RU2530553C2 - Рекомбинантное однодоменное антитело, способное специфически связывать фактор некроза опухолей человека, и его производные - Google Patents

Рекомбинантное однодоменное антитело, способное специфически связывать фактор некроза опухолей человека, и его производные Download PDF

Info

Publication number
RU2530553C2
RU2530553C2 RU2012147173/10A RU2012147173A RU2530553C2 RU 2530553 C2 RU2530553 C2 RU 2530553C2 RU 2012147173/10 A RU2012147173/10 A RU 2012147173/10A RU 2012147173 A RU2012147173 A RU 2012147173A RU 2530553 C2 RU2530553 C2 RU 2530553C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
antibody
tnf
antibodies
vhh
mini
Prior art date
Application number
RU2012147173/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2012147173A (ru
Inventor
Сергей Владимирович Тиллиб
Григорий Александрович Ефимов
Сергей Артурович Недоспасов
Андрей Алексеевич Круглов
Марина Сергеевна Друцкая
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) filed Critical Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ)
Priority to RU2012147173/10A priority Critical patent/RU2530553C2/ru
Publication of RU2012147173A publication Critical patent/RU2012147173A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2530553C2 publication Critical patent/RU2530553C2/ru

Links

Images

Landscapes

  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится области иммунологии и биотехнологии. Предложено однодоменное антитело (VHH), способное связывать цитокин фактор некроза опухолей (ФНО, TNF) человека, фрагмент ДНК, кодирующий антитело по изобретению, способ получения антитела по изобретению, а также способ выявления и определения уровня содержания ФНО человека в биологическом образце. Настоящее изобретение обеспечивает специфическую блокировку ФНО клеток макрофагально-моноцитарного ряда и может найти дальнейшее применение в терапии заболеваний, связанных с нежелательным ФНО-зависимым воспалительным ответом. 4 н.п. ф-лы, 5 пр., 7 ил.

