ES2384164T3 - NanocuerposTM mejorados contra el factor de necrosis tumoral alfa - Google Patents

NanocuerposTM mejorados contra el factor de necrosis tumoral alfa Download PDF

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ES2384164T3 ES06742962T ES06742962T ES2384164T3 ES 2384164 T3 ES2384164 T3 ES 2384164T3 ES 06742962 T ES06742962 T ES 06742962T ES 06742962 T ES06742962 T ES 06742962T ES 2384164 T3 ES2384164 T3 ES 2384164T3
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Abstract

Un nanocuerpo contra TNF-alfa que comprende cuatro regiones estructurales (FR1 a FR4) y tres regionesdeterminantes de complementariedad (CDR1 a CDR3), en el que:A) i) CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY;ii)CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; yiii) CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN; oB) i) CDR1 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuenciade aminoácidos DYWMY;ii) CDR2 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con lasecuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; yiii) CDR3 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con lasecuencia de aminoácidos SPSGFN, en la que dicho nanocuerpo tiene un valor de EC50 en el ensayo basado encélulas por medio de las células KYM que se describen en el Ejemplo 1, bajo 3) del documento de WO 04/041862 quees mejor que 5 nM.

Description

NanocuerposTM mejorados contra el factor de necrosis tumoral alfa
La presente invención se refiere un NanocuerposTM contra el factor de necrosis tumoral alfa (TMN-alfa) así como polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en uno o más de estos Nanocuerpos. [Nota: NanobodiesTM y NanocloneTM y marcas registradas de Ablynx N.V]
La invención también se refiere a ácidos nucleicos que codifican tales Nanocuerpos y polipéptidos; a células huésped que expresan o son capaces de expresar tales Nanocuerpos o polipéptido; a composiciones que comprenden tales Nanocuerpos y polipéptidos, ácidos nucleicos o células huésped; y a los usos de tales Nanocuerpos, tales polipéptidos, tales ácidos nucleicos, tales células huésped o tales composiciones, en particular con fines profilácticos, terapéuticos o diagnósticos, tales como los fines profilácticos, terapéuticos o diagnósticos mencionados a continuación.
Otros aspectos, formas de realización, ventajas y aplicaciones de la invención se aclararán a partir de la siguiente descripción adicional en la presente.
El documento WO 04/041862 se refiere un Nanocuerpos contra TNF-alfa y a la preparación y su uso, en particular para la prevención y/o tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con y/o mediados por TNF-alfa, tal como inflamación
artritis reumatoide, COPD, asma, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome intestinal inflamatorio, esclerosis múltiple, enfermedad de Addison, hepatitis autoinmune, parotiditis autoinmune, Diabetes Tipo I, epididimitis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, Lupus eritematoso sistémico, infertilidad masculina, esclerosis múltiple, miastenia gravis, pénfigo, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, tiroiditis, y vasculitis.
Los nanocuerpos anti-TNF de acuerdo con WO 04/041862 pueden ser humanizados y pueden ser monovalentes o multivalentes, estos últimos que producen aumento de afinidad por TNF. Los NanocuerposTM anti-TNF de acuerdo con WO 04/041862 también pueden ser multiespecíficos, y pueden estar en particular en forma de un constructo multiespecífico que comprende dos o más nanocuerpos contra TNF y un nanocuerpo adicional dirigido contra una proteína sérica tal como albúmina sérica humana, que lleva a un aumento de la vida media in vivo.
El documento de WO 04/041862 también se refiere a métodos para la preparación de los Nanocuerpos anti-TNF, un ácidos nucleicos o constructos que codifican los Nanocuerpos anti-TNF, así como a composiciones farmacéuticas que comprenden los Nanocuerpos anti-TNF, que pueden ser adecuados para la administración intravenosa, subcutánea, oral, sublingual, tópica, nasal, vaginal o rectal, o para la administración por inhalación. Los Nanocuerpos anti-TNF de acuerdo con WO 04/04 1862 también se pueden usar para fines diagnósticos, opcionalmente en la forma de un kit de partes.
El documento EP 0 486 526 describe los ligandos de unión a TNF-alfa contra un epitope específico de TNF. Entre los ligandos de unión, se mencionan anticuerpos de dominio únicos ("dAb").
Reiter et al, J. Mot. Biol. (1999), 290, 685-698 describen anticuerpos de dominio único contra el TNF-alfa obtenido de una biblioteca de despliegue en fago aleatorizado que se generó a partir de una estructura del dominio VH proveniente de un hibridoma de ratón.
El documento WO 00/29004 describe anticuerpos de dominio único murinos ("microcuerpos") contra TNF-alfa.
WEl documento WO 04/003019 entre otros describe los ligandos que comprenden un primer dominio de unión contra TNF-alfa y un segundo dominio de unión contra una proteína sérica tal como albúmina sérica.
Un objetivo general de la presente invención es proporcionar Nanocuerpos contra TNF-alfa, en particular contra TNFalfa humano.
En particular, un objeto de la presente invención es proporcionar Nanocuerpos contra TNF-alfa, en particular contra TNF-alfa humano, y proporcionar proteínas o polipéptidos que comprenden los mismos, que son adecuados para uso terapéutico y/o diagnóstico, y en particular para la prevención, tratamiento y/o diagnóstico de una a más enfermedades y trastornos asociados con y/o mediados por TNF-alfa tales como los mencionados antes, y/o que se pueden usar en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de una o más enfermedades asociadas con y/o mediadas con TNF-alfa, tales como los mencionados anteriormente.
Más en particular, un objetivo de la invención es proporcionar Nanocuerpos contra TNF-alfa, y para proporcionar proteínas y polipéptidos que comprenden lo mismo, que son una alternativa a los Nanocuerpos y polipéptidos contra TNF-alfa descripto en WO 04/041862 y/o que tienen una o más propiedades o características extrañas, en comparación con los Nanocuerpos y polipéptidos contra TNF-alfa descriptos en WO 04/041862.
Más en particular, un objetivo de la invención es proporcionar Nanocuerpos contra TNF-alfa, y para proporcionar proteínas o polipéptidos que comprenden lo mismo, que están mejorados en comparación con los Nanocuerpos y polipéptidos contra TNF-alfa descriptos en WO 04/041862 con respecto a uno o más de las siguientes propiedades o características:
-
afinidad aumentada por TNF-alfa, en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo en un forma bivalente) y/o n un formato multiespecífico (por ejemplo un de los formatos multiespecíficos descriptos en WO 04/048162 o más adelante en la presente);
-
mejor adecuación para dar formato en un formato multivalente (por ejemplo en una forma bivalente);
-
mejor adecuación para formatear en un formato multiespecífico (por ejemplo uno de los formatos multiespecíficos descriptos en WO 04/041862 o más adelante en la presente);
-
mejor adecuación o sensibilidad para "humanizar" sustituciones (como se define en la presente); y/o
-
menor inmunogenicidad, sea en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo en una forma bivalente) y/o en un formato multiespecífico (por ejemplo uno de los formatos multiespecíficos descriptos en el documento WO 04/041862 o más adelante en la presente) en un formato monovalente;
-
estabilidad aumentada, sea en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo en una forma bivalente) y/o en un formato multiespecífico (por ejemplo uno de los formatos multiespecíficos descriptos en WO 04/041862 o más adelante en la presente) en un formato monovalente;
-
especificidad aumentada hacia el TNF-alfa, sea en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo en una forma bivalente) y/o en un formato multiespecífico (por ejemplo uno de los formatos multiespecíficos descriptos en WO 04/041862 o más adelante en la presente) en un formato monovalente;
-
disminución o cuando sea necesario aumento de la reactividad cruzada con TNF-alfa de diferentes especies;
y/o
-
una o más de otras propiedades mejoradas deseables para el uso farmacéutico (que incluye uso profiláctico y/o uso terapéutico) y/o para uso diagnóstico (que incluye pero sin limitación al uso para fines de examen por imágenes), sea en un formato monovalente, en un formato multivalente (por ejemplo en una forma bivalente) y/o en un formato multiespecífico (por ejemplo, uno de los formatos multiespecíficos descriptos en WO 04/041862 o más adelante en la presente).
Estos objetos se obtienen por los Nanocuerpos, proteínas y polipéptidos descriptos en la presente. Estos Nanocuerpos también se denominan en la presente como “Nanocuerpos de las invención”; y estas proteínas y polipéptidos también se denominan colectivamente en la presente "polipéptidos de la invención".
La invención se refiere a un nanocuerpo ("nanocuerpo de la invención") contra TNF-alfa que comprende cuatro regiones estructurales (FR1 a FR4) y tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3), en las que
A)
i) CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY;
ii) CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; y
iii) CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
B)
i) CDR1 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos DYWMY;
ii) CDR2 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; y
iii) CDR3 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SPSGFN, en que dicho nanocuerpo tiene un valor de EC50 en el ensayo basado en células usando células KYM descriptas en el Ejemplo I, bajo 3) de WO 04/041862 que es mejor de 5 nM.
Debido a que los Nanocuerpos y polipéptidos descriptos en la presente, se consideran principalmente destinados al uso terapéutico y/o diagnóstico, ellos se dirigen contra (como se define en la presente) TNF-alfa humano. Sin embargo, no se excluye (pero tampoco se requiere) que los Nanocuerpos y polipéptidos descritos en la presente muestren reactividad cruzada con TNF-alfa de una o más especies de animales de sangre caliente, por ejemplo con TNF-alfa de una o más especies diferentes de primates y/o con TNF-alfa de una o más especies de animales que a menudo se usan en modelos animales para enfermedades (por ejemplo ratón, rata, conejo, cerdo o perro), y en particular en modelos animales para enfermedades y trastornos asociados con TNF-alfa (tal como los modelos de especie y animal mencionados en la presente). En este aspecto, será evidente para los expertos que tal reactividad cruzada, cuando está presente, puede tener ventajas desde un punto de vista del desarrollo del fármaco, ya que permite analizar los Nanocuerpos y polipéptidos contra TNF-alfa humano en tales modelos animales.
Los Nanocuerpos, proteínas o polipéptidos descriptos y/o reivindicados en la presente se dirigen contra y/o pueden unirse a un epitope de TNF-alfa que se halla en y/o forma parte del sitio de unión del receptor de TNF (por ejemplo, los sitios de unión para el TNF-RI, THF-RII, también conocido como p55 o p75). Como es bien conocido en la técnica, un trímero de TNF comprende tres sitios de unión al receptor, que son esencialmente equivalentes y que se forman por/en la interfaz de dos monómeros de TNF dentro de los trímeros TNF. Los Nanocuerpos, proteínas o polipéptidos descriptos y/o reivindicados en la presente preferentemente se dirigen contra y/o se unen a un epitope de TNF-alfa que comprende los siguientes residuos de aminoácidos de TNF-alfa; Gln en la posición 88, Lys en la posición 90, y/o Glu en la posición 146).
Los Nanocuerpos, proteínas o polipéptidos descriptos y/o reivindicados en la presente preferentemente se dirigen contra y/o se unen a un epitope del trímero TNF-alfa, que se halla en y/o forma parte del sitio de unión del receptor de TNF. Los Nanocuerpos, proteínas o polipéptidos descriptos y/o reivindicados en la presente se dirigen contra y/o pueden unir a un epitope del trímero de TNF-alfa que comprende los siguientes residuos de aminoácidos: Gln en la posición 88 y Lys en la posición 90 en un primer monómeros de TNF (denominado en la presente como "monómero A"), y Glu en la posición 146 en un segundo monómero de TNF (denominado en la presente como "monómero B") (en que el Monómero A y Monómero B juntos, en el trímero TNF, forma el sitio de unión del receptor de TNF.
Más particularmente, los Nanocuerpos, proteínas o polipéptidos descriptos en la presente se pueden dirigir contra y/o se pueden unir a un epitope del trímero de TNF-alfa que comprende los aminoácidos anteriormente mencionados (Gln en la posición 88 en el monómero A; Lys en la posición 90 en el monómero A y Glu en la posición 146 en el monómero B), y además al menos uno, 0 preferentemente dos o más, más preferentemente 5 o más, y preferentemente todos o esencialmente todos, los siguientes residuos de aminoácidos del monómero A de TNF-alfa: Gly en las posiciones 24, Gln en la posición 25, Thr en la posición 72, His en la posición 73, Val en la posición 74, Leu en la posición 75, Thr en la posición 77, Thr en la posición 79, Le en la posición 83, Thr en la posición 89, Val en la posición 91. Aso en la posición 92, Ile en la posición 97, Arg en la posición 131, Glu en la posición 135, Ile en la posición 136, Asn en la posición 137, Arg en la posición 138, Pro en la posición 139, Asp en la posición 140 y los siguientes residuos en el monómero B: Pro en la posición 20. Arg en la posición 32, Lys en la posición 65, Lys en la posición 112, Tyr en la posición 115, Ala en la posición. 145, Ser en la posición 147.
Tal epitope se puede delinear a partir del análisis estructural del nanocuerpo cristalizado en el complejo con la molécula de TNF, o de otros métodos tales como mapeo genético por medio del análisis pepscan.
En comparación, a partir de los datos cristalográficos (no mostrados), se puede observar que el Nanocuerpo 3E del documento WO 04/041862 se une a un epitope diferente (es decir, un epitope que comprende, Tyr en la posición 141, Asp en la posición 140, Gln en la posición 67, Gly en la posición 24 y Glu en la posición 23) que el epitope preferido de la invención.
Los dominios variables de la inmunoglobulina dirigidos contra el epitope anterior son Nanocuerpos, en tal caso las proteínas y polipéptidos que comprenden Nanocuerpos también se pueden describir adicionalmente en la presente.
En consecuencia, algunos aspectos preferidos de la invención descritos y/o reivindicados en la presentes se refieren a:
I) Un Nanocuerpo que se dirige contra el mismo epitope en el trímero de TNF-alfa como Nanocuerpo TNF1 (SEQ ID NO: 52).
II) Un Nanocuerpo que se dirige contra el mismo epitope en el trímero de TNF-alfa como Nanocuerpo TNF3 (SEQ ID NO: 60).
III) Un Nanocuerpo que se dirige contra un epitope del trímero de TNF-alfa que al menos comprende los siguientes residuos de aminoácidos: Gln en la posición 88 en el monómero A.; Lys en la posición 90 en el monómero A y Glu en la posición 146 en el monómero B.
IV). Un Nanocuerpo que se dirige contra un epitope del trímero de TNF-alfa que comprende los siguientes residuos de aminoácidos: Gln en la posición 88 en el monómero A; Lys en la posición 90 en el monómero A y Glu en la posición 146 en el monómero B; y que además comprende al menos comprende al menos uno, preferentemente dos o más, más preferentemente 5 o más, y preferentemente todos o esencialmente todos, de los siguientes residuos de aminoácidos del monómero A de TNF-alfa: Gly en la posición 24, Gln en la posición 25, Thr en la posición 72, His en la posición 73, Val en la posición 74, Leu en la posición 75, Thr en la posición 77, Thr en la posición 79, Ile en la posición 83, Thr en la posición 89, Val en la posición 91. Asn en la posición 92, Ile en la posición 97, Arg en la posición 131, Glu en la posición 135, Ile en la posición 136, Asn en la posición 137, Arg en la posición 138, Pro en la posición 139, Asp en la posición 140 y los siguientes residuos en el monómero 13: Pro en la posición 20, Arg en la posición 32, Lys en la posición 65, Lys en la posición 112, Tyr en la posición 115, Ala en la posición 145, Ser en la posición 147.
V) Un Nanocuerpo que se dirige contra un epitope del trímero de TNF-alfa que comprende los siguientes residuos de aminoácidos: Gln en la posición 88 en el monómero A; Lys en la posición 90 en el monómero A y Glu en la posición 146 del monómero B; y que además comprende al menos uno, preferentemente dos o más, más preferentemente 5 o más, y preferentemente todos o esencialmente todos, los siguientes residuos de aminoácidos de monómero A de TNF-alfa: Leu en la posición 75, Thr en la posición 77, Thr en la posición 79, Ile en la posición 80, Ser en la posición 81, Tyr en la posición 87, Thr en las posiciones 89, Val en la posición 9l, Asn en la posición 92, Ser en la posición 95, Ile en la posición 97, Glu en la posición 135, Ile en la posición 136, Asn en la posición 137 y los siguientes residuos en el monómero B: Ala en la posición 33, Ala en la posición 145, Ser en la posición 147.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de 1) a V) anterior, que tiene una tasa de Koff para TNF mejor de 2.10-3 (I/s), preferentemente mejor de 1 10-3.
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, que tiene un valor de EC50 en el ensayo basado en células por medio de células KYM descritas en el Ejemplo I, bajo 3), del documento WO 04/041862 que es mejor que 5 nM; o una variante humanizada de tal Nanocuerpo.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, que tiene un valor de EC50 en el ensayo basado en células por medio de células KYM descritas en el Ejemplo 1, bajo 3), del documento WO 04/041862 que es mejor que 3 nM; o una variante humanizada de tal Nanocuerpo.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de 1) a V) anterior, que es un Nanocuerpo humanizado.
y algunos aspectos preferidos de esta realización se refieren a:
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, que es un Nanocuerpo clase GLEW.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, que es Nanocuerpo clase GLEW humanizado.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, que contiene un residuos de arginina (R) en la posición 103.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, que contiene un residuo de arginina (R) en la posición 103, y que está humanizado.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, que es un Nanocuerpo de clase GLEW y que contiene un residuo de arginina (R) en la posición 103, y que está humanizado.
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, que contiene un residuo de leucina (L} en la posición 108.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NOs 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNFI4), 95 (TNF29) o 96 (NT30)
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, en que CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, en que CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, en que CDR3, comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, en que:
-
CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
-CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; o
-
CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; y CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, en que CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, en que CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY; CDR2 EINTNGLITKYPDSVKG; y CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, en que
a) CDR1 es:
-
la secuencia de aminoácidos DYWMY; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos DYWMY; o una secuencia de aminoácidos que tiene 2 o solo 1 diferencia de aminoácido con la secuencia de aminoácidos DYWMY;
y en que:
b) CDR2 es:
-
la secuencia de aminoácidos de EINTNGLITKYPDSVKG; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de EINTNGLITKYPDSVKG; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene 2 o solo 1 diferencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG;
y en que c) CDR3 es:
-
la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene 2 o solo 1 diferencia de aminoácido con la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, en que CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, en que CDR2 es la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, en que CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, en que:
-
CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
-
CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR2 es la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; o
-
CDR2 es la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; y CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, en que CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, en que CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY; CDR2 es la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG y CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, en que
-
cualquier sustitución de aminoácido es preferentemente a sustitución conservadora de aminoácido; y/o
-
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos.
y algunas otros aspectos preferidos de esta realización se refieren a:
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, que es Nanocuerpo clase KERE
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, que es Nanocuerpo clase KERE humanizado y con aún otros aspectos particularmente preferidos que son:
VI) Una proteína o polipéptido, que comprende a o consiste esencialmente en un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior,
VII) Una proteína o polipéptido, que comprende o consiste esencialmente en al menos un Nanocuerpo de acuerdo con alguno de I) a V) anterior.
VIII) Una proteína o polipéptido, que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con alguno de I) a V) anterior.
IX) Una proteína o polipéptido, que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, y que es tal que dicha proteína o polipéptido, después de la unión a un trímero de TNF, es capaz de inhibir o reducir el entrecruzamiento del receptor TNF que está mediado por dicho trímero TNF y/o la transducción de señales que está mediada por tal entrecruzamiento del receptor.
X) Una proteína o polipéptido, que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, y que es capaz de realizar la unión intramolecular en al menos dos sitios de unión del receptor TNF en un trímero de TNF.
XI) Una proteína o polipéptido, que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, unido por medio de un ligador adecuado.
XII) Una proteína o polipéptido, que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, unido por medio de un ligador adecuado, y que está pegilado.
XIII) Una proteína o polipéptido que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, y que además comprende al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana.
XIV) Una proteína o polipéptido que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, y que además comprende al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana, y que es tal que dicha proteína o polipéptido, después de la unión a un trímero de TNF, es capaz de inhibir o reducir el entrecruzamiento del receptor TNF que está mediado por dicho trímero de TNF y/o la transducción de señales que está mediada por tal entrecruzamiento del receptor.
XV) Una proteína o polipéptido que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, y que además comprende al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana y que es capaz de realizar la unión intramolecular en al menos dos sitios de unión del receptor TNF en un trímero TNF.
XVI) Una proteína o polipéptido que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, y que además comprende un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana, en que cada uno de los dos Nanocuerpos de acuerdo con alguno de I) a V) anterior está unido, opcionalmente por medio de un ligador adecuado, a un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana.
XVII) Una proteína o polipéptido que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, y que además comprende un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana, en que cada uno de los dos Nanocuerpos de acuerdo con alguno de I) a V) anterior está unido, opcionalmente por medio de un ligador adecuado, a un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana, y que es tal que dicha proteína o polipéptido, después de la unión a un trímero de TNF, es capaz de inhibir o reducir el entrecruzamiento del receptor de TNF que está mediado por dicho trímero de TNF y/o la transducción de señales que está mediada por tal entrecruzamiento del receptor.
XVIII) Una proteína o polipéptido que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con alguno de I) a V) anterior, y que además comprende un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana, en que cada uno de los dos Nanocuerpos de acuerdo con alguno de I) a V) anterior está ligado, opcionalmente por medio de un ligador adecuado, a un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana, y que es capaz de realizar la unión intramolecular en al menos dos sitios de unión del receptor TNF en un trímero de TNF.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo alguno de VI) a XVIII) anterior, en que al menos un Nanocuerpo dirigido contra la albúmina sérica humana es un Nanocuerpo humanizado.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo alguno de VI) a XVIII) anterior, en que el al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana es una variante humanizada del nanocuerpo ALB 1 (SEQ ID NO: 63).
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Una proteína o polipéptido de acuerdo alguno de VI) a XVIII) anterior, en que el al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana se elige de un grupo que consiste en ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB 5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALE 7 (SEQ ID NO: 101), ALB 8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) y ALB 10 (SEQ ID NO: 104).
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Una proteína o polipéptido de acuerdo alguno de VI) a XVIII) anterior, en que el al menos un Nanocuerpo dirigido contra la albúmina sérica humana es ALB 8.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo alguno de VI) a XVIII) anterior, que comprende o consiste esencialmente en dos humanizados Nanocuerpos de acuerdo con I) a V) anterior, y una variante humanizada del nanocuerpo ALB 1 (SEQ ID
NO: 63).
Cabe mencionar que cuando un Nanocuerpo se menciona anteriormente como "de acuerdo con cualquiera de I) a V) anterior", está al menos de acuerdo con uno de 1) a V), puede estar de acuerdo con dos o más de I)a V), y también pueden incluir alguno o más de los otros aspectos que se indican como que están "de acuerdo con alguno de I) a V) anterior”. De modo similar, cuando una proteína o polipéptido se menciona anteriormente como ser "de acuerdo con cualquiera de VI) a XVIII) anterior", es al menos de acuerdo con uno de VI) a XVIII), puede estar de acuerdo con dos o más de VI) a XVIII), y también puede incluir alguno o más de los otros aspectos que se indican como que están "de acuerdo con cualquiera de VI) a XVIII) anterior.
También está dentro del alcance de la invención que, cuando sea aplicable, un polipéptido de la invención se puede unir a dos o más determinantes antigénicos, epitopes, partes, dominios, subunidades o conformaciones de TNF-alfa. En tal caso, los determinantes antigénicos, epitopes, partes, dominios o subunidades de TNF-alfa al que se unen los polipéptidos de la invención pueden ser esencialmente iguales (por ejemplo, si TNF-alfa contiene motivos estructurales repetidos o está presente como un multímero) o puede ser diferente (y en este último caso, los polipéptidos de la invención se pueden unir a estos diferentes determinantes antigénicos, epitopes, partes, dominios, subunidades de TNF-alfa con una afinidad y/o especificidad que puede ser igual o diferente). Asimismo, por ejemplo, cuando TNF-alfa existe está en una conformación activada y en una conformación inactiva, los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención pueden unirse a una de estas conformaciones o puede unir a ambas conformaciones (es decir con una afinidad y/o especificidad que puede ser igual o diferente). Asimismo, por ejemplo, los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se pueden unir a una conformación de TNF-alfa en que esta se une a un ligando pertinente, se puede unir a una conformación de TNF-alfa en que esta no se une a un ligando pertinente, o se puede unir a tales conformaciones (nuevamente con una afinidad y/o especificidad que puede ser igual o diferente).
También se espera que los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención generalmente se unirán a todos los análogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos naturales o sintéticos de TNF-alfa, o al menos a los análogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos de TNF-alfa que contienen uno o más determinantes antigénicos o epitopes que son esencialmente los mismos que el determinante antigénico o epitope al que se unen los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención en TNF-alfa (por ejemplo en TNF-alfa). Nuevamente, en tal caso, los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se pueden unir a tales análogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos con una afinidad y/o especificidad que son las mismas o diferentes de (es decir mayor de o menor de) la afinidad y especificidad con la que los Nanocuerpos de la invención se unen a TNF-alfa (tipo salvaje). También se incluyen dentro del alcance de la invención que los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se unan a algunos análogos, variantes, mutantes, alelos, partes y fragmentos de TNF-alfa; pero no a otras.
En general, los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se unirán al menos a estas formas (que incluyen formas monoméricas, multiméricas y asociadas) que son las más relevantes de un punto de vista biológico y/o terapéutico, tal como será evidente para los expertos.
Asimismo, debido a que TNF-alfa existe en una forma monomérica y en formas multiméricas, y en particular en forma trimérica, está dentro del alcance de la invención que los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención solo se unan a TNF-alfa en la forma monomérica, o que los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención además también se unen a una
o más de estas formas multimérica, tales como la forma trimérica de TNF, o solo se pueden unir a tal forma multimérica (por ejemplo trimérica). En consecuencia, generalmente cuando en esta descripción, se hace referencia a un Nanocuerpo, proteína o polipéptido que se dirige a TNF-alfa, se debe entender que esta también comprende los Nanocuerpos dirigidos contra TNF-alfa en su forma trimérica (que incluyen pero sin limitación los Nanocuerpos contra los sitios de unión al receptor (por ejemplo los sitios de unión para el TNF-RI, TNF-RIII, también conocido como p55 o p75) de tal trímero). En todos los casos, los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se pueden unir a tales multímeros o complejos de proteína asociada con una afinidad y/o especificidad que puede ser igual como o diferente de (es decir mayor de o menor de) la afinidad y/o especificidad con que los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se unen a TNF-alfa en sus estado monomérico y no asociado.
Asimismo, generalmente, los polipéptidos de la invención que contienen dos o más Nanocuerpos dirigidos contra TNFalfa se pueden unir con mayor avidez que los correspondientes Nanocuerpo o Nanocuerpos monoméricos.
Por ejemplo, y sin limitación, una proteína o polipéptido multivalente (como se define en la presente) que contiene dos o más Nanocuerpos que se dirigen contra epitopes diferentes de TNF-alfa proteína o polipéptido multivalente (como se define en la presente) que contiene dos o más Nanocuerpos que se dirigen contra diferentes epitopes de TNF-alfa se puede unir a TNF-alfa con avidez más altas que los correspondientes monómeros.
De modo más importante, una proteína o polipéptido multivalente (como se define en la presente) que contiene dos o más Nanocuerpos que se dirigen contra TNF-alfa pueden (y usualmente) se unen con mayor avidez a un multímero de TNF-alfa que a un monómero of TNF-alfa, y usualmente también se unirán con mayor avidez que los correspondientes
Nanocuerpos monoméricos. En tal proteína o polipéptido multivalente, dos o más Nanocuerpos por ejemplo se pueden dirigir contra los mismos epitopes, epitopes sustancialmente equivalentes, o epitopes diferentes. En una realización de tal proteína o polipéptido multivalente, los dos o más Nanocuerpos pueden ser iguales (y en consecuencia se dirige contra el mismo epitope).
Esta última es de particular importancia, ya que se sabe que el modo de primario de transducción de señal por parte de TNF involucra el entrecruzamiento por receptores TNF por un trímero de moléculas TNF, que contiene tres sitios de unión al receptor (ver por ejemplo Peppel et al., J. Exp. Med., 174 (1991), 1483-1489; Engelmann et a1.,J. Biol. Chem., 265 (1990), 14497; Smith y Baglioni, J. Biol. Chem., 264 (1989), 14646). Por ejemplo, como se describe por Peppel et al., un dominio extracelular monovalente manipulado genéticamente del receptor TNF – que fue solo capaz de bloquear un sitio de unión al receptor único en un trímero de TNF – fue incapaz de evitar el entrecruzamiento de los receptores TNF con los dos sitios de unión al receptor restantes; mientras que una proteína manipulada genéticamente que comprende dos de estos dominios extracelulares – en consecuencia que son capaces de bloquear dos sitios de unión al receptor – proporcionaron una eficacia notable en comparación con el dominio extracelular monovalente.
En la presente invención, se ha hallado que los Nanocuerpos monovalentes son capaces de unirse a TNF alfa de manera tal que se reduce la actividad de TNF, tanto en los modelos in vitro, como los modelos celulares y en los modelos ex vivo (ver la siguiente sección Experimental). Si bien la invención no se limita a ningún mecanismo, explicación o hipótesis específica, se considera que debido a su tamaño pequeño y alta afinidad por TNF-alfa, dos o tres Nanocuerpos monovalentes de la invención son capaces de ocupar simultáneamente dos o tres sitios de unión diferentes al receptor sobre el trímero TNF, en consecuencia se evita que el trímero inicie el entrecruzamiento del receptor y de este modo inicie la transducción de señal (sin embargo, otros mecanismos de acción no se excluyen: por ejemplo, de acuerdo con el epitope contra el cual se dirige, un Nanocuerpo de la invención también puede inhibir la asociación del TNF en el estado trimérico).
También se debe indicar que, en forma adicional o alternativa a la unión a dos o más sitios de unión al receptor en un trímero de TNF único, las proteínas o polipéptidos de la presente invención que comprenden o consisten esencialmente en dos o más dominios variables de inmunoglobulina (o fragmentos adecuados de este) que se dirigen contra epitopes de TNF-alfa pueden unir (por ejemplo, en forma intermolecular) los epitopes de dos moléculas de TNF-alfa separadas (por ejemplo dos trímeros separados).
Sin embargo, de acuerdo con una realización particularmente preferida, la invención se refiere a una proteína o polipéptido que comprende o consiste esencialmente en dos o más dominios variables de inmunoglobulina (o fragmentos adecuados de estos) que se dirigen contra los epitopes en las TNF-alfa (y en particular del trímero TNF-alfa) que se halla y/o forma parte del sitio de unión al receptor del trímero TNF, de modo que dicho polipéptido, después de la unión a un trímero de TNF, es capaz de inhibir o reducir el entrecruzamiento del receptor de TNF que está mediado por dicho trímero de TNF yo la transducción de señal que está mediada por tal entrecruzamiento del receptor.
En particular, de acuerdo con esta preferida realización, la invención se refiere a una proteína o polipéptido que comprende o consiste esencialmente en dos o más dominios variables de inmunoglobulina (o fragmentos adecuados de este) que se dirigen contra los epitopes sobre la TNF-alfa (y en particular del trímero de TNF-alfa) que se halla en y/o forman parte del sitio de unión al receptor del Trímero de TNF-alfa, en los que dichos dominios variables de inmunoglobulina se ligan entre sí de modo tal que la proteína o polipéptido es capaz de unirse simultáneamente a dos o más sitios de unión al receptor en un trímero de TNF único (en otras palabras, es capaz de realizar la intramolecular en al menos dos sitios de unión al receptor de TNF en un trímero TNF). En esta realización, los dos o más dominios variables de inmunoglobulina son preferentemente Nanocuerpos (de modo que la proteína o polipéptido es un constructo de Nanocuerpo multivalente, como se describe adicionalmente en la presente). Asimismo, en esta realización, los dos o más dominios variables de inmunoglobulina pueden ser iguales o diferentes; y se pueden dirigir contra epitopes diferentes dentro del sitio de unión al receptor de TNF, pero preferentemente se dirigen contra el mismo epitope.
En un aspecto preferido de esta realización, los dos o más dominios variables de inmunoglobulina se dirigen contra epitopes del trímeros de TNF-alfa, estos epitopes se hallan en y/o forman parte del sitio de unión al receptor del TNF(s). Por ejemplo, los dos o más dominios variables de inmunoglobulina preferentemente se dirigen contra y/o se pueden unir al epitope del trímero de TNF-alfa que comprende los siguientes residuos de aminoácidos: Gln en la posición 88 y Lys en la posición 90 en el primer monómero de TNF (denominado en la presente como "monómero A"), y Glu en la posición 146 en un segundo monómero de TNF (denominado en la presente como "monómero B") (en que el Monómero A y Monómero B juntos, en el trímero de TNF, forman el sitio de unión al receptor del TNF).
Como se describe adicionalmente más adelante con más detalle con respecto a los Nanocuerpos, en tal proteína o polipéptido, al menos dos dominios variables de inmunoglobulina se une preferentemente de manera tal que la distancia entre el extremo N-terminal y el extremo C-terminal de los dos dominios variables de inmunoglobulina presentes en talproteína o polipéptido, es preferentemente al menos 50 Ángstrom, y más preferentemente en la región de 55-200 Ángstrom, y más preferentemente en la región de Ángstrom, y en particular en la región de 65-150 Ángstrom.
En un aspecto particularmente preferido de esta realización, estas dos o más secuencias de inmunoglobulina son Nanocuerpos, y preferentemente se eligen de los Nanocuerpos descriptos en la presente. Algunos Nanocuerpos particularmente preferidos para usar en esta realización de la invención son PMP1C2 (TNF1, SEQ ID NO:52) y/o PMP5F10 (TNF3, SEQ ID NO: 60), así como sus variantes humanizadas y otras (que se describen en la presente); con PMP1C2 (TNF1, SEQ ID NO:52) y sus variantes humanizadas son particularmente preferidas.
Por consiguiente, la presente realización se describirá a continuación con más detalle con referencia a los Nanocuerpos. Sin embargo, será evidente para los expertos que las enseñanzas de la presente se pueden aplicar en forma análoga a los dominios variables de inmunoglobulina, con la condición de que al menos uno de dichos dominios sea un Nanocuerpo descrito en la presente.
In esta realización de la invención, las dos o más secuencias de inmunoglobulina usualmente se unirán por medio de uno o más ligadores adecuados, tales ligadores son de modo tal que cada secuencia de inmunoglobulina se puede unir a un sitio de unión al receptor diferente en el mismo trímero de TNF. Los ligadores adecuados dependerán entre otros de (la distancia entre) los epitopes del trímero de TNF al que se unen las secuencias de inmunoglobulina, y será evidente para los expertos sobre la base de la descripción de la presente, opcionalmente después de algún grado limitado de experimentación de rutina. Por ejemplo, cuando las dos o más secuencias de inmunoglobulina son dominio (único) de los anticuerpos o Nanocuerpos (único), los ligadores adecuados se pueden elegir de los ligadores que se describen en la presente, pero con una longitud del ligador que es tal que los dos o más anticuerpos o Nanocuerpos de dominio (único) se pueden unir a diferentes sitios de unión al receptor en el mismo trímero de TNF.
Asimismo, cuando los dos o más secuencias de inmunoglobulina que se unen a los sitios de unión al receptor de TNFalfa son dominio (único) de los anticuerpos o Nanocuerpos, ellos se pueden ligar entre sí por medio de un tercer dominio (único) del anticuerpo o Nanocuerpo (en que dos o más secuencias de inmunoglobulina se pueden unir directamente al tercer dominio (único) del anticuerpo o Nanocuerpo o por medio de ligadores adecuados). Tal tercer dominio (único) del anticuerpo o Nanocuerpo por ejemplo pueden ser un dominio (único) del anticuerpo o Nanocuerpo que proporciona un aumento de la vida media, que también se describe en la presente. Por ejemplo, este último dominio r (único) del anticuerpo o Nanocuerpo puede ser un dominio (único) del anticuerpo o Nanocuerpo que es capaz de unirse a una proteína sérica (humana) tal como albúmina sérica (humana), que también se describe en la presente.
Alternativamente, las dos o más secuencias de inmunoglobulina que se unen al sitio de unión al receptor de TNF-alfa se pueden unir en serie (sea directamente o por medio de un ligador adecuado) y el tercer dominio (único) del anticuerpo o Nanocuerpo (que puede proporcionar aumento de la vida media, como se describió antes) se puede conectar en forma directa o por medio de un ligador a uno de estos dos o más secuencias de inmunoglobulina mencionadas anteriormente. Algunos ejemplos no limitantes de tales constructos son los constructos de la SEQ ID) NOS: 93 o 94.
En particular, se ha hallado en la invención (ver los datos cristalográficos mencionados en la presente) que, cuando los Nanocuerpos presentes en una proteína o polipéptido de la invención multivalente o multiespecífico se une al epitope particular que se describió anteriormente (que es el epitope de TNF1 y sus variantes humanizadas, así como TNF3 y sus variantes humanizadas) luego preferentemente, los dos (o más) Nanocuerpos anti-TNF presentes en tal proteína o polipéptido se deben unit de modo tal que la distancia entre el extremo N-terminal y el extremo C-terminal de dos Nanocuerpos anti-TNF presentes en tal proteína o polipéptido preferentemente deber ser al menos 50 Ángstrom, y máspreferentemente en la región de 55-200 Ángstrom, y en particular en la región de 65-150 Ángstrom (con el límite superior que es menos crítico, y se elige por razones de conveniencia, por ejemplo con una vista a la expresión/producción de la proteína); o más generalmente que dicha distancia debe ser tal que permite a la proteína o polipéptido experimentar la unión intramolecular al trímero de TNF (es decir en cambio de la unión intermolecular). La distancia entre el extremo N-terminal y el extremo C-terminal de dos Nanocuerpos anti-TNF se puede determinar por cualquier medio adecuado, tal como por cristalografía o modelado molecular (como se describe en la presente). Estas técnicas generalmente permiten determinar si una proteína o polipéptido multivalente o multiespecífica específica es capaz de proporcionar el modelado intramolecular.
Alternativamente, la presente invención también proporciona un experimento simple por medio de cromatografía de exclusión por tamaño (descripto por Santora et al., Anal. Biochem., 299: 119-129) que se puede usar para determinar si una proteína o polipéptido determinado de la invención proporcionará (predominantemente) unión intramolecular a un trímero de TNF o (predominantemente) unión intermolecular entre dos o más trímeros de TNF-alfa. En consecuencia, en una realización particular de la invención, una proteína o polipéptido de la invención preferentemente es tal que en este experimento, en forma predominante o esencial y exclusivamente produce la unión intramolecular. Sin embargo, como se destacó anteriormente, cabe mencionar que las proteínas o polipéptidos de la invención que operar por medio de unión intermolecular de moléculas TNF-alfa separadas (por ejemplo trímeros) también están dentro del alcance de la presente invención.
En consecuencia, en otro aspecto, la invención proporciona una proteína o polipéptido multivalente o multiespecífica que comprende al menos dos Nanocuerpos contra TNF-alfa (y en particular del trímero TNF-alfa), en que dichos Nanocuerpos preferentemente se dirigen a esencialmente el mismo epitope que el Nanocuerpo PMP1C2 (como se menciona en la presente), y en que dichos al menos dos Nanocuerpos se unen de modo que el tiempo de distancia entre el extremo N-terminal y el extremo C-terminal de al menos dos Nanocuerpos anti-TNF es tal que la proteína o polipéptido es capaz de experimentar unión intramolecular (como se describe en la presente) con un trímero de TNFalfa. Preferentemente, en tal proteína o polipéptido, la distancia entre el extremo N-terminal y el extremo C-terminal dedos Nanocuerpos anti-TNF es al menos 50 Ángstrom, y más preferentemente en la región de 55-200 Ángstrom, y enparticular en la región de 65-150 Ángstrom.
En tal proteína o polipéptido de preferencia, los dos o más Nanocuerpos se pueden unir de cualquier modo adecuado, siempre que se puede obtener la distancia preferida entre el extremo N-terminal y el extremo C-terminal de al menos dos Nanocuerpos anti-TNF, y/o siempre que la proteína o polipéptido sea capaz de experimentar la unión intramolecular (como se describe en la presente) con un trímero de TNF-alfa.
Por ejemplo, en su forma más simple, al menos dos Nanocuerpos se unen directamente por medio de un ligador o espaciador adecuado que proporciona la distancia preferida entre el extremo N-terminal y el extremo C-terminal del al menos dos Nanocuerpos anti-TNF y que pueden permitir que la proteína o polipéptido experimente la unión intramolecular (como se describe en la presente) con un trímero de TNF. Los ligadores adecuados se describen en la presente, y pueden - por ejemplo y sin limitación – comprender una secuencia de aminoácidos, tal secuencia de aminoácidos preferentemente tiene una longitud de 14 aminoácidos, más preferentemente al menos 17 aminoácidos, tal como aproximadamente 20-40 secuencia de aminoácidos (que, usando una distancia promedio de 3,5 Angstrom paraun aminoácido, corresponde a las longitudes del ligador de 49 Ángstrom, 59,5 Ángstrom y aproximadamente 70Ángstrom, respectivamente; la máxima cantidad de aminoácidos se calcula de la misma manera sobre la base de las distancias mencionadas anteriormente). Preferentemente, tal secuencia de aminoácidos también debe ser tal que permita que la proteína o polipéptido experimente la unión intramolecular (como se describe en la presente) con un trímero de TNF-alfa,
En consecuencia, en otro aspecto, la invención proporciona una proteína o polipéptido multivalente o multiespecífica que comprende al menos dos Nanocuerpos contra TNF-alfa (y en particular del trímero de TNF-alfa), en que dichos Nanocuerpos preferentemente se dirigen a esencialmente el mismo epitope que el Nanocuerpo PMP1C2 (como se menciona en la presente), y en que dichos al menos dos Nanocuerpos se unen directamente entre si por medio de un ligador o espaciador adecuado de modo que la distancia entre el extremo N-terminal y el extremo C-terminal de al menos dos Nanocuerpos anti-TNF es tal que la proteína o polipéptido es capaz de experimentar la unión intramolecular (como se describe en la presente) con un trímero de TNF. Preferentemente, en tal proteína o polipéptido, la distancia entre el extremo N-terminal y el extremo C-terminal de dos Nanocuerpos anti-TNF (y de este modo la longitud preferidadel ligador o espaciador) es al menos 50 Ángstrom, y más preferentemente en la región de 55-200 Ángstrom, y enparticular en la región de 65-150 Ángstrom.
Más preferentemente, en este aspecto preferido, el ligador o espaciador es una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 14, preferentemente al menos 17, más preferentemente al menos 20 aminoácidos (con un límite superior no crítico elegido por razones de conveniencia que es aproximadamente 50, y preferentemente aproximadamente 40 aminoácidos). En una realización preferida, pero no limitante, el ligador consiste esencialmente en residuos de serina y glicina (que también se describe a continuación). Por ejemplo, un ligador adecuado es el ligador GS30 que se describe en la presente, que comprende 30 residuos de aminoácido.
En otra realización, el al menos dos Nanocuerpos contra TNF-alfa se ligan entre sí por medio de otro resto (opcionalmente por medio de uno o dos ligadores), tal como otra proteína o polipéptido. En esta realización, puede ser conveniente tener la distancia preferida (es decir, como se mencionó anteriormente) entre el extremo N-terminal y el extremo C-terminal de al menos dos Nanocuerpos anti-TNF, por ejemplo, de modo que la proteína o polipéptido todavía pueden experimentar unión intramolecular (como se describe en la presente) con un trímero de TNF. En esta realización, los al menos dos Nanocuerpos se pueden ligar directamente al otro residuo, o usar un ligador o espaciador adecuado, nuevamente siempre que aún se pueda lograr la distancia preferida y/o unión intramolecular deseada. El residuo puede ser cualquier residuo adecuado que no detraiga (demasiado) de la unión de la proteína o polipéptido al TNF y/o de las propiedades biológicas o farmacológicas deseadas de la proteína o polipéptido. Como tal, el residuo puede ser esencialmente inactivo o puede ser biológicamente activo, y como tal puede o no mejorar las propiedades deseadas de la proteína o polipéptido y/o pueden conferir una o más propiedades deseadas adicionales a la proteína o polipéptido. Por ejemplo, y sin limitación, el resto puede aumentar la vida media de la proteína o polipéptido, y/o puede reducir su inmunogenicidad o mejorar cualquier otra propiedad deseada.
En una realización preferida, el resto puede ser otro Nanocuerpo (que incluye pero sin limitación un tercer Nanocuerpo contra TNF-alfa, si bien esto no es necesario y usualmente menos preferido), y en particular otro Nanocuerpo que mejora la vida media de la proteína o polipéptido, tal como un Nanocuerpo que se dirige contra una proteína sérica, por ejemplo contra albúmina sérica humana. Los ejemplos de tales proteínas y polipéptidos se describen en la presente.
En consecuencia, en una realización, la invención se refiere a un constructo de multivalente multiespecífico que comprende dos o más secuencias de inmunoglobulina (o sus fragmentos adecuados) que se dirigen contra epitopes en TNF-alfa (por ejemplo del trímero de TNF-alfa) que se halla en y/o forma parte del sitio de unión al receptor, y que se unen entre sí por medio de al menos una secuencia de inmunoglobulina que proporciona aumento de la vida media (y opcionalmente por medio de uno o más ligadores adecuados), de modo que dicho polipéptido, después de la unión al trímero de TNF, es capaz de inhibir o reducir el entrecruzamiento del receptor de TNF y/o la transducción de señal que es mediada por dicho trímero de TNF. Tal polipéptido puede ser tal que dichas dos o más secuencias de inmunoglobulina mencionadas primero se pueden unir a un diferente sitio de unión al receptor en un trímero de TNF.
En particular, en esta realización, el polipéptido puede comprender un nanocuerpo biespecífico trivalente, que comprende dos Nanocuerpos que se dirigen contra epitopes sobre TNF-alfa (y en particular del trímero de TNF-alfa) que se halla en y/o forma parte del sitio de unión al receptor, en que dichos Nanocuerpos se unen entre sí por medio de un tercer Nanocuerpo que proporciona un aumento de la vida media (por ejemplo un Nanocuerpo que se dirige a una proteína sérica tal como albúmina sérica humana), en que cada uno de los dos Nanocuerpos mencionados primero se pueden unir directamente a dicho tercer Nanocuerpo o por medio de uno o más ligadores adecuados, de modo que dicho polipéptido, después de la unión a un trímero TNF, es capaz de inhibir o reducir el entrecruzamiento del receptor de TNF y/o la transducción de señales que está mediada por dicho trímero de TNF. Tal polipéptido puede ser tal que dichos dos Nanocuerpos mencionados primero se pueden unir a diferentes sitios de unión al receptor en un trímero de TNF. Nuevamente, algunos Nanocuerpos particularmente preferidos para usar en esta realización de la invención son PMP1C2 (TNF1, SEQ ID NO:52) y/o PMP5F10 (TNF3, SEQ ID NO: 60), así como variantes humanizadas y otras (como se describe en la presente); con PMP1C2 (TNF1, SEQ ID NO:52) y sus variantes humanizadas son particularmente preferidas; y los Nanocuerpos dirigidos contra albúmina sérica humana descriptos en la presente. Algunos constructos preferidos, pero no limitantes de esta realización de la invención son TNF 24 (SEQ ID NO: 90), TNF 27 (SEQ ID NO: 93), y TNF 60 (SEQ ID NO; 417) de los cuales TNF 60 es particularmente preferido. En consecuencia, algunos aspectos preferidos de esta realización de la invenció se refieren a:
XIX) Una proteína o polipéptido que comprende o consiste esencialmente en dos o más dominios variables de la inmunoglobulina (o sus fragmentos adecuados) que se dirigen contra epitopes sobre el trímero TNF-alfa (y en particular del trímero TNF-alfa) que se halla en y/o forma parte del sitio de unión al receptor(s) del trímero de TNF, de modo que dicho polipéptido, después de la unión a un trímero de TNF, es capaz de inhibir o reducir el Entrecruzamiento del receptor de TNF que está mediado por dicho trímero TNF y/o
la transducción de señal que está mediada por tal entrecruzamiento del receptor.
XX) Una proteína o polipéptido que comprende o consiste esencialmente en dos o más dominios variables de la inmunoglobulina (o sus fragmentos adecuados) que se dirigen contra epitopes sobre TNF-alfa (y en particular del trímero de TNF-alfa) que se halla en y/o forma parte del sitio de unión al receptor(s) del trímero de TNF, de modo que dicho polipéptido es capaz de experimentar unión intramolecular en al menos dos sitios de unión al receptor de TNF sobre un trímero de TNF.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que dichos dominios variables de la inmunoglobulina se unen entre sí de manera tal que la proteína o polipéptido es capaz de unirse en forma simultánea a dos o más sitios de unión al receptor en trímero de TNF único.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que dichos dominios variables de la inmunoglobulina son capaces de unirse al mismo epitope que el Nanocuerpo TNF1 (SEQ ID NO: 52).
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que dichos dominios variables de la inmunoglobulina son capaces de unirse contra el epitope dentro del sitio de unión al receptor del TNF del trímero de TNF que al menos comprende los siguientes residuos de aminoácidos: Gln en la posición 88 en el monómero A; Lys en la posición 90 en el monómero A y Glu en la posición 146 en el monómero B.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que dichos dominios variables de la inmunoglobulina son capaces de unirse contra el epitope dentro del sitio de unión al receptor del TNF del trímero de TNF que al menos comprende los siguientes residuos de aminoácidos: Gln en la posición 88 como monómero A; Lys en la posición 90 en el monómero A y Glu en la posición 146 en el monómero B; y que además comprende al menos uno, preferentemente dos o más, más preferentemente 5 o más, y preferentemente todos o esencialmente todos, los siguientes residuos de aminoácidos del monómero A de TNF-alfa: Gly en la posición 24, Gln en la posición 25, Thr en la posición 72, His en la posición 73, Val en la posición 74, Leu en la posición 75, Thr en la posición 77, Thr en la posición 79, He en la posición 83, Thr en la posición 89, Val en la posición 91. Aso en la posición 92, Ile en la posición 97, Arg en la posición 131, Glu en la posición 135, Ile en la posición 136, Asa en la posición 137, Arg en la posición 138, Pro en la posición 139, Asp en la posición 140 y los siguientes residuos en el monómero B: Pro en la posición 20, Arg en la posición 32, Lys en la posición 65, Lys en la posición 112, Tyr en la posición 1.15, Ala en la posición 145, Ser en la posición 147.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que dichos dominios variables de inmunoglobulina son capaces de unirse contra el epitope dentro del sitio de unión al receptor del TNF del trímero de TNF que al menos comprende los siguientes residuos de aminoácidos: Gln en la posición 88 en el monómero A; Lys en la posición 90 en el monómero A y Glu en la posición 146 en el monómero B; y que además comprende al menos uno, preferentemente dos o más, más preferentemente 5 o más y preferentemente todos o esencialmente todos, los siguientes residuos de aminoácidos del monómero A de TNF-alfa, Leu en la posición 75, Thr en la posición 77, Thr en la posición 79, Ile en la posición 80, Ser en la posición 81, Tyr en la posición 87, Thr en la posición 89, Val en la posición 91, Asn en la posición 92, Ser en la posición 95, Ile en la posición 97, Glu en la posición 135, Ile en la posición 136, Asn en la posición 137 y los siguientes residuos en el monómero B: Ala en la posición 33, Ala en la posición 145, Ser en la posición 147.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que al menos dos dominios variables de inmunoglobulina se unen de modo que la distancia entre el extremo N-terminal del primer dominio variable de la inmunoglobulina y el extremo C-terminal del segundo dominio variable de la inmunoglobulina presente en tal proteína o
polipéptido es al menos 50 Ángstrom.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que la distancia entre el extremo Nterminal primer dominio variable de la inmunoglobulina y el extremo C-terminal del segundo dominio variable de lainmunoglobulina esta entre 55-200 Ángstrom
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que la distancia entre el extremo Nterminal del primer dominio variable de la inmunoglobulina y el extremo C-terminal del segundo dominio variable de lainmunoglobulina está entre 65-150 Ángstrom
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el primer y segundo dominio variable de la inmunoglobulina se unen entre sí por medio de un ligador o espaciador.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el ligador o espaciador es una secuencia de aminoácidos.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el ligador o espaciador comprende al menos 14 residuos de aminoácidos.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el ligador o espaciador comprende al menos 17 - 50 residuos de aminoácidos.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el ligador o espaciador consiste esencialmente en residuos de serina y glicina.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el ligador o espaciador GS30 (SEQ ID NO: 69).
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el primer y segundo dominio variable de la inmunoglobulina se unen entre sí por medio de otro resto.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que dicho otro resto es resto de proteína o polipéptido.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que dicho otro resto confiere al menos una propiedad deseada a la proteína o polipéptido, o mejora al menos una propiedad deseada de la proteína o polipéptido.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que dicho otro resto aumenta la vida media de la proteína o polipéptido y/o reduce la inmunogenicidad de la proteína o polipéptido.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que cada una del primer y segundo dominio variable de la inmunoglobulina se unen a dicho otro resto por medio de un ligador o espaciador.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el ligador o espaciador es una secuencia de aminoácidos.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el ligador o espaciador consiste esencialmente en residuos de serina y glicina.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el dicho otro resto es un Nanocuerpo.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el otro resto es un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana es un Nanocuerpo humanizado.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana es una variante humanizada del nanocuerpo ALB I (SEQ ID NO: 63).
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana se elige de un grupo que consiste en ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB 5 (SEQ ID NO; 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB 8 (SEQ ID NO. 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) y ALB 10 (SEQ ID NO: 104).
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana es ALB 8.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el primer y segundo dominios variables de la inmunoglobulina son Nanocuerpos.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el primer y segundo dominios variables de inmunoglobulina son Nanocuerpos con una tasa de Koff para TNF mejor que 2.10-3 (1/s), preferentemente mejor de 1.10-3 (1/s); o una variante humanizada de tal Nanocuerpo.,
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el primer y segundo dominios variables de la inmunoglobulina son Nanocuerpos con un valor de EC50 en el ensayo basado en células usando células KYM descritas en el Ejemplo I, bajo 3), del documento WO 04/041862 que es mejor que el valor de EC50 del Nanocuerpo VHH E (SEQ ID NO:4) del documento WO 04/041862 del mismo ensayo; o una variante humanizada de tal Nanocuerpo.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el primer y segundo dominios variables de la inmunoglobulina son Nanocuerpos con un valor de EC50 en el ensayo basado en células por medio de células KY descritas en el Ejemplo 1, de acuerdo con 3), del documento WO 04/041862 que es mejor que 12 nM; o una variante humanizada de tal Nanocuerpo.
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el primer y segundo dominios variables de la inmunoglobulina son Nanocuerpos con un valor de EC50 en el ensayo basado en células por medio de células KYM descritas en el Ejemplo 1, de acuerdo con 3), del documento WO 04/041862 que es mejor que 3 nM; o una variante humanizada de tal Nanocuerpo.
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el primer y segundo dominios variables de inmunoglobulina son Nanocuerpos con un valor de EC50 en el ensayo basado en células por medio de células KYM descritas en el Ejemplo 1, de acuerdo con 3), del documento WO 04/041862 que es mejor que 3 nM; una variante humanizada de tal Nanocuerpo.
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el primer y segundo dominios variables de inmunoglobulina son Nanocuerpos de acuerdo con cualquier de XIX) a XX) anterior, que están humanizados;
algunos aspectos particularmente preferidos de esta realización son:
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el primer y segundo dominios variables de inmunoglobulina son Nanocuerpos clase GLEW.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el primer y segundo dominios variables de inmunoglobulina son Nanocuerpos con un residuo de arginina (R) en la posición 103.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el primer y segundo dominios variables de inmunoglobulina son Nanocuerpos clase GLEW con un residuo de arginina (R) en la posición 103.
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el primer y segundo dominios variables de inmunoglobulina son Nanocuerpos con al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) o 96 (TNF30)
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el primer y segundo dominios variables de la inmunoglobulina son Nanocuerpos que se describen para las proteínas o polipéptidos de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) en que:
a) CDR1 comprende:
-
secuencia de aminoácidos DYWMY; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos DYWMY; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene 2 o solo 1 diferencia de aminoácido con la secuencia de aminoácidos DYWMY;
y
b) CDR2 comprende:
-
la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene 2 o solo 1 diferencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG;
c) CDR3 comprende:
-
la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene 2 o solo 1 diferencia de aminoácido con la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior, en que el primer y segundo dominios variables de inmunoglobulina son Nanocuerpos descritos para las proteínas o polipéptidos de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) en que CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY.
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX), en que el primer y segundo dominios variables de inmunoglobulina son Nanocuerpos descritos para las proteínas o polipéptidos de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) en que CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG.
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX), en que el primer y segundo dominios variables de inmunoglobulina son Nanocuerpos descritos para las proteínas o polipéptidos de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) en que CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX), en que el primer y segundo dominios variables de la inmunoglobulina son Nanocuerpos descritos para las proteínas o polipéptidos de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) en que:
-
CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
-
CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; o
-CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; y CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX), en que el primer y segundo dominios variables de la inmunoglobulina son Nanocuerpos descritos para las proteínas o polipéptidos de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) en que CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX), en que el primer y segundo dominios variables de la inmunoglobulina son Nanocuerpos descritos para las proteínas o polipéptidos de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) en que CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY; CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG y CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX), en que el primer y segundo dominios variables de la inmunoglobulina son Nanocuerpos descritos para las proteínas o polipéptidos de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) en que
a) CDR1 es:
-
la secuencia de aminoácidos DYWMY; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos DYWMY; o una secuencia de aminoácidos que tiene 2 o solo 1 diferencia de aminoácido con la secuencia de aminoácidos DYWMY;
y en que:
b) CDR2 es:
-
la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene 2 o solo 1 diferencia de aminoácido con la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG;
y en que
c) CDR3 es:
-
la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene 2 o solo t diferencia de aminoácido con la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX), en que el primer y segundo dominios variables de inmunoglobulina son Nanocuerpos descritos para las proteínas o polipéptidos de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) en que CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY.
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX), en que el primer y segundo dominios variables de inmunoglobulina son Nanocuerpos descritos para las proteínas o polipéptidos de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) en que CDR2 es la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG.
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX), en que el primer y segundo dominios variables de inmunoglobulina son Nanocuerpos descritos para las proteínas o polipéptidos de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) en que CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX), en que el primer y segundo dominios variables de inmunoglobulina son Nanocuerpos descritos para las proteínas o polipéptidos de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) en que:
-
CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
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CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR2 es la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; o
-
CDR2 es la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; y CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX), en que el primer y segundo dominios variables de la inmunoglobulina son Nanocuerpos descritos para las proteínas o polipéptidos de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) en que CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX), en que el primer y segundo dominios variables de inmunoglobulina son Nanocuerpos descritos para las proteínas o polipéptidos de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) en que CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY; CDR2 es la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG y CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX), en que el primer y segundo dominios variables de la inmunoglobulina son Nanocuerpos descritos para las proteínas o polipéptidos de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) en que:
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cualquier sustitución de aminoácido es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido; y/o
-
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos.
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX, en que el primer y segundo dominios variables de la inmunoglobulina se eligen del grupo que consiste en el nanocuerpo TNF1 (SEQ ID NO: 52) y variantes humanizadas del nanocuerpo TNF 1 (SEQ ID NO: 52).
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX), en que el primer y segundo dominios variables de la inmunoglobulina. se eligen del grupo que consiste en T13 (SEQ ID NO: 76), TNF 14 (SEQ ID NO: 77), TNF 29 (SEQ ID NO: 95) y TNF 30 (SEQ ID NO:96).
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX), en que el primer y segundo dominios variables de la inmunoglobulina son TNF 30 (SEQ ID N0:96);
y algunos aspectos particularmente preferidos de esta realización son:
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX), en que el primer y segundo dominios variables de la inmunoglobulina son Nanocuerpos clase KERE.
Cabe destacar que cuando una proteína o polipéptido se mencionó anteriormente como que está "de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior”, está al menos de acuerdo con XIX) a XX), y puede estar de acuerdo con ambos XIX) y XX), y también puede incluir alguno o más de otros aspectos que se indican como que están "de acuerdo con cualquiera de XIX) a XX) anterior”.
Sin embargo, cabe mencionar que la invención no está limitada a cualquier mecanismo específico de acción o hipótesis. En particular, se ha hallado que los Nanocuerpos monovalentes de la invención también pueden ser activos en los ensayos y modelos descriptos en la presente, que confirman la unión intramolecular del trímero de TNF, si bien se prefiere en una realización específica de la invención, no se requiere para obtener la acción deseada y efecto de los Nanocuerpos, proteínas y polipéptidos descritos en la presente. De modo similar, también está comprendido dentro del alcance de la invención que las proteínas y polipéptidos que se describen en la presente obtienen acción deseada por medio de cualquier mecanismo apropiado (es decir, por unión intramolecular, unión intermolecular o incluso por unión a TNF monomérico, de este modo se inhibe la formación de TNF (trímeros).
También está dentro del alcance de la invención para usar partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos y/o derivados de los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención, y/o para usar proteínas o polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en los mismos, siempre que sean adecuados para los usos previstos en la presente. Tales partes, fragmentos, análogos, mutantes, variantes, alelos, derivados, proteínas y/o polipéptidos se describirán en la descripción adicional de la presente.
Los Nanocuerpos contra TNF-alfa descritos anteriormente y como se describen también más adelante en la presente también se denominan en la presente como Nanocuerpos de la invención.
La siguiente Tabla I lista las CDR y secuencias estructurales que están presentes en PMP1C2 (TNF1), un nanocuerpo de acuerdo con la invención.
Tabla 1: Combinaciones preferidas de secuencias estructurales y CDR (PMP1C2 es un nanocuerpo de acuerdo con la invención)
Tabla 1 (continuación): Tabla 1 (continuación): Tabla 1 (continuación):
Notas a la Tabla I:
-
ID se refiere a la SEQ ID NO en el listado de secuencias adjunto
-
Para CDR1: SEQ ID NO: 164 corresponde a la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 167 corresponde a las SEQ ID NO. 16; SEQ ID NO: 17 corresponde a las SEQ ID NO: 17, SEQ ID NOs: 165 y 166 corresponde las SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 170 corresponde a las SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 171 corresponde a las SEQ ID NO: 251, antt SEQ ID NOS: 168 y 169 corresponden a las SEQ ID NO: 21.
-
Para CDR2: SEQ ID NOS: 232 y 233 corresponde a las SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 235 corresponde a las SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 240 corresponde a la SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 234 corresponde a la SEQ ID NO: 25, las SEQ ID NOS: 236 y 237 corresponden a las SEQ ID NO 26, SEQ ID NO: 238 corresponde a las SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 239 corresponde a las SEQ ID NO: 28.
-
Para CDR3: SEQ ID NO: 303 corresponde a la SEQ ID NO: 29, la SEQ ID NO: 308 corresponde a la SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 306 corresponde a las SEQ ID NO: 31, la SEQ ID NO: 301 corresponde a las SEQ ID NO: 32, SEQ ID NOS: 304 y 305 corresponde a las SEQ ID NO: 33, SEQ 10 NO: 300 corresponde a las SEQ ID NO: 34, y SEQ ID NOS: 301 y 302 corresponden a las SEQ ID NO: 35.
En consecuencia, en los Nanocuerpos de la invención, al menos uno de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 presentes se elige de modo adecuado del grupo que consiste en las secuencias consisten en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID No: 164, SEQ ID No:232 y SEQ: 300, respectivamente, listada en la Tabla I; o del grupo de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEQ ID No: 164, SEQ ID No:232 y SEQ: 300, respectivamente, que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% "identidad de secuencia" (como se define en la presente) con al menos una de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID No: 164, SEQ ID No:232 y SEQ: 300, respectivamente, listada en la Tabla I; y/o del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con al menos una de las secuencias de SEQ ID No: 164, SEQ ID No:232 y SEQ: 300 respectivamente, listadas en la Tabla E. En este contexto, por "elegido adecuadamente" significa que, cuando sea aplicable, una secuencia de CDR1 se elige de las secuencias de CDR1 adecuadas (es decir como se define en la presente), una secuencia de CDR2 se elige de las secuencias de CDR2 adecuados (es decir como se define en la presente) y una secuencia de CDR3 se elige de la secuencias de CDR3 adecuadas (es decir como se define en la presente), respectivamente.
Aun más preferentemente, en los Nanocuerpos de la invención, las secuencias de los tres CDR1, CDR2 y CDR3 presentes se eligen adecuadamente del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEQ ID No: 164, SEQ ID No: 232 y SEQ ID NO; 300, respectivamente, listado en la Tabla I.
Asimismo, generalmente, se prefieren las combinaciones de CDR listadas de la Tabla I (es decir, los mencionados en la misma línea en la Tabla I).
Preferentemente, cuando una secuencia de CDR se elige adecuadamente del grupo de secuencias de CDR que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las secuencias de CDR listadas en la Tabla 1; y/o cuando una secuencia de CDR se elige adecuadamente del grupo que consiste en las secuencias de CDR que tienen 3, 2 o solo diferencias de aminoácidos) con una de las secuencias de CDR listadas en la Tabla 1:
i) cualquier sustitución de aminoácido es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente); y/o
ii) dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con la secuencia de CDR listada en la Tabla I.
De acuerdo con una realización no limitante pero no preferido de la invención, las secuencias de CDR en los Nanocuerpos de la invención son como se definieron anteriormente y también son tal que el nanocuerpo de la invención se une a la TNF-alfa con una constante de disociación (KD) de l0-5 a 10-12 moles/litro (M) o menos, y preferentemente 107 a 10-12 moles/litro (M) o menos y más preferentemente 10-8 a 10-12 moles/litro (M), y/o con una constante de asociación (KA) de al menos 107 M-1, preferentemente al menos 108 M-1, más preferentemente al menos 109 M-1, tal como al menos 1012 M-1, y en particular con una KD menos de 500 nM, preferentemente menos de 200, más preferentemente menos de 10 nM, tal como menos de 500 nM. Los valores de KD y KA del nanocuerpo de la invención contra TNF-alfa se puede determinar de una manera conocida per se, por ejemplo usando el ensayo descrito en la presente.
De acuerdo con otra realización preferida, pero no limitante de la invención (a) CDR1 tiene una longitud de entre 1 y 12 residuos de aminoácidos, y usualmente entre 2 y 9 residuos de aminoácidos, tal como 5, 6 o 7 residuos de aminoácidos; y/o (b) CDR,2 tiene una longitud de entre 13 y 24 residuos de aminoácidos, y usualmente entre 15 y 21 residuos de aminoácido, tal como 16 y 17 residuos de aminoácidos; y/o (c) CDR3 tiene una longitud de entre 2 y 35 residuos de aminoácidos, y usualmente entre 3 y 30 residuos de aminoácido, tal como entre 6 y 23 residuos de aminoácidos.
En un aspecto, la invención proporciona Nanocuerpos contra la TNF-alfa que se desempeñan mejor que el Nanocuerpo 3E, el Nanocuerpo de mejor desempeño de acuerdo con WO 04/041862.
Más específicamente, algunos aspectos preferidos descritos y/o reivindicados en la presente
XXI) Un Nanocuerpo contra TNF-alfa, que consiste en 4 regiones estructurales (FR1 a FR4 respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3 respectivamente}, que tiene una tasa Koff para Tyr de mejor que 2.10-3 (1/s), preferentemente menor que 1.10-3 (1/s); o una variante humanizada de tal Nanocuerpo.
XXIV) Un Nanocuerpo contra TNF-alfa, que tiene un valor de EC50 en el ensayo basado en células usando células KYM descritos en el Ejemplo 1, de acuerdo con 3), del documento WO 04/041862 que es mejor que 5 nM; o una variante humanizada de tal Nanocuerpo.
XXV) Un Nanocuerpo contra TNF-alfa, que tiene un valor de EC50 en el ensayo basado en células usando células KYM descritos en el Ejemplo 1, de acuerdo con 3), del documento WO 04/041862 que es mejor que 3 nM; o una variante humanizada de tal Nanocuerpo.
algunos aspectos particularmente preferidos son:
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Un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV) que es un Nanocuerpo de la clase GLEW.
-
Un Nanocuerpo de con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV) que contiene un residuo de arginina (R) en la posición
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV) que es un Nanocuerpo humanizado.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV) que contiene un residuo de leucina (L) en la posición 108.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV) que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente 95%, más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos de (SEQ ID) NOs: 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) o 96 (TNF30).
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV), en que CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR3 comprende las secuencia de aminoácido SPSGFN.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV), en que CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos de EINTNGLITKYPDSVKG
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV), en que CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV), en que
-
CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
-
CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; o
-
CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; y CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV), en que CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV), en que CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY; CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG y CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV), en que: a) CDR1 es:
-
la secuencia de aminoácidos DYWMY; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos DYWMY; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene 2 o solo 1 diferencia de aminoácido con la secuencia de aminoácidos DYWMY;
y en que: b) CDR2 es:
-
la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 50%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene 2 o solo I diferencia de aminoácidos) con la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG;
y en que c) CDR3 es:
-
la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun con más preferencia al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene 2 o solo 1 diferencia de aminoácido con la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV), en que CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY;
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV), en que CDR2 es la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV), en que CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV), en que:
-
CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
-
CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR2 es la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; o
-
CDR2 es la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; y CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV), CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN,
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Un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV), en que CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY; CDR2 es la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG y CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
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Un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV), en que
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cualquier sustitución de aminoácido es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácidos; y/o
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dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos.
y algunos otros aspectos particularmente preferidos son:
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Un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV), que es un Nanocuerpo de clase KERE. Un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV), en que
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cualquier sustitución de aminoácido es preferentemente a sustitución conservadora de aminoácido; y/o
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dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos.
