KR102410763B1

KR102410763B1 - 복합체-특이적 항체 및 항체 단편 및 그의 용도

Info

Publication number: KR102410763B1
Application number: KR1020157006495A
Authority: KR
Inventors: 스테판 할틀; 크리스챤 프리슈; 아킴 크나픽
Original assignee: 모르포시스 아게
Priority date: 2012-08-17
Filing date: 2013-08-08
Publication date: 2022-06-20
Also published as: EP2885639B1; CN104995517B; EP3540438A1; JP2015531762A; EP2885639A1; US20180134807A1; US20200339703A1; WO2014026905A1; US20240067753A1; CA2878814A1; KR20150041801A; AU2013304237B2; AU2013304237A1; ES2734130T3; CN104995517A; US20150197579A1; JP6437913B2; CA2878814C; DK2885639T3; US10774154B2

Abstract

본 발명은 특정 동족 항원-결합 모이어티, 특히 항체와 그의 항원의 복합체를 특이적으로 검출하는 항체 및 그의 단편을 제공한다. 본 개시내용의 항체는 단독의 상기 동족 항원 결합 모이어티 또는 상기 항원에는 결합하지 않으며, 이에 따라, 예를 들어, 항원-결합된 항원-결합 모이어티를 직접 검출하기 위해 사용될 수 있다. 상기 항체 및 항체 단편의 이용 방법이 추가로 개시된다.

Description

복합체-특이적 항체 및 항체 단편 및 그의 용도{COMPLEX-SPECIFIC ANTIBODIES AND ANTIBODY FRAGMENTS AND ITS USE}

관련 출원과의 상호 참조

본 출원은 전문이 참조로 포함되는 미국 가출원 제61/684,836호(출원일: 2012년 8월 20일)의 이익을 주장한다.

본 발명은 복합체-특이적 항체 및 항체 단편 및 그의 용도에 관한 것이다.

약제 산업에 있어서, 면역글로불린, 예를 들어, 항체의 관심은 지속적으로 증가하고 있다. 2000년도부터, 모노클로널 항체에 대한 치료 시장은 기하급수적으로 성장하여 왔고, 2007년도에는, 미국에서 가장 많이 팔린 20가지의 생명공학 약물 중 8가지가 치료용 모노클로널 항체였으며, 각각은 전 세계 연간 매출액이 50억 USD 초과였다.

현재, 상당한 개수의 항체 및 또한 면역글로불린의 유도체 및 단편은 전임상 및 임상 개발 중이다. 인간으로의 도입 전에, 조사 중인 약물을 광범위한 발견 및 전임상 시험에서 분석하고 특성화하여야 한다. 안전하고 강력한 약물 프로파일의 확립을 위해 독성학적, 약동학적 및 약력학적 특성과 같은 중요한 기준을 조사할 필요가 있다. 치료용 항체 수준을 정량화하고 모니터링하기 위하여, 이들 연구 중 다수는 예를 들어, 환자 또는 실험 동물 유래의 혈청 또는 임의의 체액과 같은 시료 매트릭스 중의 치료용 항체의 특이적인 검출을 위한 약물-특이적 작용제의 사용을 필요로 한다.

약물-특이적 작용제에는 예를 들어, 오직 인간 또는 인간화 면역글로불린만을 검출하고, 이에 따라 비인간 실험 숙주로부터 유래된 시료에서 인간 또는 인간화 치료용 항체를 정량화하는데 사용될 수 있는 항체가 포함된다(예를 들어, 그 전문이 참조로 포함되는 WO2006066912호; 미국 제11/792,910호 참조). 추가의 한 단계는 치료용 항체 내의 독특한 구조에 특이적인 항-이디오타입 항체 또는 항체 단편을 사용한다. 따라서, 항-이디오타입 항체는 시료가 분리되는 숙주와 관계 없이, 시료 매트릭스 내의 특이적 치료용 항체 또는 항체 단편을 검출하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, WO2009032128호 참조). 그러나, 대다수의 항-이디오타입 항체가 치료용 항체의 독특한 CDR 중 하나 이상에 결합하고, CDR이 치료용 항체의 항원과 특이적으로 상호작용하는 파라토프를 한정하기 때문에, 유리형, 항원-미결합된 치료용 항체의 검출 및 모니터링만이 가능하다.

US 2012/0157663호에는 소위 "도미노 항체"가 기재되어 있으며, 이는 항체가 각각의 항원에 결합하는 경우에만 항체에 결합하는 능력을 갖는다. US 2012/0157663호의 항체는 특정 하이브리도마-기반의 스크리닝 기술을 통해 생성된다. 표적 항체 상의 도미노 항체의 에피토프가 각각의 항원으로의 표적 항체의 결합 시에 입체형태 변화를 통해 형성되는 것은 모든 도미노 항체에 통상적이다. 에피토프는 표적 항체의 불변 영역(예를 들어, 경쇄의 불변 영역)에 위치하며, 항원 또는 표적 항체의 CDR 영역 중 어떠한 부분도 포함하지 않는다. 대조적으로, 본 발명의 복합체-특이적 항체 및 항체 단편은 표적 항체의 CDR 영역의 적어도 특정 부분에 결합한다. 따라서, 도미노 항체는 표적 항체가 그들 각각의 항원에 결합하는 경우에만 표적 항체를 인식하지만, 도미노 항체는 동일한 항원 특이성을 갖는 다른 표적 항체에도 결합하며, 다시 말하면, 그들은 이 점에서는 범특이적(pan-specific)이다. 대조적으로, 본 발명의 항체 및 항체 단편은 하나의 단일의 표적 항체에 대해 특이적이며, 그들은 표적 항체가 그의 항원에 결합하는 경우에만 이러한 표적 항체에 결합한다.

환자에 적용되는 치료용 항체가 항상 숙주의 신체의 주변부 내에서 상이한 상태 간에 균형을 이루기 때문에, 이들 상이한 상태의 모니터링과 비율에 의해, 치료용 항체의 안전성에 대한 필수 정보가 제공된다. 이들 상이한 상태는 질량 작용의 법칙에 따라 균형을 이루며, 전체 항체, 미결합된 항체 및 결합된 항체를 포함하고, 상기 균형은 예를 들어, 치료용 항체의 친화성 및 또한 신체 내의 항원의 농도에 따라 달라진다. 더욱이, 신체로부터의 치료용 항체의 상대적으로 느린 제거 때문에, 치료용 항체가 그의 항원에 결합되어, 더 긴 기간 동안의 치료용 항체의 투여 시에 항원 수준의 증가가 야기된다(문헌[Charles P. (1999) Journal of Immunology 163; 1521-1528]). 치료용 항체의 존재 하에서, 결합된 항원은 중화되고, 대부분 생활성이 아니다. 그러나, 이러한 현상을 모니터링하여야 하며, 예를 들어, 약물의 갑작스런 중단의 위험을 평가하는데 중요하다.

종합해 보면, 전체 항체, 미결합된 항체 및 결합된 항체의 특이적 검출은 치료용 항체의 프로파일링과 이후의 승인에 대해 특히 흥미롭고 중요하다(문헌[Kuang B. (2010) Bioanalysis, 2(6): 1125-40]). 미결합된 치료용 항체에 결합할 수 있으며, 복합체(그의 항원에 결합된 치료용 항체)에도 또한 결합할 수 있으며, 이에 따라, 전체 항체 로드(load)를 검출하는데 유용한 소수의 항-이디오타입 항체만이 예시되어 있다. 이러한 비-파라토프 항-이디오타입 항체는 WO2009032128호에 개시되어 있다.

대조적으로, 거의 모든 항-이디오타입 항체는 표적 항체의 CDR로 이동되며, 이에 따라, 오직 미결합된 항체만을 검출한다(예를 들어, 문헌[Tornetta M. (2007) Journal of Immunological Methods 328, 34-44] 참조).

그러나, CDR-특이적 항-이디오타입 항체의 사용 또는 비-파라토프 항-이디오타입 항체의 사용 중 어느 것도, 오직 약물-항원 복합체만의 직접적인 검출과 정량화를 가능하게 하지 않는다. 결합된 항체를 정량화하기 위하여, 다양한 ELISA-기반의 검정을 확립하였으나, 간접적인 검출을 위하여 이차, 예를 들어, 항-인간 Fc, 항체의 사용을 항상 필요로 한다. Fc-특이적 검출 항체의 사용은 혈청 면역글로불린으로부터 복합체를 포획하고 분리하기 위해 추가의 단계와 대규모의 세척을 필요로 하며, 이에 따라, 이들 검정은 백그라운드 노이즈와 신호 변화에 민감하다.

따라서, 항체-항원 복합체를 검출하고 정량화하기 위해 더욱 민감하고 강력한 대안적 방법이 필요하다.

발명의 요약

본 발명은 동족(cognate) 항체와 그의 항원의 복합체를 특이적으로 검출하고 이에 결합하는 항체 및 항체 단편을 개시한다. 본 개시내용의 항체는 단독의 상기 동족 항원 결합 모이어티(moiety) 또는 상기 항원에는 결합하지 않으며, 이에 따라, Fc-특이적 이차 항체를 사용하지 않고, 결합된 치료용 항체를 직접 검출하는데 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 특정 동족 항체와 그의 항원의 복합체를 특이적으로 검출하고 이에 결합하는 항체 및 항체 단편을 개시한다. 특히, 본 발명의 항체 및 항체 단편은 동일한 항원 특이성을 갖는 다른 동족 항체의 복합체에 결합하지 않는다.

이들 복합체-특이적 항체는 인간 환자 또는 실험 동물로부터 분리된 시료에서 항체-항원 복합체뿐 아니라 유리 또는 미결합된 약물을 정량화하는 뛰어난 방법을 가능하게 한다. 예를 들어, ELISA 체제와 같은 더욱 민감하고 더욱 강력한 검정이 본 명세서에 개시되어 있으며, 약동학적 연구를 위한 대안적이며 향상된 검정을 제공한다. 추가로, 본 명세서에 개시된 정량화 검정을 사용하여, 예를 들어, 약물 수준의 모니터링을 위한 측방 유동 기술(lateral flow technique)을 사용하는 현장현시 검사(point of care test)를 개발할 수 있다.

본 개시내용은 또한, 상기 복합체의 검출을 위한 검정에서의 상기 항체의 용도를 개시한다. 또한, 본 개시내용은 특정 동족 항체와 그의 항원의 복합체를 특이적으로 검출하는 항체의 확인 방법을 개시한다.

