JP2023528207A - 組換えｃｄ４０結合タンパク質及びそれらの使用 - Google Patents

組換えｃｄ４０結合タンパク質及びそれらの使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2023528207A
JP2023528207A JP2022568692A JP2022568692A JP2023528207A JP 2023528207 A JP2023528207 A JP 2023528207A JP 2022568692 A JP2022568692 A JP 2022568692A JP 2022568692 A JP2022568692 A JP 2022568692A JP 2023528207 A JP2023528207 A JP 2023528207A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
ankyrin repeat
amino acid
acid sequence
binding protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2022568692A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2021229076A5 (ja
Inventor
ヴァレリー ペリーヌ カラブロ
ニコロ リガモンティ
クララ ドンケ
アーニャ クリスティーナ シュレーゲル
Original Assignee
モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフト
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフト filed Critical モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフト
Publication of JP2023528207A publication Critical patent/JP2023528207A/ja
Publication of JPWO2021229076A5 publication Critical patent/JPWO2021229076A5/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/75—Agonist effect on antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Abstract

本発明は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインを含む、組換え結合タンパク質に関する。加えて、本発明は、そのような結合タンパク質をコードする核酸、そのような結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びＣＤ４０を発現する細胞においてＣＤ４０を活性化する方法での、そのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の使用、例えば、腫瘍局在性Ｂ細胞、及びヒトを含む哺乳動物における癌などの疾患の治療又は診断のための使用に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、欧州特許庁に２０２０年５月１４日出願の欧州特許出願公開第ＥＰ２０１７４８３０号の利益及び優先権を主張する。欧州特許出願公開第ＥＰ２０１７４８３０の内容は、全ての表、図、及び特許請求の範囲を含め、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
［技術分野］
本発明は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインを含む、組換え結合タンパク質に関する。加えて、本発明は、そのような結合タンパク質をコードする核酸、そのような結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びＣＤ４０を発現する細胞においてＣＤ４０を活性化する方法での、そのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の使用、例えば、腫瘍局在性Ｂ細胞、及びヒトを含む哺乳動物における癌などの疾患の治療又は診断のための使用に関する。
腫瘍壊死因子受容体（Tumor necrosis factor receptor：ＴＮＦＲ）スーパーファミリーメンバーＣＤ４０は、重要な共刺激受容体であり、そのリガンド（ＣＤ４０Ｌ）又はアゴニスト抗体によって係合される場合、細胞性及び体液性の適応免疫の開始及び進行を含む広範囲の分子及び細胞プロセスの調節に関与する。例えば、樹状細胞の表面上でのＣＤ４０係合は、それらのサイトカイン生成を促進し、それらの表面上の共刺激分子の発現を誘導し、かつ抗原の提示を促進することが実証されている。全体として、ＣＤ４０シグナル伝達の影響は、樹状細胞が成熟し、Ｔ細胞の活性化及び分化を効果的に誘発するために必要な特性の全てを達成することを「許可」する。Ｂ細胞におけるＣＤ４０シグナル伝達は、胚中心形成、免疫グロブリン（Ｉｇ）アイソタイプスイッチング、抗原に対する親和性を増強するためのＩｇの体細胞高頻度変異、最後に長寿命形質細胞及びメモリーＢ細胞の形成を促進する。更に、ＣＤ４０経路は、正常条件及び炎症条件下において、胚中心Ｂ細胞、樹状細胞、及び内皮細胞を含む多くの細胞型の生存に重要であることが示されている。ＣＤ４０シグナル伝達の調節解除は様々な自己免疫疾患において観察されている。合わせて、この広範な機能は、獲得免疫応答の産生のためのＣＤ４０受容体の重要性を強調している。
ＣＤ４０は、最初にＢ細胞上で特徴付けられ、樹状細胞、単球、血小板、及びマクロファージ、並びに筋線維芽細胞、線維芽細胞、上皮細胞、及び内皮細胞などの非造血細胞上にもまた発現される。ＣＤ１５４又はＣＤ４０Ｌとして知られるＣＤ４０のリガンドは、主に活性化Ｔ細胞、並びに活性化Ｂ細胞及び血小板によって発現され、炎症条件下においては、単球細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、及び好塩基球においてもまた誘導される。
ＣＤ４０は自然免疫系及び適応免疫系の両方を活性化することができるため、腫瘍免疫療法の好適な標的として認識されている。いくつかの報告では、ＣＤ４０刺激が樹状細胞成熟によって抗腫瘍免疫応答を増強し得ることが確認されている。ＣＤ４０のアゴニストによる樹状細胞の活性化は、それらの生存、ＩＬ－１、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、及びマクロファージ炎症性タンパク質－１αの分泌の増加をもたらす。加えて、ＣＤ４０活性化は、ＭＨＣクラスＩＩ、ＬＦＡ－３、ＣＤ８０、及びＣＤ８６などの共刺激分子の上方制御を誘導し、それぞれ、Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ）及び細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の抗原提示、プライミング、及びクロスプライミングを促進する。ＣＤ４０に対するアゴニスト抗体は、前臨床マウス腫瘍モデルにおいて有効であることが証明されている。しかしながら、臨床におけるそれらの使用はいくらかの抗腫瘍有効性を示しているが、アゴニスト性抗ＣＤ４０抗体の臨床開発は、用量制限毒性及び結果として生じる低い有効性によって妨げられている可能性が高い。
したがって、新規のＣＤ４０特異的結合タンパク質、並びに癌を含む疾患の治療及び特徴付けのための処置的及び診断的アプローチが依然として必要であり、ＣＤ４０特異的結合及び活性化に有益である。特に、ＣＤ４０の有効なアゴニストとして機能することができ、かつ例えばローカライザ分子などの他の機能的部分と容易に組み合わせることもまたできる、新しいＣＤ４０特異的結合タンパク質が必要とされている。
本発明は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインを含む、組換え結合タンパク質を提供する。更に、結合タンパク質によるＣＤ４０のクラスタリング媒介活性化を促進する、１つ以上のローカライザ分子に結合したそのような結合タンパク質が提供される。加えて、本発明は、そのような結合タンパク質をコードする核酸、及びそのような結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、ＣＤ４０発現細胞又は腫瘍組織などの組織におけるＣＤ４０の局所的活性化、及びヒトを含む哺乳動物における癌などの疾患を治療及び診断するための方法における、そのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の使用を提供する。
一態様では、本発明は、ＣＤ４０に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含むそのような組換え結合タンパク質を提供し、ここで、当該アンキリン反復ドメインは、（１）配列番号３９～９５、及び（２）配列番号３９～９５のうちいずれかにおける１０個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、アンキリン反復モジュールを含む。一例として、特定の一実施形態では、本発明のＣＤ４０特異的組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ここで、当該アンキリン反復ドメインは、（１）配列番号７６、７７、及び７８、並びに（２）配列番号７６、７７、及び７８のうちいずれかにおける１０個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、アンキリン反復モジュールを含む。特定の一実施形態では、本発明のＣＤ４０特異的組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ここで、当該アンキリン反復ドメインは、（１）配列番号７６、及び（２）配列番号７６における１０個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第１のアンキリン反復モジュールを含み、当該アンキリン反復ドメインは、（ｉ）（１）配列番号７７、及び（２）配列番号７７における１０個までのアミノ酸が他のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２のアンキリン反復モジュールと、（ｉｉ）（１）配列番号７８、及び（２）配列番号７８における１０個までのアミノ酸が他のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第３のアンキリン反復モジュールと、を更に含む。好ましくは、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、当該第２のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。更により好ましくは、当該アンキリン反復ドメインは、（ｉｉｉ）Ｎ末端キャッピングモジュールであって、当該Ｎ末端キャッピングモジュールが、（１）配列番号５～８、及び（２）配列番号５～７のうちいずれかにおける１０個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｎ末端キャッピングモジュールと、（ｉｖ）Ｃ末端キャッピングモジュールであって、当該Ｃ末端キャッピングモジュールが、（１）配列番号１２～１５、及び（２）配列番号１２～１４のうちいずれかにおける１０個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、Ｃ末端キャッピングモジュールと、を更に含む。
一態様では、本発明は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含むそのような組換え結合タンパク質を提供し、ここで、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～３５のうちいずれか１つと少なくとも７５％～最大１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１６～３５の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一例として、特定の一実施形態では、本発明のＣＤ４０特異的組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ここで、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、当該アンキリン反復ドメインの１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。別の特定の実施形態では、本発明のＣＤ４０に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは、ＣＤ４０受容体のＮ末端システインリッチドメイン（ＣＲＤ）１に特異的に結合する。ＣＤ４０受容体のアミノ酸配列は、配列番号９６で本明細書に提供され、ここで、ＣＲＤ１は、配列番号９６のアミノ酸２３～５９に対応する。
別の態様では、本発明は、そのようなＣＤ４０特異的組換え結合タンパク質を提供し、ここで、結合タンパク質は、ローカライザ分子を更に含む。ローカライザ分子は、異なる構造的及び機能的クラスの分子から選択されてもよい。例えば、ローカライザは、ポリペプチド結合ドメイン、細胞表面受容体リガンド、又はそのフラグメント若しくはバリアント、抗体若しくはそのフラグメント若しくはバリアント、又は足場に基づく抗体様タンパク質であってもよい。本発明の一態様では、ローカライザ分子は、ＣＤ４０特異的組換え結合タンパク質に共有結合している。共有結合は、融合タンパク質をもたらす、ＣＤ４０特異的結合タンパク質とローカライザペプチド又はポリペプチドとの間のペプチド結合であってもよい。あるいは、ローカライザ分子は、ＣＤ４０特異的結合タンパク質に共有結合してもよい。
特定の一実施形態では、本発明のＣＤ４０特異的組換え結合タンパク質は、例えば腫瘍関連抗原などの癌生物学に関連するローカライザ標的タンパク質に対して結合特異性を有する、ローカライザに融合したＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む。一例として、特定の一実施形態では、本発明のＣＤ４０特異的組換え結合タンパク質は、線維芽細胞活性化タンパク質（fibroblast activation protein：ＦＡＰ）に対する結合特異性を有する別のアンキリン反復ドメインに融合した、ＣＤ４０に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む。ＦＡＰに対する結合特異性を有するそのようなアンキリン反復ドメインの例は、配列番号９８に提供される。
別の態様では、本発明は、本発明のＣＤ４０特異的結合タンパク質をコードする核酸を提供する。更なる態様では、本発明は、本発明のＣＤ４０特異的結合タンパク質又は核酸、並びに薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本発明は、哺乳動物におけるＣＤ４０発現細胞又は組織中のＣＤ４０の局所的活性化の方法を提供し、この方法は、ローカライザ分子を含む本発明のＣＤ４０特異的結合タンパク質を当該哺乳動物に投与することを含む。特定の一実施形態では、そのような方法は、ＣＤ４０発現細胞又は腫瘍組織中でＣＤ４０の腫瘍局所性活性化をもたらす、ＣＤ４０発現細胞又は組織を含む腫瘍を有するヒト患者を含む哺乳動物に、ＣＤ４０特異的結合タンパク質を投与することを含む。
別の態様では、本発明は、ヒト患者における医学的状態を治療するための方法を提供し、この方法は、ローカライザ分子に共有結合しているか又はローカライザ分子を含む本発明のＣＤ４０特異的結合タンパク質を当該患者に投与することを含み、このローカライザ分子は、ＣＤ４０特異的結合タンパク質によってＣＤ４０の局所活性化を媒介する。特定の一実施形態では、医学的状態は、癌であり、ここで、癌又は腫瘍組織は、ＣＤ４０を発現する細胞を含み、ローカライザ分子は、当該癌又は腫瘍組織において選択的に発現又は過剰発現された標的に結合する。特定の一実施形態では、当該標的は、当該癌又は腫瘍組織において選択的に発現又は過剰発現される細胞表面タンパク質の細胞外ドメインである。一実施形態では、当該癌は、大腸直腸癌、胃癌、非小細胞肺癌、乳癌、頭頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、肺癌、侵襲性膀胱癌、膵臓癌、転移性脳腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、食道扁平上皮癌、肺扁平上皮癌、皮膚扁平上皮癌、尿路上皮癌、黒色腫、乳腺癌、肺腺癌、子宮頸部扁平上皮癌、膵臓扁平上皮癌、結腸扁平上皮癌、又は胃扁平上皮癌、前立腺癌、骨肉腫、又は軟組織肉腫、及び良性腫瘍から選択される。一実施形態では、そのような癌は、肺癌、結腸直腸癌、胃癌、膀胱癌、卵巣癌、及び乳癌、並びに骨及び軟部組織肉腫を含む、上皮悪性腫瘍（原発性及び転移性）から選択される。
本発明は、本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物を含むキットを更に提供する。本発明は、本発明の組換え結合タンパク質を産生するための方法であって、（ｉ）当該組換え結合タンパク質を細菌中で発現させる工程と、（ｉｉ）クロマトグラフィを使用してこの組換え結合タンパク質を精製する工程と、を含む、方法を更に提供する。
インビトロＢ細胞活性化アッセイを示すイラスト。アッセイは、精製された初代ヒトＢ細胞及びＦＡＰ発現（＋ＦＡＰ）又は非ＦＡＰ発現（－ＦＡＰ）ＣＨＯ細胞を用いて行った。 ＭＦＩと、及びＣＤ８６陽性細胞との割合を測定するために使用されるゲーティング戦略の概要。以下の設定を使用した：ＦＳＣ：２００；ＳＳＣ：４００；取得：２００ｕＬ／分、１００．０００イベント。略語：ＦＭＯ＝蛍光マイナス１、ＳＳＣ＝側方散乱、ＦＳＣ＝前方散乱、ＦＳＣ－Ａ＝前方散乱面積（Forward scatter area）、ＦＳＣ－Ｈ＝前方散乱高さ。 ＭＦＩと、及びＣＤ８６陽性細胞との割合を測定するために使用されるゲーティング戦略の概要。以下の設定を使用した：ＦＳＣ：２００；ＳＳＣ：４００；取得：２００ｕＬ／分、１００．０００イベント。略語：ＦＭＯ＝蛍光マイナス１、ＳＳＣ＝側方散乱、ＦＳＣ＝前方散乱、ＦＳＣ－Ａ＝前方散乱面積（Forward scatter area）、ＦＳＣ－Ｈ＝前方散乱高さ。 ローカライザと組み合わされたＣＤ４０特異的結合タンパク質は、厳密にはローカライザ依存的様式でＣＤ４０シグナル伝達を活性化し、ＨＳＡ結合ドメイン（複数可）は、この多機能性結合タンパク質の効力及び有効性を損なう。ヒトＢ細胞を、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞（黒塗り記号）の存在下において共培養し、漸増濃度のＳＭＡ０１４（上向きの三角形）、ＳＭＡ０８７（下向きの三角形）、ＳＭＡ０９５（菱形）、及びアゴニスト抗ＣＤ４０ ｍＡｂ（正方形）で処置した。対照として、Ｂ細胞をＦＡＰ陰性ＣＨＯ細胞の存在下において共培養し、それぞれの構築物の最高濃度のみで処置し、白塗りの記号として示した。ヒトＢ細胞の活性化を、６００μＭのＨＳＡの非存在下（Ａ）及び存在下（Ｂ）におけるＣＤ８６の上方制御（平均蛍光強度（mean fluorescence intensity：ＭＦＩ）及び細胞の割合（％）として測定）に関して評価した。各値は重複した測定値の平均を示す。示されるデータは２つの独立した実験を代表する。エラーバーは±ＳＥＭを示す。ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下における全ての構築物についてのＥＣ５０値及び有効性値（ｎＭ）を、グラフ中に示された表に示す。 ローカライザと組み合わされたＣＤ４０特異的結合タンパク質は、厳密にはローカライザ依存的様式でＣＤ４０シグナル伝達を活性化し、ＨＳＡ結合ドメイン（複数可）は、この多機能性結合タンパク質の効力及び有効性を損なう。ヒトＢ細胞を、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞（黒塗り記号）の存在下において共培養し、漸増濃度のＳＭＡ０１４（上向きの三角形）、ＳＭＡ０８７（下向きの三角形）、ＳＭＡ０９５（菱形）、及びアゴニスト抗ＣＤ４０ ｍＡｂ（正方形）で処置した。対照として、Ｂ細胞をＦＡＰ陰性ＣＨＯ細胞の存在下において共培養し、それぞれの構築物の最高濃度のみで処置し、白塗りの記号として示した。ヒトＢ細胞の活性化を、６００μＭのＨＳＡの非存在下（Ａ）及び存在下（Ｂ）におけるＣＤ８６の上方制御（平均蛍光強度（mean fluorescence intensity：ＭＦＩ）及び細胞の割合（％）として測定）に関して評価した。各値は重複した測定値の平均を示す。示されるデータは２つの独立した実験を代表する。エラーバーは±ＳＥＭを示す。ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下における全ての構築物についてのＥＣ５０値及び有効性値（ｎＭ）を、グラフ中に示された表に示す。 ＣＤ４０二価性は、多機能性ＣＤ４０ローカライザ結合タンパク質の効力及び有効性を強く増加させる。ヒトＢ細胞を、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下において培養し、漸増濃度のＳＭＡ０１４（上向きの三角形）、ＳＭＡ１０４（下向きの三角形）、ＳＭＡ１０５（菱形）、及びアゴニスト抗ＣＤ４０ ｍＡｂ（正方形）で処置した。対照として、Ｂ細胞をＦＡＰ陰性ＣＨＯ細胞の存在下において共培養し、それぞれの構築物の最高濃度のみで処置し、白塗りの記号として示した。ヒトＢ細胞の活性化を、ＨＳＡの非存在下におけるＣＤ８６の上方制御（平均蛍光強度（ＭＦＩ）及び細胞の割合（％）として測定）に関して評価した。各値は重複した測定値の平均を示す。示されるデータは２つの独立した実験を代表する。エラーバーは±ＳＥＭを示す。ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下における全ての構築物についてのＥＣ５０値及び有効性値（ｎＭ）を、グラフ中に示された表に示す。 ＣＤ４０二価性はＨＳＡ結合ドメインによって誘導される阻害効果を救済する。ヒトＢ細胞を、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下において培養し、漸増濃度のＳＭＡ０１４（上向きの三角形）、ＳＭＡ１０４（下向きの三角形）、ＳＭＡ０９１（丸）、ＳＭＡ０９９（菱形）、ＡＳ５７９（六角形）、及びアゴニスト抗ＣＤ４０ ｍＡｂ（正方形）で処置した。対照として、Ｂ細胞をＦＡＰ陰性ＣＨＯ細胞の存在下において共培養し、それぞれの構築物の最高濃度のみで処置し、白塗りの記号として示した。ヒトＢ細胞の活性化を、ＨＳＡの非存在下（Ａ）及び存在下（Ｂ）におけるＣＤ８６の上方制御（平均蛍光強度（ＭＦＩ）及び細胞の割合（％）として測定）に関して評価した。各値は重複した測定値の平均を示す。示されるデータは２つの独立した実験を代表する。エラーバーは±ＳＥＭを示す。ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下における全ての構築物についてのＥＣ５０値及び有効性値（ｎＭ）を、グラフ中に示された表に示す。 ＣＤ４０二価性はＨＳＡ結合ドメインによって誘導される阻害効果を救済する。ヒトＢ細胞を、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下において培養し、漸増濃度のＳＭＡ０１４（上向きの三角形）、ＳＭＡ１０４（下向きの三角形）、ＳＭＡ０９１（丸）、ＳＭＡ０９９（菱形）、ＡＳ５７９（六角形）、及びアゴニスト抗ＣＤ４０ ｍＡｂ（正方形）で処置した。対照として、Ｂ細胞をＦＡＰ陰性ＣＨＯ細胞の存在下において共培養し、それぞれの構築物の最高濃度のみで処置し、白塗りの記号として示した。ヒトＢ細胞の活性化を、ＨＳＡの非存在下（Ａ）及び存在下（Ｂ）におけるＣＤ８６の上方制御（平均蛍光強度（ＭＦＩ）及び細胞の割合（％）として測定）に関して評価した。各値は重複した測定値の平均を示す。示されるデータは２つの独立した実験を代表する。エラーバーは±ＳＥＭを示す。ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下における全ての構築物についてのＥＣ５０値及び有効性値（ｎＭ）を、グラフ中に示された表に示す。 ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９（配列番号２９）と複合体を形成したヒト腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー５（ｈＣＤ４０）のＸ線結晶学の構造解析による構造決定。
