RU2794974C2

RU2794974C2 - СВЯЗЫВАЮЩИЙ TNF-α ПОЛИПЕПТИД И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ СВЯЗАННЫХ С TNF-α ЗАБОЛЕВАНИЙ

Info

Publication number: RU2794974C2
Application number: RU2017133794A
Authority: RU
Inventors: Эльс БАЙНАЭРТ
Original assignee: Аблинкс Н.В.
Priority date: 2005-05-18
Filing date: 2017-09-28
Publication date: 2023-04-26

Abstract

Группа изобретений относится к иммунологии и биотехнологии. Предложены способы для лечения болезни, связанной с фактором некроза опухоли α (TNF-α), включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества полипептида, содержащего вариабельную область иммуноглобулина, которая специфически связывается с эпитопом TNF-α. При этом связывающий TNF-α полипептид специфически связывает эпитоп TNF-α с K_D менее чем 500 нМ, имеет значение EC50 в клеточном анализе с использованием клеток KYM, которое лучше 5 нМ. Также предложено применение эпитопа TNF-α для отбора или получения полипептида, который предназначен для применения в способе и фармацевтической композиции для лечения болезни, связанной TNF-α. 5 н. и 41 з.п. ф-лы, 62 ил., 50 табл., 65 пр.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к улучшенным нанотелам (Nanobodies™) против фактора некроза опухоли (TNF-альфа), а также к полипептидам, содержащим или по существу состоящим из одного или более таких нанотел. [Примечание: Nanobody™, Nanobodies™ и Nanoclone™ являются товарными знаками от Ablynx N.V.]

Также, изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим такие нанотела и полипептиды; к способам приготовления таких нанотел и полипептидов; к клеткам-хозяевам, экспрессирующих или способных к экспрессии таких нанотел или полипептидов; к композициям, содержащим такие нанотела, полипептиды, нуклеиновые кислоты или клетки-хозяева; и к применениям таких нанотел, таких полипептидов, таких нуклеиновых кислот, таких клеток-хозяев или таких композиций, а именно, в профилактических, терапевтических и диагностических целях, таких как профилактические, терапевтические и диагностические цели, приведенные ниже.

Другие аспекты, воплощения, преимущества и применения изобретения станут понятны из дальнейшего описания, приведенного ниже.

Уровень техники

WO 04/041862 заявителя относится к нанотелам против TNF-альфа и к их приготовлению и применению, в частности, для профилактики и/или лечения заболеваний и нарушений, связанных с и/или опосредованных TNF-альфа, таких как воспаление, ревматоидный артрит, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, воспалительные заболевания кишечника, рассеянный склероз, болезнь Аддисона, аутоиммунный гепатит, аутоиммунный паротит, диабет 1 типа, эпидидимит, гломерулонефрит, болезнь Грейвса, синдром Гийена–Барре, тиреоидит Хашимото, гемолитическая анемия, системная красная волчанка, мужское бесплодие, множественный склероз, злокачественная миастения, пузырчатка, псориаз, ревматический полиартрит, ревматоидный артрит, саркоидоз, склеродермия, Синдром Шегрена, спондилоартропатия, тиреоидит и васкулит.

Анти-TNF нанотела в соответствии с WO 04/041862 могут быть гуманизированными и могут быть одновалентными или поливалентными, последние из которых приводят к повышенному сродству к TNF. Анти-TNF Nanobodies™ по WO 04/041862 могут также быть мультиспецифичными, и могут, в частности, быть представлены в форме мультиспецифичной конструкции, содержащей два или более нанотел против TNF и дополнительно нанотело, направленное против сывороточного белка, такого как сывороточный альбумин человека, который приводит к удлинению времени полужизни in vivo.

WO 04/041862 также относится к способам приготовления анти-TNF нанотел, к нуклеиновым кислотам или конструкциям, кодирующим анти-TNF нанотела, а также к фармацевтическим композициям, содержащим анти-TNF нанотела, которые могут быть пригодными для внутривенного, подкожного, перорального, сублингвального, топического, назального, вагинального или ректального применения или для применения путем ингаляционного введения. Анти-TNF нанотела согласно WO 04/041862 могут также применяться для диагностических целей, необязательно в виде комплекса.

EP 0 486 526 описывает связывающие TNF-альфа-лиганды против специфичного эпитопа TNF. Среды связывающих лигандов упоминаются однодоменные антитела (“dAbs”).

Reiter et al., J. Mol. Biol. (1999), 290, 685-698, описывают однодоменные антитела против TNF-альфа, полученные из рандомизированной фаговой дисплейной библиотеки, которая создавалась начиная с домена VH, происходящего из мышиной гибридомы.

WO 00/29004 описывает мышиные однодоменные антитела (“микротела”) против TNF-альфа.

WO 04/003019 в частности описывает лиганды. Содержащие первый связывающий домен против TNF-альфа и второй связывающий домен против сывороточного белка, такого как сывороточный альбумин.

Раскрытие изобретения

Основная цель настоящего изобретения состоит в обеспечении нанотел против TNF-альфа, в частности против TNF-альфа человека.

В особенности, цель настоящего изобретения заключается в обеспечении нанотел против TNF-альфа, а именно, против TNF-альфа человека, и в обеспечении белков или полипептидов, содержащих такие нанотела, которые пригодны для терапевтического и/или диагностического применения, и, в частности, для профилактики, лечения и/или диагностики одного или более заболеваний или нарушений, связанных с и/или опосредованных TNF-альфа, которые упоминались выше, и/или которые могут применяться для приготовления фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения одного или более заболеваний, связанных с и/или опосредованных TNF-альфа, которые указаны выше.

Кроме того, цель настоящего изобретения заключается в обеспечении нанотел против TNF-альфа, и в обеспечении белков или полипептидов, содержащих такие нанотела, при этом каждый альтернативен нанотелам и полипептидам против TNF-альфа, описанным в WO 04/041862, и/или которые имеют одно или более улучшенных свойств или характеристик, по сравнению с нанотелами и полипептидами против TNF-альфа, описанными в WO 04/041862.

Более того, целью настоящего изобретения является обеспечение нанотел против TNF-альфа, и обеспечение белков или полипептидов, содержащих такие нанотела, которые усовершенствованы, по сравнению с нанотелами и полипептидами против TNF-альфа, описанными в WO 04/041862, в отношении одного или более из следующих свойств или характеристик:

- повышенное сродство к TNF-альфа, или в моновалентной форме, в мультивалентной форме (например, в бивалентной форме) и/или в мультиспецифичной форме (например, одна из мультиспецифичных форм, описанная в WO 04/041862 или приведенная ниже);

- лучшая пригодность для форматирования в мультивалентный формат (например, для бивалентного формата);

- лучшая пригодность для форматирования в мультиспецифичный формат (например, один из мультиспецифичных форматов, описанных в WO 04/041862 или приведенных ниже);

- повышенная пригодность или предрасположенность для “гуманизированных” замещений (как определено здесь); и/или

- меньшая иммуногенность, либо в моновалентном формате, в мультивалентном формате (например, в бивалентном формате) и/или в мультиспецифичном формате (например, один из мультиспецифичных форматов, описанных в WO 04/041862 или приведенных ниже) в моновалентом формате;

- повышенная стабильность, или в моновалентном формате, в мультивалентном формате (например, в бивалентном формате) и/или в мультиспецифичном формате (например, один из мультиспецифичных форматов, описанных в WO 04/041862 или приведенных ниже) в моновалентом формате;

- повышенная специфичность по отношению к TNF-альфа, или в моновалентном формате, в мультивалентном формате (например, в бивалентном формате) и/или в мультиспецифичном формате (например, один из мультиспецифичных форматов, описанных в WO 04/041862 или приведенных ниже) в моновалентом формате;

- сниженная или при необходимости повышенная перекрёстная реактивность с TNF-альфа из различных видов;

и/или

- одно или более других свойств, подходящих для фармацевтического применения (включая профилактическое применение и/или терапевтическое применение) и/или для диагностического применения (включая, но не ограничиваясь, применение для изображаемых целей), или в моновалентном формате, в мультивалентном формате (например, в бивалентном формате) и/или в мультиспецифичном формате (например, один из мультиспецифичных форматов, описанных в WO 04/041862 или приведенных ниже).

Данные цели достигаются с помощью нанотел, белков и полипептидов, описанных в данном документе. Эти нанотела также обозначаются здесь как “Нанотела изобретения”; и эти белки и полипептиды также в совокупности обозначаются здесь “полипептиды изобретения”.

Поскольку нанотела и полипептиды, описываемые здесь, главным образом предназначаются для терапевтического и/или диагностического применения, они направлены против (как определено здесь) человеческого TNF-альфа. Однако не исключается (но также и не является желаемым), что нанотела и полипептиды, описываемые здесь, демонстрируют перекрестную реактивность с TNF-альфа от одного или более других видов теплокровных животных, например, с TNF-альфа от одного или более других видов приматов и/или с TNF-альфа от одного или более других видов животных, которые часто применяются в экспериментальных моделях болезней (например, мышь, крыса, кролик, свинья или собака), и, в особенности, в экспериментальных моделях болезней и нарушений, связанных с TNF-альфа (такие как экспериментальные модели на видах и животных, указанные в данном документе). В связи с этим, для специалиста в данной области является ясным, что такая перекрестная реактивность, при наличии, может иметь преимущества от усовершенствования лекарственного средства, поскольку обеспечиваются нанотела и полипептиды против человеческого TNF-альфа, которые тестируются в таких моделях заболеваний.

Настоящее изобретение в его широком понимании также не ограничивается или характеризуется специфичной антигенной детерминантой, эпитопом, частью, доменом, субъединицей или конфирмацией (где применимо) TNF-альфа, против которого направлены нанотела и полипептиды изобретения.

Однако, в предпочтительном воплощении, нанотела, белки или полипептиды, описываемые здесь, направлены против и/или могут связываться с эпитопом TNF-альфа, который находится в и/или является частью сайта(ов) связывания с TNF-рецепторами (напр., сайты связывания для TNF-RI, THF-RII, также известные как p55 или p75). Из уровня техники хорошо известно, что тример TNF содержит три сайта связывания с рецепторами, которые по существу эквивалентны и которые образованы с помощью/на стыке двух мономеров TNF с тримером TNF. Например, нанотела, белки или полипептиды, описываемые здесь, предпочтительно направлены против и/или могут связываться с эпитопом TNF-альфа, который содержит следующие аминокислотные остатки TNF-альфа: Gln в положении 88, Lys в положении 90 и/или Glu в положении 146.

В частности, нанотела, белки или полипептиды, описываемые здесь, направлены против и/или могут связываться с эпитомом тримера TNF-альфа, который находится в и/или является частью сайта(ов) связывания с TNF-рецепторами. Например, нанотела, белки или полипептиды, описываемые здесь, могут быть направлены против и/или могут связываться с эпитопом тримера TNF-альфа, который содержит следующие аминокислотные остатки: Gln в положении 88 и Lys в положении 90 в первом мономере TNF (обозначаемый здесь как “мономер A”), и Glu в положении 146 во втором мономере TNF (обозначаемый здесь как “мономер B”) (в котором Мономер A и Мономер B совместно, в тримере TNF, из сайта(ов) связывания с TNF-рецепторами).

Более того, нанотела, белки или полипептиды, описываемые здесь, могут быть направлены против и/или могут связываться с эпитопом тримера TNF-альфа, который содержит вышеуказанные аминокислоты (Gln в положении 88 в мономере A; Lys в положении 90 в мономере A и Glu в положении 146 в мономере B), и в дополнении, по меньшей мере, один, предпочтительно два или более, более предпочтительно 5 или более, и предпочтительно все или по существу все, из следующих аминокислотных остатков мономера A TNF-альфа: Gly в положении 24, Gln в положении 25, Thr в положении 72, His в положении 73, Val в положении 74, Leu в положении 75, Thr в положении 77, Thr в положении 79, Ile в положении 83, Thr в положении 89, Val в положении 91. Asn в положении 92, Ile в положении 97, Arg в положении 131, Glu в положении 135, Ile в положении 136, Asn в положении 137, Arg в положении 138, Pro в положении 139, Asp в положении 140 и следующие остатки в мономере B: Pro в положении 20, Arg в положении 32, Lys в положении 65, Lys в положении 112, Tyr в положении 115, Ala в положении 145, Ser в положении 147.

Альтернативно, нанотела, белки или полипептиды, описываемые здесь, могут быть направлены против и/или могут связываться с эпитопом TNF-альфа, который содержит вышеуказанные аминокислоты (Gln в положении 88 в мономере A; Lys в положении 90 в мономере A и Glu в положении 146 в мономере B), и в дополнении, по меньшей мере, один, предпочтительно два или более, более предпочтительно 5 или более, и предпочтительно все или по существу все, из следующих аминокислотных остатков TNF-альфа мономера A: Leu в положении 75, Thr в положении 77, Thr в положении 79, Ile в положении 80, Ser в положении 81, Tyr в положении 87, Thr в положении 89, Val в положении 91, Asn в положении 92, Ser в положении 95, Ile в положении 97, Glu в положении 135, Ile в положении 136, Asn в положении 137 и следующие остатки в мономере B: Ala в положении 33, Ala в положении 145, Ser в положении 147.

Такой эпитоп может определяться при помощи структурного анализа нанотела, кристаллизованного в комплексе с молекулой TNF, или при помощи других способов, таких как картирование эпитопов посредством метода Рepscan.

Для сравнения необходимо отметить, что на основании данных кристаллографии (не показаны), можно увидеть, что нанотело 3E из WO 04/041862 связывается с другим эпитопом (т.е. эпитопом, содержащим Tyr в положении 141, Asp в положении 140, Gln в положении 67, Gly в положении 24 и Glu в положении 23), чем предпочтительный эпитоп изобретения.

Таким образом, в другом аспекте, настоящее изобретение относится к вариабельному домену иммуноглобулина (или его пригодного фрагмента), который может связываться с эпитопом TNF-альфа, который находится в и/или является частью сайта связывания с TNF-рецепторами, и предпочтительно с эпитопом, который содержит, по меньшей мере, один, предпочтительно два или более, и предпочтительно все из следующих аминокислотных остатков TNF-альфа: Gln в положении 88; Lys в положении 90 и Glu в положении 146. Такой вариабельный домен иммуноглобулина предпочтительно представляет собой вариабельный домен тяжелой цепи или вариабельный домен легкой цепи, и, в частности, вариабельный домен тяжелой цепи, который может являться любым вариабельным доменом тяжелой цепи млекопитающих, включая, но не ограничиваясь, вариабельные домены тяжелой цепи иммуноглобулина человека, вариабельные домены тяжелой цепи мыши и вариабельные домены тяжелой цепи Camelid (такие как вариабельные домены тяжелой цепи из четырехцепочечных иммуноглобулинов Camelid или вариабельные домены тяжелой цепи (VHH домены) от так называемых антител тяжелой цепи). Вариабельный домен иммуноглобулина предпочтительно представляет собой доменное антитело или монодоменное антитело или пригоден для применения в качестве (моно) доменного антитела. Наиболее предпочтительно, вариабельный домен иммуноглобулина представляет собой нанотело (как здесь определено), и особенно предпочтительными, но не ограничивающими примерами нанотел, которые пригодны для применения в данном аспекте изобретения, являются PMP1C2 (TNF1, SEQ ID NO:52) и PMP5F10 (TNF3, SEQ ID NO: 60), а также гуманизированные и другие их варианты (что в дальнейшем здесь описывается).

Также, вышеуказанный вариабельный домен иммуноглобулина может быть гуманизированным (как например и без ограничений), описываемый здесь, в отношении нанотел. Изобретение также относится к белкам и полипептидам, которые содержат или по существу состоят из таких вариабельных доменов иммуноглобулинов, которые могут, например, представлять собой те, которые as здесь описываются. Альтернативно, такие вариабельные домены могут являться частью конструкций ScFv, биспецифичных конструкций, химерного антитела или структур антитела и других иммуноглобулиновых конструкций, которые, например, рассмотрены Hoogenboom (Nature Biotechnology (1997), 15:125-126). Предпочтительно, однако, чтобы вариабельные домены иммуноглобулинов, направленные против указанного эпитопа, представляли нанотела, при этом белки и полипептиды, содержащие такие нанотела, могут быть такими, как далее описывается.

Таким образом, некоторые предпочтительные аспекты изобретения относятся к:

- Нанотелу, которое направлено против того же эпитопа на тримере TNF-альфа, что и нанотело TNF1 (SEQ ID NO: 52).

- Нанотелу, которое направлено против того же эпитопа на тримере TNF-альфа, что и нанотело TNF3 (SEQ ID NO: 60).

- Нанотелу, которое направлено против того же эпитопа на тримере TNF-альфа, которое, по меньшей мере, содержит следующие аминокислотные остатки: Gln в положении 88 в мономере A; Lys в положении 90 в мономере A и Glu в положении 146 в мономере B.

- Нанотелу, которое направлено против того же эпитопа на тримере TNF-альфа, которое содержит следующие аминокислотные остатки: Gln в положении 88 в мономере A; Lys в положении 90 в мономере A и Glu в положении 146 в мономере B; и которое дополнительно содержит, по меньшей мере, содержит, по меньшей мере, один, предпочтительно два или более, более предпочтительно 5 или более, и предпочтительно все или по существу все, из следующих аминокислотных остатков TNF-альфа мономера A: Gly в положении 24, Gln в положении 25, Thr в положении 72, His в положении 73, Val в положении 74, Leu в положении 75, Thr в положении 77, Thr в положении 79, Ile в положении 83, Thr в положении 89, Val в положении 91, Asn в положении 92, Ile в положении 97, Arg в положении 131, Glu в положении 135, Ile в положении 136, Asn в положении 137, Arg в положении 138, Pro в положении 139, Asp в положении 140 и следующие остатки в мономере B: Pro в положении 20, Arg в положении 32, Lys в положении 65, Lys в положении 112, Tyr в положении 115, Ala в положении 145, Ser в положении 147.

- Нанотелу, которое направлено против того же эпитопа на тримере TNF-альфа, которое содержит следующие аминокислотные остатки: Gln в положении 88 в мономере A; Lys в положении 90 в мономере A и Glu в положении 146 в мономере B; и которое дополнительно содержит, по меньшей мере, один, предпочтительно два или более, более предпочтительно 5 или более, и предпочтительно все или по существу все, из следующих аминокислотных остатков TNF-альфа мономера A: Leu в положении 75, Thr в положении 77, Thr в положении 79, Ile в положении 80, Ser в положении 81, Tyr в положении 87, Thr в положении 89, Val в положении 91, Asn в положении 92, Ser в положении 95, Ile в положении 97, Glu в положении 135, Ile в положении 136, Asn в положении 137 и следующие остатки в мономере B: Ala в положении 33, Ala в положении 145, Ser в положении 147.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), которое имеет значение K_off (константы диссоциации) для TNF более чем 2⋅10^-3(1/с), предпочтительно более чем 1⋅10^-3.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), которое имеет значение EC50 по клеточному анализу при использовании KYM-клеток, описанных в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое больше чем значение EC50 для нанотела VHH 3E (SEQ ID NO:4) из WO 04/041862 по аналогичному анализу; или гуманизированный вариант такого нанотела.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), которое имеет значение EC50 по клеточному анализу при использовании KYM-клеток, описанных в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше чем 12 нM; или гуманизированный вариант такого нанотела.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), которое имеет значение EC50 по клеточному анализу при использовании KYM-клеток, описанных в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше чем 5нM; или гуманизированный вариант такого нанотела.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), которое имеет значение EC50 по клеточному анализу при использовании KYM-клеток, описанных в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше чем 3нM; или гуманизированный вариант такого нанотела.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), которое представляет собой гуманизированное нанотело.

И некоторые предпочтительные аспекты этого воплощения относятся к:

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), которое представляет собой нанотело класса GLEW.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), которое представляет собой гуманизированное нанотело класса GLEW.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), которое содержит остаток аргинина (R) в положении 103.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), которое содержит остаток аргинина (R) в положении 103, и которое является гуманизированным.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), которое представляет собой нанотело класса GLEW, и которое содержит остаток аргинина (R) в положении 103, и которое является гуманизированным.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), которое содержит остаток лейцина (L) в положении 108.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), которое имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как здесь определено) с одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) или 96 (TNF30)

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), в котором

- CDR1 содержит:

аминокислотную последовательность DYWMY; или

аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью DYWMY; или

аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью DYWMY;

и

- CDR2 содержит:

аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; или

аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG; или

аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG;

и

- CDR3 содержит:

аминокислотную последовательность SPSGFN; или

аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SPSGFN; или

аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью SPSGFN.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), в котором CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), в котором CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), в котором:

CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN; или

CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; или

CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

- CDR1 представляет собой:

аминокислотную последовательность DYWMY; или

и в котором:

- CDR2 представляет собой:

и в котором

- CDR3 представляет собой:

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), в котором CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), в котором CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN

CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN; или

CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; или

CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

любая аминокислотная замена является предпочтительно консервативной аминокислотной заменой; и/или

Указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены, и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, по сравнению с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями).

И некоторые другие предпочтительные аспекты этого воплощения относятся к:

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), которое является нанотелом класса KERE

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), которое является гуманизированным Нанотелом класса KERE

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), которое, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как здесь определено) с одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 50 (TNF3), 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) или 98 (TNF33).

- CDR1 представляет собой:

аминокислотную последовательность NYYMG; или

аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью NYYMG; или

аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью NYYMG;

и

- CDR2 представляет собой:

аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; или

аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью NISWRGYNIYYKDSVKG; или

аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью NISWRGYNIYYKDSVKG;

и

- CDR3 представляет собой:

аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY; или

аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SILPLSDDPGWNTY; или

аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью SILPLSDDPGWNTY.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), в котором CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), в котором CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY; или

CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG; и CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; или

CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

Нанотелу по любому из вышеуказанных I) - V), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG; CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность ILPLSDDPGWNTY.

указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены, и не содержит аминокислотных делеций или инсерций, по сравнению с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями).

и вместе с еще другими некоторыми особенно предпочтительными аспектами:

- Белку или полипептиду, который содержит или по существу состоит из нанотела по любому из вышеуказанных I) - V).

- Белку или полипептиду, который содержит или по существу состоит из, по меньшей мере, одного нанотела по любому из вышеуказанных I) - V).

- Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I) - V).

- Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I) - V), и, который остается таким же, как и указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, что опосредовано указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора.

- Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I) - V), и который способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания для рецептора TNF на тримере TNF.

- Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I) - V), связанных посредством пригодного линкера.

- Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I) - V), связанных посредством пригодного линкера, и который пегилирован.

- Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I) - V), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека.

- Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I) - V), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, и который является таким же, как и указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, что опосредовано указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредована таким перекрестным сшиванием.

- Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I) - V), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, и который способен к внутримолекулярному связыванию, по меньшей мере, с двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF.

- Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I) - V), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, в котором каждый из двух нанотел по любому из вышеуказанных I) - V) связан, необязательно через пригодный линкер, с одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека.

- Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I) - V), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, в котором каждый из двух нанотел по любому из вышеуказанных I) - V) связан, необязательно через пригодный линкер, с одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека, и который является таким же, как и указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, что опосредовано указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредована таким перекрестным сшиванием рецептора.

- Белку или полипептиду, который содержит два нанотела по любому из вышеуказанных I) - V), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, в котором каждый из двух нанотел по любому из вышеуказанных I) - V) связан, необязательно через пригодный линкер, с одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека, и который способен к внутримолекулярному связыванию, по меньшей мере, с двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF.

Белку или полипептиду по любому из вышеуказанных VI) - XVIII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, является гуманизированным нанотелом.

Белку или полипептиду по любому из вышеуказанных VI) - XVIII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, является гуманизированным вариантом нанотела ALB 1 (SEQ ID NO: 63).

Белку или полипептиду по любому из вышеуказанных VI) - XVIII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, выбирается из группы, состоящей из ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB 5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB 8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) и ALB 10 (SEQ ID NO: 104).

Белку или полипептиду по любому из вышеуказанных VI) - XVIII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой ALB 8.

Белку или полипептиду по любому из вышеуказанных VI) - XVIII), который содержит или по существу состоит из двух гуманизированных нанотел по любому из вышеуказанных I) - V), и одного гуманизированного варианта нанотела ALB 1 (SEQ ID NO: 63).

Следует отметить, что если нанотело обозначается как “по любому из вышеуказанных I) - V)”, то соответствует, по меньшей мере, по одному из I) - V), может быть по двум или более из I) - V), и могут также включать любой один или более из других аспектов, которые указываются как “по любому из вышеуказанных I) - V)”. Аналогично, если белок или полипептид обозначается как “по любому из вышеуказанных VI) - XVIII)”, то соответствует, по меньшей мере, по одному из VI) - XVIII), может быть по двум или более из VI) - XVIII), и могут также включать любой один или более из других аспектов, которые указываются как “по любому из вышеуказанных VI) - XVIII).

Также в объем изобретения входит то, что, если применимо, нанотело или полипептид изобретения может связываться с двумя или более антигенными детерминантами, эпитопами, частями, доменами, субъединицами или конфирмациями TNF-альфа. При этом, антигенные детерминанты, эпитопы, части, домены или субъединицы TNF-альфа, с которыми связаны нанотела и/или полипептиды изобретения, могут быть по существу аналогичными (например, если TNF-альфа содержит множественные структурные фрагменты или присутствует как мультимер) или могут отличаться (и во втором случае, нанотела и полипептиды изобретения могут связываться с такими разными антигенными детерминантами, эпитопами, частями, доменами, субъединицами TNF-альфа со сродством и/или специфичностью, которые могут одинаковыми или отличаться). Также, например, если TNF-альфа находится в активированной конформации и в неактивированной конформации, нанотела и полипептиды изобретения могут связываться как с одной такой конформацией, так и с обеими этими конформациями (т.е. со сродством и/или специфичностью, которые могут одинаковыми или отличаться). Также, например, нанотела и полипептиды изобретения могут связываться с конформацией TNF-альфа, в которой они связаны с подходящим лигандом, могут связываться с конформацией TNF-альфа, в которой они не связаны с подходящим лигандом, или могут связываться с обеими такими конформациями (опять же, со сродством и/или специфичностью, которые могут одинаковыми или отличаться).

Также предполагается, что нанотела и полипептиды изобретения могут, главным образом, связываться со всеми природными или синтетическими аналогами, вариантами, мутантами, аллелями, частями и фрагментами TNF-альфа, или, по меньшей мере, с теми аналогами, вариантами, мутантами, аллелями, частями и фрагментами TNF-альфа, которые содержат одну или более антигенных детерминант или эпитопы, которые являются по существу аналогичными антигенной(ым) детерминанте(ам) или эпитопу(ам), с которыми связаны нанотела и полипептиды изобретения в TNF-альфа (напр., в TNF-альфа дикого типа). Кроме того, при этом, нанотела и полипептиды изобретения могут связываться с такими аналогами, вариантами, мутантами, аллелями, частями и фрагментами со сродством и/или специфичностью, которые такие же или отличаются от (т.е. выше или ниже), сродства и специфичности, с которыми нанотела изобретения связываются с (дикий тип) TNF-альфа. Также в объем изобретения входит то, что нанотела и полипептиды изобретения связываются с некоторыми аналогами, вариантами, мутантами, аллелями, частями и фрагментами TNF-альфа, но не с другими.

Как правило, нанотела и полипептиды изобретения будут, по меньшей мере, связываться с теми формами (включая мономерные, мультимерные и сопутствующие формы), которые наиболее релеванты с биологической и/или терапевтической точки зрения, что ясно для специалиста в данной области.

Также, поскольку TNF-альфа присутствует в мономерной форме и в мультимерных формах, в частности в тримерной форме, то в объем изобретения входит то, что нанотела и полипептиды изобретения связываются только с TNF-альфа в мономерной форме, или что нанотела и полипептиды изобретения дополнительно связываются также с одной или более таких мультимерных форм, с такой как тримерная форма TNF; или могут связываться только с такой мультимерной формой (напр., тримерной). Таким образом, обычно, если в данном описании ссылка относится к нанотелу, белок или полипептиду, которое направлено к TNF-альфа, то необходимо понимать, что это также содержит нанотела, направленные против TNF-альфа в его тримерной форме (включая, но не ограничиваясь, нанотела против сайтов связывания рецепторов (напр., сайтов связывания для TNF-RI, THF-RII, также известных как p55 или p75, этого тримера). Во всех этих случаях, нанотела и полипептиды изобретения могут связываться с такими мультимерами или ассоциированными белковыми комплексами со сродством и/или специфичностью, которые могут быть аналогичными или отличаться от (т.е. выше или ниже) сродства и/или специфичности, с которыми нанотела и полипептиды изобретения связываются с TNF-альфа в его мономерном и неассоциированном состоянии.

Также, главным образом, полипептиды изобретения, которые содержат два или более нанотела, направленных против TNF-альфа, могут связываться с более высокой авидностью, чем соответствующие мономерное нанотело или нанотела.

Например, и без ограничения, многовалентный (как определено здесь) белок или полипептид, который содержит два или более нанотел, которые направлены против различных эпитопов TNF-альфа, многовалентный (как определено здесь) белок или полипептид который содержит два или более нанотел, которые направлены против различных эпитопов TNF-альфа может связываться с TNF-альфа с более высокой авидностью, чем соответствующие мономеры.

Более того, многовалентный (как определено здесь) белок или полипептид, который содержит два или более нанотел, которые направлены против TNF-альфа, может (и обычно будет) связываться с более высокой авидностью с мультимером TNF-альфа чем с мономером TNF-альфа, и будет, как правило, также связываться с более высокой авидностью, чем соответствующие мономерные нанотела. В таком многовалентном белке или полипептиде, два или более нанотел могут, например, быть направлены против таких же эпитопов, по существу аналогичных эпитопов, или различных эпитопов. В одном воплощении такого многовалентного белка или полипептида, два или более нанотел, могут быть одинаковыми (и, следовательно, быть направленными против одного эпитопа).

Последнее представляет собой особенную значимость, поскольку известно, что начальный этап сигнальной трансдукции, опосредованный TNF, включает связывание TNF рецепторов с молекулами TNF, каждая из которых содержит три сайта связывания рецепторов (см., например: Peppel et al., J. Exp. Med., 174 (1991), 1483-1489; Engelmann et al., J. Biol. Chem., 265 (1990), 14497; Smith and Baglioni, J. Biol. Chem., 264 (1989), 14646). Например, как описано в работе Peppel et al., рекомбинантный моновалентный домен рецептора TNF - который был способен только к блокированию одного сайта связывания рецептора на тримере TNF – не был в состоянии препятствовать связыванию рецепторов TNF с другими двумя сайтами связывания рецепторов; несмотря на то, что рекомбинантный белок, который содержит два таких внеклеточных домена – следовательно, способный блокировать два сайта связывания рецепторов – обеспечивал поразительную эффективность по сравнению с моновалентным внеклеточным доменом.

В настоящем изобретении, было обнаружено, что моновалентные нанотела способны к связыванию с TNF альфа таким образом, что активность TNF снижается, как в моделях in vitro, в клеточных моделях и в моделях ex vivo (см. «Экспериментальный раздел» ниже). Хотя изобретение не ограничивается каким-либо специфическим механизмом, объяснением или гипотезой, предполагается, что из-за их небольшого размера и высокого сродства к TNF-альфа, два или три моновалентных нанотел изобретения способны к одновременному захвату двух или трех различных сайтов связывания рецепторов на тримере TNF, таким образом, предохраняя тример от стимулирования рецепторного связывания и, следовательно, от стимулирования сигнальной трансдукции (однако, не исключены и другие механизмы действия: например, в зависимости от эпитопа, против которого они направлены, нанотело изобретения может также ингибировать связь TNF в тримерном состоянии).

Также следует отметить, что дополнительно или в качестве альтернативы к связыванию с двумя или более сайтами связывания рецепторов на одном тримере TNF, белки или полипептиды настоящего изобретения, которые содержат или по существу состоят из двух или более вариабельных доменов иммуноглобулинов (или их пригодных фрагментов), которые направлены против эпитопов TNF-альфа, могут связываться (напр., внутримолекулярно) с эпитопами на двух отдельных молекулах TNF-альфа (напр., двух отдельных тримерах).

Однако, в соответствии с одним особенно предпочтительным воплощением, изобретение относится к белок или полипептиду, который содержит или по существу состоит из двух или более вариабельных доменов иммуноглобулинов (или их пригодных фрагментов), где каждый направлен против эпитопов TNF-альфа (и, в частности, тримера TNF-альфа), которые находятся и/или составляют часть сайта(ов) связывания рецепторов TNF-тримера, так что указанный полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать связывание с рецепторами TNF, что опосредовано указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредована таким рецепторным связыванием.

В частности, в соответствии с эти предпочтительным воплощением, изобретение относится к белок или полипептиду, который содержит или по существу состоит из двух или более вариабельных доменов иммуноглобулинов (или их пригодных фрагментов), которые каждый направлены против эпитопов на TNF-альфа (и, в частности, тримера TNF-альфа), которые находятся и/или составляют часть сайта(ов) связывания рецепторов TNF-тримера, где указанные вариабельные домены иммуноглобулинов связаны друг с другом таким образом, что белок или полипептид способен одновременно связываться с двумя или более сайтами связывания рецепторов на одном тримере TNF (другими словами, способен к внутримолекулярному связыванию, по меньшей мере, с двумя сайтами связывания TNF рецепторов на тримере TNF). В этом воплощении, два или более вариабельных доменов иммуноглобулинов предпочтительно являются как определено выше и наиболее предпочтительно являются нанотелами (так что белок или полипептид является многовалентной конструкцией нанотела, как в дальнейшем будет здесь определено). Также, в этом воплощении, два или более вариабельных доменов иммуноглобулинов могут быть аналогичными или отличаться; и могут быть направленными против различных эпитопов с сайта(ов) связывания TNF рецепторов, но предпочтительно направлены против одного эпитопа.

В одном предпочтительном аспекте этого воплощения, два или более вариабельных доменов иммуноглобулинов направлены против эпитопов тримера TNF-альфа, при этом эпитопы находятся и/или составляют часть сайта(ов) связывания TNF-рецепторов. Например, два или более вариабельных доменов иммуноглобулинов предпочтительно направлены против и/или могут связываться с эпитопом тримера TNF-альфа, который содержит следующие аминокислотные остатки: Gln в положении 88 и Lys в положении 90 на первом мономере TNF (обозначаемый здесь как “мономер A”), и Glu в положении 146 на втором мономере TNF (обозначаемый здесь как “мономер B”) (где Мономер A и Мономер B вместе, в TNF тримере, из сайта(ов) связывания TNF-рецепторов).

Как в дальнейшем дополнительно описывается более подробно относительно нанотела, в таком белке или полипептиде, по меньшей мере, два вариабельных доменов иммуноглобулинов предпочтительно связаны таким образом, что расстояние между N-концом и C-концом двух вариабельных доменов иммуноглобулинов, находящихся в таком белке или полипептиде, составляет предпочтительно, по меньшей мере, 50 Ангстрем, и более предпочтительно порядка 55-200 Ангстрем, и более предпочтительно порядка Ангстрем, в частности, порядка 65-150 Ангстрем.

В особенно предпочтительном аспекте этого воплощения, эти две или более иммуноглобулиновые последовательности представляют собой нанотела, и предпочтительно выбираются из нанотел, указанных здесь. Некоторые особенно предпочтительные нанотела для применения в данном воплощении изобретения представляют собой PMP1C2 (TNF1, SEQ ID NO:52) и/или PMP5F10 (TNF3, SEQ ID NO: 60), а также гуманизированные и другие их варианты (как здесь описывается); с PMP1C2 (TNF1, SEQ ID NO:52) и его гуманизированными вариантами, являющимися особенно предпочтительными.

В связи с чем, настоящее воплощение будет описываться более подробно в отношении нанотел. Однако для специалиста в данной области будет ясно, что идея данного воплощения может аналогично применяться и к вариабельным доменам иммуноглобулинов.

В этом воплощении изобретения, две или более иммуноглобулиновых последовательностей будут, как правило, связываться через один или более пригодные линкеры, при этом линкеры являются такими, что каждая иммуноглобулиновая последовательность может связываться с различным сайтом связывания рецептора на одном тримере TNF. Пригодные линкеры будут в частности зависеть от эпитопов (расстояния между ними) на тримере TNF, с которыми иммуноглобулиновые последовательности связаны, и для специалиста на основании раскрываемого здесь будет понятно, что необязательно после некоторой ограниченной степени рутинного экспериментирования. Например, если две или более иммуноглобулиновых последовательностей являются (одно) доменными антителами или нанотелами, то пригодные линкеры могут выбираться из линкеров, описываемых здесь, но с размером линкера, который соответствует двум или более (одно) доменным антителам или нанотелам, каждый из которых связываться с различным сайтом связывания рецептора на одном тримере TNF.

Кроме того, если два или более иммуноглобулиновых последовательностей, которые связаны с сайтами связывания рецепторов TNF-альфа, представляют собой (одно) доменные антитела или нанотела, то они могут также связываться друг с другом через третье (одно) доменное антитело или нанотело (где две или более иммуноглобулиновые последовательности могут быть связаны непосредственно с третьим (одно) доменным антителом/нанотелом посредством пригодных линкеров). Такое третье (одно) доменное антитело или нанотело может, например, быть (одно) доменным антителом или нанотелом, которое обеспечивает повышенное время полужизни, что дополнительно здесь описано. Например, последнее (одно) доменное антитело или нанотело может являться (одно) доменным антителом или нанотелом, которое проявляет способность к связыванию (человеческим) сывороточным белком, таким как (человеческий) сывороточный альбумин, что дополнительно здесь описано.

Альтернативно, две или более иммуноглобулиновых последовательностей, который связаны с сайтом(ами) связывания рецепторов TNF-альфа, могут присоединяться последовательно (либо непосредственно, либо через пригодный линкер) и третье (одно) доменное антитело или нанотело (которое может обеспечивать повышенное время полужизни, как описано выше) может соединяться непосредственно или через линкер с одной из этих двух или более вышеуказанных иммуноглобулиновых последовательностей. Некоторыми неограничивающими примерами таких конструкций являются конструкции из SEQ ID NOS: 93 или 94.

В частности, было обнаружено в изобретении (см. здесь указанные результаты кристаллографии,) что, если нанотела, присутствующие в многовалентном или мультиспецифичном белке или полипептиде изобретения, связаны со специфичным эпитопом, описанным выше (которым является эпитоп TNF1 и его гуманизированные варианты, а также TNF3 и его гуманизированные варианты), то, предпочтительно, два (или более) анти-TNF нанотела, присутствующие в таком белке или полипептиде, должны быть связаны таким образом, что расстояние между N-концом и C-концом двух анти-TNF нанотел, присутствующих в таком белке или полипептиде, должно, предпочтительно, составлять, по меньшей мере, 50 Ангстрем, и более предпочтительно порядка 55-200 Ангстрем, и, в частности, порядка 65-150 Ангстрем (с максимумом, который составляет менее критического, и выбранный из соображений удобства, напр., на предмет экспрессии/продукции белка); или в более общем смысле, что указанное расстояние должно быть таким, что оно позволяет белок или полипептиду подвергаться внутримолекулярному связыванию с TNF-тримером (т.е. вместо межмолекулярного связывания). Расстояние между N-концом и C-концом двух анти-TNF нанотел может определяться с помощью любых пригодных способов, таких как кристаллография или молекулярное моделирование (как здесь описывается). Эти способы также обеспечивают возможность определить, способен ли специфичный многовалентный или мультиспецифичный белок или полипептид обеспечить внутримолекулярное моделирование. Альтернативно, настоящее изобретение также обеспечивает простой эксперимент при использовании гель-хроматографии (как описывается Santora et al., Anal. Biochem., 299: 119-129), которая может применяться для определения, будет ли данный белок или полипептид изобретения (преимущественно) обеспечивать внутримолекулярное связывание с TNF-тримером или (преимущественно) межмолекулярное связывание между двумя или более TNF-тримерами. Таким образом, в одном конкретном воплощении изобретения, белок или полипептид изобретения является предпочтительно таким, что, в этом эксперименте, он преимущественно или по существу исключительно приводит к внутримолекулярному связыванию. Однако, как подчеркнуто выше, следует отметить, что белки или полипептиды изобретения, которые действуют посредством внутримолекулярного связывания отдельных молекул TNF-альфа (напр., тримеров), также включены в объем настоящего изобретения.

Таким образом, в другом предпочтительном аспекте, изобретение обеспечивает многовалентный или мультиспецифичный белок или полипептид, который содержит, по меньшей мере, два нанотела против TNF-альфа (и, в особенности, тримера TNF-альфа), где указанные нанотела предпочтительно направлены к по существу такому же эпитопу, как нанотело PMP1C2 (как здесь отмечено), и где указанные, по меньшей мере, два нанотела соединены таким образом, что расстояние между N-концом и C-концом, по меньшей мере, двух анти-TNF нанотел такое, что белок или полипептид способен подвергаться внутримолекулярному связыванию (как здесь описывается) с TNF-тримером. Предпочтительно, в таком белке или полипептиде, расстояние между N-концом и C-концом двух анти-TNF нанотел составляет, по меньшей мере, 50 Ангстрем, и более предпочтительно порядка 55-200 Ангстрем, и, в частности, порядка 65-150 Ангстрем.

В таком предпочтительном белке или полипептиде, два или более нанотел могут соединяться любым пригодным образом, если только может достигаться предпочтительное расстояние между N-концом и C-концом, по меньшей мере, двух анти-TNF нанотел, и/или если белок или полипептид способен подвергаться внутримолекулярному связыванию с (как здесь описывается) TNF-тримером.

Например, в простейшей конструкции, по меньшей мере, два нанотела непосредственно соединены через пригодный линкер или спейсер, который обеспечивает предпочтительное расстояние между N-концом и C-концом, по меньшей мере, двух анти-TNF нанотел и который предоставляет возможность белок или полипептиду подвергаться внутримолекулярному связыванию с (как здесь описывается) TNF-тримером. Пригодные линкеры здесь описываются, и могут - например, и без ограничений - содержать аминокислотную последовательность, где аминокислотная последовательность предпочтительно имеет длину в 14 аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере, 17 аминокислот, как например, около 20-40 аминокислотной последовательности (которая, при использовании расстояния в 3,5 Ангстрема для одной аминокислоты, соответствует длинам линкера в 49 Ангстрем, 59,5 Ангстрем и около 70 Ангстрем, соответственно; с максимальным количеством аминокислот, что рассчитывалось таким же образом из расчета расстояний, как определено выше). Предпочтительно, такая аминокислотная последовательность должна быть такой, чтобы предоставлять возможность белок или полипептиду подвергаться внутримолекулярному связыванию с (как здесь описывается) TNF-тримером.

Таким образом, в другом предпочтительном аспекте, изобретение обеспечивает многовалентный или мультиспецифичный белок или полипептид, который содержит, по меньшей мере, два нанотела против TNF-альфа (и, в частности, тримера TNF-альфа), в котором указанные нанотела предпочтительно направлены к по существу такому же эпитопу, как нанотело PMP1C2 (как указано здесь), и в котором указанные, по меньшей мере, два нанотела непосредственно соединены друг с другом с помощью пригодного линкера или спейсера так, что расстояние между N-концом и C-концом, по меньшей мере, двух анти-TNF нанотел такое, что белок или полипептид способен подвергаться внутримолекулярному связыванию с (как здесь описывается) TNF-тримером. Предпочтительно, в таком белке или полипептиде, расстояние между N-концом и C-концом двух анти-TNF нанотел (и, следовательно, предпочтительная длина линкера или спейсера) составляет, по меньшей мере, 50 Ангстрем, и более предпочтительно порядка 55-200 Ангстрем, и, в частности, порядка 65-150 Ангстрем.

Более предпочтительно, в этом предпочтительном аспекте, линкер или спейсер является аминокислотной последовательностью, которая содержит, по меньшей мере, 14, предпочтительно, по меньшей мере, 17, более предпочтительно, по меньшей мере, 20 аминокислот (с некритическим максимумом, выбранным из соображений удобства, который составляет около 50, и предпочтительно около 40 аминокислот). В одном предпочтительном, но не ограничивающем воплощении, линкер по существу состоит из глициновых и сериновых остатков (как в дальнейшем описывается). Например, один пригодный линкер представляет собой GS30 линкер, описываемый здесь, который содержит 30 аминокислотных остатка.

В другом воплощении, по меньшей мере, два нанотела против TNF-альфа связаны друг с другом через другие агенты (необязательно через один или два линкера), как например другой белок или полипептид. В этом воплощении, возможно желаемо иметь предпочтительное расстояние (т.е. как упоминается выше) между N-концом и C-концом, по меньшей мере, двух анти-TNF нанотел, например, такое, что белок или полипептид может еще подвергаться внутримолекулярному связыванию с (как здесь описывается) TNF-тримером. В этом воплощении, по меньшей мере, два нанотела могут быть связаны непосредственно другим агентом, или при использовании пригодного линкера или спейсера, и в этом случае до достижения предпочтительного расстояния и/или желаемого внутримолекулярного связывания. Агентом может быть любой пригодный агент, который не снижает (чрезмерно) связывание белка или полипептида с TNF и/или в дальнейшем желаемые биологические и фармакологические свойства белка или полипептид. По существу, агент может быть по существу неактивным или может быть биологически активным, и как таковой может или не может улучшать желаемые свойства белка или полипептида и/или может предоставлять одно или более дополнительные желаемые свойства для белка или полипептида. Например, и без ограничения, агент может увеличивать время полужизни белка или полипептида, и/или может снижать его иммуногенность или улучшать любые другие желаемые свойства. В одном предпочтительном воплощении, агент может быть другим нанотелом (включая, но не ограничиваясь, третье нанотело против TNF-альфа, хотя это необязательно и обычно менее предпочтительно), и, в частности. Другим нанотелом, которое обеспечивает время полужизни белка или полипептида, как, например, нанотело, которое направленно против сывороточного белка, например, против сывороточного альбумина человека. Примерами таких белков и полипептидов являются те, которые здесь описываются.

Таким образом, в одном воплощении, изобретение относится к многовалентной мультиспецифичной конструкции, содержащей две или более иммуноглобулиновые последовательности (или их пригодные фрагменты), каждая из которых направлена против эпитопов на TNF-альфа (напр., тримере TNF-альфа), которые находятся в и/или составляют часть сайта связывания рецепторов, и которые связаны друг с другом посредством, по меньшей мере, одной иммуноглобулиновой последовательностью, которая обеспечивает повышенное время полужизни (и необязательно посредством одного или более пригодных линкеров), так, что указанный полипептид, после связывания с TNF тримером, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредована указанным тримером TNF. Такой полипептид может быть таким, что указанные в начале заявки две или более иммуноглобулиновые последовательности могут каждая связываться с различным сайтом связывания рецептора на тримере TNF.

В частности, в этом воплощении, полипептид может содержать тривалентное биспецифичное нанотело, которое содержит два нанотела, каждое из которых направлено против эпитопов на TNF-альфа (и, в особенности, тримере TNF-альфа), которые находятся в и/или составляют часть сайта связывания рецепторов, где указанные нанотела связаны друг с другом посредством третьего нанотела, которое обеспечивает повышенное время полужизни (напр., нанотело, которое направлено к сывороточному белок, такому как сывороточный альбумин человека), где каждое из вышеуказанных двух нанотел могут быть непосредственно связаны с указанным третьим нанотелом или через один или более пригодные линкеры, так что указанный полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется указанным тримером TNF. Такой полипептид может быть таким, что каждое из вышеуказанных двух нанотел может связываться с другим сайтом связывания рецептора на TNF-тримере. Кроме того, некоторыми особенно предпочтительными нанотелами для применения в этом воплощении изобретения являются PMP1C2 (TNF1, SEQ ID NO:52) и/или PMP5F10 (TNF3, SEQ ID NO: 60), а также гуманизированные и другие их варианты (как здесь описывается); с PMP1C2 (TNF1, SEQ ID NO:52) и его гуманизированными вариантами, которые являются особенно предпочтительными; и нанотела, направленные против сывороточного альбумина человека, описанные здесь. Некоторыми предпочтительными, но не ограничивающими, конструкциями данного воплощения изобретения являются TNF 24 (SEQ ID NO: 90), TNF 26 (SEQ ID NO: 92), TNF 27 (SEQ ID NO: 93), TNF 28 (SEQ ID NO: 94), TNF 60 (SEQ ID NO: 417) и TNF 62 (SEQ ID NO:418), из которых TNF 60 является особенно предпочтительным.

Таким образом, некоторые предпочтительные аспекты данного воплощения изобретения относятся к:

- Белку или полипептиду, который содержит или по существу состоит из двух или более вариабельных доменов иммуноглобулинов (или их пригодных фрагментов), при этом каждый из которых направлен против эпитопов на TNF-альфа (и, в частности, тримере TNF-альфа), которые находятся в и/или составляют часть сайта(ов) связывания рецепторов тримера TNF, так что указанный полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, опосредуемое указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора.

- Белку или полипептиду, который содержит или по существу состоит из двух или более вариабельных доменов иммуноглобулинов (или их пригодных фрагментов), при этом каждый из которых направлен против эпитопов на TNF-альфа (и, в частности, тримере TNF-альфа), которые находятся в и/или составляют часть сайта(ов) связывания рецепторов тримера TNF, так что указанный полипептид способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором указанные вариабельные домены иммуноглобулинов связаны друг с другом таким образом, что белок или полипептид способен одновременно связываться с двумя или более сайтами связывания рецепторов на одном тримере TNF.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором указанные вариабельные домены иммуноглобулинов способны связываться с некоторыми эпитопами, например, как нанотело TNF1 (SEQ ID NO: 52).

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором указанные вариабельные домены иммуноглобулинов способны связываться против эпитопа с сайта связывания рецепторов TNF тримера TNF, который, по меньшей мере, содержит следующие аминокислотные остатки: Gln в положении 88 в мономере A; Lys в положении 90 в мономере A и Glu в положении 146 в мономере B.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором указанные вариабельные домены иммуноглобулинов способны связываться против эпитопа с сайта связывания рецепторов TNF тримера TNF, который, по меньшей мере, содержит следующие аминокислотные остатки: Gln в положении 88 в мономере A; Lys в положении 90 в мономере A и Glu в положении 146 в мономере B; и что дополнительно содержит, по меньшей мере, один, предпочтительно два или более, более предпочтительно 5 или более, и предпочтительно все или почти все следующие аминокислотные остатки мономера A TNF-альфа: Gly в положении 24, Gln в положении 25, Thr в положении 72, His в положении 73, Val в положении 74, Leu в положении 75, Thr в положении 77, Thr в положении 79, Ile в положении 83, Thr в положении 89, Val в положении 91. Asn в положении 92, Ile в положении 97, Arg в положении 131, Glu в положении 135, Ile в положении 136, Asn в положении 137, Arg в положении 138, Pro в положении 139, Asp в положении 140 и следующие остатки в мономере B: Pro в положении 20, Arg в положении 32, Lys в положении 65, Lys в положении 112, Tyr в положении 115, Ala в положении 145, Ser в положении 147.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором указанные вариабельные домены иммуноглобулинов способны связываться против эпитопа с сайта связывания рецепторов TNF тримера TNF, который, по меньшей мере, содержит следующие аминокислотные остатки: Gln в положении 88 в мономере A; Lys в положении 90 в мономере A и Glu в положении 146 в мономере B; и который дополнительно содержит, по меньшей мере, один, предпочтительно два или более, более предпочтительно 5 или более, и предпочтительно все или по существу все следующие аминокислотные остатки мономера A TNF-альфа: Leu в положении 75, Thr в положении 77, Thr в положении 79, Ile в положении 80, Ser в положении 81, Tyr в положении 87, Thr в положении 89, Val в положении 91, Asn в положении 92, Ser в положении 95, Ile в положении 97, Glu в положении 135, Ile в положении 136, Asn в положении 137 и следующие остатки в мономере B: Ala в положении 33, Ala в положении 145, Ser в положении 147.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором, по меньшей мере, два вариабельных домена иммуноглобулинов связаны таким образом, что расстояние между N-концом первого вариабельного домена иммуноглобулина и C-концом второго вариабельного домена иммуноглобулина, присутствующих в таком белке или полипептиде, составляет, по меньшей мере, 50 Ангстрем.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором расстояние N-концом первого вариабельного домена иммуноглобулина и C-концом второго вариабельного домена иммуноглобулина составляет между 55-200 Ангстрем

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором расстояние N-концом первого вариабельного домена иммуноглобулина и C-концом второго вариабельного домена иммуноглобулина составляет между 65-150 Ангстрем

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулина связаны друг с другом через линкер или спейсер.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором линкер или спейсер представляют собой аминокислотную последовательность.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором линкер или спейсер содержит, по меньшей мере, 14 аминокислотных остатка.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором линкер или спейсер содержит, по меньшей мере, 17 - 50 аминокислотных остатка

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором линкер или спейсер по существу состоит из глициновых или сериновых остатков.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором линкер или спейсер представляет собой GS30 (SEQ ID NO: 69).

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулина связаны друг с другом посредством другого агента.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором указанный другой агент представляет собой белковый или полипептидный агент.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором указанный другой агент предоставляет, по меньшей мере, одно желаемое свойство белок или полипептиду, или повышает, по меньшей мере, одно желаемое свойство белка или полипептида.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором указанный другой агент увеличивает время полужизни белка или полипептида и/или снижает иммуногенность белка или полипептида.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором каждый из первого и второго вариабельного домена иммуноглобулина связан с указанным другим агентом через линкер или спейсер.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором линкер или спейсер представляет собой аминокислотную последовательность.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором линкер или спейсер по существу состоит из глициновых и сериновых остатков.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором указанный другой агент представляет собой нанотело.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором другой агент представляет собой нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, является гуманизированным нанотелом.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, является гуманизированным вариантом нанотела ALB 1 (SEQ ID NO: 63).

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, выбирается из группы, состоящей из ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB 5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB 8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) и ALB 10 (SEQ ID NO: 104).

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, является ALB 8.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов являются нанотелами.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов являются нанотелами со значением Koff для TNF лучше чем 2·10^-3 (1/с), предпочтительно лучше чем 1·10^-3 (1/с); или гуманизированным вариантом такого нанотела.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов являются нанотелами со значением EC50, определенное по клеточному анализу при использовании клеток линии KYM, что описано в примере 1 (ниже 3) в WO 04/041862, которое лучше значения EC50 нанотела VHH 3E (SEQ ID NO:4) из WO 04/041862 по результатам аналогичного анализа; или гуманизированным вариантом такого нанотела.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов являются нанотелами со значением EC50, определенным по клеточному анализу при использовании клеток линии KYM, что описано в примере 1 (ниже 3) в WO 04/041862, которое лучше 12 нM; или гуманизированным вариантом такого нанотела.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов являются нанотелами со значением EC50, определенным по клеточному анализу при использовании клеток линии KYM, что описано в примере 1 (ниже 3) в WO 04/041862, которое лучше 5 нM; или гуманизированным вариантом такого нанотела.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов являются нанотелами со значением EC50, определенным по клеточному анализу при использовании клеток линии KYM, что описано в примере 1 (ниже 3) в WO 04/041862, которое лучше 3 нM; или гуманизированным вариантом такого нанотела.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела по любому из вышеуказанных XIX) - XX), которые гуманизированы;

со следующими некоторыми особенно предпочтительными аспектами данного изобретения:

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела класса GLEW.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела с аргининовым остатком (R) в положении 103.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела класса GLEW с аргининовым остатком (R) в положении 103.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела с, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичностью последовательности (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) или 96 (TNF30)

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в которых:

- CDR1 содержит:

- аминокислотную последовательность DYWMY; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью DYWMY; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью DYWMY;

и

- CDR2 содержит:

- аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG;

и

- CDR3 содержит:

- аминокислотную последовательность SPSGFN; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SPSGFN; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью SPSGFN.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в которых CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в которых CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в которых CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN

- CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и

- CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN; или

- CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; или

- CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в которых CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в которых CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в которых

- CDR1 представляет собой:

и в котором:

- CDR2 представляет собой:

и в котором

- CDR3 представляет собой:

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в которых CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX) - XX), в которых CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX) - XX), в которых CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX) - XX), в которых:

- CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 является аминокислотной последовательностью SPSGFN; или

- CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; или

- CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX) - XX), в которых CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX) - XX), в которых CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX) - XX), в которых

- любой аминокислотной заменой является предпочтительно консервативная аминокислотная замена; и/или

- указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены, и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями).

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов выбираются из группы, состоящей из нанотела TNF 1 (SEQ ID NO: 52) и гуманизированных вариантов нанотела TNF 1 (SEQ ID NO: 52).

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов выбираются из группы, состоящей из TNF 13 (SEQ ID NO: 76), TNF 14 (SEQ ID NO: 77), TNF 29 (SEQ ID NO: 95) и TNF 30 (SEQ ID NO:96).

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой TNF 30 (SEQ ID NO:96);

и со следующими некоторыми особенно предпочтительными аспектами этого воплощения:

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела класса KERE.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела с, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичностью последовательности (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 50 (TNF3), 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) или 98 (TNF33).

- CDR1 содержит:

- аминокислотную последовательность NYYMG; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью NYYMG; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью NYYMG;

и

- CDR2 содержит:

- аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью NISWRGYNIYYKDSVKG; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью NISWRGYNIYYKDSVKG;

и

- CDR3 содержит:

- аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SILPLSDDPGWNTY; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ые) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью SILPLSDDPGWNTY.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX) - XX), в которых CDR1 содержит аминокислотную последовательность NYYMG.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX) - XX), в которых CDR2 содержит аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX) - XX), в которых CDR3 содержит аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

- CDR1 содержит аминокислотную последовательность NYYMG; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY; или

CDR1 содержит аминокислотную последовательность NYYMG; и CDR2 содержит аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; или

- CDR2 содержит аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX) - XX), в которых CDR1 содержит аминокислотную последовательность NYYMG; CDR2 содержит аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY и CDR3 содержит аминокислотную последовательность ILPLSDDPGWNTY (SEQ ID NO:436).

- CDR1 представляют собой:

и

- CDR2 представляет собой:

и

- CDR3 представляет собой:

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX) - XX), в которых CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX) - XX), в которых CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX) - XX), в которых CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

- CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY; или

- CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG; и CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; или

- CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов представляют собой нанотела, которые описаны для белков или полипептидов по любому из XIX) - XX), в которых CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG; CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность ILPLSDDPGWNTY.

- любая аминокислотная замена представляет собой предпочтительно консервативную аминокислотную замену; и/или

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов выбираются из группы, состоящей из нанотела TNF 3 (SEQ ID NO: 60) и гуманизированных вариантов нанотела TNF 3 (SEQ ID NO: 60).

Белок или полипептид по любому из вышеуказанных XIX) - XX), в котором первый и второй вариабельные домены иммуноглобулинов выбираются из группы, состоящей из TNF20 (SEQ ID NO:83), TNF21 (SEQ ID NO: 84), TNF 22 (SEQ ID NO: 85), TNF23 (SEQ ID NO: 86) или TNF33 (SEQ ID NO: 99).

Следует отметить, что если белок или полипептид представляет собой вышеуказанное как “по любому из вышеуказанных XIX) - XX)”, то это означает, что, по меньшей мере, по одному из XIX) - XX), и может быть по обоим XIX) и XX), и также может включать любой один или более других аспектов, которые обозначены как “по любому из вышеуказанных XIX) - XX)”.

Однако необходимо указать, что изобретение не ограничивается каким-либо специфическим механизмом действия или гипотезой. А именно, было обнаружено, что моновалентные нанотела изобретения также могут быть активными в анализах и моделях, описываемых здесь, которые подтверждают, что внутримолекулярное связывание с тримером TNF, хотя предпочтительное по одному воплощению изобретения, не требуется для достижения желаемого действия и эффекта нанотел, белков и полипептидов, описываемых в данном документе. Аналогично, также охватывается объемом изобретения, что белки и полипептиды, описываемые здесь, обеспечивают их желаемое действие посредством любого подходящего механизма (т.е. путем межмолекулярного связывания, внутримолекулярного связывания или даже путем связывания с мономерным TNF, таким образом ингибируя образование тримеров TNF).

Также в объем изобретения входит применение частей, фрагментов, аналогов, мутантов, вариантов, аллелей и/или производных нанотел и полипептидов изобретения, и/или применение белков или полипептидов содержащих или по существу состоящих из таковых, поскольку они являются пригодными для применений, представленных здесь. Такие части, фрагменты, аналоги, мутанты, варианты, аллели, производные, белки и/или полипептиды будут рассмотрены при дальнейшем описании данного документа.

В другом аспекте, изобретение относится к нанотелу (как определено здесь), против TNF-альфа, которое состоит из 4 каркасных областей (FR1 - FR4 соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1 - CDR3 соответственно), в котором:

- CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей CDR1 SEQ ID NO: 15 - 21 или из группы, состоящей из последовательностей CDR1 SEQ ID NO: 164 - 197;

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15 – 21, или с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 164 - 197, где

(1) любая аминокислотная замена представляет собой предпочтительно консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены, и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями);

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 2 или только 1 “аминокислотное(ых) отличие(ия)” (как определено здесь) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 15 – 21, или с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 164 - 197, где:

и в котором:

- CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из последовательностей CDR2 из SEQ ID NO: 22 – 28, или из группы, состоящей из последовательностей CDR2 из SEQ ID NOS: 232 - 265;

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR2 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22 – 28, или с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR2 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 232 - 265, где

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 “аминокислотное(ых) отличие(ия)” (как определено здесь) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR2 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 22 - 28, или с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR2 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 232 - 265, где:

и в котором:

- CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность выбранную из группы, состоящей из последовательностей CDR3 SEQ ID NO: 29 – 33, или из группы, состоящей из последовательностей CDR3 SEQ ID NO: 300-333;

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR3 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 29 – 33, или с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR3 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 300-333, где:

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 “аминокислотное(ых) отличие(ия)” (как определено здесь) или с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR3 из группы, состоящей из SEQ ID NO: 330 - 333, где:

или из группы, состоящей из последовательностей CDR3 из SEQ ID NO:34 – 35 или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR3 из SEQ ID NO: 34 и 35, где:

(1) любая аминокислотная замена предпочтительно представляет собой консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 “аминокислотное(ых) отличие(ия)” (как определено здесь) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR3 из SEQ ID NO: 34 и 35, где:

Нанотела против TNF-альфа, которые описывались выше и будут в дальнейшем описаны ниже, также относятся здесь к нанотелам изобретения.

Среди нанотел изобретения, нанотела, содержащие один или более CDR, точно перечисленные выше, являются особенно предпочтительными; нанотела, содержащие два или более CDR, точно перечисленные выше, являются более предпочтительными; и нанотела, содержащие три CDR, точно перечисленные выше, являются наиболее предпочтительными.

Некоторые особенно предпочтительные, но не ограничивающие, комбинации последовательностей CDR можно видеть в таблице I ниже, в которой перечисляются CDR и каркасные последовательности, которые присутствуют во многих предпочтительных (но не ограничивающих) нанотелах изобретения. Как будет понятно для специалиста, комбинации последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, которые встречаются в одном клоне (т.е. последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, которые упоминаются на одной линии в таблице I), обычно будут предпочтительными (хотя изобретение в его широком смысле не ограничивается этим, и также содержит другие пригодные комбинации последовательностей CDR, указанных в таблице I).

Кроме того, в нанотелах изобретения, которые содержат комбинации CDR, приведенные в таблице I, каждый CDR может заменяться на CDR, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с указанными CDR; где

и/или выбранный из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 (как указывалось в предыдущем параграфе) “аминокислотное(ых) отличие(ия)” (как определено здесь) с указанным(и) CDR одной из вышеприведенных аминокислотных последовательностей, где:

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены, и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями).

Однако, как будет понятно для специалиста, (комбинации) последовательностей CDR, приведенные в таблице I, будут, главным образом, предпочтительными.

Таким образом, в нанотелах изобретения, по меньшей мере, одна из присутствующих последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 надлежаще выбирается из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенных в таблице I; или из группы последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% “идентичности последовательности” (как определено здесь) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенной в таблице I; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют 3, 2 или только 1 “аминокислотное(ых) отличие(я)” (как определено здесь) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенной в таблице I. В данном контексте, под “надлежаще выбранной” понимается, что, в зависимости от конкретного случая, последовательность CDR1 выбирается из пригодных последовательностей CDR1 (т.е. как определено здесь), последовательность CDR2 выбирается из пригодных последовательностей CDR2 (т.е. как определено здесь) и последовательность CDR3 выбирается из пригодных последовательностей CDR3 (т.е. как определено здесь), соответственно.

В частности, в нанотелах изобретения, по меньшей мере, последовательность CDR3 надлежащим образом выбирается из группы, состоящей из последовательностей CDR3, приведенных в таблице I или из группы последовательностей CDR3, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR3, приведенной в таблице I; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR3, которые имеют 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR3, приведенной в таблице I.

Предпочтительно, в нанотелах изобретения, по меньшей мере, две из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 надлежаще выбирается из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенных в таблице I, или из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенной в таблице I; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют 3, 2 или только 1 “аминокислотное(ых) отличие(я)” с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенной в таблице I.

В особенности, в нанотелах изобретения, по меньшей мере, присутствующая последовательность CDR3 надлежащим образом выбирается из группы, состоящей из последовательностей CDR3, приведенных в таблице I, или из группы последовательностей CDR3, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR3, приведенной в таблице I, соответственно; и, по меньшей мере, одна из присутствующих последовательностей CDR1 и CDR2 надлежаще выбирается из группы, состоящей из последовательностей CDR1 и CDR2, соответственно, приведенных в таблице I, или из группы последовательностей CDR1 и CDR2, соответственно, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1 и CDR2, соответственно, приведенных в таблице I; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR1 и CDR2, соответственно, которые имеют 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1 и CDR2, соответственно, приведенных в таблице I.

Наиболее предпочтительно, в нанотелах изобретения, все три присутствующие последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 надлежаще выбираются из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенных в таблице I, или из группы последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенных в таблице I; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые содержат 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенных в таблице I.

Даже более предпочтительно, в нанотелах изобретения, по меньшей мере, одна из присутствующих последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 надлежаще выбирается из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенных в таблице I. Предпочтительно, в этом воплощении, по меньшей мере, одна или предпочтительно обе другие две присутствующие последовательности CDR подходящим образом выбираются из последовательностей CDR, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с, по меньшей мере, одной из соответствующих последовательностей CDR, соответственно, приведенных в таблице I; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR, которые имеют 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с, по меньшей мере, одной из соответствующих последовательностей, соответственно, приведенных в таблице I.

В частности, в нанотелах изобретения, по меньшей мере, присутствующая последовательность CDR3 подходящим образом выбирается из группы, состоящей из CDR3, приведенной в таблице I. Предпочтительно, в этом воплощении, по меньшей мере, одна и предпочтительно обе присутствующие последовательности CDR1 и CDR2 подходящим образом выбирается из групп последовательностей CDR1 и CDR2, соответственно, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с последовательностями CDR1 и CDR2, соответственно, приведенных в приведенной в таблице I; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR1 и CDR2, соответственно, которые содержат 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с, по меньшей мере, одной из последовательностей CDR1 и CDR2, соответственно, приведенных в таблице I.

Даже более предпочтительно, в нанотелах изобретения, по меньшей мере, две присутствующие последовательности из CDR1, CDR2 и CDR3 подходящим образом выбираются из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенных в таблице I. Предпочтительно, в этом воплощении, оставшаяся имеющаяся последовательность CDR подходящим образом выбирается из группы последовательностей CDR, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с, по меньшей мере, одной из соответствующих последовательностей CDR, приведенных в таблице I; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR, которые содержат 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с, по меньшей мере, одной из соответствующих последовательностей, приведенных в таблице I.

В частности, в нанотелах изобретения, по меньшей мере, последовательность CDR3 подходящим образом выбирается из группы, состоящей из последовательностей CDR3, приведенных в таблице I, и либо последовательность CDR1 либо последовательность CDR2 подходящим образом выбирается из группы, состоящей из последовательностей CDR1 и CDR2, соответственно, приведенных в таблице I. Предпочтительно, в этом воплощении, оставшаяся имеющаяся последовательность CDR подходящим образом выбирается из группы последовательностей CDR, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с, по меньшей мере, одной из соответствующих последовательностей CDR, приведенных в таблице I; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR, которые имеют 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с соответствующими последовательностями CDR, приведенными в таблице I.

Даже более предпочтительно, в нанотелах изобретения, все три имеющиеся последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 подходящим образом выбираются из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенных в таблице I.

Также, главным образом, комбинации CDR, приведенные в таблице I (т.е. те, которые указаны на той же линии в таблице I) являются предпочтительными. Таким образом, является, в целом, предпочтительным, что, если CDR в нанотеле изобретения представляет собой последовательность CDR, указанную в таблице I, или подходящим образом выбирается из группы последовательностей CDR, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с последовательностью CDR, приведенной в таблице I; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR, которые имеют 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с последовательностью CDR, приведенной в таблице I, то, по меньшей мере, одна и предпочтительно обе другие CDR подходящим образом выбираются из последовательностей CDR, которые принадлежат к той же комбинации в таблице I (т.е. указанные на той же линии в таблице I), или подходящим образом выбираются из группы последовательностей CDR которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с последовательностью(ями) CDR, принадлежащих к той же комбинации, и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR, которые имеют 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с последовательностью(ями) CDR, принадлежащих к аналогичной комбинации. Другие предпочтения, указанные в параграфах выше, также применяются для комбинаций CDR, указанных в таблице I.

Таким образом, через неограничивающие примеры, нанотело изобретения может например, содержать последовательность CDR1, которая имеет более чем 80% идентичность последовательности с одной из последовательностей CDR1, указанной в таблице I, последовательность CDR2, которая имеет 3, 2 или 1 аминокислотное отличие с одной из последовательностей CDR2, указанных в таблице I (но принадлежащей к другой комбинации), и последовательность CDR3.

Некоторые предпочтительные нанотела изобретения могут, например, содержать: (1) последовательность CDR1, которая имеет более чем 80% идентичность последовательности с одной из последовательностей CDR1 указанной в таблице I, последовательность CDR2, которая имеет 3, 2 или 1 аминокислотное отличие с одной из последовательностей CDR2, указанных в таблице I (но принадлежащей к другой комбинации), и последовательность CDR3, которая имеет более чем 80% идентичность последовательности с одной из последовательностей CDR3, указанной в таблице I (но принадлежащей к другой комбинации); или (2) последовательность CDR1, которая имеет более чем 80% идентичность последовательности с одной из последовательностей CDR1 указанной в таблице I; последовательность CDR2, и одну из последовательностей CDR3, приведенную в таблице I; или (3) последовательность CDR1; последовательность CDR2, которая имеет более чем 80% идентичность последовательности с одной из последовательностей CDR2, приведенной в таблице I; и последовательность CDR3, которая имеет 3, 2 или 1 аминокислотные отличия с последовательностью CDR3, указанной в таблице I, которая состоит из такой же комбинации, что и последовательность CDR2.

Некоторые особенно предпочтительные нанотела изобретения могут, например, содержать: (1) последовательность CDR1, которая имеет более чем 80% идентичность последовательности с одной из последовательностей CDR1, указанной в таблице I; последовательность CDR2, которая имеет 3, 2 или 1 аминокислотное отличие с последовательностью CDR2, указанной в таблице I, которая состоит из такой же комбинации; и последовательность CDR3, которая имеет более чем 80% идентичность последовательности с последовательностью CDR3, указанной в таблице I, которая состоит из такой же комбинации; (2) последовательность CDR1; CDR2, приведенная в таблице I, и последовательность CDR3, приведенная в таблице I (в котором, последовательность CDR2 и последовательность CDR3 могут принадлежать к разным комбинациям).

Некоторые даже более предпочтительные нанотела изобретения могут, например, содержать: (1) последовательность CDR1, которая имеет более чем 80% идентичность последовательности с одной из последовательностей CDR1, указанной в таблице I; последовательность CDR2, приведенная в таблице I, которая состоит из такой же комбинации; и последовательность CDR3, указанная в таблице I, которая принадлежит к разной комбинации; или (2) последовательность CDR1, указанная в таблице I; последовательность CDR2, которая имеет 3, 2 или 1 аминокислотные отличия с последовательностью CDR2, указанной в таблице I, которая состоит из такой же комбинации; и более чем 80% идентичности последовательности с последовательностью CDR3, приведенной в таблице I, которая состоит из той же разной комбинации.

Особенно предпочтительные нанотела изобретения могут, например, содержать последовательность CDR1, указанную в таблице I, последовательность CDR2, которая имеет более чем 80% идентичность последовательности с последовательностью CDR2, указанной в таблице I, которая состоит из такой же комбинации; и последовательность CDR3, указанную в таблице I, которая принадлежит к аналогичной.