도 1은 ELISA에서, 일련의 관련없는 항원 및 관련된 항원, 및 아달리무맙(Adalimumab)/TNF-α 복합체에 대한 특이적인 결합에 대해 시험된 7가지 항체의 결과를 도시한 것이다. 5 ㎍/㎖의 각 항원을 하룻밤 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 세척 및 5% BSA를 사용한 블로킹 후에, Fab-FH 형식의 항-아달리무맙/TNF-α 항체(2 ㎍/㎖ 용액 유래의 20 ㎕)를 첨가하였다. 검출을 HRP-표지된 항-His 항체 및 퀀타블루(QuantaBlu) 형광 과산화효소 기질을 사용하여 수행하였다.
도 2는 ELISA에서 상이한 고정화된 항원에 대한 AdaTNF#5의 적정의 결과를 도시한 것이다. 시험한 농도 범위(0.03 내지 2000 ng/㎖)에 걸쳐, AdaTNF#5는 아달리무맙/TNF-α 복합체에만 결합하고 그의 단일의 성분과 다른 항원에는 결합하지 않는다.
도 3은 ELISA에서 다양한 항원에 대하여 시험되는 전장 인간 IgG1으로 전환되는 정제된 AdaTNF#5의 결과를 도시한 것이다. HRP에 컨쥬게이트된 정제된 AdaTNF#5-hIgG1은 아달리무맙과 TNF-α의 복합체에 특이적으로 결합한다.
도 4는 약동학적 ELISA 검정의 결과를 도시한 것이다. 인간 TNF-α를 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하고, 증가하는 농도의 아달리무맙을 10% 인간 혈청에 첨가하고, 이를 사전-코팅된 플레이트에 적용하였다. 세척 후에, 항-아달리무맙/TNF-α hIgG1 항체 AdaTNF#5(HRP에 컨쥬게이트됨)를 2 ㎍/㎖로 첨가하였다. 퀀타블루® 형광 과산화효소 기질을 첨가함으로써 검출을 수행하였다. AdaTNF#5는 인간 혈청의 존재 하에서 용량-의존적 방식으로 아달리무맙/TNF-α 복합체에 결합한다.
도 5는 ELISA에서 다양한 항원에 대하여 시험된 IFX-TNF#1, IFX-TNF#2 및 IFX-TNF#3의 결과를 도시한 것이다. 따라서, 각 항원 5 ㎍/㎖을 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하고, Fab-FH 형식의 항-인플릭시맙(Infliximab)/TNF-α 항체(2 ㎍/㎖ 용액 유래의 20 ㎕)를 첨가하였다. IFX-TNF#1이 인플릭시맙/TNF-α 복합체를 특이적으로 검출하는 것이 입증되었다(도 5).
도 6은 항-MOR103/GM-CSF 복합체 항체를 검출하기 위한 스크리닝 ELISA의 결과를 도시한 것이다. 5 ㎍/㎖의 각각의 항원(BSA, GST, MOR03207 및 MOR103)을 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 또한, MOR103/GM-CSF 복합체도 또한 플레이트 상에 고정화시켰다. M103GmCSF#1, M103GmCSF#2 및 M103GmCSF#3은 MOR103/GM-CSF 복합체를 특이적으로 검출하나 단독의 GM-CSF 또는 MOR103을 검출하지는 않는다.
도 7은 표적 선택성에 대하여 M103GmCSF#1을 시험하는 ELISA의 결과를 도시한 것이다. 단독의 MOR103, 비오티닐화 GM-CSF 또는 MOR103에 결합된 비오티닐화 GM-CSF를 아비딘(Avidin)-코팅된 플레이트 상에 코팅하였다. His-태그화된(tagged) M103GmCSF#1 Fab를 증가하는 농도로 첨가하고, 검출하였다. M103GmCSF#1은 약물-표적 복합체로의 결합에 대하여 높은 선택성을 보였으나, 개별 단백질(약물 및 표적)에는 그렇지 않았다.
도 8은 인간 혈청 중의 MOR103/GM-CSF 복합체를 정량화하기 위한 MSD®(메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery)) 기반의 리간드 결합 검정의 결과를 도시한 것이다. MOR103/GM-CSF 복합체에 인간 혈청을 보충하고, 멀티-어레이(Multi-array)® 96-웰 플레이트 스탠다드(Standard) 플레이트 상에서 적정하였다. ECL-표지된 M103GmCSF#1 IgG를 사용하여 MOR103/GM-CSF 복합체를 검출하였다. 적정 곡선을 통하여, MOR103/GM-CSF 복합체를 50% 인간 혈청의 존재 하에 용량 의존적 방식으로 특이적으로 검출하였다.

따라서, 일 양태에서, 본 개시내용은 특정 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하는 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 일 구현예에서, 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편은 특정 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하며, 단독의 상기 동족 항원-결합 모이어티 또는 상기 항원에는 결합하지 않는다.

분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편

다른 양태에서, 개시내용은 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편에 관한 것이며, 여기서, 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편은 100nM, 90nM, 80nM, 70nM, 60nM, 50nM, 40nM, 30nM, 20nM, 10nM, 9nM, 8nM, 7nM, 6nM, 5nM, 4nM, 3nM, 2nM 또는 1 nM 미만의 EC50 농도로, 특정 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합한다.

다른 양태에서, 개시내용은 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편에 관한 것이며, 여기서, 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편은 1 × 107 M-1, 108 M-1, 109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1, 1012 M-1 또는 1013 M-1 미만의 해리 상수(KD)로, 특정 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합한다.

일 양태에서, 개시내용은 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편에 관한 것이며, 여기서, 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편은 모노클로널 항체 또는 폴리클로널 항체이다. 일 구현예에서, 상기 분리된 항체 또는 그의 단편은 인간 또는 인간화 항체이다. 일 구현예에서, 상기 분리된 항체 또는 그의 단편은 키메라 항체이다. 일 구현예에서, 상기 분리된 항체 또는 그의 단편은 인간 중쇄 불변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 분리된 항체는 IgG 아이소타입(isotype)이다. 다른 구현예에서, 항체는 임의의 아이소타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA), 분류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 그의 유도체(예를 들어, IgG1f LALA)의 것일 수 있다. 일 구현예에서, 항체는 IgG1f LALA 아이소타입의 것이다. 일 구현예에서, 상기 분리된 항체 또는 그의 단편은 Fab, F(ab2)', F(ab)2' 및 scFV로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 분리된 항체는 모노클로널 항체, 폴리클로널 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 합성 항체로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 항체 또는 그의 단편은 인간 또는 인간화 항체이다.

동족 항원 결합 모이어티

일 양태에서, 개시내용은 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하는 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 다른 양태에서, 개시내용은 특정 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하는 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 일 구현예에서, 상기 동족 항원 결합 모이어티 또는 상기 특정 동족 항원 결합 모이어티는 동족 항체 또는 그의 단편이다. 일 구현예에서, 상기 동족 항체 또는 그의 단편, 또는 상기 특정 동족 항체 또는 그의 단편은 치료용 항체 또는 치료용 항체 단편이다. 다른 구현예에서, 상기 동족 항체 또는 그의 단편 또는 상기 특정 동족 항체 또는 그의 단편은 진단용 항체 또는 진단용 항체 단편이다.

바람직한 구현예에서, 동족 항체 또는 그의 단편은 특정 동족 모노클로널 항체 또는 그의 단편이다. "특정 동족 모노클로널 항체"는 그의 항원에 특이적으로 결합하는 하나의, 그리고 단 하나의 모노클로널 항체를 말한다. 소위 "도미노 항체"(US 2012/0157663호 참조)의 표적 항체는 이러한 정의 하에서 특정 동족 항체가 아닌데, 이는 도미노 항체가 그들의 표적 항체의 불변 영역에 결합하고, 이에 따라, 하나의 단일의 항체에 대하여 특이적이지 않고, 소정의 표적 특이성을 갖는 모든 또는 적어도 수많은 항체에 대하여 특이적이기 때문이다.

바람직한 구현예에서, 동족 항체 또는 그의 단편은 동족 모노클로널 항체 또는 그의 단편이다.

일 구현예에서, 상기 동족 모노클로널 항체 또는 그의 단편은 인간 또는 인간화 항체이다. 일 구현예에서, 상기 동족 모노클로널 항체 또는 그의 단편은 키메라 항체이다. 일 구현예에서, 상기 동족 모노클로널 항체 또는 그의 단편은 인간 중쇄 불변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 동족 모노클로널 항체는 IgG 아이소타입이다. 다른 구현예에서, 동족 항체는 임의의 아이소타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA), 분류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 그의 유도체(예를 들어, IgG1f LALA)의 것일 수 있다. 일 구현예에서, 동족 항체는 IgG1f LALA 아이소타입의 것이다.

일 구현예에서, 상기 동족 모노클로널 항체 또는 그의 단편은 Fab, F(ab2)', F(ab)2' 및 scFV로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 상기 동족 모노클로널 항체 또는 그의 단편은 모노클로널 항체, 폴리클로널 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 및 합성 항체로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 동족 항체 또는 그의 단편은 인간 또는 인간화 항체이다.

일 양태에서, 개시내용은 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원, 또는 특정 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하는 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편에 관한 것이며, 여기서, 동족 항원 결합 모이어티는 항체-유래 스캐폴드(scaffold)이다. 일 구현예에서, 항체-유래 스캐폴드는 scFv, 4가 항체, 교차-결합 Fab 또는 IgG로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 동족 항체 또는 그의 단편은 단쇄 항체이다.

일 양태에서, 개시내용은 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체, 또는 특정 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하는 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편에 관한 것이며, 여기서, 동족 항원 결합 모이어티는 단일 도메인 항체, 맥시바디(maxibody), 미니바디(minibody), 인트라바디(intrabody), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), v-NAR, 카멜리드(camelid) 항체, 안키린(ankyrin), 도메인 항체, 리포칼린(lipocalin), 작은 모듈형 면역-약제(small modular immuno-pharmaceutical), 맥시바디(maxybody), 단백질 A 및 아필린(affilin)으로 구성된 군으로부터 선택된다.

일 양태에서, 개시내용은 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체, 또는 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하는 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편에 관한 것이며, 여기서, 동족 항원 결합 모이어티는 아달리무맙, MOR103, 리툭시맙(Rituximab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 베바시주맙(Bevacizumab), 세툭시맙(Cetuximab), 젬투주맙(Gemtuzumab), 인플릭시맙, 라니비주맙(Ranibizumab), 유스테키누맙(Ustekinumab), 골리무맙(Golimumab), 나탈리주맙(Natalizumab), 오파투무맙(Ofatumumab), 오말리주맙(Omalizumab), 파니투무맙(Panitumumab)으로 구성되나 이들에 한정되지 않는 목록으로부터 선택된다.

항원

일 양태에서, 개시내용은 특정 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하는 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편에 관한 것이며, 여기서, 항원은 단백질이다. 바람직한 구현예에서, 단백질은 인간 단백질이다.

본 발명의 분리된 모노클로널 항체 또는 단편의 에피토프는 특정 동족 항체의 가변 영역의 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 따라서, 특정 양태에서, 본 개시내용은 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편에 관한 것이며, 여기서, 상기 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편의 에피토프는 특정 동족 항체의 가변 영역의 하나 이상의 아미노산을 포함한다. 다른 양태에서, 본 개시내용은 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편에 관한 것이며, 여기서, 상기 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편의 에피토프는 특정 동족 항체의 가변 영역의 하나 이상의 아미노산, 및 상기 특정 동족 항체의 항원의 하나 이상의 아미노산을 포함한다.

다른 양태에서, 본 개시내용은 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편에 관한 것이며, 여기서, 상기 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편의 에피토프는 특정 동족 항체와, 상기 특정 동족 항체의 항원 둘 모두로부터의 스트레치(stretch)를 포함한다.

일 구현예에서, 상기 단백질은 특정 장애와 관련이 있다. 일 구현예에서, 상기 단백질은 특정 장애에서의 특정 생물학적 치료법에 유용한 표적이다. 일 구현예에서, 상기 단백질은 특정 약물에 대한 유용한 표적이다. 일 구현예에서, 상기 단백질은 치료용 항체 또는 그의 단편에 대한 유용한 표적이다. 일 구현예에서, 상기 단백질은 진단용 항체 또는 그의 단편에 대한 유용한 표적이다. 일 구현예에서, 상기 단백질은 사이토카인이다. 일 구현예에서, 상기 단백질은 수용체이다.

일 구현예에서, 상기 단백질은 염증성 질병, 자가면역 질병, 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염, 악성 종양, 신경변성 질병 또는 임의의 종양-관련 질병과 관련이 있다. 일 구현예에서, 상기 단백질은 암과 관련이 있다.

일 구현예에서, 일 구현예에서, 상기 단백질은 TNF-α, TNF-β, VEGF-A, α4-인테그린, CD20, IgE(Fc 영역), EGFR, GM-CSF, CD19, M-CSF, CD38, MIF, DDT, IL-17A, IL-17C, IL-1α, IL1-β, IL-6, IL-12, IL-23, Her2/c-neu, CD52, CD33으로 구성되나 이들에 한정되지 않는 목록으로부터 선택된다.

일 양태에서, 개시내용은 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하는 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편에 관한 것이며, 여기서, 복합체는 아달리무맙/TNF-α, MOR103/GM-CSF, 트라스투주맙/Her2/c-neu, 알렘투주맙/CD52, 베바시주맙/VEGF-A, 세툭시맙/EGF-R, 젬투주맙/CD33, 인플릭시맙/TNF-α, 라니비주맙/VEGF-A, 유스테키누맙/IL-12, 유스테키누맙/IL-23, 골리무맙/TNF-α, 나탈리주맙/α4-인테그린, 오파투무맙/CD20, 리툭시맙/CD20, 오말리주맙/IgE(Fc 영역), 파니투무맙/EGFR로 구성되나 이들에 한정되지 않는 군으로부터 선택된다.

