TWI788698B - 抗ｐｄ-ｌ１抗體及其應用 - Google Patents
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Abstract
本發明涉及一種PD-L1免疫抑制劑，具體涉及一種能夠靶向PD-L1的單克隆抗體以及編碼這些抗體的核苷酸、多核苷酸組合、表達載體以及表達載體組合。本發明還提供了包含上述抗PD-L1抗體的偶聯物或者藥物組合物。本發明還提供了上述抗PD-L1抗體核苷酸、多核苷酸組合、表達載體、表達載體組合、偶聯物或者藥物組合物在治療或預防癌症的藥物中的用途。本發明提供的抗PD-L1單克隆抗體與人PD-L1有著良好的親和力並表現出良好的特異性，並能夠極好的與人PD-1競爭結合人PD-L1。本發明提供的抗PD-L1單克隆抗體在非小細胞肺癌和結直腸癌的體外動物模型中均表現出良好的抑腫瘤效果。
Description
本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及一種抗PD-L1抗體或其抗原結合片段及其醫藥用途。
近年來，在腫瘤治療領域，越來越多地人們致力於利用自身免疫系統來抵禦腫瘤，這種通過調動機體免疫系統，抑制和殺傷腫瘤細胞的方法稱為腫瘤免疫治療。腫瘤免疫治療是當前腫瘤治療領域中最具前景的研究方向，其中包括細胞免疫療法、腫瘤疫苗、靶向腫瘤的被動免疫治療，以及免疫檢查點抑制劑等研究熱點，並已取得了很多具有應用前景的研究成果。
免疫檢查點是指通過平衡共刺激和共抑制信號來控制T細胞免疫應答強度的信號通路(文獻1)。機體在正常情況下，免疫檢查點可以通過調節自身免疫反應的強度來維持免疫耐受。然而，機體在受到腫瘤侵襲時，免疫檢查點的啟動可抑制自身免疫，有利於腫瘤細胞的生長和逃逸。CTLA-4、程式性死亡受體-1(programmed death receptor-1，PD-1)/程式性死亡配體-1(programmed death ligand-1，PD-L1)、TIM-3等是免疫檢查點中關鍵負向調控分子，在腫瘤免疫逃逸中起重要作用。用特異性抗體阻斷免疫檢查點的負向調控通路，重建機體免疫系統對腫瘤細胞的識別和殺傷能力，在腫瘤免疫治療中取得了較好的療效。在已知的免疫檢查點中，PD-1/PD-L1在腫瘤免疫研究和治療中受到高度關注。
PD-1(programmed death 1，程式性死亡受體1，CD279)是一種重要的免疫抑制分子，CD28超家族成員。PD-1表達於活化的T細胞、B細胞、NK細胞、單核細胞以及部分腫瘤細胞，是由PDCD1基因編碼，288個氨基酸組成的跨膜蛋白。PD-1結構主要包括胞外區-免疫球蛋白可變區(IgV)樣結構域、跨膜區以及胞內區。胞內區包括C端和N端氨基酸殘基，含有2個獨立的磷酸化作用位點，分別為免疫
受體酪氨酸抑制基(immunoreceptor tyrosine based inhibitorymotif，ITIM)和免疫受體酪氨酸轉換基序(immunore-ceptor tyrosine based switch motif，ITSM)。PD-1胞外IgV樣結構與其配體結合，ITSM改變，募集SHP2信號，啟動下游通路(文獻2)。
PD-1的天然配體有兩個，分別為PD-L1和PD-L2(文獻3)。PD-L1(Programmed death ligand 1，CD274，B7-H1)是40kDa的跨膜蛋白，由CD274基因編碼，誘導表達於T細胞、B細胞、樹突細胞、巨噬細胞、間充質幹細胞、骨髓來源的肥大細胞和非造血細胞，在干擾素及其他炎症因數刺激應答的腫瘤組織和其他組織中都可能會迅速上調(文獻4)。PD-1/PD-L1通路啟動後，在癌症、妊娠、組織移植以及自身免疫病中抑制免疫系統。PD-L2(Programmed death ligand 1，CD273，B7-DC)表達範圍較窄，主要在活化的巨噬細胞、樹突細胞、肥大細胞中表達上調(文獻5)。PD-L1與PD-L2有37%的同源序列，但由於主要表達載體的不同，導致調節作用是不同的。PD-L1不同於PD-L2，表達在多種腫瘤細胞中，使PD-L1成為研究PD-1/PD-L通路在腫瘤免疫治療領域中的主要配體。
由於PD-L1還可以與CD80(屬於免疫球蛋白超家族，其配體是CD28和CTLA4，在自身免疫監控、體液免疫應答及移植反應中發揮重要作用)結合(文獻6)，抑制PD-L1或可解除對CD80的干擾，從而增強T細胞活性；從藥物安全性方面考慮，由於PD-1還有另外一個受體PD-L2，且PD-L2對PD-1的親和力是PD-L1的三倍(文獻7)，而PD-L1阻斷劑不與PD-L2結合。從理論上而言，PD-1抗體同時阻斷了PD-1與PD-L1、PD-L2的關聯，而PD-L1抗體只阻斷PD-1與PD-L1的關聯，保留了PD-1與PD-L2的相互作用。而PD-L2對於維持肺部、胃腸道的免疫耐受非常重要。因此，PD-L1抗體可能比PD-1抗體，在肺和胃腸道方面的副作用上，可能更小。相對PD-1阻斷劑，PD-L1阻斷劑從有效性和安全性方面可能會有一個更好的表現(文獻8)。
目前，美國FDA已批准上市了3種PD-L1抗體藥物(如表1所示)。
其中，Atezolizumab在2016年5月首次獲美國FDA批准，此後兩年又獲批多種適應症(如表2所示)。
