WO2009142221A1 - 抗原を結合した抗体と抗原を結合していない抗体の構造変化を識別する抗体とその取得法 - Google Patents

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antigen
antibodies
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東　隆親
壽男 滝沢
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大塚製薬株式会社
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    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
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    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/32—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency specific for a neo-epitope on a complex, e.g. antibody-antigen or ligand-receptor

Definitions

  • the present invention relates to an antibody for distinguishing structural changes between an antibody bound to an antigen and an antibody not bound to an antigen, and a method for obtaining the antibody.
  • Antibody is expressed by specificity and binding power for recognizing an antigen. Monoclonal technology has been developed, and protein chemistry analysis and application technology of antibodies have progressed dramatically.
  • the antigen / antibody complex has an effector function such as activation of a complement cascade having no free antibody. This suggests that the structural change of the antibody due to antigen binding is induced in the constant domain to which complement binds, but the complement cascade is also activated by antibody aggregates. Effector function has been interpreted as agglutination.
  • Higashi et al. Analyzed the binding reaction between S. aureus protein A and the antibody in detail, and found that the antigen-bound antibody and the non-antigen-bound antibody had different reactivity to protein A. (Non-Patent Document 2, 3). However, the difference in structure between the free antibody detected by protein A and the antigen / antibody complex was small, and it was difficult to detect this difference by ELISA or the like.
  • An object of the present invention is to provide an antibody and a method for producing the same that facilitate structural changes that occur in the constant domain of the antibody.
  • the present invention provides the following antibodies and methods for producing the same.
  • Item 1. An antibody that recognizes a first antibody and specifically recognizes one of a free first antibody and an antigen-binding first antibody.
  • Item 2. The antibody (Domino antibody) according to Item 1, wherein the specific recognition antibody specifically recognizes and binds to an antigen-binding first antibody.
  • Item 3. Item 2. The antibody (unlocked antibody) according to Item 1, wherein the specific recognition antibody specifically recognizes and binds to a free first antibody.
  • the specific recognition antibody recognizes one selected from the group consisting of the light chain part of the first antibody or the partial peptide of the light chain part, Fd (heavy chain variable region + CH1 region) and the partial peptide thereof The antibody according to any one of 1 to 3.
  • Item 5. A hybridoma that produces the antibody according to any one of Items 1 to 4.
  • Item 6. The hybridoma according to Item 5, wherein the ATCC accession number is PTA-9167 or PTA-9168.
  • Item 7. A method for obtaining a domino antibody or an unlocking antibody, comprising immunizing with gamma globulin as an antigen and selecting the domino antibody or the unlocking antibody from the obtained monoclonal antibody produced by the hybridoma.
  • Item 8 The method according to Item 7, wherein the antigen is a light chain of gamma globulin or a fragment thereof.
  • Item 9 After the hapten antibody captures the hapten or antigen, the hapten or antigen is chemically fixed or bound to the antibody, and an antigen-antibody complex in which the antigen does not dissociate from the antibody is prepared. How to get.
  • the result obtained by the assay method of the L series antibody is shown.
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  • CFA Complete Freund's adjuvant
  • CGG Chicken gamma globulin
  • NP 4-hydroxy-3-nitrophenyl acetyl
  • C ⁇ 1 is an epitope. Binding characteristics of anti-NP mAb and anti- ⁇ 1 mAb # 0806-12 in the presence or absence of NP-Ag (specimen: 9T13mAb, 9T13mAb + NP-Cap or 9T13mAb + DNP-Cap).
  • the “first antibody” means an antibody that is recognized by an antibody that specifically recognizes one of the free first antibody and the antigen-binding first antibody of the present invention (specific recognition antibody). To do.
  • the first antibody recognizes an antigen, which may be an antibody or a non-antibody.
  • “First antibody” includes both free and antigen-binding first antibodies.
  • “specific recognition of one antibody of the free primary antibody and the antigen-binding primary antibody” means that the primary antibody that is not bound to the antigen (free primary antibody) and the antigen are bound. It means that either one of the first antibodies (antigen-binding first antibodies) specifically recognizes and binds, and the other does not bind at all or does not substantially bind.
  • the binding to the other free primary antibody or antigen-binding primary antibody that is not recognized by the specific recognition antibody of the present invention is at a level equivalent to that of an antigen unrelated to antibody recognition, such as the antigen recognized by the primary antibody. Ground level).
  • Free first antibody means a first antibody not bound to an antigen
  • antigen-bound first antibody means a first antibody bound to an antigen
  • the specific recognition antibody of the present invention is a domino antibody (Domino antibody) or an unlocked antibody (Antibody Unlocking Antibody: AUA). Includes both.
  • domino antibody means an antibody that specifically recognizes a first antibody bound to an antigen.
  • the domino antibody is an antibody that recognizes an antibody such as a primary antibody or a secondary antibody, and the antibody recognized by the domino antibody may be a complex with an antibody (for example, a secondary antibody, a tertiary antibody, etc.) Any antibody (eg, primary antibody) bound to an antigen other than an antibody may be used.
  • the second domino antibody Domino II antibody
  • Domino III antibody the third domino antibody
  • the second domino antibody and the third domino antibody are successively bound to each other. Therefore, in the present specification, such an antibody is named a domino antibody (FIG. 14).
  • Antibodies Antibodies: Antibodies: AUA
  • An unlocked antibody was named this way because it can extract (unlock) the antigen or antibody from the antibody bound antigen when it has a high affinity.
  • a preferable unlocking antibody of the present invention is an antibody capable of extracting (unlocking) an antigen or an antibody from an antibody bound to the antigen.
  • antibody is used in the broadest sense and includes monoclonal antibodies (including full-length or intact monoclonal antibodies), polyclonal antibodies, multivalent antibodies, multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies), and the like Antibody fragments are also included so long as they exhibit the biological activity.
  • multivalent antibody is used throughout this specification to refer to an antibody comprising three or more antigen binding sites. Multivalent antibodies are preferably genetically engineered to have 3 or more antigen binding sites and are generally not native sequence IgM or IgA antibodies.
  • Antibody fragments comprise a portion of an antibody that retains the ability to bind to an antigen.
  • Examples of antibody fragments encompassed by this definition include: (i) a Fab fragment having a VL, CL, VH and CH1 domain; (ii) a Fab fragment having one or more cysteine residues at the C-terminus of the CH1 domain.
  • the term “monoclonal antibody” as used herein refers to an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies. That is, the individual antibodies that make up the population are identical except for naturally occurring possible mutations that may be present in small amounts. Monoclonal antibodies are highly specific and are directed against a single antigenic site. Furthermore, unlike polyclonal antibody preparations that typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody is directed against a single determinant of the antigen. The modifier “monoclonal” does not imply that the antibody must be produced in any specific manner.
  • monoclonal antibodies used in the present invention can be made by the hybridoma method first described in Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), or can be made by recombinant DNA methods (eg, US No. 4,816,567).
  • the “monoclonal antibody” is a phage antibody using the technique described in, for example, Clackson et al., Nature, 624352: 624-628 (1991) or Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991). It can also be isolated from a library.
  • the monoclonal antibodies described herein are particularly those in which a portion of the heavy and / or light chain is derived from a particular species or is identical or homologous to the corresponding sequence of an antibody belonging to a particular antibody class or subclass.
  • Such antibody fragments US Pat. No. 4,816,567; and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984)).
  • “Humanized” forms of non-human (eg, murine) antibodies are chimeric antibodies that contain minimal sequence derived from non-human immunoglobulin.
  • humanized antibodies are of non-human species, such as mice, rats, rabbits or non-human primates with the desired specificity, affinity and ability, from the recipient hypervariable region.
  • Human immunoglobulin (recipient antibody) replaced by residues from the hypervariable region (donor antibody).
  • donor antibody residues from the hypervariable region
  • framework region (FR) residues of the human immunoglobulin are replaced by corresponding non-human residues.
  • humanized antibodies may contain residues that are found neither in the recipient antibody nor in the donor antibody. These modifications are made to further refine antibody properties.
  • a humanized antibody has at least one, wherein all or substantially all hypervariable loops correspond to those of non-human immunoglobulin, and all or substantially all FRs are of human immunoglobulin sequences. Typically comprising substantially all of the two variable domains.
  • a humanized antibody optionally comprises at least a portion of an immunoglobulin constant region (Fc), typically that of a human immunoglobulin.
  • Fc immunoglobulin constant region
  • Human antibodies are those having an amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of an antibody produced by a human and / or produced using any technique for producing a human antibody disclosed herein. Is. Human antibodies can be produced by using various techniques known in the art. In one embodiment, the human antibody is selected from a phage library, wherein the phage library expresses a human antibody (Vaughan et al., Nature Biotechnology 14: 309-314 (1996): Sheets et al., PNAS, (USA) 95). : 6157-6162 (1998); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 1991 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581 1991 (1991)).
  • Human antibodies can also be produced by introducing human immunoglobulin into transgenic animals, such as mice in which endogenous immunoglobulin genes have been partially or completely inactivated. Upon exposure, production of human antibodies is observed that closely resembles that seen in humans in all respects, including gene rearrangement, assembly and antibody repertoire. This approach is described, for example, in U.S. Pat. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; and 5,661,016, and the following scientific literature: Marks et al., Bio / Technology 10: 779-783.
  • human antibodies may be prepared by immortalization of human B lymphocytes that produce antibodies against the target antigen (such B lymphocytes may be recovered from the individual and immunized in vitro. May be).
  • B lymphocytes may be recovered from the individual and immunized in vitro. May be).
  • Cole et al. ⁇ Monoclonal> Antibodies> and ⁇ Cancer> Therapy, ⁇ Alan> R. Liss. P.77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1): 86-95 (1991); and US Pat. See
  • Disease is any symptom that can benefit from treatment with antibodies. This includes chronic and acute diseases or conditions, including pathological conditions that predispose mammals to the disease in question.
  • diseases to be treated by the antibodies of the present invention include benign and malignant tumors; leukemias and lymphoid malignancies; neurons, glia, astrocytes, hypothalamus and other glands, macrophages , Epithelial, stromal and split cavity diseases; and inflammation, angiogenesis and immune diseases.
  • terapéuticaally effective amount means the amount of a drug effective to treat a mammal disease or disorder.
  • Treatment refers to both therapeutic treatment and prophylactic or protective measures. Those in need of treatment include those already with the disease as well as those in which the disease is to be prevented.
  • label refers to a detectable compound or composition that binds directly or indirectly to a polypeptide (eg, an antigen or antibody).
  • the label may itself be detectable (eg, a radioisotope label or a fluorescent label) or, in the case of an enzyme label, may catalyze chemical conversion of the detectable substrate compound or composition.
  • the expressions “cell”, “cell line” and “cell culture” are used interchangeably and all terms include progeny.
