ES2953482T3 - Dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica - Google Patents

Dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica Download PDF

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Abstract

Nuevos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, proteínas de unión recombinantes que comprenden al menos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, así como proteínas de unión recombinantes que comprenden al menos un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el crecimiento de hepatocitos Se describen al menos un dominio repetido de anquirina diseñado con especificidad de unión para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A), y al menos dos dominios repetidos de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, así como ácidos nucleicos que codifican tales dominios de repetición de anquirina diseñados y proteínas de unión recombinantes, composiciones farmacéuticas que comprenden dichos dominios de repetición de anquirina diseñados, proteínas de unión recombinantes o ácidos nucleicos y el uso de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados, proteínas de unión recombinantes, ácidos nucleicos o composiciones farmacéuticas en el tratamiento de enfermedades. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio y la prioridad de la solicitud de patente europea EP 15162502 presentada el 2 de abril de 2015 en la Oficina Europea de Patentes. La presente solicitud también reivindica el beneficio y la prioridad de la solicitud de patente europea EP 15162511 presentada el 2 de abril de 2015 en la Oficina Europea de Patentes.
Campo de la descripción
Se proporcionan proteínas de unión recombinantes que comprenden dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, que presentan propiedades farmacocinéticas mejoradas en comparación con las proteínas de unión recombinantes que comprenden solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica humana. En particular, se proporcionan proteínas de unión recombinantes que comprenden al menos un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF, por sus siglas en inglés) humano, que comprende al menos un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A, por sus siglas en inglés) humano, y que comprende al menos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana. Adicionalmente, se proporcionan ácidos nucleicos que codifican dichas proteínas de unión recombinantes, composiciones farmacéuticas que comprenden dichas proteínas de unión recombinantes o ácidos nucleicos, y dichos dominios de repetición de anquirina diseñados, proteínas de unión recombinantes, ácidos nucleicos, o composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento de una enfermedad.
Antecedentes
La siguiente discusión de los antecedentes se proporciona meramente para ayudar al lector a comprender la invención y no se admite que describa o constituya la técnica anterior a la presente invención.
Además de los anticuerpos, existen nuevas proteínas de unión o dominios de unión que pueden utilizarse para unir específicamente una molécula diana (p. ej., Binz, H.K., Amstutz, P., Plückthun, A., Nat. Biotechnol. 23, 1257-1268, 2005). Una de dichas nuevas clases de proteínas de unión o dominios de unión que no poseen un Fc se basa en proteínas de repetición diseñadas o dominios de repetición diseñados, tales como las proteínas de repetición de anquirina diseñadas o los dominios de repetición de anquirina diseñados (documento w O 2002/020565; Binz, H.K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M.T., Briand, C, Forrer, P., Grütter, M.G., Plückthun, A., Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004). El documento WO 2002/020565 describe cómo se pueden construir grandes bibliotecas de proteínas de repetición, tales como las proteínas de repetición de anquirina, y su aplicación general. El documento WO 2012/069654 describe las proteínas de unión recombinantes que comprenden un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica. El documento WO 2010/060748 describe proteínas de unión recombinantes que comprenden dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el VEGF-A, y el documento WO 2011/135067 describe versiones modificadas de dichas proteínas de unión recombinantes específicas para la unión al VEGF-A. El documento WO 2014/191574 describe proteínas de unión recombinantes que comprenden dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HGF. Ninguna de estas solicitudes de patente divulga una proteína de unión recombinante que comprenda un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el VEGF-A y un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el HGF.
Fiedler y col. (2014) describen una proteína DARPin biespecífica dirigida a ambas vías al neutralizar específicamente el VEGF y el HGF. El documento WO 2012/069557 describe combinaciones de antagonistas del HGF con antagonistas del VEGF, y proporciona proteínas de unión a antígenos que se unen al HGF, que comprenden un armazón proteico unido a uno o más dominios de unión a epítopos, métodos para fabricar dichas construcciones y sus usos.
A diferencia de, p. ej., los anticuerpos IgG, que presentan una larga semivida media sistémica mediada por reciclaje de FcRn, las proteínas que comprenden dominios de repetición de anquirina diseñados, normalmente, muestran una rápido aclaramiento farmacocinético y una corta semivida terminal, a menos que la proteína comprenda elementos que mejoren las propiedades farmacocinéticas, tales como, p. ej., un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificad de unión para albúmina sérica, descrito en el documento WO 2012/069654. La utilización de la unión a albúmina sérica para mejorar las propiedades farmacocinéticas de las proteínas, es un proceso muy conocido en la técnica (véase, p. ej., el documento WO 9101743; Frejd F.Y., 2012 [en Kontermann, R (Ed.) “ Therapeutic proteins: strategies to modulate their plasma half-lives” , Wiley-VCH Verlag GmbH, 2012, ISBN 978-3-527-32849-9]; Nguyen, A., Reyes, A.E.II., Zhang, M., McDonald, P., Wong, W.L., Damico, L.A., Dennis, M.S. Protein Eng. Des. Sei. 19, 291­ 297, 2006; WO 2008/096158; WO 2006/122787; WO 2011/095545; y WO 2012/069654). Con el fin de poder utilizar los dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica en candidatos a fármacos clínicos, ha de mejorarse la estabilidad de almacenamiento de los dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica. En la presente memoria se divulgan dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica con propiedades mejoradas.
No se ha investigado el efecto de la valencia de los dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica sobre las propiedades farmacocinéticas de las proteínas de unión recombinantes. En base a los hallazgos del dominio de unión a la albúmina (Hopp, J., Horning, N., Zettlitz, K.A., Schwarz, A., Fuss, N., Müller, D., Kontermann, R.E. Protein Eng. Des. Sei. 23, 827-834, 2010), un experto en la técnica esperaría que una proteína de unión recombinante que comprenda dos dominios proteicos de unión a la albúmina, tales como los dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, no tuvieran propiedades farmacocinéticas mejoradas en comparación con una proteína de unión recombinante que comprenda solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica. Sorprendentemente, descubrimos que esto no es así. Se divulgan, por lo tanto, proteínas de unión recombinantes que comprenden dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, que presentan propiedades farmacocinéticas mejoradas (es decir, semividas terminales prolongadas, exposiciones aumentadas, aclaramiento reducido, y/o porcentajes aumentados de dosis inyectada) en comparación con las proteínas de unión recombinantes que comprenden solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica humana.
Se sabe ampliamente que la neovascularización (formación de nuevos vasos sanguíneos) desempeña un papel importante en el desarrollo y mantenimiento de los tumores (Ferrera, N., y Kerbel, R.S., Nature 438, 967-974, 2005). En consecuencia, la inhibición de la angiogénesis se ha convertido en una piedra angular principal de la oncología clínica moderna; especialmente, la orientación del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y sus receptores (Hurwitz, H., Clin. Colorectal Cancer, Suppl. 2, 62-68, 2004; Escudier, B., Clin. Adv. Hematol. Oncol. 5, 530-531,2007). La familia del VEGF de mamíferos consta de cinco glicoproteínas denominadas VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D (también conocido como FIGF) y factor de crecimiento placentario (PIGF, también conocido como PGF). Se ha demostrado que el VEGF-A es una diana eficaz para la terapia antiangiogénica (Weis, S.M., y Cheresh, D.A., Nat. Med. 17, 1359-1370, 2011). Los ligandos del VEGF-A se unen y activan tres receptores tirosina quinasa de tipo III estructuralmente similares, denominados VEGFR-1 (también conocidos como FLT-1), VEGFR-2 (también conocido como KDR) y VEGFR-3 (también conocido como FLT4). Hasta la fecha, han recibido la aprobación reguladora varios inhibidores de la angiogénesis, mostrando una supervivencia prolongada sin progresión (SLP, por sus siglas en inglés) y/o una supervivencia global en distintos tipos de cáncer, en combinación con quimioterapia. Desafortunadamente, inevitablemente se producen resistencias durante el periodo del tratamiento con inhibidores del VEGF/VEGFR, tal como el inhibidor del VEGF-A bevacizumab (Avastin®), lo que sugiere que puede ser necesaria la inhibición concomitante de dianas adicionales y vías de resistencia, para conseguir resultados clínicos superiores (Kerbel, R.S., N. Engl. J. Med. 358, 2039-2049, 2008; Hurwitz, 2004, loc. cit; Escudier, 2007, loc. cit.).
La cMet tirosina quinasa es un receptor de superficie celular para el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF, también conocido como factor de dispersión, SF) expresado principalmente en células epiteliales (Comoglio, P.M., Giordano, S., y Trusolino, L, Nat. Rev. Drug Discov. 7, 504-516, 2008). Aunque el cMet y el HGF se expresen en bajos niveles en los tejidos normales de adulto, su expresión frecuentemente está regulada al alza en una amplia variedad de tumores humanos, lo que se ha correlacionado en modelos preclínicos con la supervivencia, el crecimiento, la angiogénesis, la invasión y la metástasis de las células tumorales (Rong, S., Segal, S., Anver, M., Resau, J.H., Vande Woude, G.F., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 91, 4731-4735, 1994; Michieli, P., Mazzone, M., Basilico, C, Cavassa, S., Sottile, A., Naldini, L, Comoglio, P.M., Cancer Cell 6, 61-73, 2004). Se ha descubierto que la regulación y la señalización al alza del HGF y/o el cMet está asociada a un mal pronóstico y resistencia a los fármacos en muchos tipos de tumores en la clínica (Fasolo, A., Sessa, C, Gianni, L, Broggini, M., Ann. Oncol. 24,14-20, 2013). En conjunto, esto indica que el eje HGF-cMet es una diana importante para la intervención terapéutica (Comoglio, 2008 loc. cit.; Fasolo y col., 2013, loc. cit.). Mediante la unión a su receptor, el HGF media en varias respuestas celulares, incluyendo la dispersión de diversos tipos celulares, la formación de túbulos y lúmenes, la transición epitelio-mesénquima, la angiogénesis, la regeneración hepática, la cicatrización de heridas y el desarrollo embriológico. Se ha demostrado también que la vía de señalización HGF/cMet desempeña un papel en diversas enfermedades, incluyendo muchos tumores sólidos humanos, en los que participa en el desarrollo del tumor, la invasión y metástasis. Los inhibidores actuales de la vía HGF/Met en el desarrollo clínico en fase II o III comprenden anticuerpos monoclonales (mAbs) que se dirigen al dominio extracelular del cMet (es decir, Metilab de Genentech-Roche) o inhibidores de molécula pequeña de su dominio quinasa intracelular. Los inhibidores de moléculas pequeñas, tales como el tivantinib (ArQule®) y el cabozantinib (Cometriq®), son muy potentes, pero menos específicos que los mAb, y tienen un potencial de toxicidad más alta. Los agentes biológicos contra el HGF/SF incluyen el rilotumumab (AMG102), un mAb humanizado contra el HGF, y el ficlatuzumab (AV-299), un anti-HGF IgG1 humanizado. El uso de inhibidores de HGF/cMet en combinación con otros agentes dirigidos, es un campo activo de investigación con el objetivo de inhibir simultáneamente diversas vías de señalización que tengan funciones tumorales redundantes o sinérgicas. El HGF/cMet desencadena potentes señales angiogénicas que actúan sinérgicamente con el VEGF en la inducción de nuevos vasos sanguíneos tumorales, y puede inducir resistencia a la terapia antiangiogénica, tal como Avastin® y Sutent® (sunitinib) en el glioblastoma. (Jahangiri, A., De Lay, M., Miller, L.M., Carbonell, W.S., Hu, Y.L., Lu, K., Tom, M.W., Paquette, J., Tokuyasu, T.A., Tsao, S., Marshall, R., Perry, A., Bjorgan, K.M., Chaumeil, M.M., Ronen, S.M., Bergers, G., Aghi, M.K., Clin. Cancer Res. 19, 1773-1783, 2013) y cáncer de células renales, respectivamente. Actualmente existen varios compuestos antiHGF/cMet en investigación, en combinación con otros agentes dirigidos, tales como los inhibidores del receptor anti-VEGF, que han demostrado un perfil de seguridad favorable en diversos tipos de turnes (Sharma, P.S., Sharma, R., Tyagi, T. Curr. Cancer Drug Targets. 11, 624-653, 2011). Sin embargo, dichas estrategias de terapia de combinación implican que el paciente debe recibir dos tratamientos distintos, cada uno con un perfil de seguridad diferente, lo que puede dar lugar a un aumento de toxicidades indeseables, lo que a su vez pueden limitar las opciones de tratamiento médico. Además, los distintos tratamientos pueden someterse a diferentes esquemas de administración, lo que podría hacer que la dosificación fuera más molesta para el paciente. Por último, pero no menos importante, la dosificación de diversos agentes simultáneamente, puede aumentar significativamente los costes asociados al tratamiento y la atención al paciente.
Un fármaco comercializado con doble actividad inhibidora de cMet y VEGF, es el cabozantinib (Cometriq®; un fármaco de molécula pequeña), un inhibidor oral multiespecífico de la tirosina quinasa, que se dirige al cMet y al VEGFR 1-3 (además de ReT, KIT, AXL y FLT3). El cabozantinib ha validado el enfoque clínico de inhibir simultáneamente el HGF y el VEGF en tumores con un único agente (Yakes, F.M., Chen, J., Tan, J., Yamaguchi, K., Shi, Y., Yu, P., Qian, F., Chu, F., Bentzien, F., Cancilla, B., Orf, J., You, A., Laird, A.D., Engst, S., Lee, L, Lesch, J., Chou, Y.C., Joly, A.H., Mol. Cancer Ther. 10, 2298-2308, 2011; Castellone, M.D., Carlomagno, F., Salvatore, G., Santoro, M., Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. 22, 1023-1038, 2008). Por ejemplo, en el cáncer de próstata resistente a la castración, en una indicación en la que el mAb anti-HGF rilotumumab fue incapaz de demostrar eficacia como agente único en estudios de fase II, el cabozantinib mostró actividad antitumoral en un alto porcentaje de pacientes en fase II (Smith, D.C., Smith, M.R., Sweeney, C, Elfiky, A.A., Logothetis, C, Corn, P.G., Vogelzang, N.J., Small, E.J., Harzstark, A.L., Gordon, M.S., Vaishampayan, U.N., Haas, N.B., Spira, A.I., Lara, P.N. Jr., Lin, C.C., Srinivas, S., Sella, A., Schoffski, P., Scheffold, C, Wefeman, A.L., Hussain, M., J. Clin. Oncol. 31,412-419, 2013). Sin embargo, la actividad fue paralela a una alta incidencia de acontecimientos adversos que dieron lugar a reducciones de la dosis en el 62 % de los pacientes, lo que plantea dudas sobre la seguridad y tolerancia de dichos modos de acción pleiotrópicos.
La actuación simultánea sobre el VEGF-A y el HGF/cMet puede alterar beneficiosamente la angiogénesis y la progresión tumoral. Como se ha descrito anteriormente en la presente memoria, las terapias actuales que actúan simultáneamente sobre las vías VEGF-A/VEGFR-2 y HGF/cMet o bien se basan en terapias únicas que son inespecíficas y dan lugar a problemas de seguridad, o bien implican varias terapias específicas que deban combinarse, dando como resultado necesitar la co-administración o múltiples administraciones. Además, algunos de los fármacos actuales presentan semividas sistémicas cortas. Por lo tanto, existe la necesidad de proporcionar fármacos mejorados que bloqueen las vías VEGF-A/VEGFR-2 y HGF/cMet. Esto es técnicamente difícil de conseguir con los fármacos anticuerpos, que, además, padecen la necesidad de una producción laboriosa en células de mamífero. En la presente memoria se proporcionan proteínas de unión recombinantes que afrontan estos problemas. En algunas realizaciones, una proteína de unión recombinante que se proporciona en el presente documento comprende al menos un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el VEGF-A, al menos un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el HGF, y, para la mejora de la propiedad farmacocinética, al menos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica.
Resumen
La presente descripción se refiere a un nuevo dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica humana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, que presenta una mejor estabilidad de almacenamiento con respecto a los dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana. En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende al menos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, en la que dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana comprenden cada uno SEQ ID NO: 50. En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende un primer, un segundo, un tercer y un cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado, en donde dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado tiene especificidad de unión para el VEGF-A humano, y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, y en donde dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado tiene especificidad de unión para el HGF humano, y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26, y en donde dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados tienen cada uno especificidad de unión para la albúmina sérica humana, y comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. En una realización, dichos primer, segundo, tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados de dicha proteína de unión recombinante están en el orden tercerosegundo-primero-cuarto desde el extremo N hasta el extremo C. En una realización, dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado de dicha proteína de unión recombinante, comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO 18, y dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado de dicha proteína de unión recombinante, comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26, y dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados de dicha proteína de unión recombinante comprenden cada uno la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 50, y dichos dominios de repetición de anquirina diseñados están unidos por enlazadores polipeptídicos que consisten en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9.
En una realización, dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado de dicha proteína de unión recombinante, comprende secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 18, y dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado de dicha proteína de unión recombinante, comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26, y dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados de dicha proteína de unión recombinante, comprende cada uno la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 50, y dichos dominios de repetición de anquirina diseñados están unidos por enlazadores polipeptídicos que consisten en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
La presente descripción también se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134. En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134. En una realización preferida, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134.
La invención se refiere adicionalmente a un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína de unión recombinante de la invención.
La invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión recombinante o un ácido nucleico de la presente invención y, opcionalmente, un portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptables.
La invención también se refiere a la composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En una realización, se refiere a la composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento del cáncer, cáncer gástrico o cáncer renal.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Ilustración de proteínas de unión recombinantes que comprenden dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica.
(a) Ilustración de un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica. Ejemplos de dichos dominios de repetición de anquirina son dominios de repetición de anquirina diseñados con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 40 a 56, en particular, el dominio de repetición de anquirina diseñado con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. (b) Ilustración de un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para otra diana distinta de la albúmina sérica. Ejemplos de dichos dominios de repetición de anquirina son dominios de repetición de anquirina diseñados con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 12 a 39. (c) Ilustración de un enlazador polipeptídico (por ejemplo, un polipéptido con una secuencia de aminoácidos correspondiente a cualquiera de las SEQ ID NOs: 2 a 9). (d) Ilustración de una secuencia de aminoácidos en el extremo N. Ejemplos de dichas secuencias de aminoácidos en el extremo N son, por ejemplo, las secuencias MGS o GS, o las etiquetas polipeptídicas, como se ejemplifica por la secuencia de aminoácidos correspondiente a SEQ ID NO: 1. (e) Ilustración de un compuesto bioactivo. Dicha fracción puede ser, por ejemplo, una proteína o dominio proteico con, p. ej., actividad agonista (p. ej., una hormona, o enzima), antagonista (p. ej., un dominio de receptor o fragmento de anticuerpo), o tóxica (p. ej., una toxina). Dicha fracción puede ser también, por ejemplo, un compuesto de molécula pequeña que presente, por ejemplo, actividad agonista, antagonista, o tóxica, (f) Ilustración de una proteína de unión recombinante que se proporciona en la presente memoria que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, y un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para otra diana distinta de la albúmina sérica, unidos por enlazadores polipeptídicos y con una secuencia de aminoácidos en el extremo N. Por ejemplo, una proteína de unión recombinante con una secuencia de aminoácidos que se corresponde con cualquiera de las SEQ ID NOs: 73 a 81 consta de dichos tres dominios de repetición de anquirina diseñados, en los que las SEQ ID NOs: 73, 75, 78, y 80 tienen los dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, flanqueando el tercer dominio de repetición de anquirina diseñado respectivo, como se muestra en la ilustración, (g) Ilustración de una proteína de unión recombinante que se proporciona en la presente memoria, que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, y dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para otras dianas distintas de la albúmina sérica, unidos por enlazadores polipeptídicos y que tienen una secuencia de aminoácidos en el extremo N. Los dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica flanquean a los otros dos dominios de repetición de anquirina diseñados. Por ejemplo, una proteína de unión recombinante con una secuencia de aminoácidos que se corresponde con cualquiera de las SEQ ID NOs: 95 a 107, 110, 116, 122, 129 a 131, 134 a 144, 149 a 172, y 175 a 179, en particular, SEQ ID NO: 134 se corresponde con esta ilustración. (h) Ilustración de una proteína de unión recombinante que se proporciona en la presente memoria, que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, y dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para otras dianas distintas de la albúmina sérica, unidos por enlazadores polipeptídicos y que tienen una secuencia de aminoácidos en el extremo N. Los dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica se encuentran en el extremo N de los otros dos dominios de repetición de anquirina diseñados. Por ejemplo, una proteína de unión recombinante con una secuencia de aminoácidos correspondiente a cualquiera de las SEQ ID NOs: 112, 119, 124, 128, 132 y 133, se corresponde con esta ilustración, (i) Ilustración de un compuesto farmacéutico que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica y un compuesto bioactivo. El compuesto bioactivo puede unirse covalentemente a los dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica mediante acoplamiento químico o, en el caso de los polipéptidos, por fusión proteica.
