CN104768972A - 血管生成素样4抗体及其用在癌症治疗中的方法 - Google Patents

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Abstract

结合血管生成素样4蛋白的C末端区域的抗体，其用途以及用其治疗癌症的方法。

Description

血管生成素样4抗体及其用在癌症治疗中的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年8月14日提交的美国临时专利申请第61/682,920号的优先权权益，为了所有目的，其全部内容通过引用合并于此。
技术领域
本发明涉及用于治疗癌症的抗体和治疗癌症的方法。
背景技术
ANGPTL蛋白属于与血管生成素家族成员具有最高相似性的调节血管生成的分泌性蛋白的超家族。除了为人类同源基因的ANGPTL5，已在人类和小鼠中发现血管生成素样家族的所有成员(Angptl 1～7)(Grootaert等，2012；Zhu等，2012)。天然全长的ANGPTL4可通过分子间二硫键形成更高级结构(Yin等，2009)。ANGPTL4的N末端区域(这里表示为nANGPTL4)负责组装为二聚体或四聚体结构(Ge等，2004)，而ANGPTL4的低聚对于其作为富含甘油三酯的脂蛋白(LPL)的脂解的抑制剂的功能很重要(Yau等，2009；Ge等，2004；Yin等，2009)。通过前蛋白转化酶，全长ANGPTL4蛋白在连接区域发生蛋白水解作用，释放nANGPTL4和ANGPTL4的单体C末端部分(cANGPTL4)(Yang等，2008；Lei等，2011；Ge等，2004)。
血管生成素样蛋白4(ANGPTL4)为主要在肝脏中表达的分泌性蛋白，其已被证明通过抑制富含甘油三酯的脂蛋白的脂解而调节甘油三酯代谢。实验结果显示ANGPTL4作用，以在不同营养状态期间调节循环的甘油三酯水平，并因此在给食/禁食期间通过脂蛋白脂肪酶(LPL)的差别化抑制而在脂类代谢中发挥作用。血管生成素样蛋白的N末端结构域已经显示在脂类代谢中发挥了积极的作用。通过使用缺失突变体证明，是含有N末端结构域的片段(17～207)而非含有C末端纤维蛋白原样结构域的片段(207～460)增加了小鼠中的血浆甘油三酯水平：ANGPTL4已被确认为一种新的旁分泌，并且可能是脂类代谢的内分泌调节剂和过氧化物酶体增殖物激活的受体(PPAR)的目标。它在许多细胞类型中表达，例如脂肪细胞和肝细胞，并且在禁食和缺氧时被上调。重要的是，ANGPTL4发生蛋白水解作用而释放其C末端纤维蛋白原样结构域(cANGPTL4)，其作为单体循环，但其功能仍不清楚。ANGPTL4的N末端卷曲螺旋结构域(nANGPTL4)调节ANGPTL4的低聚，并与脂蛋白脂肪酶结合，以调制调节低聚的脂蛋白代谢和脂蛋白代谢。相反，cANGPTL4作为单体存在，并且其功能仍然未知。已显示ANGPTL4在血管生成和血管渗透性中起依赖于环境的功能。目前ANGPTL4被确定为是与能量代谢和伤口愈合的调节有关的细胞基质蛋白。
ANGPTL4被确定为可以预测乳腺癌向肺部转移的最频繁基因中的一种(Minn等，2005)，并且进一步的研究表明TGFI3经由ANGPTL4通过调节内皮细胞完整性而控制肺转移播种，以调节肺转移的播种(Zhang等，2008)。ANGPTL4已被确认为在小范围体内缺氧标志中的突出的基因，该缺氧标志在多种肿瘤类型中预示较差的结果(Hu等，2009；Murata等，2009)。已发现ANGPTL4mRNA在多种人类肿瘤、肾透明细胞癌、口腔舌鳞状细胞癌和人类胃癌中上调(Nakayama等，2011；Le Jan等，2003)。组织阵列分析表明，ANGPTL4在多达40种已知人类上皮性肿瘤类型中的表达升高，并且其表达随着肿瘤由良性进化至转移状态而增加(Zhu等，2011)。TGFI3诱导的ANGPTL4增强了癌细胞在肺部的保持力，破坏了血管内皮细胞间连接，增加了肺毛细血管的通透性，并且促进了肿瘤细胞的跨内皮通道，从而促进了转移的关键步骤(Padua等，2008)。ANGPTL4在多种癌症中的升高的表达表明ANGPTL4在肿瘤生长中的作用，并且提出其可能通过淋巴管入侵在转移中起作用(Shibata等，2010)。最近通过Broad-Novartis癌细胞系百科全书发表的数据进一步确认了Angptl4的表达在约1000种癌细胞系中增加(http://www.broadinstitute.org/ccle/home)。该网页包含公众可获得约1000种细胞系的DNA拷贝数、mRNA表达和突变数据的分析和图像信息。
肿瘤衍生的Angptl4与β1整合素直接相互作用，并且操纵整合素控制的信号，以保持升高的致癌O:H2O2比。该作用刺激了氧化还原调节的Src运转的激活，并因此激活下游PI3K1PKBa和ERK信号级联，以促进细胞存活和肿瘤生长。值得注意的是，RNAi对ANGPTL4的抑制调节了细胞内活性氧类(ROS)的生成，从而减弱与体内和体外细胞凋亡的增加相关的肿瘤生长。已报道了靶向小鼠ANGPTL4蛋白的N末端的抗ANGPTL4抗体(Desai等，2007)，其在体外起作用，而显示其影响该蛋白在体内的线粒体活性和血糖调节。我们进一步证明肿瘤衍生的cANGPTL4通过直接与三种新型结合配体(整合素α5β1、VE-钙粘蛋白和claudin-5)相互作用，以时间顺序的方式引起了对内皮连续性的破坏，从而促进了转移(Huang等，2011)。
目前使用的所有ANGPTL4抑制剂都仍处于实验室阶段，并且对工业规模的生产来说不稳定或不合适。仍需要具有抗肿瘤性质、低免疫原性并能够在患者体内稳定存在的ANGPTL4的特异性抑制剂，以用于癌症治疗。
发明内容
本发明的第一方面包括结合血管生成素样4蛋白的C末端区域(cANGPTL4)的抗体，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3区域，并且所述轻链包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中：所述VL CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO:3，主要由SEQ ID NO:3组成或者由氨基酸序列SEQ ID NO:3组成；所述VL CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO:4，主要由氨基酸序列SEQ ID NO:4组成，或者由氨基酸序列SEQ ID NO:4组成；所述VL CDR3包含氨基酸序列SEQ IDNO:5，主要由氨基酸序列SEQ ID NO:5组成，或者由氨基酸序列SEQ ID NO:5组成；所述VH CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO:6，主要由氨基酸序列SEQ ID NO:6组成，或者由氨基酸序列SEQ ID NO:6组成；所述VH CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，主要由氨基酸序列SEQ ID NO:7组成，或者由氨基酸序列SEQ ID NO:7组成；并且所述VH CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO:8，主要由氨基酸序列SEQ ID NO:8组成，或者由氨基酸序列SEQ ID NO:8组成。
另一方面，本发明涉及治疗患有癌症相关疾病的患者的方法，所述方法包含给药治疗有效量的本文所述抗体。
另一方面，本发明涉及降低细胞增殖的体外方法，所述方法包含步骤：(a)使正在增殖的细胞与本文所述抗体接触。
本发明的另一方面涉及编码所述抗体的重链或轻链的核酸分子。
本发明的另一方面涉及用于治疗癌症的包含本文所述抗体以及载体的组合物。
参照以下附图和各非限制性实施方式的描述，本发明的其它方面对本领域技术人员来说将显而易见。
附图说明
附图并不一定按照比例绘制，相反，重点通常在于说明各实施方式的原理。在以下描述中，参照以下附图说明本发明的各实施方式。
图1：mAb 11F6C4的核苷酸序列(A)和氨基酸序列(B)。
图2：scFV 11F6C4与ANGPTL4的结合。E.coli中表达的ANGPTL4附着在芯片上，而同时各种稀释的scFv 11F6C4通过。
图3：ANGPTL4与人类单克隆抗体(mAb)的相互作用动力学图，显示为结合速率常数和解离速率常数(Kon和Koff)，以及导致相同的亲和常数(KD)数值的Kon和Koff的组合(对角线)，由表面等离子体共振(SPR)确定。图中的标记表明多种mAb克隆。基于其较好的Kon、Koff和KD数值，选择mAb11F6C4以用于后面的免疫治疗实验。
图4：ANGPTL4抗体损害致癌性。(A)作为时间的函数，被皮下注射过表达cANGPTL4的重组细胞并以30mg/kg/周被静脉注射mAb11F6C4或对照的IgG的裸鼠中的肿瘤体积(每组n＝6)。每个圆圈表示在每只鼠上进行的三次测量的平均值±SEM。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。(B)如(A)中所述的被对照IgG或mAb11F6C4治疗的裸鼠(8周)的代表性图片。白色箭头指示接种部位。
具体实施方式
特别感兴趣的是Angptl4及其对肿瘤产生和转移的影响。我们证实，被mAb11F6C4治疗的小鼠显示降低的肿瘤血管通透性、抑制肿瘤血管生成，并因此该小鼠具有减弱的肺转移。有趣的是，使用抗人类cANGPTL4的单克隆抗体(mAb11F6C4)的治疗显著地拖延了黑色素瘤在小鼠模型中的生长，再现了RNAi效果。与另一则报道过的靶向小鼠ANGPTL4蛋白的N末端的抗ANGPTL4抗体(mAb14D12)(Desai等，2007)不同，mAb11F6C4靶向位于人类ANGPTL4的C末端内的表位，并且其不影响该蛋白的线粒体活性和血糖调节。
