CN105358577A - 具有经修饰的糖基化的西妥昔单抗及其用途 - Google Patents
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Abstract
在一个方面,本公开涉及具有改变的糖基化模式的抗体,产生所述抗体的方法,以及其使用方法。在一些实施方案中,所述抗体是西妥昔单抗。
Description
相关申请
本申请要求2013年2月13日提交的美国临时申请系列号61/764,446的在35U.S.C.§119(e)下的权益,该临时申请标题为“CetuximabwithModifiedGlycosylationandUsesThereof”,其全部公开通过提述并入本文。
发明领域
本发明部分涉及具有改变的糖基化模式的抗体,其生产方法,以及使用方法。
发明背景
Erbitux(爱必妥)(西妥昔单抗(cetuximab))是一种结合人上皮生长因子(EGFR)的胞外域的重组嵌合单克隆抗体,并在临床上用于治疗特定形式的癌症。不幸的是,当使用治疗时,一些患者已经经历变应性反应,在某些情况下为过敏性休克和死亡。已显示了该变应性反应由识别存在于西妥昔单抗的商业形式上的gal-α-1,3-gal糖基化分子的IgE所致(C.Chung,etal.Cetuximab-inducedanaphylaxisandIgEspecificforgalactose-alpha-1,3-galactose.NEnglJMed(2008);358:1109-17)。gal-α-1,3-gal的添加认为是用于商业生产的哺乳动物(鼠骨髓瘤)细胞培养系统的结果。在中国仓鼠卵巢细胞中生产蛋白也可以导致蛋白上的gal-α-1,3-gal部分(moieties)(Bosquesetal.,Nat.Biotechn.28:1153-1156,2010)。
发明概述
已发现在哺乳动物乳腺上皮细胞中产生的抗体(如经工程化而在其乳中分泌抗体的转基因动物的哺乳动物乳腺上皮细胞)没有可检测的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分。因而,一方面,本公开提供没有可检测的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分的抗体及其组合物。还提供生产此类抗体的方法以及其使用方法。
在一个方面,本公开提供糖基化抗体,其包含
(a)包含SEQIDNO:1的重链;
(b)包含SEQIDNO:2的轻链;
其中所述糖基化抗体比非乳腺细胞培养产生的糖基化抗体具有更少的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分。
在本文提供的糖基化抗体的一些实施方案中,所述非乳腺细胞培养物是小鼠骨髓瘤细胞培养物。在本文提供的糖基化抗体的一些实施方案中,所述更少的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分位于重链的可变区中。在本文提供的糖基化抗体的一些实施方案中,所述更少的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分位于如SEQIDNO:1所示的重链的107位置中。在本文提供的糖基化抗体的一些实施方案中,所述糖基化抗体缺乏半乳糖-α-1,3-半乳糖部分。在本文提供的糖基化抗体的一些实施方案中,所述糖基化抗体在乳腺上皮细胞中产生。在本文提供的糖基化抗体的一些实施方案中,所述糖基化抗体在非人转基因哺乳动物的乳腺上皮细胞中产生。在本文提供的糖基化抗体的一些实施方案中,所述非人哺乳动物是山羊、绵羊、野牛(bison)、骆驼、母牛(cow)、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠或羊驼(llama)。在一些实施方案中,所述非人哺乳动物是山羊。在本文提供的糖基化抗体的一些实施方案中,所述抗体是嵌合的,人源化的,或完全人的抗体。在本文提供的糖基化抗体的一些实施方案中,所述抗体是西妥昔单抗。
在一个方面,本公开提供组合物,其包括本文提供的任何糖基化抗体,以及药学上可接受的载体。
在一个方面,本公开提供包括糖基化抗体群体的组合物,其中所述糖基化抗体包含:
(a)包含SEQIDNO:1的重链;
(b)包含SEQIDNO:2的轻链;且
其中所述抗体比非乳腺细胞培养产生的糖基化抗体具有更少的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分。
在本发明提供的组合物的一些实施方案中,所述非乳腺细胞培养物是小鼠骨髓瘤细胞培养物。在本文提供的组合物的一些实施方案中,所述更少的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分位于重链的可变区中。在本文提供的组合物的一些实施方案中,所述更少的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分位于如SEQIDNO:1所示的重链的107位置处。在本文提供的组合物的一些实施方案中,糖基化抗体缺乏半乳糖-α-1,3-半乳糖部分。在本文提供的组合物的一些实施方案中,所述糖基化抗体群体在乳腺上皮细胞中产生。在本文提供的组合物的一些实施方案中,所述糖基化抗体群体在非人转基因哺乳动物的乳腺上皮细胞中产生。在一些实施方案中,所述非人哺乳动物是山羊、绵羊、野牛、骆驼、母牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠或羊驼。
在一些实施方案中,所述非人哺乳动物是山羊。
在本文提供的组合物的一些实施方案中,所述群体中的糖基化抗体是嵌合的,人源化的,或完全人的抗体。在本文提供的组合物的一些实施方案中,所述群体中的糖基化抗体是西妥昔单抗抗体。在本文提供的组合物的一些实施方案中,所述组合物进一步包括乳(milk)。在本文提供的组合物的一些实施方案中,所述组合物进一步包括药学上可接受的载体。
在一个方面,本公开提供包括单克隆抗体的组合物,其中所述单克隆抗体包含:
(a)包含SEQIDNO:1的重链;
(b)包含SEQIDNO:2的轻链;且
其中所述组合物在转基因山羊的乳腺中产生。
在一个方面,本公开提供包括单克隆抗体的组合物,其中所述单克隆抗体包含:
(a)包含SEQIDNO:1的重链;
(b)包含SEQIDNO:2的轻链;且
其中所述单克隆抗体缺乏半乳糖-α-1,3-半乳糖。
在一个方面,本公开提供方法,其包括在乳腺上皮细胞中产生糖基化抗体群体,使得产生的糖基化抗体群体比非乳腺细胞培养产生的糖基化抗体群体具有更少的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分,并且其中所述糖基化抗体含有包含SEQIDNO:1的重链和包含SEQIDNO:2的轻链。
在本文提供的方法的一些实施方案中,所述非乳腺细胞细胞培养物是小鼠骨髓瘤细胞培养物。在本文提供的方法的一些实施方案中,糖基化抗体群体缺乏半乳糖-α-1,3-半乳糖部分。在本文提供的方法的一些实施方案中,所述方法进一步包括收集糖基化抗体群体。在本文提供的方法的一些实施方案中,在体外发生产生。在本文提供的方法的一些实施方案中,在体内发生产生。在本文提供的方法的一些实施方案中,在非人转基因哺乳动物中发生产生。在本文提供的方法的一些实施方案中,所述非人哺乳动物是山羊、绵羊、野牛、骆驼、母牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠或羊驼。在一些实施方案中,所述非人哺乳动物是山羊。
在本文提供的方法的一些实施方案中,所述方法进一步包括纯化糖基化抗体群体。在本文提供的方法的一些实施方案中,所述方法包括比较所述糖基化抗体群体中存在的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分的数量与在非乳腺细胞培养物中产生的糖基化抗体群体中存在的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分的数量。
在一个方面,本公开提供通过本文提供的任意方法产生的糖基化抗体群体。
在一个方面,本公开提供乳腺上皮细胞,其产生本文提供的任意抗体。在本文提供的乳腺上皮细胞的一些实施方案中,所述乳腺上皮细胞含有包含SEQIDNO:3的核酸和包含SEQIDNO:4的核酸。在本文提供的乳腺上皮细胞的一些实施方案中,包含SEQIDNO:3的核酸和包含SEQIDNO:4的核酸相连。
在一个方面,本公开提供转基因非人哺乳动物,其包括本文公开的任意乳腺上皮细胞。在一些实施方案中,所述非人哺乳动物是山羊。
在一个方面,本公开提供乳腺上皮细胞,其产生本文公开的任意抗体群体。在一些本文提供的乳腺上皮细胞的实施方案中,所述乳腺上皮细胞含有包含SEQIDNO:3的核酸和包含SEQIDNO:4的核酸。在本文提供的乳腺上皮细胞的一些实施方案中,包含SEQIDNO:3的核酸和包含SEQIDNO:4的核酸相连。
在一个方面,本公开提供转基因非人哺乳动物,其包括本文公开的任意乳腺上皮细胞。
在一个方面,本公开提供方法,其包括将有效量的本文提供的任意抗体施用到有所需要的受试者。
在一个方面,本文提供方法,其包括将有效量的本文提供的任意组合物施用到有所需要的受试者。