Figura 2. Mejora de la estabilidad de almacenamiento de las proteínas de unión recombinantes que comprenden SEQ ID NO: 50. Análisis SDS PAGE al 15 %, de las Proteínas n° 49 y n° 50 (correspondientes a las SEQ ID NOs: 49 y 50, respectivamente, que tienen adicionalmente SEQ ID NO: 1 en el extremo N; preparadas como se describe en el Ejemplo 4), almacenadas a 10mg/ml en PBS durante 1 semana a 4°C (1), 25 °C (2), 40 °C (3) y 60 °C (4), respectivamente. M: Marcador (banda inferior: 6,5 kDa; banda a nivel de la Proteína n° 50: 14,4 kDa; banda superior en el caso de la Proteína n° 50 PAGE: 21,5 kDa).
Figura 3. Estudios farmacocinéticos en ratones, que ilustran las ventajas de tener dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica en una proteína de unión recombinante. Se realizaron estudios farmacocinéticos en ratones, utilizando proteínas etiquetadas con m99Tc, como se describe en el Ejemplo 5. El porcentaje de dosis inyectada (% DI), en referencia a un punto de tiempo de medición temprano (a: 4 h; b-d: 1 h) se muestra respecto al tiempo (t; horas). Las proteínas utilizadas incluían una etiqueta His en el extremo N (SEQ ID NO: 1), además de la secuencia indicada, a menos que se indique lo contrario, (a) Comparación del perfil farmacocinético de la Proteína n° 57 (dominio de repetición de anquirina de diseño único con especificidad de unión para la albúmina sérica; SEQ ID NO: 57, que comprende SEQ ID NO: 51; círculos sólidos) con las Proteínas n° 62 y n° 63 (proteínas que comprenden dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica [dos veces SEQ ID NO: 51], unidas por enlaces polipeptídicos ricos en GS [SEQ ID NO: 63; rombos sólidos] o en PT [SEQ ID NO: 62; cuadrados sólidos]). Tener dos dominios diseñados de repetición diseñados de anquirina con especificidad de unión para la albúmina sérica lleva a un % de DI mayor, por ejemplo, a las 24 h (+57 % GS; 59 % PT), 48 h (+76 % GS; 82 % PT) o 72 h (+79 % GS; 94 % PT ) tras la inyección, y lleva a una mejora de la semivida terminal (+38 % GS; 48 % PT) en comparación con la proteína que comprende un único dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica, (b) Comparación del perfil farmacocinético de la Proteína n° 64 (círculos sólidos), que comprende las SEQ ID NOs: 22 (dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para otra diana distinta de la albúmina sérica) y 51 (dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica), con las Proteínas n° 73 (cuadrados sólidos) y n° 74 (rombos sólidos), que comprenden cada una las SEQ ID NOs: 22 y dos veces la 51. La Proteína n° 73 tiene SEQ ID NO: 51 flanqueando la SEQ ID NO: 22, y la Proteína n° 74 tiene dos veces SEQ ID NO: 51 en el extremo N de SEQ ID NO: 22. Tener dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina lleva a un % DI mayor a, por ejemplo, 24 h (+62 % en el extremo N; 89 % la flanqueante), o 48 h (+136 % en el extremo N; 175 % la flanqueante) post-inyección, y lleva a una mejoría de la semivida terminal (+63 % para tanto en el extremo N o para la flanqueante) en comparación con la proteína que comprende solo un único dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica. (c) Comparación del perfil farmacocinético de la Proteína n° 82 (círculos sólidos), que comprenden SEQ ID NOs: 11 (dos veces; dominio de repetición de anquirina diseñado sin especificidad de unión conocida) y 51 (dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica), con la Proteína n° 109 (cuadrados sólidos) que comprende las s Eq ID NOs: 11 (dos veces) y 51 (dos veces; en el extremo N). Tener dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica lleva a un % de DI mayor, p. ej., a las 24 h (+12 %), o a las 48 h (+35 %) tras la inyección, y lleva a una mejora en la semivida terminal (+71 %), en comparación con la proteína que comprende un único dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica, (d) Comparación del perfil farmacocinético de la Proteína n° 83 (círculos sólidos), que comprende las SEQ ID NOs: 38 y 39 (dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para otra diana distinta de la albúmina sérica) y 50 (dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica), con la Proteína n° 110 (cuadrados sólidos), que comprende cada uno las SEQ ID NOs: 38, 39 y 50 (dos veces; flanqueando las SEQ ID NOs: 38 y 39). Tener dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica lleva a un % de DI mayor, p. ej., a las 24 h (+198 %), 48 h (+198 %), o 72 h (+228 %) tras la inyección, y lleva a una mejora de la semivida terminal (+19 %) en comparación con la proteína que comprende solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica. Obsérvese que la medición de la Proteína n° 83 se aproximó al límite inferior de cuantificación.
Figura 4. Estudios farmacocinéticos en monos Cynomolgus, que ilustran el beneficio de tener dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica en una proteína de unión recombinante. Se realizaron los estudios farmacocinéticos en monos Cynomolgus, como se describe en el Ejemplo 6. La concentración de la proteína respectivas se muestra en nM (a), o como valor relativo en referencia al punto de medición a los 10 minutos postinyección (b), a lo largo del tiempo indicado en días (a) o en horas (b). Las proteínas utilizadas comprenden una etiqueta His en el extremo N (SEQ ID NO: 1) además de la secuencia indicada, a menos que se indique lo contrario. (a) Comparación del perfil farmacocinético de la Proteína n° 57 (0,5 mg/kg; 27,7 nmol/kg; dominio de repetición de anquirina de diseño único con especificidad de unión para la albúmina sérica; SEQ ID NO: 57; que comprende SEQ ID NO: 51; círculos sólidos) con la Proteína n° 62 (1,04 mg/kg; 34,5 nmol/kg; proteína que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica (dos veces SEQ ID NO: 51), unidos por un enlazador peptídico rico en PT). Tener dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica lleva a una mayor exposición (2138 d*nmol/l frente a 4676 d*nmol/l, es decir, un 119 % calculado hasta el día 7), lleva a un aclaramiento reducido [0,0108 l/(d*kg) frente a 0,0031 l/(d*kg); es decir -71 %], y lleva a una mejora de la semivida terminal (4,57 d frente a 9,00 d, es decir, 97 % calculado desde el día 1 al día 7), en comparación con la proteína que contiene solo un único dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica, (b) Se muestran el perfil farmacocinético de la Proteína n° 97 (una proteína de unión recombinante que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 97; cuadrados sólidos) y la Proteína n° 134 (una proteína de unión recombinante que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134, sin etiqueta de secuencia adicional; círculos sólidos) administrada a 1 mg/kg i.v. a monos Cynomolgus. La Proteína n° 134 tiene un perfil farmacocinético mejorado en comparación con la Proteína n° 97.
Figura 5. Cromatografía de exclusión por tamaño acoplada a dispersión de luz estática de una proteína de unión recombinante (Proteína n° 134) que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica. El experimento se realizó como se describe en el Ejemplo 7, utilizando la Proteína n° 134 (una proteína de unión recombinante que consiste en SEQ ID NO: 134; línea continua), albúmina sérica humana (línea de puntos), y una mezcla de las dos (línea discontinua). El experimento indica que la Proteína n° 134 que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados (dos veces SEQ ID NO: 50) con especificidad de unión para la albúmina sérica, es capaz de unir dos moléculas de albúmina sérica humana simultáneamente.
Figura 6. Análisis ELISA de proteínas de unión recombinantes. Análisis de la Proteína n° 134 (una proteína de unión recombinante que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134) en varios ELISA de unión, como se describe en el Ejemplo 10. La Proteína n° 134 comprende un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para VEGF-A, un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para HGF, y dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, y, en consecuencia, se espera la interacción de la Proteína n° 134 con estas proteínas diana, (a) ELISA de VEGF-A. Se muestra la señal de unión de distintas concentraciones de la Proteína n° 134 al VEGF-A inmovilizado de ser humano (círculos sólidos), rata (cuadrados sólidos), y ratón (rombos sólidos), así como al VEGF-C humano (triángulos invertidos huecos), y a PDGF-AB humano (círculos huecos), y las curvas de inhibición ajustadas correspondientes. La Proteína n° 134 se une al VEGF-A de estas especies con gran afinidad y no se une al VEGF-C ni al PDGF-AB. (b) ELISA de HGF. Se muestra la señal de unión de distintas concentraciones de la Proteína n° 134 al HGF inmovilizado de ser humano (círculos sólidos), mono Cynomolgus (triángulos sólidos), y ratón (rombos sólidos), y las curvas de inhibición ajustadas correspondientes. La Proteína n° 134 se une al HGF de estas especies con gran afinidad. (c) ELISA de albúmina sérica. Se muestra la señal de unión de varias concentraciones de Proteína n° 134 a albúmina sérica inmovilizada de ser humano (círculos sólidos), mono Cynomolgus (triángulo invertido hueco), rata (triángulo hueco), ratón (cuadrados huecos), y perro (rombo hueco) y las curvas de inhibición ajustadas correspondientes. La Proteína n° 134 se une a la albúmina sérica de estas especies con gran afinidad. DO, densidad óptica a 450 nm menos DO a 620 nm; c[μM], concentración de proteína de unión recombinante en μM en escala logarítmica.
Figura 7. Ensayos de competición de los receptores VEGF-A/VEGF-R2 y HGF/cMet. Análisis de la Proteína n° 134 (una proteína de unión recombinante que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134) en distintos ensayos de competición, como se describe en el Ejemplo 11. (a) Ensayo de competición de unión de VEGF-A/VEGFR-2 HTRF. La Proteína n° 134 inhibe la interacción VEGF-A/VEGFR-2. La línea base se indica mediante la línea discontinua, la señal de no competición se indica por el símbolo circular. R: relación de señal a 665 nm respecto a la señal a 620 nm; c: concentración de la Proteína n° 134 en nM. (b) Ensayo de competición de unión de HGF/cMet. La Proteína n° 134 inhibe la interacción HGF/cMet. DO: DO a 450 nm menos DO a 620 nm. c: concentración de la Proteína n° 134 en nM. (c) ELISA de competición de unión de VEGF-A. La Proteína n° 134 se une al VEGF-A con un CI 50 superior a 10 μM. DO: DO a 450 nm menos DO a 620 nm, c: concentración de la Proteína n° 134 en μM.
Figura 8. Análisis SPR de proteínas de unión recombinantes. Análisis de la unión de VEGF-A, HGF y HSA por la Proteína n° 134 (una proteína de unión recombinante que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134), utilizando un instrumento ProteOn, como se describe en el Ejemplo 12. El HGF humano se inmoviliza en el chip biosensor, y la Proteína n° 134, el VEGF-A humano, o la albúmina sérica humana se inyectan según los siguientes esquemas de inyección: (1) Proteína n° 134 - hVEGF-A - HSA, (2) Proteína n° 134 - hVEGF-A - PBST, (3; línea de puntos) Proteína n° 134 - PBST - HSA, (4) PBST - PBST - PBST, (5) PBST - hVEGF-A - PBST, (6) PBST - PBST -HSA. Las curvas 1 y 2 indican que la Proteína n° 134 puede unirse simultáneamente al HGF humano y al VEGF-A humano. Además, dado que la unión al VEGF-A alcanza la saturación en la curva 1, la curva 1 indica que la Proteína n° 134 se puede unir simultáneamente al HGF humano, al VEGF-A humano y a la albúmina sérica humana. Las inyecciones de control indican que no se producen interacciones inespecíficas. UR: unidades de resonancia; t: tiempo en segundos.
Figura 9. Efecto de las proteínas de unión recombinantes sobre la proliferación celular y la migración celular. Se evaluó el efecto de la Proteína n° 134 (una proteína de unión recombinante que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134) en diferentes ensayos celulares, como se describe en el Ejemplo 13. (a) Inhibición de la proliferación de HUVEC por la Proteína n° 134. Se estimularon las HUVEC (3 x 103 células/pocillo) con 8 ng/ml de VEGF-A humano.
Se analizó el estado proliferativo de las HUVEC en ausencia (círculo hueco) o en presencia de concentraciones crecientes de la Proteína n° 134 (círculos sólidos). Tras 3 días de cultivo a 37 °C y un 5 % de CO2, se cuantificó la inhibición mediante la adición de BrdII durante las últimas 24 h de incubación. La Proteína n° 134 exhibe CI50 en el intervalo de 100-150 μM. Las barras de error reflejan la desviación estándar de duplicados independientes. DO: DO a 450 nm menos DO a 620 nm, c: concentración de la Proteína n° 134 en ng/ml. El eje X se muestra en escala logarítmica, (b) Efecto de la Proteína n° 134 en un ensayo Oris de migración celular con células A549. La Proteína n° 134 inhibe significativamente la migración celular inducida por el HGF. Las células se sembraron 24 h antes de la estimulación con HGF (500 μM; H y D) o PBS (N), en presencia (D) y ausencia (H, N) de la Proteína n° 134 (5 j M). Se retiraron los tapones y se detectó y cuantificó la migración 48 h después de teñir las células con calceína. Se tomaron imágenes y se cuantificó el área sin cubrir en el pocillo de la placa de cultivo celular. U: Área sin cubrir en 8 pocillos independientes en jm 2, H: HGF, sin Proteína n° 134, N. Sin HGF, sin Proteína n° 134, D: HGF, sin Proteína n° 134, N: HGF y Proteína n° 134. (c) Inhibición de la fosforilación de cMet en las células A549 por la Proteína n° 134. Se privaron de nutrientes a las células A549 durante la noche y se estimularon con 1 nM de HGF humano (sin HGF para el control negativo) en presencia de PBS o concentraciones crecientes de Proteína n° 134 durante 10 minutos. Se detectó el P-cMet en lisados celulares mediante ELISA midiendo la DO450-620. Las señales relativas (% de fosforilación) se calcularon utilizando la señal máxima (HGF, sin Proteína n° 134) y la señal mínima (sin HGF, sin Proteína n° 134). La Proteína n° 134 inhibe la fosforilación de cMet con un CI50 superior a 1 nM. % P: % de fosforilación, c: concentración de la Proteína n° 134 en nM.
Figura 10. Efecto de las proteínas de unión recombinantes sobre el crecimiento tumoral in vivo. Se evaluó la eficacia de la Proteína n° 134 (una proteína recombinante que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134; comprende (i) un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para VEGF-A, (ii) un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para HGF, y (iii) dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para albúmina sérica; véase la Figura 1) y de otras proteínas de unión recombinante en modelos de xenoinjertos tumoral en ratón, como se describe en el Ejemplo 14. (a) Cuantificación de células proliferativas y área vascular media en el tejido tumoral de un modelo de ratón U87M tratado con Proteína n° 134, Proteína n° 60 (una proteína de unión recombinante que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 60, y que tiene adicionalmente tiene SEQ ID NO: 1 en el extremo N; comprende un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para HGF [idéntico al de la Proteína n° 134], y un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para albúmina sérica [idéntico al de la Proteína n° 134]), o la Proteína n° 61 (una proteína de unión recombinante que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 y que tiene adicionalmente SEQ ID NO: 1 en el en el extremo N; comprende un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para VEGF-A [idéntico al de la Proteína n° 134], y un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para albúmina sérica [idéntico al de la Proteína n° 134]), como se describe en el Ejemplo 14. Con respecto a la inhibición de la proliferación de las células tumorales xenoinjertadas U87M (P; medido como porcentaje de células proliferativas, % cp), la Proteína n° 60 presenta una ligera inhibición, similar a la Proteína n° 61, mientras que la Proteína n° 134 tiene un efecto significativamente mayor. Asimismo, con respecto al crecimiento vascular (A; medido como porcentaje medio del área vascular; % mav), la Proteína n° 60 presenta una ligera inhibición, la Proteína n° 61 muestra una inhibición intermedia, y la Proteína n° 134 muestra el efecto más fuerte. PBS (barras blancas), Proteína n° 60 (barras con líneas horizontales), Proteína n° 61 (barras con líneas verticales), Proteína n° 134 (barras negras). (b) Efecto de la Proteína n° 134 en el crecimiento tumoral en un modelo de ratón con un xenoinjerto de un tumor renal derivado de un paciente en comparación con sorafenib y PBS. Los detalles del modelo se describen en el Ejemplo 14. El sorafenib suprime el crecimiento tumoral como se esperaba. De manera interesante, la Proteína n° 134 suprime el crecimiento tumoral más allá de los niveles del sorafenib, controlando el volumen tumoral en sus niveles iniciales. V: volumen tumoral en mm3, d: días de tratamiento, círculos abiertos: vehículo, círculos cerrados: Proteína n° 134 (4 mg/kg), cuadrado abierto: sorafenib (200 mg/kg). (c) Efectos de la Proteína n° 134 sobre el crecimiento tumoral en un modelo de ratón con un xenoinjerto de tumor gástrico derivado de un paciente en comparación con paclitaxel y una combinación de la Proteína n° 134 y paclitaxel. Los detalles del modelo se describen en el Ejemplo 14. El paclitaxel y la Proteína n° 134 suprimen el crecimiento tumoral a aproximadamente el mismo nivel. La combinación de Paclitaxel y la Proteína n° 134 suprime el crecimiento tumoral aún más, controlando el volumen tumoral en sus niveles iniciales. V: volumen tumoral en mm3, d: días tras la terapia, círculos abiertos: vehículo, círculos cerrados: Proteína n° 134 (4 mg/kg i.v.), cuadrado abierto: paclitaxel (15 mg/kg i.v.), triángulos abiertos: Proteína n° 134 (4 mg/kg) y paclitaxel (15 mg/kg).