Un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV), que es un Nanocuerpo humanizado.
y con aún algunos otros aspectos particularmente preferidos son:
XXVI) Una proteína o polipéptido, que comprende o consiste esencialmente en al menos un Nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV).
XXVII) Una proteína o polipéptido, que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV).
XXVIII) Una proteína o polipéptido, que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV)
y que es tal que dicha proteína o polipéptido, después de la unión a un trímero TNF, es capaz de inhibir o reducir el entrecruzamiento del receptor de TNF que está mediado por dicho trímero de TNF y/o las transducción de señal que está mediada por tal entrecruzamiento del receptor.
XXIX) Una proteína o polipéptido, que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV), y que es capaz de experimentar la unión intramolecular a al menos dos TNF sitios de unión al receptor en un Trímero de TNF.
XXX) Una proteína o polipéptido, que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV), unido por medio de un ligador adecuado.
XXXI)Una proteína o polipéptido, que comprende dos Nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV), unido por medio de un ligador adecuado, y que está pegilado.
XXXII) Una proteína o polipéptido que comprende dos Nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV), y que además comprende al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana.
XXXIII) Una proteína o polipéptido que comprende dos Nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV) y que además comprende al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana, y que es tal que dicha proteína o polipéptido, después de la unión a un trímero de TNF, es capaz de inhibir o reducir el entrecruzamiento del receptor de TNF que está mediado por dicho trímero TNF y/o la transducción de señal que está mediada por tal entrecruzamiento del receptor.
XXXIV) Una proteína o polipéptido que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV) que además comprende al menos un Nanocuerpo
dirigido contra albúmina sérica humana y que es capaz de experimentar unión intramolecular a al menos dos sitios de unión al receptor de TNF en los trímeros de TNF.
XXXV) Una proteína o polipéptido que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV) y que además comprende un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana, en que cada uno de los dos Nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV) está unido, opcionalmente por medio de un ligador adecuado al Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana,
XXXVI) Una proteína o polipéptido que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV) y que además comprende un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana, en que cada uno de los dos Nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV) y que además comprende al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana, y que es tal que dicha proteína o polipéptido, después de la unión a un trímero de TNF, es capaz de inhibir o reducir el entrecruzamiento del receptor de TNF que está mediado por dicho trímero TNF y/o la transducción de señal que está mediada por tal entrecruzamiento del receptor.
XXXVII) Una proteína o polipéptido que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV) que además comprende al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana en que cada uno de los dos Nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV) está unido, opcionalmente por medio de un ligador adecuado, al Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana, y que es capaz de experimentar unión intramolecular a al menos dos sitios de unión al receptor en un trímero TNF.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XXVI) a XXXVII) en que el al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana es un nanocuerpo humanizado.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XXVI) a XXXVII), en que el al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana es una variante humanizada del nanocuerpo ALB 1 (SEQ ID NO: 63).
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XXVI) a XXXVII), en que al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana es uno seleccionado del grupo que consiste en ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB 5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB 8 (SEQ, ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) y ALB 10 (SEQ ID NO: 104).
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XXVI) a XXXVII), en que al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana es ALB 8.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XXVI) a XXXVII), que comprende o consiste esencialmente en dos Nanocuerpos humanizados de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV) y una variante humanizada del nanocuerpo ALB 1(SEQ ID NO: 63).
Cabe mencionar que cuando un Nanocuerpo se menciona anteriormente como "de acuerdo con cualquiera de XXI), XXIV) o XXV) anterior", está al menos de acuerdo con uno de XXI), XXIV) o XXV), puede estar de acuerdo con dos o más de XXI), XXIV) o XXV), y también pueden incluir alguno o más de los otros aspectos que se indican como que están "de acuerdo con alguno de XXI), XXIV) o XXV) anterior”. De modo similar, cuando una proteína o polipéptido se menciona anteriormente como ser "de acuerdo con cualquiera de XXVI a XXXVI anterior", está al menos de acuerdo con uno de XXVI a XXXVI), puede estar de acuerdo con dos o más de XXVI a XXXVI), y también puede incluir alguno o más de los otros aspectos que se indican como que están "de acuerdo con cualquiera de XXVI a XXXVI) anterior.
Se ha hallado que un clon particularmente útil como un anticuerpo anti-TNF es el clon PMP1C2 (TNF1). Como se puede observar a partir de los datos comparativos del ensayo de KYM en la Tabla 39, TNF1 tiene un valor de EC50 que es más de 4 veces mejor que el mejor Nanocuerpo monovalente descrito en WO 04/41862 (Nanocuerpo 3E), es decir 2,466 nM para PMP1C2 versus 12 nM para 3E (como se puede observar a partir de la Tabla 39, todos los Nanocuerpos TNF1 a TNF 9 de la invención dieron un valor mejor de EC50 en este ensayo que 3E). En este aspecto, también se debe indicar que el Nanocuerpo 3E de WO 04/41862 pertenece a la "clase KERE" (como se describe en la presente), y en consecuencia se puede humanizar en un grado menor que el Nanocuerpo PMP1C2 (que pertenece a la "clase GLEW"). Cuando el Nanocuerpo PMP1C2 se compara con el nanocuerpo 1A de WO 04/41862, un Nanocuerpo clase GLEW con el mayor grado de homología de secuencia con PMP1C2 (tanto en las CDR como las estructuras), el valor de E50 obtenido para PMP1C2 en el ensayo KYM es más de 50 veces mejor, es decir 2,466 nM para PMP1C2 en comparación con 100 nM para 1A.
Por consiguiente, los Nanocuerpos descritos y reivindicados en la presente comprenden uno o más, preferentemente dos y más preferentemente los tres CDR presentes en el clon PMP1C2 (o secuencias de CDR que derivan de estas o corresponden a estas) son particularmente preferidos en la invención. Asimismo, estos Nanocuerpos preferentemente pertenecen el "grupo 103 P,R,S" (como se define en la presente), y con máxima preferencia tienen un R en la posición 103, y preferentemente también tienen una secuencia GLEW o tipo GLEW en las posiciones 44-47. Asimismo, cuando dos estos nanocuerpos pertenecen al "grupo 103 P,R,S" (y en particular cuando tienen un R en la posición 103), una sustitución humanizante preferida pero no limitante es 108Q a 108L. Otras sustituciones humanizantes limitantes pero no preferidas en estos Nanocuerpos son una o más de los presentes en las variantes humanizadas de TNF1 que se describen en la presente, tal como TNF13, TNF14, TNF29 o TNF30, que serán inmediatamente evidentes a partir de una comparación entre la secuencia de TIF1 y estas secuencias humanizadas.
En consecuencia, en un nanocuerpo particularmente preferido de la invención, al menos una de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 se elige adecuadamente del grupo que consiste en la secuencia de CDR1 de la SEQ ID NO: 164, la secuencia de CDR2 de SEQ ID NO: 232, y la secuencia de CDR3 de SEQ ID NO: 300, respectivamente (es decir las secuencias de CDR presentes en el clon TNF1), o del grupo de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de "identidad de secuencia" (como se define en la presente) con la secuencia de CDR1 de la SEQ ID NO: 164, la secuencia de CDR2 de SEQ ID NO: 232, y la secuencia de CDR3 de la SEQ ID NO: 300, respectivamente; y/o del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con la secuencia de CDR1 de la SEQ ID NO: 164, la secuencia de CDR2 de SEQ ID NO: 232., y la secuencia de CDR3 de SEQ ID NC: 300, respectivamente,
Preferentemente, en estos Nanocuerpos preferidos de la invención, al menos dos de las secuencias de CDR1, CD2 y CDR3 presentes se eligen adecuadamente del grupo que consiste en la secuencia de CDR1 de la SEQ ID NO: 164, la secuencia de CDR2 de la SEQ ID NO: 232, y la secuencia de CDR3 de la SEQ ID NO: 300, respectivamente (es decir las secuencias de CDR presentes en el clon TNF1), o del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de CDR1 de la SEQ ID NO: 164, la secuencia de CDR2 de la SEQ ID NO: 232, y la secuencia de CDR3 de la SEQ ID NO: 300, respectivamente; y/o del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" con la secuencia de CDR1 de la SEQ ID NO: 164, la secuencia de CDR2 de la SEQ ID NO: 232, y la secuencia de CDR3 de la SEQ ID NO: 300, respectivamente.
Con máxima preferencia, en estos Nanocuerpos preferidos de la invención, las tres secuencias CDR1, CDR2 y CDR3 presentes se eligen adecuadamente del grupo que consiste en la secuencia de CDR1 de la SEQ ID NO: 164, la secuencia de CDR2 de la SEQ ID NO: 232, y la secuencia de CDR3 de la SEQ ID NO: 300, respectivamente (es decir las secuencias de CDR presentes en el clon TNF1), o del grupo de secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de CDR1 de la SEQ ID NO: 164, la secuencia de CDR2 de la SEQ ID NO: 232, y la secuencia de CDR3 de la SEQ ID NO: 300, respectivamente; y/o del grupo que consiste en las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente, que tienen 3, 2 o solo 1 diferencia de aminoácido con la secuencia de CDR1 de la SEQ ID NO: 164, la secuencia de CDR2 de la SEQ ID NO: 232, y la secuencia de CDR3 de la SEQ ID NO: 300, respectivamente.
Aun más preferentemente, en estos Nanocuerpos preferidos de la invención, al menos una de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 presentes se elige adecuadamente del grupo que consiste en la secuencia de CDR1 de la SEQ ID NO: 164, la secuencia de CDR2 de la SEQ ID NO: 232, y la secuencia de CDR3 de la SEQ ID NO: 300, respectivamente (es decir las secuencias de CDR presentes en el clon TNF1). Preferentemente, en esta realización, al menos uno o preferentemente las otras dos secuencias de CDR presentes se eligen adecuadamente de las secuencias de CDR que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de CDR1 de la SEQ ID NO: 164, la secuencia de CDR2 de la SEQ ID NO: 232, y la secuencia de CDR3 de la SEQ ID NO: 300, respectivamente; y/o se eligen adecuadamente del grupo que consiste en las secuencias de CDR que tienen 3, 2 o solo 1 diferencia de aminoácido con la secuencia de CDR1 de la SEQ ID NO: 164, la secuencia de CDR2 de la SEQ ID NO: 232, y la secuencia de CDR3 de la SEQ ID NO: 300, respectivamente.
Aun más preferentemente, en estos Nanocuerpos preferidos de la invención, al menos dos de las secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 presentes se eligen adecuadamente del grupo que consiste en la secuencia de CDR1 de la SEQ ID NO: 164, la secuencia de CDR2 de la SEQ ID NO: 232, y la secuencia de CDR3 de la SEQ ID NO: 300, respectivamente (es decir, las secuencias de CDR presentes en el clon TNF1). Preferentemente, en esta realización, La restante secuencia de CDR presente se eligen adecuadamente del grupo de las secuencias de CDR que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95% aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de CDR1 de la SEQ ID NO: 164, la secuencia de CDR2 de la SEQ ID NO: 232, y la secuencia de CDR3 de la SEQ ID NO: 300, respectivamente; y/o del grupo que consiste en secuencias de CDR que tienen 3, 2 o solo 1 diferencia de aminoácido) con la secuencia de CDR1 de la SEQ ID NO: 164, la secuencia de CDR2 de la SEQ ID NO: 232, y la secuencia de CDR3 de la SEQ U) NO: 300, respectivamente.
Los nanocuerpos particularmente preferidos de la invención comprenden la secuencia de CDR1 de la SEQ ID NO: 164, la secuencia de CDR2 de la SEQ ID NO: 232, y la secuencia de CDR3 de la SEQ ID NO: 300, respectivamente (es decir la secuencias de CDR presente en el clon TNF1).
Los Nanocuerpos con las anteriores secuencias de CDR preferentemente tienen secuencias estructurales que son como también se definen en la presente. Algunas combinaciones preferidas, pero no limitantes de las secuencias estructurales se pueden observar en la Tabla I anterior. Como será evidente para los expertos, usualmente se preferirá una combinación de las secuencias de FR1, FR2, FR3 y FR4 que se producen en el mismo clon (es decir, secuencias de FR1, FR2, FR3 y FR4 que se mencionan en la misma línea de la Tabla I) (si bien la invención en su sentido más amplio no se limita a esto, y también comprende otras combinaciones adecuadas de las secuencias estructurales mencionadas en la Tabla I).
Más específicamente, algunos aspectos preferidos descritos y reivindicados en la presente son:
XXXVIII) Un Nanocuerpo contra TNF-alfa, que consiste en 4 regiones estructurales (FR1 a FR4 respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3 respectivamente), en que:
a) CDR1 comprende:
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la secuencia de aminoácidos DYWMY; o
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una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos DYWMY; o una secuencia de aminoácidos que tiene solo 1 diferencia de aminoácido con la secuencia de aminoácidos DYWMY;
y
b) CDR2 comprende:
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la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; o
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una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos
EINTNGLITKYPDSVKG; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene 2 o solo 1 diferencia de aminoácido con la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG;
y c) CDR3 comprende:
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la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
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una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
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una secuencia de aminoácidos que tiene solo 1 diferencia de aminoácido con la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXVIII), en que CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY.
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXVIII), en que CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG.
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXVIII), en que CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXVIII) de acuerdo con XXXVIII) en que: -CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYW'; y CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
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CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; o
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CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; y CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con VIII), en que CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXVIII) en que CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY; CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG y CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXVIII, en que
-
cualquier sustitución de aminoácido es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido; y/o
-
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con la anterior secuencia de aminoácido.
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXVIII, que es un Nanocuerpo de clase GLEW.
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXVIII, que contiene un residuo de arginina (R) en la posición 103.
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXVIII, que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aún más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nos 52 (TFN1), 76 (TNF13), 77 (TNFl4), 95 (TNF29) o 96 (7NF30).
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXVIII, que es un Nanocuerpo humanizado.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXVIII, que contiene un residuo de leucina (L) en la posición 108.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXVIII, que tiene una tasa de Koff para el TNF de mejor que 2.10-3 (1/s), preferentemente mejor que 1.10-3 (1/s); o una variante humanizada de tal Nanocuerpo;
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXVIII, que tiene un valor de EC50 en el ensayo basado en células usando células KYM descriptos en el Ejemplo 1, de acuerdo con 3), del documento WO 04/041862 que es mejor que 5 nM; o una variante humanizada de tal Nanocuerpo.
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXVIII que tiene un valor de EC50 en el ensayo basado en células usando células KYM descriptos en el Ejemplo 1, de acuerdo con 3), del documento WO 04/041862 que es mejor que 3 nM; o una variante humanizada de tal Nanocuerpo.
XXXIX) Un Nanocuerpo contra TNF-alfa descripto y reivindicado en la presente, que consiste en 4 regiones estructurales (FR1 a FR4 respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3 respectivamente), en que
a) CDR1 es:
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la secuencia de aminoácidos DYWMY; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene al menos SE}%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos DYWMY; o
una secuencia de aminoácidos solo tiene 1 diferencia de aminoácido con la secuencia de aminoácidos DYWMY; y en que: b) CDR 2 es:
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la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene 2 o solo 1 diferencia de aminoácido con la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG;
y en que e) CDR3 es:
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la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
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una secuencia de aminoácidos que tiene solo 1 diferencia de aminoácido con la secuencia de aminoácidos SPSGFN. -- Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXIX) en que CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY.
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXIX), en que CDR2 es la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG.
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXIX), en que CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXIX), en que: ´- CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
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CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR2 es la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; o
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CDR2 es la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; y CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN
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Un Nanocuerpo acuerdo con XXXIX), en que CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXIX), en que CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY; CDR2 es la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG y CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXIX), en que:
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cualquier sustitución de aminoácido es preferentemente a sustitución conservadora de aminoácido; y/o
-
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXIX), que es un nanocuerpo de clase GLEW.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXIX), que contiene un residuo de arginina (R) en la posición 103.
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXIX), que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NOs 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14); 95 (TNF29) o 96 (TNF30).
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXIX), que es un Nanocuerpo humanizado.
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXIX), que contiene un residuo de leucina (L) en la posición 108.
-
Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXIX), que tiene una tasa de Koff para TNF mejor e 2.10-3 (l/s), preferentemente mejor que 1.10-3 (l/s); o una variante humanizada de tal Nanocuerpo.
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXIX), que tiene un valor de EC50 en el ensayo basado en células usando células KYM descritas en el Ejemplo 1, de acuerdo con 3) del documento WO 04/041862 que es mejor que 5 nM; o una variante humanizada de tal Nanocuerpo.
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXIX), que tiene un valor de EC50 en el ensayo basado en células usando células KYM descritas en el Ejemplo 1, de acuerdo con 3) del documento WO 04/041862 que es mejor que 3 nM; o una variante humanizada de tal Nanocuerpo.
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXIX) se elige del grupo que consiste en TNF 13 (SEQ ID NO: 76), TNF 14 (SEQ ID NO: 77), TNF 29 (SEQ ID NO: 95) y TNF 30 (SEQ ID NO: 96).
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Un Nanocuerpo de acuerdo con XXXIX), que es TNF 30 (SEQ ID NO; 96);
algunos otros aspectos preferidos son:
XL) Una proteína o polipéptido, que comprende o consiste esencialmente en un Nanocuerpo de acuerdo con XXXVII) o XXXIX) o
XLI) Una proteína o polipéptido, que comprende o consiste esencialmente en al menos un Nanocuerpo de acuerdo con XXXVII) o XXXIX),
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI), que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con XXXVII) o XXXIX). - Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI), que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con XXXVIII) o XXXIX), y que es tal que dicha proteína o polipéptido, después de la unión a un trímero de TNF, es capaz de inhibir o reducir el entrecruzamiento del receptor de TNF que está mediado por dicho trímero de TNF y/o la transducción de señales que está mediada por tal entrecruzamiento del receptor.
-
Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI), que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con XXXVIII) o XXXIX), y que es capaz de experimentar unión intramolecular a al menos dos sitios de unión al receptor de TNF sobre un trímero TNF.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI), que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con XXXVIII) o XXXIX), que se unen directamente entre sí o se ligan entre sí por medio de un ligador.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI), que comprende dos Nanocuerpos de acuerdo con XXXVIII) o XXXIX), que se unen entre sí por medio de una secuencia de aminoácidos.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI), que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con XXVXVIII) o XXXIX), que se unen entre sí por medio de una secuencia de aminoácidos (tal como, sin limitación, una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de serina y glicina) que comprende al menos 14 aminoácidos, más preferentemente al menos 17 aminoácidos, tal como aproximadamente 20-40 aminoácidos (tal como el ligador GS30).
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI), que comprende o consiste esencialmente en el polipéptido TNF 7 (SEQ ID NO: 73), en que ambos Nanocuerpos TNF han sido humanizados.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI), que comprende o consiste esencialmente en el polipéptido TNF 55 (SEQ ID NO: 419) o TNF 56 (SEQ ID NO: 420).
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI), que está pegilado.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI), que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con XXXVIII) o XXXIX), y que es tal que dicha proteína o polipéptido, después de la unión a un trímero TNF, es capaz de inhibir o reducir el entrecruzamiento del receptor de TNF que está mediado por dicho trímero de TNF y/o la transducción de señal que está mediada por tal entrecruzamiento del receptor; y/o que es tal que dicha proteína o polipéptido es capaz de experimentar unión intramolecular a al menos dos sitios de unión del receptor TNF en un trímero de TNF, y tal proteína o polipéptido también comprende al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XL) o )(LA, que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con XXXVIII) o XXXIX), y tal proteína o polipéptido además comprende al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana, en que los dos Nanocuerpos de acuerdo con XXXVIII) o XXXIX) se unen entre sí por medio de al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana, y en que los dos Nanocuerpos de acuerdo con XXXVIII) o XXXIX) se ligan directamente a al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana, o se unen a al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana por medio de un ligador.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI), que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con XXXVIII) o XXXIX), y tal proteína o polipéptido además comprende al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana, en que los dos Nanocuerpos de acuerdo con XXXVIII) o XXXIX) se unen entre sí por medio de al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana, y en que los dos Nanocuerpos de acuerdo con XXXVIII) o XXXIX) se unen directamente a al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana, o se unen a al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana por medio de un ligador, en que el ligador es una secuencia de aminoácidos (tal como, sin limitación, un ligador que comprende residuos de serina y glicina), y en particular una secuencia de aminoácidos que comprende entre 3 y 40 residuos de aminoácidos, tal como entre 5 y 15 residuos de aminoácidos (tal como el ligador GS9).
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI), que comprende dos Nanocuerpos de acuerdo con XXXVIII) o XXDUX), y tal proteína o polipéptido además comprende al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana, en que los dos Nanocuerpos de acuerdo con XXXVIII) o XXXIX) se unen entre sí por medio de al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana, y en que los dos Nanocuerpos de acuerdo con XXXVIII) o XXXIX) se unen directamente a al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana, o se unen a al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana por medio de un ligador, y que la proteína o polipéptido es tal que dicha proteína o polipéptido, después de la unión a un trímero de TNF, es capaz de inhibir o reducir el entrecruzamiento del receptor de TNF que está mediado por dicho trímero de TNF y/o la transducción de señal que está mediado por tal entrecruzamiento del receptor; y/o que la proteína o polipéptido es tal que dicha proteína o polipéptido es capaz de experimentar unión intramolecular a al menos dos sitios de unión del receptor TNF on a trímero TNF.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI), en que el al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana es un Nanocuerpo humanizado.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI), en que al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana es una variante humanizada del nanocuerpo ALB 1 (SE() ID NO: 63).
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI), en que el al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana se elige de un grupo que consiste en ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB 5 (SEC) ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB 8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) y ALB 10 (SEQ ID NO: 104).
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI), en que el al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana es ALB 8.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI), que comprende o consiste esencialmente en dos Nanocuerpos humanizados de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI) y una variante humanizada del nanocuerpo ALB 1(SEQ ID NO: 63).
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI), que comprende o consiste esencialmente en el polipéptido TNF24 (SEQ ID NO: 90), en que el nanocuerpo TNF 1 así como el nanocuerpo ALB 1 se ha humanizado.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI), que comprende o consiste esencialmente en dos Nanocuerpos TNF 30 y un Nanocuerpo ALB 8.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI), que comprende o consiste esencialmente en el polipéptido TNF 60 (SEQ ID NO: 417).
Cabe mencionar que cuando un Nanocuerpo se menciona anteriormente como "de acuerdo con XXXVIII” o “de acuerdo con XXXIX", está al menos de acuerdo con uno de XXXVIII) o XXXIX), y también puede incluir alguno o más de otros aspectos que se indican como que están "de acuerdo con XXXVIII" o "de acuerdo con XXXIX" anteriormente. De modo similar, cuando se mencionó anteriormente una proteína o polipéptido como que está "de acuerdo con cualquiera de XL)
o XLI)", está al menos de acuerdo con uno de XL) a XLI), puede estar de acuerdo con dos o más de VI) a XVIII), y también puede incluir alguno o más de los otros aspectos que se indican como "de acuerdo con cualquiera de XL) o XLI) anterior.
Para los Nanocuerpos basados en el Nanocuerpo TNF1 anterior (que incluyen pero sin limitación los Nanocuerpos humanizados), las secuencias estructurales generalmente se pueden describir en la presente, y preferentemente son las siguientes:
a) FR1 comprende o es:
-
la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 130;o
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una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 130; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene solo 1 diferencia de aminoácido con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 130;
y
b) FR2 comprende o es:
-
la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 198; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 198; o una secuencia de aminoácidos que tiene 2 o solo I diferencia de aminoácido con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 198;
y
c) FR3 comprende o es:
-
la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 266; o
-
una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 266; o una secuencia de aminoácidos que tiene solo 1 diferencia de aminoácido con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 266.
y
d) FR4 comprende o es:
-
la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 334; o
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una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 334; o una secuencia de aminoácidos que tiene solo 1 diferencia de aminoácido con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 334;
en que la diferencia de aminoácidos presentes en las secuencias estructurales son más preferentemente como se describe en la presente.
En otro aspecto, la invención se refiere a un Nanocuerpo con una secuencia de aminoácidos que se elige del grupo que consiste en SEQ ID NOs. 52, 76, 77, 95 o 96.
Con máxima preferencia, los Nanocuerpos de la invención se eligen del grupo que consiste en la SEQ ID Nos 76, 77, 95
o Se prefieren particularmente las variantes humanizadas del clon PMP1C2 (TFN1; SEQ ID NO: 52). Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de tales variantes humanizadas son los clones TNF13 (SEQ ID NO: 76), TNF14 (SEQ ID NO.:77), TNF29 (SEQ ID NO: 95) y TNF 30 (SEQ ID NO: 96). En consecuencia, en un aspecto preferido, la invención se refiere a un Nanocuerpo humanizado con una secuencia de aminoácidos que se elige del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 76, 77, 95 o 96.
Algunos aspectos preferidos de esta realización de la invención son:
LI) Una variante humanizada del nanocuerpo TNF 1, que tiene un valor de EC50 en el ensayo basado en células que usa células KYM descritas en el Ejemplo 1, de acuerdo con 3), del documento WO 04/041862 que es mejor que 5 nM.
LI) Una variante humanizada del nanocuerpo TNF 1, que tiene un valor de EC50 en el ensayo basado en células que usa células KYM descritas en el Ejemplo 1, de acuerdo con 3), del documento WO 04/041862 que es mejor que 3 nM.
LIII) Una proteína o polipéptido, que comprende o consiste esencialmente en al menos un Nanocuerpo que es una variante humanizada del nanocuerpo TNF 1 de acuerdo con cualquiera de LI) a LII).
LIV) Una proteína o polipéptido, que comprende o consiste esencialmente en dos Nanocuerpos que son variantes humanizadas del nanocuerpo TNF I de acuerdo con cualquiera de LI) a LII) (opcionalmente unido por medio de un ligador),
LV) Una proteína o polipéptido, que comprende o consiste esencialmente en dos Nanocuerpos que son variantes humanizadas del nanocuerpo TNF1 de acuerdo con cualquiera de LI) a LII) (opcionalmente unido por medio de un ligador), y que es tal que dicha proteína o polipéptido, después de la unión a un trímero de TNF, es capaz de inhibir o reducir el entrecruzamiento del receptor de TNF que está mediado por dicho trímero de TNF y/o la transducción de señal está mediada por tal entrecruzamiento del receptor.
LVI) Una proteína o polipéptido, que comprende o consiste esencialmente en dos Nanocuerpos que son variantes humanizadas del nanocuerpo TNF1 de acuerdo con cualquiera de LI) a LII) que es capaz de experimentar unión intramolecular a al menos dos sitios de unión al receptor de TNF sobre un trímero de TNF.
LVII) Una proteína o polipéptido que comprende o consiste esencialmente en el polipéptido TNF7 (SEQ ID NO: 73), en que ambos Nanocuerpos TNF1 se han humanizado.
LVIII) Una proteína o polipéptido que comprende o consiste esencialmente en el polipéptido TNF7 (SEQ ID NO: 73), en que ambos Nanocuerpos TNF1 se han humanizado, y que están pegilados.
LIX) Una proteína o polipéptido, que comprende o consiste esencialmente en dos Nanocuerpos que son variantes humanizadas del nanocuerpo TNF 1 de acuerdo con cualquiera de LI) a LII) y que además comprende al menos un Nanocuerpo dirigido contra la albúmina sérica humana.
LX) Una proteína o polipéptido, que comprende o consiste esencialmente en dos Nanocuerpos que son variantes humanizadas del nanocuerpo TNF 1 de acuerdo con cualquiera de LI) a LII), que están unidas (opcionalmente unidas por medio de un ligador) a un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de LIII) a LX), en que al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana es un Nanocuerpo humanizado.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de LIII) a LX), en que al menos un Nanocuerpo dirigido contra la albúmina sérica humana es una variante humanizada del nanocuerpo ALB 1 (SEQ ID NO: 63).
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de LIII) a LX), en que el al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana se elige de un grupo que consiste en ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB 5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB 8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) y ALB 10 (SEQ ID NO: 104).
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de LIII) a LX), en que el al menos un Nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana es ALB 8.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de LIII) a LX), que comprende o consiste esencialmente en el polipéptido TNF24 (SEQ ID NO: 90), en que el nanocuerpo TNF 1 así como el nanocuerpo ALB TNF 1 se han humanizado.
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Una proteína o polipéptido de acuerdo con cualquiera de LIII) a LX), que comprende o consiste esencialmente en dos Nanocuerpos TNF 30 y un Nanocuerpo ALB 8.
En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido que comprende o consiste esencialmente en al menos un Nanocuerpo contra TNF-alfa como se define en la presente, Tales polipéptidos también se denominan en la presente como "polipéptidos de la invención" y pueden ser como se describe adicionalmente más adelante en la presente y/o como se describe generalmente en el documento WO 04/041862 para los Nanocuerpos desvelados en la presente y por ejemplo, pueden ser polipéptidos multivalentes o polipéptidos multiespecíficos, nuevamente como se describen adicionalmente más adelante en la presente.
Preferentemente, un polipéptido de la invención es bivalente o trivalente (es decir, que comprende dos o tres Nanocuerpos de la invención, respectivamente, opcionalmente ligados por medio de uno o dos ligadors que se definen más adelante, respectivamente) o un polipéptido multiespecífico, que comprende uno o dos, y preferentemente dos, Nanocuerpos de la invención y al menos un Nanocuerpo dirigido contra una proteína sérica, y en particular contra una proteína sérica humana, tal como contra albúmina sérica humana.
En una realización preferida, pero no limitante, los Nanocuerpos de la invención presentes en los polipéptidos de la invención se eligen del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 52 a 60 y SEQ ID NOs 105-129 o de sus variantes humanizadas, y en particular de los Nanocuerpos “humanizados” de la SEQ ID NOs 76 a 86 y SEQ ID NOs: 95 a 99. Los Nanocuerpos contra albúmina sérica humana presentes en los polipéptidos de la invención son preferentemente como se definen a continuación, más preferentemente se eligen del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 61 a 67, SEQ ID) NOs: 87 a 89 y SEQ ID NOs: 100-104, y en particular de los Nanocuerpos “humanizados” contra albúmina sérica humana de la SEQ ID NOs 76 a 86 y SEQ ID NOs 100-104.
Con respecto a los Nanocuerpos que están presentes en los polipéptidos de la invención, será evidente para los expertos que los Nanocuerpos que se mencionan en la presente como “preferidos" (o como "más preferidos", "aun más preferidos", etc.) también son preferidos (o más preferidos, o aun más preferidos, etc.) para el uso en los polipéptidos descritos en la presente. En consecuencia, los polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en uno o más Nanocuerpos "preferidos" de la invención se preferirán generalmente, y los polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en uno o más Nanocuerpos "más preferidos" de la invención generalmente serán más preferidos, etc.
En consecuencia, en la invención, los polipéptidos que comprenden uno o más Nanocuerpos que consisten esencialmente en una de las variantes preferidas del clon PMP1C2 (TNF 1; SEQ ID NO: 52), en que dichas variantes preferidas definidas en la presente, son particularmente preferidas. Aun se prefieren más los polipéptidos que comprenden uno o más Nanocuerpos que consisten esencialmente en una de las variantes humanizadas del clon PMP1C2 (TNF1; SEQ ID NO: 52), en que dichas variantes humanizadas son como se definen en la presente (los ejemplos son sin limitación, TNF13, TNF14, TNF29 y TNF30). TNF30 es un “bloque de construcción” humanizado particularmente preferido para usar en los polipéptidos de la invención.
Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de tales proteínas y polipéptidos son PMP1C2 mismo, las variantes humanizadas TNFL3, TNF 14, TNF29 y TNF30; los constructos de la SEQ ID NO: 70 (TNF4), SEQ ID NO: 73 (TNF7), SEQ ID NO: 90 (TNF24), SEQ ID) NO: 93 (TNF27); y los constructos de la SEQ ID) NO: 417 (TNF60), SEQ ID NO: 419 (TNF55) y SEQ ID NO: 420 (TNF56), en que estos últimos tres constructos contienen la variante humanizada TNF 30 como un bloque de construcción.
Como se menciona en la presente, los Nanocuerpos y constructos descritos en la presente pueden estar pegilados, o contener uno o más residuos de aminoácidos (adicionales) que permiten la pegilación y/o facilitan la pegilación. Dos ejemplos preferidos, pero no limitantes de tales polipéptidos son TNF55 y TNF56, los cuales contienen un residuo de cisteína adicional para la unión sencilla de un grupo PEG.
Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de los polipéptidos de la invención son el polipéptido bivalente de la invención y el polipéptido multiespecífico de la invención de la SEQ ID NOs: 90 y 93 y las SEQ ID NOs 417 a 420.
Como se puede observar a partir de los siguientes datos representados, y en particular de los datos dados en el Ejemplo comparativo, los Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención tienen propiedades mejoradas. En particular, las proteínas y polipéptidos de la invención pueden tener mejor afinidad por TNF-alfa humana (expresada como el valor de EC50 en el ensayo KYM que se describe en la presente), en comparación con ellos productos biológicos anti-TNF disponibles en el comercio EnbrelTM, HumiraTM y RemicadeTM. Asimismo, los Nanocuerpos descritos en la presente puede tener una mejor afinidad para TNF-alfa en comparación con el mejor desempeño del Nanocuerpo descrito en la Solicitud internacional WO 04/041862. En consecuencia, se puede esperar que los polipéptidos de la invención que comprende al menos uno de los Nanocuerpos de la invención también tendrá propiedades mejoradas en comparación con los polipéptidos que comprenden solo los Nanocuerpos contra TNF-alfa descritos en el documento WO 04/041862.
Más en particular, un polipéptido como se describe en la presente que comprende dos o más (y preferentemente dos) Nanocuerpos en la presente (y opcionalmente por ejemplo un Nanocuerpo contra albúmina sérica humana), tiene un valor de EC50 en el ensayo basado en células por medio de células KIM descritas en el Ejemplo 1, de acuerdo con 3), del WO 04/041862 que es mejor que el valor de EC50 de Humira® en Remicade®, y preferentemente también mejor que Enbrel® en el mismo ensayo.
Por ejemplo, tal proteína o polipéptido preferentemente tiene un valor de EC50 en el ensayo basado en células por medio de células KIM descritas en el Ejemplo 1, de acuerdo con 3), del WO 04/041862 que es mejor que 0,2 nM, preferentemente mejor que 0,1 nM, tal como mejor que 0,7 nM y en particular mejor que 0,4 nM.
Los solicitantes también han demostrado que los Nanocuerpos contra TNF-alfa de ratón y los polipéptidos que comprenden Nanocuerpos contra TNF-alfa de ratón muestran una actividad biológica beneficiosa en los siguientes modelos de enfermedad (datos no mostrados):
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El modelo de dextran sulfato de sodio ("DSS") de colitis, que emplea ratones regulares así como ratones deficientes en IL-10, descrito por Okayasu et al (Gastroenterol 1990, 30 98(3):694)
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El modelo de artritis inducida por colágeno ("CIA") (“CIA"), descrito por Courtenay et al. (Nature 1980, 283(5748): 666), por medio de ratones regulares así como ratones deficientes en IL-10;
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El modelo del ratón deficiente en IL-10 de IBD, por ejemplo descrito en Rennick et al (Clin Immunol Immunopathol 1995, 76(3 Pt 2): S 174)
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El modelo Kollias, por ejemplo como se describe en Keffer et al. (EMBO J 1991, 10(13): 4025)
-
El modelo de ácido 2,4,6-trinitrobencensulfónico (“TNBS") de, que se describe en Elson et al. (J Immnunol 1996, 157(5): 2174)
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El modelo CIA de RA, descrito por Koppieters et al (manuscrito en preparación);
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El modelo de fibroblasto derivado sinovial (que se describe más adelante); y
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El modelo de bolsa de aire murino.
Preferentemente, los nanocuerpos descritos en la presente son mejores que el Nanocuerpo 1A del documento WO 04/041862 en al menos uno de estos modelos, y preferentemente en todos estos modelos y con más preferencia son mejores que el Nanocuerpo 3E del documento WO 04/041862 en al menos uno de estos modelos, y preferentemente en todos estos modelos. Asimismo, los polipéptidos descritos en la presente son preferentemente equivalentes a o mejores que Humira® o Remicade® en al menos de estos modelos, y preferentemente en todos estos modelos; y más preferentemente también equivalente a o mejor que Enbrel® en al menos uno de estos modelos, y preferentemente en todos estos modelos.
Estos datos confirman que los Nanocuerpos contra TNF-alfa y los polipéptidos que contienen los mismos, tal como los Nanocuerpos y polipéptidos descritos en WO 04/041862 y en particular los Nanocuerpos y polipéptidos descritos en la presente, deben tener eficacia terapéutica contra enfermedades y trastornos mediados por TNF, tal como las enfermedades y trastornos mencionados anteriormente.
En otro aspecto, la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica un Nanocuerpo de la invención y/o un polipéptido de la invención. Tal ácido nucleico también se referirá a continuación como un "ácido nucleico de la invención" y por ejemplo puede estar en las formas de un constructo genético, que se define más adelante.
En otro aspecto, la invención se refiere a un huésped o célula huésped que expresa o es capaz de expresar un Nanocuerpo de la invención y/o un polipéptido de la invención; y/o que contiene un ácido nucleico que codifica un Nanocuerpo de la invención y/o un polipéptido de la invención. Tal huésped o una célula huésped también puede ser análoga a los huéspedes y células huésped descritas en el documento WO 04/041862, pero que expresan o son capaces de expresar un Nanocuerpo de la invención y/o un polipéptido de la invención y/o que contiene un ácido nucleico como se describe en la presente.
La invención también se refiere a un producto o composición que contiene o que comprende un Nanocuerpo de la invención, a polipéptido de la invención; y/o un ácido nucleico de la invención. Tal producto o composición por ejemplo puede ser una composición farmacéutica (que se describe a continuación) o un producto o composición para uso diagnóstico (como también se describe a continuación). Tal producto o composición también puede ser análoga a los productos y composiciones descritos en el documento WO 04/041862, pero que contiene o que comprende un Nanocuerpo de la invención, a polipéptido de la invención o un ácido nucleico de la invención.
La invención también se refiere a procedimientos para preparar o generar Nanocuerpos, polipéptidos, ácidos nucleicos, células huésped, productos y composiciones que se describe en la presente, estos procedimientos también se describen a continuación. Asimismo, generalmente, los Nanocuerpos, polipéptidos, ácidos nucleicos, células huésped, productos y composiciones descritos en la presente también se pueden preparar y usar de una manera análoga a la manera descrita en el documento WO 04/041862.
La invención también se refiere a aplicaciones y usos de los anteriores Nanocuerpos, polipéptidos, ácidos nucleicos, células huésped, productos y composiciones descritas en la presente, tales aplicaciones y uso incluyen, pero sin limitación, la aplicaciones y usos descritos más adelante en la presente y/o los usos y aplicaciones adicionales para Nanocuerpos contra TNF-alfa y/o para los polipéptidos que contienen los mismos en el documento WO 04/041862.
Otros aspectos, realizaciones, ventajas y aplicaciones de la invención serán evidentes a partir de la descripción adicional más adelante en la presente.
Descripción detallada de la invención
Los anteriores y otros aspectos y realizaciones de la invención serán evidentes a partir de la descripción adicional más adelante en la presente, en que:
a) A menos que se indique o defina lo contrario, todos los términos usados tienen su significado usual en la técnica, que será evidente para los expertos. Se hace referencia, por ejemplo, a los manuales estándares, tales como Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" ( 2nd.Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing y Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Old et al., "Principios of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edición, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., "Immunology" (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., Roitt's Essential Immunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK (2001); y Janeway et al., "lrnmunobiolol y" (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005), así como los antecedentes generales de la técnica mencionados en la presente;
b) A menos que se indique lo contrario, el término "secuencia de inmunoglobulina" – sea que se use en la presente para referirse a un anticuerpo de cadena pesada o a un convencional anticuerpo de 4 cadenas – se usa como un término general para incluir tanto el anticuerpo de tamaño completo, sus cadenas individuales, así como las partes, dominios o fragmentos de estos (que incluyen pero sin limitación dominios de unión al antígeno o fragmentos tales como VHH o dominios VH/VL, respectivamente). Además, el término "secuencia" como se usa en la presente (por ejemplo en términos como "secuencia de inmunoglobulina", "secuencia del anticuerpo", "secuencia del dominio variable”, "secuencia VHH" o "secuencia de la proteína"), se deben entender generalmente que incluyen tanto las secuencias de aminoácidos relevantes así como secuencias de ácidos nucleicos o secuencias de nucleótidos que codifican los mismos, a menos que el contexto requiera una interpretación más limitada;
c) A menos que se indique lo contrario, todos los procedimientos, etapas, técnicas y manipulaciones que no se describen específicamente en detalle se pueden realizar y se han realizado de una manera conocida per se, como será evidente para los expertos. Se hace referencia, por ejemplo, nuevamente a los manuales estándares, a la técnica de antecedentes general mencionados anteriormente y a las adicionales referencias citadas en el presente;
d) Los residuos de aminoácidos se indicarán de acuerdo con los códigos de aminoácidos tres letras o una letra estándares, mencionados en la Tabla 4;
Tabla 1:Códigos aminoácidos de una letra y tres letras
No polar, no cargado (a pH 6,07,0)
Alanina Ala A
Valina
Val V
Leucina
Leu L
Isoleucina
Ile I
fenilalanina
Phe F
Metionina(1)
Met M
Triptofano
Trp W
Prolina
Pro P
Polar, no cargado (a pH 6,0-7,0)
Glicina(2) Gly G
Serina
Ser S
Treonina
Thr T
Cisteína
Cys C
Asparagina
Asn N
Glutamina
Gln Q
Tirosina
Tyr Y
Polar, Cargado (a pH 6,0-7,0)
Lisina Lys K
Arginina
Arg R
Histidina
His H
Aspartato
Asp D
Glutamato
Glu E
Notas. (1) (2)
Algunas veces considerado como un aminoácido polar no cargado.
Algunas veces considerado como un aminoácido no polar no cargado
(3) Como será evidente para los expertos, el hecho que un residuo de aminoácido se mencione e este tabla como cargado o no cargado a pH 6,0 a 7,0 no se refleja de ninguna manera en la carga, dicho residuo de aminoácido pueden tener un pH menor que 6,0 y/o a un pH más alto que 7,0, los residuos de aminoácidos mencionados en esta tabla pueden estar cargados y/o no cargados a tal pH más alto o más bajo, como será evidente para los expertos. (4) Como es conocido en la técnica, la carga de un residuo de His es muy dependiente de incluso pequeños cambios de pH, pero un residuo de His generalmente se puede considerar esencialmente no cargado a un pH de aproximadamente 6,5.
e) Para los fines de comparar dos o más secuencias de nucleótidos, el porcentaje de "identidad de secuencia" entre una primer secuencia de nucleótidos y una segunda secuencia de nucleótidos se puede calcular por la división de [el número entero de nucleótidos en la primera secuencia de nucleótidos que son idénticos en los nucleótidos a las correspondientes posiciones en la segunda secuencia de nucleótidos] por [el número entero de nucleótidos en la primera secuencia de nucleótidos] y multiplicar por [100%), en que cada supresión, inserción, sustitución o adición de un nucleótido en la segunda secuencia de nucleótidos en comparación con la primera secuencia de nucleótidos – se considera como una diferencia en un nucleótido único (posición).
Alternativamente, el grado de identidad de secuencia entre dos o más secuencias de nucleótidos se puede calcular por medio de un algoritmo de computadora conocido para el alineamiento de secuencias tales como NCBI Blast v2.0, por medio de ajustes estándares.
Algunas otras técnicas, algoritmos de computadora y ajustes para determinar el grado de identidad de secuencia, por ejemplo se describen en WO 04/037999, EP 0 967 284, EP 1 085 089, WO 00155318, WO 00178972, WO 98149185 y GB 2 357 768-A.
Usualmente, para el fin de determinar el porcentaje de "identidad de secuencia" entre las dos secuencias de nucleótidos está de acuerdo con el procedimiento de cálculo descripto en la presente anteriormente, la secuencia de nucleótidos con el mayor número de nucleótidos se tomará como la "primera" secuencia de nucleótidos, y la otra secuencia de nucleótidos se tomará como la "segunda" secuencia de nucleótidos;
f) Para los fines de comparar dos o más secuencias de aminoácidos, el porcentaje de "identidad de secuencia" entre una primera secuencia de aminoácidos y una segunda secuencia de aminoácidos se puede calcular por la división del [número de residuos de aminoácidos en la primera secuencia de aminoácidos que son idénticos a los residuos de aminoácidos en las correspondientes posiciones en la segunda secuencia de aminoácidos] por [el número total de residuos de aminoácidos de la primera secuencia de aminoácidos] y multiplicar por y [100%], en que cada supresión, inserción, sustitución o adición de un residuo de aminoácido en la segunda secuencia de aminoácidos – en comparación con la primera secuencia de aminoácidos – se considera como una diferencia en un residuo de aminoácido único (posición), es decir como una “diferencia de aminoácido" que se define más adelante.
Alternativamente, el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se puede calcular por medio de un algoritmo de computadora, tal como los mencionados anteriormente para determinar el grado de identidad de secuencia para las secuencias de nucleótidos, nuevamente por medio de ajustes estándares.
Usualmente, para el fin de determinar el porcentaje de la "identidad de secuencia" entre dos secuencias de aminoácidos de acuerdo con el procedimiento del cálculo descrito en la presente anteriormente, la secuencia de aminoácidos con el mayor número de residuos de aminoácidos se tomará como la "primera" secuencia de aminoácidos, y la otra secuencia de aminoácidos se tomará la "segunda" secuencia de aminoácidos.
Asimismo, para determinar el grado de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos, los expertos pueden tomar en cuenta las llamadas sustituciones de aminoácido "conservadoras", que en general se pueden describir como sustituciones de aminoácido en que un residuo de aminoácido se reemplaza con otro residuo de aminoácido de similar estructura química y que tiene poca o esencialmente ninguna influencia en la función, actividad u otras propiedades biológicas del polipéptido. Tales sustituciones conservadoras de aminoácidos son bien conocidas en la técnica, por ejemplo de los documentos WO 04/037999, GB-A-2 357 768, WO 98/49185, WO 00/46383 y WO 01/09300; y tipos y/o combinaciones (preferidas) de tales sustituciones se pueden seleccionar sobre la base de las enseñanzas pertinentes del documento WO 04/037999 así como el documento WO 98/49185 y de las referencias adicionales allí mencionadas.
Estas sustituciones conservadoras preferentemente son sustituciones en que un aminoácido de los siguientes grupos
(a) - (e) se sustituye con otro residuo de aminoácido del mismo grupo: (a) residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, Pro y Gly; (b) residuos con carga negativa, polares y sus amidas (no cargados): Asp, Asn, Glu y Gln; (c) residuos con carga positiva, polares: His, Arg y Lys; (d) residuos alifáticos grandes, no polares: Met, Leu, Ile, Val y Cys; y (e) residuos aromáticos: Phe, Tyr y Trp.
Las sustituciones conservadoras particularmente preferidas son las siguientes: Ala en Gly o en Sec; Arg en Lys; Asn en Gln o en His; Asp en Glu; Cys en Ser; Gln en Asn; Glu en Asp; Gly en Ala o en Pro; His en Asn o en Gln; Ile en Leu o en Val; Leu en Ile o en Val; Lys en Arg, en Gln o en Glu; Met en Leu, en Tyr o en Ile; Phe en Met, en Leu o en Tyr, Ser en Thr, Thr en Ser; Trp En Tyr, Tyr en Trp; y/o Phe en Val, en Ile o en Leu.
Cualquiera de las sustituciones de aminoácido aplicadas a los polipéptidos descritos en la presente también se pueden basar en el análisis de las frecuencia de las variaciones de aminoácido entre proteínas homólogas de diferentes especies desarrolladas por Schulz et al, Principios of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978, sobre el análisis de potenciales formadores de estructuras desarrollados por Chou y Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974 y Adv. Enzymol.,
47: 45-149, 1978, y sobre el análisis de patrones de hidrofobicidad en las proteínas desarrollado por Eisenberg et al., Proc. Nad. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 198 1, y Goldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986, todos incorporados en la presente en su totalidad por referencia. La información sobre la estructura primaria, secundaria y terciaria de los Nanocuerpos dados en la descripción en la presente y de la técnica previa generalmente mencionados anteriormente. Asimismo, para este fin, la estructura cristalina de un dominio VHH de una llama por ejemplo se proporciona en Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803 (1996); Spinelli et al, Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757; y Decanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361 (1999). Información adicional acerca de algunos de los residuos de aminoácido que en los dominios VH convencionales forman la interfaz VH/VL y potenciales sustituciones camelizantes en estas posiciones se pueden hallar en la técnica previa sobre Nanocuerpos mencionada en la presente;
g) se dice que las secuencias de aminoácidos y secuencias de ácidos nucleicos son "exactamente iguales" si ellas tienen 100% de identidad de secuencia (como se define en la presente) respecto de su longitud completa;
h) cuando se comparan dos secuencias de aminoácidos, el término "diferencia de aminoácido" se refiere a una inserción, supresión o sustitución de un residuo de aminoácido único en una posición de la primera secuencia, en comparación con la segunda secuencia; se considera que dos secuencias de aminoácidos pueden contener uno, dos o más de estas diferencias de aminoácidos;
i) una secuencia de ácidos nucleicos o secuencia de aminoácidos se considera que está "(en forma) esencialmente aislada" - por ejemplo, en comparación con su fuente biológica nativa y/o el medio de reacción o medio de cultivo del cual se ha obtenido – cuando se ha separado de al menos un componente diferente con el que está usualmente asociado en dicha fuente o medio, tal como otro ácido nucleico, otra proteína/polipéptido, otro componente biológico o macromolécula o al menos un contaminante, impureza o componente menor. En particular, una secuencia de ácidos nucleicos o secuencia de aminoácidos se considera "esencialmente aislada" cuando se ha purificado al menos 2 veces, en particular al menos 10 veces, más en particular al menos 100 veces, y hasta 1000 veces o más. Una secuencia de ácidos nucleicos o secuencia de aminoácidos que está "en forma esencialmente aislada" es preferentemente esencialmente homogénea, que se determina por medio de una técnica adecuada, tal como una técnica de cromatografía adecuada, tal como electroforesis de gel de poliacrilamida;
j) El término "dominio" como se usa en la presente se refiere en general a una región globular de una cadena del anticuerpo, y en particular a una región globular de un anticuerpo de cadena pesada, o a un polipéptido que consiste esencialmente en tal región globular. Usualmente, tal dominio comprenderá bucles de péptidos (por ejemplo 3 o 4 bucles de péptidos) estabilizados, por ejemplo, como una hoja o enlaces disulfuro.
k) El término “determinante antigénico” se refiere a el epitope del antígeno reconocido por la molécula de unión al antígeno (tal como un Nanocuerpo o un polipéptido de la invención) y más en particular por el sitio de unión al antígeno de dicha molécula. Los términos "determinante antigénico" y "epitope” también se pueden usar de modo indistinto.
i) Una secuencia de aminoácidos (tal como un Nanocuerpo, un anticuerpo, un polipéptido de la invención, o generalmente una proteína o polipéptido de unión al antígeno o fragmento de este) que se puede unir a, que tiene afinidad por y/o que tiene especificidad por un determinante antigénico, epitope antígeno o proteína específico (o por al menos una parte, fragmento o epitope de este) se dice que es "contra" o "dirigido contra" dicho determinante antigénico, epitope, antígeno o proteína.
m) El término "especificidad" se refiere al número de diferentes tipos de antígenos o determinantes antigénicos a los que una molécula de unión al antígeno o molécula de proteína de unión al antígeno particular (tal como un Nanocuerpo o un polipéptido de la invención) se puede unir. La especificidad de una proteína de unión al antígeno se puede determinar sobre la base de la afinidad y/o avidez. La afinidad, representada por la constante de equilibrio para la disociación de un antígeno con una proteína de unión al antígeno (KD), es una medida para la fuerza de unión entre un determinante antigénico y un sitio de unión al antígeno en la proteína de unión al antígeno: a menor valor de la KD, mayor fuerza de unión entre un determinante antigénico y la molécula de unión al antígeno (alternativamente, la afinidad también se puede expresar como la constante de afinidad (KA), que es 1/KD). Como será evidente para los expertos (por ejemplo sobre la base de la posterior descripción en la presente), la afinidad se puede determinar de una manera conocida per se, de acuerdo con el antígeno específico de interés. Avidez es la medida de la fuerza de unión entre una molécula de unión al antígeno (tal como un Nanocuerpo o polipéptido de la invención) y el antígeno pertinente. La avidez se relaciona con la afinidad entre un determinante antigénico y su sitio de unión al antígeno sobre la molécula de unión al antígeno y el número de sitios de unión pertinentes presentes en la molécula de unión al antígeno. Normalmente, las proteínas de unión al antígeno (tales como los Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención) se unirán con una constante de disociación 10-5 a 10-12 moles/litro (M) o menos, y preferentemente 10-7 a 10-12 moles/litro (M) o menos y
M-1
más preferentemente 10-8 a 10-12 moles/litro, y/o con una constante de asociación (KA) de al menos 107 , preferentemente al menos 108 M-1, más preferentemente al menos 109 M-1, tal como al menos 1012 M-1. Cualquier valor de KD mayor de 10-1 generalmente se considera que indica unión no específica. Preferentemente, un Nanocuerpo o polipéptido de la invención se unirá al antígeno deseado con una KD es menor de 500 nM, preferentemente menos de 200 nM, más preferentemente menos de 10 nM, tal como menos de 500 nM. La unión específica de una proteína de unión al antígeno a un antígeno o determinante antigénico se puede determinar de alguna manera adecuada conocida per se, que incluye, por ejemplo, análisis de Scatchard y/o ensayos de unión competitiva, tal como radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA) y ensayos de competición sándwich, y las diferentes variantes de estas conocidas per se en la técnica.
n) como también se describe más adelante en la presente, la secuencia de aminoácidos y estructura de un Nanocuerpo se puede considerar – sin embargo se limita a esto – que está compuesta de cuatro regiones estructurales o "FR", que se mencionan en la técnica y más adelante en la presente como "Región estructural 1" o "FR1"; como "Región estructural 2" o "FR2"; como "Región estructural 3" o "FR3"; y como "Región estructural 4" o "FR4", respectivamente; tales regiones estructurales se interrumpen con tres regiones determinantes de complementariedad o "CDR", que se denominan en la técnica "Región determinante de complementariedad 1” "CDR1"; como "Región determinante de complementariedad 2" o "CDR2"; y como "Región determinante de complementariedad 3" o "CDR3", respectivamente;
o) como también se describe más adelante en la presente, el número total de residuos de aminoácidos en un Nanocuerpo puede estar en la región de 110-120, preferentemente 112-115, y con máxima preferencia 113. Sin embargo, se debe indicar que las partes, fragmentos o análogos (que se describe adicionalmente más adelante en la presente) de un Nanocuerpo no están limitadas particularmente en cuanto a su longitud y/o tamaño, siempre que tales partes, fragmentos o análogos cumplan los requerimientos indicados más adelante en la presente y también son preferentemente adecuados para los fines descriptos en la presente;
p) los residuos de aminoácidos de un Nanocuerpo se numeran de acuerdo con la numeración general para los dominios VH dados por Kabat et al. ("Sequence de proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publicación No. 91), que se aplica a los dominios VHH de los camélidos en el artículos de Riechmann y Muyldermans, mencionado anteriormente (ver por ejemplo Figura 2 de dicha referencia). De acuerdo con esta numeración, FR1 de un Nanocuerpo comprende los residuos de aminoácidos de las posiciones 1-30, CDR1 de un Nanocuerpo comprende los residuos de aminoácidos de las posiciones 31-36, FR2 de un Nanocuerpo comprende los aminoácidos en las posiciones 36-49, CDR2 de un Nanocuerpo comprende los residuos de aminoácidos de las posiciones 50-65, FR3 de un Nanocuerpo comprende los residuos de aminoácidos de las posiciones 66-94, CDR3 de un Nanocuerpo comprende los residuos de aminoácidos de las posiciones 95-102, y FR4 de a Nanocuerpo comprende los residuos de aminoácidos de las posiciones 103-113. (En este aspecto, cabe mencionar que – como bien se conoce en la técnica para los dominios VH y para los dominios VHH - el número total de residuos de aminoácidos en cada una de las CDR puede variar y puede no corresponder al número total de residuos de aminoácidos indicados por la numeración de Rabat (es decir, una o más de las posiciones de acuerdo con la numeración de Kabat puede no estar ocupada en la secuencia real, o la secuencia real puede contener más residuos de aminoácidos que el número permitido por la numeración de Kabat). Esto significa que, generalmente, la numeración de acuerdo con Kabat puede o no puede corresponder a la numeración real de los residuos de aminoácidos en la secuencia real. Generalmente, sin embargo, se puede decir que, de acuerdo con la numeración de Kabat e independientemente del número de residuos de los aminoácidos en las CDR, la posición 1 de acuerdo con la numeración de Kabat corresponde a la del comienzo de FR1 y viceversa, la posición 36 de acuerdo con la numeración de Kabat corresponde a la de comienzo de la FR2 y viceversa, posición 66 de acuerdo con la numeración de Kabat corresponde a la de comienzo de la FR3 y viceversa, y posición 103 de acuerdo con la numeración de Kabat corresponde a la de comienzo de la FR4 y viceversa.
Los procedimientos alternativos para la numeración de los residuos de aminoácidos de los dominios VH, que también se pueden aplicar de una manera análoga a los dominios VHH de los camélidos y a Nanocuerpos, son el procedimiento descrito por Chothia et al. (Nature 342, 877-883 (1989)), la llamada "definición AbM” y la llamada "definición contacto". Sin embargo, en la presente descripción, reivindicaciones y figuras, se seguirá la numeración de acuerdo con Rabat aplicada a los dominios VHH por Riechmann y Muyldermans, a menos que se indique lo contrario; y
q) las Figuras, Listado de Secuencias y la Parte Experimental/Ejemplos se dan solo para ilustrar adicionalmente la invención y no se deben interpretar o analizar como limitación del alcance de la invención y/o de las reivindicaciones anexas de ningún modo, a menos que se indique explícitamente de otro modo en la presente.
Para una descripción general de los anticuerpos de cadena pesada y sus dominios variables, se hace referencia entre otras a las siguientes referencias, que se mencionan en la los antecedentes de la técnica general: WO 94/04678, WO 95/04079 y WO 96/34103 de la Vrije Universiteit Brussel; WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00140968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/140310, WO 01/44301, EP 1134231 y WO 02/48193 de Unilever; WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 y WO 03/055527 del Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB); WO 03/050531 de Algonomics N V y solicitante; WO 01/90190 por el National Research Council of Canada; WO 03/025020 (= EP 1 433 793) by the Institute of Antibodies; así como WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551 por solicitante y otras solicitudes de patentes publicadas por el solicitante; Flamers-Castennan et al, Nature 1993 June 3; 363 (6428): 446-8; Davies y Riechmann, FEBS Lett. 1994 Feb 21; 339(3): 285-90; Muyldermans et al, Protein Eng. 1994 Sep; 7(9): 1129-3; Davies y Riechmann, Biotechnology (NY) 1995 May; 13(5): 475-9; Gharoudi et al., 9th Forum of Applied Biotechnology, Med. Fac. Landbouw Univ. Gent. 1995; 60/4a part I: 2097-2100; Davies y Riechmann, Protein Eng. 1996 Jun; 9(6): 531-7; Desmyter et al, Nat Struct Biol. 1996 Sep; 3(9): 803-1 1; Sheriff et al., Nat Strata Biol. 1996 Sep; 3(9): 733-6; Spinelli et al, Nat Struct Biol. 1996 Sep; 3(9): 752-7; Arbabi Ghahroudi et al., FEBS Lett. 1997 Sep 15; 414(3): 521-6; Vu et al, Mol Immunol. 1997 Nov-Dec; 34(16-17): 1121-31; Atarhouch et al, Journal of Camel Practice and Research 1997; 4: 177-182; Nguyen et al, J. Mol. Biol. 1998 Jan 23; 275(3): 413-8; Lauwereys et al, EMBO J. 1998 Jul 1; 17(13): 3512-20; Frenken et al, Res lmmunol. 1998 Jul-Aug;149(6):589-99; Transue et al, Proteins 1998 Sep 1; 32(4): 515-22; Muyldermans y Lauwereys, J. Mot. Recognit. 1999 Mar-Apr; 12 (2): 13140; van der Linden et al., Biochim. Biophys. Acta 1999 Apr 12; 1431(1): 37-46.; Decanniere et al., Structure Fold. Des. 1999 Apr 15; 7(4): 361-70; Nguyen et al., Mol. Inumunol. 1999 Jun; 36(8): 515-24; Woolven et al., Immunogenetics 1999 Oct; 50 (1-2): 98-101; Riechmann y Muyldermans, J. Immunol. Methods 1999 Dec 10; 231 (1-2): 25-38; Spinelli et al., Biochemistry 2000 Feb t5; 39(6): 1217-22; Frenken et al., J. Biotechnol. 2000 Feb 28; 78(t): 1.1-2.1; Nguyen et al, EMBO J. 2000 Mar 1; 19(5): 921-30; van der Linden et al, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-95; Decanniere et al, J. Mol. Biol. 2000 Jun 30; 300 (1): 83-91; van der Linden et al, J. Biotechnol 2000 Jul 14; 80(3): 261-70; Harmsen et al, Mol. Immunol. 2000 Aug; 37(10): 579-90; Perez et al, Biochemistry 2001 Jan 9; 40(1): 74-83; Conrath et al., J. Biol. Chem. 2001 Mar 9; 276 (10): 7346-50; Muyldermans et al., Trends Biochem Sci. 2001 Apr;26(4):230-5; Muyldermans S., J. Biotechnol. 2001 Jun; 74 (4): 277-302; Desmyter et al., J. Biol. Chem. 2001 Jul 13 ;276 (28): 2628590; Spinelli et al., J. Mol. Biol. 2001 Aug 3; 311 (1): 123-9; Conrath et al., Antimicrob Agents Chemother. 2001 Oct; 45 (10): 2807-12; Decanniere et al, J. Mot. Biol. 2001 Oct 26; 313(3): 473-8; Nguyen et al, Adv lmmttnol. 2001; 79: 261-96; Muruganandam et al, FASEB J. 2002 Feb; 16 (2): 240-2; Ewert et al., Biochemistry 2002-
Mar 19; 41 (I 1): 3628-36; Dumoulin et al., Protein Sci. 2002 Mar; 11 (3): 500-15; Cortez-Retamozo et al., Int. J. Cancer. 2002 Mar 20; 98 (3): 456-62; Su et al, Mol. Biol. Eliot. 2002 Mar; 19 (3): 205-15; van der Vaart JM., Methods Mol Biol. 2002; 178: 359-66; Vranken et al, Biochemistry 2002 Jul 9; 41 (27): 8570-9; Nguyen et al, Immunogenetics 2002 Apr; 54 (1): 39-47; Renisio et al, Proteínas 2002 Jun 1; 47 (4): 546-55; Desmyter et al., J. Biol. Chem. 2002 Jun 28; 277 (26): 23645-50; Ledeboer et al, J. Dairy Sci. 2002 Jun; 85 (6): 1376-82; De Genst et al., J. Biol. Chem. 2002 Aug 16; 277 (33): 29897-907; Ferrat et al., Biochem. 3. 2002 Sep 1; 366 (Pt 2): 415-22; Thomassen et al, Enzyme and Microbial Technol. 2002; 30: 273-8; Harmsen et al., Appl Microbial. Biotechnol. 2002 Dec; 60 (4): 449-54; Jobling et al, Nat Biotechnol. 2003 Jan; 21 (1): 77-80; Conrath et al., Dev. Comp. Immunol. 2003 Feb; 27 (2): 87-103; Pleschberger et al, Bioconjug. Chem. 2003 Mar-Apr, 14 (2): 440-8; Lah et al, J. Biol. Chem. 2003 Apr 18; 278 (16): 14101-11; Nguyen et al., Immunology. 2003 May; 109 (I): 93-101; Joosten et al., Microb. Cell Fact. 2003 Jan 30; 2 (1): 1; Li et al, Proteínas 2003 Jut 1; 52 (1): 47-50; Loris et al., Biol Chem. 2003 Jul 25; 278 (30): 28252-7; van Koningsbruggen et al., Immunol. Methods. 2003 Aug; 279 (1-2): 149-61; Dumoulin et al, Nature. 2003 Aug 14; 424 (6950): 783-8; Bond et al, J. Mol. Biol. 2003 Sep 19; 332 (3): 643-55; Yau et al, J. Immunol. Methods. 2003 Oct 1; 281 (1-2): 161-75; Dekker et al., J. Virol. 2003 Nov; 77 (22): 12132-9; Meddeb-Mouelhi et al., Toxicon. 2003 Dec; 42 (7): 785-91; Verheesen et al., Biochim. Biophys. Acta 2003 Dec 5; 1624 (1-3): 21-8; Zhang et al., J Mol Biol. 2004 Jan 2; 335 (1): 49-56; Stijlemans et al., .J, Biol Chem. 2004 Jan 9; 279 (2): 1256-61; Cortez-Retamozo et al., Cancer Res. 2004 Apr 15; 64 (8): 2853-7; Spinelli et al., FEBS Lett. 2004 Apr 23; 564 (1-2): 35-40; Pleschberger et al., Bioconjug. Chem. 2004 May-Jun; 15 (3): 664-71; Nicaise et al, Protein S'ei. 2004 Jul; 13 (7): 1882-91; Omidfar et al., Tumour Biol. 2004 Jul-Aug; (4): 179-87; Omidfar et al, Tumour Biol. 2004 Sep-Dec; 25(5-6): 296-305; Szynol et al, Antimicrob Agents Chemother. 2004 Sep;48(9):3390-5; Saerens et al., J. Biol. Chem. 2004 Dec 10; 279 (50): 51965-72; De Genst et al., J. Biol. Chem. 2004 Dec 17; 279 (51): 53593-601; Dolk et al., Appl. Environ. Microbiol. 2005 Jan; 71(1): 442-50; Joosten et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2005 Jan; 66(4): 384-92; Dumoulin at alt, J. Mol. Biol. 2005 Feb 25; 346 (3): 773-88; Yau at aL, J Immunol Methods 2005 Feb; 297 (1-2): 213-24; De Genst et al., J. Biol. Chem. 2005 Apr 8; 280 (14): 14114-21; Huang et al, Eur. J. Hum. Genet. 2005 Apr 13; Dolk et al., Proteins. 2005 May 15; 59 (3): 555-64; Bond et al., J. Mol. Biol. 2005 May 6;348(3):699-709; Zarebski et al., J. Mol. Biol. 2005 Apr 21; (E-publicación antes de impresión].
De acuerdo con la terminología usada en las referencias anteriores, los dominios variables presentes en los anticuerpos de cadena pesada naturales también se denominarán como "Dominios VHH", a fin de distinguirlos de los dominios variables de cadena pesada que están presentes en anticuerpos de 4 cadenas convencionales (que se denominará más adelante en la presente como "dominios VH") y los dominios variables de cadena liviana que están presentes en anticuerpos de 4 cadenas convencionales (que se denominará más adelante en la presente como "dominios VL").
Como se mencionó en la técnica previa referida anteriormente, los dominios VHH tienen numerosas características estructurales y propiedades funcionales únicas que hacen que los dominios VHH aislados (así como Nanocuerpos basados en estos, que comparten estas características estructurales y propiedades funcionales con los dominios VHH naturales) y las proteínas que contienen los mismos sean muy ventajosas para usar como dominios de unión o proteínas funcionales. En particular, y sin limitarse a esto, los dominios VHH (que se han "diseñado” por la naturaleza para unirse funcionalmente a un antígeno sin la presencia de, y sin ninguna interacción con, un dominio variable de cadena liviana) los Nanocuerpos pueden actuar como una unidad estructural, dominio o proteína de unión al antígeno, funcional, relativamente pequeño e individual. Esto distingue a los dominios VHH de los dominios VH y VL de los anticuerpos de cuatro cadenas convencionales, que generalmente no son adecuados de por sí para la aplicación práctica como proteínas o dominios de unión al antígeno individual, sino que necesitan combinarse de alguna forma u otra para proporcionar una unidad de unión al antígeno funcional (como por ejemplo, en los fragmentos de anticuerpo convencionales tales como fragmentos Fab; en los fragmentos ScFv, que consisten en un dominio VH unido covalentemente a un dominio VL).
