TW201321410A - 抗腫瘤壞死因子-α之改良奈米體 - Google Patents
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Abstract
本案係改良型對抗腫瘤壞死因子-α(TNF-α)之奈米抗體TM，其包含或本質上帶有一個以上該奈米抗體的聚胜肽有關。此本案也相關於決定該奈米抗體與聚胜肽的核酸；製備該奈米抗體與聚胜肽的方法；表現或有能力表現該奈米抗體或聚胜肽的宿主細胞；包含該奈米抗體、聚胜肽、核酸或宿主細胞的組成；及該奈米抗體、該聚胜肽、該核酸、該宿主細胞或該組成的應用，特別是針對預防、治療或診斷目的，像是預防、治療或診斷之用途。
Description
目前對抗腫瘤壞死因子(TNF)-α的進展，均牽涉改良型奈米抗體(TM)，否則也會跟或多或少帶有一個或多個這些奈米抗體的聚胜肽相關。「註：奈米抗體(TM)及奈米克隆(TM)均為Ablynx N.V.公司之商標」
此進展亦關係到奈米抗體和聚胜肽類的核酸，製備奈米抗體和聚胜肽的方法，表現或能表現奈米抗體和聚胜肽的宿主細胞，帶有奈米抗體、聚胜肽、核酸或宿主細胞的組合，尤其是這些成分的在預防、治療、診斷方面的應用，接下來便會提到這些應用。
此本案的其他面向、實用化、優點以及應用，將在本文的後敘中逐漸說明。
申請人提出的WO 04/041862與對抗腫瘤壞死因子-α的奈米抗體相關，亦牽涉其製備與應用，特別是針對下列疾病的預防和/或治療，以及由腫瘤壞死因子-α所調控的機能失調，例如發炎、風濕性關節炎、克隆氏症、潰瘍性結腸炎、發炎性腸道症候群、多重硬化症、愛迪生氏病、自體免疫性肝炎、自體免疫性腮腺炎、第一型糖尿病、附睪炎、腎小球腎炎、葛瑞芙氏症、格林-巴利症侯群、橋本氏病、溶血性貧血、全身紅斑性狼瘡、女性不孕、多重硬化症、重症肌無力、天皰瘡、牛皮癬、風濕熱、風濕性關節炎、類肉瘤病、硬皮病、修格連氏症候群、脊椎關節病變、甲狀腺炎、血管炎。
依照WO 04/041862的抗TNF奈米抗體或許可應用於人體，本身可為單價或多價，其中多價的與TNF親和力較強。依照WO 04/041862的抗TNF奈米抗體(TM)也可為多特異性，特別是在具有兩個以上抗TNF奈米抗體的多特異性結構中，並可由高階奈米抗體主導來抗人類血清白蛋白之類的血清蛋白，這樣可以提升體內試驗中的半生期。
WO 04/041862也跟牽涉製造抗TNF奈米抗體的方法，包含表現抗TNF奈米抗體的核酸或是結構，亦關係到含有抗TNF奈米抗體的醫藥組合物，這些也許可適用於靜脈注射、皮下、口服、舌下、外用、鼻吸式、陰道或直腸給藥，或是吸入式給藥法。依照WO 04/041862的抗TNF奈米抗體，或許也可應用於診斷目的，及選擇性地用於部件套組。
EP 0 486 526描述的是可對抗TNF抗原表位的TNF-α配位基。在這些配位基中，會提到單接合抗體(“dAbs”)。
Reiter等人在J.Mol.Biol.(1999),290,685-698中，描述了得自某個任意化噬菌體表現資料庫的對抗TNF-α之單接合抗體，這是從老鼠的單株抗體中所得到的VH區域骨架開始，再予以建立的資料庫。
WO 00/29004描述的是對抗TNF-α的老鼠單接合抗體(「微小體」)。
在其他部份中，WO 04/003019描述的是配位基，其含有對抗TNF-α之第一結合區域，又含有對抗血清白蛋白之類血清蛋白的第二結合區域。
TNF-alpha.這是現階段本案中的常見目標，要找出對抗TNF-α之奈米抗體，特別是針對人類的TNF-α。
特別的是，此為一項現階段本案中的目標，要找出對抗TNF-α之
奈米抗體，特別是針對人類的TNF-α，並找出帶有相同組成的蛋白質或聚胜肽，以適用於治療及/或診斷用途，尤其是針對一種以上前述的疾病，和由腫瘤壞死因子-α所調控的機能失調，進行預防、治療及/或診斷；並/或根據針對一種以上前述的疾病，和由腫瘤壞死因子-α所調控的機能失調，找尋可用來製造醫藥組合物的成分。
更重要的是，這是現階段找出對抗TNF-α之奈米抗體本案中的一項主題，並要找出帶有相同組成的蛋白質或聚胜肽，而它們必須為WO 04/041862中所述的對抗TNF-α之奈米抗體或聚胜肽選項之一，並/或與WO 04/041862中所述的對抗TNF-α之奈米抗體及聚胜肽比較起來，能提供一個以上更優越的特性。
值得一提的是，這是現階段找出對抗TNF-α之奈米抗體本案中的一項主題，並要找出帶有相同組成的蛋白質或聚胜肽，與WO 04/041862中所述的對抗TNF-α之奈米抗體及聚胜肽比較起來，它們具有下列特性中一個以上的優點：- 不論是以單價、多價(例如二價形)，及/或以多特異性形式(例如WO 04/041862或後敘中所述的多特異性形式之一)，對TNF-α的親和力更佳；- 在多價形式(例如在二價的形式)中有更適當的成形性；- 在多特異性形式(例如WO 04/041862或後敘中所述的多特異性形式之一)中有更適當的成形性；- 對於用以「人體化」的取代物(如此處所定義)，有更高的適切性或感受性；及/或- 不論在單價、多價(例如二價形)形式中，及/或單價形式中的多特異性形式(例如WO 04/041862或後敘所述的多特異性形式之一)中，較不會引起免疫反應；
- 不論在單價、多價(例如二價形)形式中，及/或單價形式中的多特異性形式(例如WO 04/041862或後敘所述的多特異性形式之一)中，穩定性較佳；- 不論在單價、多價(例如二價形)形式中，及/或單價形式中的多特異性形式(例如WO 04/041862或後敘所述的多特異性形式之一)中，對於TNF-α的專一性更佳；- 在不同物種之間，與TNF-α相關的交互反應性要降低，或在必要時提高；及/或- 不論在單價、多價(例如二價形)形式中，及/或單價形式中的多特異性形式(例如WO 04/041862或後敘所述的多特異性形式之一)中，針對醫藥(包括預防用途及/或治療用途)及/或診斷(包含但不侷限於造影方面的應用)用途所需，有一個以上其他的較佳特性。
此處描述的的奈米抗體、蛋白質和聚胜肽，達成了這些目標。此處亦將奈米抗體稱作「開發的奈米抗體」；同時，此處亦將這些蛋白質和聚胜肽統稱為「開發的聚胜肽」。
既然這裡描述的奈米抗體和聚胜肽主要用於治療及/或診斷，它們都被導向於對抗人類的TNF-α。但不可排除(卻也不必要)的是，這裡描述的奈米抗體和聚胜肽，在一個以上的溫血動物物種中，會表現出與TNF-α的交互反應性，例如在靈長類及/或其他常用的疾病(例如老鼠、大鼠、兔子、豬或狗)動物模式之間，特別是那些用於跟TNF-α相關的疾病或機能失調中的動物模式。就這點來講，顯見一個實驗者在藥物本案的觀點上，可以利用可能出現的交互反應性，而這點也讓對抗人類TNF-α的奈米抗體和聚胜肽，用於這類的疾病模式中
進行試驗。
廣義來說，針對本案進行中的奈米抗體和聚胜肽，現階段本案並未特別侷限或定義於其對抗TNF-α中特定的抗原決定基、抗原表位、局部、區域、次單元或確認處。
然而，更具體地說，這裡描述了用來及/或可結合於TNF-α之抗原表位的奈米抗體、蛋白質或聚胜肽，而此抗原表位則埋在及/或形成TNF受器結合位的部份(例如，TNF-RI與TNF-RII的結合位，亦稱作p55或p75)。就像是藝術一般，TNF的三聚體含有三個結合位，而它們本質上是相等的，並由/在TNF三聚體內的兩個TNF單體界面之間形成。例如，當TNF-α之抗原表位具有下列TNF-α之氨基酸殘基：88位的Gln、90位的Lys，以及146位的Glu，這裡所描述的奈米抗體、蛋白質或聚胜肽便能用來及/或可結合於TNF-α之抗原表位。
特別的是，這裡描述了用來及/或可結合於TNF-α三聚體之抗原表位的奈米抗體、蛋白質或聚胜肽，而此抗原表位則埋在及/或形成TNF受器結合位的部份。舉例來說，這裡所描述用來及/或可結合於TNF-α三聚體之抗原表位的奈米抗體、蛋白質或聚胜肽，發生於當TNF-α三聚體之抗原表位具有下列氨基酸殘基時：在第一TNF單體上有88位的Gln、90位的Lys(這裡稱作「單體A」)，在第二TNF單體上有146位的Glu(這裡稱作「單體B」)(其中單體A與單體B在TNF三聚體中，共同形成TNF結合位)。
再者，這裡描述了用來及/或可結合於TNF-α三聚體之抗原表位的奈米抗體、蛋白質或聚胜肽，發生於當TNF-α三聚體之抗原表位具有上述的氨基酸殘基(在單體A中88位的Gln；在單體A中90位的Lys及在單體B中146位的Glu)，此外，在TNF-α的單體A中，起碼要帶一項下列的氨基酸殘基，兩個以上亦可，五個以上更佳，最好是全部都有
或基本上都有：24位的Gly、25位的Gln、72位的Thr、73位的His、74位的Val、75位的Leu、77位的Thr、79位的Thr、83位的Ile、89位的Thr、91位的Val、92位的Asn、97位的Ile、131位的Arg、135位的Glu、136位的Ile、137位的Asn、138位的Arg、139位的Pro、140位的Asp，以及在單體B中的下列殘基：20位的Pro、32位的Arg、65位的Lys、112位的Lys、115位的Tyr、145位的Ala、147位的Ser。
或者是，這裡描述了用來及/或可結合於TNF-α之抗原表位的奈米抗體、蛋白質或聚胜肽，發生於當TNF-α之抗原表位具有上述的氨基酸殘基(在單體A中88位的Gln；在單體A中90位的Lys及在單體B中146位的Glu)，此外，在TNF-α的單體A中，起碼要帶一項下列的氨基酸殘基，兩個以上亦可，五個以上更佳，最好是全部都有或基本上都有：75位的Leu、77位的Thr、79位的Thr、80位的Ile、81位的Ser、87位的Tyr、89位的Thr、91位的Val、92位的Asn、95位的Ser、97位的Ile、135位的Glu、136位的Ile、137位的Asn，以及在單體B中的下列殘基：33位的Ala、145位的Ala、147位的Ser。
這類的抗原表位，可以由奈米抗體跟TNF分子的共結晶結構，或是透過肽掃描分析的抗原表位標定之類方法來解釋。
從結晶資料(未顯示)中比較，可以看出WO 04/041862中的奈米抗體3E接在不同的抗原表位(就是帶有141位的Tyr、140位的Asp、67位的Gln、24位的Gly及23位的Glu之抗原表位)上，而非主流本案中的抗原表位。
另一方面，目前本案牽涉到可以結合於TNF-α之抗原表位的免疫球蛋白變異區(或稱合適片段)，此抗原表位則埋在及/或形成TNF受器結合位的部份，且易發生於當抗原表位起碼帶一項下列的TNF-α氨基酸殘基，兩個以上亦可，五個以上更佳，最好是全部都有或基本上
都有：88位的Gln、90位的Lys、及146位的Glu。這類的免疫球蛋白變異區最好是重鏈變異區或輕鏈變異區，特別是可能為某種哺乳類的重鏈變異區，其中包含但不限於人類的重鏈變異區、老鼠的重鏈變異區，及駱駝科的重鏈變異區(像是駱駝科4鏈免疫球蛋白中的重鏈變異區，或是所謂重鏈抗體中的重鏈變異區(VHH區域))。免疫球蛋白變異區最好是某區域抗體、或單一區域抗體，或適用於(單一)區域抗體。最佳的情況是，此免疫球蛋白變異區為奈米抗體(如此處定義)，有時也有些不受限的例子，像是被人體化，以及其他變數(如後敘)，而是在此本案中適用的奈米抗體有PMP1C2(TNF1，序列編碼：52)及PMP5F10(TNF3，序列編碼：60)。
前述的免疫球蛋白變異區，或許可以隨奈米抗體在這裡描述般被人體化(如例中，且無限制)。此本案亦跟包含或本質上由這種免疫球蛋白變異區組成的蛋白質和聚胜肽有關，就像此處所定義的。此外，這種變異區可能形成局部的ScFv組態、雙特異性組態、複合抗體或抗體結構，以及其他免疫球蛋白組態，如同Hoogenboom(Nature Biotechnology(1997),15：125-126)的整理。然而，欲作為對抗上述抗原表位的免疫球蛋白變異區為奈米抗體，而含有該奈米抗體的蛋白質和聚胜肽將會在後面描述。
因此，此本案中較重要的部份包括：
I)用來對抗像奈米抗體TNF1(序列編碼：52)這種TNF-α三聚體上相同抗原表位的奈米抗體。
II)用來對抗像奈米抗體TNF3(序列編碼：60)這種TNF-α三聚體上相同抗原表位的奈米抗體。
III)對於起碼含下列氨基酸殘基的TNF-α三聚體，用來對抗其抗原表位之奈米抗體：在單體A中88位的Gln；在單體A中90位的Lys及在
單體B中146位的Glu。
IV)用來及/或可結合於TNF-α三聚體之抗原表位的奈米抗體，發生於當TNF-α三聚體之抗原表位具有下列的氨基酸殘基：在單體A中88位的Gln；在單體A中90位的Lys及在單體B中146位的Glu；甚至，在TNF-α的單體A中，起碼要帶一項下列的氨基酸殘基，兩個以上亦可，五個以上更佳，最好是全部都有或基本上都有：24位的Gly、25位的Gln、72位的Thr、73位的His、74位的Val、75位的Leu、77位的Thr、79位的Thr、83位的Ile、89位的Thr、91位的Val、92位的Asn、97位的Ile、131位的Arg、135位的Glu、136位的Ile、137位的Asn、138位的Arg、139位的Pro、140位的Asp，以及在單體B中的下列殘基：20位的Pro、32位的Arg、65位的Lys、112位的Lys、115位的Tyr、145位的Ala、147位的Ser。
V)用來及/或可結合於TNF-α三聚體之抗原表位的奈米抗體，發生於當TNF-α三聚體之抗原表位具有下列的氨基酸殘基：在單體A中88位的Gln；在單體A中90位的Lys及在單體B中146位的Glu；甚至，在TNF-α的單體A中，起碼要帶一項下列的氨基酸殘基，兩個以上亦可，五個以上更佳，最好是全部都有或基本上都有：75位的Leu、77位的Thr、79位的Thr、80位的Ile、81位的Ser、87位的Tyr、89位的Thr、91位的Val、92位的Asn、95位的Ser、97位的Ile、135位的Glu、136位的Ile、137位的Asn，以及在單體B中的下列殘基：33位的Ala、145位的Ala、147位的Ser。
VI)
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，並且對TNF的Koff速率優於2.10-3(l/s)，最好能好過1.10-3。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，使用WO 04/041862的3)之
範例中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比相同分析下WO 04/041862奈米抗體VHH 3E(序列編碼：4)的EC50值還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，使用WO 04/041862的3)之範例中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比12nM還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，使用WO 04/041862的3)之範例中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比5nM還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，使用WO 04/041862的3)之範例中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比3nM還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，亦為一種人體化變異。
本實用化的一些較佳層面包括：
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，並屬於GLEW級。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，並屬於人體化GLEW級。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，並在103位帶有精胺酸殘基(R)。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，並在103位帶有精胺酸殘基(R)，同時又被人體化。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，並屬於人體化GLEW級、在103位帶有精胺酸殘基(R)，同時又被人體化。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，並在108位帶有白胺酸殘基(L)。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，並且序列一致性(如此處
定義)起碼要達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%，而該氨基酸序列的序列編碼有52(TNF1)、76(TNF13)、77(TNF14)、95(TNF29)或96(TNF30)。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中a)CDR1包含：- DYWMY的氨基酸序列；或- 與DYWMY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與DYWMY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；及b)CDR2包含：- EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；或- 與EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；及c)CDR3包含：- SPSGFN的氨基酸序列；或- 與SPSGFN的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或
- 與SPSGFN的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中CDR1包含了DYWMY的氨基酸序列。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中CDR2包含了EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中CDR3包含了SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中：- CDR1包含了DYWMY的氨基酸序列；同時CDR3包含了SPSGFN的氨基酸序列；或- CDR1包含了DYWMY的氨基酸序列；同時CDR2包含了EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；或- CDR2包含了EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；同時CDR3包含了SPSGFN的氨基酸序列。- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中CDR1包含了DYWMY的氨基酸序列；同時CDR3包含了SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中CDR1包含了DYWMY的氨基酸序列；而CDR2包含了EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列，同時CDR3包含了SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中a)CDR1為：- DYWMY的氨基酸序列；或- 與DYWMY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列
一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與DYWMY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；同時其中：b)CDR2為：- EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；或- 與EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；其中還有c)CDR3為：- SPSGFN的氨基酸序列；或- 與SPSGFN的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與SPSGFN的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中CDR1為DYWMY的氨基酸序列。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中CDR2為EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中CDR3為SPSGFN的氨
基酸序列。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中：- CDR1為DYWMY的氨基酸序列；同時CDR3為SPSGFN的氨基酸序列；或- CDR1為DYWMY的氨基酸序列；同時CDR2為EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；或- CDR2為EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；同時CDR3為SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中CDR1為DYWMY的氨基酸序列；同時CDR3為SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中CDR1為DYWMY的氨基酸序列；而CDR2為EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列，同時CDR3為SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中- 任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代為佳；及/或- 與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形。
其他關於此實用化的理想層面包括：
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，並屬於KERE級。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，並屬於人體化的KERE級。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，並且序列一致性(如此處定義)起碼要達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%，而該氨基酸序列的序列編碼有50(TNF3)、83(TNF20)、85(TNF21)、85(TNF22)、96(TNF23)或98(TNF33)。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中a)CDR1為：- NYYMG的氨基酸序列；或- 與NYYMG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與NYYMG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異。及b)CDR2為：- NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列；或- 與NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異。及c)CDR3為：- SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列；或- 與SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中CDR1為NYYMG的氨
基酸序列。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中CDR2為NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中CDR3為SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中：- CDR1為NYYMG的氨基酸序列；同時CDR3為SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列；或- CDR1為NYYMG的氨基酸序列；同時CDR2為NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列；或- CDR2為NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列；同時CDR3為SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中CDR1為NYYMG的氨基酸序列；而CDR2為NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列，同時CDR3為SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列。
- 符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，其中- 任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代為佳；及/或- 與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形。
迄今，其他格外受到矚目的層面有：
VII)包含或基本上帶有符合上述I)至V)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽。
VIII)包含或基本上帶有起碼一個符合上述I)至V)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽。
IX)包含兩個符合上述I)至V)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽。
x)包含兩個符合上述I)至V)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽，並且即所謂結合於TNF三聚體上的蛋白質或聚胜肽，對於所謂TNF三聚體調控的交聯，及/或這類受器交聯調控的訊息傳遞，能夠抑制或降低TNF受器之交聯。
XI)包含兩個符合上述I)至V)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽，並且在TNF三聚體上，可以於起碼兩個TNF受器結合位之間控制分子間結合。
XII)包含兩個符合上述I)至V)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽，而兩奈米抗體間則被適當地連接起來。
XIII)包含兩個符合上述I)至V)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽，而兩奈米抗體間則被適當地連接起來，並與PEG連結。
XIV)包含兩個符合上述I)至V)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽，甚至包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體。
XV)包含兩個符合上述I)至V)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽，甚至包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，並且即所謂結合於TNF三聚體上的蛋白質或聚胜肽，對於所謂TNF三聚體調控的交聯，及/或這類受器交聯調控的訊息傳遞，能夠抑制或降低TNF受器之交聯。
XVI)包含兩個符合上述I)至V)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽，甚至包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，並且在TNF三聚體上，可以於起碼兩個TNF受器結合位之間控制分子間結合。
XVII)包含兩個符合上述I)至V)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽，甚至包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，其中這兩個符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，皆被適當地連結
於該用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體。
XVIII)包含兩個符合上述I)至V)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽，甚至包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，其中這兩個符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，皆被適當地連結於該用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，而此即所謂結合於TNF三聚體上的蛋白質或聚胜肽，對於所謂TNF三聚體調控的交聯，及/或這類受器交聯調控的訊息傳遞，能夠抑制或降低TNF受器之交聯。
XIX)包含兩個符合上述I)至V)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽，甚至包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，其中這兩個符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，皆被適當地連結於該用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，並且在TNF三聚體上，可以於起碼兩個TNF受器結合位之間控制分子間結合。
- 符合上述VI)至XVIII)中任一項之蛋白質或聚胜肽，其中起碼有一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體是人體化的奈米抗體。
- 符合上述VI)至XVIII)中任一項之蛋白質或聚胜肽，其中起碼有一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體是奈米抗體ALB 1(序列編碼：63)的人體化變異。
- 符合上述VI)至XVIII)中任一項之蛋白質或聚胜肽，其中起碼有一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，選自帶有下列之群組：ALB 3(序列編碼：87)、ALB 4(序列編碼：88)、ALB 5(序列編碼：89)、ALB 6(序列編碼：100)、ALB 7(序列編碼：101)、ALB 8(序列編碼：102)、ALB 9(序列編碼：103)及ALB 10(序列編碼：104)。
- 符合上述VI)至XVIII)中任一項之蛋白質或聚胜肽，其中起碼有一
個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體為ALB 8。
- 符合上述VI)至XVIII)中任一項之蛋白質或聚胜肽，包含或基本上帶有兩個符合上述I)至V)中任一項之人體化奈米抗體，及一項奈米抗體ALB 1(序列編碼：63)的人體化變異。
值得注意的是，當提到某個奈米抗體「符合上述I)至V)中任一項」時，它起碼符合I)至V)中的一項，也可能符合I)至V)中的兩項以上，當然還可能涵蓋其他被指為符合上述I)至V)中任一項的一個以上之層面。又如當提到某個蛋白質或聚胜肽「符合上述VI)至XVIII)中任一項」時，它起碼符合VI)至XVIII)中的一項，也可能符合VI)至XVIII)中的兩項以上，當然還可能涵蓋其他被指為符合上述VI)至XVIII)中任一項的一個以上之層面。
在可應用的地方，一項可結合於兩個以上TNF-α的抗原決定基、抗原表位、局部、區域、次單元或確認處之奈米抗體或聚胜肽，也屬於此本案的範圍內。在這樣的例子中，本案中可結合於奈米抗體及/或聚胜肽的TNF-α抗原決定基、抗原表位、局部、區域或次單元，本質上可能相同(例如，如果TNF-α包含重複的結構基序，或是它形成了多聚體)或相異(在後者中，本案中的奈米抗體及/或聚胜肽或許會結合於不同的TNF-α抗原決定基、抗原表位、局部、區域或次單元，其間的親和力及/或專一性也可能有異同)。此外，像是當TNF-α有活化與非活化的構形存在時，本案中的奈米抗體及聚胜肽可能會結合於這些構形的其中一種(即其間的親和力及/或專一性也可能有異同)。同樣地，本案中的奈米抗體及聚胜肽可能會結合於已接有適當配位基的TNF-α構形，也可能會結合於未接有適當配位基的TNF-α構形，或是兩種構形都會結合(一樣是其間的親和力及/或專一性可能有異同)。
據推測，本案中的奈米抗體及聚胜肽會逐漸結合於所有天然的或合成的TNF-α類似物、變異、突變、等位基因、局部和片段，或是起碼要含有一個以上抗原決定基或抗原表位的TNF-α之類似物、變異、突變、等位基因、局部和片段，而它們本質上對結合於TNF-α(例如天然的TNF-α)之本案中的奈米抗體及聚胜肽會與抗原決定基或抗原表位相同。再者，本案中的奈米抗體及聚胜肽在這樣的例子中，可能會結合於該類似物、變異、突變、等位基因、局部和片段，因為親和力及/或專一性相同，或是異於(高於或低於)與本案中的奈米抗體對(天然的)TNF-α之親和力及專一性。
一般本案中的奈米抗體及聚胜肽，起碼會結合於那些形式(包括單體、多聚體和聚合形式)，而該形式是以生物及/或治療觀點看來最切要的，也是實驗者將要釐清的。
此外，因為TNF-α會以單體和多聚體形式存在，特別是三聚體，本案中僅結合於TNF-α單體形式的奈米抗體及聚胜肽也在本案範圍中，或是它們也會結合於一個以上的多聚體形式，像是TNF的三聚體形式；或可能僅結合於該種多聚體(例如三聚體)形式。因此，當此敘述用來針對對抗TNF-α的奈米抗體、蛋白質或聚胜肽，也應該了解其為含有對抗三聚體形式TNF-α的抗米抗體(包含但不侷限於針對該三聚體的受器結合位之奈米抗體(例如TNF-RI、THF-RII的結合位，亦稱p55或p75))。在所有情況中，本案中的奈米抗體及聚胜肽可能結合於該多聚體或聚合蛋白錯合物，而其親和力及/或專一性，可能會相同或相異(例如較高或較低)於結合於本案中的奈米抗體及聚胜肽結合於單體及非聚合狀態的TNF-α之親和力及/或專一性。
同時，一般本案中的帶有兩個以上奈米抗體並被用來對抗TNF-α的聚胜肽，可能會比相對的單體奈米抗體結合得更緊密。
舉例來說，通常帶有兩個以上奈米抗體並被用來對抗不同TNF-α的抗原表位之多價(依此處定義)蛋白質或聚胜肽，可能會比相對的單體奈米抗體對TNF-α結合得更緊密。
更重要的是，帶有兩個以上奈米抗體並被用來對抗不同TNF-α的抗原表位之多價(依此處定義)蛋白質或聚胜肽，可能(通常會)較傾向與多聚體TNF-α結合，勝過與單體TNF-α結合，通常也會比相對的單體奈米抗體結合得更緊密。在這樣的多價蛋白質或聚胜肽中，例如兩個以上的奈米抗體可能會備用來對抗相同的、本質上相等的或不同的抗原表位。在一項該多價蛋白質或聚胜肽的實用化中，可能有兩個以上的奈米抗體會是相同的(因此被用來對抗相同的抗原表位)。
後面的部份格外重要，平常由TNF所調控的訊息傳遞之首要模式，會經由TNF三聚體形成的TNF受器參與在交聯中，其中TNF三聚體有三個受器結合位(參見範例Peppel et al.,J.Exp.Med.,174(1991),1483-1489；Engelmann et al.,J.Biol.Chem.,265(1990),14497；Smith and Baglioni,J.Biol.Chem.,264(1989),14646)。舉例而言，如Peppel所描述，一個設計過的TNF受器之單價胞外區域，無法藉由兩個保留的受器結合位防止TNF受器的交聯，而僅能阻斷TNF三聚體上的單一受器結合位；而一個設計過包含兩個此類胞外區域的蛋白質與單價胞外區域比較起來，可提供驚人的效能，便可阻斷兩個受器結合位。
本案中，在體外、細胞內及細胞外模式裡，都見到單價奈米抗體可以在TNF活性降低時結合於TNF-α(見下方實驗部份)。雖然本案並不限於任何特定機轉，解釋或假設，一般相信本案中的兩個或三個單價奈米抗體之小體積及對TNF-α的高親和力，讓它們可以同時佔據
TNF三聚體上的兩個或三個不同的受器結合位，因此阻止該三聚體進行受器交聯和後續的訊息傳遞(然而，其他機轉也有可能：例如，依照抗原表位所對抗的目標，本案中的奈米抗體也可能抑制TNF聚合成三聚體的狀態)。
還有，欲在單一TNF三聚體上另行結合於兩個以上的結合位，當有免疫球蛋白變異區(或合適片段)是用來對抗TNF-α的抗原表位時，包含或本質上帶有兩個以上該免疫球蛋白變異區的蛋白質或聚胜肽，可能會結合於兩個分離的TNF-α分子(例如兩個分離的三聚體)之抗原表位。
然而，根據一項出奇的實例，當有免疫球蛋白變異區(或合適片段)是用來對抗TNF-α(尤指TNF-α三聚體)的抗原表位時，且其埋在及/或形成TNF三聚體受器結合位的部份，就像所謂結合於TNF三聚體的聚胜肽，而牽涉包含或本質上帶有兩個以上該免疫球蛋白變異區的蛋白質或聚胜肽之本案，可以抑制或降低由所謂TNF三聚體所調控的TNF受器交聯，及/或該受器交聯所調控的訊息傳遞。
另外，根據此範例，牽涉包含或本質上帶有兩個以上該免疫球蛋白變異區的蛋白質或聚胜肽之本案，當有免疫球蛋白變異區(或合適片段)是用來對抗TNF-α(尤指TNF-α三聚體)的抗原表位時，且其埋在及/或形成TNF三聚體受器結合位的部份，其中所謂的免疫球蛋白變異區會相互連結，而蛋白質或聚胜肽可同時結合於單一TNF三聚體上兩個以上的受器結合位(換句話說，可以讓一個TNF三聚體的起碼兩個TNF受器結合位產生分子間結合)。在此實例中，兩個以上的免疫球蛋白變異區遵照上述定義，且最好是奈米抗體(故蛋白質或聚胜肽如後述為多價奈米抗體結構)。同時兩個以上的免疫球蛋白變異區可能有異同；可能會被用於TNF受器結合位間對抗不同的抗原表
位，但最好還是針對相同的抗原表位。
此實例有另一項重點，兩個以上的免疫球蛋白變異區是要用於對抗TNF-α三聚體抗原表位，而該抗原表位則埋在及/或形成TNF三聚體受器結合位的部份。例如兩個以上的免疫球蛋白變異區最好是用來對抗及/或可以結合於TNF-α三聚體的抗原表位，而該抗原表位包括下列的氨基酸殘基：在第一TNF單體上88位的Gln及90位的Lys(此稱「單體A」)，而第二TNF單體上146位的Glu(此稱「單體B」)(在TNF三聚體中，單體A及單體B一起形成TNF受器結合位)。
如下方所詳述的奈米抗體部份，在這樣的蛋白質或聚胜肽中，起碼兩個以上的免疫球蛋白變異區會在特定情況下連結，此時蛋白質或聚胜肽的兩個免疫球蛋白變異區之N端與C端距離起碼為50埃，更好的狀況為55-200埃的範圍，尤其是在65-150的範圍。
再者，該兩個以上的免疫球蛋白序列為奈米抗體，最好是由此處提到的奈米抗體中選出。在此實例中，某些較實用的奈米抗體為PMP1C2(TNF1，序列編碼：52)及/或PMP5F10(TNF3，序列編碼：60)，就像人體化與其他變異(如此處所述)；以及PMP1C2(TNF1，序列編碼：52)，而這是格外理想的人體化變異。
因此，本案將會以奈米抗體的相關資料詳述。然而，實驗者會更清楚，此處的訊息可能會類似地應用於免疫球蛋白變異區。
在此本案實例中，經常會將兩個以上的免疫球蛋白序列透過一個以上的合適連結相連，這樣的連結中，免疫球蛋白序列可以結合於相同TNF三聚體上不同的受器結合位。經過一些例行實驗的有限層級之後，在各種對象中，合適的連結是依照(兩者間距)TNF三聚體上的抗原表位對所結合的免疫球蛋白序列而定，而實驗者也會根據此處的發現進行了解。例如當兩個以上免疫球蛋白序列為(單一)區域抗體
或是奈米抗體，合適的連結應該從此處所述中挑選，但是連結的長度應該要使兩個以上的(單一)區域抗體或是奈米抗體能夠結合於相同TNF三聚體上不同的受器結合位。
另外，當兩個以上結合於TNF-α受器結合位的免疫球蛋白序列為(單一)區域抗體或是奈米抗體，它們應該也會透過第三個(單一)區域抗體或是奈米抗體而相互連結(其中兩個以上免疫球蛋白序列可能會直接或透過第三個(單一)區域抗體/奈米抗體而連結)。這樣的第三個(單一)區域抗體或是奈米抗體可能是延長半生期的(單一)區域抗體或是奈米抗體，以後會加以描述。例如，較後面的(單一)區域抗體或是奈米抗體，可能為可結合於例如(人類)血清白蛋白這樣的(人類)血清蛋白質之(單一)區域抗體或是奈米抗體。
而結合於TNF-α受器結合位上的兩個以上免疫球蛋白序列可能會串聯(無論直接或透過合適的連結)，同時該第三個(單一)區域抗體或是奈米抗體(也許能如前述般延長半生期)可能會直接或透過前述的免疫球蛋白序列兩者之一以上進行連結。一些屬於這類組成的未受限實驗為序列編碼：93或94的組成。
根據本案顯示(參照此處所附之結晶資料)，當現有的奈米抗體在多價或多專一性的蛋白質或聚胜肽出現，而結合於前述的特定抗原表位(TNF1的抗原表位及其人體化變異，連同TNF3的抗原表位及其人體化變異)，在這樣的蛋白質或聚胜肽中，起碼兩個(或以上)的抗TNF奈米抗體會相連，而兩個抗TNF奈米抗體連結時，N端與C端距離起碼為50埃，更好的狀況為55-200埃的範圍，尤其是在65-150的範圍(上限較不重要，以方便原則加以挑選，即視蛋白質的表現/製造觀點而定)；或是依常用距離，應該讓蛋白質或聚胜肽能夠跟TNF三聚體產生分子間結合(亦即非分子內結合)。兩個抗TNF奈米抗體連結
間的N端與C端距離可以用各種合適的方法測定，像是結晶學或分子模擬(如此處所述)。不論是特定的多價或多專一性蛋白質或聚胜肽，在提供分子間模擬之下，這些技術均能測得該距離。此外，目前的本案還能利用大小排除層析法(參見Santora et al.,Anal.Biochem.,299：119-129)提供簡單的實驗，以用來決定本案中的蛋白質或聚胜肽將會(預先)形成對TNF三聚體的分子間結合，或(預先)產生在兩個以上TNF三聚體間的分子內結合。因此，本案的一項重點為，本案中的蛋白質或聚胜肽在實驗中，最好能預先或本身排除導致分子間結合的情形。然而，如前面強調的，須注意本案中會透過分離的TNF-α分子(例如三聚體)而進行運作的蛋白質或聚胜肽，也屬於本案的範圍。
因此，本案另一方面提出了多價或多專一性而包含起碼兩個對抗TNF-α(尤指TNF-α三聚體)之奈米抗體的蛋白質或聚胜肽，其中所謂的奈米抗體被用於跟奈米抗體PMP1C2(如此處所提)本質相同的抗原表位，並有至少兩個奈米抗體，它們這些抗TNF奈米抗體連結時，N端與C端的距離使得蛋白質或聚胜肽足以跟TNF三聚體形成分子間結合(如此處所提)。較佳的條件為蛋白質或聚胜肽中的N端與C端距離起碼為50埃，更好的狀況為55-200埃的範圍，尤其是在65-150的範圍最好。
這樣的蛋白質或聚胜肽中，只要這起碼兩個抗TNF奈米抗體的N端到C端符合理想距離，及/或當蛋白質或聚胜肽足以跟TNF三聚體形成分子間結合(如此處所提)時，兩個以上的奈米抗體便可能會以適當方式相連。
例如在最簡單的形式中，起碼兩個奈米抗體透過合適的連結而直接相連，而符合這起碼兩個抗TNF奈米抗體的N端到C端之理想距
離，並能夠讓蛋白質或聚胜肽足以跟TNF三聚體形成分子間結合(如此處所提)。在不設限的情形下，此處所提到的合適連結包含一段含14個氨基酸的氨基酸序列，最好是能有17個以上，像是20-40個這樣的氨基酸序列(以氨基酸的平均距離為3.5埃來看，相對的連結長度分別為49埃、59.5埃及大約70埃；其中氨基酸數量的最大值是以跟距離相同的方法計算)。這樣的氨基酸序列應該使蛋白質或聚胜肽足以跟TNF三聚體形成分子間結合(如此處所提)。
因此，本案另一方面提出了多價或多專一性而包含起碼兩個對抗TNF-α(尤指TNF-α三聚體)之奈米抗體的蛋白質或聚胜肽，其中所謂的奈米抗體被用於跟奈米抗體PMP1C2(如此處所提)本質相同的抗原表位，並有至少兩個奈米抗體，它們這些抗TNF奈米抗體連結時，N端與C端的距離使得蛋白質或聚胜肽足以跟TNF三聚體形成分子間結合(如此處所提)。較佳的條件為蛋白質或聚胜肽中的N端與C端距離起碼為50埃，更好的狀況為55-200埃的範圍，尤其是在65-150的範圍最好。
再者，此處的連結包含一段起碼為14個氨基酸的氨基酸序列，價好的起碼要17個，最好能達起碼20個(上限較不重要，以方便原則挑選，最多可到50，通常是在40個左右)。在較理想的未受限實例中，連結基本上要含有甘氨酸和絲胺酸殘基(如後述)。例如某個合適的連結為此處提到的GS30連結，它便含有30個氨基酸殘基。
另一種例子中，兩個以上的抗TNF-α奈米抗體透過像是另一個蛋白質或聚胜肽的其他部位相連(可選擇一個或兩個連結)。此例中，在此兩個以上的抗TNF-α奈米抗體N端與C端間有理想的距離(如上述)較佳，因此該蛋白質或聚胜肽仍可與TNF三聚體形成分子間結合(如此處所提)。此例中，此兩個以上的抗TNF-α奈米抗體可直接與
其他部位相連，或是透過合適的連結，只要前提有適當的距離及/或仍可產生分子間結合。該部位可以為任何合適者，只要它不會破壞(太多)蛋白質或聚胜肽與TNF之間的結合，及/或後敘中蛋白質或聚胜肽的生物或藥理性質。因此，此部位基本上可以不具活性或具生物活性，也不會增加蛋白質或聚胜肽的預期性質，及/或帶來一個以上額外的蛋白質或聚胜肽性質。例如不設限時，此部位可能會提高蛋白質或聚胜肽的半生期，及/或降低其免疫性或增加任何其他性質。在某個實例中，此部位可能為另一個奈米抗體(包含但不限於第三個對抗TNF-α之奈米抗體，雖然這個並非必要而且常被忽略)，特別是另一個能增加蛋白質或聚胜肽半生期的奈米抗體，例如一個用來對抗像血清白蛋白這類血清蛋白質的奈米抗體。此處會描述這些蛋白質或聚胜肽的例子。
在某個實例中，本案提到包含兩個以上免疫球蛋白序列(或合適片段)的多價多專一性組成，而且該序列皆被用來對抗埋在及/或形成受器結合位的部份之TNF-α抗原表位(例如TNF-α三聚體的部份)，相互之間透過一個以上能增長半生期(可選擇性地透過一個以上的適當連結)的免疫球蛋白序列產生連結，像經過連結到TNF三聚體的過程，所謂的聚胜肽就可以抑制或降低TNF交聯及/或由TNF三聚體所調控的訊息傳遞。這類的聚胜肽可能為前面提過的兩個以上之免疫球蛋白，它們可以連結於TNF三聚體上的不同受器結合位。
本實例中，特別的是此聚胜肽可能含有三價雙專一性的奈米抗體，而它含有兩個皆用來對抗埋在及/或形成受器結合位部份的TNF-α抗原表位之奈米抗體，其中所謂的奈米抗體透過了第三個能增長半生期的奈米抗體(例如用來對抗人類血清白蛋白這類血清蛋白質的奈米抗體)而相互連結，透過一個以上的合適連結，前述的兩個奈米抗體
皆直接連結到所謂的第三個奈米抗體上，經過連結到TNF三聚體的過程，所謂的聚胜肽就可以抑制或降低TNF交聯及/或由TNF三聚體所調控的訊息傳遞。這樣的聚胜肽可能為前述的兩個奈米抗體，而它們都可以接到TNF三聚體上的不同受器接受位。某些在本實例中格外受到重視的奈米抗體為人體化與其他變異的PMP1C2(TNF1，序列編碼：52)及/或PMP5F10(TNF3，序列編碼：60)；而PMP1C2(TNF1，序列編碼：52)與其變異則格外重要；以及用來對抗此處人類血清白蛋白的奈米抗體。此實例中有些較佳但未受限定的組成為TNF 24(序列編碼：90)、TNF 26(序列編碼：92)、TNF 27(序列編碼：93)、TNF 28(序列編碼：94)、TNF 60(序列編碼：417)及TNF 62(序列編碼：418)，其中TNF 60格外受到重視。
因此，此本案中某些重要的層面包括：
XX)包含或本質上由兩個以上免疫球蛋白變異區(或合適片段)組成的蛋白質或聚胜肽，而且皆用來對抗埋在及/或形成TNF三聚體受器結合位部份的TNF-α抗原表位(尤指TNF-α三聚體)，經過連結到TNF三聚體的過程，所謂的聚胜肽就可以抑制或降低TNF三聚體所調控的交聯，及/或由這類受器交聯所調控的訊息傳遞。
XXI)包含或本質上由兩個以上免疫球蛋白變異區(或合適片段)組成的蛋白質或聚胜肽，而且皆用來對抗埋在及/或形成TNF三聚體受器結合位部份的TNF-α抗原表位(尤指TNF-α三聚體)，經過連結到TNF三聚體的過程，所謂的聚胜肽就可以在TNF三聚體上對兩個以上TNF受器結合位形成分子間連結。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中所謂的免疫球蛋白變異區相互連結，而蛋白質或聚胜肽可以在單一TNF三聚體上同時連結兩個以上的受器結合位。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中所謂的免疫球蛋白變異區可以連結到像奈米抗體TNF1(序列編碼：52)的相同抗原表位。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中所謂的免疫球蛋白變異區可以在TNF三聚體內的TNF受器結合位連結來對抗該抗原表位，TNF三聚體此則包含了下列氨基酸殘基：單體A中88位的Gln；單體A中90位的Lys及單體B中146位的Glu。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中所謂的免疫球蛋白變異區可以在TNF三聚體內的TNF受器結合位連結來對抗該抗原表位，TNF三聚體此則包含了下列氨基酸殘基：單體A中88位的Gln；單體A中90位的Lys及單體B中146位的Glu，並在TNF-α中進一步包含下列氨基酸殘基的一個以上，甚至兩個以上，再好些能夠達五個以上，而最好是全部或本質上全部：24位的Gly、25位的Gln、72位的Thr、73位的His、74位的Val、75位的Leu、77位的Thr、79位的Thr、83位的Ile、89位的Thr、91位的Val、92位的Asn、97位的Ile、131位的Arg、135位的Glu、136位的Ile、137位的Asn、138位的Arg、139位的Pro、140位的Asp，以及在單體B的下列殘基：20位的Pro、32位的Arg、65位的Lys、112位的Lys、115位的Tyr、145位的Ala、147位的Ser。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中所謂的免疫球蛋白變異區可以在TNF三聚體內的TNF受器結合位連結來對抗該抗原表位，而TNF三聚體起碼包含了下列氨基酸殘基：單體A中88位的Gln；單體A中90位的Lys及單體B中146位的Glu；並在TNF-α中進一步包含下列氨基酸殘基的一個以上，甚至兩個以上，再好些能夠達五個以上，而最好是全部或本質上全部：75位
的Leu、77位的Thr、79位的Thr、80位的Ile、81位的Ser、87位的Tyr、89位的Thr、91位的Val、92位的Asn、95位的Ser、97位的Ile、135位的Glu、136位的Ile、137位的Asn，以及在單體B的下列殘基：33位的Ala、145位的Ala、147位的Ser。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中兩個以上免疫球蛋白變異區相互連結，而在該蛋白質或聚胜肽之第一個免疫球蛋白變異區的N端與第二個免疫球蛋白變異區的C端之間，距離起碼為50埃。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個免疫球蛋白變異區的N端與第二個免疫球蛋白變異區的C端之間，距離介於55-200埃。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個免疫球蛋白變異區的N端與第二個免疫球蛋白變異區的C端之間，距離介於65-150埃。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其第一個免疫球蛋白變異區與第二個免疫球蛋白變異區透過某種連結而相連。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，透過某個氨基酸相連。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，透過含14個氨基酸以上的殘基相連。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，透過含17-50個氨基酸以上的殘基相連。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，透過本質上含有甘氨酸或絲氨酸的連結而相連。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，透過GS30(序列
編碼：69)相連。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區透過另一個基團而相連。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中有其他基團屬於某蛋白質或聚胜肽的基團。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中有其他基團使得該蛋白質或聚胜肽帶有一個以上的預期性質，或是提升了該蛋白質或聚胜肽一個以上的性質。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中有其他基團使得該蛋白質或聚胜肽的半生期延長，及/或降低了該蛋白質或聚胜肽的免疫性。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區透過另一個連結而與其他基團相連。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中藉由某個氨基酸序列相連。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其連結本質上含有甘氨酸與絲氨酸殘基。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中的其他基團為奈米抗體。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中的其他基團為用來對抗人類血清白蛋白之奈米抗體。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中起碼有一個用來對抗人類血清白蛋白之奈米抗體為人體化之奈米抗體。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中起碼有一個用來對抗人類血清白蛋白之奈米抗體為奈米抗體ALB 1(序列編
碼：63)之人體化變異。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中起碼有一個用來對抗人類血清白蛋白之奈米抗體為選自下列組成之奈米抗體：ALB 3(序列編碼：87)、ALB 4(序列編碼：88)、ALB 5(序列編碼：89)、ALB 6(序列編碼：100)、ALB 7(序列編碼：101)、ALB 8(序列編碼：102)、ALB 9(序列編碼：103)及ALB 10(序列編碼：104)。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中起碼有一個用來對抗人類血清白蛋白之奈米抗體為ALB 8。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為奈米抗體。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為奈米抗體，且對於TNF的Koff速率優於2.10-3(l/s)，較佳的狀況是優於1.10-3(l/s)；或是一種該奈米抗體的人體化變異。
- 符合上述XIX)至XX)任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為奈米抗體，使用WO 04/041862的3)之範例1中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比相同分析下WO 04/041862奈米抗體VHH 3E(序列編碼：4)的EC50值還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為奈米抗體，使用WO 04/041862的3)之範例中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比12nM還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與
第二個免疫球蛋白變異區為奈米抗體，使用WO 04/041862的3)之範例中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比5nM還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為奈米抗體，使用WO 04/041862的3)之範例中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比3nM還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，而且皆已被人體化。
此實例還有一些特別受重視的部份為：
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為GLEW級的奈米抗體。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為在103位帶有精胺酸殘基(R)之奈米抗體。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為在103位帶有精胺酸殘基(R)之GLEW級奈米抗體。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為奈米抗體，且跟下列的氨基酸序列(如此處定義)編碼一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%：52(TNF1)、76(TNF13)、77(TNF14)、95(TNF29)或96(TNF30)。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與
第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，其中：a)CDR1包含：- DYWMY的氨基酸序列；或- 與DYWMY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與DYWMY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；及b)CDR2包含：- EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；或- 與EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；及c)CDR3包含：- SPSGFN的氨基酸序列；或- 與SPSGFN的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與SPSGFN的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，而且CDR1為DYWMY的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，而且CDR2為EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，而且CDR3為SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，而且：- CDR1為DYWMY的氨基酸序列；而CDR3為SPSGFN的氨基酸序列；或- CDR1為DYWMY的氨基酸序列；而CDR2為EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；或- CDR2為EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；而CDR3為SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，而CDR1為DYWMY的氨基酸序列；CDR3為SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，而CDR1為包含DYWMY的氨基酸序列；CDR2為
EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列且CDR3為SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，其中：a)CDR1為：- DYWMY的氨基酸序列；或- 與DYWMY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與DYWMY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；而且：b)CDR2為：- EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；或- 與EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；還有c)CDR3為：- SPSGFN的氨基酸序列；或- 與SPSGFN的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要
95%，甚至好到99%；或- 與SPSGFN的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，而CDR1為DYWMY的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，而CD2為EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，而CDR3為SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，其中：- CDR1為DYWMY的氨基酸序列；CDR3為SPSGFN的氨基酸序列；或- CDR1為DYWMY的氨基酸序列；CDR2為EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；或- CDR2為EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；CDR3為SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，其中CDR1為DYWMY的氨基酸序列；CDR3為SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，其中CDR1為DYWMY的氨基酸序列；而CDR2為EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列，CDR3為SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，其中：- 任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代為佳；及/或- 與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區，選自帶有奈米抗體TNF 1(序列編碼：52)與奈米抗體TNF 1(序列編碼：52)的人體化變異群組中。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區，選自帶有TNF 13(序列編碼：76)、TNF 14(序列編碼：77)、TNF 29(序列編碼：95)及30(序列編碼：96)的群組中。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為TNF 30(序列編碼：96)；本本案的其他重要層面為：- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為KERE級的奈米抗體。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區與下列氨基酸的序列一致性(如此處定
義)起碼要達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%，而該氨基酸序列的序列編碼有50(TNF3)、83(TNF20)、85(TNF21)、85(TNF22)、96(TNF23)或98(TNF33)。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，其中：a)CDR1包含：- NYYMG的氨基酸序列；或- 與NYYMG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與NYYMG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；及b)CDR2包含：- NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列；或- 與NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；及c)CDR3包含：- SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列；或- 與SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列對照，一段氨基酸
序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，其中CDR1包含NYYMG的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，其中CDR2包含NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，其中CDR3包含SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，而且：- CDR1包含NYYMG的氨基酸序列；而CDR3包含SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列；或- CDR1包含NYYMG的氨基酸序列；而CDR2包含NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列；或- CDR2包含NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列；而CDR3包含SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，其中CDR1包含NYYMG的氨基酸序列，其中CDR1包含NYYMG的氨基酸序列；而CDR2包含NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列，CDR3包含
SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，其中CDR1包含NYYMG的氨基酸序列，其中a)CDR1為：- NYYMG的氨基酸序列；或- 與SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與NYYMG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；及b)CDR2為：- NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列；或- 與NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；及c)CDR3為：- SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列；或- 與SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列對照，一段氨基酸
序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，而且CDR1為NYYMG的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，而且CDR2為NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，而且CDR3為SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，而且：- CDR1為NYYMG的氨基酸序列；而CDR3為SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列；或- CDR1為NYYMG的氨基酸序列；而CDR2為NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列；或- CDR2為NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列；而CDR3為SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，而且CDR1為NYYMG的氨基酸序列；CDR2為NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列，CDR3為SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與
第二個免疫球蛋白變異區為符合上述XIX)至XX)中任一項的奈米抗體，而且- 任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代為佳；及/或- 與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區，選自帶有奈米抗體TNF 3(序列編碼：60)及奈米抗體TNF 3(序列編碼：60)的人體化變異群組中。
- 符合上述XIX)至XX)中任一項的蛋白質或聚胜肽，其中第一個與第二個免疫球蛋白變異區，選自帶有TNF20(序列編碼：83)、TNF21(序列編碼：84)、TNF 22(序列編碼：85)、TNF23(序列編碼：86)或TNF33(序列編碼：99)。
值得注意的是，當提到某個蛋白質或聚胜肽「符合上述XIX)至XX)中任一項」時，它起碼符合XIX)至XX)中的一項，也可能符合XIX)至XX)中的兩項，當然還可能涵蓋其他被指為符合上述XIX)至XX)中任一項的一個以上之層面。
然而值得注意的是，本案並不限於任何特定的行為機轉或假設。特別是已知本案中的單價奈米抗體可能在此處提到的分析與模式中表現活性，藉以確定TNF三聚體的分子間結合，雖然這是某一個特定實用化本案的重點，但是並不須要知道此處奈米抗體、蛋白質和聚胜肽的預期動作及效應。類似的部份還包括本案範圍中，此處的蛋白質和聚胜肽可以透過任何適當的機制(及分子間結合、分子內結合或甚至是指單體TNF結合，藉以抑制TNF三聚體的生成)完成其需要的動作。
本案範圍還包括使用本案的奈米抗體與聚胜肽之部份、片段、類
似物、突變、變異、等位基因及/或衍生物，及/或當這些適合於此處所重視的用途時，使用包含或本質上相同的蛋白質或聚胜肽。
在另外的層面上，本案還包括對抗帶有4個骨架區域(分別為FR1至FR4)與3個互補決定區域(分別為CDR1至CDR3)之TNF-α的奈米抗體(如此處定義)，其中：(i)CDR1為選自含序列編碼為15至21或164至197的CDR1序列之氨基酸；或是與含序列編碼為15至21或164至197的至少一個CDR1序列比較起來，選自的氨基酸序列群組之序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%(如此處定義)，其中(1)任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代(如此處定義)為佳；及/或(2)與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形；與序列編碼為15至21或164至197的至少一個CDR1序列比較起來，選自的氨基酸序列群組中只有二個或一個「氨基酸差異」如此處定義，其中：(1)任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代(如此處定義)為佳；及/或(2)與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形；並且：(ii)CDR2為選自含序列編碼為22至28或232至265的CDR2序列之氨基酸；
或是與含序列編碼為22至28或232至265的至少一個CDR2序列比較起來，選自的氨基酸序列群組之序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%(如此處定義)，其中(1)任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代(如此處定義)為佳；及/或(2)與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形；及/或與序列編碼為22至28或232至265的至少一個CDR2序列比較起來，選自的氨基酸序列群組中只有三、二個或一個「氨基酸差異」如此處定義，其中：(1)任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代(如此處定義)為佳；及/或(2)與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形；而且：(iii)CDR3為選自含序列編碼為29至33或300至333的CDR3序列之氨基酸；或是與含序列編碼為29至33或300至333的至少一個CDR3序列比較起來，選自的氨基酸序列群組之序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%(如此處定義)，其中(1)任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代(如此處定義)為佳；及/或(2)與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有
氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形；及/或與序列編碼為29至33或300至333的至少一個CDR2序列比較起來，選自的氨基酸序列群組中只有三、二個或一個「氨基酸差異」如此處定義，其中：(1)任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代(如此處定義)為佳；及/或(2)與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形；或是選自序列編碼34與35的CDR3序列，或與含序列編碼為34與35的至少一個CDR3序列比較起來，選自的氨基酸序列群組之序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%(如此處定義)，其中；(1)任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代(如此處定義)為佳；及/或(2)與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形；及/或與序列編碼為34與35的至少一個CDR3序列比較起來，選自的氨基酸序列群組中只有三、二個或一個「氨基酸差異」(如此處定義)，其中：(1)任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代(如此處定義)為佳；及/或(2)與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形；上述與接下來所述要用以對抗TNF-α的奈米抗體，均為本案中的奈米抗體之參考。
本案中的奈米抗體裡，具有上述一個以上的CDR特徵者較佳；具有兩個以上該特徵的更好；而最理想狀況則是具有三個CDR的特徵。
有些較佳但不受限的CDR序列組合可以參見下列表I，當中列出了此本案中較受重視(但未限定)的CDR與骨架序列。實驗者要知道的是，相同的克隆中所出現的CDR1、CDR2與CDR3序列組合(即表I中相同線上所提到的CDR1、CDR2與CDR3序列)將常被選用(雖然廣義的本案並不限於此，也可以包含其他適當表I中所提到的CDR序列組合)。
同時，在包含表I中所提到的CDR序列組合奈米抗體之中，每一個CDR皆可以由選自下列群組的CDR取代，它們跟所提到的CDR氨基酸序列群組之序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%(如此處定義)，其中(1)任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代(如此處定義)為佳；及/或(2)與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形；及/或與所提及的CDR所含有之前述氨基酸序列比較起來，選自的氨基酸序列群組中只有三、二個或一個「氨基酸差異」(如前段定義)，其中：(1)任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代(如此處定義)為佳；及/或(2)與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形；然而，實驗者要知道的是，表I中提到的CDR序列(之組合)將會常被選用。
表I中的注意事項：
- ID須參照附加序列表中的序列編碼
- 對CDR1：序列編碼：164對應於序列編碼：15、序列編碼：167對應於序列編碼：16；序列編碼：172對應於序列編碼：17、序列編碼：165及166對應於序列編碼：18、序列編碼：170對應於序列編碼：19、序列編碼：171對應於序列編碼：20，而序列編碼：168及169對應於序列編碼：21。
- 對CDR2：序列編碼：232及233對應於序列編碼：22、序列編碼：235對應於序列編碼：23、序列編碼：240對應於序列編碼：24、序列編碼：234對應於序列編碼：25序列編碼：236及237對應於序列編碼：26、序列編碼：238對應於序列編碼：27，而序列編碼：239對應於序列編碼：28。
- 對CDR3：序列編碼：303對應於序列編碼：29、序列編碼：308對應於序列編碼：30、序列編碼：306對應於序列編碼：31、序列編碼：307對應於序列編碼：32、序列編碼：304及305對應於序列編碼：33、序列編碼：300對應於序列編碼：34，而序列編碼：301及302對應於序列編碼：35。
因此在本案中的奈米抗體裡，呈現的CDR1、CDR2與CDR3序列起碼有一個是從分別含CDR1、CDR2與CDR3序列的群組中適當地選出，而它們就列在表I中；或是從起碼有一個跟分別含表I中的CDR1、CDR2與CDR3序列的群組中選出，而「序列一致性」起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%(如此處定義)；及/或與起碼一個表I中的CDR1、CDR2與CDR3序列比較起來，選自的含CDR1、CDR2與CDR3序列的群組之氨基酸序列群組中只有三、二個或一個「氨基酸差異」(如此處定義)。本文中，「適當
地選出」表示在可行的情況下，分別將CDR1選自適當的CDR1序列中(即此處定義)，CDR2選自適當的CDR2序列中(即此處定義)，而CDR3選自適當的CDR3序列中(即此處定義)。
特別是本案中的奈米抗體中，起碼有CDR3序列是適當地選自表I中含CDR3的序列，或是選自序列一致性跟表I中的CDR3起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%的群組；及/或選自跟表I中的CDR3序列只有三、二個或一個氨基酸差異的含CDR3之群組中。
此外，本案中的奈米抗體中，起碼有CDR1、CDR2與CDR3中兩個以上的序列是適當地選自表I中分別含CDR1、CDR2與CDR3的序列，或是選自序列一致性跟表I中的CDR1、CDR2與CDR3起碼分別達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%的群組；及/或選自跟表I中的CDR1、CDR2與CDR3序列分別只有三、二個或一個氨基酸差異的分別含CDR1、CDR2與CDR3之群組中。
此外，本案的奈米抗體中，起碼CDR3序列是適當地選自表I中含CDR3的序列，或是選自序列一致性跟表I中的CDR3起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%的群組；及/或起碼CDR1與CDR2中有一個序列是適當地選自表I中所含CDR1與CDR2的序列，或是選自序列一致性跟表I中的CDR1與CDR2中起碼一個達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%的群組；及/或選自跟表I中分別的CDR1與CDR2序列只有三、二個或一個氨基酸差異的分別含CDR1與CDR2之群組中。
最理想的是，在本案的奈米抗體中，CDR1、CDR2與CDR3三個序列皆適當地選自表I中分別含CDR1、CDR2與CDR3的序列，或是選自序列一致性跟表I中的CDR1、CDR2與CDR3中起碼一個達80%，較佳
的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%的群組；及/或選自跟表I中分別的CDR1、CDR2與CDR3序列只有三、二個或一個氨基酸差異的分別含CDR1、CDR2與CDR3之群組中。
值得一提的是，在本案的奈米抗體中，CDR1、CDR2與CDR3序列中起碼一個適當地選自表I中分別含CDR1、CDR2與CDR3的序列。而且，在實例中，其他兩個CDR序列中起碼一個要適當地選自序列一致性跟表I中一個以上的CDR1序列達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%的群組；及/或選自跟表I中一個以上的對應序列只有三、二個或一個氨基酸差異的含CDR序列之群組中。
此外，在本案的奈米抗體中，起碼CDR3序列是適當地選自表I中含CDR3的序列，或是選自序列一致性跟表I中的CDR3起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%的群組；及/或起碼CDR1與CDR2中有一個序列是適當地選自表I中所含CDR1與CDR2的序列，或是選自序列一致性跟表I中的CDR1與CDR2中起碼一個達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%的群組；及/或選自跟表I中分別的CDR1與CDR2序列只有三、二個或一個氨基酸差異的分別含CDR1與CDR2之群組中。