Descripción detallada
En el contexto de la presente invención, el término “ proteína” se refiere a un polipéptido, en donde al menos parte del polipéptido, tiene o es capaz de adquirir una disposición tridimensional definida, formando estructuras secundarias, terciarias o cuaternarias dentro de una única cadena polipeptídica y/o entre múltiples cadenas polipeptídicas. Si una proteína comprende dos o más cadenas polipeptídicas, las cadenas polipeptídicas individuales se pueden unir no covalentemente o covalentemente, p. ej., mediante un enlace disulfuro entre dos polipéptidos. Una parte de una proteína, que tiene individualmente, o es capaz de adquirir una disposición tridimensional definida al formar una estructura secundaria o terciaria, se denomina “ dominio proteico” . Dichos dominios proteicos son bien conocidos por el experto en la técnica.
El término “ recombinante” , como se utiliza en la proteína recombinante, en el dominio proteico recombinante, en la proteína de unión recombinante, y similares, significa que dichos polipéptidos se producen mediante el uso de tecnologías de ADN recombinante bien conocidas por el experto en la técnica relevante. Por ejemplo, una molécula de ADN recombinante (p. ej., producida mediante síntesis genética) que codifica un polipéptido, se puede clonar en un plásmido de expresión bacteriana (p. ej., pQE30, QIAgen), un plásmido de expresión de levaduras, un plásmido de expresión de mamíferos, o un plásmido de expresión de plantas, o un ADN capaz de la expresión in vitro. Si, por ejemplo, dicho plásmido de expresión recombinante en bacterias se inserta en una bacteria apropiada (p. ej., Escherichia coli), esta bacteria puede producir el polipéptido codificado mediante este ADN recombinante. El polipéptido producido correspondientemente se denomina polipéptido recombinante o proteína recombinante.
En el contexto de la presente invención, el término “ proteína de unión” se refiere a una proteína que comprenda dos o más, preferentemente tres o más, más preferentemente cuatro o más dominios de unión. Preferentemente, dicha proteína de unión es una proteína de unión recombinante. Preferentemente, dicha proteína de unión comprende dos o más dominios de repetición. Más preferentemente, dicha proteína de unión comprende tres dominios de repetición. Más preferentemente, dicha proteína de unión comprende cuatro dominios de repetición. También preferentemente, dicha proteína de unión comprende tres o más dominios de repetición de anquirina diseñados. Aún más preferentemente, dicha proteína de unión comprende cuatro o más dominios de repetición de anquirina diseñados. Más preferentemente, dicha proteína de unión comprende cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados. Opcionalmente, dicha proteína de unión comprende uno o más compuestos bioactivos. Dichos dominios de unión de dicha proteína de unión tienen cada uno una especificidad de diana. Preferentemente, dos o más de dichos dominios de unión de dicha proteína de unión tienen cada uno una especificidad de diana para la albúmina sérica. Preferentemente, dicha proteína de unión comprende al menos tres dominios de unión que se unen a al menos dos dianas diferentes. Más preferentemente, dicha proteína de unión comprende al menos cuatro dominios de unión que se unen a al menos tres dianas diferentes.
Además, cualquier proteína de unión puede comprender polipéptidos adicionales (tales como, p. ej., etiquetas polipeptídicas, o enlazadores polipeptídicos, bien conocidos por el experto en la técnica).
El término “ compuesto bioactivo” se refiere a un compuesto que modifica la enfermedad cuando se aplica a un mamífero que tenga dicha enfermedad. Un compuesto bioactivo puede tener propiedades agonistas o antagonistas, y puede ser un compuesto bioactivo proteináceo o un compuesto bioactivo no proteináceo. Dichos compuestos bioactivos proteináceos pueden unirse covalentemente, por ejemplo, a un dominio de unión de la invención mediante la generación de polipéptidos de fusión genética, utilizando tecnologías de clonación de ADN convencionales, seguida de su expresión y purificación convencionales. Los compuestos bioactivos no proteináceos se pueden unir covalentemente, por ejemplo, a un dominio de unión de la invención mediante medios químicos, p. ej., mediante acoplamiento a un tiol de la cisteína por medio de un enlazador maleimida con una cisteína acoplándose por medio de un enlazador polipeptídico al extremo N o C de un dominio de unión, como se describió anteriormente en la presente memoria. Ejemplos de compuestos bioactivos proteináceos son los dominios de unión que tienen una especificidad de diana diferente (p. ej., que neutralizan un factor de crecimiento uniéndose a él), citocinas (p. ej., interleucinas), factores de crecimiento (p. ej., la hormona de crecimiento humana), anticuerpos y fragmentos de los mismos, hormonas (p. ej., GLP-1), o un fármaco proteináceo. Ejemplos de compuestos bioactivos no proteináceos son las toxinas (p. ej., DM1 de ImmunoGen), las moléculas pequeñas que se dirigen a los GPCR, antibióticos o un fármaco no proteináceo.
La expresión “ dominio de unión” significa un dominio proteico que presenta el mismo “ plegamiento” (es decir, estructura secundaria, terciaria, y/o cuaternaria) como armazón proteico y que tiene una propiedad predeterminada, como se define posteriormente. Dicho dominio de unión puede obtenerse por técnicas de ingeniería proteica racionales, o más comúnmente, combinatorias, habilidades que se conocen en la técnica (Binz y col., 2005, loc. cit). Por ejemplo, se puede obtener un dominio de unión que tenga una propiedad predeterminada mediante un método que comprende las etapas de (a) proporcionar una colección diversa de dominios proteicos que presenten el mismo plegamiento que un armazón de la proteína como se define más adelante; y (b) cribar dicha colección diversa y/o seleccionar de dicha colección diversa, para obtener al menos un dominio proteico que tenga dicha propiedad predeterminada. La colección diversa de dominios proteicos puede proporcionarse mediante varios métodos según el sistema de cribado y selección que se utilice, y puede comprender el uso de métodos bien conocidos por el experto en la técnica, tal como el despliegue de fagos o Ribosome Display. Preferentemente, dicho dominio de unión es un dominio de unión recombinante.
El término “ armazón proteico” significa una proteína con áreas de superficie expuestas en las que las inserciones, sustituciones o eliminaciones de aminoácidos son altamente tolerables. Ejemplos de armazones proteicos que se pueden utilizar para generar los dominios de unión de la presente invención son los anticuerpos o fragmentos de los mismos, tales como fragmentos Fv o Fab de cadena sencilla, la proteína A de Staphylococcus aureus, la proteína de unión a bilina de Pieris brassicae, u otras lipocalinas, proteínas de repetición de anquirina u otras proteínas de repetición, y fibronectina humana. Los armazones proteicos son conocidos por el experto en la técnica (Binz y col., 2005, loc. cit.; Binz y col., 2004, loc. cit.).
El término “ diana” se refiere a una molécula individual, tal como una molécula de ácido nucleico, un polipéptido o proteína, un carbohidrato, o cualquier otra molécula de origen natural, incluyendo cualquier parte de dicha molécula individual, o complejos de dos o más de dichas moléculas. Una diana puede ser una célula completa o una muestra de tejido, o puede ser un compuesto no natural. Preferentemente, una diana es un polipéptido de origen natural o no natural, o un polipéptido que contenga modificaciones químicas, por ejemplo, modificado mediante fosforilación, acetilación, o metilación natural o no natural. En la aplicación particular de la presente invención, las dianas son albúmina sérica, HGF y VEGF-A.
El término “ propiedad predeterminada” se refiere a una propiedad tal como la unión a una diana, el bloqueo de una diana, la activación de una reacción mediada por una diana, actividad enzimática, y otras propiedades relacionadas. Dependiendo del tipo de propiedad deseada, un experto en la técnica será capaz de identificar el formato y las etapas necesarias para llevar a cabo el cribado y/o la selección de un dominio de unión con la propiedad deseada. Preferentemente, dicha propiedad determinada se une específicamente a una diana.
En el contexto de la presente invención, el término “ polipéptido” se refiere a una molécula que consiste en una cadena de múltiples, es decir, dos o más, aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos. Preferentemente, un polipéptido consiste en más de ocho aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos. El término “ polipéptido” también incluye múltiples cadenas de aminoácidos, unidas entre sí por puentes S-S de cisteínas. Los polipéptidos son bien conocidos por el experto en la técnica.
El término “ etiqueta polipeptídica” se refiere a una secuencia de aminoácidos unida a un polipéptido/proteína, en donde dicha secuencia de aminoácidos es útil para la purificación, detección, o “ direccionamiento” (es decir localización en el sitio de una diana) de dicho polipéptido/proteína, o donde dicha secuencia de aminoácidos mejora el comportamiento fisicoquímico del polipéptido/proteína, o donde dicha secuencia de aminoácidos posee una función efectora. Las etiquetas polipeptídicas individuales de una proteína de unión se pueden conectar a otras partes de la proteína de unión directamente o mediante enlazadores polipeptídicos. Estos marcadores polipeptídicos son muy conocidos en la técnica y están totalmente disponibles para el experto en la técnica. Ejemplos de etiquetas polipeptídicas son las secuencias polipeptídicas pequeñas, por ejemplo, His (p. ej., la etiqueta His de la SEQ ID NO: 1), myc, FLAG, o etiquetas-Strep, o polipéptidos, tales como enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina), que permiten la detección de dicho polipéptido/proteína, o los polipéptidos que se puedan utilizar para el direccionamiento (tal como inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas) y/o moléculas efectoras.
El término “ enlazador polipeptídico” se refiere a una secuencia de aminoácidos, que sea capaz de unir, por ejemplo, dos dominios proteicos, una etiqueta polipeptídica y un dominio proteico, un dominio proteico y un compuesto no proteináceo o un polímero, tal como polietilenglicol, o dos etiquetas de secuencia. Dichos dominios adicionales, etiquetas, compuestos no proteináceos o polímeros, y enlazadores, son conocidos por el experto en la técnica relevante. Se proporciona una lista de ejemplos en la descripción de la solicitud de patente WO 2002/020565. Ejemplos particulares de dichos enlazadores son los enlazadores de serina-glicina y los enlazadores de prolina-treonina de longitudes variables; preferentemente, dichos enlazadores tienen una longitud de entre 2 y 30 aminoácidos; más preferentemente, dichos enlazadores tienen una longitud de entre 2 y 24 aminoácidos. Ejemplos de enlazadores glicina-serina son GS y secuencias de aminoácidos proporcionadas en las SEQ ID NO: 2 a 6, y se proporcionan ejemplos de enlazadores prolina-treonina en las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 7 a 9.
La solicitud de patente WO 2002/020565 y Forrer y col., 2003 (loc. cit), contiene una descripción general de características de proteína de repetición y características, técnicas y aplicaciones de dominios de repetición. El término “ proteína de repetición” se refiere a una proteína que contiene uno o más dominios de repetición. Preferentemente, una proteína de repetición comprende hasta seis dominios de repetición. Más preferentemente, una proteína de repetición comprende hasta cinco dominios de repetición. Más preferentemente, una proteína de repetición comprende hasta cuatro dominios de repetición. Además, dicha proteína de repetición puede comprender dominios proteicos adicionales sin repeticiones, etiquetas polipeptídicas y/o enlazadores polipeptídicos. Los dominios de repetición pueden ser dominios de unión, como se ha descrito anteriormente en la presente memoria.
El término “ dominio de repetición” se refiere a un dominio proteico que comprende dos o más módulos consecutivos repetidos como unidades estructurales, en donde dichas unidades estructurales tienen el mismo plegamiento, y se apilan firmemente para crear una estructura superhelicoidal con un núcleo hidrofóbico conjunto. Junto con una homología estructural, dichos módulos de repetición tienen adicionalmente una homología de secuencia. Preferentemente, un dominio de repetición comprende, además, una repetición de recubrimiento del extremo N y/o del extremo C. Para mayor claridad, una repetición de recubrimiento puede ser un módulo de repetición. Dichos dominios de repetición, módulos de repetición y repeticiones de recubrimiento, motivos de secuencia, así como la homología estructural y la homología de secuencia, son bien conocidos por el experto en la técnica a partir de los ejemplos de dominios de repetición de anquirina diseñados (documento WO 2002/020565), dominios de repetición ricos en leucina (documento WO 2002/020565), dominios de repetición de tetratricopéptidos (Main, E.R., Xiong, Y., Cocco, M.J., D'Andrea, L, Regan, L, Structure 11 [5], 497-508, 2003), y dominios de repetición de armadillo (documento WO 2009/040338). Además, es bien conocido por los expertos en la técnica, que dichos dominios de repetición son diferentes de las proteínas que comprenden secuencias de aminoácidos repetidas, donde cada secuencia de aminoácidos repetida es capaz de formar un dominio individual (por ejemplo, dominios FN3 de Fibronectina), o en donde las secuencias de aminoácidos repetidas no son unidades estructurales, es decir, dichas secuencias de aminoácidos repetidas no se apilan firmemente para crear una estructura superhelicoidal que tenga un núcleo hidrofóbico conjunto. Los métodos para identificar y determinar módulos de repetición o motivos de secuencias repetidas o para identificar familias de proteínas relacionadas que comprendan dichas unidades o motivos repetidos, tales como las búsquedas de homología (BLAST, etc.), están bien establecidos en el campo de la bioinformática, y son bien conocidos por el experto en la técnica.
El término “ proteína diseñada de repetición” y “ dominio diseñado de repetición” , se refiere a una proteína de repetición o dominio de repetición, respectivamente, que se obtiene como resultado de un procedimiento inventivo, p. ej., como se explica en la solicitud de patente WO 2002/020565. El término “ diseñado” se refiere a la propiedad de que dichas proteínas de repetición y dominios de repetición, respectivamente, están creados por el hombre, son sintéticos y no naturales. Las proteínas diseñadas de repetición o los dominios diseñados de repetición del documento WO 2002/020565 incluyen proteínas de repetición de anquirina diseñadas o dominios de repetición de anquirina diseñados, respectivamente. En consecuencia, una proteína de repetición de anquirina diseñada, en la presente memoria se corresponde con la proteína de la invención que comprende al menos un dominio de repetición de anquirina diseñado. Además, la expresión “ no natural” significa que la secuencia de dicha proteína de unión o dicho dominio de unión no está presente como entrada de secuencia no artificial en una base de datos de secuencias, por ejemplo, en GenBank, EMBL-Bank o Swiss-Prot. Estas bases de datos y otras bases de datos de secuencias similares son bien conocidas por el experto en la técnica. Las proteínas de unión recombinantes o los dominios de repetición de anquirina de la invención diseñados no son de origen natural.
Los términos “ módulo de repetición” , “ unidad de repetición” , “ repetición de recubrimiento” , “ módulo de repetición de recubrimiento” , y términos adicionales relacionados con las proteínas de repetición y los dominios de repetición, se definen en el documento WO 2002/020565.
La expresión “tiene especificidad de unión para una diana” , “ se une específicamente a una diana” , “ unión a una diana con alta especificidad” , “ específico para una diana” o “ especificidad de diana” y similares, significa que una proteína de unión o un dominio de unión se une en PBS a una diana con una constante de disociación menor (es decir, se une con mayor afinidad) que a la que se une a una proteína no relacionada, tal como la proteína de unión a la maltosa (MBP, por sus siglas en inglés) de E. coli. Preferentemente, la constante de disociación (“ Kd” ) en PBS para la diana es al menos 102; más preferentemente, al menos 103; más preferentemente, al menos 104; o más preferentemente, al menos 105 veces menor que la constante de disociación correspondiente para MBP.
Los métodos para determinar las constantes de disociación de las interacciones proteína-proteína, tal como las tecnologías basadas en resonancia de plasmón de superficie (SPR, por sus siglas en inglés) (p. ej., análisis de equilibrio en SPR) o la calorimetría de titulación isotérmica (ITC, por sus siglas en inglés), son bien conocidos por el experto en la técnica. Los valores medidos de Kd de una interacción proteína-proteína particular pueden variar si se miden en diferentes condiciones (p. ej., concentración de sales, pH). Por lo tanto, las mediciones de los valores de Kd se hacen, preferentemente, con soluciones estandarizadas de proteínas y un tampón estandarizado, tales como el PBS.
El término “ PBS” significa una solución de agua tamponada con fosfato que contenga 137 mM de NaCl, 10 mM de fosfato, y 2,7 mM de KCl, y que tenga un pH de 7,4.
La expresión “ inhibe la unión” en el contexto de los dominios de unión de la presente invención, se refiere a la capacidad de dichos dominios de unión para evitar la unión de su diana a otra proteína, normalmente, un ligando natural de la diana u otro antagonista. La fuerza de la inhibición se mide normalmente evaluando la concentración de inhibición semimáxima (CI50). El término inhibición y la evaluación de los valores de la CI50 están bien establecidos en el campo. Por ejemplo, el dominio de repetición de anquirina diseñado de la SEQ ID NO: 18 inhibe la unión del VEGF-A a su ligando natural VEGFR-2.
La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. La descripción también se refiere a dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, y a proteínas de unión recombinantes que comprenden dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, y a proteínas de unión recombinantes que comprenden un primer, un segundo, un tercer, y un cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados, en donde dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado tiene especificidad de unión para el VEGF-A humano, y en donde dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado tiene especificidad de unión para el HGF humano, y en donde dicho tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados tienen cada uno especificidad de unión para la albúmina sérica.
La descripción se refiere a dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50 (véase también los Ejemplos). Ejemplos adicionales de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica se describen en el documento WO 2012/069654. La presente descripción también se refiere a dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica con un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. La presente descripción también se refiere a un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica humana que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. El dominio preferido de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica humana es SEQ ID NO: 50. Preferentemente, dicho dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica se une a la albúmina sérica de origen de ratón, rata, perro, mono Cynomolgus, o ser humano, más preferentemente albúmina sérica de origen de ratón, mono Cynomolgus, o ser humano, más preferentemente albúmina sérica de origen de mono Cynomolgus, o ser humano, más preferentemente albúmina sérica de origen de ser humano, en PBS con una constante de disociación (Kd) menor de 10-5 M; preferentemente menor de 10-6 M; o más preferentemente menor de 10-7 M. El término “ albúmina sérica de ratón” se refiere al número de acceso de UniProt P07724, el término “ albúmina sérica de mono Cynomolgus” (es decir, Macaca fascicularis) se refiere al número de acceso de UniProt A2V9Z4, y el término “ albúmina sérica humana” se refiere al número de acceso de UniProt P02768. En una realización, la invención se refiere a un dominio diseñado de repetición de anquirina con especificidad de unión para la albúmina sérica humana que comprende, más preferentemente que consiste en, SEQ ID NO: 50, que presenta estabilidades de almacenamiento mejoradas en comparación con SEQ ID NO: 51. “ Estabilidad de almacenamiento mejorada” , en el contexto de la presente invención, significa un punto medio mejorado de temperatura de desnaturalización (es decir, el punto medio de despliegue cooperativo al aumentar la temperatura) en 0,5 °C, 1 °C, 1,5 °C, 2 °C, 2,5 °C, 3 °C, 3,5 °C, o 4 °C, y/o la reducción de las 30 cantidades de una banda de degradación, preferentemente la reducción de la cantidad de productos de degradación, según se detecta mediante una SDS-PAGE con tinción Coomassie que se produce tras el almacenamiento a 40 °C durante 1 mes a 10 mg/ml en PBS, en al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, o 50 %. Los métodos para evaluar la estabilidad de almacenamiento mediante SDS-PAGE y los métodos para determinar el punto medio de desnaturalización mediante métodos fluorimétricos o de dicroísmo circular, son bien conocidos por el experto en la técnica. En una realización, la invención se refiere a un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica humana que comprende, más preferentemente consiste en, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 50, que presenta una estabilidad de almacenamiento mejorada en comparación con la SEQ ID NO: 49, preferentemente que presenta cantidades reducidas de productos de degradación, según se detecta mediante SDS-PAGE, que ocurren tras el almacenamiento a 40 °C durante 1 mes a 10 mg/ml en PBS, al menos en un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, o 50 %, en comparación con la SEQ ID NO: 49. Ejemplos de dominios de repetición de anquirina diseñados y proteínas de unión recombinantes con propiedades de estabilidad de almacenamiento mejoradas, se dan en el Ejemplo 9.