Debido a estas propiedades únicas, el uso de los dominios VHH y los Nanocuerpos como proteínas de unión al antígeno únicas o como dominios de unión al antígeno (es decir, como parte de una proteína o polipéptido más grande) ofrece numerosas ventajas significativas respecto del uso de dominios VH y VL convencionales, scFv o fragmentos de anticuerpo convencionales (tales como fragmentos Fab- o F(ab')2):
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solo se requiere un dominio único para unirse a un antígeno con alta afinidad y con alta selectividad, de modo que no existe la necesidad de tener dos dominios separados presentes, ni de asegurar que estos dos dominios estén presentes en la conformación y configuración espacial estrecha (es decir, a través del uso de ligadores especialmente diseñados, como con scFv);
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los dominios VHH y Nanocuerpos se pueden expresar a partir de un gen único y no requieren plegado o modificaciones pos-traducción;
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los dominios VHH y Nanocuerpos se pueden manipular genéticamente en forma sencilla en formatos multivalentes y multiespecíficos (como se describe adicionalmente en la presente);
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los dominios dominio VHHs y Nanocuerpos son altamente solubles y no tienen una tendencia a agregarse (como con los dominios de unión al antígeno derivado de ratón descrito por Ward et al, Nature, Vol. 341, 1989, p. 544);
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los dominios VHH y Nanocuerpos son muy estables para calentar, pH, proteasas y otros agentes desnaturalizantes o condiciones (ver por ejemplo Ewert et al, supra);
-
los dominios VHH y Nanocuerpos son sencillos y relativamente económicos para preparar, incluso en una escala requerida para la producción. Por ejemplo, los dominios VHH, Nanocuerpos y proteínas/polipéptidos que contiene los mismos se pueden producir usando fermentación microbiana (por ejemplo que también se describe a continuación) y no requieren el uso de sistemas de expresión mamíferos, con por ejemplo fragmentos de anticuerpo convencionales;
-
los dominios VHH y Nanocuerpos son relativamente pequeños (aproximadamente 15 kD, o 10 veces menor que una IgG convencional) en comparación los anticuerpos de 4 cadenas convencionales y sus fragmentos de unión al antígeno, y en consecuencia muestran penetración mayor en tejidos (que incluyen pero sin limitación, tumores sólidos y otros tejidos densos) que tales anticuerpos de 4 cadenas convencionales y sus fragmentos de unión al antígeno;
-
los dominios VHH y Nanocuerpos pueden mostrar las llamadas propiedades de unión a la cavidad (entre otras debido a su bucle de CD3 extendido, en comparación con los dominios VH convencionales) y en consecuencia también pueden acceder a blancos y epitopes no accesibles para los anticuerpos de 4 cadenas convencionales y sus fragmentos de unión al antígeno. Por ejemplo, se ha demostrado que los dominios VHH y Nanocuerpos pueden inhibir las enzimas (ver por ejemplo WO 97/49805; Transue et al., (1998), supra; Lauwereys et al., (1998), supra.
Como se mencionó anteriormente, la invención generalmente se refiere a Nanocuerpos dirigidos contra TNF-alfa, así como a polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en uno o más de tales Nanocuerpos, que pueden usar para los fines profilácticos, terapéuticos y/o diagnósticos que se describen a continuación y en WO 04/041862.
Como también se mencionó anteriormente y se describen adicionalmente a continuación, la invención también se refiere a ácido nucleicos que codifica tales Nanocuerpos y polipéptidos, a procedimientos para preparar tales Nanocuerpos y polipéptidos, a células huésped que expresan o capaces de expresar tales Nanocuerpos o polipéptidos, a usos de tales Nanocuerpos, polipéptidos, ácido nucleicos o células huésped, y a composiciones que comprenden tales Nanocuerpos, polipéptidos, ácido nucleicos o células huésped.
Generalmente, cabe mencionar que el término Nanocuerpo como se usa en la presente en su sentido más amplio no se limita a una fuente biológica específica o a un procedimiento específico de preparación. Por ejemplo, como se describirá en más detalle a continuación, los Nanocuerpos de la invención se pueden obtener (1) aislar el dominio VHH de un anticuerpo de cadena pesada natural; (2) por la expresión de una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio VHH natural; (3) por "humanización" (como se describe a continuación) de un dominio VHH natural o por la expresión de un ácido nucleico que codifica un dominio VHH humanizado; (4) por "camelización" (como se describe a continuación) de un dominio VH natural de cualquier especie animal, en particular una especie de mamífero, tal como de un ser humano, o por la expresión de un ácido nucleico que codifica tal dominio VH camelizado (5) por "camelización" de un "anticuerpo del dominio" o "Dab" como se describe en Ward et al (supra), o por la expresión de un ácido nucleico que codifica tal un dominio VH camelizado; (6) usando técnicas sintéticas o semisintéticas para preparar proteínas, polipéptidos u otras secuencias de aminoácidos; (7) por la preparación de un ácido nucleico que codifica un Nanocuerpo usando técnicas para la síntesis de ácido nucleico, seguido por la expresión del ácido nucleico así obtenida; y/o (8) por cualquier combinación de los precedentes. Los procedimientos y técnicas adecuados para realizar los precedentes serán evidentes para los expertos sobre la base de la descripción de la presente y por ejemplo, incluyen los procedimientos y técnicas descritos con más detalle más adelante en la presente.
Sin embargo, de acuerdo con una realización específica, los Nanocuerpos de la invención no tienen una secuencia de aminoácidos que sea exactamente igual (es decir, como un grado de identidad de secuencia de 100% con) la secuencia de aminoácidos de un dominio VH natural, tal como la secuencia de aminoácidos de un dominio VH natural de un mamífero, y en particular de un ser humano.
Una clase particularmente preferida de Nanocuerpos de la invención comprende los Nanocuerpos con una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos de un dominio VHH natural, pero que ha sido "humanizado", es decir, por el reemplazo de uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de dicha secuencia de VHH natural por uno o más de los residuos de aminoácidos que aparecen en la correspondiente posición en un dominio VH de un anticuerpo de 4 cadenas convencional de un ser humano (por ejemplo, indicado anteriormente). Esto se puede realiza de una manera conocida per se, que será evidente para los expertos, por ejemplo sobre la base de la siguiente descripción adicional y la técnica previa sobre la humanización denominado en la presente. Nuevamente, cabe mencionar que tales Nanocuerpos humanizados de la invención se pueden obtener de alguna manera adecuada conocida per se (es decir, como se indica bajo los puntos (1) - (8) anteriores) y en consecuencia no se limitan estrictamente a los polipéptidos que se han obtenido por medio de un polipéptido que comprende un dominio VHH natural como un material de partida.
Una sustitución humanizante preferida, pero no limitante para los Nanocuerpos pertenecientes al grupo 103 P,R,S y/o el grupo GLEW (como se define en la presente) es 108Q a 108L.
Otra clase particularmente preferida de Nanocuerpos de la invención comprende Nanocuerpos con una secuencia de aminoácidos que corresponde a la secuencia de aminoácidos de un dominio VH natural que se ha “camelizado", es decir por el reemplazo de uno o más de residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de un dominio VH natural de un anticuerpo de 4 cadenas convencional en uno o más de los residuos de aminoácidos que aparecen en las correspondientes posiciones de un dominio VHH de un anticuerpo de cadena pesada. Esto se puede realizar de una manera conocida per se, que será evidente para los expertos, por ejemplo sobre la base de la siguiente descripción adicional. También se hace referencia al documento WO 94/04678. Tal camelización puede ocurrir con preferencia en las posiciones de aminoácido que están presentes en la interfaz VH-VL y en los llamados residuos marcadores de Camelidae (ver por ejemplo, también el documento WO 94/04678), que también se menciona a continuación. Preferentemente, el dominio o secuencia de VH que se usa como material de partida o punto de partida para generar o diseñar el Nanocuerpo camelizado es preferentemente una secuencia VH de un mamífero, más preferentemente la secuencia de VH de un ser humano. Sin embargo, cabe mencionar que tales Nanocuerpos camelizados de la invención se pueden obtener de alguna manera adecuada per se (es decir, indicad bajo los puntos (1) - (8) anterior) y en consecuencia no están estrictamente limitado a polipéptidos que han sido obtenidos mediante un polipéptido que comprende un dominio VH natural como un material inicial.
Por ejemplo, nuevamente como también se describe a continuación, tanto la "humanización" como la “camelización" se pueden realizar proporcionando una secuencia de nucleótidos que codifica tal dominio VHH natural o dominio VH, respectivamente, y posteriormente cambiar de una manera conocida per se, uno o más codones de dicha secuencia de nucleótidos de modo que la nueva secuencia de nucleótidos codifica un Nanocuerpo humanizado o camelizado de la invención, respectivamente, y posteriormente que expresar la secuencia de nucleótidos así obtenida de una manera conocida per se de modo para proporcionar el Nanocuerpo deseado de la invención. Alternativamente, sobre la base de la secuencia de aminoácidos de un dominio VHH o dominio VH natural, respectivamente, la secuencia de aminoácidos del Nanocuerpo humanizado o camelizado deseado de la invención, respectivamente, se puede diseñar y posteriormente sintetizar de novo mediante técnicas para síntesis de péptidos conocidas per se. Asimismo, sobre la base de la secuencia de aminoácidos o secuencia de nucleótidos de un dominio VHH o dominio VH natural, respectivamente, una secuencia de nucleótidos que codifica el Nanocuerpo humanizado o camelizado deseado de la invención, respectivamente, se puede diseñar y posteriormente sintetizar de novo mediante técnicas para síntesis de ácido nucleico conocidas per se, después de cual la secuencia de nucleótidos así obtenidas se puede expresar de una manera conocida per se para proporcionar el Nanocuerpo deseado de la invención.
Otras maneras y técnicas adecuadas para obtener los Nanocuerpos de la invención y/o las secuencias de nucleótidos y/o ácido nucleicos que codifican las mismas, a partir de (la secuencia de aminoácidos de) los dominios VH naturales o preferentemente los dominios VHH y/o de las secuencias de nucleótidos y/o secuencias de ácidos nucleicos que codifican los mismos serán evidentes para los expertos, y por ejemplo, pueden comprender combinar una o más secuencias de aminoácidos y/o secuencias de nucleótidos de los dominios VH naturales (tales como una o más FR y/o CDR) con una o más secuencias de aminoácidos y/o secuencias de nucleótidos de los dominios VHH naturales (tal como una o más FR o CDR), de una manera adecuada para proporcionar (una secuencia de nucleótidos o ácido nucleico que codifica) un Nanocuerpo de la invención.
De acuerdo con un aspecto preferido, pero no limitante del aspecto de la invención, un Nanocuerpo en su sentido más amplio se puede definir generalmente como un polipéptido que comprende:
a) una secuencia de aminoácidos que está compuesta de cuatro regiones /secuencias estructurales interrumpidas por tres regiones /secuencias determinantes de complementariedad, en que el residuo de aminoácido de la posición 108 de acuerdo con la numeración de Rabat es Q; y/o
b) una secuencia de aminoácidos que está compuesta de cuatro regiones /secuencias estructurales interrumpidas tres regiones /secuencias determinantes de complementariedad, en que el residuo de aminoácido de la posición 44 de acuerdo con la numeración de Kabat es E y en que el residuo de aminoácido de la posición 45 de acuerdo con la numeración de Kabat es una R;
y/o
c) una secuencia de aminoácidos que está compuesta de cuatro regiones /secuencias estructurales interrumpidas tres regiones /secuencias determinantes de complementariedad, en que el residuo de aminoácido de la posición 103 de acuerdo con la numeración de Rabat se elige del grupo que consiste en P, R y S en particular se elige del grupo que consiste en R y S.
En consecuencia, en un primer aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocuerpo de la invención puede tener la estructura
FR1 CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
en que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en que
i) el residuo de aminoácido de la posición 108 de acuerdo con la numeración de Kabat es Q;
y/o en que:
ii) el residuo de aminoácido de la posición 44 de acuerdo con la numeración de Kabat es E y en que el residuo de aminoácido de la posición 45 de acuerdo con la numeración de Kabat es R; y/o en que: iii) el residuo de aminoácido de la posición 103 de acuerdo con la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste
en P, R y S, y en particular se elige del grupo que consiste en R y S; y en que iv) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definieron anteriormente En particular, un Nanocuerpo contra TNF-alfa de acuerdo con la invención puede tener la estructura:
FR- CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
en que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en que i) el residuo de aminoácido de la posición 10& de acuerdo con la numeración de Kabat es Q; y/o en que: ii) el residuo de aminoácido de la posición 44 de acuerdo con la numeración de Kabat es E y en que el residuo de
aminoácido de la posición 45 de acuerdo con la numeración de Kabat es una R; y/o en que: iii) el residuo de aminoácido de la posición 103 de acuerdo con la numeración de Kabat se elige del grupo que
consiste en P, R y S, y en particular se elige del grupo que consiste en R y S; y en que iv) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definieron anteriormente. En particular, de acuerdo con un aspecto preferido pero no limitante del aspecto de la invención, un Nanocuerpo se
puede definir generalmente como un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que está compuesta de cuatro regiones /secuencias estructurales interrumpidas tres regiones /secuencias determinantes de complementariedad, en que;
a-1) el residuo de aminoácido de la posición 44 de acuerdo con la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste
en G, E, D, G, Q, R, S, L; y preferentemente se elige del grupo que consiste en G, E o Q; y a-2) el residuo de aminoácido de la posición.45 de acuerdo con la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en L, R o C; y preferentemente se elige del grupo que consiste en L o R; y
a-3) el residuo de aminoácido de la posición 103 de acuerdo con la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en W, R o S; y preferentemente es W o R, y con máxima preferencia es W; a-4) el residuo de aminoácido de la posición 108 de acuerdo con la numeración de Kabat es Q;
o en que:
b-1) el residuo de aminoácido de la posición 44 de acuerdo con la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en E y Q; y b-2) el residuo de aminoácido de la posición 45 de acuerdo con la numeración de Kabat es R; y b-3) el residuo de aminoácido de la posición 103 de acuerdo con la numeración de Kabat se elige del grupo que
consiste en W, R y S; y es preferentemente W; b-4) el residuo de aminoácido de la posición 108 de acuerdo con la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en Q y L; y es preferentemente Q;
o en que: c-i) el residuo de aminoácido de la posición 44 de acuerdo con la numeración de Kabat se elige del grupo que
consiste en G, E, D, Q, R, S y L; y preferentemente se elige del grupo que consiste en G, E y Q; y
c-2) el residuo de aminoácido de la posición 45 de acuerdo con la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en L, R y C; y preferentemente se elige del grupo que consiste en L y R; y 15 c-3) el residuo de aminoácido de la posición 103 de acuerdo con la numeración de Kabat se elige del grupo que
consiste en P, R y S; y en particular se elige del grupo que consiste en R y S; y
c-4) el residuo de aminoácido de la posición 108 de acuerdo con la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en Q y L; es preferentemente Q. En consecuencia, en otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocuerpo de la invención puede tener la estructura
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
en que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en que: i) el residuo de aminoácido de la posición 44 de acuerdo con la numeración de Kabat se elige del grupo que
consiste en G, E, D, G, Q, R, S, L; y preferentemente se elige del grupo que consiste en G, E o Q; y en que: ii) el residuo de aminoácido de la posición 45 de acuerdo con la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en
L R o C; y preferentemente se elige del grupo que consiste en L o R; y en que: iii) el residuo de aminoácido de la posición 103 de acuerdo con la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste
en W, R o S; y es preferentemente W o R, y con máxima preferencia es W; y en que
iv)
el residuo de aminoácido de la posición 108 de acuerdo con la numeración de Kabat es Q;
10
y en que:
v)
CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definieron anteriormente.
En otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocuerpo de la invención puede tener la estructura FR1 -CDR1 - FR2 CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
en que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en que: i) el residuo de aminoácido de la posición 44 de acuerdo con la numeración de Kabat se elige del grupo que
consiste en E y Q; y en que: ii) el residuo de aminoácido de la posición 45 de acuerdo con la numeración de Kabat es R; y en que: iii) el residuo de aminoácido de la posición 103 de acuerdo con la numeración de Kabat se elige del grupo que
consiste en W, R y S; y es preferentemente W;
y en que:
iv) el residuo de aminoácido de la posición 108 de acuerdo con la numeración de Kabat es Q;
y en que:
CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definieron anteriormente
En otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocuerpo de la invención puede tener la estructura FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
en que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en que CDR1 a CDR3 se refieren a
las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en que:
i) el residuo de aminoácido de la posición 44 de acuerdo con la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste en G, E, D, Q, R, S y L; y preferentemente se elige del grupo que consiste en G, E y Q; y en que: ii) el residuo de aminoácido de la posición 45 de acuerdo con la numeración de Kabat se elige del grupo que
consiste en L, R y C; y preferentemente se elige del grupo que consiste en L y R; y en que: iii) el residuo de aminoácido de la posición 103 de acuerdo con la numeración de Kabat se elige del grupo que consiste
en P, R y S; y en particular se elige del grupo que consiste en R y S; y en que: iv) el residuo de aminoácido de la posición 108 de acuerdo con la numeración de Kabat se elige del grupo que
consiste en Q y L; es preferentemente Q; y en que: v) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definieron anteriormente. Dos grupos particularmente preferidos, pero no limitantes de los Nanocuerpos de la invención son los que están de
acuerdo con a) anterior; de acuerdo con 1) a a-4) anterior; de acuerdo con b)anterior; de acuerdo con b1) a b-4) anterior;
de acuerdo con c) anterior; y/o de acuerdo con c-1) a c-4) anterior, en que; a) los residuos de aminoácidos de las posiciones 44-47 de acuerdo con la numeración de Kabat forman la secuencia GLEW o una secuencia tipo GLEW que se define más adelante) y el residuo de aminoácido de la posición 108 es Q;
o en que: b) los residuos de aminoácidos de las posiciones 43-46 de acuerdo con la numeración de Kabat forman la secuencia
KERE o KQRE (o una secuencia tipo KERE) y el residuo de aminoácido de la posición 108 es Q o L, y es preferentemente Q, En consecuencia, en otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocuerpo de la invención puede tener la estructura
FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
5 en que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en que: i) los residuos de aminoácidos de las posiciones 4.4-47 de acuerdo con la numeración de Kabat forman la
secuencia GLEW (o una secuencia tipo GLEW que se define más adelante) y el residuo de aminoácidos de la posición 108 es Q; y en que: ii) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definieron anteriormente. En otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocuerpo de la invención puede tener la estructura
FR1 - CDR - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4 en que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3. respectivamente, y en que:
i) los residuos de aminoácidos de las posiciones 43-46 de acuerdo con la numeración de Kabat forman la secuencia KERE o KQRE (o una secuencia tipo KERE) y el residuo de aminoácido de la posición 108 es Q o L, y es preferentemente Q;
y en que ii) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definieron anteriormente. En los Nanocuerpos de la invención en que los residuos de aminoácidos de las posiciones 43-46 de acuerdo con la
numeración de Kabat forman la secuencia KERE o KQRE, el residuo de aminoácido de la posición 37 con máxima preferencia es F. En los Nanocuerpos de la invención en que los residuos de aminoácidos de las posiciones 44-47 de acuerdo con la numeración de Kabat forman la secuencia GLEW, el residuo de aminoácido de la posición 37 se elige del grupo que consiste en Y, H, I, V o F, y con máxima preferencia es F.
En consecuencia, sin limitarse a estos de ninguna manera, sobre la base de los residuos de aminoácido presentes en las posiciones mencionadas anteriormente, los Nanocuerpos de la invención se puede clasificar generalmente sobre al base de los siguientes tres grupos:
a) El "grupo GLEW”: Nanocuerpos con la secuencia de aminoácidos GLEW en las posiciones 44-47 de acuerdo con la numeración de Kabat y Q en la posición 108 de acuerdo con la numeración de Kabat. Como también se describe en la presente, los Nanocuerpos de este grupo usualmente tienen una V en la posición 37, y pueden tener un W, P, R o S en la posición 103, y preferentemente tener un W en la posición 103. El grupo GLEW también comprende algunas secuencias tipo GLEW tales como las mencionadas en la siguiente Tabla 2;
b) El "grupo KERE": Nanocuerpos con la secuencia de aminoácidos KERE o KQRE o en las posiciones 43-46 de acuerdo con la numeración de Kabat y Q o L en la posición 108 de acuerdo con la numeración de Kabat. Como también se describe en la presente, los Nanocuerpos de este grupo usualmente tienen un P en la posición 37, un L o P en la posición 47; y pueden tener un W, P, R o S en la posición 103, y preferentemente tener un W en la posición 103;
c) El "grupo 103 P, R, S": Nanocuerpos con un P, R o S en la posición 103. Estos Nanocuerpos pueden tener la secuencia de aminoácidos GLEW en las posiciones 44-47 de la numeración de Kabat o la secuencia de aminoácidos KERE o KERE en las posiciones 43-46 de acuerdo con la numeración de Kabat, esta última con máxima preferencia en combinación con una P en la posición 37 y una L o una P en la posición 47 (como se define para el grupo KERE); y puede tener Q o L en la posición 108 de acuerdo con la numeración de Kabat, y preferentemente tener Q.
En consecuencia, en otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocuerpo de la invención puede ser un Nanocuerpo perteneciente al grupo GLEW (como se define en la presente), y en que CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definieron anteriormente.
En otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocuerpo de la invención puede ser un Nanocuerpo perteneciente al grupo KERE (como se define en la presente), y en que CDR1, CDR2 io y CDR3 son como se definieron anteriormente:
En consecuencia, en otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocuerpo de la invención puede ser un Nanocuerpo perteneciente al grupos 103 P, R, S (como se define en la presente), y en que CDR 1, CDR2 y CDR3 son como se definieron anteriormente.
Asimismo, en forma más general y además de los residuos 108Q, 43E/44R y 103P,R,S mencionados anteriormente, los Nanocuerpos de la invención pueden contener, en una o más posiciones que, en un dominio VH convencional, pueden formar parte (parte de) de la interfaz VH/VL, contener uno más residuos de aminoácidos que están más altamente cargados que los residuos de aminoácidos que aparecen naturalmente en la misma posición en los correspondientes dominios VH y VL naturales; y en particular uno o más residuos de aminoácidos cargados (mencionados en la Tabla 1).
Tales sustituciones incluyen, pero sin limitación las secuencias tipo GLEW mencionadas en la siguiente Tabla 2; así como las sustituciones que se describen en la solicitud internacional WO 00/29004 para los llamados “microcuerpos", por ejemplo una Q en la posición 108 y KLEW en las posiciones 44-47.
En algunas realizaciones de los Nanocuerpos de la invención, el residuo de aminoácido de la posición 83 se elige del grupo que consiste en L, M, S, V y W; y es preferentemente L.
Asimismo, en algunas realizaciones de los Nanocuerpos de la invención, el residuo de aminoácido de la posición 83 se elige del grupo que consiste en R, K, N, I y Q; y con máxima preferencia es K o E (para Nanocuerpos correspondientes a los dominios VHH naturales) o R (para Nanocuerpos “humanizados”, que se describen a continuación). El residuo de aminoácido de la posición 84 en algunas realizaciones se elige del grupo que consiste en P, A, R, S, D y V, y con máxima preferencia es P (para Nanocuerpos correspondientes a los dominios VHH naturales) o R (para Nanocuerpos “humanizados”, que se describen a continuación).
Además, en algunas realizaciones de los Nanocuerpos de la invención, el residuo de aminoácido de la posición 104 se elige del grupo que consiste en G y D; y con máxima preferencia es G.
En conjunto, los residuos de aminoácidos de las posiciones 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 y 108, que en los Nanocuerpos son como se mencionaron anteriormente, también se denominarán en la presente como "residuos Marcadores". Los residuos marcadores y los residuos de aminoácidos de las correspondientes posiciones del dominio VH humano más estrechamente relacionado, VH3, se sintetizan en la Tabla 2.
Algunas combinaciones especialmente preferidas de estos residuos marcadores que aparecen en los dominios VHH naturales se mencionan en la Tabla 3. Para comparación, los correspondiente residuos de aminoácidos del VH3 humano llamado DP-47 se han indicado en itálica.
Tabla 2: residuos Marcadores en los Nanocuerpos Notas:
Posición
VH3 humano residuos Marcadores
11
L, V; predominantemente L. L, M, S. V,W; preferentemente L
37
V, I, F; usualmente V Y, H, I o V, preferentemente o Y
44(2)
G G(2), E(3), Q, R, S, L; preferentemente G(2), E (3) o Q; con máxima preferencia G(2) o E (3)
45(2)
L L(2), E(3), C, I, L, P, Q, V; preferentemente L o R(3)
47(3)
W, Y W(2), L(1) o F(1), A, G, I, M, R, S o Y; preferentemente W(2), L(1) o F(1) o R
83
R o K; usualmente R R, K(2), N, E(1), I, M o Q; preferentemente K o R; con máxima preferencia K
84
A,T,D; predominantemente A P(2), A, L, R, S, D, V; preferentemente P
103
W W(4), P(6), R(6), S; preferentemente W
104
G G o D, preferentemente G
108
L, M o T predominantemente L Q, L(2) o R, preferentemente Q o L(2)
(1): En particular, pero no exclusivamente, en combinación con KERE (SEQ ID NO: 437) o KQRE (SEQ ID NO: 438) en las posiciones 43-46.
5 (2): Usualmente como GLEW (SEQ ID NO: 439) en las posiciones 44-47.
(3): Usualmente como KERE o KQRE en las posiciones 43-46, por ejemplo como KEREL (SEQ ID NO: 440), KEREF (SEQ ID NO. 441), KQREL (SEQ ID NO. 442), KQREF (SEQ ID NO: 443) o KEREG (SEQ ID NO: 444) en las posiciones 43-47. Alternativamente, también las secuencias tal como TERE (SEQ ID NO: 445) (por ejemplo TEREL (SEQ ID NO: 446)), KECE (SEQ ID NO: 447) (por ejemplo KECEL (SEQ ID NO: 448) o KECER (SEQ ID NO: 449)),
10 RERE (SEQ ID NO: 450) (por ejemplo REREG (SEQ ID NO. 451)), QERE (SEQ ID NO: 452) (por ejemplo QEREG (SEQ ID NO: 453)), KGRE (SEQ ID NO: 454) (por ejemplo KGREG (SEQ ID NO; 455)), KDRE (SEQ ID NO: 456) (por ejemplo KDREV (SEQ ID NO: 457)) son posibles. Algunas otras secuencias posibles, pero menos preferidas incluyen por ejemplo DECKL (SEQ ID NO: 458) y NVCEL (SEQ ID NO: 459).
(4): Con GLEW en las posiciones 44-47 y KERE o KQRE en las posiciones 43-46.
15 (5): A menudo como KP o EP en las posiciones 83-84 de los dominios VHH naturales.
(6): En particular, pero no exclusivamente, en combinación con GLEW en las posiciones 44-47.
(7): Con la condición que cuando las posiciones 44-47 son GLEW, posición 108 es siempre Q.
(8): El grupo GLEW también contiene secuencias tipo GLEW en las posiciones 44-47, tal como por ejemplo GVEW (SEQ ID NO: 460), EPEW (SEQ ID NO: 461), GLER (SEQ NO: 462), DQEW (SEQ E) NO: 463), DLEW (SEQ ID NO:
20 464), GIEW (SEQ ID NO: 465), ELEW (SEQ ID NO: 466), GPEW (SEQ ID NO: 467), EWLP (SEQ.ID NO: 468), GPER (SEQ ID NO: 469), GLER (SEQ ID NO: 470) y ELEW.
Tabla 3: Algunas combinaciones preferidas de los residuos marcadores en los Nanocuerpos naturales. Para la humanización de estas combinaciones, se hace referencia a la memoria especificativa.
En los Nanocuerpos, cada residuo de aminoácido en cualquier otra posición que los residuos Marcadores puede ser cualquier residuo de aminoácido que se producen naturalmente en la correspondiente posición (de acuerdo con la numeración de Kabat) de un dominio VHH natural.
Tales residuos de aminoácidos serán evidentes para los expertos. Las Tablas 4 -7 mencionan algunos residuos no
5 limitantes que pueden estar presentes en cada posición (de acuerdo con la numeración de Kabat) de las FR1, FR2, FIR y FR4 de los dominios VHH naturales. En cada posición, el residuo de aminoácido que aparece más frecuentemente en cada posición de un dominio VHH natural (y que es el residuo de aminoácido más preferido para dicha posición en un Nanocuerpo) está indicado en negrita; y otros residuos preferidos de aminoácidos para cada posición se han subrayado (nota: el número de residuos de aminoácidos que se hallan en las posiciones 26-30 de los dominios VHH naturales
10 respalda la hipótesis subyacente de la numeración (supra) de que los residuos de estas posiciones ya forman parte de CDR1).
En las Tablas 4 - 7, también se han mencionado algunos de los residuos no limitantes que pueden estar presentes en cada posición de un dominio VH3 humano. Nuevamente, para cada posición, el residuo de aminoácido que aparece con más frecuencia en cada posición del dominio VH3 humano natural se indica en negrita; y otros residuos de aminoácidos
15 preferidos se han subrayado.
Tabla 4: Ejemplos no limitantes de residuos de aminoácidos en la FR1 (para las notas al pie, ver las notas al pie de la Tabla 2)
Tabla 4: Ejemplos no limitantes de residuos de aminoácidos en la FR1 (continuación)
Tabla 5: Ejemplos no limitantes de residuos de aminoácidos in FR2 (para las notas al pie, ver las notas al pie de Tabla 2)
Tabla 6: Ejemplos no limitantes de residuos de aminoácidos in FR3 (para las notas al pie, ver las notas al pie a la Tabla 2)
Tabla 6: Ejemplos no limitantes de residuos de aminoácidos in FR3 (continuado)
Tabla 7: Ejemplos no limitantes de residuos de aminoácidos in FR4 (para las notas al pie, ver las notas al pie en la Tabla 2)
En consecuencia, en otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocuerpo de la invención puede tener la estructura 5 FR1 - CDR1 - FR2-CDR2-FR3-CDR3 - FR4
en que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4 respectivamente, y en que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en que: i) los residuos marcadores son como se definieron anteriormente; y en que: ii) CDR2, CDR2 y CDR3 son como se definieron anteriormente.
10 En otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocuerpo de la invención puede tener la estructura FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3-FR4
en que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en que: i) FR1 se elige del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos:
15 [1] QVQLQESGGGXVQAGGSLRLSCAASG [26] [SEQ ID NO: 1)
o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la anterior secuencia de aminoácidos; en que
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente
20 una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido como se define en la Tabla 4; y/o
(2) dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos;
y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se 25 define en la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 4; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o
supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos; y en que: ii) FR2 se elige del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos:
[36] WXRQAPGKXXEXVA [49] [SEQ ID NO: 2]
o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 20 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la anterior secuencia de aminoácidos; en que
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente a sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 5; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos;
y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 5; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos;
y en que: iii) FR.3 se elige del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos:
[66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLXXEDTSAVYYCAA [94] [SEQ ID NO: 3]
o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la anterior secuencia de aminoácidos; en que
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 6; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos;
y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 6; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos;
y en que: iv) FR4 se elige del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos:
[103] XXQGTXVTVSS [113] [SEQ ID NO: 4]
o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la anterior secuencia de aminoácidos; en que
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 7; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos;
y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 7; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos;
y en que: v) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definieron anteriormente en que los residuos Marcadores se indican con "X" y son como se definieron anteriormente en la presente y en los que los números entre corchetes se refieren a la posición del aminoácido de acuerdo con la numeración de Kabat.
En otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocuerpo de la invención puede tener la estructura FR1 - CDR1 - FR2 – CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
en que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en que: i) FR1 se elige del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos:
[1] QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [26] [SEQ ID NO: 5)
o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la anterior secuencia de aminoácidos; en que
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 4; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos; y
(3)
el residuo Marcador en la posición es como se indica en la secuencia anterior;
y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido” (como se define en la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 4; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos; y
el residuo Marcador en la posición como se indica en la secuencia anterior; y en que: ii) FR2 se elige del grupo que consiste en la secuencias de aminoácidos:
[36]
WFRQAPGKERELVA [49] [SEQ ID NO: 6]
[36]
WFRQAPGKEREFVA [49])[SEQ ID NO: 7]
[36]
WFRQAPGKEREGA [49] [SEQ ID NO: 8]
[36]
WFRQAPGKQRELVA [49] [SEQ ID NO: 9)
[36]
WFRQAPGKQREFVA [49] [SEQ ID NO: 10] [36) WYRQAPGKGLEWA [49] [SEC ID NO: 1 i]
o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos; en que
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 5; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos; y
(3)
los residuos Marcadores en las posiciones 37, 44, 45 y 47 indicados en cada de una de las secuencias anteriores;
y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 5; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos; y
(3)
los residuos Marcadores en las posiciones 37, 44, 45 y 47 son como se indica en cada una de las secuencias anteriores;
y en que:
iii) FR3 se elige del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos:
o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con la anterior secuencia de aminoácidos; en que
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) 5 y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 6; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos; y
(3)
los residuos Marcadores en las posiciones 83 y 84 son como se indica en cada una de las secuencias anteriores;
y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 6; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos; y
(3)
los residuos Marcadores en las posiciones 83 y 84 son como se indica en cada una de las secuencias anteriores; y en que: iv) FR4 se elige del grupo que consiste en la secuencias de aminoácidos:
o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en
la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos; en que
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 6; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y 5 sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos; y
(3)
los residuos Marcadores en las posiciones 103, 104 y 108 son como se indica en cada una de las secuencias anteriores;
y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácido anteriores, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 6; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido., en comparación con las anteriores secuencias; y
(3)
los residuos Marcadores en las posiciones 103, 104 y 108 son como se indica en cada una de las secuencias anteriores; y en que: v) CDR1. CDR2 y CDR3 son como se definieron anteriormente} En otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocuerpo de la invención puede tener la estructura
FR1 -CDR1 -FR2-CDR2 -FR3-CDR3 -FR4 en que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en que: y en que
i) FR1 se elige del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos:
y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácido anteriores, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 4; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos; y
(3)
el residuo Marcador en la posición como se indica en la secuencia anterior;
y en que: ii) FR2 se elige del grupo que consiste en la secuencias de aminoácidos:
y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se 5
define en la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido .en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 5; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos; y
(3)
los residuos Marcadores en las posiciones 37, 44, 45 y 47 son como se indica en cada una de las secuencias anteriores;
y en que: iii) FR3 se elige del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos:
y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 6; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos; y
(3)
los residuos Marcadores en las posiciones 83 y 84 son como se indica en cada una de secuencias anteriores; y en que: iv) FR4 se elige del grupo que consiste en la secuencias de aminoácidos:
y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 7; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos; y
(3)
los residuos Marcadores en las posiciones 103, 104 y 108 son como se indica en cada una de las secuencias anteriores; y en que: En otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocuerpo de la invención puede tener la estructura
FR1-CDR1 -FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4 en que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en que: y en que
i) FR1 se elige del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos: y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tiene 3, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 4; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos; y
(3)
el residuo Marcador en la posición es como se indica en la secuencia anterior; y en que: ii) FR2 se elige del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos:
que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 5; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y 5 sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos; y
(3)
los residuos Marcadores en las posiciones 37, 44, 45 y 47 son como se indica en cada una de las secuencias anteriores;
y en que: iii) FR3 se elige del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos:
y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 6; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos; y
(3)
los residuos Marcadores en las posiciones 83 y 84 son como se indica en cada una de las secuencias anteriores; y en que: iv) FR4 se elige del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos:
y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tiene, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente o una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 7; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos; y
(3)
los residuos Marcadores en las posiciones 103, 1 04 y 108 son como se indica en cada una de las secuencias anteriores; y en que:
v) CDR1, CDR2 y CDR3 son como se definieron anteriormente. Algunas otras secuencias estructurales que pueden estar presentes en los Nanocuerpos de la invención se pueden hallar en la Patente Europea EP 656 946 mencionada anteriormente (ver por ejemplo, también la US concedida equivalente 5.759.808).
En otro aspecto preferido, pero no limitante, un Nanocuerpo de la invención puede tener la estructura FR1 - CDR! - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4
en que FR1 a FR4 se refieren a las regiones estructurales 1 a 4, respectivamente, y en que CDR1 a CDR3 se refieren a las regiones determinantes de complementariedad 1 a 3, respectivamente, y en que: y en que i) FR1 se elige del grupo que consiste en las secuencias de FR1 presentes en los Nanocuerpos de la SEQ ID No
52 a 60, SEQ U) NOs 76 a 86 o SEQ ID NOs 95 a 99, y en particular los Nanocuerpos humanizados de la SEQ ID NOs 76 a 86 o SEQ ID NOs 95 a 99,
o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de dichas secuencias de FR1; en que
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 4; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con dicha secuencia de FR1; y
(3)
el residuo Marcador en la posición es como se indica en dicha secuencia de FR1; y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tiene 3, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con una de dichas secuencias de FR1, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 4; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con dicha secuencia de FR1; y
(3)
el residuo Marcador en la posición es como se indica en dicha secuencia de FR1;
y en que:
ii) FR2 se elige del grupo que consiste en las secuencias de FR2 presentes en los Nanocuerpos de las SEQ ID NOs 52 a 60, SEQ NOs 76 a 86 o SEQ ID NOs 95 a 99, y en particular en los Nanocuerpos humanizados de la SEQ ID) NOs 76 a 86 o SEQ ID NOs 95 a 99,
o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 20 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de dichas secuencias de FR2; en que
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente)
y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 5; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con dicha secuencia de FR2; y
(3)
los residuos Marcadores en las posiciones 37, 44, 45 y 47 son como se indica en dicha secuencia FR2;
y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencias de aminoácido" (como se define en la presente) con una de dichas secuencias de FR2, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente
una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 5; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con dicha secuencia de FR2; y
(3)
los residuos Marcadores en las posiciones 37, 44, 45 y 47 son como se indican en dicha secuencia de FR2;
y en que:
iii) FR3 se elige del grupo que consiste en las secuencias de FR3 presentes en los Nanocuerpos de la SEQ ID NOs 52 a 60, SEQ ID NOs 76 a 86 o SEQ ID NOs 95 a 99, y en particular en los Nanocuerpos humanizados de la SEQ ID NOs 76 a 86 o SEQ ID NOs 95 a 99,
o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de dichas secuencias de FR3; en que (1) cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 6; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con dicha secuencia de FR3; y
(3)
los residuos Marcadores en las posiciones 83 y 84 como se indican en dicha secuencia de FR3;
y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tiene, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con una de dichas secuencias de FR3, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 6; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con dicha secuencia de FR3; y
(3)
los residuos Marcadores en las posiciones 83 y 84 are como se indica en dicha secuencia de FR3;
y en que:
iv) FR4 se elige del grupo que consiste en las secuencias de FR4 presentes en los Nanocuerpos de la SEQ ID NOs 52 a 60, SEQ ID NOs 76 a 86 o SEQ ID NOs 95 a 99, y en particular en los Nanocuerpos humanizados de la SEQ No 76 a 86 o SEQ ID NOs 95 a 99,
o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de dichas secuencias de FR4; en que
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 6; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácidos, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con dicha secuencia de FR4; y
(3)
los residuos Marcadores en las posiciones 103, 104 y 108 son como se indican dicha secuencia de FR4;
y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tiene, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con una de dichas secuencias de FR4, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en la Tabla 6; y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con dicha secuencia FR4; y
(3)
los residuos Marcadores en las posiciones 103, 304 y 108 son como se indica en dicha secuencia de FR4; y en que:
v) CDR], CDR2 y CDR3 son como se definieron anteriormente, y son preferentemente definidas de acuerdo con una de las definiciones preferidas anteriores y más preferentemente son como se definieron de acuerdo con una de las definiciones anteriores más preferidas.
Algunos nanocuerpos particularmente preferidos de la invención se pueden elegir de las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID Nos 52, 76, 77, 95 y 96 y en particular los Nanocuerpos humanizados de la SEQ ID 76 y 77 o SEQ ID NOs 95 y 96 del grupo que consiste en aminoácido secuencias que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID Nos 52, 76, 77, 95 y 96; en que
(1)
los residuos Marcadores se pueden indicar como en la Tabla 2 anterior;
(2)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido como se define en las Tablas 4-7; y/o
(3)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos,
Algunos nanocuerpos aun más particularmente preferidos de la invención se pueden elegir del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID Nos 52, 76, 77, 95 y 96 y en particular de los Nanocuerpos de la SEQ ID NO 76 a 86 o SEQ ID Nos 95 a 99 o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen al menos 130%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 990/ identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO SEQ ID Nos 52, 76, 77, 95 y 96; en que
(1)
los residuos Marcadores son como se indican en la secuencia pertinente elegida de las SEQ ID Nos 52, 76, 77, 95 y 96;
(2)
cualquier sustitución de aminoácido en cualquier posición diferente de una posición Marcadora es preferentemente una sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente) y/o una sustitución de aminoácido que se define en las Tablas 4-7; y/o
(3)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con la secuencia pertinente elegida de las SEQ ID Nos 52, 76, 77, 95 y 96.
Algunos de los Nanocuerpos más preferidos de la invención se pueden elegir del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NO ID Nos 52, 76, 77, 95 y 96, y en particular de los nanocuerpos de la SEQ ID No ID Nos 76, 77, 95 y 96.
Como será evidente a partir de lo anterior, el término Nanocuerpos de la invención como se usa en la presente en su sentido más amplio también comprende mutantes, variantes, alelos, análogos y ortólogos naturales o sintéticos (de aquí en adelante denominado colectivamente como "análogos") de los Nanocuerpos mencionados en las SEQ ID No 52, 76, 77, 95 y 96.
Generalmente, tales análogos por ejemplo pueden comprender secuencias homólogas, porciones funcionales, o una porción funcional de una secuencia homóloga (que también se define más adelante) de un Nanocuerpo. Generalmente, en tales análogos, cada residuo de aminoácido (diferente del residuo Marcador) en cada una de las regiones estructurales se puede reemplazar con otro residuo de aminoácido, con la condición de que el grado total de identidad de secuencia de las regiones estructurales permanece como se definió anteriormente. Preferentemente, sin embargo, en tales análogos:
-
uno o más residuos de aminoácidos en las anteriores secuencias estructurales se reemplazan con uno o más residuos de aminoácidos que se producen naturalmente en la misma posición en un dominio VHH natural. Algunos ejemplos de tales sustituciones se mencionan en las Tablas 4-7 anteriores;
y/o:
-
uno o más residuos de aminoácidos de las secuencias estructurales anteriores se reemplazan con uno o más residuos que se pueden considerar una sustitución "conservadora" de aminoácido, como se describió anteriormente en la presente;
-
uno o más residuos de las anteriores secuencias estructurales se reemplazan con uno o más residuos de aminoácidos que aparecen naturalmente en la misma posición en un dominio VH natural de un ser humano, esto generalmente se denomina como "humanización" del VHH/Nanocuerpo natural en general y de dicha posición en particular, y se discutirá con más detalle a continuación en la presente;
Y posiciones en las cuales solo se menciona un residuo de aminoácido para el dominio VH y el dominio VHH de las Tablas 4 – 7 anterior preferentemente no se reemplazan.
Asimismo, si bien generalmente se prefiere menos, en tales análogos, uno o más residuos de aminoácidos se pueden suprimir en las regiones estructurales y/o se insertan en las regiones estructurales (opcionalmente además a uno o más sustituciones de aminoácido como se mencionó anteriormente), con la condición que el grado total de identidad de secuencia de las regiones estructurales permanece como se definió anteriormente. Los residuos Marcadores no se deben suprimir. Asimismo, con máxima preferencia, los residuos de aminoácidos para los cuales solo un residuo de aminoácido se menciona para ambos el dominio VH y el dominio VHH en las Tablas 4 - 7 anteriores preferentemente no se suprimen.
Preferentemente, tales análogos deben ser tales que se puedan unir a, tener afinidad por y/o tener especificidad por TNF-alfa, es decir, con una afinidad y/o una especificidad que es al menos 10%, preferentemente al menos 50%, más preferentemente al menos 70%, aun más preferentemente al menos 80%, tal como al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o más, de afinidad y/o especificidad de al menos uno de los Nanocuerpos, determinados mediante un ensayo adecuado, por ejemplo un ensayo para determinar la unión del análogo al TNF, y en particular uno de los ensayos usados en los siguientes Ejemplos.
Generalmente, tales análogos por ejemplo se pueden obtener por la provisión de un ácido nucleico que codifica un dominio VHH natural, cambio de los codones por uno o más residuos de aminoácidos que se humanizan en los codones para el correspondiente residuo de aminoácido humano, que expresa la secuencia de ácido nucleicos/nucleótidos así obtenido en un huésped o sistema de expresión adecuado; y opcionalmente aislar y/o purificar el análogo así obtenido para proporcionar dicho análogo en forma esencialmente aislada (como se definió anteriormente en la presente). Generalmente esto se puede realizar mediante procedimientos y técnicas conocidas per se, que será evidente para los expertos, por ejemplo a partir de los manuales y referencias mencionadas en la presente y/o a partir de la siguiente descripción adicional en la presente. Alternativamente, y por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un análogo se puede sintetizar de una manera conocida per se (por ejemplo, mediante un aparato automatizado para sintetizar las secuencias de ácidos nucleicos con una secuencia de aminoácidos predefinida) y puede expresar en un huésped o sistema de expresión adecuado, después de lo cual el análogo así obtenido opcionalmente se puede aislar y/o purificar de modo de proporcionar dicho análogo en forma esencialmente aislada (como se definió anteriormente en la presente). Otro modo de proporcionar los análogos involucrar la síntesis química de la secuencia pertinente de aminoácidos usando técnicas para síntesis de péptidos conocida per se, tal como los mencionados más adelante en la presente.
Generalmente también será evidente para los expertos que los Nanocuerpos (que incluyen sus análogos) también se pueden preparar a partir de las human secuencias de VH (es decir, secuencias de aminoácidos o las correspondientes secuencias de nucleótidos), tal como por ejemplo secuencias de VH3 tales como DP-47, DP-51, DP-54 o DP-29, por el cambio de uno o más residuos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de dicho dominio VH humano, de modo de proporcionar una secuencia de aminoácidos que tiene (a) un Q en la posición 108; y/o (b) E en la posición 44 y/o R en la posición 45, y preferentemente E en la posición 44 y R en la posición 45; y/o (c) p, R o S en la posición 103, como se describió anteriormente. Nuevamente, esto se puede realizar generalmente mediante diversos procedimientos y técnicas mencionados en el párrafo previo, por medio de una secuencia de aminoácidos y/o secuencia de nucleótidos para un dominio VH humano como punto de partida.
El término Nanocuerpos como se usa en la presente en su sentido más amplio también comprende partes o fragmentos de los Nanocuerpos (que incluyen análogos) de la invención como se definió anteriormente, que nuevamente también se puede describir mas adelante.
Generalmente, las partes o fragmentos de los Nanocuerpos y/o análogos tienen secuencias de aminoácidos en que, en comparación con la secuencia de aminoácidos del correspondiente Nanocuerpo o análogo de longitud completa, se ha suprimido y/o eliminado uno o más de los residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal, uno o más residuos de aminoácidos en el extremo C-terminal, uno o más residuos de aminoácidos internos contiguos, o cualquier combinación de estos. También es posible combinar una o más de estas partes o fragmentos para proporcionar un Nanocuerpo de la invención.
Preferentemente, la secuencia de aminoácidos de un Nanocuerpo que comprende uno o más partes o fragmentos de un Nanocuerpo y/o análogo de longitud completa debe tener un grado de identidad de secuencia de al menos 50%, preferentemente al menos 60%, más preferentemente al menos 70%, tal como al menos80%, al menos 90% o al menos 95%, con la secuencia de aminoácidos del correspondiente Nanocuerpo de longitud completa.
Asimismo, la secuencia de aminoácidos de un Nanocuerpo que comprende uno o más partes o fragmentos de un Nanocuerpo y/o análogo de longitud completa es preferentemente tal que comprende al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, preferentemente al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, más preferentemente al menos 30 residuos de aminoácidos contiguos, tal como al menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, de la secuencia de aminoácidos del correspondiente Nanocuerpo de longitud completa.
Generalmente, tales partes o fragmentos de los Nanocuerpos de la invención tendrán secuencias de aminoácidos en que, en comparación con la secuencia de aminoácidos del correspondiente Nanocuerpo de longitud completa de la invención, se han suprimido y/o eliminado uno o más de los residuos de aminoácidos en el extremo N-terminal, uno o más residuos de aminoácidos en el extremo C-terminal, uno o más residuos de aminoácidos internos contiguos, o cualquier combinación de estos. También es posible combinar una o más de tales partes o fragmentos para proporcionar un Nanocuerpo de la invención.
De acuerdo con una realización preferida, un fragmento usado en la presente comprende al menos una de las CDR presentes en un Nanocuerpo de tamaño completo de la invención, preferentemente al menos dos de las CDR presentes en un Nanocuerpo de tamaño completo de la invención, más preferentemente al menos CDR2 y CDR3 presentes en un Nanocuerpo de tamaño completo de la invención, tal como por ejemplo las tres CDR presentes in a Nanocuerpo de tamaño completo de la invención.
De acuerdo con otra realización particularmente preferida, pero no limitante, tal parte o fragmento comprende al menos FR3, CDR3 y FR4 del correspondiente Nanocuerpo de longitud completa de la invención, es decir como se describe por ejemplo en la Solicitud internacional WO 03/050531 (Lasters et al.).
Preferentemente, tales partes o fragmentos deben ser de modo tal que se puedan unir a, tener afinidad por y/o tener especificidad por TNF-alfa, es decir con una afinidad y/o una especificidad que es al menos 10%, preferentemente al menos 50%, más preferentemente al menos 70%, incluso más preferentemente al menos 80%, tal como al menos 90%, al menos 95%, al menos 99% o más, de la afinidad y/o especificidad del correspondiente Nanocuerpo de tamaño completo de la invención, por ejemplo, en un ensayo para determinar la unión del análogo a TNF, y en particular uno de los ensayos usados en los siguientes Ejemplos.
A partir de la descripción anterior de la presente, será evidente que la secuencias de aminoácidos de los Nanocuerpos usado en la presente difieren en al menos una posición de aminoácido en al menos una de las regiones estructurales de las secuencias de aminoácidos de dominios VH naturales, tales como la secuencias de aminoácidos de los dominios VH naturales de los anticuerpos de los seres humanos. En particular, será evidente que las secuencias de aminoácidos de los Nanocuerpos usado en la presente difieren en al menos uno de los residuos Marcadores de las secuencias de aminoácidos de los dominios VH naturales, tal como la secuencias de aminoácidos de los dominios VH naturales de anticuerpos de camélidos y/o seres humanos.
En consecuencia, de acuerdo con una realización específica, un Nanocuerpo de la invención tiene una secuencia de aminoácidos que difiere en al menos una posición de aminoácido en una de las regiones estructurales de la secuencia de aminoácidos de un dominio VH natural. De acuerdo con una realización más específica, pero no limitante de la invención, un Nanocuerpo de la invención tiene una secuencia de aminoácidos que difiere en al menos uno de los residuos Marcadores de la secuencia de aminoácidos de un dominio VH natural.
A partir de la descripción anterior de la presente, también será evidente que las secuencias de aminoácidos de algunos de los Nanocuerpos de la invención, tal como los Nanocuerpos humanizados de la invención, diferirán en al menos una posición de aminoácido en al menos una de las regiones estructurales (es decir, en la posición de un residuo Marcador
o en otra posición) de las secuencias de aminoácidos de los dominios VHH naturales. En consecuencia, de acuerdo con una realización específica, pero no limitante, un Nanocuerpo de la invención tiene una secuencia de aminoácidos que difiere en al menos una posición de aminoácido en una de las regiones estructurales de la secuencia de aminoácidos de un dominio VHH natural. De acuerdo con una realización más específica, pero no limitante de la invención, un Nanocuerpo de la invención tiene una secuencia de aminoácidos que difiere en al menos uno de los residuos Marcadores de la secuencia de aminoácidos de dominio VHH natural.
La invención en sentido más amplio también comprende derivados de los Nanocuerpos de la invención. Tales derivados generalmente se pueden obtener por la modificación, y en particular por la modificación química y/o biológica (por ejemplo, enzimática) de los Nanocuerpos de la invención y/o de uno o más de los residuos de aminoácidos que formar los Nanocuerpos de la invención.
Los ejemplos de tales modificaciones, así como ejemplos de residuos de aminoácidos dentro de la secuencia del nanocuerpo que se puede modificar de tal manera (es decir en el esqueleto de la proteína pero preferentemente en una cadena lateral), procedimientos y técnicas que se pueden usar para introducir tales modificaciones y los usos y ventajas potenciales de tales modificaciones serán evidentes para los expertos.
Por ejemplo, tal modificación puede involucrar la introducción (por ejemplo, por unión covalente o de otra manera adecuada) de uno o más grupos, residuos o restos funcionales en el nanocuerpo de la invención, y en particular de uno
o más grupos, residuos o restos funcionales que confieren una o más propiedades o funcionalidades deseadas para el nanocuerpo de la invención. Ejemplo de tales grupos funcionales serán claros para los expertos.
Por ejemplo, tal modificación puede comprender la introducción (por ejemplo, por unión covalente o de cualquier otra manera adecuada) de uno o más grupos funcionales que aumentan la vida media, la solubilidad y/o al absorción del nanocuerpo de la invención, que reducen la inmunogenicidad y/o la toxicidad del nanocuerpo de la invención, que eliminan o atenúan cualquier efecto secundarios no deseable del nanocuerpo de la invención, y/o que confieren otras propiedades ventajosas y/o reducen las propiedades no deseadas de los Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención;
o cualquier combinación de dos o más de los precedentes. Los ejemplos de tales grupos funcionales y de técnicas para introducirlos serán evidentes para los expertos, y en general pueden comprender todos los grupos funcionales y
técnicas mencionadas en los antecedentes generales de la técnica mencionado anteriormente en la presente así como los grupos funcionales y técnicas conocidas per se para la modificación de proteínas farmacéuticas, y en particular para la modificación de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (que incluyen ScFv y anticuerpos de dominio único), para los cuales se hace referencia por ejemplo en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980). Tales grupos funcionales por ejemplo se pueden unir directamente (por ejemplo, en forma covalente) a un Nanocuerpo de la invención, u opcionalmente por medio de un ligador o espaciador adecuado, como nuevamente será evidente para los expertos.
Una de las técnicas más ampliamente usadas para aumentar la vida media y/o la reducción de la inmunogenicidad de las proteínas farmacéuticas comprende la unión de un polímero farmacológicamente aceptable adecuado, tal como poli(etilenglicol) (PEG) o sus derivados (tal como metoxipoli(etilenglicol) o mPEG). Generalmente, se pueden usar cualquier forma adecuada de pegilación, tal como la pegilación usada en la técnica para los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (que incluyen pero sin limitación anticuerpos de dominio (único) y ScFv); se hace referencia por ejemplo en Chapman, Nat. Biotechnol, 54, 531-545 (2002); por Veronese y Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), por Hans y Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003) y en WO 04/060965. Varios reactivos para la pegilación de proteínas también están disponibles en el comercio, por ejemplo, en Nektar Therapeutics, USA.
Preferentemente, se usa la pegilación dirigida al sitio, en particular por medio de un residuo de cisteína (ver por ejemplo Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003). Por ejemplo, para este fin, el PEG se puede unir a un residuo de cisteína que aparecen naturalmente en un Nanocuerpo de la invención, un Nanocuerpo de la invención se puede modificar de modo de introducir adecuadamente uno o más residuos de cisteína para la unión de PEG, o una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más residuos de cisteína para la unión de PEG se puede fusionar al extremo Ny/o C-terminal de un Nanocuerpo de la invención, por medio del uso de las técnicas de ingeniería de proteínas conocida per se por los expertos.
Preferentemente, para los Nanocuerpos y proteínas de la invención, se usa un PEG con un peso molecular de más de 5000, tal como más de 10.000 y menos de 200.000, tal como menos de 100.000; por ejemplo en el rango de 20.000
80.000.
Con respecto a la pegilación, cabe mencionar que generalmente, la invención también abarca cualquier Nanocuerpo de la invención y/o polipéptido de la invención que ha sido pegilado en una o más posiciones de aminoácido, preferentemente de manera que dicha pegilación (1) aumenta la vida media in vivo; (2) reduce la inmunogenicidad; (3) proporciona una o más propiedades beneficiosas conocidas per se para la pegilación; (4) no afecta esencialmente la afinidad del nanocuerpo y/o polipéptido para TNF-alfa (por ejemplo no reduce dicha afinidad en más de 90%, preferentemente no en más de 50%, y más preferentemente no en más de 10%, determinado por un ensayo adecuado, tal como los descriptos en los siguientes Ejemplos); y/o (4) no afecta ninguna de las otras propiedades deseadas de los Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención. Los grupos PEG y procedimientos adecuados para unirlos, sea en forma específica o no específica, será evidente para los expertos. Los kits y reactivos adecuados para tal pegilación por ejemplo, se pueden obtener en Nektar (CA, USA).
Otra modificación, usualmente menos preferida comprende glicosilación ligada a N o ligada a O, usualmente como parte de la modificación co-traducción y/o pos-traducción, dependiendo de la célula huésped usada para expresar el nanocuerpo o polipéptido de la invención.
Aún otra modificación puede comprender la introducción de una o más marcas detectables u otros grupos o restos generadores de señal, de acuerdo con el uso deseado del Nanocuerpo marcado. Las marcas detectables y técnicas para fijarlas, usarlas y detectarlas serán evidentes para los expertos, y por ejemplo incluyen, pero sin limitación, marcas fluorescentes (tal como fluoresceína, isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído, y fluorescamina y metales fluorescentes tales como 152Eu u otros metales de la serie lantánido), marcas fosforescentes, marcas quimioluminiscentes o marcas bioluminiscentes (tal como luminal, isoluminol, éster de acridinio teromático, imidazol, sales de acridinio, éster de oxalato, dioxetano o GFP y sus análogos), radio-isótopos (tal como 3H, 125I, 32P,32S, 14C, 57Cr, 58Co, 59Fe, y 75Se), metales, quelatos de metales o cationes metálicos (por ejemplo cationes metálicos tales como 99mTc, 123I, 111In, 131I, 97Ru, 67Cu, 67Ga, y 68Ga u otros metales o cationes metálicos que son particularmente adecuados para usar en el diagnóstico y análisis por imágenes in vivo, in vitro o in situ, tal como (157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr, y 56Fe), así como cromóforos y enzimas (tales como malato deshidrogenasa, nucleasa estafilocócica, isomerasa delta-V-esteroide, alcohol deshidrogenasa de levadura, glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, biotinavidina peroxidasa, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, -galactosidasa,
ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-VI-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolina esterasa). Otras marcas adecuadas serán evidentes para los expertos, y por ejemplo incluyen restos que se pueden detectar por espectroscopia RMN o ESR.
Tales Nanocuerpos y polipéptidos marcados de la invención por ejemplo se pueden usar en ensayos in vitro, in vivo o in situ (que incluyen inmunoensayos conocidos per se tal como ELISA, RIA, EIA y otros "ensayos sándwich", etc.) así como con fines diagnósticos y de análisis por imágenes in vivo, que dependen de la elección de la marca específica.
Como será evidente para los expertos, otra modificación puede involucrar la introducción de un grupo quelante, por ejemplo para quelar uno de los metales o cationes metálicos mencionados anteriormente. Los grupos quelantes adecuados por ejemplo incluyen, sin limitación, ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
Aún otra modificación puede comprender la introducción de un grupo funcional que es una parte de un par de unión específica, tal como el par de unión biotina-(estrept)avidina. Tal grupo funcional se puede usar para unir el nanocuerpo de la invención a otra proteína, polipéptido o compuesto químico que se une a la otra mitad del par de unión, es decir, mediante la formación del par de unión. Por ejemplo, un Nanocuerpo de la invención se puede conjugar a biotina, y unir a otra proteína, polipéptido, compuesto o portador conjugado a avidina o estreptavidina. Por ejemplo, tal Nanocuerpo conjugado se puede usar como indicador, por ejemplo en un sistema diagnóstico donde un agente que produce una señal detectable se conjuga avidina o estreptavidina. Tales pares de unión por ejemplo también se pueden usar para unir el nanocuerpo de la invención a un portador, que incluye los portadores adecuados para fines farmacéuticos. Uno ejemplo no limitante son las formulaciones liposómicas descritas por Cao y Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257 (2000). Tales pares de unión también se pueden usar para unir un agente terapéuticamente activo al nanocuerpo de la invención.
En algunas aplicaciones, en particular en las aplicaciones en que desea destruir una célula que expresa el blanco contra el que se dirigen los Nanocuerpos de la invención (por ejemplo, en el tratamiento del cáncer), o para reducir o lentificar el crecimiento y/o proliferación de tal célula, los Nanocuerpos de la invención también se pueden ligar a una toxina o a un residuo o resto tóxico. Los ejemplos de restos, compuestos o residuos tóxicos que se pueden unir a un Nanocuerpo de la invención para proporcionar - por ejemplo – un compuesto citotóxico serán evidente para los expertos y por ejemplo se pueden hallar en la técnica previa citada anteriormente y/o en la adicional descripción de la presente. Un ejemplo es la llamada tecnología ADEPTTM del documento WO 03/055527.
Otras potenciales modificaciones químicas y enzimáticas serán evidentes para los expertos. Tales modificaciones también se pueden introducir para fines de investigación (por ejemplo para estudiar las relaciones función-actividad). Se ha referencia por ejemplo en Lundblad y Bradshaw, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 143-151 (1997).
Como se mencionó anteriormente, la invención también se refiere a proteínas o polipéptidos que comprenden al menos un dominio VHH (es decir, que se identifica por medio de los procedimientos de la invención) o al menos un Nanocuerpo basado en este.
De acuerdo con una realización no limitante de la invención, tal polipéptido de la invención consiste esencialmente en un Nanocuerpo. POr "consiste esencialmente en" se entiende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la invención es exactamente la misma que la secuencia de aminoácidos de un Nanocuerpo (como se mencionó anteriormente) o corresponde a la secuencia de aminoácidos de un Nanocuerpo en que se ha añadido un número limitado de residuos de aminoácidos, tal como 1-10 residuos de aminoácidos y preferentemente 1-6 residuos de aminoácidos, tal como 1, 2, 3, 4, 5 o 6 residuos de aminoácidos, al extremo amino terminal, al extremo carboxi terminal,
o al extremo amino terminal y al extremo carboxi terminal de la secuencia de aminoácidos del nanocuerpo.
Dichos residuos de aminoácidos pueden cambiar o no, alterarse o influir de otro modo en las propiedades (biológicas) del nanocuerpo y pueden añadirse o no funcionalidad adicional al nanocuerpo. Por ejemplo, tales residuos de aminoácidos:
a) pueden comprender un residuo Met N-terminal, por ejemplo como resultado de la expresión en una célula huésped u organismo huésped heterólogo.
b) pueden formar una secuencia señal o secuencia líder que dirige la secreción del nanocuerpo desde una célula huésped después de la síntesis. Los péptidos líderes secretores serán evidentes para los expertos, y también se pueden describir en la presente. Usualmente, tal secuencia líder se unirá al extremo N-terminal del nanocuerpo, si bien la invención en su sentido más amplio no se limita a este;
c) puede formar una secuencia o señal que permite dirigir el nanocuerpo hacia y/o penetrar o entrar en órganos, tejidos, células, o partes o compartimientos de células específicos y/o que permite que el nanocuerpo penetre o atraviese una barrera biológica tal como una membrana celular, una capa de células tal como una capa de células epiteliales, un tumor que incluye tumores sólidos, o la barrera hematoencefálica. Los ejemplos de tales secuencias de aminoácidos serán evidentes para los expertos. Algunos ejemplos no limitantes son los vectores de péptido pequeño ("vectores Peptrans") descritos en el documento WO 03/026700 y en Temsamani et al., Expert Opin. Biol. Ther., 1, 773 (2001); Temsamani y Vidal, Drug Discov. Today, 9, 1012 (004) y Rousselle, J. Pharmacol. Exp: Ther, 296, 124-131 (2001), y la secuencia translocadora de membrana descrita por Zhao et al., Apoptosis, 8, 631-637 (2003). Las secuencias de de aminoácidos C-terminal y N-terminal para el direccionamiento intracelular de los fragmentos de anticuerpos por ejemplo, se describen en Cardinale et al., Methods, 34, 171 (2004). Otras técnicas adecuadas para el direccionamiento intracelular involucran la expresión y/o use de los llamados "intracuerpos” que comprenden un Nanocuerpo de la invención, que se menciona a continuación;
d) puede formar una "marca”, por ejemplo una secuencia de aminoácidos o residuo que permite o facilita la purificación del nanocuerpo, por ejemplo, mediante técnicas de afinidad dirigidas contra dicho secuencia o residuo. A partir de este momento, dicha secuencia o residuo se puede eliminar (por ejemplo, por escisión química o enzimática) para proporcionar la secuencia del nanocuerpo (por este propósito, la marca opcionalmente se puede ligar a la secuencia del nanocuerpo por medio de una secuencia ligadora escindible o contener un motivo escindible). Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de tales residuos son múltiples residuos de histidina, residuos de glutatión y una marca myc tal como AAAEQKLISEEDLNGAA (SEQ ID NO:4761;
e) puede ser uno o más residuos de aminoácidos que han sido funcionalizados y/o que pueden actuar como un sitio de unión de los grupos funcionales. Los residuos e aminoácidos y grupos funcionales adecuados serán evidente para los expertos e incluyen, pero sin limitación, los residuos de aminoácidos y grupos funcionales mencionados en la presente para los derivados de los Nanocuerpos de la invención.
De acuerdo con otra realización, un polipéptido de la invención comprende un Nanocuerpo de la invención, que se fusiona en su extremo amino terminal, a su extremo carboxi terminal, o tanto en su extremo amino terminal como en su extremo carboxi terminal a al menos una secuencia de aminoácidos adicional, es decir para proporcionar una proteína de fusión que comprende dicho Nanocuerpo de la invención y la una o más secuencias de aminoácidos adicionales. Tal fusión también se denominará en la presente como "fusión del Nanocuerpo".
La una o más secuencias de aminoácidos adicionales pueden ser cualquier secuencia de aminoácidos adecuada y/o deseada. Las secuencias de aminoácidos adicionales pueden o no cambiar, alterarse o influir de otro en las propiedades (biológicas) del nanocuerpo, y pueden o no añadir funcionalidad adicional al nanocuerpo o el polipéptido de la invención. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos adicional es tal que confiere una o más propiedades o funcionalidades deseadas al nanocuerpo o el polipéptido de la invención.
Los ejemplos de tales secuencias de aminoácidos serán evidentes para los expertos, y generalmente pueden comprender todas las secuencias de aminoácidos que se usan en las fusiones peptídicas basadas en los anticuerpos convencionales y sus fragmentos (que incluyen pero sin limitación ScFv y anticuerpos de dominio único). Se hace referencia por ejemplo a la revisión de Holliger y Hudson, 31) Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 (2005),
Por ejemplo, secuencia de aminoácidos puede ser una secuencia de aminoácidos que aumenta la vida media, la solubilidad o la absorción, reduce la inmunogenicidad o la toxicidad elimina o atenúa los efectos secundarios no deseables y/o confiere otras propiedades ventajosas y/o reduce las propiedades no deseadas de los polipéptidos de la invención, en comparación con el nanocuerpo de la invención per se. Algunos ejemplos no limitantes de tales secuencias de aminoácidos son las proteínas séricas, tales como albúmina sérica humana (ver por ejemplo el documento WO 00/27435) o moléculas hapténicas (por ejemplo haptenos que son reconocidos por los anticuerpos circulantes, ver por ejemplo el documento de WO 98/22141).
Las secuencias de aminoácidos adicionales también pueden proporcionar un segundo sitio de unión, tal sitio de unión puede ser dirigido contra cualquiera proteína, polipéptido, antígeno, determinante antigénico o epitope deseado (que incluyen pero sin limitación la proteína, polipéptido, antígeno, determinante antigénico o epitope igual contra el cual se dirige el nanocuerpo de la invención o una proteína, polipéptido, antígeno, determinante antigénico o epitope diferente). Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos adicionales pueden proporcionar un segundo sitio de unión que se dirige contra una proteína sérica (tal como, por ejemplo, albúmina sérica humana u otra proteína sérica tal como IgG), de modo de proporcionar un aumento de la vida media en suero. Se hace referencia por ejemplo en los documentos EP 0 368 684, WO 91/01743, WO 01/45746 y WO 04/003019 (en que se mencionan varias proteínas séricas), la Solicitud internacional por el solitante titulada "NanobodiesTM against amyloid-beta and polypeptides comprisind the same for the treatment degenerative neural diseases such as Alzheimer's disease" (en que se mencionan varias proteínas diferentes), así como en Hamsen et al., Vaccine, 23 (41); 4926-42.
De acuerdo con otra realización, la una o más secuencias de aminoácidos adicionales pueden comprender una o más partes, fragmentos o dominios de los anticuerpos de 4 cadenas convencionales (y en particular anticuerpos humanos) y/o de anticuerpos de cadena pesada. Por ejemplo, si bien se prefiere menos, un Nanocuerpo de la invención se puede unir a un dominio VH o VL convencional (preferentemente humano) o a un análogo natural o sintético de un dominio VH
o VL, otra vez, opcionalmente por medio de una secuencia ligadora (que incluye pero sin limitación otros anticuerpos de dominio (único), tal como el dAb descrito por Ward et al.).
Al menos un Nanocuerpo también se puede unir a uno o más dominios CH1, CH2 y/o CH3 (preferentemente humanos) opcionalmente por medio de una secuencia ligadora. Por ejemplo, un Nanocuerpo ligado a un dominio CH1 adecuado por ejemplo se puede usar – juntos con las cadenas livianas adecuadas – para generar fragmentos/estructuras de anticuerpos análogas a los fragmentos Fab o fragmentos F(ab')2 convencionales, pero en que uno o (en el caso de un fragmento de F(ab')2) o ambos dominios VH convencionales han sido reemplazados por un Nanocuerpo de la invención. Asimismo, dos Nanocuerpos se pueden ligar a un dominio CH3 (opcionalmente por medio de un ligador) para proporcionar un constructo con aumento de vida media in vivo.