В наиболее предпочтительном в нанотелах изобретения, имеющиеся последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 подходящим образом выбираются из одной комбинации последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, приведенной в таблице I.

Предпочтительно, если последовательность CDR подходящим образом выбирается из группы последовательностей CDR, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из последовательностей CDR, приведенных в таблице I; и/или если CDR последовательность подходящим образом выбирается из группы, состоящей из последовательностей CDR, которые имеют 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с одной из последовательностей CDR, приведенных в таблице I, то:

- любая аминокислотная замена представляет собой, предпочтительно консервативную аминокислотную замену (как определено здесь); и/или

- указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены, и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с последовательностью CDR, приведенной в таблице I.

В соответствии с неограничивающим, но предпочтительным воплощением изобретения, последовательности CDR в нанотелах изобретения представляют собой те, которые описаны выше, и также такие, что нанотела изобретения связываются с TNF-альфа с константой диссоциации (K_D) 10^-5- 10^-12 моль/литр (M) или менее, и предпочтительно 10^-7- 10^-12 моль/литр (M) или менее и более предпочтительно 10^-8- 10^-12 моль/литр (M), и/или с константой ассоциации (K_A), по меньшей мере, 10⁷ M^-1, предпочтительно, по меньшей мере, 10⁸ M^-1, более предпочтительно, по меньшей мере, 10⁹ M^-1, такой как, по меньшей мере, 10¹² M^-1; и в частности с K_D менее 500 нM, предпочтительно менее 200 нM, более предпочтительно менее 10 нM, такой как менее 500 нM. Значения K_D и K_A нанотел изобретения против TNF-альфа могут определяться способом, известным самим по себе, например, с помощью анализа, здесь описываемого.

В соответствии с другим предпочтительным, но не ограничивающим, воплощением изобретения (a) CDR1 имеет длину между 1 и 12 аминокислотными остатками, и, как правило, между 2 и 9 аминокислотными остатками, такую как в 5, 6 или 7 аминокислотных остатка; и/или (b) CDR2 имеет длину между 13 и 24 аминокислотными остатками, и, как правило, между 15 и 21 аминокислотными остатками, такую как в 16 и 17 аминокислотных остатка; и/или (c) CDR3 имеет длину между 2 и 35 аминокислотными остатками, и, как правило, между 3 и 30 аминокислотными остатками, такую как между 6 и 23 аминокислотными остатками.

В одном аспекте, изобретение обеспечивает нанотела против TNF-альфа, которые лучше производятся, чем нанотела 3E, лучше производятся, чем нанотела по WO 04/041862.

В частности, некоторыми предпочтительными аспектами этого воплощения изобретения являются:

- Нанотело против TNF-альфа, которое состоит из 4 каркасных областей (FR1 - FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1 - CDR3, соответственно), которое имеет значение K_offдля TNF лучше чем 2·10^-3 (1/с), предпочтительно лучше 1·10^-3 (1/с); или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело против TNF-альфа, которое состоит из 4 каркасных областей (FR1 - FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1 - CDR3, соответственно), которое имеет значение EC50, определенное по клеточному анализу при использовании клеток линии KYM, описанного в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое выше значения EC50 для нанотела VHH 3E (SEQ ID NO:4) из WO 04/041862 по результатам того же анализа; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело против TNF-альфа, которое имеет значение EC50, определенное по клеточному анализу при использовании клеток линии KYM, описанного в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 12 нM; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело против TNF-альфа, которое имеет значение EC50, определенное по клеточному анализу при использовании клеток линии KYM, описанного в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 5 нM; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело против TNF-альфа, имеет значение EC50, определенное по клеточному анализу при использовании клеток линии KYM, описанного в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 3 нM; или гуманизированный вариант такого нанотела;

со следующими особенно предпочтительными аспектами:

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), которое представляет собой нанотело класса GLEW.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), которое содержит аргининовый остаток (R) в положении 103.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), которое представляет собой гуманизированное нанотело.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), которое содержит лейциновый остаток (L) в положении 108.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), которое имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) или 96 (TNF30).

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором

- CDR1 содержит:

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с аминокислотной последовательностью DYWMY;

и

- CDR2 содержит:

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG;

и

- CDR3 содержит:

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с аминокислотной последовательностью SPSGFN.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором:

- CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN; или

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором

- CDR1 представляет собой:

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью DYWMY;

и в котором:

- CDR2 представляет собой:

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью EINTNGLITKYPDSVKG;

и в котором

- CDR3 представляет собой:

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью SPSGFN.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором:

- CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN; или

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором

- любая аминокислотная замена представляет собой, предпочтительно, консервативную аминокислотную замену; и/или

и с некоторыми другими особенно предпочтительные аспектами, а именно:

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), которое представляет собой нанотело класса KERE.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), которое имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 50 (TNF3), 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) или 98 (TNF33).

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором

- CDR1 содержит:

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью NYYMG;

и

- CDR2 содержит:

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с аминокислотной последовательностью NISWRGYNIYYKDSVKG;

и

- CDR3 содержит:

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью SILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность NYYMG.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором CDR2 содержит аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором CDR3 содержит аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором:

- CDR1 содержит аминокислотную последовательность NYYMG; и CDR2 содержит аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG; или

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность NYYMG; CDR2 содержит аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY и CDR3 содержит аминокислотную последовательность ILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором

- CDR1 представляет собой:

и

- CDR2 представляет собой:

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(ия) с аминокислотной последовательностью NISWRGYNIYYKDSVKG;

и

- CDR3 представляет собой:

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором:

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG; CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность ILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по любому из XXI) - XXV), в котором

и с еще некоторыми другими, особенно предпочтительными аспектами, а именно:

- Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из, по меньшей мере, одного нанотела по любому из XXI) - XXV).

- Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI) - XXV).

- Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI) - XXV), и который таков, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, которое опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора.

- Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI) - XXV), и который способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF .

- Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI) - XXV), связанных посредством пригодного линкера.

- Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI) - XXV), связанных посредством пригодного линкера, и которое является пегилированным.

- Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI) - XXV), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека.

- Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI) - XXV), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, и которое является таковым, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, что опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора.

- Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI) - XXV), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, и который способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF .

- Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI) - XXV), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, в котором каждый из двух нанотел по любому из XXI) - XXV) связан, необязательно через пригодный линкер, с одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека.

- Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI) - XXV), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, в котором каждый из двух нанотел по любому из XXI) - XXV) связан, необязательно через пригодный линкер, с одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека, и которое является таковым, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, которое опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора.

- Белок или полипептид, который содержит два нанотела по любому из XXI) - XXV), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, в котором каждый из двух нанотел по любому из XXI) - XXV) связан, необязательно через пригодный линкер, с одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека, и который способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF .

- Белок или полипептид по любому из XXVI) - XXXVII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированное нанотело.

- Белок или полипептид по любому из XXVI) - XXXVII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированный вариант нанотела ALB 1 (SEQ ID NO: 63).

- Белок или полипептид по любому из XXVI) - XXXVII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, выбирается из группы, состоящей из ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB 5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB 8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) и ALB 10 (SEQ ID NO: 104).

- Белок или полипептид по любому из XXVI) - XXXVII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой ALB 8.

- Белок или полипептид по любому из XXVI) - XXXVII), который содержит или по существу состоит из двух гуманизированных нанотел по любому из XXI) - XXV), и одного гуманизированного варианта нанотела ALB 1 (SEQ ID NO: 63).

Следует отметить, что если нанотело представляет собой, указанное выше, как “по любому из вышеуказанных XXI) - XXV)”, то оно представляет собой, по меньшей мере, по одному из XXI) - XXV), может быть по двум или более из XXI) - XXV), и также может включать любой один или более из других аспектов, которые указаны как “по любому из вышеуказанных XXI) - XXV)”. Аналогично, если белок или полипептид представляет собой, указанное выше, как “по любому из вышеуказанных XXVI) - XXXVII)”, то он представляет собой, по меньшей мере, по одному из XXVI) - XXXVII), может быть по двум или более из XXVI) - XXXVII), и также может включать любой один или более из других аспектов, которые указаны как “по любому из вышеуказанных XXVI) - XXXVII) ”.

Клон, который, как было обнаружено, является особенно пригодным в качестве анти-TNF нанотела, представляет собой клон PMP1C2 (TNF1). Как можно видеть из сравнительных данных KYM-анализа в таблице 39, TNF1 имеет значение EC₅₀, которое в четыре раза больше такового для лучшего моновалентного нанотела, описанного в WO 04/41862 (нанотело 3E), а именно, 2466 нM для PMP1C2 в сравнении с 12 нM для 3E (как можно увидеть из таблицы 39, все нанотела TNF1 - TNF 9 изобретения обеспечивают лучшие значения EC50 в данном анализе, чем 3E). В связи с этим, также необходимо отметить, что нанотело 3E из WO 04/41862 принадлежит к “ классу KERE ” (как здесь описывается), и может, следовательно, гуманизироваться в меньшей степени, чем нанотело PMP1C2 (которое принадлежит к “ классу GLEW”). Если нанотело PMP1C2 сравнивать с нанотелом 1A из WO 04/41862, нанотело класса GLEW с большей степенью гомологии в последовательности с PMP1C2 (по обоим CDR и каркасам), то значение EC_50, полученное для PMP1C2 в анализе KYM, более чем в 50 раз лучше, т.е. 2,466 нM для PMP1C2 по сравнению с 100 нM для 1A.

Соответственно, нанотела, которые содержат одну или более, предпочтительно любые две и более, предпочтительно все три имеющиеся CDR в клоне PMP1C2 (или последовательности CDR, которые получены из него или аналогичны ему) являются особенно предпочтительными в изобретении. Также, эти нанотела предпочтительно принадлежат к “103 P,R,S группе” (как определено здесь), и наиболее предпочтительно имеют R в положении 103, и предпочтительно также содержат GLEW или GLEW-подобную последовательность в положениях 44-47. Также, если эти нанотела принадлежат к “103 P, R, S группе” (и, в частности, если они имеют R в положении 103), одной предпочтительной, но не ограничивающей, гуманизированной заменой является 108Q на 108L. Другие предпочтительные, но не ограничивающие, гуманизированные замены в данных предпочтительных нанотелах представляют собой одну или более из тех, которые присутствуют в гуманизированных вариантах TNF1, описываемых здесь, как, например, TNF13, TNF14, TNF 29 или TNF30, как будет немедленно понятно при сравнении последовательности TNF1 с этими гуманизированными последовательностями.

Таким образом, в особенно предпочтительном нанотеле изобретения, по меньшей мере, одна из имеющихся последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 подходящим образом выбирается из группы, состоящей из последовательности CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательность CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательности CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно (т.е. последовательностей CDR, присутствующих в клоне TNF1), или из группы последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно по меньшей мере, 99% “ идентичность последовательности” (как определено здесь) с последовательностью CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательностью CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательностью CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют 3, 2 или только1 “аминокислотное(ых) отличие(я)” (как определено здесь) с последовательностью CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательностью CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательностью CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно.

Предпочтительно, в данных предпочтительных нанотелах изобретения, по меньшей мере, две из присутствующих последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 подходящим образом выбираются из группы, состоящей из последовательности CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательности CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательности CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно (т.е. последовательностей CDR, присутствующих в клоне TNF1), или из группы последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно по меньшей мере, 99% “идентичность последовательности” (как определено здесь) с последовательностью CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательностью CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательностью CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют 3, 2 или только1 “аминокислотное(ых) отличие(я)” (как определено здесь) с последовательностью CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательностью CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательностью CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно.

Наиболее предпочтительно, в данных предпочтительных нанотелах изобретения, все три присутствующие последовательности CDR1, CDR2 и CDR3 подходящим образом выбираются из группы, состоящей из последовательности CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательности CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательности CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно (т.е. последовательностей CDR, присутствующих в клоне TNF1), или из группы последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% “ идентичность последовательности” (как определено здесь) с последовательностью CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательностью CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательностью CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно, которые имеют 3, 2 или только 1 “аминокислотное(ых) отличие(я)” (как определено здесь) с последовательностью CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательностью CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательностью CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно.

Даже более предпочтительно, в данных предпочтительных нанотелах изобретения, по меньшей мере, одна из присутствующих последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 подходящим образом выбирается из группы, состоящей из последовательности CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательности CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательности CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно (т.е. последовательностей CDR, присутствующих в клоне TNF1). Предпочтительно, в этом воплощении, по меньшей мере, одна или предпочтительно обе другие две имеющиеся последовательности CDR подходящим образом выбираются из последовательностей CDR, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с последовательностью CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательностью CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательностью CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно; и/или подходящим образом выбираются из группы, состоящей из последовательностей CDR, которые имеют 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с последовательностью CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательностью CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательностью CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно.

Даже более предпочтительно, в данных предпочтительных нанотелах изобретения, по меньшей мере, две из присутствующих последовательностей CDR1, CDR2 и CDR3 подходящим образом выбираются из группы, состоящей из последовательности CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательности CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательности CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно (т.е. последовательностей CDR, присутствующих в клоне TNF1). Предпочтительно, в этом воплощении, оставшаяся имеющаяся последовательность CDR подходящим образом выбираются из группы последовательностей CDR, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с последовательностью CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательностью CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательностью CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно; и/или из группы, состоящей из последовательностей CDR, которые имеют 3, 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с последовательностью CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательностью CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательностью CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно.

Особенно предпочтительные нанотела изобретения содержат последовательность CDR1 из SEQ ID NO: 164, последовательность CDR2 из SEQ ID NO: 232, и последовательность CDR3 из SEQ ID NO: 300, соответственно (т.е. последовательности CDR, присутствующие в клоне TNF1).

Нанотела с вышеуказанными последовательностями CDR предпочтительно имеют каркасные последовательности, которые здесь описываются. Некоторые особенно предпочтительные, но не ограничивающие, комбинации каркасных последовательностей можно видеть в вышеприведенной таблице I. Как будет ясно для специалиста, комбинация последовательностей FR1, FR2, FR3 и FR4, которые встречаются в том же клоне (т.е. последовательностей FR1, FR2, FR3 и FR4, которые указаны на одной линии в таблице I), будут, как правило, предпочтительными (хотя изобретение в широком смысле не ограничивается ими, и также содержит другие пригодные комбинации каркасных последовательностей, указанных в таблице I).

А именно, некоторыми предпочтительными аспектами этого воплощения изобретения являются:

- Нанотело против TNF-альфа, которое состоит из 4 каркасных областей (FR1 - FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1 - CDR3, соответственно), в котором:

- CDR1 содержит:

- аминокислотные последовательности, которые имеют только 1 аминокислотное отличие с аминокислотной последовательностью DYWMY;

и

- CDR2 содержит:

и

- CDR3 содержит:

- аминокислотные последовательности, которые имеют только 1 аминокислотное отличие с аминокислотной последовательностью SPSGFN.

- Нанотело по XXXVIII), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY.

- Нанотело по XXXVIII), в котором CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG.

- Нанотело по XXXVIII), в котором CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по XXXVIII), в котором:

- Нанотело по XXXVIII), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по XXXVIII), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность DYWMY; CDR2 содержит аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG и CDR3 содержит аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по XXXVIII), в котором

- Нанотело по XXXVIII), которое представляет собой нанотело класса GLEW.

- Нанотело по XXXVIII), которое содержит аргининовый остаток (R) в положении 103.

- Нанотело по XXXVIII), которое имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) или 96 (TNF30).

- Нанотело по XXXVIII), которое представляет собой гуманизированное нанотело.

- Нанотело по XXXVIII), которое содержит лейциновый остаток (L) в положении 108.

- Нанотело по XXXVIII), которое имеет значение K_off для TNF лучше 2·10^-3 (1/с), предпочтительно лучше 1·10^-3 (1/с); или гуманизированный вариант такого нанотела;

- Нанотело по XXXVIII), которое имеет значение EC50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше значения EC50 для нанотела VHH 3E (SEQ ID NO:4) из WO 04/041862 по результатам того же анализа; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XXXVIII), которое имеет значение EC50 по клеточному анализу при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 5нM; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XXXVIII), которое имеет значение EC50 по клеточному анализу при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 3нM; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотела против TNF-альфа, которое состоит из 4 каркасных областей (FR1 - FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1 - CDR3 соответственно), в котором:

- CDR1 представляет собой

и в котором:

- CDR2 представляет собой

и в котором:

- CDR3 представляет собой

- Нанотело по XXXIX), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY.

- Нанотело по XXXIX), в котором CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG.

- Нанотело по XXXIX), в котором CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN

- Нанотело по XXXIX), в котором:

- Нанотело по XXXIX), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по XXXIX), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность DYWMY; CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность EINTNGLITKYPDSVKG и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SPSGFN.

- Нанотело по XXXIX), в котором:

- Нанотело по XXXIX), которое представляет собой нанотело класса GLEW.

- Нанотело по XXXIX), которое содержит аргининовый остаток (R) в положении 103.

- Нанотело по XXXIX), которое имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO 52 (TNF1), 76 (TNF13), 77 (TNF14), 95 (TNF29) или 96 (TNF30).

- Нанотело по XXXIX), которое представляет собой гуманизированное нанотело.

- Нанотело по XXXIX), которое содержит лейциновый остаток (L) в положении 108.

- Нанотело по XXXIX), которое имеет значение K_off для TNF лучше 2·10^-3 (1/с), предпочтительно лучше 1·10^-3 (1/с); или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XXXIX), которое имеет значение EC50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше значения EC50 для нанотела VHH 3E (SEQ ID NO:4) из WO 04/041862 по тому же анализу, или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XXXIX), которое имеет значение EC50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 5нM; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XXXIX), имеет значение EC50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 3нM; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XXXIX), которое выбирается из группы, состоящей из TNF 13 (SEQ ID NO: 76), TNF 14 (SEQ ID NO: 77), TNF 29 (SEQ ID NO: 95) и TNF 30 (SEQ ID NO:96).

- Нанотело по XXXIX), которое представляет собой TNF 30 (SEQ ID NO: 96);

с некоторыми другими предпочтительными аспектами:

- Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из нанотела по XXXVIII) или XXXIX).

- Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из, по меньшей мере, одного нанотела по XXXVIII) или XXXIX) .

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит два нанотела по XXXVIII) или XXXIX) .

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит два нанотела по XXXVIII) или XXXIX), и который таков, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, которое опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит два нанотела по XXXVIII) или XXXIX), и который способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF .

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит два нанотела по XXXVIII) или XXXIX), которые непосредственно связаны друг с другом или связаны друг с другом посредством линкера.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит два нанотела по XXXVIII) или XXXIX), которые связаны друг с другом посредством аминокислотной последовательности.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит два нанотела по XXXVIII) или XXXIX), которые связаны друг с другом посредством аминокислотной последовательности (как, например, без ограничения, посредством аминокислотной последовательности, которая содержит глициновые и сериновые остатки), которая содержит, по меньшей мере, 14 аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере, 17 аминокислот, например, около 20-40 аминокислот (например, как линкер GS30).

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит или по существу состоит из полипептида TNF 7 (SEQ ID NO: 73), в котором оба нанотела TNF 1 гуманизированы .

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит или по существу состоит из полипептида TNF 55 (SEQ ID NO: 419) или TNF 56 (SEQ ID NO: 420).

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который является пегилированным.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит два нанотела по XXXVIII) или XXXIX), и который таков, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, которое опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора; и/или который таков, что указанный белок или полипептид способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF, и который белок или полипептид дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит два нанотела по XXXVIII) или XXXIX), и который белок или полипептид дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, в котором два нанотела по XXXVIII) или XXXIX) связаны друг с другом посредством, по меньшей мере, одного нанотела, направленного против сывороточного альбумина человека, и в котором два нанотела по XXXVIII) или XXXIX) либо связаны непосредственно с, по меньшей мере, одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека, либо связаны с, по меньшей мере, одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека, посредством линкера.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит два нанотела по XXXVIII) или XXXIX), и который белок или полипептид дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, в котором два нанотела по XXXVIII) или XXXIX) связаны друг с другом посредством, по меньшей мере, одного нанотела, направленного против сывороточного альбумина человека, и в котором два нанотела по XXXVIII) или XXXIX) либо связаны непосредственно с, по меньшей мере, одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека, либо связаны с, по меньшей мере, одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека, посредством линкера, в котором линкер представляет собой аминокислотную последовательность (как, например, без ограничения, линкер, который содержит глициновые и сериновые остатки), и, в особенности, аминокислотную последовательность, которая содержит 3 - 40 аминокислотных остатка, например, 5 - 15 аминокислотных остатка (как, например, линкер GS9).

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит два нанотела по XXXVIII) или XXXIX), и который белок или полипептид дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, в котором два нанотела по XXXVIII) или XXXIX) связаны друг с другом посредством, по меньшей мере, одного нанотела, направленного против сывороточного альбумина человека, и в котором два нанотела по XXXVIII) или XXXIX) либо связаны непосредственно с, по меньшей мере, одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека, либо связаны с, по меньшей мере, одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека, посредством линкера, и который белок или полипептид таков, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, которое опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора; и/или который белок или полипептид таков, что указанный белок или полипептид способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированное нанотело.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированный вариант нанотела ALB 1 (SEQ ID NO: 63).

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, выбирается из группы, состоящей из ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB 5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB 8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) и ALB 10 (SEQ ID NO: 104).

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой ALB 8.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит или по существу состоит из двух гуманизированных нанотел по любому из XL) или XLI) и одного гуманизированного варианта нанотела ALB 1 (SEQ ID NO: 63).

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит или по существу состоит из полипептида TNF24 (SEQ ID NO: 90), в котором оба нанотела TNF 1, а также нанотело ALB 1, гуманизированы.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит или по существу состоит из двух нанотела TNF 30 и одного нанотела ALB 8.

- Белок или полипептид по любому из XL) или XLI), который содержит или по существу состоит из полипептида TNF 60 (SEQ ID NO: 417).

Следует отметить, что если нанотело представляет собой, указанное выше, как “по XXXVIII” или “по XXXIX”, то оно представляет собой, по меньшей мере, по одному из XXXVIII) и/или XXXIX), и также может включать любой один или более из других аспектов, которые указаны как “по XXXVIII” или “по XXXIX” Аналогично, если белок или полипептид представляет собой, указанное выше, как “по любому из вышеуказанных XL) или XLI)”, то он представляет собой, по меньшей мере, по одному из XL) - XLI), может быть по двум или более из XL) - XLI), и также может включать любой один или более из других аспектов, которые указаны как “по любому из вышеуказанных XL) или XLI)”.

Для нанотел, основанного на вышеуказанном нанотеле TNF1 (включая, но не ограничиваясь, гуманизированные нанотела), каркасные последовательности могут, как правило, быть, как здесь описывается, и предпочтительно представляют собой следующие:

- FR1 содержит или представляет собой:

- аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 130; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют только 1 аминокислотное отличие с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 130;

и

- FR2 содержит или представляет собой:

- аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 198; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 198; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 198;

и

- FR3 содержит или представляет собой:

- аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 266; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 266; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют только 1 аминокислотное отличие с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 266.

и

- FR4 содержит или представляет собой:

- аминокислотную последовательность of SEQ ID NO: 334; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 334; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют только 1 аминокислотное отличие с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 334;

в котором аминокислотные отличия, имеющиеся в каркасных последовательностях, являются более предпочтительными, как здесь описывается.

Нанотела против TNF-альфа, которые содержат каркасные области, как описано выше (т.е. аналогично к TNF1), и в которых, по меньшей мере, одна из каркасных областей (а также, любые две, любые три или все четыре каркасные области) гуманизирована, составляют следующий аспект изобретения. Такие нанотела могут, в частности, иметь CDR, которые таковы, что нанотело имеет значение K_off для TNF лучше 2⋅10^-3 (1/с), предпочтительно лучше 1⋅10^-3 (1/с); и/или иметь CDR, которые таковы, что нанотело имеет значение EC50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше значения EC50 нанотела VHH 3E (SEQ ID NO:4) из WO 04/041862 по аналогичному анализу; и, в частности, лучше 12нM, в частности, лучше 5 нM, даже в особенности лучше 3нM. Кроме того, или альтернативно, такие нанотела предпочтительно направлены против одного и того же эпитопа TNF (т.е. тримера TNF), например, TNF1.

В частности, изобретение относится к нанотелу против TNF-альфа, которое представляет собой гуманизированный вариант нанотела против TNF-альфа, при этом нанотело против TNF-альфа имеет следующие каркасные последовательности: FR1: SEQ ID NO: 130; FR2: SEQ ID NO: 198; FR3: SEQ ID NO: 266; и FR4: SEQ ID NO: 334. Такое нанотело может, в частности, иметь CDR, которые таковы, что нанотело имеет значение K_off для TNF лучше 2⋅10^-3 (1/с), предпочтительно лучше 1⋅10^-3 (1/с); и/или иметь CDR, которые таковы, что нанотело имеет значение EC50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862 которое лучше значения EC50 для нанотела VHH 3E (SEQ ID NO:4) из WO 04/041862 в аналогичном анализе; и, в частности, лучше 12нM, в частности, лучше 5 нM, даже в особенности лучше 3нM. Также, или альтернативно, такие нанотела предпочтительно направлены против одного и того же эпитопа TNF (т.е. тримера TNF), например, TNF1.

Другим клоном, который, как было обнаружено в особенности применим как анти-TNF нанотело, является клон PMP5F10 (TNF3, SEQ ID NO: 60). Как можно увидеть из сравнительных данных KYM-анализа, представленных в таблице 39, TNF3 имеет значение EC_50, которое более чем в 15 раз лучше такового для наилучшего моновалентного нанотела, описанного в WO 04/41862.

Таким образом, нанотела, которые содержат одну или более, предпочтительно любые две и более, предпочтительно все три CDR, имеющиеся в клоне PMP5F10 (или последовательности CDR, которые получены из него или ему соответствуют) являются особенно предпочтительными в изобретении. Также, эти нанотела предпочтительно принадлежат к классу KERE.

- Нанотело против TNF-альфа, которое состоит из 4 каркасных областей (FR1 - FR4, соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1 - CDR3, соответственно), в котором

- CDR1 содержит:

и

- CDR2 содержит:

и

- CDR3 содержит:

- Нанотело по XLII), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность NYYMG.

- Нанотело по XLII), в котором CDR2 содержит аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG.

- Нанотело по XLII), в котором CDR3 содержит аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по XLII), в котором:

- Нанотело по XLII), в котором CDR1 содержит аминокислотную последовательность NYYMG; CDR2 содержит аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY и CDR3 содержит аминокислотную последовательность ILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по XLII), в котором

- Нанотело по XLII), которое представляет собой нанотело класса KERE.

- Нанотело по XLII), которое имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO 50 (TNF3), 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) или 99 (TNF33).

- Нанотело по XLII), которое представляет собой гуманизированное нанотело.

- Нанотело по XLII), которое имеет значение K^off для TNF лучше 2⋅10^-3(1/с), предпочтительно лучше 1⋅10^-3(1/с); или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XLII), которое имеет значение EC50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше значения EC50 для нанотела VHH 3E (SEQ ID NO:4) из WO 04/041862 по тому же анализу; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XLII), которое имеет значение EC50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 5нM; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XLII), которое имеет значение EC50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 3нM; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- CDR1 представляет собой:

и

- CDR2 представляет собой:

и

- CDR3 представляет собой:

- Нанотело по XLIII), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG.

- Нанотело по XLIII), в котором CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность NISWRGYNIYYKDSVKG.

- Нанотело по XLIII), в котором CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по XLIII), в котором:

- Нанотело по XLIII), в котором CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность NYYMG; CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность SILPLSDDPGWNTY и CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность ILPLSDDPGWNTY.

- Нанотело по XLIII), в котором

- Нанотело по XLIII), которое представляет собой нанотело класса KERE.

- Нанотело по XLIII), которое имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO 50 (TNF3), 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) или 99 (TNF33).

- Нанотело по XLIII), которое представляет собой гуманизированное нанотело.

- Нанотело по XLIII), которое имеет значение K_off для TNF лучше 2⋅10^-3(1/с), предпочтительно лучше 2⋅10^-3(1/с); или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XLIII), которое имеет значение EC50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше значения EC50 для нанотела VHH 3E (SEQ ID NO:4) из WO 04/041862 по тому же анализу; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XLIII), которое имеет значение EC50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое составляет лучше 5нM; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XLIII), которое имеет значение EC50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862 которое лучше 3нM; или гуманизированный вариант такого нанотела.

- Нанотело по XLIII), которое выбирается из группы, состоящей из SEQ ID NO 83 (TNF20), 85 (TNF21), 85 (TNF22), 96 (TNF23) или 98 (TNF33), TNF 13 (SEQ ID NO: 76), TNF 14 (SEQ ID NO: 77), TNF 29 (SEQ ID NO: 95) и TNF 30 (SEQ ID NO:96)

с некоторыми другими предпочтительными аспектами, а именно:

- Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из нанотела по XLII) или XLIII).

- Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из, по меньшей мере, одного нанотела по XLII) или XLIII).

- Белок или полипептид, который содержит два нанотела по XLII) или XLIII).

- Белок или полипептид, который содержит два нанотела по XLII) или XLIII), и который таков, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, которое опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора.

- Белок или полипептид, который содержит два нанотела по XLII) или XLIII), и который способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF.

- Белок или полипептид по любому из XLIV) или XLVIII), который содержит или по существу состоит из полипептида TNF 6 (SEQ ID NO: 72) или TNF 9 (SEQ ID NO: 75), в котором оба нанотела TNF 3 гуманизированны.

- Белок или полипептид по любому из XLIV) или XLVIII), который является пегилированным.

- Белок или полипептид, который содержит два нанотела по XLII) или XLIII), и который таков, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, которое опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора; и/или который таков, что указанный белок или полипептид способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF, и где белок или полипептид дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека.

- Белок или полипептид по любому из XLIV) или XLVIII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированное нанотело.

- Белок или полипептид по любому из XLIV) или XLVIII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированный вариант нанотела ALB 1 (SEQ ID NO: 63).

- Белок или полипептид по любому из XLIV) или XLVIII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, выбирается из группы, состоящей из ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB 5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB 8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) и ALB 10 (SEQ ID NO: 104).

- Белок или полипептид по любому из XLIV) или XLVIII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой ALB 8.

- Белок или полипептид по любому из XLIV) или XLVIII), который содержит или по существу состоит из двух гуманизированных нанотел по любому из XLIV) или XLVIII) и одного гуманизированного варианта нанотела ALB 1 (SEQ ID NO: 63).

- Белок или полипептид по любому из XLIV) или XLVIII), который содержит или по существу состоит из полипептида TNF26 (SEQ ID NO: 92), в котором оба нанотела TNF 3, а также нанотело ALB 1, гуманизированы .

Следует отметить, что если нанотело обозначается как “по XLII” или “по XLIII”, это соответствует, по меньшей мере, по одному из XLII) и/или XLIII), и может также включать любой один или более других аспектов, которые обозначаются выше как “по XLII)” или “по XLIII)”. Аналогично, если белок или полипептид обозначается как “по любому из XLIV) или XLVIII)”, то соответствует, по меньшей мере, по одному из XL) - XLI), может быть по двум или более из XLIV) - XLVIII), и может также включаться любой один или более из других аспектов, которые указываются как “по любому из вышеуказанных XLIV) или XLVIII).

Для нанотел, основанных на вышеуказанном нанотеле TNF3 (включая, но не ограничиваясь, гуманизированные нанотела), каркасные последовательности могут являться, в целом, как здесь описывается, и предпочтительно следующими:

- FR1 содержит или представляет собой:

- аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138;или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 138; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют только 1 аминокислотное отличие с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 138;

и

- FR2 содержит или представляет собой:

- аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 206; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 206; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют 2 или только 1 аминокислотное(ых) отличие(я) с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 206;

и

- FR3 содержит или представляет собой:

- аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 274; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 274; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют только 1 аминокислотное отличие с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 274.

и

- FR4 содержит или представляет собой:

- аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 342; или

- аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 342; или

- аминокислотные последовательности, которые имеют только 1 аминокислотное отличие с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 342;

где аминокислотные отличия, имеющиеся в каркасных последовательностях, более предпочтительны, как здесь описывается.

В другом аспекте, изобретение относится к нанотелу с аминокислотной последовательностью, которая выбирается из группы, состоящей из SEQ ID NO: 52 - 60, из группы, состоящей из SEQ ID NO: 76 - 86, из группы, состоящей из SEQ ID NO: 95 - 99, из группы, состоящей из SEQ ID NO 105 - 129 или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют более 80%, предпочтительно более 90%, более предпочтительно более 95%, а также 99% или более “ идентичности последовательности” (как определено здесь) с одной или более аминокислотный последовательностей из SEQ ID NO: 52 - 60, SEQ ID NO: 76 - 86, SEQ ID NO: 95 - 99 или SEQ ID NO 105 - 129, где последние аминокислотные последовательности наиболее предпочтительно имеют каркасные последовательности, которые являются таковыми, как дополнительно указывается ниже в общем описании каркасных последовательностей нанотел.

В соответствии со специфическим, но не ограничивающим, воплощением последние аминокислотные последовательности являются “гуманизированными”, как дополнительно здесь описывается.

Наиболее предпочтительно, нанотела изобретения выбираются из группы, состоящей из SEQ ID NO: 52 - 60, из группы, состоящей из SEQ ID NO: 76 - 86, из группы, состоящей из SEQ ID NO: 95 - 99, или из группы, состоящей из SEQ ID NO 105 -129, из которых “гуманизированные” нанотела из SEQ ID NO 76 - 86 и SEQ ID NO: 95 - 99 могут являться особенно предпочтительными.

Как указано выше, особенно предпочтительное нанотело изобретения представляет собой клон PMP1C2 (TNF1; SEQ ID NO: 52). Таким образом, в предпочтительном аспекте, изобретение относится к нанотелу с аминокислотной последовательностью, которая выбирается из группы, состоящей из SEQ ID NO: 52 или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют более чем 80%, предпочтительно более чем 90%, более предпочтительно более чем 95%, а также 99% или более “идентичности последовательности” (как определено здесь) с аминокислотной последовательностью из SEQ ID NO:52, где последние аминокислотные последовательности наиболее предпочтительно имеют каркасные последовательности, которые являются таковыми, как дополнительно указывается ниже в общем описании каркасных последовательностей нанотел.

Особенно предпочтительными являются гуманизированные варианты клона PMP1C2 (TNF1; SEQ ID NO: 52). Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, примеры таких гуманизированных вариантов являются клоны TNF13 (SEQ ID NO: 76), TNF14 (SEQ ID NO:77), TNF29 (SEQ ID NO: 95) и TNF 30 (SEQ ID NO: 96). Таким образом, в предпочтительном аспекте, изобретение относится к гуманизированному нанотелу с аминокислотной последовательностью, которая выбирается из группы, состоящей из SEQ ID NO: 76, 77, 95 или 96, или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют более чем 80%, предпочтительно более чем 90%, более предпочтительно более чем 95%, а также 99% или более “идентичности последовательности” (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO: 76, 77, 95 или 96, где последние аминокислотные последовательности наиболее предпочтительно имеют каркасные последовательности, которые являются таковыми, как дополнительно указывается ниже в общем описании каркасных последовательностей нанотел.

В соответствии с одним предпочтительным воплощением, нанотело изобретения представляет собой гуманизированный вариант нанотела TNF 1 (SEQ ID NO: 52).

Некоторыми предпочтительными аспектами этого воплощения изобретения являются:

- Гуманизированный вариант нанотела TNF 1, который имеет значение K_offдля TNF лучше 2⋅10^-3 (1/с), предпочтительно лучше 1⋅10^-3 (1/с).

- Гуманизированный вариант нанотела TNF 1, который имеет значение EC50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше значения EC50 для нанотела VHH 3E (SEQ ID NO:4) из WO 04/041862 по тому же анализу.

- Гуманизированный вариант нанотела TNF 1, который имеет значение EC50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 5нM.

- Гуманизированный вариант нанотела TNF 1, который имеет значение EC50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 3нM.

- Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из, по меньшей мере, одного нанотела, которое представляет собой гуманизированный вариант нанотела TNF 1 по любому из вышеуказанных XLIX) - LII)

- Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из двух нанотел, которые являются гуманизированными вариантами нанотела TNF 1 по любому из вышеуказанных XLIX) - LII) (необязательно связанных посредством линкера).

- Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из двух нанотел, которые являются гуманизированными вариантами нанотела TNF 1 по любому из вышеуказанных XLIX) - LII) (необязательно связанных посредством линкера), и которые таковы, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, которое опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора.

- Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из двух нанотел, которые являются гуманизированными вариантами нанотела TNF 1 по любому из вышеуказанных XLIX) - LII) и которые способны к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF.

- Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из полипептида TNF 7 (SEQ ID NO: 73), в котором оба нанотела TNF 1 гуманизированы.

- Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из полипептида TNF 7 (SEQ ID NO: 73), в котором оба нанотела TNF 1 гуманизированы, и который является пегилированным.

- Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из двух Нанотел, которые являются гуманизированными вариантами нанотела TNF 1 по любому из вышеуказанных XLIX) - LII), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно Нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека.

- Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из двух нанотел, которые являются гуманизированными вариантами нанотела TNF 1 по любому из вышеуказанных XLIX) - LII), где каждый связан (необязательно связаны посредством линкера) с одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека.

- Белок или полипептид по любому из LIII) - LX), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированное нанотело.

- Белок или полипептид по любому из LIII) - LX), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированный вариант нанотела ALB 1 (SEQ ID NO: 63).

- Белок или полипептид по любому из LIII) - LX), в котором, по меньшей мере, одно ннотело, направленное против сывороточного альбумина человека, выбирается из группы, состоящей из ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB 5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB 8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) и ALB 10 (SEQ ID NO: 104).

- Белок или полипептид по любому из LIII) - LX), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой ALB 8.

- Белок или полипептид по любому из LIII) - LX), который содержит или по существу состоит из полипептида TNF24 (SEQ ID NO: 90), в котором оба нанотела TNF 1, также как и нанотело ALB TNF 1, гуманизированы.

- Белок или полипептид по любому из LIII) - LX), который содержит или по существу состоит из двух нанотел TNF 30 и одного нанотела ALB 8.

Согласно одному предпочтительному воплощению, нанотело изобретения представляет собой гуманизированный вариант нанотела TNF 3 (SEQ ID NO: 60).

- Гуманизированный вариант нанотела TNF 3, который имеет значение K_offдля TNF лучше 2⋅10^-3 (1/с), предпочтительно лучше 1⋅10^-3 (1/с).

- Гуманизированный вариант нанотела TNF 3, который имеет значение EC50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862 которое лучше значения EC50 для нанотела VHH 3E (SEQ ID NO:4) из WO 04/041862 по тому же анализу.

- Гуманизированный вариант нанотела TNF 3, который имеет значение EC50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 5нM.

- Гуманизированный вариант нанотела TNF 3, которое имеет значение EC50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 3нM.

- Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из, по меньшей мере, одного нанотела, которое представляет собой гуманизированный вариант нанотела TNF 3 по любому из LXI) - LXIV).

- Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из двух нанотел, которые являются гуманизированными вариантами нанотела TNF 3 по любому из LXI) - LXIV) (необязательно связанных посредством линкера).

- Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из двух нанотел, которые являются гуманизированными вариантами нанотела TNF 3 по любому из LXI) - LXIV) (необязательно связанных посредством линкера), и которые таковы, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать перекрестное сшивание рецептора TNF, которое опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким перекрестным сшиванием рецептора.

- Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из двух нанотел, которые являются гуманизированными вариантами нанотела TNF 3 по любому из LXI) - LXIV) и которые способны к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF.

- Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из полипептида TNF 6 (SEQ ID NO: 72) или TNF 9 (SEQ ID NO: 75), в котором оба нанотела TNF 3 гуманизированы.

- Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из полипептида TNF 6 (SEQ ID NO: 72) или TNF 9 (SEQ ID NO: 75), в котором оба нанотела TNF 3 гуманизированы, и который является пегилированным.

- Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из двух нанотел, которые являются гуманизированными вариантами нанотела TNF 3 по любому из LXI) - LXIV), и который дополнительно содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека.

- Белок или полипептид, который содержит или по существу состоит из двух нанотел, которые являются гуманизированными вариантами нанотела TNF 3 по любому из LXI) - LXIV), каждое из которых связано (необязательно связано посредством линкера) с одним нанотелом, направленным против сывороточного альбумина человека.

- Белок или полипептид по любому из LXV) - LXXII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированное нанотело.

- Белок или полипептид по любому из LXV) - LXXII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой гуманизированный вариант нанотела ALB 1 (SEQ ID NO: 63).

- Белок или полипептид по любому из LXV) - LXXII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, выбирается из группы, состоящей из ALB 3 (SEQ ID NO: 87), ALB 4 (SEQ ID NO: 88), ALB 5 (SEQ ID NO: 89), ALB 6 (SEQ ID NO: 100), ALB 7 (SEQ ID NO: 101), ALB 8 (SEQ ID NO: 102) ALB 9 (SEQ ID NO: 103) и ALB 10 (SEQ ID NO: 104).

- Белок или полипептид по любому из LXV) - LXXII), в котором, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного альбумина человека, представляет собой ALB 8.

- Белок или полипептид по любому из LXV) - LXXII), которое содержит или по существу состоит из полипептида TNF26 (SEQ ID NO: 92), в котором оба нанотела TNF 3, так же как и нанотело ALB 1, гуманизированны.

В другом аспекте, изобретение относится к полипептиду, который содержит или по существу состоит из, по меньшей мере, одного нанотела против TNF-альфа, как определено здесь. Такие полипептиды также относятся здесь к “полипептидам изобретения” и могут являться таковыми, как дополнительно здесь в дальнейшем описывается и/или как, в целом, описывается в WO 04/041862 для нанотел, раскрываемых здесь, и могут, например, быть многовалентными полипептидами или мультиспецифичными полипептидами, опять же, как дополнительно описывается здесь ниже.

Предпочтительно, полипептид изобретения является как бивалентным, так и тривалентным (т.е. содержащий два или три нанотела изобретения, соответственно, необязательно связанных посредством одного или двух линкеров, как определено ниже, соответственно) или мультиспецифичным полипептидом, содержащим одно или два, и предпочтительно два, нанотела изобретения и, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного белка, и в частности, против сывороточного белок человека, а также против сывороточного альбумина человека.

В одном предпочтительном, но не ограничивающем, воплощении, нанотела изобретения, присутствующие в полипептидах изобретения, выбираются из группы, состоящей из SEQ ID NO: 52 - 60 и SEQ ID NO 105-129 или из их гуманизированных вариантов, и в частности из “гуманизированных” нанотел из SEQ ID NO 76 - 86 и SEQ ID NO: 95 - 99. Нанотела против сывороточного альбумина человека, присутствующие в полипептидах изобретения, являются таковыми, как определено ниже, и более предпочтительно выбираются из группы, состоящей из SEQ ID NO: 61 - 67, SEQ ID NO: 87 - 89 и SEQ ID NO: 100-104, и в частности из “гуманизированных” нанотел против сывороточного альбумина человека из SEQ ID NO 76 - 86 и SEQ ID NO 100-104.

В отношении нанотел, присутствующих в полипептидах изобретения, необходимо отметить, что для специалиста будет понятно, что нанотела, которые определены здесь как “предпочтительные” (или как ”более предпочтительные”, “даже более предпочтительные”, и т.д.) являются также предпочтительными (или более предпочтительные, или даже более предпочтительные, и т.д.) для применения в полипептидах, здесь описываемых. Таким образом, полипептиды, которые содержат или по существу состоят из одного или более “предпочтительных” нанотел изобретения, в целом, будут являться предпочтительными, и полипептиды, которые содержат или по существу состоят из одного или более “более предпочтительных” нанотел изобретения, будут, в общем, являться более предпочтительными, и т.д.

Таким образом, в изобретении, полипептиды, которые содержат одно или более нанотела, которые по существу состоят из одного из предпочтительных вариантов клона PMP1C2 (TNF1; SEQ ID NO: 52), где указанные предпочтительные варианты таковы, как определено здесь, являются особенно предпочтительными. Даже более предпочтительными являются полипептиды, которые содержат одно или более нанотела, которые по существу состоят из одного из гуманизированных вариантов клона PMP1C2 (TNF1; SEQ ID NO: 52), где указанные предпочтительные варианты таковы, как определено здесь (примеры включают, без ограничения, TNF13, TNF14, TNF29 и TNF30). TNF30 является особенно предпочтительной гуманизированной “структурной единицей” для применения в полипептидах изобретения.

Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, примеры таких белков и полипептидов являются сами PMP1C2, гуманизированные варианты TNF13, TNF14, TNF29 и TNF30; конструкции SEQ ID NO: 70 (TNF4), SEQ ID NO: 73 (TNF7), SEQ ID NO: 90 (TNF24), SEQ ID NO: 93 (TNF27); и конструкции SEQ ID NO: 417 (TNF60), SEQ ID NO: 419 (TNF55) и SEQ ID NO: 420 (TNF56), где последние три конструкции содержат гуманизированный вариант TNF 30 как структурную единицу.

Как указано здесь, нанотела и конструкции, описываемые здесь, могут быть пегилированными, или содержать одно или более (дополнительные) аминокислотные остатки, которые вводятся для пегилирования и/или облегчения пегилирования. Два предпочтительных, но не ограничивающих, примера таких полипептидов являются TNF55 и TNF56, оба из которых содержат дополнительный цистеиновый остаток для облегчения связывания PEG-группы.

Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, примеры полипептидов изобретения являются бивалентными полипептидами изобретения, содержащими SEQ ID NO: 70 – 75, и мультиспецифичными полипептидами изобретения, содержащими SEQ ID NO: 90 - 94 и SEQ ID NO 417 - 420.

Как можно увидеть из данных, представленных ниже, и в частности из данных, приведенных в Сравнительном примере, нанотела и/или полипептиды изобретения обладают улучшенными свойствами. В частности, белки и полипептиды изобретения могут обладать улучшенным сродством к человеческому TNF-альфа (выраженному как значение EC₅₀ в анализе KYM, описываемому здесь), по сравнению с коммерчески доступными биологическими анти-TNF препаратами Enbrel™, Humira™ и Remicade™. Также, нанотела, описываемые здесь, могут обладать улучшенным сродством к TNF-альфа по сравнению с наилучшими нанотелами, которые описаны в Международной заявке WO 04/041862. Таким образом, можно предположить, что полипептиды изобретения, содержащие, по меньшей мере, одно из нанотел изобретения, будут также обладать улучшенными свойствами по сравнению с полипептидами, которые содержат только нанотела против TNF-альфа, описываемые в WO 04/041862.

Кроме того, полипептид, как описывается здесь, который содержит два или более (и предпочтительно два) нанотел, которые описываются здесь (и необязательно, например, нанотело против сывороточного альбумина человека), имеют значение EC50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше значения EC50 для Humira® и Remicade ®, и, предпочтительно, также лучше для Enbrel® по тому же анализу.

Например, такой белок или полипептид предпочтительно имеет значение EC50, определенное в клеточном анализе при использовании KYM-клеток, описанное в примере 1, под 3), из WO 04/041862, которое лучше 0,2 нM, предпочтительно лучше 0,1 нM, а также лучше чем 0,7 нМ и, в частности, лучше 0,4 нМ.

Также заявителем показывается, что нанотела против мышиного TNF-альфа и полипептиды, содержащие нанотела против мышиного TNF-альфа, демонстрируют существенную биологическую активность в следующих моделях болезней (данные не показаны):

- Модель колита, вызванного введением декстрана сульфата натрия (“DSS”) при использовании как нормальных мышей, так и мышей с нокаутом IL-10, как описывается Okayasu et al. (Gastroenterol 1990, 98(3): 694)

- Модель артрита (“RA”), коллаген-индуцированный артрит (“CIA”), как описывается Courtenay et al. (Nature 1980, 283(5748): 666), при использовании как нормальных мышей, так и мышей с нокаутом IL-10;

- Мышиная модель IBD для мышей с нокаутом IL-10, как, например, описывается Rennick et al. (Clin Immunol Immunopathol 1995, 76(3 Pt 2): S174)

- Модель RA Коллиаса, как, например, описывается Keffer et al. (EMBO J 1991, 10(13): 4025)

- Модель IBD, вызванного введением 2,4,6-тринитробензолсульфоновой кислоты (“TNBS”), как описывается Elson et al. (J Immunol 1996, 157(5): 2174)

- CIA модель RA, описываемая Koppieters et al (рукопись в процессе подготовки);

- Модель фибробластов, полученных из синовиальной оболочки (описываемая ниже); и

- Мышиная модель «воздушный карман».

Предпочтительно, нанотела, описываемые здесь, являются лучше нанотела 1A из WO 04/041862 в, по меньшей мере, одной из вышеуказанных моделях, и предпочтительно во всех этих моделях; и более предпочтительно являются лучше нанотела 3E из WO 04/041862 в, по меньшей мере, одной из вышеуказанных моделях, и предпочтительно во всех этих моделях. Также, полипептиды, описываемые здесь, предпочтительно эквивалентны или лучше Humira® или Remicade ® в, по меньшей мере, одной из вышеуказанных моделях, и предпочтительно во всех этих моделях; и более предпочтительно также эквивалентны или лучше Enbrel®, по меньшей мере, в одной из вышеуказанных моделях, и предпочтительно во всех этих моделях.

Эти данные подтверждают, что нанотела против TNF-альфа и полипептиды, их содержащие, а также нанотела и полипептиды, описываемые в WO 04/041862, и в частности нанотела и полипептиды, описываемые здесь, должны обладать терапевтическим действием против заболеваний и нарушений, опосредованных TNF, а также заболеваний и нарушений, указанных выше.

В другом аспекте, изобретение относится к нуклеиновой кислоте, которая кодирует нанотело изобретения и/или полипептид изобретения. Такая нуклеиновая кислота будет также упоминаться ниже как “нуклеиновая кислота изобретения” и может, например, быть в виде генетической конструкции, как определяется ниже.

В другом аспекте, изобретение относится к хозяину или клетке-хозяину, который экспрессирует или способен к экспрессии нанотела изобретения и/или полипептида изобретения; и/или которая содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую нанотело изобретения и/или полипептид изобретения. Такой хозяин или клетка-хозяин также может быть аналогичным с хозяевами или клетками-хозяевами, описываемыми в WO 04/041862, но экспрессирующий или способный к экспрессии нанотела изобретения и/или полипептида изобретения и/или, содержащий нуклеиновую кислоту, как здесь описывается.

Изобретение дополнительно относится к продукту или композиции, содержащему или состоящему из нанотела изобретения, полипептида изобретения; и/или нуклеиновой кислоты изобретения. Такой продукт или композиция может, например, представлять собой фармацевтическую композицию (как описывается ниже) или продукт или композицию для диагностического применения (что также описывается ниже). Такой продукт или композиция может также быть аналогичным продуктам и композициям, описываемым в WO 04/041862, но содержащий или состоящий из нанотела изобретения, полипептида изобретения или нуклеиновой кислоты изобретения.

Изобретение дополнительно относится к способам приготовления или производства нанотел, полипептидов, нуклеиновых кислот, клеток-хозяев, продуктов и композиций, которые здесь описываются, где способы представляют собой такие, которые дополнительно описываются ниже. Также, в целом, нанотела, полипептиды, нуклеиновые кислоты, клетки-хозяева, продукты и композиции, описываемые здесь, могут также приготавливаться способом, аналогичным со способом, описываемым в WO 04/041862.

Изобретение дополнительно относится к способам применения и использования вышеуказанных нанотел, полипептидов, нуклеиновых кислот, клеток-хозяев, продуктов и композиций, здесь описываемых, где способы применения и использования включают, но не ограничиваются, способы применения и использования, которые описываются ниже, и/или дополнительно способы использования и применения нанотел против TNF-альфа и/или их содержащих полипептидов, указанные в WO 04/041862.

Другие аспекты, воплощения, преимущества и применения изобретения станут ясными из дальнейшего описания.

Подробное описание изобретения

Вышеуказанные и другие аспекты и воплощения изобретения станут ясными из дальнейшего описания, в котором:

- Если не указано или не определено иное, все используемые термины имеют их обычное значение для данной области техники, которое будет понятно для специалиста. Ссылки приведены, например, на общепринятые справочники, а также Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" ( 2nd.Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, “Genes II”, John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Old et al., “Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering”, 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981); Roitt et al., “Immunology” (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al., Roitt’s Essential Immunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK (2001); and Janeway et al., “Immunobiology” (6th Ed.), Garland Science Publishing /Churchill Livingstone, New York (2005), так же как и на общий уровень техники, приводимый здесь;

- Если не указано иное, термин “иммуноглобулиновая последовательность” – используется ли здесь для обозначения антитела к тяжелой цепи или для стандартного четырехцепочечного антитела – применяется как общий термин, включающий как полноразмерное антитело, его отдельные цепи, так же как и все его части, домены или фрагменты (включая, но не ограничиваясь, антигенсвязывающие домены или фрагменты, а также V_HH домены или V_H/V_L домены, соответственно). В дополнении, термин “последовательность”, в используемом здесь значении (например, в терминах, как “иммуноглобулиновая последовательность”, “последовательность антитела, “последовательность вариабельного домена”, “V_HH последовательность” или “белковая последовательность”), должен пониматься, в целом, как включающий и релевантную аминокислотную последовательность, так же как и последовательности нуклеиновых кислот или нуклеотидные последовательности, кодирующие их, если контекстом не предусмотрено более ограниченное значение;

- Если не указано иное, все способы, этапы, техники и манипуляции, которые специально не описываются подробно, могут выполняться и осуществляются способом, по существу известным, который будет понятным для специалиста. Ссылка, например, снова приведена на общепринятые справочники, на общий уровень техники, указанный выше, и дополнительно на ссылки, цитируемые здесь;

- Аминокислотные остатки будут указаны в соответствии с общепринятым трехбуквенным или однобуквенным аминокислотным кодом, как указано в таблице 1;

Таблица 1: однобуквенный и трехбуквенный аминокислотный код

Неполярный, незаряженный (при pH 6,0 – 7,0)⁽³⁾	Аланин	Ala	A
	Валин	Val	V
	Лейцин	Leu	L
	Изолейцин	Ile	I
	Фенилаланин	Phe	F
	Метионин⁽¹⁾	Met	M
	Триптофан	Trp	W
	Пролин	Pro	P
Полярный, незаряженный (при pH 6,0-7,0)	Глицин⁽²⁾	Gly	G
	Серин	Ser	S
	Треонин	Thr	T
	Цистеин	Cys	C
	Аспарагин	Asn	N
	Глутамин	Gln	Q
	Тирозин	Tyr	Y
Полярный, заряженный (при pH 6,0-7,0)	Лизин	Lys	K
	Аргинин	Arg	R
	Гистидин⁽⁴⁾	His	H
	Аспартат	Asp	D
	Глутамат	Glu	E
Примечания: (1) Иногда также считается полярной незаряженной аминокислотой. (2) Иногда также считается неполярная незаряженной аминокислотой. (3) Как будет ясно для специалиста, то, что аминокислотный остаток указывается в этой таблице как либо заряженный или незаряженный при pH 6,0 – 7,0, не отражается в любом случае на заряде, указанный аминокислотный остаток может иметь при pH ниже 6,0 и/или при pH выше 7,0; аминокислотные остатки, указанные в таблице могут быть либо заряженными и/или незаряженными при таких более высоких или низких pH, как будет ясно для специалиста. (4) Как известно из уровня техники, заряд остатка His в целом зависим от даже небольшого изменения pH, но остаток His может рассматриваться, в общем, по существу незаряженным при pH около 6,5.

е) Для целей сравнения двух или более нуклеотидных последовательностей, процент “идентичности последовательности” между первой нуклеотидной последовательности и второй нуклеотидной последовательностью может быть рассчитан путем деления [количества нуклеотидов в первой нуклеотидной последовательности, которое идентично количеству нуклеотидов в соответствующих положениях во второй нуклеотидной последовательности] на [общее количество нуклеотидов в первой нуклеотидной последовательности] и умноженное на [100%], где каждая делеция, инсерция, замена или дополнение нуклеотида во второй нуклеотидной последовательности - сравнительно с первой нуклеотидной последовательностью - рассматривается как отличие в одном нуклеотиде (положении).

Альтернативно, степень идентичности последовательности между двумя или более нуклеотидными последовательностями может быть рассчитана при использовании известного компьютерного алгоритма для анализа последовательностей, а также NCBI Blast v2.0, используя установки по умолчанию.

Некоторые другие способы, компьютерные алгоритмы и установки для определения степени идентичности последовательности, например, описываются в WO 04/037999, EP 0 967 284, EP 1 085 089, WO 00/55318, WO 00/78972, WO 98/49185 и GB 2 357 768-A.

Обычно, для определения процента “идентичности последовательности” между двумя нуклеотидными последовательностями по способу расчета, представленному выше, нуклеотидная последовательность с большим количеством нуклеотидов выбирается в качестве “первой” нуклеотидной последовательности, а другая нуклеотидная последовательность будет являться “второй” нуклеотидной последовательностью;

- Для сравнения двух или более аминокислотных последовательностей, процент “идентичности последовательности” между первой нуклеотидной последовательности и второй нуклеотидной последовательностью может быть рассчитан путем деления [количества аминокислотных остатков в первой нуклеотидной последовательности, которое идентично количеству аминокислотных остатков в соответствующих положениях во второй аминокислотной последовательности] на [общее количество аминокислотных остатков в первой аминокислдотной последовательности] и умноженное на [100%], где каждая делеция, инсерция, замена или дополнение аминокислотного остатка во второй аминокислотной последовательности - сравнительно с первой аминокислотной последовательностью - рассматривается как отличие в одном аминокислотном остатке (положении), т.е. как “аминокислотное отличие”, как определено ниже.

Альтернативно, степень идентичности последовательности между двумя аминокислотными последовательностями может быть рассчитана при использовании известного компьютерного алгоритма, такого как указано выше для определения степени идентичности последовательности для нуклеотидных последовательностей, опять же при использовании общепринятых установок.

Как правило, для определения процента “идентичности последовательности” между двумя аминокислотными последовательностями по способа расчета, приведенному выше, аминокислотная последовательность с большим числом аминокислотных остатков выбирается в качестве “первой” аминокислотной последовательности, и другая аминокислотная последовательность будет являться “второй” аминокислотной последовательностью.

Также, для определения степени идентичности последовательности между двумя аминокислотными последовательностями, специалист может принимать во внимание так называемые “консервативные” аминокислотные замены, которые в общем могут описываться как аминокислотные замены, где аминокислотный остаток замещается другим аминокислотным остатком аналогичной химической структуры и который имеет небольшое или по существу не имеет влияния на функцию, активность или другие биологические свойства полипептида. Такие консервативные аминокислотные замены хорошо известны из уровня техники, например, из WO 04/037999, GB-A-2 357 768, WO 98/49185, WO 00/46383 и WO 01/09300; и (предпочтительные) типы и/или комбинации таких замен могут выбираться на основе соответствующих рекомендаций из WO 04/037999, так же и из WO 98/49185 и из дополнительных ссылок, цитируемых здесь.

Такие консервативные замены предпочтительно представляют собой замены, где одна аминокислота со следующими группами (a) - (e) замещается другим аминокислотным остатком аналогичной группы: (a) малые алифатические, неполярные или слабо полярные остатки: Ala, Ser, Thr, Pro и Gly; (b) полярные, отрицательно заряженные остатки и их (незаряженные) амиды: Asp, Asn, Glu и G1n; (c) полярные, положительно заряженные остатки: His, Arg и Lys; (d) большие алифатические, неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val и Cys; и (e) ароматические остатки: Phe, Tyr и Trp.

Особенно предпочтительными консервативными заменами являются следующие: Ala на Gly или на Ser; Arg на Lys; Asn на Gln или на His; Asp на Glu; Cys на Ser; Gln на Asn; Glu на Asp; Gly на Ala или на Pro; His на Asn или на Gln; Ile на Leu или на Val; Leu на Ile или на Val; Lys на Arg, на Gln или на Glu; Met на Leu, на Tyr или на Ile; Phe на Met, на Leu или на Tyr; Ser на Thr; Thr на Ser; Trp на Tyr; Tyr на Trp; и/или Phe на Val, на Ile или на Leu.

Любые аминокислотные замены, применяемые к полипептидам, описываемые здесь, могут также основываться на анализе частот аминокислотных вариаций между гомологичными белками различных видов, разработанном Schulz et al., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, 1978, на анализе структурирующих потенциалов, разработанном Chou and Fasman, Biochemistry 13: 211, 1974 и Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978, и на анализе гидрофобности групп в белках, разработанном Eisenberg et al., Proc. Nad. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984; Kyte & Doolittle; J Molec. Biol. 157: 105-132, 1981, и Goldman et al., Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986, все включены здесь путем ссылки. Сведения о первичной, вторичной и третичной структуре нанотел представлены в описании и в общем уровне техники, приведенном выше. Также, для этих целей, кристаллическая структура VHH домена из ламы, например, представлена Desmyter et al., Nature Structural Biology, Vol. 3, 9, 803 (1996); Spinelli et al., Natural Structural Biology (1996); 3, 752-757; и Decanniere et al., Structure, Vol. 7, 4, 361 (1999). Дополнительная информация относительно некоторых аминокислотных остатков, которые в присутствуют в традиционных VH доменов из VH/VL области, и потенциальных «camelizing» замен в этих положениях можно обнаружить в уровне технике для нанотел, цитируемом здесь;

g) аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновых кислот указываются как “точно такие же”, если они имеют 100% идентичности последовательности (как определено здесь) вдоль всей их длины;

h) при сравнении двух аминокислотных последовательностей, термин “аминокислотное отличие” относится к инсерции, делеции или замене одного аминокислотного остатка в положении первой последовательности, сравнительно со второй последовательностью; при этом предполагается, что две аминокислотные последовательности могут содержать одно, два или более таких аминокислотных отличий;

i) последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность рассматривается как “(в) по существу изолированной (форме)” - например, сравнительно с ее нативным биологическим источником и/или реакционной средой или средой культивирования, из которой она была получена - когда разделена от, по меньшей мере, одного другого компонента, с которым, как правило, ассоциируется в указанном источнике или среде, таком как другая нуклеиновая кислота, другой белок/полипептид, другой биологический компонент или макромолекула, или, по меньшей мере, один контаминант, примесь или второстепенный компонент. В частности, последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность рассматривается как “по существу выделенная”, если она очищена, по меньшей мере, 2-кратно, в частности, по меньшей мере, 10-кратно, более в частности, по меньшей мере, 100-кратно, и до 1000-кратно или более. Последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность, которая находится “по существу в выделенном виде” предпочтительно по существу гомогенна, как определено при использовании пригодного способа, такого как пригодный хроматографический способ, например, способ электрофореза в полиакриламидном геле;

j) Термин “домен” в используемом здесь значении, обычно относится глобулярной области цепи антитела, и, в частности, к глобулярной области тяжелой цепи антитела, или к полипептид, который по существу состоит из такой глобулярной области. Как правило, такой домен будет содержать пептидные петли (например, 3 или 4 пептидные петли), стабилизированные, складка или путем дисульфидных связей.

k) Термин ‘антигенная детерминанта’ относится к эпитопу на антигене, распознающийся антиген-связывающей молекулой (а также, нанотелом или полипептидом изобретения), а именно, антиген-связывающим сайтом указанной молекулой. Термины “антигенная детерминанта” и “эпитоп’ могут также являться здесь взаимозаменяемыми.

l) Аминокислотная последовательность (например нанотела, антитела, полипептида изобретения, или, в целом, антиген связывающего белка или полипептида или их фрагменты), которая может связываться с, которая имеет сродство к и/или которая имеет специфичность к специфичной антигенной детерминанте, эпитопу, антигену или белок (или к, по меньшей мере, их одной части, фрагменту или эпитопу) указывается как “против” или “направленная против” указанной антигенной детерминанты, эпитопа, антигена или белка.

m) Термин “специфичность” относится к числу различных типов антигенов или антигенных детерминант, к которым определенная антиген-связывающая молекула или молекула постоянная равновесия (а также, нанотела или полипептида изобретения) может присоединяться. Специфичность антиген-связывающего белка может определяться с учетом сродства и/или авидности. Сродство, представленное константой равновесия для диссоциации антигена с антиген-связывающим белком (K_D), измеряется на связывающую способность между антигенной детерминантой и антиген-связывающим сайтом: чем меньше значение K_D, тем сильнее связывающая способность между антигенной детерминантой и молекулой, содержащей антиген-связывающий сайт (альтернативно, сродство также может выражаться как константа сродства (K_A), которая соответствует 1/K_D). Как будет понятно для специалиста (например, на основании дополнительного описания), сродство может определяться способом, известным per se, в зависимости от специфичности интересующего антигена. Авидность представляет собой величину силы связывания между антиген-связывающей молекулой (такой как, нанотело или полипептид изобретения) и соответствующим антигеном. Авидность относится как к сродству между антигенной детерминантой и ее антиген-связывающим сайтом на антиген-связывающей молекуле и к количеству соответствующих сайтов связывания, имеющихся антиген-связывающей молекуле. Обычно, антиген-связывающие белки (а также, нанотела и/или полипептиды изобретения) могут связываться с константой диссоциации (K_D), составляющей 10^-5 - 10^-12 моль/литр (M) или менее, и предпочтительно 10^-7 - 10^-12 моль/литр (M) или менее и более предпочтительно 10^-8 - 10^-12 моль/литр, и/или с константой ассоциации (K_A), по меньшей мере, 10⁷ M^-1, предпочтительно, по меньшей мере, 10⁸ M^-1, более предпочтительно, по меньшей мере, 10⁹ M-1, а также, по меньшей мере, 10¹² M^-1. Любое значение K_D больше, чем 10^-4 M обычно считается, что отражает неспецифичное связывание. Предпочтительно, нанотело или полипептид изобретения будет связываться с желательным антигеном с K_D менее 500 нM, предпочтительно менее 200 нM, более предпочтительно менее 10 нM, а также менее 500 нM. Специфичное связывание антиген-связывающего белка с антигеном или антигенной детерминантой может определяться любым пригодным способом, известным per se, включая, например, анализ Скэтчарда и/или анализы конкурентного связывания, такие как радиоиммунный анализ (RIA), иммуноферментный анализ (EIA) и сэндвич-анализ конкурентного связывания, и другие их варианты, известные по сути из уровня техники.

n) как дополнительно в дальнейшем описывается, аминокислотная последовательность и структура нанотела может рассматриваться - без каких-либо ограничений – как содержащая четыре каркасных областей или “FR”, которое относятся в уровне техники и в дальнейшем к “Каркасная область 1” или “FR1”; “Каркасная область 2” или ”FR2”; “Каркасная область 3” или “FR3”; и “Каркасная область 4” или “FR4”, соответственно; где каркасные области прерванные тремя гипервариабельными областями или “CDR”, которое обозначаются в уровне техники как “Гипервариабельная область 1”или “CDR1”; как “Гипервариабельная область 2” или ”CDR2”; и как “Гипервариабельная область 3” или “CDR3”, соответственно;

o) как также дополнительно в дальнейшем описывается, общее число аминокислотных остатков в нанотеле может составлять порядка 110-120, предпочтительно 112-115, и наиболее предпочтительно 113. Однако необходимо отметить, что части, фрагменты или аналоги (как дополнительно в дальнейшем описывается) нанотела по существу не ограничены по их длине и/или размеру, так же как части, фрагменты или аналоги соответствуют дополнительным требованиям, приведенным ниже, и также предпочтительно пригодны для целей, описываемых ниже;

p) аминокислотные остатки нанотела нумеруются в соответствии с обычной нумерацией для V_H доменов, приведенную Kabat et al. (“Sequence of proteins of immunological interest”, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91), которая применяется для V_HH доменов из Camelids в статье Riechmann and Muyldermans, указанной выше (см., например, фигуру 2 указанной ссылки). В соответствии с нумерацией, FR1 нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 1-30, CDR1 нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 31-36, FR2 нанотела содержит аминокислоты в положениях 36-49, CDR2 нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 50-65, FR3 нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 66-94, CDR3 нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 95-102, и FR4 нанотела содержит аминокислотные остатки в положениях 103-113. [В связи с чем, следует указать, что - как известно из уровня техники для V_H доменов и для V_HH доменов - общее число аминокислотных остатков в каждом из CDR может отличаться и может не соответствовать общему числу, указанному в Номенклатуре Кабата (что одно или более положений по номенклатуре Кабата может не быть занятым в действительной последовательности, или действительная последовательность может содержать больше аминокислотных остатков, чем число, допустимое по номенклатуре Кабата). Это означает, что, в целом, нумерация по Кабату может или не может соответствовать действительному числу аминокислотных остатков в действительной последовательности. В общем, однако, можно указать, что согласно нумерации аминокислотных остатков в CDR, положение 1 по номенклатуре Кабата соответствует началу FR1 и наоборот, положение 36 по номенклатуре Кабата соответствует началу FR2 и наоборот, положение 66 по номенклатуре Кабата соответствует началу FR3 и наоборот, и положении 103 по номенклатуре Кабата соответствует началу FR4 и наоборот.].

Альтернативные способы нумерации аминокислотных остатков V_H доменов, чьи способы также могут применяться аналогичным образом к V_HH доменам от Camelids и к Нанотелам, представляют собой способы, описываемые Chothia et al. (Nature 342, 877-883 (1989)), так называемое “AbM определение” и так называемое “контактное определение”. Однако, в настоящем описании, формуле и фигурах, нумерация по Кабату как применяется для V_HH доменам Riechmann and Muyldermans будет следующей, если другое не определено, и

q) Фигуры, Перечень последовательностей и Экспериментальная часть/примеры предоставлены только для дополнительного пояснения изобретение и не должны интерпретироваться или истолковываться как ограничивающие объем изобретения и/или прилагаемой формулы.

