JPS58177921A - 抗免疫複合体抗体およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 うる新規抗体とその製造方法に関するものである。

免疫複合体は抗原、抗体および補体が結合したものであ
り、通常は形成されても白血球やマクロファージに取込
まれて無害化される。しかしながら、抗原が多量に存在
する場合とか抗体が形成されにくい抗原が体内にある場
合には免疫複合体め量が増して、急性の糸球体腎炎とか
血管炎、慢性じん麻疹、血小板減少症など種々の疾患を
ひき起こす。

そこで、この免疫複合体の検出方法が切望され、補体成
分やリューマチファクターが免疫複合体と反応する性質
を利用する方法、細胞の生物活性、特にＦｃレセデター
と免疫複合体が結合する性質を利用する方法、グル涙過
性、蔗糖密度勾配法、ポリエチレングリコール沈澱法な
どの物理化学的方法など数多くの方法が開発されてきた
。しかしながら、補体成分、リューマチファクターやＦ
ｃレセゾターを使用する方法はいずれも凝集ＩｇＧを検
出し免疫複合体との識別ができないという重大な欠陥が
あシ、物理化学的方法も操作が煩雑であるにもかかわら
ず識別性が充分でないという欠点があった。

一方、最近加納らによって抗原に抗体が結合することに
よって生ずるＦａｂフラグメントの構造変化を認識する
抗抗体を用いて免疫複合体を検出する方法が開発された
。この方法は３凝集°価の抗抗体と抗り抗体感作血球と
の凝集反応を被検血清中の免疫複合体が抑制すｂことを
利用しており、操作が簡便で凝集ＩｇＧを検出せず免疫
複合体を特異的に検出するすぐれた方法であるが、抗抗
体の入手が容易でないという欠点があった。

本発明者らは、加納らの方法において用いられている抗
体のかわりに、この抗体を分解して得られたＦ　（ａ　
ｂ　’　）　２フラグメントを用いて抗原と複合体を形
成させ、この新規な複合体を抗原として抗体を形成させ
て分離取得した。そして、この抗体は新規であって免疫
複合体のみを特異的に検出することができ、かつ免疫複
合体であればその種類を問わず検出することができるす
ぐれたものであることを見出した。そして、この抗体は
兎など人間以外の動物の生体を用いて製造することがで
き、。

まだ、モノクロナル抗体としても製造しうろことを見出
して本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、（１）全身性エリテマトーデス患者
血清に含まれる免疫複合体および慢性関節リュウマチ患
者血清に含まれる免疫複合体と反応し、凝集ＩｇＧ抗体
と反応せず、かつケ゛ル濾過性で測定した分子量が１５
〜１８万である糖蛋白質よシなる抗免疫複合体抗体と、
（２）抗原とその抗体のＦ　（ａ　ｂ　’　）　２フラ
グメントとを接触させることによって該抗原と該Ｆ　（
ａ　ｂ　’　）　２フラグメントの複合体を形成せしめ
、この複合体を抗原として対応する抗体を産生せしめて
これを採取することを特徴とする抗免疫複合体抗体の製
法に関するものである。

抗原の種類は特に限定されないが水溶性のものがよい。

抗原の例としては馬ＩｇＧ、甲状腺由来のヒトクリオグ
ロプリンなどを挙げることができる。

抗原は単離してから使用するほうが望ましい。

このような抗原と複合体を形成させるものはこの抗原に
対応する抗体のＦ　（ａ　ｂ　’　）　２フラグメント
である。抗体は抗原に応じて種々のものが使用され、Ｉ
ｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＥ抗体、およ
びＩｇＤ抗体を問わず適用できる。抗体は不純のままで
あってもよいが、抗体すなわちγ−グロブリンを精製す
る公知の方法に従って精製してから中いるのがよい。精
製法としてはＣｏｈｎらのエタノール分画法がよいが、
そのほか硫安リバノール分画法、ポリエチレングリコー
ル分画法などいずれの方法によるものであってもよい。

