JPWO2019160007A1 - 抗原結合分子および組合せ - Google Patents
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Abstract
Description
[1]第1の抗原および前記第1の抗原に結合する第1の抗原結合分子を含む抗原−抗原結合分子複合体に結合し、前記第1の抗原結合分子の前記第1の抗原への結合活性を増加させる、第2の抗原結合分子。
[2]前記第1の抗原結合分子の存在下における前記第1の抗原への結合活性が、前記第1の抗原結合分子の非存在下に比べて高い、[1]に記載の第2の抗原結合分子。
[3]前記第1の抗原が免疫関連分子または細胞代謝物である、[1]または[2]に記載の第2の抗原結合分子。
[4]前記免疫関連分子が、免疫細胞の細胞膜に存在する分子である、[3]に記載の第2の抗原結合分子。
[5]前記免疫細胞が、顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、T細胞、およびB細胞からなる群から選択される少なくとも一つである、[4]に記載の第2の抗原結合分子。
[6]前記免疫関連分子がCD3である、[3]〜[5]のいずれかに記載の第2の抗原結合分子。
[7]前記第1の抗原結合分子が、重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せがそれぞれ配列番号:1と配列番号:122、配列番号:114と配列番号:115、配列番号:116と配列番号:117、配列番号:118と配列番号:119、および配列番号:120と配列番号:121から選択されるいずれかの組合せからなるCD3結合ポリペプチド、または前記CD3結合ポリペプチドから改変された第1の改変ポリペプチドを含み、前記第1の改変ポリペプチドのCD3への結合活性は前記CD3結合ポリペプチドに比べて低い、[6]に記載の第2の抗原結合分子。
[8]前記細胞代謝物が、アデノシンまたはその誘導体である、[3]に記載の第2の抗原結合分子。
[9]前記第1の抗原結合分子が、重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せがそれぞれ配列番号:106と配列番号:107、配列番号:108と配列番号:109、配列番号:110と配列番号:111、および配列番号:112と配列番号:113から選択されるいずれかの組合せからなるアデノシン結合ポリペプチド、または前記アデノシン結合ポリペプチドから改変された第2の改変ポリペプチドを含み、前記第2の改変ポリペプチドのアデノシへの結合活性は前記アデノシン結合ポリペプチドに比べて低いまたは高い、[8]に記載の第2の抗原結合分子。
[10]前記第1の抗原結合分子が多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第2の抗原に結合する、[1]〜[9]のいずれかに記載の第2の抗原結合分子。
[11]前記第2の抗原が、癌抗原または免疫関連分子である、[10]に記載の第2の抗原結合分子。
[12]多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第3の抗原に結合する、[1]〜[11]のいずれかに記載の第2の抗原結合分子。
[13]前記第3の抗原が、癌抗原または免疫関連分子である、[12]に記載の第2の抗原結合分子。
[14]前記第1の抗原結合分子が多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第2の抗原に結合し、前記第2の抗原結合分子が多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第3の抗原に結合し、前記第1の抗原と前記第2の抗原と前記第3の抗原の組合せが、以下の(1)〜(5)のいずれかの組合せである、[1]〜[13]のいずれかに記載の第2の抗原結合分子。
(1)前記第1の抗原が免疫関連分子であり、前記第2の抗原が第1の癌抗原であり、前記第3の抗原が第2の癌抗原である組合せ
(2)前記第1の抗原が標的細胞の細胞代謝物であり、前記第2の抗原が癌抗原であり、前記第3の抗原が免疫関連分子である組合せ
(3)前記第1の抗原が標的細胞の細胞代謝物であり、前記第2の抗原が免疫関連分子であり、前記第3の抗原が癌抗原である組合せ
(4)前記第1の抗原が第1の免疫関連分子であり、前記第2の抗原が癌抗原であり、前記第3の抗原が第2の免疫関連分子である組合せ
(5)前記第1の抗原が第1の免疫関連分子であり、前記第2の抗原が第2の免疫関連分子であり、前記第3の抗原が癌抗原である組合せ
[15][1]に記載の第1の抗原結合分子および第2の抗原結合分子の組合せ。
[16]第1の抗原に結合する第1の抗原結合分子であって、前記第1の抗原結合分子の前記第1の抗原への結合活性が、前記第1の抗原および前記第1の抗原結合分子を含む抗原−抗原結合分子複合体に結合する第2の抗原結合分子によって増加される、第1の抗原結合分子。
[17]前記第1の抗原結合分子の存在下における前記第2の抗原結合分子の前記第1の抗原への結合活性が、前記第1の抗原結合分子の非存在下に比べて高い、[16]に記載の第1の抗原結合分子。
[18]前記第1の抗原が免疫関連分子または細胞代謝物である、[16]または[17]に記載の第1の抗原結合分子。
[19]前記免疫関連分子が、免疫細胞の細胞膜に存在する分子である、[18]に記載の第1の抗原結合分子。
[20]前記免疫細胞が、顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、T細胞、およびB細胞からなる群から選択される少なくとも一つである、[19]に記載の第1の抗原結合分子。
[21]前記免疫関連分子がCD3である、[19]〜[20]のいずれかに記載の第1の抗原結合分子。
[22]前記第1の抗原結合分子が、重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せがそれぞれ配列番号:1と配列番号:122、配列番号:114と配列番号:115、配列番号:116と配列番号:117、配列番号:118と配列番号:119、および配列番号:120と配列番号:121から選択されるいずれかの組合せからなるCD3結合ポリペプチド、または前記CD3結合ポリペプチドから改変された第1の改変ポリペプチドを含み、前記第1の改変ポリペプチドのCD3への結合活性は前記CD3結合ポリペプチドに比べて低い、[21]に記載の第1の抗原結合分子。
[23]前記細胞代謝物が、アデノシンまたはその誘導体である、[18]に記載の第1の抗原結合分子。
[24]前記第1の抗原結合分子が、重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せがそれぞれ配列番号:106と配列番号:107、配列番号:108と配列番号:109、配列番号:110と配列番号:111、および配列番号:112と配列番号:113から選択されるいずれかの組合せからなるアデノシン結合ポリペプチド、または前記アデノシン結合ポリペプチドから改変された第2の改変ポリペプチドを含み、前記第2の改変ポリペプチドのアデノシへの結合活性は前記アデノシン結合ポリペプチドに比べて低いまたは高い、[23]に記載の第1の抗原結合分子。
[25]多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第2の抗原に結合する、[16]〜[24]のいずれかに記載の第1の抗原結合分子。
[26]前記第2の抗原が、癌抗原または免疫関連分子である、[25]に記載の第1の抗原結合分子。
[27]前記第2の抗原結合分子が多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第3の抗原に結合する、[16]〜[26]のいずれかに記載の第1の抗原結合分子。
[28]前記第3の抗原が、癌抗原または免疫関連分子である、[27]に記載の第1の抗原結合分子。
[29]前記第1の抗原結合分子が多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第2の抗原に結合し、前記第2の抗原結合分子が多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第3の抗原に結合し、前記第1の抗原と前記第2の抗原と前記第3の抗原の組合せが、以下の(1)〜(5)のいずれかの組合せである、[16]〜[28]のいずれかに記載の第1の抗原結合分子。
(1)前記第1の抗原が免疫関連分子であり、前記第2の抗原が第1の癌抗原であり、前記第3の抗原が第2の癌抗原である組合せ
(2)前記第1の抗原が標的細胞の細胞代謝物であり、前記第2の抗原が癌抗原であり、前記第3の抗原が免疫関連分子である組合せ
(3)前記第1の抗原が標的細胞の細胞代謝物であり、前記第2の抗原が免疫関連分子であり、前記第3の抗原が癌抗原である組合せ
(4)前記第1の抗原が第1の免疫関連分子であり、前記第2の抗原が癌抗原であり、前記第3の抗原が第2の免疫関連分子である組合せ
(5)前記第1の抗原が第1の免疫関連分子であり、前記第2の抗原が第2の免疫関連分子であり、前記第3の抗原が癌抗原である組合せ
[30][16]に記載の第1の抗原結合分子および第2の抗原結合分子の組合せ。
[31]医薬組成物である、[15]または[30]に記載の組合せ。
[32]前記第1の抗原結合分子および前記第2の抗原結合分子が、同時にまたは別々に投与される、[31]に記載の組合せ。
[33]SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイを用いた第1の抗原結合分子の第1の抗原への結合活性が、化合物または抗体もしくはその断片のライブラリから任意に選択される1つの化合物または抗体もしくはその断片が存在する条件では検出されるが、前記1つの化合物または抗体もしくはその断片が存在しない条件では検出不可能である場合に、前記1つの化合物または抗体もしくはその断片を第2の抗原結合分子として同定することを含む、スクリーニング方法。
[34]SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイを用いた第1の抗原結合分子の第1の抗原への結合活性が、化合物または抗体もしくはその断片のライブラリから任意に選択される1つの化合物または抗体もしくはその断片が存在しない条件に比べて、前記1つの化合物または抗体もしくはその断片が存在する条件で高い場合に、前記1つの化合物または抗体もしくはその断片を第2の抗原結合分子として同定することを含む、スクリーニング方法。
[35](a)哺乳動物に第1の抗原と第1の抗原結合分子からなる抗原−抗原結合分子複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第1の群を得る工程、
(b)前記第1の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第1の抗原および該複合体を形成していない第1の抗原結合分子のいずれか一方または両方への結合活性が検出不可能であるモノクローナル抗体を産生する第2の群を選択する工程、
(c)前記第2の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて第1の抗原結合分子の第1の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第3の群を選択し、前記第3の群を第2の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程を含む、スクリーニング方法。
[36](a)哺乳動物に第1の抗原と第1の抗原結合分子からなる抗原−抗原結合分子複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第1の群を得る工程、
(b)前記第1の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第1の抗原および該複合体を形成していない第1の抗原結合分子のいずれか一方または両方への結合活性が、該複合体への結合に比べ低いモノクローナル抗体を産生する第2の群を選択する工程、
(c)前記第2の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて第1の抗原結合分子の第1の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第3の群を選択し、前記第3の群を第2の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程を含む、スクリーニング方法。
[37](a)哺乳動物に第1の抗原と第1の抗原結合領域からなる抗原−抗原結合領域複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第1の群を得る工程、
(b)前記第1の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第1の抗原および該複合体を形成していない第1の抗原結合領域のいずれか一方または両方への結合活性が検出不可能であるモノクローナル抗体を産生する第2の群を選択する工程、
(c)前記第2の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて第1の抗原結合領域の第1の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第3の群を選択し、前記第3の群を第2の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程を含む、スクリーニング方法。
[38](a)哺乳動物に第1の抗原と第1の抗原結合領域からなる抗原−抗原結合領域複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第1の群を得る工程、
(b)前記第1の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第1の抗原および該複合体を形成していない第1の抗原結合領域のいずれか一方または両方への結合活性が、該複合体への結合に比べ低いモノクローナル抗体を産生する第2の群を選択する工程、
(c)前記第2の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて第1の抗原結合領域の第1の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第3の群を選択し、前記第3の群を第2の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程を含む、スクリーニング方法。
[39](d)以下の(a)工程から(c)工程を含むスクリーニング方法により得られた抗体産生細胞を培養する工程;
(a)哺乳動物に第1の抗原と第1の抗原結合分子からなる抗原−抗原結合分子複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第1の群を得る工程、
(b)前記第1の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第1の抗原および該複合体を形成していない第1の抗原結合分子のいずれか一方または両方への結合活性が検出不可能であるモノクローナル抗体を産生する第2の群を選択する工程、
(c)前記第2の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて第1の抗原結合分子の第1の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第3の群を選択し、前記第3の群を第2の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程;
(e)前記抗体産生細胞培養物から培養上清または細胞破砕物を得る工程、
(f)前記培養上清または細胞破砕物から第2の抗原結合分子を精製する工程を含む、第2の抗原結合分子の製造方法。