尤有甚者，在本案的奈米抗體中，CDR1、CDR2與CDR3序列中起碼兩個適當地選自表I中分別含CDR1、CDR2與CDR3的序列。而且，在實例中，剩餘的CDR序列適當地選自序列一致性跟表I中含CDR序列者達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%的群組；及/或選自跟表I中一個以上的對應序列只有三、二個或一個氨基酸差異的含CDR序列之群組中。
另外，在本案的奈米抗體中，起碼CDR3序列是適當地選自表I中含CDR3的序列，而CDR1與CDR2任一個序列是適當地選自表I中分別
含CDR1與CDR2的序列。在實例中，剩餘的CDR序列適當地選自序列一致性跟表I中起碼含一個對應的CDR序列比較起來達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%的群組；及/或選自跟表I中一個以上的對應序列只有三、二個或一個氨基酸差異的含CDR序列之群組中。
尤有甚者，在本案的奈米抗體中，CDR1、CDR2與CDR3三個序列皆適當地選自表I中分別含CDR1、CDR2與CDR3的序列。
通常表I所列的CDR之組合(即在表I中所提到的同一線上)較佳。因此，較理想的狀況是，當本案的奈米抗體中CDR為表I中所提到的CDR序列，或是適當地選自表I中含CDR的序列，而序列一致性跟表I中的CDR比較起來達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%的群組；及/或選自跟表I中的對應序列只有三、二個或一個氨基酸差異的含CDR序列之群組中，而且有一個或最好兩個是適當地選自表I中所含屬於相同組成CDR的序列(即在表I中所提到的同一線上)或適當地選自表I中含CDR的序列，而序列一致性跟表I中的屬於相同組成的CDR比較起來達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%的群組及/或選自跟表I中的對應序列只有三、二個或一個氨基酸差異的含相同組成CDR序列之群組中。上述段落中其他較佳的部份也可應用於表I中提到的CDR組成。
因此，藉由未受限的例子，像是本案的奈米抗體中就可以包含CDR1序列，其序列一致性跟表I中提到的CDR1比較起來達80%，還有跟表I中提到的CDR2序列只有三、二個或一個氨基酸差異(但屬於不同組合)的CDR2序列，以及CDR3序列。
有些本案的奈米抗體中就可以包含：(1)序列一致性跟表I中提到的CDR1序列比較起來達80%的CDR1序列；跟表I中提到的CDR2序列
只有三、二個或一個氨基酸差異(但屬於不同組合)的CDR2序列；序列一致性跟表I中提到的CDR3序列(但屬於不同組合)比較起來達80%的CDR3序列；或(2)序列一致性跟表I中提到的CDR1序列比較起來達80%的CDR1序列；CDR2序列及一個表I中所列的CDR3序列之一；或(3)CDR1序列；序列一致性跟表I中提到的CDR2序列比較起來達80%的CDR2序列；跟表I中提到的CDR3序列只有三、二個或一個氨基酸差異(但屬於不同組合)的CDR3序列，並屬於跟CDR2相同的組合。
有些本案的奈米抗體中就可以包含：(1)序列一致性跟表I中提到的CDR1序列比較起來達80%的CDR1序列；跟表I中提到的CDR2序列只有三、二個或一個氨基酸差異(但屬於不同組合)的CDR2序列，並屬於相同的組合；以及序列一致性跟表I中提到的CDR3序列比較起來達80%的CDR3序列，並屬於相同的組合；(2)CDR1序列；表I中所列的CDR2，以及表I中所列的CDR3序列(其中CDR2與CDR3序列可能屬於不同組合)。
有些本案的奈米抗體中就可以包含：(1)序列一致性跟表I中提到的CDR1序列比較起來達80%的CDR1序列；表I中所列屬於相同組合的CDR2；及表I中所列屬於不同組合的CDR3；或(2)表I中提到的CDR1序列；跟表I中提到的CDR2序列只有三、二個或一個氨基酸差異的CDR2序列，並屬於相同的組合；表I中提到的CDR3序列比較起來達80%的序列一致性，並屬於相同的組合。
本案中重要的奈米抗體可以包含表I中提到的CDR1序列，表I中提到的CDR2序列比較起來達80%並屬於相同組合的CDR2序列；及表I中提到屬於相同組合的CDR3。
在裡面最重要的奈米抗體中，CDR1、CDR2與CDR3序列均適當
地選自表I中分別所列的CDR1、CDR2與CDR3序列之組合。
此外，當一個CDR序列適當地選自表I中含CDR的序列，而序列一致性(如此處定義)跟表I中的CDR比較起來達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%的群組；及/或當一個CDR序列適當地選自表I中只有三、二個或一個氨基酸差異的CDR序列之一。
i)任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代(如此處定義)為佳；及/或ii)與表I所列的的CDR序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形。
根據未限定的理想本案實例，奈米抗體中的CDR序列如前述定義，並會使得本案中的奈米抗體結合於TNF-α時具有10-5至10-12莫耳/升(M)或以下的解離常數(KD)，較佳的情形是10-7至10-12莫耳/升(M)或以下，更好則是到10-8至10-12莫耳/升(M)，及/或起碼達107 M-1的結合常數(KA)，較佳的情形是到108 M-1，更好則是到109 M-1以上，像是起碼有1012 M-1；特別是KD低於500 nM，較佳的情形是低於200 nM，更好則是低於10 nM，像是低於500 pM。本案中用來對抗TNF-α的奈米抗體之KD及KA值可以由周知的方法確認，例如使用此處所述的分析。
根據另外較佳但未限定的本案實例，(a)CDR1的長度為介於1到12個氨基酸殘基，且通常是2到9個氨基酸殘基，像是5、6或7個氨基酸殘基；及/或(b)CDR2的長度為介於13到24個氨基酸殘基，且通常是介於15到21個氨基酸殘基，像是16與17個氨基酸殘基；及/或(c)CDR3的長度為介於2到35個氨基酸殘基，且通常是介於3到30個氨基酸殘基，像是介於6到23個氨基酸殘基。
在某方面，此本案提出了比奈米抗體3E更佳的對抗TNF-α之奈米抗體，是根據WO 04/041862表現最佳的奈米抗體。
特別的是，此本案實例中某些較重要的層面為：
XXII)含有4個骨架區域(分別為FR1到FR4)及3個互補決定區域(分別為CDR1到CDR3)的對抗TNF-α之奈米抗體，而且對TNF的Koff速率優於2.10-3(l/s)，甚至好到優於1.10-3(l/s)；或是這類奈米抗體的人體化變異。
XXIII)含有4個骨架區域(分別為FR1到FR4)及3個互補決定區域(分別為CDR1到CDR3)的對抗TNF-α之奈米抗體，使用WO 04/041862的3)之範例1中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比相同分析下WO 04/041862奈米抗體VHH 3E(序列編碼：4)的EC50值還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
XXIV)對抗TNF-α之奈米抗體，使用WO 04/041862的3)之範例1中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比12nM還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
XXV)對抗TNF-α之奈米抗體，使用WO 04/041862的3)之範例1中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比5nM還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
XXVI)對抗TNF-α之奈米抗體，使用WO 04/041862的3)之範例1中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比3nM還好；或是這類奈米抗體的人體化變異；還有一些特定的層面為：- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，並屬於GLEW級。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，並在103位帶有精胺酸殘基(R)。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，並屬於人體化奈米抗體。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，並在108位帶有白胺酸殘基(L)。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，並且序列一致性(如此處定義)起碼要達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%，而該氨基酸序列的序列編碼有52(TNF1)、76(TNF13)、77(TNF14)、95(TNF29)或96(TNF30)。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中a)CDR1包含：- DYWMY的氨基酸序列；或- 與DYWMY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與DYWMY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；及b)CDR2包含：- EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；或- 與EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；及
c)CDR3包含：- SPSGFN的氨基酸序列；或- 與SPSGFN的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與SPSGFN的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中CDR1包含了DYWMY的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中CDR2包含了EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中CDR3包含了SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中：- CDR1包含了DYWMY的氨基酸序列；同時CDR3包含了SPSGFN的氨基酸序列；或- CDR1包含了DYWMY的氨基酸序列；同時CDR2包含了EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；或- CDR2包含了EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；同時CDR3包含了SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中CDR1包含了DYWMY的氨基酸序列；同時CDR3包含了SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中CDR1包含了DYWMY的氨基酸序列；而CDR2包含了EINTNGLITKYPDSVKG
的氨基酸序列，同時CDR3包含了SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中a)CDR1為：- DYWMY的氨基酸序列；或- 與DYWMY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與DYWMY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；同時其中：b)CDR2為：- EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；或- 與EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；其中還有c)CDR3為：- SPSGFN的氨基酸序列；或- 與SPSGFN的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與SPSGFN的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中CDR1為DYWMY的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中CDR2為EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中CDR3為SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中：- CDR1為DYWMY的氨基酸序列；同時CDR3為SPSGFN的氨基酸序列；或- CDR1為DYWMY的氨基酸序列；同時CDR2為EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；或- CDR2為EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；同時CDR3為SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中CDR1為DYWMY的氨基酸序列；同時CDR3為SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中CDR1為DYWMY的氨基酸序列；而CDR2為EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列，同時CDR3為SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中- 任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代為佳；及/或- 與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形。
其他關於此實用化的理想層面包括：- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，並屬於KERE級。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，並且序列一致性
(如此處定義)起碼要達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%，而該氨基酸序列的序列編碼有50(TNF3)、83(TNF20)、85(TNF21)、85(TNF22)、96(TNF23)或98(TNF33)。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中a)CDR1包含：- NYYMG的氨基酸序列；或- 與NYYMG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與NYYMG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；及b)CDR2包含：- NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列；或- 與NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；及c)CDR3包含：- SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列；或- 與SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更
佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中CDR1為NYYMG的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中CDR2為NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中CDR3為SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中：- CDR1為NYYMG的氨基酸序列；同時CDR3為SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列；或- CDR1為NYYMG的氨基酸序列；同時CDR2為NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列；或- CDR2為NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列；同時CDR3為SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中CDR1為NYYMG的氨基酸序列；而CDR2為NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列，同時CDR3為SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中a)CDR1為：- NYYMG的氨基酸序列；或- 與NYYMG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或
- 與NYYMG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；及b)CDR2為：- NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列；或- 與NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；及c)CDR3為：- SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列；或- 與SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中CDR1為NYYMG的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中CDR2為NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中CDR3為SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中：
- CDR1為NYYMG的氨基酸序列；同時CDR3為SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列；或- CDR1為NYYMG的氨基酸序列；同時CDR2為NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列；或- CDR2為NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列；同時CDR3為SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中CDR1為NYYMG的氨基酸序列；而CDR2為NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列，同時CDR3為SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列。
- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，其中- 任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代為佳；及/或- 與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有
氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形。- 符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，並屬於人體化的奈米抗體。
迄今，其他格外受到矚目的層面有：
XXVII)包含或基本上帶有起碼一個符合上述XXI)至XXV)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽。
XXVIII)包含兩個符合上述XXI)至XXV)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽。
XXIX)包含兩個符合上述XXI)至XXV)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽，並且即所謂結合於TNF三聚體上的蛋白質或聚胜肽，對於所謂TNF三聚體調控的交聯，及/或這類受器交聯調控的訊息傳遞，能夠抑制或降低TNF受器之交聯。
XXX)包含兩個符合上述XXI)至XXV)中任一項奈米抗體之蛋白質或
聚胜肽，並且在TNF三聚體上，可以於起碼兩個TNF受器結合位之間控制分子間結合。
XXXI)包含兩個符合上述XXI)至XXV)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽，而兩奈米抗體間則被適當地連接起來。
XXXII)包含兩個符合上述XXI)至XXV)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽，而兩奈米抗體間則被適當地連接起來，並與PEG連結。
XXXIII)包含兩個符合上述XXI)至XXV)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽，甚至包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體。
XXXIV)包含兩個符合上述XXI)至XXV)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽，甚至包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，並且即所謂結合於TNF三聚體上的蛋白質或聚胜肽，對於所謂TNF三聚體調控的交聯，及/或這類受器交聯調控的訊息傳遞，能夠抑制或降低TNF受器之交聯。
XXXV)包含兩個符合上述XXI)至XXV)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽，甚至包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，並且在TNF三聚體上，可以於起碼兩個TNF受器結合位之間控制分子間結合。
XXXVI)包含兩個符合上述XXI)至XXV)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽，甚至包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，其中這兩個符合上述I)至V)中任一項的奈米抗體，皆被適當地連結於該用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體。
XXXVII)包含兩個符合上述XXI)至XXV)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽，甚至包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗
體，其中這兩個符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，皆被適當地連結於該用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，而此即所謂結合於TNF三聚體上的蛋白質或聚胜肽，對於所謂TNF三聚體調控的交聯，及/或這類受器交聯調控的訊息傳遞，能夠抑制或降低TNF受器之交聯。
XXXVIII)包含兩個符合上述XXI)至XXV)中任一項奈米抗體之蛋白質或聚胜肽，甚至包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，其中這兩個符合上述XXI)至XXV)中任一項的奈米抗體，皆被適當地連結於該用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，並且在TNF三聚體上，可以於起碼兩個TNF受器結合位之間控制分子間結合。
- 符合上述XXVI)至XXXVIII)中任一項之蛋白質或聚胜肽，其中起碼有一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體是人體化的奈米抗體。
- 符合上述XXVI)至XXXVIII)中任一項之蛋白質或聚胜肽，其中起碼有一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體是奈米抗體ALB 1(序列編碼：63)的人體化變異。
- 符合上述XXVI)至XXXVIII)中任一項之蛋白質或聚胜肽，其中起碼有一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，選自帶有下列之群組：ALB 3(序列編碼：87)、ALB 4(序列編碼：88)、ALB 5(序列編碼：89)、ALB 6(序列編碼：100)、ALB 7(序列編碼：101)、ALB 8(序列編碼：102)、ALB 9(序列編碼：103)及ALB 10(序列編碼：104)。
- 符合上述XXVI)至XXXVIII)中任一項之蛋白質或聚胜肽，其中起碼有一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體為ALB 8。
- 符合上述XXVI)至XXXVIII)中任一項之蛋白質或聚胜肽，包含或基本上帶有兩個符合上述I)至V)中任一項之人體化奈米抗體，及一項奈米抗體ALB 1(序列編碼：63)的人體化變異。
值得注意的是，當提到某個奈米抗體「符合上述XXI)至XXV)中任一項」時，它起碼符合XXI)至XXV)中的一項，也可能符合XXI)至XXV)中的兩項以上，當然還可能涵蓋其他被指為符合上述XXI)至XXV)中任一項的一個以上之層面。又如當提到某個蛋白質或聚胜肽「符合上述XXVI)至XXXVIII)中任一項」時，它起碼符合XXVI)至XXXVIII)中的一項，也可能符合XXVI)至XXXVIII)中的兩項以上，當然還可能涵蓋其他被指為符合上述XXVI)至XXXVIII)中任一項的一個以上之層面。
有個特別有效的對抗TNF-α奈米抗體之克隆叫作克隆PMP1C2(TNF1)。在表39的KYM-分析之比較資料發現，TNF1的EC50值比WO 04/41862中所述的單價奈米抗體(Nanobody 3E)還要好4倍以上，即PMP1C2為2.466 nM，而3E為12 nM(可參見表39，TNF1到TNF9的所有奈米抗體在此分析中，EC50值都比3E好)。值得注意的是，WO 04/41862中的3E屬於「KERE級」(如此處所述)，並可被人體化到比奈米抗體PMP1C2(屬於「GLEW級」)更小的等級。比較奈米抗體PMP1C2與WO 04/41862中的奈米抗體1A時，其中奈米抗體1A跟PMP1C2(在CDR與骨架兩方面皆是)的序列同源性相當高，KYM分析中所得的PMP1C2之EC50值可以好到50倍以上，即PMP1C2為2.466 nM，而1A為12 nM。
此外，含有三個克隆PMP1C2之CDR(或指該處衍生或相對應的CDR序列)中一個以上、兩個以上的奈米抗體在本案中特別受重視。這三個奈米抗體傾向屬於「103 P,R,S群組」(如此處所述)，並在103
位有一個R，最好在44-47位也有GLEW或類似GLEW的序列。同時，當這些奈米抗體屬於「103 P,R,S群組」(特別是在103位有一個R)，一個較佳但不限定的人體化取代為108Q到108L。另外，這些奈米抗體中非限定的人體化取代，為此處所述的TNF1人體化變異之一個以上，像是TNF13、TNF14、TNF 29或TNF30，而很快就可以從TNF1跟這些人體化序列的比較中發現。
現階段較理想的奈米抗體，起碼要有一個CDR1、CDR2與CDR3的序列適當地選自下列群組，分別包含序列編碼：164的CDR1序列，序列編碼：232的CDR2序列以及序列編碼：300的CDR3序列(即克隆TNF1中的CDR序列)，或是選自CDR1、CDR2與CDR3的序列分別有起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%的「序列一致性」(如此處定義)，其中分別有序列編碼：164的CDR1序列，序列編碼：232的CDR2序列以及序列編碼：300的CDR3序列；及/或選自包含CDR1、CDR2與CDR3序列的群組，跟序列編碼：164的CDR1序列，序列編碼：232的CDR2序列以及序列編碼：300的CDR3序列比較起來，只有三、二個或一個「氨基酸差異」(如此處定義)。
再好一點，現階段較理想的奈米抗體，起碼要有兩個CDR1、CDR2與CDR3的序列適當地選自下列群組，分別包含序列編碼：164的CDR1序列，序列編碼：232的CDR2序列以及序列編碼：300的CDR3序列(即克隆TNF1中的CDR序列)，或是選自CDR1、CDR2與CDR3的序列分別有起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%的序列一致性，其中分別有序列編碼：164的CDR1序列，序列編碼：232的CDR2序列以及序列編碼：300的CDR3序列；及/或選自包含CDR1、CDR2與CDR3序列的群組，跟序列編
碼：164的CDR1序列，序列編碼：232的CDR2序列以及序列編碼：300的CDR3序列比較起來，只有三、二個或一個「氨基酸差異」。
最好的是，現階段較理想的奈米抗體，三個CDR1、CDR2與CDR3的序列均適當地選自下列群組，分別包含序列編碼：164的CDR1序列，序列編碼：232的CDR2序列以及序列編碼：300的CDR3序列(即克隆TNF1中的CDR序列)，或是選自CDR1、CDR2與CDR3的序列分別有起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%的序列一致性，其中分別有序列編碼：164的CDR1序列，序列編碼：232的CDR2序列以及序列編碼：300的CDR3序列；及/或選自包含CDR1、CDR2與CDR3序列的群組，跟序列編碼：164的CDR1序列，序列編碼：232的CDR2序列以及序列編碼：300的CDR3序列比較起來，只有三、二個或一個氨基酸差異。
甚至，這些理想的奈米抗體中，起碼要有一個CDR1、CDR2與CDR3的序列適當地選自下列群組，分別包含序列編碼：164的CDR1序列，序列編碼：232的CDR2序列以及序列編碼：300的CDR3序列(即克隆TNF1中的CDR序列)。本案中，起碼一個、最好是兩個其他的CDR序列是選自CDR1、CDR2與CDR3的序列分別有起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%的序列一致性，其中分別有序列編碼：164的CDR1序列，序列編碼：232的CDR2序列以及序列編碼：300的CDR3序列；及/或選自包含CDR1、CDR2與CDR3序列的群組，跟序列編碼：164的CDR1序列，序列編碼：232的CDR2序列以及序列編碼：300的CDR3序列比較起來，只有三、二個或一個氨基酸差異。
再者，這些理想的奈米抗體中，起碼要有兩個CDR1、CDR2與CDR3的序列適當地選自下列群組，分別包含序列編碼：164的CDR1
序列，序列編碼：232的CDR2序列以及序列編碼：300的CDR3序列(即克隆TNF1中的CDR序列)。本案中，剩餘的CDR序列是選自CDR1、CDR2與CDR3的序列分別有起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%的序列一致性，其中分別有序列編碼：164的CDR1序列，序列編碼：232的CDR2序列以及序列編碼：300的CDR3序列；及/或選自包含CDR1、CDR2與CDR3序列的群組，跟序列編碼：164的CDR1序列，序列編碼：232的CDR2序列以及序列編碼：300的CDR3序列比較起來，只有三、二個或一個氨基酸差異。
此本案中格外受到矚目的奈米抗體分別包含序列編碼：164的CDR1序列，序列編碼：232的CDR2序列以及序列編碼：300的CDR3序列(即克隆TNF1中的CDR序列)。
帶有上述CDR序列的奈米抗體之骨架序列，此處會進一步定義。某些重要但不受限的骨架序列組合可以參見上表I。實驗者會知道，能會出現在相同克隆中(即表I中同條線上提及的FR1、FR2、FR3與FR4序列)的FR1、FR2、FR3與FR4序列之組合，將經常被使用(雖然本案的廣義處並不限於此，同時包含其他表I中所提到適合的骨架序列組合)。
特別是，此本案的重要層面還包括：XXXIX)包括對抗帶有4個骨架區域(分別為FR1至FR4)與3個互補決定區域(分別為CDR1至CDR3)之TNF-α的奈米抗體(如此處定義)，其中：a)CDR1包含：- DYWMY的氨基酸序列；或- 與DYWMY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列
一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與DYWMY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有一個氨基酸差異；及b)CDR2包含：- EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；或- 與EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；及c)CDR3包含：- SPSGFN的氨基酸序列；或- 與SPSGFN的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與SPSGFN的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有一個氨基酸差異。
- 符合XXXVIII)的奈米抗體，其中CDR1為含DYWMY的氨基酸序列；- 符合XXXVIII)的奈米抗體，其中CDR2為含EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；- 符合XXXVIII)的奈米抗體，其中CDR3為含SPSGFN的氨基酸序
列；- 符合XXXVIII)的奈米抗體，其中：- CDR1為含DYWMY的氨基酸序列；同時CDR3為含SPSGFN的氨基酸序列；或- CDR1為含DYWMY的氨基酸序列；同時CDR2為含EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；或- CDR2為含EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；同時CDR3為含SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合XXXVIII)的奈米抗體，其中CDR1為含DYWMY的氨基酸序列；同時CDR3為含SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合XXXVIII)的奈米抗體，其中CDR1為含DYWMY的氨基酸序列；而CDR2為含EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列，同時CDR3為含SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合XXXVIII)的奈米抗體，其中- 任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代為佳；及/或- 與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形。
- 符合XXXVIII)的奈米抗體，並屬於GLEW級。
- 符合XXXVIII)的奈米抗體，並在103位帶有精胺酸殘基(R)。
- 符合XXXVIII)的奈米抗體，並且序列一致性(如此處定義)起碼要達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%，而該氨基酸序列的序列編碼有52(TNF1)、76(TNF13)、77(TNF14)、95(TNF29)或96(TNF30)。
- 符合XXXVIII)的奈米抗體，並且被人體化。
- 符合XXXVIII)的奈米抗體，並在108位帶有白胺酸殘基(L)。
- 符合XXXVIII)的奈米抗體，且對於TNF的Koff速率優於2.10-3(l/s)，較佳的狀況是優於1.10-3(l/s)；或是一種該奈米抗體的人體化變異；- 符合XXXVIII)的蛋白質或聚胜肽，使用WO 04/041862的3)之範例1中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比相同分析下WO 04/041862奈米抗體VHH 3E(序列編碼：4)的EC50值還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
- 符合XXXVIII)的蛋白質或聚胜肽，使用WO 04/041862的3)之範例中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比5nM還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
- 符合XXXVIII)的蛋白質或聚胜肽，使用WO 04/041862的3)之範例中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比3nM還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
XL)對抗帶有4個骨架區域(分別為FR1至FR4)與3個互補決定區域(分別為CDR1至CDR3)之TNF-α的奈米抗體，其中a)CDR1為：- DYWMY的氨基酸序列；或- 與DYWMY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與DYWMY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有一個氨基酸差異；而且：b)CDR2為：- EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；或
- 與EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；還有c)CDR3為：- SPSGFN的氨基酸序列；或- 與SPSGFN的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與SPSGFN的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異。
- 符合XXXIX)的奈米抗體，其中CDR1為DYWMY的氨基酸序列。
- 符合XXXIX)的奈米抗體，其中CDR2為EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列。
- 符合XXXIX)的奈米抗體，其中CDR3為SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合XXXIX)的奈米抗體，其中：- CDR1為DYWMY的氨基酸序列；同時CDR3為SPSGFN的氨基酸序列；或- CDR1為DYWMY的氨基酸序列；同時CDR2為EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；或- CDR2為EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列；同時CDR3為SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合XXXIX)的奈米抗體，其中CDR1為DYWMY的氨基酸序列；
同時CDR3為SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合XXXIX)的奈米抗體，其中CDR1為DYWMY的氨基酸序列；而CDR2為EINTNGLITKYPDSVKG的氨基酸序列，同時CDR3為SPSGFN的氨基酸序列。
- 符合XXXIX)的奈米抗體，其中：- 任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代為佳；及/或- 與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形。
- 符合XXXIX)的奈米抗體，並屬於GLEW-級。
- 符合XXXIX)的奈米抗體，並在103位帶有精胺酸殘基(R)。
- 符合XXXIX)的奈米抗體，並且序列一致性(如此處定義)起碼要達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%，而該氨基酸序列的序列編碼有52(TNF1)、76(TNF13)、77(TNF14)、95(TNF29)或96(TNF30)。
- 符合XXXIX)的奈米抗體，並且被人體化。
- 符合XXXIX)的奈米抗體，並在108位帶有白胺酸殘基(L)。
- 符合XXXIX)的奈米抗體，並且對TNF的Koff速率優於2.10-3(l/s)，最好能好過1.10-3；或是這類奈米抗體的人體化變異。
- 符合XXXIX)的奈米抗體，使用WO 04/041862的3)之範例中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比相同分析下WO 04/041862奈米抗體VHH 3E(序列編碼：4)的EC50值還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
- 符合XXXIX)的奈米抗體，使用WO 04/041862的3)之範例中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比5nM還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
- 符合XXXIX)的奈米抗體，使用WO 04/041862的3)之範例中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比3nM還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
- 符合XXXIX)的奈米抗體，並選自包含下列者之群組TNF 13(序列編碼：76)、TNF 14(序列編碼：77)、TNF 29(序列編碼：95)及TNF 30(序列編碼：96)。
- 符合XXXIX)的奈米抗體，並為TNF 30(序列編碼：96)；還有一些較佳層面包括：
XLI)包含或基本上帶有符合XXXVIII)或XXXIX)的奈米抗體之蛋白質或聚胜肽。
XLII)包含或基本上帶有起碼一項符合XXXVIII)或XXXIX)的奈米抗體之蛋白質或聚胜肽。
- 包含或基本上帶有起碼兩個符合XXXVIII)或XXXIX)的奈米抗體之符合XL)或XLI)任一項之蛋白質或聚胜肽。
- 包含兩個符合XXXVIII)或XXXIX)之奈米抗體的符合XL)或XLI)任一項之蛋白質或聚胜肽，並且即所謂結合於TNF三聚體上的蛋白質或聚胜肽，對於所謂TNF三聚體調控的交聯，及/或這類受器交聯調控的訊息傳遞，能夠抑制或降低TNF受器之交聯。
- 包含兩個符合XXXVIII)或XXXIX)之奈米抗體的符合XL)或XLI)任一項之蛋白質或聚胜肽，並且在TNF三聚體上，可以於起碼兩個TNF受器結合位之間控制分子間結合。
- 包含兩個符合XXXVIII)或XXXIX)之奈米抗體的符合XL)或XLI)任一項之蛋白質或聚胜肽，而兩奈米抗體間則被適當地連接起來。
- 包含兩個符合XXXVIII)或XXXIX)之奈米抗體的符合XL)或XLI)任一項之蛋白質或聚胜肽，而兩奈米抗體間則藉由一段氨基酸序列
被適當地連接起來。
- 包含兩個符合XXXVIII)或XXXIX)之奈米抗體的符合XL)或XLI)任一項之蛋白質或聚胜肽，而兩奈米抗體間則藉由一段氨基酸序列被適當地連接起來(像是不限定之下含有甘氨酸與絲氨酸殘基的氨基酸序列)，而該序列含有14個以上的氨基酸，較佳則是有17個，像是約20-40個氨基酸(像是GS30的連結)。
- 符合XL)或XLI)任一項之蛋白質或聚胜肽，並含有或本質上帶有聚胜肽TNF 7(序列編碼：73)，其中兩個奈米抗體TNF 1都已被人體化。
- 符合XL)或XLI)任一項之蛋白質或聚胜肽，並含有或本質上帶有聚胜肽TNF 55(序列編碼：419)或TNF 56(序列編碼：420)。
- 符合XL)或XLI)任一項之蛋白質或聚胜肽，並與PEG連結。
- 包含兩個符合XXXVIII)或XXXIX)之奈米抗體的符合XL)或XLI)任一項之蛋白質或聚胜肽，並且即所謂結合於TNF三聚體上的蛋白質或聚胜肽，對於所謂TNF三聚體調控的交聯，及/或這類受器交聯調控的訊息傳遞，能夠抑制或降低TNF受器之交聯；及/或在TNF三聚體上，可以於起碼兩個TNF受器結合位之間控制分子間結合，而該蛋白質或聚胜肽，甚至包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體。
- 包含兩個符合XXXVIII)或XXXIX)之奈米抗體的符合XL)或XLI)任一項之蛋白質或聚胜肽，而該蛋白質或聚胜肽，甚至包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，其中兩個符合XXXVIII)或XXXIX)之奈米抗體，透過起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體相連結，且兩者之一是直接連結於起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，或是皆透過連結而直接連結於起碼
一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體。
- 包含兩個符合XXXVIII)或XXXIX)之奈米抗體的符合XL)或XLI)任一項之蛋白質或聚胜肽，甚至包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，其中兩個符合XXXVIII)或XXXIX)之奈米抗體，透過起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體相連結，且兩者之一是直接連結於起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，或是皆透過連結而直接連結於起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，當中的連結為氨基酸序列(像是不限定之下含有甘氨酸與絲氨酸殘基的氨基酸序列)，而該序列含有介於3到40個氨基酸的殘基，如5到15個氨基酸的殘基(像是GS9的連結)。
- 包含兩個符合XXXVIII)或XXXIX)之奈米抗體的符合XL)或XLI)任一項之蛋白質或聚胜肽，甚至包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，其中兩個符合XXXVIII)或XXXIX)之奈米抗體，透過起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體相連結，且兩者之一是直接連結於起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，或是皆透過連結而直接連結於起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，並且即所謂結合於TNF三聚體上的蛋白質或聚胜肽，對於所謂TNF三聚體調控的交聯，及/或這類受器交聯調控的訊息傳遞，能夠抑制或降低TNF受器之交聯；及/或在TNF三聚體上，可以於起碼兩個TNF受器結合位之間控制分子間結合。
- 符合XL)或XLI)任一項之蛋白質或聚胜肽，其中包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體為人體化奈米抗體。
- 符合XL)或XLI)任一項之蛋白質或聚胜肽，其中包含起碼一個用
來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體為人體化奈米抗體ALB 1(序列編碼：63)的變異。
- 符合XL)或XLI)任一項之蛋白質或聚胜肽，其中包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，選自含有下列的群組：ALB 3(序列編碼：87)、ALB 4(序列編碼：88)、ALB 5(序列編碼：89)、ALB 6(序列編碼：100)、ALB 7(序列編碼：101)、ALB 8(序列編碼：102)、ALB 9(序列編碼：103)及ALB 10(序列編碼：104)。
- 符合XL)或XLI)任一項之蛋白質或聚胜肽，其中包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體為ALB 8。
- 符合XL)或XLI)任一項之蛋白質或聚胜肽，並含有或本質上帶有兩個符合XL)或XLI)任一項之人體化奈米抗體，以及一個人體化奈米抗體ALB 1(序列編碼：63)之變異。
- 符合XL)或XLI)任一項之蛋白質或聚胜肽，並含有或本質上帶有聚胜肽TNF24(序列編碼：90)，其中兩個奈米抗體TNF 1就像奈米抗體ALB 1已被人體化。
- 符合XL)或XLI)任一項之蛋白質或聚胜肽，並含有或本質上帶有兩個奈米抗體TNF 30與一個奈米抗體ALB 8。
- 符合XL)或XLI)任一項之蛋白質或聚胜肽，並含有或本質上帶有聚胜肽TNF 60(序列編碼：417)。
值得注意的是，當提到某個奈米抗體「符合XXXVIII」或「符合XXXIX」時，它起碼符合XXXVIII)及/或XXXIX)中的一項，也可能包含於上述XXXVIII)或XXXIX)中其他層面的一項以上。類似的當提到某個上述的蛋白質或聚胜肽「符合XL)或XLI)任一項」時，它起碼會符合XL)或XLI)中的一項、或兩項以上，當然還可能包含於上述「符
合XL)或XLI)任一項」。
對奈米抗體於根據上述TNF1的奈米抗體(包括但不限於人類化奈米抗體)，其骨架序列通常會如此所述，並傾向於下列情況：a)FR1包含或為：- 序列編碼：130的氨基酸序列；或- 與序列編碼：130的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與序列編碼：130的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有一個氨基酸差異；及b)FR2包含或為：- 序列編碼：198的氨基酸序列；或- 與序列編碼：198的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與序列編碼：198的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有兩個或一個氨基酸差異；及c)FR3包含或為：- 序列編碼：266的氨基酸序列；或- 與序列編碼：266的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與序列編碼：266的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的
序列中只有一個氨基酸差異。及d)FR4包含或為：- 序列編碼：334的氨基酸序列；或- 與序列編碼：334的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與序列編碼：334的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有一個氨基酸差異；其中，骨架序列中的氨基酸差異就像此處所述般格外重要。
對抗帶有上述骨架區域(即與TNF1相似者)之TNF-α的奈米抗體，其中一個以上的骨架區域(像是任兩個、任三個或全部四個骨架區域)已被人體化，形成了本本案的深入面。奈米抗體對於TNF的Koff速率優於2.10-3(l/s)，較佳的狀況是優於1.10-3(l/s)；具有CDR可使該奈米抗體在使用WO 04/041862的3)之範例1中所述的KYM細胞進行細胞分析時，得到EC50的值比相同分析下WO 04/041862奈米抗體VHH 3E(序列編碼：4)的EC50值還好；較佳的情況是比12nM還好，更佳的比5nM還好，甚至好到優於3nM。同時，這樣的奈米抗體是用來對抗像TNF1般的TNF之相同抗原表位(即TNF三聚體)。
另外，本本案亦包含對抗TNF-α的奈米抗體，而且它是對抗TNF-α的奈米抗體之人體化變異，該對抗TNF-α的奈米抗體具有下列骨架序列：FR1：序列編碼：130；FR2：序列編碼：198；FR3：序列編碼：266；及FR4：序列編碼：334。這樣的奈米抗體可能有CDR使得該奈米抗體對於TNF的Koff速率優於2.10-3(l/s)，較佳的狀況是優於1.10-3(l/s)；及/或具有CDR可使該奈米抗體在使用WO 04/041862的3)之範
例1中所述的KYM細胞進行細胞分析時，得到EC50的值比相同分析下WO 04/041862奈米抗體VHH 3E(序列編碼：4)的EC50值還好，較佳的情況是比12nM還好，更佳的比5nM還好，甚至好到優於3nM。同時，這樣的奈米抗體是用來對抗像TNF1般的TNF之相同抗原表位(即TNF三聚體)。
另有一個在當作抗TNF奈米抗體時特別有效的克隆為克隆PMP5F10(TNF3，序列編碼：60)。從表39中的KYM分析之比較數據可以發現，TNF3的EC50值比WO 04/41862中所述的最佳單價奈米抗體還要好上15倍。
所以含有克隆PMP5F10(或是從此或相對應的地方衍生之CDR序列)之一個以上、任兩個、甚至所有三個CDR的奈米抗體在本本案特別重要。同時，這些奈米抗體都屬於KERE級。
此外，本本案實例中的某些重要層面為：XLIII)對抗帶有4個骨架區域(分別為FR1至FR4)與3個互補決定區域(分別為CDR1至CDR3)之TNF-α的奈米抗體，其中a)CDR1包含：- NYYMG的氨基酸序列；或- 與NYYMG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與NYYMG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；及b)CDR2包含：- NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列；或
- 與NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；及c)CDR3包含：- SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列；或- 與SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異。
- 符合XLII)的奈米抗體，其中CDR1包含NYYMG的氨基酸序列。
- 符合XLII)的奈米抗體，其中CDR2包含NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列。
- 符合XLII)的奈米抗體，其中CDR3包含SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列。
- 符合XLII)的奈米抗體，其中：- CDR1包含NYYMG的氨基酸序列；同時CDR3包含SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列；或- CDR1包含NYYMG的氨基酸序列；同時CDR2包含NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列；或- CDR2包含NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列；同時CDR3包含SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列。
- 符合XLII)的奈米抗體，其中CDR1包含NYYMG的氨基酸序列；而CDR2包含SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列，同時CDR3包含ILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列。
- 符合XLII)的奈米抗體，其中- 任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代為佳；及/或- 與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形。
- 符合XLII)的奈米抗體，並屬於KERE級。
- 符合XLII)的奈米抗體，並且序列一致性(如此處定義)起碼要達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%，而該氨基酸序列的序列編碼有50(TNF3)、83(TNF20)、85(TNF21)、85(TNF22)、96(TNF23)或99(TNF33)。
- 符合XLII)的奈米抗體，並屬於人體化奈米抗體。
- 符合XLII)的奈米抗體，而且對TNF的Koff速率優於2.10-3(l/s)，甚至好到優於1.10-3(l/s)；或是這類奈米抗體的人體化變異。
- 符合XLII)的奈米抗體，使用WO 04/041862的3)之範例1中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比相同分析下WO 04/041862奈米抗體VHH 3E(序列編碼：4)的EC50值還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
- 符合XLII)的奈米抗體，使用WO 04/041862的3)之範例1中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比5nM還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
- 符合XLII)的奈米抗體，使用WO 04/041862的3)之範例1中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比3nM還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
XLIV)對抗帶有4個骨架區域(分別為FR1至FR4)與3個互補決定區域(分別為CDR1至CDR3)之TNF-α的奈米抗體，其中：a)CDR1為：- NYYMG的氨基酸序列；或- 與NYYMG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與NYYMG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；及b)CDR2為：- NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列；或- 與NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異；及c)CDR3為：- SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列；或- 與SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有二個或一個氨基酸差異。
- 符合XLIII)的奈米抗體，其中CDR1為NYYMG的氨基酸序列。
- 符合XLIII)的奈米抗體，其中CDR2為NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列。
- 符合XLIII)的奈米抗體，其中CDR3為SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列。
- 符合XLIII)的奈米抗體，其中：- CDR1為NYYMG的氨基酸序列；同時CDR3為SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列；或- CDR1為NYYMG的氨基酸序列；同時CDR2為NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列；或- CDR2為NISWRGYNIYYKDSVKG的氨基酸序列；同時CDR3為SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列。
- 符合XLIII)的奈米抗體，其中CDR1為NYYMG的氨基酸序列；而CDR2為SILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列，同時CDR3為ILPLSDDPGWNTY的氨基酸序列。
- 符合XLIII)的奈米抗體，其中- 任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代為佳；及/或- 與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形。
- 符合XLIII)的奈米抗體，並屬於KERE級。
- 符合XLIII)的奈米抗體，並且序列一致性(如此處定義)起碼要達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%，而該氨基酸序列的序列編碼有50(TNF3)、83(TNF20)、85(TNF21)、85(TNF22)、96(TNF23)或989(TNF33)。
- 符合XLIII)的奈米抗體，並屬於人體化的奈米抗體。
- 符合XLIII)的奈米抗體，而且對TNF的Koff速率優於2.10-3(l/s)，甚至好到優於1.10-3(l/s)；或是這類奈米抗體的人體化變異。
- 符合XLIII)的奈米抗體，使用WO 04/041862的3)之範例1中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比相同分析下WO 04/041862奈米抗體VHH 3E(序列編碼：4)的EC50值還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
- 符合XLIII)的奈米抗體，使用WO 04/041862的3)之範例1中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比5nM還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
- 符合XLIII)的奈米抗體，使用WO 04/041862的3)之範例1中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比3nM還好；或是這類奈米抗體的人體化變異。
- 符合XLII)的奈米抗體，並且選自的群組含下列序列：83(TNF20)、85(TNF21)、85(TNF22)、96(TNF23)或98(TNF33)、TNF 13(序列編碼：76)、TNF 14(序列編碼：77)、TNF 29(序列編碼：95)及TNF 30(序列編碼：96)。
其他重要的層面還有：
XLV)含有或本質上帶有符合XLII)或XLIII).之奈米抗體的蛋白質或聚胜肽。
XLVI)含有或本質上帶有一個以上符合XLII)或XLIII).之奈米抗體的蛋白質或聚胜肽。
XLVII)含有或本質上帶有兩個符合XLII)或XLIII).之奈米抗體的蛋白質或聚胜肽。
XLVIII)含有或本質上帶有兩個符合XLII)或XLIII).之奈米抗體的蛋白質或聚胜肽，並且即所謂結合於TNF三聚體上的蛋白質或聚胜
肽，對於所謂TNF三聚體調控的交聯，及/或這類受器交聯調控的訊息傳遞，能夠抑制或降低TNF受器之交聯。
XLIX)含有或本質上帶有兩個符合XLII)或XLIII).之奈米抗體的蛋白質或聚胜肽，並可TNF三聚體上，於起碼兩個TNF受器結合位之間控制分子間結合，- 符合XLIV)或XLVIII)任一項之蛋白質或聚胜肽，並含有或本質上帶有聚胜肽TNF 6(序列編碼：72)或TNF 9(序列編碼：75，其中兩個奈米抗體TNF 3都已被人體化)。
- 符合XLIV)或XLVIII)任一項之蛋白質或聚胜肽，並與PEG連結。
- 包含兩個符合XLII)或XLIII).之奈米抗體的蛋白質或聚胜肽，並且即所謂結合於TNF三聚體上的蛋白質或聚胜肽，對於所謂TNF三聚體調控的交聯，及/或這類受器交聯調控的訊息傳遞，能夠抑制或降低TNF受器之交聯；及/或在TNF三聚體上，可以於起碼兩個TNF受器結合位之間控制分子間結合，而該蛋白質或聚胜肽，甚至包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體。
- 符合XLII)或XLIII)之蛋白質或聚胜肽，其中一個以上用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體已被人體化。
- 符合XLIV)或XLVIII).之蛋白質或聚胜肽，其中一個以上用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體為人體化奈米抗體ALB 1(序列編碼：63)的變異。
- 符合XLIV)或XLVIII)之蛋白質或聚胜肽，其中包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，選自含有下列的群組：ALB 3(序列編碼：87)、ALB 4(序列編碼：88)、ALB 5(序列編碼：89)、ALB 6(序列編碼：100)、ALB 7(序列編碼：101)、ALB 8(序列編碼：102)、ALB 9(序列編碼：103)及ALB 10(序列編
碼：104)。
- 符合XLIV)或XLVIII)之蛋白質或聚胜肽，其中一個以上用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體為ALB 8。
- 符合XLIV)或XLVIII)任一項之蛋白質或聚胜肽，並含有或本質上帶有兩個符合XLIV)或XLVIII)任一項之人體化奈米抗體，以及一個人體化奈米抗體ALB 1(序列編碼：63)之變異。
- 符合XLIV)或XLVIII)任一項之蛋白質或聚胜肽，並含有或本質上帶有聚胜肽TNF26(序列編碼：92)，其中兩個奈米抗體TNF 3就像奈米抗體ALB 1已被人體化。
值得注意的是，當提到某個奈米抗體「符合XLII」或「符合XLIII」時，它起碼符合XLII)及/或XLIII)中的一項，也可能包含於上述XLII)或XLIII)中其他層面的一項以上。類似的當提到某個上述的蛋白質或聚胜肽「符合XLIV)或XLVIII)任一項」時，它起碼會符合XL)或XLI)中的一項、或符合XLIV)或XLVIII)兩項以上，當然還可能包含於上述「符合XLIV)或XLVIII)任一項」。
對奈米抗體於根據上述TNF3的奈米抗體(包括但不限於人類化奈米抗體)，其骨架序列通常會如此所述，並傾向於下列情況：a)FR1包含或為：- 序列編碼：138的氨基酸序列；或- 與序列編碼：138的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與序列編碼：138的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有一個氨基酸差異；及
b)FR2包含或為：- 序列編碼：206的氨基酸序列；或- 與序列編碼：206的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與序列編碼：206的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有兩個或一個氨基酸差異；及c)FR3包含或為：- 序列編碼：274的氨基酸序列；或- 與序列編碼：274的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與序列編碼：274的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有兩個或一個氨基酸差異。及d)FR4包含或為：- 序列編碼：342的氨基酸序列；或- 與序列編碼：342的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列一致性起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；或- 與序列編碼：342的氨基酸序列對照，一段氨基酸序列的序列中只有兩個或一個氨基酸差異；其中，所呈現出骨架序列的差異以此處敘述為重。
此外，此本案包括選自帶有下列的群組之奈米抗體，序列編碼：
52至60、序列編碼：76至86、序列編碼：95至99、序列編碼：105至129，或是選自與下列之序列一致性(如此處定義)起碼要達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%或以上，而該一個以上氨基酸序列的序列編碼有52至60、76至86、95至99、105至129，其中基於一般奈米抗體的骨架序列描述，後面的氨基酸序列應該有如後述定義的進一步骨架序列。
根據特定但非限定的實例，後面的氨基酸序列為後續定義中的「人體化」。
再者，此本案包括選自帶有下列的群組之奈米抗體，序列編碼：52至60、序列編碼：76至86、序列編碼：95至99、序列編碼：105至129，其中76至86與95至99的「人體化」奈米抗體可能格外重要。
如上所述，本本案中格外重要的奈米抗體為克隆PMP1C2(TNF1；序列編碼：52)。因此，此本案包括選自帶有下列的群組之奈米抗體，序列編碼：52或是跟序列編碼：52之「序列一致性」(如此處定義)起碼要達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%或以上，其中後面的氨基酸序列基於一般奈米抗體的骨架序列描述，應該有如後述定義的進一步骨架序列。
特別上矚目的人體化變異為克隆PMP1C2(TNF1；序列編碼：52)。有些重要但未限定的這類人體化變異例子為克隆TNF13(序列編碼：76)、TNF14(序列編碼：77)、TNF29(序列編碼：95)及TNF 30(序列編碼：96)。因五，此本案包括選自帶有下列氨基酸序列的群組之奈米抗體，其序列編碼有：76、77、95或96，或是跟序列編碼：76、77、95或96之「序列一致性」(如此處定義)起碼要達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%或以上，其中後面的氨基酸序列基於一般奈米抗體的骨架序列描述，應該有如後述定
義的進一步骨架序列。
根據一項重要實例，本案中的奈米抗體為人體化奈米抗體TNF 1(序列編碼：52)的變異。
本本案實例中的某些重要層面為：
L)奈米抗體TNF 1的人體化變異，並且對於TNF的Koff速率優於2.10-3(l/s)，較佳的狀況是優於1.10-3(l/s)。
LI)奈米抗體TNF 1的人體化變異，並在使用WO 04/041862的3)之範例1中所述的KYM細胞進行細胞分析時，得到EC50的值比相同分析下WO 04/041862奈米抗體VHH 3E(序列編碼：4)的EC50值還好。
LII)奈米抗體TNF 1的人體化變異，並在使用WO 04/041862的3)之範例1中所述的KYM細胞進行細胞分析時，得到EC50的值比5nM還好。
LIII)奈米抗體TNF 1的人體化變異，並在使用WO 04/041862的3)之範例1中所述的KYM細胞進行細胞分析時，得到EC50的值比3nM還好。
LIV)含有或本質上帶有一個以上符合XLIX)或LII)任一項之人體化奈米抗體TNF 1變異的蛋白質或聚胜肽。
LV)含有或本質上帶有兩個符合XLIX)或LII)(選擇性地被連結)任一項之人體化奈米抗體TNF 1變異的蛋白質或聚胜肽。
LVI)含有或本質上帶有兩個符合XLIX)或LII)(選擇性地被連結)任一項之人體化奈米抗體TNF 1變異的蛋白質或聚胜肽，並且即所謂結合於TNF三聚體上的蛋白質或聚胜肽，對於所謂TNF三聚體調控的交聯，及/或這類受器交聯調控的訊息傳遞，能夠抑制或降低TNF受器之交聯。
LVII)含有或本質上帶有兩個符合XLIX)或LII)(選擇性地被連結)任一項之人體化奈米抗體TNF 1變異的蛋白質或聚胜肽，並且在TNF三聚體上，可以於起碼兩個TNF受器結合位之間控制分子間結合。
LVIII)含有或本質上帶有聚胜肽TNF 7(序列編碼：73)的蛋白質或聚胜肽，其中兩個奈米抗體TNF 1皆被人體化。
LIX)含有或本質上帶有聚胜肽TNF 7(序列編碼：73)的蛋白質或聚胜肽，其中兩個奈米抗體TNF 1皆被人體化，並接上PEG。
LX)含有或本質上帶有兩個符合XLIX)或LII)任一項之人體化奈米抗體TNF 1變異的蛋白質或聚胜肽，甚至包含起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體。
LXI)含有或本質上帶有兩個符合XLIX)或LII)任一項之人體化奈米抗體TNF 1變異的蛋白質或聚胜肽，並被連結(選擇性地被連結)到用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體。
- 符合LIII)到LX)任一項之蛋白質或聚胜肽，其中起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體為人體化之奈米抗體。
- 符合LIII)到LX)任一項之蛋白質或聚胜肽，其中起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體為人體化奈米抗體ALB 1(序列編碼：63)之變異。
- 符合LIII)到LX)任一項之蛋白質或聚胜肽，其中起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體選自含有下列之群組：ALB 3(序列編碼：87)、ALB 4(序列編碼：88)、ALB 5(序列編碼：89)、ALB 6(序列編碼：100)、ALB 7(序列編碼：101)、ALB 8(序列編碼：102)、ALB 9(序列編碼：103)及ALB 10(序列編碼：104)。
- 符合LIII)到LX)任一項之蛋白質或聚胜肽，其中起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體為ALB 8。
- 符合LIII)到LX)任一項之蛋白質或聚胜肽，並含有或本質上帶有聚胜肽TNF24(序列編碼：90)，其中兩個奈米抗體TNF 1就像奈米抗體ALB 1已被人體化。
- 符合LIII)到LX)任一項之蛋白質或聚胜肽，並含有或本質上帶有兩個奈米抗體TNF 30與一個奈米抗體ALB 8。
根據一項重要實例，本案中的奈米抗體為人體化奈米抗體TNF 3(序列編碼：60)之變異。
本案實例中的某些重要層面為：
LXII)奈米抗體TNF 3的人體化變異，對於TNF的Koff速率優於2.10-3(l/s)，較佳的狀況是優於1.10-3(l/s)。
LXIII)奈米抗體TNF 3的人體化變異，在使用WO 04/041862的3)之範例1中所述的KYM細胞進行細胞分析時，得到EC50的值比相同分析下WO 04/041862奈米抗體VHH 3E(序列編碼：4)的EC50值還好。
LXIV)奈米抗體TNF 3的人體化變異，使用WO 04/041862的3)之範例1中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比5nM還好。
LXV)奈米抗體TNF 3的人體化變異，使用WO 04/041862的3)之範例1中所述的KYM細胞進行細胞分析，得到EC50的值比3nM還好。
LXVI)含有或本質上帶有一個以上符合LXI)到LXIV)任一項之人體化奈米抗體TNF 3變異的蛋白質或聚胜肽。
LXVII)含有或本質上帶有兩個符合LXI)到LXIV)(選擇性地被連結)任一項之人體化奈米抗體TNF 3變異的蛋白質或聚胜肽。
LXVIII)含有或本質上帶有兩個符合LXI)到LXIV)(選擇性地被連
結)任一項之人體化奈米抗體TNF 3變異的蛋白質或聚胜肽，並且即所謂結合於TNF三聚體上的蛋白質或聚胜肽，對於所謂TNF三聚體調控的交聯，及/或這類受器交聯調控的訊息傳遞，能夠抑制或降低TNF受器之交聯。
LXIX)含有或本質上帶有兩個符合LXI)到LXIV)(選擇性地被連結)任一項之人體化奈米抗體TNF 3變異的蛋白質或聚胜肽，在TNF三聚體上，可以於起碼兩個TNF受器結合位之間控制分子間結合。
LXX)含有或本質上帶有聚胜肽TNF 6(序列編碼：72)或TNF 9(序列編碼：75)的蛋白質或聚胜肽，其中兩個奈米抗體TNF 3已被人體化。
LXXI)含有或本質上帶有聚胜肽TNF 6(序列編碼：72)或TNF 9(序列編碼：75)的蛋白質或聚胜肽，其中兩個奈米抗體TNF 3已被人體化，且與PEG連結。
LXXII)含有或本質上帶有一個以上符合LXI)到LXIV)任一項之人體化奈米抗體TNF 3變異的蛋白質或聚胜肽，甚至進一步包含一個以上用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體。
LXXIII)含有或本質上帶有一個以上符合LXI)到LXIV)任一項之人體化奈米抗體TNF 3變異的蛋白質或聚胜肽，並被連結(選擇性地被連結)到用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體。
- 符合LXV)到LXXII)任一項之蛋白質或聚胜肽，其中起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體為人體化奈米抗體。
- 符合LXV)到LXXII)任一項之蛋白質或聚胜肽，其中起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體為人體化奈米抗體，並為人體化奈米抗體ALB 1(序列編碼：63)之變異。
- 符合LXV)到LXXII)任一項之蛋白質或聚胜肽，其中起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，選自含有下列的群組：ALB 3(序列編碼：87)、ALB 4(序列編碼：88)、ALB 5(序列編碼：89)、ALB 6(序列編碼：100)、ALB 7(序列編碼：101)、ALB 8(序列編碼：102)、ALB 9(序列編碼：103)及ALB 10(序列編碼：104)。
- 符合LXV)到LXXII)任一項之蛋白質或聚胜肽，其中起碼一個用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體為ALB 8。
- 符合LXV)到LXXII)任一項之蛋白質或聚胜肽，並含有或本質上帶有聚胜肽TNF26(序列編碼：92)，其中兩個奈米抗體TNF 3就像奈米抗體ALB 1已被人體化。
此外，本案包括含有或本質上帶有一個以上對抗此處所定義TNF-α之抗米抗體的聚胜肽。這類的聚胜肽可參考此處的「本案之聚胜肽」，並可能針對此處概括的奈米抗體在後敘及/或普遍描述於WO 04/041862中，還可能被列舉為多價聚胜肽或是多專一性的聚胜肽，如同此處的後敘描述。
本案中的聚胜肽可以為二價或三價(即分別包含兩個或三個本案中的聚胜肽，分別在後述中被選擇性地連結)或是多專一性聚胜肽，包含一個或兩個更好的本案中之聚胜肽，及一個以上用來對抗血清蛋白質之奈米抗體，特別是對抗像是人類血清白蛋白這樣的人類血清蛋白質。
在某重要但不限定的實例中，本案中的聚胜肽裡，奈米抗體是選自含有下列序列編碼的群組中：52到60及105-129，或是選自此處的人體化變異，特別是選自序列編碼76到86及95到99的「人體化」奈米抗體。在聚胜肽裡用來對抗人類血清白蛋白的奈米抗體為應如下所
定義，最好是能選自含有下列序列編碼的群組中：61到67、87到89及100-104，特別是選自序列編碼76到86及100-104的對抗人類血清白蛋白之「人體化」奈米抗體。
關於本案的聚胜肽中之奈米抗體，實驗者會知道此處提到的「重要」(或是「更重要」、「尤其重要」等)奈米抗體，對於應用在此處所述的聚胜肽亦很重要(或是更重要、尤其重要等)。因此，含有或本質上帶有一個以上「重要」的本案中奈米抗體之聚胜肽通常會是重點，而含有或本質上帶有一個以上「更重要」的本案中奈米抗體之聚胜肽通常更為重要。
因此，含有一個以上本質上帶有一個重要克隆PMP1C2(TNF1；序列編碼：52)的重要變異之聚胜肽，會格外重要，其中所謂的重要變異則如此處定義。尤其重要的是含有一個以上本質上帶有一個人體化克隆PMP1C2(TNF1；序列編碼：52)變異之奈米抗體的聚胜肽，其中所謂的人體化變異如此處定義(不受限的例子有TNF13、TNF14、TNF29及TNF30)。對於本案中的聚胜肽之應用，TNF30是一個特別重要的人體化構件。
這類蛋白質或聚胜肽有些重要但不受限的例子為PMP1C2本身，人體化的TNF13、TNF14、TNF29及TNF30之變異；序列編碼：70(TNF4)、序列編碼：73(TNF7)、序列編碼：90(TNF24)、序列編碼：93(TNF27)的組成；及序列編碼：417(TNF60)、序列編碼：419(TNF55)及序列編碼：420(TNF56)的組成，其中後面三個組成包含了當作構件的人體化變異TNF 30。
如此處提到，所述的奈米抗體與組成可能會街上PEG或是包含一個以上(外加讀)氨基酸殘基，以使得PEG可以接上及/或容易進行。兩個重要但未限定的該聚胜肽例子為TNF55與TNF56，兩個皆包
含外加的半胱氨酸以利PEG基團的連結。
某些重要但未限定的聚胜肽例子為序列編碼：70到75的兩價聚胜肽，以及序列編碼：90到94與417到420的多專一性聚胜肽。
下面的數據，尤其是在比較實例中顯示，本案中的奈米抗體及/或聚胜肽可以改善特性。特別是跟WO 04/041862的世界性應用中所述之最高效能奈米抗體相比，本案中的蛋白質或聚胜肽對人類TNF-α的親和力可能夠高。可以預期的是，與WO 04/041862中所述僅包含一個對抗TNF-α的抗米抗體相比，本案中包含一個以上奈米抗體的聚胜肽將會有更佳的特性。
再者，此處提到的包含兩個以上(最好是兩個)奈米抗體(選擇性地例如對抗人類血清白蛋白之奈米抗體)的聚胜肽，在使用WO 04/041862的3)之範例1中所述的KYM細胞進行細胞分析時，得到EC50的值比相同分析中的Humira®與Remicade ®好，甚至還比Enbrel®更佳。
例如這樣的蛋白質或聚胜肽在使用WO 04/041862的3)之範例1中所述的KYM細胞進行細胞分析時，得到EC50的值比0.2 nM還佳，甚至優於0.1 nM，像是優於0.7 nM，特別是能優於0.4 nM。
申請人也指出，對抗老鼠TNF-α的奈米抗體及包含對抗老鼠TNF-α奈米抗體的聚胜肽，在下列的疾病模型中(數據未附上)會表現出良好的生物活性：
- 跟IL-10基因剔除小鼠一樣使用兩隻尋常老鼠，其結腸的dextran sulfate sodium(DSS)模型，描述於Okayasu et al.(Gastroenterol 1990,98(3)：694)
- 跟IL-10基因剔除小鼠一樣使用兩隻尋常老鼠，其關節炎(RA)的膠原蛋白誘發關節炎(CIA)模型，描述於Courtenay et al.