抗体からＦ　（ａ　ｂ’）　２フラグメントを製造する
方法は公知の方法を用いればよく、通常は抗体に被プシ
ンを作用させる。抗体のぜゾンン分解物はそのまま抗原
と接触させても抗原とＦ　（ａ　ｂ’）　２フラグメン
トの複合体を形成させることができるが該分解物からＦ
　（ａ　ｂ’）　２フラグメントを分離してから抗原と
接触させるのがよい。分離方法としては、Ｆ　（ａ　ｂ
　’　）　２フラグメントの分子量が原料抗体の種類を
問わず約１０万であるところから蛋白質を分子量分画す
る方法によるのがよく、例えばケ９ルＶ過性によって分
離することができる。

抗原とＦ　（ａ　ｂ　’　）　２フラグメントの複合体
は抗原とＦ　（ａ　ｂ　’　）　２フラグメントを溶液
中で接触させるだけで形成される。溶液のＰｈは５〜９
程度がよく、通例は緩衝液中で行なわれる。抗原の濃度
は１．０〜１０■／ｍ６程度、そしてＦ（ａｂ’）、、
フラグメント濃度は１．０〜１０■／ｍ／Ｖ程度がよく
、両者のモル比縄はぼ３：１になるようにするのがよい
。添加順序および添加の際の抗原とＦ　（ａｂ’）　２
フラグメントの形態すなわち溶液あるいは凍結乾燥品で
あるかは問うところではなく、要は抗原とＦ（ａｂ’）
２フラグメントを所定の濃度で含みかつ所定のＰＨの溶
液が得られればよい。この溶液に食塩を添加することに
よって生成した複合体を安定化することができる。複合
体を完全に形成させるために３５〜４０℃程度に１〜６
時間程度加温するのがよい。

形成された抗原とＦ　（ａ　ｂ’）　２フラグメントの
複合体はケ免ル濾過などで橢−製し、必要により一旦凍
結乾燥してから本発明の抗体の取得に供する。

このようにして得られた複合体はフェノール硫酸法で測
定した糖合量が２〜６チ程度の糖蛋白であシ、ゲル濾過
法で測定した分子量が３０万〜５０万程度、そして沈降
定数が１０８〜１５．２程度のものである８なお、沈降
定数は高速沈降平衡法で測定した。

本発明の抗体の取得方法としては生体を利用してもよく
、生体外の細胞培養を利用してもよい３、生体を利用す
る場合には兎、モルモット、ニワトリなどの温血動物を
広く利用できる。これらの温血動物は予め免疫寛容性を
付与しておくと本発明の抗体の産生率を高めることが出
来る。免疫寛容性を付与するにはＦ　（ａ　ｂ　’　）
　２フラグメントを例えば兎の場合には１羽あたり１０
ｍ９程度を静脈に注射すれば１〜３日後に免疫寛容性が
発現するっ他の動物を用いる場合には、トレランスに使
用し、た抗原を少量アクユパントと混ぜて注射し、亜寒
、発熱等のショック状態の発生の有無を調べることによ
って免疫寛容性発現の有無を知り、それに応じてＦ　（
ａ　ｂ’）　２フラグメント投Ｊｊ量を増減して適旧投
与量および方法を定めればよい。

免疫寛容性を付催した生体まだはしなかった生体に前記
の抗原とＦ　（ａ　ｌ：ｌ’）　２フラグメントの腹合
体を投与して生体内に本発明の抗体を発現させる。

投与方法としては、例えば皮下注射すればよく、投与量
は例えば兎の場合には１回あたり０１〜１０〜程度を２
日間〜２週間ごとに数回性なう程度でよい。一方、モル
モットの場合は１回あたり０．０５〜５〜程度、そして
ニワトリは０１〜１０ｍ９程度を数回投与すればよい。

他の動物については上記の投与量を参考にして試行錯誤
して定めればよい。

一方、本発明の抗体をモノクロナル抗体として製造する
場合には、例えばマウスの肺臓細胞を用いればよい。こ
の場合には、まず、例えばＢＡＬＢ／Ｃ系のマウスに抗
原とＦ　（ａ　ｂ’）　２フラグメントの複合体を注射
後体内に抗免疫複合体抗体が発現するようになってから
肺臓を摘出し、この肺臓細胞にＢＡＬＢ／Ｃ系のマウス
の癌細胞を例えばポリエチレングリコールを用いて常法
により細胞融合させる。