[40](d)以下の(a)工程から(c)工程を含むスクリーニング方法により得られた抗体産生細胞を培養する工程;
(a)哺乳動物に第1の抗原と第1の抗原結合分子からなる抗原−抗原結合分子複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第1の群を得る工程、
(b)前記第1の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第1の抗原および該複合体を形成していない第1の抗原結合分子のいずれか一方または両方への結合活性が、該複合体への結合に比べ低いモノクローナル抗体を産生する第2の群を選択する工程、
(c)前記第2の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて第1の抗原結合分子の第1の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第3の群を選択し、前記第3の群を第2の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程;
(e)前記抗体産生細胞培養物から培養上清または細胞破砕物を得る工程、
(f)前記培養上清または細胞破砕物から第2の抗原結合分子を精製する工程を含む、第2の抗原結合分子の製造方法。
[41](d)以下の(a)工程から(c)工程を含むスクリーニング方法により得られた抗体産生細胞を培養する工程;
(a)哺乳動物に第1の抗原と第1の抗原結合領域からなる抗原−抗原結合領域複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第1の群を得る工程、
(b)前記第1の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第1の抗原および該複合体を形成していない第1の抗原結合領域のいずれか一方または両方への結合活性が検出不可能であるモノクローナル抗体を産生する第2の群を選択する工程、
(c)前記第2の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて第1の抗原結合領域の第1の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第3の群を選択し、前記第3の群を第2の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程;
(e)前記抗体産生細胞培養物から培養上清または細胞破砕物を得る工程、
(f)前記培養上清または細胞破砕物から第2の抗原結合分子を精製する工程を含む、第2の抗原結合分子の製造方法。
[42](d)以下の(a)工程から(c)工程を含むスクリーニング方法により得られた抗体産生細胞を培養する工程;
(a)哺乳動物に第1の抗原と第1の抗原結合領域からなる抗原−抗原結合領域複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第1の群を得る工程、
(b)前記第1の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第1の抗原および該複合体を形成していない第1の抗原結合領域のいずれか一方または両方への結合活性が、該複合体への結合に比べ低いモノクローナル抗体を産生する第2の群を選択する工程、
(c)前記第2の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて第1の抗原結合領域の第1の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第3の群を選択し、前記第3の群を第2の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程;
(e)前記抗体産生細胞培養物から培養上清または細胞破砕物を得る工程、
(f)前記培養上清または細胞破砕物から第2の抗原結合分子を精製する工程を含む、第2の抗原結合分子の製造方法。
[43]第1の抗原に結合する第1の抗原結合分子をアミノ酸改変して、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイで前記第1の抗原への結合が低下したまたは検出限界下である第1の抗原結合分子の改変体を得る第1の工程、
既存のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリから、前記第1の抗原および前記改変体のいずれか一方または両方に結合する抗原結合分子を提示するファージを除去した、第1のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを得る第2の工程、および
前記第1のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリから、前記第1の抗原および前記第1の抗原結合分子を含む抗原−抗原結合分子複合体に結合する抗原結合分子を提示するファージを濃縮した第2のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを得る第3の工程を含む、ファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリの製造方法。
[44]前記第2のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを前記既存のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリとし、前記第2の工程および前記第3の工程が繰り返される、[43]の製造方法。
[45]既存のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリから、(i)第1の抗原に結合し得るが前記第1の抗原に結合していない第1の抗原結合分子に結合し、および(ii)前記第1の抗原結合分子に結合していない前記第1の抗原に結合する、抗原結合分子を提示するファージを除去した、第1のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを得る第1の工程、ならびに
前記第1のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリから、前記第1の抗原および前記第1の抗原結合分子を含む抗原−抗原結合分子複合体に結合する抗原結合分子を提示するファージを濃縮した第2のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを得る第2の工程を含む、ファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリの製造方法。
[46]前記第2のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを前記既存のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリとし、前記第1の工程および前記第2の工程が繰り返される、[45]の製造方法。
本明細書において「ポリペプチド」は、複数のアミノ酸がペプチド結合したペプチドすべてを包含する。本明細書においては、ポリペプチドを「ペプチド」または「タンパク質」と呼ぶことがある。
本明細書において「抗原結合領域」は、抗原に特異的に結合する活性を有する化合物を意味する。抗原結合領域は、ペプチド性であってもよく、非ペプチド性であってもよい。
本明細書において、「CH2」は、抗体のCH2の1鎖のポリペプチドを意味する。具体的には、CH2は、EUナンバリングシステムでの重鎖231〜340位のアミノ酸残基で示される領域であり、本明細書では野生型のほか、野生型においてアミノ酸残基の置換、付加、または欠失させた改変体も包含する。
本明細書において、「CH3」は、抗体のCH3の1鎖のポリペプチドを意味する。具体的には、CH3は、EUナンバリングシステムでの重鎖341位からC末端までのアミノ酸残基で示される領域であり、本明細書では野生型のほか、野生型においてアミノ酸残基の置換、付加、または欠失させた改変体も包含する。
本明細書において、「CL」は、抗体のCLの1鎖のポリペプチドを意味する。具体的には、CLは、EUナンバリングシステムでの軽鎖108位からC末端までのアミノ酸残基で示される領域であり、本明細書では野生型のほか、野生型においてアミノ酸残基の置換、付加、または欠失させた改変体を包含する。
一態様において、抗体半分子は、キメラ抗体やヒト化抗体に由来するものを包含する。
一態様において、抗体半分子は、IgG、IgM、IgA、IgD、IgEなどの各種アイソタイプに由来するものを包含する。抗体半分子は、好ましくはIgG由来のものである。IgGには、IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4が存在する。抗体半分子は、これらのうちいずれのサブタイプ由来でもよい。抗体半分子は、天然に存在する抗体からその重鎖間の結合を解離させたものでもよく、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失させた遺伝子組換え体でもよい。
Biacore(登録商標)T200を利用したSPRで測定した場合のKDは、約1×10-12から約1×10-4の範囲で可能である。KDはこの範囲内(1×10-12から1×10-4)で大きいほど結合活性が低く、小さいほど結合活性が高い。抗原結合分子の抗原への結合活性においてKDが1×10-6以上である場合には、抗原結合分子は生理的な機能を発揮しにくいことが多い。例えば、抗原結合分子が抗体である場合、そのエフェクター機能を発揮しにくいことが多い。そこで本明細書では、SPR による測定で、KDが1×10-6以上である場合を「低結合活性」、1×10-6より低い場合を「高結合活性」と定義する。
分子間の結合アッセイの温度条件は通常25〜37℃である。SPRの場合の温度条件は、好ましくは25℃や37℃であり、より好ましくは37℃である。BLIの場合の温度条件は、好ましくは30℃である。ELISAの場合の温度条件は、好ましくは25℃である。結合アッセイに用いられるランニングバッファーは、市販のものを使ってもよく、用事調整により得てもよい。市販の例は、HBS-EP+(GE Healthcare)(0.01M HEPES、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.05% (v/v) polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate、pH 7.4)である。用事調整の例は、ACESバッファー(20 mM ACES (Nacalai tesque)、150 mM NaCl、0.05% (w/v) polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate (純生化学)、pH 7.4)である。試験化合物は所望のバッファー中に溶解される。アッセイ中に分子間結合に影響を及ぼし得る主要な組成はNaClである。行われる実験の目的によってNaClの濃度は異なるものの、塩濃度の条件検討を伴わない通常の実験で使用されるバッファー中のNaClの濃度は150 mMである。すなわち、通常用いられるランニングバッファー中のNaClの濃度としては、150 mMが好ましい。pHもアッセイ中に分子間結合に影響を及ぼし得るが、pHの条件検討を伴わない通常の実験で使用されるバッファーは、pH 7.4である。すなわち、通常用いられるランニングバッファーではpH 7.4が好ましい。
本発明の第1の抗原結合分子は、第1の抗原に結合する。すなわち、第1の抗原結合分子は、第1の抗原に結合する第1の抗原結合領域を含む。第1の抗原結合分子は第1の抗原に結合して抗原−抗原結合分子複合体を形成する。特定の態様において、第1の抗原結合分子は、生体内で発現していない抗原結合分子である。第1の抗原結合分子は、生体内で発現していない抗原結合分子であることが好ましい。「抗原結合分子が生体内で発現していない」とは、「抗原結合分子が投薬や免疫など人工的な処理が何もなされていない生体において、通常発現しているタンパク質またはその断片ではない」ことを意味する。
一態様において、第1の抗原結合分子または第1の抗原結合領域の第1の抗原への結合活性は、抗原−抗原結合分子複合体に結合する後述の第2の抗原結合分子(本明細書では、「clamping分子」と呼ぶこともある。)によって増加される。第1の抗原結合分子は、第1の抗原への結合活性が第2の抗原結合分子によって増加されるものであれば特に限定されず、天然の抗体のような軽鎖2分子と重鎖2分子からなる抗体の完全体であってもよく、抗体半分子、ダイアボディ(diabody;Db)、scFv、単鎖抗体、sc(Fv)2、sc(Fab')2等の抗体断片であってもよい。
別の態様において、後述する第1の抗原が受容体である場合、第1の抗原結合分子または第1の抗原結合領域は、当該受容体に対するリガンドであってもよい。例えば、第1の抗原がT細胞受容体複合体、共刺激分子、または共抑制分子である場合には、第1の抗原結合分子または第1の抗原結合領域はそれらのリガンドであってもよい。具体的には、第1の抗原がPD-1である場合、第1の抗原結合分子または第1の抗原結合領域は、PD-L1またはPD-L2であってもよい。
KD(clamping-)/ KD(clamping+)が高いほど、第2の抗原結合分子の非存在下に対する、第2の抗原結合分子の存在下の第1の抗原結合分子または第1の抗原結合領域の第1の抗原への結合活性の増加率が大きいことを意味する。換言すれば、これは、第2の抗原結合分子の存在による第1の抗原結合分子または第1の抗原結合領域の第1の抗原への結合のon/offがより明確であることを意味する。
第1の抗原結合分子を二重特異性抗体とし、第1の抗原を後述の免疫関連分子とした場合、副作用の低減の観点から、好ましくは、第1の抗原結合分子の第1の抗原への結合活性は、SPRによる測定で低結合活性であるか、SPRによる検出が不可能なほど低い。ここで「SPRによる検出が不可能なほど低い」とは、第1の抗原結合分子の第1の抗原に対する結合活性はSPRによる検出が不可能であるが、第1の抗原結合分子の第1の抗原への特異的な結合が僅かながらでも生じることを意味する。第1の抗原結合分子の第1の抗原に対する結合活性がSPRによる検出が不可能なほど低い場合には、上述のKD(clamping-)/ KD(clamping+)は用いられない。
該態様において、第1の抗原結合分子の非存在下に比べた、第1の抗原結合分子の存在下における第2の抗原結合分子の第1の抗原への結合活性の指標として、例えば、SPRにおける、第1の抗原結合分子非存在下における第2の抗原結合分子の遊離している第1の抗原に対する解離定数KD (第1の抗原結合分子−)を、第1の抗原結合分子存在下の第1の抗原に対する第2の抗原結合分子の解離定数KD (第1の抗原結合分子+)で除した、KD (第1の抗原結合分子−)/ KD (第1の抗原結合分子+)が用いられる。上述の「第1の抗原結合分子の存在下における第2の抗原結合分子の第1の抗原への結合活性は、第1の抗原結合分子の非存在下に比べて高い」は、KD (第1の抗原結合分子−)/ KD (第1の抗原結合分子+)が1より高いことを意味する。
第2の抗原結合分子を二重特異性抗体とし、第1の抗原を後述の免疫関連分子とした場合、副作用の低減の観点から、好ましくは、第2の抗原結合分子の遊離している第1の抗原に対する結合活性は、SPRによる測定で低結合活性であるか、SPRによる検出が不可能なほど低い。ここで「SPRによる検出が不可能なほど低い」とは、第2の抗原結合分子の遊離している第1の抗原に対する結合活性はSPRによる検出が不可能であるが、第2の抗原結合分子の遊離している第1の抗原への特異的な結合が僅かながらでも生じることを意味する。第2の抗原結合分子の遊離している第1の抗原に対する結合活性がSPRによる検出が不可能なほど低い場合には、上述のKD (遊離)/ KD (複合体)は用いられない。