(Nature 1980,283(5748)：666)；- IBD的IL-10基因剔除小鼠模型，例如描述於Rennick et al.(Clin Immunol Immunopathol 1995,76(3 Pt 2)：S174)
- 例如RA的Kollias模型，描述於Keffer et al.(EMBO J 1991,10(13)：4025)
- IBD的2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid(“TNBS”)模型，描述於Elson et al.(J Immunol 1996,157(5)：2174)
- RA的CIA模型，描述於Koppieters et al(預備投稿)；- 關節導向的纖維母細胞模型(後敘)；及- 鼠類氣袋模型。
此處的奈米抗體在一個以上的這些模型之中，比WO 04/041862裡的奈米抗體1A還要好，並在所有模型中都適宜；在一個以上的這些模型之中，更多p比WO 04/041862裡的奈米抗體3E還要好。同時，此處的聚胜肽在一個以上的這些模型之中，與Humira®或Remicade ®成等價或更好，並在所有模型中都適宜；在一個以上的這些模型之中與Enbrel®相比，也成等價或更好，並在所有模型中都適宜。
像是WO 04/041862中所述的奈米抗體與聚胜肽，特別是此處所提及者，這些數據確定了對抗TNF-α的奈米抗體與含有相同成分的聚胜肽，應該對於對抗TNF所調控的疾病與異常有療效，包括前述的疾病與異常。
另外，本案包括標記本案中的奈米抗體及/或聚胜肽之核酸。這類核酸將會參照到下列的「本案中的核酸」，並可能成為後面定義之基因組成的範例。
此外，本案包括宿主或宿主細胞，其表現或可以表現本案之奈米抗體及/或本案之聚胜肽；及/或包含某決定本案之奈米抗體的核酸及/
或本案之聚胜肽。這類宿主或宿主細胞可能為WO 04/041862描述的宿主或宿主細胞之類似物，但是表現或可以表現出本案之奈米抗體及/或本案之聚胜肽及/或包含此處所述的核酸。
本案進一步牽涉到產物或包含或帶有本案之奈米抗體之組成、本案之聚胜肽；及/或本案之核酸。這類產物或組成可能為WO 04/041862描述的產物或組成之類似物，但是包含或帶有本案之奈米抗體、本案之聚胜肽，或本案之核酸。
本案進一步牽涉到製備或生產此處所提奈米抗體、聚胜肽、核酸、宿主細胞、產物及組成之方法，後面會描述該方法。同時，此處的奈米抗體、聚胜肽、核酸、宿主細胞、產物及組成通常在WO 04/041862中製備於並用於該類似物。
本案進一步牽涉到上述奈米抗體、聚胜肽、核酸、宿主細胞、產物及組成的應用，而該應用包括但不限於後面及/或進一步所提到的對抗TNF-α及/或WO 04/041862中組成相同之聚胜肽的應用。
此本案現在要用下列非限定的例子與圖片深入敘述，其中圖片顯示：單價TNFα奈米抗體
圖1：人類TNFα奈米抗體之序列排列
圖2：血清白蛋白專一TNFα奈米抗體之序列排列
圖3：白蛋白專一TNFα奈米抗體與人類血清白蛋白之結合
圖4：白蛋白專一TNFα奈米抗體與恆河猴血清白蛋白之結合
圖5：白蛋白專一TNFα奈米抗體與老鼠血清白蛋白之結合
圖6：TNFα與血清白蛋白奈米抗體之純度(SDS-PAGE)
圖7：TNFα與血清白蛋白奈米抗體之西方點墨分析
圖8：奈米抗體與人類TNFα之結合(ELISA)
圖9：TNFα奈米抗體與恆河猴TNFα之結合(ELISA)
圖10：對人類TNFα之Enbrel受器抑制分析
圖11：對恆河猴TNFα之Enbrel受器抑制分析
圖12：TNFα奈米抗體與人類TNFα之結合(Biacore)
圖13：TNFα奈米抗體與恆河猴TNFα之結合(Biacore)
圖14：TNFα奈米抗體與蛋白A之結合(Biacore)
圖15：TNFα與血清白蛋白奈米抗體之溫度處理(西方點墨)
圖16：安定性：TNFα奈米抗體之溫度處理(ELISA)
圖17：血清白蛋白奈米抗體之溫度處理(Biacore)
二價TNFα奈米抗體
圖18：二價TNFα奈米抗體之純度(SDS-PAGE)
圖19：二價TNFα奈米抗體之西方點墨分析
圖20：對二價TNFα奈米抗體之Enbrel受器抑制分析
圖21：安定性：二價TNFα奈米抗體之溫度處理(ELISA)
人體化單價TNFα奈米抗體
圖22：TNF1人體化奈米抗體之多序列排列
圖23：TNF2人體化奈米抗體之多序列排列
圖24：TNF3人體化奈米抗體之多序列排列
圖25：ALB1人體化奈米抗體之多序列排列
圖26：人體化TNFα與血清白蛋白奈米抗體之純度(SDS-PAGE)
圖27：人體化TNFα與血清白蛋白奈米抗體之西方點墨分析
圖28：人體化TNFα奈米抗體與人類TNFα之結合
圖29：人體化血清白蛋白奈米抗體與人類血清白蛋白之結合
圖30：安定性：人體化TNFα奈米抗體之溫度處理(ELISA)
三價TNFα奈米抗體
圖31：三價TNFα奈米抗體之純度(SDS-PAGE)
圖32：三價TNFα奈米抗體之西方點墨分析
圖33：安定性：三價TNFα奈米抗體之溫度處理(ELISA)
人體化單價TNFα奈米抗體(第二回)
圖34：TNF1人體化奈米抗體之多序列排列
圖35：TNF2人體化奈米抗體之多序列排列
圖36：TNF3人體化奈米抗體之多序列排列
圖37：ALB1人體化奈米抗體之多序列排列
圖38：人體化TNFα奈米抗體之純度(SDS-PAGE)
圖39：人體化TNFα奈米抗體之西方點墨分析
圖40：人體化TNFα奈米抗體與人類TNFα之結合
圖41：安定性：人體化TNFα奈米抗體之溫度處理(ELISA)
圖42：純化TNF60分析於銀染色SDS-PAGE膠(A)Coomassie染色SDS-PAGE膠(B)與用抗-NB之西方點墨分析(C)用於偵測
圖43：在Superdex HR75上之TNF60分析型尺寸排斥色層分析法
圖44：TNF60與人類TNFα之結合
圖45：與Enbrel(Etanercept),Humira(Adalimumab)及Remicade(Infliximab)相比，使用奈米抗體TM TNF60時與人類TNFα得自細胞毒性分析的劑量反應曲線
圖46：與Enbrel(Etanercept),Humira(Adalimumab)及Remicade(Infliximab)相比，使用奈米抗體TM TNF60時與恆河猴TNFα得自細胞毒性分析的劑量反應曲線
圖47：老鼠中TNF60的藥動資料
圖48：老鼠中TNF60的免疫性資料
圖49：純化TNF56-PEG40,TNF56-PEG60,TNF56-biotine,TNF55-PEG40,TNF55-PEG60與TNF55-biotine在Coomassie染色SDS-PAGE膠上的分析
圖50：純化TNF56-PEG40分析於SDS-PAGE膠上使用銀染色(A)Coomassie染色(B)與用抗-NB之西方點墨分析(C)用於偵測
圖51：在Superdex HR75上之TNF56-PEG40分析型尺寸排斥色層分析法
圖52：Chromatogram of analytical size exclusion of TNF56-PEG40 on Superdex HR 200在Superdex HR 200上之TNF56-PEG40分析型尺寸排斥色層分析法
圖53：與Enbrel(Etanercept),Humira(Adalimumab)及Remicade(Infliximab)相比，使用奈米抗體TM TNF56-PEG40及單價原型奈米抗體TM TNF1時與人類TNFα得自細胞毒性分析的劑量反應曲線
圖54：與Enbrel(Etanercept),Humira(Adalimumab)及Remicade(Infliximab)相比，使用奈米抗體TM TNF56-PEG40及單價原型奈米抗體TM TNF1時與恆河猴TNFα得自細胞毒性分析的劑量反應曲線
圖55：老鼠中靜脈給藥後PEG化的二價奈米抗體TM TNF56-PEG40與TNF56-PEG60的藥動分析
圖56：老鼠中靜脈給藥後PEG化的二價奈米抗體TM 3E-3E-PEG20、PEG化的二價奈米抗體TM 3E-3E-PEG40與二價奈米抗體TM 3E-3E-AR1的藥動分析
圖57：老鼠中TNF56-PEG40與TNF56-PEG60的免疫性資料
圖58：老鼠中TNF60預防慢性多發性關節炎的效力
圖59：老鼠中TNF60治療慢性多發性關節炎的效力
圖60：老鼠中TNF60奈米抗體TM之形式對預防慢性多發性關節炎的效
力影響
圖61：奈米抗體TM PMP1C2,3E,1A與3G之序列排列
圖62：TNF-60之分子模型
本案的其他層面、實例、優點與應用，將會在後敘中逐漸分明。
本案的上述與其他層面以及實例將會在後敘中逐漸分明，其中：
a)除非另有聲明或定義，所有項目均使用它們的學術定義，因此實驗者可以清楚知道。例子的文獻參考標準書目，如Sambrook et al,"Molecular Cloning：A Laboratory Manual"(2nd.Ed.),Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；F.Ausubel et al,eds.,"Current protocols in molecular biology",Green Publishing and Wiley Interscience,New York(1987)；Lewin,“Genes II”,John Wiley & Sons,New York,N.Y.,(1985)；Old et al.,“Principles of Gene Manipulation：An Introduction to Genetic Engineering”,2nd edition,University of California Press,Berkeley,CA(1981)；Roitt et al.,“Immunology”(6th.Ed.),Mosby/Elsevier,Edinburgh(2001)；Roitt et al.,Roitt’s Essential Immunology,10th Ed.Blackwell Publishing,UK(2001)；及Janeway et al.,“Immunobiology”(6th Ed.),Garland Science Publishing/Churchill Livingstone,New York(2005)，均如此處所引用的一般背景理論；
b)除非另有聲明或定義，不論是用於此處以指稱重鏈抗體或是傳統的4鏈抗體，「免疫球蛋白序列」一詞均為包含兩種全尺寸抗體與個
別鍊的一般字眼，就像所有部份、區域或片段這樣(包括但不限定於抗原結合區域或片段，如個別的VHH區或VH/VL區)。此外，除非文章中需要較限定的表示法，此處用的「序列」一詞(例如「免疫球蛋白序列」、「抗體序列」、「變異區序列」、「VHH序列」或「蛋白質序列」的字眼)應明白地包刮兩種相關氨基酸序列，就像是核酸序列或是表現相同的核苷酸；
c)除非另有聲明，所有未特別細述的方法、步驟、技術與操控平台，即可以操作或於本質已知的情況下操作，並讓實驗者知道。例子的文獻還是參考標準書目，均如此處前述或後敘所引用的一般背景理論；
d)將跟去標準的三碼或一碼氨基酸編碼來描述氨基酸殘基，如表1中所提；
f)為比較兩個以上的核苷酸序列，第一核苷酸序列與第二核苷酸序列之間的「序列一致性」可以由「第一核苷酸序列中與第二核苷酸
序列中對應位置的等同之核苷酸序列數目」除以「第一核苷酸序列中的總核苷酸數目」並乘上「100%」加以計算，其中在第二核苷酸序列中所有的刪除、插入、取代或增加-與第一核苷酸序列相比-均視作單一核苷酸(位置)上的差異。
此外，兩個以上核苷酸序列的序列一致性等級，可以由針對序列排比的已知電腦演算法加以計算，像是使用標準設定的NCBI Blast v2.0。
某些決定序列一致性等級的其他技術、電腦演算法及設定，如WO 04/037999、EP 0 967 284、EP 1 085 089、WO 00/55318、WO 00/78972、WO 98/49185及GB 2 357 768-A所述。
通常，為決定兩核苷酸序列之間符合此處所提的計算方法之「序列一致性」的百分比，具有最多核苷酸數目的核苷酸序列將會被當作「第一」核苷酸序列，而其他核苷酸序列則被當作「第二」核苷酸序列；
g)為了比較兩個以上的氨基酸序列，第一氨基酸序列與第二氨基酸序列之間的「序列一致性」可以由「第一氨基酸序列中與第二氨基酸序列中對應位置的等同之氨基酸殘基數目」除以「第一氨基酸序列中的總核苷酸數目」並乘上「100%」加以計算，其中在第二氨基酸序列中所有的刪除、插入、取代或增加-與第一氨基酸序列相比-均視作單一氨基酸(位置)上的差異。
此外，兩個以上氨基酸序列的序列一致性等級，可以由已知的電腦演算法加以計算，像是那些前述用來決定核苷酸序列之序列一致性等級者，如使用標準設定。
通常，為決定兩氨基酸序列之間符合此處所提的計算方法之「序列一致性」的百分比，具有最多氨基酸數目的氨基酸序列將會被當作
「第一」氨基酸序列，而其他氨基酸序列則被當作「第二」氨基酸序列。
同時，為決定兩氨基酸序列之間的序列一致性等級，實驗者會算入所謂的「固有性」氨基酸取代，它可以普遍地被描述為某氨基酸殘基被另一化學結構相似的氨基酸殘基取代後之氨基酸序列取代，而且它在該聚胜肽的功能、活性或其他生物性質方面，本質上幾乎沒有影響。這樣的固有性氨基酸取代，例如在周知的學理中有WO 04/037999、GB-A-2 357 768、WO 98/49185、WO 00/46383及WO 01/09300；及這類取代的(重要)類型及/或組合可以像WO 98/49185般依照WO 04/037999中相關的教學加以挑選，也可以根據此處後面引用到的文獻。
這類重要的固有性取代中，必須包含下列群組中的一個氨基酸(a)-(e)表示在相同群組內由另一個氨基酸殘基取代(a)小的脂肪族、非極性或低極性殘基：Ala、Ser、Thr、Pro及Gly；(b)極性、帶負電殘基及其(未帶電)之胺類：Asp、Asn、Glu及Gln；(c)極性、帶正電殘基：His、Arg及Lys；(d)大的脂肪族、非極性殘基：Met、Leu、Ile、Val及Cys；及(e)芳香性殘基：Phe、Tyr及Trp。
特別重要的固有性取代如下：Ala到Gly或到Ser；Arg到Lys；Asn到Gln或到His；Asp到Glu；Cys到Ser；Gln到Asn；Glu到Asp；Gly到Ala或到Pro；His到Asn或到Gln；Ile到Leu或到Val；Leu到Ile或到Val；Lys到Arg、到Gln或到Glu；Met到Leu、到Tyr或到Ile；Phe到Met、到Leu或到Tyr；Ser到Thr；Thr到Ser；Trp到Tyr；Tyr到Trp；及/或Phe到Val、到Ile或到Leu。
任何應用於此處聚胜肽的氨基酸取代，可能會依照Schulz et al.,Principles of Protein Structure,Springer-Verlag,1978所本案不同種之
同源蛋白質間的氨基酸變異之頻率分析，Chou and Fasman,Biochemistry 13：211,1974與Adv.Enzymol.,47：45-149,1978之結構形成潛力分析，以及Eisenberg et al.,Proc.Nad.Acad Sci.USA 81：140-144,1984；Kyte & Doolittle；J Molec.Biol.157：105-132,198 1與Goldman et al.,Ann.Rev.Biophys.Chem.15：321-353,1986之蛋白質的疏水性特質分析，此處皆參考他們文獻中的完整資料。此處提到的一級、二級與三級奈米抗體結構資訊，均在描述及前面提到的引用之中。同時，為了此目的，例如駱駝的VHH區之結晶結構也已在Desmyter et al.,Nature Structural Biology,Vol.3,9,803(1996)；Spinelli et al.,Natural Structural Biology(1996)；3,752-757；及Decanniere et al.,Structure,Vol.7,4,361(1999)中見到。有些在VH/VL界面的傳統VH區之氨基酸殘基的進一步資訊，及這些位置的駱駝化取代，皆可在此處引用的奈米抗體之先前理論中發現。
h)如果在全長上有100%的序列一致性(如此處定義)，則氨基酸序列與核苷酸序列為所謂的「完全相同」；
i)在比較兩個氨基酸序列時，「氨基酸差異」一詞指的是與第二序列相比時，在第一序列的某位置上之單一氨基酸殘基插入、刪除或取代；可知兩個氨基酸序列含有一、二或多個這樣的氨基酸差異；
j)核酸序列或氨基酸序列被認為「(在)本質上單離(形式)」-例如比較其取得處之固有的生物來源及/或反應媒介或培養基質-當它由一個以上經常伴隨於來源或介質的其他成分中分離出來，像是別的核酸、別的蛋白質/聚胜肽、別的生物成分或大分子或一種以上的污染。特別是當被純化到2倍以上，特別是10倍以上，甚至是100倍以上、高達1000倍或以上時，核酸來源或氨基酸序列會被認為「本質上單離」。「在本質上單離之形式」的核酸序列或是氨基酸序列，在使用
像是聚丙烯醯胺-凝膠電泳這類適切的層析技術測定後，本質上應該是同源；
k)此處用到的「區」一詞通常指的是抗體鏈的球狀區域，特別是指重鏈抗體的球狀區域，或是本質上含有這類球狀區域的聚胜肽。通常，這樣的區會包含胜肽環(例如3或4個胜肽環)，藉由形成片狀或是雙硫鍵加以穩定。
l)「抗原決定基」一詞指的是抗原上的抗原表位，藉由與抗原結合的分子(像是本案中的奈米抗體或聚胜肽)，尤其是這種分子的抗原結合位加以辨識。「抗原決定基」與「抗原表位」在此處的用法可以互換。
m)氨基酸序列(像奈米抗體、本案中的聚胜肽，或是尋常的抗原結合蛋白質或聚胜肽或此處的某片段)因為對特定的抗原決定基、抗原表位、抗原或蛋白質(或一個以上的局部、片段或抗原表位)有親和力及/或專一性而產生連結，即所謂的「對抗」或「用來對抗」所謂的抗原決定基、抗原表位、抗原或蛋白質。
n)「專一性」一詞指的是抗原或抗原決定基的不同類型之數目使得特定的抗原結合分子或抗原結合蛋白質(像是本案中的奈米抗體或聚胜肽)分子可以結合。抗原結合蛋白質的專一性可以由親和力及/或親抗原性來決定。由抗原跟抗原結合蛋白質間分離的平衡常數(KD)所表示的親和力，是一種在抗原結合蛋白質上的抗原決定基與抗原結合位間之結合強度：KD的值越低，則抗原決定基與抗原結合分子間的結合力越強(另一方面，親和力也可表示為親和力常數(KA)，即1/KD)。實驗者將會知道(例如根據後敘顯示)，親和力可以根據特定的目標抗原，由已知的條件本身測得。親抗原性則關係到抗原決定基與其抗原結合分子上的抗原結合位間之親和力，以及抗原結合分子
上的相關結合位之數目。一般的抗原結合蛋白質(像是本案中的奈米抗體及/或聚胜肽)就會跟分離常數(KD)為10-5到10-12 moles/liter(M)或以下、較佳的為10-7到10-12 moles/liter(M)或以下、甚至是10-8到10-12 moles/liter的結合，及/或跟結合常數(KA)至少107 M-1、較佳的起碼為108 M-1、甚至是起碼為109 M-1例如1012 M-1以上的結合。任何KD值比10-4 M大的通常被視作非專一性集合，而本案中的奈米抗體或聚胜肽則會與預期的抗原結合，其KD小於500 nM、較佳的小於200 nM，甚至到小於10 nM，像是低於500 pM。特定的抗原結合蛋白質與抗原或抗原決定位之結合可以由已知的條件本身測得，例子有Scatchard分析及/或競爭性結合分析，像是放射免疫分析(RIA)、酵素免疫分析(EIA)與三明治競爭分析，而在學理中已經了解此處不同的變異本身。
o)如後敘，氨基酸序列與奈米抗體的結構可以被視作-尚未被限制於此-包含於四個骨架區域或「FR」；像是下面說法中分別有「骨架區域1」或「FR1」；「骨架區域2」或「FR2」；「骨架區域3」或「FR3」「骨架區域4」或「FR4」；其中骨架區域被三個互補決定區或「CDR」給打斷，分別有「互補決定區1」或「CDR1」；「互補決定區2」或「CDR2」；及「互補決定區3」或「CDR3」；
p)如後敘還有，奈米抗體內的氨基酸殘基總數可以在110-120的區域，較佳的是112-115，而最好是在113。然而，應注意的是，奈米抗體的局部、片段或類似物(如此處後敘)並不特定限於它們的長度及/或尺寸，只要這些局部、片段或類似物能符合此處提出的進一步要求，並且還能切合此處提到的目的；
q)奈米抗體的氨基酸殘基是根據Kabat et al.(“Sequence of proteins of immunological interest”,US Public Health Services,NIH Bethesda,
MD,Publication No.91)提出的一般VH區域編號方式而編號，如同Riechmann與Muyldermans文中的駱駝VHH區之應用，可參照上述(參見文獻中圖2的例子)。根據此編號，奈米抗體的FR1包括1-30位的氨基酸殘基，而奈米抗體的CDR1包括31-36位的氨基酸殘基，奈米抗體的FR2包括36-49位的氨基酸殘基，而奈米抗體的CDR2包括50-65位的氨基酸殘基，奈米抗體的FR3包括66-94位的氨基酸殘基，而奈米抗體的CDR3包括95-102位的氨基酸殘基，還有FR4包括103-113位的氨基酸殘基。[根據這點，應注意-如周知的VH區及VHH區之理論-每一個CDR中的氨基酸殘基之總數可能會不同，也可能不會反映出Kabat編號所指出的氨基酸殘基總數(即根據Kabat編號的一個或更多位置可能不會佔據於實際序列中，或是實際序列可能會含有比Kabat編號所允許更多的氨基酸殘基數)。這表示一般根據Kabat的編號不一定會反映出實際序列中的實際氨基酸殘基數。然而，一般來說可以根據Kabat編號及不考慮CDR中的氨基酸殘基數，根據Kabat編號的1位對應到FR1的起始並反推，根據Kabat編號的36位對應到FR2的起始並反推，根據Kabat編號的66位對應到FR3的起始並反推，根據Kabat編號的103位對應到FR4的起始並反推]。
別的計算VH區之氨基酸殘基編號方法，可以應用於從駱駝到奈米抗體的類似情形之方法，並描述於Chothia et al.(Nature 342,877-883(1989))，亦稱作「AbM定義」與所謂的「接觸定義」。然而，在現有的描述、聲稱與圖片中，當應用到Riechmann及Muyldermans的VHH區時，除非有另外聲明，根據Kabat的編號將會在後面提到；及r)圖片、序列條列及實驗部份/實例只會出現於後面的本案講解中，並且應該不會表示成或形成限制本案範圍及/或以任何形式的附加聲明，除非該處另有明確指出。
針對重鏈抗體及變異區的一般描述，特別提出下列的參考文獻，並在一般的背景學理中提到：Vrije Universiteit Brussel的WO 94/04678、WO 95/04079及WO 96/34103；Unilever的WO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231及WO 02/48193；Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)的WO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016及WO 03/055527；Algonomics N.V.及申請人之WO 03/050531；National Research Council of Canada的WO 01/90190；Institute of Antibodies的WO 03/025020(=EP 1 433 793)；如同申請人的WO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551及申請人進一步發表的專利申請；Hamers-Casterman et al.,Nature 1993 June 3；363(6428)：446-8；Davies and Riechmann,FEBS Lett.1994 Feb 21；339(3)：285-90；Muyldermans et al.,Protein Eng.1994 Sep；7(9)：1129-3；Davies and Riechmann,Biotechnology(NY)1995 May；13(5)：475-9；Gharoudi et al.,9th Forum of Applied Biotechnology,Med.Fac.Landbouw Univ.Gent.1995；60/4a part I：2097-2100；Davies and Riechmann,Protein Eng.1996 Jun；9(6)：531-7；Desmyter et al.,Nat Struct Biol.1996 Sep；3(9)：803-11；Sheriff et al.,Nat Struct Biol.1996 Sep；3(9)：733-6；Spinelli et al.,Nat Struct Biol.1996 Sep；3(9)：752-7；Arbabi Ghahroudi et al.,FEBS Lett.1997 Sep 15；414(3)：521-6；Vu et al.,Mol Immunol.1997 Nov-Dec；34(16-17)：1121-31；Atarhouch et al.,Journal of Camel Practice and Research 1997；4：177-182；Nguyen et al.,J.Mol.Biol.1998 Jan 23；275(3)：413-8；Lauwereys et al.,EMBO J.1998 Jul 1；
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符合前述文獻使用的名稱，在重鏈抗體中自然產生的店疫區將會被指為「VHH區」，以區別它們跟傳統4鏈抗體中的重鏈變異區(將會被指為「VH區」)，還可以區別它們跟傳統4鏈抗體中的輕鏈變異區(將會在後敘中被指為「VL區」)。
如上述的理論之前所提，VHH區有很多獨特的結構特徵與功能性，可以讓單離的VHH區(如此處的奈米抗體依據，其跟天然形成的VHH區共用了這些結構特徵與功能性)，且如同功能性抗原結合區或蛋白質，包含相同組成的蛋白質對應用上有莫大助益。特別是在未限定時，VHH區(被大自然「設計」來功能性地結合於抗原上，而不需
要輕鏈變異區的存在與任何作用力)與奈米抗體可以像單一、相對小的功能性抗原結合結構單位、區域或蛋白質般作用。這個將VHH區與傳統4鏈抗體中的VH區與VL區作了區隔，而它們本身通常不適於單一抗原結合蛋白或區域的實用性，但是卻必須與某些或另外的形式結合以提供功能性抗原結合單元(如例中的傳統抗體片段，像是Fab片段；在包含與VL區共價連結的H區之ScFv片段)。
因為這些獨特性質，VHH區與如同單一抗原結合蛋白質或抗原結合區(即較大的蛋白質或聚胜肽之部份)的奈米抗體之用途，提供了許多超越傳統VH與VL區、scFv片段或傳統抗體片段(像是Fab-或F(ab’)2-片段)用途的顯著優勢：- 只需要單一區域以高親和力與高選擇性結合於抗原上，以致無須兩個分離的區域，也不需確保這兩個在正確空間構形與組態中的區域(即使用透過特別設計的結合，像是用scFv’s；- VHH區與奈米抗體可以從單一基因表現，而且不需要後轉譯摺疊或修飾；- VHH區與奈米抗體可以簡易地被加工為多價及多專一性形式(後面會討論)；- VHH區與奈米抗體很好溶，而且不會聚集(如同Ward et al.,Nature,Vol.341,1989,p.544所述的老鼠衍生之抗原結合；區)- VHH區與奈米抗體對高溫、pH、分解酵素，及其他去活劑或條件都很穩定(見Ewert et al,supra的例子)；- 就算大規模量產，VHH區與奈米抗體在製備上容易且相對便宜。例如相同組成的VHH區、奈米抗體及蛋白質/聚胜肽，都可用微生物發酵來製造(例如後面的敘述)，而且不需要使用哺乳類表現系統，例如傳統的抗體片段；
- 與傳統的4鏈抗體及抗原結合片段相比，VHH區與奈米抗體相對而言很小(大約15 kDa或比傳統的IgG小上10倍)，而與傳統的4鏈抗體及抗原結合片段相比，還可大量穿透組織(包括但不限於固體瘤及其他緊密的組織)；- VHH區與奈米抗體可以呈現所謂的空洞結合性質(特別是因為它們與傳統VH區相比時延伸的CDR3環)，還可以接觸傳統4鏈抗體及抗原結合片段所搆不到的標的及抗原表位。例如，它呈現了可抑制酵素的VHH區與奈米抗體(見例子WO 97/49805；Transue et al.,(1998),supra；Lauwereys et al.,(1998),supra)。
如前述，本案通常牽涉用來對抗TNF-α之奈米抗體，就像包含或本質上帶有一個以上這類奈米抗體的聚胜肽，而且可用於WO 04/041862中及下面敘述中的預防性、治療性及/或診斷用途。
又如前述與下面的後敘，此本案會涵蓋決定該奈米抗體及聚胜肽的核酸，製備該奈米抗體及聚胜肽的方法，表現或可以表現該奈米抗體及聚胜肽的的宿主細胞，該奈米抗體、聚胜肽、核酸或宿主細胞的用途，及包含該奈米抗體、聚胜肽、核酸或宿主細胞的的組成。
一般應注意此處廣義的奈米抗體一詞並不限於特定的生物來源或特定的製備法。例如後面會詳細討論的本案中之奈米抗體可以來自(1)單離天然重鏈抗體的VHH區；(2)表現可決定天然VHH區的核苷酸序列；(3)天然VHH區的「人體化」(如後敘描述)或是決定人類化天然VHH區的核酸表現；(4)從任一動物物種的天然VHH區的「駱駝化」(如後敘描述)，特別是指像人類這樣的哺乳類，或是表現決定駱駝化天然VHH區的核酸；(5)由Ward et al(supra)所描述的「區域抗體」或「Dab」之「駱駝化」，或表現決定這類駱駝化天然VHH區的核酸；(6)使用合成或半合成技術來製備蛋白質、聚胜肽或其他氨基酸序列；
(7)用核酸合成技術製備決定奈米抗體的核酸，接著表現所得的核酸；及/或(8)任何前述的組合。根據此處所示，實驗者會知道合適的表現方法與技術，例如包括後面會詳述的方法及技術。
然而，根據特定例子，本案中的奈米抗體沒有完全跟天然VH區之氨基酸序列相同(即序列一致性等級達100%)的氨基酸序列，像是天然的哺乳類VH區，特別是人類的氨基酸序列。
有個格外重要的本案中奈米抗體分類，包含了帶有一個對應於天然VHH區之氨基酸序列的奈米抗體，但已被「人體化」，即將一個以上在天然VHH區氨基酸序列中的氨基酸序列，置換成一個以上傳統人類4鏈抗體中的VH區對應位置之氨基酸序列(例如前述)。這個可以表現於本身已知的情況中，而讓實驗者知道，例如後敘描述的依據與參照到此的人體化之前理論。同時，應該注意這類本案中奈米抗體的人體化可以於本身已知的情況中獲得(即前述(1)-(8)點中所指)，並在使用包含天然VHH區的起始物時，也不嚴格限制所得的聚胜肽。
針對屬於103 P,R,S-群組及/或GLEW群組(如此處定義)的某個重要但未限定之人體化取代為108Q到108L。
還有個格外重要的本案中奈米抗體分類，包含了帶有一個對應於天然VH區之氨基酸序列的奈米抗體，但已被「駱駝化」，即將一個以上在傳統人類4鏈抗體中的VH區氨基酸序列中的氨基酸序列，置換成一個以上重鏈抗體天然VHH區中對應位置之氨基酸序列(例如前述)。這個可以表現於本身已知的情況中，而讓實驗者知道，例如後敘描述的依據。參考文獻還包括WO 94/04678。這類駱駝化可能發生於在VH-VL界面及所謂的駱駝驗證殘基(例見WO 94/04678)之氨基酸位置，而後面再敘。同時，VH區或用作製造或設計駱駝化奈米抗體的起始物或啟示點之序列，應該是哺乳類的VH序列，更好的則是
人類的VH序列。然而，應該注意這類本案中奈米抗體的駱駝化可以於本身已知的情況中獲得(即前述(1)-(8)點中所指)，並在使用包含天然VH區的起始物時，也不嚴格限制所得的聚胜肽。
例如後面會提的，「人體化」及「駱駝化」皆可用來分別提供決定該天然VHH區或VH區的核酸序列，然後在本身已知的情況中改變一個以上所謂的核苷酸序列之密碼子，使得新核苷酸序列分別表現出人體化或駱駝化的奈米抗體，再表現出本身已知的情況中所得之核苷酸序列，以提供理想的本案之奈米抗體。另外，分別根據天然VHH區或VH區的氨基酸序列，理想中分別人體化或駱駝化的奈米抗體之氨基酸序列，可以設計再即刻使用本身已知的胜肽合成技術加以合成。而分別根據天然VHH區或VH區的氨基酸序列或核苷酸序列，分別決定理想的人體化或駱駝化之奈米抗體的核苷酸序列可以被設計再即刻使用本身已知的核酸合成技術加以合成，然後所得的核苷酸序列可以在本身已知的條件下表現，以提供理想的本案之奈米抗體。
要得到本案之奈米抗體及/或核苷酸序列及/或決定相同組成的核酸之其他合適方法與技術，實驗者會知道的是從天然VH區或甚至VHH區(的氨基酸序列)及/或決定相同組成的核酸序列，例如在本身已知的條件下，包含合併一個以上之天然VH區的氨基酸序列及/或核苷酸序列(像一個或以上的FR及/或CDR)，且帶有一個或一個以上或更多天然VHH區的氨基酸序列及/或核苷酸序列(像是一個或以上的FR或CDR)，以提供本案之奈米抗體。
根據一項重要但未限定的本案層面，廣義的奈米抗體一般可以定義為一種聚胜肽而包含：a)具有被三個互補決定區域/序列打斷的四個骨架區域/序列之氨基酸序列，其中根據Kabat編號，在108位的氨基酸殘基為Q；
及/或：b)具有被三個互補決定區域/序列打斷的四個骨架區域/序列之氨基酸序列，其中根據Kabat編號，在44位的氨基酸殘基為E，而根據Kabat編號，在45位的氨基酸殘基為R；及/或：c)具有被三個互補決定區域/序列打斷的四個骨架區域/序列之氨基酸序列，其中根據Kabat編號，在103位的氨基酸殘基是選自含P、R及S的群組，並特別選自含R及S的群組。因此，重要但未限定的層面中，本案中的奈米抗體之結構首選可能為：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1到FR4指的是1到4個別的骨架區域，而CDR1到CDR3指的是1到3個別的互補決定區域，其中i)根據Kabat編號，在108位的氨基酸殘基為Q；及/或：ii)根據Kabat編號，在44位的氨基酸殘基為E，而根據Kabat編號，在45位的氨基酸殘基為R；及/或：iii)根據Kabat編號，在103位的氨基酸殘基是選自含P、R及S的群組，並特別選自含R及S的群組；其中還有iv)前面已定義過CDR1、CDR2及CDR3，還可以依照前述的一項重要定義，甚至根據前述一個以上的更重要定義。
特別是，根據本案對抗TNF-α的奈米抗體可能有此結構：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1到FR4指的是1到4個別的骨架區域，而CDR1到CDR3指的是1到3個別的互補決定區域，其中i)根據Kabat編號，在108位的氨基酸殘基為Q；及/或：ii)根據Kabat編號，在44位的氨基酸殘基為E，而根據Kabat編號，在45位的氨基酸殘基為R；及/或：iii)根據Kabat編號，在103位的氨基酸殘基是選自含P、R及S的群組，並特別選自含R及S的群組；其中還有iv)前面已定義過CDR1、CDR2及CDR3，還可以依照前述的一項重要定義，甚至根據前述一個以上的更重要定義。
另外，根據本案中的一項重要但未限定層面，通常奈米抗體可定義為包含一氨基酸序列的聚胜肽，而該氨基酸序列包含被三個互補決定區域/序列打斷的四個骨架區域/序列，其中：a-1)根據Kabat編號，在44位的氨基酸殘基是選自含G,E,D,G,Q,R,S,L的群組；特別是選自含G,E或Q的群組；及a-2)根據Kabat編號，在45位的氨基酸殘基是選自含L,R或C的群組；特別是選自含L或R的群組；及a-3)根據Kabat編號，在103位的氨基酸殘基是選自含W,R或S的群組；特別是選自含W或R的群組，最好是W；
a-4)根據Kabat編號，在108位的氨基酸殘基為Q；其中或：b-1)根據Kabat編號，在44位的氨基酸殘基是選自含E及Q的群組；及b-2)根據Kabat編號，在45位的氨基酸殘基為R；及b-3)根據Kabat編號，在103位的氨基酸殘基是選自含W,R或S的群組；特別是W；b-4)根據Kabat編號，在108位的氨基酸殘基是選自含Q和L的群組；特別是Q；其中或：c-1)根據Kabat編號，在44位的氨基酸殘基是選自含G,E,D,G,Q,R,S及L的群組；特別是選自含G,E及Q的群組；及c-2)根據Kabat編號，在45位的氨基酸殘基是選自含L,R及C的群組；特別是選自含L及R的群組；及c-3)根據Kabat編號，在103位的氨基酸殘基是選自含P,R及S的群組；特別是選自含R及S的群組；及c-4)根據Kabat編號，在108位的氨基酸殘基是選自含Q和L的群組；特別是Q。
因此，重要但未限定的層面中，本案中的奈米抗體之結構可能為：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1到FR4指的是1到4個別的骨架區域，而CDR1到CDR3指的是1到3個別的互補決定區域，其中：i)根據Kabat編號，在44位的氨基酸殘基是選自含G,E,D,G,Q,R,
S,L的群組；特別是選自含G,E或Q的群組；其中：ii)根據Kabat編號，在45位的氨基酸殘基是選自含L,R或C的群組；特別是選自含L或R的群組；其中：iii)根據Kabat編號，在103位的氨基酸殘基是選自含W,R或S的群組；特別是選自含W或R的群組，而最好是W；其中：iv)根據Kabat編號，在108位的氨基酸殘基是Q；其中：v)前面已定義過CDR1、CDR2及CDR3，還可以依照前述的一項重要定義，甚至根據前述一個以上的更重要定義。
在另一重要但未限定的層面中，本案中的奈米抗體之結構可能為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1到FR4指的是1到4個別的骨架區域，而CDR1到CDR3指的是1到3個別的互補決定區域，其中：i)根據Kabat編號，在44位的氨基酸殘基是選自含E與Q的群組；其中：ii)根據Kabat編號，在45位的氨基酸殘基是R；其中：iii)根據Kabat編號，在103位的氨基酸殘基是選自含W,R及S的群組；最好是W；
其中：iv)根據Kabat編號，在108位的氨基酸殘基是Q；其中：vi)前面已定義過CDR1、CDR2及CDR3，還可以依照前述的一項重要定義，甚至根據前述一個以上的更重要定義。
在另一重要但未限定的層面中，本案中的奈米抗體之結構可能為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1到FR4指的是1到4個別的骨架區域，而CDR1到CDR3指的是1到3個別的互補決定區域，其中：i)根據Kabat編號，在44位的氨基酸殘基是選自含G,E,D,Q,R,S及L的群組；特別是選自含G,E及Q的群組；其中：ii)根據Kabat編號，在45位的氨基酸殘基是選自含L,R及C的群組；特別是選自含L及R的群組；其中：iii)根據Kabat編號，在103位的氨基酸殘基是選自含P,R及S的群組；特別是選自含R及S的群組；其中：iv)根據Kabat編號，在108位的氨基酸殘基是選自含Q和L的群組；特別是Q；其中：v)前面已定義過CDR1、CDR2及CDR3，還可以依照前述的一項重要定義，甚至根據前述一個以上的更重要定義。
有兩個重要但未限定的本案中之奈米抗體群組是依據a)上述；根據上述I)到a-4)；根據上述b)；根據上述b-1)到b-4)；根據上述c)；及/或根據上述c-1)到c-4)，其中；a)根據Kabat編號，在44-47位的氨基酸殘基是選自序列GLEW(或是類似後敘定義的GLEW的序列)及108位的氨基酸殘基是Q；或其中：b)根據Kabat編號，在43-46位的氨基酸殘基是選自序列KERE或KQRE(或是類似KERE的序列)及108位的氨基酸殘基是Q或L，而Q較佳；因此，重要但未限定的層面中，本案中的奈米抗體之結構可能為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1到FR4指的是1到4個別的骨架區域，而CDR1到CDR3指的是1到3個別的互補決定區域，其中：i)根據Kabat編號，在44-47位的氨基酸殘基是選自序列GLEW(或是類似後敘定義的GLEW的序列)及108位的氨基酸殘基是Q；其中：ii)前面已定義過CDR1、CDR2及CDR3，還可以依照前述的一項重要定義，甚至根據前述一個以上的更重要定義。
在另一重要但未限定的層面中，本案中的奈米抗體之結構可能為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1到FR4指的是1到4個別的骨架區域，而CDR1到CDR3指的是
1到3個別的互補決定區域，其中：i)根據Kabat編號，在43-46位的氨基酸殘基是選自序列KERE或KQRE(或是類似KERE的序列)及108位的氨基酸殘基是Q或L，而Q較佳；其中：ii)前面已定義過CDR1、CDR2及CDR3，還可以依照前述的一項重要定義，甚至根據前述一個以上的更重要定義。
根據Kabat編號，在43-46位的氨基酸殘基是選自序列KERE或KQRE，在37位的氨基酸殘基最好是37。在本案中的奈米抗體裡，根據Kabat編號，在44-47位的氨基酸殘基是選自序列GLEW，在37位的氨基酸殘基則是選自含Y,H,I,V或F的群組，而最好是F。
因此，任何不設限的方式中，根據前面提過的氨基酸殘基，本案中的奈米抗體一般可以依照下列三群組加以分類：
a)「GLEW群組」：根據Kabat編號，在44-47位的有氨基酸序列GLEW，及根據Kabat編號，在108位為Q的奈米抗體。如進一步會描述的，在此群組內的奈米抗體通常在37位為V，並在103位可有W,P,R或S，而103位最好是W。GLEW群組亦包含某些表2中提及的類似GLEW之序列。
b)「KERE群組」：根據Kabat編號，在43-46位有氨基酸序列KERE或KQRE，及根據Kabat編號，在108位為Q或L的奈米抗體。如進一步會描述的，在此群組內的奈米抗體通常在37位為F，而47位為L或F；103位則可有W,P,R或S，而103位最好是W。
c)「103 P,R,S群組」：在103位為P、R或S的奈米抗體。根據Kabat編號，這些奈米抗體可以在44-47位有氨基酸序列GLEW，或者是在43-46位有氨基酸序列KERE或KQRE，後者最好還能連同37
位為F而47位為L或F(如KERE群組定義)；根據Kabat編號，可在108位為Q或L，其中Q較佳。
因此，在另外重要但未限定的層面中，本案中的奈米抗體可能為屬於GLEW群組(如定義)的奈米抗體，其中前面已定義過CDR1、CDR2及CDR3，還可以依照前述的一項重要定義，甚至根據前述一個以上的更重要定義。
在另一重要但未限定的層面中，本案中的奈米抗體可能為屬於KERE群組(如定義)的奈米抗體，其中前面已定義過CDR1、CDR2及CDR3，還可以依照前述的一項重要定義，甚至根據前述一個以上的更重要定義。
因此，在另外重要但未限定的層面中，本案中的奈米抗體可能為屬於103 P,R,S群組(如定義)的奈米抗體，其中前面已定義過CDR1、CDR2及CDR3，還可以依照前述的一項重要定義，甚至根據前述一個以上的更重要定義。
同時，再提到前述的108Q,43E/44R及103P,R,S殘基，本案中的奈米抗體可在一個或更多的位置，含有在傳統的VH區中形成之VH/VL界面(的部份)，含有一個或更多比天然VH區或VHH區的對應位置中的氨基酸殘基帶更多電荷之氨基酸殘基，特別是一個或更多帶電的氨基酸殘基(如表1中所提)。
這類取代包括但不限於下方表2所提到的類似GLEW之序列；如同WO 04/041862的世界性應用中對所謂的「微粒體」描述之取代，例如108位的Q及44-47位的KLEW。
在某些本案中的奈米抗體實例裡，83位的氨基酸殘基是選自L,M,S,V及W群組；以L較佳。
同時，在某些本案中的奈米抗體實例裡，83位的氨基酸殘基是選
自含R,K,N,E,I及Q的群組；以K或E(對應於天然VHH區的奈米抗體)或R(如後敘的「人體化」奈米抗體)最好。84位的氨基酸殘基在某些實例中是選自含P,A,R,S,D及V的群組，最好是P(對應於天然VHH區的奈米抗體)或R(如後敘的「人體化」奈米抗體)。
再者，在某些本案中的奈米抗體實例裡，104位的氨基酸殘基是選自含G與D的群組；以G最好。
總之，在前述的奈米抗體中之11,37,44,45,47,83,84,103,104及108位的氨基酸殘基將可以如「驗證殘基」來參見此處。與人類VH區域，VH3，最緊密相關對應位置上的驗證殘基與氨基酸殘基已歸納於表2。
有些這類天然VHH區的驗證殘基之特別重要組合，已在表3中提及。為了比較，稱作DP-47之人類VH3的對應氨基酸殘基已經用斜體表示。
注意：
(1)：特別但不唯一的是在43-46位合併KERE或KQRE。
(2)：通常在44-47位為GLEW。
(3)：通常在43-46位為KERE，例如43-47位的KEREL,KEREF,KQREL,KQREF或KEREG。另外，也有像是TERE(例如TEREL),KECE(例如KECEL或KECER),RERE(例如REREG),QERE(例如QEREG),KGRE(例如KGREG),KDRE(例如KDREV)的序列都有可能。有些其他可能但較不重要的序列包括DECKL及NVCEL。
(4)：同時在44-47位有GLEW而43-46位有KERE或KQRE。
(5)：通常在天然的VHH區之83-84位為KP或EP。
(6)：特別但不唯一的是在44-47位合併GLEW。
(7)：但書是當44-47位為GLEW時，108位必定為Q。
(8)：GLEW群組亦在44-47為包含類似GLEW的序列，例如GVEW,EPEW,GLER,DQEW,DLEW,GIEW,ELEW,GPEW,EWLP,GPER,GLER及ELEW。
在該奈米抗體中，任何其他位置上非驗證殘基的每個氨基酸序列，可以為天然VHH區的對應位置(根據Kabat編號)之任何氨基酸殘基。