분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편의 용도

일 양태에서, 개시내용은 시료 중의 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체, 또는 특정 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체의 검출을 위한 분리된 항체 또는 그의 단편의 용도에 관한 것이며, 상기 분리된 항체 또는 그의 단편은 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체, 또는 특정 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하며, 단독의 상기 동족 항원 결합 모이어티 또는 상기 항원에는 결합하지 않는다.

다른 양태에서, 개시내용은 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체, 또는 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하며, 단독의 상기 동족 항원 결합 모이어티 또는 상기 항원에는 결합하지 않는 분리된 항체 또는 그의 단편을 사용하는 시료 중의 동족 항원-결합 모이어티와 그의 항원의 복합체, 또는 특정 동족 항원-결합 모이어티와 그의 항원의 복합체의 검출 방법에 관한 것이다.

일 양태에서, 개시내용은 시료 중의 동족 항원-결합 모이어티와 그의 항원의 복합체 또는 특정 동족 항원-결합 모이어티와 그의 항원의 복합체의 검출 방법에 관한 것이며, 상기 방법은

a) 상기 시료를 분리된 항체 또는 그의 단편과 접촉시키는 단계로서, 상기 분리된 항체 또는 그의 단편이 상기 복합체에 특이적으로 결합하며, 단독의 상기 동족 항원 결합 모이어티 또는 상기 항원에는 결합하지 않는 단계, 및

b) 상기 복합체에 결합된 상기 분리된 항체 또는 단편을 검출하는 단계를 포함한다.

다른 양태에서, 개시내용은 시료 중의 동족 항원-결합 모이어티와 그의 항원, 또는 특정 동족 항원-결합 모이어티와 그의 항원의 복합체의 검출 방법에 관한 것이며, 상기 방법은

a) 상기 시료를 분리된 항체 또는 그의 단편과 접촉시키는 단계로서, 상기 분리된 항체 또는 그의 단편이 상기 복합체에 특이적으로 결합하며, 단독의 상기 동족 항원 결합 모이어티 또는 상기 항원에는 결합하지 않는 단계,

b) 상기 복합체에 결합된 상기 분리된 항체 또는 단편을 검출하는 단계, 및

c) 상기 복합체에 결합된 상기 분리된 항체 또는 단편을 상기 항원-결합된 동족 항원-결합 모이어티의 농도와 연관시키는 단계를 포함한다.

다른 양태에서, 개시내용은 시료 중의 동족 항체와 그의 항원의 복합체 또는 특정 동족 항체와 그의 항원의 복합체의 검출 방법에 관한 것이며, 상기 방법은

a) 분석할 시료를 제공하는 단계,

b) 상기 시료를 분리된 항체 또는 그의 단편과 접촉시키는 단계로서, 상기 분리된 항체 또는 그의 단편이 상기 복합체에 특이적으로 결합하며, 단독의 상기 동족 항체 또는 상기 항원에는 결합하지 않는 단계,

c) 상기 복합체에 결합된 상기 분리된 항체 또는 단편을 검출하는 단계, 및

d) 상기 복합체에 결합된 상기 분리된 항체 또는 단편을 상기 항원-결합된 동족 항체의 농도와 연관시키는 단계를 포함한다.

일 구현예에서, 상기 동족 항원 결합 모이어티는 동족 항체 또는 그의 단편이다. 바람직한 구현예에서, 동족 항체 또는 그의 단편은 동족 모노클로널 항체 또는 그의 단편이다. 일 구현예에서, 상기 동족 모노클로널 항체 또는 그의 단편은 인간 또는 인간화 항체이다. 일 구현예에서, 상기 동족 모노클로널 항체 또는 그의 단편은 키메라 항체이다. 일 구현예에서, 상기 동족 모노클로널 항체 또는 그의 단편은 인간 중쇄 불변 영역 및 인간 경쇄 불변 영역을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 동족 모노클로널 항체는 IgG 아이소타입이다. 다른 구현예에서, 동족 항체는 임의의 아이소타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA), 분류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 그의 유도체(예를 들어, IgG1f LALA)의 것일 수 있다. 일 구현예에서, 동족 항체는 IgG1f LALA 아이소타입의 것이다.

일 구현예에서, 상기 특정 동족 항체와 그의 항원의 복합체는 아달리무맙/TNF-α, MOR103/GM-CSF, 트라스투주맙/Her2/c-neu, 알렘투주맙/CD52, 베바시주맙/VEGF-A, 세툭시맙/EGF-R, 젬투주맙/CD33, 인플릭시맙/TNF-α, 라니비주맙/VEGF-A, 유스테키누맙/IL-12, 유스테키누맙/IL-23, 골리무맙/TNF-α, 나탈리주맙/α4-인테그린, 오파투무맙/CD20, 리툭시맙/CD20, 오말리주맙/IgE(Fc 영역), 파니투무맙/EGFR로 구성되나 이들에 한정되지 않는 군으로부터 선택된다.

일 양태에서, 개시내용은 시료 중의 항원-결합 모이어티의 검출 방법에 관한 것이며, 상기 방법은

a) 동족 항원-결합 모이어티의 항원을 고정화시키는 단계,

b) 상기 고정화된 항원이 상기 시료와 접촉되게 하는 단계, 및

c) 상기 동족 항원-결합 모이어티와 그의 항원 간에 형성된 복합체를, 상기 복합체에 특이적으로 결합하며 단독의 상기 동족 항원 결합 모이어티 또는 상기 항원에는 결합하지 않는 분리된 항체 또는 그의 단편을 사용하여 검출하는 단계를 포함한다.

다른 양태에서, 개시내용은 시료 중의 미결합된 동족 항원-결합 모이어티의 검출 방법에 관한 것이며, 상기 방법은

a) 동족 항원-결합 모이어티의 항원을 고정화시키는 단계,

b) 상기 고정화된 항원이 상기 시료와 접촉되게 하는 단계,

c) 상기 동족 항원-결합 모이어티와 그의 항원 간에 형성된 복합체를, 상기 복합체에 특이적으로 결합하며 단독의 상기 동족 항원 결합 모이어티 또는 상기 항원에는 결합하지 않는 분리된 항체 또는 그의 단편을 사용하여 검출하는 단계, 및

d) b)에서 형성된 복합체를 시료 중의 미결합된 동족 항원-결합 모이어티의 농도와 연관시키는 단계를 포함한다.

방법의 일 구현예에서, 상기 검출은 EIA, ELISA, RIA, 간접적 경쟁 면역검정, 직접적 경쟁 면역검정, 비-경쟁 면역검정, 샌드위치 면역검정, 응집(agglutination) 검정 및 MSD(메소 스케일 디스커버리)로 구성된 군으로부터 선택되는 수단에 의해 달성된다. 바람직한 구현예에서, 상기 검출은 샌드위치 ELISA에 의해 달성된다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 검출은 MSD(메소 스케일 디스커버리) 검정에 의해 달성된다.

일 구현예에서, 시료는 조직 또는 액체 시료이다. 추가의 구현예에서, 액체 시료는 타액, 소변, 전혈, 혈장 또는 혈청이다. 바람직한 구현예에서, 시료는 실험 동물 또는 인간으로부터 수득된다. 더욱 바람직한 구현예에서, 시료는 인간으로부터 수득된 전혈, 혈장 또는 혈청이다.

일 양태에서, 개시내용은 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하며, 단독의 상기 동족 항원 결합 모이어티 또는 상기 항원에는 결합하지 않는 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편의 확인 방법에 관한 것이며, 상기 방법은

(a) 미결합된 항원 및 동족 항체와 동일한 아이소타입을 갖는 항체의 존재 하에서, 동족 항체와 그의 항원의 복합체 또는 특정 동족 항체와 그의 항원의 복합체에 대하여 항체 또는 항체 단편의 라이브러리를 스크리닝하는 단계,

(b) 상기 동족 항체와 그의 항원의 복합체 또는 상기 특정 동족 항체와 그의 항원의 복합체 및 결합된 항원-결합 모이어티를 분리하는 단계, 및

(c) 상기 항원-결합 모이어티를 확인하고 분리하는 단계를 포함한다.

다른 양태에서, 개시내용은 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하며, 단독의 상기 동족 항원 결합 모이어티 또는 상기 항원에는 결합하지 않는 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편의 확인 방법에 관한 것이며, 상기 방법은

(a) 미결합된 항원 및 동족 항체와 동일한 아이소타입 및 동일한 프레임워크를 갖는 항체의 존재 하에서, 동족 항체와 그의 항원의 복합체 또는 특정 동족 항체와 그의 항원의 복합체에 대하여 항체 또는 항체 단편의 라이브러리를 스크리닝하는 단계,

일 양태에서, 개시내용은 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체 또는 특정 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하며, 단독의 상기 동족 항원 결합 모이어티 또는 상기 항원에는 결합하지 않는 하나 이상의 항체 또는 그의 단편 및 이러한 복합체의 검출에 필요한 적어도 하나의 시약 또는 디바이스(device)를 포함하는 키트에 관한 것이다.

다른 양태에서, 개시내용은 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체 또는 특정 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 그의 단편 및 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원 또는 특정 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 하나 이상의 상이한 복합체의 검출에 필요한 적어도 하나의 시약 또는 디바이스를 포함하는 키트에 관한 것이다. 다른 양태에서, 개시내용은 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체 또는 특정 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편, 및 상기 복합체의 검출에 필요한 적어도 하나의 시약 또는 디바이스를 포함하는 키트에 관한 것이다. 일 구현예에서, 상기 디바이스는 측방 유동 디바이스이다.

다른 양태에서, 개시내용은 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체 또는 특정 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 그의 단편을 포함하는 측방 유동 디바이스에 관한 것이다. 일 구현예에서, 상기 하나 이상의 항체 또는 그의 단편은 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체 또는 특정 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하며, 단독의 상기 동족 항원 결합 모이어티 또는 상기 항원에는 결합하지 않는다. 추가의 구현예에서, 상기 하나 이상의 항체는 아달리무맙/TNF-α, MOR103/GM-CSF, 트라스투주맙/Her2/c-neu, 알렘투주맙/CD52, 베바시주맙/VEGF-A, 세툭시맙/EGF-R, 젬투주맙/CD33, 인플릭시맙/TNF-α, 라니비주맙/VEGF-A, 유스테키누맙/IL-12, 유스테키누맙/IL-23, 골리무맙/TNF-α, 나탈리주맙/α4-인테그린, 오파투무맙/CD20, 리툭시맙/CD20, 오말리주맙/IgE(Fc 영역), 파니투무맙/EGFR로 구성되나 이들에 한정되지 않는 군으로부터 선택되는 복합체 중 하나에 결합하는 항체 또는 그의 단편의 군으로부터 선택된다.

다른 양태에서, 개시내용은 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하는 모노클로널 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 분리된 핵산에 관한 것이다.

다른 양태에서, 개시내용은 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하는 모노클로널 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.

다른 양태에서, 개시내용은 동족 항원 결합 모이어티와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하는 모노클로널 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 일 구현예에서, 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 숙주 세포이다. 바람직한 구현예에서, 숙주 세포는 포유류 숙주 세포이다.

다른 양태에서, 개시내용은 표 1에 기재된 항체와 상호 경쟁하는 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 특정 구현예에서, 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편은 표 1에 기재된 항체와 상호 경쟁하며, ELISA-기반의 상호 경쟁에서 표 1에 기재된 항체 중 하나의 특이적 결합을 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 감소시킨다.

다른 양태에서, 개시내용은 표 1에 기재된 항체와 동일한 에피토프와 상호작용하는(예를 들어, 결합, 안정화, 공간 분포에 의함) 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.