  • the phrases “transformants” and “transformed cells” include those derived from the first subject cell and the first, regardless of how many times the culture has been passaged.
  • Monoclonal antibody preparation Means for preparing and characterizing antibodies are well known in the art. Exemplary techniques for the production of antibodies used in the present invention are now described.
  • the antigen used for the production of the antibody can be an antibody or a part thereof, preferably an antibody light chain or a fragment thereof.
  • the preparation of the antibody of the present invention is characterized by using a light chain.
  • a domino antibody that recognizes only the antibody complex and does not recognize a free antibody seems to be prepared by administering the antigen-antibody complex to the host.
  • the present inventors actually used such a method Only antibodies recognizing both free and complexed antibodies were obtained.
  • a domino antibody that specifically recognizes the antigen-antibody complex or an unlocked antibody that specifically recognizes the free antibody could be obtained by producing an antibody using the light chain.
  • the hapten or antigen is chemically fixed or bound to the antibody to produce an antigen-antibody complex in which the antigen does not dissociate from the antibody, and then the complex is immunized to domino.
  • Antibodies can be obtained.
  • haptens include steroid hormones such as testosterone, estradiol, estriol and cortisol, and compounds having a mononitrophenyl group, a dinitrophenyl group, a trinitrophenyl group, a fluorescein group, etc.
  • a hapten antibody is an antibody that specifically recognizes these haptens.
  • the chemical immobilization or binding of the hapten or antigen and the antibody can be performed using a crosslinking agent, for example, dialdehydes such as glutaraldehyde, formaldehyde and paraformaldehyde, and diisocyanates such as tolylene-2,4-diisocyanate.
  • the domino antibody and unlocking antibody of the present invention can be prepared using the light chain or fragments thereof, using the hybridoma method first described by Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975), or by the recombinant DNA method ( U.S. Pat. No. 4,816,567).
  • a hybridoma in which a light chain of an antibody recognized by a domino antibody or an unlocking antibody is obtained and administered to a host (mouse, rat, rabbit, hamster, macaque, etc.) using this light chain as an immunogen. It can be produced by the method.
  • the host is immunized as described above to produce or derive lymphocytes that can produce antibodies that specifically bind to the light chain or fragment thereof used for immunization.
  • lymphocytes can be immunized in vitro.
  • lymphocytes are then fused with myeloma cells using a suitable fusing agent such as polyethylene glycol to form hybridoma cells (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pages 59-103 (Academic Press, 1986) ).
  • a suitable fusing agent such as polyethylene glycol
  • the light chain is used as an antigen.
  • the antigen is an H chain fragment containing the H chain and the variable region of the H chain and the C1H region, the target antibody is similarly obtained. Production hybridomas can be obtained.
  • the antibody captures the antigen with a divalent Fab portion
  • the Fab is composed of a light chain (VL + CL) and a heavy chain Fd (heavy chain variable region VH + CH1 region).
  • the light chain (VL + CL) and Fd (VH + CH1) in Fab are a pair of functionally symmetric proteins. Three regions (hypervariable region) divided into VL of this pair of proteins, VH However, similarly, there are three regions (hypervariable regions) divided at positions corresponding to VL, and antigens are captured by these regions.
  • the L chain and the H chain are a pair of functionally symmetric proteins. There are also three portions where antigens are captured in regions of approximately the same position and length.
  • light chain immunity is superior in the following ways: (i) Fd is first purified through Fab and F (ab ′) 2. In this respect, the light chain is easier to purify and is advantageous in terms of yield; (ii) The light chain is easier to handle in terms of physical properties.
  • the H chain is a hydrophobic protein and tends to precipitate during purification.
  • the disadvantages of the above H chain are, for example, 1) immunization with a chemically synthesized Fd partial peptide, and 2) obtaining a recombinant protein containing only Fd in Escherichia coli or yeast. 3) It can be avoided by immunizing with KO mice lacking a specific Fd portion.
  • the hybridoma cells thus prepared are seeded and grown in a suitable medium that preferably contains one or more substances that inhibit the growth or survival of the unfused parent myeloma cells.
  • a suitable medium that preferably contains one or more substances that inhibit the growth or survival of the unfused parent myeloma cells.
  • the parent myeloma cells lack the enzyme hypoxanthine anidine phosphoribosyltransferase (HGPRT or HPRT)
  • the culture medium for hybridomas is typically hypopoxia, a substance that prevents the growth of HGPRT-deficient cells. It will contain xanthine, aminopterin and thymidine (HAT medium).
  • Preferred myeloma cells are cells that fuse efficiently, support stable high level production of antibodies by selected antibody-producing cells, and are sensitive to a medium such as HAT medium.
  • preferred myeloma cell lines are mouse myeloma lines, such as MOPC-21 and MPC-11 mouse tumors available from Souk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, and American type. • Derived from SP-2 or X63-Ag8-653 cells available from Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Human myeloma and mouse-human heteromyeloma cell lines have also been disclosed for the production of human monoclonal antibodies (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51 -63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).
  • the medium in which the hybridoma cells are growing is assayed for production of monoclonal antibodies against the antigen (free antibody or antibody bound to the antigen).
  • the binding specificity of monoclonal antibodies produced by hybridoma cells is measured by immunoprecipitation or in vitro binding assays, such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). .
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • hybridoma cell After a hybridoma cell that produces an antibody having a desired specificity, affinity, and / or activity as a domino antibody or an unlocking antibody is identified, the clone is subcloned by a limiting dilution method and grown by a standard method.
  • Suitable culture media for this purpose include, for example, D-MEM or RPMI-1640 medium.
  • hybridoma cells can be grown in vivo as ascites tumors in animals.
  • Monoclonal antibodies secreted by the subclone are suitable from medium, ascites fluid or serum by conventional immunoglobulin purification methods such as protein A-sepharose, hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, or affinity chromatography. Separated.
  • the DNA encoding the monoclonal antibody is immediately isolated and sequenced by conventional methods (eg, by using oligonucleotide probes capable of specifically binding to the genes encoding the heavy and light chains of the monoclonal antibody). Is done. Hybridoma cells are a preferred source of such DNA.
  • the DNA is placed in an expression vector, which is then transformed into an E. coli cell, monkey COS cell, Chinese hamster ovary (CHO) cell, or myeloma cell that otherwise does not produce immunoglobulin protein. It can be transfected into host cells to achieve the synthesis of monoclonal antibodies in recombinant host cells. Recombinant production of antibodies is described in further detail below.
  • antibodies or antibody fragments can be isolated from antibody phage libraries produced using the techniques described in McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-5971991 (1991) describe the isolation of mouse and human antibodies using phage libraries. ing. Another reference is the production of high affinity (nM range) human antibodies by chain shuffling (Marks et al., Bio / Technology, 10: 779-783 (1992)), as well as for constructing very large phage libraries.
  • DNA can also be obtained, for example, by replacing the coding sequences of human heavy and light chain constant domains in place of homologous mouse sequences (US Pat. No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81: 6851 (1984)), or can be modified by covalently linking all or part of the coding sequence of the non-immunoglobulin polypeptide to the immunoglobulin coding sequence.
  • non-immunoglobulin polypeptide is substituted with a constant domain of an antibody or substituted with a variable domain of one antigen-binding site of an antibody and has one antigen-binding site with specificity for an antigen.
  • a chimeric bivalent antibody is created comprising another antigen binding site with specificity for a different antigen.
  • Humanized and human antibodies have one or more amino acid residues derived from non-human origin. These non-human amino acid residues are often referred to as “import” residues, which are typically taken from an “import” variable domain. Humanization essentially involves the method of Winter and co-workers (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986), Riechmann, by replacing rodent CDRs or CDR sequences with the corresponding sequences of human antibodies. Et al., Nature, 332: 323-327 (1988), Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)). Accordingly, such “humanized” antibodies are chimeric antibodies (US Pat. No.
  • humanized antibodies are typically humans in which some hypervariable region residues and possibly some FR residues are substituted by residues from analogous sites in rodent antibodies. Antibody.
  • the same framework can be used for several different humanized antibodies (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)) .
  • a preferred method uses a three-dimensional model of the parent and humanized sequences to prepare the humanized antibody through an analysis step of the parent sequence and various conceptual humanized products.
  • Three-dimensional immunoglobulin models are commonly available and are familiar to those skilled in the art.
  • Computer programs that illustrate and display the putative three-dimensional conformational structure of selected candidate immunoglobulin sequences are available for purchase. Examining these representations allows analysis of the possible role of residues in the function of candidate immunoglobulin sequences, ie, analysis of residues that affect the ability of candidate immunoglobulins to bind antigen.
  • FR residues can be selected and combined from the recipient and import sequences so that the desired antibody characteristic, such as increased affinity for the target antigen (s), is achieved.
  • the CDR residues directly and most substantially affect antigen binding.
  • transgenic animals eg, mice
  • transgenic animals can be made that can be produced by immunizing the entire repertoire of human antibodies without endogenous immunoglobulin production.
  • J H antibody heavy chain joining region
  • homozygous removal of the antibody heavy chain joining region (J H ) gene in chimeric and germ-line mutant mice results in complete inhibition of endogenous antibody production.
  • Transfer of human germline immunoglobulin gene sequences in such germline mutant mice results in the production of human antibodies upon challenge.
  • Human antibodies can also be derived from phage-display libraries (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991). Vaughan et al. Nature Biotech 14: 309 (1996)).
  • Antibody Fragments Various techniques have been developed to produce antibody fragments. Traditionally, these fragments have been derived through proteolytic digestion of intact antibodies (e.g. Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) and Brennan et al., Science , 229: 81 (1985)). However, these fragments can now be produced directly by recombinant host cells. For example, antibody fragments can be isolated from the antibody phage libraries discussed above. Alternatively, Fab′-SH fragments can be recovered directly from E. coli and chemically coupled to form F (ab ′) 2 fragments (Carter et al., Bio / Technology 10: 163-167 (1992)). ).
  • F (ab ′) 2 fragments can be isolated directly from recombinant host cell culture.
  • Other methods for the production of antibody fragments will be apparent to those skilled in the art.
  • the selection antibody is a single chain Fv fragment (scFV). See WO 93/16185.
  • a cysteine residue may be introduced into the Fc region, thereby forming an interchain disulfide bond in this region.
  • the homodimeric antibody thus generated may have improved internalization capability and / or increased complement-mediated cell killing and antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC). See Caron et al., J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992).
  • homodimeric antibodies with improved antitumor activity can be prepared using heterobifunctional cross-linking agents described in Wolff et al., “Cancer Research 53”: 2560-2565 (1993).
  • the antibody can be engineered to have two Fc regions, thereby improving complement lysis and ADCC capabilities. See Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989).
  • the antibodies disclosed herein can also be formulated as immunoliposomes.