實驗者將會知道這類氨基酸殘基。表4-7提到某些出現於天然VHH區的FR1,FR2,FR3及FR4各位置(根據Kabat編號)之未限定殘基。對每個位置而言，最常出現於天然VHH區各位置的氨基酸殘基(亦為奈米抗體中該位置最重要的氨基酸殘基)以粗體表示；其他各位置重要的氨基酸殘基則標以底線(注意：天然VHH區的26-30位之氨基酸殘基數目驗證了Chothia(supra)標號下方的假設，這些位置的殘基已形成CDR1之部分。)
在表4-7中，某些可以在人類VH3區出現的未受限殘基也已提過。再者，在天然VH3區的每個位置最常出現之氨基酸殘基已用粗體標示；其他重要的氨基酸殘基則標以底線。
因此，另外重要但未限定的層面中，本案中的奈米抗體之結構可能為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1到FR4指的是1到4個別的骨架區域，而CDR1到CDR3指的是1到3個別的互補決定區域，其中：i)驗證殘基如上述定義；其中：ii)前面已定義過CDR1、CDR2及CDR3，還可以依照前述的一項重要定義，甚至根據前述一個以上的更重要定義。
在另一重要但未限定的層面中，本案中的奈米抗體之結構可能為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1到FR4指的是1到4個別的骨架區域，而CDR1到CDR3指的是1到3個別的互補決定區域，其中：以及i)FR1選自含下列氨基酸序列的群組：[1]QVQLQESGGG X VQAGGSLRLSCAASG[26][序列編碼：1]或選自含下列氨基酸序列的群組，與前述氨基酸序列相比，序列一致性(如此處定義)起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；其中
(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表4中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及/或選自與前述氨基酸相比，僅有三、二或一個「氨基酸差異」(如此處定義)的群組，其中：(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表4中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；其中：ii)FR2選自含下列氨基酸序列的群組：[36]W X RQAPGK XX E X VA[49][序列編碼：2]或選自含下列氨基酸序列的群組，與前述氨基酸序列相比，序列一致性(如此處定義)起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；其中(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表5中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及/或選自與前述氨基酸相比，僅有三、二或一個「氨基酸差異」(如此處定義)的群組，其中：(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代
(如定義)及/或表5中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；其中：iii)FR3選自含下列氨基酸序列的群組：[66]RFTISRDNAKNTVYLQMNSL XX EDTAVYYCAA[94][序列編碼：3]或選自含下列氨基酸序列的群組，與前述氨基酸序列相比，序列一致性(如此處定義)起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；其中(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表6中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及/或選自與前述氨基酸相比，僅有三、二或一個「氨基酸差異」(如此處定義)的群組，其中：(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表6中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；其中：iv)FR4選自含下列氨基酸序列的群組：[103] XX QGT X VTVSS[113][序列編碼：4]
或選自含下列氨基酸序列的群組，與前述氨基酸序列相比，序列一致性(如此處定義)起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；其中(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表6中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及/或選自與前述氨基酸相比，僅有三、二或一個「氨基酸差異」(如此處定義)的群組，其中：(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表6中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；其中：：v)前面已定義過CDR1、CDR2及CDR3，還可以依照前述的一項重要定義，甚至根據前述一個以上的更重要定義；其中驗證殘基標示為“ X ”，並如同此處前述定義，其中兩括號之間的數字表示依據Kabat編號的氨基酸位置。
在另一重要但未限定的層面中，本案中的奈米抗體之結構可能為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1到FR4指的是1到4個別的骨架區域，而CDR1到CDR3指的是1到3個別的互補決定區域，其中：
以及i)FR1選自含下列氨基酸序列的群組：[1]QVQLQESGGG L VQAGGSLRLSCAASG[26][序列編碼：5]或選自含下列氨基酸序列的群組，與前述氨基酸序列相比，序列一致性(如此處定義)起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；其中(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表4中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；(3)位置上的驗證殘基如上述序列所示；及/或選自與前述氨基酸相比，僅有三、二或一個「氨基酸差異」(如此處定義)的群組，其中：(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表4中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)位置上的驗證殘基如上述序列所示；以及：ii)FR2選自含下列氨基酸序列的群組：
[36]W F RQAPGK ER E L VA[49][序列編碼：6]
[36]W F RQAPGK ER E F VA[49][序列編碼：7]
[36]W F RQAPGK ER E G A[49][序列編碼：8]
[36]W F RQAPGK QR E L VA[49][序列編碼：9]
[36]W F RQAPGK QR E F VA[49][序列編碼：10]
[36]W Y RQAPGK GL E W A[49][序列編碼：11]或選自含下列氨基酸序列的群組，與前述氨基酸序列相比，序列一致性(如此處定義)起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；其中(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表5中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)在37,44,45及47位置上的驗證殘基如上述各序列所示；及/或選自與前述氨基酸相比，僅有三、二或一個「氨基酸差異」(如此處定義)的群組，其中：(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表5中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)在37,44,45及47位置上的驗證殘基如上述各序列所示；以及：：iii)FR3選自含下列氨基酸序列的群組：：[66]RFTISRDNAKNTVYLQMNSL KP EDTAVYYCAA[94][序列編碼：12]
或選自含下列氨基酸序列的群組，與前述氨基酸序列相比，序列一致性(如此處定義)起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；其中(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表6中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)在83及84位置上的驗證殘基如上述各序列所示；及/或選自與前述氨基酸相比，僅有三、二或一個「氨基酸差異」(如此處定義)的群組，其中：(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表6中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)在83及84位置上的驗證殘基如上述各序列所示；以及：iv)FR4選自含下列氨基酸序列的群組：[103] WG QGT Q VTVSS[113][序列編碼：13]
[103] WG QGT L VTVSS[113][序列編碼：14]或選自含下列氨基酸序列的群組，與前述氨基酸序列相比，序列一致性(如此處定義)起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；其中(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代
(如定義)及/或表6中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)在103,104及108位置上的驗證殘基如上述各序列所示；及/或選自與前述氨基酸相比，僅有三、二或一個「氨基酸差異」(如此處定義)的群組，其中：(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表6中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)在103,104及108位置上的驗證殘基如上述各序列所示；以及：v)前面已定義過CDR1、CDR2及CDR3，還可以依照前述的一項重要定義，甚至根據前述一個以上的更重要定義。
在另一重要但未限定的層面中，本案中的奈米抗體之結構可能為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1到FR4指的是1到4個別的骨架區域，而CDR1到CDR3指的是1到3個別的互補決定區域，其中：以及i)FR1選自含下列氨基酸序列的群組：[1]QVQLQESGGG L VQAGGSLRLSCAASG[26][序列編碼：5]
及/或選自與前述氨基酸相比，僅有三、二或一個「氨基酸差異」(如此處定義)的群組，其中：(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表4中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)位置上的驗證殘基如上述序列所示；以及：ii)FR2選自含下列氨基酸序列的群組：
[36]W F RQAPGK ER E L VA[49][序列編碼：6]
[36]W F RQAPGK ER E F VA[49][序列編碼：7]
[36]W F RQAPGK ER E G A[49][序列編碼：8]
[36]W F RQAPGK QR E L VA[49][序列編碼：9]
[36]W F RQAPGK QR E F VA[49][序列編碼：10]
及/或選自與前述氨基酸相比，僅有三、二或一個「氨基酸差異」(如此處定義)的群組，其中：(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表5中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)在37,44,45及47位置上的驗證殘基如上述各序列所示；以及：iii)FR3選自含下列氨基酸序列的群組：
[66]RFTISRDNAKNTVYLQMNSL KP EDTAVYYCAA[94][序列編碼：12]及/或選自與前述氨基酸相比，僅有三、二或一個「氨基酸差異」(如此處定義)的群組，其中：(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表6中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；(3)在83及84位置上的驗證殘基如上述各序列所示；以及：iv)FR4選自含下列氨基酸序列的群組：[103] WG QGT Q VTVSS[113][序列編碼：13]
[103] WG QGT L VTVSS[113][序列編碼：14]
及/或選自與前述氨基酸相比，僅有三、二或一個「氨基酸差異」(如此處定義)的群組，其中：(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表7中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)在103,104及108位置上的驗證殘基如上述各序列所示；以及：v)前面已定義過CDR1、CDR2及CDR3，還可以依照前述的一項重
要定義，甚至根據前述一個以上的更重要定義。
在另一重要但未限定的層面中，本案中的奈米抗體之結構可能為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1到FR4指的是1到4個別的骨架區域，而CDR1到CDR3指的是1到3個別的互補決定區域，其中：以及i)FR1選自含下列氨基酸序列的群組：[1]QVQLQESGGG L VQAGGSLRLSCAASG[26][序列編碼：5]及/或選自與前述氨基酸相比，僅有三、二或一個「氨基酸差異」(如此處定義)的群組，其中：(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表4中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)位置上的驗證殘基如上述序列所示；以及：ii)FR2選自含下列氨基酸序列的群組：[36]W Y RQAPGK GL E W A[49][序列編碼：11]及/或選自與前述氨基酸相比，僅有二或一個「氨基酸差異」(如
此處定義)的群組，其中：(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表5中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)在37,44,45及47位置上的驗證殘基如上述各序列所示；以及：iii)FR3選自含下列氨基酸序列的群組：[66]RFTISRDNAKNTVYLQMNSL KP EDTAVYYCAA[94][序列編碼：12]及/或選自與前述氨基酸相比，僅有三、二或一個「氨基酸差異」(如此處定義)的群組，其中：(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表6中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)在83及84位置上的驗證殘基如上述各序列所示；以及：iv)FR4選自含下列氨基酸序列的群組：[103] WG QGT Q VTVSS[113][序列編碼：13]及/或選自與前述氨基酸相比，僅有三、二或一個「氨基酸差異」(如此處定義)的群組，其中：
(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表7中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)在103,104及108位置上的驗證殘基如上述各序列所示；以及：v)前面已定義過CDR1、CDR2及CDR3，還可以依照前述的一項重要定義，甚至根據前述一個以上的更重要定義。
還有些可以出現在本案中奈米抗體的其他骨架序列，可以參見前述的歐洲專利EP 656 946(也可見獲得授權的美國同等之5,759,808)。
在另一重要但未限定的層面中，本案中的奈米抗體之結構可能為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4其中FR1到FR4指的是1到4個別的骨架區域，而CDR1到CDR3指的是1到3個別的互補決定區域，其中：以及i)FR1選自含下列序列編號的FR1序列之奈米抗體群組：52到60、76到86或95到99，特別是76到86或95到99的人體化奈米抗體，或選自含下列氨基酸序列的群組，與該FR1序列之一相比，序列一致性(如此處定義)起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；其中(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代
(如定義)及/或表4中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與該FR1序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)在位置上的驗證殘基如該FR1序列所示；及/或選自與該FR1序列相比，僅有三、二或一個「氨基酸差異」(如此處定義)的群組，其中：(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表4中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與該FR1序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)在位置上的驗證殘基如該FR1序列所示；以及：ii)FR2選自含下列序列編號的FR2序列之奈米抗體群組：52到60、76到86或95到99，特別是76到86或95到99的人體化奈米抗體，或選自含下列氨基酸序列的群組，與該FR2序列之一相比，序列一致性(如此處定義)起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；其中(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表5中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與該FR2序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)在37,44,45及47位置上的驗證殘基如該FR2序列所示；及/或選自與該FR2序列相比，僅有三、二或一個「氨基酸差異」(如此處定義)的群組，其中：
(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表5中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與該FR2序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)在37,44,45及47位置上的驗證殘基如該FR2序列所示；以及：iii)FR3選自含下列序列編號的FR3序列之奈米抗體群組：52到60、76到86或95到99，特別是76到86或95到99的人體化奈米抗體，或選自含下列氨基酸序列的群組，與該FR3序列之一相比，序列一致性(如此處定義)起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；其中(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表6中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與該FR3序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)在83及84位置上的驗證殘基如該FR2序列所示；及/或選自與該FR3序列相比，僅有三、二或一個「氨基酸差異」(如此處定義)的群組，其中：(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表6中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與該FR3序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)在83及84位置上的驗證殘基如該FR2序列所示；以及：
iv)FR4選自含下列序列編號的FR4序列之奈米抗體群組：52到60、76到86或95到99，特別是76到86或95到99的人體化奈米抗體，或選自含下列氨基酸序列的群組，與該FR4序列之一相比，序列一致性(如此處定義)起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；其中(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表6中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與該FR3序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)及/或選自與該FR4序列相比，僅有三、二或一個「氨基酸差異」(如此處定義)的群組，其中：(1)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表6中定義的氨基酸取代為佳；及/或(2)與該FR4序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸；及(3)在103,104及108位置上的驗證殘基如該FR4序列所示；以及：v)前面已定義過CDR1、CDR2及CDR3，還可以依照前述的一項重要定義，甚至根據前述一個以上的更重要定義；有些重要的本案中奈米抗體可選自含下列序列編號的氨基酸序列之群組：52到60、76到86或95到99，特別是76到86或95到99的人體化奈米抗體，或是選自與含52到60、76到86或95到99之一的氨基酸序列群組相比，序列一致性(如此處定義)起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；其中
(1)驗證殘基如上表2中所示；(2)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表4-7中定義的氨基酸取代為佳；及/或(3)與上述的氨基酸序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸。
有些更重要的本案中奈米抗體可選自含下列序列編號的氨基酸序列之群組：52到60、76到86或95到99，特別是76到86或95到99的人體化奈米抗體，或是選自與含52到60、76到86或95到99之一的氨基酸序列群組相比，序列一致性(如此處定義)起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；其中(1)驗證殘基如選自序列編碼52到60、76到86或95到99的適當序列所示；(2)在任何非驗證位置的任何氨基酸取代以固有的氨基酸取代(如定義)及/或表4-7中定義的氨基酸取代為佳；及/或(3)與選自序列編碼52到60、76到86或95到99的適當序列相比，該氨基酸序列僅含有氨基酸取代為佳，而非減少或插入氨基酸。
有些最重要的本案中奈米抗體可選自含下列序列編號的氨基酸序列之群組：52到60、76到86或95到99，特別是76到86或95到99的人體化奈米抗體。
從上述可知，此處所用的本案中奈米抗體一詞，廣義地包含序列編碼52到60、76到86或95到99中提到的奈米抗體天然或合成的突變、變異、等位基因、類似物與異物種同源基因(下文中統一稱「類似物」)。
通常，該類似物包含奈米抗體的同源序列、功能性部位，或是
同源序列的功能性部位(如後面定義)。這樣的類似物，一般來說在每個骨架區域裡的所有氨基酸殘基(非驗證殘基)，都可被任何其他氨基酸殘基替代，表示該骨架區域序列一致性的總程度還是如上述定義。然而，較常見於這些類似物：- 上述骨架序列中一個以上的氨基酸殘基，在天然VHH區的相同位置被一個以上天然的氨基酸殘基置換掉。這類取代的例子已在上述表4-7中提過；及/或：- 上述骨架序列中一個以上的氨基酸殘基，被一個以上前述中被視為「固有性」氨基酸取代的氨基酸殘基置換掉；及/或：- 上述骨架序列中一個以上的氨基酸殘基，在人類的天然VH區的相同位置被一個以上的氨基酸殘基置換掉。這個通常在一般情況或特例中稱作在該位置天然VHH/奈米抗體的「人體化」，並會在下文中細述；及：- 上述表4-7中提到的VH區及VHH區中僅有一個氨基酸殘基的位置較不會被置換。
同時，雖然平常提到的不多，這些類似物中一個以上的氨基酸殘基可能會從骨架區域中被移除及/或插入骨架區域(選擇性地加到一個以上前述的氨基酸取代)，表示該骨架區域序列一致性的總程度還是如上述定義。驗證殘基則不應被移除。更重要的是，上述表4-7中提到的VH區及VHH區中僅有一個氨基酸殘基位置之氨基酸殘基較不會被移除。
這些類似物使得它們仍有親和力及/或專一性可以結合於TNF-
α，即使用適當分析法測定該親和力及/或專一性時，對一個以上序列編碼52到60、76到86或95到99之奈米抗體的親和力及/或專一性起碼達10%，較佳的為50%，再好些到起碼70%甚至到起碼80%，像是起碼達90%、起碼95%、起碼99%或更高，例如測定結合於TNF類似物的分析，特別是一種用於下面例子中的方法。
通常給予決定天然VHH區的核酸，改變一個以上用來人體化為對應人類氨基酸殘基密碼子的氨基酸殘基之密碼子，在適當的宿主或表現系統中表現所得的核酸/核苷酸序列，可以得到這樣的類似物；選擇性單離及/或純化所得的該類似物可得到本質上單離的該類似物(如上述定義)。這個通常可以用本身已知的方法與技術來進行，實驗者將可從此處引用的參考書與文獻及/或下文敘述中知道。另外，決定某類似物的核酸可以在本身已知的條件下合成(例如用自動化儀器合成具有尚未定義的氨基酸序列之核酸序列)，並表現於合適的宿主或表現系統中，藉此所得的類似物可以選擇性地被單離及/或純化，以提供該本質上單離的類似物(如上述定義)。另一個提供類似物的方法，包括以本身已知的胜肽合成技術來化學合成適當的氨基酸序列，這些下文會提到。
實驗者還會知道奈米抗體(包括其類似物)也可以藉由改變一個以上該人類VH區氨基酸序列之氨基酸殘基，從人類的VH序列(即氨基酸序列或對應的核苷酸序列)開始而製備，像是DP-47,DP-51,DP-54或DP-29這樣的人類VH3序列，以提供(a)在108位有Q的氨基酸序列；及/或(b)在44位有E及/或45位有R，而以44位有E及45位有R較佳；及/或(c)103位有P,R或S，如上述。這一般可以用前面段落中提到的不同方法與技術進行，並以某人類VH區的氨基酸序列及/或核苷酸序列當作起始點。
此處用的奈米抗體一詞，廣義來說也可包含前面定義的本案中奈米抗體(包括類似物)之部分或片段，這個下文還會提到。
與對應的全長奈米抗體或類似物之氨基酸序列相比，通常奈米抗體及/或類似物之部分或片段，會在N端一個以上的氨基酸殘基、C端一個以上的氨基酸殘基、一個以上相連的內部氨基酸殘基，或是任何組合裡，發生刪除及/或移除氨基酸序列。也可以結合一個以上的該部份或片段以提供本案中的奈米抗體。
含有全長奈米抗體及/或類似物一個以上部份或片段的奈米抗體之氨基酸序列，與對應的全長奈米抗體的氨基酸序列相比，其序列一致性程度起碼應為50%，再好些到起碼60%，甚至到起碼70%，像是起碼達80%、起碼90%或起碼95%。
而含有全長奈米抗體及/或類似物一個以上部份或片段的奈米抗體之氨基酸序列，應該包含對應的全長奈米抗體的氨基酸序列之起碼10個相鄰的氨基酸殘基，較佳的是起碼20個相鄰的氨基酸殘基，甚至起碼30個相鄰的氨基酸殘基，像是起碼40個相鄰的氨基酸殘基。
通常，本案中奈米抗體之部分或片段與本案中對應的全長奈米抗體之氨基酸序列相比，會在N端一個以上的氨基酸殘基、C端一個以上的氨基酸殘基、一個以上相連的內部氨基酸殘基，或是任何組合裡，發生刪除及/或移除氨基酸序列。也可以結合一個以上的該部份或片段以提供本案中的奈米抗體。
根據一重要實例，此處用的片段包含全尺寸本案中奈米抗體的一個以上之CDR，全尺寸本案中奈米抗體的二個以上之CDR更好，甚至是起碼全尺寸本案中奈米抗體中的CDR2及CDR3，像是全尺寸本案中奈米抗體中的全部三個CDR。
根據另一項很重要但未限定的實例，這類起碼包含全長之本案
中奈米抗體的FR3,CDR3及FR4之部分或片段，即WO 03/050531(Lasters et al.)的世界性應用中所述。這樣的部份或片段應能使它們仍有親和力及/或專一性而可以結合於TNF-α，即其親和力及/或專一性對相對的全長之本案中奈米抗體親和力及/或專一性起碼達10%，較佳的為50%，再好些到起碼70%甚至到起碼80%，像是起碼達90%、起碼95%、起碼99%或更高，例如測定結合於TNF類似物的分析，特別是一種用於下面例子中的方法。
從上述中可知此處用的奈米抗體之氨基酸序列，跟天然VH區氨基酸序列的一個以上骨架區域中之一個以上氨基酸位置不同，諸如人類抗體的天然VH區之氨基酸序列。特別是可知此處用的奈米抗體之氨基酸序列，跟天然VH區之氨基酸序列的一個以上驗證殘基不同，諸如駱駝及/或人類抗體抗體的天然VH區之氨基酸序列。
因此，根據某特定實例，本案中的奈米抗體具有異於天然VH區之氨基酸序列裡某骨架區域中一個以上氨基酸位置的氨基酸序列。根據更專一但未限定的本案實例，本案中的奈米抗體具有異於天然VH區之氨基酸序列裡一個以上驗證殘基的氨基酸序列。
從上述可知某些像本案中人體化抗體這樣的本案中氨基酸序列，會異於天然VHH區之氨基酸序列裡一個以上骨架區域(即位於驗證殘基或另一位置)中一個以上氨基酸序列。因此，根據某專一但未限定的本案實例，本案中奈米抗體具有某氨基酸序列，異於天然VHH區之氨基酸序列裡一個骨架區域中一個以上的氨基酸序列。根據更專一但未限定的本案實例，本案中奈米抗體具有某氨基酸序列，異於天然VHH區之氨基酸序列裡一個以上的驗證殘基。
廣義來說，此本案包含本案中奈米抗體的衍生物。這類衍生物
一般可以由本案的奈米抗體及/或本案的奈米抗體中之一個以上氨基酸序列修飾而得，特別是藉由化學及/或生物(例如酵素)修飾。
這些修飾的例子如奈米抗體序列內的氨基酸殘基，可以在該條件(即在蛋白質骨幹上，而在支鏈上較佳)、方法及技術方面以用來提供該修飾及可能的用途與優點，實驗者將會知道這些修飾。
例如，該修飾可能包含加入(例如藉由共價連結或其他合適物質)一個以上的官能基、殘基或局部至本案中奈米抗體，特別是一個以上可以提供起碼一樣理想性質或功能於本案中奈米抗體的官能基、殘基或局部。實驗者將會知道這些官能基的例子。
例如，這類修飾可能包含加入(例如藉由共價連結或其他合適物質)一個以上可延長本案中奈米抗體之半生期、溶解度及/或吸收度的官能基，因而降低本案中奈米抗體的免疫性及/或毒性，減少或減緩任何本案中奈米抗體的非預期副作用，及/或提供本案中奈米抗體及/或聚胜肽的其他優良性質及/或降低其非預期性質；或任何兩個以上前述的組合。實驗者會知道提供這類官能基與技術的例子，一般會包含前面的基本背景理論中提及之所有官能基與技術，連同用於醫藥蛋白質修飾之本身已知的官能基與技術，特別是抗體或抗體片段的修飾(包括ScFv及單一區抗體)，相關文獻可參見Remington's Pharmaceutical Sciences,16th ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA(1980)。這類官能基可能會直接連結(如共價)於本案中的奈米抗體，或是透過合適連結而選擇性地連結，這些實驗者也會知道。
對醫藥蛋白質要延長半生期及/或降低免疫性，最常用的技術之一為提供聚乙二醇(PEG)或其衍生物(像甲氧聚乙二醇或mPEG)等合適的藥理可用高分子。通常任何合適的接上PEG形式皆可用，像是對於抗體及抗體片段的理論PEG用法(包括但不限於(單一)區及
ScFv的抗體)；參考資料有Chapman,Nat.Biotechnol.,54,531-545(2002)；Veronese and Harris,Adv.Drug Deliv.Rev.54,453-456(2003)，Harris and Chess,Nat.Rev.Drug.Discov.,2,(2003)與WO 04/060965。也可買到不同的蛋白質接上PEG試劑，像是購自Nektar Therapeutics,USA。
位置導向以接上PEG較為常用，特別是透過半胱氨酸殘基(參見Yang et al.,Protein Engineering,16,10,761-770(2003)的例子)。為了此目的，PEG可接在天然的本案中奈米抗體之半胱氨酸殘基上，本案中奈米抗體可能經修飾而已適當地加入一個以上的半胱氨酸殘基以接上PEG，或是包含一個以上半胱氨酸殘基以接上PEG的氨基酸序列可能會與本案中奈米抗體之N及/或C端連在一起，所有這些使用的本身已知之蛋白質工程技術，實驗者都會知道。
針對本案中的奈米抗體和蛋白質，會使用分子量大於5000讀PEG，像是介於10,000到200,000，還有低於100,000的；例如在20,000-80,000的範圍內。
為了接上PEG，應注意一般的本案也包含任何本案中的奈米抗體及/或本案中的聚胜肽，它們一個以上的氨基酸位置是已接上PEG的，尤其是接PEG之後會(1)增長體內半生期；(2)降低免疫性；(3)因為本身接上PEG而增加一個以上更多的有利性質；(4)本質上不會影響對抗TNF-α的奈米抗體及/或聚胜肽之親和力(例如用下文中提到的例子進行合適的分析測量，而不會降低該親和力之幅度低於90%，較佳的低於50%，甚至低於10%)；及/或(4)不會影響任何本案中的奈米抗體及/或本案中的聚胜肽之其他預期性質。不論專一或非專一，實驗者將會知道合適的PEG基團及連接它們的方法。用於接PEG的合適實驗組件及試劑可以購自Nektar(CA,USA)。
另外，通常包含像是共轉譯及/或後轉譯修飾的部份之N或O連結糖化的修飾較為少見，這個視用來表現本案中奈米抗體或聚胜肽的宿主細胞而定。
然而另外的修飾可能含有一個以上可刪除的標記或其他產生訊息的基團或局部，視被標記的奈米抗體之用意而定。實驗者將會知道用來連結、使用及刪除它們的合適標記與技術，不限定的例子有螢光標記(像是fluorescein,isothiocyanate,rhodamine,phycoerythrin,phycocyanin,allophycocyanin,o-phthaldehyde，及fluorescamine和螢光金屬，例如152Eu或其他鑭系的金屬)、磷光標記化學發光標記或生物發光標記(像是luminal,isoluminol,theromatic acridinium ester,imidazole,acridinium鹽，oxalate酯，dioxetane或GFP及其類似物)、放射性同位素(像是3H,125I,32P,35S,14C,51Cr,36Cl,57Co,58Co,59Fe，及75Se)、金屬、金屬螯合物或金屬陽離子(例如99mTc,123I,111In,131I,97Ru,67Cu,67Ga，及68Ga的金屬陽離子)，或是其他特別適合於體內、體外或預先診斷及照影使用的金屬或金屬陽離子，像是(157Gd,55Mn,162Dy,52Cr，及56Fe)，就如同發光團和酵素(像是金屬脫氫酵素、葡萄球菌核酸酵素、delta-V-固醇異構酵素、酵母菌醇類脫氫酵素、α-甘油磷酸鹽脫氧酵素、磷酸丙糖異構酵素、抗生物素蛋白過氧化酵素、山葵過氧化酵素、鹼性磷酸酵素、天門冬素、葡萄糖氧化酵素、β-乳醣水解酵素、核糖酸水解酵素、尿素酵素、過氧化氫酵素、葡萄糖-VI-磷酸脫氫酵素、糖化酵素及乙醯膽鹼酯解酵素)。實驗者將會知道其他的合適標記，並包括可以用NMR或ESR光譜測得的局部。
這類被標記的本案中奈米抗體與聚胜肽可能用於體內、體外或預先分析(包括本身已知的免疫分析法，如ELISA,RIA,EIA及其他「三明治分析」等)，就像體內的診斷及照影目的，視特定標記的選
擇而定。
實驗者將會知道，另外的修飾可能包含加入螯合基團，例如可捕捉上述的金屬或金屬陽離子。不設限時，合適的螯合基團包括diethyl-enetriaminepentaacetic acid(DTPA)或ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)。
另外的修飾可能包含加入官能基，它可以是特定結合配對的一部份，像是生物素-鏈霉素的結合配對。該官能基可能用在將本案中的奈米抗體接上別的連結於結合配對之另一半的蛋白質、聚胜肽或化學化合物，即藉由結合配對的形成。例如，本案中的奈米抗體可能與生物素共軛，並連結於另外共軛於抗生物素或鏈霉素的蛋白質、聚胜肽、化合物或載體。例如，該共軛奈米抗體就當作受器，用於在可偵測的訊號生成劑共軛於抗生物素或鏈霉素時的診斷系統。這類結合配對也可以用來結合本案中奈米抗體與載體，包括適於醫藥用途的載體。有項未限定的例子是Cao and Suresh,Journal of Drug Targetting,8,4,257(2000)中所描述的微脂體劑型。該結合配對也可用於連結治療用的藥物與本案中之奈米抗體。
針對某些應用，特別是在那些預期會殺死細胞的用途中，而該細胞會表現出對抗被引導的本案中奈米抗體之目標(例如癌症治療)，或是降低或減緩該細胞的生長及/或增生，本案中的奈米抗體還可能接在某毒素或毒性殘基或部位上。實驗者將會知道，可連結到本案中之奈米抗體的毒性部位、化合物或殘基以形成細胞毒殺化合物的例子，這些也可在前述的學理之前及/或下文敘述中找到。有個例子是所謂的ADEPTTM技術WO 03/055527。
實驗者還會知道其他有可能的化學與酵素修飾。這些修飾可能因為其他目的而使用(例如探討功能-活性關係)。文獻可參考
Lundblad and Bradshaw,Biotechnol.Appl.Biochem.,26,143-151(1997)。
如前述，此本案也包括含有一個以上V
HH
區(即用本案之方法所確認)或一個以上源於奈米抗體的蛋白質或聚胜肽。
根據某未限定的本案中奈米抗體，該本案中聚胜肽本質上含有奈米抗體。而「本質上含有」表示該本案中聚胜肽的氨基酸序列，跟奈米抗體的氨基酸酸序列(如上述)在一定數量的氨基酸殘基上完全相同或相對應，像是1-10個氨基酸殘基及更好的1-6個氨基酸殘基，如1,2,3,4,5或6個氨基酸殘基，已被接於氨基端、酸基端，或是奈米抗體的氨基酸序列之兩端。
該氨基酸殘基改變、替換或是要影響奈米抗體的(生物)性質與否皆有可能，增加奈米抗體的進階功能與否也有可能。例如，該氨基酸序列：
a)可包含N端的Met殘基，例如在異源宿主細胞或宿主組織中的表現情形。
b)可能形成訊息序列或領導序列，以導引奈米抗體從宿主細胞經合成而分泌。實驗者將會知道適當的引導聚胜肽，下文可能會提到。通常該引導序列會連接到奈米抗體的N端，即便是廣義的本案並沒有因而設限；
c)可形成某序列，以容許奈米抗體被用來針對及/或穿透或進入特定器官、組織、細胞或部位或細胞區隔，及/或容許奈米抗體穿透或穿越生物障蔽，像是細胞膜、如表皮細胞這樣的細胞層、包含固態瘤這樣的癌，或是血腦障蔽。實驗者將會知道這類氨基酸序列的例子。某些未限定的例子有WO 03/026700及Temsamani et al.,Expert Opin.Biol.Ther.,1,773(2001)中所述的小型胜肽載體
(「Pep-trans載體」)；Temsamani and Vidal,Drug Discov.Today,9,1012(004)及Rousselle,J.Pharmacol.Exp.Ther.,296,124-131(2001)，與Zhao et al.,Apoptosis,8,631-637(2003)所述的膜轉移序列。抗體片段的C端與N端氨基酸序列之分子間定位則描述於Cardinale et al.,Methods,34,171(2004)。其他合適的分子間定位技術包含該含有下文中的本案中奈米抗體之「胞內抗體」的表現及/或用途；
d)可能形成「親和系統」，例如可容許或促進奈米抗體純化之氨基酸序列或殘基，就像使用對抗該序列或殘基的親和力技術。此後，該序列或殘基可能會被移除(例如透過化學或酵素裂解)以得到奈米抗體序列(針對此目的，該親合系統可能透過可斷裂的連結序列或包含可裂解的部份，而被選擇性連結到奈米抗體序列上)。某些較佳但未限定的該序列例子為多組氨酸殘基、麩氨基硫殘基及AAAEQKLISEEDLNGAA[序列編碼：31]這樣的myc-tag；
e)可能為一個以上已被功能化及/或可當作官能基附加位的氨基酸序列。實驗這將會知道合適的氨基酸殘基及官能基，並涵蓋但不限於此處為了本案中奈米抗體之衍生物的氨基酸殘基及官能基。
根據另一項實例，有種本案中的聚胜肽包含本案中奈米抗體的，該抗體在其氨基端、酸基端或兩端融合在一起，並在其酸基端與起碼一個的進階氨基酸序列融合，即用以提供包含該本案中奈米抗體及一個以上進階氨基酸序列的相連蛋白質。這樣的融合可參照此處的「奈米抗體融合」。
一個以上的進階氨基酸序列可能為合適的及/或預期的氨基酸序列。進階氨基酸序列改變、替換或是要影響奈米抗體的(生物)性質
與否皆有可能，增加奈米抗體或聚胜肽的進階功能與否也有可能。甚至，進階氨基酸序列就表示它提供給本案中一奈米抗體或聚胜肽一個以上的理想性質或功能性。
本案者將會知道這些氨基酸序列的例子，起這些例子通常可能包含所有根據傳統抗體與片段而用於胜肽融合的氨基酸序列(包括但不限於ScFv與單一的區抗體)。Holliger and Hudson,Nature Biotechnology,23,9,1126-1136(2005)有提出回顧的文獻。
例如，與本案中奈米抗體本身比較起來，該氨基酸序列對本案中聚胜肽可能會延長半生期、溶解度或吸收性，降低免疫性或毒性，消除或緩和不預期的副作用，及/或提供其他優良性質及/或不預期的性質。某些該氨基酸序列的未限定實例有人類寫清白蛋白之類的血清蛋白質(參見WO 00/27435的例子)或附著分子(例如由循環抗體所辨認的半抗原，可見WO 98/22141的例子)。
進接氨基酸序列可能提供第二結合位，該結合位可能用於對抗任何預期的蛋白質、聚胜肽、抗原、抗原決定基或抗原表位(包括但不限於相同蛋白質、聚胜肽、抗原、抗原決定基或抗原表位以對抗被定位的本案中奈米抗體，或不同的蛋白質、聚胜肽、抗原、抗原決定基或抗原表位)。例如，進階氨基酸序列可能提供第二結合位，以用來對抗血清蛋白質(像是人類血清白蛋白或另外如IgG的血清蛋白質)，以延長血清的半生期。參考實例有EP 0 368 684,WO 91/01743,WO 01/45746及WO 04/003019(其中已提過不同的血清蛋白質)，如同Harmsen et al.,Vaccine,23(41)；4926-42，即為申請人在世界性應用中的標題「對抗包含相同組成之乙型-澱粉樣蛋白與及聚胜肽的奈米抗體TM，以用於治療像是阿茲海默症這類的神經退化症」(其中提到不同的其他蛋白質)。
根據另外的實例，一個以上氨基酸序列可能包含一個以上4鏈抗體(特別是人類抗體)的部份、片段或區域及/或重鏈抗體。例如，雖然一般較少提到，本案中奈米抗體可能透過連結序列(包括但不限於其他(單一)區域奈米抗體，像是Ward et al.描述的dAb’s)選擇性地連結到傳統(人類為佳)的VH或VL區，或是天然或合成的VH或VL區類似物。
起碼一個奈米抗體可能透過連結序列選擇性地連結到一個以上(以人類為佳)的CH1,CH2及/或CH3區。例如連結到合適CH1區的奈米抗體可被用來-與合適的輕鏈-產生抗體片段/結構類似物到傳統Fab片段或F(ab’)2片段，但其中一個(在F(ab’)2片段的情形)或傳統VH區的一個或兩者都被本案中奈米抗體給置換。同時，兩個奈米抗體可以連結到C H3區(選擇性透過連結)以提供有較長體內半生期的組成。
根據的某特定實例，一個以上的本案中奈米抗體可能連結到一個以上的抗體部份、片段或區域，提供了本案中聚胜肽一個以上有影響力的功能，及/或可能提供連結到一個以上Fc受器的能力。例如為了此目的而不受限的情形，一個以上進階氨基酸序列可能從重鏈抗體(如此述)甚至從傳統的人類4鏈抗體而包含抗體一個以上的CH2及/或CH3區，及/或可能，如從IgG、IgE或另外的人類Ig形成Fc區域(的部份)。例如WO 94/04678描述了包含駱駝VHH區重鏈抗體或人體化衍生物(如奈米抗體)，其中駱駝CH2及/或CH3區已被人類CH2及CH3區所置換，而能提供含兩個重鏈的免疫球蛋白，其中每個蛋白包含一奈米抗體及人類CH2與CH3區(但非CH1區)，免疫球蛋白藉CH2及CH3區得到了有影響的功能，而在無輕鏈存在時免疫球蛋白仍可運作。實驗者會知道其他可以上當連結到本案中奈米抗體而提供
有影響的功能之氨基酸序列，該序列可能依照理想的影響功能而選擇。可參考Holliger and Hudson,supra所回顧的WO 04/058820,WO 99/42077及WO 05/01714。與對應的本案中奈米抗體比較起來，本案中奈米抗體與Fc部份的耦合也可能延長半生期。對於某些應用來說，可以延長半生期而不會有生物方面影響的Fc部份及/或固定區域(例如CH2及/或CH3區)的應用可能很適合或更好。實驗者將會知道其他包含一個以上奈米抗體及一個以上能延長你內半生期的固定區域之合適組成，它們也可能包含兩個透過連結序列選擇性地連結到CH3區的奈米抗體。通常任何的融合蛋白質或具有延長半生期的衍生物，分子量會大於50 kD，這是腎臟吸收的截取值。