Для общего описания антител к тяжелым цепям и их вариабельных доменов, ссылки можно отнести к следующим источникам, которые описывают общий уровень техники: WO 94/04678, WO 95/04079 и WO 96/34103 (Vrije Universiteit Brussel); WO 94/25591, WO 99/37681, WO 00/40968, WO 00/43507, WO 00/65057, WO 01/40310, WO 01/44301, EP 1134231 WO 02/48193 (Unilever); WO 97/49805, WO 01/21817, WO 03/035694, WO 03/054016 и WO 03/055527 (Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB)); WO 03/050531 (Algonomics N.V.); WO 01/90190 (National Research Council of Canada); WO 03/025020 (= EP 1 433 793) ( Institute of Antibodies); так же как и WO 04/041867, WO 04/041862, WO 04/041865, WO 04/041863, WO 04/062551; Hamers-Casterman et al., Nature 1993 June 3; 363 (6428): 446-8; Davies and Riechmann, FEBS Lett. 1994 Feb 21; 339(3): 285-90; Muyldermans et al., Protein Eng. 1994 Sep; 7(9): 1129-3; Davies and Riechmann, Biotechnology (NY) 1995 May; 13(5): 475-9; Gharoudi et al., 9th Forum of Applied Biotechnology, Med. Fac. Landbouw Univ. Gent. 1995; 60/4a part I: 2097-2100; Davies and Riechmann, Protein Eng. 1996 Jun; 9(6): 531-7; Desmyter et al., Nat Struct Biol. 1996 Sep; 3(9): 803-11; Sheriff et al., Nat Struct Biol. 1996 Sep; 3(9): 733-6; Spinelli et al., Nat Struct Biol. 1996 Sep; 3(9): 752-7; Arbabi Ghahroudi et al., FEBS Lett. 1997 Sep 15; 414(3): 521-6; Vu et al., Mol Immunol. 1997 Nov-Dec; 34(16-17): 1121-31; Atarhouch et al., Journal of Camel Practice and Research 1997; 4: 177-182; Nguyen et al., J. Mol. Biol. 1998 Jan 23; 275(3): 413-8; Lauwereys et al., EMBO J. 1998 Jul 1; 17(13): 3512-20; Frenken et al., Res Immunol. 1998 Jul-Aug;149(6):589-99; Transue et al., Proteins 1998 Sep 1; 32(4): 515-22; Muyldermans and Lauwereys, J. Mol. Recognit. 1999 Mar-Apr; 12 (2): 131-40; van der Linden et al., Biochim. Biophys. Acta 1999 Apr 12; 1431(1): 37-46.; Decanniere et al., Structure Fold. Des. 1999 Apr 15; 7(4): 361-70; Ngyuen et al., Mol. Immunol. 1999 Jun; 36(8): 515-24; Woolven et al., Immunogenetics 1999 Oct; 50 (1-2): 98-101; Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 1999 Dec 10; 231 (1-2): 25-38; Spinelli et al., Biochemistry 2000 Feb 15; 39(6): 1217-22; Frenken et al., J. Biotechnol. 2000 Feb 28; 78(1): 11-21; Nguyen et al., EMBO J. 2000 Mar 1; 19(5): 921-30; van der Linden et al., J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-95; Decanniere et al., J. Mol. Biol. 2000 Jun 30; 300 (1): 83-91; van der Linden et al., J. Biotechnol. 2000 Jul 14; 80(3): 261-70; Harmsen et al., Mol. Immunol. 2000 Aug; 37(10): 579-90; Perez et al., Biochemistry 2001 Jan 9; 40(1): 74-83; Conrath et al., J. Biol. Chem. 2001 Mar 9; 276 (10): 7346-50; Muyldermans et al., Trends Biochem Sci. 2001 Apr;26(4):230-5; Muyldermans S., J. Biotechnol. 2001 Jun; 74 (4): 277-302; Desmyter et al., J. Biol. Chem. 2001 Jul 13 ;276 (28): 26285-90; Spinelli et al., J. Mol. Biol. 2001 Aug 3; 311 (1): 123-9; Conrath et al., Antimicrob Agents Chemother. 2001 Oct; 45 (10): 2807-12; Decanniere et al., J. Mol. Biol. 2001 Oct 26; 313(3): 473-8; Nguyen et al., Adv Immunol. 2001; 79: 261-96; Muruganandam et al., FASEB J. 2002 Feb; 16 (2): 240-2; Ewert et al., Biochemistry 2002 Mar 19; 41 (11): 3628-36; Dumoulin et al., Protein Sci. 2002 Mar; 11 (3): 500-15; Cortez-Retamozo et al., Int. J. Cancer. 2002 Mar 20; 98 (3): 456-62; Su et al., Mol. Biol. Evol. 2002 Mar; 19 (3): 205-15; van der Vaart JM., Methods Mol Biol. 2002; 178: 359-66; Vranken et al., Biochemistry 2002 Jul 9; 41 (27): 8570-9; Nguyen et al., Immunogenetics 2002 Apr; 54 (1): 39-47; Renisio et al., Protein 2002 Jun 1; 47 (4): 546-55; Desmyter et al., J. Biol. Chem. 2002 Jun 28; 277 (26): 23645-50; Ledeboer et al., J. Dairy Sci. 2002 Jun; 85 (6): 1376-82; De Genst et al., J. Biol. Chem. 2002 Aug 16; 277 (33): 29897-907; Ferrat et al., Biochem. J. 2002 Sep 1; 366 (Pt 2): 415-22; Thomassen et al., Enzyme and Microbial Technol. 2002; 30: 273-8; Harmsen et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002 Dec; 60 (4): 449-54; Jobling et al., Nat Biotechnol. 2003 Jan; 21 (1): 77-80; Conrath et al., Dev. Comp. Immunol. 2003 Feb; 27 (2): 87-103; Pleschberger et al., Bioconjug. Chem. 2003 Mar-Apr; 14 (2): 440-8; Lah et al., J. Biol. Chem. 2003 Apr 18; 278 (16): 14101-11; Nguyen et al., Immunology. 2003 May; 109 (1): 93-101; Joosten et al., Microb. Cell Fact. 2003 Jan 30; 2 (1): 1; Li et al., Proteins 2003 Jul 1; 52 (1): 47-50; Loris et al., Biol Chem. 2003 Jul 25; 278 (30): 28252-7; van Koningsbruggen et al., J. Immunol. Methods. 2003 Aug; 279 (1-2): 149-61; Dumoulin et al., Nature. 2003 Aug 14; 424 (6950): 783-8; Bond et al., J. Mol. Biol. 2003 Sep 19; 332 (3): 643-55; Yau et al., J. Immunol. Methods. 2003 Oct 1; 281 (1-2): 161-75; Dekker et al., J. Virol. 2003 Nov; 77 (22): 12132-9; Meddeb-Mouelhi et al., Toxicon. 2003 Dec; 42 (7): 785-91; Verheesen et al., Biochim. Biophys. Acta 2003 Dec 5; 1624 (1-3): 21-8; Zhang et al., J Mol Biol. 2004 Jan 2; 335 (1): 49-56; Stijlemans et al., J Biol Chem. 2004 Jan 9; 279 (2): 1256-61; Cortez-Retamozo et al., Cancer Res. 2004 Apr 15; 64 (8): 2853-7; Spinelli et al., FEBS Lett. 2004 Apr 23; 564 (1-2): 35-40; Pleschberger et al., Bioconjug. Chem. 2004 May-Jun; 15 (3): 664-71; Nicaise et al., Protein Sci. 2004 Jul; 13 (7): 1882-91; Omidfar et al., Tumour Biol. 2004 Jul-Aug; 25 (4): 179-87; Omidfar et al., Tumour Biol. 2004 Sep-Dec; 25(5-6): 296-305; Szynol et al., Antimicrob Agents Chemother. 2004 Sep;48(9):3390-5; Saerens et al., J. Biol. Chem. 2004 Dec 10; 279 (50): 51965-72; De Genst et al., J. Biol. Chem. 2004 Dec 17; 279 (51): 53593-601; Dolk et al., Appl. Environ. Microbiol. 2005 Jan; 71(1): 442-50; Joosten et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2005 Jan; 66(4): 384-92; Dumoulin et al., J. Mol. Biol. 2005 Feb 25; 346 (3): 773-88; Yau et al., J Immunol Methods. 2005 Feb; 297 (1-2): 213-24; De Genst et al., J. Biol. Chem. 2005 Apr 8; 280 (14): 14114-21; Huang et al., Eur. J. Hum. Genet. 2005 Apr 13; Dolk et al., Proteins. 2005 May 15; 59 (3): 555-64; Bond et al., J. Mol. Biol. 2005 May 6;348(3):699-709; Zarebski et al., J. Mol. Biol. 2005 Apr 21; (досрочная электронная публикация).

По использующейся в вышеуказанных ссылках терминологии, вариабельные домены, имеющиеся в природных антителах к тяжелым цепям, будут также относиться к “V_HH доменам”, для того, чтобы отличать их от вариабельных доменов тяжелых цепей, которые присутствуют в традиционных четырехцепочечных антителах (которые будет относиться здесь далее к “V_H доменами”), и от вариабельных доменов легких цепей, которые представлены в традиционных 4-цепочечных антителах (которые будет относиться здесь далее к “V_L доменами”).

Как указанно в предыдущем уровне техники, V_HH домены имеют число уникальных структурных характеристик и функциональных свойств, которые делают выделенные V_HH домены (так же как и нанотела, на их основе, которые разделяют эти структурные характеристики и функциональные свойства с природными V_HH доменами) и белки, содержащие их, высоко полезными для применения в качестве функциональных антиген-связывающих доменов или белков. В частности, и без ограничений, V_HH домены (которые “сконструированы” путем природы для функционального связывания с антигеном при отсутствии и без любого взаимодействия с легкой цепью вариабельного) и нанотела могут функционировать как единичные, относительно небольшие, функциональные антиген-связывающие структурные единицы, домены или белок. Это отличает V_HH домены от V_H и V_L доменов традиционных 4-цепочечных антител, которые сами по себе обычно не подходят для практического применения в качестве отдельных антиген-связывающих белков или доменов, но нужны для комбинирования в некоторой форме или других для обеспечения функциональной антиген-связывающей единицы (как в, например, традиционных фрагментах антител, таких как Fab фрагменты; в ScFv фрагментах, которые состоят из V_H домена, ковалентно связанного с V_L доменом).

Из-за этих уникальных свойств, применение V_HH доменов и нанотел в качестве отдельных антиген-связывающих белков или как антиген-связывающих доменов (т.е. в качестве части более крупного белка ил полипептиды) обеспечивает количество значимых преимуществ перед применением традиционных V_H и V_L доменов, scFv или традиционных фрагментов антител (таких как Fab- или F(ab’)₂-фрагменты):

- только один домен требуется для связывания антигена с высоким сродством и с высокой селективностью, так, что не существует необходимости в присутствии двух отдельных доменах, а также гарантии того, что эти два домена присутствуют в правильной пространственной конформации или конфигурации (т.е. через использование сконструированных особенным образом линкеров, например, с scFv);

- V_HH домены и нанотела могут экспрессироваться из отдельного гена и не требуются посттрансляционный фолдинг или модификации;

- V_HH домены и нанотела могут с легкостью конструироваться в многовалентных и мультиспецифичных форматах (как дополнительно обсуждается здесь);

- V_HH домены и нанотела высоко растворимы и не имеют тенденции к агрегации (по сравнению антиген-связывающими доменами, полученными от мышей, описываемое в Ward et al., Nature, Vol. 341, 1989, p. 544);

- V_HH домены и нанотела проявляют высокую стабильность к действию температуры, pH, протеаз и других денатуририрующих агентов и условий (см., например, Ewert et al, supra);

- V_HH домены и нанотела легки и относительно не дороги в приготовлении, даже по шкале, требуемой для изготовления. Например, V_HH домены, нанотела и белки/полипептиды, их содержащие, могут продуцироваться при использовании микробной ферментации (напр., как дополнительно описывается здесь) и не требуют применения экспрессирующих систем млекопитающих, как, например, в случае с традиционными фрагментами антител;

- V_HH домены и нанотела имеют относительно небольшой размер (примерно 15 кДа, или в 10 раз меньше, чем традиционный IgG) по сравнению с традиционными 4-цепочечными антителами и их антиген-связывающими фрагментами, и следовательно, показывают более высокую пенетрацию в тканях (включая, но не ограничиваясь, солидные опухоли и другие ткани ) чем такие традиционные 4-цепочечные антитела и их антиген-связывающие фрагменты;

- V_HH домены и нанотела могут демонстрировать так называемые полость-связывающие свойства (в частности вследствие их удлиненной CDR3 петли, сравнительно с традиционными V_H доменами) и могут, следовательно, также достигать мишени и эпитопы, которые не достижимы для традиционных 4-цепочечных антител и их антиген-связывающих фрагментов. Например, было показано, что V_HH домены и нанотела могут ингибировать ферменты (см., например: WO 97/49805; Transue et al., (1998), supra; Lauwereys et al., (1998), supra.

Как указанно выше, изобретение в целом относится к нанотелам. направленным против TNF-альфа, так же как и к полипептидам, содержащих или по существу состоящих из одного или более таких нанотел, которые могут использоваться для профилактики и/или диагностики, описываемых ниже и в WO 04/041862.

Как также указано выше и дополнительно описывается ниже, изобретение дополнительно относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим такие нанотела и полипептиды, к способам приготовления таких нанотел и полипептидов, к клеткам-хозяевам, экспрессирующих или способных к экспрессии таких нанотел или полипептидов, к применениям таких нанотел, полипептидов, нуклеиновых кислот или клеток-хозяев, и к композициям, содержащим такие нанотела, полипептиды, нуклеиновые кислоты или клетки-хозяева.

В целом, необходимо казать, что термин нанотела в используемом здесь значении, в его широком понимании не ограничивается специфическим способом приготовления. Например, как будет обсуждаться детально в дальнейшем описании, нанотела изобретения могут быть получены (1) путем выделения V_HH домена из природного антитела тяжелой цепи; (2) путем экспрессии нуклеотидной последовательности, кодирующей природный V_HH домен; (3) путем “гуманизации” (как описывается ниже) природного V_HH домена или путем экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей такой гуманизированный V_HH домен; (4) путем “камелизации” (как описывается ниже) природного V_H домена из любых видов животных, в частности видов млекопитающих, а также от человека, или путем экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей такой камелизированный such V_H домен; (5) путем “камелизации” “доменного антитела”, или “Dab”, как описывается Ward et al (supra), или путем экспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей такой камелизированный V_H домен; (6) при использовании синтетических или полусинтетических способов для приготовления белков, полипептидов или других аминокислотных последовательностей; (7) путем приготовления нуклеиновой кислоты, кодирующей нанотело, при использовании способов для синтеза нуклеиновой кислоты, с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты, полученной таким образом; и/или (8) путем любых комбинаций вышеуказанного. Пригодные способы и методы для осуществления вышеуказанных будут понятны специалисту на основании приведенного описания и, например, включают способы и методы, описываемые более детально в дальнейшем.

Однако, в соответствии со специфическим воплощением, нанотела изобретения не имеют аминокислотную последовательность, которая точно такая же, как (т.е. степень идентичности последовательности составляет 100%) аминокислотная последовательность природного V_H домена, такая как аминокислотная последовательность природного V_H домена из млекопитающих, и, в частности, от человека.

Один особенно предпочтительный класс нанотел изобретения содержит нанотела с аминокислотной последовательностью, которая соответствует аминокислотной последовательности природного V_HH домена, но которая “гуманизирована”, т.е. путем замены одного или более аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности указанной природной V_HH последовательности одним или более аминокислотными остатками, которые встречаются в соответствующем(их) положении(ях) в V_H домене из традиционного 4-цепочечного антитела от человека (напр., указанное выше). Это может осуществляться способом, известным per se, который будет понятен специалисту, например, на основании дополнительного описания, приведенного ниже, и предыдущего уровня техники относительно гуманизации, приведенного здесь. Кроме того, следует указать, что такое гуманизированное нанотело изобретения может быть получено любым пригодным образом, известным per se (т.е. как указывается в пунктах (1) - (8) выше) и, таким образом, строго не ограничены полипептидами, которые получены при использовании полипептида, который содержит природный V_HH домен как исходный материал.

Предпочтительная, но не ограничивающая, гуманизирующая замена для нанотела, принадлежащего к 103 P,R,S-группе и/или GLEW-группе (как определено здесь) представляет собой 108Q - 108L.

Другой особенно предпочтительный класс нанотел изобретения содержит нанотела с аминокислотной последовательностью, которая соответствует аминокислотной последовательности природного V_H домена, которая “камелизирована”, т.е. путем замены одного или более аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности природного V_H домена из традиционного 4-цепочечного антитела одним или более аминокислотными остатками, которые встречаются в соответствующем(их) положении(ях) в V_H домене антитела тяжелой цепи. Это может осуществляться способом, известным per se, который будет понятен специалисту, например, на основании дополнительного описания, приведенного ниже. Ссылкой может являться также WO 94/04678. Такая камелизация может предпочтительно происходить в аминокислотных положениях, которые присутствуют во взаимосвязи V_H-V_L и в так называемых Camelidae характеристических остатках (см., например, также WO 94/04678), как также указано ниже. Предпочтительно, V_H домен или последовательность, которые используются как исходный материал или отправная точка для генерации или конструирования камелизованного нанотела, предпочтительно является V_H последовательностью из млекопитающего, более предпочтительно V_H последовательностью человека. Однако следует указать, что такое камелизированное нанотело изобретения может быть получено любым пригодным образом, известным per se (т.е. как указывается в пунктах (1) - (8) выше) и, таким образом, строго не ограничены полипептидами, которые получены при использовании полипептида, который содержит природный V_HH домен как исходный материал.

Например, кроме того, как дополнительно описывается ниже, “гуманизация” и “камелизация” могут осуществляться путем обеспечения нуклеотидной последовательности, которая кодирует такой природный V_HH домен или V_H домен, соответственно, и, затем изменяет, способом, известным per se, один или более кодонов в указанной нуклеотидной последовательности, например, как новая нуклеотидная последовательность кодирует гуманизированное или камелизированное нанотело изобретения, соответственно, и затем экспрессируется нуклеотидная последовательность, таким образом полученная, способом, известным per se, таким образом обеспечивается желаемое нанотело изобретения. Альтернативно, на основе аминокислотной последовательности природного V_HH домена или V_H домена, соответственно, аминокислотная последовательность желаемого гуманизированного или камелизированного нанотела изобретения, соответственно, может быть сконструирована и затем синтезирована de novo при использовании способов пептидного синтеза, известных per se. Также, на основании аминокислотной последовательности или нуклеотидной последовательности природного V_HH домена или V_H домена, соответственно, нуклеотидная последовательность, кодирующая желаемое гуманизированное или камелизированное нанотело изобретения, соответственно, может быть сконструирована и затем синтезирована de novo при использовании способов синтеза нуклеиновой кислоты, известных per se, после чего, нуклеотидная последовательность, таким образом полученная, может экспрессироваться образом, известным per se, так что обеспечивается желаемое нанотело изобретения.

Другие пригодные пути и способы получения нанотел изобретения и/или нуклеотидных последовательностей и/или нуклеиновых кислот, кодирующих их, начиная с (аминокислотной последовательности) природных V_H доменов или предпочтительно V_HH доменов и/или с нуклеотидных последовательностей и/или последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих их, будут понятны специалистам и могут, например, содержать комбинации одной или более аминокислотных последовательностей и/или нуклеотидных последовательностей из природных V_H доменов (таких как, одна или более FR и/или CDR ) с одной или более аминокислотными последовательностями и/или нуклеотидными последовательностями из природных V_HH доменов (например, одна или более FR или CDR ), пригодным образом, так, что обеспечивается ( нуклеотидная последовательность или кодирующая нуклеиновая кислота) нанотело изобретения.

В соответствии с одним предпочтительным, но не ограничивающим, аспектом аспекта изобретения, нанотело в его широком понимании может, в общем, определяться как полипептид, содержащий:

- аминокислотную последовательность, которая содержит четыре каркасных областей/последовательностей, прерванных тремя гипервариабельными участками/последовательностями, где аминокислотный остаток в положении 108 по номенклатуре Кабата представляет собой Q;

и/или

- аминокислотную последовательность, которая содержит четыре каркасных областей/последовательностей, прерванных тремя гипервариабельными участками/последовательностями, где аминокислотный остаток в положении 44 по номенклатуре Кабата представляет собой E и где аминокислотный остаток в положении 45 по номенклатуре Кабата представляет собой R;

и/или

- аминокислотную последовательность, которая содержит четыре каркасных областей/последовательностей, прерванных тремя гипервариабельными участками/последовательностями, где аминокислотный остаток в положении 103 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из P, R и S, и, в частности, выбирается из группы, состоящей из R и S.

Таким образом, в первом предпочтительном, но не ограничивающем, аспекте, нанотела изобретения могут иметь структуру

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

где FR1 - FR4 относятся к каркасным областям 1 - 4, соответственно, и в которой CDR1 - CDR3 относятся к гипервариабельным участкам 1 - 3, соответственно, и в которой

- аминокислотный остаток в положении 108 по номенклатуре Кабата представляет собой Q;

и/или в которой:

- аминокислотный остаток в положении 44 по номенклатуре Кабата представляет собой E и в которой аминокислотный остаток в положении 45 по номенклатуре Кабата представляет собой R;

и/или в которой:

- аминокислотный остаток в положении 103 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из P, R и S, и, в частности, выбирается из группы, состоящей из R и S;

и в которой:

- CDR1, CDR2 и CDR3 являются как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений.

В частности, нанотело против TNF-альфа по изобретению может иметь структуру:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

в которой FR1 - FR4 относятся к каркасным областям 1 - 4, соответственно, и в которой CDR1 - CDR3 относятся к гипервариабельным участкам 1 - 3, соответственно, и в которой

и/или в которой:

и в которой

В частности, по одному предпочтительному, но не ограничивающему, аспекту из аспектов изобретения, нанотело может, в целом, определяться как полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая содержит четыре каркасные области/последовательности, прерванные тремя гипервариабельными участками/последовательностями, где:

1. аминокислотный остаток в положении 44 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из G, E, D, G, Q, R, S, L; и предпочтительно выбирается из группы, состоящей из G, Eили Q; и

2. аминокислотный остаток в положении 45 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из L, Rили C; и предпочтительно выбирается из группы, состоящей из L или R; и

3. аминокислотный остаток в положении 103 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из W, R или S; и представляет собой предпочтительно W или R, и представляет собой наиболее предпочтительно W;

4. аминокислотный остаток в положении 108 по номенклатуре Кабата представляет собой Q;

или где:

1. аминокислотный остаток в положении 44 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из E и Q; и

2. аминокислотный остаток в положении 45 по номенклатуре Кабата представляет собой R; и

3. аминокислотный остаток в положении 103 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из W, R и S; и представляет собой предпочтительно W;

4. аминокислотный остаток в положении 108 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из Q и L; и представляет собой предпочтительно Q;

или где:

1. аминокислотный остаток в положении 44 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из G, E, D, Q, R, S и L; и предпочтительно выбирается из группы, состоящей из G, E и Q; и

2. аминокислотный остаток в положении 45 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из L, Rи C; и предпочтительно выбирается из группы, состоящей из L и R; и

3. аминокислотный остаток в положении 103 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из P, R и S; и, в частности, выбирается из группы, состоящей из R и S; и

4. аминокислотный остаток в положении 108 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из Q и L; представляет собой предпочтительно Q.

Таким образом, в другом предпочтительным, но не ограничивающем, аспекте, нанотело изобретения может иметь структуру

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

в которой FR1 - FR4 относятся к каркасным областям 1 - 4, соответственно, и в которой CDR1 - CDR3 относятся к гипервариабельным участкам 1 - 3, соответственно, и в которой:

- аминокислотный остаток в положении 44 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из G, E, D, G, Q, R, S, L; и предпочтительно выбирается из группы, состоящей из G, E или Q;

и в которой:

- аминокислотный остаток в положении 45 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из L, R или C; и предпочтительно выбирается из группы, состоящей из L или R;

и в которой:

- аминокислотный остаток в положении 103 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из W, R или S; и представляет собой предпочтительно W или R, и представляет собой наиболее предпочтительно W;

и в которой:

В другом предпочтительным, но не ограничивающем, аспекте, нанотело изобретения может иметь структуру

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

- аминокислотный остаток в положении 44 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из E и Q;

и в которой:

- аминокислотный остаток в положении 45 по номенклатуре Кабата представляет собой R;

и в которой:

- аминокислотный остаток в положении 103 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из W, R и S; и представляет собой предпочтительно W;

и в которой:

В другом предпочтительном, но не ограничивающем, аспекте, нанотело изобретения может иметь структуру

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

- аминокислотный остаток в положении 44 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из G, E, D, Q, R, S и L; и предпочтительно выбирается из группы, состоящей из G, E и Q;

и в которой:

- аминокислотный остаток в положении 45 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из L, R и C; и предпочтительно выбирается из группы, состоящей из L и R;

и в которой:

- аминокислотный остаток в положении 103 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из P, R и S; и, в частности, выбирается из группы, состоящей из R и S;

и в которой:

- аминокислотный остаток в положении 108 по номенклатуре Кабата выбирается из группы, состоящей из Q и L; и представляет собой предпочтительно Q;

и в которой:

Две особенно предпочтительные, но не ограничивающие, группы нанотел изобретения выбираются в соответствии с вышеуказанным a); в соответствии с вышеуказанным I) - 4); в соответствии с вышеуказанным b); в соответствии с вышеуказанным b-1) - b-4); в соответствии с вышеуказанным c); и/или в соответствии с вышеуказанным c-1) - c-4), где;

- аминокислотные остатки в положениях 44-47 по номенклатуре Кабата образуют последовательность GLEW (или GLEW-подобной последовательности, как определено ниже) и аминокислотный остаток в положении 108 представляет собой Q;

или где:

- аминокислотные остатки в положениях 43-46 по номенклатуре Кабата образуют последовательность KERE или KQRE (или KERE-подобной последовательности) и аминокислотный остаток в положении 108 представляет собой Q или L, и представляет собой предпочтительно Q.

Таким образом, в другом предпочтительном, но не ограничивающем, аспекте, нанотело изобретения может иметь структуру

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

и где:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

- аминокислотные остатки в положениях 43-46 по номенклатуре Кабата образуют последовательность KERE или KQRE (или KERE-подобной последовательности) и аминокислотный остаток в положении 108 представляет собой Q или L, и представляет собой предпочтительно Q;

и в которой:

В нанотелах изобретения, в которых аминокислотные остатки в положениях 43-46 по номенклатуре Кабата образуют последовательность KERE или KQRE, аминокислотный остаток в положении 37 представляет собой наиболее предпочтительно F. В нанотелах изобретения, в которых аминокислотные остатки в положениях 44-47 по номенклатуре Кабата образуют последовательность GLEW, аминокислотный остаток в положении 37 выбирается из группы, состоящей из Y, H, I, V или F, и представляет собой наиболее предпочтительно F.

Таким образом, без ограничения данного документа, с учетом аминокислотных остатков, имеющихся в положениях, указанных выше, нанотела изобретения могут, в общем, классифицироваться на основании следующих трех групп:

- “GLEW-группа”: нанотела с аминокислотной последовательностью GLEW в положениях 44-47 по номенклатуре Кабата и Q в положении 108 по номенклатуре Кабата. Как дополнительно здесь описывается, нанотела в этой группе, как правило, имеют V в положении 37, и могут иметь W, P, R или S в положении 103, и предпочтительно имеют W в положении 103. GLEW группа также содержит некоторые GLEW-подобные последовательности, а также те, которые указаны в таблице 2 ниже;

- “KERE-группа”: нанотела с аминокислотной последовательностью KERE или KQRE или в положениях 43-46 по номенклатуре Кабата и Q или L в положении 108 по номенклатуре Кабата. Как дополнительно здесь описывается, нанотела в этой группе, как правило, имеют F в положении 37, L или F в положении 47; и могут иметь W, P, R или S в положении 103, и предпочтительно иметь W в положении 103;

- “103 P, R, S-группа”: нанотела с P, R или S в положении 103. Эти нанотела могут иметь либо аминокислотную последовательность GLEW в положениях 44-47 номенклатуры Кабата или аминокислотную последовательность KERE или KQRE в положениях 43-46 по номенклатуре Кабата, последняя наиболее предпочтительна в сочетании с F в положении 37 и L или F в положении 47 (как определено для KERE-группы); и могут иметь Q или L в положении 108 по номенклатуре Кабата, и предпочтительно иметь Q.

Таким образом, в другом предпочтительном, но не ограничивающем, аспекте, нанотела изобретения могут являться нанотелами, принадлежащими к GLEW-группе (как определено здесь), и где CDR1, CDR2 и CDR3 являются, как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений.

В другом предпочтительном, но не ограничивающем, аспекте, нанотела изобретения могут являться нанотелами, принадлежащими к KERE-группе (как определено здесь), и где CDR1, CDR2 и CDR3 являются, как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений.

Таким образом, в другом предпочтительном, но не ограничивающем, аспекте, нанотела изобретения могут являться нанотелами, принадлежащими к 103 P, R, S-группе (как определено здесь), и где CDR1, CDR2 и CDR3 являются как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений.

Кроме того, в более общем и в дополнении к 108Q, 43E/44R и 103P,R,S остаткам, указанным выше, нанотела изобретения могут содержать то, в одном или более положениях, что, в традиционном V_H домене, будут образовывать (часть) область V_H/V_L, содержать один или более аминокислотные остатки, которые более высоко заряжены, чем аминокислотные остатки, которые встречаются в природе, в таком(их) же положении(ях) в соответствующем природном V_H или V_HH домене, и в частности один или более заряженные аминокислотные остатки (как указано в таблице 1).

Такие замены включают, но не ограничиваются, GLEW-подобные последовательности, указанные в таблице 2 ниже; так же как и замены, которые описываются в Международной Заявке WO 00/29004 для так называемых “микротел”, напр., Q в положении 108 и KLEW в положениях 44-47.

В некоторых воплощениях нанотел изобретения, аминокислотный остаток в положении 83 выбирается из группы, состоящей из L, M, S, V и W; и представляет собой предпочтительно L.

Также, в некоторых воплощениях нанотел изобретения, аминокислотный остаток в положении 83 выбирается из группы, состоящей из R, K, N, E, I и Q; и представляет собой наиболее предпочтительно или K или E (для нанотел, соответствующих природному V_HH домену) или R (для “гуманизированных” нанотел, как описывается ниже). Аминокислотный остаток в положении 84 в некоторых воплощениях выбирается из группы, состоящей из P, A, R, S, D и V, и представляет собой наиболее предпочтительно P (для нанотел, соответствующих природному V_HH домену) или R (для “гуманизированных” нанотел, как описывается ниже).

Кроме того, в некоторых воплощениях нанотел изобретения, аминокислотный остаток в положении 104 выбирается из группы, состоящей из G и D; и представляет собой наиболее предпочтительно G.

Совместно, аминокислотные остатки в положениях 11, 37, 44, 45, 47, 83, 84, 103, 104 и 108, которые в нанотелах являются, как указанных выше, будут также относиться здесь к “Характеристическим (Hallmark) остаткам”. Характеристические остатки и аминокислотные остатки в соответствующих положениях наиболее близкородственного человеческого VH домена, VH3, резюмированы в таблице 2.

Некоторые особенно предпочтительные комбинации этих характеристических остатков, которые встречаются в природных V_HHдоменах, указаны в таблице 3. Для сравнения, соответствующие аминокислотные остатки человеческого V_H3, называемого DP-47, указываются курсивом.

Таблица 2: Характеристические остатки в нанотелах

Положение	Человеческий V_H3	Характеристические остатки
11	L, V; преимущественно L	L, M, S, V,W; предпочтительно L
37	V, I, F; как правило, V	F⁽¹⁾, Y, H, I или V, предпочтительно F⁽¹⁾ или Y
44⁽⁸⁾	G	G⁽²⁾, E⁽³⁾ _,D, Q, R, S, L; предпочтительно G⁽²⁾, E⁽³⁾ или Q; наиболее предпочтительно G⁽²⁾ или E⁽³⁾ _.
45⁽⁸⁾	L	L⁽²⁾, R⁽³⁾, C, I, L, P, Q, V; предпочтительно L⁽²⁾ или R⁽³⁾
47⁽⁸⁾	W, Y	W^(2), L⁽¹⁾ или F⁽¹⁾, A, G, I, M, R, S или Y; предпочтительно W^(2), L⁽¹⁾, F⁽¹⁾ или R
83	R или K; как правило, R	R, K⁽⁵⁾, N, E⁽⁵⁾, I, M или Q; предпочтительно K или R; наиболее предпочтительно K
84	A, T, D; преимущественно A	P⁽⁵⁾, A, L, R, S, D, V; предпочтительно P
103	W	W⁽⁴⁾, P⁽⁶⁾, R⁽⁶⁾, S; предпочтительно W
104	G	G или D; предпочтительно G
108	L, M или T; преимущественно L	Q, L⁽⁷⁾ или R; предпочтительно Q или L⁽⁷⁾

Примечания:

1. В частности, но не исключительно, в комбинации с KERE (SEQ ID NO: 437) или KQRE (SEQ ID NO: 438) в положениях 43-46.

2. Как правило, как GLEW (SEQ ID NO: 439) в положениях 44-47.

3. Как правило, как KERE или KQRE в положениях 43-46, напр., как KEREL (SEQ ID NO: 440), KEREF (SEQ ID NO: 441), KQREL (SEQ ID NO: 442), KQREF (SEQ ID NO: 443) или KEREG (SEQ ID NO: 444) в положениях 43-47. Альтернативно, возможны также последовательности, такие как TERE (SEQ ID NO: 445) (например, TEREL (SEQ ID NO: 446)), KECE (SEQ ID NO: 447) (например, KECEL (SEQ ID NO: 448) or KECER (SEQ ID NO: 449)), RERE (SEQ ID NO: 450) (например, REREG (SEQ ID NO: 451)), QERE (SEQ ID NO: 452) (например, QEREG (SEQ ID NO: 453)), KGRE (SEQ ID NO: 454) (например, KGREG (SEQ ID NO: 455)), KDRE (SEQ ID NO: 456) (например, KDREV (SEQ ID NO: 457)). Некоторые другие возможные, но наименее предпочтительные последовательности включают, например, DECKL (SEQ ID NO: 458) и NVCEL (SEQ ID NO: 459).

4. С обеими GLEW в положениях 44-47 и KERE или KQRE в положениях43-46.

5. Часто как KP или EP в положениях 83-84 природных V_HH доменов.

6. В частности, но не исключительно, в сочетании с GLEW в положениях 44-47.

7. С ограничением, что если положения 44-47 являются GLEW, положение 108 представляет собой всегда Q.

8. GLEW группа также содержит GLEW-подобные последовательности в положениях 44-47, такие как, например, GVEW (SEQ ID NO: 460), EPEW (SEQ ID NO: 461), GLER (SEQ ID NO: 462), DQEW (SEQ ID NO: 463), DLEW (SEQ ID NO: 464), GIEW (SEQ ID NO: 465), ELEW (SEQ ID NO: 466), GPEW (SEQ ID NO: 467), EWLP (SEQ ID NO: 468), GPER (SEQ ID NO: 469), GLER (SEQ ID NO: 470) и ELEW.

В нанотелах, каждый аминокислотный остаток в любом другом положении, чем характеристический остаток может являться любым аминокислотным остатком, который встречается в природе в соответствующих положениях (по номенклатуре Кабата) природного V_HHдомена.

Такие аминокислотные остатки будут ясны для специалиста. Таблицы 4–7 указывают некоторые неограничивающие остатки, которые могут присутствовать в каждом положении (по номенклатуре Кабата) FR1, FR2, FR3 и FR4 природных V_HH доменов. Для каждого положения, аминокислотный остаток, который наиболее часто встречается в каждом природном V_HH домене (и который представляет собой наиболее предпочтительный аминокислотный остаток для указанного положения в нанотеле) указывается жирным шрифтом; и другие предпочтительные аминокислотные остатки для каждого положения подчеркнуты (примечание: число аминокислотных остатков, которые найдены в положениях 26-30 природных V_HH доменов подтверждают гипотезу, лежащую в основе номенклатуры Chothia (ранее), что остатки в этих положениях уже составляют часть CDR1)

В таблицах 4 - 7, некоторые из неограничивающих остатков, которые присутствуют в каждом положении человеческого V_H3 домена, также отмечаются. Кроме того, для каждого положения, аминокислотный остаток, который наиболее часто встречается в каждом положении природного человеческого V_H3 домена, указывается жирным шрифтом; и другие предпочтительные аминокислотные остатки подчеркнуты.

Таблица 4: Неограничивающие примеры аминокислотных остатков в FR1 (для примечаний, см. примечания к таблице 2)

Пол.	Аминокислотный(ые) остаток(ки):
	Человеческий V _H 3	V _HH ’s верблюжьих
1	E, Q	Q, A, E, D, H, R
2	V	V, A, E, G, L, M, Q
3	Q	Q, K, E, H, P, R, Y
4	L	L, F, P, R, V
5	V, L	Q, E, L, V, M, P, A, I
6	E	E, D, Q, A, H
7	S, T	S, F, H
8	G, R	G, A, R
9	G	G, E
10	G, V	G, D, R, A, E, N, T, V
11	Характеристический остаток: L, M, S, V,W, F, N, P, T, Y; предпочтительно L
12	V, I	V, A, G, M
13	Q, K, R	Q, E, K, D, G, A, H, L, N, P, R, T
14	P	A, Q, A, G, P, T, V, E, F, I, N, S
15	G	G
16	G, R	G, A, E, D, N, P, R, S, V, W
17	S	S, F, T, N, P, A, C
18	L	L, V, M, Q, R
19	R, K	R, K, L, N, S, T, A, F, G, I, M, Q
20	L	L, F, I, V, M, S
21	S	S, F, T, G, H, P, A
22	C	C
23	A, T	A, D, P, S, T, V, E, G, I, L, Q, R
24	A	A, I, S, T, V, C, E, F, G, L, N, P, Q, Y

Таблица 4: Неограничивающие примеры аминокислотных остатков в FR1 (продолжение)

Пол.	Аминокислотный(е) остаток(ки):
	Человеческого V _H 3	V _HH ’s верблюжьих
25	S	S, A, F, P, T, L, V
26	G	G, D, E, R, S, V, A, I, M, P, T
27	F	S, F, R, L, P, G, N, A, D, E, H, I, K, M, Q, T, V, Y
28	T	N, T, E, D, S, I, R, A, G, R, F, Y, L, M, P, V
29	F, V	F,L, D, S, I, G, V, A, E, P, T, Y
30	S, D, G	N, S, E, G, A, D, M, T, H, I, P, R, V, W

Таблица 5: Неограничивающие примеры аминокислотных остатков в FR2 (для примечаний, см. примечания к таблице 2)

Пол.	Аминокислотный(ые) остаток(ки):
	Человеческий V _H 3	V _HH ’s верблюжьих
36	W	W
37	Характеристический остаток: F⁽¹⁾, Y, H, I, A, L, P, S или V предпочтительно F⁽¹⁾ или Y
38	R	R
39	Q	Q, H, P, R, A, D, G, L, E
40	A	A, F, G, P, T, V, I, L, N, R, S, Y
41	P, S, T	P, A, L, S, I, Q, T
42	G	G, E, D, R, T, V
43	K	K, D, E, N, Q, R, T, V, A, L, M, S
44	Характеристический остаток: G⁽²⁾, E⁽³⁾ _,D, Q, R, S, L, A, F, K, M, N, P, V, W, Y; предпочтительно G⁽²⁾, E⁽³⁾ или Q; наиболее предпочтительно G⁽²⁾ или E⁽³⁾ _.
45	Характеристический остаток : L⁽²⁾, R⁽³⁾, C, I, L, P, Q, V, D, E, G, H, K, T; предпочтительно L⁽²⁾ или R⁽³⁾
46	E, V	E, D, K, Q, V, A, G, N
47	Характеристический остаток: W^(2), L⁽¹⁾ или F⁽¹⁾, A, G, I, M, R, S, D, E, H, K, Q, T, V или Y; предпочтительно W^(2), L⁽¹⁾, F⁽¹⁾ или R
48	V	V, I, L, A, C, E, F, G, H, M, P, Q, R, S, T, V, W, Y
49	S, A, G	A, S, A, G, T, V, D, E, I, L, Q, R, Y

Таблица 6: Неограничивающие примеры аминокислотных остатков в FR3 (для примечаний, см. примечания к таблице 2)

Пол.	Аминокислотный(ые) остаток(ки):
	Человеческий V _H 3	V _HH ’s верблюжьих
66	R	R
67	F	F, L, V, A, D, I, S, Y
68	T	T, A, S, D, F, G, I, K, N
69	I	I, M, V, A, F, L, R, S, T
70	S	S, A, F, E, G, K, P, T, V
71	R	R, G, I, K, Q, S, T, W, A, F, L, M, N
72	D, E	D, E, G, N, V, A, H, I, L, Q, S, T
73	N, D, G	N, D, F, I, K, S, T, Y, A, G, H, L, M, R, V
74	A, S	A, D, G, N, P, S, T, F, H, I, L, R, V, Y
75	K	K, A, E, K, L, N, Q, R, D, G, I, M, S, T, V, W
76	N, S	N, D, K, R, S, T, Y, E, G, H, I, Q
77	S, T, I	T, A, E, I, M, S, K, L, N, R, V
78	L, A	V, L,A, F, G, I, M, E, N, Q, R, S, T, W
79	Y, H	Y, A, D, F, H, S, T, C, E, I, L, N, V, W
80	L	L, F, V, M
81	Q	Q, E, R, T, G, H, I, K, L, M, N
82	M	M, I, L, V, G, P, T
82a	N, G	N, D, G, H, S, T, A, E, I, K, R, V
82b	S	S, N, D, G, R, A, C, E, F, I, K, M, P, T, V
82c	L	L, P, M, T, V
83	Характеристический остаток: R, K⁽⁵⁾, N, E⁽⁵⁾, I, M, A, D, G, L, Q, S, T или Q; предпочтительно K или R; наиболее предпочтительно K
84	Характеристический остаток: P⁽⁵⁾, A, L, R, S, D, V, F, G, H, N, T, Y; предпочтительно P
85	E, G	E, D, G, Q, A, N, R, V, Y
86	D	D, E, F, Y
87	T, M	T, S, A, C, M
88	A	A, G, S, D, L, N, P
89	V, L	V, A, D, I, L, M, N, R, T, E, F, S
90	Y	Y, F, E, H, N
91	Y, H	Y, D, F, H, L, S, T, V, C, I, N, R, W
92	C	C
93	A, K, T	A, N, G, H, K, R, S, T, V, Y, E, F, I, L, M, Q
94	K, R, T	A, V, C, F, G, I, L, R, S, D, E, K, M, N, P, Q, T, W, Y T или K;

Таблица 7: Неограничивающие примеры аминокислотных остатков в FR4 (для примечаний, см. примечания к таблице 2)

Пол.	Аминокислотный(ые) остаток(ки):
	Человеческий V _H 3	V _HH верблюжьих
103	Характеристический остаток: W⁽⁴⁾, P⁽⁶⁾, R⁽⁶⁾, S, F, G, K, L, N, Q, V, Y; предпочтительно W
104	Характеристический остаток: G, A, R, S, T или D; предпочтительно G
105	Q, R	Q, E, K, P, R, G, H, L, S, V
106	G	G
107	T	T, A, I, N, P
108	Характеристический остаток: Q, L⁽⁷⁾, E, H, N, P, T или R; предпочтительно Q или L⁽⁷⁾
109	V	V
110	T	T, I, A
111	V	V, A, I, G
112	S	S, F, A, L, P, T, Y
113	S	S, A, L, P, F, T

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

- Характеристические остатки являются, как определено выше;

и в которой:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

и в которой

- FR1 выбирается из группы, состоящей из аминокислотной последовательности:

[1] QVQLQESGGGXVQAGGSLRLSCAASG [26] [SEQ ID NO: 1]

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с вышеуказанной аминокислотной последовательностью; в которой

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 4; и/или

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 “аминокислотное(ых) отличие(я)” (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, где:

и в которой:

- FR2 выбирается из группы, состоящей из аминокислотной последовательности:

[36] WXRQAPGKXXEXVA [49] [SEQ ID NO: 2]

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 5; и/или

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 “аминокислотное(ых) отличие(я)” (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, в которой:

и в которой:

- FR3 выбирается из группы, состоящей из аминокислотной последовательности:

[66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLXXEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID NO: 3]

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 6; и/или

и в которой:

- FR4 выбирается из группы, состоящей из аминокислотной последовательности:

[103] XXQGTXVTVSS [113] [SEQ ID NO: 4]

и в которой:

- CDR1, CDR2 и CDR3 являются, как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений;

в которой характеристические остатки указаны как “X” и соответствуют, как определено здесь выше, и где числа между скобками относятся к аминокислотным положениям по номенклатуре Кабата.

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

и в которой

- FR1 выбирается из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей:

[1] QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [26] [SEQ ID NO: 5]

(1) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблице 7; и/или

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены, и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями); и

(3) характеристический остаток в положении соответствует, как указано в вышеприведенной последовательности;

и в которой:

- FR2 выбирается из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей:

[36] WFRQAPGKERELVA [49] [SEQ ID NO: 6]

[36] WFRQAPGKEREFVA [49] [SEQ ID NO: 7]

[36] WFRQAPGKEREGA [49] [SEQ ID NO: 8]

[36] WFRQAPGKQRELVA [49] [SEQ ID NO: 9]

[36] WFRQAPGKQREFVA [49] [SEQ ID NO: 10]

[36] WYRQAPGKGLEWA [49] [SEQ ID NO: 11]

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей; в которой

(3) характеристические остатки в положениях 37, 44, 45 и 47 соответствуют, как указано в каждой из вышеприведенных последовательностей;

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 “аминокислотное(ых) отличие(я)” (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, в котором:

и в которой:

[66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID NO: 12]

(3) характеристические остатки в положениях 83 и 84 соответствуют, как указано в каждой из вышеприведенных последовательностей;

и в которой:

- FR4 выбирается из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей:

[103] WGQGTQVTVSS [113] [SEQ ID NO: 13]

[103] WGQGTLVTVSS [113] [SEQ ID NO: 14]

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из вышеуказанной аминокислотной последовательностью; в которой

(3) характеристические остатки в положениях 103, 104 и 108 соответствуют, как указано в каждой из вышеприведенных последовательностей;

и в которой:

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

и в которой

[1] QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [26] [SEQ ID NO: 5]

(3) характеристический остаток в положении соответствует, как определено в вышеприведенной последовательности;

и в которой:

[36] WFRQAPGKERELVA [49] [SEQ ID NO: 6]

[36] WFRQAPGKEREFVA [49] [SEQ ID NO: 7]

[36] WFRQAPGKEREGA [49] [SEQ ID NO: 8]

[36] WFRQAPGKQRELVA [49] [SEQ ID NO: 9]

[36] WFRQAPGKQREFVA [49] [SEQ ID NO: 10]

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 2 или только 1 “аминокислотное(ых) отличие(я)” (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, в которой:

и в которой:

[66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID NO: 12]

и в которой:

[103] WGQGTQVTVSS [113] [SEQ ID NO: 13]

[103] WGQGTLVTVSS [113] [SEQ ID NO: 14]

и в которой:

- CDR1, CDR2 и CDR3 являются, как определено выше, и предпочтительно являются, как определено по одному из предпочтительных вышеуказанных определений, и более предпочтительно являются, как определено по одному из более предпочтительных вышеуказанных определений.

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

и в которой

[1] QVQLQESGGGLVQAGGSLRLSCAASG [26] [SEQ ID NO: 5]

и в которой:

[36] WYRQAPGKGLEWA [49] [SEQ ID NO: 11]

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 2 или только 1 “аминокислотное(ых) отличие(я)” (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, в котором:

и в которой:

[66] RFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAA [94] [SEQ ID NO: 12]

и в которой:

[103] WGQGTQVTVSS [113] [SEQ ID NO: 13]

и в которой:

Некоторые другие каркасные последовательности, которые могут присутствовать в нанотелах изобретения, могут быть найдены в Европейском патенте EP 656 946, указанном выше (см., например, также выданный эквивалентный патент США № 5759808).

FR1 - CDR1 - FR2 - CDR2 - FR3 - CDR3 - FR4

и в которой

- FR1 выбирается из группы, состоящей из последовательностей FR1, присутствующих в нанотелах из SEQ ID NO 52 - 60, SEQ ID NO 76 - 86 или SEQ ID NO 95 - 99, и, в частности, в гуманизированных нанотелах из SEQ ID NO 76 - 86 или SEQ ID NO 95 - 99,

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одно из указанных последовательностей FR1; в которой

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены, и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с указанной последовательностью FR1; и

(3) характеристический остаток в положении представляет собой, как определено в указанной последовательности FR1;

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 “аминокислотное(ых) отличие(я)” (как определено здесь) с одной из указанных последовательностей FR1, в которой:

и в которой:

- FR2 выбирается из группы, состоящей из последовательностей FR2, имеющихся в нанотелах, состоящих из SEQ ID NO 52 - 60, SEQ ID NO 76 - 86 или SEQ ID NO 95 - 99, и, в частности, в гуманизированных нанотелах из SEQ ID NO 76 - 86 или SEQ ID NO 95 - 99,

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из указанных последовательностей FR2; в которой

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены, и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с указанной последовательностью FR2; и

(3) характеристические остатки в положениях 37, 44, 45 и 47 соответствуют, как указано в вышеприведенной последовательности FR2;

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 “аминокислотное(ых) отличие(я)” (как определено здесь) с одной из указанных последовательностей FR2, в которой:

и в которой:

- FR3 выбирается из группы, состоящей из последовательностей FR3, присутствующих в нанотелах, состоящих из SEQ ID NO 52 - 60, SEQ ID NO 76 - 86 или SEQ ID NO 95 - 99, и, в частности, в гуманизированных нанотелах из SEQ ID NO 76 - 86 или SEQ ID NO 95 - 99,

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из указанных последовательностей FR3; в котором

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены, и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с указанной последовательностью FR3; и

(3) характеристические остатки в положениях 83 и 84 соответствуют, как указано в вышеприведенной последовательности FR3;

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 “аминокислотное(ых) отличие(я)” (как определено здесь) с одной из указанных последовательностей FR3, в которой:

и в которой:

- FR4 выбирается из группы, состоящей из последовательностей FR4, присутствующих в нанотелах, состоящих из SEQ ID NO 52 - 60, SEQ ID NO 76 -86 или SEQ ID NO 95 - 99, и, в частности, в гуманизированных нанотелах из SEQ ID NO 76 - 86 или SEQ ID NO 95 - 99,

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из указанных последовательностей FR4; в которой

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены, и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с указанной последовательностью FR4; и

(3) характеристические остатки в положениях 103, 104 и 108 соответствуют, как указано в вышеприведенной последовательности FR4;

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 “аминокислотное(ых) отличие(я)” (как определено здесь) с одной из указанных последовательностей FR4, в которой:

и в которой:

Некоторые особенно предпочтительные нанотела изобретения могут выбираться из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO 52 - 60, SEQ ID NO 76 - 86 или SEQ ID NO 95 - 99, и, в частности, в гуманизированных нанотелах из SEQ ID NO 76 - 86 или SEQ ID NO 95 - 99 или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO 52 - 60, SEQ ID NO 76 - 86 или SEQ ID NO 95 - 99; в которой

(1) характеристические остатки могут соответствовать, как показано в вышеприведенной таблице 2;

(2) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем Характеристическое положение, представляет собой предпочтительно либо консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблицах 4-7; и/или

(3) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены, и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанной(ыми) аминокислотной(ыми) последовательностью(ями).

Некоторые даже более особенно предпочтительные нанотела изобретения могут выбираться из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 52 - 60, SEQ ID NO 76 - 86 или SEQ ID NO 95 - 99, и, в частности, в гуманизированных нанотелах из SEQ ID NO 76 - 86 или SEQ ID NO 95 - 99 или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из аминокислотных последовательностей из SEQ ID NO 52 - 60, SEQ ID NO 76 - 86 или SEQ ID NO 95 - 99; в которой

(1) характеристические остатки соответствуют, как указано в соответствующей последовательности, выбранной из SEQ ID NO 52 - 60, SEQ ID NO 76 - 86 или SEQ ID NO 95 - 99;

(2) любая аминокислотная замена в любом другом положении, чем характеристическое положение, представляет собой предпочтительно или консервативную аминокислотную замену (как определено здесь) и/или аминокислотную замену, как определено в таблицах 4-7; и/или

(3) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены, и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с соответствующей последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 52 - 60, SEQ ID NO 76 - 86 или SEQ ID NO 95 - 99.

Некоторые из наиболее предпочтительных нанотел изобретения могут выбираться из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 52 - 60, SEQ ID NO 76 - 86 или SEQ ID NO 95 - 99, и, в частности, из гуманизированных нанотел из SEQ ID NO 76 - 86 или SEQ ID NO 95 - 99.

Как может быть ясным из вышеприведенного, термин нанотела изобретения, в используемом здесь значении, в их широком понимании также включает природные и синтетические мутанты, варианты, аллели, аналоги и ортологи (в дальнейшем в совокупности указываемые как “аналоги”) нанотел, указанных в SEQ ID NO 52 - 60, SEQ ID NO 76 - 86 или SEQ ID NO 95 - 99.

В целом, такие аналоги могут, например, содержать гомологичные последовательности, функциональные части, или функциональную часть гомологичной последовательности (как дополнительно определено ниже) нанотела. В общем, в таких аналогах, каждый аминокислотный остаток (отличный от характеристического остатка) в каждой из каркасных областей может замещаться любым другим аминокислотным остатком, при условии, что полная степень идентичности последовательности каркасных областей остается, как определено выше. Предпочтительно, однако, в таких аналогах:

- один или более аминокислотных остатков в вышеуказанных каркасных последовательностях замещаются одним или более аминокислотными остатками, которые имеют природное происхождение, в том же положении в V_HH домене, происходящим естественным образом. Некоторые примеры таких замен указаны в вышеприведенных таблицах 4-7;

и/или:

- один или аминокислотных остатков в вышеуказанных каркасных последовательностях замещаются одним или более аминокислотными остатками, которые могут рассматриваться как “консервативная” аминокислотная замена, как здесь описывается выше;

и/или:

- один или аминокислотных остатков в вышеуказанных каркасных последовательностях замещаются одним или более аминокислотными остатками, которые имеют природное происхождение, в том же положении в V_HH домене, происходящим естественным образом, у человека. Это, главным образом, относится к “гуманизации” V_HH/нанотела, происходящего естественным образом, в общем, и в указанном положении, в частности, и будет подробно обсуждаться в дальнейшем;

и:

- положения, для которых только один аминокислотный остаток упоминается для обоих V_H домена и V_HH домена в вышеприведенных таблицах 4 – 7, предпочтительно не замещаются.

Также, несмотря на то, что в общем наименее предпочтительно, в таких аналогах, один или более аминокислотных остатков могут быть вычеркнуты из каркасных областей и/или внесены в каркасные области (необязательно в дополнении к одной или более аминокислотным заменам, как указанно выше), при условии, что полная степень идентичности последовательности каркасных областей остается, как определено выше. Характеристические остатки не должны исключаться. Также, наиболее предпочтительно, аминокислотные остатки, для которых только один аминокислотный остаток упоминается для обоих V_H домена и V_HH домена в вышеприведенных таблицах 4 – 7, предпочтительно не исключается.

Предпочтительно, такие аналоги не должны быть таковыми, что они еще могут связываться с, обладают сродством к и/или обладают специфичностью для TNF-альфа, т.е. со сродством и/или специфичностью, которые составляют, по меньшей мере, 10%, предпочтительно, по меньшей мере, 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, 70%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, а также, по меньшей мере, 90%,, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 99% или более сродства и/или специфичности, по меньшей мере, одного из нанотел из SEQ ID NO SEQ ID NO 52 - 60, SEQ ID NO 76 - 86 или SEQ ID NO 95 - 99, что определяется при использовании пригодного анализа, например, анализа определения связывания аналога с TNF, и, в частности, одного из анализов, который используется в нижеприведенных примерах.

В целом, такие аналоги могут, например, быть получены путем обеспечения нуклеиновой кислоты, которая кодирует природный V_HH домен, изменяя кодоны для одного или более аминокислотных остатков, которые следует гуманизировать, в кодоны для соответствующего(их) человеческого(их) аминокислотного(ых) остатка(ов), экспрессируя нуклеиновую кислоту/нуклеотидную последовательность, таким образом полученную, в пригодном хозяине или экспрессирующей системе; и необязательно изолируя и/или очищая аналог, полученный таким образом, для обеспечения указанного аналога по существу в изолированной форме (как определено здесь выше). Это может, в целом, осуществляться при использовании общеизвестных методов и способов, которые будут ясны специалисту, например, из справочников и ссылок, приведенных здесь и/или из дополнительного дальнейшего описания. Альтернативно, и для примера, нуклеиновая кислота, кодирующая аналог, может синтезироваться способом, известным по существу (например, при использовании автоматизированных устройств для синтезирования последовательностей нуклеиновых кислот с предварительным определением аминокислотной последовательности) и может экспрессироваться в пригодный хозяине или экспрессирующей системе, после чего аналог, полученный таким образом, может необязательно отделяться и/или очищаться для обеспечения указанного аналога по существу в выделенной форме (как определено здесь выше). Другой способ обеспечения аналогов включает химический синтез соответствующей аминокислотной последовательности при использовании способов синтеза пептидов, известных по существу, а также тех, которые в дальнейшем упоминаются.

Также, для специалиста, в общем, будет ясно, что нанотела (включая их аналоги) может также приготавливаться, начиная с человеческих V_H последовательностей (т.е. аминокислотных последовательностей или соответствующих нуклеотидных последовательностей), а также, например, человеческих V_H3 последовательностей, а также DP-47, DP-51, DP-54 или DP-29, путем изменения одного или более аминокислотных остатков в аминокислотной последовательности указанного человеческого V_H домена, для обеспечения аминокислотной последовательности, которая имеет (a) Q в положении 108; и/или (b) E в положении 44 и/или R в положении 45, и предпочтительно E в положении 44 и R в положении 45; и/или (c) P, R или S в положении 103, как описывается выше. Кроме того, это может, в целом, осуществляться при использовании различных методов и способов, указанных у предыдущем параграфе, используя аминокислотную последовательность и/или нуклеотидную последовательность для человеческого V_H домена в качестве исходного положения.

Термин нанотела, в используемом здесь значении, в его широком понимании, также содержит части или фрагменты нанотел (включая аналоги) изобретения, как определено выше, которые могут снова быть такими, как дополнительно в дальнейшем описывается.

В целом, части или фрагменты нанотел и/или аналогов имеют аминокислотные последовательности, в которых, в сравнении с аминокислотной последовательностью соответствующего полноразмерного нанотела или аналога, один или более аминокислотных остатков на N-концевой области, один или более аминокислотных остатков на C-концевой области, один или более смежных внутренних аминокислотных остатков, или любая их комбинация, исключены и/или удалены. Это также возможно для объединения одной или более таких частей или фрагментов для обеспечения нанотела изобретения.

Предпочтительно, аминокислотная последовательность нанотела, которая содержит одну или более части или фрагменты полноразмерного нанотела и/или аналога, должна иметь степень идентичности последовательности, по меньшей мере, 50%, предпочтительно, по меньшей мере, 60%, более предпочтительно, по меньшей мере, 70%, а также, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 90% или, по меньшей мере, 95% с аминокислотной последовательностью соответствующего полноразмерного нанотела.

Также, аминокислотная последовательность нанотела, которая содержит одну или более части или фрагменты полноразмерного нанотела и/или аналога, предпочтительно такова, что содержит, по меньшей мере, 10 соседних аминокислотных остатков, предпочтительно, по меньшей мере, 20 соседних аминокислотных остатков, более предпочтительно, по меньшей мере, 30 соседних аминокислотных остатков, а также, по меньшей мере, 40 соседних аминокислотных остатков из аминокислотной последовательности соответствующего полноразмерного нанотела.

В целом, такие части или фрагменты нанотела изобретения будут содержать аминокислотные последовательности, в которых, по сравнению с аминокислотной последовательностью соответствующего полноразмерного нанотела изобретения, один или более аминокислотных остатков на N-концевой области, один или более аминокислотных остатков на C-концевой области, один или более смежных внутренних аминокислотных остатков, или любая их комбинация, исключены и/или удалены. Это также возможно для объединения одной или более таких частей или фрагментов для обеспечения нанотела изобретения.

В соответствии с одним предпочтительным воплощением, фрагмент, в используемом здесь значении, содержит, по меньшей мере, одну из CDR, имеющихся в полноразмерном нанотеле изобретения, предпочтительно, по меньшей мере, две из CDR, имеющихся в полноразмерном нанотеле изобретения, более предпочтительно, по меньшей мере, CDR2 и CDR3, имеющихся в полноразмерном нанотеле изобретения, а также например, все три CDR, имеющихся в полноразмерном нанотеле изобретения.

В соответствии с другим особенно предпочтительным, но не ограничивающим, воплощением, такая часть или фрагмент содержит, по меньшей мере, FR3, CDR3 и FR4 соответствующего полноразмерного нанотела изобретения, т.е. как например, описываемые в Международной заявке WO 03/050531 (Lasters et al.).

Предпочтительно, такие части или фрагменты должны быть такими, что они еще могут связываться с, обладать сродством к и/или обладать специфичностью для TNF-альфа, т.е. со сродством и/или специфичностью, которые составляют, по меньшей мере, 10%, предпочтительно, по меньшей мере, 50%, более предпочтительно, по меньшей мере, 70%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 80%, а также, по меньшей мере, 90%, по меньшей мере, 95%, по меньшей мере, 99% или более сродства и/или специфичности соответствующего полноразмерного нанотела изобретения, например, по анализу определения связывания аналога с TNF, и, в частности, одному из анализов, использующихся в нижеуказанных примерах.

Из вышеприведенного описания, для специалиста будет ясно, что аминокислотные последовательности нанотел, здесь использующихся, отличаются, по меньшей мере, одним аминокислотным положением в, по меньшей мере, одной из каркасных областей от аминокислотных последовательностей природных V_H доменов, а также от аминокислотных последовательностей природных V_H доменов антител человека. В частности, будет понятно, что аминокислотные последовательности нанотел, здесь использующихся, отличаются, по меньшей мере, одним из Характеристических остатков от аминокислотных последовательностей природных V_H доменов, а также от аминокислотных последовательностей природных V_H доменов из антител из верблюжьих и/или человека.

Таким образом, по одному специфичному воплощению, нанотело изобретения имеет аминокислотную последовательность, которая отличается, по меньшей мере, одним аминокислотным положением в одной из каркасных областей от аминокислотной последовательности природного V_H домена. В соответствии с более специфичным, но не ограничивающим, воплощением изобретения, нанотело изобретения содержит аминокислотную последовательность, которая отличается на, по меньшей мере, один из характеристических остатков от аминокислотной последовательности природного V_H домена.

Из вышеприведенного описания, для специалиста будет ясно, что аминокислотные последовательности некоторых нанотел изобретения, а также гуманизированных нанотел изобретения, будут отличаться на, по меньшей мере, одно аминокислотное положение в, по меньшей мере, одной из каркасных областей (т.е. как в положении характеристического остатка, так и в другом положении) от аминокислотных последовательностей природных V_HH доменов. Таким образом, в соответствии с одним специфичным, но не ограничивающим, воплощением, нанотело изобретения содержит аминокислотную последовательность, которая отличается на, по меньшей мере, одно аминокислотное положение в одной из каркасных областей от аминокислотной последовательности природного V_H домена. В соответствии с более специфичным, но не ограничивающим, воплощением изобретения, нанотело изобретения содержит аминокислотную последовательность, которая отличается, по меньшей мере, одним из Характеристических остатков от аминокислотной последовательности природного V_H домена.

Изобретение в его широком понимании также включает производные нанотела изобретения. Такие производные могут в общем быть получены путем модификации, и, в частности, путем химической и/или биологической (напр., ферментативной) модификации, нанотел изобретения и/или одного или более аминокислотных остатков, которые образуют нанотела изобретения.

Примерами таких модификаций, так же как и примерами аминокислотных остатков с последовательностью нанотел, которые могут модифицироваться таким образом (т.е. либо на белковой основе, но предпочтительно на боковой цепи), являются способы и методы, которые могут применяться для внесения таких модификаций и потенциальные применения и преимущества таких модификаций будут понятны для специалиста.

Например, такая модификация может включать введение (напр., путем ковалентного связывания или другим пригодным образом) одной или более функциональных групп, остатков или частей в или на нанотело изобретения, и, в частности одной или более функциональных групп, остатков или частей, которые придают одно или более желаемых свойств или функциональностей нанотелу изобретения. Пример такой функциональной группы будет очевиден специалисту.

Например, такая модификация может включать введение (напр., путем ковалентного связывания или другим пригодным образом) одной или более функциональных групп, которые увеличивают время полужизни, растворимость и/или абсорбцию нанотела изобретения, которые снижают иммуногенность и/или токсичность нанотела изобретения, которые устраняют или ослабляют любые нежелательные побочные эффекты нанотела изобретения, и/или которые придают другие полезные свойства и/или уменьшают нежелательные свойства нанотел и/или полипептидов изобретения; или любую комбинацию двух или более вышеуказанных. Примеры таких функциональных групп и способов их введения будут понятны специалисту, и могут, в целом, включать все функциональные группы и способы, указанные в общем уровне техники, цитируемом выше, так же как и функциональные группы и способы, известные по сути, для модификации фармацевтических белков, и, в частности, для модификации антител или фрагментов антител (включая ScFv и однодоменные антитела), для которых ссылка, например, приводится на Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1980). Такие функциональные группы могут, например, быть связаны непосредственно (например, ковалентно) с нанотелом изобретения, или необязательно через пригодный линкер или спейсер, что опять таки понятно специалисту.

Один из наиболее широко применяемых способов увеличения времени полужизни и/или снижения иммуногенности фармацевтических белков включает связывание подходящего фармацевтически пригодного полимера, а также поли(этиленгликоля) (PEG) или его производных (как, например, метоксиполи(этиленгликоль), или mPEG). В общем, может применяться любая пригодная форма пегилирования, а также пегилирование, применяемое в области технике для антител и фрагментов антител (включая, но не ограничиваясь, (одно) доменных антител и ScFv); ссылаясь на, например, Chapman, Nat. Biotechnol., 54, 531-545 (2002); Veronese and Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54, 453-456 (2003), Harris and Chess, Nat. Rev. Drug. Discov., 2, (2003) и WO 04/060965. Различные реагенты для пегилирования белков также коммерчески доступны, например, от Nektar Therapeutic, USA.

Предпочтительно, сайт-направленное пегилирование применяется, в частности, через цистеиновый-остаток (см., например, Yang et al., Protein Engineering, 16, 10, 761-770 (2003). Например, для этого, PEG может связываться с цистеиновым остатком, который является природным в нанотеле изобретения, нанотело изобретения может модифицироваться для пригодного введения одного или более цистеиновых остатков для связывания PEG, или аминокислотная последовательность, содержащая один или более цистеиновых остатков для связывания PEG, может сливаться с N- и/или C-концом нанотела изобретения, всеми используемыми способами белковой инженерии, известными специалисту по существу.

Предпочтительно, для нанотел и белков изобретения, PEG используется с молекулярной массой более 5000, а также более 10000, и менее 200000, а также менее 100000; например, в пределах 20000-80000.

В отношении пегилирования, необходимо указать, что, в целом, изобретение также охватывает любое нанотело изобретения и/или полипептид изобретения, который пегилирован по одному или более аминокислотным положениям, предпочтительно таким образом, что указанное пегилирование либо (1) увеличивает время полужизни in vivo; (2) уменьшает иммуногенность; (3) обеспечивает одно или более дополнительных полезных свойств, известных по сути для пегилирования; (4) по существу не влияет на сродство нанотела и/или полипептида с TNF-альфа (напр., не снижает указанное сродство более чем на 90%, предпочтительно не более чем на 50%, и более предпочтительно не более чем на 10%, что определяется пригодным способом, а также теми, которые описываются в примерах ниже); и/или (4) не оказывает влияния на любые другие желаемые свойства нанотел и/или полипептидов изобретения. Пригодные PEG-группы и способы их связывания, как специфичного, так и неспецифичного, будут понятны для специалиста. Пригодные наборы и реагенты для такого пегилирования могут, например, быть получены от Nektar (CA, USA).

Другая, как правило, наименее предпочтительная модификация включает N-связанное или O-связанное гликозилирование, которое, как правило, является частью котрансляционной и/или посттрансляционной модификации, в зависимости от клетки-хозяина, использующегося для экспрессирования нанотела или полипептида изобретения.

Еще другая модификация может включать введение одной или более детектируемых меток или других групп или частиц, генерирующих сигналы, в зависимости от предполагаемого использования меченного нанотела. Пригодные метки и способы связывания, их использование и выявление будут ясны специалисту, и, например, включают, но не ограничиваются, флуоресцентные метки (такие, как флуоресцеин, изотиоцианат, родамин, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин, o-фтальдегид, и флуорескамин и флуоресцентные металлы, такие, как ¹⁵²Eu или другие металлы из лантаноидного ряда), фосфоресцирующие метки, хемилюминесцентные метки или биолюминесцентные метки (такие, как люминол, изолюминол, сложный эфир акридиния, имидазол, соли акридиния, эфир щавелевой кислоты, диоксетан или GFP и его аналоги), радиоактивные изотопы (такие, как ³H, ¹²⁵I, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ³⁶Cl, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, и ⁷⁵Se), металлы, хелаты металлов или катионы металлов (например, катионы металлов, таких как ^99mTc, ¹²³I, ¹¹¹In, ¹³¹I, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, и ⁶⁸Ga, или других металлов, или катионы металлов, которые особенно подходят для применения в диагностике и визуализации in vivo, in vitro или in situ, а также (¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr, и ⁵⁶Fe), так же как и хромофоры и ферменты (такие, как малатдегидрогеназа, стафилококковая нуклеаза, дельта-V-стероидизомераза, дрожжевая алкогольдегидрогеназа, альфа-глицерофосфатдегидрогеназа, триозофосфатизомераза, биотин-авидинпероксидаза, пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, аспарагиназа, глюкозооксидаза, β-галактозидаза, рибонуклеаза, уреаза, каталаз, глюкозо-VI-фосфатдегидрогеназа, глюкоамилаза и ацетилхолинэстераза). Другие пригодные метки будут ясны специалисту, и, например, включают агенты, которые могут выявляться при использовании ЯМР или ЭПР спектроскопии.

Такие меченные нанотела и полипептиды изобретения могут, например, использоваться для анализов in vitro, in vivo или in situ (включая иммунологические анализы, известные по существу, а именно ELISA, RIA, EIA и другие “сэндвич”-анализы, и т.д.), так же как и для целей диагностики и визуализации in vivo, в зависимости от выбора специфичной метки.

Как будет ясно для специалиста, другая модификация может включать введение хелатирующей группы, например, для хелатирования одного из металлов или катионов металлов, указанных выше. Пригодные хелатирующие группы, например, включают, без ограничения, диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA) или этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA).

Еще другая модификация может содержать введение функциональной группы, которая является одной частью специфично связывающей пары, как, например, биотин-(стрепт)авидин связывающая пара. Такая функциональная группа может применяться для связывания нанотела изобретения с другим белком, полипептидом или химическим соединением, который связывается с другой половиной связывающей пары, т.е. через образование связующей пары. Например, нанотело изобретения может связываться с биотином, и соединяться с другим белком, полипептидом, соединением или носителем, связанным с авидином или стрептавидином. Например, такое конъюгированное нанотело может использоваться в качестве репортера, например, в диагностической системе, где детектируемый агент, продуцирующий сигнал, связан с авидином или стрептавидином. Такие связывающие пары могут, например, также применяться для связывания нанотела изобретения с носителем, включая носители, пригодные в фармацевтических целях. Одним не ограничивающим примером являются липосомальные составы, описанные Cao and Suresh, Journal of Drug Targetting, 8, 4, 257 (2000). Такие связывающие пары могут также использоваться для соединения терапевтически активного агента с нанотелом изобретения.

Для некоторых способов применения, в частности, для таких способов, в которых предполагается разрушение клетки, которая экспрессирует мишень, против которой направлены нанотела изобретения (напр., в лечении раковой опухоли), или снижение или замедление роста и/или пролиферации такой клетки, нанотела изобретения могут быть соединены с токсином или токсичным остатком или агентом. Примеры токсичных агентов, соединений или остатков, которое могут связываться с нанотелом изобретения для обеспечения – например, – цитотоксического соединения, будут понятны для специалиста и могут, например, быть обнаружены в уровне техники, цитируемой выше, и/или в дополнительном дальнейшем описании. Одним примером является так называемая ADEPT™ технология, WO 03/055527.

Другие химические и ферментативные модификации будут понятны специалисту. Такие модификации могут также вводится для исследовательских целей (напр., для изучения отношений функция-аткивность). Ссылкой, например, может быть Lundblad and Bradshaw, Biotechnol. Appl. Biochem., 26, 143-151 (1997).

Как указанно выше, изобретение также относится к белкам или полипептидам, содержащим, по меньшей мере, один V_HH домен (т.е. как установлено при использовании способов изобретения) или, по меньшей мере, одно нанотело, основанное на нем.

Согласно одному неограничивающему воплощению изобретения, такой полипептид изобретения по существу состоит из нанотела. Под “по существу состоит из” понимается, что аминокислотная последовательность полипептида изобретения либо является точно такой же, что и аминокислотная последовательность нанотела (как указано выше), либо соответствует аминокислотной последовательности нанотела, в котором ограниченное число аминокислотных остатков, как, например, 1-10 аминокислотных остатков и, предпочтительно, 1-6 аминокислотных остатков, а также 1, 2, 3, 4, 5 или 6 аминокислотных остатков, добавлены к амино-концевой области, к карбокси-концевой области, либо и к амино-концевой области и к карбокси-концевой области аминокислотной последовательности нанотела.

Указанные аминокислотные остатки могут или не могут менять, видоизменять или иным образом влиять на (биологические) свойства нанотела и могут или не могут добавлять дополнительную функциональность нанотелу. Например, такие аминокислотные остатки:

- могут содержать N-концевой остаток Met, например, как результат экспрессии в гетерологичной клетке-хозяине или организме-хозяина.