  • Liposomes containing antibodies are described in, for example, Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688 (1985); Hwang et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4030 (1980); and US Pat. And by methods known in the art as described in US Pat. Liposomes with increased circulation time are disclosed in US Pat. No. 5,013,556.
  • Particularly useful liposomes can be prepared by the reverse phase evaporation method using a lipid composition containing phosphatidylcholine, cholesterol and PEG-derivatized phosphatidylethanolamine (PEG-PE). Liposomes are extruded through a filter with a defined pore size to obtain liposomes having a desired diameter.
  • Fab ′ fragments of the antibodies of the invention can be conjugated to liposomes via a disulfide exchange reaction as described in Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982). .
  • a chemotherapeutic agent such as doxorubicin
  • Covalent modifications of antibodies are within the scope of the present invention. They can be made by chemical synthesis, as appropriate, or by enzymatic or chemical cleavage of antibodies. Another type of covalent modification of the antibody is introduced into the molecule by reacting the target amino acid region with an organic derivatizing agent capable of reacting with a selected side chain or N- or C-terminal residue. .
  • Covalent modification involves chemically or enzymatically coupling glycosides to the antibody. These procedures are advantageous in that they do not require production of antibodies in a host cell that has glycosylation capabilities for N- or O-linked glycosylation.
  • the sugar (s) can be (a) arginine and histidine, (b) a free carboxyl group, (c) a free sulfhydryl group such as cysteine, (d) serine.
  • a free hydroxyl group such as that of threonine or hydroxyproline, (e) an aromatic residue such as phenylalanine, tyrosine or tryptophan, or (f) an amide group of glutamine.
  • Removal of any carbohydrate moieties present in the antibody can be done chemically or enzymatically.
  • Chemical deglycosylation requires exposure of the antibody to the compound trifluoromethanesulfonic acid, or an equivalent compound. This treatment results in cleavage of most or all sugars except the conjugated sugar (N-acetylglucosamine or N-acetylgalactosamine) while leaving the antibody intact.
  • Chemical deglycosylation is described by Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys., 259: 52 (1987), and Edge et al., Anal. Biochem., 118: 131 (1981).
  • Enzymatic cleavage of the carbohydrate moiety on the antibody can be achieved by using various endo and exoglycosidases as described in Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138: 350 (1987).
  • Another type of covalent modification of the antibody is to convert the antibody to one of a variety of non-proteinaceous polymers, such as polyethylene glycol, polypropylene glycol, or polyoxyalkylene, US Pat. Nos. 4,640,835; 4,496,689; No. 4670417; 4791192 or 4179337.
  • the antibody of the present invention can be produced recombinantly.
  • the nucleic acid encoding it is isolated and inserted into a replicable vector for further cloning (DNA amplification) or expression.
  • the DNA encoding the monoclonal antibody is immediately isolated and sequenced using conventional techniques (e.g., using oligonucleotide probes capable of specifically binding to the genes encoding the heavy and light chains of the antibody).
  • Vector components generally include, but are not limited to, one or more of the following: a signal sequence, an origin of replication, one or more marker genes, an enhancer element, a promoter, and a transcription termination sequence. It is.
  • the therapeutic formulations of antibodies used in the present invention are obtained by mixing an optional pharmaceutically acceptable carrier, excipient or stabilizer with an antibody having the desired purity (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol , A [1980]), prepared for storage in the form of a lyophilized formulation or an aqueous solution. Typically, an appropriate amount of a pharmaceutically acceptable salt is used in the carrier to make the formulation isotonic.
  • Acceptable carriers, excipients or stabilizers are nontoxic to cells at the dosages and concentrations used and are buffers such as phosphate, citrate and other organic acids; antioxidants including ascorbic acid and methionine Preservatives (eg octadecyldimethylbenzylammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride; benzethonium chloride; phenol, butyl or benzyl alcohol; alkyl parabens such as methyl or propylparaben; catechol; resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; and m-cresol); low molecular weight (less than 10 residues) polypeptide; protein such as serum albumin, gelatin or immunoglobulin; hydrophilic polymer such as polyvinylpyrrolidone; glycine, glutamine, asparagine, Histidine, a Amino acids such as ginine or
  • the formulation may also contain one or more active compounds necessary for the particular indication being treated, preferably those with complementary activities that do not adversely affect each other.
  • the active ingredient can also be incorporated into colloidal drug delivery systems (e.g. liposomes, microcapsules prepared by coacervation or interfacial polymerization, e.g. hydroxymethylcellulose or gelatin-microcapsules and poly- (methyl methacrylate) microcapsules, respectively.
  • Albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles and nanocapsules or macroemulsions.
  • sustained release preparations may be prepared. Suitable examples of sustained release preparations include solid hydrophobic polymer semipermeable matrices containing antibodies, which are in the form of shaped articles such as films or microcapsules. Examples of sustained release matrices include polyesters, hydrogels (eg poly (2-hydroxyethyl-methacrylate) or poly (vinyl alcohol)), polylactides (US Pat. No.
  • the encapsulated antibody When the encapsulated antibody remains in the body for a long time, it may be denatured or aggregated as a result of exposure to moisture at 37 ° C., thereby eliminating biological activity and changing immunogenicity. Rational strategies can be devised depending on the mechanism involved. For example, rational measures can be devised to obtain stability depending on the mechanism involved. For example, if the aggregation mechanism is found to be the formation of intermolecular SS bonds by thio-disulfide exchange, the sulfhydryl residue is modified, lyophilized from an acidic solution, the water content is adjusted, and appropriate additives are added. Stabilization can be achieved by using and developing specific polymer matrix compositions.
  • the antibodies of the present invention can be administered in a known manner, for example, intravenously as a bolus or by continuous infusion over a period of time, intramuscular, intraperitoneal, intracerebral spinal, subcutaneous, intraarticular, intrasynovial, subarachnoid space It is administered to human patients by internal, oral, topical, or inhalation routes. Intravenous or subcutaneous administration of the antibody is preferred.
  • the antibodies of the invention are administered every 2 to 3 weeks at a dose ranging from about 5 mg / kg to about 15 mg / kg. The progress of the therapy of the invention is easily monitored by conventional techniques and assays.
  • the antibody of the present invention may be administered as a single antibody, but can be administered in combination with other antibody drugs.
  • the antibody of the present invention is useful in immunoassays such as ELISA because it distinguishes and recognizes a free primary antibody and an antigen-binding primary antibody.
  • the present invention is made with an antibody, but the subject of the present invention may be a nucleic acid (aptamer) or peptide instead of an antibody. That is, an aptamer that recognizes an antibody that recognizes an antigen and a peptide, or an antibody that recognizes an aptamer that recognizes an antigen, an aptamer, and a peptide are also synonymous. Aptamers can be obtained by SELEX method and peptides can be obtained by phage library.
  • Anti-FITC rat monoclonal antibody # 55 (IgG2a ⁇ ) was established by a conventional method.
  • an anti-FITC rat monoclonal antibody # 7 (IgG2a ⁇ ) was independently established by a conventional method.
  • CGG Chicken gamma globulin
  • BSA Bovine serum albumin
  • the light chain was purified from anti-FITC rat monoclonal antibody # 55 obtained by the above operation.
  • the method for separating and purifying the light chain was performed according to Azuma, T et al. PNAS (1981) 78 pp569-573. That is, the purified antibody # 55 is dissolved in a final concentration of 0.01 M Dithiothreitol, 0.2 M Tris-HCl (pH 8.2). Warm the solution at 37 ° C. for 30 minutes. After the reaction, the reaction mixture was returned to room temperature (standing for about 10 minutes) and added to a final concentration of 0.3 M Iodoacetoamide and allowed to stand for 30 minutes to perform an alkylation reaction. HPLC was used to separate heavy and light chains.
  • alkylation # 55 was applied to a column equilibrated with PBS (pH 7.2) in which 5 M Guanidine-HCl was dissolved to obtain a light chain fraction.
  • the fraction contaminated with the heavy chain was again subjected to HPLC to obtain a light chain fraction.
  • the light chain fraction was dialyzed against PBS and then aliquoted and stored frozen.
  • the culture supernatant of Hybridoma is applied to each of the above three types of plates with 100 ⁇ l of the culture supernatant of Hybridoma and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After washing the plate, the plate was washed after reacting with HRP-labeled anti-mouse IgG (rat IgG non-crossing) (Jackson Laboratories) for 1 hour at room temperature, and 100 ⁇ l of coloring solution TMB substrate solution (KPL, MD, USA) was added. After reaction for 50 minutes, color development is stopped with 50 ⁇ l of 2N sulfuric acid, and a wavelength of 450 nm is read with a plate reader.
  • HRP-labeled anti-mouse IgG rat IgG non-crossing
  • TMB substrate solution KPL, MD, USA
  • antibodies appearing in the sera of immunized animals include those that react with antibody A, antibodies that react with antigen B, and those that recognize AB conjugates, regardless of antibody structural changes.
  • An antibody that recognizes the structural change of antibody A accompanying AB binding, such as the target antibody, is presumed to have a very low frequency of appearance.
  • the fluorescent substance FITC fluorescein isothiocyanate
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • the inventors first obtained two types of high-affinity anti-FITC antibodies using this property (the above-mentioned # 55 (IgG2a ⁇ ) and # 7 (IgG2a ⁇ )).
  • FITC capture # 55 1) FITC dissolved in DMSO was added at a molar ratio of about 1: 5 to purified # 55 antibody solubilized in PBS (pH 6.8). Immediately, it was applied to a desalting PD-10 column (GE Healthcare Bio-Science Corp, NJ, USA) that had been equilibrated in advance with PBS (pH 6.8), and a high molecular weight fraction was fractionated. Immediately thereafter, 0.5 volume of 1M sodium carbonate buffer (pH 8.3) was added to make the solution weakly alkaline. Light-shielded and left at room temperature for 1 hour.
  • FITC 1: 2.
  • FITC bound to FITC anti-affinity antibody # 55 forms a covalent bond with a charged amino acid in the vicinity of the binding with the antibody and continues to stably bind FITC.
  • FITC capture # 55 immunization and hybridoma preparation FITC capture # 55 (30 ⁇ g / 100 ⁇ l in PBS) was made into an emulsion with the same volume of adjuvant Titer Max Gold (CytRx Corp, GA, USA) and Balb / c mouse ( ⁇ ) Immunization was carried out intraperitoneally 3 times every 2 weeks at 7 weeks of age. Two weeks later, the same amount of FITC-captured # 55 (80 ⁇ g / 100 ⁇ l in PBS) was immunized intraperitoneally without adjuvant. Three days later, the spleen was isolated from the mouse, and the spleen cells were isolated. Cells (P3U1) were fused with polyethylene glycol, and HAT medium was used as a cell selection medium in 10 96-well plates (F series).