進階氨基酸序列可能形成訊息序列或引導序列，可導引本案中奈米抗體或聚胜肽從宿主細胞透過合成的分泌(例如生成本案中聚胜肽的前、後或預後的形式，視用來表現本案中聚胜肽的宿主細胞而定)。
進階氨基酸序列可能形成序列或訊息以讓本案中奈米抗體或聚胜肽用來針對及或透過或進入特定器官、組織、細胞，或部份或細胞區隔，及/或讓本案中奈米抗體或聚胜肽穿透或穿越生物障蔽，像是細胞膜、如表皮細胞這樣的細胞層、包含固態瘤這樣的癌，或是血腦障蔽。實驗者將會知道該氨基酸序列的適當例子，並包括但不限於前述的「Peptrans」載體，Cardinale et al.所述的序列及本身已知的氨基酸序列及抗體片段，即所謂的「胞內抗體」可用來表現或製造本案中奈米抗體或聚胜肽，例如描述於WO 94/02610,WO 95/22618,US-A-7004940,WO 03/014960,WO 99/07414；WO 05/01690；EP 1 512 696；及Cattaneo,A.& Biocca,S.(1997)分子間抗體：本案與應用。Landes及Springer-Verlag；以及Kontermann,Methods 34,(2004),163-170，還有
此處的更多文獻。
對某些應用來說，特別是那些用來殺掉會表現出對抗受導引的本案中奈米抗體標的之細胞(例如癌症治療)，或是降低或減緩該細胞的生長及/或增生，本案中奈米抗體也可能連結於(細胞)毒性蛋白或聚胜肽。可連結到本案中奈米抗體的毒性蛋白與聚胜肽提供了本案中的毒性聚胜肽，並會被實驗者所熟知，也可在前面的理論及/或下文中尋得。有個例子稱為ADEPTTM技術WO 03/055527。
根據一項未限定的實例，一個以上的氨基酸序列可以加到、插入及/或取代於本案中奈米抗體或聚胜肽的氨基酸序列，以提供一個以上特定的氨基酸序列來附著於PEG基團上。
蛋白質藥物的效力決定於它調和標的物的能力，但也要看有效藥物本身的藥動性質。因為通常腎臟會濾掉低於60,000道爾吞(Da)的分子，要降低此清除率則要透過蛋白質融合、糖化或以聚乙二醇高分子PEG化(Lee et al.,1999；Abuchowski et al.,1977；Nucci et al.,1991；Lecolley,et al.Chem Commun,2004；Tao et al.,J Am Chem Soc,2004；Mantovani et al.,2005)來提高生物藥物的分子量(Syed et al.,1997)。這些方法成功地增加生物藥物在體內的表現。
另外，用其他的PEG化試劑可以延長半生期，像是與兩價奈米抗體共軛的POLY PEG、TNF56或TNF55。POLY PEG為蜂巢狀的高分子，在其甲基丙烯骨架上帶有PEG的齒突。POLY PEG可以在PEG鏈上、甲基丙烯骨架上及決定POLY PEG共軛於奈米抗體的的方法之活性終端基上，變化不同長度。在奈米抗體中C端半胱氨酸之位置特定共軛可以藉由POLY PEG中的活性馬來硫亞氨終端基來達成。
此本案亦包含任何本案中奈米抗體及/或一個以上氨基酸位置已被糖化的本案中聚胜肽，通常決定於用來表現本案中奈米抗體或聚胜
肽的宿主(如下文敘述)。
根據一項未限定的實例，一個以上的氨基酸殘基可以加到、插入及/或取代於本案中奈米抗體或聚胜肽的氨基酸序列，以提供一個以上的特定氨基酸殘基及/或能夠讓選用的宿主進行糖化之位置。一項重要但未限定的例子為本案中奈米抗體CDR2之50位上的N殘基可以被Q、D或S殘基置換，以提供一個糖化位置，例如酵母菌的糖化。
根據另一實例，本案中聚胜肽可包含氨基端、酸基端或兩端起碼有一個進階氨基酸序列被融合的奈米抗體之氨基酸序列。
再者，所謂的氨基酸序列改變、替換或是影響奈米抗體的(生物)性質與否皆有可能，增加抗體的進階功能與否也有可能。
例如根據一項重要但未限定的實例，所謂的進階氨基酸序列可能包含一個以上的進階奈米抗體，以提供包含像兩個以上、三個、四個或五個奈米抗體的本案中聚胜肽，其中該奈米抗體可能選擇性地透過一個以上連結序列而相連(如此處定義)。
包含兩個以上奈米抗體的本案中聚胜肽亦可稱作「多價」聚胜肽。例如本案中的「兩價」聚胜肽包含兩個奈米抗體，選擇性地透過連結序列而相連，其中本案中的「三價」聚胜肽包含了三個奈米抗體，選擇性地透過兩個連結序列而相連；等等。
在多價本案中聚胜肽裡，兩個以上的奈米抗體可能相同或相異。例如在多價本案中聚胜肽裡，兩個以上的奈米抗體：- 可能用來對抗相同抗原，即對抗相同的該抗原之部分或抗原表位，或是對抗兩個以上不同的該抗原之部分或抗原表位；及/或：- 可能用來對抗相異抗原；或是關係到一種組合。
因此，兩價的本案中聚胜肽如：- 可能包含兩個同等的奈米抗體；- 可能包含用來對抗某抗原之第一部份或抗原表位之第一奈米抗體，及用來對抗該抗原之相同相同部份或抗原表位或對抗該抗原之另一部份或抗原表位之第二奈米抗體；- 或可能包含用來對抗第一抗原之第一奈米抗體，及用來對抗與該第一抗原不同之第二抗原的第二奈米抗體；其中本案中的三價聚胜肽如：- 可能包含三個等同或不同的用來對抗相同抗原之相同或不同部份或抗原表位之奈米抗體；- 可能包含兩個等同或不同的在第一抗原上用來對抗相同或不同部份或抗原表位之奈米抗體，及在用來對抗異於該第一抗原之第二抗原的第三奈米抗體；或- 可能包含用來對抗第一抗原之第一奈米抗體，及用來對抗與該第一抗原不同之第二抗原的第二奈米抗體，及用來對抗與該第一抗原和第二抗原接不同的第三抗原之的第三奈米抗體。
包含兩個以上奈米抗體的本案中聚胜肽，其中一個以上的奈米抗體被用來對抗第一抗原，一個以上的奈米抗體被用來對抗異於第一抗原的第二抗原，可參考「多價」奈米抗體。因此，「雙專一性」的奈米抗體包含一個以上用來對抗第一抗原的奈米抗體及一個以上用來對抗第二抗原的進階奈米抗體，其中「三專一性」的奈米抗體包含一個以上用來對抗第一抗原的奈米抗體，一個以上用來對抗第二抗原的進階奈米抗體，及一個以上用來對抗第三抗原的進階奈米抗體；等等。
據此，本案中雙專一性聚胜肽的最簡單形式為兩價的本案中聚胜肽(如此處定義)，包含一個用來對抗第一抗原的奈米抗體及一個
以上用來對抗第二抗原的第二奈米抗體，其中所謂的第一及第二奈米抗體可能透過連結序列選擇性地相連(如此處定義)；其中三專一性本案中聚胜肽的最簡單形式為三價本案中聚胜肽(如此處定義)，包含用來對抗第一抗原的第一奈米抗體，用來對抗第二抗原的第二奈米抗體，及用來對抗第三抗原的第三奈米抗體，其中該第一、第二及第三、奈米抗體可能夠過一個以上，好的一個、更好是兩個連結序列而選擇性地相連。
然而，如此處描述所示，本案雖未受限，多專一性本案中聚胜肽可能包含任何數量用來對抗兩個以上不同抗原的奈米抗體。
對包含一個以上VHH區的多價或多專一性聚胜肽及其製備來說，可參考Conrath et al.,J.Biol.Chem.,Vol.276,10.7346-7350，以及EP 0 822 985。
在本案中聚胜肽裡，一個以上的奈米抗體及一個以上聚胜肽可能直接相連(如WO 99/23221中描述的例子)及/或夠過一個以上適當連結或任何組合而相連。
實驗者將會知道多價與多專一性聚胜肽之可用的適當連結，通常還可能為理論中用來連結氨基酸序列的任何連結。較佳的是，該連結適用於建構用作醫藥功能之蛋白質或聚胜肽。
有些格外重要的連結包括理論上用來連結抗體片段或抗體區域的連結。這些包括前述的一般背景中之連結，以及用於建構二元體或ScFv片段之連結(然而，這方面應注意在二元體及ScFv片段之中，使用的連結序列應有足夠長度、彈性及其他性質以讓相關的VH及VL區結合而形成完整的抗原結合位，本案中聚胜肽所使用的連結不限長度或彈性，因為每個奈米抗體本身會形成完整的抗原結合位)。
其他合適的連結通常包含有機化合物或高分子，特別是那些適
用於醫藥用途的」蛋白質。例如聚乙二醇部位已被用來連結抗體區域，可參見WO 04/081026。
本案還包括所用的連結提供了一個以上對本案中聚胜肽其他的有利性質或功能性，及/或提供一個以上衍生物的形成位置，及/或讓官能基附著(例如此處所述的本案中奈米抗體之衍生物)。例如，包含一個以上帶電氨基酸殘基的連結(見上表A-3)可以提供較高的親水性，其中會形成或包含小抗原表位或親合系統的連結可用來偵測、確認及/或純化。同時，根據此處所示，實驗者將可以選擇性地在某些受限的例行實驗後，決定用於特定本案中聚胜肽的最佳連結。
最後，當兩個以上的連結用於本案中聚胜肽時，這些連結可能相同或相異。再者，根據此處所示，實驗者將可以選擇性地在某些受限的例行實驗後，決定用於特定本案中聚胜肽的最佳連結。
實驗者將會知道用於多價及多專一性聚胜肽中的連結，包括像是(glyxsery)z這類的gly-ser連結，如(WO 99/42077中所描述的(gly4ser)3或(gly3ser2)3像是天然重鏈抗體或類似序列的樞紐區之類似樞紐的區域)。關於其他合適的連結，已在上述的一般背景理論中。某些特別重要的連結則在序列編碼68及69中。
連結可以對多價或多專一性聚胜肽提供某些功能性。例如，包含一個以上帶電氨基酸殘基的連結(見上表1)就可以提供更高的親水性，其中形成或包含小抗原表位或親和系統的連結，則可以用於偵測、確認及/或純化
如此處所提，在本案中蛋白質或聚胜肽裡，所提到的抗TNF之奈米抗體傾向於透過結合到TNF三聚體的方式連結，該蛋白質或聚胜肽對於所謂TNF三聚體調控的交聯，及/或這類受器交聯調控的訊息傳遞，能夠抑制或降低TNF受器之交聯；及/或在TNF三聚體上，該蛋白
質或聚胜肽可以於起碼兩個TNF受器結合位之間控制分子間結合。合適的連結如此處所述。
如所示，不論該蛋白質或聚胜肽帶來分子內結合或分子外結合，均可以藉由分子大小排斥層析加以評估(起碼在初期)。藉由分子大小排斥層析，TNF-α與抗體的錯合物可以藉分析來確定抗體與TNF-α在錯合物中的數目與比例。從此數據可以推斷是否發生了分子內或分子間結合，如Santora與同伴們(Santora,L.C.,et al,Anal Biochem.2001)所做的，以用來建立單株抗體D2E7(Humira)對TNF-α在不同比例的抗體與標的下之結合統計。從錯合物的分子量可以歸納出三個帶有三個TNF三聚體的抗體分子，因而得知該抗體在分子間模式裡結合。類似的實驗用了兩價奈米抗體進行，其中不同型式的連結促使了由分子內鍵結而得到的大分子錯合物形成。然而，從膠體過濾管柱中流出的具有較長連結之相同的兩價奈米抗體組成像是分離的小錯合物，會表現出分子間鍵結。與生物分析數據併看，其中含奈米抗體TNF1的較長連結具有最佳的效力(分析中用來完全中和TNF之數量，即10 pM)，可以歸納出兩價奈米抗體的分子間結合，有效地抑制兩細胞連結之受器的交聯與聚合受器的活化。像是Humira或Remicade等已知的單珠抗體無法形成這樣的分子間鍵結，總是讓三聚體TNF分子上的兩受器結合位有一定程度能讓細胞連結之受器互相作用，這個可以轉錄為生物分析中所測得的較無效中和。
另外，蛋白質或聚胜肽提供了分子內結合或分子外結合與否，都可以由層析法及/或分子模擬(或其他合適的電腦化技術)測得。三聚體TNF30/TNF-α錯合物的模型是根據單體原生型TNF1/TNF-α錯合物的結晶結構而得。由此結構，模擬了TNF30-連結-ALB8-連結-TNF30的組成。模擬TNF30-連結-ALB8-連結-TNF30的組成是由帶有
兩個TNF30分子鍵結的TNFα三聚體開始。因為不知道ALB8的結構，便改用第三個TNF30分子代替，它是在沿著介於N與C端線上的其他兩個奈米抗體之間被置換。9個氨基酸的連結則是後來動手加上去的。
此模型如圖62中所示。9個氨基酸清楚地跟ALB8連結在一起，在兩個連結到TNFα的TNF30區之間，提供了可開展大約66 Å的廣大空間。ALB8本身就開展了40 Å，每個連結於完全延展的構形中可再開展~27 Å。於是，ALB8有足夠的能力可移動，而它與白蛋白的結合也應該不會對它與TNFα的結合產生太大影響。
再者，縮短它的連結並不會影響活性，特別是該連結為ALB8的C端。透過與三聚體的交聯提高結合於相同的TNFα三聚體會有助益，因為第二個TNF30與不同TNFα聚合的可能性隨著連結長度而增加。
如後敘所提，多專一性用來對抗預期抗原、對抗一個以上下文會提到的血清蛋白、特別是對抗人類血清白蛋白之本案中聚胜肽，與對應的單價奈米抗體相比，可能在血清中會有較長的半生期。
如上文所提，此處的方法特別適用於生成這類多專一性的本案中多價聚胜肽。
在本案中聚胜肽裡，一個以上的奈米抗體可能透過一段連結序列連結於傳統VH區或天然或合成的VH區類似物。
在本案中聚胜肽裡，一個以上的奈米抗體可能透過一段連結序列連結於傳統VL區或天然或合成的VL區類似物，以提供類似於傳統scFv片段的本案中聚胜肽形式，但包含的是奈米抗體而非VH區。
在本案中聚胜肽裡起碼一個奈米抗體可能會透過連結序列選擇性地連結於一個以上的CH1,CH2及/或CH3區。例如連結到合適CH1區的奈米抗體可被用來-連同合適的輕鏈-生成與傳統Fab片段
或F(ab’)2片段類似的抗體片段/結構，但其中一個(假使為F(ab’)2片段)或傳統VH區的一個或兩個已被奈米抗體給置換。這類的片段可能為異專一性或雙專一性，即用來對抗兩個以上抗原。例如從駱駝所衍生出連結到合適CH2及CH3區的奈米抗體可能用於形成單專一性或雙專一性的重鏈抗體。最終，例如衍生自人類而連結到合適CH1、CH2及CH3區的奈米抗體可被用來-連同合適的輕鏈-形成類似於傳統4鏈抗體的抗體，但其中一個或兩個傳統VH區已被奈米抗體給置換。
同時，在一個以上的奈米抗體之外，本案中聚胜肽可能含有像是具療效的官能基、部位或殘基等組成，這些下文會提到，及/或記號或標記，像是螢光標記、同位素等等，下面會進一步加以描述。
本案中奈米抗體、本案中聚胜肽及決定相同組成的核酸，均可以在本身已知的條件下製備，這些實驗者可以從下文敘述中得知。某些重要但未限定的製備奈米抗體、聚胜肽及核酸之方法包括上述及/或下面會描述的方法及技術。
如實驗者所知，某個特別有用的製備本案中奈米抗體及/或聚胜肽之方法通常包含這些步驟：- 在合適的宿主細胞或宿主組織(此處稱「本案中之宿主」)或另外決定本案中奈米抗體或聚胜肽之合適核酸的表現系統(此處稱「本案中之核酸」)，選擇性地隨著：- 單離及/或純化因而得到的本案中奈米抗體或聚胜肽。
特別是該方法可能包含的步驟：- 在該本案中宿主表現及/或生成一個以上的本案中奈米抗體或聚胜肽之條件下，培養及/或維持本案中宿主；選擇性地隨著：- 單離及/或純化因而得到的本案中奈米抗體或聚胜肽。
本案中核酸可以為單股或雙股DNA或RNA的形式，並以雙股DNA較佳。例如本案中核苷酸序列可能為基因體DNA、cDNA或合成的DNA(像是有使用已被特別用來表現於預期的宿主細胞或宿主組織之密碼子)。
根據某本案中的實例，本案中核酸本質上為單離的形式，如上述的定義。
本案中核酸可能出現於及/或為載體的一部份，並為質體、黏質體或YAC的形式，且本質上為單離的形式。
根據此處的本案中聚胜肽之氨基酸序列資訊，本案中核酸可以由本身已知的條件製得，及/或可由合適的天然來源中單離出來。決定天然VHH區的核酸可以藉由定點突變以提供類似物，所以要提供決定該類似物的本案中奈米抗體。實驗者也會知道，為製備本案中核酸，以及像是能決定奈米抗體的一個以上之核苷酸序列的數種核苷酸序列，還有決定一個以上連結的核酸，可以在合適的條件中連結在一起。
實驗者將會知道用來產生本案中核酸的技術，還在未限定下可能包含自動化DNA合成；定點突變；結合兩個以上天然及/或合成序列(或兩個以上部份)，加入可帶來縮短的表現產物之突變；加入一個以上限制位(例如使用合適的限制酵素創造可能易於設計及/或連接的卡匣及/或區域)，及/或使用一個以上「錯配」引子而藉由PCR反應加入突變，例如可以用天然的GPCR序列當作模版。
本案中核酸可能在某基因組成存在及/或為它的一部份時形成該形式，實驗者將會從理論中知道此事。該基因組成通常包含一個以上選擇性地連結於一個以上已知的基因組成本身之成分的本案中核酸，如一個以上合適的調控因子(像是合適的啟動子、增強子、終結子
等)及下文提到的進階基因組成之成分。這類基因組成包含了至少一個本案中核酸，此處稱「本案中的基因組成」。
本案中基因組成可能為DNA或RNA，並以雙股DNA較佳。本案中基因組成也可能為適於預期之宿主細胞或宿主組織變化的形式，適於預期之宿主細胞的基因體DNA整合的形式，或是適於預期之宿主組織中獨立複製、維持及/或遺傳的形式。例如本案中基因組成可能為載體形式，像是質體、黏質體、YAC、病毒載體或轉位子。特別是該載體可能為表現載體，即可提供體外及/或體內表現的載體(例如在合適的宿主細胞、宿主組織及/或表現系統中)。
在某個重要但未限定的實例中，本案中基因組成包含a)至少一個本案中核酸；可手動連結於b)一個以上的調控因子，像是啟動子與可選擇的適當轉位子；c)還可選擇地d)一個以上本身已知的基因組成之進階成分；其中「調控因子」、「啟動子」、「終結子」及「可手動連結」等詞均有其學理上的慣用含意(下文會敘述)；其中基因組成中所謂的「進階成分」可能像能夠促使或增加變化或整合(之效能)的3’-或5’-UTR序列、引導序列、選擇記號、表現記號/報導基因，及/或成分。實驗這將會知道針對該基因組成的這些及其他合適成分，還會依照所使用的組成類別、預期的宿主細胞或宿主組織；值得注意的本案中核苷酸序列被表現出來(例如透過構成、暫時或誘導的表現)；及/或將要使用的轉變技術。
本案中基因組成裡，可謂至少一個本案中核酸、調控因子、選擇性一個以上進階成分，相互間會被「手動連結」，通常表示它們相互之間有功能性的關聯。例如假使某啟動子可以啟動或者控制/調控
某編碼序列的轉譯及/或表現(其中該編碼序列應視作受到該啟動子「控制」)，則該啟動子被認為「手動連結」於編碼序列。通常當兩核苷酸序列被手動連結後，它們會有相同的位向並處於相同的讀取架構。雖然不是必須，但它們本質上通常會相連。
本案中基因組成之調控與進階成分表示它們可以在預期的宿主細胞或宿主組織中提供預期的生物功能。
例如啟動子、促進子或終結子在宿主細胞或宿主組織中應該為「可操作」，表示(例如)該啟動子應能啟動或控制/調控某核苷酸序列的轉譯及/或表現-例如某編碼序列-並可予以手動連結(如此處定義)。
某些特別重要的啟動子包括但不限於細菌細胞中本身已知者，像是下文會提到的及/或那些例子中所用的。
選擇標記表示它容許-即在適當的選擇條件下-已(成功地)隨著本案中核苷酸序列而轉變的宿主細胞及/或宿主組織，可以與未(成功地)轉變的宿主細胞/組織區隔。某些重要但未限定的該標記例子為提供對抗抗生素(例如卡那黴素或安比西林)能力的基因、能對抗高溫的基因，或容許宿主細胞或宿主組織在缺乏某些因子、化合物及/或(食物)成分等未轉化細胞或組織的基本維生條件之介質中，還能維生的基因。
引導序列應該-在預期的宿主細胞或宿主組織中-容許理想的後轉譯修飾及/或導引轉譯過的mRNA成為細胞的理想部份或胞器。引導序列可能容許該細胞表現產物之分泌。於是，引導序列可能在宿主細胞或宿主組織中為任何的後-、前-、或預後-序列，而引導序列在細菌細胞的表現中並非要角。
表現標記或報導基因應該-在宿主細胞或宿主組織中-容許
偵測基因組成的表現(呈現的基因或核苷酸序列)。表現標記可能選擇性地容許表現產物定位，例如細胞中的特定部位或胞器及/或多細胞組織中的特定細胞、組織、器官或部位。該報導基因可能表現為蛋白質跟本案中氨基酸序列的融合。某些重要但未限定的例子包括GFP這樣的螢光蛋白質。
某些重要但未限定的合適啟動子、終結子及進階成分的實例包括那些用於後敘中的例子。針對某些(進一步)未限定而可能出現/用於本案中基因組成的啟動子、選擇標記、引導序力、表現標記及進階成分之例子-像是終結子、轉譯及/或轉錄促進子及/或整何因子-可參見像前述的Sambrook et al.與Ausubel et al.之一般參考書，以及WO 95/07463,WO 96/23810,WO 95/07463,WO 95/21191,WO 97/11094,WO 97/42320,WO 98/06737,WO 98/21355,US-A-6,207,410,US-A-5,693,492與EP 1 085 089中的例子。實驗者還會知道其他的例子。可以參考上述提到的一般背景及下文中提到的進一步文獻。
本案中基因組成通常可能由合適地連結本案中核苷酸序列與一個以上前述的進階成分而得到，例如使用前述的Sambrook et al.與Ausubel et al.之一般參考書中描述的技術。
通常本案中基因組成可藉由插入本案中核苷酸序列於本身已知的合適(表現)載體中而得。某個重要但未限定的合適表現載體實例為那些下文實例中所使用的，於下文中會提到。
本案中核酸及/或本案中基因組成可能用於轉化宿主細胞或宿主組織。該宿主或宿主細胞可能為任何適合的(蕈類、原核或真核)細胞或細胞株或任何合適的真菌、原核或真核組織，例如：- 一菌種，包括但不限於革蘭氏陰性菌，像是大腸桿菌；奇異變型桿菌之類的變型桿菌；螢光假單胞菌之類的假單胞菌；及革蘭氏
陽性菌，像是枯草桿菌或短芽孢桿菌之類的桿菌；像是變鉛青鏈黴菌之類的鏈黴菌；像是肉葡萄球菌之類的葡萄球菌；像是乳酸球菌之類的乳酸菌；- 一真菌細胞，包括但不限細胞種源為半知菌木黴之類的黴菌；橘色麵包黴之類的神經孢子菌；草類子囊菌之類的子囊菌；黑麴菌或醬油麴菌之類的麴菌；或其他絲狀性的真菌；- 一酵母菌細胞，包括但不限種源為釀酒酵母之類的酵母菌；啤酒釀酵母之類的裂殖酵母菌；甲醇酵母或甲醇畢赤酵母之類的畢赤酵母；多形漢遜氏酵母之類的漢遜氏酵母；乳酸克魯維酵母之類的克魯維酵母；阿蘇拉耐鹽酵母之類的耐高鹽分酵母；適冷性海洋酵母之類的海洋酵母；- 兩棲類的細胞或細胞株，如青蛙卵母細胞；- 來自昆蟲的細胞或細胞株，如來自鱗翅目，包括但不限於夜蛾SF9與Sf21細胞或來自果蠅的細胞/細胞株，像是Schneider與Kc細胞；- 植物或植物細胞，例如煙草株；及/或- 哺乳類細胞或細胞株，如來自人類的細胞或細胞株，包括但不限於CHO-細胞、BHK-細胞(例如BHK-21細胞)的哺乳類，或是HeLa、COS(如COS-7)與PER.C6的人類細胞或細胞株；如同所有其他用來表現與製造抗體與抗體片段(包括但不限於(單一)區域抗體與ScFv片段)之本身已知的宿主細胞或宿主組織，實驗者將會知道這部份。可參照前述的一般背景理論，以及WO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken et al.,(1998),supra；Riechmann與Muyldermans,(1999),supra；van der Linden,(2000),supra；Thomassen et al.,(2002),supra；Joosten et al.,(2003),supra；Joosten
et al.,(2005),supra中的例子，還有後面所引用的文獻。
本案中奈米抗體與聚胜肽可加入並表現於多細胞組織中一個以上的細胞、組織或器官，例如為了預防及/或治療目的(例如基因療法)。針對此目的，本案中核苷酸序列可以透過任何適當方法加到細胞或組織中，例如在本身或之後將它們加入合適的基因治療載體(例如衍生自腺病毒的反轉錄病毒，或腺病毒有關的病毒之小病毒)。實驗者將會知道該基因療法，可以藉由體內及/或患者體內原位給予本案中核酸或決定等同於患者或患者之特定細胞或地定組織或器官之合適的基因療法載體；或適當的細胞(通常取自患者體內來使用，像是外界移植來的白血球、骨髓抽出物或組織切片)可能與本案中核苷酸序列在體內投予，然後在適當地(重新)送進患者體內。實驗者知道的基因治療載體、技術及遞送系統可以表現所有項目，如Culver,K.W.,"Gene Therapy",1994,p.xii,Mary Ann Liebert,Inc.,Publishers,New York,N.Y).Giordano,Nature F Medicine 2(1996),534-539；Schaper,Circ.Res.79(1996),911-919；Anderson,Science 256(1992),808-813；Verma,Nature 389(1994),239；Isner,Lancet 348(1996),370-374；Muhlhauser,Circ.Res.77(1995),1077-1086；Onodera,Blood 91；(1998),30-36；Verma,Gene Ther.5(1998),692-699；Nabel,Ann.N.Y.Acad.Sci.：811(1997),289-292；Verzeletti,Hum.Gene Ther.9(1998),2243-51；Wang,Nature Medicine 2(1996),714-716；WO 94/29469；WO 97/00957,US 5,580,859；1 US 5,5895466；或Schaper,Current Opinion in Biotechnology 7(1996),635-640。例如ScFv片段(Afanasieva et al.,Gene Ther.,10,1850-1859(2003))與抗體(Blanco et al.,J.Immunol,171,1070-1077(2003))的原位表現已描述於理論中。
針對細胞中的奈米抗體表現，它們可被表現為或像是WO
94/02610,WO 95/22618與US-A-7004940；WO 03/014960；Cattaneo,A.& Biocca,S.(1997)Intracellular Antibodies：Development and Applications.Landes and Springer-Verlag中；及Kontermann,Methods 34,(2004),163-170中描述所謂的「內抗體」。
針對製造，本案中奈米抗體與聚胜肽也可生產於基因轉植哺乳類的乳汁中，例如在兔子、牛、山羊、綿羊中(參見US-A-6,741,957,US-A-6,304,489與US-A-6,849,992用來將轉植基因加到哺乳類的的一般技術)，在植物或植物的部份中，包括但不限於它們的葉子、花、果實、種子、根部或塊莖(例如煙草、玉米、大豆或紫花苜蓿)，或在家蠶的蛹之中。
再者，本案中奈米抗體與聚胜肽也可在無細胞表現系統中表現及/或製備，本案者會知道該系統的合適例子。某些重要但未受限的例子包括在麥胚芽系統中的表現；在兔子的視網膜細胞溶解物中；或是大腸桿菌Zubay系統中。
如上述所提，使用奈米抗體的一項優點就是上述的聚胜肽可以透過表現於合適的細菌系統中而製得，實踐者將會從上面引用的文獻知道合適的細菌表現系統、載體、宿主細胞、調控因子等。然而應注意廣義的本案並不限於表現於細菌系統中。
在本案中，像是細菌表現系統之類(體內或體外)的表現系統用來提供適合醫藥使用的本案中聚胜肽，而實驗者將會知道該表現系統。實驗者還會知道適用於醫藥的本案中聚胜肽可以用胜肽合成技術來製備。
針對工業化生產，較佳的生產奈米抗體或含奈米抗體的蛋白質療法之異源宿主，包含適合大型表現/生產/發酵的大腸桿菌、甲醇酵母、啤酒釀酵母，特別是針對大型醫藥表現/生產/發酵。實驗者將會
知道這類物種的合適例子。有公司推出了該物種與生產/表現系統，如Biovitrum(Uppsala,Sweden)。
此外，哺乳類細胞株，尤其是中國田鼠卵巢(CHO)細胞，可以用於大型表現/生產/發酵，特別是大型醫藥表現/生產/發酵。上述的公司也推出了這樣的表現/生產系統。
特定表現系統的選擇中有一部份視特定後轉譯修飾之需求而定，主要是指糖化。含奈米抗體重組蛋白質針對何種糖化之生產為預期或需要的，將決定有能力將表現蛋白糖化的哺乳類表現宿主之用途。因此，實驗者將會知道所得的糖化片段(即所接的殘基之類型、數目與位置)將視用來表現的細胞或細胞株而定。不論用的是人類細胞或細胞株(即帶來本質上帶有人類糖化片段的蛋白質)或另外的哺乳類細胞株，均可提供本質上及/或功能上等同於人類糖化或起碼模擬人類糖化之糖化片段。通常向大腸桿菌這樣的原核宿主無法將蛋白質糖化，像酵母菌這樣的低等真核生物通常會帶來異於人類糖化的糖化片段。然而，應了解所有前述可用於本案中的細胞與表現系統，視得到的預期奈米抗體或蛋白質而定。
因此，根據一項未限定的本案中實例，本案中奈米抗體或聚胜肽被糖化了。根據另外的未限定本案實例，本案中奈米抗體或聚胜肽未被糖化。
根據一項重要但不受限的本案實例，本案中奈米抗體或聚胜肽生產於細菌細胞，特別是適用於大型醫藥生產的細菌細胞，像是前述的物種細胞。
根據另一項重要但不限定的本案實例，本案中奈米抗體或聚胜肽生產於酵母細胞中，特別是適用於大型醫藥生產的酵母細胞，像是前述的物種細胞。
再根據另一項重要但不限定的本案實例，本案中奈米抗體或聚胜肽生產於哺乳類細胞中，特別是在人類細胞或人類細胞株，尤其是適用於大型醫藥生產的人類細胞或人類細胞株，像是前述的細胞株。
當宿主細胞中的表現用來生產本案中奈米抗體與蛋白質時，本案中奈米抗體與蛋白質可由細胞內(例如在細胞質、細胞間質或包涵體中)生產，再由宿主細胞中單離出來，並進一步選擇性純化；或可由細胞外(例如在培養宿主細胞的基質中)生產，再由培養基中單離出來，並進一步選擇性純化。當使用的是真核宿主細胞時，通常偏好細胞外生產，因為它方便於進一步單離與處理下游所得的奈米抗體與蛋白質。像是上述的大腸桿菌之類的細菌細胞正常下不會在胞外分泌蛋白質，除非是少數像毒素與溶血素之類，而大腸桿菌的分泌生產表示蛋白質穿過內膜到細胞間質空間的轉移。細胞間質生產比細胞質生產多了幾個優點。例如分泌產物的N端氨基酸序列，可以等同於用特定訊息蛋白水解酵素將分泌訊息序列切斷之後的天然基因產物。同時，在細胞間質中的水解酵素活性遠低於在細胞質中。而因為細胞間質裡帶來污染的蛋白質較少，蛋白質純化變得簡單多了。另一項優點是可能會形成正確的雙硫鍵，因為細胞間質提供了比細胞質更好的氧化環境。大腸桿菌內過度表現的蛋白質常形成所謂包涵體之不溶聚集物。這些包涵體可能分佈於細胞質或細胞間質中；從這些包涵體回收的具生物活性之蛋白質需要去活/再折疊過程。許多重組蛋白質，包括治療用蛋白質，均回收自包涵體。另外，實驗者會知道基因修飾過的重組細菌種會分泌預期的蛋白質而可以使用，特別是本案中奈米抗體或聚胜肽。
因此，根據一項本案中未受限的實例，本案中奈米抗體或聚胜肽為細胞間生產，並自宿主細胞單離的奈米抗體或聚胜肽，特別是單
離自細菌細胞或細菌細胞內的包涵體。根據另一項未限定的本案中實例，本案中奈米抗體或聚胜肽為細胞外生產，並自培養宿主細胞的介質中單離出的奈米抗體或聚胜肽。
跟這些宿主細胞併用的某些重要但未限定之啟動子包括，- 用於大腸桿菌內的表現：lac啟動子(與像是lacUV5啟動子的衍生物)：阿糖啟動子；噬菌體λ的左-(PL)及右向(PR)啟動子；trp操縱子的啟動子；雜交lac/trp啟動子(tac與trc)；T7-啟動子(特別指T7-噬菌體10號基因的)與其他T-噬菌體啟動子；Tn10抗四環黴素基因之啟動子；包括一個以上外來調控操縱者序列複製之上述啟動子的工程化變異；- 對甲醇酵母中的表現：構成：ADH1(醇類脫氫酵素1),ENO(烯醇酵素)，CYC1(細胞色素異構-1),GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酵素)；PGK1(磷酸甘油酸激化酵素)，PYK1(丙酮酸激化酵素)；調控：GAL1,10,7(半乳糖代謝酵素)，ADH2(醇類脫氫酵素2),PHO5(酸磷酸酵素)，CUP1(銅金屬硫蛋白)；異源：CaMV(花椰菜崁紋病毒35S啟動子)；- 對甲醇畢赤酵母中的表現：AOX1啟動子(醇類氧化酵素I)- 對哺乳類細胞中的表現：緊鄰人類巨細胞病毒(hCMV)之初期促進子/啟動子；包含兩個四環黴素操縱者序列以致啟動子可被Tet抑制子調控之人類巨細胞病毒(hCMV)；單純疱疹病毒胸腺嘧啶激化酵素(TK)啟動子；勞氏肉瘤病毒長端重複(RSV LTR)促進子/啟動子；來自人類、黑猩猩、老鼠或大鼠的延長因子1α(hEF-1α)啟動子；SV40初期啟動子；HIV-1長端重複啟動子；β-肌動蛋白啟動子；與這些宿主細胞併用的某些重要但未限定之載體包括：
- 用於在哺乳類細胞表現之載體：pMAMneo(Clontech),pcDNA3(Invitrogen),pMC1neo(Stratagene),pSG5(Stratagene),EBO-pSV2-neo(ATCC 37593),pBPV-1(8-2)(ATCC 37110),pdBPV-MMTneo(342-12)(ATCC 37224),pRSVgpt(ATCC37199),pRSVneo(ATCC37198),pSV2-dhfr(ATCC 37146),pUCTag(ATCC 37460)與1ZD35(ATCC 37565)，以及像那些根據腺病毒的病毒類表現系統；- 用於在細菌細胞表現之載體：pET載體(Novagen)與pQE載體(Qiagen)；- 用於在酵母細胞或其他真菌細胞表現之載體：pYES2(Invitrogen)與畢赤酵母表現載體(Invitrogen)；- 用於在昆蟲細胞表現之載體：pBlueBacII(Invitrogen)與其他桿狀病毒載體- 用於在植物或植物細胞表現之載體：例如根據花椰菜崁紋病毒或煙草崁紋病毒、合適的農桿菌之載體，或根據Ti-質體的載體。與這些宿主細胞併用的某些重要但未限定之分泌序列包括：- 像用在大腸桿菌之類的細菌細胞：PelB,Bla,OmpA,OmpC,OmpF,OmpT,StII,PhoA,PhoE,MalE,Lpp,LamB，與相似物；TAT單胜肽，溶血素C端分泌訊號- 對用於酵母：α-配對因子預後序列，磷酸酵素(phol)，轉化酵素(Suc)，等；- 對用於哺乳類細胞：以防目標蛋白為真核啟始點之原有訊號；鼠類Ig κ-鏈V-J2-C訊號胜肽；等。
實驗者將會知道轉化本案中宿主或宿主細胞的合適技術，可能會視將使用的預期宿主細胞/宿主組織與基因組成而定。可參考前述
的參考書與專利應用。
轉化後，對於與本案中核苷酸序列/基因組成一同成功轉化的那些宿主細胞或宿主組織，可能會執行偵測與選擇的步驟。例如根據本案中基因組成的可選擇標記之選擇步驟，或是包含本案中氨基酸序列偵測的步驟，例如使用特定抗體。
轉化後的宿主細胞(可能為此形式或穩定的細胞株)或宿主組織(可能為此形式或穩定的突變株或物種)構成了現有本案的後續層面。
這些宿主細胞或宿主組織為它們表現或(起碼)有能力表現本案中的氨基酸序列(在宿主組織：在起碼一個細胞、部份、組織或器官中)。
為製造/得到本案中氨基酸序列的表現，轉化後的宿主細胞或轉化後的宿主組織，通常會在本案中(理想)氨基酸序列表現/生產的條件下被維持、保留及/或培養。實驗者將會知道合適的條件，且它們通常關係於使用的宿主細胞/宿主組織，就像控制本案中(相關)核苷酸序列表現的調控因子。可參考前述本案中基因組成之段落的參考書與專利應用。
通常，合適的條件包括使用合適的介質、合適的食物來源及/或合適的養分，使用適當的溫度，並有適當的誘導因子或化合物(例如當本案中核苷酸序列受到誘導型啟動子控制時)；其中每一樣都可能由實驗者選擇。在該條件下，本案中氨基酸序列可能表現於構成的情況、於暫時的情況，或僅在於適當地誘發。
實驗者也會知道本案中氨基酸序列可能(第一次)在未成熟的形式下生成(如前述)，然後就接受了後轉譯修飾，視使用的宿主細胞/宿主組織而定。同時，本案中氨基酸序列可能被糖化，也要視使
用的宿主細胞/宿主組織而定。
本案中氨基酸序列可能會由使用的宿主細胞/宿主組織及/或介質中單離，其中該宿主細胞或宿主組織是使用本身已知的蛋白質單離及/或純化技術加以培養，像是(製備型)層析及/或電泳技術、微差沈澱技術、親和力技術(例如使用特殊、可裂解並與本案中氨基酸序列融合的的氨基酸序列)及/或製備型免疫技術(即使用對抗欲單離的氨基酸序列之抗體)。
通常，針對醫藥用途，本案中聚胜肽可能製成包含一個以上本案中胜肽製藥與一個以上藥劑容許載體、稀釋劑或賦形劑及/或佐劑的劑型，並選擇性地含一個以上有藥性的聚胜肽及/或化合物。關於未限定的例子，該劑型可能為合適的口服給藥、靜脈給藥(像是靜脈注射、肌肉注射或皮下注射或靜脈灌注)、表皮給藥、吸入給藥、皮膚貼片、外科注入、栓劑等。該合適給藥法-可能為固體、半固體或液體，視給藥對象而定-如同用於製備的方法與載體，這些實驗者都會知道，下文中會再描述。
通常，本案中奈米抗體與聚胜肽可用任何本身已知的合適條件製劑及給藥，可參照前面引用的一般背景理論(特別是WO 04/041862,WO 04/041863,WO 04/041865與WO 04/041867)，如同Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Ed.,Mack Publishing Company,USA(1990)或Remington,the Science and Practice of Pharmacy,21th Edition,Lippincott Williams and Wilkins(2005)之類的標準參考書。
例如，針對傳統抗體及抗體片段(包括ScFv’s與二元體)與其他具藥效的蛋白質，本案中奈米抗體與聚胜肽可用任何本身已知的合適條件製劑及給藥。實驗者將會知道用來製備相同成分的劑型與方法，
例如包括適用於非腸道投藥(例如靜脈、腹膜、皮下、肌肉、管道內、動脈或脊椎腔內給藥)的製備，或表皮(即穿皮或皮內)給藥。
製備非腸道投藥可能有適於灌注或注射的無菌溶液、懸浮液、分散液或乳糜液。用於這類製備的合適載體或稀釋液在不限定下包括無菌水與水性緩衝液，以及像生理磷酸緩衝的鹽水溶液、林格氏液、右旋糖溶液與漢克溶液；水油；丙三醇；酒精；像丙烯二醇的二醇類或礦物油、動物油與蔬菜油，例如花生油、大豆油，還有相關的合適混合物。通常以水溶液或懸浮液較佳。
本案中奈米抗體及聚胜肽可用基因治療遞送法給藥。即參見美國專利5,399,346號，它整個已與參考文獻合併。使用基因治療遞送法，主要與決定本案中奈米抗體及聚胜肽的基因轉植之細胞，可以再與組織特異的啟動子轉植到標的特異的器官、組織、移植、腫瘤，或細胞，也可以為了胞下定位表現而再與訊息及穩定序列進行轉植。
因此，本案中奈米抗體及聚胜肽可能全身給藥，例如合併醫藥上許可的媒介以口服，像是惰性的稀釋液或可同化的食用性載體。它們可能包在軟或硬的殼狀膠質膠囊中，可能再壓進錠中，或直接與患者的飲食並用。針對口服治療給藥，本案中奈米抗體及聚胜肽可能合併一個以上的賦形劑且用於可吞式錠劑、口腔錠、藥片、膠囊、萬用藥、懸浮液、糖漿、薄片及類似物的形式。該組成與製備應包涵0.1%以上的本案中奈米抗體及聚胜肽。該組成與製備的百分比當然可能會有所不同，並且為了方便，可能會在所給的單位劑量形式之重量2到60%之間。在該醫療用組成中的本案中奈米抗體及聚胜肽之數量為發揮有效劑量的等級。
錠劑、藥片、藥丸膠囊與其類似物可能也含有下列成分：天然樹膠、橡膠、穀類澱粉或膠質；像是磷酸二鈣的賦形劑；像是穀類澱
粉、馬鈴薯澱粉、海藻酸及類似物的分散劑；像是硬脂酸鎂的潤滑劑；像蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜之類的增甜劑，或像是薄荷、冬青油或櫻桃香料類的增香劑都有可能添加。當單位劑量形式為膠囊，它就可能在上述類型的材料以外包涵像是蔬菜油或聚乙二醇之類的液狀載體。不同的其他材料可能用於包覆或其他修飾其固態單位劑量的物理形式。例如，錠劑、藥丸或膠囊可能包在膠質、臘、蟲膠或糖及其類似物之中。糖漿或萬用藥可能包涵本案中奈米抗體及聚胜肽、當作增甜劑的蔗糖或果糖、當作防腐劑的甲基與對羥基苯甲酸丙酯、染料與像是櫻桃或橘子口味的香料。當然，任何用來製備任何單位劑量的材質，在使用的數量上應該要為醫藥適用及本質上無毒的。此外，本案中奈米抗體及聚胜肽可能併入緩釋的製備與裝置中。
口服給藥的製備與劑型可以用腸道包覆的方式，如此可讓本案中組成能對抗胃部環境並進入小腸。再者，口服給藥的製備與劑型可以經合適的製劑遞送到任何腸胃道的預期部位。合適的栓劑可以用來遞送到腸胃道裡。
本案中奈米抗體及聚胜肽也可透過靜脈或腹膜灌注或注射的方式給藥。本案中奈米抗體及聚胜肽的溶液或其鹽類可以選擇性地與無毒性介面活性劑混合後，配製於水中。分散液也可配於甘油、液態聚乙二醇、三乙酸甘油酯與所述的混合物及油中。在一般的儲存與使用條件下，防腐劑在這些製備中可防止微生物生長。
適用於注射或灌注的藥品劑量形式可包涵殺菌過的水溶液或分散液或包含活性成分的殺菌粉末，這些都可在殺菌注射或灌注溶液或分散液的臨時製備使用，可選擇性地包覆在在微脂體中。所有的最終劑型都必須殺菌過、呈液狀，並在生產包裝的條件下穩定。液態的載體或媒介可為溶劑或包含水、酒精、多醇類(例如甘油、聚乙二醇、
液態聚乙二醇，及其類似物)的液態分散溶媒、蔬菜油、無毒三乙酸甘油酯與合適的所述混合物。可以藉由形成微脂體、藉分散條件維持所需的顆粒大小或藉著使用介面活性劑以維持適當的流動性。可以用不同的抗菌及抗真菌劑以防止微生物滋生，包括苯甲酸酯、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞及其類似物。在許多情況下，用糖、緩衝液或氯化鈉這些等張劑較理想。可以藉由使用延遲吸收的藥劑組成已延長注射組成的吸收，像是硬脂酸鋁與膠質。
將本案中奈米抗體及聚胜肽與所需量的合適溶劑與上述所列的其他不同必需成分混合，再經過濾殺菌即可製備殺菌注射液。關於製備殺菌注射溶液的殺菌粉末，較佳的方法是抽氣乾燥與冷凍乾燥技術，這樣可以得到有效成分加上任何前述殺菌過濾溶液中附帶需要成分的粉末。
針對表皮給藥，可能會採用純的本案中奈米抗體及聚胜肽，即它們的液態型。然而，通常以其組成或劑型與皮膚可接受的載體併用於皮膚上，會是較理想的方式，而載體就可能是固體或液體。
有用的固態載體包括精細打散過的固體，像是滑石、黏土、微晶纖維素、矽、氧化鋁，及其類似物。有用的液態載體包括水、羥基烷類或二醇類或水-醇/二醇混合物，其中本案中奈米抗體及聚胜肽可溶解或分散至有效程度，並選擇性地添加無毒介面活性劑。像是芳香劑及附加的抗微生物劑這些佐藥，可用來增強既定用途的性質。最終的液態組成可以從吸收墊上取用，用以填充繃帶與其他裝備，或是以幫浦式或氣膠式噴霧器噴灑到有效區域上。
增稠劑則有合成高分子、脂肪酸、脂肪酸鹽與酯類、脂肪醇、修飾過的纖維素或修飾過的礦物材質，均可以與液態載體合用以直接在皮膚上形成可分散的糊狀物、凝膠、軟膏、肥皂，及其類似物。
可用來遞送本案中奈米抗體及聚胜肽到皮膚上的有用皮膚組成實例，在學術中已很清楚；例如，可參見Jacquet et al.(U.S.Pat.No.4,608,392),Geria(U.S.Pat.No.4,992,478),Smith et al.(U.S.Pat.No.4,559,157)與Wortzman(U.S.Pat.No.4,820,508)。
本案中奈米抗體及聚胜肽的有用劑量，可比較它們在動物模型中的體外與體內活性而知。用來推斷從老鼠與其他動物到人類的有效劑量之方法，在學理中已為人所知；可參考U.S.Pat.No.4,938,949。
通常，本案中奈米抗體及聚胜肽在像是乳霜這種液態組成中的濃度大約為0.1-25 wt-%，較佳的約0.5-10 wt-%。在像是凝膠或粉末的半固態或固態組成中之濃度大約為0.1-5 wt-%，較佳的約0.5-2.5 wt-%。
本案中奈米抗體及聚胜肽在治療上的所需量會隨著特定選擇的奈米抗體或聚胜肽以及給藥途徑而不同，患者在治療時的條件本身、年紀與狀況，最終都會左右在場醫師或臨床醫師的決定。
理想的劑量可能以單一劑量或在適當間格的分散給藥劑量較方便表現，例如每日二、三、四或更多的次劑量。次劑量本身可能再進一步分配，即分成間格給藥的分散數目；像是從吹藥器的多次吸入或滴入眼睛的使用次數。
給藥方法可包括長期、每日治療。「長期」表示起碼兩個星期，甚至是為期數週、月、或年。此劑量範圍的必要修飾，可使用一項此處所教的例行實驗於理論中的一項常用技巧來決定。參見Remington’s Pharmaceutical Sciences(Martin,E.W.,ed.4),Mack Publishing Co.,Easton,PA。劑量也可由個別醫師於任何複雜因素中加以調整。
另一方面，此本案關係於針對所謂包括給藥的方法之預防及/或
治療一項以上此處所提與TNF相關的疾病或異常、給需要的個體、本案中奈米抗體及聚胜肽的醫藥有效量，及/或包含相同的藥劑組成。
在現行本案的背景中，「預防及/或治療」一詞包含了預防及/或治療疾病，一般還包含了預防疾病發作、減緩或扭轉疾病過程、預防或減緩一項以上與疾病相關症狀發作、降低疾病的嚴重性及/或期間及/或任何相關症狀，及/或預防進一步疾病及/或其症狀惡化，預防、降低或扭轉任何由疾病引起的生理傷害，通常還有任何有利於受治療患者的藥理反應。
被治療的個體可能為任何溫血動物，但特別是哺乳類，更重要的是人類。實驗者會知道被治療的個體特別是指患有或可能患有此處所提的疾病或異常之人。
此本案還關於起碼一種疾病或異常的預防及/或治療法，可透過包含給藥方法對病人給予本案中奈米抗體或聚胜肽以預防及/或治療、對於需要的個體、本案中奈米抗體及聚胜肽的醫藥有效量，及/或包含相同的藥劑組成。
更重要的是，本案關於起碼一種選自包含此處所列的疾病與異常之群組的疾病或異常的預防及/或治療法，即所謂包含給藥的方法、對於需要的個體、本案中奈米抗體及聚胜肽的醫藥有效量，及/或包含相同的藥劑組成。
另一實例中，本案關於免疫療法的方法，特別是被動的免疫療法，即所謂包含給藥的方法、對於患有或可能患有此處所提疾病與異常的個體、本案中奈米抗體及聚胜肽的醫藥有效量，及/或包含相同的藥劑組成。
上述方法中，本案中奈米抗體及/或聚胜肽及/或包含相同的組成可以用任何適當形式給藥，視特定的醫藥形式或所用的組成而定。因
此，本案中奈米抗體及/或聚胜肽及/或包含相同的組成可以口服、腹腔注射(即例如靜脈、皮下、肌肉，或透過任何其他繞行腸胃道的給藥途徑)、鼻腔、經皮、表皮，藉助於栓劑、吸入，這還是要視特定使用的醫藥劑型或組成而定。臨床醫師會選擇合適的給藥途徑及醫藥劑型或組成以用於給藥，視該臨床醫師所知的待預防或治療之疾病或異常及其他因素。
本案中奈米抗體及/或聚胜肽及/或包含相同的組成會根據適於預防及/或治療待預防或治療的疾病或異常之治療體制給藥。臨床醫師通常會依照一些因素決定合適的治療方式，像是待預防或治療的疾病或異常、待治療的疾病及/或症狀之嚴重性、所用的特定本案中奈米抗體及/或聚胜肽、所用的特定給藥途徑與醫藥劑型或組成、患者的年紀、性別、體重、飲食、一般狀況，與臨床醫師所知的相似因素。
