JP2010512734A - Ｉｌ−６／ｉｌ−６受容体複合体等受容体介在性シグナル伝達に関与する複合体に特異的なポリペプチド - Google Patents

Ｉｌ−６／ｉｌ−６受容体複合体等受容体介在性シグナル伝達に関与する複合体に特異的なポリペプチド Download PDF

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Abstract

本発明は、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、インターロイキン−６受容体（「ＩＬ−６Ｒ」）、及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に関する、及び／又はこれらに関連する疾患及び障害を予防又は治療するのに使用することができるポリペプチドに関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、インターロイキン−６受容体（「ＩＬ−６Ｒ」）及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に関する、及び／又はそれらに関連がある疾患及び障害を予防又は治療するのに使用することができるポリペプチドに関する。
具体的には、本発明は、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、インターロイキン−６受容体（「ＩＬ−６Ｒ」）及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与するシグナル伝達経路（複数可）及び／又は生物学的な機能及び応答を調節するのに使用することができるポリペプチドに関する。
より具体的には、本発明は、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体とｇｐ１３０との相互作用を調節するのに使用することができるポリペプチドに関する。
本発明は、次に挙げるものにも関する；このようなポリペプチドをコードする核酸；このようなポリペプチドを調製する方法；このようなポリペプチドを発現する又は発現可能な宿主細胞；このようなポリペプチド、核酸及び／又は宿主細胞を含む組成物、特に薬学的組成物；特に予防、治療又は診断目的（本明細書で言及される予防、治療又は診断目的等）のためのこのようなポリペプチド、核酸、宿主細胞及び／又は組成物の使用。
本発明のポリペプチド及びこれを含む薬学的組成物は、次に挙げるものに関連する疾患及び障害の予防及び／又は治療に使用することができる；インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）；インターロイキン−６受容体（「ＩＬ−６Ｒ」）；ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体；及び／又は、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、インターロイキン−６受容体（「ＩＬ−６Ｒ」）及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与するシグナル伝達経路（複数可）及び／又は生物学的な機能及び応答。
具体的には、本発明のポリペプチド及びこれを含む薬学的組成物は、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、インターロイキン−６受容体（「ＩＬ−６Ｒ」）及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が関与する、シグナル伝達経路（複数可）及び／又は生物学的な機能及び応答を調節することで利益を得ることができる、疾患及び障害の予防及び／又は治療に使用することができる。一般的に、これらの疾患及び障害は、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、インターロイキン−６受容体（「ＩＬ−６Ｒ」）及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に関連する、異常な、望ましくない、増大した、及び／又は低減したシグナル伝達を特徴とする。
より具体的には、本発明のポリペプチド及びこれを含む薬学的組成物は、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体とｇｐ１３０との相互作用を調節することで利益を得ることができる疾患及び障害の予防及び／又は治療に使用することができる。
上記で言及された疾患及び障害（本明細書中で集合的に「ＩＬ−６関連障害」）の例は、例えば本明細書中で以下に言及される背景技術等の従来技術から当業者にとって明らかである。
本発明の他の態様、実施の形態、利点及び用途は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
元々Ｂ細胞分化因子として同定されたタンパク質であるＩＬ−６（特許文献１）と、ＩＬ−６Ｒ（特許文献２）との相互作用によって、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が形成される。この複合体は、標的細胞上の膜タンパク質であるｇｐ１３０（特許文献３）と結合し、ＩＬ−６の様々な生理作用を伝える。このため、ｇｐ１３０は、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒで形成される２分子の複合体と二量体を形成し、これによりＩＬ−６媒介性シグナル伝達が誘発される。
現在ＩＬ−６は、とりわけ免疫応答の調節、造血、急性期応答、骨代謝、血管形成、及び炎症に関与することが知られている。ＩＬ−６産生の脱制御は、幾つかの自己免疫及び慢性炎症増殖性疾患プロセスの病変に関与する（Ishihara and Hirano, 2002）。結果として、過去にはＩＬ−６誘導性シグナル伝達の阻害剤に大きな注目が集まった（Hirano et al., 1990）。ＩＬ−６（特許文献４）、ＩＬ−６Ｒ（特許文献５）又はｇｐ１３０（特許文献６）と特異的に結合するポリペプチドがＩＬ−６の機能化に対して効果的な阻害作用を示すことが証明された。
ＩＬ−６過剰産生及びシグナル伝達（特にいわゆるトランスシグナル伝達（trans-signalling））は、様々な疾患及び障害（例えば敗血症（Starnes et al., 1999）、及び多発性骨髄腫疾患（ＭＭ）、腎細胞癌（ＲＣＣ）、形質細胞性白血病（Klein et al., 1991）、リンパ腫、Ｂリンパ増殖性障害（ＢＬＰＤ）及び前立腺癌等の様々な形態の癌）に関与する。過剰なＩＬ−６産生又はシグナル伝達によって引き起こされる他の疾患の非限定的な例としては、骨吸収（骨粗鬆症）（Roodman et al., 1992、Jilka et al., 1992）、悪液質（Strassman et al., 1992）、乾癬、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫（Emilie et al., 1994）、炎症性疾患及び障害（リウマチ性関節炎、全身性発症若年性特発性関節炎、高ガンマグロブリン血症（Grau et al., 1990）、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、キャッスルマン病、ＩｇＭ免疫グロブリン血症、心臓粘液腫、喘息（特にアレルギー性喘息）及び自己免疫インスリン依存性糖尿病（Campbell et al., 1991）等）が挙げられる。他のＩＬ−６関連障害は当業者にとって明らかである。
例えば上記の参考文献から分かるように、従来技術は、ＩＬ−６関連障害の予防及び治療のためのヒトＩＬ−６、ヒトＩＬ−６Ｒ及びヒトｇｐ１３０タンパク質に指向性を有する抗体及び抗体断片を説明している。例えば、トシリズマブ（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）、ＢＥ８（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）及びCentocorのＣＮＴＯ−３２８（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）である。ＩＬ−６関連障害の予防及び治療のための当該技術分野で既知の別の有効成分は、可溶性ｇｐ１３０のＦｃ融合体である（非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５）。
ＥＰ０２５７４０６（Hirano et al., 1985） ＥＰ０３２５４７４（Yamasaki et al., 1988） ＥＰ０４１１９４６（Taga et al., 1989） ＥＰ０３１２９９６（Klein et al., 1991） ＥＰ０４０９６０７ ＥＰ０５７２１１８（Saito et al., 1993）
Woo P, et al. Arthritis Res Ther.（2005）7: 1281-8 Nishimoto N et al. Blood.（2005）106: 2627-32 Ito H et al. Gastroenterology.（2004）126: 989-96 Choy EH et al. Arthritis Rheum.（2002）46: 3143-50 Bataille R et al. Blood（1995）86:685-91 Emilie D et al. Blood（1994）84:2472-9 Beck JT et al. N Engl J Med.（1994）330:602-5 Wendling D et al. J Rheumatol.（1993）20:259-62 Journal of Clinical Oncology,（2004）22/14S: 2560 Journal of ClinicalOncology,（2004）22/14S: 2608 Int J Cancer（2004）111:592-5 Becker C et al. Immunity.（2004）21: 491-501 Doganci A et al. J Clin Invest.（2005）115:313-25 NowellMA et al. J Immunol.（2003）171:3202-9 Atreya R et al. Nat Med.（2000）6:583-8
それにもかかわらず、ＩＬ−６関連障害の予防又は治療に使用することができる、代替的な、又は改善された有効成分に対する必要性が存在する。
本発明は、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に特異的及び／又は選択的であり、及び／又はそれぞれ、ＩＬ−６単独及び／又はＩＬ−６Ｒ単独と結合するのに比べて、より高い結合活性でＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と結合するポリペプチドを提供することによってこの課題を解決する。本発明のポリペプチド及び調製物は概して、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体とｇｐ１３０タンパク質との結合を調節、特に阻害及び／又は阻止するのに、またしたがってＩＬ−６媒介性シグナル伝達（トランスシグナル伝達等（これらに限定されない））を調節、特に阻害及び／又は阻止するのに、及び／又はこのようなシグナル伝達に関連する生物学的な応答及び効果を調節するのに使用することができる。このようにして、本発明のポリペプチド及び調製物は、ＩＬ−６関連障害の予防及び治療に、特に過剰及び／又は不要なＩＬ−６媒介性シグナル伝達を特徴とするこのような疾患及び障害に対して使用することができる。
したがってこれに限定されないが、本発明のポリペプチドは例えば、ＩＬ−６又はＩＬ−６Ｒ媒介性シグナル伝達を調節することができる活性成分（例えばＩＬ−６、ＩＬ−６受容体若しくはｇｐ１３０に対する抗体又は抗体断片）又は可溶性ｇｐ１３０のＦｃ融合体で現在予防又は治療されている全ての疾患及び障害を予防又は治療するのに使用することができる。本発明のポリペプチドは、このような活性成分による治療が現在展開中であるか、提案されているか、又は将来提案若しくは展開予定である全て疾患及び障害を予防又は治療するのに使用することができることも予想される。また、本明細書でさらに記載される特有の特性から、本発明のポリペプチドは、これらの既知の活性成分が現在使用中か又は提案若しくは展開予定であるもの以外の他の疾患及び障害の予防及び治療に使用してもよいこと、及び／又は本発明のポリペプチドは、本明細書に記載の疾患及び障害を治療する新規の方法及び措置（regimens）を提供し得ることが予想される。
本発明は最も広義には、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と結合することができるポリペプチドを提供し、このような結合によって、当該複合体とｇｐ１３０との相互作用を調節することができる。これに関して、このような調節によって、即ち本発明のポリペプチド非存在下の複合体に比べて、ｇｐ１３０に対する複合体の結合親和性（逆もまた同様）を増大させるか、又はｇｐ１３０に対する複合体の結合親和性（逆もまた同様）を低減させることができる。このようにして、本発明のポリペプチドは、ＩＬ−６媒介性シグナル伝達、並びにこれに関連する生物学的な機能及び応答に対するアゴニスト作用又は拮抗作用を有し得る。
好ましいが、非限定的な一実施の形態によれば、本発明のポリペプチドの結合によって、ｇｐ１３０に対する複合体の結合親和性（逆もまた同様）を低減させるか、及び／又はＩＬ−６媒介性シグナル伝達、並びにこれに関連する生物学的な機能及び応答に対する拮抗作用をもたらす。しかし、本明細書中の記載から明らかなように、本発明は最も広義にはそれらに限定されず、例えばアゴニスト作用を有するポリペプチドも含む。
したがって概して、本発明は、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有するポリペプチドを提供する。当該ポリペプチドは、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体とｇｐ１３０タンパク質との相互作用を阻害することができることが好ましく、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体とｇｐ１３０タンパク質との相互作用を競合的に阻害することができることがより好ましい。
上記ポリペプチドは、（本明細書で規定のように）ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有する、少なくとも１つの結合単位又はその断片を含むか、又は本質的にこれから成るのが好ましい。
代替的に、上記ポリペプチドは、ＩＬ−６に指向性を有する少なくとも１つの結合単位又はその断片、及びＩＬ−６Ｒに指向性を有する少なくとも１つの結合単位又はその断片、を含むか又は本質的にこれから成る。好ましくは、このようなポリペプチドは、得られたポリペプチドが、それぞれ、ＩＬ−６単独及び／又はＩＬ−６Ｒ単独と結合するのに比べて、より高い結合活性でＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と結合するように、ＩＬ−６に指向性を有する少なくとも１つの結合単位又はその断片、及びＩＬ−６Ｒに指向性を有する少なくとも１つの結合単位又はその断片を含む。
本発明のポリペプチドにおいて、上記少なくとも１つの結合単位は、免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片、より好ましくは抗体、又はＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）断片、Ｆ（ａｂ'２）断片、Ｆｖ断片、又はｓｃＦｖ断片等の抗体断片であるのが好ましい。さらにより好ましくは、当該少なくとも１つの結合単位は、ＶＨドメイン又はＶＬドメイン等の免疫グロブリン可変ドメイン、特に（単一）ドメイン抗体（（ｓ）ｄＡｂ）である。最も好ましくは、当該少なくとも１つの結合単位が、ナノボディ（登録商標）である。
本発明のポリペプチド（単一特異性又は二重特異性）は、哺乳動物のＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体、より好ましくはヒトのＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有するのが好ましい。
より具体的には、本発明は、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に特異的であり、及び／又はＩＬ−６単独及び／又はＩＬ−６Ｒ単独それぞれと結合するのに比べて、より高い結合活性でＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と結合し、且つヒトのＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体とヒトのｇｐ１３０タンパク質との結合を（例えば競合的に）阻害するのが好ましいポリペプチドを提供する。好ましいが、非限定的な一実施の形態によれば、本発明のポリペプチドは、いわゆる「トランスシグナル伝達」を（選択的に）阻害することができる。しかし概して、本発明のポリペプチドは、ＩＬ−６関連障害に対して有益な効果を達成する生物学的機構に限定されないことに留意されたい。概して、これに限定されないが、本発明のポリペプチドに存在するいくつかのアミノ酸残基は、複合体のＩＬ−６部分内に存在するアミノ酸残基と相互作用し、本発明のポリペプチドに存在する他のアミノ酸残基は複合体のＩＬ−６Ｒ部分内に存在するアミノ酸残基と相互作用するということができる。
本発明の状況では、「ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体」は、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒ（例えばＩＬ−６Ｒの膜結合形態の可溶性細胞外ドメインを本質的に含む、膜結合形態のＩＬ−６Ｒ又はｓＩＬ−６Ｒのいずれか）とが結び付いた際に形成される複合体を意味する。
本発明は最も広義には、また特に本発明のポリペプチドが指向性を有するＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体の特定の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット若しくは高次構造に限定されず、又はこれによって定義されない。したがって、例えば以下で言及されるように及び図１で図示されるように、本発明のポリペプチドは、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ界面に指向性を有し得る。この実施の形態の状況では、本発明のポリペプチドが、ＩＬ−６／ＩＬ−６受容体複合体に特異的であるのが好ましく、「に特異的」は、例えば好適なアッセイを使用して求められるように、個々のＩＬ−６及び／又はＩＬ−６Ｒに対するポリペプチドの親和性より少なくとも２倍（例えば５倍及び好ましくは１０倍超）の複合体に対する親和性で、ポリペプチドがＩＬ−６及び／又はＩＬ−６受容体の存在下でヒトのＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と相互作用することを意味する。例えば、これに限定されないが、本発明のこの実施の形態では、本発明のポリペプチドは、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒの両方に由来のアミノ酸残基から構成されるエピトープに関する単一結合部位を含む。
本発明のポリペプチドが、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体の２つ以上の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニット又は高次構造と結合することができることも、本発明の範囲内である。このような場合、本発明のポリペプチドが結合するＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体の抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン又はサブユニットは、本質的に同じであり得るか（例えば、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が、反復構造モチーフを含有するか、又は多量体として、例えばＩＬ−６Ｒ及び／又は細胞表面連結ｇｐ１３０及び／又は可溶性ｇｐ１３０との複合体で存在する場合）、又は異なり得る（後者の場合、本発明のポリペプチドは、同じであり得るか又は異なり得る親和性及び／又は特異性で、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体のこのような異なる抗原決定基、エピトープ、部分、ドメイン、サブユニットと結合し得る）。また例えば、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体が活性化高次構造及び不活性化高次構造で存在する場合、本発明のポリペプチドは、これらの高次構造のいずれか１つと結合し得るか、又はこれらの高次構造の両方と（即ち同じであり得るか又は異なり得る親和性及び／又は特異性で）結合し得る。また例えば、本発明のポリペプチドは、（ｇｐ１３０等の）関連リガンドと結合するＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体高次構造と結合し得るか、（ｓｐ１３０等の）関連リガンドと結合しないＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体高次構造と結合し得るか、及び／又は（ここでもまた、同じであり得るか又は異なり得る親和性及び／又は特異性で）このような高次構造の両方と結合し得る。
本発明に関して結合単位として使用するのに好ましい幾つかのＩＬ−６バインダーは、ABLYNX N. V.によって提出された米国仮特許出願第６０／７８２，２４３号明細書（２００６年３月１３日出願）及び"Nanobodies against IL-6 and polypeptides comprising the same"と題されたABLYNX N. V.によって提出された米国仮特許出願（２００６年１２月１日出願）で記載されたアミノ酸配列である。これらの中でも、本願に記載するナノボディが特に好ましい。これらのナノボディの中でも、以下のものが特に好ましい：配列番号１９５〜配列番号３２２（配列番号は、ABLYNX N. V.によって出願された米国仮特許出願第６０／７８２，２４３号明細書（２００６年３月１３日出願）及び"Nanobodies against IL-6 and polypeptides comprising the same"と題されたABLYNX N. V.によって出願された米国仮特許出願（２００６年１２月１日出願）に列挙されているものである）。
本発明の状況での結合単位として使用するのに好ましい幾つかのＩＬ−６バインダーは、ABLYNX N. V.によって出願された米国仮特許出願第６０／８３８，９０４号明細書（２００６年８月１８日出願）及び"Amino acid sequences directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with IL-6-mediated signalling"と題されたABLYNX N. V.によって出願された米国仮特許出願（２００６年１２月５日出願）で記載されたアミノ酸配列である。これらの中でも、本願に記載するナノボディが特に好ましい。これらのナノボディの中でも、以下のものが特に好ましい：配列番号３９９〜配列番号４７１（配列番号は、ABLYNX N. V.によって出願された米国仮特許出願第６０／８３８，９０４号明細書（２００６年８月１８日出願）及び"Amino acid sequences directed against IL-6R and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with IL-6-mediated signalling"と題されたABLYNX N. V.によって出願された米国仮特許出願（２００６年１２月５日出願）に列挙される）。
したがって、当業者にとって明らかなように、本発明のポリペプチドは例えば、さらに本特許出願の上記で記載されたようにＩＬ−６に指向性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列と、ＩＬ−６Ｒに指向性を有する少なくとも１つのアミノ酸配列と、任意で１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列とを含有する、上記で言及された本願で記載されたようなポリペプチド、特に多重特異性ポリペプチドであり得る。
１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列は、任意の好適及び／又は所望のアミノ酸配列であり得る。さらなるアミノ酸配列は、ポリペプチドの（生物学的）特性を変更するか、改質するか、そうでなければこれに影響を与えても又は与えなくてもよく、本発明のポリペプチドにさらなる機能性を付加しても又は付加しなくてもよい。好ましくは、さらなるアミノ酸配列は、本発明のポリペプチドに、１つ又は複数の所望の特性又は機能性を付与するようなものである。
例えば、さらなるアミノ酸配列はまた、任意の所望のタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基又はエピトープ（本発明のポリペプチドが指向性を有する同一のタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基若しくはエピトープ、又は異なるタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基若しくはエピトープが挙げられるが、これらに限定されない）に指向性を有し得る第２の結合部位をもたらし得る。
このようなアミノ酸配列の例は当業者にとって明らかであり、概して、従来の抗体及びその断片（ＳｃＦｖ抗体及び単一ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない）に基づきペプチド融合に用いられる全てのアミノ酸配列を含み得る。例えば、Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136（2005）による概説を参照する。
例えば、このようなアミノ酸配列は、本発明のポリペプチド自体に比べて、半減期、溶解性又は吸収を増大させ、免疫原性又は毒性を低減し、望ましくない副作用を排除又は減衰し、及び／又は他の有益な特性を本発明のポリペプチドに付与し、及び／又は本発明のポリペプチドの望ましくない特性を減らすアミノ酸配列であり得る。このようなアミノ酸配列の幾つかの非限定的な例は、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（例えば国際公開第００／２７４３５号を参照されたい）又はハプテン分子（例えば、循環抗体として認識されるハプテン（例えば国際公開第９８／２２１４１号を参照されたい））である。
特に、免疫グロブリン断片（例えば、ＶＨドメイン）と血清アルブミン又はその断片との連結を利用して半減期を増大させることができることが、当該技術分野において説明されている。国際公開第００／２７４３５号及び国際公開第０１／０７７１３７号を参照する。本発明によれば、本発明のポリペプチドは好ましくは、血清アルブミン（又はその好適な断片）に直接連結するか、又は好適なリンカーを介して、特に好適なペプチドを介して連結することにより、本発明のポリペプチドを遺伝子融合（タンパク質）として発現することができる。具体的な一態様によれば、本発明のポリペプチドは、少なくとも血清アルブミンのドメインＩＩＩ又はその一部を含む、血清アルブミンの断片に連結し得る。例えば、"Albumin derived amino acid sequence, use thereof forincreasing the half-life of therapeutic proteins and of other therapeutic proteinsand entities, and constructs comprising the same"と題されたAblynx N.V.の米国仮特許出願第６０／７８８，２５６号明細書（２００６年３月３１日出願）を参照する。
代替的に、さらなるアミノ酸配列は、血清中の半減期を増大させるように、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン又はＩｇＧ等の別の血清タンパク質等）に指向性を有する、第２の結合部位又は結合単位を与え得る。このようなアミノ酸配列は例えば、下記のナノボディと、国際公開第９１／０１７４３号、国際公開第０１／４５７４６号及び国際公開第０２／０７６４８９号に記載の小ペプチド及び結合タンパク質と、国際公開第０３／００２６０９号及び国際公開第０４／００３０１９号に記載のdAb'sとを含む。Harmsen et al., Vaccine, 23（41）; 4926-42、並びに欧州特許第０３６８６８４号明細書、並びに、本明細書で言及されるAblynxN.Vによる以下の米国仮特許出願第６０／８４３，３４９号明細書、同第６０／８５０，７７４号明細書、同第６０／８５０，７７５号明細書も参照する。
このようなアミノ酸配列は特に、血清アルブミン（及びより詳細にはヒト血清アルブミン）及び／又はＩｇＧ（及びより詳細にはヒトＩｇＧ）に指向性を有し得る。例えば、このようなアミノ酸配列は、（ヒト）血清アルブミンに指向性を有するアミノ酸配列、及び血清アルブミンとＦｃＲｎとの結合に関与しない（ヒト）血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合し得るアミノ酸配列（例えば、国際公開第０６／０１２２７８７号を参照されたい）、及び／又は血清アルブミンのドメインＩＩＩの一部を形成しない血清アルブミン上のアミノ酸残基に結合し得るアミノ酸配列（例えば、同様に国際公開第０６／０１２２７８７号）；増大した半減期を有するか又は半減期を増大させ得るアミノ酸配列（例えば、"Serum albumin binding proteins with long half-lives"と題されたAblynx N.V.による米国仮特許出願第６０／８４３，３４９号明細書（２００６年９月８日出願）を参照されたい）；哺乳動物の少なくとも１種及び特に霊長類の少なくとも１種（例えば、限定されるものではないが、マカク属のサル（例えば、及び特に、カニクイザル（Macaca fascicularis）及び／又はアカゲサル（Macaca mulatta））、並びにヒヒ（Papio ursinus）、同様に米国仮特許出願第６０／８４３，３４９号明細書を参照する）に由来の血清アルブミンと交差反応性であるヒト血清アルブミンに対するアミノ酸配列；ｐＨ非依存的に血清アルブミンに結合し得るアミノ酸配列（例えば、"Amino acid sequences that bind to serum proteins in a mannerthat is essentially independent of the pH, compounds comprising the same, anduses thereof"と題されたAblynx N.V.による米国仮特許出願第６０／８５０，７７４号明細書（２００６年１０月１１日出願）を参照されたい）、及び／又は条件付きバインダーであるアミノ酸配列（例えば、"Amino acid sequences that bind to a desired molecule in aconditional manner"と題されたAblynx N.V.による米国仮特許出願第６０／８５０，７７５号明細書（２００６年１０月１１日出願）を参照されたい）であり得る。
一般に、半減期が増大した本発明のポリペプチドの半減期は、本発明の対応するアミノ酸配列自体の半減期の、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍又は２０倍超である。例えば、半減期が増大した本発明の化合物又はポリペプチドは、本発明の対応するアミノ酸配列自体に比べて、半減期が１時間を超えて、好ましくは２時間を超えて、より好ましくは６時間を超えて、例えば１２時間を超えて、又はさらに２４時間、４８時間若しくは７２時間を超えて増大し得る。
好ましいが、非限定的な本発明の態様において、このような本発明のポリペプチドは、少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間以上のヒトにおける血清半減期を示す。例えば本発明の化合物又はポリペプチドは、少なくとも５日（約５日〜１０日等）、好ましくは少なくとも９日（約９日〜１４日等）、より好ましくは少なくとも約１０日（約１０日〜１５日等）、若しくは少なくとも約１１日（約１１日〜１６日等）、より好ましくは少なくとも約１２日（約１２日〜１８日以上等）、又は１４日超（約１４日〜１９日等）の半減期を有し得る。
別の態様によれば、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列は、従来の４本鎖抗体（及び、特にヒト抗体）及び／又は重鎖抗体の１つ又は複数の部分、断片、又はドメインを含み得る。例えば、通常は好ましさの程度は低いが、本発明のポリペプチドを、従来の（好ましくはヒト）ＶＨドメイン若しくはＶＬドメイン、又はＶＨドメイン若しくはＶＬドメインの天然型類似体若しくは合成類似体に、ここでもまた任意でリンカー配列を介して、連結してもよい（Ward et al.によって記載されているｄＡｂ等のような他の（単一）ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない）。
また、少なくとも１つのポリペプチドは、任意でリンカー配列を介して、１つ又は複数の（好ましくはヒト）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインと連結してもよい。例えば、好適なＣＨ１ドメインと連結するポリペプチドを、例えば従来のＦａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片に類似する抗体断片／構築物を生成するように（好適な軽鎖と共に）使用することができるが、従来のＶＨドメインの１つ、又は（Ｆ（ａｂ’）２断片の場合）１つ若しくは両方は本発明のポリペプチドによって置き換えられた。また、２つのナノボディは、（任意でリンカーを介して）ＣＨ３ドメインと連結してｉｎ ｖｉｖｏで半減期が増大した構築物をもたらすことができる。
本発明のポリペプチドの具体的な一態様によれば、１つ又は複数の本発明のナノボディは、１つ又は複数のエフェクタ機能を本発明のポリペプチドに付与し及び／又は１つ又は複数のＦｃ受容体に結合する能力を付与し得る、１つ又は複数の抗体部分、断片又はドメインと連結し得る。例えば、この目的で、及びこれらに限定されるものではないが、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列は、重鎖抗体（本明細書中に記載）及びより好ましくは従来のヒト４本鎖抗体等に由来する抗体の１つ又は複数のＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインを含んでいてもよく、及び／又は例えばＩｇＧ、ＩｇＥ又は別のヒトＩｇに由来するＦｃ領域（の一部）を形成してもよい。例えば、国際公開第９４／０４６７８号は、ラクダＶＨＨドメイン又はそのヒト化誘導体（即ち、ポリペプチド）を含む重鎖抗体を説明しており、ここでは、ラクダＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインが、ヒトＣＨ２及びＣＨ３ドメインに置き換えられている。それによりポリペプチドとヒトＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（ただしＣＨ１ドメインは含まない）とをそれぞれ含む２つの重鎖から成る免疫グロブリンがもたらされるが、その免疫グロブリンは、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインによって付与されるエフェクタ機能を有し、全く軽鎖が存在しなくても機能することができる。エフェクタ機能を付与するように、本発明のナノボディと好適に連結することができる他のアミノ酸配列は当業者にとって明らかであり、所望のエフェクタ機能（複数可）に基づき選択され得る。例えば、国際公開第０４／０５８８２０号、国際公開第９９／４２０７７号、及び国際公開第０５／０１７１４８号、並びに上記のHolliger and Hudsonの概説を参照する。本発明のポリペプチドとＦｃ部分とのカップリングによっても、対応する本発明のポリペプチドに比べて半減期の増大が生じ得る。用途によっては、全く生物学的に重要なエフェクタ機能も伴わずに半減期が増大したＦｃ部分及び／又は定常ドメイン（即ち、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメイン）の使用も好適であり得るか、又は一層好ましい。１つ又は複数のナノボディと、ｉｎ ｖｉｖｏで半減期が増大した１つ又は複数の定常ドメインとを含む他の好適な構築物は当業者にとって明らかであり、例えば任意でリンカー配列を介してＣＨ３ドメインに連結する２つのナノボディを含み得る。一般に、半減期が増大した任意の融合タンパク質又は誘導体は好ましくは、腎臓吸収のカットオフ値である５０ｋＤを超える分子量を有する。
また、さらなるアミノ酸配列は、合成の際に宿主細胞から本発明のポリペプチドの分泌を導くシグナル配列又はリーダー配列を形成し得る（例えば、本発明のポリペプチドを発現するのに用いられる宿主細胞に応じて、本発明のポリペプチドのプレ、プロ又はプレプロフォームをもたらす）。
また、さらなるアミノ酸配列は、本発明のポリペプチドが、特定の器官、組織、細胞、又は細胞の一部若しくはコンパートメントに誘導され、及び／又はそれらに侵入するか若しくは入り込むことを可能にし、及び／又は本発明のポリペプチドが、細胞膜、上皮細胞の層等の細胞層、固形腫瘍等の腫瘍、又は血液脳関門のような生物学的障壁に侵入するか若しくはそれらを横断することを可能にする配列又はシグナルを形成し得る。このようなアミノ酸配列の好適な例は当業者にとって明らかであり、上述の「Peptrans」のベクター、Cardinale et al.によって記載される配列、並びに例えば国際公開第９４／０２６１０号、国際公開第９５／２２６１８号、米国特許第７００４９４０号明細書、国際公開第０３／０１４９６０号、国際公開第９９／０７４１４号；国際公開第０５／０１６９０号；欧州特許第１５１２６９６号明細書；及び、Cattaneo, A. & Biocca, S.（1997）Intracellular Antibodies：Development andApplications. Landes and Springer-Verlag；及びKontermann,Methods 34,（2004）, 163-170、並びに本明細書中に記載のさらなる参照文献に記載されるような、いわゆる「細胞内抗体（intrabodies）」である本発明のナノボディ及びポリペプチドを発現又は製造するのに使用することができる、それ自体が既知のアミノ酸配列及び抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。
上記の出願でも記載されたように、本発明の多重特異性ポリペプチドは、ポリペプチド内の結合単位と連結する１つ又は複数のリンカーを含有することができる。これらのリンカーは、上述の２つの特許出願で記載されたようなものでもあり得る。このような多重特異性タンパク質は、さらなるアミノ酸配列又は結合単位を含有することもでき、フォーマット化することができ、及び／又は半減期を増大することができる。
本発明に有用な多重特異性ポリペプチドの好ましいが、非限定的な幾つかの例は、本願で列挙される配列番号４２〜配列番号６１の構築物である。
したがって、例えば及び以下でさらに言及されるように、及び図１で概略的に図示されるように、本発明のポリペプチドは、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体のＩＬ−６部分上のエピトープに指向性を有する少なくとも１つの結合部位（例えば第１のドメイン抗体又はナノボディ）と、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体のＩＬ−６Ｒ部分上のエピトープに対する少なくとも１つの結合部位（例えば第２のドメイン抗体又はナノボディ）とを有する二重特異性ポリペプチドであってもよく、このためポリペプチドは両方の結合部位を介して複合体と結合することができ、これによりそれぞれ、ＩＬ−６単独及び／又はＩＬ−６Ｒ単独と結合するのに比べて、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体との結合活性が高くなる。
この実施の形態において、第１の結合部位（即ち結合単位又はナノボディ）は、（本明細書で規定のように）ＩＬ−６に特異的であるのが好ましく、第２の結合部位（即ち結合単位又はナノボディ）は、（本明細書で規定のように）ＩＬ−６Ｒに特異的であるのが好ましい。
この実施の形態によれば、本発明のこの「二重特異性」（又は任意で多重特異性又は二重特異性の三価又は多価）ポリペプチドは、個々の成分に比べて、複合体との選択的又は優先的な結合を有する。このことは、ＩＬ−６又はＩＬ−６Ｒ別々の場合よりも（例えば少なくとも２倍超、例えば５倍超又はさらに１０倍以上）高い、複合体に対する全結合親和性（又は結合活性）として測定することができる。複合体に対する全結合親和性は、複合体における成分に対する個々のポリペプチド構成単位の相互作用の親和性、及び二重特異性ポリペプチドにおけるこれらの２つの構成単位間の連結性及び間隔によって求められる。
したがって、これに限定されないが、その各抗原に対する個々の構成単位の親和性を調節することによって、個々の成分に比べて、二重特異性分子の全親和性（又は結合活性）レベル、及びしたがって複合体との結合の選択性を調節することができる。二重特異性ポリペプチドが、複合体との選択的又は優先的な結合（selective or preferential bind the complex）を有するか又は必要とすると予想される場合、コンパートメントにおける個々の抗原及び複合体の平均、測定、又は予想レベルに基づき、その各抗原又はエピトープに対して個々の構成単位の親和性を選択することができる。このようにして、この結合活性に基づく標的化によって、個々の成分と比べて、複合体に対する選択性（優先的な結合）を達成することができる。また又はさらに、複合体との選択的（又は優先的）結合を達成するのに最適なポリペプチドに対する全親和性を実験アプローチに基づき求めてもよい。例えばＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの界面領域から遠く離れたエピトープを認識するモノクローナル抗体によって直接又はキャプチャを介して、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体をコーティングするＥＬＩＳＡにおいて個々の成分の存在下での二重特異性ポリペプチドと複合体との結合相互作用を試験すること、溶液中でＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒの競合因子を与えること、及びそれから二重特異性ポリペプチドと複合体との結合活性を測定することによって、二重特異性ポリペプチドと複合体の個々の成分との結合よりも複合体の結合が強い（avid）ことに起因する選択的又は優先的な結合、即ち結合活性の相対的差異を測定することができる。代替的に、複合体又は個々の成分に対する二重特異性ポリペプチドの相対的な結合活性及び／又は選択性は、様々な濃度の二重特異性ポリペプチドで測定してもよい。したがって、生理学的に関連する濃度の両方のポリペプチド、即ち複合体及び／又は個々の成分で二重特異性ポリペプチドに対する選択的結合を得るように、個々の成分の結合親和性を調整することができる。この実験アプローチを使用して、二重特異性ポリペプチドの選択的結合に寄与するか、又はこれと対抗することができる全ての因子を考慮し、これには容易には予測することができず、また生化学的データ（例えばＩＬ−６Ｒ二量体等の複合体の個々の成分の二量体の存在、事前に複合体形成したｇｐ１３０／ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒの存在、又は異なる成分間に平衡をもたらすことができる他の血清タンパク質の存在）が不足しているため完全に理解されてはいない因子が全て含まれる。ポリペプチドとＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体との優先的結合には、個々の成分、ＩＬ−６、細胞表面提示ＩＬ−６Ｒ及び可溶性ＩＬ−６Ｒは、複合体と同等には結合されないという利点がある。生理的濃度（典型的にヒトにおいて最大で１０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ）の本発明のポリペプチドの存在下で、複合体を形成していない成分が依然として、その天然リガンドとの或る特定レベルの相互作用を有し得るように、相互作用の親和性を選択し得る。例えば、ＩＬ−６に対する結合単位の親和性が低い場合、このような条件下で新たに産出及び分泌された複合体を形成していないＩＬ−６の循環によって、肝細胞表面上に提示されたＩＬ−６Ｒと結合し、シグナル変換を誘導することができる。これに対して、ＩＬ−６に対する結合単位の親和性が高い場合、ＩＬ−６は、本発明の二重特異性ポリペプチドによって容易に結合し、ＩＬ−６Ｒとの３分子複合体を形成する。さらにＩＬ−６経路の生物学的結果は、このような複合体が可溶性ｇｐ１３０又は細胞表面連結ｇｐ１３０と結合することができるか否か、及びシグナル伝達を誘導することができるか否かによって変わる。