  • the culture supernatant of Hybridoma is applied to each of the above three types of plates with 100 ⁇ l of the culture supernatant of Hybridoma and allowed to stand at room temperature for 2 hours. After washing the plate, the plate was washed after reacting with HRP-labeled anti-mouse IgG (rat IgG non-crossing) (Jackson Laboratories) for 1 hour at room temperature, and 100 ⁇ l of coloring solution TMB substrate solution (KPL, MD, USA) was added. After reaction for 50 minutes, color development was stopped with 50 ⁇ l of 2N sulfuric acid, and a wavelength of 450 nm was read with a plate reader.
  • HRP-labeled anti-mouse IgG rat IgG non-crossing
  • TMB substrate solution KPL, MD, USA
  • the target antibody production wells are indicated by A (Domino antibody) or S (Unlocked antibody). Reactivity of 6 types of domino antibodies (L-1A to 6A) and 3 types of unlocked antibodies (L-1S to 3S) from the L series, and 1 type of domino antibody (F-1A) from the F series A clone was obtained.
  • the domino antibody (F-1A, L-6A) -producing hybridoma obtained by cloning a hybridoma producing the target antibody was deposited with the ATCC on April 23, 2008, and the following ATCC numbers were assigned.
  • mAb monoclonal antibody
  • hybridomas were prepared by cell fusion with the myeloma cell line SP2 / 0. Screening for hybridomas that secrete useful mAbs was performed by ELISA using a culture medium and using the binding ability to E11 as an index.
  • clone # 0806-12 with a large amount of antibody production was cultured in large quantities, and affinity purified using a column in which E11 was covalently bound to agarose beads.
  • a yeast strain expressing the Ig domains of E11 (VH, CH1, CH2, CH3, VL, CL domains) on the surface was prepared and biotinylated # 0806-12 When the yeast surface was stained with streptavidin-PE and analyzed by FACS, it bound only to the yeast strain that expressed the CL domain. This shows that Ab # 0806-12 binds with the ⁇ 1 light chain constant region as an epitope (FIG. 12).
  • the unlocked antibody (0806-12) -producing hybridoma obtained by cloning the hybridoma producing the target antibody was deposited with the ATCC on April 16, 2009, and the following ATCC numbers were assigned.
  • mAb # 0806-12 It was analyzed using Biacore whether mAb # 0806-12 can detect an antigen-antibody reaction. Purified mAb # 0806-12 was immobilized on a Biacore® CM5 sensor chip by about 2000 RU by an amine coupling method, and binding to 9T13 (IgG1® / ⁇ 1), an anti-NP® mAb, was examined (FIG. 13).
  • the anti- ⁇ 1 light chain monoclonal antibody # 0806-12 obtained this time specifically binds to an anti-NP mAb having a ⁇ 1 light chain and has an affinity when the anti-NP mAb binds to an NP antigen. It can be said that the antigen-antibody reaction can be discriminated because of a marked decrease in.
  • Application example 1 of antibody recognizing antibody recognizing antigen 1 As means of measuring method (i) Biosensor: detection of trace antigens (realization of ultra-high sensitivity)
  • Biosensor detection of trace antigens (realization of ultra-high sensitivity)
  • a rat monoclonal antibody (A) that recognizes only a mouse antibody bound to an antigen.
  • the hamster monoclonal antibody (B) reacts only when the rat antibody recognizes the antigen, and is assembled by changing the antibody recognition site (Fc part, light chain) and antibody species so that such a chain reaction occurs. Can do. That is, it is considered that a very small signal can be greatly amplified, and a highly sensitive sensor can be provided.
  • a primary antibody that recognizes an antigen is labeled with a fluorescent protein CFP, and for example, the antibody is labeled with another type of fluorescent protein YFP.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • This measurement method does not require antigen purification, does not require antigen labeling, and can be applied to any measurement as long as a primary antibody that reacts with the antigen exists.
  • the antibody can be labeled with an anticancer agent or radioactivity and can be widely used as an enhancer for antibody drugs.
  • This antibody can be used as a potentiator regardless of the type of antibody drug provided that it is a human antibody that can react with the antibody. Moreover, since it reacts only with the pharmaceutical antibody couple
  • Natural antibody enhancer acquired at the time of infection or cancer-bearing The living body responds at least upon the invasion of foreign bodies (viruses, recent), onset and growth of tumors, and the elimination of foreign bodies and tumor growth Encourage inhibition. That is, although it may not be sufficient, it is thought that the antibody is produced with respect to a foreign material or a tumor in the case of the said response. Therefore, in order to enhance the antibody supplementing the foreign substance or tumor cell, it is possible to administer the antibody to assist the biological reaction. That is, in the above (i), it is enhancement of the administered pharmaceutical antibody, but in this case, it can be said that it is a more effective globulin preparation that is applied as enhancement of innate immunity in vivo.
  • Antigen-antibody complex removal column The antibody can be immobilized on a column and used. In certain diseases, large amounts of immune complexes are known to contribute to disease progression (eg, rheumatoid arthritis, SLE, etc.).
  • This antibody column can be used as an extracorporeal circulation column to circulate blood in a patient and remove an immune complex antibody bound with an antigen.
  • antibodies that are not involved in the immune complex return to the body without being adsorbed on the column. That is, only the immune complex causing the disease state can be removed.
  • (ii) Trace poison removal column As in the case of (i) above, the column can be used to remove a poison that has entered the body by mistake. In this case, an antibody that binds to the poison is prepared. The antibody that reacts when the antibody is bound is bound to the column. In order to remove the toxic substance, a primary antibody that binds to the toxic substance is intravenously injected into the toxic body. Immediately, the column efficiently removes only the antibody bound to the toxin that initiates extracorporeal circulation.
  • the antibody is tasteless and odorless and easily dissolved in water
  • in order to remove the poison mixed in tap water, drinking water, etc. drop the primary antibody that binds to the poison in drinking water and then pass it through a filter with this antibody immobilized. Detoxification is possible.
  • a similar application can also be applied to removing poisons in the air.
  • the antibody having high affinity is presumed to have a function of dissociating the antigen from the antibody that recognizes the antibody.
