KR101772231B1 - 항원이 결합된 항체와 항원이 결합되어 있지 않은 항체의 구조 변화를 식별하는 항체와 그의 취득법 - Google Patents

항원이 결합된 항체와 항원이 결합되어 있지 않은 항체의 구조 변화를 식별하는 항체와 그의 취득법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제1 항체를 인식하는 항체로서, 유리 제1 항체와 항원 결합 제1 항체 중 한쪽의 항체를 특이적으로 인식하는 항체에 관한 것으로, 상세하게는 상기 특이적 인식 항체가 항원 결합 제1 항체를 특이적으로 인식하여 결합하는 항체(도미노 항체), 유리 제1 항체를 특이적으로 인식하여 결합하는 항체(개정 항체)에 관한 것이다.

Description

항원이 결합된 항체와 항원이 결합되어 있지 않은 항체의 구조 변화를 식별하는 항체와 그의 취득법{ANTIBODY CAPABLE OF DISCRIMINATING THE CHANGE IN STRUCTURE BETWEEN ANTIBODY CONJUGATED WITH ANTIBODY AND ANTIBODY UNCONJUGATED WITH ANTIBODY, AND METHOD FOR PRODUCTION OF THE ANTIBODY}
본 발명은 항원이 결합된 항체와 항원이 결합되어 있지 않은 항체의 구조 변화를 식별하는 항체와 그의 취득법에 관한 것이다.
항체는 항원을 인식하는 특이성과 결합력으로 표현된다. 모노클로널 기술이 개발되어 비약적으로 항체의 단백 화학적인 해석과 응용 기술이 진보하였다.
오늘날 항체와 항원의 결합 반응은 열역학적인 해석이나 측정은 간편하게 행할 수 있도록 되어 있으나, 항원 결합에 수반하는 항체의 입체 구조 변화에 관해서는 아직 상세한 정보가 없다. 이는 널리 단백질의 입체 구조의 해석에 이용되고 있는 X선 결정 해석이 항체와 같은 거대 단백질에 적용하기가 어렵기 때문이고, 많은 항원·항체 복합체의 구조 해석은 효소 소화에 의해 얻어진 항체의 Fab 프래그먼트를 이용하여 이루어지고 있다(비특허문헌 1). 이들 해석에서는 항원의 결합에 의해 수 옹스트롬의 구조 변화가 항원 결합 부위의 아미노산 잔기에 일어나는 것이 나타나 있으나, 프래그먼트의 구조 해석으로부터는 이 변화가 결합 부위로부터 공간적으로 떨어진 정상 도메인에 유도되고 있는지를 판단할 수 없다. 한편, 항원·항체 복합체는 유리의 항체가 갖지 않는 보체(補體) 캐스케이드의 활성화와 같은 이펙터 기능을 갖고 있다. 이는 항원 결합에 의한 항체의 구조 변화가 보체가 결합하는 정상 도메인에 유도되고 있음을 시사하고 있으나, 보체 캐스케이드는 항체의 응집체에서도 활성화되는 점으로부터 복합체의 이펙터 기능은 응집에 의한다고 해석되어 왔다. 한편, 히가시 등은 황색 포도구균 유래의 프로테인(protein) A와 항체의 결합 반응을 상세하게 해석한 결과, 항원이 결합된 항체와 항원이 결합되어 있지 않은 항체가 프로테인 A에 대한 반응성이 상이함을 발견하였다(비특허문헌 2, 3). 그러나, 프로테인 A가 검출하는 유리 항체와 항원·항체 복합체의 구조의 차는 작아, 이 차를 ELISA 등으로 검출하기는 어려웠다.
Structural evidence for induced fit as a mechanism for antibody-antigen recognition. James M. Rini, Ursula Schulze-Gahmen, Ian A. Wilson. Science, 255:959-965(1992) Evidence of allosteric conformational changes in the antibody constant region upon antigen binding. Masayuki Oda, Haruo Kozono, Hisayuki Mori, and Takachika Azuma. International Immunology, 15:417-426(2003). Conformational changes in the antibody constant domains upon hapten-binding. Takuma Sagawa, Masayuki Oda, Misayuki Morii, Hisao Takizawa, Haruo Kozono, and Takachika Azuma. Molecular Immunology, 42:9-18(2005)
전술한 바와 같이 종래의 기술에서는 유리된 항체와 항원이 결합되어 있는 항체를 판별하는 수단이 없었기 때문에, 반응액 중의 유리된 항체와 복합체를 미리 분리하고 나서, 항체에 대한 항체(항항체)로 복합체를 형성하고 있는 항체를 검출해야만 했었다. 또한, 프로테인 A 등의 항체 결합 단백질은 결합 부위가 한정되어 있기 때문에, 항체의 정상 도메인에 일어나는 구조 변화를 검출하기에는 한계가 있었다.
본 발명은 항체의 정상 도메인에 일어나는 구조 변화를 용이하게 하는 항체의 제공과 제작 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 이하의 항체 및 그의 제조법을 제공하는 것이다.
항 1. 제1 항체를 인식하는 항체로서, 유리 제1 항체와 항원 결합 제1 항체 중 한쪽의 항체를 특이적으로 인식하는 항체.
항 2. 상기 특이적 인식 항체가 항원 결합 제1 항체를 특이적으로 인식하여 결합하는 항 1에 기재된 항체(도미노 항체).
항 3. 상기 특이적 인식 항체가 유리 제1 항체를 특이적으로 인식하여 결합하는 항 1에 기재된 항체(개정 항체; antibody unlocking antibody).
항 4. 상기 특이적 인식 항체가 제1 항체의 경쇄 부분 또는 경쇄 부분의 부분 펩티드 및 Fd(중쇄 가변 영역+CH1 영역) 및 그의 부분 펩티드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나를 인식하는 것인 항 1 내지 항 3 중 어느 하나에 기재된 항체.
항 5. 항 1 내지 4 중 어느 하나에 기재된 항체를 생산하는 하이브리도마.
항 6. ATCC의 수탁 번호가 PTA-9167 또는 PTA-9168인 항 5에 기재된 하이브리도마.
항 7. 감마 글로불린을 항원으로서 면역하고, 얻어진 하이브리도마가 생산하는 모노클로널 항체로부터 도미노 항체 또는 개정 항체를 선별하는 것을 특징으로 하는 도미노 항체 또는 개정 항체의 취득 방법.
항 8. 상기 항원이 감마 글로불린의 경쇄 또는 그의 단편인 항 7에 기재된 방법.
항 9. 합텐 항체에 합텐 또는 항원을 포착시킨 후, 합텐 또는 항원을 항체에 화학적으로 고정 또는 결합하여 항원이 항체로부터 해리되지 않는 항원 항체 복합물을 제조한 후, 당해 복합물을 면역하여 도미노 항체를 얻는 방법.
본 발명에 의하면, 유리된 항체와 항원이 결합되어 있는 항체를 판별할 수 있게 되었다.
도 1a는 L 시리즈의 항체의 어세이 방법에 의해 얻어진 결과를 나타낸다.
도 1b는 L 시리즈의 항체의 어세이 방법에 의해 얻어진 결과를 나타낸다.
도 2a는 L 시리즈의 항체의 어세이 방법에 의해 얻어진 결과를 나타낸다.
도 2b는 L 시리즈의 항체의 어세이 방법에 의해 얻어진 결과를 나타낸다.
도 3a는 L 시리즈의 항체의 어세이 방법에 의해 얻어진 결과를 나타낸다.
도 3b는 L 시리즈의 항체의 어세이 방법에 의해 얻어진 결과를 나타낸다.
도 4a는 L 시리즈의 항체의 어세이 방법에 의해 얻어진 결과를 나타낸다.
도 4b는 L 시리즈의 항체의 어세이 방법에 의해 얻어진 결과를 나타낸다.
도 5a는 L 시리즈의 항체의 어세이 방법에 의해 얻어진 결과를 나타낸다.
도 5b는 L 시리즈의 항체의 어세이 방법에 의해 얻어진 결과를 나타낸다.
도 6a는 F 시리즈의 항체의 어세이 방법에 의해 얻어진 결과를 나타낸다.
도 6b는 F 시리즈의 항체의 어세이 방법에 의해 얻어진 결과를 나타낸다.
도 7a는 F 시리즈의 항체의 어세이 방법에 의해 얻어진 결과를 나타낸다.
도 7b는 F 시리즈의 항체의 어세이 방법에 의해 얻어진 결과를 나타낸다.
도 8a는 F 시리즈의 항체의 어세이 방법에 의해 얻어진 결과를 나타낸다.
도 8b는 F 시리즈의 항체의 어세이 방법에 의해 얻어진 결과를 나타낸다.
도 9a는 F 시리즈의 항체의 어세이 방법에 의해 얻어진 결과를 나타낸다.
도 9b는 F 시리즈의 항체의 어세이 방법에 의해 얻어진 결과를 나타낸다.
도 10a는 F 시리즈의 항체의 어세이 방법에 의해 얻어진 결과를 나타낸다.
도 10b는 F 시리즈의 항체의 어세이 방법에 의해 얻어진 결과를 나타낸다.
도 11은 항-NP항체(E11)+NP-CGG에 대한 면역 스케줄을 나타낸다. 100ul/마우스/주입 중의 100㎍의 E11과 NP14-CGG(Ab:Ag=3:1/몰 비율). 도 11에 있어서, CFA: 완전 프로인트 아쥬반트(Complete Freund's adjuvant) CGG: 치킨 감마 글로불린(Chicken gamma globulin) NP: 4-히드록시-3-니트로페닐 아세틸
도 12는 효모 세포 표면 디스플레이에 의한 mAb#0806-12의 에피토프 매핑을 나타낸다. Cλ1이 에피토프이다.