在一些实施方案中,所述受试者患有癌症。在一些实施方案中,所述癌症是头和颈癌或结肠直肠癌。在本文提供的方法的一些实施方案中,所述方法进一步包括施用至少一种另外的治疗剂。在一些实施方案中,所述至少一种另外的治疗剂是伊立替康(irinotecan)、亚叶酸钙(leucovorincalcium)、氟脲嘧啶(fluorouracil)或其组合。
附图简述
首先描述附图。应当理解附图为示例性的而对于实现本发明是不需要的。
图1示出了西妥昔单抗的重链(HC)的氨基酸序列(SEQIDNO:1)。
图2示出了西妥昔单抗的轻链(LC)的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。
图3示出了西妥昔单抗的重链(HC)的核酸序列(SEQIDNO:3)。
图4示出了西妥昔单抗的轻链(LC)的核酸序列(SEQIDNO:4)。
图5示出了质粒BC2552LC西妥昔单抗(轻链)(A)和该质粒的核酸序列(SEQIDNO:5)(B)。
图6示出了质粒BC2554HC西妥昔单抗(重链)(A)和该质粒的核酸序列(SEQIDNO:6)(B)。
图7示出了携带重链的质粒BC2584嘌呤霉素β酪蛋白载体(A)和该质粒的核酸序列(SEQIDNO:7)(B)。
图8示出了具有两种小鼠品系(#15和#27)的乳中的西妥昔单抗的表达水平的Western印迹。
图9示出了用于检测乳产生的西妥昔单抗和商业产生的西妥昔单抗中α-1,3-gal水平的Western印迹。
图10示出了山羊#1和#2的乳中产生的西妥昔单抗的Western印迹。
图11示出了山羊乳中产生的西妥昔单抗的纯化。
图12是描述对山羊中产生的西妥昔单抗(第2道,山羊#1和第3道,山羊#2),以及商业产生的的抗α1,3半乳糖单克隆抗体染色的Western印迹。
图13是纯化的山羊#1的乳中产生的纯化的西妥昔单抗,以及山羊#2的乳中产生的纯化的西妥昔单抗的质谱(LS/MS)。
发明详述
(西妥昔单抗)是一种结合人上皮生长因子受体(EGFR)的胞外域的人/小鼠嵌合重组抗体,并在临床上用来治疗癌症。对结构的研究表明在重链的框架区3上存在的一个N-连接糖基化位点被gal-α-1,3-gal(本文中也称为“gal-α-1,3-gal”或“α-1,3-gal”)占据,见JunQian,etal.:StructuralcharacterizationofN-linkedoligosaccharidesonmonoclonalantibodycetuximabbythecombinationoforthogonalmatrix-assistedlaserdesorption/ionizationhybridquadrupole-quadrupoletime-of-flighttandemmassspectrometryandsequentialenzymaticdigestion(AnalyticalBiochemistry364(2007)8–18)。这一gal-α-1,3-gal的存在认为是由于商业的在小鼠骨髓瘤细胞中产生的事实所致,已知所述小鼠骨髓细胞在N-连接糖基化位点上添加gal-α-1,3-gal。
已显示了该gal-α-1,3-gal糖基化在一些使用治疗的患者中引起变应性反应(Chung,etal.Cetuximab-inducedanaphylaxisandIgEspecificforgalactose-alpha-1,3-galactose.NEnglJMed(2008);358:1109-17)。显示了这些患者具有预先存在的针对gal-α-1,3-gal的IgE,其在使用抗体治疗后引起过敏性反应。
另外,已显示了半乳糖-α-1,3-半乳糖在其它背景中引起变应性反应。例如,gal-α-1,3-gal存在于红肉上,并且发现在食用红肉后经历变应性反应(例如过敏反应)的人们具有对gal-α-1,3-gal特异性的IgE抗体(Comminsetal.,Delayedanaphylaxis,angioedema,orurticariaafterconsumptionofredmeatinpatientswithIgEantibodiesspecificforgalactose-alpha-1,3-galactose.JAllergyClinImmunol.2009Feb;123(2):426-33;和ComminsandPlatts-Mills,Anaphylaxissyndromesrelatedtoanewmammaliancross-reactivecarbohydratedeterminant.JAllergyClinImmunol.2009October;124(4):652–657.)。在另一种情况下,显示了存在于猫IgA上的gal-α-1,3-gal(另一种过敏原)可以被人类IgE结合(Gronlundetal.Thecarbohydrategalactose-alpha-1,3-galactoseisamajorIgE-bindingepitopeoncatIgA.JAllergyClinImmunol.2009May;123(5):1189-91)。因此,半乳糖-α-1,3-半乳糖的存在提出了人治疗使用的抗体和其它糖蛋白的开发中的潜在问题。
重组抗体的产生通常使用完善建立的细胞系(如NSo和Sp2/0)在细胞培养物中进行。已显示这些细胞系以α(1-3)连接向重组抗体添加半乳糖来形成gal-α-1,3-gal(Chung,etal.Cetuximab-inducedanaphylaxisandIgEspecificforgalactose-alpha-1,3-galactose.NEnglJMed(2008);358:1109-17)。在人类和高等灵长类中,通过在α(1,3)连接中添加半乳糖产生gal-α-1,3-gal的基因(α-1,3半乳糖转移酶)是非功能的,因此人类和高等灵长类通常不产生gal-α-1,3-gal。因此,gal-α-1,3-gal阴性的动物(如人类)具有将gal-α-1,3-gal识别为“非我”的潜力,并能产生对该寡糖特异性的IgE和IgG抗体,从而潜在引起上文所述的变应性反应。因此,对产生缺乏gal-α-1,3-gal部分的重组治疗性抗体的方法存在需要。
通过转基因技术修饰动物基因组的能力提供了制造具有经修饰的糖基化模式的重组抗体的备选。在转基因家畜的乳中产生人重组药物解决了许多与微生物生物反应器(例如缺乏适当的翻译后修饰,不正确的蛋白折叠,高纯化费用)或动物细胞生物反应器(例如,高资本成本,昂贵的培养基,低产量)相关的问题。
令人惊讶的是,如本文所公开的,发现通过在乳腺上皮细胞中表达西妥昔单抗的重链和轻链在小鼠和山羊的乳中产生的西妥昔单抗没有可检测的gal-α-1,3-gal(通过LS/MS和Western印迹分析确定)。这是令人惊讶的,至少因为商业化生产的西妥昔单抗(其在小鼠骨髓瘤细胞中产生)含有gal-α-1,3-gal部分。另外,山羊血清蛋白也显示gal-α-1,3-gal部分。
相应的,本公开的方面涉及糖基化抗体或抗体群体,其与细胞培养物中产生的糖基化抗体相比具有改变的糖基化模式,特别是更少的gal-α-1,3-gal部分。在一些实施方案中,所述抗体是西妥昔单抗。本公开的其它方面提供用于生产包含比细胞培养物中产生的糖基化抗体更少的gal-α-1,3-gal部分的糖基化抗体或抗体群体的方法。本公开的再一个方面涉及哺乳动物乳腺上皮细胞或转基因动物,其能够产生与细胞培养物中产生的糖基化抗体相比具有改变的糖基化模式的抗体群体,特别是更少的gal-α-1,3-gal部分。在一些实施方案中,本文中提供的糖基化抗体没有任何可检测水平的gal-α-1,3-gal部分。
抗体及其抗原结合片段
如本文所使用的,术语“抗体”可以指包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个域CH1、CH2和CH3构成。每条轻链是由轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个域CL构成。VH和VL区可以进一步细分为超变性区,称为互补决定区(CDR),其散布有更保守的区域,称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成,从氨基末端到羧基末端以下述顺序排列:FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合域。在一些实施方案中,抗原是人上皮生长因子受体(EGFR)的胞外域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白结合到宿主组织或因子,包括免疫系统的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)。当两种蛋白以化学计算量表达并以适当的构造自身组装时,可以完成成熟的功能性抗体分子的形成。