そして、この融合細胞を培養液を種々変えて継代培養を
繰返し選別することによってクローン化して抗免疫複合
体抗体産生能のある細胞を得る。そして、これをマウス
の腹腔へ注入して腹腔内で増殖させたのち腹水あるいは
血液を採取すればよい。

血液あるいは腹水から本発明の抗免疫複合体抗体を採取
する方法は抗体を採取する公知の方法に準じて行なえば
よく、例えば硫安沈澱法、ＤＥＡＦ−セルロースを用い
たイオン交換クロマトグラフィー、ケ゛／Ｌ、　（ｐ過
失などを適宜組合わせればよく、抗体の公知の分画法、
例えばＣｏｈｎらのエタノ−ル分画法、硫安リバノール
分画法、ポリエチレングリコール分画法などを適用して
もよい。これらの精製法によって得られた抗免疫複合体
抗体には反別抗原に対する抗体とＦ　（ａ　ｂ　’　）
　２フラク−ｆ′Ａ／トに対する抗体とが含まれている
ことが多いところから、この抗原とフラグメントをカッ
プリングした担体１．を用いてアフィニティークロマト
ダラフィーでさらに精製するのがよい。

本発明の抗免疫複合体抗体の物性値を次に示す。

（１）免疫複合体に対する反応 本発明の抗免疫複合体抗体は全身性エリテマトーデス患
者血清に含まれる免疫複合体および慢性関節９ユウマチ
患者血清に含まれる免疫複合体と反応する。

尚、測定は後述する使用例と同様にして行なった。

（２）凝集ＩｇＧ抗体との反応 健常人血清７例に熱凝集ＩｇＧ抗体を血清１　、ｆｉ／
あたシ２００μｇになるように添加して後述する使用例
と同様にして測定したところすべて陰性であった。

（３）分子量 （イ）　兎およびモルモットの血清から得られたもの１
５〜１６万（ケ゛ル濾過失） １５万　（ＳＤＳポリアクリルアミド 電気泳動） （ロ）　ニワトリの血清から得られたもの１６〜１８万
（ケ゛ル濾過失） （４）沈降定数 （イ）　兎およびモルモットの血清から得られたもの６
．５（高速平衡法） （ロ）　ニワトリの血清から得られたもの７．１（高速
平衡法） （５）糖含量 （イ）　兎およびテルモットの血清から得られだもの２
〜４％　　（フェノール硫酸法） （ロ）　ニワ１．　ＩＪの血清から得られたもの３．５
〜４５％　　　（フェノール硫酸法）（６）等電点 ５８〜８７ 但し、兎およびモルモットの血清から得られたものにつ
いて測定した。

本発明の抗免疫複合体抗体は以上の如き物性値を有して
いるが、この抗体の製造に用いる抗原とその抗体のＦ　
（ａ　ｂ’）　２フラグメントとの複合体がそもそも新
規であり、この新規な複合体を抗原として得た抗体であ
るから明らかに新規な抗体である。

例えば加納らの抗抗体と免疫複合体に対する作用は類似
しているが、本発明の抗抗体がヒト以外の温血動物由来
のものであるのに対し加納らの抗抗体がヒト由来のもの
である点で基本的に相違している。

本発明の抗体は、凝集ＩｇＧとは反応せず免疫腹合体“
と特異的に反応するところから、加納らの方法（Ｃｌ１
ｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕ
ｎｏｐａｔ４ｏ１ｏｇｙ＋ｖｏ１．９．ｐｐ４２５−４
３５（１９７８）　）において用いられている抗抗体に
代替しつるものである。そして、この加納らの方法が、
抗抗体が人体を媒介して生産されるために実用化されな
かったところを本発即者らの抗体によって打破したので
ある。すなわち、本発明の抗体は人体によらず他の動物
を用いあるいはモノクロナル抗体として量産しうるとこ
ろに特徴があり、この抗体によって免疫複合体の正確な
定量を実用的に行ないうる手段を初めて提供し、従来、
原因究明が容易でなかった免疫複合体に基づく各種の疾
患の治療を容易にすることができた。本発明の抗体は各
種の免疫複合体と巾広く反応するところに特徴があり、
ひとつの抗体で免疫複合体の種類を問わず測定できる。

