DE112009000507T5 - Neue Antigen-bindende Dimerkomplexe, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung - Google Patents

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Patrick Stanssens
Christine Labeur
Carlo Boutton
Anne BRIGÉ
Hendricus Renerus Jacobus Mattheus Hoogenboom
Els Anna Alice Beirnaert
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Abstract

Ein stabiles NFD, erhältlich durch ein Verfahren, umfassend den Schritt der Konzentration eines Polypeptids, umfassend mindestens eine einzelne variable Domäne.

Description

  • Gemäß einem breiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung allgemein neue Dimerkomplexe (hier als ”nicht-fusionierte Dimere” oder NFDs bezeichnet), umfassend einzelne variable Domänen, wie beispielsweise Nanobodies, Verfahren, um diese Komplexe herzustellen und ihre Verwendungen. Diese nicht-kovalent gebundenen Dimerkomplexe bestehen aus zwei identischen Monomeren, die jeweils ein oder mehr einzelne variable Domänen (Homodimere) oder zwei unterschiedliche Monomere umfassend, die jeweils ein oder mehr einzelne variable Domänen umfassen (Heterodimere). Die betroffenen NFDs weisen typischerweise veränderte, z. B. verbesserte oder verminderte Bindungseigenschaften gegenüber ihren monomeren Gegenstücken auf. Die NFDs der Erfindung können weiter durch Bindung über flexible Peptide oder Cysteine manipuliert werden, um die Stabilität zu verbessern. Diese Erfindung beschreibt auch Bedingungen, unter denen solche NFDs gebildet werden und Bedingungen, unter denen die Bildung solcher Dimere vermieden werden kann. Die vorliegende Erfindung stellt beispielsweise auch Verfahren zur Unterdrückung von NFDs bereit, wie beispielsweise die Dimerisierung von (menschlichem Serum) Albumin-bindenden Nanobodies durch Zugabe von ein oder mehr Exzipienzien zu einer Formulierung, die die Schmelztemperatur der einzelnen variablen Domäne erhöhen, wie beispielsweise Mannit oder andere Polyole zu einer flüssigen Formulierung.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Die Antigen-Bindungsstellen konventioneller Antikörper werden primär durch hypervariable Schleifen von sowohl den variablen Domänen der schweren als auch der leichten Kette gebildet. Funktionelle Antigen-Bindungsstellen können jedoch auch durch variable Domänen schwerer Ketten (VH) allein gebildet werden. In vivo haben sich solche Bindungsstellen bei Kamelen und Kameliden als Teile von Antikörpern entwickelt, die nur aus zwei schweren Ketten bestehen und denen die leichten Ketten fehlen. Weiterhin unterstützte eine Analyse der Unterschiede hinsichtlich der Aminosäuresequenz zwischen den VHs dieser nur aus schweren Ketten bestehenden Antikörper von Kamelen (auch bezeichnet als VHH) und der VH-Domänen konventioneller menschlicher Antikörper, veränderte menschliche VH-Domänen zu entwerfen (Lutz Riechmann und Serge Muyldermans, J. of Immunological Methods, Band 231, Ausgaben 1 bis 2, 1999, 25–38). Auf ähnliche Weise wurde gezeigt, und zwar durch Mutationsstudien an Grenzflächenresten, wie auch hinsichtlich der CDR3 an den VH des Anti-Her2-Antikörpers 4D5 parallel zum Anti-hCG VHH H14, einige Mutationen existieren, die das autonome VH-Domänen-Verhalten unterstützten (d. h. günstig für die Löslichkeit und die reversible neuerliche Faltung) (Barthelemy PA et al., 2008, J. of Biol. Chemistry, Band 283, Nr. 6, Seiten 3639–3654). Es wurde auch festgestellt, dass eine Erhöhung der Hydrophilie der früheren leichte Ketten-Grenzfläche durch Ersatz exponierter hydrophober Reste durch hydrophilere Reste das autonome VH-Domänen-Verhalten verbesserte. Diese manipulierten VHs erwiesen sich als bei hoher Konzentration vorherrschend monomer zu sein, jedoch wurden geringe Mengen an dimeren und anderen Aggregaten dieser manipulierten VHs ebenfalls angetroffen, die vermutlich relativ schwache Wechselwirkungen bilden, ähnlich wie diejenigen, die auf dem Gebiet für Wechselwirkungen von VL-VH-Paaren beschrieben werden. Ähnlich wird von einem kamelisierten VH, der cVH-E2 genannt wird, behauptet, dass er Dimere in Lösung in konzentrationsabhängiger Weise bildet, d. h. bei Konzentrationen oberhalb von 7 mg/ml (wobei festzuhalten wäre, dass in dieser Studie keine Daten dargestellt werden; Dottorini et al., Biochemistry, 2004, 43, 622–628). Unterhalb dieser Konzentration dissoziiert das Dimer wahrscheinlich in seine Monomere und es bleibt unklar, ob diese Dimere aktiv (d. h. Antigen-bindend) waren. Weiterhin wurde kürzlich darüber berichtet, dass ein verkürzter vom Lama abstammender VHH (die ersten sieben Aminosäuren waren abgespalten) mit einer sehr kurzen CDR3 (nur 6 Reste), bezeichnet als VHH-R9, ein hinsichtlich der Domänen ausgetauschtes Dimer in der Kristallstruktur bildet. Da gezeigt wurde, dass VHH-R9 in Lösung funktional ist (niedrige Kd gegen Hapten) und nur aus Monomer besteht, ist wahrscheinlich, dass die Dimerisierung während des sehr langsamen Kristallisierungsprozesses (4 bis 5 Wochen) auftrat und dass Elemente wie eine N-terminale Spaltung, hohe Konzentrationsbedingungen und kurze CDR3 zu einem ”Kondensations”-Phänomen führen oder beitragen könnten (siehe insbesondere auch den Teil der Schlussfolgerung in Spinelli et al., FEBS Letter 564, 2004, 35–40). Sepulveda et al. (J. Mol. Biol. (2003) 333, 355–365) haben festgestellt, dass die spontane Bildung von VH-Dimeren (VHD) in vielen Fällen permissiv ist, wobei Moleküle mit einer Antigen-Bindungsspezifität erzeugt werden. Basierend auf der berichteten spontanen Bildung (gegenüber den durch PIA, wie hier berichtet, gebildeten Dimeren) und dem Fehlen von Stabilitätsdaten hinsichtlich der nicht-fusionierten Dimere ist es jedoch wahrscheinlich, dass diese schwach in Wechselwirkung tretenden Dimere ähnlich wie diejenigen sind, die von Barthelemy (supra) beschrieben wurden. Zusammengefasst beschreibt die Literatur die Bildung von Dimeren von einzelnen variablen Domänen und Fragmenten davon, die a) primär durch relativ schwache hydrophobe Wechselwirkungen in Wechselwirkung treten (die beispielsweise von der Konzentration abhängig sind, reversibel) und/oder b) bei einer anderen Gelegenheit nur im Kristallisationsprozess auftreten (z. B. als Ergebnis von Kristallverpackungskräften). Weiterhin wurde beschrieben, dass diese Dimere keine Antigene mehr banden (siehe bei Spinelli (supra)) oder es ist unklar, ob diese Dimere bindende Dimere waren (wie bei Dottorini (supra) und Barthelemy (supra)).
  • Beschreibung der Erfindung
  • Es wurde nun überraschend festgestellt, dass stabile Dimerkomplexe in Lösung für Polypeptide erzeugt werden können, umfassend mindestens eine einzelne variable VHH-Domäne, vorzugsweise für Polypeptide, umfassend einzelne variable VHH-Domänen, die Dimere bilden, wobei die hier beschriebenen Verfahren verwendet werden (d. h. eine Prozessinduzierte Assoziation, eine Einführung von die CDR3-/Framework-Region 4 destabilisierenden Resten und/oder eine Lagerung bei hoher Temperatur und hoher Konzentration), noch bevorzugter für Polypeptide, umfassend mindestens eine einzelne variable VHH-Domäne mit den Sequenzen SEQ ID NO: 1 bis 6 und/oder Varianten davon, z. B. eine einzelne variable VHH-Domäne mit Sequenzen, die zu 70% und mehr zu den SEQ ID NO: 1 bis 6 identisch sind. Einige dieser stabilen Dimerkomplexe (hier auch als nicht-fusionierte Dimere oder NFDs bezeichnet; nicht-fusioniertes Dimer oder NFD) können sich eine Bindungsfunktionalität von mindestens 50% erhalten oder können sogar im Vergleich zu ihren monomeren Bildungsblöcken eine erhöhte Bindungsaffinität aufweisen, wobei andere eine verminderte oder keine Bindungsfunktionalität mehr aufweisen. Diese NFDs sind im Vergleich zu den z. B. in Barthelemy (supra) beschriebenen ”transienten” konzentrationsabhängigen Dimeren sehr viel stabiler und werden sobald sie gebildet sind, über einen breiten Konzentrationsbereich stabil sein. Diese NFDs können durch Austausch der Framework-4-Region zwischen den monomeren Baublöcken gebildet werden, wobei beide monomere Baublöcke ineinandergreifen (siehe experimenteller Teil der Kristallstruktur von Polypeptid B NFD). Diese Dimere werden typischerweise durch prozessinduzierte Assoziation (PIA) unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren und/oder Lagerung bei relativ hoher Temperatur über Wochen (wie beispielsweise bei 37°C über 4 Wochen) und hoher Konzentration (z. B. wie höher als 50 mg/ml, z. B. 65 mg/ml) gebildet. Die Erfindung lehrt auch, wie man die Bildung der Dimerkomplexe i) in z. B. einer zu einer Massenproduktion hochgefahrenen Produktion oder einem Reinigungsprozess der Polypeptide, umfassend (eine) einzelne variable Domäne(n) unter Nicht-Stressbedingungen (d. h. Bedingungen, die eine Auffaltung der Immunglobuline nicht begünstigen), ii) durch adäquate Formulierung mit Exzipienzien, die die Schmelztemperatur der einzelnen variablen Domäne(n) erhöhen, z. B. durch Mannit in der Formulierung und/oder iii) durch Erhöhung der Stabilität der CDR3- und/oder Framework 4-Region-Konformation vermeidet.
  • Definitionen:
    • a) Falls nicht angegeben oder anders definiert, haben alle Bezeichnungen, die hier verwendet werden, ihre übliche Bedeutung auf dem Gebiet, die dem Fachmann klar sein wird. Es wird beispielsweise Bezug genommen auf Standard-Handbücher, wie Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2. Auflage), Bände 1–3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al., Hrsg., ""Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N. Y., (1985); Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2. Auflage, University of California Press, Berkeley, CA (1981): Roitt et al, "Immunology" (6. Auflage). Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., Roitt et al., Essential Immunology, 10. Auflage, Blackwell Publishing, UK (2001) und Janeway et al., "Immunobiology" (6. Ausgabe), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005), wie auch den allgemeinen Hintergrund, der darin zitiert wird.
    • b) Falls nicht anders angegeben, können alle Verfahren, Schritte, Techniken und Manipulationen, die nicht im Detail spezifisch beschrieben sind, auf eine per se bekannte Weise durchgeführt werden und wurden so durchgeführt, wie dem Fachmann klar sein wird. Wiederum wird beispielsweise Bezug auf Standardhandbücher und den allgemeinen Stand der Technik, der darin erwähnt wird und die weiteren hier zitierten Referenzen genommen; wie auch beispielsweise auf die folgenden Übersichtsartikel, Presta, Adv. Drug Deliv. Rev. 2006, 58 (5–6): 640–56; Levin und Weiss, Mol. Biosyst. 2006, 2(1): 49–57; Irving et al., J. Immunol. Methods, 2001, 248(1–2), 31–45; Schmitz et al., Placenta, 2000, 21 Suppl. A. S106–12, Gonzales et al., Tumour Biol., 2005, 26(1), 31–43, die Verfahren für die Protein-Manipulation, wie eine Affinitätsreifung und andere Verfahren zur Verbesserung der Spezifität und anderer gewünschter Eigenschaften von Proteinen wie Immunglobulinen, beschreiben.
    • c) Aminosäurereste werden gemäß dem üblichen Drei-Buchstaben- oder Ein-Buchstaben-Aminosäurecode angegeben, wie in Tabelle A-2 erwähnt:
  • Tabelle A-2: Ein-Buchstaben- und Drei-Buchstaben-Aminosäurecode
    Alanin Ala A
    Nichtpolar, ungeladen (bei einem pH von 6,0–7,0)(3) Valin Val V
    Leucin Leu L
    Isoleucin Ile I
    Phenylalanin Phe F
    Methionin(1) Met M
    Tryptophan Trp W
    Prolin Pro P
    Polar, nicht geladen (bei einem pH von 6,0–7,0) Glycin(2) Gly G
    Serin Ser S
    Threonin Thr T
    Cystein Cys C
    Asparagin Asn N
    Glutamin Gin Q
    Tyrosin Tyr Y
    Polar geladen (bei einem pH von 6,0–7,0) Lysin Lys K
    Arginin Arg R
    Histidin(4) His H
    Aspartat Asp D
    Glutamat Glu E
    Anmerkungen:
    (1) Manchmal auch als polare, ungeladene Aminosäure betrachtet.
    (2) Manchmalauch als nicht-polare, ungeladene Aminosäure betrachtet.
    (3) Wie dem Fachmann klar sein wird, reflektiert die Tatsache, dass ein Aminosäurerest in dieser Tabelle als geladen oder ungeladen bei einem pH von 6,0 oder 7,0 bezeichnet wird, auf keine Weise die Ladung, die dieser Aminosäurerest bei einem niedrigeren pH als 6,0 und/oder einem höheren pH als 7,0 aufweisen würde; die in der Tabelle erwähnten Aminosäurereste können entweder geladen und/oder ungeladen bei einem solchen höheren oder niedrigeren pH sein, wie dem Fachmann klar sein wird.
    (4) Wie auf dem Gebiet bekannt, hängt die Ladung eines His-Restes sehr stark von sogar nur geringen pH-Veränderungen ab, jedoch kann ein His-Rest im Allgemeinen bei einem pH von ungefähr 6,5 als im Wesentlichen ungeladen betrachtet werden.
    • d) Zum Zweck des Vergleichs von zwei oder mehr Nukleotidsequenzen kann der Prozentsatz der ”Sequenzidentität” zwischen einer ersten Nukleotidsequenz und einer zweiten Nukleotidsequenz durch Division [die Zahl der Nukleotide in der ersten Nukleotidsequenz, die zu den Nukleotiden an korrespondierenden Stellungen in der zweiten Nukleotidsequenz identisch sind] durch [die Gesamtzahl von Nukleotiden in der ersten Nukleotidsequenz] und durch Multiplikation mit [100%] berechnet werden, wobei jede Deletion, Insertion, Substitution oder Addition eines Nukleotids in der zweiten Nukleotidsequenz – im Vergleich zur ersten Nukleotidsequenz – als ein Unterschied in einem einzelnen Nukleotid (Position) betrachtet wird.
  • Alternativ kann das Ausmaß der Sequenzidentität zwischen zwei oder mehr Nukleotidsequenzen unter Verwendung eines bekannten Computeralgorithmus für die Sequenzausrichtung, wie z. B. NCBI Blast v2.0, unter Verwendung von Standardeinstellungen berechnet werden.
  • Einige andere Verfahren, Computeralgorithmen und Einstellungen zur Bestimmung des Ausmaßes der Sequenzidentität werden beispielsweise in WO 04/037999 , EP 0 967 284 , EP 1 085 089 , WO 00/55318 , WO 00/78972 , WO 98/49185 und GB 2 357 768-A beschrieben.
  • Üblicherweise wird zum Zwecke der Bestimmung des Prozentsatzes einer ”Sequenzidentität” zwischen zwei Nukleotidsequenzen in Übereinstimmung mit dem oben beschriebenen Berechnungsverfahren die Nukleotidsequenz mit der größten Anzahl an Nukleotiden als ”erste” Nukleotidsequenz genommen und die andere Nukleotidsequenz wird als ”zweite” Nukleotidsequenz genommen.
    • e) Zum Zwecke des Vergleichs von zwei oder mehr Aminosäuresequenzen kann der Prozentsatz einer ”Sequenzidentität” zwischen einer ersten Aminosäuresequenz und einer zweiten Aminosäuresequenz (hiernach auch bezeichnet als ”Aminosäureidentität”) durch Division [die Zahl des Aminosäurerests in der ersten Aminosäuresequenz, die zu den Aminosäureresten an korrespondierenden Stellungen in der zweiten Aminsäuresequenz identisch sind] durch [die Gesamtzahl der Aminosäurereste in der ersten Aminosäuresequenz] und durch Multiplikation mit [100%] berechnet werden, wobei jede Deletion, Insertion, Substitution oder Addition eines Aminosäurerests in der zweiten Aminosäuresequenz – im Vergleich zur ersten Aminosäuresequenz – als ein Unterschied in einem einzelnen Aminosäurerest (Position) betrachtet wird, d. h. als eine ”Aminosäuredifferenz”, wie hier definiert.
  • Alternativ kann der Grad der Sequenzidentität zwischen zwei Aminosäuresequenzen unter Verwendung eines bekannten Computeralgorithmus, wie dem oben für die Bestimmung des Grads der Sequenzidentität von Nukleotidsequenzen erwähnten, wiederum unter Verwendung von Standardeinstellungen, berechnet werden.
  • Üblicherweise wird zum Zwecke der Bestimmung des Prozentsatzes einer ”Sequenzidentität” zwischen zwei Aminosäuresequenzen in Übereinstimmung mit dem oben beschriebenen Berechnungsverfahren die Aminosäuresequenz mit der größten Anzahl an Aminosäuren als ”erste” Aminosäuresequenz genommen und die andere Aminosäuresequenz wird als ”zweite” Aminosäuresequenz genommen.
  • Zur Bestimmung des Ausmaßes der Sequenzidentität zwischen zwei Aminosäuresequenzen kann der Fachmann auf dem Gebiet auch sogenannte ”konservative” Aminosäuresubstitutionen mit in die Betrachtung einbeziehen, die allgemein als Aminosäuresubstitutionen beschrieben werden können, bei denen ein Aminosäurerest durch einen anderen Aminosäurerest mit ähnlicher chemischer Struktur ersetzt wird, wobei dies wenig oder im Wesentlichen keinen Einfluss auf die Funktion, Aktivität oder andere biologische Eigenschaften des Polypeptids hat. Solche konservativen Aminosäuresubstitutionen sind auf dem Gebiet wohlbekannt, beispielsweise aus den WO 04/037999 , GB-A-3 357 768 , WO 98/49185 , WO 00/46383 und WO 01/09300 ; und (bevorzugte) Arten und/oder Kombinationen solcher Substitutionen können auf der Basis der einschlägigen Lehren aus der WO 04/037999 wie auch der WO 98/49185 und den weiteren darin zitierten Referenzen gewählt werden.
  • Solche konservativen Substitutionen sind vorzugsweise Substitutionen, wobei eine Aminosäure innerhalb der folgenden Gruppen (a) bis (e) durch einen anderen Aminosäurerest innerhalb der selben Gruppe ersetzt wird: (a) kleine aliphatische, nichtpolare oder leicht polare Reste: Ala, Ser, Thr, Pro und Gly; (b) polare, negativ geladene Reste und ihre (ungeladenen) Amide: Asp, Asn, Glu und Gln; (c) polare, positiv geladene Reste: His, Arg und Lys; (d) große aliphatische, nichtpolare Reste: Met, Leu, Ile, Val und Cys und (e) aromatische Reste: Phe, Tyr und Trp.
  • Besonders bevorzugte konservative Substitutionen sind wie folgt: Ala zu Gly oder zu Ser; Arg zu Lys; Asn zu Gln oder in His; Asp zu Glu; Cys zu Ser; Gln zu Asn; Glu zu Asp; Gly zu Ala oder zu Pro; His zu Asn oder zu Gln; Ile zu Leu oder zu Val; Leu zu Ile oder zu Val; Lys zu Arg, zu Gln oder zu Glu; Met zu Leu, zu Tyr oder zu Ile: Phe zu Met, zu Leu oder zu Tyr; Ser zu Thr; Thr zu Ser; Trp zu Tyr; Tyr zu Trp und/oder Phe zu Val, zu Ile oder zu Leu.
  • Alle denkbaren Aminosäuresubstitutionen, die auf die hier beschriebenen Polypeptide angewandt werden, können auch auf der Analyse der Häufigkeiten von Aminosäurevariationen zwischen homologen Proteinen unterschiedlicher Spezies basieren, entwickelt von Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978, auf den Analysen des strukturbildenden Potenzials, entwickelt von Chou und Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974 und Adv. Enzymol., 47: 45–149, 1978 und auf der Analyse des Hydrophobizitätmusters bei Proteinen, entwickelt von Eisenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 140–144, 1984; Kyte & Doolittle; J. Molec. Biol. 157: 105–132, 1981 und Goldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321–353, 1986, hier alle in ihrer Gesamtheit durch Inbezugnahme einbezogen. Informationen hinsichtlich der primären, sekundären und tertiären Struktur von Nanobodies werden in der Beschreibung hier angegeben wie auch in dem allgemeinen, oben zitierten Stand der Technik. Zu diesem Zweck wird auch die Kristallstruktur einer VHH-Domäne von einem Lama, beispielsweise von Desmyter et al., Nature Structural Biology, Band 3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752–757; und Decanniere et al., Structure, Band 7, 4, 361 (1999) angegeben. Weitere Informationen hinsichtlich einiger der Aminosäurereste, die in konventionellen VH-Domänen, die VH/VL-Grenzfläche bilden und potenziell kamelisierende Substitutionen dieser Positionen können in dem oben zitierten Stand der Technik angetroffen werden.
    • f) Aminosäuresequenzen und Nukleinsäuresequenzen werden als ”exakt gleich” bezeichnet, wenn sie eine 100%ige Sequenzidentität (wie hier definiert) über ihre gesamte Länge aufweisen;
    • g) Wenn zwei Aminosäuresequenzen verglichen werden, bezieht sich die Bezeichnung ”Aminosäuredifferenz” auf eine Insertion, Deletion oder Substitution eines einzelnen Aminosäurerests an einer Position der ersten Sequenz im Vergleich zur zweiten Sequenz; wobei verstanden werden soll, dass zwei Aminosäuresequenzen eine, zwei oder mehr solche Aminosäuredifferenzen enthalten können.
    • h) Wenn eine Nukleotidsequenz oder Aminosäuresequenz als eine andere Nukleotidsequenz bzw. Aminosäuresequenz ”umfassend” bezeichnet wird oder aus einer anderen Nukleotidsequenz oder Aminosäuresequenz ”im Wesentlichen bestehend”, kann dies bedeuten, dass die letztere Nukleotidsequenz oder Aminosäuresequenz in die ersterwähnte Nukleotidsequenz bzw. Aminosäuresequenz eingebaut wurde, bedeutet jedoch üblicherweise allgemein, dass die zuerst erwähnte Nukleotidsequenz oder Aminosäuresequenz in ihrer Sequenz eine Strecke von Nukleotiden bzw. Aminosäureresten umfasst, die dieselbe Nukleotidsequenz bzw. Aminosäuresequenz wie die letztere Sequenz aufweist, unabhängig davon, wie die zuerst erwähnte Sequenz tatsächlich erzeugt oder erhalten wurde (was beispielsweise durch irgendein hier beschriebenes geeignetes Verfahren geschehen sein kann). Als nicht begrenzendes Beispiel kann, wenn von einem Nanobody der Erfindung gesagt wird, dass er eine CDR-Sequenz umfasst, dies bedeuten, dass diese CDR-Sequenz in den Nanobody der Erfindung eingebaut wurde, bedeutet jedoch üblicherweise allgemein, dass der Nanobody der Erfindung innerhalb seiner Sequenz eine Strecke von Aminosäureresten mit derselben Aminosäuresequenz wie die CDR-Sequenz enthält, unabhängig davon, wie der Nanobody der Erfindung erzeugt oder erhalten wurde. Es sollte auch festgehalten werden, dass wenn die letztere Aminosäuresequenz eine spezifische biologische oder strukturelle Funktion aufweist, sie vorzugsweise im Wesentlichen dieselbe, eine ähnliche oder eine äquivalente biologische oder strukturelle Funktion in der zuerst erwähnten Aminosäuresequenz aufweist (anders ausgedrückt ist die zuerst erwähnte Aminosäuresequenz vorzugsweise so ausgebildet, dass die letztere Sequenz dazu in der Lage ist, im Wesentlichen dieselbe, eine ähnliche oder eine äquivalente biologische oder strukturelle Funktion auszuüben). Wenn beispielsweise von einem Nanobody der Erfindung gesagt wird, dass er eine CDR-Sequenze bzw. eine Frameworksequenz umfasst, sind die CDR-Sequenz und das Framework in dem Nanobody vorzugsweise dazu in der Lage, als CDR-Sequenz bzw. Frameworksequenz zu wirken. Wenn außerdem von einer Nukleotidsequenz gesagt wird, dass sie eine andere Nukleotidsequenz umfasst, ist die zuerst erwähnte Nukleotidsequenz vorzugsweise so ausgebildet, dass sie, wenn sie als Expressionsprodukt exprimiert wird (z. B. als Polypeptid), die von der letzteren Nukleotidsequenz codierte Aminosäuresequenz einen Teil des Expressionsprodukts bildet (anders ausgedrückt, dass sich die letztere Nukleotidsequenz im selben Leserahmen wie die zuerst erwähnte, größere Nukleotidsequenz befindet).