术语“抗体”也意图涵盖其抗原结合片段。用于生成抗体和抗原结合片段的方法在本领域中是公知的(见,例如Sambrooketal,"MolecularCloning:ALaboratoryManual"(2ndEd.),ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989);Lewin,"GenesIV",OxfordUniversityPress,NewYork,(1990)和Roittetal.,"Immunology"(2ndEd.),GowerMedicalPublishing,London,NewYork(1989),WO2006/040153,WO2006/122786,和WO2003/002609)。如本文所使用的,抗体的“抗原结合片段”指代抗体中保留了特异性结合抗原(如EGFR的胞外域)的能力的一个或多个部分。已显示了抗体的抗原结合能力可以通过全长抗体的片段来进行。包括在术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的例子包括(i)Fab片段,即由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段;(ii)F(ab’)2片段,即包括通过铰链区的二硫化物桥相连的两个Fab片段的二价片段;(iii)由VH和CH1域组成的Fd片段;(iv)由抗体的单臂的VL和VH域组成的Fv片段,(v)由VH域组成的dAb片段(Wardetal.,(1989)Nature341:544-546);和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外,虽然Fv片段的两个域VL和VH由分开的基因编码,但是它们可以使用重组方法通过合成接头连接,所述合成接头使它们能够作为单个蛋白链生成,其中VL和VH区配对来形成单价分子(称为单链Fv(scFv),见例如,Birdetal.(1988)Science242:423-426;及Hustonetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。这种单链抗体也意图包含在术语抗体的“抗原结合部分”中。这些抗体片段使用常规方法(如蛋白水解片段化(proteolyticfragmentation)方法,如描述于J.Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,pp98-118(N.Y.AcademicPress1983)(其通过提述并入本文))以及通过本领域技术人员已知的其它技术获得。以与完整抗体相同的方式对片段筛选效果。
在一些实施方案中,抗体属于同种型IgG、IgA或IgD。在进一步的实施方案中,抗体选自下组:IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD、IgE或具有IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgM,IgA1,IgA2,IgAsec,IgD或者IgE的免疫球蛋白恒定和/或可变域。在其它实施方案中,抗体是双特异性或多特异性抗体。根据一个可选的实施方案,本公开的抗体可以经修饰以成为双特异性抗体,或多特异性抗体的形式。术语“双特异性抗体”意图包括具有两个不同结合特异性的任何药剂(例如蛋白、肽、或蛋白或肽复合物),其与(a)细胞表面抗原和(b)效应细胞表面上的Fc受体结合或相互作用。术语“多特异性抗体”意图包括具有多于两个不同结合特异性的任何药剂(例如蛋白、肽,或蛋白或肽复合物),其与(a)细胞表面抗原、(b)效应细胞表面上的Fc受体,和(c)至少一个其它组分结合或相互作用。相应的,该公开包括但不限于针对细胞表面抗原以及效应细胞上的Fc受体的双特异性、三特异性、四特异性,以及其它多特异性抗体。术语“双特异性抗体”进一步包括双抗体(diabody)。双抗体是二价的,双特异性的抗体,其中VH和VL域表达在一条多肽链上,但使用接头,该接头太短从而不允许同一条链上的两个域间的配对,因此迫使各域与另一条链上的互补域配对并创造两个抗原结合位点(见例如,Holliger,P.,etal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448;Poijak,R.J.,etal.(1994)Structure2:1121-1123)。
术语“抗体”也包含不同类型的抗体,例如重组抗体,单克隆抗体,人源化抗体或嵌合抗体,或这些的混合物。
在一些实施方案中,抗体是重组抗体。如本文中使用的,术语“重组抗体”意图包括通过重组手段制备、表达、创造或分离的抗体,如从在另一物种的免疫球蛋白基因方面转基因的动物分离的抗体,使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体,从重组的组合抗体库分离的抗体,或通过任意涉及免疫球蛋白基因序列剪接为其它DNA序列的其它手段制备、表达、创造或分离的抗体。
在其它实施方案中,抗体可以是嵌合或人源化的抗体。如本文所使用的,术语“嵌合抗体”指代将非人类(例如小鼠、大鼠、兔)抗体的部分与人抗体的部分组合的抗体。如本文所使用的,术语“人源化抗体”指仅保留与人框架区结合的来自亲本抗体的抗原结合CDR的抗体(见,Waldmann,1991,Science252:1657)。此类保留了鼠抗体的结合特异性的嵌合或人源化抗体在为了根据本公开的诊断、预防或治疗应用而体内施用时预期具有减少的免疫原性。在一些实施方案中,所述抗体是西妥昔单抗。
在某些实施方案中,抗体是人抗体。如本文中使用的,术语“人抗体”意图包括具有衍生于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本公开的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如,通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而,如本文中使用的,术语“人抗体”不意图包括如下的抗体,其中已经将衍生于另一哺乳动物物种种系(如小鼠)的CDR序列嫁接到人框架区序列上(本文称为“人源化抗体”)。使用携带人免疫系统而不是小鼠系统的部分的转基因小鼠产生人抗体。还可以通过免疫在大部分人免疫球蛋白重链和轻链基因座方面转基因的小鼠来制备完全人单克隆抗体。见例如美国专利5,591,669,5,598,369,5,545,806,5,545,807,6,150,584,以及其中引用的参考文献,其内容通过提述并入本文。这些动物已经经过遗传修饰,使得在内源性(如鼠)抗体的产生中存在功能缺失。这些动物经进一步修饰以含有人种系免疫球蛋白基因座的全部或部分,使得免疫这些细胞导致针对感兴趣抗原的全人抗体的产生。在免疫这些小鼠(例如,XenoMouse(Abgenix),HuMAb小鼠(Medarex/GenPharm))后,根据标准杂交瘤技术制备单克隆抗体。这些单克隆抗体具有人免疫球蛋白氨基酸序列,因此当施用到人时将不会引发人抗小鼠抗体(HAMA)应答。人抗体(如本文提供的任意抗体)可以是单克隆抗体。
在一些实施方案中,抗体是全长抗体。在一些实施方案中,全长抗体包含重链和轻链。在一些实施方案中,重链包括SEQIDNO:1而轻链包括SEQIDNO:2。在一些实施方案中,重链由SEQIDNO:1组成而轻链由SEQIDNO:2组成。在一些实施方案中,抗体是西妥昔单抗。
在一些实施方案中,抗体是糖基化抗体。在本文中更详细描述了糖基化抗体。在一些实施方案中,糖基化抗体含有包含SEQIDNO:1的重链和包含SEQIDNO:2的轻链。在一些实施方案中,糖基化抗体含有由SEQIDNO:1组成的重链和由SEQIDNO:2组成的轻链。在一些实施方案中,糖基化抗体比在非乳腺细胞培养物中产生的糖基化抗体具有更少的半乳糖-α-1,3半乳糖部分。在一些实施方案中,更少的半乳糖-α-1,3半乳糖部分位于糖基化抗体的重链可变区中。在一些实施方案中,更少的半乳糖-α-1,3半乳糖部分位于如SEQIDNO:1所示的重链中的位置107(在图1中突出显示)。
糖基化
糖基化对于治疗性糖蛋白的正确折叠、靶向、生物活性和清除是重要的。糖基化是一种翻译后修饰,其可以产生多种天然状态的最终蛋白形式。糖基化模式在不同动物(例如小鼠和人)之间不同。碳水化合物结构的某些改变也可以影响抗体功能、耐受性,或治疗效率。例如,如上文所述,某些糖部分(如gal-α-1,3-gal)能在人中导致变应性反应。
除了人和高等灵长类之外,大多数动物在N连接的糖上掺入α-1,3-gal。例如,用于生产治疗性蛋白的CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系在某些位点放置低水平的α-1,3半乳糖。此外,用于生产治疗性抗体西妥昔单抗的小鼠骨髓瘤细胞系也掺入α-1,3半乳糖部分。
令人惊讶的是,如本文所公开的,在转基因小鼠和山羊两者的乳腺中产生的重组西妥昔没有可检测的gal-α-1,3-gal。也如上文所提到的,结果是令人惊讶的,至少因为已知在小鼠骨髓瘤中产生的西妥昔单抗含有gal-α-1,3-gal糖(JunQian,etal.StructuralcharacterizationofN-linkedoligosaccharidesonmonoclonalantibodycetuximabbythecombinationoforthogonalmatrix-assistedlaserdesorption/ionizationhybridquadrupole-quadrupoletime-of-flighttandemmassspectrometryandsequentialenzymaticdigestion.AnalyticalBiochemistry364(2007)8–18)。