La SEQ ID NO: 49 comprende un alto número de sitios de degradación potenciales. La degradación se puede producir, por ejemplo, en la proximidad de una cualquiera de las 5 asparaginas (incluyendo los dipéptidos asparagina-glicina), los 13 aspartatos, o las 10 glicinas de SEQ ID NO: 49, entre los sitios adicionales de degradación potenciales. La SEQ ID NO: 49 comprende, además, varios sitios potenciales de oxidación. Sorprendentemente, se puede conseguir un gran efecto de estabilidad de almacenamiento al mutar solo la posición 78 de la SEQ ID NO: 49. Además, la funcionalidad de la repetición de anquirina diseñada con especificidad de unión para la albúmina sérica se puede conservar al mutar la posición 78 de la SEQ ID NO: 49 de aspartato a glutamina. El dominio de repetición de anquirina diseñado que consiste en la SEQ ID NO: 49 que comprende Glutamato en la posición 78, presenta una mayor estabilidad de almacenamiento en comparación con el dominio de repetición de anquirina diseñado que comprende Aspartato en esa posición.
La presente descripción también se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana. La proteína de unión recombinante preferida comprende exactamente dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana. Un ejemplo de dicha proteína de unión recombinante se da en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134.
La presente descripción también se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, en donde dicha proteína de unión recombinante presenta propiedades farmacocinéticas mejoradas en comparación con la proteína de unión recombinante que comprende solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica humana. Los ejemplos desvelan dichas proteínas de unión recombinantes.
La expresión “ la proteína de unión recombinante que comprende solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica” , significa una proteína de unión recombinante que tiene la composición de una proteína de unión recombinante en la que el número de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica se reduce a uno, al eliminar todos los dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica excepto uno, y los enlazadores polipeptídicos correspondientes. Preferentemente, dicho restante un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica se ubica en una posición en la proteína de unión recombinante correspondiente a una posición que comprendía un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica en la proteína de unión recombinante de la presente invención, y el restante un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica es idéntico al dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica que estaba en la posición correspondiente en la proteína de unión recombinante de la presente invención. A título ilustrativo, la proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 85, es la proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 95, en la que se ha eliminado el dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica del extremo C (en este caso, la SEQ ID NO: 50), así como el enlazador polipeptídico adyacente (en este caso, la SEQ ID NO: 9). De manera importante, el restante dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica (SEQ ID NO: 50) de la SEQ ID NO: 85, se encuentra en el extremo N, y la SEQ ID NO: 95 comprende la misma SEQ ID NO: 50 en la misma posición. De manera similar, la proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 83 es la proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 110, en la que se ha eliminado el dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica del extremo C (en este caso, la SEQ ID NO: 50), así como el enlazador polipeptídico adyacente (en este caso, SEQ ID NO: 9).
La expresión “ presenta propiedades farmacocinéticas mejoradas” , “ propiedades farmacocinéticas mejoradas” , o “ mejora de propiedad farmacocinética” en la presente invención, tiene el significado de que un parámetro farmacocinético de una proteína de unión recombinante ha mejorado en comparación con el parámetro farmacocinético correspondiente de una proteína con la que se compara. Los ejemplos correspondientes se muestran en los Ejemplos 5 y 6, y las Figuras 3 y 4. A modo ilustrativo, al comparar la Proteína n° 110 (una proteína que consiste en la s Eq ID NO: 110 y adicionalmente la SEQ ID NO: 1 en el extremo N) con la Proteína n° 83 (una proteína que consiste en la SEQ ID NO: 83 y adicionalmente la SEQ ID NO: 1 en el extremo N) en estudios farmacocinéticos en monos Cynomolgus, la Proteína n° 110 tiene una mayor exposición (+32%), un aclaramiento reducido (-47%), así como una mayor semivida terminal (+168 %, calculado del día 1 al día 6) que la Proteína n° 83. Como otro ejemplo, cuando se compara la Proteína n° 62 (una proteína que consiste en la SEQ ID NO: 62 y adicionalmente la Se Q ID NO: 1 en el extremo N) con la Proteína n° 57 (una proteína que consiste en la SEQ ID NO: 57 y adicionalmente la SEQ ID NO: 1 en el extremo N) en estudios farmacocinéticos en monos Cynomolgus, la Proteína n° 62 tiene una mayor exposición (+119%), un aclaramiento reducido (-71 %), así como una mayor semivida terminal (+97%, calculada desde el día 1 al día 7) que la Proteína n° 57. O cuando se compara la Proteína n° 109 (una proteína que consiste en la SEQ ID NO: 109 y adicionalmente la SEQ ID NO: 1 en el extremo N) con la Proteína n° 82 (una proteína que consiste en la SEQ ID NO: 82 y adicionalmente la SEQ ID NO: 1 en el extremo N) en estudios farmacocinéticos en monos Cynomolgus, la Proteína n° 109 tiene una mayor exposición (+19 %), un aclaramiento reducido (-37 %), así como una mayor semivida terminal (+55 %, calculada desde el día 1 al día 7) que la Proteína n° 82. Como otro ejemplo más, cuando se compara la Proteína n° 97 (una proteína que consiste en la SEQ ID NO: 97 y adicionalmente la SEQ ID NO: 1 en el extremo N) con la Proteína n° 68 (una proteína que consiste en la SEQ ID NO: 68 y adicionalmente la SEQ ID NO: 1 en el extremo N) en estudios farmacocinéticos en monos Cynomolgus, la Proteína n° 97 tiene una mayor semivida terminal (+264 %, calculada desde el día 1 al día 7) que la Proteína n° 68. Se dan ejemplos adicionales en los Ejemplos 5 y 6, así como en las Figuras 3 y 4. Preferentemente, una propiedad farmacocinética mejorada es un aclaramiento reducido, y/o un aumento de exposición, y/o un aumento de la semivida terminal. Más preferentemente, una propiedad farmacocinética mejorada es un aumento de la semivida terminal. En una realización, una proteína de unión recombinante de la presente invención, que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, presenta un aumento de la semivida terminal, y/o un aclaramiento reducido, y/o un aumento de exposición de al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, o 250 %, en comparación con la proteína de unión recombinante que comprende solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica humana. En una realización, una proteína de unión recombinante de la presente invención, que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, presenta un aumento de la semivida terminal, preferentemente un aumento de la semivida terminal de al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, o 250 %, en comparación con la proteína de unión recombinante que comprende solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica humana.
Preferentemente, el aclaramiento, y/o la exposición, y/o la semivida terminal se evalúan en un mamífero, más preferentemente en un ratón y/o en un mono Cynomolgus, más preferentemente en un mono Cynomolgus. Preferentemente, cuando se mide el aclaramiento, y/o la exposición, y/o la semivida terminal en el ratón, la evaluación se realiza considerando los datos hasta las 48 h tras la inyección. Más preferentemente, la evaluación de la semivida terminal en el ratón se calcula desde las 24 h a las 48 h. Preferentemente, cuando se mide el aclaramiento, y/o la exposición, y/o la semivida terminal en el mono Cynomolgus, la evaluación se realiza considerando los datos hasta el día 7 tras la inyección. Más preferentemente, la evaluación de la semivida terminal en el mono Cynomolgus, se calcula desde el día 1 al día 7. El término “ semivida terminal” de un fármaco tal como una proteína de unión recombinante de la invención, se refiere al tiempo necesario para alcanzar la mitad de la concentración plasmática del fármaco aplicado a un mamífero tras alcanzar el pseudo-equilibrio (por ejemplo, calculado desde las 24 h a las 48 h en el ratón, o calculado desde el día 1 al día 7 en el mono Cynomolgus). La semivida terminal no se define como el tiempo necesario para eliminar la mitad de la dosis del fármaco administrado al mamífero. La semivida terminal es bien conocida por el experto en la técnica. Preferentemente, la comparación farmacocinética se realiza a cualquier dosis, más preferentemente a una dosis equivalente (es decir, la misma dosis en mg/kg), o a una dosis equimolar (es decir, la misma dosis en mol/kg), más preferentemente a una dosis equimolar (es decir, la misma dosis en mol/kg). El experto en la técnica entiende que la dosificación equivalente y/o la equimolar en los animales se somete a variaciones de dosis experimental de al menos un 20 %, más preferentemente un 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, o 100 %. Preferentemente, una dosis que se utiliza para la medición farmacocinética se selecciona de desde 0,001 a 1000 mg/kg, más preferentemente de 0,01 a 100 mg/kg, más preferentemente 0,1 a 50 mg/kg, más preferentemente de 0,5 a 10 mg/kg.
En una realización, una proteína de unión recombinante de la presente invención, que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, presenta un mayor porcentaje de dosis inyectada en un ratón a las 24 h y/o 48 h y/o 72 h tras la inyección, preferentemente 24 h tras la inyección, preferentemente 48 h tras la inyección, más preferentemente 72 h tras la inyección, más preferentemente 72 h y 48 h tras la inyección, más preferentemente 24 h, 48 h y 72 h tras la inyección, en comparación con la proteína de unión recombinante que comprende solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica humana. Preferentemente, el porcentaje de dosis inyectada en un ratón se calcula al comparar la concentración medida 1 h o 4 h tras la inyección, preferentemente 1 h tras la inyección. En una realización la proteína de unión recombinante de la presente invención, que comprende al menos dos, más preferentemente que comprende dos, dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, presenta un alto porcentaje de dosis inyectada en un mono Cynomolgus 4 días y/o 5 días y/o 6 días tras la inyección, preferentemente 4 días, preferentemente 5 días, más preferentemente 6 días, más preferentemente 5 y 6 días tras la inyección, más preferentemente 4, 5, y 6 días tras la inyección, en comparación con la proteína de unión recombinante que comprende solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica. Preferentemente, el porcentaje de dosis inyectada en un mono Cynomolgus se calcula al compararlo a la medición de la concentración 10 min o 1 h tras la inyección, preferentemente 10 min tras la inyección. Un mayor porcentaje de dosis inyectada se refiere a un aumento de porcentaje de dosis en al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, o 250 %.
En una realización, la proteína de unión recombinante comprende cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados, en donde dos dominios de repetición de anquirina diseñados son dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana. Se da un ejemplo de dicha proteína de unión recombinante en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 134.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, en donde cada uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, en PBS con una constante de disociación (Kd) menor de 10-5 M, preferentemente menor de 10-6 M, más preferentemente menor de 10-7 M. Se dan ejemplos de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, en el Ejemplo 2 y en la SEQ ID NO: 50.
En una realización, la presente invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, en donde dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana se encuentran a un extremo N y un extremo C de otros dominios de repetición de anquirina diseñados, comprendidos en dicha proteína de unión recombinante. La SEQ ID NO: 134 ilustra la disposición preferida de dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana en una proteína de unión recombinante de la presente invención.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados, en donde dos de dichos cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados cada uno tiene especificidad de unión para la albúmina sérica humana, y/o, preferentemente y en donde dichos cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados están unidos por enlazadores polipeptídicos.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, en donde dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, tienen cada uno al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %, de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, en donde dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica comprende cada uno la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, en donde dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica son al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % idénticos en secuencia de aminoácidos. En una realización, dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana de dicha proteína de unión recombinante, son idénticos en secuencia de aminoácidos.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, en donde los dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica son capaces de unirse simultáneamente a una molécula de albúmina sérica. En el Ejemplo 7 se muestran ejemplos de unión simultánea de dos moléculas de albúmina sérica humana por proteínas de unión recombinantes de la presente invención, que comprenden dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados, en donde dos de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados son dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, y en donde de dos de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, uno es extremo N y otro es extremo C de otros dominios de repetición de anquirina diseñados, y en donde dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica se unen cada uno a albúmina sérica humana en PBS, con una constante de disociación (Kd) de al menos 10-5 M, preferentemente menor de 10-6 M, o más preferentemente menor de 10-7 M, y en donde dicha proteína de unión recombinante presenta un aumento de semivida terminal, preferentemente un aumento de semivida terminal de al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, o 50 %, en comparación con la proteína de unión recombinante que comprende solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, y en donde dichos cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados están unidos por enlazadores polipeptídicos. En una realización, dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana de dicha proteína de unión recombinante son al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 % idénticos, más preferiblemente idénticos.
En una realización, los dominios proteicos o los dominios de repetición de anquirina diseñados presentes en una proteína de unión recombinante de la presente invención, están unidos por enlazadores polipeptídicos. En una realización, los enlazadores polipeptídicos unen dominios proteicos, o los dominios de repetición de anquirina diseñados presentes en una proteína de unión recombinante de la presente invención comprenden la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9. En una realización, los Gly Ser que flanquean el extremo N de SEQ ID NO: 9 y/o los Gly Ser que flanquean el extremo C de SEQ ID NO: 9 están, opcionalmente, ausentes. En una realización, los enlazadores polipeptídicos que unen los dominios de repetición de anquirina diseñados presentes en una proteína de unión recombinante de la presente invención, consisten en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. En una realización, dichos enlazadores polipeptídicos presentes en una proteína de unión recombinante de la presente invención son idénticos.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, en donde dichos enlazadores polipeptídicos comprenden la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, y en donde cada uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %, de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, en donde cada uno de dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, en donde cada uno de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, y en donde dicha proteína de unión recombinante presenta una estabilidad de almacenamiento mejorada, preferentemente con cantidades reducidas de productos de degradación tras el almacenamiento a 40 °C durante 1 mes a 10mg/ml en PBS, en comparación con la proteína de unión recombinante, en donde cada uno de dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49, y/o en comparación con la proteína de unión recombinante, en donde cada uno de dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51, preferentemente en comparación con la proteína recombinante, en donde cada uno de dichos al menos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, en donde cada uno de dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, y en donde dichos dominios de repetición de anquirina diseñados están unidos por enlazadores polipeptídicos que comprenden cada uno la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, en donde cada uno de dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, en donde cada uno de dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, y en donde dichos dominios de repetición de anquirina diseñados están unidos por enlazadores que comprenden cada uno la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados, en donde dos de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados son dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, en donde cada uno de dichos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, y en donde dichos dominios de repetición de anquirina diseñados están unidos por enlazadores que comprenden cada uno la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, y en donde dichos dominios de repetición de anquirina diseñados tienen la disposición (desde el lado del extremo N al lado del extremo C): SEQ ID NO: 50 - SEQ ID NO: 9 - XXX - SEQ ID NO: 9 - YYY - SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 50, en donde XXX e YYY representa cada uno un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para otra diana distinta de la albúmina sérica.
En una realización, la presente invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende al menos un primer, un segundo, un tercer y un cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado, en donde dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado tiene especificidad de unión para el VEGF-A humano, y en donde dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado tiene especificidad de unión para el HGF humano, y en donde dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados tienen cada uno especificidad de unión para la albúmina sérica humana. Preferentemente, dicha proteína de unión recombinante consiste en una única cadena polipeptídica. Más preferentemente, dichos primer, segundo, tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados están unidos por enlazadores polipeptídicos. En una realización, la presente invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende un primer, un segundo, un tercer y un cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados, en donde dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado tiene especificidad de unión para el VEGF-A humano, y en donde dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado tiene especificidad de unión para el HGF humano, y en donde dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados tienen especificidad de unión para la albúmina sérica humana. Se da un ejemplo de dicha proteína de unión recombinante en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134.
Preferentemente, el VEGF-A es el VEGF-A165 humano. En la presente memoria se dan ejemplos de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el VEGF-A (p. ej., SEQ iD NO: 18; véase los ejemplos), y se describen ejemplos adicionales en los documentos WO 2010/060748 y WO 2011/135067.
En la presente memoria se dan ejemplos de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HGF (p. ej., SEQ ID NO: 26; véase los ejemplos), y se describen ejemplos adicionales en el documento WO 2014/191574.
En una realización la proteína de unión recombinante o el dominio de repetición de anquirina diseñado carece de un resto de Cys libre. Un “ resto de Cys libre” no está implicado en la formación de un enlace disulfuro. En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión o a un dominio de unión libre de cualquier resto de Cys. En una realización, el dominio de repetición de anquirina diseñado y/o la proteína de unión recombinante carecen de cualquier enlace disulfuro. Los enlaces disulfuro de fragmentos de anticuerpo se conocen, por ejemplo, por el experto en la técnica por dificultar la producción simple de los fragmentos de anticuerpo en las bacterias.
Las técnicas para modificar una proteína de unión recombinante de la presente invención, son bien conocidas por el experto en la técnica.
En particular, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende al menos un primer, un segundo, un tercer, y un cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado, en donde dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado se une al VEGF-A humano en PBS con una constante de disociación (Kd) menor de 10'7 M; preferentemente menor de 10'8 M; más preferentemente menor de 10'9 M; o más preferentemente menor de 10'1° M; y en donde dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado se une al HGF en PBS con una constante de disociación (Kd) menor de 10'7 M; preferentemente menor de 10'8 M; más preferentemente menor de 10' 9 M; o más preferentemente menor de 10■1° M; y en donde dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados se unen a la albúmina sérica en PBS con una constante de disociación (Kd) menor de 10-5 M; preferentemente menor de 10-6 M; o más preferentemente menor de 10-7 M. En la presente memoria se dan ejemplos de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el VEGF-A humano, dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HGF humano, y dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana (p. ej., SEQ ID NOs: 18, 26 y 50; véase los ejemplos).
Además, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende al menos un primer, un segundo, un tercer, y un cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado, en donde dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado inhibe la unión del VEGF-A humano al VEGFR-2 humano en p Bs con un valor de CI50 menor de 10-7 M; preferentemente 10-8 M; más preferentemente 10-9 M, y en donde dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado inhibe la unión del HGF humano al cMet humano en PBS con un valor de CI50 menor de 10-7 M; preferentemente 10-8 M; más preferentemente 10-9 M.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende al menos un primer, un segundo, un tercer, y un cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado, en donde dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. En una realización, dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, en la que los aminoácidos individuales se sustituyen por cualquier aminoácido que exista en la misma posición de un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. En una realización dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. En una realización dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. Además, dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado de dicha proteína de unión recombinante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. En una realización, dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 26, en la que aminoácidos individuales se sustituyen con cualquier aminoácido que exista en la misma posición de un alineamiento la de secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. En una realización, dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. En una realización, dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26. En una realización, dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados de dicha proteína de unión recombinante comprenden cada uno una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. En una realización, dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados comprenden cada uno la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, en la que aminoácidos individuales se sustituyen por cualquier aminoácido que exista en la misma posición de un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. En una realización, cada uno de dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. En una realización, cada uno de dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. En una realización dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados son idénticos. En una realización adicional, dichos dominios de repetición de anquirina diseñados están unidos por el enlazador polipeptídico de SEQ ID NO: 9. En una realización, los Gly Ser que flanquean el extremo N de SEQ ID NO: 9, y/o los Gly Ser que flanquean el extremo C de SEQ ID NO: 9, están, opcionalmente, ausentes. En una realización, los enlazadores polipeptídicos que unen los dominios de repetición de anquirina diseñados presentes en una proteína de unión recombinante de la presente invención, consisten en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9. En una realización, dichos enlazadores polipeptídicos presentes en una proteína recombinante de la presente invención son idénticos. En los ejemplos se dan ejemplos de dichos enlazadores polipeptídicos, variaciones de los mismos, y el uso de dichos enlazadores polipeptídicos en proteínas de unión recombinantes.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende al menos un primer, un segundo, un tercer y un cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado, en donde dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, y en donde dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, y en donde cada uno de dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, y en donde dichos dominios de repetición de anquirina diseñados están unidos por enlazadores polipeptídicos que consisten en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende al menos un primer, un segundo, un tercer, y un cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado, en donde dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado tiene especificidad de unión para el VEGF-A humano, y en donde dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado tiene especificidad de unión para el HGF humano, y en donde dichos tercero y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados tienen cada uno especificidad de unión para la albúmina sérica humana, y donde dichos dominios diseñados de repetición de anquirina diseñados están unidos por enlazadores polipeptídicos, y en donde dicha proteína de unión recombinante se puede unir al VEGF-A humano, al HGF humano, y a la albúmina sérica humana, simultáneamente. En una realización, dicha proteína de unión recombinante se puede unir a dos moléculas de albúmina sérica humanas, simultáneamente.