    • i) Eine Nukleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz wird als ”im Wesentlichen sich in isolierter Form befindend oder im Wesentlichen isoliert” bezeichnet – beispielsweise im Vergleich zu der nativen biologischen Quelle und/oder dem Reaktionsmedium oder Kultivierungsmedium, woraus sie erhalten wurde, wenn sie von mindestens einer anderen Komponente getrennt wurde, mit der sie üblicherweise in der Quelle oder dem Medium assoziiert ist, wie beispielsweise einer anderen Nukleinsäure, einem anderen Protein/Polypeptid, einer anderen biologischen Komponente oder einem Makromolekül oder mindestens einer kontaminierenden, unreinen oder geringfügigen Komponente. Eine Nukleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz wird insbesondere als ”im Wesentlichen isoliert” betrachtet, wenn sie um das mindestens 2-fache, insbesondere um das mindestens 10-fache, insbesondere um das mindestens 100-fache und bis um das 1000-fache oder mehr gereinigt wurde. Eine Nukleinsäuresequenz oder Aminosäuresequenz, die sich in ”im Wesentlichen isolierter Form” befindet, ist vorzugsweise im Wesentlichen homogen, bestimmt unter Verwendung geeigneter Techniken, wie beispielsweise einer geeigneten chromatographischen Technik, wie einer Polyacrylamidgelelektrophorese.
    • j) Die Bezeichnung ”Domäne”, wie hier verwendet, bezeichnet allgemein einen globulären Bereich einer Aminosäuresequenz (wie einer Antikörperkette und insbesondere einen globulären Bereich eines Antikörpers mit schwerer Kette) oder ein Polypeptid, das im Wesentlichen aus einem solchen globulären Bereich besteht. Üblicherweise wird eine solche Domäne Peptidschleifen umfassen (z. B. 3 oder 4 Peptidschleifen), die beispielsweise als Blatt oder durch Disulfidbindungen stabilisiert sind. Die Bezeichnung ”Bindungsdomäne” bezieht sich auf eine solche Domäne, die gegen eine antigene Determinante gerichtet ist (wie hier definiert).
    • k) Die Bezeichnung ”antigene Determinante” bezieht sich auf ein Epitop, auf dem Antigen, das von dem Antigen bindenden Molekül (wie beispielsweise einem Nanobody oder einem Polypeptid der Erfindung) und insbesondere durch die Antigen-bindende Stelle des Moleküls erkannt wird. Die Bezeichnungen ”antigene Determinante” und ”Epitop” können hier auch austauschbar verwendet werden.
    • l) Eine Aminosäuresequenz (wie ein Nanobody, ein Antikörper, ein Polypeptid der Erfindung oder allgemein ein Antigen bindendes Protein oder Polypeptid oder ein Fragment davon), die eine spezifische antigene Determinante, ein Epitop, ein Antigen oder Protein (oder mit zumindest einem Teil, einem Fragment oder Epitop davon) (spezifisch) binden kann, eine Affinität und/oder eine Spezifität dafür aufweist, wird als ”gegen” oder ”gerichtet gegen” die antigene Determinante, das Epitop, das Antigen oder Protein bezeichnet.
    • m) Die Bezeichnung ”Spezifität” bezieht sich auf eine Anzahl unterschiedlicher Arten von Antigenen oder antigenen Determinanten, an die ein bestimmtes Antigen-bindendes Molekül oder Antigen-bindendes Protein (wie ein Nanobody oder ein Polypeptid der Erfindung) binden können. Die Spezifität eines Antigen-bindenden Proteins kann basierend auf der Affinität und/oder Avidität bestimmt werden. Die Affinität, repräsentiert durch die Gleichgewichtskonstante für die Dissoziation eines Antigens mit einem Antigen-bindenden Protein (KD) ist ein Maßstab für die Bindungsstärke zwischen einer antigenen Determinante und einer antigenen Bindungsstelle auf dem Antigen-bindenden Protein: je geringer der KD-Wert, desto stärker die Bindungsstärke zwischen einer antigenen Determinante und dem Antigen-bindenden Molekül (alternativ kann die Affinität auch als Affinitätskonstante (KA) ausgedrückt werden, das ist 1/KD). Wie dem Fachmann klar sein wird (beispielsweise auf Basis der hier weiter dargestellten Offenbarung), kann die Affinität auf bekannte Weise bestimmt werden, abhängig von dem spezifischen Antigen von Interesse. Avidität ist ein Maßstab für die Stärke der Bindung zwischen einem Antigen-bindenden Molekül (wie einem Nanobody oder Polypeptid der Erfindung) und dem dazugehörigen Antigen. Avidität bezieht sich sowohl auf die Affinität zwischen einer antigenen Determinante und ihrer Antigen-Bindungsstelle auf dem Antigen-bindenden Molekül als auch die Anzahl zugehöriger Bindungsstellen, die auf dem Antigen-bindenden Molekül vorliegen. Typischerweise werden Antigen-bindende Proteine (wie Aminosäuresequenzen, Nanobodies und/oder Polypeptide der Erfindung) an ihr Antigen mit einer Dissoziationskonstante (KD) von 10–5 bis 10–12 mol/l oder weniger und vorzugsweise 10–7 bis 10–12 mol/l oder weniger und noch bevorzugter 10–8 bis 10–12 mol/l (d. h. mit einer Assoziationskonstante (KA) von 105 bis 1012 l/mol oder mehr und vorzugsweise 107 bis 1012 l/mol oder mehr und noch bevorzugter 108 bis 1012 l/mol) binden. Jeder KD-Wert, der größer ist als 104 mol/l (oder jeder KA-Wert, der niedriger liegt als 104 M–1) l/mol wird allgemein als eine nicht-spezifische Bindung angesehen. Vorzugsweise wird eine monovalente Immunglobulinsequenz der Erfindung an das gewünschte Antigen mit einer Affinität von weniger als 500 nM, vorzugsweise weniger als 200 nM, noch bevorzugter weniger als 10 nM, sowie weniger als 500 pM binden. Eine spezifische Bindung eines Antigen-bindenden Proteins an ein Antigen oder eine antigene Determinante kann auf jede geeignete Weise, die per se bekannt ist, beispielsweise beinhaltend eine Scatchard-Analyse und/oder kompetitive Bindungsassays, wie Radioimmunassays (RIA), Enzymimmunassays (EIA) und Sandwich-Kompetitionsassays und die per se auf dem Gebiet bekannten unterschiedlichen Varianten davon wie auch durch die anderen hier erwähnten Verfahren bestimmt werden.
  • Die Dissoziationskonstante kann die tatsächliche oder die anscheinende Dissoziationskonstante sein, wie dem Fachmann klar sein wird. Verfahren zur Bestimmung der Dissoziationskonstante werden dem Fachmann klar sein und beinhalten beispielsweise die hier erwähnten Verfahren. In diesem Hinblick wird auch klar sein, dass es unter Umständen nicht möglich sein kann, Dissoziationskonstanten von mehr als 10–4 mol/l oder 10–3 mol/l (z. B. 10–2 mol/l) zu messen. Optional wird es dem Fachmann auch klar sein, dass die (tatsächliche oder anscheinende) Dissoziationskonstante auf der Basis der (tatsächlichen oder anscheinenden) Assoziationskonstante (KA), durch die Beziehung [KD = 1/KA] berechnet werden kann.
  • Die Affinität bezeichnet die Stärke oder Stabilität der molekularen Wechselwirkung. Die Affinität wird allgemein durch die KD oder Dissoziationskonstante angegeben, die mol/l-Einheiten (oder M) aufweist. Die Affinität kann auch als Assoziationskonstante KA ausgedrückt werden, was 1/KD entspricht mit einer Einheit von (mol/l)–1 (oder M–1). In der vorliegenden Beschreibung wird die Stabilität einer Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen (wie einer Aminosäuresequenz, einem Nanobody oder einem Polypeptid der Erfindung und dem beabsichtigten Ziel) im Wesentlichen im Hinblick auf den KD-Wert ihrer Wechselwirkung ausgedrückt werden. Es wird dem Fachmann auf dem Gebiet klar sein, dass die Angabe der Stärke der molekularen Wechselwirkung durch den KD-Wert im Hinblick auf die Beziehung KA = 1/KD auch verwendet werden kann, um den korrespondierenden KA-Wert zu berechnen. Der KD-Wert charakterisiert die Stärke einer molekularen Wechselwirkung ebenfalls im thermodynamischen Sinne, da er zu der freien Energie (DG) der Bindung durch die wohlbekannte Beziehung DG = RT·ln(KD) in Beziehung steht (äquivalent DG = –RT·ln(KA)), wobei R die Gaskonstante ist, T die absolute Temperatur und in den natürlichen Logarithmus bezwichnet.
  • Die KD für biologische Wechselwirkungen, die als bedeutsam (z. B. spezifisch) betrachtet werden, liegt typischerweise in einem Bereich von 10–10 M (0,1 nM) bis 10–5 M (10.000 nM). Je stärker die Wechselwirkung, desto niedriger ist ihre KD.
  • Die KD kann auch das Verhältnis der Dissoziationsratenkonstante eines Komplexes, bezeichnet als koff zur Assoziationsrate, bezeichnet als kon, ausgedrückt werden (so dass KD = koff/kon und KA = kon/koff). Die Off-Rate koff hat die Einheit s–1 (wobei s die SI-Einheitsbezeichnung für Sekunde ist). Die On-Rate kon hat die Einheit M–1s–1. Die On-Rate kann zwischen 102 M–1s–1 und ungefähr 107 M–1s–1 variieren, wo sie sich der diffusionsbegrenzten Assoziationsratenkonstante für biomolekulare Wechselwirkungen annähert. Die Off-Rate steht zur Halbwertszeit einer gegebenen molekularen Wechselwirkung durch die Beziehung t1/2 = ln(2)/koff in Beziehung. Die Off-Rate kann zwischen 10–6s–1 (fast irreversibler Komplex mit einer t1/2 von einigen Tagen) bis zu 1 s–1 (t1/2 = 0,69 s) variieren.
  • Die Affinität einer molekularen Interaktion zwischen zwei Molekülen kann durch unterschiedliche per se bekannte Verfahren gemessen werden, wie beispielsweise die wohlbekannte Oberflächenplasmonresonanz (SPR) Biosensortechnik (siehe beispielsweise Ober et al, Intern. Immunology, 13, 1551–1559, 2001), wobei ein Molekül auf dem Biosensorchip immobilisiert ist und das andere Molekül über das immobilisierte Molekül unter Flussbedingungen geführt wird, was kon-, koff-Messungen und daher KD-(oder KA-)Werte ergibt. Dies kann beispielsweise unter Verwendung der wohlbekannten BIACORE-Instrumente durchgeführt werden.
  • Es wird dem Fachmann auch klar sein, dass die gemessene KD zu der anscheinenden KD korrespondiert, wenn das Messverfahren die innewohnende Bindungsaffinität der beteiligten Moleküle beispielsweise durch Artefakte in Bezug auf die Beschichtung auf dem Biosensor eines Moleküls irgendwie beeinflusst. Auch kann eine anscheinende KD gemessen werden, wenn ein Molekül mehr als eine Erkennungsstelle für das andere Molekül enthält. In einer solchen Situation kann die gemessene Affinität durch die Avidität der Interaktion zwischen den beiden Molekülen beeinflusst werden.
  • Ein anderer Ansatz, der verwendet werden kann, um die Affinität zu bewerten, ist der 2-Stufen ELISA (Enzymgebundener Immunosorbent Assay) von Friguet et al., (J. Immunol. Methods, 77, 305–19, 1985). Dieses Verfahren etabliert eine Bindungsgleichgewichtsmessung in Lösungsphase und vermeidet mögliche Artefakte in Bezug auf die Adsorption von einem der Moleküle auf einen Träger wie Kunststoff.
  • Die akkurate Messung der KD kann jedoch sehr arbeitsintensiv sein und dementsprechend werden häufig anscheinende KD-Werte bestimmt, um die Bindungsstärke von zwei Molekülen zu bewerten. Es sollte festgehalten werden, dass, solange alle Messungen konsistent durchgeführt werden (z. B. indem die Assaybedingungen unverändert gehalten werden) anscheinende KD-Messungen als Annäherung der echten KD verwendet werden können und daher sollten in dem vorliegenden Dokument KD und anscheinende KD mit gleicher Wichtigkeit oder Relevanz betrachtet werden. Schließlich sollte festgehalten werden, dass der erfahrene Wissenschaftler in vielen Situationen es als günstig ansehen kann, die Bindungsaffinität relativ zu einem Referenzmolekül zu bestimmen. Um beispielsweise die Bindungsstärke zwischen den Molekülen A und B zu bewerten, kann man beispielsweise ein Referenzmolekül C verwenden, von dem bekannt ist, dass es an B bindet und das auf geeignete Weise mit einer Fluorophor- oder einer Chromophor-Gruppe oder einem anderen chemischen Bestandteil markiert ist, wie beispielsweise Biotin für einen einfachen Nachweis in einem ELISA oder FACS (Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren) oder einem anderen Format (das Fluorophor für den Fluoreszenznachweis, das Chromophor für den Lichtabsorptionsnachweis, das Biotin für den Streptavidin-vermittelten ELISA-Nachweis). Typischerweise wird das Referenzmolekül C bei fester Konzentration gehalten und die Konzentration von A wird für eine gegebene Konzentration oder eine Menge von B variiert. Im Ergebnis wird ein IC50-Wert erhalten, der zur Konzentration von A korrespondiert, bei der das für C in Abwesenheit von A gemessene Signal sich halbiert. Unter der Voraussetzung, dass KDref, die KD des Referenzmoleküls bekannt ist, wie auch die Gesamtkonzentration cref des Referenzmoleküls, kann die anscheinende KD für die Wechselwirkung A-B durch die folgende Formel erhalten werden: KD = IC50/(1 + cref/KDref). Unter der Voraussetzung, dass die Messung des IC50 in konsistenter Weise durchgeführt wird (indem cref gleich gehalten wird) und zwar für die Bindungsstoffe, die verglichen werden, kann die Stärke oder Stabilität einer molekularen Wechselwirkung durch den IC50 bewertet werden und diese Messung wird als äquivalent zu KD oder anscheinendem KD in diesem Text angesehen.
    • n) Die Halbwertszeit einer Aminosäuresequenz, Verbindung oder eines Polypeptids der Erfindung kann allgemein als die Zeit definiert werden, die die Serumkonzentration der Aminosäuresequenz, der Verbindung oder des Polypeptids benötigt, um in vivo um 50% reduziert zu werden, beispielsweise aufgrund eines Abbaus der Sequenz oder der Verbindung und/oder durch Clearance oder Abfangen der Sequenz oder der Verbindung durch natürliche Mechanismen. Die In-vivo-Halbwertszeit einer Aminosäuresequenz, Verbindung oder des Polypeptids der Erfindung kann auf jede per se bekannte Weise bestimmt werden, wie beispielsweise durch pharmakokinetische Analysen. Geeignete Techniken werden dem Fachmann auf dem Gebiet klar sein und können beispielsweise Schritte einer geeigneten Verabreichung, einer geeigneten Dosis der Aminosäuresequenz, der Verbindung oder eines Polypeptids der Erfindung an ein warmblütiges Tier (d. h. einen Menschen oder einen anderen geeigneten Säuger, wie eine Maus, ein Kaninchen, eine Ratte, ein Schwein, einen Hund oder einen Primaten, beispielsweise Affen der Gattung Macaca (wie beispielsweise insbesondere Cynomolgus-Affen (Macaca fascicularis) und/oder Rhesusaffen (Macaca mulatto)) und Paviane (Papio ursinus)), die Entnahme von Blutproben oder anderen Proben von dem Tier, die Bestimmung des Niveaus oder der Konzentration der Aminosäuresequenz, der Verbindung oder des Polypeptids der Erfindung in der Blutprobe und die Berechnung der Zeit, bis das Niveau oder die Konzentration der Aminosäuresequenz, der Verbindung oder des Polypeptids der Erfindung um 50% im Vergleich zu dem anfänglichen Niveau bei der Dosierung reduziert wurde aus (einem Plot der) Daten, die so erhalten wurden, involvieren. Es wird beispielsweise auf den unten dargestellten experimentellen Teil Bezug genommen, wie auch auf Standardhandbücher wie Kenneth, A. et al.: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and Peters et al., Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996). Bezug wird auch auf genommen auf "Pharmacokinetics", M. Gibaldi & D. Perron, veröffentlicht durch Marcel Dekker, 2. Rev. Ausgabe (1982). Wie den Fachmann klar sein wird (siehe beispielsweise Seiten 6 und 7 der WO 04/003019 und die weiteren darin zitierten Referenzen), kann die Halbwertszeit unter Verwendung von Parametern wie t1/2-alpha, t1/2-beta und dem Bereich unter der Kurve (AUC) ausgedrückt werden. In der gegenwärtigen Beschreibung bezieht sich ein ”Anstieg in der Halbwertszeit” auf einen Anstieg eines dieser Parameter, wie z. B. irgendeinem oder zwei dieser Parameter oder im Wesentlichen aller drei dieser Parameter. Wie hier verwendet, bezieht sich ein ”Anstieg der Halbwertszeit” oder eine ”erhöhte Halbwertszeit” insbesondere auf einen Anstieg von t1/2-beta, entweder mit oder ohne einen Anstieg von t1/2-alpha und/oder AUC oder beiden.
    • o) Im Kontext der vorliegenden Erfindung bedeutet ”modulieren” oder ”moduliert” allgemein entweder die Reduktion oder die Inhibition der Aktivität oder alternativ eine Anhebung der Aktivität von Ziel oder Antigen, gemessen unter Verwendung von einem geeigneten in vitro, zellulären oder in vivo Assay. Insbesondere kann ”modulieren” oder ”moduliert” entweder eine Reduktion oder eine Inhibition der Aktivität oder alternativ eine Verstärkung einer (relevanten oder beabsichtigten) biologischen Aktivität eines Ziels oder Antigens bedeuten, gemessen unter Verwendung eines geeigneten in vitro, zellulären oder in vivo Assays (der üblicherweise von dem beteiligten Ziel oder Antigen abhängen wird), und zwar um mindestens 1%, vorzugsweise mindestens 5%, wie beispielsweise mindestens 10% oder mindestens 25%, beispielsweise um mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80% oder 90% oder mehr, im Vergleich zu der Aktivität des Ziels oder Antigens im selben Assay unter denselben Bedingungen, jedoch ohne die Gegenwart des Konstrukts der Erfindung.
  • Wie dem Fachmann klar sein wird, kann eine ”Modulation” auch die Bewirkung einer Veränderung (wobei es sich entweder um einen Anstieg oder eine Verminderung) der Affinität, Avidität., Spezifität und/oder Selektivität eines Ziels oder Antigens für einen oder mehr seiner Liganden, Bindungspartner, Partner für die Assoziation zu einer homomultimeren oder heteromultimeren Form oder Substrate beinhalten; und/oder die Bewirkung einer Veränderung (wobei es sich entweder um einen Anstieg oder eine Verminderung handelt) der Sensitivität des Ziels oder Antigens für ein oder mehr Bedingungen im Medium oder die Umgebung, in der das Ziel oder Antigen vorliegen (beispielsweise pH, Ionenstärke, Gegenwart von Cofaktoren usw.) im Vergleich zu denselben Bedingungen, jedoch ohne Gegenwart des Konstrukts der Erfindung. Wie dem Fachmann klar sein sollte, kann dies wiederum auf jede geeignete Weise und/oder unter Verwendung jedes per se bekannten geeigneten Assays, abhängig von dem beteiligten Ziel oder Antigen, bestimmt werden.
  • ”Modulation” kann auch die Bewirkung einer Veränderung (d. h. einer Aktivität als Agonist, als Antagonist oder als reverser Agonist, abhängig von dem Ziel oder Antigen und der gewünschten biologischen oder physiologischen Wirkung) im Hinblick auf ein oder mehr biologische oder physiologische Mechanismen, Wirkungen, Reaktionen, Funktionen, Stoffwechselwege oder Aktivitäten, an denen das Ziel oder Antigen (oder sein Substrat(e), Ligand(en) oder Stoffwechselweg(e) beteiligt sind, wie der Signalweg oder der Stoffwechselweg und ihre assoziierten biologischen oder physiologischen Wirkungen) beteiligt ist, bedeuten. Wiederum wird es dem Fachmann klar sein, dass eine solche Wirkung als Agonist oder Antagonist auf jede geeignete Weise und/oder unter Verwendung von irgendeinem geeigneten (in vitro und üblicherweise zellulären oder in vivo Assay) Assay, die per se bekannt sind, abhängig von dem Ziel oder Antigen, die beteiligt sind, bestimmt werden kann. Insbesondere kann eine Wirkung als Agonist oder Antagonist so ausgeprägt sein, dass eine beabsichtigte biologische oder physiologische Aktivität erhöht oder vermindert ist, und zwar um mindestens 1%, vorzugsweise mindestens 5%, beispielsweise mindestens 10 oder mindestens 25%, beispielsweise mindestens 50%, mindestens 60%, mindestens 70%, mindestens 80% oder 90% oder mehr im Vergleich zu der biologischen oder physiologischen Aktivität im selben Assay unter denselben Bedingungen, jedoch ohne die Gegenwart des Konstrukts der Erfindung.
  • Eine Modulation kann beispielsweise auch eine allosterische Modulation des Ziels oder Antigens und/oder eine Reduktion oder Inhibition der Bindung des Ziels oder Antigens an eines seiner Substrate oder Liganden und/oder eine Kompetition mit einem natürlichen Liganden, einem Substrat zur Bindung an das Ziel oder das Antigen beinhalten. Die Modulation kann auch eine Aktivierung des Ziels oder Antigens oder des Mechanismus oder Stoffwechsel/Signalweges, die beteiligt sind, beinhalten. Die Modulation kann beispielsweise auch eine Bewirkung einer Veränderung im Hinblick auf eine Faltung oder Konformation des Ziels oder Antigens oder im Hinblick auf die Fähigkeit des Ziels oder Antigens zur Faltung, zur Veränderung der Konformation (beispielsweise bei Bindung eines Liganden), zur Assoziation an andere (Sub)einheiten oder zur Dissoziation beinhalten. Die Modulation kann beispielsweise auch die Bewirkung einer Veränderung der Fähigkeit des Ziels oder Antigens zum Transport anderer Verbindungen oder um als Kanal für andere Verbindungen zu dienen (wie beispielsweise Ionen) beinhalten.
  • Die Modulation kann reversibel oder irreversibel sein, wird jedoch für pharmazeutische und pharmakologische Zwecke üblicherweise reversibel sein.
    • p) Im Hinblick auf ein Ziel oder Antigen bedeutet die Bezeichnung ”Wechselwirkungsstelle” auf dem Ziel oder Antigen eine Stelle, ein Epitop, eine antigene Determinante, ein Teil, eine Domäne oder eine Strecke von Aminosäureresten an dem Ziel oder Antigen, bei der es sich um eine Stelle zur Bindung an einen Liganden, einen Rezeptor oder einen anderen Bindungspartner handelt, eine katalytische Stelle, eine Spaltungsstelle, eine Stelle für eine allosterische Wechselwirkung, eine Stelle, die an einer Multimerisierung beteiligt ist (wie beispielsweise einer Homomerisierung oder Heterodimerisierung) des Ziels oder Antigens; oder irgendeine andere Stelle, ein Epitop, eine antigene Determinante, ein Teil, eine Domäne oder eine Strecke von Aminosäureresten auf dem Ziel oder Antigen, die an einer biologischen Wirkung oder einem Mechanismus von Ziel oder Antigen beteiligt sind. Allgemeiner ausgedrückt kann eine ”Wechselwirkungsstelle” jede Stelle, Epitop, antigene Determinante, Teil, Domäne oder Strecke von Aminosäureresten auf dem Ziel oder Antigen sein, an die eine Aminosäuresequenz oder ein Polypeptid der Erfindung so binden kann, dass das Ziel oder Antigen (und/oder jeder Weg, Wechselwirkung, Signalbildung, biologischer Mechanismus oder biologische Wirkung, an denen Ziel oder Antigen beteiligt sind) moduliert wird (wie hier definiert).
    • q) Eine Aminosäuresequenz oder ein Polypeptid wird als ”spezifisch für” ein erstes Ziel oder ein Antigen im Vergleich zu einem zweiten Ziel oder Antigen bezeichnet, wenn sie/es an das erste Antigen mit einer Affinität (wie oben beschrieben und in geeigneter Weise als KD-Wert, KA-Wert, Koff-Rate und/oder Kon-Rate ausgedrückt) bindet, die mindestens 10mal, wie mindestens 100mal und vorzugsweise mindestens 1.000mal und bis zu 10.000mal oder besser ist als die Affinität, mit der die Aminosäuresequenz oder das Polypeptid an das zweite Ziel oder Polypeptid bindet. Beispielsweise kann das erste Antigen an ein Ziel oder Antigen mit einem KD-Wert binden, der mindestens 10mal weniger, wie mindestens 100mal weniger und vorzugsweise mindestens 1.000mal weniger, wie 10.000mal weniger oder sogar weniger ist als die KD, mit der die Aminosäuresequenz oder das Polypeptid an das zweite Ziel oder Polypeptid bindet. Wenn eine Aminosäuresequenz oder ein Polypeptid für ein erstes Ziel oder Antigen im Vergleich zu einem zweiten Ziel oder Antigen ”spezifisch” ist, ist sie/es vorzugsweise gegen (wie hier definiert) das erste Ziel oder Antigen gerichtet, jedoch nicht gegen das zweite Ziel oder Antigen.
    • r) Die Bezeichnungen ”kreuzblockieren”, ”kreuzblockiert” und ”kreuzblockierend” werden hier austauschbar verwendet, um die Fähigkeit einer Aminosäuresequenz oder anderer Bindungsmittel (wie beispielsweise eines Polypeptids der Erfindung) zum Eingreifen in die Bindung anderer Aminosäuresequenzen oder Bindungsmittel der Erfindung an ein gegebenes Ziel zu bezeichnen. Das Ausmaß, in dem eine Aminosäuresequenz oder andere Bindungsmittel der Erfindung dazu in der Lage sind, in die Bindung eines anderen an ein [Ziel] einzugreifen und also, ob dies als Kreuzblockierung gemäß der Erfindung bezeichnet werden kann, kann unter Verwendung von Kompetitionsbindungsassays bestimmt werden. Ein besonders geeigneter qualitativer Assay verwendet eine Biacoremaschine, die das Ausmaß von Wechselwirkungen unter Verwendung einer Oberflächenplasmonresonanztechnologie messen kann. Ein anderer geeigneter quantitativer Kreuzblockierungsassay verwendet einen auf einem ELISA basierenden Ansatz, um die Kompetition zwischen einer Aminosäuresequenz oder anderen Bindungsmitteln im Hinblick auf ihre Bindung an das Ziel zu messen.