このため、本発明の二重特異性ポリペプチドにおける結合部位／単位は、それぞれＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ上のエピトープと結合することができるようなものであり、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒが複合体へと結び付く場合、本発明のポリペプチドによって結合しやすいようなものであるのが最も好ましい。また本発明のポリペプチドは、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒが複合体へと結び付く場合、それぞれの結合部位／単位が、それぞれＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ上の各エピトープと結合することができるようなものであるのが最も好ましい。
本発明のポリペプチドは概して、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（及び／又は二重特異性分子の場合、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒ）の全ての天然又は合成の類似体、変異体、突然変異体、対立遺伝子、部分及び断片と、又は少なくとも本発明のポリペプチドがＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体（例えば野生型ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体）において結合する抗原決定基（複数可）又はエピトープ（複数可）と本質的に同じである、１つ又は複数の抗原決定基又はエピトープを含有する、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体の類似体、変異体、突然変異体、対立遺伝子、部分及び断片が結合することも予測される。本発明のポリペプチドが結合する、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体の類似体、変異体、突然変異体、対立遺伝子、部分及び断片もあれば、結合しないものもあることも本発明の範囲内に含まれる。
本明細書で想定される使用に好適である限り、本発明のポリペプチドの一部、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子及び／又は誘導体を使用すること、及び／又はこれを含むか、又は本質的にこれから成るタンパク質又はポリペプチドを使用することも本発明の範囲内である。このような一部、断片、類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子、誘導体、タンパク質及び／又はポリペプチドは、本明細書中のさらなる記載で説明する。
本発明の非限定的ではあるが、好ましい実施の形態によれば、本発明のポリペプチドは、１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌまたはそれ未満、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌまたはそれ未満、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で、及び／又は少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１、例えば少なくとも１０１２Ｍ−１の結合親和性（結合定数（ＫＡ））で、及び／又は５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性（解離定数ＫＤ）でＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と結合するようなものであるのが好ましい。ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に対する本発明のポリペプチドの親和性は、例えば本明細書で記載されるアッセイを使用するそれ自体が既知の方法で求めることができる。
本発明の非限定的ではあるが、好ましい実施の形態によれば、ＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとの複合体に対する複数の結合部位を含む本発明のポリペプチドは、別々に個々の成分よりも高い結合活性でＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と結合するようなものであるのが好ましい。このような相互作用のために、文献において、強い相互作用（抗原及びＩｇＧ分子等の２つの分子間の２つ以上の結合部位との相互作用）を測定するために、アッセイ条件が測定値に影響し得ることが確立されていることに注意して全親和性又は結合活性の値を求めることができる。このような強い相互作用に対して測定された全解離定数は、１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌまたはそれ未満、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌまたはそれ未満、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌであり、及び／又は結合親和性は、少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１、例えば少なくとも１０１２Ｍ−１であり、及び／又は親和性は、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満であるのが好ましい。複合体の個々の成分に比べてのＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体への本発明のポリペプチドの相対的な結合力の増大は、２倍、５倍、１０倍、２０倍及び５０倍であるのが好ましい。この差異は、特定の試験で求められる親和性値の比較から、又は結合試験において複合体の個々の成分を有する本発明のポリペプチドと、複合体自体との相互作用を直接比較することによって明らかになり得る。相対的な結合又は結合活性の増大は、例えばそれぞれ固定化されたＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒによる３つのＥＬＩＳＡにおける相対的シグナルに基づく、又は本発明のポリペプチドが固定化する表面上にこれらの３つの成分を注入するBIAcore測定若しくは親和性及び／又は結合活性定数を求めるのに使用する任意の他の方法に基づく、又は本明細書に記載のアッセイを使用する、当該技術分野で既知の方法で求めることができる。典型的に個体に対する結合親和性は、中程度〜低度（１０−５モル／Ｌ〜１０−８モル／Ｌ）であり、２つの結合部位の組合せによって、例えば表面プラズモン共鳴（BIAcore）における解離相に対する効果によって実験的に測定することができる強い効果が生まれ、フローサイトメトリでの結合が強ければ、ＥＬＩＳＡ等におけるシグナルが強くなる。
また本発明によれば、第１の種の温血動物由来のＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有するポリペプチドは、１つ又は複数の他の種の温血動物由来のＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と交差反応性を示しても又は示さなくてもよい。例えば、ヒトＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有するポリペプチドは、１つ又は複数の他の種の霊長類由来のＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体、疾患のために動物モデル（例えばマウス、ラット、ウサギ、ブタ又はイヌ）及び特にＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に関連がある疾患及び障害のために動物モデルで使用されることが多い、１種又は複数種の動物（例えば本明細書で言及される種及び動物モデル）由来のＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と交差反応性を示しても又は示さなくてもよい。この点では、このような疾患モデルでヒトＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に対するポリペプチドを試験することが可能であるので、存在する場合、このような交差反応性は薬剤開発の観点から都合がいいことが当業者にとって明らかである。
より一般的には、１種の動物由来のＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有するポリペプチド（例えばヒトＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に対するポリペプチド）は、ポリペプチドの使用によって、治療する種において所望の効果が与えられれば、別の種の動物の治療に使用することも本発明の範囲内に包含される。
発症する特定の疾患又は障害に応じて、任意の好適なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞ベースのアッセイ、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ及び／又はそれ自体が既知の動物モデル、又はそれらの任意の組合せを使用して、本発明のポリペプチド、及びこれを含む組成物の有効性を試験することができる。好適なアッセイ及び動物モデルは当業者にとって明らかであり、例えばＩＬ−６依存性細胞株（Ｂ９、ＸＧ１及び７ＴＤ１を含む）を使用する細胞増殖アッセイ、コラーゲン誘導関節炎モデル、ＳＣＩＤマウスにおける滑膜組織の移植モデル、様々なヒトの癌（リンパ腫、骨髄腫、前立腺癌及び腎細胞癌を含む）の移植片モデル、ＩＢＤモデル（ＴＮＢＳ、ＤＳＳ及びＩＬ１０ノックアウトモデルを含む）が挙げられる。
以下に、本発明のポリペプチドの好ましいが、非限定的な２つの実施の形態を記載する。
第１の実施の形態において、本発明のポリペプチドは、ヒトのＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に特異的である結合単位を少なくとも１つ含む。このような結合単位は例えば、任意の好適な結合ドメイン（例えば、免疫グロブリン配列、抗体、又はこれらには限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’２）断片、Ｆｖ断片若しくはｓｃＦｖ断片等の抗体断片）であり得る。結合単位は、ＶＨドメイン又はＶＬドメイン等の可変ドメインを少なくとも１つ含むのが好ましい。さらにより好ましくは、結合単位は（単一）ドメイン抗体を少なくとも１つ含む。またさらにより好ましくは、結合単位はナノボディ（登録商標）を少なくとも１つ含む。ナノボディ（登録商標）及びこれを調製する方法は当業者にとって既知である。
この実施の形態において、本発明のポリペプチドは、（図１に概略的に図示されるように）ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体界面に結合するようなもの、及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に結合する際、本発明のポリペプチドがＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体とｇｐ１３０との結び付きを調節、特に阻害することができるようなものであるのが好ましい。
本発明のこの第１の実施の形態で使用するのに適した結合単位は、任意の好適な方法で生成することができる。例えば、Hoogenboom, Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116（2005）に概説されるスクリーニング法等の当業者に既知の好適な技法を用いて、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に対する免疫グロブリン配列（又はこれをコードする核酸）を生成することができる。特定の標的に対する免疫グロブリンを生成する他の技法としては、例えばナノクローン技術（例えば、事前公開されていない（non-prepublished）米国仮特許出願第６０／６４８，９２２号明細書に記載）、いわゆるＳＬＡＭ技術（例えば、欧州特許出願第０５４２８１０号明細書に記載）、ヒト免疫グロブリンを発現するトランスジェニックマウスの使用、又は既知のハイブリドーマ技法（例えば、Larrick et al., Biotechnology,Vol.7, 1989, p.934を参照されたい）が挙げられる。例えば、ヒト免疫グロブリン配列のナイーブライブラリから、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を好適に免疫付与した哺乳動物由来の免疫レパートリを含有するライブラリから、又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を好適に免疫付与した哺乳動物から得られたＢ細胞の血液若しくはサンプルから開始して、全てのこれらの技法を、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に対する免疫グロブリンを生成するのに（即ち複合体に対する免疫応答を引き起こすために）使用することができる。このため、ライブラリをスクリーニングしてもよく、及び／又はＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとのタンパク質融合体（その非限定的な例は、「ハイパーＩＬ−６」（例えば、Fischer M et al., Nat Biotechnol（1997）15: 142-145を参照されたい）として既知のタンパク質融合体である）を哺乳動物に免疫付与してもよい。また哺乳動物は、ヒト（化）抗体レパートリを発現するトランスジェニック哺乳動物（ゼノマウス（Xenomouse）（商標）等）であり得る。
したがって、本発明の一実施の形態によれば、本明細書に記載のポリペプチドは、（本明細書で規定のように）ハイパーＩＬ−６等のＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとのタンパク質融合体に指向性を有し、及び／又は（本明細書で規定のように）ハイパーＩＬ−６等のＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとのタンパク質融合体に指向性を有する結合部位（結合単位、例えばナノボディ等）を少なくとも１つ含むポリペプチドである。本発明の別の実施の形態は、（本明細書で規定のように）ハイパーＩＬ−６等のＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとのタンパク質融合体に特異的であり、及び／又は（本明細書で規定のように）ハイパーＩＬ−６等のＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとのタンパク質融合体に特異的である結合部位（結合単位、例えばナノボディ等）を少なくとも１つ含むポリペプチドである。
別の実施の形態は、ポリペプチド、結合単位、又は（さらに全て本明細書に記載されるように）本明細書に記載のポリペプチド若しくは結合単位を提供するために本明細書に記載の一般的方法によって得られる結合単位を少なくとも１つ含むポリペプチドであり、当該ポリペプチド又は当該結合単位は、ハイパーＩＬ−６等のＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとのタンパク質融合体に指向性を有する、及び／又はこれに特異的である。このようなタンパク質又はポリペプチドを得るために、例えばハイパーＩＬ−６等のＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとのタンパク質融合体を好適に免疫付与した哺乳動物（好ましくはラクダ科動物）の血液又はＢ細胞から開始して、及び／又はハイパーＩＬ−６等のＩＬ−６とＩＬ−６Ｒとのタンパク質融合体による（例えば免疫グロブリン配列のライブラリの）スクリーニングによって、それ自体が既知の方法で及び／又は本明細書にさらに記載されるように、本明細書に記載の方法を行うことができる。
好適な結合単位（又はこれをコードするヌクレオチド配列）を同定及び単離した後、本発明のポリペプチドとして使用しても、又は（任意で好適な発現の後に）本発明のポリペプチドを提供するように、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列（又はこれをコードするヌクレオチド配列）と連結してもよい。
本質的にこの全てを本明細書で記載のように行ってもよい。特に、ラマ等のラクダ科動物に、複合体又はハイパーＩＬ−６を免疫付与してもよく、その後全て本明細書にさらに記載されるように、免疫付与動物から得られたＢ細胞から開始して、複合体に指向性を有するナノボディ配列を生成及び単離してもよい。
第２の実施の形態において、本発明のポリペプチドは、それぞれ、ＩＬ−６単独及び／又はＩＬ−６Ｒ単独と結合するのに比べて、より高い結合活性でＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と結合するポリペプチドである。好ましくは、このようなポリペプチドは、第１の結合部位がＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体のＩＬ−６部分上のエピトープと結合することができ、第２の結合部位がＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体のＩＬ−６Ｒ部分上のエピトープと結合することができるように、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体のＩＬ−６部分上のエピトープに指向性を有する少なくとも１つの結合部位と、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体のＩＬ−６Ｒ部分上のエピトープに対する少なくとも１つの結合部位とを含む。例えば、本発明のポリペプチドが、個々の成分よりＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に対する結合活性又は親和性が高くなるように、このような二重特異性分子は、ヒトＩＬ−６に指向性を有する少なくとも１つの結合単位と、ヒトＩＬ−６Ｒに指向性を有する少なくとも１つの結合単位とを含むことができ、この結合単位という用語は上記で規定される。
したがって例えば、本発明のこの実施の形態の二重特異性分子は、（任意で好適なリンカー又は別の好適なアミノ酸配列を介して）ＩＬ−６に指向性を有する第１の（単一）ドメイン抗体又はナノボディと、ＩＬ−６Ｒに指向性を有する第２の（単一）ドメイン抗体又はナノボディとを含むことができ、ポリペプチドは、ＩＬ−６に対する第１の（単一）ドメイン抗体又はナノボディがＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体のＩＬ−６部分上のエピトープと結合することができ、ＩＬ−６Ｒに指向性を有する第２の（単一）ドメイン抗体又はナノボディがＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体のＩＬ−６Ｒ部分上のエピトープと結合することができるようなものである。
この第２の実施の形態の二重特異性分子を提供するために、ＩＬ−６に指向性を有する結合単位（又はこれをコードするヌクレオチド配列）は、本発明のポリペプチド（又はこれをコードするヌクレオチド配列）を提供するように、任意で好適なリンカーを介して（又はこれをコードするヌクレオチド配列を介して）、及び任意でさらなるアミノ酸配列（又はこれをコードするヌクレオチド配列）に対して及び／又はこれを介してＩＬ−６Ｒに指向性を有する結合単位（又はこれをコードするヌクレオチド配列）（例えば（本明細書にさらに記載されるように）半減期を増大させるさらなる結合単位）と連結してもよい。ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒに対する結合単位（又はこれをコードするヌクレオチド配列）は、それ自体が既知であり得るか、又は本明細書で言及される技法等の任意の好適な方法で生成され得る。特に、ラマ等のラクダ科動物に、それぞれＩＬ−６及び／又はＩＬ−６Ｒを免疫付与してもよく、その後全て本明細書でさらに記載されるように、免疫付与動物から得られたＢ細胞から開始して、それぞれＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒに指向性を有するナノボディ配列を生成及び単離してもよい。
本発明の二重特異性分子に包含される、それぞれＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒに指向性を有する結合単位は、本明細書で規定されるように、それぞれＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒに特異性があるのが好ましい。幾つかの好ましいが、非限定的な本発明のポリペプチドに使用することができるＩＬ−６に対するナノボディは、本願と同一出願日である"Nanobodies(登録商標) against IL-6 andpolypeptides comprising the same"と題された同時係属の米国仮特許出願に記載されている。
概して、本記載及び特許請求の範囲において、単一の結合単位（本発明の単一の結合単位等）を含むか、又は本質的にこれから成るタンパク質又はポリペプチドは、本明細書で「一価」タンパク質若しくはポリペプチド、又は「一価構築物」と呼ばれる。２つ以上の結合単位（本発明の少なくとも２つの結合単位、又は本発明の少なくとも１つの結合単位及び少なくとも１つの他の結合単位等）を含むか、又は本質的にこれから成るタンパク質及びポリペプチドは、本明細書で「多価」タンパク質若しくはポリペプチド、又は「多価構築物」と呼ばれ、これらは、対応する本発明の一価の結合単位に比べてある特定の利点を与え得る。このような多価構築物の幾つかの非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
別の具体的ではあるが、非限定的な実施の形態によれば、本発明のポリペプチドは、（例えばＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有するナノボディの場合）少なくとも１つの本発明の結合単位、又は（例えば複合体のＩＬ−６部分及びＩＬ−６受容体部分に指向性を有する二重特異性分子の場合）少なくとも２つの結合単位及び少なくとも１つの他の（即ち別のエピトープ、抗原、標的、タンパク質又はポリペプチドに指向性を有する）結合単位を含むか、又は本質的にこれから成る。このようなタンパク質又はポリペプチドはまた、本明細書で「多重特異性」タンパク質若しくはポリペプチド、又は「多重特異性構築物」と呼ばれ、これらは、対応する本発明の一価の結合単位に比べて或る特定の利点を与え得る。ここでもまた、このような多重特異性構築物の幾つかの非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
さらに別の具体的ではあるが、非限定的な実施の形態によれば、本発明のポリペプチドは、（例えばＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有するナノボディの場合）少なくとも１つの本発明の結合単位、又は（例えば複合体のＩＬ−６部分及びＩＬ−６受容体部分に指向性を有する二重特異性分子の場合）少なくとも２つの結合単位及び本発明の結合単位及び／又は得られた融合タンパク質に少なくとも１つの所望の特性を与える少なくとも１つの他のアミノ酸配列（タンパク質又はポリペプチド等）を含むか、又は本質的にこれから成る。ここでもまた、このような融合タンパク質は、対応する本発明の一価又は二重特異性の結合単位に比べて或る特定の利点を与え得る。このようなアミノ酸配列及びこのような融合構築物の幾つかの非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
上記の構築物において、１つ又は複数の結合単位及び／又は他のアミノ酸配列は、直接或いは１つ又は複数のリンカー配列を介して連結し得る。このようなリンカーの幾つかの好適ではあるが、非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
好ましくは、本発明のポリペプチドは、任意で１つ又は２つのリンカーを介して連結して、２つ又は３つの本発明の結合単位を含むか、或いは１つ又は２つ、好ましくは２つの本発明の結合単位と、半減期を増大させる少なくとも１つの結合単位（血清タンパク質、特にヒト血清タンパク質（ヒト血清アルブミン等）に指向性を有する結合単位等）とを含む多重特異性ポリペプチドであり、任意で当該結合単位はまた、１つ又は複数のリンカーを介して連結する。
別の好ましい本発明の実施の形態において、本発明のポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏで得られた本発明のポリペプチドの半減期を増大させる１つ又は複数（例えば２つ及び好ましくは１つ）のアミノ酸配列と（任意で１つ又は複数の好適なリンカー配列を介して）連結した、１つ又は複数（例えば２つ又は好ましくは１つ）の本発明の結合単位を含む。特に、ｉｎ ｖｉｖｏで得られた本発明のポリペプチドの半減期を増大させる当該アミノ酸配列は、１つ又は複数（例えば２つ及び好ましくは１つ）の結合単位、特にヒト血清タンパク質（ヒト血清アルブミン等）に指向性を有する結合単位であり得る。
概して、医薬用途のために、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの本発明のポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤、及び／又はアジュバントと、任意で１つ又は複数のさらなる薬学的に活性なポリペプチド及び／又は化合物とを含む薬学的調製物として配合することができる。
別の態様において本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸に関する。このような核酸は、本明細書で「本発明の核酸」とも称され、例えば本明細書で規定されるように遺伝的構築物の形態であり得る。
別の態様において本発明は、本発明のポリペプチドを発現し、又は発現することができ、及び／又は本発明の核酸を含有する、宿主又は宿主細胞に関する。このような宿主又は宿主細胞の幾つかの好ましいが、非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
本発明はさらに、少なくとも１つの本発明のポリペプチド、及び／又は少なくとも１つの本発明の核酸、及び任意で（即ち組成物の目的とする用途に応じて）それ自体が既知のこのような組成物の１つ又は複数のさらなる成分を含有するか又は含む生成物又は組成物に関する。このような生成物又は組成物は例えば、（本明細書に記載の）薬学的組成物、獣医学的組成物又は（本明細書にも記載の）診断用途のための生成物又は組成物であり得る。このような生成物又は組成物の幾つかの好ましいが、非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
本発明はさらに、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物及び組成物を調製又は生成する方法に関する。このような方法の幾つかの好ましいが、非限定的な例は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
本発明はさらに、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、宿主細胞、生成物及び組成物の適用及び使用に、並びにＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に関連する疾患及び障害を予防及び／又は治療する方法に関する。幾つかの好ましいが、非限定的な適用及び使用は、本明細書中のさらなる記載から明らかになる。
また本発明の他の態様、実施の形態、利点及び用途は、本明細書中の以下のさらなる記載から明らかになる。
本発明は、結合単位（複数可）の具体例としてナノボディ（登録商標）を用いて以下にさらに記載する。しかし、本明細書中の開示から、他の結合単位（本明細書で言及されるものを含むが、これに限定されない）を本発明で使用してもよいことは、当業者にとって明らかである。
［発明の詳細な説明］
本発明の上記及び他の態様、実施の形態及び利点は、本明細書中の以下のさらなる記載から明らかになる。
ａ）特に他に指示又は規定がなければ、使用される全ての用語は当該技術分野における通常の意味を有し、当業者にとって明らかである。例えば標準的なハンドブック（例えばSambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual"（2nd.Ed.）, Vols. 1-3, Cold Spring HarborLaboratory Press（1989）、F.Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", GreenPublishing and Wiley Interscience, New York（1987）、Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y.,（1985）、Old et al., "Principles of GeneManipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition,University of California Press, Berkeley, CA（1981）、Roitt et al., "Immunology"（6th.Ed.）, Mosby/Elsevier, Edinburgh（2001）、Roitt et al., Roitt's EssentialImmunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK（2001）、及びJaneway et al., "Immunobiology"（6thEd.）, Garland Science Publishing/Churchill Livingstone,New York（2005））、並びに本明細書で言及される一般的な背景技術を参照する。
ｂ）特に他に指示がなければ、用語「免疫グロブリン配列」は、本明細書で重鎖抗体に言及するのに使用されるのか又は従来の４鎖抗体に言及するのに使用されるかに関係なく、全長抗体、その個々の鎖、及びその全ての一部、ドメイン又は断片（これらに限定されないが、それぞれＶＨＨドメイン又はＶＨ／ＶＬドメイン等の抗原結合ドメイン又は断片を含む）の両方を含む一般的な用語として使用される。さらに（例えば「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」又は「タンパク質配列」等の用語で）本明細書で使用される用語「配列」は一般的に、文脈上さらなる限定的な解釈が要求される場合を除き、関連のアミノ酸配列と、これをコードする核酸配列又はヌクレオチド配列との両方を含むと理解されたい。
ｃ）特に他に指示がなければ、具体的に詳しく説明されていない全ての方法、工程、技法及び操作を実施することができ、当業者にとって明らかなそれ自体が既知の方法で実施した。また例えば、例えば標準的なハンドブック及び本明細書で言及される一般的な背景技術、並びに本明細書で言及されるさらなる参考文献を参照する。
ｄ）アミノ酸残基は、表Ａ−２に言及されるように標準的な３文字アミノ酸コード又は１文字アミノ酸コードに従って示す。
ｅ）２つ以上のヌクレオチド配列を比較するために、［第２のヌクレオチド配列における対応する位置のヌクレオチドと同一な第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの数］を［第１のヌクレオチド配列におけるヌクレオチド総数］で除算し、［１００％］で乗算することによって、第１のヌクレオチド配列と第２のヌクレオチド配列との間の「配列同一性」のパーセントを算出することができ、第１のヌクレオチド配列に比べて、第２のヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの欠失、挿入、置換又は付加のそれぞれは、単一ヌクレオチド（位置）での差異と考えられる。
代替的に、標準的な設定を用いて、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔ ｖ２．０等の配列アラインメント用の既知のコンピュータアルゴリズムを使用して、２つ以上のヌクレオチド配列間の配列同一性の程度を算出することができる。
配列同一性の程度を決定するための幾つかの他の技法、コンピュータアルゴリズム及び設定は例えば、国際公開第０４／０３７９９９号、欧州特許第０９６７２８４号明細書、欧州特許第１０８５０８９号明細書、国際公開第００／５５３１８号、国際公開第００／７８９７２号、国際公開第９８／４９１８５号及び英国特許出願公開第２３５７７６８号明細書に記載されている。
通常、上述で概説された算出方法に従って、２つのヌクレオチド配列間の「配列同一性」のパーセントを決定するために、最も多くのヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を「第１の」ヌクレオチド配列とし、他のヌクレオチド配列を「第２の」ヌクレオチド配列とする。
ｆ）２つ以上のアミノ酸配列を比較するために、［第２のアミノ酸配列における対応する位置のアミノ酸残基と同一な第１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の数］を［第１のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基総数］で除算し、［１００％］で乗算することによって、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列との間の「配列同一性」（本明細書で「アミノ酸同一性」と称される）のパーセントを算出することができ、第１のアミノ酸配列に比べて、第２のアミノ酸配列におけるアミノ酸残基の欠失、挿入、置換又は付加のそれぞれは、単一アミノ酸残基（位置）での差異、即ち本明細書に規定の「アミノ酸差異」と考えられる。
代替的に、ここでもまた標準的な設定を用いて、既知のコンピュータアルゴリズム（例えばヌクレオチド配列に関する配列同一性の程度を決定するのに上記で言及されるもの）を使用して、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を算出することができる。
通常、上述で概説された算出方法に従って、２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセントを決定するために、最も多くのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を「第１の」アミノ酸配列とし、他のアミノ酸配列を「第２の」アミノ酸配列とする。
また、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を決定する際、当業者は、いわゆる「保存的な」アミノ酸置換を考慮してもよく、これは一般的に、アミノ酸残基が同様の化学構造を有する別のアミノ酸残基に置き換わり、且つポリペプチドの機能、活性又は他の生物学的特性への影響がほとんど、又は本質的に全くないアミノ酸置換と説明することができる。このような保存的なアミノ酸置換は、例えば国際公開第０４／０３７９９９号、英国特許出願公開第２３５７７６８号明細書、国際公開第９８／４９１８５号、国際公開第００／４６３８３号及び国際公開第０１／０９３００号から当該技術分野において既知であり、このような置換の（好ましい）種類及び／又は組合せは、関連の教示に基づいて国際公開第０４／０３７９９９号及び国際公開第９８／４９１８５号、並びに本明細書で言及されるさらなる参考文献から選択することができる。
このような保存的な置換は、以下の（ａ）群〜（ｅ）群内の或るアミノ酸が、同じ群内の別のアミノ酸残基に置換される置換である：（ａ）低分子脂肪族で非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ及びＧｌｙ、（ｂ）極性で負に荷電した残基及びこの（非荷電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ及びＧｌｎ、（ｃ）極性で正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ及びＬｙｓ、（ｄ）巨大な脂肪族で非極性の残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ及びＣｙｓ、並びに（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ及びＴｒｐ。
特に好ましい保存的置換は以下のようなものである：ＡｌａをＧｌｙに又はＳｅｒに、ＡｒｇをＬｙｓに、ＡｓｎをＧｌｎに又はＨｉｓに、ＡｓｐをＧｌｕに、ＣｙｓをＳｅｒに、ＧｌｎをＡｓｎに、ＧｌｕをＡｓｐに、ＧｌｙをＡｌａに又はＰｒｏに、ＨｉｓをＡｓｎ又はＧｌｎに、ＩｌｅをＬｅｕに又はＶａｌに、ＬｅｕをＩｌｅに又はＶａｌに、ＬｙｓをＡｒｇに、Ｇｌｎに又はＧｌｕに、ＭｅｔをＬｅｕに、Ｔｙｒに又はＩｌｅに、ＰｈｅをＭｅｔに、Ｌｅｕに又はＴｙｒに、ＳｅｒをＴｈｒに、ＴｈｒをＳｅｒに、ＴｒｐをＴｙｒに、ＴｙｒをＴｒｐに、及び／又はＰｈｅをＶａｌに、Ｉｌｅに又はＬｅｕに。
本明細書に記載のポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換はまた、Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag,1978によって開発された異なる種の相同タンパク質間のアミノ酸変異頻度の解析、Chou and Fasman,Biochemistry 13: 211, 1974及びAdv. Enzymol., 47: 45-149,1978によって開発された構造形成可能性（structure forming potentials）の解析、並びにEisenberg et al., Proc. Nad. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte& Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 1981、及びGoldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986によって開発されたタンパク質における疎水性パターンの解析に基づき得る（全て全体が参照により本明細書に援用される）。ナノボディの一次構造、二次構造、及び三次構造に関する情報は、本明細書中の記載及び上記で言及された一般的な背景技術で与えられる。またこのため、ラマ由来のＶＨＨドメインの結晶構造は例えば、Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803（1996）、Spinelli et al., Natural StructuralBiology（1996）; 3, 752-757、及びDecanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361（1999）によって与えられる。従来のＶＨドメインにおける幾つかのアミノ酸残基に関するさらなる情報は、これらの位置でＶＨ／ＶＬ界面及び潜在的なラクダ化置換を形成する。
ｇ）アミノ酸配列及び核酸配列は、その全長にわたって（本明細書に規定のように）１００％の配列同一性を有する場合、「全く同じ」であると言える。
ｈ）２つのアミノ酸配列を比較するとき、用語「アミノ酸差異」は、第２の配列に比べて第１の配列の位置での単一アミノ酸残基の挿入、欠失又は置換を表し、２つのアミノ酸配列は、１つ又は２つ以上のこのようなアミノ酸差異を含有し得ることが理解される。
ｉ）核酸配列又はアミノ酸配列は、通常その天然の生物学的供給源又はそれから得られる反応媒体又は培養媒体に関連がある少なくとも１つの他の成分（例えば別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分、又は巨大分子）、又は少なくとも１つの汚染物質、不純物若しくは微量成分から単離されている場合、（例えば当該供給源及び／又は当該媒体に比べて）「本質的な単離（形態）」であると見なされる。特に、核酸配列又はアミノ酸配列は、少なくとも２倍、具体的に少なくとも１０倍、より具体的に少なくとも１００倍、及び最大１０００倍以上精製されている場合に、「本質的に単離」すると考えられる。「本質的に単離形態である」核酸配列又はアミノ酸配列は、好適な技法、例えば好適なクロマトグラフィ技法（例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動法）を使用して求められるように、本質的に均一であるのが好ましい。
ｊ）本明細書で使用される用語「ドメイン」は概して、抗体鎖の球状領域、特に重鎖抗体の球状領域、又は本質的にこのような球状領域から成るポリペプチドを表す。通常、このようなドメインは、例えばシートとして、又はジスルフィド結合によって安定化したペプチドループ（例えば３つ又は４つのペプチドループ）を含む。
ｋ）用語「抗原決定基」は、抗原結合分子（例えば本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチド）によって、及びより具体的には当該分子の抗原結合部位によって認識される抗原上のエピトープを表す。用語「抗原決定基」及び「エピトープ」は、本明細書で区別なく使用することもできる。
ｌ）特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質（又はその少なくとも１つの部分、断片又はエピトープ）と結合することができる、特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質に対する親和性を有する、及び／又は特定の抗原決定基、エピトープ、抗原又はタンパク質に対する特異性を有するアミノ酸配列（例えば本発明のナノボディ（登録商標）、抗体、ポリペプチド、又は概して抗原結合タンパク質若しくはポリペプチド、又はその断片）は、当該抗原決定基、当該エピトープ、当該抗原又は当該タンパク質「に対する(against)」、又は「に指向性を有する」と言われる。