本文所述的抗体是独特的。抗体11F6C4及其高变区域或列于SEQ ID NO.1和SEQID No.2中所表示的序列中的CDR对人类ANGPTL4的C末端具有特异性，适合用于癌症的免疫治疗。我们开发了产生高水平的抗Angplt4的人源化(humanized)或嵌合mAb的稳定转染的细胞克隆。产生高水平抗体的克隆适于用于工业规模的生产。这种同时保留其Angptl4结合特异性、其抗肿瘤和抗转移性质的改性mAb显示具有对增强临床应用很重要的属性，即降低的免疫原性和在患者体内更长的血清半衰期。
因此，本发明的第一方面包括结合血管生成素样4蛋白的C末端区域(cANGPTL4)的抗体，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3区域，并且所述轻链包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中：所述VL CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO:3，主要由SEQ ID NO:3组成或者由氨基酸序列SEQ ID NO:3组成；所述VL CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO:4，主要由氨基酸序列SEQ ID NO:4组成，或者由氨基酸序列SEQ ID NO:4组成；所述VL CDR3包含氨基酸序列SEQ IDNO:5，主要由氨基酸序列SEQ ID NO:5组成，或者由氨基酸序列SEQ ID NO:5组成；所述VH CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO:6，主要由氨基酸序列SEQ ID NO:6组成，或者由氨基酸序列SEQ ID NO:6组成；所述VH CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，主要由氨基酸序列SEQ ID NO:7组成，或者由氨基酸序列SEQ ID NO:7组成；并且所述VH CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO:8，主要由氨基酸序列SEQ ID NO:8组成，或者由氨基酸序列SEQ ID NO:8组成。
在各实施方式中，所述重链可包含VH结构域，所述VH结构域包含由SEQ ID NO:1中列出的所述氨基酸序列，主要由SEQ ID NO:1中列出的所述氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:1中列出的所述氨基酸序列组成，并且轻链可包含VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:2中列出的所述氨基酸序列，主要由SEQ ID NO:2中列出的所述氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:2中列出的所述氨基酸序列组成。
本文中，“抗体”是指由主要被所有或部分公认的免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽组成的蛋白。公认的免疫球蛋白基因(例如在人体中)包括κ、λ和重链遗传基因座，其一起包含无数的可变区基因，以及分别编码IgM、IgD、IgG(IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgE和IgA(IgA1和IgA2)同种型的恒定区基因μ、δ、γ、ε和α。本文中的抗体是指包括全长抗体和抗体片段，并且可指来自任何有机体的天然抗体，基因工程抗体，或用于实验、治疗或其它目的而重组产生的抗体。
文中使用的“IgG”是指属于主要由公认的免疫球蛋白γ基因编码的一类抗体的多肽。在人类中，该类包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在小鼠中该类包含IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3。
文中使用的“特异性结合(Specifically binding，specific binding)”是指抗体基于对靶分子上的表位的识别与其目标(分解物)结合。该抗体优选以相对于其结合到其它可能存在的化合物更高的结合亲和性识别并结合靶分子ANGPTL4。在本发明的各实施方式中，“特异性结合”可指以比其结合与靶分子无关的分子大至少约106倍的亲和性与靶分子cANGPTL4结合的抗体，优选至少约107倍的亲和性，更优选至少约108倍的亲和性，最优选至少约109倍的亲和性。典型地，特异性结合是指比非特异性结合大约106倍至约109倍范围内的亲和性。在一些实施方式中，特异性结合可通过超过非特异性结合的109倍亲和性表征。可通过任何合适的方法确定结合亲和性。本领域中已知这样的方法，并包括而不限于，表面等离子体共振和等温滴定量热法。在具体的实施方式中，抗体独特识别并结合靶分解物。
本文中，“免疫球蛋白(Ig)”是指由主要由免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。免疫球蛋白包括但不限于抗体。免疫球蛋白可具有多种构造形态，包括但不限于全长抗体、抗体片段和个体的免疫球蛋白结构域。在各实施方式中，免疫球蛋白为IgG1κ免疫球蛋白。
本文中，“免疫球蛋白(Ig)结构域”是指由蛋白质结构领域的技术人员确定的以不同的结构实体存在的免疫球蛋白的区域。Ig结构域通常具有特征性的β折叠拓扑结构。抗体的IgG类中已知的Ig结构域为VH、Cγ1、Cγ2、Cγ3、VL和CL。
文中使用的“氨基酸”和“氨基酸同一性”是指可能在特定的限定位置存在的20种天然存在的氨基酸或任何非天然类似物中的一种。因此，文中使用的“氨基酸”同时包括天然存在的和合成的氨基酸。例如，为了本发明的目的，同型苯丙氨酸、瓜氨酸和noreleucine为所考虑的氨基酸。“氨基酸”还包括亚氨基酸残基，例如脯氨酸和羟基脯氨酸。支链可为(R)或(S)构型。在实施方式中，氨基酸为(S)或L构型。如果使用了非天然存在的支链，可使用非氨基酸取代基，例如以防止或阻碍体内降解。
抗体的可变区含有分子的抗原结合决定因子，并因此决定了抗体对其靶抗原的特异性。被称为可变区是因为与同类中的其它抗体相比，它的序列最不同。在可变区中，对于重链和轻链的可变(V)结构域的每个聚集三个环，以形成抗原结合位点。每个环被称为互补决定区(下文称作“CDR”)，其中氨基酸序列中的变化是最显著的。总共有6个CDR，重链和轻链各有三个，表示为VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3。CDR外的可变区被称为框架区(FR)。尽管并没有CDR变化多，但在不同抗体间也在FR区内发生序列变化。总的来说，抗体的该特征性结构提供了稳定的支架(FR区)，免疫体系可由此开发大量的抗原结合多样性(CDR)，以获得对多种抗原的特异性。已获得来自不同有机体的多种可变区片段的几种高分辨率结构，一些未结合，一些与抗原形成复合物。抗体可变区的序列和结构特征在，例如，Morea等，1997,Biophys Chem 68:9-16；Morea等，2000,Methods 20:267-279中公开，并且抗体的保守特征在，例如，Maynard等，2000,Annu Rev Biomed Eng 2:339-376中公开。
在各实施方式中，抗体包含重链和轻链，重链包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3区，并且轻链包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3区，其中：所述VL CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO:3，主要由SEQ ID NO:3组成或者由氨基酸序列SEQ ID NO:3组成；所述VL CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO:4，主要由氨基酸序列SEQ ID NO:4组成，或者由氨基酸序列SEQ ID NO:4组成；所述VL CDR3包含氨基酸序列SEQ IDNO:5，主要由氨基酸序列SEQ ID NO:5组成，或者由氨基酸序列SEQ ID NO:5组成；所述VH CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO:6，主要由氨基酸序列SEQ ID NO:6组成，或者由氨基酸序列SEQ ID NO:6组成；所述VH CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，主要由氨基酸序列SEQ ID NO:7组成，或者由氨基酸序列SEQ ID NO:7组成；并且所述VH CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO:8，主要由氨基酸序列SEQ ID NO:8组成，或者由氨基酸序列SEQ ID NO:8组成。
本文所定义的抗体的“恒定区”是指被轻链或重链免疫球蛋白恒定区基因中的一种编码的抗体区域。
文中使用的“恒定轻链”或“轻链恒定区”是指被κ(Cκ)或λ(Cλ)轻链编码的抗体区域。恒定区轻链通常包含单一结构域，并且如本文所定义的，是指Cκ或lambdaCλ的108～214位，其中根据EU索引编号。
文中使用的“恒定重链”或“重链恒定区”是指被μ、δ、γ、α或ε基因编码以分别限定抗体同种型为IgM、IgD、IgG、IgA或IgE的的抗体区域。对于全长IgG抗体，如本文所定义的，恒定重链是指CH1结构域的N末端至CH3结构域的C末端，因此包含118～447位，其中根据EU索引编号。