도 13은 NP-Ag의 존재 하 또는 비존재 하의 항-NP mAb와 항 λ1 mAb #0806-12의 결합 특성(검체: 9T13mAb, 9T13mAb+NP-Cap 또는 9T13mAb+DNP-Cap)을 나타낸다. 도 13에 있어서: 9T13: 항-NP 항체/IgG1. I 센서 칩: CM5 유량: 10 ml/분 가동 버퍼: PBS(0.005% 트윈(Tween)20) 리간드: 항-E11mAb(#0806-12), 2000 RU 분석 물질 농도: 9T13mAb(200nM) 9T13mAb(200nM)+NP-Cap(1mM) 9T13mAb(200nM)+DNP-Cap(1mM) 주입 시간: 3분 재생: 10mM Gly-HCl(pH 1.6) 10ml×4회
도 14는 도미노 항체를 나타낸다.
도 15는 해정 항체를 나타낸다.
본 명세서에 있어서 “제1 항체”란 본 발명의 유리 제1 항체와 항원 결합 제1 항체 중 한쪽의 항체를 특이적으로 인식하는 항체(특이적 인식 항체)에 의해 인식되는 항체를 의미한다. 제1 항체는 항원을 인식하는데, 이 항원은 항체일 수도 비항체일 수도 있다. “제1 항체”는 유리 제1 항체와 항원 결합 제1 항체 둘 다를 포함한다.
본 명세서에 있어서 “유리 제1 항체와 항원 결합 제1 항체 중 한쪽의 항체를 특이적으로 인식한다”란, 항원에 결합하고 있지 않은 제1 항체(유리 제1 항체)와 항원에 결합한 제1 항체(항원 결합 제1 항체) 중 어느 한쪽을 특이적으로 인식하여 결합하고, 다른 쪽은 전혀 결합하지 않거나 실질적으로 결합하지 않는 것을 의미한다. 예를 들면, 본 발명의 특이적 인식 항체에 의해 인식되지 않는 다른 쪽 유리 제1 항체 또는 항원 결합 제1 항체와의 결합은, 제1 항체에 의해 인식되는 항원 등의 항체 인식과 관계가 없는 항원과 동등 레벨(백그라운드의 레벨)을 나타낸다.
“유리 제1 항체”는 항원과 결합하고 있지 않은 제1 항체를 의미하고, “항원 결합 제1 항체”는 항원과 결합한 제1 항체를 의미한다.
본 발명의 특이적 인식 항체(유리 제1 항체와 항원 결합 제1 항체 중 한쪽의 항체를 특이적으로 인식하는 항체)는, 도미노 항체(Domino antibody)와 해정 항체(Antibody Unlocking Antibody: AUA)의 양쪽을 포함한다.
본 명세서에 있어서 “도미노 항체”란 항원과 결합한 제1 항체를 특이적으로 인식하는 항체를 의미한다. 도미노 항체는 일차 항체, 이차 항체 등의 항체를 인식하는 항체이고, 도미노 항체에 의해 인식되는 항체는 항체와의 복합체(예를 들면 이차 항체, 삼차 항체 등)이어도, 항체 이외의 항원과 결합한 항체(예를 들면, 일차 항체) 중 어느 것이어도 된다. 제1 도미노 항체(Domino Ⅰ antibody)에 대한 제2 도미노 항체(Domino Ⅱ antibody), 제2 도미노 항체에 대한 제3 도미노 항체(Domino Ⅲ antibody)를 조합하여 사용하면, 항원 결합 제1 항체에 대하여 제2 도미노 항체, 제3 도미노 항체가 차례차례 결합하게 되기 때문에, 본 명세서에서는 이와 같은 항체를 도미노 항체라고 명명하였다(도 14).
“해정 항체(Antibody Unlocking Antibody: AUA)”는 항원과 결합하고 있지 않은 유리의 제1 항체를 특이적으로 인식하는 항체를 의미한다. 해정 항체는 고도의 친화성을 갖는 경우 항원을 결합한 항체로부터 항원 또는 항체를 뽑아 낼(해정할) 수 있기 때문에 이와 같이 명명되었다. 본 발명의 바람직한 개정 항체는 항원을 결합한 항체로부터 항원 또는 항체를 뽑아 낼(해정할) 수 있는 항체이다.
「항체」라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로널 항체(완전장 또는 무상의 모노클로널 항체를 포함한다), 폴리클로널 항체, 다가 항체, 다중 특이성 항체(예를 들면 이중 특이성 항체), 및 그들이 원하는 생물 활성을 나타내는 한 항체 단편도 포함한다.
특별히 언급이 없는 한은 본 명세서 전체를 통하여 「다가 항체」라는 표현은 3 또는 그 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 항체를 가리키기 위해서 사용된다. 다가 항체는 바람직하게는 3 또는 그 이상의 항원 결합 부위를 갖도록 유전자 조작된 것으로, 일반적으로는 천연 서열 IgM 또는 IgA 항체는 아니다.
「항체 단편」은 항원에 결합하는 능력을 유지하고 있는 항체의 일부를 포함한다. 본 정의에 포함되는 항체 단편의 예에는 (ⅰ) VL, CL, VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fab 단편; (ⅱ) CH1 도메인의 C 말단에 하나 또는 복수의 시스테인 잔기를 갖는 Fab 단편인 Fab' 단편; (ⅲ) VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fd 단편; (ⅳ) CH1 도메인의 C 말단에 하나 또는 복수의 시스테인 잔기와 VH 및 CH1 도메인을 갖는 Fd' 단편; (ⅴ) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인을 갖는 Fv 단편; (ⅵ) VH 도메인으로 이루어지는 dAb 단편(문헌 [Ward 등, Nature 341, 544-546(1989)]); (ⅶ) 단리된 CDR 영역; (ⅷ) F(ab')2 단편; (ⅸ) 단쇄 항체 분자(예를 들면 단쇄 Fv; scFv) (문헌 [Bird 등, Science 242:423-426(1988); 및 Huston 등, PNAS(USA) 85:5879-5883(1988)]); (ⅹ) 동일한 폴리펩티드쇄 중에서 경쇄 가변 도메인(VL)에 결합한 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위를 갖는 「다이아보디(diabodies)」(예를 들면 유럽 특허 공보 제404097호; 국제 공개 제93/11161호; 및 문헌 [Hollinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448(1993)]을 참조); (ⅹⅰ) 상보적 경쇄 폴리펩티드와 함께 1쌍의 항원 결합 영역을 형성하는 1쌍의 탠덤 Fd 세그먼트(VH-CH1-VH-CH1)를 포함하는 「선형 항체」(문헌 [Zapata 등, Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)]; 및 미국 특허 제5641870호)가 포함된다.
여기서 사용되는 「모노클로널 항체」라는 용어는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻어지는 항체를 의미한다. 즉, 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 저절로 생기는 것이 가능한 돌연변이를 제외하고 동일하다. 모노클로널 항체는 고도로 특이적이고, 단일의 항원 부위에 대한 것이다. 또한, 상이한 결정기(에피토프)에 대한 상이한 항체를 전형적으로는 포함하는 폴리클로널 항체 조제물과는 달리, 각 모노클로널 항체는 항원의 단일의 결정기에 대한 것이다. 「모노클로널」이라는 수식 어구는 항체를 무엇인가 특정의 방법으로 생산해야만 하는 것을 의미하는 것은 아니다. 예를 들면, 본 발명에서 사용되는 모노클로널 항체는 최초로 문헌 [Kohler 등, Natrue, 256:495(1975)]에 기재된 하이브리도마법에 의해 만들 수 있거나, 또는 재조합 DNA법에 의해 만들 수 있다(예를 들면 미국 특허 제4816567호를 참조할 것). 또한 「모노클로널 항체」는 예를 들면 문헌 [Clackson 등, Nature, 352:624-628(1991) 또는 Marks 등, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수도 있다.
여기에 기재된 모노클로널 항체는 특히 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정의 종으로부터 유래하거나, 특정의 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동인 한편, 쇄의 나머지가 다른 종으로부터 유래하거나, 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 상동인 「키메라」 항체, 및 그들이 원하는 생물 활성을 나타내는 한은 그와 같은 항체의 단편을 포함한다(미국 특허 제4816567호; 및 문헌 [Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984)]).
비인간(예를 들면 마우스) 항체의 「인간화」형은 비인간 면역 글로불린에 유래하는 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분에 있어서, 인간화 항체는 수용자의 고빈도 가변 영역으로부터의 잔기가, 마우스, 래트, 토끼 또는 원하는 특이성, 친화성 및 능력을 갖는 비인간 영장류와 같은 비인간종의 고빈도 가변 영역으로부터의 잔기(공여자 항체)에 의해 치환된 인간 면역 글로불린(수용자 항체)이다. 어느 경우에는 인간 면역 글로불린의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 대응하는 비인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체에도 또는 공여자 항체에도 발견되지 않는 잔기를 포함하고 있어도 된다. 이들 수식은 항체의 특성을 더욱 세련되게 하기 위해서 행해진다. 일반적으로 인간화 항체는 모두 또는 실질적으로 모든 고빈도 가변 루프가 비인간 면역 글로불린의 것에 대응하고, 모두 또는 실질적으로 모든 FRs가 인간 면역 글로불린 서열의 것인, 적어도 1개 전형적으로는 2개의 가변 도메인의 실질적으로 모두를 포함한다. 인간화 항체는 경우에 따라서는 면역 글로불린 정상 영역(Fc), 전형적으로는 인간 면역 글로불린의 것의 적어도 일부를 포함한다. 더욱 상세한 것에 대해서는 문헌 [Jones 등, Nature 321:522-525(1986); Riechmann 등, Nature 332:323-329(1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)]을 참조할 것.