本明細書に開示及び例証されるように、本開示は、ＣＤ４０を特異的に標的化するアンキリン反復タンパク質を提供する。設計アンキリン反復タンパク質ライブラリー（国際公開第２００２／０２０５６５号、Ｂｉｎｚら、「Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」、第２２巻第５７５～５８２頁（２００４年）；Ｓｔｕｍｐｐら、「Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ」第１３巻第６９５～７０１頁（２００８年））は、高い親和性でそれらの標的に結合する標的特異的設計アンキリン反復ドメインの選択に使用することができる。次に、そのような標的特異的設計アンキリン反復ドメインを、疾患を治療するための組換え結合タンパク質の価値ある成分として使用することができる。設計アンキリンリピートタンパク質は、モノクローナル抗体の限界を克服する可能性を有する結合分子のクラスであり、したがって新規な治療的アプローチを可能にする。そのようなアンキリン反復タンパク質は、単一の設計アンキリン反復ドメインを含んでもよく、又は同じ若しくは異なる標的特異性を有する２つ以上の設計アンキリン反復ドメインの組合せを含んでもよい（Ｓｔｕｍｐｐら、「Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １３，６９５－７０１，２００８；米国特許第９，４５８，２１１号）。単一の設計アンキリン反復ドメインのみを含むアンキリンリピートタンパク質は、高い親和性及び特異性で所与の標的タンパク質に結合するように選択され得る小タンパク質（１４ｋＤａ）である。これらの特徴、及び１つのタンパク質中の２つ以上の設計アンキリン反復ドメインを組み合わせる可能性は、設計アンキリン反復タンパク質を、理想的なアゴニスト、拮抗薬及び／又は阻害薬候補にする。更に、そのようなアンキリンリピートタンパク質は、様々なエフェクター機能、例えば細胞傷害性剤又は半減期延長剤を担持し、完全に新しい薬物フォーマットを可能にするように操作することができる。まとめると、設計アンキリンリピートタンパク質は、既存の抗体薬物を超える可能性を有するタンパク質治療薬の次世代の例である。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによって所有される商標である。
一態様では、本発明は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインを含む、組換え結合タンパク質を提供する。一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、アンキリン反復ドメインを含み、ここで、当該アンキリン反復ドメインは、ＣＤ４０に対して結合特異性を有し、かつ当該アンキリン反復ドメインは、（１）配列番号３９～９５、並びに（２）配列番号３９～９５のいずれかにおける１０個まで、又は９個まで、又は８個まで、又は７個まで、又は６個まで、又は５個まで、又は４個まで、又は３個まで、又は２個まで、又は１個までのアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、アンキリン反復モジュールを含む。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３９～９５、及び（２）配列番号３９～９５のうちいずれかにおける１０個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３９～９５、及び（２）配列番号３９～９５のうちいずれかにおける９個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３９～９５、及び（２）配列番号３９～９５のうちいずれかにおける８個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３９～９５、及び（２）配列番号３９～９５のうちいずれかにおける７個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３９～９５、及び（２）配列番号３９～９５のうちいずれかにおける６個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３９～９５、及び（２）配列番号３９～９５のうちいずれかにおける５個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３９～９５、及び（２）配列番号３９～９５のうちいずれかにおける４個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３９～９５、及び（２）配列番号３９～９５のうちいずれかにおける３個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３９～９５、及び（２）配列番号３９～９５のうちいずれかにおける２個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３９～９５、及び（２）配列番号３９～９５のうちいずれかにおける１個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸置換の全てが、当該アンキリン反復モジュール（複数可）のフレームワーク位置に生じる。好ましい一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号３９～９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、アンキリン反復ドメインを含み、ここで、当該アンキリン反復ドメインは、ＣＤ４０に対して結合特異性を有し、かつ当該アンキリン反復ドメインは、（１）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３、並びに（２）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３のうちいずれかにおける１０個まで、又は９個まで、又は８個まで、又は７個まで、又は６個まで、又は５個まで、又は４個まで、又は３個まで、又は２個まで、又は個１までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、アンキリン反復モジュールを含む。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３、並びに（２）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３のうちいずれかにおける１０個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３、並びに（２）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３のうちいずれかにおける９個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３、並びに（２）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３のうちいずれかにおける８個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３、並びに（２）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３のうちいずれかにおける７個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３、並びに（２）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３のうちいずれかにおける６個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３、並びに（２）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３のうちいずれかにおける５個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３、並びに（２）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３のうちいずれかにおける４個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３、並びに（２）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３のうちいずれかにおける３個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３、並びに（２）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３のうちいずれかにおける２個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３、並びに（２）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３のうちいずれかにおける１個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸置換の全てが、当該アンキリン反復モジュール（複数可）のフレームワーク位置に生じる。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、アンキリン反復ドメインを含み、ここで、当該アンキリン反復ドメインは、ＣＤ４０に対して結合特異性を有し、かつ当該アンキリン反復ドメインは、（１）配列番号７６、７７、及び７８、並びに（２）配列番号７６、７７、及び７８のいずれかにおける１０個まで、又は９個まで、又は８個まで、又は７個まで、又は６個まで、又は５個まで、又は４個まで、又は３個まで、又は２個まで、又は１個までのアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、アンキリン反復モジュールを含む。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７６、７７、及び７８、並びに（２）配列番号７６、７７、及び７８のうちいずれかにおける１０個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７６、７７、及び７８、並びに（２）配列番号７６、７７、及び７８のうちいずれかにおける９個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７６、７７、及び７８、並びに（２）配列番号７６、７７、及び７８のうちいずれかにおける８個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７６、７７、及び７８、並びに（２）配列番号７６、７７、及び７８のうちいずれかにおける７個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７６、７７、及び７８、並びに（２）配列番号７６、７７、及び７８のうちいずれかにおける６個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７６、７７、及び７８、並びに（２）配列番号７６、７７、及び７８のうちいずれかにおける５個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７６、７７、及び７８、並びに（２）配列番号７６、７７、及び７８のうちいずれかにおける４個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７６、７７、及び７８、並びに（２）配列番号７６、７７、及び７８のうちいずれかにおける３個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７６、７７、及び７８、並びに（２）配列番号７６、７７、及び７８のうちいずれかにおける２個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７６、７７、及び７８、並びに（２）配列番号７６、７７、及び７８のうちいずれかにおける１個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸置換の全てが、当該アンキリン反復モジュール（複数可）のフレームワーク位置に生じる。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号７６、７７、及び７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、アンキリン反復ドメインを含み、ここで、当該アンキリン反復ドメインは、ＣＤ４０に対して結合特異性を有し、かつ当該アンキリン反復ドメインは、配列番号５６のアミノ酸配列、又は配列番号５６中の１つ若しくは２つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列を含む、アンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号５７のアミノ酸配列、又は配列番号５７中の１つ若しくは２つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号５８のアミノ酸配列、又は配列番号５８中の１つ若しくは２つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号７６のアミノ酸配列、又は配列番号７６中の１つ若しくは２つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号７７のアミノ酸配列、又は配列番号７７中の１つ若しくは２つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号７８のアミノ酸配列、又は配列番号７８中の１つ若しくは２つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号８１のアミノ酸配列、又は配列番号８１中の１つ若しくは２つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号８２のアミノ酸配列、又は配列番号８２中の１つ若しくは２つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号８３のアミノ酸配列、又は配列番号８３中の１つ若しくは２つのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号５６のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号７６のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号７７のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号７８のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号８１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号８２のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該アンキリン反復モジュールは、配列番号８３のアミノ酸配列を含む。
好ましい一実施形態では、本明細書に説明及び言及されるような当該アンキリン反復モジュール（複数可）の当該のアミノ酸置換の全ては、当該アンキリン反復モジュール（複数可）のフレームワーク位置において起こり、典型的には、モジュール（複数可）の全体構造は、置換によって影響を受けない。より好ましい一実施形態では、本明細書に説明及び言及されるような当該アンキリン反復モジュール（複数可）の当該のアミノ酸置換の全ては、配列番号３９～９５の当該アンキリン反復モジュール（複数可）のランダム化位置３、４、６、１４、及び１５以外の位置において起こる。
一実施形態では、本発明のアンキリン反復ドメインは、第１のアンキリン反復モジュール及び第２のアンキリン反復モジュールを含む。一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。
一実施形態では、本発明のアンキリン反復ドメインは、第１のアンキリン反復モジュール及び第２のアンキリン反復モジュール及び第３のアンキリン反復モジュールを含む。好ましい一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、当該第２のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。
一実施形態では、当該第１、当該第２、及び存在する場合、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号３９～９５、並びに（２）配列番号３９～９５のいずれかにおける１０個まで、又は９個まで、又は８個まで、又は７個まで、又は６個まで、又は５個まで、又は４個まで、又は３個まで、又は２個まで、又は１個までのアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該第１、当該第２、及び存在する場合、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３、並びに（２）配列番号５６～５８、７６～７８、及び８１～８３のうちいずれかにおける１０個まで、又は９個まで、又は８個まで、又は７個まで、又は６個まで、又は５個まで、又は４個まで、又は３個まで、又は２個まで、又は個１までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該第１、当該第２、及び存在する場合、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７６、７７、及び７８、並びに（２）配列番号７６、７７、及び７８のいずれかにおける１０個まで、又は９個まで、又は８個まで、又は７個まで、又は６個まで、又は５個まで、又は４個まで、又は３個まで、又は２個まで、又は１個までのアミノ酸が、別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、本発明によるアンキリン反復ドメインは、第１のアンキリン反復モジュールと、第２のアンキリン反復モジュールと、第３のアンキリン反復モジュールとを含み、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５６、及び（２）配列番号５６における１０個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５７、及び（２）配列番号５７の１０個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８、及び（２）配列番号５８の１０個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５６、及び（２）配列番号５６の６個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５７、及び（２）配列番号５７の６個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８、及び（２）配列番号５８の６個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５６、及び（２）配列番号５６の３個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５７、及び（２）配列番号５７の３個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８、及び（２）配列番号５８の３個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５６、及び（２）配列番号５６の２個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５７、及び（２）配列番号５７の２個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８、及び（２）配列番号５８の２個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５６、及び（２）配列番号５６の１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５７、及び（２）配列番号５７の１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号５８、及び（２）配列番号５８の１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号５６のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号５７のアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、当該アンキリン反復モジュール（複数可）の当該アミノ酸置換の全ては、配列番号５６、５７、及び５８の当該アンキリン反復モジュール（複数可）のランダム化した３位、４位、６位、１４位、及び１５位以外のフレームワーク位置において起こり、典型的には、モジュール（複数可）の全体的な構造は、置換の影響を受けない。好ましい一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、当該第２のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。