一態様において、第1の抗原結合分子の存在下における第2の抗原結合分子の第1の抗原への結合活性を測定する際、および第2の抗原結合分子の抗原−抗原結合分子複合体に対する結合活性を測定する際において、第1の抗原結合分子と融合された第1の抗原を用いてもよい。
一態様において、第2の抗原結合分子の抗原−抗原結合分子複合体に対する結合活性と、第2の抗原結合分子の第1の抗原結合分子への結合活性とを比較する場合には、第1の抗原の存在下で測定した第2の抗原結合分子の第1の抗原結合分子への結合活性が、第1の抗原の非存在下で測定した第2の抗原結合分子の第1の抗原結合分子への結合活性と対比され得る。
第1の抗原は、特に限定されず、如何なる抗原をも包含する。具体的な抗原の種類としては、国際公開第2013/180200号に掲載されている抗原が挙げられる。第1の抗原は、好ましくは、免疫関連分子または細胞代謝物であるが、これらに限定されない。
一態様において、第1の抗原は細胞外に存在するタンパク質である。該細胞外に存在するタンパク質には、細胞膜タンパク質が包含される。好ましくは、該細胞外に存在するタンパク質は細胞膜タンパク質である。
別の態様において、第1の抗原はネイティブなタンパク質である。このネイティブなタンパク質は、遺伝子工学的に細胞に発現させたタンパク質ではないタンパク質である。第1の抗原は、好ましくは、ネイティブな細胞膜タンパク質である。
免疫細胞の細胞膜に存在する分子の具体的な例示は、T細胞活性化因子である、T細胞受容体複合体、共刺激分子、共抑制分子が挙げられる。これらの中でも、T細胞受容体複合体と共刺激分子が好ましい。免疫細胞の細胞膜に存在する分子は、より好ましくは、遺伝子工学的に発現させたタンパク質ではなく、ネイティブなタンパク質である。
共刺激分子としては、CD2、CD27、CD28、CD40、CD137(4−1BB)、CD40、OX40(CD134)、ICOS (Inducible co-stimulator) 、DR3、GITR、CD30、TIM1、SLAM、CD226等が挙げられる。T細胞受容体複合体としてはその構成因子であるCD3が挙げられる。CD3にはサブタイプとして、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζが存在する。これらの中でも、CD3εが好ましい。
共抑制分子としては、CTLA4、PD1、TIM3、TIGIT、CD160、LAG3、LAIR1、B7−1、B7−H1等が挙げられる。
細胞外に放出される分子には、例えば、種々サイトカインが包含される。
癌組織特異的代謝産物としては、乳酸、コハク酸、クエン酸等の解糖系、またはクレブス回路の一次代謝産物、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸等のアミノ酸、キヌレニン(kynurenine)等のアミノ酸の代謝産物、プロスタグランジンE2(Prostaglandin E2)等のアラキドン酸の代謝産物、アデノシン、アデノシン3リン酸(ATP)、アデノシン2リン酸(ADP)、アデノシン1リン酸(AMP)等のプリン環構造を有するヌクレオシド、尿酸、1-メチルニコチンアミド等が挙げられる。これらの中でもプリン環構造を有するヌクレオシドが好ましく、アデノシンがより好ましい。
炎症組織特異的代謝産物としては、プロスタグランジンE2(Prostaglandin E2)等のアラキドン酸の代謝産物、アデノシン、アデノシン3リン酸(ATP)、アデノシン2リン酸(ADP)、アデノシン1リン酸(AMP)等のプリン環構造を有するヌクレオシド、尿酸等が挙げられる。これらの中でもプリン環構造を有するヌクレオシドが好ましく、アデノシンがより好ましい。
第1の抗原結合分子は、単一の抗原に結合するものでもよく、複数の抗原に結合する、いわゆる多重抗原特異性を有するものでもよい。
第1の抗原結合分子が多重抗原特異性を有する場合には、第1の抗原結合分子は少なくとも第2の抗原に結合する。すなわち、第1の抗原結合分子は、第2の抗原に結合する第2の抗原結合領域を含む。第2の抗原結合領域としては、抗体の断片が挙げられる。該抗体の断片は、第2の抗原に結合し得る限り如何なる断片でもよい。該抗体の断片としては、Fv、Fabが挙げられる。
癌抗原の具体的例示は、国際公開第2015/156268号に例示されている癌特異的抗原が挙げられる。免疫関連分子およびその例示は、上述の第1の抗原における免疫関連分子と同様である。第1の抗原が免疫関連分子である場合には、好ましくは、第2の抗原は免疫関連分子以外の抗原であり、より好ましくは癌抗原である。
一態様において、第1の抗原結合分子は、抗原結合領域以外の構成(第1の他の構成)を含んでいてもよく、含まなくてもよい。第1の他の構成は、例えば、抗体断片、リンカー、および細胞傷害剤である。
第1の抗原結合分子に種々の機能を付加できる観点から、好ましくは、第1の抗原結合分子は第1の他の構成を含む。第1の抗原結合分子の血漿中の安定性および製造効率等を向上させるため、第1の他の構成は、好ましくは、抗体断片である。抗体断片としては、抗体のFc領域および抗体の定常領域が挙げられる。
第1の抗原結合分子が抗体のFc領域を含む場合、Fc領域は天然の抗体のFc領域と同じアミノ酸配列を有する天然Fc領域であってもよく、天然Fc領域から改変された改変Fc領域であってもよい。この場合、抗体のFc領域は、IgGのFc領域由来であることが好ましい。該IgGはヒト由来であることが好ましい。
第1の抗原結合分子が抗体の定常領域を含む場合、該定常領域は天然の抗体の定常領域と同じアミノ酸配列を有する天然定常領域であってもよく、天然定常領域から改変された改変定常領域であってもよい。この場合、抗体の該定常領域は、IgGの定常領域由来であることが好ましい。該IgGはヒト由来であることが好ましい。
FcγRへの結合が抑えられたまたは結合しない改変Fc領域または改変定常領域としては、国際公開第2012/073985号に掲載される改変Fc領域または改変定常領域等が挙げられる。
(ii)第1のCH3および第2のCH3のいずれか一方が凸部を有し、他方が凹部を有し、ヘテロ二量体が形成される際に該凸部が該凹部に嵌合して相互作用する、改変
(iii)第1のCH3および第2のCH3が改変されたIgGのCH3であり、該改変されたIgGのCH3はその一部がIgAのCH3の一部と置き換えられており、ヘテロ二量体が形成される際に該第1のCH3に置き換えられた該IgAのCH3の一部と該第2のCH3に置き換えられた該IgAのCH3の一部とが相互作用する、改変
具体的には、例えば一方の重鎖定常領域のアミノ酸配列におけるEUナンバリングシステムでの356位と439位、357位と370位、及び、399位と409位の組み合わせのうち、少なくとも1つの組み合わせを同一の電荷を有するアミノ酸に改変すること、他方の重鎖定常領域のEUナンバリングシステムでの356位と439位、357位と370位、及び、399位と409位の組み合わせのうち、少なくとも1つの組み合わせを一方の重鎖定常領域とは反対の電荷を有するアミノ酸に改変することが挙げられる。より具体的には、例えば、いずれか一方の重鎖定常領域にEUナンバリングシステムでの356位のGluをLysに置換する変異を導入し、他方の重鎖定常領域にEUナンバリングシステムでの439位のLysをGluに置換する変異を導入することが挙げられる。
具体的には、CH3にT366Y,もう一方のCH3にY407Aを導入する組み合わせ、あるいは一方のCH3にT366W、もう一方のCH3にY407Aを導入する組み合わせ、あるいは一方のCH3にF405A、もう一方のCH3にT394Wを導入する組み合わせ、あるいは一方のCH3にY407T、もう一方のCH3にT366Yを導入する組み合わせ、あるいは一方のCH3にT366Y/F405A、もう一方のCH3にT394W/Y407Tを導入する組み合わせ、あるいは一方のCH3にT366W/F405W、もう一方のCH3にT394S/Y407Aを導入する組み合わせ、あるいは一方のCH3にF405W/Y407A、もう一方のCH3にT366W/T394Sを導入する組み合わせ、あるいは一方のCH3にF405W、もう一方のCH3にT394Sを導入する組み合わせ、あるいは一方のCH3にT366W、もう一方のCH3にT366S/L368A/Y407Vを導入する組み合わせ、が挙げられる。該(ii)の改変は該(i)の改変と組み合わせることも可能である。このような組み合わせとしては、例えば、国際公開第2012/058768号に掲載されているものが挙げられる。
第1の抗原がCD3である場合の第1の抗原結合分子または第1の抗原結合領域の例示を以下に示す。この場合、第1の抗原結合分子はCD3に結合する分子である限り、新たに作製したものでも、国際公開第2016/020444号、国際公開第2008/119565号および国際公開第2007/042261号に掲載されいてるような公知のものでもよい。
本例示の具体例としては、第1の抗原結合分子または第1の抗原結合領域は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せがそれぞれ配列番号:1と配列番号:122、配列番号:114と配列番号:115、配列番号:116と配列番号:117、配列番号:118と配列番号:119、および配列番号:120と配列番号:121から選択されるいずれかの組合せからなるCD3結合ポリペプチド、または前記CD3結合ポリペプチドから改変された第1の改変ポリペプチドを含む。第1の改変ポリペプチドのCD3への結合活性はCD3結合ポリペプチドに比べて低い。
本具体例では、好ましくは、第1の抗原結合分子または第1の抗原結合領域は、配列番号:1と配列番号:122、配列番号:114と配列番号:115、配列番号:116と配列番号:117、配列番号:118と配列番号:119、および配列番号:120と配列番号:121から選択されるいずれかの組合せからなるCD3結合ポリペプチドから改変された第1の改変ポリペプチドを含む。その改変は、第1の改変ポリペプチドのCD3への結合活性がCD3結合ポリペプチドに比べて低い限り、如何なるものをも包含する。第1の改変ポリペプチドとその改変元のCD3結合ポリペプチドの間のアミノ酸配列の相同性は、好ましくは80%以上であり、より好ましくは90%以上である。
第1の改変ポリペプチドのCD3への結合活性がSPRによる検出が不可能なほど低い場合には、上述のKD(改変前)/ KD(改変後)は用いられず、後述する第2の抗原結合分子の存在下における、第1の改変ポリペプチドのCD3に対するKDの値が用いられる。第2の抗原結合分子の存在下における、第1の改変ポリペプチドのCD3に対する結合活性は、例えば、第1の抗原結合分子が抗体である場合にその抗体がエフェクター機能を発揮できる範囲であればよい。好ましくは、第2の抗原結合分子の存在下における、第1の改変ポリペプチドのCD3に対する結合活性は、高結合活性である。
本具体例においては、第1の抗原結合分子は、第2の抗原結合分子の非存在下ではCD3に結合しにくいが、第2の抗原結合分子の存在下でCD3に結合しやすくなる。第2の抗原結合分子による第1の抗原結合分子のCD3への結合のon/off機構に有用である。例えば、いずれも多重抗原特異性を有する第1の抗原結合分子および第2の抗原結合分子が組合せられて医薬として用いられた場合に、該機構によりT細胞による細胞傷害活性がより標的細胞特異的に誘導されるため、副作用がより低減される。
第1の抗原結合分子が結合するCD3εのエピトープは、特に限定されない、好ましくは、CD3εのエピトープは少なくともCD3εのN末端から27番目までのアミノ酸配列を含み、より好ましくは、CD3εのエピトープは少なくともCD3εのN末端から8番目までのアミノ酸配列を含み、最も好ましくは、CD3εのエピトープは少なくともCD3εのN末端から5番目までのアミノ酸配列を含む。
第2の改変ポリペプチドのアデノシンへの結合活性がSPRによる検出が不可能なほど低い場合には、上述のKD(改変前)/ KD(改変後)は用いられず、後述する第2の抗原結合分子の存在下における、第2の改変ポリペプチドのアデノシンに対するKDの値が用いられる。第2の抗原結合分子の存在下における、第2の改変ポリペプチドのアデノシンに対する結合活性は、例えば、第1の抗原結合分子が抗体である場合にその抗体がエフェクター機能を発揮できる範囲であればよい。好ましくは、第2の抗原結合分子の存在下における、第2の改変ポリペプチドのアデノシンに対する結合活性は、高結合活性である。
第1の抗原結合分子と組合せて用いられる第2の抗原結合分子は、単一の抗原に結合するものでもよく、複数の抗原に結合する、いわゆる多重抗原特異性を有するものでもよい。第3の抗原結合領域および第3の抗原は、後述する第2の抗原結合分子におけるものと同じである。
本発明の第2の抗原結合分子は、抗原−抗原結合分子複合体に結合する。すなわち、第2の抗原結合分子は、該複合体に結合する複合体結合領域を含む。該複合体は、第1の抗原および該第1の抗原に結合する第1の抗原結合分子を含む。
第2の抗原結合分子は、複合体結合領域を含み、第1の抗原結合分子の第1の抗原への結合活性を増加させるものであれば特に限定されず、天然の抗体のような軽鎖2分子と重鎖2分子からなる抗体の完全体であってもよく、抗体半分子、ダイアボディ(diabody;Db)、scFv、単鎖抗体、sc(Fv)2、sc(Fab')2等の抗体断片であってもよい。
第1の抗原結合分子が重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含む抗体である場合は、第2の抗原結合分子のエピトープは第1の抗原結合分子中の重鎖可変領域または軽鎖可変領域のいずれか一方または両方および、第1の抗原に含まれる。この場合、好ましくは第2の抗原結合分子が結合するエピトープは第1の抗原結合分子中の重鎖可変領域および第1の抗原に含まれる。
第2の抗原結合分子は、該複合体が形成される前後に第1の抗原および第1の抗原結合分子に結合して、第1の抗原結合分子の第1の抗原への結合活性を増加させる。すなわち、第2の抗原結合分子は、該複合体を安定化する。
該態様における第2の抗原結合分子の第1の抗原結合分子から遊離している第1の抗原への結合活性と、第1の抗原結合分子の存在下における第1の抗原への結合活性との対比の指標は、上述の第1の抗原結合分子における指標と同様である。
該態様においては、第2の抗原結合分子の第1の抗原への結合は第1の抗原結合分子の存在により高まる。これは、第2の抗原結合分子の第1の抗原への特異性は、第1の抗原結合分子の存在により高くなることを意味する。この特性を利用することにより、特に第1の抗原結合分子と第2の抗原結合分子が二重抗原特異性を有し、両分子が医薬として組合せて用いられた場合に、副作用がより低減される。
第1の抗原がCD3である場合の第2の抗原結合分子または第2の抗原結合領域の例示を以下に示す。本例示の具体例は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せがそれぞれ配列番号:45と配列番号:46、配列番号:47と配列番号:48、配列番号:49と配列番号:50および配列番号:51と配列番号:52から選択されるいずれかの組合せからなるポリペプチドを含む第2の抗原結合分子または第2の抗原結合領域である。
重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せがそれぞれ配列番号:160と配列番号:161、配列番号:162と配列番号:163、および配列番号:164と配列番号:165から選択されるいずれかの組合せからなるポリペプチド。
第2の抗原結合分子は、単一の抗原に結合するものでもよく、複数の抗原に結合する、いわゆる多重抗原特異性を有するものでもよい。
第2の抗原結合分子が多重抗原特異性を有する場合には、第2の抗原結合分子は少なくとも第3の抗原に結合する。すなわち、第2の抗原結合分子は、第3の抗原に結合する第3の抗原結合領域を含む。第3の抗原結合領域としては、抗体の断片が挙げられる。該抗体の断片は、第3の抗原に結合し得る限り如何なる断片でもよい。該抗体の断片としては、Fv、Fabが挙げられる。