「인간 항체」는 인간에 의해 생산되는 항체의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 갖는 것, 및/또는 여기서 개시된 인간 항체를 제조하기 위한 어느 하나의 기술을 사용하여 제조된 것이다. 인간 항체는 당해 분야에서 알려져 있는 여러 가지 기술을 사용함으로써 생산하는 것이 가능하다. 일 실시 형태에서는 인간 항체는 파지 라이브러리로부터 선택되고, 여기서 파지 라이브러리가 인간 항체를 발현한다(문헌 [Vaughan 등, Nature Biotechnology 14:309-314(1996): Sheets 등, PNAS, (USA)95:6157-6162(1998); Hoogenboom 및 Winter, J. Mol. Biol., 227:381(1991); Marks 등, J. Mol. Biol., 222:581(1991)]). 또한, 인간 항체는 인간 면역 글로불린을 유전자 이식 동물, 예를 들면 내재성 면역 글루불린 유전자가 부분적 또는 완전히 불활성화된 마우스 중에 도입함으로써 생산할 수 있다. 폭로시에 유전자 재구성, 어셈블리 및 항체 레퍼토리를 포함하는, 모든 점에서 인간에 보이는 것과 밀접하게 유사한 인간 항체의 생산이 관찰된다. 이 어프로치법은 예를 들면 미국 특허 제5545807호; 제5545806호; 제5569825호; 제5625126호; 제5633425호; 제5661016호, 및 다음의 과학 문헌 [Marks 등, Bio/Technology 10:779-783(1992); Lonberg 등, Nature 368:856-859(1994); Morrison 등, Nature 368:812-13(1994); Fishwild 등, Nature Biotechnology 14:845-51(1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14:826(1996); Lonberg 및 Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93(1995)]에 기재되어 있다. 또는 인간 항체는 표적 항원에 대하여 항체를 생산하는 인간 B 림프구의 불사화에 의해 조제되어도 된다(그와 같은 B 림프구는 개체로부터 회수되어도 되고, 시험관 내(in vitro)에서 면역화되어 있어도 된다). 예를 들면, 문헌 [Cole 등, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985); Boerner 등, J. Immunol., 147(1):86-95(1991)]; 및 미국 특허 제5750373호를 참조할 것.
「질환」은 항체로 치료함으로써 이익을 얻는 모든 증상을 말한다. 이것에는 문제의 질환에 포유동물을 이환시키는 소인이 되는 병리 상태를 포함하는 만성 및 급성의 질환 또는 병이 포함된다. 여기서, 본 발명의 항체에 의해 치료되는 질환의 비한정적인 예에는 양성 및 악성의 종양; 백혈병 및 림프 악성 종양; 뉴런, 신경교, 성상세포, 시상하부 및 다른 선, 매크로파지, 상피, 스트로마 및 할강의 질환; 및 염증, 혈관 형성 및 면역성 질환이 포함된다.
「치료적 유효량」이라는 용어는 포유동물의 질병 또는 질환을 치료하는 데 효과적인 약제의 양을 의미한다.
「치료」는 치료적 처치 및 예방적 또는 보호적 수단을 모두 가리킨다. 치료가 필요한 것에는 이미 질환에 걸려 있는 것 및 질환이 예방되어야 할 것이 포함된다.
「라벨」이라는 말은 여기서 이용되는 경우 폴리펩티드(예를 들면 항원 또는 항체)에 직접적 또는 간접적으로 결합하는 검출 가능한 화합물 또는 조성물을 의미한다. 라벨은 그 자신이 검출 가능하여도 되고(예를 들면, 방사성 동위체 라벨 또는 형광 라벨), 또는 효소 라벨의 경우에는 검출 가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변환을 촉매하여도 된다.
여기서 사용되는 경우 「세포」, 「세포주」 및 「세포 배양」이라는 표현은 상호 교환 가능하게 이용되고, 그 모든 용어는 자손을 포함한다. 따라서, 「형질 전환체」 및 「형질 전환 세포」라는 어구는 최초의 대상 세포 및 몇 번 배양이 계대되었는가에 관계없이 최초의 것으로부터 유도된 것을 포함한다.
모노클로널 항체 조제
항체를 조제하여 특징 지우는 수단은 당해 분야에서 잘 알려져 있다. 본 발명에서 사용되는 항체의 생산을 위한 예시적인 기술에 대하여 다음에 설명한다. 항체의 생산에 사용되는 항원은 항체 또는 그 일부일 수 있고, 바람직하게는 항체의 경쇄 또는 그의 단편을 들 수 있다.
본 발명의 항체의 조제는 경쇄를 이용하는 것을 특징으로 한다. 항체의 복합체만 인식하고, 유리된 항체를 인식하지 않는 도미노 항체는 항원 항체 복합체를 숙주에 투여하여 제작할 수 있는 것처럼 생각되지만, 본 발명자가 실제로 이와 같은 방법을 이용한 경우, 유리 항체와 복합화 항체의 양쪽을 인식하는 항체만 얻을 수 있었다. 한편, 경쇄를 이용하여 항체를 생산시킴으로써, 항원 항체 복합체를 특이적으로 인식하는 도미노 항체, 또는 유리 항체를 특이적으로 인식하는 해정 항체를 얻을 수 있었다.
또는 합텐 항체에 합텐 또는 항원을 포착시킨 후, 합텐 또는 항원을 항체에 화학적으로 고정 또는 결합하고, 항원이 항체로부터 해리되지 않는 항원 항체 복합체를 작성한 후, 당해 복합물을 면역하여 도미노 항체를 얻을 수 있다. 합텐으로서는, 예를 들면 테스토스테론, 에스트라디올, 에스트리올, 코르티솔 등의 스테로이드 호르몬이나, 모노니트로페닐기, 디니트로페닐기, 트리니트로페닐기, 플루오레세인기 등을 갖는 화합물(예를 들면 2,4-디니트로페놀(DNP)), 디곡신, 저분자 약물로 대표되는 저분자 물질로서, 마우스 등의 포유동물에 투여함으로써 그에 대한 항체를 유도할 수 있는 물질을 들 수 있다. 합텐 항체는 이들 합텐을 특이적으로 인식하는 항체이다. 합텐 또는 항원과 항체의 화학적 고정 또는 결합은 가교제, 예를 들면 글루타르알데히드, 포름알데히드, 파라포름알데히드 등의 디알데히드류나 톨릴렌-2,4-디이소시아네이트 등의 디이소시아네이트류를 이용하여 행할 수 있다.
본 발명의 도미노 항체 및 해정 항체는 경쇄 또는 그의 단편을 이용하고, 문헌 [Kohler 등, Nature, 256:495(1975)]에 의해 최초로 기재된 하이브리도마법을 이용하여 제작할 수 있거나, 또는 재조합 DNA법(미국 특허 제4816567호)에 의해 제작할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시 형태에서는 도미노 항체 또는 해정 항체에 의해 인식되는 항체의 경쇄를 취득하고, 이 경쇄를 면역원으로서 숙주(마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 머카크 원숭이 등)에 투여하는 하이브리도마법에 의해 제작할 수 있다. 예를 들면, 숙주를 상기한 바와 같이 하여 면역하고, 면역화에 이용되는 경쇄 또는 그의 단편과 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 또는 생산할 수 있는 림프구를 이끌어낸다. 다른 방법으로서 림프구를 시험관 내에서 면역할 수도 있다. 다음에 림프구를 폴리에틸렌글리콜과 같은 적당한 융합제를 이용하여 미엘로마 세포와 융합시키고, 하이브리도마 세포를 형성한다(문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103페이지(Academic Press, 1986)]).
또한, 본 모노클로널 항체 취득에 관하여 항원으로서 경쇄를 이용하는 것을 특징으로서 기술하여 왔으나, 항원이 H쇄 및 H쇄의 가변 영역과 C1H 영역을 포함하는 H쇄 단편인 경우에도 마찬가지로 목적의 항체 생산 하이브리도마를 취득하는 것이 가능하다.
즉, 항체는 2가의 Fab 부분에서 항원을 포착하는데, Fab는 경쇄(VL+CL)와 중쇄의 Fd(중쇄 가변 영역 VH+CH1 영역)로 구성되어 있다. Fab에 있어서의 경쇄(VL+CL)와 Fd(VH+CH1)는 기능적으로 대칭인 1쌍의 단백질이고, 이 1쌍의 단백질의 VL 중에 분단된 3개의 영역(초가변 영역), VH에서도 마찬가지로 VL에 대한 위치에 분단된 3개의 영역(초가변 영역)이 존재하고 그 부분에서 항원을 포착하고 있다.
도미노 항체나 개정 항체가 L쇄를 면역하여 얻어진다는 것은, 항체가 항원을 포착하면 항체의 Fab 부분의 L쇄에 구조 변화가 일어나는 것을 나타내고 있다. 따라서, 표현을 바꾸면 L쇄의 구조 변화를 분별할 수 있는 항체가 도미노 항체나 개정 항체라는 것으로 된다. 이와 같이 항체의 항원 결합 반응을 통하여 L쇄에 구조 변화가 일어나고, 또한 그 구조 변화 부분을 인식할 수 있는 항체를 취득할 수 있는 것은 아무도 믿지 않았던 것으로, 본 발명은 당해 지견을 기초로 완성된 것이다.
전술한 바와 같이 항체의 Fab에 주목한 경우 L쇄와 H쇄는 기능적으로 대칭인 1쌍의 단백질이다. 항원을 포착하는 부분도 거의 동일한 위치 동일한 길이의 영역에서 각 3개소씩 존재한다. 이번에 도미노 항체, 개정 항체 취득을 통하여 L쇄에 구조 변화를 추정할 수 있었던 것은, 대상을 이루는 다른 1쌍의 단백질, 중쇄의 Fd에서도 항원 포착에 의해 마찬가지의 구조 변화가 일어나는 것으로 생각된다. 즉, 중쇄의 Fd 부분 또는 그의 단편을 면역하고, 동일한 스크리닝 방법을 실시하면 도미노 항체 및 개정 항체를 얻을 수 있는 것으로 생각된다.
단, 경쇄의 면역은 이하의 점에서 우수하다, 즉:
(ⅰ) Fd는 우선 Fab, F(ab')2를 거쳐 정제를 행하게 된다. 이 점에서 경쇄 쪽이 정제가 간단하고, 수량의 점에서 유리하다;
(ⅱ) 경쇄 쪽이 물성의 점에서 취급하기 쉽다. H쇄는 소수성 단백질이고 정제시에 침강하기 쉽다.
