller polypeptid, som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, og som er slik at ovennevnte protein eller polypeptid, ved binding til en TNF trimer, er i stand til å inhibere eller redusere TNF reseptor kryssbindingen som er mediert av ovennevnte TNF trimer og/eller signaltransduksjonen som er mediert av slik reseptor kryssbinding.
X) Et protein eller polypeptid, som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, og som er i stand til intramolekylær binding til minst to TNF reseptor bindingsseter på en TNF trimer.
XI) Et protein eller polypeptid, som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, forbundet via en egnet linker.
XII) Et protein eller polypeptid, som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, forbundet via en egnet linker, og som er pegylert. XIII) Et protein eller polypeptid som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, og som videre omfatter minst ett Nanobody rettet mot humant serum albumin.
XIV) Et protein eller polypeptid som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, og som videre omfatter minst ett Nanobody rettet mot humant serum albumin, og som er slik at ovennevnte protein eller polypeptid, ved binding til en TNF trimer, er i stand til å inhibere eller redusere TNF reseptor kryssbindingen som er mediert av ovennevnte TNF trimer og/eller signaltransduksjonen som er mediert av slik reseptor kryssbinding. XV) Et protein eller polypeptid som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, og som videre omfatter minst ett Nanobody rettet mot humant serum albumin og som er i stand til intramolekylær binding til minst to TNF reseptor bindingsseter på en TNF trimer.
XVI) Et protein eller polypeptid som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, og som videre omfatter ett Nanobody rettet mot humant serum albumin, der hver av de to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over er forbundet, valgfritt via en egnet linker, til det ene Nanobodiet som er rettet mot humant serum albumin.
XVII) Et protein eller polypeptid som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, og som videre omfatter ett Nanobody rettet mot humant serum albumin, der hver av de to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over er forbundet, valgfritt via en egnet linker, til det ene Nanobodiet som er rettet mot humant serum albumin, og som er slik at ovennevnte protein eller polypeptid, ved binding til en TNF trimer, er i stand til å inhibere eller redusere TNF reseptor kryssbindingen som er mediert av ovennevnte TNF trimer og/eller signaltransduksjonen som er mediert av slik reseptor kryssbinding.
XVIII) Et protein eller polypeptid som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, og som videre omfatter ett Nanobody rettet mot humant serum albumin, der hver av de to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over er forbundet, valgfritt via en egnet linker, til det ene Nanobodiet som er rettet mot humant serum albumin, og som er i stand til intramolekylær binding til minst to TNF reseptor bindingsseter på en TNF trimer.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av VI) til XVIII) over, der minst ett Nanobody rettet mot humant serum albumin er et humanisert Nanobody.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av VI) til XVIII) over, der minst ett Nanobody rettet mot humant serum albumin er en humanisert variant av Nanobodiet ALB 1 (SEQ ID NO: 63).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av VI) til XVIII) over, der minst ett Nanobody rettet mot humant serum albumin er et valgt fra gruppen som består av ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB
5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB
8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) og ALB 10 (SEQ ID NO: 104). - Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av VI) til XVIII) over, der minst ett Nanobody rettet mot humant serum albumin er ALB 8. - Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av VI) til XVIII) over, som omfatter eller essensielt består av to humaniserte Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over, og en humanisert variant av Nanobodiet ALB 1 (SEQ ID NO: 63).
Det bør noteres at når et Nanobody er nevnt over som å være “i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over”, er det minst i følge en av I) til V), kan være i følge to eller flere av I) til V), og kan også inkludere en hvilken som helst eller flere av de andre aspektene som er indikert som å være “i henhold til en hvilken som helst av I) til V) over. På lignende måte, når et protein eller polypeptid er nevnt over som å være “i henhold til en hvilken som helst av VI) til XVIII) over”, er det minst i følge en av VI) til XVIII), kan være i følge to eller flere av VI) til XVIII), og kan også inkludere en hvilken som helst eller flere av de andre aspektene som er indikert som å være “i henhold til en hvilken som helst av VI) til XVIII) over.
Det er også innen omfanget av den foreliggende oppfinnelsen, hvor anvendelig, at et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen kan binde til to eller flere antigendeterminanter, epitoper, deler, domener, subenheter eller konfirmasjoner av TNF-alfa. I et slikt tilfelle, kan antigendeterminantene, epitopene, delene, domenene eller subenhetene til TNF-alfa der Nanobodies og/eller polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen binder være de essensielt samme (for eksempel, hvis TNF-alfa inneholder repeterte strukturelle motiver eller er foreliggende som en multimer) eller kan være forskjellige (og i det siste tilfellet, Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen kan binde til slike forskjellige antigendeterminanter, epitoper, deler, domener, subenheter av TNF-alfa med en affinitet og/eller spesifisitet som kan være det samme eller forskjellig). Også, for eksempel, når TNF-alfa eksisterer i en aktivert konformasjon og i en inaktiv konformasjon, kan Nanobodies og polypeptidene til den foreliggende oppfinnelsen binde til enten en av disse konformasjonene, eller kan binde til begge disse konformasjonene (dvs. med en affinitet og/eller spesifisitet som kan være den samme eller forskjellig). Nanobodies og polypeptidene til den foreliggende oppfinnelsen kan også, for eksempel, binde til en konformasjon av TNF-alfa der den er bundet til en relevant ligand, kan binde til en konformasjon av TNF-alfa der den ikke er bundet til en relevant ligand, eller kan binde til begge slike konformasjoner (igjen med en affinitet og/eller spesifisitet som kan være den samme eller forskjellig).
Det er også forventet at Nanobodies og polypeptidene til den foreliggende oppfinnelsen generelt vil binde til alle naturlig forekommende eller syntetiske analoger, varianter, mutanter, alleler, deler og fragmenter av TNF-alfa, eller minst til de analoger, varianter, mutanter, alleler, deler og fragmenter av TNF-alfa som omfatter en eller flere antigendeterminanter eller epitoper som er essensielt det samme som antigendeterminanten(e) eller epitopen(e) til at Nanobodies og polypeptidene til den foreliggende oppfinnelsen binder i TNF-alfa (f.eks. i vill-type TNF-alfa). Igjen, i et slikt tilfelle, kan Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen binde til slike analoger, varianter, mutanter, alleler, deler og fragmenter med en affinitet og/eller spesifisitet som er den samme som, eller som forskjellige fra (dvs. høyere enn eller lavere enn), affiniteten og spesifisiteten som Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen binder til (vill-type) TNF-alfa. Det er også inkludert innen omfanget av den foreliggende oppfinnelsen at Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen binder til noen analoger, varianter, mutanter, alleler, deler og fragmenter av TNF-alfa, men ikke til andre.
Generelt, vil Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen minst binde til de former (inkludert monomere, multimere og assosierte former) som er de mest relevante fra et biologisk og/eller terapeutisk synspunkt, som vil være klart for den faglærte personen.
Også, etter som TNF-alfa eksisterer i en monomer form og i multimere former, og spesielt i trimer form, er det innen omfanget av den foreliggende oppfinnelsen at Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen bare binder til TNF-alfa i monomer form, eller som Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen i tillegg også binder til en eller flere av slike multimere former, slik som de trimere formene av TNF; eller kan bare binde til en slik multimer (f.eks. trimer) form. Således, generelt, når det i denne beskrivelsen er referert til et Nanobody, protein eller polypeptid som er rettet mot TNF-alfa, skal det bli forstått at dette også omfatter Nanobodies rettet mot TNF-alfa i sine trimere former (inkludert men ikke begrenset til Nanobodies mot reseptor bindingssetene (f.eks. bindingssetene for TNF-RI, THF-RII, også kjent som p55 eller p75) av en slik trimer). I alle disse tilfellene, kan Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen binde til slike multimerer eller assosierte proteinkomplekser med en affinitet og/eller spesifisitet som kan være den samme som eller forskjellige fra (dvs. høyere enn eller lavere enn) affiniteten og/eller spesifisiteten som Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen binder til TNF-alfa i sin monomere og ikke-assosierte tilstand.
Polypeptider av den foreliggende oppfinnelsen som inneholder to eller flere Nanobodies rettet mot TNF-alfa kan også, generelt, binde med høyere iver enn det korresponderende monomere Nanobodiet eller Nanobodies.
For eksempel, og uten begrensning, kan et multivalent (som definert heri) protein eller polypeptid som inneholder to eller flere Nanobodies som er rettet mot forskjellige epitoper av TNF-alfa multivalent (som definert heri) protein eller polypeptid som inneholder to eller flere Nanobodies som er rettet mot forskjellige epitoper av TNF-alfa binde til TNF-alfa med høyere iver enn de korresponderende monomerene.
Viktigere er det, at et multivalent (som definert heri) protein eller polypeptid som inneholder to eller flere Nanobodies som er rettet mot TNF-alfa kan (og vanligvis vil) binde med høyere iver til en multimer av TNF-alfa enn til en monomer av TNF-alfa, og vil vanligvis også binde med høyere iver enn de korresponderende monomere Nanobodies. I et slikt multivalent protein eller polypeptid, kan de to eller flere Nanobodies for eksempel bli rettet mot de samme epitopene, vesentlig ekvivalente epitoper, eller forskjellige epitoper. I en utførelsesform av et slikt multivalent protein eller polypeptid, kan de to eller flere Nanobodies være de samme (og derfor være rettet mot den samme epitopen).
Det sistnevnte er av spesiell viktighet, ettersom det er kjent at den primære formen av signaltransduksjon med TNF involverer kryssbinding med TNF reseptorer med en trimer av TNF molekyler, som inneholder tre reseptor bindingsseter (se for eksempel Peppel et al., J. Exp. Med., 174 (1991), 1483-1489; Engelmann et al., J. Biol. Chem., 265 (1990), 14497; Smith og Baglioni, J. Biol. Chem., 264 (1989), 14646). For eksempel, som beskrevet av Peppel et al., var et engineered monovalent ekstracellulært domene av TNF reseptoren - som bare var i stand til å blokkere et enkelt reseptor bindingssete på en TNF trimer –ute av stand til å forhindre kryssbinding av TNF reseptorene med de gjenværende to reseptor bindingssetene; mens et engineered protein som omfatter to slike ekstracellulære domener – og således er i stand til å blokkere to reseptor bindingsseter – fremskaffet en slående effekt sammenlignet med det monovalente ekstracellulære domenet.
I den foreliggende oppfinnelsen, har det blitt funnet at monovalente Nanobodies er i stand til å binde til TNF alfa på en slik måte at aktiviteten til TNF er redusert, både i in vitro modeller, i cellulære modeller og i ex vivo modeller (se den Eksperimentelle Seksjonen under). Selv om den foreliggende oppfinnelsen ikke er begrenset til noen spesifikk mekanisme, forklaring eller hypotese, er det antatt at på grunn av deres lille størrelse og høye affinitet for TNF-alfa, er to eller tre monovalente Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen i stand til samtidig å okkupere to eller tre forskjellige reseptor bindingsseter på TNF trimeren, og derved forhindre trimeren i å initiere reseptor kryssbinding og derved å initiere signaltransduksjon (likevel, er andre aksjonsmekanismer ikke ekskludert: for eksempel, avhengig av epitopen som den er rettet mot, kan et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen også inhibere assosiasjonen av TNF inn i den trimere tilstanden).
Det skulle også bli notert at, i tillegg eller som et alternativ til binding til to eller flere reseptor bindingsseter på en enkel TNF-trimer, kan proteinene eller polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen som omfatter eller essensielt består av to eller flere immunoglobulin variable domener (eller egnede fragmenter derav) som er rettet mot epitoper av TNF-alfa binde (f.eks. intermolekylært) epitoper på separate TNF-alfa molekyler (f.eks. to separate trimerer).
Imidlertid, i følge en spesielt foretrukket utførelsesform, relateres den foreliggende oppfinnelsen til et protein eller polypeptid som omfatter eller essensielt består av to eller flere immunoglobulin variable domener (eller egnede fragmenter derav) som hver er rettet mot epitoper på TNF-alfa (og spesielt til TNF-alfa trimeren) som ligger i og/eller danner en del av reseptor bindingssetet(bindingssetene) til TNF trimeren, slik som ovennevnte polypeptid, ved binding til en TNF trimer, er i stand til å inhibere eller redusere TNF reseptor kryssbindingen som er mediert av ovennevnte TNF trimer og/eller signaltransduksjonen som er mediert av slik reseptor kryssbinding.
Spesielt, i følge denne foretrukkede utførelsesformen, relateres den foreliggende oppfinnelsen til et proteinpolypeptid som omfatter eller essensielt består av to eller flere immunoglobulin variable domener (eller egnede fragmenter derav) som hver er rettet mot epitoper på TNF-alfa (og spesielt på TNF-alfa trimeren) som ligger i og/eller danner en del av reseptor bindingssetet(bindingssetene) til TNF-trimeren, hvori ovennevnte immunoglobulin variable domener er bundet til hverandre på en slik måte at proteinet eller polypeptidet er i stand til samtidig å binde til to eller flere reseptor bindingsseter på en enkel TNF trimer (med andre ord, er i stand til intramolekylær binding til minst to TNF reseptor bindingsseter på en TNF trimer). I denne utførelsesformen, er de to eller flere immunoglobulin variable domenene fortrinnsvis som definert over og er mest foretrukket Nanobodies (slik som proteinet eller polypeptidet er et multivalent Nanobody konstrukt, som videre beskrevet heri). I denne utførelsesformen, kan de to eller flere immunoglobulin variable domenene også være det samme eller forskjellig; og kan være rettet mot forskjellige epitoper innen TNF reseptor bindingssetet(bindingssetene), men er fortrinnsvis rettet mot den samme epitopen.
I et foretrukket aspekt av denne utførelsesformen, er de to eller flere immunoglobulin variable domenene rettet mot epitoper av TNF-alfa trimeren, som epitoper ligger i og/eller danner en del av TNF reseptor bindingssetet(bindingssetene). For eksempel, er de to eller flere immunoglobulin variable domenene fortrinnsvis rettet mot og/eller kan binde til en epitop av TNF-alfa trimeren som omfatter de følgende aminosyreresidiene: Gln i posisjon 88 og Lys i posisjon 90 på en første TNF monomer (referert til heri som “monomer A”), og Glu i posisjon 146 på en annen TNF monomer (referert til heri som “monomer B”) (som at Monomer A og Monomer B sammen, i TNF trimeren, danner TNF reseptor bindingssetet(bindingssetene)).
Som videre beskrevet mer detaljert under med hensyn til Nanobodies, i et slikt protein eller polypeptid, er de minst to immunoglobulin variable domenene fortrinnsvis forbundet på en slik måte at avstanden mellom den N-terminale enden og den C-terminale enden av de to immunoglobulin variable domenene foreliggende i et slikt protein eller polypeptid er fortrinnsvis minst 50 Angstroms, og mer foretrukket i området på 55-200 Angstroms, og mer foretrukket i området til Angstroms, og spesielt i området på 65-150 Angstroms.
I et spesielt foretrukket aspekt av denne utførelsesformen, er disse to eller flere immunoglobulin sekvensene Nanobodies, og er fortrinnsvis valgt fra Nanobodies beskrevet heri. Noen spesielt foretrukne Nanobodies for anvendelse i denne utførelsesformen av den foreliggende oppfinnelsen er PMP1C2 (TNF1, SEQ ID NO:52) og/eller PMP5F10 (TNF3, SEQ ID NO: 60), så vel som humaniserte og andre varianter derav (som beskrevet heri); med PMP1C2 (TNF1, SEQ ID NO:52) og deres humaniserte varianter som er spesielt foretrukket.
Således, vil den foreliggende utførelsesformen nå bli beskrevet i mer detalj med referanse til Nanobodies. Imidlertid, vil det være klart for den faglærte personen at læringen heri kan bli anvendt analogt med immunoglobulin variable domener.
I denne utførelsesformen av den foreliggende oppfinnelsen, vil de to eller flere immunoglobulinsekvensene vanligvis være forbundet via en eller flere egnede linkere, der linkere er slik at hver immunoglobulinsekvens kan binde til et forskjellige reseptor bindingssete på den samme TNF trimeren. Egnede linkere vil inter alia avhenge av (avstanden mellom) epitopene på TNF trimeren til hvor immunoglobulinsekvensene binder, og vil være klart for den faglærte personen basert på beskrivelsen heri, valgfritt etter noe grad av rutineeksperimentering. For eksempel, når de to eller flere immunoglobulinsekvensene er (enkle) domene antistoffer eller Nanobodies, kan egnede linkere bli valgt fra linkerene beskrevet heri, men med en linkerlengde som er slik at de to eller flere (enkle) domene antistoffene eller Nanobodies hver kan binde til et forskjellige reseptor bindingssete på den samme TNF trimeren.
Også, når de to eller flere immunoglobulinsekvensene som binder til reseptor bindingssetene til TNF-alfa er (enkle) domene antistoffer eller Nanobodies, kan de også bli forbundet til hverandre via et tredje (enkelt) domene antistoff eller Nanobody (ved at de to eller flere immunoglobulinsekvensene kan bli forbundet direkte til det tredje (enkelt) domene antistoffet/Nanobodiet eller via egnede linkere). Et slikt tredje (enkelt) domene antistoff eller Nanobody kan for eksempel være et (enkelt) domene antistoff eller Nanobody som fremskaffer for et økt halvliv, som videre beskrevet heri. For eksempel, det sistnevnte (enkelt) domene antistoffet eller Nanobodiet kan være et (enkelt) domene antistoff eller Nanobody som er i stand til å binde til et (humant) serumprotein slik som (humant) serum albumin, som videre beskrevet heri.
Alternativt, kan de to eller flere immunoglobulinsekvensene som binder til reseptor bindingssetet(bindingssetene) til TNF-alfa bli forbundet i serier (enten direkte eller via en egnet linker) og det tredje (enkelt) domene antistoffet eller Nanobodiet (som kan fremskaffe økt halv-liv, som beskrevet over) kan bli koblet direkte eller via en linker til en av disse to eller flere tidligere nevnte immunoglobulinsekvensene. Noen ikke-begrensende eksempler på slike konstrukter er konstruktene til SEQ ID NOS: 93 eller 94.
Spesielt, har det blitt funnet i den foreliggende oppfinnelsen (se krystallografidataene referert til heri) at, når Nanobodies foreliggende i et multivalent eller multispesifikt protein eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen binder til den spesielle epitopen beskrevet over (som er epitopen til TNF1 og dens humanisert varianter, så vel som til TNF3 og dens humanisert varianter) så skulle fortrinnsvis, de to (eller flere) anti-TNF Nanobodies foreliggende i et slikt protein eller polypeptid bli forbundet på en slik måte at avstanden mellom den N-terminale enden og den C-terminale enden til to anti-TNF Nanobodies foreliggende i et slikt protein eller polypeptid skulle fortrinnsvis være minst 50 Angstroms, og mer foretrukket i området på 55-200 Angstroms, og spesielt i området på 65-150 Angstroms (der den øvre grense er mindre kritisk, og som blir valgt for bekvemmelighetsårsaker, f.eks. med en betraktning av ekspresjon/produksjon av proteinet); eller mer generelt som ovennevnte avstand skulle være slik at det tillater proteinet eller polypeptidet å gjennomgå intramolekylær binding til TNF-trimeren (dvs. i stedet for intermolekylær binding). Avstanden mellom den N-terminale enden og den C-terminale enden av to anti-TNF Nanobodies kan bli bestemt av et hvilket som helst egnet middel, slik som med krystallografi eller molekylær modellering (som beskrevet heri). Disse teknikkene gjør det også generelt mulig å bestemme hvorvidt et spesifikt multivalent eller multispesifikt protein eller polypeptid er i stand til å fremskaffe intramolekylær modellering. Alternativt, fremskaffer den foreliggende oppfinnelsen også et enkelt eksperiment ved å anvende størrelse-utelukkelse kromatografi (som beskrevet av Santora et al., Anal. Biochem., 299: 119-129) som kan bli anvendt til å bestemme hvorvidt et gitt protein eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen vil (predominant) fremskaffe intramolekylær binding til en TNF-trimer eller (predominant) intermolekylær binding mellom to eller flere TNF-trimerer. Derfor, i en spesiell utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, er et protein eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen fortrinnsvis slik at i dette eksperimentet, leder det predominant eller essensielt eksklusivt til intramolekylær binding. Imidlertid, som fremhevet over, skulle det bli notert at proteiner eller polypeptider av den foreliggende oppfinnelsen som opererer via intermolekylær binding av separate TNF-alfa molekyler (f.eks. trimerer) også er innenfor omfanget av den foreliggende oppfinnelsen.
Derfor, i et annet foretrukket aspekt, fremskaffer den foreliggende oppfinnelsen et multivalent eller multispesifikt protein eller polypeptid som omfatter minst to Nanobodies mot TNF-alfa (og spesielt til TNF-alfa trimeren), der ovennevnte Nanobodies fortrinnsvis er rettet mot essensielt den samme epitopen som Nanobody PMP1C2 (som nevnt heri), og der ovennevnte minst to Nanobodies er forbundet på en slik måte at avstanden mellom den N-terminale enden og den C-terminale enden av de minst to anti-TNF Nanobodies er slik at proteinet eller polypeptidet er i stand til å gjennomgå intramolekylær binding (som beskrevet heri) med en TNF-trimer. Fortrinnsvis, i et slikt protein eller polypeptid, er avstanden mellom den N-terminale enden og den C-terminale enden av to anti-TNF Nanobodies minst 50 Angstroms, og mer foretrukket i området på 55-200 Angstroms, og spesielt i området på 65-150 Angstroms.
I et slikt foretrukket protein eller polypeptid, kan de to eller flere Nanobodies være forbundet på en hvilken som helst egnet måte, så lenge som den foretrukne avstanden mellom den N-terminale enden og den C-terminale enden av de minst to anti-TNF Nanobodies kan bli oppnådd, og/eller så lenge som proteinet eller polypeptidet er i stand til å gjennomgå intramolekylær binding (som beskrevet heri) med en TNF-trimer.
For eksempel, i sin enkleste form, er de minst to Nanobodies direkte forbundet via en egnet linker eller spacer som fremskaffer den foretrukne avstanden mellom den N-terminale enden og den C-terminale enden til de minst to anti-TNF Nanobodies og som kan tillate proteinet eller polypeptidet å gjennomgå intramolekylær binding (som beskrevet heri) med en TNF-trimer. Egnede linkere er beskrevet heri, og kan - for eksempel og uten begrensning - omfatte en aminosyresekvens, der aminosyresekvensen fortrinnsvis har en lengde på 14 aminosyrer, mer foretrukket minst 17 aminosyrer, slik som omtrent 20-40 aminosyresekvenser (som, der det anvendes en gjennomsnittsdistanse på 3.5 Ångstrøm for en aminosyre, korresponderer til linkerlengder på 49 Angstroms, 59.5 Angstroms og omtrent 70 Angstroms, respektivt; med maksimummengden av aminosyrer som blir beregnet på den samme måten basert på avstandene nevnt over). Fortrinnsvis, skulle en aminosyresekvens også være slik at den tillater proteinet eller polypeptidet å gjennomgå intramolekylær binding (som beskrevet heri) med en TNF-trimer.
Derfor, i et annet foretrukket aspekt, fremskaffer den foreliggende oppfinnelsen et multivalent eller multispesifikt protein eller polypeptid som omfatter minst to Nanobodies mot TNF-alfa (og spesielt av TNF-alfa trimeren), der ovennevnte Nanobodies fortrinnsvis er rettet mot essensielt den samme epitopen som Nanobody PMP1C2 (som nevnt heri), og der ovennevnte minst to Nanobodies er direkte forbundet til hverandre ved å anvende en egnet linker eller spacer slik at avstanden mellom den N-terminale enden og den C-terminale enden av de minst to anti-TNF Nanobodies er slik at proteinet eller polypeptidet er i stand til å gjennomgå intramolekylær binding (som beskrevet heri) med en TNF-trimer. Fortrinnsvis, i et slikt protein eller polypeptid, er avstanden mellom den N-terminale enden og den C-terminale enden av to anti-TNF Nanobodies (og derved den foretrukne lengden av linkeren eller spaceren) minst 50 Angstroms, og mer foretrukket i området på 55-200 Angstroms, og spesielt i området på 65-150 Angstroms.
Mer foretrukket, i dette foretrukne aspektet, er linkeren eller spaceren en aminosyresekvens som omfatter minst 14, fortrinnsvis minst 17, mer foretrukket minst 20 aminosyrer (med en ikke-kritisk øvre grense valgt for bekvemmelighetsårsaker som er omtrent 50, og fortrinnsvis omtrent 40 aminosyrer). I en foretrukket, men ikke-begrensende utførelsesform, består linkeren essensielt av glycin- og serin-residier (som videre beskrevet under). For eksempel, en egnet linker er GS30 linkeren beskrevet heri, som omfatter 30 aminosyreresidier.
I en annen utførelsesform, er de minst to Nanobodies mot TNF-alfa forbundet til hverandre via en annen gruppe (valgfritt via en eller to linkere), slik som et annet protein eller polypeptid. I denne utførelsesformen, kan det være ønskverdig å ha den foretrukne avstanden (dvs. som nevnt over) mellom den N-terminale enden og den C-terminale enden av de minst to anti-TNF Nanobodies, for eksempel slik at proteinet eller polypeptidet fremdeles kan gjennomgå intramolekylær binding (som beskrevet heri) med en TNF-trimer. I denne utførelsesformen, kan de minst to Nanobodies bli forbundet direkte til den andre gruppen, eller anvende en egnet linker eller spacer, igjen så lenge som den foretrukne distansen og/eller ønskede intramolekylære bindingen fremdeles kan bli oppnådd. Gruppen kan være en hvilken som helst egnet gruppe som ikke avleder (for mye) fra bindingen av proteinet eller polypeptidet til TNF og/eller fra de videre ønskede biologiske eller farmakologiske egenskapene til proteinet eller polypeptidet. Som slikt, kan gruppen være essensielt inaktiv eller kan være biologisk aktiv, og som slik kan eller kan ikke forbedre de ønskede egenskapene til proteinet eller polypeptidet og/eller kan tildele en eller flere ønskede tilleggsegenskaper til proteinet eller polypeptidet. For eksempel, og uten begrensning, kan gruppen forbedre halv-liv til proteinet eller polypeptidet, og/eller kan redusere dens immunogenitet eller forbedre en hvilket som helst annen ønsket egenskap. I en foretrukket utførelsesform, kan gruppen være et annet Nanobody (inkludert men ikke begrenset til et tredje Nanobody mot TNF-alfa, selv om dette ikke er nødvendig og vanligvis mindre foretrukket), og spesielt et annet Nanobody som forbedrer halv-livet til proteinet eller polypeptidet, slik som et Nanobody som er rettet mot et serumprotein, for eksempel mot humant serum albumin. Eksempler på slike proteiner og polypeptider er beskrevet heri.
Derfor, i en utførelsesform, relateres den foreliggende oppfinnelsen til et multivalent multispesifikt konstrukt som omfatter to eller flere immunoglobulinsekvens (eller egnede fragmenter derav) som hver er rettet mot epitoper på TNF-alfa (f.eks. av TNF-alfa trimeren) som ligger i og/eller danner en del av reseptorbindingssetet, og som er forbundet til hverandre via minst en immunoglobulinsekvens som fremskaffer økt halv-liv (og valgfritt via en eller flere egnede linkere), slik at ovennevnte polypeptid, ved binding til en TNF trimer, er i stand til å inhibere eller redusere TNF reseptor kryssbindingen og/eller signaltransduksjonen som er mediert av ovennevnte TNF trimer. Et slikt polypeptid kan være slik at ovennevnte førstnevnte to eller flere immunoglobulinsekvenser hver kan binde til et forskjellige reseptor bindingssete på en TNF trimer.
Spesielt, i denne utførelsesformen, kan polypeptidet omfatte et trivalent bispesifikt Nanobody, som omfatter to Nanobodies som hver er rettet mot epitoper på TNF-alfa (og spesielt av TNF-alfa trimeren) som ligger i og/eller danner en del av reseptorbindingssetet, der ovennevnte Nanobodies er forbundet til hverandre via et tredje Nanobody som fremskaffer et økt halv-liv (f.eks. et Nanobody som er rettet mot et serumprotein slik som humant serum albumin), der hvert av de førstnevnte to Nanobodies kan bli direkte forbundet til ovennevnte tredje Nanobody eller via en eller flere egnede linkere, slik at ovennevnte polypeptid, ved binding til en TNF trimer, er i stand til å inhibere eller redusere TNF reseptor kryssbindingen og/eller signaltransduksjonen som er mediert av ovennevnte TNF trimer. Et slikt polypeptid kan være slik at ovennevnte førstnevnte to Nanobodies hver kan binde til et forskjellig reseptor bindingssete på en TNF trimer. Igjen, er noen spesielt foretrukne Nanobodies for anvendelse i denne utførelsesformen av den foreliggende oppfinnelsen PMP1C2 (TNF1, SEQ ID NO:52) og/eller PMP5F10 (TNF3, SEQ ID NO: 60), så vel som humanisert og andre varianter derav (som beskrevet heri); med PMP1C2 (TNF1, SEQ ID NO:52) og deres humaniserte varianter som er spesielt foretrukket; og Nanobodies rettet mot humant serum albumin beskrevet heri. Noen foretrukne, men ikke-begrensende konstrukter av denne utførelsesformen av den foreliggende oppfinnelsen er TNF 24 (SEQ ID NO: 90), TNF 26 (SEQ ID NO: 92), TNF 27 (SEQ ID NO: 93), TNF 28 (SEQ ID NO: 94), TNF 60 (SEQ ID NO: 417) og TNF 62 (SEQ ID NO:418), der TNF 60 er spesielt foretrukket.
Derfor, relateres noen foretrukne aspekter av denne utførelsesformen av den foreliggende oppfinnelsen til:
XIX) Et protein eller polypeptid som omfatter eller essensielt består av to eller flere immunoglobulin variable domener (eller egnede fragmenter derav) som hver er rettet mot epitoper på TNF-alfa (og spesielt av TNF-alfa trimeren) som ligger i og/eller danner en del av reseptor bindingssetet(bindingssetene) til TNF trimeren, slik at ovennevnte polypeptid, ved binding til en TNF trimer, er i stand til å inhibere eller redusere TNF reseptor kryssbindingen som er mediert av ovennevnte TNF trimer og/eller signaltransduksjonen som er mediert av slik reseptor kryssbinding.
XX) Et protein eller polypeptid som omfatter eller essensielt består av to eller flere immunoglobulin variable domener (eller egnede fragmenter derav) som hver er rettet mot epitoper på TNF-alfa (og spesielt på TNF-alfa trimeren) som ligger i og/eller danner en del av reseptor bindingssetet(bindingssetene) til TNF trimeren, slik at ovennevnte polypeptid er i stand til intramolekylær binding til minst to TNF reseptor bindingsseter på en TNF trimer.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der ovennevnte immunoglobulin variable domener er forbundet til hverandre på en slik måte at proteinet eller polypeptidet er i stand til samtidig å binde til to eller flere reseptor bindingsseter på en enkel TNF trimer.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der ovennevnte immunoglobulin variable domener er i stand til å binde til den samme epitopen som Nanobody TNF1 (SEQ ID NO: 52).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der ovennevnte immunoglobulin variable domener er i stand til å binde mot epitopen inne i TNF reseptor bindingssetet til TNF trimeren som minst omfatter de følgende aminosyreresidiene: Gln i posisjon 88 i monomer A; Lys i posisjon 90 i monomer A og Glu i posisjon 146 i monomer B.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der ovennevnte immunoglobulin variable domener er i stand til å binde mot epitopen inne i TNF reseptor bindingssetet til TNF trimeren som minst omfatter de følgende aminosyreresidiene: Gln i posisjon 88 i monomer A; Lys i posisjon 90 i monomer A og Glu i posisjon 146 i monomer B; og som videre omfatter minst en, fortrinnsvis to eller flere, mer foretrukket 5 eller flere, og fortrinnsvis alle eller essensielt alle, av de følgende aminosyreresidiene til TNF-alfa monomer A: Gly i posisjon 24, Gln i posisjon 25, Thr i posisjon 72, His i posisjon 73, Val i posisjon 74, Leu i posisjon 75, Thr i posisjon 77, Thr i posisjon 79, Ile i posisjon 83, Thr i posisjon 89, Val i posisjon 91. Asn i posisjon 92, Ile i posisjon 97, Arg i posisjon 131, Glu i posisjon 135, Ile i posisjon 136, Asn i posisjon 137, Arg i posisjon 138, Pro i posisjon 139, Asp i posisjon 140 og de følgende residiene i monomer B: Pro i posisjon 20, Arg i posisjon 32, Lys i posisjon 65, Lys i posisjon 112, Tyr i posisjon 115, Ala i posisjon 145, Ser i posisjon 147.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der ovennevnte immunoglobulin variable domener er i stand til å binde mot epitopen inne i TNF reseptor bindingssetet til TNF trimeren som minst omfatter de følgende aminosyreresidiene: Gln i posisjon 88 i monomer A; Lys i posisjon 90 i monomer A og Glu i posisjon 146 i monomer B; og som videre omfatter minst en, fortrinnsvis to eller flere, mer foretrukket 5 eller flere, og fortrinnsvis alle eller essensielt alle, av de følgende aminosyreresidiene til TNF-alfa monomer A Leu i posisjon 75, Thr i posisjon 77, Thr i posisjon 79, Ile i posisjon 80, Ser i posisjon 81, Tyr i posisjon 87, Thr i posisjon 89, Val i posisjon 91, Asn i posisjon 92, Ser i posisjon 95, Ile i posisjon 97, Glu i posisjon 135, Ile i posisjon 136, Asn i posisjon 137 og de følgende residiene i monomer B: Ala i posisjon 33, Ala i posisjon 145, Ser i posisjon 147.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der de minst to immunoglobulin variable domenene er forbundet på en slik måte at avstanden mellom den N-terminale enden av det første immunoglobulin variable domenet og den C-terminale enden det andre immunoglobulin variable domenet foreliggende i et slikt protein eller polypeptid er minst 50 Angstroms.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der avstanden mellom den N-terminale enden av det første immunoglobulin variable domenet og den C-terminale enden av det andre immunoglobulin variable domenet er mellom 55-200 Angstroms.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der avstanden mellom den N-terminale enden av det første immunoglobulin variable domenet og den C-terminale enden av det andre immunoglobulin variable domenet er mellom 65-150 Angstroms.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der det første og andre immunoglobulin variable domenet er forbundet til hverandre via en linker eller spacer.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der linkeren eller spaceren er en aminosyresekvens.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der linkeren eller spaceren omfatter minst 14 aminosyreresidier.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der linkeren eller spaceren omfatter minst 17 - 50 aminosyreresidier. - Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der linkeren eller spaceren essensielt består av glycin- og serin-residier. - Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der linkeren eller spaceren er GS30 (SEQ ID NO: 69).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der det første og andre immunoglobulin variable domenet er forbundet til hverandre via en annen gruppe.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der ovennevnte andre gruppe er en protein- eller polypeptid-gruppe.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der ovennevnte andre gruppe tildeler minst en ønsket egenskap til proteinet eller polypeptidet, eller forbedrer minst en ønsket egenskap til proteinet eller polypeptidet.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der ovennevnte andre gruppe forbedrer halv-livet til proteinet eller polypeptidet og/eller reduserer immunogeniteten til proteinet eller polypeptidet.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der hver av det første og andre immunoglobulin variable domene er forbundet til ovennevnte andre gruppe via en linker eller spacer.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der linkeren eller spaceren er en aminosyresekvens.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der linkeren eller spaceren essensielt består av glycin- og serin-residier .
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der den ovennevnte andre gruppen er et Nanobody.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der den andre gruppen er et Nanobody rettet mot humant serum albumin.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er et humanisert Nanobody.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er en humanisert variant av Nanobodiet ALB 1 (SEQ ID NO: 63).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er valgt fra gruppen som består av ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88),
ALB 5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101),
ALB 8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) og ALB 10 (SEQ ID NO: 104).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er ALB 8.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies med en Koff rate for TNF på bedre enn 2.10<-3 >(1/s), fortrinnsvis bedre enn 1.10<-3 >(1/s); eller en humanisert variant av et slikt Nanobody., - Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies med en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der det anvendes KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn EC50 verdien til Nanobody VHH 3E (SEQ ID NO:4) av WO 04/041862 i det samme assayet; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies med en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der det anvendes KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn 12nM; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies med en EC50 verdi i det celle-baserte assayet som anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn 5nM; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies med en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der det anvendes KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn 3nM; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, som er humanisert;
med noen spesielt foretrukne aspekter av denne utførelsesformen som er:
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der de første og andre immunoglobulin variable domenene er GLEW-klasse Nanobodies.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies med et argininresidie (R) i posisjon 103.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der de første og andre immunoglobulin variable domenene er GLEW-klasse Nanobodies med et argininresidie (R) i posisjon 103.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies med minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av aminosyresekvensene til SEQ ID NO 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) eller 96 (TNF30).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) der:
a) CDR1 omfatter:
- aminosyresekvensen DYWMY; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen DYWMY; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen DYWMY;
og
b) CDR2 omfatter:
- aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG;
og
c) CDR3 omfatter:
- aminosyresekvensen SPSGFN; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen SPSGFN; eller - en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over, der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) der CDR1 omfatter aminosyresekvensen DYWMY.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) der CDR2 omfatter aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) der CDR3 omfatter aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) der:
- CDR1 omfatter aminosyresekvensen DYWMY; og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SPSGFN; eller
- CDR1 omfatter aminosyresekvensen DYWMY; og CDR2 omfatter aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- CDR2 omfatter aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SPSGFN
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) der CDR1 omfatter aminosyresekvensen DYWMY; og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) der CDR1 omfatter aminosyresekvensen DYWMY; CDR2 omfatter aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) der
a) CDR1 er:
- aminosyresekvensen DYWMY; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen DYWMY; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen DYWMY;
og der:
b) CDR2 er:
- aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG;
og der
c) CDR3 er:
- aminosyresekvensen SPSGFN; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen SPSGFN; eller - en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) der CDR1 er aminosyresekvensen DYWMY.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) der CDR2 er aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) der CDR3 er aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) der:
- CDR1 er aminosyresekvensen DYWMY; og CDR3 er aminosyresekvensen SPSGFN; eller
- CDR1 er aminosyresekvensen DYWMY; og CDR2 er aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- CDR2 er aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; og CDR3 er aminosyresekvensen SPSGFN
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) der CDR1 er aminosyresekvensen DYWMY; og CDR3 er aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) der CDR1 er aminosyresekvensen DYWMY; CDR2 er aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG og CDR3 er aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) der
- En hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon; og/eller
- ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er valgt fra gruppen som består av Nanobodiet TNF 1 (SEQ ID NO: 52) og humaniserte varianter av Nanobodiet TNF 1 (SEQ ID NO: 52).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er valgt fra gruppen som består av TNF 13 (SEQ ID NO: 76), TNF 14 (SEQ ID NO: 77), TNF 29 (SEQ ID NO: 95) og TNF 30 (SEQ ID NO:96).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er TNF 30 (SEQ ID NO:96);
og med noen spesielt foretrukne aspekter av denne utførelsesformen som er: - Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er KERE-klasse Nanobodies.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies med minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av aminosyresekvensene til SEQ ID NO 50 (TNF3), 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) eller 98 (TNF33).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) der:
a) CDR1 omfatter:
- aminosyresekvensen NYYMG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen NYYMG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen NYYMG;
og
b) CDR2 omfatter:
- aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG;
og
c) CDR3 omfatter:
- aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) der CDR1 omfatter aminosyresekvensen NYYMG.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) der CDR2 omfatter aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) der CDR3 omfatter aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der:
- CDR1 omfatter aminosyresekvensen NYYMG; og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY; eller
- CDR1 omfatter aminosyresekvensen NYYMG; og CDR2 omfatter aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; eller
- CDR2 omfatter aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der CDR1 omfatter aminosyresekvensen NYYMG; CDR2 omfatter aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY og CDR3 omfatter aminosyresekvensen ILPLSDDPGWNTY (SEQ ID NO: 436).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der
a) CDR1 er:
- aminosyresekvensen NYYMG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen NYYMG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen NYYMG;
og
b) CDR2 er:
- aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG;
og
c) CDR3 er:
- aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der CDR1 er aminosyresekvensen NYYMG.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der CDR2 er aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der CDR3 er aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY. - Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der:
- CDR1 er aminosyresekvensen NYYMG; og CDR3 er aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY; eller
- CDR1 er aminosyresekvensen NYYMG; og CDR2 er aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; eller
- CDR2 er aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; og CDR3 er aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der CDR1 er aminosyresekvensen NYYMG; CDR2 er aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY og CDR3 er aminosyresekvensen ILPLSDDPGWNTY.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er Nanobodies som beskrevet for proteinene eller polypeptidene i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der
- En hvilken som helst aminosyresubstitusjon er fortrinnsvis en konservativ aminosyresubstitusjon; og/eller
- ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er valgt fra gruppen som består av Nanobodiet TNF 3 (SEQ ID NO: 60) og humaniserte varianter av Nanobodiet TNF 3 (SEQ ID NO: 60).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX), der de første og andre immunoglobulin variable domenene er valgt fra gruppen som består av 83 TNF20 (SEQ ID NO:83), TNF21 (SEQ ID NO: 84), TNF 22 (SEQ ID NO: 85), TNF23 (SEQ ID NO: 86) eller TNF33 (SEQ ID NO: 99).
Det skulle bli notert at når et protein eller polypeptid er nevnt over som å være “i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over”, er det minst i følge en av XIX) til XX), og kan være i følge både XIX) og XX), og kan også inkludere et hvilket som helst eller flere av de andre aspektene som er indikert som å være “i henhold til en hvilken som helst av XIX) til XX) over”.
Imidlertid, skulle det bli notert at den foreliggende oppfinnelsen ikke er begrenset til noen spesifikk aksjonsmekanisme eller hypotese. Spesielt, har det blitt funnet at de monovalente Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen også kan være aktive i assayene og modellene beskrevet heri, som bekrefter at intramolekylær binding av TNF trimeren, selv om foretrukket i en spesifikk utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, ikke er krevet for å oppnå den ønskede virkningen og effekten på Nanobodies, proteinene og polypeptidene beskrevet heri. På lignende måte, er det også omfattet innen omfanget av den foreliggende oppfinnelsen at proteinene og polypeptidene beskrevet heri oppnår deres ønskede virkning via en hvilken som helst passende mekanisme (dvs. med intramolekylær binding, intermolekylær binding eller selv med binding til monomere TNF, derfor inhiberer dannelsen av TNF trimerer).
Det er også innen omfanget av den foreliggende oppfinnelsen å anvende deler, fragmenter, analoger, mutanter, varianter, alleler og/eller derivater av Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen, og/eller å anvende proteiner eller polypeptider som omfatter eller essensielt består av det samme, så lenge som disse er egnet for anvendelsene tenkt for seg heri. Slike deler, fragmenter, analoger, mutanter, varianter, alleler, derivater, proteiner og/eller polypeptider vil bli beskrevet i den videre beskrivelsen heri.
I et annet aspekt, relateres den foreliggende oppfinnelsen til et Nanobody (som definert heri), mot TNF-alfa, som består av 4 rammeverkregioner (FR1 til FR4 respektivt) og 3 komplementært bestemmende regioner (CDR1 til CDR3 respektivt), der:
(i) CDR1 er en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av CDR1 sekvensene til SEQ ID NOS: 15 til 21 eller fra gruppen som består av CDR1 sekvensene til SEQ ID NOS: 164 til 197;
eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med minst en av CDR1 sekvensene fra gruppen som består av SEQ ID NOS: 15 til 21 eller med minst en av CDR1 sekvensene fra gruppen som består av SEQ ID NOS: 164 til 197, der
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over;
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med minst en av CDR1 sekvensene fra gruppen som består av SEQ ID NOS: 15 til 21 eller med minst en av CDR1 sekvensene fra gruppen som består av SEQ ID NOS: 164 til 197, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over;
og der:
(ii) CDR2 er en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av CDR2 sekvensene til SEQ ID NOS: 22 til 28 eller fra gruppen som består av CDR2 sekvensene til SEQ ID NOS: 232 til 265;
eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med minst en av CDR2 sekvensene fra gruppen som består av SEQ ID NOS: 22 til 28 eller med minst en av CDR2 sekvensene fra gruppen som består av SEQ ID NOS: 232 til 265, der
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over;
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med minst en av CDR2 sekvensene fra gruppen som består av SEQ ID NOS: 22 til 28 eller med minst en av CDR2 sekvensene fra gruppen som består av SEQ ID NOS: 232 til 265, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over;
og der:
(iii) CDR3 er en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av CDR3 sekvensene til SEQ ID NOS: 29 til 33 eller fra gruppen som består av CDR3 sekvensene til SEQ ID NOS: 300-333;
eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med minst en av CDR3 sekvensene fra gruppen som består av SEQ ID NOS: 29 til 33 eller med minst en av CDR3 sekvensene fra gruppen som består av SEQ ID NOS: 300-333, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over;
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) eller med minst en av CDR3 sekvensene fra gruppen som består av SEQ ID NOS: 300-333, der: (1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over;
eller fra gruppen som består av CDR3 sekvensene til SEQ ID NOS: 34 og 35
eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med minst en av CDR3 sekvensene til SEQ ID NOS: 34 og 35, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over;
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med minst en av CDR3 sekvensene til SEQ ID NOS: 34 og 35, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over.
Nanobodies mot TNF-alfa som beskrevet over og som videre beskrevet heriunder er også referert til heri som Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen.
Av Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, er Nanobodies som omfatter en eller flere av CDR’ene eksplisitt listet opp over spesielt foretrukket; Nanobodies som omfatter to eller flere av CDR’ene eksplisitt listet opp over er mer spesielt foretrukket; og Nanobodies som omfatter tre av CDR’ene eksplisitt listet opp over er mest spesielt foretrukket.
Noen spesielt foretrukne, men ikke-begrensende kombinasjoner av CDR sekvenser kan bli sett i Tabell I under, som lister opp CDR’ene og rammeverksekvensene som er foreliggende i et antall av foretrukne (men ikkebegrensende) Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen. Som vil være klart for den faglærte personen, vil en kombinasjon av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser som forekommer i den samme klonen (dvs. CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser som er nevnt på den samme linjen i Tabell I) vanligvis bli foretrukket (selv om den foreliggende oppfinnelsen i sin videste forstand ikke er begrenset dertil, og også omfatter andre egnede kombinasjoner av CDR sekvensene nevnt i Tabell I).
Også, i Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen som omfatter kombinasjonene av CDR’er nevnt i Tabell I, kan hver CDR bli erstattet av en CDR valgt fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med de nevnte CDR’ene; der
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over;
og/eller valgt fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 (som indikert i paragrafen foran) “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med den/de nevnte CDR ́en(CDR ́ene) en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over.
Imidlertid, som vil være klart for den faglærte personen, vil (kombinasjoner av) CDR sekvensene nevnt i Tabell I generelt bli foretrukket.
Tabell I: Foretrukne kombinasjoner av rammeverk og CDR sekvenser
Tabell I (fortsatt):
Tabell I (fortsatt):
Tabell I (fortsatt):
Tabell I (fortsatt):
Notater til Tabell I:
ID refererer til SEQ ID NO'ene i den vedlagte sekvenslisten
For CDR1: SEQ ID NO: 164 korresponderer til SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 167 korresponderer til SEQ ID NO: 16; S NO: 17, SEQ ID NOS: 165 og 166 korresponderer til SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 170 korresponderer til SEQ ID NO: 1 ID NO: 20, og SEQ ID NOS: 168 og 169 korresponderer til SEQ ID NO: 21.
For CDR2: SEQ ID NOS: 232 og 233 korresponderer til SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 235 korresponderer til SEQ ID N SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 234 korresponderer til SEQ ID NO: 25, SEQ ID NOS: 236 og 237 korresponderer til SEQ I til SEQ ID NO: 27, og SEQ ID NO: 239 korresponderer til SEQ ID NO: 28.
For CDR3: SEQ ID NO: 303 korresponderer til SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 308 korresponderer til SEQ ID NO: 30, S NO: 31, SEQ ID NO: 307 korresponderer til SEQ ID NO: 32, SEQ ID NOS: 304 og 305 korresponderer til SEQ ID NO: 3 ID NO: 34, og SEQ ID NOS: 301 og 302 korresponderer til SEQ ID NO: 35.
Derfor, i Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, er minst en av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene foreliggende passende valgt fra gruppen som består av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, respektivt, listet opp i Tabell I; eller fra gruppen av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser, respektivt, som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% “sekvensidentitet” (som definert heri) med minst en av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, respektivt, listet opp i Tabell I; og/eller fra gruppen som består av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, respektivt, som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med minst en av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, respektivt, listet opp i Tabell I. I denne konteksten, er det med “passende valgt” ment at, som brukbar, er en CDR1 sekvens valgt fra egnede CDR1 sekvenser (dvs. som definert heri), er en CDR2 sekvens valgt fra egnede CDR2 sekvenser (dvs. som definert heri) og en CDR3 sekvens er valgt fra egnede CDR3 sekvenser (dvs. som definert heri), respektivt.
Spesielt, i Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, er minst CDR3 sekvensen foreliggende passende valgt fra gruppen som består av CDR3 sekvensene listet opp i Tabell I eller fra gruppen av CDR3 sekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med minst en av CDR3 sekvensene listet opp i Tabell I; og/eller fra gruppen som består av CDR3 sekvensene som har 3, 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med minst en av CDR3 sekvensene listet opp i Tabell I.
Fortrinnsvis, i Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, er minst to av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene foreliggende passende valgt fra gruppen som består av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, respektivt, listet opp i Tabell I eller fra gruppen som består av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser, respektivt, som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med minst en av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, respektivt, listet opp i Tabell I; og/eller fra gruppen som består av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, respektivt, som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” med minst en av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, respektivt, listet opp i Tabell I.
Spesielt, i Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, er minst CDR3 sekvensen foreliggende passende valgt fra gruppen som består av CDR3 sekvensene listet opp i Tabell I eller fra gruppen av CDR3 sekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med minst en av CDR3 sekvensene listet opp i Tabell I, respektivt; og minst en av CDR1 og CDR2 sekvensene foreliggende er passende valgt fra gruppen som består av CDR1 og CDR2 sekvensene, respektivt, listet opp i Tabell I eller fra gruppen av CDR1 og CDR2 sekvenser, respektivt, som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med minst en av CDR1 og CDR2 sekvensene, respektivt, listet opp i Tabell I; og/eller fra gruppen som består av CDR1 og CDR2 sekvensene, respektivt, som har 3, 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med minst en av CDR1 og CDR2 sekvensene, respektivt, listet opp i Tabell I.
Mest foretrukket, i Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, er alle tre CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser foreliggende passende valgt fra gruppen som består av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, respektivt, listet opp i Tabell I eller fra gruppen av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser, respektivt, som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med minst en av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, respektivt, listet opp i Tabell I; og/eller fra gruppen som består av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, respektivt, som har 3, 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med minst en av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, respektivt, listet opp i Tabell I.
Enda mer foretrukket, i Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, er minst en av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene foreliggende passende valgt fra gruppen som består av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, respektivt, listet opp i Tabell I. Fortrinnsvis, i denne utførelsesformen, er minst en eller fortrinnsvis begge av de andre to CDR sekvensene foreliggende passende valgt fra CDR sekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med minst en av de korresponderende CDR sekvensene, respektivt, listet opp i Tabell I; og/eller fra gruppen som består av CDR sekvensene som har 3, 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med minst en av de korresponderende sekvensene, respektivt, listet opp i Tabell I.
Spesielt, i Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, er minst CDR3 sekvensen foreliggende passende valgt fra gruppen som består av CDR3 ́ene listet opp i Tabell I. Fortrinnsvis, i denne utførelsesformen, er minst en og fortrinnsvis begge av CDR1 og CDR2 sekvensene foreliggende passende valgt fra gruppene av CDR1 og CDR2 sekvenser, respektivt, som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med CDR1 og CDR2 sekvensene, respektivt, listet opp i Tabell I; og/eller fra gruppen som består av CDR1 og CDR2 sekvensene, respektivt, som har 3, 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med minst en av CDR1 og CDR2 sekvensene, respektivt, listet opp i Tabell I.
Enda mer foretrukket, i Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, er minst to av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene foreliggende passende valgt fra gruppen som består av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, respektivt, listet opp i Tabell I. Fortrinnsvis, i denne utførelsesformen, er den gjenværende CDR sekvensen foreliggende passende valgt fra gruppen CDR sekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med minst en av de korresponderende CDR sekvensene listet opp i Tabell I; og/eller fra gruppen som består av CDR sekvenser som har 3, 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med minst en av de korresponderende sekvensene listet opp i Tabell I.
Spesielt, i Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, er minst CDR3 sekvensen passende valgt fra gruppen som består av CDR3 sekvensene listet opp i Tabell I, og enten CDR1 sekvensen eller CDR2 sekvens er passende valgt fra gruppen som består av CDR1 og CDR2 sekvensene, respektivt, listet opp i Tabell I. Fortrinnsvis, i denne utførelsesformen, er den gjenværende CDR sekvensen foreliggende passende valgt fra gruppen CDR sekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med minst en av de korresponderende CDR sekvensene listet opp i Tabell I; og/eller fra gruppen som består av CDR sekvenser som har 3, 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med de korresponderende CDR sekvensene listet opp i Tabell I.
Enda mer foretrukket, i Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, er alle tre CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser foreliggende passende valgt fra gruppen som består av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, respektivt, listet opp i Tabell I.
Også, generelt, er kombinasjonene av CDR’er listet opp i Tabell I (dvs. de nevnt på den samme linjen i Tabell I) foretrukket. Derfor, er det generelt foretrukket at, når en CDR i et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen er en CDR sekvens nevnt i Tabell I eller er passende valgt fra gruppen av CDR sekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med en CDR sekvens listet opp i Tabell I; og/eller fra gruppen som består av CDR sekvenser som har 3, 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med en CDR sekvens listet opp i Tabell I, som minst en og fortrinnsvis begge av de andre CDR’ene er passende valgt fra CDR sekvensene som tilhører den samme kombinasjonen i Tabell I (dvs. nevnt på den samme linjen i Tabell I) eller er passende valgt fra gruppen av CDR sekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med CDR sekvens(sekvensene) som tilhører den samme kombinasjonen og/eller fra gruppen som består av CDR sekvenser som har 3, 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med CDR sekvens(sekvensene) som tilhører den samme kombinasjonen. De andre preferansene indikert i paragrafene over gjelder også kombinasjonene av CDR’er nevnt i Tabell I.
Derfor, ved hjelp av ikke-begrensende eksempler, kan et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen for eksempel omfatte en CDR1 sekvens som har mer enn 80 % sekvensidentitet med en av CDR1 sekvensene nevnt i Tabell I, en CDR2 sekvens som har 3, 2 eller 1 aminosyre forskjell med en av CDR2 sekvensene nevnt i Tabell I (men som tilhører en forskjellige kombinasjon), og en CDR3 sekvens.
Noen foretrukne Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen kan for eksempel omfatte: (1) en CDR1 sekvens som har mer enn 80 % sekvensidentitet med en av CDR1 sekvensene nevnt i Tabell I; en CDR2 sekvens som har 3, 2 eller 1 aminosyre forskjell med en av CDR2 sekvensene nevnt i Tabell I (men som tilhører en forskjellig kombinasjon); og en CDR3 sekvens som har mer enn 80 % sekvensidentitet med en av CDR3 sekvensene nevnt i Tabell I (men som tilhører en forskjellig kombinasjon); eller (2) en CDR1 sekvens som har mer enn 80 % sekvensidentitet med en av CDR1 sekvensene nevnt i Tabell I; en CDR2 sekvens, og en av CDR3 sekvensene listet opp i Tabell I; eller (3) en CDR1 sekvens; en CDR2 sekvens som har mer enn 80% sekvensidentitet med en av CDR2 sekvensene listet opp i Tabell I; og en CDR3 sekvens som har 3, 2 eller 1 aminosyre forskjeller med CDR3 sekvensen nevnt i Tabell I som tilhører den samme kombinasjonen som CDR2 sekvensen.
Noen spesielt foretrukne Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen kan for eksempel omfatte: (1) en CDR1 sekvens som har mer enn 80 % sekvensidentitet med en av CDR1 sekvensene nevnt i Tabell I; en CDR2 sekvens som har 3, 2 eller 1 aminosyre forskjell med CDR2 sekvensen nevnt i Tabell I som tilhører den samme kombinasjonen; og en CDR3 sekvens som har mer enn 80 % sekvensidentitet med CDR3 sekvensen nevnt i Tabell I som tilhører den samme kombinasjonen; (2) en CDR1 sekvens; en CDR 2 listet opp i Tabell I og en CDR3 sekvens listet opp i Tabell I (der CDR2 sekvensen og CDR3 sekvensen kan tilhøre forskjellige kombinasjoner).
Noen enda mer foretrukne Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen kan for eksempel omfatte: (1) en CDR1 sekvens som har mer enn 80 % sekvensidentitet med en av CDR1 sekvensene nevnt i Tabell I; CDR2 sekvensen listet opp i Tabell I som tilhører den samme kombinasjonen; og en CDR3 sekvens nevnt i Tabell I som tilhører en forskjellig kombinasjon; eller (2) en CDR1 sekvens nevnt i Tabell I; en CDR2 sekvens som har 3, 2 eller 1 aminosyre forskjeller med CDR2 sekvensen nevnt i Tabell I som tilhører den samme kombinasjonen; og mer enn 80% sekvensidentitet med CDR3 sekvensen listet opp i Tabell I som tilhører samme forskjellige kombinasjon.
Spesielt foretrukne Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen kan for eksempel omfatte en CDR1 sekvens nevnt i Tabell I, en CDR2 sekvens som har mer enn 80 % sekvensidentitet med CDR2 sekvensen nevnt i Tabell I som tilhører den samme kombinasjonen; og CDR3 sekvensen nevnt i Tabell I som tilhører det samme.
I den mest foretrukne i Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, er CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene foreliggende passende valgt fra en av kombinasjonene av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser, respektivt, listet opp i Tabell I.
Fortrinnsvis, når en CDR sekvens er passende valgt fra gruppen CDR sekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av CDR sekvensene listet opp i Tabell I; og/eller når en CDR sekvens er passende valgt fra gruppen som består av CDR sekvenser som har 3, 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med en av CDR sekvensene listet opp i Tabell I:
i) er en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller
ii) inneholder ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med CDR sekvensen listet opp i Tabell I. I følge en ikke-begrensende men foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, er CDR sekvensene i Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen som definert over og også slik at Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen binder til TNF-alfa med dissosiasjonskonstant (KD) på 10<-5 >til 10<-12 >mol/liter (M) eller mindre, og fortrinnsvis 10<-7 >til 10<-12 >mol/liter (M) eller mindre og mer foretrukket 10<-8 >til 10<-12 >mol/liter (M), og/eller med assosiasjonskonstant(KA) på minst 10<7 >M<-1>, fortrinnsvis minst 10<8 >M<-1>, mer foretrukket minst 10<9 >M<-1>, slik som minst 10<12 >M<-1>; og spesielt med en KD mindre enn 500 nM, fortrinnsvis mindre enn 200 nM, mer foretrukket mindre enn 10 nM, slik som mindre enn 500 pM. KD og KA verdiene til Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen mot TNF-alfa kan bli bestemt på en måte kjent per se, for eksempel ved å anvende assayet beskrevet heri.
I følge en annen foretrukket, men ikke-begrensende utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen (a) har CDR1 en lengde på mellom 1 og 12 aminosyreresidier, og vanligvis mellom 2 og 9 aminosyreresidier, slik som 5, 6 eller 7 aminosyreresidier; og/eller (b) har CDR2 en lengde på mellom 13 og 24 aminosyreresidier, og vanligvis mellom 15 og 21 aminosyreresidier, slik som 16 og 17 aminosyreresidier; og/eller (c) CDR3 har en lengde på mellom 2 og 35 aminosyreresidier, og vanligvis mellom 3 og 30 aminosyreresidier, slik som mellom 6 og 23 aminosyreresidier.
I ett aspekt, fremskaffer den foreliggende oppfinnelsen Nanobodies mot TNF-alfa som er bedre utøvende enn Nanobody 3E, det beste utøvende Nanobodiet i følge WO 04/041862.
Mer spesifikt, er noen foretrukne aspekter av denne utførelsesformen av den foreliggende oppfinnelsen:
XXI) Et Nanobody mot TNF-alfa, som består av 4 rammeverkregioner (FR1 til FR4 respektivt) og 3 komplementaritetsbestemmende regioner (CDR1 til CDR3 respektivt), som har en Koff rate for TNF på bedre enn 2.10-3 (1/s), fortrinnsvis bedre enn 1.10-3 (1/s); eller en humanisert variant av et slikt Nanobody. XXII) Et Nanobody mot TNF-alfa, som består av 4 rammeverkregioner (FR1 til FR4 respektivt) og 3 komplementaritetsbestemmende regioner (CDR1 til CDR3 respektivt), som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), til WO 04/041862 som er bedre enn EC50 verdien til Nanobody VHH 3E (SEQ ID NO:4) til WO 04/041862 i det samme assayet; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
XXIII) Et Nanobody mot TNF-alfa, som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), til WO 04/041862 som er bedre enn 12nM; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
XXIV) Et Nanobody mot TNF-alfa, som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), til WO 04/041862 som er bedre enn 5nM; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
XXV) Et Nanobody mot TNF-alfa, som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), til WO 04/041862 som er bedre enn 3nM; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody;
med noen spesielt foretrukne aspekter som er:
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), som er et GLEW-klasse Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), som inneholder et argininresidie (R) i posisjon 103.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), som er et humanisert Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), som inneholder et leucinresidie (L) i posisjon 108.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av aminosyresekvensene til SEQ ID NO 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) eller 96 (TNF30).
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der
a) CDR1 omfatter:
- aminosyresekvensen DYWMY; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen DYWMY; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen DYWMY;
og
b) CDR2 omfatter:
- aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG;
og
c) CDR3 omfatter:
- aminosyresekvensen SPSGFN; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen SPSGFN; eller - en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der CDR1 omfatter aminosyresekvensen DYWMY.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der CDR2 omfatter aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der CDR3 omfatter aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der:
- CDR1 omfatter aminosyresekvensen DYWMY; og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SPSGFN; eller
- CDR1 omfatter aminosyresekvensen DYWMY; og CDR2 omfatter aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- CDR2 omfatter aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der CDR1 omfatter aminosyresekvensen DYWMY; og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der CDR1 omfatter aminosyresekvensen DYWMY; CDR2 omfatter aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SPSGFN. - Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der
a) CDR1 er:
- aminosyresekvensen DYWMY; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen DYWMY; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen DYWMY;
og der:
b) CDR2 er:
- aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG;
og der
c) CDR3 er:
- aminosyresekvensen SPSGFN; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen SPSGFN; eller - en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der CDR1 er aminosyresekvensen DYWMY.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der CDR2 er aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der CDR3 er aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der:
- CDR1 er aminosyresekvensen DYWMY; og CDR3 er aminosyresekvensen SPSGFN; eller
- CDR1 er aminosyresekvensen DYWMY; og CDR2 er aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- CDR2 er aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; og CDR3 er aminosyresekvensen SPSGFN
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der CDR1 er aminosyresekvensen DYWMY; og CDR3 er aminosyresekvensen SPSGFN. - Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der CDR1 er aminosyresekvensen DYWMY; CDR2 er aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG og CDR3 er aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der
- en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon; og/eller
- ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over.
og med noen andre spesielt foretrukne aspekter som er:
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), som er et KERE-klasse Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av aminosyresekvensene til SEQ ID NO 50 (TNF3), 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) eller 98 (TNF33).
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der
a) CDR1 omfatter:
- aminosyresekvensen NYYMG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen NYYMG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen NYYMG;
og
b) CDR2 omfatter:
- aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG;
og
c) CDR3 omfatter:
- aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der CDR1 omfatter aminosyresekvensen NYYMG.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der CDR2 omfatter aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der CDR3 omfatter aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der:
- CDR1 omfatter aminosyresekvensen NYYMG; og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY; eller
- CDR1 omfatter aminosyresekvensen NYYMG; og CDR2 omfatter aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; eller
- CDR2 omfatter aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der CDR1 omfatter aminosyresekvensen NYYMG; CDR2 omfatter aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY og CDR3 omfatter aminosyresekvensen ILPLSDDPGWNTY.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der
a) CDR1 er:
- aminosyresekvensen NYYMG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen NYYMG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen NYYMG;
og
b) CDR2 er:
- aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG;
og
c) CDR3 er:
- aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der CDR1 er aminosyresekvensen NYYMG.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der CDR2 er aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der CDR3 er aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der:
- CDR1 er aminosyresekvensen NYYMG; og CDR3 er aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY; eller
- CDR1 er aminosyresekvensen NYYMG; og CDR2 er aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; eller
- CDR2 er aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; og CDR3 er aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der CDR1 er aminosyresekvensen NYYMG; CDR2 er aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY og CDR3 er aminosyresekvensen ILPLSDDPGWNTY. - Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), der
- en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon; og/eller
- ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over.
- Et Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), som er et humanisert Nanobody.
og med enda noen andre spesielt foretrukne aspekter som er:
XXVI) Et protein eller polypeptid, som omfatter eller essensielt består av minst ett Nanobody i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV).
XXVII) Et protein eller polypeptid, som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV).
XXVIII) Et protein eller polypeptid, som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), og som er slik som ovennevnte protein eller polypeptid, ved binding til en TNF trimer, er i stand til å inhibere eller redusere TNF reseptor kryssbindingen som er mediert av ovennevnte TNF trimer og/eller signaltransduksjonen som er mediert av slik reseptor kryssbinding.
XXIX) Et protein eller polypeptid, som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), og som er i stand til intramolekylær binding til minst to TNF reseptor bindingsseter på en TNF trimer.
XXX) Et protein eller polypeptid, som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), forbundet via en egnet linker.
XXXI) Et protein eller polypeptid, som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), forbundet via en egnet linker, og som er pegylert.
XXXII) Et protein eller polypeptid som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), og som videre omfatter minst ett Nanobody rettet mot humant serum albumin.
XXXIII) Et protein eller polypeptid som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), og som videre omfatter minst ett Nanobody rettet mot humant serum albumin, og som er slik som ovennevnte protein eller polypeptid, ved binding til en TNF trimer, er i stand til å inhibere eller redusere TNF reseptor kryssbindingen som er mediert av ovennevnte TNF trimer og/eller signaltransduksjonen som er mediert av slik reseptor kryssbinding.
XXXIV) Et protein eller polypeptid som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), og som videre omfatter minst ett Nanobody rettet mot humant serum albumin og som er i stand til intramolekylær binding til minst to TNF reseptor bindingsseter på en TNF trimer.
XXXV) Et protein eller polypeptid som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), og som videre omfatter et Nanobody rettet mot humant serum albumin, der hver av de to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV) er forbundet, valgfritt via en egnet linker, til det ene Nanobodiet som er rettet mot humant serum albumin.
XXXVI) Et protein eller polypeptid som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), og som videre omfatter ett Nanobody rettet mot humant serum albumin, der hver av de to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV) er forbundet, valgfritt via en egnet linker, til det ene Nanobodiet som er rettet mot humant serum albumin, og som er slik som ovennevnte protein eller polypeptid, ved binding til en TNF trimer, er i stand til å inhibere eller redusere TNF reseptor kryssbindingen som er mediert av ovennevnte TNF trimer og/eller signaltransduksjonen som er mediert av slik reseptor kryssbinding.
XXXVII) Et protein eller polypeptid som omfatter to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), og som videre omfatter et Nanobody rettet mot humant serum albumin, der hver av de to Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV) er forbundet, valgfritt via en egnet linker, til det ene Nanobodiet som er rettet mot humant serum albumin, og som er i stand til intramolekylær binding til minst to TNF reseptor bindingsseter på en TNF trimer.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XXVI) til XXXVII), der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er et humanisert Nanobody.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XXVI) til XXXVII), der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er en humanisert variant av Nanobodiet ALB 1 (SEQ ID NO: 63).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XXVI) til XXXVII), der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er et valgt fra gruppen som består av ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID
NO: 88), ALB 5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB 8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) og ALB 10 (SEQ ID NO: 104).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XXVI) til XXXVII), der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er ALB 8.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XXVI) til XXXVII), som omfatter eller essensielt består av to humaniserte Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV), og en humanisert variant av Nanobodiet ALB 1 (SEQ ID NO: 63).
Det skulle det bli notert at når et Nanobody er nevnt over som å være “i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV) over”, er det minst i følge en av XXI) til XXV), kan være i følge to eller flere av XXI) til XXV), og kan også inkludere en hvilken som helst av ett eller flere av de andre aspektene som er indikert som å være “i henhold til en hvilken som helst av XXI) til XXV) over. På lignende måte, når et protein eller polypeptid er nevnt over som å være “i henhold til en hvilken som helst av XXVI) til XXXVII) over”, er det minst i følge en av XXVI) til XXXVII), kan være i følge to eller flere av XXVI) til XXXVII), og kan også inkludere en hvilken som helst av ett eller flere av de andre aspektene som er indikert som å være “i henhold til en hvilken som helst av XXVI) til XXXVII) over.
En klon som har blitt funnet å være spesielt nyttig som et anti-TNF Nanobody er klonen PMP1C2 (TNF1). Som kan bli sett fra de komparative data fra KYM-assayet i Tabell 39, har TNF1 en EC50 verdi som er mer enn 4 ganger bedre enn det beste monovalente Nanobodiet beskrevet i WO 04/41862 (Nanobody 3E), dvs.
2,466 nM for PMP1C2 vs. 12 nM for 3E (Som kan bli sett fra Tabell 39, ga alle Nanobodies TNF1 til TNF 9 av den foreliggende oppfinnelsen en bedre EC50 verdi i dette assayet enn 3E). I dette henseendet, skulle det også bli notert at Nanobody 3E fra WO 04/41862 tilhører “KERE klassen” (som beskrevet heri), og kan derfor bli humanisert i en mindre grad enn Nanobody PMP1C2 (som tilhører “GLEW klassen”). Når Nanobody PMP1C2 er sammenlignet med Nanobodiet 1A fra WO 04/41862, et GLEW-klasse Nanobody med den høysete graden av sekvenshomologi med PMP1C2 (i begge CDR’ene og rammeverkene), er EC50 verdien ervervet for PMP1C2 i KYM assayet mer enn 50 ganger bedre, dvs.2.466 nM for PMP1C2 sammenlignet med 100 nM for 1A.
Følgelig, er Nanobodies som omfatter en eller flere, fortrinnsvis hvilke som helst to og mer foretrukket alle tre av CDR’ene foreliggende i klonen PMP1C2 (eller CDR sekvenser som er avledet derfra eller korresponderer dertil) spesielt foretrukket i den foreliggende oppfinnelsen. Disse Nanobodies tilhører også fortrinnsvis “103 P,R,S gruppen” (som definert heri), og mest foretrukket har en R i posisjon 103, og fortrinnsvis også har GLEW eller en GLEW-lignende sekvens i posisjoner 44-47. Også, når disse Nanobodies tilhøre “103 P, R, S gruppen” (og spesielt når de har en R i posisjon 103), er en foretrukket, men ikke-begrensende humaniserende substitusjon 108Q til 108L. Andre foretrukne, men ikkebegrensende humaniserende substitusjoner i disse foretrukne Nanobodies er en eller flere av de foreliggende i de humaniserte variantene av TNF1 beskrevet heri, slik som TNF13, TNF14, TNF 29 eller TNF30, som umiddelbart vil bli klart fra en sammenligning mellom sekvensen til TNF1 og disse humaniserte sekvensene.
Derfor, i et spesielt foretrukket Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen, er minst en av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene foreliggende passende valgt fra gruppen som består av CDR1 sekvensen til SEQ ID NO: 164, CDR2 sekvensen til SEQ ID NO: 232, og CDR3 sekvensen til SEQ ID NO: 300, respektivt (dvs. CDR sekvensene foreliggende i klon TNF1), eller fra gruppen av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser, respektivt, som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% “sekvensidentitet” (som definert heri) med CDR1 sekvensen til SEQ ID NO: 164, CDR2 sekvensen til SEQ ID NO: 232, og CDR3 sekvensen til SEQ ID NO: 300, respektivt; og/eller fra gruppen som består av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, respektivt, som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med CDR1 sekvensen til SEQ ID NO: 164, CDR2 sekvensen til SEQ ID NO: 232, og CDR3 sekvensen til SEQ ID NO: 300, respektivt.
Fortrinnsvis, i disse foretrukne Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, er minst to av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene foreliggende passende valgt fra gruppen som består av CDR1 sekvensen til SEQ ID NO: 164, CDR2 sekvensen til SEQ ID NO: 232, og CDR3 sekvensen til SEQ ID NO: 300, respektivt (dvs. CDR sekvensene foreliggende i klon TNF1), eller fra gruppen som består av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser, respektivt, som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med CDR1 sekvensen til SEQ ID NO: 164, CDR2 sekvensen til SEQ ID NO: 232, og CDR3 sekvensen til SEQ ID NO: 300, respektivt; og/eller fra gruppen som består av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, respektivt, som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” med CDR1 sekvensen til SEQ ID NO: 164, CDR2 sekvensen til SEQ ID NO: 232, og CDR3 sekvensen til SEQ ID NO: 300, respektivt.
Mest foretrukket, i disse foretrukne Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, er alle tre CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser foreliggende passende valgt fra gruppen som består av CDR1 sekvensen til SEQ ID NO: 164, CDR2 sekvensen til SEQ ID NO: 232, og CDR3 sekvensen til SEQ ID NO: 300, respektivt (dvs. CDR sekvensene foreliggende i klon TNF1), eller fra gruppen av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvenser, respektivt, som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med CDR1 sekvensen til SEQ ID NO: 164, CDR2 sekvensen til SEQ ID NO: 232, og CDR3 sekvensen til SEQ ID NO: 300, respektivt; og/eller fra gruppen som består av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene, respektivt, som har 3, 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med CDR1 sekvensen til SEQ ID NO: 164, CDR2 sekvensen til SEQ ID NO: 232, og CDR3 sekvensen til SEQ ID NO: 300, respektivt.
Enda mer foretrukket, i disse foretrukne Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, er minst en av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene foreliggende passende valgt fra gruppen som består av CDR1 sekvensen til SEQ ID NO: 164, CDR2 sekvensen til SEQ ID NO: 232, og CDR3 sekvensen til SEQ ID NO: 300, respektivt (dvs. CDR sekvensene foreliggende i klon TNF1). Fortrinnsvis, i denne utførelsesformen, er minst en eller fortrinnsvis begge av de andre to CDR sekvensene foreliggende passende valgt fra CDR sekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med CDR1 sekvensen til SEQ ID NO: 164, CDR2 sekvensen til SEQ ID NO: 232, og CDR3 sekvensen til SEQ ID NO: 300, respektivt; og/eller passende valgt fra gruppen som består av CDR sekvensene som har 3, 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med CDR1 sekvensen til SEQ ID NO: 164, CDR2 sekvensen til SEQ ID NO: 232, og CDR3 sekvensen til SEQ ID NO: 300, respektivt.