ｍ）用語「特異性」は、特定の抗原結合分子又は抗原結合タンパク質（例えば本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチド）分子が結合することができる、様々な種類の抗原又は抗原結合基の数を表す。抗原結合タンパク質の特異性は、親和性及び／又は結合活性に基づき決定することができる。親和性（抗原と抗原結合タンパク質との解離に関する平衡定数（ＫＤ）によって表される）は、抗原結合タンパク質上の抗原決定基と抗原結合部位との間の結合力に関する評価基準であり、ＫＤ値が小さくなれば、抗原決定基と抗原結合分子との間の結合力が大きくなる（代替的に、親和性は、１／ＫＤである親和定数（ＫＡ）としても表すことができる）。（例えば本明細書中のさらなる開示に基づき）当業者にとって明らかなように、対象となる特異的な抗原に応じて、それ自体が既知の方法で親和性を決定することができる。結合活性は、抗原結合分子（例えば本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチド）と関連抗原との間の結合力の測定基準である。結合活性は、抗原結合分子上での抗原決定基とその抗原結合部位との間の親和性、及び抗原結合分子に存在する関連結合部位の数の両方に関係する。典型的には、抗原結合タンパク質（例えば本発明のナノボディ（登録商標）及び／又はポリペプチド）は、１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌまたはそれ未満、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌまたはそれ未満、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で、及び／又は少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１、例えば少なくとも１０１２Ｍ−１の結合親和性で結合する。１０−４Ｌ／モルより大きい任意のＫＤ値は一般的に非特異的な結合を示すと考えられる。好ましくは、本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドは、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、５００ｐＭ未満等の親和性で所望の血清タンパク質と結合する。抗原結合タンパク質と抗原又は抗原決定基との特異的な結合は、それ自体が既知の任意の好適な方法（例えばスキャッチャード解析及び／又は競合的結合アッセイ（例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）及びサンドイッチ競合アッセイ）を含む）及び当該技術分野でそれ自体が既知の様々なその変更方法で求めることができる。
ｎ）本明細書でさらに記載されるように、ナノボディ（登録商標）のアミノ酸配列及び構造は、これらに限定されないが、４つのフレームワーク領域即ち「ＦＲ」から構成されていると考えることができ、当該技術分野及び本明細書中でそれぞれ、「フレームワーク領域１」即ち「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」即ち「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」即ち「ＦＲ３」及び「フレームワーク領域４」即ち「ＦＲ４」と称され、このフレーム領域の間には、３つの相補性決定領域即ち「ＣＤＲ」が挿入され、これは当該技術分野でそれぞれ、「相補性決定領域１」即ち「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」即ち「ＣＤＲ２」及び「相補性決定領域３」即ち「ＣＤＲ３」と称される。
ｏ）また本明細書でさらに記載されるように、ナノボディ（登録商標）におけるアミノ酸残基の総数は、１１０〜１２０、好ましくは１１２〜１１５の範囲内、及び最も好ましくは１１３であり得る。しかし、ナノボディ（登録商標）の一部、断片、類似体又は誘導体（本明細書中に記載）は、本明細書に概説されるさらなる要求を満たし、また好ましくは本明細書に記載の目的に好適であれば、その長さ及び／又はサイズに特に限定されないことに留意されたい。
ｐ）ナノボディのアミノ酸残基は、Riechmann and Muyldermansの論文（例えば当該論文の図２を参照されたい）においてラクダ科動物由来のＶＨＨドメインに適用されるように、Kabat et al.（"Sequence of proteins ofimmunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD,Publication No. 91）によって与えられたＶＨドメインに関する一般的なナンバリングに従って数字が付けられる。このナンバリングに従うと、ナノボディ（登録商標）のＦＲ１は１位〜３０位のアミノ酸残基を含み、ナノボディ（登録商標）のＣＤＲ１は３１位〜３６位のアミノ酸残基を含み、ナノボディ（登録商標）のＦＲ２は３６位〜４９位のアミノ酸残基を含み、ナノボディ（登録商標）のＣＤＲ２は５０位〜６５位のアミノ酸残基を含み、ナノボディ（登録商標）のＦＲ３は６６位〜９４位のアミノ酸残基を含み、ナノボディ（登録商標）のＣＤＲ３は９５位〜１０２位のアミノ酸残基を含み、ナノボディ（登録商標）のＦＲ４は１０３位〜１１３位のアミノ酸残基を含む。［これに関して、ＶＨドメイン及びＶＨＨドメインに関して当該技術分野で既知のように、ＣＤＲそれぞれにおけるアミノ酸残基の総数は変わる可能性があり、カバットナンバリングで示されるアミノ酸残基の総数に対応していなくてもよい（即ちカバットナンバリングによる１つ又は複数の位置が実際の配列で占められていなくてもよく、又は実際の配列が、カバットナンバリングによって可能になる数より多くのアミノ酸残基を含有してもよい）ことに留意されたい。このことは、概してカバットによるナンバリングは、実際の配列におけるアミノ酸残基の実際のナンバリングに対応していても、又は対応していなくてもよいことを意味する。しかし一般的に、ＣＤＲにおけるアミノ酸残基の数に関係なく、カバットナンバリングに従うと、カバットナンバリングによる１位は、ＦＲ１の出発点に対応し（逆もまた同様）、カバットナンバリングによる３６位は、ＦＲ２の出発点に対応し（逆もまた同様）、カバットナンバリングによる６６位は、ＦＲ３の出発点に対応し（逆もまた同様）、カバットナンバリングによる１０３位は、ＦＲ４の出発点に対応する（逆もまた同様）］。
ＶＨドメインのアミノ酸残基の数字を付ける代替方法（この方法は、類似の方法でラクダ科動物由来のＶＨＨドメイン及びナノボディ（登録商標）に適用することができる）は、Chothia et al.（Nature 342, 877-883（1989））によって説明される方法、いわゆる「ＡｂＭ定義」及びいわゆる「接触定義」である。しかし本明細書、特許請求の範囲及び図面では、特に他に指示がなければ、Riechmann and MuyldermansによってＶＨＨドメインに適用されるようなカバットによるナンバリングに従う。
ｑ）図面、配列表及び実験部部分／実施例は、本発明をさらに説明するためだけに与えられ、特に他にはっきりと本明細書中に指示がなければ、本発明の範囲及び／又は添付の特許請求の範囲を限定するものとしては決して解釈されない。
重鎖抗体及びその可変ドメインの概要に関しては、特に一般的な背景技術として言及される以下の参考文献を参照する：Vrije Universiteit Brusselの国際公開第９４／０４６７８号、国際公開第９５／０４０７９号、及び国際公開第９６／３４１０３号；Unileverの国際公開第９４／２５５９１号、国際公開第９９／３７６８１号、国際公開第００／４０９６８号、国際公開第００／４３５０７号、国際公開第００／６５０５７号、国際公開第０１／４０３１０号、国際公開第０１／４４３０１号、欧州特許第１１３４２３１号明細書及び国際公開第０２／４８１９３号；Vlaams Instituut voor Biotechnologie（VIB）の国際公開第９７／４９８０５号、国際公開第０１／２１８１７号、国際公開第０３／０３５６９４号、国際公開第０３／０５４０１６号及び国際公開第０３／０５５５２７号；Algonomics N.V.及び出願人の国際公開第０３／０５０５３１号；カナダのNational Research Councilによる国際公開第０１／９０１９０号；Institute of Antibodiesによる国際公開第０３／０２５０２０号（＝欧州特許第１４３３７９３号明細書）；並びに出願人による国際公開第０４／０４１８６７号、国際公開第０４／０４１８６２号、国際公開第０４／０４１８６５号、国際公開第０４／０４１８６３号、及び国際公開第０４／０６２５５１号、並びに出願人によってさらに公開された特許出願；Hamers-Castermanet al., Nature 1993 June 3; 363（6428）:446-8；Davies and Riechmann, FEBS Lett. 1994 Feb 21; 339（3）: 285-90；Muyldermanset al., Protein Eng. 1994 Sep; 7（9）: 1129-3；Davies and Riechmann, Biotechnology（NY）1995 May; 13（5）: 475-9；Gharoudi et al., 9th Forum of Applied Biotechnology, Med. Fac. Landbouw Univ. Gent. 1995; 60/4a part I:2097-2100；Davies and Riechmann, Protein Eng. 1996 Jun;9（6）: 531-7；Desmyter et al., Nat. Struct. Biol. 1996 Sep; 3（9）: 803-11；Sheriffet al., Nat. Struct Biol. 1996 Sep; 3（9）: 733-6；Spinelli et al., Nat. Struct Biol.1996 Sep; 3（9）: 752-7；Arbabi Ghahroudi et al., FEBS Lett. 1997 Sep 15; 414（3）: 521-6；Vu et al.,Mol Immunol. 1997 Nov-Dec; 34（16-17）: 1121-31；Atarhouch et al., Journal of CamelPractice and Research 1997; 4: 177-182；Nguyen et al.,J. Mol. Biol. 1998 Jan 23; 275（3）: 413-8；Lauwereys et al., EMBO J. 1998 Jul1; 17（13）: 3512-20；Frenken et al., Res. Immunol. 1998 Jul-Aug; 149（6）: 589-99；Transueet al., Proteins 1998 Sep 1; 32（4）: 515-22；Muyldermans and Lauwereys, J. Mol.Recognit. 1999 Mar-Apr; 12（2）: 131-40；van der Linden et al., Biochim. Biophys.Acta 1999 Apr 12; 1431（1）: 37-46.；Decanniere et al., Structure Fold. Des. 1999 Apr 15; 7（4）: 361-70；Ngyuen etal., Mol. 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また上記の参考文献で使用される専門用語に従って、天然重鎖抗体に存在する可変ドメインは、この可変ドメインを従来の４鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（以下「ＶＨドメイン」と表す）と、及び従来の４鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（以下、「ＶＬドメイン」と表す）と区別するために、「ＶＨＨドメイン」とも表される。
上記で表された従来技術で言及されるように、単離ＶＨＨドメイン（並びにこれに基づくナノボディ（登録商標）、これは天然ＶＨＨドメインと、これらの構造的特徴及び機能的性質を共有する）及びこれを含有するタンパク質（これは機能的な抗原結合ドメイン又はタンパク質としての使用に非常に有利である）を作製する、多くの特有の構造的特徴及び機能的性質を、ＶＨＨドメインは有する。特に、これらに限定されないが、（軽鎖可変ドメインの非存在下で、及びこれとの相互作用が全くなく、自然に抗原と機能的に結合するように「設計」された）ＶＨＨドメイン及びナノボディ（登録商標）は、単一で比較的小さな機能的な抗原結合構造単位、ドメイン又はタンパク質としても機能することができる。このことは、ＶＨＨドメインを従来の４鎖抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインと区別し、概してこれら自体は単一抗原結合タンパク質又はドメインとしての実際の適用に適しておらず、幾つかの形態又は機能的な抗原結合単位を与えるような別の形態で（例えばＦａｂ断片等の従来の抗体断片、ＶＬドメインと共有結合するＶＨドメインから成るＳｃＦｖ断片等で）組合せる必要がある。
これらの特有の性質のために、単一抗原結合タンパク質又は抗原結合ドメインとして（即ちより大きなタンパク質又はポリペプチド部分として）のＶＨＨドメイン及びナノボディ（登録商標）の使用によって、従来のＶＨドメイン及びＶＬドメイン、ｓｃＦｖ又はその従来の抗体断片（例えばＦａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片）の使用に対する多くの有意な利点が与えられる：
単一ドメインだけが、高い親和性及び高い選択性で抗原と結合することが要求されるので、２つの分離ドメインを存在させる必要もなく、これらの２つのドメインが正しい空間配座及び構造で存在することを（即ち特別に設計されたリンカー（ｓｃＦｖ等）の使用によって）確認する必要もない。
ＶＨＨドメイン及びナノボディ（登録商標）は単一遺伝子から発現することができ、翻訳後フォールディング又は修飾の必要はない。
ＶＨＨドメイン及びナノボディ（登録商標）は、（本明細書でさらに考察されるように）多価及び多重特異性のフォーマットに容易に遺伝子組み換えすることができる。
ＶＨＨドメイン及びナノボディ（登録商標）は、高溶解性であり、凝集しにくい（Ward et al., Nature, Vol.341, 1989, p.544で記載されるマウス由来の抗原結合ドメイン」等）。
ＶＨＨドメイン及びナノボディ（登録商標）は、熱、ｐＨ、プロテアーゼ及び他の変性剤又は条件に対する安定性が高い（例えば上記のEwert et alを参照されたい）。
ＶＨＨドメイン及びナノボディ（登録商標）は、製造で要求される規模であっても調製するのが容易であり、且つ比較的安価である。例えば、ＶＨＨドメイン、ナノボディ（登録商標）、及びこれを含有するタンパク質／ポリペプチドは、微生物発酵を使用して（例えば以下でさらに記載されるように）製造することができ、哺乳動物の発現系（例えば従来の抗体断片）を使用する必要がない。
ＶＨＨドメイン及びナノボディ（登録商標）は、従来の４鎖抗体及びその抗原結合断片に比べて比較的小さい（約１５ｋＤａ、即ち従来のＩｇＧの１０分の１）であるため、このような従来の４鎖抗体及びその抗原結合断片よりも高い組織（充実性腫瘍及び他の高密度組織を含むが、これらに限定されない）への浸透性を示す。
ＶＨＨドメイン及びナノボディ（登録商標）は、（特に従来のＶＨドメインに比べてＣＤＲ３ループが伸長するため）いわゆるキャビティ結合性を示すことができ、したがって従来の４鎖抗体及びその抗原結合断片には接近することができない標的及びエピトープに接近することもできる。例えば、ＶＨＨドメイン及びナノボディ（登録商標）は酵素を阻害することができることが分かっている（例えば国際公開第９７／４９８０５号、Transue et al.,（1998）（上記）、Lauwereys et al.,（1998）（上記）を参照されたい）。
概して上述のように本発明は、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有するナノボディと、本明細書に記載の予防目的、治療目的及び／又は診断目的に使用することができる、１つ又は複数のこのようなナノボディ（登録商標）を含むか、又は本質的にこれから成るポリペプチドとに関する。
また本明細書にさらに記載されるように、本発明はさらに、このようなナノボディ及びポリペプチドをコードする核酸と、このようなナノボディ（登録商標）及びポリペプチドを製造する方法と、このようなナノボディ（登録商標）若しくはポリペプチドを発現する、又は発現することができる宿主細胞と、このようなナノボディ（登録商標）、ポリペプチド、核酸又は宿主細胞を含む組成物と、このようなナノボディ（登録商標）、ポリペプチド、核酸、宿主細胞又は組成物の使用とに関する。
概して、最も広義には本明細書で使用される用語ナノボディ（登録商標）は、特定の生物学的供給源又は特定の製造方法に限定されないことに留意されたい。例えば、以下でより詳細に考察されるように、本発明のナノボディ（登録商標）は概して、（１）天然の重鎖抗体のＶＨＨドメインを単離すること、（２）天然のＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列の発現、（３）天然ＶＨＨドメインの（本明細書に記載の）「ヒト化」、又はこのようなヒト化ＶＨＨドメインをコードする核酸の発現、（４）任意の動物種、特に哺乳動物種（例えばヒト）由来の天然ＶＨドメインの（本明細書に記載の）「ラクダ化」、又はこのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現、（５）Ward et al（上記）によって記載されるような「ドメイン抗体」若しくは「Ｄａｂ」の「ラクダ化」、又はこのようなラクダ化ＶＨドメインをコードする核酸の発現、（６）それ自体が既知である、タンパク質、ポリペプチド又は他のアミノ酸配列を調製するのに合成技法又は半合成技法を使用すること、（７）それ自体が既知である核酸合成技法を使用して、ナノボディ（登録商標）をコードする核酸を調製した後、このようにして得られた核酸を発現すること、及び／又は（８）上記の１つ又は複数の任意の組合せによって得ることができる。上記を実施するのに好適な方法及び技法は、本明細書中の開示に基づいて当業者にとって明らかであり、例えば本明細書でより詳細に記載される方法及び技法が含まれる。
１つの好ましいクラスのナノボディ（登録商標）は、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有する天然重鎖抗体のＶＨＨドメインに対応する。本明細書にさらに記載されるように、このようなＶＨＨ配列は概して、（即ち免疫応答及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有する重鎖抗体を生じるように）ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体をラクダ種に好適に免疫付与すること、当該ラクダ科動物由来の好適な生体サンプル（例えば血液サンプル、血清サンプル又はＢ細胞のサンプル）を得ること、及びそれ自体が既知の任意の好適な技法を使用して、当該サンプルからＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有するＶＨＨ配列を生成することによって、生成又は入手することができる。このような技法は、当業者にとって明らかであり、及び／又は本明細書でさらに記載される。
代替的に、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に対するこのような天然ＶＨＨドメインは、例えばそれ自体が既知の１つ又は複数のスクリーニング技法を用いて、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体、又は少なくとも１つのその一部、断片、抗原決定基若しくはエピトープを使用して、このようなライブラリをスクリーニングすることによってラクダＶＨＨ配列のナイーブライブラリから得ることができる。このようなライブラリ及び技法は例えば、国際公開第９９／３７６８１号、国際公開第０１／９０１９０号、国際公開第０３／０２５０２０号及び国際公開第０３／０３５６９４号に記載されている。代替的に、ナイーブＶＨＨライブラリ由来の改良型の合成ライブラリ又は半合成ライブラリ（例えばランダム突然変異法及び／又はＣＤＲシャッフリング（例えば国際公開第００／４３５０７号に記載されているようなもの）等の技法によって、ナイーブＶＨＨライブラリから得られるＶＨＨライブラリ）を使用してもよい。
ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有するＶＨＨ配列を得るためのさらに別の技法は、（即ち免疫応答及び／又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有する重鎖抗体を生じるように）重鎖抗体を発現することができるトランスジェニック哺乳動物に好適に免疫付与すること、当該トランスジェニック哺乳動物由来の好適な生体サンプル（例えば血液サンプル、血清サンプル又はＢ細胞のサンプル）を得ること、及びそれからそれ自体が既知の任意の好適な技法を使用して、当該サンプルからＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有するＶＨＨ配列を生成することを伴う。例えばこのために、国際公開第０２／０８５９４５号、及び国際公開第０４／０４９７９４号に記載されている重鎖抗体発現マウス、並びにさらなる方法及び技法を使用することができる。
特に好ましいクラスの本発明のナノボディ（登録商標）は、天然ＶＨＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、即ち当該天然ＶＨＨ配列（特にフレームワーク配列）のアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸残基を、（例えば上記の）ヒトの従来の４鎖抗体由来のＶＨドメインの対応する位置（複数可）で発生する１つ又は複数のアミノ酸残基に置き換えることによって「ヒト化」したアミノ鎖配列を有するナノボディ（登録商標）を含む。例えば本明細書中のさらなる記載及び本明細書で言及されたヒト化に関する従来技術に基づいて、当業者にとって明らかなそれ自体が既知の方法で、これを実施することができる。また、このような本発明のヒト化ナノボディ（登録商標）は、それ自体が既知の任意の好適な方法で（即ち上記の（１）〜（８）で示されたように）得ることができ、このため出発材料として天然ＶＨＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに厳密に限定されないことに留意されたい。
別の特に好ましいクラスの本発明のナノボディ（登録商標）は、天然ＶＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、従来の４鎖抗体由来の天然ＶＨドメインのアミノ酸配列における１つ又は複数のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶＨＨドメインの対応する位置（複数可）で発生する１つ又は複数のアミノ酸残基に置き換えることによって「ラクダ化」したアミノ酸配列を有するナノボディ（登録商標）を含む。例えば本明細書中のさらなる記載に基づいて、当業者にとって明らかなそれ自体が既知の方法で、これを実施することができる。このような「ラクダ化」置換は、本明細書に規定のように、ＶＨ−ＶＬ界面を形成し及び／又はこれに存在するアミノ酸位置に、及び／又はいわゆるラクダ科動物の特徴的な残基に、挿入するのが好ましい（例えば国際公開第９４／０４６７８号及びDavies and Riechmann（1994 and 1996）（上記）を参照されたい）。好ましくは、出発材料又はラクダ化ナノボディを生成若しくは設計するための出発点として使用されるＶＨ配列は、好ましくは哺乳動物由来のＶＨ配列、より好ましくはヒトのＶＨ配列（例えばＶＨ３）である。しかし、このような本発明のラクダ化ナノボディ（登録商標）は、それ自体が既知の任意の好適な方法で（即ち上記の（１）〜（８）で示されたように）得ることができ、このため出発材料として天然ＶＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに厳密に限定されないことに留意されたい。
例えばまた、本明細書にさらに記載されるように、それぞれ天然のＶＨＨドメイン又はＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列を準備した後、それ自体が既知の方法で、新規のヌクレオチド配列がそれぞれ、本発明の「ヒト化」又は「ラクダ化」ナノボディ（登録商標）をコードするように、当該ヌクレオチド配列における１つ又は複数のコドンを変えることによって、「ヒト化」及び「ラクダ化」の両方を行うことができる。次にこの核酸は、所望の本発明のナノボディ（登録商標）を提供するようにそれ自体が既知の方法で発現することができる。代替的に、それぞれ天然のＶＨＨドメイン又はＶＨドメインのアミノ酸配列に基づき、それぞれ所望の本発明のヒト化又はラクダ化ナノボディ（登録商標）のアミノ酸配列を設計した後、それ自体が既知のペプチド合成技法を使用してｄｅ ｎｏｖｏで合成することができる。また、それぞれ天然のＶＨＨドメイン又はＶＨドメインのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列に基づき、それぞれ所望の本発明のヒト化又はラクダ化ナノボディ（登録商標）をコードするヌクレオチド配列を設計した後、それ自体が既知のペプチド合成技法を使用してｄｅ ｎｏｖｏで合成することができ、その後所望の本発明のナノボディ（登録商標）を提供するように、それ自体が既知の方法で、このようにして得られた核酸を発現することができる。
天然ＶＨ配列又は好ましくはＶＨＨ配列から、本発明のナノボディ（登録商標）及び／又はこれをコードする核酸を得るのに好適な他の方法及び技法は、当業者にとって明らかであり、例えば本発明のナノボディ（登録商標）、又はこれをコードするヌクレオチド配列若しくは核酸を提供するように好適な方法で、１つ又は複数の天然ＶＨ配列（例えば１つ又は複数のＦＲ配列及び／又はＣＤＲ配列）の一部分又は複数部分、１つ又は複数の天然ＶＨＨ配列（例えば１つ又は複数のＦＲ配列及び／又はＣＤＲ配列）の一部分又は複数部分、及び／又は１つ又は複数の合成又は半合成の配列を組み合わせることを含み得る。
好ましいが、非限定的な本発明の一態様によれば、ナノボディ（登録商標）は概して、最も広義には
（ａ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱである）、及び／又は
（ｂ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、（本明細書に規定の）荷電アミノ酸又はシステインであり、４４位はＥであるのが好ましい）、及び／又は
（ｃ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＰ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、特にＲ及びＳから成る群から選択される）を含む、ポリペプチドと定義することができる。
したがって好ましいが、非限定的な第１の態様において、本発明のナノボディ（登録商標）は、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
（ａ）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱであり、及び／又は
（ｂ）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、荷電アミノ酸又はシステイン残基であり、カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基はＥであるのが好ましく、及び／又は
（ｃ）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＰ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、特にＲ及びＳから成る群から選択される。
特に、ナノボディ（登録商標）は概して、最も広義には
（ａ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱである）、及び／又は
（ｂ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基はＥであり、カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基はＲである）、及び／又は
（ｃ）３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列（カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＰ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、特にＲ及びＳから成る群から選択される）を含む、ポリペプチドと定義することができる。
したがって好ましいが、非限定的な態様によれば、本発明のナノボディ（登録商標）は、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
ａ）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱであり、及び／又は
ｂ）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基はＥであり、カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基はＲであり、及び／又は
ｃ）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＰ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、特にＲ及びＳから成る群から選択される。
特に本発明によるＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に対するナノボディ（登録商標）は、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る、ここで
（ａ）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱであり、及び／又は
（ｂ）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基はＥであり、カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基はＲであり、及び／又は
（ｃ）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基はＰ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、特にＲ及びＳから成る群から選択される。
特に、好ましいが、非限定的な本発明の一態様によれば、ナノボディ（登録商標）は一般的に、３つの相補性決定領域／配列が間に挿入された４つのフレームワーク領域／配列から成るアミノ酸配列を含むポリペプチドと定義することができ、
（ａ−１）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｌから成る群から選択され、好ましくはＧ、Ｅ若しくはＱから成る群から選択され、
（ａ−２）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ若しくはＣから成る群から選択され、好ましくはＬ若しくはＲから成る群から選択され、
（ａ−３）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ若しくはＳから成る群から選択され、好ましくはＷ若しくはＲであり、最も好ましくはＷであり、
（ａ−４）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱであるか、又は
（ｂ−１）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ｅ及びＱから成る群から選択され、
（ｂ−２）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基はＲであり、
（ｂ−３）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、好ましくはＷであり、
（ｂ−４）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱ及びＬから成る群から選択され、好ましくはＱであるか、又は
（ｃ−１）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ及びＬから成る群から選択され、好ましくはＧ、Ｅ及びＱから成る群から選択され、
（ｃ−２）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ及びＣから成る群から選択され、好ましくはＬ及びＲから成る群から選択され、
（ｃ−３）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｐ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、特にＲ及びＳから成る群から選択され、
（ｃ−４）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱ及びＬから成る群から選択され、好ましくはＱである。
したがって、別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明のナノボディ（登録商標）は、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
（ａ）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｇ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｌから成る群から選択され、好ましくはＧ、Ｅ若しくはＱから成る群から選択され、
（ｂ）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ若しくはＣから成る群から選択され、好ましくはＬ若しくはＲから成る群から選択され、
（ｃ）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ若しくはＳから成る群から選択され、好ましくはＷ若しくはＲであり、最も好ましくはＷであり、
（ｄ）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱである。
別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明のナノボディ（登録商標）は、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
（ａ）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ｅ及びＱから成る群から選択され、
（ｂ）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基はＲであり、
（ｃ）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、好ましくはＷであり、
（ｄ）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱである。
別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明のナノボディ（登録商標）は、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
（ａ）カバットナンバリングによる４４位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ及びＬから成る群から選択され、好ましくはＧ、Ｅ及びＱから成る群から選択され、
（ｂ）カバットナンバリングによる４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ及びＣから成る群から選択され、好ましくはＬ及びＲから成る群から選択され、
（ｃ）カバットナンバリングによる１０３位のアミノ酸残基は、Ｐ、Ｒ及びＳから成る群から選択され、特にＲ及びＳから成る群から選択され、
（ｄ）カバットナンバリングによる１０８位のアミノ酸残基はＱ及びＬから成る群から選択され、好ましくはＱである。
２つの特に好ましいが、非限定的な本発明のナノボディ（登録商標）群は、上記のａ）、上記の（ａ−１）〜（ａ−４）、上記のｂ）、上記の（ｂ−１）〜（ｂ−４）、上記の（ｃ）、及び／又は、上記の（ｃ−１）〜（ｃ−４）によるものであり、ここで：
ａ）カバットナンバリングによる４４位〜４７位のアミノ酸残基は、配列ＧＬＥＷ（又は本明細書に記載のＧＬＥＷ様配列）を形成し、１０８位のアミノ酸残基はＱであるか、又は
ｂ）カバットナンバリングによる４３位〜４６位のアミノ酸残基は、配列ＫＥＲＥ又はＫＱＲＥ（又はＫＥＲＥ様配列）を形成し、１０８位のアミノ酸残基はＱ又はＬであり、好ましくはＱである。
したがって、別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明のナノボディ（登録商標）は、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで
（ａ）カバットナンバリングによる４４位〜４７位のアミノ酸残基は、配列ＧＬＥＷ（又は本明細書に記載のＧＬＥＷ様配列）を形成し、１０８位のアミノ酸残基はＱである。
別の好ましいが、非限定的な態様において、本発明のナノボディ（登録商標）は、構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る、ここでカバットナンバリングによる４３位〜４６位のアミノ酸残基は、配列ＫＥＲＥ又はＫＱＲＥ（又はＫＥＲＥ様配列）を形成し、１０８位のアミノ酸残基はＱ又はＬであり、好ましくはＱである。
カバットナンバリングによる４３位〜４６位のアミノ酸残基が、配列ＫＥＲＥ又はＫＱＲＥを形成する、本発明のナノボディ（登録商標）において、３７位のアミノ酸残基がＦであるのが最も好ましい。カバットナンバリングによる４４位〜４７位のアミノ酸残基が、配列ＧＬＥＷを形成する、本発明のナノボディ（登録商標）において、３７位のアミノ酸残基は、Ｙ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｖ又はＦから成る群から選択され、Ｆであるのが最も好ましい。
したがって、決してこれらには限定されないが、上述の位置に存在するアミノ酸残基に基づき、概して本発明のナノボディ（登録商標）を以下の３つの群に基づいて分類することができる：
ａ）「ＧＬＥＷ群」：カバットナンバリングによる４４位〜４７位にアミノ酸配列ＧＬＥＷ、及びカバットナンバリングによる１０８位にＱを有するナノボディ（登録商標）。本明細書でさらに記載されるように、この群内のナノボディ（登録商標）は通常、３７位にＶを有し、１０３位にＷ、Ｐ、Ｒ又はＳを有することができ、好ましくは１０３位にＷを有する。ＧＬＥＷ群は、以下の表Ａ−３で言及されるもののような幾つかのＧＬＥＷ様配列も含む。
ｂ）「ＫＥＲＥ群」：カバットナンバリングによる４３位〜４６位にアミノ酸配列ＫＥＲＥ又はＫＱＲＥ、及びカバットナンバリングによる１０８位にＱ又はＬを有するナノボディ（登録商標）。この群内のナノボディ（登録商標）は通常、３７位にＦ、及び４７位にＬ又はＦを有し、１０３位にＷ、Ｐ、Ｒ又はＳを有することができ、好ましくは１０３位にＷを有する。
ｃ）「１０３Ｐ、Ｒ、Ｓ群」：１０３位にＰ、Ｒ又はＳを有するナノボディ（登録商標）。これらのナノボディ（登録商標）は、カバットナンバリングによる４４位〜４７位にアミノ酸配列ＧＬＥＷ、又はカバットナンバリングによる４３位〜４６位にアミノ酸配列ＫＥＲＥ又はＫＱＲＥのいずれかを有することができ（後者は、（ＫＥＲＥ群に関して規定のように）３７位のＦと、４７位のＬ又はＦと組合せるのが最も好ましい）、カバットナンバリングによる１０８位にＱ又はＬを有することができ、Ｑを有するのが好ましい。
また、より一般的には、上記で言及された１０８Ｑ、４３Ｅ／４４Ｒ及び１０３Ｐ、Ｒ、Ｓ残基の他に、本発明のナノボディ（登録商標）は、従来のＶＨドメインでＶＨ／ＶＬ界面（の一部）が形成される１つ又は複数の位置で、対応する天然ＶＨ配列における同じ位置（複数可）で自然発生するアミノ酸残基よりも強く荷電する、１つ又は複数のアミノ酸残基、特に（表Ａ−２で言及される）１つ又は複数の荷電アミノ酸残基を含有することができる。このような置換としては、これらに限定されないが、以下の表Ａ−３で言及されるＧＬＥＷ様配列、及び４４位〜４７位のＫＬＥＷと共に１０８位にＱを有するナノボディ（登録商標）を得るために、いわゆる「ミクロボディ」に関して国際出願の国際公開第００／２９００４号で説明される置換が挙げられる。これらの位置での他の可能性のある置換は、本明細書中の開示に基づいて当業者にとって明らかである。
本発明のナノボディ（登録商標）の一実施の形態において、８３位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｖ及びＷから成る群から選択され、Ｌであるのが好ましい。
また、本発明のナノボディ（登録商標）の一実施の形態において、８３位のアミノ酸残基は、Ｒ、Ｋ、Ｎ、Ｅ、Ｇ、Ｉ、Ｔ及びＱから成る群から選択され、（天然ＶＨＨドメインに対応するナノボディ（登録商標）に関しては）Ｋ若しくはＥ、又は（本明細書に記載の「ヒト化」ナノボディ（登録商標）に関しては）Ｒのいずれかであるのが最も好ましい。一実施の形態では、８４位のアミノ酸残基は、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｓ、Ｄ、Ｔ及びＶから成る群から選択され、（天然ＶＨＨドメインに対応するナノボディ（登録商標）に関しては）Ｐ、又は（本明細書に記載の「ヒト化」ナノボディ（登録商標）に関しては）Ｒであるのが最も好ましい。
さらに本発明のナノボディ（登録商標）の一実施の形態において、１０４位のアミノ酸残基は、Ｇ及びＤから成る群から選択され、Ｇであるのが最も好ましい。
まとめると、ナノボディ（登録商標）において上記で言及される、１１位、３７位、４４位、４５位、４７位、８３位、８４位、１０３位、１０４位及び１０８位のアミノ酸残基は、本明細書で「特徴的な残基」とも称される。特徴的な残基及び最も密接に関連したヒトＶＨドメイン（ＶＨ３）の対応する位置のアミノ酸残基を表Ａ−３に要約する。
幾つかの特に好ましいが、非限定的な天然ＶＨＨドメインで生じるこれらの特徴的な残基の組合せを表Ａ−４で言及する。比較のために、ＤＰ−４７と呼ばれるヒトＶＨ３の対応するアミノ酸残基をイタリック体で示している。
ナノボディ（登録商標）において、特徴的な残基以外の任意の位置の各アミノ酸残基は、天然ＶＨＨドメインの（カバットナンバリングによる）対応する位置で自然発生する任意のアミノ酸残基であり得る。
このようなアミノ酸残基は当業者にとって明らかである。表Ａ−５〜表Ａ−８は、天然ＶＨＨドメインのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の（カバットナンバリングによる）それぞれの位置に存在し得る幾つかの非限定的な残基を表す。それぞれの位置に関しては、天然ＶＨＨドメインのそれぞれの位置で最も頻繁に発生する（ナノボディ（登録商標）における当該位置に最も好ましいアミノ酸残基である）アミノ酸残基を太字で示し、それぞれの位置に好ましい他のアミノ酸残基を下線処理する（備考：天然ＶＨＨドメインの２６位〜３０位で見られるアミノ酸残基の数は、これらの位置の残基が既にＣＤＲ１部分を形成するというChothia（上記）によるナンバリングに基づく仮説を支持する）。
表Ａ−５〜表Ａ−８では、ヒトＶＨ３ドメインのそれぞれの位置に存在し得る非限定的な残基も幾つか表している。また、それぞれの位置に関しては、天然ヒトＶＨ３ドメインのそれぞれの位置で最も頻繁に発生するアミノ酸残基を太字で示し、他の好ましいアミノ酸残基を下線処理する。