단, 상기 H쇄의 결점은 예를 들면 1) 화학 합성한 Fd의 부분 펩티드로 면역하는 것이고, 2) 대장균이나 효모로 Fd만의 재조합 단백을 얻는다는 것이다. 3) 특정의 Fd 부분이 없는 KO 마우스를 이용하여 면역하는 등으로 회피할 수 있다.
이와 같이 하여 조제된 하이브리도마 세포를, 융합되어 있지 않은 부모 미엘로마 세포의 증식 또는 생존을 저해하는 하나 또는 복수의 물질을 바람직하게는 포함하는 적당한 배지에 뿌리고 증식시킨다. 예를 들면, 부모 미엘로마 세포가 효소 히포크산틴구아니딘포스포리보실트란스페라아제(HGPRT 또는 HPRT)를 결실한다면, 하이브리도마를 위한 배지는 전형적으로는 HGPRT 결실 세포의 증식을 방해하는 물질인 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유할 것이다(HAT 배지).
바람직한 미엘로마 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생산 세포에 의한 항체의 안정된 고 레벨의 생산을 지원하고, HAT 배지와 같은 배지에 대하여 감수성인 세포이다. 이들 중에서도 바람직한 미엘로마 세포주는 마우스 미엘로마주, 예를 들면 소크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터 입수할 수 있는 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양, 및 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(미국 메릴랜드주 로크빌 소재)으로부터 입수할 수 있는 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포로부터 유도된 것이다. 인간 미엘로마 및 마우스-인간 헤테로미엘로마 세포주도 또한 인간 모노클로널 항체의 생산을 위해서 개시되어 있다(문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001(1984); Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63페이지(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]).
하이브리도마 세포가 생육하고 있는 배지를, 항원(유리 항체 또는 항원이 결합된 항체)에 대한 모노클로널 항체의 생산에 대하여 어세이한다. 바람직하게는 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로널 항체(도미노 항체 및 해정 항체)의 결합 특이성은 면역 침강 또는 시험관 내 결합 검정, 예를 들면 방사 면역 측정법(RIA; Radio Immuno Assay) 또는 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA)에 의해 측정한다.
도미노 항체 또는 해정 항체로서 원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 동정된 후, 그 클론을 한계 희석법에 의해 서브클로닝하고, 표준적인 방법에 의해 증식시킬 수 있다(문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies; Principles and Practice, 59-103페이지(Academic Press, 1986)]). 이 목적에 바람직한 배지에는, 예를 들면 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 추가로 하이브리도마 세포는 동물에 있어서 복수 종양으로서 생체 내(in vivo)에서 증식시킬 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로널 항체는, 예를 들면 프로테인 A-세팔로스, 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 관용의 면역 글로불린 정제법에 의해 배지, 복수 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.
모노클로널 항체를 코드하고 있는 DNA는 통상법에 의해(예를 들면, 모노클로널 항체의 중쇄 및 경쇄를 코드하고 있는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써) 즉시 단리되어 서열 결정된다. 하이브리도마 세포는 이와 같은 DNA의 바람직한 공급원이 된다. 일단 단리되었다면, DNA를 발현 벡터 중에 넣고, 다음으로 이것을 그렇게 하지 않으면 면역 글로불린 단백질을 생산하지 않는 대장균 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 미엘로마 세포와 같은 숙주 세포 중에 형질감염하여 재조합 숙주 세포 중에서 모노클로널 항체의 합성을 달성할 수 있다. 항체의 재조합 생산은 이하에 더 상세하게 기재한다.
또 다른 실시 양태에서는 항체 또는 항체 단편은 문헌 [McCafferty 등, Nature, 348:552-554(1990)]에 기재된 기술을 사용하여 생산되는 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 문헌 [Clackson 등, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks 등, J. Mol. Biol., 222:581-597(1991)]은 파지 라이브러리를 사용한 마우스 및 인간 항체의 단리를 기술하고 있다. 별도의 문헌은 쇄 셔플링에 의한 고친화성(nM 범위)의 인간 항체의 생산(문헌 [Marks 등, Bio/Technology, 10:779-783(1992)]), 및 매우 큰 파지 라이브러리를 구축하기 위한 방책으로서 조합 감염(combinatorial infection)과 생체 내 재조합(문헌 [Waterhouse 등, Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266(1993)])을 기술하고 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로널 항체의 분리에 대한 전통적인 모노클로널 항체 하이브리도마법에 대한 실행 가능한 대체법이다.
DNA는 또한 예를 들면 인간 중쇄 및 경쇄 정상 도메인의 코드화 서열을, 상동적 마우스 서열 대신에 치환함으로써(미국 특허 제4816567호; 문헌 [Morrison 등, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:6851(1984)]), 또는 면역 글로불린 코드 서열에 비면역 글로불린 폴리펩티드의 코드 서열의 전부 또는 일부를 공유 결합시킴으로써 수식할 수 있다.
전형적으로는 이와 같은 비면역 글로불린 폴리펩티드는 항체의 정상 도메인에 치환되거나 또는 항체의 일 항원 결합 부위의 가변 도메인에 치환되어 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원 결합 부위와 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 또 하나의 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 만들어낸다.
인간화 및 인간 항체
인간화 항체에는 비인간 유래의 하나 또는 복수의 아미노산 잔기가 도입되어 있다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 전형적으로는 「이입」 가변 도메인으로부터 얻어지는 「이입」 잔기라고 불린다. 인간화는 본질적으로는 인간 항체의 대응하는 서열에 설치류 CDRs 또는 CDR 서열을 치환함으로써 윈터와 공동 연구자의 방법(문헌 [Jones 등, Nature, 321:522-525(1986), Riechmann 등, Nature, 332:323-327(1988), Verhoeyen 등, Science, 239:1534-1536(1988)])을 사용하여 실시할 수 있다. 따라서, 이와 같은 「인간화」 항체는 무상(無傷)의 인간 가변 도메인보다 실질적으로 적은 쪽이 비인간종 유래의 대응하는 서열로 치환된 키메라 항체(미국 특허 제4816567호)이다. 실제로는 인간화 항체는 전형적으로는 얼마간의 고빈도 가변 영역 잔기 및 경우에 따라서는 얼마간의 FR 잔기가 설치류 항체의 유사 부위로부터의 잔기에 의해 치환되어 있는 인간화 항체이다.
항원성을 저감하기 위해서는 인간화 항체를 제작할 때에 사용하는 인간의 경중 양쪽의 가변 도메인의 선택이 매우 중요하다. 소위 「베스트 피트법」에서는 설치동물 항체의 가변 도메인의 서열을 기지의 인간 가변 도메인 서열의 라이브러리 전체에 대하여 스크리닝한다. 다음에 설치동물의 것에 가장 가까운 인간 서열을 인간화 항체의 인간 프레임워크 영역(FR)으로서 받아들인다(문헌 [Sims 등, J. Immunol., 151:2296(1993); Chothia 등, J. Mol. Biol., 196:901(1987)]). 다른 방법에서는 경쇄 또는 중쇄의 특정의 서브그룹의 인간 항체 모두의 컨센서스 서열로부터 유도되는 특정의 프레임워크 영역을 사용한다. 동일한 프레임워크를 몇 개의 상이한 인간화 항체에 사용할 수 있다(문헌 [Carter 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285(1992); Presta 등, J. Immunol., 151:2623(1993)]).
또한, 항체를 항원에 대한 고친화성이나 다른 바람직한 생물학적 성질을 유지하여 인간화하는 것이 중요하다. 이 목표를 달성하기 위해서 바람직한 방법으로는 부모 및 인간화 서열의 삼차원 모델을 사용하여 부모 서열 및 여러 가지 개념적 인간화 산물의 분석 공정을 거쳐 인간화 항체를 조제한다. 삼차원 면역 글로불린 모델은 일반적으로 입수 가능하고, 당업자에게는 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역 글로불린 서열의 추측 삼차원 입체 배좌 구조를 도해하고, 표시하는 컴퓨터 프로그램이 구입 가능하다. 이들 표시를 조사함으로써, 후보 면역 글로불린 서열의 기능에 있어서의 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 후보 면역 글로불린의 항원과의 결합 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석이 가능해진다. 이와 같이 하여 예를 들면 표적 항원에 대한 친화성이 높아진다고 하는 바람직한 항체 특성이 달성되도록, FR 잔기를 수용자 및 이입 서열로부터 선택하여 조합할 수 있다. 일반적으로 CDR 잔기는 직접적 또한 가장 실질적으로 항원 결합성에 영향을 미치고 있다.
별도의 방법으로서, 내인성의 면역 글로불린 생산이 없어도 인간 항체의 전체 레퍼토리를 면역화함으로써 생산할 수 있는 트랜스제닉 동물(예를 들면, 마우스)을 만드는 것이 가능하다. 예를 들면, 키메라 및 생식계열 돌연변이체 마우스에 있어서의 항체 중쇄 결합 영역(JH) 유전자의 동형 접합 제거가 내인성 항체 생산의 완전한 저해를 초래하는 것이 기재되어 있다. 이와 같은 생식계열 돌연변이체 마우스에 있어서의 인간 생식계열 면역 글로불린 유전자열의 전이는 항원 투여시에 인간 항체의 생산을 초래한다. 예를 들면, 문헌 [Jakobovits 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551(1993); Jakobovits 등, Nature 362:255-258(1993); Bruggerman 등, Year in Immuno., 7:33(1993); 및 Duchosal 등 Nature 355:258(1992)]을 참조하기 바란다. 인간 항체는 또한 파지-디스플레이 라이브러리로부터 유도할 수도 있다(문헌 [Hoogenboom 등, J. Mol. Biol., 227:381(1991); Marks 등, J. Mol. Biol., 222:581-597(1991); Vaughan 등 Nature Biotech 14:309(1996)]).