在2019年，Atezolizumab又獲批了3大難治性晚期癌症一線治療的適應症，包括歐盟批准的Atezolizumab+貝伐+化療，用於晚期非鱗非小細胞肺癌一線治療；美國批准的Atezolizumab聯合化療，用於PD-L1陽性的晚期三陰性乳腺癌的一線治療以及用於晚期小細胞肺癌的一線治療。
另外兩種上市的PD-L1抗體藥物Avelumab和Durvalumab也陸續被批准用於治療轉移性MERKEL細胞癌、局部晚期或轉移性尿路上皮癌或無法手術切除的III期非小細胞肺癌等，具體見表3-4。
專利申請CN102245640A中也公開了一種PD-L1抗體以及其用於增強T細胞功能從而上調細胞介導的免疫應答的用途和提供治療T細胞功能障礙病症，所述病症包括感染(例如急性的和慢性的)和腫瘤免疫。腫瘤免疫針對的癌症包括：乳腺癌(breast cancer)、肺癌(lung cancer)、結腸癌(colon cancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、黑色素瘤(melanoma)、膀胱癌(bladder cancer)、腎癌(kidney cancer)、肝癌(liver cancer)、唾液腺癌(salivary cancer)、胃癌(stomach cancer)、神經膠質瘤(gliomas)、甲狀腺癌(thyroid cancer)、胸腺癌(thymic cancer)、上皮癌(epithelial cancer)、頭和頸癌(head and neck cancers)、胃癌和胰腺癌(gastric and pancreatic cancer)。
從目前各PD-L1抗體藥物批准的適應症及現有技術文獻來看，儘管同為PD-L1抗體，但所針對的適應症還存在各方面的差異，已上市的三種抗體藥物還存在多個三期臨床失敗進程，如Bavencio針對卵巢癌適應症的3項試驗：JAVELIN Ovarian 100、JAVELIN Ovarian 200和JAVELIN Ovarian PARP 100。這表明目前還存在大量的重大臨床需求未得到滿足。因此臨床上還亟需開發更多藥效更好且針對更多適應症有效的PD-L1類抑制劑，尤其是靶向PD-L1的單克隆抗體。
本發明提供了一種抗PD-L1抗體，以及編碼這些抗體的核苷酸、多核苷酸組合、表達載體以及表達載體組合。本發明還提供了包含上述抗PD-L1抗體的偶聯物或者藥物組合物。本發明還提供了上述抗PD-L1抗體核苷酸、多核苷酸組合、表達載體、表達載體組合、偶聯物或者藥物組合物在治療或預防癌症的藥物中的用途。
本發明提供一種分離的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，所述的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段包括重鏈可變區和輕鏈可變區，所述重鏈可變區的CDR和/或所述輕鏈可變區的CDR與如下序列限定的抗體
具有相同的CDR序列或在如下序列限定的抗體的CDR上進行1-2個氨基酸替換，所述序列限定的抗體為：
(1)重鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO：31所示；和/或
(2)輕鏈可變區氨基酸序列為SEQ ID NO：32所示。
在特定實施方案中，根據採用不同的測定方法或系統認定，相應重鏈和輕鏈可變區的互補決定區CDR 1-3如表5所示。
進一步的，本發明還提供了一種分離的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，在某些具體實施方案中，其包括重鏈和輕鏈可變區序列，其中：
(1)重鏈可變區CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO：1、7、13、19或25所示或對SEQ ID NO：1、7、13、19或25進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列；CDR2氨基酸序列序列如SEQ ID NO：2、8、14、20或26所示或對SEQ ID NO：2、8、14、20或26進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO：3、9、15、21或27所示或對SEQ ID NO：3、9、15、21或27進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列；和/或
(2)輕鏈可變區CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO：4、10、16、22或28所示或對SEQ ID NO：4、10、16、22或28進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列；、CDR2氨基酸序列如SEQ ID NO：5、11、17、23或29所示對SEQ ID NO：5、11、17、23或29進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列；CDR3氨基酸序列如SEQ ID NO：6、12、18、24或30所示或對SEQ ID NO：6、12、18、24或30進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列。