Los términos “ primer” , “ segundo” , “ tercer” y, opcionalmente, “ cuarto” , que se utilizan en “ primer dominio de repetición de anquirina diseñado” , “ segundo dominio de repetición de anquirina diseñado” , “tercer dominio de repetición de anquirina diseñado” , y “ cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado” , no indican o implican una disposición posicional de dichos dominios de repetición de anquirina diseñados, en la proteína de unión recombinante.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende al menos un primer, un segundo, un tercer, y un cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado que están unidos por enlazadores polipeptídicos. En una realización, dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado se encuentra en el extremo N del dominio de repetición de anquirina diseñado del extremo C, y en el extremo C de los otros dos dominios de repetición de anquirina diseñados. En una realización, dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado, que tiene una especificidad de unión para el HGF humano, se encuentra en el extremo C del dominio de repetición de anquirina diseñado del extremo N, y en el extremo N de los otros dos dominios de repetición de anquirina diseñados. En una realización, dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados, que tienen cada uno una especificidad de unión para la albúmina sérica humana, se encuentran en un extremo N, y en un extremo C de los otros dos dominios de repetición de anquirina diseñados. En una realización, dicho tercer dominio de repetición de anquirina diseñado se encuentra en el extremo N de los otros tres dominios de repetición de anquirina diseñados, dicho cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado se encuentra en el extremo C de los otros tres dominios de repetición de anquirina diseñados, dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado se encuentra en el extremo C de dicho tercer dominio de repetición de anquirina diseñado, y en el extremo N de dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado, y dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado se encuentra en el extremo C de dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado, y en el extremo N de dicho cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende un primer, un segundo, un tercer y un cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado, en donde dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado tiene una especificidad de unión para el VEGF-A humano, y en donde dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado tiene una especificidad de unión para el HGF humano, y en donde cada uno de dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados tiene especificidad de unión para la albúmina sérica humana, y en donde dichos dominios de repetición de anquirina diseñados están unidos por enlazadores polipeptídicos. En una realización, dicho primer, segundo, tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados, están en el orden (desde el extremo N hasta el extremo C) tercero-segundo-primero-cuarto.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende al menos un primer, un segundo, un tercer y un cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado, en donde dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado tiene una especificidad de unión para el VEGF-A humano, y en donde dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado tiene especificidad de unión para el HGF humano, y en donde cada uno de dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados tiene especificidad de unión para la albúmina sérica humana, en donde dicha proteína de unión recombinante se une al VEGF-A humano con una CE50 de menos de 10'7 M, preferentemente menos de 10'8 M, más preferentemente menos de 10'9 M, más preferentemente menos de 10-10 M.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende un primer, un segundo, un tercer, y un cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado, en donde cada uno de dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50. En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende un primer, un segundo, un tercer, y un cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado, en donde dicho primer dominio diseñado de repetición de anquirina comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, y en donde dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, y en donde cada uno de dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, y en donde dichos dominios de repetición de anquirina diseñados están unidos por enlazadores polipeptídicos que comprenden cada uno la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende un primer, un segundo, un tercer, y un cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado, en donde dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado comprende la secuencia de SEQ ID NO: 18, y en donde dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, y en donde cada uno de dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, y en donde dichos dominios de repetición de anquirina diseñados están unidos por enlazadores polipeptídicos que comprenden cada uno la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, y en donde dichos dominios de repetición de anquirina diseñados tienen la disposición (desde el lado del extremo N hasta el lado del extremo C): SEQ ID NO: 50 - SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 26 - SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 18 - SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 50.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende un primer, un segundo, un tercer, y un cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado, en donde el primer dominio de repetición de anquirina diseñado tiene una especificidad de unión para el VEGF-A humano, y en donde dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado tiene especificidad de unión para el HGF humano, y en donde cada uno de dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados tiene especificidad de unión para la albúmina sérica humana, y en donde dichos dominios de repetición de anquirina diseñados están unidos por enlazadores polipeptídicos que comprenden cada uno la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, y en donde dicha proteína de unión recombinante se une al VEGF-A, y/o al HGF, preferentemente al VEGF-A con un menor, es decir, mejor, CE50, en comparación con la proteína de unión recombinante en donde dichos dominios de repetición de anquirina diseñados están unidos por enlazadores polipeptídicos que comprenden cada uno la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6. En el Ejemplo 8 se dan ejemplos del enlazador sobre la CE50, y el término “ CE50 menor” es bien conocido por el experto en la técnica. Preferentemente, el término “ CE50 menor” significa un valor de la CE50 que está mejorada por un factor de 1,1, más preferentemente 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende un primer, un segundo, un tercer, y un cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado, en donde dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado tiene especificidad de unión para el VEGF-A humano, y en donde dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado tiene especificidad de unión para el HGF humano, y en donde cada uno de dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados tiene especificidad de unión para la albúmina sérica humana, en donde dicha proteína de unión recombinante se une al VEGF-A, y/o al HGF, preferentemente al VEGF-A con una menor, es decir, mejor, CE50, en comparación con la proteína de unión recombinante que comprende solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica. Se dan ejemplos en el Ejemplo 8.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100%, de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134.
En cualquier realización de la presente invención que se refiere a un dominio de repetición de anquirina diseñado o una proteína de unión recombinante que comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 100 %, de identidad con una secuencia de aminoácidos determinada, los aminoácidos no idénticos se pueden ubicar en cualquier posición del dominio de repetición de anquirina diseñado o de la proteína de unión recombinante.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134.
La invención se refiere de manera particular a una proteína de unión recombinante que comprenda una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, o 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134.
La invención se refiere adicionalmente de manera particular a una proteína de unión recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134. En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134.
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134.
Se prefiere la SEQ ID NO: 134. Se prefiere una proteína de unión recombinante, en donde la secuencia de aminoácidos es la SEQ ID NO: 134. Se prefiere una proteína, en donde la secuencia de aminoácidos es la SEQ ID NO: 134. Se prefiere una proteína de unión recombinante que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134.
Múltiples características hacen a la SEQ ID NO: 134 la proteína de unión recombinante preferida de la invención. Comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, que consiste cada uno en la SEQ ID NO: 50, que muestra propiedades de estabilidad de almacenamiento mejoradas (véase el Ejemplo 9; Figura 2) en comparación con un dominio de repetición de anquirina diseñado conocido con especificidad de unión para la albúmina sérica humana. Comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, que, sorprendentemente, da lugar a propiedades farmacocinéticas mejoradas (Ejemplos 5 y 6, Figuras 3 y 4). Los dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana están flanqueando los otros dominios de repetición de anquirina diseñados, dando lugar a las mejores propiedades farmacocinéticas observadas (Ejemplo 6). Los dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el VEGF-A humano y el HGF humano, así como su disposición estructural, se escogieron para maximizar la actividad del compuesto (Ejemplo 8). Los dominios de repetición de anquirina diseñados están conectados utilizando un enlazador rico en PT, que, sorprendentemente, da lugar a una actividad mejorada de los dominios de repetición de anquirina individuales diseñados (Ejemplo 8) y, sorprendentemente, dan lugar a propiedades farmacocinéticas mejoradas (Ejemplo 5).
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende al menos un primer, un segundo, un tercer y un cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado, en donde dicho primer dominio de repetición de anquirina diseñado tiene especificidad de unión para el VEGF-A humano, y en donde dicho segundo dominio de repetición de anquirina diseñado tiene especificidad de unión para el HGF humano, y en donde cada uno de dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados tiene especificidad para la para albúmina sérica humana, y en donde dicho primer, segundo, tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina diseñados están unidos por enlazadores polipeptídicos, y en donde dicha proteína de unión recombinante presenta un aumento de la semivida terminal, preferentemente un aumento de la semivida terminal de al menos un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, o 45 %, en comparación con la proteína de unión recombinante que carece de dicho cuarto dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica. Ejemplos de dicho aumento de la semivida terminal se dan en los Ejemplos 5 y 6, y en las Figura 3 y 4.
En una realización, la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína de unión recombinante de la presente invención, más preferentemente una proteína de unión recombinante de la presente invención. En una realización, la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de cualquier proteína de unión recombinante de la presente invención, que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana. En una realización, la invención se refiere a un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína de unión recombinante de la presente invención. Además, la invención se refiere a vectores que comprenden cualquier ácido nucleico de la invención. Los ácidos nucleicos son bien conocidos por el experto. En los ejemplos, se utilizaron ácidos nucleicos para producir dominios de repetición de anquirina diseñados o proteínas de unión recombinantes de la invención, en E. coli.
En una realización, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión recombinante de la presente invención, o un ácido nucleico que codifica la proteína de unión recombinante de la presente invención y, opcionalmente, un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptables.
En una realización, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión recombinante o un ácido nucleico que codifica una proteína de unión recombinante y, opcionalmente, un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptables.
Los vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables son conocidos por el experto en la técnica, y se explican con más detalle a continuación. Aún más, se considera una composición diagnóstica que comprende una o más de las proteínas de unión recombinantes y/o ácidos nucleicos, en particular, proteínas de unión recombinantes.
Una composición farmacéutica comprende una proteína de unión recombinante, y/o un ácido nucleico como se describe en la presente memoria, y un vehículo, excipiente o estabilizante farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, como se describe en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed., 1980. Los vehículos, excipientes o estabilizantes adecuados conocidos por el experto en la técnica, son la solución salina, la solución de Ringer, la solución de dextrosa, la solución de Hank, los aceites no volátiles, el etil oleato, la dextrosa al 5 % en solución salina, las sustancias que aumenten la isotonicidad y la estabilidad química, los tampones y los conservantes. Otros vehículos adecuados incluyen cualquier vehículo que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos perjudiciales para el individuo que reciba la composición, tal como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, y copolímeros de aminoácidos. Una composición farmacéutica también puede ser una formulación combinada, que comprenda un principio activo adicional, tal como un agente anti-cáncer o un agente antiangiogénico, o un compuesto bioactivo adicional.
Una realización de la presente invención se refiere al uso de una proteína de unión recombinante de la presente invención, que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica humana, para la elaboración de una composición farmacéutica, en donde dicha proteína de unión recombinante presente un aumento de la semivida terminal, preferentemente un aumento de la semivida terminal de al menos un 5 %, preferentemente un 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, o 250 %, en comparación con la proteína de unión recombinante que comprende solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica humana.
En una realización, una composición farmacéutica comprende al menos una proteína de unión recombinante como se describe en la presente memoria, y un detergente, tal como un detergente no iónico, un tampón, tal como un fosfato, y una azúcar, tal como la sacarosa. En una realización, dicha composición comprende proteínas de unión recombinante, como se describió anteriormente, y PBS.
En una realización, la invención se refiere a una composición farmacéutica, o una proteína de unión recombinante según la presente invención, para su uso en el tratamiento de una enfermedad. Para dicho fin, la composición farmacéutica, o la proteína de unión recombinante según la presente invención, se administra, a un paciente que necesite la misma, en una cantidad terapéuticamente eficaz. La administración puede incluir la administración tópica, la administración oral, y la administración parenteral. La vía típica de administración es la administración parenteral. En la administración parenteral, el medicamento de la presente invención se formulará en forma de unidad de dosificación inyectable, tal como una solución, una suspensión o una emulsión, conjuntamente con los excipientes farmacéuticamente aceptables, como se definió anteriormente. La dosificación y el modo de administración dependerán del individuo que se vaya a tratar, y a la enfermedad en particular.
Además, cualquiera de las composiciones farmacéuticas mencionadas anteriormente o la proteína de unión recombinante, se considera para su uso en el tratamiento de un trastorno.
Una composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar, por ejemplo, mediante administración parenteral. En la administración parenteral, el medicamento de la presente invención se formulará en forma de unidad de dosificación inyectable, tal como una solución, una suspensión o una emulsión, conjuntamente con los excipientes farmacéuticamente aceptables, como definió anteriormente. La dosificación y modo de administración dependerán del individuo que se vaya a tratar, y de la enfermedad en particular. En una realización, dicha proteína de unión recombinante o dicha otra composición farmacéutica descrita en la presente memoria, se aplica por vía intravenosa. Para la aplicación parenteral, la proteína de unión recombinante o dicha composición farmacéutica, se puede inyectar por inyección en bolo, o mediante una infusión lenta en una cantidad terapéuticamente eficaz.
El Ejemplo 14 (Figura 10) ilustra la utilidad del uso de una proteína de unión recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 134, para el tratamiento del cáncer. En una realización, la invención se refiere a una composición farmacéutica de la presente invención, para su uso en el tratamiento de una enfermedad. En una realización, la invención se refiere a una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad.
Una “ afección médica” (o trastorno) puede ser aquella que se caracterice por la angiogénesis inadecuada. Una afección médica puede ser una afección hiperproliferativa. Ejemplos de afecciones médicas adecuadas para el tratamiento incluyen trastornos autoinmunitarios, trastornos inflamatorios, retinopatías (particularmente, retinopatías proliferativas), trastornos neurodegenerativos, infecciones, y enfermedades neoplásicas. Cualquiera de las proteínas de unión recombinantes que se describen en la presente memoria, se pueden utilizar para la preparación de un medicamento para el tratamiento de dicho trastorno, en particular, un trastorno seleccionado del grupo que consiste en: un trastorno autoinmunitario, un trastorno inflamatorio, una retinopatía y una enfermedad neoplásica. La invención se refiere de manera particular a dichas composiciones farmacéuticas para su uso en un método para el tratamiento de una afección médica, comprendiendo el método la etapa de administración, a un paciente que necesite dicho tratamiento, de una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión recombinante de dicha composición farmacéutica de la invención. En algunas realizaciones dicha afección médica es una enfermedad neoplásica. El término “ enfermedad neoplásica” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un estado anormal o afección de las células o del tejido, que se caracteriza por un rápido crecimiento celular proliferativo o neoplasia. En un sentido más específico, el término se refiere al cáncer. En un sentido más específico, el término puede relacionarse con cáncer renal y/o cáncer gástrico y/o mieloma múltiple. El término “ cantidad terapéuticamente eficaz” , significa una cantidad que sea suficiente para producir un efecto deseado en un paciente.
En particular, la invención se refiere a una composición farmacéutica de la presente invención, para su uso en el tratamiento de una afección médica, en donde dicha afección médica es el cáncer.
La proteína de unión recombinante de la presente invención o dichas composiciones farmacéuticas para su uso en el tratamiento de enfermedades cancerosas, también pueden estar en combinación con cualquier otra terapia conocida en la técnica. La expresión “ uso en combinación con” , como se utiliza en la presente memoria, se referirá a una coadministración, que se lleva a cabo bajo un régimen determinado. Esto incluye la administración sincronizada de diferentes compuestos, así como la administración diferida de los diferentes compuestos (p. ej., el compuesto A se da una vez, y el compuesto B se da varias veces después, o viceversa, o ambos compuestos se dan de manera sincronizada, y uno de los dos también se da en fases posteriores).
Se considera, además, la proteína recombinante para su uso en el tratamiento de una enfermedad que incluya la angiogénesis patológica. El término “ angiogénesis patológica” , se refiere a la formación y crecimiento de vasos sanguíneos durante el mantenimiento y la progresión de varios estados de enfermedad.
En una realización adicional, la invención se refiere al uso de una proteína de unión recombinante de la invención, para la elaboración de un medicamento que se utilice para el tratamiento de una afección médica, preferentemente una enfermedad neoplásica, más preferentemente el cáncer.
En una realización, la invención se refiere al uso de una composición farmacéutica de la invención para la elaboración de un medicamento que se utilice para el tratamiento de una afección médica, que puede ser una enfermedad neoplásica, en particular, el cáncer.
Las formulaciones que se vayan a utilizar para la administración in vivo, han de ser asépticas o estériles. Esto se consigue fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles.
La expresión “ seleccionado del grupo que consiste en” en conexión con una única elección en la presente invención, tiene el significado de esa particular elección. Por ejemplo, en una realización, “ la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 134” , que tiene el significado “ la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134” .
En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende cualquiera de los dominios de repetición mencionados anteriormente. En una realización, la invención se refiere a una proteína de unión recombinante que comprende la SEQ ID NO: 134 mencionada anteriormente.
La invención no está restringida a las realizaciones particulares descritas en los Ejemplos. Se pueden utilizar y procesar otras fuentes, siguiendo la descripción general descrita posteriormente.
Se citan varios documentos a lo largo de la presente memoria descriptiva.
La memoria descriptiva se refiere a varias secuencias de aminoácidos del listado de secuencias de aminoácidos de la presente memoria descriptiva, llamado “ MD41211_Sequence_Listing.txt” .
Ejemplos
Todos los materiales y reactivos convencionales divulgados en el presente documento son conocidos por los expertos en la técnica, y están disponibles en el mercado o se pueden preparar utilizando técnicas bien conocidas.
Materiales
Los productos químicos se adquirieron en Sigma-Aldrich (Suiza). Los oligonucleótidos procedieron de Mycrosinth (Suiza). A menos que se especifique lo contrario, las ADN polimerasas, las enzimas de restricción y los tampones, se procedieron de New England Biolabs (EE. UU.), o de Thermo Fisher Scientific Fermentas (Lituania). La cepa de clonación y producción proteica era E. co liXL-1-Blue (Stratagene, EE. UU.), o BL21 (Novagen, EE. UU.). El VEGF-A recombinante (de seres humanos, ratón, rata), el VEGF-C, el PDGF-AB, y el HGF (de seres humanos, mono Cynomolgus, ratón) procedieron de R&D Systems (Biotechne; Minneapolis, EE. UU.), Peprotech (Rocky Hill, EE. UU.), Sino Biological (Beijing, China), ReliaTech (Wolfenbüttel, Alemania), o se produjeron en Chinese Hamster Ovary Cells o en Pichia pastoris, y se purificaron según protocolos convencionales. La albúmina sérica de las diferentes especies procedió de Sigma-Aldrich, Innovative Research (Novi, EE. UU.), CSL Behring (Suiza), o se recolectó directamente de los animales, utilizando métodos convencionales. El VEGF-A o el HGF biotinilados se obtuvieron químicamente mediante el acoplamiento del resto de biotina a las aminas primarias de la proteína, utilizando reactivos y métodos de biotinilación convencionales (Thermo Fisher Scientific Inc., EE. UU.). Los anticuerpos procedieron de Thermo Fisher Scientific o QIAgen (Alemania), o se generaron utilizando procedimientos de inmunización e hibridoma convencionales en ratones o conejos, procedimientos que son bien conocidos por el experto en la técnica relevante. Los reactivos del cultivo celular procedieron de Lonza (Suiza), Roche (Suiza), Thermo Fisher Scientific, y Promocell (Alemania).