癌抗原の具体的例示は、上述の第2の抗原における癌抗原と同様である。ただし、第2の抗原と第3の抗原がいずれも癌抗原である場合には、好ましくは、第2の抗原と第3の抗原は異種の癌抗原である。より好ましくは、第2の抗原と第3の抗原は、同じ癌細胞または癌組織に発現する異種の癌抗原である。
免疫関連分子およびその例示は、上述の第1の抗原における免疫関連分子と同様である。ただし、第1の抗原と第3の抗原がいずれも免疫関連分子である場合には、好ましくは、第1の抗原と第3の抗原は異種の免疫関連分子である。ここで言う「異種」とは、単一のタンパク質の一次構造または高次構造の表面における異なる領域である場合を包含する。
一態様において、第3の抗原は細胞外に存在するタンパク質である。該細胞外に存在するタンパク質には、細胞膜タンパク質をも包含される。好ましくは、該細胞外に存在するタンパク質は細胞膜タンパク質である。
一態様において、第2の抗原結合分子は、抗原結合領域以外の構成(第2の他の構成)を含んでいてもよく、含まなくてもよい。第2の他の構成は、例えば、抗体断片、リンカーおよび標識化合物である。
第2の抗原結合分子に種々の機能を付加できる観点から、好ましくは、第2の抗原結合分子は第2の他の構成を含む。第1の抗原結合分子の血漿中の安定性および製造効率等を向上させるため、第2の他の構成は、好ましくは、抗体断片である。抗体断片としては、抗体のFc領域および抗体の定常領域が挙げられる。
第2の抗原結合分子が抗体のFc領域を含む場合、Fc領域は天然の抗体のFc領域と同じアミノ酸配列を有する天然Fc領域であってもよく、天然Fc領域から改変された改変Fc領域であってもよい。この場合、抗体のFc領域は、IgGのFc領域由来であることが好ましい。該IgGはヒト由来であることが好ましい。
第2の抗原結合分子が抗体の定常領域を含む場合、該定常領域は天然の抗体の定常領域と同じアミノ酸配列を有する天然定常領域であってもよく、天然定常領域から改変された改変定常領域であってもよい。この場合、抗体の該定常領域は、IgGの定常領域由来であることが好ましい。該IgGはヒト由来であることが好ましい。
第2の抗原結合分子と組合せて用いられる第1の抗原結合分子の第1の抗原は、上述の第1の抗原結合分子におけるものと同じである。
第2の抗原結合分子と組合せて用いられる第1の抗原結合分子は、単一の抗原に結合するものでもよく、複数の抗原に結合する、いわゆる多重抗原特異性を有するものでもよい。第2の抗原結合領域および第2の抗原は、上述の第1の抗原結合分子におけるものと同じである。
第1の抗原結合分子と第2の抗原結合分子の両方が多重抗原特異性を有する場合において、第1の抗原と、第2の抗原と、第3の抗原の種類は、以下の(1)〜(5)のいずれかの組合せであることが好ましい。
(1)第1の抗原が免疫関連分子であり、第2の抗原が第1の癌抗原であり、第3の抗原が第2の癌抗原である組合せ
(2)第1の抗原が標的細胞の細胞代謝物であり、第2の抗原が癌抗原であり、第3の抗原が免疫関連分子である組合せ
(3)前記第1の抗原が標的細胞の細胞代謝物であり、前記第2の抗原が免疫関連分子であり、前記第3の抗原が癌抗原である組合せ
(4)前記第1の抗原が第1の免疫関連分子であり、前記第2の抗原が癌抗原であり、前記第3の抗原が第2の免疫関連分子である組合せ
(5)前記第1の抗原が第1の免疫関連分子であり、前記第2の抗原が第2の免疫関連分子であり、前記第3の抗原が癌抗原である組合せ
特に上記(1)においては、副作用をさらに低減する観点から、好ましくは第2の癌抗原の種類は第1の抗原と異なる。この場合において、より好ましくは第1の抗原は第2の抗原と同じ癌組織もしくは炎症組織に特異的に発現している。
上記(4)においては、副作用をさらに低減する観点から、第2の免疫関連分子の種類が好ましくは第1の免疫関連分子と異なる。この場合において、より好ましくは第2の免疫関連分子はCD8である。さらに好ましくは第1の免疫関連分子はCD3である。
a.第1の抗原結合分子
第1の抗原結合分子として用いられるものは、第1の抗原に結合する第1の抗原結合領域を含む分子であれば如何なる化合物でよい。第1の抗原結合分子は、低分子化合物、高分子化合物、またはこれらの融合分子でよい。
第1の抗原結合領域としては、例えば、抗体の可変領域が挙げられる。抗原結合領域をコードするcDNAは、国際公開第2013/180200号に掲載されるような、精製抗原による免疫またはDNA免疫、免疫された動物からの免疫細胞の採取、ハイブリドーマの形成、およびハイブリドーマから可変領域をコードするcDNAのクローニングなど、一般的な抗体作製手順により取得可能である。可変領域は、ヒト化されてもよい。クローニングされたcDNAを用いて公知のタンパク質発現系により発現した可変領域は、そのまま第1の抗原結合分子として用いられる。
SPRによる測定で第1の抗原への結合活性が低結合活性である、またはSPRによる検出が不可能なほど低い第1の抗原結合分子は、SPRによる測定で第1の抗原への結合が高結合活性なものから、アラニンスキャン(Biochemistry Vol.32, No.27, 1993, 6828-6835)などの抗体改変技術によりその抗原結合活性を減弱することで作製され得る。SPRによるカイネティクス解析からKD値が算出できないほど結合性の低い第1の抗原結合分子は、上述の一般的な抗体作製手順により作製される。例えば、SPRによる検出が不可能なほど低い第1の抗原結合分子は、まずELISAなど異なるモードの分子間相互作用の測定で第1の抗原への結合活性が検出されたポリペプチド候補群を得て、次いで、該ポリペプチド候補群からSPRによっては検出が不可能なポリペプチドを特定するスクリーニング方法により作製される。
第2の抗原結合分子は、第1の抗原結合分子の第1の抗原への結合活性を増加させるものをスクリーニングすることにより同定される。第2の抗原結合分子は、例えば、化合物または抗体もしくはその断片のライブラリから、公知の結合活性を測定する方法により同定すればよい。具体的には、以下の(方法I)および(方法II)が挙げられる。
SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイを用いた第1の抗原結合分子の第1の抗原への結合活性が、化合物または抗体もしくはその断片のライブラリから任意に選択される1つの化合物または抗体もしくはその断片が存在する条件では検出されるが、前記1つの化合物または抗体もしくはその断片が存在しない条件では検出不可能である場合に、前記1つの化合物または抗体もしくはその断片を第2の抗原結合分子として同定することを含む、スクリーニング方法。
SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイを用いた第1の抗原結合分子の第1の抗原への結合活性が、化合物または抗体もしくはその断片のライブラリから任意に選択される1つの化合物または抗体もしくはその断片が存在しない条件に比べて、前記1つの化合物または抗体もしくはその断片が存在する条件で高い場合に、前記1つの化合物または抗体もしくはその断片を第2の抗原結合分子として同定することを含む、スクリーニング方法。
(a)哺乳動物に第1の抗原と第1の抗原結合分子からなる抗原−抗原結合分子複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第1の群を得る工程、
(b)前記第1の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第1の抗原および該複合体を形成していない第1の抗原結合分子のいずれか一方または両方への結合活性が検出不可能であるモノクローナル抗体を産生する第2の群を選択する工程、
(c)前記第2の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて第1の抗原結合分子の第1の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第3の群を選択し、前記第3の群を第2の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程を含む、スクリーニング方法。
(a)哺乳動物に第1の抗原と第1の抗原結合分子からなる抗原−抗原結合分子複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第1の群を得る工程、
(b)前記第1の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第1の抗原および該複合体を形成していない第1の抗原結合分子のいずれか一方または両方への結合活性が、該複合体への結合に比べ低いモノクローナル抗体を産生する第2の群を選択する工程、
(c)前記第2の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて第1の抗原結合分子の第1の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第3の群を選択し、前記第3の群を第2の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程を含む、スクリーニング方法。
(a)哺乳動物に第1の抗原と第1の抗原結合領域からなる抗原−抗原結合領域複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第1の群を得る工程、
(b)前記第1の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第1の抗原および該複合体を形成していない第1の抗原結合領域のいずれか一方または両方への結合活性が検出不可能であるモノクローナル抗体を産生する第2の群を選択する工程、
(c)前記第2の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて第1の抗原結合領域の第1の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第3の群を選択し、前記第3の群を第2の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程を含む、スクリーニング方法。
(a)哺乳動物に第1の抗原と第1の抗原結合領域からなる抗原−抗原結合領域複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第1の群を得る工程、
(b)前記第1の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第1の抗原および該複合体を形成していない第1の抗原結合領域のいずれか一方または両方への結合活性が、該複合体への結合に比べ低いモノクローナル抗体を産生する第2の群を選択する工程、
(c)前記第2の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて第1の抗原結合領域の第1の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第3の群を選択し、前記第3の群を第2の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程を含む、スクリーニング方法。
これら(方法I)から(方法VI)の中でも、第1の抗原結合分子と第2の抗原結合分子を二重特異性抗体とし医薬として用いた場合に副作用を低減する観点から(方法III)から(方法VI)が好ましい。スクリーニングの効率性の観点から(方法V)および(方法VI)がより好ましく、副作用をさらに低減する観点から(方法III)および(方法V)がより好ましく、いずれの観点から(方法V)が最も好ましい。
(d)以下の(a)工程から(c)工程を含むスクリーニング方法により得られた抗体産生細胞を培養する工程;
(a)哺乳動物に第1の抗原と第1の抗原結合分子からなる抗原−抗原結合分子複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第1の群を得る工程、
(b)前記第1の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第1の抗原および該複合体を形成していない第1の抗原結合分子のいずれか一方または両方への結合活性が検出不可能であるモノクローナル抗体を産生する第2の群を選択する工程、
(c)前記第2の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて第1の抗原結合分子の第1の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第3の群を選択し、前記第3の群を第2の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程;
(e)前記抗体産生細胞培養物から培養上清または細胞破砕物を得る工程、
(f)前記培養上清または細胞破砕物から第2の抗原結合分子を精製する工程を含む、第2の抗原結合分子の製造方法。
(d)以下の(a)工程から(c)工程を含むスクリーニング方法により得られた抗体産生細胞を培養する工程;
(a)哺乳動物に第1の抗原と第1の抗原結合分子からなる抗原−抗原結合分子複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第1の群を得る工程、
(b)前記第1の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第1の抗原および該複合体を形成していない第1の抗原結合分子のいずれか一方または両方への結合活性が、該複合体への結合に比べ低いモノクローナル抗体を産生する第2の群を選択する工程、
(c)前記第2の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて第1の抗原結合分子の第1の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第3の群を選択し、前記第3の群を第2の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程;
(e)前記抗体産生細胞培養物から培養上清または細胞破砕物を得る工程、
(f)前記培養上清または細胞破砕物から第2の抗原結合分子を精製する工程を含む、第2の抗原結合分子の製造方法。
(d)以下の(a)工程から(c)工程を含むスクリーニング方法により得られた抗体産生細胞を培養する工程;
(a)哺乳動物に第1の抗原と第1の抗原結合領域からなる抗原−抗原結合領域複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第1の群を得る工程、
(b)前記第1の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第1の抗原および該複合体を形成していない第1の抗原結合領域のいずれか一方または両方への結合活性が検出不可能であるモノクローナル抗体を産生する第2の群を選択する工程、
(c)前記第2の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて第1の抗原結合領域の第1の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第3の群を選択し、前記第3の群を第2の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程;
(e)前記抗体産生細胞培養物から培養上清または細胞破砕物を得る工程、
(f)前記培養上清または細胞破砕物から第2の抗原結合分子を精製する工程を含む、第2の抗原結合分子の製造方法。
(d)以下の(a)工程から(c)工程を含むスクリーニング方法により得られた抗体産生細胞を培養する工程;
(a)哺乳動物に第1の抗原と第1の抗原結合領域からなる抗原−抗原結合領域複合体を免疫し、該複合体に結合するモノクローナル抗体を産生する抗体産生細胞の第1の群を得る工程、