일 양태에서, 개시내용은 표 1의 항체 중 임의의 것의 카바트(Kabat)에 의해 정의된 6개의 CDR을 포함하는 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다. 다른 양태에서, 개시내용은 표 1의 항체 각각의 카바트에 의해 정의된 6개의 CDR을 포함하는 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.

일 양태에서, 개시내용은 표 1의 항체 중 임의의 것의 VH 및 VL을 포함하는 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편에 관한 것이다.

다른 양태에서, 개시내용은 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 핵산에 관한 것이며, 여기서, 핵산은 표 1의 항체 중 임의의 것의 VH 및 VL을 포함한다.

다른 양태에서, 개시내용은 표 1에 기재된 핵산과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 서열 동일성을 갖는 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 핵산에 관한 것이다.

정의

본 명세서에 사용되는 용어 "항원 결합 모이어티"는 주어진 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 부여하는 폴리펩티드를 포함하는 모이어티를 말한다. 예를 들어, 항체, 항체 단편, 항체 유도체, 항체-유사 스캐폴드 및 대체 스캐폴드는 적어도 하나의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 또한, 항원 결합 모이어티는 단일 도메인 항체, 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 scFv로 혼입될 수 있다(예를 들어, 문헌[Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136] 참조). 항원 결합 모이어티를 포함하는 분자의 추가의 예는 본 명세서에서 하기에 제공되어 있으며, 피브로넥틴(브리스톨-마이어스 스큅(Bristol-Myers Squibb)이 전부 소유한 아드넥서스(Adnexus), 미국 매사추세츠주 월섬), 카멜리드 항체, 안키린(몰레큘라 파트너즈 아게(Molecular Partners AG), 스위스 취리히), 도메인 항체(도만티스, 리미티드(Domantis, Ltd.), 미국 매사추세츠주 캠브리지, 및 아블린크스 엔브이(Ablynx nv), 벨기에 즈뷔나아르드), 리포칼린(피에리스 프로테오랩 아게(Pieris Proteolab AG), 독일 프라이싱), 작은 모듈형 면역-약제(트루비온 파마슈티칼즈 인코포레이티드(Trubion Pharmaceuticals Inc.), 미국 워싱턴주 시애틀), 맥시바디(아비디아, 인코포레이티드(Avidia, Inc.), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰), 단백질 A(아피바디 아게(Affibody AG), 스웨덴) 및 아필린(감마-크리스탈린 또는 유비퀴틴)(스실 프로테인즈 게엠베하(Scil Proteins GmbH), 독일 할레)을 포함한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "항원-결합 영역"은 항원 결합 모이어티와 항원 간의 특이적 결합의 원인이 되는 항원 결합 모이어티의 도메인을 말한다. 예를 들어, 항체 또는 그의 단편의 항원-결합 영역은 중쇄(본 명세서에서 VH로 약칭) 및 경쇄(본 명세서에서 VL로 약칭)의 N-말단 가변 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. VH 및 VL의 가변 영역은 각각 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 3개의 초가변 영역을 포함한다. VH의 3개의 CDR 및 VL의 3개의 CDR은 서로 3차원적으로 배치되어, 항원 결합 표면을 형성한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "항체"는 전체 항체 및 그의 임의의 단편 또는 단쇄를 포함한다. 천연 발생 "항체"는 이황화 결합에 의해 서로 연결되는 적어도 2개의 중(H) 쇄 및 2개의 경(L) 쇄를 포함하는 단백질이다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 VH로 약칭) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 VL로 약칭) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역(FR)으로 지칭되는 더욱 보존된 영역이 산재되어 있는 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 고가변성 영역으로 추가로 하위분류될 수 있다. 각 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 하기의 순서로 배치되는 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포(예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적 보체계의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자로의 면역글로불린의 결합을 매개할 수 있다. 항체는 임의의 아이소타입(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 분류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2), 그의 하위분류 또는 변형된 버전(예를 들어, IgG1f LALA)의 것일 수 있다.

용어 항체의 "단편"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 말한다. 용어 "단편"에 포함되는 결합 단편의 예는 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편; F(ab)2 단편, 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; VH 도메인으로 구성된 단일 도메인 항체(dAb) 단편(문헌[Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]); 및 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 및 VL 및 VH 영역이 쌍을 형성하여, 1가 분자를 형성하는 단쇄 단편(scFv)(단쇄 Fv(scFv)로 공지됨; 예를 들어, 문헌[Bird et al., (1988) Science 242:423-426]; 및 문헌[Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883] 참조)을 포함한다. 2개의 도메인 VL 및 VH가 개별 유전자에 의해 암호화되지만, 그들이 단일 단백질 쇄로서 제조되게 할 수 있는 인공 펩티드 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다. 이러한 단쇄 항체는 하나 이상의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지되어 있는 통상의 기술을 사용하여 수득되며, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대하여 스크리닝한다.

"항원"은 항원-결합 모이어티에 의해 특이적으로 결합되는 임의의 분자 또는 임의의 분자의 복합체로서 정의된다.

용어 "복합체"는 서로에 대하여 친화성을 갖는 적어도 2개의 모이어티 간의 회합물(예를 들어, 화학적 또는 생화학적)을 말한다. "단백질 복합체" 또는 "폴리펩티드 복합체"는 적어도 하나 또는 그 이상의 폴리펩티드를 포함하는 복합체를 말한다. 본 명세서에 사용되는 복합체는 동족 항원-결합 모이어티와 그의 항원으로 구성된다. 일 구현예에서, 복합체는 항체-항원 복합체이다. 바람직한 구현예에서, 복합체는 치료용 항체와 그의 항원으로 구성된 항체-항원 복합체이다.

용어 "동족"은 함께 기능하거나, 또는 서로, 예를 들어, 오르소고날(orthogonal) tRNA 및 오르소고날 아미노아실-tRNA 신테타제 또는 항체 및 항원에 대하여 일부 양태의 특이성을 갖는 성분을 말한다. 또한 상기 성분은 상보적인 것으로 지칭될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 동족 항원-결합 모이어티는 그의 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 모이어티이다.

용어 "중쇄 가변 영역 CDR1" 및 "H-CDR1"은 용어 "중쇄 가변 영역 CDR2" 및 "H-CDR2", 용어 "중쇄 가변 영역 CDR3" 및 "H-CDR3", 용어 "경쇄 가변 영역 CDR1" 및 "L-CDR1"; 용어 "경쇄 가변 영역 CDR2" 및 "L-CDR2" 및 용어 "경쇄 가변 영역 CDR3" 및 "L-CDR3"이 상호교환 가능한 것처럼 상호교환가능하게 사용된다.

본 명세서에 사용되는 용어 "인간 항체"는 프레임워크 및 CDR 영역 둘 모두가 인간 기원의 서열로부터 유래되는 가변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 인간 항체는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 또는 전장 중쇄 또는 경쇄를 포함한다. 특정 경우에, 인간 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열과 아미노산 서열이 적어도 60%, 70%, 80%, 90% 또는 적어도 95% 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 그렇게 함으로써 상기 인간 항체는 B-세포로부터 분리된 VH/VL 레퍼토리의 PCR-증폭에 의해 생성되거나, 합성에 의해 생성되는 인간 생식계열 유전자로부터 유래된 항체를 포함하는 기술 플랫폼으로부터 수득될 수 있다. 기술 플랫폼은 파지, 리보솜 또는 효모에 디스플레이되는 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 라이브러리 기반의 방법을 포함한다. 각각의 디스플레이 기술은 과학계에서의 표준이다. 또한, 인간 면역글로불린 레퍼토리를 지니는 트랜스제닉 마우스의 면역화는 대상 항원에 대하여 인간 항체를 생성하기 위한 다른 방법이다. 모포시스(MorphoSys) HuCAL® 개념(문헌[Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86])에 기초하여 항체 라이브러리로부터 선택된 항체 또는 그의 단편은 완전 인간으로 간주된다.

본 명세서에 사용되는 용어 "모노클로널 항체"는 단일 분자 조성의 항체 분자의 제제를 말한다. 모노클로널 항체 조성은 특정 에피토프에 대하여 독특한 결합 특이성 및 친화성을 갖는 독특한 결합 부위를 디스플레이한다.

"인간화" 항체는 비-인간 항체의 반응성을 보유하나 인간에서 면역원성이 더 낮은 항체이다. 이는 예를 들어, 비-인간 CDR 영역을 유지하고, 항체의 나머지 부분을 그들의 인간 대응부(즉, 불변 영역 및 가변 영역의 프레임워크 부분)로 대체함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Morrison et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855]; 문헌[Morrison and Oi (1988) Adv. Immunol., 44:65-92]; 문헌[Verhoeyen et al. (1988) Science, 239:1534-1536]; 문헌[Padlan, Molec (1991) Immun., 28:489-498]; 및 문헌[Padlan, Molec (1994) Immun., 31:169-217]을 참조한다. 인간 조작(engineering) 기술의 다른 예에는 US 5,766,886호에 개시된 좀마(Xoma) 기술이 포함되나 이에 한정되지 않는다.

용어 "키메라 항체"는 (a) 불변 영역 또는 그의 부분이 변경되거나, 대체되거나 또는 교환되어, 항원 결합 부위(가변 영역)가 상이하거나 변경된 분류, 이펙터 기능 및/또는 종의 불변 영역, 또는 키메라 항체에 새로운 특성을 부여하는 완전히 상이한 분자, 예를 들어, 효소, 독소, 호르몬, 성장 인자, 약물 등에 결합되거나; 또는 (b) 가변 영역 또는 그의 부분이 상이하거나 변경된 항원 특이성을 갖는 가변 영역으로 변경되거나, 대체되거나, 또는 교환된 항체 분자이다. 예를 들어, 마우스(mouse) 항체는 그의 불변 영역을 인간 면역글로불린 유래의 불변 영역으로 대체함으로써 변형될 수 있다. 인간 불변 영역으로의 대체 때문에, 키메라 항체는 항원의 인식에서 그의 특이성을 유지하면서, 원래 마우스 항체에 비하여 인간에서 항원성이 감소될 수 있다.

용어 "분리된"은 예를 들어, 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체 또는 항원 결합 모이어티가 실질적으로 없는 항체 또는 항원 결합 모이어티일 수 있는 화합물을 말한다. 또한, 분리된 항체 또는 항원 결합 모이어티는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다.

용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 폴리머를 지칭하기 위해 본 명세서에 상호교환가능하게 사용된다. 상기 용어는 자연 발생 아미노산 폴리머 및 비-자연 발생 아미노산 폴리머 뿐만 아니라, 1개 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 모방체인 아미노산 폴리머에도 적용된다. 달리 나타내지 않는 한, 특정 폴리펩티드 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체도 함축적으로 포함한다.

용어 "사이토카인"은 세포간 매개체로서 다른 세포에 대해 작용하는, 한 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반 용어이다. 이러한 사이토카인의 예에는 림포카인, 모노카인 및 통상적인 폴리펩티드 호르몬이 있다. 이러한 사이토카인에는 특히 성장 호르몬, 예컨대 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소의 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 당단백질 호르몬, 예컨대 여포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH), 및 황체형성 호르몬(LH); 간 성장 인자; 섬유모세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 뮬러관 억제 물질; 마우스 고나도트로핀-관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 A-F(예를 들어, VEGF-A); 인테그린(예를 들어, α4-인테그린); 트롬보포이에틴(TPO); 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β; 혈소판-성장 인자; 형질전환 성장 인자(TGF), 예컨대 TGF-α 및 TGF-β; 인슐린 유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도성 인자; 인터페론, 예컨대 인터페론-α, -β 및 -γ; 콜로니 자극 인자(CSF), 예컨대 대식세포-CSF(M-CSF); 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF); 인터류킨(IL), 예컨대 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-17-과 구성원(예를 들어, IL-17C); 종양 괴사 인자, 예컨대 TNF-α 또는 TNF-β; 및 기타 폴리펩티드 인자, 예를 들어 LIF, 키트 리간드(KL), MIF, D-DT가 포함된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 사이토카인은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물 유래의 단백질 및 고유 서열 사이토카인의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.