一実施形態では、本発明によるアンキリン反復ドメインは、第１のアンキリン反復モジュールと、第２のアンキリン反復モジュールと、第３のアンキリン反復モジュールとを含み、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７６、及び（２）配列番号７６における１０個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７７、及び（２）配列番号７７の１０個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７８、及び（２）配列番号７８の１０個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７６、及び（２）配列番号７６における６個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７７、及び（２）配列番号７７の６個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７８、及び（２）配列番号７８の６個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７６、及び（２）配列番号７６における３個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７７、及び（２）配列番号７７の３個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７８、及び（２）配列番号７８の３個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７６、及び（２）配列番号７６における２個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７７、及び（２）配列番号７７の２個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７８、及び（２）配列番号７８の２個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７６、及び（２）配列番号７６の１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７７、及び（２）配列番号７７の１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号７８、及び（２）配列番号７８の１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号７６のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号７７のアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、配列番号７８のアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、当該アンキリン反復モジュール（複数可）の当該アミノ酸置換の全ては、配列番号７６、７７、及び７８の当該アンキリン反復モジュール（複数可）のランダム化した３位、４位、６位、１４位、及び１５位以外のフレームワーク位置において起こり、典型的には、モジュール（複数可）の全体的な構造は、置換の影響を受けない。好ましい一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、当該第２のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。
一実施形態では、本発明によるアンキリン反復ドメインは、第１のアンキリン反復モジュールと、第２のアンキリン反復モジュールと、第３のアンキリン反復モジュールとを含み、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８１、及び（２）配列番号８１における１０個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８２、及び（２）配列番号８２の１０個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８３、及び（２）配列番号８３の１０個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８１、及び（２）配列番号８１における６個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８２、及び（２）配列番号８２の６個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８３、及び（２）配列番号８３の６個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８１、及び（２）配列番号８１における３個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８２、及び（２）配列番号８２の３個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８３、及び（２）配列番号８３の３個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８１、及び（２）配列番号８１における２個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８２、及び（２）配列番号８２の２個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８３、及び（２）配列番号８３の２個までのアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８１、及び（２）配列番号８１の１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８２、及び（２）配列番号８２の１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、（１）配列番号８３、及び（２）配列番号８３の１個のアミノ酸が別のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、そのようなアンキリン反復ドメインにおいて、当該第１のアンキリン反復モジュールは、配列番号８１のアミノ酸配列を含み、当該第２のアンキリン反復モジュールは、配列番号８２のアミノ酸配列を含み、当該第３のアンキリン反復モジュールは、配列番号８３のアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、当該アンキリン反復モジュール（複数可）の当該アミノ酸置換の全ては、配列番号８１、８２、及び８３の当該アンキリン反復モジュール（複数可）のランダム化した３位、４位、６位、１４位、及び１５位以外のフレームワーク位置において起こり、典型的には、モジュール（複数可）の全体的な構造は、置換の影響を受けない。好ましい一実施形態では、当該第１のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、当該第２のアンキリン反復モジュールは、当該アンキリン反復ドメイン内の当該第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する。
好ましい一実施形態では、本明細書の実施形態のいずれかに記載される本発明のアンキリン反復ドメインは、Ｎ末端キャッピングモジュール及び／又はＣ末端キャッピングモジュールを更に含む。より好ましい一実施形態では、本発明のアンキリン反復ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向かう、Ｎ末端キャッピングモジュール；本明細書の実施形態のいずれかにより具体的に記載されている１つ、２つ、３つ、又はそれ以上のアンキリン反復モジュール（複数可）；及びＣ末端キャッピングモジュールを含む。
一実施形態では、当該Ｎ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号５～８、並びに（２）配列番号５～７のいずれかにおける１０個まで、又は９個まで、又は８個まで、又は７個まで、又は６個まで、又は５個まで、又は４個まで、又は３個まで、又は２個まで、又は１個までのアミノ酸が、他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該Ｎ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号５～８、及び（２）配列番号５～７のうちいずれかにおける１０個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該Ｎ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号５～８、及び（２）配列番号５～７のうちいずれかにおける９個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該Ｎ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号５～８、及び（２）配列番号５～７のうちいずれかにおける８個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該Ｎ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号５～８、及び（２）配列番号５～７のうちいずれかにおける７個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該Ｎ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号５～８、及び（２）配列番号５～７のうちいずれかにおける６個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該Ｎ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号５～８、及び（２）配列番号５～７のうちいずれかにおける５個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該Ｎ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号５～８、及び（２）配列番号５～７のうちいずれかにおける４個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該Ｎ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号５～８、及び（２）配列番号５～７のうちいずれかにおける３個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該Ｎ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号５～８、及び（２）配列番号５～７のうちいずれかにおける２個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該Ｎ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号５～８、及び（２）配列番号５～７のうちいずれかにおける１個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、当該Ｎ末端キャッピングモジュールの当該アミノ酸置換の全てが、配列番号５～７の１０位及び１７位以外の位置において生じる。一実施形態では、当該Ｎ末端キャッピングモジュールは、配列番号５のアミノ酸配列を含むか、配列番号５のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、当該Ｎ末端キャッピングモジュールは、配列番号６のアミノ酸配列を含むか、配列番号６のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、当該Ｎ末端キャッピングモジュールは、配列番号７のアミノ酸配列を含むか、配列番号７のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、当該Ｎ末端キャッピングモジュールは、配列番号８のアミノ酸配列を含むか、配列番号８のアミノ酸配列からなり、ここで、Ｘは、いずれかのアミノ酸を表す。一実施形態では、配列番号５～８の当該Ｎ末端キャッピングモジュールの１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。
一実施形態では、当該Ｃ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号１２～１５、並びに（２）配列番号１２～１４のいずれかにおける１０個まで、又は９個まで、又は８個まで、又は７個まで、又は６個まで、又は５個まで、又は４個まで、又は３個まで、又は２個まで、又は１個までのアミノ酸が、他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。したがって、一実施形態では、当該Ｃ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号１２～１５、及び（２）配列番号１２～１４のうちいずれかにおける１０個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該Ｃ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号１２～１５、及び（２）配列番号１２～１４のうちいずれかにおける９個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該Ｃ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号１２～１５、及び（２）配列番号１２～１４のうちいずれかにおける８個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該Ｃ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号１２～１５、及び（２）配列番号１２～１４のうちいずれかにおける７個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該Ｃ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号１２～１５、及び（２）配列番号１２～１４のうちいずれかにおける６個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該Ｃ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号１２～１５、及び（２）配列番号１２～１４のうちいずれかにおける５個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該Ｃ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号１２～１５、及び（２）配列番号１２～１４のうちいずれかにおける４個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該Ｃ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号１２～１５、及び（２）配列番号１２～１４のうちいずれかにおける３個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該Ｃ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号１２～１５、及び（２）配列番号１２～１４のうちいずれかにおける２個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該Ｃ末端キャッピングモジュールは、（１）配列番号１２～１５、及び（２）配列番号１２～１４のうちいずれかにおける１個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。好ましい一実施形態では、当該Ｃ末端キャッピングモジュールの当該アミノ酸置換の全てが、配列番号１３～１４の１４位及び１８位以外の位置において生じる。一実施形態では、当該Ｃ末端キャッピングモジュールは、配列番号１２のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、当該Ｃ末端キャッピングモジュールは、配列番号１３のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、当該Ｃ末端キャッピングモジュールは、配列番号１４のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、当該Ｃ末端キャッピングモジュールは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むか、配列番号１５のアミノ酸配列からなる。ここで、Ｘは、いずれかのアミノ酸を表す。一実施形態では、配列番号１２の最後から２番目の位置Ｌ及び／又は最後の位置Ｎは、任意選択的に、Ａによって置換される。
好ましい一実施形態では、本発明に提供され、本明細書に説明される設計アンキリン反復ドメインは、当該配列修飾を含まない設計アンキリン反復ドメインと比較して、当該設計アンキリン反復ドメインの薬物動態特性の改善につながるＮ末端キャッピングモジュール及び／又はＣ末端キャッピングモジュールにおける配列修飾を含む。
より好ましい一実施形態では、本発明の設計アンキリン反復ドメインは、改善された薬物動態特性を有するＮ末端キャッピングモジュールを含み、ここで、当該Ｎ末端キャッピングモジュールは、８位のアミノ酸がＱであり、及び／又は１５位のアミノ酸がＬであるアミノ酸配列を有する。そのようなＮ末端キャッピングモジュールの例は、配列番号５～８で提供される。一実施形態では、当該Ｎ末端キャッピングモジュールは、アミノ酸配列を有し、ここで、４位のアミノ酸はＳであり、８位のアミノ酸はＱであり、１５位のアミノ酸はＬであり、１７位のアミノ酸がＴであり、２０位のアミノ酸がＴであり、及び／又は２３位のアミノ酸はＱである。そのようなＮ末端キャッピングモジュールの例は、配列番号７で提供される。好ましい一実施形態では、当該Ｎ末端キャッピングモジュールは、３０アミノ酸のアミノ酸配列を含む。更に好ましい実施形態では、当該Ｎ末端キャッピングモジュールは、３０アミノ酸からなるアミノ酸配列からなる。好ましくは、Ｎ末端キャッピングモジュールの位置の当該位置番号は、配列番号５の位置番号を用いて配列番号５にアラインメントすることによって測定する。好ましくは、当該アラインメントは、アミノ酸ギャップを含まない。配列アラインメント生成は、当技術分野で周知の手順である。
別のより好ましい実施形態では、本発明の設計アンキリン反復ドメインは、改善された薬物動態特性を有するＣ末端キャッピングモジュールを含み、ここで、当該Ｃ末端キャッピングモジュールは、１４位のアミノ酸がＲであり、及び／又は１８位のアミノ酸がＱであるアミノ酸配列を有する。そのようなＣ末端キャッピングモジュールの例は、配列番号１３～１５で提供される。一実施形態では、当該Ｃ末端キャッピングモジュールは、アミノ酸配列を有し、ここで、３位のアミノ酸はＴであり、４位のアミノ酸はＱであり、６位のアミノ酸はＴであり、１４位のアミノ酸はＲであり、１８位のアミノ酸はＱであり、１９位のアミノ酸がＱであり、２２位のアミノ酸はＳであり、及び／又は２６位のアミノ酸はＱである。そのようなＮ末端キャッピングモジュールの例は、配列番号１４で提供される。好ましい実施形態では、当該Ｃ末端キャッピングモジュールは、２８アミノ酸のアミノ酸配列を含む。更に好ましい実施形態では、当該Ｃ末端キャッピングモジュールは、２８アミノ酸からなるアミノ酸配列からなる。好ましくは、Ｃ末端キャッピングモジュールの位置の当該位置番号は、配列番号１３の位置番号を用いて配列番号１３にアラインメントすることによって測定する。好ましくは、当該アラインメントは、アミノ酸ギャップを含まない。
一実施形態では、用語改善された薬物動態特性は、増加した曲線下面積、低減したクリアランス、又は延長した終末相半減期を指す。一実施形態では、用語改善された薬物動態特性は、増加した曲線下面積を指す。一実施形態では、当該曲線下面積の増加は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、最も好ましくは８５％である。一実施形態では、用語改善された薬物動態特性は、低減したクリアランスを指す。一実施形態では、当該クリアランスの低減は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、最も好ましくは４５％である。一実施形態では、用語改善された薬物動態特性は、延長した終末相半減期を指す。一実施形態では、当該終末相半減期の延長は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、最も好ましくは８５％である。一実施形態では、薬物動態パラメータは、マウスにおいて決定される。好ましくは、マウスの当該薬物動態パラメータは、Ｂａｌｂ／ｃマウスの尾静脈への静脈内注射によって１ｍｇ／ｋｇの用量でタンパク質を適用することによって決定される。一実施形態では、薬物動態パラメータは、カニクイザルにおいて決定される。好ましくは、カニクイザルの当該薬物動態パラメータは、３０分間の静脈内注射によって１ｍｇ／ｋｇの用量でタンパク質を適用することによって決定される。
好ましい実施形態では、本発明によって提供され、本明細書に記載される設計アンキリン反復ドメインは、ＣＤ４０受容体のＮ末端システインリッチドメイン（ＣＲＤ）１に特異的に結合する。ＣＤ４０受容体のアミノ酸配列は、配列番号９６で本明細書に提供され、ここで、アミノ酸残基２３～５９はＣＲＤ１を形成し、アミノ酸残基６２～１０３はＣＲＤ２を形成し、アミノ酸残基１０５～１４３はＣＲＤ３を形成し、アミノ酸残基１４６～１８６はＣＲＤ４を形成する。したがって、好ましい実施形態では、ＣＤ４０に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインが結合するＣＤ４０エピトープは、ＣＲＤ１内、すなわち、ＣＤ４０受容体（配列番号９６）のアミノ酸残基２３～５９内に位置する。別の態様では、本発明は、アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質を提供し、当該アンキリン反復ドメインは、ＣＤ４０に対して結合特異性を有し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１６～３５の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～３５のいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１６～３５の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～３５のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１６～３５の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～３５のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１６～３５の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～３５のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１６～３５の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～３５のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１６～３５の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。したがって、好ましい一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はこれらからなり、ここで、配列番号１６～３５の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２、２９、及び３１のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２、２９、及び３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２、２９、及び３１のいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２、２９、及び３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２、２９、及び３１のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２、２９、及び３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２、２９、及び３１のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２、２９、及び３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２、２９、及び３１のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２、２９、及び３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２、２９、及び３１のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２、２９、及び３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。