文中使用的“可变区”是指包含基本上分别被组成κ、λ和重链免疫球蛋白遗传基因座的Vκ、Vλ和/或VH基因的任一种编码的一种或多种Ig结构域。
文中使用的“人源化”抗体是指包含人类框架区(FR)以及来自非人类(通常是小鼠或大鼠)抗体的一种或多种互补决定区(CDR)的抗体。提供CDR的非人类抗体被称为“供体”，而提供框架的人类免疫球蛋白被称为“受体”。人源化主要依赖于供体CDR向受体(人类)VL和VH框架上的接枝(Winter US 5,225,539)。该策略被称为“CDR接枝”。所选定的受体框架残基向相应的供体残基的“回复突变”通常需要恢复在初始接枝构建中损失的亲和性。最优地，人源化抗体还包含至少部分免疫球蛋白恒定区，通常是人类免疫球蛋白，并且因此通常包含人类Fc区。本领域已知多种用于人源化和重塑非人类抗体的技术和方法(参见Tsurushita&Vasquez,2004,Humanization of Monoclonal Antibodies,Molecular Biology of B Cells,533-545,ElsevierScience(USA)以及其中引用的文献)。降低非人类抗体可变区的免疫原性的人源化或其它方法可包括表面重修(resurfacing)法，如Roguska等，1994,Proc Natl Acad SciUSA 91969-973中所述。在一个实施方式中，可使用基于选择的方法来人源化和/或亲合成熟的抗体可变区，即增加可变区对其靶抗原的亲和性。其它人源化方法可包括仅接枝部分CDR，包括但不限于Tan等，2002,J Immunol 1691119-1125,De Pascalis等，2002,J Immunol 1693076-3084中所述的方法。可使用基于结构的方法以人源化和亲合成熟，例如在US专利7,117,096及相关申请中所述。
在各实施方式中，免疫球蛋白在免疫球蛋白重链中包含人类IgG1恒定区，并在免疫球蛋白轻链中包含人类恒定区。在各实施方式中，免疫球蛋白在所述重链的可变区和在所述轻链的可变区中包含全部或部分人类框架区。在各实施方式中，免疫球蛋白在重链的可变区以及在轻链中包含鼠科框架区。
本文所述的抗体优选适用于治疗肿瘤。这里所定义的肿瘤是癌症或肿瘤，可包括黑色素瘤、前列腺癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌或肺癌。在术语肿瘤或癌症中包括其中Angptl4的表达增加的1000种癌细胞系中的任一种。衍生自这些癌细胞系中的任何癌症也包括在术语肿瘤或癌症中。在术语肿瘤或癌症中包括转移性癌。
抗体可为单克隆抗体。文中使用的术语“单克隆抗体”是指由基本均质的抗体种群获得的抗体，即包含相同种群(除了可能少量存在的天然发生的突变外)的单一抗体。单克隆抗体具有高度特异性，指向单一抗原位点。此外，与通常包括指向不同免疫决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体相反，每种单克隆抗体指向抗原上的单一决定簇子。除了其特异性，单克隆抗体的优点还在于它们可通过杂交瘤细胞培养合成，不会被其它免疫球蛋白污染。形容词“单克隆”表示获自基本均质的抗体种群的抗体的特性，并不应理解为需要通过任何特定方法产生的抗体。单克隆抗体可包括“嵌合”抗体(美国专利4,816,567；和Morrison等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855)和人源化抗体(Jones等，(1986)Nature,321:522-525；Reichmann等，(1988)Nature,332:323-329；Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596)。
可通过任何提供由培养物中的连续细胞系产生抗体分子的技术获得单克隆抗体。这些包括但不限于杂交瘤技术(Koehler和Milsein(1975),Nature,256:495-7；和美国专利4,376,110)，人类B细胞杂交瘤技术(Kosbor等，(1983),Immunology Today,4:72；Cote等，(1983),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:2026-30)和EBV杂交瘤技术(Cole等，(1985),Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,New York,77-96)。对靶化合物特异性的单克隆抗体的制备也在Harlow和Lane,eds.(1988)Antibodies–Alaboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory,Chapter 6中描述。这样的抗体可为包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD及其任何子类的任何免疫球蛋白种类。产生mAb的杂交瘤可在体内或体外培养。由于在体内产生高滴定量的mAb，因此使其成为一种非常有效的生产方法。
优选的永生化细胞系为那些有效融合、支持由所选定的产生抗体的细胞稳定且高水平表达抗体、并对例如HAT培养基的培养基敏感的细胞系。更优选的永生化细胞系为鼠科骨髓瘤系，其可由例如加利福尼亚州圣地亚哥的Salk Institute Cell DistributionCenter和弗吉尼亚州马纳萨斯的American Type Culture Collection获得。也提到将人类骨髓瘤和小鼠-人类杂合骨髓瘤细胞系用于生产人类单克隆抗体(Kozbor,J.(1984)Immunol.,133:3011)。
然后可使用ANGPTL4的C末端纤维蛋白原样结构域(cANGPTL4)测试其中培养杂交瘤细胞的培养基中是否存在单克隆抗体。
可通过本领域已知的重组DNA法制备单克隆抗体。
“多克隆抗体”为由被抗原或其抗原功能衍生物免疫的动物的血清获得的抗体分子的异质种群。可通过用抗原或半抗原-载体偶联物(可选择添加助剂)注射以使宿主动物(例如兔子、小鼠和山羊)免疫来产生多克隆抗体。
可采用被描述为产生单链抗体的技术(美国专利4,946,778；Bird(1988),Science242:423-26；Huston等，(1988),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:5879-83；和Ward等，(1989),Nature,334:544-46)来生产基因-单链抗体。通常通过由氨基酸桥将Fv区域的重链和轻链片段相连产生单链多肽而形成单链抗体。
可通过已知技术产生识别特定表位的抗体片段。例如，该片段包括但不限于：可通过胃蛋白酶酶切抗体分子而产生的F(ab’)2片段和可通过还原F(ab’)2片段的二硫桥产生的Fab片段。备选地，可构建Fab表达文库以允许对具有所需特异性的单克隆Fab片段的快速简单的鉴定(Huse等，(1989),Science,246:1275-1281)。抗体可为单价抗体。本领域中熟知制备单价抗体的方法。例如，一种方法包括免疫球蛋白轻链和改性重链的重组表达。通常可在Fc区域的任何位点截断重链以防止重链交联。备选地，用另一氨基酸残基取代相关的半胱氨酸残基，或将半胱氨酸残基去除，以防止交联。轻链可为SEQ ID No.1。重链可为SEQ ID No.2。
体外方法也适于制备单价抗体。可使用本领域已知的常规技术完成对抗体的酶切以产生其片段(具体地，Fab片段)。
在各实施方式中，将包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列，主要由SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列组成，或由SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8中列出的氨基酸序列组成的可变区克隆到具有人类恒定区的Fab结构中以产生嵌合Fab。嵌合Fab稳定，可以工业规模生产，抗肿瘤/抗转移，具有降低的免疫原性，并在人类血清中具有更长的血清半衰期。
本发明的抗体可进一步包含上述人源化的抗体或人类抗体。
也可使用本领域已知的各种技术(包括噬菌体显示库)生产人类抗体。类似地，可通过将人类免疫球蛋白基因座引入转基因动物，如引入其中内源性免疫球蛋白基因被部分或全部失活的小鼠中，而制备人类抗体。应激时，观察到人类抗体的产生，包括基因重排、整合和抗体谱，这在各方面与人类中所见极度相似。
备选地，抗体可为各种结构，包括但不限于抗体片段。抗体片段包括但不限于双特异性抗体、微抗体、结构域抗体、合成抗体、拟抗体、嵌合抗体、抗体融合(有时称为“抗体偶联物”)、以及其各自的片段。具体的抗体片段包括但不限于，(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段，(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段，(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由单一可变区组成的dAb片段，(v)分离的CDR区，(vi)F(ab’)2片段，包含两个相连的Fab片段的二价片段，(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过允许两个结构域相连以形成抗原结合位点的肽连接物相连，(viii)双特异性单链Fv二聚体，和(ix)“双体”或“三体”，由基因融合构建的多价或多特异性片段。可对抗体片段进行修饰。例如，可通过包含连接VH和VL结构域的二硫桥使分子稳定。抗体通式和结构的实例在Holliger&Hudson,2006Nature Biotechnology 23(9):1126-1136和Carter 2006,Nature Reviews Immunology 6:343-357以及其中所引用的参考文献中描述。