Description

Область техники
Изобретение относится к биотехнологии, белковой инженерии и молекулярной медицине, а именно к получению рекомбинантных однодоменных антител, избирательно связывающих белок фактор некроза опухолей человека, в том числе продуцируемый клетками макрофагально-моноцитарного ряда. Изобретение может быть применимо при заболеваниях, характеризующихся патологическим воспалительным процессом, опосредованным сверхэкспрессией фактора некроза опухолей, таких как септический шок, аутоиммунные и онкологические заболевания.
Уровень техники
Фактор некроза опухолей (ФНО) - цитокин, который играет ключевую роль в патогенезе некоторых заболеваний. Нарушение регуляции и избыточная продукция ФНО приводит к аутоиммунным патологиям, в том числе ревматоидному артриту [Elliott MJ, et al., Treatment of rheumatoid arthritis with chimeric monoclonal antibodies to tumor necrosis factor alpha. Arthritis Rheum; 1993. Р.1681-1690], псориазу [Benoit S, et al., Treatment of recalcitrant pustular psoriasis with infliximab: effective reduction of chemokine expression. The British journal of dermatology; 2004. Р.1009-1012], анкилозирующему спондилоартриту (болезни Бехтерева), а также к хроническому воспалению стенки кишечника, вызванному микрофлорой - болезни Крона [Haraoui В. Differentiating the efficacy of the tumor necrosis factor inhibitors Seminars in arthritis and rheumatism; 2005. Р.7-11]. При этом было обнаружено, что блокировка ФНО моноклональными антителами снижает выработку интерлейкина I [Brennan FM, et al., Inhibitory effect of TNF alpha antibodies on synovial cell interleukin-1 production in rheumatoid arthritis Lancet; 1989. Р.244-247] и других провоспалительных цитокинов [Haworth С, et al., Expression of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in rheumatoid arthritis: regulation by tumor necrosis factor-alpha. Eur J Immunol; 1991. Р.2575-2579]. Ключевая роль ФНО в патогенезе аутоиммунитета, например при ревматоидном артрите, подтвердилась при блокировке биологического эффекта ФНО in vivo [Fong Y, et al. Antibodies to cachectin/tumor necrosis factor reduce interleukin 1 beta and interleukin 6 appearance during lethal bacteremia J Exp Med; 1989. Р.1627-1633]. Одновременно повышенная концентрация ФНО и рецептора к ФНО на поверхности клеток была обнаружена в биоптатах синовиальной оболочки больных [Saxne Т, et al., Detection of tumor necrosis factor alpha but not tumor necrosis factor beta in rheumatoid arthritis synovial fluid and serum. Arthritis Rheum; 1988. Р.1041-1045]. В хронической стадии заболевания в воспаленных синовиальных тканях активированные макрофаги представляют собой основной источник «повреждающего» ФНО, и количество макрофагов вместе со степенью экспрессии ФНО коррелирует с клинической тяжестью картины и болевым синдромом [Tak PP et al., Analysis of the synovial cell infiltrate in early rheumatoid synovial tissue in relation to local disease activity. Arthritis and rheumatism; 1997. Р.217-225.]
Однако ФНО представляет собой цитокин широкого спектра действия, в норме играющий роль в защите от патогенов, формировании лимфоидных органов в процессе онтогенеза и развитии воспалительной реакции. ФНО вырабатывается преимущественно клетками иммунной системы: макрофагами, нейтрофилами, лимфоцитами и дендритными клетками [Vilcek J, Lee TH. Tumor necrosis factor. New insights into the molecular mechanisms of its multiple actions. J Biol Chem; 1991. Р.7313-7316], а рецепторы к ФНО конститутивно экспрессируются на поверхности всех клеток организма. Для устранения симптомов определенных воспалительных заболеваний можно использовать блокаторы сигнального пути ФНО, такие как моноклональные антитела к ФНО (например, адалимумаб или инфликсимаб) или гибридные белки на основе рецептора к ФНО (например, этанэрцепт). Целый ряд рекомбинантных блокаторов ФНО в настоящее время успешно применяется в клинике: этанэрцепт (коммерческое название Энбрел), ФНОР2, слитый с Fc-фрагментом человеческого IgG1, химерное полноразмерное антитело инфликсимаб, включающее мышиные и человеческие участки (торговая марка Ремикейд), человеческие полноразмерные антитела адалимумаб (торговая марка Хумира) и голимумаб (торговая марка Симпони); F(ab)2 фрагмент антитела мыши афелимомаб; ПЭГилированный Fab-фрагмент гуманизированного антитела мыши цертолизумаб пегол (торговая марка Цимзия).
Примеры блокирующих ФНО антител широко отражены в международных и российских патентах, например в патенте RU 2270030 «Способ ингибирования активности человеческого TNF α (варианты), применение выделенного антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента в качестве компонента для производства лекарственного средства (варианты) и выделенное человеческое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент», который соответствует антителу адалимумаб; в патенте RU 2416645 «Одноцепочечное антитело, связывающее фактор некроза опухоли альфа, ДНК, плазмидная ДНК и способ получения одноцепочечного антитела», который соответствует оптимизированному под систему экспрессии в клетках яичников китайского хомячка антителу инфликсимаб; в патенте RU2377253 «Антитела, специфичные к фактору некроза опухолей, и их применение», который соответствует антителу голимумаб, и т.д. Однако данные молекулы осуществляют неспецифическое блокирование каскада передачи сигнала ФИО, приводя к нежелательным побочным эффектам, к которым относятся: реактивация латентной формы туберкулеза [Keane J, et al. Tuberculosis associated with infliximab, a tumor necrosis factor alpha-neutralizing agent. N Engl J Med; 2001. Р.1098-1104], усиление демиелинизации при рассеянном склерозе [van Oosten BW, et al. Increased MRI activity and immune activation in two multiple sclerosis patients treated with the monoclonal anti-tumor necrosis factor antibody cA2. Neurology; 1996. Р.1531-1534] и индуцированная ФНО-блокаторами системная красная волчанка [Shakoor N, et al., Drug-induced systemic lupus erythematosus associated with etanercept therapy. Lancet; 2002. Р.579-580]. В силу широко спектра действия ФНО и плейотропного эффекта его блокирование представляется целесообразным проводить специфически, как минимум разграничивая действие блокатора на клетки - продуценты ФНО лимфоцитарного ряда (блокирующий эффект должен быть минимальным) и клетки - продуценты ФНО макрофагально-моноцитарного ряда (блокирующий эффект должен быть максимальным).