進一步，本發明提供的分離的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，在某些具體實施方案中，其中：
(1)重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：1-3或對SEQ ID NO：1-3進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列；和/或輕鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：4-6或對SEQ ID NO：4-6進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列；或
(2)重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：7-9或對SEQ ID NO：7-9進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列；和/或輕鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：10-12或對SEQ ID NO：10-12進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列；或
(3)重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：13-15或對SEQ ID NO：13-15進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列；和/或輕鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：16-18或對SEQ ID NO：16-18進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列；或
(4)重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：19-21或對SEQ ID NO：19-21進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列；和/或輕鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：22-24或對SEQ ID NO：22-24進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列；或
(5)重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：25-27或對SEQ ID NO：25-27進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列；和/或輕鏈可變區CDR1-3
氨基酸序列為SEQ ID NO：28-30或對SEQ ID NO：28-30進行1或2個氨基酸替換後的氨基酸序列。
在某些具體實施方案中，本發明所提供的抗體或其抗原結合片段，其重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：1-3；輕鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：4-6。
在某些具體實施方案中，本發明所提供的抗體或其抗原結合片段，其包括選自如下一組的可變區：
(1)重鏈可變區的序列如SEQ ID NO：31所示，或與SEQ ID NO：31具有相同的CDR1-3且與SEQ ID NO：31相比同一性大於80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的序列；和/或
(2)輕鏈可變區的序列如SEQ ID NO：32所示，或與SEQ ID NO：32具有相同的CDR 1-3且與SEQ ID NO：32相比同一性大於80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%的序列。
本發明涉及的抗PD-L1抗體重鏈可變區氨基酸序列(SEQ ID NO：31)：
本發明涉及的抗PD-L1抗體輕鏈可變區氨基酸序列(SEQ ID NO：32)：
在某些具體實施方案中，本發明所提供的抗體或其抗原結合片段，其中：(1)重鏈可變區的序列如SEQ ID NO：31所示；和/或(2)輕鏈可變區的序列分別SEQ ID NO：32所示。
在某些具體實施方案中，本發明所提供的抗體或其抗原結合片段，其：(1)重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示；和/或(2)輕鏈的氨基酸序列分別SEQ ID NO：34所示。