- могут образовывать сигнальную последовательность или лидерную последовательность, которая направляет выделение нанотела из клетки-хозяина после синтеза. Пригодные секреторные лидерные пептиды известны специалистам и могут быть такими, как описывается ниже. Как правило, такая лидерная последовательность будет связываться с N-концом нанотела, хотя изобретение в его широком понимании не ограничивается этим;

- могут образовывать последовательность или сигнал, которая позволяет нанотелу направляться к и/или проникать или входить в специфичные органы, ткани, клетки, или части или участки клеток, и/или которая позволяет нанотелу проникать или проходить через биологический барьер, например, клеточную мембрану, клеточный слой, а также слой эпителиальных клеток, опухоль, включая солидные опухоли, или гематоэнцефалитический барьер. Примеры таких аминокислотных последовательностей известны специалистам. Некоторые неограничивающие примеры представляют собой малые пептидные векторы (“Pep-транс векторы”), описываемые в WO 03/026700 и в Temsamani et al., Expert Opin. Biol. Ther., 1, 773 (2001); Temsamani and Vidal, Drug Discov. Today, 9, 1012 (004) и Rousselle, J. Pharmacol. Exp. Ther., 296, 124-131 (2001), и мембранную транслокаторную последовательность, описываемую Zhao et al., Apoptosis, 8, 631-637 (2003). C-концевые и N-концевые аминокислотные последовательности для внутриклеточного таргетинга фрагментов антител, например, описываются Cardinale et al., Methods, 34, 171 (2004). Другие пригодные способы внутриклеточного таргетинга включают экспрессию и/или применение так называемых одноцепочечных антител (“intrabodies”), содержащих нанотела изобретения, как указывается ниже;

- могут образовывать “метку”, например, аминокислотная последовательность или остаток, которая обеспечивает или облегчает очистку нанотела, например, используя способы сродства, направленные против указанной последовательности или остатка. В дальнейшем, указанная последовательность или остаток может удаляться (напр., путем химического или ферментативного расщепления) для обеспечения последовательности нанотела (для этой цели, метка необязательно может связываться с последовательностью нанотела через расщепляющую линкерную последовательность или содержать расщепляющий фрагмент). Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, примеры таких остатков являются множественные гистидиновые остатки, глутатионовые остатки и myc-tag, такой как AAAEQKLISEEDLNGAA [SEQ ID NO:476];

- могут включать один или более аминокислотных остатков, которые функционализированы и/или которые могут служить в качестве сайта для связывания функциональных групп. Пригодные аминокислотные остатки и функциональные группы будут понятны для специалиста и включают, но не ограничиваются, аминокислотные остатки и функциональные группы, указанные здесь для производных нанотел изобретения.

В соответствии с другим воплощением, полипептид изобретения содержит нанотело изобретения, которое является слитым по его амино-концевой области, по его карбокси-концевой области, или по обеим его amino-концевой области и по его карбокси-концевой области с, по меньшей мере, одной дополнительной аминокислотной последовательностью, т.е. для обеспечения слитого белка, содержащего указанное нанотело изобретения и одну или более дополнительных аминокислотных последовательностей. Такое слияние будет также относится здесь к “слиянию нанотела”.

Одна или более дополнительных аминокислотных последовательностей могут быть любыми пригодными и/или желаемыми аминокислотными последовательностями. Дополнительные аминокислотные последовательности могут или не могут меняться, видоизменяться или иным образом влиять на (биологические) свойства нанотела и могут или не могут добавлять дополнительную функциональность нанотелу. Предпочтительно, дополнительная аминокислотная последовательность такова, что она предоставляет одно или более желаемых свойств или функциональностей нанотелу или полипептиду изобретения.

Примеры таких аминокислотных последовательностей понятны для специалиста и могут, в целом, содержать все аминокислотные последовательности, которые используются для слияния пептидов, на основании традиционных антител и их фрагментов (включая, но не ограничиваясь, ScFv и однодоменные антитела). Отсылка может быть дана, например, на обзор Holliger and Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136 (2005),

Например, такая аминокислотная последовательность может быть аминокислотной последовательностью, которая повышает время полужизни, растворимость, или абсорбцию, снижает иммуногенность или токсичность, устраняет или ослабляет нежелательные побочные эффекты, и/или предоставляет другие полезные свойства и/или уменьшает нежелательные свойства полипептидов изобретения, сравнительно с нанотелами изобретения по сути. Некоторые не ограничивающие примеры таких аминокислотных последовательностей включают сывороточные белки, а также сывороточный альбумин человека (см., например, WO 00/27435) или гаптеновые молекулы (например, гаптены, которые распознаются циркулирующими антителами, см., например, WO 98/22141).

Дополнительная аминокислотная последовательность может также обеспечивать второй связывающий сайт, где связывающий сайт может быть направленным против любого желаемого белка, полипептида, антигена, антигенной детерминанты или эпитопа (включая, но не ограничиваясь, тот же белок, полипептид, антиген, антигенную детерминанту или эпитоп, против которого нанотело изобретения направлено, или другой белок, полипептид, антиген, антигенную детерминанту или эпитоп). Например, дополнительная аминокислотная последовательность может обеспечивать второй связывающий сайт, который направлен против сывороточного белка (такого как, например, сывороточного альбумина человека или другого сывороточного белка, а также IgG), для обеспечения увеличенного времени полужизни в сыворотке. Ссылка дается, например, на EP 0 368 684, WO 91/01743, WO 01/45746 и WO 04/003019 (где указываются различные сывороточные белки), Международную заявку заявителя, названную “Nanobodies™ against amyloid-beta and polypeptides comprising the same for the treatment of degenerative neural diseases such as Alzheimer’s disease” (где указаны ряд других белков), так же как и на Harmsen et al., Vaccine, 23 (41); 4926-42.

В соответствии с другим воплощением, одна или более дополнительных аминокислотных последовательностей могут содержать одну или более части, фрагменты или домены традиционных 4-цепочечных антител (и в частности человеческих антител) и/или антител тяжелой цепи. Например, хотя, как правило, наименее предпочтительно, нанотело изобретения может связываться с традиционным (предпочтительно человеческим) V_H или V_L доменом или с природным или синтетическим аналогом V_H или V_L домена, опять же необязательно через линкерную последовательность (включая, но не ограничиваясь, другие (одно) доменные антитела, такие как dAb, описанные Ward et al.).

По меньшей мере, одно нанотело может связываться с одним или более (предпочтительно человеческими) CH₁, CH₂ и/или CH₃ доменами, необязательно через линкерную последовательность. Например, нанотело, связанное с пригодным CH₁ доменом, может, например, использоваться – совместно с пригодными легкими цепями – для образования фрагментов/структур антител, аналогичных традиционным Fab фрагментам или F(ab’)2 фрагментам, но в которых один или (для F(ab’)2 фрагмента) один или оба традиционных V_H доменов замещены нанотелом изобретения. Также, два нанотела могут связываться с CH3 доменом (необязательно через линкер) для обеспечения конструкции с увеличенным временем полужизни in vivo.

В соответствии с одним специфичным воплощением полипептида изобретения, одно или более нанотел изобретения могут связываться с одной или более частями, фрагментами или доменами антител, которые придают одну или более эффекторных функций полипептиду изобретения и/или могут придавать способность к связыванию с одним или более Fc рецепторами. Например, для этого, и без ограничения, одна или более дополнительных аминокислотных последовательностей могут содержать один или более CH₂ и/или CH₃ доменов антитела, таких, которые из антител к тяжелой цепи (как здесь описывается) и более предпочтительно из традиционного человеческого 4-цепочеченого антитела; и/или могут образовывать (часть) и Fc область, например, из IgG, из IgE или из другого человеческого Ig. Например, WO 94/04678 описывает антитела тяжелой цепи, содержащие V_HHдомен верблюжьих, или их гуманизированное производное (т.е. нанотело), в котором CH₂ и/или CH₃ домен верблюжьих замещен человеческими CH₂ и CH₃ доменами, для обеспечения иммуноглобулина, который состоит из 2 тяжелых цепей, каждая из которых содержит нанотело и человеческие CH2 и CH3 домены но не CH1 домен), который иммуноглобулин обладает эффекторной функцией, обеспечиваемой CH2 и CH3 доменами, и который иммуноглобулин может функционировать в отсутствии любых легких цепей. Другие аминокислотные последовательности, которые могут приемлемо связываться с нанотелами изобретения для обеспечения эффекторной функции будут понятны для специалиста и могут выбираться на основании желаемой(ых) эффекторной(ых) функции(ий). О чем упоминается в WO 04/058820, WO 99/42077 и WO 05/017148, так же как и в обзоре Holliger and Hudson, supra. Связывание нанотела изобретения с Fc областью может также приводить к повышению времени полужизни, сравнительно с соответствующим нанотелом изобретения. Для некоторых применений, использование Fc области и/или постоянных доменов (т.е. CH₂ и/или CH₃ доменов), которые придают повышенное время полужизни без какой-либо биологически значимой эффекторной функции, могут также быть пригодными или даже предпочтительными. Другие пригодные конструкции, содержащие одно или более нанотела и один или более постоянных доменов с повышенным временем полужизни in vivo, будут ясны специалисту, и могут, например, содержать два нанотела, связанных с CH3 доменом, необязательно через линкерную последовательность. В общем, любой слитой белок или производные с повышенным временем полужизни будут предпочтительно иметь молекулярную массу более чем 50 кД, малозначимая величина для почечной абсорбции.

Дополнительные аминокислотные последовательности могут также формировать сигнальную последовательность или лидерную последовательность, которая направляет секрецию нанотела или полипептида изобретения из клетки-хозяина после синтеза (например, для обеспечения пре-, про- или препроформ полипептида изобретения, в зависимости от клетки-хозяина, используемого для экспрессии полипептида изобретения).

Дополнительная аминокислотная последовательность может также формировать последовательность или сигнал, которая позволяет нанотелу или полипептиду изобретения быть направленным к и/или проникать или проходить в специфичные органы, ткани, клетки, или части или отделы клеток, и/или которая позволяет нанотелу или полипептиду изобретения проникать или пересекать биологический барьер, такой как клеточную мембрану, клеточный слой, такой как слой эпителиальных клеток, опухоль, включая солидные опухоли, или гематоэнцефалитический барьер. Пригодные примеры таких аминокислотных последовательностей будут ясны специалисту, и, например, включают, но не ограничиваются, векторы “Peptrans”, указанные выше, последовательности, описываемые Cardinale et al. и аминокислотные последовательности и фрагменты антител, по существу известные, которые могут применяться для представления или изготовления нанотел и полипептидов изобретения, как так называемые “intrabodies” – внутриклеточные фрагменты антител, например, которые описываются в WO 94/02610, WO 95/22618, US-A-7004940, WO 03/014960, WO 99/07414; WO 05/01690; EP 1 512 696; и в Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag; и в Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170, и в дополнительных ссылках, описываемых здесь.

Для некоторых способов применения, в частности, для таких применений, в которых предполагается уничтожение клетки, которая представляет мишень, против которой направлены нанотела изобретения (напр., в лечении раковой опухоли), или подавление или замедление роста и/или пролиферации такой клетки, нанотела изобретения могут также связываться с (цито)токсичным белком или полипептидом. Примеры таких токсичных белков и полипептидов, которые могут связываться с нанотелом изобретения для обеспечения – например, – цитотоксичного полипептида изобретения, будут ясны специалисту и могут, например, быть обнаружены в уровне технике, цитируемом выше, и/или в дополнительном этом описании. Одним примером является так называемая ADEPT™ технология, WO 03/055527.

В соответствии с одним не ограничивающим воплощением, один или более аминокислотных остатков могут добавляться к, включаться в и/или замещаться в аминокислотной последовательности нанотела или полипептида изобретения для обеспечения одного или более специфичных аминокислотных остатков для связывания PEG-группы.

Эффективность белковых лекарственных средств зависит от их активности по уничтожению мишени, но также от внутренних фармакинетик потенциального лекарственного средства. Поскольку почки обычно фильтруют молекулы ниже 60000 Дальтон (Да), усилия по снижению клиренса направлены на увеличение молекулярной массы биофармацевтического лекарства через слияния белков (Syed et al., 1997), гликозилирования или модификацию с полиэтиленгликольными полимерами, т.е. ПЭГилирование (Lee et al., 1999; Abuchowski et al., 1977; Nucci et al., 1991; Lecolley, et al. Chem Commun, 2004; Tao et al., J Am Chem Soc, 2004; Mantovani et al., 2005). Эти способы с успехом повышают выделение биофармацевтического лекарства in vivo.

Альтернативно, время полужизни может повышаться при использовании другого пегилирующего агента, POLY PEG, для связывания с бивалентными нанотелами, TNF56 или TNF55. POLY PEG представляет собой полимер в форме расчески с PEG зубьями на метакриловом каркасе. POLY PEG могут отличаться по длине цепи PEG, по метакриловой цепи и по активной концевой группе, которая определяет способ конъюгации POLY PEG с нанотелом. Сайт-специфичная конъюгация с C-концевым цистеином, имеющимся в нанотелах, может обеспечиваться через активную малеимидную концевую группу в POLY PEG.

Изобретение также охватывает любое нанотело изобретения и/или полипептид изобретения, которое гликозилировано по одному или более аминокислотным положениям, что, как правило, зависит от хозяина, используемого для представления нанотела или полипептида изобретения (как дополнительно описывается ниже).

В соответствии с одним не ограничивающим воплощением, один или более аминокислотных остатков могут добавляться к, включаться в и/или замещаться в аминокислотной последовательности нанотела или полипептида изобретения, для обеспечения одного или более специфичных аминокислотных остатков и/или участка, которые могут быть гликозилированы используемым организмом-хозяина. Посредством предпочтительного, но не ограничивающего, примера, N-остаток в положении 50 в CDR2 нанотела изобретения может, например, заменяться на Q, D или S остаток для обеспечения сайта гликозилирования, напр., для гликозилирования Pichia.

В соответствии с другим воплощением, полипептид изобретения может содержать аминокислотную последовательность нанотела, которая слита по ее аминоконцевой области, по ее карбоксиконцевой области, или по ее обеим аминоконцевой и карбоксиконцевой областям, по меньшей мере, с одной дополнительной аминокислотной последовательностью.

Кроме того, указанная(ые) дополнительная(ые) аминокислотная(ые) последовательность(и) могут или не могут менять, видоизменять или же влиять на (биологические) свойства нанотела и могут или не могут добавлять дополнительные функциональности нанотелу.

Например, в соответствии с одним предпочтительным, но не ограничивающим, воплощением, указанная дополнительная аминокислотная последовательность может содержать, по меньшей мере, одно дополнительное нанотело для обеспечения полипептида изобретения, который содержит, по меньшей мере, два, а также три, четыре или пять нанотел, в котором указанные нанотела могут необязательно быть связаны посредством одной или более линкерных последовательностей (как определено здесь).

Полипептиды изобретения, содержащие два или более нанотела также будут относиться здесь к “многовалентным” полипептидам. Например, “бивалентный” полипептид изобретения содержит два нанотела, необязательно связанных посредством линкерной последовательности, при этом “тривалентный” полипептид изобретения содержит три нанотела, необязательно связанных посредством двух линкерных последовательностей; и т.д.

В многовалентном полипептиде изобретения, два или более нанотел могут являться аналогичными или отличаться. Например, два или более нанотел в многовалентном полипептиде изобретения:

- могут быть направлены против одного и того же антигена, т.е. против одних и тех же частей или эпитопов указанного антигена или против двух или более различных частей или эпитопов указанного антигена; и/или:

- могут быть направлены против различных антигенов;

или их комбинации.

Таким образом, бивалентный полипептид изобретения, например:

- может содержать два идентичных нанотела;

- может содержать первое нанотело, направленное против первой части или эпитопа антигена, и второе нанотело, направленное против той же части или эпитопа указанного антигена или против другой части или эпитопа указанного антигена;

- или может содержать первое нанотело, направленное против первого антигена, и второе нанотело, направленное против второго антигена, отличного от указанного первого антигена;

тогда как тривалентный Полипептид изобретения, например:

- может содержать три идентичных или отличных нанотела, направленных против одних и тех же или различных частей или эпитопов одного и того же антигена;

- может содержать два идентичных или отличных нанотела, направленных против одних и тех же или различных частей или эпитопов первого антигена, и третье нанотело, направленное против второго антигена, отличного от указанного первого антигена; или

- может содержать первое нанотело, направленное против первого антигена, второе нанотело, направленное против второго антигена, отличного от указанного первого антигена, и третье нанотело, направленное против третьего антигена, отличного от указанных первого и второго антигенов.

Полипептиды изобретения, которые содержат, по меньшей мере, два нанотела, где, по меньшей мере, одно нанотело направлено против первого антигена, и, по меньшей мере, одно нанотело направлено против второго антигена, отличного от первого антигена, также будет относиться к “мультиспецифичным” нанотелам. Таким образом, “биспецифичное” нанотело представляет собой нанотело, которое содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против первого антигена, и, по меньшей мере, одно дополнительное нанотело, направленное против второго антигена, тогда как “триспецифичное” нанотело представляет собой нанотело, которое содержит, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против первого антигена, по меньшей мере, одно дополнительное нанотело, направленное против второго антигена, и, по меньшей мере, одно дополнительное нанотело, направленное против третьего антигена; и т.д.

Соответственно, в его простейшем виде, биспецифичный полипептид изобретения представляет собой бивалентный полипептид изобретения (как определено здесь), содержащий первое нанотело, направленное против первого антигена, и второе нанотело, направленное против второго антигена, в котором указанные первое и второе нанотела могут необязательно быть связанными посредством линкерной последовательности (как определено здесь); тогда как триспецифичный полипептид изобретения, в его простейшем виде, представляет собой тривалентный полипептид изобретения (как определено здесь), содержащий первое нанотело, направленное против первого антигена, второе нанотело, направленное против второго антигена, и третье нанотело, направленное против третьего антигена, в котором указанные первое, второе и третье нанотела могут необязательно быть связанными через одну или более, и, в частности, одну и более, в частности, две линкерные последовательности.

Тем не менее, как следует из вышеприведенного описания, изобретение не ограничивается тем, в том смысле, что мультиспецифичный полипептид изобретения может содержать любое число нанотел, направленных против двух или более различных антигенов.

Для многовалентных и мультиспецифичных полипептидов, содержащих один или более V_HHдоменов, и их приготовления, ссылку также можно указать на Conrath et al., J. Biol. Chem., Vol. 276, 10. 7346-7350, так же как и на EP 0 822 985.

В полипептидах изобретения, одно или более нанотел и один или более полипептидов могут быть непосредственно связаны друг с другом (как, например, описывается в WO 99/23221) и/или могут быть связаны друг с другом посредством одного или более пригодных спейсеров или линкеров, или любая их комбинация.

Пригодные спейсеры или линкеры для применения в многовалентных и мультиспецифичных полипептидах будут ясны специалисту, и могут, в общем, быть любым линкером или спейсером, используемым в технике, для связывания аминокислотных последовательностей. Предпочтительно, указанный линкер или спейсер представляет собой пригодный для применения в создании белков или полипептидов, которые предполагаются для фармацевтического применения.

Некоторые особенно предпочтительные спейсеры включают спейсеры и линкеры, которые используются в технике для связывания фрагментов антител или доменов антител. Они включают линкеры, указанные в общем уровне техники, цитируемом выше, а так же, например, линкеры, которые используются в технике для создания димеров или ScFv фрагментов (в этом отношении, однако, следует отметить, что поскольку, в димерах и в ScFv фрагментах, используемая линкерная последовательность должна иметь длину, степень жесткости и другие свойства, которые позволяют соответствующим V_H и V_L доменам сближаться для формирования полного антиген-связывающего сайта, не существует особенного ограничения относительно длины и жесткости линкера, использующегося для полипептида изобретения, так как каждое нанотело, само по себе, формирует полный антиген-связывающий сайт).

Другие пригодные линкеры, в общем, содержат органические соединения или полимеры, в частности, такие, которые пригодны для использования в белках для фармацевтического применения. Например, поли(этиленгликолевые) агенты используются для связывания доменов антител, см., например, WO 04/081026.

Также в объем изобретения входит то, что использующий(е)ся линкер(ы) придают одно или более другие полезные свойства или функциональности полипептидам изобретения, и/или обеспечивают одним или более сайтами для формирования производных и/или для связывания функциональных групп (напр., как описывается здесь, для производных нанотел изобретения). Например, линкеры, содержащие один или более заряженных аминокислотных остатков (см. выше таблицу A-3) могут обеспечивать повышенные гидрофильные свойства, тогда как линкеры, которые формируют или содержат небольшие эпитопы или метки, могут использоваться для целей обнаружения, идентификации и/или очистки. Кроме того, с учетом описания раскрытия изобретения, приведенного здесь, специалист будет способен определить оптимальные линкеры для использования в специфическом полипептиде изобретения, необязательно после проведения некоторых рутинных экспериментов.

В заключении, если два или более линкера используются в полипептидах изобретения, то эти линкеры могут быть одинаковыми или отличаться. Кроме того, на основании раскрытия изобретения, приведенного здесь, специалист будет способен определить оптимальные линкеры для использования в специфическом полипептиде изобретения, необязательно после проведения некоторых рутинных экспериментов.

Линкеры для использования в многовалентных и мультиспецифичных полипептидах будут ясны специалисту, и например, включают gly-ser линкеры, например, тип (gly_xser_y)_z, такие, как (gly₄ser)₃ или (gly₃ser₂)₃, как описывается в WO 99/42077, шарниро-подобные участки, такие как шарнирные участки природных антител, состоящих только из тяжелых цепей или аналогичных последовательностей. Для других пригодных линкеров отсылку можно дать на общий уровень техники, цитируемый выше. Некоторые особенно предпочтительные линкеры представлены в SEQ ID NO 68 и 69.

Линкеры могут также обеспечивать некоторые функциональности для многовалентного или мультиспецифичного полипептида. Например, линкеры, содержащие один или более заряженных аминокислотных остатков (см. таблицу 1 выше), могут обеспечивать улучшенные гидрофильные свойства, при этом линкеры, которые формируют или содержат небольшие эпитопы или метки, могут использоваться для целей обнаружения, идентификации и/или очистки.

Как указано здесь, в белке или полипептиде изобретения, анти-TNF нанотела, здесь указанные, предпочтительно связываются таким образом, что указанный белок или полипептид, после связывания с тримером TNF, способен ингибировать или снижать связывание с рецептором TNF, которое опосредуется указанным тримером TNF, и/или сигнальную трансдукцию, которая опосредуется таким рецепторным связыванием; и/или таким образом, что белок или полипептид способен к внутримолекулярному связыванию с, по меньшей мере, двумя сайтами связывания рецепторов TNF на тримере TNF. Пригодные линкеры такие, которые здесь описываются.

Как также здесь указывается, независимо от того, обеспечивает белок или полипептид внутримолекулярное связывание или внемолекулярное связывание, он может быть определен (по меньшей мере, исходно) с помощью гель-хроматографии. С помощью гель-хроматографии комплексы TNF-альфа и антител могут быть проанализированы для обнаружения количества и отношения антитела и молекул TNF-альфа в комплексе. На основании этих данных можно сделать вывод, произошло меж- или внутримолекулярное связывание, как было сделано Santora и его коллегами (Santora, L.C., et al, Anal Biochem. 2001) для установления стехиометрии связывания моноклонального антитела D2E7 (Humira) с TNF-альфа в различных соотношениях антитела и мишени. По молекулярной массе комплекса было сделано заключение, что три молекулы антитела образовали комплекс с тремя тримерами TNF, тем самым показывая, что антитело связано межмолекулярным путем. Аналогичные эксперименты проводились с бивалентными нанотелами, в которых очень короткий линкер индуцировал образование крупномолекулярных комплексов, которое были получены межмолекулярными связями. Однако, те же конструкции из бивалентных нанотел с более длинными линкерами извлекались из колонки для гель-фильтрации как мелкие дискретные комплексы, тем самым показывая, что были образованы внутримолекулярные связи. Объединив результаты биоанализа, где более длинный линкер, содержащий нанотело TNF1, имел оптимальную активность (полная нейтрализация числа TNF, используемого в анализе, т.е. 10 пM), было сделано заключение, что внутримолекулярное связывание бивалентного нанотела эффективно препятствует перекрестному связыванию двух клеточных рецепторов и ассоциированной активации рецепторов. Известные моноклональные антитела, такие как Humira или Remicade, не могут формировать такие внутримолекулярные связи, оставляя всегда два сайта связывания с рецепторами на тримерной молекуле TNF в некоторой степени способными для взаимодействия с клеточным рецептором, который переводит в наименее сильную нейтрализацию, как определено в биоанализе.

Альтернативно, независимо от того, обеспечивает белок или полипептид внутримолекулярное связывание или внемолекулярное связывание, он может быть определен с помощью кристаллографии и/или молекулярного моделирования (или другими пригодными способами in silico). Модель тримерного TNF30/TNF-альфа комплекса была генерирована с учетом кристаллической структуры мономерного комплекса TNF1/TNF-альфа дикого типа. По этой структуре была смоделирована итоговая конструкция TNF30-линкер-ALB8-линкер-TNF30. Конструкция TNF30-линкер-ALB8-линкер-TNF30 была смоделирована, начиная с тримера TNFα с двумя связанными молекулами TNF30. Поскольку структура ALB8 не известна, то вместо него использовалась третья молекула TNF30, которая была помещена между другими двумя нанотелами вдоль линии между N- и C-концами. Затем вручную были добавлены 9 аминокислотных линкеров.

Модель показана на фигуре 62. Очевидно, что 9 аминокислотных линкера совместно с ALB8 обеспечивают достаточно места для расстояния в около 66 Å между двумя доменами TNF30, связанных TNFα. ALB8 сам по себе уже занимает 40 Å, и каждый линкер может занять другие приблизительно 27 Å в полностью растянутой конформации. Как результат, ALB8 обладает некоторой жесткостью движения, и не ожидается, что его связывание с альбумином будет препятствовать связыванию с TNFα.

Кроме того, вероятно, что линкеры могут быть сокращены не нарушая авидность, особенно для линкера, который представляет собой C-конец ALB8. Это может оказывать положительное действие, заключающееся в повышенном связывании с тем же тримером TNFα по сравнению со сшитыми тримерами, поскольку возможность, что второй TNF30 связывается с различным TNFα, увеличивается с длиной линкера.

Как также дополнительно описывается здесь, мультиспецифичный полипептид изобретения, направленный против желаемого антигена и против, по меньшей мере, одного сывороточного белка, такого как сывороточный белок, указываемый ниже, и, в частности, против сывороточного альбумина человека, может демонстрировать повышенное время полужизни в сыворотке, сравнительно с соответствующим моновалентным нанотелом.

Как указано здесь выше, способы, описываемые здесь, особенно пригодны для образования таких многовалентных и мультиспецифичных полипептидов изобретения.

В полипептиде изобретения, по меньшей мере, одно нанотело может также быть связанными с традиционным V_H доменом или с природным или синтетическим аналогом V_H домена, необязательно через линкерную последовательность.

В полипептиде изобретения, по меньшей мере, одно нанотело может также быть связанными с V_L доменом или с природным или синтетическим аналогом V_L домена, необязательно через линкерную последовательность, для обеспечения полипептида изобретения, который находится в аналогичной форме с традиционным scFv фрагментом, но содержащий нанотело вместо V_H домена.

В полипептиде изобретения, по меньшей мере, одно нанотело может также быть связанными с одним или более CH1, CH2 и/или CH3 доменом, необязательно через линкерную последовательность. Например, нанотело, связанное с пригодным CH1 доменом может, например, использоваться – вместе с пригодными легкими цепями – с образованием фрагментов/структур антител, аналогичных традиционным Fab фрагментам или F(ab’)₂ фрагментам, но в котором один или (в случае F(ab’)₂ фрагмента) один или оба традиционных V_H доменов заменяются нанотелом. Такие фрагменты могут также быть гетероспецифичными или биспецифичное, т.е. направленными против двух или более антигенов. Нанотело, связанное с пригодными CH2 и CH3 доменами, например, полученное от Camelids, могут использоваться для образования моноспецифичного или биспецифичного антитела тяжелой цепи. В итоге, нанотело, связанное с пригодными CH2 и CH3 доменами, например, полученное от человека, может использоваться – вместе с пригодными легкими цепями – для образования антитела, которое аналогично традиционному 4-цепочечному антителу, но в котором один или оба традиционных V_H доменов заменены нанотелом.

Также, в дополнении к одному или более нанотелам, Полипептиды изобретения могут также содержать функциональные группы, части или остатки, например, терапевтически активные субстанции, такие, как указанные ниже, и/или маркеры или метки, такие, как флуоресцентные маркеры, изотопы, и т.д., как дополнительно описывается в дальнейшем.

Нанотела изобретения, полипептиды изобретения и их кодирующие нуклеиновые кислоты могут приготавливаться способом, известным по сути, который будет очевиден для специалист из дополнительного описания, приведенного здесь. Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, способы приготовления нанотел, полипептидов и нуклеиновых кислот включают способы и методы, указанные выше и/или дополнительно описываемые ниже.

Как будет ясно для специалиста, один особенно пригодный способ приготовления нанотела и/или полипептида изобретения, в общем, содержит следующие этапы:

- экспрессию, в пригодной клетке-хозяине или организме-хозяине (также упоминается здесь как “хозяин согласно изобретению”) или в другой пригодной экспрессирующей системе нуклеиновой кислоты, которая кодирует указанное нанотело или полипептид изобретения (также относится здесь к “нуклеиновой кислоте изобретения”), необязательно с последующим:

- отделением и/или очисткой нанотела или полипептида изобретения, полученным таким образом.

В частности, такой способ может содержать этапы:

- культивирование и/или поддерживание хозяина изобретения в условиях, которые такие, что указанный хозяин изобретения экспрессирует и/или продуцирует, по меньшей мере, одно нанотело и/или полипептид изобретения; необязательно с последующим:

Нуклеиновая кислота изобретения может находиться в форме одно или двухцепочечной ДНК или РНК, и предпочтительно в форме двухцепочечной ДНК. Например, нуклеотидными последовательностями изобретения могут быть геномная ДНК, кДНК или синтетическая ДНК (такие как ДНК с использованием кодонов, которая специфично адаптирована для экспрессии в предполагаемой клетке-хозяине или организме-хозяине).

В соответствии с одним воплощением изобретения, нуклеиновая кислота изобретения находится по существу в изолированной форме, как определено здесь выше.

Нуклеиновая кислота изобретения может также находится в форме, присутствует в и/или является частью вектора, такого как, например, плазмида, космида или YAC, которые опять таки могут находиться по существу в изолированной форме.

Нуклеиновые кислоты изобретения могут быть приготовлены или получены способом, известным по сути с учетом сведений об аминокислотных последовательностях для полипептидов изобретения, указанных здесь, и/или могут быть отделены из пригодного природного источника. Для обеспечения аналогов, нуклеотидные последовательности, кодирующие природные V_HH домены, могут например, подвергаться сайт-направленному мутагенезу для обеспечения нуклеиновой кислоты изобретения, кодирующей указанный аналог. Также, как будет ясно специалисту, при приготовлении нуклеиновой кислоты изобретения, также несколько нуклеотидных последовательностей, таких как, по меньшей мере, одна нуклеотидная последовательность, кодирующая нанотело, и, например, нуклеиновая кислота, кодирующая один или более линкеры, могут быть связаны друг с другом пригодным образом.

Способы создания нуклеиновых кислот изобретения будут ясны специалисту и могут, например, включать, но не ограничиваются, автоматический синтез ДНК; сайт-направленный мутагенез; комбинирование двух или более природных и/или синтетических последовательностей (или двух или более их частей), введение мутаций, которые приводят к экспрессии процессированного продукта экспрессии; введение одного или более сайтов рестрикции (напр., для создания кассет и/или областей, которые могут с легкостью расщепляться и/или лигироваться при использовании пригодных рестрикционных ферментов), и/или введение мутаций с помощью ПЦР реакции при использовании одного или более праймеров с мисматчами, при использовании, например, последовательности природного GПЦР в качестве матрицы. Эти и другие способы будут ясны специалисту, и снова ссылка дается на стандартные справочники, такие как Sambrook et al. и Ausubel et al., указанные выше, так же как и на нижеуказанные примеры.

Нуклеиновая кислота изобретения может также находится в форме, присутствовать в и/или являться частью генетической конструкции, как будет очевидно для специалиста в данной области техники. Такие генетические конструкции обычно содержат, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту изобретения, которая необязательно связана с одним или более элементами генетических конструкций, известных по сути, такими как, например, с одним или более пригодными регуляторными элементами (такими как пригодный(е) промотор(ы), энхансер(ы), терминатор(ы), и т.д.) и дополнительными элементами генетических конструкций, указанных здесь ниже. Такие генетические конструкции, содержащие, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту изобретения будут также относится здесь как “генетические конструкции изобретения”.

Генетические конструкции изобретения могут быть ДНК или РНК, и предпочтительно двухцепочечной ДНК. Генетические конструкции изобретения могут также быть в форме, пригодной для трансформации предполагаемой клетки-хозяина или организма-хозяина, в форме, пригодной для интеграции в геномную ДНК предполагаемой клетки-хозяина или организма-хозяина, в форме, пригодной для независимой репликации, поддержания и/или наследования в предполагаемой клетке-хозяине или организме-хозяине. Например, генетические конструкции изобретения могут находиться в форме вектора, такого как, например, плазмида, космиды, YAC, вирусного вектора или транспозона. В частности, вектор может являться экспрессирующим вектором, т.е. вектором, который обеспечивает экспрессию in vitro и/или in vivo (напр., в пригодной клетке-хозяине, организме-хозяине и/или экспрессирующей системе).

В предпочтительном, но не ограничивающем, воплощении, генетическая конструкция изобретения содержит

- по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту изобретения, функционально связанную с

- одним или более регуляторными элементами, такими как промотор и необязательно пригодный терминатор;

- и необязательно также

- одним или более дополнительными элементами генетических конструкций, известных по сути;

где термины “регуляторный элемент”, “промотор”, “терминатор” и “функционально связанный” имеют их обычное значение, известное в уровне технике (как дополнительно описывается ниже); и где указанные “дополнительные элементы”, имеющиеся в генетических конструкциях могут, например, быть 3’- или 5’-UTR (нетранслируемые) последовательности, лидерные последовательности, маркеры выделения, маркеры экспрессии/репортерные гены, и/или элементы, которые могут облегчать или увеличивать (эффективность) трансформации или интеграции. Эти и другие пригодные элементы таких генетических конструкций будут ясны специалисту, и могут, например, зависеть от типа используемой конструкции, предполагаемой клетки-хозяина или организма-хозяина; способа, по которому интересующие нуклеотидные последовательности изобретения экпрессируются (напр., посредством конституционной, транзиторной или индуцируемой экспрессии); и/или используемого способа трансформации.

Предпочтительно, в генетических конструкциях изобретения, указанная, по меньшей мере, одна нуклеиновая кислота изобретения и указанные регуляторные элементы, и необязательно указанный один или более дополнительные элементы, “функционально связаны” друг с другом, что, по сути, означает, что они находятся в функциональной взаимосвязи друг с другом. Например, промотор рассматривается как “функционально связанный” с кодирующей последовательностью, если указанный промотор способен инициировать, или же контролировать/регулировать транскрипцию и/или экспрессию кодирующей последовательности (где под указанной кодирующей последовательностью следует понимать, что она находится “под контролем” указанного промотора). Обычно, если две нуклеотидные последовательности функционально связаны, то они будут одинаково ориентированы и, как правило, также находится в одной рамке считывания. Они также будут, как правило, находится по существу рядом, хотя это необязательно.

Предпочтительно, регуляторные и дополнительные элементы генетических конструкций изобретения таковы, что они способны обеспечивать их предполагаемые биологические функции в предполагаемой клетке-хозяине или организме-хозяине.

Например, промотор, энхансер или терминатор должны быть “функциональными” в предполагаемой клетке-хозяине или организме-хозяине, что значит, что (например) указанный промотор должен являться способным инициировать или же контролировать/регулировать транскрипцию и/или экспрессию нуклеотидной последовательности - напр., кодирующей последовательности – с которой он функционально связан (как определено здесь).

Некоторые особенно предпочтительные промоторы включают, но не ограничиваются, промоторы, известные сами по себе для экспрессии в бактериальных клетках, а также те, которые приведены в дальнейшем и/или те, которые используются в примерах.

Селекционный маркер должен быть таким, чтобы позволять - т.е. при подходящих селекционных условиях - клеткам-хозяевам и/или организмам-хозяевам, которые (успешно) трансформированы нуклеотидной последовательностью изобретения, дифференцироваться от клеток-хозяев/организмов, которые (успешно) не трансформированы. Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, примеры таких маркеров представляют собой гены, которые обеспечивают резистентность к антибиотикам (таким как канамицин или ампициллин), гены, которые обеспечивают температурную резистентность, или гены, которые позволяют клетке-хозяину или организму-хозяину сохраняться при отсутствии некоторых факторов, соединений и/или (питательных) компонентов в среде, которая является важной для существования нетрансформированных клеток или организмов.

Лидерная последовательность должна быть такой, чтобы - в предполагаемой клетке-хозяине или организме-хозяина - обеспечивать желаемые посттрансляционные модификации и/или такой, чтобы направлять считываемую область мРНК в желаемую часть или органеллу клетки. Лидерная последовательность может также обеспечивать секрецию продукта экспрессии из указанной клетки. А также, лидерная последовательность может являться любой про-, пре-, или препропоследовательностью, функционирующей в клетке-хозяине или в организме-хозяина. Лидерная последовательностей может не требоваться для экспрессии в бактериальной клетке.

Маркер экспрессии или репортерный ген должен таким, чтобы - в предполагаемой клетке-хозяине или организме-хозяина - обеспечивать обнаружение экспрессии (присутствующего гена или нуклеотидной последовательности) генетической конструкции. Маркер экспрессии также, необязательно, может обеспечивать локализацию экспрессированного продукта, напр., в специфической части или органелле клетки и/или в специфической(их) клетке(ах), ткани(ях), органе(ах) или части(ях) многоклеточного организма. Такие репортерные гены могут также экспрессироваться как белок, слитый с аминокислотной последовательностью изобретения. Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, примеры включают флуоресцентные белки, такие как GFP.

Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, примеры пригодных промоторов, терминатора и дополнительных элементов включают такие, которые используются в нижеприведенных примерах. Для некоторых (дополнительных) неограничивающих примеров промоторов, селективных маркеров, лидерных последовательностей, маркеров экспрессии и дополнительных элементов, которые могут быть представлены/использованы в генетических конструкциях изобретения – такие как терминаторы, транскрипционные и/или трансляционные энхансеры и/или факторы интеграции – ссылки представлены на общие справочники, такие как Sambrook et al. и Ausubel et al., указанных выше, так же как и на примеры, которые приведены в WO 95/07463, WO 96/23810, WO 95/07463, WO 95/21191, WO 97/11094, WO 97/42320, WO 98/06737, WO 98/21355, US-A-6,207,410, USA № 5693492 и EP 1 085 089. Другие примеры будут ясны специалисту. Ссылки также приводятся на общий уровень техники, цитируемый выше, и на дополнительные ссылки, цитируемые в дальнейшем.

Генетические конструкции изобретения могут, в целом, обеспечиваться за счет пригодного связывания нуклеотидной(ых) последовательности(ей) изобретения с одним или более дополнительными элементами, описываемыми выше, например, за счет использования способов, описываемых в общих справочниках, по редакцией Sambrook et al. и Ausubel et al., указанных выше.

Часто, генетические конструкции изобретения будут образовываться путем включения нуклеотидных последовательность изобретения в пригодный вектор (экспрессии), известный в чистом виде. Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, примеры пригодных векторов экспрессии приведены в дальнейших примерах, а так же упоминаются в дальнейшем.

Нуклеиновые кислоты изобретения и/или генетические конструкции изобретения могут использоваться для трансформации клетки-хозяина или организма-хозяина. Клетка-хозяин или организм-хозяин может являться любой пригодной (грибковой, прокариотной или эукариотной) клеткой или клеточной линией или любым пригодным грибковым, прокариотным или эукариотным организмом, например:

- бактериальным штаммом, включая, но не ограничиваясь, грамотрицательные штаммы, такие как штаммы Escherichia coli; Proteus, например, Proteus mirabilis; Pseudomonas, например, Pseudomonas fluorescens; и грамположительные штаммы, такие как штаммы Bacillus, например, Bacillus subtilis или Bacillus brevis; Streptomyces, например, Streptomyces lividans; Staphylococcus, например, Staphylococcus carnosus; и Lactococcus, например, Lactococcus lactis;

- грибковой клеткой, включая, но не ограничиваясь, клетки из штаммов Trichoderma, например, из Trichoderma reesei; Neurospora, например, из Neurospora crassa; Sordaria, например, из Sordaria macrospora; Aspergillus, например, из Aspergillus niger или из Aspergillus sojae; или из других нитчатых грибов;

- дрожжевой клеткой, включая, но не ограничиваясь, клетки из штаммов Saccharomyces, например, Saccharomyces cerevisiae; Schizosaccharomyces, например, Schizosaccharomyces pombe; Pichia, например, Pichia pastoris или Pichia methanolica; Hansenula, например, Hansenula polymorpha; Kluyveromyces, например, Kluyveromyces lactis; Arxula, например, Arxula adeninivorans; Yarrowia, например, Yarrowia lipolytica;

- клеткой земноводных или клеточной линией, такой как ооциты Xenopus;

- клеткой, полученной из насекомых, или клеточной линией, таких как клетки/клеточные линии, полученные из чешуекрылых, включая, но не ограничиваясь, клетки Spodoptera SF9 и Sf21, или клетки/клеточные линии, полученные из Drosophila, такие как клетки Schneider и Kc;

- растением и растительной клеткой, например, табачным растением; и/или

- клеткой млекопитающих или клеточной линией, например, полученной клеткой или клеточной линией, полученной от человека, от млекопитающих, включая, но не ограничиваясь, CHO-клетки, BHK-клетки (например, клетки BHK-21) и клетки человека или клеточные линии, такие как HeLa, COS (например, COS-7) и PER.C6 клетки;

так же как и все другие хозяева или клетки-хозяева, известные per se для экспрессии и продукции антител и фрагментов антител (включая, но не ограничиваясь, (одно) доменные антитела и фрагменты ScFv), которые будут ясны специалисту. Ссылки относятся к общему уровню техники, цитируемому выше, например, WO 94/29457; WO 96/34103; WO 99/42077; Frenken et al., (1998), supra; Riechmann and Muyldermans, (1999), supra; van der Linden, (2000), supra; Thomassen et al., (2002), supra; Joosten et al., (2003), supra; Joosten et al., (2005), supra; и дополнительным ссылкам, цитируемым в данном документе.

Нанотела и полипептиды изобретения могут также вводиться и экспрессироваться в одной или более клетках, тканях или органах многоклеточного организма, например, для профилактических и/или терапевтических целей (напр., как генная терапия). Для этого, нуклеотидные последовательности изобретения могут вводиться в клетки или ткани любым пригодным путем, например, таким как (напр., при использовании липосом) или после того как они были внесены в пригодный геннотерапевтический вектор (например, полученный из ретровирусов, такого как аденовирус, или парвовирусов, такого как аденоассоциированный вирус). Как будет также ясно для специалиста, такая генная терапия может осуществляться in vivo и/или in situ в организме пациента путем введения нуклеиновой кислоты изобретения или кодирующего ее пригодного геннотерапевтического вектора пациенту или специфичным клеткам или специфичной ткани или органу пациента; или пригодные клетки (часто взятые из организма пациента для воздействия, таких как эксплантированные лимфоциты, пунктаты костного мозга или биопсии тканей) могут быть обработаны нуклеотидной последовательностью изобретения in vitro и затем пригодным образом вновь внесены в организм пациента. Все это может осуществляться при использовании геннотерапевтических векторов, способов и систем доставки, которые хорошо известны специалистам, например из Culver, K. W., "Gene Therapy", 1994, p. xii, Mary Ann Liebert, Inc., Publishers, New York, N.Y). Giordano, Nature F Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992),808-813; Verma, Nature 389 (1994),239; Isner, Lancet 348 (1996),370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995),1077-1086; Onodera, Blood 91; (1998),30- 36; Verma, Gene Ther. 5 (1998),692-699; Nabel, Ann. N.Y. Acad. Sci.: 811 (1997), 289-292; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-51; Wang, Nature Medicine 2 (1996),714-716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5580859; US 5589466; или из Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640. Например, экспрессия in situ фрагментов ScFv (Afanasieva et al., Gene Ther., 10, 1850-1859 (2003)) и димеров (Blanco et al., J. Immunol, 171, 1070-1077 (2003)) описана в уровне технике.

Для экспрессии нанотел в клетке, они могут также экспрессироваться как так называемые “интратела”, что, например, описывается в WO 94/02610, WO 95/22618 и US-A-7004940; WO 03/014960; в Cattaneo, A. & Biocca, S. (1997) Intracellular Antibodies: Development and Applications. Landes and Springer-Verlag; и в Kontermann, Methods 34, (2004), 163-170.

Для продукции, нанотела и полипептиды изобретения могут, например, также продуцироваться в молоке трансгенных млекопитающих, например, в молоке кроликов, коров, коз или овец (см., например, US-A-6741957, US-A-6304489 и US-A-6849992 относительно общих способов введения трансгенов млекопитающим), в растениях или частях растений, включая, но не ограничиваясь, их листья, цветки, плоды, семена, корни или клубни (например, в табаке, маисе, сое или люцерне) или в, например, куколке тутового шелкопряда Bombyx mori.

Кроме того, нанотела и полипептиды изобретения могут также экспрессироваться и/или продуцироваться в бесклеточных экспрессирующих системах, и пригодные примеры таких систем будут ясны специалисту. Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, примеры включают экспрессию в системе из проростков пшеницы; в системе лизата кроличьих ретикулоцитов; или в системе E. coli Zubay.

Как указанно выше, одним из преимуществ использования из нанотел является то, что полипептиды, основанные на них, могут приготавливаться посредством экспрессии в пригодной бактериальной системе, и пригодные бактериальные экспрессирующие системы, векторы, клетки-хозяева, регуляторные элементы, и т.д., будут понятны специалисту, например, из ссылок, приведенных выше. Тем не менее, следует отметить, что изобретение в его широком смысле не ограничивается экспрессией в бактериальных системах.

Предпочтительно, в изобретении, (in vivo или in vitro) экспрессирующая система, такая как бактериальная экспрессирующая система, применяется для обеспечения полипептидов изобретения в форме, которая пригодна для фармацевтического применения, и такие экспрессирующие системы опять же будут понятны для специалиста. Как также будет ясно специалисту, полипептиды изобретения, пригодные для фармацевтического использования, могут приготавливаться с помощью способов пептидного синтеза.

Для продукции в промышленном масштабе, предпочтительные гетерологичные хозяева для (промышленного) производства нанотел или лекарственных средств на основе нанотело-содержащего белка включают штаммы E. coli, Pichia pastoris, S. cerevisiae, которые пригодны для широкой экспрессии/продукции/ферментации, и, в частности, для широкой фармацевтической экспрессии/продукции/ферментации. Пригодные примеры таких штаммов будут ясны специалисту. Такие штаммы и системы продукции/экспрессии также предоставляются компаниями, такими как Biovitrum (Uppsala, Sweden).

Альтернативно, клеточные линии млекопитающих, в частности клетки яичника китайского хомячка (CHO), могут применяться для масштабной экспрессии/продукции/ферментации, и, в частности, для масштабной фармацевтической экспрессии/продукции/ферментации. Кроме того, такие системы экспрессии/продукции также предоставляются некоторыми компаниями, указанными выше.

Выбор специфичной экспрессирующей системы будет зависеть частично от требований для определенной посттрансляционной модификации, более специфично, гликозилирования. Продукция нанотело-содержащего рекомбинантного белка, для которого гликозилирование является желаемым или требуемым, вызовет необходимость в применении экспрессирующих хозяев млекопитающих, которые имеют способность гликозилирования экспрессированного белка. При этом, специалисту будет ясно, что способ гликозилирования (т.е. вид, число и положение присоединенных остатков) будет зависеть от клетки или клеточной линии, которая используется для экспрессии. Предпочтительно, используется либо клетка или клеточная линия человека (т.е. приводя к тому, что белок по существу имеет человеческий тип гликозилирования) или клеточная линия другого млекопитающего, что может обеспечивать тип гликозилирования, который по существу и/или функционально такой же, как и гликозилирование у человека или, по меньшей мере, имитирует гликозилирование у человека. В целом, прокариотные хозяева, такие как E. coli, не обладают способностью гликозилировать белки, и применение низших эукариот, таких как дрожжи, как правило, приводит к типу гликозилирования, который отличается от гликозилирования у человека. Тем не менее, необходимо понимать, что все вышеприведенные клетки-хозяева и экспрессирующие системы могут использоваться в изобретении, в зависимости от получаемого желаемого нанотела или белка.

Таким образом, в соответствии с одним не ограничивающим воплощением изобретения, нанотело или полипептид изобретения является гликозилированным. В соответствии с другим не ограничивающим воплощением изобретения, нанотело или полипептид изобретения является негликозилированным.

В соответствии с одним предпочтительным, но не ограничивающим, воплощением изобретения, нанотело или полипептид изобретения продуцируется в бактериальной клетке, в частности, в бактериальной клетке, пригодной для широкомасштабной фармацевтической продукции, такой как клетки штаммов, указанных выше.

В соответствии с другим предпочтительным, но не ограничивающим, воплощением изобретения, нанотело или полипептид продуцируется в дрожжевой клетке, в частности, в дрожжевой клетке, пригодной для широкомасштабной фармацевтической продукции, такой как клетки штаммов, указанных выше.

В соответствии с еще другим предпочтительным, но не ограничивающим, воплощением изобретения, нанотело или полипептид изобретения продуцируется в клетке млекопитающего, в частности, в клетке человека или в клетке клеточной линии человека, и в частности, в клетке человека или в клетке клеточной линии человека, которая пригодна широкомасштабной фармацевтической продукции, как, например, клеточные линии, указанные выше.

Если экспрессия в клетке-хозяине используется для продукции нанотел и белков изобретения, то нанотела и белки изобретения могут продуцироваться либо внутриклеточно (напр., в цитозоле, в периплазме или в тельцах включениях) и затем отделяться от клеток-хозяев и необязательно дополнительно очищаться; либо могут продуцироваться внеклеточно (напр., в среде, в которой клетки-хозяева культивируются) и затем отделяться от культуральной среды и необязательно дополнительно очищаться. Если используется эукариотные клетки-хозяева, то, как правило, предпочтительной является внеклеточная продукция поскольку это существенно облегчает дополнительное отделение и выделение полученных нанотел и белков. Бактериальные клетки, такие как штаммы E. сoli, указанные выше, при нормальных условиях не секретируют белки внеклеточно, за исключением нескольких классов белков, таких как токсины и гемолизин, и секреторная продукция в E. coli относится к транслокации белков через внутреннюю мембрану в периплазматическое пространство. Периплазматическая продукция обеспечивает некоторые преимущества перед цитозольной продукцией. Например, N-концевая аминокислотная последовательность секретируемого продукта может быть идентична натуральному генному продукту после расщепления секреторной сигнальной последовательности специфичной сигнальной пептидазой. Также, по-видимому, в периплазме активность протеазы гораздо ниже, чем в цитоплазме. В дополнении, очистка белок происходит наиболее простым образом вследствие меньшего загрязнения белков в периплазме. Другим преимуществом является то, что могут образовываться правильные дисульфидные связи, поскольку периплазма обеспечивает наиболее окислительную среду, чем цитоплазма. Белки, сверхэкспрессирующиеся в E. сoli, нередко обнаруживаются в нерастворимых агрегатах, так называемых тельцах включения. Эти тельца включения могут располагаться в цитозоле или в периплазме; для извлечения биологически активных белков из этих телец включения требуется процесс денатурации/рефолдинга. Многие рекомбинантные белки, включая терапевтические белки, извлекаются из телец включения. Альтернативно, как будет ясно специалисту, могут применяться такие рекомбинантные штаммы бактерий, которые генетически модифицированы таким образом, что секретируют желаемый белок, и, в частности нанотело или полипептид изобретения.

Таким образом, в соответствии с одним не ограничивающим воплощением изобретения, нанотело или полипептид изобретения представляет собой нанотело или полипептид, который продуцируется внутриклеточно и который выделяется из клетки-хозяина и, в частности, из бактериальной клетки или из тельца включения в бактериальной клетке. В соответствии с другим не ограничивающим воплощением изобретения, нанотело или полипептид изобретения представляет собой нанотело или полипептид, который продуцируется внеклеточно, который выделяется из среды, в которой клетки-хозяева культивируются.

Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, промоторы для использования в таких клетках-хозяевах включают,

- для экспрессии в E. coli: lac промотор (и его производные, такие как промотор lacUV5); арабинозный промотор; слева- (PL) и справа расположенный (PR) промотор фага лямбда; промотор trp-оперона; гибридные промоторы lac/trp (tac и trc); T7-промотор (более специфичен, чем T7-фаг гена 10) и другие промоторы T-фага; промотор гена устойчивости к тетрациклину Tn10; рекомбинантные варианты вышеуказанных промоторов, которые включают одну или более копий инородной регуляторной операторной последовательности;

- для экспрессии в S. cerevisiae: конститутивные: ADH1 (алкогольдегидрогеназа 1), ENO (энолаза), CYC1 (цитохром c iso-1), GAPDH (глицеральдегид -3-фосфатдегидрогеназа); PGK1 (фосфоглицераткиназа), PYK1 (пируваткиназа); регулируемые: GAL1,10,7 (ферменты метаболизма галактозы), ADH2 (алкогольдегидрогеназа 2), PHO5 (кислая фосфотаза), CUP1 (медный металлотионеин); гетерологичные: CaMV (35S промотор вирус мозаики цветной капусты);

- для экспрессии в Pichia pastoris: AOX1 промотор (алкогольоксидаза I)

- для экспрессии в клетках млекопитающих: немедленный ранний энхансер/промотор человеческого цитомегаловируса (hCMV); вариант немедленного раннего промотора человеческого цитомегаловируса (hCMV), который содержит две тетрациклиновые операторные последовательности, такой, что промотор может регулироваться репрессором Tet; промотор гена тимидинкиназы вируса простого герпеса (TK); энхансер/промотор длинного концевого повтора вируса саркомы Рауса (RSV LTR); промотор фактора элонгации трансляции 1α (hEF-1α) из человека, шимпанзе, мыши или крысы; SV40 ранний промотор; промотор длинного концевого повтора HIV-1; промотор β-актина;

Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, векторы для применения с этими клетками-хозяевами включают:

- векторы экспрессии в клетках млекопитающих: pMAMneo (Clontech), pcДНК3 (Invitrogen), pMC1neo (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593), pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC37199), pRSVneo (ATCC37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) и 1ZD35 (ATCC 37565), так же как и экспрессирующие системы на основе вирусов, такие как те, которые основаны на аденовирусе;

- векторы экспрессии в бактериальных клетках: pET векторы (Novagen) и pQE векторы (Qiagen);

- векторы экспрессии в дрожжах и других грибковых клетках: pYES2 (Invitrogen) и векторы экспрессии Pichia (Invitrogen);

- векторы экспрессии в клетках насекомых: pBlueBacII (Invitrogen) и другие бакуловирусные векторы;

- векторы экспрессии в растениях или растительных клетках: например, векторы, основанные на вирусе мозаики цветной капусты или вирусе табачной мозаики, пригодные штаммы Agrobacterium, или векторы на основании Ti-плазмид.

Некоторые предпочтительные, но не ограничивающие, секреторные последовательности для применения с этими клетками-хозяевами включают:

- для применения в бактериальных клетках, таких как E. coli: PelB, Bla, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, StII, PhoA, PhoE, MalE, Lpp, LamB, и подобные; TAT сигнальный пептид, C-концевой секреторный сигнал гемолизина;

- для применения в дрожжах: препропоследовательность фактора α-скрещивания, фосфатаза (pho1), инвертаза (Suc), и т.д.;

- для применения в клетках млекопитающих: местный сигнал в случае, когда целевой белок имеет эукариотическое происхождение; сигнальный пептид κ-цепи V-J2-C мышиного Ig и т.д.

Пригодные способы трансформирования хозяина или клетки-хозяина изобретения будут ясны специалисту и могут зависеть от предполагаемой клетки-хозяина /организма-хозяина и используемой генетической конструкции. Ссылки снова приводятся на справочники и патентные заявки, указанные выше.

После трансформации, может выполняться стадия обнаружения и выбора тех клеток-хозяев или организмов-хозяев, которые успешно трансформировались с нуклеотидной последовательностью/генетической конструкцией изобретения. Такой стадией выбора может быть, например, стадия, основанная на селективном маркере, присутствующем в генетической конструкции изобретения, или стадия, включающая обнаружение аминокислотной последовательности изобретения, напр., при использовании специфичных антител.

Трансформированная клетка-хозяин (которая может находиться в форме стабильной клеточной линии) или организм-хозяин (который может находиться в форме стабильной мутантной линии или штамма) образуют дополнительные аспекты настоящего изобретения.

Предпочтительно, эти клетки-хозяева или организмы-хозяева таковы, что они экспрессируют или (по меньшей мере) способны экспрессировать (напр., при пригодных условиях) аминокислотную последовательность изобретения (и в случае организма-хозяина: в, по меньшей мере, одной клетке, части, ткани или органе его). Изобретение также включает дополнительные генерации, потомство и/или продукты клетки-хозяина или организма-хозяина изобретения, которые могут, например, быть получены путем клеточного деления или путем полового или бесполого размножения.

Для продуцирования/получения экспрессии аминокислотных последовательностей изобретения, трансформированная клетка-хозяин или трансформированный организм-хозяин может, как правило, храниться, поддерживаться и/или культивироваться при таких условиях, что (желаемая) аминокислотная последовательность изобретения экспрессируется/продуцируется. Пригодные условия будут ясны специалисту и будут, как правило, зависеть от применяемой клетки-хозяина /организма-хозяина, так же как и от регуляторных элементов, которые контролируют экспрессию (релевантной) нуклеотидной последовательности изобретения. Снова ссылки даны на справочники и патентные заявки, указанные выше в абзацах, касающихся генетических конструкций изобретения.

Как правило, пригодные условия могут включать применение пригодной среды, наличия пригодного источника питания и/или пригодных питательных веществ, применение пригодной температуры, и необязательно наличие пригодного индуцирующего фактора или соединения (напр., если нуклеотидные последовательности изобретения находятся под контролем индуцируемого промотора); все из которых могут выбираться специалистом. Снова, при таких условиях, аминокислотные последовательности изобретения могут быть экспрессированы конститутивный способом, транзиторным способом, или только если пригодным образом индуцированы.

Также для специалист будет ясно, что аминокислотная последовательность изобретения может (сначала) образовываться в незрелой форме (как указанно выше), которая может затем подвергаться посттрансляционной модификации, в зависимости от клетки-хозяина/организма-хозяина, которые используются. Также, аминокислотная последовательность изобретения может быть гликозилированной, опять таки в зависимости от клетки-хозяина/организма-хозяина, которые используются.

Аминокислотная последовательность изобретения может затем отделяться от клетки-хозяина/организма-хозяина и/или от среды, в которой указанная клетка-хозяин или организм-хозяин культивировались, с помощью способов выделения белков и/или очистки, известных per se, а также способов (препаративной) хроматографии и/или электрофореза, способов дифференциальной преципитации, аффинных способов (напр., при использовании специфичной, расщепляемой аминокислотной последовательности, слитой с аминокислотной последовательностью изобретения) и/или препаративных иммунологических способов (т.е. при использовании антител против аминокислотной последовательности, которая выделяется).

В целом, для фармацевтического применения, полипептиды изобретения могут составляться как фармацевтический препарат, содержащий, по меньшей мере, один полипептид изобретения и, по меньшей мере, один фармацевтически пригодный носитель, разбавитель или наполнитель и/или адъювант, и необязательно один или более дополнительных фармацевтически активных полипептидов и/или соединений. Через неограничивающие примеры, такие составы могут находиться в форме, пригодной для перорального применения, для парентерального применения (такого как внутривенное, внутримышечное или подкожное введение или внутривенная инфузия), для топического применения, для применения путем ингаляций, посредством трансдермального пластыря, посредством имплантата, посредством суппозитория и т.д. Такие пригодные формы для применения - которые могут быть твердыми, полутвердыми или жидкими, зависят от способа применения - также как и от способов и носителей, использующихся в их приготовлении, будут ясны специалисту, и дополнительно описываются ниже.

В общем, нанотела и полипептиды изобретения могут быть составлены и применены любым пригодным способом, известным per se, для которых ссылки даются на общий уровень техники, цитируемый выше (и, в частности, на WO 04/041862, WO 04/041863, WO 04/041865 и WO 04/041867) так же как и на стандартные справочники, такие как Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18^th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990) или Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21th Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005).

Например, нанотела и полипептиды изобретения могут быть составлены и применены любым способом, известным per se, для традиционных антител фрагментов антител (включая ScFv и димеры) и других фармацевтически активных белков. Такие составы и способы для приготовления будут ясны специалисту, и, например, включают приготовления пригодных для парентерального применения (например, внутривенного, внутриперитонеального, подкожного, внутримышечного, внутрипросветного, внутриартериального или интратекального введения) или для топического (т.е. трансдермального или интрадермального) применения.

Препараты для парентерального применения могут, например, быть стерильными растворами, суспензиями, дисперсиями или эмульсиями, которые пригодны для инфузии и инъекции. Пригодные носители или разбавители таких препаратов, например, включают, без ограничения, стерилизованную воду и водные буферы и растворы, такие как физиологический раствор с фосфатным буфером, растворы Рингера, раствор декстрозы, и растворы Хэнкса; водные масла; глицерин; этанол; гликоли, такие как пропиленгликоль, или такие как минеральные масла, животные масла и растительные масла, например, ореховое масло, соевое масло, так же как и пригодные их смеси. Как правило, водные растворы и суспензии будут предпочтительными.

Нанотела и полипептиды изобретения могут также применяться при использовании геннотерапевтических способов доставки. См., напр., Патент США № 5,399,346, который включается посредством отсылки полностью. При использовании геннотерапевтических способов доставки, первичные клетки, трансфицированные геном, кодирующим нанотело или полипептид изобретения могут дополнительно быть трансфицированы тканью специфичных промоторов для нацеливания на специфичные органы, ткани, трансплантаты, опухоли или клетки и могут дополнительно быть трансфицированы сигнальной и стабилизационной последовательностями для субклеточно локализованной экспрессии.

Таким образом, нанотела и полипептиды изобретения могут быть систематически вводиться, напр., перорально, в комбинации с фармацевтически пригодным носителем, таким как инертный разбавитель, или усваиваемым пищевым носителем. Они могут быть заключены в твердые или мягкие желатиновые капсулы, могут быть спрессованы в таблетки, или могут быть включены непосредственно в пищу диеты пациента. Для перорального терапевтического применения, нанотела и полипептиды изобретения могут комбинироваться с одним или более наполнителями и использоваться в форме принимаемых внутрь таблеток, буккальных таблеток, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, вафель и подобных. Такие композиции и препараты должны содержать, по меньшей мере, 0,1% нанотела или полипептида изобретения. Процентное содержание композиций и препаратов может, конечно, варьировать и может обычно составлять между от около 2 до около 60% массы данной стандартной лекарственной формы. Количество нанотела или полипептида изобретения в таких терапевтически пригодных композициях таково, чтобы получался эффективный уровень лекарственного средства.

Таблетки, пастилки, пилюли, капсулы и подобные могут также содержать следующее: связующие вещества, такие как трагакант, акация, маисовый крахмал или желатин; наполнители, такие как дикальция фосфат; дезинтегрирующие агенты, такие как маисовый крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота и подобные; смягчители, такие как стеарат магния; и подсластители, такие как сахароза, фруктоза, лактоза или аспартам или ароматизаторы, такие как мятное масло, гаультериевое масло или черешневый ароматизатор могут добавляться. Если стандартная лекарственная форма представляет собой капсулу, то она может содержать, дополнительно к материалам вышеуказанного типа, носитель, а также растительное масло или этиленгликоль. Различные другие материалы могут присутствовать как покрытия или же модифицирующие физические формы твердые лекарственные формы. Например, Таблетки, пилюли, или капсулы могут быть покрыты желатином, воском, шеллаком или сахаром и подобными. Сироп или эликсир может содержать нанотела и полипептиды изобретения, сахарозу или фруктозу в качестве подсластителей, метил и пропилпарабен как стабилизаторы, красители и вкусовые добавки, такие как вишневый или апельсиновый ароматизатор. Конечно, любой материал, используемый при приготовлении любой стандартной лекарственной формы должен быть фармацевтически пригодным и по существу нетоксичным в использующихся количествах. В дополнении, нанотела и полипептиды изобретения могут включаться в препараты и устройства с замедленным высвобождением.

Лекарственные средства и составы для перорального применения могут также быть обеспечены с энтеросолюбильном покрытием таблетки, что будет позволять конструкциям изобретения быть представленными в желудочной среде и проходить в кишечник. Кроме того, лекарственные средства и составы для перорального применения могут быть составлены пригодным образом для доставки в любую желаемую часть желудочно-кишечного тракта. В дополнении, пригодные суппозитории могут использоваться для доставки в желудочно-кишечного тракт.

Нанотела и полипептиды изобретения могут также вводиться внутривенно или внутриперитонеально с помощью инфузии или инъекции. Растворы нанотел и полипептидов изобретения или их соли могут быть приготовлены в воде, смешанной с нетоксичным сурфактантом. Дисперсии могут также быть приготовлены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях, триацетилглицерине и их смесях и маслах. При нормальных условиях хранения и применения, эти лекарственные средства содержат стабилизаторы для предотвращения роста микроорганизмов.

Фармацевтические лекарственные формы, пригодные для инъекции или инфузии, могут включать стерильные водные растворы или дисперсии или стерильные порошки, содержащие активный ингредиент, который адаптирован для приготовленных для немедленного приёма лекарственного средства стерильных инъецируемых или инфузируемых растворов или дисперсий, необязательно включенных в липосомы. Во всех случаях, итоговая лекарственная форма должна быть стерильной, текучей и стабильной в условиях производства и хранения. Жидкий носитель или наполнитель может быть растворителем или жидкой дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкие полиэтиленгликоли, и подобные), растительные масла, нетоксические эфиры глицерина и пригодный их смеси. Должная текучесть может поддерживаться, например, с помощью состава липосом, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий или посредством применения сурфактантов. Профилактика действия микроорганизмов могут осуществляться с помощью антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабенов, хлоробутанола, фенола, сорбиновой кислоты, тимеросала, и подобных. Во многих случаях, предпочтительным будет включать изотонические агенты, например, сахара, буферы или хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъецируемых композиций достигаться путем применения композиций агентов, замедляющих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.

Стерильные инъецируемые растворы приготавливают путем смешивания нанотел и полипептидов изобретения в требуемом количестве в подходящем растворителе с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъецируемых растворов, предпочтительные способы приготовления включают способы вакуумной сушки и лиофильной сушки, с помощью которых образуется порошок, содержащий активный ингредиент вместе с любым дополнительным желательным ингредиентом, имеющимся в предварительно стерилизованных растворах.

Для местного применения, нанотела и полипептиды изобретения могут применяться в очищенном виде, т.е. если они являются жидкими. Однако, будет в целом желаемым наносить их на кожу как композиции или составы в сочетании с дерматологически пригодным носителем, который может быть в твердой или жидкой форме.

Пригодные твердые носители включают конечно разбавленные твердые формы, такие как тальк, глина, микрокристаллическая целлюлоза, кремний, алюминий и подобные. Пригодные жидкие носители включают воду, гидроксиалкилы или гликоли или водно-спиртовые/гликолевые смеси, в которых нанотела и полипептиды изобретения могут растворяться или диспергироваться в эффективных уровнях, необязательно с помощью нетоксических сурфактантов. Адъюванты, такие как ароматизаторы, и дополнительные антимикробные агенты могут быть добавлены для оптимизации свойств для данного использования. Полученные жидкие композиции могут наноситься из гигроскопических прокладок, могут использоваться для импрегнации бандажей и других перевязочных материалов, или могут распыляться на пораженные области при использовании распылителей помпового и аэрозольного типа.

Сгустители, такие как синтетические полимеры, жирные кислоты, соли жирных кислот и эфиры, жирные спирты, модифицированные целлюлозы или модифицированные минеральные материалы могут также использоваться с жидкими носителями для образования легко намазывающихся паст, гелей, мазей, мыла и тому подобного, для нанесения непосредственно на кожу пользователя.

Примеры пригодных дерматологических композиций, которые могут использоваться для доставки нанотел и полипептидов изобретения к коже известны из уровня техники, например, см.: Jacquet et al. (U.S. Pat. No. 4,608,392), Geria (U.S. Pat. No. 4,992,478), Smith et al. (U.S. Pat. No. 4,559,157) и Wortzman (U.S. Pat. No. 4,820,508).

Используемые дозировки нанотел и полипептидов изобретения могут определяться путем сравнения их действия in vitro и in vivo на моделях животных. Способы экстраполяции эффективных доз мышам, и другим животным, человеку, известны из уровня техники, например, см. патент США №. 4,938,949.

В целом, концентрация нанотел и полипептидов изобретения в жидкой композиции, такой как лосьон, будет составлять от около 0,1 до 25 процентов по массе, предпочтительно от около 0,5 до 10 процентов по массе. Концентрация в полутвердой или твердой композиции, такой как гель или порошок, будет составлять от около 0,1 до 5 процентов по массе, предпочтительно от около 0,5 до 2,5 процентов по массе.

Количество нанотел и полипептидов изобретения, требуемых для применения в лечении, будет изменяться не только в зависимости от определенного нанотела или полипептида, выбранного, но также и от способа применения, природы состояния, которое лечится, и возраста и состояния пациента и будет в итоге составлять по назначению лечащего врача или клинициста. Также дозировка нанотел и полипептидов изобретения изменяется в зависимости от клетки-мишени, опухоли, ткани, трансплантата или органа.

Желаемая доза может удобным образом быть представлена в одноразовой дозе или раздельных дозах, применяемых в подходящих интервалах, например, по две, три, четыре или более субдоз в день. Сами субдозы могут быть дополнительно разделены, напр., по количеству назначенный применений; таких как многократные ингаляции из инсуффлятора или при применении множества капель в глаза.

Режим применения может включать длительное, каждодневное лечение. Под “длительным” понимается, по меньшей мере, длительность в две недели и предпочтительно, в несколько недель, месяцев, или лет. Необходимые модификации в этом дозовом интервале могут определяться специалистом в данной области при использовании только рутинных экспериментов, при обучении. См.: Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. Дозировка может также регулироваться лечащим врачом для избегания любых осложнений.

В другом аспекте, изобретение относится к способу профилактики и/или лечения, по меньшей мере, одного TNF-связанного заболевания или состояния, которые указаны здесь, при этом указанный способ содержит введение нуждающемуся пациенту фармацевтическую активного количества нанотела изобретения, полипептида изобретения, и/или фармацевтической композиции их содержащей.

В контексте настоящего изобретения, термин “профилактики и/или лечения” не только содержит предупреждение и/или лечение заболевания, но также в общем включает предотвращение начала заболевания, замедления или изменения развития заболевания, предотвращение или замедление начала одного или более симптомов, связанных с заболеванием, снижение и/или ослабление одного или более симптомов, связанных с заболеванием, снижение тяжести и/или длительности заболевания и/или любых симптомов, связанных с ним, и/или предотвращение дополнительного повышения тяжести заболевания и/или любых симптомов, связанных с ним, предотвращение, снижение или изменение любого физиологического поражения, вызванного заболеванием, и в общем любого фармакологического действия, которое полезно для лечащегося пациента.

Объектом лечения может быть любое теплокровное животное, а именно млекопитающее, и, в частности, человек. Как будет ясно специалисту, объектом лечения будет, в частности, персона, страдающая от или подвергнутая риску заболеваний и нарушений, здесь указанных.

Изобретение также относится к способу профилактики и/или лечения, по меньшей мере, одного заболевания или нарушения, которое может быть предотвращено и/или излечено путем введения нанотела или полипептида изобретения пациенту, указанный способ содержит введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтически активного количества нанотела изобретения, полипептида изобретения и/или фармацевтической композиции, их содержащей.

А именно, изобретение относится к способу профилактики и/или лечения, по меньшей мере, одного заболевания или нарушения, выбранного из группы, состоящей из заболеваний и нарушений, здесь перечисленных, указанный способ содержит введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, фармацевтически активного количества нанотела изобретения, полипептида изобретения и/или фармацевтической композиции, их содержащей.

В другом воплощении, изобретение относится к способу иммунотерапии, и, в частности пассивной иммунотерапии, при этом способ содержит введение субъекту, страдающего от или подвергнутого риску развития заболеваний и нарушений, указанных здесь, фармацевтически активного количества нанотела изобретения, полипептида изобретения и/или фармацевтической композиции, их содержащей.

В вышеуказанных способах, нанотела и/или полипептиды изобретения и/или содержащие их композиции могут применяться пригодным способом, в зависимости от специфического фармацевтического состава или композиции, которые используются. Таким образом, нанотела и/или полипептиды изобретения и/или содержащие их композиции могут, например, применяться перорально, внутриперитонеально (напр., внутривенно, подкожно, внутримышечно, или посредством любого другого пути введения, который избегает попадание в желудочно-кишечный тракт), трансназально, трансдермально, местно, посредством суппозитории, ингаляции, опять таки в зависимости от специфического фармацевтического состава или композиции, которые используются. Клиницист сможет выбрать пригодный путь введения и пригодный фармацевтический состав или композицию для использования в таких введениях, в зависимости от заболевания или нарушения, которое предотвращается или лечится, других факторов, известных клиницисту.

Нанотела и/или полипептиды изобретения и/или содержащие их композиции применяются в соответствии с режимом лечения, который является пригодным для предотвращения и/или лечения или нарушения, которое предотвращается или лечится. Клиницист в целом сможет определить пригодный режим лечения, в зависимости от факторов, таких как заболевание или нарушение, которое предотвращается или лечится, от тяжести заболевания, которое лечится, и/или от тяжести его симптомов, специфичности используемого нанотела или полипептида, специфичного путем введения и фармацевтического состава или композиции, которые используются, возраста, пола, веса, диеты, общего состояния пациента, и подобных факторов, известных клиницисту.