因此,在一些方面,本公开提供具有改变的糖基化模式的糖基化抗体或糖基化抗体群体。在一些实施方案中,本公开提供包含比在细胞培养物中产生的糖基化抗体或糖基化抗体群体更少的gal-α-1,3-gal部分的糖基化抗体或糖基化抗体群体。在一些实施方案中,导致较高水平的半乳糖-α-1,3半乳糖部分的产生的细胞培养物是非乳腺细胞培养物。如本文所描述的,“非乳腺细胞培养物”表示一种细胞培养系统,其中所使用的细胞不是乳腺组织起源的。在一些实施方案中,非乳腺细胞培养物是哺乳动物细胞培养物。在一些实施方案中,所述非乳腺细胞培养物是小鼠细胞培养物。在一些实施方案中,所述非乳腺细胞培养物是小鼠骨髓瘤细胞培养物。
在一些实施方案中,本公开提供缺乏gal-α-1,3-gal部分的糖基化抗体或糖基化抗体群体。如本文所使用的,“缺乏gal-α-1,3-gal部分的糖基化抗体或糖基化抗体群体”描述在整个抗体中不含gal-α-1,3-gal部分的抗体或抗体群体,或者在抗体中的规定位置处没有可检测的gal-α-1,3-gal的抗体。检测gal-α-1,3-gal的方法在本领域中是公知的,并在本文中也有描述。在一些实施方案中,本公开的糖基化抗体或糖基化抗体群体包括包含SEQIDNO:1的重链和包含SEQIDNO:2的轻链。在一些实施方案中,本文公开的糖基化抗体或糖基化抗体群体是西妥昔单抗抗体。
在其它方面,本公开提供生产具有改变的糖基化模式的糖基化抗体的方法。在一些实施方案中,本公开提供用于生产糖基化抗体的方法,所述糖基化抗体含有比在细胞培养物中产生的糖基化抗体更少的gal-α-1,3-gal部分。在一些实施方案中,所述更少的半乳糖-α-1,3半乳糖部分位于糖基化抗体的重链可变区。在一个实施方案中,所述更少的半乳糖-α-1,3半乳糖部分定位在SEQIDNO:1中的氨基酸位置107。在一些实施方案中,细胞培养物是非乳腺细胞培养物。在一些实施方案中,非乳腺细胞培养物是哺乳动物细胞培养物。在一些实施方案中,非乳腺细胞培养物是小鼠细胞培养物。在一些实施方案中,非乳腺细胞培养物是小鼠骨髓瘤细胞培养物。在一些实施方案中,本公开提供用于生产缺乏gal-α-1,3-gal部分的糖基化抗体的方法。在一些实施方案中,上述方法包括生产糖基化抗体的方法,所述抗体包括包含SEQIDNO:1的重链和包含SEQIDNO:2的轻链。在一些实施方案中,上述方法包括生产西妥昔单抗。
在一些实施方案中,糖基化抗体或糖基化抗体群体包含比在细胞培养物(例如,非乳腺细胞培养物)中产生的糖基化抗体或糖基化抗体群体更少的gal-α-1,3-gal部分。在一些实施方案中,糖基化抗体或糖基化抗体群体包含比在细胞培养物(例如,非乳腺细胞培养物)中产生的糖基化抗体或糖基化抗体群体少至少10%,至少20%,至少30%,至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少80%,至少90%,或100%的gal-α-1,3-gal部分。糖基化模式(例如gal-α-1,3-gal部分的数量)可以通过本领域的多种已知方法确定,例如液相色谱-质谱法(LC/MS)或串联质谱术。例如,用于分析蛋白上碳水化合物的方法已描述于美国专利申请US2006/0057638和US2006/0127950。分析蛋白上的碳水化合物的方法通过提述并入本文。因此,可以测量抗体或抗体群体中的gal-α-1,3-gal部分的量并与另一种抗体或抗体群体比较,从而确定在一个群体与另一个相比是否存在更少的gal-α-1,3-gal部分。
在另一个方面,本公开提供糖基化抗体或糖基化抗体群体的组合物。在一个方面,本公开提供包括糖基化抗体群体的组合物,其中所述糖基化抗体包括:
(a)包含SEQIDNO:1的重链;
(b)包含SEQIDNO:2的轻链;和
其中所述抗体群体具有比在非乳腺细胞培养物中产生的糖基化抗体群体更少的半乳糖-α-1,3半乳糖部分。
在另一个方面,本公开提供包含单克隆抗体的组合物,其中所述单克隆抗体包括:
(a)包含SEQIDNO:1的重链
(b)包含SEQIDNO:2的轻链;和
其中所述组合物在转基因山羊的乳腺中产生。
在再一个方面,本公开提供包含单克隆抗体的组合物,其中所述单克隆抗体包含:
(a)包含SEQIDNO:1的重链
(b)包含SEQIDNO:2的轻链;和
其中所述单克隆抗体缺乏半乳糖-α-1,3-半乳糖。
如上文所述的抗体或抗体群体的组合物可以具有本文所述的任意进一步限制。例如,在一些实施方案中,组合物在转基因非人动物(例如山羊)的乳腺中产生。在一些实施方案中,所述组合物进一步包含乳。在其它实施方案中,所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中,抗体或抗体群体包含比细胞培养物(例如,非乳腺细胞培养物)中产生的糖基化抗体更少的gal-α-1,3-gal部分。在其它实施方案中,抗体或抗体群体缺乏的gal-α-1,3-gal部分。
哺乳动物乳腺上皮细胞和转基因动物
在一个方面,本公开涉及产生糖基化抗体的哺乳动物乳腺上皮细胞。本文提供用于在哺乳动物乳腺上皮细胞中生产糖基化抗体的方法。
在一些实施方案中,通过在细胞培养物中(即体外或离体)生成来完成生产。乳腺组织起源的细胞的例子包括但不限于,乳腺上皮细胞、乳房上皮细胞、乳腺肿瘤细胞(例如乳腺癌细胞)。乳腺组织起源的细胞可以是原代细胞,永生化细胞,或转化细胞。
在一些实施方案中,通过在转基因动物中(即体内)生成完成生产。在一些实施方案中,哺乳动物乳腺上皮细胞在转基因动物中。在一些是实施方案中,哺乳动物乳腺上皮细胞经工程化而在转基因动物(如小鼠或山羊)的乳中表达重组抗体。为了完成这点,编码重组蛋白的基因的表达可以是例如在山羊β-酪蛋白调控元件的控制下。先前已经建立在小鼠和山羊乳两者中表达重组蛋白(例如抗体)(见例如美国专利申请No.2008-0118501)。在一些实施方案中,对产生乳蛋白的个体乳腺导管上皮细胞优化表达。
能够生产重组抗体的转基因动物可以根据本领域已知的方法产生(见,例如美国专利号5,945,577和美国专利申请号2008-0118501)。适合转基因表达的动物包括但不限于,山羊、绵羊、野牛、骆驼、母牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠或羊驼。适合的动物还包括牛、山羊、绵羊和猪,其分别涉及牛、山羊、绵羊和猪的物种。适合的动物还包括有蹄类动物。如本文所使用的,“有蹄类动物”属于或者涉及有蹄的通常食草的四足哺乳动物,包括但不限于,绵羊、猪、山羊、牛和马。适合的动物也包括乳品动物(如山羊和牛),或小鼠。在一些实施方案中,适合用于转基因表达的动物是山羊。
在一些实施方案中,通过产生包含感兴趣构建体的原代细胞,然后将原代细胞核核转移到去核的卵母细胞中来产生转基因动物。通过使用包含感兴趣的抗体(例如西妥昔单抗的重和轻链)的编码序列的单个构建体注射或转染原代细胞或者通过使用包含抗体(例如西妥昔单抗)的重链和轻链的编码序列的不同构建体共转染或共注射原代细胞来产生包含感兴趣的构建体的原代细胞。接着,扩增并表征这些细胞来评估转基因拷贝数,转基因结构完整性以及染色体整合位点。然后,使用具有期望转基因拷贝数,转基因结构完整性和染色体整合位点的细胞进行核转移以产生转基因动物。如本文所使用的,“核转移”指克隆的方法,其中将来自供体细胞的核移植到去核的卵母细胞中。
可以通过筛选源自选择的动物(例如人、牛或小鼠)的遗传材料或逆向翻译(reverse-translated)的信使RNA从序列数据库(如NCBI、Genbank),或通过使用本领域已知的方法(例如肽图谱)获得抗体的序列,来获得待在哺乳动物乳腺上皮细胞中表达的感兴趣的抗体的编码序列。序列可以克隆到适合的质粒载体中,并在适合的宿主生物(如大肠杆菌)中扩增。如本文所使用的,“载体”可以是可以通过限制和连接接受期望的序列插入以在不同遗传环境之间转运或用于在宿主细胞中表达的众多核酸的任一个。载体通常由DNA组成,虽然也可用RNA载体。载体包括但不限于质粒和噬菌粒。克隆载体是能够在宿主细胞中复制,并且特征还在于一个或多个内切核酸酶限制性位点的载体,在所述内切核酸酶限制性位点处所述载体以可确定的方式剪切,并可以对该内切核酸酶限制性位点连接期望的DNA序列,使得新的重组载体保留其在宿主细胞中复制的能力。表达载体是可以通过限制和连接接受期望的DNA序列插入,使得其可操作连接到调控序列并可以表达为RNA转录物的载体。载体可以进一步含有一个或多个标志物序列,其适合用于鉴定已经或尚未用所述载体转化或转染的细胞。标志物包括例如编码增加或减少对抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白的基因,编码可通过本领域已知的标准测定法检测的酶(例如β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶)的基因,以及明显影响转化或转染的细胞、宿主、集落或斑块的表型的基因。