Enda mer foretrukket, i disse foretrukne Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, er minst to av CDR1, CDR2 og CDR3 sekvensene foreliggende passende valgt fra gruppen som består av CDR1 sekvensen til SEQ ID NO: 164, CDR2 sekvensen til SEQ ID NO: 232, og CDR3 sekvensen til SEQ ID NO: 300, respektivt (dvs. CDR sekvensene foreliggende i klon TNF1). Fortrinnsvis, i denne utførelsesformen, er den gjenværende CDR sekvensen foreliggende passende valgt fra gruppen CDR sekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med CDR1 sekvensen til SEQ ID NO: 164, CDR2 sekvensen til SEQ ID NO: 232, og CDR3 sekvensen til SEQ ID NO: 300, respektivt; og/eller fra gruppen som består av CDR sekvenser som har 3, 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med CDR1 sekvensen til SEQ ID NO: 164, CDR2 sekvensen til SEQ ID NO: 232, og CDR3 sekvensen til SEQ ID NO: 300, respektivt.
Spesielt foretrukne Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen omfatter CDR1 sekvensen til SEQ ID NO: 164, CDR2 sekvensen til SEQ ID NO: 232, og CDR3 sekvensen til SEQ ID NO: 300, respektivt (dvs. CDR sekvensene foreliggende i klon TNF1).
Nanobodies med CDR sekvensene over har fortrinnsvis rammeverksekvenser som er som videre definert heri. Noen spesielt foretrukne, men ikke-begrensende kombinasjoner av rammeverk sekvenser kan bli sett i Tabell I over. Som vil være klart for den faglærte personen, vil en kombinasjon av FR1, FR2, FR3 og FR4 sekvenser som forekommer i den samme klonen (dvs. FR1, FR2, FR3 og FR4 sekvenser som er nevnt på den samme linjen i Tabell I) vanligvis bli foretrukket (selv om den foreliggende oppfinnelsen i sin videste forstand ikke er begrenset dertil, og også omfatter andre egnede kombinasjoner av rammeverksekvensene nevnt i Tabell I).
Mer spesifikt, er noen foretrukne aspekter av denne utførelsesformen av den foreliggende oppfinnelsen:
XXXVIII) Et Nanobody mot TNF-alfa, som består av 4 rammeverkregioner (FR1 til FR4 respektivt) og 3 komplementaritetsbestemmende regioner (CDR1 til CDR3 respektivt), der:
a) CDR1 omfatter:
- aminosyresekvensen DYWMY; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen DYWMY; eller
- en aminosyresekvens som har bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen DYWMY;
og
b) CDR2 omfatter:
- aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG;
og
c) CDR3 omfatter:
- aminosyresekvensen SPSGFN; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen SPSGFN; eller - en aminosyresekvens som har bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et Nanobody i henhold til XXXVIII), der CDR1 omfatter aminosyresekvensen DYWMY.
- Et Nanobody i henhold til XXXVIII), der CDR2 omfatter aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG.
- Et Nanobody i henhold til XXXVIII), der CDR3 omfatter aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et Nanobody i henhold til XXXVIII), der:
- CDR1 omfatter aminosyresekvensen DYWMY; og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SPSGFN; eller
- CDR1 omfatter aminosyresekvensen DYWMY; og CDR2 omfatter aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- CDR2 omfatter aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et Nanobody i henhold til XXXVIII), der CDR1 omfatter aminosyresekvensen DYWMY; og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et Nanobody i henhold til XXXVIII) der CDR1 omfatter aminosyresekvensen DYWMY; CDR2 omfatter aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et Nanobody i henhold til XXXVIII) , der
- en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon; og/eller
- ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over.
- Et Nanobody i henhold til XXXVIII), som er et GLEW-klasse Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til XXXVIII), som inneholder et argininresidie (R) i posisjon 103.
- Et Nanobody i henhold til XXXVIII), som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av aminosyresekvensene til SEQ ID NO 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) eller 96 (TNF30). - Et Nanobody i henhold til XXXVIII), som er et humanisert Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til XXXVIII), som inneholder et leucinresidie (L) i posisjon 108.
- Et Nanobody i henhold til XXXVIII), som har en Koff rate for TNF på bedre enn 2.10-3 (1/s), fortrinnsvis bedre enn 1.10-3 (1/s); eller en humanisert variant av et slikt Nanobody;
- Et Nanobody i henhold til XXXVIII), som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn EC50 verdien til Nanobody VHH 3E (SEQ ID NO:4) til WO 04/041862 i det samme assayet; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til XXXVIII), som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn 5nM; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til XXXVIII), som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn 3nM; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
XXXIX) Et Nanobody mot TNF-alfa, som består av 4 rammeverkregioner (FR1 til FR4 respektivt) og 3 komplementaritetsbestemmende regioner (CDR1 til CDR3 respektivt), der
a) CDR1 er:
- aminosyresekvensen DYWMY; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen DYWMY; eller
- en aminosyresekvens som har bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen DYWMY;
og der:
b) CDR2 er:
- aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG;
og der
c) CDR3 er:
- aminosyresekvensen SPSGFN; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen SPSGFN; eller - en aminosyresekvens som har bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et Nanobody i henhold til XXXIX), der CDR1 er aminosyresekvensen DYWMY.
- Et Nanobody i henhold til XXXIX), der CDR2 er aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG.
- Et Nanobody i henhold til XXXIX), der CDR3 er aminosyresekvensen SPSGFN
- Et Nanobody i henhold til XXXIX), der:
- CDR1 er aminosyresekvensen DYWMY; og CDR3 er aminosyresekvensen SPSGFN; eller
- CDR1 er aminosyresekvensen DYWMY; og CDR2 er aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; eller
- CDR2 er aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG; og CDR3 er aminosyresekvensen SPSGFN
- Et Nanobody i henhold til XXXIX), der CDR1 er aminosyresekvensen DYWMY; og CDR3 er aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et Nanobody i henhold til XXXIX), der CDR1 er aminosyresekvensen DYWMY; CDR2 er aminosyresekvensen EINTNGLITKYPDSVKG og CDR3 er aminosyresekvensen SPSGFN.
- Et Nanobody i henhold til XXXIX), der:
- en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon; og/eller
- ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over.
- Et Nanobody i henhold til XXXIX), som er et GLEW-klasse Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til XXXIX), som inneholder et argininresidie (R) i posisjon 103.
- Et Nanobody i henhold til XXXIX), som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av aminosyresekvensene til SEQ ID NO 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) eller 96 (TNF30).
- Et Nanobody i henhold til XXXIX), som er et humanisert Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til XXXIX), som inneholder et leucinresidie (L) i posisjon 108.
- Et Nanobody i henhold til XXXIX), som har en Koff rate for TNF på bedre enn 2.10-3 (1/s), fortrinnsvis bedre enn 1.10-3 (1/s); eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til XXXIX), som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn EC50 verdien til Nanobody VHH 3E (SEQ ID NO:4) av WO 04/041862 i det samme assayet eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til XXXIX), som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn 5nM; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til XXXIX), som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn 3nM; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til XXXIX), som er valgt fra gruppen som består av
TNF 13 (SEQ ID NO: 76), TNF 14 (SEQ ID NO: 77), TNF 29 (SEQ ID NO: 95)
og TNF 30 (SEQ ID NO:96).
- Et Nanobody i henhold til XXXIX), som er TNF 30 (SEQ ID NO: 96); med noen andre foretrukne aspekter som er:
XL) Et protein eller polypeptid, som omfatter eller essensielt består av et Nanobody i henhold til XXXVIII) eller XXXIX).
XLI) Et protein eller polypeptid, som omfatter eller essensielt består av minst ett Nanobody i henhold til XXXVIII) eller XXXIX) .
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI), som omfatter to Nanobodies i henhold til XXXVIII) eller XXXIX) .
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI), som omfatter to Nanobodies i henhold til XXXVIII) eller XXXIX), og som er slik at ovennevnte protein eller polypeptid, ved binding til en TNF trimer, er i stand til å inhibere eller redusere TNF reseptor kryssbindingen som er mediert av ovennevnte TNF trimer og/eller signaltransduksjonen som er mediert av slik reseptor kryssbinding.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI), som omfatter to Nanobodies i henhold til XXXVIII) eller XXXIX), og som er i stand til intramolekylær binding til minst to TNF reseptor bindingsseter på en TNF trimer.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI), som omfatter to Nanobodies i henhold til XXXVIII) eller XXXIX), som er direkte forbundet til hverandre eller forbundet til hverandre via en linker.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI), som omfatter to Nanobodies i henhold til XXXVIII) eller XXXIX), som er forbundet til hverandre via en aminosyresekvens.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI), som omfatter to Nanobodies i henhold til XXXVIII) eller XXXIX), som er forbundet til hverandre via en aminosyresekvens (slik som, uten begrensning, en aminosyresekvens som omfatter glycin- og serin-residier ) som omfatter minst 14 aminosyrer, mer foretrukket minst 17 aminosyrer, slik som omtrent 20-40 aminosyrer (slik som linkeren GS30).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI), som omfatter eller essensielt består av polypeptidet TNF 7 (SEQ ID NO: 73), der begge Nanobodies TNF 1 har blitt humanisert.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI), som omfatter eller essensielt består av polypeptidet TNF 55 (SEQ ID NO: 419) eller TNF 56 (SEQ ID NO: 420).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI), som er pegylert.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI), som omfatter to Nanobodies i henhold til XXXVIII) eller XXXIX), og som er slik at ovennevnte protein eller polypeptid, ved binding til en TNF trimer, er i stand til å inhibere eller redusere TNF reseptor kryssbindingen som er mediert av ovennevnte TNF trimer og/eller signaltransduksjonen som er mediert av slik reseptor kryssbinding; og/eller som er slik som ovennevnte protein eller polypeptid er i stand til intramolekylær binding til minst to TNF reseptor bindingsseter på en TNF trimer, og som protein eller polypeptid videre omfatter minst ett Nanobody rettet mot humant serum albumin.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI), som omfatter to Nanobodies i henhold til XXXVIII) eller XXXIX), og som protein eller polypeptid videre omfatter minst ett Nanobody rettet mot humant serum albumin, der de to Nanobodies i henhold til XXXVIII) eller XXXIX) er forbundet til hverandre via minst det ene av Nanobodies rettet mot humant serum albumin, og der de to Nanobodies i henhold til XXXVIII) eller XXXIX) er enten forbundet direkte til minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin, eller er forbundet til minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin via en linker.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI), som omfatter to Nanobodies i henhold til XXXVIII) eller XXXIX), og som protein eller polypeptid videre omfatter minst ett Nanobody rettet mot humant serum albumin, der de to Nanobodies i henhold til XXXVIII) eller XXXIX) er forbundet til hverandre via minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin, og der de to Nanobodies i henhold til XXXVIII) eller XXXIX) er enten forbundet direkte til minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin, eller er forbundet til minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin via en linker, der linkeren er en aminosyresekvens (slik som, uten begrensning, en linker som omfatter glycin- og serin-residier), og spesielt en aminosyresekvens som omfatter mellom 3 og 40 aminosyreresidier, slik som mellom 5 og 15 aminosyreresidier (slik som linkeren GS9).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI), som omfatter to Nanobodies i henhold til XXXVIII) eller XXXIX), og som protein eller polypeptid videre omfatter minst ett Nanobody rettet mot humant serum albumin, der de to Nanobodies i henhold til XXXVIII) eller XXXIX) er forbundet til hverandre via minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin, og der de to Nanobodies i henhold til XXXVIII) eller XXXIX) er enten forbundet direkte til minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin, eller er forbundet til minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin via en linker, og som protein eller polypeptid er slik som ovennevnte protein eller polypeptid, ved binding til en TNF trimer, er i stand til å inhibere eller redusere TNF reseptor kryssbindingen som er mediert av ovennevnte TNF trimer og/eller signaltransduksjonen som er mediert av slik reseptor kryssbinding; og/eller som protein eller polypeptid er slik som ovennevnte protein eller polypeptid er i stand til intramolekylær binding til minst to TNF reseptor bindingsseter på en TNF trimer.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI), der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er et humanisert Nanobody.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI), der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er en humanisert variant av Nanobodiet ALB 1 (SEQ ID NO: 63).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI), der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er et valgt fra gruppen som består av ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB
5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB
8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) og ALB 10 (SEQ ID NO: 104). - Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI), der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er ALB 8. - Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI), som omfatter eller essensielt består av to humaniserte Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI) og en humanisert variant av Nanobodiet ALB 1 (SEQ ID NO: 63).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI), som omfatter eller essensielt består av polypeptidet TNF24 (SEQ ID NO: 90), der både Nanobodiet TNF 1 så vel som Nanobodiet ALB 1 har blitt humanisert. - Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI), som omfatter eller essensielt består av to Nanobodies TNF 30 og ett Nanobody ALB 8.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI), som omfatter eller essensielt består av polypeptidet TNF 60 (SEQ ID NO: 417).
Det skulle bli notert at når et Nanobody er nevnt over som å være “i henhold til XXXVIII” eller “i henhold til XXXIX”, er det minst i følge en av XXXVIII) og/eller XXXIX), og kan også inkludere et hvilket som helst av ett eller flere av de andre aspektene som er indikert som å være “i henhold til XXXVIII” eller “i henhold til XXXIX” over. På lignende måte, når et protein eller polypeptid er nevnt over som å være “i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI)”, er det minst i følge en av XL) til XLI), kan være i følge to eller flere av VI) til XVIII), og kan også inkludere en hvilken som helst av ett eller flere av de andre aspektene som er indikert som å være “i henhold til en hvilken som helst av XL) eller XLI) over.
For Nanobodies basert på Nanobody TNF1 over (inkludert men ikke begrenset til de humaniserte Nanobodies), kan rammeverksekvensene generelt være som beskrevet heri, og er fortrinnsvis som følgende:
a) FR1 omfatter eller er:
- aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 130; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 130; eller
- en aminosyresekvens som har bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 130;
og
b) FR2 omfatter eller er:
- aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 198; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 198; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 198;
og
c) FR3 omfatter eller er:
- aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 266; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 266; eller
- en aminosyresekvens som har bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 266.
og
d) FR4 omfatter eller er:
- aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 334; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 334; eller
- en aminosyresekvens som har bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 334;
der aminosyreforskjellene foreliggende i rammeverksekvensene er mer foretrukket som beskrevet heri.
Nanobodies mot TNF-alfa, som har rammeverkregioner som beskrevet over (dvs. lignende til TNF1), og der minst en av rammeverkregionene (slik som hvilke som helst to, hvilke som helst tre eller alle fire rammeverk regioner) har blitt humanisert, danner et videre aspekt av den foreliggende oppfinnelsen. Slike Nanobodies kan spesielt ha CDR’er som er slik at Nanobodiet har en Koff rate for TNF på bedre enn 2.10-3 (1/s), fortrinnsvis bedre enn 1.10-3 (1/s); og/eller har CDR’er som er slik at Nanobodiet har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), til WO 04/041862 som er bedre enn EC50 verdien til Nanobody VHH 3E (SEQ ID NO:4) til WO 04/041862 i det samme assayet; og spesielt bedre enn 12nM, mer spesielt bedre enn 5 nM, enda mer spesielt bedre enn 3nM. Slike Nanobodies er fortrinnsvis også, eller alternativt, rettet mot den samme epitopen til TNF (dvs. TNF trimeren) som TNF1.
Spesielt, relateres den foreliggende oppfinnelsen til et Nanobody mot TNF-alfa, som er en humanisert variant av et Nanobody mot TNF-alfa, hvilket Nanobody mot TNF-alfa har de følgende rammeverk sekvensene: FR1: SEQ ID NO: 130; FR2: SEQ ID NO: 198; FR3: SEQ ID NO: 266; og FR4: SEQ ID NO: 334. Et slikt Nanobody kan spesielt har CDR’er som er slik at Nanobodiet har en Koff rate for TNF på bedre enn 2.10-3 (1/s), fortrinnsvis bedre enn 1.10-3 (1/s); og/eller har CDR’er som er slik at Nanobodiet har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn EC50 verdien til Nanobody VHH 3E (SEQ ID NO:4) av WO 04/041862 i det samme assayet; og spesielt bedre enn 12nM, mer spesielt bedre enn 5 nM, enda mer spesielt bedre enn 3nM. Også, eller alternativt, er slike Nanobodies fortrinnsvis rettet mot den samme epitopen til TNF (dvs. TNF trimeren) som TNF1.
En annen klon som har blitt funnet å være spesielt nyttig som et anti-TNF Nanobody er klonen PMP5F10 (TNF3, SEQ ID NO: 60). Som kan bli sett fra de komparative data fra KYM-assayet i Tabell 39, har TNF3 en EC50 verdi som er mer enn 15 ganger bedre enn det beste monovalente Nanobodiet beskrevet i WO 04/41862.
Således, Nanobodies som omfatter en eller flere, fortrinnsvis hvilke som helst to og mer foretrukket alle tre av CDR’ene foreliggende i klonen PMP5F10 (eller CDR sekvenser som er avledet derfra eller korresponderer dertil) er spesielt foretrukket i den foreliggende oppfinnelsen. Disse Nanobodies tilhører også fortrinnsvis KERE klassen.
Mer spesifikt, er noen foretrukne aspekter av denne utførelsesformen av den foreliggende oppfinnelsen:
XLII) Et Nanobody mot TNF-alfa, som består av 4 rammeverkregioner (FR1 to FR4 respektivt) og 3 komplementaritetsbestemmende regioner (CDR1 to CDR3 respektivt), der
a) CDR1 omfatter:
- aminosyresekvensen NYYMG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen NYYMG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen NYYMG;
og
b) CDR2 omfatter:
- aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG;
og
c) CDR3 omfatter:
- aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY.
- Et Nanobody i henhold til XLII), der CDR1 omfatter aminosyresekvensen NYYMG.
- Et Nanobody i henhold til XLII), der CDR2 omfatter aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG.
- Et Nanobody i henhold til XLII), der CDR3 omfatter aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY.
- Et Nanobody i henhold til XLII), der:
- CDR1 omfatter aminosyresekvensen NYYMG; og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY; eller
- CDR1 omfatter aminosyresekvensen NYYMG; og CDR2 omfatter aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; eller
- CDR2 omfatter aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; og CDR3 omfatter aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY.
- Et Nanobody i henhold til XLII), der CDR1 omfatter aminosyresekvensen NYYMG; CDR2 omfatter aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY og CDR3 omfatter aminosyresekvensen ILPLSDDPGWNTY.
- Et Nanobody i henhold til XLII), der
- en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon; og/eller
- ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over.
- Et Nanobody i henhold til XLII), som er et KERE-klasse Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til XLII), som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av aminosyresekvensene til SEQ ID NO 50 (TNF3), 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) eller 99 (TNF33).
- Et Nanobody i henhold til XLII), som er et humanisert Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til XLII), som har en Koff rate for TNF på bedre enn 2.10<-3 >(1/s), fortrinnsvis bedre enn 1.10<-3 >(1/s); eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til XLII), som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn EC50 verdien til Nanobody VHH 3E (SEQ ID NO:4) av WO 04/041862 i det samme assayet; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til XLII), som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn 5nM; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til XLII), som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn 3nM; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
XLIII) Et Nanobody mot TNF-alfa, som består av 4 rammeverkregioner (FR1 til FR4 respektivt) og 3 komplementaritetsbestemmende regioner (CDR1 til CDR3 respektivt), der
a) CDR1 er:
- aminosyresekvensen NYYMG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen NYYMG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen NYYMG;
og
b) CDR2 er:
- aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG;
og
c) CDR3 er:
- aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY.
- Et Nanobody i henhold til XLIII), der CDR1 er aminosyresekvensen NYYMG. - Et Nanobody i henhold til XLIII), der CDR2 er aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG.
- Et Nanobody i henhold til XLIII), der CDR3 er aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY.
- Et Nanobody i henhold til XLIII), der:
- CDR1 er aminosyresekvensen NYYMG; og CDR3 er aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY; eller
- CDR1 er aminosyresekvensen NYYMG; og CDR2 er aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; eller
- CDR2 er aminosyresekvensen NISWRGYNIYYKDSVKG; og CDR3 er aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY.
- Et Nanobody i henhold til XLIII), der CDR1 er aminosyresekvensen NYYMG;
CDR2 er aminosyresekvensen SILPLSDDPGWNTY og CDR3 er aminosyresekvensen ILPLSDDPGWNTY.
- Et Nanobody i henhold til XLIII), der
- en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon; og/eller
- ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over.
- Et Nanobody i henhold til XLIII), som er et KERE-klasse Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til XLIII), som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av aminosyresekvensene til SEQ ID NO 50 (TNF3), 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) eller 99 (TNF33).
- Et Nanobody i henhold til XLIII), som er et humanisert Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til XLIII), som har en Koff rate for TNF på bedre enn 2.10<-3 >(1/s), fortrinnsvis bedre enn 2.10<-3 >(1/s) ; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til XLIII), som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn EC50 verdien til Nanobody VHH 3E (SEQ ID NO:4) av WO 04/041862 i det samme assayet; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til XLIII), som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn 5nM; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til XLIII), som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn 3nM; eller en humanisert variant av et slikt Nanobody.
- Et Nanobody i henhold til XLIII), som er valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO, 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) eller 98
(TNF33)TNF 13 (SEQ ID NO: 76), TNF 14 (SEQ ID NO: 77), TNF 29 (SEQ ID
NO: 95) og TNF 30 (SEQ ID NO:96)
med noen andre foretrukne aspekter som er:
XLIV) Et protein eller polypeptid, som omfatter eller essensielt består av et Nanobody i henhold til XLII) eller XLIII).
XLV) Et protein eller polypeptid, som omfatter eller essensielt består av minst ett Nanobody i henhold til XLII) eller XLIII).
XLVI) Et protein eller polypeptid, som omfatter to Nanobodies i henhold til XLII) eller XLIII).
XLVII) Et protein eller polypeptid, som omfatter to Nanobodies i henhold til XLII) eller XLIII), og som er slik som ovennevnte protein eller polypeptid, ved binding til en TNF trimer, er i stand til å inhibere eller redusere TNF reseptor kryssbindingen som er mediert av ovennevnte TNF trimer og/eller signaltransduksjonen som er mediert av slik reseptor kryssbinding.
XLVIII) Et protein eller polypeptid, som omfatter to Nanobodies i henhold til XLII) eller XLIII), og som er i stand til intramolekylær binding til minst to TNF reseptor bindingsseter på en TNF trimer.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XLIV) eller XLVIII), som omfatter eller essensielt består av polypeptidet TNF 6 (SEQ ID NO: 72) eller TNF 9 (SEQ ID NO: 75, der begge Nanobodies TNF 3 har blitt humanisert.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XLIV) eller XLVIII), som er pegylert.
- Et protein eller polypeptid, som omfatter to Nanobodies i henhold til XLII) eller XLIII), og som er slik at ovennevnte protein eller polypeptid, ved binding til en TNF trimer, er i stand til å inhibere eller redusere TNF reseptor kryssbindingen som er mediert av ovennevnte TNF trimer og/eller signaltransduksjonen som er mediert av slik reseptor kryssbinding; og/eller som er slik at ovennevnte protein eller polypeptid er i stand til intramolekylær binding til minst to TNF reseptor bindingsseter på en TNF trimer, og hvilket protein eller polypeptid videre omfatter minst ett Nanobody rettet mot humant serum albumin.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XLIV) eller XLVIII), der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er et humanisert Nanobody.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XLIV) eller XLVIII), der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er en humanisert variant av Nanobodiet ALB 1 (SEQ ID NO: 63).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XLIV) eller XLVIII), der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er et valgt fra gruppen som består av ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO:
88), ALB 5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO:
101), ALB 8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) og ALB 10 (SEQ ID NO: 104).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XLIV) eller XLVIII), der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er ALB 8.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XLIV) eller XLVIII), som omfatter eller essensielt består av to humaniserte Nanobodies i henhold til en hvilken som helst av XLIV) eller XLVIII) og en humanisert variant av Nanobodiet ALB 1 (SEQ ID NO: 63).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av XLIV) eller XLVIII), som omfatter eller essensielt består av polypeptidet TNF26 (SEQ ID NO: 92), der begge Nanobodies TNF 3 så vel som Nanobodiet ALB 1 har blitt humanisert.
Det skulle bli notert at når et Nanobody er nevnt over som å være “i henhold til XLII” eller “i henhold til XLIII”, er det minst i følge en av XLII) og/eller XLIII), og kan også inkludere et hvilket som helst av ett eller flere av de andre aspektene som er indikert som å være “i henhold til XLII)” eller “i henhold til XLIII)” over. På lignende måte, når et protein eller polypeptid er nevnt over som å være “i henhold til en hvilken som helst av XLIV) eller XLVIII)”, er det minst i følge en av XL) til XLI), kan være i følge to eller flere av XLIV) til XLVIII), og kan også inkludere et hvilket som helst av ett eller fler av de andre aspektene som er indikert som å være “i henhold til en hvilken som helst av XLIV) eller XLVIII) over.
For Nanobodies basert på Nanobody TNF3 over (inkludert men ikke begrenset til de humaniserte Nanobodies), kan rammeverksekvensene generelt være som beskrevet heri, og er fortrinnsvis som følgende:
a) FR1 omfatter eller er:
- aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 138; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 138; eller
- en aminosyresekvens som har bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 138;
og
b) FR2 omfatter eller er:
- aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 206; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 206; eller
- en aminosyresekvens som har 2 eller bare 1 aminosyre forskjell(er) med aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 206;
og
c) FR3 omfatter eller er:
- aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 274; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 274; eller
- en aminosyresekvens som har bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 274.
og
d) FR4 omfatter eller er:
- aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 342; eller
- en aminosyresekvens som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 342; eller
- en aminosyresekvens som har bare 1 aminosyre forskjell med aminosyresekvensen til SEQ ID NO: 342;
der aminosyreforskjellene foreliggende i rammeverksekvensene er mer foretrukket som beskrevet heri.
I et annet aspekt, relateres den foreliggende oppfinnelsen til et Nanobody med en aminosyresekvens som er valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 52 til 60, fra gruppen som består av SEQ ID NO: 76 til 86, fra gruppen som består av SEQ ID NO: 95 til 99, fra gruppen som består av SEQ ID NO 105 til 129 eller fra gruppen som består av fra aminosyresekvenser som har mer enn 80%, fortrinnsvis mer enn 90%, mer foretrukket mer enn 95%, slik som 99% eller mer “sekvensidentitet” (som definert heri) med en eller flere av aminosyresekvensene til SEQ ID NO: 52 til 60, SEQ ID NO: 76 til 86, SEQ ID NO: 95 til 99 eller SEQ ID NO 105 til 129, der de sistnevnte aminosyresekvensene mest foretrukket har rammeverksekvenser som er som videre definert nedenfor under den generelle beskrivelsen av rammeverksekvensene til Nanobodies.
I følge en spesifikk, men ikke-begrensende utførelsesform, er de sistnevnte aminosyresekvensene “humanisert”, som videre beskrevet heri.
Mest foretrukket, er Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 52 til 60, fra gruppen som består av SEQ ID NO: 76 til 86, fra gruppen som består av SEQ ID NO: 95 til 99, eller fra gruppen som består av SEQ ID NO 105 til 129, hvis “humaniserte” Nanobodies til SEQ ID NO 76 til 86 og SEQ ID NO: 95 til 99 kan være spesielt foretrukket.
Som nevnt over, er et spesielt foretrukket Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen klonen PMP1C2 (TNF1; SEQ ID NO: 52). Derfor, i et foretrukket aspekt, relateres den foreliggende oppfinnelsen til et Nanobody med en aminosyresekvens som er valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 52 eller fra gruppen som består av fra aminosyresekvenser som har mer enn 80%, fortrinnsvis mer enn 90%, mer foretrukket mer enn 95%, slik som 99% eller mer “sekvensidentitet” (som definert heri) med aminosyresekvensen til SEQ ID NO:52, der de sistnevnte aminosyresekvensene mest foretrukket har rammeverksekvenser som er som videre definert nedenfor under den generelle beskrivelsen av rammeverksekvensene til Nanobodies.
Spesielt foretrukket er humaniserte varianter av klonen PMP1C2 (TNF1; SEQ ID NO: 52). Noen foretrukne, men ikke-begrensende eksempler på slike humaniserte varianter er klonene TNF13 (SEQ ID NO: 76 ), TNF14 (SEQ ID NO:77), TNF29 (SEQ ID NO: 95) og TNF 30 (SEQ ID NO: 96). Derfor, i et foretrukket aspekt, relateres den foreliggende oppfinnelsen til et humanisert Nanobody med en aminosyresekvens som er valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 76, 77, 95 eller 96, eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har mer enn 80%, fortrinnsvis mer enn 90%, mer foretrukket mer enn 95%, slik som 99% eller mer “sekvensidentitet” (som definert heri) med en av aminosyresekvensene til SEQ ID NO: 76, 77, 95 eller 96, der de sistnevnte aminosyresekvensene mest foretrukket har rammeverksekvenser som er som videre definert under den generelle beskrivelsen av rammeverksekvensene til Nanobodies.
I følge en foretrukket utførelsesform, er Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen en humanisert variant av Nanobodiet TNF 1 (SEQ ID NO: 52).
Noen foretrukne aspekter av denne utførelsesformen av den foreliggende oppfinnelsen er:
XLIX) En humanisert variant av Nanobodiet TNF 1, som har en Koff rate for TNF på bedre enn 2.10-3 (1/s), fortrinnsvis bedre enn 1.10-3 (1/s).
L) En humanisert variant av Nanobodiet TNF 1, som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn EC50 verdien til Nanobody VHH 3E (SEQ ID NO:4) av WO 04/041862 i det samme assayet.
LI) En humanisert variant av Nanobodiet TNF 1, som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn 5nM.
LII) En humanisert variant av Nanobodiet TNF 1, som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn 3nM.
LIII) Et protein eller polypeptid, som omfatter eller essensielt består av minst ett Nanobody som er en humanisert variant av Nanobodiet TNF 1 i henhold til en hvilken som helst av XLIX) til LII).
LIV) Et protein eller polypeptid, som omfatter eller essensielt består av to Nanobodies som er humaniserte varianter av Nanobodiet TNF 1 i henhold til en hvilken som helst av XLIX) til LII) (valgfritt forbundet via en linker).
LV) Et protein eller polypeptid, som omfatter eller essensielt består av to Nanobodies som er humaniserte varianter av Nanobodiet TNF 1 i henhold til en hvilken som helst av XLIX) til LII) (valgfritt forbundet via en linker), og som er slik at ovennevnte protein eller polypeptid, ved binding til en TNF trimer, er i stand til å inhibere eller redusere TNF reseptor kryssbindingen som er mediert av ovennevnte TNF trimer og/eller signaltransduksjonen som er mediert av slik reseptor kryssbinding.
LVI) Et protein eller polypeptid, som omfatter eller essensielt består av to Nanobodies som er humaniserte varianter av Nanobodiet TNF 1 i henhold til en hvilken som helst av XLIX) til LII) og som er i stand til intramolekylær binding til minst to TNF reseptor bindingsseter på en TNF trimer.
LVII) Et protein eller polypeptid som omfatter eller essensielt består av polypeptidet TNF 7 (SEQ ID NO: 73), der begge Nanobodies TNF 1 har blitt humanisert. LVIII) Et protein eller polypeptid som omfatter eller essensielt består av polypeptidet TNF 7 (SEQ ID NO: 73), der begge Nanobodies TNF 1 har blitt humanisert, og som er pegylert.
LIX) Et protein eller polypeptid, som omfatter eller essensielt består av to Nanobodies som er humaniserte varianter av Nanobodiet TNF 1 i henhold til en hvilken som helst av XLIX) til LII), og som videre omfatter minst ett Nanobody rettet mot humant serum albumin.
LX) Et protein eller polypeptid, som omfatter eller essensielt består av to Nanobodies som er humaniserte varianter av Nanobodiet TNF 1 i henhold til en hvilken som helst av XLIX) til LII), som hver er forbundet (valgfritt forbundet via en linker) til et Nanobody rettet mot humant serum albumin.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av LIII) til LX), der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er et humanisert Nanobody.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av LIII) til LX), der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er en humanisert variant av Nanobodiet ALB 1 (SEQ ID NO: 63).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av LIII) til LX), der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er et valgt fra gruppen som består av ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB
5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB
8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) og ALB 10 (SEQ ID NO: 104). - Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av LIII) til LX), der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er ALB 8.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av LIII) til LX), som omfatter eller essensielt består av polypeptidet TNF24 (SEQ ID NO: 90), der både Nanobodiet TNF 1 så vel som Nanobodiet ALB TNF 1 har blitt humanisert.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av LIII) til LX), som omfatter eller essensielt består av to Nanobodies TNF 30 og ett Nanobody ALB 8.
I følge en foretrukket utførelsesform, er Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen en humanisert variant av Nanobodiet TNF 3 (SEQ ID NO: 60).
Noen foretrukne aspekter av denne utførelsesformen av den foreliggende oppfinnelsen er:
LXI) En humanisert variant av Nanobodiet TNF 3, som har en Koff rate for TNF på bedre enn 2.10-3 (1/s), fortrinnsvis bedre enn 1.10-3 (1/s).
LXII) En humanisert variant av Nanobodiet TNF 3, som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn EC50 verdien til Nanobody VHH 3E (SEQ ID NO:4) av WO 04/041862 i det samme assayet.
LXIII) En humanisert variant av Nanobodiet TNF 3, som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn 5nM.
LXIV) En humanisert variant av Nanobodiet TNF 3, som har en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn 3nM.
LXV) Et protein eller polypeptid, som omfatter eller essensielt består av minst ett Nanobody som er en humanisert variant av Nanobodiet TNF 3 i henhold til en hvilken som helst av LXI) til LXIV).
LXVI) Et protein eller polypeptid, som omfatter eller essensielt består av to Nanobodies som er humaniserte varianter av Nanobodiet TNF 3 i henhold til en hvilken som helst av LXI) til LXIV) (valgfritt forbundet via en linker).
LXVII) Et protein eller polypeptid, som omfatter eller essensielt består av to Nanobodies som er humaniserte varianter av Nanobodiet TNF 3 i henhold til en hvilken som helst av LXI) til LXIV) (valgfritt forbundet via en linker), og som er slik at ovennevnte protein eller polypeptid, ved binding til en TNF trimer, er i stand til å inhibere eller redusere TNF reseptor kryssbindingen som er mediert av ovennevnte TNF trimer og/eller signaltransduksjonen som er mediert av slik reseptor kryssbinding.
LXVIII) Et protein eller polypeptid, som omfatter eller essensielt består av to Nanobodies som er humaniserte varianter av Nanobodiet TNF 3 i henhold til en hvilken som helst av LXI) til LXIV) og som er i stand til intramolekylær binding til minst to TNF reseptor bindingsseter på en TNF trimer.
LXIX) Et protein eller polypeptid som omfatter eller essensielt består av polypeptidet TNF 6 (SEQ ID NO: 72) eller TNF 9 (SEQ ID NO: 75), der begge Nanobodies TNF 3 har blitt humanisert.
LXX) Et protein eller polypeptid som omfatter eller essensielt består av polypeptidet TNF 6 (SEQ ID NO: 72) eller TNF 9 (SEQ ID NO: 75), der begge Nanobodies TNF 3 har blitt humanisert, og som er pegylert.
LXXI) Et protein eller polypeptid, som omfatter eller essensielt består av to Nanobodies som er humaniserte varianter av Nanobodiet TNF 3 i henhold til en hvilken som helst av LXI) til LXIV), og som videre omfatter minst ett Nanobody rettet mot humant serum albumin.
LXXII) Et protein eller polypeptid, som omfatter eller essensielt består av to Nanobodies som er humaniserte varianter av Nanobodiet TNF 3 i henhold til en hvilken som helst av LXI) til LXIV), som hver er forbundet (valgfritt forbundet via en linker) til et Nanobody rettet mot humant serum albumin.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av LXV) til LXXII), der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er et humanisert Nanobody.
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av LXV) til LXXII), der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er en humanisert variant av Nanobodiet ALB 1 (SEQ ID NO: 63).
- Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av LXV) til LXXII), der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er et valgt fra gruppen som består av ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB
5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB
8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) og ALB 10 (SEQ ID NO: 104). - Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av LXV) til LXXII), der minst det ene Nanobodiet rettet mot humant serum albumin er ALB 8. - Et protein eller polypeptid i henhold til en hvilken som helst av LXV) til LXXII), som omfatter eller essensielt består av polypeptidet TNF26 (SEQ ID NO: 92), der begge Nanobodies TNF 3 så vel som Nanobodiet ALB 1 har blitt humanisert.
I et annet aspekt, relateres den foreliggende oppfinnelsen til et polypeptid som omfatter eller essensielt består av minst ett Nanobody mot TNF-alfa som definert heri. Slike polypeptider er også referert til heri som “polypeptider av den foreliggende oppfinnelsen” og kan være som videre beskrevet heriunder og/eller som generelt beskrevet i WO 04/041862 for Nanobodies beskrevet deri, og kan for eksempel være multivalente polypeptider eller multispesifikke polypeptider, igjen som videre beskrevet heriunder.
Fortrinnsvis, er et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen enten bivalent eller trivalent (dvs. som omfatter to eller tre Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, respektivt, valgfritt forbundet via en eller to linkere som definert under, respektivt) eller et multispesifikt polypeptid, som omfatter et eller to, og fortrinnsvis to, Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen og minst ett Nanobody rettet mot et serumprotein, og spesielt mot et humant serumprotein, slik som mot humant serum albumin.
I en foretrukket, men ikke-begrensende utførelsesform, er Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen foreliggende i polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 52 til 60 og SEQ ID NO 105-129 eller fra humaniserte varianter derav, og spesielt fra de “humaniserte” Nanobodies til SEQ ID NO 76 til 86 og SEQ ID NO: 95 til 99. Nanobodies mot humant serum albumin foreliggende i polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen er fortrinnsvis som definert under, og er mer foretrukket valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 61 til 67, SEQ ID NO: 87 til 89 og SEQ ID NO: 100-104, og spesielt fra de “humaniserte” Nanobodies mot humant serum albumin til SEQ ID NO 76 til 86 og SEQ ID NO 100-104.
Med hensyn til Nanobodies som er foreliggende i polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen, vil det være klart for den faglærte personen at Nanobodies som er nevnt heri som “foretrukket” (eller som ”mer foretrukket”, “enda mer foretrukket”, osv.) er også foretrukket (eller mer foretrukket, eller enda mer foretrukket, osv.) for anvendelse i polypeptidene beskrevet heri. Derfor, vil polypeptider som omfatter eller essensielt består av et eller flere “foretrukne” Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen generelt bli foretrukket, og polypeptider som omfatter eller essensielt består av et eller flere “mer foretrukne” Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen generelt være mer foretrukket, osv..
Derfor, i den foreliggende oppfinnelsen, er polypeptider som omfatter et eller flere Nanobodies som essensielt består av en av de foretrukne variantene av klon PMP1C2 (TNF1; SEQ ID NO: 52), der ovennevnte foretrukne varianter er som definert heri, spesielt foretrukket. Enda mer foretrukket er polypeptider som omfatter et eller flere Nanobodies som essensielt består av en av de humaniserte variantene av klon PMP1C2 (TNF1; SEQ ID NO: 52), der ovennevnte humaniserte varianter er som definert heri (eksempler som er, uten begrensning, TNF13, TNF14, TNF29 og TNF30). TNF30 er en spesielt foretrukket humanisert “byggekloss” for anvendelse i polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen.
Noen foretrukne, men ikke-begrensende eksempler på slike proteiner og polypeptider er PMP1C2 selv, de humaniserte variantene TNF13, TNF14, TNF29 og TNF30; konstruktene til SEQ ID NO: 70 (TNF4), SEQ ID NO: 73 (TNF7), SEQ ID NO: 90 (TNF24), SEQ ID NO: 93 (TNF27); og konstruktene til SEQ ID NO: 417 (TNF60), SEQ ID NO: 419 (TNF55) og SEQ ID NO: 420 (TNF56), der de sistnevnte tre konstruktene omfatter den humaniserte varianten TNF 30 som en byggekloss.
Som nevnt heri, kan Nanobodies og konstruktene beskrevet heri være pegylert, eller omfatte en eller flere (tilleggs) aminosyreresidier som tillater pegylering og/eller letter pegylation. To foretrukne, men ikke-begrensende eksempler på slike polypeptider er TNF55 og TNF56, som begge omfatter et tilleggs cysteinresidie for lett fastgjøring av en PEG-gruppe.
Noen foretrukne, men ikke-begrensende eksempler på polypeptider av den foreliggende oppfinnelsen er de bivalente polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen til SEQ ID NO: 70 til 75 og de multispesifikke polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen til SEQ ID NO: 90 til 94 og SEQ ID NO 417 til 420.
Som kan bli sett fra dataene representert under, og spesielt fra dataene gitt i det Komparative Eksempelet, har Nanobodies og/eller polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen forbedrede egenskaper. Spesielt, kan proteinene og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen ha en forbedret affinitet for humant TNF-alfa (uttrykt som EC50-verdien i KYM assayet beskrevet heri), sammenlignet med de kommersielt tilgjengelige anti-TNF biologiske midlene Enbrel™, Humira™ og Remicade™. Nanobodies beskrevet heri kan også ha en forbedret affinitet for TNF-alfa sammenlignet med best utførende Nanobody beskrevet i den Internasjonale søknaden WO 04/041862. Det kan derfor være forventet at polypeptider av den foreliggende oppfinnelsen som omfatter minst ett av Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen også vil ha forbedrede egenskaper sammenlignet med polypeptider som omfatter bare Nanobodies mot TNF-alfa beskrevet i WO 04/041862.
Mer spesielt, har et polypeptid som beskrevet heri som omfatter to eller flere (og fortrinnsvis to) Nanobodies som heri (og valgfritt for eksempel et Nanobody mot humant serum albumin), en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn EC50 verdien til Humira<® >en Remicade <®>, og fortrinnsvis også bedre enn Enbrel<® >i det samme assayet.
For eksempel, har et slikt protein eller polypeptid fortrinnsvis en EC50 verdi i det celle-baserte assayet der man anvender KYM celler beskrevet i Eksempel 1, under 3), av WO 04/041862 som er bedre enn 0.2 nM, fortrinnsvis bedre enn 0.1 nM, slik som bedre enn 0.7 Nm og spesielt bedre enn 0.4 nM.
Det har også blitt vist av søkere at Nanobodies mot muse TNF-alfa og polypeptider som omfatter Nanobodies mot muse TNF-alfa viser en fordelaktig biologisk aktivitet i de følgende sykdomsmodellene (data ikke vist):
- Dextran sulfat natrium (“DSS”) modellen for kolitt, der det anvendes både vanlige mus så vel som IL-10 knock out mus, som beskrevet av Okayasu et al. (Gastroenterol 1990, 98(3): 694)
- Den collageninduserte artritt (“CIA”) modellen for artritt (“RA”), som beskrevet av Courtenay et al. (Nature 1980, 283(5748): 666), der det anvendes både vanlige mus så vel som IL-10 knock out mus;
- IL-10 knockout mus modellen for IBD, som for eksempel beskrevet av Rennick et al. (Clin Immunol Immunopathol 1995, 76(3 Pt 2): S174)
- Kollias modellen for RA som for eksempel beskrevet av Keffer et al. (EMBO J 1991, 10(13): 4025)
- 2,4,6-trinitrobenzensulfonsyre (“TNBS”) modellen for IBD, som beskrevet av Elson et al. (J Immunol 1996, 157(5): 2174)
- CIA modellen for RA, beskrevet av Koppieters et al (manuskript under utarbeidelse);
- Den synovial-avledede fibroblast modellen (beskrevet under); og
- Den murine luftpose modellen.
Fortrinnsvis, er Nanobodies beskrevet heri bedre enn Nanobody 1A fra WO 04/041862 i minst en av disse modellene, og fortrinnsvis i alle disse modellene; og mer p er bedre enn Nanobody 3E fra WO 04/041862 i minst en av disse modellene, og fortrinnsvis i alle disse modellene. Polypeptidene beskrevet heri er fortrinnsvis også ekvivalente med eller bedre enn Humira<® >eller Remicade<® >i minst en av disse modellene, og fortrinnsvis i alle disse modellene; og mer foretrukket også ekvivalent med eller bedre enn Enbrel<® >i minst en av disse modellene, og fortrinnsvis i alle disse modellene.
Disse dataene bekrefter at Nanobodies mot TNF-alfa og polypeptider som omfatter det samme, slik som Nanobodies og polypeptidene beskrevet i WO 04/041862 og spesielt Nanobodies og polypeptidene beskrevet heri, skulle ha terapeutisk effekt mot TNF medierte sykdommer og forstyrrelser, slik som sykdommene og forstyrrelsene nevnt over.
I et annet aspekt, relateres den foreliggende oppfinnelsen til en nukleinsyre som koder for et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen og/eller et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen. En slik nukleinsyre vil også bli referert til under som en “nukleinsyre av den foreliggende oppfinnelsen” og kan for eksempel være i form av et genetisk konstrukt, som definert under.
I et annet aspekt, relateres den foreliggende oppfinnelsen til vert eller vertsceller som uttrykker eller er i stand til å utrykke et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen og/eller et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen; og/eller som inneholder en nukleinsyre som koder for et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen og/eller et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen. En slik vert eller en vertscelle kan også være analog til vertene og vertscellene beskrevet i WO 04/041862, men uttrykker eller er i stand til å uttrykke et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen og/eller et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen og/eller som omfatter en nukleinsyre som beskrevet heri.
Den foreliggende oppfinnelsen relateres videre til et produkt eller sammensetning som inneholder eller som omfatter et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen, et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen; og/eller en nukleinsyre av den foreliggende oppfinnelsen. Et slikt produkt eller sammensetning kan for eksempel være en farmasøytisk sammensetning (som beskrevet under) eller et produkt eller sammensetning for diagnostisk anvendelse (som også beskrevet under). Et slikt produkt eller sammensetning kan også være analogt til produktene og sammensetningene beskrevet i WO 04/041862, men som inneholder eller som omfatter et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen, et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen eller en nukleinsyre av den foreliggende oppfinnelsen.
Den foreliggende oppfinnelsen relateres videre til fremgangsmåter for å fremstille eller generere Nanobodies, polypeptidene, nukleinsyrene, vertscellene, produktene og sammensetningene som beskrevet heri, hvilke fremgangsmåter er som videre beskrevet under. Også, generelt, kan Nanobodies, polypeptidene, nukleinsyrene, vertscellene, produktene og sammensetningene beskrevet heri også bli fremstilt og anvendt på en måte som er analog til måten beskrevet i WO 04/041862.
Den foreliggende oppfinnelsen relateres videre til applikasjoner og anvendelser av Nanobodies, polypeptidene, nukleinsyrene, vertscellene, produktene og sammensetningene over beskrevet heri, hvilke applikasjoner og anvendelser inkluderer, men er ikke begrenset til, applikasjonene og anvendelsene beskrevet heriunder og/eller de videre anvendelsene og applikasjonene for Nanobodies mot TNF-alfa og/eller for polypeptider som omfatter det samme i WO 04/041862.
Andre aspekter, utførelsesformer, fordeler og applikasjoner av den foreliggende oppfinnelsen vil bli klare fra den videre beskrivelsen heriunder.
Detaljert beskrivelse av den foreliggende oppfinnelsen
De over og andre aspekter og utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelsen vil bli klare fra den videre beskrivelsen heriunder, der:
a) Med mindre indikert eller definert på annen måte, har alle anvendte termer sin vanlige mening i faget, som vil være klart for den faglærte personen. Det er for eksempel referert til standard håndbøkene, slik som Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" ( 2nd.Ed.), Vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing og Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, “Genes John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Old et al., “Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering”, 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., “Immunology” (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., Roitt’s Essential Immunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK (2001); og Janeway et al., “Immunobiology” (6th Ed.), Garlog Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005), så vel som til det generelle bakgrunnsfaget sitert heri;
b) Med mindre indikert på annen måte, er termen “immunoglobulinsekvens” -hvorvidt det er anvendt heri for å referere til et tungkjede antistoff eller til et konvensjonelt 4-kjede antistoff - anvendt som en generell term for å inkludere både fullstørrelse antistoffet, de individuelle kjedene derav, så vel som alle deler, domener eller fragmenter derav (inkludert men ikke begrenset til antigenbindingsdomener eller fragmenter slik som VHH domener eller VH/VL domener, respektivt). I tillegg, skulle termen “sekvens” som anvendt heri (for eksempel i termer som “immunoglobulinsekvens”, “antistoffsekvens”, “variabel domene sekvens”, “VHH sekvens” eller “proteinsekvens”), generelt bli forstått å inkludere både den relevante aminosyresekvensen så vel som nukleinsyresekvenser eller nukleotidesekvenser som koder for det samme, med mindre konteksten krever en mer begrenset tolkning;
c) Med mindre indikert på annen måte, kan alle fremgangsmåter, trinn, teknikker og manipuleringer som ikke er spesifikt beskrevet i detalj bli utført og har blitt utført på en måte kjent per se, som vil være klart for den faglærte personen. Det er for eksempel igjen referert til standard håndbøkene, til det generelle bakgrunnsfaget referert til over og til de videre referansene sitert deri;
d) Aminosyreresidier vil bli indikert ifølge den standard tre-bokstavers eller enbokstavers aminosyrekoden, som nevnt i Tabell 1;
Tabell 1 : en -bokstavers og tre-bokstavers aminosyrekode
Notater:
(1) Noen ganger også ansett å være en polar uladet aminosyre. (2) Noen ganger også ansett å være en upolar uladet aminosyre. (3) Noe som vil være klart for den faglærte personen, er det faktum at et aminosyreresidie er referert til i denne Tabellen som å være enten ladet eller uladet ved pH 6.0 til 7.0 ikke på noen måte reflekterer ladningen ovennevnte aminosyreresidie kan ha ved en pH lavere enn 6.0 og/eller ved en pH høyere enn 7.0; aminosyreresidiene nevnt i Tabellen kan enten være ladet og/eller uladet ved en slik høyere eller lavere pH, som vil være klart for den faglærte personen.
(4) Som er kjent i faget, er ladningen til et His residie sterkt avhengig ved selv små omslag i pH, men et His residie kan generelt bli ansett essensielt uladet ved en pH på omtrent 6.5.
e) For formålene å sammenligne to eller flere nukleotidesekvenser, kan prosenten av “sekvensidentitet” mellom en første nukleotidesekvens og en andre nukleotidesekvens bli beregnet ved å dele [antallet nukleotider i den første nukleotidesekvensen som er identisk til nukleotidene ved de korresponderende posisjonene i den andre nukleotidesekvensen] med [det totale antallet nukleotider i den første nukleotidesekvensen] og multiplisere med [100%], der hver delesjon, insersjon, substitusjon eller addisjon av en nukleotide i den andre nukleotidesekvensen - sammenlignet med den første nukleotidesekvensen - er ansett som en forskjell ved en enkel nukleotide (posisjon).
Alternativt, kan graden av sekvensidentitet mellom to eller flere nukleotidesekvenser bli beregnet ved å anvende en kjent dataalgoritme for sekvensinnretting slik som NCBI Blast v2.0, ved å anvende standard settinger.
Noen andre teknikker, dataalgoritmer og settinger for å bestemme graden av sekvensidentitet er for eksempel beskrevet i WO 04/037999, EP 0967 284, EP 1 085 089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/49185 og GB 2357768-A.
Vanligvis, for formålet av å bestemme prosenten av “sekvensidentitet” mellom to nukleotidesekvenser i henhold til beregningsmetoden oppsummert heriover, vil nukleotidesekvensen med det største antall nukleotider bli fulgt som den “første” nukleotidesekvensen, og den andre nukleotidesekvensen vil bli fulgt som den “andre” nukleotidesekvensen;
f) For formålet av å sammenligne to eller flere aminosyresekvenser, kan prosenten av “sekvensidentitet” mellom en første aminosyresekvens og en andre aminosyresekvens bli beregnet ved å dele[antallet aminosyreresidier i den første aminosyresekvensen som er identisk til aminosyreresidiene ved de korresponderende posisjonene i den andre aminosyresekvensen] med [det totale antallet nukleotider i den første aminosyresekvensen] og multiplisere med [100%], der hver delesjon, insersjon, substitusjon eller addisjon av et aminosyreresidie i den andre aminosyresekvensen - sammenlignet med den første aminosyresekvensen -er ansett som en forskjell ved et enkelt aminosyre residie (posisjon), dvs. som en “aminosyreforskjell” som definert under.
Alternativt, kan graden av sekvensidentitet mellom to aminosyresekvenser bli beregnet ved å anvende en kjent dataalgoritme, slik som de nevnt over for å bestemme graden av sekvensidentitet for nukleotidesekvenser, igjen ved å anvende standard settinger.
Vanligvis, for formålet av å bestemme prosenten av “sekvensidentitet” mellom to aminosyresekvenser i henhold til beregningsmetoden oppsummert heriover, vil aminosyresekvensen med det største antallet aminosyreresidier bli fulgt som den “første” aminosyresekvensen, og den andre aminosyresekvensen vil bli fulgt som den “andre” aminosyresekvensen.
Til å bestemme graden av sekvensidentitet mellom to aminosyresekvenser, kan den faglærte personen også ta med i beregningen såkalte “konservative” aminosyresubstitusjoner, som generelt kan bli beskrevet som aminosyresubstitusjoner der et aminosyreresidie er erstattet med et annet aminosyreresidie med lignende kjemisk struktur og som har liten eller essensielt ingen påvirkning på funksjonen, aktiviteten eller andre biologiske egenskaper til polypeptidet. Slike konservative aminosyresubstitusjoner er godt kjent innen faget, for eksempel fra WO 04/037999, GB-A-2357768, WO 98/49185, WO 00/46383 og WO 01/09300; og (foretrukne) typer og/eller kombinasjoner av slike substitusjoner kan bli selektert på basis av de relevante undervisninger fra WO 04/037999 så vel som WO 98/49185 og fra de videre referanser sitert deri.
Slike konservative substitusjoner er fortrinnsvis substitusjoner der en aminosyre innen de følgende gruppene (a) – (e) er substituert med et annet aminosyreresidie innen den samme gruppen: (a) små alifatiske, upolare eller svakt polare residier: Ala, Ser, Thr, Pro og Gly; (b) polare, negativt ladede residier og deres (uladede) amider: Asp, Asn, Glu og G1n; (c) polare, positivt ladede residier: His, Arg og Lys; (d) store alifatiske, upolare residier: Met, Leu, Ile, Val og Cys; og (e) aromatiske residier: Phe, Tyr og Trp.
Spesielt foretrukne konservative substitusjoner er som følgende: Ala inn i Gly eller inn i Ser; Arg inn i Lys; Asn inn i Gln eller inn i His; Asp inn i Glu; Cys inn i Ser; Gln inn i Asn; Glu inn i Asp; Gly inn i Ala eller inn i Pro; His inn i Asn eller inn i Gln; Ile inn i Leu eller inn i Val; Leu inn i Ile eller inn i Val; Lys inn i Arg, inn i Gln eller inn i Glu; Met inn i Leu, inn i Tyr eller inn i Ile; Phe inn i Met, inn i Leu eller inn i Tyr; Ser inn i Thr; Thr inn i Ser; Trp inn i Tyr; Tyr inn i Trp; og/eller Phe inn i Val, inn i Ile eller inn i Leu.
Hvilke som helst aminosyresubstitusjoner anvendt for polypeptidene beskrevet heri kan også være basert på analysen av frekvensene av aminosyrevariasjoner mellom homologe proteiner av forskjellige typer utviklet av Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978, på analyser av strukturdannende potensialer utviklet av Chou and Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974 og Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978, og på analysen av hydrofobisitetsmønstre i proteiner utviklet av Eisenberg et al., Proc. Nad. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 1981, og Goldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem.15: 321-353, 1986, alle inkorporert heri i sin helhet som referanse. Informasjon om den primære, sekundære og tertiære strukturen av Nanobodies gitt i beskrivelsen heri og i det generelle bakgrunnsfaget sitert over. Også, for dette formålet, er krystallstrukturen til et VHH domene fra en lama for eksempel gitt av Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol.3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757; og Decanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361 (1999). Videre informasjon om noen av aminosyreresidiene som i konvensjonelle VH domener danner VH/VL interfasen og potensielle cameliserings-substitusjoner på disse posisjonene kan bli funnet i det tidligere faget om Nanobodies sitert heri;
g) aminosyresekvenser og nukleinsyresekvenser er sagt å være “eksakt de samme” hvis de har 100% sekvensidentitet (som definert heri) over deres hele lengde;
h) når to aminosyresekvenser sammenlignes, refererer termen “aminosyreforskjell” til en insersjon, delesjon eller substitusjon av et enkelt aminosyreresidie i en posisjon av den første sekvensen, sammenlignet med den andre sekvensen; er det forstått at to aminosyresekvenser kan inneholde en, to eller flere slike aminosyreforskjeller;
i) en nukleinsyresekvens eller aminosyresekvens er ansett å være “(i) essensielt isolert (form)” - for eksempel, sammenlignet med dennes naturlige biologiske kilde og/eller reaksjonsmediet eller kultiveringsmediet fra som den har blitt ervervet - når den har blitt separert fra minst en annen komponet med de som vanligvis er assosierte i ovennevnte kilde eller medium, slik som en annen nukleinsyre, et annet protein/polypeptid, en annen biologisk komponent eller makromolekyl eller minst en kontaminant, urenhet eller mindre komponent. Spesielt, er en nukleinsyresekvens eller aminosyresekvens ansett “essensielt isolert” når den har blitt renset minst 2-ganger, spesielt minst 10-ganger, mer spesielt minst 100-ganger, og opptil 1000-ganger eller mer. En nukleinsyresekvens eller aminosyresekvens som er “i essensielt isolert form” er fortrinnsvis essensielt homogen, som bestemt ved å anvende en egnet teknikk, slik som en egnet kromatografisk teknikk, slik som polyacrylamid-gelelektroforese;
j) Termen “domene” som anvendt heri refererer generelt til en globulær region til en antistoffkjede, og spesielt til en globulær region av et tungkjede antistoff, eller til et polypeptid som essensielt består av en slik globulær region. Vanligvis, vil et slikt domene omfatte peptid-looper (for eksempel 3 eller 4 peptid-looper) stabilisert, for eksempel, som et sheet eller ved disulfidbånd.
k) Termen ‘antigen determinant’ refererer til epitopen på antigenet gjenkjent av det antigen-bindende molekylet (slik som et Nanobody eller et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen) og mer spesielt av antigen-bindingssetet til ovennevnte molekyl. Termene “antigen determinant” og “epitop’ kan også bli anvendt vekslende heri.
l) En aminosyresekvens (slik som et Nanobody, et antistoff, et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen, eller generelt et antigenbindende protein eller polypeptid eller et fragment derav) som kan binde til, som har affinitet for og/eller som har spesifisitet for en spesifikk antigendeterminant, epitop, antigen eller protein (eller for minst en del, fragment eller epitop derav) er sagt å være “mot” eller “rettet mot” ovennevnte antigendeterminant, epitop, antigen eller protein.
m) Termen “spesifisitet” refererer til antallet forskjellige typer av antigener eller antigendeterminanter som et spesielt antigen-bindende molekyl eller antigenbindende protein (slik som et Nanobody eller et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen) molekyl kan binde til. Spesifisiteten til et antigen-bindende protein kan bli bestemt basert på affinitet og/eller aviditet. Affiniteten, representert av likevektskonstanten for dissosiasjonen av et antigen med et antigen-bindende protein (KD), er et mål for bindingsstyrken mellom en antigendeterminant og et antigen-bindingssete på det antigen-bindende proteinet: dess mindre verdien av KD ́en, dess sterkere er bindingsstyrken mellom en antigendeterminant og det antigen-bindende molekylet (alternativt, kan affiniteten også bli uttrykt som affinitetskonstanten (KA), som er 1/KD). Som vil være klart for den faglærte personen (for eksempel på basis av den videre beskrivelsen heri), kan affinitet bli bestemt på en måte kjent per se, avhengig av det spesifikke antigenet av interesse. Aviditet er målet på styrken av binding mellom et antigen-bindende molekyl (slik som et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen) og det relevante antigenet. Aviditet er relatert til både affiniteten mellom en antigendeterminant og dets antigen bindingssete på det antigen-bindende molekylet og antallet relevante bindingsseter foreliggende på det antigen-bindende molekylet. Antigen-bindende proteiner (slik som Nanobodies og/eller polypeptider av den foreliggende oppfinnelsen) vil typisk binde med en dissosiasjonskonstant (KD) på 10<-5 >til 10<-12 >mol/liter (M) eller mindre, og fortrinnsvis 10<-7 >til 10<-12 >mol/liter (M) eller mindre og mer foretrukket 10<-8 >til 10<-12 >mol/liter, og/eller med an assosiasjonskonstant (KA) på minst 10<7 >M<-1>, fortrinnsvis minst 10<8 >M<-1>, mer foretrukket minst 10<9 >M-1, slik som minst 10<12 >M<-1>. En hvilken som helst KD verdi større enn 10<-4 >M er generelt ansett å indikere ikke-spesifikk binding. Et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen vil fortrinnsvis binde til det ønskede antigenet med en KD mindre enn 500 nM, fortrinnsvis mindre enn 200 nM, mer foretrukket mindre enn 10 nM, slik som mindre enn 500 pM. Spesifikk binding av et antigen-bindende protein til et antigen eller antigen determinant kan bli bestemt på en hvilken som helst egnet måte kjent per se, inkludert, for eksempel, Scatchard analyse og/eller kompetitive bindingsassayer, slik som radioimmunoassayer (RIA), enzym immunoassayer (EIA) og sandwich konkurranseassayer, og de forskjellige varianter derav kjent per se innen faget. n) som videre beskrevet heriunder, kan aminosyresekvensen og strukturen til et Nanobody bli ansett - uten likevel å være begrenset dertil – til å bli omfattet av fire rammeverkregioner eller “FR’er”, som er referert til faget og heriunder som “Rammeverkregion1” eller “FR1”; som “Rammeverkregion2” eller ”FR2”; som “Rammeverkregion3” eller “FR3”; og som “Rammeverkregion4” eller “FR4”, respektivt; hvis rammeverkregioner er avbrutt av tre komplementære bestemmende regioner eller “CDR’er”, som er referert til i faget som “Komplementaritetsbestemmende Region 1” eller “CDR1”; som “Komplementaritetsbestemmende Region 2” eller ”CDR2”; og som “Komplementaritetsbestemmende Region 3” eller “CDR3”, respektivt;
o) som også videre beskrevet heriunder, kan det totale antall aminosyreresidier i et Nanobody være i området på 110-120, er fortrinnsvis 112-115, og er mest foretrukket 113. Det skulle likevel bli notert at deler, fragmenter eller analoger (som videre beskrevet heriunder) av et Nanobody ikke er spesielt begrenset angående deres lengde og/eller størrelse, så lenge som slike deler, fragmenter eller analoger møter de videre behovene oppsummert heriunder og er også fortrinnsvis egnet for formålet beskrevet heri;
p) aminosyreresidiene til et Nanobody er nummerert i følge den generelle nummereringen for VH domener gitt av Kabat et al. (“Sequence of proteins of immunological interest”, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91), som anvendt for VHH domener fra Camelider i artikkelen til Riechmann og Muyldermans, referert til over (se for eksempel Figur 2 i ovennevnte referanse). I følge denne nummeringen, omfatter FR1 til et Nanobody aminosyreresidiene i posisjoner 1-30, omfatter CDR1 til et Nanobody aminosyreresidiene i posisjoner 31-36, omfatter FR2 til et Nanobody aminosyrerene i posisjoner 36-49, omfatter CDR2 til et Nanobody aminosyreresidiene i posisjoner 50-65, omfatter FR3 til et Nanobody aminosyreresidiene i posisjoner 66-94, omfatter CDR3 til et Nanobody aminosyreresidiene i posisjoner 95-102, og omfatter FR4 til et Nanobody aminosyreresidiene i posisjoner 103-113. [I dette henseendet, skulle det bli notert at - som er godt kjent innen faget for VH domener og for VHH domener –det totale antallet av aminosyreresidier i hver av CDR’ene kan variere og kan ikke korrespondere til det totale antallet aminosyreresidier indikert av Kabat nummereringen (det vil si, en eller flere posisjoner i følge Kabat nummereringen kan ikke bli okkupert i den faktiske sekvensen, eller den faktiske sekvensen kan inneholde flere aminosyreresidier enn antallet tillatt for av Kabat nummereringen). Dette betyr generelt at, nummereringen i følge Kabat kan eller kan ikke korrespondere til den faktiske nummereringen til aminosyreresidiene i den faktiske sekvensen. Generelt, imidlertid, kan det bli sagt at, i følge nummereringen til Kabat og uten hensyn til antallet aminosyreresidier i CDR’ene, korresponderer posisjon 1 i følge Kabat nummereringen til starten av FR1 og vice versa, korresponderer posisjon 36 i følge Kabat nummereringen til starten av FR2 og vice versa, korresponderer posisjon 66 i følge Kabat nummereringen til starten av FR3 og vice versa, og korresponderer posisjon 103 i følge Kabat nummereringen til starten av FR4 og vice versa.].
Alternative fremgangsmåter for nummerering av aminosyreresidiene til VH domener, kan som fremgangsmåter også bli anvendt på en analog måte for VHH domener fra Camelider og til Nanobodies, er fremgangsmåten beskrevet av Chothia et al. (Nature 342, 877-883 (1989)), den såkalte “AbM definisjonen” og den såkalte “kontakt definisjonen”. Likevel, i den foreliggende beskrivelsen, kravene og figurene, vil nummereringen i følge Kabat som anvendt for VHH domener av Riechmann og Muyldermans bli fulgt, med mindre indikert på annen måte; og q) Figurene, Sekvens Listingen og den Eksperimentelle Delen/Eksemplene er bare gitt for videre å illustrere den foreliggende oppfinnelsen og skulle ikke bli tolket eller konstruert som begrensende på omfanget av den foreliggende oppfinnelsen og/eller på de tilføyde kravene på noen måte, med mindre eksplisitt indikert på annen måte heri.
For en generell beskrivelse av tungkjede antistoffer og de variable domenene derav, er det referert inter alia for de følgende referansene, som er nevnt som generelt bakgrunnsfag: WO 94/04678, WO 95/04079 og WO 96/34103 fra Vrije Universiteit Brussel; WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 og WO 02/48193 fra Unilever; WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 og WO 03/055527 fra Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB); WO 03/050531 fra Algonomics N.V. og søker; WO 01/90190 av the National Research Council of Canada; WO 03/025020 (= EP 1433793) av the Institute of Antibodies; så vel som WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551 av søker og de videre publiserte patentapplikasjonene av søker;
Hamers-Casterman et al., Nature 1993 June 3; 363 (6428): 446-8; Davies and Riechmann, FEBS Lett.1994 Feb 21; 339(3): 285-90; Muyldermans et al., Protein Eng. 1994 Sep; 7(9): 1129-3; Davies and Riechmann, Biotechnology (NY) 1995 May; 13(5): 475-9; Gharoudi et al., 9th Forum of Applied Biotechnology, Med. Fac. Landbouw Univ. Gent. 1995; 60/4a part I: 2097-2100; Davies and Riechmann, Protein Eng.1996 Jun; 9(6): 531-7; Desmyter et al., Nat Struct Biol.1996 Sep; 3(9): 803-11; Sheriff et al., Nat Struct Biol. 1996 Sep; 3(9): 733-6; Spinelli et al., Nat Struct Biol. 1996 Sep; 3(9): 752-7; Arbabi Ghahroudi et al., FEBS Lett. 1997 Sep 15; 414(3): 521-6; Vu et al., Mol Immunol. 1997 Nov-Dec; 34(16-17): 1121-31; Atarhouch et al., Journal of Camel Practice and Research 1997; 4: 177-182; Nguyen et al., J. Mol. Biol. 1998 Jan 23; 275(3): 413-8; Lauwereys et al., EMBO J.
1998 Jul 1; 17(13): 3512-20; Frenken et al., Res Immunol. 1998 Jul-Aug;149(6):589-99; Transue et al., Proteins 1998 Sep 1; 32(4): 515-22; Muyldermans and Lauwereys, J. Mol. Recognit.1999 Mar-Apr; 12 (2): 131-40; van der Linden et al., Biochim. Biophys. Acta 1999 Apr 12; 1431(1): 37-46.; Decanniere et al., Structure Fold. Des.1999 Apr 15; 7(4): 361-70; Ngyuen et al., Mol. Immunol.
1999 Jun; 36(8): 515-24; Woolven et al., Immunogenetics 1999 Oct; 50 (1-2): 98-101; Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 1999 Dec 10; 231 (1-2): 25-38; Spinelli et al., Biochemistry 2000 Feb 15; 39(6): 1217-22; Frenken et al., J. Biotechnol. 2000 Feb 28; 78(1): 11-21; Nguyen et al., EMBO J.2000 Mar 1; 19(5): 921-30; van der Linden et al., J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-95; Decanniere et al., J. Mol. Biol. 2000 Jun 30; 300 (1): 83-91; van der Linden et al., J. Biotechnol. 2000 Jul 14; 80(3): 261-70; Harmsen et al., Mol. Immunol.2000 Aug; 37(10): 579-90; Perez et al., Biochemistry 2001 Jan 9; 40(1): 74-83; Conrath et al., J. Biol. Chem. 2001 Mar 9; 276 (10): 7346-50; Muyldermans et al., Trends Biochem Sci. 2001 Apr;26(4):230-5; Muyldermans S., J. Biotechnol. 2001 Jun; 74 (4): 277-302; Desmyter et al., J. Biol. Chem. 2001 Jul 13 ;276 (28): 26285-90; Spinelli et al., J. Mol. Biol. 2001 Aug 3; 311 (1): 123-9; Conrath et al., Antimicrob Agents Chemother.2001 Oct; 45 (10): 2807-12; Decanniere et al., J. Mol. Biol.2001 Oct 26; 313(3): 473-8; Nguyen et al., Adv Immunol. 2001; 79: 261-96; Muruganandam et al., FASEB J.2002 Feb; 16 (2): 240-2; Ewert et al., Biochemistry 2002 Mar 19; 41 (11): 3628-36; Dumoulin et al., Protein Sci.2002 Mar; 11 (3): 500-15; Cortez-Retamozo et al., Int. J. Cancer. 2002 Mar 20; 98 (3): 456-62; Su et al., Mol. Biol. Evol. 2002 Mar; 19 (3): 205-15; van der Vaart JM., Methods Mol Biol.
2002; 178: 359-66; Vranken et al., Biochemistry 2002 Jul 9; 41 (27): 8570-9; Nguyen et al., Immunogenetics 2002 Apr; 54 (1): 39-47; Renisio et al., Proteins 2002 Jun 1; 47 (4): 546-55; Desmyter et al., J. Biol. Chem.2002 Jun 28; 277 (26): 23645-50; Ledeboer et al., J. Dairy Sci.2002 Jun; 85 (6): 1376-82; De Genst et al., J. Biol. Chem. 2002 Aug 16; 277 (33): 29897-907; Ferrat et al., Biochem. J. 2002 Sep 1; 366 (Pt 2): 415-22; Thomassen et al., Enzyme and Microbial Technol.2002; 30: 273-8; Harmsen et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002 Dec; 60 (4): 449-54; Jobling et al., Nat Biotechnol. 2003 Jan; 21 (1): 77-80; Conrath et al., Dev. Comp. Immunol. 2003 Feb; 27 (2): 87-103; Pleschberger et al., Bioconjug. Chem. 2003 Mar-Apr; 14 (2): 440-8; Lah et al., J. Biol. Chem.2003 Apr 18; 278 (16): 14101-11; Nguyen et al., Immunology.2003 May; 109 (1): 93-101; Joosten et al., Microb. Cell Fact. 2003 Jan 30; 2 (1): 1; Li et al., Proteins 2003 Jul 1; 52 (1): 47-50; Loris et al., Biol Chem.2003 Jul 25; 278 (30): 28252-7; van Koningsbruggen et al., J. Immunol. Methods. 2003 Aug; 279 (1-2): 149-61; Dumoulin et al., Nature.2003 Aug 14; 424 (6950): 783-8; Bond et al., J. Mol. Biol.2003 Sep 19; 332 (3): 643-55; Yau et al., J. Immunol. Methods.2003 Oct 1; 281 (1-2): 161-75; Dekker et al., J. Virol.2003 Nov; 77 (22): 12132-9; Meddeb-Mouelhi et al., Toxicon. 2003 Dec; 42 (7): 785-91; Verheesen et al., Biochim. Biophys. Acta 2003 Dec 5; 1624 (1-3): 21-8; Zhang et al., J Mol Biol.2004 Jan 2; 335 (1): 49-56; Stijlemans et al., J Biol Chem.2004 Jan 9; 279 (2): 1256-61; Cortez-Retamozo et al., Cancer Res. 2004 Apr 15; 64 (8): 2853-7; Spinelli et al., FEBS Lett. 2004 Apr 23; 564 (1-2): 35-40; Pleschberger et al., Bioconjug. Chem. 2004 May-Jun; 15 (3): 664-71; Nicaise et al., Protein Sci.
2004 Jul; 13 (7): 1882-91; Omidfar et al., Tumour Biol. 2004 Jul-Aug; 25 (4): 179-87; Omidfar et al., Tumour Biol. 2004 Sep-Dec; 25(5-6): 296-305; Szynol et al., Antimicrob Agents Chemother. 2004 Sep;48(9):3390-5; Saerens et al., J. Biol. Chem. 2004 Dec 10; 279 (50): 51965-72; De Genst et al., J. Biol. Chem.2004 Dec 17; 279 (51): 53593-601; Dolk et al., Appl. Environ. Microbiol.2005 Jan; 71(1): 442-50; Joosten et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2005 Jan; 66(4): 384-92; Dumoulin et al., J. Mol. Biol.2005 Feb 25; 346 (3): 773-88; Yau et al., J Immunol Methods.2005 Feb; 297 (1-2): 213-24; De Genst et al., J. Biol. Chem.2005 Apr 8; 280 (14): 14114-21; Huang et al., Eur. J. Hum. Genet.2005 Apr 13; Dolk et al., Proteins. 2005 May 15; 59 (3): 555-64; Bond et al., J. Mol. Biol.2005 May 6;348(3):699-709; Zarebski et al., J. Mol. Biol.2005 Apr 21; [E-publikasjon i vente på print].
I henhold til terminologien anvendt i referansene over, vil de variable domenene foreliggende i naturlig forekommende tungkjede antistoffer også bli referert til som “VHH domener”, for å kunne skille dem fra de tungkjede variable domenene som er foreliggende i konvensjonelle 4-kjede antistoffer (som vil bli referert til heriunder som “VH domener”) og fra de lettkjede variable domenene som er foreliggende i konvensjonelle 4-kjede antistoffer (som vil bli referert til heriunder som “VL domener”).
Som nevnt i det tidligere faget referert til over, har VHH domener et antall unike strukturelle karakteristikker og funksjonelle egenskaper som gjør isolerte VHH domener (så vel som Nanobodies basert derpå, som deler disse strukturelle karakteristikkene og funksjonelle egenskapene med de naturlig forekommende VHH domenene) og proteiner som inneholder det samme høyt fordelaktige for anvendelse for funksjonelle antigen-bindingsdomener eller proteiner. Spesielt, og uten å være begrenset dertil, kan VHH domener (som har blitt “designet” av naturen til funksjonelt å binde til et antigen uten nærværet av, og uten noen interaksjon med, et lettkjede variabelt domene) og Nanobodies fungere som en enkel, relativt liten, funksjonell antigen-bindende strukturell enhet, domene eller protein. Dette skiller VHH domenene fra VH og VL domenene til konvensjonelle 4-kjede antistoffer, som av dem selv ikke er generelt passende for praktisk applikasjon som enkle antigenbindende proteiner eller domener, men trenger å være kombinert i en eller annen form for å fremskaffe en funksjonell antigen-bindende enhet (som for eksempel konvensjonelle antistoff fragmenter slik som Fab fragmenter; i ScFv fragmenter, som består av et VH domene kovalent forbundet til et VL domene).
På grunn av disse unike egenskapene, tilbyr anvendelsen av VHH domener og Nanobodies som enkle antigen-bindende proteiner eller som antigenbindingsdomener (dvs. som del av et større protein eller polypeptid et antall av signifikante fordeler over anvendelsen av konvensjonelle VH og VL domener, scFv’er eller konvensjonelle antistoff fragmenter (slik som Fab- eller F(ab’)2-fragmenter):
- bare ett enkelt domene er krevet for å binde et antigen med høy affinitet og med høy selektivitet, slik at det ikke er noe behov for å ha to separate domener til stede, og heller ikke for å forsikre at disse to domenene er foreliggende i den rette romkonformasjonen og konfigurasjonen (dvs. gjennom anvendelsen av spesielt designede linkere, som med scFv’er);
- VHH domener og Nanobodies kan bli uttrykt fra et enkelt gen og krever ingen post-translasjonell folding eller modifikasjoner;
- VHH domener og Nanobodies kan lett bli engineered inn i multivalente og multispesifikke formater (som videre diskutert heri);
- VHH domener og Nanobodies er sterkt løselige og har ikke en tendens til å aggregere (som med de mus-avledede antigen-bindingsdomenene beskrevet av Ward et al., Nature, Vol.341, 1989, p.544);
- VHH domener og Nanobodies er veldig stabile overfor varme, pH, proteaser og andre denaturerende agenter eller forhold (se for eksempel Ewert et al, supra);
- VHH domener og Nanobodies er lette og relativt billige å fremstille, selv på en skala krevet for produksjon. For eksempel, kan VHH domener, Nanobodies og proteiner/polypeptider som omfatter det samme bli produsert ved å anvende mikrobiell fermentering (f.eks. som videre beskrevet under) og krever ikke anvendelsen av pattedyrekspresjonssystemer, som med for eksempel konvensjonelle antistoff-fragmenter;
- VHH domener og Nanobodies er relativt små (omtrentlig 15 kDa, eller 10 ganger mindre enn et konvensjonelt IgG) sammenlignet med konvensjonelle 4-kjede antistoffer og antigen-bindende fragmenter derav, og viser derfor høy(ere) penetrering inn i vev (inkludert men ikke begrenset til faste tumorer og andre tette vev) enn slike konvensjonelle 4-kjede antistoffer og antigenbindende fragmenter derav;
- VHH domener og Nanobodies kan vise såkalt hule-bindende egenskaper (inter alia på grunn av deres forlengede CDR3 loop, sammenlignet med konvensjonelle VH domener) og kan derfor også få tilgang til mål og epitoper som ikke er tilgjengelige for konvensjonelle 4-kjede antistoffer og antigenbindende fragmenter derav. For eksempel, har det vært vist at VHH domener og Nanobodies kan inhibere enzymer (se for eksempel WO 97/49805; Transue et al., (1998), supra; Lauwereys et al., (1998), supra.
Som nevnt over, relateres den foreliggende oppfinnelsen generelt til Nanobodies rettet mot TNF-alfa, så vel som til polypeptider som omfatter eller essensielt består av en eller flere av slike Nanobodies, som kan bli anvendt for de profylaktiske, terapeutiske og/eller diagnostiske formål beskrevet under og i WO 04/041862.
Som også nevnt over og videre beskrevet under, relateres den foreliggende oppfinnelsen videre til nukleinsyrer som koder for slike Nanobodies og polypeptider, til fremgangsmåter for å fremstille slike Nanobodies og polypeptider, til vertsceller som uttrykker eller er i stand til å uttrykke slike Nanobodies eller polypeptider, til anvendelser av slike Nanobodies, polypeptider, nukleinsyrer eller vertsceller, og til sammensetninger som omfatter slike Nanobodies, polypeptider, nukleinsyrer eller vertsceller.
Generelt, skulle det bli notert at termen Nanobody som anvendt heri i sin videste forstand ikke er begrenset til en spesifikk biologisk kilde eller til en spesifikk fremgangsmåte for fremstilling. For eksempel, som vil bli diskutert i mer detalj under, kan Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen bli ervervet (1) ved å isolere VHH domenet til et naturlig forekommende tungkjede antistoff; (2) ved ekspresjon av en nukleotidesekvens som koder for et naturlig forekommende VHH domene; (3) ved “humanisering” (som beskrevet under) av et naturlig forekommende VHH domene eller ved ekspresjon av en nukleinsyre som koder for et slikt humanisert VHH domene; (4) ved “camelisering” (som beskrevet under) av et naturlig forekommende VH domene fra hvilke som helst dyrearter, spesielt en pattedyrart, slik som fra et menneske, eller ved ekspresjon av en nukleinsyre som koder for et slikt camelisert VH domene; (5) ved “camelisering” av et “domene antistoff” eller “Dab” som beskrevet av Ward et al (supra), eller ved ekspresjon av en nukleinsyre som koder for et slikt camelisert VH domene; (6) ved å anvende syntestiske eller semi-syntetiske teknikker for å fremstille proteiner, polypeptider eller andre aminosyresekvenser; (7) ved å fremstille en nukleinsyre som koder for et Nanobody ved å anvende teknikker for nukleinsyresyntese, fulgt av ekspresjon av nukleinsyren således ervervet; og/eller (8) ved en hvilken som helst kombinasjon av det foregående. Egnede fremgangsmåter og teknikker for å utføre det foregående vil være klart for den faglærte personen basert på beskrivelsen heri og for eksempel inkludere fremgangsmåtene og teknikkene beskrevet i mer detalj heriunder.
Imidlertid, i følge en spesifikk utførelsesform, har ikke Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen en aminosyresekvens som er eksakt den samme som (dvs. som en grad av sekvensidentitet på 100% med) aminosyresekvensen til et naturlig forekommende VH domene, slik som aminosyresekvensen til et naturlig forekommende VH domene fra et pattedyr, og spesielt fra et menneske.
En spesielt foretrukket klasse av Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen omfatter Nanobodies med en aminosyresekvens som korresponderer til aminosyresekvensen til et naturlig forekommende VHH domene, men som har blitt “humanisert”, dvs. ved å erstatte en eller flere aminosyreresidier i aminosyresekvensen av ovennevnte naturlig forekommende VHH sekvens med en eller flere av aminosyreresidiene som forekommer i den(de) korresponderende posisjonen(e) i et VH domene fra et konvensjonelt 4-kjede antistoff fra et menneske (f.eks. indikert over). Dette kan bli utført på en måte kjent per se, som vil være klart for den faglærte personen, for eksempel på grunnlag av den videre beskrivelsen under og det tidligere faget om humanisering referert til heri. Igjen, skulle det bli notert at slike humaniserte Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen kan bli ervervet med en hvilken som helst egnet måte kjent per se (dvs. som indikert under punkter (1) – (8) over) og er derfor ikke strengt begrenset til polypeptider som har blitt ervervet ved å anvende et polypeptid som omfatter et naturlig forekommende VHH domene som et startmateriale.
Som foretrukket, men ikke-begrensende humaniserende substitusjon for Nanobodies som tilhører 103 P,R,S-gruppen og/eller GLEW-gruppen (som definert heri) er 108Q til 108L.