Наиболее близким аналогом настоящего изобретения являются однодоменные антитела ламы, указанные в патенте RU 2455312, «Однодоменные антитела, направленные против фактора некроза опухолей альфа, и их применение». Они представляют собой полипептид, включающий в себя рекомбинантное однодоменное антитело ламы к ФНО, в количестве не менее двух субъединиц, и дополнительные субъединицы, также являющиеся однодоменными антителами, которые связываются с сывороточными белками. Антитела, описанные в патенте RU 2455312, получены на основе однодоменных антител ламы. Производные однодоменных антител ламы к ФНО содержат дополнительные субъединицы, которые также являющиеся однодоменными антителами и связываются с сывороточными белками, что направлено на увеличение срока циркуляции миниантител в кровотоке, но не обеспечивает тканеспецифической доставки и селективного наведения на отдельные клеточные источники ФНО. Производные однодоменных антител ламы к ФНО, описанные в патенте RU 2455312, блокируют ФНО-сигналинг системно, за счет своих ФНО-связывающих доменов, что препятствует созданию на их основе специфических ФНО-блокаторов.
Таким образом, цель настоящего изобретения состояла в том, чтобы создать новые антитела, которые эффективно связывали бы ФНО, но не блокировали бы его активность при системном воздействии. При этом такие антитела могут найти применение как сами по себе, в виде компонента новой диагностической системы для определения уровня ФНО у пациентов, так и в виде биспецифических производных, направленных на избирательное блокирование ФНО-сигналинга, в момент секреции этого цитокина иммунными клетками отдельной популяции, например инфильтрировавшимися в очаг воспаления макрофагами.
Раскрытие изобретения
Задачей, решаемой авторами настоящего изобретения, является создание новых антител, эффективно связывающих ФНО, а также антител, эффективно связывающих ФНО, но не блокирующих его активность при системном воздействии, в частности биспецифических производных, направленных на избирательное блокирование ФНО, продуцируемого клетками макрофагально-моноцитарного ряда.
Технический результат настоящего изобретения заключается в получении новых антител, обеспечивающих связывание ФНО человека и позволяющих создавать их производные, способные селективно блокировать ФНО, производимый отдельной популяцией клеток иммунной системы, в частности производные, представляющее собой селективный блокатор ФНО, направленный на ФНО, продуцируемый клетками макрофагально-моноцитарного ряда.
Поставленная задача решается благодаря разработке рекомбинантного однодоменного мини-антитела VHH (названного авторами настоящего изобретения «VHH-41»), способного связывать белок фактор некроза опухолей (ФНО) человека и имеющего вариабельный домен, характеризующийся последовательностью аминокислот, представленной в SEQ ID NO:1.
Также частным вариантом настоящего изобретения является упомянутый выше фрагмент ДНК, имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2.
Также настоящее изобретение предоставляет способ получения упомянутого выше антитела, включающий следующие стадии:
а) конструирование вектора, содержащего упомянутый выше фрагмент ДНК под промотором, обеспечивающим его экспрессию;
б) трансформацию клеток-продуцентов вектором, полученным на стадии а);
в) экспрессию антитела в клетках-продуцентах;
г) выделение и очистку антитела из клеток-продуцентов.
Также частным вариантом настоящего изобретения является способ выявления и определения уровня фактора некроза опухоли человека в биологическом образце, включающий:
а) приведение в контакт биологического образца с антителом по п.1,
б) определение связывания указанного антитела с указанным образцом, и
в) сравнение связывания, обнаруженного на стадии (б), со стандартом, соответствующим нормальному или повышенному уровню содержания фактора некроза опухоли человека.
В основе настоящего изобретения находятся неклассические полноразмерные антитела, которые применялись для создания всех ныне применяющихся блокаторов ФНО, а малые однодоменные антитела на основе верблюжьих мини-антител, которые имеют ряд преимуществ по сравнению с классическими антителами для практического применения в области терапии заболеваний.
Рекомбинантные однодоменные антитела получают на основе особых неканонических однодоменных антител, существующих в норме наряду с классическими антителами у животных семейства Верблюдовых (и у некоторых видов акул). Эти особые антитела состоят из димера только одной укороченной (без первого константного района СН1) тяжелой цепи иммуноглобулина и полнофункциональны в отсутствие легкой цепи иммуноглобулина. Для собственно специфического узнавания и связывания антигена при этом необходим и достаточен лишь один вариабельный домен (VHH, «мини-антитело», «nanobody» или однодоменное антитело) этого антитела. Организация вариабельных доменов (VHH) неканонических антител в значительной степени подобна той, что у вариабельных доменов (VH) классических антител (у человека VH-домены иммуноглобулинов подкласса IgG3 имеют особо выраженную гомологию с VH и VHH верблюдовых). В обоих случаях V-домены состоят из четырех консервативных каркасных участков (FR, «framework regions»), окружающих три гипервариабельных участка (определяющие комплементарность, CDR, от «complementarity determining regions»). В обоих случаях домены формируют типичную для V-домена иммуноглобулина пространственную структуру из двух бета-листов [Padlan E.A. X-Ray crystallography of antibodies. Adv. Protein Chem. 1996; 49: 57-133. Muyldermans S., Cambillau C., Wyns L. Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. TIBS 2001; 26: 230-235]. В этой структуре все три гипервариабельных участка сгруппированы с одной стороны V-домена (где они участвуют в узнавании антигена) и располагаются в петлях, соединяющих бета-структуры. Однако имеются и важные отличия, связанные с функционированием VHH в формате одного домена. Так, гипервариабельные участки CDR1 и CDR3 заметно увеличены в случае VHH. Часто в гипервариабельных участках VHH обнаруживаются цистеиновые остатки, причем присутствующие сразу в двух участках (чаще всего в CDR1 и CDR3, реже - в CDR2 и CDR3). При исследовании кристаллических структур VHH было показано, что эти цистеиновые остатки формируют новые дисульфидные связи, что приводит к дополнительной стабилизации структуры петель данного антигена. Наиболее явным и воспроизводимым отличительным признаком VHH являются четыре замены гидрофобных аминокислотных остатков на гидрофильные во втором каркасном участке (Val37Phe, Gly44Glu, Leu45Arg, Trp47Gly согласно нумерации Кабат). Этот каркасный участок в случае VH домена является высоко консервативным, обогащен гидрофобными аминокислотными остатками и особо важен для образования связи с вариабельным доменом VL легкой цепи. VHH-домен в этом плане сильно отличается: указанные замены гидрофобных аминокислот на гидрофильные делают невозможной ассоциацию VHH и VL. Эти замены также объясняют высокую растворимость VHH, антитела, когда его получают в виде рекомбинантного белка [Тиллиб С.В. «Верблюжьи антитела» - эффективный инструмент для исследований, диагностики и терапии. Молекулярная биология 2011; 45(1): 77-85].