感兴趣的抗体或抗体的重链和轻链的编码序列可以可操作地连接到控制序列,所述控制序列使得编码序列能够在转基因非人哺乳动物的乳中表达。在载体扩增后,可以使用限制性酶消化DNA构建体,从载体的剩余部分中纯化,并引入到受精的胚胎中来产生转基因动物。转基因动物将具有整合到它们的基因组中的期望的转基因蛋白。
适合用于将生成引导到转基因动物的乳的DNA序列可以携带衍生于天然来源的乳蛋白质的5’启动子区。该启动子因此在激素和组织特异性因子的控制下,并在哺乳期的乳腺组织中最活跃。在一些实施方案中,使用的启动子是乳特异性启动子。如本文所使用的,“乳特异性启动子”是在分泌蛋白到乳中的细胞中(例如乳腺上皮细胞)天然指导基因表达的启动子,包括例如酪蛋白启动子,例如α-酪蛋白启动子(例如αS-1酪蛋白启动子和αS2-酪蛋白启动子),β-酪蛋白启动子(例如山羊β酪蛋白基因启动子)(DiTullio,BioTechnology10:74-77,1992),γ-酪蛋白启动子,κ-酪蛋白启动子,乳清酸性蛋白(WAP)启动子(Gortonetal.,BioTechnology5:1183-1187,1987),β-乳球蛋白启动子(Clarketal.,BioTechnology7:487-492,1989),以及α-乳清蛋白启动子(Soulieretal.,FEBSLetts.297:13,1992)。这一定义也包括在乳腺组织中特异性活化的启动子,如例如小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)的长末端重复(LTR)启动子。在一些实施方案中,启动子是山羊的β酪蛋白启动子。
启动子可以可操作地连接到指导蛋白质前导序列产生的DNA序列,所述蛋白质前导序列指导转基因蛋白穿过乳腺上皮分泌到乳中。如本文所使用的,编码序列和调控序列(例如启动子)当它们以如下的方式连接时称为“可操作地连接”,所述方式使得将编码序列的表达或转录置于调控序列的影响或控制下。如本文所使用的,“前导序列”或“信号序列”是编码蛋白质分泌信号,并且当与编码转基因蛋白的下游核酸分子可操作地连接时指导分泌的核酸序列。引导序列可以是天然的人引导序列,人为来源的引导序列,或从用于指导转基因编码序列转录的启动子相同的基因获得,或从通常从细胞(如哺乳动物乳腺上皮细胞)分泌的另一种蛋白获得。在一些实施方案中,可以添加3’序列来改善mRNA的稳定性,所述3’序列可以衍生于天然分泌的乳蛋白质。
在一些实施方案中,为了产生含有构建体(例如编码西妥昔单抗抗体)的原代细胞系以用于通过核转移产生转基因山羊,重链和轻链构建体可以转染到原代山羊皮肤上皮细胞中,将所述上皮细胞扩增并完全表征以评估转基因拷贝数量,转基因结构完整性和染色体整合位点。如本文所使用的,“核转移”指克隆的方法,其中将来自供体细胞的核移植到去核的卵母细胞中。
克隆将导致转基因动物的多样性(multiplicity):每一个能够生产感兴趣的抗体或其它基因构建体。生产方法包括使用克隆的动物和那些动物的后代。克隆还包含胎儿的核转移,嵌合后代的核转移、组织和器官移植以及创建。克隆方法的一个步骤包括将细胞(例如含有感兴趣的转基因的原代细胞)的基因组转移到去核的卵母细胞中。如本文所使用的,“转基因”是指下述的核酸分子的任何部分,其通过人为插入细胞,或其祖先中,并成为从该细胞形成的动物基因组的一部分。这种转基因可以包括对于转基因的动物部分或全部外源性(即外来)的基因,或可以表示与动物的内源性基因具有同一性的基因。适合于卵母细胞的哺乳动物来源包括山羊、绵羊、牛、猪、兔、豚鼠、小鼠、仓鼠、大鼠、非人灵长类,等等。优选的是,卵母细胞从有蹄动物,且最优选山羊或牛获得。卵母细胞的分离方法是本领域已知的。基本上,方法包括从哺乳动物(例如山羊)的卵巢或生殖道分离卵母细胞。一种现成的有蹄动物卵母细胞的来源是来自激素诱导的雌性动物。为了技术(如遗传工程、核转移和克隆)的成功使用,可以优选地在体内成熟卵母细胞,之后这些细胞可以用作核转移的受体细胞,以及之后通过精细胞使它们受精以形成胚胎。中期第II阶段的卵母细胞(其已经在体内成熟)已经成功用于核转移技术。基本上,在动情期的开始后或人绒毛膜促性腺激素(hCG)或类似激素注射后几小时,通过手术从非超排卵或超排卵的动物收集成熟的中期II卵母细胞。
因此,在一个方面,本公开提供乳腺上皮细胞,其产生本公开的抗体或组合物。在一些实施方案中,抗体含有包含SEQIDNO:3的核酸和包含SEQIDNO:4的核酸。在一些实施方案中,包含SEQIDNO:3的核酸和包含SEQIDNO:4的核酸相连。“相连”用于本文表示物理连接核酸,例如在同一个载体中或在大约相同基因组位置内。在一些实施方案中,上文的乳腺上皮细胞在转基因的非人哺乳动物中。在一些实施方案中,转基因的非人哺乳动物是山羊。
在另一个方面,本公开提供用于生产转基因抗体以及其变体和片段的方法,该方法包括在转基因的非人哺乳动物的乳中表达由核酸构建体编码的转基因抗体。在一些实施方案中,用于生产本公开的抗体的方法包括:
(a)使用编码西妥昔单抗抗体的转基因DNA构建体转染非人哺乳动物细胞;
(b)选择所述西妥昔单抗转基因DNA构建体已插入到细胞的基因组中的细胞;和
(c)进行第一次核转移方案来产生在西妥昔单抗抗体上杂合并可以在其乳中表达它的非人转基因哺乳动物。
在一些实施方案中,转基因DNA构建体包含SEQIDNO:3和/或SEQIDNO:4。在一些实施方案中,非人转基因哺乳动物是山羊。在另一个方面,本公开提供以下方法:
(a)提供经工程化改造以表达西妥昔单抗抗体的非人转基因哺乳动物,
(b)在非人转基因哺乳动物的乳中表达西妥昔单抗抗体;和
(c)分离乳中表达的西妥昔单抗抗体。
在一些实施方案中,西妥昔单抗抗体含有包含SEQIDNO:1的重链和包含SEQIDNO:2的轻链。用于预测在乳腺中表达的重组蛋白的数量和质量的工具之一是通过诱导泌乳(EbertKM,1994)。诱导的泌乳允许从转基因生产的早期起,而不是从怀孕导致的首次天然泌乳(其迟了至少一年)起表达和分析蛋白。泌乳的诱导可以使用激素或手动完成。
在一些实施方案中,本文提供的糖基化抗体的组合物进一步包含乳。在一些实施方案中,本文提供的方法包括从转基因动物的乳中分泌抗体群体的步骤。用于从转基因动物的乳中分离抗体的方法是本领域已知的,并描述于例如Pollocketal.,JournalofImmunologicalMethods,Volume231,Issues1-2,10December1999,Pages147-157。在一些实施方案中,本文提供的方法包括纯化具有期望量的gal-α-1,3-gal的糖基化抗体的步骤。
药物组合物、剂量和施用
在一个方面,本公开提供药物组合物,其包含一定量的感兴趣的抗体或所述抗体的药学上可接受的盐,和药学上可接受的媒介物,稀释剂或载体。
在另一个方面,本公开提供治疗受试者的方法,包括将组合物施用到受试者,所述组合物以有效治疗受试者患有或有风险患有的疾病的量提供。在一个实施方案中,所述受试者是人类。在另一个实施方案中,所述受试者是非人的动物,例如,犬、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊或灵长类。在一些实施方案中,所述疾病是癌症。在一些实施方案中,所述癌症包括表达EGFR的癌细胞。在一些实施方案中,所述癌症包括具有野生型KRAS基因的细胞。在一些实施方案中,所述癌症是头和颈癌。在一些实施方案中,所述头和颈癌是鳞状细胞癌。在一些实施方案中,所述癌症是结直肠癌。在一些实施方案中,所述结直肠癌是转移性结直肠癌。
一些方法考虑与已知的癌症药物或疗法(例如化疗剂、免疫治疗剂、癌症疫苗、激素疗法,生物反应修饰剂、手术方案,或放射疗法)的联合疗法。应当理解本公开的抗体或组合物的施用和另一种药物或疗法的施用可以同时或不同时发生。在一个实施方案中,联合疗法包括施用与放射疗法联合的本文提供的抗体和组合物。
在另一个实施方案中,对所述受试者进一步施用另外的癌症药物。在一个实施方案中,所述另外的癌症药物是化疗剂。在一些实施方案中,所述化疗剂是氟尿嘧啶(也称为5-氟尿嘧啶或5-FU)。在一些实施方案中,所述化疗试剂是伊立替康(irinotecan)。在一些实施方案中,联合疗法包括:
(a)本公开的抗体或药物组合物(例如西妥昔单抗);
(b)亚叶酸钙;
(c)氟尿嘧啶;和
(d)盐酸伊立替康。
在本领域中,(b)、(c)和(d)的联合称为FOLFIRI。因此,在一些实施方案中,治疗方法包括施用本公开的抗体或药物组合物和FOLFIRI。
根据涉及施用治疗有效量的本文提供的抗体到需要治疗的受试者的实施方案,“治疗有效”或“有效治疗的量”表示用来抑制或逆转疾病状况(例如,减少或抑制癌症生长)需要的抗体或组合物的量。特别地,确定治疗有效量依赖于如药物的毒性和效力等的因素。这些因素将随其它因素而不同,如效力,相对生物利用度,患者体重,不利副作用的严重性和优选的给药方式。可以使用本领域公知的方法确定毒性。可以利用相同的指导确定效力。例如,效力可以通过靶标组织(例如肿瘤)的质量的减少来测量。因此,药学上有效的量是临床医生认为毒理学上能容许的但有效的量。
根据施用方式,可以适当调整剂量来达到期望的局部或系统的药物水平。如果受试者中的响应在此剂量时不充足,那么可以在患者耐受性允许的程度上采用甚至更高的剂量(或通过不同的,更局部的递送途径实现的有效的更高剂量)。考虑每天多剂来达到适合的抗体系统水平。可以通过例如测量药物的患者峰值或持续血清水平来确定适合的系统水平。“剂(dose)”和“剂量(dosage)”在本文中可互换使用。