通常治療方法包含於一種以上醫藥有效劑量中一種以上本案中奈米抗體及/或聚胜肽或一種以上包含相同組成的給藥。特定給藥劑量可由臨床醫師根據前述的因素決定。
通常預防及/或治療此處所提的疾病與異常，還有依照待治療的特定疾病與異常、所用的特定本案中奈米抗體及聚胜肽之效力、給藥的特定途徑與使用的特定藥物劑型或組成，本案中奈米抗體及聚胜肽將以每日每公斤體重1克與0.01微克之間的量來給藥，較佳的則介於每日每公斤體0.1克與0.1微克，像是每日每公斤體重大約1,10,100或1000微克，可以在每日中單一劑量連續(例如灌注)給藥，或是在一天中分多次劑量給藥。臨床醫師通常可以根據此處所提的因素決定合適的一日劑量。可知在特殊情況下，臨床醫師會選擇改變這些藥量，例如根據上述因素與他的專業判斷。通常可以針對透過本質上路徑相同且對抗相同給藥標的比較性之傳統抗體或抗體片段，以得到某
些藥量方面的服用指示，這可以解釋親和力/親抗原性、效力、身體分佈性、半生期與實驗者熟知的相似因素間之差異。
通常在上述方法中，會使用單一本案中奈米抗體或聚胜肽。然而併用兩種以上奈米抗體及/或聚胜肽也在本案範圍中。
本案中奈米抗體及聚胜肽可能與一種以上有進階藥效的化合物或原理併用，即合併的治療法，至於帶來協同效應與否則都有可能。臨床醫師可以基於上述因素與他的專業判斷，選擇進階化合物或像是適當的合併治療法之原理。
特別是本案中奈米抗體及聚胜肽可能與一種以上有進階藥效的化合物或原理併用，而它們是或可能用於預防及/或治療此處提及的疾病與異常，結果會帶來協同效應與否則都有可能。臨床醫師將會知道該化合物與原理的例子，像是給藥路徑、方法與藥物劑型或組成。
當兩種以上的物質或原理用於合併治療法的一部份時，它們可以透過相同或不同的給藥路徑，在基本上相同或不同的時間(例如基本上同時、連續或根據另外方法)進行給藥。當物質或原理透過相同路徑同步給藥時，它們可能以不同的藥物劑型或組成或合併藥物劑型或組成的部份進行給藥，這些實驗者將會知道。
同時，當兩種以上活性物質或原理用於合併治療法的一部份時，每項物質或原理可能會以相同數量給藥，並在使用化合物或原理本身時，根據相同的方法使用，而該合併用法會帶來協同效應與否則都有可能。然而，當兩種以上活性物質或原理的合併用法帶來了協同效應，就可以在維持理想治療效果的前提下，減少一個、多個或全部物質或原理的給藥數量。這可能在仍維持理想藥物或治療效應時，有益於避免、限制或減少任何不期望的伴隨正常數量物質或原理使用時之副作用。
臨床醫師會之知道，根據本案使用的治療法之效力可能決定於及/或隨著任何本身已知的相關疾病或異常。在合適或因地制宜的前提下，臨床醫師也可以改變或修飾特殊的治療法，以達到理想的治療效果，預防、限制或降低不想要的副作用，及/或在一方面達到預期效果、一方面避免、限制或降低非預期副作用之間取得適當的平衡。
在達到理想治療效果之前，及/或只要維持住理想治療效果，通常會持續治療方法。這個還是由臨床醫師決定。
因此，在進一步的層面上，此本案關於包含一個以上本案中奈米抗體或一個以上本案中聚胜肽與一個以上合適載體(即適合獸醫使用的載體)的醫藥組成，並選擇性地包含一個以上進階有效物質。
此本案還關於本案中奈米抗體及/或本案中聚胜肽在製備醫藥組成上的使用，特別是製備針對預防及/或治療由TNF-α調控或相關(例如與不正常的TNF-α活性、不正常的TNF-α等級、不正常的TNF-α表現及/或不正常的TNF-α感應或反應，或有一項與TNF-α相關的生物現象)的疾病或異常之醫藥組成(包括但不限於一項以上症狀緩減)，像是上述的一項疾病或異常。
此本案還關於針對預防及/或治療(包括但不限於一項以上症狀緩減)由TNF-α調控或相關(例如與不正常的TNF-α活性、不正常的TNF-α等級、不正常的TNF-α表現及/或不正常的TNF-α感應或反應，或有一項與TNF-α相關的生物現象)的疾病或異常之方法，像是上述的一項疾病或異常，其方法包含對需要的對象給予有效量的本案中奈米抗體、本案中聚胜肽及/或上述的醫藥組成。
現階段本案提供了包含一個以上直接對抗腫瘤壞死因子α(TNF-α)的奈米抗體之聚胜肽。現行本案進一步關於它們在診斷與治療上的用途。該奈米抗體可能有與人類骨架序列高度同源的骨架序列。包
含單獨對抗腫瘤壞死因子α(TNF-α)或與其他藥物併用的組成會再描述。
腫瘤壞死因子α(TNF-α)應該在多種異常中扮演了重要角色，例如風濕性關節炎、克隆氏症、潰瘍性大腸炎與多重硬化症的發炎反應。TNF-α與受器(CD120a,CD120b)都已被廣泛本案。TNF-α的生物有效形式為三聚體，而相鄰次單元形成的溝槽對於細胞激素-受器作用很重要。有許多用來抑制細胞激素活性的策略已被本案出來，並且目前以用來治療不同的疾病階段。
對TNF-α具有足夠專一性與選擇性的TNF-α抑制劑，在預防或治療異常以TNF-α為源頭的異常時，可能會是有效的預防或治療藥物。治療與TNF-α抗體相關的中毒性休克(EP 486526)、腫瘤增長、細胞毒性抑制(US 6448380,US 6451983,US 6498237)、像是風濕性關節炎與克隆氏症的自體免疫疾病(EP 663836,US 5672347,US 5656272)、移植器官跟主體反應(US 5672347)、細菌性髓膜炎(EP 585705)之方法如文中所述。
然而目前沒有藥物在治療自體免疫疾病上完全有效，大部分都受限於嚴重的毒性。本案對該標的序列有效而有選擇性的新型化學物質(NCE)之過程則是艱難又漫長。另一方面，以抗體為基礎的治療劑特別有潛力成為藥物，因為它們對標的有特佳的專一性，而固有的毒性又低。此外，與本案新型化學物質(NCE)比較起來，本案時間可以縮短。然而，傳統抗體在配位基的受器結合區包在溝槽之處，很難用來對抗多聚體蛋白質，就像是TNF-α。本案中衍生自駱駝的的重鏈抗體就具有空洞結合的傾向(WO97/49805；Lauwereys et al,EMBO J.17,5312,1998)。因此該重鏈抗體本質上適合於結合在TNF這樣的配位基之受器結合區。而該抗體長期都很穩定，也延長了它們的自我生
命(Perez et al,Biochemistry,40,74,2001)。再者，使用比哺乳類細胞培養發酵便宜的表現系統，像是酵母或其他微生物(EP 0 698 097).，該重鏈抗體片段就可以在發酵罐中生成「群體」。
使用衍生自老鼠、綿羊、山羊、兔子等來源與人體化衍生物的抗體，用於治療需要調節發炎的情況下，會有幾個問題。傳統抗體在室溫下不穩定，並需要冷藏製備並保存，因此需要冷藏實驗室設備、儲存與輸送，這些都會耗時耗經費。在本案中國家，有時候不易做到冷藏。因為用於表現完整有活性的抗體之哺乳類細胞系統需要高度的時間與設備支援，所以生產或小規模製造該抗體是很貴的，而且產率也很低。大體積的傳統抗體會限制在發炎組織處的組織穿透。再者，傳統抗體的結合力關係於pH，因此不適合用於超出一般生理pH範圍的環境，如治療胃出血、胃部手術。傳統抗體在低或高的pH都不穩定，因此不適用於口服。然而，已證實駱駝抗體可抗拒嚴苛條件，像是極端的pH、去活劑與高溫(Dumoulin et al,Protein Science 11,500,2002)，所以便適用於口服遞送。而傳統抗體的結合力決定於溫度，因此不適合用於操作時溫度超出生物活性溫度範圍(例如37±20℃)的分析或套組中。
聚胜肽藥物與以抗體為基礎的藥物特別有潛力成為藥物，因為它們對標的有特佳的專一性，而固有的毒性又低。然而，有經驗的人就知道，針對醫藥有效標的所得的抗體須要另外修飾以製備來治療人類，所以要避免給藥於人體時不想要的免疫反應。這修飾過程通常叫做「人體化」。有經驗的學者就知道，在非人類物種中的抗體需要人體化，以保持在人體內的抗體醫療效果((1)CDR移植：Protein Design Labs：US 6180370,US 5693761；Genentech US 6054297；Celltech：460167,EP 626390,US 5859205；(2)貼合Xoma：US
5869619,US 5766886,US 5821123)。需要有一種製造抗體的方法以避免實質上的人體化，或是完全去除人體化的必要。需要一種定義過骨架區域或氨基酸序列，且可以對人體給藥而不需要實質人體化或是根本不需要人體化的新抗體類別。
傳統抗體的另一項重要缺失為它們太複雜、分子大且相對不穩定，還有怕水解酵素破壞。這表示傳統抗體藥物不能口服、舌下、表皮、鼻腔、陰道、直腸、或吸入給藥，因為它們無法對抗這些部位的低pH、這些部位與血中的酵素作用，及/或因為它們的大體積。它們透過注射(靜脈、皮下等)來克服這些問題。注射給藥需要特別訓練，以正確安全地操作皮下注射針筒或針頭。還需要殺菌設備、醫療聚胜肽的液態劑型、該聚胜肽在殺菌與穩定形式的小瓶包裝，以及主體的合適受針部位。再者，主體在接受注射前通常會經歷身體及生理上的壓力。因此，需要能夠避免注射之遞送醫療聚胜肽的方法，而且不只是省時便宜，還要方便又不造成主體的不適。
以奈米抗體為基礎的藥物特別有潛力成為藥物，因為它們對標的有特佳的專一性，而固有的毒性又低。然而，增加它們進一步的本質與功能親和力可以為患者帶來很多益處，像是降低醫藥劑量、加速治療，及減少副作用。
現行本案的一項實例為抗TNF-α奈米抗體，該奈米抗體最好就像前文中深入的定義。
現行本案的一項實例為包含一個以上抗TNF-α奈米抗體之抗TNF-α聚胜肽，該聚胜肽最好就像前文中深入的定義。
另一項現行本案的實例為進一步包含一個以上用來對抗血清蛋白質的奈米抗體之前述抗TNF-α聚胜肽。
另一項現行本案的實例為前述抗TNF-α聚胜肽，當中該血清蛋白
質為血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結合蛋白質、運鐵蛋白或纖維蛋白原之一。
另一項現行本案的實例為進一步包含一個以上選自包含抗IFN-γ奈米抗體、抗TNF-α受器奈米抗體與抗IFN-γ受器奈米抗體的群組之前述抗TNF-α聚胜肽。
另一項現行本案的實例為前述抗TNF-α聚胜肽，其中用來對抗TNF-α的奈米抗體起碼有兩個。
另一項現行本案的實例為前述抗TNF-α聚胜肽，其中起碼一個奈米抗體為人體化的駱駝VHHs。
另一項現行本案的實例為包含前述抗TNF-α聚胜肽的組成，起碼一個奈米抗體選自含抗IFN-γ奈米抗體、抗TNF-α受器奈米抗體與抗IFN-γ受器奈米抗體的群組，以同時、分開或接續對主體給藥。
另一項現行本案的實例為前述抗TNF-α聚胜肽，或是前述組成，其中該奈米抗體為同源序列、功能性部份，或是全長奈米抗體的同源序列之功能性部份。
另一項現行本案的實例為前述抗TNF-α聚胜肽，或是前述組成，其中抗TNF-α聚胜肽為同源序列、功能性部份，或是全長抗TNF-α聚胜肽的同源序列之功能性部份。
另一項現行本案的實例為前述抗TNF-α聚胜肽，或是前述組成，其中起碼一個奈米抗體為駱駝VHH。
另一項現行本案的實例為決定前述抗TNF-α聚胜肽的核酸。
另一項現行本案的實例為確認調節前述抗TNF-α聚胜肽與包含下列步驟的腫瘤壞死因子-α之結合作用者的方法：(a)在容許該聚胜肽與標的結合之條件下，有無調節子選擇時，接觸具有腫瘤壞死因子α標的之前述抗TNF-α聚胜肽，及
(b)測量步驟(a)的聚胜肽與標的之間結合，其中相對於無該調節子選擇，該調節子選擇讓結合降低的事實，確定了該調節子選擇為調節前述抗TNF-α聚胜肽與腫瘤壞死因子-α之結合的作用者。
另一項現行本案的實例為透過前述抗TNF-α聚胜肽與包含下列的腫瘤壞死因子-α之結合，而確認調節腫瘤壞死因子-α所調控異常的作用者之方法：(a)在容許該聚胜肽與標的結合之條件下，有無調節子選擇時，接觸具有腫瘤壞死因子α標的之前述抗TNF-α聚胜肽，及(b)測量步驟(a)的聚胜肽與標的之間結合，其中相對於無該調節子選擇，該調節子選擇讓結合降低的事實，確定了該調節子選擇為調節腫瘤壞死因子-α所調控的異常之作用者。
另一項現行本案的實例為透過前述抗TNF-α聚胜肽與包含下列的腫瘤壞死因子-α之結合，而確認調節腫瘤壞死因子-α與其受器的作用者之方法：(a)在容許該聚胜肽與標的結合之條件下，有無調節子選擇時，接觸具有腫瘤壞死因子α標的之前述抗TNF-α聚胜肽，及(b)測量步驟(a)的聚胜肽與標的之間結合，其中相對於無該調節子選擇，該調節子選擇讓結合降低的事實，確定了該調節子選擇為調節腫瘤壞死因子-α與其受器結合之作用者。
另一項現行本案的實例為一套組，用來篩選調節包含前述抗TNF-α聚胜肽與腫瘤壞死因子-α之腫瘤壞死因子-α調控的異常之作用者。
另一項現行本案的實例為調節前述抗TNF-α聚胜肽與腫瘤壞死因子-α之結合的未知作用者，是根據前述的方法而確定。
另一項現行本案的實例為調節腫瘤壞死因子-α調控的異常，是
根據前述的方法而確定。
另一項現行本案的實例為前述的未知作用者，其中該異常為發炎、風濕性關節炎、克隆氏症、潰瘍性大腸炎、炎性腸道症與多重硬化症的一種以上。
另一項現行本案的實例為用來治療及/或預防及/或減緩與發炎過程有關的異常之前述抗TNF-α聚胜肽，或是前述的核酸，或是前述的組成，或是前述作用者。
另一項現行本案的實例為使用前述抗TNF-α聚胜肽，或是前述的核酸，或是前述的組成，或是前述作用者，來製備用於治療及/或預防及/或減緩與發炎反應有關的異常之藥物。
另一項現行本案的實例為前述抗TNF-α聚胜肽或是前述的組成，用來治療及/或預防及/或減緩容易受到本案中奈米抗體或聚胜肽調節之異常，此奈米抗體或聚胜肽可在無物質被活化時通過胃部環境。
另一項現行本案的實例為使用前述抗TNF-α聚胜肽或前述的組成，來製備用於治療及/或預防及/或減緩容易受到本案中奈米抗體或聚胜肽調節之異常症狀的藥物，奈米抗體或聚胜肽可在無物質被活化時通過胃部環境。
另一項現行本案的實例為前述抗TNF-α聚胜肽或前述的組成，用來治療及/或預防及/或減緩容易受到遞送至陰道及/或直腸之本案中奈米抗體或聚胜肽調節的異常。
另一項現行本案的實例為使用前述抗TNF-α聚胜肽或前述的組成，來製備用於治療、預防及/或減緩容易受到遞送至陰道及/或直腸之本案中奈米抗體或聚胜肽調節之異常症狀的藥物。
另一項現行本案的實例為前述抗TNF-α聚胜肽或前述的組成，用來治療及/或預防及/或減緩容易受到遞送至鼻子、上呼吸道及/或肺部
之本案中奈米抗體或聚胜肽調節的異常。
另一項現行本案的實例為使用前述抗TNF-α聚胜肽或前述的組成，來製備用於治療、預防及/或減緩容易受到遞送至鼻子、上呼吸道及/或肺部之本案中奈米抗體或聚胜肽調節之異常症狀的藥物。
另一項現行本案的實例為前述抗TNF-α聚胜肽或前述的組成，用來治療及/或預防及/或減緩容易受到遞送至腸黏膜之本案中奈米抗體或聚胜肽調節的異常，其中該異常會增加腸黏膜的通透性。
另一項現行本案的實例為使用前述抗TNF-α聚胜肽或前述的組成，來製備用於治療、預防及/或減緩容易受到遞送至腸黏膜之本案中奈米抗體或聚胜肽調節之異常症狀的藥物，其中該異常會增加腸黏膜的通透性。
另一項現行本案的實例為前述抗TNF-α聚胜肽或前述的組成，用來治療及/或預防及/或減緩容易受到可有效通過舌下組織之本案中奈米抗體或聚胜肽調節的異常。
另一項現行本案的實例為使用前述抗TNF-α聚胜肽或前述的組成，來製備用於治療、預防及/或減緩容易受到可有效通過舌下組織之本案中奈米抗體或聚胜肽調節之異常症狀的藥物。
另一項現行本案的實例為前述抗TNF-α聚胜肽或前述的組成，用來治療及/或預防及/或減緩容易受到可有效通過皮膚之本案中奈米抗體或聚胜肽調節的異常。
另一項現行本案的實例為使用前述抗TNF-α聚胜肽或前述的組成，來製備用於治療、預防及/或減緩容易受到可有效通過皮膚之本案中奈米抗體或聚胜肽調節之異常症狀的藥物。
另一項現行本案的實例為前述方法、前述套組、前述核酸或作用者、使用前述核酸或使用者、前述組成、使用前述組成、前述抗
TNF-α聚胜肽、使用前述抗TNF-α聚胜肽，其中該異常為發炎、風濕性關節炎、COPD、氣喘、克隆氏症、潰瘍性大腸炎與炎性腸道症、多重硬化症、愛迪生氏症、自體免疫肝炎、自體免疫腮腺炎、第一型糖尿病、副睾炎、腎小球腎炎、葛瑞芙氏症、姬蘭巴雷症候群、橋本氏病、溶血性貧血、全身性紅斑狼瘡、男性不孕、多重硬化症、重症肌無力、天皰瘡、牛皮癬、風濕熱、風濕性關節炎、類肉瘤病、硬皮病、薛格連氏症候群、脊柱關節病、甲狀腺炎與血管炎之一。
另一項現行本案的實例為包含前述核酸或作用者、前述抗TNF-α聚胜肽、或前述組成，與合適的藥物媒介之組成。
另一項現行本案的實例為診斷有包含下列之腫瘤壞死因子-α失調特徵的異常之方法：(a)接觸帶有前述抗TNF-α聚胜肽的樣本，(b)偵測該聚胜肽與該樣本結合，及(c)將步驟(b)中測到的結合與標準比較，其中與該樣本相關的結合差異為有包含腫瘤壞死因子-α失調特徵的異常診斷。
另一項現行本案的實例為使用前述方法而篩選前述異常的套組。
另一項現行本案的實例為包含單離的前述抗TNF-α聚胜肽於使用前述方法而篩選前述異常的套組。
另一項現行本案的實例為使用前述抗TNF-α聚胜肽來純化該腫瘤壞死因子-α。
另一項現行本案的實例為使用前述抗TNF-α聚胜肽來抑制腫瘤壞死因子-α與一個以上的腫瘤壞死因子-α受器間之作用。
另一項現行本案的實例為製造前述抗TNF-α聚胜肽之方法，包含這些步驟：
(a)取得決定用於腫瘤壞死因子-α之駱駝VHH的雙股DNA，(b)克隆並表現步驟(b)中所選的DNA。
另一項現行本案的實例為製造前述抗TNF-α聚胜肽之方法，包含：(a)在容許聚胜肽表現的條件下，培養包含能決定前述抗TNF-α聚胜肽之核酸的宿主細胞，(b)從培養基中回收已製造的聚胜肽。
另一項現行本案的實例為前述方法，其中該宿主細胞為細菌或酵母。
另一項現行本案的實例為篩選包含前述抗TNF-α聚胜肽之發炎、風濕性關節炎、克隆氏症、潰瘍性大腸炎、炎性腸道症或多重硬化症的任一種之套組。
根據現行本案，VHHs與有經驗的受訊者所知道者，為衍生自天生缺乏輕鏈的免疫球蛋白之重鏈變異區，像是WO 94/04678(參照下文的VHH區或奈米抗體)中描述的駱駝衍生物。VHH分子大約比IgG分子小了十倍。它們是穩定的單一聚胜肽，可抗極端的pH與高溫。它們也不怕水解酵素的作用，而傳統抗體就辦不到了。體外的VHHs表現可得到高產率，適當地包住功能性VHHs。透過使用抗體資料庫或透過將駱駝外的哺乳類免疫化(WO 9749805)，駱駝所產生的抗體會辨認抗原表位，而非那些被體外產生的抗體所辨認者。因此，抗TNF-α的VHH可能比傳統抗體對TNF-α的作用更有效率，而能更有效地阻斷它跟TNF-α受器的作用。
TNF-α也是有能力引起免疫反應的TNF-α之片段。TNF-α也是也能力結合用以對抗全長TNF-α的TNF-α之片段。
對抗TNF-α的奈米抗體意指該奈米抗體可結合於TNF-α，而親和
力優於10-6 M。
一項現行本案的實例為抗TNF-α聚胜肽，其中奈米抗體包含用來對抗TNF-α的駱駝VHH。
抗TNF-α聚胜肽的一個以上用來對抗TNF-α的奈米抗體可能有相同序列。而它們的序列也未必要相同。本案範圍也包括含有序列未必全部相同的抗TNF-α奈米抗體之抗TNF-α聚胜肽，但它們是用來對抗一個以上抗原這樣的相同標的。
現行本案進一步關於抗TNF-α聚胜肽，其中該奈米抗體為用來對抗TNF-α的VHH，而VHH屬於有類似人類序列的等級。該等級的特徵是VHHs帶了選自下列群組的氨基酸，包括根據Kabat編碼的45位glycine,alanine,valine,leucine,isoleucine,proline,phenylalanine,tyrosine,tryptophan,methionine,serine,threonine,asparagine，或glutamine，像是L45，以及103位的tryptophan。另一項駱駝奈米抗體的類似人類等級已描述於WO03035694中，並包含常見於傳統人類起點或其他物種的抗體之疏水性FR2殘基，但藉著取代雙鏈抗體中固有VH的色氨酸殘基為103位帶電之精氨酸殘基，以補償其親水性下降。因此，屬於此兩等級的聚胜肽顯現了對人類VH骨架區域的高度氨基酸序列同源性，而該聚胜肽可能在沒有非預期免疫反應的情形下直接投予人體，也不會有進一步人體化的負擔。此本案還跟可決定該聚胜肽的核酸有關。
每個此本案中所用的VHHs可能為傳統等級或類似人類的駱駝抗體等級。該抗體可能用來對抗整個TNF-α或其片段，或是該同源序列的片段。這些聚胜肽包括名為Fc與VHH區的全長駱駝抗體，這是虛擬的本身帶有人類Fc或VHH區或衍生自其片段之重鏈駱駝抗體。
抗血清白蛋白VHH可能比身為載體蛋白的傳統抗體跟血清白蛋白
作用得更有效率。而載體蛋白有些血清白蛋白的抗原表位被邊界蛋白、胜肽與小型化學化合物阻隔了。因為已知VHH會結合到「不尋常」或非傳統的抗原表位，像是空洞(WO 97/49805)，該VHH對循環血清的親和力可能會增加。
現行本案也關於發現此處描述的抗TNF-α聚胜肽進一步會包含一個以上用來對抗一個以上主體血清蛋白質的奈米抗體，並在該主體內循環時，與不是該組成部份的抗TNF-α奈米抗體比較起來，出奇地擁有特別長的半生期。另外，該聚胜肽會表現相同的理想奈米抗體性質，像是在老鼠中保有完整的安定性、對抗極端的pH、高溫下的安定性與高標的親和力。
該血清蛋白可為任何主體血清中找到的合適蛋白。在此本案的另一層面，血清蛋白為血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結合蛋白、運鐵蛋白或纖維蛋白原。根據預期使用，像是對於標的抗原有效治療及/或區隔所必需的半生期，VHH配對者可用來針對一項上述的血清蛋白。
根據特定但不限定的本案層面，對抗人類血清白蛋白的奈米抗體包含4個骨架區域(分別為FR1至FR4)與3個互補決定區域(分別為CDR1至CDR3)，其中：(iv)CDR1為選自包含下列者之群組的氨基酸序列：SFGMS[序列編碼：36]LNLMG[序列編碼：37]INLLG[序列編碼：38]NYWMY；[序列編碼：39]及/或選自帶有氨基酸序列的群組，與上述氨基酸序列之一僅有二個或一個「氨基酸差異」(如此處定義)，其中：
(1)任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代為佳(如此處定義)；及/或(2)與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形；其中：(v)CDR2為選自包含下列者之群組的氨基酸序列：SISGSGSDTLYADSVKG[序列編碼：40]TITVGDSTNYADSVKG[序列編碼：41]TITVGDSTSYADSVKG[序列編碼：42]SINGRGDDTRYADSVKG[序列編碼：43]AISADSSTKNYADSVKG[序列編碼：44]AISADSSDKRYADSVKG[序列編碼：45]RISTGGGYSYYADSVKG[序列編碼：46]或選自帶有氨基酸序列的群組，與上述氨基酸序列之一的序列一致性(如此處定義)起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；其中(1)任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代為佳(如此處定義)；及/或(2)與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形；及/或選自帶有氨基酸序列的群組，與上述氨基酸序列之一僅有三、二個或一個「氨基酸差異」(如此處定義)，其中：(1)任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代為佳(如此處定義)；及/或(2)與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有
氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形；其中：(vi)CDR3為選自包含下列者之群組的氨基酸序列：DREAQVDTLDFDY[序列編碼：47]或選自帶有氨基酸序列的群組，與上述氨基酸序列之一的序列一致性(如此處定義)起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；其中(1)任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代為佳(如此處定義)；及/或(2)與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形；及/或選自帶有氨基酸序列的群組，與上述氨基酸序列之一僅有三、二個或一個「氨基酸差異」(如此處定義)，其中：(1)任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代為佳(如此處定義)；及/或(2)與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形；或選自包含下列者之群組GGSLSR[序列編碼：48]RRTWHSEL[序列編碼：49]GRSVSRS[序列編碼：50]GRGSP[序列編碼：51]及/或選自帶有氨基酸序列的群組，與上述氨基酸序列之一僅有三、二個或一個「氨基酸差異」(如此處定義)，其中：(1)任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代為佳(如此處定
義)；及/或(2)與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形。
在另一層面，本案關於對抗人類血清白蛋白的奈米抗體，包含4個骨架區域(分別為FR1至FR4)與3個互補決定區域(分別為CDR1至CDR3)，而且選自含有區域抗體及/或單一區域抗體及下列CDR1,CDR2與CDR3的各個組合之一：- CDR1：SFGMS；CDR2：SISGSGSDTLYADSVKG；CDR3：GGSLSR；- CDR1：LNLMG；CDR2：TITVGDSTNYADSVKG；CDR3：RRTWHSEL；- CDR1：INLLG；CDR2：TITVGDSTSYADSVKG；CDR3：RRTWHSEL；- CDR1：SFGMS；CDR2：SINGRGDDTRYADSVKG；CDR3：GRSVSRS；- CDR1：SFGMS；CDR2：AISADSSDKRYADSVKG；CDR3：GRGSP；- CDR1：SFGMS；CDR2：AISADSSDKRYADSVKG；CDR3：GRGSP；- CDR1：NYWMY；CDR2：RISTGGGYSYYADSVKG；CDR3：DREAQVDTLDFDY.在包含上述CDR組合之本案中奈米抗體裡，每個CDR都被選自帶有氨基酸序列的群組之CDR取代，與提及的CDR相比，序列一致性(如此處定義)起碼達80%，較佳的則起碼要90%，更佳的則要95%，甚至好到99%；其中
(1)任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代為佳(如此處定義)；及/或(2)與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形；及/或選自帶有氨基酸序列的群組，與上述CDR之一項上述氨基酸序列僅有三、二個或一個(如前段指出)「氨基酸差異」(如此處定義)，其中：(1)任何的氨基酸取代，以固有的氨基酸取代為佳(如此處定義)；及/或(2)與前述的氨基酸序列比較起來，提及的氨基酸序列最好只有氨基酸取代，而沒有減少或插入氨基酸的情形。
然而，包含上述CDR組合之奈米抗體，以包含起碼一個上列CDR的奈米抗體為佳；以包含起碼兩個上列CDR的奈米抗體為佳更好；而包含三個上列CDR的奈米抗體最佳。
在這些對抗人類血清白蛋白的奈米抗體中，對本案中奈米抗體在前述中定義了較佳的骨架區域FR1至FR4。
對抗人類血清白蛋白的奈米抗體中，較佳的為選自包含序列編碼：6167，序列編碼87至89及序列編碼100-104之群組。出現在這些奈米抗體中較理想的CDR與骨架區域之組合也列在表II中。表II：在對抗人類血清白蛋白的奈米抗體中，理想骨架序列與CDR組合。
另一項本案層面為此處所示的抗TNF-α聚胜肽，進一步包含一個以上選自帶有抗IFN-γ聚胜肽、抗TNF-α受器聚胜肽與抗IFN-γ受器聚胜肽的群組之一個以上聚胜肽。
根據一項本案層面，某奈米抗體是用來對抗TNF-α受器。該奈米抗體可能為駱駝VHH。
根據一項本案層面，某奈米抗體是用來對抗IFN-γ受器。該奈米抗體可能為駱駝VHH。
另一項本案層面為此處所指治療自體免疫疾病或情況的方法，包含給予患者有效劑量的抗TNF-α聚胜肽，且進一步包含一個以上選自含抗IFN-γ聚胜肽、抗TNF-α受器聚胜肽與抗IFN-γ受器聚胜肽的群組之聚胜肽，像是下文中互相摻雜的聚胜肽。
這類多專一性組成可能會增強藥效，像是發炎治療化合物對於單專一性組成。
本案中的一項層面為包含此處的抗TNF-α聚胜肽與一個以上選自含抗IFN-γ聚胜肽、抗TNF-α受器聚胜肽與抗IFN-γ受器聚胜肽群組之聚胜肽的組成，以同時、區隔或連續對主體給藥。
一項本案層面為治療自體免疫疾病的方法，包含對個體同時、區隔或連續給予有效劑量的抗TNF-α聚胜肽，及一個以上選自含抗IFN-γ聚胜肽、抗TNF-α受器聚胜肽與抗IFN-γ受器聚胜肽的群組之聚胜肽。
另一項本案層面為一套組，包含抗TNF-α聚胜肽，及一個以上選自含抗IFN-γ聚胜肽、抗TNF-α受器聚胜肽與抗IFN-γ受器聚胜肽的群組之聚胜肽，以對某主體同時、區隔或連續給藥。它是一項本案層面，此套組可能根據此本案使用。它是一項本案層面，此套組可能用來治療此處所提的疾病。
同時給藥表示聚胜肽在同時間給予一個主體。例如，聚胜肽或
包含該聚胜肽之組成的混合物。例子還包括但不限於靜脈給藥的溶液、錠劑、液體、表皮乳霜等等，其中每種製備包含了受矚目的聚胜肽。
區隔給藥表示聚胜肽在同時間或本質上同時給予一個主體。在套組中的聚胜肽為區隔、未混合的製備。例如，不同的聚胜肽可能在套組中為個別錠劑。錠劑可能藉由同時吞兩顆錠劑、或一顆接著另一顆來對主體給藥。
連續給藥表示聚胜肽連續地給予一個主體。在套組中的聚胜肽為區隔、未混合的製備。兩劑之間有段時間差。例如某個聚胜肽在另一成分之後達336,312,288,264,240,216,192,168,144,120,96,72,48,24,20,16,12,8,4,2,1，或0.5小時再給藥。
在連續給藥中，一種聚胜肽可能在給另一聚胜肽之前及/或之後給一次或好幾次，並且是不同的劑量。連續給藥可能跟同時或連續給藥併用。
下列的抗TNF-α聚胜肽醫療用途也適用於包含此處抗TNF-α聚胜肽及一個以上選自含抗IFN-γ聚胜肽、抗TNF-α受器聚胜肽與抗IFN-γ受器聚胜肽的群組之聚胜肽，以同時、區隔或連續對上述主體給藥。
根據一項本案的層面，抗IFN-γ聚胜肽為用來對抗IFN-γ之抗TNF-α奈米抗體。該奈米抗體可能為駱駝VHH。
根據一項本案的層面，抗TNF-α奈米抗體為對抗TNF-α受器。該奈米抗體可能為駱駝VHH。
根據一項本案的層面，抗IFN-γ受器聚胜肽為用來對抗IFN-γ受器之抗TNF-α奈米抗體。該奈米抗體可能為駱駝VHH。
另一項現行本案實例為此處的抗TNF-α聚胜肽，其中用來對抗TNF-α的奈米抗體數目為兩個以上。該多價抗TNF-α聚胜肽的優點在於對標的之功能性親和力通常很高，跟它們的單價對應者比起來，表
現得比預期的抑制性質更高。
多價抗TNF-α聚胜肽的功能性親和力比單價原始多價抗TNF-α聚胜肽高了好幾級。本案者發現，對於兩價與多價抗體而言，這些多價聚胜肽的功能性親和力比之前的理論報導還要高。特別的是現行本案中直接或透過短連結序列相互連結之抗TNF-α聚胜肽，表現出與多價傳統四鏈抗體理論上預期的高功能性親和力。
本案者發現該功能性親和力的大幅增加可用帶有多區域與多聚體蛋白質的抗原來偵測，可以用直接結合分析或功能性分析，例如細胞毒性分析。
使用理論上的方法或任何進階的方法，奈米抗體可能會聚集形成任何此處所示包含一個以上奈米抗體的聚胜肽。例如它們可能透過Blattler et al,Biochemistry 24,1517-1524；EP294703所述的有機衍生劑與氨基酸殘基反應，經化學交聯而融合。另外，奈米抗體通常可能在DNA層級融合，即所形成能決定完整含一個以上抗標的奈米抗體及一個以上抗血清蛋白抗米抗體之聚胜肽組成的聚核苷酸組成。針對生產兩價或多價VHH聚胜肽組成的方法可見PCT專利應用WO 96/34103。有一個結合多個奈米抗體的方法是透過直接連結或胜肽連結的連結奈米抗體編碼序列之基因方式。例如第一奈米抗體的C端可能連結於下一個奈米抗體的N端。為了建構與製造三-、四-等功能性結構，連結模式可延伸來連結更多奈米抗體。
根據現行本案的一項層面，奈米抗體是直接互相連結而沒有用到連結物。對應於連結大型傳統抗體，需要連結序列以保持兩次單元的結合活性，本案中聚胜肽可直接連結以避免可能的連結序列問題，像是對人類主體給藥時的抗原反應、連結序列的不穩定性而造成次單元分離。
根據另一項現行本案的層面，奈米抗體透過了聚胜肽連結序列
而互相連結。該連結序列可能為天然或非天然的序列。預期連結序列在主體中對給予的抗TNF-α聚胜肽為非免疫性。連結序列可能在對抗水解性分解的同時，為多價抗TNF-α聚胜肽帶來足夠的靈活性。一項未限定的連結序列實例為可衍生自WO 96/34103中描述的VHHs遮蔽區。
根據另一項現行本案的層面，包含兩個以上多價奈米抗體的奈米抗體可直接或透過連結序列互相連結。該組成不易與傳統抗體生產，而因為大型次單原之立體阻礙，會損失功能性或大幅不升反降，就像本案中VHH與單價組成相比。
此處所示的聚胜肽組成可能由厲害的本案者根據理論中的已知方法或任何進階方法製得。例如用理論中已知方法將駱駝免疫並取得融合瘤，或是用已知的分子生物技術來克隆奈米抗體資料庫再接著用噬菌體表現選擇，則可得到VHHs。
根據一項本案層面，抗TNF-α聚胜肽可能為全長抗TNF-α聚胜肽的同源序列。根據另一項本案層面，抗TNF-α聚胜肽可能為全長抗TNF-α聚胜狀的功能部位。根據另一項本案層面，抗TNF-α聚胜肽可能為全長抗TNF-α聚胜肽的同源序列。根據另一項本案層面，抗TNF-α聚胜肽可能為全長抗TNF-α聚胜肽的同源序列之功能部位。根據一項本案層面，抗TNF-α聚胜肽可能包含抗TNF-α聚胜肽的序列。
根據一項本案層面，用來形成抗TNF-α聚胜肽的奈米抗體可能為完整的奈米抗體(例如VHH)或其同源序列。根據另一項本案層面，用來形成聚胜肽組成的奈米抗體可能為完整奈米抗體的功能性部位。根據另一項本案層面，用來形成聚胜肽組成的奈米抗體可能為完整奈米抗體的同源序列。根據另一項本案層面，用來形成聚胜肽組成的奈米抗體可能為完整奈米抗體的同源序列之功能性部位。
這裡所用的現行本案之同源序列可能包含一個以上氨基酸增
加、刪除或取代，而這實質上不會改變本案中聚胜肽的功能性。氨基酸序列刪除或取代的數目理想為1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69或70個氨基酸。
根據現行本案的同源序列可能為氨基酸經增加、刪除或取代修飾的聚胜肽，跟未修飾的聚胜肽比較起來，該修飾並未實質上改變功能性。
根據現行本案的同源序列可能為氨基酸經增加、刪除或取代修飾的聚胜肽，跟未修飾的聚胜肽比較起來，該修飾並未實質上改變功能性。
根據現行本案的同源序列可能為存在於另外的駱駝物種之序列，例如駱駝類、單峰駱駝、駱駝、羊駝、駱馬等。
在同源序列表示序列一致性時，即表示呈現與來源序列序列一致性高的序列(序列一致性高於70%,75%,80%,85%,90%,95%或98%)及其特徵最好為與來源序列相似的親和力性質，即用已知方法算出該一致性。
另外，同源序列可能為在任何根據下列公式的來源序列位置之任何得自所容許取代的氨基酸序列：Ser被Ser,Thr,Gly與Asn取代；Arg被Arg,His,Gln,Lys與Glu之一取代；Leu被Leu,Ile,Phe,Tyr,Met與Val之一取代；Pro被Pro,Gly,Ala與Thr之一取代；Thr被Thr,Pro,Ser,Ala,Gly,His與Gln之一取代；Ala被Ala,Gly,Thr與Pro之一取代；
Val被Val,Met,Tyr,Phe,Ile與Leu之一取代；Gly被Gly,Ala,Thr,Pro與Ser之一取代；Ile被Ile,Met,Tyr,Phe,Val與Leu之一取代；Phe被Phe,Trp,Met,Tyr,Ile,Val與Leu之一取代；Tyr被Tyr,Trp,Met,Phe,Ile,Val與Leu之一取代；His被His,Glu,Lys,Gln,Thr與Arg之一取代；Gln被Gln,Glu,Lys,Asn,His,Thr與Arg之一取代；Asn被Asn,Glu,Asp,Gln與Ser之一取代；Lys被Lys,Glu,Gln,His與Arg之一取代；Asp被Asp,Glu與Asn之一取代；Glu被Glu,Asp,Lys,Asn,Gln,His與Arg之一取代；Met被Met,Phe,Ile,Val,Leu與Tyr之一取代。
根據現行本案的同源核苷酸序列可能表示超過50,100,200,300,400,500,600,800或1000核苷酸而在嚴格雜交條件下(像是某項Sambrook et al.,Molecular Cloning,Laboratory Manuel,Cold Spring,Harbor Laboratory press,New York中所描述的)可以雜交到有能力決定來源序列的核苷酸序列之逆完整的核苷酸序列。
如此處所用的功能性部位表示有足夠尺寸的奈米抗體序列，使得有用的作用力保持在親和力為1 x 10-6 M或更佳。
另外，功能性部位包含完整氨基酸序列的部份刪除而仍保持結合位及標的結合與作用所需的蛋白質區。
如此處所用的功能性部位表示低於完整序列的100%(例如99%,90%,80%,70%,60%50%,40%,30%,20%,10%,5%,1%等)，但包含5個以上氨基酸或15個以上核苷酸。
像是這裡提到的抗TNF-α、TNF-α受器、血清蛋白質(例如血清白蛋白、血清免疫球蛋白、甲狀腺素結合蛋白質、運鐵蛋白或纖維蛋白
原)與IFN-γ、IFN-γ受器之標的可能為該標的之片段。因此標的也是能夠免除免疫反應之該標的片段。標的也是能夠結合於用來對抗全長標的之耐米抗體之該標的片段。
此處用的片段代表低於序列的100%(例如99%,90%,80%,70%,60%,50%,40%,30%,20%,10%等)，但包含5,6,7,8,9,10,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25以上的氨基酸。有足夠長度的片段可以使有用的作用力保持在親和力為1 x 10-6 M或更佳。
此處用的片段也代表最佳化的一個以上氨基酸插入、刪除與取代，而且不會實質上改變標的結合於用來對抗原型標的之奈米抗體的穩定性。理想的氨基酸插入、刪除與取代的數目是1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69或70個氨基酸。
現行本案的同源序列可能包括人體化的抗TNF-α聚胜肽。VHHs之新等級的抗體人體化將進一步降低人體內給藥時非預期免疫反應的發生率。
一項現行本案的實例關於根據llama抗體藉由決定抗體變異區(VHH)的的氨基酸殘基以製備修飾過的聚胜肽之方法，該變異區可能在沒有減少原本對抗原的區域親和力與將低其對異源物種之免疫性時即修飾；使用在相同殘基有修飾的VHHs對於異源物種給藥時有效；並對VHH加以修飾。
再者，此本案關於製備修飾過的VHHs，這是修飾來對人類給藥，所得到的VHH本身與使用該「人體化」VHHs於人類的疾病治療上。人體化表示以突變讓對人類患者給藥時的免疫性降低或消失。根據現行本案，人體化一個聚胜肽包含置換一個以上駱駝氨基酸為它們
存在於人類一致序列的人類配對物之步驟，而沒有喪失聚胜肽的代表性質，即人體化不會明顯影響所得聚胜肽的抗原結合力。有經驗的操作者知道這些方法。
駱駝奈米抗體的人體化需要有限量的單一聚胜肽鏈之氨基酸參與及突變化。對照起來，scFv,Fab,(Fab)2與IgG之人體化需要兩鏈中的氨基酸變化參與、輕與重鏈及保留兩鏈聚合。
如WO 04/041862中所述，抗TNF奈米抗體可以被人體化。人體化可包含第1與5位FR1殘基的突變化，而這些殘基是由用於全序列克隆的引子所導入並且不會在天然駱駝序列中出現。該殘基的突變化不會導致結合及/或抑制活性損失。人體化可能包含第74,76,83,84,93位FR3殘基的突變化。該殘基的突變化不會導致結合及/或抑制活性驟然損失。結合FR1與FR3的突變不會影響結合及/或抑制活性。人體化可能包含第108位FR4殘基的突變化。Q108L的突變化導致大腸桿菌中的低產量。108位是駱駝VHH中接觸溶劑處，而這位置的人類抗體則埋在VH-VL介面(Spinelli,1996；Nieba,1997)。108位的單離的VHs為接觸溶劑處。加入非極性疏水性Leu起帶極性不帶電的Gln可以得到顯著的固有分子折疊/穩定性效應。同時以44與45位的人類疏水性殘基(E44G與R45L)置換親水性殘基，不會影響結合及/或抑制。然而當加入F37V與F47W時，會發現結合及/或抑制活性的損失。模擬數據確認了37關鍵殘基以保留CDR3迴結構及活性的完整性(所有編號皆依照Kabat)。
根據一項現行本案的實例，人體化包含在單獨或合併的情況下換掉任何下列殘基：- FR1的1,5,28與30位，- FR2中44與45位的驗證氨基酸，- FR3殘基74,75,76,83,84,93與94，
- 及FR4中的103,104,108與111位；- 根據Kabat編號的編號。
一項現行本案中的實例為能夠決定該聚胜肽用於治療、預防及/或減緩與發炎過程相關異常的抗TNF-α聚胜肽或是核酸。發炎過程中就有TNF-α，阻斷TNF-α作用可以達到抗發炎的效果，這在像是克隆氏症的特定疾病階段中非常受到期待。這些例子根據本案結合TNF-α與更多層面、阻斷其結合於TNF-α受器以闡述VHHs。
現行本案的抗TNF-α聚胜肽可應用於自體免疫疾病，像是愛迪生氏症(腎上腺)、耳朵自體免疫疾病(耳朵)、眼睛自體免疫疾病(眼睛)、自體免疫肝炎(肝)、自體免疫腮腺炎(腮腺)、克隆氏症(小腸)、第一型糖尿病(胰臟)、副睾炎(副睾)、腎小球腎炎(腎臟)、葛瑞芙氏症(甲狀腺)，姬蘭巴雷症候群(神經細胞)、橋本氏病(甲狀腺)、溶血性貧血(紅血球)、全身性紅斑狼瘡(多重組織)、男性不孕(精液)、多重硬化症(神經細胞)、重症肌無力(神經肌肉關節)、天皰瘡(皮膚)、牛皮癬(皮)、風濕熱(心臟與關節)、風濕性關節炎(關節內襯)、類肉瘤病(多重組織與器官)、硬皮病(s皮與連結組織)、薛格連氏症候群(外分泌腺與其他組織)、脊柱關節病(中軸骨骼與其他組織)、甲狀腺炎(甲狀腺)、血管炎(血管)。
括弧內的表示受疾病影響的組織。所列出的自體免疫疾病是用來舉例而非概括。
現行本案中抗TNF-α聚胜肽可以接受的自體免疫情況包括AIDS、異位性過敏、支氣管氣喘、濕疹、痲瘋病、精神分裂症、遺傳憂鬱症、組織與器官移植、慢性疲勞症候群、阿茲海默症、巴金森氏症、心肌梗塞、中風、自閉症、癲癇、亞祖現象、過敏性反應及酒精與藥物成癮。在前面確認的自體免疫情況中，受影響的組織為首要標的，在其他例子中則為次要標的。這些情況有部份或大多數為自體
免疫症候群。因此在治療時，可以用此處所示相同的方法或同方法的層面，有時候會跟其他方法合併。
另一項現行本案的實例為根據本案使用有能力決定該用於製備治療與發炎過程有關異常的藥物之聚胜肽的抗TNF-α聚胜肽或是核酸。異常的例子有風濕性關節炎、克隆氏症、潰瘍性結腸炎、發炎性結腸症與多重硬化症。
根據現行本案的聚胜肽與核酸可能經靜脈注射之類的傳統路徑對主體給藥。然而，本案中抗TNF-α聚胜肽的特殊性質為它們能穿過像是組織膜及/或腫瘤的障礙，並在局部作用，而它們也穩定到能承受像是胃部的嚴苛環境。因此另一項現行本案的層面關於抗TNF-α聚胜肽的遞送。
當本案中奈米抗體及/或聚胜肽用來或預計用來預防或治療腸胃道疾病與異常時，特別指口服給藥或其他對腸胃道給藥，通常不必用到在血清中半生期較長的本案中聚胜肽(即已被PEG化或包含抗血清蛋白質之奈米抗體)。因此，根據此前提，本案中聚胜肽可用僅含本案中奈米抗體的。特別是還發現以口服給藥來預防與治療腸胃道合併及/或由TNF-α調控的疾病或異常(像是IBD與其他前述的腸胃道疾病與異常)，使用本案中單價奈米抗體或本質上帶有本案中單價奈米抗體的本案中聚胜肽較佳。針對其他因素，像是治療風濕性關節炎(RA)，使用兩價本案中奈米抗體則較佳。當該奈米抗體要透過血流到達其預期的位置，使用在血清中半生期長的本案中聚胜肽較佳。
根據本案的主體可為任何易受到醫療用聚胜肽治療的哺乳類。
口服遞送本案中抗TNF-α聚胜肽造成了該分子在受到異常影響之局部位置的克隆中形成活性形式。這些位置很有可能發炎並含有製造TNF-α的細胞。結合到TNF-α的本案中抗TNF-α聚胜肽可以局部抵銷TNF-α，避免散布到全身且限制了不利的副作用。通常像雷特氏微球
菌這類修飾過的微生物有能力分泌抗體或功能性部份。這類修飾過的微生物可用作腸內抗體或功能性部位局部生產與遞送之介質。使用生產抗TNF-α聚胜肽的物種，就可能治療發炎性結腸症。
另一項本案層面包含用非侵入性細菌的表面表現或分泌來遞送抗TNF-α聚胜肽，像是使用WO00/23471中描述的載體之乳酸菌類的革蘭氏陽性宿主組織。
一項現行本案的實例為此處的抗TNF-α聚胜肽用於治療、預防及/或緩解易受到本案中奈米抗體或聚胜肽調控的異常症狀，且它有能力通過胃部環境而不至於失去活性。
異常的例子為任何引起發炎者，包括但不限於風濕性關節炎、克隆氏症、潰瘍性結腸炎、發炎性結腸症與多重硬化症。知識豐富者就知道在擁有該聚胜肽組成時，置劑技術可能用在對的位置(在胃、結腸等)以釋放最大量的聚胜肽。遞送方法對治療、預防及/或緩解標的在腹部系統之異常症狀很重要。
一項本案層面為對治療、預防及/或緩解易受到本案中奈米抗體或聚胜肽調控的異常症狀，且它在口服對主體給予此處的抗TNF-α聚胜肽時有能力通過胃部環境而不至於失去活性。
另一項現行本案的實例為使用此處的抗TNF-α聚胜肽以製備治療、預防及/或緩解易受到本案中奈米抗體或聚胜肽調控的異常症狀之藥物，且它有能力通過胃部環境而不至於失去活性。
一項本案層面為以口服遞送對主體給予此處的抗TNF-α聚胜肽時，本案中奈米抗體或聚胜肽到腹部系統而不會失去活性的方法。
一項本案層面為以口服遞送對主體給予此處的抗TNF-α聚胜肽時，本案中奈米抗體或聚胜肽到血流而不會失去活性的方法。