По сравнению с традиционными и чисто рекомбинантными антителами верблюжьи антитела обладают рядом преимуществ, что позволяет предполагать большой потенциал их будущего использования в различных исследованиях и при создании новых биотехнологических устройств, а также в клинических целях для диагностики и лечения заболеваний, в том числе:
- удобство способа получения и селекции верблюжьих мини-антител;
- небольшой размер 13-15 кДа, обеспечивающий высокую биодоступность;
- возможность образовывать «выпуклые» антигенсвязывающие участки, способные связываться с углублениями и активными центрами антигенов-мишеней;
- высокий выход и простота системы экспрессии, в качестве которой можно использовать Е. coli;
- легкость в проведении генно-инженерных манипуляций, включая создание бифункциональных и полифункциональных производных.
Разработанное авторами настоящего изобретения рекомбинантное однодоменное мини-антитело VHH, названное VHH-41, не имеет участков гомологии ни с одним из ранее описанных антител к ФНО; гипервариабельные участки этих антител также не имеют гомологии, как следствие - принципиально разными свойствами будут обладать и гуманизированные производные этих антител.
Кроме того, авторами настоящего изобретения, разработано производное рекомбинантного однодоменного мини-антитела VHH-41, содержащее дополнительные субъединицы, которые связываются с белками-макрофагальными маркерами, что позволяет осуществлять тканеспецифическую доставку и селективное наведение на отдельные клеточные источники ФНО. В частности, разработанное производное рекомбинантного однодоменного мини-антитела VHH-41 позволяет осуществлять направленное воздействие на специфическую блокировку ФНО, синтезируемого клетками макрофагально-моноцитарного ряда. Производные антитела VHH-41 блокируют ФНО-сигналинг только после связывания и с ФНО, и с макрофагальным маркером, обеспечивая специфичность блокирующего действия.
Указанное производное может быть использовано для лечения, и/или предупреждения, и/или облегчения состояния, связанного с воспалительным ответом, вызванным клетками макрофагально-моноцитарного ряда.
В одном из вариантов реализации настоящее изобретение представляет собой рекомбинантное однодоменное антитело VHH-41, содержащее последовательность аминокислот вариабельного домена SEQ ID NO:1, способное связывать белок фактор некроза опухолей (ФНО) человека.
В другом варианте реализации настоящее изобретение представляет собой фрагмент ДНК, кодирующий рекомбинантное однодоменное антитело VHH-41. Частным примером таких последовательностей является SEQ ID NO:2. При этом необходимо учитывать, что полипептиды однодоменных антител, соответствующих настоящему изобретению, могут кодироваться большим множеством молекул нуклеиновых кислот, что является результатом хорошо известного в данной области техники явления вырожденности генетического кода. Суть его состоит в том, что любая аминокислота (за исключением триптофана и метионина), входящая в состав природных пептидов, может кодироваться более чем одним триплетным нуклеотидным кодоном. Любая из этих вырожденных кодирующих молекул нуклеиновых кислот может входить в состав кассет, экспрессирующих антитела, заявленные в соответствии с настоящим изобретением, и относится к области действия настоящего изобретения.
В другом варианте реализации настоящее изобретение представляет собой способ получения антитела VHH-41 или его производного, предусматривающий следующие стадии:
а) конструирование вектора, содержащего последовательность нуклеотидов, кодирующую антитело VHH-41 или его производное, под обеспечивающим высокий уровень экспрессии промотором, конститутивным либо индуцибельным, который также может содержать последовательности, позволяющие селективно очистить полученное антитело, на основе любого коммерчески доступного вектора, известного специалисту в данной области техники;
б) трансфекция/трансформация клеток-продуцентов предварительно полученным вектором, при этом клетками продуцентами предпочтительно являются микроорганизмы, более предпочтительно прокариотические, наиболее предпочтительно Е. coli, однако в качестве продуцентов могут использоваться любые другие системы экспрессии, известные специалисту в данной области техники, включая дрожжей, клеточные культуры млекопитающих и насекомых, и т.д.;
в) экспрессия антитела в клетках-продуцентах, при этом экспрессия может быть конститутивной, либо, предпочтительно, индуцибельной, внутриклеточной либо секреторной, предпочтительно направленной в периплазматическое пространство в случае продуцента Е. coli, либо в любой стандартной модификации, известной специалисту в данной области техники;
г) выделение и очистка антитела из клеток-продуцентов с использованием гексагистидиновой метки и аффинной хроматографии или любой стандартной методики, известной специалисту в данной области техники.
В другом варианте реализации настоящее изобретение представляет собой способ выявления и определения уровня фактора некроза опухоли человека в биологическом образце, включающий:
а) приведение в контакт биологического образца с антителом по п.1,
б) определение связывания указанного антитела с указанным образцом, и
в) сравнение связывания, обнаруженного на стадии (б), со стандартом, соответствующим нормальному или повышенному уровню содержания фактора некроза опухоли человека.
Согласно настоящему изобретению в качестве биологического образца могут быть использованы, например, цельная кровь, плазма, сыворотка крови, ткани, отдельные клетки, межклеточная жидкость, слезная жидкость и др. Определение связывания антитела с биологическим образцом может осуществляться любым стандартным методом, известным специалисту в данной области, в частности иммуноферментным анализом. В качестве стандарта могут быть использованы препараты рекомбинантного ФНО, имеющие концентрацию активного вещества, соответствующую нормальному или повышенному уровню ФНО, характерному для исследуемого типа образца, известному специалисту в данной области техники.
Краткое описание чертежей
Фиг.1. Результаты анализа антитела VHH-41 методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидном геле. Проведена электрофореграмма рекомбинантного антитела VHH-41 после аффинной очистки. Мономер антитела имеет молекулярную массу 16 кДа, совпадающую с расчетной.
Фиг.2. Результаты твердофазного ИФА антитела VHH-41 и контрольного мини-антитела, специфичного к чФНО [Coppieters, K., Dreier, Т., Silence, К., de Haard, Н., Lauwereys, M., Casteels, P., Beirnaert, E., et al. (2006). Formatted anti-tumor necrosis factor alpha VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collagen-induced arthritis. Arthritis & Rheumatism, 54(6), 1856-1866. doi:10.1002/art.21827]. Антитело VHH-41 демонстрирует аффинность к человеческому ФНО, сопоставимую с аффинностью контрольных мини-антител к чФНО.