在一些实施方案中,施用到受试者的抗体或药物组合物的量为每周50至500mg/m2,100至400mg/m2,或200至300mg/m2。在一个实施方案中,施用到受试者的抗体或药物组合物的量为每周250mg/m2。在一些实施方案中,第一周将400mg/m2的起始剂量施用到受试者,接着在随后的几周中,施用250mg/m2到受试者。在一些实施方案中,施用速率小于10mg/min。在一些实施方案中,对受试者施用所述抗体或药物组合物发生在使用另一种治疗剂(例如5-FU或FOLFIRI)治疗前至少一小时。在一些实施方案中,在施用所述抗体或药物组合物之前施用预处理。在一个实施方案中,所述预处理是施用H1拮抗剂。在一个实施方案中,所述H1拮抗剂是苯海拉明。
在一个实施方案中,提供的组合物用于体内应用。根据意图的体内施用方式,使用的组合物可以是固体、半固体或液体剂型,例如片剂、丸剂、粉剂、胶囊剂、凝胶、软膏、液体、悬浮液,等等。优选地,所述组合物以适合单次施用精确剂量量的单位剂型施用。根据期望的配制剂,所述组合物还可以包括药学上可接受的载体或稀释剂,其定义为通常用于配制药物组合物以供动物或人施用的基于水性(aqueous-based)的媒介物。稀释剂经选择使得不影响感兴趣的人重组蛋白的生物学活性。这些稀释剂的例子为蒸馏水、生理盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和汉克(Hank)氏溶液。相同的稀释剂可以用于重建冻干的感兴趣的重组蛋白。另外,药物组合物还可以包括其它医药剂、药学剂、载体、佐剂、无毒的、非治疗的、非免疫原性的稳定剂,等等。这些稀释剂或载体的有效量是指在组分的溶解度,生物活性等方面有效获得药学上可接受配制剂的量。在一些实施方案中,本文提供的组合物是无菌的。
体内治疗期间的施用可以通过许多途径进行,包括口服、肠胃外、肌肉内、鼻内、舌下、气管内、吸入、眼、阴道和直肠。还可以采用囊内、静脉内和腹膜内施用途径。熟练技术人员认识到施用的途径随待治疗的病症而变化。例如,本文的组合物或抗体可以通过口服、肠胃外或局部使用和除此以外系统形式施用到受试者用于抗癌症治疗,例如头和颈癌或结直肠癌。在一个实施方案中,本文的组合物或抗体通过静脉内输注施用。
化合物当期望系统性递送它们时可以配制用于通过注射的肠胃外施用,例如通过推注或连续输注。用于注射的配制剂可以以单位剂量形式,例如在安瓶中或在多剂量容器中呈现,添加有防腐剂。组合物可以采取此类形式,如溶于油性或水性媒介物的悬浮液、溶液或乳剂,并可以含有配制用药剂,如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
用于肠胃外施用的药物配制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外,活性化合物的悬浮液可以制备为适当的油性注射悬浮液。适合的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油,如芝麻油,或合成脂肪酸酯,如油酸乙酯或甘油三酯,或脂质体。水性注射悬浮液可以含有增加悬浮液粘度的物质,如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇,或葡聚糖。可选地,悬浮液还可以含有适合的稳定剂或增加化合物溶解度以允许制备高度浓缩的溶液的试剂。或者,活性化合物可以是粉末的形式,在使用前使用适合的媒介物例如无菌无热源水重建。
对于口服施用,药物组合物可以采取例如片剂或胶囊剂的形式,其通过常规方法使用药学上可接受的赋形剂制备,例如粘合剂(例如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素);填充剂(例如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙);润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石或硅土);崩解剂(例如马铃薯淀粉或淀粉羟基乙酸钠);或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。片剂可以通过本领域公知的方法包被。用于口服施用的液体制剂可以采取例如溶液、糖浆剂或悬浮液的形式,或它们可以呈现为干燥品,使用前与水或其它适合的媒介物重建。这些液体制剂可以通过常规方法使用药学上可接受的添加剂制备,如悬浮剂(例如山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂肪);乳化剂(例如卵磷脂或阿拉伯胶);非水媒介物(例如杏仁油、油酯、乙醇或分馏的植物油);和防腐剂(例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。在适当时,制剂还可以含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。组分可以经化学修饰,使得抗体的口服递送是有效的。通常来说,考虑的化学修饰是将至少一种分子附接到抗体,其中所述分子允许(a)对蛋白水解的抑制;和(b)从胃或小肠吸收到血液中。也希望抗体的整体稳定性的增加和在机体中循环时间的增加。这些分子的例子包括:聚乙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和聚脯氨酸。Abuchowski和Davis,1981,"SolublePolymer-EnzymeAdducts"In:EnzymesasDrugs,HocenbergandRoberts,eds.,Wiley-Interscience,NewYork,NY,pp.367-383;Newmark,etal.,1982,J.Appl.Biochem.4:185-189。可以使用的其它聚合物是聚-1,3-二氧戊环(poly-1,3-dioxolane)和聚-1,3,6-三氧辛环(poly-1,3,6-tioxocane)。如上文所指出的,对于药物使用优选的聚乙二醇分子。对于口服组合物,释放的位置可以是胃、小肠(十二指肠、空肠,或回肠),或大肠。本领域的技术人员具有可用的配制剂,其将不在胃中溶解但将在十二指肠或小肠的其它位置释放材料。优选地,释放将通过保护抗体或通过在胃环境之外,如在小肠中释放生物学活性材料来避免胃环境的有害影响。
对于含服施用,组合物可以采取以常规方式配制的片剂或锭剂的形式。
对于通过吸入施用,用于根据本公开使用的化合物可以以加压包装或喷雾器的气溶胶喷雾形式,使用适合的推进剂方便地递送,例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其它适合的气体。在加压气溶胶的情况下,可以通过提供阀门来递送计量的量以确定剂量单位。例如,可以配制吸入器或吹入器中使用的明胶的胶囊和药筒,其含有化合物和合适的粉末基质(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
本文还考虑肺部递送。组合物当吸入时可以递送到哺乳动物的肺,并穿过肺上皮衬里到血流。考虑用于本公开的实施中的是许多经设计用于肺部递送治疗产品的机械装置,包括但不限于喷雾器、计量剂量吸入器和粉末吸入器,所有这些对于本领域的技术人员都是熟悉的。
还考虑鼻腔递送本公开的药物组合物。在治疗产品施用到鼻后,鼻腔递送允许本公开的药物组合物直接通到血流中,而不需要产物在肺中的沉积。用于鼻腔递送的配制剂包括那些具有葡聚糖或环糊精的配制剂。
化合物还可以配制为直肠或阴道组合物,如栓剂或保留灌肠,例如含有常规栓剂基质,如可可脂或其它甘油酯。
药物组合物还可以包含适合的固相或凝胶相载体或赋形剂。这些载体或赋形剂的例子包括但不限于,碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶,和聚合物,如聚乙二醇。
适合的液体或固体药物制剂形式为例如用于吸入的水溶液或盐水溶液,微囊化的,螺旋化的(encochleated),涂覆到微观金颗粒上,包含在脂质体中,喷化的,气溶胶,用于植入皮肤中的团粒,或干燥到待挖入皮肤中的尖锐物体上。药物组合物还包括颗粒剂、粉剂、片剂、包衣片剂、(微)胶囊、栓剂、糖浆剂、乳剂、悬浮剂、乳膏、滴剂(drop)或活性化合物的延长缓释的制剂,在该制剂中赋形剂和添加剂和/或助剂,如崩解剂、粘合剂、包衣剂、溶胀剂、润滑剂、调味剂、甜味剂或增溶剂如上文所述常规使用。药物组合物适合用于多种药物递送系统。对于药物递送方法的简要综述,见Langer,Science249:1527-1533,1990,其通过提述并入本文。
抗体以及任选的其它治疗剂可以以本身(纯的)或以药学上可接受的盐的形式施用。当用于药物中时,盐应当是药学上可接受的,但非药学上可接受的盐可以便利地用于制备其药学上可接受的盐。这些盐包括但不限于,从以下酸制备的那些:盐酸,氢溴酸,硫酸,硝酸,磷酸,马来酸,乙酸,水杨酸,对甲苯磺酸,酒石酸,柠檬酸,甲磺酸,甲酸,丙二酸,琥珀酸,萘-2-磺酸,和苯磺酸。此外,这些盐可以制备为碱金属或碱土金属盐,例如羧基基团的钠、钾或钙盐。