Biología molecular
A menos que se especifique lo contrario, los métodos se realizan según los protocolos descritos (Sambrook J., Fritsch E.F. y Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, New York).
Dominios, bibliotecas y selecciones de repetición de anquirina diseñados
Se describen métodos para generar bibliotecas de proteínas de repetición de anquirina diseñadas, ejemplos de bibliotecas de proteínas de repetición de anquirina diseñadas, y métodos para seleccionar proteínas de repetición de anquirina diseñadas, a partir de bibliotecas de proteínas de repetición de anquirina diseñadas (documentos WO 2002/020565; WO 2010/060748; WO 2012/069654; WO 2012/069655; WO 2014/001442; Binz y col., 2004, loc. cit.).
Ejemplo 1: Selección, expresión, purificación, y análisis de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el VEGF-A, el HGF, o la albúmina sérica
Utilizando Ribosome Display (Binz y col., 2004, loc. cit.) se seleccionaron dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el VEGF-A, el HGF, o la albúmina sérica, a partir de bibliotecas combinatorias, mediante los métodos descritos en el documento WO 2010/060748 para la generación de los dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el VEGF-A, y mediante los métodos descritos en el documento W o 2014/191574 para la generación de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HGF, y mediante los métodos descritos en el documento WO 2012/069654 para la generación de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica. La unión de los clones seleccionados con dianas específicas (VEGF-A, HGF, o albúmina sérica, respectivamente) e inespecíficas (p. ej., MBP, proteína de unión a maltosa de E. coli), se evaluó mediante un ELISA de extracto bruto, indicando que cientos de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el VEGF-A, el HGF, o la albúmina sérica, respectivamente, se seleccionaron satisfactoriamente en cada selección, para la diana respectiva. Por ejemplo, los dominios de repetición de anquirina diseñados de SEQ ID NOs: 12 a 22, constituyen secuencias de aminoácidos de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el VEGF-A, los dominios de repetición de anquirina diseñados de SEQ ID NOs: 23 a 37 constituyen las secuencias de aminoácidos de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HGF, y los dominios de repetición de anquirina diseñados de SEQ ID NOs: 40 a 56 constituyen las secuencias de aminoácidos de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica.
Estos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el VEGF-A, el HGF, o la albúmina sérica, y los dominios de repetición de anquirina diseñados de control negativo sin especificidad de unión conocida (es decir, las Proteínas n° 10 y n° 11) se clonaron en un vector de expresión basado en pQE (QIAgen, Alemania), proporcionando una etiqueta His en el extremo N, para facilitar la purificación simple proteica. Las proteínas se produjeron y purificaron con métodos conocidos por el experto en la técnica, como los descritos en el documento WO 2010/060748.
Ejemplo 2: Uso de resonancia de plasmón de superficie (SPR) para la caracterización de dominios de repetición de anquirina diseñados
Se midió la SPR utilizando un instrumento ProteOn (BioRad) y se llevó a cabo la medición según procedimientos convencionales conocidos por el experto en la técnica. Los valores de Kd que se midieron para las proteínas seleccionadas se enumeran en las Tablas 1 a 3.
Tabla 1: Ejemplos de constantes de disociación de los dominios de repetición de anquirina diseñados que se unen al VEGF-A humano
Figure imgf000023_0001
* Las Proteínas n° 12, n° 13, y n° 16 en la presente tabla, representan
dominios de repetición de anquirina diseñados que consisten en las
correspondientes secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 12, 13 y 16, y,
adicionalmente, una etiqueta His en el extremo N (SEQ ID NO: 1).
Se obtuvieron valores similares de la constante de disociación del VEGF-A,
para las Proteínas n° 14, n° 15, y n° 17 a n° 22.
Tabla 2: Ejemplos de constantes de disociación de dominios de repetición de anquirina diseñados que se unen al HGF humano
Figure imgf000023_0002
* Las Proteínas n° 23 a n° 29 en la presente tabla, representan dominios de
repetición de anquirina diseñados que consisten en las correspondientes secuencias de
aminoácidos de SEQ ID NOs: 23 a 29, y, adicionalmente, una etiqueta His en el extremo
N (SEQ ID NO: 1).
Se obtuvieron valores similares de la constante de disociación del HGF, para las proteínas
n° 30 a n° 37.
Tabla 3: Ejemplos de constantes de disociación de dominios de repetición de anquirina diseñados que se unen al HSA humano
Figure imgf000023_0003
Figure imgf000024_0001
* Las Proteínas n° 44 a n° 55 en la presente tabla, representan dominios de repetición
de anquirina diseñados que consisten en las correspondientes secuencias de aminoácidos de
SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 54 y 55, y, adicionalmente, una etiqueta His en
el extremo N (SEQ ID NO: 1).
Se obtuvieron valores similares de la constante de disociación de la albúmina sérica humana,
para las Proteínas n° 40 a n° 43, n° 53, n° 56, y n° 57.
Ejemplo 3: Ensayos de competición de unión y ensayos de competición de unión del receptor
Caracterización de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el VEGF-A, el HGF, o la albúmina sérica, respectivamente, mediante ensayos de competición. Dichos ensayos son bien conocidos por el experto en la técnica. Para los dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el VEGF-A, se utilizó una técnica de inmunoensayo enzimático sándwich cuantitativo, según el fabricante (VEGF-A Quantikine kit DVE00, R&D Systems). Se revistió previamente sobre una microplaca un anticuerpo monoclonal específico del VEGF-A. Se aplicaron estándares del VEGF-A y mezclas del VEGF-A (20 μM) y la Proteína n° 18, n° 19, o n° 20, a concentraciones variables en los pocillos, y cualquier VEGF-A libre que estuviera presente (es decir, no unido al dominio de repetición de anquirina diseñado) se une por el anticuerpo inmovilizado. Después del lavado de cualquier sustancia sin unir, se añadió a los pocillos un anticuerpo policlonal unido a una enzima específica para el VEGF-A. A continuación de un lavado para eliminar cualquier reactivo anticuerpo-enzima no unido, se añadió una solución de sustrato a los pocillos, y se desarrolla un color en proporción a la cantidad del VEGF-A unido en la etapa inicial. El desarrollo del color se detuvo y se midió la intensidad del color. En este ensayo, las proteínas de repetición de anquirina diseñadas probadas presentaron una alta potencia de inhibición del VEGF-A. Se calcularon los valores de CI50 a partir de dichas curvas de titulación obtenidas como se describió anteriormente, utilizando el software Graph Pad Prism y procedimientos convencionales conocidos por el experto en la técnica. Para los dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para el HGF, se llevó a cabo un ensayo de competición del receptor cMet. Con este objetivo, se inmovilizaron 5 nM del receptor de cMet humano en PBS sobre placas Maxisorp durante la noche a 4 °C. Tras el lavado con PBS con un 0,05 % de TWEEN 20, la placa se bloqueó durante 2 h con agitado a 300 rpm, utilizando PBS que contenía un 0,05 % de TWEEN 20 y un 0,25 % de Caseína a TA. Se pre-incubó una concentración constante de 5 nM de HGF humano durante 30 min a Ta , con 1000 nM-1 μM de las Proteínas n° 23, n° 26, n° 28, y n° 29 (en series de dilución de 1:4 cada una), en una placa de dilución en PBS con un 0,05 % de TWEEN 20. Tras el lavado de la placa de ELISA con PBS con un 0,05 % de TWEEN, se transfirieron muestras pre-incubadas a la placa de ELISA, y se incubó la placa durante 2 h a TA, con agitado a 300 rpm. Tras el lavado con PBS con un 0,25 % de TWEEN, se añadieron 200 ng/ml de anticuerpo anti-HGF humano durante 1 h a TA, con agitado a 300 rpm. Tras el lavado con PBS con un 0,05% de TWEEN, se añadieron 100 ng/ml de anticuerpo policlonal anti especies HGF conjugado con HRP, durante 30 min a TA, con agitado a 300 rpm. La detección utilizó MB blue POD (Roche) diluido 1:3. Se detuvo la reacción de color tras 15 min, mediante la adición de H2SO41 M. La lectura se hizo a A450 utilizando como referencia la longitud de onda A620.
Se dan ejemplos de los valores de la CI50 en las Tablas 4 y 5. Se obtuvieron valores similares a la CI50 para el VEGF-A con las Proteínas n° 12 a n° 17, n° 21, y se obtuvieron valores de la CI50 similares para el HGF con las Proteínas n° 24, n° 25, n° 27, y n° 30 a n° 37.
Tabla 4: Inhibición de la unión de VEGF-A de un anticuerpo mediante los dominios de repetición de anquirina diseñados (valores medios de la CI50)
Figure imgf000024_0002
* Las Proteínas n° 18 a n° 20 en la presente tabla, representan dominios de
repetición de anquirina diseñados que consisten en las correspondientes secuencias de
aminoácidos de SEQ ID NOs: 18 a 20, y, adicionalmente, una etiqueta His en el extremo N
(SEQ ID NO: 1).
Tabla 5: Inhibición de la unión de HGF a cMet mediante los dominios de repetición de anquirina diseñados (valores medios de la CI50)
Figure imgf000025_0001
* Las Proteínas n° 23, n° 26, n° 28 y n° 29 en la presente tabla, representan
dominios de repetición de anquirina diseñados que consisten en las correspondientes
secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 23, 26, 28 y 29, y, adicionalmente, una
etiqueta His en el extremo N (SEQ ID NO: 1).
Ejemplo 4: Generación de proteínas de unión recombinantes, en particular, proteínas de unión recombinantes que comprenden dos, tres o cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados, y otras proteínas de repetición
Se generó el ADN que codifica los dominios de repetición de anquirina diseñados o las proteínas de unión recombinantes, mediante medios genéticos bien conocidos por el experto en la técnica. Las proteínas de unión recombinantes seleccionas del grupo de secuencias de aminoácidos SEQ ID NOs: 58 a 133, que tienen adicionalmente la SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos GS en el extremo N o proteínas de unión recombinantes seleccionadas del grupo de secuencias de aminoácidos SEQ ID NOs: 134 a 179, o dominios de repetición de anquirina diseñados que se seleccionan del grupo de secuencias de aminoácidos SEQ ID NOs: 10 a 57, que tienen adicionalmente la SEQ ID NO: 1 o los aminoácidos GS en el extremo N, se expresaron en el citoplasma de Escherichia coli, utilizando técnicas convencionales que utilizan el sistema de expresión pQE de QIAgen (Alemania). En el caso de que los aminoácidos GS estuvieran en el extremo N, el resto Met codificado adicionalmente por el vector de expresión, se escindía eficazmente en el citoplasma de E. coli desde el polipéptido expresado, ya que al Met de inicio lo sigue un pequeño resto de Gly (es decir, el aminoácido en la posición 1 de las SEQ ID NOa: 134 a 179). Se lisaron las células utilizando una prensa francesa, y se purificaron las proteínas cerca de la homogeneidad a partir del extracto celular bruto, utilizando técnicas cromatográficas convencionales bien conocidas por el experto en la técnica.
Ejemplo 5. Mejora de la propiedades farmacocinéticas con el aumento del número de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica comprendidos en una proteína de unión recombinante - estudios farmacocinéticos en ratón.
Para los estudios farmacocinéticos en ratón las Proteínas n° 57, n° 62, n° 63, n° 64, n° 68, n° 73, n° 74, n° 82, n° 83, n° 97, n° 109, y n° 110 (proteínas correspondientes a las SEQ ID NOs: 57, 62, 63, 64, 68, 73, 74, 82, 83, 97, 109, y 110, que tienen adicionalmente la SEQ ID NO: 1 en el extremo N) preparadas como se describió en el Ejemplo 4, se etiquetaron radiactivamente como se describió (Zahnd, C, Kawe, M., Stumpp, M.T., de Pasquale, C, Tamaskovic, R., Nagy-Davidescu, G., Dreier, B., Schibli, R., Binz, H.K., Waibel, R., Plückthun, A., Cancer Res.70, 1595-1605, 2010) y se administró a 10 μg en 100 μl en una única inyección intravenosa en bolo en la vena de la cola de ratones BALB/c hembras, respectivamente. Se recolectaron muestras de suero de cada ratón en distintos puntos de tiempo y se determinó la radiactividad acumulada, utilizando un contador de gamma-centelleo.
En estos experimentos, las proteínas que comprenden dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, presentaban constantemente propiedades farmacocinéticas mejoradas, en comparación con las construcciones comparables que comprendían solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica (Figura 3). Por ejemplo, la comparación de la Proteína n° 57, que comprende un único dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica (SEQ ID NO: 57, que comprende la SEQ ID NO: 51 más un polipéptido en el extremo C) con las Proteínas n° 62 y n° 63, que comprenden dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica (dos veces la SEQ ID NO: 51, unidos por enlazadores polipeptídicos ricos en GS [SEQ ID NO: 63] o ricos en PT [SEQ ID NO: 62]), muestra que tener dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, da lugar a un % de DI mayor a las, p. ej., 24 h (+57 % GS; 59 % PT), 48 h (+76 % GS; 82 % PT) o 72 h (+79 % GS; 94 % PT) tras la inyección, y lleva a una mejora de la semivida terminal (+38 % GS; 48 % PT) en comparación con la proteína que comprende solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica (Figura 3a). En particular, utilizando un enlazador rico en PT, en particular, de SEQ ID NO: 9, da lugar a propiedades farmacocinéticas mejoradas (Figura 3a). Los siguientes tres ejemplos muestran que el método de las propiedades farmacocinéticas mejoradas teniendo dos dominios de repetición de anquirina diseñados (en vez de uno) con especificidad de unión para la albúmina sérica presente en una proteína, es transferible a diferentes proteínas que comprendan diferentes dominios de repetición de anquirina diseñados. Por ejemplo, la comparación del perfil farmacocinético de la Proteína n° 64, que comprende las SEQ ID NOs: 22 (dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para otra diana distinta de la albúmina sérica) y 51 (dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica), con las Proteínas n° 73 y n° 74, que comprenden cada una las SEQ ID NO: 22 y dos veces la 51 (la Proteína n° 73 tiene la SEQ ID NO: 51 flanqueando la SEQ ID NO: 22, y la Proteína n° 74 tiene la SEQ ID NO: 51 en el extremo N de la SEQ ID NO: 22), muestra que tener dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, da lugar a un % de DI más alto a las, p. ej., 24 h (+62 % la del extremo N; 89 % la flanqueante), o 48 h (+136 % la del extremo N; 175 % la flanqueante), tras la inyección, da lugar a una semivida terminal mejorada (+>63 % tanto para la del extremo N como para la flanqueante), en comparación con la proteína que comprende solo un único dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica (Figura 3b). De manera similar, una comparación del perfil farmacocinético de la Proteína n° 82, que comprende dos veces la SEQ ID NO: 11 (dominio de repetición de anquirina diseñado sin especificidad de unión conocida ) y una vez la SEQ ID NO: 51 (dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica), con la Proteína n° 109, que comprende dos veces la SEQ ID NO: 11 y dos veces la SEQ ID NO: 51 (en el extremo N), indica que tener dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica da lugar a un % de DI más alto a las, p. ej., 24 h (+12 %), o 48 h (+35 %) tras la inyección, y da lugar a una semivida terminal mejorada (+71 %), en comparación con la proteína que comprende solo un único dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica (Figura 3c). Además, la comparación del perfil farmacocinéticos de la Proteína n° 83, que comprende las SEQ ID NOs: 38 y 39 (dominios de repetición de anquirina diseñados, cada uno con especificidad de unión para otra diana distinta de la albúmina sérica), y 50 (dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica), con la Proteína n° 110, que comprende cada una las SEQ ID NOs: 38 y 39, y dos veces la SEQ ID NO: 50 (que flanquea las SEQ ID NOs: 38 y 39), muestra que tener dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, da lugar a un % de DI más alto a las, p. ej., 24 h(+198 %), 48 h (+198 %), o 72 h (+228 %) tras la inyección, y da lugar a una semivida terminal mejorada (+19 %), en comparación con la proteína que comprende solo un único dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica (Figura 3d). Además, la Proteína n° 97 presenta propiedades farmacocinéticas significativamente mejoradas respecto a la Proteína n° 68, p. ej., las semividas terminales eran de 21 y 16 horas, respectivamente, indicando que tener dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, es beneficioso respecto a tener solo uno de dichos dominios.
Estos resultados indican, sorprendentemente, que utilizando dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, en vez de uno en una proteína de unión recombinante, da lugar a propiedades farmacocinéticas mejoradas, como se expone adicionalmente en el Ejemplo 6.
Ejemplo 6. Mejorar las propiedades farmacocinéticas con el aumento del número de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, comprendidos en una proteína de unión recombinante - estudios farmacocinéticos en monos Cynomolgus.
Para los estudios farmacocinéticos en monos Cynomolgus, se administraron las Proteínas n° 57, n° 62, y n° 97 (proteínas correspondientes a las SEQ ID NOs: 57, 62, y 97, que tienen adicionalmente la SEQ ID NO: 1 en el extremo N) y la Proteína n° 134 (una proteína correspondiente a la SEQ ID NO: 134), preparadas como se describe en el Ejemplo 4, por vía de infusión intravenosa durante 30 minutos, a un nivel de dosis diana de entre 0,5-100 mg/kg, a monos Cynomolgus. Se recogieron muestras de sangre pre-dosis, y de nuevo en puntos de tiempo seleccionados, por ejemplo, a los 5 min, 10 min, 0,5 h, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h y 168 h, tras el final de la infusión (es decir, post-inyección). Las muestras de sangre se dejaron reposar a temperatura ambiente, y se centrifugaron para generar suero, seguido de un almacenamiento a -80 °C, pendientes de análisis. Se determinaron los parámetros farmacocinéticos utilizando procedimientos bien conocidos por el experto en la técnica. Las concentraciones séricas de las Proteínas n° 57, n° 62, n° 97 y n° 134, se determinaron mediante ELISA en sándwich, utilizando un anticuerpo monoclonal de conejo anti dominio de repetición de anquirina diseñado como reactivo de captura, y un anticuerpo monoclonal murino anti dominio de repetición de anquirina diseñado como reactivo de detección, y utilizando una curva estándar. Los parámetros farmacocinéticos se determinaron utilizando un software convencional, tal como Phoenix WinNonLin (Certara, Princeton, EE. UU.) o GraphPadPrism (GraphPad Software, La Jolla, EE. UU.), y análisis convencionales, tales como los análisis no compartimentales. Los perfiles farmacocinéticos resultantes se muestran en la Figura 4. Las proteínas que comprenden dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, presentaban constantemente propiedades farmacocinéticas mejoradas, en comparación con construcciones comparables que comprendían solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica. Por ejemplo, al comparar la Proteína n° 57 (0,5 mg/kg; 27,7 nmol/kg), que comprende un único dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica (SEQ ID NO: 51), con la Proteína n° 62 (1,04 mg/kg; 34,5 nmol/kg), una proteína que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica (dos veces la SEQ ID NO: 51, unidas por un enlazador polipeptídico rico en PT), los resultados muestran que tener dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica en una proteína, da lugar a una exposición mayor (2138 d*nmol/l vs. 4676 d*nmol/l, es decir, 119 % calculado hasta el día 7), da lugar a un aclaramiento reducido (0,0108 l/[d*kg] vs. 0,0031 l/[d*kg]; es decir, -71 %), y da lugar a una semivida terminal mejorada (4,57 d vs. 9,00 d, es decir, 97 %, calculado desde el día 1 al día 7), en comparación con la proteína que comprende solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica (Figura 4a). También, el porcentaje de dosis inyectada, normalizada a la concentración medida 10 min post-inyección, se aumenta al comparar la Proteína n° 57 con la Proteína n° 62 el día 4 (23,39 % vs 57,72 %; 148 %), día 5 (19,00 % vs. 48,41 %; 155 %), y el día 6 (18,5 % vs. 51,94 %; 175 %). Como ejemplo adicional en monos Cynomolgus, la Proteína n° 134 (una proteína correspondiente a la SEQ ID NO: 134, producida como se describe en el Ejemplo 4), se ensayó a distintas dosis en 10 animales cada una (5 machos y 5 hembras, cada dosis), y se evaluó la semivida terminal, utilizando WinNonLin, considerando los valores de concentración hasta el día 7. La Proteína n° 134 presentó un promedio de semivida terminal de 4,0 días (95 h), cuando se administró 1 mg/kg (en comparación con la Proteína n° 97, que presentó 2,7 días [65 h] de semivida terminal a 1 mg/kg [+46 %]), 5,3 días (127 h), cuando se administró 10 mg/kg, y 5,8 días (139 h), cuando se administró 100 mg/kg a los monos Cynomolgus. El perfil farmacocinético de la Proteína n° 134 en comparación con la Proteína n° 97 en monos Cynomolgus, se muestra en la Figura 4b. Como en el Ejemplo 5, estos resultados indican, sorprendentemente, que utilizando dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, en vez de uno en una proteína de unión recombinante, da lugar a propiedades farmacocinéticas mejoradas. Estos resultados se tratan a continuación.