De acuerdo con una realización específica de un polipéptido de la invención, uno o más Nanocuerpos de la invención se pueden unir a una o más partes, fragmentos o dominios del anticuerpo que confieren una o más funciones efectoras al polipéptido de la invención y/o pueden conferir la capacidad de unir a uno o más receptores de Fc. Por ejemplo, para este fin, y sin limitación, la una o más secuencias de aminoácidos adicionales puede comprender una o más dominios de CH2 y/o CH3 de un anticuerpo, tal como de un anticuerpo de cadena pesada (como se describe en la presente) y más preferentemente de un anticuerpo de 4 cadenas humano convencional; y/o puede formar (parte de) y la región Fc, por ejemplo de IgG, de IgE o de otra Ig humana. Por ejemplo, el documento WO 94/04678 describe anticuerpos de cadena pesada que comprenden un dominio VHH de camélido o un derivado humanizado de este (es decir un Nanocuerpo), en que el dominio de CH2 y/o CH3 de Camelidae se ha reemplazado con dominios de CH2 y CH3 humanos, para proporcionar una inmunoglobulina que consiste en 2 cadenas pesadas que comprenden un Nanocuerpo y los dominios de CH2 y CH3 humanos (pero no el dominio CH1), tal inmunoglobulina tiene la función efectora provista por los dominios de CH2 y CH3 y tal inmunoglobulina puede actuar sin la presencia de ninguna cadena liviana. Otras secuencias de aminoácidos que se pueden usar de modo adecuado en los Nanocuerpos de la invención para proporcionar una función efectorab serán evidentes para los expertos, y se pueden elegir sobre la base de las funciones efectoras deseadas. Se hace referencia por ejemplo en los documentos WO 04/058820, WO 99/42077 y WO 05/017148, así como en la revisión de Holliger y Hudson, supra. El acoplamiento de un Nanocuerpo de la invención a una porción de Fc también puede llevar a un aumento de la vida media, en comparación con el correspondiente Nanocuerpo de la invención. En algunas aplicaciones, el uso de una porción de Fc y/o de los dominios (es decir dominios de CH2 y/o CH3) que confieren aumento de la vida media sin ninguna función efectora biológicamente significativa también puede ser adecuado o incluso preferido. Otros constructos adecuados que comprenden uno o más Nanocuerpos y uno o más dominios constantes con aumento de la vida media in vivo serán evidentes para los expertos, y por ejemplo pueden comprender dos Nanocuerpos ligados a un dominio CH3, opcionalmente por medio de un secuencia ligadora. Generalmente, cualquier proteína de fusión o derivados con aumento de la vida media tendrá preferentemente un peso molecular de más de 50 kD, el valor límite para la absorción renal.
Las secuencias de aminoácidos adicionales también pueden formar una secuencia señal o secuencia líder que dirige la secreción del nanocuerpo o el polipéptido de la invención desde una célula huésped después de la síntesis (por ejemplo, para proporcionar una forma pre-, pro- o prepro- del polipéptido de la invención, de acuerdo con la célula huésped usada para expresar el polipéptido de la invención).
Las secuencias de aminoácidos adicionales también pueden formar una secuencia o señal que permite que el nanocuerpo o polipéptido de la invención sea dirigido hacia y/o penetre o entre en órganos, tejidos, células, o partes o compartimientos de células específicos y/o que permita que el nanocuerpo o polipéptido de la invención penetre o atraviese una barrera biológica tal como una membrana celular, una capa de células tal como una capa de células epiteliales, un tumor que incluye tumores sólidos, o la barrera hematoencefálica. Los ejemplos de tales secuencias de aminoácidos serán evidentes para los expertos y por ejemplo incluyen, pero sin limitación, los vectores "Peptrans" mencionados anteriormente, las secuencias descritas por Cardinale et al. y la secuencias de aminoácidos y fragmentos de anticuerpos conocidas per se que se pueden usar para expresar o producir los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención llamados "intracuerpos", por ejemplo como se describe en los documentos WO 94/02610, WO 95/22618, USA-7004940, WO 03/014960, WO 99/07414; WO 05/01690; EP 1 512 696; y en Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag; y en Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170, y las referencias adicionales allí descritas.
En algunas aplicaciones, en particular en las aplicaciones en que desea destruir una célula que expresa el blanco contra el que se dirigen los Nanocuerpos de la invención (por ejemplo, en el tratamiento del cáncer), o para reducir o lentificar el crecimiento y/o proliferación de tal célula, los Nanocuerpos de la invención también se pueden ligar a proteína o polipéptido (cito)tóxico. Los ejemplos de tales proteínas y polipéptidos tóxicos que se pueden ligar a un Nanocuerpo de la invención para proporcionar o -por ejemplo – un polipéptido citotóxico de la invención serán evidente para los expertos y por ejemplo se pueden hallar en la técnica previa citada anteriormente y/o en la adicional descripción de la presente. Un ejemplo es la llamada tecnología ADEPTTM del documento WO 03/055527.
De acuerdo con una realización no limitante, uno o más residuos de aminoácidos se pueden añadir a, insertar en y/o sustituir en la secuencia de aminoácidos de un Nanocuerpo o polipéptido de la invención, para proporcionar uno o más residuos de aminoácidos específicos para la unión de un grupo PEG.
La eficacia de los agentes farmacéuticos de proteína depende de su potencia para neutralizar el blanco pero también de la farmacocinética intrínseca del fármaco potencial. Debido a que el riñón generalmente filtra las moléculas menores de
60.000 Dalton (Da), se han centrado esfuerzos para reducir la depuración al aumentar el peso molecular del agente biofarmacéutico a través de las fusiones de proteína (Syed et al., 1997), glicosilaciones o modificación con polímeros de polietilenglicol, es decir, PEGilación (Lee et al., 1999; Abuchowski et al., 1977; Nucci et al., 1991; Lecolley, et al. Chem Commun, 2004; Tao et al., J Am Chem Soc, 2004; Mantovani et al., 2005). Estos procedimientos extienden con éxito la exposición in vivo del agente biofarmacéutico.
Alternativamente, la vida media se puede extender por medio de otro agente pegilante, POLY PEG para la conjugación a los Nanocuerpos bivalentes, TNF56 o TNF55. POLY PEG son polímeros con forma de peine con dientes de PEG sobre un esqueleto metacrílico. Los POLY PEG pueden variar con la longitud de la cadena del PEG, en el esqueleto metacrílico y sobre el grupo terminal activo que determina el procedimiento de conjugación del POLY PEG en el nanocuerpo. La conjugación específica del sitio en la cisteína C-terminal presente en los Nanocuerpos se puede obtener a través del grupo terminar maleimida activo en el POLY PEG.
La invención también abarca cualquier Nanocuerpo de la invención y/o polipéptido de la invención que se ha glicosilado en una o más posiciones de aminoácido, usualmente de acuerdo con el huésped usado para expresar el nanocuerpo o polipéptido de la invención (que también se describe a continuación).
De acuerdo con una realización no limitante, uno o más residuos de aminoácidos se pueden añadir a, insertar en y/o sustituir en la secuencia de aminoácidos de un Nanocuerpo o polipéptido de la invención, para proporcionar uno o más residuos de aminoácidos específicos y/o un sitio que puede ser glicosilado por el organismo huésped usado. Por medio de un ejemplo preferido, pero no limitante, el residuo N d de la posición 50 dentro de CDR2 de un Nanocuerpo de la invención por ejemplo se puede reemplazar con un residuo Q, D o S para proporcionar un sitio de glicosilación, por ejemplo, para la glicosilación por Pichia.
De acuerdo con otra realización, un polipéptido de la invención puede comprender la secuencia de aminoácidos de un Nanocuerpo, que se fusiona en su extremo amino terminal, en su extremo carboxi terminal o tanto en su extremo amino terminal y como su extremo carboxi terminal con al menos una secuencia de aminoácidos adicional.
Nuevamente, dichas secuencias de aminoácidos adicionales pueden o no cambiar, alterarse o influir de otro en las propiedades (biológicas) del nanocuerpo, y pueden o no añadir funcionalidad adicional al nanocuerpo.
Por ejemplo, de acuerdo con una realización preferida, pero no limitante, dichas secuencias de aminoácidos adicionales pueden comprender al menos un Nanocuerpo adicional, para proporcionar un polipéptido de la invención que comprende al menos dos, tal como tres, cuatro o cinco Nanocuerpos, en que dichos Nanocuerpos opcionalmente pueden estar unidos por medio de una o más secuencias ligadoras (como se define en la presente).
Los polipéptidos de la invención que comprenden dos o más Nanocuerpos también se denominarán en la presente como polipéptidos "multivalentes". Por ejemplo un polipéptido "bivalente" de la invención comprende dos Nanocuerpos, opcionalmente unidos por medio de una secuencia ligadora, mientras que un polipéptido "trivalente" de la invención comprende tres Nanocuerpos, opcionalmente unidos por medio de dos secuencias ligadoras; etc.
En un polipéptido multivalente de la invención, los dos o más Nanocuerpos pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, los dos o más Nanocuerpos en una polipéptido multivalente de la invención:
-
se pueden dirigir con el mismo antígeno, es decir contra las mismas partes o epitopes de dicho antígeno o contra dos o más partes o epitopes diferentes de dicho antígeno; y/o: - se puede dirigir con antígenos diferentes;
o a combinación de estos.
En consecuencia, un polipéptido bivalente de la invención por ejemplo:
-
puede comprender dos Nanocuerpos idénticos;
-
puede comprender un primer Nanocuerpo dirigido contra una primera parte o epitope de un antígeno y un segundo Nanocuerpo dirigido contra la misma parte o epitope de dicho antígeno o contra otra parte o epitope de dicho antígeno;
- o puede comprender un primer Nanocuerpo dirigido contra un primer antígeno y un segundo Nanocuerpo dirigido contra un segundo antígeno diferente de dicho primer antígeno; mientras que un polipéptido trivalente de la invención por ejemplo:
-
puede comprender tres Nanocuerpos idénticos o diferentes dirigidos contra partes o epitopes iguales o diferentes del mismo antígeno;
-
puede comprender dos Nanocuerpos idénticos o diferentes dirigidos contra partes o epitopes iguales o diferentes del de un primer antígeno y un tercer Nanocuerpo dirigido contra un segundo antígeno diferente del dicho primer antígeno; o
-
puede comprender un primer Nanocuerpo dirigido contra a primer antígeno, un segundo Nanocuerpo dirigido contra un segundo antígeno diferente de dicho primer antígeno, y un tercer Nanocuerpo dirigido contra un tercer antígeno diferente de dicho primer y segundo antígeno,
Los polipéptidos de la invención que contienen al menos dos Nanocuerpos, en que al menos un Nanocuerpo se dirige contra un primer antígeno y al menos un Nanocuerpo se dirige contra un segundo antígeno diferente del primer antígeno, también se denominarán como Nanocuerpos “multiespecífico”. En consecuencia, un Nanocuerpo “biespecífico” es un Nanocuerpo que comprende al menos un Nanocuerpo dirigido contra un primer antígeno y al menos un Nanocuerpo adicional dirigido contra un segundo antígeno, mientras que un Nanocuerpo “triespecífico” es un Nanocuerpo que comprende al menos un Nanocuerpo dirigido contra un primer antígeno, al menos un Nanocuerpo adicional dirigido contra un segundo antígeno, y al menos un Nanocuerpo adicional dirigido contra un tercer antígeno; etc.
Por consiguiente, en su forma más simple, un polipéptido biespecífico de la invención es un polipéptido bivalente de la invención (como se define en la presente), que comprende un primer Nanocuerpo dirigido contra un primer antígeno y un segundo Nanocuerpo dirigido contra un segundo antígeno, en que dicho primer y segundo Nanocuerpo opcionalmente pueden estar unidos por medio de una secuencia ligadora (como se define en la presente); mientras que un polipéptido triespecífico de la invención en su forma más simple es un polipéptido trivalente de la invención (como se define en la presente), que comprende un primer Nanocuerpo dirigido contra un primer antígeno, un segundo Nanocuerpo dirigido contra un segundo antígeno y un tercer Nanocuerpo dirigido contra un tercer antígeno, en que dicho primer, segundo y tercer Nanocuerpo opcionalmente pueden estar ligados por medio de una o más, y en particular una y más en particular dos, secuencia ligadoras.
Sin embargo, como será evidente a partir de la descripción anterior de la presente, la invención no se limita a estos, en el sentido que un polipéptido multiespecífico de la invención puede comprender numerosos Nanocuerpos dirigidos contra dos o más antígenos diferentes.
Para polipéptidos multivalentes y multiespecíficos que contienen uno o más dominios VHH y su preparación, también se hace referencia a Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, así como al documento de EP 0 822 985.
En los polipéptidos de la invención, el uno o más Nanocuerpos y el uno o más polipéptidos se pueden unir directamente entre sí (como se describe, por ejemplo en el documento WO 99/23221) y/o se pueden unir entre sí por medio de uno o más espaciadores o ligadores adecuados, o alguna combinación de estos.
Los espaciadores o ligadores adecuados para usar en los polipéptidos multivalentes y multiespecíficos serán evidentes para los expertos, y generalmente pueden ser culquier ligador o espaciador usado en la técnica para unir secuencias de aminoácidos. Preferentemente, dicho ligador o espaciador es adecuado para usar en la construcción de proteínas o polipéptidos que están destinados para el uso farmacéutico.
Algunos espaciadores particularmente preferidos incluyen los espaciadores y ligadores que se usan en la técnica para unir fragmentos de anticuerpos o dominios de anticuerpo. Estos incluyen los ligadores mencionados en la técnica previa general citados anteriormente, así como por ejemplo los ligadores que se usan en la técnica para construir diacuerpos o fragmentos ScFv (en este aspecto, sin embargo, cabe indicar que, mientras que en los diacuerpos y en los fragmentos ScFv, la secuencia ligadora usada debe tener una longitud, un grado de flexibilidad y otras propiedades que permiten que los dominios de VH y VL pertinentes se unan para formar el sitio de unión al antígeno completo, no existe limitación particular sobre la longitud o la flexibilidad del ligador usado en el polipéptido de la invención, ya que cada Nanocuerpo por sí mismo forma un sitio de unión al antígeno completo).
Otros ligadores adecuados generalmente comprenden compuestos o polímeros orgánicos, en particular los adecuados para usar en las proteínas para uso farmacéutico. Por ejemplo, los restos de poli(etilenglicol) se han usado para ligar dominios de anticuerpo, ver por ejemplo el documento WO 04/081026.
También está dentro del alcance de la invención que los ligadores usados confieran una o más propiedades o funcionalidad favorables diferentes a los polipéptidos de la invención, y/o proporcionen uno o más sitios para la formación de derivados y/o para la unión de los grupos funcionales (por ejemplo como se describe en la presente para los derivados de los Nanocuerpos de la invención). Por ejemplo, los ligadores que contiene uno o más residuos de aminoácidos cargados (ver Tabla A-3 anterior) pueden proporcionar mejores propiedades hidrófilas, mientras que los ligadores que forman o contienen epitopes o marcas pequeñas se pueden usar para los fines detección, identificación y/o purificación. Nuevamente, sobre la base de la descripción de la presente, los expertos podrán determinar los óptimos ligadores para usar en un polipéptido específico de la invención, opcionalmente después de algunos experimentos de rutina limitados.
Finalmente, cuando se usan dos o más ligadores en los polipéptidos de la invención, estos ligadores pueden ser iguales
o diferentes. Nuevamente, sobre la base de la descripción de la presente, los expertos podrán determinar los óptimos ligadores para usar en un polipéptido específico de la invención, opcionalmente después de algunos experimentos de rutina limitados.
Los ligadores para usar en los polipéptidos multivalentes y multiespecíficos serán evidentes para los expertos, y por ejemplo incluyen ligadores gly-ser, por ejemplo del tipo (glyx,sery)z, tal como (por ejemplo (gly4ser)3 o (gly3ser2)3, como se describe en el documento WO 99/42077, regiones bisagra tales como las regiones bisagra de los anticuerpos de cadena pesada naturales o secuencias similares. Para otros ligadores adecuados, también se hace referencia en la técnica previa general citada anteriormente. Algunos ligadores particularmente preferidos se dan en las SEC. ID NOs 68 y 69.
Los ligadores también pueden proporcionar alguna funcionalidad al polipéptido multivalente o multiespecífico. Por ejemplo, los ligadores que ponen en contacto uno o más residuos de aminoácidos cargados (ver Tabla 1 anterior) pueden proporcionar mejores propiedades hidrófilas, mientras que los ligadores que forman o contienen epitopes o marcas pequeñas se pueden usar para fines de detección, identificación y/o purificación.
Como se menciona en la presente, en una proteína o polipéptido de la invención, los Nanocuerpos anti-TNF mencionados en la presente preferentemente se ligan de modo tal que dicha proteína o polipéptido, después de la unión a un trímero TNF, es capaz de inhibir o reducir el entrecruzamiento del receptor de TNF que está mediado por dicho trímero TNF y/o la transducción de señal que está mediada por dicho entrecruzamiento del receptor; y/o de modo tal que la proteína o polipéptido es capaz de experimentar unión intramolecular en al menos dos sitios de unión del receptor TNF de un trímero TNF. Los ligadores adecuados son como se describen en la presente.
Como también se menciona en la presente, se puede evaluar si una proteína o polipéptido proporciona unión intermolecular o extramolecular (al menos en forma inicial) por una cromatografía de exclusión por tamaño. Por cromatografía de exclusión por tamaño se pueden analizar los complejos de TNF-alfa y anticuerpos para determinar el número y la relación de las moléculas de anticuerpo y TNF-alfa del complejo. A partir de estos datos se puede deducir si se produce la unión inter-o intramolecular, que fue realizado por Santora y colegas (Santora, LC., et al, Anal Biochem. 2001) para establecer la estequiometría de la unión del anticuerpo monoclonal D2E7 (Humira) a TNF-alfa en diferentes relaciones de anticuerpo y blanco. A partir del peso molecular del complejo se concluyó que tres moléculas de anticuerpo se complejaron con tres trímeros de TNF, lo que indica de este modo que el anticuerpo se une en un modo intermolecular. Se realizaron experimentos similares con Nanocuerpos bivalentes, en que un ligador muy corto indujo la formación de complejos moleculares grandes, que se obtuvieron por enlaces intermoleculares. Sin embargo, los mismos constructos de Nanocuerpos bivalentes con ligadores más largos eluyeron de la columna de filtración en gel como complejos pequeños diferenciados, de este modo se demuestra que se formaron enlaces intramoleculares. En combinación con los datos del bioensayo, en que el ligador más largo que contiene el Nanocuerpo TNF1 tubo una potencia óptima (neutralización completa de la cantidad de TNF usado en el ensayo, es decir 10 pM), se puede concluir que la unión intramolecular del Nanocuerpo bivalente impide de modo eficiente el entrecruzamiento de dos receptores unidos a células y la activación del receptor asociado. Los anticuerpos monoclonales conocidos tales como Humira o Remicade no pueden formar tales enlaces intramoleculares, dejando siempre dos sitios de unión al receptor sobre la molécula de TNF trimérica en un cierto grado disponible para la interacción con el receptor unido a la célula, lo que se traduce en una neutralización menos potente medida en el bioensayo.
Alternativamente, se puede evaluar si una proteína o polipéptido proporciona unión intermolecular o extramolecular por cristalografía y/o modelado molecular (u otras técnicas in silito adecuadas). Un modelo de complejo de TNF30/TNF-alfa trimérico se generó sobre la base de la estructura del cristal del complejo de TNF1/TNF-alfa tipo salvaje monomérico. A partir de esta estructura, se modeló el constructo final de TNF30-ligador-ALB8-ligador-TFN30. El constructo de TNF30ligador-ALB8-ligador-TNF30 se modeló a partir del trímero de TNFéculas de TNF30 unidas. Como la
d Ron dos molestructura del ALB8 no se conoce, se usó en cambio una tercera molécula de TNF30, que se colocó entre los otros dos Nanocuerpos a lo largo de la línea de entre N y C-terminal, Los 9 ligadores de aminoácido se añadieron posteriormente de modo manual.
El modelo se muestra en la Figura 62. Claramente, los 9 ligadores de aminoácido junto con el ALB8 proporcionan unespacio amplio para abarcar los aproximadamente 66 Å entre los dos dominios TNF30 unidos a TNFí
d l.BS por smismo ya abarca 40 Å, y cada ligador puede abarcar otros ~27 Å en la conformación completamente extendida. Como resultado, el ALB8 tiene bastante flexibilidad de movimiento y no se espera que su unión a la albúmina pueda interferir mucho en la unión a TNFd
Más aún, es probable que los ligadores se puedan acortar sin afectar la avidez, especialmente en el caso del ligador que es C-terminal de ALB8. Esto puede tener el efecto beneficioso de aumentar la unión al mismo trímero de TNF
d versus los trímeros de entrecruzamiento, porque la probabilidad de que el segundo TNF30 se asocie con un TNF
d diferente aumenta con la longitud del ligador.
Como también se describe en la presente, un polipéptido multiespecífico de la invención dirigido contra un antígeno deseado y contra al menos una proteína sérica, tal como las proteína séricas mencionadas más adelante en la presente, y en particular contra albúmina sérica humana, puede mostrar el aumento de la vida media en el suero, en comparación con el correspondiente Nanocuerpo monovalente.
Como se mencionó anteriormente en la presente, los procedimientos descritos en la presente son particularmente adecuados para generar tales polipéptidos multivalentes o multiespecíficos de la invención.
En un polipéptido de la invención, el al menos un Nanocuerpo también se puede ligar a un dominio VH convencional o a un análogo natural o sintético de un dominio VH, opcionalmente por medio de una secuencia ligadora.
En un polipéptido de la invención, el al menos un Nanocuerpo también se puede ligar a un dominio VL o a un análogo natural o sintético de un dominio VL, opcionalmente por medio de un secuencia ligadora, para proporcionar un polipéptido de la invención que está en la forma análoga a un fragmento scFv convencional, pero que contiene un Nanocuerpo en vez de un dominio VH.
En un polipéptido de la invención, el al menos un Nanocuerpo también se puede ligar a uno o más de un dominio CH1, CH2 y/o CH3, opcionalmente por medio de una secuencia ligadora. Por ejemplo, un Nanocuerpo ligado a un dominio CH1 adecuado se puede usar por ejemplo – junto con cadenas livianas adecuadas – para generar fragmentos /estructuras de anticuerpos análogas a los fragmentos Fab o fragmentos F(ab’) convencionales, pero en el que uno o (en el caso de un fragmento F(ab')2) se han reemplazado uno o ambos de los dominios VH convencionales con un Nanocuerpo. Tales fragmentos también pueden ser heteroespecífico o biespecífico, es decir dirigido contra dos o más antígenos. Un Nanocuerpo ligado a dominios de CH2 y CH3 adecuados, por ejemplo derivado de camélidos se puede usar para formar un anticuerpo de cadena pesada monoespecífico o biespecífico. Finalmente, un Nanocuerpo ligado a dominios adecuados de CH1, CH2 y dominio CH3, por ejemplo derivados de un ser humano, se puede usar – junto con cadenas livianas adecuadas – para formar un anticuerpo que es análogo a un anticuerpo de 4 cadenas convencional, pero en que se han reemplazado uno o ambos de los dominios VH convencionales por un Nanocuerpo.
Asimismo, además de uno o más Nanocuerpos, los polipéptidos de la invención también pueden contener grupos, restos o residuos funcionales, por ejemplo sustancias terapéuticamente activas, tal como las que se mencionan a continuación, y/o marcadores o marcas, tales como marcadores fluorescentes, isótopos, etc., que se describen adicionalmente más adelante en la presente.
Los Nanocuerpos de la invención, los polipéptidos de la invención, y ácido nucleicos que codifican los mismos, se pueden preparar de una manera conocida per se, como será evidente para los expertos a partir de la descripción adicional de la presente. Algunos procedimientos preferidos, pero no limitantes para preparar los Nanocuerpos, polipéptidos y ácido nucleicos incluye los procedimientos y técnicas mencionados anteriormente y/o que descritos adicionalmente más adelante en la presente.
Como será evidente para los expertos, un procedimiento particularmente útil para preparar un Nanocuerpo y/o un polipéptido de la invención generalmente comprende las etapas de:
-
la expresión, en una célula huésped u organismo huésped adecuado (también denominado en la presente como un "huésped de la invención'") o en otros sistema de expresión adecuado de un ácido nucleico que codifica dicho Nanocuerpo o polipéptido de la invención (también denominado en la presente como un "ácido nucleico de la invención"), opcionalmente seguido por:
-
aislamiento y/o purificación del nanocuerpo o polipéptido de la invención así obtenido.
En particular, tal procedimiento puede comprender las etapas de:
-
cultivar y/o mantener un huésped de la invención en condiciones tales que dicho huésped de la invención exprese y/o produzca al menos un Nanocuerpo y/o polipéptido de la invención; opcionalmente seguido por:
-
aislar y/o purificar el nanocuerpo o polipéptido de la invención así obtenido.
Un ácido nucleico de la invención puede estar en la forma de un ADN o ARN de cadena simple o doble, y está preferentemente en la forma de ADN de cadena doble. Por ejemplo, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden ser ADN genómico, ADNc o ADN sintético (tal como ADN con un uso de codón que se ha adaptado específicamente para la expresión en la célula huésped u organismo huésped deseado),
De acuerdo con una realización de la invención, el ácido nucleico de la invención es forma esencialmente aislada, como se definió anteriormente en la presente.
El ácido nucleico de la invención también puede estar en forma de, estar presente en y/o ser parte de un vector, tal como por ejemplo un plásmido, cósmido o YAC, que nuevamente puede estar en forma esencialmente aislada.
Los ácidos nucleicos de la invención se pueden preparar u obtener de una manera conocida per se, sobre la base de la información de las secuencias de aminoácidos para los polipéptidos de la invención dados en la presente, y/o se pueden aislar de una fuente natural adecuada. Para proporcionar los análogos, las secuencias de nucleótidos que codificas dominios VHH naturales por ejemplo, se pueden someter a mutagénesis dirigida al sitio, para proporcionar un ácido nucleico de la invención que codifica dicho análogo. Asimismo, como será evidente para los expertos, para preparar un ácido nucleico de la invención, también varias secuencias de nucleótidos, tal como al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un Nanocuerpo y por ejemplo los ácido nucleicos que codifican uno o más ligadores se pueden ligar entre sí de una manera adecuada.
Las técnicas para generar los ácidos nucleicos de la invención serán evidente para los expertos y por ejemplo, pueden incluir, pero sin limitación, síntesis de ADN automatizada; mutagénesis dirigida al sitio; combinación de dos o más secuencias naturales y/o sintéticas (o dos o más partes de estas), introducción de mutaciones que llevan a la expresión de un producto de expresión truncado; introducción de uno o más sitios de restricción (por ejemplo, para crear casetes y/o regiones que se pueden digerir fácilmente y/o ligar mediante enzimas de restricción adecuadas), y/o la introducción de mutaciones por medio de una reacción de PCR mediante uno o mas cebadores "mal apareados", usando por ejemplo una secuencia de un GPCR natural como un molde. Estas y otras técnicas serán evidente para los expertos, y se hace referencia nuevamente a los manuales estándares tales como Sambrook et al, y Ausubel et al., mencionados anteriormente, así como a los siguientes Ejemplos.
El ácido nucleico de la invención también puede estar en la forma de, presente en y/o ser parte de un constructo genético, como será evidente para los expertos en la técnica. Tales constructos genéticos generalmente comprenden al menos un ácido nucleico de la invención que está opcionalmente unido a uno o más elementos de los constructos genéticos conocidos per se, tal como por ejemplo uno o más elementos regulatorios (tal como un promotor, potenciador, terminador, etc adecuado) y los elementos adicionales de los constructos genéticos denominados más adelante en la presente. Tales constructos genéticos que comprenden al menos un ácido nucleico de la invención también se denominarán en la presente como "constructos genéticos de la invención".
Los constructos genéticos de la invención pueden ser de ADN o ARN, y preferentemente son ADN de cadena doble. Los constructos genéticos de la invención también pueden estar en una forma adecuada para la transformación de la célula huésped u organismo huésped deseados, en una forma adecuada para la integración en el ADN genómico de la célula huésped deseada o en una forma adecuada de replicación, mantenimiento y/o herencia independiente en el organismo huésped deseado. por ejemplo, los constructos genéticos de la invención pueden estar en la forma de un vector, tal como por ejemplo un plásmido, cósmido, YAC, vector viral o transposón. En particular, el vector puede ser un vector de expresión, es decir un vector que puede proporcionar la expresión in vitro y/o in vivo (por ejemplo en una célula huésped, organismo huésped y/o sistema de expresión adecuado).
En una realización preferida pero no limitante, un constructo genético de la invención comprende
a) al menos un ácido nucleico de la invención; conectado operativamente a
b) uno o más elementos regulatorios, tal como un promotor y opcionalmente un terminador adecuado;
c) y opcionalmente también
d) uno o más elementos adicionales de los constructos genéticos conocidos per se;
en que los términos "elemento regulatorio", "promotor", "terminador" y "conectado operativamente" tienen sus significados usuales en la técnica (que también se describen a continuación); y en que dichos “elementos adicionales" presentes en los constructos genéticos por ejemplo, pueden ser secuencias UTR 3' o 5', secuencias líderes, marcadores de selección, marcadores de expresión/genes indicadores y/o elementos que pueden facilitar o aumentar (la eficiencia de) la transformación o integración. Estos y otros elementos adecuados para tales constructos genéticos serán evidentes para los expertos, y por ejemplo pueden depender del tipo de constructo usado, la célula huésped u organismo huésped deseado; la manera que las secuencias de nucleótidos de la invención de interés se van a expresar (por ejemplo, por medio de expresión constitutiva, transitoria o inducible); y/o la técnica de transformación usada.
Preferentemente, en los constructos genéticos de la invención, dicho al menos un ácido nucleico de la invención y dichos elementos regulatorios, y opcionalmente dicho uno o más elementos adicionales, están "unidos operativamente" entre sí, por el cual se entiende generalmente que ellos están en relación funcional entre sí. Por ejemplo, se considera que un promotor está "unido operativamente" a una secuencia codificadora si dicho promotor es capaz de inicial o controlar/regular de otro modo la transcripción y/o al expresión de una secuencia codificadora (en que dicha secuencia codificadora se debe entender que está "bajo el control de dicho promotor”). Generalmente, cuando dos secuencias de nucleótidos están unidas operativamente, estarán en la misma orientación y usualmente también en el mismo marco de lectura. Estas usualmente también están esencialmente contiguas, si bien esto también puede no ser necesario.
Preferentemente, los elementos regulatorios y adicionales de los constructos genéticos de la invención son de modo tal que sean capaces proporcionar su función biológica deseada en la célula huésped u organismo huésped deseado.
Por ejemplo, un promotor, potenciador o terminador deben ser "operables" en la célula huésped u organismo huésped deseado, por lo que se entiende que (por ejemplo) dicho promotor debe ser capaz de iniciar o controlar/regular de oro modo la transcripción y/o la expresión de una secuencia de nucleótidos - por ejemplo una secuencia codificadora – a la que se une operativamente (como se define en la presente).
Algunos promotores particularmente preferidos incluyen, pero sin limitación, promotores conocidos per se para la expresión en las células bacterianas, tales como los mencionados más adelante en la presente y/o los usados en los Ejemplos.
Un marcador de selección debe ser tal que permita – es decir en condiciones de selección apropiadas – distinguir las células huésped y/u organismos huésped que han sido transformados (con éxito) con la secuencia de nucleótidos de la invención de las células/organismos huésped que no sido transformadas (con éxito). Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de tales marcadores son genes que proporcionan resistencia contra los antibióticos (tal como kanamicina o ampicilina), genes que proporcionan resistencia a la temperatura o genes que permiten la célula huésped u organismo huésped sea mantenida en ausencia de ciertos factores, compuestos y/o componentes alimenticios en el medio que son esenciales para la supervivencia de las células u organismos no transformados.
Una secuencia líder debe ser tal que – en la célula huésped u organismo huésped deseado – permita las modificaciones pos-traducción deseadas y/o tal que dirija el ARNM transcripto a una parte u organela celular deseada. Una secuencia líder también puede permitir la secreción del producto de expresión de dicha célula. Como tal, la secuencia líder puede ser cualquier pro-, pre-, o prepro-secuencia operable en la célula huésped u organismo huésped. Las secuencias líderes pueden no ser necesarias para la expresión en una célula bacteriana.
Un marcador de expresión o gen indicador debe ser tal que -en la célula huésped u organismo huésped – permita la detección de la expresión de (un gen o secuencia de nucleótidos presente) en el constructo genético. Un marcador de expresión opcionalmente también permite la localización del producto expresado, por ejemplo en una parte u organela de la célula específica y/o en (a) células, tejidos, órganos o partes específicas de este organismo multicelular. Tales genes indicadores también se pueden expresar como una fusión de la proteína con la secuencia de aminoácidos de la invención. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes incluyen proteínas fluorescentes tales como GFP.
Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de promotores, terminadores y elementos adicionales adecuados incluyen los usados en los siguientes Ejemplos. En algunos ejemplos no limitantes (adicionales) de los promotores, marcadores de selección, secuencias líderes, marcadores de expresión y elementos adicionales que pueden estar presentes/usarse en los constructos genéticos de la invención - tales como terminadores, potenciadores de transcripción y/o traducción y/o factores de integración – se hace referencia a los manuales generales tales como Sambrook et al. y Ausubel et al. mencionados anteriormente, así como los ejemplos que se dan en los documentos WO 95/07463, WO 96/23810, WO 95/07463, WO 95/21191, WO 97/11094, WO 97/42320, WO 98/06737, WO 98/21355, US-A-6.207.410, US-A- 5.693.492 y EP 1 085 089. Otros ejemplos serán evidentes para los expertos. También se hace referencia a la técnica previa general mencionada anteriormente y las referencias adicionales citadas más adelante en la presente.
Los constructos genéticos de la invención generalmente se pueden proporcionar por la unión adecuada de las secuencias de nucleótidos) de la invención a uno o más elementos adicionales descritos anteriormente, por ejemplo usando las técnicas descritos en los manuales generales tales como Sambrook et al. y Ausubel et al., mencionados anteriormente.
A menudo, los constructos genéticos de la invención se obtendrán por la inserción de una secuencia de nucleótidos de la invención en un vector (expresión) adecuado conocido per se. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes de los vectores de expresión adecuados son los usados en los siguientes Ejemplos, así como los que se mencionan a continuación.
Los ácidos nucleicos de la invención y/o los constructos genéticos de la invención se pueden usar para transformar una célula huésped u organismo huésped. La célula huésped u organismo huésped puede ser cualquier célula o línea celular adecuada (fúngica, procariótica o eucariótica) o línea celular o cualquier organismo fúngico, procariótico o eucariótico adecuado, por ejemplo:
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una cepa bacteriana, que incluyen pero sin limitación cepas gram-negativas tales como cepas de Escherichia coli; de Proteus, por ejemplo de Proteus mirabilis; de Pseudomonas, por ejemplo de Pseudomonas fluorescens; y cepas grampositivas tales como cepas de Bacillus, por ejemplo de Bacillus subtilis o de Bacillus brevis; de Streptomyces, por ejemplo de Streptomyces lividans; de Staphylococcus, por ejemplo de Staphylococcus carnosus; y de Lactococcus, por ejemplo de Lactococcus lactis;
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una célula fúngica, que incluye pero sin limitación células de especies de Trichoderma, por ejemplo de Trichoderma reesei; de Neurospora, por ejemplo de Neurospora crassa; de Sordaria, por ejemplo de Sordaria macrospora; de Aspergillus, por ejemplo de Aspergillus niger o de Aspergillus sojae; o de otros hongos filamentosos;
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una célula de levadura, que incluye pero sin limitación células de especies de Saccharomyces, por ejemplos de Saccharomyces cerevisiae; de Schizosaccharomyces, por ejemplo de Schizosaccharomyces pombe; de Pichia, por ejemplo de Pichia pastoris o de Pichia methanolica; de Hansenula, por ejemplo de Hansenula polimorpha; de Kluyveromyces, por ejemplo de Kluyveromyces lactis; de Arxula, por ejemplo de Arxula adeninivorans; de Yarrowia, por ejemplo de Yarrowia lipolytica;
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una célula o línea celular anfibia, tal como Xenopus oocytes;
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una célula o línea celular derivada de insecto, tal como células/líneas celulares derivadas de lepidópteros, que incluyen pero sin limitación células de Spodoptera SF9 y Sf2l o células/líneas celulares derivadas de Drosophila, tales como células de Schneider y Kc;
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una planta o células de planta, por ejemplo en plantas de tabaco; y/o
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una célula o línea celular de mamífero, por ejemplo derivada de una célula o línea celular derivada de un ser humano, de los mamíferos que incluyen pero sin limitación células CHO, células BHK (por ejemplo, células BHK-21) y células o líneas celulares humanas tales células HeLa, COS (por ejemplo COS-7) y PER.C6;
así como otros huéspedes o células huésped conocidos per se para la expresión y producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos (que incluyen pero sin limitación anticuerpos de dominio (único) y fragmentos ScFv), que serán evidentes para los expertos. También se hace referencia en la técnica previa general citada anteriormente en la presente, así como por ejemplo en los documentos WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken et al., (1998), supra; Riechmann y Muyldermans, (1999), supra; van der Linden, (2000), supra; Thomassen et al., (2002), supra; Boosten et al., (2003), supra; Jo-esters et a€., (2005), supra; y las referencias adicionales citadas en la presente.
Los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención también se pueden introducir y expresar en una uno o más células, tejidos u órganos de un organismo multicelular, por ejemplo para fines profilácticos y/o terapéuticos (por ejemplo, como una terapia génica). Para este fin, las secuencias de nucleótidos de la invención se pueden introducir en las células o tejidos de cualquier modo adecuado, por ejemplo como tal (por ejemplo, mediante liposomas) o después de que se han insertado en un vector de terapia génica adecuado (por ejemplo derivado de retrovirus tal como adenovirus, o parvovirus tal como virus adeno-asociados). Como también será evidente para los expertos, tal terapia génica se puede realizar in vivo y/o in situ en el cuerpo de un paciente por la administración de un ácido nucleico de la invención o un vector de terapia génica adecuada que codifica los mismos al paciente o a células específicas o a un tejido u órgano específico del paciente; o las células adecuadas (a menudo tomadas del cuerpo del paciente por tratar, tal como linfocitos explantados, aspirados de médula ósea o biopsias de tejido) se pueden tratar in vitro con una secuencia de nucleótidos de la invención y posteriormente se reintroducen de modo adecuado en el cuerpo del paciente. Todo esto se puede realizar mediante vectores de terapia génica, técnicas y sistemas de administración que son bien conocidos por los expertos, por ejemplo Culver, K.. W., "Gene Therapy", 1994, p. xii Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York, N.Y g. Giordano, Nature F Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992),1108-813; Verma, Nature 389 (1994),239; Isner, Lancet 348 (1996),370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995),1077-1086; Onodera, Blood 91; (1998),30- 36; Verma, Gene Ther. 5 (1998),692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci.: 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996),714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5.580.859; US 5.589.466 o Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640. Por ejemplo, in situ expression of fragmnts ScFv (Afanasieva et al., Gene Ther., 10, 1850-1859 (2003)) y de diacuerpos (Blanco et al., J. Immunol, 171, 1070-1077 (2003)) se han descripto en la técnica.
Para la expresión de los Nanocuerpos en una célula, también se pueden expresar como los llamados "intracuerpos", por ejemplo, que se describen en los documentos WO 94/02610, WO 95/22618 y US-A-7004940; WO 03/014960; en Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications Landes and Springer-Verlag; y en Kontermann, Methods 34, (2004), 163-00.
Para la producción, los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención por ejemplo también se pueden producir en la leche de animales transgénicos, por ejemplo en la leche de conejos, vacas, cabras u oveja (ver por ejemplo US-A-6.741.957, US-A-6.304.489 y US-A-6.849.992 para técnicas generales para introducir transgenes en mamíferos), en plantas o partes de plantas que incluyen pero sin limitación sus hojas, flores, frutas, semilla, raíces o tubérculos (por ejemplo en tabaco, maíz, soja o alfalfa) o en por ejemplo pupas del gusano de seda Bambyx mori.
Además, los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención también se pueden expresar y/o producir en sistemas de expresión libres de células, y los ejemplos adecuados de tales sistemas serán evidentes para los expertos. Algunos ejemplos preferidos, pero no limitantes incluyen la expresión en el sistema de germen de trigo; en lisados de reticulocitos de conejo; o en el sistema Zubay de E. coli.
Como se mencionó anteriormente, una de las ventajas del uso de Nanocuerpos es que los polipéptidos basados en estos se pueden preparar mediante la expresión en un sistema bacteriano adecuado, y los sistemas de expresión bacterianos, vectores, células huésped, elementos regulatorios, etc., serán evidentes para los expertos, por ejemplo a partir de las referencias citadas anteriormente. Sin embargo, se debe indicar que la invención en su sentido más amplio no se limita a la expresión en sistemas bacterianos.
Preferentemente, en la invención, se usa un sistema de expresión (in vivo o in vitro), tal como un sistema de expresión bacteriano, que proporciona los polipéptidos de la invención en una forma que es adecuada para uso farmacéutico, y tales sistemas de expresión nuevamente serán evidentes para los expertos. También será evidente para los expertos, que los polipéptidos de la invención adecuados para el uso farmacéutico se pueden preparar mediante técnicas para la síntesis de péptidos.
Para la producción en escala industrial, los huéspedes heterólogos preferidos para la producción (industrial) de Nanocuerpos o proteínas terapéuticas que contienen Nanocuerpos incluyen cepas de E. coli, Pichia pastoris, S. cerevisiae que son adecuadas para la expresión/producción/fermentación en gran escala, y en particular para la expresión/producción/fermentación de productos farmacéuticos en gran escala. Los ejemplos adecuados de tales cepas serán evidentes para los expertos. Tales cepas y sistemas de producción/ expresión también están disponibles en compañías tales como Biovitrum (Uppsala, Suecia).
Alternativamente, las líneas celulares de mamíferos, en particular las células de ovario de hámster chino (CHO), se pueden usar para la expresión/producción/fermentación en gran escala, y en particular para expresión/producción/fermentación en gran escala de productos farmacéuticos. Además, tales sistemas de expresión/producción también están disponibles en algunas de las compañías mencionadas anteriormente.
La elección del sistema de expresión específico puede depender en parte del requerimiento de determinadas modificaciones pos-traducción, más específicamente la glicosilación. La producción de una proteína recombinante que contiene Nanocuerpo en la que se desea o requiere la glicosilación puede necesitar el uso de huéspedes de expresión mamíferos que tengan la capacidad de glicosilar la proteína expresada. En este aspecto, será evidente para los expertos que el patrón de glicosilación obtenido (es decir la clase, número y posición de los residuos unidos) dependerá de la célula o línea celular que se usa para la expresión. Preferentemente, se usa una célula o línea celular humana (es decir, que produce una proteína que esencialmente tiene un patrón de glicosilación humano) o se usa otra línea celular que puede proporcionar un patrón de glicosilación que es esencial y/o funcionalmente igual al la glicosilación humana o al menos imita la glicosilación humana. Generalmente, los huéspedes procarióticos tales como E. Coli que no tienen la capacidad de glicosilar las proteínas, y el uso de eucariotas inferiores tales como las levaduras usualmente llevan a un patrón de glicosilación que difiere de la glicosilación humana. No obstante, se debe entender que todas las células huésped y sistemas de expresión precedentes se pueden usar en la invención, de acuerdo con el Nanocuerpo o proteína que se desea obtener En consecuencia, de acuerdo con una realización no limitante de la invención, el nanocuerpo o polipéptido de la invención está glicosilado. De acuerdo con otra realización no limitante de la invención, el nanocuerpo o polipéptido de la invención está no glicosilado.
De acuerdo con una realización preferida, pero no limitante de la invención, el Nanocuerpo o polipéptido de la invención se produce en una célula bacteriana, en particular una célula bacteriana adecuada para la producción farmacéutica en gran escala, tal como las células de las cepas mencionadas anteriormente.
De acuerdo con otra realización preferida, pero no limitante de la invención, el nanocuerpo o polipéptido de la invención se produce en una célula de levadura, en particular una célula de levadura adecuada para la producción farmacéutica en gran escala, tal como las células de las especies mencionadas anteriormente.
De acuerdo con aún otra realización preferida, pero no limitante de la invención, el nanocuerpo o polipéptido de la invención se produce en una célula de mamífero, en particular en una célula humana o en una célula de una línea celular humana, y más en particular en una célula humana o en una célula de una línea celular humana que es adecuada para la producción farmacéutica en gran escala, tal como las líneas celulares mencionadas anteriormente en la presente.
Cuando se usa la expresión en una célula huésped para producir los Nanocuerpos y las proteínas de la invención, los Nanocuerpos y proteínas de la invención se pueden producir en forma celular (por ejemplo en el citosol, en el periplasma o en los cuerpos de inclusión) y posteriormente se aíslan de las células huésped y opcionalmente se purifican adicionalmente; o se pueden producir en forma extracelular (por ejemplo, en el medio en que las células huésped se cultivan) y posteriormente se aíslan del medio de cultivo y opcionalmente también se purifican. Cuando se usan las células huésped eucarióticas, usualmente se prefiere la producción extracelular ya que esto facilita considerablemente el aislamiento adicional y el procesamiento posterior de los Nanocuerpos y proteínas obtenidos. Las células bacterianas tales como las cepas de E. coli mencionadas anteriormente normalmente no secretan proteínas en forma extracelular, excepto por unas pocas clases de proteínas tales como toxinas y hemolisina, y la producción secretora en E. coli se refiere a la translocación de proteínas a través de la membrana interna en el espacio periplásmico. La producción periplásmica proporciona varias ventajas respecto de la producción citosólica. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos N-terminal del producto secretado puede ser idéntica a la del producto génico natural después de la escisión de la secuencia señal de secreción por una peptidasa de señal específica. Asimismo, parece haber mucha menos actividad de proteasa en el periplasma que en el citoplasma. Además, la purificación de la proteína es más simple debido a menos proteínas contaminantes en el periplasma. Otra ventaja es que se pueden formar enlaces disulfuros correctos debido a que el periplasma proporciona un ambiente más oxidativo que el citoplasma. Las proteínas sobreexpresadas en E. coli se hallan a menudo en los agregados insolubles, llamados cuerpos de inclusión. Estos cuerpos de inclusión se pueden localizar en el citosol o en el periplasma, la recuperación de las proteínas biológicamente activas de estos cuerpos de inclusión requiere un proceso de desnaturalización/replegado. Muchas proteínas recombinantes, que incluyen proteínas terapéuticas, se recuperan a partir de cuerpos de inclusión. Alternativamente, como será evidente para los expertos, se pueden usar cepas recombinantes de las bacterias que se han modificado genéticamente para secretar una proteína deseada proteína, y en particular un Nanocuerpo o a polipéptido de la invención.
En consecuencia, de acuerdo con una realización no limitante de la invención, el nanocuerpo o polipéptido de la invención es un Nanocuerpo o polipéptido que se ha producido en forma intracelular y que se ha aislado de la célula huésped, y en particular de una célula bacteriana o de un cuerpo de inclusión en una célula bacteriana. De acuerdo con otra realización no limitante de la invención, el nanocuerpo o polipéptido de la invención es un Nanocuerpo o polipéptido que se ha producido en forma extracelular y que se ha aislado del medio en que se cultiva la célula huésped.
Algunos promotores preferidos, pero no limitantes para usar en estas células huésped incluyen,
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para la expresión en E. coli: promotor lac (y sus derivados tal como el promotor lacUV5); promotor de arabinosa, promotor de fago lambda izquierdo (PL) y derecho (PR); promotor del operón trp; promotores lac/trp híbridos (tac y tic); promotor T7 (más específicamente que el del gen 10 del fago T7) y otros promotores del fago T; promotor del gen de resistencia de tetraciclina Tn10; variantes manipuladas genéticamente de los promotores anteriores que incluyen una o más copias de una secuencia del operador regulatorio extraño;
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para la expresión en S. cerevisiae: constitutivo: ADH1 (alcohol deshidrogenasa 1), ENO (enolasa), CYC1 (citocromo c iso-1), GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa); PGK1 (fosfoglicerato quinasa), PYK1 (piruvato quinasa); regulado: GALI,10,7 (enzimas de galactosa metabólica), ADH2 (alcohol deshidrogenasa 2), PHO5 (fosfatasa ácida), CUP1 (metalotioneína de cobre); heterólogo: CaMV (promotor del virus de mosaico de coliflor 35S);
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para la expresión en Pichia pastoris: el promotor AOX1 promotor (alcohol oxidasa I)
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para la expresión en células mamíferas: potenciador/promotor temprano inmediato de citomegalovirus humana (hCMV); variante del promotor temperano inmediato del citomegalovirus humano (hCMV) que contiene dos secuencias operadoras de tetraciclina de modo que el promotor se puede regular con el represor Tet, promotor de timidina quinasa del virus Herpes Simplex (TK); potenciador/promotor de la repetición terminal larga del virus de sarcoma Rous (RSV LTR); promotor del factor de elongación 1-1d) de humano, RhimpanRé, ratón o rata; el promotor temprano de
d (hEF SV40; promotor de la repetición terminar larga VIH-1; promotor de �-actina; Algunos vectores preferidos, pero no limitantes para usar con estas células huésped incluyen:
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vectores para la expresión en células de mamífero: pMAMneo (Clontech), pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-l (8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC37199), pRSVneo (ATCC37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) y 1ZD35 (ATCC 37565), así como sistemas de expresión basados en virus, tal como los basados en adenovirus;
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vectores para la expresión en células bacterianas: vectores pET (Novagen) y vectores pQE (Qiagen);
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vectores para la expresión en células de levaduras o fúngicas: pYES2 (Invitrogen) y vectores de expresión de Pichia (invitrogen);
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vectores para la expresión en células de insectos: pBlueBacII (Invitrogen) y otros vectores de baculovirus
– vectores para la expresión en plantas o células de plantas: por ejemplo vectores basados en virus del mosaico de coliflor o virus del mosaico de tabaco, cepas adecuadas de Agrobacterium, o vectores basados en plásmido Ti.
Algunas secuencias secretoras preferidas, pero no limitantes para usar con estas células huésped incluyen:
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para usar en células bacterianas tales como E. coli: PelB, Bla, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, StII, PhoA, PhoE, MaIE, Lpp, LamB y similares; péptido señal TAT, señal de secreción C-terminal de hemolisina
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para usar en levaduras: prepro-seRuenRia del faRtor de d-apareamiento, fosfatasa (pho1), invertasa (Suc), etc.;
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para usar en células mamíferas: señal indígena en el caso de proteína blanco es de origen eucariótico, péptido señal de la Radena K de IG de V-12-C; etc.
Las técnicas adecuadas para transformar un huésped o célula huésped de la invención serán evidentes para los expertos y pueden depender de la célula huésped/organismo huésped deseados y el constructo genético usado. También se hace referencia a los manuales y solicitudes de patente mencionadas anteriormente.
Después de la transformación, se puede realizar una etapa para detectar y seleccionar las células huésped u organismos huésped que se han transformado con éxito con la secuencia de nucleótidos/constructo genético de la invención. Por ejemplo, esto puede ser una etapa de selección basada en un marcador seleccionable en el constructo genético de la invención o una etapa que involucra la detección de la secuencia de aminoácidos de la invención, por ejemplo mediante anticuerpos específicos.
La célula huésped transformada (que pueden estar en la forma de una línea celular estable) u organismos huésped (que pueden estar en la forma de una línea o cepa mutante estable) forman los aspectos adicionales de la presente invención.
Preferentemente, estas células huésped u organismos huésped son tales que expresan, o son capaces de expresar (al menos) (por ejemplo en condiciones adecuadas), una secuencia de aminoácidos de la invención (y en el caso de un organismo huésped: en al menos una célula, parte, tejido u órgano de esto). La invención también incluye otras generaciones, progenie y/o descendencia de la célula huésped u organismo huésped de la invención, que por ejemplo se puede obtener por la división celular o por reproducción sexual o asexual.
Para producir/obtener la expresión de las secuencias de aminoácidos de la invención, la célula huésped transformada u organismo huésped transformado generalmente se puede conservar, mantener y/o cultivar en condiciones tales que se exprese/produzca la secuencia de aminoácidos (deseada) de la invención. Las condiciones adecuadas serán evidentes para los expertos y usualmente dependerán de la célula huésped/organismo huésped usada así como en los elementos regulatorios que controlan la expresión de la secuencia de nucleótidos (relevante) de la invención. Además, se hace referencia en los manuales y solicitudes de patente mencionados anteriormente en los párrafos de los constructos genéticos de la invención.
Generalmente, las condiciones adecuadas pueden incluir el uso de un medio adecuado, la presencia de una fuente de alimento adecuado y/o nutrientes adecuados, el uso de una temperatura adecuada, y opcionalmente la presencia de un factor inductor adecuado o compuesto (por ejemplo cuando las secuencias de nucleótidos de la invención están bajo el control de un promotor inducible); los cuales pueden ser seleccionados por los expertos. Además, en tales condiciones, la secuencias de aminoácidos de la invención se pueden expresar de una manera constitutiva, de una manera transitoria o solo cuando se inducen adecuadamente.
También será evidente para los expertos que la secuencia de aminoácidos de la invención se puede generar (primero) en una forma inmadura (como se mencionó anteriormente), que posteriormente se puede someter a la modificación postraducción, de acuerdo con la célula huésped/organismo huésped usado. Asimismo, la secuencia de aminoácidos de la invención se puede glicosilar, otra vez de acuerdo con la célula huésped/organismo huésped usado.
La secuencia de aminoácidos de la invención posteriormente se puede aislar de la célula huésped/organismo huésped y/o del medio en que se cultivó dicha célula huésped u organismo huésped mediante aislamiento de proteínas y/o técnicas de purificación conocidas per se, tal como técnicas de cromatografía (preparativa) y/o electroforesis, técnicas de precipitación diferencial, técnicas de afinidad (por ejemplo mediante una secuencia de aminoácidos escindible específica, fusionada con la secuencia de aminoácidos de la invención) y/o técnicas inmunológicas preparativas (es decir mediante anticuerpos contra la secuencia de aminoácidos aislada).
Generalmente, para el uso farmacéutico, los polipéptidos de la invención de las invenciones se pueden formular como una preparación farmacéutica que comprende al menos un polipéptido de la invención y al menos un portador, diluyente
o excipiente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente uno o más polipéptidos y/o compuestos adicionales farmacéuticamente activos. Por de ejemplos no limitantes, tal formulación puede estar en forma adecuada para administración oral, para administración parenteral (tal como por inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea o infusión intravenosa), para administración tópica, para administración por inhalación, por un parche cutáneo, por un implante, por un supositorio, etc. Tales formas de administración adecuadas – que pueden ser sólidos, semisólidos o líquidos, de acuerdo con la manera de administración - así como procedimientos y portadores para usar en la preparación de esta, serán evidentes para los expertos, y se describen adicionalmente más adelante en la presente.
Generalmente, los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se pueden formular y administrar en cualquier manera adecuada per se, para el cual se hace referencia por ejemplo en la técnica previa general citada anteriormente (y en particular al documento WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865 y WO 04/041867) así como en los manuales estándares, tal como Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990) o Remington, the Science y Practice de Pharmacy, 21th Edición, Lippincott Williams y Wilkins (2005).
Por ejemplo, los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se pueden formular y administrar de cualquiera manera conocida per se para los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos convencionales (que incluyen ScFv y diacuerpos) y otras proteínas farmacéuticamente activas. Tales formulaciones y procedimientos para preparar los mismos serán evidentes para los expertos, y por ejemplo incluyen preparaciones adecuadas para la administración parenteral (por ejemplo administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intraluminal, intra-arterial o intratecal) o administración tópica (es decir, transdérmica o intradérmica).
Las preparaciones para administración parenteral por ejemplo, pueden ser soluciones, suspensiones, dispersiones o emulsiones estériles que son adecuadas para la infusión o inyección. Los portadores o diluyentes adecuados para tales preparaciones por ejemplo incluyen, sin limitación, agua estéril y tampones acuosos y soluciones tales como solución salina regulada con fosfato fisiológicas, soluciones de Ringer, solución de dextrosa, y solución de Hank; aceites acuosos; glicerol; etanol; glicoles tal como propilenglicol o así como aceites minerales, aceites animales y aceites vegetales, por ejemplo aceite de maní, aceite de soja, así como sus mezclas adecuadas. Usualmente, se preferirán las soluciones o suspensiones acuosas.
Los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención también se pueden administrar mediante procedimientos de administración de terapia génica. Ver, por ejemplo, Patente U.S Núm. 5.399.346, que se incorpora por referencia en su totalidad. Mediante un procedimiento de administración de terapia génica, las células primarias transfectadas con el gen que codifica un Nanocuerpo o polipéptido de la invención se pueden transfectar adicionalmente con promotores específicos de tejido en órganos, tejido, injertos, tumores, o células específicos blanco y adicionalmente se pueden transfectar con secuencias señal y de estabilización para la expresión localizada en forma subcelular.
En consecuencia, los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se pueden administrar por vía sistémica, por ejemplo, vía oral, en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. Estos se pueden encapsular en cápsulas de gelatina de cubierta dura o blanda, se pueden comprimir en comprimidos, o se pueden incorporan directamente con el alimento de la dieta del paciente. Para la administración terapéutica oral, los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se pueden combinar con uno o más excipientes y usados en la forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, pastillas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Tales composiciones y preparaciones se deben contener al menos 0,1% del nanocuerpo o polipéptido de la invención. El porcentaje de las composiciones y preparaciones, obviamente, se puede variar y puede estar convenientemente entre aproximadamente 2 a aproximadamente 60% del peso de una forma de dosis unitaria dada. La cantidad del nanocuerpo o polipéptido de la invención en tales composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá un nivel de dosis efectivo.
Los comprimidos, pastillas, píldoras, cápsulas, y similares también pueden contener los siguientes: aglutinantes tales como goma de tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; un agente desintegrante tal como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; y se puede añadir un agente edulcorante tal como sacarosa, fructosa, lactosa o aspártamo o un agente saborizante tal como menta, aceite de gaulteria, o cereza. Cuando la forma de dosis unitaria es una cápsula, puede contener además de los materiales del tipo anterior, un portador líquido, tal como un aceite vegetal o un polietilenglicol. Otros diversos materiales pueden estar presentes como cubiertas o modificar de otro modo la forma física de la forma de dosis unitaria sólida. Por ejemplo, los comprimidos, pastillas, o cápsulas se pueden recubrir con gelatina, cera, goma laca o azúcar y similares. Un jarabe o elixir puede contener los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención, sacarosa o fructosa como un agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante y saborizante tal como sabor de cereza o naranja. Obviamente, cualquier material usado para preparar cualquier forma de dosis unitaria debe ser farmacéuticamente aceptable y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se pueden incorporar en preparaciones y dispositivos de liberación sostenida.
Las preparaciones y formulaciones para administración oral también se pueden proporcionar con una cubierta entérica que permitirá que los constructos de la invención resistan el ambiente gástrico y pasen en los intestinos. Más generalmente, las preparaciones y formulaciones para administración oral se pueden formular adecuadamente para la administración de cualquier parte deseada del aparato gastrointestinal. Además, se pueden usar supositorios adecuados para la administración en el aparato gastrointestinal.
Los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención también se pueden administrar por vía intravenosa o intraperitoneal por infusión o inyección. Las soluciones de los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención o sus sales se pueden preparar en agua, opcionalmente mezcla con un tensioactivo no tóxico. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos, triacetina, y sus mezclas y en aceites. En las condiciones de conservación y uso ordinarias, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.
Las formas de dosis farmacéuticas adecuadas para la inyección o infusión pueden incluir soluciones o dispersiones acuosas estériles o polvos estériles que comprenden el ingrediente activo que se adaptan para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles inyectables o infusibles, opcionalmente encapsuladas en liposomas. En todos los casos, la última forma de dosis debe ser estériles, fluidas y estables e las condiciones de fabricación y almacenamiento. El portador o vehículo líquido puede ser un solvente o medio de dispersión líquido que comprende, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicoles líquidos, y a similares), aceites vegetales, ésteres de glicerilo no tóxicos, y sus mezclas adecuadas. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, por la formación de liposomas, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones o por el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede producir por varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, tampones o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede producir por el uso de las composiciones de agentes que retardan la absorción , por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se preparan por la incorporación de los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención en la cantidad requerida en el solvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido por esterilización con filtro. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferidos son las técnicas de secado al vacío y liofilizado, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente activo adicional presente en las soluciones filtradas en forma estéril previamente.
Para la administración tópica, los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se pueden aplicar en forma pura, es decir, cuando son líquidos. Sin embargo, en general será conveniente administrarlos a la piel como composiciones o formulaciones, en combinación con un portador dermatológicamente aceptable, que puede ser sólido o líquido.
Los portadores sólidos útiles incluyen sólidos finamente divididos tales como talco, arcilla, celulosa microcristalina, sílice, alúmina y similares. Los portadores líquidos útiles incluyen agua, hidroxiaquilos o glicoles o mezclas de aguaalcohol/glicol, en que los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se pueden disolver o dispersar en niveles efectivos, opcionalmente con la ayuda de tensioactivos no tóxicos. Los adyuvantes tales como fragancias y agentes antimicrobianos adicionales se pueden añadir para optimizar las propiedades para un uso determinado. Las composiciones líquidas resultantes se pueden aplicar en parches absorbentes, usados para impregnar vendas y otros apósitos o rociar sobre el área afectada mediante el uso de rociadores tipo bomba o aerosol.
También se pueden emplear espesantes tales como polímeros sintéticos, ácidos grasos, sales y ésteres de ácido graso, alcoholes grasos, celulosas modificadas o materiales minerales modificados con portadores líquidos para formar pastas untables, geles, ungüentos, jabones y similares, para la aplicación directa en la piel del usuario.
Los ejemplos de composiciones dermatológicas útiles que se pueden usar para administrar los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención en la piel son conocidas en la técnica; por ejemplo, ver Jacquet et al. (Patente U.S. Núm. 4.608.392), Geria (Patente U.S. Núm. 4.992.478), Smith et al. (Patente U.S. Núm. 4.559.157) y Wortzman (Patente U.S. Núm. 4.820.508).
Las dosis útiles de los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se pueden determinar por la comparación de su actividad in vitro, y actividad in vivo en los modelos animales. Los procedimientos para la extrapolación de dosis efectivas en ratones, y otros, a seres humanos son conocidos en la técnica; por ejemplo, ver Patente U.S. Núm.
4.938.949.
Generalmente, la concentración de los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención en una composición líquida, tal como una loción, será de aproximadamente 0,1-25% en peso, preferentemente de aproximadamente 0,5-10% en peso. La concentración en una composición semisólida o sólida tal como un gel o un polvo será aproximadamente 0,1-5% en peso, preferentemente aproximadamente 0,5-2,5% en peso.
La cantidad de los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención necesarios para usar en el tratamiento variará no solo con el Nanocuerpo o polipéptido particular seleccionado sino también con la vía de administración, la naturaleza de la afección tratada y la edad y la afección del paciente y por último a criterio del médico o clínico asistente. Asimismo la dosis de los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención varía de acuerdo con la célula, tumor, tejido, injerto u órgano blanco.
La dosis deseada se puede presentar de modo conveniente en una dosis única o como dosis divididas administradas en intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más sub-dosis por día. La sub-dosis misma también se puede dividir adicionalmente, por ejemplo, en numerosas administraciones diferenciadas espaciadas libremente; tal como inhalaciones múltiples de un insuflador o por aplicación de una pluralidad de gotas en el ojo.
Un régimen de administración puede incluir tratamiento diario a largo plazo. Por "largo plazo" se entiende al menos dos semanas y preferentemente, varias semanas, meses o años de duración. Las modificaciones necesarias en este rango deseado pueden ser determinadas por los expertos en la técnica mediante solo experimentación de rutina dadas las enseñanzas de la presente. Ver Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. La dosis también puede ser ajustada por el médico en forma individual en el caso de alguna complicación.
En otro aspecto, la invención se refiere a un procedimiento para la prevención y/o tratamiento de al menos una enfermedad o trastorno relacionado a TNF como se menciona en la presente, dicho procedimiento que comprende administrar, a un sujeto que lo necesita, una cantidad farmacéuticamente activa de un Nanocuerpo de la invención, de un polipéptido de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende los mismos.
En el contexto de la presente invención, el término "prevención y/o tratamiento" no solo comprende prevenir y/o tratar la enfermedad, pero también generalmente comprende prevenir el inicio de la enfermedad, lentificar o revertir el progreso de la enfermedad, prevenir o lentificar el inicio de uno o más síntomas asociados con la enfermedad, reducir y/o aliviar uno o más síntomas asociados con la enfermedad, reducir la gravedad y/o la duración de la enfermedad y/o de cualquiera de los síntomas asociados con la misma y/o prevenir un aumento adicional de la gravedad de la enfermedad y/o de cualquiera de los síntomas asociados con la misma, prevenir, reducir o revertir cualquier daño fisiológico causado por la enfermedad, y generalmente cualquier acción farmacológica que es beneficioso para el paciente tratado.
El sujeto para tratar puede ser cualquier animal de sangre caliente, pero en particular es un mamífero, y más en particular un ser humano. Como será evidente para los expertos, el sujeto para tratar en particular será una persona que sufre de, o en riesgo de, las enfermedades y trastornos mencionados en la presente.
La invención también se refiere a un procedimiento para la prevención y/o tratamiento de al menos una enfermedad o trastorno que se puede prevenir y/o tratar por la administración de un Nanocuerpo o polipéptido de la invención a un paciente, dicho procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesita, una cantidad farmacéuticamente activa de un Nanocuerpo de la invención, de un polipéptido de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende los mismos.
Más en particular, la invención se refiere a un procedimiento para la prevención y/o tratamiento de al menos una enfermedad o trastorno elegido del grupo que consiste en las enfermedades y trastornos listados en la presente, dicho procedimiento que comprende administrar a un sujeto que lo necesita, una cantidad farmacéuticamente activa de un Nanocuerpo de la invención, de un polipéptido de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende los mismos.
En otra realización, la invención se refiere a un procedimiento para inmunoterapia, y en particular para la inmunoterapia pasiva, tal procedimiento comprende administrar a un sujeto que sufre de o está en riesgo de las enfermedades y trastornos mencionados en la presente, una cantidad farmacéuticamente activa de un Nanocuerpo de la invención, de un polipéptido de la invención, y/o de una composición farmacéutica que comprende los mismos.
En los anteriores procedimientos, los Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención y/o las composiciones que comprende los mismos se pueden administrar de cualquier manera, de acuerdo con la formulación o composición farmacéutica específica usada. En consecuencia, los Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención y/o las composiciones que comprende los mismos por ejemplo se pueden administrar por vía oral, intraperitoneal (por ejemplo intravenosa, subcutánea, intramuscular, o por medio de cualquier otra vía de administración que elude el aparato gastrointestinal), intranasal, transdérmico, tópico, por medio de un supositorio, por inhalación, de nuevo de acuerdo con la formulación o composición farmacéutica específica que se usa. El médico podrá seleccionar una vía de administración adecuada y una formulación o composición farmacéutica adecuada para usar en tal administración, de acuerdo con la enfermedad o trastorno por prevenir o tratar y otros factores bien conocidos en la clínica.
Los Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención y/o las composiciones que comprende los mismos se administran de acuerdo con un régimen de tratamiento que es adecuada para prevenir y/o tratar la enfermedad o trastorno por prevenir
o tratar. El clínico generalmente podrá determinar un régimen de tratamiento adecuado, de acuerdo con los factores tal como la enfermedad o trastorno por prevenir o tratar, la gravedad de la enfermedad por tratar y/o la gravedad de sus síntomas, el Nanocuerpo o polipéptido específico de la invención que se usa, la vía de administración específica y la formulación o composición farmacéutica usada, la edad, género, peso, dieta, condición general del paciente, y factores similares bien conocidos por el clínico.
Generalmente, el régimen de tratamiento comprenderá la administración de uno o más Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención, o de uno o más composiciones que comprende los mismos, en una o más cantidades o dosis farmacéuticamente efectivas. Las cantidades o dosis específicas para administrar pueden ser determinadas por el médico clínico, nuevamente sobre la base de los factores mencionados anteriormente.
Generalmente, para la prevención y/o tratamiento de las enfermedades y trastornos mencionados en la presente y de acuerdo con la enfermedad o trastorno específico por tratar, la potencia del Nanocuerpo y polipéptido específico de la invención usado, la vía específica de administración y la formulación o composición farmacéutica específica usada, los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención generalmente se administrarán en una cantidad entre 1 gramo y 0,01 microgramo por kilo de peso corporal por día, preferentemente entre 0,1 gramo y 0,1 microgramo por kg de peso corporal por día, tal como aproximadamente 1, 10, 100 o 1000 microgramos por kg de peso corporal por día, continuamente (por ejemplo, por infusión), como una dosis diaria única o como múltiples dosis divididas durante el día. El médico clínico generalmente podrá determinar una dosis diaria adecuada, de acuerdo con los factores mencionados en la presente. También será evidente que en los casos específicos, el clínico puede elegir desviarse de estas cantidades, por ejemplo sobre la base de los factores citados anteriormente y criterio experto. Generalmente, se puede obtener alguna pauta sobre las cantidades para administrar de las cantidades usualmente administradas para los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos convencionales comparables contra el mismo blanco administrado por medio de esencialmente la misma vía, tomando en cuenta sin embargo, las diferencias en afinidad(avidez, eficacia, biodistribución, vida media y factores similares bien conocidos por los expertos.