В общем, режим лечения будет содержать введение одного или более нанотел и/или полипептидов изобретения, или одной или более композиций, их содержащей, в одном или более фармацевтически эффективных количествах или дозах. Специфическое(ие) количество(а) или дозы для применения могут определяться клиницистом, опять таки с учетом факторов, перечисленных выше.

В целом, для профилактики и/или лечения заболеваний и нарушений, указанных выше и зависящих от специфического заболевания или нарушения, которое лечится, активности специфичного нанотела и полипептида изобретения, которые используются, специфичного пути введения и специфичного фармацевтического состава или композиции, использующихся, нанотела и полипептиды изобретения будут в общем применяться в количестве между 1 граммом и 0,01 микрограммом на кг массы тела в день, предпочтительно между 0,1 граммом и 0,1 микрограммом на кг массы тела в день, а также около 1, 10, 100 или 1000 микрограммов на кг массы тела в день, либо непрерывно (напр., путем инфузии), в качестве суточной дозы, либо как многократно разделенная доза в течение дня. Клиницист в целом может определить пригодную дневную дозу, в зависимости от факторов, указанных выше. Также будет понятно, что в специфических случаях клиницист сможет выбрать отклонения от этих количеств, например, с учетом факторов, указанных выше, и его экспертной оценки. Обычно, некоторые руководства по количеству применения могут быть получены из количеств, которые, как правило, применяются по сравнению с традиционными антителами или фрагментами антител против той же мишени, применяемые посредством по существу тех же путей введения, учитывая различия в сродстве/авидности, эффективности, биораспределении, времени полужизни и подобных факторов, известных специалисту.

Как правило, в вышеуказанном способе, используется одно нанотело или полипептид изобретения. Однако в объем изобретения включается использование двух или более нанотел и/или полипептидов изобретения в комбинации.

Нанотела и полипептиды изобретения могут также использоваться в комбинации с одним или более дополнительными фармацевтически активными соединениями или элементами, т.е. как комбинированный режим лечения, который может или не может привести к синергетическому эффекту. Также, клиницист сможет выбрать такие дополнительные соединения и элементы, так же как и пригодный комбинированный режим лечения, на основании факторов, указанных выше и его экспертной оценки.

В частности, нанотела и полипептиды изобретения могут использоваться в комбинации с другими фармацевтически активными соединениями или элементами, которые являются или могут быть использованы для профилактики и/или лечения заболеваний и нарушений, указанных здесь, в результате чего может быть или не может быть получен синергетический эффект. Примеры таких соединений и активных начал, а также пути, способы и фармацевтические составы или композиции для их применения будут ясны специалисту.

Если две или более активных веществ или начал используют как часть комбинированного режима лечения, то они могут применяться посредством тех же путей введения или посредством других путей введения, по существу в одно время или в различные периоды (напр., по существу одновременно, последовательно, или в соответствии с альтернативным режимом). Если субстанции или элементы применяются одновременно посредством аналогичного пути введения, они могут применяться как различные фармацевтические составы или композиции или как часть комбинированной фармацевтического состава или композиции, как будет ясно специалисту.

Также, когда два или более активные вещества или начала используют как часть комбинированного режима лечения, то каждое из веществ или начал может вводиться в одинаковом количестве и в соответствии с одинаковым режимом, который используется, если вещество или начало используется само по себе, и такое комбинированное использование может или не может привести к синергетическому эффекту. Тем не менее, если комбинированное использование двух или более активных веществ или начал приведет к синергетическому эффекту, то также является возможным снизить количество одного, более чем одного или всех веществ или начал, которые вводятся, все еще достигая желаемое терапевтическое действие. Это может, например, быть полезным для избегания, ограничения или снижения нежелательных побочных эффектов, которые ассоциированы с применением одного или более веществ или начал, когда они используются в их обычных количествах, все еще достигая желаемый фармацевтический или терапевтический эффект.

Эффективность используемого режима лечения в соответствии с изобретением может определяться и/или отслеживаться любым образом, известным per se, для включенного заболевания или нарушения, что будет ясно для клинициста. Клиницист также сможет, когда это целесообразно или с учетом каждого отдельного случая, изменять или модифицировать конкретный режим лечения, для достижения желаемого терапевтического эффекта, для избегания, ограничения или снижения нежелательных побочных эффектов, и/или для достижения необходимого баланса между достижением желаемого терапевтического эффекта, с одной стороны, и избегания, ограничения или снижения нежелательных побочных эффектов, с другой стороны.

В целом, режим лечения будет отслеживаться до достижения желаемого терапевтического эффекта и/или столько времени, сколько должен поддерживаться желаемый терапевтический эффект. Снова, это может быть определено клиницистом.

Таким образом, в дополнительном аспекте, изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит, по меньшей мере, одно нанотело изобретения или, по меньшей мере, один полипептид изобретения и, по меньшей мере, один пригодный носитель (т.е. носитель, пригодный для применения в ветеринарии), и необязательно одну или более дополнительные активные субстанции.

Изобретение также относится к применению нанотела изобретения и/или полипептида изобретения в приготовлении фармацевтической композиции, в частности, в приготовлении фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения (включая, но не ограничивая, облегчение, по меньшей мере, одного симптома) заболевания или нарушения, опосредованного TNF-альфа и/или связанного с TNF-альфа (например, связанного с патологической активностью TNF-альфа, патологическими уровнями TNF-альфа, патологической экспрессии TNF-альфа и/или патологической чувствительностью или реакцией к TNF-альфа), или одного из биологических феноменов, связанных с TNF-альфа), как, например, заболеваний или нарушений, указанных выше.

Изобретение также относится к способу предупреждения и/или лечения (включая, но не ограничиваясь, облегчение, по меньшей мере, одного симптома) заболевания или нарушения, опосредованного TNF-альфа и/или связанного с TNF-альфа (например, связанного с патологической активностью TNF-альфа, патологическими уровнями TNF-альфа, патологической экспрессии TNF-альфа и/или патологической чувствительностью или реакцией к TNF-альфа, или одного из биологических феноменов, связанных с TNF-альфа), как, например, заболеваний или нарушений, указанных выше, при этом способ включает введение нуждающемуся субъекту терапевтически активное количество нанотела изобретения, полипептида изобретения, и/или фармацевтической композиции, как описывается выше.

Настоящее изобретение обеспечивает полипептиды, содержащие одно или более нанотел, направленных к фактору некроза опухоли альфа (TNF-альфа). Настоящее изобретение дополнительно относится к их применению для диагностики и терапии. Такие антитела могут содержать каркасную последовательность с высокой гомологией с человеческими каркасными последовательностями. Описываются композиции, содержащие антитела к фактору некроза опухоли альфа (TNF-альфа) самостоятельно или в комбинации с другими лекарствами.

Фактор некроза опухоли альфа (TNF-альфа), как предполагается, играет важную роль в развитии различных нарушений, например, в воспалительных нарушениях, таких как ревматоидный артрит, Болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и множественный склероз. И TNF-альфа и рецепторы (CD120a, CD120b) изучались подробнейшим образом. TNF-альфа в его биоактивной форме представляет собой тример и углубление, сформированное соседними субъединицами, является важным для цитокин-рецепторного взаимодействия. Некоторые стратегии для антагонизма действию цитокина были разработаны и на сегодняшний день используются для лечения различных болезненных состояний.

Ингибитор TNF-альфа, который обладает значимой специфичностью и селективностью к TNF-альфа, может быть эффективным профилактическим или терапевтическим фармацевтическим соединением для предупреждения или лечения нарушений, в которых TNF-альфа подразумевается как этиологический фактор. Способы лечения токсического шока (EP 486526), регресса опухоли, ингибирования цитотоксичности (US 6448380, US 6451983, US 6498237), аутоиммунных заболеваний, таких RA и Болезнь Крона (EP 663836, US 5672347, US 5656272), реакции "трансплантат против хозяина" (US 5672347), бактериального менингита (EP 585705) с помощью антител к TNF-альфа являются желаемыми.

На сегодняшний день не существуют лекарства, полностью эффективные для лечения аутоиммунных заболеваний, и большинство из них имеют ограничения из-за высокой токсичности. В дополнении, это очень сложный и длительный процесс разработки новой химической единицы (NCE) с достаточной способностью и селективностью к такой последовательности-мишени. Лекарственные средства, основанные на антителах, с другой стороны, обладают достаточным потенциалом как лекарства, поскольку они имеют сильную специфичность к своей цели и низкую природную токсичность. В дополнении, время развития может быть снижено значительно, если сравнивать с развитием новых химических единиц (NCE). Однако, традиционные антитела с трудом получаются против мультимерных белков, где рецептор-связывающий домен лиганда заключен в бороздку, как имеет место в случае с TNF-альфа. Известно, что антитела, состоящие из тяжелых цепей, описываемые в изобретении, которые поучены из Camelidae, имеют полость-связывающее предрасположенность (WO97/49805; Lauwereys et al, EMBO J. 17, 5312, 1998)). Следовательно, такие антитела по самой своей природе пригодны для связывания с рецептор-связывающим доменом таких лигандов, как TNF. В дополнение, известно, что такие антитела стабильны в течение долгого периода времени, следовательно имеют увеличенный срок годности (Perez et al, Biochemistry, 40, 74, 2001). Кроме того, фрагменты таких антител из тяжелых цепей могут продуцироваться в ферментере массово при использовании дешевых экспрессирующих систем по сравнению с ферментацией культур клеток млекопитающих, а также дрожжей или других микроорганизмов (EP 0 698 097).

Применение антител, полученных из источников, таких как мыши, овцы, козы, кролики и т.д., и гуманизированных их производных для лечения состояний, которые требуют модуляции воспаления, является проблематичным по нескольким причинам. Традиционные антитела не стабильны при комнатной температуре, и должны подвергаться охлаждению при приготовлении и хранении, при этом требуется обязательно охлаждающее лабораторное оборудование, хранение и транспорт, что увеличивает затраты времени и средств. Охлаждение иногда невозможно в развивающихся странах. Кроме того, производство или мелкосерийная продукция указанных антител представляет собой дорогой процесс, поскольку клеточные системы млекопитающих, необходимые для экспрессии интактных и активных антител требуют высокие уровни поддержки относительно времени и устройств, а выходы очень низкие. Кроме того, крупный размер традиционных антител будет ограничивать проникновение в ткани, например, на участке воспаленной ткани. Кроме того, традиционные антитела имеют связывающую активность, которая зависит от pH, и следовательно, являются непригодными для применения в средах, отличающихся по физиологическому уровню pH, таких как, например, для лечения желудочных кровотечений, в желудочной хирургии. Кроме того, традиционные антитела нестабильны при низких и высоких pH и, следовательно, не пригодны для перорального применения. Однако было продемонстрировано, что антитела Camelidae выдерживают суровые условия, такие как экстремальный pH, денатурирующие агенты и высокие температуры (Dumoulin et al, Protein Science 11, 500, 2002), что делает их пригодными для перорального применения. Кроме того, традиционные антитела имеют связывающую способность, которая зависит от температуры, и, следовательно, они непригодны для применения в анализах и наборах, выполняемых при температурах, выходящих за пределы биологически активных температур (напр., 37 ± 20ºC).

Полипептидные средства и, в частности, лекарственные средства, основанные на антителах, имеют значительный потенциал как лекарственные средства, поскольку они обладают специфичностью к своей мишени и низкой токсичностью. Однако, для специалиста известно, что антитело, которое получено для терапевтического применения, требует дополнительной модификации для приготовления его для лечения человека, для избегания нежелательной иммунологической реакции у человека после его применения. Процесс модификации общепринято называть "гуманизацией". Известно для специалиста, что антитела, полученные в видах, отличных от человека, требуют гуманизации для их терапевтического использования для человека ((1) CDR grafting: Protein Design Labs: US 6180370, US 5693761; Genentech US 6054297; Celltech: 460167, EP 626390, US 5859205; (2) Veneering: Xoma: US 5869619, US 5766886, US 5821123). Существует потребность в способах выработки антител, которые избегают необходимости существенной гуманизации, или которые совершенно не требуют проведения гуманизации. Существует потребность в новом классе антител, которые имеют определенные каркасные области или аминокислотные остатки и которые могут применяться для человека без необходимости в проведении существенной гуманизации, или вообще без необходимости гуманизации.

Другой значимый недостаток традиционных антител заключается в том, что они являются сложными большими молекулами и, следовательно, относительно нестабильны, и они чувствительны к расщеплению протеазами. Это означает, что традиционные лекарственные средства на основе таких антител могут применяться перорально, сублингвально, местно, назально, вагинально, ректально или путем ингаляций, поскольку они не устойчивы к низким pH в этих сайтах, действию протеаз в этих сайтах и в крови и/или из-за их большого размера. Их нужно применять инъекционно (внутривенно, подкожно, и т.д.) для преодоления некоторых этих проблем. Введение посредством инъекции требует специального обучения для использования шприца для подкожных инъекций или иголки корректно и безопасно. Это дополнительно требует стерильности оборудования, жидкого состава терапевтического полипептида. Кроме того, субъекты обычно испытывают физический или психологический стресс до и после получения инъекции. Следовательно, существует потребность в способе доставки терапевтического полипептида, который бы помог избежать потребность в инъекции, что не только является экономичным в отношении времени и стоимости, но и который будет более удобен и комфортен для субъекта.

Одно воплощение настоящего изобретения представляет анти-TNF-альфа нанотела, при этом нанотела представляет собой предпочтительно, как дополнительно определено выше.

Одно воплощение настоящего изобретения представляет анти-TNF-альфа полипептид, содержащий, по меньшей мере, одно анти-TNF-альфа нанотело, где полипептид представляет собой предпочтительно, как дополнительно определено выше.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, дополнительно содержащий, по меньшей мере, одно нанотело, направленное против сывороточного белка.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, в котором указанный сывороточный белок представляет собой любой из сывороточного альбумина, сывороточных иммуноглобулинов, тироксин-связывающий белок, трансферрин, или фибриноген.

Другое воплощением настоящего изобретение представляет собой анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, дополнительно содержащий, по меньшей мере, одно нанотело, выбранное из группы, состоящей из анти-IFN-гамма нанотела, нанотело против рецептора TNF-альфа, нанотело против рецептора IFN-гамма.

Другое воплощением настоящего изобретение представляет собой анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, где число нанотел, направленных против TNF-альфа составляет, по меньшей мере, два.

Другое воплощением настоящего изобретение представляет собой анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, где, по меньшей мере, одно нанотело представляет собой гуманизированные V_HH Camelidae.

Другое воплощением настоящего изобретение представляет собой композицию, содержащую анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше и, по меньшей мере, одно нанотело из группы, состоящей из анти-IFN-гамма нанотела, нанотело против рецептора TNF-альфа и нанотело против рецептора IFN-гамма, для одновременного, раздельного или последовательного применения субъекту.

Другое воплощением настоящего изобретение представляет собой анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, или композицию, как описывается выше, где указанное нанотел представляет собой гомологичную последовательность, функциональную часть, или функциональную часть гомологичной последовательности полноразмерного нанотела.

Другое воплощением настоящего изобретение представляет собой анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, или композицию, как описывается выше, где указанное нанотел представляет собой гомологичную последовательность, функциональную часть, или функциональную часть гомологичной последовательности полноразмерного анти-TNF-альфа полипептида.

Другое воплощением настоящего изобретение представляет собой анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, или композицию как описывается выше где, по меньшей мере, одно нанотело представляет собой V_HH Camelidae.

Другое воплощением настоящего изобретение представляет нуклеиновую кислоту, кодирующую анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше.

Другое воплощением настоящего изобретение представляет способ идентификации агента, который модулирует связывание анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, с фактором некроза опухоли-альфа, включающий стадии:

(a) взаимодействие анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, с мишенью, которая представляет собой фактором некроза опухоли-альфа, в присутствии или отсутствии кандидата-модулятора при условиях, допускающих связывание между указанным полипептидом и мишенью, и

(b) измерение связывания между полипептидом и мишенью по стадии (a), где уменьшение в связывании в присутствии указанного кандидата-модулятора, относительно связывании в отсутствии указанного кандидата-модулятора, идентифицирует указанный кандидат-модулятор как агента, который модулирует связывание анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше и фактора некроза опухоли-альфа.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет способ идентификации агента, который модулирует заболевания, опосредованные фактором некроза опухоли-альфа, через связывание анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, с фактором некроза опухоли-альфа, включающий:

(a) взаимодействие анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, с мишенью, которая представляет собой фактор некроза опухоли-альфа, в присутствии или отсутствии кандидата-модулятора при условиях, допускающих связывание между указанным полипептидом и мишенью, и

(b) измерение связывания между полипептидом и мишенью по стадии (a), где уменьшение в связывании в присутствии указанного кандидата-модулятора, относительно связывании в отсутствии указанного кандидата-модулятора, идентифицирует указанный кандидат-модулятор как агент, который модулирует связывание анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, и фактора некроза опухоли-альфа.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет способ идентификации агента, который модулирует связывание фактора некроза опухоли-альфа с его рецептором через связывание анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, с фактора некроза опухоли-альфа, включающий:

взаимодействие анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, с мишенью, которая представляет собой фактор некроза опухоли-альфа, в присутствии или отсутствии кандидата-модулятора при условиях, допускающих связывание между указанным полипептидом и мишенью, и

Другое воплощение настоящего изобретения представляет набор для скрининга агентов, которые модулируют нарушения, опосредованные фактором некроза опухоли-альфа, содержащий анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, и фактора некроза опухоли-альфа.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет неизвестный агент, который модулирует связывание анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, с фактором некроза опухоли-альфа, идентифицируемый в соответствии со способом, который описан выше.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет неизвестный агент, который модулирует нарушения, опосредованные фактором некроза опухоли-альфа, идентифицируемый в соответствии со способом, который описан выше.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет неизвестный агент, как описывается выше, где указанными нарушениями являются одно или более из воспаления, ревматоидного артрита, Болезни Крона, неспецифического язвенного колита, воспалительного заболевания кишечника и множественного склероза.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, или нуклеиновую кислоту, как описывается выше, или композицию, как описывается выше, или агент, как описывается выше для лечения и/или предупреждения и/или облегчения нарушений, связанных с воспалительными процессами.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет применение анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, или нуклеиновой кислоты, как описывается выше, или композиции, как описывается выше, или агента, как описывается выше, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения и/или облегчения нарушений, связанных с воспалительными реакциями.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, или композицию, как описывается выше, для лечения и/или предупреждения и/или облегчения нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, который способен проходить через желудочную среду без инактивации субстанции.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет применение анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, или композиции, как описывается выше, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения и/или облегчения симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, который способен проходить через желудочную среду без инактивации субстанции.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, или композицию, как описывается выше, для лечения и/или предупреждения и/или облегчения нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, доставляемый в вагинальный и/или ректальный тракт.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет применение анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, или композиции, как описывается выше, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения и/или облегчения симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, доставляемый в вагинальный и/или ректальный тракт.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, или композицию, как описывается выше, для лечения и/или предупреждения и/или облегчения нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, доставляемый в нос, верхние дыхательные пути и/или легкие.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет применение анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, или композиции, как описывается выше, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения и/или облегчения симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, доставляемый в нос, верхние дыхательные пути и/или легкие.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, или композицию, как описывается выше, для лечения и/или предупреждения и/или облегчения нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, доставляемый в слизистую оболочку кишки, где указанные нарушения повышают проницаемость слизистой оболочки кишечника.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет применение анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, или композиции, как описывается выше, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения и/или облегчения симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, доставляемый в слизистую оболочку кишки, где указанные нарушения повышают проницаемость слизистой оболочки кишечника.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, или композиции, как описывается выше, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения и/или облегчения симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, который способен эффективно проходит через ткани, расположенные ниже языка.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет применение анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, или композиции, как описывается выше, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения и/или облегчения симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, который способен эффективно проходит через ткани, расположенные ниже языка.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, или композиции, как описывается выше, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения и/или облегчения симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, который способен эффективно проникать через кожу.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет применение анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, или композиции, как описывается выше, для приготовления лекарственного средства для лечения и/или предупреждения и/или облегчения симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, который способен эффективно проникать через кожу.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет способ, как описывается выше, набор, как описывается выше, нуклеиновую кислоту или агент, как описывается выше, применение нуклеиновой кислоты или агента, как описывается выше, композицию, как описывается выше, применение композиции, как описывается выше, анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, применение анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, где указанными нарушениями являются любые из воспаления, ревматоидного артрита, ХОБЛ, астмы, болезни Крона, неспецифического язвенного колита, воспалительных заболеваний кишечника, множественного склероза, болезни Аддисона, аутоиммунного гепатита, аутоиммунного паротита, диабета I типа, эпидидимита, гломерулонефрита, болезни Грейвса, синдрома Гийена–Барре, тиреоидита Хашимото, гемолитической анемии, системной красной волчанки, мужского бесплодия, множественного склероза, злокачественной миастении, пузырчатки, псориаза, ревматического полиартрита, ревматоидного артрита, саркоидоза, склеродермии, синдрома Шегрена, спондилоартропатии, тиреоидита и васкулита.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет композицию, содержащую нуклеиновую кислоту или агент, как описывается выше, анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, или композицию, как описывается выше, и пригодный фармацевтический носитель.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет способ диагностики нарушения, характеризующегося дисфункцией фактора некроза опухоли-альфа, содержащий:

(a) контактирование образца с анти-TNF-альфа полипептидом, как описывается выше,

(b) обнаружение связывания указанного полипептида с указанным образцом, и

(c) сравнение связывания, детектируемого в стадии (b), со стандартным, где различия в связывании относительно указанного образца является диагностическим для выявления нарушения, характеризующегося дисфункцией фактора некроза опухоли-альфа.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет набор для скрининга нарушения, как указано выше, при использовании способа, как описывается выше.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет набор для скрининга нарушения, как указано выше, содержащий выделенный анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет применение анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, для очистки указанного фактора некроза опухоли-альфа.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет применение анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, для ингибирования взаимосвязи между фактором некроза опухоли-альфа и одним или более рецепторами фактора некроза опухоли-альфа.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет способ приготовления анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, содержащий стадии:

(a) получение двухцепочечной ДНК, кодирующей V_HH Camelidae_, направленный против фактора некроза опухоли-альфа,

(b) клонирование и экспрессия ДНК, выбранной в стадии (b).

Другое воплощение настоящего изобретения представляет способ приготовления анти-TNF-альфа полипептида, как описывается выше, содержащий:

(a) культивирование клеток-хозяев, содержащих нуклеиновую кислоту, способную кодировать анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше, при условиях, позволяющих осуществление экспрессии полипептида, и,

(b) извлечение выработанного полипептида из культуры.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет способ, как описывается выше, где указанные клетки-хозяева являются бактериальными или дрожжевыми.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет набор для скрининга любого из воспаления, ревматоидног артрита, болезни Крона, неспецифического язвенного колита, воспалительных заболеваний кишечника или множественного склероза, содержащий анти-TNF-альфа полипептид, как описывается выше.

V_HH, в соответствии с настоящим изобретением, и как известно специалисту, представляют собой вариабельные домены тяжелых цепей, полученные из иммуноглобулинов, естественным образом лишенных легких цепей, а также тех, которые получены из Camelidae, как описывается в WO 94/04678 (и относится здесь к V_HH доменам или нанотелам). V_HH молекулы примерно в 10 раз меньше чем молекулы IgG. Они являются единичными полипептидами и очень стабильны, устойчивы к экстремальным pH и температурным условиям. Кроме того, они устойчивы к действию протеаз, что не характерно для традиционных антител. Кроме того, экспрессия V_HH in vitro продуцирует высокопродуктивное, правильно сложенные функциональные V_HH. В дополнении, антитела, генерированные в верблюжьих, будут узнавать иные эпитопы, чем те, которые узнаются антителами, образованными in vitro при применении библиотек антител или посредством иммунизации млекопитающих, отличных от верблюжьих (WO 9749805). По существу, анти-TNF-альфа V_HH могут связываться более эффективно с TNF-альфа, чем традиционные антитела, вследствие более эффективного блокирования их взаимодействия с TNF-альфа рецептором .

TNF-альфа также является фрагментом TNF-альфа, способным вызывать иммунную реакцию. TNF-альфа представляет собой также фрагмент TNF-альфа, способный к связыванию с нанотелом, индуцированным против полноразмерного TNF-альфа.

Нанотело, направленное против TNF-альфа, означает нанотело, которое способно к связыванию с TNF-альфа со сродством более 10^-6 M.

Одним воплощением настоящего изобретения является анти-TNF-полипептид, в котором нанотел содержит V_HH Camelidae, направленный против TNF-альфа.

Одно или более нанотел анти-TNF-полипептида, которые направлены против TNF-альфа, могут являться одинаковыми последовательностями. Альтернативно они могут не все иметь одинаковые последовательности. В объем изобретения включается то, что анти-TNF-полипептид содержит анти-TNF-альфа нанотела, которые не все имеют ту же последовательность, но которые направлены против одинаковой мишени, одного или более ее антигенов.

Настоящее изобретение дополнительно относится к анти-TNF-альфа полипептиду, в котором указанные нанотела представляет собой V_HH, направленные против TNF-альфа, где V_HH принадлежит к классу, имеющему последовательности, подобные человеческим. Класс характеризуется в том, что V_HH содержат аминокислоту из группы, состоящей из глицина, аланина, валина, лейцина, изолейцина, пролина, фенилаланина, тирозина, триптофана, метионина, серина, треонина, аспарагина, или шлутамина в положении 45, как, например, L45 и триптофан в положении 103, по номенклатуре Кабата. Другой человекоподобный класс нанотел Camelidae описывается в WO03035694 и содержит гидрофобные FR2 остатки, типично найденные в традиционных антителах человеческого происхождения или из других видов, но компенсирующих эту потерю гидрофильности с помощью заряженного аргининового остатка в положении 103, который замещает консервированный триптофановой остаток, имеющийся в VH из двухцепочечных антител. По существу, пептиды, принадлежащие к этим двум классам, показывают высокую гомологию аминокислотной последовательности с человеческими VH каркасными областями и указанные пептиды могут применяться для человека непосредственно без вероятности развития нежелательной иммунной реакции, и без обременения проведения дополнительной гуманизации. Изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, способным кодировать указанные полипептиды.

Любые V_HH, как используются изобретением, могут являться традиционным классом или классами человекоподобных антител Camelidae. Указанные антитела могут быть направлены против всего TNF-альфа или его фрагмента, или фрагмента его гомологичной последовательности. Эти полипептиды включают полноразмерные антитела Camelidae, а именно Fc и V_HH домены, химерные варианты антител Camelidae тяжелой цепи с человеческим Fc доменом или V_HH сами по себе или полученные фрагменты.

V_HH против сывороточного альбумина может связываться более эффективным путем с сывороточным альбумином, чем традиционные антитела, которые известны как несущие белки. Как несущий, некоторые эпитопы сывороточного альбумина могут быть недоступны связывающим белкам, пептидам и мелким химическим соединениям. Поскольку известно, что V_HH связываются с «необычными» или не-традиционными эпитопами, а также полостями (WO 97/49805), сродство таких V_HH к циркулирующему альбумину может быть повышено.

Настоящее изобретение также относится к тому, что анти-TNF-полипептид, как описывается здесь, дополнительно содержащий одно или более нанотел, направленных против одного или более сывороточных белков субъекта, неожиданно имеет значительно пролонгированное время полужизни в системе кровообращения указанного субъекта по сравнению со временем полужизни анти-TNF-альфа нанотела, когда оно не является частью указанной конструкции. Кроме того, было обнаружено, что указанные полипептиды проявляют те же полезные свойства нанотел, такие как высокая стабильность, остающаяся интактной у мышей, устойчивость к экстремальному pH, стабильность при высоких температурах и высокое сродство к мишени.

Сывороточный белок может являться любым походящим белком, обнаруженным в сыворотке субъекта. В одном аспекте изобретения, сывороточный белок представляет собой сывороточный альбумин, сывороточные иммуноглобулины, тироксин-связывающий белок, трансферрин или фибриноген. В зависимости от предполагаемого применения, а также от требующегося времени полужизни для эффективного лечения и/или компартментализации целевого антигена, V_HH-партнер может быть направленным против одного из вышеуказанных сывороточных белков.

В соответствии со специфичным, но неограничивающим, аспектом изобретения, нанотело против сывороточного альбумина человека состоит из 4 каркасных областей (FR1 - FR4 соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1 - CDR3 соответственно), в котором:

- CDR1 представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

SFGMS [SEQ ID NO: 36]

LNLMG [SEQ ID NO: 37]

INLLG [SEQ ID NO: 38]

NYWMY; [SEQ ID NO: 39]

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 2 или только 1 “аминокислотное(ых) отличие(я)” (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, где:

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены, и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанными аминокислотными последовательностями;

и в котором:

- CDR2 представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

SISGSGSDTLYADSVKG [SEQ ID NO: 40]

TITVGDSTNYADSVKG [SEQ ID NO: 41]

TITVGDSTSYADSVKG [SEQ ID NO: 42]

SINGRGDDTRYADSVKG [SEQ ID NO: 43]

AISADSSTKNYADSVKG [SEQ ID NO: 44]

AISADSSDKRYADSVKG [SEQ ID NO: 45]

RISTGGGYSYYADSVKG [SEQ ID NO: 46]

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей; где

и/или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют3, 2 или только 1 “аминокислотное(ых) отличие(я)” (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, где:

и в котором:

- CDR3 представляет собой аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

DREAQVDTLDFDY [SEQ ID NO: 47]

или из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей; в котором

или из группы, состоящей из:

GGSLSR [SEQ ID NO: 48]

RRTWHSEL [SEQ ID NO: 49]

GRSVSRS [SEQ ID NO: 50]

GRGSP [SEQ ID NO: 51]

(2) указанная аминокислотная последовательность предпочтительно содержит только аминокислотные замены, и не содержит аминокислотные делеции или инсерции, сравнительно с вышеуказанными аминокислотными последовательностями.

В другом аспекте, изобретение относится к нанотелу против сывороточного альбумина человека, которое состоит из 4 каркасных областей (FR1 - FR4 соответственно) и 3 гипервариабельных участков (CDR1 - CDR3 соответственно), которое выбирается из группы, состоящей из доменных антител и/или однодоменных антител с одной из следующих комбинаций CDR1, CDR2 и CDR3, соответственно:

- CDR1: SFGMS; CDR2: SISGSGSDTLYADSVKG; CDR3: GGSLSR;

- CDR1: LNLMG; CDR2: TITVGDSTNYADSVKG; CDR3: RRTWHSEL;

- CDR1: INLLG; CDR2: TITVGDSTSYADSVKG; CDR3: RRTWHSEL;

- CDR1: SFGMS; CDR2: SINGRGDDTRYADSVKG; CDR3: GRSVSRS;

- CDR1: SFGMS; CDR2: AISADSSDKRYADSVKG; CDR3: GRGSP;

- CDR1: NYWMY; CDR2: RISTGGGYSYYADSVKG; CDR3: DREAQVDTLDFDY.

В нанотелах изобретения, которые содержат комбинации CDR, указанные выше, каждый CDR может быть заменен CDR, выбранный из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют, по меньшей мере, 80%, предпочтительно, по меньшей мере, 90%, более предпочтительно, по меньшей мере, 95%, даже более предпочтительно, по меньшей мере, 99% идентичности последовательности (как определено здесь) с вышеуказанными CDR; где

и/или выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, которые имеют 3, 2 или только 1 (как указано в предыдущем параграфе) “аминокислотное(ых) отличие(я)” (как определено здесь) с указанными CDR одной из вышеуказанных аминокислотных последовательностей, где:

Однако из нанотел изобретения, которые содержат комбинации CDR, указанные выше, нанотела, содержащие один или более CDR, перечисленные выше, являются особенно предпочтительными; нанотела, содержащие два или более CDR, перечисленные выше, являются более особенно предпочтительными; и нанотела, содержащие три из CDR, CDR, перечисленные выше, являются наиболее особенно предпочтительными.

В этих нанотелах против сывороточного альбумина человека, каркасные области FR1 - FR4 предпочтительны, как определено здесь выше, для нанотел изобретения.

Особенно предпочтительные нанотела против сывороточного альбумина человека выбираются из группы, состоящей из SEQ ID NO: 61 - 67, SEQ ID NO 87 - 89 и SEQ ID NO 100-104. Предпочтительные комбинации CDR и каркасных областей, имеющиеся в этих нанотелах, также приведены в таблице II.

Другой аспект изобретения представляет собой анти-TNF-альфа полипептид, как здесь описывается, дополнительно содержащий, по меньшей мере, один полипептид, выбранный из группы, состоящей из анти-IFN-гамма полипептида, полипептида против рецептора TNF-альфа и полипептида против рецептора IFN-гамма.

В соответствии с одним аспектом изобретения, нанотело направлено против рецептора TNF-альфа. Указанное нанотело может быть V_HH Camelidae.

В соответствии с одним аспектом изобретения, нанотело направлено против рецептора IFN-гамма. Указанное нанотело может быть V_HH Camelidae.

Другой аспект изобретения представляет собой способ лечения аутоиммунного заболевания или состояния, как указано здесь, включающий введение пациенту эффективного количества анти-TNF-альфа полипептида, дополнительно содержащего, по меньшей мере, один полипептид, выбранный из группы, состоящей из анти-IFN-гамма полипептида, полипептида против рецептора TNF-альфа и полипептида против рецептора IFN-гамма, причем такие полипептиды объединены друг с другом, как описывается ниже.

Такие мульти-специфичные конструкции могут обладать улучшенной активностью как воспалительное терапевтическое соединение по сравнению с моно-специфичными конструкциями.

Один аспект изобретения представляет композицию, содержащую анти-TNF-альфа полипептид, как здесь описывается, и, по меньшей мере, один полипептид, выбранный из группы, состоящей из полипептида против рецептора TNF-альфа и полипептида против рецептора IFN-гамма, для совместного, раздельного или последовательного введения субъекту.

Один аспект изобретения представляет способ лечения аутоиммунного заболевания, включающий введение индивидууму эффективного количества анти-TNF-альфа полипептида и, по меньшей мере, одного полипептида, выбранного из группы, состоящей из анти-IFN-гамма полипептида, полипептида против рецептора TNF-альфа и полипептида против рецептора IFN-гамма, одновременно, раздельно или последовательно.

Другой аспект изобретения представляет набор, включающий анти-TNF-альфа полипептид и, по меньшей мере, один полипептид, выбранный из группы, состоящей из анти-IFN-гамма полипептида, полипептида против рецептора TNF-альфа и полипептида против рецептора IFN-гамма, для одновременного, раздельного или последовательного введения субъекту. В аспект изобретения включается то, что набор может использоваться в соответствии с изобретением. В аспект изобретения включается то, что набор может использоваться для лечения заболеваний, указанных здесь.

Под совместным применением понимается, что полипептиды вводятся пациенту одновременно. Например, как смесь полипептидов или композиция, содержащая указанные полипептиды. Примеры включают, но не ограничиваются, раствор, вводимый внутривенно, таблетка, жидкость, крем для местного использования и т.д., где каждое лекарственное средство содержит интересующие полипептиды.

Под раздельным применением понимается, что полипептиды вводятся пациенту в одно и тоже время или почти в одно и тоже время. Полипептиды присутствуют в наборе как отдельные, несмешанные лекарственные средства. Например, различные полипептиды могут присутствовать в наборе, как отдельные таблетки. Таблетки могут употребляться субъектом путем глотания обеих таблеток одновременно, и одной таблетки непосредственно за другой.

Под последовательным применением понимается, что полипептиды вводятся пациенту последовательно. Полипептиды, присутствующие в наборе как отдельные, несмешанные лекарственные средства. Существует временной интервал между дозами. Например, один полипептид может применяться через 336, 312, 288, 264, 240, 216, 192, 168, 144, 120, 96, 72, 48, 24, 20, 16, 12, 8, 4, 2, 1, или 0,5 часа после другого компонента.

В последовательном применении, один полипептид может применяться однократно или любое количество раз и в различных дозах перед и/или после применения другого полипептида. Последовательное применение может сочетаться с совместным или раздельным применением.

Медицинские применения анти-TNF-альфа полипептида, описываемые ниже, также применимы для композиции, содержащей анти-TNF-альфа полипептид, который здесь описывается, и, по меньшей мере, один полипептид, выбранный из группы, состоящей из анти-IFN-гамма полипептида, полипептида против рецептора TNF-альфа и полипептида против рецептора IFN-гамма для одновременного, раздельного или последовательного введения субъекту, как здесь описывается.

В соответствии с одним аспектом изобретения, анти-IFN-гамма полипептид анти-TNF-альфа нанотела направлен против IFN-гамма. Указанное нанотело может быть V_HH Camelidae.

В соответствии с одним аспектом изобретения, полипептид против рецептора TNF-альфа, анти-TNF-альфа нанотела направлен против рецептора TNF-альфа. Указанное нанотело может быть V_HH Camelidae.

В соответствии с одним аспектом изобретения, полипептид против рецептора IFN-гамма анти-TNF-альфа нанотела направлен е против IFN-гаммарецептора. Указанное нанотело может быть V_HH Camelidae.

Другое воплощение настоящего изобретения представляет собой анти-TNF-альфа полипептид, как описывается здесь, где число нанотел, направленных против TNF-альфа, составляет два или более. Такие многовалентные анти-TNF-альфа полипептиды имеют преимущество, заключающееся в необычно высоком функциональном сродстве с мишенью, проявляя более высокие, чем ожидалось, ингибиторные свойства сравнительно с его моновалентными прототипами.

Многовалентные анти-TNF-альфа полипептиды имеют функциональное сродство, которое на несколько порядков выше, чем у моновалентных исходных анти-TNF-альфа полипептидов. Изобретатели обнаружили, что функциональное сродство этих многовалентных полипептидов намного выше, чем таковое для указанных в уровне технике бивалентных и многовалентных антител. Удивительно, анти-TNF-альфа полипептиды настоящего изобретения, связанные друг с другом непосредственно или посредством короткой линкерной последовательностью, показывали высокое функциональное сродство, ожидаемые теоретически для многовалентных традиционных 4-цепочечных антител.

Изобретатели обнаружили, что такие высокие увеличенные функциональные активности могут обнаруживаться предпочтительно с антигенами, состоящими из мультидоменных и мультимерных белков, как в прямых анализах связывания, так и в функциональных анализах, напр., анализах цитотоксичности.

Нанотела могут объединяться с формированием любых полипептидов, здесь описываемых, содержащих более чем одно нанотело, при использовании способов, известных из уровня техники, или любыми будущими способами. Например, они могут быть слиты путем химического перекрестного сшивания путем взаимодействия аминокислотных остатков с органическим дериватизирующим агентом, который описан Blattler et al, Biochemistry 24,1517-1524; EP294703. Альтернативно, нанотела могут быть слиты генетически на уровне ДНК, т.е. образуется полинуклеотидная конструкция, которая кодирует всю полипептидную конструкцию, содержащая одно или более нанотел против мишени и одно или более нанотел против сывороточного белка. Способ продуцирования бивалентных или многовалентных полипептидных конструкций V_HH описывается в патентной заявке PCT WO 96/34103. Один способ соединения сложного нанотела осуществляется посредством генетического пути путем связывания кодирующей последовательности нанотела либо непосредственно, либо через пептидный линкер. Например, C-концевая область первого нанотела может быть связана с N-концевой областью следующего нанотела. Этот способ связывания может расширяться для связывания с дополнительным нанотелом для конструкции и продукции три-, тетра-, и т.д. функциональных конструкций.

В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, нанотела связаны друг с другом непосредственно, без использования линкер. В отличие от соединения крупных традиционных антител, где линкерная последовательность нужна для поддержки активности связывания в двух субъединицах, полипептиды изобретения могут быть связаны непосредственно, тем самым устраняются потенциальные проблемы, связанные с линкерной последовательностью, такие как антигенность, при применении человеку, нестабильность линкерной последовательности, ведущая к диссоциации субъединиц.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения, нанотела связаны друг с другом посредством пептидной линкерной последовательности. Такая линкерная последовательность может являться природной последовательностью или не природной последовательностью. Ожидается, что линкерная последовательность не является иммуногенной для субъекта, которому вводится анти-TNF-альфа полипептид. Линкерная последовательность может обеспечивать достаточную гибкость многовалентному анти-TNF-альфа полипептиду, одновременно являясь устойчивой к протеолитической деградации. Неограничивающим примером линкерных последовательностей является тот, который может быть получен из шарнирной области V_HH, описываемый в WO 96/34103.

В соответствии с другим аспектом изобретения, многовалентные нанотела, содержащие более чем два нанотела, могут быть связанными друг с другом либо непосредственно или посредством линкерной последовательности. Такие конструкции трудно получить в случае традиционных антител, и вследствие стерических затруднений несоответствия объемных субъединиц функциональность будет утрачена или резко снижена, вместо значительного повышения, как наблюдается с V_HH изобретения по сравнению с моновалентной конструкцией.

Полипептидные конструкции, здесь описываемые, могут быть созданы опытным специалистом в соответствии со способами, известными из уровня техники, или любыми будущими способами. Например, V_HH могут быть получены при использовании способов, известных из уровня техники, таких как иммунизация верблюда и получение из него гибридомы, или путем клонирования библиотеки нанотел при использовании способов молекулярной биологии, известных из уровня техники, и последующего отбора при использовании фагового дисплея.

В соответствии с аспектом изобретения анти-TNF-альфа полипептид может быть гомологичной последовательностью полноразмерного анти-TNF-альфа полипептида. В соответствии с другим аспектом изобретения, анти-TNF-альфа полипептид может быть функциональной частью полноразмерного анти-TNF-альфа полипептида. В соответствии с другим аспектом изобретения, анти-TNF-альфа полипептид может быть гомологичной последовательностью полноразмерного анти-TNF-альфа полипептида. В соответствии с другим аспектом изобретения, анти-TNF-альфа полипептид может быть функциональной частью гомологичной последовательности полноразмерного анти-TNF-альфа полипептида. В соответствии с аспектом изобретения, анти-TNF-альфа полипептид может содержать последовательность анти-TNF-альфа полипептида.

В соответствии с аспектом изобретения, нанотело, применяемое для формирования анти-TNF-альфа полипептида, может быть целым нанотелом (напр., V_HH) или его гомологичной последовательностью. В соответствии с другим аспектом изобретения, нанотело, применяемое для формирования полипептидной конструкции, может быть функциональной частью целого нанотела. В соответствии с другим аспектом изобретения, Нанотело, применяемое для формирования полипептидной конструкции, может быть гомологичной последовательностью целого нанотела. В соответствии с другим аспектом изобретения, нанотело, применяемое для формирования полипептидной конструкции, может быть функциональной частью гомологичной последовательности целого нанотела.

В используемом здесь значении, гомологичная последовательность настоящего изобретение может содержать дополнения, делеции или замены одной или более аминокислот, которые по существу не изменяют функциональные характеристики полипептидов изобретения. Число аминокислотных делеций или замена соответствует предпочтительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 или 70 аминокислот.

Гомологичная последовательность в соответствии с настоящим изобретением может быть модифицирована путем дополнения, делеции или замены аминокислот, при этом указанная модификация по существу не изменяет функциональные характеристики сравнительно с немодифицированным полипептидом.

Гомологичной последовательностью в соответствии с настоящим изобретением может быть последовательность, которая имеется у других видов Camelidae, таких как, например, верблюд, дромадер, лама, альпака, гунако и т.д.

Где гомологичная последовательность указывает идентичность последовательности, это означает последовательность, которая представляет высокую идентичность последовательности (более чем 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 98% идентичность последовательности) с исходной последовательностью и предпочтительно характеризуется теми же свойствами, что и исходная последовательность, а именно, сродством, где указанную идентичность рассчитывают с использованием известных способов.

Альтернативно, гомологичная последовательность может также быть любой аминокислотной последовательностью, полученной в результате осуществления замен в любых положениях исходной последовательности в соответствии с нижеуказанной формулой:

Ser заменяется Ser, Thr, Gly и Asn;

Arg заменяется одним из Arg, His, Gln, Lys и Glu;

Leu заменяется одним из Leu, Ile, Phe, Tyr, Met и Val;

Pro заменяется одним из Pro, Gly, Ala и Thr;

Thr заменяется одним из Thr, Pro, Ser, Ala, Gly, His и Gln;

Ala заменяется одним из Ala, Gly, Thr и Pro;

Val заменяется одним из Val, Met, Tyr, Phe, Ile и Leu;

Gly заменяется одним из Gly, Ala, Thr, Pro и Ser;

Ile заменяется одним из Ile, Met, Tyr, Phe, Val и Leu;

Phe заменяется одним из Phe, Trp, Met, Tyr, Ile, Val и Leu;

Tyr заменяется одним из Tyr, Trp, Met, Phe, Ile, Val и Leu;

His заменяется одним из His, Glu, Lys, Gln, Thr и Arg;

Gln заменяется одним из Gln, Glu, Lys, Asn, His, Thr и Arg;

Asn заменяется одним из Asn, Glu, Asp, Gln и Ser;

Lys заменяется одним из Lys, Glu, Gln, His и Arg;

Asp заменяется одним из Asp, Glu и Asn;

Glu заменяется одним из Glu, Asp, Lys, Asn, Gln, His и Arg;

Met заменяется одним из Met, Phe, Ile, Val, Leu и Tyr.

Гомологичная нуклеотидная последовательность в соответствии с настоящим изобретением может относиться к нуклеотидным последовательностям из более чем 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800 или 1000 нуклеотидов, способным гибридизоваться с обратным комплементом нуклеотидной последовательности, обеспечивающий кодирование исходной последовательности, при строгих условиях гибридизации (которые описываются в Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manuel, Cold Spring, Harbor Laboratory press, New York).

В используемом здесь значении, функциональная часть относится к последовательности нанотела, которая составляет достаточный размер, чтобы интересующее связывание поддерживалось со сродством 1 · 10^-6 M или лучше.

Альтернативно, функциональная часть содержит частичные делеции целой аминокислотной последовательности и еще поддерживает сайт(ы) связывания и белковый(ые) домен (ы), необходимый для связывания и взаимодействия с мишенью.

В используемом здесь значении, функциональная часть относится к менее 100% всей последовательности (напр., 99%, 90%, 80%, 70%, 60% 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 1% и т.д.), но содержит 5 или более аминокислот или 15 или более нуклеотидов.

Мишени, как указано здесь, такие как TNF-альфа, TNF-альфа рецептор, сывороточные белки (напр., сывороточный альбумин, сывороточные иммуноглобулины, тироксин связывающий белок, трансферрин, фибриноген) и IFN-гамма, рецептор IFN-гамма могут быть фрагментами указанных мишеней. Таким образом, мишень представляет собой также фрагмент указанной мишени, способный вызывать иммунную реакцию. Мишень представляет собой также фрагмент указанной мишени, способный к связыванию нанотела, индуцированного против полноразмерной мишени.

Фрагмент, в используемом здесь значении, относится к менее 100% последовательности (напр., 99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% и т.д.), но содержащий 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более аминокислот. Фрагмент представляет достаточную длину, что интересующее взаимодействие поддерживается со сродством 1 · 10^-6 M или лучше.

Фрагмент, в используемом здесь значении, также относится к необязательным инсерциям, делециям и заменам одной или более аминокислоты, что по сути не изменяет способность мишени связываться с нанотелом, индуцированным против мишени дикого типа. Число аминокислотных инсерций, делеций или замен составляет предпочтительно до 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69 или 70 аминокислот.

Гомологичная последовательность настоящего изобретение может включать анти-TNF-альфа полипептид, который гуманизирован. Гуманизация антител новым классом V_HH позволит дополнительно снизить возможность развития нежелательных иммунологических реакций у человека после применения.

Одно воплощение настоящего изобретения относится к способу приготовления модифицированных полипептидов на основании антител ламы путем определения аминокислотных остатков вариабельного домена (V_HH) антител, которые могут быть модифицированы без утраты исходного сродства домена к антигену и при его сниженной иммуногенности относительно гетерологичных видов; применению V_HH, имеющего модификации в идентифицированных остатках, которые полезны для использования гетерологичных видов; и к V_HH, таким образом модифицированному.

А именно, изобретение относится к приготовлению модифицированных V_HH, которые модифицируется для введения людям, полученным V_HH как таковым, и применению таких "гуманизированных" V_HH для лечения заболеваний у людей. Под гуманизированным понимается мутированный таким образом, что иммуногенность после применения у пациентов минимальная или отсутствует. Гуманизация полипептидов, в соответствии с настоящим изобретением, содержит стадию замещения одной или более аминокислот из Camelidae их человеческим прототипом, который найден в человеческой консенсусной последовательности, без потери полипептидом его типичной характеристики, т.е. гуманизация не оказывает существенного действия на способность к антигенносу связыванию конечного полипептида. Такие способы известны для специалиста.

Гуманизация нанотела Camelidae требует введения и мутагенеза ограниченного числа аминокислот в одной полипептидной цепи. Это в отличие от гуманизации scFv, Fab, (Fab)2 и IgG, что требует введение аминокислотных замен в две цепи, легкую и тяжелую цепи, и сохранение сборки обеих цепей.

Как описывается в WO 04/041862, анти-TNF нанотела могут быть гуманизированными. Гуманизация может например, включать мутагенез остатков в FR1 в положении 1 и 5, которое были введены праймером, использующимся для репертуарного клонирования, и не являются природными в последовательности ламы. Мутагенез этих остатков не приводит к потере связывания и/или ингибиторной активности. Гуманизация может также включать мутагенез остатков в FR3 в положении 74, 76, 83, 84, 93. Мутагенез этих остатков не приводит к резкой потери связывания и/или ингибиторной активности. Комбинирование мутаций FR1 и FR3 не оказывает влияния на связывание и/или ингибиторную активность. Гуманизация может также включать мутагенез остатков в FR4 в положении 108. Мутагенез Q108L приводит к более слабому уровню продукции в Escherichia coli. Положение 108 экспонировано растворителю в V_HH верблюжьих, тогда как для человеческих антител это положение замаскировано на границе VH-VL (Spinelli, 1996; Nieba, 1997). В выделенных VH положение 108 экспонировано растворителю. Введение неполярного гидрофобного Leu вместо полярного незаряженного Gln может оказывать существенный эффект на естественные фолдинг/стабильность молекулы. Также, замещение гидрофильных остатков человеческими гидрофобными остатками в положениях 44 и 45 (E44G и R45L), не оказывает влияния на связывание и/или ингибирование. Однако, потеря связывания и/или ингибиторной активности наблюдалось, если F37V и F47W были введены. Модельные данные подтверждают, что критический остаток 37 сохраняет целостность конформации CDR3 петли и, следовательно, активность (вся нумерация соответствует нумерации Кабата).

В соответствии с одним воплощением настоящего изобретения, гуманизация включает замещение любых из следующих остатков либо одних либо в комбинации:

- FR1 положение 1, 5, 28 и 30,

- характеристическая аминокислота в положении 44 и 45 в FR2,

- FR3 остатки 74, 75, 76, 83, 84, 93 и 94,

- и положения 103, 104, 108 и 111 в FR4;

- нумерация по номенклатуре Кабата .

Одним воплощением настоящего изобретения является анти-TNF-альфа полипептид, или нуклеиновая кислота, способная кодировать указанный полипептид, для применения в лечении, предупреждении и/или ослаблении симптомов нарушений, относящихся к воспалительному процессу. TNF-альфа включается в воспалительный процесс и блокирование действия TNF-альфа может оказывать противовоспалительный эффект, что является сильно желаемым в некоторых болезненных состояниях, таких как, например, болезнь Крона. Примеры демонстрируют, что V_HH в соответствии с изобретением связывается с TNF-альфа, кроме того, блокирует его связывание с рецептором TNF-альфа.

Анти-TNF-альфа полипептиды настоящего изобретения применимы для аутоиммунных заболеваний, таких как болезнь Аддисона (надпочечник), аутоиммунные заболевания уха (уши), аутоиммунных заболеваний глаз (глаза), аутоиммунный гепатит (печень), аутоиммунный паротит (околоушная железа), болезнь Крона (кишечник), диабет I типа (поджелудочная железа), эпидидимит (эпидимис), гломерулонефрит (почки), болезнь Грейвса (щитовидная железа), синдром Гийена–Барре (нервные клетки), тиреоидит Хашимото (щитовидная железа), гемолитическая анемия (красные клетки крови), системная красная волчанка (многие ткани), мужское бесплодие (сперма), множественный склероз (нервные клетки), злокачественная миастения (нейромышечные узлы), пузырчатка (кожа), псориаз (кожа), ревматический полиартрит (сердце и суставы), ревматоидный артрит (суставы), саркоидоз (множественные ткани и органы), склеродермия (кожа и соединительная ткань), синдром Шегрена (экзокринные железы, и другие ткани), спондилоартропатия (осевой скелет, и другие ткани), тиреоидит (щитовидная железа), васкулит (сосуды).

В скобках представлены ткани, затронутые заболеванием. Предполагается, что этот список аутоиммунных заболеваний является примерным, нежели охватывающим все.

Аутоиммунные состояния, для которых анти-TNF-альфа полипептиды настоящего изобретения применимы, включают, например, СПИД, атопическую аллергию, бронхиальную астму, экзему, лепру, шизофрению, наследственную депрессию, трансплантацию тканей и oрганов, синдром хронической усталости, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, инфаркт миокарда, инсульт, аутизм, эпилепсию, феномен Артюса, анафилаксию, и алкогольное и лекарственное привыкание. В вышеуказанных заболеваниях, аутоиммунные состояния, затронутые ткани являются первичной мишенью, в других случаях вторичной мишенью. Эти состояния являются частью или большинства аутоиммунных синдромов. Следовательно, для лечения их, предоставляется возможность применять эти способы, или аспекты этих способов, которые здесь описываются, иногда в сочетании с другими способами.

Другим воплощением настоящее изобретения является применение анти-TNF-альфа полипептида в соответствии с изобретением, или нуклеиновой кислоты, способной кодировать указанный полипептид для производства лекарственного средства для лечения нарушений, связанных с воспалительными процессами. Примеры нарушений включают ревматоидный артрит, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, воспалительные заболевания кишечника и множественный склероз.

Полипептиды и нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением могут вводиться субъекту традиционными путями, а также внутривенно. Однако, специальное свойство анти-TNF-альфа полипептидов изобретения, которое заключается в том, что они могут проходить барьеры, такие как мембраны тканей и/или опухолей, и их местное действие, и то, что они являются достаточно стабильными для того, чтобы выдерживать экстремальные условия среды, такой как в желудке. Следовательно, другим аспектом настоящего изобретения является доставка анти-TNF-альфа полипептидов.

Если нанотела и/или полипептиды изобретения используются для, или предполагается их использование для, профилактики или лечения заболеваний и нарушений желудочно-кишечного тракта, в частности путем перорального применения или другое введение в желудочно-кишечный тракт, то не будет являться необходимым, как правило, применение тех полипептидов изобретения, которые имеют повышенное время полужизни в сыворотке (т.е. которые пегилированы или которые содержат нанотела, направленные против сывороточного белка). Таким образом, для таких целей могут использоваться такие полипептиды изобретения, которые только содержат нанотела изобретения. В частности, было обнаружено, что пероральное применение для профилактики и лечения заболеваний или нарушений желудочно-кишечного тракта, связанных с и/или опосредованных TNF-альфа (а также IBD и другие заболевания и нарушения желудочно-кишечного тракта, указанные выше), с применением моновалентного нанотела изобретения или полипептида изобретения, который по существу состоит из моновалентного нанотела изобретения, может быть предпочтительным. В других обстоятельствах, например, для лечения ревматоидного артрита (RA), применение бивалентного нанотела изобретения может быть предпочтительным. Если содержание таких нанотел увеличивается в кровяном русле, то применение полипептида изобретения, который имеет повышенное время полужизни в сыворотке, может быть предпочтительным.

Субъектом в соответствии с изобретением может быть любое млекопитающее, чувствительное к лечению терапевтическими полипептидами.

Пероральная доставка анти-TNF-альфа полипептидов изобретения приводит к доставке таких молекул в их активной форме в кишечник к местным участкам, которые поражены нарушением. Эти участки могут быть сильно воспаленными и содержать TNF-альфа-продуцирующие клетки. Анти-TNF-альфа полипептиды изобретения, которые связываются с TNF-альфа могут нейтрализовать TNF-альфа местно, избегая распределения по всему организму и таким образом ограничивая негативные побочные эффекты. Генетически модифицированные микроорганизмы, такие как Micrococcus lactis, способны секретировать антитела или их функциональные части. Такие модифицированные микроорганизмы используются как носители для местной продукции и доставки антител или их функциональных частей в кишечник. При использовании штамма, который продуцирует анти-TNF-альфа полипептид, воспалительные заболевания кишечника могут лечиться.

Другой аспект изобретения включает доставку анти-TNF-полипептидов путем использования поверхностной экспрессии на или секреции из неинвазивных бактерий, таких как грамположительные организмы-хозяева, подобные Lactococcus spec., при использовании вектора, такого как описанный в WO00/23471.

Одно воплощение настоящего изобретения включает анти-TNF-альфа полипептид, который здесь описывается, для применения в лечении, предупреждении и/или ослаблении симптомов нарушений, допускающих модуляцию нанотела или полипептида изобретения, который способен проходить через желудочную среду без потери активности вещества.

Примеры нарушений включают любые, причиной которых является воспаления, включая, но не ограничиваясь, ревматоидный артрит, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, воспалительные заболевания кишечника, и множественный склероз. Как известно для специалиста, как только внесен в указанную полипептидную конструкцию, технология состава может применяться для высвобождения максимального количества полипептида в нужном местоположении (в желудке, в кишке, и т.д.). Такой способ доставки важен для лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов нарушений, чьи мишени расположены в системе кишечника.

Аспект изобретения представляет способ лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов нарушений, чувствительных для модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, который способен проходить через желудочную среду без потери активности, путем перорального введения субъекту анти-TNF-альфа полипептида, как описано здесь.

Другим воплощением настоящего изобретения является применение анти-TNF-альфа полипептида, как описано здесь, для производства лекарственного средства для лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов нарушений, чувствительных для модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, который способен проходить через желудочную среду без потери активности.

Аспект изобретения представляет способ доставки нанотела или полипептида изобретения в кишечную систему без потери активности указанного вещества, путем перорального введения субъекту анти-TNF-альфа полипептида, как описано здесь.

Аспект изобретения представляет способ доставки нанотела или полипептида изобретения в кровоток субъекта без потери активности указанного вещества, путем перорального введения субъекту анти-TNF-альфа полипептида, как описано здесь

Другим воплощением настоящего изобретения является анти-TNF-альфа полипептид, как описано здесь, для применения для лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов или нарушений, чувствительных для модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, доставляемый в вагинальный и/или ректальный тракт.

Примерами нарушений являются различные нарушения, вызванные воспалением, включая, но не ограничиваясь, ревматоидный артрит, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, воспалительные заболевания кишечника, и множественный склероз. В неограничивающем примере, состав, в соответствии с изобретением, содержит анти-TNF-альфа полипептид, как описано здесь, в форме геля, крема, суппозитории, пленки, или в форме губки или как вагинальный круг, который медленно высвобождает активный ингредиент в течение времени (такие составы описываются в EP 707473, EP 684814, US 5629001).

Аспект изобретения представляет способ лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, доставляемый в вагинальный и/или ректальный тракт, путем вагинального и/или ректального введения субъекту анти-TNF-альфа полипептида, как описано здесь.

Другим воплощением настоящего изобретения является применение анти-TNF-альфа полипептида, как описано здесь, для производства лекарственного средства для лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, доставляемый в вагинальный и/или ректальный тракт.

Аспект изобретения представляет способ доставки нанотела или полипептида изобретения в вагинальный и/или ректальный тракт без потери активности указанного вещества, путем вагинального и/или ректального введения субъекту анти-TNF-альфа полипептида, как описано здесь.

Аспект изобретения представляет собой способ доставки нанотела или полипептида изобретения в кровоток субъекту без потери активности указанного вещества, путем вагинального и/или ректального введения субъекту анти-TNF-альфа полипептида, как описано здесь.

Другим воплощением настоящего изобретения является анти-TNF-альфа полипептид, как описано здесь, для применения для лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, доставляемый в нос, верхние дыхательные пути и/или легкие.

Примерами нарушений являются различные нарушения, вызванные воспалением, включая, но не ограничиваясь, ревматоидный артрит, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, воспалительные заболевания кишечника, и множественный склероз. В неограничивающем примере, состав, в соответствии с изобретением, содержит анти-TNF-альфа полипептид, как описано здесь, в форме назального спрея (напр., аэрозоли) или ингалятора. Поскольку полипептидная конструкция имеет небольшой размер, то она может достигать своей мишени намного более эффективно, чем терапевтические молекулы IgG.

Аспект изобретения представляет способ лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, доставляемый в верхние дыхательные пути и легкие, путем введения субъекту анти-TNF-альфа полипептида, как описано здесь, путем ингалирования через рот или нос.

Другим воплощением настоящего изобретения является применение анти-TNF-альфа полипептида, как описано здесь, для производства лекарственного средства для лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, доставляемый в нос, верхние дыхательные пути и/или легкие, без потери активности указанного полипептида.

Аспект изобретения представляет способ доставки нанотела или полипептида изобретения в нос, верхние дыхательные пути и легкие без потери активности, путем введения в нос, верхние дыхательные пути и/или легкие субъекту анти-TNF-альфа полипептида, как описано здесь.

Аспект изобретения представляет способ доставки нанотела или полипептида изобретения в кровоток субъекту без потери активности путем введения в нос, верхние дыхательные пути и/или легкие субъекту анти-TNF-альфа полипептида, как описано здесь.

Одним воплощением настоящего изобретения является анти-TNF-альфа полипептид, как описано здесь, для применения для лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, доставляемый к слизистой оболочки кишки, где указанные нарушения повышают проницаемость слизистой оболочки кишки. Из-за его небольшого размера, анти-TNF-альфа полипептид, как описано здесь, может проникать через слизистую оболочку кишки и достигать кровотока более эффективно у субъектов, страдающих от нарушений, которые вызваны повышенной проницаемостью слизистой оболочки кишки, например, болезнь Крона.

Аспект изобретения представляет способ лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, доставляемый к слизистой оболочки кишки, где указанные нарушения повышают проницаемость слизистой оболочки кишки, путем перорального введения субъекту анти-TNF-альфа полипептида, как описано здесь.

Этот процесс может даже дополнительно усовершенствоваться путем дополнительного аспекта настоящего изобретения - применения носителей, обеспечивающих активный транспорт. В этом аспекте изобретения, V_HH слит с носителем, который улучшает его прохождение через стенку кишечника в кровоток. В неограничивающим примере, этот “носитель” представляет собой второй V_HH, который слит с терапевтическим V_HH. Такие слитые конструкции приготавливаются при использовании способов, известных из уровня техники. “Носитель” V_HH связывает специфично рецептор на стенке кишечника, который индуцирует активный перенос через стенку.

Другим воплощением настоящего изобретения является применение анти-TNF-альфа полипептида, как описано здесь, для производства лекарственного средства для лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, доставляемый в слизистую оболочку кишки, где указанное нарушение повышает проницаемость слизистой оболочки кишки.

Аспект изобретения представляет способ доставки нанотела или полипептида изобретения к слизистой оболочки кишки без потери активности, путем перорального введения субъекту анти-TNF-альфа полипептида изобретения.

Аспект изобретения представляет способ доставки нанотела или полипептида изобретения в кровоток субъекту без потери активности, путем перорального введения субъекту анти-TNF-альфа полипептида изобретения.

Этот процесс может даже дополнительно усовершенствоваться путем дополнительного аспекта настоящего изобретения - применения носителей, обеспечивающих активный транспорт. В этом аспекте изобретения, анти-TNF-альфа полипептид, как описываемые здесь слит с носителем, который улучшает его прохождение через стенку кишечника в кровоток. В неограничивающим примере, этот “носитель” представляет собой V_HH, который слит с указанным полипептидом. Такие слитые конструкции приготавливаются при использовании способов, известных из уровня техники. “Носитель” V_HH связывает специфично рецептор на стенке кишечника, который индуцирует активный перенос через стенку.

Одним воплощением настоящего изобретения является анти-TNF-альфа полипептид, как описано здесь, для применения для лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, которое способен эффективно проникать через ткани, расположенные ниже языка.

Примерами нарушений являются различные нарушения, вызванные воспалением, включая, но не ограничиваясь, ревматоидный артрит, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, воспалительные заболевания кишечника, и множественный склероз. Состав указанной полипептидной конструкции, как описано здесь, например, таблетка, спрей, капли помещаются под язык и абсорбируются через слизистые оболочки в капиллярную сеть под языком.

Аспект изобретения представляет способ лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, который представляет способен эффективно проникать через ткани, расположенные ниже языка, путем сублингвального введения субъекту анти-TNF-альфа полипептида, как описано здесь.

Другим воплощением настоящего изобретения является применение анти-TNF-альфа полипептида как описано здесь для производства лекарственного средства для лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, который способен эффективно проникать через ткани, расположенные ниже языка.

Аспект изобретения представляет способ доставки нанотела или полипептида изобретения в ткани, расположенной ниже языка, без потери активности, путем сублингвального введения субъекту анти-TNF-альфа полипептида, как описано здесь.

Аспект изобретения представляет способ доставки нанотела или полипептида изобретения в кровоток субъекту без потери активности, путем перорального введения субъекту анти-TNF-альфа полипептида, как описано здесь.

Одним воплощением настоящего изобретения является анти-TNF-альфа полипептид, как описано здесь, для применения для лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, который способен эффективно проникать через кожу.

Примерами нарушений являются различные наращения, вызванные воспалением, включая, но не ограничиваясь, ревматоидный артрит, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, воспалительные заболевания кишечника, и множественный склероз. Состав указанной полипептидной конструкции, например, крем, пленка, спрей, капли, пэтч помещаются на кожу и проникают сквозь.

Аспект изобретения представляет способ лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, который способен эффективно проникать через кожу, путем местного введения субъекту анти-TNF-альфа полипептида как описано здесь.

Другим воплощением настоящего изобретения является применение анти-TNF-альфа полипептида как описано здесь для производства лекарственного средства для лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов нарушений, чувствительных к модуляции нанотелом или полипептидом изобретения, который способен эффективно проникать через кожу.

Аспект изобретения представляет способ доставки нанотела или полипептида изобретения в кожу без потери активности, путем местного введения субъекту анти-TNF-альфа полипептида, как описано здесь.

Аспект изобретения представляет способ доставки нанотела или полипептида изобретения в кровоток субъекту, путем применения топически субъекту анти-TNF-альфа полипептида, как описано здесь.

В другом воплощением настоящего изобретения, анти-TNF-альфа полипептид дополнительно содержит носитель нанотела (напр., V_HH), который действует как носитель активного транспорта для транспорта указанного анти-TNF-альфа полипептида, из просвета легких в кровь.

Анти-TNF-альфа полипептид, дополнительно содержащий носитель, связывает специфично рецептор, имеющийся на поверхности (бронхиальные эпителиальные клетки), что приводит к активному транспорту из просвета легких в кровь. Носитель нанотела может быть слит с полипептидной конструкцией. Такие слитые конструкции могут изготавливаться при использовании способов, известных из уровня техники и здесь описываемых. “Носитель” нанотела связывает специфично рецептор на поверхности слизистой, который индуцирует активный перенос через поверхность.

Другим аспектом настоящего изобретение является способ определения, какое нанотело (напр., V_HH) активно транспортируется в кровоток после назального применения. Аналогично, нативная или иммунная фаговая библиотека V_HH может применяться трансназально, и после различных временных отрезков после применения, кровь или органы могут быть изолированы для высвобождения фагов, которые активно транспортированы в кровоток. Неограничивающий пример рецептора для активного транспорта из просвета легких в кровоток представляет собой Fc рецептор N (FcRn). Один аспект изобретения включает V_HH молекулы, идентифицируемые способом. Такой V_HH может затем использоваться как носитель V_HH для доставки терапевтического V_HH к соответствующей мишени в кровотоке после трансназального введения.

В одном аспекте изобретения, можно использовать анти-TNF-альфа полипептид, как описано здесь, для скрининга агентов, которые модулируют связывание полипептида с TNF-альфа. После идентификации способом, в котором измеряют отдельно связывание или вытеснение указанного полипептида, агенты должны быть подвергнуты функциональному тестированию для определения, будут ли они модулировать действие антигена in vivo.

В примере эксперимента по вытеснению, фаг или клетки, экспрессирующие TNF-альфа или его фрагмент, инкубировали в связывающем буфере с полипептидом изобретения, который был мечен, в присутствии или отсутствии возрастающих концентраций кандидата-модулятора. Для проверки достоверности и проведения калибровки анализа, могут осуществляться контрольные конкурентные реакции при использовании возрастающих концентраций указанного полипептида, который является немеченым. После инкубации клетки интенсивно промывали, и измеряли меченный полипептид, как подходит для данной метки (напр., сцинтилляционные измерения, флуоресценция, и т.д.). Снижение, по меньшей мере, на 10% количества меченого полипептида, связанного в присутствии кандидата-модулятора, показывает вытеснение связывания кандидатом-модулятором. Считается, что кандидаты-модуляторы связываются специфично в этом или других способах, описываемых здесь, если они вытесняют 50% меченого полипептида (субнасыщение дозы полипептида) при концентрации 1 мкM или менее.

Альтернативно, связывание или вытеснение связывания может регистрироваться путем поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Анализы поверхностного плазмонного резонанса могут использоваться как количественные способы измерения связывания между двумя молекулами путем изменения в массе около иммобилизованного сенсора, вызванное связыванием или потерей связывания полипептида изобретения из водной фазы с TNF-альфа, иммобилизованным на мембране на сенсоре. Это изменение массы измеряется как зависимость единиц резонанса от времени после инъекции или удаления указанного полипептида или кандидата-модулятора и измеряется при использовании биосенсора Biacore (Biacore AB). TNF-альфа может, например, иммобилизовываться на сенсорный чип (например, исследовательского чипа CM5; Biacore AB) в тонкой пленке липидной мембраны в соответствии со способами, описанными Salamon et al. (Salamon et al., 1996, Biophys J. 71: 283-294; Salamon et al., 2001, Biophys. J. 80: 1557-1567; Salamon et al., 1999, Trends Biochem. Sci. 24: 213-219, каждый из которых включен посредством ссылки). Sarrio et al. продемонстрировали, что SPR может использоваться для детектирования лигандного связывания с аденозиновым рецептором A(1), иммобилизованным в липидном слое на чипе (Sarrio et al., 2000, Mol. Cell. Biol. 20: 5164-5174, включен посредством отсылки). Условия для связывания полипептида изобретения с TNF-альфа в анализе SPR могут быть точно подобраны специалистом в данной области при использовании условий, указанных Sarrio et al. в качестве отправной точки.

Анализ SPR может проводиться для модуляторов связывания, по меньшей мере, двумя путями. Согласно первому, полипептид изобретения может быть предварительно связан с иммобилизованным TNF-альфа, с последующим введением кандидата-модулятора в концентрации, варьирующей от 0,1 нM до 1 мкM. Вытеснение связанного полипептида может количественно определяться, допуская определение связывания модулятора. Альтернативно, мембрано-связанный TNF-альфа может предварительно инкубироваться с кандидатом-модулятором и подвергаться действию полипептида изобретения. Различие в сродстве связывания между указанным полипептидом и TNF-альфа, предварительно инкубированным с модулятором, по сравнению с таковым между указанным полипептидом и TNF-альфа в отсутствии модулятора будет демонстрировать связывание или вытеснение указанного полипептида в присутствии модулятора. В анализе снижение, по меньшей мере, на 10% количества указанного полипептида, связанного в присутствии кандидата-модулятора, по сравнению с количеством указанного полипептида, связанного в отсутствии кандидата-модулятора, показывает, что кандидата-модулятор ингибирует взаимодействие TNF-альфа и указанного полипептида.