参考のみのために、表Ａ−５は、１１１８ＶＨＨ配列の代表的なサンプルにおけるそれぞれのアミノ酸位置でＶＨＨエントロピー（「ＶＨＨ Ｅｎｔ．」）及びＶＨＨ変動（「ＶＨＨ Ｖａｒ．」）に関するデータ（David Lutje Hulsing and Prof. Theo Verrips of Utrecht Universityによって無償（kindly）提供されたデータ）も含有する。ＶＨＨエントロピー及びＶＨＨ変動の値は、解析する１１１８ＶＨＨ配列間のアミノ酸残基の変動及び保存度に対する評価基準を与え、低い値（即ち１未満、例えば０．５未満）は、アミノ酸残基が、ＶＨＨ配列間で強く保存される（即ちほとんど変動性がない）ことを示す。例えば、８位のＧ及び９位のＧはそれぞれ、０．１及び０のＶＨＨエントロピー値を有し、これは（解析する全ての１１１８配列において９位がＧである場合）これらの残基が強く保存され、ほとんど変動しないことを示す一方で、ＣＤＲ部分を形成する残基に関しては概して、１．５以上の値が見られる（データ図示せず）。（１）表Ａ−５の２列目に列挙されるアミノ酸残基は、後の２列で言及されるＶＨＨエントロピー及びＶＨＨ変動性を決定するのに解析された１１１８ＶＨＨ配列よりも大きいサンプルに基づいており、（２）以下で表すデータは、２７位〜３０位のアミノ酸残基、並びにおそらく９３位及び９４位のアミノ酸残基でさえも既にＣＤＲ部分を形成しているという仮説を支持することに留意されたい（しかしながら、本発明は任意の特定の仮説又は説明に限定されず、上述のように、本明細書ではカバットによるナンバリングを使用する）。配列エントロピー、配列変動及びこれを決定する方法の一般的説明に関しては、Oliveira et al., PROTEINS: Structure, Function and Genetics, 52:544-552（2003）を参照されたい。
したがって、別の好ましいが非限定的な態様では、本発明のナノボディ（登録商標）は構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで、特徴的な残基は本明細書で規定されるようなものである。
別の好ましいが非限定的な態様では、本発明のナノボディ（登録商標）は構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで、
（ａ）ＦＲ１は次の群から選択される：
以下のアミノ酸配列から成る群：
［１］ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＸＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧ［２６］
［配列番号１］
又は、
上記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−５で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しない、
及び／又は、
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−５で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しない、
（ｂ）ＦＲ２は次の群から選択される：
以下のアミノ酸配列から成る群：
［３６］ＷＸＲＱＡＰＧＫＸＸＥＸＶＡ［４９］ ［配列番号２］
又は、
上記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−６で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しない、
及び／又は、
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−６で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しない、
（ｃ）ＦＲ３は次の群から選択される：
以下のアミノ酸配列から成る群：
［６６］ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＸＸＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ［９４］ ［配列番号３］
又は、
上記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−７で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しない、
及び／又は、
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−７で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しない、
（ｄ）ＦＲ４は次の群から選択される：
以下のアミノ酸配列から成る群：
［１０３］ＸＸＱＧＴＸＶＴＶＳＳ［１１３］ ［配列番号４］
又は、
上記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−８で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しない、
及び／又は、
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−８で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有しない；
ここで特徴的な残基は「Ｘ」で示され、且つ上記で規定されるようなものであり、括弧の間の数字はカバットナンバリングによるアミノ酸位置を指す。
別の好ましいが非限定的な態様では、本発明のナノボディ（登録商標）は構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで、
（ａ）ＦＲ１は次の群から選択される：
以下のアミノ酸配列から成る群：
［１］ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧ［２６］
［配列番号５］
又は、
上記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−５で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）所定位の特徴的な残基は上記の配列に示されるようなものである、
及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−５で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）所定位の特徴的な残基は上記の配列に示されるようなものである、
（ｂ）ＦＲ２は次の群から選択される：
以下のアミノ酸配列から成る群：
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡ［４９］ ［配列番号６］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡ［４９］ ［配列番号７］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＡ［４９］ ［配列番号８］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡ［４９］ ［配列番号９］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡ［４９］ ［配列番号１０］
［３６］ＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＡ［４９］ ［配列番号１１］
又は、
上記アミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−６で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、
ｉｉｉ）３７位、４４位、４５位及び４７位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである、
及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−６で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、
ｉｉｉ）３７位、４４位、４５位及び４７位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである、
（ｃ）ＦＲ３は次の群から選択される：
以下のアミノ酸配列から成る群：
［６６］ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ［９４］ ［配列番号１２］
又は、
上記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−７で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）８３位及び８４位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである、
及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−７で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）８３位及び８４位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである、
（ｄ）ＦＲ４は次の群から選択される：
以下のアミノ酸配列から成る群：
［１０３］ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ［１１３］ ［配列番号１３］
［１０３］ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ［１１３］ ［配列番号１４］
又は、
上記アミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−８で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）１０３位、１０４位及び１０８位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである、
及び／又は、
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−８で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、
ｉｉｉ）１０３位、１０４位及び１０８位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである。
別の好ましいが非限定的な態様では、本発明のナノボディ（登録商標）は構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで、
（ａ）ＦＲ１は次の群から選択される：
以下のアミノ酸配列から成る群：
［１］ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧ［２６］
［配列番号５］
及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−５で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）所定位の特徴的な残基は上記の配列に示されるようなものである、
（ｂ）ＦＲ２は次の群から選択される：
以下のアミノ酸配列から成る群：
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＬＶＡ［４９］ ［配列番号６］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＡ［４９］ ［配列番号７］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＧＡ［４９］ ［配列番号８］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＬＶＡ［４９］ ［配列番号９］
［３６］ＷＦＲＱＡＰＧＫＱＲＥＦＶＡ［４９］ ［配列番号１０］
及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−６で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）３７位、４４位、４５位及び４７位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである、
（ｃ）ＦＲ３は次の群から選択される：
以下のアミノ酸配列から成る群：
［６６］ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ［９４］ ［配列番号１２］
及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−７で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）８３位及び８４位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである、
（ｄ）ＦＲ４は次の群から選択される：
以下のアミノ酸配列から成る群：
［１０３］ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ［１１３］ ［配列番号１３］
［１０３］ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ［１１３］ ［配列番号１４］
及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−８で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、
ｉｉｉ）１０３位、１０４位及び１０８位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである。
別の好ましいが非限定的な態様では、本発明のナノボディ（登録商標）は構造：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
（ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜フレームワーク領域４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜相補性決定領域３を指す）を有し得る；ここで、
（ａ）ＦＲ１は次の群から選択される：
以下のアミノ酸配列から成る群：
［１］ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧ［２６］
［配列番号５］
及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−５で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、
ｉｉｉ）所定位の特徴的な残基は上記の配列に示されるようなものである、
（ｂ）ＦＲ２は次の群から選択される：
以下のアミノ酸配列から成る群：
［３６］ＷＹＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＡ［４９］ ［配列番号１１］
及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−６で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）３７位、４４位、４５位及び４７位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである、
（ｃ）ＦＲ３は次の群から選択される：
以下のアミノ酸配列から成る群：
［６６］ＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡ［９４］ ［配列番号１２］
及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−７で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、
ｉｉｉ）８３位及び８４位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである、
（ｄ）ＦＲ４は次の群から選択される：
以下のアミノ酸配列から成る群：
［１０３］ＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ［１１３］ ［配列番号１３］
及び／又は
上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ若しくは１つだけの「アミノ酸差異（複数可）」（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群、ここで：
ｉ）特徴的な位置以外の任意の位置での任意のアミノ酸置換は、好ましくは保存的アミノ酸置換（本明細書中で規定）か、及び／又は表Ａ−８で規定されるようなアミノ酸置換のいずれかであり、及び／又は
ｉｉ）当該アミノ酸配列は好ましくは、上記アミノ酸配列（複数可）と比較してアミノ酸置換のみを含有し、アミノ酸欠失又はアミノ酸挿入を含有せず、及び、
ｉｉｉ）１０３位、１０４位及び１０８位の特徴的な残基は上記の各配列に示されるようなものである。
本発明のナノボディ（登録商標）中に存在し得る幾つかの他のフレームワーク配列は、上述の欧州特許第６５６９４６号明細書（例えば同様に、登録済みの対応特許である米国特許第５，７５９，８０８号を参照されたい）で見出すことができる。
好ましくは、本発明のナノボディ（登録商標）におけるＣＤＲ配列及びＦＲ配列は、１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌまたはそれ未満、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌまたはそれ未満、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で、及び／又は少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１、例えば少なくとも１０１２Ｍ−１の結合親和性で、及び／又は５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性で、本発明のナノボディ（登録商標）がＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と結合するようなものである。ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に対する本発明のナノボディ（登録商標）の親和性は、例えば本明細書で記載されるアッセイを使用するそれ自体が既知の方法で求めることができる。
本明細書における開示より明らかなように、本明細書で規定されるような本発明のナノボディ（登録商標）の天然又は合成の類似体、突然変異体、変異体、対立遺伝子、ホモログ及びオーソログ（本明細書中で集合的に「類似体」と称される）の使用も本発明の範囲内である。したがって、本発明の一実施の形態によれば、用語「本発明のナノボディ（登録商標）」は最も広義にはこのような類似体も包含する。
一般に、このような類似体では、本明細書で規定されるような本発明のナノボディ（登録商標）と比較して、１つ又は複数のアミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加されていてもよい。このような置換、挿入又は欠失はフレームワーク領域の１つ又は複数、及び／又はＣＤＲの１つ又は複数において起こってもよい。このような置換、挿入又は欠失がフレームワーク領域の１つ又は複数において起こる場合、特徴的な残基の１つ又は複数、及び／又はフレームワーク残基中の他の位置の１つ又は複数において起こってもよいが、特徴的な残基での置換、挿入又は欠失は（それが本明細書中で説明されるような適切なヒト化置換であっても）一般的に好ましさの程度は低い。
非限定的な例によると、置換は例えば保存的置換（本明細書中で説明される）であってもよく、及び／又はアミノ酸残基は、別のＶＨＨドメインの同じ位置に自然発生する別のアミノ酸残基により置換されてもよいが（このような置換のいくつかの非限定的な例については表４〜表７を参照されたい）、本発明は一般にそれに限定されない。したがって、本発明のナノボディ（登録商標）の特性を改善するか、又は少なくとも本発明のナノボディ（登録商標）の所望の特性又は所望の特性のバランス若しくは組合せを過度に損なわない（すなわち、ナノボディ（登録商標）がもはやその使用目的に適さなくなる程度までの）任意の１つ又は複数の置換、欠失若しくは挿入、又はその任意の組合せは本発明の範囲内に含まれる。当業者は一般に、本明細書における開示に基づいて、また任意に、例えば限られた数の可能な置換を導入すること、及びそのようにして得られるナノボディ（登録商標）の特性に対するその影響を求めることを含み得る限られた日常実験の後、適切な置換、欠失若しくは挿入、又はその適切な組合せを決定及び選択することが可能である。
例えば、本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドを発現するために使用される宿主生物に応じて、翻訳後修飾される１つ又は複数の部位（例えば１つ又は複数のグリコシル化部位）を除去するような欠失及び／又は置換を、当業者の能力内で、設計してもよい。代替的には、官能基（本明細書中で説明される）が結合する１つ又は複数の部位を導入し、例えば部位特異的ペグ化（同様に本明細書中で説明される）を可能にするように、置換又は挿入を設計してもよい。
上記の表４〜表７に示すＶＨＨエントロピー及びＶＨＨ変動に関するデータから明らかなように、フレームワーク領域内の幾つかのアミノ酸残基は他よりも保存されている。一般に、任意の置換、欠失又は挿入は好ましくは保存されにくい位置で起こるが、本発明は最も広義にはそれに限定されない。また、一般に、アミノ酸置換はアミノ酸欠失又はアミノ酸挿入よりも好適である。
類似体は、１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌまたはそれ未満、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌまたはそれ未満、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で、及び／又は少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１、例えば少なくとも１０１２Ｍ−１の結合親和性で、及び／又は５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性でＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と結合することができるようなものが好ましい。ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に対する類似体の親和性は、例えば本明細書で記載されるアッセイを使用するそれ自体が既知の方法で求めることができる。
また類似体は、本明細書に記載のようにナノボディ（登録商標）の有利な特性を保持するようなものであるのが好ましい。
１つの好適なクラスの本発明のナノボディ（登録商標）の類似体は、ヒト化された（すなわち、本発明の天然のナノボディ（登録商標）の配列と比較してヒト化された）ナノボディ（登録商標）を含む。本明細書中で引用される背景技術で述べられたように、このようなヒト化は一般に、ヒトＶＨドメインでの同じ位置、例えばヒトＶＨ３ドメインで発生するアミノ酸残基による、天然のＶＨＨの配列における１つ又は複数のアミノ酸残基の置換を含む。可能なヒト化置換又はヒト化置換の組合せの例は、例えば本明細書中の表から、本明細書中で引用される背景技術で述べられた可能なヒト化置換から、及び／又はナノボディ（登録商標）の配列と天然のヒトＶＨドメインの配列との比較から当業者に明らかである。
ヒト化置換は、得られるヒト化ナノボディ（登録商標）が、本明細書で規定されるようなナノボディ（登録商標）の有利な特性を依然として保持するように、より好ましくは類似体に関して前述の段落に説明されるようなものであるように選択されるべきである。当業者は一般に、本明細書における開示に基づいて、また任意に、例えば限られた数の可能なヒト化置換を導入すること、及びそのようにして得られるナノボディ（登録商標）の特性に対するその影響を求めることを含み得る限られた日常実験の後、適切なヒト化置換又は適切なヒト化置換の組合せを決定及び選択することが可能である。
一般に、ヒト化の結果として、本発明のナノボディ（登録商標）は、本明細書中で説明されるような本発明のナノボディ（登録商標）の有利な特性を依然として保持すると同時に、より「ヒト様」となり得る。結果として、このようなヒト化ナノボディ（登録商標）は幾つかの利点、例えば対応する天然のＶＨＨドメインと比較して低減された免疫原性を有し得る。また、本明細書における開示に基づいて、また任意に限られた日常実験の後、当業者は、一方ではヒト化置換によりもたらされる有利な特性と、他方では天然のＶＨＨドメインの有利な特性との間の所望の又は適切なバランスを最適化又は達成するヒト化置換又は適切なヒト化置換の組合せを選択することが可能である。
ヒト化及び他の類似体、並びにそれをコードする核酸配列は、それ自体が既知の任意の方法で準備することができる。例えば、類似体は、天然のＶＨＨドメインをコードする核酸を準備すること、（例えば部位特異的突然変異誘発法、又は適切なミスマッチプライマーを使用するＰＣＲによって）置換を受ける１つ又は複数のアミノ酸残基に対するコドンを、対応する所望のアミノ酸残基に対するコドンに変えること、このようにして得られた核酸／ヌクレオチド配列を適切な宿主又は発現系において発現させること、及び任意に、このようにして得られた類似体を（例えば本明細書中でさらに説明されるように）単離及び／又は精製して、本質的に単離された形の当該類似体を提供する、単離及び／又は精製することにより得ることができる。これは一般に、例えば本明細書中で引用されるハンドブック及び参考文献、本明細書中で引用される背景技術及び／又は本明細書中のさらなる記載から当業者に明らかな、それ自体が既知の方法及び技法を用いて実行することができる。代替的には、所望の類似体をコードする核酸は、それ自体が既知の方法で（例えば所定のアミノ酸配列を有する核酸配列を合成する自動装置を用いて）合成することができ、次に本明細書中で説明されるように発現させることができる。さらに別の技法は、各々が所望の類似体の一部をコードする１つ又は複数の天然及び／又は合成の核酸配列を組み合わせること、及び次に組み合わせた核酸配列を本明細書中で説明されるように発現させることを含み得る。また、類似体は、例えば本明細書中で述べたような、それ自体が既知のペプチド合成技法を用いた関連アミノ酸配列の化学合成を利用して準備することができる。
この点において、本発明のナノボディ（登録商標）の配列を提供するため及び／又はこのようにして得られた配列にナノボディ（登録商標）の有利な特性を付与するために、１つ又は複数のラクダ化置換を導入する（すなわち、当該ヒトＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つ又は複数のアミノ酸残基を、ＶＨＨドメインの対応する位置で生じるアミノ酸残基に変化させる）ことによって、本発明のナノボディ（登録商標）（例えばその類似体）を、ヒトＶＨ配列、例えばＤＰ−４７、ＤＰ−５１又はＤＰ−２９等のヒトＶＨ３配列（すなわち、アミノ酸配列又は対応するヌクレオチド配列）から設計及び／又は調製することが可能であることも当業者には明らかである。また、これは一般に、開始点としてヒトＶＨドメインに対するアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列を使用し、前の段落で言及される多様な方法及び技法を用いて実行することができる。
幾つかの好ましいが非限定的なラクダ化置換は、表４〜表７から導くことができる。特徴的な残基の１つ又は複数のラクダ化置換は、他のアミノ酸位置の１つ又は複数の置換よりも一般に、所望の特性に大きな影響を与えるが、その両方及び任意の適切な組合せが本発明の範囲内に含まれることも明らかである。例えば、既に少なくとも幾つかの所望の特性を付与している１つ又は複数のラクダ化置換を導入すること、及び次に当該特性をさらに改善するか、及び／又はさらなる有利な特性を付与するさらなるラクダ化置換を導入することが可能である。また、当業者は一般に、本明細書における開示に基づいて、また任意に、例えば限られた数の可能なラクダ化置換を導入すること、及びナノボディ（登録商標）の有利な特性が獲得又は改善されたか否かを求める（すなわち、本来のＶＨドメインと比較する）ことを含み得る限られた日常実験の後、適切なラクダ化置換又は適切なラクダ化置換の組合せを決定及び選択することが可能である。
しかしながら、一般にこのようなラクダ化置換は好ましくは、得られるアミノ酸配列が少なくとも（ａ）１０８位にＱ、及び／又は（ｂ）４５位に荷電アミノ酸又はシステイン残基、好ましくは所定位にＥ、より好ましくは４４位にＥ且つ４５位にＲ、及び／又は（ｃ）１０３位にＰ、Ｒ又はＳ、並びに任意に１つ又は複数のさらなるラクダ化置換を含有するものである。より好ましくは、ラクダ化置換は、本発明のナノボディ（登録商標）及び／又はその類似体（本明細書中で規定）、例えばヒト化類似体及び／又は好ましくは前述の段落に規定されるような類似体をもたらすものである。
本明細書における開示から同様に明らかなように、本明細書で規定されるような本発明のナノボディ（登録商標）の部分又は断片、又は２つ以上の部分又は断片の組合せの使用もまた本発明の範囲内である。したがって、本発明の一実施の形態によれば、用語「本発明のナノボディ（登録商標）」は最も広義にはこのような部分又は断片も包含する。
一般に、本発明のナノボディ（登録商標）（例えばその類似体）のこのような部分又は断片は、対応する本発明の全長ナノボディ（登録商標）（又はその類似体）のアミノ酸配列と比較して、Ｎ末端の１つ又は複数のアミノ酸残基、Ｃ末端の１つ又は複数のアミノ酸残基、１つ又は複数の連続内部アミノ酸残基、又はその任意の組合せが欠失しているか、及び／又は除去されたアミノ酸配列を有する。
部分又は断片は、１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌまたはそれ未満、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌまたはそれ未満、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で、及び／又は少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１、例えば少なくとも１０１２Ｍ−１の結合親和性で、及び／又は５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性でＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と結合することができるようなものが好ましい。ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に対する類似体の親和性は、例えば本明細書で記載されるアッセイを使用するそれ自体が既知の方法で求めることができる。
任意の部分又は断片は好ましくは、対応する本発明の全長ナノボディ（登録商標）のアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続アミノ酸残基、好ましくは少なくとも２０個の連続アミノ酸残基、より好ましくは少なくとも３０個の連続アミノ酸残基、例えば少なくとも４０個の連続アミノ酸残基を含むものである。
また、任意の部分又は断片は好ましくは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３の少なくとも１つ又は少なくともその一部（特に少なくともＣＤＲ３又は少なくともその一部）を含むようなものである。より好ましくは、任意の部分又は断片は、好ましくは適切なフレームワーク配列（複数可）又は少なくともその一部により連結した、ＣＤＲの少なくとも１つ（好ましくは少なくともＣＤＲ３又はその一部）及び少なくとも１つの他のＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲ１又はＣＤＲ２）又は少なくともその一部を含むようなものである。より好ましくは、任意の部分又は断片は、好ましくは同様に適切なフレームワーク配列（複数可）又は少なくともその一部により連結した、ＣＤＲの少なくとも１つ（好ましくは少なくともＣＤＲ３又はその一部）及び残り２つのＣＤＲの少なくとも一部を含むようなものである。
別の特に好ましいが非限定的な実施の形態によれば、このような部分又は断片は、対応する本発明の全長ナノボディ（登録商標）の少なくともＣＤＲ３、例えばＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４を含む（すなわち、例えば国際出願の国際公開第０３／０５０５３１号（Lasters et al.）に説明される）。
上記で既に述べたように、２つ以上のこのような部分又は断片（すなわち、同一又は別個の本発明のナノボディ（登録商標）に由来する）を組合せること、すなわち、本発明のナノボディ（登録商標）の類似体（本明細書中で規定）及び／又はさらなる部分又は断片（本明細書中で規定）を提供することも可能である。例えば、本発明のナノボディ（登録商標）の１つ又は複数の部分又は断片を、ヒトＶＨドメインの１つ又は複数の部分又は断片と組合せることもまた可能である。
部分及び断片、並びにそれをコードする核酸配列は、任意のそれ自体が既知の方法で準備して任意に組み合わせることができる。例えば、このような部分又は断片は、完全長の本発明のナノボディ（登録商標）をコードする核酸中に終止コドンを挿入すること、及び次にこのようにして得られた核酸をそれ自体が既知の方法（例えば本明細書中で説明される）で発現させることで得ることができる。代替的には、このような部分又は断片をコードする核酸は、完全長の本発明のナノボディ（登録商標）をコードする核酸を適切に制限すること、又はこのような核酸をそれ自体が既知の方法で合成することにより得ることができる。部分又は断片はまた、それ自体が既知のペプチド合成技法を用いて準備してもよい。
本発明は最も広義には本発明のナノボディ（登録商標）の誘導体も含む。このような誘導体は一般に、本発明のナノボディ（登録商標）及び／又は本発明のナノボディ（登録商標）を形成するアミノ酸残基の１つ又は複数の修飾、特に化学的及び／又は生物学的（例えば酵素的）修飾により得ることができる。
このような修飾の例、並びにこのような形（すなわち、タンパク質骨格、好ましくは側鎖のいずれか）で修飾することができるナノボディ（登録商標）配列中のアミノ酸残基の例、このような修飾の導入のために使用することができる方法及び技法、並びにこのような修飾の潜在的使用及び利点は当業者に明らかである。
例えば、このような修飾は、１つ又は複数の官能基、残基又は部分、特に１つ又は複数の所望の特性又は官能性を本発明のナノボディ（登録商標）に付与する１つ又は複数の官能基、残基又は部分を本発明のナノボディ（登録商標）中又はナノボディ（登録商標）上に（例えば共有結合によるか、又は他の適切な形で）導入することを含み得る。このような官能基の例は当業者に明らかである。
例えば、このような修飾は、本発明のナノボディ（登録商標）の半減期、溶解性及び／又は吸収性を増大させる、本発明のナノボディ（登録商標）の免疫原性及び／又は毒性を低減する、本発明のナノボディ（登録商標）の任意の望ましくない副作用を排除又は減衰する、及び／又は本発明のナノボディ（登録商標）及び／又はポリペプチドに他の有益なな特性を付与するか、及び／又は本発明のナノボディ（登録商標）及び／又はポリペプチドの不要な特性を減らす、又は上記の２つ以上の任意の組合せである１つ又は複数の官能基を（例えば共有結合によるか、又は任意の他の適切な形で）導入することを含み得る。このような官能基及びそれらを導入する技法の例は当業者に明らかであり、一般に、上記で引用される一般的背景技術で述べた全ての官能基及び技法、並びに医薬用タンパク質の修飾、特に抗体又は抗体断片（例えばＳｃＦｖ及び単一ドメイン抗体）の修飾に関するそれ自体が既知の官能基及び技法を含み得る；これに関しては例えばRemington'sPharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA（1980）を参照する。同様に当業者に明らかなように、このような官能基は、例えば本発明のナノボディ（登録商標）に直接（例えば共有結合的に）結合するか、又は任意に適切なリンカー又はスペーサーを介して結合する。
半減期を増大するか、及び／又は医薬用タンパク質の免疫原性を低減するために最も広く使用される技法の１つは、適切な薬学的に許容可能なポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）又はその誘導体（例えばメトキシポリ（エチレングリコール）又はｍＰＥＧ）の結合を含む。一般に、任意の適切な形のペグ化、例えば当該技術分野で抗体及び抗体断片（例えば、限定されるものではないが、（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ）に対して使用されるペグ化を使用することができる；例えばChapman,Nat. Biotechnol., 54, 531-545（2002）、Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456（2003）、Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov.,2,（2003）及び国際公開第０４／０６０９６５号を参照する。タンパク質のペグ化に関する多様な試薬も、例えばNektar Therapeutics, USAより市販されている。
好ましくは、特にシステイン残基を介した部位特異的ペグ化を使用する（例えばYanget al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770（2003）を参照されたい）。例えば、このために、本発明のナノボディ（登録商標）において自然発生するシステイン残基にＰＥＧを結合してもよく、本発明のナノボディ（登録商標）を、ＰＥＧに結合する１つ又は複数のシステイン残基を適切に導入するように修飾してもよく、又はＰＥＧに結合する１つ又は複数のシステイン残基を含むアミノ酸配列を、本発明のナノボディ（登録商標）のＮ末端及び／又はＣ末端と融合してもよい（全て、それ自体が当業者に既知であるタンパク質工学の技法を使用する）。
好ましくは、ＰＥＧは、本発明のナノボディ（登録商標）及びタンパク質に対して５０００を超え（例えば１００００を超え）且つ２０００００未満（例えば１０００００未満）の分子量、例えば２００００〜８００００の範囲の分子量で使用する。
さらに、通常好ましさの程度が低い修飾は、通常翻訳時及び／又は翻訳後の修飾の一部として、本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドを発現するのに用いられる宿主細胞に応じてＮ結合型又はＯ結合型のグリコシル化を含む。
さらに別の修飾は、標識したナノボディ（登録商標）の用途に応じて、１つ又は複数の検出可能な標識、又は他のシグナル生成基若しくはシグナル生成部分の導入を含んでいてもよい。それらを結合、使用及び検出するのに好適な標識及び技法は当業者にとって明らかであり、例としては、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド、及びフルオレサミン、並びに１５２Ｅｕ等の蛍光金属、又はランタニド種からの他の金属）、リン光標識、化学発光標識又は生物発光標識（例えば、ルミナール、イソルミナール、セロマティックアクリジニウムエステル（theromatic acridinium ester）、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ジオキセタン又はＧＦＰ、並びにその類似体）、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、及び７５Ｓｅ）、金属、金属キレート又は金属カチオン（例えば、９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、９７Ｒｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、及び６８Ｇａ等の金属カチオン、又はｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｓｉｔｕ診断及びイメージングにおける使用に特に適する他の金属若しくは金属カチオン、例えば（１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒ、及び５６Ｆｅ）、並びに、発色団及び酵素（例えば、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチンアビジンペルオキシダーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩ−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な標識は当業者にとって明らかであり、例としては、ＮＭＲ分光法又はＥＳＲ分光法を用いて検出することができる部分が挙げられる。
本発明のこのような標識したナノボディ（登録商標）及びポリペプチドは、例えば特異的標識の選択に応じて、（ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ及び他の「サンドイッチアッセイ」等のそれ自体が既知のイムノアッセイを含む）ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｓｉｔｕアッセイに、並びにｉｎ ｖｉｖｏ診断及びイメージングの目的で使用され得る。
当業者にとって明らかであるように、別の修飾は、例えば上述の金属又は金属カチオンの１つをキレート化するキレート官能基（chelating group）の導入を含んでいてもよい。例えば好適なキレート官能基としては、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）又はエチレンジアミン五酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに別の修飾は、ビオチン−（ストレプト）アビジン結合対等の特異的結合対の一部である官能基の導入を含んでいてもよい。このような官能基は、本発明のナノボディ（登録商標）を別のタンパク質、ポリペプチド、又は結合対の残り半分と結合する化合物に連結させるのに（即ち、結合対の形成を介して）使用され得る。例えば、本発明のナノボディ（登録商標）は、ビオチンと結合し、別のタンパク質、ポリペプチド、アビジン若しくはストレプトアビジンと結合する化合物又は担体に連結し得る。例えば、このような結合ナノボディ（登録商標）は、例えば検出可能なシグナル生成剤がアビジン又はストレプトアビジンに結合する診断系のレポーターとして使用され得る。このような結合対は、例えば本発明のナノボディ（登録商標）を担体（医薬目的に好適な担体を含む）に結合させるのにも使用することができる。非限定的な一例は、Cao and Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257（2000）によって記載のリポソーム製剤である。このような結合対はまた、本発明のナノボディ（登録商標）に治療に有効な作用物質を連結させるのに使用することができる。
用途によっては、特に、（例えば、癌の治療において）本発明のナノボディ（登録商標）が指向性を有する標的を発現する細胞を死滅させること、又はこのような細胞の成長及び／又は増殖を低減するか若しくは遅延させることを意図する用途では、本発明のナノボディ（登録商標）は、毒物又は毒性残基又は毒性部分にも連結し得る。本発明のナノボディ（登録商標）に連結して、例えば細胞毒性化合物をもたらし得る毒性部分、毒性化合物又は毒性残基の例は当業者にとって明らかであり、例えば上述の従来技術に及び／又は本明細書中のさらなる説明に見ることができる。一例はいわゆるＡＤＥＰＴ（商標）技術である（国際公開第０３／０５５５２７号）。