Фиг.3. Результаты цитотоксического теста антитела VHH-41 и контрольного мини-антитела, специфичного к чФНО. Антитело VHH-41, в отличие от контрольного мини-антитела, само по себе не имеет блокирующей активности в отношении ФНО и не препятствует ФНО-индуцируемому апоптозу клеток.
Фиг.4. Гипервариабельные участки молекулы мини-антитела VHH-41. На чертеже приведена аминокислотная последовательность мини-антитела VHH-41 и отмечены его Гипервариабельные участки CDR1, CDR2, CDR3 (показаны черными стрелками) и гексагистидиновая метка для аффинной очистки антитела (показана черной стрелкой).
Фиг.5. Результаты хроматографии производного антитела VHH-1, имеющего дополнительную димеризующуюся субъединицу в виде флуоресцентного белка Katushka. На рисунке показаны: А) необработанная хроматограмма производного мини-антитела VHH-1, полученная методом эксклюзионной водной хроматографии (гель-фильтрации), Б) его нормализованная хроматограмма и В) график расчета его молекулярной массы по молекулярным массам калибровочных веществ. Как видно из результатов, производное мини-антитела VHH-1, имеющего дополнительную димеризующуюся субъединицу в виде слитого с ним флуоресцентного белка Katushka [Shcherbo D, Merzlyak ЕМ, Chepurnykh TV, Fradkov AF, Ermakova GV, Solovieva EA, Lukyanov KA, Bogdanova EA, Zaraisky AG, Lukyanov S, Chudakov DM. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nature Methods. 2007, V.4, No9, р.741-746], преимущественно существует в растворе в форме димера.
Фиг.6. Кинетика связывания, скорость ассоцации, скорость диссоциации и константа диссоциации мономера и димерного производных антитела VHH-41 к ФНО человека. На рисунке показаны: А) сенсограммы, характеризующие кинетику связывания однодоменного антитела VHH-41 в убывающих развдениях с рекомбинантным ФНО человека, иммобилизированном на поверхности чипа для измерения поверхностного плазменного резонанса также в убывающих разведениях. Всего представлены 15 кривых для 15 отдельных взаимодействий. Б) скорость ассоциации (Ka), скорость диссоциации (Kd) и константа диссоциации (KD) мономеров исходного мини-антитела VHH-41 (квадраты) и димеров его производного VHH-41-К, содержащих димеризующую субъединицу белка Katushka (треугольники). Данные были получены методом поверхностного плазменного резонанса на приборе Proteon XPR36 (BioRad) с использованием препаратов очищенных рекомбинантных мини-антител и очищенного рекомбинантного ФНО человека. Для эксперимента использовались иммобилизованный на поверхности биочипа рекомбинантный ФНО человека в концентрациях 1000, 666, 444, 296, 198 нМ и однодоменные мини-антитела VHH-41 в концентрации 1 мкМ, 500 и 250 нМ, всего было проанализировано 15 взаимодействий. По результатам эксперимента видно, что связывание с ФНО димерного производного VHH-41-К имеет аффинность приблизительно на два порядка сильнее, чем связывание исходного мономерного мини-антитела VHH-41. Таким образом, для практического применения более перспективными представляются производные исходного мини-антитела VHH-41, включая бивалентные, поливалентные и биспецифические.
Фиг.7. График, демонстрирующий скорость ассоциации, скорость диссоциации и константу диссоциации димеров антитела VHH-41 к ФНО человека с интактными и измененными направленным мутагенезом гипервариабельными участками. На чертеже показаны: А) скорость ассоциации (Ka), Б) скорость диссоциации (Kd) и В) константа диссоциации (KD) димеров исходного мини-антитела VHH-41 с интактными гипервариабельными участками (треугольники) и димеров его производного с гипервариабельными участками, измененными в ходе сайт-направленного мутагенеза (квадраты). Данные были получены методом поверхностного плазменного резонанса на приборе Proteon XPR36 (BioRad) с использованием препаратов очищенных рекомбинантных мини-антител и очищенного рекомбинантного ФНО человека. Для эксперимента использовались иммобилизованный на поверхности биочипа рекомбинантный ФНО человека в концентрациях 1000, 666, 444, 296, 198 нМ и однодоменные мини-антитела VHH-41 (нормальное и измененное мутагенезом) в разведении 500 нМ и 1 мкМ соответственно, всего было проанализировано 10 взаимодействий для каждого антитела. По результатам эксперимента видно, что связывание с ФНО исходного димера мини-антитела VHH-41 имеет аффиность приблизительно 100 нМ, а димера антитела с измененными гипервариабельными участками - 100 мкМ. Поскольку изменение гипервариабельных участков приводит к ухудшению аффиности мини-антитела на три порядка, тем самым показана высокая специфичность к ФНО димера мини-антитела VHH-41.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Получение библиотеки вариабельных доменов однодоменных антител.
Иммунизация.
Двугорбого верблюда Camelus bactrianus последовательно иммунизировали 5 раз. В качестве антигена использовали рекомбинантный ФНО. Рекомбинантный ФНО человека экспрессировали в клетках Е. coli и очищали по протоколу, опубликованному ранее (Мутанты фактора некроза опухолей человека: получение и некоторые свойства / Л.Н.Шингарова, Л.Н.Сагайдак, Р.Л.Турецкая, С.А.Недоспасов, Д.С.Есипов, В.Г.Коробко // Биоорг. химия. - 1996. - Т.22, вып.4. - С.243-251. - ISSN 0132-3423.)
Первую инъекцию проводили антигеном, смешанным с полным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1. Затем антиген смешивали с неполным адъювантом Фрейнда (1:1) и проводили последовательно еще 4 инъекции, соответственно через 1 месяц и трижды - через 2 недели. Забор крови (150 мл) проводили через 5 дней после последней инъекции. Для предотвращения свертывания взятой крови добавляли гепарин 35 ед./мл и ЭДТА (2 мМ).
Выделение В-лимфоцитов.
Кровь разводили в 2 раза стандартным солевым раствором (PBS), содержащим 1 мМ ЭДТА. На 15 мл-ступеньку специальной среды (Histopaque-1077, Sigma) с плотностью 1,077 г/мл наслаивали 35 мл разбавленного раствора крови и проводили центрифугирование в течение 20 мин при 800 g. Мононуклеарные клетки (лимфоциты и моноциты) отбирали из интерфазной зоны плазма/Histopaque, после чего промывали раствором PBS, содержащим 1 мМ ЭДТА.
Выделение РНК из В-лимфоцитов.
Суммарную РНК из В-лимфоцитов выделяли с помощью реагента TRIzol (Invitrogen). Затем поли(А)-содержащую РНК выделяли на колонке с олиго(dТ)-целлюлозой из тотальной РНК. Концентрацию РНК определяли с помощью биофотометра (Eppendorf) и качество выделенной РНК проверяли с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле с формальдегидом.
Реакция обратной транскрипции: синтез кДНК на матрице поли(А)+РНК. выделенной из В-лимфоцитов.
Реакцию обратной транскрипции проводили в 40 мкл по стандартному протоколу [Sambrook et al., 1989] с использованием обратной транскриптазы Н-M-MuLV, 1 мкг РНК и 1 мкг праймера олиго(dT)15 в качестве затравки.
Амплификация фрагментов кДНК, кодирующих вариабельные домены антител.