  • Im Folgenden wird allgemein ein geeigneter Biacoreassay zur Bestimmung, ob eine Aminosäuresequenz oder ein anderes Bindungsmittel gemäß der Erfindung kreuzblockiert oder dazu in der Lage ist, zu bestimmen. Es wird anerkannt werden, dass der Assay mit irgendeiner der Aminosäuresequenzen oder anderen Bindungsmittel, die hier beschrieben werden, verwendet werden kann. Die Biacoremaschine (beispielsweise Biacore 3000) wird gemäß den Empfehlungen des Herstellers betrieben. So wird in einem Kreuzblockierungsassay das Zielprotein unter Verwendung einer üblichen Aminkopplungschemie an einen CM5 Biacorechip gekoppelt, um eine Oberfläche zu generieren, die mit dem Ziel beschichtet ist. Typischerweise würden 200 bis 800 Resonanzeinheiten des Ziels an den Chip gekoppelt werden (wobei es sich um eine Menge handelt, die einfach messbare Bindungsniveaus ergibt, die jedoch durch die Konzentrationen des verwendeten Testreagenzes leicht sättigbar ist). Zwei Test-Aminosäuresequenzen (bezeichnet als A* und B*), die im Hinblick auf ihre Fähigkeit, sich untereinander kreuzweise zu blockieren, bewertet werden sollen, werden in einem 1:1 molaren Verhältnis von Bindungsstellen in einem geeigneten Puffer gemischt, um die Testmischung zu erzeugen. Wenn die Konzentrationen auf der Basis von Bindungsstellen berechnet werden, wird angenommen, dass das Molekulargewicht einer Aminosäuresequenz das Gesamtmolekulargewicht der Aminosäuresequenz, geteilt durch die Anzahl von Zielbindungsstellen auf der Aminosäuresequenz ist. Die Konzentration jeder Aminosäuresequenz in der Testmischung sollte hoch genug sein, um die Bindungsstellen für diese Aminosäuresequenz auf den Zielmolekülen, die auf dem Biacorechip gefangen sind, einfach abzusättigen. Die Aminosäuresequenzen in der Mischung befinden sich in derselben molaren Konzentration (auf Bindungsbasis) und diese Konzentration würde typischerweise zwischen 1,00 und 1,5 Mikromolar (auf der Basis von Bindungsstellen) liegen. Getrennte Lösungen, die nur A* und nur B* enthalten, werden ebenfalls hergestellt. Die A* und B* in diesen Lösungen sollten sich im selben Puffer und in derselben Konzentration wie in der Testmischung befinden. Die Testmischung wird über den Ziel-beschichteten Biacorechip geführt und die gesamte Bindungsmenge wird aufgezeichnet. Der Chip wird dann derartig behandelt, dass die gebundenen Aminosäuresequenzen entfernt werden, ohne dass das am Chip gebundene Ziel beschädigt wird. Typischerweise wird dies durchgeführt, indem der Chip mit 30 mM HCl 60 Sekunden behandelt wird. Die Lösung mit nur A* wird dann über die Ziel-beschichtete Oberfläche geführt und die Bindungsmenge aufgezeichnet. Der Chip wird wiederum so behandelt, dass alle gebundenen Aminosäuresequenzen ohne Beschädigung des chipgebundenen Ziels entfernt werden. Die Lösung mit nur B* allein wird dann über die Ziel-beschichtete Oberfläche geführt und die Bindungsmenge aufgezeichnet. Die maximale theoretische Bindung der Mischung aus A* und B* wird als nächstes berechnet und ist die Summe der Bindungen von jeder Aminosäuresequenz, wenn sie über die Zieloberfläche allein geführt wird. Wenn die tatsächlich aufgezeichnete Bindung der Mischung geringer ist als das theoretische Maximum, blockieren die beiden Aminosäuresequenzen sich kreuzweise. So ist im Allgemeinen eine kreuzblockierende Aminosäuresequenz oder ein anderes Bindungsmittel gemäß der Erfindung eine solche, die das Ziel in dem obigen Biacore-Kreuzblockierungsassay so binden wird, dass während des Assays und in Gegenwart einer zweiten Aminosäuresequenz oder eines anderen Bindungsmittels der Erfindung die aufgezeichnete Bindung zwischen 80% und 0,1% (z. B. 80% und 4%) der maximalen theoretischen Bindung liegt, insbesondere zwischen 75% und 0,1% (z. B. 75% bis 4%) der maximalen theoretischen Bindung und noch genauer zwischen 70% und 0,1% (z. B. zwischen 70% und 4%) der maximalen theoretischen Bindung (wie gerade oben definiert) der beiden Aminosäuresequenzen oder Bindungsmittel in Kombination. Der oben beschriebene Biacoreassay ist ein primärer Assay, der verwendet wird um zu bestimmen, ob sich Aminosäuresequenzen oder andere Bindungsmittel gemäß der Erfindung kreuzblockieren. In seltenen Fällen kann es vorkommen, dass bestimmte Aminosäuresequenzen oder andere Bindungsmittel nicht an ein über eine Aminchemie an einen CM5 Biacorechip gekoppeltes Ziel binden (dies tritt typischerweise auf, wenn die relevante Bindungsstelle auf dem Ziel maskiert ist oder durch die Kopplung an den Chip zerstört ist). In solchen Fällen kann die Kreuzblockierung unter Verwendung einer mit einem Tag versehenen Version des Ziels bestimmt werden, beispielsweise einer Version mit einem N-terminalen His-Tag (R & D Systems, Minneapolis, MN, USA, 2005 Kat# 1406-ST-025). Bei diesem speziellen Format würde eine Anti-His-Aminosäuresequenz an den Biacorechip gekoppelt werden, woraufhin das mit einem His-Tag versehene Ziel über die Oberfläche des Chips geführt würde und durch die Anti-His-Aminosäuresequenz gefangen würde. Die Kreuzblockierungsanalyse würde im Wesentlichen wie oben beschrieben durchgeführt werden, außer dass nach jedem Chip-Regenerationszyklus neues, mit einem His-Tag versehenen Ziel zurück auf die Anti-His-Aminosäuresequenz beschichtete Oberfläche geladen werden würde. Zusätzlich zu dem angegebenen Beispiel mit Verwendung eines N-terminalen His-Tags [Ziel], könnte auch ein C-terminales His-Tag-Ziel alternativ verwendet werden. Weiterhin können verschiedene andere Tags und Tag-Bindungsprotein-Kombinationen, die auf dem Gebiet bekannt sind, für eine solche Kreuzblockierungsanalyse verwendet werden (z. B. ein HA-Tag mit Anti-HA Antikörpern; ein FLAG-Tag mit Anti-FLAG Antikörpern; ein Biotin-Tag mit Streptavidin).
  • Im Folgenden wird allgemein ein ELISA-Assay zur Bestimmung, ob eine Aminosäuresequenz oder ein anderes Bindungsmittel, das gegen ein Ziel gerichtet ist, eine Kreuzblockierung aufweist oder dazu in der Lage ist, wie hier definiert, beschrieben. Es wird anerkannt werden, dass der Assay mit jeder der hier beschriebenen Aminosäuresequenzen (oder anderen Bindungsmitteln, wie den Polypeptiden der Erfindung) verwendet werden kann. Das allgemeine Prinzip des Assays ist, eine Aminosäuresequenz oder ein Bindungsmittel, die gegen das Ziel gerichtet ist, das auf die Vertiefungen einer ELISA-Platte geschichtet wurde, zu haben. Eine überschüssige Menge einer zweiten, potenziell kreuzblockierenden, gegen das Ziel gerichteten Aminosäuresequenz wird der Lösung zugefügt (d. h. nicht an die ELISA-Platte gebunden). Eine begrenzte Menge des Ziels wird dann den Vertiefungen zugeführt. Die beschichtete Aminosäuresequenz und die sich in Lösung befindende Aminosäuresequenz kompetitieren um die Bindung der begrenzten Anzahl Zielmoleküle. Die Platte wird gewaschen, um überschüssiges Ziel zu entfernen, das nicht von der beschichteten Aminosäuresequenz gebunden wurde und um ebenfalls die zweite, sich in Lösungsphase befindliche Aminosäuresequenz, wie auch alle Komplexe zu entfernen, die sich zwischen der zweiten, in Lösungsphase befindlichen Aminosäuresequenz und dem Ziel gebildet haben. Die gebundene Zielmenge wird dann unter Verwendung eines Reagenzes gemessen, das geeignet ist, um das Ziel nachzuweisen. Eine Aminosäuresequenz in Lösung, die dazu in der Lage wäre, die beschichtete Aminosäuresequenz kreuzweise zu blockieren, wird in der Lage sein, eine Verminderung der Anzahl an Zielmolekülen auszulösen, die die beschichtete Aminosäuresequenz binden kann, relativ zu der Zahl an Zielmolekülen, die die beschichtete Aminosäuresequenz in Abwesenheit der zweiten, sich in Lösung befindlichen Aminosäuresequenz binden könnte. In dem Fall, in dem die erste Aminosäuresequenz, z. B. ein Ak-X, als immobilisierte Aminosäuresequenz gewählt wird, wird sie auf die Vertiefungen der ELISA-Platte geschichtet, woraufhin die Platten mit einer geeigneten Blockierungslösung blockiert werden, um die nicht-spezifische Bindung von Reagenzien zu blockieren, die darauffolgend zugefügt werden. Eine überschüssige Menge der zweiten Aminosäuresequenz, d. h. Ak-Y, wird der ELISA-Platte dann so zugefügt, dass die Mol Ak-Y [Ziel] Bindungsstellen pro Vertiefung mindestens 10-fach größer sind als die Mol Ak-X [Ziel] Bindungsstellen, die pro Vertiefung während der Beschichtung der ELISA-Platte verwendet wurden. [Ziel] wird dann so zugefügt, dass die Mol [Ziel], die pro Vertiefung zugefügt werden, mindestens 25-fach weniger sind als die Mol Ak-X [Ziel] Bindungsstellen, die für die Beschichtung jeder Vertiefung verwendet wurden. Folgend auf eine geeignete Inkubationszeitspanne wird die ELISA-Platte gewaschen und ein Nachweisreagenz für das Ziel wird zugefügt, um die Menge des spezifisch an die beschichtete Anti-[Ziel]-Aminosäuresequenz (in diesem Fall Ak-X) des Ziels zu messen. Das Hintergrundsignal für den Assay wird als das Signal definiert, dass in Vertiefungen mit der beschichteten Aminosäuresequenz (in diesem Fall Ak-X), der zweiten sich in Lösungsphase befindlichen Aminosäuresequenz (in diesem Fall Ak-Y), [Ziel] Puffer allein (d. h. ohne Ziel) und Ziel-Nachweisreagenzien erhalten wird. Das positive Kontrollsignal für den Assay ist definiert als das Signal, das in Vertiefungen mit der beschichteten Aminosäuresequenz (in diesem Fall Ak-X), dem Puffer für die zweite sich in Lösung befindliche Aminosäuresequenz allein (d. h. keine zweite sich in Lösung befindliche Aminosäuresequenz), Ziel und Ziel-Nachweisreagenzien erhalten wird. Der ELISA kann derartig durchgeführt werden, dass er ein positives Kontrollsignal hat, das mindestens 6mal höher ist als das Hintergrundsignal. Um Artefakte zu vermeiden (d. h. signifikant unterschiedliche Affinitäten zwischen Ak-X und Ak-Y für [Ziel]), die sich aus der Wahl der Aminosäuresequenz zur Verwendung als Beschichtungs-Aminosäuresequenz und der Verwendung der zweiten (kompetitierenden) Aminosäuresequenz ergeben, kann man den Kreuzblockierungsassay in zwei Formaten durchführen: 1) Format 1 ist dasjenige, bei dem Ak-X die Aminosäuresequenz ist, die auf die ELISA-Platte geschichtet wird und Ak-Y die kompetitierende Aminosäuresequenz ist, die sich in Lösung befindet und 2) Format 2 ist dasjenige, bei dem Ak-Y die Aminosäuresequenz ist, die auf die ELISA-Platte geschichtet wird und Ak-X die kompetitierende Aminosäuresequenz ist, die sich in Lösung befindet. Ak-X und Ak-Y werden dann als kreuzblockierend definiert, wenn die sich in Lösung befindliche Anti-Ziel-Aminosäuresequenz entweder im Format 1 oder im Format 2 dazu in der Lage ist, eine Reduktion von 60% bis 100%, spezifisch 70% bis 100% und noch spezifischer 80% bis 100% des Ziel-Nachweissignals {d. h. der Menge Ziel, gebunden an die beschichtete Aminosäuresequenz} im Vergleich zum Ziel-Nachweissignal, erhalten in Abwesenheit der sich in Lösungsphase befindlichen Anti-Ziel-Aminosäuresequenz (d. h. in den positiven Kontrollvertiefungen), auslösen kann.
    • s) Wie hier im Weiteren beschrieben, kann sich die Gesamtzahl an Aminosäureresten in einem Nanobody in einem Bereich von 110 bis 120 befinden, liegt vorzugsweise bei 112 bis 115 und besonders bevorzugt bei 113. Es sollte jedoch festgehalten werden, dass Teile, Fragmente, Analoge oder Derivate (wie hier im Weiteren beschrieben) eines Nanobodies nicht besonders im Hinblick auf ihre Länge und/oder Größe begrenzt sind, solang solche Teile, Fragmente, Analoge oder Derivate den weiteren Anforderungen entsprechen, die hier dargelegt werden und auch vorzugsweise für die hier beschriebenen Zwecke geeignet sind.
    • t) Die Aminosäurereste eines Nanobodies werden gemäß der allgemeinen Nummerierung für VH-Domänen von Kabat et al. ("Sequence of Proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publikationsnummer 91) nummeriert, wie angewandt auf VHH-Domänen von Kameliden im Artikel von Riechmann und Muyldermans, J. Immunol. Methods 23. Juni 2000; 240 (1-2): 185–195 (siehe beispielsweise 2 dieser Veröffentlichung); oder wie hier in Bezug genommen. Gemäß dieser Nummerierung umfasst FR1 eines Nanobodies die Aminosäurereste an den Positionen 1 bis 30, die CDR1 eines Nanobodies umfasst die Aminosäurereste an den Positionen 31 bis 35, die FR2 eines Nanobodies umfasst die Aminosäuren an den Positionen 36 bis 49, die CDR2 eines Nanobodies umfasst die Aminosäurereste an den Positionen 50 bis 65, die FR3 eines Nanobodies umfasst die Aminosäurereste an den Positionen 66 bis 94, die CDR3 eines Nanobodies umfasst die Aminosäurereste an den Positionen 95 bis 102 und die FR4 eines Nanobodies umfasst die Aminosäurereste an den Positionen 103 bis 113. [In diesem Hinblick sollte festgehalten werden, dass wie auf dem Gebiet der VH-Domänen und VHH-Domänen wohlbekannt – die Gesamtzahl der Aminosäurereste in jeder der CDRs variieren kann und nicht zur Gesamtzahl der Aminosäurereste, wie von der Kabat-Nummerierung angegeben, korrespondieren kann (d. h. ein oder mehr Positionen gemäß der Kabat-Nummerierungen können in der tatsächlichen Sequenz nicht besetzt sein oder die tatsächliche Sequenz kann mehr Aminosäurereste als die Zahl enthalten, die gemäß der Kabat-Nummerierung erlaubt ist). Dies bedeutet, dass die Nummerierung gemäß Kabat allgemein zur aktuellen Nummerierung der Aminosäurereste in der tatsächlichen Sequenz korrespondieren kann oder auch nicht. Allgemein kann jedoch festgehalten werden, dass gemäß der Nummerierung von Kabat und unabhängig von der Anzahl von Aminosäureresten in den CDRs die Position 1 gemäß der Kabat-Nummerierung zum Beginn der FR1 und umgekehrt korrespondiert, Position 36 gemäß der Kabat-Nummerierung korrespondiert zum Beginn der FR2 und umgekehrt und Position 66 gemäß der Kabat-Nummerierung korrespondiert zum Beginn der FR3 und umgekehrt und Position 103 gemäß der Kabat-Nummerierung korrespondiert zum Beginn der FR4 und umgekehrt]. Alternative Verfahren zur Nummerierung der Aminosäurereste von VH-Domänen, wobei diese Verfahren auch in analoger Weise auf die VHH-Domänen von Kameliden und Nanobodies angewandt werden können, sind das von Chothia et al. (Nature 342, 877–883 (1989)) beschriebene Verfahren, die sogenannte ”AbM-Definition” und die sogenannte ”Kontaktdefinition”. In der vorliegenden Beschreibung, den Ansprüchen und Figuren wird jedoch die Nummerierung gemäß Kabat, wie auch auf VHH-Domänen von Riechmann und Muyldermans angewandt, befolgt, falls nicht anders angegeben.
    • u) Durch die Bezeichnung ”Zielmolekül” oder ”Zielmoleküle” oder ”Ziel” wird ein Protein mit einer biologischen Funktion in einem Organismus, einschließlich Bakterien und Viren, vorzugsweise einem Tier, noch bevorzugter einem Säugetier, besonders bevorzugt einem Menschen, beschrieben, wobei die biologische Funktion an dem Beginn oder dem Verlauf oder dem Erhalt einer Erkrankung beteiligt ist.
    • v) Die einzelnen variablen Domänen, die in den Konstrukten der Erfindung vorliegen, können alle denkbaren variablen Domänen sein, die eine einzelne Antigen-Bindungseinheit bilden. Allgemein wird es sich bei solchen einzelnen variablen Domänen um Aminosäuresequenzen handeln, die im Wesentlichen aus 4 Frameworkregionen (FR1 bis FR4) und 3 komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR1 bis CDR3) bestehen; oder es handelt sich um irgendein geeignetes Fragment einer solchen Aminosäuresequenz (das dann üblicherweise mindestens einige der Aminosäurereste, die mindestens eine der CDRs bilden, enthält, wie im Weiteren beschrieben). Solche einzelnen variablen Domänen und Fragmente sind besonders bevorzugt solche, die eine Immunglobulinfalte umfassen oder in der Lage dazu sind, unter geeigneten Bedingungen eine Immunglobulinfalte zu bilden. Als solche können die einzelnen variablen Domänen beispielsweise eine variable Domänensequenz der leichten Kette (z. B. eine VL-Sequenz) oder ein geeignetes Fragment davon oder eine variable Domänensequenz der schweren Kette (z. B. eine VH-Sequenz oder VHH-Sequenz) oder ein geeignetes Fragment davon umfassen, solange diese dazu in der Lage sind, eine einzelne Antigen-Bindungseinheit zu bilden (d. h. eine funktionelle Antigen-Bindungseinheit, die im Wesentlichen aus der einzelnen variablen Domäne besteht, so dass die einzelne Antigen-Bindungsdomäne nicht mit einer anderen variablen Domäne in Wechselwirkung treten muss, um eine funktionelle Antigen-Bindungseinheit zu bilden, wie beispielsweise im Fall für diejenigen variablen Domänen, die beispielsweise in konventionellen Antikörpern und ScFv-Fragmenten vorliegen, die mit einer anderen variablen Domäne – z. B. durch eine VH/VL-Wechselwirkung – interagieren müssen, um eine funktionelle Antigen-Bindungsdomäne zu bilden).
  • Beispielsweise kann es sich bei der einzelnen variablen Domäne um einen Domänen-Antikörper (oder eine Aminosäuresequenz, die zur Verwendung als Domänen-Antikörper geeignet ist), einen einzelnen Domänen-Antikörper (oder eine Aminosäuresequenz, die dazu geeignet ist, als einzelner Domänen-Antikörper verwendet zu werden), einen ”dAk” oder dAk (oder eine Aminosäuresequenz, die dazu geeignet ist, als dAk verwendet zu werden) oder einen Nanobody® (wie hier definiert und beinhaltend aber nicht begrenzt auf eine VHH-Sequenz), andere einzelne variable Domänen oder irgendein geeignetes Fragment von diesen handeln. Für eine allgemeine Beschreibung von (einzelnen) Domänen-Antikörpern wird auch auf den oben genannten Stand der Technik Bezug genommen, wie auch auf die EP 0 368 684 . Für die Bezeichnung ”dAks” wird Bezug genommen beispielsweise auf Ward et al. (Nature 12. Oktober 1989, 341 (6242): 544–6), Holt et al., Trends Biotechnol., 2003, 21(11): 484–490; wie auch auf beispielsweise die WO 04/068820 , WO 06/030220 , WO 06/003388 und andere veröffentlichte Patentanmeldungen von Domantis Ltd. Es sollte auch festgehalten werden, dass einzelne Domänen-Antikörper oder einzelne variable Domänen von bestimmten Arten des Hais abstammen können (beispielsweise die sogenannten ”IgNAR-Domänen”, siehe beispielsweise WO 05/18629 ), obwohl diese im Kontext der vorliegenden Erfindung weniger bevorzugt werden, da sie keinen Säugerursprung aufweisen.
  • Insbesondere kann die Aminosäuresequenz der Erfindung ein Nanobody® oder ein geeignetes Fragment davon sein [Merke: Nanobody®, Nanobodies® und Nanoclone® sind Marken von Ablynx N. V.]. Für eine weitere Beschreibung von VH Hs und Nanobodies wird hier auf den Übersichtsartikel von Muyldermans in Reviews in Molecular Biotechnology 74(2001), 277–302 wie auch die folgenden Patentanmeldungen, die als allgemeiner Stand der Technik genannt werden, Bezug genommen: WO 94/04678 , WO 95/04079 und WO 96/34103 von Vrije Universität Brüssel, WO 94/25591 , WO 99/37681 , WO 00/40968 , WO 00/43507 , WO 00/65057 , WO 01/40310 , WO 01/44301 , EP 1134231 und WO 02/48193 von Unilever, WO 97/49805 , WO 01/21817 , WO 03/035694 , WO 03/054016 und WO 03/055527 für Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB), WO 03/050531 von Algonomics N. V. und Ablynx N. V., WO 01/90190 vom National Research Council of Canada, WO 03/025020 (= EP 1 433 793 ) für das Institute of Antibodies, wie auch WO 04/041867 , WO 04/041862 , WO 04/041865 , WO 04/041863 , WO 04/062551 , WO 05/044858 , WO 06/40153 , WO 06/079372 , WO 06/122786 , WO 06/122787 und WO 06/122825 von Ablynx N. V. und die weiteren veröffentlichten Patentanmeldungen von Ablynx N. V. Es wird auch auf den weiter in diesen Anmeldungen genannten Stand der Technik Bezug genommen und insbesondere auf die Referenzlisten, die auf den Seiten 41 bis 43 der internationalen Anmeldung WO 06/040153 erwähnt werden, wobei diese Listen und Referenzen hier durch Inbezugnahme enthalten sind. Wie in diesen Referenzen beschrieben, können Nanobodies (insbesondere VHH-Sequenzen und teilweise humanisierte Nanobodies) insbesondere durch Gegenwart von ein oder mehr ”Schlüsselresten” in ein oder mehr der Frameworksequenzen gekennzeichnet sein.
  • Eine weitere Beschreibung der Nanobodies, einschließlich der Humanisierung und/oder Kamelisierung von Nanobodies, wie auch anderer Modifikationen, Teile oder Fragmente, Derivate oder ”Nanobodyfusionen”, multivalenter Konstrukte (einschließlich einiger nicht-begrenzender Beispiele für Linkersequenzen) und unterschiedliche Modifikationen zur Erhöhung der Halbwertszeit der Nanobodies und ihrer Präparationen werden beispielsweise in der WO 07/104529 gefunden.
    • w) Die Bezeichnung ”nicht-fusioniert” im Kontext von ”nicht-fusionierten Dimeren” bedeutet jede stabile Bindung (oder auch die hier als ”stabil” erwähnten spezifischeren Bedingungen), die unter normalen (z. B. Lagerungs- und/oder physiologischen) Bedingungen anzutreffen sind, die nicht über eine direkte genetische Bindung oder über eine zugeordnete Dimerisierungssequenz, wie in der Literatur bekannt, erhalten wurde (z. B. Jun-Fos Wechselwirkung, Wechselwirkung von CH2-CH3-Domänen von schweren Ketten usw.). Eine solche Bindung kann beispielsweise auf chemischen Kräften wie Van der Waal's-Kräften, Wasserstoffbrückenbindungen und/oder Kräften beruhen, die zwischen entgegengesetzten Ladungen von Aminosäureresten auftreten. Weiterhin können zusätzliche Komponenten, wie Strukturveränderungen, eine Rolle spielen. Solche Strukturveränderungen können beispielsweise ein Austausch von Frameworkregionen sein, beispielsweise ein Austausch der Frameworkregion 4 (ein Phänomen, das als ”Domänaustauschmuster” bezeichnet wird) Betasträngen, die von Frameworkregionen abstammen, und können durch Stabilisierung der CDR3-FR4-Region in der monomeren Strukturkonformation verhindert werden. Demgegenüber zwingt in einem genetisch gebundenen oder fusionierten Konstrukt die Fusion zwei zu exprimierende Einheiten zum Fusionsprotein und die Bindung ist kovalenter Natur (z. B. unter Verwendung von Peptidlinkern zwischen den beiden Einheiten, die den C-Terminus von einer mit dem N-Terminus der anderen Proteindomäne verbinden). Die Bezeichnung ”stabil” im Kontext von ”stabilem Dimer” oder ”stabiles NFD” (”stabile NFDs”) bedeutet, dass 50%, bevorzugter 60%, bevorzugter 70%, bevorzugter 80%, noch bevorzugter 90%, noch bevorzugter 95%, besonders bevorzugt 99% sich in Form von NFDs zum Zeitpunkt der Messung befinden; wobei 100% die Menge (z. B. molare Menge pro Volumen oder Gewicht pro Volumenmenge) NFD und seine korrespondierenden Monomere bedeutet. Die Messung der Stabilität, wie hier definiert, d. h. im Hinblick auf die dimere Natur, kann unter Verwendung einer Größenausschlusschromatographie (unter Verwendung von Standard-Laborbedingungen, wie PBS-Puffer bei Raumtemperatur) durchgeführt werden und falls benötigt, mit einem vorherigen Konzentrationsschritt der zu überprüfenden Probe. Der Bereich unter dem Peak in dem Größenausschlusschromatogramm des identifizierten dimeren und monomeren Peaks repräsentiert die relativen Mengen von Monomer und Dimer, d. h. NFD. NFD und/oder NFDs werden hier austauschbar verwendet, d. h., wann immer NFD verwendet wird, werden NFDs ebenfalls darunter verstanden und umgekehrt.