Другим способом детектирования ингибирования связывания, например, полипептида изобретения с TNF-альфа, является применение метода резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET). FRET представляет собой квантово-механический феномен, который наблюдается между донором флуоресценции (D) и акцептором флуоресценции (A) в непосредственной близости друг с другом (как правило, < 100 Å), если спектр эмиссии D перекрывается со спектром возбуждения A. Тестируемые молекулы, напр., полипептид изобретения и TNF-альфа мечены комплементарной парой донорного и акцепторного флуорофоров. При связывании близко друг с другом посредством взаимодействия TNF-альфа: полипептид, флуоресценция, излучаемая после возбуждения донорного флуорофора, будет иметь отличную длину волны от длины волны, излучаемой в ответ на возбуждение этой длиной волны, когда указанный полипептид и TNF-альфа не связаны, обеспечивая возможность количественного определения связанных по сравнению с несвязанными молекул путем измерения интенсивности эмиссии при каждой длине волны. Донорные флуорофоры, которыми метятся TNF-альфа, известны из уровня техники. Особенный интерес представляют варианты GFP A. Victoria, известные как Cyan FP (CFP, Donor (D)) и Yellow FP (YFP, Acceptor (A)). В качестве примера, вариант YFP может приготавливаться как слитый белок с TNF-альфа. Векторы для экспрессии вариантов GFP в форме слияний (Clontech), а также реагенты, меченые флуорофором (Molecular Probes), известны из уровня техники. Добавление кандидата-модулятора к смеси флуоресцентно меченного полипептида и YFP-TNF-альфа приведет к ингибированию переноса энергии, что выражается, например, снижением флуоресценции YFP относительно образца без кандидата-модулятора. В анализе с использованием FRET для детекции взаимодействия TNF-альфа: полипептид, 10% или более снижение в интенсивности эмиссии флуоресценции при длине волны акцептора в образцах, содержащих кандидат-модулятор, относительно образцов без кандидата-модулятора показывает, что кандидат-модулятора ингибирует взаимодействие TNF-альфа:полипептид.

Образец в используемом здесь значении может быть любым биологическим образцом, содержащим TNF-альфа, такой как клинический (напр., клеточные фракции, цельная кровь, плазма, сыворотка, ткань, клетки, и т.д.), полученный из клинических, сельскохозяйственных, судебных, исследовательских, или других возможных образцов. Клинические образцы могут происходить от человека или животного. Анализируемый образец может быть как твердым, так и жидким по природе. Очевидно, при использовании твердых материалов, они впервые растворяются в пригодном растворе.

Варианты FRET используют тушение флуоресценции для мониторинга молекулярного взаимодействия. Одна молекула во взаимодействующей паре может быть мечена флуорофором, а другая молекулой, которая тушит флуоресценцию флуорофора при введении в близкий контакт с ним. Изменение флуоресценции после возбуждения показывает изменение во взаимосвязи молекул, меченых парой флуорофор:гаситель. Вообще, увеличение флуоресценции меченого TNF-альфа показывает, что анти-TNF-альфа полипептид, несущий тушитель был вытеснен. Для анализа на основе тушения, 10% или большее увеличение интенсивности эмиссии флуоресценции в образцах, содержащих кандидат-модулятор, относительно образцов без кандидата-модулятора, показывает, что кандидат-модулятор ингибирует взаимодействие TNF-альфа: анти-TNF-альфа полипептид.

В дополнении к способам поверхностного плазмонного резонанса и FRET, измерение поляризации флуоресценции пригодно для определения связывания. Значение поляризации флуоресценции для флуоресцентно-меченой молекулы зависит от времени корреляции вращения или скорости поворачивания. Комплексы, такие, которые образуются путем связи TNF-альфа с флуоресцентно меченным анти-TNF-альфа полипептидом, имеют более высокое значение поляризации, чем не связанный в меченный полипептид. Включение кандидата-ингибитора взаимодействия TNF-альфа:анти-TNF-альфа полипептид приводит к снижению поляризации флуоресценции, относительно смеси без кандидата ингибитора, если кандидат-ингибитор разрушает или ингибирует взаимодействие TNF-альфа с указанным полипептидом. Поляризации флуоресценции хорошо подходит для идентификации некрупных молекул, которые разрушают образование комплексов TNF-альфа:анти-TNF-альфа полипептид. Снижение на 10% или более поляризации флуоресценции в образцах, содержащих кандидат-модулятор, относительно поляризации флуоресценции в образцах без кандидата-модулятора, показывает, что кандидат-модулятор ингибирует взаимодействие TNF-альфа:полипептид.

Другая альтернатива для мониторинга взаимодействия TNF-альфа: анти-TNF-альфа полипептид использует биосенсорный анализ. ICS биосенсоры описываются в уровне техники (Australian Membrane Biotechnology Research Institute; Cornell B, Braach-Maksvytis V, King L, Osman P, Raguse B, Wieczorek L, and Pace R. "A biosensor that uses ion-channel switches" Nature 1997, 387, 580). В этой технологии, взаимодействие TNF-альфа и анти-TNF-альфа полипептида ассоциировано с закрытием опосредованных грамицидином ионных каналов в суспендированных бислойных мембранах и, таким образом, измеряются изменения в проводимости (аналогично сопротивлению) биосенсора. Этот способ является линейным в диапазоне шести порядков величины изменения проводимости и идеально подходит для крупномасштабного высокопроизводительного скрининга комбинаторных библиотек небольших молекул. Изменение на 10% или более (увеличение или снижение) проводимости в образцах, содержащих кандидат-модулятор, относительно проводимости образцов без кандидата-модулятора показывает, что кандидат-модулятор ингибирует взаимодействие TNF-альфа:полипептид. Также важно отметить, что в анализах, тестирующих взаимодействие TNF-альфа с анти-TNF-альфа полипептидом, возможно, что модулятор взаимодействия не должен обязательно взаимодействовать непосредственно с доменом(ами) белков, которые физически взаимодействуют с указанным полипептидом. Также возможно, что модулятор будет связываться в положении, удаленном от участка взаимодействия, и приводит, например, к конформационному изменению в TNF-альфа. Модуляторы (ингибиторы или агонисты), которые действуют таким образом, все же интересны как агенты для модулирования связывания TNF-альфа с его рецептором .

Любой описанный анализ связывания может использоваться для определения присутствия агента в образце, напр., в образце ткани, который связывается с TNF-альфа, или который оказывает влияние на связывание, например, полипептида изобретения с TNF-альфа. Для того, чтобы TNF-альфа реагировал с указанным полипептидом в присутствии или отсутствии образца, и связывающий полипептид измеряется как подходящий для используемого анализа связывания. Увеличение на 10% или более связывания указанного полипептида указывает на то, что образец содержит агент, который модулирует связывание указанного полипептида с TNF-альфа. Конечно, вышеуказанный способ может с легкостью быть использован для скрининга кандидатов-модуляторов, которые изменяют связывание между любым анти-TNF-альфа полипептидом изобретения, его гомологичной последовательностью, его функциональной частью или функциональной частью его гомологичной последовательности, и TNF-альфа или его фрагментом.

Одним воплощением настоящего изобретения является неизвестный агент, идентифицируемый способом, описанным здесь.

Одним воплощением настоящего изобретения является неизвестный агент идентифицируемый способом, описанным здесь, для применения для лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов нарушений, связанный с воспалительным процессом.

Другим воплощением настоящего изобретения является применение неизвестного агент, идентифицируемого способом, описанным здесь, для применения для лечения, предупреждения и/или ослабления симптомов нарушений, связанный с воспалительным процессом.

Примеры нарушений включают ревматоидный артрит, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, воспалительные заболевания кишечника и множественный склероз.

Клетка, которая является пригодной, в соответствии с изобретением, предпочтительно выбирается из группы, состоящей из бактериальной клетки, такой как, например, E. coli, дрожжевой клетки, такой как, например, S. cerevisiae, P. pastoris, клетки насекомых или клетки млекопитающих.

Клетка, которая является пригодной, в соответствии с изобретением, может быть любой клеткой, в которую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид, содержащий анти-TNF-альфа изобретения, гомологичная ее последовательности, ее функциональной части или функциональной части ее гомологичной последовательности в соответствии с изобретением, может быть введена таким образом, что полипептид экспрессируется в природных уровнях или более, как определено здесь. Предпочтительно полипептид изобретения, который экспрессируется в клетке, проявляет нормальную или почти нормальную фармакологию, как определено здесь.

В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения, клетка выбирается из группы, состоящей из COS7-клетки, CHO клетки, LM (TK-) клетки, NIH-3T3 клетки, HEK-293 клетки, K-562 клетки или 1321N1 астроцитомной клетки, но также и другие трансфицированные клеточные линии.

В целом, “терапевтически эффективное количество”, “терапевтически эффективная доза” и “эффективное количество” означает количество, необходимое для достижения желаемого результата или результатов (модулирование TNF-альфа связывания; лечения или предупреждения воспаления). Специалисту будет ясно, что активность и, следовательно, “эффективное количество” могут отличаться для различных соединений, которые модулируют TNF-альфа связывание, используемое в изобретении.

В используемом здесь значении, термин "соединение" относится к анти-TNF-альфа полипептиду настоящего изобретения, к композиции, или нуклеиновой кислоте, способной кодировать указанный полипептид или агент, идентифицированный в соответствии со способом скрининга, описываемым здесь, или указанному полипептиду, содержащему одно или более производных аминокислот.

Под “фармацевтически пригодным” понимается материал, который не является нежелательным с биологической или иной точки зрения, т.е. материал может применяться индивидууму вместе с соединением без причинения любого нежелательного биологического эффекта или взаимодействия вредным образом с любым из других компонентов фармацевтической композиции, в которой он содержится.

Анти-TNF-альфа полипептиды, как описано здесь, пригодны для лечения или предупреждения состояний субъекта и содержит применение фармацевтически эффективного количества соединения или композиции.

Анти-TNF-полипептиды настоящего изобретения пригодны для лечения или предупреждения состояний субъекта, связанных с ревматоидным артритом, болезнью Крона, неспецифическим язвенным колитом, воспалительными заболеваниями кишечника и множественным склерозом субъекта и содержит применение фармацевтически эффективного количества соединения или композиции, которая связывает TNF-альфа.

Анти-TNF-альфа полипептиды, как здесь описывается, пригодны для лечения или предупреждения состояний субъекта и содержит применение фармацевтически эффективного количества соединения или композиции в комбинации с другими, такими как, например, аспирин.

Анти-TNF-альфа полипептиды как здесь описывается, пригодны для лечения или предупреждения состояний субъекта, связанных с ревматоидным артритом, болезнью Крона, неспецифическим язвенным колитом, воспалительными заболеваниями кишечника и множественным склерозом субъекта, которые включают введение фармацевтически эффективного количества соединения или композиции в комбинации с другими, такими как, например, аспирин.

Настоящее изобретение представляет, но не ограничивается, введение составов, содержащих одно соединение изобретения. В объем изобретения входит обеспечение комбинированного лечения, в котором пациенту, нуждающемуся в этом, вводят состав, включающий более чем одно соединение изобретения.

Состояния, опосредованные TNF-альфа, включают, но не ограничиваются, ревматоидный артрит, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит, воспалительные заболевания кишечника и множественный склероз.

Соединение, пригодное в настоящем изобретении может составляться как фармацевтические композиции и вводиться млекопитающим-хозяевам, а также пациенту или домашним животным в различных формах, адаптированных для выбранного пути введения, т.е. перорально или парентерально, интраназально, ингаляционно, внутривенно, внутримышечно, топически или подкожно.

Соединение настоящего изобретения может также применяться при использовании геннотерапевтических способов доставки. См, напр., патент США No. 5,399,346, который включен в полном объеме посредством отсылки. При использовании геннотерапевтических способов доставки, первичные клетки, трансфицированные геном для соединения настоящего изобретения могут дополнительно трансфицироваться тканеспецифичными промоторами для нацеливания на конкретные органы, ткани, трансплантаты, опухоли или клетки.

Таким образом, настоящее соединение может систематически вводиться, напр., перорально, в сочетании с фармацевтически пригодным носителем, таким как инертный разбавитель. Они могут быть включены в твердые или мягкие желатиновые капсулы, могут быть спрессованы в таблетки, или могут включаться непосредственно в пищу диеты пациента. Для перорального терапевтического применения, активное соединение может комбинироваться с одним или более наполнителями и использоваться в форме принимаемых внутрь таблеток, буккальных таблеток, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, вафель и подобных. Такие композиции и препараты должны содержать, по меньшей мере, 0,1% активного соединения изобретения. Процентное содержание композиций и препаратов может, конечно, варьировать и может обычно составлять между от около 2 до около 60% массы данной стандартной лекарственной формы. Количество активного соединения изобретения в таких терапевтически пригодных композициях таково, чтобы достигался эффективный уровень дозировки.

Таблетки, пастилки, пилюли, капсулы и подобные могут также содержать следующие: связующие вещества, такие как трагакант, акация, маисовый крахмал или желатин; наполнители, такие как дикальция фосфат; дезинтегрирующие агенты, такие как маисовый крахмал, картофельный крахмал, альгиновая кислота и подобные; мобриканты, такие как стеарат магния; и подсластители, такие как сахароза, фруктоза, лактоза или аспартам или ароматизаторы, такие как мятное масло, гаультериевое масло или черешневый ароматизатор могут добавляться. Если стандартная лекарственная форма представляет собой капсулу, то она может содержать, дополнительно к материалам вышеуказанного типа, носитель, а также растительное масло или этиленгликоль. Различные другие материалы могут присутствовать как покрытия или же модифицирующие физические формы твердые лекарственные формы. Например, таблетки, пилюли, или капсулы могут быть покрыты желатином, воском, шеллаком или сахаром и подобными. Сироп или эликсир может содержать нанотела и полипептиды изобретения, сахарозу или фруктозу в качестве подсластителей, метил- и пропилпарабен как консерванты, красители и вкусовые добавки, такие как вишневый или апельсиновый ароматизатор. Конечно, любой материал, используемый при приготовлении любой стандартной лекарственной формы должен быть фармацевтически пригодным и по существу нетоксичным в использующихся количествах. В дополнение, нанотела и полипептиды изобретения могут включаться в препараты и устройства с замедленным высвобождением.

Активное соединение изобретения может также вводиться внутривенно или внутриперитонеально с помощью инфузии или инъекции. Растворы активного соединения изобретения или их соли могут быть приготовлены в воде, смешанной с нетоксичным сурфактантом. Дисперсии могут также быть приготовлены в глицерине, жидких полиэтиленгликолях, триацетилглицерине и их смесях и маслах. При нормальных условиях хранения и применения, эти лекарственные средства содержат стабилизаторы для предотвращения роста микроорганизмов.

Стерильные инъецируемые растворы приготавливают путем смешивания активного соединения изобретения в требуемом количестве в подходящем растворителе с различными другими ингредиентами, перечисленными выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрованием. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъецируемых растворов, предпочтительные способы приготовления включают способы вакуумной сушки и лиофильной сушки, с помощью которых образуется порошок, содержащий активный ингредиент вместе с любым дополнительным желательным ингредиентом, имеющимся в предварительно стерилизованных растворах.

Для местного применения, активное соединение изобретения может применяться в очищенном виде, т.е. если они являются жидкими. Однако, будет в целом желаемым наносить их на кожу как композиции или составы в сочетании с дерматологически пригодным носителем, который может быть в твердой или жидкой форме.

Пригодные твердые носители включают тонкоизмельченные твердые вещества, такие как тальк, глина, микрокристаллическая целлюлоза, кремний, алюминий и подобные. Пригодные жидкие носители включают воду, гидроксиалкилы или гликоли или водно-спиртовые/гликолевые смеси, в которых активное соединение изобретения может растворяться или диспергироваться в эффективных уровнях, необязательно с помощью нетоксичных сурфактантов. Адъюванты, такие как ароматизаторы, и дополнительные антимикробные агенты могут быть добавлены для оптимизации свойств для данного использования. Полученные жидкие композиции могут наноситься из гигроскопических прокладок, использоваться для импрегнирования бинтов и других перевязочных материалов, или распыляться на пораженные области при использовании распылителей помпового и аэрозольного типа.

Сгустители, такие как синтетические полимеры, жирные кислоты, соли жирных кислот и эфиры, жирные спирты, модифицированные целлюлозы или модифицированные минеральные материалы могут также использоваться с жидкими носителями для образования легко намазывающихся паст, гелей, мазей, мыла, и подобных, для нанесения непосредственно на кожу пользователя.

Примеры пригодных дерматологических композиций, которые могут использоваться для доставки активного соединения изобретения к коже, известны из уровня техники, например, см.: Jacquet et al. (U.S. Pat. No. 4,608,392), Geria (U.S. Pat. No. 4,992,478), Smith et al. (U.S. Pat. No. 4,559,157) и Wortzman (U.S. Pat. No. 4,820,508).

Используемые дозировки активного соединения изобретения могут определяться путем сравнения их действия in vitro и in vivo на моделях животных. Способы экстраполяции эффективных доз у мышей и других животных в отношении человека известны из уровня техники, например, см. патент США №. 4,938,949.

В целом, концентрация активного соединения изобретения в жидкой композиции, такой как лосьон, будет составлять от около 0,1 до 25 процентов по массе, предпочтительно от около 0,5 до 10 процентов по массе. Концентрация в полутвердой или твердой композиции, такой как гель или порошок, будет составлять от около 0,1 до 5 процентов по массе, предпочтительно от около 0,5 до 2,5 процентов по массе.

Количество активного соединения изобретения, или его активной соли или производного, требуемое для применения в лечении, будет изменяться не только в зависимости от выбранной определенной соли, но также и от способа введения, природы состояния, которое лечится, и возраста и состояния пациента и будет в итоге составлять по назначению лечащего врача или клинициста. Также дозировка активного соединения изобретения изменяется в зависимости от клетки-мишени, опухоли, ткани, трансплантата или органа.

Желаемая доза может удобным образом быть представлена в одноразовой дозе или раздельных дозах, применяемых в подходящих интервалах, например, по две, три, четыре или более субдоз в день. Сами субдозы могут быть дополнительно разделены, напр., на ряд дискретных свободно разделенных во времени введений, таких, как многократные ингаляции из инсуффлятора или при применении множества капель в глаза.

Режим применения может включать длительное, каждодневное лечение. Под “длительным” понимается, по меньшей мере, длительность в две недели и предпочтительно, в несколько недель, месяцев, или лет. Необходимые модификации в этом дозовом интервале могут определяться специалистом в данной области при использовании только рутинных экспериментов, с учетом приведенных в настоящем описании наставлений. См.: Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PA. Дозировка может также регулироваться лечащим врачом в случае любых осложнений.

Изобретение обеспечивает агент, который представляет собой модулятор взаимодействий TNF-альфа / TNF-альфа-рецептор.

Кандидатный агент может быть синтетическим агентом, или смесью агентов, или может быть натуральным продуктом (напр., экстракт растения или культуральный супернатант). Кандидатный агент в соответствии с изобретением включает небольшие молекулы, которые могут синтезироваться, натуральный экстракт, пептиды, белки, карбогидраты, липиды и т.д.

Кандидатный модуляторный агент из больших библиотек синтетических или природных агентов может подвергаться скринингу. Библиотеки синтетических агентов коммерчески доступны от различных компаний, включая Maybridge Chemical Co. (Trevillet, Cornwall, UK), Comgenex (Princeton, NJ), Brandon Associates (Merrimack, NH), и Microsource (New Milford, CT). Библиотека редких химических соединений доступна от Aldrich (Milwaukee, WI). Комбинаторные библиотеки доступны и могут быть приготовлены. Альтернативно, библиотеки натуральных агентов в форме бактериальных, грибковых, растительных и животных экстрактов доступны, напр., от Pan Laboratories (Bothell, WA) или MycoSearch (NC). Дополнительно, библиотеки, полученные природным или синтетическим образом, могут быть модифицированы посредством традиционных химических, физических, и биологических способов.

Пригодные агенты могут быть найдены среди различных химических классов. Они могут быть органическими агентами, или небольшими органическими агентами. Небольшие органические агенты имеют молекулярную массу более чем 50 и менее около 2500 дальтон, предпочтительно менее около 750, более предпочтительно менее около 350 дальтон. Примерные классы включают гетероциклы, пептиды, сахариды, стероиды, и подобные. Агенты могут быть модифицированы с повышением эффективности, стабильности, фармацевтической совместимости, и подобных. Структурная идентификация агента может использоваться для идентификации, генерации или скрининга дополнительных агентов. Например, если пептидные агенты идентифицированы, то они могут быть модифицированы различными способами с повышением их стабильности, такими как при использовании неприродной аминокислоты, такой как D-аминокислота, в частности D-аланин, путем функционализации амино- или карбоксильных концов, напр., для аминогруппы — ацилирование и алкилирование, и для карбоксильной группы — этерификация или амидификация, или подобные.

Для первичного скрининга пригодная концентрация кандидатного агента в соответствии с изобретением составляет от около 10 мM до около 100 мкM или более (т.е. 1 мM, 10 мM, 100 мM, 1 M и т.д.). Концентрация для первичного скрининга будет использоваться как верхний предел, наряду с девятью дополнительными концентрациями, где дополнительные концентрации определяют путем снижения концентрации для первичного скрининга на полулогарифмические интервалы (напр., для 9 более концентраций) для вторичного скрининга или для построения кривых зависимости от концентрации.

Высокопроизводительный набор для скрининга в соответствии с изобретением содержит все необходимые инструменты и среды для выполнения обнаружения агента, который модулирует взаимодействия комплекса TNF-альфа/TNF-альфа путем связывания с TNF-альфа в присутствии полипептида, предпочтительно с концентрацией в пределе от 1 мкM до 1 мM.

Набор содержит следующие. Рекомбинантные клетки изобретения, содержащие и экспрессирующие нуклеотидную последовательность, кодирующую TNF-альфа, которые выращивают в соответствии с набором на твердой подложке, такой как титрационная микропланшета, более предпочтительно 96-луночная титрационная микропланшета, в соответствии со способами, хорошо известными для специалиста из уровня техники, особенно таким, который описан в WO 00/02045. Альтернативно, TNF-альфа применяют в очищенной форме для иммобилизации, например, на 96-луночную титрационную микропланшету специалистом в этой области. Альтернативно, TNF-альфа применяют в наборе, предварительно иммобилизирвоанным на, например, 96-луночную титрационную микропланшету. TNF-альфа может быть целым TNF-альфа или его фрагментом.

Модуляторные агенты в соответствии с изобретением, в концентрациях от около 1 мкM до 1 мM или более, добавляют к определенным лункам в присутствии подходящей концентрации анти-TNF-альфа полипептида, его гомологичной последовательности, его функциональной части или функциональной части его гомологичной последовательности, при этом указанная концентрация указанного полипептида предпочтительно составляет в пределах от 1 мкM до 1 мM. Наборы могут содержать одно или более анти-TNF-альфа полипептидов изобретения.

Анализ связывания осуществляется в соответствии со способами, уже описанными здесь, и результаты сравнивают с исходным уровнем, например, связывания TNF-альфа с анти-TNF-альфа полипептидом, его гомологичной последовательностью, его функциональной частью или функциональной частью его гомологичной последовательности, но в отсутствии добавления модуляторного агента. Лунки, показывающие, по меньшей мере, 2-кратное, предпочтительно 5-кратное, более предпочтительно 10-кратное и наиболее предпочтительно 100-кратное или более увеличение или снижение в связывании TNF-альфа-полипептида (например) по сравнению с уровнем активности в отсутствии модулятора, выбирают для дополнительного анализа.

Изобретение обеспечивает другие наборы для скрининга модуляторов связывания TNF-альфа/TNF-альфа рецептора, так же как и наборы, пригодные для диагностики нарушений, характеризующихся дисфункцией TNF-альфа. Изобретение также обеспечивает наборы, пригодные для скрининга модуляторов нарушений, так же как и наборы для их диагностики, при этом указанные нарушения характеризуются одним или более процессом, включая TNF-альфа. Наборы, пригодные в соответствии с изобретением, могут включать выделенный TNF-альфа. Альтернативно, или в дополнение, набор может содержать клетки, трансформированные для экспрессии TNF-альфа. В дополнительном воплощении, набор в соответствии с изобретением может содержать полинуклеотиды, кодирующие TNF-альфа. В еще дополнительном воплощении, набор, в соответствии с изобретением, может содержать специфичные праймеры, пригодные для амплификации TNF-альфа. Наборы, пригодные в соответствии с изобретением, могут содержать выделенный TNF-альфа полипептид, его гомолог или его функциональные части. Набор в соответствии с изобретением может содержать клетки, трансформированные для экспрессии указанного полипептида. Наборы могут содержать более чем один полипептид. В дополнительном воплощении набор в соответствии с изобретением может содержать полинуклеотиды, кодирующие TNF-альфа. В еще дополнительном воплощении набор в соответствии с изобретением может содержать специфичные праймеры, пригодные для амплификации макромолекулы, такой как, например, TNF-альфа. Все наборы в соответствии с изобретением будут содержать описанные объекты или комбинации объектов и упаковочные материалы для них. Наборы также будут включать инструкции по применению.

Кроме того, для специалиста также будет понятно, что возможно “трансплантировать” один или более CDR, указанные выше, для нанотела изобретения на другие “каркасы”, включая, но не ограничиваясь, человеческие каркасы или неиммуноглобулиновые каркасы. Пригодные каркасы и способы для такого CDR трансплантирования будут ясны специалисту и хорошо известны из уровня техники, см., например: US-A-7,180,370, WO 01/27160, EP 0 605 522, EP 0 460 167, US-A-7,054,297, Nicaise et al., Protein Science (2004), 13:1882-1891; Ewert et al., Methods, 2004 Oct; 34(2):184-199; Kettleborough et al., Protein Eng. 1991 Oct; 4(7): 773-783; O’Brien and Jones, Methods Mol. Biol. 2003: 207: 81-100; and Skerra, J. Mol. Recognit. 2000: 13: 167-187, and Saerens et al., J. Mol. Biol. 2005 Sep 23;352(3):597-607, и дополнительных ссылок, цитируемых здесь. Например, способы, известные per se для трансплантации мышиных или крысиных CDR в человеческие каркасы, могут использоваться аналогичным образом с обеспечением химерных белков, содержащих одно или более CDR нанотела изобретения и одну или более человеческих каркасных областей или последовательностей.

Таким образом, в другом воплощении, изобретение содержит химерный полипептид, содержащий, по меньшей мере, одну CDR последовательность, выбранную из группы, состоящей из CDR1 последовательностей, CDR2 последовательностей и CDR3 последовательностей, указанных здесь для нанотела изобретения. Предпочтительно, такой химерный полипептид содержит, по меньшей мере, одну CDR последовательность, выбранную из группы, состоящей из CDR3 последовательностей, указанных здесь для нанотела изобретения, и необязательно также, по меньшей мере, одну CDR последовательность, выбранную из группы, состоящей из CDR1 последовательностей и CDR2 последовательностей, указанных здесь для нанотела изобретения. Например, такой химерный полипептид может содержать одну CDR последовательность, выбранную из группы, состоящей из CDR3 последовательностей, упомянутых здесь для нанотела изобретения, одну CDR последовательность, выбранную из группы, состоящей из CDR1 последовательностей, упомянутых здесь для нанотела изобретения и одну CDR последовательность, выбранную из группы, состоящей из CDR1 последовательностей и CDR2 последовательностей, упомянутых здесь для нанотела изобретения. Комбинации CDR, которые здесь упомянуты, как предпочтительные, для нанотела изобретения будут, как правило, также предпочтительными для этих химерных полипептидов.

В указанных химерных полипептидах CDR могут быть дополнительно связанными с аминокислотными последовательностями и/или могут быть связанными друг с другом посредством аминокислотных последовательностей, в которых указанные аминокислотные последовательности являются предпочтительно каркасными последовательностями или аминокислотными последовательностями, которые действуют как каркасные последовательности, или вместе формируют каркас для представления CDR. Ссылка также может быть отнесена к уровня техники, указанного в последнем параграфе. В соответствии с одним предпочтительным воплощением, аминокислотные последовательности являются человеческими каркасными последовательностями, например, V_H3 каркасными последовательностями. Однако, не-человеческие, синтетические, полусинтетические или неиммуноглобулиновые каркасные последовательности могут также использоваться. Предпочтительно, используемые каркасные последовательности таковы, что (1) химерный полипептид способен к связыванию xxxx, т.е. со сродством, которое соответствует, по меньшей мере, 1%, предпочтительно, по меньшей мере, 5%, более предпочтительно, по меньшей мере, 10%, а также, по меньшей мере, 25% и до 50% или 90% или более сродству соответствующего нанотела изобретения; (2) химерный полипептид является пригодным для фармацевтического применения; и (3) химерный полипептид является предпочтительно по существу неиммуногенным при предполагаемых условиях для его фармацевтического применения (т.е. индикации, способа применения, дозы и режима лечения) (которые могут быть по существу аналогичными условиям, описываемым здесь для применения нанотела изобретения).

В соответствии с одним неограничивающим воплощением, химерный полипептид содержит, по меньшей мере, две CDR последовательности (как указанно выше), связанные посредством, по меньшей мере, одной каркасной последовательности, в котором, предпочтительно, по меньшей мере, одна из двух CDR последовательностей представляет собой CDR3 последовательность, и другая CDR последовательность является CDR1 или CDR2 последовательностью. В соответствии с предпочтительным, но не ограничивающим, воплощением, химерный полипептид содержит, по меньшей мере, две CDR последовательности (как указанно выше), связанные с, по меньшей мере, двумя каркасными последовательностями, в котором предпочтительно, по меньшей мере, одна из трех CDR последовательностей представляет собой CDR3 последовательность, и другие две CDR последовательности являются CDR1 или CDR2 последовательностями, и предпочтительно являются одной CDR1 последовательность, и одной CDR2 последовательностью. В соответствии с одним специфически предпочтительным, но не ограничивающим, воплощением, химерные полипептиды имеют структуру FR1’ - CDR1 - FR2’ - CDR2 - FR3’ - CDR3 - FR4’, в которой CDR1, CDR2 и CDR3 являются как определено здесь для CDR нанотел изобретения, и FR1’, FR2’, FR3’ и FR4’ являются каркасными последовательностями. FR1’, FR2’, FR3’ и FR4’ могут, в частности, являться каркасной-1, каркасной-2, каркасной-3 и каркасной-4 последовательностями, соответственно, человеческого антитела (а также V_H3 последовательностями) и/или частями или фрагментами таких каркасных последовательностей. Также возможно применение частей или фрагментов химерного полипептида со структурой FR1’ - CDR1 - FR2’ - CDR2 - FR3’ - CDR3 - FR4. Предпочтительно, такие части или фрагменты таковы, что они обеспечиваются критериями, указанные в предыдущем параграфе.

Изобретение также относится к белкам и полипептидам, содержащим и/или по существу состоящих из таких химерных полипептидов, нуклеиновых кислот, кодирующих такие белки или полипептиды; к способам приготовления таких белков и полипептидов; к клеткам-хозяевам, экспрессирующих или способных к экспрессии таких белков или полипептидов; к композициям, и в частности, к фармацевтическим композициям, которые содержат такие белки или полипептиды, нуклеиновые кислоты или клетки-хозяева; и к применениям таких белков или полипептидов, таких нуклеиновых кислот, таких клеток-хозяев и/или таких композиций, в частности для профилактических, терапевтических или диагностических целей, а таких как профилактические, терапевтические или диагностические цели, указанные здесь. Например, такие белки, полипептиды, нуклеиновые кислоты, способы, клетки-хозяева, композиции и применения могут быть аналогичными с белками, полипептидами, нуклеиновыми кислотами, способами, клетками-хозяевами, композициями и применением, описываемыми здесь, для нанотела изобретения.

Также необходимо отметить, что если нанотела изобретения содержат одну или более других CDR последовательностей, чем предпочтительные CDR последовательности, указанные выше, эти CDR последовательности могут быть любыми пригодными (т.е. пригодными для целей, описываемых здесь) CDR последовательностями и/или эти CDR последовательности могут быть получены любым способом, известным per se, например, из нанотел (предпочтительные), V_H доменов традиционных антител (и, в частности, из человеческих антител), антител тяжелых цепей, традиционных 4-цепочечных антител (а также, традиционных человеческих 4-цепочечных антител) или других иммуноглобулиновых последовательностей, направленных против TNF. Такие иммуноглобулиновые последовательности, направленные против xxxx могут генерироваться любым способом, известным по сути, что будет ясно специалисту, т.е. путем иммунизации TNF или путем скрининга пригодной библиотеки иммуноглобулиновых последовательностей с TNF, или любой их пригодной комбинации. Необязательно это может сопровождаться способами, такими как случайный или сайт-направленный мутагенез и/или другие способами созревания сродства, известными per se. Пригодные способы генерации таких иммуноглобулиновых последовательностей будут ясны специалисту, и например, включают способы скрининга, обзор которых представлен Hoogenboom, Nature Biotechnology, 23, 9, 1105-1116 (2005). Другие способы генерации иммуноглобулинов против специфической мишени включают, например, технологию Nanoclone (которая, например, описывается в неопубликованной патентной заявке США 60/648,922), так называемую SLAM технологию (которая, например, описывается в Европейской патентной заявке ЕР 0 542 810), применение трансгенных мышей, экспрессирующих человеческие иммуноглобулины или хорошо-известные гибридомные способы (см., например, Larrick et al, Biotechnology, Vol.7, 1989, p. 934). Все эти способы могут быть использованы для генерации иммуноглобулинов против TNF, и CDR таких иммуноглобулинов могут быть использованы в нанотелах изобретения, т.е. как указывалось выше. Например, последовательность таких CDR может быть определена, синтезирована и/или изолирована, и внесена в последовательность нанотел изобретения (напр., для замены соответствующей нативной CDR), всеми использующимися способами, известными per se, а также теми, которые описаны здесь, или нанотела изобретения, содержащих такие CDR (или нуклеиновые кислоты, кодирующие их same) могут быть синтезированы de novo, опять же при использовании способов, упомянутых здесь.

Изобретение будет сейчас дополнительно описано посредством следующих неограничивающих примеров и фигур, где фигуры демонстрируют:

Моновалентные нанотела к TNFα

Фигура 1: Выравнивание последовательности человеческого нанотела к TNFα

Фигура 2: Выравнивание последовательности нанотела к TNFα, специфичного к сывороточному альбумину

Фигура 3: Связывание альбумин-специфичного нанотела к TNFα с сывороточным альбумином человека

Фигура 4: Связывание альбумин-специфичного нанотела к TNFα с сывороточным альбумином макаки-резус

Фигура 5: Связывание альбумин-специфичного нанотела к TNFα с сывороточным альбумином мышей

Фигура 6: Чистота нанотел к TNFα и сывороточному альбумину (SDS-PAGE)

Фигура 7: Вестерн-блот-анализ нанотел к TNFα и сывороточному альбуминну

Фигура 8: Связывание нанотела к TNFα с TNFα человека(ELISA)

Фигура 9: Связывание нанотела к TNFα с TNFα макаки-резус (ELISA)

Фигура 10: Анализ ингибирования рецептора Enbrel для человеческого TNFα

Фигура 11: Анализ ингибирования рецептора Enbrel для TNFα макаки-резус

Фигура 12: Связывание нанотела к TNFα с TNFα человека (Biacore)

Фигура 13: Связывание нанотела к TNFα с TNFα макаки-резус (Biacore)

Фигура 14: Связывание нанотела к TNFα с белком A (Biacore)

Фигура 15: Температурная обработка нанотел к TNFα и сывороточному альбумину (Вестерн-блот)

Фигура 16: Стабильность: температурная обработка нанотел к TNFα (ELISA)

Фигура 17: Температурная обработка нанотел к сывороточному альбумину (Biacore)

Бивалентные нанотела к TNFα

Фигура 18: Чистота бивалентного нанотела к TNFα (SDS-PAGE)

Фигура 19: Вестерн-блот-анализ бивалентных нанотел к TNFα

Фигура 20: Анализ ингибирования рецептора Enbrel для бивалентных нанотел к TNFα

Фигура 21: Стабильность: температурная обработка бивалентных нанотел к TNFα (ELISA)

Гуманизированные моновалентные нанотел к TNFα

Фигура 22: Множественное выравнивание последовательности гуманизированных нанотел TNF1

Фигура 23: Множественное выравнивание последовательности гуманизированных нанотел TNF2

Фигура 24: Множественное выравнивание последовательности гуманизированных нанотел TNF3

Фигура 25: Множественное выравнивание последовательности гуманизированных нанотел ALB1

Фигура 26: Чистота гуманизированных нанотел к TNFα и сывороточному альбумину (SDS-PAGE)

Фигура 27: Вестерн-блот-анализ гуманизированных нанотел к TNFα и сывороточному альбумину

Фигура 28: Связывание гуманизированных нанотел к TNFα с человеческим TNFα

Фигура 29: Связывание гуманизированных нанотел к сывороточному альбумину с сывороточным альбумином человека

Фигура 30: Стабильность: температурная обработка гуманизированных нанотел к TNFα (ELISA)

Тривалентные нанотела к TNFα

Фигура 31: Чистота тривалентных нанотел к TNFα (SDS-PAGE)

Фигура 32: Вестерн-блот-анализ тривалентных нанотел к TNFα

Фигура 33: Стабильность: температурная обработка тривалентных нанотел к TNFα (ELISA)

Гуманизированные моновалентные нанотела к TNFα (второй раунд)

Фигура 34: Множественное выравнивание последовательности гуманизированных нанотел TNF1

Фигура 35: Множественное выравнивание последовательности гуманизированных нанотел TNF2

Фигура 36: Множественное выравнивание последовательности гуманизированных нанотел TNF3

Фигура 37: Множественное выравнивание последовательности гуманизированных нанотел ALB1

Фигура 38: Чистота гуманизированных нанотел к TNFα (SDS-PAGE)

Фигура 39: Вестерн-блот-анализ гуманизированных нанотел к TNFα

Фигура 40: Связывание гуманизированных нанотел к TNFα с человеческим TNFα

Фигура 41: Стабильность: температурная обработка гуманизированных нанотел к TNFα (ELISA)

Фигура 42: Анализ очищенного TNF60 на окрашенном серебром SDS-PAGE геле (A), окрашенном камасси SDS-PAGE геле (B), и в Вестерн-блот-анализе при использовании анти-NB (C) для обнаружения

Фигура 43: Хроматограмма аналитической гель-фильтрации TNF60 на Superdex HR75

Фигура 44: Связывание TNF60 с человеческим TNF-альфа

Фигура 45: Кривая зависимости эффект-доза, полученная в анализе цитотоксичности с человеческим TNF-альфа при использовании Нанотела™ TNF60 по сравнению с Enbrel (Etanercept), Humira (Adalimumab) и Remicade (Infliximab)

Фигура 46: Кривая зависимости эффект-доза, полученная в анализе цитотоксичности с TNFα макаки-резус при использовании Нанотела™ TNF60 по сравнению с Enbrel (Evanescent), Humira (Adalimumab) и Remicade (Infliximab)

Фигура 47: Фармакокинетический профиль TNF60 у мышей

Фигура 48: Профиль иммуногенности TNF60 у мышей

Фигура 49: Анализ очищенных TNF56-PEG40, TNF56-PEG60, TNF56-биотин, TNF55-PEG40, TNF55-PEG60 и TNF55-биотин на окрашенном Кумасси SDS-PAGE геле

Фигура 50: Анализ очищенных TNF56-PEG40 на SDS-PAGE геле при использовании окрашивания серебром (A), окрашивания Кумасси (B) и в Вестерн-блот-анализе при использовании анти-NB (C) для обнаружения

Фигура 51: Хроматограмма аналитической гель-фильтрации TNF56-PEG40 на Superdex HR75 на Superdex HR 75

Фигура 52: Хроматограмма аналитической гель-фильтрации TNF56-PEG40 на Superdex HR 200

Фигура 53: Кривая зависимости эффект-доза, полученная в анализе цитотоксичности, с человеческим TNF-альфа при использовании Нанотела™ TNF56-PEG40 и моновалентного Нанотела™ TNF1 дикого типа по сравнению с Enbrel (Etanercept), Humira (Adalimumab) и Remicade (Infliximab)

Фигура 54: Кривая зависимости эффект-доза, полученная в анализе цитотоксичности с TNFα макаки-резус при использовании Нанотела™ TNF56-PEG40 по сравнению с Enbrel (Etanercept), Humira (Adalimumab) и Remicade (Infliximab)

Фигура 55: Фармакокинетический анализ пегилированного бивалентного Нанотела™ TNF56-PEG40 и TNF56-PEG60 после внутривенного введения мышам

Фигура 56: Фармакокинетический анализ пегилированного бивалентного Нанотела™ 3E-3E-PEG20, пегилированного бивалентного Нанотела™ 3E-3E-PEG40 и биспецифичного Нанотела™ 3E-3E-AR1 после внутривенного введения мышам

Фигура 57: Профиль иммуногенности TNF56-PEG40 и TNF56-PEG60 у мышей

Фигура 58: Эффективность TNF60 в профилактике хронического полиартрита у мышей

Фигура 59: Эффективность TNF60 в терапевтическом лечении хронического полиартрита у мышей

Фигура 60: Эффективность TNF60 Нанотела™, представляющее эффективность в профилактике хронического полиартрита у мышей

Фигура 61: Выравнивание последовательности Nanobodies™ PMP1C2, 3E, 1A и 3G

Фигура 62: Молекулярная модель TNF-60

Приложенные таблицы образуют неотъемлемую часть настоящего описания и заключаются в следующем:

Моновалентные нанотела к TNFα

Таблица 8: Перечень последовательностей нанотел к TNFα

Таблица 9: Значения K_offчеловеческих нанотел к TNFα

Таблица 10: Гомология нанотел к TNFα и сывороточному альбумину с человеческими последовательностями зародышевых линий

Таблица 11: Уровни экспрессии нанотел к TNFα и сывороточному альбумину

Таблица 12: ELISA связывание с человеческим и TNFα макаки-резус

Таблица 13: Анализ ингибирования рецепторов нанотелами к TNFα

Таблица14: Анализ нанотел к TNFα методом Biacore

Таблица 15: Связывание нанотел к TNFα с TNFα (K_D-значения)

Таблица 16: Способность нанотел к TNFα нейтрализировать TNFα человекa и макаки-резус (b)

Таблица 17: OD 280 нм нанотел к TNFα и сывороточному альбумину после температурного воздействия

Таблица 18: Активность нанотел к TNFα после температурного воздействия

Бивалентные нанотела к TNFα

Таблица 19: Перечень последовательностей бивалентных нанотел к TNFα и линкерных последовательностей

Таблица 20: Конструкции бивалентных нанотел к TNFα

Таблица 21: Уровни экспрессии бивалентных нанотел к TNFα

Таблица 22: Анализ ингибирования рецепторов бивалентными нанотелами к TNFα

Таблица 23: Способность нанотел к TNFα нейтрализировать TNFα человекa и макаки-резус (b)

Таблица 24: OD 280 нм бивалентных нанотел к TNFα

Гуманизированные моновалентные нанотела к TNFα

Таблица 25: Перечень последовательностей гуманизированных моновалентных нанотел к TNFα и сывороточному альбумину

Таблица 26: Уровни экспрессии гуманизированных нанотел к TNFα и сывороточному альбумину

Таблица 27: Способность нанотел к TNFα нейтрализировать человеческий TNFα

Таблица 28: OD 280 нм гуманизированного нанотела к TNFα и сывороточному альбумину

Тривалентные нанотела к TNFα

Таблица 29: Перечень последовательностей тривалентных нанотел к TNFα

Таблица 30: Конструкции тривалентных нанотел к TNFα

Таблица 31: Уровни экспрессии тривалентных нанотел к TNFα

Таблица 32: Способность тривалентных нанотел к TNFα нейтрализовать человеческий TNFα

Таблица 33: Связывание тривалентных нанотел с сывороточным альбумином (значения K_D)

Таблица 34: OD 280 нм тривалентных нанотел к TNFα

Таблица 35: Перечень последовательностей второго раунда гуманизированных моновалентных нанотел к TNFα

Таблица 36: Уровни экспрессии гуманизированных нанотел к TNFα

Таблица 37: Способность нанотел к TNFα к нейтрализации человеческого TNFα

Таблица 38: OD 280 нм гуманизированных нанотел к TNFα

Таблица 39: Сравнение биоактивности нанотел

Дополнительные таблицы

Таблица 40: Обзор олигонуклеотидов, использующихся в форматировании тривалентных нанотел™

Таблица 41: Обзор олигонуклеотидов, использующихся в клонировании тривалентных Нанотел™

Таблица 42: Значения EC50, полученные в анализе цитотоксичности при использовании тривалентных нанотел™ TNF60 в сравнении с коммерческими контролями (Enbrel, Remicade, Humira)

Таблица 43: Определение сродства TNF60 и TNF24 к сывороточному альбумину человека в анализе Biacore. Nd, не определено.

Таблица 44: Обзор олигонуклеотидов, использующихся в форматировании бивалентных нанотел™

Таблица 45: Значения EC50, полученные в анализе цитотоксичности при использовании бивалентных нанотел™ в сравнении с коммерческими контролями (Enbrel, Remicade, Humira)

Таблица 46: Результаты исследований фибробластов, полученных из синовиальной оболочки

Таблица 47: Результаты исследований мышиного воздушного кармана

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Идентификация нанотел, cпецифичных к TNFα и сывороточному альбумину

Антагонистические нанотела были идентифицированы при использовании двух лам (Llama glama), иммунизированных человеческим TNFα путем введения 6 инъекций по 100 мкг цитокина с недельным интервалом. Скрининг осуществляли при использовании конкурентного анализа, в котором индивидуальные нанотела анализировали на их способность ингибирования связывания меченного TNFα с его рецептором. нанотела, специфичные к альбумину, идентифицировали от ламы, иммунизированной сывороточным альбумином человека. Скрининг индивидуальных нанотел осуществлялся путем ELISA при использовании человеческого, макаки-резус и мышиного альбумина, образуя набор нанотел, перекрестно реагирующих с сывороточным альбумином различных видов.

Пример 2: Анализ последовательностей выделенных нанотел

Различные классы нанотел идентифицировали на основании анализа последовательностей (фигура 1) при использовании оценочной матрицы BLOSUM62 и граничного значения уровня значимости сходства ≥ 60%: класс I (PMP1 C2, PMP1 G11, PMP1 H6), класс II (PMP1 G5, PMP1 H2, PMP3 G2), класс IIb (PMP1 D2), класс III (PMP3 D10, PMP5 F10). В таблице 8 перечислены последовательности этих нанотел к TNFα (SEQ ID NO: 52 - 60).

С учетом анализа последовательностей (фигура 2) различные классы нанотел к сывороточному альбумину были идентифицированы при использовании оценочной матрицы BLOSUM62 и граничного значения уровня значимости сходства ≥ 60%. В таблице 8 перечислены последовательности этих нанотел к сывороточному альбумину (SEQ ID NO: 61 - 67).

Пример 3: Анализ Biacore

TNFα

Связывание нанотела с TNFα было охарактеризовано с помощью поверхностного плазмонного резонанса в приборе Biacore 3000. TNF из различных видов ковалентно связывался с CM5 поверхностью сенсорного чипа посредством аминного связывания, пока не достигалось увеличение до 250 единиц отклика. Оставшиеся реактивные группы были инактивированы. Связывание нанотел определялось при одной концентрации (разведение 1 к 1000). Каждое нанотело инъецировалось в течение 4 минут при скорости потока 45 мкл/мин для обеспечения связывания с антигеном, связанным с чипом. Связывающий буфер без нанотела пропускался сверху чипа при той же скорости потока для обеспечения спонтанной диссоциации связавшегося нанотела в течение 4 часов. Значения K_off рассчитывались из сенсограмм, полученных для различных нанотел.

Неочищенные белки из каждого класса нанотел анализировались в Biacore. Значения K_off представлены в приведенной таблице 9.

Репрезентативные нанотела из каждого класса сохранялись для дополнительного анализа с учетом значения k_off. Для класса I был выбран PMP1C2 (TNF1); PMP1G5 (TNF2) выбрали как репрезентативный для класса II; PMP5F10 (TNF3) выбрали как репрезентативный для класса III.

Сывороточный альбумин

Связывание было проанализировано как описывается выше, за исключением того, что использовалось разведение 1 к 20. Фигуры 3, 4 и 5 иллюстрируют скрининг альбумин-специфических нанотел к TNFα против человеческого, макаки-резус и мышиного сывороточного альбумина при использовании неочищенного белка.

Нанотела ранжировались в соответствии со значениями k_off, см. таблицу III ниже:

Таблица III

Класс	Человеческий	Макака-резус	Мышиные
C	PMP6A8	PMP6A8	PMP6B4
C	PMP6B4	PMP6B4	PMP6A8
B	PMP6A6	PMP6A6	PMP6A6
B	PMP6C1	PMP6C1	PMP6C1
A	PMP6G8	PMP6G8	PMP6G8
A	PMP6A5	PMP6A5	PMP6A5
D	PMP6G7	PMP6G7	PMP6G7

Лучшее значение k_off было получено для членов семейства C и семейства B. Перекрестная реактивность между мышиным, человеческим и резус сывороточным альбумином также наблюдалась для членов этих семейств. Репрезентативные нанотела классов B и C определялись из дополнительного анализа: PMP6A6 (ALB1) было выбрано как репрезентативное для класса B и PMP6A8 (ALB2) было выбрано как репрезентативное для класса C.

Пример 4: Клонирование моновалентных нанотел в pAX051

Описание вектора экспрессии Escherichia coli

pAX051 представляет собой производное pUC19. Он содержит промотор LacZ, который не способен контролировать индукцию экспрессии при использовании IPTG. Вектор содержит ген устойчивости к ампициллину или карбенициллину. Полилинкер содержит несколько сайтов рестрикции, из которых SfiI и BstEII часто используются для клонирования нанотел™. В рамке с NB кодирующей последовательностью вектор кодирует C-концевую метку c-myc и метку (His)6. Сигнальный пептид представляет собой лидерную последовательность gen3, которая транслоцирует экспрессированное нанотело™ в периплазму.

ДНК, кодирующая выбранные нанотела TNF1 (PMP1C2), TNF2 (PMP1G5), TNF3 (PMP5F10), ALB1 (PMP6A6) и ALB2 (PMP6A8), клонировалась в pAX051 и конструкция трансформировалась в электрокомпетентные клетки TG1. Клоны анализировались на ПЦР вставки, и нуклеотидные последовательности определялись из 4 положительных клонов. Глицериновые запасные смеси приготавливали из клонов, содержащих правильные последовательности, и хранили при -80ºC.

Пример 5: Экспрессия моновалентных нанотел

Предварительное культивирование начинали путем инокуляции единичной колонии клона, экспрессирующего соответствующие нанотела, при 37ºC в бульоне Luria с ампициллином/карбенициллином (100мкг/мл) и 2% глюкозой на ночь. Эта прекультура использовалась для посева. Посевной материал составляет 1% (объем/ объем) от продукционной культуры (TB среда + ампициллин/ карбенициллин + 0,1% глюкоза). Продукционная культура выращивалась при 37°C до достижения OD600 нм величины 5-10, и экспрессия нанотел индуцировалась путем добавления IPTG (1мM конечная концентрация). Экспрессии белка позволяли продолжаться либо в течение 4 ч. при 37ºC, или всю ночь при 28ºC, когда клетки собирают путем центрифугирования и хранят как влажную клеточную пасту при -20ºC.

Препаративные периплазматические экстракты хранящейся при -20ºC влажной клеточной пасты приготавливались путем ресуспендирования осадка в Peri-буфере (50мM NaH₂PO₄, 300мM NaCl, регулирование pH до 8,0), вращения смеси в течение 30 мин. при 4ºC и центрифугирования смеси при использовании препаративной центрифуги (Sorvall RC-3C Plus с ротором H-6000A) до осаждения клеток. Супернатант, представляющий неочищенный экстракт периплазматического пространства, собирали для дополнительной очистки.

His(6)-меченые нанотела очищали с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном металле (IMAC). Смола TALON (Clontech) обрабатывалась в соответствии с инструкциями производителя. Экстракты инкубировали со смолой в течение 30 мин. при RT на ротаторе. Смолу промывали ЗФР и переносили в колонку. Упакованная смола промывалась 15 мM имидазолом. Нанотела элюировали из колонки при использовании 150 мM имидазола. Элюированные фракции анализировали с помощью определения на Hybond мембране и визуализировали с Ponceau. Фракции, содержащие белок, объединяли и проводила диализ против ЗФР. Диализованные белки собирали, стерилизовали, определяли концентрацию и хранили аликвоты при -20°C.

Характеристика моновалентных нанотел к TNFα

Пример 6: Гомология с последовательностями зародышевых линий человека

Аминокислотные последовательности нанотел сравнивали с последовательностями зародышевых линий человека, что представлено в таблице 10. В порядке гомологии с последовательностями человека нанотела ранжировались следующим образом: TNF1 > TNF2 > TNF3 для нанотел к TNFα; ALB1 > ALB2 для нанотел к сывороточному альбумину.

Пример 7: Уровень экспрессии

Уровни экспрессии рассчитывали и представляли в виде таблицы 11. В порядке выхода нанотела ранжировались следующим образом: TNF1>TNF2>TNF3 для нанотел к TNFα; ALB1 > ALB2 для нанотел к сывороточному альбумину.

Пример 8: SDS-Page анализ

Для определения чистоты, белковые образцы анализировали на 15% SDS-PAGE геле. 10мкл буфера Laemmli для образцов добавляли к 10 мкл (1 мкг) очищенного белка, образец нагревали в течение 10 минут при 95ºC, охлаждали и наносили на 15% SDS-PAGE гель. Гель обрабатывали в соответствии с общими процедурами и окрашивали Кумасси бриллиантовым голубым (CBB). Фигура 6 представляет SDS-PAGE для TNFα-специфичных и альбумин- специфичных нанотел.

Пример 9: Вестерн-блот-анализ

100 нг очищенного белка наносили на гель. После SDS-PAGE белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану при использовании ячейки Mini Trans-Blot® Electrophoretic Transfer Cell (Biorad). Мембрана блокировалась в течение ночи в ЗФР, 1% казеине при 4ºC.

Так как все конструкции были слиты с меткой c-myc, мышиное моноклинальное анти-mycантитело использовали в качестве детектирующего инструмента. В дополнении, кроличьи полоклональные антитела к нанотелу (R23) использовали в качестве детектирующего инструмента. Блот инкубировали в течение 1 ч. при комнатной температуре с перемешиванием в разведенном 1/2000 антителе против myc в ЗФР или 1/2000 антителе против нанотела в ЗФР, 1% казеин. Мембрану промывали 5 раз в ЗФР до того, как вносилось вторичное антитело (конъюгат кроличьего антитела против мышиного IgG со щелочной фосфатазой, Sigma, A1902, разведенный 1/1000 в ЗФР или конъюгат козьего антитела против кроличьего IgG со щелочной фосфатазой, Sigma, A8025, 1% казеин). После инкубации с аккуратным встряхиванием в течение 1 ч. при комнатной температуре, мембран промывали 5 раз в ЗФР. Блоты вырабатывались при использовании BCIP/NBT растворов и реакцию останавливали путем промывания блота milliQ водой, когда полоски были четко видны. Фигура 7 представляет Вестерн-блот-анализ.

Пример 10: ELISA связывание с TNFα человека и макаки-резус

Анализ ELISA осуществляли для определения связывания с человеческим и резус TNFα. 96-луночную плату Maxis покрывали 2 мкг/мл Нейтравидина в ЗФР ON при 4°C. Платы блокировали 1% казеином в течение 2 часов при комн.темп. Биотинилированный TNFα (400 нг/мл) добавляли к лункам и инкубировали в течение 1 часа при комн.темп. Образцы нанотел разбавляли, начиная с 2 мкг/мл и при использовании 1 в 3 разведениях. Нанотела определяли при использовании мышиного антитела к myc (1/2000 разведение) и конъюгата кроличьего антитела против мышиного иммуноглобулина и щелочной фосфатазы (разведение 1/2000, Sigma, A1902) и pNPP (2мг/мл) в качестве субстрата. Фигуры 9 и 10 представляют связывание в ELISA с TNFα человека и макаки-резус.

Результаты суммированы в таблице 12. TNF1 и TNF3 показывают связывание с обоими человеческим и резус TNFα. TNF2 связывается с человеческим TNFα, но только слабо реактивен с TNFα макаки-резус.

Пример 11: Анализ ингибирования рецепторов

Способность ингибирования взаимодействия рецептор-лиганд определяли для резус и человеческого TNFα. 96-луночную плату Maxisorp покрывали 2 мкг/мл Enbrel в ЗФР ON при 4°C. Платы блокировали 1% казеином в течение 2 часов при комн.темп. Образцы нанотел предварительно инкубировали в течение 30 минут при комн.темп. с биотинилированным TNFα (10 нг/мл) начиная с концентрации 5 мкг/мл и при использовании разведений 1 к 2. Образцы добавляли к платам и инкубировали в течение 1 ч. при комн.темп. Биотинилированный TNFα обнаруживали при использовании конъюгата экстравидин-щелочная фосфатаза (разведение 1/2000) и pNPP (2 мг/мл) в качестве субстрата. Фигуры 11 и 12 представляют ингибирование ELISA для человеческого и резус TNFα. Результаты суммированы в таблице 13. Ингибирование связывания лиганд/рецептор определяется для TNF1 и TNF3 для обоих человеческого и резус TNF, тогда как TNF2 ингибирует только человеческий TNFα.

Пример 12: Анализ Biacore

TNFα связывание

Анализ осуществлялся как описано в примере 3. Фигуры 13 и 14 иллюстрируют связывание с человеческим и резус TNFα посредством анализа Biacore. Результаты суммированы в таблице 14. Эксперименты по связыванию в Biacore подтверждают результаты ELISA: перекрестное связывание для TNF1 и TNF3, тогда как TNF2 только значимо связывается с человеческим TNFα.

Сывороточный альбумин

Связывание анализировали, как описывается выше, за исключением того, что использовали серии различных концентраций. Каждая концентрация вносилась в течении 4 минут при скорости потока 45 мкл/мин для осуществления связывания с антигеном, иммобилизованным на чипе. Связывающий буфер без анализируемого вещества пропускали через чип при аналогичной скорости потока для диссоциации связанного нанотела. Через 15 минут, оставшийся связанный аналит переносили путем инъекции раствора для регенерации (25 мM NaOH).

Из сенсограмм, полученных для различных концентраций каждого анализируемого вещества, значения K_Dрассчитывались посредством сродства в стационарном состоянии, когда достигалось равновесие.

Результаты суммированы в таблице 15. Перекрестная реактивность определяется для обоих ALB1 и ALB2. Наивысшее сродство обнаруживается для ALB2 с человеческим и резус TNFα. Однако, разница в сродстве для человеческого/резусного в отличие от мышиного сывороточного альбумина более выражено для ALB2 (коэффициент 400), тогда как для ALB1 наблюдается разница с коэффициентом 12.

Пример 13: Биологический анализ.

Клеточная линия TNFα чувствительных мышиных фибробластов L929s использовалась для определения анти-TNFα активности выбранных нанотел. При достаточно высокой концентрации TNFα в среде, т.е. цитотоксическая доза, L929 клетки подвергались некрозу. Ингибирование взаимодействия TNFα с его рецептором определялось путем преинкубации серий разведений антител с цитотоксической концентрацией TNFα перед добавлением смеси к клеткам. Наличие актиномицина D в среде дополнительно повышает чувствительность клеток к TNFα, что приводит к повышенной чувствительности биологического анализа к свободному TNFα.

L929 клетки выращивали почти до конфлюэнтности, осаждали в 96-луночных микротитровальных платах по 5000 клеток на лунку и инкубировали в течение ночи. Актиномицин D добавляли к клеткам с конечной концентрацией 1 мкг/мл. Серии разведений нанотел, которые тестируют, смешивали с цитотоксичными концентрациями TNFα (конечная концентрация при анализе составляет 0,5 нг/мл млм 15 МЕ/мл). После, по меньшей мере, 30-минутной инкубации при 37ºC, эту смесь добавляли к осажденным клеткам. Платы инкубировали в течение 24 часов при 37ºC и 5% CO₂. Клеточная выживаемость определялась путем использования соли тетразолия WST-1. Кривые зависимости доза-отклик и значения EC₅₀ рассчитывались с помощью Graphpad Prism.

Результаты суммированы в таблице 16 для человеческого и резус TNFα. С учетом их способности нейтрализовать цитотоксическую активность, молекулы ранжировались следующим образом: TNF3>TNF1>TNF2 для человеческого TNFα, и TNF1 = TNF3 > TNF2 для резус TNFα.

Пример 14: Связывание белка A

Фигура 14 представляет связывание белка A, анализированное в Biacore, как описано в примере 12. Положительное связывание было получено для TNF1, TNF2, ALB1. Отсутствие или слабое связывание наблюдалось для TNF3 и ALB2.

Пример 15: Температурная стабильность

Образцы разводились до 200 мкг/мл и разделялись на 8 аликвот, содержащих по 500 мкл. Различные пробирки инкубировали при заданной температуре, начиная от комн.темп. до 90°C. После обработки образцы охлаждали в течение 2 часов при комн.темп., и хранили их при 4°C. Преципитаты удалили путем центрифугирования в течение 30 мин. при 14,000 об/мин. Супернатанты аккуратно удаляли и дополнительно анализировали.

OD 280 нм

OD (оптическую плотность) при длине волны 280 нм измеряли, и рассчитывали концентрацию. Результаты суммированы в таблице 17. Снижение содержания белка наблюдали для TNF2 и TNF3 начиная при 80°C, тогда как для ALB2 снижение наблюдалось, начиная с температуры 70°C.

Вестерн-блот

2 мкг обработанного белка разделяли в 15% SDS-PAGE и переносили на нитроцеллюлозную мембрану и обрабатывали, как описывается выше. Определение осуществляли при использовании поликлонального антитела против нанотела (R23, разведение 1/2000) и конъюгата кроличьего антитела и пероксидазы хрена (DAKO, P0448, 1/2000 разведение). Фигура 15 представляет Вестерн-блот-анализ. Отчетливое снижение в концентрации белка наблюдалась для ALB2, обработанного при 70, 80 и 90°C. Агрегация еще наблюдалась для TNF1, обработанного при 70, 80 и 90°C; для TNF3, обработанного при 90°C; для ALB1, обработанного при 90°C, означая, что супернатант еще содержит следы осажденных веществ, что приводит к более высоким результатам измерения OD 280 нм. Это объясняет, почему концентрация белка, при измерении по OD 280 нм, не снижается для TNF1, TNF3 и ALB1, обработанных при этих более высоких температурах.

ELISA

ELISA для определения связывания с человеческим TNFα по существу выполнялась, как описывается в примере 10. Результаты представлены на фигуре 16. Связывание человеческого TNFα снижается для TNF1, TNF2, TNF3, начиная с 80°C.

Био-анализ

Био-анализ выполнялся, как описывается в примере 13. Результаты суммированы в таблице 18. Активность нанотела снижается для TNF1, начиная с 70°C; для TNF2 и TNF3, начиная с 80°C.

Biacore

Связывание с сывороточным альбумином человека определялось, как описано в примере 12. Использовалась фиксированная концентрация (1 к 50 разведение). Результаты представлены на фигуре 17. Температурная обработка не оказывала влияния на связывание сывороточного альбумина для ALB1. Обработка оказывала эффект на k_on для ALB2, начиная с T=70°C.

Бивалентные нанотела

Пример 16: Форматирование бивалентных TNFα специфичных нанотел

TNF1, TNF2 и TNF3 форматировали к бивалентным нанотелам. Использовали спейсер между двумя составляющими либо GlySer линкер длиной 9 аминокислот (таблица 19 SEQ ID No: 68), либо GlySer линкер длиной 30 аминокислот (таблица 19 SEQ ID No: 69). Эти образованные конструкции представлены в таблице 20. В таблице 19 приведен перечень последовательностей бивалентных нанотел к TNFα (SEQ ID NO: 70 - 75).

Пример 17: Экспрессия бивалентных TNFα специфичных нанотел

Экспрессия осуществлялась как описано в примере 5. His(6)-меченые нанотела очищали с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном металле (IMAC). Ni-NTA смола (Qiagen) обрабатывалась в соответствии с инструкциями производителя. Экстракты инкубировали со смолой в течение 30 мин. при комн.темп. на вертушке. Смолу промывали ЗФР и переносили в колонку. Упакованная смола промывалась ЗФР (1 к 10 разведение). Колонку предварительно элюировали 15 мM имидазолом. Нанотела элюировали из колонки при использовании 25 мM лимонной кислоты, pH=4. Элюированные фракции анализировали с помощью определения на Hybond мембране и визуализировали с Ponceau. Фракции, содержащие белок, объединяли и дополнительно очищали путем катионного обмена, с последующей гель-фильтрацией. Очищенные белки собирали, стерилизовали, определяли концентрацию и хранили аликвоты при -20°C.

Характеристика бивалентных TNFα-специфичных нанотел

Пример 18: Уровень экспрессии

Уровни экспрессии бивалентных TNFα нанотел рассчитывали и результаты представлены в таблице 21. Линкер не оказывал значимый эффект на уровень экспрессии нанотел.

Пример 19: SDS-PAGE

SDS-Page осуществлялся, как описано в примере 8. Фигура 18 показывает результаты SDS-Page.

Пример 20: Вестерн-блот

Вестерн-блот-анализ осуществлялся, как описано в примере 9. Фигура 19 показывает результаты Вестерн-блот-анализа.

Пример 21: Анализ ингибирования рецепторов

Анализ осуществлялся, как описано в примере 11. Фигура 20 и таблица 22 показывают результаты. Усиление ингибирования связывания лиганд/рецептор наблюдалось для всех бивалентных нанотел сравнительно с моновалентным форматом.

Пример 22: Био-анализ

Анализ осуществлялся, как описано в примере 13. Результаты суммированы в таблице 23. С учетом их способности к нейтрализации цитотоксической активности TNF8, TNF7, TNF9 и TNF5 обладают эффективностью, сходной с Enbrel.

Пример 23: Температурная стабильность

Образцы анализировали, как описывается в примере 15.

OD 280 нм

OD при 280 нм измеряли, и рассчитывали концентрацию. Результаты суммированы в таблице 24. Уменьшение содержания белка наблюдалось для TNF4 и TNF7, начиная с 70ºC, при этом для TNF5, TNF6, TNF8 и TNF9 уменьшение наблюдалось, начиная с 80ºC.

Вестерн-блот

Образцы анализировали на наличие агрегатов, как описывается в примере 15.

ELISA

ELISA для определения связывания с человеческим TNFα осуществлялась по существу, как описывается выше. Результаты представлены на фигуре 21. Связывание человеческого TNFα снижалось для TNF5, TNF6, TNF8 и TNF9, начиная с 80ºC, для TNF4 и TNF7, начиная с 70ºC.

Гуманизированные моновалентные нанотела

Пример 24: Идентификация нечеловеческих аминокислотных положений в нанотелах, специфичных к TNFα и сывороточному альбумину

Фигура 22 (TNF1), фигура 23 (TNF2), фигура 24 (TNF3) и фигура 25 (ALB1) представляют множественные выравнивания последовательностей (Clustal W 1.7) с последовательностями DP51, DP53, DP54 и DP29.

В дополнение к аминокислотным мутациям, осуществляли оптимизацию кодонов, что дало последовательности SEQ ID NO: 76 - 89, представленные в таблице 25 (Нанотела против TNF-альфа и сывороточного альбумина человека, соответственно).

Пример 25: Генерация мутантов с оптимизированными кодонами

Синтезировали олигонуклеотиды, охватывающие полную последовательность нанотел.

Пример 26: Экспрессия бивалентных TNFα-zспецифичных нанотел

Экспрессия осуществлялась, как описывается в примере 5.

Характеристика гуманизированных нанотел

Пример 27: Уровень экспрессии

Таблица 26 представляет рассчитанные уровни экспрессии. Экспрессия достигалась с выходами в диапазоне 3,5-11,7 мг/мл. Время индукции не оказывало влияния на выход.

Пример 28: SDS-PAGE

SDS-Page осуществлялся, как описано в примере 8. Фигура 26 показывает результаты SDS-Page

Пример 29: Вестерн-блот

Вестерн-блот-анализ осуществлялся, как описано в примере 9. Фигура 27 показывает результаты Вестерн-блот-анализа.

Пример 30: Био-анализ

Анализ осуществлялся, как описано в примере 13.

Результаты гуманизированных нанотел суммированы в таблице 27. Нанотела дикого типа включены в качестве образца сравнения.

Пример 31: Анализ Biacore

Анализ осуществлялся, как описано в примере 12. Фигуры 28 и 31 показывают результаты анализа Biacore .

Пример 32: Температурная стабильность

OD 280 нм

OD при 280 нм измеряли, и рассчитывали концентрацию. Результаты суммированы в таблице 28.

Не наблюдалось значительного уменьшения в концентрации белка для гуманизированных TNF1 нанотел (TNF13-14). Уменьшение содержания белка наблюдалось для гуманизированных TNF2 (TNF15-19) и TNF3 (TNF20-23), начиная с 80ºC. Уменьшение содержания белка наблюдалось для гуманизированного ALB1 (ALB4-5), начиная с 70°C, и для ALB3, начиная с 60°C.

Вестерн-блот

ELISA

ELISA для определения связывания с человеческим TNFα осуществлялась по существу, как описывается в примере 15. Результаты представлены на фигуре 30.

Связывание человеческого TNFα сравнимо для обработанного температурой WT TNF1 и гуманизированных TNF13 и 14; для обработанного температурой WT TNF2 и гуманизированного TNF15-19; связывание человеческого TNFα снижалось для TNF21 и 22, и в меньшей степени для TNF23, тогда как не наблюдалось эффекта для TNF20 сравнительно с обработанным температурой WT TNF3.

Тривалентные нанотела к TNFα

Пример 33: Форматирование тривалентных TNFα-специфичных нанотел

TNF1, TNF2 и TNF3 и ALB1 форматировали в тривалентные нанотела. Использовали в качестве спейсера между двумя составляющими либо GlySer линкер длиной 9 аминокислот (таблица 19 SEQ ID No: 68), либо GlySer линкер длиной 30 аминокислот (таблица 19 SEQ ID No: 69). Эти образованные конструкции представлены в таблице 30. В таблице 29 приведен перечень последовательностей тривалентных нанотел к TNFα (SEQ ID NO: 91 - 94).

Пример 34: Экспрессия тривалентных TNFα-специфичных нанотел

Экспрессия осуществлялась как описано в примере 5. His(6)-меченые нанотела очищали с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном металле (IMAC). Ni-NTA смола (Qiagen) обрабатывалась в соответствии с инструкциями производителя. Экстракты инкубировали со смолой в течение 30 мин. при комн.темп. на ротаторе. Смолу промывали ЗФР и переносили в колонку. Упакованная смола промывалась ЗФР (1 к 10 разведение). Колонку предварительно элюировали 15 мM имидазолом. Нанотела элюировали из колонки при использовании 25 мM лимонной кислоты, pH=4. Элюированные фракции анализировали с помощью определения на Hybond мембране и визуализировали с Ponceau. Фракции, содержащие белок, объединяли и дополнительно очищали путем катионного обмена, с последующей гель-фильтрацией. Очищенные белки собирали, стерилизовали, определяли концентрацию и хранили аликвоты при -20°C.

Характеристика тривалентных TNFα/сывороточный альбумин-специфичных нанотел

Пример 35: Уровень экспрессии

Уровни экспрессии рассчитывали и результаты представлены в таблице 31.

Пример 36: SDS-PAGE анализ

SDS-Page осуществлялся, как описано в примере 8. Фигура 31 показывает результаты SDS-Page.

Пример 37: Вестерн-блот-анализ

Вестерн-блот-анализ осуществлялся, как описано в примере 9. Фигура 32 показывает результаты Вестерн-блот-анализа.

Пример 38: Био-анализ

Результаты бивалентных нанотел суммированы в таблице 32. По своей способности к нейтрализации цитотоксической активности, молекулы обладали одинаковой эффективностью и сравнимы по своей эффективности с бивалентными молекулами.

Пример 39: Связывание с сывороточным альбумином человека

Связывание анализировали, как описывается выше, за исключением того, что использовали серии различных концентраций. Каждая концентрация вносилась в течении 4 минут при скорости потока 45 мкл/мин для осуществления связывания с антигеном, иммобилизованным на чипе. Затем, связывающий буфер без аналита пропускали через чип при аналогичной скорости потока для диссоциации связанного нанотела. Через 15 минут, оставшийся связанный аналит переносили путем инъекции раствора для регенерации (25 мM NaOH).

Из сенсограмм, полученных для различных концентраций каждого анализируемого вещества, значения K_Dрассчитывались через сродство в стационарном состоянии, когда достигалось равновесие.

Результаты суммированы в таблице 33. Снижение сродства наблюдалось для форматированного связывающего агент с ALB1 сравнительно с диким типом ALB1. Сродство, тем не менее, лежит все еще в интервале 7,2-14 нM.

Пример 40: Температурная стабильность

OD 280 нм

OD при 280 нм измеряли и рассчитывали концентрацию. Результаты суммированы в таблице 34. Уменьшение содержания белка наблюдалось для TNF24, TNF27 и TNF28, начиная с 60ºC, тогда как для TNF25 и TNF26, начиная с 70°C.