Продукты обратной транскрипции (1 мкл) использовали в качестве матрицы в полимеразной цепной реакции объемом 50 мкл, содержащей два праймера CALL001 (5'-gtcctggctgctcttctacaagg-3') и CALL002 (5'-ggtacgtgctgttgaactgttcc-3') в количестве 20 пмоль в следующих условиях: 95°С, 90 с, (95°С - 30 с, 59°С - 120 с, 72°С - 90 с)×30 циклов, 72°С, 300 с. Продукты амплификации разделяли в агарозном геле, содержащем бромистый этидий. Продукты амплификации размером 600-800 п.н., соответствующие неканоническим антителам, выделялись из геля с помощью набора QIAEX II (QIAGEN, США) и использовались в качестве матрицы в аналогичной реакции амплификации с праймерами 5'-ccagccggccatggctgatgtgcagctggtggagtctgg-3' и 5'-ggactagtgcggccgcttgaggagacggtgacctgggt-3', содержащими дополнительные последовательности, соответствующие участкам узнавания рестрикционных эндонуклеаз, соответственно Ncol и Notl.
Создание библиотеки вариабельных доменов однодоменных антител.
Полученные продукты амплификации клонировали по сайтам Ncol и Notl в фагмидный вектор pHEN4 и, используя в качестве фага-помощника бактериофаг М13К07 (New England Biolabs, США), получали фаговую библиотеку с поверхностной экспрессией вариабельных доменов однодоменных антител, как описано [Hamers-Casterman et al., 1993; Nguyen et al., 2001; Saerens et al., 2004; Rothbauer et al., 2006].
Пример 2
Селекция мини-антител, специфически узнающих ФИО.
Селекцию мини-антител проводили методом фагового дисплея с использованием рекомбинантного ФНО, иммобилизованного на дне лунок 96-луночного ИФА-планшета. Использовали полистироловые иммунологические планшеты с высокой сорбцией MICROLON 600 (Greiner Bio-One). Для блокировки использовали 1%-ный BSA (Sigma-Aldrich, США) и/или 1%-ное обезжиренное молоко (Bio-Rad, США) в PBS. Процедуру селекции и последующей амплификации отбираемых фаговых частиц (содержащих ген мини-антитела внутри, а экспрессирующееся мини-антитело - в составе поверхностного фагового белка pill) повторяли, как правило, последовательно три раза. Все манипуляции проводили, как описано [Hamers-Casterman et al., 1993; Nguyen et al., 2001; Saerens et al., 2004; Rothbauer et al., 2006].
Пример 3
Продукция мини-антитела VHH-41.
Полученную кДНК мини-антитела VHH-41 переклонировали в экспрессионный плазмидный вектор - модифицированный вектор pHEN6 [Conrath K.E., Lauwereys M., Galleni M., Matagne A., Frere J.M., Kinne J., Wyns L., Muyldermans S. Beta-lactamase inhibitors derived from single-domain antibody fragments elicited in the Camelidae. Antimicrob. Agents Chemother. 2001; 45:2807-12], обеспечивающий присоединение к С-концу мини-антитела полигистидинового (His)6-эпитопа (сразу вслед за НА-эпитопом, кодируемым в векторе pHEN6). Благодаря наличию на N-конце экспрессируемой последовательности сигнального пептида (pelB) нарабатываемый рекомбинантный белок (мини-антитело) накапливается в периплазме бактерий, что позволяет эффективно его выделять методом осмотического шока, не разрушая собственно бактериальные клетки. Продукцию мини-антител проводили в Е. coli (штамм BL21). Экспрессию индуцировали добавлением 1 мМ индолил-бета-В-галактопиранозида и клетки инкубировали при интенсивном перемешивании в течение 7 часов при 37°С или в течение ночи при 29°С. Мини-антитела VHH-41 выделяли из периплазматического экстракта с использованием аффинной хроматографии на Ni-NTA-агарозе с использованием системы для очистки QIAExpressionist (QIAGEN, США). Результаты очистки мини-антитела VHH-41 приведены на ФИГ.1, структура мини-антитела VHH-41 показана на ФИГ.4.
Пример 4
Определение биологической активности мини-антител VHH-41.
Измерение биологической активности и оценку эффективности блокировки ФНО проводили с помощью цитотоксического теста на клетках мышиной фибросаркомы линии L929, чувствительных к ФНО. Вкратце, клетки линии L929 были посажены в 96-луночный планшет из расчета по 5×104 клеток на лунку. Постоянная концентрация рекомбинантного ФНО человека (чФНО) 20 нг/мл и Актиномицина Д маннитола 4 мкг/мл (Sigma A5156), охарактеризованная ранее как вызывающая гибель 95% клеток, и убывающие разведения тканеспецифического блокатора чФНО добавляли к монослою L929 клеток в 96-луночные планшеты. После инкубации в течение 24 часов к клеткам добавляли раствор МТТ (Sigma M5655) до конечной концентрации 6 пМ/мл. Через 16 часов кристаллы формазана солюбилизировали 10% раствором додецилсульфата натрия в диметилсульфоксиде, после чего измеряли оптическую активность на микропланшетном фотометре при длине волны 540 нм с референсным значением 492 нм. Значения оптической плотности были пересчитаны на количество живых клеток. Результаты исследования показали, что VHH-41 эффективно связывает ФНО, но сам по себе не блокирует цитотоксическое действие чФНО на клетки мышиной фибросаркомы линии L929 (См. ФИГ 3).
Пример 5
Исследование физико-химических свойств мини-антитела VHH-41 методом поверхностного плазмонного резонанса.
Подтверждение способности мини-антитела VHH-41 связывать чФНО было выполнено с помощью метода твердофазного ИФА (См. Фиг.2). Для дальнейшего определения физико-химических свойств мини-антитела VHH-41, определяющих его аффинность, были проведены измерения его кинетики связывания с чФНО. Определение скорости ассоциации, скорости диссоциации и константы диссоциации мини-антитела VHH-41 проводились с помощью прибора поверхностного плазмонного резонанса Proteon XPR36 (Bio-Rad).
Для этого препарат очищенного рекомбинантного ФНО человека в цитратном буфере (рН=5.5) был иммобилизован на GLC-чипе, по протоколу производителя, в пяти различных концентрациях - 198 нМ, 296 нМ, 444 нМ, 666 нМ и 1000 нМ. После серии промывок и установлении базовой линии на поверхность чипа были нанесены препараты очищенных рекомбинантных мини-антител VHH41 в фосфатно-солевом буфере в концентрациях 250нМ, 500 нМ и 1000 нМ. В двух повторностях были проанализированы все 15 взаимодействий для каждого сочетания концентрации чФНО и рекомбинантного мини-антитела. Полученные кривые ассоциации - диссоциации представлены на ФИГ 6.
По результатам эксперимента видно, что связывание с ФНО димерного производного VHH-41-K имеет аффинность приблизительно на два порядка сильнее, чем связывание исходного мономерного мини-антитела VHH-41. Таким образом, для практического применения более перспективными представляются производные исходного мини-антитела VHH-41, включая бивалентные, поливалентные и биспецифические. При этом аффинность димерного мини-антитела VHH41 сопоставима с известной из уровня техники аффинностью коммерческого препарата инфликсимаба. При этом производные мини-антитела VHH-41, несущие измененные последовательности аминокислот гипервариабельных участков, имеют существенно сниженную аффинность к ФНО (Фиг.7), что свидетельствует о высокой специфичности исходного мини-антитела VHH-41.