本発明の抗体の用途は加納法の抗抗体の代替にのみ留ま
るものではなく、酵素免疫測定法による免疫複合体の検
出を行なうこともできる。

以下、製造例および使用例を示す。

製造例１ 破傷風に感染して抗破傷風馬血清の投与を受け、その結
果抗馬血清抗体を有している健常人より血液を得た。こ
の血液より分離した血清を常法に従って硫安塩析し、さ
らにＤＥＡＥセルロース？　用いたイオン交換クロマト
グラフィーで分画してＩｇＧ画分を得た。ＩｇＧ画分は
馬ＩｇＧをカップリングしたセファロース４Ｂ（ファル
マシア社製）ヲ用いてアフィニティークロマトグラフィ
ーを行ない、抗馬ＩｇＧのヒトＩｇＧを得た。

このヒトＩｇＧ］０００〜をｐＨ４，５の０．０１　Ｍ
ホウ酸緩衝液２００ｍｔに加えて溶液とし、この溶液に
ペゾシン１０ｍｇを加えて３７℃で１８時間攪拌した。

この被プシン分解液をセファデック、スＧ−２００（フ
ァルマシア社製）でケ゛ル許過し、流出液の２８０　ｎ
ｍにおける吸光度を測定して第２番目のピークの区分を
採取して凍結乾燥した。

コノ凍結乾燥物２００１ｎ９と馬ＩｇＧ　６００１／１
９を０、１４’？Ｍ　ＮａＣ６を含有するｐＨ８，０（
７）０．００１Ｍトリス塩酸緩衝液３０ｍＡに溶解し１
，３７℃で２時間ゆっ〈シ攪拌した。攪拌後、この溶液
をセファアクリルＳ−３００を用いてグル濾過し、通過
液を凍結乾燥して馬ＩｇＧと杭周ＩｇＧヒトＦ　（ａ　
ｂ　’）　２フラグメ／トとの複合体の凍結乾燥物を得
た。

一方、先に調製したＦ（ａｂ’）２フラグメントを生理
食塩水に溶かして２０羽の兎の耳静脈に１羽につき１０
■宛注射し、２日間放置してこの２０羽の兎を免疫寛容
群とした。

前記複合体凍結乾燥品を生理食塩水で４ｍ９７ｍｅにな
るように溶解し、この溶液に等量のフロイントの完全ア
ジュバントを加えて乳化して免疫源とした。この乳化液
を免疫寛容群および無処置群各２０羽の兎にいずれも前
肢と後肢の指裏皮内および大腿筋肉に１羽あた９１回９
．５　ｍｌを隔週ごとに３回注射した。第３回の注射終
了１週間後頚動脈より全採血した。

得られた血液を各兎ごとに血漿を分離し、血清５０ｍＡ
に硫安１２．ＩＦｚ９（４０％飽和）を加えて３０分間
攪攪拌後０００ｒｐｍで３Ｑ分間遠心して沈澱物を集め
た。この沈澱物をｐＨ８，０の０．ＯＩＭ）すスー塩酸
バッファー　１０１に対して一夜透析し、透過残液を予
めｐＨ８，０の０．０２　Ｍ　トリ又−塩酸・々ッファ
ーで平衡化しておいだＤＥ−５２（ワット１フ社製）の
カラム（２，０αｘ　６０　ｃｍ　）に通液し２な。

素直り区分をｐｉ−］　８．５の０．０１Ｍホウ酸パア
ファー１０１に対して一夜透析し、馬ＩｇＧを力１．シ
リングしたセファロース４．Ｂｉ充填Ｌ　ｐＨ８，５の
Ｏ，Ｉ　Ｍホウ酸バッファーで平衡化しておいた１６α
×１０−のカラムおよび尻馬ｉｇＧのヒトＦ　（ａ　ｂ
’）　２を力、プリングしたセファロース４Ｂを充填し
ｐＨ８，５の０．１　Ｍホウ酸バッファーで平衡化し７
ておいた１、６ｍＸ１０ｃｒｎのカラムに通液して素通
り区分を集めた。この素通り区分をｐＨ８，０のＩ／１
．０００Ｍ　）　！Ｊスス−酸バッファーを含む生理食
塩水に対して一夜透析し、透析残液を凍結乾燥して兎１
羽あたり１０ｍｇの凍結乾燥品を得た。