适合的缓冲剂包括:乙酸和盐(1-2%w/v);柠檬酸和盐(1-3%w/v);硼酸和盐(0.5-2.5%w/v);以及磷酸和盐(0.8-2%w/v)。适合的防腐剂包括苯扎氯铵(0.003-0.03%w/v);氯丁醇(0.3-0.9%w/v);对羟基苯甲酸酯(0.01-0.23%w/v)和硫柳汞(0.004-0.02%w/v)。
本公开的药物组合物含有有效量的抗体,以及任选地治疗剂,其包括在药学上可接受的载体中。术语药学上可接受的载体表示一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包囊物质,其适合用于施用到人或其它脊椎动物。术语载体表示与活性成分组合来促进应用的天然或合成的有机或无机成分。药物组合物的组分还能够以如下的方式与本公开的化合物以及互相混合,从而没有会实质上损害期望的药用效率的相互作用。
治疗剂(特别地包括但不限于抗体)可以以颗粒提供。如用于本文,颗粒包括纳米颗粒或微粒(或在一些情况下更大),其可以全部或部分由抗体或与所述抗体一同施用的其它治疗剂构成。除了治疗剂外,颗粒可以包括任意在药学和医学领域中常规使用的材料,包括但不限于,可腐蚀的、不可腐蚀的、可生物降解的,或不可生物降解的材料或其组合。颗粒可以是微胶囊,其含有溶液或半固体状态的抗体。颗粒可以是几乎任何形状的。
生产方法
本公开的一个方面提供用于糖基化抗体或糖基化抗体群体的生产方法,该方法包括在转基因非人哺乳动物的乳中表达由核酸构建体编码的糖基化抗体。在一个实施方案中,哺乳动物乳腺上皮细胞是经工程化而在其乳中表达抗体的非人哺乳动物的。在另一个实施方案中,哺乳动物乳腺上皮细胞是培养中的哺乳动物乳腺上皮细胞。
在一个实施方案中,所述方法包括:
(a)提供经工程化而表达抗体的非人转基因哺乳动物,
(b)在所述非人转基因哺乳动物的乳中表达抗体;
(c)分离乳中表达的抗体;和
(d)在分离的抗体上检测gal-α-1,3-gal部分的存在。
在再一个实施方案中,所述方法包括在乳腺上皮细胞中产生糖基化抗体群体,使得产生的糖基化抗体群体包含比在非乳腺细胞培养物中产生的糖基化抗体群体更少的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分,其中所述糖基化抗体包括包含SEQIDNO:1的重链和包含SEQIDNO:2的轻链。在一些实施方案中,该方法在体外进行。在其他实施方案中,该方法在体内进行,例如在转基因山羊的乳腺中。
在一些实施方案中,以上方法进一步包括诱导泌乳的步骤。在其它实施方案中,所述方法进一步包括另外的分离和/或纯化步骤。在其它实施方案中,所述方法进一步包括用于比较获得的抗体与在细胞培养物(例如非乳腺细胞培养物)中产生的抗体的糖基化模式的步骤。在进一步的实施方案中,所述方法进一步包括比较获得的抗体和由非乳腺上皮细胞产生的抗体的糖基化模式的步骤。这些细胞可以是细胞培养物的细胞。在一些实施方案中,所述糖基化模式是gal-α-1,3-gal模式,例如存在于抗体或抗体群体上的gal-α-1,3-gal部分的量。在一些实施方案中,所述方法进一步包括比较糖基化抗体群体中存在的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分的数量和细胞培养物(例如,非乳腺细胞培养物)中产生的糖基化抗体群体中存在的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分的数量。用于评估抗体的糖基化模式的实验技术可以是任意本领域普通技术人员已知的技术或如本文(如在下面的实施例)中所提供的技术。此类方法包括例如液相色谱质谱术、串联质谱术、以及Western印迹分析。
在一些实施方案中,可以通过从如本文所提供的产生的转基因动物的乳或从所述转基因动物的后代收集抗体来获得抗体。在一些实施方案中,由转基因哺乳动物产生的抗体以每升生成的乳至少1克的水平上产生。
除非本文另有定义,与本公开相关使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外,除了上下文另有要求,单数术语应当包括复数形式而复数术语应当包括单数形式。本公开的方法和技术通常根据本领域公知的常规方法进行。一般来说,本文描述的与生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学和蛋白和核酸化学以及杂交的相关术语和技术为本领域公知并常用的。除非另有指示,本公开的方法和技术一般根据本领域公知的常规方法并且如贯穿本说明书所引用和讨论的各种通用且更具体的参考文献中所描述的那样进行。
本发明通过以下实施例进一步阐述,其决不应解释为进一步的限制。贯穿本发明所引用的所有参考文献(包括文献参考文献、授权专利、公开的专利申请,以及共同待批的专利申请)的全部内容在此通过提述并入本文。
实施例
方法
表1.SEQIDNO列表
编码西妥昔单抗的基因
西妥昔单抗/的氨基酸序列公布于CharlotteMagdelaine-Beuzelin,etal.,CriticalReviewsinOncology/Hematology64(2007)210–225并用作确认商业生产的的序列的参照。
肽图谱
商业生产的西妥昔单抗通过生成重链和轻链的肽图谱来分析,并确认了公布的氨基酸序列。通过胰蛋白酶和Asp-N消化,然后进行HPLC和质谱分析来生成肽图谱。然后,商业生产的西妥昔单抗的氨基酸序列用于设计在转基因动物的乳中表达西妥昔单抗的DNA表达序列。
β酪蛋白表达构建体
西妥昔单抗重链和轻链的DNA序列针对在牛系统中表达来优化(SEQIDNO:3(重链)和4(轻链))。本文中所描述的所有构建体含有优化过的序列。
用于本文的构建体包括西妥昔单抗的编码序列,Kozak共有序列以及帮助克隆到β酪蛋白表达载体中的侧翼XhoI位点。用于本项目的表达载体为Bc450,Bc451,Bc800,和Bc350,所有这些载体都在赋予AmpR和KanR的supercos背景中。
质粒Bc2553(图5)含有表达载体Bc450中的西妥昔单抗轻链核苷酸序列(SEQIDNO:4),其包括在supercos骨架中的鸡β球蛋白绝缘子序列,6.2kb的5'β酪蛋白序列,XhoI克隆位点,以及7.1kb3'β酪蛋白侧翼序列。supercos载体可以使用侧翼SalI位点移除。
质粒Bc2554(图6)含有表达载体Bc800中的西妥昔单抗重链核苷酸序列(SEQIDNO:3),其包括也在supercos骨架中的相同的鸡β球蛋白绝缘子序列,6.2kb的5'β酪蛋白序列,XhoI克隆位点,以及7.1kb3'β酪蛋白侧翼序列,添加有NeoR标志物,其侧翼有另外的鸡β球蛋白绝缘子序列。supercos载体使用存在于两端的NotI位点移除。
连接三段DNA来产生质粒Bc2584(图7)。第一段通过将重链编码序列插入Bc350来制成,所述Bc350与上述的Bc450相同,除了使用NotI替换了下游的SalI外。这一SalI-NotI片段(其含有绝缘子,β酪蛋白,以及重链序列)连接到pGL71的SalI-NotI片段(其含有嘌呤霉素抗性基因),以及带有侧翼SalI位点的supercos片段。
转基因小鼠的产生
携带西妥昔单抗的重链和轻链的β酪蛋白构建体(分别为SEQIDNO:6和SEQIDNO:5;BC2554和BC2553)使用标准的原核(pro-nuclear)显微注射技术用于产生转基因小鼠。通过使用NotI消化来释放supercos骨架并电洗脱β酪蛋白重链注射片段从BC2554HCNeo分离重链的注射片段。同样地,通过用SalI消化,接着电洗脱注射片段从β酪蛋白轻链片段移除supercos。
转基因山羊的产生
转基因山羊通过体细胞核转移(SCNT)或克隆产生。选择标志物加到β酪蛋白表达构建体以选择带有期望转基因的细胞培养物。标志物通过将嘌呤霉素抗性基因与β酪蛋白重链相连来添加标志物,产生BC2584HCpuro(SEQIDNO:7;图7)。该DNA构建体用于转染原代雌性成纤维细胞。选择后,表征克隆来保证整合了重链和轻链两者。实施了SCNT,并从G100细胞系中产生了两只雌性山羊。诱导这两只山羊#1和#2进行泌乳,以在它们的乳中产生西妥昔单抗。
LC/MS
通过液相色谱-质谱术(LC/MS)使用本领域公知的方法分析从山羊#1和#2纯化的西妥昔单抗和商业的(见图13)。
结果
肽图谱
肽图谱确认了商业生产的西妥昔单抗的可变区序列是正确的,如公布于CharlotteMagdelaine-Beuzelinetal.,(CriticalReviewsinOncology/Hematology64(2007)210–225)。另外,肽图谱确认了重链恒定区为人IgG1而轻链携带κ恒定区。
在小鼠中表达
鉴定了在其基因组中携带西妥昔单抗的重链和轻链构建体两者的几个小鼠品系。小鼠在成熟后育种并在分娩后挤奶。通过Western印迹对乳分析西妥昔单抗的存在以确定表达水平。在两个小鼠的品系(#15和#27)中,西妥昔单抗的表达水平示于图8。
从小鼠的乳中纯化了西妥昔单抗并在Western印迹上分析来确定α-1,3-gal是否存在。如图9所看到的,在小鼠产生的抗体中没有α-1,3-gal的证据(第10道)。与此相反,商业生产的西妥昔单抗确实显示出α-1,3-gal(第2道)。
在山羊中表达
使用上文描述的方法衍生于细胞系G100的转基因山羊对于连接到西妥昔单抗的重链和轻链的酪蛋白载体是转基因的。该动物在3个月龄时诱导泌乳。收集乳并通过Western印迹分析来确定西妥昔单抗的表达水平。如Western印迹所示,山羊#1和#2中每一只在它们的乳中产生了10-15mg/ml的西妥昔单抗,其中抗人IgG1用于检测重组抗体(图10)。