したがって、好ましい一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２、２９、及び３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はこれらからなり、ここで、配列番号２２、２９、及び３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２９の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２９の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２９の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２９の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２９の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２９の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。したがって、好ましい一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、配列番号２９の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。好ましい実施形態では、ＣＤ４０に対する結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、ＣＤ４０受容体のＣＲＤ１におけるエピトープへ特異的に結合する。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ここで、当該アンキリン反復ドメインは、１０-7Ｍ未満、又は７．５ｘ１０-8Ｍ未満、又は５×１０-8Ｍ未満、又は２×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）で、ＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に結合する。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に結合する。別の実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、７．５ｘ１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に結合する。そして、更なる一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、５×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に結合する。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、２ｘ１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に結合する。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１６～３５の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～３５のいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１６～３５の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～３５のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１６～３５の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～３５のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１６～３５の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～３５のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１６～３５の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～３５のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号１６～３５の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。したがって、一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ここで、当該アンキリン反復ドメインは、１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６～３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はこれらからなり、配列番号１６～３５のうちいずれか１つの１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、７．５ｘ１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２、２９、及び３１のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２、２９、及び３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２、２９、及び３１のいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２、２９、及び３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２、２９、及び３１のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２、２９、及び３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２、２９、及び３１のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２、２９、及び３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２、２９、及び３１のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２、２９、及び３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２、２９、及び３１のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２、２９、及び３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。したがって、一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ここで、当該アンキリン反復ドメインは、７．５ｘ１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２、２９、及び３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はこれらからなり、ここで、配列番号２２、２９、及び３１の１位のいずれか１つの１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、５ｘ１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２、２９、及び３１のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２、２９、及び３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２、２９、及び３１のいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２、２９、及び３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２、２９、及び３１のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２、２９、及び３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２、２９、及び３１のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２、２９、及び３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２、２９、及び３１のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２、２９、及び３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２、２９、及び３１のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２、２９、及び３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。したがって、一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ここで、当該アンキリン反復ドメインは、５ｘ１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２、２９、及び３１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、又はこれらからなり、ここで、配列番号２２、２９、及び３１の１位のいずれか１つの１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０-7Ｍ未満、又は７．５×１０-8Ｍ未満、又は５×１０-8Ｍ未満、又は２×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ここで、配列番号２２の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。したがって、一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０-7Ｍ未満、又は７．５×１０-8Ｍ未満、又は５×１０-8Ｍ未満、又は２×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、ここで、配列番号２２のいずれか１つの１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０-7Ｍ未満、又は７．５ｘ１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２９の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２９の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２９の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２９の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２９の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２９の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。したがって、一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０-7Ｍ未満、又は７．５×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、ここで、配列番号２９のいずれか１つの１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０-7Ｍ未満、又は７．５ｘ１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３１と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３１と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３１と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３１のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号３１のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３１の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。したがって、一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、１０-7Ｍ未満、又は７．５×１０-8Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号２９のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、ここで、配列番号３１のいずれか１つの１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。
ＣＤ４０に対する結合特異性を有する本発明の組換え結合タンパク質の解離定数（ＫD）の典型的かつ好ましい決定は、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：ＳＰＲ）分析による。したがって、一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質のＣＤ４０に対する当該結合特異性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってＰＢＳ中で決定される。一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質のＣＤ４０に対する当該結合特異性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってＰＢＳ中で決定される。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対する結合特異性を有する２つ、又は３つ、又はそれ以上のアンキリン反復ドメインを含む。好ましい一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対する結合特異性を有する２つ又は３つのアンキリン反復ドメインを含み、当該２つ又は３つのアンキリン反復ドメインの各々は、独立して、本明細書の態様及び実施形態のいずれかにおいてより具体的に記載されているＣＤ４０に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインからなる。したがって、特定の一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、本明細書の態様及び実施形態のいずれかにおいてより具体的に記載されるようなＣＤ４０に対する結合特異性を有する第１のアンキリン反復ドメインを含み、ＣＤ４０に対する結合特異性を有する第２のアンキリン反復ドメインを更に含む。より好ましい一実施形態では、ＣＤ４０に対する結合特異性を有する当該第２のアンキリン反復ドメインは、本明細書の態様及び実施形態のいずれかにおいてより具体的に記載されているようなＣＤ４０に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、これは、ＣＤ４０に対する結合特異性を有する当該第１のアンキリン反復ドメインと異なっていてもよく、又は同一であってもよい。
したがって、例示的な一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号２９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２９の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。したがって、一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号２９と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。配列番号２９の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号２９と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２９の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号２９と少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２９の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号２９と少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２９の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。一実施形態では、当該アンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号２９と少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２９の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。したがって、好ましい一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対する２つの結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインの各々は、独立して、配列番号２９のアミノ酸配列を含むか、又はこれからなり、配列番号２９の１位のＧ及び／又は２位のＳは、任意選択的に欠落している。
一実施形態では、当該２つ、又は３つ、又はそれ以上のアンキリン反復ドメインは、ペプチドリンカーにより結合されている。一実施形態では、当該ペプチドリンカーは、高プロリン－トレオニンペプチドリンカーである。一実施形態では、当該ペプチドリンカーは、配列番号１又は２の高プロリン－トレオニンペプチドリンカーである。一実施形態では、当該２つ、又は３つ、又はそれ以上のアンキリン反復ドメインは、配列番号１又は２の高プロリン－トレオニンペプチドリンカーにより結合されている。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ローカライザ分子を更に含む。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、当該ＣＤ４０特異的アンキリン反復ドメイン又は当該２つ、若しくは３つ、若しくはそれ以上のＣＤ４０特異的アンキリン反復ドメインに、結合、コンジュゲート、融合、又は別様に物理的結合される。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、当該ＣＤ４０特異的アンキリン反復ドメイン又は当該２つ、若しくは３つ、若しくはそれ以上のＣＤ４０特異的アンキリン反復ドメインに共有結合される。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、当該ＣＤ４０特異的アンキリン反復ドメイン又は当該２つ、若しくは３つ、若しくはそれ以上のＣＤ４０特異的アンキリン反復ドメインに、ペプチドリンカーを用いて共有結合される。一実施形態では、当該ペプチドリンカーは、高プロリン－トレオニンペプチドリンカーである。一実施形態では、当該ペプチドリンカーは、配列番号１又は２の高プロリン－トレオニンペプチドリンカーである。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、配列番号１又は２の高プロリン－トレオニンペプチドリンカーにより、当該ＣＤ４０特異的アンキリン反復ドメイン又は当該２つ、若しくは３つ、若しくはそれ以上のＣＤ４０特異的アンキリン反復ドメインに共有結合される。
実施例３に示すように、本発明の１つ、２つ、又は３つのＣＤ４０特異的アンキリン反復ドメインは、例えばローカライザ媒介クラスタリングを介して、組換え結合タンパク質によってＣＤ４０の局所的活性化を促進することができるローカライザに結合され得る。例えば腫瘍組織を標的とするこのような局所的活性化は、ＣＤ４０の全身活性化、及び結果として生じる肝毒性の回避又は低減に、非常に有益であり得る。そのような実施形態は、例えば、標的組織の細胞において選択的に発現される分子の細胞外ドメインに特異的に結合し、それによってＣＤ４０特異的アンキリン反復ドメイン又はドメイン（複数）をクラスタリングして近傍のＣＤ４０発現細胞においてＣＤ４０活性化を達成する、当該ローカライザ分子を介して、ＣＤ４０の活性化を特定の組織に局在化又は送達することを可能にする。更なる例として、多数の膜貫通タンパク質は、様々な種類の癌における腫瘍組織中で特異的に発現又は過剰発現されることが知られている。このような腫瘍特異的タンパク質として、非制限的に、アンカタンパク質、受容体、酵素、及び輸送タンパク質、例えばＮＤＣ１（ＴＭＥＭ４８）、ＴＭＥＭ４５Ａ、ＴＭＥＭ９７、アノクタミン－１（ａｎｏｃｔａｍｉｎ－１）（ＴＭＥＭ１６Ａ）、ＴＭＥＭ１４０、ＴＭＥＭ４５Ｂ、αｖβ３、インテグリン、ボンベシンＲ、ＣＡＩＸ、ＣＥＡ、ＣＤ１３、ＣＤ４４ ｖ６、ＣＸＣＲ４、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ－２、ＨＥＲ２、Ｅｍｍｐｒｉｎ、エンドグリン、ＥｐＣＡＭ、ＥｐｈＡ２、フィブロネクチン・エキストラ・ドメインＢ（ＥＤ－Ｂ）、ＦＡＰ－α、葉酸Ｒ、ＧＲＰ７８、ＩＧＦ－１Ｒ、マトリプターゼ、メソセリン、ｃＭＥＴ／ＨＧＦＲ、ＭＴ１－ＭＭＰ、ＭＴ６－ＭＭＰ、Ｍｕｃ－１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、Ｔｎ抗原、ｕＰＡＲが挙げられる（Ｓｃｈｍｉｔ Ｋ及びＭｉｃｈｉｅｌｓ Ｃ、「Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．」（２０１８年）第９巻第１３４５頁；Ｂｏｏｎｓｔｒａ ＣＭら、「Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ」（２０１６年）第８巻第１１９～１３３頁）。