(b)前記第1の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて該複合体を形成していない第1の抗原および該複合体を形成していない第1の抗原結合領域のいずれか一方または両方への結合活性が、該複合体への結合に比べ低いモノクローナル抗体を産生する第2の群を選択する工程、
(c)前記第2の群から、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイにおいて第1の抗原結合領域の第1の抗原への結合活性を増強するモノクローナル抗体を産生する第3の群を選択し、前記第3の群を第2の抗原結合分子を産生する抗体産生細胞として同定する工程;
(e)前記抗体産生細胞培養物から培養上清または細胞破砕物を得る工程、
(f)前記培養上清または細胞破砕物から第2の抗原結合分子を精製する工程を含む、第2の抗原結合分子の製造方法。
第1の抗原に結合する第1の抗原結合分子をアミノ酸改変して、SPR、BLIおよびELISAから選択される少なくとも1つのアッセイで前記第1の抗原への結合が低下したまたは検出限界下である第1の抗原結合分子の改変体を得る第1の工程、
既存のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリから、前記第1の抗原および前記改変体のいずれか一方または両方に結合する抗原結合分子を提示するファージを除去した、第1のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを得る第2の工程、および
前記第1のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリから、前記第1の抗原および前記第1の抗原結合分子を含む抗原−抗原結合分子複合体に結合する抗原結合分子を提示するファージを濃縮した第2のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを得る第3の工程を含む、ファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリの製造方法。
既存のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリから、(i)第1の抗原に結合し得るが前記第1の抗原に結合していない第1の抗原結合分子に結合し、および(ii)前記第1の抗原結合分子に結合していない前記第1の抗原に結合する、抗原結合分子を提示するファージを除去した、第1のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを得る第1の工程、ならびに
前記第1のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリから、前記第1の抗原および前記第1の抗原結合分子を含む抗原−抗原結合分子複合体に結合する抗原結合分子を提示するファージを濃縮した第2のファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリを得る第2の工程を含む、ファージディスプレイ抗原結合分子ライブラリの製造方法。
本発明の組合せは、上述の第1の抗原結合分子と、上述の第2の抗原結合分子との組合せである。第1の抗原と第2の抗原と第3の抗原の組合せが、上述の「D.第1の抗原と第2の抗原と第3の抗原の好適な組合せ」における(1)〜(5)のいずれかの組合せである場合には、該組合せはTDCC活性誘導剤またはADCC活性誘導剤であることが好ましく、TDCC活性誘導剤であることがより好ましい。
該組合せは、医薬組成物であることが好ましい。該組合せが医薬組成物である場合において、第1の抗原結合分子と第2の抗原結合分子は、同時に投与されてもよく、別々に投与されてもよい。好ましくは、第1の抗原結合分子と第2の抗原結合分子は、別々に投与される。
第1の抗原結合分子と第2の抗原結合分子とが別々に製剤化された場合、それらを組合せてキット化してもよく、一方の製剤の添付文書に他方の製剤と組合せて用いられることを記載してもよい。前者の例としては、第1の抗原結合分子と第2の抗原結合分子を別々のアンプルに充填し、両アンプルを一の箱に梱包してキット化することが挙げられる。
医薬組成物は、第1の抗原結合分子および第2の抗原結合分子以外にその他の成分を含有していてもよい。
その他の成分としては、例えば、薬学的に許容される担体が挙げられる。
医薬組成物は、好ましくは非経口投与により投与される。例えば、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型の組成物とすることができる。例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
医薬組成物の対象疾患は、特に限定されない。好ましくは、対象疾患は、第1の抗原が細胞代謝物である場合には該細胞代謝物が正常組織に比べ高レベルに発現する疾患であり、第1の抗原が免疫代謝物である場合には第2の抗原および第3の抗原が正常組織に比べ高レベルに発現する疾患である。すなわち、該疾患は、第1の抗原結合分子と第2の抗原結合分子が共同して標的細胞にエフェクター細胞、特にT細胞を誘導し、エフェクター機能、特にTDCC活性を発揮させることが望ましい疾患である。
具体的な対象疾患としては、例えば、細胞増殖性疾患、免疫亢進性疾患、感染性疾患などが挙げられる。細胞増殖性疾患としては、腫瘍が挙げられる。免疫亢進性疾患としては、自己免疫疾患が挙げられる。感染性疾患としては、細菌感染およびウイルス感染が挙げられる。
本発明の組合せは、医薬組成物以外の用途にも用いられる。
一の態様において、第1の抗原が細胞代謝物のような低分子化合物である場合、本発明の組合せは、低分子化合物を検出するためのより簡便なアッセイに有用である。低分子化合物の検出のために、通常SPRやHPLCが用いられるが、ELISAなどで用いられるサンドイッチ法は抗原が小さすぎるため適用することは困難であることが多い。しかし、該組合せによれば、第1の抗原結合分子と第2の抗原結合分子が低分子化合物を挟み込んで同時に結合することができることから、より簡便な低分子化合物の検出系が提供され得る。
上述の第1の抗原結合分子と第2の抗原結合分子を組合せて医薬として用いる場合、第1の抗原結合分子と第2の抗原結合分子は、同時に投与されてもよく、別々に投与されてもよい。どのように投与されるかは、第1の抗原結合分子と第2の抗原結合分子の薬物動態や作用機序に基づき決定されればよい。
投与量及び投与方法は、患者の体重、年齢、症状などにより変動するが、当業者であればそれらの条件を考慮し適当な投与量及び投与方法を設定することが可能である。
本実施例は本発明の一態様を示すものである。本発明における抗原は本実施例で用いられたものに必ずしも限定されない。
抗原と結合した抗体を認識して結合する抗体のコンセプト
副作用を回避しつつ薬効を発揮するために、正常組織や血液中において全身的に作用せず、病変部位である癌や炎症部位においてのみ作用するような創薬技術が求められている。例えば、EGFR-BiTE(非特許文献: BiTE: Baeuerle PA et. al. Curr. Opin. Mol. Ther. 2009. 11, 22-30)はCD3を介してT細胞をリクルートし活性化することによって抗腫瘍効果を発揮するため、EGFR-BiTEに対して、癌細胞近傍にいるT細胞に発現しているCD3には結合するが、癌細胞近傍以外にいるT細胞に発現しているCD3に結合しない性質を付与することができれば、そのような性質を付与された改変EGFR-BiTEは、癌においてのみT細胞を活性化することが可能であり、副作用を回避しつつ強力な抗腫瘍効果を発揮することが可能となる。
そこで、癌組織において高濃度に存在すると考えられる低分子として知られるアデノシン(adenosine)に対する結合抗体、CD3シグナルを誘導可能な抗CD3抗体に対するクランピング抗体の取得が試みられた。
減弱型CD3抗体の取得
抗CD3抗体CE115HA000はCD3εを認識するラット由来抗体をヒト化した抗体である。抗原決定領域(CDR)に変異導入することにより、TDCCの誘導能の異なるバリアントが得られている。これらのうちTDCC活性が減弱したCE115HA146とTDCC活性が認められないCE115HA056を使用した。重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列番号:1-3に示す。
抗CD3抗体に対するクランピング抗体の取得
(1)抗原調製
CE115HA146重鎖N末側に、GSリンカー(GGGSGGGS、配列番号:4)を介してエピトープとなるCD3εの8残基のアミノ酸(QDGNEEMG、配列番号:5)が連結するように設計した抗体(CE115HAPG13-rabCH1hG1m、配列番号:6)をコードする遺伝子作製し、哺乳動物培養細胞用発現ベクターに組み込んだ。対応する軽鎖(GLS3000-rabk、配列番号:7)をコードする遺伝子も同様に哺乳動物培養細胞用発現ベクターに組み込んだ。これら発現ベクターをFreeStyle 293F細胞(Thermo Fisher Scinetific)にトランスフェクション試薬293fectin Tranfection Reagent(Thermo Fisher Scientific)を用い、メーカー提供のマニュアルに従って導入し、5日間培養したのち培養液を回収した。回収した培養液からrProteinA Sepharose Fast Flow樹脂(GE Healthcare)によるアフィニティ精製にて抗体を精製した。精製抗体10 mgに、プロテアーゼ、FabRICATOR(Genovis)を1500 unit加え、15時間、37℃で切断した。その後、Eshmuno A樹脂(Merck Millipore)の素通り画分をゲルろ過カラムに供して、CD3εエピトープ融合F(ab’)2断片を調製した。精製したタンパク質の濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて算出した(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423)。
ウサギの免疫は、CD3εエピトープ融合F(ab’)2溶液とTiterMax Gold(TiterMax USA)を混合して作製したエマルジョンを皮下注射することで実施した。4回の免疫後、抗体産生の認められたウサギの血液および脾臓を採取した。抗原に特異的なB細胞受容体を表面に提示しているB細胞を濃縮するために、抹消血単核球および脾細胞を調製し、CD3εエピトープ融合CE115HA146(CE115HAPG13rabCH1hG1m/GLS3000-rabk、配列番号:6、7)および、Alexa647(Invitrogen)で標識したCE115HA146(CE115HA146-rabCH1hG1m/ GLS3000-rabk、配列番号:8、7)とを反応させ、結合した抗体をDyLite488で標識した抗ヒトIgG抗体、Goat anti-Human IgG Fc Cross Absorbed DyLight488 conjugate(Thermo Fisher Scientific)で染色した。DyLite488のみで染色された細胞をセルソーター(FACS Aria III, BD)により分離し、1細胞/wellとなるように96 wellプレートに播種し、25000細胞/wellのEL4細胞存在下、BT培地で10日間培養した。なおEL4細胞は予めmytomycin C(Sigma-Aldrich)で処理をすることで細胞増殖が抑制されたものを使用した。BT培地は、RPMI 1640 with L-Gln(nacalai tesque)に、Fetal Bovine Serum, ultra-low IgG(Life technologies)、1/20容量のウサギT細胞培養培地を添加して作製した。ウサギT細胞培養培地はPhytohemagglutinin-M (Roche), phorbol 12-myristate 13-acetate (Sigma-Aldrich) 2% FBSを添加したRPMI-1640培地でウサギT細胞を培養することで調製した。
B細胞クローニングおよびELISAによるスクリーニングで選抜された抗体の遺伝子をFreeStyle 293F細胞に導入して抗体の発現を行った。6wellの細胞培養プレートに1 wellあたり5 mLの培地を添加してメーカーのマニュアルに従いトランスフェクションを実施した。4日間の培養後、細胞上清を調製し、rProteinA Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)を用いたバッチ精製により同業者公知の方法により精製抗体を得た。抗体濃度は上記(1)でのタンパク質の濃度の算出と同様の方法で算出した。十分な発現が得られたクローンは212クローンであった。
標的細胞としてSK-HEP-1細胞(ATCC HTB-52)にヒトGPC3を強制発現させたSK-pca60細胞株を使用し、エフェクター細胞としてCD3シグナルによりLuciferaseを発現するNFAT-RE-luc2-Jurkat細胞(Jurkat-luc細胞、Promega)を使用した。25 μLのAssay buffer(10%FBS (HyClone)、1×MEM Non-Essential Amino Acids Solution (Gibco)、1mM Sodium Pyruvateを含むRPMI-1640 (Nacalai teesuque))にBiAb1を0.09 μg/mL、BiAb2を0.3 μg/mLとなるように白色96 wellプレート(Corning)に添加した。また、各プレートにはプレート間のシグナル補正およびコントロールのため、抗体非添加、BiAb1のみ、BiAb2のみ添加ウェルをそれぞれ用意し、添加液量は25 μLとなるように不足分はAssay bufferにて調整した。抗体溶液添加後、標的細胞を25 μL/well (1×104 細胞/ well)、Jurkat-Luc細胞溶液を25 μL/well (1×104 細胞/ well)を播種し、37℃、5% CO2条件下で6時間培養した。96 wellプレートを常温で15分間静置した後、Bio-Glo Luciferase assay reagent (Promega)を75 μL添加し、撹拌後、10分間反応させ、プレートリーダーEnVision(Perkin Elmer)で発光測定を行った。
TDCC活性の指標としての相対発光強度の平均値(RLU)を下記の式1により補正した。
表面プラズモン共鳴(SPR)による抗CD3抗体-CD3εペプチド複合体とクランピング抗体との結合性評価
(1)アナライトおよびリガンドの調製
アナライトは、実施例3で得られた4クローン、CLA0022、CLA0028、CLA0311、CLA0334の抗体より調製したFab断片を使用した。具体的には、それぞれの抗体の配列CLA0022VH-F760mnP17/CLA0022VL-k0C(配列番号:53、54)、CLA0028VH-F760mnP17/CLA0028VL-k0C(配列番号:55、56)、CLA0311VH-F760mnP17/CLA0311VL-k0C(配列番号:57、58)、CLA0334VH-F760mnP17/CLA0334VL-k0C(配列番号:59、60))をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターをExpiFectamine293(Thermo Fisher Scientific)を用いてExpi293Fに導入し、培養5日目の培養上清を回収し、HiTrap MabSelect SuReを用いて同業者公知の方法で調製した。精製抗体からPierce Fab Preparation Kit(Thermo Fisher Scientific)を用い、メーカー添付のマニュアルに従ってFab断片を調製した。得られたFab断片の濃度は実施例3(1)でのタンパク質の濃度の算出と同様の方法で算出した。