另一項現行本案的實例為使用此處的抗TNF-α聚胜肽以製備治療、預防及/或緩解易受到遞送至陰道及/或直腸之本案中奈米抗體或
聚胜肽調控的異常症狀。
異常的例子為任何引起發炎者，包括但不限於風濕性關節炎、克隆氏症、潰瘍性結腸炎、發炎性結腸症與多重硬化症。在非限定的例子中，根據包含此處抗TNF-α聚胜肽之本案的劑型，形式為凝膠、乳霜、栓劑、薄膜，或該劑型描述於海綿形式或如同陰道環緩慢釋放活性成分(EP 707473,EP 684814,US 5629001)。
一項本案實例為治療、預防及/或緩解易受到遞送至陰道及/或直腸之本案中奈米抗體或聚胜肽調控的異常症狀之方法，透過陰道及/或直腸給予主體此處的抗TNF-α聚胜肽。
另一項現行本案的實例為使用此處的抗TNF-α聚胜肽以製備治療、預防及/或緩解易受到遞送至陰道及/或直腸之本案中奈米抗體或聚胜肽調控的異常症狀之藥物。
一項本案層面為遞送本案中奈米抗體或聚胜肽到陰道及/或直腸之方法，透過陰道及/或直腸給予主體此處的抗TNF-α聚胜肽，而不至於使該物質失去活性。
一項本案層面為遞送本案中奈米抗體或聚胜肽到血流之方法，透過陰道及/或直腸給予主體此處的抗TNF-α聚胜肽，而不至於使該物質失去活性。
另一項現行本案層面為此處的抗TNF-α聚胜肽用於治療、預防及/或緩解易受到遞送至鼻子、上呼吸道及/或肺部之本案中奈米抗體或聚胜肽調控的異常症狀之藥物。
異常的例子為任何引起發炎者，包括但不限於風濕性關節炎、克隆氏症、潰瘍性結腸炎、發炎性結腸症與多重硬化症。在非限定的例子中，根據包含此處抗TNF-α聚胜肽之本案的劑型，有鼻腔噴霧(例如氣膠體)或吸入劑。因為聚胜肽結構很小，它可以比醫療用的IgG分子更有效地到達其標的。
一項本案層面為以此處的抗TNF-α聚胜肽對主體給藥，用於透過嘴巴或鼻子吸入遞送至上呼吸道與肺部之治療、預防及/或緩解易受到本案中奈米抗體或聚胜肽調控的異常症狀之方法。
另一項現行本案實例為使用此處遞送至鼻子、上呼吸道及/或肺部的抗TNF-α聚胜肽，用於治療、預防及/或緩解易受到本案中奈米抗體或聚胜肽調控的異常症狀之藥物。
一項本案層面為以此處遞送至鼻子、上呼吸道及肺部而不失去活性的本案中奈米抗體或聚胜肽，對主體透過鼻子、上呼吸道及/或肺部給予此處的抗TNF-α聚胜肽之方法。
一項本案層面為以此處遞送至血流而不失去活性的本案中奈米抗體或聚胜肽，對主體透過鼻子、上呼吸道及/或肺部給予此處的抗TNF-α聚胜肽之方法。
一項現行本案的實例為此處的抗TNF-α聚胜肽用於治療、預防及/或緩解易受到遞送至腸黏膜之本案中奈米抗體或聚胜肽調控的異常症狀，其中該異常增加了腸黏膜的通透性。因為它們小，此處的抗TNF-α聚胜肽可以通過腸黏膜並更有效地到達帶有引起腸黏膜的通透性增加之異常的主體血流，例如克隆氏症。
一項本案層面為治療、預防及/或緩解遞送至腸黏膜之易受到本案中奈米抗體或聚胜肽調控的異常症狀之方法，其中該異常透過對主體口服給予此處的抗TNF-α聚胜肽而增加了腸黏膜的通透性。
此過程還可以更由額外的現行本案層面來改進-使用活性運輸載體。在本案層面中，VHH跟載體融合以加強透過腸壁到血流的傳輸。在一項非限定的例子中，「載體」是融合於醫療用VHH的第二個VHH。該融合結構是用學理中的方法所得。「載體」VHH專一地結合於腸壁上的受器而引發透過此壁的活性運輸。
另一項現行本案的實例為使用此處的抗TNF-α聚胜肽製備用於治
療、預防及/或緩解遞送至腸黏膜之易受到本案中奈米抗體或聚胜肽調控的異常症狀之醫藥，其中該異常增加了腸黏膜的通透性。
一項本案層面為透過對主體口服給予本案中抗TNF-α聚胜肽以遞送本案中奈米抗體或聚胜肽到腸黏膜而不失去活性的方法。
一項本案層面為透過對主體口服給予本案中抗TNF-α聚胜肽以遞送本案中奈米抗體或聚胜肽到血流而不失去活性的方法。
此過程還可以更由額外的現行本案層面來改進-使用活性運輸載體。在本案層面中，此處的抗TNF-α聚胜肽跟載體融合以加強透過腸壁到血流的傳輸。在一項非限定的例子中，「載體」是融合於該聚胜肽的VHH。該融合結構是用學理中的方法所得。「載體」VHH專一地結合於腸壁上的受器而引發透過此壁的活性運輸。
一項本案層面的實例為此處的抗TNF-α聚胜肽，用於治療、預防及/或緩解能有效穿透舌下組織之易受到本案中奈米抗體或聚胜肽調控的異常症狀。
異常的例子為任何引起發炎者，包括但不限於風濕性關節炎、克隆氏症、潰瘍性結腸炎、發炎性結腸症與多重硬化症。此處所示的該聚胜肽結構劑型有放在舌下並透過黏膜吸收至舌下微血管網的錠劑、噴劑、滴劑。
一項本案層面為治療、預防及/或緩解能有效穿透舌下組織之易受到本案中奈米抗體或聚胜肽調控的異常症狀之方法，透過舌下對主體給予此處的抗TNF-α聚胜肽。
另一項現行本案的實例為使用此處的抗TNF-α聚胜肽於製備治療、預防及/或緩解能穿透舌下組織之易受到本案中奈米抗體或聚胜肽調控的異常症狀之藥物。
一項本案層面為遞送本案中奈米抗體或聚胜肽到舌下組織而不失去活性之方法，透過舌下對主體給予此處的抗TNF-α聚胜肽。
一項本案層面為遞送本案中奈米抗體或聚胜肽到血流而不失去活性之方法，透過口服對主體給予此處的抗TNF-α聚胜肽。
一項現行本案的實例為此處的抗TNF-α聚胜肽，用於治療、預防及/或緩解能有效穿透皮膚之易受到本案中奈米抗體或聚胜肽調控的異常症狀。
異常的例子為任何引起發炎者，包括但不限於風濕性關節炎、克隆氏症、潰瘍性結腸炎、發炎性結腸症與多重硬化症。該聚胜肽結構劑型有貼在皮膚上穿透的乳霜、薄膜、噴劑、滴劑、貼片。
一項本案的實例治療、預防及/或緩解能有效穿透皮膚之易受到本案中奈米抗體或聚胜肽調控的異常症狀之方法，透過表皮對主體給予此處的抗TNF-α聚胜肽。
另一項現行本案的實例為使用此處的抗TNF-α聚胜肽於製備治療、預防及/或緩解能有效穿透皮膚織之易受到本案中奈米抗體或聚胜肽調控的異常症狀。
一項本案層面為遞送本案中奈米抗體或聚胜肽到皮膚而不失去活性之方法，透過表皮對主體給予此處的抗TNF-α聚胜肽。
一項本案層面為遞送本案中奈米抗體或聚胜肽到血流而不失去活性之方法，透過表皮對主體給予此處的抗TNF-α聚胜肽。
在另一項現行本案的實例中，抗TNF-α聚胜肽進一步包含如活性運輸載體般作用的載體奈米抗體(例如VHH)，以從肺腔到血液運輸該抗TNF-α聚胜肽。
進一步包含載體的抗TNF-α聚胜肽專一地結合於黏膜表面(支氣管表皮細胞)的受器，導致了該抗TNF-α聚胜肽從肺腔到血液的活性運輸。載體奈米抗體可能融合於聚胜肽結構。該融合結構可能用理論中的方法製得並在此描述。「載體」奈米抗體專一地結合於黏膜表面引起了透過表面的活性運輸。
另一項現行本案層面為決定哪個奈米抗體(例如VHHs)為經由鼻腔給藥活性運輸至血流之方法。類似的原始或免疫VHH噬菌體資料庫可以鼻腔給藥，並在不同時間點給藥之後，可以單離出血液或器官以釋放被活性運輸至血流的噬菌體。從肺腔到血液的活性運輸之非限定受器例子為Fc受器N(FcRn)。一項本案層面包括此方法確認的VHH分子。該VHH可以接著用作載體VHH以透過鼻腔給藥遞送醫療用VHH到血流中之對應標的。
在一項本案層面中，可以用此處的TNF-α聚胜肽來篩選調控聚胜肽結合到TNF-α的作用者。當在測量結合或僅有該聚胜肽置換的分析法中確認時，作用者必須送至功能性測試以決定它們是否會在體內調節抗原作用。
在置換實驗的例子中，表現TNF-α或片段的噬菌體或細胞是在結合緩衝液中與有標示的本案中聚胜肽一起培養，無論目標調節子是否有提高濃度。為證實並校正此分析，用提高濃度且未標示的該聚胜肽以進行控制競爭反應。培養後，大量地清洗細胞，而連結的與標示的聚胜肽則以提供的合適標示加以測試(例如閃爍計數、螢光等)。在目標調節子存在下損失了10%以上標示結合聚胜肽的量，表示目標調節子進行了結合置換。如果它們在濃度為1 μM以下置換了50%的標示聚胜肽(次飽和聚胜肽劑量)，則目標調節子被視作專一結合於此或其他此處所述分析。
另外，結合的結合或置換可用表面電漿共振(SPR)加以監測。表面電漿共振分析可以藉著本案中聚胜肽在水相到感測器膜上的固定TNF-α間之結合或去結合所引起之固定感測器附近的質量改變，用作定量方法以量測兩分子間的結合。此質量改變由注射或移去該聚胜肽或目標調節子後的共振單位對時間而量得，並用Biacore生物感測器(Biacore AB)加以測量。例如TNF-α可以根據Salamon等人(Salamon
et al.,1996,Biophys J.71：283-294；Salamon et al.,2001,Biophys.J.80：1557-1567；Salamon et al.,1999,Trends Biochem.Sci.24：213-219,其中每一個此處都以介面合併)描述的方法固定於薄膜脂質膜中的感測器晶片上(例如本案級CM5晶片；Biacore AB)。Sarrio等人指出SPR可用來偵測結合於在晶片上固定於脂質層的GPCR A(1)腺嘌呤核苷受器之配位基(Sarrio et al.,2000,Mol.Cell.Biol.20：5164-5174，此處都以介面合併)。在SPR分析裡本案中聚胜肽結合於TNF-α的條件，可以經熟練者用Sarrio等人報導的條件當作起始點加以精密調整。
起碼有兩個方法可以用SPR對調節子結合加以分析。首先，本案中聚胜肽可以預結合於固定的TNF-α，接著於0.1 nM到1 μM的濃度範圍再注射目標調節子。結合聚胜肽的置換可以定量，即證實了調節子結合的偵測。再者，膜結合TNF-α可以跟目標調節子預培養，並嘗試本案之聚胜肽。在該聚胜肽與加調節子預培養的TNF-α之間的結合親和力差異，和兩者之間無調節子時相比，可以解釋有調節子時該聚胜肽的結合或置換。另外的分析裡，對應於目標調節子不存在時結合的該聚胜肽之量，在目標調節子存在時結合的該聚胜肽之量下降了10%或更多表示目標調節子抑制了TNF-α與該聚胜肽的作用。
另一個偵測本案中聚胜肽的聚胜肽結合到TNF-α之抑制方法使用了螢光共振能量轉移(FRET)。FRET是發生在相互接近(通常相隔<100 Å)時，如果螢光給予者(D)的發射光譜與螢光接受者(A)的激發光譜重疊，D與A之間的量子力學現象。要測試的分子，例如本案中聚胜肽的聚胜肽，會與TNF-α與給予者和接受者的螢光團之互補配對一起標示。當由TNF-α一同緊密連結時：聚胜肽作用力、透過給予者螢光團激發的螢光發射，會跟該聚胜肽與TNF-α未連結時回應激發波長的發射有不同之波長，提供了測量各波長發射強度所得之結合對於未結合分子定量。給予者螢光團跟要標示的TNF-α已明示於學理
中。特別重要的變異為熟知的藍綠FP(CFP，給予者(D))及黃色FP(YFP，接受者(A))之A.Victoria GFP。例如YFP變異可以製造成融合蛋白質與TNF-α。表現GFP變異之融合(Clontech)為螢光團標示作用者(Molecular Probes)的載體已明示於理論中。將目標調節子加到螢光標示聚胜肽與YFP-TNF-α將導致能量轉移受到抑制，證據為對應於簡單但無目標調節子時之YFP螢光減少。在使用FRET來偵測TNF-α的分析中：在包含目標調節子的樣本中，對應於沒有目標調節子的樣本，接受者波長處10%以上螢光發射強度減少之聚胜肽作用，表示目標調節子抑制了TNF-α：聚胜肽作用。
此處所用的樣本可能為任何包含TNF-α的生物樣本，像是臨床(例如細胞碎片、全血、血漿、血清、組織、細胞等)、衍生自臨床、農業、法庭、本案或其他可能的樣本。臨床樣本可能來自人類或動物。所分析的樣本原本可以為固體或液體。在使用固體材料時，明顯地它們要先溶於合適的溶液中。
一項FRET的變異使用螢光淬熄以監測分子作用。作用對中的一個分子可以用螢光團標示，而其他的則在接近它的位置時，跟抵銷螢光團螢光的分子一起。激發的螢光改變表示跟螢光團：淬熄物配對標記之分子結合改變。通常標記的TNF-α螢光增加表示帶有淬熄物之抗TNF-α聚胜肽已被置換。關於淬熄分析，在包含目標調節子的樣本中，對應於沒有目標調節子的樣本，10%以上螢光發射強度增加表示目標調節子抑制了TNF-α：抗TNF-α聚胜肽作用。
在表面電漿共振與FRET方法之外，螢光極化測量對結合定量很有用。螢光極化的值對螢光標記分子而言，須視旋轉校正時間或滾動速率而定。像是那些由TNF-α與螢光標記的抗TNF-α聚胜肽一同形成之錯合物，就比未錯合且標記的聚胜肽有更高的極化值。對應於沒有目標抑制劑的混合物，如果目標抑制劑干擾或抑制了TNF-α與該聚胜
肽作用，則TNF-α：抗TNF-α聚胜肽作用之目標抑制劑的內容導致了螢光極化的衰減。螢光極化很適合確定干擾TNF-α：抗TNF-α聚胜肽錯合物形成的小分子。對應於缺乏目標調節子的樣本之螢光極化，包含目標調節子的樣本減少10%以上螢光極化，表示目標調節子抑制了TNF-α：抗TNF-α聚胜肽作用。
另一項監測TNF-α：抗TNF-α聚胜肽作用的選擇使用的是生物感測器分析。文獻中有記載ICS生物感測器(Australian Membrane Biotechnology Research Institute；Cornell B,Braach-Maksvytis V,King L,Osman P,Raguse B,Wieczorek L,and Pace R."A biosensor that uses ion-channel switches" Nature 1997,387,580)。在此技術中，TNF-α與抗TNF-α聚胜肽合併了關閉懸吊膜雙層中促進短桿菌抗生素的離子通道，並因此帶來生物感測器中可測得的導納改變(類似組抗)。此方法為導納改變六個級數的線性倍數，且理論上適用於大規模、高通量的小分子組合資料庫篩選。對應於缺乏目標調節子的導納，包含目標調節子的樣本改變10%以上(增加或減少)導納，表示目標調節子抑制了TNF-α與該聚胜肽之作用。要注意分析中測試TNF-α與抗TNF-α聚胜肽之作用，作用的調節子可能不必直接跟與該聚胜肽有物理作用的蛋白質區域發生作用。調節子也可能跟從作用位移除的位置作用，並引起TNF-α中的構形改變。在此情況中作用的調節子(抑制劑或促進劑)還是當作調節TNF-α對其受器結合的作用者。
任何描述過的結合分析都可用來決定樣本中作用劑的存在，例如結合於TNF-α或影響本案中聚胜肽的聚胜肽結合於TNF-α之組織樣本。為此，TNF-α會跟該聚胜肽在樣本有無時反應，並針對所用的結合分析適當地測量聚胜肽結合。該聚胜肽中減少10%以上的結合，表示該樣本包含了調節該聚胜肽與TNF-α結合之作用者。當然，前述一般化的方法可能容易用於篩選能改變任何本案中抗TNF-α聚胜肽之間
結合的目標調節子，可以是同源序列、功能性部位或同源序列的功能性部位，以及TNF-α或片段。
一項現行本案的實例為此處方法所確認的未知作用者。
一項現行本案的實例為此處方法所確認的未知作用者，用來治療、預防及/或緩解與發炎過程有關的異常症狀。
另一項現行本案的實例為使用此處方法所確認的未知作用者來治療、預防及/或緩解與發炎過程有關的異常症狀。
異常的例子包括風濕性關節炎、克隆氏症、潰瘍性結腸炎、發炎性結腸症與多重硬化症。
根據本案有用的細胞最好選自帶有大腸桿菌之類的細菌細胞、釀酒酵母與甲醇畢赤酵母之類的酵母細胞、昆蟲細胞或哺乳類細胞之群組。
根據本案有用的細胞可以為任何細胞到決定包含本案中抗TNF-α之聚胜肽、同源序列、功能性部位或同源序列的功能性部位的核酸序列，根據本案可以加入表現於此處定義之自然等級或高於自然等級的聚胜肽。理想的本案中聚胜肽在細胞中表現會顯示此處定義之一般或近乎一般的藥理。
根據現行本案的較佳實例，細胞會選自帶有COS7細胞、CHO細胞、LM(TK-)細胞、NIH-3T3細胞、HEK-293細胞、K-562細胞或1321N1星狀細胞瘤細胞和其他感染性細胞株的群組。
通常「醫療有效量」、「醫療有效劑量」與「有效量」表示要達到理想結果或結果(調節TNF-α結合；治療或預防發炎)所需的量。理論中一項普通的技術可確認藥效，而「有效量」可隨著調節本案中所用TNF-α結合的不同化合物而改變。熟悉理論者即可評估化合物的藥效。
如此處所用，「化合物」一詞表示有能力決定該聚胜肽或根據此
處所述之篩選方法確認的作用者之現行本案的抗TNF-α聚胜肽、組成，或核酸，或是該聚胜肽包含了一個以上衍生化的氨基酸。
「醫藥上可接受」表示非生物或其他方面不預期之材料，即該材料可能單獨對個體連同化合物給藥而不加任何其他它含有的醫療組成之成分。
此處的抗TNF-α聚胜肽有用於治療或預防主體的情況，並包含給予化合物或組成的醫藥有效量。
現行本案的抗TNF-α聚胜肽有用於在主體中治療或預防關於風濕性關節炎、克隆氏症、潰瘍性結腸炎、發炎性結腸症與多重硬化症的情況，並包含給予結合於TNF-α之化合物或組成的醫藥有效量。
此處的抗TNF-α聚胜肽有用於治療或預防主體的情況，並包含給予化合物合併阿斯匹靈之類的醫藥有效量。
此處的抗TNF-α聚胜肽有用於在主體中治療或預防關於風濕性關節炎、克隆氏症、潰瘍性結腸炎、發炎性結腸症與多重硬化症的情況，並包含給予化合物合併阿斯匹靈之類的醫藥有效量。
現行本案不限於包含單一本案中化合物的劑型。本案範圍還包含提供合併療法，其中給所需患者的劑型包含一個以上本案中化合物。
由TNF-α調控的情況包括但不限於風濕性關節炎、克隆氏症、潰瘍性結腸炎、發炎性結腸症與多重硬化症。
現行本案中有效的化合物可以製成醫藥組成並對哺乳類宿主給藥，像是依合適的途徑對人類患者或家畜給藥，即口服或靜脈或鼻腔內的吸入、靜脈注射、肌肉注射、表面或皮下途徑。
現行本案的化合物可以用基因治療遞送法給藥。即參見U.S.Patent No.5,399,346，其全篇附有參考資料。使用基因治療遞送法，針對現行本案化合物與基因感染的初代細胞可以另外跟對組織專一的
啟動子感染而對準特定器官、組織、轉植物、腫瘤，或細胞。
因此，現行化合物可以全身給藥，即合併醫藥上可接受的介質來口服，像是惰性稀釋液或可同化的食用性載體。它們可能呈現硬或軟的殼狀膠質膠囊，可能壓入錠劑中，或直接與患者飲食併用。針對口服治療給藥，活性化合物可能合併一個以上的賦形劑，並使用於可吞式錠劑、口腔錠劑、藥片、膠囊、萬用藥、懸浮液、糖漿、薄片及其類似物。該組成與製備應包含0.1%以上的有效化合物。組成和製備的百分比當然可能不同，並以介於單位劑量形式重量的大約2到60%之間最方便。有效化合物的量在醫藥有效組成中，即達到有效劑量等級。
錠劑、藥片、藥丸、膠囊及類似物可能含有下列者：樹膠制藥之類的連結物、橡膠、穀類澱粉或膠質；像是磷酸二鈣的賦形劑；像是穀類澱粉、馬鈴薯澱粉、藻酸與類似物之類的分散劑；像是硬脂酸鎂的潤滑劑；蔗糖、果糖、乳糖或阿斯巴甜之類的增甜劑或薄荷、冬青油或櫻桃香料之類的香味劑都可能添加。當單位劑量形式為膠囊時，它可能包含了上述材料類型之外的液態載體，像是蔬菜油或聚乙二醇。不同的其他材料可能為包覆物或用來修飾固態單位劑量形式的物理型態。例如錠劑、藥丸或膠囊可能包在膠質、臘、蟲漆或糖與類似物之內。糖漿或萬用藥可能包含活性成分、當作增甜劑的蔗糖或果糖、當作防腐劑的甲基與對羥基苯甲酸丙酯、染料與櫻桃或橘子香味的香料。當然任何用於製造任何單位劑量型式的材料應該為醫藥上可接受，並且該使用量本質上無毒。此外，活性化合物可能與緩效製劑與設備併用。
活性化合物也可能透過灌注或注射進行靜脈注射或腹膜內給藥。活性化合物或其鹽類的溶液可製於水中，並選擇性地與無毒介面活性劑混合。分散形可以製於甘油、液態聚乙二醇、醋酸甘油與混合
物及油中。在一般儲存與使用條件下，這些製備添加了防腐劑以防止微生物生長。
適用於注射或灌注的醫藥劑型，可包含帶有適用於殺菌注射或灌注溶液或分散液之臨時製備的活性成分殺菌水溶液或分散液或殺菌粉末，並選擇性地包覆在微脂體中。所有情形中，最終劑型必須是殺菌的、流狀並在生產與存放條件下穩定。液態載體或介質可為溶劑或包含水、乙醇、多醇(例如甘油、丙二醇、液態聚乙二醇與類似物)、蔬菜油、無毒甘油酯與適當混合物之類的液態分散媒介。可藉由形成微脂體在分散條件中維持必需的顆粒大小或使用介面活性劑以保持適當的流動性。要防制微生物孳長可以用不同的抗菌與抗真菌藥物，例如對羥基苯甲酸、氯丁醇、酚、己二烯酸、硫柳汞與類似物。在很多情況中，最好是有等張劑，像是糖、緩衝液或氯化鈉。可注射組成的長效吸收，可藉由使用延長吸收劑的組成來達到，例如硬脂酸鋁與膠質。
殺菌注射溶液的製備是合併了必需量的活性化合物與不同的其他前述列舉成分於適當溶劑中，接著再過濾殺菌。在製備殺菌注射溶液的殺菌粉末情況中，較佳的製備方法是真空乾燥與冷凍乾燥技術，可以得到活性成分的粉末加上任何前面殺菌過濾溶液中額外需要的成分。
針對表皮給藥，現行化合物可能以單純形式使用，即液態。然而，通常將它們合併皮膚可接受的固態或液態載體之組成或劑型來對皮膚給藥較理想。
有用的固態載體包含精細打散過的固體，像是滑石、黏土、微晶纖維素、矽、氧化鋁，及其類似物。有用的液態載體包括水、羥基烷類或二醇類或水-醇/二醇混合物，其中本案中奈米抗體及聚胜肽可溶解或分散至有效程度，並選擇性地添加無毒介面活性劑。像是芳香
劑及附加的抗微生物劑這些佐藥，可用來增強既定用途的性質。最終的液態組成可以從吸收墊上取用，用以填充繃帶與其他裝備，或是以幫浦式或氣膠式噴霧器噴灑到有效區域上。
增稠劑則有合成高分子、脂肪酸、脂肪酸鹽與酯類、脂肪醇、修飾過的纖維素或修飾過的礦物材質，均可以與液態載體合用以直接在皮膚上形成可分散的糊狀物、凝膠、軟膏、肥皂，及其類似物。
可用來遞送本案中化合物到皮膚上的有用皮膚組成實例，在學術中已很清楚；例如，可參見Jacquet et al.(U.S.Pat.No.4,608,392),Geria(U.S.Pat.No.4,992,478),Smith et al.(U.S.Pat.No.4,559,157)與Wortzman(U.S.Pat.No.4,820,508)。
該化合物的有用劑量，可比較它們在動物模型中的體外與體內活性而知。用來推斷從老鼠與其他動物到人類的有效劑量之方法，在學理中已為人所知；例子可參考U.S.Pat.No.4,938,949。
通常，該化合物在像是乳霜這種液態組成中的濃度大約為0.1-25 wt-%，較佳的約0.5-10 wt-%。在像是凝膠或粉末的半固態或固態組成中之濃度大約為0.1-5 wt-%，較佳的約0.5-2.5 wt-%。
治療上需要使用的化合物或有效鹽類或衍生物，量會隨著特定選擇的鹽類以及給藥途徑而不同，患者在治療時的條件本身、年紀與狀況，最終都會左右在場醫師或臨床醫師的決定。同樣地，化合物的劑量也會隨目標細胞、組織、移植物或器官而不同。
理想的劑量可能以單一劑量或在適當間格的分散給藥劑量較方便表現，例如每日二、三、四或更多的次劑量。次劑量本身可能再進一步分配，即分成間格給藥的分散數目；像是從吹藥器的多次吸入或滴入眼睛的使用次數
給藥方法可包括長期、每日治療。「長期」表示起碼兩個星期，甚至是為期數週、月、或年。此劑量範圍的必要修飾，可使用一項此
處所教的例行實驗於理論中的一項常用技巧來決定。參見Remington’s Pharmaceutical Sciences(Martin,E.W.,ed.4),Mack Publishing Co.,Easton,PA。劑量也可由個別醫師於任何複雜因素中加以調整。
此本案對TNF-α/TNF-α-受器作用的調節子提供了一種藥物。
目標藥物可能為合成藥物或是藥物混合物，或可能為天然物(例如植物萃取物或培養表層物)。根據本案的目標藥物包含可合成、天然萃取物、胜肽、蛋白質、碳水化合物、脂質等的小分子。
來自大型合成或天然物資料庫的目標調節子藥物可被篩選出來。現在用大量方法於以糖類、胜肽及核酸為基礎的藥物之隨機與定向合成。合成藥物資料庫可以從很多上市公司買到，包括Maybridge Chemical Co.(Trevillet,Cornwall,UK),Comgenex(Princeton,NJ),Brandon Associates(Merrimack,NH)，與Microsource(New Milford,CT)。而Aldrich(Milwaukee,WI)提供了一個希罕的化學資料庫。可以購得或製得組合資料庫。另外，細菌、真菌、植物與動物萃取物之天然藥物資料庫可從Pan Laboratories(Bothell,WA)或MycoSearch(NC)取得，或自行用理論中的方法製造。此外，天然與合成生產的資料庫與藥物可以透過傳統化學、物理及生化方法加以修飾。
有用的藥物可能在大量化學分類中找到。有用的藥物可能為有機物或小型有機物。小型有機物的分子量大於50但小於2,500道爾吞，較佳的是小於750左右，最好能小於350道爾吞左右。分類的例子有雜環、胜肽、糖類、固醇及類似物。該藥物可以修飾來提高藥效、安定性、藥物相容性與相似者。可使用藥物的結構確認來確認、生產或篩選更多藥物。例如確認了胜肽藥物時，它們可以用不同方法修飾以提高其安定性，像是用D-氨基酸這類的非天然的氨基酸，特別是D-丙氨酸，可透過改變氨端或羧端的方式，像是對於氨基，有醯
化、烷基化，而對於羧基，有酯化或醯胺化或類似者。
對於初步篩選，根據本案的有用目標藥物濃度從大約10 mM至大約100 μM或以上(即1 mM,10 mM,100 mM,1 M等)。初步篩選濃度將連同其他九個濃度用作上限，其中其他濃度是藉由在半對數間隔處降低初步篩選濃度來決定(例如9個更多濃度)，以作為第二篩選或用來產生濃度曲線。
根據本案的高速篩選套組包含所有需要的方法與介質，在聚胜肽存在下透過與TNF-α作用以完成偵測調控TNF-α/TNF-α-受器作用的藥物，理想的濃度範圍是1μM到1 mM。
套組包含了下列物。本案中重組細胞，包含並表現決定TNF-α的核苷酸序列，它是根據固體支持物上的套組而生長，像是微量滴定盤，根據理論的實驗者所知之方法，尤其是WO 00/02045中所描述，更理想的是96槽的微量滴定盤。另外TNF-α是來自待固定的純化形式，例如理論實驗者操作的96槽微量滴定盤。而TNF-α是來自預固定的套組，例如96槽微量滴定盤。此TNF-α可能為全TNF-α或其片段。
根據本案的調節子藥物在濃度從大約1 μM到1 mM以上，在有適當濃度的抗TNF-α聚胜肽、其同源序列、其功能性部位或同源序列的功能性部位時，加到定義好的槽中，該聚胜肽的該濃度最好在1 μM到1 mM的範圍內。套組可能包含一個以上的抗TNF-α聚胜肽。
結合分析是根據此處提出的方法進行，結果會與基線等級相比，例如TNF-α結合於抗TNF-α聚胜肽、其同源序列、其功能性部位或同源序列的功能性部位，但未添加調節子藥物。選至後續分析的槽是在TNF-α聚胜肽結合中(例如)與未加調節子的活性等級相比，表現出兩倍以上、較佳的為5倍，更好的為10倍，而最好的是100倍以上的增加或減少。
本案提供了其他對篩選TNF-α/TNF-α-受器作用之調節子有用的
套組，就像可用於TNF-α失調之異常診斷的套組。本案也提供了可用來篩選異常之調節子的有用套組，像是其診斷的套組，該異常是由一個以上包含TNF-α的過程所造成。根據本案的有用套組包括單離的TNF-α。另外，套組可以包含轉變至表現TNF-α的細胞。在進一步的實例中，根據本案的套組還包含決定TNF-α的聚核苷酸。在更進一步的實例中，根據本案的套組可能包含用於增加TNF-α的特殊引子。根據本案有用的套組可能包含單離的TNF-α聚胜肽、其同源子，或其功能性部位。根據本案的套組可包含轉變至表現該聚胜肽的細胞。套組可能包含一個以上聚胜肽。在進一步的實例中，根據本案的套組可能包含決定TNF-α的聚核苷酸。在更進一步的實例中，根據本案的套組可能包含用於增加巨分子的特殊引子，例如TNF-α。所有根據本案的套組將包含所述的項目或項目組合與套裝材料。套組還會包含使用指示。
再者，實驗者將會知道可能「轉植」一個以上前述的本案中奈米抗體之CDR到其他「骨架」上，包括但不限於人類骨架或非免疫球蛋白骨架實驗者將會知道且理論中亦有對於該CDR轉植的合適骨架與技術，可參見US-A-7,180,370,WO 01/27160,EP 0 605 522,EP 0 460 167,US-A-7,054,297,Nicaise et al.,Protein Science(2004),13：1882-1891；Ewert et al.,Methods,2004 Oct；34(2)：184-199；Kettleborough et al.,Protein Eng.1991Oct；4(7)：773-783；O’Brien and Jones,Methods Mol.Biol.2003：207：81-100；and Skerra,J.Mol.Recognit.2000：13：167-187，與Saerens et al.,J.Mol.Biol.2005 Sep 23；352(3)：597-607以及該處引用的深入資料。例如，用來轉植老鼠或老鼠CDR到人類骨架結構的本身已知技術可用於類似條件中，以提供包含一個以上本案中奈米抗體CDR與一個或人類骨架區域或序列的虛擬蛋白質。
因此，在另一項實例中，本案包含了帶有以一個以上選自帶有
針對本案中奈米抗體的此處提及之CDR1序列、CDR2序列與CDR3序列群組的CDR序列之虛擬聚胜肽。較理想的是該擬聚胜肽包含一個以上選自帶有針對本案中奈米抗體的此處CDR3序列之群組的CDR序列，選擇性地還有一個以上針對本案中奈米抗體的此處CDR1與CDR2序列之群組的CDR序列。例如，該擬聚胜肽包含一個以上選自帶有針對本案中奈米抗體的此處CDR3序列之群組的CDR序列，一個選自帶有針對本案中奈米抗體的此處CDR1序列之群組的CDR序列，與一個選自帶有針對本案中奈米抗體的此處CDR1與CDR2序列之群組的CDR序列。此處提到適用於本案中奈米抗體的CDR組合通常將適用於這些虛擬聚胜肽。
在該虛擬聚胜肽中，CDR可能連結於進階氨基酸序列的序列及/或透過氨基酸序列相互連結，其中該氨基酸序列為理想的骨架序列或形同骨架序列的氨基酸序列，或是一同形成表現CDR的骨架。最後一段所提的理論之前還有資料。根據一項重要實例，該氨基酸序列為人類骨架序列，例如VH 3骨架序列。然而，可能會用非人類、合成、半合成或非免疫球蛋白骨架序列。理想的是所用的骨架序列為(1)虛擬聚胜肽有能力結合xxxx，即其親和力對應於本案中奈米抗體的親和力起碼達1%，能達5%較佳，更好的要達10%，像是起碼25%甚至高達50%或90%以上；(2)虛擬聚胜肽適用於醫藥用途；及(3)虛擬聚胜肽最好本質上在醫藥用途(即指示、給藥模式、劑量與治療方法)的預期條件下為非免疫性(這可能針對使用本案中奈米抗體為對此處所述條件本質上的類似物)。
根據一項非限定實例，虛擬聚胜肽包含兩個以上透過一個以上骨架序列連結的CDR序列，其中理想的是兩個CDR序列中一個以上是CDR3序列，而另一個CDR序列為CDR1或CDR2序列。根據一項重要但非限定的實例，虛擬聚胜肽包含兩個以上在兩個以上骨架序列相連
的CDR序列(如前述)，其中理想的是三個CDR序列中一個以上是CDR3序列，而另二個CDR序列為CDR1或CDR2序列，最好是一個CDR1序列與一個CDR2序列。根據一項特別重要但非限定的實例，虛擬聚胜肽的結構為FR1’-CDR1-FR2’-CDR2-FR3’-CDR3-FR4’，其中CDR1,CDR2與CDR3為此處對本案中奈米抗體定義的CDR，而FR1’,FR2’,FR3’與FR4’為骨架序列。FR1’,FR2’,FR3’與FR4’可能特別指人類抗體(像是VH3序列)分別的骨架1、骨架2、骨架3與骨架4序列及/或該骨架序列的部份或片段。還可以與FR1’-CDR1-FR2’-CDR2-FR3’-CDR3-FR4的結構使用虛擬聚胜肽的部份或片段。重要的是，該部份或片段代表它們符合前段提出的標準。
本案還關於包含及/或本質上帶有該虛擬聚胜肽的蛋白質與聚胜肽，決定該蛋白質或聚胜肽的核酸；製備該蛋白質與聚胜肽的方法；表現或能表現該蛋白質或聚胜肽的宿主細胞；組成，特別是包含該蛋白質或聚胜肽、核酸或宿主細胞的醫藥組成；與使用該蛋白質或聚胜肽、該核酸、該宿主細胞及/或該組成，特別是預防、治療或診斷目的，像是此處提及的預防、治療或診斷目的。例如，該蛋白質、聚胜肽、核酸、方法、宿主細胞、組成與用途，可能類似於此處所述對於本案中奈米抗體的蛋白質、聚胜肽、核酸、方法、宿主細胞、組成與用途。
要注意當本案中奈米抗體包含一個以上其他CDR序列而非前述的理想CDR序列時，這些CDR序列可為任何適合(即適於此處描述的目的)CDR序列及/或這些序列可在任何本身已知的情況中得到，例如從奈米抗體(較佳)、傳統抗體的VH區(特別是從人類抗體)、重鏈抗體、傳統4鏈抗體(像是傳統人類4鏈抗體)或其他用來對抗TNF的免疫球蛋白序列。該用來對抗xxxx的免疫球蛋白序列可得自任何本身已知的條件，實驗者將會知道，即透過跟TNF免抑或透過跟
TNF篩選適合的免疫球蛋白資料庫，或任何適當的組合。而這個之後可能接著隨機或位置導向的突變化技術及/或其他本身已知的親和力成熟技術。實驗者將會知道對於該免疫球蛋白序列的合適生產技術，例如包含Hoogenboom,Nature Biotechnology,23,9,1105-1116(2005)回顧的篩選技術。其他製造對抗特定標的之免疫球蛋白的技術包括奈米克隆技術(例如未發表的美國臨時專利應用60/648,922中所描述)，即所謂的SLAM技術(例如歐洲專利應用0 542 810中所描述)，使用基因轉植鼠表現人類免疫球蛋白或已知的融合瘤技術(見Larrick et al,Biotechnology,Vol.7,1989,p.934)。所有這些技術可以用來生產對抗TNF的免疫球蛋白，而該免疫球蛋白的CDR可以用於本案中奈米抗體，即如前面所述。例如該CDR的序列可以決定、合成及/或單離，並插入本案中奈米抗體的序列(例如用來置換對應的原始CDR)，皆使用像此處所述之本身已知的技術，或包含該CDR(或決定相同者之核酸)的本案中奈米抗體可以使用此處所提的技術從頭合成。
附加表為現行規格中的完整部份，並如下列：單價TNFα奈米抗體
表8：TNFα奈米抗體之序列條列
表9：人類TNFα奈米抗體之Koff值
表10：TNFα與血清白蛋白奈米抗體對人類生殖腺序列之同源性
表11：TNFα與血清白蛋白奈米抗體之表現級
表12：ELISA結合於人類與恆河猴TNFα
表13：TNFα奈米抗體之受器抑制分析
表14：TNFα奈米抗體之Biacore分析
表15：TNFα奈米抗體與TNFα之結合(KD-值)
表16：抵銷人類與恆河猴TNFα之TNFα奈米抗體效力
表17：溫度處理後TNFα與血清白蛋白奈米抗體之OD280nm
表18：溫度處理後TNFα奈米抗體之效力
二價TNFα奈米抗體
表19：二價TNFα奈米抗體與連結序列之序列條列
表20：二價TNFα奈米抗體組成
表21：二價TNFα奈米抗體之表現級
表22：二價TNFα奈米抗體之受器抑制分析
表23：抵銷人類(a)與恆河猴(b)TNFα之TNFα奈米抗體效力
表24：二價TNFα奈米抗體之OD280nm
人體化單價TNFα奈米抗體
表25：人體化單價TNFα與血清白蛋白奈米抗體之序列條列
表26：人體化TNFα與血清白蛋白奈米抗體之表現級
表27：抵銷人類TNFα之TNFα奈米抗體效力
表28：人體化TNFα與血清白蛋白奈米抗體之OD280nm
三價TNFα奈米抗體
表29：三價TNFα奈米抗體之序列條列
表30：三價TNFα奈米抗體組成
表31：三價TNFα奈米抗體之表現級
表32：抵銷人類TNFα之三價TNFα奈米抗體效力
表33：三價奈米抗體與血清白蛋白之結合(KD-值)
表34：三價TNFα奈米抗體之OD280nm
人體化單價TNFα奈米抗體(第二回)
表35：第二回人體化單價TNFα奈米抗體之序列條列
表36：人體化TNFα奈米抗體之表現級
表37：抵銷人類TNFα之TNFα奈米抗體效力
表38：人體化TNFα奈米抗體之OD280nm
表39：比較奈米抗體之生物活性
進階表
表40：用於三價奈米抗體TM成形之寡核苷酸總覽
表41：用於三價奈米抗體TM克隆之寡核苷酸總覽
表42：與市售對照組(Enbrel,Remicade,Humira)相比，使用三價奈米抗體TM於細胞毒性分析中所得之EC50值
表43：在Biacore.Nd，中的人類血清白蛋白之TNF60與TNF24親和力確認未完成
表44：用於二價奈米抗體TM成形之寡核苷酸總覽
表45：與市售對照組(Enbrel,Remicade,Humira)相比，使用二價奈米抗體TM於細胞毒性分析中所得之EC50值
表46：衍生自滑膜的纖維母細胞之本案結果
表47：老鼠氣袋之本案結果
在星期間隔中藉由100 μg細胞激素6次注射，與人類TNFα使用兩種駱駝(雙峰駱駝)免疫之拮抗型奈米抗體。使用競爭為依據的分析來篩選，其中對個別奈米抗體分析它們抑制標示的TNFα與其受器結合之能力。白蛋白專一奈米抗體是從與人類血清白蛋白免疫的駱駝所確認。用ELISA來篩選個別奈米抗體，使用了人類、恆河猴與老鼠的白蛋白，得到一盤奈米抗體與不同物種之血清白蛋白的家差反應。
例2：單離之奈米抗體的序列分析
不同奈米抗體的等級是依照序列分析使用BLOSUM62積分陣列與截止60%之類似性重要值而確認(圖1)：等級I(PMP1 C2,PMP1 G11,PMP1 H6)，等級II(PMP1 G5,PMP1 H2,PMP3 G2)，等級IIb(PMP1 D2)，等級III(PMP3 D10,PMP5 F10)。表8列出了這些TNFα
奈米抗體的序列(序列編碼：52至60)。
根據序列分析(圖2)不同血清白蛋白奈米抗體的分類是使用BLOSUM62積分陣列與截止60%之類似性重要值而確認。表8列出了這些血清白蛋白奈米抗體的序列(序列編碼：61至67)。
奈米抗體與TNFα之結合是由表現電漿共振於Biacore 3000儀器中測得。不同物種的TNF會透過胺耦合共價連結到CM5感測器晶片表面，直到增加達250倍反應單位。保持反應基團是沒有活性的。奈米抗體結合是在一種濃度下評估(1稀釋到1,000)。每個奈米抗體皆以45 μl/min的流速注射4分鐘，以讓與晶片連結的抗原結合。沒有奈米抗體的連結緩衝液在相同流速下帶出晶片，以同時與連結的奈米抗體分開4小時。Koff-值是從不同奈米抗體所得的感應圖算出。
每種奈米抗體等級的未純化蛋白質皆在Biacore中分析。Koff數據則列在表9中。
每個等級的代表性奈米抗體將根據koff值保留至後續分析。對等級I選擇了PMP1C2(TNF1)；對等級II則選PMP1G5(TNF2)為代表；對等級III則選PMP5F10(TNF3)為代表。
除了使用1稀釋到20，根據前述來分析結合。圖3、4與5顯示了使用未純化蛋白質篩選白蛋白專一TNFα奈米抗體相對於人類、恆河猴與老鼠血清白蛋白。
根據koff-值對奈米抗體進行排序，可見下表40：
最佳的koff是得自C族與B族的成分。從那些族的成分也可觀察老鼠、人類與恆河猴血清白蛋白之間的交叉反應性。針對後續分析定議了等級B與C的代表性奈米抗體：等級B的代表為PMP6A6(ALB1)，等級C的代表為PMP6A8(ALB2)。
pAX051為pUC19之衍生物。它包含用IPTG而能表現控制引導的LacZ啟動子。此載體對Ampicillin或Carbenicillin有對抗基因。多克隆為包含了數個限制位，其中SfiI與BstEII經常用於奈米抗體TM之克隆。在NB編碼序列的框架中，載體對C端c-myc標記與(His)6標記編碼。訊息胜肽為轉移表現的奈米抗體TM至細胞間質的gen3引導序列。
對選定的奈米抗體TNF1(PMP1C2),TNF2(PMP1G5),TNF3(PMP5F10),ALB1(PMP6A6)與ALB2(PMP6A8)之DNA編碼在pAX051中克隆出來，而其結構轉變為TG1電穿孔法勝任細胞。對於PCR插入分析了克隆，而核苷酸序列則由4個正向克隆決定。甘油原料則由包含正確序列且存放於-80℃的克隆所製得。
預培養藉由接種在Luria Broth,Ampicillin/Carbenicillin(100μg/ml)與2%葡萄糖在37℃下過夜表現個別奈米抗體的單一克隆群落開始。此預培養是用來接種的。接種體為生產培養(TB介質+Ampicillin/Carbenicillin+0.1%葡萄糖)之1%(v/v)。生產培養在37℃下生長，直到達5-10的OD600nm，且奈米抗體之表現藉由添加IPTG(最終濃度1mM)而開始。蛋白質表現以37℃下4小時或28℃下過夜持續進行，在該點上藉離心收集細胞並於-20℃下儲存於濕細胞膠中。
-20℃儲存的濕細胞膠之製備級細胞間質萃取物，是藉由間質緩衝液(50mM NaH2PO4,300mM NaCl，調整pH至8.0)中再懸浮藥丸而得，將混合物於4℃旋轉30分鐘，並用製備級離心(Sorvall RC-3C Plus與H-6000A旋轉子)將混合物離心而讓細胞變成球形。浮在表面的表示細胞間質處的粗萃取物，也收集來進一步純化。
His(6)-標記的奈米抗體在固相金屬親和性管柱層析(IMAC)上純化。根據製造者說明處理TALON樹脂(Clontech)。萃取物跟樹脂一起在室溫下於旋轉器上培養30分鐘。樹脂用PBE洗過再轉填至管柱。填充好的樹脂用15 mM咪唑洗過。沖提部份藉由點在雜交膜上來分析，並以紅色素染色觀察。將包含蛋白質的部份集中起來對PBS透析。透析過的蛋白質則予以收集、過濾殺菌、確定濃度，並於-20℃下等分儲存。
表10中比較了奈米抗體氨基酸序列與人類生殖細胞序列。人類序列的同源性順序中，奈米抗體的排序如下：對TNFα奈米抗體為TNF1>TNF2>TNF3；對血清白蛋白奈米抗體為ALB1>ALB2。
表現級計算於表11中。生產奈米抗體之排序如下：對TNFα奈米抗體為TNF1>TNF2>TNF3；對血清白蛋白奈米抗體為ALB1>ALB2。
為決定純度，蛋白質樣品在15% SDS-PAGE膠上分析。將10μl Laemmli樣品緩衝液加到10μl(1ug)純化過的蛋白質中，將樣品加熱10分鐘到95℃，予以冷卻並塗到15% SDS-PAGE膠上。根據一般程序處理此膠並以Coomassie Brilliant Blue(CBB)染色。圖6表示對TNFα-專一及血清白蛋白專一的奈米抗體之SDS-PAGE。
將100 ng純化過的蛋白質塗到膠上。在SDS-PAGE之後，使用Mini Trans-Blot®電泳轉移細胞(Biorad)將蛋白質轉移硝基纖維素膜上。此膜在PBS與1%酪蛋白中於4℃下封閉過夜。
因為所有的結構都跟c-myc標記融合了，所以用老鼠單克隆抗myc抗體當作偵測器。此外，兔子多克隆抗奈米抗體(R23)也用作偵測器。該點墨在室溫下於PBS裡的1/2000稀釋抗myc抗體中或是於PBS裡的1%酪蛋白中之1/2000抗奈米抗體激化培養1小時。在使用第二抗體(兔子抗老鼠IgG鹼性磷酸共軛基，Sigma,A1902，稀釋1/1000於PBS或山羊抗兔子IgG鹼性磷酸共軛基，Sigma,A8025,1%酪蛋白)前，於PBS中洗該膜5次。於室溫下溫和激化培養1小時後，於PBS中洗該膜5次。用BCIP/NBT溶液促成點墨，而在各帶已清晰可見時，以milliQ水清洗來停止反應。圖7呈現的為西方點墨分析。
ELISA是用來檢視對人類與恆河猴TNFα的結合。96-槽的Maxisorp盤在4℃下於PBS ON中塗上2 μg/ml Neutravidin。各盤在室
溫下與1%酪蛋白封閉2小時。將生物素化的TNFα(400 ng/ml)加到槽中於室溫下培養1小時。奈米抗體樣品從2 μg/ml開始稀釋，並且將1個稀釋成3個。用老鼠抗myc(1/2000稀釋)與兔子抗老鼠鹼性磷酸鹽(1/2000稀釋，Sigma,A1902)與pNPP(2mg/ml)當基質來偵測奈米抗體。圖9與10表示ELISA中對人類與恆河猴TNFα的結合。
結果整理於表12. TNF1與TNF3顯示了對人類與恆河猴TNFα兩者的結合。TNF2結合於人類TNFα，但對恆河猴TNFα的反應很弱。
針對人類與恆河猴TNFα，分析了抑制受器-配位基作用的能力。96-槽的Maxisorp盤在4℃下於PBS ON中塗上2 μg/ml Enbrel。各盤在室溫下與1%酪蛋白封閉2小時。奈米抗體樣品跟生物素化的TNFα(10 ng/ml)於室溫下預培養30分鐘，起始濃度為5 μg/ml，並且將1個稀釋成2個。將樣品加到盤中並於室溫下培養1小時。用Extravidin的鹼性磷酸鹽(1/2000稀釋)來偵測生物素化的TNFα，並用pNPP(2mg/ml)當作基質。圖11與12顯示了對人類與恆河猴TNFα的抑制ELISA。結果整理於表13。關於人類與恆河猴TNF，針對TNF1與TNF3觀察了配位基/受器之抑制，其中TNF2只抑制人類的TNFα。
用例3中的描述來進行此分析。圖13與14藉Biacore分析說明了人類與恆河猴TNFα的結合。結果整理於表14。Biacore中的結合實驗確認了ELISA結果：對TNF1與TNF3的交叉反應結合，其中TNF2僅明顯結合於人類TNFα。
除了使用不同濃度系列，以上述來分析結合。每個濃度以45 μl/min的流速注射4分鐘，以讓晶片結合抗原能夠結合。沒有分析物
的結合緩衝液以相同流速帶過晶片，以帶走結合的奈米抗體。15分鐘後，注入再生溶液(25 mM NaOH).以去除還連著的分析物。
當平衡時，透過穩定態的親和力，可以從每個分析物之不同濃度所得的感測圖算出KD-值。
結果整理於表15。對ALB1與ALB2兩者觀察交叉反應性。在人類與恆河猴TNFα上可以見到ALB2的最高親和力。然而，對於人類/恆河猴對老鼠血清白蛋白的親和力差異，以ALB2(因子400)最明顯，其中觀察了ALB1的因子12之差異。
使用對TNFα敏感的老鼠纖維母細胞L929細胞株來測量所選奈米抗體的抗TNFα活性。在介質中足量的高TNFα濃度，即細胞毒殺的劑量，L929細胞會壞死。添加混合物至細胞之前，藉著預培養一系列奈米抗體稀釋物與TNFα的細胞毒殺濃度，可決定TNFα跟其受器的作用的抑制性。介質中的actinomycin D會讓細胞對TNFα更敏感，造成純TNFα的生物分析靈敏度增加。
L929細胞長得幾乎要融合，在96槽的微量滴定盤中，每槽5000個細胞滿盤並培養過夜。在最終濃度1 μg/ml時將Actinomycin D加到細胞中。待測試的奈米抗體依序稀釋混合著TNFα的細胞毒殺濃度(最終分析濃度為0.5 ng/ml或15 IU/ml)。在37℃下起碼培養30分鐘後，將混合物加到裝盤的細胞中。各盤在37℃與5% CO2下培養24小時。使用四唑鹽WST-1來確定細胞變異性。以Graphpad Prism計算劑量反應曲線與EC50值。
人類與恆河猴TNFα的結果整理於表16。根據它們抵銷細胞毒性的效能，各分子排列如下：人類TNFα為TNF3>TNF1>TNF2，恆河猴TNFα為TNF1=TNF3>TNF2。
圖14表示蛋白質A之結合在例12中的Biacore的分析。TNF1,TNF2,ALB1有正向結合。TNF3與ALB2的結合很弱或沒有。.