  • the antibody that reacts strongly in a state where IgE is not bound to an antigen is used as an antiallergic drug, the antibody binds to the antigen from the IgE antibody even if IgE binds the antigen allergen. Dissociates and IgE bound to allergen (antigen) can be prevented from inducing an allergic reaction.

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Abstract

　本発明は、第一抗体を認識する抗体であって、遊離第一抗体と抗原結合第一抗体の一方の抗体を特異的に認識する抗体に関し、詳しくは前記特異的認識抗体が、抗原結合第一抗体を特異的に認識し結合する抗体（ドミノ抗体）、遊離第一抗体を特異的に認識し結合する抗体（開錠抗体）に関する。

Description

抗原を結合した抗体と抗原を結合していない抗体の構造変化を識別する抗体とその取得法
　本発明は、抗原を結合した抗体と抗原を結合していない抗体の構造変化を識別する抗体とその取得法に関する。
　抗体は、抗原を認識する特異性と結合力で表現される。モノクローナル技術が開発されて、飛躍的に抗体の蛋白化学的な解析と応用技術が進歩した。
　今日、抗体と抗原の結合反応は、熱力学的な解析や測定は簡便に行えるようになっているが、抗原結合に伴う抗体の立体構造変化に関しては未だ詳細な情報がない。これは、広く蛋白質の立体構造の解析に用いられているＸ線結晶解析が抗体のような巨大蛋白質に適用することが難しいためで、多くの抗原・抗体複合体の構造解析は、酵素消化によって得られた抗体のFabフラグメントを用いてなされている(非特許文献1)。これらの解析では、抗原の結合により数オングストロームの構造変化が抗原結合部位のアミノ酸残基に生じることが示されているが、フラグメントの構造解析からは、この変化が結合部位から空間的に離れた定常ドメインに伝達されているかを判断できない。一方、抗原・抗体複合体は、遊離の抗体がもたない補体カスケードの活性化のようなエフェクター機能をもっている。このことは、抗原結合による抗体の構造変化が補体の結合する定常ドメインに誘導されていることを示唆しているが、補体カスケードは抗体の凝集体でも活性化されることから複合体のエフェクター機能は凝集によると解釈されてきた。一方、東らは、黄色ブドウ球菌由来のprotein Aと抗体の結合反応を詳細に解析した結果、抗原を結合した抗体と抗原を結合してない抗体がprotein Aに対する反応性が異なることを見出した(非特許文献2, 3)。しかしながら、protein Aが検出する遊離抗体と抗原・抗体複合体の構造の差は小さく、この差をELISA等で検出することは困難であった。
Structural evidence for induced fit as a mechanism for antibody-antigen recognition.  James M. Rini, Ursula Schulze-Gahmen, Ian A. Wilson. Science,255:959-965 (1992) Evidence of allosteric conformational changes in the antibody constant region upon antigen binding. Masayuki Oda, Haruo Kozono, Hisayuki Mori, and Takachika Azuma. International Immunology, 15:417-426 (2003). Conformational changes in the antibody constant domains upon hapten-binding. Takuma Sagawa, Masayuki Oda, Misayuki Morii, Hisao Takizawa, Haruo Kozono, and Takachika Azuma. Molecular Immunology, 42:9-18 (2005)
　前述したように、従来の技術では遊離の抗体と抗原を結合している抗体とを判別する手段が無かったので、反応液中の遊離の抗体と複合体を前もって分離してから、抗体に対する抗体（抗抗体）で複合体を形成している抗体を検出しなければならなかった。更に、protein A等の抗体結合蛋白質は結合部位が限定されているために、抗体の定常ドメインに生ずる構造変化を検出するには限界があった。
　本発明は、抗体の定常ドメインに生ずる構造変化を容易にする抗体の提供と作製方法を提供することを目的とする。
　本発明は、以下の抗体及びその製造法を提供するものである。
項１．　第一抗体を認識する抗体であって、遊離第一抗体と抗原結合第一抗体の一方の抗体を特異的に認識する抗体。
項２．　前記特異的認識抗体が、抗原結合第一抗体を特異的に認識し結合する項１記載の抗体（ドミノ抗体）。
項３．　前記特異的認識抗体が、遊離第一抗体を特異的に認識し結合する、項１記載の抗体（開錠抗体）。
項４．　前記特異的認識抗体が、第一抗体の軽鎖部分或いは軽鎖部分の部分ペプチドおよびFd（重鎖可変領域＋ＣＨ１領域）およびその部分ペプチドからなる群から選ばれるいずれかを認識するものである項１～３のいずれかに記載の抗体。
項５．　項１～４のいずれかに記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
項６．　ATCCの受託番号がPTA-9167またはPTA-9168である、項５に記載のハイブリドーマ。
項７．　ガンマグロブリンを抗原として免疫し、得られたハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体から、ドミノ抗体もしくは開錠抗体を選別することを特徴とするドミノ抗体もしくは開錠抗体の取得方法。
項８．　前記抗原がガンマグロブリンの軽鎖又はその断片である項７に記載の方法。
項９．　ハプテン抗体にハプテン又は抗原を捕捉させた後、ハプテン又は抗原を抗体に化学的に固定または結合し、抗原が抗体から解離しない抗原抗体複合物を作成した後、当該複合物を免疫しドミノ抗体を得る方法。
　本発明によれば、遊離の抗体と抗原を結合している抗体とを判別することができるようになった。
Lシリーズの抗体のAssay方法により得られた結果を示す。 Lシリーズの抗体のAssay方法により得られた結果を示す。 Lシリーズの抗体のAssay方法により得られた結果を示す。 Lシリーズの抗体のAssay方法により得られた結果を示す。 Lシリーズの抗体のAssay方法により得られた結果を示す。 Lシリーズの抗体のAssay方法により得られた結果を示す。 Lシリーズの抗体のAssay方法により得られた結果を示す。 Lシリーズの抗体のAssay方法により得られた結果を示す。 Lシリーズの抗体のAssay方法により得られた結果を示す。 Lシリーズの抗体のAssay方法により得られた結果を示す。 Ｆシリーズの抗体のAssay方法により得られた結果を示す。 Ｆシリーズの抗体のAssay方法により得られた結果を示す。 Ｆシリーズの抗体のAssay方法により得られた結果を示す。 Ｆシリーズの抗体のAssay方法により得られた結果を示す。 Ｆシリーズの抗体のAssay方法により得られた結果を示す。 Ｆシリーズの抗体のAssay方法により得られた結果を示す。 Ｆシリーズの抗体のAssay方法により得られた結果を示す。 Ｆシリーズの抗体のAssay方法により得られた結果を示す。 Ｆシリーズの抗体のAssay方法により得られた結果を示す。 Ｆシリーズの抗体のAssay方法により得られた結果を示す。 抗-NP抗体(E11) + NP-CGGについての免疫スケジュールを示す100μg of E11 with NP14-CGG (Ab:Ag=3:1 /Mol ratio) in 100ul / mouse / injection。図11において、CFA:  Complete Freund's adjuvantCGG: Chicken gamma globulinNP:  4-hydroxy-3-nitrophenyl acetyl 酵母細胞表面ディスプレイによるmAb#0806-12のエピトープマッピング。Cλ1がエピトープである。 NP-Agの存在下もしくは非存在下の抗-NP mAbと抗λ1 mAb #0806-12の結合特性（検体：9T13mAb 、9T13mAb＋NP-Capもしくは9T13mAb＋DNP-Cap）。図13において：9T13:              Anti-NP antibody / IgG1.lSensor chip:       CM5Flow rate:         10ml/minRunning buffer:    PBS (0.005% Tween20)Ligand:            anti-E11mAb (#0806-12), 2000 RUAnalyte conc. :    9T13 mAb (200nM)                   9T13 mAb (200nM) + NP-Cap (1mM)                   9T13 mAb (200nM) + DNP-Cap (1mM)Injection time :   3 minRegeneration:      10mM Gly-HCl (pH 1.6) 10ml x 4 times ドミノ抗体を示す。 解錠抗体を示す。
　本明細書において、“第一抗体”とは、本発明の遊離第一抗体と抗原結合第一抗体の一方の抗体を特異的に認識する抗体(特異的認識抗体)によって認識される抗体を意味する。第一抗体は抗原を認識するが、この抗原は抗体であっても非抗体であってもよい。“第一抗体”は、遊離第一抗体と抗原結合第一抗体の両方を包含する。
　本明細書において、” 遊離第一抗体と抗原結合第一抗体の一方の抗体を特異的に認識する“とは、抗原に結合していない第一抗体（遊離第一抗体）と抗原に結合した第一抗体（抗原結合第一抗体）のいずれか一方を特異的に認識して結合し、他方は全く結合しないか、実質的に結合しないことを意味する。例えば、本発明の特異的認識抗体により認識されない他方の遊離第一抗体または抗原結合第一抗体との結合は、第一抗体により認識される抗原などの抗体認識に無関係の抗原と同等レベル(バックグラウンドのレベル)を示す。
　“遊離第一抗体”は、抗原と結合していない第一抗体を意味し、“抗原結合第一抗体”は、抗原と結合した第一抗体を意味する。
　本発明の特異的認識抗体（遊離第一抗体と抗原結合第一抗体の一方の抗体を特異的に認識する抗体）は、ドミノ抗体（Domino antibody）と解錠抗体(Antibody Unlocking Antibody: AUA)の両方を包含する。
　本明細書において、”ドミノ抗体”とは、抗原と結合した第一抗体を特異的に認識する抗体を意味する。ドミノ抗体は、一次抗体、二次抗体などの抗体を認識する抗体であり、ドミノ抗体により認識される抗体は、抗体との複合体(例えば、二次抗体、三次抗体など)であっても、抗体以外の抗原と結合した抗体(例えば、一次抗体)のいずれであってもよい。第一のドミノ抗体(Domino I antibody)に対する第二のドミノ抗体(Domino II antibody)、第二のドミノ抗体に対する第三のドミノ抗体(Domino III antibody)を組み合わせて使用すると、抗原結合第一抗体に対して第二のドミノ抗体、第三のドミノ抗体が次々に結合することになるので、本明細書ではこのような抗体をドミノ抗体と命名した(図14)。
　“解錠抗体(Antibody Unlocking Antibody: AUA)”は、抗原と結合していない遊離の第一抗体を特異的に認識する抗体を意味する。解錠抗体は、高度な親和性を有する場合抗原を結合した抗体から、抗原または抗体を引き抜く(解錠する)ことができるので、このように命名された。本発明の好ましい開錠抗体は、抗原を結合した抗体から、抗原または抗体を引き抜く(解錠する)ことができる抗体である。
　「抗体」という用語は最も広義に使用され、モノクローナル抗体（完全長又は無傷のモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片も含む。
　特に断らない限りは、本明細書全体を通して「多価抗体」という表現は３又はそれ以上の抗原結合部位を含む抗体を指すために使用される。多価抗体は好ましくは３又はそれ以上の抗原結合部位を持つように遺伝子操作されたもので、一般には天然配列ＩｇＭ又はＩｇＡ抗体ではない。
　「抗体断片」は、抗原に結合する能力を保持している抗体の一部を含む。本定義に包含される抗体断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦａｂ断片；（ｉｉ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に一又は複数のシステイン残基を持つＦａｂ断片であるＦａｂ'断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦｄ断片；（ｉｖ）ＣＨ１ドメインのＣ末端に一又は複数のシステイン残基とＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦｄ'断片；（ｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを持つＦｖ断片；（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward等, Nature 341, 544-546 (1989)）；（ｖｉｉ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉｉｉ）Ｆ(ａｂ')２断片；（ｉｘ）単鎖抗体分子（例えば単鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ）（Bird等, Science 242:423-426 (1988);及びHuston等, PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)）；（ｘ）同一のポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を持つ「ダイアボディー(diabodies)」（例えば、欧州特許公報第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照）；（ｘｉ）相補的軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１）を含む「線形抗体」(Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)；及び米国特許第５６４１８７０号)が含まれる。
　ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含むポリクローナル抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」との修飾語句は、抗体が何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる（例えば米国特許第４８１６５６７号を参照のこと）。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson等, Nature, 352：624-628 (1991)又はMarks等, J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
　ここに記載のモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から由来するか、特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である一方、鎖の残りが、他の種から由来するか、他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である「キメラ」抗体、並びにそれらが所望の生物活性を示す限りはそのような抗体の断片を含む(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。