本發明所提供的抗體可以是單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體或Fab片段、F(ab')片段、F(ab')2片段、Fv片段、dAb、Fd、單鏈抗體(scFv)。進一步地，所述抗體是人源化單克隆抗體。
本發明所提供的抗體進一步包括人或鼠恒定區，所述恒定區進一步可選自IgG1,IgG2,IgG3,IgG4。所述IgG2包括IgG2A，IgG2B。
本發明還提供分離的編碼上述抗體或其抗原結合片段的多核苷酸或編碼上述抗體或抗原結合片段重鏈或重鏈部分片段以及輕鏈或輕鏈部分片段的多核苷酸組合。
本發明還提供一種核酸構建體或載體，其包含了上述編碼抗PD-L1抗體或其抗原結合片段的多核苷酸。
本發明進一步提供了一種宿主細胞，其包含上述核酸構建體或載體。所述細胞可以是原核細胞、真核細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、大腸桿菌細胞或CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、BHK細胞。
本發明進一步提供了一種抗體藥物偶聯物，其含有本發明中的抗PD-L1抗體或其抗原結合部分及藥物毒素。所述藥物毒素可以選自可直接或間接抑制細胞生長或殺滅細胞、或通過啟動機體免疫反應從而抑制或殺死細胞，從而達到治療腫瘤的化學物質、毒素、多肽、酶、同位素、細胞因數、抗體或其他具有生物活性的但以物質或混合物質，優選白介素類、腫瘤壞死因數、趨化因數、納米顆粒、MMAE、MMAF、DM1、DM4、卡奇黴素(Calicheamicin)、duocarmycin、阿黴素(Doxorubicin)。
本發明進一步提供了一種藥物組合物，包含了本發明中的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段和/或上述偶聯物，以及藥學上可接受的載體。
本發明進一步提供了一種製備抗PD-L1抗體的方法，其包括在適合表達編碼抗PD-L1抗體或抗原結合片段的載體的條件下培養上述宿主細胞，並且回收所述抗體或片段。
本發明進一步提供了一種增強T細胞功能的方法，其包括向功能障礙的T細胞施用有效量本發明中的上述藥用組合物。
又一方面，本發明提供了一種治療或預防癌症的方法，其包括向有此需要的物件施用治療有效量的根據本發明的抗體、多核苷酸、多核苷酸組合、表達載體、偶聯物和/或藥物組合物。
又一方面，本發明提供了本發明中抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、其編碼多核苷酸、多核苷酸組合、相應的核酸構建體或載體、抗體藥物偶聯物、或藥物組合物在製備用於治療或預防癌症的藥物中的用途。
又一方面，本發明提供了根據本發明的抗體、多核苷酸、多核苷酸組合、表達載體、偶聯物和/或藥物組合物，其用於治療或預防癌症。
進一步地，其中所述癌症為實體瘤。
進一步地，其中所述實體瘤為肺癌、結直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、膀胱癌、尿路上皮癌、腎癌、肝癌、唾液腺癌、胃癌、神經膠質瘤、甲狀腺癌、胸腺癌、上皮癌、頭和頸癌、胃癌和胰腺癌。
進一步地，其中所述肺癌為非小細胞肺癌。
進一步地，其中所述卵巢癌為三陰性乳腺癌。
本發明又一方面提供了治療T細胞功能障礙的病症的方法，其包括向患有T細胞功能障礙的病症的患者施用治療有效量本發明中的上述藥用組合物，所述T細胞功能障礙的病症包括感染、腫瘤免疫。所述腫瘤免疫由選自下述各項癌症導致：乳腺癌，肺癌、結腸癌、卵巢癌、黑色素瘤、膀胱癌、腎癌、肝癌、唾液腺癌、胃癌、神經膠質瘤、甲狀腺癌、胸腺癌、上皮癌、頭和頸癌、胃癌和胰腺癌。
本發明進一步提供了本發明中抗PD-L1抗體或其抗原結合片段、其編碼多核苷酸、多核苷酸組合、相應的核酸構建體或載體、抗體藥物偶聯物、或藥物組合物在製備用於治療或預防癌症的藥物中的用途。
本發明提供的抗PD-L1單克隆抗體是一種全新的靶向PD-L1的單克隆抗體，其具有全新的CDR序列及氨基酸序列。本發明提供的抗PD-L1單克隆抗體與人PD-L1具有驚人的親和力和特異性，在與人PD-1競爭結合人PD-L1上具有顯著優勢。本發明提供的抗PD-L1單克隆抗體在非小細胞肺癌和結直腸癌的體外動物模型中均表現出意料不到的抑制腫瘤效果，為抑制腫瘤進程提供了更佳的選擇。
圖1顯示了hAAG5D8與人PD-L1的親和力結合解離曲線，其中編號為1的曲線表示hAAG5D8的濃度為100nM，編號為2的曲線表示hAAG5D8的濃度為50nM，編號為3的曲線表示hAAG5D8的濃度為25nM。
圖2顯示了hAAG5D8與人PD-1的競爭結合曲線。
圖3顯示了hAAG5D8與多種B7家族蛋白(PD-L1、PD-L2、B7-H3、PD-1及CD80)的結合能力。
圖4顯示了在人非小細胞肺癌皮下異種移植腫瘤模型中，給藥hAAG5D8(5mg/kg)、MPDL3820A(5mg/kg，陽性對照)、Human IgG1(5mg/kg，陰性對照)後的腫瘤生長曲線圖。
圖5顯示了在人結直腸癌皮下異種移植腫瘤模型中，給藥hAAG5D8(1mg/kg、3mg/kg、9mg/kg)、MPDL3820A(10mg/kg，陽性對照)、PBS(陰性對照)後的腫瘤體積變化趨勢。