Claims (4)

1. Рекомбинантное однодоменное мини-антитело VHH, способное связывать белок фактор некроза опухолей человека и характеризующееся последовательностью аминокислот вариабельного домена, представленной в SEQ ID NO:1.
2. Фрагмент ДНК, кодирующий рекомбинантное однодоменное мини-антитело VHH по п.1 и имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:2.
3. Способ получения антитела по п.1, включающий следующие стадии:
а) конструирование вектора, содержащего фрагмент ДНК по п.2 под промотором, обеспечивающим его экспрессию;
б) трансформацию клеток-продуцентов вектором, полученным на стадии а);
в) экспрессию антитела в клетках-продуцентах;
г) выделение и очистку антитела из клеток-продуцентов.
4. Способ выявления и определения уровня содержания фактора некроза опухоли человека в биологическом образце, включающий:
а) приведение в контакт биологического образца с антителом по п.1,
б) определение связывания указанного антитела с указанным образцом, и
в) сравнение связывания, обнаруженного на стадии (б), со стандартом, соответствующим нормальному или повышенному уровню содержания фактора некроза опухоли человека.
RU2012147173/10A 2012-11-07 2012-11-07 Рекомбинантное однодоменное антитело, способное специфически связывать фактор некроза опухолей человека, и его производные RU2530553C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2012147173/10A RU2530553C2 (ru) 2012-11-07 2012-11-07 Рекомбинантное однодоменное антитело, способное специфически связывать фактор некроза опухолей человека, и его производные