　非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域からの残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種の高頻度可変領域からの残基（ドナー抗体）によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲｓがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部を含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
　「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここで開示されたヒト抗体を製造するための何れかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体は、当該分野で知られている様々な技術を使用することによって生産することが可能である。一実施態様では、ヒト抗体はファージライブラリーから選択され、ここでファージライブラリーがヒト抗体を発現する（Vaughan等, Nature Biotechnology 14:309-314 (1996):Sheets等, PNAS, (USA)95:6157-6162(1998)；Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)）。また、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンをトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウス中に導入することにより産生することができる。暴露時に、遺伝子再構成、アセンブリ及び抗体レパートリーを含む、あらゆる点でヒトに見られるものと密接に類似しているヒト抗体の産生が観察される。このアプローチ法は、例えば米国特許第５５４５８０７号；第５５４５８０６号；第５５６９８２５号；第５６２５１２６号；第５６３３４２５号；第５６６１０１６号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10:779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison等, Nature 368: 812-13 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対して抗体を生産するヒトＢリンパ球の不死化によって調製されてもよい(そのようなＢリンパ球は、個体から回収されてもよいし、インビトロで免疫化されていてもよい)。例えば、Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)；Boerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991)；及び米国特許第５７５０３７３号を参照のこと。
　「疾患」は抗体で治療することで恩恵を得るあらゆる症状のことである。これには、問題の疾患に哺乳動物を罹患させる素因になる病理状態を含む、慢性及び急性の疾患又は病気が含まれる。ここで、本発明の抗体により治療される疾患の非限定的な例には、良性及び悪性の腫瘍；白血病及びリンパ悪性腫瘍；ニューロン、神経膠、星状細胞、視床下部及び他の腺、マクロファージ、上皮、ストロマ及び割腔の疾患；及び炎症、血管形成及び免疫性疾患が含まれる。
　「治療的有効量」という用語は、哺乳動物の疾病又は疾患を治療するのに効果的な薬剤の量を意味する。
　「治療」は治療的処置及び予防的又は保護的手段の両方を指す。治療が必要なものには、既に疾患に罹っているもの並びに疾患が予防されるべきものが含まれる。
　「ラベル」という語は、ここで用いられる場合、ポリペプチド（例えば抗原または抗体）に直接的又は間接的に結合する検出可能な化合物又は組成物を意味する。ラベルはそれ自身が検出可能でもよく（例えば、放射性同位体ラベル又は蛍光ラベル）、あるいは、酵素ラベルの場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学的変換を触媒してもよい。　　　
 　ここで使用される場合、「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養」という表現は相互に交換可能に用いられ、その全ての用語は子孫を含む。従って、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という語句は、最初の対象細胞及び何度培養が継代されたかに関わらず最初のものから誘導されたものを含む。
モノクローナル抗体調製
　抗体を調製し特徴付ける手段は当該分野でよく知られている。本発明において使用される抗体の生産のための例示的な技術について次に説明する。抗体の産生に使用される抗原は抗体又はその一部であり得、好ましくは抗体の軽鎖又はその断片が挙げられる。
　本発明の抗体の調製は、軽鎖を用いることを特徴とする。抗体の複合体のみ認識し、遊離の抗体を認識しないドミノ抗体は、抗原抗体複合体を宿主に投与して作製できるように思われるが、本発明者が実際にこのような方法を用いた場合、遊離抗体と複合化抗体の両方を認識する抗体しか得られなかった。一方、軽鎖を用いて抗体を産生させることで、抗原抗体複合体を特異的に認識するドミノ抗体、あるいは遊離抗体を特異的に認識する解錠抗体を得ることができた。
　あるいは、ハプテン抗体にハプテン又は抗原を捕捉させた後、ハプテン又は抗原を抗体に化学的に固定または結合し、抗原が抗体から解離しない抗原抗体複合物を作成した後、当該複合物を免疫しドミノ抗体を得ることができる。ハプテンとしては、例えばテストステロン、エストラジオール、エストリオール、コルチゾール等のステロイドホルモンや、モノニトロフェニル基、ジニトロフェニル基、トリニトロフェニル基、フルオレセイン基などを有する化合物(例えば２,４－ジニトロフェノール(ＤＮＰ))、ジゴキシン、低分子薬物に代表される低分子物質であって、マウス等の哺乳動物に投与することによってそれに対する抗体を誘導し得る物質が挙げられる。ハプテン抗体は、これらハプテンを特異的に認識する抗体である。ハプテンまたは抗原と抗体の化学的固定または結合は、架橋剤、例えばグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒドなどのジアルデヒド類やトリレン－２，４－ジイソシアネートなどのジイソシアネート類を用いて行うことができる。
　本発明のドミノ抗体及び解錠抗体は、軽鎖又はその断片を用い、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作製することができる。
　本発明の好ましい実施形態では、ドミノ抗体または解錠抗体により認識される抗体の軽鎖を取得し、この軽鎖を免疫源として宿主(マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、マカクザルなど)に投与するハイブリドーマ法により作製することができる。例えば宿主を上記したようにして免疫し、免疫化に用いられる軽鎖又はその断片と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いてミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁(Academic Press, 1986))。
　また、本モノクローナル抗体取得に関して、抗原として軽鎖を用いることを特徴として述べてきたが、抗原がＨ鎖およびＨ鎖の可変領域とＣ１Ｈ領域を含むＨ鎖断片の場合にも同様に目的の抗体産生ハイブリドーマを取得することが可能である。
　つまり、抗体は二価のFab部分で抗原を捕捉するが、Fabは軽鎖（VL+CL）と重鎖のFd（重鎖可変領域VH＋CH1領域）から構成されている。Fabにおける軽鎖（VL+CL）とFd（VH+CH1）は機能的に対称な一対の蛋白質であり、この一対の蛋白質のVLの中に分断された３つの領域（超可変領域）、VHでも同様にVLと対する位置に分断された３つの領域（超可変領域）が存在しその部分で抗原を捕捉している。
　ドミノ抗体や開錠抗体がL鎖を免疫して得られるということは、抗体が抗原を捕捉すれば抗体のFab部分のL鎖に構造変化が生ずることを示している。したがって、表現を変えればL鎖の構造変化を見分られる抗体がドミノ抗体や開錠抗体ということになる。このように、抗体の抗原結合反応を通じてL鎖に構造変化が引き起こされ、更に該構造変化部分を認識できる抗体が取得できることは誰も信じていなかったことであり、本発明は当該知見を元に完成されたものである。
　上述したように、抗体のFabに着目した場合L鎖とH鎖は機能的に対称な一対の蛋白質である。抗原を捕捉する部分もほぼ同じ位置同じ長さの領域で各三箇所ずつ存在する。今回、ドミノ抗体、開錠抗体取得を通じてL鎖に構造変化が推定できたことは、対象をなすもう一対の蛋白質、重鎖のFdでも抗原補足により同様の構造変化が起こるものと思われる。即ち、重鎖のFd部分若しくはその断片を免疫し、同様のScreening方法を実施すればドミノ抗体及び開錠抗体を得ることができるものと思われる。
　但し、軽鎖の免疫は以下の点で優れている、即ち：
　　　(i)Fdは、先ずFab, F(ab’)2を経て精製を行うことになる。この点、軽鎖の方が精製が簡単であり、収量の点で有利である；
　　　(ii)軽鎖の方が物性の点で扱いやすい。H鎖は疎水性蛋白質であり精製の際沈殿しやすい。
　但し、上記H鎖の欠点は例えば１）化学合成したFdの部分ペプチドで免疫する、２）大腸菌や酵母でFdのみの組み換え蛋白を得る。３)特定のFd部分を欠いたKOマウスを用いて免疫する、等で回避できる。
　このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親のミエローマ細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親のミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
　好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましいミエローマ細胞株は、マウスミエローマ株、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、ＵＳＡから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
　ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原(遊離抗体又は抗原を結合した抗体)に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体（ドミノ抗体及び解錠抗体）の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
　ドミノ抗体または解錠抗体として所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
　サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような慣用の免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から適切に分離される。
　モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、常法により(例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)直ぐに単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又はミエローマ細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体の組換え生産は以下に更に詳細に記載する。
　更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリーから単離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリーを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。別の文献は、鎖シャッフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266(1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な代替法である。
　ＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることで修飾できる。
　典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の一抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対する特異性を有する一つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
ヒト化及びヒト抗体
　ヒト化抗体には非ヒトである由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の対応する配列に齧歯類ＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には幾らかの高頻度可変領域残基及び場合によっては幾らかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト化抗体である。
　抗原性を低減するには、ヒト化抗体を作製する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものに最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークを幾つかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
　更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムが購入可能である。これら表示を調べることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
　別法として、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。例えばJakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggerman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；及びDuchosal等 Nature 355:258 (1992)を参照されたい。ヒト抗体はまたファージ-ディスプレイライブラリーから誘導することもできる (Hoogenboom等, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Vaughan等 Nature Biotech 14:309 (1996))。
抗体断片
　抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照)。しかし、これらの断片は今は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収し、化学的に結合させてＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開第９３／１６１８５号を参照。