Usualmente, en el procedimiento anterior, se usará un Nanocuerpo o polipéptido de la invención único. Sin embargo, está dentro del alcance de la invención usar dos o más Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención en combinación.
Los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención también se pueden usar en combinación con uno o más compuestos o principios farmacéuticamente activos adicionales, es decir como un régimen de tratamiento combinado, que puede o no producir un efecto sinérgico. Además, el clínico podrán seleccionar estos compuestos o principios adicionales, así como un régimen de tratamiento combinado adecuado, sobre la base de los factores citados anteriormente y su criterio experto.
En particular, los Nanocuerpos y polipéptidos de la invención se pueden usar en combinación con otros compuestos o principios farmacéuticamente activos que son o se pueden usar para la prevención y/o tratamiento de las enfermedades y trastornos mencionados en la presente, como resultado del cual se puede obtener o no un efecto sinérgica. Los ejemplos de tales compuestos y principios, así como vías, procedimientos y formulaciones o composiciones farmacéuticas para administrarlos serán evidentes para el clínico.
Cuando dos o más sustancias o principios se usan como parte de un régimen de tratamiento combinado, ellos se pueden administrar por medio de la misma vía de administración o por medio de diferentes vías de administración, en esencialmente el mismo tiempo o a diferentes tiempos (por ejemplo esencialmente en forma simultánea, consecutiva, o de acuerdo con un régimen alternativo). Cuando las sustancias o principios se administran en forma simultánea por medio de la misma vía de administración, se pueden administrar como formulaciones o composiciones farmacéuticas diferentes o parte de una formulación o composición farmacéutica combinada, como será evidente para los expertos.
Asimismo, cuando se usan dos o más sustancias o principios activos: como parte de un régimen de tratamiento combinado, cada una de las sustancias o principios se pueden administrar en la misma cantidad y de acuerdo con el mismo régimen que se usa cuando el compuesto o principio se usa por sí mismo, y tal uso combinado puede o no producir un efecto sinérgico. Sin embargo, cuando el uso combinado de dos o más sustancias o principios activos produce un efecto sinérgico, también puede ser posible reducir la cantidad de uno, más o todas las sustancias o principios por administrar, mientras que aún se obtiene la acción terapéutica deseada. Esto puede ser útil por ejemplo, para evitar, limitar o reducir cualquier efecto secundario que se asocian con el uso de una o más de las sustancias o principios cuando ellos se usan en sus cantidades usuales, mientras que aún se obtiene el efecto farmacéutico o terapéutico deseado.
La efectividad del régimen de tratamiento usado de acuerdo con la invención se puede determinar y/o seguir de cualquiera manera conocida per se para la enfermedad o trastorno involucrado, como será evidente para el clínico. El clínico también podrá, cuando sea apropiado y o sobre la base caso por caso, para cambiar o modificar un régimen de tratamiento particular, de modo de obtener el efecto terapéutico deseado, para evitar, limitar o reducir los efectos secundarios no deseados y/o alcanzar un equilibrio apropiado entre lograr el efecto terapéutico deseado por una parte y evitar, limitar o reducir efectos secundarios no deseados por otra parte.
Generalmente, el régimen de tratamiento seguirá hasta obtener el efecto terapéutico deseado y/o durante todo el tiempo en que se mantiene el efecto terapéutico deseado. Además, esto puede ser determinado por el clínico, en consecuencia, en un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene al menos un Nanocuerpo de la invención o al menos un polipéptido de la invención y al menos un portador adecuado (es decir un portador adecuado para uso veterinario), y opcionalmente una o más sustancias activas adicionales.
La invención también se refiere al uso de un Nanocuerpo de la invención y/o de un polipéptido de la invención en la preparación de una composición farmacéutica, en particular en la preparación de una composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento (que incluye pero sin limitación al alivio de al menos un síntoma) de una enfermedad o trastorno mediado por TNF-alfa y/o asociado con TNF-alfa (por ejemplo, asociado con una actividad anormal de TNFalfa, niveles anormales de TNF-alfa, expresión anormal de TNF-alfa y/o sensibilidad anormal o respuesta a TNF-alfa) o de uno de los fenómenos biológicos asociados con TNF-alfa tal como una de las enfermedades o trastornos mencionados anteriormente.
La invención también se refiere a un procedimiento para prevenir y/o tratar (que incluye pero sin limitación al alivio de al menos un síntoma) de una enfermedad o trastorno mediada por TNF-alfa y/o asociado con TNF-alfa (por ejemplo asociado con actividad anormal de TNF-alfa, niveles anormales de TNF-alfa, expresión anormal de TNF-alfa y/o sensibilidad o respuesta anormal a TNF-alfa, o de uno de los fenómenos biológicos asociados con TNF-alfa), tal como una de las enfermedades o trastornos mencionados anteriormente, tal procedimiento comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente activa de un Nanocuerpo de la invención, de polipéptido de la invención, y/o de a composición farmacéutica como se describió anteriormente.
La presente invención proporciona polipéptidos que comprende uno o más nanocuerpos se dirige hacia factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa). La presente invención también se refiere a su uso y diagnostico y terapia. Tales anticuerpos pueden tener una secuencia estructural con alta homología con las secuencias estructurales humanas. Se describen composiciones que comprenden anticuerpos para el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) solo o en combinación con otros fármacos.
Se considera que el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) cumple un papel importante en varios trastornos, por ejemplo, en trastornos inflamatorios tal como artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa y esclerosis múltiple. Tanto TNF-alfa como los receptores (CD120a, CD12Ob) se han estudiado en gran detalle. La TNF-alfa en su forma bioactiva es un trímero y el surco formado por las subunidades vecinas es importante para la interacción de la citoquina-receptor. Se han desarrollado varias estrategias para antagonizar la acción de la citoquina y se usan actualmente para tratar los estados de enfermedad.
Un inhibidor de TNF-alfa que tiene suficiente especificidad y selectividad para TNF-alfa puede ser un compuesto farmacéutico profiláctico o terapéutico eficiente para prevenir o tratar trastornos en que los se ha implicado el TNF-alfa como agente causante. Se han descrito los procedimientos de tratar el shock tóxico (EP 486526), regresión del tumor, inhibición de citotoxicidad (US 6448380, US 6451983, US 6498237), enfermedad autoinmune tal como RA y enfermedad de Crohn (EP 663836, US 5672347, US 5656272), reacción de injerto versus huésped (US 5672347), meningitis bacteriana (EP 585705) por medio de un anticuerpo al TNF-alfa.
Sin embargo ninguno de los fármacos disponibles actualmente son completamente efectivos para el tratamiento de la enfermedad autoinmune, y la mayor parte están limitados por toxicidad severa. Además, es extremadamente difícil y un proceso prolongado desarrollar una nueva entidad química (NCE) con suficiente potencia y selectividad para tal secuencia blanco. Por otra parte los agentes terapéuticos basados en el anticuerpo tienen significativo potencial como fármacos debido a que tienen especificidad exquisita por su blanco y una baja toxicidad intrínseca. Además, el tiempo de desarrollo se puede reducir en forma considerable cuando se compararon con el desarrollo de nuevas entidades químicas (NCE). Sin embargo, los anticuerpos convencionales son difíciles de originar contra proteínas multiméricas donde el receptor-dominio de unión del ligando está incrustado en un surco, como es en el caso con TNF-alfa. Los anticuerpos de cadena pesada descritos en la invención que se derivan de los camélidos, son conocidos por tener propiedades de unión en la cavidad (W097/49805; Lauwereys et al, EMBO J. 17, 5312, 1998)). En consecuencia, tales anticuerpos de cadena pesada son inherentemente adecuados para unirse a los dominios de unión del receptor de tales ligandos como TNF. Además, se sabe que tales anticuerpos son estables durante períodos de tiempo más largos, en consecuencia aumenta su vida media (Perez et al, Biochemistry, 40, 74, 2001). Por otra parte, tales fragmentos del anticuerpo de cadena pesada se pueden producir “en masa” en fermentadores mediante sistemas de expresión económicos en comparación con la fermentación de cultivo de las células mamíferas, tal como levaduras u otros microorganismos (EP 0 698 097).
El uso de anticuerpos derivados de fuentes tales como ratón, oveja, cabra, conejo, etc., y sus derivados humanizados como un tratamiento para las afecciones que requieren una modulación de inflamación es problemático por varias razones. Los anticuerpos tradicionales no son estables a temperatura ambiente, y se deben refrigerar para la preparación y el almacenamiento, lo que requiere el equipamiento de laboratorio, almacenamiento y transporte refrigerado necesario, lo que contribuye al tiempo y gasto. La refrigeración algunas veces no es factible en los países en desarrollo. Además, la fabricación o producción en pequeña escala de dichos anticuerpos es costosa porque los sistemas celulares de mamífero necesarios para la expresión de anticuerpos intactos y activos requieren altos niveles de soporte en términos de tiempo y equipo, y los rendimientos son muy bajos. Por otra parte el tamaño grande de los anticuerpos convencionales, puede restringir la penetración del tejido, por ejemplo, en el sitio del tejido inflamado. Además, los anticuerpos tradicionales tienen una actividad de unión que depende del pH, y en consecuencia son inadecuados para usar en ambientes fuera del rango de pH fisiológico usual tal como, por ejemplo, para tratar el sangrado gástrico, cirugía gástrica. Además, los anticuerpos tradicionales son inestables a pH bajo o alto y en consecuencia no son adecuados para administración oral. Sin embargo, se ha demostrado que los anticuerpos de camélidos resisten condiciones duras, tales como pH extremo, reactivos desnaturalizantes y altas temperaturas (Dumoulin et al, Protein Science I I, 500, 2002), de este modo los hace adecuados para la administración por administración oral. Por otra parte, los anticuerpos tradicionales tienen una actividad de unión, que depende de la temperatura, y en consecuencia no son adecuados para usar en los ensayos o kits realizados a temperaturas fuera de los rangos de temperatura biológicamente activos (por ejemplo 37 ± 20ºC).
Los agentes terapéuticos polipeptídicos y en particular los agentes terapéuticos basados en anticuerpos tienen potencial significativo como fármacos ya que ellos tienen especificidad exquisita por su blanco y una baja toxicidad intrínseca. Sin embargo, es conocido por los destinatarios expertos que un anticuerpo que ha sido obtenido para un blanco terapéuticamente útil requiere modificación adicional a fin de prepararlo para la terapia humana, de modo de evitar una reacción inmunológica no deseada en un individuo humano después de la administración de este. El proceso de modificación se denomina comúnmente “humanización". Es conocido por los expertos que los anticuerpos originados en especies, diferentes de los seres humanos requieren la humanización para producir el anticuerpo terapéuticamente útil en los seres humanos ((1) CDR grafting Protein Design Labs: US 6180370, US 5693761; Genentech US 6054297; Celltech: 460167, EP 626390, US 5859205; (2) Veneering: Xoma: US 5869619, US 5766886, US 5821123). Se necesita un procedimiento para producir anticuerpos que eviten el requerimiento de humanización sustancial, o que se obvie completamente la necesidad de humanización. Se necesita una nueva clase de anticuerpos que tengan regiones estructurales o residuos de aminoácidos definidos y que se puedan administrar a un sujeto humano sin el requerimiento de humanización sustancial, o la necesidad de humanización en absoluto.
Otro importante inconveniente de los anticuerpos convencionales es que ellos son moléculas grandes y complejas, y en consecuencia son relativamente inestables, y son sensibles a la degradación por proteasas. Esto significa que los fármacos de anticuerpo convencional no se pueden administrar por vía oral, sublingual, tópica, nasal, vaginal, rectal o por inhalación debido a que no son resistentes al pH bajo en estos sitios, la acción de las proteasas en estos sitios y en la sangre y/o debido a su gran tamaño. Estos se deben administra por inyección (en forma intravenosa, subcutánea, etc.) para superar algunos de estos problemas. La administración por inyección requiere el entrenamiento del especialista para usar una jeringa o aguja hipodérmica en forma correcta y segura. También se requiere equipamiento estéril, una formulación líquida del polipéptido terapéutico, empaquetado del vial de dicho polipéptido de una forma estéril y estable y, del sujeto, un sitio adecuado para la entrada de la aguja. Por otra parte, los sujetos comúnmente experimentan estrés físico y fisiológico antes y después de recibir una inyección. En consecuencia, se necesita un procedimiento para la administración de polipéptidos terapéuticos que evite la necesidad de inyección que es no solo ahorrador de costo/tiempo, pero que también puede ser más conveniente y más cómodo para el sujeto.
Los agentes terapéuticos basados en Nanocuerpos tienen potencial significativo como fármacos ya que tienen especificidad exquisita por su blanco y una baja toxicidad inherente. Sin embargo, la mejora adicional de su afinidad intrínseca y funcional puede producir muchos beneficios para un paciente tal como reducción de la dosis de agentes terapéuticos, terapia más rápida y reducción defectos secundarios.
Una realización de la presente invención es un Nanocuerpo anti-TNF-alfa, tal nanocuerpo es preferentemente como también se describió anteriormente.
Una realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa que comprende al menos un Nanocuerpo antiTNF-alfa, tal polipéptido es preferentemente como también se describió anteriormente.
Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente que además comprende al menos un Nanocuerpo dirigido contra a proteína sérica.
Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa que se describió anteriormente en el que dicha proteína sérica es alguna de albúmina sérica, inmunoglobulinas séricas, proteína de unión a tiroxina, transferrina, o fibrinógeno.
Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente que además comprende al menos un Nanocuerpo seleccionado del grupo que consiste en Nanocuerpo anti-INF-gamma, Nanocuerpo del receptor anti-TNF-alfa y Nanocuerpo del receptor anti-TNF-gamma.
Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente, en el que el número de Nanocuerpos dirigidos contra TNF-alfa es al menos dos.
Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa que se describió anteriormente, en el que al menos un Nanocuerpo es un VHH de camélidos humanizado.
Otra realización de la presente invención es una composición que comprende un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente y al menos un Nanocuerpo del grupo que consiste en Nanocuerpo anti-INF-gamma, Nanocuerpo del receptor anti-TNF-alfa y Nanocuerpo del receptor anti-TNF-gamma, para al administración simultánea, separada o secuencial a un sujeto.
Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente, o una composición como se describió anteriormente, en que dicho nanocuerpo es una secuencia homóloga, una porción funcional, o una porción funcional de una secuencia homóloga del Nanocuerpo de longitud completa.
Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente, o una composición como se describió anteriormente, en el que el polipéptido anti-TNF-alfa es una secuencia homóloga, una porción funcional, o una porción funcional de una secuencia homóloga del polipéptido anti-TNF-alfa de longitud completa.
Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente, o una composición como se describió anteriormente en el que al menos un Nanocuerpo es un VHH de camélidos.
Otra realización de la presente invención es un ácido nucleico que codifica un polipéptido anti-TNF-alfa anti- como se describió anteriormente.
Otra realización de la presente invención es un procedimiento de identificar un agente que modula la unión de un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente, al factor de necrosis tumoral alfa que comprende las etapas de:
(a)
poner en contacto un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente con un blanco que es el Factor de necrosis tumoral alfa, en presencia y ausencia de un modulador candidato en condiciones que permiten la unión entre dicho polipéptido y blanco, y
(b)
medir la unión entre el polipéptido y blanco de la etapa (a), en la que una disminución de la unión en presencia de dicho modulador candidato, con respecto a la unión en ausencia de dicho modulador candidato identificó dicho modulador candidato como un agente que modula la unión de un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente y factor de necrosis tumoral alfa.
Otra realización de la presente invención es un procedimiento de identificar un agente que modula trastornos mediados por factor de necrosis tumoral alfa a través de la unión de un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente al factor de necrosis tumoral alfa que comprende:
(a)
poner en contracto un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente con un blanco que es el factor de necrosis tumoral alfa, en presencia y ausencia de a modulador candidato en condiciones que permiten entre dicho polipéptido y blanco, y
(b)
medir la unión entre el polipéptido y blanco de la etapa (a), en que una disminución de la unión en presencia de dicho modulador candidato, con respecto a la unión en ausencia de de dicho modulador candidato identificó, dicho modulador candidato como un agente que modula trastornos mediados por factor de necrosis tumoral alfa.
Otra realización de la presente invención es un procedimiento de identificación de un agente que modula los trastornos mediados por factor de necrosis tumoral alfa a su receptor a través de la unión de un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente al factor de necrosis tumoral alfa que comprende:
(a)
poner en contacto un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente con un blanco que es el factor de necrosis tumoral alfa, en presencia y ausencia de a modulador candidato en condiciones que permiten la unión entre dicho polipéptido y blanco, y
(b)
medir la unión entre el polipéptido y blanco de la etapa (a), en que una disminución de la unión en presencia de dicho modulador candidato, con respecto a la unión en ausencia de dicho modulador candidato identificó dicho modulador candidato como un agente que modula la unión de factor de necrosis tumoral alfa a su receptor.
Otra realización de la presente invención es un kit para detectar agentes que modulan trastornos mediados por factor de necrosis tumoral alfa que comprende un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente y factor de necrosis tumoral alfa.
Otra realización de la presente invención es un agente desconocido que modula la unión de un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente al factor de necrosis tumoral alfa, identificado de acuerdo con el procedimiento como se describió anteriormente.
Otra realización de la presente invención es un agente desconocido que modula trastornos mediados por factor de necrosis tumoral alfa, identificado de acuerdo con los procedimientos que se describieron anteriormente.
Otra realización de la presente invención es un agente desconocido como se describió anteriormente en que dichos trastornos son uno o más de inflamación, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome intestinal inflamatorio y esclerosis múltiple.
Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti TNF-alfa que se describió anteriormente, o un ácido nucleico como se describió anteriormente, o una composición como se describió anteriormente, o un agente como se describió anteriormente para tratar y/o prevenir y/o aliviar trastornos relacionados con los procesos inflamatorios.
Otra realización de la presente invención es un uso de un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente o a ácido nucleico como se describió anteriormente, o una composición que se describió anteriormente, o un agente como se describió anteriormente para la preparación de un medicamento para tratar y/o prevenir y/o aliviar trastornos relacionados con las reacciones inflamatorias.
Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente o una composición como se describió anteriormente, para tratar y/o prevenir y/o aliviar trastornos susceptible para la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención que es capaz de atravesar el ambiente gástrico sin que se inactive la sustancia.
Otra realización de la presente invención es un uso de un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente o una composición como se describió anteriormente, para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención que es capaz de atravesar el ambiente gástrico sin que se inactive la sustancia.
Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa que se describió anteriormente o una composición como se describió anteriormente, para tratar y/o prevenir y/o aliviar trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención administrado en el tracto vaginal y/o rectal.
Otra realización de la presente invención es un uso de un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente o una composición como se describió anteriormente, para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención administrado en el tracto vaginal y/o rectal.
Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente o una composición como se describió anteriormente, para tratar y/o prevenir y/o aliviar trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención administrado en la nariz, vías respiratorias superiores y/o pulmón.
Otra realización de la presente invención es un uso de un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente o una composición como se describió anteriormente, para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención administrado en la nariz, vías respiratorias superiores y/o pulmón.
Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente o una composición como se describió anteriormente, para tratar y/o prevenir y/o aliviar trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención administrado en la mucosa intestinal, en el que dicho trastorno aumenta la permeabilidad de la mucosa intestinal.
Otra realización de la presente invención es un uso de un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente o una composición como se describió anteriormente, para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención administrado en la mucosa intestinal, en el que dicho trastorno aumenta la permeabilidad de la mucosa intestinal.
Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa que se describió anteriormente o una composición como se describió anteriormente, para tratar y/o prevenir y/o aliviar trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención que es capaz de atravesar los tejidos debajo de la lengua en forma efectiva.
Otra realización de la presente invención es un uso de un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente o una composición como se describió anteriormente, para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención que es capaz de atravesar los tejidos debajo de la lengua en forma efectiva.
Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente o una composición como se describió anteriormente, para tratar y/o prevenir y/o aliviar trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención que es capaz de atravesar la piel en forma efectiva.
Otra realización de la presente invención es un uso de un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente o una composición como se describió anteriormente, para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención que es capaz de atravesar la piel en forma efectiva.
Otra realización de la presente invención es un procedimiento como se describió anteriormente, un kit como se describió anteriormente, un ácido nucleico o agente como se describió anteriormente, uso de un ácido nucleico o agente como se describió anteriormente, a composición como se describió anteriormente, use de a composición como se describió anteriormente, un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente, use de un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente en el que dichos trastornos son cualquiera de inflamación, artritis reumatoide, COPD, asma, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome intestinal inflamatorio, esclerosis múltiple, enfermedad de Addison, hepatitis autoinmune, parotiditis autoinmune, Diabetes Tipo I, epididimitis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, Lupus eritematoso sistémico, Infertilidad masculina, esclerosis múltiple, miastenia gravis, pénfigo, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, tiroiditis, y vasculitis.
Otra realización de la presente invención es una composición que comprende un ácido nucleico o agente como se describió anteriormente, un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente, o una composición como se describió anteriormente, y un vehículo farmacéutico adecuado.
Otra realización de la presente invención es un procedimiento de diagnosticar un trastorno caracterizado por la disfunción del factor de necrosis tumoral alfa que comprende:
(a)
poner en contacto una muestra con un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente,
(b)
detectar la unión de dicho polipéptido a dicha muestra, y
(c)
comparar la unión detectada de la etapa (b) con un estándar, en que una diferencia en la unión con respecto a dicha muestra es diagnóstico de un trastorno caracterizado por la disfunción del factor de necrosis tumoral alfa.
Otra realización de la presente invención es un kit para detectar un trastorno mencionado anteriormente, mediante un procedimiento como se describió anteriormente.
Otra realización de la presente invención es un kit para detectar un trastorno mencionado anteriormente que comprende un polipéptido anti-TNF-alfa aislado como se describió anteriormente.
Otra realización de la presente invención es un uso de un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente para la purificación de dicho factor de necrosis tumoral alfa.
Otra realización de la presente invención es un uso de un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente para inhibir la interacción entre el factor de necrosis tumoral alfa y uno o más receptores del factor de necrosis tumoral alfa.
Otra realización de la presente invención es un procedimiento para producir un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente que comprende las etapas de
(a)
obtener ADN de cadena doble que codifica un VHH de camélidos dirigido al factor de necrosis tumoral alfa,
(b)
clonar y expresar el ADN seleccionado en la etapa (b).
Otra realización de la presente invención es un procedimiento de producir un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente que comprende:
(a)
cultivar las células huésped que comprende ácido nucleico capaz de codificar un polipéptido anti-TNF-alfa como se describió anteriormente, en condiciones que permiten la expresión del polipéptido, y,
(b)
recuperar el polipéptido producido del cultivo.
Otra realización de la presente invención es un procedimiento como se describió anteriormente, en que dichas células huésped son bacterianas o de levadura.
Otra realización de la presente invención es un kit para detectar alguna de inflamación, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome intestinal inflamatorio o esclerosis múltiple que comprende un polipéptido antiTNF-alfa como se describió anteriormente.
VHH, de acuerdo con la presente invención, y como es conocido por los destinatarios expertos son dominios variables de cadena pesada derivados de inmunoglobulinas desprovistas naturalmente de las cadenas livianas tales como las derivadas de los Camelidae como se describe en el documento WO 94/04678 (y denominada de aquí en adelante en la presente como dominios VHH o nanocuerpos). Las moléculas de VHH aproximadamente l0x más pequeñas que las moléculas de IgG. Ellos son polipéptidos simples y muy estables, que resisten condiciones extremas de pH y/o temperatura. Además, son resistentes a la acción de las proteasas, lo que no es el caso para los anticuerpos convencionales. Además, la expresión in vitro de los VHH produce alto rendimiento de VHH funcionales plegados apropiadamente. Además, los anticuerpos generados en los camélidos reconocerán epitopes diferentes de los reconocidos por los anticuerpos generados in vitro mediante el uso de bibliotecas de anticuerpos o por medio de la inmunización de mamíferos diferentes de los camélidos (WO 9749805). Como tal, los VHH anti-TNF-alfa pueden interactuar más eficientemente con TNF-alfa que los anticuerpos convencionales, de este modo bloquean su interacción con el receptor de TNF-alfa de modo más eficiente.
TNF-alfa también es el fragmento de TNF-alfa, capaz de inducir una respuesta inmunológica. TNF-alfa también es un fragmento de TNF-alfa, capaz de unirse a un Nanocuerpo originado contra el TNF-alfa de longitud completa.
Un Nanocuerpo dirigido contra TNF-alfa significa el nanocuerpo que es capaz de unirse a TNF-alfa con una afinidad mejor que 10-6M.
El uno o más nanocuerpos del polipéptido anti-TNF que se dirigen contra un TNF-alfa pueden ser de la misma secuencia. Alternativamente ellos pueden no tener la misma secuencia. Está dentro del alcance de la invención que un polipéptido anti-TNF comprenda nanocuerpos anti-TNF-alfa que no comparten la misma secuencia, pero que se dirigen contra el mismo blanco, uno o más antígenos de estos.
La presente invención también se refiere a un polipéptido anti-TNF alfa descrito y reivindicado en la presente, en el dicho nanocuerpo es un VHH dirigido contra TNF-alfa, en el que el VHH pertenece a una clase que tiene secuencias tipo humanas. La clase se caracteriza porque los VHH portan un aminoácido del grupo que consiste en glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptofano, metionina, serina, treonina, asparagina, o glutamina en la posición 45, tal como, por ejemplo, L45 y un triptofano en la posición 103, de acuerdo con la numeración de Kabat. Otra clase de tipo humana de los nanocuerpos de camélidos se ha descrito en el documento WO03035694 y contienen los residuos hidrófobos FR2 que se hallan normalmente en los anticuerpos convencionales de origen humano o de otra especie, pero que compensa esta pérdida de hidrofilicidad con el residuo de arginina cargado de la posición 103 que sustituye el residuo de triptofano conservado presente en el VH de los anticuerpos de cadena doble. Como tal, los pépticos pertenecientes a las dos clases muestran una alta homología de secuencia de aminoácidos con las regiones estructurales del VH humano y dichos péptidos se podrían administrar a un ser humano en forma directa sin expectativas de una respuesta inmunitaria no deseada a partir de los mismos, y sin la cara de la humanización posterior. La invención también se refiere a los ácidos nucleicos capaces de codificar dichos polipéptidos.
Cualquiera de las VHH que se usaron en la invención puede ser de la clase tradicional o de las clases de anticuerpos de camélidos tipo humano. Dichos anticuerpos se pueden dirigir contra TNF-alfa completo o un fragmento de este, o un fragmento de una secuencia homóloga del mismo. Estos polipéptidos incluyen los anticuerpos de camélidos de longitud completa, a saber dominios de Fc y VHH, versiones de los anticuerpos de camélidos de cadena completa con un con un dominio de Fc o VHH humano por sí mismos o fragmentos derivados.
Los VHH anti-albúmina sérica pueden interactuar de una manera más eficiente con albúmina sérica que los anticuerpos convencionales que es conocida por ser una proteína portadora. Como proteína portadora, algunos de los epitopes de la albúmina sérica pueden ser inaccesibles para las proteínas unidas, péptidos y compuestos químicos pequeños. Debido a que se sabe que los VHH se unen a los a los epitopes “inusuales” o no convencionales tales como cavidades (documento WO 97149805), se puede aumentar la afinidad de tales VHH en la albúmina circulante.
La presente invención también se refiere al hallazgo de que un polipéptido anti-TNF que se describe en la presente que además comprende uno o más Nanocuerpos dirigidos contra una o más proteína séricas de un sujeto, de modo sorprendente presenta una vida media significativamente prolongada en la circulación de dicho sujeto en comparación la vida media del Nanocuerpo anti-TNF-alfa cuando no parte de dicho constructo. Por otra parte, se halló que los dichos polipéptidos exhiben las mismas propiedades favorables de los nanocuerpos tales como alta estabilidad que continúa intacta en los ratones, resistencia de pH extremo, estabilidad a temperatura alta y alta afinidad por el blanco.
La proteína sérica puede ser cualquier proteína adecuada hallada en el suero del sujeto. En aspecto de la invención, la proteína sérica es albúmina sérica, inmunoglobulinas séricas, proteína de unión a tiroxina, transferrina o fibrinógeno. De acuerdo con el uso deseado tal como la vida media requerida para el tratamiento efectivo y/o compartimentalización del antígeno blanco, el compañero de VHH se puede dirigir a una de las anteriores proteínas séricas.
De acuerdo con un aspecto específico, pero no limitante de la invención, el nanocuerpo contra albúmina sérica humana consiste en 4 regiones estructurales (FR1 a FR4 respectivamente) y 3 5 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3 respectivamente), en que:
(iv) CDR1 es una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en:
SFGMS [SEQ ID NO: 361
LNLMG (SEQ ID NO: 371
INLLG [SEQ ID NO: 38]
NYWMY; (SEQ ID NO: 391
y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido es preferentemente a sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente); y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos;
(v)
CDR2 es una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en
O del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos; en que
(1)
cualquier sustitución de aminoácido es preferentemente a sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente); y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos;
y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido es preferentemente a sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente); y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos;
y en que:
(vi)
CDR3 es una secuencia de aminoácidos elegida del grupo que consiste en: DREAQVDTLDFDY [SEQ ID NO: 47]
o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos; en que
(1)
cualquier sustitución de aminoácido es preferentemente a sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente); y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos;
y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido es preferentemente a sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente); y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos;
o del grupo que consiste en:
y en que: GRGSP (SEQ ID NO: 51)
GGSLSR
[SEQ ID NO: 48)
RRTWHSEL
(SEQ ID NO: 49)
GRSVSRS
[SEQ ID NO: 50)
y/o del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solo 1 "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con una de las anteriores secuencias de aminoácidos, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido es preferentemente a sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente); y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos.
En otro aspecto, la invención se refiere a un Nanocuerpo contra albúmina sérica humana, que consiste en 4 regiones estructurales (FR1 a FR4 respectivamente) y 3 regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3 respectivamente), que se elige del grupo que consiste en anticuerpos del dominio y/o anticuerpos de dominio único con una de las siguientes combinaciones de CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente:
En los Nanocuerpos de la invención que comprenden las combinaciones de CDR mencionadas anteriormente, cada CDR se puede reemplazar con una CDR elegida del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen al menos 80%, preferentemente al menos 90%, más preferentemente al menos 95%, aun más preferentemente al menos 99% de identidad de secuencia (como se define en la presente) con las mencionadas CDR; en que
(1)
cualquier sustitución de aminoácido es preferentemente a sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente); y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos;
y/o elegida del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos que tienen 3, 2 o solo 1 (como se indica en el párrafo precedente) "diferencia de aminoácido" (como se define en la presente) con las mencionadas CDR una de las anteriores secuencias de aminoácidos, en que:
(1)
cualquier sustitución de aminoácido es preferentemente a sustitución conservadora de aminoácido (como se define en la presente); y/o
(2)
dicha secuencia de aminoácidos preferentemente solo contiene sustituciones de aminoácido, y sin inserciones o supresiones de aminoácido, en comparación con las anteriores secuencias de aminoácidos.
Sin embargo, de los Nanocuerpos de la invención que comprenden las combinaciones de CDR mencionados anteriormente, los Nanocuerpos que comprenden uno o más de las CDR enumeradas anteriormente son particularmente preferidos; los Nanocuerpos que comprenden dos o más de las CDR enumeradas anteriormente son más particularmente preferido; y Nanocuerpos que comprende tres de las CDR enumeradas anteriormente son los más particularmente preferido.
En estos Nanocuerpos contra albúmina sérica humana, las regiones estructurales FR1 a FR4 son preferentemente como se definieron anteriormente en la presente para los Nanocuerpos de la invención.
Los Nanocuerpos particularmente preferidos contra albúmina sérica humana se eligen del grupo que consiste en las SEQ ID NOs: 61 a 67, SEQ ID NOs 87 a 89 y SEQ ID NOs 100-104, Las combinaciones preferidas de CDR y las regiones estructurales presentes en estos Nanocuerpos también se enumeran en la Tabla II
Tabla II: Combinación preferida de secuencias estructurales y CDR en los Nanocuerpos contra albúmina sérica humana.
Otro aspecto de la invención es un polipéptido anti-TNF-alfa que se describe en la presente que además comprende al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en polipéptido anti-INF-gamma, un polipéptido del receptor de anti-TNF-alfa y polipéptido del receptor anti-IFN-gamma.
Otro aspecto de la invención es un procedimiento de tratar una enfermedad o afección autoinmune mencionado en la presente, que comprende administrar a un paciente una cantidad efectiva de un polipéptido anti-TNF-alfa descrito y reivindicado en la presente, que además comprende al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en polipéptido anti-INF-gamma, polipéptido del receptor de anti-TNF-alfa y polipéptido del receptor de anti-IFN-gamma, tales polipéptidos se unen entre sí que se describen a continuación.
Tales constructos multiespecíficos pueden tener mejor potencia como compuesto terapéutico inflamatorio respecto de los constructos monoespecíficos.
Un aspecto de la invención es una composición que comprende un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente y al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en polipéptido anti-INF-gamma, polipéptido del receptor de anti-TNF-alfa y polipéptido del receptor de anti-IFN-gamma, para la administración simultánea, separada o secuencial a un sujeto.
Un aspecto de la invención es un procedimiento para tratar la enfermedad autoinmune que comprende administrar a un individuo una cantidad efectiva de un polipéptido anti-TNF-alfa descrito y reivindicado en la presente y al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en polipéptido anti-INF-gamma, polipéptido del receptor de anti-TNFalfa y polipéptido del receptor de anti-IFN-gamma en forma simultánea, separada o secuencial.
Otro aspecto de la invención es un kit que contiene un polipéptido anti-TNF-alfa descrito y reivindicado y al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en polipéptido anti-INF-gamma, polipéptido del receptor de anti-TNFalfa y polipéptido del receptor de anti-IFN-gamma para la administración simultánea, separada o secuencial a un sujeto. Un aspecto de la invención es que el kit se puede usar de acuerdo con la invención. Un aspecto de la invención es que el kit se puede usar para tratar las enfermedades mencionadas en la presente.
Por administración simultánea se entiende que los polipéptidos se administran a un sujeto al mismo tiempo. Por ejemplo, como una mezcla de polipéptidos o una composición que comprende dichos polipéptidos. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación una solución administrada por vía intravenosa, un comprimido, líquido, crema tópica, etc., en los que cada preparación comprende los polipéptidos de interés.
Por administración separada se entiende que los polipéptidos se administran a un sujeto al mismo tiempo o sustancialmente al mismo tiempo. Los polipéptidos se presentan en el kit como preparaciones no mezcladas separadas. Por ejemplo, los polipéptidos diferentes pueden estar presentes en el kit como comprimidos individuales. Los comprimidos se pueden administrar al sujeto al tragar ambos comprimidos al mismo tiempo, o un comprimido directamente después del otro.
Por administración secuencial se entiende que los polipéptidos se administran a un sujeto en forma secuencial. Los polipéptidos se presentan en el kit como preparaciones no mezcladas separadas. Existe un intervalo de tiempo entre las dosis. Por ejemplo, un polipéptido se podría administrar hasta 336, 312, 288, 254, 240, 216, 192, 168, 144, 126, 96, 72, 48, 24, 20, 16, 12, 8, 4, 2, 1, o 0,5 horas después del otro componente.
En la administración secuencial, un polipéptido se puede administrar una vez, o cualquier número de veces y en varias dosis antes y/o después de la administración de otro polipéptido. La administración secuencial se puede combinar con administración simultánea o secuencial.
Los uso médicos del polipéptido anti-TNF-alfa que se describe a continuación, también se aplican en la composición que comprende un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente y al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en el polipéptido anti-IFN-gamma, polipéptido del receptor de anti-TNF-alfa y polipéptido del receptor de anti-IFN-gamma, para la administración simultánea, separada o secuencial a un sujeto que se describió anteriormente en la presente.
Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa como se describe en la presente, en el que el número de nanocuerpos dirigidos contra TNF-alfa es dos o más. Tales polipéptidos anti-TNF-alfa multivalentes tienen la ventaja de una afinidad funcional inusualmente alta por el blanco, y exhiben propiedades inhibitorias mucho más altas que las esperadas en comparación con sus contrapartes monovalentes.
Los polipéptidos anti-TNF-alfa multivalentes tienen afinidades funcionales que son varios órdenes de magnitud más altos de que los polipéptidos anti-TNF-alfa monovalentes originales. Los inventores han hallado que las afinidades funcionales de estos polipéptidos multivalentes son mucho más altas que los informados en la técnica previa para los anticuerpos bivalentes y multivalentes. De modo sorprendente, los polipéptidos anti-TNF-alfa de la presente invención ligados entre sí directamente o por medio de una secuencia ligadora corta muestran las afinidades funcionales altas esperadas teóricamente con los anticuerpos de cuatro cadenas multivalentes convencionales.
Los inventores han hallado que tales actividades funcionales muy aumentadas se pueden detectar preferentemente con antígenos compuestos de proteínas multidominio y multiméricas, sea en ensayos de unión o ensayos funcionales, por ejemplo ensayos de citotoxicidad.
Los Nanocuerpos se pueden unir para formar cualquiera de los polipéptidos descritos en la presente que comprenden más de un Nanocuerpo mediante los procedimientos conocidos en la técnica o cualquier procedimiento futuro. Por ejemplo, ellos se pueden fusionar por entrecruzamiento químico por la reacción de los residuos de aminoácidos con un agente derivatizante orgánico tal como se describe en Blatter et al, Biochemistry 24,1517-1524; EP294703. Alternativamente, el nanocuerpo se puede fusionar genéticamente al nivel del AD, es decir, un constructo de polinucleótido formado que codifica el constructo de polipéptido completo que comprende uno o más nanocuerpos antiblanco y uno o más de nanocuerpos anti-proteína sérica. Un procedimiento para producir constructos de polipéptidos de VHH bivalente o multivalente en la solicitud de patente PCT WO 96/46103. Una manera de unir nanocuerpos múltiples es por medio de la vía genética por la unión a las secuencia codificadoras del nanocuerpo sea directamente o por medio de un ligador del péptido. Por ejemplo, el extremo C-terminal del primer Nanocuerpo se puede unir al extremo N-terminal del próximo nanocuerpo. Este modo de unión se puede extender a fin de unir nanocuerpos adicionales para la construcción y producción de tri-, tetra-, etc. constructos funcionales.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, los Nanocuerpos se unen entre sí directamente sin uso de un ligador. En forma contraria a la unión de los anticuerpos voluminosos convencionales donde se necesita una secuencia ligadora para retener la actividad de unión en las dos subunidades, los polipéptidos de la invención se pueden ligar directamente y de este modo evitar los potenciales problemas de la secuencia ligadora, tal como la antigenicidad cuando se administra a un sujeto humano, inestabilidad de la secuencia ligadora que lleva a la disociación de las subunidades.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, los Nanocuerpos se unen entre sí por medio de una secuencia ligadora peptídica. Tal secuencia ligadora puede ser una secuencia natural o una secuencia no natural. Se espera que la secuencia ligadora no sea inmunogénica en el sujeto al que se administra el polipéptido anti-TNF-alfa. La secuencia ligadora puede proporcionar suficiente flexibilidad al polipéptido anti-TNF-alfa multivalente, al mismo tiempo que es resistente a la degradación proteolítica. Un ejemplo no limitante de una secuencia ligadoras es una que puede derivar de la región bisagra de los VHH descritos en el documento WO 96/34103.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, los nanocuerpos multivalentes que comprende más de dos nanocuerpos se pueden ligar entre sí en forma directa o por medio de un secuencia ligadora. Tales constructos son difíciles de producir con anticuerpos convencionales y debido al impedimento estático de las subunidades voluminosas, se perderá funcionalidad o disminuirá mucho en vez de aumentar considerablemente como se observa con los VHH de la invención en comparación con el constructo monovalente.
Los constructos de polipéptido descritos en la presente pueden ser obtenidos por los profesionales expertos de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica o cualquier procedimiento futuro. Por ejemplo, los VHH se pueden obtener mediante los procedimientos conocidos en la técnica tal como por inmunizar un camello y obtener hibridomas de a partir de los mismos, o por la clonación de una biblioteca de nanocuerpos mediante técnicas de biología molecular conocidas en la materia y posterior selección por medio de despliegue en fago.
De acuerdo con un aspecto de la invención un polipéptido anti-TNF-alfa puede ser una secuencia homóloga de un polipéptido anti-TNF-alfa de longitud completa descrito y reivindicado en la presente. De acuerdo con otro aspecto de la invención, un polipéptido anti-TNF-alfa puede ser una porción funcional de un polipéptido anti-TNF-alfa de longitud completa descrito y reivindicado en la presente. De acuerdo con otro aspecto de la invención, un polipéptido anti-TNFalfa descrito y reivindicado en la presente puede ser una secuencia homóloga de un polipéptido anti-TNF-alfa de longitud completa. De acuerdo con otro aspecto de la invención, un polipéptido anti-TNF-alfa puede ser una porción funcional de una secuencia homóloga de un polipéptido anti-TNF-alfa de longitud completa descrito y reivindicado en la presente. De acuerdo con un aspecto de la invención un polipéptido anti-TNF-alfa puede comprender a secuencia de un polipéptido anti-TNF-alfa descrito y reivindicado en la presente.
De acuerdo con un aspecto de la invención un Nanocuerpo usado para formar un polipéptido anti-TNF-alfa puede ser un nanocuerpo completo (por ejemplo un VHH) o a secuencia homóloga de este. De acuerdo con otro aspecto de la invención, un Nanocuerpo usado para formar el constructo de polipéptido puede ser una porción funcional de un nanocuerpo completo. De acuerdo con otro aspecto de la invención, un Nanocuerpo usado para formar el constructo de polipéptido puede ser una secuencia homóloga de un nanocuerpo completo. De acuerdo con otro aspecto de la invención, un Nanocuerpo usado para formar el constructo de polipéptido puede ser una porción funcional de una secuencia homóloga de un nanocuerpo completo.
Como se usa en la presente, una secuencia homóloga de la presente invención puede comprender adiciones, supresiones o sustituciones de uno o más aminoácidos, que no alteran sustancialmente las características funcionales de los polipéptidos de la invención. El número de supresiones o sustituciones de aminoácido es preferentemente hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, o 66, 67, 68, 69 o 70 aminoácidos.
Una secuencia homóloga de acuerdo con la presente invención puede ser un polipéptido modificado por la adición, supresión o sustitución de aminoácidos, dicha modificación no altera sustancialmente las características funcionales en comparación el polipéptido no modificado.
Una secuencia homóloga de acuerdo con la presente invención puede ser un polipéptido modificado por la adición, supresión o sustitución de aminoácidos dicha modificación no altera sustancialmente las características funcionales en comparación el polipéptido no modificado.
Una secuencia homóloga de acuerdo con la presente invención puede ser una secuencia que existe en otras especies
de camélidos tales como, por ejemplo, camello, dromedario, llama, alpaca, guanaco etc. Cuando la secuencia homóloga indica identidad de secuencia, significa una secuencia que presenta una alta identidad de secuencia (más de 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 98% de identidad de secuencia) con secuencia original y preferentemente se caracteriza por propiedades similares de la secuencia original, a saber afinidad, dicha identidad se calcula mediante procedimientos conocidos.
Alternativamente, una secuencia homóloga también puede ser cualquier secuencia de aminoácidos resultante de las sustituciones permitidas en numerosas posiciones de la secuencia original de acuerdo con la siguiente fórmula: Ser sustituida por Ser, Thr, Gly, y Asn; Arg sustituida por uno de Arg, His, G1n, Lys, y Glu; Leu sustituida por uno de Leu, Ile, Phe, Tyr, Met, y Val; Pro sustituida por uno de Pro, Gly, Ala, y Thr; Thr sustituida por uno de Thr, Pro, Ser, Ala, Gly, His, y Gln; Ala sustituida por uno de Ala, Gly, Thr, y Pro; Val sustituida por uno de Val, Met, Tyr, Phe, He, y Leu; Gly sustituida por uno de Gly, Ala, Thr, Pro, y Ser; Ile sustituida por uno de He, Met, Tyr, Phe, Val, y Leu; Phe sustituida por uno de Phe, Trp, Met, Tyr, Ile, Val, y Leu; Tyr sustituida por uno de Tyr, Trp, Met, Phe, Ile, Val, y Leu His sustituida por uno de His, Glu, Lys, Gln, Thr, y Arg; Gln sustituida por uno de Gln, Glu, Lys, Asa, His, Thr, y Arg; Asn sustituida por uno de Asn, Glu, Asp, Gln, y Ser; Lys sustituida por uno de Lys, Glu, Gln, His, y Arg; Asp sustituida por uno de Asp, Glu, y Asn; Glu sustituida por uno de Glu, Asp, Lys, Mn, Gln, His, y Arg;
Met sustituida por uno de Met, Phe, Ile, Val, Leu, y Tyr. Una secuencia homóloga de nucleótidos de acuerdo con la presente invención se puede referir a las secuencias de nucleótidos de más de 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800 o 1000 nucleótidos capaces de hibridar al complemento inverso de la secuencia de nucleótidos capaz de codificar la secuencia original, en condiciones de hibridación rigurosas (tal como las descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manuel, Cold Spring, Harbor Laboratory press, New York).
Como se usa en la presente, una porción funcional se refiere a una secuencia de un Nanocuerpo que es tamaño
suficiente de modo que se mantiene la interacción de interés con afinidad de 1 x 10-6 M o mejor. Alternativamente, una porción funcional comprende una supresión parcial de la secuencia de aminoácidos completa y aún mantiene el sitio de unión y dominio de la proteína necesario para la unión de y la interacción con el blanco.
Como se usa en la presente, una porción funcional se refiere a menos de 100% de la secuencia completa (por ejemplo, 99%, 90%, 80%, 70%, 60% 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% etc.), pero comprende 5 o más aminoácidos o 15 o más nucleótidos.
Los blancos mencionados en la presente tales como TNF-alfa, receptor de TNF-alfa, proteínas séricas (por ejemplo albúmina sérica, inmunoglobulinas séricas, proteína de unión a tiroxina, transferrina, fibrinógeno) e IFN-gamma, receptor de IFN-gamma pueden ser fragmentos de dichos blancos. En consecuencia un blanco también es un fragmento de dicho blanco, capaz de inducir una respuesta inmune. Un blanco también es un fragmento de dicho blanco, capaz de unirse a un nanocuerpo originado contra el blanco de longitud completa.
Un fragmento como se usa en la presente se refiere a menos de 100% de la secuencia (por ejemplo, 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% etc.), pero que comprende 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 o más aminoácidos. Un fragmento es de suficiente longitud de modo de mantener la interacción de interés con una afinidad de 1 x 10-6 M o mejor.
Un fragmento como se usa en la presente también se refiere a inserciones, supresiones y sustituciones opcionales de uno o más aminoácidos que no alteran sustancialmente la capacidad del blanco de unirse a un Nanocuerpo originado contra el blanco tipo salvaje. El número de inserciones supresiones o sustituciones de aminoácidos es preferentemente hasta 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,289 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, .52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 o 70 aminoácidos.
Una secuencia homóloga de la presente invención puede incluitr un polipéptido anti-TNF-alfa descrito y reivindicado en la presente que ha sido humanizado. La humanización de los anticuerpos de la nueva clase de VHH también reduce la posibilidad de reacción inmunológica no deseada en un individuo humano después de la administración.
Una realización de la presente invención se refiere a un procedimiento para preparar polipéptidos modificados sobre la base de los anticuerpos de llama por la determinación de los residuos de aminoácidos del dominio variable del anticuerpo (VHH) que se puede modificar sin disminuir la afinidad nativa del dominio para el antígeno y a la vez reducir su inmunogenicidad con respecto a una especie heteróloga; el uso de los VHH que tienen modificaciones en los residuos identificados que son útiles para la administración a especies heterólogas; y al VHH así modificado.
Más específicamente, la invención se refiere a la preparación de VHH modificados, que se modifican para la administración a los seres humanos, los VHH resultantes mismos y el uso de tales VHH "humanizados" en el tratamiento de enfermedades en los seres humanos. Por humanizado se entiende mutado de modo que la inmunogenicidad después de la administración en pacientes humanos sea menor o inexistente. La humanización de un polipéptido, de acuerdo con la presente invención, comprende una etapa de reemplazar uno o más de los aminoácidos de camélidos por su contraparte humana que se halla en la secuencia de consenso humana, sin que el polipéptido pierda su carácter típico, es decir la humanización no afecta significativamente la capacidad de unión del antígeno del polipéptido resultante. Tales procedimientos son conocidos por el destinatario experto.
La humanización de los nanocuerpos de camélidos requiere la introducción y mutagénesis de una cantidad limitada de aminoácidos en una cadena de polipéptido simple. Esto es en contraste con la humanización de scFv, Fab, (Fab)2 e IgG, que requiere la introducción de cambios de aminoácidos en las dos cadenas, la cadena liviana y la cadena pesada y la conservación del ensamblaje de ambas cadenas.
Como se describe en el documento WO 04/041862, un nanocuerpo anti-TNF se puede humanizar. La humanización por ejemplo puede involucrar la mutagénesis de residuos en FR1 en la posición 1 y 5 que fueron introducidos por el cebador usado para la clonación del repertorio y no aparece naturalmente en la secuencia de llama. La mutagénesis de estos residuos no produjo la pérdida de unión y/o actividad de inhibición. La humanización también puede involucrar la mutagénesis de residuos en FR3 en la posición 74, 76, 83, 84, 93. La mutagénesis de de estos residuos no produjo una pérdida drástica de actividad de unión y/o inhibición. La combinación de las mutaciones de FR1 y FR3 por ende no afectaron la actividad de unión y/o inhibición. La humanización también puede involucrar la mutagénesis de residuos en FR4 en la posición 108. La mutagénesis de Q108L produjo menor nivel de producción en Escherichia coli. La posición 108 se expone al disolvente en el VHH de camélido, mientras que en los anticuerpos humanos esta posición está sepultada en la interfaz VH-VL (Spinelli, 1996; Nieba, 1997). En los VH aislados la posición 108 está expuesta al disolvente. La introducción de una Leu hidrófoba no polar en vez de Gln polar no cargado puede tener un efecto drástico sobre el pegamiento/estabilidad intrínseca de la molécula. Asimismo, el reemplazo de los residuos hidrófilos por residuos hidrófobos humanos en las posiciones 44 y 45 (E44G y R45L), no tuvieron efecto sobre la unión y/o inhibición. Sin embargo, se observó pérdida de unión y/o actividad de inhibición cuando se introdujeron F37V y F47W. Los datos de modelado confirmaron el residuo crítico 37 para conservar la integridad de la conformación del bucle de CDR3 y en consecuencia sobre la actividad (toda la numeración de acuerdo con Kabat ).
De acuerdo con una realización de la presente invención, la humanización involucrar el reemplazo de alguno de los siguientes residuos solos o en combinación:
-
FR1 posición 1, 5, 28 y 30,
-
el aminoácido marcador en la posición 44 y 45 en FR2,
-
FR3 residuos 74, 75, 76, 83, 84, 93 y 94,
-
y las posiciones 103, 104, 108 y 111 en FR4 ;
-
numeración de acuerdo con la numeración de Kabat.
Una realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa, o un ácido nucleico capaz de codificar dicho polipéptido para usar en el tratamiento, prevención y/o alivio de los síntomas de trastornos relacionados con los procesos inflamatorios. TNF-alfa está involucrado en los procesos inflamatorios, y el bloqueo de la acción de TNF-alfa acción puede tener un efecto antiinflamatorio, que es muy conveniente en ciertos estados de enfermedad tales como, por ejemplo, enfermedad de Crohn. Los Ejemplos demuestran VHH de acuerdo con la invención que se unen a TNF-alfa y además, bloquean su unión al receptor TNF-alfa.
Los polipéptidos anti-TNF-alfa de la presente invención son aplicables a las enfermedades autoinmunes, tales como enfermedad de Addison (adrenal), enfermedades autoinmunes del oído (oíd), enfermedades autoinmunes de los ojos (ojo), hepatitis autoinmune (hígado), parotiditis autoinmune (glándulas parótidas), enfermedad de Crohn (intestino), Diabetes Tipo I (páncreas), epididimitos (epidídimo), glomerulonefritis (riñones), enfermedad de Graves (tiroides), síndrome de Guillain-Barre (células nerviosas), enfermedad de Hashimoto (tiroides), anemia hemolítica (eritrocitos), Lupus eritematoso sistémico (múltiples tejidos), infertilidad masculina (esperma), esclerosis múltiple (células nerviosas), miastenia gravis (unión neuromuscular), pénfigo (principalmente piel), psoriasis (piel), fiebre reumática (corazón y articulaciones), artritis reumatoide (revestimiento de la articulación), sarcoidosis (múltiples tejidos y órganos), escleroderma (piel y tejidos conectivos), síndrome de Sjogren (glándulas exocrinas, y otros tejidos), espondiloartropatías (esqueleto axial y otros tejidos), tiroiditis (tiroides), Vasculitis (vasos sanguíneos).
Dentro del paréntesis está el tejido afectado por la enfermedad. Este listado de enfermedades autoinmunes se considera ejemplificativo más que inclusivo.
Las enfermedades autoinmunes en las que los polipéptidos anti-TNF-alfa de la presente invención se pueden aplicar incluyen, por ejemplo, SIDA, alergia atópica, asma bronquial, eczema, lepra, esquizofrenia, depresión hereditaria, trasplante de tejidos y órganos, síndrome de fatiga crónica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, autismo, epilepsia, fenómeno de Arthus, anafilaxis, y adicción a alcohol y fármacos. En las enfermedades autoinmunes identificadas anteriormente, el tejido afectado es el blanco primario, en otros casos es el blanco secundario. Estas afecciones son en parte o principalmente
síndromes autoinmunes. En consecuencia, para tratarlos, es posible usar los mismos procedimientos, o aspectos de los mismos procedimientos que se describen en la presente, algunas veces en combinación con otros procedimientos.
Otra realización de la presente invención es un uso de un polipéptido anti-TNF-alfa de acuerdo con la invención, o un ácido nucleico capaz de codificar dicho polipéptido para la preparación de un medicamento para tratar un trastorno relacionado con los procesos inflamatorios. Los ejemplos de trastornos incluyen artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome intestinal inflamatorio y esclerosis múltiple.
Los polipéptidos y ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención se pueden administrar a un sujeto por vías convencionales, tal como vía intravenosa. Sin embargo, una propiedad especial de los polipéptidos anti-TNF-alfa de la invención es que penetran barreras tales como membranas tisulares y/o tumores y actúan localmente en ellos y son suficientemente estables para resistir los ambientes extremos tal como en el estómago. En consecuencia, otro aspecto de la presente invención se refiere a la administración del polipéptido anti-TNF-alfa descrito y reivindicado en la presente.
Cuando los Nanocuerpos y/o polipéptidos de la invención se usan para, o están destinados al uso para la prevención o tratamiento de enfermedades y trastornos del aparato gastrointestinal, en particular por medio de la administración oral u otra administración en el aparato gastrointestinal, usualmente no será necesario usar polipéptidos de la invención que tengan aumento de la vida media en suero (es decir, que han sido pegilados o que contienen un Nanocuerpo dirigido contra una proteína sérica). En consecuencia, para tales indicaciones, se pueden usar los polipéptidos de la invención que solo contienen los Nanocuerpos de la invención. En particular, se ha hallado que en la administración oral para la prevención y tratamiento de enfermedades o trastornos del aparato gastrointestinal asociados con y/o mediados por TNF-alfa (tal como IBD y las otras enfermedades y trastornos del aparato gastrointestinal mencionados anteriormente), se puede preferir el uso de un Nanocuerpo monovalente de la invención o de un polipéptido de la invención que consiste esencialmente en un Nanocuerpo monovalente de la invención. Para otras indicaciones, tales como el tratamiento de artritis reumatoide (RA), se puede preferir el uso de un Nanocuerpo bivalente de la invención. Cuando tal Nanocuerpo debe alcanzar su sitio de acción deseado por medio del torrente sanguíneo, se puede preferir el uso de un polipéptido de la invención que tiene un aumento de vida media en el suero.
Un sujeto de acuerdo con la invención puede ser cualquier mamífero susceptible al tratamiento con polipéptidos terapéuticos.
La administración oral de los polipéptidos anti-TNF-alfa de la invención produce la provisión de tales moléculas en una forma activa en el colon en los sitios locales que son afectados por el trastorno. Estos sitios pueden estar muy inflamados y contener células productoras de TNF-alfa. Los polipéptidos anti-TNF-alfa de la invención que se unen a TNF-alfa pueden neutralizar el TNF-alfa en forma local, evitando la distribución a lo largo del cuerpo completo y de este modo se limitan los efectos secundarios negativos. Los microorganismos genéticamente modificados tales como Micrococcus lactis son capaces de secretar el anticuerpo o porciones funcionales de este. Tales microorganismos modificados se pueden usar como vehículos para la producción local y liberación de anticuerpos o sus porciones funcionales en el intestino. Por medio de una cepa que produce un polipéptido anti-TNF-alfa, se puede tratar el síndrome intestinal inflamatorio.
Otro aspecto de la invención involucra la liberación de los polipéptidos anti-TNF por medio de la expresión en superficie
o la secreción de bacterias no invasivas, tales como organismos huésped Gram-positivos como Lactococcus spec usando un vector tal como se describe en el documento WO 00/23471.
Una realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente para usar en el tratamiento, prevención y/o alivio de los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención que es capaz de atravesar el ambiente gástrico sin que se inactive la sustancia.
Los ejemplos de trastornos son cualquiera que causa inflamación, que incluyen pero sin limitación, artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome intestinal inflamatorio, y esclerosis múltiple. Como es conocido por los expertos en técnica, una vez en posesión de dicho constructo de polipéptido, se puede aplicar la tecnología de la formulación para liberar una cantidad máxima polipéptido en la ubicación correcta (en el estómago, en el colon, etc.). Este procedimiento de liberación es importante para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos cuyos blancos se ubican en el sistema intestinal.
Un aspecto de la invención es un procedimiento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de un trastorno susceptible a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención que es capaz de atravesar el ambiente gástrico sin inactivarse, por la administración en forma oral a un sujeto de una polipéptido anti-TNF alfa que se describe en la presente.
Otra realización de la presente invención es un uso de un polipéptido anti-TNF-alfa que se describe en la presente para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención que es capaz de atravesar el ambiente gástrico sin inactivarse.
Un aspecto de la invención es un procedimiento para liberar un Nanocuerpo o polipéptido de la invención en el sistema intestinal sin que dicha sustancia se inactive, por la administración en forma oral a un sujeto un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente.
Un aspecto de la invención es un procedimiento para liberar un Nanocuerpo o polipéptido de la invención en el torrente sanguíneo de un sujeto sin que se inactive la sustancia, por la administración en forma oral a un sujeto un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente.
Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente para usar en el tratamiento, prevención y/o aliviar los síntomas o trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención administrado en el tracto vaginal y/o rectal.
Los ejemplos de trastornos son cualquiera que causa inflamación, que incluye pero sin limitación artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome intestinal inflamatorio, y esclerosis múltiple. En un ejemplo no limitante, una formulación de acuerdo con la invención comprende un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente, en la forma de un gel, crema, supositorio, película, o en la forma de una esponja o como un anillo vaginal que libera lentamente el ingrediente activo con el tiempo (tales formulaciones se describen en los documentos EP 707473, EP 684814, US 5629001).
Un aspecto de la invención es un procedimiento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención administrado en el tracto vaginal y/o rectal, por la administración vaginal y/o rectal a un sujeto un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente.
Otra realización de la presente invención es un uso de un polipéptido anti-TNF-alfa que se describe en la presente para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención administrado en el tracto vaginal y/o rectal.
Un aspecto de la invención es un procedimiento para liberar un Nanocuerpo o polipéptido de la invención en el tracto vaginal y/o rectal sin que dicha sustancia se inactive, por la administración en el tracto vaginal y/o rectal de un sujeto un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente.
Un aspecto de la invención es un procedimiento para liberar un Nanocuerpo o polipéptido de la invención en el torrente sanguíneo de un sujeto sin que dicha sustancia se inactive, por la administración en el tracto vaginal y/o rectal de un sujeto un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente.
Otra realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente, para usar en el tratamiento, prevención y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención administrado en la nariz, vías respiratorias superiores y/o pulmón.
Los ejemplos de trastornos son cualquiera que causa inflamación, que incluye pero sin limitación artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome intestinal inflamatorio, y esclerosis múltiple. En un ejemplo no limitante, una formulación de acuerdo con la invención, comprende un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente en la forma de un spray nasal (por ejemplo, un aerosol) o inhalador. Debido a que el constructo de polipéptido es pequeño, puede alcanzar su objetivo mucho más efectivamente que las moléculas de IgG terapéuticas.
Un aspecto de la invención es un procedimiento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención liberado en las vías respiratorias superiores y pulmón, por la administración a un sujeto de un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente, por inhalación a través de la boca o nariz.
Otra realización de la presente invención es un uso de un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención administrado en la nariz, vías respiratorias superiores y/o pulmón, sin que dicho polipéptido se inactive.
Un aspecto de la invención es un procedimiento para liberar un Nanocuerpo o polipéptido de la invención en la nariz, vías respiratorias superiores y pulmón sin inactivación, por la administración en la nariz, vías respiratorias superiores y pulmón de un sujeto un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente.
Un aspecto de la invención es un procedimiento para liberar un Nanocuerpo o polipéptido de la invención en el torrente sanguíneo de un sujeto sin inactivación por la administración en la nariz, vías respiratorias superiores y pulmón de un sujeto un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente.
Una realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente para usar en el tratamiento, prevención y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención administrado en la mucosa intestinal, en el que dicho trastorno aumenta la permeabilidad de la mucosa intestinal. Debido a su tamaño pequeño, un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente puede atravesar la mucosa intestinal y alcanzar el torrente sanguíneo más eficientemente en sujetos que sufren de los trastornos que causan un aumento en la permeabilidad de la mucosa intestinal, por ejemplo enfermedad de Crohn.
Un aspecto de la invención es un procedimiento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención administrado en la mucosa intestinal, en el que dicho trastorno aumenta la permeabilidad de la mucosa intestinal, por la administración en forma oral a un sujeto un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente.
Este proceso aun se puede mejorar adicionalmente en un aspecto adicional de la presente invención – el uso de portadores de transporte activos. En este aspecto de la invención, VHH se fusiona a un portador que aumenta la transferencia a través de la pared intestinal en el torrente sanguíneo. En un ejemplo no limitante, este "portador" es un segundo VHH que se fusiona al VHH terapéutico. Tales constructos de fusión se obtienen por medio de procedimientos conocidos en la técnica. El "portador" VHH se une específicamente a un receptor de la pared intestinal que induce una transferencia activa a través de la pared.
Otra realización de la presente invención es un uso de un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir o y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención administrado en la mucosa intestinal, en el que dicho trastorno aumenta la permeabilidad de la mucosa intestinal.
Un aspecto de la invención es un procedimiento para liberar un Nanocuerpo o polipéptido de la invención en la mucosa intestinal sin inactivarse, por la administración en forma oral a un sujeto un polipéptido anti-TNF-alfa de la invención.
Un aspecto de la invención es un procedimiento para liberar un Nanocuerpo o polipéptido de la invención en el torrente sanguíneo de un sujeto sin inactivarse, por la administración en forma oral a un sujeto un polipéptido anti-TNF-alfa de la invención.
Este proceso aun se puede mejorar adicionalmente en un aspecto adicional de la presente invención – el uso de portadores de transporte activos. En este aspecto de la invención, un polipéptido anti-TNF-alfa como se describe en la presente se fusiona a un portador que aumenta la transferencia a través de la pared intestinal en el torrente sanguíneo. En un ejemplo no limitante, este "portador" es un VHH que se fusiona a dicho polipéptido. Tales constructos de fusión se obtienen por medio de procedimientos conocidos en la técnica. El "portador" VHH se une específicamente a un receptor de la pared intestinal que induce una transferencia activa a través de la pared.
Una realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente para usar en el tratamiento, prevención y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención que es capaz de atravesar los tejidos debajo de la lengua en forma efectiva.
Los ejemplos de trastornos son cualquiera que causa inflamación, que incluye pero sin limitación artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome intestinal inflamatorio, y esclerosis múltiple. A formulación de dicho constructo de polipéptido que se describe en la presente, por ejemplo, un comprimido, spray, la gota se coloca debajo de la lengua y se adsorbe a través de las membranas mucosas en la red capilar debajo de la lengua.
Un aspecto de la invención es un procedimiento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención que es capaz de atravesar los tejidos debajo de la lengua en forma efectiva, por la administración sublingual a un sujeto un polipéptido anti-TNF alfa que se describe en la presente.
Otra realización de la presente invención es un uso de un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención que es capaz de atravesar los tejidos debajo de la lengua en forma efectiva.
Un aspecto de la invención es un procedimiento para liberar un Nanocuerpo o polipéptido de la invención a los tejidos debajo de la legua sin inactivarse, por la administración sublingual a un sujeto un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente.
Un aspecto de la invención es un procedimiento para liberar un Nanocuerpo o polipéptido de es la invención en el torrente sanguíneo de un sujeto sin inactivarse, por la administración en forma oral a un sujeto de un polipéptido antiTNF-alfa que se desvela en la presente.
Una realización de la presente invención es un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente para usar en el tratamiento, prevención y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención que es capaz de atravesar la piel en forma efectiva.
Los ejemplos de trastornos son cualquiera que causa inflamación, que incluye pero sin limitación artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome intestinal inflamatorio, y esclerosis múltiple. Una formulación de dicho constructo de polipéptido, por ejemplo, una crema, película, spray, gota, parche se coloca en la piel y pasa a través de ella.
Un aspecto de la invención es un procedimiento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención que es capaz de atravesar la piel en forma efectiva, por la administración tópica a un sujeto de un polipéptido anti-TNF-alfa que se describe en la presente.
Otra realización de la presente invención es un uso de polipéptido anti-TNF-alfa que se describe en la presente para la preparación de un medicamento para tratar, prevenir y/o aliviar los síntomas de trastornos susceptibles a la modulación por un Nanocuerpo o polipéptido de la invención que es capaz de atravesar la piel en forma efectiva.
Un aspecto de la invención es un procedimiento para liberar un Nanocuerpo o polipéptido de la invención a la piel sin inactivarse, por la administración tópica a un sujeto de un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente.
Un aspecto de la invención es un procedimiento para liberar un Nanocuerpo o polipéptido de la invención en el torrente sanguíneo de un sujeto, por la administración tópica a un sujeto de polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente.
En otra realización de la presente invención, un polipéptido anti-TNF-alfa también comprende un nanocuerpo portador (por ejemplo VHH) que actúa como un portador de transporte activo para el transporte de dicho polipéptido anti-TNF-alfa, desde el lumen pulmonar a la sangre.
Un polipéptido anti-TNF-alfa que además comprende a portador que se une específicamente a un receptor presente en la superficie de la mucosa (células epiteliales bronquiales) que produce el transporte activo del polipéptido desde el lumen pulmonar a la sangre. El nanocuerpo portador se puede fusionar al constructo de polipéptido. Tales constructos de fusión se pueden obtener mediante procedimientos conocidos en la técnica y se describen en la presente. El nanocuerpo "portador" se une específicamente a un receptor sobre la superficie de la mucosa que induce una transferencia activa a través de la superficie.
Otro aspecto de la presente invención es un procedimiento para determinar cuáles nanocuerpos (por ejemplo VHH) se transportan activamente en el torrente sanguíneo después de la administración nasal. De modo similar, una biblioteca de fago de VHH inactivo o inmune se puede administrar por vía nasal y después de diferentes puntos de tiempo después de la administración, se pueden aislar sangre u órganos para rescatar los fagos que se han trasportado activamente en el torrente sanguíneo. Un ejemplo no limitante de un receptor para el transporte activo desde el lumen pulmonar al torrente sanguíneo es el receptor de Fc (FcRn). Un aspecto de la invención incluye las moléculas de VHH identificadas por el procedimiento. Tal VHH posteriormente se puede usar como un portador VHH para la administración de un VHH terapéutico al correspondiente blanco en el torrente sanguíneo después de la administración nasal.
En un aspecto de la invención, se puede usar un polipéptido anti-TNF-alfa que se desvela en la presente, a fin de detectar agentes que modulen la unión del polipéptido a TNF-alfa. Cuando se identifican en un ensayo que mide unión o dicho desplazamiento del polipéptido solo, los agentes deberán someterse al análisis funcional para determinar si ellos pueden modular la acción del antígeno in vivo.