  • Nicht-fusionierte Dimere (NFDs)
  • Bestimmte Bedingungen oder Aminosäuresequenzveränderungen können ansonsten stabile monomere einzelne variable Domänen in stabile dimere und in einigen Umständen multimere Moleküle umwandeln. Ein Schlüssel zu diesem Verfahren ist die Bereitstellung von Bedingungen, unter denen zwei einzelne variable Domänen dazu in der Lage sind, eine erhöhte, nicht-kovalente Wechselwirkung zu zeigen. NFDs werden beispielsweise durch einen Prozess hergestellt, der sich prozessinduzierte Assoziation nennt (hiernach auch ”PIA”). Diese Dimerisierung wird unter anderem von der Konzentration angetrieben und kann beispielsweise durch Kombination hoher Proteinkonzentrationen (z. B. höher als 50 mg Protein/ml), schnelle pH-Veränderungen (z. B. eine pH-Veränderung von 2 Einheiten innerhalb von 1 Säulenvolumen) und/oder schnelle Salztauschprozesse (z. B. ein Salzaustausch mit 1 Säulenvolumen) im Herstellungsverfahren verstärkt werden. Die hohe Konzentration wird die Wahrscheinlichkeit von Wechselwirkungen individueller monomerer Moleküle erhöhen, während pH und Salzveränderungen eine transiente (partielle) Auffaltung induzieren und/oder hydrophobe Wechselwirkungen und/oder eine Umordnung der Proteinstruktur unterstützen können. Da diese NFDs schlussendlich in oder als Therapeutikum oder prognostisches Mittel verwendet werden können, soll die Bezeichnung ”NFD” oder ”NFDs” bedeuten (oder austauschbar verwendbar sein), dass das NFD sich in Lösung befindet, z. B. in physiologischer Präparation, z. B. einem physiologischen Puffer, umfassend das NFD oder die NFDs (außer wenn die Bedingungen, z. B. Bedingungen spezieller Art, z. B. eine Lagerbedingung für bis zu 2,5 Jahre, über die ein NFD stabil ist) spezifisch beschrieben wird.
  • Alternativ können die NFDs auch unter belastenden Lagerbedingungen hergestellt werden; z. B. wie einer relativ hohen Temperatur (z. B. 37°C) über Wochen, wie beispielsweise 4 Wochen. Weiterhin können NFDs (sogar mit verbesserter, d. h. schnellerer Kinetik) durch Einführung destabilisierender Aminosäurereste in der Nachbarschaft der CDR3 und/oder der Frameworkregion 4 der einzelnen variablen Domäne, die für eine Dimerisierung empfänglich ist (siehe auch den experimentellen Teil, Polypeptid F (= mutiertes Polypeptid B) bildet NFDs schneller als das Polypeptid B unter denselben Bedingungen) hergestellt werden.
  • Der Erhalt einer hohen Konzentration der Komponenten, die dimerisieren sollen, kann durch eine Vielzahl von Verfahren bewirkt werden, die Bedingungen beinhalten, die die Immunglobulinstruktur der einzelnen variablen Domänen, z. B. Nanobodies, z. B. durch eine Chromatographie, (z. B. eine Affinitätschromatographie, wie eine Protein A-, Ionenaustausch-, immobilisierte Metall-Affinitätschromatographie oder IMAC und eine hydrophobe Wechselwirkungschromatographie oder HIC), eine Temperaturaussetzung bis zu nahe der Tm der einzelnen variablen Domäne und Lösungsmittel, die Peptide aufweisen, wie 1 bis 2 M Guanidin, teilweise auffalten. Beispielsweise für die Chromatographie, während des Elutionsprozesses der Proteine von der Säule unter Verwendung von z. B. einer pH-Veränderung oder einem Salzgradienten (wie später erklärt), können die NFDs gebildet werden. Üblicherweise muss die benötigte Konzentration und/oder das exakte Verfahren zur Bildung der NFDs für jedes Polypeptid der Erfindung bestimmt werden und kann unter Umständen nicht für jedes Polypeptid der Erfindung durchführbar sein. Es ist unsere Erfahrung, dass es bestimmte einzelne variable Domänen entweder allein (z. B. Polypeptide B und F) und/oder in einem Konstrukt (z. B. Polypeptide A, C, E, F) gibt, die eine NFD bilden. Kritisch für die Dimerisierung kann eine relativ kurze CDR3 sein (z. B. 3 bis 8 Aminosäuren, mehr bevorzugt 4 bis 7 Aminosäuren, noch bevorzugter 5 bis 6 Aminosäuren, z. B. 6 Aminosäuren)) und destabilisierende Faktoren in der Nachbarschaft der CDR3 und/oder FR4. Weiterhin kann eine hohe Konzentration, wie beispielsweise die maximale Löslichkeit der Polypeptide, umfassend einzelne variable Domäne(n) bei der verwendeten Konzentration (z. B. 5 mg Polypeptid A pro ml Protein A Harz – siehe experimenteller Teil) oder eine Lagerung bei hoher Temperatur über Wochen (z. B. 37°C über 4 Wochen), ein niedriger pH (z. B. ein pH von unter pH 6), eine hohe Konzentration (höher als 50 mg/ml, z. B. 65 mg/ml) nötig sein, um einen vernünftigen Ertrag der NFD-Bildung zu erhalten.
  • Neben einer Säulenchromatographie, die bei beispielsweise maximaler Säulenbeladung durchgeführt wird, kann ähnlich eine benötigte hohe Konzentration zum Erhalt von NFDs durch Konzentrationsverfahren wie Ultrafiltration und/oder Diafiltration, z. B. Ultrafiltration mit einem Puffer mit niedriger Ionenstärke, erhalten werden.
  • Das Verfahren ist nicht an eine spezifische Zahl einzelner variabler Domänen gebunden, da die Bildung von NFDs mit monovalenten, bivalenten und trivalenten monomeren Baublöcken (= Polypeptiden, umfassend (eine) einzelne variable Domäne(n)) und selbst mit einzelnen variablen Domänen-HSA-Fusionen beobachtet wurde. In dem Fall, in dem das Polypeptid zwei unterschiedliche einzelne variable Domänen umfasst, können sich NFDs über nur die identischen oder unterschiedliche (vorzugsweise die identischen) einzelne variable Domänen bilden und üblicherweise nur über eine der einzelnen variablen Domäne(n), z. B. diejenige, die als für eine Bildung von NFDs empfänglich identifiziert wurde (z. B. Polypeptid B) (siehe auch 2b).
  • Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, lösliche und stabile, z. B. stabil innerhalb eines bestimmten Konzentrationsbereichs, Puffers und/oder Temperaturbedingungen; Dimerkomplexe bereitzustellen, die als NFDs bezeichnet werden und die verwendet werden können, um auf Moleküle abzuzielen und/oder so Zellreaktionen zu inhibieren oder zu unterstützen. Es werden hier NFDs beschrieben, umfassend monomere Baublöcke, wie einzelne variable Domänen – auch NFDs-Mo genannt; NFDs, die dimere Baublöcke umfassen, wie zwei kovalent gebundene einzelne variable Domänen – auch NFDs-Di genannt; NFDs, die trimere Baublöcke umfassen, wie drei kovalent gebundene einzelne variable Domänen – auch NFDs-Tri genannt; NFDs, die tetramere Baublöcke umfassen, wie vier kovalent gebundene einzelne variable Domänen – auch NFDs-Te genannt und NFDs, die mehr als vier (= multimere) Baublöcke umfassen, wie multimer kovalent gebundene einzelne variable Domänen – auch NFDs-Mu genannt (siehe 2a + b für einen schematischen Überblick über solche Strukturen). Die NFDs können identische einzelne variable Domänen oder unterschiedliche einzelne variable Domänen enthalten (2b). Wenn die Baublöcke (das Polypeptid) aus einzelnen unterschiedlichen variablen Domänen bestehen, z. B. Nanobodies, haben wir die Erfahrung gemacht, dass vorzugsweise nur eine der einzelnen variablen Domänen in dem Polypeptid ein Dimer bilden wird. Zum Beispiel kann die Dimerisierungseinheit (einzelne variable Domäne, z. B. Nanobody, wie beispielsweise das Polypeptid B oder F) eines trivalenten Polypeptids (siehe 2b) sich in der Mitte oder am C-Terminus oder am N-Terminus des Konstrukts befinden.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Herstellung und Verwendung der NFDs bereitzustellen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Informationen bereitzustellen, wie man solche NFDs vermeiden kann.
  • Diese obigen und andere Aufgaben werden durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt, die im breiten Sinn auf Verfahren, Kits, nicht-fusionierte Dimere gerichtet ist, die bei der Behandlung neoplastischer, Immun- oder anderer Störungen verwendet werden können. Zu diesem Zweck stellt die vorliegende Erfindung stabile NFDs bereit, die eine einzelne variable Domäne oder einzelne variable Domänen umfassen, wie beispielsweise einen Nanobody oder Nanobodies (z. B. Polypeptid B), die verwendet werden können, um Patienten zu behandeln, die an einer Vielzahl von Störungen leiden. In diesem Hinblick wurde überraschend festgestellt, dass die NFDs der vorliegenden Erfindung biochemische Eigenschaften aufweisen, die sie für die Behandlung von Patienten, für die diagnostische Bewertung einer Erkrankung bei Patienten und/oder die Überwachungsbewertung einer Erkrankung bei Patienten, die dessen bedürfen, besonders geeignet machen. Genauer gesagt wurde überraschend festgestellt, dass bestimmte einzelne variable Domänen, Subgruppen davon (einschließlich humanisierter VHHs oder tatsächlich kamelisierter menschlicher VHs) und formatierte Versionen davon (und tatsächlich ist dies auch für menschliche VH und Derivate davon möglich) zur Bildung stabiler Dimere angeregt werden können (d. h. NFD-Mo, NFD-Di, NFD-Tri, NFD-Te oder NFD-Mu), die günstige Eigenschaften im Hinblick auf beispielsweise Herstellbarkeit und Effizienz aufweisen. Es ist bekannt, dass einzelne variable Domänen sich beispielsweise bei Temperaturveränderungen nicht denaturieren sondern sich reversibel neu falten, wenn sie abgekühlt werden ohne zu aggregieren (Ewert et al., Biochemistry 2002, 41: 3628–36), ein Schlüsselmerkmal, das zur effizienten Bildung von Antigen bindenden Dimeren beitragen könnte.
  • NFDs sind bei vielen Anwendungen von besonderem Vorteil. Bei therapeutischen Anwendungen können NFDs-Mu, z. B. NDF-Di-, Bindemittel in Situationen vorteilhaft sein, bei denen eine Oligomerisierung der Zielrezeptoren benötigt wird, wie beispielsweise für die einen Zelltod auslösenden Rezeptoren (auch als TRAIL-Rezeptor bezeichnet). Beispielsweise wird von NFD-Di aufgrund ihrer engen Wechselwirkung der jeweiligen Baublöcke angenommen, dass sie eine andere räumliche Ausrichtung als ”konventionelle” kovalent gebundene korrespondierende Tetrameere aufweisen und so eine positive oder negative Wirkung auf die Antigenbindung bereitstellen können (siehe 2 für eine schematische Illustration bestimmter NFDs). Weiterhin können NFDs, z. B. ein NFD-Mo, ein multimeres Zielmolekül effektiver als ein konventionell kovalent gebundenes einzelnes variables Domänendimer binden. Weiterhin können heteromere NFDs zielspezifische Bindemittel und Bindemittel an Serumproteine, z. B. menschliches Serumalbumin, mit langer Halbwertszeit umfassen. Zusätzlich können ”konventionell” kovalent gebundene Dimere (über z. B. Aminosäuresequenzlinker) Expressionsprobleme aufweisen (indem sie nicht genug tRNA für bestimmte repetitive Kodons enthalten) und können daher zur Herstellung von zunächst Monomeren und dann Umwandlung der Monomere in ein NFD in einem Post-Expressionsverfahren vorteilhaft sein, z. B. durch das hier beschriebene Verfahren. Dies kann Erträge ergeben, die für die NFDs höher sind als für die respektiven kovalent gebundenen Dimere. Ähnlich kann erwartet werden, dass z. B. der Gesamtertrag eines NFD-Di oder NFD-Tri höher ist als der des relevanten kovalent gebundenen Tetramers oder Hexamers. Das gesamt höher liegende Expressionsniveau kann ein entscheidender Faktor bei beispielsweise der Kostenbestimmung zur Auswahl des NFD-Ansatzes sein. Es wird beispielsweise berichtet, dass Expressionserträge und die Sekretionseffizienz rekombinanter Proteine eine Funktion der Kettengröße sind (Skerra & Pluckthun, 1991, Protein Eng. 4, 971).
  • Außerdem könnten weniger Linkerregionen weniger Protease-empfängliche Linkerregionen im Gesamtprotein bedeuten. Es könnte auch nützlich sein, die Wirkung der Multimerisierung einer einzelnen variablen Domäne gemäß den hier beschriebenen Verfahren in vitro und/oder in vivo zu testen. Insgesamt wird erwartet, dass die Feststellung dieser Erfindung zusätzliche effektive Lösungen für die Arzneimittelentwicklung unter Verwendung formatierter einzelner variabler Domänen als zugrundeliegende Gerüststruktur als die bis jetzt bekannten Ansätze, d. h. im Wesentlichen kovalent gebundene einzelne variable Domänenformate bereitstellen könnte.
  • Die NFDs der vorliegenden Erfindung können in einem gewünschten Bereich biologisch relevanter Bedingungen stabil sein, wie beispielsweise einem breiten Konzentrationsbereich (d. h. üblicherweise niedrigem nM-Bereich), Temperatur (37°C), Zeit (Wochen, z. B. 3 bis 4 Wochen) und pH (neutral, pH 5, pH 6 oder Magen-pH wie pH 1). Gemäß einer weiteren Ausführungsform können die NFDs der vorliegenden Erfindung in vivo stabil sein (bei einer Rate von z. B. 95%, wobei 100% die Menge von monomerer und dimerer Form ist), z. B. im menschlichen Körper und zwar über eine verlängerte Zeitspanne, z. B. 1 bis 4 Wochen oder 1 bis 3 Monate und bis zu 6 bis 12 Monate. Weiterhin können die NFDs der vorliegenden Erfindung auch in einem gewünschten Bereich von lagerungsrelevanten Bedingungen, wie beispielsweise einem breiten Konzentrationsbereich (hohe Konzentration wie beispielsweise mg pro ml Bereich), Temperatur (–20°C, 4°C, 20 oder 25°C), Zeit (Monate, Jahre), Resistenz gegenüber organischen Lösungsmitteln und Detergenzien (in Formulierungen, Verfahren zum Erhalt von Formulierungen) stabil sein. Weiterhin wurde überraschend festgestellt, dass die Denaturierung mit Guanidin HCl (GdnHCl) ungefähr 1 M mehr GdnHCl benötigt, um das Polypeptid B-Dimer zu denaturieren als das Polypeptid B-Monomer unter ansonsten gleichen Bedingungen (siehe experimenteller Teil). Außerdem zeigt die überraschende Feststellung, dass die FR4 in dem Polypeptid B NFD-Mo getauscht ist (und möglicherweise ähnlich bei anderen NFDs gemäß der Erfindung) an, dass diese Dimere tatsächlich stabile Komplexe bilden und weiter einzelne variable Domänen oder Nanobodystrukturen stabilisieren können. Weiterhin gibt es Anzeichen, dass eine der Humanisierungsstellen (siehe experimenteller Teil: Polypeptid E gegenüber Polypeptid B) eine schwächere CDR3-Wechselwirkung mit dem Framework ausgelöst haben könnte und so eine stärker verlängerbare CDR3 erhältlich wäre, die wahrscheinlicher zu einer Dimerbildung führen kann.
  • So sind die bevorzugten NFDs der Erfindung stabil (im Hinblick auf die dimere Natur) und zwar in den folgenden Bereichen (und wobei die Bereiche weiter kombiniert werden können, z. B. 2, 3, 4 oder mehr Bereiche, wie unten beschrieben, werden kombiniert, um andere nützliche Ausführungsformen zu bilden):
    • – Bevorzugte Ausführungsformen von NFDs sind stabil (im Hinblick auf die dimere Natur) unter physiologischen Temperaturbedingungen, d. h. einer Temperatur um 37°C, über eine verlängerte Zeitspanne, z. B. eine Zeit von bis zu 1 Tag, noch bevorzugter 1 Woche, besonders bevorzugt 2 Wochen, noch bevorzugter 3 Wochen, besonders bevorzugt 4 Wochen vom Zeitpunkt der Verabreichung des Arzneimittels zu dem bedürftigen Patienten;
    • – Bevorzugte Ausführungsformen von NFDs sind stabil (im Hinblick auf die dimere Natur) unter verschiedenen Lagertemperaturbedingungen, d. h. Temperaturen wie –20°C, noch bevorzugter 4°C, noch bevorzugter 20°C, besonders bevorzugt 25°C, über eine verlängerte Zeitspanne, z. B. bis zu 6 Monaten, noch bevorzugter 1 Jahr, besonders bevorzugt 2 Jahre;
    • – Bevorzugte Ausführungsformen von NFDs sind stabil (im Hinblick auf die dimere Natur) unter verschiedenen physiologischen pH-Bedingungen, d. h. pH-Bereiche wie einem pH von 6 bis 8, noch bevorzugter pH 5 bis 8, besonders bevorzugt pH 1 bis 8, über eine verlängerte Zeitspanne, z. B. eine Zeit von bis zu 1 Woche, noch bevorzugter 2 Wochen, noch bevorzugter 3 Wochen, besonders bevorzugt 4 Wochen vom Zeitpunkt der Verabreichung des Arzneimittels zu dem bedürftigen Patienten an;
    • – Bevorzugte Ausführungsformen von NFDs sind stabil (im Hinblick auf ihre dimere Natur) unter verschiedenen physiologischen Konzentrationsbedingungen, d. h. eine Konzentration von NFDs unterhalb von 200 ng NFD/ml Lösungsmittel, z. B. in einem pH 7-Puffer, wie phosphatgepufferter Lösung und/oder z. B. auch Serum, z. B. menschlichem Serum; noch bevorzugter unterhalb von 100 ng NFD/ml Lösungsmittel, noch bevorzugter unter 50 ng NFD/ml Lösungsmittel, besonders bevorzugt 10 ng NFD/ml Lösungsmittel; in einer weiter bevorzugten Ausführungsform sind NFDs in den obigen Konzentrationen bei 37°C bis zu 1 Tag und mehr, z. B. 1 Woche, noch bevorzugter 2 Wochen, noch bevorzugter 3 Wochen und besonders bevorzugt bis zu 4 Wochen stabil;
    • – Bevorzugte Ausführungsformen von NFDs sind stabil (im Hinblick auf die dimere Natur) unter verschiedenen physiologischen Konzentrationsbedingungen, z. B. einer Konzentration von NFDs von ungefähr 1 mg/ml, noch bevorzugter 5 mg/ml, noch bevorzugter 10 mg/ml, noch bevorzugter 15 mg/ml, noch bevorzugter 20 mg/ml, noch bevorzugter 30 mg/ml, noch bevorzugter 40 mg/ml, noch bevorzugter 50 mg/ml, noch bevorzugter 60 mg/ml, noch bevorzugter 70 mg/ml und bei einer Temperatur von um 37°C über eine verlängerte Zeitspanne, z. B. eine Zeit von bis zu 1 Tag, noch bevorzugter 1 Woche, noch bevorzugter 2 Wochen, noch bevorzugter 3 Wochen, besonders bevorzugt 4 Wochen vom Zeitpunkt der Verabreichung des Arzneimittels zu dem bedürftigen Patienten an;
    • – Bevorzugte Ausführungsformen von NFDs sind stabil (im Hinblick auf die dimere Natur) unter verschiedenen Lagerkonzentrationsbedingungen, d. h. einer Konzentration von NFDs oberhalb von 0,1 mg NFD/ml Lösungsmittel, z. B. in einem pH 7-Puffer, wie einer phosphatgepufferten Lösung, noch bevorzugter über 1 mg NFD/ml Lösungsmittel, noch bevorzugter über 5 mg NFD/ml Lösungsmittel, noch bevorzugter über 10 mg NFD/ml Lösungsmittel und besonders bevorzugt über 20 mg NFD/ml Lösungsmittel; in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind NFDs in den obigen Konzentrationen bei –20°C bis zu 6 Monate und mehr, z. B. 1 Jahr, noch bevorzugter 2 Jahre, noch bevorzugter 3 Jahre und besonders bevorzugt 4 Jahre stabil; in einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform sind NFDs in den obigen Konzentrationen bei 4°C bis zu 6 Monate und mehr, z. B. 1 Jahr, noch bevorzugter 2 Jahre, noch bevorzugter 3 Jahre und besonders bevorzugt bis zu 4 Jahre stabil; in einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform sind NFDs in den obigen Konzentrationen bei 25°C bis zu 6 Monate und mehr, z. B. 1 Jahr, noch bevorzugter 2 Jahre, noch bevorzugter 3 Jahre und besonders bevorzugt bis zu 4 Jahre stabil;
    • – Bevorzugte Ausführungsformen von NFDs sind stabil (im Hinblick auf die dimere Natur) in Mischungen (z. B. pharmazeutischen Formulierungen oder Prozessintermediaten) mit organischen Lösungsmitteln, z. B. Alkoholen, wie Ethanol, Isopropylalkohol, Hexanol und/oder anderen, wobei Alkohol (vorzugsweise Ethanol) bis zu 5%, noch bevorzugter 10%, noch bevorzugter 15%, noch bevorzugter 20%, besonders bevorzugt 30% für eine verlängerte Zeitspanne bei einer bestimmten Temperatur, z. B. über lange Lagerdauern, wie beispielsweise bei –20°C bis zu 6 Monaten und mehr, z. B. 1 Jahr, noch bevorzugter 2 Jahre, noch bevorzugter 3 Jahre und besonders bevorzugt bis zu 4 Jahre zugefügt werden kann; in einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind NFDs in den obigen Mischungen bei 4°C bis zu 6 Monate und mehr, z. B. 1 Jahr, noch bevorzugter 2 Jahre, noch bevorzugter 3 Jahre und besonders bevorzugt bis zu 4 Jahre stabil; in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind NFDs in den obigen Mischungen bei 25°C bis zu 6 Monate und mehr, z. B. 1 Jahr, noch bevorzugter 2 Jahre, noch bevorzugter 3 Jahre und besonders bevorzugt bis zu 4 Jahre stabil, wobei organische Lösungsmittel, wie beispielsweise Alkohol (vorzugsweise Ethanol) bis zu 5%, noch bevorzugter 10%, noch bevorzugter 15%, noch bevorzugter 20% und besonders bevorzugt 30% zugefügt werden können;
    • – Bevorzugte Ausführungsformen von NFDs sind stabil (im Hinblick auf die dimere Natur) in Mischungen (z. B. pharmazeutischen Formulierungen oder Prozessintermediaten) mit Detergenzien, z. B. nichtionischen Detergenzien, wie beispielsweise Triton-X, bis zu 0,01%, noch bevorzugter 0,1%, besonders bevorzugt 1% für eine verlängerte Zeitspanne bei einer bestimmten Temperatur, z. B. über längere Lagerdauern, wie beispielsweise –20°C bis zu 6 Monate und mehr, z. B. 1 Jahr, noch bevorzugter 2 Jahre, noch bevorzugter 3 Jahre und besonders bevorzugt bis zu 4 Jahre; in einer weiter bevorzugten Ausführungsform sind die NFDs in den obigen Mischungen bei 4°C bis zu 6 Monate und mehr, z. B. 1 Jahr, noch bevorzugter 2 Jahre, noch bevorzugter 3 Jahre und besonders bevorzugt bis zu 4 Jahre stabil; in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die NFDs in den obigen Mischungen bei 25°C bis zu 6 Monate und mehr, z. B. 1 Jahr, noch bevorzugter 2 Jahre, noch bevorzugter 3 Jahre und besonders bevorzugt bis zu 4 Jahre stabil.
  • In einer anderen Ausführungsform der gegenwärtigen Erfindung erhalten sich die NFDs die Bindungsaffinität von mindestens einer der beiden Komponenten im Vergleich zu den Monomeren, z. B. kann diese Affinität oder die der NFDs nicht weniger als 10%, noch bevorzugter nicht weniger als 50%, noch bevorzugter nicht weniger als 60%, noch bevorzugter nicht weniger als 70%, noch bevorzugter nicht weniger als 80% und noch bevorzugter nicht weniger als 90% der Bindungsaffinität des ursprünglichen monomeren Polypeptids ausmachen oder es gibt multiple, funktionale Bindungskomponenten mit einer im Vergleich zum Monomer verbesserten anscheinenden Affinität, z. B. können sie eine 2-fache, 3-fache, 4-fache, 5-fache, 6-fache, 7-fache, 8-fache, 9-fache oder 10-fache, noch bevorzugter 50-fache, noch bevorzugter 100-fache, noch bevorzugter 1.000-fache verbesserte Affinität im Vergleich zum ursprünglichen monomeren Polypeptid aufweisen.