本发明的抗体可包括多特异性抗体，尤其是双特异性抗体，有时也被称为“双体”。这些是与两种(或更多种)不同抗原相结合的抗体。可以本领域已知的各种方式制造双体，如化学制备或由杂交杂交瘤制备。在一个实施方式中，抗体为微抗体。微抗体为包含连接到CH3结构域中的scFv的最小化的抗体样蛋白。在一些情况中，scFv可连接到Fc区，并可包括一些或全部铰链区。关于多特异性抗体的描述参见Holliger&Hudson,2006,Nature Biotechnology 23(9):1126-1136及其中所引用的参考文献。
在一个实施方式中，本发明的抗体为抗体片段。特别感兴趣的是包含Fc区、Fc融合体和重链的恒定区(CH1-铰链-CH2-CH3)的抗体。本发明的抗体可包含Fc片段。本发明的Fc片段可包含1％至90％的Fc区，如10％至90％、30％至90％等。因此，例如，本发明的Fc片段可包含IgG1Cγ2结构域、IgG1Cγ2结构域和铰链区、IgG1Cγ3结构域等。在一个实施方式中，本发明的Fc区还包含融合伴侣，有效使其成为Fc片段融合体。Fc片段可包含或可不包含另外的多肽序列。
在一个实施方式中，本发明的抗体为抗体“融合蛋白”，本文中有时被称为“抗体偶联物”。融合伴侣或偶联伴侣可为蛋白质或非蛋白质；后者通常使用抗体上或偶联伴侣上的官能团而产生。偶联和融合伴侣可为任何分子，包括小分子化学化合物以及多肽。例如，在Trail等，1999,Curr.Opin.Immunol.11:584-588中描述了多种抗体偶联物及方法。可能的偶联伴侣包括但不限于细胞因子、细胞毒性剂、毒素、放射性同位素、化疗剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、和其它治疗活性剂。在一些实施方式中，偶联伴侣可更多地认为是有效载荷，也就是说偶联物的目的是通过抗体将偶联伴侣靶向递送至靶细胞，例如癌细胞或免疫细胞。因此，例如，毒素向抗体的偶联以将毒素递送至表达靶抗原的细胞为目标。本领域技术人员应理解，在现实中融合和偶联的概念和定义有重合。将抗体表示为融合体或偶联体并不意味着将其限定于本发明的任何特定实施方式。相反，宽松地使用这些术语，从而表达这种宽泛的概念，即本发明的任何抗体都可通过基因、化学或其它方式连接到一种或多种多肽或分子，以提供一些所需性质。
合适的偶联体包括但不限于：下述标记、药物和细胞毒性剂，包括但不限于：细胞毒性药物(如化疗剂)或毒素或该毒素的活性片段。合适的毒素及其相应的片段包括白喉A链、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思子毒素A链、泻果素、巴豆毒素、酚霉素、依诺霉素等。细胞毒性剂还包括通过将放射性同位素偶联至抗体、或将放射性核素结合至已与抗体共价相连的螯合剂而制备的放射性化学品。其它实施方式使用卡奇霉素、aunstatin、格尔德霉素、美登素和倍癌霉素以及类似物；关于后者参见美国专利申请2003/0050331。
在一个实施方式中，本发明的抗体与细胞因子融合或偶联。文中使用的“细胞因子”是指被一种细胞种群释放的在另一种细胞上作用为细胞间介质的蛋白质的通用术语。例如，如Penichet等，2001,J Immunol Methods 248-91-101中所述，细胞因子可融合至抗体以提供一系列所需性质。这样的细胞因子的实例为淋巴因子、单核因子、以及传统的多肽激素。细胞因子包括：生长激素，例如人类生长激素、N-甲硫氨酰人类生长激素、和牛生长激素；甲状旁腺激素、甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素、松弛素原；糖蛋白激素，例如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体生成激素(LH)；肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素；肿瘤坏死因子α和β；抑制苗勒管的物质、小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素、血管内皮生长因子；整合素；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子，例如NGF-β；血小板生长因子、转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子I和II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子、干扰素如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)、白细胞介素(IL)如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；C5a；和其它多肽因子，包括LIF和KIT配体(KL)。如文中使用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质、和天然序列细胞因子的生物活性等效物。
在备选的实施方式中，本发明的抗体与毒素融合、偶联或可选地相连，所述毒素包括但不限于细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素和酶活性毒素，包括其片段和/或变体。例如，在Thrush等，1996,Ann.Rev.Immunol.14:49～71中描述了多种免疫毒素和免疫毒素方法。小分子毒素包括但不限于卡奇霉素、美登素(US 5,208,020)、单端孢菌毒素和CC1065。发现可将多拉司他汀10类似物(如阿里他汀E(AE)和单甲基阿里他汀E(MMAE))用作本发明的抗体的偶联物。有用的酶活性毒素包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A链、相思子毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-次黄嘌呤、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制物、泻果素、巴豆毒素、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒素、丝林霉素、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌毒素。本发明进一步预期本发明的抗体与具有溶核活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸内切酶，如脱氧核糖核酸酶(DNase))之间的偶联物。
在备选实施方式中，本发明的抗体可与放射性同位素融合、偶联或可操作地相连以形成放射性偶联物。多种放射性同位素都可用于生产放射性偶联抗体。实例包括但不限于At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素。
在另一个实施方式中，本发明的抗体可与“受体”(如链霉亲和素)偶联以用于肿瘤预定位，其中对患者给药抗体-受体偶联物，随后使用清洗剂从循环体系中除去未结合的偶联物，然后给药“配体”(如抗生物素蛋白)，所述配体与细胞毒性剂(如放射性核苷酸)偶联。在备选的实施方式中，抗体与酶偶联或可操作地相连，以进行抗体依赖性酶介导的药物治疗(ADEPT)。可通过将抗体与能够将前体药物(如肽基化疗剂，参见PCT申请WO 81/01145，其全部内容通过引用合并于此)转化为活性抗癌药物的前体药物激活酶偶联或可操作地相连来使用ADEPT。例如，参见PCT申请WO88/07378或US专利4,975/278，其全部内容均通过引用合并于此。对于ADEPT有用的免疫偶联物的酶组分包括任何能够作用于前体药物的酶，所述酶以将其转化为其更活性、细胞毒性的形式的方式作用于所述前体药物。在本发明的方法中有用的酶包括但不限于：有用地将含磷酸酯的前体药物转化为游离药物的碱性磷酸酶；有用地将含硫酸酯的前体药物转化为游离药物的芳基硫酸酯酶；有用地将无毒5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脱氨酶；有用地将含肽前体药物转化为游离药物的蛋白酶，如沙雷菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)；有用地转化含D-氨基酸取代基的前体药物的D-丙氨酰羧肽酶；有用地将糖基化的药物转化为游离药物的碳水化合物切割酶，如β-半乳糖苷酶和神经氨酸酶；有用地将α-内酰胺衍生的药物转化为游离药物的β-内酰胺酶；有用地将在氨基氮处分别用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转化成游离药物的青霉素酰胺酶，例如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。备选地，可使用具有酶活性的抗体，本领域也称作“抗体酶”，将本发明的前体药物转化为游离的活性药物(参见例如Massey，Nature，328：457-458，1987，其全部内容通过引用合并于此)。可制备抗体-抗体酶偶联物，用于将抗体酶递送至肿瘤细胞群。预期本发明的抗体的各种另外的偶联物。以下将描述多种化疗剂、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂和其它治疗剂，其可用作抗体偶联物。
本发明的另一方面涉及治疗患有癌症相关疾病的患者的方法，其包含给药治疗有效量的本文所述的抗体。