En annen spesielt foretrukket klasse av Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen omfatter Nanobodies med en aminosyresekvens som korresponderer til aminosyresekvensen av et naturlig forekommende VH domene som har blitt “camelisert”, dvs. ved å erstatte en eller flere aminosyreresidier i aminosyresekvensen til et naturlig forekommende VH domene fra et konvensjonelt 4-kjede antistoff med en eller flere av aminosyreresidiene som forekommer i den(de) korresponderende posisjonen(e) i et VHH domene til et tungkjede antistoff.
Dette kan bli utført på en måte kjent per se, som vil være klart for den faglærte personen, for eksempel på grunnlag av den videre beskrivelsen under. Det refereres også til WO 94/04678. Slik camelisering kan fortrinnsvis forekomme ved aminosyreposisjoner som er foreliggende i VH-VL grenseflaten og ved de såkalte Camelidae Kjennetegnresidier (se for eksempel også WO 94/04678), som også nevnt under. Fortrinnsvis, er VH domenet eller sekvensen som er anvendt som et startmateriale eller startpunkt for å generere eller designe det cameliserte Nanobodiet fortrinnsvis en VH sekvens fra et pattedyr, mer foretrukket VH sekvensen til et menneske. Imidlertid, skulle det bli notert at slike cameliserte Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen kan bli ervervet på en hvilken som helst egnet måte kjent per se (dvs. som indikert under punkter (1) – (8) over) og derfor ikke er strengt begrenset til polypeptider som har blitt ervervet ved å anvende et polypeptid som omfatter et naturlig forekommende VH domene som et startmateriale.
For eksempel, igjen som videre beskrevet under, kan både “humanisering” og “camelisering” bli utført ved å fremskaffe en nukleotidesekvens som koder for et slikt naturlig forekommende VHH domene eller VH domene, respektivt, og deretter bytte, på en måte kjent per se, et eller flere kodon i ovennevnte nukleotidesekvens slik at den nye nukleotidesekvensen koder for et humanisert eller camelisert Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen, respektivt, og deretter uttrykke nukleotidesekvensen således ervervet på en måte kjent per se for å fremskaffe det ønskede Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen. Alternativt, basert på aminosyresekvensen til et naturlig forekommende VHH domene eller VH domene, respektivt, kan aminosyresekvensen til det ønskede humaniserte eller cameliserte Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen, respektivt, bli designet og deretter syntetisert de novo ved å anvende teknikker for peptid syntese kjent per se. Også, basert på aminosyresekvensen eller nukleotidesekvensen til et naturlig forekommende VHH domene eller VH domene, respektivt, kan en nukleotidesekvens som koder for det ønskede humaniserte eller cameliserte Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen, respektivt, bli designet og deretter syntetisert de novo ved å anvende teknikker for nukleinsyresyntese kjent per se, etter at nukleotidesekvensen således ervervet kan bli uttrykt på en måte kjent per se for å fremskaffe det ønskede Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen.
Andre egnede måter og teknikker for å erverve Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen og/eller nukleotidesekvenser og/eller nukleinsyrer som koder for det samme, starter fra (aminosyresekvensen til) naturlig forekommende VH domener eller fortrinnsvis VHH domener og/eller fra nukleotidesekvenser og/eller nukleinsyresekvenser som koder for det samme vil være klart for den faglærte personen, og kan for eksempel omfatte å kombinere en eller flere aminosyresekvenser og/eller nukleotidesekvenser fra naturlig forekommende VH domener (slik som en eller flere FR’er og/eller CDR’er) med en eller flere aminosyresekvenser og/eller nukleotidesekvenser fra naturlig forekommende VHH domener (slik som en eller flere FR’er eller CDR’er), på en egnet måte for å fremskaffe (en nukleotidesekvens eller nukleinsyre som koder for) et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen.
I følge et foretrukket, men ikke-begrensende aspekt av aspektet av den foreliggende oppfinnelsen, kan et Nanobody i sin videste forstand generelt bli definert som et polypeptid som omfatter:
a) en aminosyresekvens som er omfattet av fire rammeverk-regioner/-sekvenser avbrutt av tre komplementaritetsbestemmende regioner/sekvenser, der aminosyreresidiet i posisjon 108 i følge Kabat nummereringen er Q;
og/eller:
b) en aminosyresekvens som er omfattet av fire rammeverk regioner/sekvenser avbrutt av tre komplementaritetsbestemmende regioner/sekvenser, der aminosyreresidiet i posisjon 44 i følge Kabat nummereringen er E og der aminosyreresidiet i posisjon 45 i følge Kabat nummereringen er en R; og/eller:
c) en aminosyresekvens som er omfattet av fire rammeverk-regioner/-sekvenser avbrutt av tre komplementaritetsbestemmende regioner/sekvenser, der aminosyreresidiet i posisjon 103 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av P, R og S, og er spesielt valgt fra gruppen som består av R og S.
Derfor, i et første foretrukket, men ikke-begrensende aspekt, kan et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen ha strukturen
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
der FR1 til FR4 refererer til rammeverkregioner 1 til 4, respektivt, og der CDR1 til CDR3 refererer til de komplementaritetsbestemmende regionene 1 til 3, respektivt, og der
i) aminosyreresidiet i posisjon 108 i følge Kabat nummereringen er Q; og/eller der:
ii) aminosyreresidiet i posisjon 44 i følge Kabat nummereringen er E og der aminosyreresidiet i posisjon 45 i følge Kabat nummereringen er en R; og/eller der:
iii) aminosyreresidiet i posisjon 103 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av P, R og S, og er spesielt valgt fra gruppen som består av R og S;
og der
iv) CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert over, og er fortrinnsvis som definert i følge en av de foretrukne definisjonene over, og er mer foretrukket som definert i følge en av de mer foretrukne definisjonene over.
Spesielt, kan et Nanobody mot TNF-alfa i følge den foreliggende oppfinnelsen ha strukturen:
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
der FR1 til FR4 refererer til rammeverkregioner 1 til 4, respektivt, og der CDR1 til CDR3 refererer til de komplementaritetsbestemmende regionene 1 til 3, respektivt, og der
i) aminosyreresidiet i posisjon 108 i følge Kabat nummereringen er Q; og/eller der:
ii) aminosyreresidiet i posisjon 44 i følge Kabat nummereringen er E og der aminosyreresidiet i posisjon 45 i følge Kabat nummereringen er en R; og/eller der:
iii) aminosyreresidiet i posisjon 103 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av P, R og S, og er spesielt valgt fra gruppen som består av R og S;
og der
iv) CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert over, og er fortrinnsvis som definert i følge en av de foretrukne definisjonene over, og er mer foretrukket som definert i følge en av de mer foretrukne definisjonene over.
Spesielt, i følge et foretrukket, men ikke-begrensende aspekt til aspektet av den foreliggende oppfinnelsen, kan et Nanobody generelt bli definert som et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens som er omfattet av fire rammeverkregioner/-sekvenser avbrutt av tre komplementaritetsbestemmende regioner/sekvenser, der;
a-1) aminosyreresidiet i posisjon 44 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av G, E, D, G, Q, R, S, L; og fortrinnsvis er valgt fra gruppen som består av G, E eller Q; og
a-2) aminosyreresidiet i posisjon 45 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av L, R eller C; og fortrinnsvis er valgt fra gruppen som består av L eller R; og
a-3) aminosyreresidiet i posisjon 103 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av W, R eller S; og er fortrinnsvis W eller R, og er mest foretrukket W;
a-4) aminosyreresidiet i posisjon 108 i følge Kabat nummereringen er Q; eller der:
b-1) aminosyreresidiet i posisjon 44 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av E og Q; og
b-2) aminosyreresidiet i posisjon 45 i følge Kabat nummereringen er R; og b-3) aminosyreresidiet i posisjon 103 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av W, R og S; og er fortrinnsvis W;
b-4) aminosyreresidiet i posisjon 108 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av Q og L; og er fortrinnsvis Q;
eller der:
c-1) aminosyreresidiet i posisjon 44 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av G, E, D, Q, R, S og L; og er fortrinnsvis valgt fra gruppen som består av G, E og Q; og
c-2) aminosyreresidiet i posisjon 45 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av L, R og C; og er fortrinnsvis valgt fra gruppen som består av L og R; og
c-3) aminosyreresidiet i posisjon 103 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av P, R og S; og er spesielt valgt fra gruppen som består av R og S; og
c-4) aminosyreresidiet i posisjon 108 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av Q og L; er fortrinnsvis Q.
Derfor, i et annet foretrukket, men ikke-begrensende aspekt, kan et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen ha strukturen
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
der FR1 til FR4 refererer til rammeverkregioner 1 til 4, respektivt, og der CDR1 til CDR3 refererer til de komplementaritetsbestemmende regionene 1 til 3, respektivt, og der:
i) aminosyreresidiet i posisjon 44 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av G, E, D, G, Q, R, S, L; og er fortrinnsvis valgt fra gruppen som består av G, E eller Q;
og der:
ii) aminosyreresidiet i posisjon 45 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av L, R eller C; og er fortrinnsvis valgt fra gruppen som består av L eller R;
og der:
iii) aminosyreresidiet i posisjon 103 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av W, R eller S; og er fortrinnsvis W eller R, og er mest foretrukket W;
og der
iv) aminosyreresidiet i posisjon 108 i følge Kabat nummereringen er Q;
og der:
v) CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert over, og er fortrinnsvis som definert i følge en av de foretrukne definisjonene over, og er mer foretrukket som definert i følge en av de mer foretrukne definisjonene over.
I et annet foretrukket, men ikke-begrensende aspekt, kan et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen ha strukturen
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
der FR1 til FR4 refererer til rammeverkregioner 1 til 4, respektivt, og der CDR1 til CDR3 refererer til de komplementaritetsbestemmende regionene 1 til 3, respektivt, og der:
i) aminosyreresidiet i posisjon 44 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av E og Q;
og der:
ii) aminosyreresidiet i posisjon 45 i følge Kabat nummereringen er R;
og der:
iii) aminosyreresidiet i posisjon 103 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av W, R og S; og er fortrinnsvis W;
og der:
iv) aminosyreresidiet i posisjon 108 i følge Kabat nummereringen er Q;
og der:
vi) CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert over, og er fortrinnsvis som definert i følge en av de foretrukne definisjonene over, og er mer foretrukket som definert i følge en av de mer foretrukne definisjonene over.
I et annet foretrukket, men ikke-begrensende aspekt, kan et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen ha strukturen
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
der FR1 til FR4 refererer til rammeverkregioner 1 til 4, respektivt, og der CDR1 til CDR3 refererer til de komplementaritetsbestemmende regionene 1 til 3, respektivt, og der:
i) aminosyreresidiet i posisjon 44 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av G, E, D, Q, R, S og L; og er fortrinnsvis valgt fra gruppen som består av G, E og Q;
og der:
ii) aminosyreresidiet i posisjon 45 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av L, R og C; og er fortrinnsvis valgt fra gruppen som består av L og R;
og der:
iii) aminosyreresidiet i posisjon 103 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av P, R og S; og er spesielt valgt fra gruppen som består av R og S;
og der:
iv) aminosyreresidiet i posisjon 108 i følge Kabat nummereringen er valgt fra gruppen som består av Q og L; er fortrinnsvis Q;
og der:
v) CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert over, og er fortrinnsvis som definert i følge en av de foretrukne definisjonene over, og er mer foretrukket som definert i følge en av de mer foretrukne definisjonene over.
To spesielt foretrukne, men ikke-begrensende grupper av Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen er de i følge a) over; i følge I) til a-4) over; i følge b) over; i følge b-1) til b-4) over; i følge c) over; og/eller i følge c-1) til c-4) over, der; a) aminosyreresidiene i posisjoner 44-47 i følge Kabat nummereringen danner sekvensen GLEW (eller en GLEW-lignende sekvens som definert under) og aminosyreresidiet i posisjon 108 er Q;
eller der:
b) aminosyreresidiene i posisjoner 43-46 i følge Kabat nummereringen danner sekvensen KERE eller KQRE (eller en KERE-lignende sekvens) og aminosyreresidiet i posisjon 108 er Q eller L, og er fortrinnsvis Q.
Derfor, i et annet foretrukket, men ikke-begrensende aspekt, kan et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen ha strukturen
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
der FR1 til FR4 refererer til rammeverkregioner 1 til 4, respektivt, og der CDR1 til CDR3 refererer til de komplementaritetsbestemmende regionene 1 til 3, respektivt, og der:
i) aminosyreresidiene i posisjoner 44-47 i følge Kabat nummereringen danner sekvensen GLEW (eller en GLEW-lignende sekvens som definert under) og aminosyreresidiet i posisjon 108 er Q;
og der:
ii) CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert over, og er fortrinnsvis som definert i følge en av de foretrukne definisjonene over, og er mer foretrukket som definert i følge en av de mer foretrukne definisjonene over.
I et annet foretrukket, men ikke-begrensende aspekt, kan et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen ha strukturen
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
der FR1 til FR4 refererer til rammeverkregioner 1 til 4, respektivt, og der CDR1 til CDR3 refererer til de komplementaritetsbestemmende regionene 1 til 3, respektivt, og der:
i) aminosyreresidiene i posisjoner 43-46 i følge Kabat nummereringen danner sekvensen KERE eller KQRE (eller en KERE-lignende sekvens) og aminosyreresidiet i posisjon 108 er Q eller L, og er fortrinnsvis Q;
og der:
ii) CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert over, og er fortrinnsvis som definert i følge en av de foretrukne definisjonene over, og er mer foretrukket som definert i følge en av de mer foretrukne definisjonene over.
I Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen der aminosyreresidiene i posisjoner 43-46 i følge Kabat nummereringen danner sekvensen KERE eller KQRE, er aminosyreresidiet i posisjon 37 mest foretrukket F. I Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen der aminosyreresidiene i posisjoner 44-47 i følge Kabat nummereringen danner sekvensen GLEW, er aminosyreresidiet i posisjon 37 valgt fra gruppen som består av Y, H, I, V eller F, og er mest foretrukket F.
Derfor, uten å være begrenset hertil på noen som helst måte, på grunnlag av aminosyreresidiene foreliggende i posisjonene nevnt over, kan Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen generelt bli klassifisert på grunnlag av de følgende tre gruppene:
a) “GLEW-gruppen”: Nanobodies med aminosyresekvensen GLEW i posisjoner 44-47 i følge Kabat nummereringen og Q i posisjon 108 i følge Kabat nummereringen. Som videre beskrevet heri, har Nanobodies innen denne gruppen vanligvis en V i posisjon 37, og kan ha en W, P, R eller S i posisjon 103, og fortrinnsvis ha en W i posisjon 103. GLEW gruppen omfatter også noen GLEW-lignende sekvenser slik som de nevnt i Tabell 2 under;
b) “KERE-gruppen”: Nanobodies med aminosyresekvensen KERE eller KQRE eller i posisjoner 43-46 i følge Kabat nummereringen og Q eller L i posisjon 108 i følge Kabat nummereringen. Som videre beskrevet heri, har Nanobodies innen denne gruppen vanligvis en F i posisjon 37, en L eller F i posisjon 47; og kan ha en W, P, R eller S i posisjon 103, og fortrinnsvis ha en W i posisjon 103;
c) “103 P, R, S-gruppen”: Nanobodies med en P R eller S i posisjon 103. Disse Nanobodies kan ha enten aminosyresekvensen GLEW i posisjoner 44-47 av Kabat nummereringen eller aminosyresekvensen KERE eller KQRE i posisjoner 43-46 i følge Kabat nummereringen, det sistnevnte mest foretrukket i kombinasjon med en F i posisjon 37 og en L eller en F i posisjon 47 (som definert for KERE-gruppen ); og kan ha Q eller L i posisjon 108 i følge Kabat nummereringen, og fortrinnsvis ha Q.
Derfor, i et annet foretrukket, men ikke-begrensende aspekt, kan et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen være et Nanobody som tilhører GLEW-gruppen (som definert heri), og der CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert over, og er fortrinnsvis som definert i følge en av de foretrukne definisjonene over, og er mer foretrukket som definert i følge en av de mer foretrukne definisjonene over.
I et annet foretrukket, men ikke-begrensende aspekt, kan et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen være et Nanobody som tilhører KERE-gruppen (som definert heri), og der CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert over, og er fortrinnsvis som definert i følge en av de foretrukne definisjonene over, og er mer foretrukket som definert i følge en av de mer foretrukne definisjonene over.
Derfor, i et annet foretrukket, men ikke-begrensende aspekt, kan et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen være et Nanobody som tilhører 103 P, R, S-gruppen (som definert heri), og der CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert over, og er fortrinnsvis som definert i følge en av de foretrukne definisjonene over, og er mer foretrukket som definert i følge en av de mer foretrukne definisjonene over.
Også, mer generelt og i tillegg til 108Q, 43E/44R og 103P,R,S residiene nevnt over, kan Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen inneholde, ved en eller flere posisjoner som, i et konvensjonelt VH domene, vil danne (del av) VH/VL grenseflaten, inneholde en eller flere aminosyreresidier som er høyere ladet enn aminosyreresidiene som naturlig forekommer ved den(de) samme posisjonen(e) i det korresponderende naturlig forekommende VH eller VHH domenet, og spesielt en eller flere ladete aminosyreresidier (som nevnt i Tabell 1).
Slike substitusjoner inkluderer, men er ikke begrenset til de GLEW-lignende sekvensene nevnt i Tabell 2 under; så vel som substitusjonene som er beskrevet i den Internasjonale Søknaden WO 00/29004 for såkalte “mikrolegemer”, f.eks. en Q i posisjon 108 og KLEW i posisjoner 44-47.
I noen utførelsesformer av Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, er aminosyreresidiet i posisjon 83 valgt fra gruppen som består av L, M, S, V og W; og er fortrinnsvis L.
Også, i noen utførelsesformer av Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, er aminosyreresidiet i posisjon 83 valgt fra gruppen som består av R, K, N, E, I og Q; og er mest foretrukket enten K eller E (for Nanobodies korresponderende til naturlig forekommende VHH domener) eller R (for “humaniserte” Nanobodies, som beskrevet under). Aminosyreresidiet i posisjon 84 i noen utførelsesformer er valgt fra gruppen som består av P, A, R, S, D og V, og er mest foretrukket P (for Nanobodies korresponderende til naturlig forekommende VHH domener) eller R (for “humaniserte” Nanobodies, som beskrevet under).
Videre, i noen utførelsesformer av Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, er aminosyreresidiet i posisjon 104 valgt fra gruppen som består av G og D; og er mest foretrukket G.
Kollektivt, vil aminosyreresidiene i posisjoner 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 og 108, der Nanobodies er som nevnt over, også bli referert til heri som “Kjennetegnresidier”. Kjennetegnresidiene og aminosyreresidiene ved de korresponderende posisjonene til det nærest relaterte humane VH domenet, VH3, er oppsummert i Tabell 2.
Noen spesielt foretrukne kombinasjoner av disse Kjennetegnresidiene som forekommer i naturlig forekommende VHH domener er nevnt i Tabell 3. Til sammenligning, har de korresponderende aminosyreresidiene til det humane VH3 kalt DP-47 blitt indikert i kursiv.
Tabell 2: Kjennetegnresidier i Nanobodies
Notater:
(1): Spesielt, men ikke eksklusivt, i kombinasjon med KERE (SEQ ID NO: 437) eller KQRE (SEQ ID NO: 438) i posisjoner 43-46.
(2): Vanligvis som GLEW (SEQ ID NO: 439) i posisjoner 44-47.
(3): Vanligvis som KERE eller KQRE i posisjoner 43-46, f.eks. som KEREL, (SEQ ID NO: 440), KEREF (SEQ ID NO.441), KQREL (SEQ ID NO.442) , KQREF (SEQ ID NO: 443) eller KEREG (SEQ ID NO: 444) i posisjoner 43-47. Alternativt, også sekvenser slik som TERE (SEQ ID NO: 445) (for eksempel TEREL (SEQ ID NO: 446)), KECE (SEQ ID NO: 447) (for eksempel KECEL (SEQ ID NO: 448) eller KECER (SEQ ID NO: 449)), RERE (SEQ ID NO: 450) (for eksempel REREG (SEQ ID NO.451)), QERE (SEQ ID NO: 452) (for eksempel QEREG (SEQ ID NO: 453)), KGRE (SEQ ID NO: 454) (for eksempel KGREG (SEQ ID NO: 455)), KDRE (SEQ ID NO: 456) (for eksempel KDREV (SEQ ID NO: 457)) er mulig. Noen andre mulige, men mindre foretrukne sekvenser inkluderer for eksempel DECKL (SEQ ID NO: 458) og NVCEL (SEQ ID NO: 459).
(4): Med både GLEW i posisjoner 44-47 og KERE eller KQRE i posisjoner 43-46.
(5): Ofte som KP eller EP i posisjoner 83-84 av naturlig forekommende VHH domener.
(6): Spesielt, men ikke eksklusivt, i kombinasjon med GLEW i posisjoner 44-47. (7): Med forbeholdet at når posisjoner 44-47 er GLEW, er posisjon 108 alltid Q. (8): GLEW gruppen inneholder også GLEW-lignende sekvenser i posisjoner 44-47, slik som for eksempel GVEW (SEQ ID NO: 460), EPEW (SEQ ID NO: 461), GLER (SEQ ID NO: 462), DQEW (SEQ ID NO: 463), DLEW (SEQ ID NO: 464), GIEW (SEQ ID NO: 465), ELEW (SEQ ID NO: 466), GPEW (SEQ ID NO: 467), EWLP (SEQ ID NO: 468), GPER (SEQ ID NO: 469), GLER (SEQ ID NO: 470) og ELEW.
Tabell 3: Noen foretrukne kombinasjoner av Kjennetegnresidier i naturlig forekommende For humanisering av disse kombinasjonene, refereres det til spesifikasjonen.
I Nanobodies, kan hvert aminosyreresidie ved en hvilken som helst annen posisjon enn Kjennetegnresidiene være et hvilket som helst aminosyreresidie som naturlig forekommer ved den korresponderende posisjonen (i følge Kabat nummereringen) til et naturlig forekommende VHH domene.
Slike aminosyreresidier vil være klart for den faglærte personen. Tabeller 4 - 7 nevner noen ikke-begrensende residier som kan være foreliggende i hver posisjon (i følge Kabat nummereringen) til FR1, FR2, FR3 og FR4 til naturlig forekommende VHH domener. For hver posisjon, er aminosyreresidiet som oftest forekommer i hver posisjon av et naturlig forekommende VHH domene (og som er det mest foretrukne aminosyreresidiet for ovennevnte posisjon i et Nanobody) indikert i uthevet skrift; og andre foretrukne aminosyreresidier for hver posisjon har blitt understreket (legg merke til: antallet aminosyreresidier som er funnet i posisjoner 26-30 av naturlig forekommende VHH domener støtter hypotesen som danner grunnlag for nummereringen Chothia (supra) at residiene i disse posisjonene allerede danner en del av CDR1.)
I Tabeller 4 - 7, har noen av de ikke-begrensende residiene som kan være foreliggende i hver posisjon av et humant VH3 domene også blitt nevnt. Igjen, for hver posisjon, har aminosyreresidiet som oftest forekommer i hver posisjon av et naturlig forekommende humant VH3 domene indikert med uthevet skrift; og andre foretrukne aminosyreresidier blitt understreket.
Tabell 4: Ikke-begrensende eksempler på aminosyreresidier i FR1 (for fotnotene, se fotnotene til Tabell 2)
Tabell 4: Ikke-begrensende eksempler på aminosyreresidier i FR1 (fortsatt)
Tabell 5: Ikke-begrensende eksempler på aminosyreresidier i FR2 (for fotnotene, se fotnotene til Tabell 2)
Tabell 6: Ikke-begrensende eksempler på aminosyreresidier i FR3 (for fotnotene, se fotnotene til Tabell 2)
Tabell 6: Ikke-begrensende eksempler på aminosyreresidier i FR3 (fortsatt)
Tabell 7: Ikke-begrensende eksempler på aminosyreresidier i FR4 (for fotnotene, se fotnotene til Tabell 2)
Derfor, i et annet foretrukket, men ikke begrensende aspekt, kan et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen ha strukturen
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
der FR1 til FR4 refererer til rammeverkregioner 1 til 4, respektivt, og der CDR1 til CDR3 refererer til de komplementaritetsbestemmende regionene 1 til 3, respektivt, og der:
i) Kjennetegnresidiene er som definert over;
og der:
ii) CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert over, og er fortrinnsvis som definert i følge en av de foretrukne definisjonene over, og er mer foretrukket som definert i følge en av de mer foretrukne definisjonene over.
I et annet foretrukket, men ikke begrensende aspekt, kan et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen ha strukturen
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
der FR1 til FR4 refererer til rammeverkregioner 1 til 4, respektivt, og der CDR1 til CDR3 refererer til de komplementaritetsbestemmende regionene 1 til 3, respektivt, og der:
i) FR1 er valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensen:
[1] QVQLQESGGGXVQAGGSLRLSCAASG [26] [SEQ ID NO: 1]
eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med aminosyresekvensen over; der (1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 4; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 4; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og der:
ii) FR2 er valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensen:
[36] WXRQAPGKXXEXVA [49] [SEQ ID NO: 2]
eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med aminosyresekvensen over; der (1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 5; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 5; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og der:
iii) FR3 er valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensen:
[66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLXXEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID NO: 3]
eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med aminosyresekvensen over; der (1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 6; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 6; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og der:
iv) FR4 er valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensen:
[103] XXQGTXVTVSS [113] [SEQ ID NO: 4]
eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med aminosyresekvensen over; der (1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 6; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 6; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og der:
v) CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert over, og er fortrinnsvis som definert i følge en av de foretrukne definisjonene over, og er mer foretrukket som definert i følge en av de mer foretrukne definisjonene over;
der Kjennetegnresidiene er indikert med “X” og er som definert heriover og der numrene mellom parentes refererer til aminosyreposisjonene i følge Kabat nummereringen.
I et annet foretrukket, men ikke begrensende aspekt, kan et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen ha strukturen
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
der FR1 til FR4 refererer til rammeverkregioner 1 til 4, respektivt, og der CDR1 til CDR3 refererer til de komplementaritetsbestemmende regionene 1 til 3, respektivt, og der:
i) FR1 er valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensen:
[1] QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [26] [SEQ ID NO: 5]
eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med aminosyresekvensen over; der (1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 4; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og (3) Kjennetegnresidiet i posisjon er som indikert i sekvensen over; og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 4; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og (3) Kjennetegnresidiet i posisjon er som indikert i sekvensen over;
og der:
ii) FR2 er valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensene:
[36] WFRQAPGKERELVA [49] [SEQ ID NO: 6] [36] WFRQAPGKEREFVA [49] [SEQ ID NO: 7] [36] WFRQAPGKEREGA [49] [SEQ ID NO: 8] [36] WFRQAPGKQRELVA [49] [SEQ ID NO: 9] [36] WFRQAPGKQREFVA [49] [SEQ ID NO: 10] [36] WYRQAPGKGLEWA [49] [SEQ ID NO: 11]
eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over; der
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 5; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og (3) Kjennetegnresidiene i posisjoner 37, 44, 45 og 47 er som indikert i hver av sekvensene over;
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 5; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og (3) Kjennetegnresidiene i posisjoner 37, 44, 45 og 47 er som indikert i hver av sekvensene over;
og der:
iii) FR3 er valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensen:
[66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID NO: 12]
eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med aminosyresekvensen over; der (1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 6; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og (3) Kjennetegnresidiene i posisjoner 83 og 84 er som indikert i hver av sekvensene over;
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 6; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og (3) Kjennetegnresidiene i posisjoner 83 og 84 er som indikert i hver av sekvensene over;
og der:
iv) FR4 er valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensene:
[103] WGQGTQVTVSS [113] [SEQ ID NO: 13]
[103] WGQGTLVTVSS [113] [SEQ ID NO: 14]
eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over; der
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 6; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og (3) Kjennetegnresidiene i posisjoner 103, 104 og 108 er som indikert i hver av sekvensene over;
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 6; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og (3) Kjennetegnresidiene i posisjoner 103, 104 og 108 er som indikert i hver av sekvensene over;
og der:
v) CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert over, og er fortrinnsvis som definert i følge en av de foretrukne definisjonene over, og er mer foretrukket som definert i følge en av de mer foretrukne definisjonene over.
I et annet foretrukket, men ikke begrensende aspekt, kan et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen ha strukturen
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
der FR1 til FR4 refererer til rammeverkregioner 1 til 4, respektivt, og der CDR1 til CDR3 refererer til de komplementaritetsbestemmende regionene 1 til 3, respektivt, og der:
i) FR1 er valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensen:
[1] QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [26] [SEQ ID NO: 5]
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 4; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og (3) Kjennetegnresidiet i posisjon er som indikert i sekvensen over;
og der:
ii) FR2 er valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensene:
[36] WFRQAPGKERELVA [49] [SEQ ID NO: 6] [36] WFRQAPGKEREFVA [49] [SEQ ID NO: 7] [36] WFRQAPGKEREGA [49] [SEQ ID NO: 8] [36] WFRQAPGKQRELVA [49] [SEQ ID NO: 9] [36] WFRQAPGKQREFVA [49] [SEQ ID NO: 10]
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 5; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og (3) Kjennetegnresidiene i posisjoner 37, 44, 45 og 47 er som indikert i hver av sekvensene over;
og der:
iii) FR3 er valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensen:
[66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID NO: 12]
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 6; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og (3) Kjennetegnresidiene i posisjoner 83 og 84 er som indikert i hver av sekvensene over;
og der:
iv) FR4 er valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensene:
[103] WGQGTQVTVSS [113] [SEQ ID NO: 13] [103] WGQGTLVTVSS [113] [SEQ ID NO: 14]
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 7; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og (3) Kjennetegnresidiene i posisjoner 103, 104 og 108 er som indikert i hver av sekvensene over;
og der:
v) CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert over, og er fortrinnsvis som definert i følge en av de foretrukne definisjonene over, og er mer foretrukket som definert i følge en av de mer foretrukne definisjonene over.
I et annet foretrukket, men ikke begrensende aspekt, kan et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen ha strukturen
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
der FR1 til FR4 refererer til rammeverkregioner 1 til 4, respektivt, og der CDR1 til CDR3 refererer til de komplementaritetsbestemmende regionene 1 til 3, respektivt, og der:
i) FR1 er valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensen:
[1] QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [26] [SEQ ID NO: 5]
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 4; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og (3) Kjennetegnresidiet i posisjon er som indikert i sekvensen over;
og der:
ii) FR2 er valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensen:
[36] WYRQAPGKGLEWA [49] [SEQ ID NO: 11]
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 5; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og (3) Kjennetegnresidiene i posisjoner 37, 44, 45 og 47 er som indikert i hver av sekvensene over;
og der:
iii) FR3 er valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensen:
[66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID NO: 12]
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 6; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og (3) Kjennetegnresidiene i posisjoner 83 og 84 er som indikert i hver av sekvensene over;
og der:
iv) FR4 er valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensen:
[103] WGQGTQVTVSS [113] [SEQ ID NO: 13]
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 7; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over; og (3) Kjennetegnresidiene i posisjoner 103, 104 og 108 er som indikert i hver av sekvensene over;
og der:
v) CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert over, og er fortrinnsvis som definert i følge en av de foretrukne definisjonene over, og er mer foretrukket som definert i følge en av de mer foretrukne definisjonene over.
Noen andre rammeverksekvenser som kan være foreliggende i Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen kan bli funnet i det Europeiske patentet EP 656 946 nevnt over (se for eksempel også det oppfylte US ekvivalentet 5,759,808).
I et annet foretrukket, men ikke begrensende aspekt, kan et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen ha strukturen
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
der FR1 til FR4 refererer til rammeverkregioner 1 til 4, respektivt, og der CDR1 til CDR3 refererer til de komplementaritetsbestemmende regionene 1 til 3, respektivt, og der:
i) FR1 er valgt fra gruppen som består av FR1 sekvensene foreliggende i Nanobodies til SEQ ID NO 52 til 60, SEQ ID NO 76 til 86 eller SEQ ID NO 95 til 99, og spesielt i de humaniserte Nanobodies til SEQ ID NO 76 til 86 eller SEQ ID NO 95 til 99,
eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av ovennevnte FR1 sekvenser; der
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 4; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med ovennevnte FR1 sekvens; og
(3) Kjennetegnresidiet i posisjon er som indikert i ovennevnte FR1 sekvens; og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av ovennevnte FR1 sekvenser, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 4; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med ovennevnte FR1 sekvens; og
(3) Kjennetegnresidiet i posisjon er som indikert i ovennevnte FR1 sekvens; og der:
ii) FR2 er valgt fra gruppen som består av FR2 sekvensene foreliggende i Nanobodies til SEQ ID NO 52 til 60, SEQ ID NO 76 til 86 eller SEQ ID NO 95 til 99, og spesielt i de humaniserte Nanobodies til SEQ ID NO 76 til 86 eller SEQ ID NO 95 til 99,
eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av ovennevnte FR2 sekvenser; der
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 5; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med ovennevnte FR2 sekvens; og
(3) Kjennetegnresidiene i posisjoner 37, 44, 45 og 47 er som indikert i ovennevnte FR2 sekvens;
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av ovennevnte FR2 sekvenser, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 5; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med ovennevnte FR2 sekvens; og
(3) Kjennetegnresidiene i posisjoner 37, 44, 45 og 47 er som indikert i ovennevnte FR2 sekvens;
og der:
iii) FR3 er valgt fra gruppen som består av FR3 sekvensene foreliggende i Nanobodies til SEQ ID NO 52 til 60, SEQ ID NO 76 til 86 eller SEQ ID NO 95 til 99, og spesielt i de humaniserte Nanobodies til SEQ ID NO 76 til 86 eller SEQ ID NO 95 til 99,
eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av ovennevnte FR3 sekvenser; der
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 6; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med ovennevnte FR3 sekvens; og
(3) Kjennetegnresidiene i posisjoner 83 og 84 er som indikert i ovennevnte FR3 sekvens;
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av ovennevnte FR3 sekvenser, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 6; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med ovennevnte FR3 sekvens; og
(3) Kjennetegnresidiene i posisjoner 83 og 84 er som indikert i ovennevnte FR3 sekvens;
og der:
iv) FR4 er valgt fra gruppen som består av FR4 sekvensene foreliggende i Nanobodies til SEQ ID NO 52 til 60, SEQ ID NO 76 til 86 eller SEQ ID NO 95 til 99, og spesielt i de humaniserte Nanobodies til SEQ ID NO 76 til 86 eller SEQ ID NO 95 til 99,
eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av ovennevnte FR4 sekvenser; der
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 6; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med ovennevnte FR4 sekvens; og
(3) Kjennetegnresidiene i posisjoner 103, 104 og 108 er som indikert i ovennevnte FR3 sekvens;
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av ovennevnte FR4 sekvenser, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabell 6; og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med ovennevnte FR4 sekvens; og
(3) Kjennetegnresidiene i posisjoner 103, 104 og 108 er som indikert i ovennevnte FR4 sekvens;
og der:
v) CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert over, og er fortrinnsvis som definert i følge en av de foretrukne definisjonene over, og er mer foretrukket som definert i følge en av de mer foretrukne definisjonene over.
Noen spesielt foretrukne Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen kan bli valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensene til SEQ ID NO 52 til 60, SEQ ID NO 76 til 86 eller SEQ ID NO 95 til 99, og spesielt i de humaniserte Nanobodies til SEQ ID NO 76 til 86 eller SEQ ID NO 95 til 99 eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av aminosyresekvensene til SEQ ID NO 52 til 60, SEQ ID NO 76 til 86 eller SEQ ID NO 95 til 99; der
(1) Kjennetegnresidiene kan være som indikert i Tabell 2 over;
(2) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabeller 4-7; og/eller
(3) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensen(aminosyresekvensene) over.
Noen enda mer spesielt foretrukne Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen kan bli valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensene til SEQ ID NO 52 til 60, SEQ ID NO 76 til 86 eller SEQ ID NO 95 til 99, og spesielt i de humaniserte Nanobodies til SEQ ID NO 76 til 86 eller SEQ ID NO 95 til 99 eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av aminosyresekvensene til SEQ ID NO 52 til 60, SEQ ID NO 76 til 86 eller SEQ ID NO 95 til 99; der
(1) Kjennetegnresidiene er som indikert i den relevante sekvensen valgt fra SEQ ID NO 52 til 60, SEQ ID NO 76 til 86 eller SEQ ID NO 95 til 99; (2) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon ved en hvilken som helst posisjon andre enn en Kjennetegnposisjon er fortrinnsvis enten en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri) og/eller en aminosyresubstitusjon som definert i Tabeller 4-7; og/eller
(3) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med den relevante sekvensen valgt fra SEQ ID NO 52 til 60, SEQ ID NO 76 til 86 eller SEQ ID NO 95 til 99.
Noen av de mest foretrukne Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen kan bli valgt fra gruppen som består av aminosyresekvensene til SEQ ID NO 52 til 60, SEQ ID NO 76 til 86 eller SEQ ID NO 95 til 99, og spesielt fra de humaniserte Nanobodies til SEQ ID NO 76 til 86 eller SEQ ID NO 95 til 99.
Som vil være klart fra det over, kan termen Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen som anvendt heri i sin videste forstand også omfatte naturlige eller syntetiske mutanter, varianter, alleler, analoger og ortologer (heriunder kollektivt referert til som “analoger”) av Nanobodies nevnt i SEQ ID NO’ene 52 til 60, SEQ ID NO 76 til 86 eller SEQ ID NO 95 til 99.
Generelt, kan slike analoger for eksempel omfatte homologe sekvenser, funksjonelle deler, eller en funksjonell del av en homolog sekvens (som videre definert under) til et Nanobody. Generelt, i slike analoger, kan hvert aminosyreresidie (andre enn Kjennetegnresidiet) i hver av rammeverkregionene bli erstattet av et hvilket som helst annet aminosyreresidie, fremskaffet som den totale graden av sekvensidentitet av rammeverkregionene gjenstår som definert over. Fortrinnsvis, imidlertid, i slike analoger:
- er en eller aminosyreresidier i rammeverksekvensene over erstattet av en eller flere aminosyreresidier som naturlig forekommer i den samme posisjonen i et naturlig forekommende VHH domene. Noen eksempler på slike substitusjoner er nevnt i Tabeller 4-7 over;
og/eller:
- er en eller aminosyreresidier i rammeverksekvensene over erstattet av en eller flere aminosyreresidier som kan bli ansett som en “konservativ” aminosyresubstitusjon, som beskrevet heriover;
og/eller:
- er en eller aminosyreresidier i rammeverksekvensene over erstattet av en eller flere aminosyreresidier som naturlig forekommer i den samme posisjonen i et naturlig forekommende VH domene til et menneske. Dette er generelt referert til som “humanisering” av det naturlig forekommende VHH/Nanobodiet generelt og av ovennevnte posisjon spesielt, og vil bli diskutert mer detaljert heriunder; og:
- posisjoner der bare et aminosyreresidie er nevnt for både VH domenet og VHH domenet i Tabeller 4 – 7 over er fortrinnsvis ikke erstattet.
Også, selv om generelt mindre foretrukket, i slike analoger, kan en eller flere aminosyreresidier bli deletert fra rammeverkregionene og/eller insertert inn i rammeverkregionene (valgfritt i tillegg til en eller flere aminosyresubstitusjoner som nevnt over), gitt at den totale graden av sekvensidentitet til rammeverkregion gjenstår som definert over. Kjennetegnresidiene skulle ikke bli deletert. Også, mest foretrukket, aminosyreresidier der bare et aminosyreresidie er nevnt for både VH domenet og VHH domenet i Tabeller 4 – 7 over er fortrinnsvis ikke deletert.
Fortrinnsvis, slike analoger skulle ikke være slik at de kan binde til, har affinitet for og/eller har spesifisitet for TNF-alfa, dvs. med en affinitet og/eller en spesifisitet som er minst 10%, fortrinnsvis minst 50%, mer foretrukket minst 70%, enda mer foretrukket minst 80%, slik som minst 90%, minst 95%, minst 99% eller mer, av affiniteten og/eller spesifisiteten til minst ett av Nanobodies til SEQ ID NO SEQ ID NO 52 til 60, SEQ ID NO 76 til 86 eller SEQ ID NO 95 til 99, som bestemt ved å anvende et egnet assay, for eksempel et assay for å bestemme binding av analogene til TNF, og spesielt et av assayene som anvendt i Eksemplene under.
Generelt, kan slike analoger for eksempel bli ervervet ved å fremskaffe en nukleinsyre som koder for et naturlig forekommende VHH domene, forandre kodonene for det ene eller flere aminosyreresidier som skal bli humanisert til kodonene for det(de) korresponderende humane aminosyreresidiet(aminosyreresidiene), som uttrykker nukleinsyre-/nukleotide-sekvensen således ervervet i en egnet vert eller ekspresjonssystem; og valgfritt isolerer og/eller renser analogen således ervervet for å fremskaffe ovennevnte analog i essensielt isolerte former (som definert heriover). Dette kan generelt bli utført ved å anvende fremgangsmåter og teknikker kjent per se, som vil være klart for den faglærte personen, for eksempel fra håndbøkene og referansene sitert heri og/eller fra den videre beskrivelsen heriunder. Alternativt, og for eksempel, kan en nukleinsyre som koder for en analog bli syntetisert på en måte kjent per se (for eksempel ved å anvende et automatisert apparat for å syntetisere nukleinsyresekvenser med en predefinert aminosyresekvens) og kan bli uttrykt i en egnet vert eller ekspresjonssystem, ved at analogen således ervervet valgfritt kan bli isolert og/eller renset for å fremskaffe ovennevnte analog i essensielt isolerte former (som definert heriover). En annen måte å fremskaffe analogene involverer kjemisk syntese av den relevante aminosyresekvensen ved å anvende teknikker for peptidsyntese kjent per se, slik som de nevnt heriunder.
Det vil be også generelt være klart for den faglærte personen at Nanobodies (inkludert analoger derav) også kan bli fremstilt ved å starte fra humane VH sekvenser (dvs. aminosyresekvenser eller de korresponderende nukleotidesekvensene), slik som for eksempel humane VH3 sekvenser slik som DP-47, DP-51, DP-54 eller DP-29, ved å forandre et eller flere aminosyreresidier i aminosyresekvensen til ovennevnte humane VH domene, for slik å fremskaffe en aminosyresekvens som har (a) en Q i posisjon 108; og/eller (b) E i posisjon 44 og/eller R i posisjon 45, og fortrinnsvis E i posisjon 44 og R i posisjon 45; og/eller (c) P, R eller S i posisjon 103, som beskrevet over. Igjen, kan dette generelt bli utført ved å anvende de forskjellige fremgangsmåtene og teknikkene referert til i den tidligere paragrafen, ved å anvende en aminosyresekvens og/eller nukleotidesekvens for et humant VH domene som et utgangspunkt.
Termen Nanobodies som anvendt heri i sin videste forstand omfatter også deler eller fragmenter av Nanobodies (inkludert analoger) av den foreliggende oppfinnelsen som definert over, som igjen kan bli som videre beskrevet under.
Generelt, har deler eller fragmenter av Nanobodies og/eller analogene aminosyresekvenser der, sammenlignet med aminosyresekvensen til det korresponderende full-lengde Nanobodiet eller analogen, en eller flere av aminosyreresidiene ved den N-terminale enden, et eller flere aminosyreresidier ved den C-terminale enden, et eller flere tilstøtende interne aminosyreresidier, eller en hvilken som helst kombinasjon derav, har blitt deletert og/eller fjernet. Det er også mulig å kombinere en eller flere av slike deler eller fragmenter for å fremskaffe et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen.
Fortrinnsvis, skulle aminosyresekvensen til et Nanobody som omfatter en eller flere deler eller fragmenter av et full-lengde Nanobody og/eller analog ha en grad av sekvensidentitet på minst 50%, fortrinnsvis minst 60%, mer foretrukket minst 70%, slik som minst 80%, minst 90% eller minst 95%, med aminosyresekvensen til det korresponderende full-lengde Nanobodiet.
Aminosyresekvensen til et Nanobody som omfatter en eller flere deler eller fragmenter av et full-lengde Nanobody og/eller analog er fortrinnsvis også slik at det omfatter minst 10 tilstøtende aminosyreresidier, fortrinnsvis minst 20 tilstøtende aminosyreresidier, mer foretrukket minst 30 tilstøtende aminosyreresidier, slik som minst 40 tilstøtende aminosyreresidier, til aminosyresekvensen av det korresponderende full-lengde Nanobodiet.
Generelt, vil slike deler eller fragmenter av Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen ha aminosyresekvenser der, sammenlignet med aminosyresekvensen til det korresponderende full-lengde Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen, ett eller flere av aminosyreresidiene ved den N-terminale enden, ett eller flere aminosyreresidier ved den C-terminal enden, ett eller flere tilstøtende interne aminosyreresidier, eller en hvilken som helst kombinasjon derav, ha blitt deletert og/eller fjernet. Det er også mulig å kombinere en eller flere av slike deler eller fragmenter for å fremskaffe et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen.
I følge en foretrukket utførelsesform, omfatter et fragment som anvendt heri minst en av CDR’ene foreliggende i et full-størrelse Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen, fortrinnsvis minst to av CDR’ene foreliggende i et full-størrelse Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen, mer foretrukket minst CDR2 og CDR3 foreliggende i et full-størrelse Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen, slik som for eksempel alle tre CDR’er foreliggende i et full-størrelse Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen.
I følge en annen spesielt foretrukket, men ikke-begrensende utførelsesform, omfatter en slik del eller fragment minst FR3, CDR3 og FR4 av det korresponderende full-lengde Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen, dvs. som for eksempel beskrevet i den Internasjonale søknaden WO 03/050531 (Lasters et al.).
Fortrinnsvis, skulle slike deler eller fragmenter være slik at de fortsatt kan binde til, ha affinitet for og/eller har spesifisitet for TNF-alfa, dvs. med en affinitet og/eller en spesifisitet som er minst 10%, fortrinnsvis minst 50%, mer foretrukket minst 70%, enda mer foretrukket minst 80%, slik som minst 90%, minst 95%, minst 99% eller mer, av affiniteten og/eller spesifisiten til det korresponderende full-størrelse Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen, for eksempel et assay for å bestemme binding av analogen til TNF, og spesielt et av assayene som anvendt i Eksemplene under.
Fra beskrivelsen heriover, vil det være klart at aminosyresekvensene til Nanobodies anvendt heri skilles ved minst en aminosyreposisjon i minst en av rammeverkregionene fra aminosyresekvensene til naturlig forekommende VH domener, slik som aminosyresekvensene til naturlig forekommende VH domener av antistoffer fra mennesker. Spesielt, vil det være klart at aminosyresekvensene til Nanobodies anvendt heri skilles ved minst ett av Kjennetegnresidiene fra aminosyresekvenser til naturlig forekommende VH domener, slik som aminosyresekvensene til naturlig forekommende VH domener fra antistoffer fra Camelider og/eller mennesker.
Derfor, i følge en spesifikk utførelsesform, har et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen en aminosyresekvens som er forskjellig ved minst en aminosyreposisjon i en av rammeverkregionene fra aminosyresekvensen til et naturlig forekommende VH domene. I følge en mer spesifikk, men ikke-begrensende utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, har et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen en aminosyresekvens som er forskjellig ved minst ett av Kjennetegnresidiene fra aminosyresekvensen til et naturlig forekommende VH domene.
Fra beskrivelsen heriover, vil det også være klart at aminosyresekvensene til noen av Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, slik som de humaniserte Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, vil være forskjellig ved minst en aminosyreposisjon i minst en av rammeverkregionene (dvs. enten i posisjonen til et Kjennetegnresidie eller i en annen posisjon) fra aminosyresekvensene til naturlig forekommende VHH domener. Derfor, i følge en spesifikk, men ikke-begrensende utførelsesform, har et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen en aminosyresekvens som er forskjellig ved minst en aminosyreposisjon i en av rammeverkregionene fra aminosyresekvensen til et naturlig forekommende VHH domene. I følge en mer spesifikk, men ikke-begrensende utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, har et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen en aminosyresekvens som er forskjellig ved minst en av Kjennetegnresidiene fra aminosyresekvensen til et naturlig forekommende VHH domene.
Den foreliggende oppfinnelsen i sin videste forstand omfatter også derivater av Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen. Slike derivater kan generelt bli ervervet ved modifisering, og spesielt ved kjemisk og/eller biologisk (f.eks. enzymatisk) modifisering, av Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen og/eller av en eller flere av aminosyreresidiene som danner Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen.
Eksempler på slike modifikasjoner, så vel som eksempler på aminosyreresidier inne i Nanobodysekvensen som kan bli modifisert på en slik måte (dvs. enten på proteinryggraden men fortrinnsvis på en sidekjede), vil fremgangsmåter og teknikker som kan bli anvendt til å introdusere slike modifikasjoner og de potensielle anvendelser og fordeler for slike modifikasjoner være klart for den faglærte personen.
For eksempel, kan en slik modifikasjon involvere introduksjonen (f.eks. ved kovalent forbinding eller på en annen egnet måte) av en eller flere funksjonelle grupper, residier eller grupper inn i eller over til Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen, og spesielt til en eller flere funksjonelle grupper, residier eller grupper som tildeler en eller flere ønskede egenskaper eller funksjonaliteter til Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen. Eksempel på slike funksjonelle grupper vil være klart for den faglærte personen.
For eksempel, kan slik modifisering omfatte introduksjonen (f.eks. ved kovalent binding eller på en hvilken som helst annen egnet måte) av en eller flere funksjonelle grupper som øker halv-livet, løseligheten og/eller absorbsjonen av Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen, som reduserer immunogeniteten og/eller toksisiteten til Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen, som eliminerer eller attenuerer hvilke som helst uønskverdige bivirkninger av Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen, og/eller som tildeler andre fordelaktige egenskaper til og/eller reduserer de unønskede egenskapene til Nanobodies og/eller polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen; eller en hvilken som helst kombinasjon av to eller flere av de foregående. Eksempler på slike funksjonelle grupper og på teknikker for å introdusere dem vil være klart for den faglærte personen, og kan generelt omfatte alle funksjonelle grupper og teknikker nevnt i det generelle bakgrunnsfaget sitert heriover så vel som de funksjonelle gruppene og teknikkene kjent per se for modifiseringen av farmasøytiske proteiner, og spesielt for modifiseringen av antistoffer eller antistofffragmenter (inkludert ScFv’er og enkeltdomene antistoffer), der det for eksempel er referert til Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980). Slike funksjonelle grupper kan for eksempel være forbundet direkte (for eksempel kovalent) til et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen, eller valgfritt via en egnet linker eller spacer, som igjen vil være klart for den faglærte personen.
En av de mest utbredte anvendte teknikkene for å øke halv-livet og/eller den reduserende immunogenitet av farmasøytiske proteiner omfatter festing av en egnet farmakologisk akseptabel polymer, slik som poly(etylenglykol) (PEG) eller derivater derav (slik som metoksypoly(etylenglykol) eller mPEG). Generelt, kan hvilke som helst egnede former av pegylering bli anvendt, slik som pegyleringen anvendt innen faget for antistoffer og antistoffragmenter (inkludert men ikke begrenset til (enkelt) domene antistoffer og ScFv’er); det er for eksempel referert til Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); av Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), av Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003) og i WO 04/060965. Forskjellige reagenser for pegylering av proteiner er også kommersielt tilgjengelige, for eksempel fra Nektar Therapeutics, USA.
Fortrinnsvis, er sete-rettet pegylering anvendt, spesielt via et cystein-residie (se for eksempel Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003). For eksempel, for dette formålet, kan PEG bli festet til et cysteinresidie som naturlig forekommer i et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen, et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen kan bli modifisert for slik å passende introdusere en eller flere cysteinresidier for festing av PEG, eller en aminosyresekvens som omfatter en eller flere cysteinresidier for påfesting av PEG kan bli fusjonert til de N- og/eller C-terminale endene av et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen, alle anvender teknikker fra protein engineering kjent per se for den faglærte personen.
Fortrinnsvis, for Nanobodies og proteiner av den foreliggende oppfinnelsen, er en PEG anvendt med en molekylvekt på mer enn 5000, slik som mer enn 10,000 og mindre enn 200,000, slik som mindre enn 100,000; for eksempel i området på 20,000-80,000.
Med hensyn til pegylering, skulle det bli notert at generelt, omfatter den foreliggende oppfinnelsen også et hvilket som helst Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen og/eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen som har blitt pegylert ved en eller flere aminosyreposisjoner, fortrinnsvis på en slik måte at ovennevnte pegylering enten (1) øker halv-livet in vivo; (2) reduserer immunogenitet; (3) fremskaffer en eller flere videre fordelaktige egenskaper kjent per se for pegylering; (4) ikke essensielt påvirker affiniteten til Nanobodiet og/eller polypeptidet for TNF-alfa (f.eks. ikke reduserer ovennevnte affinitet med mer enn 90%, fortrinnsvis ikke med mer enn 50 %, og mer foretrukket ikke med mer enn 10%, som bestemt av et egnet assay, slik som de beskrevet i Eksemplene under); og/eller (4) ikke påvirker noen av de andre ønskede egenskapene til Nanobodies og/eller polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen. Egnede PEG-grupper og fremgangsmåter for å feste dem på, enten spesifikt eller ikke-spesifikt vil være klart for den faglærte personen. Egnede kit og reagenser for slik pegylering kan for eksempel bli ervervet fra Nektar (CA, USA).
En annen, vanligvis mindre foretrukket modifisering omfatter N-forbundet eller O-forbundet glykosylering, vanligvis som del av co-translasjonell og/eller posttranslasjonell modifisering, avhengig av vertscellen anvendt for å uttrykke Nanobodiet eller polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen.
Enda en annen modifisering kan omfatte introduksjonen av en eller flere detekterbare merkinger eller andre signal-genererende grupper, avhengig av den mente anvendelsen av det merkede Nanobodiet. Egnede merkinger og teknikker for å feste på, anvende og detektere dem vil være klart for den faglærte personen, og for eksempel inkludere, men er ikke begrenset til, fluorescerende merker (slik som fluorescein, isotiocyanat, rhodamin, fycoerytrin, fycocyanin, allofycocyanin, ofthaldehyd, og fluorescamin og fluorescerende metaller slik som <152>Eu eller andre metaller fra lantanid seriene), fosforescerende merker, kjemiluminescente merker eller bioluminescerende merker (slik som luminal, isoluminol, teromatisk acridinium ester, imidazol, acridinium salter, oksalat ester, dioksetan eller GFP og dens analoger ), radio-isotoper (slik som <3>H, <125>I, <32>P, <35>S, <14>C, <51>Cr, <36>Cl, <57>Co, <58>Co, <59>Fe, og <75>Se), metaller, metallchelater eller metalliske kationer (for eksempel metalliske kationer slik som <99m>Tc, <123>I, <111>In, <131>I, <97>Ru, <67>Cu, <67>Ga, og <68>Ga eller andre metaller eller metalliske kationer som er spesielt passende for anvendelser i in vivo, in vitro eller in situ diagnose og avbilding, slik som (<157>Gd, <55>Mn, <162>Dy, <52>Cr, og <56>Fe), så vel som kromoforer og enzymer (slik som malat dehydrogenase, staphylococcal nuclease, delta-V-steroid isomerase, gjær alkohol dehydrogenase, alfa-glycerofosfat dehydrogenase, triose fosfat isomerase, biotinavidin peroksidase, hestereddik peroksidase, alkalisk fosfatase, asparaginase, glucose oksidase, β-galaktosidase, ribonuklease, urease, katalase, glukose-VI-fosfat dehydrogenase, glukoamylase og acetylcholin esterase). Andre egnede merker vil være klart for den faglærte personen, og for eksempel inkludere grupper som kan bli detektert ved å anvende NMR eller ESR spektroskopi.
Slike merkede Nanobodies og polypeptider av den foreliggende oppfinnelsen kan for eksempel bli anvendt for in vitro, in vivo eller in situ assayer (inkludert immunoassayer kjent per se slik som ELISA, RIA, EIA og andre “sandwich assayer”, osv.) så vel som in vivo diagnostiske og avbildende formål, avhengig av valget av det spesifikke merket.
Som vil være klart for den faglærte personen, kan en annen modifisering involvere introduksjonen av en chelaterende gruppe, for eksempel for å chelatere et av metallene eller metalliske kationene referert til over. Egnede chelaterende grupper inkluderer for eksempel, uten begrensning, dietyl-enetriaminepenta acetat (DTPA) eller etylenediaminetetra acetat (EDTA).
Enda en annen modifisering kan omfatte introduksjonen av en funksjonell gruppe som er en del av et spesifikt bindingspar, slik som biotin-(strept)avidin bindingsparet. En slik funksjonell gruppe kan bli anvendt til å forbinde Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen til et annet protein, polypeptid eller kjemisk forbindelse som er bundet til den andre halvdelen av bindingsparet, dvs. gjennom dannelse av bindingsparet. For eksempel, kan et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen bli konjugert til biotin, og forbundet til et annet protein, polypeptid, forbindelse eller bærer konjugert til avidin eller streptavidin. For eksempel, kan et slikt konjugert Nanobody bli anvendt som en reporter, for eksempel i et diagnostisk system hvor en detekterbar signal-produserende agent er konjugert til avidin eller streptavidin. Slike bindingspar kan for eksempel også bli anvendt til å binde Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen til en bærer, inkludert bærere egnet for farmasøytiske formål. Et ikkebegrensende eksempel er de liposomale formuleringene beskrevet av Cao og Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257 (2000). Slike bindingspar kan også bli anvendt til å forbinde en terapeutisk aktiv agent til Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen.
For noen applikasjoner, spesielt for de applikasjonene der det er ment å drepe en celle som utrykker målet som Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen er rettet mot(f.eks. i behandlingen av kreft), eller til å redusere eller sakke veksten og/eller proliferereingen av en slik celle, kan Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen også bli forbundet til et toksin eller til et toksisk residie eller gruppe. Eksempler på toksiske grupper, forbindelser eller residier som kan bli forbundet til et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen for å fremskaffe – for eksempel – en cytotoksisk forbindelse vil være klart for den faglærte personen og kan for eksempel bli funnet i det tidligere faget sitert over og/eller i den videre beskrivelsen heri. Et Eksempel er den såkalte ADEPT™ teknologien WO 03/055527.
Andre potensielle kjemiske og enzymatiske modifikasjoner vil være klart for den faglærte personen. Slike modifikasjoner kan også bli introdusert for forskningsformål (f.eks. for å studere funksjon-aktivitet forhold). Det er for eksempel referert til Lundblad and Bradshaw, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 143-151 (1997).
Som nevnt over, relateres også den foreliggende oppfinnelsen til proteiner eller polypeptider som omfatter minst ett VHH domene (dvs. som identifisert ved å anvende fremgangsmåtene av den foreliggende oppfinnelsen) eller minst ett Nanobody basert på dette.
I følge en ikke-begrensende utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, består et slikt polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen essensielt av et Nanobody. Med “består essensielt av” er det ment at aminosyresekvensen til polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen enten er eksakt det samme som aminosyresekvensen til et Nanobody (som nevnt over) eller korresponderer til aminosyresekvensen til et Nanobody der et begrenset antall aminosyreresidier, slik som 1-10 aminosyreresidier og fortrinnsvis 1-6 aminosyreresidier, slik som 1, 2, 3, 4, 5 eller 6 aminosyreresidier, har blitt tilsatt til den aminoterminale enden, til den karboksyterminale enden, eller både til den aminoterminale enden og til den karboksyterminale enden av aminosyresekvensen til Nanobodiet.
Ovennevnte aminosyreresidier kan eller kan ikke endre, forandre eller på annen måte påvirke de (biologiske) egenskapene til Nanobodiet og kan eller kan ikke legge til videre funksjonalitet til Nanobodiet. For eksempel, slike aminosyreresidier:
a) kan omfatte et N-terminalt Met residie, for eksempel som resultat av ekspresjon i en heterolog vertscelle eller vertsorganisme.
b) kan danne en signalsekvens eller ledersekvens som retter sekresjon av Nanobodiet fra en vertscelle ved syntese. Egnede sekretoriske lederpeptider vil være klart for den faglærte personen, og kan være som videre beskrevet heri. Vanligvis, vil en slik ledersekvens være forbundet til den N-terminale enden av Nanobodiet, selv om den foreliggende oppfinnelsen i sin videste forstand ikke er begrenset dertil;
c) kan danne en sekvens eller et signal som tillater Nanobodiet å være rettet mot og/eller til å penetrere eller entre inn i spesifikke organer, vev, celler, eller deler eller avdelinger av celler, og/eller som tillater Nanobodiet å penetrere eller krysse en biologisk barriere slik som en cellemembran, et cellelag slik som et lag av epitelceller, en tumor inkludert faste tumorer, eller blod-hjerne-barriere. Eksempler på slike aminosyresekvenser vil være klart for den faglærte personen. Noen ikke-begrensende eksempler er de små peptidvektorene (“Pep-trans vektorer”) beskrevet i WO 03/026700 og i Temsamani et al., Expert Opin. Biol. Ther., 1, 773 (2001); Temsamani og Vidal, Drug Discov. Today, 9, 1012 (004) og Rousselle, J. Pharmacol. Exp. Ther., 296, 124-131 (2001), og membran translokatorsekvensen beskrevet av Zhao et al., Apoptosis, 8, 631-637 (2003). C-terminale og N-terminale aminosyresekvenser for intracellulær målsikting av antistoffragmenter er for eksempel beskrevet av Cardinale et al., Methods, 34, 171 (2004). Andre egnede teknikker for intracellulær målsikting involverer ekspresjonen og/eller anvendelsen av såkalte “intralegemer” som omfatter et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen, som nevnt under;
d) kan danne en “tag”, for eksempel en aminosyresekvens eller residie som tillater eller letter rensingen av Nanobodiet, for eksempel ved å anvende affinitetsteknikker rettet mot ovennevnte sekvens eller residie. Deretter, kan ovennevnte sekvens eller residie bli fjernet (f.eks. ved kjemisk eller enzymatisk kutting) for å fremskaffe Nanobodysekvensen (for dette formålet, kan tag ́en valgfritt bli forbundet til Nanobodysekvensen via en kuttbar linkersekvens eller inneholde et kuttbart motiv). Noen foretrukne, men ikke-begrensende eksempler på slike residier er mangfoldige histidinresidier, glutationresidier og en myc-tag slik som AAAEQKLISEEDLNGAA [SEQ ID NO:476];
e) kan være en eller flere aminosyreresidier som har blitt funksjonalisert og/eller som kan tjene som et sete for binding av funksjonelle grupper. Egnede aminosyreresidier og funksjonelle grupper vil være klart for den faglærte personen og inkludere, men er ikke begrenset til, aminosyreresidiene og funksjonelle gruppene nevnt heri for derivatene til Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen.
I følge en annen utførelsesform, omfatter et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen, som er fusjonert i sin aminoterminale ende, i sin karboksyterminale ende, eller både i sin aminoterminale ende og i sin karboksyterminale ende til minst en videre aminosyresekvens, dvs. for slik å fremskaffe et fusjonsprotein som omfatter ovennevnte Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen og de en eller flere videre aminosyresekvensene. En slik fusjon vil også bli referert til heri som en “Nanobodyfusjon”.
Det ene eller flere videre aminosyresekvensene kan være hvilke som helst egnede og/eller ønskede aminosyresekvenser. De videre aminosyresekvensene kan eller kan ikke endre, forandre eller på annen måte påvirke de (biologiske) egenskapene til Nanobodiet, og kan eller kan ikke legge til videre funksjonalitet til Nanobodiet eller polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen. Fortrinnsvis, er den videre aminosyresekvensen slik at den tildeler en eller flere ønskede egenskaper eller funksjonaliteter til Nanobodiet eller polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen.
Eksempel på slike aminosyresekvenser vil være klart for den faglærte personen, og kan generelt omfatte alle aminosyresekvenser som er anvendt i peptidfusjoner basert på konvensjonelle antistoffer og fragmenter derav (inkludert men ikke begrenset til ScFv’er og enkeltdomene antistoffer). Det er for eksempel referert til review ́et av Holliger og Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 (2005), For eksempel, kan en slik aminosyresekvens være en aminosyresekvens som øker halv-livet, løseligheten, eller absorbsjonen, reduserer immunogeniteten eller toksisiteten, eliminerer eller attenuerer uønskverdige bivirkninger, og/eller tildeler andre fordelaktige egenskaper til og/eller reduserer de uønskede egenskapene til polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen, sammenlignet med Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen per se. Noen ikke-begrensende eksempler på slike aminosyresekvenser er serumproteiner, slik som humant serum albumin (se for eksempel WO 00/27435) eller hapteniske molekyler (for eksempel haptener som er gjenkjent av sirkulerende antistoffer, se for eksempel WO 98/22141).
Den videre aminosyresekvensen kan også fremskaffe et annet bindingssete, hvis bindingssete kan være rettet mot et hvilket som helst ønsket protein, polypeptid, antigen, antigen determinant eller epitop (inkludert men ikke begrenset til det samme proteinet, polypeptidet, antigenet, antigendeterminanten eller epitopen som Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen er rettet mot, eller et forskjellige protein, polypeptid, antigen, antigendeterminant eller epitop). For eksempel, kan den videre aminosyresekvensen fremskaffe et annet bindingssete som er rettet mot et serumprotein (slik som, for eksempel, humant serum albumin eller et annet serumprotein slik som IgG), for slik å fremskaffe økt halv-liv i serum. Det er for eksempel referert til EP 0368 684, WO 91/01743, WO 01/45746 og WO 04/003019 (der forskjellige serumproteiner er nevnt), den Internasjonale søknaden av søker med tittelen “Nanobodies™ mot amyloid-beta og polypeptider som omfatter det samme for behandlingen av degenerative nevrale sykdommer slik som Alzheimers sykdom” (der forskjellige andre proteiner er nevnt), så vel som til Harmsen et al., Vaccine, 23 (41); 4926-42.
I følge en annen utførelsesform, kan en eller flere av aminosyresekvensene videre omfatte en eller flere deler, fragmenter eller domener av konvensjonelle 4-kjede antistoffer (og spesielt humane antistoffer) og/eller tungkjede antistoffer. For eksempel, selv om vanligvis mindre foretrukket, kan et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen bli forbundet til et konvensjonelt (fortrinnsvis humant) VH eller VL domene eller til en naturlig eller syntetisk analog av et VH eller VL domene, igjen valgfritt via en linkersekvens (inkludert men ikke begrenset til andre (enkle) domene antistoffer, slik som dAb’ene beskrevet av Ward et al.).
Minst det ene Nanobodiet kan også bli forbundet til et eller flere (fortrinnsvis humane) CH1, CH2 og/eller CH3 domener, valgfritt via en linkersekvens. For eksempel, kunne et Nanobody forbundet til et egnet CH1 domene for eksempel bli anvendt -sammen med egnede lettkjeder – for å generere antistoff-fragmenter/-strukturer analoge til konvensjonelle Fab fragmenter eller F(ab’)2 fragmenter, men der et eller (i tilfelle med et F(ab’)2 fragment) begge de konvensjonelle VH domenene har blitt erstattet av et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen. To Nanobodies kunne også bli forbundet til et CH3 domene (valgfritt via en linker) for å fremskaffe et konstrukt med økt halv-liv in vivo.
I følge en spesifikk utførelsesform av et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen, kan ett eller flere Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen være forbundet til en eller flere antistoff deler, fragmenter eller domener som tildeler en eller flere effektorfunksjoner til polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen og/eller kan tildele evnen til å binde til en eller flere Fc reseptorer. For eksempel, for dette formålet, og uten å være begrenset dertil, kan de en eller flere videre aminosyresekvensene omfatte en eller flere CH2 og/eller CH3 domener av et antistoff, slik som fra et tungkjede antistoff (som beskrevet heri) og mer foretrukket fra et konvensjonelt humant 4-kjede antistoff; og/eller kan danne (del av) en Fc region, for eksempel fra IgG, fra IgE eller fra et annet humant Ig. For eksempel, beskriver WO 94/04678 tungkjede antistoffer som omfatter et Camelid VHH domene eller et humanisert derivativ derav (dvs. et Nanobody), der Camelidae CH2 og/eller CH3 domenet har blitt erstattet av humane CH2 og CH3 domener, for å fremskaffe et immunoglobulin som består av 2 tungkjeder som hver omfatter et Nanobody og humane CH2 og CH3 domener (men inget CH1 domene), hvilket immunoglobulin har effektorfunksjonen fremskaffet av CH2 og CH3 domenene og hvilket immunoglobulin kan fungere uten tilstedeværelsen av noen lettkjeder. Andre aminosyresekvenser som kan være passende forbundet til Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen for slik å fremskaffe en effektorfunksjon vil være klart for den faglærte personen, og kan bli valgt på grunnlag av den(de) ønskede effektorfunksjonen(funksjonene). Det er for eksempel referert til WO 04/058820, WO 99/42077 og WO 05/017148, så vel som review ́et av Holliger og Hudson, supra. Kobling av et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen til en Fc del kan også føre til et økt halv-liv, sammenlignet med det korresponderende Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen. For noen applikasjoner, kan anvendelsen av en Fc del og/eller av konstante domener (dvs. CH2 og/eller CH3 domener) som tildeler økt halv-liv uten noen biologisk signifikant effektorfunksjon også være egnet eller til og med foretrukket. Andre egnede konstrukter som omfatter en eller flere Nanobodies og en eller flere konstante domener med økt halv-liv in vivo vil være klart for den faglærte personen, og kan for eksempel omfatte to Nanobodies forbundet til et CH3 domene, valgfritt via en linker sekvens. Generelt, vil et hvilket som helst fusjonsprotein eller derivater med økt halv-liv fortrinnsvis ha en molekylær vekt på mer enn 50 kD, cut-off verdien for renal absorbsjon.
De videre aminosyresekvensene kan også danne en signalsekvens eller ledersekvens som retter sekresjon av Nanobodiet eller polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen fra en vertscelle ved syntese (for eksempel for å fremskaffe en pre-, pro- eller prepro- form av polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen, avhengig av vertscellen anvendt til å uttrykke polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen).
Den videre aminosyresekvensen kan også danne en sekvens eller et signal som tillater Nanobodiet eller polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen å bli rettet mot og/eller til å penetrere eller trenge inn i spesifikke organer, vev, celler, eller deler eller avdelinger av celler, og/eller som tillater Nanobodiet eller polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen å penetrere eller krysse en biologisk barriere slik som en cellemembran, et cellelag slik som et lag av epitelceller, en tumor inkludert faste tumorer, eller blod-hjerne-barrieren. Egnede eksempler på slike aminosyresekvenser vil være klart for den faglærte personen, og for eksempel inkludere, men er ikke begrenset til, “Peptran” vektorene nevnt over, sekvensene beskrevet av Cardinale et al. og aminosyresekvensene og antistoffragmenter kjent per se som kan bli anvendt til å uttrykke eller produsere Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen som såkalte “intralegemer”, for eksempel som beskrevet i WO 94/02610, WO 95/22618, US-A-7004940, WO 03/014960, WO 99/07414; WO 05/01690; EP 1 512 696; og i Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag; og i Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170, og de videre referansene beskrevet deri.
For noen applikasjoner, spesielt for de applikasjonene der det er ment å drepe en celle som uttrykker målet som Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen er rettet mot (f.eks. i behandlingen av kreft), eller til å redusere eller sakke veksten og/eller prolifereringen av en slik celle, kan Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen også bli forbundet til et (cyto)toksisk protein eller polypeptid. Eksempler på slike toksiske proteiner og polypeptider som kan bli forbundet til et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen for å fremskaffe – for eksempel – et cytotoksisk polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen vil være klart for den faglærte personen og kan for eksempel bli funnet i det tidligere faget sitert over og/eller i den videre beskrivelsen heri. Et eksempel er den såkalte ADEPT™ teknologien WO 03/055527.
I følge en ikke-begrensende utførelsesform, kan en eller flere aminosyreresidier bli tilsatt til, insertert i og/eller substituert i aminosyresekvensen til et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen, for slik å fremskaffe ett eller flere spesifikke aminosyreresidier for fastgjøring av en PEG-gruppe.
Effekten av proteinlegemidler avhenger av dens potens til å nøytalisere målet men også av den indre farmakokinetikken til det potensielle legemiddelet. Fordi nyren generelt filtrerer ut molekyler under 60,000 Daltons (Da), har anstrengelser for å redusere klarering fokusert på å øke den molekylære vekten til bio-legemiddelet gjennom proteinfusjoner (Syed et al., 1997), glykosyleringer eller modifisering med polyetylen glykol polymerer, dvs., PEGylering (Lee et al., 1999; Abuchowski et al., 1977; Nucci et al., 1991; Lecolley, et al. Chem Commun, 2004; Tao et al., J Am Chem Soc, 2004; Mantovani et al., 2005). Disse fremgangsmåtene forlenger vellykket in vivo eksponeringen av legemiddelet.
Alternativt, kan halv-livet bli forlenget ved å anvende et annet pegylerende middel, POLY PEG for konjugering til de bivalente Nanobodies, TNF56 eller TNF55. POLY PEG er kamformede polymerer med PEG tenner på en metakryl ryggrad. POLY PEGer kan variere i lengden av PEG kjeden, i metakryl ryggraden og i den aktive ende-gruppen som bestemmer fremgangsmåten for konjugering av POLY PEG ́en til Nanobodiet. Sete-spesifikk konjugering til det C-terminale cysteinet foreliggende i Nanobodies kan bli oppnådd gjennom den aktive maleimid ende-gruppen i POLY PEG ́en.
Den foreliggende oppfinnelsen omfatter også et hvilket som helst Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen og/eller polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen som har blitt glykosylert ved en eller flere aminosyreposisjoner, vanligvis avhengig av verten anvendt til å uttrykke Nanobodiet eller polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen (som videre beskrevet under).
I følge en ikke-begrensende utførelsesform, kan en eller flere aminosyreresidier bli lagt til, insertert i og/eller substituert i aminosyresekvensen til et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen, for slik å fremskaffe et eller flere spesifikke aminosyreresidier og/eller et sete som kan bli glykosylert av vertsorganismen anvendt. Ved hjelp av et foretrukket, men ikke-begrensende eksempel, kan N-residiet i posisjon 50 inne i CDR2 av et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen for eksempel bli erstattet av et Q, D eller S residie for slik å fremskaffe et glykosyleringsete, f.eks. for glykosylering av Pichia.
I følge en annen utførelsesform, kan et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen omfatte aminosyresekvensen til et Nanobody, som er fusjonert ved sin aminoterminal ende, ved sin karboksyterminale ende, eller både ved sin aminoterminale ende og ved sin karboksyterminale ende med minst en videre aminosyresekvens.
Igjen, kan eller kan ikke ovennevnte videre aminosyresekvens(aminosyresekvenser) endre, forandre eller på annen måte påvirke de (biologiske) egenskapene til Nanobodiet og kan eller kan ikke tilføye videre funksjonalitet til Nanobodiet.
For eksempel, i følge en foretrukket, men ikke-begrensende utførelsesform, kan ovennevnte videre aminosyresekvens omfatte minst et videre Nanobody, for slik å fremskaffe et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen som omfatter minst to, slik som tre, fire eller fem, Nanobodies, der ovennevnte Nanobodies valgfritt kan bli forbundet via en eller flere linkersekvenser (som definert heri).
Polypeptider av den foreliggende oppfinnelsen som omfatter to eller flere Nanobodies vil også bli referert til heri som “multivalente” polypeptider. For eksempel omfatter et “bivalent” polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen to Nanobodies, valgfritt forbundet via en linkersekvens, mens et “trivalent” polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen omfatter tre Nanobodies, valgfritt forbundet via to linkersekvenser; osv.
I et multivalent polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen, kan de to eller flere Nanobodies være de samme eller forskjellige. For eksempel, de to eller flere Nanobodies i et multivalent polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen:
- kan være rettet mot det samme antigenet, dvs. mot de samme deler eller epitoper av ovennevnte antigen eller mot to eller flere forskjellige deler eller epitoper av ovennevnte antigen; og/eller:
- kan være rettet mot de forskjellige antigenene;
eller en kombinasjon derav.
Derfor, kan et bivalent polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen for eksempel:
- omfatte to identiske Nanobodies;
- omfatte et første Nanobody rettet mot en første del eller epitop av et antigen og et andre Nanobody rettet mot den samme delen eller epitopen av ovennevnte antigen eller mot en annen del eller epitop av ovennevnte antigen;
- eller omfatte et første Nanobody rettet mot et første antigen og et andre Nanobody rettet mot et andre antigen forskjellig fra ovennevnte første antigen; mens et trivalent Polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen for eksempel:
- kan omfatte tre identiske eller forskjellige Nanobodies rettet mot den samme eller forskjellige deler eller epitoper av det samme antigenet;
- kan omfatte to identiske eller forskjellige Nanobodies rettet mot den samme eller forskjellige deler eller epitoper på et første antigen og et tredje Nanobody rettet mot et andre antigen forskjellig fra ovennevnte første antigen; eller - kan omfatte et første Nanobody rettet mot et første antigen, et andre Nanobody rettet mot et andre antigen forskjellige fra ovennevnte første antigen, og et tredje Nanobody rettet mot et tredje antigen forskjellige fra ovennevnte første og andre antigen,
Polypeptider av den foreliggende oppfinnelsen som inneholder minst to Nanobodies, der minst ett Nanobody er rettet mot et første antigen og minst ett Nanobody er rettet mot et andre Nanobody forskjellige fra det første antigenet, vil også bli referert til som “multispesifikke” Nanobodies. Derfor, et “bispesifikt” Nanobody er et Nanobody som omfatter minst ett Nanobody rettet mot et første antigen og minst et videre Nanobody rettet mot et andre antigen, mens et “trispesifikt” Nanobody er et Nanobody som omfatter minst ett Nanobody rettet mot et første antigen, minst et videre Nanobody rettet mot et andre antigen, og minst et videre Nanobody rettet mot et tredje antigen; osv.
Således, i deres enkleste form, er et bispesifikt polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen et bivalent polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen (som definert heri), som omfatter et første Nanobody rettet mot et første antigen og et andre Nanobody rettet mot et andre antigen, der ovennevnte første og andre Nanobody valgfritt kan bli forbundet via en linkersekvens (som definert heri); mens et trispesifikt polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen i sine enkleste former er et trivalent polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen (som definert heri), som omfatter et første Nanobody rettet mot et første antigen, et andre Nanobody rettet mot et andre antigen og et tredje Nanobody rettet mot et tredje antigen, der ovennevnte første, andre og tredje Nanobody valgfritt kan bli forbundet via en eller flere, og spesielt en og mer spesielt to, linkersekvenser.
Likevel, som vil være klart fra beskrivelsen heriover, er den foreliggende oppfinnelsen ikke begrenset dertil, i den forstand at et multispesifikt polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen kan omfatte et hvilket som helst antall av Nanobodies rettet mot to eller flere forskjellige antigener.
For multivalente og multispesifikke polypeptider som omfatter ett eller flere VHH domener og deres fremstilling, er det også referert til Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10.7346-7350, så vel som til EP 0822 985.
I polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen, kan de et eller flere Nanobodies og de et eller flere polypeptidene være direkte forbundet til hverandre (som for eksempel beskrevet i WO 99/23221) og/eller kan være forbundet til hverandre via en eller flere egnede spacere eller linkere, eller en hvilken som helst kombinasjon derav.
Egnede spacere eller linkere for anvendelse i multivalente og multispesifikke polypeptider vil være klart for den faglærte personen, og kan generelt være en hvilken som helst linker eller spacer anvendt innen faget til å forbinde aminosyresekvenser. Fortrinnsvis, er ovennevnte linker eller spacer egnet for anvendelse til å konstruere proteiner eller polypeptider som er ment for farmasøytisk anvendelse.
Noen spesielt foretrukne spacere inkluderer spacerene og linkerene som er anvendt innen faget til å koble antistoffragmenter eller antistoffdomener. Disse inkluderer linkerene nevnt i det generelle bakgrunnsfaget sitert over, så vel som for eksempel linkere som er anvendt innen faget til å konstruere dialegemer eller ScFv fragmenter (i dette henseendet, skulle det imidlertid bli notert at, mens i dialegemer og i ScFv fragmenter, bør linkersekvensen anvendt ha en lengde, en grad av fleksibilitet og andre egenskaper som tillater de relevante VH og VL domenene å komme sammen for å danne det komplette antigen-bindingssetet, er det ingen spesiell begrensning på lengden eller fleksibiliteten til linkeren anvendt i polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen, siden hvert Nanobody av seg selv danner et komplett antigenbindingssete).
Andre egnede linkere omfatter generelt organiske forbindelser eller polymerer, spesielt de egnet for anvendelse i proteiner for farmasøytiske anvendelse. For eksempel, poly(etylenglykol) grupper har blitt anvendt til å koble antistoffdomener, se for eksempel WO 04/081026.
Det er også innen omfanget av den foreliggende oppfinnelsen at linkeren(e) anvendt tildeler en eller flere andre fordelaktige egenskaper eller funksjonalitet til polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen, og/eller fremskaffer en eller flere seter for dannelsen av derivater og/eller for fastsettingen av funksjonelle grupper (f.eks. som beskrevet heri for derivatene til Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen). For eksempel, kan linkere som inneholder et eller flere ladete aminosyreresidier (se Tabell A-3 over) fremskaffe forbedrede hydrofile egenskaper, mens linkere som danner eller inneholder små epitoper eller tags kan bli anvendt for deteksjonsformålet, identifisering og/eller rensing. Igjen, basert på beskrivelsen heri, vil den faglærte personen være i stand til å bestemme de optimal linkerene for anvendelse i et spesifikt polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen, valgfritt etter noen begrensede rutineeksperimenter.
Endelig, når to eller flere linkere er anvendt i polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen, kan disse linkerene være de samme eller forskjellige. Igjen, basert på beskrivelsen heri, vil den faglærte personen være i stand til å bestemme de optimal linkerene for anvendelse i et spesifikt polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen, valgfritt etter noen begrensede rutineeksperimenter.
Linkere for anvendelse i multivalente og multispesifikke polypeptider vil være klart for den faglærte personen, og for eksempel inkludere gly-ser linkere, for eksempel av typen (glyxsery)z, slik som (for eksempel (gly4ser)3 eller (gly3ser2)3, som beskrevet i WO 99/42077, hengsel-lignende regioner slik som hengselregionene til naturlig forekommende tungkjede antistoffer eller lignende sekvenser. For andre egnede linkere, er det også referert til det generelle bakgrunnsfaget sitert over. Noen spesielt foretrukne linkere er gitt i SEQ ID NO 68 og 69.
Linkere kan også fremskaffe noe funksjonalitet for det multivalente eller multispesifikke polypeptidet. For eksempel, kan linkere som inneholder et eller flere ladete aminosyreresidier (se Tabell 1 over) fremskaffe forbedrede hydrofile egenskaper, mens linkere som danner eller inneholder små epitoper eller tags kan bli anvendt for formålene med deteksjon, identifisering og/eller rensing.
Som nevnt heri, i et protein eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen, er anti-TNF Nanobodies nevnt heri fortrinnsvis forbundet på en slik måte at ovennevnte protein eller polypeptid, ved binding til en TNF trimer, er i stand til å inhibere eller redusere TNF reseptor kryssbindingen som er mediert av ovennevnte TNF trimer og/eller signaltransduksjonen som er mediert av slik reseptor kryssbinding; og/eller på en slik måte at proteinet eller polypeptidet er i stand til intramolekylær binding til minst to TNF reseptor bindingsseter på en TNF trimer. Egnede linkere er som beskrevet heri.
Som også nevnt heri, hvorvidt et protein eller polypeptid fremskaffer intermolekylær binding eller ekstramolekylær binding kan bli fastsatt (i det minste initielt) av en størrelseeksklusjonskromatografi. Med Størrelseeksklusjonskromatografi kan kompleksene av TNF-alfa og antistoffer bli analysert for å bestemme antallet og ratioen til antistoff og TNF-alfa molekyler i komplekset. Fra disse dataene kan det bli dedusert om inter- eller intra-molekylær binding forekommer, som ble gjort av Santora og kolleger (Santora, L.C., et al, Anal Biochem. 2001) for å etablere bindingsstokiometrien til monoklonalt antistoff D2E7 (Humira) til TNF-alfa ved forskjellige ratioer av antistoff og mål. Fra den molekylære vekten til komplekset ble det konkludert at tre antistoffmolekyler var satt sammen i kompleks med tre TNF trimerer, derved indikererte at antistoff binder på en intermolekylær måte. Lignende eksperimenter ble utført med bivalente Nanobodies, der en veldig kort linker induserte dannelsen av store molekylære komplekser, som ble ervervet av intermolekylære bånd. Likevel, de samme bivalente Nanobodykonstruktene med lengre linkere eluerte fra gelfiltreringskolonnen som atskilte små komplekser, og demonstrerte derved at intramolekylære bånd ble dannet. Kombinert med bioassaydata, der den lengre linkeren som omfattet Nanobody TNF1 hadde en optimal potens (komplett nøytralisering av mengde av TNF anvendt i assayet, dvs.10 pM), kan det bli konkludert at intramolekylær binding av det bivalente Nanobodiet effektivt forebygger kryss-binding av to cellebundne reseptorer og den assosierte reseptoraktiveringen. Kjente monoklonale antistoffer slik som Humira eller Remicade kan ikke danne slike intramolekylære bånd, som alltid etterlater to reseptor bindingseter på trimer TNF molekylet til en viss grad tilgjengelig for interaksjon med cellebundet reseptor, som translaterer over til mindre potent nøytralisering som målt i bioassayet.
Alternativt, hvorvidt et protein eller polypeptid fremskaffer intermolekylær binding eller ekstramolekylær binding kan bli vurdert med krystallografi og/eller molekylær modellering (eller andre egnede in silico teknikker). En modell av et trimer TNF30/TNF-alfa kompleks ble generert basert på krystallstrukturen til monomer villtype TNF1/TNF-alfa komplekset. Fra denne strukturen ble det endelige TNF30-linker-ALB8-linker-TNF30 konstruktet modellert. TNF30-linker-ALB8-linker-TNF30 konstruktet ble modellert ved å starte fra trimeren til TNFD med to TNF30 molekyler bundet. Ettersom strukturen til ALB8 ikke er kjent, ble et tredje TNF30 molekyl anvendt i stedet, som ble plassert mellom de andre to Nanobodies langs linjen mellom N- og C-termini. De 9 aminosyre linkerene ble deretter tilsatt manuelt.
Modellen er vist i Figur 62. Det er klart, at de 9 aminosyrelinkerene sammen med ALB8 fremskaffer tilstrekkelig rom til å spenne over de omtrent 66 Å mellom de to TNF30 domenene bundet til TNFD. ALB8 strekker seg allerede selv over 40 Å, og hver linker kan strekke seg over nye ~27 Å i fullstendig utstrukket konformasjon. Som et resultat, har ALB8 ikke så lite bevegelsesfleksibilitet, og det er ikke forventet at dennes binding til albumin ville interferere mye med bindingen til TNFD.
Dessuten, er det sannsynlig at linkerene kan bli kortet ned uten å påvirke aviditet, spesielt i tilfellet med linkeren som er C-terminal for ALB8. Dette kan ha den fordelaktige effekten av økt binding til den samme TNFD trimeren versus kryssbinding til trimereren, fordi sannsynligheten at den andre TNF30 assosierer med en forskjellig TNFD øker med lengden til linkeren.
Som også videre beskrevet heri, kan et multispesifikt polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen rettet mot et ønsket antigen og mot minst et serumprotein, slik som serumproteinene nevnt heriunder, og spesielt mot humant serum albumin, vise økt halv-liv i serum, sammenlignet med det korresponderende monovalente Nanobodiet.
Som nevnt heriover, er fremgangsmåtene beskrevet heri spesielt egnet for å generere slike multivalente av multispesifikke polypeptider av den foreliggende oppfinnelsen.
I et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen, kan minst det ene Nanobodiet også bli forbundet til et konvensjonelt VH domene eller en naturlig eller syntetisk analog av et VH domene, valgfritt via en linkersekvens.
I et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen, kan minst det ene Nanobodiet også bli forbundet til et VL domene eller en naturlig eller syntetisk analog av et VL domene, valgfritt via en linkersekvens, for slik å fremskaffe et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen som er i formen analog til et konvensjonelt scFv fragment, men som omfatter et Nanobody i stedet for et VH domene.
I et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen, kan minst det ene Nanobodiet også bli forbundet til et eller flere av et CH1, CH2 og/eller CH3 domene, valgfritt via en linkersekvens. For eksempel, et Nanobody forbundet til et egnet CH1 domene kunne for eksempel bli anvendt - sammen med egnede lettkjeder – for å generere antistoff- fragmenter/-strukturer analoge til konvensjonelle Fab fragmenter eller F(ab’)2 fragmenter, men der en eller (i tilfellet med et F(ab’)2 fragment) et eller begge de konvensjonelle VH domenene har blitt erstattet av et Nanobody. Slike fragmenter kan også være heterospesifikke eller bispesifikke, dvs. rettet mot to eller flere antigener. Et Nanobody forbundet til egnede CH2 og CH3 domener, for eksempel avledet fra Camelider, kunne bli anvendt til å danne et monospesifikt eller bispesifikt tungkjede antistoff. Til slutt, kunne et Nanobody forbundet til egnede CH1, CH2 og CH3 domener, for eksempel avledet fra et menneske, bli anvendt – sammen med egnede lettkjeder – for å danne et antistoff som er analogt til et konvensjonelt 4-kjede antistoff, men der et eller begge de konvensjonelle VH domenene har blitt erstattet av et Nanobody.
Også, i tillegg til ett eller flere Nanobodies, kan Polypeptider av den foreliggende oppfinnelsen også omfatte funksjonelle grupper eller residier, for eksempel terapeutisk aktive substanser, slik som de nevnt under, og/eller markører eller merkelapper, slik som fluorescerende markører, isotoper, osv., som videre beskrevet heriunder.
Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen, og nukleinsyrer som koder for det samme, kan bli fremstilt på en måte kjent per se, som vil være klart for den faglærte personen fra den videre beskrivelsen heri. Noen foretrukne, men ikke-begrensende fremgangsmåter for å fremstille Nanobodies, polypeptidene og nukleinsyrene inkluderer fremgangsmåtene og teknikkene nevnt over og/eller videre beskrevet heriunder .
Som vil være klart for den faglærte personen, omfatter en spesielt nyttig fremgangsmåte for å fremstille et Nanobody og/eller et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen generelt av trinnene av:
- ekspresjonen, i en egnet vertscelle eller vertsorganisme (også referert til heri som en “vert av den foreliggende oppfinnelsen”) eller i et annet egnet ekspresjonssystem av en nukleinsyre som koder for ovennevnte Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen (også referert til heri som en “nukleinsyre av den foreliggende oppfinnelsen”), valgfritt etterfulgt av:
- å isolere og/eller rense Nanobodiet eller polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen således ervervet.
Spesielt, kan en slik fremgangsmåte omfatte trinnene av:
- å kultivere og/eller opprettholde en vert av den foreliggende oppfinnelsen under vilkår som er slik at ovennevnte vert av den foreliggende oppfinnelsen uttrykker og/eller produserer minst ett Nanobody og/eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen; valgfritt etterfulgt av:
- å isolere og/eller rense Nanobodiet eller polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen således ervervet.
En nukleinsyre av den foreliggende oppfinnelsen kan være i form av enkelteller dobbeltrådet DNA eller RNA, og er fortrinnsvis i form av dobbeltrådet DNA. For eksempel, kan nukleotidesekvensene av den foreliggende oppfinnelsen være genomisk DNA, cDNA eller syntetisk DNA (slik som DNA med en kodonanvendelse som har blitt spesifikt tilpasset for ekspresjon i den mente vertscellen eller vertsorganismen).
I følge en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, er nukleinsyren av den foreliggende oppfinnelsen essensielt i isolert form, som definert heriover.
Nukleinsyren av den foreliggende oppfinnelsen kan også være i form av, være foreliggende i og/eller være del av en vektor, slik som for eksempel et plasmid, cosmid eller YAC, som igjen kan være i essensielt isolert form.
Nukleinsyrene av den foreliggende oppfinnelsen kan bli fremstilt eller ervervet på en måte kjent per se, basert på informasjonen om aminosyresekvensene for polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen gitt heri, og/eller kan bli isolert fra en egnet naturlig kilde. For å fremskaffe analoger, kan nukleotidesekvenser som koder for naturlig forekommende VHH domener for eksempel bli gjort til gjenstand for seterettet mutagenese, for slik å fremskaffe en nukleinsyre av den foreliggende oppfinnelsen som koder for ovennevnte analog. Også, som vil være klart for den faglærte personen, for å fremstille en nukleinsyre av den foreliggende oppfinnelsen, kan også flere nukleotidesekvenser, slik som minst en nukleotidesekvens som koder for et Nanobody og for eksempel nukleinsyrer som koder for en eller flere linkere bli forbundet sammen på en egnet måte.
Teknikker for å generere nukleinsyrene av den foreliggende oppfinnelsen vil være klare for den faglærte personen og kan for eksempel inkludere, men er ikke begrenset til, automatisert DNA syntese; sete-rettet mutagenese; å kombinere to eller flere naturlig forekommende og/eller syntetiske sekvenser (eller to eller flere deler derav), introduksjon av mutasjoner som fører til ekspresjonen av et trunkert ekspresjonsprodukt; introduksjon av en eller flere restriksjonsseter (f.eks. for å skape kassetter og/eller regioner som lett kan bli kuttet og/eller ligert ved å anvende egnede restriksjonsenzymer), og/eller introduksjonen av mutasjoner ved hjelp av en PCR reaksjon der det anvendes en eller flere “mismatchede” primere, der man for eksempel anvender en sekvens av en naturlig forekommende GPCR som et templat. Disse og andre teknikker vil være klart for den faglærte personen, og det er igjen referert til standard håndbøkene, slik som Sambrook et al. og Ausubel et al., nevnt over, så vel som Eksemplene under.
Nukleinsyren av den foreliggende oppfinnelsen kan også være i form av, være foreliggende i og/eller være del av et genetisk konstrukt, som vil være klart for den faglærte personen. Slike genetiske konstrukter omfatter generelt minst en nukleinsyre av den foreliggende oppfinnelsen som er valgfritt forbundet til en eller flere elementer av genetiske konstrukter kjent per se, slik som for eksempel ett eller flere egnede regulatoriske elementer (slik som en egnet promoter(e), enhancer(e), terminator(er), osv.) og de videre elementene av genetiske konstrukter referert til heriunder. Slike genetiske konstrukter som omfatter minst en nukleinsyre av den foreliggende oppfinnelsen vil også bli referert til heri som “genetiske konstrukter av den foreliggende oppfinnelsen”.
De genetiske konstruktene av den foreliggende oppfinnelsen kan være DNA eller RNA, og er fortrinnsvis dobbeltrådete DNA. De genetiske konstruktene av den foreliggende oppfinnelsen kan også være i en form egnet for transformering av den mente vertscellen eller vertsorganismen, i en form egnet for integrasjon inn i det genomiske DNA av den mente vertscellen eller i en form egnet for uavhengig replikasjon, opprettholdelse og/eller nedarving i den mente vertsorganismen. For eksempel, de genetiske konstruktene av den foreliggende oppfinnelsen kan være i form av en vektor, slik som for eksempel et plasmid, cosmid, YAC, en viral vektor eller transposon. Spesielt, kan vektoren være en ekspresjonsvektor, dvs. en vektor som kan fremskaffe for ekspresjon in vitro og/eller in vivo (f.eks. i en egnet vertscelle, vertsorganisme og/eller ekspresjonssystem).
I en foretrukket men ikke-begrensende utførelsesform, omfatter et genetisk konstrukt av den foreliggende oppfinnelsen
a) minst en nukleinsyre av den foreliggende oppfinnelsen; operativt forbundet til b) et eller flere regulatoriske elementer, slik som en promoter og valgfritt en egnet terminator;
c) og valgfritt også
d) et eller flere videre elementer av genetiske konstrukter kjent per se;
der termene “regulatorisk element”, “promoter”, “terminator” og “operativt forbundet” har deres vanlige mening innen faget (som videre beskrevet under); og der ovennevnte “videre elementer” foreliggende i de genetiske konstruktene for eksempel kan være 3’- eller 5’-UTR sekvenser, ledersekvenser, seleksjonsmarkører, ekspresjonsmarkører/reportergener, og/eller elementer som kan forenkle eller øke (effektiviteten av) transformering eller integrasjon. Disse og andre egnede elementer for slike genetiske konstrukter vil være klart for den faglærte personen, og kan for eksempel avhenge av typen av konstrukt anvendt, den mente vertscellen eller vertsorganismen; måten der nukleotidesekvensene av den foreliggende oppfinnelsen av interesse skal bli uttrykt (f.eks. via konstitutiv, transient eller induserbar ekspresjon); og/eller transformeringsteknikken som skal bli anvendt.
Fortrinnsvis er, i de genetiske konstruktene av den foreliggende oppfinnelsen, ovennevnte minst en nukleinsyre av den foreliggende oppfinnelsen og ovennevnte regulatoriske elementer, og valgfritt ovennevnte en eller flere videre elementer , “opererbart forbundet” til hverandre, som ved dette generelt er ment at de er i et funksjonelt forhold med hverandre. For eksempel, en promoter er ansett “opererbart forbundet” til en kodende sekvens hvis ovennevnte promoter er i stand til å initiere eller på annen måte kontrollere/regulere transkripsjonen og/eller ekspresjonen av en kodende sekvens (der ovennevnte kodende sekvens skulle bli forstått som å være “under kontrollen av” ovennevnte promoter). Generelt, når to nukleotidesekvenser er opererbart forbundet, vil de være i den samme orienteringen og vanligvis også i den samme leserammen. De vil vanligvis også være essensielt tilstøtende, selv om dette også ikke kan bli krevet.
Fortrinnsvis, er de regulatoriske og videre elementer av de genetiske konstruktene av den foreliggende oppfinnelsen slik at de er i stand til å fremskaffe deres mente biologiske funksjon i den mente vertscellen eller vertsorganismen.
For eksempel, en promoter, enhancer eller terminator bør være “opererbare” i den mente vertscellen eller vertsorganismen, som ved dette er ment at (for eksempel) ovennevnte promoter bør være i stand til å initiere eller på annen måte kontrollere/regulere transkripsjonen og/eller ekspresjonen av en nukleotidesekvens -f.eks. en kodende sekvens - som den er opererbart forbundet til (som definert heri).
Noen spesielt foretrukne promotere inkluderer, men er ikke begrenset til, promotere kjent per se for ekspresjonen i bakterieceller, slik som de nevnt heriunder og/eller de anvendt i Eksemplene.
En seleksjonsmarkør skulle være slik at den tillater - dvs. under passende seleksjonsforhold - vertsceller og/eller vertsorganismer som har blitt (vellykket) transformert med nukleotidesekvensen av den foreliggende oppfinnelsen til å bli skjelnet fra vertsceller/organismer som ikke har blitt (vellykket) transformert. Noen foretrukne, men ikke-begrensende eksempler på slike markører er gener som fremskaffe resistens mot antibiotika (slik som kanamycin eller ampicillin), gener som fremskaffer temperaturresistens, eller gener som tillater vertscellen eller vertsorganismen å bli opprettholdt i fravær av visse faktorer, forbindelser og/eller (mat) komponenter i mediet som er essensielt for overlevelse av de ikke-transformerte cellene eller organismene.
En ledersekvens skulle være slik at - i den mente vertscellen eller vertsorganismen - den tillater de ønskede post-translasjonelle modifikasjonene og/eller slik at den retter det transkriberte mRNA til en ønsket del eller organelle av en celle. En ledersekvens kan også tillate sekresjon av ekspresjonensproduktet fra ovennevnte celle. Som slik, kan ledersekvensen være en hvilken som helst pro-, pre, eller prepro-sekvens opererbar i vertscellen eller vertsorganismen. Ledersekvenser kan ikke bli krevet for ekspresjon i en bakteriecelle.
En ekspresjonsmarkør eller et reportergen skulle være slik at - i vertscellen eller vertsorganismen - den tillater for deteksjon av ekspresjonen til (et gen eller nukleotidesekvens foreliggende på) det genetiske konstruktet. En ekspresjonsmarkør kan valgfritt også tillate lokaliseringen av det uttrykte produktet, f.eks. i en spesifikk del eller organelle av en celle og/eller i (en) spesifikk(e) celle(r), vev, organ(er) eller del(er) av en multicellulær organisme. Slike reportergener kan også bli uttrykt som en proteinfusjon med aminosyresekvensen av den foreliggende oppfinnelsen. Noen foretrukne, men ikke-begrensende eksempler inkluderer fluorescente proteiner slik som GFP.
Noen foretrukne, men ikke-begrensende eksempler på egnede promotere, terminator og videre elementer inkluderer de anvendt i Eksemplene under. For noen (videre) ikke-begrensende eksempler av promoterene, seleksjonsmarkørene, ledersekvensene, ekspresjonsmarkørene og videre elementer som kan være foreliggende/anvendt i de genetiske konstruktene av den foreliggende oppfinnelsen -slik som terminatorer, transkripsjonelle og/eller translasjonelle enhancere og/eller integrasjonsfaktorer – er det referert til de generelle håndbøkene slik som Sambrook et al. og Ausubel et al. nevnt over, så vel som til Eksemplene som er gitt i WO 95/07463, WO 96/23810, WO 95/07463, WO 95/21191, WO 97/11094, WO 97/42320, WO 98/06737, WO 98/21355, US-A-6,207,410, US-A- 5,693,492 og EP 1085 089. Andre eksempler vil være klart for den faglærte personen. Det er også referert til det generelle bakgrunnsfaget sitert over og de videre referansene sitert heriunder.
De genetiske konstruktene av den foreliggende oppfinnelsen kan generelt bli fremskaffet ved passende å linke nukleotidesekvensen(nuklotidesekvensene) av den foreliggende oppfinnelsen til det ene eller flere videre elementer beskrevet over, for eksempel ved å anvende teknikkene beskrevet i de generelle håndbøkene slik som Sambrook et al. og Ausubel et al., nevnt over.
De genetiske konstruktene av den foreliggende oppfinnelsen vil ofte bli ervervet ved å insertere en nukleotidesekvens av den foreliggende oppfinnelsen i en egnet (ekspresjons) vektor kjent per se. Noen foretrukne, men ikke-begrensende eksempler på egnede ekspresjonsvektorer er de anvendt i Eksemplene under, så vel som de nevnt under.
Nukleinsyrene av den foreliggende oppfinnelsen og/eller de genetiske konstruktene av den foreliggende oppfinnelsen kan bli anvendt til å transformere en vertscelle eller vertsorganisme. Verten eller vertscellen kan være en hvilken som helst egnet (sopp, prokaryot eller eukaryot) celle eller cellelinje eller en hvilken som helst egnet sopp, prokaryot eller eukaryot organisme, for eksempel:
- en bakteriestamme, inkludert men ikke begrenset til gram-negative stammer slik som stammer av Escherichia coli; av Proteus, for eksempel av Proteus mirabilis; av Pseudomonas, for eksempel av Pseudomonas fluorescens; og gram-positive stammer slik som stammer av Bacillus, for eksempel av Bacillus subtilis eller av Bacillus brevis; av Streptomyces, for eksempel av Streptomyces lividans; av Staphylococcus, for eksempel av Staphylococcus carnosus; og av Lactococcus, for eksempel av Lactococcus lactis;
- en soppcelle, inkludert men ikke begrenset til celler fra arter av Trichoderma, for eksempel fra Trichoderma reesei; av Neurospora, for eksempel av Neurospora crassa; av Sordaria, for eksempel av Sordaria macrospora; av Aspergillus, for eksempel av Aspergillus niger eller av Aspergillus sojae; eller av andre filamentøse sopp;
- en gjærcelle, inkludert men ikke begrenset til celler fra arter av Saccharomyces, for eksempel av Saccharomyces cerevisiae; av Schizosaccharomyces, for eksempel av Schizosaccharomyces pombe; av Pichia, for eksempel av Pichia pastoris eller av Pichia methanolica; av Hansenula, for eksempel av Hansenula polymorpha; av Kluyveromyces, for eksempel av Kluyveromyces lactis; av Arxula, for eksempel av Arxula adeninivorans; av Yarrowia, for eksempel av Yarrowia lipolytica;
- en amfibiecelle eller cellelinje, slik som Xenopus oocytes;
- en insekt-avledet celle eller cellelinje, slik som celler/cellelinjer avledet fra lepidoptera, inkludert men ikke begrenset til Spodoptera SF9 og Sf21 celler eller celler/cellelinjer avledet fra Drosophila, slik som Schneider og Kc celler;
- en plante eller plantecelle, for eksempel i tobakkplanter; og/eller
- en pattedyrcelle eller cellelinje, for eksempel en celle eller cellelinje avledet fra et menneske, fra pattedyrene inkludert men ikke begrenset til CHO-celler, BHK-celler (for eksempel BHK-21 celler) og humane celler eller cellelinjer slik som HeLa, COS (for eksempel COS-7) og PER.C6 celler;
så vel som alle andre verter eller vertsceller kjent per se for ekspresjonen og produksjonen av antistoffer og antistofffragmenter (inkludert men ikke begrenset til (enkelt) domene antistoffer og ScFv fragmenter), som vil være klart for den faglærte personen. Det er også referert til det generelle bakgrunnsfaget sitert heriover, så vel som til for eksempel WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken et al., (1998), supra; Riechmann og Muyldermans, (1999), supra; van der Linden, (2000), supra; Thomassen et al., (2002), supra; Joosten et al., (2003), supra; Joosten et al., (2005), supra; og de videre referansene sitert heri.
Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen kan også bli introdusert og uttrykt i en eller flere celler, vev eller organer fra en multicellulær organisme, for eksempel for profylaktiske og/eller terapeutiske formål (f.eks. som en genterapi). For dette formålet, kan nukleotidesekvensene av den foreliggende oppfinnelsen bli introdusert inn i cellene eller vevet på en hvilken som helst egnet måte, for eksempel som slikt (f.eks. ved å anvende liposomer) eller etter de har blitt insertert inn i en egnet genterapivektor (for eksempel avledet fra retrovirus slik som adenovirus, eller parvovirus slik som adeno-assosierte virus). Som også vil være klart for den faglærte personen, kan slik genterapi bli utført in vivo og/eller in situ i kroppen til en pasient ved å administrere en nukleinsyre av den foreliggende oppfinnelsen eller en egnet genterapivektor som koder for det samme til pasienten eller til spesifikke celler eller et spesifikt vev eller organ til pasienten; eller egnede celler (ofte tatt fra kroppen til pasienten som skal behandles, slik som eksplanterte lymfocytter, beinmargaspirater eller vevsbiopsier) kan bli behandlet in vitro med en nukleotidesekvens av den foreliggende oppfinnelsen og deretter bli passende (gjen-)introdusert inn i kroppen til en pasient. Alt dette kan bli utført ved å anvende genterapivektorer, teknikker og leveringssystemer som er godt kjent for den faglærte personen, for Culver, K. W., "Gene Therapy", 1994, p. xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York, N.Y). Giordano, Nature F Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res.79 (1996), 911-919; Ogerson, Science 256 (1992),808-813; Verma, Nature 389 (1994),239; Isner, Lancet 348 (1996),370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995),1077-1086; Onodera, Blood 91; (1998),30- 36; Verma, Gene Ther. 5 (1998),692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci. : 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996),714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5,580,859; 1 US 5,5895466; eller Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640. For eksempel, in situ ekspresjon av ScFv fragmenter (Afanasieva et al., Gene Ther., 10, 1850-1859 (2003)) og av dialegemer (Blanco et al., J. Immunol, 171, 1070-1077 (2003)) har blitt beskrevet i faget.
For ekspresjon av Nanobodies i en celle, kan de også bli uttrykt som såkalte eller som såkalte “intralegemer”, som for eksempel beskrevet i WO 94/02610, WO 95/22618 og US-A-7004940; WO 03/014960; in Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag; og i Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170.
For produksjon, kan Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen for eksempel også bli produsert i melken til transgene pattedyr, for eksempel i melken til kaniner, kuer, geiter eller sauer (se for eksempel US-A-6,741,957, US-A-6,304,489 og US-A-6,849,992 for generelle teknikker for å introdusere transgener inn i pattedyr), i planter eller deler av planter inkludert men ikke begrenset til deres blader, blomster, frukt, frø, røtter eller knoller (for eksempel i tobakk, mais, soyabønne eller alfalfa) eller i for eksempel puppe av silkeormen Bombix mori.
Videre, kan Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen også bli uttrykt og/eller produsert i celle-frie ekspresjonssystemer, og egnede eksempler på slike systemer vil være klart for den faglærte personen. Noen foretrukne, men ikke-begrensende eksempler inkluderer ekspresjon i hvete kimsystemet; i kanin retikulocyttlysater; eller i E. coli Zubay systemet.
Som nevnt over, er en av fordelene med anvendelsen av Nanobodies at polypeptidene basert på dette kan bli fremstilt gjennom ekspresjon i et egnet bakterielt system, og egnede bakterielle ekspresjonssystemer, vektorer, vertsceller, regulatoriske elementer, osv., vil være klart for den faglærte personen, for eksempel fra referansene sitert over. Det skulle likevel bli notert at den foreliggende oppfinnelsen i sin videste forstand ikke er begrenset til ekspresjon i bakterielle systemer.
Fortrinnsvis, i den foreliggende oppfinnelsen, er et (in vivo eller in vitro) ekspresjonssystem, slik som et bakterielt ekspresjonssystem, anvendt som fremskaffer polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen i en form som er egnet for farmasøytiske anvendelser, og slike ekspresjonssystemer vil igjen være klart for den faglærte personen. Som også vil være klart for den faglærte personen, kan polypeptider av den foreliggende oppfinnelsen egnet for farmasøytiske anvendelser bli fremstilt ved å anvende teknikker for peptidsyntese.
For produksjon i industriell skala, inkluderer foretrukne heterologe verter for den (industrielle) produksjonen av Nanobodies eller Nanobody-omfattende proteinterapi stammer av E. coli, Pichia pastoris, S. cerevisiae som er egnet for storskala ekspresjon/produksjon/fermentering, og spesielt for storskala farmasøytisk ekspresjon/produksjon/fermentering. Egnede eksempler på slike stammer vil være klart for den faglærte personen. Slike stammer og produksjons/ekspresjonssystemer er også gjort tilgjengelig av selskaper slik som Biovitrum (Uppsala, Sverige).
Alternativt, kan pattedyrcellelinjer, spesielt Kinesiske hamster ovarie (CHO) celler, bli anvendt for storskala ekspresjon/produksjon/fermentering, og spesielt for storskala farmasøytisk ekspresjon/produksjon/fermentering. Igjen, er slike ekspresjons-/produksjons- systemer også gjort tilgjengelig av noen av selskapene nevnt over.
Valget av det spesifikke ekspresjonssystemet vil delvis avhenge av behovet for visse post-translasjonelle modifikasjoner, mer spesifikt glykosylering. Produksjonen av et Nanobody-omfattende rekombinant protein der glykosylering er ønsket eller krevet vil nødvendiggjøre anvendelsen av pattedyr ekspresjonsverter som har evnen til å glykosylere det uttrykte proteinet. I dette henseendet, vil det være klart for den faglærte personen at glykosyleringsmønsteret ervervet (dvs. typen, antall og posisjon av residier tilføyd) vil avhenge av cellen eller cellelinjene som er anvendt for ekspresjonen. Fortrinnsvis, er enten en human celle eller cellelinje anvendt (dvs. som fører til et protein som essensielt har et humant glykosyleringsmønster) eller en annen pattedyrcellelinje anvendt som kan fremskaffe et glykosyleringsmønster som er essensielt og/eller funksjonelt det samme som human glykosylering eller minst etterligner human glykosylering. Generelt, har ikke prokaryote verter slik som E. coli evnen til å glykosylere proteiner, og anvendelsen av lavere eukaryoter slik som gjær fører vanligvis til et glykosyleringsmønster som er forskjellig fra human glykosylering. Likevel, det bør forstås at alle de foregående vertscellene og ekspresjonssystemene kan bli anvendt i den foreliggende oppfinnelsen, avhengig av det ønskede Nanobodiet eller proteinet som skal bli ervervet.
Derfor, i følge en ikke-begrensende utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, er Nanobodiet eller polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen glykosylert. I følge en annen ikke-begrensende utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, er Nanobodiet eller polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen ikkeglykosylert.
I følge en foretrukket, men ikke-begrensende utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, er Nanobodiet eller polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen produsert i en bakteriecelle, spesielt en bakteriell celle egnet for storskala farmasøytisk produksjon, slik som celler av stammene nevnt over.
I følge en annen foretrukket, men ikke-begrensende utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, er Nanobodiet eller polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen produsert i en gjærcelle, i spesielt en gjærcelle egnet for storskala farmasøytisk produksjon, slik som celler fra artene nevnt over.
I følge enda en annen foretrukket, men ikke-begrensende utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, er Nanobodiet eller polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen produsert i en pattedyrcelle, spesielt i en human celle eller i en celle fra en human cellelinje, og mer spesielt i en human celle eller i en celle fra en human cellelinje som er egnet for storskala farmasøytisk produksjon, slik som cellelinjene nevnt heriover.
Når ekspresjon i en vertscelle er anvendt til å produsere Nanobodies og proteinene av den foreliggende oppfinnelsen, kan Nanobodies og proteinene av den foreliggende oppfinnelsen bli produsert enten intracellulært (f.eks. i cytosol, i periplasma eller i inklusjonslegemer) og deretter isolert fra vertscellene og valgfritt videre renset; eller kan bli produsert ekstracellulært (f.eks. i mediet der vertscellene er dyrket) og deretter isolert fra kulturmediet og valgfritt videre renset. Når eukaryote vertsceller er anvendt, er vanligvis ekstracellulær produksjon foretrukket siden dette vesentlig letter den videre isoleringen og nedstrøms prosesseringen av Nanobodies og proteinene ervervet. Bakterieceller slik som stammene til E. coli nevnt over skiller normalt ikke ut proteiner ekstracellulært, unntatt for noen få klasser av proteiner slik som toksiner og hemolysin, og sekretorisk produksjon i E. coli refererer til translokasjonen av proteiner over den indre membranen til det periplasmiske rom. Periplasmisk produksjon fremskaffer flere fordeler over cytosolisk produksjon. For eksempel, N-terminal aminosyresekvensen til det utskilte produktet kan være identisk til det naturlige genproduktet etter kutting av sekresjons signalsekvensen med en spesifikk signal peptidase. Det ser også ut til å være mye mindre proteaseaktivitet i periplasmaen enn i cytoplasmaen. I tillegg, er proteinrensing enklere på grunn av færre kontaminerende proteiner i periplasmaen. En annen fordel er at korrekte disulfidbindinger kan dannes fordi periplasmaen fremskaffer et mer oksidativt miljø enn cytoplasmaen. Proteiner overuttrykt i E. coli er ofte funnet i uløselige aggregater, såkalte inklusjonslegemer. Disse inklusjonslegemene kan være lokalisert i cytosolen eller i periplasmaen; gjenvinningen av biologisk aktive proteiner fra disse inklusjonslegemene krever en denaturerings/refoldings prosess. Mange rekombinante proteiner, inkludert terapeutiske proteiner, er gjenvunnet fra inklusjonslegemer. Alternativt, som vil være klart for den faglærte personen, kan rekombinante stammer av bakterier som har blitt genetisk modifisert for slik å utsondre et ønsket protein, og spesielt et Nanobody eller et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen, bli anvendt.
Derfor, i følge en ikke-begrensende utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, er Nanobodiet eller polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen et Nanobody eller polypeptid som har blitt produsert intracellulært og som har blitt isolert fra vertscellen, og spesielt fra en bakteriecelle eller fra et inklusjonslegeme i en bakteriecelle. I følge en annen ikke-begrensende utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, er Nanobodiet eller polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen et Nanobody eller polypeptid som har blitt produsert ekstracellulært, og som har blitt isolert fra mediet der vertscellen er dyrket.
Noen foretrukne, men ikke-begrensende promotere for anvendelse med disse vertscellene inkluderer,
- for ekspresjon i E. coli: lac promoter (og derivater derav slik som lacUV5 promoteren); arabinose promoter; venstre- (PL) og høyre (PR) promoter til fag lambda; promoter til trp operonet; hybrid lac/trp promotere (tac og trc); T7-promoter (mer spesifikt som til T7-fag-genet 10) og andre T-fag promotere; promoter til Tn10 tetracyclin resistensgenet; engineered varianter av promoterene over som inkluderer en eller flere kopier av en utenforstående regulatorisk operatorsekvens;
- for ekspresjon i S. cerevisiae: konstitutivt: ADH1 (alkohol dehydrogenase 1), ENO (enolase), CYC1 (cytochrom c iso-1), GAPDH (glyceraldehyder-3-fosfat dehydrogenase); PGK1 (fosfoglycerat kinase), PYK1 (pyruvat kinase); regulert: GAL1,10,7 (galactose metabolske enzymer), ADH2 (alkohol dehydrogenase 2), PHO5 (syre fosfatase), CUP1 (kobber metallotionein); heterologt: CaMV (blomkål mosaikk virus 35S promoter);
for ekspresjon i Pichia pastoris: AOX1 prom oteren (alkohol oksidase I) for ekspresjon i pattedyrceller: humant cytomegalovirus (hCMV) umiddelbar tidlig enhancer/promoter; humant cytomegalovirus (hCMV) umiddelbar tidlig promoter variant som inneholder to tetracyclin operatorsekvenser slik at prom oteren kan bli regulert av Tet repressoren; Herpes Simplex Virus tymidin kinase (TK) promoter; Rous Sarcoma Virus lang terminal repeat (RSV LTR) enhancer/promoter; elongeringsfaktor 1a (hEF-1a) promoter fra menneske, sjimpanse, mus eller rotte; SV40 tidlig promoteren; HIV-1 lang terminal repeat promoter; β-aktin promoter;
Noen foretrukne, men ikke-begrensende vektorer for anvendelse med disse vertscellene inkluderer:
vektorer for ekspresjon i pattedyrceller: pMAMneo (Clontech), pcDNA3 (Invitrogen), pMCIneo (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC37199), pRSVneo (ATCC37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) og 1ZD35 (ATCC 37565), så vel som virus-baserte ekspresjonssystemer, slik som de basert på adenovirus;
vektorer for ekspresjon i bakterieceller: pET vektorer (Novagen) og pQE vektorer (Qiagen);
- vektorer for ekspresjon i gjær eller andre soppceller: pYES2 (Invitrogen) og Pichia ekspresjonsvektorer (Invitrogen);
vektorer for ekspresjon i insektceller: pBlueBacll (Invitrogen) og andre baculovirus vektorer
vektorer for ekspresjon i planter eller planteceller: for eksempel vektorer basert på blomkål mosaikk virus eller tobakk mosaikk virus, egnede stammer av Agrobacterium, eller Ti-plasmid baserte vektorer.
Noen foretrukne, men ikke-begrensende sekretoriske sekvenser for anvendelse med disse vertscellene inkluderer:
for anvendelse i bakterieceller slik som E. coli: PelB, Bla, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, Stil, PhoA, PhoE, MalE, Lpp, LamB, og dets like; TAT signalpeptid, hemolysin C-terminal sekresjonssignal
for anvendelse i gjær: a-mating faktor prepro-sekvens, fosfatase (pho1), invertase (Sue), osv.;
for anvendelse i pattedyrceller: medfødt signal i tilfelle målproteinet er av eukaryot opprinnelse; murint lg κ-kjede V-J2-C signalpeptid; osv.
Egnede teknikker for å transformere en vert eller vertscelle av den foreliggende oppfinnelsen vil være klart for den faglærte personen og kan avhenge av den mente vertscelle/vertsorganismen og det genetiske konstruktet som skal bli anvendt. Det er igjen referert til håndbøkene og patentsøknadene nevnt over.
Etter transformering, kan et trinn for å detektere og selektere de vertscellene eller vertsorganismene som har blitt vellykket transformert med nukleotidesekvensen/genetiske konstruktet av den foreliggende oppfinnelsen bli utført. Dette kan for eksempel være et seleksjonstrinn basert på en selekterbar markør foreliggende i det genetiske konstruktet av den foreliggende oppfinnelsen eller et trinn som involverer deteksjonen av am inosyresekvensen av den foreliggende oppfinnelsen, f. eks. ved å anvende spesifikke antistoffer.
Den transformerte vertscellen (som kan være i formen av en stabil cellelinje) eller vertsorganismer (som kan være i form av en stabil mutant linje eller stamme) danner videre aspekter av den foreliggende oppfinnelsen.
Fortrinnsvis, er disse vertscellene eller vertsorganismene slik at de uttrykker, eller er (minst) i stand til å uttrykke (f. eks. under egnede forhold), en aminosyresekvens av den foreliggende oppfinnelsen (og i tilfelle av en vertsorganisme : i minst en celle, del, vev eller organ derav). Den foreliggende oppfinnelsen inkluderer også videre generasjoner, avkom og/eller etterkommere av vertscellen eller vertsorganismen av den foreliggende oppfinnelsen, som for eksempel kan bli ervervet ved celledeling eller ved seksuell eller aseksuell reproduksjon.
For å produsere/oppnå ekspresjon av am inosyresekvensene av den foreliggende oppfinnelsen, kan den transformerte vertscellen eller transformerte vertsorganismen generelt bli bevart, opprettholdt og/eller dyrket under vilkår slik som den (ønskede) am inosyresekvensen av den foreliggende oppfinnelsen er uttrykt/produsert. Egnede vilkår vil være klart for den faglærte personen og vil vanligvis avhenge av vertscellen/vertsorganismen anvendt, så vel som av de regulatoriske elementene som kontrollerer ekspresjonen av den (relevante) nukleotidesekvensen av den foreliggende oppfinnelsen. Igjen, er det referert til håndbøkene og patentsøknadene nevnt over i paragrafene om de genetiske konstruktene av den foreliggende oppfinnelsen.
Generelt, kan egnede forhold inkludere anvendelsen av et egnet medium, tilstedeværelsen av en egnet matkilde og/eller egnede næringsstoffer, anvendelsen av en egnet temperatur, og valgfritt tilstedeværelsen av en egnet induserende faktor eller forbindelse (f.eks. når nukleotidesekvensene av den foreliggende oppfinnelsen er under kontrollen av en induserbar promoter); der alle kan bli selektert av den faglærte personen. Igjen, under slike forhold, kan aminosyresekvensene av den foreliggende oppfinnelsen bli uttrykt på en konstitutiv måte, på en transient måte, eller bare når passende indusert.
Det vil også være klart for den faglærte personen at aminosyresekvensen av den foreliggende oppfinnelsen (først) kan bli generert i en umoden form (som nevnt over), som deretter kan bli gjort til gjenstand for post-translasjonell modifisering, avhengig av vertscellen/vertsorganismen anvendt. Aminosyresekvensen av den foreliggende oppfinnelsen kan også bli glykosylert, igjen avhengig av vertscellen/vertsorganismen anvendt.
Aminosyresekvensen av den foreliggende oppfinnelsen kan deretter bli isolert fra vertscellen/vertsorganismen og/eller fra mediet der ovennevnte vertscelle eller vertsorganisme ble dyrket, ved å anvende proteinisolerings- og/eller rensingsteknikker kjent per se, slik som (preparativ) kromatografi og/eller elektroforeseteknikker, differensielle presipiteringsteknikker, affinitetsteknikker (f.eks. der det anvendes en spesifikk, kuttbar aminosyresekvens fusjonert med aminosyresekvensen av den foreliggende oppfinnelsen) og/eller preparative immunologiske teknikker (dvs. der det anvendes antistoffer mot aminosyresekvensen som skal bli isolert).
Generelt, for farmasøytisk anvendelse, kan polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen av de foreliggende oppfinnelsene bli formulert som en farmasøytisk fremstilling som omfatter minst ett polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen og minst en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel eller eksipient og/eller hjelpemiddel, og valgfritt en eller flere videre farmasøytisk aktive polypeptider og/eller forbindelser. Ved hjelp av ikke-begrensende eksempler, kan en slik formulering være i en form egnet for oral administrering, for parenteral administrering (slik som ved intravenøs, intramuskulær eller subkutan injeksjon eller intravenøs infusjon), for topisk administrering, for administrering ved inhalasjon, med en hudlapp, med et implantat, med en suppositorie, osv.. Slike egnede administreringsformer - som kan være faste, halv-faste eller i væskeform, avhengig av måten av administrering - så vel som fremgangsmåter og bærere for anvendelse i fremstillingen derav, vil være klart for den faglærte personen, og er videre beskrevet heriunder.
Generelt, kan Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen bli formulert og administrert på en hvilken som helst egnet måte kjent per se, der det for eksempel er referert til det generelle bakgrunnsfaget sitert over (og spesielt til WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865 og WO 04/041867) så vel som til standard håndbøkene, slik som Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18<th >Ed., Mack Publishing Company, USA (1990) eller Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005).
For eksempel, kan Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen bli formulert og administrert på en hvilken som helst måte kjent per se for konvensjonelle antistoffer og antistoffragmenter (inkludert ScFv’er og dialegemer) og andre farmasøytisk aktive proteiner. Slike formuleringer og fremgangsmåter for å fremstille det samme vil være klart for den faglærte personen, og for eksempel inkludere fremstillinger egnet for parenteral administrering (for eksempel intravenøs, intraperitoneal, subkutan, intramuskulær, intraluminal, intra-arteriell eller intrathecal administrering) eller for topisk (dvs. transdermal eller intradermal) administrering.
Fremstillinger for parenteral administrering kan for eksempel være sterile løsninger, suspensjoner, dispersjoner eller emulsjoner som er egnet for infusjon eller injeksjon. Egnede bærere eller fortynningsmidler for slike fremstillinger inkluderer for eksempel, uten begrensning, sterilt vann og vandige buffere og løsninger slik som fysiologisk fosfat-bufret saltløsning, Ringers løsninger, dekstrose løsning, og Hanks løsning; vannoljer; glycerol; etanol; glykoler slik som propylen glykol eller så vel som mineraloljer, animalske oljer og vegetabilske oljer, for eksempel peanøttolje, soyaolje, så vel som egnede blandinger derav. Vanligvis, vil vandige løsninger eller suspensjoner bli foretrukket.
Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen kan også bli administrert ved å anvende genterapi fremgangsmåter for levering. Se, f.eks, U.S. Patent No. 5,399,346, som er inkorporert som referanse i sin helhet. Ved å anvende genterapi fremgangsmåte for levering, kan primære celler transfektert med genet som koder for et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen i tillegg bli transfektert med vevsspesifikke promotere for å sikte mot spesifikke organer, vev, transplantert vev, tumorer, eller celler og kan i tillegg bli transfektert med signal- og stabiliserings-sekvenser for subcellulær lokalisert ekspresjon.
Derfor, kan Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen bli systemisk administrert, f.eks., oralt, i kombinasjon med et farmasøytisk akseptabelt hjelpemiddel slik som et inaktivt fortynningsmiddel eller en fordøyelig spiselig bærer. De kan være omsluttet i harde eller myke skallgelatinkapsler, kan bli presset sammen til tabletter, eller kan bli inkorporert direkte i maten i pasientens diett. For oral terapeutisk administrering, kan Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen bli kombinert med en eller flere eksipienter og anvendt i form av svelgbare tabletter, kinntabletter, pastiller, kapsler, eliksirer, suspensjoner, siruper, vaffelkjeks, og dets like. Slike sammensetninger og fremstillinger bør inneholde minst 0.1% av Nanobodiet eller polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen. Prosenten av sammensetningene og fremstillingene kan, selvfølgelig, bli variert og kan beleilig være mellom omtrent 2 til omtrent 60% av vekten av en gitt enhets doseform. Mengden av Nanobodiet eller polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen i slike terapeutisk nyttige sammensetninger er slik at et effektivt dosenivå vil bli ervervet.
Tablettene, pastillene, pillene, kapslene, og dets like kan også inneholde det følgende: bindere slik som gummi tragacant, akasie, maisstivelse eller gelatin; eksipienter slik som dikalsium fosfat; et disintegrerende middel slik som maisstivelse, potetstivelse, alginat og dets like; et smøremiddel slik som magnesium stearat; og et søtningsmiddel slik som sukrose, fruktose, laktose eller aspartam eller et smaksmiddel slik som peppermynte, vintergrønnolje, eller kirsebærsmak kan bli tilsatt. Når enhetsdoseformen er en kapsel, kan den inneholde, i tillegg til materialer av typen over, en flytende bærer, slik som en vegetabilsk olje eller en polyetylen glykol. Forskjellige andre materialer kan være foreliggende som dekker eller til på annen måte å modifisere den fysiske formen av den faste enhets doseformen. For eksempel, kan tabletter, piller, eller kapsler bli dekket med gelatin, voks, skjellakk eller sukker og dets like. En sirup eller eliksir kan inneholde Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen, sukrose eller fruktose som et søtningsmiddel, metyl og propylparabener som konserveringsmidler, en farge og smak slik som kirsebær- eller appelsin-smak. Selvfølgelig, skulle et hvilket som helst materiale anvendt til å fremstille en hvilken som helst enhets doseform være farmasøytisk akseptabelt og vesentlig ikke-toksisk i mengdene benyttet. I tillegg, kan Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen bli inkorporert inn i opprettholdt-frigjørings fremstillinger og anordninger.
Fremstillinger og formuleringer for oral administrering kan også bli fremskaffet med et enterisk dekke som vil tillate konstruktene av den foreliggende oppfinnelsen å motstå det gastriske miljøet og passere inn i tarmene. Mer generelt, kan fremstillinger og formuleringer for oral administrering bli passende formulert for levering inn i en hvilken som helst ønsket del av den gastrointestinale trakt. I tillegg, kan egnede suppositorier bli anvendt for levering inn i den gastrointestinale trakt.
Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen kan også bli administrert intravenøst eller intraperitonealt ved infusjon eller injeksjon. Løsninger av Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen eller deres salter kan bli fremstilt i vann, valgfritt blandet med en ikke-toksisk surfaktant. Dispersjoner kan også bli fremstilt i glycerol, flytende polyetylen glykoler, triacetin, og blandinger derav og i oljer. Ved ordinære lagrings- og anvendelses-forhold, inneholder disse fremstillingene et konserveringsmiddel for å forebygge veksten av mikroorganismer.
De farmasøytiske doseformene egnet for injeksjon eller infusjon kan inkludere sterile vandige løsninger eller dispersjoner eller sterile pulvere som omfatter den aktive ingrediensen som er adaptert for den improviserte fremstillingen av sterile injiserbare eller infuserbare løsninger eller dispersjoner, valgfritt innkapslet i liposomer. I alle tilfeller, må den ultimate doseformen være steril, flytende og stabil under fremstillingsog lagrings-forholdene. Den flytende bæreren eller hjelpemiddelet kan være et solvent eller flytende dispersjonsmedium som omfatter, for eksempel, vann, etanol, et polyol (for eksempel, glycerol, propylen glykol, flytende polyetylen glykoler, og dets like), vegetabilske oljer, ikke-toksiske glyceryl estere, og egnede blandinger derav. Den passende fluiditet kan bli opprettholdt, for eksempel, ved dannelsen av liposomer, ved opprettholdelsen av den forlangte partikkelstørrelsen i tilfellet med dispersjoner eller ved anvendelsen av surfaktanter. Forebyggingen av virkningen av mikroorganismer kan medføres med varierende antibakterielle og antisopp midler, for eksempel, parabener, klorobutanol, fenol, sorbat, timerosal, og dets like. I mange tilfeller, vil det være foretrukket å inkludere isotone midler, for eksempel, sukkere, buffere eller natrium klorid. Forlenget absorbsjon av de injiserbare sammensetningene kan i sammensetningene medføres ved anvendelsen av midler som forsinker absorbsjon, for eksempel, aluminium monostearat og gelatin.
Sterile injiserbare løsninger er fremstilt ved å inkorporere Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen i den forlangte mengden i det passende løsningsmiddelet med de ulike andre ingrediensene nevnt over, som forlangt, fulgt av filter sterilisering. I tilfellet med sterile pulvere for fremstillingen av sterile injiserbare løsninger, er de foretrukne fremgangsmåtene for fremstilling vacuumtørking og frysetørringsteknikkene, som gir et pulver av den aktive ingrediensen pluss en hvilken som helst ønsket ingrediens i tillegg som er foreliggende i de tidligere steril-filtrerte løsningene.
For topisk administrering, kan Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen bli anvendt i ren form, dvs., når de er væsker. Likevel, vil det generelt være ønskverdig å administrere dem til hud som sammensetninger eller formuleringer, i kombinasjon med en dermatologisk akseptabel bærer, som kan være et fast stoff eller en væske.
Nyttige faste bærere inkluderer fint oppdelte faste stoffer slik som talkum, leire, mikrokrystallin cellulose, silica, alumina og dets like. Nyttige væskebærere inkluderer vann, hydroksyalkyler eller glykoler eller vann-alkohol/glykol blandinger, der Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen kan bli løst opp eller spredd i effektive nivåer, valgfritt med hjelp av ikke-toksiske surfaktanter. Adjuvanter slik som dufter og andre antimikrobielle midler kan bli tilsatt for å optimalisere egenskapene for en gitt anvendelse. De resulterende væskesammensetningene kan bli anvendt fra absorberende puter, anvendt til å impregnere bandasjer og andre påkledninger, eller sprayet på det berørte området ved å bruke pumpe-type eller aerosol sprayer.
Fortykningsmidler slik som syntetiske polymerer, fettsyrer, fettsyresalter og estere, fettholdige alkoholer, modifiserte celluloser eller modifiserte mineralmaterialer kan også bli anvendt med væskebærere for å danne utspredbare pastaer, geler, salver, såper, og dets like, for bruk direkte på huden til brukeren.
Eksempler på nyttige dermatologiske sammensetninger som kan bli anvendt til å levere Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen til huden er kjent i faget; for eksempel, se Jacquet et al. (U.S. Pat. No. 4,608,392), Geria (U.S. Pat. No. 4,992,478), Smith et al. (U.S. Pat. No. 4,559,157) og Wortzman (U.S. Pat. No. 4,820,508).
Nyttige doseringer av Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen kan bli bestemt ved å sammenligne deres in vitro aktivitet, og in vivo aktivitet i dyremodeller. Fremgangsmåter for ekstrapoleringen av effektive doseringer i mus, og andre dyr, til mennesker er kjent i faget; for eksempel, se U.S. Pat. No.
4,938,949.
Generelt, vil konsentrasjonen av Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen i en væskesammensetning, slik som en lotion, være fra omtrent 0.1-25 wt-%, fortrinnsvis fra omtrent 0.5-10 wt-%. Konsentrasjonen i en halvfast eller fast sammensetning slik som en gel eller et pulver vil være omtrent 0.1-5 wt-%, fortrinnsvis omtrent 0.5-2.5 wt-%.
Mengden av Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen krevet for anvendelse i behandling vil variere ikke bare med det enkelte Nanobodiet eller polypeptidet selektert men også med administrasjonsruten, naturen til tilstanden som blir behandlet og alderen og tilstanden til pasienten og vil til slutt være ved skjønnet til den tjenestegjørende legen eller klinikeren. Også doseringen av Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen varierer avhengig av målcellen, tumoren, vevet, det transplanterte vevet, eller organet.
Den ønskede dosen kan beleilig bli presentert i en enkeltdose eller som oppdelte doser administrert med passende intervaller, for eksempel, som to, tre, fire eller flere under-doser per dag. Under-dosen selv kan bli videre oppdelt, f.eks., opp i et antall av atskilte løst plasserte administreringer; slik som atskillige inhalasjoner fra en innblåser eller ved anvendelse av et mangfold av dråper inn i øyet.
Et administreringsregime kunne inkludere lang-tids, daglig behandling. Med “lang-tids” er det ment minst to uker og fortrinnsvis, flere uker, måneder, eller års varighet. Nødvendige modifikasjoner i dette doseområdet kan bli bestemt av en med ordinær ferdighet innen faget ved bare å anvende rutineeksperimentering gitt ved undervisningen heri. Se Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed.4), Mack Publishing Co., Easton, PA. Doseringen kan også bli justert av den individuelle legen i tilfellet av en hvilken som helst komplikasjon.
Subjektet som skal bli behandlet kan være et hvilket som helst varmblodig dyr, men er spesielt et pattedyr, og mer spesielt et menneske. Som vil være klart for den faglærte personen, vil subjektet som skal behandles spesielt være en person som lider av, eller kan risikere å få, sykdommene og forstyrrelser nevnt heri.
Klinikeren vil generelt være i stand til å bestemme et egnet behandlingsregime, avhengig av faktorer slik som sykdommen eller forstyrrelsen som skal bli forebygget eller behandlet, alvorligheten av sykdommen som skal bli behandlet og/eller alvorligheten av symptomene derav, det spesifikke Nanobodiet eller polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen som skal bli anvendt, den spesifikke administreringsruten og farmasøytiske formuleringen eller sammensetningen som skal bli anvendt, alderen, kjønnet, vekten, dietten, den generelle tilstanden til pasienten, og lignende faktorer godt kjent for klinikeren.
Generelt, vil behandlingsregimet omfatte administreringen av en eller flere Nanobodies og/eller polypeptider av den foreliggende oppfinnelsen, eller av en eller flere sammensetninger som omfatter det samme, i en eller flere farmasøytisk effektive mengder eller doser. Den(de) spesifikke mengden(mengdene) eller dosene som skal bli administrert kan bli bestemt av klinikeren, igjen basert på faktorene sitert over.
Generelt, for forebyggingen og/eller behandlingen av sykdommene og forstyrrelsene nevnt heri og avhengig av den spesifikke sykdommen eller forstyrrelsen som skal bli behandlet, styrken til det spesifikke Nanobodiet og polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen som skal bli anvendt, den spesifikke administreringsruten og den spesifikke farmasøytiske formuleringen eller sammensetningen anvendt, vil Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen generelt bli administrert i en mengde mellom 1 gram og 0.01 mikrogram per kg kroppsvekt per dag, fortrinnsvis mellom 0.1 gram og 0.1 mikrogram per kg kroppsvekt per dag, slik som omtrent 1, 10, 100 eller 1000 mikrogram per kg kroppsvekt per dag, enten kontinuerlig (f.eks. ved infusjon), som en enkelt daglig dose eller som flere oppdelte doser i løpet av dagen. Klinikeren vil generelt være i stand til å bestemme en egnet daglig dose, avhengig av faktorene nevnt heri. Det vil også bli klart at i spesifikke tilfeller, kan klinikeren velge å avvike fra disse mengdene, for eksempel på grunnlag av faktorene sitert over og hans ekspertdømmekraft. Generelt, noen veiledning for mengdene som skal bli administrert kan bli ervervet fra mengdene vanligvis administrert for sammenlignbare konvensjonelle antistoffer eller antistoffragmenter mot det samme målet administrert via essensielt den samme ruten, der man likevel tar med i regnskapet forskjeller i affinitet/aviditet, effekt, biodistribusjon, halv-liv og lignende faktorer godt kjent for den faglærte personen.
Vanligvis, i fremgangsmåten over, vil et enkelt Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen bli anvendt. Det er imidlertid innen omfanget av den foreliggende oppfinnelsen å anvende to eller flere Nanobodies og/eller polypeptider av den foreliggende oppfinnelsen i kombinasjon.
Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen kan også bli anvendt i kombinasjon med en eller flere videre farmasøytisk aktive forbindelser eller prinsipper, dvs. som et kombinert behandlingsregime, som kan eller ikke kan føre til en synergistisk effekt. Igjen, vil klinikeren være i stand til å velge slike videre forbindelser eller prinsipper, så vel som et egnet kombinert behandlingsregime, basert på faktorene sitert over og hans ekspertdømmekraft.
Spesielt, kan Nanobodies og polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen bli anvendt i kombinasjon med andre farmasøytisk aktive forbindelser eller prinsipper som er eller kan bli anvendt for forebyggingen og/eller behandlingen av sykdommene og forstyrrelsene sitert heri, som et resultat av at en synergistisk effekt kan eller ikke kan bli ervervet. Eksempler på slike forbindelser og prinsipper, så vel som ruter, fremgangsmåter og farmasøytiske formuleringer eller sammensetninger for å administere dem vil være klart for klinikeren.
Når to eller flere substanser eller prinsipper skal bli anvendt som del av et kombinert behandlingsregime, kan de bli administrert via den samme administreringsruten eller via forskjellige ruter for administrering, på essensielt den samme tiden eller ved forskjellige tider (f.eks. essensielt samtidig, fortløpende, eller i følge et alternerende regime). Når substansene eller prinsippene er administrert til å være samtidig via den samme administreringsruten, kan de bli administrert som forskjellige farmasøytiske formuleringer eller sammensetninger eller del av en kombinert farmasøytisk formulering eller sammensetning, som vil være klart for den faglærte personen.
Også, når to eller flere aktive substanser eller prinsipper skal bli anvendt som del av et kombinert behandlingsregime, kan hver av substansene eller prinsippene bli administrert i den samme mengden og i følge det samme regimet som anvendt når forbindelsen eller prinsippet er anvendt på egenhånd, og slik kombinert anvendelse kan eller kan ikke føre til en synergistisk effekt. Likevel, når den kombinerte anvendelsen av de to eller flere aktive substansene eller prinsippene fører til en synergistisk effekt, kan det også være mulig å redusere mengden av en, flere eller alle av substansene eller prinsippene som skal bli administrert, mens fortsatt oppnå den ønskede terapeutiske handlingen. Dette kan for eksempel være nyttig for å unngå, begrense eller redusere hvilke som helst uønskede bivirkninger som er assosiert med anvendelsen av en eller flere av substansene eller prinsippene når de er anvendt i deres vanlige mengder, mens fortsatt oppnå den ønskede farmasøytiske eller terapeutiske effekten.
Effektiviteten av behandlingsregimet anvendt i følge den foreliggende oppfinnelsen kan bli bestemt og/eller fulgt på en hvilken som helst måte kjent per se for sykdommen eller forstyrrelsen involvert, som vil være klart for klinikeren. Klinikeren vil også være i stand til, hvor passende og eller et tilfelle-til-tilfelle basis, å forandre eller modifisere et spesielt behandlingsregime, for slik å oppnå den ønskede terapeutiske effekten, til å unngå, begrense eller redusere uønskede bivirkninger, og/eller til å oppnå en passende balanse mellom å oppnå den ønskede terapeutiske effekten på den ene siden og unngå, begrense eller redusere uønskede bivirkninger på den andre siden.
Generelt, vil behandlingsregimet bli fulgt inntil den ønskede terapeutiske effekten er oppnådd og/eller for så lenge som den ønskede terapeutiske effekten skal bli opprettholdt. Igjen, kan dette bli bestemt av klinikeren.
Derfor, i et videre aspekt, relateres den foreliggende oppfinnelsen til en farmasøytisk sammensetning som inneholder minst ett Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen eller minst ett polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen og minst en egnet bærer (dvs. en bærer egnet for veterinæranvendelse), og valgfritt en eller flere videre aktive substanser.
Den foreliggende oppfinnelsen relateres også til anvendelsen av et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen og/eller til et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen i fremstillingen av en farmasøytisk sammensetning, spesielt i fremstillingen av en farmasøytisk sammensetning for forebyggingen og/eller behandlingen (inkludert men ikke begrenset til lindringen av minst ett symptom) av en sykdom eller forstyrrelse mediert av TNF-alfa og/eller assosiert med TNF-alfa (for eksempel assosiert med en unormal aktivitet til TNF-alfa, unormale nivåer av TNF-alfa, unormal ekspresjon av TNF-alfa og/eller unormal sensitivitet eller respons til TNF-alfa, eller av en av de biologiske fenomenene assosiert med TNF-alfa), slik som en av sykdommene eller forstyrrelsene nevnt over.
Den foreliggende oppfinnelsen fremskaffer polypeptider som omfatter en eller flere Nanobodies rettet mot tumor nekrose faktor alfa (TNF-alfa). Den foreliggende oppfinnelsen relateres videre til deres anvendelse i diagnose og terapi. Slike antistoffer kan ha en rammeverksekvens med høy homologi til humane rammeverksekvenser. Sammensetninger som omfatter antistoffer til tumor nekrose faktor alfa (TNF-alfa) alene eller i kombinasjon med andre legemidler er beskrevet.
Tumor nekrose faktor alfa (TNF-alfa) er antatt å spille en viktig rolle i forskjellige forstyrrelser, for eksempel i inflammatoriske forstyrrelser slik som revmatoid artritt, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt og multippel sklerose. Både TNF-alfa og reseptorene (CD120a, CD120b) har blitt studert veldig detaljert. TNF-alfa i sine bioaktive former er en trimer og sprekken dannet av tilgrensende subenheter er viktig for cytokin-reseptor interaksjonen. Flere strategier for å antagonisere handlingen til cytokinet har blitt utviklet og er for tiden anvendt til å behandle forskjellige sykdomstilstander.
En TNF-alfa inhibitor som har tilstrekkelig spesifisitet og selektivitet mot TNF-alfa kan være en effektiv profylaktisk eller terapeutisk farmasøytisk forbindelse for å forebygge eller behandle forstyrrelser hvor TNF-alfa har blitt implisert som forårsakende agent. Fremgangsmåter for å behandle toksisk sjokk (EP 486526), tumor regresjon, inhibering av cytotoksisitet (US 6448380, US 6451983, US 6498237), autoimmun sykdom slik som RA og Crohns sykdom (EP 663836, US 5672347, US 5656272), transplantat versus vert reaksjon (US 5672347), bakteriell meningitt (EP 585705) ved hjelp av et antistoff mot TNF-alfa har blitt beskrevet.
Men likevel er ingen av de nåværende tilgjengelige legemidlene fullstendig effektive for behandlingen av autoimmun sykdom, og de fleste er begrenset av alvorlig toksisitet. I tillegg, er det ekstremt vanskelig og en langvarig prosess å utvikle en ny kjemisk enhet (NCE) med tilstrekkelig potens og selektivitet mot en slik målsekvens. Antistoff-baserte medikamenter har på den annen side signifikant potensial som legemidler fordi de har utsøkt spesifisitet mot deres mål og en lav naturlig toksisitet. I tillegg, kan utviklingstiden bli redusert betydelig når sammenlignet med utviklingen av nye kjemiske enheter (NCE’er). Likevel, er konvensjonelle antistoffer vanskelige å forøke mot multimere proteiner hvor reseptor-bindingsdomenet til liganden er lagret i en sprekk, som er tilfelle med TNF-alfa. Tungkjede antistoffer beskrevet i den foreliggende oppfinnelsen som er avledet fra Camelidae, er kjent for å ha hulebindende tendenser (WO97/49805; Lauwereys et al, EMBO J. 17, 5312, 1998)).
Derfor, er slike tungkjede antistoffer iboende egnet til å binde til reseptor bindingsdomener til slike ligander som TNF. I tillegg, er slike antistoffer kjent for å være stabile over lange tidsperioder, og derfor øke deres hylle-liv (Perez et al, Biochemistry, 40, 74, 2001). Dessuten, kan slike tungkjede antistoffragmenter bli produsert ‘en-masse’ i fermentorer ved å anvende billige ekspresjonssystemer sammenlignet med pattedyr cellekultur fermentering, slik som gjær eller andre mikroorganismer (EP 0698 097).
Anvendelsen av antistoffer avledet fra kilder slik som mus, sau, geit, kanin osv., og humaniserte derivater derav som en behandling for tilstander som krever en modulering av inflammasjon er problematisk av forskjellige grunner. Tradisjonelle antistoffer er ikke stabile ved romtemperatur, og må kjøles i kjøleskap for fremstilling og lagring, noe som krever nødvendig nedkjølt laboratorieutstyr, lagring og transport, som bidrar mot tid og omkostninger. Nedkjøling er noen ganger ikke mulig i utviklingsland. Videre, er fremstillingen eller små-skala produksjon av ovennevnte antistoffer kostbar fordi cellulære pattedyrsystemer nødvendig for ekspresjonen av intakte og aktive antistoffer krever høye nivåer av støtte når det gjelder tid og utstyr, og utbytter er veldig lave. Videre vil den store størrelsen av konvensjonelle antistoffer, begrense vevspenetrering, for eksempel, i åstedet for det betente vevet. Videre, har tradisjonelle antistoffer en bindingsaktivitet som avhenger av pH, og er følgelig uegnet for anvendelse i miljøer utenfor det vanlige fysiologiske pH området slik som, for eksempel, i behandling av gastrisk blødning, gastrisk kirurgi. Videre, er tradisjonellel antistoffer ustabile ved lav eller høy pH og er følgelig ikke egnet for oral administrering. Likevel, har det blitt demonstrert at camelidae antistoffer motstår barske forhold, slik som ekstrem pH, denaturerende reagenser og høye temperaturer (Dumoulin et al, Protein Science 11, 500, 2002), slik at det gjør dem egnet for levering ved oral administrering. Videre, har tradisjonelle antistoffer en bindingsaktivitet, som avhenger av temperatur, og er følgelig uegnet for anvendelse i assayer eller kit utført ved temperaturer utenfor biologisk aktive-temperaturområder (f.eks.37 ± 20ºC).
Polypeptidmedikamenter og spesielt antistoff-baserte medikamenter har signifikant potensial som legemidler fordi de har utsøkt spesifisitet mot deres mål og en lav iboende toksisitet. Likevel, er det kjent av den faglærte adressat at et antistoff som har blitt ervervet for et terapeutisk nyttig mål krever ytterligere modifisering for å kunne fremstille det for human terapi, for slik å unngå en uønsket immunologisk reaksjon i et menneskeindivid ved administrering dertil. Modifiseringsprosessen blir vanligvis kalt "humanisering". Det er kjent av den dyktige håndverker at antistoffer dyrket i arter, andre enn i mennesker, krever humanisering for å gi antistoffet som er terapeutisk nyttig i mennesker ( (1) CDR transplantering : Protein Design Labs: US 6180370, US 5693761; Genentech US 6054297; Celltech: 460167, EP 626390, US 5859205; (2) Veneering: Xoma: US 5869619, US 5766886, US 5821123). Det er et behov for en fremgangsmåte for å produsere antistoffer som unngår behovet for vesentlig humanisering, eller som fullstendig unngår behovet for humanisering. Det er et behov for en ny klasse av antistoffer som har definerte rammeverkregioner eller aminosyreresidier og som kan bli administrert til et menneskesubjekt uten behovet for vesentlig humanisering, eller behovet for humanisering i det hele tatt.
En annen viktig ulempe med konvensjonelle antistoffer er at de er komplekse, store molekyler og derfor er relativt ustabile, og de er sensitive for nedbrytning av proteaser. Dette betyr at konvensjonelle antistofflegemidler ikke kan bli administrert oralt, sublingvalt, topisk, nasalt, vaginalt, rektalt eller ved inhalasjon fordi de ikke er resistente mot den lave pH i disse stedene, handlingen til proteaser ved disse stedene og i blodet og/eller på grunn av deres store størrelse. De må bli administrert ved injeksjon (intravenøst, subkutant, osv.) for å overvinne noen av disse problemene. Administrering ved injeksjon krever spesialisttrening for å kunne anvende en hypodermisk sprøyte eller nål korrekt og sikkert. Det kreves videre sterilt utstyr, en væskeformulering av det terapeutiske polypeptidet, rørpakking av ovennevnte polypeptid i en steril og stabil form og, for subjektet, et egnet sted for inntreden av nålen. Videre, opplever subjekter vanligvis fysisk og psykologisk stress før og mens de mottar en injeksjon. Derfor, er det behov for en fremgangsmåte for leveringen av terapeutiske polypeptider som unngår behovet for injeksjon som ikke bare er kostnads-/tids-besparende, men som også ville være mer bekvemt og mer konfortabelt for subjektet.
Nanobody-baserte medikamenter har signifikant potential som legemidler fordi de har utsøkt spesifisitet mot deres mål og en lav iboende inherent toksisitet. Likevel, videre forbedring av deres virkelige og funksjonelle affinitet kan føre til mange fordeler for en pasient slik som redusert medikamentdose, raskere terapi, og redusert bivirkninger.
En utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa Nanobody, hvilket Nanobody fortrinnsvis er som videre definert over.
En utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som omfatter minst ett anti-TNF-alfa Nanobody, hvilket polypeptid fortrinnsvis er som videre definert over.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over som videre omfatter minst ett Nanobody rettet mot et serumprotein.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over hvori ovennevnte serumprotein er et hvilket som helst av serum albumin, serum immunoglobuliner, tyroksin-bindende protein, transferrin, eller fibrinogen.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over som videre omfatter minst ett Nanobody selektert fra gruppen som består av anti-IFN-gamma Nanobody, anti-TNF-alfa reseptor Nanobody og anti-IFN-gamma reseptor Nanobody.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over, hvori antallet Nanobodies rettet mot TNF-alfa er minst to.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over, hvori minst ett Nanobody er en humanisert Camelidae VHHs.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en sammensetning som omfatter et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over og minst ett Nanobody fra gruppen som består av anti-IFN-gamma Nanobody, anti-TNF-alfa reseptor Nanobody og anti-IFN-gamma reseptor Nanobody, for samtidig, atskilt eller fortløpende administrering til et subjekt.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over, eller en sammensetning som beskrevet over, hvori ovennevnte Nanobody er en homolog sekvens, en funksjonell del, eller en funksjonell del av en homolog sekvens av full-lengde Nanobodiet.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over, eller en sammensetning som beskrevet over, hvori anti-TNF-alfa polypeptidet er en homolog sekvens, en funksjonell del, eller en funksjonell del av en homolog sekvens av full-lengde anti-TNF-alfa polypeptidet. En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over, eller en sammensetning som beskrevet over hvori minst ett Nanobody er et Camelidae VHH.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en nukleinsyre som koder for et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å identifisere en agent som modulerer bindingen av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over, til Tumor Nekrose Faktor-alfa som omfatter trinnene av:
(a) å kontakte et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over med et mål som er Tumor Nekrose Faktor alfa, i nærværet og fraværet av en kandidatmodulator under forhold som tillater binding mellom ovennevnte polypeptid og mål, og
(b) å måle bindingen mellom polypeptidet og målet til trinn (a), hvori en minking i binding i nærværet av ovennevnte kandidatmodulator, relativt til bindingen i fravær av ovennevnte kandidatmodulator identifiserte ovennevnte kandidatmodulator som en agent som modulerer bindingen av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over og Tumor Nekrose Faktor-alfa.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å identifisere en agent som modulerer Tumor Nekrose Faktor-alfamedierte forstyrrelser gjennom bindingen av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over til Tumor Nekrose Faktor-alfa som omfatter:
(a) å kontakte et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over med et mål som er Tumor Nekrose Faktor alfa, i nærværet og fraværet av en kandidatmodulator under forhold som tillater binding mellom ovennevnte polypeptid og mål, og
(b) å måle bindingen mellom polypeptidet og målet i trinn (a), hvori en minking i binding i nærværet av ovennevnte kandidatmodulator, relativt til bindingen i fravær av ovennevnte kandidatmodulator identifisert, ovennevnte kandidatmodulator som en agent som modulerer Tumor Nekrose Faktor alfa-medierte forstyrrelser.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å identifisere en agent som modulerer bindingen av Tumor Nekrose Faktor alfa til dens reseptor gjennom bindingen av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over til Tumor Nekrose Faktor-alfa som omfatter:
(a) å kontakte et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over med et mål som er Tumor Nekrose Faktor-alfa, i nærværet og fraværet av en kandidatmodulator under forhold som tillater binding mellom ovennevnte polypeptid og mål, og
(b) å måle bindingen mellom polypeptidet og målet i trinn (a), hvori en minking i binding i nærværet av ovennevnte kandidatmodulator, relativt til bindingen i fravær av ovennevnte kandidatmodulator identifiserte ovennevnte kandidatmodulator som en agent som modulerer bindingen av Tumor Nekrose Faktor-alfa til sin reseptor.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et kit for å screene for agenter som modulerer Tumor Nekrose Faktor-alfa-medierte forstyrrelser som omfatter et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over og Tumor Nekrose Faktor-alfa.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en ukjent agent som modulerer bindingen av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over til Tumor Nekrose Faktor-alfa, identifisert i følge fremgangsmåten som beskrevet over.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en ukjent agent som modulerer Tumor Nekrose Faktor-alfa-medierte forstyrrelser, identifisert i følge fremgangsmåtene som beskrevet over.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en ukjent agent som beskrevet over hvori ovennevnte forstyrrelser er en eller flere av inflammasjon, revmatoid artritt, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, inflammatorisk bowel syndrom og multippel sklerose.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over, eller en nukleinsyre som beskrevet over, eller en sammensetning som beskrevet over, eller en agent som beskrevet over for å behandle og/eller forebygge og/eller lindre forstyrrelser som relateres til inflammatoriske prosesser.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en anvendelse av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over eller en nukleinsyre som beskrevet over, eller en sammensetning som beskrevet over, eller en agent som beskrevet over for fremstillingen av et medikament for å behandle og/eller forebygge og/eller lindre forstyrrelser som relateres til inflammatoriske reaksjoner.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over eller en sammensetning som beskrevet over, for å behandle og/eller forebygge og/eller lindre forstyrrelser mottagelige for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen som er i stand til å passere gjennom det gastriske miljøet uten at substansen blir inaktivert.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en anvendelse av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over eller en sammensetning som beskrevet over, for fremstillingen av et medikament for å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene av forstyrrelser mottagelige for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen som er i stand til å passere gjennom det gastriske miljøet uten at substansen blir inaktivert.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over eller en sammensetning som beskrevet over, for å behandle og/eller forebygge og/eller lindre forstyrrelser mottagelige for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen levert til den vaginale og/eller rektale trakt.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en anvendelse av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over eller en sammensetning som beskrevet over, for fremstillingen av et medikament for å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene av forstyrrelser mottagelige for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen levert til den vaginale og/eller rektale trakt.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over eller en sammensetning som beskrevet over, for å behandle og/eller forebygge og/eller lindre forstyrrelser mottagelige for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen levert til nesen, øvre respiratoriske trakt og/eller lunge.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en anvendelse av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over eller en sammensetning som beskrevet over, for fremstillingen av et medikament for å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene av forstyrrelser mottagelige for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen levert til nesen, øvre respiratoriske trakt og/eller lunge.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over eller en sammensetning som beskrevet over, for å behandle og/eller forebygge og/eller lindre forstyrrelser mottagelige for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen levert til tarmslimhinnen, hvori ovennevnte forstyrrelse øker permeabiliteten til tarmslimhinnen.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en anvendelse av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over eller en sammensetning som beskrevet over, for fremstillingen av et medikament for å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene til forstyrrelser mottagelige for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen levert til tarmslimhinnen, hvori ovennevnte forstyrrelse øker permeabiliteten til tarmslimhinnen.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over eller en sammensetning som beskrevet over, for å behandle og/eller forebygge og/eller lindre forstyrrelser mottagelige for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen som er i stand til å effektivt passere gjennom vevet under tungen.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en anvendelse av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over eller en sammensetning som beskrevet over, for fremstillingen av et medikament for å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene til forstyrrelser mottagelige for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen som er i stand til å effektivt passere gjennom vevet under tungen.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over eller en sammensetning som beskrevet over, for å behandle og/eller forebygge og/eller lindre forstyrrelser mottagelige for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen som effektivt er i stand til å passere gjennom huden.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en anvendelse av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over eller en sammensetning som beskrevet over, for fremstillingen av et medikament for å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene til forstyrrelser mottagelige for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen som effektivt er i stand til å passere gjennom huden.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte som beskrevet over, et kit som beskrevet over, en nukleinsyre eller agent som beskrevet over, anvendelse av en nukleinsyre eller agent som beskrevet over, en sammensetning som beskrevet over, anvendelse av en sammensetning som beskrevet over, et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over, anvendelse av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over hvori ovennevnte forstyrrelser er en hvilken som helst av inflammasjon, revmatoid artritt, COPD, astma, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, inflammatorisk bowel syndrom, multippel sklerose, Addisons sykdom, Autoimmun hepatitt, Autoimmun parotitt, Diabetes Type I, Epididymitt, Glomerulonefritt, Graves sykdom, Guillain-Barre syndrom, Hashimotos sykdom, Hemolytisk anemi, Systemisk lupus erythematosus, Mannlig infertilitet, Multippel sklerose, Myasthenia Gravis, Pemfigus, Psoriasis, Revmatisk feber, Revmatoid artritt, Sarkoidose, Skleroderma, Sjøgrens syndrom, Spondyloartropati, Tyroiditt, og Vaskulitt.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en sammensetning som omfatter en nukleinsyre eller agent som beskrevet over, et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over, eller en sammensetning som beskrevet over, og et egnet farmasøytiske hjelpemiddel.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å diagnostisere en forstyrrelse karakterisert av dysfunksjonen til Tumor Nekrose Faktor-alfa som omfatter:
(a) å kontakte en prøve med et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over,
(b) å detektere binding av ovennevnte polypeptid til ovennevnte prøve, og
(c) å sammenligne bindingen detektert i trinn (b) med en standard, hvori en forskjell i binding relativt til ovennevnte prøve er diagnostisk for en forstyrrelse karakterisert ved dysfunksjon av Tumor Nekrose Faktor-alfa.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et kit for å screene for en forstyrrelse som sitert over, ved å anvende en fremgangsmåte som beskrevet over.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et kit for å screene for en forstyrrelse som sitert over som omfatter et isolert anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en anvendelse av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over for rensingen av ovennevnte Tumor Nekrose Faktor-alfa.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en anvendelse av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over for å inhibere interaksjonene mellom Tumor Nekrose Faktor-alfa og en eller flere Tumor Nekrose Faktor-alfa reseptorer.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å produsere et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over som omfatter trinnene av:
(a) å oppnå dobbeltrådet DNA som koder for et Camelidae VHH rettet mot Tumor Nekrose Faktor alfa,
(b) å klone og uttrykke DNA ́et selektert i trinn (b).
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å produsere et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over som omfatter:
(a) å dyrke vertsceller som omfatter nukleinsyre i stand til å kode for et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over, under forhold som tillater ekspresjonen av polypeptidet, og,
(b) å gjenvinne det produserte polypeptidet fra kulturen.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte som beskrevet over, hvori ovennevnte vertsceller er bakterie eller gjær.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et kit for å screene for en hvilken som helst av inflammasjon, revmatoid artritt, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, inflammatorisk bowel syndrom eller multippel sklerose som omfatter et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet over.
VHHer, i følge den foreliggende oppfinnelsen, og som kjent for den dyktige adressaten er tungkjede variable domener avledet fra immunoglobuliner naturlig blottet for lettkjeder slik som de avledet fra Camelidae som beskrevet i WO 94/04678 (og referert til heretter som VHH domener eller Nanobodies). VHH molekyler er omtrent 10x mindre enn IgG molekyler. de er enkle polypeptider og veldig stabile, motstår ekstreme pH- og temperatur-forhold. Dessuten, er de resistente mot virkningen av proteaser som ikke er tilfellet for konvensjonelle antistoffer. Videre, in vitro ekspresjon av VHHer produserer høyt utbytte, riktig foldede funksjonelle VHHer. I tillegg, vil antistoffer generert i Camelider gjenkjenne epitoper andre enn de gjenkjent av antistoffer generert in vitro gjennom anvendelsen av antistoffbiblioteker eller via immunisering av pattedyr andre enn Camelider (WO 9749805). Som slikt, kan anti-TNF-alfa VHH’er interagere mer effektivt med TNF-alfa enn konvensjonelle antistoffer, og derved blokkere sin interaksjon med TNF-alfa reseptoren mer effektivt.
TNF-alfa er også et fragment av TNF-alfa, som er i stand til å fremkalle en immunrespons. TNF-alfa er også et fragment av TNF-alfa, som er i stand til å binde til et Nanobody dyrket mot full-lengde TNF-alfa ́en.
Et Nanobody rettet mot TNF-alfa betyr Nanobody som det er i stand til å binde til TNF-alfa med en affinitet på bedre enn 10<-6 >M.
En utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF polypeptid, hvori Nanobodies omfatter Camelidae VHH rettet mot TNF-alfa.
De et eller flere Nanobodies av anti-TNF polypeptidet som er rettet mot et TNF-alfa kan være av den samme sekvensen. Alternativt kan ikke alle ha den samme sekvensen. Det er innen omfanget av den foreliggende oppfinnelsen at et anti-TNF polypeptid omfatter anti-TNF-alfa Nanobodies som ikke alle deler den samme sekvensen, men som er rettet mot det samme målet, et eller flere antigener derav.
Den foreliggende oppfinnelsen relateres videre til et anti-TNF-alfa polypeptid, hvori ovennevnte Nanobody er et VHH rettet mot TNF-alfa, hvori VHH ́et tilhører en klasse som har menneske-lignende sekvenser. Klassen er karakterisert ved at VHHer bærer en aminosyre fra gruppen som består av glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, prolin, fenylalanin, tyrosin, tryptofan, metionin, serin, threonin, asparagin, eller glutamin i posisjon 45, slik som, for eksempel, L45 og en tryptofan i posisjon 103, i følge Kabat nummereringen. En annen menneske-lignende klasse av Camelidae Nanobodies har blitt beskrevet i WO03035694 og omfatter de hydrofobiske FR2 residiene typisk funnet i konvensjonelle antistoffer av menneskeopprinnelse eller fra andre arter, men kompenserer dette tapet i hydrofilitet ved det ladede argininresidiet i posisjon 103 som erstatter det konserverte tryptofanresidiet foreliggende i VH fra dobbel-kjede antistoffer. Som slik, viser peptider som tilhører disse to klassene en høy aminosyresekvenshomologi med humane VH rammeverkregioner og ovennevnte peptider kan bli administrert til et menneske direkte uten forventning av en uønsket immunrespons derfra, og uten byrden med videre humanisering. Den foreliggende oppfinnelsen relateres også til nukleinsyrer som er i stand til å kode for ovennevnte polypeptider.
Et hvilket som helst av VHHer som anvendt av den foreliggende oppfinnelsen kan være av den tradisjonelle klassen eller av klassene til menneske-lignende Camelidae antistoffer. Ovennevnte antistoffer kan være rettet mot hele TNF-alfa eller et fragment derav, eller et fragment av en homolog sekvens derav. Disse polypeptidene inkludere de full-lengde Camelidae antistoffene, nemlig Fc og VHH domenene, kimere versjoner av tungkjede Camelidae antistoffer med et humant Fc domene eller VHH’er alene eller avledede fragmenter.
Anti-serum albumin VHH’er kan interagere på en mer effektiv måte med serum albumin enn konvensjonelle antistoffer som er kjent for å være et bærerprotein. Som et bærerprotein kan noen av epitopenene til serum albumin være utilgjengelig ved bundne proteiner, peptider og små kjemiske forbindelser. Siden VHH’er er kjent for å binde inn i ‘uvanlige’ eller ikke-konvensjonelle epitoper slik som huler (WO 97/49805), kan affiniteten av slike VHH’er til sirkulerende albumin bli økt.
Den foreliggende oppfinnelsen relateres også til funnet at et anti-TNF polypeptid som beskrevet heri som videre omfatter ett eller flere Nanobodies rettet mot ett eller flere serumproteiner til et subjekt, overraskende har signifikant forlenget halvliv i sirkulasjonen til ovennevnte subjekt sammenlignet med halv-livet til anti-TNF-alfa Nanobodiet når ikke del av ovennevnte konstrukt. Dessuten, ble de ovennevnte polypeptidene funnet å vise de samme fordelaktige egenskapene til Nanobodies slik som høy stabilitet som forble intakt i mus, ekstrem pH resistens, høy temperaturstabilitet og høy målaffinitet.
Serumproteinet kan være et hvilket som helst egnet protein funnet i serumet til et subjekt. I et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen, er serumproteinet serum albumin, serum immunoglobuliner, thyroksin-bindende protein, transferrin, eller fibrinogen. Avhengig av den mente anvendelsen slik som det forlangte halv-livet for effektiv behandling og/eller avdelingsinndelingen av målantigenet, kan VHH-partneren være rettet mot ett av serumproteinene over.
I følge et spesifikt, men ikke-begrensende aspekt av den foreliggende oppfinnelsen, består Nanobodiet mot humant serum albumin av 4 rammeverkregioner (FR1 til FR4 respektivt) og 3 komplementaritetsbestemmende regioner (CDR1 til CDR3 respektivt), der:
(iv) CDR1 er en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av:
SFGMS [SEQ ID NO: 36]
LNLMG [SEQ ID NO: 37]
INLLG [SEQ ID NO: 38]
NYWMY; [SEQ ID NO: 39]
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensene over;
og der:
(v) CDR2 er en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av:
SISGSGSDTLYADSVKG [SEQ ID NO: 40]
TITVGDSTNYADSVKG [SEQ ID NO: 41]
TITVGDSTSYADSVKG [SEQ ID NO: 42]
SINGRGDDTRYADSVKG [SEQ ID NO: 43]
AISADSSTKNYADSVKG [SEQ ID NO: 44]
AISADSSDKRYADSVKG [SEQ ID NO: 45]
RISTGGGYSYYADSVKG [SEQ ID NO: 46]
eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over; der
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensene over;
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensene over;
og der:
(vi) CDR3 er en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av:
DREAQVDTLDFDY [SEQ ID NO: 47]
eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over; der
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensene over;
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensene over;
eller fra gruppen som består av:
GGSLSR [SEQ ID NO: 48]
RRTWHSEL [SEQ ID NO: 49]
GRSVSRS [SEQ ID NO: 50]
GRGSP [SEQ ID NO: 51]
og/eller fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensene over.
I et annet aspekt, relateres den foreliggende oppfinnelsen til et Nanobody mot humant serum albumin, som består av 4 rammeverkregioner (FR1 til FR4 respektivt) og 3 komplementaritetsbestemmende regioner (CDR1 til CDR3 respektivt), som er valgt fra gruppen som består av domene antistoffer og/eller enkeltdomene antistoffer med den ene av de følgende kombinasjonene av CDR1, CDR2 og CDR3, respektivt: - CDR1: SFGMS; CDR2: SISGSGSDTLYADSVKG; CDR3: GGSLSR;
- CDR1: LNLMG; CDR2: TITVGDSTNYADSVKG; CDR3: RRTWHSEL;
- CDR1: INLLG; CDR2: TITVGDSTSYADSVKG; CDR3: RRTWHSEL;
- CDR1: SFGMS; CDR2: SINGRGDDTRYADSVKG; CDR3: GRSVSRS;
- CDR1: SFGMS; CDR2: AISADSSDKRYADSVKG; CDR3: GRGSP;
- CDR1: SFGMS; CDR2: AISADSSDKRYADSVKG; CDR3: GRGSP;
- CDR1: NYWMY; CDR2: RISTGGGYSYYADSVKG; CDR3:
DREAQVDTLDFDY.
I Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen som omfatter kombinasjonene av CDR’er nevnt over, kan hvert CDR bli erstattet av en CDR valgt fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har minst 80%, fortrinnsvis minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet (som definert heri) med de nevnte CDR’ene; der
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensene over;
og/eller valgt fra gruppen som består av aminosyresekvenser som har 3, 2 eller bare 1 (som indikert i den forrige paragrafen) “aminosyre forskjell(er)” (som definert heri) med de nevnte CDR(er) en av aminosyresekvensene over, der:
(1) en hvilken som helst aminosyresubstitusjon fortrinnsvis er en konservativ aminosyresubstitusjon (som definert heri); og/eller
(2) ovennevnte aminosyresekvens fortrinnsvis bare inneholder aminosyresubstitusjoner, og ingen aminosyredelesjoner eller insersjoner, sammenlignet med aminosyresekvensene over.
Likevel, av Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen som omfatter kombinasjonene av CDR’er nevnt over, er Nanobodies som omfatter en eller flere av CDR’ene listet opp over spesielt foretrukket; Nanobodies som omfatter to eller flere av CDR’ene listet opp over er mer spesielt foretrukket; og Nanobodies som omfatter tre av CDR’ene listet opp over er mest spesielt foretrukket.
I disse Nanobodies mot humant serum albumin, er rammeverkregionene FR1 til FR4 fortrinnsvis som definert heriover for Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen.
Spesielt foretrukne Nanobodies mot humant serum albumin er valgt fra gruppen som består av SEQ ID NO: 61 til 67, SEQ ID NO 87 til 89 og SEQ ID NO 100-104. De foretrukne kombinasjonene av CDR’er og rammeverkregioner foreliggende i disse Nanobodies er også listet opp i Tabell II
Tabell II: Foretrukne kombinasjoner av Rammeverksekvenser og CDR’er i Nanobodies mot humant
Et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri som videre omfatter minst ett polypeptid selektert fra gruppen som består av et anti-IFN-gamma polypeptid, et anti-TNF-alfa reseptor polypeptid og anti-IFN-gamma reseptor polypeptid.
I følge et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen, er et Nanobody rettet mot TNF-alfa reseptor. Ovennevnte Nanobody kan være et Camelidae VHH.
I følge et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen, er et Nanobody rettet mot IFN-gamma reseptor. Ovennevnte Nanobody kan være et Camelidae VHH.
Slike multi-spesifikke konstrukter kan ha forbedret potens som inflammatorisk terapeutisk forbindelse over mono-spesifikke konstrukter.
Et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er en sammensetning som omfatter et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri og minst ett polypeptid selektert fra gruppen som består av anti-IFN-gamma polypeptid, anti-TNF-alfa reseptor polypeptid og anti-IFN-gamma reseptor polypeptid, for samtidig, separat eller sekvensiell administrering til et subjekt.
Et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er et kit som inneholder et anti-TNF-alfa polypeptid og minst ett polypeptid selektert fra gruppen som består av anti-IFN-gamma polypeptid, anti-TNF-alfa reseptor polypeptid og anti-IFN-gamma reseptor polypeptid for samtidig, separat eller sekvensiell administrering til et subjekt. Det er et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen at kitet kan bli anvendt i følge den foreliggende oppfinnelsen. Det er et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen at kitet kan bli anvendt til å behandle sykdommene som sitert heri.
Ved samtidig administrering menes at polypeptidene er administrert til et subjekt på samme tid. For eksempel, som en blanding av polypeptidene eller en sammensetning som omfatter ovennevnte polypeptider. Eksempler inkluderer, men er ikke begrenset til en løsning administrert intravenøst, en tablett, væske, topisk krem, osv., hvori hver fremstilling omfatter polypeptidene av interesse.
Med separat administrering menes at polypeptidene er administrert til et subjekt på samme tid eller vesentlig den samme tiden. Polypeptidene er foreliggende i kitet som separate, ublandede fremstillinger. For eksempel, kan de forskjellige polypeptidene være foreliggende i kitet som individuelle tabletter. Tablettene kan bli administrert til subjektet ved å svelge begge tabletter på samme tid, eller en tablett direkte etter den andre.
Med sekvensiell administrering menes at polypeptidene er administrert til et subjekt sekvensielt. Polypeptidene er foreliggende i kitet som separate, ublandede fremstillinger. Det er et tidsintervall mellom doser. For eksempel, et polypeptid kan bli administrert opptil 336, 312, 288, 264, 240, 216, 192, 168, 144, 120, 96, 72, 48, 24, 20, 16, 12, 8, 4, 2, 1, eller 0.5 timer etter den andre komponenten.
I sekvensiell administrering, kan et polypeptid kan bli administrert en gang, eller et hvilket som helst antall ganger og i varierende doser før og/eller after administrering av et annet polypeptid. Sekvensiell administrering kan bli kombinert med samtidig eller sekvensiell administrering.
De medisinske anvendelsene av anti-TNF-alfa polypeptidet beskrevet under, gjelder også for sammensetningen som omfatter et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri og minst ett polypeptid selektert fra gruppen som består av anti-IFN-gamma polypeptid, anti-TNF-alfa reseptor polypeptid og anti-IFN-gamma reseptor polypeptid, for samtidig, separat eller sekvensiell administrering til et subjekt som beskrevet her over.
I følge et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen, et anti-IFN-gamma polypeptid anti-TNF-alfa et Nanobody rettet mot IFN-gamma. Ovennevnte Nanobody kan være et Camelidae VHH.
I følge et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen, anti-TNF-alfa et Nanobody rettet mot TNF-alfa reseptor. Ovennevnte Nanobody kan være et Camelidae VHH.
I følge et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen, et anti-IFN-gamma reseptor polypeptid anti-TNF-alfa et Nanobody rettet mot IFN-gamma reseptor. Ovennevnte Nanobody kan være et Camelidae VHH.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri, hvori antallet Nanobodies rettet mot TNF-alfa er to eller flere. Slike multivalente anti-TNF-alfa polypeptider har fordelen av uvanlig høy funksjonell affinitet for målet, og utviser mye høyere inhibitoriske egenskaper enn forventet sammenlignet med deres monovalente motstykker.
De multivalente anti-TNF-alfa polypeptidene har funksjonelle affiniteter som er flere størrelsesordener høyere enn de monovalente opphav anti-TNF-alfa polypeptidene. Oppfinnerne har funnet at de funksjonelle affinitetene til disse multivalente polypeptidene er mye høyere enn de rapportert i det tidligere faget for bivalente og multivalente antistoffer. Overraskende, viser anti-TNF-alfa polypeptider av den foreliggende oppfinnelsen forbundet til hverandre direkte eller via en kort linkersekvens de høye funksjonelle affinitetene forventet teoretisk med multivalente konvensjonelle fire-kjede antistoffer.
Oppfinnerne har funnet at slike store økte funksjonelle aktiviteter kan bli detektert fortrinnsvis med antigener sammensatt av multidomene og multimere proteiner, enten i rette bindingsassayer eller i funksjonelle assayer, f.eks. cytotoksiske assayer.
Nanobodies kan bli forent for å danne et hvilket som helst av polypeptidene beskrevet heri som omfatter mer enn ett Nanobody ved å anvende fremgangsmåter kjent innen faget eller en hvilken som helst fremtidig fremgangsmåte. For eksempel, kan de bli fusjonert ved kjemisk kryss-binding med reagerende aminosyreresidier med en organisk derivatiserende agent slik som beskrevet av Blattler et al, Biochemistry 24,1517-1524; EP294703. Alternativt, kan Nanobodies bli fusjonert genetisk på DNA nivå dvs. et polynukleotidekonstrukt dannet som koder for det komplette polypeptidkonstruktet som omfatter ett eller flere anti-target Nanobodies og en eller flere anti-serum protein Nanobodies. En fremgangsmåte for å produsere bivalente eller multivalente VHH polypeptidkonstrukter er beskrevet i PCT patentsøknaden WO 96/34103. En måte å forene mangfoldige Nanobodies er via den genetiske ruten ved å forbinde Nanobody-kodende sekvenser enten direkte eller via en peptidlinker. For eksempel, kan den C-terminale enden av det første Nanobodiet bli forbundet til den N-terminale enden av det neste Nanobodiet. Denne forbindingsmåten kan bli forlenget for å kunne forbinde andre Nanobodies for konstruksjonen og produksjonen av tri-, tetra-, osv. funksjonelle konstrukter.
I følge et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen, er Nanobodies forbundet til hverandre direkte, uten anvendelse av en linker. I motsetning til å forene store konvensjonelle antistoffer hvor en linkersekvens trengs for å beholde bindingsaktivitet i de to subenhetene, kan polypeptider av den foreliggende oppfinnelsen bli forbundet direkte og derved unngå potensielle problemer med linkersekvensen, slik som antigeniteten når administrert til et menneskesubjekt, der ustabilitet til linkersekvensen fører til dissosiering av subenhetene.
I følge et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelsen, er Nanobodies forbundet til hverandre via en peptidlinkersekvens. Slik linkersekvens kan være en naturlig forekommende sekvens eller en ikke-naturlig forekommende sekvens. Linkersekvensen er forventet å være ikke-immunogen i subjektet der anti-TNF-alfa polypeptidet er administrert. Linkersekvensen kan fremskaffe tilstrekkelig fleksibilitet til det multivalente anti-TNF-alfa polypeptidet, og på samme tid være resistent mot proteolytisk degradering. Et ikke-begrensende eksempel på en linkersekvens er en som kan være avledet fra hengselsregionen til VHHer beskrevet i WO 96/34103.
I følge et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelsen, kan multivalente Nanobodies som omfatter flere enn to Nanobodies bli forbundet til hverandre enten direkte eller via en linkersekvens. Slike konstrukter er vanskelig å produsere med konvensjonelle antistoffer og på grunn av sterisk hindring av de store subenhetene, vil funksjonalitet bli tapt eller veldig svekket heller enn økt betydelig som sett med VHH’er av den foreliggende oppfinnelsen sammenlignet med det monovalente konstruktet.
Polypeptidkonstruktene beskrevet heri kan bli fremstilt av den faglærte håndverker i følge fremgangsmåter kjent innen faget eller en hvilken som helst fremtidig fremgangsmåte. For eksempel, kan VHH ́er bli ervervet ved å anvende fremgangsmåter kjent innen faget slik som ved å immunisere en kamel og erverve hybridomer derfra, eller ved å klone et bibliotek av Nanobodies ved å anvende molekylære biologiteknikker kjent innen faget og følgende seleksjon ved å anvende fagdisplay.
I følge et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen kan et anti-TNF-alfa polypeptid være en homolog sekvens av et full-lengde anti-TNF-alfa polypeptid. I følge et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelsen, kan et anti-TNF-alfa polypeptid være en funksjonell del av et full-lengde anti-TNF-alfa polypeptid. I følge et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelsen, kan et anti-TNF-alfa polypeptid kan være en homolog sekvens av et full-lengde anti-TNF-alfa polypeptid. I følge et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelsen, kan et anti-TNF-alfa polypeptid være en funksjonell del av en homolog sekvens av et fulllengde anti-TNF-alfa polypeptid. I følge et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen kan et anti-TNF-alfa polypeptid omfatte en sekvens av et anti-TNF-alfa polypeptid.
I følge et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen kan et Nanobody anvendt til å danne et anti-TNF-alfa polypeptid være et komplett Nanobody (f.eks.
et VHH) eller en homolog sekvens derav. I følge et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelsen, kan et Nanobody anvendt til å danne polypeptidkonstruktet være en funksjonell del av et komplett Nanobody. I følge et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelsen, kan et Nanobody anvendt til å danne polypeptidkonstruktet være en homolog sekvens av et komplett Nanobody. I følge et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelsen, kan et Nanobody anvendt til å danne polypeptidkonstruktet være en funksjonell del av en homolog sekvens av et komplett Nanobody.
Som anvendt heri, kan en homolog sekvens av den foreliggende oppfinnelsen omfatte addisjoner, delesjoner eller substitusjoner av en eller flere aminosyrer, som ikke vesentlig forandrer de funksjonelle karakteristikkene til polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen. Antallet aminosyre-delesjoner eller -substitusjoner er fortrinnsvis opptil 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 eller 70 aminosyrer.
En homolog sekvens i følge den foreliggende oppfinnelsen kan være et polypeptid modifisert ved addisjonen, delesjonen eller substitusjonen av aminosyrer, der ovennevnte modifisering ikke vesentlig forandrer de funksjonelle karakteristikkene sammenlignet med det umodifiserte polypeptidet.
En homolog sekvens i følge den foreliggende oppfinnelsen kan være et polypeptid modifisert ved addisjonen, delesjonen eller substitusjonen av aminosyrer, der ovennevnte modifisering ikke vesentlig forandrer de funksjonelle karakteristikkene sammenlignet med det umodifiserte polypeptidet.
En homolog sekvens i følge den foreliggende oppfinnelsen kan være en sekvens som eksisterer i andre Camelidae arter slik som, for eksempel, kamel, dromedar, lama, alpakka, guansko osv.
Hvor homolog sekvens indikerer sekvensidentitet, menes det en sekvens som presenterer en høy sekvensidentitet (mer enn 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% eller 98% sekvensidentitet) med foreldresekvensen og er fortrinnsvis karakterisert ved lignende egenskaper til foreldresekvensen, nemlig affinitet, ovennevnte identitet beregnet ved å anvende kjente fremgangsmåter.
Alternativt, kan en homolog sekvens også være en hvilken som helst aminosyresekvens som resulterer fra tillatte substitusjoner ved et hvilket som helst antall av posisjoner til foreldresekvensen i følge formelen under:
Ser substituert med Ser, Thr, Gly, og Asn;
Arg substituert med en av Arg, His, Gln, Lys, og Glu;
Leu substituert med en av Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, og Val;
Pro substituert med en av Pro, Gly, Ala, og Thr;
Thr substituert med en av Thr, Pro, Ser, Ala, Gly, His, og Gln;
Ala substituert med en av Ala, Gly, Thr, og Pro;
Val substituert med en av Val, Met, Tyr, Phe, Ile, og Leu;
Gly substituert med en av Gly, Ala, Thr, Pro, og Ser;
Ile substituert med en av Ile, Met, Tyr, Phe, Val, og Leu;
Phe substituert med en av Phe, Trp, Met, Tyr, Ile, Val, og Leu;
Tyr substituert med en av Tyr, Trp, Met, Phe, Ile, Val, og Leu;
His substituert med en av His, Glu, Lys, Gln, Thr, og Arg;
Gln substituert med en av Gln, Glu, Lys, Asn, His, Thr, og Arg;
Asn substituert med en av Asn, Glu, Asp, Gln, og Ser;
Lys substituert med en av Lys, Glu, Gln, His, og Arg;
Asp substituert med en av Asp, Glu, og Asn;
Glu substituert med en av Glu, Asp, Lys, Asn, Gln, His, og Arg;
Met substituert med en av Met, Phe, Ile, Val, Leu, og Tyr.
En homolog nukleotidesekvens i følge den foreliggende oppfinnelsen kan refere til nukleotidesekvenser på mer enn 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800 eller 1000 nukleotider i stand til å hybridisere til det revers-komplemente av nukleotidesekvensen som er i stand til å kode for patentsekvensen, under stringente hybridiseringsforhold (slik som de beskrevet av Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manuel, Cold Spring, Harbor Laboratory press, New York).
Som anvendt heri, refererer en funksjonell del til en sekvens av et Nanobody som er på tilstrekkelig størrelse slik at interaksjonen av interesse er opprettholdt med affinitet på 1 x 10<-6 >M eller bedre.
Alternativt, omfatter en funksjonell del en partiell delesjon av den komplette aminosyresekvensen og fortsatt opprettholder bindings-setet(-setene) og protein-domenene(-domenet) nødvendig for bindingen av og interaksjonen med målet.
Som anvendt heri, refererer en funksjonell del til mindre enn 100% av den komplette sekvensen (f.eks., 99%, 90%, 80%, 70%, 60% 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% osv.), men omfatter 5 eller flere aminosyrer eller 15 eller flere nukleotider.
Mål som nevnt heri slik som TNF-alfa, TNF-alfa reseptor, serum proteiner (f.eks. serum albumin, serum immunoglobuliner, tyroksin-bindende protein, transferrin, fibrinogen) og IFN-gamma, kan IFN-gamma reseptor være fragmenter av ovennevnte mål. Derfor er et mål også et fragment av ovennevnte mål, i stand til å å fremkalle en immunrespons. Et mål er også et fragment av ovennevnte mål, i stand til å binde til et Nanobody dyrket mot fullengdemålet.
Et fragment som anvendt heri refererer til mindre enn 100% av sekvensen (f.eks., 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% osv.), men som omfatter 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 eller flere aminosyrer. Et fragment er av tilstrekkelig lengde slik at interaksjonen av interesse er opprettholdt med affinitet på 1 x 10<-6 >M eller bedre.
Et fragment som anvendt heri refererer også til valgfrie insersjoner, delesjoner og substitusjoner av en eller flere aminosyrer som ikke vesentlig forandrer evnen til målet til å binde til et Nanobody dyrket mot villtypemålet. Antallet aminosyre insersjoner, delesjoner eller substitusjoner er fortrinnsvis opptil 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 eller 70 aminosyrer.
En homolog sekvens av den foreliggende oppfinnelsen kan inkludere et anti-TNF-alfa polypeptid som har blitt humanisert. Humaniseringen av antistoffer av den nye klassen av VHHer ville videre redusere muligheten for uønsket immunologisk reaksjon i et menneskeindivid etter administrering.
En utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen relateres til en fremgangsmåte for å fremstille modifiserte polypeptider basert på lama antistoffer ved å bestemme aminosyreresidiene til det antistoff variable domenet (VHH) som kan bli modifisert uten å minske den naturlige affiniteten til domenet for antigen og samtidig redusere dens immunogenitet med hensyn til heterologe arter; anvendelsen av VHHer som har modifikasjoner ved de identifiserte residiene som er nyttige for administrering til heterologe arter; og til VHH ́et slik modifisert.
Mer spesifikt, relateres den foreliggende oppfinnelsen til fremstillingen av modifiserte VHHer, som er modifisert for administrering til mennesker, de resulterende VHH selv, og anvendelsen av slike "humaniserte" VHHer i behandlingen av sykdommer i mennesker. Med humanisert er det ment mutert slik at immunogenitet etter administrering i humane pasienter er mindre eller ikkeeksisterende. Humanisering av et polypeptid, i følge den foreliggende oppfinnelsen, omfatter et trinn med å erstatte en eller flere av Camelidae aminosyrene med deres humane motstykke som funnet i den humane konsensussekvensen, uten at det polypeptidet mister sin typiske karakter, dvs. humaniseringen ikke signifikant påvirker antigen bindingskapasiteten til det resulterende polypeptidet. Slike fremgangsmåter er kjent av den dyktige adressat.
Humanisering av Camelidae Nanobodies krever introduksjonen og mutagenesen av en begrenset mengde av aminosyrer i en enkelt polypeptidkjede. Dette er i kontrast til humanisering av scFv, Fab, (Fab)2 og IgG, som krever introduksjonen av aminosyreforandringer i to kjeder, den lette og den tunge kjeden og bevaringen av samlingen av begge kjeder.
Som beskrevet i WO 04/041862, kan et anti-TNF Nanobody bli humanisert. Humanisering kan for eksempel involvere mutagenese av residier i FR1 i posisjon 1 og 5 som ble introdusert av primeren anvendt for repertoar kloning og ikke forekommer naturlig i lama sekvensen. Mutagenese av de residiene resulterte ikke i tap av bindings- og/eller inhiberings-aktivitet. Humanisering kan også involvere mutagenese av residier i FR3 i posisjon 74, 76, 83, 84, 93. Mutagenese av de residiene resulterte ikke i et dramatisk tap av bindings- og/eller inhiberings-aktivitet. Kombinering av mutasjonene til FR1 og FR3 påvirket derfor ikke bindings- og/eller inhiberings-aktiviteten. Humanisering kan også involvere mutagenese av residier i FR4 i posisjon 108. Mutagenese av Q108L resulterte i lavere produksjonsnivå i Escherichia coli. Posisjon 108 er solvent eksponert i camelid VHH, mens i humane antistoffer er denne posisjonen begravet i VH-VL grenseflaten (Spinelli, 1996; Nieba, 1997). I isolerte VHer er posisjon 108 solvent eksponert. Introduksjonen av en ikke-polar hydrofobisk Leu i stedet for polar uladet Gln kan ha en drastisk effekt på den indre foldingen/stabiliteten til molekylet. Utskifting av de hydrofile residiene med humane hydrofobe residier i posisjoner 44 og 45 (E44G og R45L), hadde også ingen effekt på binding og/eller inhibering. Imidlertid, ble tap av bindings- og/eller inhiberings-aktivitet observert når F37V og F47W ble introdusert. Modelleringsdata bekreftet det kritiske residiet 37 til å bevare integriteten til CDR3 loop konformasjonen og herav på aktivitet (all nummerering i følge Kabaten ).
I følge en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, involverer humanisering å erstatte et hvilket som helst av de følgende residiene enten alene eller i kombinasjon:
- FR1 posisjon 1, 5, 28 og 30,
- kjennemerke aminosyren i posisjon 44 og 45 i FR2,
- FR3 residier 74, 75, 76, 83, 84, 93 og 94 ,
- og posisjoner 103, 104, 108 og 111 i FR4 ;
- nummerering i følge Kabat nummereringen.
En utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid, eller en nukleinsyre i stand til å kode for ovennevnte polypeptid for anvendelse i å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene til forstyrrelser som relateres til inflammatoriske prosesser. TNF-alfa er involvert i inflammatoriske prosesser, og blokkeringen av TNF-alfa påvirkning kan ha en anti-inflammatorisk effekt, som er høyt ønskverdig i visse sykdomstilstander slik som, for eksempel, Crohns sykdom. Eksemplene demonstrerer VHHer i følge den foreliggende oppfinnelsen som binder TNF-alfa og dessuten, blokkerer dens binding til TNF-alfa reseptoren.
Anti-TNF-alfa polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen er anvendelige for autoimmune sykdommer, slik som Addisons sykdom (adrenal), Autoimmune sykdommer i øret (øre), Autoimmune sykdommer i øyet (øye), Autoimmun hepatitt (lever), Autoimmun parotitt (parotide kjertler), Crohns sykdom (tarm), Diabetes Type I (pankreas), Epididymitt (epididymis), Glomerulonefritt (nyrer), Graves sykdom (tyroid), Guillain-Barre syndrom (nerveceller), Hashimotos sykdom (tyroid), Hemolytisk anemi (røde blodceller), Systemisk lupus erythematosus (mangfoldige vev), Mannlig infertilitet (sperm), Multippel sklerose (nerveceller), Myasthenia Gravis (nevromuskulært knutepunkt), Pemfigus (primært hud), Psoriasis (hud), Revmatisk feber (hjerte og ledd), Revmatoid artritt (leddfyll), Sarkoidose (mangfoldige vev og organer), Skleroderma (hud og bindevev), Sjøgrens syndrom (eksokrine kjertler, og andre vev), Spondyloartropati (aksialt skjelett, og andre vev), Tyroiditt (tyroid), Vaskulitt (blodårer).
Inni parentes er vevet rammet av sykdommen. Denne opplistingen av autoimmune sykdommer er ment å være eksemplarisk heller enn fullstendig.
Autoimmune tilstander der anti-TNF-alfa polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen er anvendelige inkluderer, for eksempel, AIDS, atopisk allergi, bronkial astma, eksem, lepra, schisofreni, arvelig depresjon, transplantering av vev og organer, kronisk tretthetssyndrom, Alzheimers sykdom, Parkinsons sykdom, myokard infarkt, slag, autisme, epilepsi, Arthus ́ fenomen, anafylakse, og alkohol- og stoff-avhengighet. I de over-identifiserte autoimmune tilstandene, er vevet som er angrepet det primære målet, i andre tilfeller er det det sekundære målet. Disse tilstandene er delvis eller for det meste autoimmune syndromer. Derfor, for å behandle dem, er det mulig å anvende de samme fremgangsmåtene, eller aspektene av de samme fremgangsmåtene som er beskrevet heri, noen ganger i kombinasjon med andre fremgangsmåter.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en anvendelse av et anti-TNF-alfa polypeptid i følge den foreliggende oppfinnelsen, eller en nukleinsyre i stand til å kode for ovennevnte polypeptid for fremstillingen av et medikament for å behandle en forstyrrelse som relateres til inflammatoriske prosesser. Eksempler på forstyrrelser inkluderer revmatoid artritt, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, inflammatorisk bowel syndrom og multippel sklerose.
Polypeptider og nukleinsyrer i følge den foreliggende oppfinnelsen kan bli administrert til et subjekt med konvensjonelle ruter, slik som intravenøst. Likevel, en spesiell egenskap hos anti-TNF-alfa polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen er at de penetrerer barrierer slik som vevsmembraner og/eller tumorer og virker lokalt på disse, og de er tilstrekkelig stabile til å motstå ekstreme miljøer slik som i magen. Derfor, relateres et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelsen til leveringen av anti-TNF-alfa polypeptider.
Når Nanobodies og/eller polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen er anvendt for, eller er ment for anvendelse i, forebyggingen eller behandlingen av sykdommer og forstyrrelser i den gastro-intestinale trakten, spesielt med midler av oral administrering eller annen administrering inn i den gastrointestinale trakt, vil det vanligvis ikke være nødvendig å anvende polypeptider av den foreliggende oppfinnelsen som har økt halv-liv i serum (dvs. som har blitt pegylert eller som omfatter et Nanobody rettet mot et serumprotein). Derfor, for slike indikasjoner, kan polypeptider av den foreliggende oppfinnelsen bli anvendt som bare omfatter Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen. Spesielt, har det blitt funnet at for oral administrering for forebyggingen og behandlingen av sykdommer eller forstyrrelser i den gastro-intestinale trakten assosiert med og/eller mediert av TNF-alfa (slik som IBD og de andre sykdommene og forstyrrelsene til den gastro-intestinale trakten nevnt over), kan anvendelsen av et monovalent Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen eller av et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen som essensielt består av et monovalent Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen bli foretrukket. For andre indikasjoner, slik som behandlingen av revmatoid artritt (RA), kan anvendelsen av et bivalent Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen bli foretrukket. Når et slikt Nanobody skal nå sitt mente aksjonssete via blodstrømmen, kan anvendelsen av et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen som har økt halvliv i serum bli foretrukket.
Et subjekt i følge den foreliggende oppfinnelsen kan være et hvilket som helst pattedyr mottagelig for behandling med terapeutiske polypeptider.
Oral levering av anti-TNF-alfa polypeptider av den foreliggende oppfinnelsen resulterer i provisjonen av slike molekyler i en aktiv form i kolon i lokale seter som er rammet av forstyrrelsen. Disse setene kan være sterkt betente og omfatte TNF-alfa-produserende celler. Anti-TNF-alfa polypeptidene av den foreliggende oppfinnelsen som binder til TNF-alfa kan nøytalisere TNF-alfa lokalt, og unngå distribuering gjennom hele kroppen og derfor begrense negative bivirkninger. Genetisk modifiserte mikroorganismer slik som Micrococcus lactis er i stand til å skille ut antistoff eller funksjonelle deler av disse. Slike modifiserte mikroorganismer kan bli anvendt som hjelpemidler for lokal produksjon og levering av antistoffer eller funksjonelle deler av disse i tarmen. Ved å anvende en stamme som produserer et anti-TNF-alfa polypeptid, kunne inflammatorisk bowel syndrom bli behandlet.
Et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelsen involverer levering av anti-TNF polypeptider ved å anvende overflateekspresjon på eller sekresjon fra ikke-invaderende bakterier, slik som Gram-positive vertsorganismer som Lactococcus spec. Ved å anvende en vektor slik som beskrevet i WO00/23471.
En utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri for anvendelse til å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene til forstyrrelser mottakelige for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen som er i stand til å passere gjennom det gastriske miljøet uten at substansen blir inaktivert.
Eksempler på forstyrrelser er en hvilken som helst som fører til inflammasjon, inkludert, men ikke begrenset til revmatoid artritt, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, inflammatorisk bowel syndrom, og multippel sklerose. Som kjent av personer som er dyktige i faget, når først i besittelse av ovennevnte polypeptidkonstrukt, kan formuleringsteknologi bli anvendt for å frigjøre en maksimumsmengde av polypeptid i den rette lokaliteten (i magen, i kolon, osv.). Denne fremgangsmåten for levering er viktig for å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene til forstyrrelser hvis mål er lokalisert i tarmsystemet.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en anvendelse av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri for fremstillingen av et medikament for å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene til forstyrrelser mottakelig for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen som er i stand til å passere gjennom det gastriske miljøet uten å bli inaktivert.
Et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å levere et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen til tarmsystemet uten at ovennevnte substans blir inaktivert, ved oralt å administrere til et subjekt et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri.
Et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å levere et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen til blodstrømmen til et subjekt uten at substansen blir inaktivert, ved oralt å administrere til et subjekt et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri for anvendelse i å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene eller forstyrrelsene mottakelig for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen levert til den vaginale og/eller rektale trakt.
Eksempler på forstyrrelser er en hvilket som helst som fører til inflammasjon, inkludert, men ikke begrenset til revmatoid artritt, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, inflammatorisk bowel syndrom, og multippel sklerose. I et ikkebegrensende eksempel, omfatter en formulering i følge den foreliggende oppfinnelsen et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri, i form av en gele, krem, suppositorie, film, eller i form av en svamp eller som en vaginal ring som langsomt frigjør den aktive ingrediensen over tid (slike formuleringer er beskrevet i EP 707473, EP 684814, US 5629001).
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en anvendelse av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri for fremstillingen av et medikament for å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene til forstyrrelser mottakelig for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen levert til den vaginale og/eller rektale trakt.
Et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å levere et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen til den vaginale og/eller rektale trakt uten at ovennevnte substans blir inaktivert, ved å administrere til den vaginale og/eller rektale trakt til et subjekt et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri.
Et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å levere et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen til blodstrømmen til et subjekt uten at ovennevnte substans blir inaktivert, ved å administrere til den vaginale og/eller rektale trakt til et subjekt et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri, for anvendelse i å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene til forstyrrelser mottakelig for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen levert til nesen, øvre respiratoriske trakt og/eller lunge.
Eksempler på forstyrrelser er en hvilken som helst som fører til inflammasjon, inkludert, men ikke begrenset til revmatoid artritt, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, inflammatorisk bowel syndrom, og multippel sklerose. I et ikkebegrensende eksempel, omfatter en formulering i følge den foreliggende oppfinnelsen, et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri i form av en nesespray (f.eks. en aerosol) eller inhalator. Siden polypeptidkonstruktet er lite, kan det nå målet sitt mye mer effektivt enn terapeutiske IgG molekyler.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en anvendelse av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri for fremstillingen av et medikament for å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene til forstyrrelser mottakelig for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen levert til nesen, øvre respiratoriske trakt og/eller lunge, uten at ovennevnte polypeptid blir inaktivert.
Et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å levere et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen til nesen, øvre respiratoriske trakt og lunge uten inaktivering, ved å administrere til nesen, øvre respiratoriske trakt og/eller lunge til et subjekt et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri.
Et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å levere et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen til blodstrømmen til et subjekt uten inaktivering ved å administrere til nesen, øvre respiratoriske trakt og/eller lunge til et subjekt et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri.
En utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri for anvendelse i å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene til forstyrrelser mottakelig for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen levert til tarmslimhinnen, hvori ovennevnte forstyrrelse øker permeabiliteten til tarmslimhinnen. På grunn av dens lille størrelse, kan et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri passere gjennom tarmslimhinnen og nå blodstrømmen mer effektivt i subjekter som lider av forstyrrelser som fører til en økning i permeabiliteten til tarmslimhinnen, for eksempel Crohns sykdom.
Denne prosessen kan også bli videre forsterket med et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelsen - anvendelsen av aktive transportbærere. I dette aspektet av den foreliggende oppfinnelsen, er VHH fusjonert til en bærer som forsterker overføringen gjennom tarmveggen inn i blodstrømmen. I et ikkebegrensende eksempel, er denne “bæreren” et annet VHH som er fusjonert til det terapeutiske VHH. Slike fusjonskonstrukter er fremstilt ved å anvende fremgangsmåter kjent innen faget. “Bæreren” VHH binder spesifikt til en reseptor på tarmveggen som induserer en aktiv overføring gjennom veggen.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en anvendelse av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri for fremstillingen av et medikament for å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene til forstyrrelser mottakelig for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen levert til tarmslimhinnen, hvori ovennevnte forstyrrelse øker permeabiliteten for tarmslimhinnen.
Et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å levere et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen til tarmslimhinnen uten å bli inaktivert, ved oralt å administrere et anti-TNF-alfa polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen til et subjekt.
Et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å levere et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen til blodstrømmen til et subjekt uten å bli inaktivert, ved å administrere oralt et anti-TNF-alfa polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen til et subjekt.
Denne prosessen kan også bli videre forsterket ved et ytterligere aspekt av den foreliggende oppfinnelsen - anvendelsen av aktive transportbærere. I dette aspektet av den foreliggende oppfinnelsen, er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri fusjonert til en bærer som forsterker overføringen gjennom tarmveggen inn i blodstrømmen. I et ikke-begrensende eksempel, er denne “bæreren” et VHH som er fusjonert til ovennevnte polypeptid. Slike fusjonskonstrukter er fremstilt ved å anvende fremgangsmåter kjent innen faget. “Bærer” VHH ́et binder spesifikt til en reseptor på tarmveggen som induserer en aktiv overføring gjennom veggen.
En utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri for anvendelse i å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene til forstyrrelser mottakelige for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen som effektivt er i stand til å passere gjennom vevet under tungen.
Eksempler på forstyrrelser er hvilke som helst som fører til inflammasjon, inkludert, men ikke begrenset til revmatoid artritt, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, inflammatorisk bowel syndrom, og multippel sklerose. En formulering av ovennevnte polypeptidkonstrukt som beskrevet heri, for eksempel, en tablett, spray, dråpe er plassert under tungen og absorbert gjennom slimhinnemembranene inn i kapillærnettverket under tungen.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en anvendelse av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri for fremstillingen av et medikament for å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene til forstyrrelser mottakelig for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen som er i stand til å passere gjennom vevet under tungen.
Et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å levere et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen til vevet under tungen uten å bli inaktivert, ved å administrere sublinvalt et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri til et subjekt.
Et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å levere et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen til blodstrømmen til et subjekt uten å bli inaktivert, ved å administrere oralt til et subjekt et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri.
En utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri for anvendelse i å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene til forstyrrelser mottakelig for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen som er i stand til å passere effektivt gjennom huden.
Eksempler på forstyrrelser er hvilke som helst som fører til inflammasjon, inkludert, men ikke begrenset til revmatoid artritt, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, inflammatorisk bowel syndrom, og multippel sklerose. En formulering av ovennevnte polypeptidkonstrukt, for eksempel, en krem, film, spray, dråpe, lapp, er plassert på huden og passerer gjennom.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en anvendelse av et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri for fremstillingen av et medikament for å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene til forstyrrelser mottakelig for modulering av et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen som er i stand til å passere effektivt gjennom huden.
Et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å levere et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen til huden uten å bli inaktivert, ved å administrere topisk til et subjekt et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri.
Et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å levere et Nanobody eller polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen til blodstrømmen til et subjekt, ved å administrere topisk til et subjekt et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri.
I en annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, omfatter et anti-TNF-alfa polypeptid videre et bærer Nanobody (f.eks. VHH) som virker som en aktiv transportbærer for transport av ovennevnte anti-TNF-alfa polypeptid, fra lungelumen til blodet.
Et anti-TNF-alfa polypeptid som videre omfatter en bærer binder spesifikt til en reseptor foreliggende på slimhinneoverflaten (bronkiale epitelceller) som resulterer i den aktive transporten av polypeptidet fra lungelumen til blodet. Bærer-Nanobodiet kan bli fusjonert til polypeptidkonstruktet. Slike fusjonskonstrukter kan bli fremstilt ved å anvende fremgangsmåter kjent innen faget og er beskrevet heri. “Bærer”-Nanobodiet binder spesifikt til en reseptor på slimhinneoverflaten som induserer en aktiv overføring gjennom overflaten.
Et annet aspekt av den foreliggende oppfinnelsen er en fremgangsmåte for å bestemme hvilke Nanobodies (f.eks. VHHer) som er aktivt transportert inn i blodstrømmen etter nasal administrering. På lignende måte, kan et naïvt eller immunt VHH fag bibliotek bli administrert nasalt, og etter forskjellige tidspunkter etter administrering, kan blod eller organer bli isolert for å berge fag som har blitt aktivt transportert til blodstrømmen. Et ikke-begrensende eksempel på en reseptor for aktiv transport fra lungelumen til blodstrømmen er Fc reseptoren N (FcRn). Et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen inkluderer VHH molekylene identifisert ved fremgangsmåten. Slike VHH kan så bli anvendt som et bærer VHH for leveringen av et terapeutisk VHH til det korresponderende målet i blodstrømmen etter nasal administrering.
I et aspekt av den foreliggende oppfinnelsen, kan man anvende et anti-TNF-alfa polypeptid som beskrevet heri, for å kunne screene for agenter som modulerer bindingen av polypeptidet til TNF-alfa. Når identifisert i et assay som måler binding eller ovennevnte polypeptid forflytning alene, vil agenter måtte bli gjort til gjenstand for funksjonell testing for å bestemme hvorvidt de ville modulere handlingen til antigenet in vivo.
I et eksempel på et forflytningseksperiment, er fag eller celler som uttrykker TNF-alfa eller et fragment av dette inkubert i bindingsbuffer med polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen som har blitt merket, i nærvær eller fravær av økende konsentrasjoner av en kandidatmodulator. For å validere og kalibrere assayet, kan kontroll konkurransereaksjoner der det anvendes økende konsentrasjoner av ovennevnte polypeptid og som er umerket, bli utført. Etter inkubering, er celler omfattende vasket, og bundet, merket polypeptid er målt som passende for det gitte merket (f.eks., scintilleringstelling, fluorescens, osv.). En nedgang på minst 10% i mengden av merket polypeptid bundet i nærvær av kandidatmodulator indikerer forflytning av binding av kandidatmodulatoren. Kandidatmodulatorer er ansett å binde spesifikt i dette eller andre assayer beskrevet heri hvis de forflytter 50% av merket polypeptid (sub-mettende polypeptiddose) ved en konsentrasjon på 1 μM eller mindre.
Alternativt, kan binding eller forflytting av binding bli monitorert med overflate plasmon resonans (SPR). Overflate plasmon resonans assayer kan bli anvendt som en kvantitativ fremgangsmåte for å måle binding mellom to molekyler ved forandringen i masse nær en immobilisert sensor forårsaket av bindingen eller tapet av binding av polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen fra den vandige fasen til TNF-alfa immobilisert i en membran på sensoren. Denne forandringen i masse er målt som resonansenheter versus tid etter injeksjon eller fjerning av det ovennevnte polypeptid eller kandidatmodulator og er målt ved å anvende en Biacore Biosensor (Biacore AB). TNF-alfa kan for eksempel være immobilisert på en sensor chip (for eksempel, forskningsgrad CM5 chip; Biacore AB) i en tynn lipidmembran film i følge fremgangsmåter beskrevet av Salamon et al. (Salamon et al., 1996, Biophys J.71: 283-294; Salamon et al., 2001, Biophys. J. 80: 1557-1567; Salamon et al., 1999, Trends Biochem. Sci.24: 213-219, som hver er inkorporert heri som referanse.). Sarrio et al. demonstrerte at SPR kan bli anvendt til å detektere ligandbinding til GPCR A(1) adenosin reseptoren immobilisert i et lipidlag på chip ́en (Sarrio et al., 2000, Mol. Cell. Biol.20: 5164-5174, inkorporert heri som referanse). Forhold for bindingen av et polypetid av den foreliggende oppfinnelsen til TNF-alfa i et SPR assay kan bli fin-innstilt av en med ferdighet i faget ved å anvende forholdene rapportert av Sarrio et al. som et startpunkt.
SPR kan assaye for bindingsmoduatorer på minst to måter. Først, kan et polypetid av den foreliggende oppfinnelsen bli pre-bundet til immobilisert TNF-alfa fulgt av injeksjon av kandidatmodulator med en konsentrasjon som rangerer fra 0.1 nM til 1 μM. Forflytting av det bundne polypeptidet kan bli kvantitert, som tillater deteksjon av modulatorbinding. Alternativt, kan det membran-bundne TNF-alfa bli pre-inkubert med en kandidatmodulator og utfordret med polypeptidet av den foreliggende oppfinnelsen. En forskjell i bindingsaffinitet mellom ovennevnte polypeptid og TNF-alfa pre-inkubert med modulatoren, sammenlignet med den mellom ovennevnte polypeptid og TNF-alfa i fravær av modulatoren vil demonstrere binding eller forflytting av ovennevnte polypeptid i nærvær av modulator. I begge assayer, indikerer en nedgang på 10% eller mer i mengden av ovennevnte polypeptid bundet i nærvær av kandidatmodulator, relativt til mengden av ovennevnte polypeptid bundet i fravær av kandidatmodulator at kandidatmodulatoren inhiberer interaksjonen av TNF-alfa og ovennevnte polypeptid.
En annen fremgangsmåte for å detektere inhibering av binding av, for eksempel, et polypetid av den foreliggende oppfinnelsen, til TNF-alfa anvender fluorescens resonans energi overføring (FRET). FRET er et kvantum mekanisk fenomen som forekommer mellom en fluorescens donor (D) og en fluoescens akseptor (A) i tett nærhet til hverandre (vanligvis < 100 Å separasjon) hvis emmisjonsspekteret til D overlapper med eksitasjonsspekteret til A. Molekylene som skal bli testet, f.eks. et polypetid av den foreliggende oppfinnelsen og et TNF-alfa er merket med et komplementært par av donor og akseptor fluoroforer. Mens de er bundet tett sammen av TNF-alfa: polypeptid interaksjon, vil fluorescensen emittert etter eksitering av donor fluoroforen ha en forskjellige bølgelengde fra den emittert i respons til eksitasjonsbølgelengden når det ovennevnte polypeptidet og TNF-alfa ikke er bundet, og fremskaffe for kvantitering av bundne versus ubundne molekyler ved måling av emisjonsintensitet ved hver bølgelengde. Donor fluoroforer som man merker TNF-alfa med er godt kjent i faget. Av spesiell interesse er varianter av A. Victoria GFP kjent som Cyan FP (CFP, Donor (D)) og Gul FP (YFP, Acceptor (A)). Som et eksempel, kan YFP varianten bli fremstilt som et fusjonsprotein med TNF-alfa. Vektorer for uttrykkingen av GFP varianter som fusjonerer (Clontech) så godt som fluorofor-merkede reagenser (Molecular Probes) er kjent i faget. Tilsettingen av en kandidatmodulator til blandingen av fluorescens-merket polypeptid og YFP-TNF-alfa vil resultere i en inhibering av energioverføring bevist ved, for eksempel, en nedgang i YFP fluoescens relativt til en prøve uten kandidatmodulatoren. I et assay der det anvendes FRET for deteksjonen av TNF-alfa: polypeptid interaksjon, indikerer en 10% eller større nedgang i intensiteten av fluorescerende emisjon ved akseptor bølgelengden i prøver som omfatter en kandidatmodulator, relativt til prøver uten kandidatmodulatoren, at kandidatmodulatoren inhiberer TNF-alfa:polypeptid interaksjon.
En prøve som anvendt heri kan være en hvilken som helst biologisk prøve som omfatter TNF-alfa slik som klinisk (f.eks. cellefraksjoner, fullblod, plasma, serum, vev, celler, osv.), avledet fra kliniske, agrikuturelle, tekniske, forsknings, eller andre mulige prøver. De kliniske prøvene kan være fra menneske- eller dyre-herkomst. Prøven analysert kan være av både fast eller flytende natur. Det er åpenbart at når faste materialer anvendes, blir disse først løst opp i en egnet løsning.
En variasjon av FRET anvender fluoescens quenching til å monitorere molekylære interaksjoner. Et molekyl i det interagerende paret kan bli merket med en fluorofor, og det andre med et molekyl som quencher fluorescensen til fluoroforen når bragt i nær plassering med det. En forandring i fluoescens etter eksitasjon er indikativt for en forandring i assosiasjonen av molekylene merket med fluorofor:quencher paret. Generelt, er en økning i fluoescens av det merkede TNF-alfa indikativt at anti-TNF-alfa polypeptid som bærer quencheren har blitt forflyttet. For quenchingsassayer, indikerer en 10% eller større økning i intensiteten av fluorescent emisjon i prøver som omfatter en kandidatmodulator, relativt til prøver uten kandidatmodulatoren, at kandidatmodulatoren inhiberer TNF-alfa: anti-TNF-alfa polypeptidinteraksjon.
I tillegg til overflate plasmon resonansen og FRET fremgangsmåtene, er fluoescens polariseringsmåling nyttig for å kvantitere binding. Fluorescenspolariseringsverdien for et fluorescens-tagget molekyl avhenger av rotasjonskorrelasjonstiden eller virvlingsraten. Komplekser, slik som de dannet ved TNF-alfa som assosierer med et fluorescent merket anti-TNF-alfa polypeptid, har høyere polariseringsverdier enn ukomplekst, merket polypeptid. Inklusjonen av en kandidatinhibitor av TNF-alfa:anti-TNF-alfa polypeptid interaksjonen resulterer i en nedgang i fluoescenspolarisering, relativt til en blanding uten kandidatinhibitoren, hvis kandidatinhibitoren forstyrrer eller inhiberer interaksjonen til TNF-alfa med ovennevnte polypeptid. Fluoescenspolarisering er godt egnet for identifiseringen av små molekyler som forstyrrer dannelsen av TNF-alfa:anti-TNF-alfa polypeptid komplekser. En nedgang på 10% eller mer i fluoescenspolarisering i prøver som omfatter en kandidatmodulator, relativt til fluoescenspolarisering i en prøve som mangler kandidatmodulatoren, indikerer at kandidatmodulatoren inhiberer TNF-alfa : anti-TNF-alfa polypeptidinteraksjonen.
Et annet alternativ for å monitorere TNF-alfa : anti-TNF-alfa polypeptidinteraksjonene anvender et biosensor assay. ICS biosensorer har blitt beskrevet i faget (Australian Membrane Biotechnology Research Institute; Cornell B, Braach-Maksvytis V, King L, Osman P, Raguse B, Wieczorek L, og Pace R. "A biosensor that uses ion-channel switches" Nature 1997, 387, 580). I denne teknologien, er assosiasjonen av TNF-alfa og et anti-TNF-alfa polypeptid koblet til lukkingen av gramacidin-forenklede ionekanaler i opphengte membranbilag og derfor til en målbar forandring i adgangen (likt med impendans) av biosensoren. Denne tilnærmingen er lineær over seks størrelsesordener for adgangsforandring og er ideelt egnet for storskala, høykapasitets screening av små molekyl kombinatoriske biblioteker. En 10% eller større forandring (økning eller minsking) i adgang i en prøve som omfatter en kandidatmodulator, relativt til adgangen for en prøve som mangler kandidatmodulatoren, indikerer at kandidatmodulatoren inhiberer interaksjonen av TNF-alfa og ovennevnte polypeptid. Det er viktig å notere at i assayer som tester interaksjonen av TNF-alfa med et anti-TNF-alfa polypeptid, er det mulig at en modulator av interaksjonen ikke nødvendigvis trenger å interagere direkte med domenet(domenene) til proteinene som fysisk interagerer med ovennevnte polypeptid. Det er også mulig at en modulator vil interagere i en lokalitet som er fjernet fra interaksjonssetet og føre til, for eksempel, en konformasjonell forandring i TNF-alfa. Modulatorer (inhibitorer eller agonister) som virker på denne måten er ikke desto mindre av interesse som agenter for å modulere bindingen av TNF-alfa til sin reseptor.
Et hvilket som helst av bindingsassayene beskrevet kan bli anvendt til å bestemme nærværet av en agent i en prøve, f.eks., en vevsprøve, som binder til TNF-alfa, eller som påvirker bindingen av, for eksempel, et polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen til TNF-alfa. For å gjøre dette er et TNF-alfa reagert med ovennevnte polypeptid i nærvær eller fravær av prøven, og polypeptidbindingen er målt som passende for bindingsassayet som blir anvendt. En nedgang på 10% eller mer i bindingen av ovennevnte polypeptid indikerer at prøven omfatter en agent som modulerer bindingen av ovennevnte polypeptid til TNF-alfa. Selvfølgelig, kunne den over-generaliserte fremgangsmåten lett bli anvendt til å screene for kandidatmodulatorer som forandrer bindingen mellom et hvilket som helst anti-TNF-alfa polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen, en homolog sekvens av dette, en funksjonell del av dette eller en funksjonell del av en homolog sekvens av dette, og TNF-alfa eller et fragment av dette.
En utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en ukjent agent identifisert ved fremgangsmåten beskrevet heri.
En utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en ukjent agent identifisert ved fremgangsmåten beskrevet heri for anvendelsen i å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene til forstyrrelser som relateres til inflammatoriske prosesser.
En annen utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen er en anvendelse av en ukjent agent identifisert ved fremgangsmåten beskrevet heri for anvendelsen i å behandle, forebygge og/eller lindre symptomene til forstyrrelser som relateres til inflammatoriske prosesser.
Eksempler på forstyrrelser inkluderer revmatoid artritt, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, inflammatorisk bowel syndrom og multippel sklerose.
En celle som er nyttig i følge den foreliggende oppfinnelsen er fortrinnsvis selektert fra gruppen som består av bakterieceller slik som, for eksempel, E. coli, gjærceller slik som, for eksempel, S. cerevisiae, P. pastoris, insektceller eller pattedyrceller.
En celle som er nyttig i følge den foreliggende oppfinnelsen kan være en hvilken som helst celle der en nukleinsyresekvens som koder for et polypeptid som omfatter et anti-TNF-alfa av den foreliggende oppfinnelsen, en homolog sekvens derav, en funksjonell del derav eller en funksjonell del av en homolog sekvens derav i følge den foreliggende oppfinnelsen kan bli introdusert inn i slik at polypeptidet er uttrykt på naturlige nivåer eller over naturlige nivåer, som definert heri. Fortrinnsvis utviser et polypetid av den foreliggende oppfinnelsen som er uttrykt i en celle som viser normal eller nær normal farmakologi, som definert heri.
I følge en foretrukket utførelsesform av den foreliggende oppfinnelsen, er en celle selektert fra gruppen som består av COS7-celler, en CHO celle, en LM (TK-) celle, en NIH-3T3 celle, HEK-293 celle, K-562 celle eller en 1321N1 astrocytoma celle men også andre transfekterbare cellelinjer.
Generelt, menes “terapeutisk effektiv mengde”, “terapeutisk effektive dose” og “effektiv mengde” mengden som trengs for å oppnå det ønskede resultatet eller resultatene (å modulere TNF-alfa binding; behandle eller forebygge inflammasjon). En med ordinære ferdigheter i faget vil anerkjenne at kraften og, derfor, en “effektive mengde” kan variere for de forsjellige forbindelsene som modulerer TNF-alfa binding anvendt i den foreliggende oppfinnelsen. En som er dyktig i faget kan lett vurdere kraften til forbindelsen.
Som anvendt heri, refererer termen "forbindelse" til et anti-TNF-alfa polypeptid av den foreliggende oppfinnelsen, en sammensetning, eller en nukleinsyre som er i stand til å kode for ovennevnte polypeptid eller en agent identifisert i følge screenings fremgangsmåten beskrevet heri eller ovennevnte polypeptid som omfatter en eller flere derivatiserte aminosyrer.
Med “farmasøytisk akseptabel” er det ment et materiale som ikke er biologisk eller på annen måte uønskverdig, dvs., materialet kan bli administrert til et individ sammen med forbindelsen uten å føre til noen uønskverdige biologiske effekter eller interagere på en fordervelig måte med noen av de andre komponentene av den farmasøytiske sammensetningen som den er omfattet med.
Anti-TNF-alfa polypeptider som beskrevet heri er nyttige for å behandle eller forebygge tilstander i et subjekt og omfatter å administrere en farmasøytisk effektiv mengde av en forbindelse eller sammensetning.
Anti-TNF polypeptider av den foreliggende oppfinnelsen er nyttig for å behandle eller forebygge tilstander som relateres til revmatoid artritt, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, inflammatorisk bowel syndrom og multippel sklerose i et subjekt og omfatter å administrere en farmasøytisk effektiv mengde av en forbindelse eller sammensetning som binder TNF-alfa.
Anti-TNF-alfa polypeptider som beskrevet heri er nyttig for å behandle eller forebygge tilstander i et subjekt og omfatter å administrere en farmasøytisk effektiv mengde av en forbindelsekombinasjon med en annen, slik som, for eksempel, aspirin.
Anti-TNF-alfa polypeptidene som beskrevet heri er nyttig for å behandle eller forebygge tilstander som relateres til revmatoid artritt, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, inflammatorisk bowel syndrom og multippel sklerose i et subjekt og omfatter å administrere en farmasøytisk effektiv mengde av en forbindelsekombinasjon med en annen, slik som, for eksempel, aspirin.
Den foreliggende oppfinnelsen er ikke begrenset til administreringen av formuleringer som omfatter en enkelt forbindelse av den foreliggende oppfinnelsen. Det er innen rekkevidden av den foreliggende oppfinnelsen å fremskaffe kombinasjonsbehandlinger hvori en formulering er administrert til en pasient med behov for det som omfatter mer enn en forbindelse av den foreliggende oppfinnelsen.
Tilstander mediert av TNF-alfa inkluderer, men er ikke begrenset til revmatoid artritt, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt, inflammatorisk bowel syndrom og multippel sklerose.
En forbindelse som er nyttig i den foreliggende oppfinnelsen kan bli formulert som farmasøytiske sammensetninger og administrert til en pattedyrvert, slik som en menneskepasient eller et husdyr i forskjellige former tilpasset til den valgte administrasjonsruten, dvs., oralt eller parenteralt, ved intranasalt ved inhalasjon, intravenøse, intramuskulære, topiske eller subkutane ruter.
En forbindelse av den foreliggende oppfinnelsen kan også bli administrert ved å anvende genterapi fremgangsmåter for levering. Se, f.eks., U.S. Patent No.
5,399,346, som er inkorporert som referanse i sin helhet. Ved å anvende en genterapifremgangsmåte for levering, kan primære celler transfektert med genet for forbindelsen av den foreliggende oppfinnelsen i tilegg bli transfektert med vevsspesifikke promotere til målspesifikke organer, vev, transplantert vev, tumorer, eller celler.
Således, kan den foreliggende forbindelsen bli systemisk administrert, f.eks., oralt, i kombinasjon med et farmasøytisk akseptabelt hjelpemiddel slik som et inaktivt fortynningsmiddel eller en fordøyelig spiselig bærer. De kan bli omgitt i harde eller myke skall gelatin kapsler, kan bli presset sammen til tabletter, eller kan bli inkorporert direkte med maten i pasientens diett. For oral terapeutisk administrering, kan den aktive forbindelsen bli kombinert med en eller flere eksipienter og anvendt i form av svelgbare tabletter, kinntabletter, pastiller, kapsler, eliksirer, suspensjoner, sirup, vafler, og dets like. Slike sammensetninger og fremstillinger bør omfatte minst 0.1% av aktiv forbindelse. Prosenten av sammensetningene og fremstillingene kan, selvfølgelig, bli variert og kan beleilig være mellom omtrent 2 til omtrent 60% av vekten av en gitt enhets doseform. Mengden av aktiv forbindelse i slike terapeutisk nyttige sammensetninger er slik at et effektivt dosenivå vil bli ervervet.
Tablettene, pastillene, pillene, kapslene, og dets like kan også omfatte det følgende: bindere slik som gummi tragant, akasie, maisstivelse eller gelatin; eksipienter slik som dikalsium fosfat; et disintegrerende middel slik som maisstivelse, potetstivelse, alginat og dets like; et smøremiddel slik som magnesium stearat; og et søtningsmiddel slik som sukrose, fruktose, laktose eller aspartam eller et smaksmiddel slik som peppermint, vintergrønnolje, eller kirsebærsmak kan bli tilsatt. Når enhets doseformen er en kapsel, kan den omfatte, i tillegg til materialer av typen over, en flytende bærer, slik som en vegetabilsk olje eller en polyetylen glykol. Forskjellige andre materialer kan være foreliggende som dekke eller for å på annen måte modifisere den fysiske formen av den faste enhets doseformen. For eksempel, kan tabletter, piller, eller kapsler bli dekket med gelatin, voks, skjellakk eller sukker og dets like. En sirup eller eliksir kan omfatte den aktive forbindelsen, sukrose eller fruktose som et søtningsmiddel, metyl og propylparabener som konserveringsmidler, en farge og smakstilsetning slik som kirsebær eller appelsinsmak. Selvfølgelig, et hvilket som helst materiale anvendt ved fremstilling av en hvilket som helst enhets doseform skulle være farmasøytisk akseptabel og vesentlig ikke-toksisk i mengdene anvendt. I tillegg, kan den aktive forbindelsen bli inkorporert inn i vedvarendefrigjøringsfremstillinger og planer.
Den aktive forbindelsen kan også bli administrert intravenøst eller intraperitonalt ved infusjon eller injeksjon. Løsninger av den aktive forbindelsen eller dens salter kan bli fremstilt i vann, valgfritt blandet med en ikke-toksisk surfaktant. Dispersjoner kan også bli fremstilt i glycerol, flytende polyetylen glykoler, triacetin, og blandinger av disse og i oljer. Under ordinære lagrings- og anvendelses-tilstander, omfatter disse fremstillingene et konserveringsmiddel for å forebygge veksten av mikroorganismer.
De farmasøytiske doseringsformene egnet for injeksjon eller infusjon kan inkludere sterile vandige løsninger eller dispersjoner eller sterile pulvere som omfatter den aktive ingrediensen som er tilpasset for den improviserte fremstillingen av sterile injiserbare eller infuserbare løsninger eller dispersjoner, valgfritt innkapslet i liposomer. I alle tilfeller, må den ultimate doseringsformen være steril, flytende og stabil under fremstillings- og lagrings-forhold. Den flytende bæreren eller hjelpemiddelet kan være et solvent eller flytende dispersjonsmedium som omfatter, for eksempel, vann, etanol, et polyol (for eksempel, glycerol, propylen glykol, flytende polyetylen glykoler, og dets like), vegetabilske oljer, ikke-toksiske glyceryl estere, og egnede blandinger derav. Den riktige fluiditet kan bli opprettholdt, for eksempel, ved dannelsen av liposomer, ved opprettholdelsen av den krevede partikkelstørrelsen i tilfellet med dispersjoner eller ved anvendelsen av surfaktanter. Forebyggingen av virkningen av mikroorganismer kan bli medført omtrent med forskjellige antibakterielle og antisopp midler, for eksempel, parabener, klorobutanol, fenol, sorbat, timerosal, og dets like. I mange tilfeller, vil det være foretrukket å inkluderer isotone agenter, for eksempel, sukkere, buffere eller natriumklorid. Forlenget absorbsjon av de injiserbare sammensetningene kan medføres omtrent ved anvendelsen av midler som forsinker absorbsjon, for eksempel, aluminium monostearat og gelatin i sammensetningene.
Sterile injiserbare løsninger er fremstilt ved å inkorporere den aktive forbindelsen i den forlangte mengden i det passende løsningsmiddelet med flere av de andre ingrediensene nevnt over, som krevet, fulgt av filtersterilisering. I tilfellet med sterile pulvere for fremstillingen av sterile injiserbare løsninger, er de foretrukne fremgangsmåtene for fremstilling vacuumtørkings- og frysetørkingsteknikkene, som gir et pulver av den aktive ingrediensen pluss en hvilken som helst annen ønsket ingrediens foreliggende i de tidligere steril-filtrerte løsningene.
For topisk administrering, kan den foreliggende forbindelsen bli anvendt i ren form, dvs., når de er flytende. Likevel, vil det generelt være ønskverdig å administrere dem til huden som sammensetninger eller formuleringer, i kombinasjon med en dermatologisk akseptabel bærer, som kan være et fast stoff eller en væske.
Nyttige faste bærere inkluderer fint oppdelte faste stoffer slik som talkum, leire, mikrokrystallin cellulose, silica, alumina og dets like. Nyttige væskebærere inkluderer vann, hydroksyalkyler eller glykoler eller vann-alkohol/glykol blandinger, der den foreliggende forbindelsen kan bli løst opp eller spredt på effektive nivåer, valgfritt med hjelp av ikke-toksiske surfaktanter. Adjuvanser slik som dufter og andre antimikrobielle midler kan bli tilsatt for å optimalisere egenskapene for en gitt anvendelse. De resulterende væskesammensetningene kan bli anvendt fra absorberende puter, anvendt til å impregnere bandasjer og andre påkledninger, eller sprayet på det rammede området ved å anvende pumpe-type eller aerosol sprayer.
Fortykningsmidler slik som syntetiske polymerer, fettsyrer, fettsyresalter og estere, fettholdige alkoholer, modifiserte celluloser eller modifiserte mineralmaterialer kan også bli anvendt med væskebærere for å danne utspredbare pastaer, geler, salver, såper, og dets like, for bruk direkte på huden av brukeren.
Eksempler på nyttige dermatologiske sammensetninger som kan bli anvendt til å levere forbindelsen til huden er kjent i faget; for eksempel, se Jacquet et al. (U.S. Pat. No.4,608,392), Geria (U.S. Pat. No. 4,992,478), Smith et al. (U.S. Pat. No.4,559,157) og Wortzman (U.S. Pat. No.4,820,508).
Nyttige doseringer av forbindelsen kan bli bestemt ved å sammenligne deres in vitro aktivitet, og in vivo aktivitet i dyremodeller. Fremgangsmåter for ekstrapoleringen av effektive doseringer i mus, og andre dyr, til mennesker er kjent i faget; for eksempel, se U.S. Pat. No.4,938,949.
Generelt, vil konsentrasjonen av forbindelsen(forbindelsene) i en flytende sammensetning, slik som en lotion, være fra omtrent 0.1-25 wt-%, fortrinnsvis fra omtrent 0.5-10 wt-%. Konsentrasjonen i halv-fast eller fast sammensetning slik som en gel eller et pulver vil være omtrent 0.1-5 wt-%, fortrinnsvis omtrent 0.5-2.5 wt-%.
Mengden av forbindelsen, eller et aktiv salt eller derivativ derav, krevet for anvendelse i behandling vil variere ikke bare med det spesielle saltet selektert men også med administrasjonsruten, naturen til tilstanden som blir behandlet og alderen og tilstanden til pasienten og vil til slutt være ved skjønnet til den tjenestegjørende legen eller klinikeren. Doseringen av forbindelsen varierer også avhengig av målcellen, tumoren, vevet, det transplanterte vevet eller organet.
Den ønskede dosen kan beleilig bli presentert i en enkelt dose eller som oppdelte doser administrert med passende intervaller, for eksempel, som to, tre, fire eller flere under-doser per dag. Under-dosen selv kan videre bli delt opp, f.eks., til et antall av atskilte løst fordelte administreringer; slik som mangfoldige inhalasjoner fra en innblåser eller ved anvendelse av et flertall av dråper inn i øyet.
En administreringskur kunne inkludere lang-tids, daglig behandling. Ved “lang-tids” er det ment minst to uker og fortrinnsvis, flere uker, måneder, eller års varighet. Nødvendige modifikasjoner i denne doseringsrekkevidden kan bli bestemt av en med ordinær dyktighet i faget som bare anvender rutineeksperimentering gitt undervisningen heri. Se Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed.4), Mack Publishing Co., Easton, PA. Doseringen kan også bli justert av den individuelle legen i tilfelle av en hvilken som helst komplikasjon.
Den foreliggende oppfinnelsen fremskaffer for et middel som er en modulator av TNF-alfa / TNF-alfa-reseptor interaksjoner.
Kandidatmiddelet kan være et syntetisk middel, eller en blanding av midler, eller kan være et naturlig produkt (f.eks. et planteekstrakt eller kultursupernatant). Et kandidatmiddel i følge den foreliggende oppfinnelsen inkluderer et lite molekyl som kan bli syntetisert, et naturlig ekstrakt, peptider, proteiner, karbohydrater, lipider osv.
Kandidatmodulatormidler fra store biblioteker av syntetiske eller naturlige midler kan bli screenet. Tallrike midler er for tiden anvendt for tilfeldig og kontrollert syntese av sakkarid, peptid, og nukleinsyrebaserte agenter. Syntetiske middelbiblioteker er kommersielt tilgjengelige fra et antall selskaper inkludert Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH), og Microsource (New Milford, CT). Et sjeldent kjemisk bibliotek er tilgjengelig fra Aldrich (Milwaukee, WI). Kombinatoriske biblioteker er tilgjengelige og kan bli fremstilt. Alternativt, er biblioteker av naturlige midler i form av bakterie-, sopp-, plante- og dyreekstrakter tilgjengelige fra f.eks., Pan Laboratories (Bothell, WA) eller MycoSearch (NC), eller er lett produserbare med fremgangsmåter godt kjent i faget. I tillegg, er naturlige og syntetiske produserte biblioteker og midler lett modifisert gjennom konvensjonelle kjemiske, fysiske, og biokjemiske midler.
Nyttige midler kan bli funnet innen mange kjemiske klasser. Nyttige midler kan være organiske midler, eller små organiske midler. Små organiske midler har en molekylærvekt på mer enn 50 likevel mindre enn omtrent 2,500 daltons, fortrinnsvis mindre enn omtrent 750, mer foretrukket mindre enn omtrent 350 daltons. Eksemplariske klasser inkluderer heterosykler, peptider, sakkarider, steroider, og dets like. Midlene kan bli modifisert for å forsterke effekten, stabiliteten, farmasøytiske kompatibiliteten, og dets like. Strukturell identifisering av et middel kan bli anvendt til å identifisere, generere, eller screene andre midler. For eksempel, hvor peptidmidler er identifisert, kan de bli modifisert på mange måter for å forsterke deres stabilitet, slik som ved å anvende en unaturlig aminosyre, slik som en D-aminosyre, spesielt D-alanine ved å funksjonalisere amino eller karboksyl terminal ende, f.eks. for aminogruppen, acylering eller alkylering, og for karboksylgruppen, esterifisering eller amidifisering, eller dets like.
For primær screening, er en nyttig konsentrasjon av et kandidatmiddel i følge den foreliggende oppfinnelsen fra omtrent 10 mM til omtrent 100 μM eller mer (dvs. 1 mM, 10 mM, 100 mM, 1 M osv.). Den primære screeningskonsentrasjonen vil bli anvendt som en øvre grense, sammen med ni andre konsentrasjoner, hvori de andre konsentrasjonene er bestemt ved å redusere den primære screeningskonsentrasjonen med halv-log intervaller (f.eks. for 9 flere konsentrasjoner) for sekundære screens eller for å generere konsentrasjonskurver.
Et høykapasitets screeningkit i følge den foreliggende oppfinnelsen omfatter alle de nødvendige midler og media for å utføre deteksjonen av en agent som modulerer TNF-alfa/TNF-alfa reseptorinteraksjoner ved å interagere med TNF-alfa i nærvær av et polypeptid, fortrinnsvis med en konsentrasjon i området 1μM til 1 mM.
Kitet omfatter det følgende. Rekombinante celler av den foreliggende oppfinnelsen, som omfatter og uttrykker nukleotidesekvensen som koder for TNF-alfa, som er dyrket i følge kitet på et fast underlag, slik som en mikrotiter plate, mer foretrukket en 96 brønners mikrotiter plate, i følge fremgangsmåter godt kjent for personen som er dyktig i faget spesielt som beskrevet i WO 00/02045. Alternativt kommer TNF-alfa i en renset form for å bli immobilisert på, for eksempel, en 96 brønners mikrotiterplate av personen med dyktighet i faget. Alternativt kommer TNF-alfa i kitet pre-immobilisert på, for eksempel, en 96 brønners mikrotiter plate. TNF-alfa kan være hele TNF-alfa eller et fragment av dette.
Modulatormidler i følge den foreliggende oppfinnelsen, ved konsentrasjoner fra omtrent 1 μM til 1 mM eller mer, er tilsatt til definerte brønner i nærvær av en passende konsentrasjon av anti-TNF-alfa polypeptid, en homolog sekvens av dette, en funksjonell del derav eller en funksjonell del av en homolog sekvens derav, ovennevnte konsentrasjon av ovennevnte polypeptid fortrinnsvis i området 1 μM til 1 mM. Kit kan omfatte et eller flere anti-TNF-alfa polypeptider av den foreliggende oppfinnelsen.
Bindingsassayer er utført som i følge fremgangsmåtene allerede beskrevet heri og resultatene er sammenlignet med grunnivået av, for eksempel TNF-alfa binding til et anti-TNF-alfa polypeptid, en homolog sekvens derav, en funksjonell del derav eller en funksjonell del av en homolog sekvens derav, men i fravær av tilsatt modulatormiddel. Brønner som viser minst 2 ganger, fortrinnsvis 5 ganger, mer foretrukket 10 ganger og mest foretrukket en 100 ganger eller mer økning eller minking i TNF-alfa-polypeptidbindingen (for eksempel) som sammenlignet med aktivitetsnivået i fravær av modulator, er selektert for videre analyse.
Den foreliggende oppfinnelsen fremskaffer for andre kit nyttig for screening for modulatorer av TNF-alfa/TNF-alfa reseptorbinding, så vel som kit nyttige for diagnose av forstyrrelser karakterisert ved funksjonsforstyrrelse av TNF-alfa. Den foreliggende oppfinnelsen fremskaffer også kit nyttige for screening for modulatorer for forstyrrelser så vel som kit for deres diagnose, ovennevnte forstyrrelser karakterisert av en eller flere prosesser som involverer TNF-alfa. Kit som er nyttige i følge den foreliggende oppfinnelsen kan inkludere en isolert TNF-alfa. Alternativt, eller i tillegg, kan et kit omfatte celler transformert til å uttrykke TNF-alfa. I en videre utførelsesform, kan et kit i følge den foreliggende oppfinnelsen omfatte et polynukleotid som koder for TNF-alfa. I enda en videre utførelsesform, kan et kit i følge den foreliggende oppfinnelsen omfatte de spesifikke primerene som er nyttige for amplifisering av TNF-alfa. Kit som er nyttige i følge den foreliggende oppfinnelsen kan omfatte et isolert TNF-alfa polypeptid, en homolog derav, eller en funksjonell del derav. Et kit i følge den foreliggende oppfinnelsen kan omfatte celler transformert til å uttrykke ovennevnte polypeptid. Kit kan omfatte mer enn ett polypeptid. I en videre utførelsesform, kan et kit i følge den foreliggende oppfinnelsen omfatte et polynukleotid som koder for TNF-alfa . I enda en videre utførelsesform, kan et kit i følge den foreliggende oppfinnelsen omfatte de spesifikke primerene som er nyttige for amplifisering av et makromolekyl slik som, for eksempel, TNF-alfa. Alle kit i følge den foreliggende oppfinnelsen vil følgelig omfatte de oppgitte artiklene eller kombinasjoner av artikler og pakkingsmaterialer. Kit vil også inkludere instruksjoner for anvendelse.
Videre, vil det også være klart for den faglærte person at det kan være mulig å “transplantere” en eller flere av CDR’ene nevnt over for Nanobodiest av den foreliggende oppfinnelsen inn i andre “skafotter”, inkludert men ikke begrenset til humane skafotter eller ikke-immunoglobulin skafotter. Egnede skafotter og teknikker for slik CDR transplantering vil være klart for den faglærte person og er godt kjent i faget, se for eksempel US-A-7,180,370, WO 01/27160, EP 0 605 522, EP 0460 167, US-A-7,054,297, Nicaise et al., Protein Science (2004), 13:1882-1891; Ewert et al., Methods, 2004 Oct; 34(2):184-199; Kettleborough et al., Protein Eng. 1991 Oct; 4(7): 773-783; O’Brien og Jones, Methods Mol. Biol. 2003: 207: 81-100; og Skerra, J. Mol. Recognit. 2000: 13: 167-187, og Saerens et al., J. Mol. Biol. 2005 Sep 23;352(3):597-607, og de videre referansene sitert deri. For eksempel, kan teknikker kjent per se for å transplantere mus eller rotte CDR’er inn i menneske rammeverker og skafotter bli anvendt på en analog måte for å fremskaffe kimere proteiner som omfatter en eller flere av CDR’ene av Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen og en eller humane rammeverk regioner eller sekvenser.
Derfor, i en annen utførelsesform, omfatter den foreliggende oppfinnelsen et kimert polypeptid som omfatter minst en CDR sekvens valgt fra gruppen som består av CDR1 sekvenser, CDR2 sekvenser og CDR3 sekvenser nevnt heri for Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen. Fortrinnsvis, omfatter et slik kimert polypeptid minst en CDR sekvens valgt fra gruppen som består av CDR3 sekvensene nevnt heri for Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, og valgfritt også minst en CDR sekvens valgt fra gruppen som består av CDR1 sekvensene og CDR2 sekvensene nevnt heri for Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen. For eksempel, kan et slikt kimert polypeptid omfatte en CDR sekvens valgt fra gruppen som består av CDR3 sekvensene nevnt heri for Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, en CDR sekvens valgt fra gruppen som består av CDR1 sekvensene nevnt heri for Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen og en CDR sekvens valgt fra gruppen som består av CDR1 sekvensene og CDR2 sekvensene nevnt heri for Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen. Kombinasjonene av CDR’er som er nevnt heri som å bli foretrukket for Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen vil vanligvis også bli foretrukket for disse kimere polypeptidene.