용어 "수용체"는 특정 리간드 또는 결합 파트너와의 상호작용의 결과로서, 예를 들어, 세포에서, 생물학적 활성에 영향을 주는 능력을 가진 단백질에 대한 일반 용어이다. 세포막 결합된 수용체는 세포외 리간드-결합 도메인, 하나 이상의 막 스패닝 또는 막관통 도메인, 및 전형적으로 신호 전달에 수반되는 세포내 이펙터 도메인을 특징으로 한다. 세포막 수용체로의 리간드 결합은 세포막을 가로질러 통신되며, 하나 이상의 세포내 단백질과 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 세포외 도메인의 변화를 야기하며, 세포 특성, 예를 들어, 효소 활성, 세포 모양, 또는 유전자 발현 프로파일을 바꾼다. 수용체는 또한 세포 표면에 결합되지 않고 세포질, 핵에 있거나, 세포로부터 함께 방출될 수 있다. 일반적으로, 수용체는 막 결합 수용체, 세포질 수용체 또는 핵 수용체; 모노머(예를 들어, 갑상선 자극 호르몬 수용체, 베타-아드레날린신경 수용체) 또는 멀티머(예를 들어, PDGF 수용체, 성장 호르몬 수용체, IL-3 수용체, GM-CSF 수용체, G-CSF I 수용체, 에리트로포이에틴 수용체 및 IL-6 수용체)일 수 있다. 수용체의 더욱 특정한 예에는 추가의 분화 클러스터(예를 들어, CD20, CD19, CD38, CD52, CD33), 면역글로불린(예를 들어, IgE(Fc 영역)), 상피 성장 인자 수용체(예를 들어, EGFR) 또는 수용체 티로신 키나제(RTK)(예를 들어, Her2/c-neu, Her3, Her4)가 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

용어 "아이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 분류(예를 들어, IgM, IgE, IgG, 예를 들어, IgG1 또는 IgG4)를 말한다. 또한, 아이소타입은 이들 분류 중 하나의 변형된 버전을 포함하며, 여기서, 변형은 Fc 기능을 변경시키기 위해, 예를 들어, 이펙터 기능 또는 Fc 수용체로의 결합을 향상시키거나 감소시키기 위해 이루어진다. 예를 들어, IgG1f LALA는 상당히 감소된 이펙터 기능을 갖는 IgG 아이소타입의 변형된 버전이다. 아미노산의 특정 치환은 미변형 항체에 비하여 Fc 감마 RI 수용체에 대한 결합 친화성을 감소시킨다. IgG1f LALA는 전문이 참조로 포함되는 미국 제08/479,752호(SCOTGEN BIOPHARMACEUTICALS INC.)에 기재되어 있다. 본 개시내용의 특정 구현예에서, 항원-결합 모이어티는 항체의 것, 및 IgG, IgM, IgA, IGE 또는 IgD 유형의 것이다. 특정 구현예에서, 항체는 IgG 유형의 것이다. 본 개시내용의 특정 구현예에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 하위유형의 것이다. 특정 구현예에서, 항체는 IgG1 또는 IgG4 하위유형의 것이다. 다른 특정 구현예에서, 항체는 IgG1 또는 IgG1f LALA 하위유형의 것이다.

항원에 "특이적으로 결합한다"라는 어구는 단백질 및 다른 생물제제의 불균질 집단 중 항원의 존재 하에 결정가능한 결합 반응을 지칭한다. 이에 의해, 어구 "항원을 인식하는" 및 "항원에 특이적인"은 본 명세서에서 용어 "항원에 특이적으로 결합하는"과 상호교환가능하게 사용된다. 항원으로의, 예를 들어, 모노클로널 항체와 같은 항원 결합 모이어티의 특이적인 결합은 당업계에 공지되어 있으며, ELISA, FACS, 웨스턴 블롯(Western Blot), 이뮤노 블롯(Immuno Blot), MSD, 비아코어(BIAcore) 및 SET를 포함하는 다양한 확립된 방법에 의해 결정될 수 있다. 본 개시내용에서, 항원 결합 모이어티는 항원 결합 모이어티가 백그라운드에 비하여 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배, 적어도 100배, 적어도 500배, 적어도 1000배 특정 항원에 결합할 수 있는 것으로 입증되는 경우에 항원에 특이적인 것으로 간주된다. 그에 의해, 백그라운드는 선택된 항원에 비특이적인 것으로 공지되어 있는 항원 결합 모이어티에 의해, 또는 관련없는 항원으로의 결합과 비교하여 결정된다.

"상호 경쟁한다"는 표준 경쟁 결합 검정에서, 특정 항원으로의 다른 항체 또는 항원-결합 모이어티의 결합을 방해하는 항체 또는 다른 항원-결합 모이어티의 능력을 의미한다. 항체 또는 다른 항원-결합 모이어티가 특정 항원으로의 다른 항체 또는 항원-결합 모이어티의 결합을 방해할 수 있는 능력 또는 정도와, 이에 따라, 그것이 본 발명에 따라 상호 경쟁하는 것으로 지칭될 수 있는 지는 표준 경쟁 결합 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 하나의 적절한 검정은 표면 플라스몬 공명 기술을 사용하여 상호작용의 정도를 측정할 수 있는 비아코어 기술(예를 들어, 비아코어 3000 기기(스웨덴 웁살라 소재의 비아코어)의 사용에 의함)의 사용을 포함한다. 상호-경쟁을 측정하기 위한 다른 검정은 ELISA-기반의 방법을 사용한다. 그들의 상호-경쟁에 기초한 "에피토프 비닝(binning)" 항체를 위한 고효율 과정은 국제 특허 출원 WO 2003/48731호에 기재되어 있다.

용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있거나, 다르게는 분자와 상호작용할 수 있는 임의의 단백질 결정인자를 포함한다. 에피토프 결정인자는 일반적으로 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹화(grouping)로 구성되며, 특이적인 3차원적 구조 특징뿐 아니라 비전하(specific charge) 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 "선형" 또는 "입체형태"일 수 있다. 용어 "선형 에피토프"는 단백질과 상호작용 분자(예를 들어, 항체) 간의 상호작용점 모두가 단백질의 일차 아미노산 서열을 따라 선형으로 존재하는 에피토프를 지칭한다(연속적). 용어 "입체형태 에피토프"는 불연속 아미노산이 3차원 입체형태에서 합쳐지는 에피토프를 지칭한다. 입체형태 에피토프에서, 상호작용점은 서로 분리된 단백질 상의 아미노산 잔기에 걸쳐 존재한다.

"~와 동일한 에피토프에 결합하는"은 예시된 항체와 동일한 에피토프를 가지며, 특정 항원에 대하여 결합하는 항체 또는 다른 항원-결합 모이어티의 능력을 의미한다. 예시된 항체 및 다른 항체의 에피토프는 에피토프 맵핑(mapping) 기술을 사용하여 결정될 수 있다. 에피토프 맵핑 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 입체형태 에피토프는 예를 들어, 수소/중수소 교환, x-선 결정학 및 2차원 핵 자기 공명과 같은 것에 의해서 아미노산의 공간적 입체형태를 결정함으로써 용이하게 확인된다.

본 명세서에 사용된 용어 "친화성"은 단일 항원 부위에서의 예를 들어, 모노클로널 항체와 같은 항원 결합 모이어티와 항원 사이의 상호작용의 세기를 지칭한다. 각각의 항원 부위 내에서, 항체 "아암"의 가변 영역은 다수의 부위에서 항원과의 약한 비-공유 결합력을 통해 상호작용하고; 상호작용이 많을수록 친화성이 강해진다.

본 명세서에 사용된 용어 "KD"는 Kd 대 Ka의 비(즉, Kd/Ka)로부터 수득되며, 몰 농도(M)로 표현되는 해리 상수를 지칭한다. 예를 들어, 모노클로널 항체와 같은 항원 결합 모이어티에 대한 KD 값은 당업계에 널리 확립되어 있는 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 모노클로널 항체와 같은 항원 결합 모이어티의 KD를 결정하는 방법에는 SET(용액 평형 적정) 또는 바이오센서 시스템, 예컨대 비아코어® 시스템을 사용하는 표면 플라즈몬 공명이 있다. 본 개시내용에서, 항원-결합 모이어티는 전형적으로, 5×10^-2M 미만, 10^-2M 미만, 5×10^-3M 미만, 10^-3M 미만, 5×10^-4M 미만, 10^-4M 미만, 5×10^-5M 미만, 10^-5M 미만, 5×10^-6M 미만, 10^-6M 미만, 5×10^-7M 미만, 10^-7M 미만, 5×10^-8M 미만, 10^-8M 미만, 5×10^-9M 미만, 10^-9M 미만, 5×10^-10M 미만, 10^-10M 미만, 5×10^-11M 미만, 10^-11M 미만, 5×10^-12M 미만, 10^-12M 미만, 5×10^-13M 미만, 10^-13M 미만, 5×10^-14M 미만, 10^-14M 미만, 5×10^-15M 미만 또는 10^-15M 미만 또는 그 이하의 해리 속도 상수(KD)(koff/kon)를 갖는다.

"장애"는 예를 들어, 치료용 항체 또는 다른 항원-결합 모이어티를 사용함으로써 의학적 처치로부터 이익을 얻을 임의의 질환이다. 장애의 비제한적인 예에는 자가면역 질병, 염증, 세포 증식 장애; B 세포 림프종, 비-백혈병 및 림프성 악성종양; 뉴런, 신경교, 성상세포, 시상하부 및 다른 선상, 대식세포, 상피, 기질 및 포배강 장애; 및 염증성, 면역학적 및 감염성 질병이 포함된다. 용어 "세포 증식성 장애" 및 "증식성 장애"는 어느 정도의 비정상 세포 증식과 관련된 장애를 말한다. 일 구현예에서, 장애는 암이다.

본 명세서에 사용되는 용어 "자가면역 질병"은 일반적으로 자기 인식의 성분을 갖는 것으로 특성화된 질병을 말한다. 자가면역 질병의 예에는 비제한적으로 자가면역 간염, 다발경화증, 전신홍반루푸스, 특발저혈소판자색반병, 중증근육무력증, I형 당뇨병, 류마티스 관절염, 건선, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 강직척추염, 쇼그렌병, CREST 증후군, 피부경화증, IgA 신장병, 물집유사천포창, 보통천포창, ANCA-관련 혈관염, 항인지질증후군 등이 포함된다. 대부분의 자가면역 질병은 또한 만성 염증성 질병이다. 이는 염증성 세포(백혈구)의 장기간(6개월 초과) 활성화와 관련된 질병 과정으로 정의된다. 만성 염증은 환자 기관 또는 조직의 손상을 야기한다. 많은 질병은 만성 염증성 장애이나, 자가면역 기초인 것으로 알려져 있지 않다. 예를 들어, 죽상동맥경화증, 울혈성심부전, 크론병, 궤양성 대장염, 결정성 다발동맥염, 휘플씨병, 원발 경화성 담관염 등이 있다.

용어 "암"은 통상적으로 비조절성 세포 성장/증식을 특징으로 하는 포유동물에서의 생리학적 질환을 지칭한다. 암의 예로는, 이들로 한정되지는 않지만, 암종, 림프종, 모세포종 및 백혈병을 들 수 있다. 암의 더욱 특별한 예에는 비제한적으로, 대장암, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 비 소세포(NSCLC)를 포함하는 폐암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 전립선암, 대장암, 장 카르시노이드(intestinal carcinoid), 방광암, 위암, 췌장암, 간암(간세포암), 간모세포종, 식도암, 폐 선암종, 중피종, 활막성 육종, 골육종, 두경부 편평 세포 암종, 연소성 비인두 혈관섬유종, 지방육종, 갑상선암, 흑색종, 기저세포 암종(BCC), 수모세포종 및 유건종(desmoid)이 포함된다. 대상 방법에 의한 치료에 특히 흥미로운 암에는 신경아교종, 수모세포종, 결장암, 대장암, 흑색종, 유방암, 폐암, 간암 및 위암이 포함된다.