“疗法”和“治疗”及其同义词是指治疗处理，其中的目的是停止或减少癌细胞中的细胞增殖。优选对细胞增殖的影响能够至少停止或暂停肿瘤的生长、或减少(减小)肿瘤的大小、或停止或减缓转移。需要这样的治疗的人们包括被诊断为癌症、肿瘤或转移性癌的个体或患者。患者或个体是指动物，如哺乳动物，优选人类。在各实施方式中，所述细胞为在体外的。在其它各实施方式中，所述细胞为在体内的，并且抗体可被给药给需要治疗的受试者，如患者或个体。
本发明的另一方面涉及减少细胞增殖的体外方法，其包含步骤：(a)使正在增殖细胞与本文所述抗体接触。
在各实施方式中，体外细胞为细胞系。在其它各实施方式中，可将抗体给药给细胞以减少癌细胞中的细胞增殖。
优选以治疗有效量给药受试者所述抗体。治疗有效量能够在培养物或肿瘤位点的正在增殖细胞中阻断血管生成素样4蛋白(ANGPTL4)多肽。如文中使用，抗体的“治疗有效量”为能够停止或暂停细胞增殖的量，因而能够导致肿瘤生长停止或暂停、或使肿瘤大小减少(减小)。其还可以指作预防。临床药理学或药代动力学领域的技术人员可确定本发明的抗体在药物组合物中的剂量和给药。将治疗地使用的抗体(例如本文所述抗体)的有效量取决于，例如，治疗对象、给药途径和哺乳动物的情况。因此，治疗师有必要根据需要调整剂量并改变给药途径以获得最佳治疗效果。典型的每日剂量可为在每天约10ng至达到100mg或更多，优选每天约1μg至10mg。剂量可包括每天在10μg至100μg范围内的任意量，或更优选25μg、50μg或75μg。
本发明的另一方面涉及编码本文所述抗体的重链或轻链的核酸分子。
术语“多核苷酸”和“核酸(分子)”在本文中可互换使用，是指任意长度的聚合物形式的核苷酸，包括天然存在和非天然存在的核酸。多核苷酸可含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或其类似物。选择和制备核酸的方法各不相同，并在标准的生物分子实验方案中详细描述过。典型的方式为由已存在的模板DNA起始的制备性PCR和色谱纯化，或人造核酸的逐步合成。通常，本文中核酸分子是指DNA分子。
在各实施方式中，核酸分子包含编码SEQ ID NO:9中列出的所述的轻链的可变结构域的核苷酸序列。
类似地，在各实施方式中，核酸分子包含编码在SEQ ID NO:10中列出的所述的重链的可变结构域的核苷酸序列。
本发明可进一步包括表达体系，其包含：
(i)编码轻链的第一基因；和
(ii)编码重链的第二基因。
其中，可诱导该表达体系表达本文所述的抗体。
优选地，该表达体系为基于细胞的表达体系(如上所述的原核细胞或真核细胞)。优选地，该表达体系为原核、异源表达体系。在各实施方式中，第一基因包含SEQ IDNO:9中列出的所述的核酸序列。在其它各实施方式中，第二基因包含在SEQ ID NO:10中列出的所述的核酸序列。
本发明的其它方面涉及用于治疗癌症的组合物，所述组合物包含本文所述抗体以及载体。
将药物组合物设计为其中配制有本发明的抗体和一种或多种活性治疗剂。通过将具有所需纯度的抗体与可选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington’sPharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.,1980)混合而制备本发明的抗体制剂，将其以冻干制剂或水溶液的形式储存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂以所施用的剂型和浓度来说对被施用者无毒，并包括：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量多肽(小于约10个残基)；蛋白质，如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；甜味剂和其它调味剂；填料，如微晶纤维素、乳糖、玉米和其它淀粉；结合剂；添加剂；着色剂；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM、或聚乙二醇(PEG)。在一个实施方式中，包含本发明的抗体的药物组合物可为水溶性的形式，如以药学上可接受的盐存在，这指的是同时包括酸加成盐和碱加成盐。“药学上可接受的酸加成盐”是指那些与无机酸(如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等)和有机酸(如醋酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等)形成的、保留了游离碱的生物有效性同时又非在生物上或其它方面不合需要的盐。“药学上可接受的碱加成盐”包括那些衍生自无机碱的盐，如钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。特别有用的是铵盐、钾盐、钠盐、钙盐和镁盐。衍生自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括以下胺类的盐：伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、环胺和碱性离子交换树脂，如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺和乙醇胺。用于体内给药的制剂应为无菌的。这可通过使用无菌滤膜过滤或其它方法容易地实现。
本文所公开的抗体也可被配制为免疫脂质体。脂质体为含有多种有用地将治疗剂向哺乳动物递送的脂类、磷脂和/或表面活性剂的小囊泡。通过本领域已知方法制备包含抗体的脂质体，如在PCT申请WO 97/38731中所述的。在US专利5,013,556中公开了具有延长的循环时间的脂质体。脂质体的组分通常以双层形式排列，这与生物膜中的脂类排列类似。可通过使用包含磷脂酰胆碱、类固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂类组合物通过逆相蒸发法产生特别有用的脂质体。通过具有限定孔径的滤膜挤出脂质体以产生具有所需直径的脂质体。脂质体中可选地包含化疗剂或其它治疗活性剂。
也可将抗体和其它治疗活性剂包裹于微胶囊中，所述为胶囊通过以下方法制备，包括但不限于：凝聚技术、界面聚合(例如使用羟甲基纤维素或明胶-微胶囊，或聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶体药物递送体系(例如脂质体、白蛋白微胶囊、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、和微乳液。这些技术在Remington’s Pharmaceutical Science 16thedition,Osol,A.Ed.,1980中公开。可制备缓释制剂。缓释制剂的合适的实例包括固体疏水性聚合物的半透性基质，所述基质为成形制品的形式，如膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(US专利3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如Lupron(其为由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射的微滴)、聚-D-(-)-3-羟基丁酸、和(可商购自Alkermes)，其为由加入聚-DL-丙交酯-共-乙交酯(PLG)基质中的所需生物活性分子组成的微球类递送体系。
可以多种方式给药包含本发明的抗体的药物组合物(例如为无菌水溶液形式)，包括但不限于口服、皮下、静脉内、鼻内、intraotically、经皮、局部(如凝胶、软膏、洗液、乳霜等)、腹腔内、肌内、肺内、阴道、肠道外、直肠、或眼内。如本领域已知，可根据给药方式配制药物组合物。
如本领域已知，通常通过静脉输注或药丸递送蛋白质疗法。本发明的抗体也可使用这样的方法递送。例如，可通过以0.9％氯化钠作为输注媒介或载体通过静脉输注而给药。
此外，可使用本领域已知的多种递送体系的任一种来给药本发明的抗体。实例包括但不限于：包裹于脂质体、微粒、和微球(如PLA/PGA微球)等。备选地，可使用多孔、无孔或胶状材料的植入物(包括膜或纤维)。缓释体系可包含聚合材料或基质，如聚酯、水凝胶、聚(乙烯醇)、聚交酯、L-谷氨酸和乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、乙烯-醋酸乙烯酯、乳酸-乙醇酸共聚物，如Lupron Depot(R)、和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。还可给药编码本发明的抗体的核酸，例如通过逆转录病毒感染、直接注射、或用脂类、细胞表面受体、或其它转染剂涂布。在所有情况下都可使用控释体系在所需作用位点处或附近释放抗体。
在一个实施方式中，可选择给药的剂量和频率为治疗有效或预防有效。如本领域已知，可有必要根据蛋白质降解、全身与局部递送、和新蛋白质合成速率、以及年龄、体重、健康状况、性别、饮食、给药时间、药物相互作用和病情的严重程度进行调整，且该调整可由本领域技术人员通过常规实验确定。
制剂中的治疗活性抗体的浓度可在约0.1至100wt％内变化。在一个实施方式中，抗体的浓度在0.003μM至1.0摩尔的范围内。为了治疗患者，可以给药治疗有效剂量的本发明的抗体。本文中，“治疗有效剂量”是指产生其给药效果的剂量。确切的剂量取决于治疗目的，并可由本领域技术人员使用已知技术确定。剂量可在0.0001至100mg/kg体重或更大的范围内，例如，0.1、1、10或50mg/kg体重，如1至10mg/kg体重。
在一些实施方式中，仅使用单一剂量的抗体。在其它实施方式中，给药多剂量的抗体。给药间的经过的时间可为小于1小时、约1小时、约1至2小时、约2至3小时、约3至4小时、约6小时、约12小时、约24小时、约48小时、约2至4天、约4至6天、约1周、约2周、或多于2周。