  • Eine andere Ausführungsform der gegenwärtigen Erfindung ist diejenige, dass die NFDs die Bindungsaffinität von mindestens einer der beiden Komponenten im Vergleich zu den Monomeren teilweise oder vollständig verlieren, z. B. kann die Affinität oder die der NFDs nicht weniger als 90%, noch bevorzugter nicht weniger als 80%, noch bevorzugter nicht weniger als 70%, noch bevorzugter nicht weniger als 60%, noch bevorzugter nicht weniger als 50%, noch bevorzugter nicht weniger als 30%, noch bevorzugter nicht weniger als 20%, noch bevorzugter nicht weniger als 10% oder noch bevorzugter nicht weniger als 1% der Bindungsaffinität betragen und besonders bevorzugt ist gar keine Bindungsaffinität mehr nachweisbar; oder es gibt multiple funktionale Bindungskomponenten, bei denen die anscheinende Affinität im Vergleich zum Monomer verringert ist, z. B. eine um das 2-fache, 3-fache, 4-fache, 5-fache, 6-fache, 7-fache, 8-fache, 9-fache oder 10-fache, noch bevorzugter 50-fache, noch bevorzugter 100-fache noch bevorzugter 1.000-fache verringerte Affinität im Vergleich zu dem ursprünglichen monomeren Polypeptid.
  • Weiterhin ist eine Ausführungsform der gegenwärtigen Erfindung eine Präparation, umfassend NFDs und ihre monomeren Baublöcke, z. B. Präparationen, umfassend mehr als 30% NFDs (z. B. die 2 identischen monomeren Baublöcke, die das NFD bilden), z. B. noch bevorzugter Präparationen, umfassend mehr als 35% NFDs, noch bevorzugter Präparationen, umfassend mehr als 40% NFDs, noch bevorzugter Präparationen, umfassend mehr als 50% NFDs, noch bevorzugter Präparationen, umfassend mehr als 60% NFDs, noch bevorzugter Präparationen, umfassend mehr als 70% NFDs, noch bevorzugter Präparationen, umfassend mehr als 80% NFDs, noch bevorzugter Präparationen, umfassend mehr als 90% NFDs, noch bevorzugter Präparationen, umfassend mehr als 95% NFDs und/oder besonders bevorzugt Präparationen, umfassend mehr als 99% NFDs (wobei 100% die Gesamtmenge von NFDs und den korrespondierenden monomeren Einheiten bedeutet). Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform können die Verhältnisse in einer Präparation, wie hier für NFDs beschrieben, bestimmt werden.
  • Weiterhin ist eine Ausführungsform der gegenwärtigen Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend NFDs, noch bevorzugter umfassend mehr als 30% NFDs (z. B. die 2 identischen monomeren Baublöcke bilden das NFD), z. B. noch bevorzugter eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mehr als 35% NFDs, noch bevorzugter eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mehr als 40% NFDs, noch bevorzugter eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mehr als 50% NFDs, noch bevorzugter eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mehr als 60% NFDs, noch bevorzugter eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mehr als 70% NFDs, noch bevorzugter eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mehr als 80% NFDs, noch bevorzugter eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mehr als 90% NFDs, noch bevorzugter eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mehr als 95% NFDs und/oder besonders bevorzugt eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend mehr als 99% NFDs (worin 100% die Gesamtmenge NFDs und der korrespondierenden monomeren Einheit bedeuten).
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Mischung, umfassend Polypeptide in monomerer und dimerer Form, d. h. die NFDs, bei denen die Präparation für 1 Monat bei 4°C in einem neutralen pH-Puffer in einer 1 mM, noch bevorzugter 0,1 mM, noch bevorzugter 0,01 mM, noch bevorzugter 0,001 mM oder besonders bevorzugt 100 mM Gesamtkonzentration (= Konzentration der monomeren und dimeren Form) stabil ist und wobei die Präparation mehr als 25%, noch bevorzugter 30%, noch bevorzugter 40%, noch bevorzugter 50%, noch bevorzugter 60%, noch bevorzugter 70%, noch bevorzugter 80% oder besonders bevorzugt 90% Dimer, d. h. NFD, umfasst.
  • Während die hier beschriebene Verfahrensweise im Wesentlichen auf die Dimerbildung oder Multimerbildung von entweder Fab-Fragmenten, Fv-Fragmenten, scFv-Fragmenten oder einzelnen variablen Domänen anwendbar ist oder sein kann, sind es die letzteren, für die ihre Verwendung besonders vorteilhaft ist. In diesem Fall können dimere Fragmente, d. h. die NFDs, konstruiert werden, die stabil, gut definiert und die die Anwendbarkeit der einzelnen variablen Domänen jenseits des gegenwärtigen Horizonts ausdehnen. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform sind die NFDs aus natürlich abgeleiteten VHHs erhältlich, z. B. von Lamas oder Kamelen, gemäß den hier beschriebenen Verfahren oder aus den humanisierten Versionen davon, insbesondere humanisierten Versionen, die bestimmte Schlüsselreste enthalten, z. B. diejenigen, die die früheren Grenzflächenreste der leichten Kette bildeten, wie z. B. auch beschrieben in der WO 2006/122825 oder hier in 1, die nicht verändert werden und so bleiben, wie sie von den natürlich erhaltenen einzelnen variablen Domänen abgeleitet wurden. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die NFDs aus Polypeptiden erhältlich, umfassend mindestens einen Einzel-Domänen-Antikörper (oder Nanobody) mit ähnlichen CDR3- und FR4-Aminosäureresten (SEQ ID NO: 9) wie Polypeptid B, z. B. NFDs, die von Polypeptiden erhältlich sind, umfassend mindestens einen Nanobody mit einer CDR3- und FR4-Region, die 80%, bevorzugter 90%, noch bevorzugter 95%, 96%, 97%, 98%, 99% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 9 aufweist.
  • Früher bedeutete die Erhöhung der Anzahl von Bindungsstellen, basierend auf einzelnen variablen Domänen die Herstellung kovalent gebundener Domänen auf dem genetischen Niveau oder über andere wechselwirkende Domänen (z. B. durch Fusion an Fc, Jun-Fos, CH2/CH3 konstante Domäne der schweren Ketten Interaktion, VL-VH-Antikörper Domänen-Interaktionen usw.), während es nun möglich ist, solche Einheiten später auf dem Proteinnivau alternativ zu bilden. Diese nicht-fusionierten Dimere verbinden drei Hauptmerkmale miteinander: (a) Die Möglichkeit, ein oder mehr einzelne variable Domänen mit ein oder mehr Spezifitäten (z. B. gegen ein Zielmolekül und gegen Serumprotein mit langer Halbwertszeit) zu NFDs durch biochemische Verfahren (gegenüber genetischen Verfahren) zu kombinieren, (b) eine kontrollierte dimere Wechselwirkung, die eine Antigenbindung erhält oder deletiert (gegenüber einer ”unkontrollierten” Aggregation) und (c) eine ausreichende Stabilität, für beispielsweise eine Langzeitlagerung (aus praktischen und ökonomischen Gründen) und für eine Anwendung in vivo, d. h. für eine Anwendung über verlängerte Zeitspannen bei z. B. 37°C (eine wichtige Anforderung für die kommerzielle Verwendung dieser NFDs).
  • Es ist so eine weitere Aufgabe der Erfindung, neue individuelle und stabile NFDs mit bi- oder sogar multifunktionalen Bindungsstellen zu erzeugen. Es wurde festgestellt, dass Antikörperfragment-Fusionsproteine, die einzelne variable Domänen enthielten, durch biochemische Verfahren erzeugt werden konnten, die beispielsweise die hier beschriebenen spezifizierten und verbesserten Eigenschaften aufwiesen. Beispielsweise ist eine besondere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ein NFD oder NFDs, umfassend ein erstes Polypeptid, umfassend (eine) einzelne variable Domäne(n), z. B. einen Nanobody oder Nanobodies, gegen ein Zielmolekül und ein zweites Polypeptid, umfassend (eine) einzelne variable Domäne(n), z. B. einen Nanobody oder Nanobodies, gegen ein Serumprotein, z. B. menschliches Serumalbumin (siehe z. B. Polypeptid C und E (die jeweils ein Rezeptorziel und menschliches Serumalbumin binden) im experimentellen Teil, siehe auch 2a + b). Andere Beispiele für die Verwendung einer Bispezifität können bei Kufer et al., Trends in Immunology 22: 238 (2004) gefunden werden. In dem Fall, in dem zwei unterschiedliche Antigen bindende einzelne variable Domänen verwendet werden, kann das Verfahren zur Herstellung der NFDs leicht verändert werden, um die Bildung von Heterodimeren gegenüber Homodimeren zu unterstützen oder es kann alternativ ein Verfahren zum Trennen dieser Formen folgen.
  • Es ist weiterhin eine Aufgabe der Erfindung, daher in einem ersten Schritt ein monomeres Polypeptid bereitzustellen (oder zu selektieren), das im Wesentlichen aus einer einzelnen variablen Domäne besteht, wobei das Polypeptid zur Dimerbildung mit sich selbst durch eine prozessinduzierte Assoziation (PIA) oder andere hier beschriebene alternative Verfahren in der Lage ist.
  • Genauer gesagt beschreiben wir in dieser Erfindung NFDs, die beispielsweise durch ein Verfahren erhältlich sind, das einen Schritt eines Screenings hinsichtlich Präparationen umfasst, umfassend Antikörperfragmente oder Polypeptide, umfassend (eine) einzelne variable Domäne(n), die Dimere bildet, durch die Verfahren, wie hier beschrieben. Daher kann das Screeningverfahren, umfassend das Identifizieren der Polypeptide, ein erster Schritt bei der Erzeugung von NFDs sein. Hier beschriebene multiple ”PIA”-Verfahren können verwendet werden, um eine Dimerbildung in einer Ausgangspräparation zu erzwingen, umfassend den monomeren Baublock. An diesem Punkt kann es eine Anzeige geben, dass Dimere unter geeigneten Bedingungen gebildet werden könnten, z. B. die hier beschriebene prozessinduzierte Assoziation (PIA). Eine Anzeige ist zu diesem Zeitpunkt ausreichend und kann einfach bedeuten, dass eine geringe Menge von z. B. Protein A gereinigter Fraktion in der Größenausschlusschromatographie als angenommenes Dimer im Standardreinigungsprotokoll eluiert. Sobald die Dimerbildung nahegelegt und später bestätigt wurde (z. B. durch analytische SEC, dynamische Lichtstreuung und/oder analytische Ultrazentrifugation) kann eine weitere Verbesserung zur Begünstigung der Dimerisierung (z. B. durch höhere Säulenbeladung, Bedingungen, die eine teilweise Auffaltung begünstigen, Bedingungen, die hydrophobe Wechselwirkungen begünstigen, hohe Temperaturen, wie beispielsweise eine Aussetzung gegenüber 37°C für einige Zeit, z. B. Wochen, wie beispielsweise 4 Wochen, eine Einführung CDR3 destabilisierender Aminosäurereste usw.) oder um die Dimerisierung zu minimieren (entgegengesetzte Strategie) begonnen werden (um beispielsweise den Ertrag zu erhöhen).
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Selektion eines monomeren Polypeptids, das mindestens eine einzelne variable Domäne, vorzugsweise mindestens einen Nanobody umfasst, der dazu in der Lage ist, eine NFD gemäß der Erfindung und wie hier definiert zu bilden, dadurch gekennzeichnet, dass das NFD stabil ist und vorzugsweise eine ähnliche oder bessere anscheinende Affinität gegenüber dem Zielmolekül als das monomere Polypeptid aufweist, was zeigt, dass die Bindungsstelle aktiv oder zumindest teilweise aktiv ist. Diese Affinität sollte nicht weniger als 10%, noch bevorzugter 50%, noch bevorzugter nicht weniger als 60%, noch bevorzugter nicht weniger als 70%, noch bevorzugter nicht weniger als 80% und sogar noch bevorzugter nicht weniger als 90% der Bindungsaffinität des ursprünglichen monomeren Polypeptids betragen, z. B. kann sie eine 2-fach, 3-fach, 4-fach, 5-fach, 6-fach, 7-fach, 8-fach, 9-fach oder 10-fach, noch bevorzugter 50-fach, noch bevorzugter 100-fach, noch bevorzugter 1.000-fach verbesserte anscheinende Affinität im Vergleich zum ursprünglichen monomeren Polypeptid aufweisen. Diese Affinität kann durch auf dem Gebiet bekannte Merkmale ausgedrückt werden, beispielsweise durch Dissoziationskonstanten, d. h. Kd, Affinitätskonstanten, d. h. KA-, koff- und/oder kon-Werte – diese und andere können die Bindungsstärke eines NFDs an sein Zielmolekül in geeigneter Weise beschreiben.
  • Weiterhin betrifft die Erfindung außerdem ein Verfahren zur Selektion eines monomeren Polypeptids, das mindestens eine einzelne variable Domäne umfasst, vorzugsweise mindestens einen Nanobody, der dazu in der Lage ist, ein NFD gemäß der Erfindung und wie hier definiert zu bilden, dadurch gekennzeichnet, dass das NFD stabil ist und vorzugsweise keine anscheinende Affinität für das Zielmolekül, z. B. menschliches Serumalbumin, aufweist.
  • Diese Selektion kann den Schritt der Konzentration der Präparation umfassen, umfassend das monomere Ausgangsmaterial, d. h. das Polypeptid, umfassend oder im Wesentlichen bestehend aus mindestens einer einzelnen variablen Domäne, auf eine hohe Konzentration, z. B. eine Konzentration von mehr als 5 mg/ml Harz, durch Verfahren, die dem Fachmann in dem Gebiet bekannt sind, z. B. durch Beladung des Polypeptids auf eine Säule, z. B. eine Protein A-Säule, bis zur fast Überbeladung der Säulenkapazität (z. B. bis zu 2 bis 5 mg Polypeptid pro ml Harz Protein A) und dann optional durch Elution des Polypeptids mit einer ”steilen” pH-Veränderung (”steil” bedeutet z. B. eine bestimmte pH-Verlagerung oder Veränderung (z. B. einer Abnahme oder Zunahme von 10-, noch bevorzugter 100- oder noch bevorzugter 1.000-mal der H+-Konzentration) in einem Schritt (d. h. eine sofortige Pufferveränderung) oder innerhalb von einem, zwei oder drei, noch bevorzugter einem oder eine sofortige Pufferveränderung) Säulenvolumen (Säulenvolumina). Weiterhin kann die ”steile” pH-Verlagerung mit einer gewählten pH-Veränderung kombiniert werden, d. h. der pH kann oberhalb oder unterhalb des pI des Polypeptids beginnen und dann zu einem pH, unterhalb oder oberhalb des pI des Polypeptids verändert werden. Alternativ ist die Konzentration der Polypeptide, die zur NFD-Bildung führt, durch andere Mittel erhältlich, wie z. B. immobilisierte Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) oder eine Ultrafiltration. Vorzugsweise werden Bedingungen verwendet, bei denen die Polypeptide der Erfindung sich vermutlich auffalten (Extreme im Hinblick auf pH und hohe Temperatur) und/oder Kombinationen von Bedingungen, die eine hydrophobe Wechselwirkung begünstigen, wie beispielsweise pH-Veränderungen um den pI des Polypeptids herum und eine niedrige Salzkonzentration. Weiterhin können die Bedingungen, die verwendet werden, um diese Dimere auseinanderzutreiben auch verwendet werden, um die Bestimmung weiterer Verfahren zur Erzeugung dieser Dimere zu untersuchen, d. h. eine Kombination dieser Verfahren (z. B. 15 Minuten Aussetzung gegenüber einer Temperatur von ungefähr 70°C für Polypeptid A mit einer hohen Polypeptidkonzentration und darauffolgendes Abkühlen).
  • Beispiele für Verfahren zum Erhalt von NFDs werden weiter in nicht begrenzender Weise im experimentellen Teil dieser Erfindung beschrieben.
  • Eine andere Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren zum Erhalt eines NFDs, gekennzeichnet dadurch, dass die für das vollständige monomere Polypeptid codierenden Gene, umfassend mindestens eine einzelne variable Domäne (z. B. eine, zwei, drei oder vier einzelne variable Domäne(n)) oder funktionale Teile der einzelnen variablen Domäne(n) (z. B. wie durch das hier beschriebene Screeningverfahren erhalten) in mindestens ein Expressionsplasmid kloniert werden, eine Wirtszelle mit dem Expressionsplasmid (den Plasmiden) transformiert wird und in einer Nährlösung kultiviert wird und das monomere Polypeptid in der Zelle oder in das Medium exprimiert wird und in dem Fall, dass nur Teile der Fusionsproteine kloniert wurden, zusätzliche Proteinmanipulationsschritte gemäß Standardverfahren durchgeführt werden.
  • Weiterhin ist eine andere Aufgabe der Erfindung ein Verfahren zur Assoziation von zwei monomeren identischen Polypeptiden, umfassend mindestens eine einzelne variable Domäne (z. B. eine, zwei, drei oder vier einzelne variable Domäne(n)) oder funktionelle Teile der einzelnen variablen Domäne(n) zur Bildung eines NFDs, wobei das Verfahren einen Schritt der Erzeugung einer Umgebung umfasst, in der hydrophobe Wechselwirkungen und/oder eine teilweise Neufaltung der Polypeptide begünstigt werden, z. B. durch Hochkonzentrieren einer Präparation, umfassend die monomeren Polypeptide, Aussalzen, Zugabe von Detergenzien oder organischen Lösungsmitteln, Neutralisieren der Gesamtladung des Polypeptids (d. h. pH der Polypeptidlösung um den pI des Polypeptids oder der Polypeptide) und/oder eine hohe Temperatur nahe der Schmelztemperatur des Polypeptids oder der einzelnen variablen Domäne, die für eine Dimerbildung empfänglich ist, z. B. eine Temperatur um 37°C oder höher, z. B. 40°C, 45°C oder 50°C oder höher über eine längere Zeitspanne, z. B. Wochen, wie beispielsweise 1, 2, 3, 4 oder mehr Wochen, vorzugsweise 4 Wochen während des Dimerbildungsverfahrens, was so eine enge Wechselwirkung zwischen den Polypeptiden ermöglicht. Interessanterweise und sehr überraschend müssen diese Bedingungen nicht aufrechterhalten werden, um die NFDs zu stabilisieren, sobald das Dimer gebildet wurde, d. h. die NFDs in Lösung sind über einen breiten Bereich biologisch relevanter Bedingungen, so wie hier erwähnt, überraschend stabil.
  • Die NFDs gemäß der Erfindung können eine hohe Avidität gegen korrespondierende Antigene und eine zufriedenstellende Stabilität aufweisen. Diese neuen NFD-Strukturen können z. B. einfach während des Reinigungsverfahrens aus der Mischung von Polypeptiden und anderen Proteinen und/oder Peptiden hergestellt werden, die durch genetisch modifizierte prokaryontische oder eukaryontische Wirtszellen, wie beispielsweise E. coli und Pichia pastoris, erhalten wurden.
  • Weiterhin können die monomeren Baublöcke, die NFDs bilden können, präselektiert werden, bevor ein Prozess zur Selektion oder dem Screening, wie oben hier im Weiteren beschrieben wird, durchgeführt wird, indem primäre Aminosäuresequenzen und Kristallstrukturinformationen, falls diese zur Verfügung stehen, mit in die Betrachtung einbezogen werden. Weiterhin kann es zum Verständnis der potenziellen Wechselwirkungen bei diesen nicht-fusionierten Proteindomänen ratsam sein, unterschiedliche Röntgen- oder NMR-Strukturen nicht-fusionierter einzelner variablen Domänen, d. h. NFDs, zu analysieren. Dies stellt dann beispielhaft dar, wie möglicherweise in Lösung Wechselwirkungen bei NFDs auftreten können, jedoch ist dies keinesfalls eine vollständige Erklärung für den wahrscheinlichen Wechselwirkungsbereich zwischen den NFD-Komponenten.
  • Zudem kann eine weitere Stabilisierung des Dimers günstig sein und kann durch geeignete Linker bewirkt werden, die die Enden der Polypeptide verbinden und/oder Cysteine an den Wechselwirkungsstellen verbinden. Beispielsweise kann eine kovalente Anbindung der beiden Domänen durch Einführung von 2 Cysteinen in jedem der zwei Baublöcke an räumlich gegenüberliegenden Positionen möglich sein, wodurch eine Bildung einer Disulfidbrücke an der neuen Wechselwirkungsstelle oder im N- oder C-terminalen Bereich der NFD erzwungen wird, wie beispielsweise bei Diabodies durchgeführt (Holliger & Hudson, Nat Biotech 2004, 23(9): 1126. Weiterhin kann es vorteilhaft sein, ein flexibles Peptid zwischen den Enden der beiden monomeren Baublöcke einzuführen. Beispielsweise kann der obere Hingebereich von Maus-IgG3 verwendet werden. Eine Vielzahl von Hinges oder anderen Linkern kann jedoch verwendet werden. Dies ist für die Dimerbildung per se nicht nötig, stellt jedoch ein Ineinandergreifen der beiden Baublöcke bereit. Die natürlich auftretenden Hinges von Antikörpern sind vernünftige Ausführungsformen für Hinges. In einem solchen Fall müssen die Polypeptide der Erfindung zunächst unter reduzierenden Bedingungen existieren, damit die NFDs während der Reinigung gebildet werden können, woraufhin eine Oxidation zu den Cysteinpaarungen führen kann, was die NFDs in einem fixierten Zustand einschließt. Im Falle von NFDs können die Hinges oder Linker kürzer sein als in konventionellen kovalent gebundenen einzelnen variablen Domänen enthaltenen Polypeptiden. Dies soll erreichen, dass die erwartete enge Wechselwirkung der monomeren Baublöcke nicht gestört wird und die Flexibilität des Dimers ist nicht notwendig. Die Wahl des Hinges wird durch die gewünschte Sequenzrestlänge bestimmt (Argos, 1990, J. Mol. Biol. 211, 943–958), durch die Kompatibilität mit der Faltung und die Stabilität der Dimere (Richardson & Richardson, 1988, Science 240, 1648–1652), die Sekretion und die Resistenz gegen Proteasen und kann, falls nötig, experimentell bestimmt oder optimiert werden.
  • Außerdem kann eine weitere Stabilisierung der Monomere günstig sein (d. h. eine Vermeidung einer Dimerbildung oder in bestimmten Fällen möglicher Multimerbildungen) und kann durchgeführt werden, indem geeignete Linker gewählt werden, die die Enden der Polypeptide und/oder Cysteine an oder nahe bei der CDR3- und/oder FR4-Region verbinden, die einzelne variable Domänen an einer Dimerbindung hindern. Beispielsweise kann eine kovalente Stabilisierung von CDR3 und/oder FR4 möglich sein, indem 2 Cysteine nahe bei oder/und innerhalb der CDR3- und/oder FR4-Region an räumlich gegenüberliegenden Positionen eingeführt werden, um eine Bildung einer Disulfidbrücke zu erzwingen, wie beispielsweise mit Cystatin durchgeführt, das gegen einen dreidimensionalen Domänenaustausch durch manipulierte Disulfidbindungen stabilisiert wurde (Wahlbom el al., J. of Biological Chemistry Band 282, Nr. 25, Seiten 18318-18326, 22. Juni 2007). Weiterhin kann es vorteilhaft sein, ein flexibles Peptid einzuführen, das dann manipuliert wird, um ein Cystein aufzuweisen, das dann eine Disulfidbrücke mit beispielsweise einem Cystein vor der CDR3-Region bildet. In einem solchen Fall müssen die Polypeptide der Erfindung zunächst unter reduzierenden Bedingungen vorliegen, damit sich die Monomere bilden können, woraufhin eine Oxidation zu den Cysteinpaarungen führen kann, was die Monomere in einem fixierten, stabilisierten Zustand einschließt.
  • Außerdem kann eine weitere Stabilisierung der Monomere günstig sein (d. h. eine Vermeidung einer Dimerbildung oder in bestimmten Fällen mögliche Multimerbildungen) und kann durchgeführt werden, indem ein destabilisierender Aminosäurerest oder Reste (z. B. identifiziert durch Screening von Mutanten, z. B. durch Affinitätsreifungsverfahren – siehe beispielsweise WO 2009/004065 ) durch einen stabilisierenden Aminosäurerest oder Reste in der Nachbarschaft der CDR3 und/oder FR4 ersetzt werden.
  • Gemäß einem anderen Aspekt der Erfindung kann eine weitere Stabilisierung der Monomere (d. h. eine Vermeidung einer Dimerbildung oder in bestimmten Fällen möglicher Multimerbildungen) durch geeignete Formulierung erreicht werden. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Unterdrückung der Dimerbildung und Multimerbildung von (menschlichem Serum) Albumin-bindenden Nanobodies (z. B. Polypeptid B) und anderer Polypeptide, umfassend Nanobodies bereit, indem Mannit oder andere Polyole einer flüssigen Formulierung zugefügt werden. Mannit wird allgemein zum Erhalt der Stabilität und Isotonizität flüssiger Proteinformulierungen verwendet. Es ist auch ein übliches massebildendes Mittel für eine Lyophilisierung der Formulierung. Überraschend wurde in der vorliegenden Erfindung entdeckt, dass Mannit spezifisch die Bildung von Dimeren inhibieren kann, die während der Lagerung (bei erhöhter Temperatur) etlicher Albumin-bindenden Nanobodies beobachtet wurde. Im Ergebnis erhöhen mannithaltige Formulierungen die Proteinstabilität und unterstützen die biologische Aktivität, wodurch sie die Lagerfähigkeit des Arzneimittelprodukts verlängern. Die stabilisierende Wirkung von Mannit wird durch Daten gestützt, die höhere Tm (Schmelztemperatur) Werte bei Proteinformulierungen mit ansteigenden Mannitkonzentrationen demonstrieren.