I ovennevnte kimere polypeptider, kan CDR’ene bli forbundet til videre aminosyresekvenser og/eller kan bli forbundet til hverandre via aminosyresekvenser, der ovennevnte aminosyresekvenser fortrinnsvis er rammeverksekvenser eller er aminosyresekvenser som fungerer som rammeverksekvenser, eller sammen danner et skafott for å presentere CDR’ene. Det er igjen referert til det tidligere faget nevnt i den siste paragrafen. I følge en foretrukket utførelsesform, er aminosyresekvensene humane rammeverksekvenser, for eksempel VH3 rammeverksekvenser. Likevel, kan ikkehumane, syntetiske, semi-syntetiske eller ikke-immunoglobulin rammeverksekvenser også bli anvendt. Fortrinnsvis, er rammeverksekvensene anvendt slik at (1) det kimere polypeptidet er i stand til å binde xxxx, dvs. med en affinitet som er minst 1%, fortrinnsvis minst 5%, mer foretrukket minst 10%, slik som minst 25% og opp til 50% eller 90% eller mer av affiniteten til det korresponderende Nanobodiet av den foreliggende oppfinnelsen; (2) det kimere polypeptidet er egnet for farmasøytisk anvendelse; og (3) det kimere polypeptidet er fortrinnsvis essensielt ikke-immunogent under de mente tilstander for farmasøytisk anvendelse (dvs. indikasjon, administreringsmåte, dose og behandlingskur) derav (som kan være essensielt analogt til tilstandene beskrevet heri for anvendelsen av Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen).
I følge en ikke-begrensende utførelsesform, omfatter det kimere polypeptidet minst to CDR sekvenser (som nevnt over) forbundet via minst en rammeverksekvens, der fortrinnsvis minst en av de to CDR sekvensene er en CDR3 sekvens, med den andre CDR sekvensen som er en CDR1 eller CDR2 sekvens. I følge en foretrukket, men ikke-begrensende utførelsesform, omfatter det kimere polypeptidet minst to CDR sekvenser (som nevnt over) forbundet minst to rammeverksekvenser, der fortrinnsvis minst en av de tre CDR sekvensene er en CDR3 sekvens, med de andre to CDR sekvensene som er CDR1 eller CDR2 sekvenser, og fortrinnsvis som er en CDR1 sekvens og en CDR2 sekvens. I følge en spesielt foretrukket, men ikke-begrensende utførelsesform, har de kimere polypeptidene strukturen FR1’ - CDR1 - FR2’ -CDR2 - FR3’ - CDR3 - FR4’, der CDR1, CDR2 og CDR3 er som definert heri for CDR’ene av Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, og FR1’, FR2’, FR3’ og FR4’ er rammeverksekvenser. FR1’, FR2’, FR3’ og FR4’ kan spesielt være Rammeverk 1, Rammeverk 2, Rammeverk 3 og Rammeverk 4 sekvenser, respektivt, av et humant antistoff (slik som VH3 sekvenser) og/eller deler eller fragmenter av slike Rammeverksekvenser. Det er også mulig å anvende deler eller fragmenter av et kimert polypeptid med strukturen FR1’ - CDR1 - FR2’ -CDR2 - FR3’ - CDR3 - FR4. Fortrinnsvis, er slike deler eller fragmenter slik at de møter kriteriet satt ut i den foregående paragrafen.
Den foreliggende oppfinnelsen relateres også til proteiner og polypeptider som omfatter og/eller essensielt består av slike kimere polypeptider, til nukleinsyrer som koder for slike proteiner eller polypeptider; til fremgangsmåter for å fremstille slike proteiner og polypeptider; til vertsceller som uttrykker eller er i stand til å uttrykke slike proteiner eller polypeptider; til sammensetninger, og spesielt til farmasøytiske sammensetninger, som omfatter slike proteiner eller polypeptider, nukleinsyrer eller vertsceller; og til anvendelser av slike proteiner eller polypeptider, slike nukleinsyrer, slike vertsceller og/eller slike sammensetninger, spesielt for profylaktiske, terapeutiske eller diagnostiske formål, slik som de profylaktiske, terapeutiske eller diagnostiske formål nevnt heri. For eksempel, kan slike proteiner, polypeptider, nukleinsyrer, fremgangsmåter, vertsceller, sammensetninger og anvendelser være analoge til proteinene, polypeptidene, nukleinsyrene, fremgangsmåtene, vertscellene, sammensetningene og anvendelsen beskrevet heri for Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen.
Det skulle også bli notert at, når Nanobodies av de foreliggende oppfinnelsene inneholder en eller flere andre CDR sekvenser enn de foretrukne CDR sekvensene nevnt over, kan disse CDR sekvensene være hvilke som helst egnede (dvs. egnet for formålet beskrevet heri) CDR sekvenser og/eller disse CDR sekvensene kan bli ervervet på en hvilken som helst måte kjent per se, for eksempel fra Nanobodies (foretrukket), VH domener fra konvensjonelle antistoffer (og spesielt fra humane antistoffer), tungkjede antistoffer, konvensjonelle 4-kjede antistoffer (slik som konvensjonelle humane 4-kjede antistoffer) eller andre immunoglobulinsekvenser rettet mot TNF. Slike immunoglobulinsekvenser rettet mot xxxx kan bli generert på en hvilken som helst måte kjent per se, som vil være klart for den faglærte person, dvs. ved immunisering med TNF eller ved å screene et egnet bibliotek av immunoglobulinsekvenser med TNF, eller en hvilken som helst egnet kombinasjon derav. Valgfritt, kan dette bli fulgt av teknikker slik som tilfeldig eller sete-rettet mutagenese og/eller andre teknikker for affinitetsmodning kjent per se. Egnede teknikker for å generere slike immunoglobulinsekvenser vil være klart for den faglærte person, og for eksempel inkludere screeningteknikkene gjennomgått av Hoogenboom, Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005). Andre teknikker for å generere immunoglobuliner mot et spesifisert mål inkluderer for eksempel Nanoklonteknologien (som for eksempel beskrevet i den ikke-prepubliserte US provisoriske patentsøknaden 60/648,922), såkalt SLAM teknologi (som for eksempel beskrevet i den Europeiske patentsøknaden 0 542 810), anvendelsen av transgene mus som uttrykker humane immunoglobuliner eller de vel-kjente hybridomateknikkene (se for eksempel Larrick et al, Biotechnology, Vol. 7, 1989, p. 934). Alle disse teknikkene kan bli anvendt til å generere immunoglobuliner mot TNF, og CDR’ene fra slike immunoglobuliner kan bli anvendt i Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen, dvs. som oppsummert over. For eksempel, kan sekvensen av et slikt CDR bli bestemt, syntetisert og/eller isolert, og inserted; inn i sekvensen til et Nanobody av den foreliggende oppfinnelsen (f. eks. for slik å erstatte det korresponderende naturlige CDR), der alle anvender teknikker kjent per se slik som de beskrevet heri, eller Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen som omfatter slike CDR’er (eller nukleinsyrer som koder for det samme) kan bli syntetised de novo, der det igjen anvendes teknikkene nevnt heri.
Den foreliggende oppfinnelsen vil nå videre bli beskrevet ved hjelp av de følgende ikke-begrensende eksemplene og figurene, der Figurene viser:
Monovalente TNFα Nanobodies
Figur 1 : Sekvensinnretting av humane TNFa Nanobodies
Figur 2: Sekvensinnretting av serum albumin spesifikke TNFa Nanobodies Figur 3: Binding av albumin spesifikke TNFa Nanobodies til humant serum albumin
Figur 4: Binding av albuminspesifikke TNFa Nanobodies til rhesus serum albumin
Figur 5: Binding av albuminspesifikke TNFa Nanobodies til mus serum albumin Figur 6: Renhet av TNFa og serum albumin Nanobodies (SDS-PAGE) Figur 7: Western Blot analyse av TNFa og serum albumin Nanobodies Figur 8: Binding av TNFa Nanobodies til humant TNFa (ELISA)
Figur 9: Binding av TNFa Nanobodies til rhesus TNFa (ELISA)
Figur 10: Reseptor-inhiberingsassay på Enbrel for humant TNFa
Figur 11 : Reseptor-inhiberingsassay på Enbrel for rhesus TNFa
Figur 12: Binding av TNFa Nanobodies til humant TNFa (Biacore)
Figur 13: Binding av TNFa Nanobodies til rhesus TNFa (Biacore)
Figur 14: Binding av TNFa Nanobodies til Protein A (Biacore)
Figur 15: Temperaturbehandling av TNFa og serum albumin Nanobodies (Western Blot)
Figur 16: Stabilitet: temperaturbehandling av TNFa Nanobodies (ELISA) Figur 17: Temperaturbehandling av serum albumin Nanobodies (Biacore) Bivalente TNFα Nanobodies
Figur 18: Renhet av bivalente TNFa Nanobodies (SDS-PAGE)
Figur 19: Western Blot analyse av bivalente TNFa Nanobodies
Figur 20: Reseptor-inhiberingsassay på Enbrel for bivalente TNFa Nanobodies Figur 21 : Stabilitet: temperaturbehandling av bivalente TNFa Nanobodies (ELISA)
Flumaniserte monovalente TNFα Nanobodies
Figur 22: Multippel sekvensinnretting av TNF1 humaniserte Nanobodies Figur 23: Multippel sekvensinnretting av TNF2 humaniserte Nanobodies Figur 24: Multippel sekvensinnretting av TNF3 humaniserte Nanobodies Figur 25: Multippel sekvensinnretting av ALB1 humaniserte Nanobodies Figur 26: Renhet av humaniserte TNFa og serum albumin Nanobodies (SDS-PAGE)
Figur 27: Western Blot analyse av humaniserte TNFa og serum albumin Nanobodies
Figur 28: Binding av humaniserte TNFa Nanobodies til humant TNFa
Figur 29: Binding av humaniserte serum albumin Nanobodies til humant serum albumin
Figur 30: Stabilitet: temperaturbehandling av humaniserte TNFa Nanobodies (ELISA)
Trivalente TNFα Nanobodies
Figur 31 : Renhet av trivalente TNFa Nanobodies (SDS-PAGE)
Figur 32: Western Blot analyse av trivalente TNFa Nanobodies
Figur 33: Stabilitet: temperaturbehandling av trivalente TNFa Nanobodies (ELISA)
Humaniserte monovalente TNFa Nanobodies (andre runde)
Figur 34: Multippel sekvensinnretting av TNF1 humaniserte Nanobodies Figur 35: Multippel sekvensinnretting av TNF2 humaniserte Nanobodies Figur 36: Multippel sekvensinnretting av TNF3 humaniserte Nanobodies Figur 37: Multippel sekvensinnretting av ALB1 humaniserte Nanobodies Figur 38: Renhet av humaniserte TNFa Nanobodies (SDS-PAGE)
Figur 39: Western Blot analyse av humaniserte TNFa Nanobodies
Figur 40: Binding av humaniserte TNFa Nanobodies til humant TNFa
Figur 41 : Stabilitet: temperaturbehandling av humaniserte TNFa Nanobodies (ELISA)
Figur 42: Analyse av renset TNF60 på Sølvfarget SDS-PAGE gel (A) Coomassiefarget SDS-PAGE gel (B) og i Western blot analyse ved å anvende anti-NB (C) for deteksjon
Figur 43: Krom atog ram av analytisk størrelseekslusjon av TNF60 på Superdex HR75
Figur 44: Binding av TNF60 til humant TNF-alfa
Figur 45: Doseresponskurve ervervet i cytotoksisitetsassay med humant TNF-alfa ved å anvende Nanobody™ TNF60 sammenlignet med Enbrel (Etanercept), Humira (Adalimumab) og Remicade (Infliximab)
Figur 46: Doseresponskurve ervervet i cytotoksisitetsassay med rhesus TNFa ved å anvende Nanobody™ TNF60 sammenlignet med Enbrel (Etanercept), Humira (Adalimumab) og Remicade (Infliximab)
Figur 47: Farmakokinetisk profil av TNF60 i mus
Figur 48: Immunogenitetsprofil av TNF60 i mus
Figur 49: Analyse av renset TNF56-PEG40, TNF56-PEG60, TNF56-biotin, TNF55-PEG40, TNF55-PEG60 og TNF55-biotin på Coomassiefarget SDS-PAGE gel
Figur 50: Analyse av renset TNF56-PEG40 på SDS-PAGE gel ved å anvende Sølvfarge (A) Coomassiefarge (B) og i Western blot analyse ved å anvende anti-NB (C) for deteksjon
Figur 51: Kromatogram av analytisk størrelseekslusjon av TNF56-PEG40 på Superdex HR 75
Figur 52: Kromatogram av analytisk størrelseekslusjon av TNF56-PEG40 på Superdex HR 200
Figur 53: Doseresponskurve ervervet i cytotoksisitetsassay med humant TNFa ved å anvende Nanobody™ TNF56-PEG40 og det monovalente vill-type Nanobody™ TNF1 sammenlignet med Enbrel (Etanercept), Humira (Adalimumab) og Remicade (Infliximab)
Figur 54: Doseresponskurve ervervet i cytotoksisitetsassay med rhesus TNFa ved å anvende Nanobody™ TNF56-PEG40 sammenlignet med Enbrel (Etanercept), Humira (Adalimumab) og Remicade (Infliximab)
Figur 55: Farmakokinetisk analyse av pegylert bivalent Nanobody™ TNF56-PEG40 og TNF56-PEG60 etter intravenøs administrering i mus
Figur 56: Farmakokinetisk analyse av pegylert bivalent Nanobody™ 3E-3E-PEG20, pegylert bivalent Nanobody™ 3E-3E-PEG40 og bispesifikt Nanobody™ 3E-3E-AR1 etter intravenøs administrering i mus
Figur 57: Immunogenitetsprofil av TNF56-PEG40 og TNF56-PEG60 i mus Figur 58: Effekt av TNF60 i forebyggingen av kronisk polyartritt i mus
Figur 59: Effekt av TNF60 i terapeutisk behandling av kronisk polyartritt i mus Figur 60: Effekt av TNF60 Nanobody™ formatering på effekt i forebyggingen av kronisk polyartritt i mus
Figur 61 : Sekvensinnretting av Nanobodies™ PMP1C2, 3E, 1A og 3G Figur 62: Molekylær modell av TNF-60
De tilføyde Tabellene danner en integral del av den foreliggende spesifikasjonen og er som følgende:
Monovalente TNFα Nanobodies
Tabell 8: Sekvens opplisting av TNFa Nanobodies
Tabell 9: Koff verdier av humane TNFa Nanobodies
Tabell 10: Homologi av TNFa og serum albumin Nanobodies til humane kimlinje sekvenser
Tabell 11 : Ekspresjonsnivåer av TNFa og serum albumin Nanobodies Tabell 12: ELISA binding til humant og rhesus TNFa
Tabell 13: Reseptor-inhiberingsassay av TNFa Nanobodies
Table14: Biacore analyse av TNFa Nanobodies
Tabell 15: Binding av TNFa Nanobodies til TNFa (KD-verdier)
Tabell 16: Potens av TNFa Nanobodies til å nøytralisere humant (a) og rhesus (b) TNFa
Tabell 17: OD280nm av TNFa og serum albumin Nanobodies etter temperaturbehandling
Tabell 18: Potens av TNFa Nanobodies etter temperaturbehandling Bivalente TNFa Nanobodies
Tabell 19: Sekvens opplisting av bivalente TNFa Nanobodies og linkersekvenser Tabell 20: Bivalente TNFa Nanobody konstrukter
Tabell 21 : Ekspresjonsnivåer av bivalente TNFa Nanobodies
Tabell 22: Reseptor-inhiberingsassay av bivalente TNFa Nanobodies Tabell 23: Potens av TNFa Nanobodies for å nøytalisere humant (a) og rhesus (b) TNFa
Tabell 24: OD280nm av bivalente TNFa Nanobodies
Flumaniserte monovalente TNFa Nanobodies
Tabell 25: Sekvens opplisting av humaniserte monovalente TNFa og serum albumin Nanobodies
Tabell 26: Ekspresjonsnivåer av humaniserte TNFa og serum albumin Nanobodies
Tabell 27: Potens av TNFa Nanobodies til å nøytralisere humant TNFa Tabell 28: OD280nm av humaniserte TNFa og serum albumin Nanobodies Trivalente TNFa Nanobodies
Tabell 29: Sekvens opplisting av trivalente TNFa Nanobodies
Tabell 30: Trivalente TNFa Nanobody konstrukter
Tabell 31 : Ekspresjonsnivåer av trivalente TNFa Nanobodies
Tabell 32: Potens av trivalente TNFa Nanobodies til å nøytralisere humant TNFa Tabell 33: Binding av trivalente Nanobodies til serum albumin (KD-verdier) Tabell 34: OD280nm av trivalente TNFa Nanobodies
Humaniserte monovalente TNFa Nanobodies (andre runde)
Tabell 35: Sekvens opplisting av andre runde humaniserte monovalente TNFa Nanobodies
Tabell 36: Ekspresjonsnivåer av humaniserte TNFa Nanobodies
Tabell 37: Potens av TNFa Nanobodies til å nøytralisere humant TNFa Tabell 38: OD280nm av humaniserte TNFa Nanobodies
Tabell 39: Sammenligning av bio-aktivitet av Nanobodies
Videre tabeller
Tabell 40: Oversikt over oligonukleotider anvendt i formatering av trivalente Nanobodies™
Tabell 41 : Oversikt over oligonukleotider anvendt i kloning av trivalente Nanobodies™
Tabell 42: EC50 verdier ervervet i cytotoksisitetsassay ved å anvende trivalent Nanobody™ TNF60 sammenlignet med kommersielle kontroller (Enbrel, Remicade, Humira)
Tabell 43: Affinitetsbestemmelse av TNF60 og TNF24 på humant serum albumin i Biacore. Nd, ikke bestemt.
Tabell 44: Oversikt over oligonukleotider anvendt i formatering av bivalente Nanobodies™
Tabell 45: EC50 verdier ervervet i cytotoksisitetsassay ved å anvende bivalente Nanobodies™ sammenlignet med kommersielle kontroller (Enbrel, Remicade, Flumira)
Tabell 46: Resultater av synovium avledete fibroblast studier
Tabell 47: Resultater av murine luftposestudier
EKSEMPLER
Eksempel 1: Identifisering av TNFa og serum albumin spesifikke Nanobodies
Antagonistiske Nanobodies ble identifisert ved å anvende to lamaer (Llama glama) immunisert med humant TNFa med 6 injeksjoner med 100 μg av cytokinet ved ukentlige intervaller. Screening ble utført ved å anvende et konkurransebasert assay, der individuelle Nanobodies ble analysert for deres evne til å inhibere binding av merket TNFa til sin reseptor. De albuminspesifikke Nanobodies ble identifisert fra en lama immunisert med humant serum albumin. Screening av individuelle Nanobodies ble utført med ELISA ved å anvende humant, rhesus og mus albumin, som gir et panel av Nanobodies som kryssreagerer med serum albuminet til forskjellige arter.
Eksempel 2: Sekvensanalyse av isolerte Nanobodies
Forskjellige klasser av Nanobodies ble identifisert basert på sekvensanalyse (Figur 1) ved å anvende en BLOSUM62 skåringsmathks og en likhets signifikantverdi cut-off på > 60%: Klasse I (PMP1 C2, PMP1 G11, PMP1 H6), Klasse II (PMP1 G5, PMP1 H2, PMP3 G2), Klasse Mb (PMP1 D2), Klasse III (PMP3 D10, PMP5 F10). Tabell 8 lister opp sekvensene til disse TNFa Nanobodies (SEQ ID NOs: 52 to 60).
Basert på sekvensanalyse (Figur 2) ble forskjellige klasser av serum albumin Nanobodies identifisert ved å anvende BLOSUM62 skåringsmatriksen og en likhets signifikansverdi cut-off på > 60%. Tabell 8 lister opp sekvensene til disse serum albumin Nanobodies (SEQ ID NOs: 61 to 67).
Eksempel 3: Biacore analyse
TNFa
Binding av Nanobodies til TNFa ble karakterisert med overflate plasmon resonans i et Biacore 3000 instrument. TNF fra forskjellige arter ble kovalent bundet til CM5 sensor chips overflate via aminkobling inntil en økning på 250 responsenheter ble nådd. Gjenværende reaktive grupper ble inaktivert. Nanobodybinding ble vurdert ved en konsentrasjon (1 til 1 ,000 fortynnet). Hvert Nanobody ble injisert i 4 minutter med en flytrate på 45 μl/min for å tillate binding til chip-bundet antigen. Bindingsbuffer uten Nanobody ble sendt over chip'en med den samme flowraten for å tillate spontan dissosiering av bundet Nanobody i 4 timer. Kof-verdier ble beregnet fra sensorgrammene ervervet for de forskjellige Nanobodies.
For hver klasse av Nanobodies ble urensede proteiner analysert i Biacore. Koff data er listed opp i Tabell 9.
Representative Nanobodies fra hver klasse ble bevart for videre analyse basert på koff verdi. For Klasse I ble PMP1C2 (TNF1) valgt; PMP1G5 (TNF2) ble valgt som representant for Klasse II; PMP5F10 (TNF3) ble valgt som representant for Klasse III.
Serum albumin
Binding ble assayet som beskrevet over unntatt at 1 til 20 fortynninger ble anvendt. Figurer 3, 4 og 5 illustrerer screening av albuminspesifikke TNFa Nanobodies versus humant, rhesus og mus serum albumin ved å anvende urenset protein.
Nanobodies er rangert i følge kof-verdier, se Tabell III under:
Tabell III
Den beste koff ble ervervet for medlemmer av familie C og familie B. Kryssreaktivitet mellom mus, humane og rhesus serum albumin ble også observert for medlemmer av disse familiene. Et representativt Nanobody fra klasse B og C ble definert for videre analyse: PMP6A6 (ALB1) ble valgt som representant for Klasse B og PMP6A8 (ALB2) ble valgt som representant for Klasse C.
Eksempel 4: Kloning av monovalente Nanobodies i pAX051
Beskrivelse av Escherichia coli ekspresjonsvektor
pAX051 er et derivat av pUC19. Det omfatter LacZ promoteren som gjør det mulig for en kontrollert induksjon av ekspresjon ved å anvende IPTG. Vektoren har et resistensgen for Ampicillin eller Carbenicillin. Multikloningssetene huser flere restriksjonsseter der SfiI og BstEII ofte er anvendt for kloning av Nanobodies™. I ramme med den NB kodende sekvensen koder vektoren for en C-terminal c-myc tag og en (His)6 tag. Signalpeptidet er gen3 ledersekvensen som translokerer det uttrykte Nanobodiet™ til periplasmaen.
DNA ́et som koder for de selekterte Nanobodies TNF1 (PMP1C2), TNF2 (PMP1G5), TNF3 (PMP5F10), ALB1 (PMP6A6) og ALB2 (PMP6A8) ble klonet i pAX051 og konstruktet ble transformert til TG1 elektrokompetente celler. Kloner ble analysert for PCR insert og nukleotidesekvensen ble bestemt fra 4 positive kloner. Glycerol stamløsninger ble fremstilt fra kloner som omfattet den korrekte sekvensen og lagret ved -80ºC.
Eksempel 5: Ekspresjon av monovalente Nanobodies
En forkultur ble started ved å inokulere en enkeltkoloni av klonen som uttrykker de respektive Nanobodies ved 37°C i Luria Buljong, Ampicillin/Carbenicillin (100μg/ml) og 2% glukose overnatt. Denne forkulturen ble anvendt til å inokulere. Inokulum er 1 % prosent (v/v) av produksjonskulturen (TB medium Ampicillin/Carbenicillin 0.1% Glukose). Produksjonskulturen er dyrket ved 37°C inntil en OD600nm på 5-10 er nådd og Nanobodyekspresjon er indusert ved å tilsette IPTG (1mM sluttkonsentrasjon). Proteinekspresjon er tillatt å fortsette enten i 4 timer ved 37°C eller overnatt ved 28°C, hvor på det punktet celler er samlet inn ved sentrifugering og lagret som våt cellepasta ved -20°C.
Preparative periplasmiske ekstrakter av den -20°C lagrede våte cellepastaen er fremstilt ved å resuspendere pelleten i Peri-buffer (50mM NaH2P04, 300mM NaCI, justert pH til 8.0), rotere blandingen i 30min ved 4°C og sentrifugere blandingen ved å anvende en preparativ sentrifuge (Sorvall RC-3C Plus med H-6000A rotor) for å pelletere cellene. Supernatant, som representerer et grovt ekstrakt av det periplasm iske rom, er samlet inn for videre rensing.
De His(6)-taggede Nanobodies er renset på Immobilisert Metall Affinitet Kromatografi (IMAC). TALON res i net (Clontech) er prosessert i følge produsentens instruksjoner. Ekstraktene er inkubert med resinet i 30 min ved RT i en rotor. Resinet er vasket med PBS og overført til en kolonne. Det pakkede resinet er vasket med 15 mM Imidazole. Nanobodies er eluert fra kolonnen ved å anvende 150 mM Imidazole. De eluerte fraksjonene er analysert ved spotting på Hybond Membran og visualisering med Ponceau. Fraksjoner som omfatter protein er poolet og dialysert mot PBS. Dialyserte proteiner er samlet inn, filtersterilisert, konsentrasjon bestemt og lagret i alikvoter ved -20°C.
Karakterisering av monovalente TNFa Nanobodies
Eksempel 6: Homologi til humane kimlinje sekvenser
Nanobody am inosyresekvensene ble sammenlignet med de humane kimlinje sekvensene som representert i Tabell 10. I rekkefølge av homologi til humane sekvenser rangerer Nanobodies som følgende: TNF1 > TNF2 > TNF3 for TNFa Nanobodies ; ALB1 > ALB2 for serum albumin Nanobodies.
Eksempel 7: Ekspresjonsnivå
Ekspresjonsnivåer ble beregnet og representert i Tabell 11. I rekkefølge av utbytte rangerer Nanobodies som følgende: TNF1>TNF2>TNF3 for TNFa Nanobodies ; ALB1 > ALB2 for serum albumin Nanobodies.
Eksempel 8: SDS-Page analyse
For å bestemme renheten, ble proteinprøver analysert på en 15% SDS-PAGE gel. 10μΙ Laemmli prøvebuffer ble tilsatt til 10μΙ (1ug) renset protein, prøven ble varmet i 10 minutter ved 95°C, kjølt ned og lastet på en 15% SDS-PAGE gel. Gelen ble prosessert i følge generelle prosedyrer og farget med Coomassie Brilliant Blue (CBB). Figur 6 representerer SDS-PAGE for de TNFaspesifikke og serum album in-spesifikke Nanobodies.
Eksempel 9: Western Blot analyse
100 ng av renset protein ble lastet på gelen. Etter SDS-PAGE, ble proteiner overført til en nitrocellulosemembran ved å anvende Mini Trans-Blot<® >Electrophoretic T ransfer Cell (Biorad). Membranen ble blokkert overnatt i PBS, 1% kasein ved 4°C.
Ettersom alle konstrukter ble fusjonert til c-myc tag, ble mus monoklonalt antimyc antistoff anvendt som et deteksjonsverktøy. I tillegg, ble kanin polyklonalt anti-Nanobody (R23) anvendt som et deteksjonsverktøy. Blottet ble inkubert i 1 time ved romtemperatur med risting i 1/2000 fortynnet anti-myc antistoff i PBS eller 1/2000 anti-Nanobody antistoff i PBS , 1% kasein. Membranen ble vasket 5 ganger i PBS før det sekundære antistoffet ble anvendt (kanin-anti-mus IgG alkalisk fosfatase konjugat, Sigma, A1902, fortynnet 1/1000 i PBS eller geit antikanin IgG alkalisk fosfatase konjugat, Sigma, A8025, 1% kasein). Etter inkubering med forsiktig risting i 1 time ved romtemperatur, ble membranen vasket 5 ganger i PBS. Blots ble fremkalt ved å anvende BCIP/NBT løsninger og reaksjonen ble stoppet ved å vaske blottet med rnilliQ vann når bånd var klart synlige. Figur 7 representerer Western Blot analysen.
Eksempel 10: ELISA binding til humant og rhesus TNFa
En ELISA ble utført for å undersøke binding til humant og rhesus TNFa. En 96-brønners Maxisorp plate ble coatet med 2 μg/ml Neutravidin i PBS ON ved 4°C. Plater ble blokkert med 1 % kasein i 2 timer ved RT. Biotinylert TNFa (400 ng/ml) ble tilsatt til brønnene og inkubert i 1 time ved RT. Nanobodyprøver ble fortynnet ved å starte med 2 pg/ml og ved å anvende 1 til 3 fortynninger. Nanobodies ble detektert ved å anvende mus anti-myc (1/2000 fortynnet) og kanin anti-mus alkalisk fosfatase (1/2000 fortynnet, Sigma, A1902) og pNPP (2mg/ml) som substrat. Figurer 9 og 10 respresenterer bindingen i ELISA til humant og rhesus TNFa.
Resultater er oppsummert i Tabell 12. TNF1 og TNF3 viser binding til både humant og rhesus TNFa. TNF2 er binding til humant TNFa men er bare svakt reaktiv for rhesus TNFa.
Eksempel 11: Reseptor-Inhiberingsassay
Evnen til å inhibere reseptor-ligand interaksjon ble analysert for rhesus og humant TNFa. En 96-brønners Maxisorp plate ble coatet med 2 μg/ml Enbrel i PBS ON ved 4°C . Plater ble blokkert med 1 % Kase in i 2 timer ved RT. Nanobodyprøver ble pre-inkubert i 30 min ved RT med biotinylert TNFa (10ng/ml) som startet med en konsentrasjon på 5 pg/ml og ved å anvende 1 til 2 fortynninger. Prøver ble tilsatt til platene og inkubert i 1 time ved RT. Biotinylert TNFa ble detektert ved å anvende Extravidin alkalisk fosfatase (1/2000 fortynnet) og pNPP (2mg/ml) som substrat. Figurer 11 og 12 representerer en inhiberings ELISA for humant og rhesus TNFa. Resultater er oppsummert i Tabell 13. Inhibering av ligand/reseptor binding er observert for TNF1 og TNF3 for både humant og rhesus TNF, mens TNF2 bare inhiberer humant TNFa.
Eksempel 12: Biacore analyse
TNFα binding
Analysen ble utført som beskrevet i Eksempel 3. Figurer 13 og 14 illustrerer bindingen til humant og rhesus TNFa via Biacore analyse. Resultater er oppsummert i Tabell 14. Bindingseksperimenter i Biacore bekrefter ELISA resultatene: kryss-reaktiv binding for TNF1 og TNF3, mens TNF2 bare signifikant binder humant TNFa.
Serum albumin
Binding ble assayet som beskrevet over unntatt at serier av forskjellige konsentrasjoner ble anvendt. Hver konsentrasjon ble injisert i 4 minutter med en flytrate på 45 μl/min for å tillate binding til chip-bundet antigen. Bindingsbuffer uten analytt ble sendt over chip'en med den samme flytraten for å tillate dissosiering av bundet Nanobody. Etter 15 minutter, ble gjenværende bundet analytt fjernet ved injeksjon av regenereringsløsning (25 mM NaOH).
Fra sensorgrammene ervervet for de forskjellige konsentrasjonene for hver analytt ble KD-verdier beregnet via fast tilstand affinitet når equilibrium ble nådd.
Resultater er oppsummert i Tabell 15. Kryss-reaktivitet er observert for både ALB1 og ALB2. Den høyeste affiniteten er observert for ALB2 på humant og rhesus TNFa. Likevel, forskjellen i affinitet for humant/rhesus versus mus serum albumin er mer uttalt for ALB2 (faktor 400), mens for ALB1 er en forskjell med en faktor 12 observert.
Eksempel 13: Bio-assay
Den TNFa sensitive mus fibroblast cellelinje L929s ble anvendt for å måle anti-TNFa aktiviteten til de selekterte Nanobodies. Ved en tilstrekkelig høy konsentrasjon av TNFa i mediet, dvs. cytotoksisk dose, gjennomgår L929s cellene nekrose. Inhiberingen av TNFa interaksjon med dens reseptor ble bestemt ved å pre-inkubere en serie av antistofffortynninger med en cytotoksisk konsentrasjon av TNFa før blandingen ble tilsatt til cellene. Nærværet av actinomycin D i mediet sensiterer cellene videre til TNFa, som resulterer i økt sensitivitet av bioassayet for fritt TNFa.
L929 cellene ble dyrket til nesten konfluitet, platet ut i 96-brønners mikrotiterplater med 5000 celler per brønn og inkubert overnatt. Actinomycin D ble tilsatt til cellene med en sluttkonsentrasjon på 1 μg/ml. Seriefortynninger av Nanobodies som skulle bli testet ble blandet med en cytotoksisk konsentrasjon av TNFa (endelig assaykonsentrasjon er 0.5 ng/ml eller 15 IU/ml). Etter minst 30 minutter med inkubering ved 37°C, ble denne blandingen tilsatt til de platede cellene. Plater ble inkubert i 24 timer ved 37°C og 5% CO2. Celleviabilitet ble bestemt ved anvendelse av tetrazoliumsaltet WST-1. Dose-respons kurver og EC50 verdier ble beregnet med Graphpad Prism.
Resultatene er oppsummert i Tabell 16 for humant og rhesus TNFa. Basert på deres kraft til å nøytralisere cytotoksisk aktivitet, er molekylene rangert som følgende: TNF3>TNF1>TNF2 for humant TNFa, og TNF1 = TNF3 > TNF2 for rhesus TNFa.
Eksempel 14: Protein A binding
Figur 14 representerer Protein A binding analysert i Biacore som beskrevet i Eksempel 12. Positiv binding ble ervervet for TNF1 , TNF2, ALB1. Ingen eller svak binding ble observert for TNF3 og ALB2.
Eksempel 15: T emperatu rstabi I itet
Prøver ble fortynnet til 200 μg/ml og delt i 8 alikvoter som inneholdt 500 pl. De forskjellige rørene ble inkubert hver ved en gitt temperatur rangert fra RT til 90°C. Etter behandling ble prøvene kjølt ned i 2 timer ved RT, de ble holdt ved 4°C. Presipitater ble fjernet ved sentrifugering i 30 min ved 14,000 rpm. SN ble forsiktig fjernet og videre analysert.
QD280nm
OD ved 280 nm ble målt og konsentrasjonen ble beregnet. Resultater er oppsummert i Tabell 17. En nedgang i proteininnhold ble observert for TNF2 og TNF3 som starter ved 80°C, mens for ALB2 er en nedgang observert som starter fra 70° C.
Western Blot
2 μg av behandlet protein ble separert på en 15% SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran og behandlet som beskrevet over. Deteksjon ble utført ved å anvende polyklonalt anti-Nanobody (R23, 1/2000 fortynnet) og antikanin hestereddik peroksidase (DAKO, P0448, 1/2000 fortynnet). Figur 15 representerer Western Blot analysen. Et klart dropp i proteinkonsentrasjon ble observert for ALB2 behandlet ved 70, 80 og 90°C. Aggregering ble fortsatt observert for TNF1 behandlet ved 70, 80 og 90°C; for TNF3 behandlet ved 90°C; for ALB1 behandlet ved 90°C, som betyr at SN'et fortsatt inneholder spor av presipitater som resulterer i en høyere OD280nm avlesning. Dette forklarer hvorfor proteinkonsentrasjonen som målt ved OD280nm ikke minker for TNF1 , TNF3 og ALB1 behandlet ved disse høyere T'ene.
ELISA ELISA'en til å detektere binding til humant TNFa ble essensielt utført som beskrevet i Eksempel 10. Resultater er presentert i Figur 16. Human TNFa binding er minsket for TNF1 , TNF2, TNF3 som starter ved 80°C.
Bio-assay
Bio-assayet ble utført som beskrevet i Eksempel 13. Resultatene er oppsummert i Tabell 18. Nanobodiesnes potens er minsket for TNF1 som starter ved 70°C; for TNF2 og TNF3 som starter ved 80°C.
Biacore
Binding til humant serum albumin ble bestemt som beskrevet i Eksempel 12. En fiksert konsentrasjon ble anvendt (1 til 50 fortynnet). Resultater er presentert i Figur 17. Temperaturbehandling påvirker ikke binding til serum albumin for ALB1. Behandlingen har en effekt på kon for ALB2 som starter fra T=70°C.
Bivalente Nanobodies
Eksempel 16: Formatering av bivalente TNFa spesifikke Nanobodies TNF1 , TNF2 og TNF3 ble formatert til bivalente Nanobodies. Som spacer mellom de to byggeblokkene ble enten en 9AA GlySer linker (Tabell 19 SEQ ID No: 68) eller en 30 AA GlySer linker (Tabell 19 SEQ ID No: 69) anvendt. Dette genererte konstruktene representert av Tabell 20. Tabell 19 lister opp sekvensene til disse bivalente TNFa Nanobodies (SEQ ID NOs: 70 to 75).
Eksempel 17: Ekspresjon av bivalente TNFa spesifikke Nanobodies Ekspresjon ble utført som beskrevet i Eksempel 5. De His(6)-taggede Nanobodies ble renset på Immobilisert Metall Affinitets Kromatografi (IMAC). Ni-NTA resinet (Qiagen) ble prosessert i følge produsentens instruksjoner. Ekstraktene ble inkubert med resinet og inkubert i 30 min ved RT på en rotor. Resinet ble vasket med PBS og overført til en kolonne. Det pakkede resinet ble vasket med PBS (1 til 10 fortynnet). Kolonnen ble pre-eluert med 15 mM Imidazole. Nanobodies ble eluert fra kolonnen ved å anvende 25 mM Citrat pH=4. De eluerte fraksjonene ble analysert ved spotting på Hybond Membran og ved visualisering med Ponceau. Fraksjoner som inneholdt protein ble poolet og videre renset på Cation utbytting etterfulgt av størrelseekslusjon. Rensede proteiner ble samlet inn, filtersterilisert, konsentrasjon bestemt og lagret i alikvoter ved -20°C.
Karakterisering av bivalente TNFa spesifikke Nanobodies
Eksempel 18: Ekspresjonsnivå
Ekspresjonsnivåer til de bivalente TNFa Nanobodies ble beregnet og representert i Tabell 21. Linkeren har ingen signifikant effekt på ekspresjonsnivået til Nanobodies.
Eksempel 19: SDS-PAGE
SDS-Page ble utført som beskrevet i Eksempel 8. Figur 18 viser resultatet av SDS-Page'en.
Eksempel 20: Western Blot
Western Blot analyse ble utført som beskrevet i Eksempel 9. Figur 19 representerer Western Blot resultatene.
Eksempel 21: Reseptor-Inhiberingsassay
Assayet ble utført som beskrevet i Eksempel 11. Figur 20 og Tabell 22 representerer resultatene. Forsterkning av inhibering av ligand/reseptor binding ble observert for alle bivalente Nanobodies sammenlignet med det monovalente formatet.
Eksempel 22: Bio-assay
Assayet ble utført som beskrevet i Eksempel 13. Resultater er oppsummert i Tabell 23. Basert på deres potens til å nøytralisere cytotoksisk aktivitet har TNF8, TNF7, TNF9 og TNF5 en potens i området til Enbrel.
Eksempel 23: Temperaturstabilitet
Prøver ble analysert som beskrevet i Eksempel 15.
OD280 nm
OD ved 280 nm ble målt og konsentrasjonen ble beregnet. Resultater er oppsummert i Tabell 24. En nedgang i proteininnhold ble observert for TNF4 og TNF7 som starter ved 70°C, mens for TNF5, TNF6, TNF8 og TNF9 ble en nedgang observert som starter fra 80°C.
Western Blot
Prøver ble analysert for nærværet av aggregater som beskrevet i Eksempel 15.
ELISA ELISA'en til å detektere binding til humant TNFa ble essensielt utført som beskrevet over. Resultater er presentert i Figur 21 . Human TNFa binding ble minsket for TNF5, TNF6, TNF8 og TNF9 som starter ved 80°C, forTNF4 og TNF7 som starter fra 70°C.
Humaniserte monovalente Nanobodies
Eksempel 24: Identifisering av ikke-humane aminosyreposisjoner i TNFa og serum albumin spesifikke Nanobodies
Figur 22 (TNF1 ), Figur 23 (TNF2), Figur 24 (TNF3) og Figur 25 (ALB1 ) representerer mangfoldige sekvensinnrettinger (Clustal W 1 .7) med DP51 , DP53, DP54 og DP29 sekvenser.
I tillegg til aminosyremutasjonene, ble kodonoptimalisering utført som gir sekvensene i Tabell 25 SEQ ID NOs: 76 til 89 (Nanobodies mot TNF-alfa og humant serum albumin, respektivt).
Eksempel 25: Generering av kodonoptimaliserte mutanter Oligonukleotider ble syntetisert som strakk seg over hele sekvensen til Nanobodies.
Eksempel 26: Ekspresjon av bivalente TNFa spesifikke Nanobodies Ekspresjon ble utført som beskrevet i Eksempel 5.
Karakterisering av humanisert Nanobody
Eksempel 27: Ekspresjonsnivå
Tabell 26 representerer beregnede ekspresjonsnivåer. Ekspresjon ble oppnådd med utbytter i området 3.5-11.7 mg/ml. Induksjonstid påvirket ikke utbyttet.
Eksempel 28: SDS-PAGE
SDS-PAGE ble utført som beskrevet i Eksempel 8. Figur 26 representerer SDS-PAGE gelen.
Eksempel 29: Western Blot
Western Blot analyse ble utført som beskrevet i Eksempel 9. Figur 27 representerer Western Blot resultatene.
Eksempel 30: Bio-assay
Assayet ble utført som beskrevet i Eksempel 13.
Resultatene av de humaniserte Nanobodies er oppsummert i Tabell 27. Villtype Nanobodies er inkludert som referanse.
Eksempel 31: Biacore
Analysen ble utført som beskrevet i Eksempel 12. Figur 28 og 31 viser Biacore resultater.
Eksempel 32: Temperaturstabilitet
Prøver ble analysert som beskrevet i Eksempel 15.
OD280 nm
OD ved 280 nm ble målt og konsentrasjonen ble beregnet. Resultater er oppsummert i Tabell 28.
Ingen signifikant nedgang i proteinkonsentrasjon er observert for de humaniserte TNF1 Nanobodies (TNF13-14). En nedgang i proteinkonsentrasjon er observert for humaniserte TNF2 (TNF15-19) og TNF3 (TNF20-23) som starter ved 80ºC. En nedgang i proteinkonsentrasjon er observert for humanisert ALB1 (ALB4-5) som starter ved 70°C og for ALB3 som starter ved 60°C.
Western Blot
Prøver ble analysert for nærværet av aggregater som beskrevet i Eksempel 15.
ELISA ELISA'en til å detektere binding til humant TNFa ble essensielt utført som beskrevet i Eksempel 15. Resultater er presentert i Figur 30.
Human TNFa binding er sammenlignbar for temperaturbehandlet WT TNF1 og de humaniserte TNF13 og 14; for temperaturbehandlet WT TNF2 og de humaniserte TNF15-19; er humant TNFa binding minsket for TNF21 og 22, og i en mindre grad for TNF23, mens ingen effekt er observert for TNF20 sammenlignet med det temperaturbehandlede WT TNF3.
Trivalente TNFa Nanobodies
Eksempel 33: Formatering av trivalente TNFa spesifikke Nanobodies TNF1 , TNF2, TNF3 og ALB1 ble formatert til trivalente Nanobodies. Som spacer mellom 2 byggeblokker ble enten en 9AA GlySer linker (Tabell 19 SEQ ID No 68) eller en 30 AA GlySer linker (Tabell 19 SEQ ID No 69) anvendt. Dette genererte konstruktene til Tabell 30. Tabell 29 lister opp sekvensene til trivalente TNFa Nanobodies (SEQ ID NOs: 91 til 94).
Eksempel 34: Ekspresjon av trivalent TNFa spesifikt Nanobody Ekspresjon ble utført som beskrevet i Eksempel 5. De His(6)-taggede Nanobodies er renset på Immobilisert Metall Affinitets Kromatografi (IMAC). Ni-NTA resinet (Qiagen) er prosessert i følge produsentens instruksjoner. Ekstraktene er inkubert med resinet og inkubert i 30 min ved RT på en rotor. Resinet er vasket med PBS og overført til en kolonne. Det pakkede resinet er vasket med PBS (1 til 10 fortynnet). Pre-eluert med 15 mM Imidazole. Nanobodies er eluert fra kolonnen ved å anvende 25 mM Citrat pH=4. De eluerte fraksjonene er analysert ved spotting på Hybond Membran og visualisering med Ponceau. Fraksjoner som inneholder protein er poolet og videre renset på Kation utbytting etterfulgt av stø rrel seeks lusj on. Rensede proteiner er samlet inn, filtersterilisert, konsentrasjon bestemt og lagret i alikvoter ved -20°C.
Karakterisering av trivalente TNFa/SA spesifikke Nanobodies Eksempel 35: Ekspresjonsnivå
Ekspresjonsnivåer ble beregnet og representert i Tabell 31.
Eksempel 36: SDS-PAGE analyse
SDS-PAGE ble utført som beskrevet i Eksempel 8. Figur 31 representerer SDS-PAGE gelen.
Eksempel 37: Western Blot analyse
Western Blot analyse ble utført som beskrevet i Eksempel 9. Figur 32 representerer Western Blot analysen.
Eksempel 38: Bio-assay
Assayet ble utført som beskrevet i Eksempel 13.
Resultatene av de bivalente Nanobodies er oppsummert i Tabell 32. Basert på deres potens til å nøytralisere cytotoksisk aktivitet, er molekylene like potente og sammenlignbare med deres potens som bivalente molekyler.
Eksempel 39: Binding til Humant serum albumin
Binding ble assayet som beskrevet over unntatt at serier av forskjellige konsentrasjoner ble anvendt. Fiver konsentrasjon ble injisert i 4 minutter med en flytrate på 45 μΙ/min for å tillate binding til chip-bundet antigen. Deretter, ble bindingsbuffer uten analytt sendt over chip<'>en med den samme flytraten for å tillate dissosiering av bundet Nanobody. Etter 15 minutter, ble gjenværende bundet analytt fjernet ved injeksjon av regenereringsløsningen (25 mM NaOH).
Fra sensorgrammene ervervet for de forskjellige konsentrasjonene av hver analytt ble KD-verdier beregnet via fast form affinitet når likevekt ble nådd.
Resultater er oppsummert i Tabell 33. En minskning i affinitet ble observert for den formaterte ALB1 binder sammenlignet med villtype ALB1. Affiniteten er likevel fortsatt i området av 7.2-14 nM.
Eksempel 40: Temperaturstabilitet
Prøver ble analysert som beskrevet i Eksempel 15.
OD280 nm
OD ved 280 nm ble målt og konsentrasjonen ble beregnet. Resultater er oppsummert i Tabell 34. En minsking i proteininnhold er observert for TNF24, TNF27 og TNF28 som starter ved 60°C, mens for TNF25 og TNF26 som starter fra 70° C.
Western Blot
Prøver ble analysert for nærværet av aggregater som beskrevet i Eksempel 15.
ELISA ELISA'en til å detektere binding til humant TNFa ble essensielt utført som beskrevet over. Resultater er presentert i Figur 33. Human TNFa binding er minsket for TNF24 og TNF27, som starter fra 60°C og for TNF25, TNF26 og TNF28 som starter ved 70°C.
Humaniserte monovalente Nanobodies (andre runde)
Eksempel 41 : Identifisering av ikke-humane aminosyreposisjoner i TNFa og serum albumin spesifikke Nanobodies
Figur 34 (TNF1 ), Figur 35 (TNF2), Figur 36 (TNF3) og Figur 37 (ALB1 ) representerer mangfoldige sekvensinnrettinger (Clustal W 1 .7) med DP51 , DP53, DP54 og DP29 sekvenser. De muterte molekylene ble uttrykt og renset som beskrevet over, som gir sekvensene i Tabell 35 SEQ ID NO: 95 til 104 (mot TNF-alfa og humant serum albumin, respektivt).
Karakterisering av humanisert Nanobody
Eksempel 42: Ekspresjonsnivå
Tabell 36 representerer beregnede ekspresjonsnivåer. Ekspresjon ble oppnådd med utbytter i området av 0.5-2.7 mg/ml.
Eksempel 43: SDS-PAGE
SDS-Page ble utført som beskrevet i Eksempel 8. Figur 38 representerer SDS-Page gelen.
Eksempel 44: Western Blot
Western Blot analyse ble utført som beskrevet i Eksempel 9. Figur 39 representerer Western Blot resultatene.
Eksempel 45: Bio-assay
Assayet ble utført som beskrevet i Eksempel 13.
Resultatene av de humaniserte Nanobodies er oppsummert i Tabell 37. Villtype Nanobodies og første runde av humaniserte Nanobodies er inkludert som referanse.
Eksempel 46: Biacore
Analysen ble utført som beskrevet i Eksempel 12. Figur 40 viser Biacore resultater.
Eksempel 47: Temperaturstabilitet
Prøver ble analysert som beskrevet i Eksempel 15.
OD280 nm
OD ved 280 nm ble målt og konsentrasjonen ble beregnet. Resultater er oppsummert i Tabell 38.
Ingen signifikant minsking i proteinkonsentrasjon er observert for de humaniserte TNF1 Nanobodies (TNF29-30). En minsking i proteinkonsentrasjon er observert for humaniserte TNF2 (TNF31-32) og TNF3 (TNF33) som starter ved 80°C.
Western Blot
Prøver ble analysert for nærværet av aggregater som beskrevet i Eksempel 15.
ELISA ELISA'en til å detektere binding til humant TNFa ble essensielt utført som beskrevet i Eksempel 15. Resultater er presentert i Figur 41.
Human TNFa binding er komparativt for WT TNF1 og de humaniserte TNF29 og TNF30; komparativt for WT TNF2 og de humaniserte TNF31 og TNF32; og også for WT TNF3 og humaniserte TNF33.
Komparativt Eksempel
I dette Komparative Eksempelet, ble ni Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen sammenlignet med tre Nanobodies fra WO 04/041862, kalt “VHH#1 A” eller “1 A”, “VHH3E” eller “3E” og “VHH#3G” eller “3G” respektivt (SEQ ID NOS: 1 , 4 og 5 i WO 04/041862). Assayet anvendt var det cellebaserte assayet som anvender KYM-celler referert til i WO 04/41862 (se for eksempel Eksempel 1 , under 3)). Resultatene er nevnt i Tabell 39 under. Som kan bli sett, har Nanobodies av den foreliggende oppfinnelsen en EC50 verdi i dette assayet som er 18-ganger bedre enn EC50 verdien til 3E, det best utøvende Nanobody i følge WO 04/041862.
Eksempel 48: Generering av trivalente bispesifikke humaniserte Nanobodies™
Trivalente bispesifikke Nanobodies ble formatert og klonet i E. coli ekspresjonsvektoren pAX054 først og deretter berget gjennom PCR og klonet i pPICZaA ekspresjonsvektoren.
Beskrivelse av Escherichia coli ekspresjons vektor
pAX54 er et derivat av pUC19. Det omfatter LacZ prom oteren som gjør det i stand til en kontrollert induksjon av ekspresjon ved å anvende IPTG. Vektoren håret resistensgen for Ampicillin eller Carbenicillin. Multikloningssetene huser flere restriksjonsseter av hvilke Sfi\ og BstEW ofte er anvendt for kloning av Nanobodies™. Signalpeptidet er gen3 leder sekvensen som translokerer det uttrykte Nanobodiet™ til pehplasmaet.
Beskrivelse av Pichia pastoris ekspresjonsvektor
pPICZaA inneholder et pUC-avledet replikasjonsorigo som tillater propagering i E coli. Det inneholder prom oteren til Pichia pastoris AOX1 (alkohol oksidase 1) genet. Denne 942 bp promoterregionen (i) tillater metanolinduserbar, høy-nivå ekspresjon av det interessante genet, og (ii) målplasmid integrasjon til AOX1 lokuset etter transformering av Pichia med vektor DNA som er linearised innen 5' AOX1 promoterregionen. Noter at pPICZa vektorer ikke inneholder et gjær replikasjonsorigo og at, følgelig, transform anter bare kan bli isolert hvis rekombinasjon inntreffer mellom plasmidet og Pichia genomet. Vektoren spesifiserer resistens til det antibiotiske Zeocin i både E, coli og Pichia pastoris vertsceller. Vektoren innkorporerer sekresjonssignalet til Saccharomyces cerevisiae a-mating faktoren som tillater effektiv sekresjon av de fleste proteiner til kulturmediet. Initierings ATG i α-faktor signalsekvensen korresponderer til det naturlige initierings ATG til AOX1 genet. Multikloningssetet huser flere restriksjonsseter av hvilke XhoMEcoRI eller XhoMNot1 typisk er anvendt for fusjon av de Nanobody™ kodende sekvensene til sekresjonssignalet. Multikloningssetet er etterfulgt av AOX1 transkhpsjonsterminehngs-regionen. Mer detaljer om denne ekspresjonsvektoen kan bli funnet på nettsiden til Invitrogen
(http://www.invitroqen.com/innhold/sfs/manuals/ppiczalpha man.pdf).
Formatering av trivalente Nanobodies
Tre separate PCR reaksjoner ble satt opp for å amplifisere den N-terminale, den midtre og den C-terminale Nanobody™ subenheten ved å anvende oligokombinasjonene indikert i WPA-0012. Det N-terminale Nanobodiet™ ble amplifisert ved å anvende M13_rev/ Rev_9GlySer_L108; det midtre Nanobodiet™ ble amplifisert ved å anvende For_GlySer/Short og Rev_15BspEI_L108; det C-temninal Nanobodiet™ ble amplifisert ved å anvende For_BspEI/M13_for. En PCR reaksjon med 1 pl plasmid DNA (50-100 ng), 1.5 pl forward primer (10 μΜ → 300 nM), 1.5 μl revers primer (10 μΜ → 300 nM), 1 μl dNTPs (10 mM → 0.2 mM), 5 μΙ buffer (10x → 1 x), 0.75 μl enzym (3.5 U/μΙ → 2.6 U/μΙ) og 39.25 μl H2O med et totalvolum på 50 μl ble fremstilt. Primersekvenser er gitt i Tabell 40. Et PCR program ble startet med 2 minutter ved 94°C. En sykel på 30 sekunder ved 94°C, 30 sekunder ved 50°C og 1 minutt ved 72°C ble repetert 30 ganger og etterfulgt av 10 minutter ved 72°C. Amplifisering ble sjekket ved å separere 5 μl av PCR reaksjonen på en 2% agarose gel. PCR produktet ble renset ved å anvende QIAquick PCR Rensings Kitet i følge produsentens instruksjoner. En kolonne ble anvendt og eluert med 50 μl EB buffer. Det N-terminale VHH fragmentet ble fremstilt ved å inkubere 50 μΙ DNA og 2 μl BamH\ (10 U/μl) i den passende bufferen anbefalt av produsenten ved 37°C i 2 timer. Deretter, ble 2 μΙ Sfil (10U/μl) tilsatt og blandingen ble inkubert ved 55°C i 2 timer.
Det midtre VHH fragmentet ble fremstilt ved å inkubere 50 μΙ DNA og 2 μl BamHl (10 U/μl) og 2 μl BspEl (10 U/μl) i den passende bufferen anbefalt av produsenten ved 37°C i 2 timer. Det C-terminale VHH fragmentet ble fremstilt ved å inkubere 50 μl DNA med 2 μl BspEl (10 U/μl) i den passende bufferen anbefalt av produsenten ved 37°C i 2 timer. Deretter, ble 2 μl BstEll (10U/μl) tilsatt og blandingen ble inkubert ved 60°C i 1 time. De tidligere kuttingsreaksjonene ble separert på en 2% agarose gel. VHH båndene (350-450 bp) ble kuttet ut av gelen og DNA'et ble renset ved å anvende QIAquick Gel Ekstraksjonskitet i følge produsentens instruksjoner. En kolonne (med maksimum 400 mg agarose gel per kolonne) ble anvendt og det bundne DNA'et ble eluert med 50 μl EB buffer. DNA konsentrasjon ble bestemt ved å måle OD260 (1 OD enhet = 50 μg/ml). En ligeringsblanding med et sluttvolum på 10 μl som inneholdt 100 ng vektor pAX54, 12 ng N-terminalt VHH, 12 ng midtre VHH fragment, 12 ng C-terminalt VHH fragment, 1 μl ligeringsbuffer og 1 μl ligase (3U) ble fremstilt og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Transformering av E. coli, TG1 ble utført ved å anvende 2 μl av ligeringsblanding. Kolonier er analysert ved å anvende PCR som beskrevet i WPA-0010. Sekvensanalvse er utført på positive kloner. Plasmid preparering ble utført ved å anvende Qiaprep spin Miniprep kit (Qiagen) i følge produsentens instruksjoner og beskrevet over. Sekvensering ble utført ved VIB sekvensfasiliteten, Antwerpen, Belgia.
Amplifisering av kodende DNA
Den Nanobody™ kodende regionen klonet i pAX054 E. coli ekspresjonsvektoren er berget gjennom PCR ved å anvende et passende primerpar. For å sørge for at Nanobodiet™ er uttrykt med en naturlig N-terminus, er den kodende regionen klonet i ramme med Kex2 kuttingssetet til sekresjonssignalet. Forward primeren smelter den C-terminale delen av sekresjonssignalet, opp til Xho1 gjenkjenningssetet, til den Nanobody™ kodende regionen. En PCR reaksjon av 1 μl plasmid DNA (50-100 ng), 1.5 μl forward primer (10 μΜ → 300 nM), 1.5 μl revers primer (10 μΜ → 300 nM), 1 μl dNTPs (10 mM → 0.2 mM), 5 μl buffer (10x → 1x), 0.75 μl enzym (3.5 U/μl → 2.6 U) og 39.25 μl H2O med et totalvolum på 50 μl ble fremstilt. Primersekvenser er gitt i Tabell 41. Et PCR program ble startet med 2 minutter ved 94°C. En sykel på 30 sekunder ved 94°C, 30 sekunder ved 50°C og 2 minutter ved 72°C ble repetert 20 ganger og etterfulgt av 10 minutter ved 72°C. Amplifisering ble sjekket ved å separere 5 pl av PCR reaksjonen på en 2% agarosegel. PCR produktet ble renset ved å anvende QIAquick PCR Rensingskitet i følge produsentens instruksjoner. En kolonne ble anvendt og det bundne DNA<'>et ble eluert med 50 μΙ EB buffer.
Kloningsstrategi
DNA fragmentet som koder for NB så vel som pPICZaA ekspresjonsvektoren er kuttet med de passende restriksjonsenzymene ( Xhol Notl). Insertet er ervervet ved å inkubere 50 μl PCR produkt med 2 μl Xhol (10 U/μl) og 2 μl Notl (10 U/μl) i den passende bufferen anbefalt av produsenten i 3 timer ved 37°C. Vektor er ervervet på samme måte, der mengden av restriksjonsenzymer er tilpasset til mengden av plasmid. Både vektoren og det NB kodende fragmentet er renset og DNA konsentrasjonen er kvantitert ved å anvende BioPhotometeret (Eppendorf). Fragmentet og akseptorvektoren er ligert i likemolare ratioer ved å anvende 1 Enhet T4 ligase (Promega) i 30 minutter ved romtemperatur eller overnatt ved 16°C. DNA'et (20-30 ng) er transformert til TG1 celler. Kolonier er analysert gjennom PCR ved å anvende 3ΆΟΧ1 R og 5ΆΟΧ1 F primerene. Sekvensanalyse er utført på positive kloner. TNF30, TNF33 og ALB8 ble formatert til trivalente bispesifikke Nanobodies™. Som spacer mellom byggeblokkene ble det anvendt en 9AA GlySer linker.
Transformering av P. pastoris
For å isolere plasmid DNA, er en forkultur startet ved å inokulere en enkeltkoloni av klonen i 50 ml Luria Buljong Ampicillin eller Carbenicillin (100μg/ml) 2% glukose og inkubering ved 37°C overnatt. Plasmid DNA er fremstilt ved å anvende Plasmid Midi kitet (Qiagen) i følge produsentens instruksjoner. DNA'et er linearised ved å inkubere 30 μg plasmid DNA med 6 μl BstX 1 (10 U/μl) i den passende bufferen i følge produsentens instruksjoner i 3 timer ved 45°C. Kuttet DNA er renset ved å anvende PCR Rensingskit (Qiagen) i følge produsentens instruksjoner. DNA'et er konsentrert ved å anvende EtOH presipitering i følge standard prosedyrer. X-33 elektrokompetente celler er transformert med 10 pg linearised DNA og celler er tillatt å vokse i 48 timer på en selektiv YPD agar plate som inneholder Zeocin (100/250/500 μg/ml). X-33 er en villtype Pichia pastoris stamme; stammen selv så vel som de avledete rekombinante stammene inneholder det naturlige AOX1 genet og er i stand til å metabolisere metanol (Mut<+>).
Kloner er screenet for ekspresjonsnivå ved å inokulere enkle kolonier i 1 ml BGCM i en 24-brønners plate og dyrke dem i 48 timer ved 30°C ved 120 rpm. Celler er sentrifugert og fersk BMCM er tilsatt til cellene for dyrking ved 30°C ved 120 rpm over 48 timer. Deretter, er MeOH tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 0.5 % og celler er dyrket ved 30°C ved 120 rpm over 8 timer, etter der MeOH er tilsatt igjen til en sluttkonsentrasjon på 0.5 %. Celler er dyrket overnatt ved 30°C ved 120 rpm. Celler er sentrifugert og supernatanten er høstet og analysert i ELISA som beskrevet i eksempel 10.
Eksempel 49: Ekspresjon og rensing av trivalente bispesifikke humaniserte Nanobodies™
Produksjon i Pichia pastoris
Sammensetning av buffere, løsninger og andre kan bli funnet på websiden til Invitrogen (http://www.invitrogen.com/innhold/sfs/manuals/ppiczalpha_man.pdf).
En forkultur ble startet ved å inokulere en enkeltkoloni fra plate i 5 ml YPD. Kulturen ble dyrket overnatt ved 180 rpm og 30°C. Den neste dagen, ble forkulturen fortynnet til 50 ml med YPD og dyrket overnatt ved 180 rpm og 30°C. Produksjonskulturer ble startet ved å inokulere forkulturen til en slutt OD600nm = 0.04-0.08. Kulturer ble dyrket i BGCM i 24 timer ved 30 °C ved 180 rpm og sentrifugert ved 4,500 rpm i 30 minutter. Celler ble resuspendert i 1/3 av det originale volumet i BMCM medium med en slutt OD600 nm = 15-20. Celler ble indusert med MeOH ved regelmessige tidspunkter, typisk 3 ganger/dag, som aldri overskred 1 % MeOH innholdet. Etter 50 timer med induksjon er supernatanten høstet inn.
Rensing av Nanobody uttrykt i Pichia pastoris
Kultursupernatant er filtrert over en .22 μm filtreringsmembran Micro filtration (Hydrosart, Sartorius). Prøve er konsentrert ved å anvende diafiltrering på 10kDa ultra filtreringsmembran (HydroSart, Sartorius) og konsentrert til 0.5-1L.
Nanobodies™ er renset ved å anvende Protein A affinitetskromatografi (MabSelect Xtra, GE Healthcare) ved å anvende PBS som kjørebuffer og Glycin [100mM pH=2.5] for eluering. Prøver er nøytalisert ved å anvende 1.5 M Tris pH=8.8. Nanobodies™ er videre prosessert i Anion Utbyttings Kromatografi (Source 30Q, GE Healthcare). Prøver er fortynnet 10-ganger med 10mM Piperazin pH=10.2 og justert til pH=10.2 med 1M NaOH og en konduktivitet på <2mS/cm med MilliQ vann.
Nanobodies er prosessert i Størrelseekslusjonskromatografi (Superdex 75pg, Hiload XK26/60, GE Healthcare) og LPS er fjernet via Anion Utbyttings Kromatografi (Source 30Q, GE Healthcare) ved passering gjennom 5ml kolonne, som er sanert med 1M NaOH og ekvilibrert i Dulbecco PBS.
Til å bestemme renheten, ble proteinprøver analysert på en 15% SDS-PAGE gel som beskrevet i eksempel 8. Gelen er prosessert ved å anvende SilverQuest™ i følge generelle prosedyrer beskrevet av produsenten (Invitrogen). Alternativt, er gel prosessert ved å anvende coomassie brilliant blue eller i western blot som beskrevet i eksempel 8 og 9. Resultater er gitt i Figur 42.
Eksempel 50: Karakterisering av trivalente bispesifikke humaniserte Nanobodies™
TNF60 består av 363 aminosyrer. Proteinet har en molekylærvekt på 38,441 Da. pI er 8.71. Ekstinksjonskoeffisienten ved 280 nm er 1.736.
Massespektrofotometri
Massen til proteinet ble bestemt i ESI-MS i følge standard prosedyrer. Den teoretiske massen for TNF60 er 38,441 Da. Proteinet har 2 S-S broer som skulle resultere i en masse på 38,435 Da in ESI-MS. Massen som ble eksperimentelt bestemt for TNF60 avledet fra 3 forskjellige batcher rangerer fra 38,433 Da til 38,435 Da, som skilles maksimalt 0.005% med den teoretiske massen.
N-terminal sekvensering
N-terminal sekvensering ble utført ved Edman degradering i følge standard prosedyrer. N-terminal sekvensering viste at proteinsekvensen for de første 7 aminosyrene er som følgende: EVQLVES. Dette er overensstemmende med den teoretiske proteinsekvensen, som indikerer riktig N-terminal prosessering.
Analytisk ordning etter størrelse
Prøver (100 ug) ble analysert på den høyoppløsnings Superdex75 kolonnen, for å karakterisere de forskjellige batchene av Nanobody™. Størrelsesekslusjonskromatografi av Nanobodiet™ gir typisk en symmetrisk topp, med en retensjonstid på 11.5 ml på Superdex75. Absorbansen er typisk registrert ved 280, 254 og 214 nm. 214 nm målingen tillater høyere deteksjonssensitivitet. Analytisk ordning etter størrelse i PBS fremskaffer en symmetrisk topp. Ingen kontaminanter ble observert. Retensjonstiden observert for 3 forskjellige batcher er 11 ,5-11 ,55 ml. En representativ profil er vist i Figur 43.
Eksempel 51: Binding av TNF60 til humant TNFa i ELISA Funksjonaliteten til TNF60, dvs. binding til humant TNFa ble analysert i ELISA som beskrevet i eksempel 10. Resultatene er oppsummert i Figur 44 og demonstrerer klart en dose-avhengig og mettbar binding av 2 batcher av TNF60 til humant TNFa.
Eksempel 52: Funksjonalitet i Celle-basert assay
Potensen til å nøytralisere den cytotoksisk aktiviteten til TNFa ble analysert i et celle-basert assay som beskrevet i eksempel 13. Resultatene er oppsummert i Tabell 42 og i Figurer 45 og 46.
Dataene viser at TNF60 har potens i området av Enbrel/Etanercept og en 10-ganger bedre potens enn Humira/Adalimumab og Remicade/lnfliximab.
Eksempel 53: Binding av TNF60 til serum albumin
Binding til humant og rhesus serum albumin ble analysert i Biacore som beskrevet i eksempel 12. KD, kon og koff verdier er representert i Tabell 43. TNF60 er sammenlignet med TNF24, som er det trivalente bispesifikke foreldre Nanobody™ med vill-type byggeblokker.
Affinitet av TNF60 for humant og rhesus serum albumin er lignende.
Affinitet er 2-ganger lavere når sammenlignet med affiniteten observert for TNF24 som er villtype analogen til TNF60. Kon er identisk for begge molekyler, men koff er 2-ganger høyere for TNF60.
Eksempel 54: Farmakokinetisk og immunogenitets analyse av trivalente bispesifikke humaniserte Nanobodies i mus
Dyr
DBA1 eller BALBc mus ble varmet opp under en infrarød lampe og 200 pl Nanobody™ (100 μg per mus) ble injisert intravenøst i halen. Blodprøver ble ervervet ved forskjellige tidspunkter ved å lage et lite snitt i halen og samle blodet 1 et mikrorør. Blod ble typisk samplet ved t=15 min, 2 timer, 4timer, 6 timer, 1 dag, 2 dager, 3 dager, 4 dager, 7 dager, 14 dager. Serum ble fremstilt i følge standard prosedyrer.
Bestemmelse av Nanobody™ konsentrasjon i museserum
En mikrotiterplate (NUNC, Maxisorb) ble coatet med 2 μg/ml neutravidin overnatt ved 4°C . Platen ble vasket 5 ganger med PBS/0.05% Tween-20 og blokkert i 2 timer ved RT med PBS/1% kasein. Biotinylert humant TNFa (1/2000 i PBS /0.2% kasein; 400 ng/ml) ble anvendt til brønnene og inkubert i 1 time ved RT. Standard referanse Nanobodiet™ ble anvendt som starter ved en konsentrasjon på 5 pg/ml og ved å anvende 5-ganger fortynninger i PBS som inneholder 1% museplasma. Nanobodies™ ble tillatt å binde i 2 timer ved RT. Platen ble vasket 5 ganger og kanin polyklonalt anti-Nanobody (R23) ble anvendt med en 2000-ganger fortynning i en time ved RT. Etter vasking av platen, ble binding detektert med geit-polyklonalt-anti-kanin-HRP (DAKO) ved en 3000-ganger fortynning i en time ved RT, og farget med ABTS/H2O2. OD405nm ble målt.
Denne første ELISA'en ble anvendt til å bestemme den lineære rekkevidden til standardreferansen. I en annen ELISA, ble standardreferansen anvendt ved konsentrasjoner i denne lineære rekkevidden og typisk ved å anvende 2-ganger fortynninger. I denne andre ELISA'en, ble serum testprøver fortynnet 100-ganger og videre ble 5-ganger fortynninger fremstilt i 1% museplasma, for å bestemme fortynningen hvor serumprøvene fremskaffet en avlesning i den lineære rekkevidden til standardkurven. I en tredje ELISA, er serum prøver fortynnet ved en passende konsentrasjon bestemt i den andre ELISA'en og ved å anvende 2 -ganger fortynninger for nøyaktig bestemmelse av Nanobody™ konsentrasjonen i serum prøvene.
Eksperimenter ble utført for å bestemme den farmakokinetiske profilen av TNF60 i mus (n=3). En Cmaks verdi på 103,84 ± 31 μg/ml ble nådd 15 minutter etter administrering. Halv-livet (t1 /2β) ble bestemt til å være 1.9 dager, likt halvlivet til muse serum albumin, som indikerer at TNF60 opptar halv-livet til serum albumin. Data er presentert i Figur 47.
Bestemmelse av anti-Nanobody antistoffer i mus
Nanobody™ ble coatet ved 5 pg/ml i PBS ved 4°C overnatt. Platen ble vasket 5 ganger med PBS/0.05% Tween-20 og blokkert i 2 timer ved RT med PBS/1% kasein. Serumprøver ble fortynnet 100-ganger og anvendt til brønnene for inkubering i løpet av 1 time ved romtemperatur. Deteksjon ble utført ved å anvende 1000-ganger fortynnet polyklonalt kanin anti-mus-HRP (DAKO, P0260) og ved å anvende ABTS som substrat.
Serumprøver ble fortynnet 50-ganger og analysert for nærværet av mus anti-TNF60 antistoffer. Mangel på immunogenitet ble demonstrert for TNF60. Data er presentert i Figur 48.
Eksempel 55: Generering av bivalente lange halv-livete humaniserte Nanobodies™
Beskrivelse av Pichia pastoris ekspresjonsvektor
Se eksempel 48
Formatering av bivalente Nanobodies™
To separate PCR reaksjoner ble satt opp for å amplifisere den N-terminale og C-terminale Nanobody™ subenheten ved å anvende prosedyrene som indikert i WPA-0011. For amplifiseringen av det N-terminale Nanobodiet™ ble PiForLong og Rev_30GlySer_L108 anvendt som primerkombinasjon; for amplifiseringen av det C-terminale Nanobodiet™ ble For_GlySer og PiRevCyslhum anvendt eller alternativt For_GlySer og PiRevCys2hum, og introduserte restriksjonssetene krevet for formatering og frie cysteinresidier krevet for C-terminale modifikasjoner.
PCR reaksjon av 1 μl plasmid DNA (50-100 ng), 1.5 μl forward primer (10 μΜ → 300 nM), 1.5 μl revers primer (10 μΜ → 300 nM), 1 μl dNTPs (10 mM → 0.2 mM), 5 μΙ buffer (10x → 1x), 0,75 μl enzym (3.5 U/μl → 2.6 U/μl) og 39.25 μl H2O med et totalvolum på 50 μl ble fremstilt. Primersekvenser er gitt i Tabell 44. Et PCR program ble startet med 2 minutter ved 94°C. En sykel på 30 sekunder ved 94°C, 30 sekunder ved 50°C og 1 minutt ved 72°C ble repetert 30 ganger og etterfulgt av 10 minutter ved 72°C. Amplifisering ble sjekket ved å separere 5 μΙ av PCR reaksjonen på en 2% agarose gel. PCR produktet ble renset ved å anvende QlAquick PCR Rensekitet i følge produsentens instruksjoner. En kolonne ble anvendt og eluert med 50 μl EB buffer. Det N-terminale VHH fragmentet ble fremstilt ved å inkubere 50 μl DNA og 2 μl BamHl (10 U/μl) og 2 μl Xhol (10 U/μl) i den passende bufferen anbefalt av produsenten ved 37°C i 1.5 timer. Det C-terminale VHH fragmentet ble fremstilt ved å inkubere 50 μl DNA og 2 μl BamHl (10 U/μl) og 2 μl EcoRl (10 U/μl) i den passende bufferen anbefalt av produsenten ved 37°C i 1 time. De tidligere kuttingsreaksjonene ble separert på en 2% agarose gel. VHH båndene (350-450 bp) ble kuttet ut av gelen og DNA'et ble renset ved å anvende QlAquick Gel Ekstraksjonskitet i følge produsentens instruksjoner. En kolonne (med maksimum 400 mg agarose gel per kolonne) ble anvendt og det bundne DNA'et ble eluert med 50 μl EB buffer. DNA konsentrasjon ble bestemt ved å måle OD260 (1 OD enhet = 50 μg/ml). En ligeringsblanding med et sluttvolum på 10 μl som inneholdt 100 ng vektor pPICZaA, linearisert med Xho\IEcoR\, 30 ng N-terminale VHH, 30 ng C-terminalt VHH fragment, 1 μl ligeringsbuffer og 1 μl ligase (3U) ble fremstilt og inkubert i 1 time ved RT. Transformering av E. coli, TG1 ble utført ved å anvende 2 μl av ligehngsblanding. Kolonier er analysert ved å anvende PCR som beskrevet i WPA-0010 men ved å anvende AOXlFor/AOXIRev primerkombinasjonen. Sekvensanalyse er utført på positive kloner. Plasm idpreparering ble utført ved å anvende Qiaprep spin Miniprep kitet (Qiagen) i følge produsentens instruksjoner og beskrevet over. Sekvensering ble utført ved VIB sekvens fasiliteten, Antwerpen, Belgia.
Transformering av P. pastoris
Se eksempel 48.
TNF30 ble formatert til bivalente Nanobodies™. Som spacer mellom de 2 byggeblokkene ble det anvendt en 30 AA GlySer linker. For å tillate C-terminale sete-spesifikke modifikasjoner ble et fritt cystein introdusert, enten som den siste AA av Nanobodiet™ eller med en ekstra spacer som består av GlyGlyGlyCys (SEQ ID NO: 471)..
Eksempel 56: Ekspresjon og rensing av bivalente lange halv-livete humaniserte Nanobodies™
Produksjon i Pichia pastoris
Se eksempel 49
Rensing av bivalente Nanobodies
Kulturmediet ble fremstilt celle-fritt via sentrifugering og 0.22μm filtrering. Det sterile mediet ble lagret ved 4ºC inntil videre prosessert. Lav molekylærvekt kontaminanter ble redusert via ultrafiltrering på en 10kDa ultrafiltrerings (UF) membran (HydroSart Sartocon Slice Cassette, Sartorius) som følgende: fire liter medium ble konsentrert til 0.5-1 lit, deretter fortynnet med 5lit PBS og igjen konsentrert til 0.5lit. Denne handlingen ble utført to ganger.
Retentatet til UF ble filtrert gjennom nylon 47mm membraner 0,45μm (Alltech #2024).
I et neste trinn ble bivalent Nanobody™ fanget fra det konsentrerte mediet via Protein A affinitetsrensing (ved å anvende MabSelectXtraTM, GE Healthcare). Kolonnen [35X100mm] ble ekvilibrert i PBS og etter prøveapplikasjon vasket ekstensivt med PBS. TNF56 ble eluert med Glycin [100mM, pH=2.5].
De eluerte fraksjonene av MabSelectXtraTM ble nøytalisert med Tris [1,5M, pH 8,8] og lagret ved 4°C . TNF56 ble konsentrert og renset via AEX (A= 10mM piperazin, pH 10,8 og B=1M NaCl i 50mM Tris, pH 7,5) ved å anvende Source 30Q (GE Healthcare). Til denne enden ble Nanobody™ fraksjonene fortynnet med A buffer (10mM piperazin, pH 10,8) til en konduktivitet på 5mS/cm og pH ble justert til 10,8. Kolonnen [25X100mm] ble ekvilibrert i A buffer før loading av prøven på kolonnen. TNF56 ble eluert med en 5 Kolonne Volum (CV) gradient. pH av de innsamlede fraksjonene ble justert til 7.8 ved å anvende 1M Tris pH=7.8.
Pegylering av bivalente Nanobodies™ uttrykt i Pichia pastoris
Reduksjon av C-terminale cysteiner
Dithiotreitol (DTT, Aldrich Cat 15,046-0) ble tilsatt til de nøytaliserte fraksjonene for å redusere potensielle disulfidbroer som ble dannet mellom de karboksyterminale cysteinene til Nanobodies™ (vanligvis rundt 20%). En sluttkonsentrasjon på 10mM DTT og inkubering overnatt ved 4°C ble funnet å være optimalt. Reduksjonen ble evaluert med analytisk størrelsesekslusjonskromatografi (SEC). Derfor ble 25μl av det reduserte Nanobodiet™ tilsatt til 75μl D-PBS og injisert på en en Sup7510/300 GL kolonne ekvilibrert i Dulbecco’s PBS (D-PBS, GibcoTM REF 14190-094).
Ikke-redusert Nanobody™ og DTT ble fjernet ved preparativ SEC på en Hiload 26/60 Superdex75 prep grade kolonne ekvilibrert i D-PBS.
Konsentrasjonen av det reduserte Nanobodiet™ ble målt ved å måle absorbansen ved 280nm. Et Uvikon 943 Double Beam UV/VIS Spektrofotometer (fremgangsmåte: se SOP ABL-0038) ble anvendt. Absorbsjonen ble målt i et bølgelengde scan 245-330nm. To Presisjonsceller fremstilt av Quartz Suprasil<® >celler ble anvendt (Hellma type No.: 104-QS; lysvei: 10mm). Først ble absorbsjonen av blanken målt ved 280nm ved å plassere to celler fylt av 900μl D-PBS. Prøven ble fortynnet (1/10) ved å tilsette 100Pl av prøven til den første cellen. Absorbsjonen av prøven ble målt ved 280nm.
Konsentrasjonen ble beregnet med følgende formel:
For TNF55: ε=1,85
For TNF56: ε=1,83.
Pegylering
For å PEGylere Nanobodiet™ ble et 5X molar overskudd av nylig fremstilt 1mM PEG40 løsning tilsatt til den reduserte Nanobody™ løsningen. (MPEG2-MAL-40K av NEKTAR™ Transforming Therapeutics (2D3YOTO1) Mw = 40,000 g/mol; MPEG2-MAL-60K of NEKTAR™ Transforming Therapeutics (2D3YOVO1) Mw = 60,000 g/mol).
Nanobody™-PEG blandingen ble inkubert i 1 time ved romtemperatur (RT) med forsiktig risting og deretter overført til 4°C. Pegyleringen ble evaluert via analytisk SEC. Derfor ble 25μl av Nanobodiet™ tilsatt til 75μl D-PBS og injisert på en Sup75HR 10/300 kolonne ekvilibrert i D-PBS. Pegylert Nanobody™ eluert i området av eksklusjonsvolumet til kolonnen (>75kDa).
Det Pegylerte og ikke-Pegylerte Nanobodiet™ ble separert via kation utbyttingskromatografi (CEX, ved å anvende Source30S, GE Healthcare; A buffer =25mM citrat pH=4 og B=1M NaCl i PBS ). Prøven ble fortynnet til en konduktivitet på <5mS/cm og pH ble justert til 4,0. Kolonnen [25X100mm] ble ekvilibrert og etter prøveapplikasjon vasket ekstensivt med A-buffer. Pegylert Nanobody™ ble eluert med en 3 CV gradient.
Det innsamlede Nanobodiet™ ble buffer utbyttet til D-PBS med SEC på en Hiload 26/60 Superdex 75 prep grade kolonne ekvilibrert i D-PBS.
Til slutt ble Nanobodiet™ fremstilt LPS-fritt via passasje over en anion utbyttingskolonne (Source30Q). Kolonnen (10x100mm) ble sanert overnatt i NaOH [1M] og etterpå ekvilibrert i endotoksinfritt D-PBS.
Biotinylering
For å biotinylere Nanobodiet™ ble et 5X Molart overskudd av biotin (EZ-Link® Maleimid-PO2-Biotin, Pierce #21901) fra en 10mM stamløsning tilsatt til det reduserte Nanobodiet™ (se 5.5.1). Biotin-Nanobody™ blandingen ble inkubert i 1 time ved RT med forsiktig risting og deretter lagret ved 4°C .
Renheten til biotinylert Nanobody™ ble kontrollert via analytisk SEC. Derfor ble 25μl av biotinylert Nanobody™ tilsatt til 75μl D-PBS og injisert på en Sup75HR 10/300 kolonne ekvilibrert i D-PBS. Fra det ervervede kromatogrammet kunne det bli konkludert at Nanobody™-biotinet ikke trenger videre rensing: ingen dimerisering av Nanobody™ via en oksidering av frie sulfidriler kunne bli detektert. Et bufferbytte til D-PBS ble gjort ved en passasje over en avsaltende kolonne Sephadex G25 fine (90ml) kolonne.
Til slutt ble Nanobody™-biotinet fremstilt LPS-fritt ved passaje over en anion utbyttingskolonne (Source30Q, GE Healthcare). Kolonnen (1x10cm) ble sanert overnatt i 1M NaOH og deretter ekvilibrert i D-PBS.
For å bestemme renheten, ble proteinprøver analysert på en 15% SDS-PAGE gel som beskrevet i eksempel 8 og 49. Resultater er presentert i Figur 49 og 50.
Eksempel 57: Karakterisering av bivalente lange halv-livete humaniserte Nanobodies™
Biokjemiske karakterisering
TNF55 består av 260 aminosyrer. Proteinet har en molekylærvekt på 27,106 Da. pI er 8.67. Ekstinksjonskoeffisienten ved 280 nm er 1.850.
TNF56 består av 264 aminosyrer. Proteinet har en molekylærvekt på 27,365 Da. pI er 8.67. Ekstinksjonskoeffisienten ved 280 nm er 1.830.
Massespektrometri
Den teoretiske massen av TNF55 er 27,106 Da. TNF55-Biotin proteinet har 2 S-S broer og en biotinmodifisering som skulle resultere i en masse på 27,627 Da i ESI-MS. Massen som ble eksperimentelt bestemt for TNF55-biotin er 27,627 Da.
Den teoretiske massen til TNF56 er 27,365 Da. TNF55-Biotin proteinet har 2 S-S broer og en biotinmodifisering som skulle resultere i en masse på 27,886 Da i ESI-MS. Massen som ble eksperimentelt bestemt for TNF55-biotin er 27,886 Da.
N-terminal sekvensering
N-terminal sekvensering av TNF56-PEG40 viste at proteinsekvensen for de første 7 aminosyrene er som følgende: EVQLVES. Dette er i overensstemmelse med den teoretiske proteinsekvensen, som indikerer riktig N-terminal prosessering.
Analytisk ordning etter størrelse
Analytisk ordning etter størrelse av TNF56-PEG40 i PBS fremskaffer en symmetrisk topp. Ingen kontaminanter ble observert. Retensjonstiden observert er 8.5 ml på Superdex HR 75 og 10.32 ml på Superdex HR 200. En representativ profil er vist i Figurer 51 og 52.
Eksempel 58: Funksjonalitet i celle-basert assay
Potensen til å nøytralisere den cytotoksiske aktiviteten til TNFa ble analysert i et celle-basert assay. Potensen ble undersøkt ved forskjellige konsentrasjoner av Nanobody™ så vel som til de kommersielt tilgjengelige Enbrel, Humira og Remicade på en molar base. Dess høyere EC50 observert dess lavere aktiviteten til forbindelsen til å nøytralisere TNFa.
Resultatene er oppsummert i Tabell 45 og Figurer 53 og 54.
Dataene viser en økning i kraft for de bivalente Nanobodies™ når sammenlignet med det monovalente Nanobodiet™ TNF1 . Potens av TNF55 derivativer er lignende til TNF56 derivativer, som er i området av Enbrel og 10-ganger bedre enn Humira og Remicade.
Eksempel 59: Farmakokinetisk og immunogenitet analyse av bivalente lange halv-livete humaniserte Nanobodies i mus
Se eksempel 54
Eksperimenter ble utført for å kunne undersøke halv-livet til pegylerte Nanobodies™ i mus. Halv-livet til bivalent TNF56-PEG40 ble sammenlignet med halv-livet til TNF56-PEG60. Begge Nanobodies™ har sammenlignbare halv-liv på ~ 2 dager. Resultatene er presentert i Figur 55.
I tillegg, ble halv-livet til pegylert bivalent 3E-3E utforsket. Halv-livet til 3E-3E-PEG20 ble sammenlignet med halv-livet til 3E-3E-PEG40 etter intravenøs administrering av 100 μg av Nanobodies™. 3E-3E-PEG20 har et halv-liv på 17 timer, mens 3E-3E-PEG40 har et halv-liv på 2.1 dager, sammenlignbart med halv-livet til 3E-3E-MSA21. Resultatene er presentert i Figur 56.
Serumprøver ble fortynnet 100-ganger og analysert for nærværet av mus anti-TNF56-PEG40 eller anti-TNF56-PEG60 antistoffer. Mangel på immunogenitet ble demonstrert for begge molekyler. Data er presentert i Figur 57.
Eksempel 60: Effekt av anti-TNF-α Nanobody TNF60 (TNF60) i forebygging av kronisk polyartritt
Transgene muselinjer som bærer og som uttrykker en 3'-modifisert human tumor nekrose faktor (hTNF-alfa, cachectin) transgen ble anvendt som en modell for å studere effekten av TNF60 (TNF60) i å forebygge utviklingen av artritt (EMBO J.10, 4025-4031). Disse musene har blitt vist å utvikle kronisk polyartritt med 100% forekomst ved fire til syv ukers alder.
Fra den tredje uken av alder, ble kull av transgene mus delt inn i grupper på åtte dyr. Før initialisering av studiet, ble gjennomsnitt kroppsvekt beregnet for hver gruppe. Derfra, ble det under hele studiet registrert dyrevekter en gang i uken for hver gruppe.
For å teste effekten av TNF60 i forebyggingen av kronisk polyartritt, ble intraperitoneale injeksjoner gitt to ganger i uken til hvert dyr av en spesiell gruppe i følge det følgende skjema:
-Gruppe 1 (negativ kontroll): fosfatbufret saltløsning (PBS) (formuleringsbuffer) -Gruppe 2 (Nanobody behandling): TNF60 med en endelig dose på 30 mg/kg -Gruppe 3 (Nanobody behandling): TNF60 med en endelig dose på 10 mg/kg -Gruppe 4 (Nanobody behandling): TNF60 med en endelig dose på 3 mg/kg -Gruppe 5 (1. positiv kontroll): Enbrel med en endelig dose på 30 mg/kg -Gruppe 6 (1. positiv kontroll): Enbrel med en endelig dose på 10 mg/kg -Gruppe 7 (2. positiv kontroll): Remicade med en endelig dose på 30 mg/kg -Gruppe 8 (2. positiv kontroll): Remicade med en endelig dose på 10 mg/kg -Gruppe 9 (2. positiv kontroll): Remicade med en endelig dose på 3 mg/kg For hver gruppe, ble datoer for injeksjon og injeksjonvolumer notert.
Injeksjoner fortsatte i syv uker. I løpet av denne perioden, ble kliniske skår registrert ved å observere makroskopiske forandringer i leddmorfologi for hvert dyr.
Ved 10 ukers alder, ble alle mus ofret og sera og ledd ble samlet inn. Sera ble lagret ved -70ºC og ankelledd ble konservert i formalin.
For selekterte grupper, ble ankelledd lagret i parafin og seksjonert. Ankelleddseksjoner ble deretter anvendt for histopatologisk evaluering av sykdomsprogesjon.
Resultater er beskrevet i Figur 58.
Eksempel 61: Effekt av anti-TNF-D Nanobody TNF60 (TNF60) i terapeutisk behandling av kronisk polyartritt
Transgene muselinjer som bærer og som uttrykker et 3'-modifisert human tumor nekrose faktor (hTNF-alfa, cachectin) transgen ble anvendt som en modell for å studere effekten av TNF60 (TNF60) i terapeutisk behandling av artritt (EMBO J.10, 4025-4031). Disse musene har blitt vist å utvikle kronisk polyartritt med 100% forekomst ved fire til syv ukers alder.
Fra den sjette uken av alder, ble kull av transgene mus delt inn i grupper på åtte dyr. Før studiet ble initialisert, ble gjennomsnitt kroppsvekt beregnet for hver gruppe. Fra da av, ble det i løpet av hele studiet registrert dyrevekter en gang i uken for hver gruppe.
For å teste effekten av TNF60 i den terapeutiske behandlingen av kronisk polyartritt, ble det gitt intraperitoneale injeksjoner to ganger i uken til hvert dyr fra en spesiell gruppe i følge det følgende skjema:
-Gruppe 1 (negativ kontroll): fosfatbufret saltløsning (PBS) (formuleringsbuffer) -Gruppe 2 (Nanobody behandling): TNF60 med en endelig dose på 30 mg/kg -Gruppe 3 (Nanobody behandling): TNF60 med en endelig dose på 10 mg/kg -Gruppe 4 (1. positiv kontroll): Enbrel med en endelig dose på 30 mg/kg -Gruppe 5 (2. positiv kontroll): Remicade med en endelig dose på 30 mg/kg For hver gruppe, ble datoer for injeksjon og injeksjonsvolum notert.
Injeksjoner fortsatte i syv uker. I løpet av denne perioden, ble kliniske skår registrert ved å observere makroskopiske forandringer i leddmorfologi for hvert dyr.
Ved 13 ukers alder, ble alle mus ofret og sera og ledd ble samlet inn. Sera ble lagret ved -70ºC og ankelledd ble konservert i formalin.
For selekterte grupper, ble ankelledd lagret i parafin og seksjonert. Ankelleddseksjoner ble deretter anvendt for histopatologisk evaluering av sykdomsprogresjon.
Resultater er beskrevet i Figur 59.
Eksempel 62: Effekt av formatering på effekt av et anti-TNF-D Nanobody i forebygging av kronisk polyartritt
Transgene muselinjer som bærer og som uttrykker et 3'-modifisert human tumor nekrose faktor (hTNF-alfa, cachectin) transgen ble anvendt som en modell for å studere effekten av et anti-TNF-D Nanobody formatert på forskjellige måter i forebyggingen av kronisk polyartritt (EMBO J. 10, 4025-4031). Disse musene har vist seg å utvikle kronisk polyartritt med 100% forekomst ved fire til syv ukers alder.
Fra treukersalderen, ble kull av transgene mus delt inn i grupper på åtte dyr. Før studiet ble initialisert, ble gjennomsnitt kroppsvekt beregnet for hver gruppe. Fra da av, ble dyrevekter registrert i løpet av hele studiet en gang i uken for hver gruppe.
For å studere effekten av et anti-TNF-D Nanobody i forskjellige formater for forebygging av kronisk polyartritt, ble intraperitoneale injeksjoner gitt to ganger i uken til hvert dyr av en spesiell gruppe i følge det følgende skjema:
-Gruppe 1 (negativ kontroll): fosfatbufret saltløsning (PBS) (formuleringsbuffer) -Gruppe 2 (Nanobody format 1): TNF60 med en endelig dose på 10 mg/kg -Gruppe 3 (Nanobody format 1): TNF60 med en endelig dose på 2.5 mg/kg -Gruppe 4 (Nanobody format 1): TNF60 med en endelig dose på 1 mg/kg -Gruppe 5 (Nanobody format 2): TNF56-PEG40 med en endelig dose på 10 mg/kg
-Gruppe 6 (Nanobody format 2): TNF56-PEG40 med en endelig dose på 1.8 mg/kg
-Gruppe 7 (Nanobody format 2): TNF56-PEG40 med en endelig dose på 0.7 mg/kg
-Gruppe 8 (Nanobody format 3): TNF56-biot med en endelig dose på 1.8 mg/kg -Gruppe 9 (Nanobody format 4): TNF30 med en endelig dose på 1 mg/kg -Gruppe 10 (Nanobody format 5): TNF1 med en endelig dose på 1 mg/kg -Gruppe 11 (1. positiv kontroll): Enbrel med en endelig dose på 10 mg/kg -Gruppe 12 (2. positiv kontroll): Remicade med en endelig dose på 10 mg/kg For hver gruppe, ble datoer for injeksjon og injeksjonsvolum notert.
Injeksjoner fortsatte i syv uker. I løpet av denne perioden, ble kliniske skår registrert ved å observere makroskopiske forandringer i leddmorfologi for hvert dyr.
Ved 10 ukers alder, ble alle mus ofret og sera og ledd ble samlet inn. Sera ble lagret ved -70ºC og ankelledd ble konservert i formalin.
For utvalgte grupper, ble ankelledd lagret i parafin og seksjonert. Ankelleddseksjoner ble deretter anvendt for histopatologisk evaluering av sykdomsprogresjon.
Resultater er beskrevet i Figur 60.
Eksempel 63: Farmakokinetisk studie av anti-TNF-D Nanobodies TNF60 (TNF60) og TNF56-PEG40 i rhesus ape
Fangenskap-avlede rhesus aper (Macaca mulatta) er anvendt til å bestemme den farmakokinetisk profilen av TNF60 og TNF56-PEG40.
Seksten dyr er anvendt i dette studiet (åtte hanner og åtte hunner) og er delt inn i fire grupper (to hanner og to hunner per gruppe). All dyr veide omtrentlig 5 kg og er sykdom-frie i minst seks uker før anvendelse. Sniff<® >Pri vegetarisk V3994 tjener som føde. Seksti g/kg k.v. er tilbudt til hver ape. Residiet er fjernet. Ved faste intervaller (minst to ganger i året) er maten analysert basert på EPA/USA for kontaminanter av LUFA-ITL. Springvann er tilbudt ad libitum. Dyret i hver behandlingsgruppe er huset i en blokk av flere tilstøtende bur innen apeenheten. Apene blir holdt hver for seg i V2A stålbur med en størrelse på 90 cm x 82 cm x 96 cm. Romtemperaturen er opprettholdt ved 23°C ± 3°C (maksimumsområde) og den relative fuktighet på 60% ± 20% (maksimumsområde). Avvik fra maksimumsområdet forårsaket for eksempel under rengjøringsprosedyre er behandlet i SOPer. Rommene er belyst og mørklagt i perioder av 12 timer hver.
To grupper er infusert med TNF60 og to grupper er infusert med TNF56-PEG40. Intravenøse infusjoner av TNF60 og TNF56-PEG40 (løst opp i PBS ) inn i vena cephalica til den høyre eller venstre armen ved å anvende intravenøse katetere og en TSE infusjonspumpe (se under) er gitt med en fiksert dose på 2 mg/kg.
Fire enkle administreringer er utført, separert av en utvaskingsperiode på minst fjorten dager. Etter den siste administreringen er oppfølgingsperioden minst åtte uker. To av de fire gruppene er behandlet med TNF60 eller TNF56-PEG40 i kombinasjon med methotrexat (MTX) (løst opp i PBS ). Gruppe 2 er behandlet med TNF60 og MTX; gruppe 4 er behandlet med TNF56-PEG40 og MTX. MTX er dosert ukentlig intramuskulært ved 0.2 mg/kg. På administrasjonsdagene, er MTX gitt omtrentlig 30 minutter før administrering. Dosering starter ved den første Nanobodyadministreringen og vil fortsette gjennom hele den åtte uker utvaskingen etter den fjerde dosen. Det er fjorten enkle MTX administreringer, separert av en utvaskingsperiode på minst en uke som starter ved den første testartikkel administreringen.
Eksempel 64: Synovium-avledete fibroblaststudier
I dette studiet ble evnen til de anti-TNF biologiske midlene, ALX0071 og Etanercept, til å attenuere TNFa-indusert IL-6 produksjon ved RA-synovium avledete fibroblaster vurdert.
Isolering av synoviale fibroblaster
Synovialt leddvev fra samtykkende RA pasienter ble lagret i DMEM-basert medium med antibiotika ved 4°C i opptil 96 timer etter leddutskiftingskirurgi. Synoviale celler ble isolert fra dissekert synovium ved collagenasefordøyning ved 37 °C i 2 timer. Den resulterende cellesuspensjonen ble deretter vasket ved en serie av sentrifugerings- og resuspensjons-trinn og de resulterende cellene deretter dyrket ved 37 °C i DMEM-basert kulturmedium supplert med 10% FCS (v/v). De resulterende fibroblastene ble anvendt for det følgende eksperimentet ved enten den andre eller tredje passasjen. Celler fra fire donorer ble anvendt i individuelle eksperimenter. Fibroblaster ble sådd inn i 96-brønners flatbunnete polystyrenplater ved 1.5 x10<4 >celler i et sluttvolum på 250 μl av DMEM-basert kulturmedium supplert med 10% FCS (v/v) per brønn og dyrket overnatt.
Stimulering av synoviale fibroblaster
Celler ble deretter inkubert i 72 timer i DMEM-basert kulturmedium supplert med TNFa ved 50 ng per ml (3 nM (R&D Systems 210-TA/CF) alene eller i nærvær av økende doser av ALX0071 (0.575 til 1920 ng per ml_; 0.015 til 50 nM) eller Etanercept (Wyeth Labs; 3.75 til 11250 ng per mL; 0.025 til 75 nM). Sluttvolumet i hver brønn ble 250 μL og hver vurdering ble utført i triplett. Etter 72 timer, ble supernatantmediet fjernet og lagret ved -40 °C før analyse med IL-6 ELISA (R&D Systems). Inhiberingen av TNFa-indusert IL-6 produksjon ble bestemt og IC50 verdier ble beregnet for både ALX0071 og Etanercept.
Oppsummering av resultater
Både ALX10071 og Etanercept dose-avhengig reduserte TNF-indusert IL-6 produksjon av RA synovium avledete fibroblaster fra alle fire donorer. Det ble en lignende potens mellom de to reagensene under disse assayforholdene.
Eksempel 65: Murine Luftlommestudier
I dette studiet ble evnen til de anti-TNF biologiske midlene, ALX0071 og Etanercept, til å attenuere TNFD-indusert celleinfiltrering inn i en murin luftlomme vurdert.
Skaping av Luftlomme
Luftlommer ble dannet ved den sub-kutane (s.c.) injeksjonen av 2.5mL av steril luft inn i den dorsale overflaten til anestetiserte hann C57Bl/6/J mus (25-30g, Harlan). Lommen ble blåst opp igjen ved å injisere 2.5 ml steril luft 3 dager senere.
TNFα stimulering
Seks dager etter den initielle skapelsen av luftlommen, ble dyret anestetisert og lommen injisert med 1 ml av 0.5% KarboksyMetylCellulose (CMC) hjelpemiddel som inneholdt 0.1 Pg rekombinant humant TNFD (R & D Systems, 210-TA-050/CF). I tre andre grupper av dyr, ble ALX0071 (0.0625, 0.125 og 0.25 mg/kg) injisert s.c.19 timer før injeksjonen av TNFD. Tre andre grupper av dyr ble injisert (s.c.) med Etanercept (Wyeth Labs, 0.125, 0.25 og 0.5 mg/kg) umiddelbart før injeksjonen av TNFD.
24 timer etter TNFD injeksjon, ble mus skilt ut med en økende konsentrasjon av CO2. Lommer ble skylt med 2 ml iskald endotoksinfri steril PBS som inneholdt 5 IU/ml heparin. Volum ble registrert og 0.5 ml alikvoter ble separert for telling av den total hvite blodcelle (WBC) populasjonen på en Sysmex XT-Vet celleteller. Gjennomsnitt og standard error av gjennomsnitt (SEM) totale WBC tellinger for hver gruppe ble beregnet per ml av skyllevæske trukket fra. Statistisk analyse var ved ANOVA med Kruskal-Wallis post-test på utransformerte data.
Sammendrag av resultater
Både ALX0071 og Etanercept attenuerte den TNFD-induserte WBC infiltreringen inn i luftlommene (Table). Mens denne attenueringen nådde statistisk signifikans med både 0.125 (P<0.01) og 0.25 mg/kg (P<0.05) ALX0071 dosegruppene, ble ikke statistisk signifikans observert med noen av Etanercept dosegruppene.
Tabell 8
Tabell 9
Tabell 10
Tabell 11
Tabell 12
Tabell 13
Tabell 14
Tabell 15
Tabell 16
assay : L929s Act D (5000c/w) TNF : humant TNFa @ Q.5ng/ml
assay : L929s Act D (5000c/w) TNF : rhesus TNFa @ 0.5ng/ml
Tabell 17
Tabell 18
Tabell 19
Tabell 20
Tabell 21
Tabell 22
Tabell 23
assay : L929s Act D (5000c/w) TNF : humant TNFa @ 0.5ng/ml
assay : L929s Act D (5000c/w) TNF : rhesus TNFa @ 0.5ng/ml
Tabell 24
Tabell 25
Tabell 26
Tabell 27
assay : L929s Act D (5000c/w) TNF : humant TNFa @ 0.5ng/ml
Tabell 28
Tabell 29
Tabell 30
Tabell 31
Tabell 32
assay : L929s Act D (5000c/w) TNF : humant TNFa @ 0.5ng/ml
Tabell 33
Tabell 34
Tabell 35
Tabell 36
Tabell 37
assay : L929s Act D (5000c/w)
TNF : humant TNFa @ 0.5ng/ml
R l ti t
Tabell 38
Tabell 39
assay : alphaKYM (10000c/w) TNF : humant TNFa @ 1ng/ml
Resultater fra WO 04/41862
Tabell 40
Tabell 41
Tabell 42
5 Tabell 43
Tabell 44
Tabell 45
5
Tabell 46
Tabell 47
*P<0.05, *P<0.01 vs 0.1 Pg humant TNFD
De som er dyktige i faget vil anerkjenne, eller være i stand til å få rede på ved å ikke anvende mer enn rutineeksperimentering, mange ekvivalenter til de spesifikke utførelsesformene av den foreliggende oppfinnelsen beskrevet heri. Slike ekvivalenter er ment å være omfattet av de følgende kravene.
All referanser beskrevet heri er inkorporert som referanse i sin helhet.