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2012147173/10A RU2530553C2 (ru) 2012-11-07 2012-11-07 Рекомбинантное однодоменное антитело, способное специфически связывать фактор некроза опухолей человека, и его производные

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2012147173A RU2012147173A (ru) 2014-05-20
RU2530553C2 true RU2530553C2 (ru) 2014-10-10

Family

ID=50695352

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2012147173/10A RU2530553C2 (ru) 2012-11-07 2012-11-07 Рекомбинантное однодоменное антитело, способное специфически связывать фактор некроза опухолей человека, и его производные

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2530553C2 (ru)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK3411076T3 (da) * 2016-02-05 2021-07-26 Univ Copenhagen Antistof-lægemiddelkonjugater målrettet mod UPARAP
RU2652876C1 (ru) * 2016-12-21 2018-05-03 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского" Рекомбинантное антитело, специфичное к фактору некроза опухоли и маркеру иммунных клеток миелоидного ряда

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2301967A2 (en) * 2002-11-08 2011-03-30 Ablynx N.V. Single domain antibodies for nasal administration
RU2464276C2 (ru) * 2005-05-18 2012-10-20 Аблинкс Н.В. Улучшенные нанотела против фактора некроза опухоли-альфа

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2301967A2 (en) * 2002-11-08 2011-03-30 Ablynx N.V. Single domain antibodies for nasal administration
RU2464276C2 (ru) * 2005-05-18 2012-10-20 Аблинкс Н.В. Улучшенные нанотела против фактора некроза опухоли-альфа

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COPPIETERS K. et al. "Formatted anti"tumor necrosis factor α VHH proteins derived from camelids show superior potency and targeting to inflamed joints in a murine model of collagen-induced arthritis." Arthritis & Rheumatism (2006), 54(6): 1856-1866. *
HARMSEN M. M., DE HAARD H. J., "Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments." Applied microbiology and biotechnology (2007), 77(1): 13-22 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2012147173A (ru) 2014-05-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102662387B1 (ko) B7-h3 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 의학적 용도
CA3080120C (en) Anti-galectin-9 antibodies and uses thereof
US11472882B2 (en) Anti-B7-H4 antibody, antigen-binding fragment thereof and pharmaceutical use thereof
CN109843927B (zh) 抗b7-h3抗体、其抗原结合片段及其医药用途
KR102410763B1 (ko) 복합체-특이적 항체 및 항체 단편 및 그의 용도
TWI701259B (zh) 4﹘1bb抗體及其製備方法和應用
CN112513090A (zh) 结合人il-4r的抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN112243443A (zh) 抗trop-2抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN117098780A (zh) 单域pd-l1抗体
CN115298216A (zh) 抗体或其抗原结合片段、其制备方法及医药用途
AU2020293160B2 (en) Anti-CD25 antibody and application thereof
RU2530553C2 (ru) Рекомбинантное однодоменное антитело, способное специфически связывать фактор некроза опухолей человека, и его производные
JP4134166B2 (ja) ヒト抗ヒトインターロイキン−18抗体およびその断片、並びにそれらの利用方法
CN110461874A (zh) 抗gitr抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN115843256A (zh) 抗erbb3抗体或其抗原结合片段及其医药用途
RU2792748C2 (ru) Антитело к b7-h4, его антигенсвязывающий фрагмент и его фармацевтическое применение
JPWO2018079393A1 (ja) ジスルフィド型hmgb1特異的抗体、ジスルフィド型hmgb1の測定方法および測定用キット、ならびに、還元型hmgb1、ジスルフィド型hmgb1、トロンビン分解hmgb1等の全てのhmgb1を定量することが可能な測定方法および測定用キット
US20230399416A1 (en) Wars-neutralizing antibody and use thereof
AU2021362977A1 (en) Anti-trop-2 antibody, antigen-binding fragment thereof or mutant thereof, and medical use thereof
CN116744971A (zh) 一种抗erbb3受体的抗体或其抗原结合片段及其医药用途
CN117529501A (zh) 针对抗cd79b抗体的抗独特型抗体
CN115335402A (zh) 特异性抗原结合分子,其制备方法及医药用途
JP2021504379A (ja) 非アルコール性脂肪性肝炎の抗huTNFR1治療

Legal Events

Date Code Title Description
QA4A Patent open for licensing

Effective date: 20200317