除非另有定義，本文使用的所有科技術語具有本領域普通技術人員所理解的相同含義。關於本領域的定義及術語，專業人員具體可參考Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel)。氨基酸殘基的縮寫是本領域中所用的指代20個常用L-氨基酸之一的標準3字母和/或1字母代碼。
在本發明中，抗體可變域的互補決定區(CDR)測定或編號方法包括本領域熟知的IMGT、Kabat、Chothia、AbM以及Contact法。
對本發明來說，兩種核酸或者氨基酸序列間的“一致性”、“同一性”或“相似性”是指，在最佳比對(最優比對)後所獲得的、待比較的兩序列之間相同核苷酸或相同氨基酸殘基的百分數，該百分數是純粹統計學的並且兩種序列間的差異隨機分佈並覆蓋其全長。兩種核酸或者氨基酸序列之間的序列比較通常是在以最優方式使它們匹配以後，通過比較這些序列而進行，所述比較能夠通過區段或者通過“比較窗”實施。除了能夠手工實施外，用於比較序列的最優比對，還能夠通過Smith和Waterman(1981)[Ad.App.Math.2：482]的局部同源性演算法、通過Neddleman和Wunsch的(1970)[J.Mol.Biol.48：443]局部同源性演算法、通過Pearson和Lipman的(1988)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444)相似性搜索方法、通過使用這些演算法的電腦軟體實施(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI，或者通過BLAST N or BLAST P比較軟體)。
本文所使用的“抗體”以最廣義使用，並且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單克隆抗體、多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)；本文所使用的“抗原結合片段”是指抗體片段由其來源抗體的重或輕可變鏈的部分序列構成或者包含它們，所述部分序列足以保留與其來源抗體相同的結合特異性和充分的親和力，優選至少等於其來源抗體親和力的1/100，在更優選方式中至少等於1/10。這種功能片段將包含最少5個氨基酸，優選其來源的抗體序列的10、15、25、50和100個連續氨基酸。包括(特別是)Fab、F(ab')、F(ab')2、Fv、dAb、Fd、互補決定區(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、二價單鏈抗體，其含有至少一個足以使得特異性抗原結合於該多肽的免疫球蛋白片段。上述片段可經合成、或酶法、或通過對完整免疫球蛋白的化學切割而製備，或通過重組DNA技術進行遺傳工程改造。其生產的方法在本領域中眾所周知。一條重鏈包含一重鏈可變區(縮寫為VH)和一重鏈恒定區。重鏈恒定區包含三個域(domain)，CH1、CH2和CH3。一條輕鏈包含一輕鏈可變區(縮寫為VL)和一輕鏈恒定區。該輕鏈恒定區包含一個域，CL。VH和VL區域還可再細分為具有高可變性的多個區，被稱為互補決定區(CDR)，其間散佈有更為保守的被稱為框架區(FR)的多個區域。每個VH和VL均由三個CDR和四個FR構成，按照以下順序從氨基端至羧基端排布：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重鏈和輕鏈的這些可變區包含與抗原相互作用的結合域。抗體的恒定區可介導免疫球蛋白與宿主的組織或因數結合，包括免疫系統的各種細胞(如效應細胞)和經典補體系統的第一成分(Clq)。嵌合或人源化抗體也涵蓋在根據本發明的抗體中。
術語“人源化抗體”是指一種抗體，其包含來源於非人源抗體的CDR區、並且該抗體分子的其他部分來源於一種(或幾種)人抗體。而且，為了保留結合親和力，可以修飾骨架(稱為FR)區段的一些殘基(Jones et al.，Nature，321：522-525，1986；Verhoeyen et al.，Science，239：1534-1536，1988；Riechmann et al.，Nature，332：323-327，1988)。通過本領域技術人員已知的技術可以製備根據本發明的人源化抗體或其片段(例如，描述於檔Singer et al.，J.Immun.150：2844-2857，1992；Mountain et al.，Biotechnol.Genet.Eng.Rev.，10：1-142，1992；或Bebbington et al.，Bio/Technology，10：169-175，1992)。
術語“嵌合抗體”系指以下抗體，其中的可變區序列來自一物種而恒定區序列來自另一物種，例如可變區序列來自小鼠抗體而恒定區序列來自人抗體的抗體。通過使用基因重組技術可以製備根據本發明的嵌
合抗體或其片段。例如，所述嵌合抗體可以通過克隆重組DNA來生產，所述重組DNA包含啟動子和編碼根據本發明的非人尤其是鼠單克隆抗體可變區的序列、以及編碼人抗體恒定區的序列。由這種重組基因編碼的本發明嵌合抗體將是，例如，鼠-人嵌合體，該抗體的特異性由來源於鼠DNA的可變區確定，並且其同種型由來源於人DNA的恒定區來確定。對於製備嵌合抗體的方法，例如，可以參考檔Verhoeyn et al.(BioEssays，8：74，1988)。