En un ejemplo de un experimento de desplazamiento, el fago o las células que expresan TNF-alfa o un fragmento de estas se incuban en la solución tampón de unión con el polipéptido de la invención que ha sido marcado, en presencia o ausencia de concentraciones crecientes de un modulador candidato. Para validar y calibrar el ensayo, se pueden realizar reacciones de competición control que usan concentraciones crecientes de dicho polipéptido y que están sin marcar. Después de la incubación, las células se lavan intensivamente, y se mide el polipéptido marcado unido según sea apropiado para la marca determinada (por ejemplo, contador de centelleo, fluorescencia, etc.). Una disminución de al menos 10% de la cantidad de polipéptido marcado unido en presencia de modulador candidato indica el desplazamiento de la unión por parte del modulador candidato. Se consideran que los moduladores candidatos se unen específicamente en este u otros ensayos descritos en la presente si ellos desplazan el 50% del polipéptido marcado (dosis de sub-saturación del polipéptido) a una concentración de 1 IM o menos
Alternativamente, la unión o desplazamiento de unión se puede controla por la resonancia de anión superficial (SPR). Los ensayos de resonancia de anión superficial se pueden usar como un procedimiento cuantitativo para medir la unión entre dos moléculas por el cambio de la masa cerca de sensor inmovilizado causado por la unión o pérdida de unión del polipéptido de la invención de la fase acuosa al TNF-alfa inmovilizado en una membrana sobre el sensor. Este cambio de masa se mide como unidades de resonancia versus tiempo después de la inyección o remoción de dicho polipéptido
o modulador candidato y se mide mediante un Biosensor Biacore (Biacore AB). TNF-alfase se puede inmovilizar, por ejemplo en un chip sensor (por ejemplo, chip CM5 de grado de investigación; Biacore AB) en una membrana lipídica fina de acuerdo con procedimientos descritos por Salamon et al. (Salamon et al., 1996, Biophys J. 71: 283-294; Salamon et al., 2001, Biophys. J. 80: 1557-1567; Salamon et al., 1999, Trends Biochem. Sci. 24: 213-219, cada uno de los cuales se incorpora en la presente por referencia). Sarrio et al. demostraron que la SPR se puede usar para detectar la unión del ligando al receptor de adenosina GPCR A(1) inmovilizado en una capa lipídica en el chip (Sarno et al., 2000, Mot. Célula. Biol. 20: 5164-5174, incorporado en la presente por referencia). Las condiciones para la unión de un polipéptido de la invención al TNF-alfa en un ensayo SPR pueden ser ajustadas por los expertos en la técnica mediante las condiciones informadas por Sarrio et al. como punto de partida.
El SPR puede analizar moduladores de unión de al menos dos maneras. Primero, un polipéptido de la invención se puede pre-unir al TNF-alfa inmovilizado seguido por la inyección de un modulador candidato a una concentración que varía de 0,1 nM a 1 IM El desplazamiento del polipéptido unido se puede cuantificar, lo que permite la detección de la unión del modulador. Alternativamente, el TNF-alfa unido a membrana se puede preincubar con un modulador candidato y estimular con el polipéptido de la invención. Una diferencia en la afinidad de unión entre dicho polipéptido y el TNF-alfa pre-incubado con el modulador, en comparación con la afinidad entre dicho polipéptido y TNF-alfa en ausencia del modulador demostrará la unión o desplazamiento de dicho polipéptido en presencia del modulador. En cualquier ensayo, una disminución de 10% o más en la cantidad de dicho polipéptido unido en presencia del modulador candidato, con respecto a la cantidad de dicho polipéptido unido en ausencia del modulador candidato indica que el modulador candidato inhibe la interacción de TNF-alfa y dicho polipéptido.
Otro procedimiento de detectar la inhibición de unión de, por ejemplo, un polipéptido de la invención, a TNF-alfa usa la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). FRET es un fenómeno de mecánica cuántica que ocurre entre un dador de fluorescencia (D) y un aceptor de fluorescencia (A) en estrecha proximidad entre sí (usualmente < 100 Å de separación) si el espectro de emisión de D se superpone con el espectro de excitación de A. Las moléculas para analizar, por ejemplo un polipéptido de la invención y un TNF-alfa se marcan con un par complementario de fluoróforos dador y aceptor. Mientras que están unidos estrechamente por la interacción TNF-alfa: polipéptido, la fluorescencia emitida después de la excitación del fluoróforo dador tendrá una longitud de onda diferente que la emitida en respuesta a la longitud de onda de excitación cuando dicho polipéptido y TNF-alfa no están unidos, lo que proporciona la cuantificación de las moléculas unidas versus no unidas por la medición de la intensidad de emisión en cada longitud de onda. Los fluoróforos dadores con los que se marcan el TNF-alfa son bien conocidos en la técnica, De particular interés, son las variantes de A. Victoria GFP conocido como Cyan FP (CEP, Dador (D)) y Amarillo FP (YEP, Aceptor (A)). A modo de ejemplo, la variante YFP se puede obtener como una proteína de fusión con TNF-alfa. Los vectores para la expresión de las variantes de GFP como fusiones (Clontech) así como los reactivos marcados con fluoróforo (Molecular Probes) son conocidos en la técnica. La adición de un modulador candidato a la mezcla de polipéptido marcado con fluorescencia y YFP-TNF-alfa producirá una inhibición de la transferencia de energía evidenciada, por ejemplo, por una disminución en la fluorescencia YFP con respecto a una muestra sin el modulador candidato. En un ensayos que usa FRET para la detección de la interacción de TNF-alfa: polipéptido, una disminución de 10% o mayor de la intensidad de emisión de fluorescencia en la longitud de onda del aceptor en las muestras que contiene un modulador candidato, con respecto a las muestras sin el modulador candidato, indica que el modulador candidato inhibe la interacción TNF-alfa:polipéptido.
Una muestra que se usa en la presente puede ser cualquier muestra biológica que contiene TNF-alfa tal como muestras clínicas (por ejemplo, fracciones celulares, sangre entera, plasma, suero, tejido, células, etc.), derivadas de muestras clínicas, agrícolas, forenses, investigación, u otras posibles muestras. Las muestras clínicas pueden ser de origen humano o animal. La muestra analizada puede ser de naturaleza sólida o líquida. Es evidente que cuando se usan materiales sólidos, estos primero se disuelven en una solución adecuada.
Una variación del FRET usa la inactivación de la fluorescencia para controlar las interacciones moleculares. Una molécula del par de interacción se puede marcar con un fluoróforo, y la otra con una molécula que inactiva la fluorescencia del fluoróforo cuando se colocan en estrecha aposición con esta. Un cambio de fluorescencia después de la excitación es indicativo de un cambio en la asociación de las moléculas marcados con el par fluoróforo:inactivador. Generalmente, un aumento de la fluorescencia del TNF-alfa marcado es indicativo que el polipéptido anti-TNF-alfa que porta el inactivador se ha desplazado. En los ensayos de inactivación, un aumento de 10% o mayor en la intensidad de la emisión fluorescente en las muestras que contienen un modulador candidato, con respecto a las muestras sin el modulador candidato, indica que el modulador candidato inhibe la interacción de TNF-alfa: polipéptido anti TNF-alfa.
Además de los procedimientos de resonancia de plasmón superficial y FRET, la medición de la polarización de la fluorescencia es útil para cuantificar la unión. El valor de polarización de fluorescencia para una molécula marcada con fluorescencia depende del tiempo de correlación rotacional o velocidad de giro. Los complejos, tal como los formados por TNF-alfa en asociación con un polipéptido anti-TNF-alfa marcado con fluorescencia, tienen valores de polarización más altos que el polipéptido marcado, no complejado. La inclusión de un inhibidor candidato de la interacción TNFalfa:polipéptido anti-TNF-alfa produce polarización de fluorescencia, con respecto a una mezcla del inhibidor candidato, si el inhibidor candidato altera o inhibe la interacción de TNF-alfa con dicho polipéptido. La Polarización de fluorescencia es bien adecuada para la identificación de moléculas pequeñas que alteran la formación de complejos de TNF-alfa: polipéptido anti-TNF-alfa. Una disminución de 10% o más de la polarización de fluorescencia en las muestras que contiene un modulador candidato, con respecto a la polarización de fluorescencia en una muestra que carece del modulador candidato, indica que el modulador candidato inhibe la interacción de TNF-alfa : polipéptido anti-TNF-alfa.
Otra alternativa para controlar las interacciones de TNF-alfa:polipéptido anti-TNF-alfa usa un ensayo de biosensor. Los biosensores ICS se han descrito en la técnica (Australian Membrane Biotechnology Research Institute; Cornell Li, Braach-Maksvytis V, King L, Osman P, Raguse B, Wieczorek I, y Pace R. "A biosensor that uses ion-channel switches" Nature 1997, 187, 580). En esta tecnología, la asociación de TNF-alfa y un polipéptido anti-TNF alfa se acopla al cierre de los canales iónicos facilitado por gramicidina en bicapas de membranas suspendidas y en consecuencia a un cambio medible en la admitancia (similar a impedancia) del biosensor. Este método es lineal durante seis órdenes de magnitud de cambio de admitancia y es idealmente adecuado para el análisis de alto rendimiento de gran escala de bibliotecas combinatorias de moléculas pequeñas. Un cambio de 10% o mayor (aumento o disminución) en la admitancia en una muestra que contiene un modulador candidato, con respecto a la admitancia de una muestra que carece del modulador candidato, indica que el modulador candidato inhibe la interacción de TNF-alfa y dicho polipéptido. Es importante indicar que en los ensayos que analizan la interacción de TNF-alfa con un polipéptido anti-TNF-alfa, es posible que un modulador de la interacción no deba necesariamente interactuar en forma directa con el dominio de las proteínas que interactúan físicamente con dicho polipéptido. También es posible que un modulador interactúe en una ubicación retirada del sitio de interacción y cause, por ejemplo, un cambio conformacional del TNF-alfa. Los moduladores (inhibidores o agonistas) que actúan de esta manera, sin embargo son de interés como agentes para modular la unión de TNF-alfa a su receptor.
Cualquiera de los ensayos de unión se puede usar para determinar la presencia de un agente en una muestra, por ejemplo, una muestra de tejido, que se une a TNF-alfa, o que afecta la unión de, por ejemplo, un polipéptido de la invención para el TNF-alfa. Para realizar esto un TNF-alfa se hace reaccionar con dicho polipéptido en presencia o ausencia de la muestra, y unión del polipéptido se mide según sea apropiado para ensayo de unión usado. Una disminución de 10% o más en la unión de dicho polipéptido indica que la muestra contiene un agente que modula la unión de dicho polipéptido al TNF-alfa. Obviamente, el procedimiento generalizado anteriormente se podría aplicar fácilmente al análisis de los moduladores candidatos que alteran la unión entre cualquier polipéptido anti-TNF-alfa de la invención, una secuencia homóloga de este, una porción funcional de este, una porción funcional de una secuencia homóloga de este y TNF-alfa o un fragmento de este.
Una realización de la presente invención es un agente desconocido identificado por el procedimiento desvelado en la presente.
Una realización de la presente invención es un agente desconocido identificado por el procedimiento desvelado en la presente para usar en el tratamiento, prevención y/o aliviar los síntomas de trastornos relacionados en los procesos inflamatorios.
Otra realización de la presente invención es un uso de un agente desconocido identificado por el procedimiento desvelado en la presente para usar en el tratamiento, prevención y/o aliviar los síntomas de trastornos relacionados en los procesos inflamatorios.
Los ejemplos de trastornos incluyen artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome intestinal inflamatorio y esclerosis múltiple.
Una célula que es útil de acuerdo con la invención preferentemente se selecciona del grupo que consiste en célula bacterianas tales como, por ejemplo, E. coli, células de levadura tales como, por ejemplo, S. cerevisiae, P. pastoris, células de insecto o células de mamífero.
Una célula que es útil de acuerdo con la invención puede ser cualquier célula en que se puede introducir una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que comprende un anti-TNF-alfa de la invención, una secuencia homóloga de este, una porción funcional de este o una porción funcional de una secuencia homóloga de este de acuerdo con la invención de modo que el polipéptido se exprese en niveles naturales o por encima de los niveles naturales, como se define en la presente. Preferentemente un polipéptido de la invención que se expresa en una célula exhibe farmacología normal o cerca de normal, como se define en la presente.
De acuerdo con una realización preferida de la presente invención, una célula se selecciona del grupo que consiste en células CO57, una célula CHO, una célula LM(TK-), una célula NIH-3T3, célula HEK-293, célula K-562 o una célula de astrocitoma 1321NI pero también otras líneas celulares transferibles.
En general, "cantidad terapéuticamente efectiva", "dosis terapéuticamente efectiva" y "cantidad efectiva" significa la cantidad necesaria para obtener el resultado o resultados deseados (que modula la unión de TNF-alfa; tratar o prevenir la inflamación). Los expertos en la técnica reconocerá que la potencia y en consecuencia, una "cantidad efectiva" puede variar para los diversos compuestos que modulan la unión de TNF-alfa usada en la invención. Los expertos en la técnica pueden evaluar fácilmente la potencia del compuesto.
Como se usa en la presente, el término "compuesto" se refiere a un polipéptido anti-TNF-alfa de la presente invención, una composición, o un ácido nucleico capaz de codificar dicho polipéptido o un agente identificado de acuerdo con el procedimiento de detección descrito en la presente o dicho polipéptido que comprende uno o más aminoácidos derivatizados.
Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende un material que no es biológicamente o de otro modo no deseable, es decir, el material se puede administrar a un individuo junto con el compuesto sin causar ningún efecto biológico no deseable o interactuar de manera perjudicial con ninguno de los otros componentes de la composición farmacéutica en que está contenido.
Los polipéptidos anti-TNF-alfa que se describe en la presente es útil para tratar o prevenir afecciones en un sujeto y comprende administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva de un compuesto o composición.
Los polipéptidos anti-TNF de la presente invención son útiles para tratar o prevenir afecciones relacionados con artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome intestinal inflamatorio y esclerosis múltiple en un sujeto y comprende administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva de un compuesto o composición que se une a TNFalfa.
Los polipéptidos anti-TNF-alfa que se desvelan en la presente son útiles para tratar o prevenir afecciones en un sujeto y comprende administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva de una combinación del compuesto con otro, tal como, por ejemplo, aspirina.
Los polipéptidos anti-TNF-alfa que se desvelan en la presente son útiles para tratar o prevenir afecciones relacionadas a artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome intestinal inflamatorio y esclerosis múltiple en un sujeto y comprende administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva de una combinación del compuesto con otro, tal como, por ejemplo, aspirina.
La presente invención no se limita a la administración de formulaciones que comprenden un compuesto único de la invención. Está dentro del alcance de la invención proporcionar los tratamientos de combinación en que una formulación se administra a un paciente que lo necesita que comprende más de un compuesto de la invención.
Las afecciones mediadas por TNF-alfa incluyen, pero sin limitación artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome intestinal inflamatorio y esclerosis múltiple.
Un compuesto útil en la presente invención se puede formular como composiciones farmacéuticas y administrar a un huésped mamífero, tal como un paciente humano o un animal doméstico en una variedad de formas adaptadas para la vía de administración elegida, es decir, en forma oral o parenteral, por vías intranasal por inhalación, intravenosa, intramuscular, tópica o subcutánea.
Un compuesto de la presente invención también se puede administrar mediante procedimientos de administración de la terapia génica. Ver, por ejemplo, Patente U.S. Núm. 5.399.346, que se incorpora por referencia en su totalidad. Mediante un procedimiento de administración de la terapia génica, las células primarias transfectadas con el gen para el compuesto de la presente invención adicionalmente se puede transfectar con promotores específicos del tejido para los órganos, tejido, injertos, tumores, o células blanco específicos.
En consecuencia, los presentes compuestos se pueden administrar sistémicamente, por ejemplo, en forma oral, en
combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable tal como un diluyente inerte o un portador comestible asimilable. Estos se pueden encapsular en cápsulas de gelatina de cubierta dura o blanda, se pueden comprimir en comprimidos, o se pueden incorporan directamente con el alimento de la dieta del paciente. Para la administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede combinar con uno o más excipientes y usados en la forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, pastillas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares.
Tales composiciones y preparaciones se deben contener al menos 0,1% de compuesto activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones, obviamente, se puede variar y puede estar convenientemente entre aproximadamente 2 a aproximadamente 60% del peso de una forma de dosis unitaria dada. La cantidad del compuesto activo en tal composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá un nivel de dosis efectivo.
Los comprimidos, pastillas, píldoras, cápsulas, y similares también pueden contener los siguientes: aglutinantes tales como goma de tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; un agente desintegrante tal como almidón de maíz, almidón de papa, ácido algínico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; y se puede añadir un agente edulcorante tal como sacarosa, fructosa, lactosa o aspártamo o un agente saborizante tal como menta, aceite de gaulteria, o cereza. Cuando la forma de dosis unitaria es una cápsula, puede contener además de los materiales del tipo anterior, un portador líquido, tal como un aceite vegetal o un polietilenglicol. Otros diversos materiales pueden estar presentes como cubiertas o modificar de otro modo la forma física de la forma de dosis unitaria sólida. Por ejemplo, los comprimidos, pastillas, o cápsulas se pueden recubrir con gelatina, cera, goma laca o azúcar y similares. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa o fructosa como un agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante y saborizante tal como sabor de cereza o naranja. Obviamente, cualquier material usado para preparar cualquier forma de dosis unitaria debe ser farmacéuticamente aceptable y sustancialmente no tóxico en las cantidades empleadas. Además, el compuesto activo se puede incorporar en preparaciones y dispositivos de liberación sostenida.
El compuesto activo también se puede administrar por vía intravenosa o intraperitoneal por infusión o inyección. Las soluciones del compuesto activo o sus sales se pueden preparar en agua, opcionalmente mezclar con un tensioactivo no tóxico. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos, triacetina, y sus mezclas y en aceites. En las condiciones de conservación y uso ordinarias, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.
Las formas de dosis farmacéuticas adecuadas para la inyección o infusión pueden incluir soluciones o dispersiones acuosas estériles o polvos estériles que comprenden el ingrediente activo que se adaptan para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles inyectables o infusibles, opcionalmente encapsuladas en liposomas. En todos los casos, la última forma de dosis debe ser estéril, fluida y estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento. El portador o vehículo líquido puede ser un solvente o medio de dispersión líquido que comprende, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicoles líquidos, y a similares), aceites vegetales, ésteres de glicerilo no tóxicos, y sus mezclas adecuadas. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, por la formación de liposomas, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones o por el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede producir por varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, tampones o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede producir por el uso de las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se preparan por la incorporación del compuesto activo en la cantidad requerida en el disolvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido por esterilización con filtro. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferidos son las técnicas de secado al vacío y liofilizado, que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente activo adicional presente en las soluciones filtradas en forma estéril previamente.
Para la administración tópica, el presente compuesto se puede aplicar en forma pura, es decir, cuando son líquidos. Sin embargo, en general será conveniente administrarlos a la piel como composiciones o formulaciones, en combinación con un portador dermatológicamente aceptable, que puede ser sólido o líquido.
Los portadores sólidos útiles incluyen sólidos finamente divididos tales como talco, arcilla, celulosa microcristalina, sílice, alúmina y similares. Los portadores líquidos útiles incluyen agua, hidroxiaquilos o glicoles o mezclas de aguaalcohol/glicol, en que el presente compuesto se puede disolver o dispersar en niveles efectivos, opcionalmente con la ayuda de tensioactivos no tóxicos. Los adyuvantes tales como fragancias y agentes antimicrobianos adicionales se pueden añadir para optimizar las propiedades para un uso determinado. Las composiciones líquidas resultantes se pueden aplicar en parches absorbentes, usados para impregnar vendas y otros apósitos o rociar sobre el área afectada mediante el uso de rociadores tipo bomba o aerosol.
También se pueden emplear espesantes tales como polímeros sintéticos, ácidos grasos, sales y ésteres de ácido graso, alcoholes grasos, celulosas modificadas o materiales minerales modificados con portadores líquidos para formar pastas untables, geles, ungüentos, jabones y similares, para la aplicación directa en la piel del usuario.
Los ejemplos de composiciones dermatológicas útiles que se pueden usar para administrar el compuesto en la piel son conocidas en la técnica; por ejemplo, ver Jacquet et al. (Patente U.S. Núm. 4.608.392), Geria (Patente U.S. Núm. 4.992.478), Smith et al. (Patente U.S. Núm. 4.559.157) y Wortzman (Patente U.S. Núm. 4.820.508).
Las dosis útiles para el compuesto de la invención se pueden determinar por la comparación de su actividad in vitro, y actividad in vivo en los modelos animales. Los procedimientos para la extrapolación de dosis efectivas en ratones, y otros, a seres humanos son conocidos en la técnica; por ejemplo, ver Patente U.S. Núm. 4.938.949.
Generalmente, la concentración de los compuestos en una composición líquida, tal como una loción, será de aproximadamente 0,1-25% en peso, preferentemente de aproximadamente 0,5-10% en peso. La concentración de una composición semisólida o sólida tal como un gel o un polvo será de aproximadamente 0,1-5% en peso, preferentemente aproximadamente 0,5-2,5% en peso.
La cantidad del compuesto, o una sal activa o derivado de esta, necesaria para usar en el tratamiento variará no solo con la sal particular seleccionada sino también con la vía de administración, la naturaleza de la afección que se trata y la edad y condición del paciente y finalmente será según el criterio del médico o clínico asistente. Asimismo la dosificación del compuesto varía de acuerdo con la célula, tumor, tejido, injerto u órgano.
La dosis deseada se puede presentar de modo conveniente en una dosis única o como dosis divididas administradas en intervalos apropiados, por ejemplo, como dos, tres, cuatro o más sub-dosis por día. La sub-dosis misma también se puede dividir adicionalmente, por ejemplo, en numerosas administraciones diferenciadas espaciadas libremente; tal como inhalaciones múltiples de un insuflador o por aplicación de una pluralidad de gotas en el ojo.
Un régimen de administración puede incluir tratamiento diario a largo plazo. Por "largo plazo" se entiende al menos dos semanas y preferentemente, varias semanas, meses o años de duración. Las modificaciones necesarias en este rango deseado pueden ser determinadas por los expertos en la técnica mediante solo experimentación de rutina dadas las enseñanzas de la presente. Ver Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. La dosis también puede ser ajustada por el médico en forma individual en el caso de alguna complicación.
La invención proporciona un agente que es un modulador de las interacciones TNF-alfa/receptor de TNF-alfa.
El agente candidato puede ser un agente sintético, o una mezcla de agentes o puede ser un producto natural (por ejemplo, un extracto de planta o un sobrenadante de cultivo). Un agente candidato de acuerdo con la invención incluye una pequeña molécula que se puede sintetizar, un extracto natural, péptidos, proteínas, carbohidratos, lípidos, etc.
Se pueden seleccionar agentes moduladores candidatos de bibliotecas grandes de agentes sintéticos o naturales. Actualmente se usan numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de los agentes basados en sacáridos, péptidos y ácidos nucleicos. Las bibliotecas del agente sintético están disponibles en el comercio en numerosas compañías que incluyen Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NFU), y Microsource (New Milford, CT). Una biblioteca química rara está disponible en Aldrich (Milwaukee, WI). Las bibliotecas combinatorias están disponibles y se pueden preparar. Alternativamente, las bibliotecas de agentes naturales en la forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales están disponibles en por ejemplo, Pan Laboratories (Bothell, WA) o MycoSearch (NC), o se pueden producir fácilmente por los procedimientos bien conocidos en la técnica. En forma adicional, las bibliotecas y agentes naturales y producidos sintéticamente se modifican fácilmente a través de medios químicos, físicos y bioquímicos convencionales.
Se pueden hallar agentes útiles en numerosas clases químicas. Los agentes útiles pueden ser agentes orgánicos, o agentes orgánicos pequeños. Los agentes orgánicos pequeños tienen un peso molecular de más de 50, aún menos de aproximadamente 2.500 dalton, preferentemente menos de aproximadamente 750, más preferentemente menos de aproximadamente 350 dalton. Las clases de ejemplos incluyen heterociclos, péptidos, sacáridos, esteroides, y similares. Los agentes se pueden modificar para aumentar la eficacia, estabilidad, compatibilidad farmacéutica, y similares. La identificación estructural de un agente se puede usar para identificar, generar o analizar agentes adicionales. Por ejemplo, cuando se identifican agentes peptídicos, se pueden modificar de una variedad de maneras para aumentar su estabilidad, tal como el uso de aminoácido no natural, tal como un D-aminoácido, particularmente D-alanina, por la funcionalización del extremo terminal amino o carboxílico, por ejemplo para el grupo amino, acilación o alquilación, y para el grupo carboxilo, esterificación o amidificación, o similares.
Para la detección primaria, una concentración útil de un agente candidato de acuerdo con la invención es de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 100 IM o ás (es decir 1 mM, 10 mM, 100 mM, 1 M etc.). La
mconcentración de análisis primaria se usará como un límite superior, junto con nueve concentraciones adicionales, en que se determinan las concentraciones adicionales por la reducción de la concentración de análisis primario en intervalos semilog (por ejemplo, para 9 concentraciones más) para las pruebas secundarias o para generar las curvas de concentración.
Un kit de detección de alto rendimiento de acuerdo con la invención comprende todos los medios necesarios y medios para realizar la detección de un agente que modula las interacciones de TNF-alfa/receptor de TNF-alfa por la interacción con TNF-alfa en presencia de un polipéptido, preferentemente a una concentración en el rango de 1IM a 1 M
El kit comprende lo siguiente. Las células recombinantes de la invención, que comprende y expresa la secuencia de nucleótidos que codifica TNF-alfa, que se cultivan de acuerdo con el kit sobre un soporte sólido, tal como una placa de microtitulación, más preferentemente una placa de microtitulación de 96 pocillos, de acuerdo con procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica en especial como se describe en el documento WO 00/02045. Alternativamente se suministra TNF-alfa en una forma purificada para ser inmovilizada sobre, por ejemplo, una placa de microtitulación de 96 pocillos por los expertos en la técnica. Alternativamente se suministra TNF-alfa en el kit pre-inmovilizado sobre, por ejemplo, una placa de microtitulación de 96 pocillos. The TNF-alfa puede el TNF-alfa completo o un fragmento de este.
Los agentes moduladores de acuerdo con la invención, a concentraciones de aproximadamente 1 IM a 1 mM o más, se añaden a los pocillos definidos en presencia de una concentración apropiada del polipéptido anti-TNF-alfa, una secuencia homóloga de este, una porción funcional de este o una porción funcional de una secuencia homóloga de este, dicha concentración de dicho polipéptido preferentemente en el rango de 1 IM a 1 mM .os kits pueden Rontener uno o más polipéptidos anti-TNF-alfa de la invención.
Los ensayos de unión se realizan de acuerdo con los procedimientos ya desvelados en la presente y los resultados se compran con el nivel basal de por ejemplo TNF-alfa de unión a un polipéptido anti-TNF-alfa, una secuencia homóloga de este, una porción funcional de este o una porción funcional de una secuencia homóloga de este, pero en ausencia de agente modulador agente añadido. Los pocillos que muestran al menos 2 veces, preferentemente 5 veces, más preferentemente 10 veces y con máxima preferencia a 100 veces o más aumento o disminución de la unión al polipéptido de TNF-alfa (por ejemplo) en comparación con el nivel de actividad en ausencia de modulador, se seleccionan para el análisis adicional.
La invención proporciona otros kit útiles para analizar para moduladores de la unión del TNF-alfa- receptor de TNF-alfa, así como kits útiles para el diagnóstico de los trastornos caracterizados por la disfunción de TNF-alfa. La invención también proporciona kits útiles para analizar moduladores de los trastornos así como kits para su diagnóstico, dichos trastornos caracterizados por uno o más procesos que involucran TNF-alfa. Los kits útiles de acuerdo con la invención pueden incluir un TNF-alfa aislado. Alternativamente, o además, un kit puede comprender células transformadas para expresar TNF-alfa. En una realización adicional, un kit de acuerdo con la invención puede comprender un polinucleótido que codifica TNF-alfa. En otra realización adicional, un kit de acuerdo con la invención puede comprender los cebadores específicos para la amplificación de TNF-alfa. Los kits útiles de acuerdo con la invención pueden comprender un polipéptido TNF-alfa aislado, un homólogo a este, o una porción funcional de este. Un kit de acuerdo con la invención puede comprender las células transformadas para expresar dicho polipéptido. Los kits pueden contener más de un polipéptido. En una realización adicional, un kit de acuerdo con la invención puede comprender un polinucleótido que codifica TNF-alfa. En una realización aún adicional, un kit de acuerdo con la invención puede comprender los cebadores específicos útiles para la amplificación de una macromolécula tal como, por ejemplo, TNF-alfa. Todos los kits de acuerdo con la invención comprenderán los artículos o combinaciones de artículos indicados y materiales de envase. Los kits también incluirán instrucciones para el uso.
La invención se describirá a continuación por medio de los siguiente ejemplos y figuras no limitantes, en que las Figuras muestran:
Nanocuerpos TNF-d monovalentes
Figura 1: Alineamiento de secuencias de nanocuerpos TNF-d humanos
Figura 2: Alineamiento de secuencias de nanocuerpos TNF-d espeRíficos para albúmina sérica
Figura 3: Unión de nanocuerpos TNF-d espeRíficos para albúmina sérica a albúmina sérica humana
Figura 4: Unión de nanocuerpos TNF-d espeRíficos para albúmina sérica a albúmina sérica de rhesus
Figura 5: Unión de nanocuerpos TNF-d espeRíficos para albúmina sérica a albúmina sérica de ratón
Figura 6: Pureza de TNF-d y nanocuerpos de albúmina sérica (SDS-PAGE)
Figura 7: Análisis de transferencia Western de TNF-d y nanoRuerpos de albúmina sérica
Figura 8: Unión de nanocuerpos de TNF-d a TNF-d humano (E.ISl)
Figura 9: Unión de nanocuerpos de TNF-d a TNF-d de rhesus (E.ISl)
Figura 10: Ensayo de inhibición del receptor sobre Enbrel TNF-d humano
Figura 11: Ensayo de inhibición del receptor sobre Enbrel TNF-d de rhesus
Figura 12: Unión de de nanocuerpos de TNF-d a TNF-d humano TNFo (BiaRore)
Figura 13: Unión de nanocuerpos de TNF-d a TNF-d de rhesus (BiaRore)
Figura 14: Unión de nanocuerpos de TNF-d a la Proteína A (Biacore)
Figura 15: Tratamiento de temperatura de TNF-d y nanoRuerpos de albúmina sérica (transferencia de Western)
Figura 16: Estabilidad: tratamiento de temperatura de nanocuerpos de TNF-d (E.ISl)
Figura 17: Tratamiento de temperatura de nanocuerpos de albúmina sérica (Biacore) Nanocuerpos de TNF-d bivalentes Figura 18: Pureza de nanocuerpos de TNF-d bivalentes (SOS-PAGE) Figura 19: Análisis de transferencia Western de nanocuerpos de TNF-d bivalentes Figura 20: Ensayo de inhibición del receptor sobre Enbrel para nanocuerpos de TNF-d bivalentes Figura 21: Estabilidad: tratamiento de temperatura de nanocuerpos de TNF-d bivalentes (E.ISl) Nanocuerpos de TNF-d monovalentes humanizados Figura 22: Alineamiento de secuencias múltiple de nanocuerpos humanizados TNF1, que son nanocuerpos de acuerdo
con la invención Figura 23: Alineamiento de secuencias múltiple de nanocuerpos humanizados TNF2. Figura 24: Alineamiento de secuencias múltiple de nanocuerpos humanizados TNF3 Figura 25: Alineamiento de secuencias múltiple de nanocuerpos humanizados ALB1 Figura 26: Pureza de TNF-d humanizado y nanoRuerpos de albúmina sérica (SDS-PAGE) Figura 27: Análisis de transferencia Western de TNF-d humanizado y nanoRuerpos de albúmina sérica Figura 28: Unión de nanocuerpos TNF-d humanizados a TNF-d humano Figura 29: Unión de nanocuerpos de albúmina sérica humanizada a albúmina sérica humana Figura 30: Estabilidad: tratamiento de temperatura de nanocuerpos TNF-d humanizados (E.ISl) Nanocuerpos TNF-d trivalentes Figura 31: Pureza de nanocuerpos de TNF-d trivalentes (SDS-PAGE) Figura 32: Análisis de transferencia Western de nanocuerpos de TNF-d trivalentes Figura 33: Estabilidad: tratamiento de temperatura de nanocuerpos de TNF-d trivalentes Nanocuerpos de TNF-d monovalentes humanizados (segunda ronda) Figura 34: Alineamiento de secuencias múltiple de nanocuerpos humanizados TNF1, que son nanocuerpos de acuerdo
con la invención Figura 35: Alineamiento de secuencias múltiple de nanocuerpos humanizados TNF2 Figura 36: Alineamiento de secuencias múltiple de nanocuerpos humanizados TNF3 Figura 37: Alineamiento de secuencias múltiple de nanocuerpos humanizados ALB1 Figura 38: Pureza de nanocuerpos TNF-d humanizados (SOS-PAGE) Figura 39: Análisis de transferencia Western de nanocuerpos TNF-d humanizados Figura 40: Unión de nanocuerpos TNF-d humanizados a TNF-d humano Figura 41: Estabilidad: tratamiento de temperatura de nanocuerpos TNF-d humanizados (E.ISA) Figura 42: Análisis de TNF60 purificado en gel de SDS-PAGE teñido con plata (A) y gel SDS-PAGE teñido con
Coomasie (B) y en el análisis de transferencia western usando anti-NB (C) para la detección Figura 43: Cromatograma de exclusión por tamaño analítico de TNF60 en Superdex HR75 Figura 44: Unión de TNF60 a TNF-alfa humano Figura 45: Curva de dosis respuesta obtenida en el ensayo de citotoxicidad con TNF-alfa humano usando
NanocuerpoTM TNF60 en comparación con Enbrel (Etanercept), Humira (Adalimumab) y Remicade (Infliximab) Figura 46: Curva de dosis respuesta obtenida en el ensayo de citotoxicidad con TNF-d de rhesus using NanobodyTM TNF60 en comparación con Enbrel (Etanercept), Humira (Adalimumab) y Remicade (Infliximab)
Figura 47: Perfil farmacocinético de TNF60 en ratones Figura 48: Perfil de inmunogenicidad de TNF6O en ratones Figura 49: Análisis de TNF56-PEG40, TNF56-PEG60, TNF56-biotine, TNF55-PEG40, TNF55-PEG60 y TNF55-biotina
purificados en gel SDS-PAGE teñido con Coomasie
Figura 50: Análisis de TNF56-PEG40 purificado en gel de SDS-PAGE con tinción de plata (A) tinción Coomassie (B) y
análisis de transferencia Western usando anti-NB (C) para detección
Figura 51: Cromatograma de exclusión por tamaño analítico de TNF56-PEG40 en Superdex HR 75
Figura 52: Cromatograma de exclusión por tamaño analítico de TNF56-PEG40 en Superdex HR 200
Figura 53: Curva de dosis respuesta obtenida en el ensayo de citotoxicidad con TNF-d humano usando NanobodyTM
TNF56-PEG40 y el NanobodyTM TNF1 tipo salvaje monovalente en comparación con Enbrel (Etanercept), Humira
(Adalimumab) y Remicade (Infliximab) Figura 54: Curva de dosis respuesta obtenida en el ensayo de citotoxicidad con TNF-d de rhesus usando NanobodyTM TNF56-PEG40 en comparación con Enbrel (Etanercept), Humira (Adalimumab) y Remicade (Infliximab)
Figura 55: Análisis farmacocinético de NanobodyTM TNF56-PEG40 y TNF56-PEG60 pegilado bivalente después de la
administración intravenosa en los ratones Figura 56: Análisis farmacocinético de NanobodyTM 3E-3E-PEG20 pegilado bivalente, NanobodyTM 3E-3E-PEG40 pegilado bivalente y NanobodyTM 3E-3E-AR1 biespecífico después de la administración intravenosa en los ratones
Figura 57: Perfil de inmunogenicidad de TNF56-PEG40 y TNF56-PEG60 en los ratones
Figura 58: Eficacia de TNF60 en la prevención de poliartritis crónica en los ratones
Figura 59: Eficacia de TNF60 en el tratamiento terapéutico de la poliartritis crónica en los ratones
Figura 60: Efecto del formateo de TNF60 NanobodyTM sobre la eficacia en la prevención de poliartritis crónica en los
ratones Figura 61: Alineamiento de secuencias de NanocuerposTM PMP1C2, 3E, 1A y 3G Figura 62: Modelo molecular de TNF-60 Las tablas anexas forman una parte integrante de la presente memoria descriptiva y son las siguientes: Nanocuerpos TNF-d monovalentes Tabla 8; Listado de secuencias de los nanocuerpos TNF-d Tabla 9: Valores de Koff de los nanocuerpos TNF-d humanos Tabla 10: Homología de TNF-d y nanoRuerpos de albúmina sérica para las secuencias de línea germinal humana Tabla 11: Niveles de expresión de TNF-d y nanoRuerpos de albúmina sérica Tabla 12: ELISA de unión a TNF-d humano y rhesus Tabla 13: Ensayo de inhibición del receptor de los nanocuerpos TNF-d Tabla 14: Análisis Biacore de los nanocuerpos TNF-d Tabla 15: Unión de nanocuerpos TNF-d a TNF-d (valores de KD) Tabla 16: Potencia de los nanocuerpos de TNF-d para neutralizar TNF-d humano (a) y rhesus (b) Tabla 17: DO 280 nm de TNF-d y nanoRuerpos de albúmina sérica después del tratamiento de temperatura Tabla 18: Potencia de nanocuerpos de TNF-d después del tratamiento de temperatura Nanocuerpos de TNF-d bivalentes Tabla 19: Listado de secuencias de nanocuerpos de TNF-d bivalentes y seRuenRias ligadoras Tabla 20: Constructos del nanocuerpo TNF-d bivalentes
Tabla 21: Niveles de expresión de nanocuerpos de TNF-d bivalentes Tabla 22: Ensayo de inhibición del receptor de nanocuerpos de TNF-d bivalentes Tabla 23: Potencia de nanocuerpos TNF-d para neutralizar TNF-d humano (a) y rhesus (b) Tabla 24: DO 280 nm de nanocuerpos de TNF-d bivalentes Nanocuerpos TNF-d monovalentes humanizados Tabla 25: Listado de secuencias de nanocuerpos de TNF-d monovalentes humanizados y albúmina sérica Tabla 26: Niveles de expresión de nanocuerpos de TNF-d humanizados y albúmina sérica Tabla 27: Potencia de nanocuerpos TNF-d para neutralizar TNF-d humano Tabla 28: DO 280 nm de nanocuerpos de TNF-d humanizados y albúmina sérica Nanocuerpos de TNF-d trivalentes Tabla 29: Listado de secuencias de nanocuerpos TNF-d trivalentes Tabla 30: Constructos de nanocuerpos TNF-d trivalentes Tabla 31: Niveles de expresión de nanocuerpos TNF-d trivalentes Tabla 32: Potencia de nanocuerpos TNF-d trivalentes Para neutralizar TNF-d humano Tabla 33: Unión de nanocuerpos trivalentes a albúmina sérica (valores de KD) Tabla 34: DO 280 nm de nanocuerpos TNF-d trivalentes Nanocuerpos TNF-d monovalentes humanizados (segunda ronda) Tabla 35: Listado de secuencias de nanocuerpos TNF-d monovalentes humanizados de segunda ronda Tabla 36: Niveles de expresión de nanocuerpos TNF-d humanizados Tabla 37: Potencia de nanocuerpos de TNF-d para neutralizar TNF-d humano Tabla 38: DO 280 nm de nanocuerpos TNF-d humanizados Tabla 39: Comparación de bioactividad de los nanocuerpos Tablas adicionales Tabla 40: Panorama general de oligonucleótidos usados en el formateado de NanocuerposTM trivalentes Tabla 41: Panorama general de oligonucleótidos usados en la clonación de NanocuerposTM trivalentes Tabla 42: Valores de EC50 obtenidos en el ensayo de citotoxicidad usando NanocuerposTM trivalentes TNF6O en
comparación con los controles comerciales (Enbrel, Remicade, Humira) Tabla 43: Determinación de afinidad de TNF64 y TNF24 sobre albúmina sérica humana en Biacore. ND, no determinado. Tabla 44: Panorama general de oligonucleótidos usados en el formateado de NanobodiesTM bivalentes Tabla 45: Valores de EC50 obtenidos en el ensayo de citotoxicidad usando NanobodiesTM bivalentes en comparación
con los controles comerciales (Enbrel, Remicade, Humira) Tabla 46: Resultados de los estudios de fibroblastos derivados sinoviales Tabla 47: Resultados de los estudios de bolsa de aire murinos
EJEMPLOS Ejemplo 1: Identificación de nanocuerpos específicos para TNF-a y albúmina sérica
Los nanocuerpos antagonistas se identificaron mediante dos llamas (Llama glama) inmunizadas con TNF-d humano Ron 6 inyecciones de 100 μg de la citoquina en intervalos semanales. La detección se realizó mediante un ensayo basado en competición, en que se analizaron los nanocuerpos individuales en cuanto a su capacidad para inhibir la unión de TNF-d marRado a su reReptor .os nanoRuerpos espeRíficos de albúmina se identificaron en una llama inmunizada con albúmina sérica humana. La detección de los los nanocuerpos individuales se realizó por ELISA usando albúmina humana,
rhesus y de ratón, que produce un panel de nanocuerpos que reaccionan en forma cruzada con la albúmina sérica de varias especies.
Ejemplo 2: Análisis de secuencia de nanocuerpos aislados
Se identificaron diferentes clases de nanocuerpos sobre la base del análisis de secuencia (Figura 1) por medio de una matriz de puntuación BLOSUM62 y valor límite de significancia de semejanza de � 60%;
Clase I (PMP1 C2, PMP1 G11, PMP1 H6), Clase II (PMP1 G5, PMP1 H2, PMP3 G2), Clase IIb (PMP1 D2), Clase III (PMP3 D10, PMP5 F10). La Tabla 8 lista las secuencias de estos nanocuerpos de TNF-d (SEQ IO NOs: 52 a 60)
Sobre la base del análisis de secuencia (Figura 2) se identificaron diferente clases de nanocuerpos de albúmina sérica por medio de una matriz de puntuación BLOSUM62 y un valor límite de significancia de semejanza de� 60% .a Tabla 8 lista las secuencias de estos nanocuerpos de albúmina sérica (SEQ ID NOs: 61 a 67).
Ejemplo 3: Análisis Biacore
TNF-
Unión de nanocuerpos a TNF-d se RaraRterizó por resonancia del plasmón superficial en un instrumento Biacore 3000, El TNF de diferentes especies se unió en forma covalente a la superficie de los chips sensores CM5 por medio del acoplamiento de amina hasta que se alcanzó un aumento de 250 unidades de respuesta. Los grupos reactivos restantes se inactivaron. Se evaluó la unión del nanocuerpo a una concentración (diluido 1 en 1.000). Cada nanocuerpo se inyectó durante 4 minutos a una velocidad de flujo de 45 Il/min para permitir la unión al antígeno unido al chip. La solución tampón de unión sin nanocuerpo se envió sobre el chip a la misma velocidad de flujo para permitir la disociación espontánea del nanocuerpo unido durante 4 horas. Los valores Koff se calcularon a partir de los sensogramas obtenidos para los diferentes nanocuerpos.
De cada clase de nanocuerpos, se analizaron las proteínas no purificadas en el Biacore. Los datos de Koff se listan en la Tabla 9.
Los nanocuerpos representativos de cada clase se retuvieron para el análisis posterior sobre la base del valor de Koff. Para la Clase I, se seleccionó PMP1C2 (TNF1); PAMPIG5 (TNF2) se seleccionó como representante de la Clase II; PMP5F10 (TNF3) se seleccionó como representante de la Clase III.
Albúmina sérica
La unión se analizó como se describió anteriormente excepto que se usó una dilución de 1 en 20. Las Figuras 3, 4 y 5 ilustran el análisis de los nanocuerpos TNF-d espeRíficos de albúmina versus albúmina sérica humana, rhesus y de ratón mediante el uso de proteína no purificada.
Los anticuerpos se clasificaron de acuerdo con los valores de Koff, de la siguiente Tabla:
Los mejores Koff se obtuvieron para los miembros de la familia C y familia B. También se observó reactividad cruzada entre albúmina sérica humana, rhesus y de ratón para los miembros de estas familias. Un nanocuerpo representativo de clase B y C se definió para el análisis posterior: PMP6A6 (ALB1) se seleccionó como representante de Clase B y PMP6AS (ALB2) se seleccionó como representante de Clase C.
Ejemplo 4: Clonación de nanocuerpos monovalente en pAX051 Descripción del vector de expresión de Escherichia coli
El pAX051 es un derivado de pUC19. Contiene el promotor LacZ que permite una inducción controlada de la expresión mediante IPTG. El vector tiene un gen de resistencia para ampicilina o carbenicilina. Los sitios de multiclonación albergan varios sitios de restricción de los cuales SfII y y BstTII se usan con frecuencia para la clonación de NanobodiesTM. En el marco con la secuencia codificadora NB el vector codifica una marca c-myc C-terminal y una marca (His)6. El péptido señal es la secuencia líder gen3 que transloca el NanobodyTM expresado en el periplasma.
El ADN que codifica los nanocuerpos seleccionados TNF1 (PMP1C2), TNF2 (PMP1G5), TNF3 (PMPF10), ALB1 (PMP6A6) y ALB2 (PMP6A8) se clonó en pAX051 y el constructo se transformó en las células electrocompetentes TGI. Los clones se analizaron por inserto de PCR y la secuencia de nucleótidos se determinó a partir de 4 clones positivos. Los patrones de glicerol se preparon a partir de los clones que contienen la secuencia correcta y se conservaron a 80ºC.
Ejemplo 5: Expresión de nanocuerpos monovalentes
Un precultivo se inició por la inoculación de una colonia única del clone que expresa los nanocuerpos respectivos a 37°C en caldo Luria, ampicilina/carbenicilina (100 Ig/ml) y 2% de gluRosa durante la noRhe Este preRultivo se usó para inocular. El inóculo es 1% por ciento (v/v) del cultivo de producción (medio TB + ampicilina/carbenicilina + 0,1% de glucosa). El cultivo de producción se incuba a 37°C hasta alcanzar una DO de 600 nm de 5-10 y se induce la expresión de nanocuerpos por la adición de IPTG (1 mM de concentración final). La expresión de proteína se deja continuar durante 4 h a 37°C o durante toda la noche a 28°C, en este momento se recolectan las células por centrifugación y se conservan como pasta celular húmeda a -20°C.
Los extractos periplásmicos preparativos de la pasta celular húmeda conservada a -20°C se obtienen por la resuspensión del pellet en solución tampón Peri (50 mM de NaH2PO4, 300 mM de NaCl, pH ajustado a 8,0), se hace girar la mezcla durante 30 minutos a 4°C y se centrifuga la mezcla mediante una centrífuga preparativa (Sorvall RC-3C Plus con rotor H-6000A) para sedimentar las células. Se recolecta el sobrenadante que representa un extracto aproximado del espacio periplásmico para la purificación posterior.
Los nanocuerpos marcados con His(6) se purifican por cromatografía de afinidad en metal inmovilizado (IMAC). La resina TALON (Clontech) se procesa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los extractos se incuban con la resina durante 30 min a RT sobre un rotador. La resina se lava con PBS y se transfiere a una columna. La resina empaquetada se lava con 15 mM de imidazol. Los nanocuerpos se eluyen de la columna por medio de 150 mM de imidazol. Las fracciones eluídas se analizan por siembra en la membrana Hybond y visualización con Ponceau. Las fracciones que contienen proteína se mezclan y dializan contra PBS. Las proteínas dializadas se recolectan, filtran, esterilizan, se determina la concentración y se conservan en alícuotas a -20°C.
Caracterización de nanocuerpos TNF-a monovalentes
Ejemplo 6: Homología con secuencias de línea germinal humana
Las secuencias de aminoácidos del nanocuerpo se compararon con las secuencias de línea germinal humana como se representa en la Tabla 10. En el orden de homología con las secuencias humanas, los nanocuerpos se clasifican de la siguiente manera: TNF1 > TNF2 > TNF3 para los nanocuerpos TNF-d; l.B1 > l.B2 para los nanoRuerpos de albúmina sérica.
Ejemplo 7: Nivel de expresión
Se calcularon los niveles de expresión y se representaron en la Tabla 11. En orden de rendimiento, los nanocuerpos se clasifican de la siguiente manera: TNF1>TNF2>TNF3 para los nanocuerpos TNF-d; l.B1 > l.B2 para los nanoRuerpos de albúmina sérica.
Ejemplo 8: Análisis de SDS-PAGE
Para determinar la pureza, se analizaron las muestras de proteína en gel SDS-PAGE 15%. Se añadieron 10Il de solución tampón de muestra Laemmli a 10Il (1 Ig) de proteína purificada, la muestra se calentó durante 10 minutos a 95°C, se enfrió y cargó en un gel SDS-PAGE 15%. El gel se procesó de acuerdo con procedimientos generales y se tiñço con azul de Coomassie Brilliant (CBB). La Figura 6
representa el SDS-PAGE para los nanocuerpo específicos de TNF-d y específicos de albúmina sérica.
Ejemplo 9: Análisis de transferencia Western
Se cargaron 100 ng de proteína purificada en el gel. Después del SDS-PAGE, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa por medio de Mini Trans-Blot® Electrophoretic Transfer Cell (Biorad). La membrana se bloqueó durante toda la noche en PBS, 1% de caseína a 4°C.
Como todos los constructos se fusionaron a la marca c-Myc, se usó el anticuerpo monoclonal anti-myc como una herramienta de detección. Además, el anti-nanocuerpo policlonal de conejo (R.23) se usó como herramienta de detección. La transferencia se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación en anticuerpo antimyc diluido 1/2000 en PBS o anticuerpo anti-nanocuerpo 1/2000 diluido en PBS, 1% de caseína. La membrana se lavó 5 veces en PBS antes de aplicar el anticuerpo secundario (conjugado de IgG de anti-ratón de conejo y fosfatasa alcalina, Sigma, A1902, diluido 1/1000 en PBS o conjugado de IgG de anti- conejo de cabra y fosfatasa alcalina, Sigma, A8025, 1% de caseína). Después de la incubación con agitación suave durante 1 hora a temperatura ambiente, la membrana se lavó 5 veces en PBS. Las transferencias se desarrollaron usando soluciones BCIP/NBT y la reacción se detuvo por el lavado de la transferencia con agua milliQ cuando las bandas fueron claramente visibles. La Figura 7 representa el análisis de transferencia Western.
Ejemplo 10: ELISA para unión a TNF-d humano y rhesus
Se realizó un ELISA para examinar la unión a TNF-d humano y de rhesus Una plaRa Maxisorp de 96 poRillos se recubrió con 2 Ig/ml de neutravidina en PBS ON a 4ac .as plaRas se bloquearon Ron 1% de Raseína durante 2 horas a
R.T. Se añadió TNF-d biotinilada (400 ng/ml) a los poRillos y se inRub
ó durante 1 hora a RT. Las muestras de nanoRuerpo se diluyeron a partir de 2 Ig/ml y mediante diluRiones 1 en 3 .os nanoRuerpos se deteRtaron mediante antimyc de ratón (diluido 1/2000) y anti-ratón de conejo y fosfatasa alcalina (diluido 1/200, Sigma, A1902) y pNPP (2 mg/ml) como sustrato. Las Figuras 9 y 10 representan la unión en el ELISA para la TNF-d humano y rhesus
Los resultados se sintetizan en la Tabla 12. TNF1 y TNF3 muestran unión a TNF-d humano y rhesus TNF2 se une ao TNF-d humano pero es solo débilmente reactiva para TNF-d de rhesus
Ejemplo Ensayo de inhibición del receptor
La capacidad de inhibir la interacción del receptor-ligando se analizó para TNF-d de rhesus y humana Una plaRa Maxisorp de 96 pocillos se recubrió con 2 Ig/ml de Enbrel en PBS ON a 4ac .as plaRas se bloquearon Ron 1% de caseína durante 2 horas a R.T. Las muestras de nanocuerpo se pre-incubaron durante 30 min a RT con TNF-d biotinilada (10 ng/ml) a partir de una concentración de 5 Ig/m y mediante diluRiones 1 en 2 .as muestras se añadieron a las placas y se incubaron durante 1 hora a RT. La TNF-d biotinilada se deteRtó mediante fosfatasa alcalina Extravidina (diluido 1/2000) y pNPP (2 mg/ml) como sustrato. Las Figuras 11 y 12 representan una inhibición ELLSA para TNF-d humano y rhesus. Los resultados se sintetizan en la Tabla 13. Se observa la inhibición de la unión ligando/receptor unión para TNF1 y TNF3 para el TNF humano y ratón, mientras que TNF2 es TNF-d humano.
Ejemplo 12: Análisis Biacore
Unión de TNF-d
El análisis se realizó como se describe en el Ejemplo 3. Las Figuras 13 y 14 ilustran la unión a TNF-d humano y rhesus por medio del análisis Biacore. Los resultados se sintetizan en la Tabla 14. Los experimentos de unión en el Biacore confirman los resultados de ELISA: unión con reacción cruzada para TNF1 y TNF3, mientras que TNF2 solo se une significativamente a TNF-d humano
Albúmina sérica
La unión se analizó como se describió anteriormente excepto que se usaron series de concentraciones diferentes. Cada concentración se inyectó durante 4 minutos a una velocidad de flujo de 45 Il/min para permitir la unión al antígeno unido al chip. La solución tampón de unión sin analito se envió sobre el chip a la misma velocidad de flujo para permitir la disociación del nanocuerpo unido. Después de 15 minutos, se extrajo el analito unido restante por la inyección de la solución de regeneración (25 mM de NaOH).
A partir de los sensorgramas obtenidos para las diferentes concentraciones de cada analito, se calcularon los valores de KD por medio de la afinidad en estado estacionario cuando se alcanzó el equilibrio.
Los resultados se sintetizan en la Tabla 15. Se observa reactividad cruzada para ALB1 y ALB2. La afinidad más alta se observa para ALB2 en TNF-d humano y rhesus Sin embargo, la diferenRia de afinidad para humano/rhesus versus albúmina sérica de ratón es más pronunciada para ALB2 (factor 400), mientras que para ALB1 se observa una diferencia de un factor 12.
Ejemplo 13: Bioensayo
Se usó la línea celular L929 de fibroblastos de ratón sensibles a TNF-d para medir la aRtividad anti-TNF-d de los nanocuerpos seleccionados. A una concentración suficientemente alta de TNF-d en el medio, es deRir, dosis Ritotóxica, las células L929 experimentan necrosis. La inhibición de interacción TNF-d Ron su reReptor se determin
ó por la preincubación una serie de diluciones de anticuerpo con concentración citotóxica de TNF-d antes de añadir la mezcla a las células. La presencia de actinomicina D en el medio sensibiliza las células adicionalmente para TNF-d, lo que produce aumento de la sensibilidad del bioensayo para TNF-d libre Las células L929 se cultivaron hasta casi confluencia, se sembraron en placas de microtitulación de 96 pocillos a razón de 5000 células por pocillo y se incubaron durante toda la noche. Se añadió actinomicina D a las células a una concentración final de 1 Ig/ml .as diluRiones seriadas de los nanoRuerpos para analizar se mezRlaron Ron una concentración citotóxica de TNF-d (la RonRentraRión de ensayo final es 0,5 ng/ml o 15 UI/ml). Después de al menos 30 minutos de incubación a 37°C, esta mezcla se añadió a las células sembradas. Las placas se incubaron durante 24 horas a 37°C y 5% de CO2. Se determinó la viabilidad celular por el uso de la sal de tetrazolio WST-1. Se calcularon las curvas de dosis-respuesta y los valores de EC50 con Graphpad Prism.
Los resultados se sintetizan en la Tabla 16 para TNF-d humano y rhesus Sobre la base de su potenRia para neutralizar la actividad citotóxica, las moléculas se clasifican de la siguiente manera: TNF3>TNF1>TNF2 para TNF-d humano, y TNF1 = TNF3 > TNF2 para TNF-d de rhesus
30 Ejemplo 14: Unión de Proteína A
La Figura 14 representa la unión de Proteína A analizada en Biacore como se describe en el Ejemplo 12. Se obtuvo unión positive para TNF1, TNF2, ALB1. Se observó unión débil o ninguno para TNF3 y ALB2.
Ejemplo 15: Estabilidad de temperatura
.as muestras se diluyeron a 200 Ig/ml y se dividieron en S alícuotas que contiene 500 I .os diferentes viales se incubaron a una temperatura determinada que varía de RT a 90°C. Después del tratamiento las muestras se enfriaron durante 2 horas a RT, y se mantuvieron a 4°C. Los precipitados se eliminaron por centrifugación durante 30 min a
14.000 rpm. El SN se extrajo con cuidado y se analizó posteriormente.
DO 280 nm
Se midió la DO a 280 nm y se calculó la concentración. Los resultados se sintetizan en la Tabla 17. Se observó una disminución del contenido de proteína para TNF2 y TNF3 a partir de 80°C, mientras que para ALB2 se observa a partir de 70°C.
Transferencia Western
Se separaron 2 μg de proteína tratada en 15% de SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se trató como se describió anteriormente. Se realizó la detección usando anti-nanocuerpo policlonal (R23, diluido 1/2000) y peroxidasa de rábano anti-conejo de caballo (DAKO, P0448, diluido 1/2000). La Figura 15 representa el análisis de transferencia Western. Se observó un claro descenso de la concentración de proteína para ALB2 tratado a 70, 80 y 90°C. Todavía se observó agregación para TNF1 tratado a 70, 80 y 90°C; para TNF3 tratado a 90°C; para ALB1 tratado a 90°C, lo que significa que el SN aún contiene trazas de precipitados que producen una lectura a DO 280 nm más alta. Esto explica por qué la concentración de proteína medida a DO 280 nm no disminuye para TNF1, TNF3 y ALB1 tratados a estas T más altas.
ELISA
El ELISA para detectar la unión a TNF-d humana se realizó esencialmente como se describe en el Ejemplo 1 0. Los resultados se presentan en la Figura 16. La unión al TNF-d humano disminuye para TNF1, TNF2, TNF3 a partir de 80°C.
Bioensayo
El bioensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 13. Los resultados se sintetizan en la Tabla 18. La potencia de los nanocuerpos está disminuida para TNF1 a partir de 70°C; para TNF2 y TNF3 a partir de 80°C.
Biacore
La unión a albúmina sérica humana se determinó como se describe en el Ejemplo 12. Se usó una concentración fija (dilución 1 en 50). Los resultados se presentan en la Figura 17. El tratamiento de temperatura no está influyendo en la unión a la albúmina sérica para ALB1. El tratamiento tiene efecto sobre la Kon para ALB2 a partir de T= 70ºC.
Nanocuerpos bivalentes
Ejemplo 16: Formateado de nanocuerpos específicos de TNF-d bivalentes
Se formatearon TNF1, TNF2 y TNF3 a nanocuerpos bivalentes. Como espaciador entre los dos bloques de construcción se usó un ligador 9AA GlySer (Tabla 19 SEQ ID No: 68) o un ligador 30 AA GlySer (Tabla 19 SEQ ID No: 69). Esto generó los constructos representados por la Tabla 20. La Tabla 19 lista las secuencias de estos nanocuerpos específicos de TNF-d bivalentes (SEQ 117 NOs: 70 a 75)
Ejemplo 17: Expresión de nanocuerpos específicos de TNF-d bivalentes
La expresión se realizó como se describe en el Ejemplo 5. Los nanocuerpos marcados con His(6) se purificaron por purifican cromatografía de afinidad en metal inmovilizado (IMAC). La resina Ni-NTA (Qiagen) se procesó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los extractos se incubaron con la resina durante 30 min a RT sobre un rotador. La resina se lavó con PBS y se transfirió a una columna. La resina empaquetada se lavó con PBS (diluido 1 en 10). Los nanocuerpos se eluyeron de la columna por medio de 25 nM de Imidazol. Las fracciones aclaradas se analizaron por siembra en la membrana Hybond y visualización con Ponceau. Las fracciones que contienen proteína se mezclaron y se purificaron adicionalmente por intercambio catiónico seguido por exclusión por tamaño. Las proteínas purificadas se recolectaron, filtraron, esterilizaron, se determinó la concentración y se conservaron en alícuotas a -20°C.
Caracterización de nanocuerpos específicos de TNF-d bivalentes Ejemplo 18: Nivel de expresión Los niveles de expresión de los nanocuerpos de TNF-d bivalentes se RalRularon y representaron en la Tabla 21 El
ligador no tiene efecto significativo sobre el nivel de expresión de los Nanocuerpos. Ejemplo 19: SDS-PAGE Se realizó SDS-PAGE como se describe en el Ejemplo 8. La Figura 18 muestra el resultado del SDS-PAGE. Ejemplo 20: transferencia Western El análisis de transferencia Western se realizó como se describe en el Ejemplo 9. La Figura 19 representa los resultados
de la transferencia Western. Ejemplo 21: Ensayo de inhibición del receptor El ensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 1l. Figura 20 y la Tabla 22 representa los resultados. La mejora de
la inhibición de unión de ligando/receptor se observó para todos los nanocuerpos bivalentes en comparación con el formato monovalente.
Ejemplo 22: Bioensayo El ensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 13. Los resultados se sintetizan en la Tabla 23. Sobre la base de potencia para neutralizar la actividad citotóxica, TNF8, TNF7, TNF9 y TNF5 tienen una potencia en el rango de Enbrel.
Ejemplo 23: Estabilidad a la temperatura Las muestras se analizaron como se describió en el Ejemplo 15. DO a 280 nm Se midió la DO a 280 nm y se calculó la concentración. Los resultados se sintetizan en la Tabla 24. Se observó una
disminución en el contenido de proteína para TNF4 y TNF7 a partir de 70°C, mientras que para TNF5, TNF6, TNF7, TNF8 y TNF9 se observó una disminución a partir de 80°C. Transferencia Western Las muestras se analizaron para determinar la presencia de agregados como se describió en el Ejemplo 15.
ELISA El ELISA para detectar la unión a TNF-d humano se realizó esencialmente como se describió anteriormente. Los resultados se presentan en la Figura 21.La unión a TNF-d humano disminuyó para TNF5, TNF6, TNF8 y TNF9 a partir de 80°C, para TNF4 y TNF7 a partir de 70°C.
Nanocuerpos monovalentes humanizados
Ejemplo 24: Identificación de posiciones de aminoácidos hno humanos en los nanocuerpos específicos de TNF-d y albúmina sérica La Figura 22 (TNF1), Figura 23 (TNF2), Figura 24 (TNF3) y Figura 25 (ALB1) representan alineamientos de secuencias
múltiples (Clustal W 1.7) con las secuencias de DP51, DP53, DP54 y DP29.
Además de las mutaciones de aminoácido, se realizó la optimización de codón que produce las secuencias de la Tabla 25 SEQ ID NOs: 76 a 89 (Nanocuerpos contra TNF-alfa y albúmina sérica humana, respectivamente). Ejemplo 25: Generación de mutantes optimizadas por codón Se sintetizaron oligonucleótidos que abarcan la secuencia completa de los nanocuerpos.
Ejemplo 26: Expresión de nanocuerpos específicos de TNF-d bivalentes La expresión se realizó como se describe en el Ejemplo 5. Caracterización del nanocuerpo humanizado Ejemplo 27: Nivel de expresión La Tabla 26 representa los niveles de expresión calculados. La expresión se obtuvo con rendimientos en el rango de
3,5-11,7 mg/ml. El tiempo de inducción no influyó en el rendimiento. Ejemplo 28: SDS-PAGE Se realizóSDS-PAGE como se describe en el Ejemplo 8. La Figura 26 representa el gel SDSPAGE. Ejemplo 29: Transferencia Western El análisis de transferencia Western se realizó como se describe en el Ejemplo 9. La Figura 27 representa los resultados
de la transferencia Western. Ejemplo 30: Bioensayo El ensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 13. Los resultados de los nanocuerpos humanizados se sintetizan
en la Tabla 27. Los nanocuerpos de tipo salvaje se incluyen como referencia. Ejemplo 31: Biacore El análisis se realizó como se describe en el Ejemplo 12. Figura 28 y 31 muestra los resultados de Biacore. Ejemplo 32: Estabilidad a la temperatura Las muestras se analizaron como se describió en el Ejemplo DO a 280 nm Se midió la DO a 280 y se calculó la concentración. Los resultados se sintetizan en la Tabla 28. No se observa disminución significativa de la concentración de proteína para los nanocuerpos TNF1 (TNF13-14). Se
observa una disminución de la concentración de proteína para los TNF2 (TNF15-19) y TNF3 (TNF20-23) humanizados a
partir de 80°C. Se observa una disminución de la concentración de proteína para ALB1 (ALB4-5) a partir de 70°C y para
ALB3 a partir de 60°C.
Transferencia Western
Las muestras se analizaron para determinar la presencia de agregados como se describió en el Ejemplo 15.
ELISA.
El ELISA para detectar la unión a TNF-d humano se realizó esencialmente como se describió en el Ejemplo 15. Los
resultados se presentan en la Figura 30.
La unión de TNF-d es Romparable para WT TNF1 tratado por temperatura y TNF 13 y 14 humanizados; para WT TNF2 tratado por temperatura y TNF 15-19 humanizado; La unión de TNF-d humano está diminuida para TNF21 y 22, y en menor medida para TNF23, mientras que no se
observa efecto para TNF20 en comparación con WT TNF3. Nanocuerpos TNF-d trivalentes Ejemplo 33: Formateado de nanocuerpos específicos de TNF-d Trivalentes Se formatearon TNF1, TNF2, TNF3 y ALB1 a nanocuerpos trivalentes. Como espaciador entre 2 bloques de
construcción se usó un ligador 9AA GlySer (Tabla l9 SEQ 1D No 68) o un ligador 30 AA GlySer (Tabla 19 SEQ ID No 69). Esto generó los constructos de Tabla 30. La Tabla 29 lista las secuencias de nanocuerpos específicos de TNF-d trivalentes (SEQ IO NOs: 9l a 94)
Ejemplo 34: Expresión de nanocuerpos específicos de TNF-d trivalentes La expresión se realizó como se describe en el Ejemplo 5, por cromatografía de afinidad en metal inmovilizado (IMAC).
La resina Ni-NTA (Qiagen) se procesa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los extractos se incuban con la resina y se incuban durante 30 min a RT sobre un rotador. La resina se lava con PBS y se transfiere a una columna. La resina empaquetada se lava con PBS (diluido 1 en 10). Se preeluye con 15 mM de imidazol. Los nanocuerpos se eluyen de la columna por medio de 25 mM de ácido cítrico pH=4. Las fracciones eluídas se analizan por siembra en la membrana Hybond y visualización con Ponceau. Las fracciones que contienen proteína se mezclan y se purifican posteriormente por intercambio catiónico seguido por exclusión por tamaño. Las proteínas purificadas se recolectan, filtran, esterilizan, se determina la concentración y se conservan en alícuotas a -20°C.
Caracterización de nanocuerpos específicos de TNF-d trivalentes Ejemplo 35: Nivel de expresión Los niveles de expresión se calcularon y representaron en la Tabla 31. Ejemplo 36: Análisis SDS-PAGE Se realizó SDS-PAGE como se describe en el Ejemplo 8. La Figura 31 representa el gel SDS-PAGE. Ejemplo 37: Análisis de transferencia Western El análisis de transferencia Western se realizó como se describe en el Ejemplo 9. La Figura 32 representa el análisis de
transferencia Western. Ejemplo 38: Bioensayo El ensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 13. Los resultados de los nanocuerpos bivalentes se sintetizan en la Tabla 32. Sobre la base de su potencia para neutralizar
la actividad citotóxica, las moléculas son igualmente potentes y comparables en su potencia como las moléculas bivalentes.
5 Ejemplo 34: Unión a albúmina sérica humana La unión se analizó como se describió anteriormente excepto que se usaron series de concentraciones diferentes. Cada concentración se inyectó durante 4 minutos a una velocidad de flujo de 45 Il/min para permitir la unión al an tígeno unido al chip. Después, la solución tampón de unión sin analito se envió sobre el chip a la misma velocidad de flujo para permitir la disociación del nanocuerpo unido. Después de 15 minutos, se extrajo el analito unido restante por la inyección de la solución de regeneración (25 mM de NaOH).
A partir de los sensorgramas obtenidos para las diferentes concentraciones de cada analito, se calcularon los valores de
KD por medio de la afinidad en estado estacionario cuando se alcanzó el equilibrio. Los resultados se sintetizan en la Tabla 33. Se observó una disminución de afinidad para el agente de unión ALB1 formateado en comparación con el ALB1 tipo salvaje. La afinidad sin embargo está aún en el rango de 7,2-1,4 nM.
Ejemplo 40: Estabilidad a la temperatura Las muestras se analizaron como se describió en el Ejemplo 15. DO a 280 nm. Se midió la DO a 280 nm y se calculó la concentración. Los resultados se sintetizan en la Tabla 34. Se observa una
disminución del contenido de proteína para TNF24, TNF27 y TNF28 a partir de 60°C, mientras que para TNF25 y TNF26 a partir de 70°C. Transferencia Western Las muestras se analizaron para determinar la presencia de agregados como se describió en el Ejemplo 15.