在其它实施方式中，以节律给药方案给药本发明的抗体，在不延长休息间隔的情况下通过连续输注或频繁给药。该节律给药可包括在没有休息间隔的情况下以恒定间隔给药。通常该方案包括在延长时间段内的长期低剂量或连续输注，例如1至2天、1至2周、1至2个月、或多达6个月或更多。给药更低剂量可使副作用以及对休息间隔的需求最小化。
在某些实施方式中，对患者循环给药本发明的抗体和一种或多种其它预防或治疗剂。循环疗法包括在一个时间给药第一种药剂，在第二时间给药第二种药剂，可选地在其它时间给药其它的药剂，可选经过一段休息间隔，然后重复该给药顺序一次或更多次。循环次数通常为2至10次。循环疗法可减少对一种或更多种药剂的抗药性的发展，可使副作用最小化，或可改善治疗效果。
本发明的抗体可同时与一种或多种其它治疗方案或药剂同时给药。所述其它治疗方案或药剂可用于改善抗体的效果或安全性。而且，可使用其它治疗方案或药剂来治疗相同的疾病或治疗合并症，而非改变抗体的作用。例如，本发明的抗体可与化疗、放射治疗、或放射治疗、化疗两者一起给药给患者。本发明的抗体可与一种或多种其它预防或治疗剂结合给药，所述预防或治疗剂包括但不限于细胞毒性剂、化疗剂、细胞因子、生长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、抗血管生成剂、保心药、免疫刺激剂、免疫抑制剂、促进血液细胞增殖的药剂、血管生成抑制剂、蛋白酪氨酸激酶(PTK)抑制剂、其它抗体、FcγRIIb或其它Fc受体抑制剂、或其它治疗剂。
术语“与……结合”或“共给药”并不限于正好同时给药预防剂或治疗剂。相反，这是指将本发明的抗体和其它一种或多种药剂在时间间隔内顺序给药，使得它们共同作用，以提供比仅用本发明的抗体或一种或多种其它制剂提高的效果。在一个实施方式中，该抗体与其它一种或多种药剂叠加作用，在另一个实施方式中，它们协同作用。该分子以对其目的有效的含量适当地存在。有经验的医生可以凭经验或通过考虑到药剂的药代动力学和作用模式确定每种治疗剂的适当剂量以及给药的适当时机和方法。
在一个实施方式中，本发明的抗体与一种或多种包含抗体或Fc的分子一起给药。本发明的抗体可与一种或多种具有治疗相同疾病或其它合并症的效果的其它抗体共给药，例如可给药两种能够识别在给定类型的癌症中过表达的两种抗原的抗体。
在一个实施方式中，本发明的抗体与化疗剂一起给药。文中使用的“化疗剂”是指有用地治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括但不限于：烷化剂，如噻替派和环磷酰胺；磺酸烷基酯，如白消安、英丙舒凡和派泊舒凡；雄性激素，如卡鲁睾酮、丙酸甲雄烷酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；抗雄激素，如氟他胺、尼禄米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林、和戈舍瑞林；抗生素，如阿克拉霉素、放线菌素、氨茴霉素、氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霄素、地托比星、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、依索比星、依达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培来霉素、potfiromycin、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗雌激素药，包括如他莫昔芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制剂4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、那洛昔芬、LY 117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston)；抗代谢物，如氨甲喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、氨甲喋呤、碟罗呤、曲麦克特；氮丙啶类，如苯佐替哌、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替哌；乙撑亚胺和甲基蜜胺类，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；叶酸补充剂，如亚叶酸；氮芥，诸如氯丁酸氮芥、萘氮芥、胆磷酰胺、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、松龙苯芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；硝基脲类，诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱；铂；蛋白质，如精氨酸脱亚胺酶和天冬酰胺酶；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、多西氟尿啶、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；紫杉烷，如紫杉醇(新泽西州普林斯顿，Bristol-Myers Squibb Oncology)和紫杉萜(法国Antony，Rhne-Poulenc Rorer)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；胸苷酸合成酶抑制剂(如Tomudex)；其它化疗剂，包括醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；氨苯吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；磷胺氮芥；秋水仙胺；地吖醌；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；依洛尼塞；醋酸羟吡咔唑；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；雷佐生；西索菲兰；螺旋锗；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；乌拉坦；长春碱酰胺；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌；氯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；依托泊苷(VP-16)；异磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾；诺维本；诺安托；替尼泊甙；柔红霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊拜膦酸盐；CPT-11；维甲酸；esperamicins；卡培他滨。也可使用上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
可将化疗剂或其它细胞毒性剂作为前体药物给药。文中使用的“前体药物”是指与母体药物相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小、并能够被酶激活或转化为更具活性的母体形式的药学活性物质的前体或衍生物形式。参见，例如，Wilman,1986,BiochemicalSociety Transaction,615th Meeting Belfast,14:375-382；Stella等，“Prodrugs:A ChemicalApproach to Targeted Drug Delivery,”Directed Drug Delivery；和Borchardt等，(ed.):247-267,Humana Press,1985。可用于本发明的前体药物包括但不限于：含磷酸酯的前体药物、含硫代磷酸酯的前体药物、含硫酸酯的前体药物、含肽的前体药物、D-氨基酸改性的前体药物、糖基化的前体药物、含β-内酰胺的前体药物、含可被取代的苯氧基乙酰胺的前体药物或含可被取代的苯基乙酰胺的前体药物、5-氟胞嘧啶和其它可被转化为更具活性的细胞毒性游离药物的5-氟尿苷前体药物。可被衍生为前体药物形式的与本发明的抗体一起使用的细胞毒性药物的实例包括但不限于上述任意化疗剂。
在另一实施方式中，与一种或多种免疫调节剂一起给药抗体。这样的药剂可增加或减少一种或多种细胞因子的产生、上调或下调自抗原呈递、掩盖MHC抗原、或促进一种或多种类型的免疫细胞的增殖、分化、迁移、或活化状态。免疫调节剂包括但不限于：非甾体类抗炎药(NSAID)，如阿司匹林、布洛芬、赛来考昔、双氯芬酸、依托度酸、非诺洛芬、吲哚美辛、酮咯酸(ketoralac)、奥沙普嗪、萘布美酮、舒林酸、托美丁、罗非考昔、萘普生、酮洛芬和萘布美酮；类固醇(如糖皮质激素、地塞米松、可的松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松、泼尼松龙、去炎松、水杨酰偶氮磺胺吡啶二十醛(例如前列腺素、血栓烷素和白三烯)、以及外用类固醇(如anthrahn、卡泊三烯、氯倍他索、和他佐罗汀))；细胞因子，如TGFb、IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-2、IL-4、IL-10、细胞因子、趋化因子、或受体拮抗剂，所述受体拮抗剂包括对抗BAFF、B7、CCR2、CCR5、CD2、CD3、CD4、CD6、CD7、CD8、CD11、CD14、CD15、CD17、CD18、CD20、CD23、CD28、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD402、CD64、CD80、CD86、CD147、CD152、补体因子(C5、D)CTLA4、嗜酸细胞活化趋化因子、Fas、ICAM、ICOS、IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNAR、IgE、IL-1、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5R、IL-6、IL-8、IL-9、IL-12、IL-13、IL-13R1、IL-15、IL-18R、IL-23、整合素、LFA-1、LFA-3、MHC、选择素、TGFβ、TGFα、TNFβ、TNF-R1、T细胞受体的抗体、可溶性受体、和受体-Fc融合体，包括(依那西普)、(阿达木单抗)和(英夫利昔单抗)、异源抗淋巴细胞球蛋白；其它免疫调节分子，如2-氨基-6-芳基-5取代的嘧啶、MHC结合肽和MHC片段的抗独特型抗体、硫唑嘌呤、布喹那、溴隐定、环磷酰胺、环孢霉素A、D-青霉胺、脱氧精胍菌素、FK506、戊二醛、金、羟化氯喹、来氟米特、丙二腈酰胺(如来氟米特)、氨甲喋呤、米诺环素、咪唑立宾、霉酚酸酯、雷帕霉素、和柳氮磺胺吡啶。