この凍結乾燥品について、６兎ごとに寒天平板を用いた
２次元二重拡散法でＣ，ｑ法で免疫複合体陽性の全身性
エリテマトーデス患者血清に罰する反応を調べたところ
、無処置群２０羽中３羽そして免疫寛容群２０羽中５羽
の凍結乾燥品が陽性であった０ なお、この製造例で用いたアフィニティークロマトグラ
フィーのカラムは次のようにして調製した。すなわち、
ＣＮＢｒで活性化したセファロース４Ｂ８ｇをグラスフ
ィルターに充填して１　ｍ　ＭＨＣＬ　１４００　ｍｌ
で洗浄してからビーカーに移し、これに５ｏｏｍｙの馬
ＩｇＧまたは尻馬ＩｇＧのヒトＦ（ａｂ’）２をＱ、　
５　Ｍ　ＮａＣ１を含むｐＨ９，０の０．１．　ＭＮａ
ＨＣＯｓバッファ　ｉｏｆ）ｍＡに添加し、室温にてと
きどきかきまぜながら２時間放置後濾過しだ。

次に、このセファロース４ＢにｐＨ８，０の０．１　Ｍ
トリス−塩酸バッファー１５０　ｍ、ｌを加えて室温で
ときどきかきまぜながら２時間放置して涙過しだ。

フィルター上の馬ＩｇＧまたは杭周ＩｇＧヒトＦ（ａｂ
′）２をカップリングしたセファロース４Ｂをｐ）ｌ　
８．　Ｏの０、１　Ｍホウ酸バッフ了−１５０ＰＨ８で
３回、続いてｐＨ４，０の０．１　Ｍ酢酸バッファ　１
５０ｍ１で２回洗浄してからカラムに充填し、ＰＨ８，
５の０．１　Ｍホウ酸バッファーで平衡してから使用に
供した。

製造例２ 製造例１で用いたものと同じＦ　（ａ　ｂ　’　）　２
フラグメントを生理食塩水に溶かして３０匹のモルモッ
トの足裏静脈に１匹あたり５〜宛注射し、３日間放置し
て免疫寛容群としだ。

免疫寛容群３０匹および無処置群２５匹の各モルモット
の背部に製造例１と同じ免疫源乳化液を１匹あたり１回
０．５　ｍｅ宛隔週ごとに４回皮内注射した。最終回の
注射１週間後に各モルモットとも頚動脈から全採血した
。

得られた血液を各モルモットごとに血漿を分離して５ｍ
／８の血清を得、いずれも製造例１と同様に処理して１
匹あたり０９■の凍結乾燥品を得た。

この凍結乾燥品について製造例１と同様に免疫複合体陽
性の全身性エリテマトーデス患者血清に対する反応を調
べたところ、無処置群２５匹中の３匹そして免疫寛容群
３０匹中の６匹の凍結乾燥品が陽性であった。

製造例、３ 製造例１と同じＦ　（ａ　ｂ　’　）　２フラグメント
を生理食塩水に溶かして１８羽のニワトリの羽根裏に１
羽らだ＃）１０グ宛静脈注射し１週間放置して免疫寛容
群とした。

免疫寛容群１８羽および無処置群１７羽の各°ニワトリ
の胸部に製造例１と同じ免疫源乳化液１羽あたシ１回０
．５蛯宛１週間ごとに３回筋肉注射した。最終回の注射
１週間後に各ニワトリとも頚動脈から全採血した。

得られた血液を各ニワトリごとに血漿を分離して７０ｍ
１の血清を得、いずれも製造例１と同様に処理して１羽
あた！ｌ１９■の凍結乾燥品を樽だ。

この凍結乾燥品について製造例１と同様に免疫複合体陽
性の全身性エリテスト−デス患者血清に対する反応を調
べたところ、無処置群１７羽中２羽そして免疫寛容群１
８羽中の５羽の凍結乾燥品が陽性であった。