糖基化分析
为了确认α-1,3-gal是否存在于山羊乳产生的西妥昔单抗上,纯化抗体,如图11所示。随后,使用针对α-1,3-gal的特异性单克隆抗体进行了Western印迹(图12)。作为阳性对照,使用了牛层粘连蛋白。印迹显示了商业生产的和层粘连蛋白结合α-1,3-gal单克隆抗体,但是在山羊#1或#2的乳中产生的西妥昔单抗(第2道和第3道)不结合gal-α-1,3-gal单克隆抗体。因此,山羊乳产生的抗体不包括与N-连接位点连接的α-1,3-gal。然而,令人感兴趣的是,小鼠IgG(第9道),以及山羊血清(图9;第8道)确实显示gal-α-1,3-gal。
从山羊#1和山羊#2纯化的山羊乳产生的西妥昔单抗也通过LC/MS分析并与商业的比较。如图13所示,α-1,3-gal存在于上,但不存在于转基因山羊的乳中产生的西妥昔单抗上。因此,当产生于山羊的乳腺中时,西妥昔单抗的重链可变区中的糖基化位点不被α-1,3-gal装饰。相反,在小鼠细胞中商业产生的西妥昔单抗(即)确实显示α-1,3-gal糖基化。因此,在乳腺中的生产不包括α-1,3-gal糖基化,甚至是对其它系统中(例如,在非乳腺小鼠细胞中)通常以这种方式装饰的位点。
其它实施例
本说明书公开的所有特征可以在任意组合中组合。本说明中公开的每个特征可以由用于相同、等效或类似目的的备选特征所替代。因此,除非另有明确声明,否则公开的每个特征仅为通用系列的等效或类似特征的一个例子。
从以上描述看,本领域的技术人员能够容易地确定本发明的本质特征,并且在不背离其精神和范围的情况下能进行本发明的各种改变和修饰,以使其适应各种用途和条件。因此,其它实施方案也在权利要求的范围内。
Claims (53)
1.一种糖基化抗体,其包含:
(a)包含SEQIDNO:1的重链;
(b)包含SEQIDNO:2的轻链;
其中所述糖基化抗体比在非乳腺细胞培养物中产生的糖基化抗体具有更少的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分。
2.权利要求1的糖基化抗体,其中所述非乳腺细胞培养物是小鼠骨髓瘤细胞培养物。
3.权利要求1或2的糖基化抗体,其中所述更少的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分位于所述重链的可变区中。
4.权利要求1-3任一项的糖基化抗体,其中所述更少的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分位于如SEQIDNO:1中所示的重链的位置107处。
5.权利要求1的糖基化抗体,其中所述糖基化抗体缺乏半乳糖-α-1,3-半乳糖部分。
6.权利要求1-5任一项的糖基化抗体,其中所述糖基化抗体在乳腺上皮细胞中产生。
7.权利要求1-6任一项的糖基化抗体,其中所述糖基化抗体在非人转基因哺乳动物的乳腺上皮细胞中产生。
8.权利要求7的糖基化抗体,其中所述非人哺乳动物是山羊、绵羊、野牛、骆驼、母牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠或羊驼。
9.权利要求7的糖基化抗体,其中所述非人哺乳动物是山羊。
10.权利要求1-9任一项的糖基化抗体,其中所述抗体是嵌合的、人源化的或完全人的抗体。
11.权利要求1-10任一项的糖基化抗体,其中所述抗体是西妥昔单抗(cetuximab)。
12.一种组合物,其包含权利要求1-11任一项的糖基化抗体,和药学上可接受的载体。
13.一种组合物,其包含糖基化抗体群体,其中所述糖基化抗体包含:
(a)包含SEQIDNO:1的重链;
(b)包含SEQIDNO:2的轻链;和
其中所述抗体群体比在非乳腺细胞培养物中产生的糖基化抗体群体具有更少的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分。
14.权利要求13的组合物,其中所述非乳腺细胞培养物是小鼠骨髓瘤细胞培养物。
15.权利要求13或14的组合物,其中所述更少的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分位于所述重链的可变区中。
16.权利要求13-15任一项的组合物,其中所述更少的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分位于如SEQIDNO:1中所示的重链的位置107处。
17.权利要求13的组合物,其中所述糖基化抗体缺乏半乳糖-α-1,3-半乳糖部分。
18.权利要求13-17任一项的组合物,其中所述糖基化抗体群体在乳腺上皮细胞中产生。
19.权利要求13-18任一项的组合物,其中所述糖基化抗体群体在非人转基因哺乳动物的乳腺上皮细胞中产生。
20.权利要求19的组合物,其中所述非人哺乳动物是山羊、绵羊、野牛、骆驼、母牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠或羊驼。
21.权利要求19的组合物,其中所述非人哺乳动物是山羊。
22.权利要求13-21任一项的组合物,其中所述群体中的糖基化抗体是嵌合的、人源化的或完全人的抗体。
23.权利要求13-22任一项的组合物,其中所述群体中的糖基化抗体是西妥昔单抗抗体。
24.权利要求13-23任一项的组合物,其中所述组合物进一步包含乳。
25.权利要求13-24任一项的组合物,其中所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
26.一种包含单克隆抗体的组合物,其中所述单克隆抗体包含:
(a)包含SEQIDNO:1的重链;
(b)包含SEQIDNO:2的轻链;且
其中所述组合物在转基因山羊的乳腺中产生。
27.一种包含单克隆抗体的组合物,其中所述单克隆抗体包含:
(a)包含SEQIDNO:1的重链;
(b)包含SEQIDNO:2的轻链;且
其中所述单克隆抗体缺乏半乳糖-α-1,3-半乳糖。
28.一种方法,其包括:
在乳腺上皮细胞中产生糖基化抗体群体,使得产生的糖基化抗体群体比在非乳腺细胞培养物中产生的糖基化抗体群体包含更少的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分,且
其中所述糖基化抗体群体含有包含SEQIDNO:1的重链和包含SEQIDNO:2的轻链。
29.权利要求28的方法,其中所述非乳腺细胞培养物是小鼠骨髓瘤细胞培养物。
30.权利要求28或29的方法,其中糖基化抗体群体缺乏半乳糖-α-1,3-半乳糖。
31.权利要求28-30任一项的方法,其中所述方法进一步包含收集所述糖基化抗体群体。
32.权利要求28-31任一项的方法,其中在体外发生所述产生。
33.权利要求28-31任一项的方法,其中在体内发生所述产生。
34.权利要求33的方法,其中在非人转基因哺乳动物中发生所述产生。
35.权利要求34的方法,其中所述非人哺乳动物是山羊、绵羊、野牛、骆驼、母牛、猪、兔、水牛、马、大鼠、小鼠或羊驼。
36.权利要求34的方法,其中所述非人哺乳动物是山羊。
37.权利要求28-36任一项的方法,所述方法进一步包含纯化所述糖基化抗体群体。
38.权利要求28-37任一项的方法,其中所述方法进一步包括
比较存在于所述糖基化抗体群体中的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分的数量与存在于在非乳腺细胞培养物中产生的糖基化抗体群体中的半乳糖-α-1,3-半乳糖部分的数量。
39.通过权利要求28-38任一项的方法产生的糖基化抗体群体。
40.乳腺上皮细胞,其产生权利要求1-11任一项的抗体。
41.权利要求40的乳腺上皮细胞,其中所述乳腺上皮细胞含有包含SEQIDNO:3的核酸和包含SEQIDNO:4的核酸。
42.权利要求41的乳腺上皮细胞,其中所述包含SEQIDNO:3的核酸和包含SEQIDNO:4的核酸相连。
43.一种转基因非人哺乳动物,其包含权利要求40-42任一项的乳腺上皮细胞。
44.乳腺上皮细胞,其产生权利要求13-27任一项的抗体群体。
45.权利要求44的乳腺上皮细胞,其中所述乳腺上皮细胞含有包含SEQIDNO:3的核酸和包含SEQIDNO:4的核酸。
46.权利要求45的乳腺上皮细胞,其中所述包含SEQIDNO:3的核酸和包含SEQIDNO:4的核酸相连。
47.一种转基因非人哺乳动物,其包含权利要求44-46任一项的乳腺上皮细胞。
48.权利要求43或47的转基因非人哺乳动物,其中所述转基因非人动物是山羊。
49.一种方法,其包括:
将有效量的权利要求1-11任一项的抗体或权利要求12-27任一项的组合物施用到有所需要的受试者。
50.权利要求49的方法,其中所述受试者患有癌症。
51.权利要求50的方法,其中所述癌症是头和颈癌或结肠直肠癌。
52.权利要求49-51任一项的方法,其中所述方法进一步包含施用至少一种另外的治疗剂。
53.权利要求52的方法,其中所述至少一种另外的治疗剂是伊立替康、亚叶酸钙、氟尿嘧啶,或其组合。
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