一実施形態では、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現されるタンパク質に対して結合特異性を有するタンパク質である。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、腫瘍特異的タンパク質に対して結合特異性を有するタンパク質である。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するタンパク質である。
一実施形態では、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現されるタンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、腫瘍特異的タンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである。最も好ましい一実施形態では、当該ローカライザ分子は、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである。一実施形態では、ＦＡＰに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号９８のアミノ酸配列を含む。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、かつローカライザ分子を更に含む。好ましい一実施形態では、当該ＣＤ４０特異的アンキリン反復ドメインは、本明細書の態様及び実施形態のいずれかにおいてより具体的に説明されるように、ＣＤ４０に対する結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである。より好ましい一実施形態では、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するタンパク質である。別のより好ましい実施形態では、腫瘍組織において発現される細胞表面タンパク質に対する結合特異性を有する当該タンパク質は、腫瘍組織において発現される細胞表面タンパク質に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである。最も好ましい一実施形態では、当該ローカライザ分子は、ＦＡＰに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである。一実施形態では、ＣＤ４０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメイン及び当該ローカライザアンキリン反復ドメインは、高プロリン－トレオニンペプチドリンカーにより結合されている。一実施形態では、ＣＤ４０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメイン及び当該ローカライザアンキリン反復ドメインは、配列番号１又は２の高プロリン－トレオニンペプチドリンカーにより結合されている。一実施形態では、当該ローカライザアンキリン反復ドメインは、当該組換え結合タンパク質内のＣＤ４０に対する結合特異性を有する、当該アンキリン反復ドメインのＮ末端に位置する。
一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ペプチドリンカーと結合されたＣＤ４０に対する結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインからなるポリペプチドを含み、ローカライザ分子を更に含む。好ましい一実施形態では、ＣＤ４０に対する結合特異性を有する当該２つのアンキリン反復ドメインの各々は、本明細書の態様及び実施形態のいずれかにおいてより具体的に記載されているようなＣＤ４０に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、これらは、互いに同一であってもよく、又は異なっていてもよい。好ましい一実施形態では、ＣＤ４０に対する結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインは、高プロリン－トレオニンペプチドリンカーと結合される。一実施形態では、ＣＤ４０に対する結合特異性を有する当該２つのアンキリン反復ドメインは、配列番号１又は２の高プロリン－トレオニンペプチドリンカーにより結合されている。更により好ましい実施形態では、当該ローカライザ分子は、腫瘍組織中に発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有するタンパク質である。別のより好ましい実施形態では、腫瘍組織において発現される細胞表面タンパク質に対する結合特異性を有する当該タンパク質は、腫瘍組織において発現される細胞表面タンパク質に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである。最も好ましい一実施形態では、当該ローカライザ分子は、ＦＡＰに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである。一実施形態では、当該ポリペプチド及び当該ローカライザアンキリン反復ドメインは、高プロリン－トレオニンペプチドリンカーにより結合されている。一実施形態では、当該ポリペプチド及び当該ローカライザアンキリン反復ドメインは、配列番号１又は２の高プロリン－トレオニンペプチドリンカーにより結合されている。好ましい一実施形態では、当該ローカライザアンキリン反復ドメインは、当該組換え結合タンパク質内の当該ポリペプチドのＮ末端に位置する。
一実施形態では、本発明のＣＤ４０特異的組換え結合タンパク質は、血清アルブミンに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを更に含む。一実施形態では、本発明のＣＤ４０特異的組換え結合タンパク質は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを更に含む。一実施形態では、本発明の当該ＣＤ４０特異的組換え結合タンパク質は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを更に含み、血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該２つのアンキリン反復ドメインのうち一方は、ＣＤ４０特異的アンキリン反復ドメインのＮ末端に位置し、血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該２つのアンキリン反復ドメインのうち他方は、ＣＤ４０特異的アンキリン反復ドメインのＣ末端に位置する。一実施形態では、本発明の組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを含み、血清アルブミンに対して結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを更に含み、血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該２つのアンキリン反復ドメインのうち一方は、当該ＣＤ４０特異的アンキリン反復ドメインのＮ末端に位置し、血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該２つのアンキリン反復ドメインのうち他方は、当該２つのＣＤ４０特異的アンキリン反復ドメインのＣ末端に位置する。血清アルブミンに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは、本発明の組換えタンパク質のインビボ半減期を増加させることができる。
一実施形態では、本発明のＣＤ４０特異的組換え結合タンパク質は、ポリペプチドタグを更に含む。ポリペプチドタグは、ポリペプチド／タンパク質に結合されたアミノ酸配列であり、ここで、当該アミノ酸配列は、当該ポリペプチド／タンパク質の精製、検出、若しくは標的化に有用であり、又は、当該アミノ酸配列は、ポリペプチド／タンパク質の物理化学的挙動を改善し、又は、当該アミノ酸配列はエフェクター機能を有する。結合タンパク質の個々のポリペプチドタグは、結合タンパク質の他の部位に、直接又はペプチドリンカーを介して接続してもよい。ポリペプチドタグは技術分野で周知であり、当業者には十分に利用可能である。ポリペプチドタグの例は、小ポリペプチド配列、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、若しくはＳｔｒｅｐタグ、又は酵素（例えばアルカリホスファターゼ）等のポリペプチドであり、これらにより、当該ポリペプチド／タンパク質、又は標的化に使用できるポリペプチド（免疫グロブリン又はそれらのフラグメント等）及び／若しくはエフェクター分子として使用できるポリペプチドの検出が可能となる。本発明に関連して使用され得るＨｉｓタグの特定の例は、配列番号４に示される。
一実施形態では、本発明のＣＤ４０特異的組換え結合タンパク質は、ポリペプチドリンカーを更に含む。ペプチドリンカーは、例えば、２つのタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグとタンパク質ドメイン、タンパク質ドメインと非タンパク質化合物若しくはポリエチレングリコールなどのポリマー、又はタンパク質ドメインと生物学的活性分子、タンパク質ドメインとローカライザ、又は２つの配列タグを、結合させることができるアミノ酸配列である。ペプチドリンカーは、当業者に既知である。例の一覧は、特許出願公開第ＷＯ２００２／０２０５６５号の明細書に提供されている。そのようなリンカーの具体例は、グリシン－セリン－リンカー及び可変長のプロリン－トレオニン－リンカーである。グリシン－セリン－リンカーの例は、アミノ酸配列ＧＳ及び配列番号３のアミノ酸配列であり、プロリン－トレオニン－リンカーの例は、配列番号１及び配列番号２のアミノ酸配列である。
別の態様では、本発明は、本発明のアンキリン反復ドメイン又は組換え結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする、核酸を提供する。一実施形態では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質のアミノ酸配列をコードする、核酸を提供する。一実施形態では、本発明は、本発明のＣＤ４０に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインをコードする核酸を提供する。一実施形態では、当該核酸は、配列番号１６～３５のいずれか１つのアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列をコードする。好ましい一実施形態では、当該核酸は、配列番号２２、２９及び３１のいずれか１つのアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、当該核酸は、配列番号２２のアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、当該核酸は、配列番号２９のアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、当該核酸は、配列番号３１のアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列をコードする。より好ましい一実施形態では、当該核酸は、配列番号３６、３７、及び３８からなる群から選択される。一実施形態では、当該核酸は、配列番号３６の核酸配列を含むか、又は配列番号３６からなり、これは、配列番号２９のアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、当該核酸は、配列番号３７の核酸配列を含むか、又は配列番号３７からなり、これは、配列番号２２のアミノ酸配列をコードする。一実施形態では、当該核酸は、配列番号３８の核酸配列を含むか、又は配列番号３８からなり、これは、配列番号３１のアミノ酸配列をコードする。
更に、本発明は、本発明のいずれかの核酸を含むベクターを提供する。核酸は、当業者に周知である。実施例において、核酸は、本発明の設計アンキリン反復ドメイン又は組換え結合タンパク質を、大腸菌で生産するために使用した。
一態様では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質及び／若しくは設計アンキリン反復ドメイン、並びに／又は本発明の組換え結合タンパク質及び／若しくは設計アンキリン反復ドメインをコードする核酸、並びに任意選択的に、薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を含む、医薬組成物を提供する。
一実施形態では、本発明は、組換え結合タンパク質、又は本発明の組換え結合タンパク質をコードする核酸、並びに任意選択的に、薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を含む、医薬組成物を提供する。
薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤は当業者に既知であり、下記でより詳細に説明する。また更に、上述の組換え結合タンパク質及び／若しくは設計アンキリン反復ドメイン並びに／又は核酸、特に本発明の組換え結合タンパク質及び／又は核酸のうち１つ以上を含む、診断用組成物が提供される。
医薬組成物は、本明細書に記載のような組換え結合タンパク質、及び／又はアンキリン反復ドメイン、及び／又は核酸、好ましくは、組換え結合タンパク質及び／又は核酸、及び例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編、１９８０年に記載のような、薬学的に許容される担体、賦形剤若しくは安定剤を含む。
当業者に既知の、好適な担体、賦形剤又は安定剤としては、例えば、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液、固定油、オレイン酸エチル、５％デキストロース生理食塩水、等張性及び化学的安定性を高める物質、緩衝液並びに保存剤が挙げられる。他の好適な担体としては、それ自体が、組成物を投与される個体にとって有害な抗体の産生を誘発しない任意の担体、例えば、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸及びアミノ酸コポリマーが挙げられる。医薬組成物はまた、抗癌剤若しくは抗血管新生剤、又は更なる生物活性化合物等の、追加の有効成分を含む、合剤であってもよい。
インビボ投与に使用される製剤は、無菌でなくてはならない、又は、滅菌されていなくてはならない。これは、滅菌濾過膜で濾過することにより、容易に実施される。
本発明の一実施形態は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、医薬組成物を製造するための血清アルブミンに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを更に含む、本発明の組換え結合タンパク質の使用を提供し、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインを含むが、血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは含まない対応する組換え結合タンパク質と比較して、増加した終末相半減期、好ましくは少なくとも５％、好ましくは１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、又は２５０％の増加した終末相半減期を呈する。本発明の一実施形態では、組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、血清アルブミンに対する結合特異性を有する２つのアンキリン反復ドメインを更に含む。
一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載のような少なくとも１つの組換え結合タンパク質、並びに非イオン性洗剤などの洗剤、リン酸塩緩衝液などの緩衝液、及びスクロースなどの糖を含む。一実施形態では、このような組成物は、上記のような組換え結合タンパク質及びＰＢＳを含む。
別の態様では、本発明は、ヒトを含む哺乳動物におけるＣＤ４０発現細胞中のＣＤ４０の局所的活性化の方法であって、本発明の組換え結合タンパク質を当該哺乳動物に投与する工程を含む、方法を提供する。好ましい一実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ＣＤ４０に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、ローカライザ分子を更に含む。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、ＣＤ４０とは異なる標的に対して結合特異性を有する結合タンパク質である。一実施形態では、当該哺乳動物は、ヒトである。一実施形態では、当該ＣＤ４０発現細胞は、原発性腫瘍、転移、及び／又は腫瘍間質を含む腫瘍内に位置する。
別の態様では、本発明は、医学的状態を処置するための方法であって、医学的状態を処置することを必要とする患者に、治療有効量の本発明の組換え結合タンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。好ましい実施形態では、当該組換え結合タンパク質は、ローカライザ分子を含む。好ましい一実施形態では、当該医学的状態は、癌である。
別の態様では、本発明は、医学的状態の治療方法を提供し、本方法は、このような治療を必要とする患者に、ローカライザ分子を含む本発明の組換え結合タンパク質の治療有効量を投与する工程を含み、当該ローカライザ分子は当該結合タンパク質を標的組織に局在化させるのに有効であり、当該結合タンパク質の当該局在化は標的組織中のＣＤ４０発現細胞におけるＣＤ４０の活性化をもたらす。一実施形態では、当該ローカライザ分子は、腫瘍中で発現される細胞表面タンパク質に対して結合特異性を有する結合タンパク質であり、当該細胞表面タンパク質は、ＣＤ４０とは異なる。一実施形態では、当該ＣＤ４０発現細胞は、原発性腫瘍、転移、及び／又は腫瘍間質を含む腫瘍内に位置する。これらの実施形態は、したがって、腫瘍への本発明の組換え結合タンパク質によりＣＤ４０の活性化を局在化することによって、腫瘍中のローカライザの限定発現の利用を可能にする。
別の態様では、本発明は、患者の医学的状態を診断する方法を提供し、本方法は、ヒトＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む本発明の組換え結合タンパク質を、当該診断を必要とする患者へ、又は当該診断を必要とする患者の体液若しくは組織試料へ投与する工程を含む。一実施形態では、当該体液は、血漿又はその誘導体である。一実施形態では、当該体液は、血清である。一実施形態では、当該組織は、腫瘍組織である。一実施形態では、当該医学的状態は、癌である。別の実施形態では、当該医学的状態は、自己免疫疾患である。
一実施形態では、本発明は、本発明による医薬組成物又は組換え結合タンパク質の、疾患の治療のための使用を提供する。そのため、本発明による医薬組成物又は組換え結合タンパク質は、これらを必要とする患者に、治療有効量で投与される。投与としては、局所投与、経口投与、及び非経口投与を挙げることができる。典型的な投与経路は非経口投与である。親的（parental）投与において、本発明の医薬組成物は、上で定義したような薬学的に許容される賦形剤と共に、溶液、懸濁液、又はエマルションなどの単位用量の注射可能な形態で処方される。用量及び投与方法は、治療される個体及び特定の疾患によって異なる。
更に、上述の医薬組成物又は組換え結合タンパク質のいずれかは、障害の治療について考慮される。
一実施形態では、当該組換え結合タンパク質又は本明細書に記載のこのような他の医薬組成物は、静脈内投与される。非経口用途のため、組換え結合タンパク質又は当該医薬組成物は、ボーラス注入として又は緩徐な点滴注入により、治療有効量で注入することができる。
一実施形態では、本発明は、医学的状態の治療方法であって、そのような治療を必要とする患者に、本発明の組換え結合タンパク質の治療有効量を投与する工程を含む、治療方法を提供する。一実施形態では、本発明は、医学的状態の治療方法であって、そのような治療を必要とする患者に、本発明の医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含む、治療方法を提供する。一実施形態では、本発明は、本発明による医薬組成物の、疾患の治療のための使用を提供する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療において使用するための医薬組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、医学的状態の治療において使用するための医薬組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療において使用するための核酸を提供する。一実施形態では、本発明は、当該医薬組成物、組換え結合タンパク質、又核酸分子の、疾患の治療のための医薬としての使用を提供する。一実施形態では、本発明は、当該医薬組成物、組換え結合タンパク質、又核酸分子の、医薬の製造のための使用を提供する。一実施形態では、本発明は、当該医薬組成物、組換え結合タンパク質、又核酸分子の、疾患の治療のための医薬の製造のための使用を提供する。一実施形態では、本発明は、疾患の治療のための医薬の製造プロセスであって、当該医薬組成物、組換え結合タンパク質、又は核酸分子が、医薬の活性成分である、製造プロセスを提供する。一実施形態では、本発明は、当該医薬組成物、組換え結合タンパク質、又は核酸分子を使用して疾患を治療するプロセスを提供する。
特に、本発明は、本発明の医薬組成物を使用した医学的状態の治療であって、当該医学的状態が、癌である、治療を提供する。
本発明の組換え結合タンパク質又は当該医薬組成物の癌疾患の治療のための使用はまた、当技術分野において既知の１つ以上の他の療法との併用とすることができる。用語「～との併用」は、本明細書で使用する場合、所与の投与計画の下で実施される共投与を指すものとする。これには、異なる化合物の同時投与及び異なる化合物の時間を変えた投与が含まれる（例えば、化合物Ａを１回投与し、かつ化合物Ｂをその後に数回投与する、若しくは逆もまた同様、又は、両化合物を同時に投与し、かつ２つのうちの１つを後の段階でまた投与する）。
更なる一実施形態では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質の、医学的状態、好ましくは腫瘍性疾患、より好ましくは癌の治療に使用される医薬の製造のための使用を提供する。
一実施形態では、本発明は、本発明の医薬組成物の、腫瘍性疾患、特に癌であり得る、医学的状態の治療に使用される医薬の製造のための使用を提供する。
一実施形態では、本発明は、上述のアンキリン反復ドメインのいずれかを含む組換え結合タンパク質を提供する。
一実施形態では、本発明は、当該組換え結合タンパク質を含むキットを提供する。一実施形態では、本発明は、当該組換え結合タンパク質をコードする核酸を含むキットを提供する。一実施形態では、本発明は、当該医薬組成物を含むキットを提供する。一実施形態では、本発明は、当該組換え結合タンパク質、及び／又はこの組換え結合タンパク質をコードする核酸、及び／又はこの医薬組成物を含むキットを提供する。一実施形態では、本発明は、ＣＤ４０特異的アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質、例えば配列番号２９のＣＤ４０特異的アンキリン反復ドメイン、及び／又はＣＤ４０特異的アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質をコードする核酸、例えば配列番号３６の核酸、及び／又はＣＤ４０特異的アンキリン反復ドメインを含む当該組換え結合タンパク質を含む医薬組成物、及び／又はＣＤ４０特異的アンキリン反復ドメインを含む当該組換え結合タンパク質をコードする核酸を備える、キットを提供する。