術語“單克隆抗體”系指具有單一分子組成的抗體分子的製備物。單克隆抗體組合物顯示出對於特定表位元的單一結合特異性和親和性。
術語“分離地”核酸分子是從至少一個污染物核酸分子中鑒別與分離的核酸分子，在抗體核酸的天然來源中其一般地與該污染物核酸分子有聯繫。分離的核酸分子在其形式或環境上與其在自然界中發現時不同。分離的核酸分子因此不同于其在自然細胞中存在的核酸分子。然而，分離的核酸分子包括在通常表達抗體的細胞中加以包含的核酸分子，在該細胞中例如核酸分子位於與自然細胞不同的染色體位置上。
通常，為了製備單克隆抗體或其功能片段，尤其是鼠源的單克隆抗體或其功能片段，可以參考尤其描述在手冊“Antibodies”中的技術(Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor NY，pp.726，1988)或者參考Kohler和Milstein描述的從雜交瘤細胞製備的技術(Nature，256：495-497，1975)。
下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下面實施例僅用於說明本發明，而不應視為限定本發明的範圍。
實施例1 抗PD-L1抗體的產生
通過對免疫小鼠後獲得的抗PD-L1抗體的大量篩選，從中確定了一個侯選鼠源抗體mAAG5D8。通過進一步在抗體可變區資料庫中比對，我們確定了與鼠源PD-L1抗體mAAG5D8具有很高同源性的人IgG1
框架區。針對mAAG5D8，我們進一步設計了多種人源化抗體並進行親和力比較，最終確定候選的人源化抗PD-L1抗體hAAG5D8。
抗PD-L1人源化抗體hAAG5D8重鏈可變區氨基酸序列(SEQ ID NO：31)：
抗PD-L1人源化抗體hAAG5D8輕鏈可變區氨基酸序列(SEQ ID NO：32)：
抗PD-L1人源化抗體hAAG5D8重鏈和輕鏈氨基酸序列分別如序列33(SEQ ID NO：33)和序列34(SEQ ID NO：34)所示。
實施例2 hAAG5D8與人PD-L1的親和力比較
採用生物層干涉(BLI)法檢測hAAG5D8對人PD-L1的親和力。黑色96孔板A-D第1、3、5列分別加入PBS溶液分別作為基線1、基線2和解離液，第2列加入PD-L1溶液(R&D公司)，第4列加入hAAG5D8溶液(濃度依次為100nM-50nM-25nM-0nM)，第10列加入咪唑溶液，第11列加入水，第12列加入硫酸鎳溶液。實驗採用Ni-NTA探針(Fortebio公司)，首先將探針浸入A-D第1列，保持180s，使基數穩定；將Ni-NTA探針浸入A-D第2列，保持300s，使PD-L1固化到探針上；將Ni-NTA探針浸入A-D第3列，保持120s，使基數穩定；將Ni-NTA探針浸入A-D第4列，保持600s，使不同濃度的hAAG5D8與探針上固化的PD-L1蛋
白結合；將Ni-NTA探針浸入A-D第5列，保持600s，使抗體自然解離；之後將Ni-NTA探針依次浸入A-D第10、11、12列，使固化在探針上的PD-L1從探針上強制解離。使用Data analysis 7.0進行資料分析獲得結合解離平衡常數KD。
結果及結論：hAAG5D8與人PD-L1的結合解離平衡常數KD值和親和力結合解離曲線分別如表7和圖1所示。實驗結果表明，hAAG5D8親和力與人PD-L1親和力遠高於PD-L1與PD-1的親和力8.2μM(Molecular Interactions of Antibody Drugs Targeting PD-1,PD-L1,and CTLA-4 in Immuno-Oncology，Hyun Tae Lee等，Molecules 2019,24,1190；doi：10.3390/molecules24061190，2019年3月26日，第4頁最後1段)。
實施例3 hAAG5D8與人PD-1的競爭結合
採用ELISA法檢測hAAG5D8競爭PD-1結合PD-L1的能力。用包被緩衝液(6mM Na2CO3，14mM NaHCO3)稀釋PD-L1(Fc Tag)至1μg/mL，每孔加入100μL，4℃孵育過夜。PBST洗板，每孔加入250μL封閉液封閉(3%BSA/PBST)25℃封閉2h，PBST洗板，每孔加入50μL濃度為6μg/mL的人PD-1，同時加入50μL梯度稀釋的hAAG5D8溶液(濃度為8000ng/mL、2000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、6.25ng/mL、1.25ng/mL)混勻後25℃孵育2h，PBST洗板，每孔加入100μL酶標二抗(1：5000比例稀釋的羊抗人IgG-Fc-HRP)25℃孵育1h，顯色，在450nm處讀數，並用四參數方程進行曲線擬合，計算EC50值。
結果及結論：hAAG5D8競爭結合人PD-L1的EC50值和競爭結合曲線分別如表8和圖2所示。實驗結果表明，hAAG5D8能夠有效阻斷PD-1與PD-L1的結合。
實施例4 hAAG5D8與多種其他B7家族蛋白的親和力
採用ELISA法檢測了hAAG5D8與多種其他B7家族蛋白的親