항체 단편
항체 단편을 생산하기 위해서 여러 가지 기술이 개발되어 있다. 전통적으로는 이들 단편은 무상의 항체의 단백 분해성 소화를 통하여 유도되고 있었다(예를 들면, 문헌 [Morimoto 등, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117(1992) 및 Brennan 등, Science, 229:81(1985)]을 참조). 그러나, 이들 단편은 지금은 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산할 수 있다. 예를 들면, 항체 단편은 위에서 검토한 항체 파지 라이브러리로부터 분리할 수 있다. 별도의 방법으로서, Fab'-SH 단편은 대장균으로부터 직접 회수하고, 화학적으로 결합시켜 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다(문헌 [Carter 등, Bio/Technology 10:163-167(1992)]). 다른 어프로치법에서는 F(ab')2 단편을 재조합 숙주 세포 배양으로부터 직접 분리할 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 방법은 당업자에게는 명백할 것이다. 다른 실시 형태에서는 선택 항체는 단쇄 Fv 단편(scFV)이다. 국제 공개 제93/16185호를 참조.
본 발명의 항체를 이펙터 기능에 대하여 개변하여 항체의 효과를 항진시키는 것은 바람직하다. 예를 들면, 시스테인 잔기를 Fc 영역에 도입하고, 그에 의해 이 영역에 쇄간 디설피드 결합을 형성하도록 하여도 된다. 이와 같이 하여 생성된 호모 이량체 항체는 향상된 내재화 능력 및/또는 증가한 보체 매개 세포 살상 및 항체-의존 세포성 세포 장해성(ADCC)을 가질 가능성이 있다. 문헌 [Caron 등, J. Exp. Med. 176:1191-1195(1992) 및 Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922(1992)] 참조. 또한, 향상된 항종양 활성을 갖는 호모 이량체 항체는 문헌 [Wolff 등, Cancer Research 53:2560-2565(1993)]에 기재되어 있는 헤테로 이관능성 가교제를 이용하여 조제할 수 있다. 또는 항체는 2개의 Fc 영역을 갖도록 가공하여 그에 의해 보체 용해 및 ADCC 능력을 향상시킬 수도 있다. 문헌 [Stevenson 등, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230(1989)] 참조.
또한, 여기서 개시되어 있는 항체는 면역 리포솜으로서 처방할 수도 있다. 항체를 포함하는 리포솜은, 예를 들면 문헌 [Epstein 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985); Hwang 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)]; 및 미국 특허 제4485045호 및 동 4544545호에 기재되어 있는 바와 같은 당해 분야에 있어서 기지의 방법에 의해 조제된다. 순환 시간이 많아진 리포솜은 미국 특허 제5013556호에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG 유도체화 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 함유하는 지질 조성물을 이용한 역상 증발법에 의해 제작할 수 있다. 리포솜은 구멍 직경이 정해진 필터를 통하여 압출되고, 원하는 직경을 갖는 리포솜이 얻어진다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디설피드 교환 반응을 통하여 문헌 [Martin 등, J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)]에 기재되어 있는 바와 같이 하여 리포솜에 콘주게이트할 수 있다. 경우에 따라서는 화학 요법제(독소루비신 등)는 리포솜 내에 포함된다. 문헌 [Gabizon 등, J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)]를 참조할 것.
항체의 공유 결합적 수식은 본 발명의 범위 내에 있다. 그들은 적당하면 화학 합성에 의해 또는 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 이루어질 수 있다. 항체의 공유 결합적 수식의 다른 타입은 선택되는 측쇄 또는 N 또는 C 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 항체의 표적으로 하는 아미노산 영역을 반응시킴으로써 분자 중에 도입된다.
공유 결합적 수식은 항체에 대하여 글리코시드를 화학적 또는 효소적으로 커플링시키는 것을 포함한다. 이들 수순은 그들이 N- 또는 O- 결합 글리코실화를 위한 글리코실화능을 갖는 숙주 세포 중에서의 항체의 생산을 필요로 하지 않는다는 점에서 유리하다. 이용되는 커플링 양태에 따라 당(류)은 (a) 아르기닌과 히스티딘에 (b) 유리의 카르복실기에 (c) 유리의 술프히드릴기, 예를 들면 시스테인의 것에 (d) 세린, 스레오닌 또는 히드록시프롤린의 것과 같은 유리의 히드록실기에 (e) 페닐알라닌, 티로신 또는 트립토판과 같은 방향족 잔기 또는 (f) 글루타민의 아미드기에 결합시킬 수 있다. 이들 방법은 1987년 9월 11일 공개의 국제 공개 제87/05330호 및 문헌 [Aplin 및 Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306페이지(1981)]에 기재되어 있다.
항체에 존재하는 모든 탄수화물 부분의 제거는 화학적 또는 효소적으로 행할 수 있다. 화학적 탈글리코실화에는 항체를 화합물 트리플루오로메탄술폰산 또는 등가 화합물에 폭로하는 것을 필요로 한다. 이 처리에 의해 항체를 무상인 채로 하면서 결합당(N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 거의 또는 모든 당의 절단이 일어난다. 화학적 탈글리코실화는 문헌 [Hakimuddin 등, Arch. Biochem. Biophys., 259:52(1987) 및 Edge 등, Anal. Biochem., 118:131(1981)]에 의해 기재되어 있다. 항체 상의 탄수화물 부분의 효소적 절단은 문헌 [Thotakura 등, Meth. Enzymol. 138:350(1987)]에 기재되어 있는 바와 같이 여러 가지 엔도 및 엑소글리코시다아제를 이용함으로써 달성할 수 있다.
항체의 공유 결합적 수식의 다른 타입은 항체를 여러 가지 비단백질양 중합체의 하나, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌에, 미국 특허 제4640835호; 제4496689호; 제4301144호; 제4670417호; 제4791192호 또는 제4179337호에 기재된 방법으로 결합시키는 것을 포함한다.
본 발명의 항체는 재조합적으로 제조할 수 있다.
항체의 재조합 생산을 위해서 그것을 코드하는 핵산이 단리되고, 다른 클로닝(DNA의 증폭) 또는 발현을 위해서 복제 가능한 벡터 내에 삽입된다. 모노클로널 항체를 코드하는 DNA는 즉시 단리되고, 통상의 방법(예를 들면, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코드하는 유전자에 특이적으로 결합 가능한 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여)을 이용하여 서열 결정된다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분으로서는 일반적으로 이들에 제한되는 것은 아니지만, 다음의 하나 또는 복수가 포함된다: 시그널 서열, 복제 개시점, 하나 또는 복수의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열이다.
본 발명에서 사용되는 항체의 치료 제제는 임의 성분의 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제와 원하는 순도를 갖는 항체를 혼합함으로써(문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16판, Osol, A편[1980]]), 동결 건조 제제 또는 수용액의 형태로 보존용으로 조제된다. 전형적으로는 적당량의 제약적으로 허용 가능한 염이 제제를 등장으로 하기 위해서 담체 중에 사용된다. 허용할 수 있는 담체, 부형제 또는 안정제는 이용하는 투여량 및 농도에서는 세포에 대하여 무독성이고, 인산, 시트르산 및 다른 유기산 등의 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예를 들면, 옥타데실디메틸벤질암모늄클로리드; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질알코올; 알킬파라벤류, 예를 들면 메틸 또는 프로필파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올 및 m-크레졸); 저분자량(잔기 수 10개 미만) 폴리펩티드; 혈청알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린 등의 단백질; 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린 등의 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; EDTA 등의 킬레이트제; 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨 등의 당류, 나트륨 등의 염형성 상대 이온; 금속 착물(예를 들면 Zn-단백질 착물); 및/또는 트윈TM(TWEENTM), 플루로닉스TM(PLURONICSTM) 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 비이온성 계면 활성제를 포함한다. 바람직한 동결 건조 항체 제제는 참조에 의해 여기에 도입되는 국제 공개 제97/04801호에 기재되어 있다.
또한, 제제는 치료되는 특정의 효능에 필요한 1 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 또한 활성 성분은, 예를 들면 코아세르베이션(coacervation)법 또는 계면 중합에 의해 조제된 마이크로캡슐, 예를 들면 각각 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트)마이크로 캡슐에, 콜로이드상 약물 전달계(예를 들면, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노 입자 및 나노 캡슐) 또는 매크로에멀션에 포착시킬 수 있다. 이와 같은 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16판, Oslo, A.편(1980)]에 개시되어 있다.
생체 내 투여에 사용되는 제제는 멸균되어 있어야만 한다. 이는 멸균 여과막을 통과시키는 여과에 의해 용이하게 달성된다.
서방성 조제물을 조제하여도 된다. 서방성 조제물의 적절한 예에는 항체를 포함하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스가 포함되고, 이 매트릭스는 필름 또는 마이크로캡슐 등의 성형품의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들면 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리(비닐알코올)), 폴리락티드(미국 특허 제3773919호), L-글루타민산과 γ-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-아세트산비닐, 분해성의 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들면 루프론 디포트TM(LUPRON DEPOTTM; 락트산-글리콜산 공중합체 및 아세트산류프롤리드로 이루어지는 주입 가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-아세트산비닐이나 락트산-글리콜산 등의 중합체는 100일 이상 분자를 방출할 수 있지만, 특정의 히드로겔은 더 짧은 시간 단백질을 방출한다.
봉입된 항체는 체내에 오랫동안 남는 경우, 37℃에서의 수분에 폭로되는 결과, 변성되거나 또는 응집되어 생물 활성이 소실되고, 면역원성을 변화시킬 가능성이 있다. 관여하는 기구에 따라 안정화를 위한 합리적인 방책을 안출할 수 있다. 예를 들면, 관련되는 메커니즘에 따라 안정성을 얻기 위한 합리적인 처치를 안출할 수 있다. 예를 들면, 응집 기구가 티오-디술피드 변환에 의한 분자 간 S-S 결합의 형성인 것을 알았다면, 술프히드릴 잔기를 개변하고, 산성 용액으로부터 동결 건조하고, 수분량을 조정하고, 적당한 첨가물을 사용하고, 특정의 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 안정화를 달성할 수 있다.