一実施形態では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質を産生するための方法を提供する。一実施形態では、本発明は、組換え結合タンパク質、例えば配列番号２９のアミノ酸配列を含む組換え結合タンパク質を産生するための方法を提供し、本方法は、（ｉ）当該組換え結合タンパク質を細菌中で発現させる工程と、（ｉｉ）クロマトグラフィを用いて当該組換え結合タンパク質を精製する工程と、を含む。当該方法は追加の工程を含んでもよい。
本発明は、実施例に記載の特定の実施形態に制限されない。
本明細書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、添付の配列表に開示されている多くのアミノ酸配列、核酸配列、及び配列番号を参照する。
定義
本明細書で別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。
本発明の文脈において、用語「タンパク質」とは、ポリペプチドを含む分子を指し、ポリペプチドの少なくとも一部は、単一のポリペプチド鎖内及び／又は複数のポリペプチド鎖間において二次、三次、又は四次構造を形成することによって、定義された三次元配列を有する、又は獲得することができる。タンパク質が２つ以上のポリペプチド鎖を含む場合、個々のポリペプチド鎖は、非共有結合又は共有結合により、例えば、２つのポリペプチド間のジスルフィド結合により、結合され得る。二次及び／又は三次構造を形成することによって定義された三次元配列を個別に有する、又は獲得することができるタンパク質の一部は、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。そのようなタンパク質ドメインは、当業者に周知である。
組換えタンパク質及び組換えポリペプチドなどで使用される用語「組換え」とは、当該タンパク質又はポリペプチドが、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術の使用によって産生されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子（例えば遺伝子合成によって生産される）を細菌発現プラスミド（例えばｐＱＥ３０、ＱＩＡｇｅｎ）、酵母発現プラスミド、哺乳動物発現プラスミド、若しくは植物発現プラスミド、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ発現を可能にするＤＮＡにクローニングすることができる。例えば、そのような組換え細菌発現プラスミドを適切な細菌（例えば、大腸菌）に挿入すると、これらの細菌は、この組換えＤＮＡによってコードされたポリペプチドを生産することができる。それに応じて生産されたポリペプチド又はタンパク質は、組換えポリペプチド又は組換えタンパク質と呼ばれる。
本発明の文脈において、用語「結合タンパク質」は、結合ドメインを含むタンパク質を指す。結合タンパク質はまた、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の結合ドメインを含んでもよい。好ましくは、この結合タンパク質は、組換え結合タンパク質である。本発明の結合タンパク質は、ＣＤ４０に対する結合特異性を有する少なくとも１つのアンキリン反復ドメインを含む。
更に、任意のそのような結合タンパク質は、当業者に周知の追加のポリペプチド（例えば、ポリペプチドタグ、ペプチドリンカー、結合特異性を有する他のタンパク質ドメインへの融合、サイトカイン、ホルモン、又はアンタゴニストなど）、又は化学修飾（ポリエチレングリコール、毒素（例えば、免疫原からのＤＭ１）、小分子、抗生物質などへのカップリングなど）を含み得る。本発明の結合タンパク質は、ローカライザ分子を含んでもよい。
用語「結合ドメイン」は、標的に対する結合特異性を呈するタンパク質ドメインを意味する。好ましくは、この結合ドメインは、組換え結合ドメインである。より好ましくは、当該結合ドメインは、特定の標的に対する結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである。本発明のアンキリン結合ドメインが結合し得る特異的標的の例としては、ＣＤ４０、ＦＡＰ、及び血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「標的」は、核酸分子、ポリペプチド若しくはタンパク質、炭水化物、又は任意の他の天然に存在する分子などの個々の分子を指し、そのような個々の分子の任意の一部を含むか、又はそのような分子の２つ以上の複合体、又は細胞全体若しくは組織試料、又は任意の非天然化合物を指す。好ましくは、標的は天然に存在する、若しくは、非天然のポリペプチド若しくはタンパク質、又は、例えば、天然に存在する若しくは非天然のリン酸化、アセチル化、若しくはメチル化によって修飾された、化学修飾を含むポリペプチド若しくはタンパク質である。本発明の文脈において、ＣＤ４０及びＣＤ４０発現細胞は、ＣＤ４０特異的結合タンパク質及びローカライザ標的タンパク質の標的であり、細胞は、ローカライザの標的である。
用語「核酸」又は「核酸分子」は、一本鎖又は二本鎖のいずれかのリボ核酸（ＲＮＡ）分子又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子であることができるポリヌクレオチド分子を指し、ＤＮＡ又はＲＮＡの修飾形態及び人工形態を含む。核酸分子は、単離された形態で存在するか、又は組換え核酸分子又はベクターに含まれているかのいずれかであることができる。
本発明の文脈において、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合された、複数、すなわち２つ以上のアミノ酸の鎖からなる分子に関する。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合によって結合された８個超のアミノ酸からなる。用語「ポリペプチド」はまた、システインのＳ－Ｓ架橋によって結合されたアミノ酸の複数の鎖も含む。ポリペプチドは、当業者に周知である。
特許出願第２００２／０２０５６５号及びＦｏｒｒｅｒら、２００３（Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，Ｓｔｕｍｐｐ，Ｍ．Ｔ．，Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，２００３．「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ」第５３９巻第２～６頁）には、反復タンパク質の特徴及び反復ドメインの特徴、技術、及び用途の一般的な説明が含まれる。用語「反復タンパク質」とは、１つ以上の反復ドメインドメインを含むタンパク質を指す。好ましくは、反復タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの反復ドメインを含む。更に、当該反復タンパク質は、追加の非反復タンパク質ドメイン、ポリペプチドタグ、及び／又はペプチドリンカーを含んでもよい。反復ドメインは、結合ドメインであり得る。
用語「反復ドメイン」は、構造単位として２つ以上の連続する反復モジュールを含むタンパク質ドメインを指し、この反復モジュールは、構造相同性及び配列相同性を有する。好ましくは、反復ドメインは、Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピングモジュールを更に含む。明確にするためには、キャッピングモジュールは、例えば、通常の２０個の天然に存在するアミノ酸のいずれかが許可され、又はシステイン以外のアミノ酸、若しくはグリシン、システイン、及びプロリン以外のアミノ酸などの、２０個の天然に存在するアミノ酸のほとんどが許可された。この特許出願の目的のために、配列番号３９～９５のアミノ酸残基３、４、６、１４、及び１５は、本発明のアンキリン反復モジュールのランダム化された位置である。
用語「反復配列モチーフ」は、１つ以上の反復モジュールから推定されるアミノ酸配列を指す。好ましくは、当該反復モジュールは、同じ標的に対して結合特異性を有する反復ドメインに由来する。そのような反復配列モチーフは、フレームワーク残基位置及び標的相互作用残基位置を含む。当該フレームワーク残基位置は、反復モジュールのフレームワーク残基の位置に対応する。同様に、当該標的相互作用残基位置は、反復モジュールの標的相互作用残基の位置に対応する。反復配列モチーフは、非ランダム化位置及びランダム化位置を含む。
用語「反復単位」は、１つ以上の天然に存在するタンパク質の配列モチーフを含むアミノ酸配列を指し、当該「反復単位」は複数のコピーに見出され、タンパク質のフォールディングを決定する全ての当該モチーフに共通の定義されたフォールディングトポロジーを示す。そのような反復単位の例としては、ロイシンに富む反復単位、アンキリン反復単位、アルマジロ反復単位、テトラトリコペプチド反復単位、ＨＥＡＴ反復単位、及びロイシンに富む変異体反復単位が挙げられる。
用語「標的に対する結合特異性を有する」、「標的に特異的に結合する」、「高い特異性で標的に結合する」、「標的に対して特異的な」又は「標的特異性」などは、結合タンパク質又は結合ドメインが、大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などの非関連タンパク質に結合するよりも、ＰＢＳ中で、標的に、より低い解離定数で結合する（すなわち、より高い親和性で結合する）ことを意味する。好ましくは、標的に対するＰＢＳ中での解離定数（「ＫD」）は、ＭＢＰに対する対応する解離定数よりも、少なくとも１０2倍、より好ましくは少なくとも１０3倍、より好ましくは少なくとも１０4倍、又はより好ましくは少なくとも１０5倍低い。タンパク質－タンパク質間の相互作用の解離定数を測定するための方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術（例えば、ＳＰＲ平衡解析）又は等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）は、当業者に周知である。特定のタンパク質－タンパク質相互作用のＫDの測定値は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定された場合、変動し得る。したがって、ＫD値の測定は、好ましくは、タンパク質の標準化溶液及びＰＢＳ等の標準化緩衝液を使用して実施される。ＣＤ４０に対する結合特異性を有する本発明の組換え結合タンパク質の解離定数（ＫD）の典型的かつ好ましい決定は、ＰＢＳにおいてであり、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による。
用語「ポリペプチドタグ」は、ポリペプチド／タンパク質に結合したアミノ酸配列であって、当該アミノ酸配列が、当該ポリペプチド／タンパク質の精製、検出、若しくはターゲティングに有用であり、又は、当該アミノ酸配列が、ポリペプチド／タンパク質の物理化学的挙動を改善する、アミノ酸配列、又は、当該アミノ酸配列がエフェクター機能を有する、アミノ酸配列を指す。結合タンパク質の個々のポリペプチドタグ、部分及び／又はドメインは、互いに直接的に又はポリペプチドリンカーを介して結合していてもよい。これらのポリペプチドタグは、技術分野で全て周知であり、当業者には十分に利用可能である。ポリペプチドタグの例は、小さなポリペプチド配列、例えば、Ｈｉｓ（例えば、配列番号４からなるＨｉｓタグ）、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、若しくはＳｔｒｅｐタグ、又は酵素（例えば、アルカリホスファターゼなどの酵素）であって、当該ポリペプチド／タンパク質の検出ができる酵素、又はターゲティングに使用することができる部分（免疫グロブリン又はその断片など）及び／若しくはエフェクター分子として使用することができる部分である。
用語「ポリペプチドリンカー」は、例えば、２つのタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグとタンパク質ドメイン、タンパク質ドメインとポリエチレングリコールなどの非ポリペプチド部分、又は２つのポリペプチドタグタグを結合させることができるアミノ酸配列を指す。そのような更なるドメイン、タグ、非ポリペプチド部分及びリンカーは、関連分野の当業者に公知である。そのようなポリペプチドリンカーの例は、配列番号１及び２からなるリンカーである。
用語「約」は、言及した値の＋／－２０％を意味し、例えば、「約５０」は、４０～６０を意味するものとする。
用語「ＰＢＳ」は、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩及び２．７ｍＭ ＫＣｌを含み、ｐＨが７．４であるリン酸緩衝水溶液を意味する。
本明細書で使用される「血清アルブミン」という用語は、マウス血清アルブミン、カニクイザル血清アルブミン、及びヒト血清アルブミンを含むが、これらに限定されない。用語「マウス血清アルブミン」は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０７７２４を指し、用語「カニクイザル血清アルブミン」（すなわちカニクイザル（macaca fascicularis））は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ａ２Ｖ９Ｚ４を指し、用語「ヒト血清アルブミン」はＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６８を指す。
好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期は、哺乳動物、より好ましくはマウス及び／又はカニクイザル、より好ましくはカニクイザルで評価する。好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期をマウスで測定する場合、評価は、注入後最大４８時間までのデータを考慮して実施する。より好ましくは、マウスにおける終末相半減期の評価は、２４時間～４８時間で計算される。好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期をカニクイザルで測定する場合、評価は、注射後最大７日目までのデータを考慮して実施する。より好ましくは、カニクイザルにおける終末相半減期の評価は、１日目～５日目で計算する。当業者は、標的媒介クリアランスなどの効果を更に特定し、終末相半減期を計算する場合、それらを考慮することができる。本発明の組換え結合タンパク質などの薬物の用語「終末相半減期」とは、偽平衡に達した後、哺乳動物に適用した薬物の血漿中濃度の半分に達するのに必要な時間を指す（例えば、マウスでは２４時間～４８時間で計算し、又はカニクイザルでは１日目～５日目で計算する）。終末相半減期は、哺乳動物に投与された薬物の用量の半分を排泄するのに必要な時間とは定義されない。終末相半減期という用語は、当業者に周知である。好ましくは、薬物動態の比較は、任意の用量、より好ましくは同等の用量（すなわち、同一のｍｇ／ｋｇ用量）又は等モル用量（すなわち、同一のｍｏｌ／ｋｇ用量）、より好ましくは等モル投与量（すなわち、同一のｍｏｌ／ｋｇ用量）、で行う。動物での同等及び／又は等モルの投与は、少なくとも２０％、より好ましくは３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の実験的な投与量のばらつきを伴うことが、当業者には理解される。好ましくは、薬物動態の測定に用いられる投与量は、０．００１～１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．０１～１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１～５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．５～１０ｍｇ／ｋｇから選択される。
用語「ＣＤ４０」及び「ＣＤ４０受容体」とは、本出願で互換的に使用され、ＣＤ４０受容体の任意の形態、並びにＣＤ４０受容体の活性の少なくとも一部を保持するバリアント、アイソフォーム、及び種相同体（species homolog）を指す。したがって、本明細書に定義及び開示される結合タンパク質はまた、ヒト以外の種からＣＤ４０に結合してもよい。他の場合では、結合タンパク質は、ヒトＣＤ４０に完全に特異的であってもよく、種又は他のタイプの交差反応性を呈しなくともよい。ヒトＣＤ４０に対する特定の参照によってなど異なる指示が無い限り、ＣＤ４０は、天然配列ＣＤ４０、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシの全ての哺乳動物種を含む。ヒトＣＤ４０のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１２４１．１、ＵｎｉｐｒｏｔＰ２５９４２、及び配列番号９６に示されている。共刺激受容体ＣＤ４０は、４８ｋＤａのＩ型膜貫通タンパク質であり、ヒトにおける１７３個のアミノ酸の細胞外ドメイン（配列番号９７）、２２個のアミノ酸膜貫通ドメイン、及び６２個のアミノ酸細胞内ドメインを含有する。前駆体は更に２０個のアミノ酸リーダー配列を含む。発現パターンに関して、ＣＤ４０は、最初にＢ細胞上で特徴付けられ、樹状細胞、単球、血小板、及びマクロファージ上、並びに筋線維芽細胞、線維芽細胞、上皮細胞、及び内皮細胞などの非造血細胞によりまた発現される（Ｅｌｇｕｅｔａら、「Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．」、２００９年５月；第２２９巻（第１号））。
本明細書で使用する場合の「ＣＤ４０アゴニスト」とは、ＣＤ４０に結合した際、（１）ＣＤ４０を刺激若しくは活性化する、（２）ＣＤ４０の活性、機能、若しくは存在を増強、増加、促進、誘導、若しくは延長する、又は（３）ＣＤ４０の発現を増強、増加、促進、若しくは誘導する、任意の化学化合物又は生体分子を意味する。ヒト個体が治療されている本発明の治療方法、薬剤、医薬組成物、及び使用のいずれにおいても、ＣＤ４０アゴニストは、ＣＤ４０媒介応答を増加させる。本発明の治療方法、薬剤、医薬組成物、及び使用のいくつかの実施形態では、ＣＤ４０アゴニストは、ＣＤ４０による下流シグナル伝達を著しく増強することで、様々なモデルにおける抗腫瘍活性をもたらす。
本発明のＣＤ４０特異的結合タンパク質に含まれる「ローカライザ分子」又は「ローカライザ」の文脈において、本明細書で互換的に使用される用語「局在化」又は「送達」とは、哺乳動物のローカライザ標的細胞又は組織に対し、結合タンパク質がローカライザを含まない場合と比較して、ローカライザを含むそのようなＣＤ４０特異的結合タンパク質の局在化の増加を指す。この用語はまた、ＣＤ４０特異的結合タンパク質を、哺乳動物におけるローカライザ標的細胞又は組織の部位に標的化することを指し、ＣＤ４０異的結合タンパク質は、ローカライザを含む。この用語は、好ましくは、哺乳動物におけるローカライザ標的細胞又は組織の部位での、ローカライザを含むＣＤ４０特異的結合タンパク質の蓄積及び／又は保持を更に包含する。この用語はまた、好ましくは、哺乳動物におけるローカライザ標的細胞又は組織の部位に、又はその近くにあるローカライザを含む、本発明のＣＤ４０特異的結合タンパク質によって誘導されたＣＤ４０発現細胞におけるＣＤ４０の局所的活性化を包含する。そのような局所的活性化は、例えば、ローカライザを含むＣＤ４０特異的結合タンパク質の結合時にＣＤ４０のクラスタリングを介して起こってもよく、クラスタリングは、その標的細胞又は組織へのローカライザの結合によって媒介される。この段落で使用する場合、「哺乳動物」はヒトを包含する。「局在化」の結果は、当業者に周知の様々な手段によって測定されてもよい。一例として、「局在化」は、技術分野で周知の方法に従って、ローカライザに結合された本発明の結合タンパク質の臓器対血中比を決定することによって測定されてもよい。本発明の一実施形態では、ローカライザを含むＣＤ４０特異的結合タンパク質の「局在化」に対するローカライザの効果は、ローカライザを含まない対応するＣＤ４０特異的結合タンパク質と比較して、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、又は３００％の増加した臓器対血中比によって提示される。
用語「ローカライザ分子」及び「ローカライザ」とは、本明細書で互換的に使用され、本発明のＣＤ４０特異的結合タンパク質に含まれ得、それを含む本発明のそのようなＣＤ４０特異的結合タンパク質を、例えばヒトを含む哺乳動物における標的細胞又は組織に局在化又は送達することができる、任意の分子を包含することが意図され、ローカライザは、標的細胞又は組織に結合する。ローカライザは、本発明のＣＤ４０特異的アンキリン反復ドメインに、結合、コンジュゲート、融合、又は別様に物理的に結合することができる。用語「ローカライザ分子」及び「ローカライザ」とは、ポリヌクレオチド、ペプチド／ポリペプチド、及び／又はこれらの特性を有する化学的若しくは生化学的薬剤を包含する。用語「ポリヌクレオチド」とは、一般に、ＤＮＡ又はＲＮＡを指し、ＤＮＡ又はＲＮＡの修飾された人工形態を含む。用語「ペプチド」とは、４～２００アミノ酸長などの、４～６００アミノ酸長のペプチド鎖を指し、したがって、ポリペプチド及びタンパク質を包含する。この用語は、足場、免疫調節タンパク質等に基づく、任意の自然起源若しくは人工の結合タンパク質、結合ドメイン、増殖因子受容体、又はそのフラグメント若しくはリガンド、サイトカイン、ポリペプチドホルモン、抗体、抗体様タンパク質を包含する。更に、用語「ペプチド」とはまた、例えばグリコシル化によって修飾されたペプチドと、２つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質、４～６００アミノ酸長の長さの各々、例えばインスリン及び免疫グロブリンなどのジスルフィド結合によって架橋されたタンパク質と、を包含する。用語「化学的又は生化学的薬剤」とは、レシピエントに投与され得る任意の自然起源又は合成の化合物を含むことが意図される。好ましい実施形態では、ローカライザは、標的特異的アンキリン反復ドメインである。より好ましい一実施形態では、ローカライザ分子は、ＦＡＰに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインである。
本明細書で使用される「ＦＡＰ」という用語は、線維芽細胞活性化タンパク質を指す。セプラーゼ（Seprase）としても知られる線維芽細胞活性化タンパク質α（ＦＡＰ）は、ＩＩ型内在性膜セリンペプチダーゼ（type II integral membrane serine peptidase）である。ＦＡＰは、ジペプチジルペプチダーゼＩＶファミリーに属する（Ｙｕら、「ＦＥＢＳ Ｊ．」、第２７７巻第１１２６～１１４４頁（２０１０年））。これは、酵素の触媒ドメインが位置する、大きなＣ末端細胞外ドメインを有する２つのＮ－グリコシル化サブユニットを含有する１７０ｋＤａのホモ二量体である（Ｓｃａｎｌａｎら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」、第９１巻：第５６５７～５６６１頁（１９９４年）；Ｗｏｎｇａｎｕら、「Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ」、第１８５８巻（第８号）：第１８７６～８２頁（２０１６年））。ＦＡＰは、そのグリコシル化形態では、ポスト－プロリルジペプチジルペプチダーゼ及びゼラチナーゼ活性の両方を有する（Ｓｕｎら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ」、第２４巻第２７４～２８１頁（２００２年））。ヒトＦＡＰのホモログは、マウス及びカニクイザル（Macaca fascicularis）を含むいくつかの種において見出された。ＦＡＰは、肺、結腸直腸、膀胱、卵巣及び乳癌を含む、調べた上皮悪性腫瘍（原発性及び転移性）の９０％超の反応性間質線維芽細胞において、並びに骨及び軟組織肉腫の悪性間葉細胞において選択的に発現されるが、通常、正常な成体組織には存在しない（Ｂｒｅｎｎｅｎら、「Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．」、第１１巻（第２号）：第２５７～２６６頁（２０１２年）；Ｇａｒｉｎ－Ｃｈｅｓａら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」、第８７巻第７２３５～７２３９頁（１９９０年）；Ｒｅｔｔｉｇら、「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」、第５３巻：第３３２７～３３３５頁（１９９３年）；Ｒｅｔｔｉｇら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」、第８５巻第３１１０～３１１４頁（１９８８年））。ＦＡＰはまた、特定の悪性腫瘍細胞上で発現される。正常組織における多くの一般的な癌におけるその発現及びその制限された発現により、ＦＡＰは、様々な癌の撮像、診断、及び治療のための有望な抗原性標的と考えられている。