他の可能な化学修飾及び酵素修飾は当業者にとって明らかである。このような修飾を、（例えば、機能−活性関係を研究するために）調査目的で導入してもよい。例えば、Lundblad and Bradshaw, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 143-151（1997）を参照する。
好ましくは誘導体は、１０−５モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌまたはそれ未満、及び好ましくは１０−７モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌまたはそれ未満、及びより好ましくは１０−８モル／Ｌ〜１０−１２モル／Ｌの解離定数（ＫＤ）で、及び／又は少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１０９Ｍ−１、例えば少なくとも１０１２Ｍ−１の結合親和性で、及び／又は５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満の親和性でＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と結合するようなものである。ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に対する本発明のナノボディ（登録商標）の誘導体の親和性は、例えば本明細書で記載されるアッセイを使用するそれ自体が既知の方法で求めることができる。
上述のように、本発明はまた、少なくとも１つの本発明のナノボディ（登録商標）から本質的に成るか又はこれを含む、タンパク質又はポリペプチドに関する。「から本質的に成る」とは、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列のいずれかが、本発明のナノボディ（登録商標）のアミノ酸配列と厳密に同じであるか、又は、１個〜２０個のアミノ酸残基、例えば１個〜１０個のアミノ酸残基、及び好ましくは１個〜６個のアミノ酸残基（例えば、１個、２個、３個、４個、５個又は６個のアミノ酸残基）である限定数のアミノ酸残基をナノボディ（登録商標）のアミノ酸配列のアミノ末端、カルボキシ末端、又はアミノ末端及びカルボキシ末端の両方に付加させた本発明のナノボディ（登録商標）のアミノ酸配列に対応することを意味する。
上記のアミノ酸残基は、ナノボディ（登録商標）の（生物学的）特性を変更するか、改質するか、そうでなければこれに影響を与えることもあり又は与えない場合もあり、ナノボディ（登録商標）にさらなる官能基を付加することもあり又は付加しない場合もある。例えば、このようなアミノ酸残基は、
ａ）例えば、異種宿主細胞又は異種宿主生物において発現した結果得られるＮ末端Ｍｅｔ残基を含み得る。
ｂ）合成の際に宿主細胞からのナノボディ（登録商標）の分泌を導く、シグナル配列又はリーダー配列を形成してもよい。好適な分泌リーダーペプチドは当業者にとって明らかであり、本明細書中にさらに記載されるようなものであり得る。通常、このようなリーダー配列は、ナノボディ（登録商標）のＮ末端に連結されるが、本発明は最も広義には、これらに限定されるものではない。
ｃ）ナノボディ（登録商標）が、特定の器官、組織、細胞、又は細胞の一部若しくはコンパートメントに指向性を有し、及び／又はそれらに侵入するか若しくは入り込むことを可能にし、及び／又はナノボディ（登録商標）が、細胞膜、上皮細胞の層等の細胞層、固形腫瘍を含む腫瘍、又は血液脳関門のような生物学的障壁に侵入するか若しくはそれらを横断することを可能にする、配列又はシグナルを形成し得る。このようなアミノ酸配列の例は当業者にとって明らかである。幾つかの非限定的な例は、国際公開第０３／０２６７００号、並びにTemsamani et al., Expert Opin. Biol. Ther., 1, 773（2001）、Temsamani and Vidal, Drug Discov.Today, 9, 1012（004）及びRousselle,J. Pharmacol. Exp. Ther., 296, 124-131（2001）に記載されている小さいペプチドベクター（「Ｐｅｐ−トランスベクター」）、並びにZhao et al., Apoptosis, 8, 631-637（2003）によって記載されている膜輸送体配列である。抗体断片の細胞内標的のためのＣ末端アミノ酸配列及びＮ末端アミノ酸配列は、例えばCardinale et al., Methods, 34, 171（2004）によって記載されている。細胞内標的の他の好適な技法は、以下に記述されるような、本発明のナノボディ（登録商標）を含むいわゆる「細胞内抗体」の発現及び／又は使用を伴う。
ｄ）「タグ」、例えば上記の配列又は残基を対象とする親和性技法を用いてナノボディ（登録商標）の精製を可能にするか又は容易にする、アミノ酸配列又は残基を形成し得る。その後、（例えば、化学的又は酵素学的な開裂によって）上記の配列又は残基を除去して、ナノボディ（登録商標）配列をもたらし得る（この目的のために、タグは任意で、開裂可能なリンカー配列を介してナノボディ（登録商標）配列に連結されてもよく、又は開裂可能なモチーフを含有していてもよい）。このような残基の好ましいが非限定的な幾つかの例は、複数のヒスチジン残基、グルタチオン残基、及びＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡ（配列番号３１）等のｍｙｃタグである。
ｅ）官能化し及び／又は官能基の結合のための部位として機能することができる１つ又は複数のアミノ酸残基であり得る。好適なアミノ酸残基及び官能基は当業者にとって明らかであり、本発明のナノボディ（登録商標）の誘導体について本明細書中に記述されたアミノ酸残基及び官能基が挙げられるが、これらに限定されない。
別の実施の形態によれば、本発明のポリペプチドは、そのアミノ末端、そのカルボキシ末端、又はそのアミノ末端及びカルボキシ末端の両方で、少なくとも１つのさらなるアミノ酸配列に融合する本発明のナノボディ（登録商標）を含み、即ちこれにより、本発明の当該ナノボディ（登録商標）と１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列とを含む融合タンパク質がもたらされる。このような融合は本明細書中で「ナノボディ（登録商標）融合」とも呼ばれる。
１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列は、任意の好適及び／又は所望のアミノ酸配列であり得る。さらなるアミノ酸配列は、ナノボディ（登録商標）の（生物学的）特性を変更するか、改質するか、又はそうでなければこれに影響を与えることもあり又は与えない場合もあり、本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドにさらなる官能基を付加することもあり又は付加しない場合もある。好ましくは、さらなるアミノ酸配列は、本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドに、１つ又は複数の所望の特性又は官能性を付与するようなものである。
このようなアミノ酸配列の例は当業者にとって明らかであり、一般に、従来の抗体及びその断片に基づきペプチド融合に用いられる全てのアミノ酸配列を含み得る（ＳｃＦｖ抗体及び単一ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない）。例えば、Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136（2005）による概説を参照する。
例えば、このようなアミノ酸配列は、本発明のナノボディ（登録商標）自体に比べて、半減期、溶解性又は吸着を増大させる、免疫原性又は毒性を低減する、望ましくない副作用を排除又は減衰する、及び／又は他の有益な特性を本発明のポリペプチドに付与するか、及び／又は本発明のポリペプチドの望ましくない特性を減らすアミノ酸配列であり得る。このようなアミノ酸配列の幾つかの非限定的な例は、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（例えば国際公開第００／２７４３５号を参照されたい）又はハプテン分子（例えば、循環抗体として認識されるハプテン（例えば国際公開第９８／２２１４１号を参照されたい））である。
さらなるアミノ酸配列はまた、任意の所望のタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基又はエピトープ（本発明のナノボディ（登録商標）に指向性を有する同様のタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基若しくはエピトープ、又は異なるタンパク質、ポリペプチド、抗原、抗原決定基若しくはエピトープが挙げられるが、これらに限定されない）に指向性を有し得る第２の結合部位をもたらし得る。例えば、さらなるアミノ酸配列は、血清タンパク質（例えば、ＩｇＧ等のヒト血清アルブミン又は別の血清タンパク質等）に指向性を有する第２の結合部位をもたらして、血清中で半減期を増大し得る。例えば、欧州特許第０３６８６８４号明細書、国際公開第９１／０１７４３号、国際公開第０１／４５７４６号、及び国際公開第０４／００３０１９号（様々な血清タンパク質が言及されている）、"Nanobodies(登録商標) against amyloid-beta and polypeptides comprising the same for the treatment ofdegenerative neural diseases such as Alzheimer's disease"と題された出願人による国際出願（様々な他のタンパク質が言及されている）、並びにHarmsen et al., Vaccine, 23（41）; 4926-42が参照される。
別の実施の形態によれば、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列は、従来の４本鎖抗体（及び、特にヒト抗体）及び／又は重鎖抗体の１つ又は複数の部分、断片、又はドメインを含み得る。例えば、通常は好ましさの程度が低いが、本発明のナノボディ（登録商標）は、従来の（好ましくはヒト）ＶＨドメイン若しくはＶＬドメインドメイン、又はＶＨドメイン若しくはＶＬドメインの天然型類似体若しくは合成類似体に、任意でリンカー配列（Ward et al.によって記載されているｄＡｂ抗体等の他の（単一）ドメイン抗体が挙げられるが、これらに限定されない）を介して再度、連結され得る。
また、少なくとも１つのナノボディ（登録商標）は、任意でリンカー配列を介して、１つ又は複数の（好ましくはヒト）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインと連結してもよい。例えば、好適なＣＨ１ドメインと連結するナノボディ（登録商標）は、例えば従来のＦａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片に類似する抗体断片／構築物を生成するように（好適な軽鎖と共に）使用することができるが、従来のＶＨドメインの１つ、又は（Ｆ（ａｂ’）２断片の場合）１つ若しくは両方を本発明のナノボディ（登録商標）に置き換えた。また、２つのナノボディ（登録商標）は、（任意でリンカーを介して）ＣＨ３ドメインと連結してｉｎ ｖｉｖｏで半減期が増大した構築物をもたらすことができる。
本発明のポリペプチドの具体的な一実施の形態によれば、１つ又は複数の本発明のナノボディ（登録商標）は、１つ又は複数のエフェクタ機能を本発明のポリペプチドに付与し及び／又は１つ又は複数のＦｃ受容体に結合する能力を付与し得る、１つ又は複数の抗体部分、断片又はドメインと連結し得る。例えば、この目的で、及びこれらに限定されるものではないが、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列は、重鎖抗体（本明細書中に記載）及びより好ましくは従来のヒト４本鎖抗体等に由来する抗体の１つ又は複数のＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインを含んでいてもよく、及び／又は例えばＩｇＧ、ＩｇＥ又は別のヒトＩｇに由来するＦｃ領域（の一部）を形成してもよい。例えば、国際公開第９４／０４６７８号は、ラクダＶＨＨドメイン又はそのヒト化誘導体（即ち、ナノボディ（登録商標））を含む重鎖抗体を記載しており、ここでは、ラクダＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインが、ヒトＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインで置き換えられている。それによりナノボディ（登録商標）と（ＣＨ１ドメインは含まないが）ヒトＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインとをそれぞれ含む２つの重鎖から成る免疫グロブリンがもたらされるが、その免疫グロブリンは、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインによって付与されるエフェクタ機能を有し、軽鎖が全く存在しなくても機能することができる。本発明のナノボディ（登録商標）と好適に連結してエフェクタ機能を付与し得る他のアミノ酸配列は当業者にとって明らかであり、所望のエフェクタ機能（複数可）に基づき選択され得る。例えば、国際公開第０４／０５８８２０号、国際公開第９９／４２０７７号、及び国際公開第０５／０１７１４８号、並びに上記のHolliger and Hudsonの概説を参照する。本発明のナノボディとＦｃ部分とのカップリングによっても、対応する本発明のナノボディ（登録商標）に比べて半減期の増大が生じ得る。用途によっては、如何なる生物学的に重要なエフェクタ機能も伴わずに半減期が増大したＦｃ部分及び／又は定常ドメイン（即ち、ＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメイン）を使用することも好適であるか、又は一層好ましい。１つ又は複数のナノボディ（登録商標）と、ｉｎ ｖｉｖｏで半減期が増大した１つ又は複数の定常ドメインとを含む他の好適な構築物は当業者にとって明らかであり、例えば任意でリンカー配列を介してＣＨ３ドメインに連結する２つのナノボディ（登録商標）を含み得る。一般に、半減期が増大した任意の融合タンパク質又は誘導体は好ましくは、腎臓吸収のカットオフ値である５０ｋＤを超える分子量を有する。
また、さらなるアミノ酸配列は、（例えば、本発明のポリペプチドを発現するのに用いられる宿主細胞に応じて、本発明のポリペプチドのプレフォーム、プロフォーム又はプレプロフォームをもたらすように）合成の際に宿主細胞から本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドの分泌を導くシグナル配列又はリーダー配列を形成し得る。
また、さらなるアミノ酸配列は、本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドが、特定の器官、組織、細胞、又は細胞の一部若しくはコンパートメントに誘導され、及び／又はそれらに侵入するか若しくは入り込むことを可能にし、及び／又は本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドが、細胞膜、上皮細胞の層等の細胞層、固形腫瘍等の腫瘍、又は血液脳関門のような生物学的障壁に侵入するか若しくはそれらを横断することを可能にする配列又はシグナルを形成し得る。このようなアミノ酸配列の好適な例は当業者にとって明らかであり、例えば国際公開第９４／０２６１０号、国際公開第９５／２２６１８号、米国特許第６００４９４０号明細書、国際公開第０３／０１４９６０号、国際公開第９９／０７４１４号；国際公開第０５／０１６９０号；欧州特許第１５１２６９６号明細書；及び、Cattaneo, A. & Biocca, S.（1997）Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes andSpringer-Verlag；及びKontermann, Methods 34,（2004）, 163-170、並びにこれらの文献中に記載のさらなる参照文献に記載されるような、上述の「Peptrans」のベクター、即ち、Cardinale et al.によって記載される配列、並びにいわゆる「細胞内抗体」である本発明のナノボディ（登録商標）及びポリペプチドを発現又は製造するのに使用することができる、それ自体が既知のアミノ酸配列及び抗体断片が挙げられるが、これらに限定されない。
用途によっては、特に（例えば癌の治療において）本発明のナノボディ（登録商標）が指向性を有する標的を発現する細胞を死滅させること、又はこのような細胞の成長及び／又は増殖を抑えるか若しくは遅延させることを意図する用途では、本発明のナノボディ（登録商標）はまた、（細胞）毒性タンパク質又はポリペプチドと連結し得る。このような毒性タンパク質、及び本発明のナノボディ（登録商標）と連結して、例えば本発明の細胞毒性ポリペプチドをもたらし得るポリペプチドの例は当業者にとって明らかであり、例えば上記従来技術及び／又は本明細書中のさらなる記載に見出すことができる。一例は、国際公開第０３／０５５５２７号に記載のいわゆるＡＤＥＰＴ（商標）技術である。
好ましいが非限定的な一実施の形態によれば、上記１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列は、少なくとも１つのさらなるナノボディ（登録商標）を含み、これにより、少なくとも２つ、例えば３つ、４つ、５つ以上のナノボディ（登録商標）を含む本発明のポリペプチドをもたらし、当該ナノボディ（登録商標）は任意で、１つ又は複数のリンカー配列（本明細書中で規定）を介して連結され得る。少なくとも１つが本発明のナノボディ（登録商標）である２つ以上のナノボディ（登録商標）を含む本発明のポリペプチドは、本明細書中で本発明の「多価」ポリペプチドとも呼ばれ、このようなポリペプチド中に存在するナノボディ（登録商標）は、本明細書中で「多価フォーマット」であるとも称される。例えば、本発明の「二価」ポリペプチドは、任意でリンカー配列を介して連結される２つのナノボディ（登録商標）を含み、本発明の「三価」ポリペプチドは、任意で２つのリンカー配列を介して連結される３つのナノボディ（登録商標）を含み、以下同様である。この場合、ポリペプチド中に存在するナノボディ（登録商標）の少なくとも１つ、及びポリペプチド中に存在するあらゆるナノボディ（登録商標）が、本発明のナノボディ（登録商標）である。
本発明の多価ポリペプチドでは、２つ以上のナノボディ（登録商標）は、同じであっても又は異なっていてもよく、同じ抗原又は抗原決定基（例えば、同じ部分（複数可）若しくはエピトープ（複数可）、又は異なる部分若しくはエピトープ）に指向性を有するものであってもよく、或いは代替的に異なる抗原若しくは抗原決定基、又はそれらの任意の好適な組合せに指向性を有するものであってもよい。例えば、本発明の二価ポリペプチドは、（ａ）２つの同一のナノボディ（登録商標）、（ｂ）タンパク質若しくは抗原の第１の抗原決定基に指向性を有する第１のナノボディ（登録商標）、及び第１のナノボディ（登録商標）と異なる上記タンパク質若しくは抗原の同一抗原決定基に指向性を有する第２のナノボディ、（ｃ）タンパク質若しくは抗原の第１の抗原決定基に指向性を有する第１のナノボディ（登録商標）、及び上記タンパク質若しくは抗原の別の抗原決定基に指向性を有する第２のナノボディ（登録商標）、又は（ｄ）第１のタンパク質若しくは抗原に指向性を有する第１のナノボディ（登録商標）、及び第２のタンパク質若しくは抗原（即ち、上記第１の抗原と異なる）に指向性を有する第２のナノボディ（登録商標）を含み得る。同様に、本発明の三価ポリペプチドは例えば、これらに限定されるものではないが、（ａ）３つの同一のナノボディ（登録商標）、（ｂ）抗原の第１の抗原決定基に対する２つの同一のナノボディ（登録商標）、及び同一抗原の異なる抗原決定基に指向性を有する第３のナノボディ（登録商標）、（ｃ）抗原の第１の抗原決定基に対する２つの同一のナノボディ（登録商標）、及び上記第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する第３のナノボディ（登録商標）、（ｄ）第１の抗原の第１の抗原決定基に指向性を有する第１のナノボディ（登録商標）、当該第１の抗原の第２の抗原決定基に指向性を有する第２のナノボディ（登録商標）、及び当該第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する第３のナノボディ（登録商標）、又は（ｅ）第１の抗原に指向性を有する第１のナノボディ（登録商標）、当該第１の抗原と異なる第２の抗原に指向性を有する第２のナノボディ（登録商標）、及び当該第１の抗原及び当該第２の抗原と異なる第３の抗原に指向性を有する第３のナノボディ（登録商標）を含み得る。
少なくとも２つのナノボディ（登録商標）を含有する本発明のポリペプチド（少なくとも１つのナノボディ（登録商標）が第１の抗原（即ち、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体）に指向性を有するものであり、少なくとも１つのナノボディ（登録商標）が第２の抗原（即ち、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と異なる）に指向性を有するものである）は、本発明の「多重特異性」ポリペプチドとも呼ばれており、このようなポリペプチド中に存在するナノボディ（登録商標）は、本明細書中で「多価フォーマット」であるとも称される。このため例えば、本発明の「二重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（即ちＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体）に指向性を有する少なくとも１つのナノボディ（登録商標）及び第２の抗原（即ち、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と異なる）に指向性を有する少なくとも１つのさらなるナノボディ（登録商標）を含むポリペプチドであり、本発明の「三重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（即ち、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体）に指向性を有する少なくとも１つのナノボディ（登録商標）、第２の抗原（即ち、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と異なる）に指向性を有する少なくとも１つのさらなるナノボディ（登録商標）、及び第３の抗原（即ち、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体及び第２の抗原の両方と異なる）に指向性を有する少なくとも１つのさらなるナノボディ（登録商標）を含むポリペプチド等である。
したがって、その最も単純な形態において、本発明の二重特異性ポリペプチドは、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有する第１のナノボディ（登録商標）と、第２の抗原に指向性を有する第２のナノボディ（登録商標）とを含み、当該第１のナノボディ（登録商標）及び当該第２のナノボディ（登録商標）が任意でリンカー配列（本明細書中で規定）を介して連結され得る、本発明の二価ポリペプチド（本明細書中で規定）であるのに対し、本発明の三重特異性ポリペプチドは、その最も単純な形態において、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有する第１のナノボディ（登録商標）と、第２の抗原に指向性を有する第２のナノボディ（登録商標）と、第３の抗原に指向性を有する第３のナノボディ（登録商標）とを含み、当該第１のナノボディ（登録商標）、第２のナノボディ（登録商標）及び第３のナノボディ（登録商標）が任意で１つ又は複数、特に１つ、より詳細には２つのリンカー配列を介して連結され得る、本発明の三価ポリペプチド（本明細書中で規定）である。
しかしながら、上述から明らかであるように、本発明は、本発明の多重特異性ポリペプチドが、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に対する少なくとも１つのナノボディ（登録商標）と、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と異なる１つ又は複数の抗原に指向性を有するいくつかのナノボディ（登録商標）とを含み得るという意味において、これらに限定されない。
さらに、本発明のポリペプチド中における種々のナノボディ（登録商標）の特定の順序又は配置が、最終的に得られる本発明のポリペプチドの性質（ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に関する、又は１つ若しくは複数の他の抗原に対する、親和性、特異性、又は結合活性が挙げられるが、これらに限定されない）に何らかの影響を及ぼし得る点は、本発明の範囲内に包含されるが、通常、上記順序又は配置は重要なものでなく、場合によっては本明細書中の開示に基づく限定された日常実験を幾つか実施した後に、当業者であれば好適に選択することができる。したがって、特定の本発明の多価又は多重特異性のポリペプチドについて述べられる場合、明示的に指示がない限り、これは関連するナノボディ（登録商標）の任意の順序又は配置を包含するものであることに留意されたい。
最終的に、本発明のポリペプチドが、２つ以上のナノボディ（登録商標）と、１つ又は複数のさらなるアミノ酸配列（本明細書中に記述）とを含有することも、本発明の範囲内である。
１つ又は複数のＶＨＨドメインを含有する多価の多重特異性のポリペプチド、及びそれらの調製に関しては、Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, 2001、並びに例えば国際公開第９６／３４１０３号及び国際公開第９９／２３２２１号も参照する。本発明の幾つかの特定の多重特異性及び／又は多価のポリペプチドの幾つかの他の例は、本明細書中で参照される出願人による出願に見出すことができる。
本発明の多重特異性ポリペプチドの好ましいが非限定的な一例は、少なくとも１つの本発明のナノボディ（登録商標）と、半減期の増大をもたらす少なくとも１つのナノボディ（登録商標）とを含む。このようなナノボディ（登録商標）の好ましいが非限定的な幾つかの例としては、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、チロキシン結合タンパク質、（ヒト）トランスフェリン、フィブリノゲン、ＩｇＧ、ＩｇＥ若しくはＩｇＭ等の免疫グロブリン、又は国際公開第０４／００３０１９号に列挙された他の血清タンパク質の１つに指向性を有するナノボディ（登録商標）が挙げられる。
例えば、マウスにおける実験のためには、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に対するナノボディ（登録商標）を用いることができ、医薬用途のためには、ヒト血清アルブミンに対するナノボディ（登録商標）を用いることができる。
本発明の別の実施の形態は、上記の少なくとも１つの（ヒト）血清タンパク質が、（ヒト）血清アルブミン、（ヒト）血清免疫グロブリンのいずれかである、上記のポリペプチド構築物である。
具体的であるが非限定的な本発明の態様によれば、本発明のポリペプチドは、１つ又は複数の本発明のナノボディ以外に、ヒト血清アルブミンに対する少なくとも１つのナノボディを含有する。ヒト血清アルブミンに対するこれらのナノボディは、上記で引用した出願人による出願（例えば、国際公開第０４／０６２５５１号を参照されたい）に包括的に記載されているものであってもよいが、特に好ましいが非限定的な実施の形態によれば、ヒト血清アルブミンに対する当該ナノボディは、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから成り、
ｉ）ＣＤＲ１は、
ＳＦＧＭＳ ［配列番号１５］
ＬＮＬＭＧ ［配列番号１６］
ＩＮＬＬＧ ［配列番号１７］
ＮＹＷＭＹ ［配列番号１８］
から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、
及び／又は、上記アミノ酸配列の１つとの、２つ又は１つだけの「アミノ酸差異」（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、ここで：
（１）任意のアミノ酸の置換が好ましくは、保存アミノ酸の置換（本明細書中で規定）であり、及び／又は
（２）当該アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比べて、好ましくはアミノ酸の置換のみを含有し、アミノ酸の欠失又は挿入を含有せず、
且つ
ｉｉ）ＣＤＲ２は、
ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号１９］
ＴＩＴＶＧＤＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号２０］
ＴＩＴＶＧＤＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号２１］
ＳＩＮＧＲＧＤＤＴＲＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号２２］
ＡＩＳＡＤＳＳＴＫＮＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号２３］
ＡＩＳＡＤＳＳＤＫＲＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号２４］
ＲＩＳＴＧＧＧＹＳＹＹＡＤＳＶＫＧ ［配列番号２５］
から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、
又は、上記アミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、ここで：
（１）任意のアミノ酸の置換が好ましくは、保存アミノ酸の置換（本明細書中で規定）であり、及び／又は
（２）当該アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比べて、好ましくはアミノ酸の置換のみを含有し、アミノ酸の欠失又は挿入を含有せず、
及び／又は、上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ又は１つだけの「アミノ酸差異」（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、ここで：
（１）任意のアミノ酸の置換が好ましくは、保存アミノ酸の置換（本明細書中で規定）であり、及び／又は
（２）当該アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比べて、好ましくはアミノ酸の置換のみを含有し、アミノ酸の欠失又は挿入を含有せず、
且つ
ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、
ＤＲＥＡＱＶＤＴＬＤＦＤＹ ［配列番号２６］
から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、
又は、上記アミノ酸配列の１つと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、ここで：
（１）任意のアミノ酸の置換が好ましくは、保存アミノ酸の置換（本明細書中で規定）であり、及び／又は
（２）当該アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比べて、好ましくはアミノ酸の置換のみを含有し、アミノ酸の欠失又は挿入を含有せず、
及び／又は、上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ又は１つだけの「アミノ酸差異」（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、ここで：
（１）任意のアミノ酸の置換が好ましくは、保存アミノ酸の置換（本明細書中で規定）であり、及び／又は
（２）当該アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比べて、好ましくはアミノ酸の置換のみを含有し、アミノ酸の欠失又は挿入を含有せず、
或いは、
ＧＧＳＬＳＲ ［配列番号２７］
ＲＲＴＷＨＳＥＬ ［配列番号２８］
ＧＲＳＶＳＲＳ ［配列番号２９］
ＧＲＧＳＰ ［配列番号３０］
から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、
及び／又は、上記アミノ酸配列の１つとの、３つ、２つ又は１つだけの「アミノ酸差異」（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、ここで：
（１）任意のアミノ酸の置換が好ましくは、保存アミノ酸の置換（本明細書中で規定）であり、及び／又は
（２）当該アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比べて、好ましくはアミノ酸の置換のみを含有し、アミノ酸の欠失又は挿入を含有しない。
別の態様において、本発明は、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから成り、以下のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３それぞれの組合せの１つを有するナノボディから成る群から選択される、ヒト血清アルブミンに対するナノボディに関する：
ＣＤＲ１：ＳＦＧＭＳ；ＣＤＲ２：ＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧ；ＣＤＲ３：ＧＧＳＬＳＲ；
ＣＤＲ１：ＬＮＬＭＧ；ＣＤＲ２：ＴＩＴＶＧＤＳＴＮＹＡＤＳＶＫＧ；ＣＤＲ３：ＲＲＴＷＨＳＥＬ；
ＣＤＲ１：ＩＮＬＬＧ；ＣＤＲ２：ＴＩＴＶＧＤＳＴＳＹＡＤＳＶＫＧ；ＣＤＲ３：ＲＲＴＷＨＳＥＬ；
ＣＤＲ１：ＳＦＧＭＳ；ＣＤＲ２：ＳＩＮＧＲＧＤＤＴＲＹＡＤＳＶＫＧ；ＣＤＲ３：ＧＲＳＶＳＲＳ；
ＣＤＲ１：ＳＦＧＭＳ；ＣＤＲ２：ＡＩＳＡＤＳＳＤＫＲＹＡＤＳＶＫＧ；ＣＤＲ３：ＧＲＧＳＰ；
ＣＤＲ１：ＳＦＧＭＳ；ＣＤＲ２：ＡＩＳＡＤＳＳＤＫＲＹＡＤＳＶＫＧ；ＣＤＲ３：ＧＲＧＳＰ；
ＣＤＲ１：ＮＹＷＭＹ；ＣＤＲ２：ＲＩＳＴＧＧＧＹＳＹＹＡＤＳＶＫＧ；ＣＤＲ３：ＤＲＥＡＱＶＤＴＬＤＦＤＹ。
上記ＣＤＲの組合せを含む本発明のナノボディにおいて、それぞれのＣＤＲは、上記ＣＤＲと、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％の配列同一性（本明細書で規定）を有する、アミノ酸配列から成る群から選択されるＣＤＲに置き換えることが可能であり、ここで：
（１）任意のアミノ酸の置換が好ましくは、保存アミノ酸の置換（本明細書中で規定）であり、及び／又は
（２）当該アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比べて、好ましくはアミノ酸の置換のみを含有し、アミノ酸の欠失又は挿入を含有せず、
及び／又は上記アミノ酸配列の１つの上記ＣＤＲ（複数可）との、３つ、２つ又は１つだけの（先行する段落に示されている）「アミノ酸差異」（本明細書中で規定）を有するアミノ酸配列から成る群から選択されるアミノ酸配列であり、ここで：
（１）任意のアミノ酸の置換が好ましくは、保存アミノ酸の置換（本明細書中で規定）であり、及び／又は
（２）当該アミノ酸配列が、上記アミノ酸配列と比べて、好ましくはアミノ酸の置換のみを含有し、アミノ酸の欠失又は挿入を含有しない。
しかしながら、上記ＣＤＲの組合せを含む本発明のナノボディのうち、上記に列挙した１つ又は複数のＣＤＲを含むナノボディが特に好ましく、上記に列挙した２つ以上のＣＤＲを含むナノボディが特により好ましく、上記に列挙した３つのＣＤＲを含むナノボディが特に最も好ましい。
これらのヒト血清アルブミンに対するナノボディにおいて、フレームワーク領域ＦＲ１〜ＦＲ４は好ましくは、本発明のナノボディについて上記で規定した通りである。
本発明のポリペプチドに使用することができるヒト血清アルブミンに指向性を有するナノボディの好ましいが非限定的な幾つかの例を以下の表Ａ−９に列挙する。ＡＬＢ−８は、ヒト化したＡＬＢ−１である。
一般に、半減期が増大した任意の本発明の誘導体及び／又はポリペプチド（例えば、ペグ化された本発明のナノボディ又はポリペプチド、Ｘｘｘｘ及び（ヒト）血清アルブミンに指向性を有する多重特異性ナノボディ、又はＦｃ部分に融合したナノボディ（全て本明細書中に記載した通りである））の半減期は、対応する本発明のナノボディの半減期の、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍又は２０倍超である。
また、半減期が増大した任意の本発明の誘導体又はポリペプチドは好ましくは、１時間よりも長い、好ましくは２時間よりも長い、より好ましくは６時間よりも長い、例えば１２時間よりも長い、例えば約１日、２日、１週間、２週間又は３週間の半減期を有し、及び好ましくは２ヶ月に満たない半減期を有するが、後の方のものはあまり重要ではないと考えられる。
半減期は、一般に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、例えばリガンドの分解及び／又は自然発生メカニズムによるリガンドのクリアランス若しくは捕捉により、ポリペプチドの血清濃度が５０％減少するのに要する時間として規定され得る。薬物動態解析及び半減期の決定の方法は当業者によく知られている。詳細については、Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbookfor Pharmacists及びPeters et al, Pharmacokinete analysis:A Practical Approach（1996）において見出すことができる。"Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published byMarcel Dekker, 2 nd Rev. ex edition（1982）も参照される。
本発明の一態様によれば、ポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてポリペプチドの半減期を増大させることができる１つ又は複数の分子と結合可能である。
本発明のポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて安定化され、それらの半減期は、分解耐性及び／又はクリアランス耐性若しくは捕捉耐性のある分子への結合により増大する。通常、このような分子は、それ自体がｉｎ ｖｉｖｏにおいて長い半減期を有する天然タンパク質である。
本発明の多重特異性ポリペプチドの別の好ましいが非限定的な例は、少なくとも１つの本発明のナノボディと、本発明のポリペプチドを特定の器官、組織、細胞、又は細胞の一部若しくはコンパートメントに誘導し、及び／又は本発明のポリペプチドを特定の器官、組織、細胞、又は細胞の一部若しくはコンパートメントに侵入させるか若しくは入り込ませ、及び／又はナノボディを細胞膜、上皮細胞層等の細胞層、固形腫瘍を含む腫瘍、又は血液脳関門のような生物学的障壁に侵入させるか若しくはそれらを横断する、少なくとも１つのナノボディとを含む。このようなナノボディの例としては、所望の器官、組織又は細胞（例えば、腫瘍細胞に関連する細胞表面マーカー）に特有の細胞表面タンパク質、マーカー又はエピトープ、及び国際公開第０２／０５７４４５号に記載の単一ドメインの脳標的化抗体断片に指向性を有するナノボディが挙げられ、このうち、ＦＣ４４（配列番号３５）及びＦＣ５（配列番号３６）が好ましい例である。
本発明のポリペプチドにおいて、１つ又は複数のナノボディ、及び１つ又は複数のポリペプチドは、（例えば、国際公開第９９／２３２２１号に記載のように）互いに直接連結していてもよく、及び／又は１つ又は複数の好適なスペーサー若しくはリンカー、又はこれらの任意の組合せを介して互いに連結していてもよい。
多価及び多重特異性のポリペプチドに使用するのに好適なスペーサー又はリンカーは当業者にとって明らかであり、一般に、アミノ酸配列を連結させる当該技術分野で使用する任意のリンカー又はスペーサーであってよい。好ましくは、当該リンカー又はスペーサーは、医薬用途で意図されるタンパク質又はポリペプチドを構築する上での使用に好適である。
幾つかの特に好ましいスペーサーとしては、抗体断片又は抗体ドメインを連結させるのに当該技術分野で使用されるスペーサー及びリンカーが挙げられる。これらは、上記で引用した一般的な背景技術に記載したリンカーと共に、例えばダイアボディ又はＳｃＦｖ断片を構築するのに当該技術分野で使用するリンカーを含む（しかし、この点で、ダイアボディ及びＳｃＦｖ断片では、使用するリンカー配列が、関連するＶＨドメイン及びＶＬドメインが一体となって、完全な抗原結合部位を形成することができるような長さ、柔軟性の程度、及び他の性質を有している必要があるが、それぞれのナノボディは単独で完全な抗原結合部位を形成するため、本発明のポリペプチドに使用するリンカーの長さ又は柔軟性に関しては特に制限がないことに留意されたい）。
例えば、リンカーは、好適なアミノ酸配列、特に１個〜５０個、好ましくは１個〜３０個、例えば１個〜１０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列であってもよい。このようなアミノ酸配列のいくつかの好ましい例としては、（国際公開第９９／４２０７７号に記載の（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３又は（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３）等の例えば、（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）ｚ型のｇｌｙ−ｓｅｒリンカー、天然型重鎖抗体のヒンジ領域等のヒンジ類似領域、又は（国際公開第９４／０４６７８号に記載のもの等の）同様の配列が挙げられる。
いくつかの他の特に好ましいリンカーは、ポリアラニン（ＡＡＡ等）、及び表Ａ−１１に記載したリンカーであり、これらのうち、ＡＡＡ、ＧＳ−７及びＧＳ−９が特に好ましい。
他の好適なリンカーは一般に、有機化合物又はポリマー、特に医薬用途のタンパク質に使用するのに好適な有機化合物又はポリマーを含む。例えば、ポリ（エチレングリコール）部分が、抗体ドメインを連結させるのに使用されており、例えば国際公開第０４／０８１０２６号を参照されたい。
使用するリンカー（複数可）の長さ、柔軟性の程度及び／又は他の性質（重要ではないが、ＳｃＦｖ断片に使用されるリンカーにおいて一般的なもの）が、最終的に得られる本発明のポリペプチドの性質（Ｘｘｘｘ又は１つ又は複数の他の抗原に対する親和性、特異性又は結合活性を含むがこれらに限定されない）に何らかの影響を及ぼし得ることは、本発明の範囲内に包含される。本明細書中での開示に基づき、場合によっては限定された日常実験をいくつか実施した後に、当業者であれば本発明の特定のポリペプチドに使用するために適切なリンカー（複数可）を決定することができる。
例えば、（多量体受容体又は他のタンパク質等の）多量体抗原に指向性を有するナノボディを含む本発明の多価のポリペプチドにおいて、リンカーは、好ましくは、ポリペプチド中に存在する本発明のそれぞれのナノボディを、多量体のそれぞれのサブユニット上の抗原決定基に結合させるような長さ及び柔軟性を有している。同様に、同一の抗原上の２つ以上の異なる抗原決定基（例えば、１つの抗原の異なるエピトープ、及び／又は多量体の受容体、チャネル若しくはタンパク質の異なるサブユニット）に指向性を有するナノボディを含む本発明の多重特異性ポリペプチドにおいて、リンカーは、好ましくは、それぞれのナノボディを、目的の抗原決定基に結合させるような長さ及び柔軟性を有している。この場合にも、本明細書中での開示に基づき、場合によっては限定された日常実験をいくつか実施した後に、当業者であれば本発明の特定のポリペプチドに使用するために適切なリンカー（複数可）を決定することができる。
使用するリンカー（複数可）が、本発明のポリペプチドに、１つ又は複数の他の有利な性質又は機能を付与し、及び／又は（例えば本発明のナノボディの誘導体について本明細書中に記載の）誘導体の形成及び／又は官能基の結合のための１つ又は複数の部位をもたらすことも本発明の範囲内である。例えば、１つ又は複数の荷電アミノ酸残基（上記の表Ａ−２を参照されたい）を含有するリンカーは、優れた親水性をもたらし得るのに対し、低分子量のエピトープ又はタグを形成又は含有するリンカーは、検出、同定及び／又は精製の目的で使用することができる。この場合でも、本明細書中での開示に基づき、場合によっては限定された通常実験を幾つか実施した後に、当業者であれば本発明の特定のポリペプチドに使用するために適切なリンカーを決定することができる。