용량과 투여
본 발명의 항체는 공지의 방법, 예를 들면 볼루스로서 또는 일정 시간에 걸친 연속 주입에 의한 정맥내 투여, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 골액포내, 지주막하 강내, 경구, 국소적 또는 흡입 경로에 의해 인간 환자에 투여된다. 항체의 정맥내 또는 피하 투여가 바람직하다.
질환의 타입과 위독함에 따라 약 1㎍/㎏ 내지 50㎎/㎏(예를 들면 0.1-20㎎/㎏)의 항체가, 예를 들면 1회 또는 복수회의 각각의 투여라면, 또는 연속 주입에 의한 것이라면, 환자에 대한 초기 후보 투여량이다. 전형적인 1일의 용량은 상기한 요인에 의존하여 약 1㎍/㎏ 내지 약 100㎎/㎏ 또는 그 이상의 범위이다. 수일간 또는 그 이상에 걸친 반복 투여의 경우에는 상황에 따라 질환 징후의 바람직한 억제가 일어날 때까지 치료를 계속한다. 그러나, 다른 용량 계획도 유용할 수 있다. 바람직한 양태에서는 본 발명의 항체는 약 5㎎/㎏ 내지 약 15㎎/㎏의 범위의 용량으로 2 내지 3주마다 투여된다. 본 발명의 치료법의 진행은 관용의 기술 및 어세이로 용이하게 감시된다.
본 발명의 항체는 단독의 항체로서 투여하여도 되지만, 다른 항체 의약과 조합하여 투여할 수 있다.
본 발명의 항체는 유리 제1 항체와 항원 결합 제1 항체를 구별하여 인식하기 때문에, ELISA 등의 면역학적 측정법에서 유용하다.
재료의 기탁
다음의 3가지 하이브리도마 세포주를 미국 버지니아주 마나사스의 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(ATCC)에 부다페스트 조약의 규정에 따라 기탁하였다:
(1) 기탁자가 부여한 식별 표시: 하이브리도마 세포주 F-1A
ATCC 특허 기탁 명칭: PTA-9167
ATCC에 의한 배양물의 수탁일: 2008년 4월 23일;
(2) 기탁자가 부여한 식별 표시: 하이브리도마 세포주 L-6A
ATCC 특허 기탁 명칭: PTA-9168
ATCC에 의한 배양물의 수탁일: 2008년 4월 23일;
(3) 기탁자가 부여한 식별 표시: 하이브리도마 세포주 0806-12
ATCC 특허 기탁 명칭: PTA-9967
ATCC에 의한 배양물의 수탁일: 2009년 4월 16일.
본 발명은 항체에 의해 이루어져 있으나, 본 발명의 대상은 항체를 대신하는 핵산(앱타머) 또는 펩티드이어도 된다. 즉, 항원을 인식한 항체를 인식하는 앱타머, 및 펩티드 또는 항원을 인식한 앱타머를 인식하는 항체나 앱타머 및 펩티드도 마찬가지이다. 또한, 앱타머는 SELEX법에 의해 펩티드는 파지 라이브러리에 의해 목적의 분자를 취득할 수 있다.
<실시예>
이하, 본 발명을 실시예를 이용하여 더 상세하게 설명하는데, 실시예는 단지 예시이고, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1
도미노 항체 및 해정 항체(Antibody Unlocking Antibody: AUA)의 생산
항원이 되는 래트 모노클로널 항체의 작성
항 FITC 래트 모노클로널 항체 #55(IgG2aκ)를 통상법에 의해 수립하였다. 또한, 한편에서 독립하여 항 FITC 래트 모노클로널 항체 #7(IgG2aκ)을 통상법에 의해 수립하였다. 상세하게는 치킨 감마 글로불린(CGG)(로크랜드 이뮤노케미칼즈 인크.(Rockland, Immunochemicals, Inc.), 미국 펜실베니아주 소재)과 소혈청 알부민(BSA)(시그마(Sigma), 미국 미주리주 소재)을 FITC 라벨링 키트(도진도(Dojindo), 일본 구마모또 소재)에서 FITC로 표지하였다. FITC 표지 CGG(80㎍/100μl in PBS)를 동 용량의 아쥬반트 티터 맥스 골드(Titer Max Gold; CytRx Corp, 미국 조지아주 소재)로 에멀션을 작성하고, 피셔 래트(Fischer Rat)(♀) 7주령에 2주일마다 3회 복강 내에 면역하였다. 다시 그 2주일 후 동량의 FITC 표지 CGG(80㎍/100μl in PBS)를 아쥬반트 없이 복강 내에 면역하여 그 3일 후, 래트로부터 비장을 적출하여 비장 세포를 분리하고, 통상법에 따라 마우스 미엘로마 세포(P3U1)와 폴리에틸렌글리콜을 이용하여 융합하고, HAT 배지를 세포 선택 배지로 하여 96웰 플레이트 10장에 뿌렸다. 14일 후, 각 웰의 배양 상청을 채취하고, FITC 표지 BSA를 ELISA 플레이트에 코트하여 BSA로 블록킹한 플레이트를 이용하여 항 FITC 항체를 생산하는 미엘로마를 선택하였다. 상기 융합을 2회 반복하고, 각각의 융합으로부터 각각 항 FITC 래트 모노클로널 항체 #55(IgG2aκ), 항 FITC 래트 모노클로널 항체 #7(IgG2aκ) 생산 하이브리도마를 수립하였다. 각각의 하이브리도마를 대량으로 배양하여 배양 상청으로부터 HiTrap ProteinG HP(지이 헬스케어(GE Healthcare), 미국 뉴저지주 소재) 칼럼을 이용하여 래트 모노클로널 항체를 정제하였다.
경쇄의 정제
상기 조작에 의해 얻어진 항 FITC 래트 모노클로널 항체 #55로부터 경쇄를 정제하였다. 경쇄의 분리 정제법은 문헌 [Azuma, T 등 PNAS(1981) 78 pp569-573]에 준하여 행하였다. 즉, 정제 #55 항체를 최종 농도 0.01M 디티오트레이톨, 0.2M Tris-HCl(pH 8.2)에 용해한다. 용액을 37℃, 30분간 가온한다. 반응 후 실온에 되돌려서(약 10분 정치) 최종 농도 0.3M 요오도아세토아미드가 되도록 첨가하여 30분간 정치하고, 알킬레이션 반응을 행하였다. 중쇄와 경쇄의 분리에는 HPLC를 이용하였다. 알킬레이션 반응 후, 5M 구아니딘-HCl이 용해된 PBS(pH 7.2)로 평형화한 칼럼에 알킬화 #55를 제공하여 경쇄 분획을 얻었다. 중쇄가 혼입하는 분획은 다시 HPLC에 제공하여 경쇄 분획을 얻었다. 경쇄 분획을 PBS에 대하여 투석한 후 재차 세분하여 동결 보존하였다.
경쇄의 면역과 하이브리도마의 작성
#55의 경쇄(30㎍/100μl in PBS)를 동 용량의 아쥬반트 티터 맥스 골드(CytRx Corp, 미국 조지아주 소재)로 에멀션을 작성하고, Balb/c 마우스(♀) 7주령에 2주일마다 3회 복강 내에 면역하였다. 다시 그 2주일 후 동량의 #55의 경쇄(80㎍/100μl in PBS)를 아쥬반트 없이 복강 내에 면역하여 그 3일 후, 마우스로부터 비장을 적출하여 비장 세포를 분리하고, 통상법에 따라 마우스 미엘로마 세포(P3U1)와 폴리에틸렌글리콜을 이용하여 융합하고, HAT 배지를 세포 선택 배지로 하여 96웰 플레이트 10장에 뿌렸다(L 시리즈).
항체의 어세이 방법
14일 후, 각 웰의 배양 상청을 채취하고, (ⅰ) FITC 표지 BSA를 ELISA 플레이트에 코트하여 BSA로 블록킹한 플레이트 (ⅱ) FITC 표지 BSA를 ELISA 플레이트에 코트하여 BSA로 블록킹한 플레이트에 #7 항체(1㎍/ml in PBS)를 100μl/웰 첨가하여 4℃에서 하룻밤 반응시켜 세정한 플레이트 (ⅲ) #7 항체(1㎍/ml in PBS)를 100μl/웰 첨가하여 ELISA 플레이트에 코트하여 BSA로 블록킹한 플레이트, 이상 3종류의 플레이트를 이용하여 어세이를 행하였다. 즉, 하이브리도마의 배양 상청을 상기 3종류의 플레이트에 각각 100μl의 하이브리도마의 배양 상청을 제공하여 2시간 실온에서 정치한다. 플레이트를 세정 후, HRP 표지 항 마우스 IgG(래트 IgG 비교차)(잭슨 래보러토리즈(Jackson Laboratories))와 1시간 실온에서 반응 후 플레이트를 세정하고, 발색액 TMB 기질 용액(KPL사, 미국 매릴랜드주 소재)을 100μl 첨가하여 10분간 반응 후 50μl의 2N 황산으로 발색을 정지하여 플레이트 리더로 450㎚의 파장을 판독한다.
결과의 판정
(ⅱ)와 (ⅲ)의 플레이트의 OD를 비교하여 어느 하나에 강하게 반응하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 목적의 항체 생산 하이브리도마라고 판정하였다. 적절히 (ⅰ)의 플레이트를 이용한 어세이도 행하여 BSA나 BSA-FITC에 반응하지 않음을 확인하였다.
별법
이론적으로는 항체 A가 항원으로서 단백질 B를 인식하는 경우, 그 항원 항체 복합물(A-B)-항체 A의 구조 변화가 생체 내에서 장시간 유지되도록 가교화제를 이용하여 고정하여도 됨-을 마우스 등의 동물에 면역하여 항체 A가 항원 B를 인식하였을 때에 일어나는 항체 A의 구조 변화를 인식하는 항체를 취득할 수 있다.