용어 "치료용 항체"는 인간에서 사용하는 것으로 의도된 임의의 항체 제제에 관한 것이다. 바람직하게는, 이러한 치료용 항체는 모노클로널 항체일 것이다. 추가의 바람직한 이러한 모노클로널 항체는 유인원으로부터 수득되거나, 인간 모노클로널 항체일 것이다. 바람직하게는, 그것은 인간 모노클로널 항체일 것이다. 또한, 바람직한 이러한 치료용 모노클로널 항체는 인간화 모노클로널 항체일 것이다. 치료용 항체는 다양한 장애, 예를 들어, 종양학 질병(예를 들어, 혈액 및 고형 악성종양, 예를 들어, 비-호지킨 림프종, 유방암 및 대장암), 면역학적 질병, 중추 신경 질병, 혈관 질병, 또는 감염성 질병의 치료를 위해 널리 사용된다. 일 구현예에서, 이러한 항체는 TNF-α, TNF-β, VEGF-A, α4-인테그린, CD20, IgE(Fc 영역), EGFR, GM-CSF, CD19, M CSF, CD38, MIF, DDT, IL-17C, IL-12, Her2/c-neu, CD52, CD33에 대한 항체이다. 이러한 항체에는 예를 들어, 아달리무맙, MOR103, 리툭시맙, 트라스투주맙, 알렘투주맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 젬투주맙, 인플릭시맙, 라니비주맙, 유스테키누맙, 골리무맙, 나탈리주맙, 오파투무맙, 오말리주맙 및 파니투무맙이 있다.

본 출원서에 사용되는 용어 "시료"는 생명체 또는 전에 생명체였던 것으로부터 유래하는 임의량의 물질을 말하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 생명체에는 인간, 마우스, 원숭이, 랫트(rat), 토끼 및 기타 동물이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 이러한 물질에는 개체 유래의 타액, 소변, 전혈, 혈청 또는 혈장이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 임상 경로에서 가장 널리 사용되는 시료의 공급원은 전혈, 혈장 또는 혈청이다. 바람직한 구현예에서, 시료는 환자로부터 분리된다. 더욱 바람직한 구현예에서, 시료는 인간으로부터 분리된다.

본 명세서에 사용되는 용어 "환자"는 포유동물을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 환자는 인간이다.

본 명세서에 사용되는 용어 "결합된"은 예를 들어, 화학적 커플링에 의한 공유적 또는 비-공유적, 예를 들어, 이온성 상호작용, 소수성 상호작용, 수소 결합 등일 수 있는 결합 또는 부착을 말한다. 바람직한 구현예에서, 결합 또는 부착은 비-공유적 상호작용이다. 일 예에서, 용어 "결합된"은 동족 항원 결합 모이어티의 그의 항원으로의 부착을 말한다.

용어 "항원-결합된" 항원-결합 모이어티는 그의 항원에 결합된, 실험 동물 또는 환자의 순환계에 존재하는 바와 같은 항원-결합 모이어티를 지칭하기 위해 사용된다. 추가의 구현예에서, 항원-결합된 항원-결합 모이어티는 항체이다. 추가의 구현예에서, 항원-결합된 항원-결합 모이어티는 치료용 항체이다.

용어 "미결합된" 항원-결합 모이어티는 그의 항원에 결합되지 않은, 실험 동물 또는 환자의 순환계에 존재하는 바와 같은 항원-결합 모이어티를 지칭하기 위해 사용된다. 추가의 구현예에서, 항원-결합 모이어티는 항체 또는 그의 단편이다. 추가의 구현예에서, 항원-결합 모이어티는 치료용 항체이다.

용어 "집합물" 또는 "라이브러리"는 적어도 2개의 구성원을 의미한다. 용어 "구성원"은 항체 또는 그의 단편을 암호화하는 핵산, 또는 항체 또는 그의 단편 그들 자체를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

용어 "라이브러리"는 본 명세서에 기재된 바와 같은 다양성을 갖는 2개 이상의 엔티티(entity)를 포함하는 일련의 엔티티를 지칭한다. 예를 들어, "항체 또는 항체 단편의 라이브러리"는 항체 또는 항체 단편을 암호화하며, 본 명세서에 기재된 바와 같은 다양성을 갖는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 일련의 폴리뉴클레오티드를 말한다. 예를 들어, 모포시스 HuCAL PLATINUM® 라이브러리와 같은 시판의 파지 디스플레이 라이브러리가 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 용어 "다양성"은 다양한 또는 현저한 비균질성을 말한다.

용어 "프레임워크"는 가변 도메인의 항원 결합 루프에 대한 스캐폴드로 작용되는 가변 도메인의 일부로서 카바트 등(1991)에 의해 정의된 바와 같은 항체 가변 도메인을 의미한다. 프레임워크 영역의 예에는 가변 중쇄 또는 가변 경쇄 중 어느 하나의 FR1, FR2, FR3 및 FR4가 포함된다.

용어 "아이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 제공되는 항체 분류(예를 들어, IgM, IgE, IgG, 예를 들어, IgG1 또는 IgG4)를 말한다. 아이소타입은 또한 이들 분류 중 하나의 변형된 버전을 포함하며, 여기서, 변형은 Fc 기능을 변경시키기 위해, 예를 들어, 이펙터 기능 또는 Fc 수용체로의 결합을 향상시키거나 감소시키기 위해 이루어진다.

"항-이디오타입 항체"는 다른 항체의 항원-결합 영역에 특이적으로 결합하며, 이에 따라, 다른 항체에 의해 특이적으로 결합되는 항체를 의미한다. 항-이디오타입 항체는 다른 항체에 의해 통상적으로 인식되는 에피토프를 모방할 수 있다. 이디오타입은 면역글로불린의 가변 영역 내의 구조의 유전학적으로 결정된 변형이다. 이디오타입 가변성의 정확한 유전학적 기초는 오직 부분적으로만 설명되어 있다. 그러나, 이디오타입 변형은 특히 이디오토프(idiotope)로도 지칭되는 항원-결합 영역의 영역 내의 아미노산 서열 및 단백질 구조(소위 결정인자)를 포함한다. 용어 "이디오타입"은 완전한 세트의 항체 분자의 가변 영역의 결정인자를 나타낸다.

용어 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산, 뿐만 아니라 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 지칭한다. 자연 발생 아미노산은 유전자 암호에 의해 암호화되는 것들, 뿐만 아니라 이후에 변형되는 아미노산, 예를 들어 하이드록시프롤린, γ-카르복시글루타메이트 및 O-포스포세린이다. 아미노산 유사체는 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조, 즉 수소, 카르복실 기, 아미노 기 및 R 기에 결합되어 있는 알파 탄소를 갖는 화합물, 예를 들어 호모세린, 노르류신, 메티오닌 술폭시드, 메티오닌 메틸 술포늄을 지칭한다. 이러한 유사체는 변형된 R 기를 갖거나(예를 들어, 노르류신) 또는 변형된 펩티드 백본을 갖지만, 자연 발생 아미노산과 동일한 기본 화학 구조를 보유한다. 아미노산 모방체는 아미노산의 일반 화학 구조와 상이한 구조를 갖지만, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 지칭한다.

용어 "핵산"은 본 명세서에서 용어 "폴리뉴클레오티드"와 상호교환가능하게 사용되며, 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 폴리머를 지칭한다. 상기 용어는, 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 백본 잔기 또는 연결을 함유하고, 합성, 자연 발생 및 비-자연 발생이고, 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며, 참조 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 핵산을 포함한다. 이러한 유사체의 예는 비제한적으로 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산(PNA)을 포함한다. 달리 나타내지 않는 한, 특정한 핵산 서열은 또한 명시적으로 나타낸 서열 뿐만 아니라 그의 보존적으로 변형된 변이체(예를 들어, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보적 서열도 함축적으로 포함한다. 구체적으로, 하기 상세히 설명된 바와 같이, 축퇴성 코돈 치환은 1개 이상의 선택된(또는 모든) 코돈의 제3의 위치가 혼합-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성시킴으로써 달성될 수 있다(문헌[Batzer et al. (1991) Nucleic Acid Res. 19:5081]; 문헌[Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608]; 및 문헌[Rossolini et al. (1994) Mol. Cell. Probes 8:91-98]).

용어 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 이러한 용어는 특정한 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손까지도 지칭하려는 의도임이 이해되어야 한다. 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 다음 세대에서 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로는 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본 명세서에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다.

본 명세서에 사용되는 용어 "벡터"는 외래 유전 물질을 다른 세포로 전달하기 위해 사용되는 분자 비히클을 말한다. 벡터 그 자체는 일반적으로, 삽입물(대상 서열) 및 벡터의 "백본"으로 작용되는 보다 큰 서열로 구성된 DNA 서열이다. 유전 정보를 다른 세포로 전달하기 위한 벡터의 목적은 전형적으로, 표적 세포에서 삽입물을 분리하거나, 배가시키거나 또는 발현하는 것이다.

본 명세서에 사용되는 용어 "측방 유동"은 기판 또는 캐리어, 예를 들어, 측방 유동 막의 면을 따르는 액체 유동을 말한다. 일반적으로, 측방 유동 디바이스는 모세관 작용, 즉, 위킹(wicking) 또는 크로마토그래피 작용에 의해 용액을 수송할 수 있는 물질의 스트립(또는 유체 연통되는 복수의 스트립)을 포함하며, 여기서, 스트립(들) 내의 상이한 영역 또는 구역은 검정 시약을 함유하며, 이 검정 시약은 확산에 의해 또는 비-확산 수단에 의해 기질에 결합되고, 이 기질은 용액이 이러한 구역으로 수송되거나 이를 통해 이동함에 따라, 검출가능한 신호를 생성한다. 전형적으로, 이러한 검정은 액체 시료를 수용하도록 조정된 적용 구역, 적용 구역과 유체 연통되는, 적용 구역으로부터 측방향으로 이격된 시약 구역 및 시약 구역과 유체 연통되는, 시약 구역으로부터 측방향으로 이격된 검출 구역을 포함한다. 시약 구역은 액체 중에서 이동하고, 시료 중 피분석물과 상호작용하여, 예를 들어, 피분석물-시약 복합체를 형성할 수 있고/거나 검출 구역에서 결합된 분자와 상호작용할 수 있는 화합물(예를 들어, 항체)을 포함할 수 있다. 검출 구역은 스트립 상에 고정화되고, 피분석물 및/또는 시약 및/또는 피분석물-시약 복합체와 상호작용하여 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 결합 분자(예를 들어, 항체)를 포함할 수 있다. 이러한 검정을 사용하여 직접적(샌드위치 검정) 또는 경쟁적 결합을 통하여 시료 중의 피분석물을 검출할 수 있다. 측방 유동 디바이스의 예는 미국 특허 제6,194,220호, 제5,998,221호 및 제5,798,273호에 제공되어 있다.

실시예

항체/항원 복합체에 특이적인 Fab 단편 및 항체의 생성

항체/항원 복합체를 특이적으로 인식하는 항체의 선택을 위하여, 시판의 파지 디스플레이 라이브러리, 모포시스 HuCAL PLATINUM^® 라이브러리를 사용하였다. 상기 항체 라이브러리는 HuCAL^® 개념(문헌[Knappik et al., (2000) J Mol Biol 296:57-86])에 기초하며, 파지 표면 상에 Fab를 디스플레이하기 위하여 시스디스플레이(CysDisplay)^® 기술(WO2001/05950호(Lohning))을 사용한다. 그러나, 임의의 기타 입수가능한 항체 라이브러리가 복합체-특이적 항체를 확인하는데 적절할 것이다.

항체/항원 복합체를 확인하기 위하여, 항체 특이적 패닝(panning) 전략을 개발하여, 항체/항원 복합체를 표적화시켰다. 이에 의해, 정제된 재조합 항원과 그의 각각의 재조합 치료용 항체를 패닝을 위해 사용하였다. 하기에 기재된 실시예에 따르면, 3개의 상이한 항체/항원 복합체에 대하여, 특정 복합체에 결합하는 항체만을 확인하였다. 모든 기재되어 있는 패닝 전략 및 항원을 항체 선택 과정을 위해 사용하였다. 각각의 패닝 전략은 적어도 3회차의 개별 패닝으로 구성되며, 독특한 항원, 항원 농도 및 세척 엄격성(stringency)을 포함한다.