在备选的实施方式中，本发明的抗体与细胞因子一起给药。文中使用的“细胞因子”是指由一种细胞群释放在另一种细胞上作用为细胞间介质的蛋白质的通用术语。这样的细胞因子的实例为淋巴因子、单核因子、和常规的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，如人类生长激素、N-甲硫氨酰基人类生长激素、和牛生长激素；甲状旁腺激素、甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素、松弛素原；糖蛋白激素，例如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体生成激素(LH)、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子；催乳素、胎盘催乳素、肿瘤坏死因子α和β；抑制苗勒管的物质、小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素、血管内皮生长因子；整合素；促血小板生成素(TPO)；神经生长因子，例如NGF-β；血小板生长因子、转化生长因子(TGF)，例如TGF-α和TGF-β、胰岛素样生长因子I和II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子、干扰素如干扰素α、β和γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)、白细胞介素(IL)如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；C5a；和其它多肽因子，包括LIF和KIT配体(KL)。如文中使用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质、和天然序列细胞因子的生物活性等效物。
在一个实施方式中，刺激免疫系统细胞的细胞因子或其它药剂与本发明的抗体共给药。该治疗模式可增强所需的效应子作用。例如，可共给药刺激NK细胞的药剂，包括但不限于IL-2。在另一个实施方式中，可共给药刺激巨噬细胞的药剂，包括但不限于C5a、甲酰肽，如N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰-苯基丙氨酸(Beigier-Bompadre等，(2003)Scand J.Immunol.57.221-8)。还可给药刺激中性粒细胞的药剂，包括但不限于G-CSF、GM-CSF等。此外，可使用促进这样的免疫刺激细胞因子迁移的药剂。而且，其它药剂(包括但不限于干扰素γ、IL-3和IL-7)可促进一种或多种效应子作用。
在备选的实施方式中，与本发明的抗体共给药的细胞因子或其它抑制效应子细胞功能的药剂。该治疗模式可限制不期望的效应子作用。
本发明的抗体可与其它治疗方案结合。例如，在一个实施方式中，将被本发明的抗体治疗的患者还可接收放射治疗。可根据本领域常用且技术人员已知的方案进行放射治疗。这样的疗法包括但不限于铯、铱、碘或钴辐射。放射治疗可为全体辐射，或可局部指向体内或身上的具体位点或组织，如肺、膀胱、或前列腺。在约1至2周的时间段内分次进行放射治疗。但是，可在较长时间段内进行放射治疗。例如，可对具有脑癌或颈癌的患者进行约6周至约7周的放射治疗。可选地，可以单剂量或多个连续的剂量进行放射治疗。有经验的医生可凭经验确定此处有效的合适放射治疗的一个或多个剂量。根据本发明的另一实施方式，使用本发明的抗体和一种或多种其它抗癌疗法用于体外治疗癌细胞。认为该体外治疗可用于骨髓移植(具体地，自体骨髓移植)。例如，可通过使用如上所述的抗体以及一种或多种其它抗癌疗法治疗含有癌细胞的细胞或组织，以在将其移植到受体患者之前去除或部分去除癌细胞。
当然，认为本发明的抗体可与其它治疗技术结合使用，如外科手术或光疗。
通过以下实施例进一步说明本发明。然而应理解，本发明不仅限于所说明的实施方式。
优选实施方式的实施例
产生cANGPTL4抗体
通过此前描述过的等电膜电泳(Goh等，2010)从稳定表达cANGPTL4的S2细胞的条件培养基中纯化重组ANGPTL4蛋白。如前所述(Goh等，2010)在内部产生抗人类ANGPTL4的C末端区和N末端区的兔多克隆抗体。通过以下步骤制造抗人类cANGPTL4(氨基酸186至406)的单克隆抗体(mAb)：用偶联有佐剂的cAngptl4免疫小鼠。移除小鼠的脾，并制备单细胞悬浮液。这些细胞与骨髓瘤细胞融合，并在杂交瘤筛选培养基(HAT；Gibco)中培养。在融合后将融合的细胞与腹腔巨噬细胞一起在微量滴定板中培养48小时(2×106至4×106细胞/ml)。将培养物在5％CO2的湿化器中保存7至21天，定期补充HAT培养基。第一次使用ELISA筛选培养基中的mAb以确定阳性克隆。使用有限稀释技术扩增并再克隆阳性克隆以确保单克隆性。随后，进行表面等离子体共振以确定mAb的结合动力学。以Langmuir 1:1模型对数据进行全局拟合，以使用Scrubber2(BioLogic Software Pte Ltd)确定缔合常数(k缔合)、解离常数(k解离)和亲和常数(KD)。基于其良好的K缔合、K解离和KD值以及其阻断cANGPTL4和整合素之间的相互作用的能力，选择mAb 11F6C4用于免疫疗法和其它实验。
从抗ANGPTL4杂交瘤细胞提取mRNA，并使用用于RT-PCR的SuperScriptTM IIIFirst Strand Synthesis System(Invitrogen)将其逆转录成cDNA。其用作模板，以使用Recombinant Phage Antibody System(RPAS,GE Healthcare)构建11F6C4scFv。分别使用Heavy引物组合和Light引物组合从cDNA文库中通过PCR扩增单独的编码抗体VH和VL琏的区域。使用Linker引物组合通过PCR拼接分离的、被琼脂糖凝胶纯化的编码VH和VL的DNA到一起，所述引物被设计为在两个片段之间引入连接序列，以及在被剪切的序列的5’(Stil)和3’(Notl)端引入特异的限制性内切位点。Stil和Notl核糖内切酶(NEB)的限制性酶切，并在连接该DNA到Stil和Notl酶切的载体pEXP-Lib(Clonetech)之前琼脂糖凝胶纯化酶切的连接的产物。然后通过热激(42℃)转化法将该载体用于转化TOP10E.coli感应细胞(Invitrogen)。然后将转化过的TOP10E.coli置于含有100μg/ml的氨比西林的LB琼脂板上并在37℃下培养16小时。通过菌落PCR筛选转化过的克隆，并使用pEXP-Lib正向引物(5’-CTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACT-3’)和反向引物(5’TTGGCCGCCCTAGATGCATGCTCGACCT-3’)测序。
使用BLAST工具在NCBI数据库中分析VH和VL的预测氨基酸序列，并通过鼠种小家鼠的抗体的可变区的公开数据核实超过90％的同源性。设计三组引物以用于随后将其克隆至表达载体中(表1)。设计第一组引物为扩增重链可变结构域，其中正向引物与链的5'末端区域互补，反向引物与链的3’末端区域互补。设计第二组引物为扩增连接区域(编码[GIY4Ser]3的DNA片段，[GIY4Ser]3为连接重链和轻链可变结构域的柔性连接物(flexible linker))，其中正向引物与重链可变结构域的3’端互补，并且反向引物与轻琏可变结构域的5’末端区域互补。设计第三组引物为扩增轻琏可变结构域，其中正向引物与链的5'末端序列互补，反向引物与链的3’端序列互补。将所扩增的重链、轻琏和连接物PCR产物进行凝胶纯化并一起退火。使用具有各自限制性位点的引物VH正向和VL反向扩增产生的750bp的片段。在所有PCR扩增反应中使用Pfu Turbo DNA聚合酶(Invitrogen)以获得scFv。将Ndel和Notl酶切的scFv结构克隆至被同样的酶酶切的表达载体pET28b(Novagen)中，以表达N末端的6×His标签。将该pET28b-scFv用于转化E.coli BL21-AI感应细胞(Invitrogen)。
表1：设计用于scFv克隆的引物
引物 序列
VH正向 5’GCG GCA GCC ATA TGC AGG TGC AAC TGC AGG AG 3’
VH反向 5’CTA CAC CCA TAC CAG AAG TGC TCA GTG 3’
连接物正向 5’CAC TGA GCA CTT CTG GTA TGC CTG TAG 3’
连接物反向 5’GAG ACA CAG CCA AAG CTG GAG AC 3’
VL正向 5’GTC TCC AGC TTC TTT GGC TGT GTC TC 3’