그러나, 면역 동물의 혈청 중에 출현하는 다양한 항체는 항체의 구조 변화에 관계없이 항체 A에 반응하는 것, 항원 B에 반응하는 것, A-B의 결합체를 인식하는 것 등이 존재하여 목적으로 하는 항체와 같이 A-B의 결합에 수반하는 항체 A의 구조 변화를 인식하는 항체는 출현 빈도가 매우 낮다고 추정된다.
그래서, 면역원과 면역 방법을 더 단순화하여 효율적으로 당해 항체를 얻는 방법을 고안하였다. 형광 물질 FITC(플루오레신 이소시오시아네이트)는 약 알칼리성의 용액 하에서 하전하고 있는 단백질의 아미노기에 반응하고, 티오우레아 결합을 형성하여 용이하게 단백질을 표지할 수 있다. 또한, FITC는 고친화성의 항체가 얻어지는 합텐으로서 알려져 있다. 본 발명자들은 이 성질을 이용하여 먼저 고친화성의 항 FITC 항체를 2종류 얻었다(전술한 #55(IgG2aκ), #7(IgG2aκ)).
FITC 포착 #55의 작성
1) PBS(pH 6.8)에 가용화한 정제 #55 항체에 대하여 DMSO에 용해한 FITC를 몰비로 약 1:5가 되도록 첨가하였다. 즉시, 미리 PBS(pH 6.8)로 평형화한 탈염용 PD-10 칼럼(지이 헬스케어 바이오-사이언스 코포레이션(GE Healthcare Bio-Science Corp), 미국 뉴저지주 소재)에 제공하여 고분자량 분획을 분취하였다. 즉시 1M 탄산나트륨 완충액(pH 8.3)을 0.5용량 첨가하여 용액을 약알칼리성으로 하였다. 차광하여 1시간 실온에서 방치하였다. 분광 광도계로 파장 280㎚와 495㎚를 측정하여 항체 1분자에 대한 FITC 분자의 결합 수를 계산식으로부터 이끌어내고, 거의 항체 분자:FITC=1:2인 것을 확인하였다. 본 과정에 의해 FITC에 대한 항친화성 항체#55에 결합한 FITC가 항체와의 결합 근방에서 하전하고 있는 아미노산과 공유 결합을 형성하여 FITC를 안정되게 계속해서 결합한다고 생각하였다.
FITC 포착 #55의 면역과 하이브리도마의 작성
FITC 포착 #55(30㎍/100μl in PBS)를 동 용량의 아쥬반트 티터 맥스 골드(CytRx Corp, 미국 조지아주 소재)로 에멀션을 작성하고, Balb/c 마우스(♀) 7주령에 2주일마다 3회 복강 내에 면역하였다. 다시 그 2주일 후 동량의 FITC 포착 #55(80㎍/100μl in PBS)를 아쥬반트 없이 복강 내에 면역하여 그 3일 후, 마우스로부터 비장을 적출하여 비장 세포를 분리하고, 통상법에 따라 마우스 미엘로마 세포(P3U1)와 폴리에틸렌글리콜을 이용하여 융합하고, HAT 배지를 세포 선택 배지로 하여 96웰 플레이트 10장에 뿌렸다(F 시리즈).
항체의 어세이 방법
14일 후, 각 웰의 배양 상청을 채취하고, (ⅰ) FITC 표지 BSA를 ELISA 플레이트에 코트하여 BSA로 블록킹한 플레이트 (ⅱ) FITC 표지 BSA를 ELISA 플레이트에 코트하여 BSA로 블록킹한 플레이트에 #7 항체(1㎍/ml in PBS)를 100μl/웰 첨가하여 4℃에서 하룻밤 반응시켜 세정한 플레이트 (ⅲ) #7 항체(1㎍/ml in PBS)를 100μl/웰 첨가하여 ELISA 플레이트에 코트하여 BSA로 블록킹한 플레이트, 이상 3종류의 플레이트를 이용하여 어세이를 행하였다. 즉, 하이브리도마의 배양 상청을 상기 3종류의 플레이트에 각각 100μl의 하이브리도마의 배양 상청을 제공하여 2시간 실온에서 정치한다. 플레이트를 세정 후, HRP 표지 항 마우스 IgG(래트 IgG 비교차)(잭슨 래보러토리즈)와 1시간 실온에서 반응 후 플레이트를 세정하고, 발색액 TMB 기질 용액(KPL사, 미국 매릴랜드주 소재)을 100μl 첨가하여 10분간 반응 후 50μl의 2N 황산으로 발색을 정지하여 플레이트 리더로 450㎚의 파장을 판독하였다.
결과의 판정
(ⅱ)와 (ⅲ)의 플레이트의 OD를 비교하여 어느 하나에 강하게 반응하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 목적의 항체 생산 하이브리도마라고 판정하였다. 적절히 (ⅰ)의 플레이트를 이용한 어세이도 행하여 BSA나 BSA-FITC에 반응하지 않음을 확인하였다.
상기한 항체의 어세이 방법에 의해 얻어진 결과를 도 1 내지 도 10에 나타낸다.
또한, 도면 중 목적의 항체 생산 웰에는 A(도미노 항체) 또는 S(개정 항체)의 숫자로 나타냈다. L 시리즈로부터는 6종류의 도미노 항체(L-1A 내지 6A)와 3종류의 개정 항체(L-1S 내지 3S), F 시리즈로부터는 1종의 도미노 항체(F-1A)의 반응성을 나타내는 클론이 얻어졌다.
목적의 항체를 생산하는 하이브리도마의 클론화를 행하여 얻어진 도미노 항체(F-1A, L-6A) 생산 하이브리도마를 2008년 4월 23일에 ATCC에 기탁하고, 이하의 ATCC 번호가 부여되었다.
(1) 기탁자가 부여한 식별 표시: 하이브리도마 세포주 F-1A
ATCC 특허 기탁 명칭: PTA-9167
(2) 기탁자가 부여한 식별 표시: 하이브리도마 세포주 L-6A
ATCC 특허 기탁 명칭: PTA-9168
실시예 2
항 λ1 경쇄 모노클로널 항체의 제작과 해석
항원 항체 반응을 검출하는 분자의 개발을 목적으로 하여 항체의 구조 변화를 인식하는 모노클로널 항체(mAb)의 제작을 시도하였다. 전략으로서, 합텐인 NP((4-히드록시-3-니트로페닐)아세틸)에 대하여 특이성을 갖는 mAb를 모델 항체로서 선택하였다. SJL 마우스는 λ1 경쇄 정상 영역에 존재하는 1염기의 변이에 의해, 혈청 중에 λ1 경쇄를 거의 검출할 수 없는 점으로부터 λ1 경쇄를 갖는 항 NP mAb를 SJL 마우스에 면역함으로써, λ1 경쇄를 에피토프로서 결합하고, 또한 항원 항체 반응을 검출할 수 있는 mAb 클론의 단리가 가능하다고 생각하여 시도하였다. 항 NP mAb로서 친화력이 높은 E11(IgG2a/λ1)을 이용하고, NP14-CGG와 3:1의 몰비로 혼합하고, 항체 항원 복합체를 형성시킨 상태로 면역하였다. 상세한 면역 스케줄을 도 11에 나타낸다. 2주일 간격으로 4회의 면역 후에 비장을 적출하고, 미엘로마 세포 SP2/0주와 세포 융합함으로써 하이브리도마를 제작하였다. 유용한 mAb를 분비하는 하이브리도마의 스크리닝은 배양 상청을 이용한 ELISA에 의해 E11에 대한 결합능을 지표로 행하였다.
얻어진 클론 중 항체 생산량이 많은 클론 #0806-12를 대량 배양하고, E11을 아가로스 비즈에 공유 결합한 칼럼을 이용하여 어피니티 정제하였다. mAb #0806-12의 에피토프를 확인하기 위해서, E11의 각 Ig 도메인(VH, CH1, CH2, CH3, VL, CL 도메인)을 표면에 발현하는 효모주를 제작하고, 비오틴화한 #0806-12와 스트렙토아비딘-PE에 의해 효모 표면을 염색하고, FACS로 해석한 결과, CL 도메인을 발현한 효모주에만 결합하였다. 이 점으로부터 Ab#0806-12는 λ1 경쇄 정상 영역을 에피토프로서 결합하고 있음을 알 수 있다(도 12).
목적의 항체를 생산하는 하이브리도마의 클론화를 행하여 얻어진 해정 항체(0806-12) 생산 하이브리도마를 2009년 4월 16일에 ATCC에 기탁하고, 이하의 ATCC 번호가 부여되었다.
기탁자가 부여한 식별 표시: 하이브리도마 세포주 0806-12
ATCC 특허 기탁 명칭: PTA-9967
mAb#0806-12가 항원 항체 반응을 검출할 수 있는지를 비아코어(Biacore)를 이용하여 해석하였다. 정제한 mAb#0806-12를 비아코어 CM5 센서 칩 상에 아민 커플링법으로 약 2000RU 고정화하고, 항 NP mAb인 9T13(IgG1/λ1)과의 결합을 조사하였다(도 13). 이때, 항원인 NP-Cap(1uM), 또한 항원이 아닌 NP-Cap와 구조가 유사한 DNP-Cap(1uM, 2,4-디니트로페닐)와 미리 혼합한 샘플을 해석한 결과, 항원 항체 반응을 일으키고 있는 샘플(9T13+NP-Cap)에서만 RU값의 현저한 감소가 보였다(샘플 주입 180초 후에서 약 1/6의 RU값으로 감소).
이상의 결과로부터, 이번에 얻어진 항 λ1 경쇄 모노클로널 항체 #0806-12는 λ1 경쇄를 갖는 항 NP mAb에 특이적으로 결합하고, 그 항 NP mAb가 NP 항원과 결합하였을 때에는 친화력이 현저하게 감소하는 점으로부터 항원 항체 반응을 식별할 수 있다고 할 수 있다.