Claims (18)

Patentkrav
1. Aminosyresekvens som er en immunoglobulinsekvens som er i stand til å binde seg til humant serum albumin og som består av 4 rammeverkområder, henholdsvis FR1 til FR4, og 3 komplementære bestemmende områder, henholdsvis CDR1 til CDR3, hvor (i) CDR1 innbefatter eller er aminosyresekvensen SFGMS; CDR2 innbefatter eller er aminosyresekvensen SISGSGDTLYADSVKG: CDR3 innbefatter eller er aminosyresekvensen GGSLSR og hvor (ii) aminosyresekvensen har minst 90%, mer foretrukket minst 95%, enda mer foretrukket minst 99% sekvensidentitet med minst en av aminosyresekvensene SQ ID NO 52 og 57 til 64; og
(iii) aminosyresekvensen er sekvensen PMP6A6 i henhold til SEQ ID NO: 52, eller en humanisert variant av sekvensen PMP6A6 i henhold til SEQ ID NO: 52.
2. Aminosyresekvens i henhold til krav 1, som er en humanisert variant av sekvensen PMP6A6 i henhold til SEQ ID NO: 52.
3. Aminosyresekvens i henhold til krav 2, som er valgt fra gruppen bestående av klonene ALB 3 i henhold til SEQ ID NO: 57; ALB4 i henhold til SEQ ID NO: 58; ALB5 i henhold til SEQ ID NO: 59; ALB6 i henhold til SEQ ID NO: 60; ALB7 i henhold til SEQ ID NO: 61; ALB8 i henhold til SEQ ID NO: 62; ALB9 i henhold til SEQ ID NO: 63; og ALB10 i henhold til SEQ ID NO: 64.
4. Aminosyresekvens i henhold til krav 3, som er ALB8 i henhold til SEQ ID NO: 62.
5. Aminosyresekvens i henhold til krav 1 eller 2, som er et enkeltdomene antistoff eller et nanolegeme.
6. Fusjonsprotein eller konstrukt, som innbefatter en aminosyresekvens i henhold til hvilke som helst av kravene 1-5 og minst en terapeutisk gruppe.
7. Fusjonsprotein eller konstrukt i henhold til krav 6, hvor
aminosyresekvensen i henhold til hvilke som helst av kravene 1-5 er enten direkte koblet til minst en terapeutisk gruppe eller er koblet med minst en terapeutisk gruppe via en linker eller spacer.
8. Fusjonsprotein eller konstrukt i henhold til krav 6 eller 7, hvor den terapeutiske gruppen innbefatter en immunoglobulin sekvens eller et fragment derav.
9. Fusjonsprotein eller konstrukt i henhold til krav 8, hvor den terapeutiske gruppen innbefatter det domene antistoff, fortrinnsvis et enkeltdomene antistoff.
10. Multivalent og multispesifikt nanolegeme konstrukt, innbefattende minst en aminosyresekvens i henhold til hvilke som helst av kravene 1-5 som er et nanolegeme og minst et ytterligere nanolegeme.
11. Multivalent og multispesifikt nanolegeme konstrukt i henhold til krav 10, hvor aminosyresekvensen i henhold til hvilke som helst av kravene 1-5 som er et nanolegeme som er enten direkte koblet til minst et ytterligere nanolegeme eller er koblet til det minst ene nanolegeme via en linker eller spacer.
12. Multivalent og multispesifikt nanolegeme konstrukt i henhold til krav 11, hvor aminosyresekvensen i henhold til hvilke som helst av kravene 1-5 som er et nanolegeme, er koblet til minst et ytterligere nanolegeme via en linker eller spacer, og hvor linkeren er en aminosyresekvens.
13. Nukleotid sekvens eller nukleinsyre som koder en aminosyresekvens, fusjonsprotein eller konstrukt i henhold til hvilke som helst av kravene 1-12.
14. Vert eller vertsceller som inneholder en nukleotid sekvens eller nukleinsyre i henhold til krav 13, og/eller som uttrykker eller i stand til å utrykke, en aminosyresekvens, fusjonsprotein eller konstrukt i henhold til hvilke som helst av kravene 1-12.
15. Fremgangsmåte for fremstilling av en aminosyresekvens, fusjonsprotein eller konstrukt i henhold til hvilke som helst av kravene 1-12, hvilken fremgangsmåte innbefatter kultivering eller opprettholdelse av en vertscelle som beskrevet her under betingelser slik at nevnte vertsceller produserer eller uttrykker en aminosyresekvens, fusjonsprotein eller konstrukt i henhold til hvilke som helst av kravene 1-12, og eventuelt ytterligere innbefatter isolering av aminosyresekvensen, fusjonsproteinet eller konstruktet fremstilt slik.
16. Farmasøytisk sammensetning som innbefatter minst en aminosyresekvens, fusjonsprotein eller konstrukt i henhold til hvilke som helst av kravene 1-13, og eventuelt minst en farmasøytisk akseptabel bærer, fortynningsmiddel eller eksipient.
17. En aminosyresekvens i henhold til hvilke som helst av kravene 1 til 5 for anvendelse som en fusjonspartner for å øke halveringstiden til terapeutiske grupper.
18. .
NO20161028A 2005-05-18 2016-06-17 Aminosyresekvens, fusjonsprotein eller konstrukt inneholdende denne aminosyresekvensen, samt fremgangsmåte for fremstilling av aminosyresekvensen. NO345340B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US68233205P 2005-05-18 2005-05-18
PCT/EP2006/004678 WO2006122786A2 (en) 2005-05-18 2006-05-17 Improved nanobodies™ against tumor necrosis factor-alpha