和力(PD-L1、PD-L2、B7-H3、PD-1及CD80)。用包被緩衝液(6mM Na2CO3，14mM NaHCO3)稀釋hAAG5D8至100ng/mL，每孔加入100μL，4℃孵育過夜。PBST洗板，每孔加入250μL封閉液封閉(3%BSA/PBST)25℃封閉2h，PBST洗板，每孔加入100μL濃度為5μg/mL的蛋白樣品(rhPD-L1，rhPD-L2，rhB7-H3，rhPD-1及rhCD80)25℃孵育2h，PBST洗板，每孔加入100μL酶標二抗(1：5000比例稀釋二抗Anti-His-tag)25℃孵育1h，PBST洗板，顯色，在450nm處讀數。
結果及結論：hAAG5D8與B7家族蛋白(PD-L1、PD-L2、B7-H3、PD-1及CD80)的結合如圖3所示。結果表明，hAAG5D8能夠特異性的結合PD-L1不結合PD-L2，hAAG5D8也不與同家族具有相關功能的其他蛋白結合(B7-H3，PD-1，CD80)，由此可知hAAG5D8與PD-L1的結合具有極高的特異性。
實施例5 hAAG5D8對人非小細胞肺癌HCC827 NCG小鼠皮下移植瘤的療效研究
取12只周齡4-5周，體重20-26g，高度免疫缺陷的雄性NCG小鼠(購自南京大學模式動物研究中心)，分別自尾靜脈注射100μl人外周血單個核細胞PBMC(1×107細胞/100μl，分離自健康捐獻者血液)，尾靜脈注射3天后於小鼠右側皮下接種人非小細胞肺癌HCC827細胞(ATCC)，接種後3天(平均瘤體積為57mm3)，將小鼠隨機分為3個組(A-1組、A-2組、A-3組)，每組4只，按照表9所示的給藥方案給藥。實驗同時設置陽性對照和陰性對照，陽性對照為MPDL3820A(即Atezolizumab)，陰性對照為Human IgG1(中美冠科(太倉)有限公司，批號為AB160083)。第4次給藥後當天(即腫瘤細胞接種後第13天)，將實驗小鼠CO2安樂死後取瘤，分別計算相對腫瘤抑制率(TGIRTV)和腫瘤增長抑制率(TGI△TV)進行藥效評價。
相對腫瘤抑制率的計算公式為：TGIRTV=1-TRTV/CRTV(%)。(其中，TRTV為陽性對照組或治療組在某一特定時間點的相對腫瘤體積(TV)；CRTV為陰性對照組在某一特定時間點的相對腫瘤體積；TRTV/CRTV為陽性對照組或治療組和陰性對照組相對腫瘤體積的百分比值；RTV=Vt/V0，V0為分組時該動物的瘤體積，Vt為治療後該動物的瘤體積。)；
腫瘤增長抑制率的計算公式為：TGI△TV%=(1-△T/△C)×100%。(其中，△T=陽性對照組或治療組某一特定時間點的平均腫瘤體積-陽性對照組或治療組給藥起始的平均腫瘤體積，△C=陰性對照組某一特定
時間點的平均腫瘤體積-陰性對照組給藥起始的平均腫瘤體積。)
結果及結論：hAAG5D8對人非小細胞肺癌模型腫瘤抑制作用分別如表10和圖4所示，其中表10為hAAG5D8對人非小細胞肺癌細胞的相對腫瘤抑制率和腫瘤增長抑制率，圖4為給藥後的腫瘤生長曲線圖。實驗結果表明，hAAG5D8對人非小細胞肺癌腫瘤有顯著的抑制作用。
實施例6 hAAG5D8對小鼠結直腸癌MC38轉基因小鼠皮下移植瘤療效的研究
人PD-1的轉基因雌性C57小鼠30只(同濟大學動物實驗中心)，每只小鼠在左側腹皮下植入3×106個表達人PD-L1的小鼠結直腸癌細胞(同濟大學，細胞代號MC38-hPD-L1)，待腫瘤體積生長至約100mm3左右時，將上述小鼠隨機分為5組：C-1組(陰性對照組、PBS，6只)、C-2組(陽性對照組、Atezolizumab、3mg/kg，6只)、C-3組(給藥組、hAAG5D8、1mg/kg，6只)、C-4組(給藥組、hAAG5D8、3mg/kg，6只)、C-5組(給藥組、hAAG5D8、9mg/kg，6只)，每週腹腔給藥2次，共5次。每週測兩次腫瘤體積，直至給藥開始後第16天。
計算公式：
腫瘤體積：TV=D1×D22/2，其中D1、D2分別表示瘤長徑、瘤短徑；
相對腫瘤體積：RTV=TVT/TV1，其中TV1為給藥前腫瘤體積，TVT為每次測量時腫瘤體積；
相對腫瘤增殖率：T/C(%)=TRTV/CRTV×100%，TRTV表示給藥組或陽性對照組RTV，CRTV表示陰性對照組RTV；
相對腫瘤抑制率：TGIRTV(%)=(1-TRTV/CRTV)×100%。
結果及結論：hAAG5D8對小鼠結直腸癌腫瘤抑制作用分別如表11和圖5所示，結果表明，在濃度為3mg/kg及以上劑量hAAG5D8對小鼠結直腸癌皮下移植瘤具有顯著的抑瘤作用。在同樣3mg/kg劑量時，抗PD-L1抗體的抑瘤作用已經顯著優於Atezolizumab的抑瘤效果。
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Claims (23)