실시예 1: 아달리무맙 / TNF -α 복합체에 특이적인 Fab 단편 및 항체의 생성 및 특성화

아달리무맙/TNF-α 복합체에 특이적으로 결합하는 항체를 확인하기 위하여, 자성 비드에 커플링된 재조합 TNF-α(바이오레전드(BioLegend) 570108, 로트 B137143]) 및 아달리무맙을 용액 패닝 방법을 위한 항원으로 사용하였다.

a) 패닝

용액 패닝을 위하여, TNF-α를 에폭시(Epoxy) M-450 자성 비드(다이나비즈(Dynabeads) M-450, 다이날(Dynal))에 공유적으로 커플링시키고, 파지 디스플레이 항체 라이브러리의 파지 제제를 세척하고, 케미블로커(Chemiblocker)(케미콘(Chemicon))로 블로킹시켰다.

아달리무맙/TNF-α 복합체를 제공하기 위하여, 자성 비드에 커플링시킨 재조합 TNF-α를 아달리무맙과 함께 사전-인큐베이션시켰다. 1회차 패닝을 위하여, 케미블로커(케미콘) 및 Tween/PBS의 존재 하에서, 파지-항체를 정제된 인간 IgG1 카파(50 ㎍/㎖), 10% 인간 혈청, 50 ㎍/㎖ 리툭시맙(IgG1 카파) 및 1 ㎍/㎖ TNF-α의 존재 하에 아달리무맙/TNF-α 복합체에 첨가하여, IgG1 카파 및 유리 TNF-α에 특이적이거나, 인간 혈청의 임의의 성분과 교차반응하는 모든 파지-항체를 흡수시켰다. 2 내지 8 ℃에서, 회전기에서 하룻밤 인큐베이션시킨 후에, 파지-항원 혼합물을 튜브로 옮기고, 자성 비드를 자성 분리기를 사용하여 포획하였다. 상청액을 비드로부터 조심스럽게 제거하고, 남아 있는 비드를 PBST로 세척하였다.

이후의 2회차 및 3회차의 패닝을 증가하는 농도의 유리 TNF-α(2회차 패닝에서, 5 ㎍/㎖; 3회차 패닝에서 25 ㎍/㎖)를 사용하여, 유사한 방식으로 수행하여, 엄격성을 증가시키고, 유리 TNF-α와 교차반응하는 항체를 폐기하였다.

각 회차의 패닝 시에, 남아 있는 파지를 용출시키고, 용출된 파지를 에스케리키아 콜라이(E. coli) TG1 박테리아의 감염을 위하여 즉시 사용하였다. 헬퍼 파지의 사용에 의한 파지의 구제 후에, 증폭된 폴리클로널 파지 산물을 다시 적정하고, 연이은 선택 단계에서 사용하였다. 3회차의 패닝 후에, 용출된 항원-특이적 파지의 DNA를 감염된 박테리아로부터 분리하고, Fab-암호화 DNA를 PCR을 통해 특정 Fab 발현 벡터로 서브클로닝하였다. Fab-암호화 벡터를 사용한 TG1-F 박테리아의 형질전환 후에, 단일 클론 발현 및 HuCAL-Fab 단편을 함유하는 주변세포질 추출물의 제조를 수행하였다. Fab-함유 주변세포질 추출물을 초기 스크리닝 및 특성화를 위해 사용하였다.

추가의 특성화를 위하여, 정제된 Fab를 사용하였다. TG-1 세포에서의 Fab 단편의 발현을 1 mM 클로람페니콜 및 0.1% 글루코스가 보충된 2× YT 배지 500 ㎖를 사용하여 진탕 플라스크 배양에서 수행하였다. 발현을 30℃에서 20시간 동안의 0.75 mM IPTG의 첨가에 의해 유도하였다. 세포를 라이소자임, 버그버스터(Bugbuster) 및 벤조나제(Benzonase)를 함유하는 용해 완충제를 사용하여 파괴하고, Fab 단편을 Ni-NTA 크로마토그래피(바이오-라드(Bio-Rad), 독일)에 의해 분리하였다. 단백질 농도를 UV-분광광도계에 의해 결정하였다. Fab 단편의 순도를 SDS-PAGE를 사용하여 변성된 환원 상태에서, 그리고 HP-SEC에 의해 고유 상태에서 분석하였다.

전장 IgG를 발현하기 위하여, 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 도메인 단편을 Fab 발현 벡터로부터 인간 IgG2, 인간 IgG4, 인간 IgG4_Pro 및 인간 IgG1f LALA를 위한 적절한 pMORPH®_hIg 벡터로 서브클로닝하였다.

b) 스크리닝

일차 스크리닝을 ELISA에 의해 행하였다. 368개의 클론을 상기 기재된 패닝 절차의 산물로부터 무작위로 선택하고, 384 웰 ELISA 플레이트에서 성장시켰다. 항체 발현의 유도(30℃에서 20시간 동안 0.75 mM IPTG) 및 라이소자임의 사용에 의한 세포의 용해 후에, 항체를 함유하는 세포 용해물을 ELISA에서 시험하였다.

따라서, 하기의 항원, 아달리무맙/TNF-α 복합체, 골수종 세포주 유래의 정제된 인간 IgG1/카파; 리툭시맙 및 유리 재조합 TNF-α를 ELISA 플레이트에 코팅시켰다.

복합체 상에서 양성(백그라운드에 비하여 적어도 5배의 신호)이었으나, 다른 항원에 결합하지 않았던 총 12개의 클론을 확인하였다. 그 후, 12개의 클론을 시퀀싱하여, 독특한 항체를 확인하였다. 7개의 독특한 서열을 확인할 수 있었다. 이들 7개의 클론을 발현시키고, 정제한 다음, 특성화시켰다.

c) 특성화

먼저, 7개의 항체를 ELISA에서 일련의 관련없는 항원 및 관련된 항원 및 아달리무맙/TNF-α 복합체에 대한 특이적인 결합에 대하여 시험하고, 여기서, 아달리무맙을 플레이트 상에 코팅하고, TNF-α를 복합체의 형성을 위해 처리하거나, 그 역으로 처리하였다. 따라서, 5 ㎍/㎖의 각각의 항원을 하룻밤 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅시켰다. 세척 및 5% BSA를 사용한 블로킹 후에, Fab-FH 형식의 항-아달리무맙/TNF-α 항체(2 ㎍/㎖ 용액으로부터 20 ㎕)를 첨가하였다. HRP-표지된 항-His 항체 및 퀀타블루 형광 과산화효소 기질을 사용하여 검출을 수행하였다. AdaTNF#1 및 AdaTNF#5는 복합체에 매우 특이적인 것으로 입증되었다(도 1).

다음 단계에서, AdaTNF#5를 상이한 고정화된 항원 상에서 항체를 적정함으로써 더욱 상세하게 시험하였다. 시험된 농도 범위(0.03 내지 2000 ng/㎖)에 걸쳐, 항체는 아달리무맙/TNF-α 복합체에만 결합하고, 인플릭시맙/TNF-α 복합체, 미결합 아달리무맙 또는 유리 TNF-α 및 기타 항원에는 결합하지 않았다(도 2).

AdaTNF#5를 추가의 분석을 위해 전장 인간 IgG1 형식으로 전환시키고, 인간 세포주에서 발현시키고, 단백질 A 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 먼저, (2가) IgG1 형식의 항체가 여전히 동일한 특이성을 보이는지 시험하였다. 항원을 마이크로타이터 플레이트 상에 하룻밤 5 ㎍/㎖로 코팅하였다. 세척 및 5% BSA를 사용한 블로킹 후에, HRP-컨쥬게이트된 AdaTNF#5-hIgG1(HiSpec 완충제 중의 2 ㎍/㎖ 용액으로부터 20 ㎕)을 첨가하였다. 검출을 퀀타블루® 형광 과산화효소 기질을 사용하여 수행하였다. HRP에 컨쥬게이트된 정제된 AdaTNF#5-hIgG1은 아달리무맙과 TNF-α의 복합체에 특이적으로 결합한다(도 3).

추가의 특성화를 위하여, AdaTNF#5의 일가의 고유 친화성은 고정화된 아달리무맙-TNF-α 복합체 상에서 아타나(Attana) A200 기기를 사용하는 실시간 무표지 분자 상호작용 분석에 의해, kD = 67 nM로 측정되었다. 그 다음, 복합체 특이적 항체 AdaTNF#5가 인간 혈청에 첨가된 아달리무맙을 결정하기 위해 사용될 수 있는지를 시험하였다. 인간 TNF-α를 마이크로타이터 플레이트 상에 5 ㎍/㎖로 코팅하고, 하룻밤 인큐베이션시켰다. 세척 및 PBST 중 5% BSA를 사용한 블로킹 후에, 증가하는 농도의 아달리무맙을 10% 인간 혈청에 섞고, 사전-코팅된 플레이트에 적용하였다. 세척 후에, 항-아달리무맙/TNF-α hIgG1 항체 AdaTNF#5(HRP에 컨쥬게이트됨)를 2 ㎍/㎖로 첨가하였다. 퀀타블루® 형광 과산화효소 기질을 첨가함으로써 검출을 수행하였다. AdaTNF#5는 용량-의존적 방식으로 아달리무맙/TNF-α 복합체에 결합하였다(도 4). 따라서, 이러한 신규한 특이성을 사용하여, 가장 흔하게 사용되는 브리징(bridging) 형식에 좌우되지 않는 매우 민감한 정량화 검정을 개발할 수 있다.

실시예 2: 인플릭시맙 / TNF -α 복합체에 특이적인 Fab 단편 및 항체의 생성 및 특성화

인플릭시맙/TNF-α 복합체에 특이적으로 결합하는 항체를 확인하기 위하여, 자성 비드에 커플링된 재조합 TNF-α(바이오레젠드 570108, 로트 B137143) 및 인플릭시맙을 용액 패닝 방법을 위한 항원으로 사용하였다.

패닝 및 스크리닝을 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 일차 스크리닝 시에, 3개의 독특한 항체가 인플릭시맙/TNF-α 복합체에 결합하는 것으로 확인되었으며, 이를 발현시키고, 정제하고, 추가의 특성화 연구를 수행하였다.

IFX-TNF#1, IFX-TNF#2 및 IFX-TNF#3을 ELISA에서 일련의 관련없는 항원 및 관련된 항원, 및 인플릭시맙/TNF-α 복합체에 대한 특이적인 결합에 대해 시험하였다. 따라서, 5 ㎍/㎖의 각각의 항원을 하룻밤 마이크로타이터 플레이트 상에 코팅하였다. 세척 및 5% BSA를 사용한 블로킹 후에, Fab-FH 형식의 항-인플릭시맙/TNF-α 항체(2 ㎍/㎖ 용액으로부터 20 ㎕)를 첨가하였다. HRP-표지된 항-His 항체 및 퀀타블루 형광 과산화효소 기질을 사용하여 검출을 수행하였다. IFX-TNF#1은 복합체에 매우 특이적인 것으로 입증되었다(도 5).

실시예 3: MQR103 /GM- CSF 복합체에 특이적인 Fab 단편 및 항체의 생성 및 특성화

MOR103/GM-CSF 복합체에 특이적으로 결합하는 항체를 확인하기 위하여, 재조합 비오티닐화 인간 GM-CSF 및 MOR103을 고체상 패닝 방법을 위한 항원으로 사용하였다.

a) 패닝

실시예 1에 기재된 바와 같은 패닝 절차에 따라, 파지 제제를 제조하였다.

MOR103/GM-CSF 복합체를 제공하기 위하여, 재조합 GM-CSF를 스트렙트아비딘 코팅된 플레이트 상에 고정화시키고, 복합체의 형성을 위해 MOR103을 첨가하였다.