使用例 製造例１で得られた反応陽性の凍結乾燥品を用い、各種
血清について加納らの方法に準じて測定した。

すなわち、この凍結乾燥品を０．１５　Ｍリン酸バッフ
−ｒ　−−０，１４ＭＮａＣｌ　（ｐＨ７，２）にｆｏ
ｔｔｊｉ／ｍｔＫなるように溶解し、この２０μｌと各
希釈倍率の被゛検血清２０　ｌｔ４とを混合した。２０
℃で６０分間放置後、混合液をマイクロプレートの窪み
に入れ、１％抗り抗体感作ヒトＯ型Ｒｈ士血球懸濁液２
０μｌを加えた。温室で２０℃で３０分間放置し、被検
血清を４倍希釈しても凝集抑制が起こるものを陽性とし
た。

得られた結果を下表に示す。なお、表中ＳＬＥとは全身
性エリテマトーデス患者血清を、そしてＲＡは慢性関節
す１．ウマチ患者血清をそれぞれ表わしている。ＲＡに
ついては予め０２Ｍ２−メルカゾトエタノール処理した
ものを用いた。捷た、負荷とは被検血清を５０℃で３０
分間加熱したもＳＬＥ　　　　　２０　　　４０％　　
４０チＨＡ　　　　　　　　２　１　　　　　　７　１
　　　　　　７　１健常人　　　１８　　　０　　　０ たシ２００μｍになるように測定したがいずれも陽性に
ならなかった。

特許出願人　　富士臓器製薬株式会社 代理人　弁理士田中政浩 手続補正書（自発） ■事件の表示 特願昭５７−５８２’７４号 ２発明の名称 抗免疫複合体抗体およびその製法 ３補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名称　富士レビオ株式会社 ４代理人 居所　〒１０４東京都中央区京橋二丁目１番３号６補正
の内容 （１）第３頁第１０〜１３行の記載を以下の通りに補正
する。

［本発明者らは、抗原とそのヒト抗体のＦ（ａｂっ。

フラグメントとの複合体を温血動物に注射してその体内
にこの複合体に対する抗体」（２）第３頁第１８〜２０
行に記載された「兎など・・・また、」を削除する。

（３）第４頁第１９行〜第５頁第１行の記載を以下−の
通りに補正する。

［ある。抗体はヒト由来のものである。抗体には、Ｉｇ
Ｍ抗体、■ｇＧ抗体など各種のものがあるが、そのなか
でＩｇＧ抗体が好適である。抗体は不純のま」 ７頁１３行　　「少量ア」　　　　「少量のア」〃　　
１８行　　「この凍」　　　　［このＦ　（ａ　ｂ’）
　２フラグメントの凍」 １４頁１１行　　「バンド」　　　　「パント」〃　　
】７行　　「血漿Ｊ　　　　　「血清」１５頁　２行　
　「透過」　　　　　「透析」ｔｔ　　　　９’６　　
　ｒ　”）　２をＪ　　　　　ｒｂ’）２フラグメント
を」 〃　１８行　　「法でＣＪ　　　　　ｒ法で、Ｃ」１６
頁　８行　　「Ｇまたは」　　　「Ｇ（又は」〃　　９
行　　「）２を」　　　　［）２フラグメント）を」 〃　　１０行　　ｒ　ｉ　ＯＯｍｌに」　　「に溶解し
だ液１００ｍ１を」 〃　　１５行　　「（ａｂ’）２　ｊ　　　　ｒ　（ａ
ｂ’）２フラグメント」 １７頁　７行　　「疫源乳」　　　　「疫原乳」〃　１
１行　　「血漿」　　　　　「血清」１１８頁　９行　
　　〃　　　　　　　〃以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　全身性エリテマトーデス患者血清に含まれる免疫複
   合体および慢性関節リュウマチ患者血清に含まれる免疫
   複合体と反応し、凝集ＩｇＧ抗体と反応せず、かつケ゛
   ル濾過性で測定した分子量が１５〜１８万である糖蛋白
   質よシなる抗免疫複合体抗体。 ２　抗原とその抗体のＦ　（ａ　ｂ’　）　２フラグメ
   ントとを接触させることによって該抗原と該Ｆ　（ａ　
   ｂ　’）　２フラグメントの複合体を形成せしめ、この
   複合体を抗原として対応する抗体を産生せしめてこれを
   採取することを特徴とする抗免疫複合体抗体の製法。