  • Diese Erfindung umfasst auch die Verwendung anderer Polyole, nicht-reduzierender Zucker, NaCl oder Aminosäuren.
  • Die durch beispielsweise den Serumalbumin-bindenden Nanobody ”Polypeptid B” der Erfindung (SEQ ID NO: 2) gebildeten Dimere erwiesen sich als völlig inaktiv bei einer Bindung an HSA (Biacore-Analyse), was nahelegte, dass die Albumin-Bindungsstelle an der Dimergrenzfläche durch eine Dimerbildung blockiert ist. Die Zugabe von Mannit zu der flüssigen Formulierung, wie von der Erfindung vorgeschlagen, wird daher nicht nur das Dimer-Bildungsverfahren unterdrücken, sondern in entscheidender Weise auch die HSA-bindende Aktivität des Nanobodies erhalten und die Inaktivierung verlangsamen. Allgemein verlängern die mannithaltigen Formulierungen gemäß der Erfindung die Lagerfähigkeit des formulierten Protein/Arzneimittelprodukts. Es wird angenommen, dass die Erfindung auf jeden Albumin-bindenden Nanobody anwendbar ist und auf alle Nanobodies anwendbar sein kann, die allgemein eine Tendenz zur Bildung von Dimeren aufweisen. So sind die Mannitformulierungen der Erfindung für die Formulierung von jedem Nanobody, als Prozessintermediat, Arzneimittelsubstanz oder Arzneimittelprodukt indiziert. Diese Erfindung kann über einen breiten Bereich von flüssigen Formulierungen verwendet werden, die aus jedem Puffer, einer biologisch effektiven Proteinmenge, einer Mannitkonzentration, die nicht höher liegt als ungefähr 0,6 M und anderen Exzipienzien bestehen kann, einschließlich Polyolen, nicht-reduzierenden Zuckern, NaCl oder Aminosäuren. Die flüssigen Formulierungen können direkt zur späteren Verwendung gelagert werden oder können in getrockneter Form, z. B. durch Lyophilisierung, hergestellt werden. Mannit kann in jeder Formulierung verwendet werden, um die Bildung von hochmolekularen Spezies, wie den beobachteten Dimeren, während der Lagerung, dem Einfrieren, dem Auftauen und der Rekonstituierung nach der Lyophilisierung zu inhibieren.
  • Ein besonderer Vorteil der in dieser Erfindung beschriebenen NFDs ist die Fähigkeit, sich funktionell oder teilweise funktionell während beispielsweise des Herstellungsverfahrens (z. B. dem Reinigungsschritt usw.) in kontrollierbarer Weise anzuordnen. Ein Dimerisierungsprinzip wird verwendet, das die Bildung von Homodimeren ermöglicht. Die hier beschriebenen Beispiele beinhalten NFDs-Mo, NFDs-Di und NFDs-Tri. In diesen Fällen werden die monomeren Baublöcke in einem bakteriellen System exprimiert und dann in hoher Konzentration an eine trennchromatographische Vorrichtung, z. B. Protein A oder IMAC, gebunden und schnell eluiert, um die gewünschten dimeren Komplexe, d. h. die NFDs, in substanziellem Ertrag zu erhalten. Unter diesen Bedingungen bilden sich die homodimeren Proteine selbst und können direkt in dimerer Form durch den Trennschritt isoliert und/oder weiter durch Größenausschlusschromatographie isoliert werden.
  • Kurze Beschreibung der Figuren:
  • 1: Schlüsselreste in einzelnen variablen Domänen.
  • 2a + b: Illustration verschiedener nicht-fusionierter Dimere (d. h. NFDs) und Vergleich mit den konventionell genetisch fusionierten Molekülen. Einzelne variable Domänen in jedem Konstrukt oder NFD können unterschiedlich (2a + b) oder identisch (2a) sein. Die gestrichelte Linie ist eine schematische Wechselwirkung zwischen den 2 VH-Domänen, die dem NFD ihre Stabilität verleihen (hier als Oberflächenwechselwirkungen angezeigt, jedoch können dies auch andere Wechselwirkungen sein, wie in der Erfindung hier beschrieben).
  • 3: Protein A Affinitätsreinigung des Polypeptids A (SEQ ID NO: 1) unter Bedingungen, die zu signifikanten Mengen von NFDs führen.
  • Das Protein wurde auf eine kleine Säule (400 μl Harz MabSelectXtra, GE Healthcare) geladen und durch Injektion von Glycin [100 mM, pH = 2,5] eluiert. Der pH der eluierten Nanobody®-Lösung wurde direkt unter Verwendung von 1 M Tris, pH 8,8 neutralisiert.
  • 4: Größenausschlusschromatographie von Protein A affinitätsgereinigtem Polypeptid A. Die Abtrennung von konzentriertem Polypeptid A (Fraktion 6, siehe 3) auf einer analytischen Superdex 75-Säule (GE Healthcare). Die Nanobodyfraktion wird in zwei spezifische Fraktionen, korrespondierend zum Molekulargewicht des monomeren und dimeren Polypeptids A (Position der Molekulargewichtmarker ist angegeben) aufgelöst.
  • Die Analyse durch SDS-PAGE (rechtes Panel) ergab keinen Unterschied zwischen den beiden, was anzeigte, dass sie sich unter nativen Bedingungen als Monomer und Dimer verhalten. Das letztere wird in Monomerkonformation bei Denaturierung umgewandelt (SDS Detergenz und Wärmebehandlung).
  • 5: Protein A Affinitätsreinigung von Polypeptid A bei niedriger Säulenbeladung. Eine begrenzte Menge Protein [ungefähr 2,5 mg/ml Harz] wurde auf eine kleine Säule (400 μl Harz MabSelectXtra, GE Healthcare) geladen und durch Injektion von Glycin [100 mM, pH = 2,5] eluiert. Der pH der eluierten Nanobody®-Lösung wurde direkt unter Verwendung von 1 M Tris, pH 8,8, neutralisiert.
  • 6: Größenausschlusschromatographie von Protein A affinitätsgereinigtem Polypeptid A. Auftrennung von konzentriertem Polypeptid A (Fraktion 7, siehe 5) auf einer analytischen Superdex 75 Säule (GE Healthcare). Die Nanobodyfraktion wird in spezifische Fraktionen, korrespondierend zum Molekulargewicht des monomeren Polypeptids, aufgelöst.
  • 7: Protein A-Elution des Polypeptids A. Der vorbehandelte periplasmatische Extrakt wurde auf eine Protein A MabSelectXtra-Säule geladen, gefolgt von einem Waschen mit PBS, bis eine stabile Basislinie erreicht wurde. Die Elution wurde durch eine pH-Verlagerung unter Verwendung von 100 mM Glycin, pH = 2,5 (gepunktete Linie) durchgeführt.
  • 8: Größenausschlusschromatographie des Polypeptid A Monomers und Dimers. Der Vorpeak (Fraktion 2) enthält das dimere Polypeptid A, das in den Stabilitätsstudien verwendet wurde.
  • 9: Größenausschlusschromatographie von wärmebehandelten Proben von dimerem Polypeptid A. Polypeptid A NFD (bei 0,68 mg/ml) wurde in etlichen Experimenten verwendet: 20 μl Dimerfraktionen wurden mit 90 μl D-PBS verdünnt und bei unterschiedlichen Temperaturen inkubiert und 100 μl wurden auf einer Superdex 75TM 10/300GL-Säule, äquilibriert in D-PBS, analysiert.
  • 10: Größenausschlusschromatographie von pH-behandelten Proben von Polypeptid A NFD. Polypeptid ANFD (bei 0,68 mg/ml) wurde in etlichen Experimenten verwendet: 20 μl Dimerproben wurden mit [100 mM Piperazin pH = 10,2] oder 90 μl [100 mM Glycin, pH = 2,5] verdünnt und über Nacht (ON) bei 4°C inkubiert. Die Kontrolle wurde in D-PBS inkubiert. Die Proben wurden durch SEC am nächsten Tag analysiert. Die Inkubation bei erhöhtem pH hatte keine Wirkung auf die Dissoziation, während ein niedriger pH (Glycin pH = 2,5) zu ungefähr 15% Monomer führte. Eine drastischere Inkubation bei 1% TFA für 15 min bei Raumtemperatur führte zu fast 100% Monomer.
  • 11: Größenausschlusschromatographie von kombinierten Wärme/organisches Lösungsmittel behandelten Proben von Polypeptid A NFD. Polypeptid A NFD (bei 0,68 mg/ml) wurde in etlichen Experimenten verwendet: 20 μl Dimerfraktionen wurden mit [10% Isopropanol] oder 90 μl [30% Isopropanol] verdünnt und über Nacht (ON) bei 4°C oder 15 Minuten bei 20°C inkubiert. Kombinierte Behandlungen (Wärme und Isopropanol) wurden für 15 Minuten durchgeführt. Die Kontrolle wurde in D-PBS inkubiert. Die Proben wurden über SEC analysiert. Die Inkubation bei erhöhter Temperatur mit einem organischen Lösungsmittel führte zu einer beschleunigten Dissoziation ins Monomer.
  • 12: Größenausschlusschromatographie der Ligand-NFD-Komplexbildung: 20 μl Proben von Ligand A (SEQ ID NO: 6) wurden in 90 μl [HBS-EP (Biacore) + 0,5 M NaCl] verdünnt und etliche Stunden bei RT inkubiert (Ligandenmischung). Dann wurden NFD oder Polypeptid A zugefügt und nach kurzer Inkubation (typischerweise 30 min) wurde das Material über SEC aufgelöst. Polypeptid A [3,91 mg/ml]: 17 μl [1/10 verdünnt in HBS-EP] wurden der Ligandenmischung zugefügt und 100 μl wurden injiziert.
  • 13: Das Molekulargewicht (MW) von Polypeptid A, Ligand A, Polypeptid A + Ligand A, NFD-Di von Polypeptid A und NFD-Di von Polypeptid A + Ligand A wurde berechnet (siehe Tabelle 2 für die Ergebnisse dieser Figur), basierend auf einer Kurvenanpassung des Molekulargewichtsstandards (Biorad #151-1901), die man auf derselben Säule unter denselben Bedingungen laufen ließ.
  • 14: Monomer A, wie im Dimer vorliegend (Spitze) und ein isoliertes Monomer des Polypeptids B (unten).
  • 15: Polypeptid B-Dimer (ein Beispiel für eine NFD-Mo). Framework 4 von Monomer A ist durch Framework 4 von Monomer B ersetzt und umgekehrt.
  • 16: Elektronendichte von Monomer B in schwarz. Monomer A ist in grauem Band dargestellt.
  • 17: Polypeptid B (oben) und Polypeptid F mit Pro an Position 45 (unten).
  • 18: Größenausschlusschromatographie von einem Material, das aus der Protein A-Affinitätssäule auf der Superdex 75 XK 26/60 Säule eluierte.
  • 19: Fluoreszenzemission Sypro orange in Gegenwart von Polypeptid B und Polypeptid B-Dimer (A1b11 = Polypeptid B).
  • 20: Entfaltung des Polypeptids B (= Alb11) Monomer und Polypeptid B-Dimer (= Alb11-Dimer) als Funktion der Guanidinkonzentration. Die Entfaltung wurde durch innere Fluoreszenzmessungen überwacht und dabei wurde CSM als Entfaltungsparameter verwendet.
  • 21: Die Reinheit wurde auf einem Coomassie-gefärbten Gel analysiert (Panel A: Polypeptid G; Panel B: Polypeptid H).
  • 22: Bindung des Polypeptids F, G und H auf HSA.
  • Experimenteller Teil:
  • Beispiel 1: Erzeugung von NFDs
  • Die Fermentation von Polypeptid A (SEQ ID NO: 1) erzeugendem E. coli-Klon.
  • Die Fermentation von Polypeptid A (SEQ ID NO: 1) Klon 1 (identifiziert, wie offenbart in WO 2006/122825 ) wurde im 10 Liter-Umfang in Terrific Broth (Biostat Bplus, Sartorius) mit 100 μg/ml Carbenicillin durchgeführt. Ein 2%iges Inokulum der Vorkultur (über Nacht in TB, 2% Glucose, 100 μg/ml Carbenicillin gezüchtet) wurde verwendet, um die Produktionskultur zu starten (22°C/1 vvm). Die Induktion (unter Verwendung von 1 mm IPTG) wurde bei einer OD600 von 8,0 begonnen. Nach kurzer Induktion bei 22°C wurde die Zellpaste durch Zentrifugation gesammelt (Sigma 8K, Rotor 12510; 7.000 Upm für 30 min) und bei –20°C eingefroren.
  • Reinigung des Polypeptids A.
  • Gereinigtes Polypeptid A (Monomer und Dimer) wurde über ein Verfahren erzeugt, das aus 6 Schritten bestand:
  • 1. Extraktion aus dem Zellpellet
  • Das gefrorene Zellpellet wurde aufgetaut, die Zellen wurden in kaltem PBS unter Verwendung eines Ultra Turrax (Ika Works; S25N-25G Sonde, 11.000 Upm) resuspendiert und 1 Stunde bei 4°C bewegt. Dieser erste periplasmatische Extrakt wurde durch Zentrifugation gesammelt; eine zweite Extraktion wurde auf ähnliche Weise an dem erhaltenen Zellpellet durchgeführt. Beide Extraktionen ergaben mehr als 90% des periplasmatischen Polypeptid A-Gehalts (die 2. Extraktion ergab ungefähr 25%).
  • 2. Entfernung von wesentlichen Kontaminationen durch Ansäuerung
  • Der periplasmatische Extrakt wurde auf einen pH von 3,5 unter Verwendung von 1 M Zitronensäure (VWR (Merck) #1.00244.0500), 10 mM molar, End-pH = 3,5 angesäuert und im Weiteren wurde der pH mit 1 M HCl eingestellt. Die Lösung wurde über Nacht bei 4°C bewegt. Die ausgefällten Proteine und Zellabfall wurden durch Zentrifugation abpelletiert.
  • 3. Mikrofiltration und Konzentration des Extrakts
  • Der Überstand wurde unter Verwendung eines Sartocon Slice Crossflow system (17521-101, Sartorius), ausgerüstet mit einer Hydrosart 0,20 μm Membran (305186070 10-SG, Sartorius) von Partikeln befreit und weiter für die Kationenaustauschchromatographie (CEX) durch Ultrafiltration vorbereitet. Das Volumen, das auf die CEX aufgebracht werden musste, wurde auf ungefähr 2 Liter durch Ultrafiltration abgesenkt, wobei ein Sartocon Slice Crossflow System, ausgerüstet mit Hydrosart 10.000 MWCO Membranen (305144390 1E-SG, Sartorius) verwendet wurde. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Leitfähigkeit (< 5 mS/cm) und der pH (= 3.5) überprüft.
  • 4. Einfang und Reinigung über CEX
  • Der geklärte und angesäuerte Überstand wurde auf eine Source 30S-Säule (17-1273-01, GE Healthcare), äquilibriert in Puffer A (10 mM Zitronensäure pH = 3,5), aufgebracht und die gebundenen Proteine wurden mit einem 10CV linearen Gradienten auf 100%B (1M NaCl in PBS) eluiert. Die Polypeptid A-Fraktion wurde gesammelt und bei 4°C gelagert.
  • 5. Affinitätsreinigung auf der Protein A-Säule
  • Polypeptid A (Menge = gut unterhalb der Säulenkapazität) wurde weiter durch Protein A Affinitätschromatographie (MabSelect XtraTM, 17-5269-07, GE Healthcare) gereinigt. Eine Einstufen-Flution wurde unter Verwendung von 100 mM Glycin, pH 2,5, durchgeführt. Die gesammelte Probe wurde direkt unter Verwendung von 1 M Tris, pH 7,5 neutralisiert (siehe 7).
  • 6. Größenausschlusschromatographie (optional z. B. um NFDs zu isolieren und/oder um die Menge von NFDs zu bestimmen)
  • Die gereinigten Nanobody®-Fraktion wurde weiter abgetrennt und auf D-PBS (Gibco #14190-169) über SEC unter Verwendung einer HiloadTM XK26/60 Superdex 75 Säule (17-1070-01, GE Healthcare), äquilibriert in D-PBS, übertragen. Fraktion 2 enthielt das dimere Polypeptid A (siehe 8).
  • In einem weiteren Experiment wurde Polypeptid A (SEQ ID NO: 1) auf einer Protein A-Säule akkumuliert, wobei die Konzentration gut oberhalb von 5 mg Polypeptid A/ml Harz lag und über eine starke pH-Verlagerung eluiert (einstufige Pufferveränderung auf 100 mM Glycin, pH 2,5). Während der Elution des Polypeptids A aus der Säule wurde dies in eine Elutionsfront ”gestapelt”, bestehend aus ”lokal” sehr hohen Konzentrationen (tatsächlicher Wert nach der Elution > 5 mg/ml) und die Kombination mit der pH-Verlagerung führte zu einer Isolation von ungefähr 50% stabilem Dimer (siehe 3).
  • Die Verlagerung von Monomer zu Dimer wird durch Größenausschlusschromatographie (SEC) demonstriert, was eine Bestimmung des Prozentsatzes der Dimerbildung ermöglicht (siehe 4). Wenn weniger Polypeptid A auf Protein A geladen wird (d. h. 2 mg/ml Harz unter ansonsten denselben Bedingungen wie oben, d. h. einstufige Elution mit 100 mN Glycin, pH 2,5) wurden fast keine Dimere (< 5%) während der SEC nachgewiesen (siehe 5 und 6). Auf ähnliche Weise wurden NFDs eines Polypeptids, umfassend eine einzelne variable Domäne (NFD-Mo), ein Polypeptid, umfassend drei einzelne variable Domänen (NFD-Tri) und ein Polypeptid, umfassend HSA (menschliches Serumalbumin) und eine einzelne variable Domänenfusion erhalten (siehe Tabelle 1). Tabelle 1: Beispiele für die erhaltenen NFDs
    Code für monomeres Polypeptid SEQ ID NO des monomeren Baublocks Erhalten durch Isolierter stabiler NFD-Typ Monomeres Polypeptid umfassen
    Polypeptid A 1 Protein A + SEC NFD-Di Zwei identische einzelne variable Domänen
    Polypeptid B, auch bezeichnet als Alb11 2 IMAC + AEX + SEC; Protein A + SEC NFD-Mo Eine einzelne variable Domäne, bindend an menschliches Serumalbumin
    Polypeptid C 3 Protein A + SEC NFD-tri Drei einzelne variable Domänen, von denen eine an ein menschliches Serumalbumin und die zwei anderen einzelnen variablen Domänen an ein Rezeptorziel binden
    Polypeptid D 4 Protein A + SEC NFD-Mo Einzelne variable Domäne und HSA
    Polypeptid E 5 Protein A + SEC NFD-Di Zwei einzelne variable Domänen, von denen die eine an menschliches Serumalbumin und die andere einzelne variable Domäne an ein Rezeptorziel bindet
    Polypeptid F, auch bezeichnet als Alb11 6 Protein A + SEC NFD-Mo Eine einzelne variable Domäne, die an menschliches Serumalbumin bindet
  • Beispiel 2: Stabilität der NFDs
  • Während der Reinigung von Polypeptid A wurden stabile, nicht-fusionierte Dimere (NFDs) erzeugt (siehe oben). Um einen deutlicheren Einblick in die Stabilität und Natur dieser nicht-kovalenten Wechselwirkung zu gewinnen, wurden die stabilen Polypeptid A NFDs typischen Bedingungen unterworfen, die darauf abzielten, das Dimer in die Monomere zu dissoziieren. Die Stabilität des Komplexes wurde durch 3 Kriterien bewertet: Hitzestabilität, pH-Stabilität, Resistenz gegenüber organischen Lösungsmitteln und Kombinationen davon.
  • Experimenteller Aufbau
  • Das Polypeptid A NFD wurde während einer Polypeptid A-Präparation (siehe oben) erzeugt und wurde 2,5 Jahre bei –20°C gelagert. Dieses dimere Material wurde über eine Protein A-Chromatographie und Größenausschlusschromatographie (SEC) in PBS erhalten. In der letzteren wurden monomere und dimere Materialien zu einer Präparation eines > 95% reinen Dimers getrennt. Nach Auftauen wurden ungefähr 5% monomeres Material nachgewiesen (siehe Pfeil in 9). Die Konzentration des dimeren Materials betrug 0,68 mg/ml.
  • Analytische Größenausschlusschromatographie
  • Die Stabilität des Polypeptid A NFD Dimers wurde über analytische SEC auf eine Superdex 75 10/300GL-Säule (17-5174-01, GE Healthcare) unter Verwendung einer Äkta Purifier 10 workstation (GE Healthcare) analysiert. Die Säule wurde in D-PBS bei Raumtemperatur (20°C) äquilibriert. Es wurde eine Flussrate von 1 ml/min verwendet. Die Proteine wurden über ihre Absorption bei 214 nm nachgewiesen. 12 μg Proben von Polypeptid A NFD wurden injiziert.
  • Überblick analytischer SEC-Läufe:
    • 20 μl POLYPEPTID A NFD + 90 μl D-PBS → 15'/50°C → 100 μl analysiert
    • 20 μl POLYPEPTID A NFD + 90 μl D-PBS → 15'/20°C → 100 μl analysiert
    • 20 μl POLYPEPTID A NFD + 90 μl D-PBS → 30'/45°C → 100 μl analysiert
    • 20 μl POLYPEPTID A NFD + 90 μl D-PBS → 15'/60°C → 100 μl analysiert
    • 20 μl POLYPEPTID A NFD + 90 μl D-PBS → 15'/70°C → 100 μl analysiert
    • 20 μl POLYPEPTID A NFD + 90 μl 100 mM Piperazin pH = 10,2] → ON/4°C → 100 μl analysiert
    • 20 μl POLYPEPTID A NFD + 90 μl [100 mM Glycin pH = 2,5] → ON/4°C→100 μl analysiert
    • 20 μl POLYPEPTID A NFD + 90 μl [10% Isopropanol]→ON/4°C → 100 μl analysiert
    • 20 μl POLYPEPTID A NFD + 90 μl [30% Isopropanol]→ON/4°C → 100 μl analysiert
    • 20 μl POLYPEPTID A NFD + 90 μl [1% TFA]→15'/20°C → 100 μl analysiert
    • 20 μl POLYPEPTID A NFD + 90 μl [30% Isopropanol]→15'/50°C → 100 μl analysiert
    • 20 μl POLYPEPTID A NFD + 90 μl [30% Isopropanol]→15'/20°C → 100 μl analysiert
    • 20 μl POLYPEPTID A NFD + 90 μl [30% Isopropanol]→15'/40°C → 100 μl analysiert
    • 20 μl POLYPEPTID A NFD + 90 μl [30% Isopropanol]→15'/45°C → 100 μl analysiert.
  • Dieses Material wurde in etlichen Experimenten verwendet: 20 μl Dimerfraktionen wurden mit 90 μl D-PBS oder anderen Lösungsmitteln verdünnt, unter unterschiedlichen Bedingungen inkubiert und 100 μl Proben wurden über analytische SEC analysiert.
  • Tests:
  • In einer ersten Reihe von Experimenten wurde eine Inkubation bei ansteigenden Temperaturen für 15 min durchgeführt (45, 50, 60 und 70°C), gefolgt von einer analytischen SEC (Superdex 75TM 10/300GL). Eine Inkubation bei 70°C für 15 min führte zu einer fast vollständigen Verlagerung hin zu monomerem Polypeptid A, während niedrigere Temperaturen (z. B. 50°C) keine solch drastische Wirkung hatten. Nach 15 min bei 60°C wurde ungefähr 25% dissoziiertes Material nachgewiesen (siehe 9).
  • In einem zweiten Satz von Experimenten wurde die Wirkung des pHs auf die Stabilität eines Polypeptid A NFDs untersucht. 20 μl NFD wurden mit 90 μl [100 mM Piperazin pH = 10,2] oder 90 μl [100 mM Glycin, pH = 2,5] vermischt und über Nacht (ON) bei 4°C inkubiert. 20 μl NFD wurden mit 90 μl [1% TFA] 15 min bei Raumtemperatur vermischt und dann direkt über SEC analysiert. Die Kontrolle wurde in D-PBS inkubiert. Die Proben wurden über SEC am nächsten Tag analysiert (siehe 10).
  • Ein dritter Satz Experimente bestand aus einer kombinierten Behandlung: Temperatur und organisches Lösungsmittel (Isopropanol). Weder die Inkubation in 10 oder 30% Isopropanol über Nacht bei 4°C, noch die Inkubation in 10 oder 30% Isopropanol für 15 min bei Raumtemperatur führte zu irgendeiner signifikanten Dissoziation. Die Kombination erhöhter Temperaturen und organischer Lösungsmittel führte jedoch zu einer sehr viel schnelleren Dissoziation zum Monomer. Während die Inkubation bei 45°C oder 30% Isopropanol allein keine Wirkung hatte, führte eine Kombination der beiden (für 15 min) zu einer fast vollständigen Dissoziation zum Monomer. Eine Isopropanolbehandlung bei 40°C ergab nur 30% Dissoziation (siehe 11).
  • Diskussion
  • Der konzentrationsunabhängige Charakter des Dimer-/Monomer-Gleichgewichts wurde weiter durch die nahezu Irreversibilität der Wechselwirkung unter physiologischen Bedingungen untermauert. Zusätzlich weisen die recht drastischen Maßnahmen, die verwendet werden müssen, um das Dimer (teilweise) zum Monomer zu dissoziieren, auf eine innewohnende starke Wechselwirkung hin. Eine Dissoziation wird nur durch drastische Veränderung der Bedingungen (z. B. einem pH von weniger als 2,0) erreicht oder indem man das Molekül Hochenergiebedingungen aussetzt. Temperaturstabilitätsstudien (Daten nicht dargestellt) zeigten an, dass der Tm von Polypeptid A NFD 73°C beträgt, so dass die beobachtete Dissoziation in das Monomer tatsächlich mit einer (teilweisen) Entfaltung verbunden sein könnte.