樣本以200 μg/ml稀釋，並等分作8個500 μl的。依據指定的溫度從室溫到90℃培養每個不同的樣品瓶。處理後的樣品在室溫下冷卻2小時，然後維持於4℃。以14,000 rpm離心30分鐘去除沈澱。小心地移除SN並進一步分析。
測量280 nm的OD並計算濃度。結果整理於表17。從80℃開始觀察到TNF2與TNF3的蛋白質含量減少，至於ALB2的減少情形從70℃開始。
2 μg處理過的蛋白質分散於15% SDS-PAGE上，並轉移至硝基纖維素膜而依上述處理。用多菌落抗奈米抗體(R23,1/2000稀釋)與抗兔子山葵過氧化酵素(DAKO,P0448,1/2000稀釋)偵測。圖15呈現的是西方點墨分析。對ALB2在70,80與90℃下處理可觀察到蛋白質濃度中清楚的一滴。TNF1在70,80與90℃下處理還可看到聚集；TNF3在90℃下處理；ALB1在90℃下處理，表示SN仍有殘餘沈澱，而造成較高的OD280nm讀值。這說明了在這些高溫下處理TNF1,TNF3與ALB1，何以在OD280nm處測量的蛋白質濃度不會下降。
測量結合於人類TNFα的ELISA基本上是依例10中的描述來進行。結果顯示於圖16中。從80℃開始，TNF1,TNF2,TNF3的人類TNFα結合就下降了。
依例13中的描述進行生物分析。結果整理於表18。從70℃開
始，TNF1的奈米抗體效力就下降；對TNF2與TNF3則是從80℃開始。
對人類血清白蛋白的結合依例12中的量測。使用的是固定濃度(1稀釋成50)。結果顯示於圖17中。溫度處理並不影響ALB1的血清白蛋白結合。從T=70℃開始，此處理對ALB2的kon有影響。
TNF1,TNF2與TNF3形成了二價奈米抗體。兩個建構子之間的間隔物使用的是9AA GlySer連結(表19序列編碼：68)或30 AA GlySer連結(表19序列編碼：69)。這個產生了表20呈現的結構。表19列出了這些二價TNFα奈米抗體(序列編碼：70到75)的序列。
依例5中的描述進行表現。His(6)-標記的奈米抗體在固相金屬親和性管柱層析(IMAC)上純化。根據製造者指示處理Ni-NTA樹脂(Qiagen)。萃取物跟樹脂在室溫下於旋轉器培養30分鐘。以PBS洗樹脂再轉移至管柱。配好的樹脂以PBS洗過(1稀釋到10)。將管柱以15 mM的咪唑預沖提。用25 mM檸檬酸於pH=4從管柱沖提奈米抗體。沖提出的部份由點在雜交膜上分析，並以紅色素染色觀察。將包含蛋白質的部份集中起來進一步於陽離子交換樹脂中純化，接著再用尺寸排斥。純化過的蛋白質則予以收集、過濾殺菌、確定濃度，並於-20℃下等分儲存。
表21中計算並呈現了二價TNFα奈米抗體之表現級。連結對奈米抗體的表現級沒有顯著影響。
依例8中的描述進行SDS-膠電泳。圖18呈現了SDS-膠電泳的結果。
依例9中的描述進行西方點墨分析。圖19呈現了西方點墨的結果。
依例11中的描述進行此分析。圖20與表22呈現了結果。相較於單價形式，所有二價奈米抗體的配位基/受器結合之抑制都有提升。
依例13中的描述進行此分析。結果整理於表23。根據它們抵銷細胞毒性的效力，TNF8,TNF7,TNF9與TNF5的效力跟Enbrel同級。
樣品依例15中的描述加以分析。
測量了280 nm處的OD並計算濃度。結果整理於表24。從70℃開始，TNF4與TNF7的蛋白質含量就減少了，而TNF5,TNF6,TNF8與TNF9則是從80℃開始。
樣品是依例15中描述，針對聚集物出現加以分析。
用來偵測對人類TNFα結合之ELISA基本上依前述操作。結果呈現於圖21中。從80℃開始，TNF5,TNF6,TNF8與TNF9之人類TNFα結合就減少了，而TNF4與TNF7則是從70℃開始。
圖22(TNF1)，圖23(TNF2)，圖24(TNF3)與圖25(ALB1)呈現跟DP51,DP53,DP54與DP29序列的多序列排列(Clustal W 1.7)。
除了氨基酸突變外，以密碼子最佳化得到表25序列編碼的序列：76到89(分別為抗TNF-α與人類血清白蛋白的奈米抗體)。
跨越整個奈米抗體序列來合成寡核苷酸。
如例5中的描述進行表現。
表26呈現了計算過的表現級。完成表現時的產率在3.5-11.7 mg/ml的範圍內。誘發時間並不影響產率。
SDS-PAGE依例8中的描述進行。圖26呈現的是SDS-PAGE膠。
依例9中的描述進行西方點墨分析。圖27呈現的是西方點墨之結果。
依例13中的描述進行分析。
人體化奈米抗體的結果整理於表27。連同原型奈米抗體為參考資料。
依例12中的描述進行分析。圖28呈現了31 Biacore結果。
樣品依例15中的描述進行分析。
測量了280 nm處的OD並計算濃度。結果整理於表28。
人體化TNF1奈米抗體(TNF13-14)的蛋白質濃度沒有顯著減少。從80℃開始，人體化TNF2(TNF15-19)與TNF3(TNF20-23)的蛋白質濃度減少了，而人體化ALB1(ALB4-5)則是從70℃開始，ALB3從60℃開始。
樣品的聚集物出現是依例15中的描述分析。
用來偵測結合於人類TNFα的ELISA基本上依例15中的描述進行。結果呈現於圖30。
人類TNFα之結合與溫度處理後的WT TNF1及人體化TNF13與14可相比較；與溫度處理後的WT TNF2及人體化TNF15-19；TNF21與22的人類TNFα之結合下降了，TNF23則是含量較低，而TNF20與溫度處理後的TNF3相比並未受影響。
TNF1,TNF2,TNF3與ALB1皆形成三價奈米抗體。兩建構子之間的間隔物使用的是9AA GlySer連結(表19序列編碼68)或30 AA GlySer連結(表19序列編碼69)。這得到了表30的結構。表29列出了三價TNFα奈米抗體的序列(序列編碼：91到94)。
依例5中的描述進行表現。His(6)-標記的奈米抗體在固相金屬親和性管柱層析(IMAC)上純化。根據製造者指示操作Ni-NTA樹脂(Qiagen)。萃取物跟樹脂一起在室溫下於旋轉子培養30分鐘。樹脂以
PBS洗過並轉移至管柱。配好的樹脂用PBS洗過(1稀釋到10)。以15 mM咪唑進行預沖提。用25 mM檸檬酸於pH=4從管柱沖提奈米抗體。沖提出的部份由點在雜交膜上分析，並以紅色素染色觀察。將包含蛋白質的部份集中起來進一步於陽離子交換樹脂中純化，接著再用尺寸排斥。純化過的蛋白質則予以收集、過濾殺菌、確定濃度，並於-20℃下等分儲存。
表31中計算並呈現了表現級。
依例8中的描述進行SDS-PAGE。圖31呈現了SDS-PAGE膠。
依例9中的描述進行西方點墨分析。圖32呈現了西方點墨分析。
依例13中的描述進行分析。
二價奈米抗體的結果整理於表32。根據它們抵銷細胞毒殺活性的能力，該分子的效力相同並跟二價分子的效力相當。
除了使用不同濃度的系列，皆根據上述來分析結合。每個濃度都以流速45 μl/min注射4分鐘以達到晶片結合抗原之結合。接著，以相同流速將不含分析物的結合緩衝液帶過晶片，讓結合的奈米抗體分離。15分鐘後，注入再生液(25 mM NaOH)以去除仍結合的分析物。
當平衡時，從每個分析物不同濃度所得到的感測圖，可透過穩定態的親和力計算KD-值。
結果整理於表33。跟原型ALB1相比，成形的ALB1連結者親和
力下降了。然而親和力還是在7.2-14的範圍內。
樣本依例15中的描述分析。
測量了280 nm處的OD並計算濃度。結果整理於表34。從60℃開始，TNF24,TNF27與TNF28的蛋白質含量下降了，而TNF25與TNF26則是從70℃開始。
樣本依例15的描述分析聚集物的出現。
用來偵測結合於人類TNFα的ELISA基本上依上述進行。結果呈現於圖33。從60℃開始，TNF24與TNF27的人類TNFα結合下降了，而TNF25,TNF26與TNF28則是從70℃開始。
圖34(TNF1)，圖35(TNF2)，圖36(TNF3)與圖37(ALB1)呈現了與DP51,DP53,DP54及DP29的多序列排列(Clustal W 1.7)。突變的分子依上述表現與純化，得到了表35序列編碼：95到104(分別對抗TNF-α與人類血清白蛋白)的序列。
表36呈現計算過的表現級。完成表現的產率在0.5-2.7 mg/ml的範圍內。
SDS-膠電泳依例8中的描述進行。圖38呈現了SDS-Page膠。
西方點墨依例9中的描述進行分析。圖39呈現的是西方點墨之結果。
分析是依例13中的描述進行。
人體化奈米抗體之結果整理於表37。參考資料中包含了原型奈米抗體及奈米抗體的第一回。
依例12中的描述進行分析。圖40顯示了Biacore結果。
依例15中的描述分析樣品。
測量了280 nm處的OD並計算濃度。結果整理於表38。
TNF1奈米抗體(TNF29-30)的蛋白質濃度沒有顯著減少。從80℃開始，TNF2(TNF31-32)與TNF3(TNF33)的蛋白質濃度下降了。
樣品的聚集物出現依例15的描述分析。
用來偵測結合於人類TNFα的ELISA基本上依例15中的描述進行。結果呈現於圖41。
人類TNFα結合與WT TNF1及TNF29與TNF30相比；與WT TNF2及TNF31與TNF32相比；也與WT TNF3及TNF33相比。
在此比較性例子中，本案的九種奈米抗體與WO 04/041862中的三種奈米抗體相比，分別稱“VHH#1A”或“1A”,“VHH3E”或“3E”與“VHH#3G”或“3G”(序列編碼：WO 04/041862中的1,4與5)。使用的分析
為使用參考WO 04/41862(例子可見3之下的例1)中的KYM-細胞之以細胞為基礎的分析。下面的表39中提到了結果。可見的是本案中奈米抗體在分析中的EC50值比3E的EC50值好18倍，是根據WO 04/041862表現最好的奈米抗體。
三價雙專一性奈米抗體首先在大腸桿菌表現載體pAX054中成形與克隆，然後再透過PCR取得並於pPICZαA表現載體中克隆。
pAX54為pUC19的衍生物。它包含使用IPTG時允許表現的控制引導之LacZ啟動子。此載體對Ampicillin或Carbenicillin有抵抗基因。多克隆位包藏了幾個限制位，其中SfiI與BstEII通常用於克隆奈米抗體TM。單一胜肽為移動表現的奈米抗體TM到細胞間質之gen3引導序列。
pPICZαA包含大腸桿菌中可以增生的衍生自pUC之複製起點。它包含甲醇畢赤酵母AOX1(醇類氧化酵素1)基因之啟動子。此942 bp啟動子區域(i)容許重要的甲醇誘發、高等級之基因表現，及(ii)標的質體與帶有載體DNA的畢赤酵母轉變後之AOXI所在整合，在5'AOX1啟動子區域內成線性。注意則pPICZα載體並不含酵母的複製起點，結果是假使在質體與畢赤酵母基因體之間有重組現象，轉化子可單獨分離出來。此載體特定對抗大腸桿菌與甲醇畢赤酵母宿主細胞的抗生素Zeocin。此載體包含讓大部分蛋白質有效分泌到培養基之釀酒酵母α配對因子的分泌訊息。α因子訊息序列中的ATG起始對應於天然AOX1基因的ATG起始。多克隆位包藏了數各限制位，其中Xho1/EcoR1或Xho1/Not1慣用於奈米抗體TM編碼序列與分泌訊息的融合。AOX1轉譯終止區接著就是多克隆位。更多的表現載體細節可以
參見Invitrogen的網頁。
用了WPA-0012中提出的寡糖組成，以三個區隔的PCR反應用來放大N端、中段與C端奈米抗體TM次單元。N端奈米抗體TM是使用M13_rev/Rev_9GlySer_L108來放大；中段奈米抗體TM是使用For_GlySer/Short與Rev_15BspEI_L108來放大；C端奈米抗體TM是使用For_BspEI/M13_for來放大。準備了1 μl質體DNA(50-100 ng),1.5 μl前置引子(10 μM→300 nM),1.5 μl反置引子(10 μM→300 nM),1 μl dNTPs(10 mM→0.2 mM),5 μl緩衝液(10x→1x),0.75 μl酵素(3.5 U/μl→2.6 U/μl)與39.25 μl H2O於總體積為50 μl的PCR反應。引子序列在表40中。PCR程序以94℃開始2分鐘。一次循環為94℃下30秒，50℃下30秒及72℃下1分鐘，然後重複30次，再於72℃下10分鐘。將5 μl的PCR反應在2%洋菜膠上分散以檢查此放大。根據製造者指示用QIAquick PCR純化套組純化PCR產物。用了一根管柱並以50 μl EB緩衝液沖提結合的DNA。在製造者建議的適當的緩衝液中，以37℃下2小時培養50 μl DNA與2 μl BamHI(10 U/μl)，以製備N端VHH片段。接著加入2 μl SfiI(10U/μl)，而混合物在55℃下培養2小時。在製造者建議的適當的緩衝液中，以37℃下2小時培養50 μl DNA與2 μl BamHI(10 U/μl)及2 μl BspEI(10 U/μl)，以製備中段VHH片段。在製造者建議的適當的緩衝液中，以37℃下2小時培養50 μl DNA與2 μl BspEI(10 U/μl)，以製備N端VHH片段。接著，加入2 μl BstEII(10U/μl)DNA，而混合物在60℃下培養1小時。前面的消化反應在2%洋菜膠上分散。從膠中切斷VHH帶(350-450 bp)，並根據製造者指示用QIAquick膠萃取套組純化DNA。用了一根管柱(每根管柱最大量為400 mg洋菜膠)並以50 μl EB緩衝液沖提結合的
DNA。測量OD260(1 OD單位=50 μg/ml)以決定濃度。最終體積包含100 ng載體pAX54、12 ng N端VHH、12 ng中段VHH片段、12 ng C端VHH片段之片段、1 μl黏合緩衝液與製備完成，並在室溫下培養2小時。1 μl黏合酵素(3U)為10 μl之黏合產物。用2 μl黏合混合物進行大腸桿菌TG1的轉化。依WPA-0010所描述使用PCR來分析菌落。在正向克隆上進行序列分析。根據製造者指示與上述用Qiaprep旋轉Miniprep套組(Qiagen)製備質體。在VIB序列設備，Antwerp,Belgium定序。
在pAX054大腸桿菌表現載體中的奈米抗體TM編碼區域是使用適當的引子對經由PCR而取得。為確保奈米抗體TM表現的為原始N端，編碼區域在分泌訊息的Kex2斷裂位構造處克隆。前置引子融合了分泌訊息的C端部份，直到Xho1辨識位，至奈米抗體TM編碼區域。準備了1 μl質體DNA(50-100 ng),1.5 μl前置引子(10 μM→300 nM),1.5 μl反置引子(10 μM→300 nM),1 μl dNTPs(10 mM→0.2 mM),5 μl緩衝液(10x→1x),0.75 μl酵素(3.5 U/μl→2.6 U/μl)與39.25 μl H2O於總體積為50 μl的PCR反應。引子序列在表41中。PCR程序以94℃開始2分鐘。一次循環為94℃下30秒，50℃下30秒及72℃下2分鐘，然後重複20次，再於72℃下10分鐘。將5 μl的PCR反應在2%洋菜膠上分散以檢查此放大。根據製造者指示用QIAquick PCR純化套組純化PCR產物。用了一根管柱並以50 μl EB緩衝液沖提結合的DNA。
以適當的限制酵素(XhoI+NotI)消化像pPICZαA表現載體般對NB編碼之DNA片段。在製造者建議的適當的緩衝液中，以37℃下3小時培養50 μl PCR產物與2 μl XhoI(10 U/μl)及2 μl NotI(10 U/μl)，以取
得插入物。在製造者建議的適當的緩衝液中，以37℃下2小時培養50 μl DNA與2 μl BspEI(10 U/μl)，以製備N端VHH片段。類似地，取得了載體，讓限制酵素的量合乎質體的量。純化了載體與NB編碼片段，並用BioPhotometer(Eppendorf)對DNA濃度定量。用1 Unit T4黏合酵素(Promega)以室溫下30分鐘或16℃下過夜，將片段與接受者載體以等莫耳比例黏合。將DNA(20-30 ng)轉化為TG1細胞。使用3’AOX1R與5’AOX1F引子透過PCR分析菌落。在正向克隆上進席序列分析。TNF30,TNF33與ALB8形成三價雙專一性奈米抗體TM。在建構子9AA GlySer連結之間使用了間隔物。
要單離出質體DNA，開始於50 ml Luria Broth+Ampicillin或Carbenicillin(100μg/ml)+2%葡萄糖中在37℃下過夜培養單一克隆菌落的預培養。根據製造者指示使用質體Midi kit(Qiagen)來製備質體DNA。根據製造者指示於適當緩衝液中，以6 μl BstX1(10 U/μl)與30 μg質體DNA一起於45℃下培養3小時而DNA線性化。根據製造者指示使用PCR純化套組(Qiagen)來純化消化後的DNA。根據標準程序用乙醇沈澱法濃縮DNA。X-33電穿孔法勝任細胞與10 μg線性化的DNA一起轉化，讓細胞在包含Zeocin(100/250/500 μg/ml)的選擇性YPD洋菜盤生長48小時。X-33為原型甲醇畢赤酵母物種；此物種本身跟衍生的重組物種一樣包含原始AOX1基因，並有能力代謝甲醇(Mut+)。
在24槽的盤中以培養單一菌落於1 ml BGCM來篩選克隆的表現級，並在30℃以120 rpm讓它們生長48小時。將細胞離心並將新鮮的BMCM加到細胞中，讓48小時間的生長保持30℃與120 rpm。接者，將甲醇加到最終濃度為0.5%，而細胞在8小時間於30℃與120 rpm生長，然後再加入甲醇使最終濃度為0.5%。細胞於30℃與120 rpm生長
過夜。將細胞離心，收集懸浮物並依例10中的描述於ELISA中分析。
可在Invitrogen的網站上查到緩衝液組成、溶液及其他(http：//www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/ppiczalpha_man.pdf).。以在5 ml YPD中培養單一菌落開始預培養。在180 rpm與30℃下培養生長過夜。隔天，將預培養稀釋為50 mlYPD，並在180 rpm與30℃下生長過夜。以培養預培養胎使生產培養至最終OD600nm=0.04-0.08。培養在BGCM中於180 rpm與30℃下生長24小時，並以4,500 rpm離心30分鐘。細胞再懸浮於原來的BMCM介質體積之1/3，最終OD600 nm=15-20。細胞在正規時間點以甲醇又發，慣用的是3次/天，不要超過甲醇含量的1%。誘發50小時後，收集懸浮物。
培養懸浮物以.22 μm的過濾膜微過濾(Hydrosart,Sartorius)加以過濾。以透析過濾於10kDa超過濾膜(HydroSart,Sartorius)濃縮樣品至0.5-1L。
用蛋白質A親和力層析(MabSelect Xtra,GE Healthcare)，以PBS當作緩衝液而Glycine[100mM pH=2.5]當作沖提液來純化奈米抗體TM。用1.5 M Tris pH=8.8來中和樣品。以陰離子交換樹脂(Source 30Q,GE Healthcare)進一步處理奈米抗體TM。將樣品以10mM Piperazine pH=10.2稀釋10倍，並以1M NaOH與MilliQ水調整到pH=10.2與導電度<2mS/cm。
以尺寸排斥色層分析(Superdex 75pg,Hiload XK26/60,GE Healthcare)處理奈米抗體，並用陰離子交換樹脂(Source 30Q,GE Healthcare)通過5ml以1M NaOH鹽化過且在Dulbecco PBS中平衡的管柱來移除LPS。
為決定純度，依例8中的描述在15% SDS-PAGE膠上分析蛋白質
樣品。根據製造者(Invitrogen)描述的標準步驟使用SilverQuestTM來處理膠。另外，依例8與例9中的描述用coomassie brilliant blue或在西方點墨中處理此膠。結果在圖42中。
TNF60帶有363個氨基酸。此蛋白質的分子量為38,441 Da。其pI為8.71。在280 nm的消光係數為1.736。
根據標準步驟於ESI-MS中確認蛋白質之質量。TNF60的理論質量為38,441 Da。該蛋白質有2個造成ESI-MS中質量為38,435 Da的S-S橋。3個批次之TNF60質量的實驗值在38,433 Da到38,435 Da的範圍內，最多跟理論值差了0.005%。
根據標準步驟以Edman降解法進行N端定序。N端定序顯示蛋白質序列中的前7個氨基酸為下列：EVQLVES。這符合理論蛋白質序列，表示N端處理是適當的。
樣品(100 ug)在高解析Superdex75管柱上分析，以確認不同批次的奈米抗體TM。奈米抗體TM的尺寸排斥色層分析向來可得到對稱的波峰，而在Superdex75上的滯留時間為11.5 ml。一般在280,254與214 nm處記錄吸收。214 nm的量測可得到較高偵測靈敏度。在PBS分析尺寸可得到對稱的波峰。沒有發現污染。3個不同批次所看到的滯留時間為11,5-11,55 ml。代表性的資訊呈現在圖43中。
TNF60的功能性，即結合於人類TNFα，依例10中的描述於ELISA分析。結果整理於圖44，並清楚地表示了劑量相依性與2批次
TNF60與人類TNFα之飽和結合。
TNFα抵銷細胞毒性的效力依例13的描述於細胞基礎中分析。結果整理於表42及圖45與46。
數據顯示TNF60的效力在Enbrel/Etanercept的範圍，且比Humira/Adalimumab與Remicade/Infliximab好上10倍。
對人類與恆河猴血清白蛋白之結合依例12的描述於Biacore加以分析。KD,kon與koff值呈現在表43。TNF60可與具有原始建構子的三價雙專一性原始奈米抗體TM TNF24相比。
人類與恆河猴血清白蛋白TNF60的親和力相似。與TNF60的原型類似物之TNF24所觀察到的親和力相比，親和力低了2倍。兩分子的Kon相同，但TNF60的koff高了2倍。
DBA1或BALBc老鼠在紅外線燈下熱身，並於尾巴靜脈注射200 μl奈米抗體TM(每隻鼠100 μg)。在尾巴切一個小口，於不同時間點收集血液樣品於微量管中。血液向來於t=15分，2小時，4小時，6小時，1天，2天，3天，4天，7天，14天時取樣。根據標準步驟配置血清。
將微量滴定盤(NUNC,Maxisorb)塗上2μg/ml neutravidin於4℃下過夜。該盤以PBS/0.05% Tween-20洗5次，並與PBS/1%酪蛋白封在室溫下2小時。將生物素化的人類TNFα(1/2000於PBS/0.2%酪蛋白；400 ng/ml)加至槽並在室溫下培養1小時。標準參考品奈米抗體TM從濃度為5 μg/ml開始加，並在含1%老鼠血漿的PBS中用5倍稀釋。
讓奈米抗體TM在室溫下2進行結合。將盤洗5次，並在室溫下以2000倍稀釋使用兔子多克隆抗奈米抗體(R23)一小時。洗過盤後，在室溫下以3000倍稀釋與山羊多克隆抗兔子HRP(DAKO)一起偵測一小時，並以ABTS/H2O2染色。測OD405nm。
第一個ELISA用來測定標準參考物的線性範圍。在第二個ELISA中，用在線性範圍內的標準參考物且向來是2倍稀釋。在此第二ELISA中，血清測試樣品稀釋了100倍，而在1%老鼠血漿中進一步稀釋5倍，已決定哪一個血清樣品的稀釋可得到在標準曲線線性範圍中的讀值。在第三個ELISA中，將血清樣品稀釋到第二ELISA中決定好的適當濃度，並用2倍稀釋來正確確認血清樣品中奈米抗體TM的濃度。
用實驗來確認老鼠(n=3)中TNF60的藥動資訊。給藥後15分鐘可達到103,84±31 μg/ml的Cmax值。半生期(t1/2β)經確認為1.9天，與老鼠血清白蛋白的半生期類似，表示TNF60選用了血清白蛋白的半生期。數據呈現於圖47。
將奈米抗體TM於5 μg/ml塗在PBS中，於4℃下過夜。將盤以PBS/0.05% Tween-20洗5次並與PBS/1%酪蛋白於室溫下封閉2小時。血清樣品稀釋100倍並於室溫下1小時間加到槽中培養。用1000倍稀釋的多克隆兔子抗老鼠HRP(DAKO,P0260)進行偵測，並以ABTS當基質。
將血清樣品稀釋50倍，並分析老鼠抗TNF60之抗體的出現。TNF60缺乏免疫性。數據呈現在圖48。
見例48
使用WPA-0011指出的步驟以兩個區隔的PCR反應來放大N端與C端奈米抗體TM次單位。針對放大N端奈米抗體TM，用PiForLong與Rev_30GlySer_L108當作引子組成；對放大C端奈米抗體TM，則用For_GlySer與PiRevCys1hum或是For_GlySer與PiRevCys2hum，針對成形與C端修飾所需的不受限半胱氨酸殘基加入限制位。
準備了1 μl質體DNA(50-100 ng),1.5 μl前置印子(10 μM→300 nM),1.5 μl反置引子(10 μM→300 nM),1 μl dNTPs(10 mM→0.2 mM),5 μl緩衝液(10x→1x),0,75 μl酵素(3.5 U/μl→2.6 U/μl)與39.25 μl H2O之總體積為50 μl的PCR反應。引子序列在表44。PCR程序以94℃開始2分鐘。一次循環為94℃下30秒，50℃下30秒及72℃下1分鐘，然後重複30次，再於72℃下10分鐘。將5 μl的PCR反應在2%洋菜膠上分散以檢查此放大。根據製造者指示用QIAquick PCR純化套組純化PCR產物。用了一根管柱並以50 μl EB緩衝液沖提。在製造者建議的適當的緩衝液中，以37℃下1.5小時培養50 μl DNA與2 μl BamHI(10 U/μl)及2 μl XhoI(10 U/μl)，以製備N端VHH片段。在製造者建議的適當的緩衝液中，以37℃下1小時培養50 μl DNA與2 μl BamHI(10 U/μl)及2 μl EcoRI(10 U/μl)，以製備C端VHH片段。前面的消化反應在2%洋菜膠上分散。從膠中切斷VHH帶(350-450 bp)，並根據製造者指示用QIAquick膠萃取套組純化DNA。用了一根管柱(每根管柱最大量為400 mg洋菜膠)並以50 μl EB緩衝液沖提結合的DNA。測量OD260(1 OD單位=50 μg/ml)以決定濃度。製備了黏合混合物的最終體積為10 μl，包含100 ng與XhoI/EcoRI線性化之載體pPICZαA、30 ng N端VHH、30 ng C端VHH片段之片段、1 μl黏合緩衝液與1 μl黏合酵素(3U)並在室溫下培養1小時。用2 μl黏合混合物進行大腸桿菌的轉化得到TG1。依WPA- O010所描述使用PCR來分析菌落，但用的是AOXIFor/AOXIRev引子組合。在正向克隆上進行序列分析。根據製造者指示與上述用Qiaprep旋轉Miniprep套組(Qiagen)製備質體。在VIB序列設備，Antwerp,Belgium定序。
見例48.
TNF30成為了二價奈米抗體TM。在2建構子間用的是30 AA GlySer連結當作間隔物。為了得到C端位置專一修飾，在奈米抗體TM最後的AA或是有額外含GlyGlyGlyCys的間隔物加入了不受限的半胱氨酸。
見例49
透過離心與0.22μm過濾製造無細胞的培養基。殺菌基質未使用前都存放在4℃下。利用下述在10kDa超過濾(UF)膜(HydroSart Sartocon Slice Cassette,Sartorius)上的超過濾來減少低分子量污染物：將四公升基質濃縮至0.5-1公升，然後以5公升PS稀釋再濃縮至0.5公升。這個動作要二次。
UF的被濃縮液通過耐龍47mm膜0,45μm(Alltech #2024)過濾。
下一步中，利用蛋白質A親和力純化(用MabSelectXtraTM,GE Healthcare).從濃縮基質中找出二價奈米抗體TM。管柱[35X100mm]於PBS中平衡，並在樣品使用後以大量PBS沖洗。TNF56則是用Glycine[100mM,pH=2.5]沖提。
MabSelectXtraTM的稀釋部份以Tris[1,5M,pH 8,8]中和並存放於4℃。使用Source 30Q(GE Healthcare)以AEX(A=10mM piperazin,
pH 10,8及B=1M NaCl於50mM Tris,pH 7,5)濃縮並純化TNF56。以A緩衝液(10mM piperazin,pH 10,8)稀釋奈米抗體TM部份的末段至導電度為5mS/cm，而pH則調整至10.8。將樣品填充至管柱前，以A緩衝液平衡管柱[25X100mm]。TNF56以5被管柱體積(CV)梯度稀釋。用1M Tris pH=7.8將收集部份的pH調節至7.8。
將Dithiotreitol(DTT,Aldrich Cat 15,046-0)加到中和的部份以還原奈米抗體TM酸端半胱氨酸之間潛在的雙硫橋(通常在20%左右)。最終濃度為10mM DTT並於4℃下培養過夜是最好的。用分析型尺寸排斥色層分析法(SEC)評估此還原情形。然後將25μl還原的奈米抗體TM加到75μl D-PBS並注進Dulbecco’s PBS(D-PBS,GibcoTM REF 14190-094)平衡過的Sup75 10/300 GL管柱。
以製備型SEC於D-PBS平衡過的Hiload 26/60 Superdex75製備級管柱，去除未還原的奈米抗體TM與DTT。
還原後的奈米抗體TM濃度以280nm的吸收加以測量。使用的是Uvikon 943 Double Beam UV/VIS光譜儀(方法：見SOP ABL-0038)。吸收在245-330nm的掃描波長測量。使用了以Quartz Suprasil®槽製造的精密槽體(Hellma型號：104-QS；光徑：10mm)。放兩個以900μl D-PBS填滿的槽在280nm處測量空白的第一吸收。加入100μl樣品到第一槽以稀釋樣品。樣品的吸收在280nm處測量。
濃度以下列公式計算：
對TNF55：ε=1,85
對TNF56：ε=1,83.
將過量5倍莫耳濃度之新鮮製備1mM PEG40溶液加到PEG化的奈
米抗體TM中，以還原奈米抗體TM溶液。(NEKTARTM之MPEG2-MAL-40K)
轉化藥物(2D3YOTO1)Mw=40,000 g/mol；NEKTARTM之MPEG2-MAL-60K轉化藥物(2D3YOVO1)Mw=60,000 g/mol)。
奈米抗體TM-PEG混合物以溫和激化在室溫(RT)下培養1小時，然後移至4℃。利用分析型SEC來評估PEG化。再將25μl奈米抗體TM加到75μl D-PBS並注入在D-PBS中平衡過的Sup75HR 10/300管柱。PEG化的奈米抗體TM在管柱的排斥體積範圍內沖提(>75kDa)。
以陽離子交換層析法(CEX，用Source30S,GE Healthcare；A緩衝液=25mM檸檬酸pH=4及B=1M NaCl於PBS中)分離PEG化與未PEG化的奈米抗體TM。將樣品稀釋成導電度<5mS/cm而pH調整到4.0。將管柱[25X100mm]平衡，並在使用樣本後以大量A-緩衝液沖洗。
收集到的奈米抗體TM為SEC在D-PBS平衡過的Superdex 75製備級管柱將緩衝液交換到D-PBS。
最後，通過陰離子交換管柱(Source30Q)製備沒有LPS的奈米抗體TM。該管柱(10x100mm)在NaOH[1M]中鹽化過夜，接著於無內毒素的D-PBS中平衡。
要生物素化奈米抗體TM，須將過量5倍莫耳濃度之來自10mM儲存溶液的生物素(EZ-Link® Maleimide-PO2-生物素，Pierce #21901)加進還原後的奈米抗體TM(見5.5.1)中。生物素-奈米抗體TM混合物以溫和激化在室溫下培養1小時，然後存放於4℃。
以分析級SEC控制生物素化後的奈米抗體TM純度。然後將25μl生物素化後的奈米抗體TM加到75μl D-PBS並注入於D-PBS中平衡過的Sup75HR 10/300管柱。從得到的層析圖可以歸納出，奈米抗體TM-生物素不必再純化：沒有偵測到以雙硫鍵氧化而成的奈米抗體TM雙聚
體。通過去鹽化的管柱Sephadex G25細(90ml)管柱將緩衝液換成D-PBS。
最後，通過陰離子交換管柱(Source30Q,GE Healthcare)製備沒有LPS的奈米抗體TM-生物素。該管柱(1x10cm)在1M NaOH中鹽化過夜，接著於D-PBS中平衡。
為決定純度，蛋白質樣品依例8雨49在15% SDS-PAGE膠上分析。結果在圖49與50。
TNF55帶有260個氨基酸。蛋白質的分子量為27,106 Da。pI為8.6。在280 nm的消光係數為1.850。
TNF56帶有264個氨基酸。蛋白質的分子量為27,365 Da。pI為8.67。在280 nm的消光係數為1.830。
TNF55的理論質量為27,106 Da。TNF55-生物素蛋白質有2個S-S橋以及在ESI-MS上會出現27,627 Da質量的生物素修飾。實驗測得的TNF55-生物素質量為27,627 Da。
TNF56的理論質量為27,365 Da。TNF56-生物素蛋白質有2個S-S橋以及在ESI-MS上會出現27,886 Da質量的生物素修飾。實驗測得的TNF56-生物素質量為27,886 Da。
TNF56-PEG40的N端定序顯示蛋白質的前7個氨基酸如下：EVQLVES。這符合理論上蛋白質序列，表示N端處理是合適的。
在PBS的TNF56-PEG40分析尺寸提供了對稱波峰。沒有發現污染物。觀察到的滯留時間為Superdex HR 75上8.5 ml及Superdex HR 200
上10.32 ml。代表性的資料呈現於圖51與52。
抵銷TNFα細胞毒殺活性之效力是在以細胞為基礎的分析中進行。在一個莫耳濃度的基準上，測試了不同奈米抗體TM濃度的效力，以及市售的Enbrel,Humira與Remicade。觀察到的EC50越高，則化合物抵銷TNFα效力越低。
結果整理於表45及圖53與54。
與單價奈米抗體TM TNF1比較起來，結果顯示二價奈米抗體TM的效力較高。TNF55衍生物的效力類似於TNF56衍生物，而TNF56衍生物的效力在Enbrel與比Humira及Remicade好10倍的範圍內。
見例54
實驗是為了檢測老鼠中PEG化奈米抗體TM的半生期。二價TNF56-PEG40的半生期與TNF56-PEG60的半生期相比。兩種奈米抗體TM的半生期相當，都是~2天。結果呈現於圖55。
另外，也探討了PEG化二價3E-3E的半生期。在靜脈注射100 μg該奈米抗體TM後，比較3E-3E-PEG20的半生期與3E-3E-PEG40的半生期。3E-3E-PEG20的半生期為17小時，而3E-3E-PEG40的半生期為2.1天，與3E-3E-MSA21的半生期相當。結果呈現於圖56。
血清樣品稀釋100倍，並分析其老鼠抗TNF56-PEG40或抗TNF56-PEG60抗體的存在。兩種分子都缺乏免疫性。數據呈現於圖57。
用帶有並表現3'-修飾人類腫瘤壞死因子(hTNF-α，惡病質素)轉植基因的基因轉植鼠株當作模型，來本案TNF60(TNF60)在預防關節炎加劇的效力(EMBO J.10,4025-4031)。這些老鼠顯現會在四到七週
的年紀有100%情況本案出慢性多發性關節炎。
從三週大起，將混雜的基因轉植鼠分做八個動物組。在開始本案前，會計算每組的平均體重。然後，在整個本案間，每週會記錄一次每組的動物體重。
為測試TNF60在預防慢性多發性關節炎的效力，根據下列圖示對特定組的每隻動物進行一週兩次腹膜注射：
- 1組(負向控制)：磷酸鹽緩衝過的鹽水(PBS)(劑型緩衝液)
- 2組(奈米抗體治療)：TNF60的最終劑量為30 mg/kg
- 3組(奈米抗體治療)：TNF60的最終劑量為10 mg/kg
- 4組(奈米抗體治療)：TNF60的最終劑量為3 mg/kg
- 5組(1st正向控制)：Enbrel的最終劑量為30 mg/kg
- 6組(1st正向控制)：Enbrel的最終劑量為10 mg/kg
- 7組(2nd正向控制)：Remicade的最終劑量為30 mg/kg
- 8組(2nd正向控制)：Remicade的最終劑量為10 mg/kg
- 9組(2nd正向控制)：Remicade的最終劑量為3 mg/kg
對每一組而言，要注意注射日期與注射體積。
持續了七週的注射。在此期間，以觀察每隻動物顯微鏡下關節型態的變化記錄臨床積分。
在10週大時，殺死所有的老鼠並收集血漿與關節。將sera存放在-70℃而踝關節保存於福馬林中。
對於所選的組別，將踝關節包在封膜中並分組。接著將踝關節組用於疾病本案的組織病理評估。
結果顯示在圖58。
用帶有並表現3'-修飾人類腫瘤壞死因子(hTNF-α，惡病質素)轉
植基因的基因轉植鼠株當作模型，來本案TNF60(TNF60)在醫藥治療關慢性多發性節炎的效力(EMBO J.10,4025-4031)。這些老鼠顯現會在四到七週的年紀有100%情況本案出慢性多發性關節炎。
從六週大起，將混雜的基因轉植鼠分做八個動物組。在開始本案前，會計算每組的平均體重。然後，在整個本案間，每週會記錄一次每組的動物體重。
為測試TNF60在醫藥治療關節炎的效力，根據下列圖示對特定組的每隻動物進行一週兩次腹膜注射：
- 1組(負向控制)：磷酸鹽緩衝過的鹽水(PBS)(劑型緩衝液)
- 2組(奈米抗體治療)：TNF60的最終劑量為30 mg/kg
- 3組(奈米抗體治療)：TNF60的最終劑量為10 mg/kg
- 4組(1st正向控制)：Enbrel的最終劑量為30 mg/kg
- 5組(2nd正向控制)：Remicade的最終劑量為30 mg/kg
每一組而言，要注意注射日期與注射體積。
持續了七週的注射。在此期間，以觀察每隻動物顯微鏡下關節型態的變化記錄臨床積分。
在13週大時，殺死所有的老鼠並收集血漿與關節。將sera存放在-70℃而踝關節保存於福馬林中。
對於所選的組別，將踝關節包在封膜中並分組。接著將踝關節組用於疾病本案的組織病理評估。
結果顯示在圖59。
用帶有並表現3'-修飾人類腫瘤壞死因子(hTNF-α，惡病質素)轉植基因的基因轉植鼠株當作模型，來本案不同成形方式的抗TNF-α奈米抗體在預防慢性多發性關節炎的效力(EMBO J.10,4025-4031)。這
些老鼠顯現會在四到七週的年紀有100%情況本案出慢性多發性關節炎。
從三週大起，將混雜的基因轉植鼠分做八個動物組。在開始本案前，會計算每組的平均體重。然後，在整個本案間，每週會記錄一次每組的動物體重。
為測試不同成形方式的抗TNF-α奈米抗體在醫藥治療慢性多發性關節炎的效力，根據下列圖示對特定組的每隻動物進行一週兩次腹膜注射：
- 1組(負向控制))：磷酸鹽緩衝過的鹽水(PBS)(劑型緩衝液)
- 2組(奈米抗體format 1)：TNF60的最終劑量為10 mg/kg
- 3組(奈米抗體format 1)：TNF60的最終劑量為2.5 mg/kg
- 4組(奈米抗體format 1)：TNF60的最終劑量為1 mg/kg
- 5組(奈米抗體format 2)：TNF56-PEG40的最終劑量為10 mg/kg
- 6組(奈米抗體format 2)：TNF56-PEG40的最終劑量為1.8 mg/kg
- 7組(奈米抗體format 2)：TNF56-PEG40的最終劑量為0.7 mg/kg
- 8組(奈米抗體format 3)：TNF56-生物素的最終劑量為1.8 mg/kg
- 9組(奈米抗體format 4)：TNF30的最終劑量為1 mg/kg
- 10組(奈米抗體format 5)：TNF1的最終劑量為1 mg/kg
- 11組(1st正向控制)：Enbrel的最終劑量為10 mg/kg
- 12組(2nd正向控制)：Remicade的最終劑量為10 mg/kg
每一組而言，要注意注射日期與注射體積。
持續了七週的注射。在此期間，以觀察每隻動物顯微鏡下關節型態的變化記錄臨床積分。
在10週大時，殺死所有的老鼠並收集血漿與關節。將sera存放在-70℃而踝關節保存於福馬林中。
對於所選的組別，將踝關節包在封膜中並分組。接著將踝關節
組用於疾病本案的組織病理評估。
結果顯示在圖60。
以捕獲養殖的恆河猴(Macaca mulatta)來確認TNF60與TNF56-PEG40的藥動資訊。
此本案用了十六隻動物(八公八母)，並分做四組(每組二公二母)。所有動物大約都是5公斤，並在使用的六週以前都未患病。用Sniff® Pri vegetarisch V3994當作食物。每隻動物給予g/kg b.w.。將殘基移除掉。在固定間隔(起碼一年二次)根據EPA/USA對污染物的規定由LUFA-ITL分析食物。自來水自由供應。在每個處理組中的動物都住在猴子單位裡幾個相鄰籠子構成的區塊中。這些猴子都個別關在體積為90 cm x 82 cm x 96 cm的V2A鋼製籠子裡。室溫維持在23℃±3℃(最大範圍)而相對濕度為60%±20%(最大範圍)。SOP中有處理到針對清潔過程的例子所造成最大範圍的偏差。每12小時的間隔就會點亮及弄暗這些房間。
兩組跟TNF60融合，而兩組跟TNF56-PEG40融合。在固定的2 mg/kg劑量，以內在導管將TNF60與TNF56-PEG40(溶於PBS)靜脈注射至左或右臂的頭靜脈，並給予TSE灌注幫浦(見下文)。
用了四種單一給藥，以起碼十四天的洗去時期為區隔。在最後一次給藥之後，後續的期間起碼得八星期。四組中的兩組給予TNF60或TNF56-PEG40合併甲氨喋呤(MTX)(溶於PBS)。第2組給予TNF60與MTX；第4組給予TNF56-PEG40與MTX。MTX給藥為每週肌肉注射0.2 mg/kg的劑量。在給藥日，MTX大約在給藥前30分鐘就要給。劑量開始於第一個奈米抗體給藥，並在第四劑後的整個八星期洗去之間持續。共有十四次單一MTX給藥，以起碼一星期從第一測試項目
給藥的洗去時期為區隔。
在此本案中，評估了抗TNF生物性、ALX0071與Etanercept以緩解RA-滑膜衍生的纖維母細胞帶來之TNFα引起IL-6生成的能力。
來自接受RA患者的關節組織與抗體在4℃下存放於DMEM為基底的介質，直到關節更換手術後最多96小時。以膠原酵素在37℃下消化2小時從剖開的滑膜中單離出關節細胞。然後以一系列離心與再懸浮步驟清洗得到的細胞懸浮物，並將所得細胞於37℃下在DMEM為基礎的培養介質中加入10% FCS(v/v)培養。得到的纖維母細胞用於後續二或三頁的實驗。來自四個貢獻者的細胞用於個別實驗。將纖維母細胞植入96槽平底聚苯乙烯盤的1.5 x104個細胞，最終體積為250 μL以DMEM為基礎且每槽加入10% FCS(v/v)培養基質培養過夜。
然後讓細胞在每mL單獨添加50 ng TNFα(3 nM(R&D系統210-TA/CF)或增加ALX0071(每mL 0.575至1920 ng；0.015至50 nM)的劑量或Etanercept(Wyeth Labs；每mL 3.75至11250 ng；0.025至75 nM)之以DMEM為基礎的培養基質中培養72小時。每槽的最終體積為250 μL，每次評估都重複三次。72小時後，將浮在表面的介質移除，並在IL-6 ELISA(R&D系統)之前置於-40℃。確定了抑制TNF引起的IL-6生成，並計算ALX0071與Etanercept之IC50值。
ALX10071與Etanercept皆與藉由所有四個捐獻者的RA滑膜衍生之纖維母細胞，依劑量相關地減少TNF引起的IL-6生成。在這些分析條件下，兩藥物間的效力是相似的。
在此本案中，評估了抗TNF生物性、ALX0071與Etanercept以緩解TNFα-引起細胞滲入到老鼠氣袋之能力。
藉由皮下注射2.5mL殺菌的空氣至麻醉後的公C57Bl/6/J鼠(25-30g,Harlan)之背部表面以形成氣袋。3天後，藉由注射2.5 ml的殺菌空氣來將此袋充氣。
開始製造氣袋後六天，將動物麻醉並於袋中注射1 ml包含0.1 μg重組人類TNFα(R & D系統，210-TA-050/CF)的0.5%羧甲基纖維素(CMC)介質。在另外三組動物中，於注射TNFα前的19小時皮下注射ALX0071(0.0625,0.125與0.25 mg/kg)。第二批的三組動物則在注射TNFα之前立刻注射Etanercept(Wyeth Labs,0.125,0.25與0.5 mg/kg)。
TNFα注射後的24小時，選出CO2濃度有提高的老鼠。將袋以2 ml冰冷的不含內毒素且包含5 IU/ml肝磷脂之殺菌PBS灌洗。記錄體積並以0.5 ml等分，以計算Sysmex XT-Vet細胞計數器上的總白血球(WBC)數目。每一組的總白血球數之平均與平均標準誤差(SEM)以倒出的灌洗液每ml計算。以ANOVA用Kruskal-Wallis之後測試在未轉化的數據上進行統計分析。
ALX0071與Etanercept均緩解了TNFα引起的WBC無法滲透到氣袋的現象(表)。當此緩解在0.125(P<0.01)與0.25 mg/kg(P<0.05)ALX0071劑量組中均達到統計上的意義，卻沒有在任何一個Etanercept劑量組中看到統計上的顯著性。
那些精通理論的單單用例行實驗就能辨認，或有能力確定很多此處所描述跟特定本案中實例的等同物。該等同物均預計用下列聲明來涵蓋。
所有此處所用的參考資料都有附上全部資料。
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<220>
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<213> -
<220>
<221> 多樣_特徵
<222> (3)..(3)
<223> 未知的氨基酸殘基，可能為Q
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Claims (28)
- 一種抗人體血清白蛋白之奈米抗體(Nanobody)，其係由4個架構區(framework regions，分別為FR1至FR4)和3個互補決定區(complementarity determining regions，分別為CDR1至CDR3)所組成，其中：CDR1包含，或為胺基酸序列SFGMS(SEQ ID NO：36)；CDR2包含或為胺基酸序列SISGSGSDTLYADSVKG(SEQ ID NO：40)；CDR3包含或為胺基酸序列GGSLSR(SEQ ID NO：48)。
- 如申請專利範圍第1項所述之奈米抗體，其為重鏈可變區(VHH)，人類化VHH或駱駝化(camelized)VH。
- 一種抗人體血清白蛋白之奈米抗體，其係選自由下列組成之群：ALB 3(SEQ ID NO：87)，ALB 4(SEQ ID NO：88)，ALB 5(SEQ ID NQ：89)，ALB 6(SEQ ID NO：100)，ALB 7(SEQ ID NO：101)，ALB 8(SEQ ID NO：102)，ALB 9(SEQ ID NO：103)，以及ALB 10(SEQ ID NO：104)。
- 如申請專利範圍第3項所述之奈米抗體，其為ALB 8(SEQ ID NO：102)。
- 一種抗人體血清白蛋白之奈米抗體，其係由4個架構區(分別為FR1至FR4)和3個互補決定區(分別為CDR1至CDR3)所組成，其中(i)CDR1包含或為胺基酸序列SFGMS(SEQ ID NO：36)或CDR1與SEQ ID NO：36之間具有2或只有1個“胺基酸差異”，其中：(1)任何胺基酸取代較佳是保守型胺基酸取代；和/或(2)相較於前面的胺基酸序列，該胺基酸序列較佳是僅含胺基酸取代，且無胺基酸刪減或插入；及 (ii)CDR2包含或為胺基酸序列SISGSGSDTLYADSVKG(SEQ ID NO：40)或CDR2具有至少80%，較佳是至少90%，更佳是至少95%，甚至是至少99%序列與SEQ ID NO：40相同，其中(1)任何胺基酸取代較佳是保守型胺基酸取代；和/或(2)相較於前面的胺基酸序列，該胺基酸序列較佳是僅含胺基酸取代，且無胺基酸刪減或插入；和/或其中上述CDR2與SEQ ID NO：40之間具有3，2或只有1個“胺基酸差異”，其中：(1)任何胺基酸取代較佳是保守型胺基酸取代；和/或(2)相較於前面的胺基酸序列，上述胺基酸序列較佳是僅含胺基酸取代，且無胺基酸刪減或插入；以及(iii)CDR3包含，或為胺基酸序列GGSLSR(SEQ ID NO：48)；或CDR3與SEQ ID NO：48之間具有3，2或只有1個“胺基酸差異”，其中：(1)任何胺基酸取代較佳是保守型胺基酸取代；和/或(2)相較於前面的胺基酸序列，上述胺基酸序列較佳是僅含胺基酸取代，且無胺基酸刪減或插入。
- 如申請專利範圍第5項所述之奈米抗體，其中CDR1胺基酸序列為SFGMS(SEQ ID NO：36)；CDR2胺基酸序列為SISGSGSDTLYADSVKG(SEQ ID NO：40)；CDR3胺基酸序列為GGSLSR(SEQ ID NO：48)。
- 如申請專利範圍第5項或第6項所述之奈米抗體，其中：(i)FR1包含或為選自由下列組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：370,368,369,371,372,373，和374；(ii)FR2包含或為選自由下列組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：384,383和385-388；(iii)FR3包含或為選自由下列組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NO：398,396,397,399,400和402；及(iv)FR4包含或為選自由下列組成之群之胺基酸序列：SEQ ID NQ：412,410,411和413-416。
- 如申請專利範圍第5至7其中任何一項所述之奈米抗體，其中：i)FR1為選自由下列組成之群之胺基酸序列：[1]QVQLQESGGG X VQAGGSLRLSCAASG[26](SEQ ID NO：1)及[1]QVQLQESGGG L VQAGGSLRLSCAASG[26](SEQ ID NO：5)；或選自由下列組成之群之胺基酸序列：含有胺基酸序列至少80%，最好是至少90%，更好是至少95%，甚至是至少99%序列與SEQ ID NO：1或5相同；其中(1)任何Hallmark位置之外的胺基酸取代較佳是保守型胺基酸取代和/或是表4定義的胺基酸取代；和/或(2)相較於前面的胺基酸序列，上述胺基酸序列較佳是僅含胺基酸取代，且無胺基酸刪減或插入；和/或選自由下列組成之群之胺基酸序列：與上述胺基酸序列之一之間具有3，2或只有1個“胺基酸差異”，其中：(1)任何Hallmark位置之外的胺基酸取代較佳是保守型胺基酸取代和/或是表4定義的胺基酸取代；和/或(2)相較於前面的胺基酸序列，上述胺基酸序列較佳是僅含胺基酸取代，且無胺基酸刪減或插入；且其中： ii)FR2為選自由下列組成之群之胺基酸序列：[36]W X RQAPGK XX E X VA[49](SEQ ID NO：2)[36]W F RQAPGK ER E L VA[49](SEQ ID NQ：6)[36]W F RQAPGK ER E F VA[49](SEQ ID NO：7)[36]W F RQAPGK ER E G A[49](SEQ ID NO：8)[36]W F RQAPGK QR E L VA[49](SEQ ID NO：9)[36]W F RQAPGK QR E F VA[49](SEQ ID NO：10)[36]W Y RQAPGK GL E W A[49](SEQ ID NO：11)；或選自由下列組成之群之胺基酸序列：至少80%，較佳是至少90%，更佳是至少95%，甚至是至少99%序列與SEQ ID NO：2和6-11相同；其中(1)任何Hallmark位置之外的胺基酸取代較佳是保守型胺基酸取代和/或是表5定義的胺基酸取代；和/或(2)相較於前面的胺基酸序列，上述胺基酸序列較佳是僅含胺基酸取代，且無胺基酸刪減或插入；和/或選自由下列組成之群之胺基酸序列：與上述胺基酸序列之一之間具有3，2或只有1個“胺基酸差異”，其中：(1)任何Hallmark位置之外的胺基酸取代較佳是保守型胺基酸取代和/或是表5定義的胺基酸取代；和/或(2)相較於前面的胺基酸序列，胺基酸序列較佳是僅含胺基酸取代，且無胺基酸刪減或插入；且其中：iii)FR3為選自由下列組成之群之胺基酸序列：[66]RFTISRDNAKNTVYLQMNSL XX EDTAVYYCAA[94](SEQ ID NO：3)和[66]RFTISRDNAKNTVYLQMNSL KP EDTAVYYCAA[94](SEQ ID NO：12)；或選自由下列組成之群之胺基酸序列：至少80%，最好是至少90%，更好是至少95%，甚至是至少99%序列與SEQ ID NO：3或12相同；其中(1)任何Hallmark位置之外的胺基酸取代較佳是保守型胺基酸取代和/或是表6定義的胺基酸取代；和/或(2)相較於前面的胺基酸序列，上述胺基酸序列較佳是僅含胺基酸取代，且無胺基酸刪減或插入；和/或選自由下列組成之群之胺基酸序列：與上述胺基酸序列之一之間具有3，2或只有1個“胺基酸差異”，其中：(1)任何Hallmark位置之外的胺基酸取代較佳是保守型胺基酸取代和/或是表6定義的胺基酸取代；和/或(2)相較於前面的胺基酸序列，上述胺基酸序列較佳是僅含胺基酸取代，且無胺基酸刪減或插入；且其中：iv)FR4為選自由下列組成之群之胺基酸序列：[103] XX QGT X VTVSS[113](SEQ ID NO：4)[103] WG QGT Q VTVSS[113(SEQ ID NO：13)和[103] WG QGT L VTVSS[113](SEQ ID NO：14)；或選自由下列組成之群之胺基酸序列：至少80%，較佳是至少90%，更佳是至少95%，甚至是至少99%序列與SEQ ID NO：4,13和14相同；其中(1)任何Hallmark位置之外的胺基酸取代較佳是保守型胺基酸取代和/或是表6定義的胺基酸取代；和/或(2)相較於前面的胺基酸序列，上述胺基酸序列較佳是僅含胺基酸取代，且無胺基酸刪減或插入；和/或 選自由下列組成之群之胺基酸序列：與上述胺基酸序列之一之間具有3，2或只有1個“胺基酸差異”，其中：(1)任何Hallmark位置之外的胺基酸取代較佳是保守型胺基酸取代和/或是表6定義的胺基酸取代；和/或(2)相較於前面的胺基酸序列，上述胺基酸序列較佳是僅含胺基酸取代，且無胺基酸刪減或插入；其中Hallmark殘基以“ X ”指明，依照上文之定義，其中括弧間數字為依據Kabat編號的胺基酸位置。
- 如申請專利範圍第5-8項之任何一項所述之奈米抗體，其為GLEW級奈米抗體。
- 如申請專利範圍第5-8項之任何一項所述之奈米抗體，其於103位置含精氨酸殘基(arginine residue，R)。
- 如申請專利範圍第5-10項之任何一項所述之奈米抗體，其於108位置含亮氨酸殘基(leucine residue，L)。
- 一種蛋白質或多肽，其包含或基本上由下列組成：如申請專利範圍第1-11項之任何一項所述之一奈米抗體。
- 如申請專利範圍第12項所述之蛋白質或多肽，其包含或基本上由下列組成：至少一種如申請專利範圍第1-11項之任何一項中之奈米抗體。
- 一種蛋白質或多肽，其包含成基本上由下列組成：二種或以上奈米抗體，視情況由連接序列連接，其中上述蛋白質或多肽包含至少一種申請專利範圍第1-11項中任何一項所過之奈米抗體。
- 如申請專利範圍第14項所述之蛋白質或多肽，其中上述蛋白質或多肽包含二種申請專利範圍第1-11中任何一項之奈米抗體。
- 一種蛋白質或多肽，其包含三種奈米抗體，視情況地由二連接序列連接，其中上述蛋白質或多肽包含至少一種申請專利範圍 第1-11項中任何一項之奈米抗體。
- 如申請專利範圍第16項所述之蛋白質或多肽，其中上述蛋白質或多肽包含二或三種申請專利範圍1-11中任何一項之奈米抗體。
- 一種雙功能多肽，其包含申請專利範圍1-11中任何一項之第一奈米抗體，及直接針對第二抗原的第二奈米抗體，其中該第一和第二奈米抗體可由連接序列連接。
- 一種三功能多肽，其包含申請專利範圍1-11中任何一項之第一奈米抗體，直接針對第二抗原的第二奈米抗體，及直接針對第三抗原的第三奈米抗體，其中上述第一、第二、和第三奈米抗體可由一或以上(常見是一，更常見是二)的連接序列連接。
- 一種蛋白質或多肽，其包含申請專利範圍1-11中任何一項之奈米抗體，並另包含至少一種其它奈米抗體，其中該奈米抗體直接相連或由連接序列連接。
- 如申請專利範圍第14-20項中任何一項所述之蛋白質或多肽，其中連接序列為胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第21項所述之蛋白質或多肽，其中連接序列為包含至少14個胺基酸的胺基酸序列，較佳為至少17胺基酸，例如約20-40胺基酸。
- 如申請專利範圍第21或22項所述之蛋白質或多肽，其中連接序列包含甘氨酸(glycine)和絲氨酸(serine)殘基。
- 如申請專利範圍第12-23項中任何一項所述之蛋白質或多肽，其中至少一種針對人體血清白蛋白的奈米抗體具有如ALB 8(SEQ ID NO：102)的CDR序列。
- 如申請專利範圍第12-23項中任何一項所述之蛋白質或多肽，其中至少一種針對人體血清白蛋白的奈米抗體是人類化奈米抗體。
- 如申請專利範圍第12-23項中任何一項所述之蛋白質或多肽，其中至少一種直接針對人體血清白蛋白的奈米抗體是ALB 1(SEQ ID NO：63)的人類化變體。
- 如申請專利範圍第12-23項中任何一項所述之蛋白質或多肽，其中至少一種針對人體血清白蛋白的奈米抗體係選自下列群組：ALB 3(SEQ ID NO：87)，ALB 4(SEQ ID NO：88)，ALB 5(SEQ ID NO：89)，ALB 6(SEQ ID NO：100)，ALB 7(SEQ ID NO：101)，ALB 8(SEQ ID NO：102)，ALB 9(SEQ ID NO：103)，及ALB 10(SEQ ID NO：104)。
- 如申請專利範圍第12-23項中任何一項所述之蛋白質或多肽，其中至少一種針對人體血清白蛋白的奈米抗體是ALB 8(SEQ ID NO：102)。
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