- 一種分離的抗PD-L1抗體或其抗原結合片段，所述抗體或其抗原結合片段包括重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，(1)重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：1-3的氨基酸序列；和輕鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：4-6的氨基酸序列；或(2)重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：7-9的氨基酸序列；和輕鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：10-12的氨基酸序列；或(3)重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：13-15的氨基酸序列；和輕鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：16-18的氨基酸序列；或(4)重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：19-21的氨基酸序列；和輕鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：22-24或的氨基酸序列；或(5)重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：25-27的氨基酸序列；和輕鏈可變區CDR1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：28-30的氨基酸序列。
- 根據請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中重鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：1-3；和輕鏈可變區CDR 1-3氨基酸序列為SEQ ID NO：4-6。
- 根據請求項1所述的抗體或其抗原結合片段，其中：(1)重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示；和(2)輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示。
- 根據請求項3所述的抗體或其抗原結合片段，其中：(1)重鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示；和(2)輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID NO：34所示。
- 根據請求項1-4任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體或Fab片段、F(ab')片段、F(ab')2片段、Fv片段、dAb、Fd、單鏈抗體(scFv)。
- 根據請求項1-4任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是人源化單克隆抗體。
- 根據請求項1-4任一項所述的抗體或其抗原結合片段，其進一步包括人或 鼠恒定區。
- 根據請求項7所述的抗體或其抗原結合片段，所述恒定區選自IgG1,IgG2,IgG3,IgG4。
- 根據請求項8所述的抗體或其抗原結合片段，所述恒定區是IgG1，IgG2A，IgG2B。
- 一種分離的多核苷酸，其編碼根據請求項1-9中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
- 一種分離的多核苷酸的組合，其包括：編碼請求項1-9中任一項所述抗體或其抗原結合片段之重鏈的多核苷酸和編碼請求項1-9中任一項所述抗體或其抗原結合片段之輕鏈的多核苷酸。
- 一種核酸構建體，其包含根據請求項10的多核苷酸。
- 根據請求項12所述的核酸構建體，所述核酸構建體為載體。
- 一種宿主細胞，其包含請求項12所述的核酸構建體或請求項13的載體。
- 根據請求項14所述的宿主細胞，所述細胞是CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞或BHK細胞。
- 一種抗體藥物偶聯物，其含有請求項1-9任一項中所述的抗體或其抗原結合部分及藥物毒素。
- 根據請求項16所述的抗體藥物偶聯物，所述藥物毒素選自毒素、多肽、酶、同位素、細胞因數。
- 一種藥物組合物，包含請求項1-9中任一項所述的抗體或其抗原結合片段和/或請求項16或17中所述的偶聯物，以及藥學上可接受的載體。
- 一種製備抗PD-L1抗體的方法，其包括在適合表達編碼抗PD-L1抗體或抗原結合片段的載體的條件下培養請求項14或15所述的宿主細胞，並且回收所述抗體或片段。
- 一種請求項1-9中任一項所述的抗體或其抗原結合片段、請求項10的多核苷酸、請求項11的多核苷酸組合、請求項12-13的核酸構建體、請求項16或17的抗體藥物偶聯物、或請求項18的藥物組合物在製備用於治療PD-L1陽性癌症的藥物中的用途。
- 根據請求項20所述的用途，其中所述癌症為實體瘤。
- 根據請求項21所述的用途，其中所述實體瘤為肺癌、結直腸癌、乳腺 癌、卵巢癌、黑色素瘤、膀胱癌、尿路上皮癌、腎癌、肝癌、唾液腺癌、胃癌、神經膠質瘤、甲狀腺癌、胸腺癌、上皮癌、頭和頸癌、胃癌、胰腺癌、Merkel細胞癌。
- 根據請求項22所述的用途，其中所述肺癌為非小細胞肺癌。
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