  • Die solubilisierenden Eigenschaften von TFA in Kombination mit einer Protonierung bei extrem niedrigen pH, was die Hydrophilie erhöht, führt auch zur Dissoziation.
  • Die Kombination von erhöhter Temperatur und Dissoziation im organischen Lösungsmittel zeigt an, dass die Wechselwirkung im Wesentlichen auf beispielsweise Hydrophobizität (z. B. Van der Waals-Kräfte), Wasserstoffbrückenbindungen und/oder ionischen Wechselwirkungen beruht.
  • Die verwendeten Bedingungen, um diese Dimere auseinander zu treiben, können auch nützlich sein bei der Untersuchung weiterer Verfahren zur Erzeugung dieser Dimere, d. h. eine Kombination dieser Verfahren (z. B. Temperatur von mehr als 75°C) mit einer hohen Polypeptidkonzentration.
  • Beispiel 3: Ligandenbindung von NFDs
  • Studie des Liganden A (SEQ ID NO: 6), der ein Polypeptid A bindet und Polypeptid A NFD-Di über analytischen Größenausschluß
  • Ligand A Produktion:
  • Von dem Ligand A ist bekannt, dass er die Bindungsdomäne von Polypeptid A ist, d. h. das Epitop von Polypeptid A umfasst (d. h. Ligand A repräsentiert die A1-Domäne von vWF).
  • Ligand A [1,46 mg/ml] wurde mittels Pichia in Rüttelkolben erzeugt. Biomasse wurde in BGCM-Medium erzeugt. Für die Induktion wurde ein Standardmediumwechsel zu methanolhaltigem Medium (BMCM) durchgeführt. Das sezernierte Protein wurde durch IMAC aus dem Medium gefangen, weiter auf einer Heparin-Affinitätssäule gereinigt und schließlich in 350 mM NaCl in 50 mM Hepes über Größenausschlusschromatographie (SEC) (Superdex 75 HiLoad 26/60) formuliert.
  • Analytische SEC auf Superdex 200 10/300GL (Fig. 12):
  • Polypeptid A (mit 2 erwarteten Bindungsstellen) und das korrespondierende NFD (mit 4 erwarteten Bindungsstellen) wurden wie in Beispiel 1 offenbart, erhalten und zu einem 5-fachen Überschuss von Ligand A (SEQ ID NO: 1) zugefügt. Die resultierende Verlagerung des Molekulargewichts wurde durch Größenausschlusschromatographie (SEC) überprüft. Die Verlagerung in der Retention zeigt ungefähr die Zahl von Ligand A-Molekülen an, die an Polypeptid A binden oder an das korrespondierende NFD. Ligand A hat ein Molekulargewicht von ungefähr 20 kDa. Die Molekulargewichtsverlagerung des NFD/Ligand A-Komplexes im Vergleich zu NFD allein oder Polypeptid/Ligand A-Komplex zu Polypeptid A zeigt die Anzahl von Ligand A pro NFD oder pro Polypeptid A, gebunden, an (siehe Tabelle 2).
  • Überblick über die analytischen SEC-Durchläufe auf Superdex 75 10/300GL
    • (B7)040308.1: Komplexligand-NFD 5 μl Mischung (ON gelagert bei 4°C) + 80 μl A-Puffer
    • (B7)040308.2: 20 μl Molekulargewichtsmarker + 80 μl A
    • (B7)040308.3: Komplex 20 μl Ligand + 90 μlA, 4h bei RT + Polypeptid A [17 μl 1/10], 30 min bei RT vor der Analyse
    • (B7)040308.4: Polypeptid A [17 μl in 90 μl A]
    • (B7)040308.5: Ligand in A-Puffer (lh bei RT) + Polypeptid A, 15 min bei RT vor der Analyse
    • (B7)040308.6: Ligand + Puffer A + NFD
    • (B7)040308.7: Restprobe #6 nach 1h bei RT
    • (B7)040308.8: Puffer A + NFD
  • Tabelle 2: *MW wurde basierend auf der Kurvenanpassung der Molekulargewichtsstandards berechnet (Biorad #151-1901), die auf derselben Säule unter denselben Bedingungen liefen (siehe Fig. 13).
    Material Retention (ml) Gemessenes MW (KDa)* Theoretisches MW (Da) Gemessene MW-Verlagerung mit Ligand AAussetzung Geschätzte Zahl von gebundenem Ligand A
    NFD + Ligand A 13,2 123,6 153940 (unter der Annahme von 4 Ligand A-Bindungen) 62,5 3
    Polypeptid A + Ligand A 14,1 79,1 76970 (unter der Annahme von 2 Ligand A-Bindungen) 54,1 2
    NFD 14,7 61,1 (55752) Nicht anwendbar Nicht anwendbar
    Polypeptid A 16,6 25,0 (27876) Nicht anwendbar Nicht anwendbar
    Ligand A 16,8 22,8 (24547) Nicht anwendbar Nicht anwendbar
  • Korrelation des erwarteten MW zeigt, dass mehr als 2 Liganden (vermutlich 3 und möglicherweise 4 aufgrund des atypischen Verhaltens der Ligand A-Komplexe auf der SEC) durch die NFD gebunden sind.
  • Beispiel 4: Weitere Charakterisierung eines NFD mit Polypeptid B
  • Beispiel 4.1: Kristallstruktur eines nicht-fusionierten Dimers: Polypeptid B
  • Kristallisierung
  • Das Protein wurde zunächst auf eine Konzentration von ungefähr 30 mg/ml konzentriert. Das gereinigte Protein wurde in Kristallisationsversuchen unter ungefähr 1.200 unterschiedlichen Bedingungen verwendet. Die anfänglich erhaltenen Bedingungen wurden unter Verwendung von Standardstrategien optimiert, wobei systematisch Parameter variiert wurden, die die Kristallisation kritisch beeinflussen, wie die Temperatur, die Proteinkonzentration, das Tropfverhältnis und andere. Diese Bedingungen wurden auch durch systematische Variation des pHs oder von Ausfällkonzentrationen verfeinert.
  • Datensammlung und Prozessierung
  • Die Kristalle wurden blitzeingefroren und bei einer Temperatur von 100 K gemessen. Die Röntgenbeugungsdaten wurden von den Kristallen an der SWISS LIGHT SOURCE (SLS, Villingen, Schweiz) unter Verwendung kryogener Bedingungen gesammelt.
  • Die Kristalle gehören zur Raumgruppe P 2l mit 2 Molekülen in der asymmetrischen Einheit. Die Daten wurden unter Verwendung des Programms XDS und XSCALE prozessiert. Die Datensammelstatistiken sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
    Röntgenquelle PX-3 (SLS1)
    Wellenlänge (Å) 0,97800
    Detektor MARCCD
    Temperatur (K) 100
    Raumgruppe P2l
    Zelldimensionen: a; b; c (Å) α; β; γ (°) 37,00; 67,06; 41,14 90,0; 97,7; 90,0
    Auflösung (Å)2 1,20 (1,30–1,26)
    Einzigartige Reflexionen2 60.716 (4.632)
    Multiplizität2 4,1 (4,1)
    Vollständigkeit (%)2 97,7 (96,7)
    Rsym (%)2,3 7,2 (41,4)
    Rmeas (%)2,4 8,3 (47, 6)
    I/σ2 - (-)
    Mittel(I)/sigma2,5 12,83 (4,01)
    Tabelle 3: Statistik der Datensammlung und Prozessierung
    • 1SWISS LIGHT SOURCE (SLS, Villingen, Schweiz)
    • 2Zahlen in Klammern korrespondieren zu der Auflösung bei Rsym = 41,4%
      Figure 00790001
      Figure 00790002
      wobei Ih ,i der Intensitätswert der ith Messung von h ist
      Figure 00800001
      wobei Ih,i der Intensitätswert der ith Messung von h ist
    • 5Berechnet aus unabhängigen Reflexionen.
  • Strukturmodellierung und Verfeinerung
  • Die notwendige Phaseninformation zur Bestimmung und Analyse der Struktur wurde durch Molekularersatz erhalten.
  • Der darauffolgende Modellbau und die Verfeinerung wurden gemäß Standardprotokollen mit den Softwarepaketen CCP4 und COOT durchgeführt. Für die Berechnung des R-Faktors, einem Maß zur Kreuzvalidierung der Richtigkeit des Endmodells, wurden 1,6 der gemessenen Reflexionen aus dem Verfeinerungsverfahren ausgeschlossen (Tabelle 4).
  • Die Liganden-Parameterbildung wurde mit dem Programm CHEMSKETCH durchgeführt. LIBCHECK (CCP4) wurde für die Erzeugung der korrespondierenden Bibliotheksordner verwendet.
  • Die Statistik der Endstruktur und das Verfeinerungsverfahren sind in Tabelle 4 aufgeführt.
    Auflösung (Å) 20,0–1,20
    Zahl der Reflexionen (arbeitend/Test) 59743/972
    Rcryst (%) 14,8
    Rfrei (%) 16,9
    Gesamtzahl von Atomen im Protein 1759
    Abweichung von der idealen Geometrie2 Bindungslängen (Å) Bindungswinkel (°) 0,006 1,17
    Tabelle 4: Verfeinerungsstatistik1
    • 1 Werte, wie definiert in REFMAC5, ohne Sigma cut-off
    • 2 Mittlere geometrische Wurzelabweichungen von geometrischen Zielwerten
  • Gesamtstruktur
  • Die asymmetrische Einheit der Kristalle besteht aus 2 Monomeren. Der Nanobody ist durch Elektronendichtekarten gut aufgelöst.
  • Struktur
  • Die 2 Polypeptid B-Monomere, die das Polypeptid B Dimer bilden (NFD-Mo) haben richtig gefaltete CDR1 und CDR2 und Framework 1–3. Die Framework 4 Reste (die Reste 103–113 gemäß dem Kabat-Nummerierungsschema) sind zwischen den beiden Monomeren ausgetauscht. Dies ergibt eine nicht gefaltete CDR3 beider Monomere, die im Dimer vorliegen (siehe 14). Die Dimerbildung wird durch Austausch eines β-Strangs von Q105 zu Ser113 zwischen beiden Monomeren vermittelt (siehe 15). Der Strangaustausch wird vollständig durch Elektronendichte definiert (siehe 16).
  • Die Reste von Framework 1–3 und CDR1 & CDR2 des Monomers, die das Dimer bilden, weisen eine klassische VHH-Faltung auf und sind fast perfekt überlagerbar auf eine korrekt gefaltete Polypeptid B VHH-Domäne (Grundgerüst rmsd < 0,6 Å). Eine verminderte Stabilisierung von CDR3 im Polypeptid B im Vergleich zu den Strukturen der VHHs mit ähnlichen Sequenzen zu Polypeptid B kann einer der Gründe für die Framework 4 Austauschdimerisierung sein. Eine leicht modifizierte Form von Polypeptid B mit einem Prolin an Position 45 zeigt eine Wasserstoffbrückenbindung zwischen Y91 und der Hauptkette von L98. Diese Wasserstoffbrückenbindung hat eine stabilisierende Wirkung auf die CDR3-Konformation.
  • Aufgrund des Leucins an Position 45 im Polypeptid B kann das Tyrosin 91 nicht länger die Wasserstoffbrückenbindung mit der Hauptkette von Leucin-98 bilden. Dies führt zu einer verminderten Stabilisierung der CDR3-Konformation im Polypeptid B (17).
  • Beispiel 4.2: Stabilität und verschiedene andere Studien des NFDs mit Polypeptid B
  • Produktion und Isolation von Polypeptid B
  • Ein Polypeptid B ohne Tag wurde in E. coli TOP10-Stamm bei 28°C nach einer Induktion über Nacht mit 1 mM IPTG überexprimiert. Nach der Ernte wurden die Kulturen bei 4.500 Upm 30 min zentrifugiert und die Zellpellets wurden bei –20°C eingefroren. Danach wurden die Pellets aufgetaut und in 50 mM Phosphatpuffer, enthaltend 300 mM NaCl, resuspendiert und 2 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Suspension wurde 60 min bei 4.500 Upm zentrifugiert, um den Zellabfall vom Extrakt abzutrennen. Der überstand, der Polypeptid B enthielt, wurde darauffolgend auf eine Poros MabCapture A-Säule in einem Akta-chromatographischen System geladen. Nach ausgiebigem Waschen der Affinitätssäule mit D-PBS wurde gebundenes Polypeptid B-Protein mit 100 mM Glycinpuffer, pH 2,7, eluiert. Die aus der Säule mit Säure eluierten Fraktionen wurden direkt durch Zugabe von 1,5 M IRIS, pH 8,5 Puffer neutralisiert. Auf dieser Stufe ist das Protein bereits sehr rein, da nur eine einzelne Bande des erwarteten Molekulargewichts auf Coomassie-gefärbten SDS-PAGE-Gelen beobachtet wird. Die Fraktionen, die Polypeptid B enthielten, wurden gesammelt und darauffolgend durch Ultrafiltration auf einer gerührten Zelle mit einer Polyethersulfonmembran mit einem Cut-Off von 5 kDa (Millipore) konzentriert. Die konzentrierte Proteinlösung wurde darauffolgend auf eine Superdex 75 XK 26/60-Säule geladen. Im Chromatogramm (siehe Fig. X), lag neben dem Hauptpeak, der zwischen 210 ml und 240 ml eluierte, ein Nebenpeak, der zwischen 180 ml und 195 ml eluierte.
  • Die Analyse auf dem SDS-PAGE ergab, dass beide Hauptpeaks ein einzelnes Polypeptid mit derselben Mobilität enthielten (18). Diese Beobachtung war die erste Anzeige, dass der zwischen 180 ml und 195 ml eluierende Peak eine dimere Art ist, während das zwischen 210 ml und 240 ml eluierende Material Monomer ist. Eine weitere Analyse auf einer Umkehrphasenchromatographie und LC/MS der dimeren und monomeren Art deckte auf, dass beide dasselbe Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ungefähr 12.110 Dalton enthielten. Auf diese Weise wurden insgesamt 30 mg der dimeren Art und 1.200 mg der monomeren Form von Polypeptid B aus einem 10 l-Fermenterdurchlauf isoliert.
  • Antigen-Bindungseigenschaften
  • Die Bindung des Polypeptid B-Monomers und Polypeptid B-Dimers an menschliches Serumalbumin wurde durch Oberflächen-Plasmonresonanz in einem Biacore 3000-Instrument getestet. Bei diesen Experimenten wurde menschliches Serumalbumin auf einem CM5-Chip über Standardamin-Kopplungsverfahren immobilisiert. Die Bindung von sowohl dem monomeren Polypeptid B als auch dem dimeren Polypeptid B bei einer Konzentration von 10 Nanomolar wurden überprüft. Nur für das Monomer wurde eine Bindung beobachtet, während für das dimere Polypeptid B kein Anstieg im Signal beobachtet wurde.
  • Unterschied in den physikochemischen Eigenschaften zwischen dem monomeren und dimeren Polypeptid B.
  • Der Fluoreszenzfarbstoff Sypro orange (5000x Molecular Probes) kann verwendet werden, um die thermische Entfaltung von Proteinen zu überwachen oder die Gegenwart hydrophober Strecken auf Proteinen nachzuweisen. Im Experiment wurde monomeres und dimeres Polypeptid B mit einer Konzentration von 150 μg/ml mit Sypro orange (Endkonzentration 10X) vermischt. Die Lösung wurde darauffolgend in eine Quarzküvette übertragen und die Fluoreszenzspektren wurden auf einem Jasco FP6500-Instrument aufgezeichnet. Die Anregung wurde bei 465 nm durchgeführt, während die Emission bei 475 bis 700 nm überwacht wurde. Wie in 19 dargestellt, wurde nur ein starkes Signal für das dimere Polypeptid B gezeigt, während kein Anstieg der Fluoreszenzemissionsintensität für die monomeren Polypeptid B-Art beobachtet wurde. Diese Beobachtung legt sehr deutlich nahe, dass monomere und dimere Formen von Polypeptid B eine distinkte Konformation aufweisen.
  • AUC-EQ – Sedimentations-Diffusions-Gleichgewicht
  • Material und Methoden
  • Die Experimente wurden mit einer analytischen Ultrazentrifuge XL-I von Beckman-Coulter unter Verwendung der Interferenzoptik des Instruments durchgeführt. Die Daten wurden bei einer Temperatur von 20°C und einer Rotationsgeschwindigkeit von 25.000 Upm und 40.000 Upm genommen. 150 μl wurden in einem Probensektor von 12 mm, Zwei-Sektor-Titan-Zentralstücken, gefüllt. Die Proben wurden mit Standard-PBS verdünnt, das ebenfalls für die optische Referenz verwendet wurde. Das Erreichen von einem anscheinenden chemischen und Sedimentationsgleichgewicht wurde durch Vergleich aufeinanderfolgender Scans verifiziert, bis keine Veränderung der Konzentration über die Zeit beobachtet wurde. Die Daten wurden mit der Modell-unabhängigen M*-Funktion und unter Verwendung verschiedener expliziter Modelle unter Verwendung von NONLIN evaluiert. Standardwerte für ν des Proteins und Dichte des Lösungsmittels wurden verwendet. Wenn geeignet, sind 95% Konfidenzgrenzen in Klammern angegeben.
  • Ergebnis
  • Es erwies sich, dass Polypeptid B eine molekulare Masse von 11,92 kg/mol (11,86–11,97) kg/mol von einer Anpassung unter Annahme einer einzelnen monodispersen Komponente aufwies. Dies stimmt gut mit dem Ergebnis der modellfreien Analyse überein, nämlich 12,25 kg/mol bei 0 Konzentration. Versuche, die Daten zu beschreiben, wobei eine Selbstassoziation, Nichtidealität oder Polydispersität angenommen wurden, verbesserten die globale rmsd der Anpassung nicht.
  • Polypeptid B ist ebenso gut definiert mit einer molaren Masse von 23,06 kg/mol (22,56–23,44) kg/mol, basierend auf einer direkten Anpassung unter Annahme einer einzelnen monodispersen Komponente. Die modellfreie Analyse ergibt eine molare Masse von 22,69 kg/mol. Ein kleiner Beitrag aus thermodynamischer Nichtidealität verbesserte die Anpassung leicht, veränderte jedoch die molare Masse nicht.
  • Es konnten keine Beweise für eine reversible Selbstassoziation gefunden werden.
  • Das Verhältnis von M(Polypeptid B-Dimer)/M(Polypeptid B) beträgt 1,93. Die kleine Abweichung von dem erwarteten Faktor von 2 kann durch ein unterschiedliches ν von dem Polypeptid B-Dimer im Vergleich zum Polypeptid B erklärt werden, leichte Dichteunterschiede für die unterschiedlichen Verdünnungen aufgrund des leicht unterschiedlichen Polypeptids B, leichte Dichteunterschiede für die Verdünnungen aufgrund der etwas unterschiedlichen verwendeten Puffer (PBS für die Verdünnung und D-PBS für die Lagerlösungen) und einem Beitrag von der Nichtidealität, der zu gering ist, um mit den zur Verfügung stehenden Daten verlässlich beschrieben zu werden.
  • Stabilitätsstudie von Polypeptid F und Polypeptid B bei 4°C, 25°C und 37°C
  • Lösungen des monomeren Polypeptids F und Polypeptids B, formuliert in D-PBS, wurden auf 20 mg/ml konzentriert und bei 4°C, 25°C und 37°C gelagert. Nach 3 und 6 Wochen wurden Proben durch Größenausschlusschromatographie auf einer Phenomenex BioSep SEC S-2000-Säule analysiert. In den SEC-Chromatogrammen von beiden Polypeptiden F und B wurde die Gegenwart eines Vorpeaks nur in den Chromatogrammen der Proben beobachtet, die bei 37°C gelagert wurden. Der Vorpeak, korrespondierend zu einem Dimer, wurde bei Proben, die bei 4°C, 25°C oder bei einem Referenzmaterial, gelagert bei –20°C, nicht beobachtet.
  • In Tabelle 5 unten sind die Prozentsätze für Dimer, wie vorhanden in den bei 37°C gelagerten Proben (ausgedrückt als Prozentsatz vom Bereich des Dimers gegenüber Gesamtbereich) für sowohl Polypeptid F als auch Polypeptid B zusammengetragen. Wie dieser Tabelle entnommen werden kann, scheint es, dass Polypeptid B für eine Dimerbildung empfänglicher ist als Polypeptid F. Tabelle 5:
    Nanobody % Dimer - 3 Wochen % Dimer - 6 Wochen
    Polypeptid F 3,1 5,8
    Polypeptid B 20,9 37,1
  • In einem getrennten Experiment wurde die Wirkung von Mannit als Exzipienz in dem Formulierungspuffer evaluiert. In diesem Fall wurde das monomere Polypeptid B mit einer Proteinkonzentration von 18 mg/ml in jeweils D-PBS oder D-PBS, enthaltend 5% Mannit, formuliert. Die Proben wurden bei 37°C gelagert und durch Größenausschlusschromatographie auf einer Phenomenex BioSep SEC S-2000 Säule nach 2, 4, 6 und 8 Wochen analysiert.
  • In Tabelle 6 unten wurde der Prozentsatz von Dimer, das in den bei 37°C gelagerten Proben vorlag (ausgedrückt als Prozentsatz von Bereich Dimer gegenüber Gesamtbereich) für Polypeptid B, gelagert in D-PBS und in D-PBS/5% Mannit, zusammengetragen. Wie in dieser Tabelle dargestellt, hatte die Gegenwart von Mannit im Puffer eine deutliche Wirkung auf die Kinetik der Dimerbildung von Polypeptid B bei 37°C. Tabelle 6:
    % Dimer nach 2 Wochen % Dimer nach 4 Wochen % Dimer nach 6 Wochen % Dimer nach 8 Wochen
    Polypeptid B 13,5 22,1 30,0 41,8
    Polypeptid B mit 5% Mannit 5,3 11,7 16,8 23,7
  • In einem weiteren Experiment wurden Lösungen von sowohl dem monomeren Polypeptid F als auch Polypeptid B bei Konzentrationen von 5 mg/ml, 10 mg/ml und 20 mg/ml in D-PBS bei 37°C gelagert. Nach 6 Wochen wurden die Proben durch Größenausschlusschromatographie auf einer Phenomenex BioSep SEC S-2000-Säule analysiert. In der untenstehenden Tabelle werden die Prozentsätze von Dimer, das in den bei 37°C gelagerten Proben vorlag (ausgedrückt als Prozentsatz vom Bereich des Dimers gegenüber dem Gesamtbereich) für Polypeptid F und Polypeptid B, gelagert mit 5 mg/ml, 10 mg/ml und 20 mg/ml zusammengetragen. Aus diesem Experiment lernten wir, dass, wie früher beobachtet, die Dimerbildung für Polypeptid B schneller fortschreitet als für Polypeptid F, jedoch auch, dass die Kinetik der Dimerbildung stark von der Proteinkonzentration abhängt. Tabelle 7:
    % Dimer (5 mg/ml) % Dimer (10 mg/ml) % Dimmer (20 mg/ml)
    Polypeptid F 1,2 3,1 5,7
    Polypeptid B 13,0 20,6 36,9
  • Auf ähnliche Weise wurde für Polypeptide, umfassend Polypeptid B und andere einzelne variable Domänen, z. B. Polypeptide, umfassend ein Polypeptid N und 2 Nanobodies, die an ein therapeutisches Ziel banden (z. B. 2 identische Nanobodies, die gegen ein therapeutisches Ziel gerichtet waren) eine Dimer- und möglicherweise Multimerbildung beobachtet. Die Dimer-/Multimerbildung der Polypeptide, umfassend beispielsweise Polypeptid B und andere Nanobodies, konnte verlangsamt werden und in einigen Fällen fast vermieden werden, wenn sie in einer mannithaltigen flüssigen Formulierung formuliert wurden. Andere Polyole und/oder Zucker, von denen angenommen wird, dass sie die Bildung von Dimeren (NFDs) und anderer möglicherweise höherer Multimere vorteilhaft reduzieren oder vermeiden können, sind in Tabelle 8 aufgeführt. Eine breite Vielzahl von flüssigen Formulierungen könnte nützlich sein, die aus jedem Puffer, einer biologisch effektiven Menge des Polypeptids der Erfindung, einer Mannitkonzentration, die nicht höher liegt als ungefähr 0,6 M und anderen Exzipienzien, einschließlich Polyolen, nicht-reduzierenden Zuckern, NaCl oder Aminosäuren bestehen könnte. Tabelle 8:
    Polyole Sorbit, Mannit, Xylit, Ribit, Erythritol
    Nicht-reduzierende Zucker Saccharose, Trehalose
  • Chaotrop induzierte Entfaltung von Polypeptid B und Polypeptid B-Dimer
  • Eine chaotrop induzierte Entfaltung ist eine häufig verwendete Technik, um die Stabilität von Proteinen zu beurteilen. Um eine chaotrop induzierte Entfaltung zu überwachen, kann die innewohnende Fluoreszenz von Tryptophan oder Tyrosinresten verwendet werden. Als Entfaltungsparameter kann das ”Zentrum der spektralen Masse” (CSM = Σ (Fluoreszenzintensität × Wellenzahl)/Σ (Fluoreszenzintensität) verwendet werden. Entfaltungsexperimente mit dem Polypeptid B-Monomer und Polypeptid B-Dimer wurden bei 25 μg/ml in Guanidinlösung in einem Konzentrationsbereich von 0 bis 6 M durchgeführt. Nach Inkubation dieser Lösungen über Nacht wurden Fluoreszenzspektren unter Verwendung eines Jasco FP-6500-Instruments aufgezeichnet. Die Anregung geschah bei 295 nm und die Spektren wurden zwischen 310 und 440 nm aufgezeichnet. Unter Verwendung der Spektraldaten wurde der CSM-Wert unter Verwendung der obigen Formel berechnet. In 20 ist CSM als Funktion der Guanidinkonzentration dargestellt. Wie in 20 beobachtet werden kann, entfaltet sich Polypeptid B (= Alb11) Dimer bei höherer Konzentration von Guanidin und ermöglicht es uns daher zu folgern, dass das Monomer weniger stabil ist als das Polypeptid B-Dimer.