<산업상 이용가능성>
A. 항원을 인식하고 있는 항체를 인식하는 항체의 응용예
1) 특정 방법의 수단으로서
(ⅰ) 바이오센서: 미량 항원의 검출(초고감도 실현)
예를 들면, 항원을 결합한 마우스 항체만을 인식하는 래트 모노클로널 항체 (A)가 존재한다. 또한, 래트 항체가 항원을 인식하였을 때에만 반응하는 햄스터 모노클로널 항체 (B), 이와 같은 연쇄 반응이 일어나도록 항체의 인식 부위(Fc 부분, 경쇄)나 항체의 종을 변경함으로써 조립할 수 있다. 즉, 매우 작은 시그널을 크게 증폭할 수 있는 것이 고려되어 고감도의 센서를 제공할 수 있다.
(ⅱ) 세정 불필요의 ELISA로서
예를 들면 항원을 인식하는 일차 항원에 형광 단백질 CFP로 라벨을 하고, 예를 들면 당해 항체를 별도의 종류의 형광 단백질 YFP로 라벨한다. 항원이 존재하는 용액에 일정량의 일차 항체와 당해 항체를 첨가하면, 그 항원량에 따라 형광 공명 에너지 이동(Fluorescence resonance energy transfer:FRET)이 관찰된다.
본 측정법은 항원의 정제가 불필요하고, 항원의 라벨이 불필요하며, 항원에 반응하는 일차 항체가 존재하면 어떠한 측정에도 응용이 가능하다.
2) 의약품으로서
(ⅰ) 항체 의약품의 보편적인 인핸서 항체
이미 의약품으로서 인가 실용되고 있는 의약품 항체가 체내에서 항원에 결합하여 걸리는 ADCC 반응이나 CDCC 반응을 야기할 때에 본 항체가 그 반응을 증강할 수 있다. 예를 들면, 암 항원을 인식하는 항체 의약품이 투여되어, 투여된 항체의 일부가 병소 부위에 도달한다. 그래서, 당해 항체를 투여하면, 본 항체는 병소부에서 항원과 결합하고 있는 의약품 항체에 반응하여 결합한다.
당해 항체에는 항암제나 방사 활성을 라벨할 수도 있어 널리 항체 의약품의 증강제로서 사용이 가능하다. 본 항체는 당해 항체가 반응할 수 있는 인간 항체이면, 항체 의약품의 종류에 관계없이 증강제로서 사용할 수 있다. 또한, 항원과 결합한 의약품 항체에만 반응하기 때문에 과잉량의 투여가 일어나도 안전하다.
(ⅱ) 감염증시, 담암시에 획득되는 자연 항체의 증강제
이물(바이러스, 세균)의 침입시에 또한 종양의 발증, 증식시에 적지않게 생체는 응답하여 이물의 배제나 종양의 증식의 저해 작용을 한다. 즉, 충분하지 않을지도 모르지만 상기 응답시에 이물이나 종양에 대하여 항체가 생산되고 있다고 생각된다. 그래서, 이물이나 종양 세포를 포착하고 있는 항체를 증강하기 위해서 당해 항체를 투여하여 생체의 반응을 보조하는 것이 가능하다. 즉, 상기 (ⅰ)에서는 투여된 의약품 항체의 증강이지만 이 경우에는 생체 내의 자연 면역력의 증강으로서 응용하는 더 유효한 글로불린 제제라고도 할 수 있다.
3) 의료 기구로서
(ⅰ) 항원 항체 복합체 제거 칼럼
당해 항체를 칼럼에 고정화하여 이용할 수 있다. 임의의 종의 질환에서는 다량의 면역 복합체가 병의 진전에 기여하고 있는 것이 알려져 있다(예를 들면, 만성 관절 류머티즘, SLE 등). 본 항체 칼럼은 체외 순환 칼럼으로서 환자 중의 혈액을 순환시켜 항원을 결합한 면역 복합 항체를 제거할 수 있다. 또한, 면역 복합체에 관여하고 있지 않은 항체는 본 칼럼에 흡착되지 않고 체내로 되돌아가게 된다. 즉, 병태를 악화시키고 있는 원인의 면역 복합체만을 제거할 수 있는 것이 특징이다.
(ⅱ) 미량 독물 제거 칼럼
상기 (ⅰ)과 마찬가지로 잘못해서 체내에 들어온 독물을 제거하기 위해서 이용할 수 있다. 이 경우, 독물에 결합하는 항체를 준비해 둔다. 이 항체가 결합하였을 때에 반응하는 당해 항체를 칼럼에 결합시킨다. 독물을 제거하는 목적에서 독물이 혼입된 체내에 독물에 결합하는 일차 항체를 정맥 주사한다. 즉시 체외 순환을 개시하는 독물에 결합한 항체만을 칼럼이 효율적으로 제거한다.
또한, 항체는 무미 무취이고, 용이하게 물에 용해되기 때문에 수도, 음료수 등에 혼입된 독물을 제거하기 위해서, 음료수에 독물에 결합하는 일차 항체를 적하 그 후 본 항체를 고정화한 필터에 통과시키면 무독화가 가능하다.
마찬가지의 응용은 공기 중의 독물을 제거하는 데에도 응용할 수 있다.
B. 항원을 인식하고 있지 않은 항체를 인식하는 항체(해정 항체)의 응용예로서 높은 친화성을 갖는 당해 항체는, 항체를 인식하고 있는 항체로부터 항원을 해리시키는 기능을 갖는다고 추정된다.
1) 의약품으로서
(ⅰ) 항알레르기 의약품으로서
IgE가 항원에 결합하고 있지 않은 상태에서 강하게 반응하는 당해 항체를 사용하면, IgE가 항원인 알레르겐을 결합하고 있어도 당해 항체가 결합함으로써 IgE 항체로부터 항원이 해리하고, 알레르겐(항원)을 결합한 IgE가 알레르기성 반응을 야기하는 것을 억제하는 것을 가능하게 한다.
(ⅱ) 항체 의약품 공통의 긴급용 쇼크 대처 항체로서
상기와 마찬가지의 관점으로부터 항체를 투여함으로써 일어나는 쇼크의 대처로서, 항체가 결합한 것을 해제하고자 하는 경우가 있다. 예를 들면, 아고니스트성 항체 투여에 의해 일어난 테제네로(Tegenero)가 영국에서 행한 임상 시험과 같이 금후 개발되고, 임상 시험되는 항체에서 드물게 그와 같은 사건이 일어나지 않는다고는 할 수 없다. 당해 항체는 투여된 항체의 항원에 대한 결합을 해제하여 쇼크 증상으로부터의 이탈에 효과를 나타낸다고 생각된다.
(ⅲ) 특이 항체의 출현으로 야기되는 병태 치료약
본 적응도 기본적으로 상기 2점에서 동일하다. 상기 A. 3)(ⅰ)에서 행하고 있는 체외 순환으로 제거하고 있는 항원 항체 복합체를, 당해 항체를 체내에 주사하여 체내에서 항원과 항체의 해리를 행하는 것을 들 수 있다.
Figure 112010083272029-pct00001
Figure 112010083272029-pct00002
아메리칸 타입 컬처 컬렉션 PTA-09167 20080423 아메리칸 타입 컬처 컬렉션 PTA-09168 20080423 아메리칸 타입 컬처 컬렉션 PTA-09967 20090416

Claims (9)

  1. 제1 항체를 합텐 또는 항원과 혼합시키는 공정,
    합텐 또는 항원을 상기 항체에 화학적으로 고정 또는 결합시켜, 상기 합텐 또는 항원이 상기 항체로부터 해리되지 않는 항원-항체 복합물을 제조하는 공정,
    상기 복합물로 인간을 제외한 숙주를 면역시키는 공정,
    상기 숙주의 비장 세포로부터 모노클로날 항체를 생산하는 적어도 하나의 하이브리도마를 얻는 공정, 및
    얻어진 하이브리도마에 의해 생산되는 상기 모노클로날 항체로부터 도미노 항체를 수득하는 공정
    을 포함하는, 도미노 항체를 얻는 방법이며,
    상기 도미노 항체는 상기 제1 항체가 상기 합텐 또는 항원에 결합한 경우에 상기 제1 항체의 경쇄의 구조 변화를 특이적으로 인식하는 것인, 도미노 항체를 얻는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항원이 감마 글로불린, 소혈청 알부민, 플루오레신 이소시오시아네이트(FITC) 및 (4-히드록시-3-니트로페닐)아세틸(NP) 중 적어도 하나를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 숙주가 마우스, 래트, 토끼, 햄스터 또는 원숭이인 방법.
  4. (a) 인간을 제외한 제1 숙주를 항원으로 면역시키는 공정,
    (b) 상기 항원에 결합할 수 있는 적어도 하나의 제1 항체를 상기 제1 숙주로부터 단리하는 공정,
    (c) 상기 단리된 제1 항체로부터 항체 쇄 또는 그의 단편을 얻는 공정,
    (d) 인간을 제외한 제2 숙주를 상기 항체 쇄로 면역시키는 공정,
    (e) 상기 제2 숙주의 비장 세포로부터 모노클로날 항체를 생산하는 적어도 하나의 하이브리도마를 얻는 공정, 및
    (f) 얻어진 하이브리도마에 의해 생산되는 상기 모노클로날 항체로부터 해정 항체(antibody unlocking antibody)를 선별하는 공정
    을 포함하는, 해정 항체를 얻는 방법이며,
    상기 해정 항체는 상기 제1 항체가 상기 항원에 결합하지 않은 경우에 상기 제1 항체를 특이적으로 인식하는 것이고, 상기 항체 쇄는 경쇄인, 해정 항체를 얻는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제1 숙주가 마우스, 래트, 토끼, 햄스터 또는 원숭이인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 제2 숙주가 마우스, 래트, 토끼, 햄스터 또는 원숭이인 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
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