ELISA El ELISA para detectar la unión a TNF-d humano se realizó esencialmente como se describió anteriormente. Los resultados se presentan en la Figura 33. La unión a TNF-d humano disminuye para TNF24 y TNF27, a partir de 60ac y
para TNF25, TNF26 y TNF28 a partir de 70°C. Nanocuerpos monovalentes humanizados (segunda ronda) Ejemplo 41: Identificación de posiciones de aminoácidos no humanos en nanocuerpos específicos de TNF-d y albúmina
sérica La Figura 34 (TNF1), Figura 35 (TNF2), Figura 36 (TNF3) y Figura 37 (ALB1) representan alineamientos de secuencias múltiples (Clustal W 1.7) con las secuencias DP51, DP53, DP54 y DP29 secuencias. Las moléculas mutadas se
expresaron y purificaron como se describió anteriormente, lo que produce las secuencias de la Tabla 35 SEQ ID NOs: 95 a 104 (contra TNF-alfa y albúmina sérica humana, respectivamente). Caracterización de nanocuerpos humanizados Ejemplo 42: Nivel de expresión La Tabla 36 representa los niveles de expresión calculados. La expresión se obtuvo con rendimientos en el rango de
0,5-2,7 mg/ml. Ejemplo 43: SDS-PAGE Se realizó el SDS-PAGE como se describe en el Ejemplo 8. La Figura 38 representa el gel de SDS-Page. Ejemplo 44: Transferencia Western El análisis de transferencia Western se realizó como se describe en el Ejemplo 9. La Figura 39 representa los resultados
de la transferencia Western. Ejemplo 45: Bioensayo El ensayo se realizó como se describe en el Ejemplo 13. 25 Los resultados de los nanocuerpos humanizados se sintetizan en la Tabla 37. Los nanocuerpos tipo salvaje y la
primera ronda de nanocuerpos humanizados se incluyen como referencia. Ejemplo 46: Biacore El análisis se realizó como se describe en el Ejemplo 12. La Figura 40 muestra los resultados del Biacore. Ejemplo 47: Estabilidad a la temperatura Las muestras se analizaron como se describió en el Ejemplo 15. DO a 280 nm Se midió la DO a 280 y se calculó la concentración. Los resultados se sintetizan en la Tabla 38. No se observa disminución significativa en la concentración de proteína para los nanocuerpos humanizados TNF-1
(TNF29-30). Se observa una disminución de la concentración de proteína para TNF2 humanizado (TNF31-32) y TNF3 (TNF33) a partir de 800C. Transferencia Western Las muestras se analizaron para determinar la presencia de agregados como se describió en el Ejemplo 15.
ELISA El ELISA para detectar la unión a TNF-d humano se realizó esencialmente como se describió en el Ejemplo 15, Los resultados se presentan en la Figura 41.
La unión a TNF-d humano es Romparable para WT TNF1 y los TNF29 y TNF30 humanizados; Romparable para WT TNF2 y los TNF31 y TNF32 humanizados; y también para WT TNF3 y TNF33 humanizado.
Ejemplo comparativo En este Ejemplo comparativo, se compararon nueve Nanocuerpos de la invención con tres Nanocuerpos del documento WO 04/041862, llamados "VHH#1A" o "1A", "VHH#3E" o "3E" y ""VHH#3G” o "3G" respectivamente (SEQ ID NOS:1, 4 y 5 en el documento WO 04/041862). El ensayo usado fue el ensayo basado en células que usa células KYM con referencia al documento WO 04/41862 (ver por ejemplo, el Ejemplo 1, de acuerdo con 3). Los resultados se mencionan en la siguiente Tabla 34. Como se puede observar, los Nanocuerpos de la invención tienen un valor de EC50 en este ensayo que es 18 veces mejor que el valor de EC50 de 3E, el Nanocuerpo de mejor desempeño de acuerdo con WO 04/041862.
Ejemplo 48: Generación de NanobodiesTM humanizados biespecíficos trivalentes
Los Nanocuerpos biespecíficos trivalentes se formatearon y clonaron en el vector de expresión en E. coli pAX054 primero y posteriormente se rescataron a través de PCR y se clonaron en el vector de expresión pICZa.
3) Determinación de efecto antagonista en el ensayo de citotoxicidad con la línea celular KYM
Se determinó la citostasis/citotoxicidad inducido por TNF-alfa con el ensayo colorimétrico MTT descrito por Vandenabeele y colegas (Vandenabeele, P., Declercq, W, Vercammenn, D., Van de Craen, M., Grooren J., Loetscher, H., Brockhaus, M., Lesslauer, W., Fiers, W. (1992) Function characterización of the human tumor necrosis factor receptor p75 in a transfected rat/mouse T cell hybridoma. 3. Exp.Med. 176, 1015-1024.). El MTT bromuro de (3-(4,5cimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolio) es un sustrato amarillo pálido que es escindido por las células vivas para producir un producto de formazano azul oscuro. Este proceso requiere mitocondrias activas, e incluso las células recién muertas no escinden cantidades significativas de MTT. Las células KYM (Sekiguchi M, Shiroko Y, Suzuki T, Imada M, Miyahara M, Fujii G. (1985) Characterization of a human rhabdomyosardorna cell strain in tissue culture. Biomed. Pharmacother. 39, 372-380) se sembraron en placas de microtitulación de 96 pocillos cultivada en presencia o ausencia de TNF-alfa (0,216 ng/ml o aprox. 5 pM del trímero). Además de TNF, se incluyeron de las cantidades variables del anticuerpo (VHH
o Remicade) durante el cultivo. Para el ensayo, se añadió MTT al medio de cultivo a una concentración final de 500 Ig/ml y las plaRas se inRubaron a 37ac para obtener la esRisión de MTT por las enzimas mitocondriales. El producto de formazano formado, que aparece como cristales borrosos negros en la parte inferiro del pocillo, se disolvió por la adición de isopropanol ácido (40 nM HCl en isopropanol) o DMSO. La absorbancia se mide a 570 nm.
Descripción del vector de expresión de Escherichia coli
El pAX54 es un derivado de pUC19. Este contiene el promotor promotor LacZ que permite una inducción controlada de la expresión mediante IPTG. El vector tiene un gen de resistencia para ampicilina o carbenicilina. Los sitios de multiclonación albergan varios sitios de restricción de los cuales SfII y y BstTII se usan con frecuencia para la clonación de NanobodiesTM. El péptido señal es la secuencia líder gen3 que transloca el NanobodyTM expresado en el periplasma.
Descripción del vector de expresión de Pichia pastoris
El pPICZoA contiene un origen de replicación de derivado de pUC que permite la propagación en E coli. Este contiene el promotor del gen AOXI de Pichia pastoris (alcohol oxidasa 1). Esta región promotora de 942 pb (i) permite la expresión de alto nivel inducible con metanol del gen de interés, y (ii) dirige la integración del plásmido al locus AOXI después de la transformación de Pichia con el ADN del vector que se linealiza dentro de la región promotora 5' AOXI. Cabe mencionar que los vectores pPICZa no contienen un origen de replicación de levaduras y que, en consecuencia los transformantes solo se pueden aislar si la recombinación se produce entre el plásmido y el genoma de Pichia. El vector especifica la resistencia al antibiótico Zeocina en las células huésped de E coli y Pichia pastoris. El vector incorpora la señal de secreción del factor de apareamiento d de SaRRharomyRes Rerevisiae que permite la seRreRión eficiente de la mayor parte de las proteínas en el medio de cultivo. El ATG de iniciación en la secuencia señal del factord Rorresponde al ATG de iniciación natica del gen de AOX1. El sitio de multiclonación alberga varios sitios de restricción de los cuales se usan normalmente Xho1/EcoR1 o Xhot/Notl para la fusión de las secuencias codificadoras de NanocuerpoTM a la señal de secreción. El sitio de multiclonación es seguido por la región de terminación de la transcripción AOXI. Más detalles sobre este vector de expresión se puden hallar en el sitio web de Invitrogen
(http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/ppiczalpha man.pdf).
Formateo de Nanocuerpos trivalentes
Se montaron tres reacciones de PCR separadas para amplificar la subunidad N-terminal, el medio y el C-terminal del NanobodyTM usando las combinaciones de oligo indicadas en WPA-0012. El NanobodyTM N-terminal se amplificó mediante M13_,rev/Rev_9GlySer_L108; el NanobodyTM medio se amplificó mediante For_,GlySer/Short y Rev_15BspE1_L108; el NanobodyTM C-terminal se amplificó mediante For_BspEl/M13_for. Se preparó una reacción de PCR de 1 μl de ADN del plásmido (50-100 Ig), 1,5 Il de Rebador delantero (10 I 300 nM), 1,5 1l de Rebador inverso (10 IM M 300 nM), 1 1l de dNTP (10 mM M 0,2 mM), 5 Il de soluRion tampon (10x M 1x), 0,75 Il de enzima (3,5 U/Il M 2,6 U/Il) y 39,25 1l de H2O con un volumen total de 50 μl. Las secuencias del cebador se dan en la Tabla
40. Se inició una programa de PCR con 2 minutos a 94°C. Un ciclo de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 50°C y 1 minuto a 72°C se repitió 30 veces y siguió 10 minutos a 72°C. La amplificación se examinó por la separación de 5 μl de la reacción de PCR en un gel de agarosa 2%. El producto de PCR se purificó usando el kit de purificación PCR QIAquick de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó una columna y se eluyó con 50 μl de solución tampón EB. El fragmento de VHH N-terminal se preparó por la incubación de 50 μl de ADN y 2 μl de BamHI (10 U/μl) en la solución tampón apropiada recomendada por el fabricante a 37°C durante 2 horas. Posteriormente, se añadieron 2 μl de Sfil (10 U/μl) y la mezcla se incubó a 55°C durante 2 horas. El fragmento de VHH medio se preparó por la incubación de 50 μl de ADN y 2 μl de BamHI (10 U/μl) en la solución tampón apropiada recomendada por el fabricante a 37°C durante 2 horas. El fragmento de VHH C-terminal se preparó por la incubación de 50 μl de ADN y 2 μl de BspEI (10 U/μl) en la solución tampón apropiada recomendada por el fabricante a 37°C durante 2 horas. Posteriormente, se añadieron 2 μl de BstETI (10 U/μl) y la mezcla se incubó a 60°C durante 1 hora. Las reacciones de digestión previas se separaron en un gel de agarosa 2%. Las bandas de VHH (350-450 pb) se cortaron del gel y el ADN se purificó usando el kit de extracción del gel QIAquick de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó una columna (con un máximo de 400 mg de gel de agarosa por columna) y el ADN eluido se eluyó con 50 μl de solución tampón EB. La concentración de ADN se determinó por la medición de la DO260 (1 unidad de DO = 50 μg/ml). Se preparó una mezcla de ligamiento con un volumen final de 10 μl que contiene 100 ng de vector pAX54, 12 ng de VHH N-terminal, 12 ng de fragmento medio de VHH, 12 ng de fragmento C-terminal de VHH, 1 μl de solución tampón de ligamiento y 1 μl de ligasa (3 U) y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. La transformación de E. coli, TG1 se realizó por medio de 2 μl de mezcla de ligamiento. Las colonias se analizaron mediante PCR como se describió en WPA-0010. El análisis de secuencia análisis se realiza en los clones positivos. La preparación del plásmido se realizó mediante el kit Qiaprep spin Miniprep kit (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se describió anteriormente. La secuenciación se realizó en al instalación de secuencia de VIB, Antwerp, Bélgica.
Amplificación del ADN codificador
La región codificadora del NanocuerpoTM en el vector de expresión de E. Coli AX054 se rescata a través de PCR mediante un par cebador apropiado. Para asegurar que el NanocuerpoTM se expresa con un extremo N-terminal nativo, la región codificadora se clona en marco con el sitio de escisión Kex2 de la señal de secreción. El cebador delantero se fusiona a la parte C-terminal de la señal de secreción, arriba del sitio de reconocimiento Xhol hasta la región codificadora del NanocuerpoTM. Se preparó una reacción de PCR de 1 μl de plásmido ADN (50-100 ng), 1,5 Il de Rebador delantero (10 IM M 300 nM), 1,5 1l de Rebador inverso (10 IM M 300 nM), 1 1l de dNTP (10 mM M 0,2 mM), 5 Il de soluRión tampón (10x M 1x), 0,75 Il de enzima (3,5 U/Il M 2,6 U/Il) y 39,25 1l de H 2O con un volumen total de 50 μl.
Las secuencias del cebador se dan en la Tabla 4L. Se inició una programa de PCR con 2 minutos a 94°C. Un ciclo de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 50°C y 2 minuto a 72°C se repitió 20 veces y siguió 10 minutos a 72°C. La amplificación se examinó por la separación de 5 μl de la reacción de PCR en un gel de agarosa 2%. El producto de PCR se purificó usando el kit de purificación PCR QIAquick de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó una columna y ADN unido se eluyó con 50 μl de solución tampón EB.
Estrategia de clonación
El fragmento de ADN que codifica el vector de expresión de NB así como el pPICZaA se digiere con las enzimas de restricción apropiadas (XhoI + NotI). El inserto se obtiene por la incubación de 50 μl de producto de PCR con 2 μl de Xhol (10 U/μl) y 2 μl NotI (10 U/μl) en la solución tampón apropiada recomendada por el fabricante durante 3 horas a 37°C. El vector se obtiene de modo similar, se adapta la cantidad de enzimas de restricción a la cantidad de plásmido. Tanto el vector como el fragmento codificador de NB se purifican y se cuantifica la concentración de ADN mediante el BioPhotometer (Eppendorf). El fragmento y el vector aceptor se ligan en una relación equimolar mediante el uso de 1 Unidad de T4 ligasa (Promega) durante 30 minutos a temperatura ambiente o durante toda la noche a 16°C. El ADN (20-30 ng) se transforma en las células TG1. Las colonias se analizan a través de PCR mediante los cebadores 3'AOXI R y 5'AOXI F. El análisis de secuencia se realiza en los clones positivos. Los TNF30, TNF33 y ALB8 se formatearon a NanocuerpoTM biespecíficos trivalentes. Como espaciador entre los bloques de construcción se usó un ligador 9AA GlySer.
Transformación de P. pastoris
Para aislar el ADN del plásmido, se inicia un precultivo por la inoculación de una colonia única del clon en 50 ml de caldo Luria + ampicilina o carbenicilina (100 μg/ml) + 2% de glucosa e incubación a 37°C durante toda la noche. El el ADN del plásmido se prepara mediante el kit Plasmid Midi (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN se linealiza por la incubación de 30 μg de ADN del plásmido con 6 μl de BstXI (10 U/μl) en la solución tampón apropiada de acuerdo con las instrucciones del fabricante durante 3 horas a 45°C. El ADN digerido se purifica mediante el kit de Purificación de PCR (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN se concentra mediante precipitación EtOH de acuerdo con procedimientos estándares. Las células electrocompetentes X-33 se transforman con 10 μg de ADN linealizado y las células se dejan crecer durante 48 horas en una placa de agar selectivo YPD que contiene Zeocina (100/250/500 μg/ml). La X-33 es una cepa de Pichia pastoris tipo salvaje; la cepa misma así como las cepas recombinantes derivadas contienen el gen AOXI nativo y son capaces de metabolizar metanol (Mut).
Los clones se analizan para determinar el nivel de expresión por la inoculación de colonias individuales en 1 ml de BGCM en una placa de 24 pocillos y se los cultiva durante 48 horas a 30°C a 120 rpm. Las células se centrifugan y se añade BGCM fresco a las células para el cultivo a 30°C a 120 rpm durante 48 horas. Después, se añade MeOH a una concentración final de 0,5% y las células se cultivan a 30°C a 120 rpm durante 8 horas, después de lo cual se añade MeOH a una concentración final de 0,5%. Las células se cultivan durante toda la noche a 30°C a 120 rpm. Las células se centrifugan y el sobrenadante se recolecta y analiza en ELISA como se describió en el Ejemplo 10.
Ejemplo 49: Expresión y purificación de NanocuerposTM humanizados biespecíficos trivalentes Producción en Pichia pastoris
La composición de soluciones tampón, soluciones y otros se pueden hallar en el sitio web de Invitrogen (http:l/wetw.invitrogen.com/content/sffs/manual/ppiczalpha_man.pdf). Un precultivo se inició por la inoculación de una colonia única de una placa en 5 ml de YPD. El cultivo se cultivó durante toda la noche a 180 rpm y 30°C. El día siguiente, el precultivo se diluyó a 50 ml de YPD y se cultivó durante toda la noche a 180 rpm y 30°C. Los cultivos de producción se iniciaron por la inoculación del precultivo a una DO600nm final= 0,04-0,08. Los cultivos se cultivaron en BGCM durante 24 horas a 30°C a 180 rpm y se centrifugaron a 4.500 rpm durante 30 minutos. Las células se resuspendieron en 1/3 del volumen original en medio BGCM con una DO600 nm = 15-20 final. Las células se indujeron con MeOH en puntos de tiempo regulares, normalmente 3 veces/día, nunca excediendo el 1% del contenido de MeOH. Después de 50 horas de inducción se recolecta el sobrenadante.
Purificación de nanocuerpos expresado en Pichia psatoris
El sobrenadante del cultivo se filtra sobre una membrana de filtración de 22 μm Micro filtration (Hydrosart, Sartorius). La muestra se concentra mediante diafiltración en una membrana de filtración de 10kDa (HydroSart, Sartorius) y se concentró a 0,5-1L.
Los NanocuerposTM se purifican mediante cromatografía de afinidad de Proteína A (MabSelect Xtra, GE Healthcare) mediante PBS como solución tampón de corrida y Glicina (100 mM pH=2,5) para la elución. Las muestras se neutralizan mediante Tris 1,5 M pH-8.8. Los NanocuerposTM se procesan adicionalmente en Cromatografía de intercambio aniónico (Source 30Q, GE Healthcare). Las muestras se diluyen 10 veces con 10 mM de piperazina pH=10,2 y y se ajusta a pH=10,2 con NaOH 1 M y una conductividad de <2mS/cm con agua MilliQ.
Los Nanocuerpos se procesan por cromatografía de exclusión por tamaño (Superdex 75pg, Hiload XK26/60, GE Healthcare) y el LPS se extrae por Cromatografía de intercambio aniónico (Source 30Q, GE Healthcare) por el pasaje a través de una columna de 5 ml, que se desinfecta con NaOH 1 M y se equilibra en PBS Dulbecco.
Para determinar la pureza, las muestras de proteína se analizaron en un gel de SDS-PAGE 15% como se describió en el Ejemplo 8. El gel se procesad mediante el SilverQuestTM de acuerdo con los procedimientos generales descritos por el fabricante (Invitrogen). Alternativamente, el gel se procesa mediante azul brillante coomassie o en transferencia western como se describió en el Ejemplo 8 y 9. Los resultados se dan en la Figura 42.
Ejemplo 50: Caracterización de NanocuerposTM humanizados biespecíficos trivalentes
TNF60 consiste en 363 aminoácidos. La proteína tiene un peso molecular de 38.441 Da. El pH es 8,71. El coeficiente de extinción a 280 nm es 1,736.
Espectrometría de masa
La masa de la proteína se determinó en ESI-MS de acuerdo con procedimientos estándares.
La masa teórica de TNF60 es 38.441 Da. La proteína tiene 2 puentes S-S que deben resultar en una masa de 38.435 Da en ESI-MS. El masa que determinó experimentalmente para TNF60 derivado de 3 lotes diferentes varía de 38.433 Da a 38.435 Da, que difiere como máximo 0,005% con la masa teórica.
Secuenciación N-terminal
La secuenciación N-terminal se realizó por la degradación de Edman de acuerdo con procedimientos estándares. La secuenciación N-terminal mostró que la secuencia de la proteína para los primeros 7 aminoácidos es la siguiente: EVQLVES. Esto es compatible con la secuencia de la proteína teórica, que indica el procesamiento N-terminal apropiado.
Distribución por tamaño analítico
Las muestras (100 ug) se analizaron en la columna de alta resolución Superdex75, para caracterizar los diferentes lotes de NanocuerpoTM. La cromatografía de exclusión por tamaño del NanocuerpoTM normalmente produce un pico simétrico, con un tiempo de retención de 11,5 minutos en Superdex75. La absorbancia se registra normalmente a 280, 254 y 214 nm. La medición de 214 nm permite la mayor sensibilidad de detección. La distribución por tamaño analítico en PBS proporciona un pico simétrico. No se observaron contaminantes. El tiempo de retención observado para 3 lotes diferentes es 11,5-11,55 minutos. Un perfil representativo se muestra en la Figura 43.
Ejemplo 51: Unión de TNF60 a TNFd humana en E.ISl
La funcionalidad de TNF60, es decir la unión al TNF-d humano se analizó por ELISA como se describió en el Ejemplo
10. Los resultados se sintetizan en la Figura 44 y demuestran claramente una unión dependiente de la dosis y saturable de 2 lotes de TNF60 al TNF-d humano
Ejemplo 52: Funcionalidad del ensayo basado en células
La potencia para neutralizar la actividad citotóxica de TNFd se analizó en un ensayo basado en células que se describió en el Ejemplo 13. Los resultados se sintetizan en la Tabla 42 y en las Figuras 45 y 46.
Los datos muestran que TNF60 tiene potencia en el rango de Enbrel/Etanercept y 10 veces mejor potencia que Humira/Adalimumab y Remicade/Inflixmab.
Ejemplo 53: Unión de TNF60 a la albúmina sérica
La unión a la albúmina sérica humana y de rhesus se analizó en Biacore como se describió en el Ejemplo 12. Los valores de KD, kon y koff se representan en la Tabla 43. TNF60 se compara con TNF24, que es el NanocuerpoTM biespecífico trivalente original con bloques de construcción tipo salvaje.
La afinidad de TNF60 por la albúmina sérica humana y de rhesus es similar. La afinidad es 2 veces más baja en comparación con la afinidad observada para TNF24 que es el análogo tipo salvaje de TNF60. Kon es idéntica para ambas moléculas, pero la koff es 2 veces más alta para TNF60.
Ejemplo 54: Análisis farmacocinético y de inmunogenicidad de los Nanocuerpos humanizados biespecíficos trivalentes en los ratones
Animales
Los ratones DBA1 o BALBc se calentaron bajo una lámpara infrarroja y se inyectaron 200 μl de NanobodyTM (100 μg por ratón) por vía intravenosa en la cola. Se obtuvieron muestras de sangre en diferentes puntos de tiempo haciendo una incisión en la cola y recolectando la sangre en un microtubo. Normalmente, la sangre se muestreó a t=15 min, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 7 días, 14 días. El suero se preparó de acuerdo con procedimientos estándares.
Determinación de la concentración NanocuerpoTM en suero de ratón
Una placa de microtitulación (NUNC, Maxisorb) se recubrió con 2 μg/ml de neutravidina durante toda la noche 0 a 4°C. La placa se lavó 5 veces con PBS/0,05% de Tween-20 y se bloqueó durante 2 horas a RT con PBS/1% de caseína. El TNF-d humano biotinilado (1/2000 en PBS/0,2% de Raseína; 400 ng/ml) se aplicó en los pocillos y se incubó durante 1 hora a RT. El NanobodyTM de referencia se aplicó a partir de una concentración de 5 μg/ml y mediante diluciones de 5 veces en PBS que contiene 1% de plasma de ratón. Los NanocuerposTM se dejaron unir durante 2 horas a RT.
La placa se lavó 5 veces y se aplicó anti-Nanocuerpo policlonal de conejo (R23) a una dilución de 2000 veces durante una hora a RT. Después del lavado de la placa, se detectó la unión con HRP de anti-conejo policlonal de cabra (DAKD) a una dilución de 3000 durante una hora a RT, y se tiñó con ABTS/H2O2. Se midió la DO de 405 nm.
Este primero ELISA se usó para determinar el rango lineal de la referencia estándar. En un segundo ELISA, la referencia estándar se usó en concentraciones en este rango lineal y normalmente mediante diluciones de 2 veces. En este segundo ELISA, las muestras de ensayo de suero se diluyeron 100 veces y otras diluciones de 5 veces se obtuvieron en 1% de plasma de ratón, para determinar la dilución a la que las muestras séricas proporcionan una lectura en el rango lineal de la curva estándar. En un tercer ELISA, las muestras séricas se diluyen en una concentración apropiada determinada en el segundo ELISA y mediante diluciones de 2 veces para la determinación exacta de la concentración de NanobodyTM en las muestras de suero.
Los experimentos se realizaron para determinar el perfil farmacocinética de TNF60 en los ratones (n 3). Un valor de Cmax de 103,84 ± 31 Ig/ml se alRanzó 15 minutos después de la administración. Se determinó que la vida media (t1/2�) es 1,9 días, similar a la vida media de la albúmina sérica de ratón, que indica que TNF60 adopta la vida media de la albúmina sérica. Los datos se presentan en la Figura 47.
Determinación de anticuerpos anti-Nanocuerpos en los ratones
El NanobodyTM se recubrió con 5 Ig/ml en PBS a 4ac durante toda la noRhe .a plaRa se lavó 5 veces con PBS/0,05% "Tween-20 y bloqueó durante 2 horas a RT con PBS/1% de caseína. Las muestras séricas se diluyeron 100 veces y aplicaron a los pocillos para incubación durante 1 hora a temperatura ambiente. La detección se realizó mediante HRP de anti-ratón policlonal de conejo diluido 1000 veces (DAKO, P0260) y mediante ABTS como sustrato.
Las muestras de suero se diluyeron 50 veces y analizaron para determinar la presencia de anticuerpos anti-TNF60 de ratón. La carencia de inmunogenicidad se demostró para TNF6O. Los datos se presentan en la Figura 48.
Ejemplo 55: Generación de NanocuerposTM humanizados de larga vida bivalentes
Descripción del vector de expresión de Pichia pastoris:
Ver ejemplo 48 Formateo de NanocuerposTM bivalentes
Se montaron dos reacciones de PCR separadas para amplificar la subunidad N-terminal y C-terminal del NanobodyTM mediantes los procedimientos indicados en WPA-0011. Para la amplificación del NanobodyTM N-terminal se usaron PiForLong y Rev_30GlySer L108 como combinación del cebador; para la amplificación del NanobodyTM C-terminal se usaron For_GlySer y PiRevCys1hum o alternativamente For_GlySer y PiRevCys2hum, se introducen los sitios de restricción requeridos para el formateado y los residuos de cisteína libres requeridos para las modificaciones.
Se preparó una reacción de PCR de 1 μl de ADN del plásmido (50-100 Ig), 1,5 Il de Rebador delantero (10 IM M 300 nM), 1,5 1l de Rebador inverso (10 IM M 300 nM), 1 1l de dNTP (10 mM M 0,2 mM), 5 Il de soluRion tampon (10x M 1x), 0,75 Il de enzima (3,5 U/Il M 2,6 U/Il) y 39,25 1l de H 2O con un volumen total de 50 μl. Las secuencias del cebador se dan en la Tabla 44. Se inició una programa de PCR con 2 minutos a 94°C. Un ciclo de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 50°C y 1 minuto a 72°C se repitió 30 veces y siguió 10 minutos a 72°C. La amplificación se examinó por la separación de 5 μl de la reacción de PCR en un gel de agarosa 2%. El producto de PCR se purificó usando el kit de purificación PCR QIAquick de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó una columna y se eluyó con 50 μl de solución tampón EB. El fragmento de VHH N-terminal se preparó por la incubación de 50 μl de ADN y 2 μl de BamHI (10 U/μl) en la solución tampón apropiada recomendada por el fabricante a 37°C durante 2 horas. Posteriormente, se añadieron 2 μl de Sfil (10 U/μl) y la mezcla se incubó a 55°C durante 2 horas. El fragmento de VHH medio se preparó por la incubación de 50 μl de ADN y 2 μl de BamHI (10 U/μl) y 2 pXhol (10 U/μl) en la solución tampón apropiada recomendada por el fabricante a 37°C durante 1,5 horas. El fragmento de VHH C-terminal se preparó por la incubación de 50 μl de AD, 2 μl de BamHI (10 U/μl) y 2 μl de EcoRI (10 U/ μl) en la solución tampón apropiada recomendada por el fabricante a 37°C durante 1 hora. Las reacciones de digestión previas se separaron en un gel de agarosa 2%. Las bandas de VHH (350-450 pb) se cortaron del gel y el ADN se purificó usando el kit de extracción del gel QIAquick de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó una columna (con un máximo de 400 mg de gel de agarosa por columna) y el ADN unido se eluyó con 50 μl de solución tampón EB. La concentración de ADN se determinó por la medición de la DO260 (1 unidad de DO = 50 μg/ml). Se preparó una mezcla de ligamiento con un volumen final de 10 μl que contiene 100 ng de vector pPICZaA, linealizado con XhoI/EcoRI, 30 ng de VHH N-terminal, 30 ng de fragmento VHH C-terminal, 1 μl de solución tampón de ligamiento y 1 μl de ligasa (3 U) y se incubó durante 1 hora a RT. La transformación de E. coli, TG1 se realizó por medio de 2 μl de mezcla de ligamiento. Las colonias se analizan mediante PCR como se describió en WPA-0010, pero mediante la combinación de cebadores AOXIFor/AOXIRev. El análisis de secuencia análisis se realiza en los clones positivos. La preparación del plásmido se realizó mediante el kit Qiaprep spin Miniprep kit (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se describió anteriormente. La secuenciación se realizó en al instalación de secuencia, Antwerp, Bélgica.
Transformación de P. pastoris
Ver ejemplo 48.
El F30 se formateó a Nanocuerpos bivalentesTM. Coomo espaciador entre los 2 bloques de construcción se usó un ligador 30 AA GlySer. Para permitir las modificaciones específicas de sitio C-terminal, se introdujo una cisteína libre, sea como el último AA del nanocuerpo o con un espaciador extra que consiste en GlyGlyGlyCys. (SEQ ID No=471),
Ejemplo 56: Expresión y purificación de NanocuerposTM humanizados de larga vida bivalentes
Producción en Pichia pastoris
Ver ejemplo 49
Purificación de Nanocuerpos bivalentes
El medio de cultivo se obtuvo libre de células por medio de centrifugación y filtración de 0,22
Im El medio estéril se conservó a 4°C hasta el procesado posterior. Los contaminantes de bajo peso molecular se redujeron por medio de ultra filtración en una membrana de ultra filtración e 10 kDa (UF) (HydroSart Sartocon Slice Cassette, Sartorius) de la siguiente manera: cuatro litros de medio se concentraron a 0,5-1 litro, posteriormente se diluyeron con 5 litros de PBS y se concentraron de nuevo a 0,5 litro. Esta acción se llevó a cabo dos veces.
El retenido del DE se filtró a través de membranas de nylon de 47 mm 0,45 Im (lllteRh #2024)
En una etapa próxima se capturó el NanobodyTM bivalente a partir del medio concentrado por medio de purificación de afinidad de Proteína A (mediante MabSelectXtraTM, GE Healthcare). La columna [35X100mm] se equilibró en PBS y después de la aplicación de la muestra se lavó exhaustivamente con PBS. El TNF56 eluyó con Glicina [100 mM, pH=2.5].
Las fracciones eluidas de MabSelectXtraTM se neutralizaron con Tris [1,5 M, pH 8,8] y se almacenaron a 4°C. El TNF56 se concentró y purificó por medio AEX (A= 10 mM de piperazina, pH 10,8 y B=1 M de NaCl en Tris 50 mM, pH 7,5) mediante Source 30Q (GE Healthcare). Para este fin las fracciones de NanobodyTM se diluyeron con solución tampón A (10 mM de piperazina, pH 10,8) a una conductividad de 5 mS/cm y el pH se ajustó a 10,8. La columna [25X100mm] se equilibró en una solución tampón A antes de cargar la muestra en la column. El TNF56 se eluyó con un gradiente de 5
volúmenes de columna (CV). El pH de las fracciones recolectadas se ajustó a 7,8 mediante Tris 1 M pH=7.8.
Pegilación de Nanocuerpos bivalentesTM expresados en Pichia pastoris
Reducción de cisteínas C-terminales
Se añadió ditiotreitol (DTT, Aldrich Cat 15,046-0) a las fracciones neutralizadas para reducir los potenciales puentes disulfuro que se forman entre las cisteínas carboxi terminal de los NanocuerposTM (usualmente alrededor de 20%). Se halló que una concentración final de 10 mM de DTT e incubación durante toda la noche a 4°C es óptima. La reducción se evaluó por cromatografía analítica de exclusión por tamaño (SEC). En consecuencia, 25 Il de NanoRuerpoTM reducido se añadieron a 75Il de O -PBS y se inyectaron en una columna Sup75 101300 GL equilibrada con PBS de Dulbecco (D-PBS, GibcoTM REF 14190-094).
El NanocuerpoTM no reducido y DTT se extrajeron por SEC preparativa en una columna Hiload 26160 Superdex75 de grado preparativo equilibrada con D-PBS.
Se midió la concentración del NanocuerpoTM reducido por la medición de la absorbancia a 280 nm. Se usó un espectrofotómetro UV/VIS de doble haz Uvikon 943 (procedimiento: ver SOP ABL-0038). La absorción se midió en un barrido de longitud de onda 245-330 nm. Se usaron dos celdas Precision hechas de Quartz Suprasil® (Hellma tipo No.: 104-QS; paso de luz: 10 mm), Primero se midió la absorción del blanco a 280 nm por la colocación de las dos celdas cargadas con 900 μl de D-PBS. La muestra se diluyó (1/10) por la adición de 100 Il de la muestra a la primera Relda .a absorción de la muestra se midió a 280 nm.
Se calculó la concentración con la siguiente fórmula:
Para TNF55: £=1,S5
Para TNF56: £ =1,83.
Pegilación
Para PEGilar NanobodyTM se añadió un exceso molar 5X de una solución de PEG40 1 M recién preparado a la solución de NanocuerpoTM reducido. (MPEG2-MAL-40K de NEKTARTM)
Transforming Therapeutics (2D3YOTOI) PM = 40.000 g/mol; MPEG2-MAL-60K de NEKTARTM Transforming Therapeutics (2D3YOVOI) PM = 60.000 g/mol).
La mezcla de NanobodyTM-PEG se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) con agitación suave y posteriormente se transfirió a 4°C. La PEGilación se evaluó por medio de SEC analítica. En RonseRuenRia, 25 Il de NanocuerpoTM reducido se añadieron a 75 Il de O -PBS y se inyectaron en una columna Sup75 101300 GL equilibrada con PBS de Dulbecco. El NanocuerpoTM pegilado eluyó en el rango del volumen de exclusión de la columna (>75kDa).
El NanobodyTM PEGilado y no PEGilado se separaron por medio de cromatografía de intercambio catiónico (CEX, mediante Source30S, GE Healthcare; solución tampón A =25 mM de ácido cítrico pH=4 y B=1 M NaCl en PBS). La muestra se diluyó a una conductividad de <5 mS/cm y el pH se ajustó a 4,0. La columna [25X100mm) se equilibró y después de la aplicación se lavó exhaustivamente con solución tampón A. El NanobodyTM PEGilado se eluyó con un gradiente de 3 CV.
El NanobodyTM recolectado se intercambió con la solución tampón a D-PBS por SEC en una columna Hiload 26/60 Superdex 75 de grado preparativo equilibrada en D-PBS.
Finalmente el NanobodyTM se obtuvo libre de LPS por medio del pasaje sobre una columna de intercambio aniónico (Source30Q). La columna (10x100mm) se desinfectó durante toda la noche en NaOH [1 M) y después se equilibra en D-PBS libre de endotoxina.
Biotinilación
Para biotinilar el NanobodyTM se añadió un exceso molar 5X de biotina (EZ-Link® Maleimide-PO2-Biotin, Pierce #21901) a partir de una solución patrón de 10 mM al NanobodyTM reducido (ver 5.5.1). La mezcla de biotina-NanobodyTM se incubó durante 1 hora a RT con agitación suave y posteriormente se almacenaron a 4°C.
La pureza de NanobodyTM biotinilado se controló por medio de SEC analítica. En consecuencia, 25 Il de NanobodyTM biotinilado se añadieron a 75 Il de O -PBS y se inyectaron en una columna Sup75 10/300 GL equilibrada en D-PBS. A partir del cromatograma obtenido se pudo concluir que el NanobodyTM-biotina no necesita purificación adicional: no se pudo detectar dimerización del NanobodyTM por medio de una oxidación de sulfhidrilos libres. Se realizó un cambio de solución tampón al D-PBS por un pasaje sobre una columna de desalinización Sephadex G25 fina (90 ml).
Finalmente se obtuvo NanobodyTM-biotina libre de LPS por el pasaje sobre una columna de intercambio catiónico (Source30Q, GE Healthcare). La columna (1x10 cm) se desinfectó durante toda la noche en NaOH [1 M) y después se equilibra en D-PBS.
Para determinar la pureza, las muestras de proteína se analizaron en un gel de SDS-PAGe 15% como se describió en el Ejemplo 8 y 49. Los resultados se presentan en la Figura 49 y 50.
Ejemplo 57: Caracterización de NanocuerposTM de larga vida humanizados bivalentes
Caracterización bioquímica
El TNF55 consiste en 260 aminoácidos. La proteína tiene un peso molecular de 27.106 Da. El pH es 8,67. El coeficiente de extinción a 280 nm es 1,850.
El TNF56 consiste en 264 aminoácidos. T La proteína tiene un peso molecular de 27,365 Da. El pH es 8,67. El coeficiente de extinción a 280 nm es 1,830.
Espectrometría de masa
La masa teórica de TNF55 es 27.106 Da. La proteína de TNF55-Biotina tiene 2 puentes S-S y una modificación de biotina que puede producir una masa de 27.627 Da en ESI-MS.
La masa que se determinó experimentalmente para TNF55-biotina es 27.627 Da.
La masa teórica de TNF56 es 27,365 Da. La proteína de TNF56-Biotina tiene 2 puentes S-S y a modificación de biotina que puede producir una masa de 27.886 Da en ESI-MS. La masa que se determinó experimentalmente para TNF56biotina es 27.886 Da.
Secuenciación N-terminal
La secuenciación N-terminal de TNF56-PEG40 mostró que la secuencia de la proteína para los primeros 7 aminoácidos es la siguiente: EVQLVES. Esto es compatible con la secuencia de la proteína teórica, que indica el procesamiento Nterminal apropiado.
Distribución por tamaño analítico
La distribución por tamaño analítico de TNF56-PEG40 en PBS proporciona un pico simétrico. No se observaron contaminantes. El tiempo de retención observado es 8,5 ml en Superdex HR 75 y 10,32 ml en Superdex HR 200. Un perfil representativo se muestra en las Figuras 51 y 52.
Ejemplo 58: Funcionalidad del ensayo basado en células
La potencia para neutralizar la actividad citotóxica de TNFd se analizó en un ensayo basado en células . Se examinó la potencia en diferentes concentraciones de NanocuerpoTM así como de Enbrel, Humira y Remicade disponibles en el comercio sobre una base molar. A mayor EC50 observa menor actividad del compuesto para neutralizar TNF-d
Los resultados se sintetizan en la Tabla 45 y Figures 53 y 54.
Los datos muestran que un aumento de la potencia para los NanocuerposTM bivalentes cuando se compararon con el NanocuerpoTM monovalente TNF1. La potencia de los derivados de TNF5S es similar a los derivados de TNF56, que esté en el rango de Enbrel y 10 veces mejor que Humira y Remicade.
Ejemplo 59: Análisis farmacocinético y de inmunogenicidad de los Nanocuerpos humanizados de larga vida bivalentes en los ratones
Ver ejemplo 54
Los experimentos se realizaron a fin de examinar la vida media de los NanocuerposTM pegilados en los ratones. La vida media de TNF56-PEG40 bivalente se comparó con la vida media de TNF56-PEG60. Ambos NanocuerposTM tienen vida media comparable de ~ 2 días. Los resultados se presentan en la Figura 55.
Además, se exploró la vida media de 3E-3E bivalente pegilado. La vida media de 3E-3E-PEG20 se comparó con la vida media de 3E-3E-PEG40 después de la administración intravenosa de 100 Ig de los NanoRuerposTM. 3E-3E-PEG20 tiene una vida media de 17 horas, mientras que 3E-3E-PEG40 tiene una vida media de 2,1 días, comparable con la vida media de 3E-3E-MSA21. Los resultados se presentan en la Figura 56.
Las muestras de suero se diluyeron 100 veces y analizaron para determinar la presencia de anticuerpos anti-TNF56-PEG40 o anti-TNF56-PEG60 de ratón. Se demostró la carencia de inmunogenicidad para ambas moléculas. Los datos
se presentan en la Figura 57. Ejemplo 60: Eficacia de los Nanocuerpos anti-TNFd TNF60 en la prevenRión de poliartritis crónica Las líneas de ratón transgénico que portan y expresan un transgén del factor de necrosis tumoral humano modificado 3'
(hTNF-alfa, cachectina) se usaron como modelo para estudiar la eficacia de TNF60 (TNF60) para prevenir el desarrollo de la artritis (EMBO J. 10, 4025-4031). Se ha mostrado que estos ratones desarrollan poliartritis crónica con 100% de incidencia a las cuatro a siete semanas.
A partir de la tercera semana, las crías de ratones transgénicos se dividieron en grupos de ocho animales. Antes de iniciar el estudio, se calculó el peso corporal promedio para cada grupo. A partir de este momento, durante el estudio del animal completo se registraron los pesos una vez por semana para cada grupo.
Para examinar la eficacia de TNF60 en la prevención de poliartritis crónica, se dieron inyecciones intraperitoneales dos veces por semana a cada animal de un grupo particular de acuerdo con el siguiente esquema: -Grupo 1 (control negativo): solución salina regulada con fosfato (PBS) (solución tampón de la formulación) -Grupo 2 (Tratamiento con Nanocuerpo): TNF60 a una dosis final de 30 mg/kg -Grupo 3 (Tratamiento con Nanocuerpo): TNF60 a una dosis final de 10 mg/kg -Grupo 4 (Tratamiento con Nanocuerpo): TNF60 a una dosis final de 3 mg/kg -Grupo 5 (1er control positivo): Enbrel a una dosis final de 30 mg/kg -Grupo 6 (1er control positivo): Enbrel a una dosis final de 10 mg/kg 25 -Grupo 7 (2do control positivo): Remicade a una dosis final de 30 mg/kg -Grupo 8 (2do control positivo): Remicade a una dosis final de 10 mg/kg -Grupo 9 (2do control positivo): Remicade a una dosis final de 3 mg/kg
Para cada grupo, se indicaron las fechas de inyección y los volúmenes de inyección. Las inyecciones continuaron durante siete semanas. Durante este período, se registraron las puntuaciones clínicas por la observación de cambios macroscópicos en la morfología de las articulaciones para cada animal.
A las 10 semanas, todos los ratones se sacrificaron y se recolectaron suero y articulaciones. Los sueros se conservaron
a -70°C y las articulaciones del tobillo se conservaron en formalina. En los grupos seleccionados, las articulaciones del tobillo se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones. Las secciones de las articulaciones del tobillo posteriormente se usaron para la evaluación histopatológica de la progresión de la enfermedad. Los resultados se ilustran en la figura 58.
Ejemplo 61: Eficacia de los Nanocuerpos anti-TNFd TNF60 en el tratamiento terapéutico de la poliartritis crónica Las líneas de ratón transgénico que portan y expresan un transgén del factor de necrosis tumoral humano modificado 3' (hTNF-alfa, cachectina) se usaron como modelo para estudiar la eficacia de TNF60 (TNF60) para prevenir el desarrollo
de la artritis (EMBO J. 10, 4025-4031). Se ha mostrado que estos ratones desarrollan poliartritis crónica con 100% de incidencia a las cuatro a siete semanas. A partir de la sexta semana, las crías de ratones transgénicos se dividieron en grupos de ocho animales. Antes de iniciar
el estudio, se calculó el peso corporal promedio para cada grupo. A partir de este momento, durante el estudio del
animal completo se registraron los pesos una vez por semana para cada grupo. Para examinar la eficacia de TNF60 en el tratamiento terapéutico de la poliartritis crónica, se dieron inyecciones intraperitoneales dos veces por semana a cada animal de un grupo particular de acuerdo con el siguiente esquema:
-Grupo 1 (control negativo): solución salina regulada con fosfato (PBS) (solución tampón de la formulación) -Grupo 2 (Tratamiento con Nanocuerpo): TNF60 a una dosis final de 30 mg/kg -Grupo 3 (Tratamiento con Nanocuerpo): TNF60 a una dosis final de 10 mg/kg -Grupo 4 (1er control positivo): Enbrel a una dosis final de 30 mg/kg -Grupo 5 (2do control positivo): Remicade a una dosis final de 30 mg/kg Para cada grupo, se indicaron las fechas de inyección y los volúmenes de inyección.
Las inyecciones continuaron durante siete semanas. Durante este período, se registraron las puntuaciones clínicas por
la observación de cambios macroscópicos en la morfología de las articulaciones para cada animal. A las 13 semanas, todos los ratones se sacrificaron y se recolectaron suero y articulaciones. Los sueros se conservaron a -70°C y las articulaciones del tobillo se conservaron en formalina.
En los grupos seleccionados, las articulaciones del tobillo se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones. Las secciones de las articulaciones del tobillo posteriormente se usaron para la evaluación histopatológica de la progresión de la enfermedad. Los resultados se ilustran en la figura 59.
Ejemplo 62: Efecto del formateado sobre la eficacia de un Nanocuerpo anti-TNF-d en la prevenRión de poliartritis crónica Las líneas de ratón transgénico que portan y expresan un transgén del factor de necrosis tumoral humano modificado 3' (hTNF-alfa, cachectina) se usaron como modelo para estudiar la eficacia de Nanocuerpo anti-TNF-d formateado de
diferentes maneras en la prevención de poliartritis crónica (EMBO J. 10, 4025-4031). Se ha mostrado que estos ratones desarrollan poliartritis crónica con 100% de incidencia a las cuatro a siete semanas. A partir de la tercera semana, las crías de ratones transgénicos se dividieron en grupos de ocho animales. Antes de
iniciar el estudio, se calculó el peso corporal promedio para cada grupo. A partir de este momento, durante el estudio del
animal completo se registraron los pesos una vez por semana para cada grupo. Para examinar la eficacia de Nanocuerpo anti-TNF-d en diferentes formatos para la prevenRión de poliartritis crónica, se dieron inyecciones intraperitoneales dos veces por semana a cada animal de un grupo particular de acuerdo con el siguiente esquema:
-Grupo l (control negativo): solución salina regulada con fosfato (PBS) (solución tampón de la formulación) -Grupo 2 (Formato de Nanocuerpo 1): TNF60 a una dosis final de 10 mg/kg -Grupo 3 (Formato de Nanocuerpo 1): TNF60 a una dosis final de 2-5 mg/kg -Grupo 4 (Formato de Nanocuerpo 1): TNF60 a una dosis final de 1 mg/kg -Grupo 5 (Formato de Nanocuerpo 2): TNF56-PEG40 a una dosis final de 10 mg/kg -Grupo 6 (Formato de Nanocuerpo 2): TNF56-PEG40 a una dosis final de 1.8 mg/kg -Grupo 7 (Formato de Nanocuerpo 2): TNF56-PEG40 a una dosis final de 0.7 mg/kg -Grupo 8 (Formato de Nanocuerpo 3): TNF56-biot a una dosis final de 1.8 mg/kg -Grupo 9 (Formato de Nanocuerpo t 4): TNF30 a una dosis final de 1 mg/kg -Grupo 10 (Formato de Nanocuerpo 5): TNF1 a una dosis final de I mg/kg -Grupo 11 (1er control positivo): Enbrel a una dosis final de 10 mg/kg -Grupo 12 (2do control positivo): Remicade a una dosis final de 10 mg/kg Para cada grupo, se indicaron las fechas de inyección y los volúmenes de inyección. Las inyecciones continuaron durante siete semanas. Durante este período, se registraron las puntuaciones clínicas por
la observación de cambios macroscópicos en la morfología de las articulaciones para cada animal.
A las 10 semanas, todos los ratones se sacrificaron y se recolectaron suero y articulaciones. Los sueros se conservaron a -70°C y las articulaciones del tobillo se conservaron en formalina. En los grupos seleccionados, las articulaciones del tobillo se incluyeron en parafina y se cortaron en secciones. Las
secciones de las articulaciones del tobillo posteriormente se usaron para la evaluación histopatológica de la progresión de la enfermedad. Los resultados se ilustran en la figura 60.
Ejemplo 63: Estudio farmacocinética de Nanocuerpo anti-TNF-d TNF60 (TNF60) y TNFS6-PEG40 en mono rhesus Los monos rhesus criados en cautiverio (Macaca mulatta) se usan para determinar el perfil farmacocinética de TNF60 y TNF56-PEG40.
Se usan dieciséis animales en este estudio (ocho machos y ocho hembras) y se dividen en cuatro grupos (dos machos y dos hembras por grupo). Todos los animales pesaban aproximadamente 5 kg y están libres de enfermedad durante al menos seis semanas antes de usar. Sniff® Pri vegetarisch V3994 sirve como alimento. Se ofrecen sesenta g/kg b.w. a cada mono. El residuo se retira. A intervalos regulares (al menos dos veces al año) se analiza el alimento sobre l la base
de EPA/USA para contaminantes por LUFA-ITL. Se ofrece agua corriente ad libitum. Los animales de cada grupo de tratamiento se alojan en un bloque de varias jaulas adyacentes dentro de la unidad de los monos. Los monos se mantienen en forma individual en jaulas de acero V2A con un tamaño de 90 cm x 82 cm x 96 cm. La temperatura ambiente se mantiene a 23°C ± 3°C (rango máximo) y la humedad relativa a 60% ± 20% (rango máximo). Las desviaciones del rango máximo causadas por ejemplo durante el procedimiento de limpieza se tratan con las SOP. Las habitaciones son iluminadas y oscurecidas durante períodos de 12 horas cada uno.
Dos grupos se infunden con TNF60 y dos grupos se infunden con TNF56-PEG40.
Las infusiones intravenosas de TNF60 y TNF56-PEG40 (disuelto en PBS) en la vena cefálica del brazo derecho o izquierdo mediante catéteres permanentes y una bomba de infusión de TSE (ver a continuación) se administran a una dosis fija de 2 mg/kg.
Se realizan cuatro administraciones únicas separadas por un período de lavado de al menos catorce días. Después de la última administración el perído de seguimiento es al menos de ocho semanas. Dos de cuatro grupos se tratan con TNF60 o TNF56-PEG40 en combinación con metotrexato (MTX) (disuelto en PBS). El Grupo 2 se trata con TNF60 y MTX; el grupo 4 se trata con TNF56-PEG40 y MTX. MTX se administra en forma semana por vía intramuscular a razón de 0,2 mg/kg. En los días de administración días, MTX se aplica aproximadamente 30 minutos antes de la administración. La dosificación comienza en la primera administración del Nanocuerpo y continuará a lo largo de ocho semanas de lavado después de la cuarta dosis. Existen catorce administraciones de MTX individuales, separadas por un período de lavado de al menos una semana a partir de la primera administración del artículo de ensayo.
Ejemplo 64: Estudios de fibroblastos derivados del sinovio
En este estudio se evaluó la capacidad de los productos biológicos anti-TNF, ALX0071 y Etanercept, de atenuar la producción de IL inducida por TNF-d por parte de fibroblastos derivados del sinovio
Aislamiento de fibroblastos sinoviales
El tejido articular sinovial de pacientes RA en consentimiento se conservó en medio basado en DMEM con antibióticos a 4°C durante hasta 96 horas después de la cirugía de reemplazo de articulación. Las células sinoviales se aislaron de sinovio disecado por digestión con colagenasa a 37 °C durante 2 horas. La suspensión celular resultante posteriormente se lavó con una serie de etapas de centrifugación y resuspensión y las células resultantes posteriormente se cultivaron a 37 °C en medio de cultivo basado en DMEM suplementado con 10% de FCS (v/v). Los fibroblastos resultantes se usaron para el siguiente experimento en el segundo o tercer pasaje. Las células de cuatro dadores se usaron en los experimentos individuales. Los fibroblastos se sembraron en placas de poliestireno de parte inferior plana de 96 pocillos a razón de 1,5 x104 células en un volumen final de 250 Il de medio de Rultivo basado en OMEM suplementado Ron 10% de FCS (v/v) por pocillo y se cultivaron durante toda la noche.
Estimulación de fibroblastos sinoviales
Las células posteriormente se incubaron durante 72 horas en medio de cultivo basado en DMEM suplementado con TNF-d a razón de 50 ng por ml (3 nM (R&D Systems 210-TA/CF) solo o en presencia de dosis crecientes de ALX0071 (0,575 a 1920 ng por ml; 0,015 a 50 50 nM) o Etanercept (Wyeth Labs; 3,75 a 11250 ng por ml; 0,025 a 75 uM). El volumen final en Rada poRillo fue 250 Il y Rada evaluaRi
ón se realizó por triplicado. Después de 72 horas, el medio sobrenadante se extrajo y conservó a -40 °C antes del análisis por ELISA IL-6 (R&D Systems). Se determinó la inhibición de la producción de IL-6 inducida por TNF-d y se RalRularon los valores de Ic50 para l.X007I y EtanerRept
Síntesis de resultados
Tanto ALX1007I como Etanercept redujeron la producción de IL-6 inducida por TNF-d en forma dependiente de la dosis por parte de los fibroblastos derivados de sinovio RA de los cuatro dadores. Hubo una potencia similar entre los dos reactivos en estas condiciones de ensayo.
Ejemplo 65: Estudios de bolsa de aire murina
En este estudio se evaluó la capacidad de los productos biológicos anti-TNF, ALX1007I y Etanercept, de atenuar la infiltración celular inducida por TNF-d en una bolsa de aire murina
Creación de bolsa de aire
Las bolsas de aire se formaron por la inyección subcutánea (s.c.) de 2,5 mL de aire estéril en la superficie dorsal de ratones macho C57B1/6/J anestesiados (25-30 g, Harlan). La bolsa se infló por la inyección de 2,5 ml de aire estéril 3 días después.
Estimulación de TNF-d
Seis días después de la creación inicial de la bolsa de aire, los animales se anestesiaron y la bolsa se inyectó con 1 ml de 0,5% de vehículo carboximetilcelulosa (CMC) que contiene 0,1 Ig de TNF-d reRombinante humano (R & O Systems, 210-TA-050/CF). En tres grupos diferentes de animales, ALX007I (0,0625, 0,125 y 0,25 mg/kg) se inyectó s.c. 19 horas antes de la inyección de TNF-d Se inyeRtaron tres grupos segundos de animales (s.c.) con Etanercept (Wyeth Labs, 0,125, 0,25 y 0,5 mg/kg) inmediatamente antes de la inyección de TNF-d
24 horas después de la inyección de TNF-d, los ratones se saRrifiRaron Ron una RonRentraRión creciente de CO 2. Las
5 bolsas se lavaron con 2 ml de PBS estéril libre de endotoxina que contiene 5 UI/ml de heparina. Los volúmenes se registraron y se separaron alícuotas de 0,5 ml para el recuento de la población total de leucocitos (WBC) en un contador de células Sysmex XT-Vet. Se calcularon la media y el error estándar de la media (SEM) de los recuentos WEC totales para cada grupo per ml fluido de lavado extraído. El análisis estadístico fue por ANOVA con pos-prueba Kruskal-Wallis sobre los datos transformados.
10 Síntesis de resultados
Tanto ALX0071 como Etanercept atenuaron la infiltración de WBC inducida por TNF-d en las bolsas de aire (Tabla) Si bien esta atenuación alcanzó valor estadístico en ambos grupos de dosis de ALX0071 0,125 (P<0,01) y 0,25 mg/kg (P<0,05), no se observó significancia estadística con ningún grupo de dosis de Etanercept.
Tabla 8 (PMP1C2 es un nanocuerpo de acuerdo con la invención)
Los expertos en la técnica reconocerán o serán capaces de establecer mediante no más que experimentación de rutina muchos equivalentes para las realizaciones específicas de la invención descritas en la presente.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Ablynx N.V.
<120> Nanocuerpos™ mejorados contra el factor de necrosis tumoral alfa
<130> P05-004PCT 5 <160> 435
<110> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 26
<212> PRT 10 <213> -
<220>
<221> característica_miscelánea
<222> (11) .. (11)
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<210> 2
<211> 14
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<222> (2)..(2)
<223> Residuo marcador
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<221> característica_miscelánea
<222> (9)..(9)
<223> Residuo marcador
<220> 30 <221> característica_miscelánea
<222> (10)..(10)
<223> Residuo marcador
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<221> característica_miscelánea 35 <222> (12)..(12)
<223> Residuo marcador
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3 40 <211> 32
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<223> Residuo marcador
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<221> característica_miscelánea
<222> (22)..(22)
<223> Residuo marcador
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4 10 <211> 11
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<221> característica_miscelánea 15 <222> (1)..(1)
<223> Residuo marcador
<220>
<221> característica_miscelánea
<222> (2)..(2) 20 <223> Residuo marcador
<220>
<221> característica_miscelánea
<222> (6)..(6)
<223> Residuo marcador
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<213> -
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<210> 95
<211> 115
<212> PRT
<213> -
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<212> PRT
<213> -
<400> 96
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<213> -
<400> 97
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<211> 129
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<213> -
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<212> PRT
<213> -
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<213> -
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<213> -
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<213> -
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<213> -
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<211>
115 10 <212> PRT
<213> -
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<211> 130
<212> PRT
<213> -
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<211> 122
<212> ?RT
<213> -
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<213> -
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<213> -
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<211> 121
<212> PRT
<213> -
<400> 109
10 <210> 110
<211> 124
<212> PRT
<213> -
<220> 15 <221> característica_miscelánea
<222> (1)..(4)
<223> restos de aminoácidos desconocidos, probablemente EVQL, QVQL o una secuencia similar
<400> 110
5 <210> 111
<211> 120
<212> PRT
<213> -
<220> 10 <221> característica_miscelánea
<222> (77)..(77)
<223> Resto de aminoácido desconocido
<400> 111
15 <210> 112
<211> 127
<212> PRT
<213> -
<400> 112
<210> 113
<211> 124
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<213> -
<400> 113
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<213> -
<400> 115
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<211> 127
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<213> -
<400> 116
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<213> -
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<210> 118
<211> 117
<212> PRT
<213> -
<400> 118
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<212> PRT
<213> -
<400> 119
<210> 120
<211> 115
<212> PRT
<213> -
<400> 120
<210> 121
<211> 127
<212> PRT 5 <213> -
<220>
<221> característica_miscelánea
<222> (119)..(119)
<223> Resto de aminoácido desconocido
10 <400> 121
<210> 122
<211> 115 15 <212> PRT
<213> -
<400> 122
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<211> 121
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<213> -
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<210>
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<213> -
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<213> -
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<213> -
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<212> PRT
<213> -
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<211> 30
<212> PRT
<213> -
<220> 25 <221> característica_miscelánea
<222> (1)..(4)
<223> Resto de aminoácido desconocidos, probablemente EVQL, QVQL o una secuencia similar
<400> 144
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<211> 30
<212> PRT
<213> -
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<213> -
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<212> PRT
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<212> ?RT
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<212> PRT
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<213> -
<400> 258
<210> 259
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 259
<210> 260
<211> 17
<212> PRT
<213> -
30 <400> 260
<210> 261
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 261
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<213> -
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<212> PRT
<213> -
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20 <210> 264
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<212> PRT
<213> -
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<212> PRT 20 <213> -
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<213> -
<400> 270
<210> 271 30 <211> 32
<212> PRT
<213> -
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<212> PRT
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<211> 32
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<213> -
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<212> PRT
<213> -
<400> 275
<210> 276
<211> 31
<212> PRT
<213> -
30 <400> 276 <210> 277
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 277
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<212> PRT
<213> -
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<212> PRT
<213> -
<400> 279
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<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 280
<210> 281
<211> 32
<212> PRT
<213> -
30 <220>
<221> característica_miscelánea
<222> (11)..(11)
<223> resto de aminoácido desconocido
<400> 281
<210> 282
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 282
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<211> 31
<212> PRT
<213> -
<400> 283
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<211> 32
<212> PRT
<213> -
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<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 285
<210> 286
<211> 32
<212> PRT
<213> -
30 <400> 286 <210> 287
<211> 32
<212> PRT
<213> -
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<213> -
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<213> -
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<213> -
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<212> PRT
<213> -
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<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 294
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<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 295
<210> 296
<211> 32
<212> PRT
<213> -
30 <400> 296
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<212> PRT
<213> -
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<213> -
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<212> PRT
<213> -
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<212> PRT
<213> -
30 <400> 301
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<211> 6 <212> PRT
<213> -
<400> 302
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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15 <400> 324
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<211> 18
<212> PRT 20 <213> -
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<210> 326
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<213> -
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<212> PRT
<213> -
<400> 327
35 <210> 328
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<212> PRT
<213> -
<400> 328
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<211> 12
<212> PRT
<213> -
<400> 329
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<211> 6
<212> PRT
<213> -
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<212> PRT
<213> -
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<213> -
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<213> -
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<213> -
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<213> -
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<213> -
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<213> -
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<213> -
<400> 339
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<211> 11
<212> PRT
<213> -
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<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 341
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<213> -
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<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 343
<210> 344
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 344
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<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 345
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<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 346
<210> 347
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 347
<210> 348
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 348
<210> 349
<211> 11 <212> PRT
<213> -
<400> 349
<210> 350
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 350
<210> 351
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 351
<210> 352
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 352
<210> 353
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 353
<210> 354
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 354
<210> 355
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 355 <210> 356
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 356
<210> 357
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 357
<210> 358
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 358
<210> 359
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<220>
<221> característica_miscelánea
<222> (3)..(3)
<223> Resto de aminoácido desconocido, probablemente Q
<400> 359
<210> 360
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 360
<210> 361
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 361
<210> 362
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 362
<210> 363
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 363
<210> 364
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 364
<210> 365
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 365
<210> 366
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 366
<210> 367
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 367
<210> 368
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 368 <210> 369
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 369
<210> 370
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 370
<210> 371
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 371
<210> 372
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 372
<210> 373
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 373
<210> 374
<211> 30
<212> PRT
<213> -
<400> 374
<210> 375
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 375
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<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 376
<210> 377
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 377
<210> 378
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 378
<210> 379
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 379
<210> 380
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 380 <210> 381
<211> 5
<212> PRT
<213> -
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<212> PRT
<213> -
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<212> PRT
<213> -
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<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 384
<210> 385
<211> 14
<212> PRT
<213> -
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<213> -
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<210> 387
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 387
<210> 338
<211> 14
<212> PRT
<213> -
<400> 388
<210> 389
<211> 17
<212> PRT 10 <213> -
<400> 389
<210> 390
<211> 16 15 <212> PRT
<213> -
<400> 390
<210> 391 20 <211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 391
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<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 392
<210> 393
<211> 17
<212> PRT
<213> -
35 <400> 393 <210> 394
<211> 17
<212> PRT
<213> -
<400> 394
<210> 395
<211> 18
<212> PRT
<213> -
<400> 395
<210> 396
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 396
<210> 397
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 397
<210> 398
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 398
<210> 399
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 399
<210> 400
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 400
<210> 401 10 <211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 401
15 <210> 402
<211> 32
<212> PRT
<213> -
<400> 402
<210> 403
<211> 8
<212> PRT
<213> -
25 <400> 403
<210> 404
<211> 8
<212> PRT 30 <213> -
<400> 404
<210> 405
<211> 6 <212> PRT
<213> -
<400> 405
<210> 406
<211> 7
<212> PRT
<213> -
<400> 406
<210> 407
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 407
<210> 408
<211> 5
<212> PRT
<213> -
<400> 408
<210> 409
<211> 13
<212> PRT
<213> -
<400> 409
<210> 410
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 410
<210> 411
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 411 <210> 412
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 412
<210> 413
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 413
<210> 414
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 414
<210> 415
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 415
<210> 416
<211> 11
<212> PRT
<213> -
<400> 416
<210> 417
<211> 363
<212> PRT
<213> -
<400> 417
<210> 418
<211> 379
<212> PRT
<213> -
<400> 418
<210> 419
<211> 260
<212> PRT
<213> -
<400> 419
<210> 420
<211> 264
<212> PRT
<213> -
<400> 420
5
<210> 421 <211> 20 <212> DNA <213> -
<400> 421
ggataacaat ttcacacagg
20
10
<210> 422 <211> 55
<212> DNA <213> -
<400> 422
tcagtaacct ggatccgcca ccgctgcctc caccgcctga ggagacggtg accag
55
<210> 423 <211> 39 <212> DNA <213> -
<400> 423
aggttactga ggatccgagg tgcagctggt ggagtctgg
39
<210> 424 <211> 46 <212> DNA <213> -
<400> 424
tcagtaacct tccggaaccg ccaccgcctg aggagacggt gacaag
46
<210> 425 <211> 48 <212> DNA <213> -
<400> 425
aggtcactga tccggaggcg gtagcgaggt gcagctggtg gagtctgg
48
<210> 426 <211> 19 <212> DNA <213> -
<400> 426
cacgacgttg taaaacgac
19
<210> 427 <211> 43 <212> DNA <213> -
<400> 427
atggtggtgt gcggccgcct attatgagga gacggtgacc agg
43
<210> 428 <211> 45 <212> DNA <213> -
<400> 428
aggggtatct ctcgagaaaa gagaggtgca gctggtggag tctgg
45
<210> 429 <211> 56 <212> DNA <213> -
<400> 429
gctaaagaag aaggggtatc tctcgagaaa agagaggtgc agctggtgga gtctgg
56
<210> 430
<211> 88
<212> DNA
<213> -
<400> 430
<210> 431
<211> 69
<212> DNA
<213> -
<400> 431
<210> 432
<211> 41
<212> DNA
<213> -
<400> 432
atggtggtgt gaattcttat tagcaggaga cggtgacaag g 41
<210> 433
<211> 53
<212> DNA
<213> -
<400> 433
atggtggtgt gaattcttat tagcaacctc cacctgagga gacggtgaca agg 53
<210> 434
<211> 21
<212> DNA
<213> -
<400> 434
gactggttcc aattgacaag c 21
<210> 435
<211> 21
<212> DNA
<213> -
<400> 435
gcaaatggca ttctgacatc c 21

Claims (78)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un nanocuerpo contra TNF-alfa que comprende cuatro regiones estructurales (FR1 a FR4) y tres regiones determinantes de complementariedad (CDR1 a CDR3), en el que:
    A) i) CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY;
    ii)CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; y
    iii) CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
    B) i) CDR1 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos DYWMY;
    ii) CDR2 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; y
    iii) CDR3 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos SPSGFN, en la que dicho nanocuerpo tiene un valor de EC50 en el ensayo basado en células por medio de las células KYM que se describen en el Ejemplo 1, bajo 3) del documento de WO 04/041862 que es mejor que 5 nM.
  2. 2.
    El nanocuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY.
  3. 3.
    El nanocuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG.
  4. 4.
    El nanocuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
  5. 5.
    El nanocuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que:
    CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o
    CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; o
    CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; y CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
  6. 6.
    El nanocuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
  7. 7.
    El nanocuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que CDR1 comprende la secuencia de aminoácidos DYWMY; CDR2 comprende la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; y CDR3 comprende la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
  8. 8.
    El nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en que:
    CDR1 tiene una diferencia de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos DYWMY, dicha diferencia es una sustitución conservadora de aminoácido;
    CDR2 tiene una o dos diferencias de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG, dicha diferencia es sustitución conservadora de aminoácido(s); y/o
    CDR3 tiene una diferencia de la secuencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos SPSGFN, dicha diferencia es a sustitución conservadora de aminoácido.
  9. 9.
    El nanocuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY.
  10. 10.
    El nanocuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que CDR2 es la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG.
  11. 11.
    El nanocuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
  12. 12.
    El nanocuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que: CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR3 consiste en la secuencia de aminoácidos SPSGFN; o CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR2 consiste en la secuencia de aminoácidos EINTNGLI
    TKYPDSVKG; o
    CDR2 es la secuencia de aminoácidos EINTNGLITKYPDSVKG; y CDR3 consiste en la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
  13. 13.
    El nanocuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY; y CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
  14. 14.
    El nanocuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, en el que CDR1 es la secuencia de aminoácidos DYWMY: CDR2 es la secuencia de aminoácidos EINTNGLiTKYP®SVKG: y CDR3 es la secuencia de aminoácidos SPSGFN.
  15. 15.
    El nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 que es un nanocuerpo humanizado.
  16. 16.
    El nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-15 que es un nanocuerpo clase GLEW en el que la secuencia de aminoácidos en las posiciones 44-47 de acuerdo con la numeración de Kabat se selecciona del grupo que consiste en GLEW, GVEW, EPEE/, GLER, DGEW, DLEW, GIEW, ELEW, GPEW, EWLP, GPER, GLER y ELFIN,
  17. 17.
    El nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-16 que contiene un residuo de arginina (R) en la posición 103.
  18. 18.
    El nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una de las secuencias de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NOs 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29), y 96 (TNF30).
  19. 19.
    El nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con una de las secuencias de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NOs 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29), y 96 (TNF30).
  20. 20.
    El nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con una de las secuencias de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NOs 52 (TNF1), 75 (TNF1 3), 77 (TNF14), 95 (TNF29), y 96 (TNF30).
  21. 21.
    El nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-17 que tiene al menos 99% de identidad de secuencia con una de las secuencias de aminoácidos seleccionada de las SEQ ID NOs 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29), y 96 (TNF3O).
  22. 22.
    El nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-21 que contiene un residuo de leucina (1) en la posición 108.
  23. 23.
    El nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-22, en el que el nanocuerpo se elige del grupo que consiste en TNF 13 (SEQ ID NO: 76), TNF 14 (SEQ ID NO: 77), TNF 29 (SEQ ID NO: 95), y TNF 30 (SEQ ID NO: 96).