センサーチップCM4にAcetate4.5(GE Healthcare)にて25 μg/mLに調製したSuRe protein A(GE Healthcare)をアミンカップリングキット(GE healthcare)を用いて1フローセルあたり約1000 RUを固定化した。
Bio-layer Interferometry (BLI)によるCD3εδとの結合性評価
(1)ビオチン化ヒトCD3εδヘテロダイマーの調製
ビオチン化ヒトCD3εδヘテロダイマー(以下CD3εδ)は当業者公知の方法で調製した。具体的には、ヒトCD3εの細胞外領域をコードする遺伝子断片の下流に抗体の定常領域をコードする遺伝子断片、TEVプロテアーゼで切断される配列(ENLYFQG、配列番号:67)をコードする遺伝子断片とビオチンリガーゼによってビオチンが付加されるAvi tag(GLNDIFEAQKIEWHE、配列番号:68)をコードする遺伝子断片をグリシンとセリンで構成されるリンカーをコードする遺伝子断片を介して連結した。ヒトCD3εの細胞外領域、抗体の定常領域、TEVプロテアーゼ切断配列とAvi tagが連結されたタンパク質(Fc融合型ヒトCD3ε、配列番号:69)をコードする遺伝子断片を動物細胞発現用ベクターに組み込んだ。次に、ヒトCD3δの細胞外領域をコードする遺伝子断片の下流に抗体の定常領域をコードする遺伝子断片とFlag tag(DYKDDDDK、配列番号:70)をコードする遺伝子断片を連結した。ヒトCD3δの細胞外領域、抗体の定常領域、Flag tagが連結されたタンパク質(Fc融合型ヒトCD3δ、配列番号:71)をコードする遺伝子断片を動物細胞発現用ベクターに組み込んだ。構築された2種類のプラスミドベクターはExpiFectamine 293(Thermo Fisher Scientific)を用いてFreeStyle 293F細胞 (Invitrogen)に導入された。遺伝子導入の際に、CD3εのAvi tagをビオチン化する目的でビオチンリガーゼ(BirA、配列番号:72)を発現する遺伝子とビオチンを添加した。遺伝子導入した細胞を37℃、8% CO2で培養し、目的タンパク質を培養上清中に分泌させた。この細胞培養液を0.22μmボトルトップフィルターでろ過し、培養上清を得た。
抗原であるCD3εδと抗体を1:1で結合させる目的で、ワンアーム型の抗体CE115HA000 one arm(CE115HA000-pE22Hh/GLS3000-k0//Kn010、配列番号:73、20、74)、CE115HA056 one arm(CE115HA056- pE22Hh/GLS3000-k0//Kn010、配列番号:75、20、74)、CE115HA146 one arm(CE115HA146-pE22Hh/GLS3000-k0//Kn010、配列番号:76、20、74)および陰性対照の抗KLH抗体IC17 one arm(IC17Hdk-pE22Hh/IC17L-k0//Kn010、配列番号:77、66、74)を調製した。それぞれの抗体重鎖をコードする遺伝子、軽鎖をコードする遺伝子とともに可変領域を持たない抗体断片をコードする遺伝子をExpiFectamine293(Thermo Fisher Scientific)を用いてExpi293Fに導入し、実施例4(1)と同様の方法で精製抗体を調製した。
Octet RED 384(ForteBio)を使用してストレプトアビジンセンサー(ForteBio)に、ACESにて0.2μM調製したCD3εδを37℃、300秒間反応させた。次いで0、111、333、1000 nMのCE115HA000 one arm、CE115HA056 one arm、CE115HA146 one armおよび陰性対照のIC17 one armを120秒間反応させた後、1μMのクランピング抗体Fab断片(実施例4(1)参照)含有HBS-EP(+)バッファー中で120秒間解離をモニターした。3秒ごとのレスポンス値を抽出し、Microsoft Excel 2013(Microsoft)を用いてグラフを作製した。図5に示すように、ランニングバッファーのみ、あるいは陰性対照のIC17 Fabを添加した場合は、CD3抗体の速やかな解離が認められたのに対し、クランピング抗体CLA0022、CLA0028、CLA0311、CLA0334より調製したFabを添加した場合には、抗CD3抗体の結合レスポンスにさらなるレスポンスの増加、あるいは解離の遅延が認められたことから、クランピング抗体の添加によりCD3εδと抗CD3抗体複合体が安定化されていると考えられた。
ヒト末梢血単球(PBMC)を用いたTDCC活性評価
(1)ヒトPBMC溶液の調製
1000 単位/mL のヘパリン溶液(ノボ・ヘパリン注5千単位,ノボ・ノルディスク)が予め200μL注入された注射器を用い、中外製薬株式会社所属の健常人ボランティアより末梢血50 mLを採取した。PBS(-)を用いて2倍に希釈された当該末梢血を4等分し、15 mLのFicoll-Paque PLUSが予め注入されて遠心操作が行なわれたLeucosepリンパ球分離管(Greiner bio-one)に加えた。当該末梢血が分注された分離管が1,000 x gの速度によって10分間室温にて遠心分離の操作をした後、単核球画分層を分取した。10%FBSを含むRPMI-1640 Medium(以下10%FBS/RPMI)10 mLによって1回当該各分層に含まれる細胞を洗浄した後、標的細胞に応じて10%FBS/RPMI、Dulbecco's Modified Eagle's Medium(以下10%FBS/D-MEM)、Eagle's Minimal Essential Medium(以下10%FBS/E-MEM)を用いて当該細胞が5×105 細胞/mLもしくは1×106 細胞/ mLとなるように懸濁し、ヒトPBMC溶液として以後の実験に供した。
SK-pca60(GPC3 陽性細胞)、NCI-H446(ATCC HTB-171, GPC3 陽性細胞)、ヒトEREGをSK-HEP-1細胞に強制発現させたSKE-4B2(ヒトEREG陽性細胞)、ヒトEREGとヒトGPC3をSK-HEP-1に強制発現させたhEREG/SK-pca60(ヒトEREG、GPC3陽性細胞)をCell dissociation bufferにてディッシュから剥離し、SK-pca60が10%FBS/D-MEM中にその細胞密度が6×104 細胞/mL、NCI-H446が10%FBS/RPMI中にその細胞密度が2×105 細胞/mL、SKE-4B2が10%FBS/E-MEM中にその細胞密度が1×105 細胞/mL、hEREG/SK-pca60が10%FBS/E-MEM中にその細胞密度が1×105 細胞/mLとなるように懸濁した。当該細胞懸濁液を標的細胞として以後の実験に供した。
GCH065-F760mnN17/L0011-k0(配列番号:17、18)、EGLVH-F760mnN17/EGLVL-KT0(配列番号:78、79)、CE115HA000-F760mnP17/GLS3000-k0(配列番号:63、20)、CE115HA056-F760mnP17/GLS3000-k0(配列番号:64、20)、CLA0028VH-F760-mnP17/CLA0028VL-k0C(配列番号:55、56)、IC17Hdk-F760mnN17/IC17L-k0(配列番号:65、66)の各抗体は、それぞれの重鎖、軽鎖遺伝子を組み込んだ発現ベクターをExpiFectamine293(Thermo Fisher Scientific)を用いてExpi293F細胞(Thermo Fisher Scientific)に導入し、実施例4(1)と同様の方法で精製抗体を調製した。
xCELLigence(ACEA Biosciences)を用い、電極への細胞接着に伴い生じる電気抵抗値を測定することにより、TDCC活性を評価した。まず、RTCA Resistor プレート 96に標的細胞調製に用いた培地を50μL/wellで添加し、バックグラウンド値を補正した。
一方、NCI-H446、SKE-4B2、hEREG/SK-pca60を標的細胞として使用した場合には、細胞を播種した翌日に各濃度(0、0.008、0.08、0.8、8 μg/mL)になるように調製したBiAb2 を25 μL/wellと各濃度(0、0.008、0.08、0.8、8 μg/mL)に調製したBiAb1 を25 μL /wellで添加した。その後、標的細胞の5倍量の細胞数を含むヒトPBMC懸濁液を50 μL/wellで添加し、xCELLigenceへ当該プレートを設置後、37℃、5% CO2条件下で120時間培養し、その間の電気抵抗値(Cell index)を10分間隔で経時的に測定した。
TDCC活性の指標として細胞増殖阻害率(CGI)を下記の式2により算出した。
抗体ライブラリからのアデノシン結合抗体とアデノシンまたはアデノシン誘導体の複合体を認識するクランピング抗体の取得
国際公開第2015/156268号に記載のナイーブヒト抗体ファージディスプレイライブラリ及び合成ヒト抗体ファージディスプレイライブラリからファージディスプレイ法により、アデノシン結合抗体とアデノシンまたはアデノシン誘導体の複合体に結合するクランピング抗体を取得した。国際公開第2015/083764号で取得された重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を参照し、SMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0a(配列番号:80、81)をアデノシン結合抗体として用いた。すなわち、磁性ビーズにキャプチャーされたアデノシン結合抗体SMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aにアデノシンまたはアデノシン誘導体の存在下で結合活性を示し、SMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aに1アミノ酸置換しアデノシン結合活性が減弱された変異体であるSMBh068-G1m3/SMB0002hL-k0a(配列番号:82、81)、SMBh508-G1m3/SMB0002hL-k0a(配列番号:83、81)、SMBh606-G1m3/SMB0002hL-k0a(配列番号:84、81)、SMB0002hH-G1m3/SMBl234-k0a(配列番号:80、85)及びSMB0002hH-G1m3/SMBl255-k0a(配列番号:80、86)には結合活性を示さないファージが回収された。本取得方法では、パンニング抗原としてEZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin (Thermo Fisher Scientific)を用いて当業者公知の方法でビオチン標識されたアデノシン結合抗体とその変異体が用いられた。
同様のパンニング操作をアデノシン誘導体を添加して実施した。
ファージELISAによるアデノシン結合抗体とアデノシンの複合体に対する結合活性の評価
実施例7で得られた大腸菌のシングルコロニーから常法(Methods Mol. Biol. (2002) 178, 133-145)に倣い、ファージ含有培養上清が回収された。大腸菌のシングルコロニーから当業者公知の方法で抗体遺伝子の塩基配列を決定した。回収された培養上清はNucleoFast 96(MACHEREY-NAGEL)を用いて限外ろ過された。培養上清各200 μLが各ウェルにアプライされたNucleoFast 96を遠心分離(6000×g、4℃、40分間遠心)することによってフロースルーが除去された。200 μLのH2Oが各ウェルに加えられた当該NucleoFast 96が、再度遠心分離(6000×g、4℃、20分間遠心)によって洗浄された。最後にTBS 200 μLが加えられ、室温で5分間静置された当該NucleoFast 96の各ウェルの上清に含まれるファージが精製ファージとして回収された。TBS、もしくはアデノシン/TBSが加えられた精製ファージが以下の手順でELISAに供された。384 well Microplates Streptavidin-coated(Greiner Bio-One)が上述のビオチン標識されたSMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aまたはその変異体5種類を25 pmol/mLの濃度で含む10 μLのTBSにて1時間以上コートされた。当該プレートの各ウェルをTBSTにて洗浄することによってプレートへ結合していないビオチン標識抗原が除かれた後、当該ウェルが80 μLの2%スキムミルク-TBSにて1時間以上ブロッキングされた。2%スキムミルク/TBSを除き、その後、各ウェルに精製ファージが加えられた当該プレートを室温で1時間静置することによって、ファージが提示する抗体を各ウェルに存在するビオチン標識抗原に終濃度500 μMのアデノシンの存在下または非存在下において結合させた。アデノシン/TBSTもしくはTBSTにて洗浄された各ウェルに、アデノシン/TBSTもしくはTBSTによって希釈されたHRP結合抗M13抗体(GE Healthcare)が添加されたプレートを1時間インキュベートさせた。アデノシン/TBSTもしくはTBSTにて洗浄後、TMB single溶液(ZYMED)が添加された各ウェル中の溶液の発色反応が硫酸の添加により停止された後、450 nmの吸光度によって当該発色が測定された。また、同様のスクリーニングをアデノシン誘導体を用いて実施した。その結果、アデノシンまたはアデノシン誘導体の存在下においてSMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aに対して結合し、アデノシンまたはアデノシン誘導体の非存在下で結合しない抗体提示ファージが複数確認された。また、それらのうちアデノシンまたはアデノシン誘導体の存在下でSMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aのアデノシン結合能を減弱した変異体5種類の混合液を固定したプレートに結合しないファージが複数確認された。これらの結果から、抗体提示ファージライブラリからアデノシン結合抗体に対してアデノシンまたはアデノシン誘導体の存在下でのみ結合活性を示す抗体を取得できることが示された。ファージELISAで評価した768クローンの内、そのような結合能を示し重複配列を除いた40種類の抗体がアデノシン結合抗体とアデノシンまたはアデノシン誘導体の複合体を認識するクランピング抗体の候補として取得された。
ビオチン標識SMB0002Fabの調製
SMB0002の軽鎖のC末端にTEVプロテアーゼ切断配列及びAviTag配列をリンカーを介して連結させたSMB0002hL-k0aTEVBAP(配列番号:87)をコードする遺伝子断片を動物発現用ベクターに導入した。SMB0002hH-G1m3及びSMB0002hL-k0aTEVBAPの動物発現用ベクターを293Fectin (Life Technologies)を用いてExpi293細胞 (Life Technologies)に導入した。このときEBNA1を発現する遺伝子およびビオチンリガーゼ(BirA)を発現する遺伝子を同時に導入し、さらにSMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aTEVBAP(配列番号:80、配列番号:87)の軽鎖のC末端をビオチン標識する目的でビオチンを添加した。抗体の発現ベクターが導入された細胞を37℃、8% CO2で培養し、軽鎖のC末端がビオチン標識されたSMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aTEVBAPを培養上清中に分泌させた。この細胞培養液を遠心分離し、上清をSARTPORE 2 300 (Sartorius) でろ過することで培養上清を得た。培養上清をD-PBS(-)で平衡化した5 mLサイズのProtein A担体カラムHiTrap MabSelect Sure pcc(GE Healthcare)に添加し、5 mL/min で4カラムボリュームの50 mM 酢酸緩衝液を添加することで抗体を溶出し、1.5 M Tris-HCl, pH 7.4 を添加して中和することで、抗体の精製画分とした。