　本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、抗体の効果を亢進させることは望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成されたホモ二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体-依存細胞性細胞障害性（ＡＤＣＣ）を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つホモ二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されているヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
　また、ここで開示されている抗体は、免疫リポソームとして処方することもできる。抗体を含むリポソームは、例えばEpstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；及び米国特許第４４８５０４５号及び同４５４４５４５号に記載されているような、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
　特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martin等, J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤（ドキソルビシンなど）はリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参照のこと。
　抗体の共有結合的修飾は本発明の範囲内にある。それらは、適当であれば、化学合成により、又は抗体の酵素的又は化学的切断によりなされ得る。抗体の共有結合的修飾の他のタイプは、選択される側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化剤と抗体の標的とするアミノ酸領域を反応させることにより分子中に導入される。
　共有結合的修飾は抗体に対してグリコシドを化学的又は酵素的にカップリングさせることを含む。これらの手順は、それらがＮ-又はＯ-結合グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞中での抗体の生産を必要としない点で有利である。用いられるカップリング態様に応じて、糖(類)は、(ａ)アルギニンとヒスチジンに、(ｂ)遊離のカルボキシル基に、(ｃ)遊離のスルフヒドリル基、例えばシステインのものに、(ｄ)セリン、スレオニン又はヒドロキシプロリンのもののような遊離のヒドロキシル基に、(ｅ)フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンのような芳香族残基、又は(ｆ)グルタミンのアミド基に結合させることができる。これらの方法は１９８７年９月１１日公開の国際公開第８７／０５３３０号並びにAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306頁 (1981)に記載されている。
　抗体に存在するあらゆる炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的になすことができる。化学的脱グリコシル化には、抗体を化合物トリフルオロメタンスルホン酸、又は等価化合物に暴露することを必要とする。この処理により、抗体を無傷なままにしながら、結合糖（Ｎ-アセチルグルコサミン又はＮ-アセチルガラクトサミン）を除く殆どの又は全ての糖の切断が生じる。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成できる。
　抗体の共有結合的修飾の他のタイプは、抗体を、種々の非タンパク質様ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることを含む。
　本発明の抗体は組換え的に製造することができる。
　抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、更なるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入される。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは直ぐに単離され、通常の手法(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)を用いて配列決定される。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列である。
　本発明において使用される抗体の治療製剤は、任意成分の薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤と所望の純度を有する抗体を混合することによって（Remington's Pharmaceutical Sciences, 16版, Osol,A編 [1980]）、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で保存用に調製される。典型的には、適当量の製薬的に許容可能な塩が製剤を等張にするために担体中に使用される。許容できる担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度では細胞に対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体（例えばＺｎ-タンパク質錯体）；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。好適な凍結乾燥抗体製剤は、参照によりここに取り込まれる国際公開第９７／０４８０１号に記載されている。
　また、製剤は、治療される特定の効能に必要な一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る。また活性成分は、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16版, Oslo,A.編(1980)に開示されている。
　インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過により容易に達成される。
　徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例には、抗体を含む固体疎水性重合体の半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスはフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えばポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニルや乳酸-グリコール酸等のポリマーは１００日以上分子を放出できるが、特定のヒドロゲルはより短い時間タンパク質を放出する。
　封入された抗体は体内に長い間残る場合、３７℃での水分に暴露される結果、変性し又は凝集して、生物活性を消失させ、免疫原性を変化させる可能性がある。関与する機構に応じて安定化のための合理的な方策を案出することができる。例えば、関連するメカニズムに応じて安定性を得るための合理的な処置が案出できる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間Ｓ-Ｓ結合の形成であることが分かったら、スルフヒドリル残基を改変し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分量を調整し、適当な添加物を使用し、特定の重合体マトリックス組成物を開発することで、安定化を達成することができる。
用量と投与
　本発明の抗体は、公知の方法、例えばボーラスとしてもしくは一定時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、経口、局所的、又は吸入経路によりヒト患者に投与される。抗体の静脈内又は皮下投与が好ましい。
　疾患のタイプと重篤さに応じて、約１μｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１－２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば一又は複数の別々の投与であろうと、あるいは連続注入によるものであろうと、患者への初期候補投与量である。典型的な１日の用量は、上記の要因に依存し、約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の範囲である。数日間又はそれ以上にわたる繰り返し投与の場合は、状況に応じて、疾患徴候の望ましい抑制が起こるまで治療を続ける。しかし、他の用量計画も有用でありうる。好適な態様では、本発明の抗体は約５ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で２ないし３週毎に投与される。本発明の治療法の進行は、慣用の技術及びアッセイで容易に監視される。
　本発明の抗体は、単独の抗体として投与してもよいが、他の抗体医薬と組み合わせて投与することができる。
　本発明の抗体は、遊離第一抗体と抗原結合第一抗体を区別して認識するため、ＥＬＩＳＡなどの免疫学的測定法において有用である。
材料の寄託
　次の３つのハイブリドーマ細胞株を合衆国バージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）にブタペスト条約の規定に従って寄託した：
(1)　Identification Reference by Depositor：Hybridoma Cell Line F-1A
　　ATCC Patent Deposit Designation：PTA-9167 
　　Date of Receipt of Cultures by the ATCC: April 23, 2008；
(2)　Identification Reference by Depositor：Hybridoma Cell Line L-6A
　　ATCC Patent Deposit Designation：PTA-9168 
　　Date of Receipt of Cultures by the ATCC: April 23, 2008；
(3)　Identification Reference by Depositor：Hybridoma Cell Line 0806-12
　　ATCC Patent Deposit Designation： PTA-9967
　　Date of Receipt of Cultures by the ATCC: April 16, 2009。
　本発明は、抗体によってなされているが、本発明の対象は、抗体に代る核酸（アプタマー）若しくはペプチドであっても良い。即ち、抗原を認識した抗体を認識するアプタマー、及びペプチド或いは、抗原を認識したアプタマーを認識する抗体やアプタマー及びペプチドも同義である。なお、アプタマ－はSELEX法によりペプチドはファージライブラリーにより目的の分子を取得することが出来る。
　以下、本発明を実施例を用いてより詳細に説明するが、実施例は単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
ドミノ抗体及び解錠抗体(Antibody Unlocking Antibody: AUA) の産生
抗原となるラットモノクローナル抗体の作成
　抗ＦＩＴＣラットモノクローナル抗体＃55（IgG2aκ）を常法により樹立した。また、一方で独立して抗FITCラットモノクローナル抗体＃７（IgG2aκ）を常法により樹立した。詳しくは、Chicken gamma globulin (CGG) (Rockland, Immunochemicals, Inc., PA, USA)と、Bovine serum albumin(BSA) (Sigma, Mo, USA) をFITC labeling kit（Dojindo, Kumamoto, Japan)　にてFITCで標識した。FITC標識CGG（80μg/100μl in PBS)を同容量のアジュバントTiter Max Gold(CytRx Corp, GA, USA)でエマルジョンを作成し、Fischer Rat(♀）７週齢に二週間毎に３回腹腔内に免疫した。さらにその二週間後同量のFITC標識CGG（80μg/100μl in PBS)をアジュバント無しで腹腔内に免疫しその3日後、ラットより脾臓を摘出し脾細胞を分離し、常法に従い、マウスミエローマ細胞（P3U1)とポリエチレングリコールを用いて融合し、HAT培地を細胞選択培地として96Wellプレート10枚に撒き込んだ。14日後、各Wellの培養上清を採取し、FITC標識BSAをELISAプレートにコートしBSAでBlockingしたプレートを用いて抗FITC抗体を産生するミエローマを選択した。上記融合を二回繰り返し、各々の融合からそれぞれ抗ＦＩＴＣラットモノクローナル抗体＃55（IgG2aκ）、抗FITCラットモノクローナル抗体＃７（IgG2aκ）産生ハイブリドーマを樹立した。それぞれのハイブリドーマを大量に培養し培養上清からHiTrap ProteinG HP(GE Healthcare, NJ, USA)カラムを用いてラットモノクローナル抗体を精製した。
軽鎖の精製
　上記操作により得られた抗ＦＩＴＣラットモノクローナル抗体＃55より、軽鎖を精製した。軽鎖の分離精製法は、Azuma、Tら　PNAS（1981) 78 pp569-573に準じて行った。即ち、精製＃55抗体を最終濃度0.01M Dithiothreitol、0.2M Tris-HCl (pH8.2)に溶解する。溶液を37℃、30分間加温する。反応後室温に戻し（約10分静置）最終濃度0.3M Iodoacetoamideとなるように加え30分間静置し、アルキレーション反応を行った。重鎖と軽鎖の分離にはHPLCを用いた。アルキレーション反応後、５M Guanidine-HClの溶解したPBS（ｐH 7.2) で平衡化したカラムにアルキル化＃55を供し、軽鎖分画を得た。重鎖が混入する分画は再度HPLCに供し軽鎖分画を得た。軽鎖分画をPBSに対し透析した後小分けして凍結保存した。
軽鎖の免疫とHybridomaの作成
　＃55の軽鎖（30μg/100μl in PBS）を同容量のアジュバントTiter Max Gold(CytRx Corp, GA, USA)でエマルジョンを作成し、Balb/c mouse(♀)７週齢に二週間毎に３回腹腔内に免疫した。さらにその二週間後同量の＃55の軽鎖を（80μg/100μl in PBS）をアジュバント無しで腹腔内に免疫しその3日後、マウスより脾臓を摘出し脾細胞を分離し、常法に従い、マウスミエローマ細胞（P3U1）とポリエチレングリコールを用い融合し、HAT培地を細胞選択培地として96Wellプレート10枚に撒き込んだ（Lシリーズ）。
抗体のAssay方法
　14日後、各Wellの培養上清を採取し、(i)FITC標識BSAをELISAプレートにコートしBSAでBlockingしたプレート(ii)FITC標識BSAをELISAプレートにコートしBSAでBlockingしたプレートに＃7抗体(1μg/ml in PBS)を100μl/Well 添加し４℃で一晩反応させ洗浄したプレート(iii)＃7抗体(1μg/ml in PBS)を100μl/Well 添加しELISAプレートにコートしBSAでBlockingしたプレート、以上３種類のプレートを用いアッセイを行った。即ち、Hybridomaの培養上清を上記三種類のプレートに各々100μlのHybridomaの培養上清を供し2時間室温で静置する。プレートを洗浄後、HRP標識抗マウスIgG（ラットIgG非交差）（Jackson Laboratories)と１時間室温で反応後プレートを洗浄し、発色液TMB基質溶液（KPL社, MD, USA）を100μl添加し10分間反応後50μlの２N硫酸で発色を停止しプレートリーダーで450ｎｍの波長を読み取る。