最終的に、本発明のポリペプチドに２つ以上のリンカーを使用する場合、これらのリンカーは同一であっても又は異なっていてもよい。この場合でも、本明細書中での開示に基づき、場合によっては限定された日常実験を幾つか実施した後に、当業者であれば本発明の特定のポリペプチドに使用するのに適切なリンカーを決定することができる。
通常、発現及び産生を容易にするため、本発明のポリペプチドは直鎖ポリペプチドである。しかしながら、本発明は、最も広義にはこれらに限定されない。例えば、本発明のポリペプチドが３つ以上のナノボディを含む場合、「星型」の構築物を得るために、各「アーム」がナノボディに結合する３つ以上の「アーム」を有するリンカーを使用することによってこれらを結合させることも可能である。通常好ましさの程度は低いが、環状の構築物を使用することも可能である。
また、本発明には、本発明のポリペプチドの誘導体が含まれ、これは本発明の、即ち本明細書中に記載のナノボディ（登録商標）の誘導体に本質的に類似するものであり得る。
また、本発明には、本発明のポリペプチドから「本質的に成る」タンパク質又はポリペプチドが含まれる（「から本質的になる」という語句は、上記で示したものと本質的に同じ意味を有する）。
本発明の一実施の形態によれば、本発明のポリペプチドは、本明細書中で規定したように、本質的に単離形態である。
本発明のナノボディ（登録商標）、ポリペプチド及び核酸は、本明細書中のさらなる説明により当業者にとって明らかであるようなそれ自体が既知の方法で調製することができる。例えば、本発明のナノボディ（登録商標）及びポリペプチドは、抗体の調製、特に抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片が挙げられるが、これらに限定されない）の調製のためのそれ自体が既知の任意の方法で調製することができる。ナノボディ（登録商標）、ポリペプチド及び核酸を調製するための、好ましいが非限定的な幾つかの方法としては、本明細書中に記載の方法及び技法が挙げられる。
当業者にとって明らかであるように、本発明のナノボディ（登録商標）及び／又はポリペプチドの調製に特に有用な一方法は、一般的に次の工程を含む：
・好適な宿主細胞又は宿主生物（本明細書中では「本発明の宿主」とも呼ぶ）における、又は本発明の上記ナノボディ（登録商標）又はポリペプチドをコードする核酸（本明細書中では「本発明の核酸」とも呼ぶ）に適切な別の発現系における発現、任意でその後：
・このようにして得られる本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドの単離及び／又は精製。
特に、このような方法は、次の工程を含み得る：
・本発明の宿主が少なくとも１つの本発明のナノボディ（登録商標）及び／又はポリペプチドを発現及び／又は産生するような条件下での、本発明の上記宿主の培養及び／又は維持、任意でその後：
・このようにして得られる本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドの単離及び／又は精製。
本発明の核酸は、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡの形態である可能性があり、好ましくは二本鎖ＤＮＡの形態である。例えば、本発明のヌクレオチド配列はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡ（目的とする宿主細胞又は宿主生物内の発現に特異的に適合するコドンの使用を伴うＤＮＡ等）であってもよい。
本発明の一実施の形態によれば、本発明の核酸は、本明細書中で規定したように、本質的に単離形態である。
本発明の核酸は、例えばプラスミド、コスミド又はＹＡＣ等のベクター中に存在、またはその一部、の形態であってもよく、また本質的に単離形態であってもよい。
本発明の核酸は、本明細書中で与えられる本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に関する情報に基づき、それ自体が既知の方法で調製又は入手することができ、及び／又は好適な天然資源から単離することができる。類似体を得るためには、天然型ＶＨＨドメインをコードするヌクレオチド配列に、例えば部位特異的な突然変異誘発を起こして、当該類似体をコードする本発明の核酸を得ることができる。また、当業者にとって明らかであるように、本発明の核酸を調製するために、例えばナノボディ（登録商標）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列、及び例えば、１つ又は複数のリンカーをコードする核酸等の幾つかのヌクレオチド配列を好適な方法で共に連結することができる。
本発明の核酸を生成するための技法は当業者にとって明らかであり、例えば自動ＤＮＡ合成、部位特異的突然変異誘発、２つ以上の天然型配列及び／又は合成型配列（又はこれらの２つ以上の部分）の結合、切断された発現産物を発現させる変異の導入、（例えば、好適な制限酵素を用いて容易に消化及び／又はライゲーションすることができるカセット及び／又は領域を生成するための）１つ又は複数の制限部位の導入、及び／又は１つ又は複数の「ミスマッチ」プライマーを使用し、例えば天然型ＧＰＣＲの配列を鋳型として使用するＰＣＲ反応による変異の導入が挙げられるが、これらに限定されない。これらの技法及び他の技法は当業者にとって明らかであり、同様に上記のSambrook et al.及びAusubel et al.等の標準的なハンドブック、及び以下の実施例を参照する。
本発明の核酸はまた、当業者にとって明らかであるように、遺伝子構築物の形態であり、その一部に存在し、及び／又はその一部であってもよい。このような遺伝子構築物は一般に、１つ又は複数のそれ自体が既知の遺伝子構築物の要素（例えば１つ又は複数の好適な制御要素（好適なプロモーター（複数可）、エンハンサー（複数可）、ターミネーター（複数可）等）、及び本明細書中に述べられている遺伝子構築物のさらなる要素等）に任意で連結する、少なくとも１つの本発明の核酸を含む。少なくとも１つの本発明の核酸を含むこのような遺伝子構築物は、本明細書中において「本発明の遺伝子構築物」とも呼ばれる。
本発明の遺伝子構築物は、ＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。また、本発明の遺伝子構築物は、目的とする宿主細胞又は宿主生物の形質転換に好適な形態、目的とする宿主細胞のゲノムＤＮＡへの組込みに好適な形態、又は目的とする宿主生物における単独での複製、保持及び／又は継代に好適な形態であり得る。例えば、本発明の遺伝子構築物は、例えばプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクター又はトランスポゾン等のベクターの形態であり得る。特に、ベクターは、発現ベクター、即ち、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、好適な宿主細胞、宿主生物及び／又は発現系）での発現を提供し得るベクターであってもよい。
好ましいが非限定的な一実施の形態では、本発明の遺伝子構築物は、
ａ）ｂ）と作用可能に結合している少なくとも１つの本発明の核酸と、
ｂ）プロモーター、及び場合によっては好適なターミネーター等の、１つ又は複数の制御要素と、場合によってはさらに
ｃ）それ自体が既知の遺伝子構築物の１つ又は複数のさらなる要素とを含み、ここで、用語「制御要素」、「プロモーター」、「ターミネーター」、及び「作用可能に結合した」は、当該技術分野における（本明細書中にさらに記載するような）通常の意味を有しており、遺伝子構築物中に存在する上記「さらなる要素」とは、例えば３’−又は５’−ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子、及び／又は形質転換若しくは組込み（の効率）を促進又は増大させ得る要素であってもよい。このような遺伝子構築物に関するこれらの要素及び他の好適な要素は当業者にとって明らかであり、例えば使用する構築物の種類、目的とする宿主細胞又は宿主生物、対象となる本発明のヌクレオチド配列を発現させる方法（例えば、構成的発現、一時的発現、又は誘導性発現等を介するもの）、及び／又は使用する形質転換法に応じて決定することができる。例えば、抗体及び抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片が挙げられるが、これらに限定されない）の発現及び産生のための、それ自体が既知の制御配列、プロモーター、及びターミネーターを、本質的に類似の方法で使用してもよい。
好ましくは、本発明の遺伝子構築物において、上記少なくとも１つの本発明の核酸、及び上記制御要素、及び場合によっては上記１つ又は複数のさらなる要素は、互いに「作用可能に連結」しており、このことは、これらが一般に互いに機能的な関係にあることを意味する。例えば、プロモーターが、コード配列の転写及び／又は発現を、開始又はそうでなければ制御／調節することができる場合（上記コード配列は、上記プロモーター「の制御下である」ことを理解されたい）、コード配列に「作用可能に連結」していると考えられる。一般に、２つのヌクレオチド配列が作用可能に連結している場合、これらは同一の配向を有し、通常同一リーディングフレーム内にある。必ずしも必要ではないが、通常、それらは本質的に隣接している。
好ましくは、本発明の遺伝子構築物の制御要素及びさらなる要素は、目的とする宿主細胞又は宿主生物において意図される生物学的機能を付与することができるようなものである。
例えば、プロモーター、エンハンサー又はターミネーターは、目的とする宿主細胞又は宿主生物において「作用可能」であるものとし、このことは（例えば）、当該プロモーターは、（上記で規定したように）作用可能に連結したヌクレオチド配列（例えばコード配列）の転写及び／又は発現を、開始、又はそうでなければ制御／調節することができるものであることを意味する。
特に好ましい幾つかのプロモーターとしては、本明細書中に述べた宿主細胞における発現のためのそれ自体が既知のプロモーター、特に、本明細書中に述べたもの及び／又は実施例において使用されるもの等の、細菌細胞における発現のためのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
選択マーカーは、（即ち、適切な選択条件下で）本発明のヌクレオチド配列による形質転換が（首尾良く）起こった宿主細胞及び／又は宿主生物を、形質転換が（首尾良く）起こらなかった宿主細胞及び／又は宿主生物と区別できるようなものとする。このようなマーカーの好ましいが非限定的な幾つかの例は、抗生物質（カナマイシン又はアンピシリン等）に対する耐性を付与する遺伝子、温度耐性を付与する遺伝子、又は形質転換されていない細胞若しくは生物が生存する上で不可欠な培地中の或る種の因子、化合物及び／又は（食物）成分がない状態で宿主細胞又は宿主生物を維持させる遺伝子である。
リーダー配列は、（目的とする宿主細胞又は宿主生物において）所望の翻訳後修飾を可能にし、及び／又は転写されたｍＲＮＡを細胞の所望の部分又はオルガネラに配向させるような配列であるものとする。また、リーダー配列は、当該細胞から発現生成物を分泌させてもよい。そのようなものとして、リーダー配列は、宿主細胞又は宿主生物中で作用可能な任意のプロ配列、プレ配列、又はプレプロ配列であってもよい。リーダー配列は、細菌細胞中での発現には要求されないかもしれない。例えば、抗体及び抗体断片（単一ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片が挙げられるが、これらに限定されない）の発現及び産生のための、それ自体が既知であるリーダー配列を、本質的に類似の方法で使用することができる。
発現マーカー又はレポーター遺伝子は、（宿主細胞又は宿主生物中で）遺伝子構築物（に存在する遺伝子又はヌクレオチド配列）の発現を検出できるようなものとする。発現マーカーは任意で、発現産物を、例えば細胞の特定の部分又はオルガネラ、及び／又は多細胞生物の特定の細胞（複数可）、組織（複数可）、器官（複数可）、又は部分（複数可）に局在化させてもよい。このようなレポーター遺伝子は、本発明のアミノ酸配列とのタンパク質融合体として発現されてもよい。好ましいが非限定的な幾つかの例としては、ＧＦＰ等の蛍光性タンパク質が挙げられる。
好適なプロモーター、ターミネーター、及びさらなる要素の好ましいが非限定的な幾つかの例としては、本明細書中に記載した宿主細胞における発現に使用することができるもの、特に本明細書中で言及し、及び／又は下記の実施例で用いられているもの等の細菌細胞における発現に好適であるものが挙げられる。ターミネーター、転写及び／又は翻訳エンハンサー、及び／又は組込み因子等の、本発明の遺伝子構築物中に存在／使用し得るプロモーター、選択マーカー、リーダー配列、発現マーカー、及びさらなる要素の（さらなる）非限定的な幾つかの例については、上記Sambrook et al.及びAusubel et al.による包括的なハンドブック、並びに国際公開第９５／０７４６３号、国際公開第９６／２３８１０号、国際公開第９５／０７４６３号、国際公開第９５／２１１９１号、国際公開第９７／１１０９４号、国際公開第９７／４２３２０号、国際公開第９８／０６７３７号、国際公開第９８／２１３５５号、米国特許第６，２０７，４１０号明細書、米国特許第５，６９３，４９２号明細書、及び欧州特許第１０８５０８９号明細書に示された例を参照する。他の例は当業者にとって明らかである。上記の包括的な背景技術及び本明細書中にさらに引用した参考文献も参照する。
本発明の遺伝子構築物は、通常、例えば上記Sambrook et al.及びAusubel et al.による包括的なハンドブックに記載の技法を用いて、本発明のヌクレオチド配列（複数可）を、１つ又は複数の上記のさらなる要素と適切に連結させることにより得ることができる。
多くの場合、本発明の遺伝子構築物は、本発明のヌクレオチド配列を、それ自体が既知の好適な（発現）ベクターに挿入することによって得られる。好適な発現ベクターの好ましいが非限定的な幾つかの例は、以下の実施例において使用されるもの、及び本明細書中に記載したものである。
本発明の核酸及び／又は本発明の遺伝子構築物は、宿主細胞又は宿主生物の形質転換に、即ち本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドを発現及び／又は産生させるために使用することができる。好適な宿主又は宿主細胞は当業者にとって明らかであり、例えば任意の好適な真菌、原核、又は真核細胞若しくは細胞株、或いは任意の好適な真菌、原核、又は真核生物、例えば：
− 大腸菌の菌株、ミラビリス変形菌（Proteus mirabilis）等のプロテウス属の菌株、蛍光菌（Pseudomonas fluorescens）等のシュードモナス属の菌株等のグラム陰性菌株、及び枯草菌又はブレビス菌等のバチルス属の菌株、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）等のストレプトミセス属の菌株、スタフィロコッカス・カルノサス（Staphylococcus carnosus）等のブドウ球菌の菌株、及び乳酸連鎖球菌（Lactococcus lactis）等のラクトコッカス属の菌株等のグラム陽性菌株が挙げられるがこれらに限定されない細菌株、
− トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）等のトリコデルマ属、アカパンカビ（Neurospora crassa）等のニューロスポラ属、ソルダリア・マクロスポラ（Sordaria macrospora）等のソルダリア属、アスペルギルス・ニゲル（Aspergillus niger）又はショウユコウジカビ（Aspergillus sojae）等のアスペルギルス属、又は別の糸状菌由来の細胞が挙げられるがこれらに限定されない真菌細胞、
− 出芽酵母等のサッカロミセス属、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）等のシゾサッカロミセス属、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）又はピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）等のピキア属、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）等のハンセヌラ属、クルイベロミセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）等のクルイベロミセス属、アークスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）等のアークスラ属、ヤロウィア・リポリチカ（Yarrowia lipolytica）等のヤロウィア属由来の細胞が挙げられるがこれらに限定されない酵母細胞、
− アフリカツメガエル卵母細胞等の両生類細胞又は細胞株、
− シロイチモンジヨトウＳＦ９及びＳｆ２１細胞を含むがこれらに限定されない鱗翅目に由来する細胞／細胞株、又はシュナイダー細胞及びＫｃ細胞等のショウジョウバエに由来する細胞／細胞株等の昆虫に由来する細胞又は細胞株、
− タバコ植物等の植物又は植物細胞、及び／又は
− ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞（ＢＨＫ−２１細胞等）、及びＨｅＬａ細胞、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−７細胞等）、及びＰＥＲ．Ｃ６細胞等のヒト細胞又は細胞株が挙げられるがこれらに限定されない、ヒトに由来する細胞又は細胞株、哺乳類に由来する細胞又は細胞株等の哺乳類細胞又は細胞株、
並びに、抗体及び抗体断片（（単一）ドメイン抗体及びＳｃＦｖ断片が挙げられるがこれらに限定されない）を発現及び産生するためのそれ自体が既知の他の全ての宿主又は宿主細胞であってもよく、これらは当業者に明らかである。上述の、背景技術で引用した文献、および、例えば、国際公開第９４／２９４５７号、国際公開第９６／３４１０３号、国際公開第９９／４２０７７号、Frenken et al.（1998）（上記）、Riechmann及びMuyldermans（1999）（上記）、van der Linden（2000）（上記）、Thomassen et al.（2002）（上記）、Joosten et al.（2003）（上記）、Joosten et al.（2005）（上記）及び本明細書中にさらに引用した文献を参照する。
本発明のナノボディ（登録商標）及びポリペプチドは、例えば予防及び／又は治療（遺伝子治療等）のために、多細胞生物の１つ又は複数の細胞、組織、又は器官に導入し、発現させることができる。このために、本発明のヌクレオチド配列を、例えばこのように（例えば、リポソームを用いて）、又は好適な（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等のパルボウイルス等のレトロウイルスに由来する）遺伝子治療用ベクターに挿入後、任意の好適な方法を用いて細胞又は組織に導入することができる。当業者にとって明らかであるように、このような遺伝子治療は、本発明の核酸又は本発明の核酸をコードする好適な遺伝子治療用ベクターを、患者又は患者の特定の細胞又は特定の組織若しくは器官に投与することにより患者の体内において、ｉｎ ｖｉｖｏ及び／又はｉｎ ｓｉｔｕで行うことができ、又は好適な（多くの場合、外植リンパ球、骨髄吸引物又は組織生検試料等の、治療対象となる患者の身体より採取された）細胞は、本発明のヌクレオチド配列を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで治療した後、患者の体内に好適に（再）導入することができる。これらは全て、Culver, K. W., "Gene Therapy", 1994, p. xii, Mary AnnLiebert, Inc., Publishers, New York, N.Y）、Giordano,Nature F Medicine 2（1996）,534-539、Schaper, Circ. Res. 79（1996）, 911-919、Anderson, Science 256（1992）, 808-813、Verma,Nature 389（1994）, 239、Isner, Lancet 348（1996）, 370-374、Muhlhauser, Circ. Res. 77（1995）, 1077-1086、Onodera,Blood 91;（1998）, 30-36、Verma, Gene Ther. 5（1998）, 692-699、Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci.: 811（1997）, 289-292、Verzeletti,Hum. Gene Ther. 9（1998）,2243-51、Wang, Nature Medicine 2（1996）, 714-716、国際公開第９４／２９４６９号、国際公開第９７／００９５７号、米国特許第５，５８０，８５９号明細書、米国特許第５，５８９５４６６号明細書、又はSchaper, CurrentOpinion in Biotechnology 7（1996）, 635-640に記載の当業者に既知の遺伝子治療用ベクター、技法、及び送達システムを用いて行うことができる。例えば、ＳｃＦｖ断片（Afanasieva et al., Gene Ther., 10, 1850-1859（2003））及びダイアボディ（Blanco et al., J. Immunol,171, 1070-1077（2003））のｉｎ ｓｉｔｕ発現は当該技術分野で記載されている。
細胞中でのナノボディ（登録商標）の発現のために、これらは、例えば国際公開第９４／０２６１０号、国際公開第９５／２２６１８号、及び米国特許第６００４９４０号明細書、国際公開第０３／０１４９６０号、Cattaneo, A.及びBiocca, S.（1997）Intracellular Antibodies: Developmentand Applications. Landes and Springer-Verlag、Kontermann,Methods 34,（2004）, 163-170に記載の、いわゆる「細胞内抗体」として発現させることができる。
本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドを、例えばウサギ、ウシ、ヤギ又はヒツジの母乳等のトランスジェニック哺乳動物の母乳中（トランス遺伝子を哺乳類に導入する一般的な技法については、例えば米国特許第５，７４１，９５７号明細書、米国特許第５，３０４，４８９号明細書、及び米国特許第５，８４９，９９２号明細書を参照されたい）、植物、又は葉、花、果実、種、根、塊茎を含むがこれらに限定されない植物の一部中（例えば、タバコ、トウモロコシ、ダイズ、又はアルファルファ）、又は例えば、カイコガの蛹中で産生することもできる。
さらに、本発明のナノボディ（登録商標）及びポリペプチドを、細胞を含まない発現系で発現及び／又は産生してもよく、このような系の好適な例は当業者にとって明らかである。好ましいが非限定的な幾つかの例としては、コムギ麦芽系、ウサギ網状赤血球溶解物、又はZubayの方法による大腸菌を用いた系での発現が挙げられる。
上記のように、ナノボディ（登録商標）を使用する利点の１つは、それに基づくポリペプチドを、好適な細菌系における発現によって調製することができる点であり、及び好適な細菌発現系、ベクター、宿主細胞、制御要素等は、例えば上述した参考文献によって当業者にとって明らかである。しかしながら、本発明は、最も広義には細菌系における発現に限定されないことに留意されたい。
好ましくは、本発明では、本発明のポリペプチドを医薬用途に適した形態で提供する細菌発現系等の（ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ）発現系を使用し、このような発現系も当業者にとって明らかである。当業者にとって明らかであるように、医薬用途に適した本発明のポリペプチドは、ペプチド合成法を用いて調製することもできる。
工業的スケールでの製造において、ナノボディ（登録商標）又はナノボディ（登録商標）を含有するタンパク質治療剤の（工業的）製造のために好ましい異種宿主としては、大規模スケールでの発現／産生／培養、特に大規模スケールでの医薬用途発現／産生／培養に適した大腸菌、ピキア・パストリス、出芽酵母の菌株が挙げられる。このような菌株の好適な例は、当業者とって明らかである。このような菌株及び産生／発現系は、Biovitrum社（スウェーデン、ウプサラ）等の企業から入手可能である。
代替的には、哺乳類細胞株、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、大規模スケールでの発現／産生／培養、特に大規模スケールでの医薬用途発現／産生／培養のために用いることができる。このような発現／産生系も、上記幾つかの企業から入手可能である。
特定の発現系の選択は、或る特定の翻訳後修飾、より具体的にはグリコシル化の必要条件に一部依存している。グリコシル化が望ましいか必要とされるナノボディ（登録商標）を含有する組換えタンパク質の産生には、発現したタンパク質をグリコシル化する能力を有する哺乳類発現用宿主の使用が必要である。これに関連して、得られるグリコシル化パターン（即ち、種類、数、及び残基が結合する位置）が、発現に用いられる細胞又は細胞株に依存することは、当業者にとって明らかである。好ましくは、ヒト（即ち、本質的にヒトのグリコシル化パターンを有するタンパク質を与える）細胞若しくは細胞株、又は、本質的に及び／又は機能的にヒトのグリコシル化と同一であるか、又は少なくともヒトのグリコシル化を模倣したグリコシル化パターンを与えることができる別の哺乳類の細胞株が用いられる。一般に、大腸菌等の原核宿主はタンパク質をグリコシル化する能力を有しておらず、酵母等の下等原核細胞を使用すると、通常、ヒトのグリコシル化と異なるグリコシル化パターンがもたらされる。それにもかかわらず、上記宿主細胞及び発現系の全てを、得ようとする所望のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドに応じて、本発明に用いることができることを理解されたい。
したがって、本発明の非限定的な一実施の形態によれば、本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドはグリコシル化される。本発明の別の非限定的な実施の形態によれば、本発明のナノボディ（登録商標）及びポリペプチドはグリコシル化されない。
本発明の好ましいが非限定的な一実施の形態によれば、本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドは、細菌細胞中、具体的には大規模スケールでの医薬品製造に適した上記の株の細胞等の細菌細胞中で産生する。
本発明の別の好ましいが非限定的な実施の形態によれば、本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドは、酵母細胞中、具体的には大規模スケールでの医薬品製造に適した上記の種の細胞等の酵母細胞中で産生する。
本発明のさらに別の好ましいが非限定的な実施の形態によれば、本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドは、哺乳類細胞中、具体的にはヒト細胞又はヒト細胞株の細胞中で、さらに具体的には大規模スケールでの医薬品製造に適した上記の細胞株等のヒト細胞又はヒト細胞株の細胞中で産生する。
宿主細胞中での発現が、本発明のナノボディ（登録商標）及びタンパク質の製造に用いられる場合、本発明のナノボディ（登録商標）及びタンパク質は、細胞内（例えば、細胞質中、ペリプラズム中、又は封入体中）で産生し、次いで宿主細胞から単離し、場合によってはさらに精製してもよく、又は細胞外（例えば、宿主細胞を培養する培地中）で産生し、次いで培地から単離し、場合によってはさらに精製してもよい。真核宿主細胞を使用する場合、得られるナノボディ（登録商標）及びタンパク質のさらなる単離及び下流工程での処理が大幅に容易になるため、通常、細胞外で産生されることが好ましい。通常、大腸菌の菌株等の上記細菌細胞は、毒素及び溶血毒等の数種のタンパク質を除き、タンパク質を細胞外に分泌せず、大腸菌において分泌物を産生することは、内膜を通してペリプラズム空間へタンパク質を転移させることを意味する。ペリプラズムでの産生は、細胞質での産生に対して、幾つかの利点がある。例えば、分泌産物のＮ末端のアミノ酸配列は、特異的シグナルペプチダーゼによる分泌シグナル配列の切断後の天然遺伝子産物と同一であってもよい。また、ペリプラズム中では、細胞質中よりもプロテアーゼ活性がはるかに低いと思われる。さらに、ペリプラズム中では、混入するタンパク質が少ないため、タンパク質の精製がより容易である。別の利点は、ペリプラズムが細胞質よりも酸化的な環境をもたらすため、正しい位置にジスルフィド結合が形成される可能性があるという点である。大腸菌中で過剰発現されたタンパク質は、封入体と呼ばれる不溶性の凝集物中に見られることが多い。これらの封入体は、細胞質中にもペリプラズム中にも存在させることができ、これらの封入体からの生理活性タンパク質の回収は、変性／リフォールディングプロセスを必要とする。治療効果を有するタンパク質を含む多くの組換えタンパク質は、封入体から回収される。代替的には、当業者に明らかであるように、所望のタンパク質、特に本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドを分泌するように遺伝的に修飾された細菌の組換え菌株を用いることができる。
したがって、本発明の非限定的な一実施の形態によれば、本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドは、細胞内で産生され、宿主細胞から、特に細菌細胞又は細菌細胞中の封入体から単離したナノボディ（登録商標）又はポリペプチドである。本発明の別の非限定的な実施の形態によれば、本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドは、細胞外で産生され、宿主細胞を培養する培地から単離されたナノボディ（登録商標）又はポリペプチドである。
好ましいが非限定的な幾つかの、これらの宿主細胞で用いるためのプロモーターとしては、次のプロモータが挙げられる：
− 大腸菌における発現のための：ｌａｃプロモーター（及び、ｌａｃＵＶ５プロモーター等のこれらの誘導体）、アラビノースプロモーター、λファージの左側（ＰＬ）及び右側（ＰＲ）プロモーター、ｔｒｐオペロンのプロモーター、ハイブリッドｌａｃ／ｔｒｐプロモーター（ｔａｃ及びｔｒｃ）、Ｔ７−プロモーター（より具体的にはＴ７−ファージ遺伝子１０のプロモーター）、及び他のＴ−ファージプロモーター；Ｔｎ１０テトラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター、１つ又は複数の外来制御オペレーター配列のコピーを含む上記プロモーターの組換え変異体；
− 出芽酵母における発現のための：ＡＤＨ１（アルコール脱水素酵素１）、ＥＮＯ（エノラーゼ）、ＣＹＣ１（チトクロームｃ異性化酵素１）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）、ＰＧＫ１（ホスホグリセリン酸キナーゼ）、ＰＹＫ１（ピルビン酸キナーゼ）の構成的プロモーター；ＧＡＬ１，１０，７（ガラクトース代謝酵素）、ＡＤＨ２（アルコール脱水素酵素２）、ＰＨＯ５（酸ホスファターゼ）、ＣＵＰ１（銅メタロチオネイン）の制御的プロモーター、ＣａＭＶ（カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター）の外来プロモーター；
− ピキア・パストリスにおける発現のための：ＡＯＸ１プロモーター（アルコール酸化酵素Ｉ）；
− 哺乳類細胞における発現のための：ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター、プロモーターがＴｅｔリプレッサーによって制御可能なように２個のテトラサイクリンオペレーター配列を含有するヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）前初期プロモーター変異体、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復配列（ＲＳＶ ＬＴＲ）エンハンサー／プロモーター、ヒト、チンパンジー、マウス、又はラット由来の伸長因子１α（ｈＥＦ−１α）プロモーター；ＳＶ４０初期プロモーター；ＨＩＶ−１の長末端反復配列プロモーター；βアクチンプロモーター。
好ましいが非限定的な幾つかの、これらの宿主細胞で用いるためのベクターとしては、次のベクターが挙げられる：
− 哺乳類細胞における発現のためのベクター：ｐＭＡＭｎｅｏ（Clontech）、ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Stratagene）、ｐＳＧ５（Stratagene）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４６０）及びｌＺＤ３５（ＡＴＣＣ ３７５６５）、並びにアデノウイルスに基づくもの等のウイルスに基づく発現系；
− 細菌細胞における発現のためのベクター：ｐＥＴベクター（Novagen）及びｐＱＥベクター（Qiagen）；
− 酵母又は別の真菌細胞における発現のためのベクター：ｐＹＥＳ２（Invitrogen）及びピキア発現ベクター（Invitrogen）；
− 昆虫細胞における発現のためのベクター：ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩ（Invitrogen）及び他のバキュロウイルスベクター；
− 植物又は植物細胞における発現のためのベクター：例えば、カリフラワーモザイクウイルス又はタバコモザイクウイルス、アグロバクテリウムの好適な菌株又はＴｉ-プラスミドベースのベクター。
好ましいが非限定的な幾つかの、これらの宿主細胞で使用するための分泌配列としては、次の配列があげられる：
− 大腸菌等の細菌細胞における使用のための：ＰｅｌＢ、Ｂｌａ、ＯｍｐＡ、ＯｍｐＣ、ＯｍｐＦ、ＯｍｐＴ、ＳｔＩＩ、ＰｈｏＡ、ＰｈｏＥ、ＭａｌＥ、Ｌｐｐ、ＬａｍＢ等；ＴＡＴシグナルペプチド、ヘモリシンＣ−末端分泌シグナル；
− 酵母における使用のための：α−接合因子プレプロ配列、ホスファターゼ（ｐｈｏ１）、インベルターゼ（Ｓｕｃ）等；
− 哺乳類細胞における使用のための：標的タンパク質が真核細胞由来である場合には、固有シグナル、マウスＩｇκ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド等。
本発明の宿主又は宿主細胞を形質転換するのに好適な技法は、当業者にとって明らかであり、目的とする宿主細胞／宿主生物及び使用する遺伝子構築物に依存することもある。同様に、上記ハンドブック及び特許出願を参照する。
形質転換後、本発明のヌクレオチド配列／遺伝子構築物によってうまく形質転換された宿主細胞又は宿主生物を検出及び選択する工程を実行することができる。この工程は、例えば本発明の遺伝子構築物に存在する選択可能なマーカーに基づいて選択する工程、又は、例えば特異的抗体を使用する本発明のアミノ酸配列の検出を含む工程であってもよい。
形質転換された宿主細胞（安定な細胞株の形態を取ることができる）又は宿主生物（安定な変異体系列又は株の形態を取ることができる）は、本発明の他の態様をなす。
好ましくは、これらの宿主細胞又は宿主生物は、（宿主生物の場合には、その少なくとも１つの細胞、部分、組織又は器官において）本発明のアミノ酸配列を発現し、又は（少なくとも）（例えば、好適な条件下で）発現することができるようなものである。本発明はまた、本発明の宿主細胞又は宿主生物のさらなる世代、後代及び／又は子孫を含んでおり、それらは、例えば細胞分裂又は有性若しくは無性生殖により得られるものであってよい。
本発明のアミノ酸配列を発現させ／その発現を得るために、形質転換された宿主細胞又は形質転換された宿主生物は一般に、（所望の）本発明のアミノ酸配列が発現／産生されるような条件下で保持、維持及び／又は培養され得る。好適な条件は当業者にとって明らかであり、通常、使用する宿主細胞／宿主生物、及び（関連する）本発明のヌクレオチド配列の発現を制御する制御因子に依存する。この場合にも、本発明の遺伝子構築物に関する上記の段落に記載したハンドブック及び特許出願を参照する。
一般に、好適な条件には、好適な培地の使用、好適な食餌及び／又は好適な栄養源の存在、好適な温度の使用、及び場合によっては好適な誘導因子又は化合物の存在（例えば、本発明のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターにより制御される場合）が含まれ、これらは全て当業者が選択することができる。この場合にも、このような条件下で、本発明のアミノ酸配列は、連続的、一時的、又は適切に誘導された場合にのみ発現することができる。
本発明のアミノ酸配列は、（まず）未成熟型（上記）で産生され、次いで、使用する宿主細胞／宿主生物に応じて翻訳後修飾されてもよいことも、当業者にとって明らかである。また、本発明のアミノ酸配列は、この場合にも、使用する宿主細胞／宿主生物に応じてグリコシル化されてもよい。
本発明のアミノ酸配列は、次いで、宿主細胞／宿主生物から、及び／又は当該宿主細胞若しくは宿主生物を培養した培地から、（分取）クロマトグラフィ法、及び／又は電気泳動法、分別沈殿法、アフィニティ法（例えば、本発明のアミノ酸配列に融合した特定の切断可能なアミノ酸配列を用いる）、及び／又は分取免疫法（即ち単離対象のアミノ酸配列に対する抗体を用いる）等の、それ自体が既知のタンパク質の単離技法及び／又は精製技法を用いて単離することができる。
概して、医薬用途のために、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの本発明のポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤、及び／又はアジュバントとを含み、１つ又は複数のさらなる薬学的に活性なポリペプチド及び／又は化合物を場合によっては含む薬学的調製物として配合することができる。非限定的な例により、このような製剤は、経口投与のため、非経口投与（静脈内、筋内若しくは皮下注射、又は静脈内点滴等による）のため、局所投与のため、吸入、経皮パッチ、インプラント、坐剤等による投与のために適した形態を取ることができる。このような好適な投与形態は、投与の方法、及びその調製物で用いるための方法及び担体に応じて、固体、半固体又は液体であってよく、当業者にとって明らかであり、本明細書でさらに記述する。
したがって、他の態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明のナノボディ（登録商標）又は少なくとも１つの本発明のポリペプチド、及び少なくとも１つの好適な（即ち医薬用途に好適な）担体、希釈剤又は賦形剤を含み、場合によっては１つ又は複数のさらなる活性物質を含有する薬学的組成物に関する。
概して、本発明のナノボディ（登録商標）及びポリペプチドは、それ自体が既知の任意の好適な方法により配合及び投与することができ、これらについては、例えば上記で引用した包括的な背景技術（特に、国際公開第０４／０４１８６２号、国際公開第０４／０４１８６３号、国際公開第０４／０４１８６５号及び国際公開第０４／０４１８６７号）、及びRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., MackPublishing Company, USA（1990）、又はRemington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition,Lippincott Williams and Wilkins（2005）等の標準的なハンドブックを参照する。
例えば、本発明のナノボディ（登録商標）及びポリペプチドは、従来の抗体及び抗体断片（ＳｃＦｖ及びダイアボディ等）及び他の薬学的に活性なタンパク質のための、それ自体が既知の任意の方法で配合及び投与することができる。このような製剤及びそれを調製する方法は当業者にとって明らかであり、例えば非経口投与（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、管腔内、動脈内又は髄腔内投与）又は局所（経皮又は皮内）投与に好適な調製物が挙げられる。
非経口投与のための調製物は、例えば点滴又は注射に好適な滅菌液剤、懸濁剤、分散剤又は乳化剤であってもよい。このような調製物に好適な担体又は希釈剤としては、例えば限定するものではないが、滅菌水及び緩衝水溶液、並びにリン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及びハンクス液等の溶液、水性油、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール等のグリコール、又は、鉱物油、動物油、及び植物油、例えば落花生油、大豆油、並びに好適なこれらの混合物が挙げられる。通常、水溶液剤又は懸濁剤が好ましい。
本発明のナノボディ（登録商標）及びポリペプチドは薬学的組成物として配合し、選択された投与経路、即ち経口又は非経口、鼻腔内、吸引、静脈内、筋肉内、局所、又は皮下経路に適合した様々な形態で哺乳動物宿主（ヒト患者又は家畜等）に投与することができる。本発明の薬学的組成物は、本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドと、以下に挙げられる好適な薬学的ビヒクルとを含み得る。
本発明のナノボディ（登録商標）及びポリペプチドは、遺伝子治療の送達方法を使用して投与することもできる。例えば、その全文が参照により本明細書中に援用される米国特許第５，３９９，３４６号明細書を参照されたい。遺伝子治療の送達方法を使用して、本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドの遺伝子によりトランスフェクトされた初代細胞を、特定の器官、組織、移植片、腫瘍又は細胞を標的とするための組織特異的プロモーターによりさらにトランスフェクトすることができ、細胞内に局在化した発現のためのシグナル及び安定化配列によりさらにトランスフェクトすることもできる。
このように、本発明のナノボディ（登録商標）及びポリペプチドは、不活性希釈剤又は吸収可能な食用の担体等の薬学的に許容される溶媒と組み合わせて、例えば経口的に全身投与することができる。それらを、ハード又はソフトシェルゼラチンカプセルに封入してもよく、錠剤として打錠してもよく、又は患者の食事中の食品に直接加えてもよい。経口治療用の投与のために、本発明のナノボディ（登録商標）及びポリペプチドを１つ又は複数の賦形剤と組み合わせ、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液剤、シロップ剤、ウェハー剤等の形態で使用することができる。このような組成物及び調製物は、少なくとも０．１％の本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドを含有しているものとする。組成物及び調製物の割合は、当然ながら変えることができ、所定の単位投薬形態の重量の約２％〜約６０％であることが適切である。このような治療上有用な組成物中の本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドの量は、有効な用量レベルが得られるような量である。
また、錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤等は、トラガカントガム、アラビアゴム、コーンスターチ又はゼラチン等の結着剤；リン酸二カルシウム等の賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；及びスクロース、フルクトース、ラクトース又はアスパルテーム等の甘味料を含有していてもよく、又はペパーミント、冬緑油、チェリー香料等の香料を加えてもよい。単位投薬形態がカプセル剤である場合、上記のような種類の物質以外に、植物油又はポリエチレングリコール等の液体担体を含有していてもよい。種々の他の物質が、コーティングとして、又は固体状の単位投薬形態の物理的形態を他の方法により変化させるために存在していてもよい。例えば、錠剤、丸剤又はカプセル剤は、ゼラチン、ロウ、シェラック又は砂糖等でコーティングされていてもよい。シロップ剤又はエリキシル剤は、本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチド、甘味料としてのスクロース及びフルクトース、保存料としてのメチルパラベン又はプロピルパラベン、色素、及びチェリー又はオレンジ香料等の香料を含有していてもよい。当然ながら、単位投薬形態の調製に使用される全ての物質は、薬学的に許容され、使用する量において実質的に無毒であるものとする。さらに、本発明のナノボディ（登録商標）又はポリペプチドは、徐放製剤及び装置中に封入されていてもよい。