En ausencia de cualquier actividad de unión a la albúmina, una proteína de unión recombinante tiene una semivida terminal en el intervalo de minutos, tanto en ratones como en monos Cynomolgus (véase el documento WO 2012/069654). Las proteínas que comprenden al menos un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica, muestran semividas que son con mucho mayores que si no hay presente un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica. Se muestra en las Figuras 3a y 4a un perfil farmacocinético de una proteína que comprende un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica.
La técnica contiene un estudio en el que se investigó el efecto de la valencia de otro dominio proteico de unión a la albúmina sérica, el dominio de unión a la albúmina (ABD, por sus siglas en inglés) derivado de la proteína G de estreptococos (Hopp y col., 2010; loc. cit). Otro estudio utiliza péptidos fusionados en el extremo C (documento WO 2011/095545), que no son dominios proteicos. El ABD es un dominio proteico helicoidal con especificidad de unión para la albúmina sérica. De manera importante, Hopp y col., 2010 (loc. cit.), muestran que tener dos de dichos ABD (uno en el extremo N y otro en el extremo C) en una proteína de unión recombinante, no da lugar a una semivida terminal significativamente mejorada en el ratón, en comparación con una proteína de unión recombinante que comprende solo un ABD (en el extremo C; 37,9 ± 1,1 h vs. 36,4 ± 4,8 h). En particular, a las 24 h y 72 h post-inyección, la proteína de unión recombinante que comprende un ABD, presentó un porcentaje de dosis inyectadas idéntico que el de la proteína de unión recombinante que comprendía dos ABD, indicando propiedades farmacocinéticas equivalentes de las dos proteínas de unión recombinantes. Basándose en los hallazgos con el ABD, un experto en la técnica esperaría que una proteína de unión recombinante que comprende dos dominios proteicos de unión a la albúmina, tales como los dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, no tendría propiedades farmacocinéticas mejoradas en comparación con una proteína de unión recombinante que comprendiera solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica. Sorprendentemente, descubrimos que esto no es así. Al contrario que en Hopp y col. (loc. cit), las proteínas de unión recombinante que comprenden dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, presentaron, sorprendentemente, semividas terminales claramente prolongadas, en comparación con las proteínas de unión recombinantes que comprendían solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica.
Estos ejemplos ilustran varios hallazgos adicionales. Por ejemplo, las propiedades farmacocinéticas de la Proteína n° 134 son superiores a las de la Proteína n° 97, lo que ilustra la importancia de la elección de los dominios de repetición de anquirina diseñados individuales. La SEQ ID NO: 134 se escogió para que estuviera compuesta de componentes que diesen lugar a una máxima actividad y propiedades farmacocinéticas óptimas. También, la disposición de los dominios de repetición de anquirina diseñados, en la Proteína n° 134, se escogió para dar lugar a propiedades farmacocinéticas óptimas. Cuando se analizan las proteínas de unión recombinantes que comprenden cuatro dominios de repetición de anquirina diseñados, que incluyen dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, con respecto a las farmacocinética en el ratón y el mono Cynomolgus, se observaron las propiedades farmacocinéticas más favorables para las proteínas de unión recombinantes que tenían los dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, flanqueando los otros dos dominios de repetición de anquirina diseñados.
Como los ejemplos de este ejemplo comprenden diferentes combinaciones de dominios de repetición de anquirina diseñados con una especificidad de unión para otra diana que no es la albúmina sérica, la estrategia de utilizar al menos dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, para mejorar las propiedades farmacocinéticas, parece ser aplicable, en general, a las proteínas que comprenden varios dominios de repetición de anquirina diseñados.
Ejemplo 7. Unión simultánea de dos moléculas de albúmina sérica humana por la Proteína n° 134.
La Proteína n° 134 (una proteína recombinante que consiste en la SEQ ID NO: 134, que tiene adicionalmente GS en el extremo N) se preparó como se describe en el Ejemplo 4. La Proteína n° 134, la albúmina sérica humana (HSA, por sus siglas en inglés) purificada, así como la mezcla Proteína n° 134/HSA (con una estequiometría de 1:2), se analizaron por cromatografía de exclusión por tamaño acoplada a una dispersión de luz estática multiángulo (SEC-MALS, por sus siglas en inglés). Se llevó a cabo la SEC-MALS, utilizando las proteínas de la Tabla 6 en una concentración de 30 μM (Proteína n° 134) o 60 μM (HSA), en un sistema Agilent 1200 (Life Technologies, EE. UU.) conectado a un MALS de Wyatt (EE. UU.), y a un detector del índice de refracción (caudal: 0,6 ml/min; volumen de inyección: 100 μl; columna: GE Healthcare [EE. UU.] Superdex 200 10/300GL). La mezcla Proteína n° 134/HSA se pre-incubó durante 3 horas a 20 °C antes de la inyección. Los cromatogramas se muestran en la Figura 5, y los pesos moleculares de los eluidos se determinaron y compararon con los pesos moleculares teóricos, como se muestra en la Tabla 6. Para este experimento, se purificaron l00 mg de HSA (CSL Behring en solución del 20 %), utilizando una columna Superdex 200_26.60 en un sistema AEKTA prime (GE Healthcare; 2,0 ml/min, PBS, flujo isocrático, volumen de inyección 10 ml de 1:20 de HSA diluido en PBS, recogidas en fracciones de 4 ml). La fracción de pico del pico principal se utilizó para llevar a cabo el experimento SEC-MALS.
La Proteína n° 134 a 30 μM era monodispersa con las fracciones de elución que contenían la proteína del peso molecular esperado (Figura 5). De la misma manera, la HSA purificada a 60 μM era monodispersa con las fracciones de elución que contenían las proteínas del peso molecular esperado (Tabla 6). La mezcla de 30 μM de Proteína n° 134, y 60 μM de HSA, dio como resultado dos picos en la SEC. Un pico contenía complejos proteicos con un peso molecular correspondiente a un complejo (Proteína n° 134/HSA) 1:2, indicando que los dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, son simultáneamente funcionales. Adicionalmente, en la cola de este pico, se podían detectar complejos proteicos de un peso molecular que se correspondía con un complejo (Proteína n° 134/HSA) 1:1. Adicionalmente, se podía detectar la HSA libre. Como esta cantidad es menor, se puede descartar que el pico principal sea un complejo (Proteína n° 134/HSA) 2:1, que, teóricamente, sería coherente con el peso observado, aunque se esperaría una gran fracción correspondiente al 75 % de HSA libre. No se pudo detectar Proteína n° 134/HSA libre. No se detectaron picos con un peso molecular correspondiente mayor que el del complejo (Proteína n° 134/HSA) 1:2. Las mediciones de SEC-MALS y las variaciones observadas en SEC-MALS son bien conocidas por el experto en la técnica.
Tabla 6. Cromatografía de exclusión por tamaño acoplada a dispersión de luz estática de la Proteína n° 134 y HSA, así como el complejo Proteína n° 134/HSA.
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La unión simultánea de dos moléculas de albúmina sérica humana por una proteína de unión recombinante, se observa de manera similar cuando se analiza la Proteína n° 97, y la Proteína n° 102, Proteína n° 109, Proteína n° 110 en la cromatografía de exclusión por tamaño acoplada a la dispersión de luz estática.
Ejemplo 8: Maximizar la actividad de unión a la diana, escogiendo una composición de enlazador y escogiendo el número de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica
Los enlazadores polipeptídicos que unen los dominios proteicos son bien conocidos por el experto en la técnica. Los enlazadores ricos en Gly-Ser son bien conocidos a partir de los fragmentos de anticuerpo Fv de cadena sencilla, donde se utilizan para unir las dos cadenas polipeptídicas de Fv. Existen otros enlazadores polipeptídicos distintos, incluyendo, p. ej., las regiones bisagra de anticuerpo, o los polipéptidos no estructurados, tales como las secuencias que comprenden principalmente los aminoácidos Ala, Glu, Lys, Por, Ser, Thr (documento WO 2007/103515), o Ala, Pro y Ser (documento WO 2008/155134). Además, se han divulgado enlazadores ricos en Pro-Thr (documento WO 2014/191574). El efecto de dicho enlazador sobre las propiedades de los dominios proteicos unidos por dicho enlazador, necesita evaluarse para cada combinación de enlazador/dominio. Junto con la naturaleza de un enlazador proteico, descubrimos, sorprendentemente, que el número de dominios de unión a albúmina sérica, puede influir en la funcionalidad de una proteína. Para maximizar la actividad de unión a la diana de las proteínas de unión recombinantes de la presente invención, se compararon las proteínas de unión recombinantes que comprenden enlazadores polipeptídicos ricos en Gly-Ser y ricos en Pro-Thr, así como las proteínas de unión recombinantes que comprendían uno o dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica. Con ese objetivo, las Proteínas n° 69, n° 71, y, n° 107, que tenían adicionalmente cada una la SEQ ID NO: 1 en el extremo N, y que se prepararon como se describe en el Ejemplo 4, se analizaron para la unión al VEGF-A y al HGF, respectivamente, mediante ELISA (para los métodos, véase el Ejemplo 4). Los resultados se muestran en la Tabla 7. La comparación de los valores de la CE50 de la Proteína n° 69 con los de la Proteína n° 71, indica que la proteína de unión recombinante con enlazadores ricos en Pro-Thr es más potente con respecto a la unión con el VEGF-A (factor 2) y el HGF (factor 1,3), respectivamente, en comparación con las proteínas de unión recombinantes con enlazadores ricos en Gly-Ser. La comparación de los valores de CE50 de la proteína n° 69 con los de la Proteína n° 107, indica que la proteína de unión recombinante que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, es más potente con respecto a la unión con el VEGF-A (factor 1,4) y el HGF (factor 1,1), respectivamente, en comparación con la proteína de unión recombinante que comprende solo un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica. Esto es sorprendente, en vista de los resultados previos (Hopp y col., 2010), en los que la presencia de dos dominios de unión a la albúmina, en una construcción, tuvo un impacto negativo sobre la funcionalidad de la molécula. Este resultado indica que las proteínas de unión recombinantes preferentemente comprenden enlazadores ricos en Pro-Thr y dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, en lugar de enlazadores ricos en Gly-Ser y un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica.
Tabla 7: Análisis ELISA de proteínas de unión recombinantes con diferentes enlazadores y diferente número de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica
Proteína n° * Enlazador Numero de SABDf CE50 [nM] VEGF-A CE50 [nM] HGF
69 PT 1 0,102 0,117
71 GS 1 0,205 0,179
107 PT 2 0,073 0,107
* Las Proteínas n° 69, n° 71, y n° 107, en la presente tabla, representan dominios de repetición de anquirina diseñados que consisten en las correspondientes secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 69, 71 y 107, y, adicionalmente, una etiqueta His en el extremo N (SEQ ID NO: 1).___________________________________________ f Número de dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica
Ejemplo 9: Mejora de la estabilidad proteica cuando se utiliza la SEQ ID NO: 50.
Se caracterizaron adicionalmente las proteínas n° 48, n° 49, y n° 51, por su punto medio de temperatura de desnaturalización (es decir, el punto medio de despliegue cooperativo según aumenta la temperatura), mezclando las Proteínas (25 μl; 100 μM en PBS) con un colorante fluorescente (25 μl de Sypro orange [Life Technologies] diluido 1/2500 en PBS), y midiendo una curva de fusión con un ciclador térmico que comprende un lector de fluorescencia (Sistema de detección por PCR en Tiempo Real CFX96; BioRad; con un tiempo de espera de 25 segundos cada 0,5 °C, seguido por la lectura de fluorescencia), esencialmente como describe Niesen y col. 2007 (Niesen, F.H., Berglund, H., Vedadi, M., Nature Protocols 2, 2212-2221, 2007). En PBS, la Proteína n° 48 presentó un punto medio de desnaturalización de 83,5 °C, y la Proteína n° 49 presentó un punto medio de desnaturalización de 84,5 °C, mientras que la Proteína n° 51 presentó un punto medio de desnaturalización de 79,5 °C.
Con el fin de identificar el dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica que tenga las mejores propiedades de estabilidad de almacenamiento, se prepararon las Proteínas n° 49, n° 50 y n° 51 (correspondientes a las SEQ ID NOs: 49, 50 y 51, respectivamente, que tienen adicionalmente la SEQ ID NO: 1 en el extremo N) como se describe en el Ejemplo 4, y se concentraron las muestras a 10mg/ml en PBS. Las Proteínas n° 50 y n° 51 se almacenaron a continuación durante 1 mes a -80 °C o a 40 °C, en viales de cristal, seguido por un análisis en SDS PAGE al 15 %. Mientras que las Proteínas n° 50 y n° 51 mostraron una estabilidad equivalente tras el almacenamiento a -80 °C, la Proteína n° 50 mostró cantidades significativamente reducidas de productos de degradación en >50 % de reducción, en comparación con la Proteína n° 51 en SDS PAGE al 15 %, después de 1 mes de almacenamiento a 40 °C. De manera similar, cuando se almacenaron a 4 °C, 25 °C, 40 °C y 60 °C, durante una semana a 10 ng/ml en PBS, la Proteína n° 50 mostró cantidades significativamente reducidas de productos de degradación, en comparación con la Proteína n° 49. En particular, la Proteína n° 50 mostró >50 % de reducción de productos de degradación, en comparación con la Proteína n°49 en SDS PAGE al 15 %, tanto cuando se almacenaron a 40 °C o 60 °C, respectivamente (Figura 2). Estos hallazgos ilustran que la Proteína n° 50 tiene una estabilidad de almacenamiento mejorada, en comparación con las Proteínas n° 49, y n° 51. De manera similar, cuando se compara la estabilidad de almacenamiento de las Proteínas n° 48 a n° 51 (correspondientes a las SEQ ID NO: 48 a 51, que tienen adicionalmente la SEQ ID NO: 1 en el extremo N; producidas como se describe en el Ejemplo 4), incubando las proteínas a 10 mg/ml en PBS en viales de cristal durante 1 mes a 40 °C, las Proteínas n° 48 a n° 50 presentan >30 % de reducción de productos de degradación, en comparación con la Proteína n° 51.
Estos hallazgos se corroboraron ensayando la estabilidad de almacenamiento de la Proteína n° 102 y la Proteína n° 103 (proteínas de unión recombinantes que consisten en las secuencias de aminoácidos que se corresponden con las SEQ ID NOs: 102 y 103, que ambas tienen adicionalmente la SEQ ID NO: 1 en el extremo N). La Proteína n° 102 y la Proteína n° 103 se prepararon como se describe en el Ejemplo 4, se concentraron muestras a 10 mg/ml en PBS, y se almacenaron durante 1 mes a -80 °C o a 40 °C en viales de cristal, seguido de un análisis en cromatografía de exclusión por tamaño estándar. Mientras que las Proteínas n° 102 y n° 103 mostraron perfiles de elución equivalentes tras el almacenamiento a -80 °C, la Proteína n° 102 mostró un 98,72 % de especies monoméricas, y la Proteína n° 103 mostró un 100 % de especies monoméricas, tras el almacenamiento a 40 °C. Esto indica que tener la SEQ ID NO: 50 presente en la proteína de unión recombinante, es más favorable con respecto a la estabilidad de almacenamiento que tener la SEQ ID NO: 49 presente. De manera similar, la Proteína n° 103 presenta menores cantidades de productos de degradación que la Proteína n° 102 cuando se analiza mediante SDS-PAGE tras de 1 mes de almacenamiento a 40 °C en viales de cristal en PBS a 10 mg/ml, confirmando la mayor estabilidad de almacenamiento de una proteína de unión recombinante que comprenda la SEQ ID NO: 50, en comparación con la proteína de unión recombinante que comprenda la SEQ ID NO: 49.
Se obtuvieron resultados similares cuando se comparó la Proteína n° 134 con la Proteína n° 143 o la Proteína n° 150 (proteínas de unión recombinantes que consisten en las secuencias de aminoácidos correspondientes a las SEQ ID NOs: 134, 143, y 150, respectivamente), preparadas como se describe en el Ejemplo 4. Cuando se almacena a 40 °C durante un mes a 10 mg/ml en PBS en viales de cristal, la Proteína n° 134 muestra >50 % de reducción de productos de degradación, en comparación con las Proteínas n° 143 y n° 150, cuando se analiza con SDS PAGE al 15 %. Esto indica que tener la SEQ ID NO: 50 presente en la proteína de unión recombinante, es más favorable con respecto a la estabilidad de almacenamiento que tener presentes la SEQ ID NO: 49 o la SEQ ID NO: 51.
Ejemplo 10: Caracterización de proteínas de unión recombinantes al utilizar ELISA
La proteína de unión recombinante purificada que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 134, preparada como se describe en el Ejemplo 4, se sometió a los análisis ELISA. Se inmovilizaron 100 μl o 50 μl de diana 20 nM (VEGF-A, HGF, o albúmina sérica) en PBS por pocillo, en una placa Maxisorp (Nunc, Dinamarca) durante la noche a 4 °C. Tras lavar 5 veces con 300 μl de PBST (PBS suplementado con un 0,1 % de Tween 20), se bloquearon los pocillos con 300 μl de PBST-C (PBST suplementado con un 0,25 % de caseína) durante 2 horas a temperatura ambiente, con agitado a 450 rpm en un agitador Titramax 1000 (Heidolph, Alemania). Tras lavar 5 veces como se describió anteriormente, se aplicaron 100 μl/pocillo o 50 μl/pocillo de Proteína n° 134 (con concentraciones que variaron desde 100 nM a 0,01 pM) en PBST-C, y se incubó durante 1 h a 2 h a temperatura ambiente, con agitado a 450 rpm. Tras lavar 5 veces como se describió anteriormente, se detectó la unión de la Proteína n° 134, utilizando 100 μl o 50 μl/pocillo de anticuerpo monoclonal de conejo anti-dominio de repetición de anquirina diseñado, en PBST-C durante 1 h a temperatura ambiente, con agitado a 450 rpm. Tras lavar 5 veces como se describió anteriormente, se detectó el anticuerpo anti-dominio de repetición de anquirina diseñado unido, utilizando 100 μl o 50 μl/pocillo de conjugado IgG-HRP de cabra anti-conejo, en PBST-C durante 1 h a temperatura ambiente, con agitado a 450 rpm. Tras lavar 5 veces como se describió anteriormente, a continuación, se desarrolló la ELISA utilizando 100 μl con sustrato POD blue soluble BM (Roche, Suiza), diluido en agua a 1:4. La reacción se detuvo tras 5 minutos utilizando 100 μl de H2SO41 M. Se registró entonces la DO (DO 450 nm-DO 620 nm).