本明細書で使用される「ＣＤ４０発現細胞」という用語は、Ｂ細胞、樹状細胞、単球、血小板、及びマクロファージ、並びに筋線維芽細胞、線維芽細胞、上皮細胞、及び内皮細胞などの非造血細胞を含むがこれらに限定されない、細胞表面上にＣＤ４０を発現する任意の細胞を指す。
用語「処置」又は「処置すること」は、治療手段と、予防手段又は防止手段とをいずれも指す。処置を必要とするものとしては、既に障害に罹患しているもの、及び障害が防止されるべきものが挙げられる。
「医学的状態」、「障害」、及び「疾患」という用語は、本明細書で互換的に使用され、自己免疫障害、炎症性障害、網膜症（特に増殖性網膜症）、神経変性障害、感染症、代謝性疾患、及び腫瘍性疾患が含まれる。本明細書に記載の組換え結合タンパク質のいずれかを、そのような障害、特に、自己免疫障害、炎症性障害、網膜症、及び腫瘍性疾患を含む群から選択される障害の治療のための医薬の調製に使用することができる。「医学的状態」は、不適切な細胞増殖を特徴とするものである場合がある。医学的状態は、過剰増殖状態である場合がある。本発明は、特に、医学的状態の治療方法であって、そのような治療を必要とする患者に、本発明の当該組換え結合タンパク質又は上記の医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含む、治療方法を提供する。好ましい実施形態では、当該医学的状態は、腫瘍性疾患である。用語「腫瘍性疾患」は、本明細書で使用する場合、急速に増殖する細胞増殖又は腫瘍を特徴とする、細胞又は組織の異常な状態（state or condition）を指す。一実施形態では、当該医学的状態は、悪性腫瘍性疾患である。一実施形態では、当該医学的状態は、癌である。用語「治療有効量」は、対象において所望の生物学的、薬理学的、又は治療上の結果を誘導するのに十分な量を指す。本発明の文脈における治療有効量は、いずれかの医学的処置に適用可能な妥当な利益／リスク比で疾患又は障害を処置又は予防するための結合タンパク質の十分量を意味する。
用語「癌」及び「癌性」は、本明細書では、典型的には、調節されていない細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すか、又は記載するために使用される。癌は、固形腫瘍及び液性腫瘍、並びに原発性腫瘍及び転移性を包含する。「腫瘍」は、１つ以上の癌性細胞を含む。固形腫瘍は、典型的には、腫瘍間質も含む。癌の例としては、原発性及び転移性癌、リンパ腫、芽腫、肉腫、及び白血病、並びに任意の他の上皮及びリンパ系悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。脳癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、明細胞腎臓癌、頭頸部扁平上皮癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、悪性黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、三重陰性乳癌、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、悪性中皮腫、結腸直腸癌、又は胃癌が挙げられる。
本明細書で使用される「改善された薬物動態特性」という用語は、増加した曲線下面積、低減したクリアランス、又は延長した終末相半減期を指す。これらの薬物動態特性のパラメータ及びパラメータを測定する方法は、技術分野において周知である（例えば、Ｍａｈｍｏｏｄ，Ｉ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ：Ｔｅｃｈｎｏｌ」（２００９年）、ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｄｄｔｅｃ．２００８．１２．００１）。
本発明の文脈において、例えば、配列番号８などのアミノ酸配列中の文字「Ｘ」は、いずれかのアミノ酸を表す。本発明の文脈において、用語「いずれかのアミノ酸」は、好ましくは、最も多く自然界に存在する２０個のアミノ酸、すなわちアラニン（ａｌａ、Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）、バリン（ｖａｌ、Ｖ）を意味する。
処置の目的のための用語「哺乳動物」は、ヒト、家畜及び農場動物、非ヒト霊長類、並びに、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどの、動物園動物、競技用動物、又はペット動物を含む、哺乳動物として分類されるいずれかの動物を指す。
以下に開示の出発物質及び試薬は、当業者に既知であり、市販されている、及び／又は周知の技術を用いて調製することができる。
材料
化学物質はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）より購入した。オリゴヌクレオチドはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）より購入した。特に明記しない限り、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、及び緩衝液は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）又はＦｅｒｍｅｎｔａｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）より購入した。誘導性大腸菌発現株は、例えば、大腸菌のＸＬ１－ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）又はＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）などのクローニング及びタンパク質生産に使用した。ヒトＣＤ４０の細胞外ドメインの組換えＦｃ融合タンパク質は、ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。
分子生物学
特に明記しない限り、方法は、既知のプロトコルに従って実施される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．、及びＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９年）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。
設計アンキリン反復タンパク質ライブラリー
設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーを生成する方法は、例えば、米国特許第７，４１７，１３０号；Ｂｉｎｚら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」、第３３２巻第４８９～５０３頁（２００３年）；Ｂｉｎｚら（２００４年）、上記引用に記載されている。このような方法により、ランダム化アンキリン反復モジュール及び／又はランダム化キャッピングモジュールを有する、設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーを構築することができる。例えば、そのようなライブラリーはしたがって、固定化Ｎ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号５、６、若しくは７のＮ末端キャッピングモジュール）、又は配列番号８によるランダム化Ｎ末端キャッピングモジュール、配列番号９、１０、若しくは１１の配列モチーフによる１個以上のランダム化反復モジュール、及び固定化Ｃ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号１２、１３、若しくは１４のＣ末端キャッピングモジュール）又は配列番号１５によるランダム化Ｃ末端キャッピングモジュールに基づいて組み立てることができた。好ましくは、そのようなライブラリーは、反復又はキャッピングモジュールのランダム化された位置にアミノ酸Ｃ、Ｇ、Ｍ、Ｎ（Ｇ残基の前）及びＰのいずれも有さないように組み立てられる。加えて、配列番号９、１０、又は１１の配列モチーフによるランダム化反復モジュールは、位置１０及び／又は位置１７で更にランダム化することができ、配列番号８の配列モチーフによるランダム化Ｎ末端キャッピングモジュールは、位置９で更にランダム化することができ、配列番号１５の配列モチーフによるランダム化Ｃ末端キャッピングモジュールは、位置１０及び／又は１７において更にランダム化することができた。
更に、そのようなライブラリー内のそのようなランダム化されたモジュールは、ランダム化されたアミノ酸位置を有する追加のポリペプチドループ挿入を含んでもよい。そのようなポリペプチドループ挿入の例は、抗体又はデノボ生成ペプチドライブラリーの補体決定領域（ＣＤＲ）ループライブラリーである。例えば、そのようなループ挿入は、ガイダンスとして、ヒトリボヌクレアーゼＬのＮ末端アンキリン反復ドメインの構造を用いて設計することができた（Ｔａｎａｋａ，Ｎ．、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｍ、Ｋｕｓａｋａｂｅ，Ｙ、Ｇｏｔｏ，Ｙ．、Ｋｉｔａｄｅ，Ｙ、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．Ｔ．、「ＥＭＢＯ Ｊ．」第２３巻第３０号第３９２９～３９３８頁（２００４年））。２つのアンキリン反復の境界近くに存在するβターンに１０個のアミノ酸が挿入される、このアンキリン反復ドメインと同様に、アンキリン反復タンパク質ライブラリーは、アンキリン反復ドメインの１つ以上のβターンに挿入された可変長（例えば、１～２０個のアミノ酸）のランダム化ループ（固定化及びランダム化位置を有する）を含有してもよい。
アンキリン反復タンパク質ライブラリーのいずれかのそのようなＮ末端キャッピングモジュールは、好ましくは、ＲＩＬＬＡＡモチーフ、ＲＩＬＬＫＡモチーフ、又はＲＥＬＬＫＡモチーフを有し（例えば、配列番号２９の位置２１～２６に存在）、アンキリン反復タンパク質ライブラリーのいずれかのそのようなＣ末端キャッピングモジュールは、好ましくは、ＫＬＮモチーフ、ＫＬＡモチーフ、又はＫＡＡモチーフを有する（例えば、配列番号２９における最後の３個のアミノ酸に存在）。
そのようなアンキリン反復タンパク質ライブラリーの設計は、標的と相互作用するアンキリン反復ドメインの既知の構造によって誘導され得る。蛋白質構造データバンク（Protein Data Bank：ＰＤＢ）の独自の受託コード又は識別コード（ＰＤＢ－ＩＤ）によって識別される、そのような構造の例は、１ＷＤＹ、３Ｖ３１、３Ｖ３０、３Ｖ２Ｘ、３Ｖ２Ｏ、３ＵＸＧ、３ＴＷＱ－３ＴＷＸ、１Ｎ１１、１Ｓ７０、及び２ＺＧＤである。
Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃで設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーなどの、設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーの例が説明されている（米国特許第７，４１７，１３０号、Ｂｉｎｚら、２００３年、上記引用；Ｂｉｎｚら、２００４年、上記引用）。Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃの数字は、Ｎ末端及びＣ末端のキャッピングモジュール間に存在するランダム化反復モジュールの数を説明している。
反復単位及びモジュール内の位置を定義するために使用される命名法は、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用に基づき、アンキリン反復モジュールとアンキリン反復単位との境界が、１アミノ酸位置シフトするという修飾を伴う。例えば、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用のアンキリン反復モジュールの位置１は、本開示のアンキリン反復モジュールの位置２に対応し、結果として、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用のアンキリン反復モジュールの位置３３は、本開示の以下のアンキリン反復モジュールの位置１に相当する。
実施例１：ＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質の選択
リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、「ＰＮＡＳ」第９４巻第４９３７～４２頁（１９９７年））を用いて、ヒトＣＤ４０（ｈＣＤ４０）に対して結合特異性を有する多くのアンキリン反復タンパク質を、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用による記載と同様のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ライブラリーから選択した。選択されたクローンの組換えヒトＣＤ４０標的への結合は、粗抽出物のホモジニアス時間分解蛍光測定（Homogeneous Time Resolved Fluorescence：ＨＴＲＦ）によって評価され、数百のｈＣＤ４０特異的結合タンパク質が正常に選択されたことを示した。例えば、配列番号１６～３５のアンキリン反復ドメインは、ｈＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む、選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。ｈＣＤ４０に対して結合特異性を有するそのようなアンキリン反復ドメインからの個々のアンキリン反復モジュールは、例えば、配列番号３９～９５で提供される。
リボソームディスプレイによるＣＤ４０特異的アンキリン反復タンパク質の選択
ｈＣＤ４０特異的アンキリン反復タンパク質の選択は、ヒトＣＤ４０の細胞外ドメイン（配列番号９７）を、短いリンカーを介してＣ末端でＩｇＧ１ Ｆｃドメインに融合させ（アミノ酸配列ＡＡＡ）、標的タンパク質として、上記のアンキリン反復タンパク質のライブラリー、及び確立されたプロトコルとして用いる、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（上記引用））によって実施した（例えば、Ｚａｈｎｄ，Ｃ．、Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．、及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、「Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ」第４巻第６９～７９頁（２００７年）参照）。各選択ラウンドの後の逆転写（reverse transcription：ＲＴ）－ＰＣＲサイクルの数を、結合剤の濃縮により、収率に合わせて調整して、常に減少させた。最初の４ラウンドの選択は、標準的なリボソームディスプレイ選択を採用し、標的濃度を減少させ、洗浄ストリンジェンシを増加させて、ラウンド１からラウンド４への選択圧力を増加させる（Ｂｉｎｚら、２００４年、上記引用）。いくつかのプールについては、リボソームディスプレイ選択ラウンドのいくつかにおいてエピトープブロッキングを使用した。高親和性ＣＤ４０特異的アンキリン反復タンパク質を富化するために、標準リボソームディスプレイ選択（上記）の第４ラウンドからの出力を、選択ストリンジェンシの増加を伴うオフレート選択ラウンドに供した（Ｚａｈｎｄ（２００７年）上記引用）。最後の標準選択ラウンドを、オフレート選択ラウンドの後に実施して、オフレート選択された結合タンパク質を増幅及び回収した。これら最後の２つの選択ラウンドでは、ＲＴ－ＰＣＲサイクルの数は、一定に保たれた。ラウンド４及びラウンド６の全てのプールはまた、Ｎ末端にＦＡＰ特異的結合ドメイン（実施例３を参照）を用いてフォーマットされ（すなわち、ＦＣフォーマットをもたらす）、ラウンド４の１つのプールはまた、Ｃ末端にＦＡＰ特異的結合ドメインを用いてフォーマットされ（すなわち、ＣＦフォーマットをもたらす）、ＦＡＰ結合を介したクラスタリングを必要とする細胞におけるＣＤ４０シグナル伝達の活性化についてのレポータアッセイにおける機能的スクリーニングを可能にした。簡単に説明すると、レポータアッセイは、ＣＤ４０を発現し、ＮＦ－κＢ依存性ルシフェラーゼレポータ遺伝子を有するＨＥＫ２９３細胞を使用した。ヒトＣＤ４０リガンド又は任意の他のＣＤ４０アゴニストによるＣＤ４０シグナル伝達の活性化に続いて、ＮＦ－κＢ転写因子は、ＤＮＡ応答エレメントに結合して、レポータ細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子の転写を誘導する。これらのＨＥＫ２９３細胞をＦＡＰ発現細胞の存在下及び非存在下で培養した。ＣＤ４０シグナル伝達は、結合タンパク質がＦＡＰ特異的結合ドメインを用いてフォーマットされた場合（例えば、ＦＣフォーマット）、ＦＡＰ発現細胞の存在下でのみ、本発明のＣＤ４０特異的結合タンパク質によって活性化されることで、ＦＣフォーマットされた構築物のＣＤ４０及びＦＡＰへの結合の際にＣＤ４０クラスタリングをもたらした。ＦＡＰ特異的結合ドメインは、ローカライザ分子の一例である（実施例３を参照されたい）。
選択されたクローンは、粗抽出物ＨＴＲＦによって示されるようにＣＤ４０に特異的に結合する
溶液中でＣＤ４０に特異的に結合する個々の選択されたアンキリン反復タンパク質を、標準的なプロトコルを用いて、アンキリン反復タンパク質発現大腸菌細胞の粗抽出物を使用するホモジニアス時間分解蛍光測定（ＨＴＲＦ）アッセイによって特定した。リボソームディスプレイによって選択されたアンキリン反復タンパク質クローンを、ｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体へとクローニングし、以下に記載の単一のタンパク質精製を促進することで以下に記載されるようなＮ末端Ｈｉｓ－タグ（配列番号４）を得て、大腸菌のＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へと形質転換し、ＬＢ－寒天（１％グルコース及び５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有）上に播種し、次いで、３７℃で一晩インキュベートした。１６０μＬの成長培地（１％グルコースと５０μｇ／ｍＬのアンピシリンとを含有するＴＢ）を含有する９６ウェルプレートへと単一のコロニーを播種し（単一のウェル中に各クローン）、３７℃、８００ｒｐｍで振盪しながら、一晩インキュベートした。アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有する１５０μＬの新鮮なＴＢ培地に、新しい９６ディープウェルプレート中８．５μＬの一晩培養物を播種した。３７℃及び８５０ｒｐｍで１２０分間インキュベートした後、発現をＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）で誘導し、４時間続けた。細胞を収集し、ペレットを、８．５μＬのＢ－ＰＥＲＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁する前に－２０℃で一晩凍結し、振盪（６００ｒｐｍ）しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、１６０μＬのＰＢＳを添加し、細胞片を遠心分離によって除去した（３２２０ｇで１５分間）。
各溶解したクローンの抽出物を、ＰＢＳＴＢ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）及び０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ｐＨ７．４を補充したＰＢＳ）中で、１．２５ｎＭ（最終濃度）ビオチン化ヒトＣＤ４０、１：４００（最終濃度）の抗－６Ｈｉｓ－Ｄ２ ＨＴＲＦ抗体－ＦＲＥＴ受容体コンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）、及び１：４００（最終濃度）の抗ｓｔｒｅｐ－Ｔｂ抗体ＦＲＥＴドナーコンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）と一緒に、１：５０００希釈（最終濃度）として３８４ウェルプレートのウェルへ適用し、室温で１２０分間インキュベートした。３４０ｎｍの励起波長及び６６５±１０ｎｍの発光フィルタを使用して、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００でＨＴＲＦを読み取った。そのような粗細胞抽出物ＨＴＲＦによる数百個のクローンのスクリーニングにより、ヒトＣＤ４０に対する特異性を有する１００個を超える異なるアンキリン反復ドメインが明らかになった。ヒトＣＤ４０に特異的に結合する選択されたアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列の例は、配列番号１６～３５に提供されている。
これらのアンキリン反復ドメインの全て（配列番号１６～３５）（ＦＣフォーマットで）はまた、レポータアッセイにおいて示されるように、細胞におけるＣＤ４０シグナル伝達を活性化し、ＥＣ５０値は低ナノモル範囲であった（表１を参照されたい）。
Figure 2023528207000001
ＣＤ４０特異的アンキリン反復タンパク質の高レベル及び可溶性発現
更なる分析のために、上記のように粗細胞抽出物ＨＴＲＦで特異的なＣＤ４０結合を示す選択されたクローンを、大腸菌細胞で発現させ、標準プロトコルに従ってそれらのＨｉｓタグを用いて精製した。２５ｍｌの静置一晩培養物（ＴＢ、１％のグルコース、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン；３７℃）を使用して、５００ｍＬの培養物（ＴＢ、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン、３７℃）に接種した。６００ｎｍで１．０～１．５の吸光度において、培養物を０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、振盪しながら３７℃で４～５時間インキュベートした。培養物を遠心分離し、得られたペレットを、２５ｍＬのＴＢＳ500（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８）中に再懸濁し、溶解した（超音波処理又はフレンチプレス）。溶解後、試料を５０ＫＵ ＤＮａｓｅ／ｍＬと混合し、６２．５℃で３０分間の熱処理工程の前に１５分間インキュベートし、遠心分離し、上清を回収し、濾過した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（１％（ｖ／ｖ）の最終濃度）及びイミダゾール（２０ｍＭの最終濃度）をホモジネートに添加した。タンパク質を、Ｎｉ－ニトリロ三酢（Ｎｉ－ＮＴＡ）酸カラム、続いて、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ（商標）システム上のサイズ排除クロマトグラフィで、当業者に既知の標準的なプロトコル及び樹脂に従って精製した。あるいは、Ｈｉｓタグを欠く選択されたアンキリン反復ドメインは、大腸菌における高細胞密度発酵によって生産され、当業者に知られている標準的な樹脂及びプロトコルに従って、一連のクロマトグラフィ及び限外／ダイアフィルトレーション工程によって精製される。ＣＤ４０に対して結合特異性を有する高可溶性アンキリン反復タンパク質は、４～１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥから推定される９５％超の純度で、大腸菌培養物から精製した（培養物１リットル当たり最大２００ｍｇのアンキリン反復タンパク質）。