  • Beispiel 5: Weitere Charakterisierung eines NFDs mit Polypeptid G und H
  • Unterschiedliche Mutanten des Polypeptids F wurden konstruiert, exprimiert und gereinigt. Die Sequenzinformation ist unten angegeben.
  • Die Reinheit wurde auf einem Coomassie-gefärbten Gel (21) und einem Western-Blot analysiert.
  • Bindung an Serumalbumin in Biacore
  • Die Bindung von Nanobodies an menschliches Serumalbumin (HSA) wird durch eine Oberflächen-Plasmonresonanz in einem Biacore 3000-Instrument gekennzeichnet und eine Gleichgewichtskonstante KD wird bestimmt. Kurz gefasst wurde HSA kovalent an CM5-Sensorchipoberfläche über eine Aminkopplung gebunden, bis ein Anstieg von 500 Reaktionseinheiten erreicht wurde. Die verbleibenden reaktiven Gruppen wurden inaktiviert. Die Nanobodybindung wurde unter Verwendung einer Reihe unterschiedlicher Konzentrationen bewertet. Jede NanobodyTM-Konzentration wurde 4 min mit einer Flussrate von 45 μl/min injiziert, um eine Bindung an chipgebundenes Antigen zu ermöglichen. Als Nächstes wurde ein Bindungspuffer ohne Nanobody über den Chip mit derselben Flussrate hinübergeführt, um eine Dissoziation von gebundenem Nanobody zu ermöglichen. Nach 15 min wurde verbleibender gebundener Analyt durch Injektion der Regenerationslösung (50 mM NaOH) entfernt.
  • Aus den erhaltenen Sensorgrammen (22) für die unterschiedlichen Konzentrationen von jedem Analyten wurden KD-Werte durch kinetische Datenanalyse berechnet. Polypeptid H (mit Einführung von GL anstelle von EP, insbesondere ist P durch L ersetzt, siehe auch 17 und die obigen Beispiele) hat eine größere koff-Rate. Tabelle 9: koff-Werte von Polypeptid F und den humanisierten Derivaten Polypeptid G und Polypeptid H, bestimmt in Biacore zur Bindung an HSA.
    Nanobody Koff (l/s)
    Polypeptid F 6,83 E-4
    Polypeptid G 1,18 E-3
    Polypeptid H 1,97 E-3
  • Stabilität bei Lagerung
  • Die Lösungen der monomeren Polypeptid G und Polypeptid H, formuliert in D-PBS, werden auf 20 mg/ml konzentriert und bei 4°C, 25°C und 37°C gelagert. Nach 3 und 6 Wochen werden die Proben durch Größenausschlusschromatographie auf einer Phenomenex BioSep SEC S-2000-Säule analysiert. Tabelle A: Sequenzprotokoll:
    Figure 00910001
    Figure 00920001
    Figure 00930001
  • Die Bezeichnungen und Ausdrücke, die verwendet wurden, werden als beschreibend und nicht als begrenzend verwendet und es besteht keinerlei Absicht bei der Verwendung solcher Wörter und Ausdrücke, irgendwelche Äquivalente der dargestellten und beschriebenen Merkmale oder Teilen davon auszuschließen, wobei anerkannt wird, dass verschiedene Modifikationen innerhalb des Umfangs der Erfindung möglich sind.
  • Alle hier beschriebenen Referenzen sind durch Inbezugnahme mit eingeschlossen, insbesondere hinsichtlich der Lehre, auf die hier in Bezug genommen wird.
  • Bevorzugte Aspekte:
    • 1. Ein stabiles NFD.
    • 2. Ein stabiles NFD in Lösung.
    • 3. Ein stabiles NFD, erhältlich durch ein Verfahren, umfassend den Schritt der Konzentration eines Polypeptids, umfassend mindestens eine einzelne variable Domäne und/oder durch ein Verfahren, umfassend den Schritt einer Lagerung bei erhöhter Temperatur, z. B. bei einer Temperatur nahe an der Schmelztemperatur oder z. B. bei 37°C über eine verlängerte Zeitspanne, 1 bis 4 Wochen, z. B. 4 Wochen.
    • 4. Ein stabiles NFD, erhältlich durch ein Verfahren, umfassend den Schritt der Konzentration eines Polypeptids, bestehend aus (einer) einzelnen variablen Domäne(n) und Linkern.
    • 5. Ein stabiles NFD gemäß den Aspekten 2 oder 4, wobei der Schritt der Konzentration durch Affinitäts- oder Ionenaustauschchromatographie durchgeführt wird.
    • 6. Ein stabiles NFD gemäß den Aspekten 2 bis 5, wobei der Schritt der Konzentration auf einer Protein A-Säule durchgeführt wird und wobei hohe Mengen Polypeptid auf die Säule geladen werden, z. B. 2 bis 5 mg/ml Harz Protein A.
    • 7. Ein stabiles NFD gemäß den Aspekten 5 oder 6, wobei das Polypeptid durch einen steilen pH-Gradienten eluiert wird, z. B. eine einstufige pH-Veränderung von 2.
    • 8. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei das NFD über eine Zeitspanne von bis zu 2 Jahren bei –20°C stabil ist.
    • 9. Ein stabiles NFD gemäß den obigen Aspekten, wobei das NFD über eine Zeitspanne von bis zu 2 Wochen bei 4°C stabil ist.
    • 10. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei das NFD über' eine Zeitspanne von bis zu 15 min bei 50°C stabil ist.
    • 11. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei das NFD bei saurem pH stabil ist.
    • 12. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei das NFD bei saurem pH über eine verlängerte Zeitspanne stabil ist.
    • 13. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei das NFD bei basischem pH über eine verlängerte Zeitspanne stabil ist.
    • 14. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei das NFD zwischen pH 3 und pH 8 stabil ist.
    • 15. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei das NFD zwischen pH 2,5 und pH 8 stabil ist.
    • 16. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei das NFD zwischen pH 3 und pH 8 für 4 Wochen bei 4°C stabil ist.
    • 17. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei das NFD stabil ist, wenn es mit organischen Lösungsmitteln vermischt wird.
    • 18. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei das NFD stabil ist, wenn es mit Alkohol, z. B. Isopropanol, vermischt wird.
    • 19. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei das NFD stabil ist, wenn es mit 30% v/v eines Alkohols, z. B. Isopropanol, vermischt wird.
    • 20. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei die Dissoziationskonstante für das NFD zum Zielmolekül ungefähr dieselbe ist wie die Dissoziationskonstante für den korrespondierenden monomeren Baublock an das Zielmolekül.
    • 21. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei es keine spezifische Bindung an das Zielmolekül gibt.
    • 22. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei die Dissoziationskonstante für das NFD an das Zielmolekül 30% oder weniger, vorzugsweise 20% oder weniger, noch bevorzugter 10% oder weniger der Dissoziationskonstante für den korrespondierenden monomeren Baublock an das Zielmolekül beträgt.
    • 23. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei die Dissoziationskonstante für das NFD an das Zielmolekül 100 nM oder weniger, vorzugsweise 10 nM oder weniger, noch bevorzugter 1 nM oder weniger beträgt.
    • 24. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei der koff-Wert für das NFD an das Zielmolekül ungefähr derselbe ist wie der koff-Wert des korrespondierenden monomeren Baublocks.
    • 25. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei der koff-Wert für das NFD an das Zielmolekül nicht mehr als 90%, bevorzugt 50%, noch bevorzugter 40%, noch bevorzugter 30%, noch bevorzugter 20%, besonders bevorzugt 10% höher liegt als der koff-Wert des korrespondierenden monomeren Baublocks.
    • 26. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei der koff-Wert für das NFD an das Zielmolekül nicht mehr als 50% höher liegt als der koff-Wert des korrespondierenden monomeren Baublocks.
    • 27. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei der koff-Wert für das NFD an das Zielmolekül nicht mehr als 10% höher liegt als der koff-Wert des korrespondierenden monomeren Baublocks.
    • 28. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei die einzelne variable Domäne ein Nanobody ist, wie eine VHH, eine humanisierte VHH, eine affinitätsgereifte, stabilisierte oder anders veränderte VHH oder ein Konstrukt daraus.
    • 29. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei die einzelne variable Domäne aus der Gruppe SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10, vorzugsweise SEQ ID NO: 2 gewählt ist.
    • 30. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei die einzelne variable Domäne aus der Gruppe SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10, vorzugsweise SEQ ID NO: 2 gewählt ist.
    • 31. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei die einzelne variable Domäne aus der Gruppe SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10, bevorzugt SEQ ID NO: 2 gewählt ist und einer funktionalen Sequenz, die mindestens 70%, bevorzugter 8%, noch bevorzugter 90%, besonders bevorzugt 95% identisch zu irgendeiner der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10, vorzugsweise SEQ ID NO: 2 ist.
    • 32. Ein stabiles NFD gemäß den vorherigen Aspekten, wobei die einzelne variable Domäne aus der Gruppe SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10, bevorzugt SEQ ID NO: 2 gewählt ist und einer funktionalen Sequenz, die mindestens 70%, bevorzugter 80%, noch bevorzugter 90%, besonders bevorzugt 95% identisch zu irgendeiner der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10, vorzugsweise SEQ ID NO: 2 ist und wobei die Sequenzen spezifisch an ihr Zielmolekül (Moleküle) binden, bevorzugter eine Dissoziationskonstante zu mindestens einem der Zielmoleküle, wenn sie bi- oder multispezifisch sind, von 100 nM oder weniger, noch bevorzugter eine Dissoziationskonstante von 10 nM oder weniger, besonders bevorzugt eine Dissoziationskonstante von 1 nM oder weniger aufweisen.
    • 33. Ein funktionales Fragment einer NFD, wie in den Aspekten 1 bis 32 beschrieben.
    • 34. Ein Polypeptid, umfassend mindestens eine einzelne variable Domäne; wobei mindestens eine der einzelnen variablen Domänen ein NFD, wie beispielsweise in den Aspekten 1 bis 32 beschrieben, bilden kann.
    • 35. Eine Präparation, umfassend ein NFD, wie in den Aspekten 1 bis 32 beschrieben, ein funktionales Fragment von Aspekt 33 oder ein Polypeptid von Aspekt 34.
    • 36. Eine Präparation, umfassend ein NFD, wie in den Aspekten 1 bis 32 beschrieben, ein funktionales Fragment gemäß Aspekt 33 oder ein Polypeptid gemäß Aspekt 34, wobei das Verhältnis von NFD und dem korrespondierenden monomeren Baublock ungefähr 1 Teil NFD zu 1 Teil korrespondierender monomerer Baublock bis ungefähr 1 Teil NFD zu 2 Teilen korrespondierendem monomerem Baublock ist.
    • 37. Eine Präparation, umfassend ein NFD, wie in den Aspekten 1 bis 32 beschrieben, ein funktionales Fragment gemäß Aspekt 33 oder ein Polypeptid gemäß Aspekt 34, wobei das Verhältnis von NFD und dem korrespondierenden monomeren Baublock ungefähr 1 Teil NFD zu 1 Teil korrespondierendem monomerem Baublock bis ungefähr 2 Teile NFD zu 1 Teil korrespondierendem monomerem Baublock beträgt.
    • 38. Eine Präparation, umfassend ein NFD, wie in den Ansprüchen 1 bis 32 beschrieben, ein funktionales Fragment gemäß Aspekt 32 oder ein Polypeptid gemäß Aspekt 33, wobei das Verhältnis von NFD und dem korrespondieren monomeren Baublock 25% NFD:75% monomerer Baublock beträgt.
    • 39. Eine Präparation, umfassend ein NFD, wie beschrieben in den Aspekten 1 bis 32, ein funktionales Fragment gemäß Aspekt 33 oder ein Polypeptid gemäß Aspekt 34, wobei das Verhältnis von NFD und korrespondierendem monomerem Baublock 75% NFD:25% monomerer Baublock beträgt.
    • 40. Ein Verfahren zur Herstellung eines NFDs gemäß den Aspekten 1 bis 32, eines funktionalen Fragments gemäß Aspekt 33 oder eines Polypeptids gemäß Aspekt 34, umfassend den Verfahrensschritt, der eine Bedingung aufweist, die hydrophobe Wechselwirkungen begünstigt.
    • 41. Ein Verfahren zur Herstellung eines NFDs gemäß Aspekt 40, wobei der Verfahrensschritt ein Reinigungsschritt ist.
    • 42. Ein Verfahren zur Herstellung eines NFDs gemäß Aspekt 40, wobei innerhalb des Verfahrensschritts die Bedingung so gewählt ist, dass sie eine teilweise Proteinentfaltung unterstützt.
    • 43. Ein Verfahren zur Herstellung eines NFDs gemäß Aspekt 42, wobei der Verfahrensschritt ein Reinigungsschritt ist.
    • 44. Ein Verfahren zur Herstellung eines NFDs, umfassend den Schritt der Hochkonzentration der monomeren Baublöcke des NFDs, z. B. durch Bindung der Polypeptide, umfassend (eine) einzelne variable Domäne(n) auf eine Affinitätschromatographiesäule, z. B. Protein A oder IMAC.
    • 45. Ein Verfahren zur Herstellung eines NFDs, umfassend den Schritt der Bindung von Polypeptiden, umfassend (eine)einzelne variable Domäne(n) auf einer Affinitätschromatographiesäule, z. B. Protein A oder IMAC, und Elution mit einem pH-Schritt, der eine Freisetzung des Polypeptids ermöglicht.
    • 46. Ein Verfahren zur Herstellung eines NFDs, umfassend den Schritt der Bindung von Polypeptiden, umfassend (eine) einzelne variable Domäne(n) auf einer Affinitätschromatographiesäule, z. B. Protein A und Elution mit einem pH-Schritt, der eine Freisetzung des Polypeptids innerhalb eines Säulenvolumens ermöglicht.
    • 47. Ein Verfahren zur Herstellung eines NFDs, umfassend den Schritt der Ultrafiltration.
    • 48. Ein Verfahren gemäß Aspekt 46, wobei die Ultrafiltration unter Niedrigsalzbedingungen durchgeführt wird.
    • 49. Ein Verfahren zur Herstellung eines NFDs gemäß den Aspekten 1 bis 32, umfassend den Verfahrensschritt der Lagerung des geeigneten Polypeptids, umfassend mindestens eine einzelne variable Domäne bei erhöhter Temperatur über eine verlängerte Zeitspanne.
    • 50. Ein Verfahren zur Herstellung eines NFDs gemäß Aspekt 49, wobei die erhöhte Temperatur 37°C und die Zeit 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, vorzugsweise 4 Wochen ist.
    • 51. Ein Verfahren zur Herstellung eines NFDs gemäß Aspekt 49 bis 50, wobei die erhöhte Temperatur so gewählt ist, dass sie eine teilweise Proteinentfaltung unterstützt und die Aussetzung mehr als 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, vorzugsweise 4 Wochen beträgt.
    • 52. Ein Verfahren zur Herstellung eines NFDs gemäß Aspekt 49 bis 51, wobei die erhöhte Temperatur nahe an der Schmelztemperatur des Polypeptids mit einer Aussetzung von über 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, vorzugsweise 4 Wochen liegt.
    • 53. Ein Verfahren zur Herstellung eines NFDs gemäß Aspekt 48 bis 52, wobei die CDR3 der einzelnen variablen Domäne destabilisiert ist.
    • 54. Ein Verfahren zur Herstellung eines NFDs gemäß Aspekt 49 bis 53, wobei die einzelne variable Domäne ein Nanobody, wie beispielsweise eine VHH, eine humanisierte VHH, eine affinitätsgereifte, stabilisierte oder anders veränderte VHH ist. Ein Verfahren zur Herstellung monomerer Polypeptide, umfassend (eine) einzelne variable Domäne(n), z. B. ein Nanobody, wie eine VHH, eine humanisierte VHH, eine affinitätsgereifte, stabilisierte oder anders veränderte VHH; worin jeder der Schritte bei der Herstellung des Polypeptids nicht mehr als 10%, bevorzugter 5%, noch bevorzugter 4%, noch bevorzugter 3%, noch bevorzugter 2%, noch bevorzugter 1%, besonders bevorzugt 0,1% w/w korrespondierendes NFD erzeugt.
    • 55. Ein Verfahren gemäß Aspekt 54, wobei jeder der Schritte in dem Verfahren Bedingungen vermeidet, die hydrophobe Wechselwirkungen begünstigen.
    • 56. Ein Verfahren gemäß Aspekt 54 oder Aspekt 55, wobei die Bedingungen, die hydrophobe Wechselwirkungen begünstigen, eine hohe Konzentration der Polypeptide sind, d. h. eine Konzentration der Polypeptide von beispielsweise mehr als 10 mg Polypeptid pro ml Harzsäulenmaterial und so vermeidet ein Verfahren, das solche Wechselwirkungen vermeidet, solche Bedingungen in jedem Herstellungsschritt.
    • 57. Ein Verfahren gemäß Aspekt 56, wobei die Säulenbeladungen, z. B. einer Affinitätssäule, sorgfältig evaluiert werden und eine Überladung der Säule vermieden wird, d. h. ein Säulenbeladungsmaximum sollte bestimmt werden, wobei nicht mehr als 10%, noch bevorzugter 5%, noch bevorzugter 4%, noch bevorzugter 3%, noch bevorzugter 2%, noch bevorzugter 1%, besonders bevorzugt 0,1% w/w NFD erzeugt wird.
    • 58. Ein Verfahren zur Herstellung monomerer Polypeptide, umfassend (eine) einzelne variable Domäne(n), z. B. einen Nanobody, wie beispielsweise eine VHH, eine humanisierte VHH, eine affinitätsgereifte, stabilisierte oder anders veränderte VHH gemäß einem der Aspekte 53 bis 56 ohne NFD oder mit nicht mehr als 50%, bevorzugter 40%, noch bevorzugter 30%, noch bevorzugter 20%, besonders bevorzugt 10% NFD, wobei jeder der Schritte in dem Verfahren Bedingungen vermeidet, die hydrophobe Wechselwirkungen begünstigen, z. B. worin das Verfahren nicht aus einem Protein A-Schritt besteht und/oder wobei das Verfahren Bedingungen vermeidet, bei denen die einzelne variable Domäne teilweise entfaltet ist, z. B. die CDR3 destabilisiert und/oder teilweise entfaltet ist, durch beispielsweise erhöhte Temperatur, wie z. B. eine Temperatur nahe der Schmelztemperatur des Polypeptids oder z. B. 37°C über eine verlängerte Zeitspanne, z. B. Wochen, wie beispielsweise 4 Wochen.
    • 59. Eine pharmazeutische Formulierung, umfassend ein Polypeptid, das für eine Dimerbildung empfänglich ist, z. B. ein Polypeptid gemäß einem Polypeptid, wie beschrieben in den Aspekten 1 bis 32, z. B. ein Polypeptid, das mindestens eine von SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 umfasst, z. B. ein Polypeptid, das Polypeptid B umfasst und Polyol.
    • 60. Die pharmazeutische Formulierung gemäß Aspekt 59, wobei das Polyol in einer Konzentration von beispielsweise nicht mehr als 0,6 M vorliegt.
    • 61. Die pharmazeutische Formulierung gemäß Aspekt 59 oder 60, wobei das Polyol Sorbit, Mannit, Xylit, Ribit und/oder Erythrit ist.
    • 62. Die pharmazeutische Formulierung gemäß den Aspekten 59 bis 61, wobei das Polyol Mannit ist, und z. B. mit einer Konzentration von nicht mehr als 0,6 M Mannit.
    • 63. Die pharmazeutische Formulierung gemäß den Aspekten 59 bis 62, wobei das Polypeptid Polypeptid B umfasst.
    • 64. Die pharmazeutische Formulierung gemäß den Aspekten 59 bis 63, zusätzlich umfassend einen nicht-reduzierenden Zucker, wie beispielsweise Saccharose und/oder Trehalose und optional NaCl und/oder Aminosäuren.
    • 65. Die pharmazeutische Formulierung gemäß den Aspekten 59 bis 64, wobei es sich um eine flüssige Formulierung handelt.
    • 66. Die pharmazeutische Formulierung gemäß den Aspekten 59 bis 64, die in getrockneter Form, z. B. durch Lyophilisierung, hergestellt wird.
    • 67. Die pharmazeutische Formulierung gemäß den Aspekten 59 bis 64, die als injizierbare Form verwendet wird.
    • 68. Die pharmazeutische Formulierung gemäß den Aspekten 59 bis 64, die aus subkutane Formulierung verwendet wird.
    • 69. Ein NFD, ein NFD-Fragment oder ein Polypeptid, umfassend eine einzelne variable Domäne, die dazu in der Lage ist, ein NFD von irgendeinem der vorherigen Aspekte zu bilden (oder bereits gebildet hat), z. B. wie hier beschrieben, wobei die einzelne variable Domäne nicht VHH-R9, wie beschrieben von Spinelli et al., FEBS Letters 564 (2004) 35–40, ist.
  • Zusammenfassung
  • Gemäß einem breiten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung allgemein neue Dimerkomplexe (hier als ”nicht-fusionierte Dimere” oder NFDs bezeichnet), umfassend einzelne variable Domänen, Verfahren, um diese Komplexe herzustellen und ihre Verwendungen. Diese nicht-kovalent gebundenen Dimerkomplexe bestehen aus zwei identischen Monomeren, die jeweils ein oder mehr einzelne variable Domänen (Homodimere) oder zwei unterschiedliche Monomere umfassend, die jeweils ein oder mehr einzelne variable Domänen umfassen (Heterodimere). Die betroffenen NFDs weisen typischerweise veränderte, z. B. verbesserte Bindungseigenschaften gegenüber ihren monomeren Gegenstücken auf. Die NFDs der Erfindung können weiter durch Bindung über flexible Peptide oder Cysteine manipuliert werden, um die Stabilität zu verbessern. Diese Erfindung beschreibt auch Bedingungen, unter denen solche NFDs gebildet werden und Bedingungen, unter denen die Bildung solcher Dimere vermieden werden kann.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
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Claims (15)

  1. Ein stabiles NFD, erhältlich durch ein Verfahren, umfassend den Schritt der Konzentration eines Polypeptids, umfassend mindestens eine einzelne variable Domäne.
  2. Die stabile NFD gemäß Anspruch 1, wobei die einzelne variable Domäne ein Nanobody ist, wie beispielsweise eine VHH, eine humanisierte VHH, eine affinitätsgereifte stabilisierte oder anders geänderte VHH oder ein Konstrukt daraus.
  3. Das Stabile NFD gemäß Anspruch 1, wobei die einzelne variable Domäne gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10.
  4. Das Stabile NFD gemäß Anspruch 1, wobei die einzelne variable Domäne gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10.
  5. Das Stabile NFD gemäß Anspruch 1, wobei die einzelne variable Domäne gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 und eine funktionale Sequenz, die mindestens 70 identisch zur irgendeiner der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 ist.
  6. Das stabile NFD gemäß Anspruch 1, wobei die einzelne variable Domäne gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 und einer funktionalen Sequenz, die mindestens 70 identisch ist zu irgendeiner der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10 ist und wobei die Sequenzen spezifisch mindestens an eines ihrer Zielmoleküle binden.
  7. Das stabile NFD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Polypeptid im Wesentlichen aus einer einzelnen variablen Domäne, einzelnen variablen Domänen, einem Linker oder dem Kern besteht.
  8. Das stabile NFD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Schritt der Konzentration auf einer Protein A-Säule durchgeführt und wobei hohe Mengen Polypeptid auf die Säule geladen werden, z. B. 2 bis 5 mg/ml Harz Protein A.
  9. Das stabile NFD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Dissoziationskonstante für das NFD zu dem Zielmolekül ungefähr dieselbe ist wie die Dissoziationskonstante für den korrespondierenden monomeren Baublock an das Zielmolekül.
  10. Das stabile NFD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei es keine spezifische Bindung an das Zielmolekül gibt.
  11. Das stabile NFD gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Dissoziationskonstante für das NFD an das Zielmolekül 100 nM oder weniger beträgt.
  12. Ein Polypeptid, umfassend mindestens eine einzelne variable Domäne, wobei die mindestens eine der einzelnen variablen Domänen ein NFD, wie beschrieben in den Ansprüchen 1 bis 11 bilden kann.
  13. Ein Verfahren zur Herstellung eines NFDs gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, umfassend den Verfahrensschritt, der eine Bedingung aufweist, die hydrophobe Wechselwirkungen begünstigt.
  14. Ein Verfahren zur Herstellung monomerer Polypeptide der Polypeptide, wie beschrieben in den Ansprüchen 1 bis 11, umfassend mindestens eine einzelne variable Domäne, z. B. einen Nanobody; wobei jeder der Schritte bei der Herstellung des Polypeptids nicht mehr als 50%, vorzugsweise 40%, noch bevorzugter 30%, noch bevorzugter 20%, noch bevorzugter 10% korrespondierenden NFDs erzeugt und wobei jeder der Schritte in dem Verfahren Bedingungen vermeidet, die hydrophobe Wechselwirkungen begünstigen und/oder wobei das Verfahren Bedingungen vermeidet, wobei die einzelne variable Domäne teilweise entfaltet wird, z. B. wird die CDR3 teilweise entfaltet, beispielsweise durch erhöhte Temperatur, wie eine Temperatur nahe am Schmelzpunkt des Polypeptids oder z. B. bei 37°C, über eine verlängerte Zeitspanne, z. B. Wochen, wie beispielsweise 4 Wochen.
  15. Pharmazeutische Formulierung, umfassend i) ein Polypeptid, das einen Nanobody umfasst, der für eine Dimerbildung empfänglich ist und ii) ein Polyol.
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