Los resultados de la ELISA indican que la Proteína n° 134 se une al VEGF-A humano, de mono Cynomolgus, de rata y de ratón, con potencia equivalente (Tabla 8 y Figura 6a). El VEGF-A de mono Cynomolgus es idéntico al VEGF-A humano y, por lo que no se ensayó por separado. No se detectó unión de la Proteína n° 134 al VEGF-C y al PDGF-AB (Tabla 9 y Figura 6a). El HGF humano, de mono Cynomolgus, y de ratón, se une a la Proteína n° 134 con potencia equivalente (valores de CE50 en el intervalo de 20-50 μM; Tabla 8 y Figura 6b). Además, la Proteína n° 134 se une a la albúmina sérica humana, de mono Cynomolgus, de rata, de perro y de ratón con potencia equivalente (valores de la CE50 en el intervalo de 10-20 μM; Tabla 8 y Figura 6c). Una comparación de la Proteína n° 134 (es decir, una proteína que consiste en la SEQ ID NO: 134) con la Proteína n° 60 o la Proteína n° 61 (es decir, proteínas que consisten en las SEQ ID NOs: 60 o 61, que tienen adicionalmente la SEQ ID NO: 1 en el extremo N, producidas como se describe en el Ejemplo 4), reveló que la CE50 de la proteína n° 134 observada para la unión a la albúmina sérica humana, es significativamente mejor que las observadas para las Proteínas n° 60 o n° 61 (225 μM o 322 μM, respectivamente).
Tabla 8: Valores aparentes de la CE50 de la Proteína n° 134 para la unión con VEGF-A, HGF y albúmina sérica de diferentes especies
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I.C. intervalo de confianza, f 100 % de identidad de secuencia con el VEGF-A humano, por lo tanto, se enumera el valor del VEGF-A humano, n.a. no analizado
Tabla 9. Valores aparentes de CE50 de la Proteína n° 134 para la unión con diferentes VEGF y PDGF humanos
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Ejemplo 11: Caracterización de las proteínas de unión recombinantes al utilizar ensayos de competición
La proteína de unión recombinante purificada que consiste en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 134, preparada como se describe en el Ejemplo 4, se sometió a los análisis ELISA y FRET de competición. Dichos ensayos FRET y ELISA de competición son bien conocidos por el experto en la técnica. Se midió la Proteína n° 134 en un ensayo FRET de competición de VEGF-A/VEGFR-2. Para ese objetivo, la Proteína n° 134 y el VEGF-A165 biotinilado (Reliatech, n° 300-076Bi-L) se prepararon como reservas a concentración óctuple en PBS que contenía un 0,2 de BSA y un 0,01 % de Tween (PBST-BSA). Se pre-incubó durante una hora a temperatura ambiente una mezcla de competición de 5 μl de Proteína n° 134 a 5 μl a concentración óctuple, y 5 μl de VEGF-A165 biotinilado a concentración óctuple (mezcla de competición). En paralelo, se añadieron 5 μl de Estreptavidina-Tb (Estreptavidina-Lumi4-donante de criptato de terbio, Cisbio n° 610SATLB) y 5 μl de PAb anti-hIgG-de (IgG antihumano de cabra conjugado con D2, Cisbio n° 61HFCDAA), a 500 μl de tampón PBST-BSA, y se incubaron durante 20 minutos (2x de reactivo). Se dispensaron diez μl/pocillo de 2x de reactivo en una placa blanca HTFR de 384 pocillos (Thermo Fisher Scientific Inc.) y se añadieron 5 μl/pocillo de una concentración cuádruple de la fusión hVEGF-R2-Fc (Reliatech n° SFC-008). A continuación, se añadieron a los pocillos cinco μl de la mezcla de competición pre-incubada. Se incubó la mezcla de reacción completa en oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente, antes de la lectura de la fluorescencia, utilizando un lector de fluorescencia. La mezcla final contenía 10 nM de la fusión soluble VEGF-R2-Fc, 10 nM de VEGF-A biotinilado, y varias concentraciones de Proteína n° 134. Se hizo la lectura a una longitud de onda de A665 nm y A595 nm (excitación de 340 nm). Los resultados del ensayo se muestran en la Figura 7a. En este ensayo, la Proteína n° 134 inhibe la interacción VEGF-A/VEGFR-2 con un valor de la CI50 de 0,6 nM. La Proteína n° 134 se midió adicionalmente en un experimento ELISA de competición HGF/cMet, como se describe en el Ejemplo 3. Los resultados se muestran en la Figura 7b. En este ensayo, la Proteína n° 134 inhibe la interacción HGF/cMet con un valor de la CI50 de 0,92 nM. La proteína n° 134 se midió también en un experimento ELISA de competición VEGF-A, como se describe en el Ejemplo 3. Los resultados se muestran en la Figura 7c. En este ensayo, la Proteína n° 134 inhibe la unión del VEGF con un valor de la CI50 en un intervalo de pM de único dígito (CI504,5 μM).
Ejemplo 12: Caracterización de unión simultánea a la diana de proteínas de unión recombinantes al utilizar resonancia de plasmón superficial
Se midió la SPR de manera similar a la descrita en el Ejemplo 2, con el siguiente procedimiento. Se inmovilizaron 2700 UR de HGF humano en un chip sensor. A continuación, se inyectaron 100 nM de Proteína n° 134 o PBST durante 180 segundos, seguido por un lavado con PBST de 360 segundos. Seguidamente, se inyectaron 100 nM de VEGF-A humano o PBST durante 180 segundos (dando lugar a la saturación), seguido por un lavado con PBST de 360 segundos. Finalmente, se inyectaron 100 nM de albúmina sérica humana o PBST durante 180 segundos, seguido por un lavado con PBST de 600 segundos. Las señales resultantes se muestran en la Figura 8. Los resultados indican que la Proteína n° 134 se puede unir al HGF, VEGF-A y albúmina sérica. Además, los resultados indican que la Proteína n° 134 se puede unir al HGF y VEGF-A, así como al HGF, VEGF-A y albúmina sérica al mismo tiempo.
Ejemplo 13: Caracterización de las proteínas de unión recombinantes en cultivo celular
La proteína de unión recombinante purificada que consiste en la secuencia de SEQ ID NO: 134, preparada como se describe en el Ejemplo 4, se sometió adicionalmente a ensayos celulares, incluyendo un ensayo de proliferación en HUVEC, para evaluar la inhibición de VEGF-A, y un ensayo de migración celular de A549, así como un ensayo de fosforilación de cMet, todos para evaluar la inhibición del HGF, ensayos bien conocidos por el experto en la técnica.
Se determinó la inhibición de la proliferación de HUVEC inducida por VEGF-A, titulando concentraciones crecientes de Proteína n° 134 en el ensayo de proliferación de HUVEC. Se utilizó VEGF-A humano a una concentración de 8 ng/ml (correspondiente con una CE80, como se determinó en un ensayo de proliferación). Se tituló la Proteína n° 134 a partir de 200 ng/ml a 0,195 ng/ml. Se sembraron las células en 50 μl de un medio de ensayo. Se hicieron las diluciones de proteína (en un medio de ensayo) por dilución en serie de 1:2 veces en una placa de dilución; la concentración era de cuatro veces la concentración final. Las diluciones de Proteína n° 134 se mezclaron con concentraciones de VEGF-A de cuatro veces (32 ng/ml; final de 8 ng/ml) en una relación 1:1. Se añadieron 50 μl de las mezclas a las células durante 72 h. Se determinó la proliferación celular mediante la incorporación de BrdU en la ADN replicante, o mediante el control de la actividad metabólica, utilizando WST-1. Los resultados se muestran en la Figura 9a, indicando que la Proteína n° 134 presenta una CI50 de 5,7 ng/ml (91,35 μM).
La inhibición de la interacción HGF/cMet se determinó utilizando la Proteína n° 134, en un ensayo de migración celular Oris (Platypus Technologies, EE. UU.). El ensayo se llevó a cabo según el protocolo del fabricante. En resumen, se sembraron las células con 100.000 células A549 en DMEM libre de suero. Las células se adhirieron tras 24 horas y se intercambió el medio a medio de ensayo; DMEM con y sin 0,5 nM de HGF, con y sin 5 nM de Proteína. El HGF y la Proteína neutralizante se pre-incubaron durante 1 h a TA antes de la adición a las células. Se retiraron los tapones Oris™. A continuación, se incubó el ensayo durante 48 horas, para permitir la migración celular. Las células se tiñeron con Calceína (2,5 ng/ml) durante 40 minutos, y se tomaron imágenes. La zona de migración se midió utilizando un microscopio inverso Olympus y su software CellSens Dimension. El área de migración se calculó como el área cubierta. al restar el área sin cubrir de los pocillos de pre-migración, con el área sin cubrir de los pocillos de las muestras respectivas. El área sin cubrir era el área libre de células, y se midió utilizando la función de diámetro en la carpeta de procesamiento del software. Los resultados se muestran en la Figura 9b, e indican que la Proteína n° 134 puede suprimir la migración celular inducida por el HGF de las células A549.
Se midió la inhibición de la fosforilación de cMet por la Proteína n° 134, utilizando células A 549 y un DuoSet P-cMet-ELISA (RnD Systems). Se sembraron las células, en medio completo, en placas de 96 pocillos a 200.000 células por pocillo en medio completo. 24 h más tarde se sustituyó el medio por medio libre de suero. Se incubaron las células durante otras 24 h, y se estimularon por 1 nM de HGF humano (o PBS como control negativo), en presencia y ausencia de la Proteína n° 134. El HGF y la Proteína n° 134 se pre-incubaron durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente antes de la adición a las células. Las células se estimularon durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se finalizó la estimulación, retirando el sobrenadante celular (por agitación) y añadiendo un tampón de lisis celular según el protocolo. Los lisados celulares se mantuvieron a -20 °C hasta el experimento ELISA. Los resultados se muestran en la Figura 9c, e indican que la Proteína n° 134 puede suprimir la fosforilación de cMet mediada por HGF con una CI50 de 184 pM.
Ejemplo 14: Efecto de las proteínas de unión recombinantes sobre el crecimiento tumoral in vivo
Se utilizó un modelo de xenoinjerto en ratón U87MG para evaluar el beneficio de tener un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el VEGF-A, combinado con un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el h Gf , en comparación con teniéndolos por separado. La Proteína n° 134 que consiste en la SEQ ID NO: 134 (que comprende dos dominios de repetición de anquirina diseñados con especificidad de unión para la albúmina sérica, que consiste cada uno en los aminoácidos de SEQ ID NO: 50, que comprende un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el VEGF-A, que consiste en la SEQ ID NO: 18, y que comprende un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el HGF, que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 26), la Proteína n° 61 que consiste en la SEQ ID NO: 61 (que comprende un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica, que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 50, y comprende un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el VEGF-A, que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 18), y que tienen adicionalmente la SEQ ID NO: 1 en el extremo N, o la Proteína n° 60 que consiste en la SEQ ID NO: 60 (que comprende un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para la albúmina sérica, que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 50, y comprende un dominio de repetición de anquirina diseñado con especificidad de unión para el HGF, que consiste en los aminoácidos de SEQ ID NO: 26), y que tiene adicionalmente la SEQ ID NO: 1 en el extremo N, se prepararon como se describe en el Ejemplo 4. Para los análisis in vivo, se implantaron por vía subcutánea 2*106 células U87MG por ratón, en el flanco derecho de ratones NMRI nu/nu hembras (Harlan), y se agruparon los ratones en grupos con volúmenes de tumor equivalentes cada uno. En el día 29 y el día 32, se trataron los ratones con PBS o 4 mg/kg de proteína i.v. En el día 35 se extrajeron los tumores y se crio-congelaron. Cada día del tratamiento se midió el volumen de cada tumor, utilizando la fórmula: Volumen = (ancho)2 x longitud/2. Las mediciones del peso corporal indicaron una diferencia no significativa entre los cuatro grupos de tratamiento. A continuación, las secciones transversales del tumor se tiñeron utilizando un anticuerpo para Ki67 (ab66155; Abeam, Reino Unido), para la cuantificación de la proliferación, o utilizando un anticuerpo para CD-31 (BD5500274; BD Biosciences, e E. UU.), para la cuantificación de la angiogénesis, utilizando métodos IHC convencionales. El porcentaje de células proliferativas y el porcentaje de las áreas vasculares medias se midieron utilizando el software Image J. Los resultados se muestran en la Figura 10a. En comparación con el PBS, la Proteína n° 60, así como la Proteína n° 61, inhiben la proliferación, y la Proteína n° 60 (ligeramente), así como la Proteína n° 61, inhiben la angiogénesis, como se esperaba. La combinación de las dos, que resulta en la Proteína n° 134, sin embargo, da lugar a una mejora de la inhibición, tanto de la proliferación como de la angiogénesis. Esto indica que la combinación de la actividad anti-VEGF-A y anti-HGF es clave para la buena eficacia.
La Proteína n° 134 se caracterizó adicionalmente en dos modelos de xenoinjerto de ratón derivados de un paciente, un modelo de cáncer gástrico y un modelo de cáncer renal. Los modelos de xenoinjerto de ratón de un tumor derivado de un paciente, son bien conocidos por el experto en la técnica. La Proteína n° 134 se describe en el Ejemplo 4.
Para el modelo de xenoinjerto de ratón derivado de un paciente con cáncer renal, los especímenes de células cancerosas renales de especímenes quirúrgicos, se implantaron s.c. en ratones NMRI nu/un, y se hicieron pasajes de tres a cinco veces hasta el establecimiento de patrones de crecimiento estables. Tras extraerlos de los ratones donantes, los tumores se cortaron en fragmentos de 4-5 mm de diámetro, que se implantaron s.c. en los ratones NMRI nu/nu. Cuando era obvia la aparición de crecimiento del tumor sólido, los ratones se agruparon aleatoriamente en grupos de tres animales cada uno, y los artículos de ensayo se administraron de la siguiente manera a cada uno de los animales del grupo: se administró PBS i.v. a 10 mg/kg tres veces a la semana durante tres veces; se administró la Proteína n° 134 i.v. a 4 mg/kg tres veces a la semana durante tres veces; se administró sorafenib v.o. a 200 mg/kg diariamente durante 21 días. Se evaluaron los volúmenes tumorales como se describió anteriormente, al día del inicio del tratamiento, así como en los días 3, 7, 10, 14, 18, y 21. Los resultados se muestran en la Figura 10b. En este modelo, la Proteína n° 134 es más eficaz que el sorafenib, la referencia médica actual de tratamiento para el carcinoma de células renales.
Para el modelo de xenoinjerto de ratón derivado de un paciente con cáncer gástrico, los especímenes de células cancerosas gástricas de especímenes quirúrgicos se implantaron s.c. en ratones NMRI nu/un, y se hicieron pasajes de tres a cinco veces hasta el establecimiento de patrones de crecimiento estables. Tras extraerlos de los ratones donantes, los tumores se cortaron en fragmentos de 4-5 mm de diámetro, que se implantaron s.c. en los ratones NMRI nu/nu. Cuando era obvia la aparición de crecimiento del tumor sólido, los ratones se agruparon aleatoriamente en grupos de ocho animales cada uno, y los artículos de ensayo se administraron de la siguiente manera a un grupo de animales cada uno: se administró PBS i.v. a 10 mg/kg, en los días 0, 3, 6, 9, 12, 15, y 18; se administró la Proteína n° 134 i.v. a 4 mg/kg, en los días 0, 3, 6, 9, 12, 15, y 18; se administró Paclitaxel i.v. a 15 mg/kg, en los días 0, 7. y 14; se administró Proteína n° 134 más paclitaxel i.v. a 4 mg/kg, en los días 0, 3, 6, 9, 12, 15, y 18, e i.v. a 15 mg/kg, en los días 0, 7 y 14. Se evaluaron los volúmenes tumorales como se ha descrito anteriormente, en el día del inicio del tratamiento, así como en los días 2, 6, 13, 16, y 20. Los resultados se muestran en la Figura 10c. En este modelo, la Proteína n° 134 era al menos tan eficaz como el paclitaxel, y una combinación de los dos era significativamente más eficaz que los componentes individuales.

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Una proteína de unión recombinante que comprende un primer, un segundo, un tercer y un cuarto dominio de repetición de anquirina, en donde dicho primer dominio de repetición de anquirina tiene especificidad de unión para el VEGF-A humano, y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, en donde dicho segundo dominio de repetición de anquirina tiene especificidad de unión para el HGF humano, y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, en donde dicho tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina tienen cada uno especificidad de unión para la albúmina sérica humana, y comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50, en donde dichos primer, segundo, tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina, se encuentran en el orden tercero-segundo-primero-cuarto desde el extremo N hasta el extremo C, y en donde dicha proteína de unión recombinante es capaz de unirse simultáneamente a HGF, VEGF-A y albúmina sérica.
  2. 2. La proteína de unión recombinante de la reivindicación 1, en donde dicho primer dominio de repetición de anquirina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, en donde dicho segundo dominio de repetición de anquirina comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, y en donde dicho tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina comprende cada uno una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NQ:50.
  3. 3. La proteína de unión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha proteína de unión recombinante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134.
  4. 4. La proteína de unión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha proteína de unión recombinante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134.
  5. 5. La proteína de unión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha proteína de unión recombinante comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134.
  6. 6. La proteína de unión recombinante de la reivindicación 1, en donde dicha proteína de unión recombinante consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 134.
  7. 7. La proteína de unión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho primer dominio de repetición de anquirina comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:18, en donde dicho segundo dominio de repetición de anquirina comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26, y en donde dicho tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina comprende cada uno la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NQ:50.
  8. 8. La proteína de unión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y 7, en donde dichos dominios de repetición de anquirina están unidos por enlazadores polipeptídicos que consisten en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9.
  9. 9. La proteína de unión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho primer dominio de repetición de anquirina se une al VEGF-A en PBS, con una constante de disociación (Kd) inferior a 10'7 M, y en donde dicho segundo dominio de repetición de anquirina se une al HGF en PBS con un Kd inferior a 10'7 M; y en donde dichos tercer y cuarto dominios de repetición de anquirina se unen a la albúmina sérica en PBS con un Kd inferior a 10'5 M.
  10. 10. Un ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de la proteína de unión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
  11. 11. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o el ácido nucleico de la reivindicación 10, y un vehículo y/o un diluyente farmacéuticamente aceptables.
  12. 12. La composición farmacéutica de la reivindicación 11, para su uso en el tratamiento de una enfermedad.
  13. 13. La composición farmacéutica de la reivindicación 12, para su uso en el tratamiento del cáncer.
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