結果の判定
　(ii)と(iii)のプレートのODを比較し、いずれかに強く反応する抗体を産生するHybridomaを目的の抗体産生Hybridomaと判定した。適宜(i)のプレートを用いたAssayも行いBSAやBSA-FITCに反応しないことを確認した。
別法
　理論的には、抗体Ａが抗原としてタンパク質Ｂを認識する場合、その抗原抗体複合物（Ａ－Ｂ）－抗体Ａの構造変化が生体内で長時間保たれるよう架橋化剤を用いて固定しても良い－をマウス等の動物に免疫して抗体Ａが抗原Ｂを認識した際に生ずる抗体Ａの構造変化を認識する抗体を取得できる。
　しかしながら、免疫動物の血清中に出現する多様な抗体は、抗体の構造変化に拘わり無く抗体Ａに反応するもの、抗原Ｂに反応するもの、Ａ－Ｂの結合体を認識するものなどが存在し目的とする抗体のようにＡ－Ｂの結合にともなう抗体Ａの構造変化を認識する抗体は、出現頻度が極めて低いと推定される。
　そこで、免疫原と免疫方法をより単純化して効率的に当該抗体を得る方法を考案した。蛍光物質FITC(fluorescein isothiocyanate)は、弱アルカリ性の溶液下で荷電しているタンパク質のアミノ基に反応し、チオウレア結合を形成し容易にタンパク質を標識できる。また、FITCは高親和性の抗体を得られるハプテンとして知られている。本発明者らは、この性質を利用し先ず、高親和性の抗FITC抗体を二種類得た(上述＃55（IgG2aκ）、＃７（IgG2aκ））。
FITC捕捉＃55の作成
１）PBS (pH6.8) に可溶化した精製＃55抗体に対し、DMSOに溶解したFITCをモル比で約1:5になるように加えた。直ちに、予めPBS (pH6.8)で平衡化した脱塩用PD-10カラム(GE Healthcare Bio-Science Corp, NJ, USA)に供し、高分子量分画を分取した。直ちに1M炭酸ナトリウム緩衝液（pH8.3）を0.5容量加え溶液を弱アルカリ性とした。遮光し1時間室温で放置した。分光光度計で波長280nmと495nmを測定し抗体１分子に対するFITC分子の結合数を計算式から導き出し、ほぼ抗体分子：FITC＝1：2であることを確認した。本過程により、FITCに対する抗親和性抗体＃55に結合したFITCが抗体との結合近傍で荷電しているアミノ酸と共有結合を形成しFITCを安定に結合し続けると考えた。
FITC捕捉＃55の免疫とHybridomaの作成
　FITC捕捉＃55（30μg/100μl in PBS）を同容量のアジュバントTiter Max Gold(CytRx Corp, GA, USA)でエマルジョンを作成し、Balb/c mouse(♀)７週齢に二週間毎に３回腹腔内に免疫した。さらにその二週間後同量のFITC捕捉＃55（80μg/100μl in PBS）をアジュバント無しで腹腔内に免疫しその3日後、マウスより脾臓を摘出し脾細胞を分離し、常法に従い、マウスミエローマ細胞（P3U1）とポリエチレングリコールを用い融合し、HAT培地を細胞選択培地として96Wellプレート10枚に撒き込んだ（Fシリーズ）。
抗体のAssay方法
　14日後、各Wellの培養上清を採取し、(i)FITC標識BSAをELISAプレートにコートしBSAでBlockingしたプレート(ii)FITC標識BSAをELISAプレートにコートしBSAでBlockingしたプレートに＃7抗体(1μg/ml in PBS)を100μl/Well 添加し４℃で一晩反応させ洗浄したプレート(iii)＃7抗体(1μg/ml in PBS)を100μl/Well 添加しELISAプレートにコートしBSAでBlockingしたプレート、以上３種類のプレートを用いアッセイを行った。即ち、Hybridomaの培養上清を上記三種類のプレートに各々100μlのHybridomaの培養上清を供し2時間室温で静置する。プレートを洗浄後、HRP標識抗マウスIgG（ラットIgG非交差）（Jackson Laboratories）　と１時間室温で反応後プレートを洗浄し、発色液TMB基質溶液（KPL社, MD, USA）を100μl添加し10分間反応後50μlの２N硫酸で発色を停止しプレートリーダーで450ｎｍの波長を読み取った。
結果の判定
　(ii)と(iii)のプレートのODを比較し、いずれかに強く反応する抗体を産生するHybridomaを目的の抗体産生Hybridomaと判定した。適宜(i)のプレートを用いたAssayも行いBSAやBSA-FITCに反応しないことを確認した。
　上記の抗体のAssay方法により得られた結果を図１～図10に示す。
　また、図中目的の抗体産生ウエルには、A（ドミノ抗体）又はS（開錠抗体）の数字で示した。　Lシリーズからは、６種類のドミノ抗体(L-1A～6A)と３種類の開錠抗体(L-1S～3S)、Fシリーズからは、１種のドミノ抗体(F-1A)の反応性を示すクローンが得られた。
　目的の抗体を産生するハイブリドーマのクローン化を行い得られたドミノ抗体（F-1A, L-6A）産生ハイブリドーマを２００８年４月２３日にATCCに寄託し、以下のATCC番号が付与された。
(1)　Identification Reference by Depositor：Hybridoma Cell Line F-1A
　　ATCC Patent Deposit Designation：PTA-9167 
(2)　Identification Reference by Depositor：Hybridoma Cell Line L-6A
　　ATCC Patent Deposit Designation：PTA-9168 
抗λ1軽鎖モノクローナル抗体の作製と解析
　抗原抗体反応を検出する分子の開発を目的として、抗体の構造変化を認識するモノクローナル抗体(mAb)の作製を試みた。戦略として、ハプテンであるNP((4-Hydroxy-3-Nitrophenyl)Acetyl)に対して特異性を有するmAbをモデル抗体として選択した。SJLマウスはλ1軽鎖定常領域に存在する1塩基の変異により、血清中にλ1軽鎖がほとんど検出できないことから、λ1軽鎖を有する抗NP mAbをSJLマウスに免疫することで、λ1軽鎖をエピトープとして結合し、かつ、抗原抗体反応を検出できるmAbクローンの単離が可能であると考え試みた。抗NP mAbとしてアフィニティーが高いE11（IgG2a/λ1）を用い、NP14-CGGと3:1のモル比で混合し、抗体抗原複合体を形成させた状態で免疫した。詳細な免疫スケジュールを図11に示す。2週間おき、4回の免疫後に脾臓を摘出し、ミエローマ細胞SP2/0株と細胞融合することでハイブリドーマを作製した。有用なmAbを分泌するハイブリドーマのスクリーニングは培養上製を用いたELISAにより E11への結合能を指標に行った。
　得られたクローンのうち、抗体産生量の多いクローン#0806-12を大量培養し、E11をアガロースビーズに共有結合したカラムを用いてアフィニティー精製した。mAb#0806-12のエピトープを確認するために、E11の各Igドメイン（VH, CH1, CH2, CH3, VL, CLドメイン）を表面に発現する酵母株を作製し、ビオチン化した#0806-12とストレプトアビジン-PEにより酵母表面を染色し、FACSで解析したところ、CLドメインを発現した酵母株にのみ結合した。このことから、Ab#0806-12はλ1軽鎖定常領域をエピトープとして結合していることがわかる（図12）。
　目的の抗体を産生するハイブリドーマのクローン化を行い得られた解錠抗体（0806-12）産生ハイブリドーマを２００９年４月１６日にATCCに寄託し、以下のATCC番号が付与された。
　　Identification Reference by Depositor：Hybridoma Cell Line 0806-12
　　ATCC Patent Deposit Designation： PTA-9967
　mAb#0806-12が抗原抗体反応を検出できるかを、Biacoreを用いて解析した。精製したmAb#0806-12をBiacore CM5センサーチップ上にアミンカップリング法で約2000RU固定化し、抗NP mAbである9T13（IgG1 /λ1）との結合を調べた(図13）。その際に、抗原であるNP-Cap(1uM)、また、抗原ではないがNP-Capと構造が類似したDNP-Cap（1uM, 2,4-dinitrophenyl）と予め混合したサンプルを解析したところ、抗原抗体反応を起こしているサンプル（9T13 + NP-Cap）でのみ、RU値の著しい減少が見られた（サンプル注入180秒後で約1/6のRU値に減少）。
　以上の結果から、今回得られた抗λ1軽鎖モノクローナル抗体#0806-12は、λ1軽鎖を有する抗NP mAbに特異的に結合し、その抗NP mAbがNP抗原と結合した際には親和力が著しく減少することから、抗原抗体反応を識別することができると言える。
Ａ．抗原を認識している抗体を認識する抗体の応用例
１）測定方法の手段として
(i)バイオセンサー：微量抗原の検出（超高感度実現）
　例えば、抗原を結合したマウス抗体のみを認識するラットモノクローナル抗体（A）が存在する。また、ラット抗体が抗原を認識した時にのみ反応するハムスターモノクローナル抗体（B）、このような連鎖反応が生じるように抗体の認識部位（Fc部分、軽鎖）や抗体の種を変えることにより組み立てることができる。つまり、非常に小さなシグナルを大きく増幅できることが考えられ高感度なセンサーを提供できる。
(ii)洗浄不要のELISAとして
　例えば抗原を認識する一次抗体に蛍光タンパク質CFPでラベルをし、例えば当該抗体を別の種類の蛍光タンパク質YFPでラベルする。抗原の存在する溶液に一定量の一次抗体と、当該抗体を添加すると、その抗原量に応じて蛍光共鳴エネルギー移動(Fluorescence resonance energy transfer: FRET)が観察される。
　本測定法は、抗原の精製が不要、抗原のラベルが不要であり、抗原に反応する一次抗体が存在すれば、どのような測定にも応用が可能である。
２）医薬品として
(i)抗体医薬品のUniversalなEnhancer抗体
　すでに医薬品として認可実用されている医薬品抗体が、体内で抗原に結合して懸かるＡＤＣＣ反応やＣＤＣＣ反応を惹起する際に本抗体がその反応を増強できる。たとえば、癌抗原を認識する抗体医薬品が投与されて、投与された抗体の一部が病巣部位に到達する。そこで、当該抗体を投与すると、本抗体は、病巣部において抗原と結合している医薬品抗体に反応して結合する。
　当該抗体には、抗がん剤や放射活性をラベルすることもでき広く抗体医薬品の増強剤として使用が可能である。本抗体は、当該抗体が反応しうるヒト抗体であるならば、抗体医薬品の種類を問わず増強剤として使用できる。また、抗原と結合した医薬品抗体にのみ反応するため過剰量の投与が生じても安全である。
(ii)感染症時、担癌時に獲得される自然抗体の増強剤
　異物（ウイルス、最近）の侵入に際して、また腫瘍の発症、増殖に際して少なからず生体は応答し、異物の排除や腫瘍の増殖の阻害を働きかける。つまり、十分ではないかもしれないが上記応答に際し、異物や腫瘍に対して抗体が産生されていると考えられる。そこで、異物や腫瘍細胞を補足している抗体を増強するために当該抗体を投与して生体の反応を補助することが可能である。つまり、上記(i)では、投与された医薬品抗体の増強であるがこの場合には、生体内の自然免疫力の増強として応用する、より有効なグロブリン製剤とも言える。
３）医療器具として
(i)抗原抗体複合体除去カラム
　当該抗体をカラムに固定化して用いることができる。ある種の疾患では、多量の免疫複合体が病気の進展に寄与していることが知られている（例えば、慢性関節リウマチ、ＳＬＥなど）。本抗体カラムは、体外循環カラムとして患者中の血液を循環させ抗原を結合した免疫複合抗体を除去することができる。また、免疫複合体に関与してない抗体は本カラムに吸着することなく体内に戻ることになる。即ち、病態を悪化させている原因の免疫複合体のみを除去できるのが特徴である。
(ii)微量毒物除去カラム
　上記(i)と同様に誤って体内に入った毒物を除去するために用いることができる。この場合、毒物に結合する抗体を準備しておく。この抗体が結合した時に反応する当該抗体をカラムに結合させる。毒物を除去する目的で毒物の混入した体内に毒物に結合する一次抗体を静脈注射する。直ちに、体外循環を開始する毒物に結合した抗体のみをカラムが効率的に除去する。
　また、抗体は無味無臭、容易に水に溶解するため水道、飲料水などに混入した毒物を取り除くために、飲料水に毒物に結合する一次抗体を滴下その後本抗体を固定化したFilterに通せば無毒化が可能である。
　同様な応用は空気中の毒物を除去することにも応用できる。
Ｂ．抗原を認識していない抗体を認識する抗体（解錠抗体）の応用例として高い親和性を有する当該抗体は、抗体を認識している抗体から抗原を解離させる機能を有すると推定される。
１）医薬品として
(i)抗アレルギー医薬品として
　IgEが抗原に結合していない状態で強く反応する当該抗体を使用すれば、IgEが抗原であるアレルゲンを結合していても当該抗体が結合することによりIgE抗体から抗原が解離し、アレルゲン（抗原）を結合したIgEがアレルギー性の反応を惹起することを抑制することを可能にする。
(ii)抗体医薬品共通の緊急用ショック対処抗体として
　上記と同様の観点より、抗体を投与することにより生ずるショックの対処として、抗体が結合したことを解除したい場合がある。例えば、アゴニスト性の抗体投与により生じたTegeneroが英国で行った臨床試験のように今後開発され、臨床試験される抗体でまれにそのような事件が起きないとは限らない。当該抗体は、投与された抗体の抗原への結合を解除し、ショック症状からの離脱に効果を示すと考えられる。
(iii)特異抗体の出現で惹起される病態治療薬
　本適応も基本的に上記二点と同じである。上記Ａ．３）(i)で行っている体外循環で除いている抗原抗体複合体を、当該抗体を体内に注射し体内で抗原と抗体の解離を行うものが挙げられる。
PTA-9167
PTA-9168
PTA-9967
[規則26に基づく補充 18.06.2009]　
Figure WO-DOC-RO134

Claims (9)

  1. 第一抗体を認識する抗体であって、遊離第一抗体と抗原結合第一抗体の一方の抗体を特異的に認識する抗体。
  2. 前記特異的認識抗体が、抗原結合第一抗体を特異的に認識し結合する請求項１記載の抗体。
  3. 前記特異的認識抗体が、遊離第一抗体を特異的に認識し結合する、請求項１記載の抗体。
  4. 前記特異的認識抗体が第一抗体の軽鎖部分を認識するものである請求項１～３のいずれかに記載の抗体。
  5. 請求項１～４のいずれかに記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
  6. ATCCの受託番号がPTA-9167またはPTA-9168である、請求項５に記載のハイブリドーマ。
  7. ガンマグロブリンを抗原として免疫し、得られたハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体から、ドミノ抗体もしくは開錠抗体を選別することを特徴とするドミノ抗体もしくは開錠抗体の取得方法。
  8. 前記抗原がガンマグロブリンの軽鎖又はその断片である請求項７に記載の方法。
  9. ハプテン抗体にハプテン又は抗原を捕捉させた後、ハプテン又は抗原を抗体に化学的に固定または結合し、抗原が抗体から解離しない抗原抗体複合物を作成した後、当該複合物を免疫しドミノ抗体を得る方法。
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