Вестерн-блот

ELISA

ELISA для определения связывания с человеческим TNFα осуществлялась по существу, как описывается в примере 15. Результаты представлены на фигуре 33. Связывание человеческого TNFα снижалось для TNF24 и TNF27, начиная с 60°C, и для TNF25, TNF26 и TNF28, начиная с 70°C.

Гуманизированные моновалентные нанотела (второй раунд)

Пример 41: Идентификация нечеловеческих аминокислотных положений в TNFα и альбумин-специфичных нанотелах

Фигура 34 (TNF1), фигура 35 (TNF2), фигура 36 (TNF3) и фигура 37 (ALB1) представляют множественные выравнивания последовательностей (Clustal W 1.7) с последовательностями DP51, DP53, DP54 и DP29. Мутированные молекулы экспрессировали и очищали, как описывается выше, получая последовательности таблицы 35 SEQ ID NO: 95 -104 (против TNF-альфа и сывороточного альбумина человека, соответственно).

Характеристика гуманизированных нанотел

Пример 42: Уровень экспрессии

Таблица 36 представляет рассчитанные уровни экспрессии. Экспрессия достигалась с выходами в диапазоне 0,5-2,7 мг/мл.

Пример 43: SDS-PAGE

SDS-Page осуществлялся, как описано в примере 8. Фигура 38 показывает гель после SDS-Page.

Пример 44: Вестерн-блот

Вестерн-блот анализ осуществлялся, как описано в примере 9. Фигура 39 показывает результаты Вестерн-блот-анализа.

Пример 45: Био-анализ

Результаты гуманизированных нанотел суммированы в таблице 37. Нанотела дикого типа и гуманизированные нанотела первого раунда включены в качестве образцов сравнения.

Пример 46: Анализ Biacore

Анализ осуществлялся, как описано в примере 12. Фигура 40 показывает результаты Biacore .

Пример 47: Температурная стабильность

OD 280 нм

OD при 280 нм измеряли и рассчитывали концентрацию. Результаты суммированы в таблице 38.

Не наблюдалось значительного уменьшения в белковой концентрации для гуманизированных TNF1 нанотел (TNF29-30). Уменьшение содержания белка наблюдалось для гуманизированных TNF2 (TNF31-32) и TNF3 (TNF33)), начиная с 80ºC.

Вестерн-блот

ELISA

ELISA для определения связывания с человеческим TNFα осуществлялась по существу, как описывается в примере 15. Результаты представлены на фигуре 41.

Связывание человеческого TNFα сравнивали для WT TNF1 и гуманизированных TNF29 и 30; для WT TNF2 и гуманизированных TNF31 и TNF32; а также для WT TNF3 и гуманизированного TNF33.

Сравнительный пример

В этом сравнительном примере, девять нанотел изобретения сравнивались с тремя нанотелами из WO 04/041862, называемые “V_HH#1A” или “1A”, “V_HH3E” или “3E” и “V_HH#3G” или “3G” соответственно (SEQ ID NO:1, 4 и 5 в WO 04/041862). Используемый анализ соответствовал клеточному анализу при использовании KYM-клеток, на которые сделана ссылка в WO 04/41862 (см., например, пример 1, под 3)). Результаты указаны в таблице 39 ниже. Как можно видеть, нанотела изобретения имеют значение EC50 в этом анализе, которое в 18 раз лучше значения EC50 для 3E - наилучшего нанотела в соответствии с WO 04/041862.

Пример 48: Получение тривалентных биспецифичных гуманизированных Нанотел™

Тривалентные биспецифичные нанотела форматировали и клонировали в векторе экспрессии E. coli pAX054 сначала и затем восстанавливали посредством ПЦР и клонировали в векторе экспрессии pPICZαA.

Описание вектора экспрессии Escherichia coli

pAX051 представляет собой производное pUC19. Он содержит промотор LacZ, который обеспечивает контролируемую индукцию экспрессии при использовании IPTG. Вектор содержит ген устойчивости к ампициллину или карбенициллину. Полилинкер содержит несколько сайтов рестрикции, из которых SfiI и BstEII часто используются для клонирования Нанотел™. Сигнальный пептид представляет собой лидерную последовательность gen3, которая транслоцирует экспрессированное Нанотело™ в периплазму.

Описание вектора экспрессии Pichia pastoris

pPICZαA содержит ориджин репликации, происходящий из pUC, обеспечивающий размножение в E. coli. Он содержит промотор гена AOX1 (алкогольоксидаза 1) Pichia pastoris. Эта промоторная область длиной 942 п.о. (i) обеспечивает метанол-индуцируемую, высокоуровневую экспрессию интересующего гена, и (ii) нацеливает интеграцию плазмиды в локус AOX1 после трансформации Pichia векторной ДНК, которая линеаризована по 5´ промоторной области AOX1. Следует отметить, что pPICZα векторы не содержат дрожжевой ориджин репликации и что, следовательно, трансформанты могут быть изолированы только, если рекомбинация происходит между плазмидой и геномом Pichia. Вектор обуславливает устойчивость к антибиотику Zeocin у обоих клеток-хозяев E. coli и Pichia pastoris. Вектор включает секреторный сигнал α-фактора спаривания Saccharomyces cerevisiae, обеспечивающий эффективную секрецию большинства белков в культуральной среде. Начало ATG в сигнальной последовательности α-фактора соответствует природному началу ATG гена AOX1. Полилинкер содержит несколько сайтов рестрикции, из которых Xho1/EcoR1 или Xho1/Not1 обычно используются для слияния кодирующих последовательностей Нанотел™ с сигналом секреции. Полилинкер следует за областью терминации транскрипции AOX1. Больше подробностей об этом векторе экспрессии можно найти на веб-сайте Invitrogen

(http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/ppiczальфа_man.pdf).

Форматирование тривалентных нанотел

Три отдельные ПЦР-реакции были поставлены для амплификации N-концевой, средней и C-концевой субъединиц Нанотела™ при использовании комбинаций олигонуклеотидов, указанных в WPA-0012. N-концевое Нанотело™ амплифицировали с использованием M13_rev/ Rev_9GlySer_L108; среднееe Нанотело™ амплифицировали с использованием For_GlySer/Short and Rev_15BspEI_L108; C-концевое Нанотело™ амплифицировали с использованием For_BspEI/M13_for. Готовили ПЦР-реакцию, состоящую из 1 мкл плазмиды ДНК (50-100 нг), 1,5 мкл прямого праймера (10 мкM → 300 нM), 1,5 мкл обратного праймера (мкM → 300 нM), 1 мкл dNTPs (10 мM → 0,2 мM), 5 мкл буфера (10x → 1x), 0,75 мкл фермента (3,5 Е/мкл → 2.6 Е/мкл) и 39,25 мкл H₂O в общем объеме 50 мкл. Последовательности праймеров указаны в таблице 40. Программа проведения ПЦР начиналась с 2 минут при 94°C. Цикл из 30 секунд при 94°C, 30 секунд при 50°C и 1 минуты при 72°C повторялся 30 раз и с последующими 10 минутами при 72°C. Амплификация проверялась путем разделения 5 мкл продукта реакции ПЦР на 2% агарозном геле. ПЦР-продукт очищали с использованием QIAquick ПЦР Purification Kit в соответствии с инструкциями производителя. Одну колонку использовали и элюировали 50 мкл EB буфером. N-концевой VHH фрагмент приготавливали путем инкубирования 50 мкл ДНК и 2 мкл BamHI (10 Е/мкл) в подходящем буфере, рекомендованном производителем, при 37°C в течение 2 часов. Последовательно, 2 мкл SfiI (10 Е/мкл) добавляли и смесь инкубировали при 55°C в течение 2 часов. Средний VHH фрагмент приготавливали путем инкубирования 50 мкл ДНК и 2 мкл BamHI (10 Е/мкл) и 2 мкл BspEI (10 Е/мкл) в подходящем буфере, рекомендованном производителем, при 37°C в течение 2 часов. C-концевой VHH фрагмент приготавливали путем инкубирования 50 мкл ДНК и 2 мкл BspEI (10 Е/мкл) в подходящем буфере, рекомендованном производителем, при 37°C в течение 2 часов. Последовательно, 2 мкл BstEII (10 Е/мкл)добавляли и смесь инкубировали при 60°C в течение 1 часа. Предыдущие реакции расщепления разделяли в 2% агарозном геле. Полосы VHH (350-450 п.о.) вырезали из геля, и ДНК очищали с использованием QIAquick Gel Extraction Kit в соответствии с инструкциями производителя. Одна колонка (с максимумом 400 мг агарозного геля на колонку) использовалась и объединенную ДНК элюировали с 50 мкл EB буфера. Концентрацию ДНК определяли путем измерения OD₂₆₀ (1 OD единица = 50 мкг/мл). Лигирующую смесь с конечным объемом 10 мкл, содержащую 100 нг вектора pAX54, 12 нг N-концевого VHH, 12 нг среднего VHH фрагмента, 12 нг C-концевого VHH фрагмента, 1 мкл буфера для лигирования и 1 мкл лигазы (3 Е) приготавливали и инкубировали 2 часа при комнатной температуре. Трансформация E. coli TG1 осуществлялась при использовании 2 мкл лигирующей смеси. Колонии анализировали с использованием ПЦР, как описано в WPA-0010. Анализ последовательности осуществлялся на положительных клонах. Приготовление плазмиды осуществлялось с использованием Qiaprep spin Miniprep kit (Qiagen) в соответствии с рекомендациями производителя и описывается выше. Секвенирование проводили в лаборатории секвенирования VIB, Антверпен, Бельгия.

Амплификация кодирующей ДНК

Кодирующая область Нанотела™, клонированная в векторе экспрессии E. coli pAX054, восстанавливалась посредством ПЦР при использовании подходящей пары праймеров. Для обеспечения того, чтобы Нанотело™ экспрессировалось с нативным N-концом, кодирующую область клонировали в рамке считывания с сайтом расщепления Kex2 сигнала секреции. Прямой праймер сливает C-концевую часть сигнала секреции, до сайта узнавания Xho1, с кодирующей областью Нанотела™. Приготавливали ПЦР-реакцию, состоящую из 1 мкл плазмиды ДНК (50-100 нг), 1,5 мкл прямого праймера (10 мкM → 300 нM), 1,5 мкл обратного праймера (мкM → 300 нM), 1 мкл dNTPs (10 мM → 0,2 мM), 5 мкл буфера (10x → 1x), 0,75 мкл фермента (3,5 Е/мкл → 2,6 Е/мкл) и 39,25 мкл H₂O в общем объеме 50 мкл. Последовательности праймеров указаны в таблице 41. Программа проведения ПЦР начиналась с 2 минут при 94°C. Цикл из 30 секунд при 94°C, 30 секунд при 50°C и 2минуты при 72°C повторялся 20 раз и с последующими 10 минутами при 72°C. Амплификация проверялась путем разделения 5 мкл продукта реакции ПЦР на 2% агарозном геле. ПЦР-продукт очищали при использовании QIAquick ПЦР Purification Kit в соответствии с инструкциями производителя. Одну колонку использовали и элюировали 50 мкл EB буфером.

Стратегия клонирования

ДНК фрагмент, кодирующий NB, так же как и вектор экспрессии pPICZαA, расщепляют подходящими рестрикционными ферментами (XhoI + NotI). Вставку получали путем инкубации 50 мкл ПЦР-продукта с 2 мкл XhoI (10 Е/мкл) и 2 мкл NotI (10 Е/мкл) в подходящем буфере, рекомендованным производителем, в течение 3 часов при 37°C. Вектор получали аналогично, адаптируя количество рестрикционных ферментов к количеству плазмиды. Как вектор, так и NB-кодирующий фрагмент очищали и концентрацию ДНК определяли при использовании BioPhotometer (Eppendorf). Фрагмент и акцепторный вектор лигировали в эквимолярном соотношении при использовании 1 Единицы T4 лигазы (Promega) в течение 30 минут при комнатной температуре или в течение ночи при 16°C. ДНК (20-30 нг) трансформировали в клетки TG1. Колонии анализировали посредством ПЦР при использовании праймеров 3’AOX1 R и 5’AOX1 F. Анализ последовательностей осуществляли на позитивных клонах. TNF30, TNF33 и ALB8 форматировали в тривалентные биспецифичные Нанотела™. Использовали GlySer линкер длиной 9 аминокислот в качестве спейсера между составляющими блоками.

Трансформация P. pastoris

Для выделения плазмидной ДНК, предварительное культивирование начинали с инокуляции единичной колонии клона в 50 мл бульона Luria + ампициллин или карбенициллин (100мкг/мл) + 2% глюкозы и инкубировали при 37ºC в течение ночи. Плазмидную ДНК приготавливали с использованием набора Plasmid Midi (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. ДНК линеаризовывали путем инкубации 30 мкг плазмидной ДНК с 6 мкл BstX1 (10 Е/мкл) в подходящем буфере в соответствии с инструкциями производителя в течение 3 часов при 45°C. Расщепленную ДНК очищали при использовании набора ПЦР Purification kit (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. ДНК концентрировали при помощи осаждения EtOH в соответствии со стандартными процедурами. Электрокомпетентные клетки X-33 трансформировали 10 мкг линеаризованной ДНК, и клетки оставляли для роста в течение 48 часов на чашке с селективной агаризованной средой YPD, содержащей Zeocin (100/250/500 мкг/мл). X-33 представляет собой дикий тип штамма Pichia pastoris; сам штамм, так же как и производные рекомбинантные штаммы содержат нативный ген AOX1 и способны к метаболизму метанола (Mut⁺).

Клоны подвергали скринингу для определения уровня экспрессии путем инокуляции единичных колоний в 1 мл BGCM в 24-луночной плате и выращивания их в течение 48 часов при 30°C при 120 об/мин. Клетки центрифугировали и свежий BMCM добавляли к клеткам для последующего роста при 30°C при 120 об/мин. в течение 48 часов. Затем, MeOH добавляли до конечной концентрации 0,5%, и клетки выращивали при 30°C при 120 об/мин. в течение 8 часов, после чего MeOH добавляли снова до конечной концентрации 0,5%. Клетки выращивали в течение ночи при 30°C при 120 об/мин. Клетки центрифугировали и собирали супернатант и анализировали с помощью ELISA, как описано в примере 10.

Пример 49: Экспрессия и очистка тривалентных биспецифичных гуманизированных Нанотел™

Продукция in Pichia pastoris

Состав буферов, растворов и другого может быть найден на веб-сайте Invitrogen (http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/ppiczalpha_man.pdf).

Предварительное культивирование начинали с инокуляции единичной колонии с чашки в 5 мл YPD. Культуру выращивали в течение ночи при 180 об/мин. и 30°C. На следующий день, предварительную культуру разбавляли YPD до 50 мл и выращивали в течение ночи при 180 об/мин. и 30°C. Продукционные культуры запускали путем инокулирования прекультуры до конечной OD600 нм = 0,04-0,08. Культуры выращивали в BGCM в течение 24 часов при 30 °C при 180 об/мин. и центрифугировали при 4,500 об/мин. в течение 30 минут. Клетки ресуспендировали в 1/3 от исходного объема в среде BGCM с конечной OD600 нм = 15-20. Клетки индуцировали MeOH в регулярные моменты времени, обычно 3 раза в день, никогда не превышая содержание MeOH в 1%. Через 50 часов индукции супернатант собирали .

Очистка нанотела, экспрессированного в Pichia pastoris

Культуральный супернатант фильтровали через 0,22 мкм фильтрационную мембрану Micro filtration (Hydrosart, Sartorius). Образец концентрировали при использовании диафильтрования на 10 кДа ультрафильтрационной мембране (HydroSart, Sartorius) и концентрировали до 0,5-1 л.

Nanobodies™ очищали при использовании афинной хроматографии на белке A (MabSelect Xtra, GE Healthcare) при использовании ЗФР в качестве запускающего буфера и Глицина [100мM pH=2.5] для элюции. Образцы нейтрализовали при использовании 1,5 M Tris pH=8.8. Nanobodies™ дополнительно подвергали анионообменной хроматографии (Source 30Q, GE Healthcare). Образцы разбавляли 10-кратно 10мM пиперазином с pH=10,2 и доводили pH до 10,2 с использованием 1M NaOH и электропроводностью до <2мСм/см при помощи MilliQ воды.

Нанотела подвергали гель-фильтрации (Superdex 75pg, Hiload XK26/60, GE Healthcare) и ЛПС удаляли посредством анионообменной хроматографии (Source 30Q, GE Healthcare) путем пропускания через 5мл колонку, которая санируется 1M NaOH и уравновешивается ЗФР Dulbecco.

Для определения чистоты, белковые образцы анализировали на 15% SDS-PAGE геле, как описано в примере 8. Гель обрабатывается при использовании SilverQuest™ в соответствии с общими процедурами, описанными производителем (Invitrogen). Альтернативно, гель обрабатывается при использовании Кумасси бриллиантового голубого или Вестерн-блот-анализа, как описывается в примерах 8 и 9. Результаты представлены на фигуре 42.

Пример 50: Характеристика тривалентных биспецифичных гуманизированных Нанотел™

TNF60 состоит из 363 аминокислот. Белок имеет молекулярную массу 38 441 Да. pI составляет 8,71. Коэффициент экстинкции при 280 нм составляет 1,736.

Масс-спектрометрия

Масса белка определялась в ESI-MS в соответствии со стандартными процедурами. Теоретическая масса TNF60 составляет 38441 Да. Белок имеет 2 S-S мостика, что должно давать массу 38435 Дa в ESI-MS. Масса, которая была определена экспериментальным путем, для TNF60, полученная для 3 разных партий, варьировала от 38433 Да до 38435 Да, максимально различаясь на 0,005% по сравнению с теоретической массой.

N-концевое секвенирование

N-концевое секвенирование осуществляли с помощью деградации по Edman в соответствии со стандартными процедурами. N-концевое секвенирование показывает, что белковая последовательность для первых 7 аминокислот соответствует следующему: EVQLVES. Это соответствует теоретической последовательности белка, что указывает на правильный N-концевой процессинг.

Аналитическое определение размера

Образцы (100 мкг) анализировали на колонке Superdex75 с высоком разрешением, для характеристики различных размеров Нанотела™. Эксклюзионная хроматография Нанотела™ обычно дает симметричный пик, с длительностью выдерживания 11,5 мин на Superdex75. Поглощение обычно регистрируется при 280, 254 и 214 нм. Измерения при длине волны 214 нм обеспечивают высокую чувствительность детекции. Аналитическое определение размера в ЗФР обеспечивает симметричный пик. Не было обнаружено никаких загрязнений. Время удержания, наблюдаемое для 3 различных партий, составляло 11,5-11,55 мин. Репрезентативный профиль показан на фигуре 43.

Пример 51: Связывание TNF60 с человеческим TNFα в ELISA

Функциональности TNF60, т.е. связывания с человеческим TNFα, были анализированы в ELISA, как описано в примере 10. Результаты суммированы на фигуре 44 и четко демонстрируют зависимое от дозы и насыщаемое связывание 2 партий TNF60 с человеческим TNFα.

Пример 52: Функциональность в клеточном анализе

Способность к нейтрализации цитотоксической активности TNFα анализировали с помощью клеточного анализа, как описано в примере 13. Результаты суммированы в таблице 42 и на фигурах 45 и 46.

Данные показывают, что TNF60 имеет эффективность в пределах таковой для Enbrel/Etanercept и в 10 раз лучшую эффективность, чем Humira/Adalimumab и Remicade/Infliximab.

Пример 53: Связывание TNF60 с сывороточным альбумином

Связывания с человеческим и резус сывороточным альбумином анализировали с помощью. Biacore, как описано в примере 12. Значения K_D, Кon и Кoff представлены в таблице 43. TNF60 сравнивали с TNF24, который является тривалентным биспецифичным исходным Нанотелом™ со структурными элементами дикого типа.

Сродство TNF60 к человеческому и резус сывороточному альбумину аналогично. Сродства составляет в два раза меньше по сравнению со сродством, наблюдаемым для TNF24, который представляет собой аналог TNF60 дикого типа. K_on имел одинаковые значения для обеих молекул, но k_off для TNF60 был в два раза больше.

Пример 54: Фармакокинетический и иммуногенный анализ тривалентного биспецифичного гуманизированного нанотела у мышей

Животные

Мышей линии DBA1 или BALBc прогревали под инфракрасной лампой и им в хвост вводили внутривенно 200 мкл Нанотела™ (100 мкг на мышь). Образцы крови получали в разные временные интервалы путем осуществления небольших надрезов в хвосте и сбора крови в микропробирки. Обычно, кровь отбирали в t=15 мин, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 7 дней, 14 дней. Сыворотка приготавливалась в соответствии со стандартными процедурами.

Определение концентрации Нанотела™ в мышиной сыворотке

Микротитрационный планшет (NUNC, Maxisorb) покрывали 2 мкг/мл нейтравидина в течение ночи при 4°C. Планшет промывали 5 раз с ЗФР/0,05% Tween-20 и блокировали в течение 2 часов при RT с ЗФР/1% казеин. Биотинилированный человеческий TNFα (1/2000 в ЗФР/0,2% казеина; 400 нг/мл) вводили в лунки и инкубировали в течение 1 часа при комн.темп. Стандартный образец Нанотела™ добавлялся, начиная с концентрации 5 мкг/мл и при использовании 5-кратного разбавления в ЗФР, содержащим 1% мышиной плазмы. Nanobodies™ оставляли для связывания в течение 2 часов при комн.темп. Планшет промывали 5 раз и кроличьи поликлональные антитела к нанотелу (R23) вносились в 200 кратном разведении в течение одного часа при комн.темп. После промывания планшеты, связывание детектировалось с поликлональными козьими антителами против кролика, конъюгированными с HRP (DAKO), при 3000-кратном разбавлении в течение одного часа при комн.темп., и окрашивали ABTS/H₂O₂. Измеряли OD405нм.

Эта первая ELISA использовалась для определения линейного диапазона стандартного образца сравнения. Во втором анализе ELISA, стандартный образец использовали в концентрациях этого линейного диапазона при 2-кратном разведениях. Во второй ELISA, сывороточные тестовые образцы разбавляли 100-кратно и дополнительно делали 5-кратные разбавления в 1% мышиной плазме, для определения разведения, при котором сывороточные образцы обеспечивают показатели в линейном диапазоне стандартной кривой. В третьей ELISA, сывороточные образцы разбавляли в подходящей концентрации, определенной во второй ELISA и при использовании 2-кратных разведений для более точного определения концентрации Нанотела™ в сывороточных образцах.

Эксперименты выполняли для определения фармакокинетического профиля TNF60 у мышей (n=3). Значение Cmax 103,84 ± 31 мкг/мл достигалось через 15 минут после введения. Время полужизни (t1/2β) по определению составляло 1,9 дней, такое же, как и время полужизни мышиного сывороточного альбумина, указывая на то, что TNF60 перенимает время полужизни сывороточного альбумина. Результаты представлены на фигуре 47.

Определение антител к нанотелу у мышей

Проводили сенсибилизацию Нанотелами™ при 5 мкг/мл в ЗФР при 4°C в течение ночи. Планшет промывали 5 раз ЗФР/0,05% Tween-20 и блокировали в течение 2 часов при комн.темп. ЗФР/1% казеин. Сывороточные образцы разбавляли 100-кратно и вносили в лунки для проведения инкубации в течение 1 часа при комнатной температуре. Детекцию проводили при использовании 1000-кратного разведения поликлональных антител кроличьих анти-мышиных-HRP (DAKO, P0260) и при использовании ABTS в качестве субстрата.

Сывороточные образцы разбавляли 50-кратно и анализировали на наличие мышиных анти-TNF60 антител. Недостаток иммуногенности демонстрировался для TNF60. Результаты представлены на фигуре 48.

Пример 55: Получение бивалентных гуманизированных Нанотел™ с долгим временем полужизни

Описание вектора экспрессии Pichia pastoris

См. пример 48

Форматирование бивалентных Нанотел™

Две отдельные ПЦР реакции были поставлены для амплификации N-концевой и C-концевой субъединиц Нанотел™ при использовании процедур, которые указаны в WPA-0011. Для амплификации N-концевого Нанотела™ PiForLong и Rev_30GlySer_L108 использовали в качестве комбинации праймеров; для амплификации C- концевого Нанотела ™ использовали For_GlySer и PiRevCys1hum или альтернативно For_GlySer и PiRevCys2hum, включая сайты рестрикции для форматирования и три цистеиновых остатков, необходимых для C-концевых модификаций.

ПЦР-реакция, состоящая из 1 мкл плазмиды ДНК (50-100 нг), 1,5 мкл прямого праймера (10 мкM → 300 нM), 1,5 мкл обратного праймера (мкM → 300 нM), 1 мкл dNTPs (10 мM → 0,2 мM), 5 мкл буфера (10x → 1x), 0,75 мкл фермента (3,5 Е/мкл → 2.6 Е/мкл) и 39,25 мкл H₂O в общем объеме 50 мкл. Последовательности праймеров указаны в таблице 44. Программа проведения ПЦР начиналась с 2 минут при 94°C. Цикл из 30 секунд при 94°C, 30 секунд при 50°C и 1 минуты при 72°C повторялся 30 раз и с последующими 10 минутами при 72°C. Амплификация проверялась путем разделения 5 мкл продукта реакции ПЦР на 2% агарозном геле. ПЦР-продукт очищали при использовании QIAquick ПЦР Purification Kit в соответствии с инструкциями производителя. Одну колонку использовали и элюировали 50 мкл EB буфером. N-концевой VHH фрагмент получали путем инкубирования 50 мкл ДНК и 2 мкл BamHI (10 Е/мкл) в подходящем буфере, рекомендованным производителем при 37°C в течение 1,5 часов. C-концевой VHH фрагмент получали путем инкубирования 50 мкл ДНК и 2 мкл BspНI (10 Е/мкл) и 2 мкл EcoRI (10 Е/мкл) в подходящем буфере, рекомендованным производителем при 37°C в течение 1 часов. Предыдущие реакции расцепления разделяли в 2% агарозном геле. Полосы VHH (350-450 п.о.) вырезали из геля, и ДНК очищали при использовании QIAquick Gel Extraction Kit в соответствии с инструкциями производителя. Одна колонка (с максимумом 400 мг агарозного геля на колонку) использовалась, и объединенную ДНК элюировали 50 мкл EB буфера. Концентрация ДНК определялась путем измерения OD₂₆₀ (1 OD единица = 50 мкг/мл). Готовили лигирующую смесь с конечным объемом 10 мкл, содержащую 100 нг вектора pPICZαA, линеаризованного XhoI/EcoRI, 30 нг N-концевого VHH, 30 нг C-концевого VHH фрагмента, 1 мкл буфера для лигирования и 1 мкл лигазы (3ЕД) и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Трансформация E. coli, TG1 осуществлялась при использовании 2 мкл лигирующей смеси. Колонии анализировали при использовании ПЦР, как описано в WPA-0010, но при использовании комбинации праймеров AOXIFor/AOXIRev. Анализ последовательности осуществлялся на положительных клонах. Приготовление плазмиды осуществлялось при использовании Qiaprep spin Miniprep kit (Qiagen) в соответствии с рекомендациями производителя и описывается выше. Секвенирование осуществляли в лаборатории секвенирования VIB, Антверпен, Бельгия.

Трансформация P. pastoris

См. пример 48.

TNF30 форматировали с бивалентными Нанотелами™. В качестве спейсера между 2 структурными составляющими использовали линкер GlySer, длиной 30 АК. Свободный цистеин вводили для осуществления C-концевых сайт-специфичных модификаций, либо в качестве последней AК Нанотела™, либо с помощью дополнительного спейсера, состоящего из GlyGlyGlyCys (SEQ ID NO: 471).

Пример 56: Экспрессия и очистка гуманизированных Нанотел™ с долгим временем полужизни

Продукция в Pichia pastoris

См. пример 49

Очистка бивалентных нанотел

Среду для культивирования освобождали от клеток посредством центрифугирования и 0,22мкм фильтрации. Стерильную среду хранили при 4ºC до последующего использования. Содержание низкомолекулярных примесей снижали посредством ультрафильтрации на 10 кДа ультрафильтрационной мембране (UF) (HydroSart Sartocon Slice Cassette, Sartorius) следующим образом: четыре литра среды концентрировали до 0,5-1 л, затем разбавляли 5 л ЗФР и снова концентрировали до 0,5 л. Эти действия осуществляли дважды.

Концентрат UF фильтровали через нейлоновые 47 мм мембраны 0,45мкм (Alltech #2024).

На следующем этапе, бивалентные Нанотела™ отделяли от концентрированной среды посредством аффинной очистки на белке A (при использовании MabSelectXtraTM, GE Healthcare). Колонка [35X100 мм] уравновешивалась ЗФР и после введения образца промывались интенсивно ЗФР. TNF56 был элюирован глицином [100 мM, pH=2,5].

Элюированные фракции MabSelectXtraTM нейтрализовали Tris [1,5M, pH 8,8] и хранили при 4°C. TNF56 концентрировали и очищали посредством AEX (A= 10мM пиперазин, pH 10,8 и B=1M NaCl в 50мM Tris, pH 7,5) при использовании Source 30Q (GE Healthcare). Для этого фракции Нанотел™ разводили A буфером (10мM пиперазин, pH 10,8) до электропроводности 5мСм/см и pH доводили до 10,8. Колонку [25X100 мм] уравновешивали A буфером перед заполнением образца в колонку. TNF56 элюировали градиентом, равным 5 объемам колонки (CV). pH собранных фракций доводили до 7,8 при использовании 1M Tris pH=7,8.

Пегилирование бивалентных Nanobodies™, экспрессирующихся в Pichia pastoris

Восстановление C-концевых цистеинов

Дитиотреитол (DTT, Aldrich Cat 15,046-0) добавляли к нейтрализированным фракциям для восстановления возможных дисульфидных связей, которые формируются между карбоксиконцевыми цистеинами Nanobodies™ (как правило, около 20%). Было найдено, что конечная концентрация 10мM DTT и инкубация в течение ночи при 4°C были оптимальными. Восстановление оценивали с помощью аналитической эксклюзионной хроматографии (SEC). В связи с чем, 25 мкл восстановленного Нанотела™ добавляли к 75 мкл D-ЗФР и инжектировали в Sup75 10/300 GL колонку, уравновешенную ЗФР по Dulbecco (D-ЗФР, GibcoTM REF 14190-094).

Не восстановленные Нанотела™ и DTT удалялись с помощью препаративной SEC на Hiload 26/60 Superdex75 prep grade колонке, уравновешенной D-ЗФР.

Концентрация восстановленных Нанотел™ измеряли путем измерения абсорбции при 280nm. Использовали спектрофотометр Uvikon 943 Double Beam UV/VIS (способ: см. SOP ABL-0038). Абсорбция измерялась при сканировании по длине волны при 245-330нм. Использовали две прецизионные кюветы, изготовленные из Quartz Suprasil® (Hellma type No.: 104-QS; light path: 10 mm). Сначала измеряли абсорбцию контроля при 280 нм путем помещения двух кювет, заполненных 900мкл D-ЗФР. Образец разбавляли (1/10) путем добавления 100мкл образца в первую кювету. Абсорбция образца измерялась при 280 нм.

Концентрация рассчитывалась с помощью следующей формулы:

Для TNF55: ε=1,85

Для TNF56: ε=1,83.

ПЭГилирование

Для ПЕГилирования Нанотел™ 5X молярный избыток свежеприготовленного 1мM раствора PEG40 добавляли к раствору восстановленного Нанотела™. (MPEG2-MAL-40K NEKTAR™ Transforming Therapeutics (2D3YOTO1) Mол.вес = 40,000 г/моль; MPEG2-MAL-60K NEKTAR™ Transforming Therapeutics (2D3YOVO1) Mол.вес = 60,000 г/моль).

Смесь Нанотела™-PEG инкубировали в течение 1ч при комнатной температуре (RT) при осторожном перемешивании и затем переносили на 4°C. ПЭГирование оценивали посредством аналитической SEC. Для чего 25 мкл Нанотела™ добавляли к 75мкл D-ЗФР и инжектировали в колонку Sup75HR 10/300, уравновешенную D-ЗФР. ПЕГилированные Нанотела™ элюировались в пределах свободного объема колонки (>75 кДа).

ПЭГилированные и непегилированные Нанотела™ разделяли посредством катионообменной хроматографии (CEX, при использовании Source30S, GE Healthcare; A буфер =25мM лимонная кислота pH=4 и B=1M NaCl в ЗФР). Образец разбавляли до электропроводности <5мСм/см и pH доводили до 4,0. Колонку [25X100мм] уравновешивали и после нанесения образца интенсивно промывали A-буфером. Пегилированные Нанотела™ элюировали градиентом объемом 3 CV.

В собранных Нанотелах™ заменяли буфер на D-ЗФР путем SEC на Hiload 26/60 Superdex 75 prep grade колонке, уравновешенной D-ЗФР.

В итоге Нанотела™ освобождали от ЛПС посредством пропускания через анионообменную колонку (Source30Q). Колонку (10x100 мм) подвергали санации в течение ночи в NaOH [1M] и после чего уравновешивали D-ЗФР, свободным от эндотоксина.

Биотинилирование

Для биотинилирования Нанотел™ 5X молярный избыток биотина (EZ-Link® Maleimide-PO2-Biotin, Pierce #21901) из 10 мM исходного раствора добавляли к восстановленным Нанотелам™ (sсм. 5.5.1). Смесь биотин-Нанотела™ инкубировали в течение 1 часа при комн.темп. с осторожным перемешиванием и затем хранили при 4°C.

Чистоту биотинированных Нанотел™ контролировали посредством аналитической SEC. Для этого 25 мл биотинированных Нанотела™ добавляли к 75 мкл D-ЗФР и вводили в колонку Sup75HR 10/300, уравновешенную D-ЗФР. Из полученной хроматограммы можно сделать вывод, что смеси Нанотела™-биотин не требуется дополнительной очистки: не обнаруживалась димеризация Нанотел™ через окисление свободных сульфгидрильных групп. Смену буфера на D-ЗФР осуществляли путем пропускания через колонку для обессоливания Sephadex G25 (90мл).

В итоге Нанотело™-биотин освобождали от ЛПС, путем пропускания через анионообменную колонку (Source30Q, GE Healthcare). Колонку (1x10 см) санировали в течение ночи в 1M NaOH и затем уравновешивали D-ЗФР.

Для определения чистоты, белковые образцы анализировали на 15% SDS-PAGE геле, как описывается в примере 8 и 49. Результаты представлены на фигурах 49 и 50.

Пример 57: Характеристика бивалентный гуманизированных Нанотел™ с долгим временем полужизни

Биохимическая характеристика

TNF55 состоит из 260 аминокислот. Белок имеет молекулярную массу 27106 Да. pI соответствует 8,67. Коэффициент экстинкции при 280 нм составляет 1,850.

TNF56 состоит из 264 аминокислот. Белок имеет молекулярную массу 27365 Да. pI соответствует 8,67. Коэффициент экстинкции при 280 нм составляет 1,830.

Масс-спектрометрия

Теоретическая масса TNF55 составляет 27106 Да. Белок TNF55-Биотин имеет 2 S-S мостика и биотиповую модификацию, что должно давать массу 27627 Да в ESI-MS. Масса, которая была экспериментально определена для TNF55-биотин, составляет 27627 Да.

Теоретическая масса TNF56 составляет 27365 Дa. Белок TNF55-Биотин имеет 2 S-S мостика и биотиповую модификацию, что должно давать массу 27886 Да в ESI-MS. Масса, которая была экспериментально определена для TNF55-биотин, составляет 27886 Да.

N-концевое секвенирование

N-концевое секвенирование TNF56-PEG40 показывает, что последовательность белка для первых 7 аминокислот следующая: EVQLVES. Это соответствует теоретической последовательности белка, что указывает на правильный N-концевой процессинг.

Аналитическое определение размеров

Аналитическое определение размеров TNF56-PEG40 в ЗФР обеспечивает симметричный пик. Не было обнаружено загрязнений. Время удержания составляло 8,5 мл на Superdex HR 75 и 10,32 мл на Superdex HR 200. Репрезентативный профиль показан на фигурах 51 и 52.

Пример 58: Функциональность в клеточном анализе

Способность к нейтрализации цитотоксической активности TNFα анализировали с помощью клеточного анализа. Способность исследовалась при различных концентрациях Нанотел™, так же как и коммерчески доступные Enbrel, Humira и Remicade на молярной основе. Чем выше наблюдаемое значение EC50, тем ниже активность соединения в нейтрализации TNFα.

Результаты суммированы в таблице 45 и на фигурах 53 и 54.

Данные показывают увеличение эффективности для бивалентных Nanobodies™ по сравнению с моновалентными Нанотелами™ TNF1. Эффективность производных TNF55 аналогична таковой производных TNF56, которые находятся в диапазоне Enbrel и в 10 раз лучше, чем для Humira и Remicade.

Пример 59: Фармакокинетический и иммуногенный анализ на мышах бивалентных гуманизированных Нанотел™ с долгим временем полужизни

См. пример 54

Эксперименты осуществлялись для определения времени полужизни пегилированных Nanobodies™ на мышах. Время полужизни бивалентного TNF56-PEG40 сравнивали со временем полужизни TNF56-PEG60. Оба Nanobodies™ имели сравнимое время полужизни ~ 2дней. Результаты представлены на фигуре 55.

В дополнение исследовали время полужизни пегилированного бивалентного 3E-3E. Время полужизни 3E-3E-PEG20 сравнивали со временем полужизни 3E-3E-PEG40 после внутривенного введения 100 мкг Нанотела™. 3E-3E-PEG20 имеет время полужизни 17 часов, тогда как 3E-3E-PEG40 имеет время полужизни 2,1 дня, сравнительно со временем полужизни 3E-3E-MSA21. Результаты представлены на фигуре 56.

Образцы сыворотки разбавляли 100-кратно и анализировали на наличие мышиных анти-TNF56-PEG40 или анти-TNF56-PEG60 антител. Отсутствие иммуногенности было продемонстрировано для обеих молекул. Результаты представлены на фигуре 57.

Пример 60: Эффективность анти-TNF-α нанотела TNF60 (TNF60) в предупреждении хронического полиартрита

Трансгенные мышиные линии несущие и экспрессирующие трансген 3'-модифицированного человеческого фактора некроза опухоли-альфа (hTNF-альфа, кахектин), использовали как модель для изучения эффективности TNF60 (TNF60) в предупреждении развития артрита (EMBO J. 10, 4025-4031). Было показано, что у этих мышей развивается хронический полиартрит со 100% частотой в возрасте четырех– семи недель.

В возрасте три недели помет трансгенных мышей разделяли на группы по восемь мышей. Перед началом изучения рассчитывали среднюю массу тела для каждой группы. После этого в течение всего изучения измеряли вес животных еженедельно для каждой группы.

Для исследования эффективности TNF60 для профилактики хронического полиартрита, внутриперитонеальные инъекции осуществлялись дважды в неделю каждому животному конкретной группы в соответствии со следующий схемой:

-Группа 1 (отрицательный контроль): забуференный фосфатом физиологический раствор (ЗФР) (буфер для получения состава)

-Группа 2 (Лечение нанотелом): TNF60 в конечной дозе 30 мг/кг

-Группа 3 (Лечение нанотелом): TNF60 в конечной дозе 10 мг/кг

-Группа 4 (Лечение нанотелом): TNF60 в конечной дозе 3 мг/кг

-Группа 5 (1^ый положительный контроль): Enbrel в конечной дозе 30 мг/кг

-Группа 6 (1^ый положительный контроль): Enbrel в конечной дозе 10 мг/кг

-Группа 7 (2^ой положительный контроль): Remicade в конечной дозе 30 мг/кг

-Группа 8 (2^ой положительный контроль): Remicade в конечной дозе 10 мг/кг

-Группа 9 (2^ой положительный контроль): Remicade в конечной дозе 3 мг/кг

Для каждой группы отмечали дни введения инъекций и объемы инъекции.

Инъекции продолжались в течение семи недель. В течение этого периода, клинические оценки регистрировались путем наблюдения макроскопических изменений в суставной морфологии для каждого животного.

В возрасте 10 недель всех мышей умерщвляли и сыворотку и суставы собирали. Сыворотка хранилась при -70ºC и голеностопные суставы консервировали в формалине.

Для выбранных групп, голеностопные суставы заключали в парафин и делали срезы. Срезы голеностопных суставов впоследствии использовали для гистопатологической оценки прогрессирования заболевания.

Результаты представлены на фигуре 58.

Пример 61: Эффективность анти-TNF-α нанотела TNF60 (TNF60) в терапевтическом лечении хронического полиартрита

Трансгенные мышиные линии несущие и экспрессирующие трансген 3'-модифицированного человеческого фактора некроза опухоли-альфа (hTNF-альфа, кахектин), использовали как модель для изучения эффективности TNF60 (TNF60) в терапевтическом лечении артрита (EMBO J. 10, 4025-4031). Было показано, что у этих мышей развивается хронический полиартрит со 100% частотой в возрасте четырех–семи недель.

С возраста шесть недель помет трансгенных мышей разделяли на группы по восемь мышей. Перед началом изучения рассчитывали среднюю массу тела для каждой группы. После этого в течение всего изучения измеряли вес животных еженедельно для каждой группы.

Для исследования эффективности TNF60 для терапевтического лечения хронического полиартрита внутриперитонеальные инъекции осуществлялись дважды в неделю каждому животному конкретной группы в соответствии со следующий схемой:

-Группа 4 (1^ый положительный контроль): Enbrel в конечной дозе 30 мг/кг

-Группа 5 (2^ой положительный контроль): Remicade в конечной дозе 30 мг/кг

Инъекции продолжались в течение семи недель. В течение этого периода клинические оценки регистрировались путем наблюдения макроскопических изменений в суставной морфологии для каждого животного.

В возрасте 13 недель всех мышей умерщвляли, и сыворотку и суставы собирали. Сыворотка хранилась при -70ºC, и голеностопные суставы консервировали в формалине.

Для выбранных групп голеностопные суставы заключали в парафин и делали срезы. Срезы голеностопных суставов впоследствии использовали для гистопатологической оценки прогрессирования заболевания.

Результаты представлены на фигуре 59.

Пример 62: Эффект форматирования на эффективность анти-TNF-α нанотела TNF60 (TNF60) в предупреждении хронического полиартрита

Трансгенные мышиные линии, несущие и экспрессирующие трансген 3'-модифицированного человеческого фактора некроза опухоли-альфа (hTNF-альфа, кахектин), использовали как модель для изучения эффективности анти-TNF-α нанотела, форматированного различным образом, в предупреждении хронического полиартрита (EMBO J. 10, 4025-4031). Было показано, что у этих мышей развивается хронический полиартрит со 100-процентной частотой в возрасте четырех– семи недель.

С возраста три недели помет трансгенных мышей разделяли на группы по восемь мышей. Перед началом изучения, рассчитывали среднюю массу тела для каждой группы. После этого, в течение всего изучения измеряли вес животных еженедельно для каждой группы.

Для исследования эффективности TNF60 для предупреждения хронического полиартрита внутриперитонеальные инъекции осуществлялись дважды в неделю каждому животному конкретной группы в соответствии со следующий схемой:

-Группа 1 (отрицательный контроль): забуференный фосфатом физиологический раствор(ЗФР) (буфер для получения состава)

-Группа 2 (нанотела, формат 1): TNF60 в конечной дозе 10 мг/кг

-Группа 3 (нанотела, формат 1): TNF60 в конечной дозе 2,5 мг/кг

-Группа 4 (нанотела, формат 1): TNF60 в конечной дозе 1 мг/кг

-Группа 5 (нанотела, формат 2): TNF56-PEG40 в конечной дозе 10 мг/кг

-Группа 6 (нанотела, формат 2): TNF56-PEG40 в конечной дозе 1,8 мг/кг

-Группа 7 (нанотела, формат 2): TNF56-PEG40 в конечной дозе 0,7 мг/кг

-Группа 8 (нанотела, формат 3): TNF56-biot в конечной дозе 1,8 мг/кг

-Группа 9 (нанотела, формат 4): TNF30 в конечной дозе 1 мг/кг

-Группа 10 (нанотела, формат 5): TNF1 в конечной дозе 1 мг/кг

-Группа 11 (1^ый положительный контроль): Enbrel в конечной дозе 10 мг/кг

-Группа12 (2^ой положительный контроль): Remicade в конечной дозе 10 мг/кг

В возрасте 10 недель всех мышей умерщвляли и сыворотку и суставы собирали. Сыворотка хранилась при -70ºC, и голеностопные суставы консервировали в формалине.

Результаты представлены на фигуре 60.

Пример 63: Фармакокинетическое изучение анти-TNF-α нанотела TNF60 (TNF60) и TNF56-PEG40 на обезьянах-резус

Разведенных в неволе обезьян-резус (Macaca mulatta) использовали для определения фармакокинетического профиля TNF60 и TNF56-PEG40.

Шестнадцать животных использовали для этого исследования (восемь самцов и восемь самок) и их разделяли на четыре группы (два самца и две самки на группу). Все животные весили приблизительно 5 кг и были здоровыми, по меньшей мере, в течение шести недель до начала использования. В качестве корма служил Sniff® Pri vegetarisch V3994. Для каждой обезьяны давали шестьдесят г/кг веса тела. Остатки удаляли. Регулярно (по меньшей мере, дважды в год) пищу анализировали на основании EPA/USA на наличие загрязнений с помощью LUFA-ITL. Водопроводная вода предлагалась неограниченно. Животные каждой группы лечения помещались в блоки из нескольких смежных клеток в отделении для обезьян. Обезьян держали отдельно в V₂A стальных клетках размером 90 см x 82 см x 96 см. Комнатная температура поддерживалась при 23°C ± 3°C (максимальный диапазон) и относительная влажность составляла 60% ± 20% (максимальный диапазон). Отклонения от максимального диапазона, вызванные, например, процедурой уборки, обсуждаются в стандартных эксплуатационных регламентах (SOP). Комнаты освещались и затемнялись на 12 часовых периода.

Двум группам вводили TNF60 и двум группам вводили TNF56-PEG40. Внутривенные инфузии TNF60 и TNF56-PEG40 (растворенный в ЗФР) осуществляли в вену cephalica правого или левого плеча при использовании постоянных катетеров и с помощью TSE инфузионного насоса (см. ниже) вводили фиксированную дозу 2 мг/кг.

Осуществляли четыре отдельных введения, разделенных периодом вымывания, который составлял, по меньшей мере, четырнадцать дней. После последнего применения период последующего наблюдения составлял, по меньшей мере, восемь недель. Двум из четырех групп вводили TNF60 или TNF56-PEG40 в комбинации с метотрексатом (MTX) (растворенным в ЗФР). Группа 2 обрабатывалась TNF60 и MTX; группа 4 - TNF56-PEG40 и MTX. MTX вводили один раз в неделю внутримышечно в дозе 0,2 мг/кг. В дни введения MTX давали приблизительно за 30 минут до введения. Режим введения начинали с первого введения нанотела и продолжали в течение восьми недель после четвертой дозы. Осуществляли четырнадцать однократных введений MTX, разделенных периодом вымывания длиной, по меньшей мере, в одну неделю, начиная с первого введения тестируемого соединения.

Пример 64: Изучение фибробластов, получаемых из синовиальной оболочки

В этом исследовании оценивали способность анти-TNF биологических препаратов, ALX0071 и Etanercept, ослаблять TNFα-индуцированную продукцию IL-6 фибробластами, происходящими из синовиальной оболочки пациентов с RA.

Выделение синовиальных фибробластов

Синовиальную ткань сустава от выразивших согласие пациентов с RA хранили в среде на основе DMEM с антибиотиками, при 4°C до 96 часов после операции по замещению сустава. Синовиальные клетки выделяли из рассеченной синовиальной оболочки путем расщепления коллагеназой при 37°C в течение 2 часов. Полученную суспензию клеток затем промывали путем серии стадий центрифугирования и ресуспендирования и полученные клетки затем культивировали при 37°C в среде культивирования на основе DMEM, дополненной 10-процентной детальной телячьей сывороткой (FCS) (объем/объем). Полученные фибробласты использовали для последующих экспериментов либо на втором, либо на третьем пассаже. Клетки от четырех доноров использовали в индивидуальных экспериментах. Фибробласты помещали в 96-луночные полистирольные планшеты с плоским дном в количестве 1,5 x10⁴клеток в конечном объеме 250 мкл культуральной среды на основе DMEM, дополненной 10% FCS (объем/объем), на лунку и культивировали в течение ночи.

Стимуляция синовиальных фибробластов

Клетки инкубировали в течение 72 часов в культуральной среды на основе DMEM, дополненной TNFα при 50 нг на мл (3 нM (R&D Systems 210-TA/CF) отдельно или в присутствии повышающихся доз ALX0071 (0,575 - 1920 нг на мл; 0,015 - 50 нM) или Etanercept (Wyeth Labs; 3,75 - 11250 нг на мл; 0,025 - 75 нM). Конечный объем в каждой лунке составлял 250 мкл, и каждая оценка осуществлялась троекратно. Через 72 часа, супернатантную среду удаляли и хранили при –40°C до проведения анализа с помощью IL-6 ELISA (R&D Systems). Ингибирование продукции IL-6, индуцированной TNFα, определяли и рассчитывали значения IC₅₀ для обоих ALX0071 и Etanercept.

Обобщение результатов

Как ALX10071, так и Etanercept дозо-зависимо снижали TNFα-индуцированную продукцию IL-6 фибробластами из синовиальной оболочки пациентов с RA, полученными от всех четырех доноров. Наблюдалась аналогичная эффективность среди двух реагентов при использованных условиях анализа.

Пример 65: Изучение на мышином воздушном кармане

В этом исследовании оценивали способность анти-TNF биологических препаратов, ALX0071 и Etanercept, ослаблять TNFα-индуцированную клеточную инфильтрацию в мышиный воздушный карман.

Создание воздушного кармана

Воздушные карманы были сформированы путем подкожной (s.c.) инъекции 2,5 мл стерильного воздуха в дорсальной поверхности анестезированным самцам мышей линии C57Bl/6/J (25-30г, Harlan). Карман повторно раздували путем инъекции 2,5 мл стерильного воздуха через 3 дня.

Стимуляция TNFα

Через шесть дней после создания воздушного кармана, животные подвергались анастезии и в карман, инъецировали 1 мл 0,5% носителя-карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), содержавшего 0,1 мкг рекомбинантного человеческого TNFα (R & D Systems, 210-TA-050/CF). В трех группах животных ALX0071 (0,0625, 0,125 и 0,25 мг/кг) инъецировали s.c. за 19 часов до инъекции TNFα. Вторые три группы животных были инъецированы (s.c.) Etanercept (Wyeth Labs, 0,125, 0,25 0,5 мг/кг) немедленно перед инъекциями TNFα.

Через 24 часа после инъекции TNFα мыши выбраковывались при помощи возрастающей концентрации CO₂. Карманы промывались 2 мл ледяного стерильного ЗФР, свободного от эндотоксина, содержащего 5 МЕ/мл гепарина. Объемы записывали и 0,5 мл аликвоты отделяли для подсчета общей популяции белых клеток крови (WBC) на цитометре Sysmex XT-Vet. Среднее и стандартную ошибку среднего (SEM) для общего WBC подсчитывали для каждой группы на мл отобранной промывной жидкости Статистический анализ осуществляли с помощью ANOVA с апостериорным критерием Крускала-Валлиса нетрансформированных данных.

Обобщение результатов

Как ALX0071, так и Etanercept ослабляют инфильтрацию WBC, индуцируемую TNFα, в воздушные карманы (таблица). В то время как эти ослабления достигают статистической значимости в дозовой группе как при 0,125 (P<0.01), так и при 0,25 мг/кг (P<0,05) ALX0071, статистическая значимость не обнаруживалась ни в какой из дозовых групп для Etanercept.

Таблица 8

Название	SEQ ID NO	Последовательность
PMP1C2(TNF1)	52	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRДНКKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCARSPSGFNRGQGTQVTVSS
PMP1G11	53	QVQLQESGGGMVQPGGSLRLSCAASGFDFGVSWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRДНКKTTLYLQMNSLKPEDTALYYCARSPSGSFRGQGTQVTVSS
PMP1H6	54	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFDFSVSWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYVDSVKGRFTISRДНКKNTLYLQMDSLIPEDTALYYCARSPSGSFRGQGTQVTVSS
PMP1G5(TNF2)	55	QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSEPSGYTYTIGWFRQAPGKEREFVARIYWSSGLTYYADSVKGRFTISRDIAKNTVDLLMNSLKPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVGSYNYWGQGTQVTVSS
PMP1H2	56	QVKLEESGGGLVQPGDSLRLSCAASGRTFSDYSGYTYTVGWFRQAPGKEREFVARIYWSSGNTYYADSVKGRFTISRDIAKNTVDLLMNNLEPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVESYNYWGQGTQVTVSS
PMP3G2	57	AVQLVESGGGLVQPGDSLRLSCAASGRTFSDYSGYTYTVGWFRQAPGKEREFVARIYWSSGNTYYADSVKGRFTISRDIAKNTVDLLMNNLEPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVESYNYWGQGTQVTVSS
PMP1D2	58	AVQLVDSGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSAHSVYTMGWFRQAPGKEREFVARIYWSSANTYYADSVKGRFTISRДНКKNTVDLLMNCLKPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVEAYNYWGQGTQVTVSS
PMP3D10	59	QVQLVESGGGLVQAGGSLSLSCAASGRSFTGYYMGWFRQAPGKERQLLASISWRGDNTYYKESVKGRFTISRDDAKNTIYLQMNSLKPEDTAVYYCAASILPLSDDPGWNTNWGQGTQVTVSS
PMP5F10(TNF3)	60	EVQLVESGGGLVQAGGSLSLSCSASGRSLSNYYMGWFRQAPGKERELLGNISWRGYNIYYKDSVKGRFTISRDDAKNTIYLQMNRLKPEDTAVYYCAASILPLSDDPGWNTYWGQGTQVTVSS
PMP6A8(ALB2)	61	AVQLVESGGGLVQGGGSLRLACAASERIFDLNLMGWYRQGPGNERELVATCITVG.DSTNYADSVKGRFTISDYTKQTVYLHMNSLRPEDTGLYYCKIRRTWHSELWGQGTQVTVSS
PMP6B4	62	EVQLVESGGGLVQEGGSLRLACAASERIWDINLLGWYRQGPGNERELVATITVG.DSTSYADSVKGRFTISRDYDKNTLYLQMNSLRPEDTGLYYCKIRRTWHSELWGQGTQVTVSS
PMP6A6(ALB1)	63	AVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRДНКKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS
PMP6C1	64	AVQLVDSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSFGSFGMSWVRQYPGKEPEWVSSINGRGDDTRYADSVKGRFSISRДНКKNTLYLQMNSLKPEDTAEYYCTIGRSVSRSRTQGTQVTVSS
PMP6G8	65	AVQLVESGGGLVQPGGSLRLTCTASGFTFRSFGMSWVRQAPGKDQEWVSAISADSSTKNYADSVKGRFTISRДНКKKMLYLEMNSLKPEDTAVYYCVIGRGSPSSPGTQVTVSS
PMP6A5	66	QVQLAESGGGLVQPGGSLRLTCTASGFTFGSFGMSWVRQAPGEGLEWVSAПРЕДСТАВЛЯЕТ СОБОЙADSSDKRYADSVKGRFTISRДНКKKMLYLEMNSLKSEDTAVYYCVIGRGSPASQGTQVTVSS
PMP6G7	67	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYWMYWVRVAPGKGLERISRDISTGGGYSYYADSVKGRFTISRДНКKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCAKDREAQVDTLDFDYRGQGTQVTVSS
NC55TNF_S1C4	105	EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCAASQIIFGSHVAAWFRQAPGREREFVAEIRPSGDFGPEGEFEHVTASLKGRFTIAKNSVDNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAAPYRGGRDYRWEYEYEYWGQGTQVTV
NC55TNF_S1C3	106	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCKNAGSTSNAYATGWFRRAPGKEREFVAGIQWSGGDAFYRNSVKGRFRITRDPDNTVYLQMNDLKPEDTAIYYCAQKLSPYYNDFDSSNYEYWGQGTQVTV
NC55TNF_S2C1	107	EVQLVESGGDLVQPGGSLRLSCAVSGQLFSTNDVGWYRRAPGKQRELVATITDDGTTDYGDDVKGRFVISREGEMVYLEMNSLKPEDTAVYYCNINRLRSTWGIRYDVWGQGTQVTVSS
NC55TNF_S2C5	108	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSTTSMTWVRQAPGKFEEWVSFINSDGSSTTYADSVKGRFTISRДНКKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCGRRGYGRDRSKGIQVTVAS
NC55TNF_S3C7	109	EVQLVESGGGTVQAGDSLRLSCAASGRSFSSVAMGWFRQAPGKQREFLAGVGYDGSSIRYAESVKGRFTIARGNRESTVFLQMENLKPEDTAVYFCTAEPIGAYEGLWTYWGQGTQVTVSS
NC55TNF_S3C1	110	XXXXVESGGGLMQPGGSLKLSCAASGFMFSDSAMGWFRQAPGKEREFVATISWNGGSSSYADFVKGRFTISRДНКKNTVYLQMNGLTPQDTAIYYCAGSYSNGNPHRFSQYQYWGQGTQVTVSS
NC55TNF_BMP1B2	111	EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFGTYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWGGGSIVYAESAKGRFTISRДНКKXTMYLQMDSLKPEDTAVYYCAAANNIATLRQGSWGQGTQVTVSS
NC55TNF_BMP1D2	112	EVQLVESGGELVQAGGSLKLSCTASGRNFVTYAMSWFRRAPGKEREFVASISWSGDTTYYSNSVKGRFTVSRDNGKNTAYLRMNSLKPEDTADYYCAVVQVIDPSWSGVNLDDYDYLGSGTQVTVSS
NC55TNF_BMP1E2	113	EVQLVESGGRLVQPGGSLRLSCKNAGSTSNAYATGWFRRAPGKEREFVAGIQWSGGDAFYRNSVKGRFRITRDPDNTVYLQMNDLKPEDTAIYYCAQKLSPYYNDFDSSNYEYWGQGTQVTVSS
NC55TNF_BMP1G2	114	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASATISSIVMLGWYRQAPGKQREWVASITIGSRTNYADSVKGRFTISRДНКKNTVYLQMNSLKPEDTAVYFCNAVPPRDDYWGQGTQVTVSS
NC55TNF_BMP2A2	115	EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGQTSSSYDMGWFRQAPGEGREFVARISGSDGSTYYSDRAKDRFTISRDNTKNMVYLQMDRLKPDDTAVYYCRVPRYENQWSSYDYWGQGTQVTVSS
NC55TNF_BMP2C2	116	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSTFSTYDMSWVRQAPGKGLEWVSGIDSGGGSPMYVDSVKGRFTVSRДНКKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCAKFSTGADGGSWYWSYGMDSWGKGTQVTVSS
NC55TNF_BMP2F2	117	EVQLVESGGGLVQAGDSLRLSCEASERSSNRYNMAWFRQAPGKEREFLARVDVSGGNTLYGDSVKDRFTVSRINGKNAMYLQMNNLKPEDTAIYYCAAGGWGTTQYDYDYWGQGTQVTVSS
NC55TNF_NC10	118	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVCVSSGCTFSAYSMTWVRQAPGKAEEWVSFINSDGSSTTYADSVNGRFKISRДНКKKTLYLQMNSLGPEDTAMYYCQRRGYALDRGQGTQVTVSS
NC55TNF_NC11	119	EVQLVESGGGLVQAGDSLTLSCASSGRGFYKNAMGWFRQPPGKEREFVASIKWNGNNTYYADSVRGRFTISRGNAKNTENTVSLQMNSLKPEDTADYYCAADSSHYSYVYSKAYEYDYWGQGTQVTVSS
NC55TNF_NC1	120	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVFSGFAFSASSMAWVRQAPGKYEEWVSFINSDGSSTTYADSVQGRFTISRДНКKNTLYLQMNSLKSEDTAMYYCGRRGYGRDRSQGIQVTVSS
NC55TNF_NC2	121	EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSSYAMGWFRQAPGKEREFVAAISWSGTITNYADSVKGRFTISRDNGKNTVHLQMNSLKPEDTAVYHCAVVQPYSGGDYYTGVEEYDYWGXGTQVTVSS
NC55TNF_NC3	122	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSATSMTWVRQAPGKAEEWVSFINSDGSSTTYADSVKGRFTISRДНКKNTLYLQMDDLQSEDTAMYYCGRRGYGRDRSRGIQVTVSS
NC55TNF_NC5	123	EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGGAFSNYDVGWFRQAPGEGREIVARISGSGDSTYSSNRAKGRFTISRДНКKNTVYLQMNSLKREDTAVYYCRAARYNGTWSSNDYWGQGTQVTVSS
NC55TNF_NC6	124	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCECVSSGCTFSAYSMTWVRQAPGKAEEFVSFINSDGSSTTYANSVNGRFKISRДНКKKTLYLQMNSLGPEDTAMYYCQRRGYALDRGQGTQVTVSS
NC55TNF_NC7	125	QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCTASGQTSSTADMGWFRQPPGKGREFVARISGIDGTTYYDEPVKGRFTISRDKAQNTVYLQMDSLKPEDTAVYYCRSPRYADQWSAYDYWGQGTQVTVSS
NC55TNF_NC8	126	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVVSGFTFSTTSMTWVRQAPGKFEEWVSFINSDGSSTTYADSVKGRFTISRДНКKNTLYLQMNSLKPEDTAMYYCGRRGYGRDRSKGIQVTVSS
NC55TNF_S2C2	127	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASASGVKVNDMGWYRQAPGKERELVATITDDGRTNYEDFAKGRFTISRДНКKNTVYLQMNSLLPEDTAVYYCNARTYWAHLPTYWGQGTQVTVSS
NC55TNF_S1C6	128	EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRSFGSVAMGWFRQAPGKEREFVAAIGYDGNSIRYGDSVKGRFTISRDNIKNTMYLEMENLNADDTARYLCAAEPLARYEGLWTYWGQGTQVTVSS
NC55TNF_S3C2	129	EVQLVESGGGLVQAGASLRLSCTTSTRTNDRFNMAWFHQAPGKDREFVSRIDVAGYNTAYGDFVKGRFTVSRDSAENTVVLQMNSLRPEDTGVYYCAAGGWGISQSDYDLWGQGTQVTVSS

Таблица 9

Нанотела	Класс	Рассчитанная koff (1/с)
PMP5 F10	III	2,63E-04
PMP1 G5	II	3,59E-04
PMP1 C2	I	4,39E-04
PMP1 G11	I	1,15E-03
PMP1 H6	I	2,14E-03
PMP1 H2	II	3,65E-03
PMP3 G2	II	1,09E-02

Таблица 10

Нанотела	Зародышевая последовательность	Число АК отличий / общее число AК	AК идентичности, в %
ALB1	DP51/DP53	13/87	85,1
ALB2	DP54	26/87	70,2
TNF1	DP51/DP53	6/87	93,2
TNF2	DP54	16/87	81,7
TNF3	DP29	18/87	79,4

Таблица 11

Нанотела	Время проявления индукции	Выход (мг/л)
ALB1	короткое/37°C	18
ALB2	короткое/37°C	4
TNF1	короткое/37°C	8,3
TNF2	короткое/37°C	5
TNF3	короткое/37°C	0,8

Таблица 12

	50% связывание(нг/мл)
ID	Человеческий TNFα	Резус TNFα
TNF1	12	12
TNF2	20	>3000
TNF3	18	16

Таблица 13

	50% Ингибирование (нг/мл)
ID	Человеческий TNFα	Резус TNFα
TNF1	530	220
TNF2	3500	>5000
TNF3	100	100

Таблица 14

Человеческий TNFα	Kd (1/с)
TNF1	1,05E-03
TNF2	1,33E-03
TNF3	3,02E-04

Таблица 15

		Человеческий альбумин	Резус альбумин	Мышиный альбумин
ALB1	K _D (нM)	0,57	0,52	6,5
	ka (1/мСм)	1,11E+06	1,05E+06	1,11E+06
	kd (1/с)	6,30E-04	5,46E-04	7,25E-03
ALB2	K _D (нM)	0,092	0,036	15,7
	ka (1/мСм)	8,15E+05	1,94E+06	1,95E+05
	kd (1/с)	7,52E-05	7,12E-05	3,07E-03

Таблица 16

*анализ:*	*L929s + Act D (5000c/w)*
*TNF:*	*человеческий* TNFα при *0,5нг/мл*
		EC ₅₀ в нM			Относительная активность
Нанотела		среднее	станд.откл.	#	среднее	станд.откл.
TNF1	1C2	0,707	0,265	14	0,015	0,007
TNF2	1G5	1,412	0,622	14	0,007	0,002
TNF3	5F10	0,224	0,133	14	0,048	0,019
Enbrel		0,009	0,005	45	1,002	0,011
Humira		0,079	0,043	39	0,097	0,069
Remicade		0,083	0,037	45	0,103	0,058

*анализ:*	*L929s + Act D (5000c/w)*
*TNF:*	*резус* TNFα при *0,5нг/мл*
		EC ₅₀ в нM			Относительная активность
Нанотела		среднее	станд.откл.	#	среднее	станд.откл.
TNF1	1C2	0,693	0,305	9	0,015	0,009
TNF2	1G5	>50		9
TNF3	5F10	0,602	0,283	9	0,017	0,010
Enbrel		0,009	0,003	7	1	0,000
Humira		0,071	0,025	8	0,103	0,059
Remicade		>6,7		7

Таблица 17

%	Необработанные	Комн. темп.	37°C
TNF1	100	98	98	98	98	95	92	90
TNF2	100	99	100	99	97	96	63	50
TNF3	100	96	97	98	96	94	75	70
ALB1	100	101	102	101	100	64	94	90
ALB2	100	100	102	100	100	28	8	17

Таблица 18

Нанотела	Темп., °C	EC ₅₀ в нM	#	Относительная эффективность
TNF1	контроль	0,916	1	0,013
92#2302nr1.TNF1	RT	0,873	1	0,014
	37	0,901	1	0,013
	50	0,908	1	0,013
	60	0,891	1	0,013
	70	1,218	1	0,010
	80	2,655	1	0,004
	90	5,797	1	0,002
TNF2	контроль	2,500	1	0,005
92#2302nr2.TNF2	RT	2,165	1	0,005
	37	2,212	1	0,005
	50	2,241	1	0,005
	60	1,782	1	0,007
	70	2,487	1	0,005
	80	2,818	1	0,004
	90	6,135	1	0,002
TNF3	контроль	0,278	1	0,043
92#2302nr3.TNF3	RT	0,289	1	0,041
	37	0,295	1	0,040
	50	0,290	1	0,041
	60	0,281	1	0,042
	70	0,293	1	0,040
	80	0,576	1	0,021
	90	0,861	1	0,014

Таблица 19

Название	SEQ ID NO	Последовательность
GS9	68	GGGGSGGGS
GS30	69	GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
TNF1–GS9-TNF1(TNF4)	70	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCARSPSGFNRGQGTQVTVSSGGGGSGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCARSPSGFNRGQGTQVTVSS
TNF2–GS9-TNF2(TNF5)	71	QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSEPSGYTYTIGWFRQAPGKEREFVARIYWSSGLTYYADSVKGRFTISRDIAKNTVDLLMNSLKPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVGSYNYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSQVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSEPSGYTYTIGWFRQAPGKEREFVARIYWSSGLTYYADSVKGRFTISRDIAKNTVDLLMNSLKPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVGSYNYWGQGTQVTVSS
TNF3–GS9-TNF3(TNF6)	72	EVQLVESGGGLVQAGGSLSLSCSASGRSLSNYYMGWFRQAPGKERELLGNISWRGYNIYYKDSVKGRFTISRDDAKNTIYLQMNRLKPEDTAVYYCAASILPLSDDPGWNTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLSLSCSASGRSLSNYYMGWFRQAPGKERELLGNISWRGYNIYYKDSVKGRFTISRDDAKNTIYLQMNRLKPEDTAVYYCAASILPLSDDPGWNTYWGQGTQVTVSS
TNF1–GS30-TNF1(TNF7)	73	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCARSPSGFNRGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCARSPSGFNRGQGTQVTVSS
TNF2–GS30-TNF2(TNF8)	74	QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSEPSGYTYTIGWFRQAPGKEREFVARIYWSSGLTYYADSVKGRFTISRDIAKNTVDLLMNSLKPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVGSYNYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSEPSGYTYTIGWFRQAPGKEREFVARIYWSSGLTYYADSVKGRFTISRDIAKNTVDLLMNSLKPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVGSYNYWGQGTQVTVSS
TNF3–GS30-TNF3(TNF9)	75	EVQLVESGGGLVQAGGSLSLSCSASGRSLSNYYMGWFRQAPGKERELLGNISWRGYNIYYKDSVKGRFTISRDDAKNTIYLQMNRLKPEDTAVYYCAASILPLSDDPGWNTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLSLSCSASGRSLSNYYMGWFRQAPGKERELLGNISWRGYNIYYKDSVKGRFTISRDDAKNTIYLQMNRLKPEDTAVYYCAASILPLSDDPGWNTYWGQGTQVTVSS
TNF30-30GS-TNF30-C (TNF 55)	419	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSSggggsggggsggggsggggsggggsggggsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSC
TNF30-30GS-TNF30-gggC (TNF56)	420	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSSggggsggggsggggsggggsggggsggggsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSSgggC

Таблица 20

Название	Формат	Линкер
TNF4	TNF1-TNF1	9 AК GlySer
TNF5	TNF2-TNF2	9 AК GlySer
TNF6	TNF3-TNF3	9 AК GlySer
TNF7	TNF1-TNF1	30 AК GlySer
TNF8	TNF2-TNF2	30 AК GlySer
TNF9	TNF3-TNF3	30 AК GlySer

Таблица 21

Нанотела™	Время индукции	Выход (мг/л)
TNF4	в течение ночи/28°C	3,2
TNF5	короткое/37°C	5,5
TNF6	короткое /37°C	1,19
TNF7	в течение ночи /28°C	2,7
TNF8	короткое /37°C	6,6
TNF9	в течение ночи /28°C	1,3

Таблица 22

	50% ингибирование (нг/мл)
Название	Человеческий TNFα
TNF4	13
TNF5	6,3
TNF6	30
TNF7	16
TNF8	23
TNF9	18

Таблица 23

*анализ:*	*L929s + Act D (5000c/w)*
*TNF:*	*человеческий TNFa при 0,5нг/мл*
	EC ₅₀ в нM			Относительная активность
Нанотела	среднее	станд.откл.	#	среднее	станд.откл.
TNF4	0,236	0,049	4	0,033	0,012
TNF5	0,020	0,010	9	0,566	0,275
TNF6	0,078	0,047	8	0,179	0,168
TNF7	0,013	0,005	8	0,673	0,211
TNF8	0,007	0,002	2	1,240	0,137
TNF9	0,012	0,005	6	0,729	0,242
Enbrel	0,009	0,005	45	1,002	0,011
Humira	0,079	0,043	39	0,097	0,069
Remicade	0,083	0,037	45	0,103	0,058

*анализ:*	*L929s + Act D (5000c/w)*
*TNF:*	*резус TNFa при 0,5нг/мл*
	EC ₅₀ в нM			Относительная активность
Нанотела	среднее	станд.откл.	#	среднее	станд.откл.
TNF4	0,141	0,025	4	0,065	0,015
TNF5	35,000	16,000	5	0,000	0,000
TNF6	0,398	0,074	6	0,024	0,003
TNF7	0,011	0,005	4	0,860	0,142
TNF8	1,026	0,444	2	0,010	0,001
TNF9	0,038	0,012	4	0,249	0,032
Enbrel	0,009	0,003	7	1,000	0,000
Humira	0,071	0,025	8	0,103	0,059
Remicade	>6,7		7

Таблица 24

%	необработан	комн. темп.
TNF4	100	99	99	99	98	55	34	17
TNF5	100	99	101	99	98	92	26	22
TNF6	100	103	104	103	105	99	7	7
TNF7	100	100	100	98	96	66	33	40
TNF8	100	99	100	99	100	89	11	8
TNF9	100	101	101	101	101	99	17	18