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20161028A1 NO20161028A1 (no) 2007-11-19
NO345340B1 true NO345340B1 (no) 2020-12-21

Family

ID=36954329

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20075853A NO338568B1 (no) 2005-05-18 2007-11-14 Forbedrede nanolegemer (NanobodiesTM) mot tumor necrosis faktor-alfa
NO20161028A NO345340B1 (no) 2005-05-18 2016-06-17 Aminosyresekvens, fusjonsprotein eller konstrukt inneholdende denne aminosyresekvensen, samt fremgangsmåte for fremstilling av aminosyresekvensen.

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20075853A NO338568B1 (no) 2005-05-18 2007-11-14 Forbedrede nanolegemer (NanobodiesTM) mot tumor necrosis faktor-alfa

Country Status (30)

Country Link
US (6) US8188223B2 (no)
EP (7) EP2949668B1 (no)
JP (4) JP5047950B2 (no)
KR (1) KR101308771B1 (no)
CN (2) CN103254309B (no)
AT (2) ATE537188T1 (no)
AU (1) AU2006249144B2 (no)
BR (2) BRPI0609224B1 (no)
CA (2) CA2962819C (no)
CR (1) CR9519A (no)
CY (1) CY1122672T1 (no)
DK (3) DK1888640T3 (no)
EC (1) ECSP077910A (no)
ES (3) ES2379283T3 (no)
HK (2) HK1113685A1 (no)
HU (1) HUE045710T2 (no)
IL (3) IL186941A (no)
LT (1) LT2949668T (no)
MX (3) MX363423B (no)
NI (1) NI200700291A (no)
NO (2) NO338568B1 (no)
NZ (1) NZ562695A (no)
PL (3) PL1888640T3 (no)
PT (2) PT2949668T (no)
RU (2) RU2464276C2 (no)
SG (2) SG184709A1 (no)
SI (3) SI2949668T1 (no)
TW (2) TWI439467B (no)
WO (2) WO2006122786A2 (no)
ZA (3) ZA200709867B (no)

Families Citing this family (276)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005289809A (ja) * 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
US9321832B2 (en) * 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
US9453251B2 (en) 2002-10-08 2016-09-27 Pfenex Inc. Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens
EP1900753B1 (en) 2002-11-08 2017-08-09 Ablynx N.V. Method of administering therapeutic polypeptides, and polypeptides therefor
US9320792B2 (en) 2002-11-08 2016-04-26 Ablynx N.V. Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof
US20060034845A1 (en) 2002-11-08 2006-02-16 Karen Silence Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor
BRPI0513826A2 (pt) 2004-07-26 2010-06-22 Dow Global Technologies Inc processo para expressão de proteìna melhorada através de engenharia de cepa
EP2949668B1 (en) 2005-05-18 2019-08-14 Ablynx N.V. Improved nanobodies tm against tumor necrosis factor-alpha
DE102005023617A1 (de) * 2005-05-21 2006-11-23 Aspre Ag Verfahren zum Mischen von Farben in einem Display
US20070269422A1 (en) * 2006-05-17 2007-11-22 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
EP2069402A2 (en) * 2006-09-08 2009-06-17 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
AU2007306340A1 (en) 2006-10-11 2008-04-17 Ablynx N.V. Amino acid sequences that bind to serum proteins in a manner that is essentially independent of the pH, compounds comprising the same, and use thereof
CA2672386A1 (en) * 2006-12-13 2008-06-19 Ablynx N.V. Polypeptides specific for complexes involved in receptor-mediated signaling, such as the il-6/il-6 receptor complex
WO2008071447A2 (en) * 2006-12-15 2008-06-19 Ablynx N.V. Amino acid sequences that modulate the interaction between cells of the immune system
EP2514767A1 (en) 2006-12-19 2012-10-24 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against a metalloproteinase from the ADAM family and polypeptides comprising the same for the treatment of ADAM-related diseases and disorders
US9512236B2 (en) 2006-12-19 2016-12-06 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against GPCRS and polypeptides comprising the same for the treatment of GPCR-related diseases and disorders
WO2008074839A2 (en) 2006-12-19 2008-06-26 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against gpcrs and polypeptides comprising the same for the treatment of gpcr-related diseases and disorders
EP2101801A1 (en) * 2006-12-20 2009-09-23 Ablynx N.V. Oral delivery of polypeptides
US20110118185A9 (en) * 2007-02-21 2011-05-19 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against vascular endothelial growth factor and polypeptides comprising the same for the treatment of conditions and diseases characterized by excessive and/or pathological angiogenesis or neovascularization
CN101688213A (zh) 2007-04-27 2010-03-31 陶氏环球技术公司 用于快速筛选微生物宿主以鉴定某些在表达异源蛋白质方面具有改善的产量和/或质量的菌株的方法
US9580719B2 (en) 2007-04-27 2017-02-28 Pfenex, Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
RU2481355C2 (ru) * 2007-05-24 2013-05-10 Аблинкс Н.В. Аминокислотные последовательности, направленные на rank-l, и полипептиды, включающие их, для лечения заболеваний и нарушений костей
JP5240870B2 (ja) 2007-07-03 2013-07-17 アブリンクス エン．ヴェー． 改善した免疫グロブリン配列を提供する方法
ES2667729T3 (es) 2007-09-26 2018-05-14 Ucb Biopharma Sprl Fusiones de anticuerpos con doble especificidad
JP2011504740A (ja) 2007-11-27 2011-02-17 アブリンクス エン．ヴェー． ヘテロ二量体サイトカイン及び／又はこれらの受容体に指向性を有するアミノ酸配列、並びにこれを含むポリペプチド
DE112009000507T5 (de) 2008-03-05 2011-02-10 Ablynx Nv Neue Antigen-bindende Dimerkomplexe, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung
GB0809069D0 (en) 2008-05-19 2008-06-25 Univ Leuven Kath Gene signatures
EP2260058A2 (en) 2008-04-07 2010-12-15 Ablynx N.V. Single variable domains against the notch pathways
CA2721202A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Hilde Adi Pierrette Revets Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
US8444976B2 (en) 2008-07-02 2013-05-21 Argen-X B.V. Antigen binding polypeptides
EP2334705B1 (en) 2008-09-26 2016-12-14 UCB Biopharma SPRL Biological products
MX345226B (es) * 2008-10-29 2017-01-20 Ablynx Nv Formulaciones de moleculas de union a antigeno de dominio sencillo.
AU2013202856B2 (en) * 2008-10-29 2016-02-11 Ablynx N.V. Formulations of single domain antigen binding molecules
MX2011004558A (es) * 2008-10-29 2011-06-01 Wyeth Llc Procedimientos para la purificacion de moleculas de union a antigeno de un unico dominio.
US20160095939A1 (en) 2014-10-07 2016-04-07 Immunomedics, Inc. Neoadjuvant use of antibody-drug conjugates
US9265834B2 (en) * 2009-03-05 2016-02-23 Ablynx N.V. Stable formulations of polypeptides and uses thereof
US10005830B2 (en) 2009-03-05 2018-06-26 Ablynx N.V. Antigen binding dimer-complexes, methods of making/avoiding and uses thereof
JP5647222B2 (ja) 2009-04-10 2014-12-24 アブリンクス エン．ヴェー． Ｉｌ−６ｒ関連疾患及び障害の治療のためのｉｌ−６ｒに指向性を有する改善されたアミノ酸配列及びこれを含むポリペプチド
ES2864956T3 (es) 2009-04-30 2021-10-14 Ablynx Nv Procedimiento para la producción de anticuerpos de dominio
US8945567B2 (en) 2009-06-05 2015-02-03 Ablynx N.V. Monovalent, bivalent and trivalent anti human respiratory syncytial virus (HRSV) nanobody constructs for the prevention and/or treatment of respiratory tract infections
ES2804450T3 (es) 2009-07-10 2021-02-08 Ablynx Nv Método para la producción de dominios variables
US9884117B2 (en) 2009-09-03 2018-02-06 Ablynx N.V. Stable formulations of polypeptides and uses thereof
GB201005063D0 (en) 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
UY32917A (es) 2009-10-02 2011-04-29 Boehringer Ingelheim Int Moléculas de unión a dll-4
UY32920A (es) 2009-10-02 2011-04-29 Boehringer Ingelheim Int Moleculas de unión biespecíficas para la terapia anti-angiogénesis
EP2507262A1 (en) 2009-11-30 2012-10-10 Ablynx N.V. Improved amino acid sequences directed against human respiratory syncytial virus (hrsv) and polypeptides comprising the same for the prevention and/or treatment of respiratory tract infections
US8962807B2 (en) 2009-12-14 2015-02-24 Ablynx N.V. Single variable domain antibodies against OX40L, constructs and therapeutic use
WO2011083141A2 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Ablynx Nv Method for generation of immunoglobulin sequences by using lipoprotein particles
CN102781959A (zh) 2010-02-05 2012-11-14 埃博灵克斯股份有限公司 能够结合血清白蛋白的肽和包含所述肽的化合物、构建体和多肽
US9120855B2 (en) 2010-02-10 2015-09-01 Novartis Ag Biologic compounds directed against death receptor 5
PL2533761T3 (pl) 2010-02-11 2019-09-30 Ablynx N.V. Sposoby i kompozycje do wytwarzania aerozoli
EP2533814A2 (en) 2010-02-11 2012-12-19 Ablynx N.V. Delivery of immunoglobulin variable domains and constructs thereof
JP5826194B2 (ja) 2010-03-03 2015-12-02 アブリンクス ナームローゼ フェンノートシャップ 二パラトープ性ａ−ベータ結合ポリペプチド
US8937164B2 (en) 2010-03-26 2015-01-20 Ablynx N.V. Biological materials related to CXCR7
US9556273B2 (en) 2010-03-29 2017-01-31 Vib Vzw Anti-macrophage mannose receptor single variable domains for targeting and in vivo imaging of tumor-associated macrophages
US9101674B2 (en) 2010-03-29 2015-08-11 Vib Vzw Targeting and in vivo imaging of tumor-associated macrophages
NZ603570A (en) 2010-05-20 2014-12-24 Ablynx Nv Biological materials related to her3
WO2011161263A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Ablynx Nv Pharmaceutical compositions for cutaneous administration
WO2012007880A2 (en) 2010-07-16 2012-01-19 Ablynx Nv Modified single domain antigen binding molecules and uses thereof
US20120225081A1 (en) 2010-09-03 2012-09-06 Boehringer Ingelheim International Gmbh Vegf-binding molecules
US11644471B2 (en) 2010-09-30 2023-05-09 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
EP2621953B1 (en) 2010-09-30 2017-04-05 Ablynx N.V. Biological materials related to c-met
EP2632946B1 (en) 2010-10-29 2017-12-06 Ablynx N.V. Method for the production of immunoglobulin single variable domains
TWI619811B (zh) 2010-11-08 2018-04-01 諾華公司 趨化細胞素受體結合多肽
CN103459415B (zh) 2010-11-26 2021-04-09 分子组合公司 设计的与血清白蛋白结合的重复蛋白
EP2691418A1 (en) * 2011-03-28 2014-02-05 Ablynx N.V. Bispecific anti-cxcr7 immunoglobulin single variable domains
DK2691415T3 (en) 2011-03-28 2018-10-29 Ablynx Nv PROCEDURE FOR PREPARING SOLID FORMULATIONS CONTAINING VARIABLE SINGLE DOMAINS OF IMMUNOGLOBULIN
JP6130350B2 (ja) * 2011-03-30 2017-05-17 アブリンクス エン．ヴェー． ＴＮＦαに対する単一ドメイン抗体で免疫障害を処置する方法
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
US20130078247A1 (en) * 2011-04-01 2013-03-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to dii4 and ang2
UA117218C2 (uk) 2011-05-05 2018-07-10 Мерк Патент Гмбх Поліпептид, спрямований проти il-17a, il-17f та/або il17-a/f
US9534039B2 (en) 2011-05-09 2017-01-03 Ablynx N.V. Method for the production of immunoglobulin single variable domains
CN103732625A (zh) 2011-05-27 2014-04-16 埃博灵克斯股份有限公司 使用rankl结合肽抑制骨质吸收
JP2014525736A (ja) 2011-06-23 2014-10-02 アブリンクス エン．ヴェー． ＩｇＥに対する免疫グロブリン単一可変ドメイン
EP2974737A1 (en) 2011-06-23 2016-01-20 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing a specific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
IL229503B (en) * 2011-06-23 2022-06-01 Ablynx Nv Techniques for predicting, detecting and reducing interference of a-specific protein in tests involving single variable domains of immunoglobulin
HUE047238T2 (hu) * 2011-06-23 2020-04-28 Ablynx Nv Szérumalbuminhoz kötõdõ fehérjék
EP4350345A2 (en) 2011-06-23 2024-04-10 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobin single variable domains
EP2758434A2 (en) 2011-09-23 2014-07-30 Technophage, Investigação E Desenvolvimento Em Biotecnologia, SA Anti-tumor necrosis factor-alpha agents and uses thereof
WO2013041722A1 (en) 2011-09-23 2013-03-28 Ablynx Nv Prolonged inhibition of interleukin-6 mediated signaling
US9346884B2 (en) 2011-09-30 2016-05-24 Ablynx N.V. Biological materials related to c-Met
JP6219287B2 (ja) 2011-09-30 2017-10-25 アブリンクス エン．ヴェー． ｃ−Ｍｅｔに関連する生物学的物質
CN108610421B (zh) 2012-02-27 2022-08-19 阿布林克斯有限公司 Cx3cr1结合多肽
EP2831111B1 (en) 2012-03-30 2019-03-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Ang2-binding molecules
US20130302250A1 (en) 2012-05-07 2013-11-14 The University Court Of The University Of Aberdeen Single domain binding molecule
US9328174B2 (en) 2012-05-09 2016-05-03 Novartis Ag Chemokine receptor binding polypeptides
WO2013172967A1 (en) 2012-05-17 2013-11-21 Extend Biosciences, Inc Carriers for improved drug delivery
CA2874309C (en) 2012-05-24 2021-06-15 Vib Vzw Anti-macrophage mannose receptor single variable domains for targeting and in vivo imaging of tumor-associated macrophages
RU2530553C2 (ru) * 2012-11-07 2014-10-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Рекомбинантное однодоменное антитело, способное специфически связывать фактор некроза опухолей человека, и его производные
US9315280B2 (en) * 2012-11-20 2016-04-19 Lockheed Martin Corporation Heat pipe with axial wick
WO2014087010A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Ablynx N.V. IMPROVED POLYPEPTIDES DIRECTED AGAINST IgE
EP2931749B1 (fr) 2012-12-17 2019-04-24 Laboratoire Francais du Fractionnement et des Biotechnologies Societe Anonyme Utilisation d'anticorps monoclonaux pour le traitement de l'inflammation et d'infections bacteriennes
WO2014111550A1 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Modified anti-serum albumin binding proteins
CN112858672A (zh) 2013-01-30 2021-05-28 弗拉芒区生物技术研究所 用于筛选和药物发现目的的新型嵌合多肽
EP2953973B1 (en) 2013-02-05 2019-07-10 VIB vzw Muscarinic acetylcholine receptor binding agents and uses thereof
EP2956480B1 (en) 2013-02-13 2019-09-04 Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies Highly galactosylated anti-tnf-alpha antibodies and uses thereof
CN105358577A (zh) 2013-02-13 2016-02-24 法国化学与生物科技实验室 具有经修饰的糖基化的西妥昔单抗及其用途
CA2900912A1 (en) 2013-02-13 2014-08-21 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Highly galactosylated anti-her2 antibodies and uses thereof
USRE48805E1 (en) 2013-03-06 2021-11-02 Vision Global Holdings Ltd. Method for cancer targeting treatment and detection of arginine using albumin-binding arginine deiminase fusion protein
US9255262B2 (en) 2013-03-06 2016-02-09 Vision Global Holdings Ltd. Albumin-binding arginine deminase and the use thereof
JP6457999B2 (ja) 2013-03-14 2019-01-23 ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション 処置に関してがんの対象を識別するためのｃｄ３６の使用
CA2906259C (en) 2013-03-15 2022-12-06 Vib Vzw Anti-mmr single variable domains for prognosis and monitoring of cardiovascular diseases
DK2989203T3 (da) 2013-04-23 2020-02-17 The Univ Court Of The Univ Of Aberdeen Syntetisk bibliotek for specifikke bindingsmolekyler
NL1040254C2 (en) 2013-05-17 2014-11-24 Ablynx Nv Stable formulations of immunoglobulin single variable domains and uses thereof.
AU2014340449B2 (en) 2013-10-21 2019-10-31 Takeda Pharmaceutical Company Limited Diagnosis and treatment of autoimmune diseases
AU2015217846B2 (en) 2014-01-30 2019-10-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Opioid receptor binding agents and uses thereof
BR112016022055A2 (pt) * 2014-03-26 2017-10-24 Cell Medica Switzerland Ag elementos de ligação ao tnf alfa
US20170045513A1 (en) 2014-04-24 2017-02-16 Immusant, Inc. Methods of diagnosing celiac disease using ip-10
SG10201805288QA (en) * 2014-05-16 2018-07-30 Ablynx Nv Improved immunoglobulin variable domains
US20170088896A1 (en) 2014-05-16 2017-03-30 Children's Hospital Medical Center d/b/a Cincinnati Children's Hospital, Medical Center Methods for assessing responsiveness to asthma treatment based on vnn-1 expression and promoter methylation
ES2815572T3 (es) 2014-05-16 2021-03-30 Ablynx Nv Dominios variables de inmunoglobulina
AU2015261467B2 (en) 2014-05-16 2020-12-17 Ablynx Nv Methods for detecting and/or measuring anti-drug antibodies, in particular treatment-emergent anti-drug antibodies
NL2013661B1 (en) 2014-10-21 2016-10-05 Ablynx Nv KV1.3 Binding immunoglobulins.
EP3194976B1 (en) 2014-07-22 2020-04-01 Vib Vzw Methods to select agents that stabilize protein complexes
US20170224758A1 (en) 2014-10-17 2017-08-10 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods of treating muscular dystrophy
US9789197B2 (en) 2014-10-22 2017-10-17 Extend Biosciences, Inc. RNAi vitamin D conjugates
EP3220961B1 (en) 2014-10-22 2023-07-05 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin d conjugates
WO2016065052A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin d conjugates
US20170267784A1 (en) 2014-10-23 2017-09-21 Singh Molecular Medicine, Llc Single domain antibodies directed against intracellular antigens
LT3590962T (lt) 2014-10-23 2021-12-27 Singh Molecular Medicine, Llc Vieno domeno antikūnai, nukreipti prieš viduląstelinius antigenus
CA2969463A1 (en) 2014-12-09 2016-06-16 New York University Clostridial neurotoxin fusion proteins, propeptide fusions, their expression, and use
US11426468B2 (en) 2014-12-19 2022-08-30 Ablynx N.V. Cysteine linked nanobody dimers
BR112017020275A8 (pt) 2015-03-31 2023-01-31 Sorriso Pharmaceuticals Inc Polipeptídeos
AU2016240220B2 (en) 2015-04-02 2019-11-21 Molecular Partners Ag Designed ankyrin repeat domains with binding specificity for serum albumin
CA2981543A1 (en) 2015-04-22 2016-10-27 Immunomedics, Inc. Isolation, detection, diagnosis and/or characterization of circulating trop-2-positive cancer cells
US11046767B2 (en) 2015-05-13 2021-06-29 Ablynx N.V. T cell recruiting polypeptides based on CD3 reactivity
AU2016259792B2 (en) 2015-05-13 2019-07-25 Ablynx N.V. T cell recruiting polypeptides based on TCR alpha/beta reactivity
KR101997241B1 (ko) 2015-05-21 2019-07-09 하푼 테라퓨틱스, 인크. 삼중특이성 결합 단백질 및 사용 방법
GB201510758D0 (en) 2015-06-18 2015-08-05 Ucb Biopharma Sprl Novel TNFa structure for use in therapy
EP3313519B1 (en) 2015-06-29 2023-05-31 Children's Medical Center Corporation Jak-stat inhibitors for the treatment of congenital myopathies
EP3316885B1 (en) 2015-07-01 2021-06-23 Immunomedics, Inc. Antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker
US10746739B2 (en) 2015-09-14 2020-08-18 Leukemia Therapeutics, LLC Identification of novel diagnostics and therapeutics by modulating RhoH
TWI746473B (zh) 2015-11-02 2021-11-21 美商辛分子醫藥有限公司 針對細胞內抗原之單域抗體
NO2768984T3 (no) 2015-11-12 2018-06-09
PL3374392T3 (pl) 2015-11-13 2022-03-28 Ablynx Nv Ulepszone domeny zmienne immunoglobuliny wiążące albuminę surowicy
US10925969B2 (en) 2015-11-13 2021-02-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Service Anti-BCMA polypeptides and proteins
JO3739B1 (ar) 2015-11-18 2021-01-31 Merck Sharp & Dohme روابط ctla4
CA3003777A1 (en) 2015-11-18 2017-05-26 Merck Sharp & Dohme Corp. Pd1/ctla4 binders
JP7046804B2 (ja) * 2015-11-18 2022-04-04 アブリンクス エン．ヴェー． 改良された血清アルブミン結合剤
TW202216787A (zh) 2015-11-18 2022-05-01 美商默沙東藥廠 Pd1及／或 lag3結合劑
MX2018006377A (es) 2015-11-27 2018-09-05 Ablynx Nv Polipeptidos que inhiben cd40l.
ES2821099T3 (es) 2015-12-04 2021-04-23 Boehringer Ingelheim Int Gmbh & Co Kg Polipéptidos biparatópicos antagonistas de la señalización WNT en células tumorales
GB201522394D0 (en) * 2015-12-18 2016-02-03 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
JP6991979B2 (ja) 2016-02-05 2022-03-04 オリオニス バイオサイエンシズ ビーブイ Ｃｄ８結合物質
US10465003B2 (en) * 2016-02-05 2019-11-05 Janssen Biotech, Inc. Anti-TNF antibodies, compositions, methods and use for the treatment or prevention of type 1 diabetes
US11248057B2 (en) 2016-03-07 2022-02-15 Vib Vzw CD20 binding single domain antibodies
US20190127447A1 (en) 2016-05-02 2019-05-02 Ablynx N.V. Treatment of rsv infection
CN109563141A (zh) 2016-05-13 2019-04-02 奥里尼斯生物科学公司 对非细胞结构的治疗性靶向
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
JP7042467B2 (ja) 2016-05-20 2022-03-28 ハープーン セラピューティクス，インク． 単鎖可変フラグメントｃｄ３結合タンパク質
BR112018073739A2 (pt) * 2016-05-20 2019-02-26 Harpoon Therapeutics, Inc. proteína de ligação de albumina sérica de domínio único
RU2765809C2 (ru) 2016-06-23 2022-02-03 Аблинкс Н.В. Усовершенствованные фармакокинетические анализы для одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина
WO2018007442A1 (en) 2016-07-06 2018-01-11 Ablynx N.V. Treatment of il-6r related diseases
WO2018029182A1 (en) 2016-08-08 2018-02-15 Ablynx N.V. Il-6r single variable domain antibodies for treatment of il-6r related diseases
EP3512880A1 (en) 2016-09-15 2019-07-24 Ablynx NV Immunoglobulin single variable domains directed against macrophage migration inhibitory factor
EP3519438A1 (en) 2016-09-30 2019-08-07 VHsquared Limited Compositions
US11840569B2 (en) 2016-11-16 2023-12-12 Ablynx N.V. T cell recruiting polypeptides capable of binding CD123 and TCR alpha/beta
MX2019006045A (es) 2016-11-23 2019-11-11 Harpoon Therapeutics Inc Proteinas triespecificas dirigidas a psma y metodos de uso.
KR102275008B1 (ko) 2016-11-23 2021-07-13 하푼 테라퓨틱스, 인크. 전립선 특이 막 항원 결합 단백질
WO2018099968A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 Ablynx N.V. Treatment of infection by respiratory syncytial virus (rsv)
CA3045726A1 (en) * 2016-12-07 2018-06-14 Ablynx Nv Improved serum albumin binding immunoglobulin single variable domains
GB201621907D0 (en) 2016-12-21 2017-02-01 Ucb Biopharma Sprl And Sanofi Antibody epitope
CN107674122A (zh) * 2016-12-28 2018-02-09 天津天锐生物科技有限公司 一种识别人血清白蛋白的单域抗体
AU2018209151A1 (en) 2017-01-17 2019-07-25 Ablynx Nv Improved serum albumin binders
SG10202108973SA (en) 2017-01-17 2021-09-29 Ablynx Nv Improved serum albumin binders
MX2019009255A (es) 2017-02-06 2019-11-05 Orionis Biosciences Nv Proteínas quiméricas dirigidas y sus usos.
NZ756674A (en) 2017-02-16 2023-06-30 Sonnet Biotherapeutics Inc Albumin binding domain fusion proteins
BR112019017853A2 (pt) 2017-02-28 2021-04-27 Vib Vzw Meios e métodos para liberação oral de proteína
EP3589662A4 (en) 2017-02-28 2020-12-30 Harpoon Therapeutics, Inc. INDUCTIBLE MONOVALENT ANTIGBINDING PROTEIN
SG11201908154RA (en) * 2017-03-31 2019-10-30 Ablynx Nv Improved immunogenicity assays
CA3062238A1 (en) 2017-05-11 2018-11-15 Vib Vzw Glycosylation of variable immunoglobulin domains
US10543271B2 (en) 2017-05-12 2020-01-28 Harpoon Therapeutics, Inc. Mesothelin binding proteins
EP3621648A4 (en) 2017-05-12 2021-01-20 Harpoon Therapeutics, Inc. TRISPECIFIC PROTEINS MSLN AND METHOD OF USE
EP3630816B1 (en) 2017-05-31 2024-03-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Polypeptides antagonizing wnt signaling in tumor cells
JP2020521804A (ja) 2017-06-02 2020-07-27 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＭｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ Ｍｍｐ１３結合免疫グロブリン
TWI811220B (zh) 2017-06-02 2023-08-11 比利時商艾伯林克斯公司 結合聚集蛋白聚糖之免疫球蛋白
AU2018277343A1 (en) 2017-06-02 2020-01-02 Ablynx N.V. Adamts binding immunoglobulins
KR20200015912A (ko) 2017-06-02 2020-02-13 메르크 파텐트 게엠베하 Adamts5, mmp13 및 아그레칸 결합성 폴리펩타이드
CA3061053A1 (en) 2017-06-02 2018-12-06 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anti-cancer combination therapy
GB201710973D0 (en) 2017-07-07 2017-08-23 Avacta Life Sciences Ltd Scaffold proteins
KR102625929B1 (ko) 2017-07-19 2024-01-16 브이아이비 브이지더블유 혈청 알부민 결합제
US11136403B2 (en) 2017-10-13 2021-10-05 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific proteins and methods of use
EP3694871A4 (en) 2017-10-13 2021-11-10 Harpoon Therapeutics, Inc. B-CELL MATURATION ANTIG-BINDING PROTEINS
EP3704160A1 (en) 2017-10-31 2020-09-09 VIB vzw Novel antigen-binding chimeric proteins and methods and uses thereof
US20210070854A1 (en) * 2017-12-29 2021-03-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Antimicrobial nanobodies
EP3749295A4 (en) 2018-02-05 2022-04-27 Orionis Biosciences, Inc. FIBROBLAST BINDING AGENTS AND USES THEREOF
WO2019155041A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 Vib Vzw Gβγ COMPLEX ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2019165105A1 (en) * 2018-02-26 2019-08-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Ligands of the urokinase receptor and their use in treating, detecting, and imaging cancer
CA3092421A1 (en) 2018-03-01 2019-09-06 Vrije Universiteit Brussel Human pd-l1-binding immunoglobulins
WO2019204634A1 (en) * 2018-04-20 2019-10-24 Stc. Unm Rap1-gtp, rac1-gtp and fms-like tyrosine kinase 3 ligand (flt3-l) as biomarkers for early detection of sepsis
CN110613838A (zh) * 2018-06-19 2019-12-27 姜石松 增强细胞通透性的多肽及其应用
DE102018122275A1 (de) 2018-09-12 2020-03-12 Osram Opto Semiconductors Gmbh Lichtemittierendes bauteil und verfahren zum betreiben eines lichtemittierenden bauteils
JP7425049B2 (ja) 2018-09-25 2024-01-30 ハープーン セラピューティクス，インク． Ｄｌｌ３結合タンパク質および使用方法
EP3636657A1 (en) 2018-10-08 2020-04-15 Ablynx N.V. Chromatography-free antibody purification method
CN111138536B (zh) * 2018-11-06 2021-07-09 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 抗人血清白蛋白单域抗体的制备及其应用
CN111138537B (zh) * 2018-11-06 2021-07-09 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 一种抗人血清白蛋白抗体片段、制备方法和应用
GB201818460D0 (en) * 2018-11-13 2018-12-26 Crescendo Biologics Ltd Single domain antibodies that bind human serum albumin
CN111423509B (zh) * 2019-01-10 2021-07-09 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 抗hsa单域抗体及其融合蛋白的亲和层析纯化方法
CN109627334B (zh) * 2019-01-29 2020-07-17 康元医疗科技(大连)有限公司 一种纳米抗体、以该纳米抗体为配基的吸附剂及其用途
GB201901306D0 (en) 2019-01-30 2019-03-20 Immunocore Ltd Multi-domain binding molecules
CA3130663A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anticancer combination therapy
WO2020200998A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anticancer combination therapy
US20220276244A1 (en) 2019-04-29 2022-09-01 Confo Therapeutics N.V. Chimeric proteins and methods to screen for compounds and ligands binding to gpcrs
EP3962599A1 (en) 2019-04-30 2022-03-09 Vib Vzw Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator stabilizing agents
WO2020239934A1 (en) 2019-05-28 2020-12-03 Vib Vzw Cd8+ t-cells lacking plexins and their application in cancer treatment
WO2020239945A1 (en) 2019-05-28 2020-12-03 Vib Vzw Cancer treatment by targeting plexins in the immune compartment
CA3144200A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Sorriso Pharmaceuticals, Inc. Compositions
CN114466864A (zh) 2019-06-21 2022-05-10 索瑞索制药公司 多肽
MX2021015763A (es) 2019-06-21 2022-04-18 Sorriso Pharmaceuticals Inc Polipeptidos.
CN112409480A (zh) * 2019-08-20 2021-02-26 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 结合血清白蛋白的蛋白及其用途
WO2021039574A1 (ja) * 2019-08-23 2021-03-04 株式会社カネカ Ｏ結合型糖鎖修飾が抑制された重鎖抗体
CN110642946A (zh) * 2019-09-30 2020-01-03 中国药科大学 一种人源化纳米抗体及其制备方法
TW202128775A (zh) 2019-10-16 2021-08-01 英商阿法克塔生命科學有限公司 PD-L1抑制劑-TGFβ抑制劑雙特異性藥物部分
EP4048703A1 (en) 2019-10-21 2022-08-31 Vib Vzw Nanodisc-specific antigen-binding chimeric proteins
US20220386594A1 (en) 2019-11-11 2022-12-08 Ibi-Ag Innovative Bio Insecticides Ltd. Insect control nanobodies and uses thereof
EP4065603A1 (en) 2019-11-27 2022-10-05 Vib Vzw Positive allosteric modulators of the calcium-sensing receptor
EP4069293A1 (en) 2019-12-06 2022-10-12 Ablynx N.V. Polypeptides comprising immunoglobulin single variable domains targeting tnfa and ox40l
AU2020396204A1 (en) 2019-12-06 2022-07-28 Ablynx Nv Polypeptides comprising immunoglobulin single variable domains targeting TNFα and IL-23
MX2022007035A (es) 2019-12-09 2022-06-23 Ablynx Nv Polipeptidos que comprenden dominios variables unicos de inmunoglobulina que se dirigen a il-13 y tslp.
GB201918279D0 (en) 2019-12-12 2020-01-29 Vib Vzw Glycosylated single chain immunoglobulin domains
CN110988361B (zh) * 2019-12-13 2020-09-18 山东民康生物科技有限公司 人血清白蛋白去除试剂盒
WO2021123360A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Vib Vzw Nanobody exchange chromatography
CN112300289B (zh) * 2019-12-30 2022-06-10 中国药科大学 RGD4C融合抗TNFα纳米抗体蛋白、制备方法及其应用
WO2021140205A1 (en) 2020-01-10 2021-07-15 Confo Therapeutics N.V. Methods for generating antibodies and antibody fragments and libraries comprising same
WO2021156490A2 (en) 2020-02-06 2021-08-12 Vib Vzw Corona virus binders
EP4106806A1 (en) 2020-02-21 2022-12-28 Harpoon Therapeutics, Inc. Flt3 binding proteins and methods of use
WO2021170540A1 (en) 2020-02-25 2021-09-02 Vib Vzw Leucine-rich repeat kinase 2 allosteric modulators
EP4144758A1 (en) 2020-04-22 2023-03-08 Mabwell (Shanghai) Bioscience Co., Ltd. Single variable domain antibody targeting human programmed death ligand 1 (pd-l1) and derivative thereof
WO2021229104A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Université de Liège Anti-cd38 single-domain antibodies in disease monitoring and treatment
GB202101299D0 (en) 2020-06-09 2021-03-17 Avacta Life Sciences Ltd Diagnostic polypetides and methods
WO2022003156A1 (en) 2020-07-02 2022-01-06 Oncurious Nv Ccr8 non-blocking binders
WO2022063947A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Vib Vzw Combination of p2y6 inhibitors and immune checkpoint inhibitors
WO2022063957A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Vib Vzw Biomarker for anti-tumor therapy
MX2023003522A (es) 2020-09-25 2023-04-19 Ablynx Nv Polipeptidos que comprenden dominios variables unicos de inmunoglobulina que se dirigen a il-13 y ox40l.
WO2022089435A1 (en) * 2020-10-27 2022-05-05 Beijing Ql Biopharmaceutical Co., Ltd. Fusion proteins of gdf15 and use thereof
WO2022098745A1 (en) 2020-11-03 2022-05-12 Indi Molecular, Inc. Compositions, delivery systems, and methods useful in tumor therapy
WO2022098743A1 (en) 2020-11-03 2022-05-12 Indi Molecular, Inc. Compositions, imaging, and therapeutic methods targeting folate receptor 1 (folr1)
WO2022117569A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Oncurious Nv A ccr8 antagonist antibody in combination with a lymphotoxin beta receptor agonist antibody in therapy against cancer
EP4255929A2 (en) 2020-12-02 2023-10-11 Vib Vzw An ltbr agonist in combination therapy against cancer
KR20230123497A (ko) 2020-12-18 2023-08-23 아블린쓰 엔.브이. IL-6 및 TNF-α를 표적화하는 면역글로불린 단일 가변도메인을 포함하는 폴리펩티드
KR20230122084A (ko) 2020-12-18 2023-08-22 아블린쓰 엔.브이. Tcr 알파/베타 반응성에 기초한 t 세포 동원 폴리펩타이드
TW202241947A (zh) 2020-12-18 2022-11-01 比利時商艾伯霖克斯公司 包含靶向磷脂醯肌醇蛋白聚糖—３和ｔ細胞受體的免疫球蛋白單可變結構域的多肽
GB202020502D0 (en) 2020-12-23 2021-02-03 Vib Vzw Antibody composistion for treatment of corona virus infection
WO2022136647A1 (en) 2020-12-24 2022-06-30 Oncurious Nv Human ccr8 binders
EP4267618A1 (en) 2020-12-24 2023-11-01 Vib Vzw Non-blocking human ccr8 binders
WO2022136650A1 (en) 2020-12-24 2022-06-30 Oncurious Nv Murine cross-reactive human ccr8 binders
CN117794566A (zh) 2021-02-05 2024-03-29 Vib研究所 沙贝病毒结合剂
AU2022216460A1 (en) 2021-02-05 2023-09-21 Universiteit Gent Sarbecovirus binders
CN117241804A (zh) 2021-02-17 2023-12-15 非营利性组织佛兰芒综合大学生物技术研究所 在癌症治疗中slc4a4的抑制
EP4294516A1 (en) 2021-02-19 2023-12-27 Vib Vzw Cation-independent mannose-6-phosphate receptor binders
WO2022199804A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Vib Vzw Nek6 inhibition to treat als and ftd
WO2022234003A1 (en) 2021-05-07 2022-11-10 Avacta Life Sciences Limited Cd33 binding polypeptides with stefin a protein
WO2022242892A1 (en) 2021-05-17 2022-11-24 Université de Liège Anti-cd38 single-domain antibodies in disease monitoring and treatment
EP4359421A1 (en) 2021-06-23 2024-05-01 Vib Vzw Means and methods for selection of specific binders
WO2023274183A1 (zh) 2021-06-29 2023-01-05 江苏先声药业有限公司 Cd16抗体及其应用
CN117586423A (zh) * 2021-07-14 2024-02-23 北京质肽生物医药科技有限公司 用于代谢病症的融合多肽
CN113527502B (zh) * 2021-07-20 2023-01-17 福建医科大学 一种用于治疗类风湿性关节炎的纳米抗体重组蛋白
WO2023006040A1 (zh) 2021-07-30 2023-02-02 江苏先声药业有限公司 抗pvrig/抗tigit双特异性抗体和应用
CA3228014A1 (en) 2021-07-30 2023-02-16 Vib Vzm Cation-independent mannose-6-phosphate receptor binders for targeted protein degradation
WO2023057567A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Avacta Life Sciences Limited Pd-l1 binding affimers
WO2023057946A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Avacta Life Sciences Limited Serum half-life extended pd-l1 binding polypeptides
CN113912730B (zh) * 2021-12-14 2022-03-04 北京科诺信诚科技有限公司 缓释的抗FcRn抗体或抗原结合片段及其应用
TW202342508A (zh) 2021-12-17 2023-11-01 比利時商艾伯霖克斯公司 包含靶向ＴＣＲαβ、ＣＤ３３和ＣＤ１２３的免疫球蛋白單可變結構域的多肽
WO2023135198A1 (en) 2022-01-12 2023-07-20 Vib Vzw Human ntcp binders for therapeutic use and liver-specific targeted delivery
WO2023148397A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Vib Vzw Engineered stabilizing aglycosylated fc-regions
CN116925215A (zh) * 2022-03-31 2023-10-24 普米斯生物技术(珠海)有限公司 抗血清白蛋白纳米抗体及其衍生物
WO2023198848A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Vib Vzw An ltbr agonist in combination therapy against cancer
WO2023218243A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Avacta Life Sciences Limited Lag-3/pd-l1 binding fusion proteins
WO2023222825A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Vib Vzw Sarbecovirus spike s2 subunit binders
CN115028719B (zh) * 2022-05-27 2023-01-13 深圳市人民医院 血清白蛋白结合纳米抗体及其制备方法与应用
US20240109965A1 (en) 2022-06-14 2024-04-04 Ablynx N.V. Immunoglobulin single variable domains targeting t cell receptor
WO2024003873A1 (en) * 2022-06-30 2024-01-04 Intrexon Actobiotics Nv D/B/A Precigen Actobio Single variable domain antibodies against tumor necrosis factor-alpha
WO2024008755A1 (en) 2022-07-04 2024-01-11 Vib Vzw Blood-cerebrospinal fluid barrier crossing antibodies
WO2024023271A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Ablynx Nv Polypeptides binding to a specific epitope of the neonatal fc receptor
WO2024038112A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Improved anti-albumin nanobodies and their uses
WO2024068744A1 (en) 2022-09-27 2024-04-04 Vib Vzw Antivirals against human parainfluenza virus

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001045746A2 (en) * 1999-12-24 2001-06-28 Genentech, Inc. Methods and compositions for prolonging elimination half-times of bioactive compounds
WO2004003019A2 (en) * 2002-06-28 2004-01-08 Domantis Limited Immunoglobin single variant antigen-binding domains and dual-specific constructs
WO2004041862A2 (en) * 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor

Family Cites Families (152)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US460167A (en) 1891-09-29 Car-mover
DE321017C (no) 1917-05-15 1920-05-11 Aloysius Petrus Van Leuven
SE307996B (no) 1965-11-30 1969-01-27 Asea Ab
US4352678A (en) 1978-10-02 1982-10-05 Lever Brothers Company Thickened abrasive bleaching compositions
US4722896A (en) 1981-01-26 1988-02-02 The Beth Israel Hospital Association Method for affinity purification of hybridoma antibodies
US4559157A (en) 1983-04-21 1985-12-17 Creative Products Resource Associates, Ltd. Cosmetic applicator useful for skin moisturizing
LU84979A1 (fr) 1983-08-30 1985-04-24 Oreal Composition cosmetique ou pharmaceutique sous forme aqueuse ou anhydre dont la phase grasse contient un polyether oligomere et polyethers oligomeres nouveaux
US5672347A (en) 1984-07-05 1997-09-30 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor antagonists and their use
US4735898A (en) 1985-07-16 1988-04-05 The University Of Virginia Alumini Patents Foundation Monoclonal antibodies and method of identifying species using the same
JPS62175426A (ja) 1986-01-27 1987-08-01 Kazufumi Shimizu 抗体及びこれを有効成分とするスプレ−剤
ES2073394T3 (es) 1987-06-10 1995-08-16 Dana Farber Cancer Inst Inc Constructos de anticuerpos bifuncionales y su utilizacion para destruir selectivamente las poblaciones celulares.
US4820508A (en) 1987-06-23 1989-04-11 Neutrogena Corporation Skin protective composition
US4992478A (en) 1988-04-04 1991-02-12 Warner-Lambert Company Antiinflammatory skin moisturizing composition and method of preparing same
US4938949A (en) 1988-09-12 1990-07-03 University Of New York Treatment of damaged bone marrow and dosage units therefor
JP2919890B2 (ja) 1988-11-11 1999-07-19 メディカル リサーチ カウンスル 単一ドメインリガンド、そのリガンドからなる受容体、その製造方法、ならびにそのリガンドおよび受容体の使用
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
US6448380B2 (en) 1989-08-07 2002-09-10 Peptech Limited Tumor necrosis factor antibodies
AU640400B2 (en) 1989-08-07 1993-08-26 Peptide Technology Ltd. Tumour necrosis factor binding ligands
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
NZ234246A (en) 1990-03-16 1992-06-26 Flexitech Consulting Services Form filling powdered material packages using interleaved plastics/paper packaging
GB9016299D0 (en) 1990-07-25 1990-09-12 Brien Caroline J O Binding substances
WO1992002551A1 (en) 1990-08-02 1992-02-20 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
US5656272A (en) 1991-03-18 1997-08-12 New York University Medical Center Methods of treating TNF-α-mediated Crohn's disease using chimeric anti-TNF antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
EP0590060B1 (en) 1991-06-21 1997-09-17 University Of Cincinnati Orally administrable therapeutic proteins and method of making
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
CA2103887C (en) 1991-12-13 2005-08-30 Gary M. Studnicka Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
EP0568332B1 (en) 1992-04-28 1999-07-28 Sumitomo Rubber Industries, Ltd. Solid golf ball
WO1994002610A1 (en) 1992-07-17 1994-02-03 Dana-Farber Cancer Institute Method of intracellular binding of target molecules
EP0584421A1 (en) 1992-08-21 1994-03-02 Cécile Casterman Immunoglobulins devoid of light chains
PT1498427E (pt) 1992-08-21 2010-03-22 Univ Bruxelles Imunoglobulinas desprovidas de cadeias leves
DE69321909T2 (de) 1992-08-28 1999-04-01 Bayer Ag Verwendung von monoklonalen Anti-TNF-Antikörpern für die Behandlung von bakteriellen Meningitiden
DE69312077T2 (de) 1992-10-08 1997-10-30 Kennedy Inst Of Rheumatology Behandlung von autoimmun- und entzundungskrankheiten
EP0672142B1 (en) 1992-12-04 2001-02-28 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
JPH08507070A (ja) 1993-02-22 1996-07-30 アルザ・コーポレーション 活性物質の経口投与のための組成物
EP0698097B1 (en) 1993-04-29 2001-08-16 Unilever N.V. Production of antibodies or (functionalized) fragments thereof derived from heavy chain immunoglobulins of camelidae
DK0698097T3 (da) 1993-04-29 2001-10-08 Unilever Nv Produktion af antistoffer eller (funktionaliserede) fragmenter deraf afledt af Camelidae-immunoglobuliner med tung kæde
GB9311454D0 (en) 1993-06-03 1993-07-21 Agricultural & Food Res Pharmaceutical compositions
US5910488A (en) 1993-06-07 1999-06-08 Vical Incorporated Plasmids suitable for gene therapy
AU7123494A (en) 1993-06-09 1995-01-03 Nederlandse Organisatie Voor Toegepast- Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno Process for producing fusion proteins comprising scfv fragments by a transformed mould
CA2168202A1 (en) 1993-07-30 1995-03-16 Joseph Dougherty Efficient gene transfer into primary lymphocytes
FR2708622B1 (fr) 1993-08-02 1997-04-18 Raymond Hamers Vecteur recombinant contenant une séquence d'un gène de lipoprotéine de structure pour l'expression de séquences de nucléotides.
US6091639A (en) 1993-08-27 2000-07-18 Kabushiki Kaisha Toshiba Non-volatile semiconductor memory device and data programming method
US6146826A (en) 1993-09-10 2000-11-14 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Green fluorescent protein
WO1995021191A1 (en) 1994-02-04 1995-08-10 William Ward Bioluminescent indicator based upon the expression of a gene for a modified green-fluorescent protein
AU1925195A (en) 1994-02-22 1995-09-04 Dana-Farber Cancer Institute Nucleic acid delivery system, method of synthesis and uses thereof
US5625048A (en) 1994-11-10 1997-04-29 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
AU4964896A (en) 1995-01-19 1996-08-07 Research Foundation Of The State University Of New York, The Genes encoding an insect calcium channel
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
US5693492A (en) 1995-05-05 1997-12-02 Merck & Co., Inc. DNA encoding glutamate gated chloride channels
JPH11509088A (ja) 1995-06-23 1999-08-17 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ 血管内皮増殖因子受容体をコードする遺伝子の転写調節
AU4482996A (en) 1995-09-22 1997-04-09 Novo Nordisk A/S Novel variants of green fluorescent protein, gfp
US7368111B2 (en) 1995-10-06 2008-05-06 Cambridge Antibody Technology Limited Human antibodies specific for TGFβ2
US6027881A (en) 1996-05-08 2000-02-22 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Mutant Aequorea victoria fluorescent proteins having increased cellular fluorescence
CA2258518C (en) 1996-06-27 2011-11-22 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Recognition molecules interacting specifically with the active site or cleft of a target molecule
US6124128A (en) 1996-08-16 2000-09-26 The Regents Of The University Of California Long wavelength engineered fluorescent proteins
US6417337B1 (en) 1996-10-31 2002-07-09 The Dow Chemical Company High affinity humanized anti-CEA monoclonal antibodies
WO1998021355A1 (en) 1996-11-15 1998-05-22 Life Technologies, Inc. Mutants of green fluorescent protein
WO1998022141A2 (en) 1996-11-19 1998-05-28 Sangstat Medical Corporation Enhanced effects for hapten conjugated therapeutics
US6262238B1 (en) 1997-01-14 2001-07-17 Roche Diagnostic, Gmbh Process for modifying the stability of antibodies
US6329516B1 (en) 1997-04-28 2001-12-11 Fmc Corporation Lepidopteran GABA-gated chloride channels
FR2766826B1 (fr) 1997-08-04 2001-05-18 Pasteur Institut Vecteurs derives d'anticorps pour le transfert de substances dans les cellules
US5895466A (en) 1997-08-19 1999-04-20 At&T Corp Automated natural language understanding customer service system
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
ATE461282T1 (de) 1997-10-27 2010-04-15 Bac Ip Bv Multivalente antigenbindende proteine
BR9907241A (pt) 1998-01-26 2000-10-17 Unilever Nv Biblioteca de expressão, processo para preparar a mesma, uso de uma fonte não imunizada de sequências de ácido nucleico, e, processos para preparar fragmentos de anticorpos e, para preparar um anticorpo
KR20010034512A (ko) 1998-02-19 2001-04-25 베렌슨, 론 림프구 활성화 조절을 위한 조성물 및 그 방법
EP0967284A1 (en) 1998-05-28 1999-12-29 Pfizer Limited Phosphodiesterases
CA2336929C (en) 1998-07-06 2005-10-04 Euroscreen S.A. High-throughput screening diagnostic and/or dosage method of an agonist and/or an antagonist for a calcium-coupled receptor
CN1323355A (zh) 1998-08-13 2001-11-21 美国吉诺米克斯公司 光学鉴定聚合物
GB9824632D0 (en) 1998-11-10 1999-01-06 Celltech Therapeutics Ltd Biological compounds
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
WO2000040968A1 (en) 1999-01-05 2000-07-13 Unilever Plc Binding of antibody fragments to solid supports
WO2000043507A1 (en) 1999-01-19 2000-07-27 Unilever Plc Method for producing antibody fragments
CA2361678A1 (en) 1999-02-05 2000-08-10 Rijksuniversiteit Leiden Method of modulating metabolite biosynthesis in recombinant cells
DE1100895T1 (de) 1999-03-15 2001-09-06 Univ British Columbia Abc1 polypeptide und verfahren und reagenzien zur modulation des cholesterolgehalts
CN100434441C (zh) 1999-04-22 2008-11-19 荷兰联合利华有限公司 利用单价抗原-结合蛋白抑制病毒感染
WO2000073430A2 (de) 1999-05-27 2000-12-07 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Vakzine gegen konformationsabhängige antigene sowie gegen antigene, die keine oder nicht ausschliesslich proteine oder peptide sind
KR20020012612A (ko) 1999-06-18 2002-02-16 씨브이 쎄러퓨틱스, 인코포레이티드 Ａｔｐ 결합 카세트 트랜스포터 단백질 ａｂｃ１을사용하여 콜레스테롤 유출을 증가시키고 ｈｄｌ을상승시키기 위한 조성물 및 방법
IL147920A0 (en) 1999-08-02 2002-08-14 Keygene Nv Method for generating cgmmv resistant plants, genetic constructs, and the obtained cgmmv-resistant plants
GB9922124D0 (en) 1999-09-17 1999-11-17 Pfizer Ltd Phosphodiesterase enzymes
US6479280B1 (en) 1999-09-24 2002-11-12 Vlaams Interuniversitair Institutuut Voor Biotechnologie Vzw Recombinant phages capable of entering host cells via specific interaction with an artificial receptor
US6849425B1 (en) 1999-10-14 2005-02-01 Ixsys, Inc. Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
DE19955408A1 (de) 1999-11-18 2001-05-23 Bayer Ag GABA-B-Rezeptoren
EP1242460B1 (en) 1999-11-29 2006-10-18 Unilever Plc Immobilisation of proteins using a polypeptide segment
ATE440111T1 (de) 1999-11-29 2009-09-15 Bac Ip B V Immobilisierte antigenbindende moleküle aus einer domäne
UA76708C2 (uk) * 1999-12-08 2006-09-15 Сінгента Патисипейшонс Аг Антитіло, яке застосовується в імунологічному аналізі зразка для визначення неонікотиноїдного інсектициду, білковий кон'югат для одержання антитіла, спосіб визначення концентрації неонікотиноїдного інсектициду в зразку та набір для визначення кількості неонікотиноїдного інсектициду
US7229619B1 (en) 2000-11-28 2007-06-12 Medimmune, Inc. Methods of administering/dosing anti-RSV antibodies for prophylaxis and treatment
ATE428733T1 (de) 2000-03-14 2009-05-15 Unilever Nv Variabele domänen der schweren kette eines antikörpers gegen menschliche ernährungslipasen und deren verwendungen
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
CA2380443C (en) 2000-05-26 2013-03-12 Ginette Dubuc Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
US6741957B1 (en) 2000-07-21 2004-05-25 Daimlerchrysler Corporation Analytical tire model for vehicle durability and ride comfort analysis
EP1328248A1 (fr) 2000-10-20 2003-07-23 Firmenich Sa Composition parfumante sans alcool
WO2002048193A2 (en) 2000-12-13 2002-06-20 Unilever N.V. Camelidae antibody arrays
US7054297B1 (en) 2000-12-28 2006-05-30 Cisco Technology, Inc. Distribution of packets to high data rate communications devices using multicast protocols
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
JP4336771B2 (ja) 2001-03-09 2009-09-30 モルフォシス アーゲー 血清アルブミン結合部分
US20050271663A1 (en) 2001-06-28 2005-12-08 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
AU2002319402B2 (en) 2001-06-28 2008-09-11 Domantis Limited Dual-specific ligand and its use
US20100081792A1 (en) 2001-06-28 2010-04-01 Smithkline Beecham Corporation Ligand
WO2003005053A1 (de) 2001-07-04 2003-01-16 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren zur intensitätskorrektur eines magnetresonanzbildes
WO2003014960A2 (en) 2001-08-03 2003-02-20 Medical Research Council Method of identifying a consensus sequence for intracellular antibodies
US7371849B2 (en) 2001-09-13 2008-05-13 Institute For Antibodies Co., Ltd. Methods of constructing camel antibody libraries
FR2829940A1 (fr) 2001-09-27 2003-03-28 Synt Em Compositions pour la vectorisation d'anticorps a travers la barriere hematoencephalique et leur utilisation pour le diagnostic ou le traitement des maladies du systeme nerveux central
US7084257B2 (en) 2001-10-05 2006-08-01 Amgen Inc. Fully human antibody Fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
HUP0402333A3 (en) 2001-11-12 2007-05-02 Merck Patent Gmbh Modified anti-tnf alpha antibody
US7365167B2 (en) 2001-11-26 2008-04-29 Cell Matrix, Inc. Humanized collagen antibodies and related methods
US7393648B2 (en) 2001-12-03 2008-07-01 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Hybrid antibodies
JP2005512181A (ja) 2001-12-03 2005-04-28 ダイアックス、コープ ライブラリスクリーニング
KR100599789B1 (ko) 2001-12-03 2006-07-12 삼성에스디아이 주식회사 방열효율이 향상된 플라즈마 디스플레이 장치 및 그 제조방법
AU2002351896A1 (en) 2001-12-11 2003-06-23 Ablynx N.V. Method for displaying loops from immunoglobulin domains in different contexts
US20050037358A1 (en) 2001-12-21 2005-02-17 Serge Muyldermans Method for cloning of variable domain sequences
CA2471645A1 (en) 2002-01-03 2003-07-10 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Immunoconjugates useful for treatment of tumours
DE10225567B4 (de) 2002-06-10 2006-07-06 Endress + Hauser Conducta Gesellschaft für Mess- und Regeltechnik mbH + Co. KG Kommunikationsverfahren und System hierfür
CA2490009A1 (en) * 2002-06-21 2003-12-31 Dyax Corporation Serum protein-associated target-specific ligands and identification method therefor
US20080008713A1 (en) 2002-06-28 2008-01-10 Domantis Limited Single domain antibodies against tnfr1 and methods of use therefor
US20060002935A1 (en) 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
EP1388571A1 (de) 2002-08-08 2004-02-11 Ciba Spezialitätenchemie Pfersee GmbH Polyorganosiloxanzusammensetzung enthaltend quaternäre Ammoniumgruppen
US7004940B2 (en) 2002-10-10 2006-02-28 Ethicon, Inc. Devices for performing thermal ablation having movable ultrasound transducers
JP2006512910A (ja) 2002-10-23 2006-04-20 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ Ａ３４およびａ３３様３ｄｎａ、タンパク質、それらに対する抗体、ならびに同一物を使用した治療方法
US20060034845A1 (en) 2002-11-08 2006-02-16 Karen Silence Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor
US20060228355A1 (en) 2003-11-07 2006-10-12 Toon Laeremans Camelidae single domain antibodies vhh directed against epidermal growth factor receptor and uses therefor
CN102584997A (zh) 2002-11-08 2012-07-18 埃博灵克斯股份有限公司 针对肿瘤坏死因子-α的单结构域抗体及其用途
EP2267032A3 (en) 2002-11-08 2011-11-09 Ablynx N.V. Method of administering therapeutic polypeptides, and polypeptides therefor
GB0230203D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
CA2509153C (en) 2002-12-31 2013-04-16 Nektar Therapeutics Al, Corporation Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers
CA2512545C (en) 2003-01-10 2015-06-30 Karen Silence Recombinant vhh single domain antibody from camelidae against von willebrand factor (vwf)
PL1639011T3 (pl) 2003-06-30 2009-05-29 Domantis Ltd Pegilowane przeciwciała jednodomenowe (dAb)
EP1639465B1 (de) 2003-06-30 2011-04-06 Continental Automotive GmbH Verfahren zur überwachung des programmlaufs in einem mikro-computer
EP1512696A1 (en) 2003-08-14 2005-03-09 Diatos Amino acid sequences facilitating penetration of a substance of interest into cells and/or cell nuclei
US7432238B2 (en) 2004-04-16 2008-10-07 Stc.Unm Human Kunitz-type inhibitor with enhanced antifibrinolytic activity
US7180370B2 (en) 2004-09-01 2007-02-20 Micron Technology, Inc. CMOS amplifiers with frequency compensating capacitors
US7563443B2 (en) 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
NZ555464A (en) 2004-12-02 2010-03-26 Domantis Ltd Bispecific domain antibodies targeting serum albumin and glp-1 or pyy
GB0521621D0 (en) 2005-10-24 2005-11-30 Domantis Ltd Tumor necrosis factor receptor 1 antagonists for treating respiratory diseases
EP2949668B1 (en) 2005-05-18 2019-08-14 Ablynx N.V. Improved nanobodies tm against tumor necrosis factor-alpha
DE102005023617A1 (de) 2005-05-21 2006-11-23 Aspre Ag Verfahren zum Mischen von Farben in einem Display
US20070269422A1 (en) 2006-05-17 2007-11-22 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
GB0724331D0 (en) 2007-12-13 2008-01-23 Domantis Ltd Compositions for pulmonary delivery
EA200901494A1 (ru) 2007-06-06 2010-06-30 Домантис Лимитед Способы селекции протеазоустойчивых полипептидов
WO2008149147A2 (en) 2007-06-06 2008-12-11 Domantis Limited Polypeptides, antibody variable domains and antagonists
JP2011504740A (ja) 2007-11-27 2011-02-17 アブリンクス エン．ヴェー． ヘテロ二量体サイトカイン及び／又はこれらの受容体に指向性を有するアミノ酸配列、並びにこれを含むポリペプチド
DK2700651T3 (da) 2008-07-18 2019-07-22 Bristol Myers Squibb Co Monovalente sammensætninger til cd28-binding og fremgangsmåder til anvendelse heraf
CA2806076A1 (en) 2010-07-22 2012-01-26 The Regents Of The University Of California Anti-tumor antigen antibodies and methods of use
BR112017020275A8 (pt) * 2015-03-31 2023-01-31 Sorriso Pharmaceuticals Inc Polipeptídeos
CA3019482A1 (en) * 2016-03-31 2017-10-05 Vhsquared Limited Compositions

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001045746A2 (en) * 1999-12-24 2001-06-28 Genentech, Inc. Methods and compositions for prolonging elimination half-times of bioactive compounds
WO2004003019A2 (en) * 2002-06-28 2004-01-08 Domantis Limited Immunoglobin single variant antigen-binding domains and dual-specific constructs
WO2004041862A2 (en) * 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Single domain antibodies directed against tumour necrosis factor-alpha and uses therefor
WO2004041865A2 (en) * 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CONRATH KE. ET AL. beta-Lactamase Inhibitors Derived from Single-Domain Antibody Fragments Elicited in the Camelidae. Antimicrob Agents Chemother. Oktober 2001, Vol. 45, Nr. 10, side 2807–2812., Dated: 01.01.0001 *
RAHBARIZADEH F. ET AL. Production of novel recombinant single-domain antibodies against tandem repeat region of MUC1 mucin. Hybridoma and Hybridomics. Juni 2004, Vol. 23, Nr. 3, side 151-159., Dated: 01.01.0001 *

Also Published As

Publication number Publication date
NZ562695A (en) 2011-05-27
KR20080011395A (ko) 2008-02-04
ZA200709867B (en) 2008-10-29
RU2634381C2 (ru) 2017-10-26
ATE549357T1 (de) 2012-03-15
JP5788359B2 (ja) 2015-09-30
SI1888641T1 (sl) 2012-05-31
CA2962819C (en) 2021-07-27
EP3613767A1 (en) 2020-02-26
IL225347A0 (en) 2013-06-27
MX2007014359A (es) 2008-02-06
EP2172484A2 (en) 2010-04-07
JP2008539772A (ja) 2008-11-20
JP2015157850A (ja) 2015-09-03
EP2949668B1 (en) 2019-08-14
PL1888640T3 (pl) 2012-08-31
BRPI0609224A2 (pt) 2011-10-18
US20150353635A1 (en) 2015-12-10
LT2949668T (lt) 2019-11-11
ZA200901011B (en) 2010-04-28
IL250946B (en) 2018-08-30
TWI395755B (zh) 2013-05-11
EP1888641A1 (en) 2008-02-20
SG10201708038QA (en) 2017-10-30
EP1888640B1 (en) 2012-03-14
EP2479191A2 (en) 2012-07-25
RU2007142444A (ru) 2009-06-27
EP1888641B1 (en) 2011-12-14
NO20075853L (no) 2007-12-19
MX363423B (es) 2019-03-22
IL186941A (en) 2014-05-28
IL250946A0 (en) 2017-04-30
HUE045710T2 (hu) 2020-01-28
WO2006122787A1 (en) 2006-11-23
NO20161028A1 (no) 2007-11-19
US20090028880A1 (en) 2009-01-29
RU2017133794A3 (no) 2020-12-23
SI1888640T1 (sl) 2012-07-31
SG184709A1 (en) 2012-10-30
SI2949668T1 (sl) 2019-11-29
WO2006122786A2 (en) 2006-11-23
EP2365000A3 (en) 2013-01-16
RU2012126722A (ru) 2014-01-10
ES2379283T3 (es) 2012-04-24
JP6484660B2 (ja) 2019-03-13
DK2949668T3 (da) 2019-11-11
US8188223B2 (en) 2012-05-29
BRPI0609224B1 (pt) 2021-08-17
MX342271B (es) 2016-09-21
JP2012167112A (ja) 2012-09-06
JP5047950B2 (ja) 2012-10-10
CN103254309A (zh) 2013-08-21
RU2017133794A (ru) 2019-03-28
ES2384164T3 (es) 2012-07-02
CN101248087B (zh) 2012-09-26
JP2017186318A (ja) 2017-10-12
PT2949668T (pt) 2019-10-24
AU2006249144A1 (en) 2006-11-23
TW201321410A (zh) 2013-06-01
EP2949668A1 (en) 2015-12-02
US20140335101A1 (en) 2014-11-13
EP2479191A3 (en) 2013-03-13
US20200079844A1 (en) 2020-03-12
IL225347A (en) 2017-05-29
US20230031229A1 (en) 2023-02-02
BR122013001996B1 (pt) 2022-02-01
US20170342146A1 (en) 2017-11-30
KR101308771B1 (ko) 2013-09-23
NO338568B1 (no) 2016-09-05
CR9519A (es) 2008-10-17
US11472871B2 (en) 2022-10-18
US9067991B2 (en) 2015-06-30
PT1888641E (pt) 2012-03-19
ECSP077910A (es) 2008-03-26
NI200700291A (es) 2008-05-12
CA2608770A1 (en) 2006-11-23
AU2006249144B2 (en) 2011-11-17
PL1888641T3 (pl) 2012-05-31
PL2949668T3 (pl) 2020-03-31
ZA201100385B (en) 2012-09-26
IL186941A0 (en) 2008-02-09
WO2006122786A3 (en) 2007-03-22
HK1113685A1 (en) 2008-10-10
CA2962819A1 (en) 2006-11-23
EP2172484A3 (en) 2010-05-19
CN101248087A (zh) 2008-08-20
JP6420200B2 (ja) 2018-11-07
DK1888640T3 (da) 2012-06-18
ES2778123T3 (es) 2020-08-07
EP2365000A2 (en) 2011-09-14
CN103254309B (zh) 2017-09-26
ATE537188T1 (de) 2011-12-15
EP1888640A2 (en) 2008-02-20
RU2464276C2 (ru) 2012-10-20
HK1215953A1 (zh) 2016-09-30
TW200716671A (en) 2007-05-01
CA2608770C (en) 2017-05-30
CY1122672T1 (el) 2021-03-12
TWI439467B (zh) 2014-06-01
DK1888641T3 (da) 2012-04-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230031229A1 (en) Nanobodies against tumor necrosis factor-alpha
US8703131B2 (en) Nanobodies against tumor necrosis factor-alpha
AU2014259481B2 (en) Improved NanobodiesTM against tumor necrosis factor-alpha
RU2794974C2 (ru) СВЯЗЫВАЮЩИЙ TNF-α ПОЛИПЕПТИД И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С TNF-α ЗАБОЛЕВАНИЙ