本発明のナノボディ（登録商標）及びポリペプチドはまた、点滴又は注射によって静脈内投与又は腹腔内投与してもよい。本発明のナノボディ（登録商標）及びポリペプチドの溶液は、水中で調製することがき、任意で無毒性界面活性剤と混合することができる。分散剤液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、及びそれらの混合物中、並びに油中で調製することができる。通常の保存及び使用条件下において、これらの調製物は、微生物の繁殖を防ぐための保存料を含有している。
注射又は点滴に好適な薬剤投薬形態としては、滅菌注射又は滅菌点滴可能な溶液剤又は分散液剤の即時調製に適合し、場合によってはリポソームに封入された活性成分を含む、滅菌水溶液剤又は分散液剤又は滅菌粉末が挙げられ得る。全ての場合において、最終的な投薬形態は、滅菌されており、流体であり、製造及び保存条件下で安定であるものとする。液体の担体又は溶媒は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、非毒性グリセリルエステル、及びこれらの好適な混合物を含む溶媒又は液体の分散媒であってもよい。例えば、リポソームの形成により、分散液剤の場合には必要な粒子サイズを維持することにより、又は界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の種々の抗菌剤及び抗真菌剤により微生物の作用を阻止することができる。多くの場合において、等張剤、例えば砂糖、緩衝剤、又は塩化ナトリウムを含んでいることが好ましい。組成物において、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することにより、注射可能な組成物の長時間にわたる吸収をもたらすことができる。
滅菌注射可能な溶液剤は、所望の量の本発明のナノボディ（登録商標）及びポリペプチドを、必要に応じて、上記に列挙した種々の他の成分を含む適切な溶媒中に混合させた後、滅菌濾過することにより調製される。滅菌注射可能な溶液剤を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、減圧乾燥法及び凍結乾燥法であり、活性成分の粉末、及び予め滅菌濾過された溶液剤中に存在する任意のさらなる望ましい成分が得られる。
局所投与のためには、本発明のナノボディ（登録商標）及びポリペプチドが液体の場合には、純粋な形態で適用することができる。しかし、一般に、それらは、固体であっても液体であってもよい皮膚科学的に許容される担体と共に、組成物又は製剤として皮膚に投与されることが望ましい。
有用な固体担体としては、タルク、粘土、微結晶セルロース、シリカ、アルミナ等の微粉砕された固体が挙げられる。有用な液体担体としては、水、ヒドロキシアルキル又はグリコール又は水−アルコール／グリコール混合物が挙げられ、本発明のナノボディ（登録商標）及びポリペプチドは、場合によっては非毒性の界面活性剤の作用により、有効な濃度で溶解又は分散することができる。所定用途のための性質を最適化するために、芳香剤及び他の抗菌剤等のアジュバントを加えてもよい。得られる液体組成物は、絆創膏及び他の包帯に薬剤を含浸させるのに用いられる吸収パッドによって塗布することができ、又はポンプ型又はエアロゾルスプレーを使用して患部の上に噴霧することができる。
使用者の皮膚に直接塗布するための塗布用ペースト、ゲル、軟膏及び石鹸等を形成するために、合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩及びエステル、脂肪アルコール、修飾セルロース又は修飾無機物質等の増粘剤を液体担体と共に使用することができる。
薬学的に活性のある化合物及びタンパク質を皮膚に送達するために使用することができる有用な皮膚科用組成物の例は既知であり、例えばJacquet et al.（米国特許第４，６０８，３９２号明細書）、Geria（米国特許第４，９９２，４７８号明細書）、Smith et al.（米国特許第４，５５９，１５７号明細書）及びWortzman（米国特許第４，８２０，５０８号明細書）を参照されたい。
本発明のナノボディ（登録商標）及びポリペプチドの有用な用量は、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性、及び動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ活性を比較することにより決定することができる。マウス及び他の動物における有効用量をヒトに外挿するための方法は既知であり、例えば米国特許第４，９３８，９４９号明細書を参照されたい。
概して、ローション等の液体組成物中の本発明のナノボディ（登録商標）及びポリペプチドの濃度は、約０．１重量％〜２５重量％、好ましくは、約０．５重量％〜１０重量％である。ゲル又は粉末等の半固形又は固形組成物中の濃度は、約０．１重量％〜５重量％、好ましくは約０．５重量％〜２．５重量％である。
治療における使用に必要な本発明のナノボディ（登録商標）及びポリペプチドの量は、選択される特定の塩だけでなく、投与経路、治療する症状の性質、並びに患者の年齢及び状態によっても変動し、最終的には担当する医師又は臨床医の判断に委ねられる。また、本発明のナノボディ（登録商標）及びポリペプチドの用量は、標的となる細胞、腫瘍、組織、移植片又は器官によっても変動する。
望ましい用量は便宜上、単回用量で、又は例えば、１日２回、３回、４回以上の部分用量として、適切な間隔での分割投与で示され得る。部分用量自体を、例えば吸入器からの複数回の吸入又は複数滴の点眼投与等の、個別で、大まかな間隔の数多くの投与にさらに分割してもよい。
投与計画には、長期間の毎日の処置が含まれ得る。「長期間」とは、少なくとも２週間、好ましくは数週間、数ヶ月、又は数年の期間を意味する。この用量範囲における必要な改変は、本明細書中で教示される通常の実験のみを使用して当業者によって決定され得る。Remington's Pharmaceutical Sciences（Martin,E. W., ed. 4）, Mack Publishing Co., Easton, PAを参照されたい。用量は、何らかの合併症が発症した場合には、個々の医師が調節することもできる。
概して、医薬用途のために、本発明のポリペプチドは、少なくとも１つの本発明のポリペプチドと、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤、及び／又はアジュバントとを含み、１つ又は複数のさらなる薬学的に活性なポリペプチド及び／又は化合物を場合によっては含む薬学的調製物として配合することができる。非限定的な例により、このような製剤は、経口投与のため、非経口投与（静脈内、筋内若しくは皮下注射、又は静脈内点滴等による）のため、局所投与のため、吸入、経皮パッチ、インプラント、坐剤等による投与のために適した形態を取ることができる。このような好適な投与形態は、投与の方法、及びその調製物で用いるための方法及び担体に応じて、固体、半固体又は液体であってよく、当業者にとって明らかであり、本明細書でさらに記述する。
したがって、他の態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明のナノボディ又は少なくとも１つの本発明のポリペプチド、及び少なくとも１つの好適な（即ち医薬用途に好適な）担体、希釈剤又は賦形剤を含み、場合によっては１つ又は複数のさらなる活性物質を含有する薬学的組成物に関する。
概して、本発明のナノボディ及びポリペプチドは、それ自体が既知の任意の好適な方法により配合及び投与することができ、これらについては、例えば上記で引用した包括的な背景技術（特に、国際公開第０４／０４１８６２号、国際公開第０４／０４１８６３号、国際公開第０４／０４１８６５号及び国際公開第０４／０４１８６７号）、及びRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., MackPublishing Company, USA（1990）、又はRemington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition,Lippincott Williams and Wilkins（2005）等の標準的なハンドブックを参照する。
例えば、本発明のナノボディ及びポリペプチドは、従来の抗体及び抗体断片（ＳｃＦｖ及びダイアボディ等）及び他の薬学的に活性なタンパク質のための、それ自体が既知の任意の方法で配合及び投与することができる。このような製剤及びそれを調製する方法は当業者にとって明らかであり、例えば非経口投与（例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋内、管腔内、動脈内又は髄腔内投与）又は局所（経皮又は皮内）投与に好適な調製物が挙げられる。
非経口投与のための調製物は、例えば点滴又は注射に好適な滅菌液剤、懸濁剤、分散剤又は乳化剤であってもよい。このような調製物に好適な担体又は希釈剤としては、例えば限定するものではないが、滅菌水及び緩衝水溶液、並びにリン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、及びハンクス液等の溶液、水性油、グリセロール、エタノール、プロピレングリコール等のグリコール、又は、鉱物油、動物油、及び植物油、例えば落花生油、大豆油、並びに好適なこれらの混合物が挙げられる。通常、水溶液剤又は懸濁剤が好ましい。
本発明のナノボディ及びポリペプチドは、遺伝子治療の送達方法を使用して投与することもできる。例えば、その全文が参照により本明細書中に援用される米国特許第５，３９９，３４６号明細書を参照されたい。遺伝子治療の送達方法を使用して、本発明のナノボディ又はポリペプチドをコードする遺伝子によりトランスフェクトされた初代細胞を、特定の器官、組織、移植片、腫瘍又は細胞を標的とするための組織特異的プロモーターによりさらにトランスフェクトすることができ、細胞内に局在化した発現のためのシグナル及び安定化配列によりさらにトランスフェクトすることもできる。
このように、本発明のナノボディ及びポリペプチドは、不活性希釈剤又は吸収可能な食用の担体等の薬学的に許容される溶媒と組み合わせて、例えば経口的に全身投与することができる。それらを、ハード又はソフトシェルゼラチンカプセルに封入してもよく、錠剤として打錠してもよく、又は患者の食事中の食品に直接加えてもよい。経口治療用の投与のために、本発明のナノボディ及びポリペプチドを１つ又は複数の賦形剤と組み合わせ、摂取可能な錠剤、口腔錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液剤、シロップ剤、ウェハー剤等の形態で使用することができる。このような組成物及び調製物は、少なくとも０．１％の本発明のナノボディ又はポリペプチドを含有しているものとする。組成物及び調製物中の割合は、当然ながら変えることができ、所定の単位投薬形態の重量の約２％〜約６０％であることが適切である。このような治療上有用な組成物中の本発明のナノボディ又はポリペプチドの量は、有効な用量レベルが得られるような量である。
また、錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤等は、トラガカントガム、アラビアゴム、コーンスターチ又はゼラチン等の結着剤；リン酸二カルシウム等の賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤；及びスクロース、フルクトース、ラクトース又はアスパルテーム等の甘味料を含有していてもよく、又はペパーミント、冬緑油、チェリー香料等の香料を加えてもよい。単位投薬形態がカプセル剤である場合、上記のような種類の物質以外に、植物油又はポリエチレングリコール等の液体担体を含有していてもよい。種々の他の物質が、コーティングとして、又は固体状の単位投薬形態の物理的形態を他の方法により変化させるために存在していてもよい。例えば、錠剤、丸剤又はカプセル剤は、ゼラチン、ロウ、シェラック又は砂糖等でコーティングされていてもよい。シロップ剤又はエリキシル剤は、本発明のナノボディ及びポリペプチド、甘味料としてのスクロース又はフルクトース、保存料としてのメチルパラベン又はプロピルパラベン、色素、及びチェリー又はオレンジ香料等の香料を含有していてもよい。当然ながら、任意の単位投薬形態の調製に使用される全ての物質は、薬学的に許容され、使用する量において実質的に無毒であるものとする。さらに、本発明のナノボディ及びポリペプチドは、徐放製剤及び装置中に封入されていてもよい。
本発明のナノボディ及びポリペプチドはまた、点滴又は注射によって静脈内投与又は腹腔内投与してもよい。本発明のナノボディ及びポリペプチドの溶液、又はそれらの塩は、水中で調製することがき、任意で無毒性界面活性剤と混合することができる。分散剤液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、及びそれらの混合物中、並びに油中で調製することができる。通常の保存及び使用条件下において、これらの調製物は、微生物の繁殖を防ぐための保存料を含有している。
注射又は点滴に好適な薬剤投薬形態としては、滅菌注射又は滅菌点滴可能な溶液剤又は分散液剤の即時調製に適合し、場合によってはリポソームに封入された活性成分を含む、滅菌水溶液剤又は分散液剤又は滅菌粉末が挙げられ得る。全ての場合において、最終的な投薬形態は、滅菌されており、流体であり、製造及び保存条件下で安定であるものとする。液体の担体又は溶媒は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、植物油、非毒性グリセリルエステル、及びこれらの好適な混合物を含む溶媒又は液体の分散媒であってもよい。例えば、リポソームの形成により、分散液剤の場合には必要な粒子サイズを維持することにより、又は界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の種々の抗菌剤及び抗真菌剤により微生物の作用を阻止することができる。多くの場合において、等張剤、例えば砂糖、緩衝剤、又は塩化ナトリウムを含んでいることが好ましい。組成物において、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することにより、注射可能な組成物の長時間にわたる吸収をもたらすことができる。
滅菌注射可能な溶液剤は、所望の量の本発明のナノボディ及びポリペプチドを、必要に応じて、上記に列挙した種々の他の成分を含む適切な溶媒中に混合させた後、滅菌濾過することにより調製される。滅菌注射可能な溶液剤を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、減圧乾燥法及び凍結乾燥法であり、活性成分の粉末、及び予め滅菌濾過された溶液剤中に存在する任意のさらなる望ましい成分が得られる。
局所投与のためには、本発明のナノボディ及びポリペプチドが液体の場合には、純粋な形態で適用することができる。しかし、一般に、それらは、固体であっても液体であってもよい皮膚科学的に許容される担体と共に、組成物又は製剤として皮膚に投与されることが望ましい。
有用な固体担体としては、タルク、粘土、微結晶セルロース、シリカ、アルミナ等の微粉砕された固体が挙げられる。有用な液体担体としては、水、ヒドロキシアルキル又はグリコール又は水−アルコール／グリコール混合物が挙げられ、本発明のナノボディ及びポリペプチドは、場合によっては非毒性の界面活性剤の作用により、有効な濃度で溶解又は分散することができる。所定用途のための性質を最適化するために、芳香剤及び他の抗菌剤等のアジュバントを加えてもよい。得られる液体組成物は、絆創膏及び他の包帯に薬剤を含浸させるのに用いられる吸収パッドによって塗布することができ、又はポンプ型又はエアロゾルスプレーを使用して患部の上に噴霧することができる。
使用者の皮膚に直接塗布するための塗布用ペースト、ゲル、軟膏及び石鹸等を形成するために、合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩及びエステル、脂肪アルコール、修飾セルロース又は修飾無機物質等の増粘剤を液体担体と共に使用することができる。
本発明のナノボディ及びポリペプチドを皮膚に送達するために使用することができる有用な皮膚科用組成物の例は既知であり、例えばJacquet et al.（米国特許第４，６０８，３９２号明細書）、Geria（米国特許第４，９９２，４７８号明細書）、Smith et al.（米国特許第４，５５９，１５７号明細書）及びWortzman（米国特許第４，８２０，５０８号明細書）を参照されたい。
本発明のナノボディ及びポリペプチドの有用な用量は、それらのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性、及び動物モデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏ活性を比較することにより決定することができる。マウス及び他の動物における有効用量をヒトに外挿するための方法は既知であり、例えば米国特許第４，９３８，９４９号明細書を参照されたい。
概して、ローション等の液体組成物中の本発明のナノボディ及びポリペプチドの濃度は、約０．１重量％〜２５重量％、好ましくは、約０．５重量％〜１０重量％である。ゲル又は粉末等の半固形又は固形組成物中の濃度は、約０．１重量％〜５重量％、好ましくは約０．５重量％〜２．５重量％である。
治療における使用に必要な本発明のナノボディ及びポリペプチドの量は、選択される特定の塩だけでなく、投与経路、治療する症状の性質、並びに患者の年齢及び状態によっても変動し、最終的には担当する医師又は臨床医の判断に委ねられる。また、本発明のナノボディ及びポリペプチドの用量は、標的となる細胞、腫瘍、組織、移植片又は器官によっても変動する。
望ましい用量は便宜上、単回用量で、又は例えば、１日２回、３回、４回以上の部分用量として、適切な間隔での分割投与で示され得る。部分用量自体を、例えば吸入器からの複数回の吸入又は複数滴の点眼投与等の、個別で、大まかな間隔の数多くの投与にさらに分割してもよい。
投与計画には、長期間の毎日の処置が含まれ得る。「長期間」とは、少なくとも２週間、好ましくは数週間、数ヶ月、又は数年の期間を意味する。この用量範囲における必要な改変は、本明細書中で教示される通常の実験のみを使用して当業者によって決定され得る。Remington's Pharmaceutical Sciences（Martin,E. W., ed. 4）, Mack Publishing Co., Easton, PAを参照されたい。用量は、何らかの合併症が発症した場合には、個々の医師が調節することもできる。
別の態様において、本発明は、少なくとも１つのＩＬ−６に関連する疾患を予防及び／又は治療する方法であって、それが必要な被験者に薬学的に有効な量の本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、及び／又はこれらを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。
本発明の文脈において、用語「予防及び／又は治療」とは、疾患を予防及び／又は治療することを含むだけでなく、概して、疾患の発症を予防すること、疾患の進行を遅延又は退行させること、疾患に関連する１つ又は複数の症状の発症を予防又は遅延させること、疾患に関連する１つ又は複数の症状を低減及び／又は軽減すること、疾患及び／又はそれに関連するあらゆる症状の重傷度及び／又は期間を低減すること、及び／又は疾患及び／又はそれに関連するあらゆる症状の重症度のさらなる増大を予防すること、疾患によって生じるあらゆる生理学的損傷を予防、低減又は退行させること、及び概して治療すべき患者に有益なあらゆる薬理作用も含む。
治療すべき被験者とは、任意の温血動物であり得るが、具体的には哺乳類、より具体的にはヒトである。当業者にとって明らかであるように、治療すべき被験者は、特に本明細書中に記載の疾患及び障害をわずらっているか又はそれらの危険性のあるヒトであり得る。
本発明はまた、本発明のナノボディ又はポリペプチドを患者に投与することによって予防及び／又は治療することができる少なくとも１つの疾患及び障害を予防及び／又は治療する方法であって、それが必要な被験者に薬学的に有効な量の本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、及び／又はこれらを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。
より具体的には、本発明は、本明細書中に列挙される疾患及び障害から成る群から選択される少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は治療する方法であって、それが必要な被験者に薬学的に有効な量の本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、及び／又はこれらを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。
別の実施の形態では、本発明は、免疫療法、及び特に受動免疫療法に関する方法であって、本明細書中に記載の疾患及び障害をわずらっているか又はそれらの危険性のある被験者に、薬学的に有効な量の本発明のナノボディ、本発明のポリペプチド、及び／又はこれらを含む薬学的組成物を投与することを含む、方法に関する。
上記の方法において、本発明のナノボディ及び／又はポリペプチド、及び／又はこれらを含む組成物は、使用される特定の薬学的製剤又は薬学的組成物に応じて任意の好適な方法で投与することができる。したがって、本発明のナノボディ及び／又はポリペプチド、及び／又はこれらを含む組成物は、例えばこの場合にも使用される特定の薬学的製剤又は薬学的組成物に応じて経口的、腹腔内（例えば、静脈内、皮下、筋内、又は消化管を回避した投与の任意の他の経路を介して）、鼻腔内、経皮、局所的に、座薬を用いて、吸入によって投与することができる。臨床医は、予防又は治療すべき疾患又は障害、及び臨床医に既知の他の因子に応じて、好適な投与経路、及びこのような投与に使用される好適な薬学的製剤又は薬学的組成物を選択することができる。
本発明のナノボディ及び／又はポリペプチド、及び／又はこれらを含む組成物は、予防又は治療すべき疾患又は障害の予防及び／又は治療に好適な治療計画に従って投与される。臨床医は一般的に、予防又は治療すべき疾患又は障害、治療すべき疾患の重症度及び／又はその症状の重症度、使用される本発明の特定のナノボディ又はポリペプチド、特定の投与経路、及び使用される薬学的製剤又は薬学的組成物、患者の年齢、性別、体重、食事、全身状態、並びに臨床医に既知の同様の因子に応じて、好適な治療計画を決定することができる。
概して、治療計画には、１つ又は複数の薬学的に有効な量又は用量における１つ又は複数の本発明のナノボディ及び／又はポリペプチド、又はこれらを含む１つ又は複数の組成物の投与が含まれる。投与される具体的な量（複数可）又は用量はこの場合でも上記の因子に基づき臨床医によって決定することができる。
概して、本明細書中に記載した疾患及び障害の予防及び／又は治療に関して、また治療すべき特定の疾患又は障害、使用される本発明の特定のナノボディ及びポリペプチドの効力、特定の投与経路、及び使用される特定の薬学的製剤又は薬学的組成物に応じて、本発明のナノボディ及びポリペプチドは概して、１ｇ／ｋｇ（体重）／日〜０．０１μｇ／ｋｇ（体重）／日、好ましくは、０．１ｇ／ｋｇ（体重）／日〜０．１μｇ／ｋｇ（体重）／日、例えば約１μｇ／ｋｇ（体重）／日、１０μｇ／ｋｇ（体重）／日、１００μｇ／ｋｇ（体重）／日又は１０００μｇ／ｋｇ（体重）／日の量で、連続して（例えば、点滴によって）、日々の単回用量として、又は１日の中の複数回の分割用量として投与される。臨床医は一般的に、本明細書中に記載の因子に応じて好適な日用量を決定することができる。特定の場合には、例えば上記の因子及び臨床医の専門的判断に基づきこれらの量から外れるように臨床医が選択することもあることが明らかである。一般的に、親和性／結合活性、有効性、体内分布、半減期及び当業者に既知の同様の因子の差異は考慮するものの、本質的に同様の経路を介して投与される、同様の標的に対する比較可能な従来の抗体又は抗体断片に関して通常投与される量から、投与量に関する指針を幾らか得ることができる。
通常上記の方法では、本発明の単一のナノボディ又はポリペプチドを使用している。しかしながら、２つ以上の本発明のナノボディ及び／又はポリペプチドを組み合わせて使用することも本発明の範囲内である。
本発明のナノボディ及びポリペプチドは、１つ又は複数のさらなる薬学的に有効な化合物又は成分と組み合わせて、即ち、相乗効果をもたらすことも又はもたらさないこともある複合治療計画として使用することもできる。この場合でも、臨床医は、上記の因子及び臨床医の専門的判断に基づき、このようなさらなる化合物又は成分、並びに好適な複合治療計画を選択することができる。
特に、本発明のナノボディ及びポリペプチドは、本明細書中に記載の疾患及び障害の予防及び／又は治療に用いられるか又は用いることができる他の薬学的に有効な化合物又は成分と組み合わせて使用してもよく、その結果、相乗効果が得られることも又は得られないこともある。このような化合物及び成分、並びにそれらを投与するための経路、方法及び薬学的製剤又は薬学的組成物は臨床医にとって明らかである。
２つ以上の物質又は成分を複合治療計画の一環として使用する場合、それらは、同様の投与経路を介して又は種々の投与経路を介して、本質的に同じ時間で又は種々の時間で（例えば、本質的に同時に、連続して、又は交互に）投与することができる。物質又は成分を、同様の投与経路を介して同時に投与しようとする場合、当業者にとって明らかであるような、種々の薬学的製剤又は薬学的組成物、又は併せた薬学的製剤又は薬学的組成物の一部として投与してもよい。
また、２つ以上の有効な物質又は成分を複合治療計画の一環として使用しようとする場合、化合物又は成分を単独で使用する場合に用いられるものと同様の量で、また同様の計画に従って、物質又は成分の各々を投与してもよく、このような併用によって、相乗効果がもたらされることも又はもたらされないこともある。しかしながら、２つ以上の有効な物質又は成分の併用によって相乗効果がもたらされる場合には、所望の治療作用を達成すると共に、投与される物質又は成分の１つ、複数又は全ての量を低減することができる可能性がある。これは、例えば所望の薬学的効果又は治療効果を依然として得ると共に、一般的な量で使用される場合の物質又は成分の１つ又は複数の使用に関連するあらゆる望ましくない副作用を回避、制限又は低減するのに有用であり得る。
本発明に従って使用される治療計画の有効性は、臨床医にとって明らかであるように、関与する疾患又は障害についてそれ自体が既知の任意の方法で決定及び／又は追及され得る。臨床医はまた、必要に応じて及びケースバイケースに基づき、特定の治療計画を変更又は改変し、それにより、所望の治療効果を達成し、望ましくない副作用を回避、制限又は低減し、及び／又は一方で所望の治療効果を達成することと、他方で望ましくない副作用を回避、制限又は低減することとの適切な均衡を達成することができる。
概して、所望の治療効果が達成されるまで、及び／又は所望の治療効果を維持する必要がある以上、治療計画は続けられる。また、これは臨床医が決定することができるものである。
別の態様において、本発明は、少なくとも１つのＩＬ−６に関連する障害を予防及び／又は治療するための薬学的組成物の調製における本発明のナノボディ又はポリペプチドの使用に関する。
治療すべき被験者とは、任意の温血動物であり得るが、具体的には哺乳類、より具体的にはヒトである。当業者にとって明らかであるように、治療すべき被験者は、特に本明細書中に記載の疾患及び障害をわずらっているか又はそれらの危険性のあるヒトであり得る。
本発明はまた、本発明のナノボディ又はポリペプチドを患者に投与することによって予防及び／又は治療することができる少なくとも１つの疾患又は障害を予防及び／又は治療するための薬学的組成物の調製における本発明のナノボディ又はポリペプチドの使用に関する。
より具体的には、本発明は、ＩＬ−６に関連する障害を予防及び／又は治療するための、並びに特に本明細書中に列挙した疾患及び障害の１つ又は複数を予防及び治療するための薬学的組成物の調製における本発明のナノボディ又はポリペプチドの使用に関する。
また、このような薬学的組成物では、１つ又は複数の本発明のナノボディ又はポリペプチドを、本明細書中に記載したもの等の１つ又は複数の他の有効な成分と好適に組み合わせてもよい。
最終的に、本発明はＩＬ−６／ＩＬ−６受容体複合体及びｇｐ１３０とのその相互作用に関して本明細書で記載されているが、本発明の概念及び実施の形態は、（例えば両方が循環した、又は一方が循環して、一方が細胞表面上にある）２つのタンパク質が、初めに複合体を形成した後、第３の（即ち細胞表面上の）タンパク質と相互作用し、シグナル伝達経路を活性化する、他のシグナル伝達経路にも適用することができることが想定されている。このようなタンパク質の例は、
ＩＬ−１１及びＩＬ−１１受容体−α（ｇｐ１３０と相互作用する複合体を形成し、ＩＬ−１１シグナル伝達カスケードを誘発する）
ＬＩＦ（白血病阻害因子）及びＬＩＦ受容体−β（ｇｐ１３０と相互作用する複合体を形成し、ＬＩＦシグナル伝達カスケードを誘発する）
ＴＧＦ−β（初めにＩＩ型受容体と結合（膜結合）した後、Ｉ型受容体を補充する（例えばWrana JL, Miner Electrolyte Metab. 1998;24（2-3）: 120-30）を参照されたい））である。
したがって一実施の形態において、本発明は、（本明細書中に記載の）ポリペプチド、特に（本明細書で規定されるように）第１及び第２のタンパク質によって形成される複合体に指向性を有する、及び好ましくはこれに特異的である、少なくとも１つのナノボディを含むか、又は本質的にこれから成るポリペプチドであって、当該複合体が第３のタンパク質と相互作用し、下方のシグナル伝達事象を誘発する、ポリペプチドに関する。
別の実施の形態において本発明は、第１のタンパク質と結合する第１の結合部位と、第２のタンパク質と結合する第２の結合部位とを含む二重特異性ポリペプチドであって、第１のタンパク質及び第２のタンパク質は、第３のタンパク質と相互作用する複合体を形成し、シグナル伝達カスケード又はシグナル伝達事象を誘発する、二重特異性ポリペプチドに関する。
したがって例えば、このようなポリペプチドは、第１のタンパク質によって形成される複合体の一部上のエピトープに指向性を有する少なくとも１つの結合部位（例えば第１のドメイン抗体又はナノボディ）を有し、且つ第２のタンパク質によって形成される複合体の一部上のエピトープに指向性を有する少なくとも１つの結合部位（例えば第２のドメイン抗体又はナノボディ）を有する二重特異性ポリペプチドである可能性があり、これによりポリペプチドは、両方の結合部位を介して複合体と結合することができる。
この実施の形態において、第１の結合部位（即ち結合単位又はナノボディ）は、（本明細書中で規定のように）第１のタンパク質に特異的であるのが好ましく、第２の結合部位（即ち結合単位又はナノボディ）は、（本明細書中で規定のように）第２のタンパク質に特異的であるのが好ましい。
この実施の形態によれば、複合体に対する本発明の二重特異性ポリペプチドの結合活性（以下に規定）は、それぞれ第１及び第２のタンパク質に対するポリペプチドの結合活性よりも（例えば少なくとも２倍超、例えば５倍超若しくはさらに１０倍以上）大きい。
このため、本発明の二重特異性ポリペプチドにおける結合部位／単位は、第１及び第２のタンパク質が複合体へと結び付く際、本発明のポリペプチドによって結合しやすい、それぞれ第１及び第２のタンパク質上のエピトープと結合することができるようなものであるのが最も好ましい。また、本発明のポリペプチドは、第１及び第２のタンパク質が複合体へと結び付く際、それぞれの結合部位／単位が、それぞれの第１及び第２のタンパク質上のその各エピトープと結合することができるようなものであるのが最も好ましい。
上記のタンパク質が、第１及び第２のタンパク質の複合体と結合し、またこのような結合によって当該複合体と第３のタンパク質との相互作用を調節することができる。これに関して、このような調節によって、本発明のポリペプチドが存在しない複合体に比べて、第３のタンパク質に対する複合体の結合親和性の増大（逆もまた同様）、又は第３のタンパク質に対する複合体の結合親和性の低減（逆もまた同様）のいずれかがもたらされる可能性がある。このようなものとして、本発明のポリペプチドは、シグナル伝達、並びに第１のタンパク質、第２のタンパク質、第１及び第２のタンパク質の複合体、及び／又は第３のタンパク質と関連する生物学的機能及び反応に対するアゴニスト効果又は拮抗効果を有し得る。
好ましいが、非限定的な一実施の形態によれば、本発明のポリペプチドの結合によって、第３のタンパク質に対する複合体の結合親和性の低減（逆もまた同様）、及び／又はシグナル伝達、並びに第１のタンパク質、第２のタンパク質、第１及び第２のタンパク質の複合体、及び／又は第３のタンパク質と関連する生物学的機能及び反応に対する拮抗効果がもたらされる。しかし、本明細書中の記載から明らかなように、本発明は最も広義には、これらに限定されず、例えばアゴニスト効果を有するポリペプチドも含む。
好ましいが、非限定的な一実施の形態において、第１のタンパク質はサイトカインである。
第２のタンパク質は、膜結合であり得るか、又は可溶性若しくは両方であり得る。
第３のタンパク質は膜結合しているのが好ましく、例えばこれに限定されないが、第１及び第２のタンパク質によって形成される複合体との相互作用（例えば２分子の複合体との相互作用）によって二量体化し、これによって下方のシグナル伝達事象を誘発する受容体との膜結合タンパク質であり得る。好ましいが、非限定的な第３のタンパク質の例はｇｐ１３０である。
したがって概して、本発明は、第１及び第２のタンパク質によって形成される複合体に指向性を有するポリペプチドを提供し、当該複合体と第３のタンパク質との相互作用を阻害することができるのが好ましく、複合体と第３のタンパク質との相互作用を競合的に阻害することができるのがより好ましい。
本発明は、このようなポリペプチドをコードする核酸に、このようなポリペプチドを調製する方法に、このようなポリペプチドを発現する、又は発現することができる宿主細胞に、このようなポリペプチド、核酸及び／又は宿主細胞を含む組成物、特に薬学的組成物に、及び特に予防目的、治療目的又は診断目的（本明細書で言及する予防目的、治療目的又は診断目的等）のためのこのようなポリペプチド、核酸、宿主細胞及び／又は組成物の使用にも関する。概して上述のものは全て本明細書で規定され得る。
上記の本発明のポリペプチド及びこれを含む薬学的組成物は、第１のタンパク質、第２のタンパク質、第１及び第２のタンパク質の複合体、第３のタンパク質、及び／又はシグナル伝達経路（複数可）及び／又は第１のタンパク質、第２のタンパク質、第１及び第２のタンパク質の複合体、第３のタンパク質が関与する生物学的機能及び反応に関連する疾患及び障害の予防及び／又は治療に使用することができる。
上記の実施の形態に対して有利には、本発明の方法は、（また）ヒトタンパク質に対する（即ちラクダ科動物を好適に免疫付与することによって）ポリペプチド又は結合単位を生じさせるのに使用することができる。
本発明の概念及び実施の形態は、シグナル伝達経路（（例えば循環した、又は細胞表面上にある）タンパク質が最初に、因子、化合物、リガンド、又は他の分子若しくはエンティティとの複合体を形成し、そして、当該複合体が第２の（即ち細胞表面上の）タンパク質と相互作用し、シグナル伝達経路を活性化する）に適用することもできることが想定されている。このようなタンパク質、因子、化合物、リガンド、又は他の分子若しくはエンティティ、これらが形成する複合体、これらの複合体と相互作用するタンパク質、及び上述のものが関与するシグナル伝達経路の例は、当業者に明らかである。
したがって別の実施の形態において、本発明は、（本明細書に記載の）ポリペプチド、特に第１のタンパク質及び因子、化合物、リガンド、又は他の分子若しくはエンティティによって形成される複合体に指向性を有する、好ましくは（本明細書で規定のように）これらに特異的である、少なくとも１つのナノボディを含むか、又は本質的にこれから成るポリペプチドであって、当該複合体は、第２のタンパク質と相互作用し、下方のシグナル伝達事象を誘発する、ポリペプチドに関する。
別の実施の形態において、本発明は、第１のタンパク質と結合する第１の結合部位と、因子、化合物、リガンド、又は他の分子若しくはエンティティと結合する第２の結合部位とを含む二重特異性ポリペプチドであって、第１のタンパク質及び因子、化合物、リガンド、又は他の分子若しくはエンティティが、第２のタンパク質と相互作用する複合体を形成し、シグナル伝達カスケード又はシグナル伝達事象を誘発する、二重特異性ポリペプチドに関する。
したがって例えば、このようなポリペプチドは、第１のタンパク質によって形成される複合体の一部上のエピトープに指向性を有する少なくとも１つの結合部位（例えば第１のドメイン抗体又はナノボディ）を有し、且つ因子、化合物、リガンド、又は他の分子若しくはエンティティによって形成される複合体の一部上のエピトープに対する少なくとも１つの結合部位（例えば第２のドメイン抗体又はナノボディ）を有する二重特異性ポリペプチドである可能性があり、これによりポリペプチドは、両方の結合部位を介して複合体と結合することができる。
この実施の形態において、第１の結合部位（即ち結合単位又はナノボディ）は、（本明細書中で規定のように）第１のタンパク質に特異的であるのが好ましく、第２の結合部位（即ち結合単位又はナノボディ）は、（本明細書中で規定のように）因子、化合物、リガンド、又は他の分子若しくはエンティティに特異的であるのが好ましい。
この実施の形態によれば、複合体に対する本発明の二重特異性ポリペプチドの結合活性（以下に規定）は、それぞれ第１のタンパク質及び因子、化合物、リガンド、又は他の分子若しくはエンティティに対するポリペプチドの結合活性よりも（例えば少なくとも２倍、例えば５倍又はさらに１０倍以上）大きい。
このため、本発明の二重特異性ポリペプチドにおける結合部位／単位は、それぞれ第１及び第２のタンパク質上のエピトープと結合することができるようなものであるのが最も好ましく、第１のタンパク質及び因子、化合物、リガンド、又は他の分子若しくはエンティティが複合体へと結び付いているとき、本発明のポリペプチドによって結合されやすい。また、本発明のポリペプチドは、第１のタンパク質及び因子、化合物、リガンド、又は他の分子若しくはエンティティが複合体へと結び付いているとき、それぞれの結合部位／単位が、それらの上のその各エピトープと結合することができるようなものであるのが最も好ましい。
上記のタンパク質が、第１のタンパク質と、因子、化合物、リガンド、又は他の分子若しくはエンティティとの複合体と結合し、またこのような結合によって当該複合体と第２のタンパク質との相互作用を調節することができる。これに関して、このような調節によって、本発明のポリペプチドが存在しない複合体に比べて、第２のタンパク質に対する複合体の結合親和性の増大（逆もまた同様）、又は第２のタンパク質に対する複合体の結合親和性の低減（逆もまた同様）のいずれかがもたらされる可能性がある。このようなものとして、本発明のポリペプチドは、シグナル伝達、並びに第１のタンパク質、因子、化合物、リガンド、又は他の分子若しくはエンティティ、及び／又は第２のタンパク質と関連する生物学的機能及び反応に対するアゴニスト効果又は拮抗効果を有し得る。
好ましいが、非限定的な一実施の形態によれば、本発明のポリペプチドの結合によって、第２のタンパク質に対する複合体の結合親和性の低減（逆もまた同様）、及び／又はシグナル伝達、並びに第１のタンパク質、因子、化合物、リガンド、又は他の分子、及び／又は第２のタンパク質と関連する生物学的機能及び反応に対する拮抗効果がもたらされる。しかし、本明細書中の記載から明らかなように、本発明は最も広義には、これらに限定されず、例えばアゴニスト効果を有するポリペプチドも含む。
この実施の形態において、因子、化合物、リガンド、又は他の分子は、膜結合、又は可溶性（若しくは両方）であってもよく、例えば第１のタンパク質及び／又は関連のシグナル伝達経路のアゴニスト又はアンタゴニストであり得る。好ましくは、これに限定されないが、因子、化合物、リガンド、又は他の分子は、第２のタンパク質と相互作用する複合体を形成し、それにより（アゴニスト又はアンタゴニストとして）シグナル伝達カスケードを調節するように、自然状態で第１のタンパク質と相互作用する因子、化合物、リガンド、又は他の分子である。したがって、例えばこれに限定されないが、二重特異性ナノボディは、リガンドとその受容体との両方と結合することができ、受容体に対するリガンド媒介性作用を高めるように機能する。リガンドと受容体との架橋は、相互作用の３つの成分間の相互作用の正確な性質、受容体及びリガンドの性質、ナノボディで認識されたエピトープ、それらの相互作用の親和性、並びに２つのナノボディ結合部位間の柔軟性によって異なる結果をもたらし得る。遊離リガンドがこの二重特異性ナノボディによって結合されると、複合体は、受容体に対するより高い全結合活性を得ることができる。ナノボディは受容体と結合することもでき、したがって複合体は、全体的により高い親和性又は特異性でリガンドと結合することができる。間接的にリガンドと受容体とを連結させることによって、受容体に一度結合したリガンドは、受容体との相互作用が喪失したとしても、受容体の近くに維持される。したがって、リガンドは高い効率で再結合し、その生物学的効果を媒介することができる。相互作用の全体的により高い親和性によって、リガンド誘導性の受容体の誘発における機能を得ることができ、より効率的な受容体の脱感作をもたらす可能性もある。
因子、化合物、リガンド、又は他の分子がタンパク質又はポリペプチドである場合、本発明のこの実施の形態は、直前に記載された実施の形態と本質的に同じであることも当業者に明らかである。
したがって概して、本発明は、第１のタンパク質及び因子、化合物、リガンド、又は他の分子によって形成される複合体に指向性を有するポリペプチドを提供し、当該複合体と第２のタンパク質との相互作用を阻害することができるのが好ましく、複合体と第２のタンパク質との相互作用を競合的に阻害することができるのがより好ましい。
本発明は、このようなポリペプチドをコードする核酸に、このようなポリペプチドを調製する方法に、このようなポリペプチドを発現する、又は発現することができる宿主細胞に、このようなポリペプチド、核酸及び／又は宿主細胞を含む組成物、特に薬学的組成物に、及び特に予防目的、治療目的又は診断目的、例えば本明細書で言及する予防目的、治療目的又は診断目的のためのこのようなポリペプチド、核酸、宿主細胞及び／又は組成物の使用にも関する。概して上述のものは全て本明細書で規定され得る。
上記の本発明のポリペプチド及びこれを含む薬学的組成物は、第１のタンパク質、因子、化合物、リガンド、又は他の分子、第１のタンパク質と因子、化合物、リガンド、又は他の分子の複合体、第２のタンパク質、及び／又はシグナル伝達経路（複数可）及び／又は第１のタンパク質、因子、化合物、リガンド、又は他の分子、第１のタンパク質と因子、化合物、リガンド、又は他の分子との複合体、及び／又は第２のタンパク質が関与する生物学的機能及び反応に関連する疾患及び障害の予防及び／又は治療に使用することができる。
上記の実施の形態に対して有利には、本発明の方法は、（また）ヒトの因子、化合物、リガンド、又は他の分子に対する（即ちラクダ科動物を好適に免疫付与することによって）ポリペプチド又は結合単位を生じさせるのに使用することができる。
これより本発明は、以下の非限定的な実施例及び図面によってさらに記載される。
本発明の２つの実施形態によるナノボディ、即ちＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ界面と結合するナノボディ、並びにそれぞれ複合体のＩＬ−６部分及びＩＬ−６Ｒ部分と結合する二重特異性ナノボディの概略図である。
実験部
１）免疫付与