VL反向 5’GAT ATC TGC GGC CGC TTA CCG TTT TAT TTC CAA C 3’
在E.coli.中克隆并表达scFv，并保持其结合至ANGPTL4的重组形式(图2)。
通过制造商(Bio-Rad)所推荐的胺偶联将纯化的ANGPTL4的纤维蛋白原样片段(cANGPTL4)固定在ProteOn GLC芯片上。使用电泳缓冲液(50mM Tris,pH 8.0,100mM NaCl)以25μl/min的流速在5分钟内向GLC芯片加入不同浓度的整合素。确定抗固定的cANGPTL4的多克隆抗cANGPTL4抗体的Rmax值为423.1共振单位(RU)。以Langmuir 1:1模型对数据进行全局拟合，以使用Scrubber2(BioLogic Software PteLtd)确定缔合常数(k缔合)、解离常数(k解离)和亲和常数(KD)。分别确定整合素和cANGPTL4的实验Rmax值为365.6RU和341.9UR。使用制造商(Bio-Rad)描述的一次Kinetics实验方案确定ANGPTL4的6种mAb的亲合常数。
至此，由表面等离子体共振(SPR)(图3)确定，根据其良好的Kon、Koff、和KD值确定并生产指向单克隆人类cANGPTL4的抗体mAb11F6C4，以用于我们的免疫疗法实验。
体内致瘤性测试
接下来，我们推断，通过用具有干扰ANGPTL4作用的抗体治疗被注射过表达cANGPTL4的重组细胞的小鼠，能够停止肿瘤生长或减少肿瘤大小。
从A*STAR Biological Resources Centre(新加坡)购买5至6周的BALB/c无胸腺裸雌鼠(20～22g)。将所有动物保存在无菌条件下。动物研究由南洋理工大学的动物保护和利用委员会批准，并且所有实验严格按照其规范进行。
向每只裸鼠(每组n＝5)的肩胛间区域皮下注射共5×105个细胞(过表达cANGPTL4的重组细胞)。变换注射位点以避免位点差异。让被注射的肿瘤细胞生长8周。每隔一天使用游标卡尺在外部测量皮下异种移植的肿瘤，并且使用等式V＝(L×W)/2估算肿瘤体积，其中L为肿瘤的长轴长度，并且W为短轴长度。在实验结束(8周)杀死小鼠，并收集其肿瘤以用于进一步分析。
对于抗体治疗，如上所述将过表达cANGPTL4的重组细胞植入裸鼠中(每组n＝6)。移植一周后，每周用30mg/kg/周的mAb11F6C4或同型对照IgG静脉注射一次，持续4周。抗体的剂量和递送模式与使用mAb14D 12(另一种抗ANGPTL4mAb27(Desai等，2007))的研究一致。在治疗后杀死小鼠，并收集肿瘤以用于进一步分析。使用具有Plan-Apochromat 63x/l.40Oil镜头和ZEN 2008软件的激光扫描显微镜(Carl Zeiss)。尤其地，与用对照IgG治疗的小鼠相比，mAb11F6C4对ANGPTL4的免疫抑制显著地减弱了在免疫缺陷小鼠中的体内肿瘤生长(每组n＝6)(图4A&4B)。
在小鼠中提取了很多临床上感兴趣的抗体并通过杂交瘤细胞制备。在动物模型中已被证明的这些单克隆抗体(mAb)的抗肿瘤活性使它们在临床应用中成为具有吸引力的候选。然而，小鼠mAb在人类中的免疫原性问题是限制其临床应用的主要障碍，特别是在癌症治疗中，其中需要大剂量和重复给药以实现显著的效果。因此，需要且必要地将临床上感兴趣的鼠科来源的mAb转化为物理和功能上更像人类Ig的抗体。抗体人源化用于减小动物单克隆抗体的免疫原性(mAb)，并用于改善它们在人免疫系统中的活性。用作人类治疗的人源化单克隆抗体的发展代表生物医学产业中发展最快部门之一。越来越多的人源化mAb用于临床实验并作为治疗药物销售。单克隆抗体是现代生物技术R&D目前最成功的故事之一。人类可用性以及人源化单克隆抗体提高了在癌症和免疫炎症疾病(如类风湿关节炎)的临床实验中的成功率。
我们的mAb11F6C4干扰了Angplt4和β1整合素之间的相互作用，降低了胞内ROS产量，并在体内和体外减弱了肿瘤的生长。重要的是，其强调了人源化mAb11FC4在对转移性癌以及其它血管病理学的诊断和治疗目的中的商业潜力。抗ANGPTL4的单克隆抗体用于抗肿瘤和抗致瘤性治疗。该提议将为我们提供开发新的基于氧化还原的癌症治疗途径的充足的资源。我们期待由此产生技术方面的新认识和新进步。
“包含”是指包括但不限于任何接在“包含”一词之后的东西。因此，使用术语“包含”表明所列的元素是所需的或必要的，但其它元素是可选的，可存在或不存在。
“由……组成”是指包括但不限于任何由“由……组成”短语涵盖的东西。因此，术语“由……组成”表明所列的元素是所需的或必要的，并且可不存在其它元素。
在本文示例性描述的本发明可合适地在缺少本文未具体公开的任一个或多个元素、一个或多个限制下实施。因此，例如术语“包含”、“包括”、“含有”等应被宽泛地且无限定地理解。此外，本文所用的术语和表达作为说明而不是限定性的术语使用，并且在这类术语和表述的使用中不旨在排除所示和所述特征的任何等效物或其部分，而是认为在要求保护的本发明范围内的各种修改是可能的。因此，应当理解尽管已通过优选实施方式和可选择的特征具体地公开了本发明，但本领域技术人员可采取本文所公开的包含在其中的本发明的修改和变化，并认为这类修改和改变在本发明范围内。
与给定数值(例如温度和时间段)相关的“约”是指包括在具体数值的10％以内的数值。
本文已宽泛且一般地描述了本发明。属于一般公开内容的更窄种类和亚种分组也形成本发明的一部分。这包括具有从种属中去除任何主题的附文或消极限制的本发明一般描述，而无论文中是否具体地列举了排除的材料。
其它实施方式在下列权利要求和非限定性实施例之内。此外，当根据马库什组描述本发明的特征或方面时，本领域技术人员应认识到，因此本发明也将根据马库什组的成员的任何单个组件和亚组进行描述。
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Claims (14)

1.一种结合血管生成素样4蛋白的C末端区域(cANGPTL4)的抗体，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3区域，并且所述轻链包含VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3，其中：所述VL CDR1包含氨基酸序列SEQID NO:3，主要由SEQ ID NO:3组成，或者由氨基酸序列SEQ ID NO:3组成；所述VLCDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO:4，主要由氨基酸序列SEQ ID NO:4组成，或者由氨基酸序列SEQ ID NO:4组成；所述VL CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO:5，主要由氨基酸序列SEQ ID NO:5组成，或者由氨基酸序列SEQ ID NO:5组成；所述VH CDR1包含氨基酸序列SEQ ID NO:6，主要由氨基酸序列SEQ ID NO:6组成，或者由氨基酸序列SEQ ID NO:6组成；所述VH CDR2包含氨基酸序列SEQ ID NO:7，主要由氨基酸序列SEQ ID NO:7组成，或者由氨基酸序列SEQ ID NO:7组成；并且所述VH CDR3包含氨基酸序列SEQ ID NO:8，主要由氨基酸序列SEQ ID NO:8组成，或者由氨基酸序列SEQ ID NO:8组成。
2.如权利要求1所述的抗体，其中，所述重链包含VH结构域，所述VH结构域包含由SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列，主要由SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:1中列出的氨基酸序列组成，并且所述轻链包含VL结构域，所述VL结构域包含SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列，主要由SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列组成，或者由SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列组成。
3.如权利要求1或2所述的抗体，其中，所述抗体为IgG1κ免疫球蛋白。
4.如权利要求3所述的抗体，其中，所述抗体在所述免疫球蛋白的重链中包含人类IgG1恒定区，并在所述免疫球蛋白的轻链中包含人类恒定区。
5.如权利要求3所述的抗体，其中，所述抗体在所述重链的可变结构域中以及所述轻链的可变结构域中包含全部或部分人类框架区。
6.如权利要求3所述的抗体，其中，所述抗体在所述重链的可变结构域中以及所述轻链中包含鼠科框架区。
7.如权利要求1至6中任一项所述的抗体，用于治疗肿瘤。
8.一种治疗患有癌症相关疾病的患者的方法，包含对所述患者给药治疗有效量的如权利要求1至6中任一项所述的抗体。
9.一种减少细胞增殖的体外方法，包含步骤：(a)使正在增殖的细胞与权利要求1至6中任一项所述的抗体接触。
10.一种编码权利要求1至6中任一项所述的抗体的重链或轻链的核酸分子。
11.如权利要求10所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含编码SEQ ID NO：9中列出的所述轻链的可变结构域的核苷酸序列。
12.如权利要求10所述的核酸分子，其中，所述核酸分子包含编码SEQ ID NO：10中列出所述重链的可变结构域的核苷酸序列。
13.一种用于治疗癌症的组合物，所述组合物包含载体和如权利要求1至6中任一项所述的抗体。
14.如权利要求13所述的组合物，进一步包含一种或多种另外的抗癌药剂。
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