抗体の精製画分をJumbosep 30K disc (Pall) により100 mM Tris-HCl, pH 8.0 に緩衝液を交換して濃縮した後、100 mM Tris-HCl pH 8.0にて2 mg/mLに希釈した。希釈した全長抗体に対し質量比で2000分の1倍量のLys-C(Roche)を加え、35℃に2.5時間静置した。その後、cOmplet EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail(Roche)2錠を10 mLのMQに溶かした溶液を10分の1倍量加えることで反応を停止した。
これをAmicon-Ultra 15 10K (Merck Millipore) にて濃縮後、その1.6倍液量の8M Ureaを含むD-PBS(-)を添加した。その後、Slide-A-Lyzer G2 Dialysis Cassettes 20K (Thermo Fisher Scientific)を用いて、透析外液として十分液量の6M Urea、4M Urea 及び 2M Ureaを含むD-PBS(-)中で段階的に透析を行った後、D-PBS(-)で2回透析を行い、調製したFabフラグメントのリフォールディングを行った。そして、Amicon-Ultra 4 10K (Merck Millipore) にてリフォールディング後のFab溶液を濃縮し、Millex GV filter unit 0.22 um (Merck Millipore) で濾過し、軽鎖のC末端がビオチン標識されたSMB0002hH-G1m3/SMB0002hL-k0aTEVBAPの精製Fabフラグメントを得た。これをビオチン標識SMB0002Fabとする。
取得された抗体のBLI法を用いたアデノシンクランピング抗体のアデノシン結合抗体とアデノシンの複合体への結合評価
実施例8で取得されたアデノシンクランピング抗体の重鎖および軽鎖の可変領域配列は、重鎖抗体定常領域、軽鎖kappa定常領域配列、もしくは軽鎖lambda定常領域配列を有する動物発現用プラスミドへとそれぞれ挿入され、抗体の発現ベクターが作成された。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。
SPR法を用いたアデノシンクランピング抗体のアデノシン結合抗体とアデノシンの複合体への結合評価
実施例10で取得されたアデノシン結合抗体とアデノシンの複合体に結合するクランピング抗体について、アデノシン存在下におけるアデノシン結合抗体へのアフィニティがBiacore T200 (GE Healthcare) を用いて解析された。アミンカップリング法でprotein G(Invitrogen)が適当量固定化されたSensor chip CM4(GE Healthcare)上に目的の抗体がキャプチャーされた。ランニングバッファーには20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20または20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20、500 μMアデノシンの2種類のバッファーが用いられた。実施例9で調製されたビオチン標識SMB0002Fabがそれぞれのランニングバッファーで、終濃度250 nM、62.5 nM、15.6 nMで調製され、Biacore T200 Control Software (GE Healthcare) のsingle cycle kinetic機能を用いて流速 30 μL/minで各リガンド濃度の結合時間3分、解離時間5分の条件で各抗体とSMB0002Fabの結合が測定された。その後、10 mM Glycine-HCl(pH 2.5)と10 mM NaOHを流速30 μL/minでそれぞれ10秒間インジェクトすることによって、センサーチップが再生された。測定は全て25℃で実施された。前記の方法により測定された500 μMのアデノシン(ADO)存在下と非存在下における各抗体とSMB0002Fabのアフィニティが図9に示されている。SC001, SC002, SC003, SC014, SC016, SC019, SC032, SC044, SC045, SC048はアデノシン非存在下と比較して、アデノシン存在下でアデノシン結合抗体であるSMB0002Fabに対する結合のKD値が小さく、アデノシン存在下でアデノシン結合抗体により強く結合することが確認された。アデノシン非存在下におけるSC001とSC019のアデノシン結合抗体に対する結合活性は低かったため、KD値が求められなかった。
SPR法を用いたアデノシンクランピング抗体によるアデノシン結合抗体とアデノシンの結合活性増強能の評価
実施例10で取得されたアデノシン結合抗体とアデノシンの複合体に結合するクランピング抗体について、アデノシン濃度依存的なアデノシン結合抗体への結合がBiacore T200 (GE Healthcare) を用いて評価された。アミンカップリング法でprotein G(Invitrogen)が適当量固定化されたSensor chip CM4(GE Healthcare)上に目的の抗体がキャプチャーされた。ランニングバッファーには20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% (w/v) Tween20が用いられた。実施例9で調製された 500 nM のビオチン標識SMB0002Fabが終濃度100 μM、20 μM、4 μM、800 nM、160 nM、32 nM、6.4 nM、1.28 nMのアデノシンを含むランニングバッファーで調製され、流速 30 μL/minでの結合時間3分、解離時間5分の条件でインジェクトした際の、各抗体とSMB0002Fabの結合が測定された。その後、10 mM Glycine-HCl(pH 2.5)と10 mM NaOHを流速30 μL/minでそれぞれ10秒間インジェクトすることによって、センサーチップが再生された。測定は全て25℃で実施された。前記の方法により測定された各抗体と各濃度のアデノシン存在下における500 nM SMB0002Fabとの結合を測定したセンサーグラムを図10に示す。また前記の結果から、Biacore T200 Evaluation Softwareを用いてsteady state analysisを実施し500 nM SMB0002Fab存在下におけるアデノシンへの各抗体の結合アフィニティのKD値を算出した結果を表3に示す。
アデノシンクランピング抗体を用いたアデノシン依存的な細胞傷害活性の評価
アデノシン結合抗体SMB0002hH-F760mnP17/SMB0002hL-k0a(重鎖/軽鎖(配列番号:100、81))、CD3アゴニスト抗体CE115HA000-F760mnN17/L0011-k0a(重鎖/軽鎖(配列番号:135、105))、アデノシンクランピング抗体SC003H-F760mnP17/SC003L-SCL3(重鎖/軽鎖(配列番号:136、124)、GPC3結合抗体GCH065-F760mnN17/ L0011-k0a(重鎖/軽鎖(配列番号:104、105))、ネガティブコントロール抗体 IC17HdK-F760mnN17/IC17L-k0a(重鎖/軽鎖(配列番号:137、138))またはIC17HdK-F760mnP17/IC17L-k0a(重鎖/軽鎖(配列番号:139、138))が挿入されている動物発現用ベクターをExpi293細胞に導入し、37℃、8% CO2下で培養することで培養上清中に抗体を分泌させた。その後当業者公知の方法でMonoSpin ProA 96 ウェルプレートタイプ(GL Science)を用いて抗体を精製した。実施例3(3)に記載の方法で、アデノシン結合抗体とCD3結合抗体の二重特異性抗体 (SMB0002hH-F760mnP17/SMB0002hL-k0a//CE115HA000-F760mnN17/L0011-k0a)、及びアデノシンクランピング抗体とGPC3結合抗体の二重特異性抗体(SC003H-F760mnP17/SC003L-SCL3//GCH065-F760mnN17/ L0011-k0a)、また比較対照としてアデノシンクランピング抗体とKLH結合抗体の二重特異性抗体 (SC003H-F760mnP17/SC003L-SCL3//IC17HdK-F760mnN17/IC17L-k0a)、KLH結合抗体とGPC3結合抗体の二重特異性抗体(IC17HdK-F760mnP17/IC17L-k0a//GCH065-F760mnN17/ L0011-k0a)をそれぞれ調製した。
クランピング抗体の存在・非存在下での抗CD3抗体とCD3εδとのSPRによる結合性評価
(1)固相化抗体の調製
CE115HA000-BS03a/GLS3000-k0(配列番号:140、20) CE115HA056-BS03a/GLS3000-k0(配列番号:141、20) CE115HA146-BS03a/GLS3000-k0(配列番号:142/20) IC17Hdk-BS03a/IC17L-k0(配列番号:143、66)、CLA0028VH-BS03b/CLA0028VL-k0C (配列番号:144、56) をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターをExpiFectamine293(Thermo Fisher Scientific)を用いてExpi293Fに導入し、培養5日目の培養上清を回収し、HiTrap MabSelect SuReを用いて同業者公知の方法で調製した。抗CD3抗体とクランピング抗体CLA0028とのBiAbの調製は実施例3(3)に示したFAE技術によって実施された。抗CD3抗体あるいは陰性対照のIC17抗体と、クランピング抗体CLA0028を500μgずつ混合し、D-PBS(-)(和光純薬)にて250 mMに調製した2-Mercaptoethylamine・HCl(2-MEA, Sigma-Aldrich)50μLを添加し、全量をD-PBS(-)バッファーで500 μLにメスアップした。本反応溶液を37℃で90分間加温した後、PD-minitrap G-25(GE Healthcare)を用いて2-MEAの除去およびD-PBS(-)(和光純薬)への置換を行った。得られた抗体の濃度は実施例3(1)でのタンパク質の濃度の算出と同様の方法で算出した。
ヒトCD3εδヘテロダイマー(以下CD3εδ)は当業者公知の方法で調製した。具体的には、ヒトCD3εの細胞外領域(1-129番目)をコードする遺伝子にFLAG tag(DYKDDDDK、配列番号70)および終始コドンをコードする遺伝子断片を連結した。ヒトCD3δの細胞外領域(1−106番目)をコードする遺伝子にHis tag(HHHHHH、配列番号166)および終始コドンをコードする遺伝子断片を連結した。ヒトCD3εの細胞外領域のC末側にFLAG tagが付加した可溶型ヒトCD3ε(配列番号167)をコードする遺伝子断片と、C末にHis tagが付加した可溶型ヒトCD3δ(配列番号168)をコードする遺伝子断片を動物細胞発現用ベクターに組み込んだ。構築された2種類のプラスミドベクターは293fectin(Thermo Fisher Scientific)を用いてFreeStyle 293F細胞 (Invitrogen)に導入された。遺伝子導入した細胞を37℃、8% CO2で培養し、目的タンパク質を培養上清中に分泌させた。この細胞培養液を0.22μmボトルトップフィルターでろ過し、培養上清を得た。
センサーチップCM4にAcetate4.5(GE Healthcare)にて25 μg/mLに調製したSuRe protein A(GE Healthcare)をアミンカップリングキット(GE healthcare)を用いて1フローセルあたり約1200 RUを固定化した。
ランニングバッファーはHBS-EP+(GE Healthcare)を使用し、測定温度は37℃で実施した。それぞれの抗体を流速10μL /minで60秒反応させて1000 RU捕捉し、0 nM、4.8 nM、24 nM、 120 nM、 600 nM、 3000 nM、 15000 nMに調製したアナライトCD3εδを流速30μL /minで60秒間作用させて結合相をモニターし、HBS-EP+を流速30μL /minで120秒間流して解離相をモニターした。センサーチップはGlycine1.5と25 mM NaOHをそれぞれ流速30μL/minで30秒間流して再生させた。測定で得られたセンサーグラムから算出されたカイネティクスパラメーターである結合速度定数ka(1/Ms)、および解離速度定数kd(1/s)をもとに解離定数KD(M)を算出した。各パラメーターの算出にBiacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)を用いた。得られたKD値を表5に示す。IC17アームとのBiAbで得られたKD値をCLA0028アームとのBiAbで得られたKD値を除した値からアフィニティ増強効果を算出した。その結果、CE115HA000アームのKD値は約30倍、CE115HA056は約200倍、CE115HA146は約70倍の増強が認められた。
クランピング抗体のX線結晶構造解析
(1)抗体の調製
クランピング抗体の調製はCLA0028VH-F760mnP17/CLA0028VL-k0C(配列番号:55、56)をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベクターをExpiFectamine293(Thermo Fisher Scientific)を用いてExpi293Fに導入し、培養5日目の培養上清を回収し、HiTrap MabSelect SuReを用いて同業者公知の方法で調製した。CD3εのエピトープペプチドを融合したCD3抗体は、CE115HA146重鎖(CE115HAPG13-rabCH1hG1m、配列番号:6)と対応する軽鎖(GLS3000-rabk、配列番号:7)をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込み、FreeStyle 293F細胞(Thermo Fisher Scinetific)にトランスフェクション試薬293fectin Tranfection Reagent(Thermo Fisher Scientific)を用い、メーカー提供のマニュアルに従って導入し、5日間培養した培養液からrProteinA Sepharose Fast Flow樹脂(GE Healthcare)によるアフィニティ精製にて調製した。
CLA0028VH-F760mnP17/CLA0028VL-k0Cサンプルは、Lys-C (Roche, 11047825001)用いて、35℃ × 2時間の条件でFabとFcに断片化された。次にHiTrap SP HP 1ml (GE Healthcare) + HiTrap MabSelect SuRe 1ml (GE Healthcare)によるカラム精製とHiLoad 16/600 Superdex 200 pg (GE Healthcare)によるSEC精製を経て、Fabサンプルが調製された。
得られたCLA0028 FabサンプルをCE115HAGP13-rabIgG/GLS3000-rabkサンプルに、モル比でCLA0028 Fabが少し過剰となるように加え、20mM HEPES pH7.3, 100mM NaCl をbufferとして用いたSuperdex 200 Increase 10/300 GL (GE Healthcare)によるSEC精製により、CLA0028 Fab - CE115HAGP13-rabIgG/GLS3000-rabk複合体サンプルが調製された。得られたサンプルは、Lys-C (Roche, 11047825001)用いて、室温下、一晩の条件でFabとFcに断片化、その後、切断サンプルを、HiTrap MabSelect SuRe 1ml GE Healthcare)に通すことで、Fc断片が除かれた。さらに、20mM HEPES pH7.3, 100mM NaCl をbufferとして用いたSuperdex 200 Increase 10/300 GL(GE Healthcare)によるSEC精製により、CLA0028 Fab - CE115HAPG13 Fab複合体サンプルが調製され、それを限外濾過濃縮することで結晶化用複合体サンプルが調製された。