  24. 24.
    El nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las 1-23 que es TNF 30 (SEQ ID NO: 96).
  25. 25.
    El nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-24, que es una variante humanizada de un nanocuerpo no humanizado contra TNF-alfa, tal nanocuerpo no humanizado contra TNF-alfa tiene las siguientes secuencias estructurales: FR1: SEQ ID NO: 130; FR2: SEQ ID NO: 196; FR3: SEQ ID NO: 266; y FR4: SEQ ID NO:
  26. 334.
  27. 26.
    El nanocuerpo de acuerdo con la reivindicación 25, que se dirige contra el mismo epitope de TNF como TNF1 (SEQ ID NO: 52).
  28. 27.
    El nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-25, en el que el nanocuerpo se dirige contra el mismo epitope en el trímero de TNF-alfa como nanocuerpo TNF1 (SEQ ID NO: 52).
  29. 28.
    El nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-25, en el que el nanocuerpo se dirige contra el mismo epitope de trímero de TNF-alfa como nanocuerpo TNF3 (SEQ ID NO: 60).
  30. 29.
    El nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-28, en el que el nanocuerpo es una variante humanizada del nanocuerpo TNF1 (SEQ ID NO: 52).
  31. 30.
    Un polipéptido que comprende al menos un nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-29.
  32. 31.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 30, en el que el polipéptido consiste esencialmente en un nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-29.
  33. 32.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 30, en el que el polipéptido comprende dos nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-29.
  34. 33.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 32 que comprende dos nanocuerpos TNF30 (SEC) ID NO: 96).
  35. 34.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 32 o 33, que después de la unión a un trímero de TNF, es capaz de inhibir o reducir el entrecruzamiento del receptor TNF que está mediado por dicho trímero TNF y/o la transducción de señales que está mediada por tal entrecruzamiento del receptor.
  36. 35.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 32 o 33, en el que el polipéptido es capaz de unirse en forma intramolecular a al menos dos sitios de unión del receptor TNF en un trímero TNF.
  37. 36.
    El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 32-35, en el que los dos nanocuerpos se unen directamente entre sí.
  38. 37.
    El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 32-35, en el que los dos nanocuerpos se unen directamente entre sí por medio de un ligador.
  39. 38.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 37, en el que el ligador es una secuencia de aminoácidos.
  40. 39.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 38, en el que el ligador es una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 14 aminoácidos.
  41. 40.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 38, en el que el ligador es una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 17 aminoácidos.
  42. 41.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 38, en el que el ligador es una secuencia de aminoácidos que comprende 20 a 40 aminoácidos.
  43. 42.
    El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 39-41, el que el ligador comprende residuos de glicina y serina.
  44. 43.
    El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 32-42, que comprende el polipéptido TNF 7 (SEQ ID NO: 73), en que los nanocuerpos TNF 1 se han humanizado.
  45. 44.
    El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 32-43, que comprende el polipéptido TNF 55 (SEQ ID NC: 419) o TNF 56 (SEC ID NO: 420).
  46. 45.
    El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 30-44, en el que el polipéptido está pegilado.
  47. 46.
    El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 30-43, que además comprende al menos un nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana.
  48. 47.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 46, en el que el al menos un nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana tiene las secuencias de CDR presentes en la ALB 8 (SEQ ID NO: 102).
  49. 48.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 32, que comprende dos nanocuerpos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-29 y que además comprende al menos un nanocuerpo dirigido contra la albúmina sérica humana.
  50. 49.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 48, en el que los dos nanocuerpos contra TNF se unen directamente al nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana.
  51. 50.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 48, en el que los dos nanocuerpos contra TNF se unen al nanocuerpo dirigido contra la albúmina sérica humana por medio de un ligador.
  52. 51.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 50, en el que el ligador es una secuencia de aminoácidos.
  53. 52.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 50 o 51, en el que el ligador es una secuencia de aminoácidos que comprende 3 a 40 aminoácidos.
  54. 53.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 50 o 51, en el que el ligador es una secuencia de aminoácidos que comprende 5 a 15 aminoácidos.
  55. 54.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 50 o 51, en el que el ligador comprende residuos de glicina y serina.
  56. 55.
    El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 46-54, en el que al menos un nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana tiene las secuencias de CDR presentes en la ALB 8 (SEQ iD NO: 102).
  57. 56.
    El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 48.55, en el que al menos un nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana es un nanocuerpo humanizado.
  58. 57.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 56, en el que al menos un nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana es una variante humanizada del nanocuerpo ALB 1 (SEQ ID NO: 63).
  59. 58.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 56, en el que al menos un nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana se elige del grupo que consiste en ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB 5 (SEQ ID NO: 89), ALB 8 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB 8 (SEQ ID NO: 102), ALB 9 (SEQ ID NO: 103), y ALB 10 (SEQ ID NO: 104).
  60. 59.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 58, en el que al menos un nanocuerpo dirigido contra albúmina sérica humana es ALB 8 (SEQ ID NO: 102).
  61. 60.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 48-58, que comprende dos nanocuerpos que son variantes humanizadas de un nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-29 y una variante humanizada del nanocuerpo ALB 1 (SEQ ID NO: 63).
  62. 61.
    El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 48-60, en que ambos el nanocuerpo TNF1 (SEQ ID NO: 52) así como el nanocuerpo ALB I (SEQ ID NO: 63) se ha humanizado.
  63. 62.
    El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 48-61, que comprende dos nanocuerpos TNF 30 (SEQ ID NO: 96) y un Nanocuerpo ALB 8 (SEQ ID NO: 102).
    63, El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 48-62, que comprende el polipéptido TNF 60 (SEQ ID NO: 417).
  64. 64.
    El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 48-62, que consiste en el polipéptido TNF 60 (SEQ ID NO: 417).
  65. 65.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 30, en el que el polipéptido tiene al menos 80% de identidad de secuencia con el polipéptido TNF 60 (SEQ ID NO: 417).
  66. 66.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 30, en el que el polipéptido tiene al menos 90% de identidad de secuencia con el polipéptido TNF 60 (SEQ ID NO: 417).
  67. 67.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 30, en el que el polipéptido tiene al menos 95% de identidad de secuencia con el polipéptido TNF 60 (SEQ ID NO: 417).
  68. 68.
    El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 30, en el que el polipéptido tiene al menos 99% de identidad de secuencia con el polipéptido TNF 60 (SEQ ID NO: 417).
  69. 69.
    Un ácido nucleico que comprende: (a) un ácido nucleico que codifica un nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-29; o (b) un ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 30-68.
  70. 70.
    Una célula huésped que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 69.
  71. 71.
    Una célula huésped que es capaz de expresar: (a) un nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-29; o (b) un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 30-68.
  72. 72.
    Un procedimiento para preparar un nanocuerpo, que comprende cultivar o mantenimiento de una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 70 o 71 en condiciones tales que dicha célula huésped produce un nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-29; o en condiciones tales que dicha célula huésped produces un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 30-68.
  73. 73.
    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 72, que además comprende aislar el nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-29.
  74. 74.
    El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 72, que además comprende aislar el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 30-68.
  75. 75.
    Una composición farmacéutica, que comprende (a) al menos un nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-29, y opcionalmente al menos un portador farmacéuticamente aceptable; o (b) al menos un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 30-68, y opcionalmente al menos un portador farmacéuticamente aceptable.
  76. 76.
    Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 75, que comprende al menos un nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-29, y opcionalmente al menos un portador farmacéuticamente aceptable, para usar en el tratamiento de al menos una enfermedad seleccionada de inflamación, artritis reumatoide, COPD, asma, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome intestinal inflamatorio, esclerosis múltiple, enfermedad de Addison, hepatitis autoinmune, parotiditis autoinmune, Diabetes Tipo I, epididimitis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, Lupus eritematoso sistémico, Infertilidad masculina, esclerosis múltiple, miastenia gravis, pénfigo, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, tiroiditis, y vasculitis.
  77. 77.
    Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 75, que comprende al menos un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 30-68, y opcionalmente al menos un portador farmacéuticamente aceptable, para usar en el tratamiento de al menos una enfermedad seleccionada de inflamación, artritis reumatoide, COPD, asma, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome intestinal inflamatorio, esclerosis múltiple, enfermedad
    5 de Addison, hepatitis autoinmune, parotiditis autoinmune, diabetes Type 1, epididimitis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, lupus eritematoso sistémico, fertilidad masculina, esclerosis múltiple, miastenia gravis, pénfigo, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, tiroiditis, y vasculitis.
  78. 78. Uso de (a) un nanocuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-29; o (b) a polipéptido de acuerdo
    10 con cualquiera de las reivindicaciones 30-68 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de al menos una enfermedad seleccionada de inflamación, artritis reumatoide, COPD, asma, enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, síndrome intestinal inflamatorio, esclerosis múltiple, enfermedad de Addison, hepatitis autoinmune, parotiditis autoinmune, Diabetes Type 1, epididimitos, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, Lupus eritematoso sistémico, infertilidad masculina, esclerosis múltiple,
    15 miastenia gravis, pénfigo, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma, síndrome de Sjogren. espondiloartropatías, tiroiditis, y vasculitis
    Figura 2
    Detección de nanocuerpos específicos de albúmina versus SA humano
    Detección de nanocuerpos específicos de albúmina versus SA rhesus
    Detección de nanocuerpos específicos de albúmina versus SA de monos
    Figura 21-continuación
    1G5WT y versiones humanizadas versus TNF humana (datos normalizados)
    6A6 WTy versiones humanizadas versus TNF humana (datos normalizados)
    Figura 30
    Figura 33
    Figura 40
    Figura 53
    Figura 54
    Figura 57
    Figura 59
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LT (1) LT2949668T (es)
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NI (1) NI200700291A (es)
NO (2) NO338568B1 (es)
NZ (1) NZ562695A (es)
PL (3) PL1888640T3 (es)
PT (2) PT1888641E (es)
RU (2) RU2464276C2 (es)
SG (2) SG184709A1 (es)
SI (3) SI1888640T1 (es)
TW (2) TWI439467B (es)
WO (2) WO2006122786A2 (es)
ZA (3) ZA200709867B (es)

Families Citing this family (276)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005289809A (ja) * 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
US9321832B2 (en) * 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
US9453251B2 (en) 2002-10-08 2016-09-27 Pfenex Inc. Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens
US9320792B2 (en) 2002-11-08 2016-04-26 Ablynx N.V. Pulmonary administration of immunoglobulin single variable domains and constructs thereof
US20060034845A1 (en) 2002-11-08 2006-02-16 Karen Silence Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor
NZ563471A (en) 2002-11-08 2009-04-30 Ablynx Nv Camelidae antibodies against imminoglobulin E and use thereof for the treatment of allergic disorders
US8603824B2 (en) 2004-07-26 2013-12-10 Pfenex, Inc. Process for improved protein expression by strain engineering
EP2949668B1 (en) 2005-05-18 2019-08-14 Ablynx N.V. Improved nanobodies tm against tumor necrosis factor-alpha
DE102005023617A1 (de) * 2005-05-21 2006-11-23 Aspre Ag Verfahren zum Mischen von Farben in einem Display
US20070269422A1 (en) * 2006-05-17 2007-11-22 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
WO2008028977A2 (en) * 2006-09-08 2008-03-13 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
CN101528767A (zh) 2006-10-11 2009-09-09 埃博灵克斯股份有限公司 以基本不依赖pH的方式结合血清蛋白的氨基酸序列、包括其的化合物、及其用途
WO2008071685A1 (en) * 2006-12-13 2008-06-19 Ablynx N.V. Polypeptides specific for complexes involved in receptor-mediated signaling, such as the il-6/il-6 receptor complex
AU2007331672A1 (en) * 2006-12-15 2008-06-19 Ablynx N.V. Amino acid sequences that modulate the interaction between cells of the immune system
US20100062004A1 (en) 2006-12-19 2010-03-11 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against gpcrs and polypeptides comprising the same for the treatment of gpcr-related diseases and disorders
EP2514767A1 (en) 2006-12-19 2012-10-24 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against a metalloproteinase from the ADAM family and polypeptides comprising the same for the treatment of ADAM-related diseases and disorders
US9512236B2 (en) 2006-12-19 2016-12-06 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against GPCRS and polypeptides comprising the same for the treatment of GPCR-related diseases and disorders
WO2008074868A1 (en) * 2006-12-20 2008-06-26 Ablynx N.V. Oral delivery of polypeptides
CA2678218A1 (en) * 2007-02-21 2008-08-28 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against vascular endothelial growth factor and polypeptides comprising the same for the treatment of conditions and diseases characterized by excessive and/or pathological angiogenesis or neovascularization
EP2615172A1 (en) 2007-04-27 2013-07-17 Pfenex Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
US9580719B2 (en) 2007-04-27 2017-02-28 Pfenex, Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
CN101796072B (zh) 2007-05-24 2014-09-24 埃博灵克斯股份有限公司 用于治疗骨疾病和病症的针对rank-l的氨基酸序列以及包括其的多肽
CN101802009A (zh) 2007-07-03 2010-08-11 埃博灵克斯股份有限公司 通过突变cdr和/或fr位点提供改进的免疫球蛋白序列
EP2195341B1 (en) * 2007-09-26 2017-03-22 UCB Biopharma SPRL Dual specificity antibody fusions
KR20100097716A (ko) 2007-11-27 2010-09-03 아블린쓰 엔.브이. 이종이량체 사이토킨 및/또는 이의 수용체에 대한 아미노산 서열과 이를 포함하는 폴리펩티드
CA2717015A1 (en) * 2008-03-05 2009-09-11 Ablynx Nv Novel antigen binding dimer-complexes, methods of making and uses thereof
GB0809069D0 (en) 2008-05-19 2008-06-25 Univ Leuven Kath Gene signatures
AU2009235467A1 (en) 2008-04-07 2009-10-15 Ablynx Nv Single variable domains against the Notch pathways
CA2721202A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Hilde Adi Pierrette Revets Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
US8444976B2 (en) 2008-07-02 2013-05-21 Argen-X B.V. Antigen binding polypeptides
PT2334705T (pt) 2008-09-26 2017-03-22 Ucb Biopharma Sprl Produtos biológicos
JP6113404B2 (ja) * 2008-10-29 2017-04-12 アブリンクス エン．ヴェー． 単一ドメイン抗原結合分子の精製方法
AU2013202856B2 (en) * 2008-10-29 2016-02-11 Ablynx N.V. Formulations of single domain antigen binding molecules
CN102271707B (zh) * 2008-10-29 2015-04-08 阿布林克斯公司 单域抗原结合性分子的制剂
EP2403873A1 (en) 2009-03-05 2012-01-11 Ablynx N.V. Novel antigen binding dimer-complexes, methods of making/avoiding and uses thereof
US9265834B2 (en) * 2009-03-05 2016-02-23 Ablynx N.V. Stable formulations of polypeptides and uses thereof
SG174862A1 (en) 2009-04-10 2011-11-28 Ablynx Nv Improved amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of il-6r related diseases and disorder
AU2010243551B2 (en) 2009-04-30 2015-03-26 Ablynx Nv Method for the production of domain antibodies
KR101852204B1 (ko) 2009-06-05 2018-04-26 아블린쓰 엔.브이. 기도 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 일가, 이가 및 삼가 항 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (ｈｒｓｖ) 나노바디 구조물
WO2011003622A1 (en) 2009-07-10 2011-01-13 Ablynx N.V. Method for the production of variable domains
ES2531083T3 (es) 2009-09-03 2015-03-10 Ablynx Nv Formulaciones estables de polipéptidos y usos de las mismas
GB201005063D0 (en) 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
US20110172398A1 (en) 2009-10-02 2011-07-14 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules for anti-angiogenesis therapy
UY32917A (es) 2009-10-02 2011-04-29 Boehringer Ingelheim Int Moléculas de unión a dll-4
EP2507262A1 (en) 2009-11-30 2012-10-10 Ablynx N.V. Improved amino acid sequences directed against human respiratory syncytial virus (hrsv) and polypeptides comprising the same for the prevention and/or treatment of respiratory tract infections
EP3309176A1 (en) 2009-12-14 2018-04-18 Ablynx N.V. Immunoglobulin single variable domain antibodies against ox40l, constructs and therapeutic use
WO2011083141A2 (en) 2010-01-08 2011-07-14 Ablynx Nv Method for generation of immunoglobulin sequences by using lipoprotein particles
JP2013518853A (ja) 2010-02-05 2013-05-23 アブリンクス エン．ヴェー． 血清アルブミンと結合することが可能なペプチド並びにこれを含む化合物、構築物及びポリペプチド
US9120855B2 (en) 2010-02-10 2015-09-01 Novartis Ag Biologic compounds directed against death receptor 5
EP3501499B1 (en) 2010-02-11 2022-09-07 Ablynx NV Methods and compositions for the preparation of aerosols
EP2533814A2 (en) 2010-02-11 2012-12-19 Ablynx N.V. Delivery of immunoglobulin variable domains and constructs thereof
AR080446A1 (es) 2010-03-03 2012-04-11 Boehringer Ingelheim Int Polipeptidos de union a a-beta (beta amiloide)
EP2552962B1 (en) 2010-03-26 2016-03-23 Ablynx N.V. Immunoglobulin single variable domains directed against cxcr7
US9101674B2 (en) 2010-03-29 2015-08-11 Vib Vzw Targeting and in vivo imaging of tumor-associated macrophages
US9556273B2 (en) 2010-03-29 2017-01-31 Vib Vzw Anti-macrophage mannose receptor single variable domains for targeting and in vivo imaging of tumor-associated macrophages
EP2571901B1 (en) 2010-05-20 2019-01-02 Ablynx N.V. Biological materials related to her3
WO2011161263A1 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Ablynx Nv Pharmaceutical compositions for cutaneous administration
CN108314733A (zh) * 2010-07-16 2018-07-24 埃博灵克斯股份有限公司 修饰的单结构域抗原结合分子及其应用
US20120225081A1 (en) 2010-09-03 2012-09-06 Boehringer Ingelheim International Gmbh Vegf-binding molecules
WO2012042026A1 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Ablynx Nv Biological materials related to c-met
US11644471B2 (en) 2010-09-30 2023-05-09 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
US20130261288A1 (en) 2010-10-29 2013-10-03 Ablynx N.V. Method for the production of immunoglobulin single variable domains
EP2638068B1 (en) 2010-11-08 2018-12-26 Novartis AG Cxcr2 binding polypeptides
JP6173216B2 (ja) 2010-11-26 2017-08-02 モレキュラー・パートナーズ・アーゲーＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ Ａｇ 設計アンキリンリピートタンパク質のための改善されたキャッピングモジュール
DK2691415T3 (en) 2011-03-28 2018-10-29 Ablynx Nv PROCEDURE FOR PREPARING SOLID FORMULATIONS CONTAINING VARIABLE SINGLE DOMAINS OF IMMUNOGLOBULIN
AU2012234284B2 (en) * 2011-03-28 2015-10-08 Ablynx Nv Bispecific anti-CXCR7 immunoglobulin single variable domains
JP6130350B2 (ja) * 2011-03-30 2017-05-17 アブリンクス エン．ヴェー． ＴＮＦαに対する単一ドメイン抗体で免疫障害を処置する方法
US9527925B2 (en) 2011-04-01 2016-12-27 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2
US20130078247A1 (en) 2011-04-01 2013-03-28 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bispecific binding molecules binding to dii4 and ang2
UA117218C2 (uk) 2011-05-05 2018-07-10 Мерк Патент Гмбх Поліпептид, спрямований проти il-17a, il-17f та/або il17-a/f
WO2012152823A1 (en) 2011-05-09 2012-11-15 Ablynx Nv Method for the production of immunoglobulin single variable domains
WO2012163887A1 (en) 2011-05-27 2012-12-06 Ablynx Nv Inhibition of bone resorption with rankl binding peptides
EP2974737A1 (en) 2011-06-23 2016-01-20 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing a specific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
MX350074B (es) 2011-06-23 2017-08-25 Ablynx Nv Tecnicas para predecir, detectar, y reducir la interferencia de proteinas no especificas en ensayos que implican dominios variables individuales de inmunoglobulina.
AU2012271974B2 (en) * 2011-06-23 2017-01-12 Ablynx Nv Serum albumin binding proteins
EP2723772A1 (en) 2011-06-23 2014-04-30 Ablynx N.V. Immunoglobulin single variable domains directed against ige
EP4350345A2 (en) 2011-06-23 2024-04-10 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobin single variable domains
BR112014006929A2 (pt) 2011-09-23 2017-04-04 Technophage Investigação E Desenvolvimento Em Biotecnologia Sa agentes anti-fator de necrose tumoral-alfa e seus usos
DK2747782T3 (en) 2011-09-23 2018-04-23 Ablynx Nv Long-term inhibition of interleukin-6-mediated signal transmission
US9346884B2 (en) 2011-09-30 2016-05-24 Ablynx N.V. Biological materials related to c-Met
JP6219287B2 (ja) 2011-09-30 2017-10-25 アブリンクス エン．ヴェー． ｃ−Ｍｅｔに関連する生物学的物質
EP2820046B1 (en) 2012-02-27 2022-06-15 Ablynx N.V. Cx3cr1-binding polypeptides
ES2729165T3 (es) 2012-03-30 2019-10-30 Boehringer Ingelheim Int Moléculas de unión a ANG2
EP4151658A1 (en) 2012-05-07 2023-03-22 Elasmogen Limited Single domain binding molecule
US9328174B2 (en) 2012-05-09 2016-05-03 Novartis Ag Chemokine receptor binding polypeptides
CN104302177B (zh) 2012-05-17 2019-05-28 延伸生物科学股份有限公司 用于改进的药物递送的载体
ES2715279T3 (es) 2012-05-24 2019-06-03 Vib Vzw Dominios variables individuales inmunoglobulínicos anti-receptor de manosa de macrófagos para elegir como diana y obtener imágenes in vivo de macrófagos asociados a tumores
RU2530553C2 (ru) * 2012-11-07 2014-10-10 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) Рекомбинантное однодоменное антитело, способное специфически связывать фактор некроза опухолей человека, и его производные
US9315280B2 (en) * 2012-11-20 2016-04-19 Lockheed Martin Corporation Heat pipe with axial wick
WO2014087010A1 (en) 2012-12-07 2014-06-12 Ablynx N.V. IMPROVED POLYPEPTIDES DIRECTED AGAINST IgE
EP2931749B1 (fr) 2012-12-17 2019-04-24 Laboratoire Francais du Fractionnement et des Biotechnologies Societe Anonyme Utilisation d'anticorps monoclonaux pour le traitement de l'inflammation et d'infections bacteriennes
WO2014111550A1 (en) 2013-01-17 2014-07-24 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Modified anti-serum albumin binding proteins
JP6443344B2 (ja) 2013-01-30 2018-12-26 フエー・イー・ベー・フエー・ゼツト・ウエー スクリーニングおよび薬物開発のための新規キメラポリペプチド
PT2953973T (pt) 2013-02-05 2019-10-25 Univ Brussel Vrije Agentes de ligação do receptor muscarínico de acetilololina e usos
AU2014217569B2 (en) 2013-02-13 2018-10-25 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Cetuximab with modified glycosylation and uses thereof
ES2755181T3 (es) 2013-02-13 2020-04-21 Lab Francais Du Fractionnement Anticuerpos anti-TNF-alfa altamente galactosilados y usos de los mismos
JP2016509019A (ja) 2013-02-13 2016-03-24 ラボラトワール フランセ デュ フラクショヌマン エ デ ビオテクノロジーＬａｂｏｒａｔｏｉｒｅ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｆｒａｃｔｉｏｎｎｅｍｅｎｔ ｅｔ ｄｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ 高ガラクトシル化抗ｈｅｒ２抗体およびその使用
USRE48805E1 (en) 2013-03-06 2021-11-02 Vision Global Holdings Ltd. Method for cancer targeting treatment and detection of arginine using albumin-binding arginine deiminase fusion protein
US9255262B2 (en) 2013-03-06 2016-02-09 Vision Global Holdings Ltd. Albumin-binding arginine deminase and the use thereof
ES2872403T3 (es) 2013-03-14 2021-11-02 Childrens Medical Center Péptido Psap para el tratamiento de cánceres que expresan CD36
EP2968487B1 (en) 2013-03-15 2019-01-30 Vib Vzw Anti-macrophage mannose receptor single variable domains for use in cardiovascular diseases
EP3683312B1 (en) 2013-04-23 2022-09-07 Elasmogen Limited Synthetic library of specific binding molecules
NL1040254C2 (en) 2013-05-17 2014-11-24 Ablynx Nv Stable formulations of immunoglobulin single variable domains and uses thereof.
WO2015061182A1 (en) 2013-10-21 2015-04-30 Dyax Corp. Diagnosis and treatment of autoimmune diseases
JP6687525B2 (ja) 2014-01-30 2020-04-22 ブイアイビー ブイゼットダブリュＶｉｂ Ｖｚｗ オピオイド受容体結合剤およびその使用
BR112016022055A2 (pt) * 2014-03-26 2017-10-24 Cell Medica Switzerland Ag elementos de ligação ao tnf alfa
CA2946869A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 Immusant, Inc. Methods for diagnosing celiac disease using circulating cytokines/chemokines
ES2900852T3 (es) * 2014-05-16 2022-03-18 Ablynx Nv Métodos de detección y/o medición de anticuerpos anti-fármaco, en particular anticuerpos anti-fármaco que se presentan durante el tratamiento
CA2949816A1 (en) 2014-05-16 2015-11-19 Children's Hospital Medical Center Methods for assessing responsiveness to asthma treatment based on vnn-1 expression and promoter methylation
DK3248986T3 (da) 2014-05-16 2022-04-04 Ablynx Nv Variable immunoglobulindomæner
SG10201810124PA (en) 2014-05-16 2018-12-28 Ablynx Nv Improved immunoglobulin variable domains
NL2013661B1 (en) 2014-10-21 2016-10-05 Ablynx Nv KV1.3 Binding immunoglobulins.
PT3194976T (pt) 2014-07-22 2020-07-03 Univ Brussel Vrije Métodos para selecionar agentes que estabilizam complexos proteicos
CN117138060A (zh) 2014-10-07 2023-12-01 免疫医疗公司 抗体-药物缀合物的新辅助剂用途
EP3207048A4 (en) 2014-10-17 2018-05-30 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods of treating muscular dystrophy
JP6946182B2 (ja) 2014-10-22 2021-10-06 エクステンド バイオサイエンシズ インコーポレーテッドＥｘｔｅｎｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ 治療用ビタミンｄコンジュゲート
WO2016065052A1 (en) 2014-10-22 2016-04-28 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin d conjugates
US9789197B2 (en) 2014-10-22 2017-10-17 Extend Biosciences, Inc. RNAi vitamin D conjugates
US20170267784A1 (en) 2014-10-23 2017-09-21 Singh Molecular Medicine, Llc Single domain antibodies directed against intracellular antigens
KR101831123B1 (ko) 2014-10-23 2018-02-22 싱 바이오테크놀로지, 엘엘씨 세포내 항원에 대해 지향된 단일 도메인 항체
WO2016094555A1 (en) 2014-12-09 2016-06-16 New York University Clostridial neurotoxin fusion proteins, propeptide fusions, their expression, and use
PT3233910T (pt) 2014-12-19 2020-03-17 Ablynx Nv Dímeros de nanocorpos ligados a cisteína
ES2913200T3 (es) * 2015-03-31 2022-06-01 Sorriso Pharmaceuticals Inc Polipéptidos
ES2953482T3 (es) 2015-04-02 2023-11-13 Molecular Partners Ag Dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica
CN107428837A (zh) 2015-04-22 2017-12-01 免疫医疗公司 循环trop‑2阳性癌细胞的分离、检测、诊断和/或鉴定
JP7163028B2 (ja) 2015-05-13 2022-10-31 アブリンクス エン．ヴェー． Ｃｄ３反応性に基づくｔ細胞リクルートポリペプチド
EP3294768B1 (en) 2015-05-13 2019-08-21 Ablynx N.V. T cell recruiting polypeptides based on tcr alpha/beta reactivity
ES2889906T3 (es) 2015-05-21 2022-01-14 Harpoon Therapeutics Inc Proteínas de unión triespecíficas y usos médicos
GB201510758D0 (en) 2015-06-18 2015-08-05 Ucb Biopharma Sprl Novel TNFa structure for use in therapy
WO2017004142A1 (en) 2015-06-29 2017-01-05 Children's Medical Center Corporation Treatment for myopathy
SI3316885T1 (sl) 2015-07-01 2021-09-30 Immunomedics, Inc. Imunokonjugati protitelo-SN-38 z linkerjem CL2A
CA2998611A1 (en) 2015-09-14 2017-03-23 Leukemia Therapeutics, LLC Identification of novel diagnostics and therapeutics by modulating rhoh
TWI746473B (zh) 2015-11-02 2021-11-21 美商辛分子醫藥有限公司 針對細胞內抗原之單域抗體
NO2768984T3 (es) 2015-11-12 2018-06-09
DK3374392T3 (da) 2015-11-13 2022-02-14 Ablynx Nv Forbedrede serumalbuminbindende variable immunglobulindomæner
KR20190008171A (ko) 2015-11-13 2019-01-23 더 유나이티드 스테이츠 오브 어메리카, 애즈 리프리젠티드 바이 더 세크러테리, 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비씨즈 항-bcma 폴리펩티드 및 단백질
EP3377525A2 (en) * 2015-11-18 2018-09-26 Ablynx NV Improved serum albumin binders
AU2016355570B2 (en) 2015-11-18 2020-01-02 Merck Sharp & Dohme Llc PD1 and/or LAG3 binders
TWI754622B (zh) 2015-11-18 2022-02-11 美商默沙東藥廠 Ctla4結合劑
BR112018010085A2 (pt) 2015-11-18 2018-11-13 Merck Sharp & Dohme ligantes de pd1/ctla4
SG11201803976VA (en) 2015-11-27 2018-06-28 Ablynx Nv Polypeptides inhibiting cd40l
EA201891331A1 (ru) 2015-12-04 2018-12-28 Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх Бипаратопные полипептиды - антагонисты передачи сигнала wnt в опухолевых клетках
GB201522394D0 (en) * 2015-12-18 2016-02-03 Ucb Biopharma Sprl Antibodies
ES2877568T3 (es) 2016-02-05 2021-11-17 Orionis Biosciences Nv Agentes de unión de Clec9A
US10465003B2 (en) * 2016-02-05 2019-11-05 Janssen Biotech, Inc. Anti-TNF antibodies, compositions, methods and use for the treatment or prevention of type 1 diabetes
CN109069573B (zh) 2016-03-07 2022-04-05 弗拉芒区生物技术研究所 结合cd20的单结构域抗体
US20190127447A1 (en) 2016-05-02 2019-05-02 Ablynx N.V. Treatment of rsv infection
WO2017194782A2 (en) 2016-05-13 2017-11-16 Orionis Biosciences Nv Therapeutic targeting of non-cellular structures
EP3461261A4 (en) 2016-05-20 2019-12-04 Harpoon Therapeutics Inc. PROTEINS BINDING TO THE VARIABLE MONOCATERARY FRAGMENT OF CD3
MX2018014228A (es) 2016-05-20 2019-08-12 Harpoon Therapeutics Inc Proteina de union de albumina sérica de dominio unico.
US11623958B2 (en) 2016-05-20 2023-04-11 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment CD3 binding proteins
US20190195866A1 (en) 2016-06-23 2019-06-27 Ablynx N.V. Improved pharmacokinetic assays for immunoglobulin single variable domains
WO2018007442A1 (en) 2016-07-06 2018-01-11 Ablynx N.V. Treatment of il-6r related diseases
WO2018029182A1 (en) 2016-08-08 2018-02-15 Ablynx N.V. Il-6r single variable domain antibodies for treatment of il-6r related diseases
US11098113B2 (en) 2016-09-15 2021-08-24 Vib Vzw Immunoglobulin single variable domains directed against macrophage migration inhibitory factor
WO2018060453A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Vhsquared Limited Compositions
JP7222888B2 (ja) 2016-11-16 2023-02-15 アブリンクス エン．ヴェー． Ｃｄ１２３及びｔｃｒアルファ／ベータに結合することが可能なｔ細胞動員ポリペプチド
EP3544997A4 (en) 2016-11-23 2020-07-01 Harpoon Therapeutics, Inc. PROSTATE SPECIFIC MEMBRANE ANTIGEN BINDING PROTEIN
CN110198737A (zh) 2016-11-23 2019-09-03 哈普恩治疗公司 靶向psma的三特异性蛋白质及使用方法
WO2018099968A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 Ablynx N.V. Treatment of infection by respiratory syncytial virus (rsv)
MX2019006574A (es) 2016-12-07 2019-08-21 Ablynx Nv Aglutinantes de albumina de suero mejorados.
GB201621907D0 (en) 2016-12-21 2017-02-01 Ucb Biopharma Sprl And Sanofi Antibody epitope
CN107674122A (zh) * 2016-12-28 2018-02-09 天津天锐生物科技有限公司 一种识别人血清白蛋白的单域抗体
SG10202108973SA (en) 2017-01-17 2021-09-29 Ablynx Nv Improved serum albumin binders
CN110191896B (zh) 2017-01-17 2023-09-29 埃博灵克斯股份有限公司 改进的血清白蛋白结合物
EP3577133A1 (en) 2017-02-06 2019-12-11 Orionis Biosciences NV Targeted chimeric proteins and uses thereof
BR112019017001A2 (pt) 2017-02-16 2020-04-28 Sonnet Bio Therapeutics composição, proteína de fusão, ácido nucleico, célula hospedeira, e, métodos para produção de um domínio de aglutinação de albumina, para preparação de uma variante de il-15, para produção de uma proteína de fusão e para inibição ou redução de um tumor em um indivíduo em necessidade do mesmo.
EP3589725A1 (en) 2017-02-28 2020-01-08 Vib Vzw Means and methods for oral protein delivery
EP3589662A4 (en) 2017-02-28 2020-12-30 Harpoon Therapeutics, Inc. INDUCTIBLE MONOVALENT ANTIGBINDING PROTEIN
MX2019011702A (es) * 2017-03-31 2019-11-01 Ablynx Nv Ensayos de inmunogenicidad mejorados.
US11891451B2 (en) 2017-05-11 2024-02-06 Vib Vzw Glycosylation of variable immunoglobulin domains
CN110891974B (zh) 2017-05-12 2021-08-06 哈普恩治疗公司 间皮素结合蛋白质
KR20200026810A (ko) 2017-05-12 2020-03-11 하푼 테라퓨틱스, 인크. Msln 표적화 삼중 특이적 단백질 및 사용 방법
MX2019014331A (es) 2017-05-31 2020-01-27 Boehringer Ingelheim Int Polipeptidos que antagonizan la se?alizacion wnt en celulas tumorales.
MX2019014400A (es) 2017-06-02 2020-02-10 Merck Patent Gmbh Inmunoglobulinas que se unen a adamts.
MX2019014199A (es) 2017-06-02 2020-01-23 Boehringer Ingelheim Int Tratamiento de combinacion antineoplasico.
NZ759601A (en) 2017-06-02 2023-06-30 Merck Patent Gmbh Aggrecan binding immunoglobulins
JP2020521804A (ja) 2017-06-02 2020-07-27 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングＭｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｉｔ ｂｅｓｃｈｒａｅｎｋｔｅｒ Ｈａｆｔｕｎｇ Ｍｍｐ１３結合免疫グロブリン
TWI826376B (zh) 2017-06-02 2023-12-21 德商麥克專利有限公司 與ａｄａｍｔｓ５、ｍｍｐ１３及聚集蛋白聚醣結合的多肽
GB201710973D0 (en) 2017-07-07 2017-08-23 Avacta Life Sciences Ltd Scaffold proteins
JP7241731B2 (ja) 2017-07-19 2023-03-17 フエー・イー・ベー・フエー・ゼツト・ウエー 血清アルブミン結合剤
AU2018346955A1 (en) 2017-10-13 2020-04-30 Harpoon Therapeutics, Inc. B cell maturation antigen binding proteins
WO2019075359A1 (en) 2017-10-13 2019-04-18 Harpoon Therapeutics, Inc. TRISPECIFIC PROTEINS AND METHODS OF USE
EP3704160A1 (en) 2017-10-31 2020-09-09 VIB vzw Novel antigen-binding chimeric proteins and methods and uses thereof
WO2019133827A1 (en) * 2017-12-29 2019-07-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Antimicrobial nanobodies
MX2020008208A (es) 2018-02-05 2020-11-09 Orionis Biosciences Inc Agentes de unión a fibroblastos y uso de estos.
WO2019155041A1 (en) 2018-02-12 2019-08-15 Vib Vzw Gβγ COMPLEX ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2019165105A1 (en) * 2018-02-26 2019-08-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Ligands of the urokinase receptor and their use in treating, detecting, and imaging cancer
CA3092421A1 (en) 2018-03-01 2019-09-06 Vrije Universiteit Brussel Human pd-l1-binding immunoglobulins
WO2019204634A1 (en) * 2018-04-20 2019-10-24 Stc. Unm Rap1-gtp, rac1-gtp and fms-like tyrosine kinase 3 ligand (flt3-l) as biomarkers for early detection of sepsis
CN110613838A (zh) * 2018-06-19 2019-12-27 姜石松 增强细胞通透性的多肽及其应用
DE102018122275A1 (de) * 2018-09-12 2020-03-12 Osram Opto Semiconductors Gmbh Lichtemittierendes bauteil und verfahren zum betreiben eines lichtemittierenden bauteils
IL281683B2 (en) 2018-09-25 2023-04-01 Harpoon Therapeutics Inc dll3 binding proteins and methods of use
EP3636657A1 (en) 2018-10-08 2020-04-15 Ablynx N.V. Chromatography-free antibody purification method
CN111138537B (zh) * 2018-11-06 2021-07-09 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 一种抗人血清白蛋白抗体片段、制备方法和应用
CN111138536B (zh) * 2018-11-06 2021-07-09 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 抗人血清白蛋白单域抗体的制备及其应用
GB201818460D0 (en) * 2018-11-13 2018-12-26 Crescendo Biologics Ltd Single domain antibodies that bind human serum albumin
CN112830967B (zh) * 2019-01-10 2022-06-24 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 抗hsa单域抗体及其融合蛋白的亲和层析纯化方法
CN109627334B (zh) * 2019-01-29 2020-07-17 康元医疗科技(大连)有限公司 一种纳米抗体、以该纳米抗体为配基的吸附剂及其用途
GB201901306D0 (en) 2019-01-30 2019-03-20 Immunocore Ltd Multi-domain binding molecules
AU2020250810A1 (en) 2019-03-29 2021-09-02 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anticancer combination therapy
WO2020200998A1 (en) 2019-03-29 2020-10-08 Boehringer Ingelheim International Gmbh Anticancer combination therapy
JP2022531244A (ja) 2019-04-29 2022-07-06 コンフォ セラピューティクス エヌ．ブイ． Ｇｐｃｒに結合する化合物及びリガンドをスクリーニングするためのキメラタンパク質及び方法
WO2020221888A1 (en) 2019-04-30 2020-11-05 Vib Vzw Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator stabilizing agents
EP3976067A1 (en) 2019-05-28 2022-04-06 Vib Vzw Cd8+ t-cells lacking plexins and their application in cancer treatment
US20220220197A1 (en) 2019-05-28 2022-07-14 Vib Vzw Cancer Treatment by Targeting Plexins in the Immune Compartment
AU2020294980A1 (en) 2019-06-21 2022-02-17 Sorriso Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides
WO2020254828A1 (en) 2019-06-21 2020-12-24 Vhsquared Limited Compositions
JP2022538083A (ja) 2019-06-21 2022-08-31 ソリッソ ファーマシューティカルズ，インク． ポリペプチド
CN112409480A (zh) * 2019-08-20 2021-02-26 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 结合血清白蛋白的蛋白及其用途
WO2021039574A1 (ja) * 2019-08-23 2021-03-04 株式会社カネカ Ｏ結合型糖鎖修飾が抑制された重鎖抗体
CN110642946A (zh) * 2019-09-30 2020-01-03 中国药科大学 一种人源化纳米抗体及其制备方法
TW202128775A (zh) 2019-10-16 2021-08-01 英商阿法克塔生命科學有限公司 PD-L1抑制劑-TGFβ抑制劑雙特異性藥物部分
WO2021078786A1 (en) 2019-10-21 2021-04-29 Vib Vzw Nanodisc-specific antigen-binding chimeric proteins
BR112022009087A2 (pt) 2019-11-11 2022-07-26 Ibi Ag Innovative Bio Insecticides Ltd Nanocorpos para controle de insetos e usos dos mesmos
CA3158991A1 (en) 2019-11-27 2021-06-03 Vib Vzw Positive allosteric modulators of the calcium-sensing receptor
CN114980923A (zh) * 2019-12-06 2022-08-30 艾伯霖克斯公司 包含靶向TNFα和OX40L的免疫球蛋白单可变结构域的多肽
WO2021110816A1 (en) 2019-12-06 2021-06-10 Ablynx Nv POLYPEPTIDES COMPRISING IMMUNOGLOBULIN SINGLE VARIABLE DOMAINS TARGETING TNFα AND IL-23
AU2020400938A1 (en) 2019-12-09 2022-07-28 Ablynx Nv Polypeptides comprising immunoglobulin single variable domains targeting IL-13 and TSLP
GB201918279D0 (en) 2019-12-12 2020-01-29 Vib Vzw Glycosylated single chain immunoglobulin domains
CN110988361B (zh) * 2019-12-13 2020-09-18 山东民康生物科技有限公司 人血清白蛋白去除试剂盒
WO2021123360A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Vib Vzw Nanobody exchange chromatography
CN112300289B (zh) * 2019-12-30 2022-06-10 中国药科大学 RGD4C融合抗TNFα纳米抗体蛋白、制备方法及其应用
WO2021140205A1 (en) 2020-01-10 2021-07-15 Confo Therapeutics N.V. Methods for generating antibodies and antibody fragments and libraries comprising same
WO2021156490A2 (en) 2020-02-06 2021-08-12 Vib Vzw Corona virus binders
CN115768463A (zh) 2020-02-21 2023-03-07 哈普恩治疗公司 Flt3结合蛋白及使用方法
IL295892A (en) 2020-02-25 2022-10-01 Vib Vzw Leucine-rich repeat kinase 2 allosteric modulators
EP4144758A1 (en) 2020-04-22 2023-03-08 Mabwell (Shanghai) Bioscience Co., Ltd. Single variable domain antibody targeting human programmed death ligand 1 (pd-l1) and derivative thereof
WO2021229104A1 (en) 2020-05-15 2021-11-18 Université de Liège Anti-cd38 single-domain antibodies in disease monitoring and treatment
GB202101299D0 (en) 2020-06-09 2021-03-17 Avacta Life Sciences Ltd Diagnostic polypetides and methods
WO2022003156A1 (en) 2020-07-02 2022-01-06 Oncurious Nv Ccr8 non-blocking binders
WO2022063957A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Vib Vzw Biomarker for anti-tumor therapy
US20230364049A1 (en) 2020-09-24 2023-11-16 Vib Vzw Combination of p2y6 inhibitors and immune checkpoint inhibitors
AU2021350156A1 (en) 2020-09-25 2023-06-08 Ablynx Nv Polypeptides comprising immunoglobulin single variable domains targeting il-13 and ox40l
CN115244076B (zh) 2020-10-27 2023-08-04 北京质肽生物医药科技有限公司 Gdf15融合蛋白及其用途
WO2022098743A1 (en) 2020-11-03 2022-05-12 Indi Molecular, Inc. Compositions, imaging, and therapeutic methods targeting folate receptor 1 (folr1)
WO2022098745A1 (en) 2020-11-03 2022-05-12 Indi Molecular, Inc. Compositions, delivery systems, and methods useful in tumor therapy
JP2024508207A (ja) 2020-12-02 2024-02-26 ブイアイビー ブイゼットダブリュ がんに対する組み合わせ治療におけるｌｔｂｒアゴニスト
WO2022117569A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Oncurious Nv A ccr8 antagonist antibody in combination with a lymphotoxin beta receptor agonist antibody in therapy against cancer
EP4263602A1 (en) 2020-12-18 2023-10-25 Ablynx N.V. Polypeptides comprising immunoglobulin single variable domains targeting il-6 and tnf-alpha
IL303783A (en) 2020-12-18 2023-08-01 Sanofi Sa Polypeptides comprising single immunoglobulin variable sites targeting GLYPICAN-3 and the T-cell receptor
TW202241948A (zh) 2020-12-18 2022-11-01 比利時商艾伯霖克斯公司 基於TCR α/β反應性的T細胞募集多肽
GB202020502D0 (en) 2020-12-23 2021-02-03 Vib Vzw Antibody composistion for treatment of corona virus infection
EP4267618A1 (en) 2020-12-24 2023-11-01 Vib Vzw Non-blocking human ccr8 binders
WO2022136650A1 (en) 2020-12-24 2022-06-30 Oncurious Nv Murine cross-reactive human ccr8 binders
WO2022136647A1 (en) 2020-12-24 2022-06-30 Oncurious Nv Human ccr8 binders
CN117794566A (zh) 2021-02-05 2024-03-29 Vib研究所 沙贝病毒结合剂
IL304929A (en) 2021-02-05 2023-10-01 Vib Vzw [Be/Be Sarbevirus binders
EP4294407A1 (en) 2021-02-17 2023-12-27 Vib Vzw Inhibition of slc4a4 in the treatment of cancer
CA3211270A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Vib Vzw Cation-independent mannose-6-phosphate receptor binders
WO2022199804A1 (en) 2021-03-24 2022-09-29 Vib Vzw Nek6 inhibition to treat als and ftd
WO2022234003A1 (en) 2021-05-07 2022-11-10 Avacta Life Sciences Limited Cd33 binding polypeptides with stefin a protein
WO2022242892A1 (en) 2021-05-17 2022-11-24 Université de Liège Anti-cd38 single-domain antibodies in disease monitoring and treatment
WO2022268993A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Vib Vzw Means and methods for selection of specific binders
CN117580865A (zh) 2021-06-29 2024-02-20 山东先声生物制药有限公司 Cd16抗体及其应用
WO2023284822A1 (en) * 2021-07-14 2023-01-19 Beijing Ql Biopharmaceutical Co., Ltd. Fusion polypeptides for metabolic disorders
CN113527502B (zh) * 2021-07-20 2023-01-17 福建医科大学 一种用于治疗类风湿性关节炎的纳米抗体重组蛋白
CA3227972A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Shandong Simcere Biopharmaceutical Co., Ltd. Anti-pvrig/anti-tigit bispecific antibodies and applications thereof
WO2023016828A2 (en) 2021-07-30 2023-02-16 Vib Vzw Cation-independent mannose-6-phosphate receptor binders for targeted protein degradation
WO2023057567A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Avacta Life Sciences Limited Pd-l1 binding affimers
WO2023057946A1 (en) 2021-10-07 2023-04-13 Avacta Life Sciences Limited Serum half-life extended pd-l1 binding polypeptides
CN113912730B (zh) * 2021-12-14 2022-03-04 北京科诺信诚科技有限公司 缓释的抗FcRn抗体或抗原结合片段及其应用
TW202342508A (zh) 2021-12-17 2023-11-01 比利時商艾伯霖克斯公司 包含靶向ＴＣＲαβ、ＣＤ３３和ＣＤ１２３的免疫球蛋白單可變結構域的多肽
WO2023135198A1 (en) 2022-01-12 2023-07-20 Vib Vzw Human ntcp binders for therapeutic use and liver-specific targeted delivery
WO2023148397A1 (en) 2022-02-07 2023-08-10 Vib Vzw Engineered stabilizing aglycosylated fc-regions
CN116925215A (zh) * 2022-03-31 2023-10-24 普米斯生物技术(珠海)有限公司 抗血清白蛋白纳米抗体及其衍生物
WO2023198848A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Vib Vzw An ltbr agonist in combination therapy against cancer
WO2023218243A1 (en) 2022-05-12 2023-11-16 Avacta Life Sciences Limited Lag-3/pd-l1 binding fusion proteins
WO2023222825A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Vib Vzw Sarbecovirus spike s2 subunit binders
CN115028719B (zh) * 2022-05-27 2023-01-13 深圳市人民医院 血清白蛋白结合纳米抗体及其制备方法与应用
US20240109965A1 (en) 2022-06-14 2024-04-04 Ablynx N.V. Immunoglobulin single variable domains targeting t cell receptor
WO2024003873A1 (en) * 2022-06-30 2024-01-04 Intrexon Actobiotics Nv D/B/A Precigen Actobio Single variable domain antibodies against tumor necrosis factor-alpha
WO2024008755A1 (en) 2022-07-04 2024-01-11 Vib Vzw Blood-cerebrospinal fluid barrier crossing antibodies
WO2024023271A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Ablynx Nv Polypeptides binding to a specific epitope of the neonatal fc receptor
WO2024038112A1 (en) 2022-08-17 2024-02-22 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Improved anti-albumin nanobodies and their uses
WO2024068744A1 (en) 2022-09-27 2024-04-04 Vib Vzw Antivirals against human parainfluenza virus

Family Cites Families (155)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US460167A (en) 1891-09-29 Car-mover
DE321017C (es) 1917-05-15 1920-05-11 Aloysius Petrus Van Leuven
SE307996B (es) 1965-11-30 1969-01-27 Asea Ab
US4352678A (en) 1978-10-02 1982-10-05 Lever Brothers Company Thickened abrasive bleaching compositions
US4722896A (en) 1981-01-26 1988-02-02 The Beth Israel Hospital Association Method for affinity purification of hybridoma antibodies
US4559157A (en) 1983-04-21 1985-12-17 Creative Products Resource Associates, Ltd. Cosmetic applicator useful for skin moisturizing
LU84979A1 (fr) 1983-08-30 1985-04-24 Oreal Composition cosmetique ou pharmaceutique sous forme aqueuse ou anhydre dont la phase grasse contient un polyether oligomere et polyethers oligomeres nouveaux
US5672347A (en) 1984-07-05 1997-09-30 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor antagonists and their use
US4735898A (en) 1985-07-16 1988-04-05 The University Of Virginia Alumini Patents Foundation Monoclonal antibodies and method of identifying species using the same
JPS62175426A (ja) 1986-01-27 1987-08-01 Kazufumi Shimizu 抗体及びこれを有効成分とするスプレ−剤
EP0294703B1 (en) 1987-06-10 1995-05-10 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Bifunctional antibody constructs and method for selectively destroying cell populations
US4820508A (en) 1987-06-23 1989-04-11 Neutrogena Corporation Skin protective composition
US4992478A (en) 1988-04-04 1991-02-12 Warner-Lambert Company Antiinflammatory skin moisturizing composition and method of preparing same
US4938949A (en) 1988-09-12 1990-07-03 University Of New York Treatment of damaged bone marrow and dosage units therefor
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
SE509359C2 (sv) 1989-08-01 1999-01-18 Cemu Bioteknik Ab Användning av stabiliserade protein- eller peptidkonjugat för framställning av ett läkemedel
US6448380B2 (en) 1989-08-07 2002-09-10 Peptech Limited Tumor necrosis factor antibodies
EP0486526B2 (en) 1989-08-07 2001-03-07 Peptech Limited Tumour necrosis factor binding ligands
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
NZ234246A (en) 1990-03-16 1992-06-26 Flexitech Consulting Services Form filling powdered material packages using interleaved plastics/paper packaging
GB9016299D0 (en) 1990-07-25 1990-09-12 Brien Caroline J O Binding substances
WO1992002551A1 (en) 1990-08-02 1992-02-20 B.R. Centre Limited Methods for the production of proteins with a desired function
US5656272A (en) 1991-03-18 1997-08-12 New York University Medical Center Methods of treating TNF-α-mediated Crohn's disease using chimeric anti-TNF antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
EP0590060B1 (en) 1991-06-21 1997-09-17 University Of Cincinnati Orally administrable therapeutic proteins and method of making
DE69229477T2 (de) 1991-09-23 1999-12-09 Cambridge Antibody Tech Methoden zur Herstellung humanisierter Antikörper
ES2202310T3 (es) 1991-12-13 2004-04-01 Xoma Corporation Metodos y materiales para la preparacion de dominios variables de anticuerpos modificados y sus usos terapeuticos.
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
DE69325738T2 (de) 1992-04-28 2000-01-27 Sumitomo Rubber Ind Fester Golfball
DE69334095T2 (de) 1992-07-17 2007-04-12 Dana-Farber Cancer Institute, Boston Verfahren zur intrazellulären Bindung von zielgerichteten Molekülen
ATE452975T1 (de) 1992-08-21 2010-01-15 Univ Bruxelles Immunoglobuline ohne leichte ketten
EP0584421A1 (en) 1992-08-21 1994-03-02 Cécile Casterman Immunoglobulins devoid of light chains
EP0585705B1 (en) 1992-08-28 1998-11-04 Bayer Corporation Use of monoclonal antibodies to TNF to treat bacterial meningitis
EP0663836B1 (en) 1992-10-08 1997-07-09 The Kennedy Institute Of Rheumatology Treatment of autoimmune and inflammatory disorders
AU690528B2 (en) 1992-12-04 1998-04-30 Medical Research Council Multivalent and multispecific binding proteins, their manufacture and use
WO1994018955A1 (en) 1993-02-22 1994-09-01 Alza Corporation Compositions for oral delivery of active agents
DK0698097T3 (da) 1993-04-29 2001-10-08 Unilever Nv Produktion af antistoffer eller (funktionaliserede) fragmenter deraf afledt af Camelidae-immunoglobuliner med tung kæde
EP0698097B1 (en) 1993-04-29 2001-08-16 Unilever N.V. Production of antibodies or (functionalized) fragments thereof derived from heavy chain immunoglobulins of camelidae
GB9311454D0 (en) 1993-06-03 1993-07-21 Agricultural & Food Res Pharmaceutical compositions
WO1994029469A2 (en) 1993-06-07 1994-12-22 Vical Incorporated Plasmids suitable for gene therapy
CA2162878A1 (en) 1993-06-09 1994-12-22 Leon Gerardus Joseph Frenken Process for producing fusion proteins comprising scfv fragments by a transformed mould
US5906928A (en) 1993-07-30 1999-05-25 University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey Efficient gene transfer into primary murine lymphocytes obviating the need for drug selection
FR2708622B1 (fr) 1993-08-02 1997-04-18 Raymond Hamers Vecteur recombinant contenant une séquence d'un gène de lipoprotéine de structure pour l'expression de séquences de nucléotides.
US6091639A (en) 1993-08-27 2000-07-18 Kabushiki Kaisha Toshiba Non-volatile semiconductor memory device and data programming method
WO1995007463A1 (en) 1993-09-10 1995-03-16 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of green fluorescent protein
WO1995021191A1 (en) 1994-02-04 1995-08-10 William Ward Bioluminescent indicator based upon the expression of a gene for a modified green-fluorescent protein
JPH10501681A (ja) 1994-02-22 1998-02-17 ダナ−ファーバー キャンサー インスティチュート 核酸送達システムならびにその合成および使用方法
US5625048A (en) 1994-11-10 1997-04-29 The Regents Of The University Of California Modified green fluorescent proteins
WO1996022307A1 (en) 1995-01-19 1996-07-25 The Research Foundation Of State University Of New York Genes encoding an insect calcium channel
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
US5693492A (en) 1995-05-05 1997-12-02 Merck & Co., Inc. DNA encoding glutamate gated chloride channels
WO1997000957A1 (en) 1995-06-23 1997-01-09 President And Fellows Of Harvard College Transcriptional regulation of genes encoding vascular endothelial growth factor receptors
CA2232727C (en) 1995-09-22 2002-03-26 Novo Nordisk A/S Novel variants of green fluorescent protein, gfp
US7368111B2 (en) 1995-10-06 2008-05-06 Cambridge Antibody Technology Limited Human antibodies specific for TGFβ2
US6027881A (en) 1996-05-08 2000-02-22 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Mutant Aequorea victoria fluorescent proteins having increased cellular fluorescence
DK0937140T3 (da) 1996-06-27 2008-01-28 Vlaams Interuniv Inst Biotech Antistofmolekyler, som interagerer specifikt med et målmolekyles aktive sted eller klöft
US6124128A (en) 1996-08-16 2000-09-26 The Regents Of The University Of California Long wavelength engineered fluorescent proteins
US6417337B1 (en) 1996-10-31 2002-07-09 The Dow Chemical Company High affinity humanized anti-CEA monoclonal antibodies
WO1998021355A1 (en) 1996-11-15 1998-05-22 Life Technologies, Inc. Mutants of green fluorescent protein
AU7298398A (en) 1996-11-19 1998-06-10 Sangstat Medical Corporation Enhanced effects for hapten conjugated therapeutics
US6262238B1 (en) 1997-01-14 2001-07-17 Roche Diagnostic, Gmbh Process for modifying the stability of antibodies
US6329516B1 (en) 1997-04-28 2001-12-11 Fmc Corporation Lepidopteran GABA-gated chloride channels
FR2766826B1 (fr) 1997-08-04 2001-05-18 Pasteur Institut Vecteurs derives d'anticorps pour le transfert de substances dans les cellules
US5895466A (en) 1997-08-19 1999-04-20 At&T Corp Automated natural language understanding customer service system
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
ATE461282T1 (de) 1997-10-27 2010-04-15 Bac Ip Bv Multivalente antigenbindende proteine
BR9907241A (pt) 1998-01-26 2000-10-17 Unilever Nv Biblioteca de expressão, processo para preparar a mesma, uso de uma fonte não imunizada de sequências de ácido nucleico, e, processos para preparar fragmentos de anticorpos e, para preparar um anticorpo
WO1999042077A2 (en) 1998-02-19 1999-08-26 Xcyte Therapies, Inc. Compositions and methods for regulating lymphocyte activation
EP0967284A1 (en) 1998-05-28 1999-12-29 Pfizer Limited Phosphodiesterases
DE69905291T3 (de) 1998-07-06 2009-06-25 Perkinelmer Cellular Sciences Belgium Sprl Bioluminenztest für agonisten oder antagonisten eines kalzium-gekuppelten-rezeptors
CN1323355A (zh) 1998-08-13 2001-11-21 美国吉诺米克斯公司 光学鉴定聚合物
GB9824632D0 (en) 1998-11-10 1999-01-06 Celltech Therapeutics Ltd Biological compounds
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
EP1141711A1 (en) 1999-01-05 2001-10-10 Unilever Plc Binding of antibody fragments to solid supports
AU2291700A (en) 1999-01-19 2000-08-07 Unilever Plc Method for producing antibody fragments
WO2000046383A2 (en) 1999-02-05 2000-08-10 Rijksuniversiteit Leiden Method of modulating metabolite biosynthesis in recombinant cells
JP4726302B2 (ja) 1999-03-15 2011-07-20 ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア Ａｂｃ１ポリペプチドおよびコレステロール水準を調節する方法と試薬
EP1169453A1 (en) 1999-04-22 2002-01-09 Unilever Plc Inhibition of viral infection using monovalent antigen-binding proteins
AU6424300A (en) 1999-05-27 2000-12-18 Max-Delbruck-Centrum Fur Molekulare Medizin Vaccines against conformation-dependent antigens and against antigens that are not or are not only proteins or peptides
JP2003508031A (ja) 1999-06-18 2003-03-04 スィーヴィー セラピューティクス インコーポレイテッド Ａｔｐ結合カセット輸送体蛋白質ａｂｃ１を用いるコレステロール流出を増加させｈｄｌを上昇させるための組成物および方法
AU6322900A (en) 1999-08-02 2001-02-19 Keygene N.V. Method for generating resistance against cgmmv in plants, genetic constructs for use in said method, and cgmmv-resistant plants obtained via said method
GB9922124D0 (en) 1999-09-17 1999-11-17 Pfizer Ltd Phosphodiesterase enzymes
US6479280B1 (en) 1999-09-24 2002-11-12 Vlaams Interuniversitair Institutuut Voor Biotechnologie Vzw Recombinant phages capable of entering host cells via specific interaction with an artificial receptor
US6849425B1 (en) 1999-10-14 2005-02-01 Ixsys, Inc. Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
DE19955408A1 (de) 1999-11-18 2001-05-23 Bayer Ag GABA-B-Rezeptoren
EP1242460B1 (en) 1999-11-29 2006-10-18 Unilever Plc Immobilisation of proteins using a polypeptide segment
ES2331051T3 (es) 1999-11-29 2009-12-21 Bac Ip B.V. Inmovilizacion de moleculas de union de antigenos de un dominio.
UA76708C2 (uk) * 1999-12-08 2006-09-15 Сінгента Патисипейшонс Аг Антитіло, яке застосовується в імунологічному аналізі зразка для визначення неонікотиноїдного інсектициду, білковий кон'югат для одержання антитіла, спосіб визначення концентрації неонікотиноїдного інсектициду в зразку та набір для визначення кількості неонікотиноїдного інсектициду
WO2001045746A2 (en) 1999-12-24 2001-06-28 Genentech, Inc. Methods and compositions for prolonging elimination half-times of bioactive compounds
US7229619B1 (en) 2000-11-28 2007-06-12 Medimmune, Inc. Methods of administering/dosing anti-RSV antibodies for prophylaxis and treatment
DE60138333D1 (de) 2000-03-14 2009-05-28 Unilever Nv Variabele Domänen der schweren Kette eines Antikörpers gegen menschliche Ernährungslipasen und deren Verwendungen
US7097840B2 (en) 2000-03-16 2006-08-29 Genentech, Inc. Methods of treatment using anti-ErbB antibody-maytansinoid conjugates
CA2380443C (en) 2000-05-26 2013-03-12 Ginette Dubuc Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
US6741957B1 (en) 2000-07-21 2004-05-25 Daimlerchrysler Corporation Analytical tire model for vehicle durability and ride comfort analysis
BR0107351B1 (pt) 2000-10-20 2014-12-02 Firmenich & Cie Composição perfumante sem álcool
EP1360207B1 (en) 2000-12-13 2011-06-22 Bac Ip B.V. Protein arrays of camelid heavy-chain immunoglobulin variable domains
US7054297B1 (en) 2000-12-28 2006-05-30 Cisco Technology, Inc. Distribution of packets to high data rate communications devices using multicast protocols
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
WO2002076489A1 (en) 2001-03-09 2002-10-03 Dyax Corp. Serum albumin binding moieties
ATE477280T1 (de) 2001-06-28 2010-08-15 Domantis Ltd Doppelspezifischer ligand und dessen verwendung
US20100081792A1 (en) 2001-06-28 2010-04-01 Smithkline Beecham Corporation Ligand
US20050271663A1 (en) 2001-06-28 2005-12-08 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
WO2003005053A1 (de) 2001-07-04 2003-01-16 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren zur intensitätskorrektur eines magnetresonanzbildes
CA2456121A1 (en) 2001-08-03 2003-02-20 Medical Research Council Intracellular antibodies
WO2003025020A1 (fr) 2001-09-13 2003-03-27 Institute For Antibodies Co., Ltd. Procede pour creer une banque d'anticorps de chameaux
FR2829940A1 (fr) 2001-09-27 2003-03-28 Synt Em Compositions pour la vectorisation d'anticorps a travers la barriere hematoencephalique et leur utilisation pour le diagnostic ou le traitement des maladies du systeme nerveux central
US7084257B2 (en) 2001-10-05 2006-08-01 Amgen Inc. Fully human antibody Fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
CA2466592A1 (en) 2001-11-12 2003-05-22 Koen Hellendoorn Modified anti-tnf alpha antibody
US7365167B2 (en) 2001-11-26 2008-04-29 Cell Matrix, Inc. Humanized collagen antibodies and related methods
US7393648B2 (en) 2001-12-03 2008-07-01 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Hybrid antibodies
KR100599789B1 (ko) 2001-12-03 2006-07-12 삼성에스디아이 주식회사 방열효율이 향상된 플라즈마 디스플레이 장치 및 그 제조방법
EP1461674A4 (en) 2001-12-03 2007-10-24 Dyax Corp LIBRARY SCREENING
EP1456410A2 (en) 2001-12-11 2004-09-15 AlgoNomics N.V. Method for displaying loops from immunoglobulin domains in different contexts
AU2002360068B2 (en) 2001-12-21 2009-09-03 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Method for cloning of variable domain sequences
WO2003055527A2 (en) 2002-01-03 2003-07-10 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Immunoconjugates useful for treatment of tumours
DE10225567B4 (de) 2002-06-10 2006-07-06 Endress + Hauser Conducta Gesellschaft für Mess- und Regeltechnik mbH + Co. KG Kommunikationsverfahren und System hierfür
JP2006512050A (ja) * 2002-06-21 2006-04-13 ダイアックス、コープ 血清タンパク質結合標的特異的リガンドとその同定方法
US20060002935A1 (en) 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
US20080008713A1 (en) 2002-06-28 2008-01-10 Domantis Limited Single domain antibodies against tnfr1 and methods of use therefor
PT1517921E (pt) 2002-06-28 2006-09-29 Domantis Ltd Ligandos duplamente especificos com semi-vida no soro aumentada
EP1388571A1 (de) 2002-08-08 2004-02-11 Ciba Spezialitätenchemie Pfersee GmbH Polyorganosiloxanzusammensetzung enthaltend quaternäre Ammoniumgruppen
US7004940B2 (en) 2002-10-10 2006-02-28 Ethicon, Inc. Devices for performing thermal ablation having movable ultrasound transducers
WO2004037999A2 (en) 2002-10-23 2004-05-06 Ludwig Institute For Cancer Research A34 and a33-like 3 dna, proteins, antibodies thereto and methods of treatment using same
PT2316852E (pt) 2002-11-08 2014-06-23 Ablynx Nv Anticorpos de domínio único estáveis
US20060034845A1 (en) 2002-11-08 2006-02-16 Karen Silence Single domain antibodies directed against tumor necrosis factor alpha and uses therefor
NZ563471A (en) * 2002-11-08 2009-04-30 Ablynx Nv Camelidae antibodies against imminoglobulin E and use thereof for the treatment of allergic disorders
BRPI0316092B8 (pt) 2002-11-08 2021-05-25 Ablynx Nv anticorpos de domínio único direcionados contra o fator de necrose tumoral alfa e usos para os mesmos
GB0230203D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
AU2003300133B2 (en) 2002-12-31 2008-11-13 Nektar Therapeutics Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers
AU2004204262B2 (en) 2003-01-10 2010-11-04 Ablynx N.V. Recombinant VHH single domain antibody from camelidae against von willebrand factor (vWF) or against collagen
DE502004012374D1 (de) 2003-06-30 2011-05-19 Siemens Ag Verfahren zur überwachung des programmlaufs in einem mikro-computer
EP2221317A3 (en) 2003-06-30 2011-07-27 Domantis Limited PEGylated single domain antibodies (dAb)
EP1512696A1 (en) 2003-08-14 2005-03-09 Diatos Amino acid sequences facilitating penetration of a substance of interest into cells and/or cell nuclei
DK1687338T3 (da) 2003-11-07 2011-02-07 Ablynx Nv Camelidae enkeltdomæne-antistoffer VHH, der er rettet mod epidermal vækstfaktor-receptor og anvendelser deraf
US7432238B2 (en) 2004-04-16 2008-10-07 Stc.Unm Human Kunitz-type inhibitor with enhanced antifibrinolytic activity
US7180370B2 (en) 2004-09-01 2007-02-20 Micron Technology, Inc. CMOS amplifiers with frequency compensating capacitors
US7563443B2 (en) 2004-09-17 2009-07-21 Domantis Limited Monovalent anti-CD40L antibody polypeptides and compositions thereof
GB0521621D0 (en) 2005-10-24 2005-11-30 Domantis Ltd Tumor necrosis factor receptor 1 antagonists for treating respiratory diseases
EP2769990A3 (en) 2004-12-02 2015-02-25 Domantis Limited Bispecific domain antibodies targeting serum albumin and GLP-1 or PYY
EP2949668B1 (en) 2005-05-18 2019-08-14 Ablynx N.V. Improved nanobodies tm against tumor necrosis factor-alpha
DE102005023617A1 (de) * 2005-05-21 2006-11-23 Aspre Ag Verfahren zum Mischen von Farben in einem Display
US20070269422A1 (en) 2006-05-17 2007-11-22 Ablynx N.V. Serum albumin binding proteins with long half-lives
CA2688433A1 (en) 2007-06-06 2008-12-11 Domantis Limited Methods for selecting protease resistant polypeptides
CA2683801A1 (en) 2007-06-06 2008-12-11 Domantis Limited Polypeptides, antibody variable domains and antagonists
GB0724331D0 (en) 2007-12-13 2008-01-23 Domantis Ltd Compositions for pulmonary delivery
KR20100097716A (ko) 2007-11-27 2010-09-03 아블린쓰 엔.브이. 이종이량체 사이토킨 및/또는 이의 수용체에 대한 아미노산 서열과 이를 포함하는 폴리펩티드
LT2700651T (lt) 2008-07-18 2019-06-25 Bristol-Myers Squibb Company Vienvalentinės cd28 prisijungimo atžvilgiu kompozicijos ir panaudojimo būdai
RU2598711C2 (ru) 2010-07-22 2016-09-27 Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния Антитело к противоопухолевому антигену и способы применения
ES2913200T3 (es) * 2015-03-31 2022-06-01 Sorriso Pharmaceuticals Inc Polipéptidos
AU2017240190A1 (en) * 2016-03-31 2018-09-20 Sorriso Pharmaceuticals, Inc. Compositions

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Publication number Publication date
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