Таблица 25

Название	SEQ ID NO	Последовательность
TNF13(TNF1 HUM1)	76	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTQVTVSS
TNF14(TNF1 HUM2)	77	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSS
TNF15(TNF2 HUM1)	78	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSEPSGYTYTIGWFRQAPGKGREFVARIYWSSGLTYYADSVKGRFTISRDIAKNTVDLQMNSLKPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVGSYNYWGQGTQVTVSS
TNF16(TNF2 HUM2)	79	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSEPSGYTYTIGWFRQAPGKGREFVARIYWSSGLTYYADSVKGRFTISRDIAKNTVDLQMNSLKPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVGSYNYWGQGTQVTVSS
TNF17(TNF2 HUM3)	80	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSEPSGYTYTIGWFRQAPGKGREFVARIYWSSGLTYYADSVKGRFTISRDNAKNTVDLQMNSLKPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVGSYNYWGQGTQVTVSS
TNF18(TNF2 HUM4)	81	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSEPSGYTYTIGWFRQAPGKGREFVARIYWSSGLTYYADSVKGRFTISRDIAKNTVDLQMNSLRPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVGSYNYWGQGTQVTVSS
TNF19(TNF2 HUM5)	82	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFSEPSGYTYTIGWFRQAPGKGREFVARIYWSSGLTYYADSVKGRFTISRDIAKNTVDLQMNSLKPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVGSYNYWGQGTLVTVSS
TNF20(TNF3 HUM1)	83	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRSLSNYYMGWFRQAPGKGRELLGNISWRGYNIYYKDSVKGRFTISRDDSKNTIYLQMNSLKPEDTAVYYCAASILPLSDDPGWNTYWGQGTQVTVSS
TNF21(TNF3 HUM2)	84	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYYMGWFRQAPGKGRELLGNISWRGYNIYYKDSVKGRFTISRDDSKNTIYLQMNSLKPEDTAVYYCAASILPLSDDPGWNTYWGQGTQVTVSS
TNF22(TNF3 HUM3)	85	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRSLSNYYMGWFRQAPGKGRELLGNISWRGYNIYYKDSVKGRFTISRDDSKNTIYLQMNSLKTEDTAVYYCAASILPLSDDPGWNTYWGQGTQVTVSS
TNF23(TNF3 HUM4)	86	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRSLSNYYMGWFRQAPGKGRELLGNISWRGYNIYYKDSVKGRFTISRDDSKNTIYLQMNSLKPEDTAVYYCAASILPLSDDPGWNTYWGQGTLVTVSS
ALB3(ALB1 HUM1)	87	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS
ALB4(ALB1 HUM2)	88	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS
ALB5(ALB1 HUM3)	89	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS

Таблица 26

Нанотела	Время индукциии	Выход (мг/л)
TNF13	в течение ночи/28°C	8,8
TNF14	в течение ночи/28°C	7
TNF15	короткое/37°C	7,6
TNF16	короткое/37°C	8,7
TNF17	короткое/37°C	7,2
TNF18	короткое/37°C	4,8
TNF19	короткое/37°C	8
TNF20	в течение ночи/28°C	3,5
TNF21	в течение ночи/28°C	7,5
TNF22	в течение ночи/28°C	6
TNF23	в течение ночи/28°C	2,8
ALB3	в течение ночи/28°C	11,8
ALB4	в течение ночи/28°C	9
ALB5	в течение ночи/28°C	11,7

Таблица 27

*анализ:*	*L929s + Act D (5000c/w)*
*TNF:*	*человеческий TNFa при 0,5нг/мл*
	EC ₅₀ в нM			Относительная активность
Нанотела	среднее	станд.откл.	#	среднее	станд.откл.
TNF1	0,707	0,265	14	0,015	0,007
TNF13	0,988	0,014	3	0,014	0,003
TNF14	0,981	0,007	3	0,014	0,003
TNF2	1,412	0,622	14	0,007	0,002
TNF15	1,669	1,253	4	0,002	0,000
TNF16	1,898	0,192	4	0,005	0,001
TNF17	3,023	0,562	4	0,001	0,001
TNF18	1,508	0,481	4	0,004	0,001
TNF19	2,191	0,941	4	0,001	0,001
TNF3	0,224	0,133	14	0,048	0,019
TNF20	0,380	0,080	3	0,035	0,005
TNF21	0,889	0,019	3	0,015	0,003
TNF22	0,303	0,005	3	0,044	0,011
TNF23	0,3	0,011	3	0,044	0,011
Enbrel	0,009	0,005	45	1,002	0,011
Humira	0,079	0,043	39	0,097	0,069
Remicade	0,083	0,037	45	0,103	0,058

Таблица 28

%	Необработан	Комн. темп.
TNF13	100	104	99	98	99	84	93	93
TNF14	100	98	101	95	99	96	99	90
TNF15	100	100	91	99	95	90	59	46
TNF16	100	97	102	101	94	101	58	48
TNF17	100	102	98	100	90	90	69	59
TNF18	100	100	101	97	91	93	63	50
TNF19	100	102	111	98	92	91	60	49
TNF20	100	94	93	93	93	92	85	67
TNF21	100	98	99	101	98	96	36	40
TNF22	100	102	101	105	99	93	25	31
TNF23	100	98	97	99	97	98	87	55
ALB3	100	100	99	98	25	18	60	62
ALB4	100	100	100	100	99	29	61	55
ALB5	100	100	100	99	94	32	61	48

Таблица 29

Название	SEQ ID NO	Последовательность
TNF1-9GS-ALB1-9GS-TNF1(TNF24)	90	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCARSPSGFNRGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCARSPSGFNRGQGTQVTVSS
TNF2-9GS-TNF2-9GS-ALB1(TNF25)	91	QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSEPSGYTYTIGWFRQAPGKEREFVARIYWSSGLTYYADSVKGRFTISRDIAKNTVDLLMNSLKPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVGSYNYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSEPSGYTYTIGWFRQAPGKEREFVARIYWSSGLTYYADSVKGRFTISRDIAKNTVDLLMNSLKPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVGSYNYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSIISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS
TNF3-9GS-ALB1-9GS-TNF3(TNF26)	92	EVQLVESGGGLVQAGGSLSLSCSASGRSLSNYYMGWFRQAPGKERELLGNISWRGYNIYYKDSVKGRFTISRDDAKNTIYLQMNRLKPEDTAVYYCAASILPLSDDPGWNTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQAGGSLSLSCSASGRSLSNYYMGWFRQAPGKERELLGNISWRGYNIYYKDSVKGRFTISRDDAKNTIYLQMNRLKPEDTAVYYCAASILPLSDDPGWNTYWGQGTQVTVSS
TNF1-30GS-TNF1-9GS-ALB1(TNF27)	93	QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCARSPSGFNRGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTALYYCARSPSGFNRGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS
TNF3-30GS-TNF3-9GS-ALB1(TNF28)	94	EVQLVESGGGLVQAGGSLSLSCSASGRSLSNYYMGWFRQAPGKERELLGNISWRGYNIYYKDSVKGRFTISRDDAKNTIYLQMNRLKPEDTAVYYCAASILPLSDDPGWNTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSSGGGGSEVQVVESGGGLVQAGGSLSLSCSASGRSLSNYYMGWFRQAPGKERELLGNISWRGYNIYYKDSVKGRFTISRDDAKNTIYLQMNRLKPEDTAVYYCAASILPLSDDPGWNTYWGQGTQVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKEPEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTQVTVSS
TNF30-9GS-ALB8-9GS-TNF30 (TNF60)	417	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSSggggsgggsEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSggggsgggsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSS
TNF33-9GS-ALB8-9GS-TNF33 (TNF62)	418	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRSLSNYYMGWFRQAPGKGRELLGNISWRGYNIYYKDSVKGRFTISRDDSKNTIYLQMNSLRPEDTAVYYCAASILPLSDDPGWNTYWGQGTLVTVSSggggsgggsEVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSSggggsgggsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRSLSNYYMGWFRQAPGKGRELLGNISWRGYNIYYKDSVKGRFTISRDDSKNTIYLQMNSLRPEDTAVYYCAASILPLSDDPGWNTYWGQGTLVTVSS

Таблица 30

Название	Формат
TNF24	TNF1-9GS-ALB1-9GS-TNF1
TNF25	TNF2-9GS-TNF2-9GS-ALB1
TNF26	TNF3-9GS-ALB1-9GS-TNF3
TNF27	TNF1-30GS-TNF1-9GS-ALB1
TNF28	TNF3-30GS-TNF3-9GS-ALB1

Таблица 31

Нанотела	Время индукциии	Выход (мг/л)
TNF24	в течение носи/28°C	1,7
TNF25	короткое/37°C	0,445
TNF26	короткое/37°C	0,167
TNF27	в течение ночи/28°C	2,2
TNF28	короткое/37°C	1

Таблица 32

*анализ:*	*L929s + Act D (5000c/w)*
*TNF:*	*человеческий TNFa при 0,5нг/мл*
	EC ₅₀ в нM			Относительная активность
Нанотела	среднее	станд.откл.	#	среднее	станд.откл.
TNF24	0,011	0,003	11	0,878	0,248
TNF25	0,018	0,008	14	0,603	0,243
TNF26	0,020	0,009	14	0,583	0,210
TNF27	0,012	0,003	3	0,810	0,037
TNF28	0,021	0,008	6	0,548	0,360
Enbrel	0,009	0,005	45	1,002	0,011
Humira	0,079	0,043	39	0,097	0,069
Remicade	0,083	0,037	45	0,103	0,058

Таблица 33

Человеческий альбумин	K _D (nM)	ka (1/Мс)	kd (1/с)
6A6 (ALB1)	0,57	1,11E+6	6,30E-4
1C2-GS-6A6-GS-1C2 (TNF24)	11	2,26E+05	2,48E-03
1G5-GS-1G5-GS-6A6 (TNF25)	7,2	2,91E+05	2,10E-03
5F10-GS-6A6-GS-5F10 (TNF26)	7,3	2,81E+05	2,05E-03
1C2-GS6-1C2-GS-6A6 (TNF27)	8,9	3,19E+05	2,84E-03
5F10-GS6-5F10-GS-6A6 (TNF28)	14	1,55E+05	2,13E-03

Таблица 34

%	необработан	Комн. темп.
TNF24	100	100	99	98	5	3	8	18
TNF25	100	nd	103	102	95	5	4	6
TNF26	100	109	115	112	107	10	8	10
TNF27	100	102	103	102	22	9	26	34
TNF28	100	97	99	99	66	3	6	10

Таблица 35

Название	SEQ ID NO	Последовательность
TNF29(TNF1 HUM1)	95	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLKPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSS
TNF30(TNF1 HUM2)	96	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYWMYWVRQAPGKGLEWVSEINTNGLITKYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCARSPSGFNRGQGTLVTVSS
TNF31(TNF2 HUM1)	97	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSEPSGYTYTIGWFRQAPGKGREFVARIYWSSGLTYYADSVKGRFTISRDIAKNTVDLQMNSLRPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVGSYNYWGQGTQVTVSS
TNF32(TNF2 HUM2)	98	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSEPSGYTYTIGWFRQAPGKGREFVARIYWSSGLTYYADSVKGRFTISRDIAKNTVDLQMNSLRPEDTAVYYCAARDGIPTSRSVGSYNYWGQGTLVTVSS
TNF33(TNF3 HUM1)	99	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRSLSNYYMGWFRQAPGKGRELLGNISWRGYNIYYKDSVKGRFTISRDDSKNTIYLQMNSLRPEDTAVYYCAASILPLSDDPGWNTYWGQGTLVTVSS
ALB6(ALB1 HUM1)	100	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLKPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
ALB7(ALB1 HUM2)	101	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFRSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
ALB8(ALB1 HUM3)	102	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
ALB9(ALB1 HUM4)	103	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGTLVTVSS
ALB10(ALB1 HUM5)	104	EVQLVESGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSGQGTLVTVSS

Таблица 36

Нанотела™	Время индукциии	выход
TNF29	в течение ночи/28C	2,1 мг/л
TNF30	в течение ночи /28C	2,7 мг/л
TNF31	в течение ночи /28C	2 мг/л
TNF32	в течение ночи /28C	1,5 мг/л
TNF33	в течение ночи /28C	0,5 мг/л

Таблица 37

*анализ:*	*L929s + Act D (5000c/w)*
*TNF:*	*человеческий TNFa при 0,5 нг/мл*
	EC ₅₀ в нM			Относительная активность
V _HH	среднее	станд.откл.	#	среднее	станд.откл.
TNF1	0,707	0,265	14	0,015	0,007
TNF13	0,988	0,014	3	0,014	0,003
TNF14	0,981	0,007	3	0,014	0,003
TNF29	1,336		1	0,013
TNF30	0,985		1	0,017
TNF2	1,412	0,622	14	0,007	0,002
TNF15	5,896	1,253	4	0,002	0,000
TNF16	2,422	0,192	4	0,005	0,001
TNF17	7,555	0,562	4	0,001	0,001
TNF18	3,134	0,481	4	0,004	0,001
TNF19	7,372	0,941	4	0,001	0,001
TNF31	2,195		1	0,008
TNF32	2,506		1	0,007
TNF3	0,224	0,133	14	0,048	0,019
TNF20	0,380	0,080	3	0,035	0,005
TNF21	0,889	0,019	3	0,015	0,003
TNF22	0,303	0,005	3	0,004	0,011
TNF23	0,3	0,011	3	0,04	0,011
TNF33	0,3		1	0,057
Enbrel	0,009	0,005	45	1,002	0,011
Humira	0,079	0,043	39	0,097	0,069
Remicade	0,083	0,037	45	0,103	0,058

Таблица 38

	необработан	комн. темп.
TNF29	100	100	100	100	100	96	91	89
TNF30	100	100	100	99	100	96	92	89
TNF31	100	100	100	98	91	84	56	43
TNF32	100	99	98	97	87	78	45	39
TNF33	100	98	97	97	94	91	79	49

Таблица 39

*анализ:*	*альфаKYM (10000c/w)*
*TNF:*	*человеческий TNFa при 1нг/мл*
Нанотела	EC ₅₀ в нM
TNF1	2,466
TNF2	4,236
TNF3	0,655
TNF4	0,069
TNF5	0,008
TNF6	0,121
TNF7	0,009
TNF8	0,013
TNF9	0,020
Enbrel	0,040
Humira	0,103
Remicade	0,100

*Результаты из WO 04/41862*
Нанотела	SEQ ID No	EC50 в нM
1A	1	100
3E	4	12
3G	5	20
Remicade		0,080

Таблица 40

M13_rev	SEQ ID NO: 421	GGATAACAATTTCACACAGG
Rev_9GlySer_L108	SEQ ID NO: 422	TCAGTAACCTGGATCCGCCACCGCTGCCTCCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCAG
For_GS/Short	SEQ ID NO: 423	AGGTTACTGAGGATCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG
Rev_15BspEI_L108	SEQ ID NO: 424	TCAGTAACCTTCCGGAACCGCCACCGCCTGAGGAGACGGTGACAAG
For_BspEI	SEQ ID NO: 425	AGGTTACTGATCCGGAGGCGGTAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG
M13_for	SEQ ID NO: 426	CACGACGTTGTAAAACGAC

Таблица 41

Обратный праймер		Последовательность
PiRevhumNot/a40c (Not1)	SEQ ID NO: 427	ATGGTGGTGTGCGGCCGCCTATTATGAGGAGACGGTGACCAGG
Прямой праймер
Pi2for (Xho1)	SEQ ID NO: 428	AGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG

Таблица 42

*Человеческий TNFα*	EC ₅₀ в нM
VHH	среднее	станд.откл.	Число анализов
TNF60	0,010	0,002	6
Enbrel	0,014	0,009	33
Humira	0,141	0,074	33
Remicade	0,120	0,037	33

Таблица 43

		человеческий альбумин	альбумин макаки-резус
TNF60	K_D(нM)	24,4	24,1
	k_on (1/Мс)	2,05E+05	2,09E+05
	k_off(1/с)	5,02E-03	5,04E-03
TNF24	K_D(нM)	11	не опр.
	k_on (1/Мс)	2.26E+05	не опр.
	k_off(1/с)	2.48E-03	не опр.

Таблица 44

PiForLong	SEQ ID NO: 429	GCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG
Rev_30GlySer_L108	SEQ ID NO: 430	TCAGTAACCTGGATCCCCCGCCACCGCTGCCTCCACCGCCGCTACCCCCGCCACCGC TGCCTCCACCGCCTGAGGAGACGGTGACAAG
For_GlySer	SEQ ID NO: 431	AGGTTACTGAGGATCCGGCGGTGGAGGCAGCGGTGGCGGGGGTAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG
PiRevCys1hum	SEQ ID NO: 432	ATGGTGGTGTGAATTCTTATTAGCAGGAGACGGTGACAAGG
PiRevCys2hum	SEQ ID NO: 433	ATGGTGGTGTGAATTCTTATTAGCAACCTCCACCTGAGGAGACGGTGACAAGG
AOXIFor	SEQ ID NO: 434	GACTGGTTCCAATTGACAAGC
AOXIRev	SEQ ID NO: 435	GCAAATGGCATTCTGACATCC

Таблица 45

*Человеческий TNFα*	EC ₅₀ в нM
VHH	среднее	станд.откл.	Число анализов
TNF1	0,748	0,153	27
TNF55-PEG40	0,004	0,001	8
TNF55-PEG60	0,004	0,002	6
TNF55-Биотин	0,012	0,003	5
TNF56-PEG40	0,006	0,003	57
TNF56-PEG60	0,005	0,003	7
TNF56-Биотин	0,017	0,009	13
Enbrel	0,013	0,006	71
Humira	0,127	0,058	67
Remicade	0,144	0,061	67

Таблица 46

Таблица 47

	Общее число WBC (x10⁶/мл)
Дозовая группа	ALX0071	Etanercept
Носитель КМЦ	0,86 ± 0,09
0,1 мкг человеческий TNFα	3,72 ± 0,21
0,0625 мг/кг	3,03 ± 0,6	-
0,125 мг/кг	1,23 ± 0,3**	2,40 ± 0,39
0,25 мг/кг	1,37 ± 0,17*	2,47 ± 0,54
05 мг/кг	-	2,19 ± 0,10

*P<0,05, **P<0,01 по сравнению с 0,1 мкг человеческого TNFα

Специалист в данной области сможет определить или будет способен установить при использовании не более чем рутинных экспериментов, многие эквиваленты для специфических воплощений изобретения, описанных выше. Такие эквиваленты, как предполагается, охватываются следующей формулой изобретения.

Все ссылки, приведенные здесь, включены во всей полноте, путем отсылки.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Ablynx N.V.

<120> Improved Nanobodies™ against Tumor Necrosis Factor-alpha

<130> ABL-027-PCT

<140> PCT/EP2006/004678

<141> 2006-05-17

<150> 60/682,332

<151> 2005-05-18

<160> 476

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> Hallmark residue

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Xaa Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25

<210> 2

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> Hallmark residue

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (9)..(10)

<223> Hallmark residue

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (12)..(12)

<223> Hallmark residue

<400> 2

Trp Xaa Arg Gln Ala Pro Gly Lys Xaa Xaa Glu Xaa Val Ala

1 5 10

<210> 3

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (21)..(22)

<223> Hallmark residue

<400> 3

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Xaa Xaa Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

20 25 30

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(2)

<223> Hallmark residue

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Hallmark residue

<400> 4

Xaa Xaa Gln Gly Thr Xaa Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 5

<211> 26

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

20 25

<210> 6

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 6

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 7

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 8

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Ala

1 5 10

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 9

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10

<210> 10

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 10

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 11

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 11

Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ala

1 5 10

<210> 12

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 12

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

20 25 30

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 13

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 14

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 15

Asp Tyr Trp Met Tyr

1 5

<210> 16

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 16

Glu Pro Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly

1 5 10

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 17

Asn Tyr Tyr Met Gly

1 5

<210> 18

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 18

Val Ser Trp Met Tyr

1 5

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 19

Ala His Ser Val Tyr Thr Met Gly

1 5

<210> 20

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 20

Gly Tyr Tyr Met Gly

1 5

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 21

Asp Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Val Gly

1 5 10

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 22

Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 23

Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 24

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 24

Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 25

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 25

Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Val Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 26

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 26

Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 27

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 27

Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 28

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 28

Ser Ile Ser Trp Arg Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Lys Glu Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 29

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 29

Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val Gly Ser Tyr Asn Tyr

1 5 10 15

<210> 30

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 30

Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 31

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 31

Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val Glu Ala Tyr Asn Tyr

1 5 10 15

<210> 32

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 32

Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Asn

1 5 10

<210> 33

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 33

Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val Glu Ser Tyr Asn Tyr

1 5 10 15

<210> 34

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 34

Ser Pro Ser Gly Phe Asn

1 5

<210> 35

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 35

Ser Pro Ser Gly Ser Phe

1 5

<210> 36

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 36

Ser Phe Gly Met Ser

1 5

<210> 37

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 37

Leu Asn Leu Met Gly

1 5

<210> 38

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 38

Ile Asn Leu Leu Gly

1 5

<210> 39

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 39

Asn Tyr Trp Met Tyr

1 5

<210> 40

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 40

Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 41

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 41

Thr Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 42

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 42

Thr Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 43

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 43

Ser Ile Asn Gly Arg Gly Asp Asp Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 44

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 44

Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Thr Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 45

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 45

Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Asp Lys Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 46

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 46

Arg Ile Ser Thr Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 47

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 47

Asp Arg Glu Ala Gln Val Asp Thr Leu Asp Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 48

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 48

Gly Gly Ser Leu Ser Arg

1 5

<210> 49

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 49

Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu

1 5

<210> 50

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 50

Gly Arg Ser Val Ser Arg Ser

1 5

<210> 51

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 51

Gly Arg Gly Ser Pro

1 5

<210> 52

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 52

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 53

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 53

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Met Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Gly Val Ser

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Ser Gly Ser Phe Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 54

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 54

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Asp Phe Ser Val Ser

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Ile Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Ser Gly Ser Phe Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 55

<211> 129

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 55

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro

20 25 30

Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys

35 40 45

Glu Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr

50 55 60

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Asp Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser

100 105 110

Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 56

<211> 129

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 56

Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys

35 40 45

Glu Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Asn Thr Tyr

50 55 60

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Asp Leu Leu Met Asn Asn Leu Glu Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser

100 105 110

Val Glu Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 57

<211> 129

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 57

Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys

35 40 45

Glu Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Asn Thr Tyr

50 55 60

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Asp Leu Leu Met Asn Asn Leu Glu Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser

100 105 110

Val Glu Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 58

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 58

Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ala His

20 25 30

Ser Val Tyr Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg

35 40 45

Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala

50 55 60

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

65 70 75 80

Thr Val Asp Leu Leu Met Asn Cys Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val Glu

100 105 110

Ala Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 59

<211> 123

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 59

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Gln Leu Leu

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Trp Arg Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Lys Glu Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Asn

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 60

<211> 123

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 60

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 61

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 61

Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Glu Arg Ile Phe Asp Leu Asn

20 25 30

Leu Met Gly Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Asn Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Cys Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Met Asp Tyr Thr Lys Gln Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu His Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Lys Ile Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 62

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 62

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Glu Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Glu Arg Ile Trp Asp Ile Asn

20 25 30

Leu Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Asn Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Asp Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys Lys

85 90 95

Ile Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 63

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 63

Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 64

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 64

Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Gly Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Tyr Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Asn Gly Arg Gly Asp Asp Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Glu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Arg Ser Val Ser Arg Ser Arg Thr Gln Gly Thr Gln Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 65

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 65

Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Gln Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Thr Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Ile Gly Arg Gly Ser Pro Ser Ser Pro Gly Thr Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 66

<211> 114

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 66

Gln Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Asp Lys Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Ile Gly Arg Gly Ser Pro Ala Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 67

<211> 123

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 67

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Val Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Ile

35 40 45

Ser Arg Asp Ile Ser Thr Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Lys Asp Arg Glu Ala Gln Val Asp Thr Leu Asp Phe Asp Tyr

100 105 110

Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 68

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> linker

<400> 68

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 69

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> linker

<400> 69

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

<210> 70

<211> 239

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 70

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu

115 120 125

Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu

130 135 140

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Met Tyr Trp

145 150 155 160

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Glu Ile Asn

165 170 175

Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

180 185 190

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn

195 200 205

Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Pro

210 215 220

Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

225 230 235

<210> 71

<211> 267

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 71

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro

20 25 30

Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys

35 40 45

Glu Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr

50 55 60

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Asp Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser

100 105 110

Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Glu

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

145 150 155 160

Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr

165 170 175

Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

180 185 190

Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

195 200 205

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu

210 215 220

Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

225 230 235 240

Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val Gly Ser Tyr Asn Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

260 265

<210> 72

<211> 255

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 72

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

130 135 140

Gln Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Arg Ser

145 150 155 160

Leu Ser Asn Tyr Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu

165 170 175

Arg Glu Leu Leu Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr

180 185 190

Lys Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys

195 200 205

Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala

210 215 220

Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly

225 230 235 240

Trp Asn Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

245 250 255

<210> 73

<211> 260

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 73

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp

165 170 175

Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val

245 250 255

Thr Val Ser Ser

260

<210> 74

<211> 288

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 74

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro

20 25 30

Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys

35 40 45

Glu Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr

50 55 60

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Asp Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser

100 105 110

Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

145 150 155 160

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser

165 170 175

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro Ser

180 185 190

Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu

195 200 205

Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr Tyr

210 215 220

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys

225 230 235 240

Asn Thr Val Asp Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala

245 250 255

Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val

260 265 270

Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

275 280 285

<210> 75

<211> 276

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 75

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser

145 150 155 160

Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser

165 170 175

Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln

180 185 190

Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly

195 200 205

Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

210 215 220

Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys

225 230 235 240

Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu

245 250 255

Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

260 265 270

Thr Val Ser Ser

275

<210> 76

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 76

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 77

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 77

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 78

<211> 129

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 78

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro

20 25 30

Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys

35 40 45

Gly Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr

50 55 60

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser

100 105 110

Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 79

<211> 129

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 79

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Glu Pro

20 25 30

Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys

35 40 45

Gly Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr

50 55 60

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser

100 105 110

Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 80

<211> 129

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 80

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro

20 25 30

Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys

35 40 45

Gly Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr

50 55 60

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser

100 105 110

Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 81

<211> 129

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 81

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro

20 25 30

Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys

35 40 45

Gly Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr

50 55 60

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser

100 105 110

Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 82

<211> 129

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 82

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro

20 25 30

Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys

35 40 45

Gly Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr

50 55 60

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser

100 105 110

Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 83

<211> 123

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 83

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Leu

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ile Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 84

<211> 123

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 84

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Leu

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ile Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 85

<211> 123

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 85

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Leu

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ile Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 86

<211> 123

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 86

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Leu

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ile Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 87

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 87

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 88

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 88

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 89

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 89

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 90

<211> 363

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 90

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu

115 120 125

Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu

130 135 140

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser Trp

145 150 155 160

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser

165 170 175

Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

180 185 190

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn

195 200 205

Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly

210 215 220

Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

245 250 255

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

260 265 270

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala

275 280 285

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu

290 295 300

Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

305 310 315 320

Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro

325 330 335

Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn

340 345 350

Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

355 360

<210> 91

<211> 391

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 91

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro

20 25 30

Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys

35 40 45

Glu Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr

50 55 60

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Asp Leu Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser

100 105 110

Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys

145 150 155 160

Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Glu Pro Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr

165 170 175

Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

180 185 190

Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

195 200 205

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu

210 215 220

Leu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

225 230 235 240

Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val Gly Ser Tyr Asn Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

260 265 270

Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

275 280 285

Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

290 295 300

Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu

305 310 315 320

Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr

325 330 335

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

340 345 350

Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala

355 360 365

Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly

370 375 380

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

385 390

<210> 92

<211> 379

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 92

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

130 135 140

Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

145 150 155 160

Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu

165 170 175

Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr

180 185 190

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

195 200 205

Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala

210 215 220

Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly

225 230 235 240

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

245 250 255

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

260 265 270

Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr

275 280 285

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu

290 295 300

Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val

305 310 315 320

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr

325 330 335

Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

340 345 350

Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr

355 360 365

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

370 375

<210> 93

<211> 384

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 93

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp

165 170 175

Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val

245 250 255

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln

260 265 270

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg

275 280 285

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser

290 295 300

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile

305 310 315 320

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

325 330 335

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met

340 345 350

Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly

355 360 365

Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

370 375 380

<210> 94

<211> 400

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 94

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Val Val Glu Ser

145 150 155 160

Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser

165 170 175

Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln

180 185 190

Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly

195 200 205

Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

210 215 220

Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys

225 230 235 240

Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu

245 250 255

Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

260 265 270

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln

275 280 285

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg

290 295 300

Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser

305 310 315 320

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile

325 330 335

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg

340 345 350

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met

355 360 365

Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly

370 375 380

Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

385 390 395 400

<210> 95

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 95

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 96

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 96

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 97

<211> 129

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 97

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Glu Pro

20 25 30

Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys

35 40 45

Gly Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr

50 55 60

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser

100 105 110

Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 98

<211> 129

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 98

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Glu Pro

20 25 30

Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys

35 40 45

Gly Arg Glu Phe Val Ala Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr

50 55 60

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala

65 70 75 80

Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

85 90 95

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser

100 105 110

Val Gly Ser Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 99

<211> 123

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 99

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Leu

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ile Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 100

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 100

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 101

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 101

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 102

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 102

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 103

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 103

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 104

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 104

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 105

<211> 130

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 105

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gln Ile Ile Phe Gly Ser His

20 25 30

Val Ala Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Pro Ser Gly Asp Phe Gly Pro Glu Gly Glu Phe Glu

50 55 60

His Val Thr Ala Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ala Lys Asn Ser

65 70 75 80

Val Asp Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

85 90 95

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Pro Tyr Arg Gly Gly Arg Asp

100 105 110

Tyr Arg Trp Glu Tyr Glu Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val

115 120 125

Thr Val

130

<210> 106

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 106

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Ser Asn Ala Tyr

20 25 30

Ala Thr Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Gln Trp Ser Gly Gly Asp Ala Phe Tyr Arg Asn Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Arg Ile Thr Arg Asp Pro Asp Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Gln Lys Leu Ser Pro Tyr Tyr Asn Asp Phe Asp Ser Ser Asn Tyr Glu

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

115 120

<210> 107

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 107

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Gln Leu Phe Ser Thr Asn

20 25 30

Asp Val Gly Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Asp Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Gly Asp Asp Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Val Ile Ser Arg Glu Gly Glu Met Val Tyr Leu Glu Met

65 70 75 80

Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ile Asn

85 90 95

Arg Leu Arg Ser Thr Trp Gly Ile Arg Tyr Asp Val Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 108

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 108

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Thr

20 25 30

Ser Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Phe Glu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Arg Arg Gly Tyr Gly Arg Asp Arg Ser Lys Gly Ile Gln Val Thr

100 105 110

Val Ala Ser

115

<210> 109

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 109

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Thr Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Ser Ser Val

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Leu

35 40 45

Ala Gly Val Gly Tyr Asp Gly Ser Ser Ile Arg Tyr Ala Glu Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg Gly Asn Arg Glu Ser Thr Val Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Glu Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Thr Ala Glu Pro Ile Gly Ala Tyr Glu Gly Leu Trp Thr Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 110

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(4)

<223> unknown amino acid residues, probably EVQL, QVQL or a similar

sequence

<400> 110

Xaa Xaa Xaa Xaa Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Met Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Ser Ser Tyr Ala Asp Phe Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Gly Leu Thr Pro Gln Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Gly Ser Tyr Ser Asn Gly Asn Pro His Arg Phe Ser Gln Tyr Gln

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 111

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (77)..(77)

<223> Unknown amino acid residue

<400> 111

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Trp Gly Gly Gly Ser Ile Val Tyr Ala Glu Ser Ala

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Xaa Thr Met Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ala Asn Asn Ile Ala Thr Leu Arg Gln Gly Ser Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 112

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 112

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Asn Phe Val Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Trp Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Ser Asn Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Arg Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Val Val Gln Val Ile Asp Pro Ser Trp Ser Gly Val Asn Leu Asp

100 105 110

Asp Tyr Asp Tyr Leu Gly Ser Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 113

<211> 124

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 113

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Ser Asn Ala Tyr

20 25 30

Ala Thr Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Gln Trp Ser Gly Gly Asp Ala Phe Tyr Arg Asn Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Arg Ile Thr Arg Asp Pro Asp Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Gln Lys Leu Ser Pro Tyr Tyr Asn Asp Phe Asp Ser Ser Asn Tyr Glu

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 114

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 114

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Thr Ile Ser Ser Ile Val

20 25 30

Met Leu Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Thr Ile Gly Ser Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn

85 90 95

Ala Val Pro Pro Arg Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 115

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 115

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gln Thr Ser Ser Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Arg Ile Ser Gly Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Arg Ala

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Met Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Arg Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Val Pro Arg Tyr Glu Asn Gln Trp Ser Ser Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 116

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 116

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Asp Ser Gly Gly Gly Ser Pro Met Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Phe Ser Thr Gly Ala Asp Gly Gly Ser Trp Tyr Trp Ser Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Ser Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 117

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 117

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Glu Arg Ser Ser Asn Arg Tyr

20 25 30

Asn Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Leu

35 40 45

Ala Arg Val Asp Val Ser Gly Gly Asn Thr Leu Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Ile Asn Gly Lys Asn Ala Met Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Gly Trp Gly Thr Thr Gln Tyr Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 118

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 118

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Cys Val Ser Ser Gly Cys Thr Phe Ser

20 25 30

Ala Tyr Ser Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Glu Glu

35 40 45

Trp Val Ser Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Asn Gly Arg Phe Lys Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Gly Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Gln Arg Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Arg Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 119

<211> 129

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 119

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ser Ser Gly Arg Gly Phe Tyr Lys Asn

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ser Ile Lys Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Gly Asn Ala Lys Asn Thr Glu Asn

65 70 75 80

Thr Val Ser Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Ser Ser His Tyr Ser Tyr Val Tyr Ser Lys

100 105 110

Ala Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser

115 120 125

Ser

<210> 120

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 120

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Phe Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ala Ser

20 25 30

Ser Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Tyr Glu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Arg Arg Gly Tyr Gly Arg Asp Arg Ser Gln Gly Ile Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 121

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (119)..(119)

<223> Unknown amino acid residue

<400> 121

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Trp Ser Gly Thr Ile Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val His

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys

85 90 95

Ala Val Val Gln Pro Tyr Ser Gly Gly Asp Tyr Tyr Thr Gly Val Glu

100 105 110

Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Xaa Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 122

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 122

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Thr

20 25 30

Ser Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Glu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Asp Leu Gln Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Arg Arg Gly Tyr Gly Arg Asp Arg Ser Arg Gly Ile Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 123

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 123

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ala Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Asp Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Arg Glu Ile Val

35 40 45

Ala Arg Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Ser Ser Asn Arg Ala

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Arg Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ala Ala Arg Tyr Asn Gly Thr Trp Ser Ser Asn Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 124

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 124

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Cys Val Ser Ser Gly Cys Thr Phe Ser

20 25 30

Ala Tyr Ser Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Glu Glu

35 40 45

Phe Val Ser Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asn

50 55 60

Ser Val Asn Gly Arg Phe Lys Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Gly Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Gln Arg Arg Gly Tyr Ala Leu Asp Arg Gly Gln Gly Thr Gln

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 125

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 125

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gln Thr Ser Ser Thr Ala

20 25 30

Asp Met Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Gln Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Arg Ser Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 126

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 126

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Thr

20 25 30

Ser Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Phe Glu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

85 90 95

Gly Arg Arg Gly Tyr Gly Arg Asp Arg Ser Lys Gly Ile Gln Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 127

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 127

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Ala Ser Gly Val Lys Val Asn

20 25 30

Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Thr Ile Thr Asp Asp Gly Arg Thr Asn Tyr Glu Asp Phe Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Leu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ala Arg Thr Tyr Trp Ala His Leu Pro Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Gln Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 128

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 128

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Gly Ser Val

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Gly Tyr Asp Gly Asn Ser Ile Arg Tyr Gly Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ile Lys Asn Thr Met Tyr

65 70 75 80

Leu Glu Met Glu Asn Leu Asn Ala Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Leu Cys

85 90 95

Ala Ala Glu Pro Leu Ala Arg Tyr Glu Gly Leu Trp Thr Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 129

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody

<400> 129

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Thr Arg Thr Asn Asp Arg Phe

20 25 30

Asn Met Ala Trp Phe His Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Arg Ile Asp Val Ala Gly Tyr Asn Thr Ala Tyr Gly Asp Phe Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Ser Ala Glu Asn Thr Val Val

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Gly Trp Gly Ile Ser Gln Ser Asp Tyr Asp Leu Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 130

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 130

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 131

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 131

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Met Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Gly

20 25 30

<210> 132

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 132

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Asp Phe Ser

20 25 30

<210> 133

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 133

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 134

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 134

Gln Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 135

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 135

Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 136

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 136

Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 137

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 137

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Thr

20 25 30

<210> 138

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 138

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ser Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser

20 25 30

<210> 139

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 139

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gln Ile Ile Phe Gly

20 25 30

<210> 140

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 140

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Ser Asn

20 25 30

<210> 141

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 141

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Gln Leu Phe Ser

20 25 30

<210> 142

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 142

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 143

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 143

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Thr Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Ser

20 25 30

<210> 144

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(4)

<223> Unknown amino acid residues, probably EVQL, QVQL or a similar

sequence

<400> 144

Xaa Xaa Xaa Xaa Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Met Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Met Phe Ser

20 25 30

<210> 145

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 145

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Gly

20 25 30

<210> 146

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 146

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Arg Asn Phe Val

20 25 30

<210> 147

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 147

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Asn Ala Gly Ser Thr Ser Asn

20 25 30

<210> 148

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 148

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Thr Ile Ser Ser

20 25 30

<210> 149

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 149

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gln Thr Ser Ser

20 25 30

<210> 150

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 150

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 151

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 151

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Glu Arg Ser Ser Asn

20 25 30

<210> 152

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 152

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Cys Val Ser Ser Gly Cys Thr

20 25 30

<210> 153

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 153

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ser Ser Gly Arg Gly Phe Tyr

20 25 30

<210> 154

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 154

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Phe Ser Gly Phe Ala Phe Ser

20 25 30

<210> 155

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 155

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 156

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 156

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 157

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 157

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Gly Ala Phe Ser

20 25 30

<210> 158

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 158

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Cys Val Ser Ser Gly Cys Thr

20 25 30

<210> 159

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 159

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Gln Thr Ser Ser

20 25 30

<210> 160

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 160

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 161

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 161

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Ala Ser Gly Val Lys

20 25 30

<210> 162

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 162

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Phe Gly

20 25 30

<210> 163

<211> 29

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 163

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Thr Ser Thr Arg Thr Asn

20 25

<210> 164

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 164

Asp Tyr Trp Met Tyr

1 5

<210> 165

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 165

Val Ser Trp Met Tyr

1 5

<210> 166

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 166

Val Ser Trp Met Tyr

1 5

<210> 167

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 167

Glu Pro Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Ile Gly

1 5 10

<210> 168

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 168

Asp Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Val Gly

1 5 10

<210> 169

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 169

Asp Tyr Ser Gly Tyr Thr Tyr Thr Val Gly

1 5 10

<210> 170

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 170

Ala His Ser Val Tyr Thr Met Gly

1 5

<210> 171

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 171

Gly Tyr Tyr Met Gly

1 5

<210> 172

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 172

Asn Tyr Tyr Met Gly

1 5

<210> 173

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 173

Ser His Val Ala Ala

1 5

<210> 174

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 174

Ala Tyr Ala Thr Gly

1 5

<210> 175

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 175

Thr Asn Asp Val Gly

1 5

<210> 176

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 176

Thr Thr Ser Met Thr

1 5

<210> 177

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 177

Ser Val Ala Met Gly

1 5

<210> 178

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 178

Asp Ser Ala Met Gly

1 5

<210> 179

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 179

Thr Tyr Ala Met Gly

1 5

<210> 180

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 180

Thr Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 181

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 181

Ala Tyr Ala Thr Gly

1 5

<210> 182

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 182

Ile Val Met Leu Gly

1 5

<210> 183

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 183

Ser Tyr Asp Met Gly

1 5

<210> 184

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 184

Thr Tyr Asp Met Ser

1 5

<210> 185

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 185

Arg Tyr Asn Met Ala

1 5

<210> 186

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 186

Phe Ser Ala Tyr Ser Met Thr

1 5

<210> 187

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 187

Lys Asn Ala Met Gly

1 5

<210> 188

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 188

Ala Ser Ser Met Ala

1 5

<210> 189

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 189

Ser Tyr Ala Met Gly

1 5

<210> 190

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 190

Ala Thr Ser Met Thr

1 5

<210> 191

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 191

Asn Tyr Asp Val Gly

1 5

<210> 192

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 192

Phe Ser Ala Tyr Ser Met Thr

1 5

<210> 193

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 193

Thr Ala Asp Met Gly

1 5

<210> 194

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 194

Thr Thr Ser Met Thr

1 5

<210> 195

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 195

Val Asn Asp Met Gly

1 5

<210> 196

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 196

Ser Val Ala Met Gly

1 5

<210> 197

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 197

Asp Arg Phe Asn Met Ala

1 5

<210> 198

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 198

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 199

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 199

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 200

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 200

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 201

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 201

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 202

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 202

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 203

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 203

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 204

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 204

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 205

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 205

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Gln Leu Leu Ala

1 5 10

<210> 206

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 206

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu Gly

1 5 10

<210> 207

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 207

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Arg Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 208

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 208

Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 209

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 209

Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10

<210> 210

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 210

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Phe Glu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 211

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 211

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Phe Leu Ala

1 5 10

<210> 212

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 212

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 213

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 213

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 214

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 214

Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 215

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 215

Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 216

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 216

Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Trp Val Ala

1 5 10

<210> 217

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 217

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 218

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 218

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 219

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 219

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Leu Ala

1 5 10

<210> 220

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 220

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Glu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 221

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 221

Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 222

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 222

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Tyr Glu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 223

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 223

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 224

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 224

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Glu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 225

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 225

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Arg Glu Ile Val Ala

1 5 10

<210> 226

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 226

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Glu Glu Phe Val Ser

1 5 10

<210> 227

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 227

Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 228

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 228

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Phe Glu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 229

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 229

Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10

<210> 230

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 230

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 231

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 231

Trp Phe His Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val Ser

1 5 10

<210> 232

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 232

Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 233

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 233

Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 234

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 234

Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Val Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 235

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 235

Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 236

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 236

Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 237

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 237

Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 238

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 238

Arg Ile Tyr Trp Ser Ser Ala Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 239

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 239

Ser Ile Ser Trp Arg Gly Asp Asn Thr Tyr Tyr Lys Glu Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 240

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 240

Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 241

<211> 23

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 241

Glu Ile Arg Pro Ser Gly Asp Phe Gly Pro Glu Gly Glu Phe Glu His

1 5 10 15

Val Thr Ala Ser Leu Lys Gly

20

<210> 242

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 242

Gly Ile Gln Trp Ser Gly Gly Asp Ala Phe Tyr Arg Asn Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 243

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 243

Thr Ile Thr Asp Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Gly Asp Asp Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 244

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 244

Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 245

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 245

Gly Val Gly Tyr Asp Gly Ser Ser Ile Arg Tyr Ala Glu Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 246

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 246

Thr Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Ser Ser Tyr Ala Asp Phe Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 247

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 247

Ala Ile Ser Trp Gly Gly Gly Ser Ile Val Tyr Ala Glu Ser Ala Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 248

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 248

Ser Ile Ser Trp Ser Gly Asp Thr Thr Tyr Tyr Ser Asn Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 249

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 249

Gly Ile Gln Trp Ser Gly Gly Asp Ala Phe Tyr Arg Asn Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 250

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 250

Ser Ile Thr Ile Gly Ser Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 251

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 251

Arg Ile Ser Gly Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Arg Ala Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 252

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 252

Gly Ile Asp Ser Gly Gly Gly Ser Pro Met Tyr Val Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 253

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 253

Arg Val Asp Val Ser Gly Gly Asn Thr Leu Tyr Gly Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 254

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 254

Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Asn

1 5 10 15

Gly

<210> 255

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 255

Ser Ile Lys Trp Asn Gly Asn Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Arg

1 5 10 15

Gly

<210> 256

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 256

Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 257

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 257

Ala Ile Ser Trp Ser Gly Thr Ile Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 258

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 258

Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 259

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 259

Arg Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Ser Ser Asn Arg Ala Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 260

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 260

Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asn Ser Val Asn

1 5 10 15

Gly

<210> 261

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 261

Arg Ile Ser Gly Ile Asp Gly Thr Thr Tyr Tyr Asp Glu Pro Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 262

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 262

Phe Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 263

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 263

Thr Ile Thr Asp Asp Gly Arg Thr Asn Tyr Glu Asp Phe Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 264

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 264

Ala Ile Gly Tyr Asp Gly Asn Ser Ile Arg Tyr Gly Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 265

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 265

Arg Ile Asp Val Ala Gly Tyr Asn Thr Ala Tyr Gly Asp Phe Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 266

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 266

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 267

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 267

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 268

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 268

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asp Ser Leu Ile Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Arg

20 25 30

<210> 269

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 269

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu Leu

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

20 25 30

<210> 270

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 270

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu Leu

1 5 10 15

Met Asn Asn Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

20 25 30

<210> 271

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 271

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ile Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu Leu

1 5 10 15

Met Asn Asn Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

20 25 30

<210> 272

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 272

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp Leu Leu

1 5 10 15

Met Asn Cys Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

20 25 30

<210> 273

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 273

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

20 25 30

<210> 274

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 274

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr Ile Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

20 25 30

<210> 275

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 275

Arg Phe Thr Ile Ala Lys Asn Ser Val Asp Asn Thr Val Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

20 25 30

<210> 276

<211> 31

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 276

Arg Phe Arg Ile Thr Arg Asp Pro Asp Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met

1 5 10 15

Asn Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Gln

20 25 30

<210> 277

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 277

Arg Phe Val Ile Ser Arg Glu Gly Glu Met Val Tyr Leu Glu Met Asn

1 5 10 15

Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ile

20 25 30

<210> 278

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 278

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gly Arg

20 25 30

<210> 279

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 279

Arg Phe Thr Ile Ala Arg Gly Asn Arg Glu Ser Thr Val Phe Leu Gln

1 5 10 15

Met Glu Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Ala

20 25 30

<210> 280

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 280

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Gly Leu Thr Pro Gln Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Gly

20 25 30

<210> 281

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (11)..(11)

<223> unknown amino acid residue

<400> 281

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Xaa Thr Met Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

20 25 30

<210> 282

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 282

Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Arg

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Val

20 25 30

<210> 283

<211> 31

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 283

Arg Phe Arg Ile Thr Arg Asp Pro Asp Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met

1 5 10 15

Asn Asp Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Gln

20 25 30

<210> 284

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 284

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Asn Ala

20 25 30

<210> 285

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 285

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asp Arg Leu Lys Pro Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Val

20 25 30

<210> 286

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 286

Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

20 25 30

<210> 287

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 287

Arg Phe Thr Val Ser Arg Ile Asn Gly Lys Asn Ala Met Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Ala

20 25 30

<210> 288

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 288

Arg Phe Lys Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Gly Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Arg

20 25 30

<210> 289

<211> 35

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 289

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Gly Asn Ala Lys Asn Thr Glu Asn Thr Val

1 5 10 15

Ser Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr

20 25 30

Cys Ala Ala

35

<210> 290

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 290

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gly Arg

20 25 30

<210> 291

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 291

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr Val His Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr His Cys Ala Val

20 25 30

<210> 292

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 292

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asp Asp Leu Gln Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gly Arg

20 25 30

<210> 293

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 293

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Arg Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Ala

20 25 30

<210> 294

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 294

Arg Phe Lys Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Gly Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Arg

20 25 30

<210> 295

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 295

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Gln Asn Thr Val Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asp Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Arg Ser

20 25 30

<210> 296

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 296

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Gly Arg

20 25 30

<210> 297

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 297

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Leu Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala

20 25 30

<210> 298

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 298

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ile Lys Asn Thr Met Tyr Leu Glu

1 5 10 15

Met Glu Asn Leu Asn Ala Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Leu Cys Ala Ala

20 25 30

<210> 299

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 299

Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Ser Ala Glu Asn Thr Val Val Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

20 25 30

<210> 300

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 300

Ser Pro Ser Gly Phe Asn

1 5

<210> 301

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 301

Ser Pro Ser Gly Ser Phe

1 5

<210> 302

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 302

Ser Pro Ser Gly Ser Phe

1 5

<210> 303

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 303

Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val Gly Ser Tyr Asn Tyr

1 5 10 15

<210> 304

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 304

Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val Glu Ser Tyr Asn Tyr

1 5 10 15

<210> 305

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 305

Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val Glu Ser Tyr Asn Tyr

1 5 10 15

<210> 306

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 306

Arg Asp Gly Ile Pro Thr Ser Arg Ser Val Glu Ala Tyr Asn Tyr

1 5 10 15

<210> 307

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 307

Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Asn

1 5 10

<210> 308

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 308

Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 309

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 309

Ala Pro Tyr Arg Gly Gly Arg Asp Tyr Arg Trp Glu Tyr Glu Tyr Glu

1 5 10 15

Tyr

<210> 310

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 310

Lys Leu Ser Pro Tyr Tyr Asn Asp Phe Asp Ser Ser Asn Tyr Glu Tyr

1 5 10 15

<210> 311

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 311

Asn Arg Leu Arg Ser Thr Trp Gly Ile Arg Tyr Asp Val

1 5 10

<210> 312

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 312

Arg Gly Tyr Gly Arg Asp

1 5

<210> 313

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 313

Glu Pro Ile Gly Ala Tyr Glu Gly Leu Trp Thr Tyr

1 5 10

<210> 314

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 314

Ser Tyr Ser Asn Gly Asn Pro His Arg Phe Ser Gln Tyr Gln Tyr

1 5 10 15

<210> 315

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 315

Ala Asn Asn Ile Ala Thr Leu Arg Gln Gly Ser

1 5 10

<210> 316

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 316

Val Gln Val Ile Asp Pro Ser Trp Ser Gly Val Asn Leu Asp Asp Tyr

1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 317

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 317

Lys Leu Ser Pro Tyr Tyr Asn Asp Phe Asp Ser Ser Asn Tyr Glu Tyr

1 5 10 15

<210> 318

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 318

Val Pro Pro Arg Asp Asp Tyr

1 5

<210> 319

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 319

Pro Arg Tyr Glu Asn Gln Trp Ser Ser Tyr Asp Tyr

1 5 10

<210> 320

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 320

Phe Ser Thr Gly Ala Asp Gly Gly Ser Trp Tyr Trp Ser Tyr Gly Met

1 5 10 15

Asp Ser

<210> 321

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 321

Gly Gly Trp Gly Thr Thr Gln Tyr Asp Tyr Asp Tyr

1 5 10

<210> 322

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 322

Arg Gly Tyr Ala Leu Asp

1 5

<210> 323

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 323

Asp Ser Ser His Tyr Ser Tyr Val Tyr Ser Lys Ala Tyr Glu Tyr Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 324

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 324

Arg Gly Tyr Gly Arg Asp

1 5

<210> 325

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 325

Val Gln Pro Tyr Ser Gly Gly Asp Tyr Tyr Thr Gly Val Glu Glu Tyr

1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 326

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 326

Arg Gly Tyr Gly Arg Asp

1 5

<210> 327

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 327

Ala Arg Tyr Asn Gly Thr Trp Ser Ser Asn Asp Tyr

1 5 10

<210> 328

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 328

Arg Gly Tyr Ala Leu Asp

1 5

<210> 329

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 329

Pro Arg Tyr Ala Asp Gln Trp Ser Ala Tyr Asp Tyr

1 5 10

<210> 330

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 330

Arg Gly Tyr Gly Arg Asp

1 5

<210> 331

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 331

Arg Thr Tyr Trp Ala His Leu Pro Thr Tyr

1 5 10

<210> 332

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 332

Glu Pro Leu Ala Arg Tyr Glu Gly Leu Trp Thr Tyr

1 5 10

<210> 333

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 333

Gly Gly Trp Gly Ile Ser Gln Ser Asp Tyr Asp Leu

1 5 10

<210> 334

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 334

Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 335

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 335

Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 336

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 336

Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 337

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 337

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 338

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 338

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 339

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 339

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 340

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 340

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 341

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 341

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 342

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 342

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 343

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 343

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 344

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 344

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 345

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 345

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 346

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 346

Arg Ser Lys Gly Ile Gln Val Thr Val Ala Ser

1 5 10

<210> 347

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 347

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 348

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 348

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 349

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 349

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 350

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 350

Leu Gly Ser Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 351

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 351

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 352

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 352

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 353

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 353

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 354

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 354

Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 355

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 355

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 356

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 356

Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 357

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 357

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 358

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 358

Arg Ser Gln Gly Ile Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 359

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> Unknown amino acid residue

<400> 359

Trp Gly Xaa Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 360

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 360

Arg Ser Arg Gly Ile Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 361

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 361

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 362

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 362

Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 363

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 363

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 364

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 364

Arg Ser Lys Gly Ile Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 365

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 365

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 366

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 366

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 367

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 367

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 368

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 368

Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Glu Arg Ile Phe Asp

20 25 30

<210> 369

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 369

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Glu Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ala Cys Ala Ala Ser Glu Arg Ile Trp Asp

20 25 30

<210> 370

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 370

Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg

20 25 30

<210> 371

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 371

Ala Val Gln Leu Val Asp Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Gly

20 25 30

<210> 372

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 372

Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg

20 25 30

<210> 373

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 373

Gln Val Gln Leu Ala Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly

20 25 30

<210> 374

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR1 element

<400> 374

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser

20 25 30

<210> 375

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 375

Leu Asn Leu Met Gly

1 5

<210> 376

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 376

Ile Asn Leu Leu Gly

1 5

<210> 377

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 377

Ser Phe Gly Met Ser

1 5

<210> 378

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 378

Ser Phe Gly Met Ser

1 5

<210> 379

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 379

Ser Phe Gly Met Ser

1 5

<210> 380

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 380

Ser Phe Gly Met Ser

1 5

<210> 381

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR1 element

<400> 381

Asn Tyr Trp Met Tyr

1 5

<210> 382

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 382

Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Asn Glu Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10

<210> 383

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 383

Trp Tyr Arg Gln Gly Pro Gly Asn Glu Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10

<210> 384

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 384

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 385

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 385

Trp Val Arg Gln Tyr Pro Gly Lys Glu Pro Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 386

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 386

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Gln Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 387

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 387

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val Ser

1 5 10

<210> 388

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR2 element

<400> 388

Trp Val Arg Val Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Arg Ile Ser

1 5 10

<210> 389

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 389

Thr Cys Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 390

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 390

Thr Ile Thr Val Gly Asp Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 391

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 391

Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 392

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 392

Ser Ile Asn Gly Arg Gly Asp Asp Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 393

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 393

Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Thr Lys Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 394

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 394

Ala Ile Ser Ala Asp Ser Ser Asp Lys Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 395

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR2 element

<400> 395

Arg Asp Ile Ser Thr Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 396

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 396

Arg Phe Thr Ile Ser Met Asp Tyr Thr Lys Gln Thr Val Tyr Leu His

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys Lys Ile

20 25 30

<210> 397

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 397

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Asp Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Cys Lys Ile

20 25 30

<210> 398

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 398

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile

20 25 30

<210> 399

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 399

Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Glu Tyr Tyr Cys Thr Ile

20 25 30

<210> 400

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 400

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Leu Tyr Leu Glu

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ile

20 25 30

<210> 401

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 401

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Met Leu Tyr Leu Glu

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ile

20 25 30

<210> 402

<211> 32

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR3 element

<400> 402

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln

1 5 10 15

Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Lys

20 25 30

<210> 403

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 403

Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu

1 5

<210> 404

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 404

Arg Arg Thr Trp His Ser Glu Leu

1 5

<210> 405

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 405

Gly Gly Ser Leu Ser Arg

1 5

<210> 406

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 406

Gly Arg Ser Val Ser Arg Ser

1 5

<210> 407

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 407

Gly Arg Gly Ser Pro

1 5

<210> 408

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 408

Gly Arg Gly Ser Pro

1 5

<210> 409

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 409

Asp Arg Glu Ala Gln Val Asp Thr Leu Asp Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 410

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 410

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 411

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 411

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 412

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 412

Ser Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 413

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 413

Arg Thr Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 414

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 414

Ser Ser Pro Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 415

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 415

Ala Ser Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 416

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> FR4 element

<400> 416

Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 417

<211> 363

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 417

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu

115 120 125

Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu

130 135 140

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp

145 150 155 160

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser

165 170 175

Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

180 185 190

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn

195 200 205

Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly

210 215 220

Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

245 250 255

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

260 265 270

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala

275 280 285

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu

290 295 300

Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

305 310 315 320

Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro

325 330 335

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn

340 345 350

Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

355 360

<210> 418

<211> 379

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 418

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Leu

35 40 45

Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ile Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

130 135 140

Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

145 150 155 160

Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

165 170 175

Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr

180 185 190

Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

195 200 205

Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala

210 215 220

Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly

225 230 235 240

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

245 250 255

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

260 265 270

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ser Leu Ser Asn Tyr

275 280 285

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Leu

290 295 300

Gly Asn Ile Ser Trp Arg Gly Tyr Asn Ile Tyr Tyr Lys Asp Ser Val

305 310 315 320

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Ile Tyr

325 330 335

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

340 345 350

Ala Ala Ser Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr

355 360 365

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

370 375

<210> 419

<211> 260

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 419

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp

165 170 175

Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val

245 250 255

Thr Val Ser Cys

260

<210> 420

<211> 264

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody construct

<400> 420

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp

165 170 175

Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val

245 250 255

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Cys

260

<210> 421

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotide primer

<400> 421

ggataacaat ttcacacagg 20

<210> 422

<211> 55

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotide primer

<400> 422

tcagtaacct ggatccgcca ccgctgcctc caccgcctga ggagacggtg accag 55

<210> 423

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotide primer

<400> 423

aggttactga ggatccgagg tgcagctggt ggagtctgg 39

<210> 424

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotide primer

<400> 424

tcagtaacct tccggaaccg ccaccgcctg aggagacggt gacaag 46

<210> 425

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotide primer

<400> 425

aggttactga tccggaggcg gtagcgaggt gcagctggtg gagtctgg 48

<210> 426

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotide primer

<400> 426

cacgacgttg taaaacgac 19

<210> 427

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotide primer

<400> 427

atggtggtgt gcggccgcct attatgagga gacggtgacc agg 43

<210> 428

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotide primer

<400> 428

aggggtatct ctcgagaaaa gagaggtgca gctggtggag tctgg 45

<210> 429

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotide primer

<400> 429

gctaaagaag aaggggtatc tctcgagaaa agagaggtgc agctggtgga gtctgg 56

<210> 430

<211> 88

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotide primer

<400> 430

tcagtaacct ggatcccccg ccaccgctgc ctccaccgcc gctacccccg ccaccgctgc 60

ctccaccgcc tgaggagacg gtgacaag 88

<210> 431

<211> 69

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotide primer

<400> 431

aggttactga ggatccggcg gtggaggcag cggtggcggg ggtagcgagg tgcagctggt 60

ggagtctgg 69

<210> 432

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotide primer

<400> 432

atggtggtgt gaattcttat tagcaggaga cggtgacaag g 41

<210> 433

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotide primer

<400> 433

atggtggtgt gaattcttat tagcaacctc cacctgagga gacggtgaca agg 53

<210> 434

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotide primer

<400> 434

gactggttcc aattgacaag c 21

<210> 435

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> oligonucleotide primer

<400> 435

gcaaatggca ttctgacatc c 21

<210> 436

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR3 element

<400> 436

Ile Leu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Gly Trp Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 437

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 437

Lys Glu Arg Glu

1

<210> 438

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 438

Lys Gln Arg Glu

1

<210> 439

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 439

Gly Leu Glu Trp

1

<210> 440

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 440

Lys Glu Arg Glu Leu

1 5

<210> 441

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 441

Lys Glu Arg Glu Phe

1 5

<210> 442

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 442

Lys Gln Arg Glu Leu

1 5

<210> 443

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 443

Lys Gln Arg Glu Phe

1 5

<210> 444

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 444

Lys Glu Arg Glu Gly

1 5

<210> 445

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 445

Thr Glu Arg Glu

1

<210> 446

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 446

Thr Glu Arg Glu Leu

1 5

<210> 447

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 447

Lys Glu Cys Glu

1

<210> 448

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 448

Lys Glu Cys Glu Leu

1 5

<210> 449

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 449

Lys Glu Cys Glu Arg

1 5

<210> 450

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 450

Arg Glu Arg Glu

1

<210> 451

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 451

Arg Glu Arg Glu Gly

1 5

<210> 452

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 452

Gln Glu Arg Glu

1

<210> 453

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 453

Gln Glu Arg Glu Gly

1 5

<210> 454

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 454

Lys Gly Arg Glu

1

<210> 455

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 455

Lys Gly Arg Glu Gly

1 5

<210> 456

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 456

Lys Asp Arg Glu

1

<210> 457

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 457

Lys Asp Arg Glu Val

1 5

<210> 458

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 458

Asp Glu Cys Lys Leu

1 5

<210> 459

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 459

Asn Val Cys Glu Leu

1 5

<210> 460

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 460

Gly Val Glu Trp

1

<210> 461

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 461

Glu Pro Glu Trp

1

<210> 462

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 462

Gly Leu Glu Arg

1

<210> 463

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 463

Asp Gln Glu Trp

1

<210> 464

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 464

Asp Leu Glu Trp

1

<210> 465

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 465

Gly Ile Glu Trp

1

<210> 466

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 466

Glu Leu Glu Trp

1

<210> 467

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 467

Gly Pro Glu Trp

1

<210> 468

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 468

Glu Trp Leu Pro

1

<210> 469

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 469

Gly Pro Glu Arg

1

<210> 470

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> nanobody element

<400> 470

Gly Leu Glu Arg

1

<210> 471

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> spacer

<400> 471

Gly Gly Gly Cys

1

<210> 472

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> immunoglobulin construct

<400> 472

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105

<210> 473

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> immunoglobulin construct

<400> 473

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Asn Ser Asp Gly Ser Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105

<210> 474

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> immunoglobulin construct

<400> 474

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105

<210> 475

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> immunoglobulin construct

<400> 475

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His

20 25 30

Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 476

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> linker

<400> 476

Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala

1 5 10 15

Ala

<---

Claims

1. Способ лечения болезни, связанной с фактором некроза опухоли α (TNF-α), включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества полипептида, содержащего вариабельную область иммуноглобулина, которая специфически связывается с эпитопом TNF-α с K_D менее чем 500 нМ:

(a) который содержит следующие аминокислотные остатки TNF-α: Gln в положении 88 мономера А, Lys в положении 90 мономера А и Glu в положении 146 мономера В, и дополнительно следующие аминокислотные остатки мономера А TNF-α: Gly в положении 24, Gln в положении 25, Thr в положении 72, His в положении 73, Val в положении 74, Leu в положении 75, Thr в положении 77, Thr в положении 79, Ile в положении 83, Thr в положении 89, Val в положении 91, Asn в положении 92, Ile в положении 97, Arg в положении 131, Glu в положении 135, Ile в положении 136, Asn в положении 137, Arg в положении 138, Pro в положении 139, Asp в положении 140, и следующие остатки в мономере B: Pro в положении 20, Arg в положении 32, Lys в положении 65, Lys в положении 112, Tyr в положении 115, Ala в положении 145, Ser в положении 147, или

(b) который является тем же эпитопом TNF-α, который связывает полипептид, содержащий любой из следующих наборов последовательностей CDR:

- CDR1 является DYWMY (SEQ ID NO:15); CDR2 является EINTNGLITKYPDSVKG (SEQ ID NO:22); и CDR3 является SPSGFN (SEQ ID NO:34);

- CDR1 является VSWMY (SEQ ID NO:18); CDR2 является EINTNGLITKYPDSVKG (SEQ ID NO:22); и CDR3 является SPSGSF (SEQ ID NO:35); или

- CDR1 является VSWMY (SEQ ID NO:18); CDR2 является EINTNGLITKYVDSVKG (SEQ ID NO:25); и CDR3 является SPSGSF (SEQ ID NO:35).

2. Способ по п. 1, где полипептид способен проникать через внутрижелудочную среду без инактивации.

3. Способ по п. 1 или 2, где полипептид ингибирует взаимодействие TNF-α/TNF-α-рецептор.

4. Способ по любому из пп. 1 или 2, где вариабельная область иммуноглобулина конкурирует за связывание с или замещает связывание с эпитопом TNF-α полипептида, содержащего любой из следующих наборов последовательностей CDR:

5. Способ по п. 3, где вариабельная область иммуноглобулина конкурирует за связывание с или замещает связывание с эпитопом TNF-α полипептида, содержащего любой из следующих наборов последовательностей CDR:

6. Способ по любому из пп. 1, 2 или 5, где вариабельная область иммуноглобулина конкурирует за связывание с или замещает связывание с эпитопом TNF-α полипептида, содержащего аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NOs: 52, 53, 54, 76, 77, 95 или 96.

7. Способ по любому из пп. 1, 2 или 5, где вариабельная область иммуноглобулина является однодоменным антителом, вариабельной областью тяжелой цепи или VHH.

8. Способ по любому из пп. 1, 2 или 5, где полипептид вводят как фармацевтическую композицию.

9. Способ по любому из пп. 1, 2 или 5, где полипептид вводят перорально.

10. Способ по п. 8, где фармацевтическая композиция содержит кишечнорастворимое покрытие, которое устойчиво к действию внутрижелудочной среды и проходит в кишечник.

11. Способ по п. 8, где фармацевтическая композиция является принимаемой внутрь таблеткой, буккальной таблеткой, капсулой, эликсиром, суспензией, сиропом или вафлей.

12. Способ по любому из пп. 1, 2 или 5, где болезнь является болезнью Крона, язвенным колитом или воспалительным синдромом кишечника.

13. Способ по п. 8, где фармацевтическая композиция является суппозиторием.

14. Способ по любому из пп. 1, 2 или 5, где полипептид содержит по меньшей мере две вариабельные области иммуноглобулина, которые связывают эпитоп TNF-α.

15. Связывающий TNF-α полипептид, содержащий вариабельную область иммуноглобулина, который специфически связывает эпитоп TNF-α с K_D менее чем 500 нМ:

- CDR1 является DYWMY, обозначенная как SEQ IDNO:15; CDR2 является EINTNGLITKYPDSVKG, обозначенная как SEQ IDNO:22; и CDR3 является SPSGFN, обозначенная как SEQ IDNO:34;

- CDR1 является VSWMY, обозначенная как SEQ IDNO:18; CDR2 является EINTNGLITKYPDSVKG, обозначенная как SEQ IDNO:22; и CDR3 является SPSGSF, обозначенная как SEQ IDNO:35; или

- CDR1 является VSWMY, обозначенная как SEQ IDNO:18; CDR2 является EINTNGLITKYVDSVKG, обозначенная как SEQ IDNO:25; и CDR3 является SPSGSF, обозначенная как SEQ IDNO:35,

где указанный полипептид имеет значение EC50 в клеточном анализе с использованием клеток KYM, которое лучше 5 нМ,

где указанный полипептид получают из большой библиотеки синтетических или природных полипептидов с использованием полипептида, связывающего TNF-α, содержащего любой из следующих наборов последовательностей CDR:

и при этом эпитоп TNF-α, против которого направлен выбранный полипептид, определяют на основе структурного анализа этого полипептида, кристаллизованного в комплексе с молекулой TNF, или на основе другого подхода к картированию эпитопов, такого как картирование эпитопов с помощью метода Рepscan.

16. Полипептид по п. 15, где связывающий TNF-α полипептид является гуманизированным.

17. Полипептид по п. 15 или 16, где связывающий TNF-α полипептид содержит SEQ ID NO: 96 или 52.

18. Полипептид по любому из пп. 15-17, где полипептид способен проникать через внутрижелудочную среду без инактивации.

19. Полипептид по любому из пп. 15-17, где полипептид ингибирует взаимодействие TNF-α/TNF-α-рецептор.

20. Полипептид по любому из пп. 15-17, где вариабельная область иммуноглобулина конкурирует за связывание с или замещает связывание с эпитопом TNF-α полипептида, содержащего аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NOs: 52, 53, 54, 76, 77, 95 или 96.

21. Полипептид по любому из пп. 15-17, где вариабельная область иммуноглобулина конкурирует за связывание с или замещает связывание с эпитопом TNF-α полипептида, содержащего любой из следующих наборов последовательностей CDR:

22. Полипептид по любому из пп. 15-17, где вариабельная область иммуноглобулина является однодоменным антителом, вариабельной областью тяжелой цепи или VHH.

23. Полипептид по любому из пп. 15-17, где полипептид содержит по меньшей мере две вариабельные области иммуноглобулина, которые связывают эпитоп TNF-α.

24. Полипептид по любому из пп. 15-17, где полипептид является гуманизированным.

25. Применение эпитопа TNF-α, который:

(a) содержит следующие аминокислотные остатки TNF-α: Gln в положении 88 мономера А, Lys в положении 90 мономера А и Glu в положении 146 мономера В, и дополнительно следующие аминокислотные остатки мономера А TNF-α: Gly в положении 24, Gln в положении 25, Thr в положении 72, His в положении 73, Val в положении 74, Leu в положении 75, Thr в положении 77, Thr в положении 79, Ile в положении 83, Thr в положении 89, Val в положении 91, Asn в положении 92, Ile в положении 97, Arg в положении 131, Glu в положении 135, Ile в положении 136, Asn в положении 137, Arg в положении 138, Pro в положении 139, Asp в положении 140, и следующие остатки в мономере B: Pro в положении 20, Arg в положении 32, Lys в положении 65, Lys в положении 112, Tyr в положении 115, Ala в положении 145, Ser в положении 147; или

(b) является тем же эпитопом TNF-α, который связывает полипептид (связывающий TNF-α полипептид), содержащий любой из следующих наборов последовательностей CDR:

- CDR1 является VSWMY (SEQ ID NO:18); CDR2 является EINTNGLITKYVDSVKG (SEQ ID NO:25); и CDR3 является SPSGSF (SEQ ID NO:35),

для отбора или получения полипептида, который предназначен для применения в способе лечения болезни, связанной с фактором некроза опухоли α (TNF-α).

26. Применение по п. 25, где указанный полипептид, связывающий TNF-α, содержит SEQ ID NO: 96 или 52.

27. Применение по п. 25 или 26, где полипептид способен проникать через внутрижелудочную среду без инактивации.

28. Применение по п. 25 или 26, где полипептид ингибирует взаимодействие TNF-α/TNF-α-рецептор.

29. Применение по п. 25 или 26, где полипептид конкурирует за связывание с или замещает связывание с эпитопом TNF-α полипептида, содержащего аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NOs: 52, 53, 54, 76, 77, 95 или 96.

30. Применение по п. 25 или 26, где полипептид конкурирует за связывание с или замещает связывание с эпитопом TNF-α полипептида, содержащего любой из следующих наборов последовательностей CDR:

31. Применение по п. 25 или 26, где полипептид является однодоменным антителом, вариабельной областью тяжелой цепи или VHH.

32. Применение по п. 25 или 26, где полипептид содержит по меньшей мере две вариабельные области иммуноглобулина, которые связывают эпитоп TNF-α.

33. Применение по п. 25 или 26, где полипептид является гуманизированным.

34. Способ лечения болезни, связанной с TNF-α, путем ингибирования или уменьшения перекрестного сшивания рецептора TNF-α, опосредованного эпитопом TNF-α:

(a) который содержит следующие аминокислотные остатки TNF-α: Gln в положении 88, Lys в положении 90 и/или Glu в положении 146, и дополнительно следующие аминокислотные остатки мономера А TNF-α: Gly в положении 24, Gln в положении 25, Thr в положении 72, His в положении 73, Val в положении 74, Leu в положении 75, Thr в положении 77, Thr в положении 79, Ile в положении 83, Thr в положении 89, Val в положении 91, Asn в положении 92, Ile в положении 97, Arg в положении 131, Glu в положении 135, Ile в положении 136, Asn в положении 137, Arg в положении 138, Pro в положении 139, Asp в положении 140, и следующие остатки в мономере B: Pro в положении 20, Arg в положении 32, Lys в положении 65, Lys в положении 112, Tyr в положении 115, Ala в положении 145, Ser на положении 147; или

путем использования полипептида, содержащего вариабельную область иммуноглобулина, которая специфически связывается с эпитопом TNF-α, по п. 15.

35. Способ по п. 34, где полипептид способен проникать через внутрижелудочную среду без инактивации.

36. Способ по п. 34 или 35, где полипептид ингибирует взаимодействие TNF-α/TNF-α-рецептор.

37. Способ по п. 34 или 35, где вариабельная область иммуноглобулина конкурирует за связывание с или замещает связывание с эпитопом TNF-α полипептида, содержащего аминокислотную последовательность любой из SEQ ID Nos: 52, 53, 54, 76, 77, 95 или 96.

38. Способ по п. 34 или 35, где вариабельная область иммуноглобулина конкурирует за связывание с или замещает связывание с эпитопом TNF-α полипептида, содержащего любой из следующих наборов последовательностей CDR:

39. Способ по п. 34 или 35, где вариабельная область иммуноглобулина является однодоменным антителом, вариабельной областью тяжелой цепи или VHH.

40. Способ по п. 34 или 35, где полипептид содержит по меньшей мере две вариабельные области иммуноглобулина, которые связывают эпитоп TNF-α.

41. Способ по п. 34 или 35, где полипептид является гуманизированным.

42. Фармацевтическая композиция для лечения болезни, связанной с фактором некроза опухоли α (TNF-α), содержащая полипептид по любому одному из пп. 15-24 и по меньшей мере один подходящий носитель и необязательно одно или несколько дополнительных активных веществ.

43. Фармацевтическая композиция по п. 42, которая дополнительно содержит одно или более вспомогательных веществ.

44. Фармацевтическая композиция по п. 42 или 43, где композиция является принимаемой внутрь таблеткой, буккальной таблеткой, пастилкой, капсулой, эликсиром, суспензией, сиропом или вафлей.

45. Фармацевтическая композиция по п. 42, где композиция содержит кишечнорастворимое покрытие, которое устойчиво к действию внутрижелудочной среды и проходит в кишечник.

46. Фармацевтическая композиция по п. 42, где композиция является суппозиторием.