모든 3회차의 패닝을 1OO ㎍/㎖의 MOR3207(라이소자임 특이적 인간 IgG1) 및 5 ㎍/㎖의 유리 GM-CSF의 존재 하에 수행하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이, 분리된 파지의 DNA를 Fab-발현 벡터로 서브클로닝하고, 각각의 클론에 일차 스크리닝을 수행하였다.

b) 스크리닝

일차 스크리닝을 ELISA에 의해 행하였다. 368개의 클론을 상기 기재된 패닝 절차의 산물로부터 무작위로 선택하고, 284 웰 ELISA 플레이트에서 성장시켰다. 항체 발현의 유도(30℃에서 20시간 동안 0.75 mM IPTG) 및 라이소자임의 사용에 의한 세포의 용해 후에, 항체를 함유하는 세포 용해물을 ELISA에서 시험하였다.

따라서, 하기의 항원, MOR103/GM-CSF 복합체, 정제된 인간 MOR3207(IgG1/카파); MOR103 및 유리 재조합 인간 GM-CSF를 ELISA 플레이트 상에 코팅시켰다.

복합체 상에서 양성(백그라운드에 비하여 적어도 5배의 신호)이었으나, 다른 항원에는 결합하지 않았던 총 3개의 독특한 클론을 확인하였다. 그 후, 선택된 클론을 발현시키고, 정제하고, ELISA에서 일련의 관련없는 항원 및 관련된 항원, 및 MOR103/GM-CSF 복합체에 대한 특이적인 결합에 대하여 시험하였다.

5 ㎍/㎖의 각각의 항원(BSA, GST, MOR03207 및 MOR103)을 마이크로타이터 플레이트 상에 하룻밤 코팅시켰다. 비오티닐화 GM-CSF(GM-CSF-bio)의 고정화를 위하여, 뉴트라비딘(Neutravidin)을 하룻밤 5 ㎍/㎖로 코팅하고, 5% BSA를 사용한 블로킹 후에, GM-CSF-bio를 첨가하였다. 5 ㎍/㎖의 MOR103을 고정화된 GM-CSF-bio에 첨가함으로써 각각의 MOR103/GM-CSF-bio 복합체를 형성하였다. 세척 및 5% BSA를 사용한 블로킹 후에, C-말단 6-His 태그를 함유하는 Fab 형식의 항 MOR103/GM-CSF 항체(2 ㎍/㎖ 용액으로부터 20 ㎕)를 첨가한 다음, 항-His 검출 항체를 사용하여 검출하고, 세척 후에 퀀타블루 형광 과산화효소 기질을 사용하여 정량화하였다.

모든 3개의 항체(M103GmCSF#1, M103GmCSF#2 및 M103GmCSF#3)는 MOR103/GM-CSF 복합체를 특이적으로 검출하지만, 단독의 GM-CSF 또는 MOR103을 특이적으로 검출하지 않는 것으로 밝혀졌다(도 6). MOR103으로의 M103GmCSF#1의 일부 결합이 관찰되었으나, 이후의 적정 ELISA에서는 확인할 수 없었다.

c) 특성화

M103GmCSF#1을 추가로 특성화하였다. 단독의 MOR103, 비오티닐화 GM-CSF 또는 MOR103에 결합된 비오티닐화 GM-CSF를 아비딘-코팅 플레이트 상에 코팅시켰다. His-태그화 M103GmCSF#1 Fab를 증가하는 농도로 첨가하고, His-특이적 POD 컨쥬게이트된 이차 항체를 사용하여 검출하고, 퀀타블루 형광 과산화효소 기질을 사용하여 정량화시켰다. M103GmCSF#1은 약물-표적 복합체로의 결합에 대한 높은 선택성을 보였으며, 개별 단백질(약물 및 표적)로의 결합에 대해서는 그렇지 않았다(도 7). 약물-표적 복합체에 대한 M103GmCSF#1 Fab의 일가의 친화성: kD = 4.9 nM.

실시예 4: 동족 항체와 그의 항원의 복합체에 특이적인 항체를 사용하여 인간 혈청 중의 항체/항원 복합체를 검출하기 위한 검정

인간 혈청 또는 혈장으로부터 특정 항체/항원 복합체를 모니터링하고 정량화하기 위하여, 강력한 약동학적 검출 검정을 MSD®(메소 스케일 디스커버리) 기술에 기초하여 확립하였다.

약술하면, PBS 중에 용해된 2 ㎍/㎖의 랫트 항-인간 GM-CSF를 멀티-어레이® 96-웰 플레이트 스탠다드(Standard) 플레이트(메소 스케일 디스커버리; Cat: L11XA-3)의 각각의 웰에 코팅시켰다.

다음날, MOR103(hIgG1λ; DSM: P19292; CMC2; 농도: 2.0 ㎎/㎖) 및 GM-CSF(바이엘(Bayer); NDC50419-002-33 로트: B16891; 농도: 0.25 ㎎/㎖)를 LCB 완충제(로우크로스(LowCross)-완충제, 칸도르 바이오사이언스 게엠베하(Candor Bioscience GmbH) Cat: 100500, 로트: 100C434c) 중에 희석하였다. MOR103/GM-CSF 복합체를 형성하기 위해, MOR103 및 GM-CSF를 5:1 비로 혼합하고, 100% 인간 혈청(풀링된(pooled), 남성; 시그마(Sigma), Cat: H4522; 로트: 11M0605)을 보충하였다. 1시간 인큐베이션 후에, MOR103 및 GM-CSF 혼합물을 LCB 완충제를 사용하여 2배 희석하여, 50%의 최종 혈청 농도를 야기하고, 사전-인큐베이션 플레이트로부터 사전-코팅된 멀티-어레이® 96-웰 플레이트로 전달하고, 실온에서 1시간 동안 추가로 인큐베이션시켰다. 검정 플레이트를 PBST를 사용하여 세척하고, 400 ng/㎖의 ECL-표지된 M103GmCSF#1 IgG(로트: 110801_11 STE11*1; ECL-표지: 로트: 110831_5AUN51; 농도: PBS 중 1.7 ㎎/㎖)를 1시간 동안 첨가하여, MOR103/GM-CSF 복합체를 검출하고, 이후에 MSD 판독 완충제 T(Cat: R92TC-1)를 사용하여 정량화시키고, MSD 섹터 이미저(Sector Imager) 6000(메소 스케일 디스커버리, 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재)에서 측정하였다.

적정 곡선 내내, MOR103/GM-CSF 복합체는 인간 혈청의 존재 하에서 용량-의존적 방식으로 특이적으로 검출되었으며, 핏팅된 곡선에 대한 역 정확도(back accuracy)는 각각의 농도에 대하여 적어도 96 내지 104%였다(하기 도 8 참조).

개시내용이 완전히 기재되었으며, 그것은 하기의 실시예 및 특허청구범위에 의해 추가로 예시되며, 이는 예시적이고, 더욱 제한하려는 것은 아니다.

상기 기재된 설명은 당업자가 개시내용을 실시할 수 있기에 충분한 것으로 여겨진다. 그러나, 상기의 것을 문서에서 아무리 상세히 기재할 수 있을지라도, 개시내용이 다수의 방식으로 실시될 수 있고, 개시내용이 첨부된 특허청구범위 및 그의 임의의 등가물에 따라 해석되어야 하는 것으로 이해될 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> MorphoSys AG <120> Complex-specific antibodies and antibody fragments and its use <160> 30 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> synthetic construct <220> <223> AdaTNF#1 HCDR1 <400> 1 Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Ile Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> synthetic construct <220> <223> AdaTNF#1 HCDR2 <400> 2 Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln 1 5 10 15 Lys Phe Gln Gly 20 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> synthetic construct <220> <223> AdaTNF#1 HCDR3 <400> 3 Asp Tyr Phe Ser Ser Ile Gly Trp Val Val Tyr Tyr Gly Pro Met Asp 1 5 10 15 Tyr <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> synthetic construct <220> <223> AdaTNF#1 LCDR1 <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Pro Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> synthetic construct <220> <223> AdaTNF#1 LCDR2 <400> 5 Leu Leu Ile Tyr Asp Val Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 10 <210> 6 <211> 8 <212> PRT <213> synthetic construct <220> <223> AdaTNF#1 LCDR3 <400> 6 Gln Gln Tyr Thr Ser Thr Pro Pro 1 5 <210> 7 <211> 110 <212> PRT <213> synthetic construct <220> <223> AdaTNF#1 VL <400> 7 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Pro 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Val Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Thr Ser Thr Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110 <210> 8 <211> 126 <212> PRT <213> synthetic construct <220> <223> AdaTNF#1 VH <400> 8 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Phe Ser Ser Ile Gly Trp Val Val Tyr Tyr Gly Pro 100 105 110 Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 9 <211> 330 <212> DNA <213> synthetic construct <220> <221> source <222> 1..330 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="AdaTNF#1 VL" /organism="synthetic construct" <400> 9 gatatcgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctga gcccgggtga acgtgccacc 60 ctgagctgca gagcgagcca gtctgtttct tctccgtacc tggcttggta ccagcagaaa 120 ccgggccagg ccccgcgtct attaatctac gacgtttctt ctcgtgcgac cggcattccg 180 gcgcgtttta gcggcagcgg atccggcacc gatttcaccc tgaccattag cagcctggaa 240 ccggaagact ttgcggtgta ttattgccag cagtacactt ctactccgcc gacctttggc 300 cagggcacga aagttgaaat taaacgtacg 330 <210> 10 <211> 378 <212> DNA <213> synthetic construct <220> <221> source <222> 1..378 <223> /mol_type="unassigned DNA" /note="AdaTNF#1 VH" 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aacagcctgc gtgcggaaga tacggccgtg tattattgcg cgcgtctttc tcagactggt 300 gttatggatt attggggcca aggcaccctg gtgacggtta gctca 345

Claims

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특정 동족(cognate) 항체와 그의 항원의 복합체에 특이적으로 결합하며 단독의 상기 특정 동족 항체 또는 상기 항원에는 결합하지 않는 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편의 확인 방법으로서, 상기 방법은
(a) 미결합 항원 및 특정 동족 항체와 동일한 아이소타입(isotype)을 갖는 항체의 존재 하에서, 특정 동족 항체와 그의 항원의 복합체에 대하여 항체 또는 항체 단편의 라이브러리를 스크리닝하는 단계,
(b) 상기 특정 동족 항체와 그의 항원의 복합체 및 결합된 항체 또는 항체 단편을 분리하는 단계, 및
(c) 상기 항체 또는 항체 단편을 확인하고 분리하는 단계를 포함하는, 방법.
제 12항에 있어서, 상기 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편은 특정 동족 항체 및 상기 특정 동족 항체의 항원 둘 다의 부분을 포함하는 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 12항에 있어서, 상기 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편은 적어도 특정 동족 항체의 CDR 영역 부분에 결합하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 12항에 있어서, 상기 분리된 모노클로널 항체 또는 그의 단편은 인간화 또는 인간 모노클로널 항체 또는 항체 단편인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 12항에 있어서, 상기 특정 동족 항체는 뮤린, 키메라, 인간화 또는 인간 모노클로널 항체 또는 그의 단편인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 16항에 있어서, 특정 동족 항체 또는 그의 단편은 아달리무맙 (Adalimumab), MOR103, 리툭시맙(Rituximab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 알렘투주맙(Alemtuzumab), 베바시주맙(Bevacizumab), 세툭시맙(Cetuximab), 젬투주맙 (Gemtuzumab), 인플릭시맙(Infliximab), 라니비주맙(Ranibizumab), 유스테키누맙 (Ustekinumab), 골리무맙(Golimumab), 나탈리주맙(Natalizumab), 오파투무맙 (Ofatumumab), 오말리주맙(Omalizumab), 파니투무맙(Panitumumab)으로 구성되나 이들에 한정되지 않는 목록으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 12항에 있어서, 항원은 사이토카인 또는 수용체인 것을 특징으로 하는, 방법.