獣医学部の倫理委員会（Ethical Committee of the Faculty of Veterinary Medicine ）（University Ghent, Belgium）の承認を元に、全ての現行の動物福祉規則に従って、ラマにヒトのＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を免疫付与する。免疫付与では、複合体を適切な動物に優しいアジュバントを有するエマルジョンとして配合する（Specoll, CEDI Diagnostics B. V.）。首における二点筋肉内注射によって、抗原を投与する。動物に、１週間の間隔をおいて、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体１００μｇを含有するエマルジョンを２回注射し、続けて抗原５０μｇを含有するエマルジョンを４回注射する。免疫付与中の異なる時点で、血液サンプル１０ｍｌを動物から採取し、血清を調製する。ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体によるＥＬＩＳＡ実験において血清サンプルを用いて、抗原特異的な体液性免疫反応の誘導を確認する。最後の免疫付与の５日後、血液サンプル１５０ｍｌを採取する。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配（Amersham Biosciences）を使用して、血液サンプル１５０ｍｌから、ラマの重鎖免疫グロブリン（ＨｃＡｂ）の遺伝源としての末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を単離し、５×１０８個のＰＢＬを得る。抗体の最大多様性は、ＰＢＬ数の約１０％であるサンプル化したＢリンパ球の数に等しいことが予想される（５×１０７）。ラマにおける重鎖抗体の割合は、最大でＢリンパ球の数の２０％である。したがって、血液サンプル１５０ｍｌにおけるＨｃＡｂの最大多様性は、１０７個の異なる分子として算出する。
２）ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を特異的に認識するナノボディ（登録商標）のレパートリのクローン化
ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と特異的に結合するナノボディ（登録商標）のレパートリのクローン化は、以下に記載の方法を用いて行う。
代替的に、同時係属中の出願である国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０１１８１９号明細書（出願日２００５年１１月４日）に記載のナノクローン（登録商標）法を使用することができる。
「レパートリクローン化（Repertoire cloning）」技法及び「ファージ提示」技法は、例えば欧州特許第０５８９８７７号明細書、米国特許第５，９６９，１０８号明細書、米国特許第６，２４８，５１６号明細書及びReiter et al., 1999に記載されるように、免疫グロブリン配列のクローン化に使用することができる。概して、これらの技法による免疫グロブリン配列（以下で「バインダー」とも称される）の選択及びクローン化は以下の工程を伴う。
ａ）Chomczynski and Sacchi（1987）で記載される方法を用いて細胞から「総」ｍＲＮＡを準備する工程であって、当該細胞（Ｂ細胞等）は、動物由来の全免疫「レパートリ」を発現することができ、当該ｍＲＮＡは当該動物の全免疫レパートリを含有する、
ｂ）オリゴｄ（Ｔ）オリゴヌクレオチド（de Haard et al., 1999）を用いて、ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ、Invitrogen）で上記ｍＲＮＡの外にｃＤＮＡを合成する工程、
ｃ）特異的なプライマー（欧州特許第０３６８６８４号明細書、国際公開第０３／０５４０１６号）を用いて免疫レパートリをコードするヌクレオチド配列を選択的に増幅する工程：第１のＰＣＲでは、リーダー特異的プライマー及びオリゴｄ（Ｔ）プライマーを用いて、従来の抗体遺伝子セグメント（１．６ｋｂ）及び重鎖抗体遺伝子セグメント（１．３ｋｂ）の両方のレパートリを増幅する。アガロースゲル電気泳動によって、得られたＤＮＡ断片を分離する。重鎖抗体セグメントをコードする増幅した１．３ｋｂの断片をアガロースゲルから精製し、ＳｆｉＩ制限部位を含有するＦＲ１特異的プライマーとオリゴｄ（Ｔ）プライマーとを用いたネステッド（nested）ＰＣＲにおける鋳型として使用する。その後、（ＦＲ４で自然発生する）ＳｆｉＩ及びＢｓｔＥＩＩでＰＣＲ産物を消化する。
ｄ）大腸菌等の好適な微生物を用いて、表面上の上記増幅した配列でコードされたバインダーを発現するファージ粒子を調製する工程：ゲル電気泳動後に、約４００塩基対のＤＮＡ断片をゲルから精製し、増幅したＶＨＨレパートリ３３０ｎｇをファージミドベクター１μｇの対応する制限部位にライゲートし、大腸菌ＴＧ１のエレクトロポレーション後のライブラリを得る。ファージミドベクターによって、遺伝子ＩＩＩ産物との融合タンパク質として個々のＶＨＨを発現するファージ粒子を産出することができる。
ｅ）ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と結合することができるバインダー配列を発現するファージ粒子を選択する工程：０ｎＭ〜１ｎＭの様々な濃度のビオチン化ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を、０．１％カゼインと０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０とを含有するＰＢＳ１０μｌ中のファージとインキュベートする。室温で１時間のインキュベートの後、サンプルをマイクロタイタープレートウェルに移し、５μｇ／ｍｌのストレプトアビジンでコーティングした後、室温で３時間、１％カゼインを含有するＰＢＳで遮断する。５分のインキュベートの後、ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１０回、ＰＢＳで１０回洗浄する。１ｍｇ／ｍｌのトリプシンの添加、その後の３７℃で３０分間のインキュベート、又は１００μｇ／ｍｌのｇｐ１３０−Ｆｃ １００μｌの添加、及び４℃で一晩のインキュベートによって、ファージを溶離する。溶離ファージは、指数関数的に増殖するＴＧ１細胞に感染させた後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％グルコースを含有するＬＢ寒天プレート上に平板培養することが可能である。
ｆ）工程ｅ）で選択されたファージ粒子からバインダーコード化配列を再クローン化及び発現する工程：ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に対するバインダーをコードするＤＮＡを好適な発現ベクターに再クローン化した後、エレクトロコンピテント大腸菌細胞に形質転換する。単一コロニーを用いて、２％グルコース及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ中で一晩培養を開始させる。この一晩培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＢ培地で１００倍に希釈し、ＯＤ６００＝０．５までインキュベートする。１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、培養液を３７℃で３時間超、又は２８℃で一晩インキュベートする。４℃、１００００ｒｐｍで２０分間、培養液を遠心分離する。得られたペレットを−２０℃で一晩又は１時間凍結する。次に、ペレットを室温で解凍し、元の培養量の１０分の１のＰＢＳで再懸濁する。４℃、２００００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって、ペリプラズム分画を単離する。ＶＨＨを含有する上清を直接使用するか、又はＮｉ−ＮＴＡに充填して、均一になるまで精製する。減衰係数（extinction coeffecient）に従ってＶＨＨの収率を算出する。
３）ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒを特異的に認識するナノボディ（登録商標）の機能的特徴付け
３ａ）ＥＬＩＳＡにおけるナノボディ（登録商標）と、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体との結合
ＥＬＩＳＡにおけるＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体との結合に関して、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に特異的なナノボディを試験する。したがって、マイクロタイタープレート（Nunc, Maxisorb）を、１μｇ／ｍｌの濃度のヒトＩＬ−６、ヒトＩＬ−６Ｒ又はヒトＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体でコーティングする。プレートを４℃で一晩コーティングする。それから、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＰＢＳ−１％カゼインによって、室温で２時間遮断する。洗浄後、１０μｇ／ｍｌの濃度で開始して、サンプルを適用し、３倍希釈液をＰＢＳ中で作製する。２時間のインキュベート期間の後、プレートを洗浄し、１０００倍希釈のマウスのモノクローナル抗ｍｙｃ抗体を室温で１時間適用する。プレートを洗浄し、１０００倍希釈でポリクローナル抗マウス−ＨＲＰ（DAKO）を室温で１時間適用する。プレートを洗浄し、ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質を適用する。ＯＤ４０５ｎｍを測定する。
３ｂ）ヒトｇｐ１３０タンパク質と、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体との結合阻害
ヒトｇｐ１３０とＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体との相互作用を阻害することができるナノボディをＡｌｐｈａｓｃｒｅｅｎで同定する。このアッセイでは、二重特異性ナノボディを発現する大腸菌細胞から調製したペリプラズム抽出物を、３８４ウェルプレート中でビオチン化したヒトＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と１５分間インキュベートする。その後、ｇｐ１３０−Ｆｃキメラ（R&D Systems）と、コーティングしたプロテインＡアクセプタビーズ（２０μｇ／ｍｌ）との混合液を添加し、３０分間インキュベートする。最後に、ストレプトアビジンコーティングドナービーズ（２０μｇ／ｍｌ）を添加する。１時間のインキュベートの後、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎリーダー（PerkinElmer）でプレートを読み取ることができる。
３ｃ）ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体へのナノボディ（登録商標）結合のＢＩＡＣＯＲＥにおける解析
Ｂｉａｃｏｒｅ３０００機器による表面プラズモン共鳴によって、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体とのナノボディ結合の結合速度及び解離速度を求める。この解析のために、アミンカップリングを介して、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体をＣＭ５センサーチップに共有結合させる。チップの表面をＥＤＣ／ＮＨＳ（０．４Ｍの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド及び０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドの１：１混合水溶液）の注入で活性化させる。５００個の反応単位の増大が得られるまで、活性化チップでＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を送る。過剰な反応基を１Ｍのエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で不活性化する。様々な濃度のナノボディを５分間注入し、チップ上の固定化ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と結合させる。ナノボディのないバッファーを３０分間チップで送り、結合ナノボディを自発的解離させる。様々なナノボディ濃度での結合相及び解離相を用いて、それぞれ個々のナノボディに対するｋｏｎ値及びｋｏｆｆ値をそれぞれ算出する。
３ｄ）他の種由来のナノボディ（登録商標）とＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体との交差反応性
ＥＬＩＳＡによって、異なる種（例えばマウス、ラット、イヌ、ブタ、アカゲザル、ヒヒ及びカニクイザル）由来のＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体との交差反応性に関して、ナノボディ（登録商標）を試験する。したがって、マイクロタイタープレート（Nunc, Maxisorb）を、１μｇ／ｍｌの濃度の対象となる種由来のＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体でコーティングする。プレートを４℃で一晩コーティングする。それから、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＰＢＳ−１％カゼインによって、室温で２時間遮断する。洗浄後、１０μｇ／ｍｌの濃度で開始して、ナノボディサンプルを適用し、３倍希釈液をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で作製する。２時間のインキュベート期間の後、プレートを洗浄し、１０００倍希釈のマウスのモノクローナル抗ｍｙｃ抗体を室温で１時間適用する。プレートを洗浄し、１０００倍希釈でポリクローナル抗マウス−ＨＲＰ（DAKO）を室温で１時間適用する。プレートを洗浄し、ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質を適用する。ＯＤ４０５ｎｍを測定する。
４）免疫付与
獣医学部の倫理委員会（University Ghent, Belgium）の承認を元に、全ての現行の動物福祉規則に従って、ラマにヒトＩＬ−６、ヒトＩＬ−６Ｒ、又はヒトＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体のいずれかを免疫付与する。免疫付与では、サイトカイン又はサイトカイン受容体を適切な動物に優しいアジュバントを有するエマルジョンとして配合する（Specoll, CEDI Diagnostics B. V.）。首における二点筋肉内注射によって、抗原カクテルを投与する。動物に、１週間の間隔をおいて、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体１００μｇを含有するエマルジョンを６回注射する。免疫付与中の異なる時点で、血液サンプル１０ｍｌを動物から採取し、血清を調製する。ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体によるＥＬＩＳＡ実験において血清サンプルを用いて、抗原特異的な体液性免疫反応の誘導を確認する。最後の免疫付与の５日後、血液サンプル１５０ｍｌを採取する。このサンプルから、従来の抗体及び重鎖抗体（ＨｃＡｂ）を分画化し（Lauwereys et al. 1998）、ＥＬＩＳＡにおいて使用し、これによってＨｃＡｂが抗体特異的な体液性免疫反応に関与することを示すことができる。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配（Amersham Biosciences）を使用して、血液サンプル１５０ｍｌから、ラマの重鎖免疫グロブリン（ＨｃＡｂ）の遺伝源としての末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を単離し、５×１０８個のＰＢＬを得る。抗体の最大多様性は、ＰＢＬ数の約１０％であるサンプル化したＢリンパ球の数に等しいことが予想される（５×１０７）。ラマにおける重鎖抗体の割合は、最大でＢリンパ球の数の２０％である。したがって、血液サンプル１５０ｍｌにおけるＨｃＡｂの最大多様性は、１０７個の異なる分子として算出する。
５）ＩＬ−６又はＩＬ−６Ｒを特異的に認識するナノボディ（登録商標）のレパートリのクローン化
ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体のいずれかと特異的に結合するナノボディ（登録商標）のレパートリのクローン化は、以下に記載の２つのうちの１つの方法を用いて行う。
５ａ）ファージ提示法と組合せたレパートリクローン化
「レパートリクローン化」技法及び「ファージ提示」技法は、例えば欧州特許第０５８９８７７号明細書、米国特許第５，９６９，１０８号明細書、米国特許第６，２４８，５１６号明細書及びReiter et al., 1999に記載されるように、免疫グロブリン配列のクローン化に使用することができる。概して、これらの技法による免疫グロブリン配列（以下で「バインダー」とも称される）の選択及びクローン化は以下の工程を伴う。
ａ）Chomczynski and Sacchi（1987）で記載される方法を用いて細胞から「総」ｍＲＮＡを準備する工程であって、当該細胞（Ｂ細胞等）は、動物由来の全免疫「レパートリ」を発現することができ、当該ｍＲＮＡは当該動物の全免疫レパートリを含有する、
ｂ）オリゴｄ（Ｔ）オリゴヌクレオチド（de Haard et al., 1999）を用いて、ＭＭＬＶ逆転写酵素（Invitrogen）で上記ｍＲＮＡの外にｃＤＮＡを合成する工程、
ｃ）特異的なプライマー（欧州特許第０３６８６８４号明細書、国際公開第０３／０５４０１６号）を用いて免疫レパートリをコードするヌクレオチド配列を選択的に増幅する工程：第１のＰＣＲでは、リーダー特異的プライマー（ＡＢＬ００２）及びオリゴｄ（Ｔ）プライマー（ＡＢＬ０１０）を用いて、従来の抗体遺伝子セグメント（１．６ｋｂ）及び重鎖抗体遺伝子セグメント（１．３ｋｂ）の両方のレパートリを増幅する。アガロースゲル電気泳動によって、得られたＤＮＡ断片を分離する。重鎖抗体セグメントをコードする増幅した１．３ｋｂの断片をアガロースゲルから精製し、ＦＲ１プライマー（ＡＢＬ０３７〜ＡＢＬ０４３）とＡＢＬ０１０との混合物を用いたネステッドＰＣＲにおける鋳型として使用する。その後、（ＦＲ１プライマーに導入する）ＳｆｉＩ及び（ＦＲ４で自然発生する）ＢｓｔＥＩＩでＰＣＲ産物を消化する。
ｄ）大腸菌等の好適な微生物を用いて、表面上の上記増幅した配列でコードされたバインダーを発現するファージ粒子を調製する工程：ゲル電気泳動後に、約４００塩基対のＤＮＡ断片をゲルから精製し、増幅したＶＨＨレパートリ３３０ｎｇをファージミドｐＡＸ００４ １μｇの対応する制限部位にライゲートし、大腸菌ＴＧ１のエレクトロポレーション後のライブラリを得る。ｐＡＸ００４によって、遺伝子ＩＩＩ産物との融合タンパク質として個々のＶＨＨを発現するファージ粒子を産出することができる。
ｅ）ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体のいずれかと結合することができるバインダー配列を発現するファージ粒子を選択する工程：マイクロタイタープレートにおけるウェルを２μｇ／ｍｌのＩＬ−６、２μｇ／ｍｌのＩＬ−６Ｒ、又は２μｇ／ｍｌのＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体のいずれかでコーティングして、１％カゼインを含有するＰＢＳで他のウェルをコーティングする。４℃で一晩のインキュベートの後、ウェルを室温で３時間、１％カゼインを含有するＰＢＳで遮断する。ファージ２００μｌをウェルに添加する。室温で２時間のインキュベートの後、ウェルをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１０回、ＰＢＳで１０回洗浄する。室温で一晩溶離を行う。溶離ファージは、指数関数的に増殖するＴＧ１細胞に感染させた後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び２％グルコースを含有するＬＢ寒天プレート上に平板培養する。上記と同じ条件下での２回目のパニングでこの実験を繰り返す。
ｆ）工程ｅ）で選択されたファージ粒子からバインダーコード化配列を単離／クローン化する工程：ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に対するバインダーのためにプラスミドを調製し、ＷＫ６エレクトロコンピテント細胞に形質転換する。単一コロニーを用いて、２％グルコース及び１００ｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ中で一晩培養を開始させる。この一晩培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＴＢ培地３００ｍｌで１００倍に希釈し、ＯＤ６００ｎｍ＝０．５まで３７℃でインキュベートする。１ｍＭのＩＰＴＧを添加し、培養液を３７℃で３時間超、又は２８℃で一晩インキュベートする。４℃、１００００ｒｐｍで２０分間、培養液を遠心分離する。得られたペレットを−２０℃で一晩又は１時間凍結する。次に、ペレットを室温で４０分間解凍し、ＰＢＳ ２０ｍｌで再懸濁して、１時間氷上で振盪する。４℃、２００００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって、ペリプラズム分画を単離する。ＶＨＨを含有する上清をＮｉ−ＮＴＡに充填して、均一になるまで精製する。減衰係数に従ってＶＨＨの収率を算出する。
５ｂ）ナノクローン（登録商標）技術を用いたレパートリのクローン化
この方法は、所望の抗原に対する重鎖抗体を発現するか、又は発現することができる細胞に豊富な細胞サンプル又は細胞集団が、所望の免疫グロブリン配列を生成する開始材料として容易に利用可能であることを利用し、当該方法は以下の工程を含む：
ａ）ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体のいずれかを免疫付与した少なくとも１匹の動物からＢリンパ球を得る工程、
ｂ）上記Ｂリンパ球から、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に対して特異性がある少なくとも１つのＢリンパ球を選択する工程：ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、若しくはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に特異的なＢリンパ球は、試験管、フラスコ、プレート又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、若しくはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体でコーティングした磁気マイクロビーズ（例えばＤｙｎａｌビーズ又はＭＡＣＳ）でＢリンパ球をパニングすることによって得ることができる。Ｂ細胞結合部分（抗ＣＤ１９又は抗ＣＤ４５等）と、免疫グロブリン結合部分（抗ラマ免疫グロブリンＦｃ）とから成る親和性マトリクスを介して、分泌された免疫グロブリンを元となるＢ細胞の細胞膜上に捕捉する。
ｃ）工程（ｂ）で選択された少なくとも１つのＢリンパ球から核酸を得る工程であって、当該核酸は、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、若しくはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に対する上記免疫グロブリンをコードするか、又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、若しくはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有する当該免疫グロブリンの少なくとも一部をコードする、核酸を得る工程：ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に特異的なＢリンパ球からＲＮＡを単離する。ＲＮＡを単離する方法は当該技術分野で既知であり、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen）及びＧｏｕｇｈ法（Gough, 1988）が挙げられる。その後、単離したｍＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを合成し、一本鎖ｃＤＮＡから二本鎖ＤＮＡを調製する。ｃＤＮＡ及び二本鎖ＤＮＡの調製方法は当該技術分野で既知である。
ｄ）ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、若しくはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に対する上記免疫グロブリンをコードするか、又はＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、若しくはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有する当該免疫グロブリンの少なくとも一部をコードする、増幅及び／又はクローン化した核酸を得るように当該核酸を増幅及び／又はクローン化する工程：オリゴ−ｄＴ配列を有するユニバーサル３’末端プライマーとフレームワーク特異的５’末端プライマー（ＦＲ１）とを使用して、増幅を行う。一般的にヒト又は他の哺乳動物由来の抗体のＦＲ４領域の３’末端近くに存在するとして、特有の制限部位ＢｓｔＥＩＩが見出される。このような制限部位によって、３’末端プライマーにおいて制限部位がなくとも増幅したナノボディ遺伝子をクローン化することができる。遺伝子を得たら、好ましくは保存用に抗原特異的ナノボディ遺伝子の安定したコレクションを得るために、発現不可能なベクターに増幅したＤＮＡをクローン化してもよい。このような非発現ベクターは当該技術分野で既知である。単一ナノボディ（登録商標）遺伝子の発現が要求される場合、上述のコレクションから、ナノボディ（登録商標）遺伝子を含む単一の非発現ベクターを分離し、ここでナノボディ（登録商標）遺伝子を発現ベクターに移す。このような工程を行う手段及びそのためのベクターは、当該技術分野で既知である。
６）ヒトＩＬ−６を認識する第１のナノボディ（登録商標）と、ヒトＩＬ−６Ｒを認識する第２のナノボディ（登録商標）とを含む、ヒトＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を認識する二重特異性免疫グロブリン配列の構築
非発現／発現ベクター系等のリコンビナーゼシステムによって、遺伝子を発現する個々のナノボディ（登録商標）の転写を二重特異性フォーマットで行うことができる。二重特異性免疫グロブリン配列の調製の詳細な説明に関しては、Conrath et al.（2001）、並びに例えば国際公開第９６／３４１０３号及び国際公開第９９／２３２２１号をさらに参照する。
７）ヒトＩＬ−６を認識する第１のナノボディ（登録商標）と、ヒトＩＬ−６Ｒを認識する第２のナノボディ（登録商標）とを含む、ヒトＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を認識する二重特異性免疫グロブリン配列の機能的特徴付け
７ａ）ＥＬＩＳＡにおける二重特異性免疫グロブリン配列と、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体との結合
ＥＬＩＳＡにおけるＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、又はＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体との結合に関して、二重特異性免疫グロブリン配列を試験する。したがって、マイクロタイタープレート（Nunc, Maxisorb）を、２００倍希釈のヒトＩＬ−６、ヒトＩＬ−６Ｒ又はヒトＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体でコーティングし、３７℃で１５分間予熱する。プレートを４℃で一晩コーティングする。それから、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＰＢＳ−１％カゼインによって、室温で２時間遮断する。洗浄後、１０μｇ／ｍｌの濃度で開始して、サンプルを適用し、３倍希釈液をＰＢＳ中で作製する。２時間のインキュベート期間の後、プレートを洗浄し、１０００倍希釈のマウスのモノクローナル抗ｍｙｃ抗体を室温で１時間適用する。プレートを洗浄し、１０００倍希釈でポリクローナル抗マウス−ＨＲＰ（DAKO）を室温で１時間適用する。プレートを洗浄し、ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質を適用する。ＯＤ４０５ｎｍを測定する。ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有するポリペプチドの配列を表Ｂ−１に示す。
７ｂ）ヒトｇｐ１３０タンパク質と、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体との結合阻害
Ｔｈｅｒｍａｎｏｘカバースリップ（Nunc）を８０％エタノールで一晩浸漬し、蒸留水及び空気乾燥で十分に洗い流す。ヒトＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を０．０５ｍｏｌ／ｌの酢酸に溶解させ、レタッチエアーブラシによって３０μｇ／ｃｍ２の最終濃度でカバースリップ上に噴霧する。噴霧後、室温で少なくとも１時間、カバースリップを１％ヒトアルブミンのＰＢＳ溶液で遮断する。それから、２μｇ／ｍｌのナノボディを添加して又は添加せずに、ｇｐ１３０タンパク質を５分間インキュベートする。その後、カバースリップをＨｅｐｅｓ緩衝生理食塩水（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１５０ｍＭのＮａＣＬ（ｐＨ７．４））中で洗い流し、ＰＢＳ中の０．５％グルタルアルデヒドで固定し、メタノールで脱水して、Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ及びＧｉｅｍｓａ（Riedel de Haen）で染色する。ｇｐ１３０タンパク質とＩＬ−６／ＩＬ−６受容体複合体との結合を上記のように測定した。
７ｃ）ＢＩＡＣＯＲＥにおける同種ナノボディ（登録商標）とＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体との結合の解析
或る特定のアミノ酸差異を含むラマから、ｇｐ１３０タンパク質とＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体との結合を阻害するナノボディ（登録商標）の同種配列を得る。アミンカップリングを介して、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体をセンサーチップ表面に共有結合させる。チップのＣＭ５表面をＥＤＣ／ＮＨＳ（０．４Ｍの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド及び０．１ＭのＮ−ヒドロキシスクシンイミドの１：１混合水溶液）の注入で７分間活性化させる。活性化したら、６０００個の反応単位の増大が検出されるまで、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を注入する。過剰な反応基を１Ｍのエタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で７分間不活性化する。固定化手法の間、流速を５μｌ／分で一定に維持する。溶離バッファーは、０．１５ＭのＮａＣｌと、３ｍＭのＥＤＴＡと、０．００５％ ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０とを有する０．０１ＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）である。急性事象の治療のために、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体の迅速な阻害が非常に重要であり、このため迅速な結合速度が好ましい。結合速度によって、ナノボディが、ヒト又は動物に注入される際にその標的（ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体）とどれくらい迅速に結合するかが求められる。
７ｄ）高温でのナノボディ安定性
２００μｇ／ｍｌの濃度でのナノボディのＰＢＳストック溶液を調製し、幾つかの試験管に分ける。それから、ナノボディの入ったそれぞれの試験管を異なる温度で１時間インキュベートし、室温で２時間冷まし、４℃に一晩置く。次の日、サンプルを１３０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、ＯＤ２８０ｎｍで上清を試験する。分光光度法で上清の濃度を測定し、室温での濃度のパーセントで表す。また４ａ段落で上記のように、ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体との結合に関して、ＥＬＩＳＡで上清を試験する。
７ｅ）ナノボディと、他の種由来のＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体との交差反応性
マイクロタイタープレートを４℃で一晩、１０００倍希釈でマウス抗ｍｙｃでコーティングする。それから、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＰＢＳ−１％カゼインによって、室温で２時間遮断する。洗浄後、１０μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ中にナノボディを適用する。１時間のインキュベート期間の後、プレートを洗浄し、（イヌ、ブタ、ヒト、ヒヒ及びカニクイザル由来の）ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体を好適な濃度で適用する。プレートを室温で１時間インキュベートする。プレートを洗浄し、２０００倍希釈でポリクローナル抗ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体−ＨＲＰ（DAKO）を室温で１時間適用する。プレートを洗浄し、ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２基質を適用する。ＯＤ４０５ｎｍを測定する。
７ｆ）ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に特異的なナノボディのヒト化
ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と特異的に結合するナノボディのヒト化は、ラクダ種の重鎖抗体の可変ドメインに特異的な或る特定のアミノ酸残基を、従来のヒト抗体の可変ドメインに特異的なアミノ酸残基に置き換えることによって達成することができる。ヒト化方法は当該技術分野で既知である。

Claims (32)

  1. ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有するポリペプチド。
  2. ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に特異的である、及び／又は、ＩＬ−６単独及び／又はＩＬ−６Ｒ単独それぞれと結合するのに比べて、より高い結合力でＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と結合する、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有し、且つ好ましくはＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に特異的である、少なくとも１つの結合単位又はその断片を含む又はそれから本質的に成る、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
  4. （ａ）ＩＬ−６に指向性を有し、且つ好ましくはＩＬ−６に特異的である、少なくとも１つの結合単位又はその断片
    及び、
    （ｂ）ＩＬ−６Ｒに指向性を有し、且つ好ましくはＩＬ−６Ｒに特異的である、少なくとも１つの結合単位又はその断片
    を含む、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
  5. 得られたポリペプチドが、ＩＬ−６単独及び／又はＩＬ−６Ｒ単独それぞれと結合するのに比べて、より高い結合力でＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体と結合するように、ＩＬ−６に指向性を有する（及び好ましくはＩＬ−６に特異的である）少なくとも１つの結合単位又はその断片と、ＩＬ−６Ｒに指向性を有する（及び好ましくはＩＬ−６Ｒに特異的である）少なくとも１つの結合単位又はその断片とを含む、請求項４に記載のポリペプチド。
  6. ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体とｇｐ１３０タンパク質との相互作用を阻害することが可能である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  7. ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体とｇｐ１３０タンパク質との相互作用を競合的に阻害することが可能である、請求項６に記載のポリペプチド。
  8. 前記少なくとも１つの結合単位が、免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  9. 前記少なくとも１つの結合単位が、抗体である、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  10. 前記少なくとも１つの結合単位が、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ'）断片、Ｆ（ａｂ'２）断片、Ｆｖ断片、又はｓｃＦｖ断片等の抗体断片である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  11. 前記少なくとも１つの結合単位が、ＶＨドメイン又はＶＬドメイン等の免疫グロブリン可変ドメインである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  12. 前記少なくとも１つの結合単位が、（単一）ドメイン抗体（(s)dAb）である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  13. 前記少なくとも１つの結合単位が、ナノボディ（登録商標）である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  14. 前記少なくとも１つの結合単位又はその断片が、哺乳動物のＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有する、請求項３に記載のポリペプチド。
  15. 前記少なくとも１つの結合単位又はその断片が、ヒトのＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ複合体に指向性を有する、請求項３に記載のポリペプチド。
  16. （ａ）前記少なくとも１つの結合単位又はその断片が、哺乳動物のＩＬ−６に指向性を有し、且つ
    （ｂ）前記少なくとも１つの結合単位又はその断片が、哺乳動物のＩＬ−６Ｒに指向性を有する、請求項４に記載のポリペプチド。
  17. （ａ）前記少なくとも１つの結合単位又はその断片が、ヒトのＩＬ−６に指向性を有し、且つ
    （ｂ）前記少なくとも１つの結合単位又はその断片が、ヒトのＩＬ−６Ｒに指向性を有する、請求項４に記載のポリペプチド。
  18. 前記ナノボディ（登録商標）が、４つのフレームワーク領域（それぞれ、ＦＲ１〜ＦＲ４）と、３つの相補性決定領域（それぞれ、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）とから成る、請求項１３に記載のポリペプチド。
  19. 少なくとも１つのナノボディ（登録商標）又はその断片が、ヒト化ナノボディ（登録商標）又はその断片である、請求項１３又は１８に記載のポリペプチド。
  20. 少なくとも１つのナノボディ（登録商標）又はその断片の１つ又は複数のアミノ酸が、実質的に抗原結合能を変えることなく置換されている、請求項１３、１８又は１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  21. ナノボディ（登録商標）又はその断片の数が少なくとも２である、請求項１３、１８又は１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  22. ｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドの半減期の改善に関連する少なくとも１つのポリペプチドをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  23. 前記ｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドの半減期の改善に関連する少なくとも１つのポリペプチドが、血清タンパク質に指向性を有するポリペプチドである、請求項２２に記載のポリペプチド。
  24. 前記ｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドの半減期の改善に関連する少なくとも１つのポリペプチドが、血清アルブミン、血清免疫グロブリン、チロキシン結合タンパク質、トランスフェリン又はフィブリノゲンに指向性を有するポリペプチドである、請求項２３に記載のポリペプチド。
  25. ペグ化されている請求項１〜２４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
  26. 請求項１〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
  27. 請求項１〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチド、及び／又は請求項２６に記載の核酸を含む組成物。
  28. 少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を、任意で含む薬学的組成物である、請求項２７に記載の組成物。
  29. ＩＬ−６及び／又はＩＬ−６Ｒに関連する障害又は疾患の予防及び／又は治療のための請求項１〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項２６に記載の核酸、又は請求項２７若しくは２８に記載の組成物。
  30. ＩＬ−６及び／又はＩＬ−６Ｒに関連する障害又は疾患の予防及び／又は治療用の医薬の調製のための請求項１〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項２６に記載の核酸の使用。
  31. 以下を含む請求項１〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造する方法。
    （ｂ）請求項１〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸を含むか、又は該ポリペプチドを発現させる条件下で、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチドを発現することが可能である、宿主細胞を培養すること、
    （ｃ）製造したポリペプチドを培養液から回収すること、及び
    （ｄ）任意で、該ポリペプチドをペグ化すること
  32. 前記宿主細胞が細菌細胞又は酵母細胞である、請求項３１に記載の方法。
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