得られた結晶化用複合体サンプルを用いて、21℃条件下、シッティングドロップ蒸気拡散法による結晶化がおこなわれ、Morpheus(登録商標)(Molecular Dimensions)F10のリザーバー条件において、X線結晶構造解析に適した結晶が得られた。
得られた結晶は、Morpheus(登録商標)(Molecular Dimensions)F10のリザーバー溶液に浸漬されたのち、液体窒素にて凍結され、Swiss Light Source X10SAにてX線回折データが測定された。測定中、結晶は常に100 Kの窒素流下に置くことで、凍結状態が維持された。得られた回折画像は、autoPROC(Acta Cryst. D67: 293-302 (2011))を用いて処理され、分解能2.5Åまでの回折強度データが取得された。
得られたX線回折強度データから、既知のFab結晶構造を探索モデルとして、Phaser(J. Appl. Cryst. (2007) 40, 658-674)による分子置換法を実施し、初期構造が決定された。その後、coot(Acta Cryst. D66: 486-501 (2010))、refmac5(Acta Cryst. D67: 355-367 (2011))ならびにphenix.refine(Acta Cryst. D68: 352-367 (2012))によるモデル構築と精密化が繰り返され、最終的な精密化座標が得られた。その結晶学的統計値は表6に示される。
図12に示すように、CD3eのN末7残基ペプチドを挟み込む形で、CLA0028 FabとCE115HAPG13 Fabが複合体を形成、コンセプト通りのクランピング抗体が得られたことが確認された。
ヒトT細胞を用いたGPC3、CLDN6陽性細胞特異的なTDCC活性の評価
(1)エフェクター細胞の調製
当業者公知の方法に従い、PBMC (Stemcell)からT-cell isolation kit (Stemcell) を用いてT細胞を単離し、CD3/CD28ビーズ (Invitrogen) により増殖させ、保存した。その後の試験では一度保存した単離T細胞を凍結融解、培養した懸濁液をエフェクター細胞として用いた。
NCI-H446(GPC3 陽性細胞)、AGS(CLDN6 陽性細胞)、GM5.1(GPC3、CLDN6陽性細胞)を標的細胞として以後の実験に供した。
先に記載した方法に従い、以下の表7に示すBiAbを調製した。
xCELLigence(ACEA Biosciences)を用い、電極への細胞接着に伴い生じる電気抵抗値を測定することにより、TDCC活性を評価した。まず、RTCA Resistor プレート 96に標的細胞調製に用いた培地を添加し、バックグラウンド値を補正した。
次に、実施例6のように調製した標的細胞懸濁液を播種し、xCELLigenceへ当該プレートを設置後、37℃、5% CO2条件下で一晩培養した。細胞を播種した翌日に最終濃度(0、0.4、2、10nM)になるようBiAb1を、最終濃度(10nM)となるようBiAb2 を各ウェルに添加した。その後、標的細胞の5倍量の細胞数を含むエフェクター細胞懸濁液を添加し、xCELLigenceへ当該プレートを設置後、37℃、5% CO2条件下で培養し、その間の電気抵抗値(Cell index)を10分間隔で経時的に測定した。
TDCC活性の指標として細胞増殖阻害率(CGI)を下記の式3により算出した。
GPC3とCLDN6を用いて、二重陽性細胞特異的なTDCC活性を評価した。陽性対照としてGCH065/CE115HA000(抗GPC3 TRAB)、AE3.20/CE115HA000(抗CLDN6 TRAB)を用いた。図13に示したように、GCH065/CE115HA000およびAE3.20/CE115HA000はそれぞれの抗原単陽性の細胞NCI-H446(GPC3)、AGS(CLDN6)に対しTDCC活性を示し、二重陽性細胞GM5.1(GPC3/CLDN6)に対しては両抗体がTDCC活性を示した。
BiAb1のGCH065/CE115HA056とBiAb2のIC17/CLA0028を作用させた場合、BiAb1のIC17/CE115HA056とBiAb2のAE3.20/CLA0028を作用させた場合、BiAb1のIC17/CE115HA056とBiAb2のGCH065/CLA0028を作用させた場合はいずれの細胞株に対してもTDCC活性を示さなかったが、 BiAb1のGCH065/CE115HA056はBiAb2のAE3.20/CLA0028の存在下では抗原二重陽性細胞のGM5.1に対してのみTDCC活性を示した。
以上の結果より、抗原二重陽性の細胞に特異的にTDCC活性を発揮する抗体を作出することに成功した。
ヒトT細胞を用いたGPC3、HER2陽性細胞特異的なTDCC活性の評価
(1)エフェクター細胞溶液の調製
先に記載の方法により調製した単離T細胞をエフェクター細胞として、その後の実験に用いた。
NCI-H446(GPC3 陽性細胞)、NCI-N87(HER2陽性細胞)、GPC3発現NCI-N87(GPC3、HER2陽性細胞)を標的細胞として以後の実験に供した。
先に記載した方法に従い、以下の表8に示すBiAbを調製した。
実施例16に記載したxCELLigence(ACEA Biosciences)を用いた細胞傷害アッセイを行った。細胞を播種した翌日に最終濃度(0、0.08、0.4、2nM)になるようBiAb1を、最終濃度(5nM)となるようBiAb2 を各ウェルに添加した。その後、標的細胞の5倍量の細胞数を含むエフェクター細胞懸濁液を添加し、xCELLigenceへ当該プレートを設置後、37℃、5% CO2条件下で培養し、その間の電気抵抗値(Cell index)を10分間隔で経時的に測定した。
GPC3とHER2を用いて、二重陽性細胞特異的なTDCC活性を評価した。陽性対照としてGCH065/CE115HA000(抗GPC3 TRAB)、HER2/CE115HA000(抗Her2 TRABを用いた。図14に示したように、GCH065/CE115HA000およびHER2/CE115HA000はそれぞれの抗原単陽性の細胞NCI-H446(GPC3)、NCI-N87(HER2)に対しTDCC活性を示し、二重陽性細胞GPC3発現NCI-N87(GPC3/HER2)に対しては両抗体がTDCC活性を示した。
BiAb1のGCH065/CE115HA056とBiAb2のIC17/CLA0028を作用させた場合、BiAb1のIC17/CE115HA056とBiAb2のHER2/CLA0028を作用させた場合はいずれの細胞株に対してもTDCC活性を示さなかったが、 BiAb1のGCH065/CE115HA056はBiAb2のHER2/CLA0028の存在下では抗原二重陽性細胞のGPC3発現NCI-N87に対してのみTDCC活性を示した。
以上の結果より、抗原二重陽性の細胞に特異的にTDCC活性を発揮する抗体を作出することに成功した。
クランピング抗体を用いたCD8特異的なTRAB
CD3を介してT細胞をリクルートし活性化することによって抗腫瘍効果を発揮するbispecific抗体(T cell-Redirecting AntiBody)(「TRAB」と略称する。)は強力な抗腫瘍作用を有する一方で、その副作用としてサイトカインリリースシンドロームを誘導することが知られている(非特許文献: Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2018. 6, 56)。
TRABによって誘導される抗腫瘍活性は主にCD8陽性T細胞が担う一方で、TRABによって誘導されるIL6のようなサイトカインリリースシンドロームの原因となるサイトカインは主にCD4陽性T細胞から放出されることが報告されている(非特許文献 Immunology. 2017 152(3):425-438.)。CD8陽性T細胞のみをエフェクター細胞として用いるTRABを作ることができれば、サイトカインリリースの副作用は抑えつつ、TRABの強力な抗腫瘍活性を維持した理想的な薬剤となることが期待される。このように、二重陽性細胞(今回の例の場合は、CD3/CD8発現細胞)のみを利用する技術を用いることで、より優れたTRABを開発することができる。
以下の実施例ではクランピング抗体(第2の抗原結合分子)が認識する第3の抗原を癌抗原ではなく、免疫関連分子のCD8とした。第1の抗原を認識する抗体(第1の抗原結合分子)が結合したがん細胞に、このクランピング抗体が結合したCD8陽性 T細胞が近づいたときにのみ、クランピング抗体が第1の抗原を認識する抗体とCD3が形成する抗原−抗原結合分子複合体を認識し、TDCC活性を誘導することが期待される。この場合、第2の抗原は癌抗原である。
このコンセプトを確認するために、詳細を以下に示す実験を実施した。
EasySep Human CD4+ T cell isolation kit (Stemcell)およびEasySep Human CD8+ T cell isolation kit (Stemcell) を用いてヒトPBMCからCD8陽性T細胞、CD4陽性T細胞を単離し、PBMCとともにエフェクター細胞としてその後のアッセイに用いた。
GPC3陽性細胞であるSKpca60を標的細胞として以後の実験に供した。
先に記載した方法に従い、以下の表9に示すBiAbを調製した。
実施例16に記載したxCELLigence(ACEA Biosciences)を用いた細胞傷害アッセイを行った。
図16は、二重抗原結合(GPC3およびCD8)によるCD8陽性T細胞特異的なTDCC活性を示した図である。
以上の結果より、CD8陽性T細胞特異的にTDCC活性を発揮する抗体を作出することに成功した。
上述の抗体の一部について担癌モデルを用いたin vivo薬効についても評価した。
実施例6で記載されたin vitroのアッセイで細胞傷害活性が認められた表2に示したうちの代表的な抗体についてin vivoの薬効の評価が行なわれた。GPC3およびEREGを発現するヒトがん細胞株であるhEREG/SK-pca60がNOD scidマウスに移植され、腫瘍の形成が確認されたNOD scidマウスに、in vitroでヒトPBMCを培養することにより増殖させたT細胞が移入された。当該マウスに対して抗体を投与することによる治療が行なわれた(T細胞移入モデルと称される)。
すなわち、抗体のhEREG/SK-pca60 T細胞移入モデルによる薬効試験においては、下記のような試験が行われた。健常人ボランティアより採取した血液から分離されたPBMC及びDynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Thermo Fisher Scientific社)を用いてT細胞の拡大培養が行なわれた。ヒトがん細胞株hEREG/SK-pca60 1×107細胞と、マトリゲル基底膜マトリックス(BD社)が混和され、NOD scidマウス(日本クレア、雌、7W)のそけい部皮下に移植された。移植の日をday 0とした。マウスは移植後21日目に腫瘍サイズと体重に応じて群分けが行なわれた後、抗アシアロGM1抗体が0.2 mg/匹で腹腔内に投与された。その翌日に前記拡大培養によって得られたT細胞が3×107細胞/匹で腹腔内に移植された。T細胞移植約4時間後に抗体が1 mg/kgで尾静脈内投与された。抗体投与はDay0およびDay7の2回行われた(図17)。
Claims (15)
- 第1の抗原および前記第1の抗原に結合する第1の抗原結合分子を含む抗原−抗原結合分子複合体に結合し、前記第1の抗原結合分子の前記第1の抗原への結合活性を増加させる、第2の抗原結合分子。
- 前記第1の抗原結合分子の存在下における前記第1の抗原への結合活性が、前記第1の抗原結合分子の非存在下に比べて高い、請求項1に記載の第2の抗原結合分子。
- 前記第1の抗原が免疫関連分子または細胞代謝物である、請求項1または請求項2に記載の第2の抗原結合分子。
- 前記免疫関連分子が、免疫細胞の細胞膜に存在する分子である、請求項3に記載の第2の抗原結合分子。
- 前記免疫細胞が、顆粒球、マクロファージ、樹状細胞、T細胞、およびB細胞からなる群から選択される少なくとも一つである、請求項4に記載の第2の抗原結合分子。
- 前記免疫関連分子がCD3である、請求項3〜請求項5のいずれか一項に記載の第2の抗原結合分子。
- 前記第1の抗原結合分子が、重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せがそれぞれ配列番号:1と配列番号:122、配列番号:114と配列番号:115、配列番号:116と配列番号:117、配列番号:118と配列番号:119、および配列番号:120と配列番号:121から選択されるいずれかの組合せからなるCD3結合ポリペプチド、または前記CD3結合ポリペプチドから改変された第1の改変ポリペプチドを含み、前記第1の改変ポリペプチドのCD3への結合活性は前記CD3結合ポリペプチドに比べて低い、請求項6に記載の第2の抗原結合分子。
- 前記細胞代謝物が、アデノシンまたはその誘導体である、請求項3に記載の第2の抗原結合分子。
- 前記第1の抗原結合分子が、重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列の組合せがそれぞれ配列番号:106と配列番号:107、配列番号:108と配列番号:109、配列番号:110と配列番号:111、および配列番号:112と配列番号:113から選択されるいずれかの組合せからなるアデノシン結合ポリペプチド、または前記アデノシン結合ポリペプチドから改変された第2の改変ポリペプチドを含み、前記第2の改変ポリペプチドのアデノシへの結合活性は前記アデノシン結合ポリペプチドに比べて低いまたは高い、請求項8に記載の第2の抗原結合分子。
- 前記第1の抗原結合分子が多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第2の抗原に結合する、請求項1〜9のいずれか一項に記載の第2の抗原結合分子。
- 前記第2の抗原が、癌抗原または免疫関連分子である、請求項10に記載の第2の抗原結合分子。
- 多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第3の抗原に結合する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の第2の抗原結合分子。
- 前記第3の抗原が、癌抗原または免疫関連分子である、請求項12に記載の第2の抗原結合分子。
- 前記第1の抗原結合分子が多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第2の抗原に結合し、前記第2の抗原結合分子が多重抗原特異性を有し、さらに少なくとも第3の抗原に結合し、前記第1の抗原と前記第2の抗原と前記第3の抗原の組合せが、以下の(1)〜(5)のいずれかの組合せである、請求項1〜13のいずれか一項に記載の第2の抗原結合分子。
(1)前記第1の抗原が免疫関連分子であり、前記第2の抗原が第1の癌抗原であり、前記第3の抗原が第2の癌抗原である組合せ
(2)前記第1の抗原が標的細胞の細胞代謝物であり、前記第2の抗原が癌抗原であり、前記第3の抗原が免疫関連分子である組合せ
(3)前記第1の抗原が標的細胞の細胞代謝物であり、前記第2の抗原が免疫関連分子であり、前記第3の抗原が癌抗原である組合せ
(4)前記第1の抗原が第1の免疫関連分子であり、前記第2の抗原が癌抗原であり、前記第3の抗原が第2の免疫関連分子である組合せ
(5)前記第1の抗原が第1の免疫関連分子であり、前記第2の抗原が第2の免疫関連分子であり、前記第3の抗原が癌抗原である組合せ - 請求項1に記載の第1の抗原結合分子および第2の抗原結合分子の組合せ。
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