実施例２：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によるＣＤ４０に対して結合特異性を有するアンキリン反復タンパク質の解離定数（ＫD）の決定
ヒトＣＤ４０標的上の精製されたアンキリン反復タンパク質の結合親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて分析し、当業者に既知の標準的な手順に従って測定を行った。
簡単に説明すると、ビオチン化ヒトＣＤ４０を、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）含有）中に希釈し、２レーンのＮＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）上に、それぞれ４００及び７００共鳴単位（resonance unit：ＲＵ）のレベルまで被覆した。次いで、アンキリン反復タンパク質とｈＣＤ４０との相互作用を、マルチトレースＳＰＲ測定については５０ｎＭ～３ｎＭの濃度範囲を網羅する連続希釈のアンキリン反復タンパク質を含有する２００μＬの泳動用緩衝液（０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）を注入すること（オンレート測定）、続いて１００μＬ／分の一定流量で少なくとも１０分間、泳動用緩衝液流を注入すること（オフレート測定）によって測定した。再生は、３０μＬの１０ｍＭ グリシン－ＨＣｌ ｐＨ２を用いて行った。スポット間のシグナル（すなわち、共鳴単位（ＲＵ）値）及び参照注入（すなわち、ランニング緩衝液のみの注入）を、アンキリン反復タンパク質の注入後に得られたＲＵトレースから減算した（二重参照）。オンレート及びオフレート測定から得られたＳＰＲトレースに基づいて、対応するアンキリン反復タンパク質－ＣＤ４０相互作用のオンレート及びオフレートを、１：１ラングミュア速度モデルを用いて決定した。
解離定数（ＫD）を、当業者に既知の標準的な手順を用いて、推定されたオンレート及びオフレートから算出した。ヒトＣＤ４０による選択されたアンキリン反復タンパク質の結合相互作用のＫD値は、ナノモル範囲内にあると決定された。表２は、いくつかの選択されたアンキリン反復タンパク質のＫD値を例として提供している。
Figure 2023528207000002
実施例３：ローカライザ分子と組み合わされたＣＤ４０特異的結合タンパク質
ＣＤ４０特異的結合タンパク質を、ローカライザ分子と、場合によっては血清半減期延長分子と更に組み合わせて、本発明のＣＤ４０特異的結合タンパク質のＣＤ４０アゴニスト機能を、ＣＤ４０アゴニスト機能を有効かつローカライザ依存的にし、その上また臨床開発に必要な血清半減期延長も提供し得る様式で多機能性分子においてフォーマット化できるかどうかを評価した。
ローカライザ分子として、ＦＡＰ特異的結合ドメインを選択した。配列番号９８は、ＦＡＰ特異的結合ドメインを提供する。半減期延長分子として、血清アルブミン特異的結合ドメインを選択した。このような血清アルブミン特異的結合ドメインは、当該分野で公知である。
様々なフォーマットの多機能性分子を産生し、それらのＦＡＰ特異性、有効性、及びＣＤ４０活性化の効力を決定した。これらの多機能性タンパク質は全て、ローカライザ（すなわち、ＦＡＰ特異的結合ドメイン）及びＣＤ４０特異的結合ドメインを含んだ。（ｉ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメイン（複数可）を添加すること、（ｉｉ）更なるＣＤ４０結合ドメイン（複数可）を添加することによって結合価を増加させること、及び（ｉｉｉ）タンパク質内の結合ドメインの順序を変更することによる影響を評価した。
異なるフォーマットを比較するために、ＣＤ４０誘発時にヒトＢ細胞上に発現される、共刺激受容体ＣＤ８６の上方制御を測定するインビトロアッセイを設定した。この細胞アッセイは、ＦＡＰ発現細胞の存在下又は非存在下において初代ヒトＢ細胞を使用した。ＣＤ８６共刺激分子の上方制御をＢ細胞活性化のマーカーとして評価した。その作用機序がＦＡＰ媒介架橋から独立している抗ＣＤ４０モノクローナル抗体を、参照材料として使用した。
異なるフォーマットの多機能性タンパク質。多機能性タンパク質の最も単純なフォーマットは、１つのＣＤ４０特異的結合ドメイン（配列番号２９）と、１つのローカライザ分子（すなわち、ＦＡＰ特異的結合ドメイン）との組み合わせであった（配列番号９９；ＳＭＡ０１４が得られる）。親分子としてのこの最初のフォーマットに基づいて、表３に要約されるように、いくつかの他の多機能性タンパク質フォーマットを生成した。
Figure 2023528207000003
表３中の「Ｃ」、「Ｆ」、及び「Ｈ」は、それぞれ、ＣＤ４０、ＦＡＰ、及びＨＳＡと特異的に結合するアンキリン反復ドメインを示す。表３に示される異なるドメインの順序は、タンパク質の分子構造におけるＮ末端からＣ末端までのドメインの実際の配列を反映する。全てのタンパク質は更に、Ｈｉｓタグ（配列番号４）を、Ｎ末端における精製を容易にするために有する。
材料及び方法
参照として、ＣＤ４０モノクローナル抗体を使用した。このＣＤ４０ ｍＡｂ（ＩｇＧ２ ｍＡｂ）のＣＤ４０への結合は、ＦＡＰとは無関係に抗原提示細胞の活性化をもたらす。抗ＣＤ４０ ｍＡｂは、米国特許出願第７，３３８，６６０Ｂ２号の配列２１．４．１に対応する。
ＣＨＯ細胞を、５％ＣＯ2で１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中において３７℃にて培養し、アキュターゼを用いて２～３日毎に分割して、細胞を分離した。
ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞株は、細胞表面にヒトＦＡＰを発現する安定にトランスフェクトされたクローン細胞株である。ヒトＦＡＰのＯＲＦのＧＦＰ融合を含むプラスミドは、ＯｒｉＧｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（＃ＲＧ２０４６９２）から入手した。ヒトＦＡＰ（ＧＦＰなし）をコードするｃＤＮＡは、標準的な分子生物学技術を使用してサブクローニングした。次いで、このプラスミドをＣＨＯ細胞にトランスフェクトして、リポフェクタミンを使用してヒトＦＡＰを過剰発現する安定したトランスフェクタントを生成した。異なる濃度のＧｅｎｅｔｉｃｉｎ Ｇ－４１８（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｖ８０９１）を使用して選択圧力をかけた。ＦＡＰの発現を、ＥＳＣ１１に対応する抗ＦＡＰ抗体を用いるフローサイトメトリーによって分析した（国際公開第２０１１／０４０９７２号）。条件１．９ｍｇ／ｍＬのＧ－４１８からのＦＡＰ－ＣＨＯトランスフェクタントの集団（ＦＡＰ－ＣＨＯ－１．９）はより低いＦＡＰ発現レベルを示し、条件１．７ｍｇ／ｍＬからの集団（ＦＡＰ－ＣＨＯ－１．７）はより高いＦＡＰ発現レベルを示した。この実施例におけるデータを、ＦＡＰ－ＣＨＯ－１．７を用いて産生した。
インビトロＢ細胞活性化アッセイ。インビトロＢ細胞活性化アッセイの設計を、図１に概略的に示す。バフィーコートはチューリッヒ献血センターから入手し、ＰＢＳで希釈した。次いで、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、Ｌｅｕｃｏｓｅｐチューブを使用した密度遠心分離によって単離した。数回の洗浄ステップ後、製造業者の推奨に従い、陽性選択（ヒトＣＤ１９ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓキット）を用いて、ＣＤ１９+Ｂ細胞をＰＢＭＣから濃縮した。１×１０5／ウェルのＣＤ１９+Ｂ細胞及び５×１０4細胞／ウェルのＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞又はＣＨＯ野生型（ＷＴ－ＣＨＯ）細胞を、示された分子の用量滴定（４００、２００、４０、８、５、１．６、０．３、０ｎＭ）と共に、６００μＭのＨＳＡを含む又は含まないＲＰＭＩ １６４０培地＋１０％ＦＢＳ中で一緒に９６ウェルプレートへと播種した。培養物を３７℃で５％のＣＯ２にて２４時間インキュベートし、ＣＤ２０+Ｂ細胞上のＣＤ８６及びＣＤ６９の上方制御を、ＡｔｔｕｎｅＮｘＴを用いたフローサイトメトリーによって評価した。
ＦＡＣＳ染色、フローサイトメーター設定、及び抗体希釈。細胞を、最初に１５０μＬのＰＢＳで洗浄し、次いでＰＢＳ中で希釈した（１：１００）１００μＬのＢＤヒトＦｃ－Ｂｌｏｃｋと共に室温（ＲＴ）で２０分間インキュベートした。Ｆｃブロッキングインキュベーション後、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中で希釈した１００μＬの直接標識抗体（希釈因子については以下の表５を参照）と共にインキュベートし、暗所で４℃にて更に２０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中で希釈した１００μＬのＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色（１：１０００）に再懸濁し、暗所で４℃にて２０分間インキュベートした。ＦＢＳ反応を含有するＦＡＣＳ緩衝液１００μＬを添加して、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色反応を停止させた。細胞を、ＰＢＳで再度洗浄し、製造業者の推奨に従って水中で希釈したＢＤ細胞固定溶液（１：１０）を用いて固定した。抗体の希釈及びＦＡＣＳ設定を以下の表４に概説する。ＦＡＣＳ機械の補償は、製造業者の推奨に従って補償ビーズにより行った（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ；ＡｂＣ（商標）Ｔｏｔａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ Ｂｅａｄ Ｋｉｔ）。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０．０．３）を用いて、Ｒａｗ＿ｆｃｓファイルを分析した。細胞を、Ｌｉｖｅ－Ｄｅａｄ識別色素を用いて生細胞でゲーティングした後、ＣＤ８６について図２に示すように、ＣＤ２０陽性細胞でゲーティングした。ＣＤ８６のＭＦＩ及び陽性細胞の割合をエクスポートし、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア、バージョン８．１．２を用いてプロットした。
Figure 2023528207000004
ＥＣ５０決定。ＥＣ５０値は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０２を使用して、ｌｏｇモードでｘ値（濃度）を変換し、ＥＣ５０値を決定するための可変勾配（３パラメータ）の方程式で非線形モードｌｏｇ（アゴニスト）対応答に適合させることによって決定した。
有効性決定。有効性値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン７．０２を用いて、最高濃度（４００ｎＭ）でのＭＦＩ値についての重複の平均を計算することによって決定した。
結果
本発明のＣＤ４０特異的結合タンパク質は、ローカライザと組み合わせて、ローカライザ依存性ＣＤ４０アゴニストを生成することができる。Ｆ－Ｃフォーマットの多機能性分子である、ＳＭＡ０１４を、インビトロヒトＢ細胞活性化アッセイにおいて試験した。図３、図４、及び図５に示されるように、ＣＤ４０特異的結合タンパク質（配列番号２９）と、ローカライザ（ＦＡＰ特異的結合ドメイン）とのこの組合せにより、厳密にローカライザ依存的（すなわち、ＦＡＰ依存的）な様式でヒトＢ細胞におけるＣＤ４０シグナル伝達を効果的に活性化した分子が得られた。ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞（ＦＡＰ－ＣＨＯ）の存在下でのみ、ＳＭＡ０１４は、Ｂ細胞におけるＣＤ４０シグナル伝達を効果的に活性化した（黒塗りで上向きの三角形の記号）。非ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞（ＷＴ－ＣＨＯ）の存在下では、ＳＭＡ０１４は、ＣＤ４０シグナル伝達に対して効果を有しなかった（白塗りで上向きの三角形の記号）。対照的に、かつ予想されるように、アゴニスト性抗ＣＤ４０ ｍＡｂは、ＦＡＰ発現とは無関係にヒトＢ細胞の活性化を誘導し、ＦＡＰ－ＣＨＯ細胞又はＷＴ－ＣＨＯ細胞のいずれかの存在下においてＢ細胞を活性化した。更に、ＳＭＡ０１４及び抗ＣＤ４０ ｍＡｂは、用量依存的様式でＣＤ８６を上方制御した。２つの独立した実験のＥＣ５０（効力）平均値及び最大ＭＦＩ（有効性）平均値を、ＦＡＰ－ＣＨＯについては表５及び表６に、ＷＴ－ＣＨＯについては表７にそれぞれ概説する。
要約すると、これらのデータは、本発明のＣＤ４０結合タンパク質をローカライザ分子と組み合わせて、厳密にローカライザ依存的な作用様式で有効なＣＤ４０アゴニストとして機能する多機能性分子を生成することができることを実証した。
ＨＳＡ結合ドメイン（複数可）はＣＤ４０ローカライザ結合タンパク質結合タンパク質（Ｆ－Ｃフォーマット）の効力及び有効性を損なう。ＣＤ４０及びローカライザ結合タンパク質ＳＭＡ０１４を、１つ（Ｈ－Ｆ－Ｃ、ＳＭＡ０８７）又は２つ（Ｈ－Ｆ－Ｃ－Ｈ、ＳＭＡ０９５）のＨＳＡ結合アンキリン反復ドメインを追加した追加フォーマットでクローニングし、これは、血清半減期延長部分を表す。これらの構築物をまた、インビトロＢ細胞活性化アッセイにおいて試験した。図３に示されるように、ＨＳＡ結合ドメイン（複数可）は、Ｆ－Ｃフォーマットにおける元の多機能性結合タンパク質の効力及び有効性の両方を損ない、障害のレベルは、結合タンパク質に付加されたＨＳＡ結合ドメインの数と相関した。重要なことに、阻害は、ヒト血清中のアルブミンの生理学的濃度を模倣する６００μＭのアルブミンの存在下においてより顕著であった。複合体ＨＳＡ結合剤／アルブミンは、ＣＤ４０結合ドメイン及び／又はローカライザの結合、したがって活性についての立体障害であり得ると仮定することはもっともらしい。ＨＳＡの非存在下及び存在下において、ＨＳＡ結合ドメインは、多機能性ＣＤ４０ローカライザ因子結合タンパク質のＦＡＰ特異的作用様式に影響を及ぼさなかった。２つの独立した実験のＥＣ５０（効力）平均値及び最大ＭＦＩ（有効性）平均値を、ＦＡＰ－ＣＨＯについては表５及び表６に、ＷＴ－ＣＨＯについては表７にそれぞれ概説する。
要約すると、半減期延長ＨＳＡ結合ドメイン（複数可）の付加は、ＣＤ４０ローカライザ結合タンパク質（Ｆ－Ｃフォーマット）の機能性を損ない、阻害は付加されたＨＳＡ結合ドメインの数と共に増加し、阻害は生理学的濃度のアルブミンの存在下においてより顕著であった。
ＣＤ４０の二価性は、効力及び有効性を増加させ、ＨＳＡ結合ドメインによって誘導される阻害効果を救済する。次いで、本出願人は、ＣＤ４０結合価が多機能性ＣＤ４０及びローカライザ結合分子の性能にどのように影響するかを調査した。ＳＭＡ０１４を、１つ（Ｆ－Ｃ－Ｃ、ＳＭＡ１０４）又は２つ（Ｆ－Ｃ－Ｃ－Ｃ、ＳＭＡ１０５）のＣＤ４０結合ドメインを付加する更に異なるフォーマットでクローニングし、インビトロＢ細胞活性化アッセイで試験した。図４に示すように、二価及び三価フォーマットはＣＤ８６のより強い上方制御を誘導し、このことは、結合価が分子の性能に有利に寄与することを示している。具体的には、ＣＤ４０二価性（ＳＭＡ１０４）は、ＦＡＰ発現ＣＨＯ細胞の存在下における分子の効力（２０倍）及び効力（２倍）を強く増大させた。ＣＤ４０三価（ＳＭＡ１０５）は、ＣＤ４０二価と比較して分子の効力をわずかに増加させただけであり、効力に更なる影響を及ぼさなかった。ＦＡＰの非存在下では、二価ＣＤ４０フォーマット（ＳＭＡ１０４）はヒトＢ細胞上のＣＤ８６の上方制御を誘導しなかったが、三価ＣＤ４０フォーマット（ＳＭＡ１０５）は、ＦＡＰの非存在下でもわずかな活性化を最高濃度で示し、三価ＣＤ４０結合剤によって誘導されるＦＡＰ非依存的活性化の可能性を示唆した。これらの結果を考慮すると、二価ＣＤ４０フォーマットは好ましいフォーマットを表す。特に、本出願人は、ＣＤ４０二価がＨＳＡ結合ドメインの阻害効果を救済することができるかどうかを試験した。この問題に対処するために、二価ＣＤ４０構築物ＳＭＡ１０４を、異なる位置において追加のＨＳＡ結合ドメイン（複数可）と共にクローニングした（クローンＳＭＡ０９１、ＳＭＡ０９９、及びＡＳ５７９；これらのドメインフォーマットの情報については上記の表３を参照されたい）。全ての試験したフォーマットは、ＳＭＡ０１４と比較して改善された効力及び有効性を示した（図５Ａ）。重要なことに、ＨＳＡの存在下におけるより生理学的な条件においては、ＨＳＡ結合ドメインを有する全てのフォーマットの活性は低下したが、ＳＭＡ０９１は、ＳＭＡ０１４と比較して依然として改善された活性を示した（図５Ｂ）。多機能性結合タンパク質はいずれも、最高濃度のＦＡＰの非存在下においてさえもＢ細胞上のＣＤ８６の発現を増強しなかった（図５Ａ及び図５Ｂ）。予想されるように、アゴニスト性抗ＣＤ４０ ｍＡｂは、ＦＡＰ発現とは無関係にヒトＢ細胞の活性化を誘導し、ＦＡＰ－ＣＨＯ又はＷＴ－ＣＨＯのいずれかによりＢ細胞を活性化した。２つの独立した実験のＥＣ５０（効力）平均値及び最大ＭＦＩ（有効性）平均値を、ＦＡＰ－ＣＨＯについては表５及び表６に、ＷＴ－ＣＨＯについては表７にそれぞれ概説する。
Figure 2023528207000005
Figure 2023528207000006
Figure 2023528207000007
結論：これらのデータは、本発明のＣＤ４０結合タンパク質をローカライザ分子と組み合わせて、厳密にローカライザ依存的な作用様式で有効なＣＤ４０アゴニストとして機能する多機能性分子を生成することができることを実証した。Ｆ－Ｃフォーマットの多機能性ＣＤ４０及びローカライザ（ＦＡＰ）結合タンパク質は、機能的細胞アッセイにおける良好な生物学的活性、及び良好な物理的特性を示した。しかしながら、この結合タンパク質は、その臨床開発を可能にするために半減期延長ドメインを必要とし得る。したがって、異なるフォーマットを分析して、半減期延長ＨＳＡ結合ドメインの数及び位置が分子の活性に影響を及ぼすかどうか、及びどのように影響を及ぼすかを決定した。半減期延長ドメインは分子の活性に有害な影響を及ぼし、この影響は、半延長ドメインの数及びＨＳＡの存在と共に増加することが観察された。更に、驚くべきことに、（２つのＣＤ４０結合ドメインを有することによる）ＣＤ４０二価は、結合タンパク質の効力（２０倍）及び有効性（２倍）を強く増加させ、かつストリンジェントなＦＡＰ特異的作用機序を維持したが、（３つのＣＤ４０結合ドメインを有することによる）ＣＤ４０三価は、ＣＤ４０二価と比較して効力をほんのわずかしか増加させず、有効性に更なる影響を示さなかったことが見出された。加えて、三価ＣＤ４０結合タンパク質は、ＦＡＰの非存在下においてもまた、わずかな活性化を最高濃度で示し、ＦＡＰ特異的な作用様式の部分的喪失を示唆した。ＣＤ４０二価は、結合タンパク質の効力及び有効性を増加させることによって、１つの半減期延長ドメインの阻害効果を救済することができることが更に見出された。具体的には、生理学的濃度のＨＳＡにおいて、Ｈ－Ｆ－Ｃ－Ｃフォーマットの結合タンパク質は、Ｆ－Ｃフォーマットの結合タンパク質に匹敵する活性及びＦＡＰ特異性を保持した。結論として、第２のＣＤ４０結合ドメインを付加することによって、本発明者らは、ＨＳＡ結合半減期延長ドメインの有害な影響を防止し、かつＦ－Ｃフォーマットの親結合タンパク質と同様の機能的特性を有するが、臨床開発を促進する半減期延長ドメインを備えた分子を産生することができた。
実施例４： ＣＤ４０特異的結合タンパク質が結合したヒト腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー５（ｈＣＤ４０）の複合体のＸ線構造解析
この研究の目的は、Ｘ線結晶学を用いて本発明のＣＤ４０特異的結合タンパク質によって結合された、組換えｈＣＤ４０の複合体を産生及び分析することであった。この構造分析に用いたＣＤ４０特異的結合タンパク質は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃２９（配列番号２９）であった。
材料及び方法
タンパク質生成。ｈＣＤ４０を、グリコシル化を阻止するためにツニカマイシンの存在下においてＨｉ５細胞中で発現させた。培養上清からのタンパク質を、ＨＩＳ－Ｔｒａｐ、ＴＨＢ消化物、陰性ＨＩＳ－Ｔｒａｐ、及びＳＥＣによって精製した。精製したｈＣＤ４０を、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９と１：１．２の比で混合した。過剰なＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を、ｈＣＤ４０：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中でＳＥＣを介してＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９複合体から除去した。試料を濃縮して３６．７ｍｇ／ｍＬを得た。この手順により、クーマシー染色ＳＤＳ－ＰＡＧＥから判断して９５％を超える純度を有する均質なタンパク質が得られた。
結晶化。精製されたタンパク質は、およそ１２００の異なる条件を有する標準的なスクリーニングと、文献データを用いて同定された結晶化条件との両方を採用した結晶化試験で使用された。最初に得られた条件は、標準的な戦略、温度などの結晶化に重大な影響を及ぼす全身的に変化するパラメータ、タンパク質濃度、及び滴下比などを用いて最適化された。これらの条件はまた、ｐＨ又は沈殿剤濃度を体系的に変化させることによって精密化した。
最終結晶化条件：
３０ｗ／ｖ％ ＰＥＧ ４Ｋ
０．２４Ｍ ＬｉＳＯ４
０．１ＭトリスｐＨ＝８．５０
０．３５Ｍ ＮａＢｒ
データ収集及びプロセス。結晶を急速凍結し、１００Ｋの温度で測定した。Ｘ線回折データは、極低温条件を用いてＳＷＩＳＳ ＬＩＧＨＴ ＳＯＵＲＣＥ （ＳＬＳ、Ｖｉｌｌｉｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にてリガンドＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９に結合したｈＣＤ４０の複合結晶から収集した。結晶は空間群Ｃ２に属する。データは、ａｕｔｏＰＲＯＣ、ＸＤＳ及びａｕｔｏＰＲＯＣ、ＡＩＭＬＥＳＳというプログラムを用いて処理した。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９のデータ収集及び処理統計を以下の表８に列挙する。
Figure 2023528207000008
構造モデリング及び精密化。構造の決定及び分析に必要な相情報は分子置換によって得た。ｈＣＤ４０の以前に解明された構造を検索モデルとして使用した。その後のモデル構築及び精密化を、それぞれ、ＣＯＯＴ及びソフトウェアパッケージＣＣＰ４を用いた標準プロトコルに従って実施した。最終モデルの正確さを交差検証するための尺度である自由Ｒ因子の計算のために、測定された反射の約４．９％が、精密化手順から除外された（以下の表９を参照されたい）。ＴＬＳ精密化（ＲＥＦＭＡＣ５、ＣＣｐ４を使用）を行ったところ、より低いＲ因子及びより高い品質の電子密度マップが得られた。自動的に産生された局所のＮＣＳ制約を適用した（新規のＲＥＦＭＡＣ５バージョンのキーワード「ｎｃｓｒ局所」）。リガンドのパラメータ化及び対応ライブラリーファイルの産生は、ＧＲＡＤＥ（Ｇｌｏｂａｌ Ｐｈａｓｉｎｇ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いて行った。ＲＥＦＭＡＣ５を用いて３．０で合わせたＦo－Ｆcマップのピークに水分子を入れ、ＣＯＯＴの検証ツールを用いて全ての水を確認することによって、ＣＯＯＴの「Ｆｉｎｄ ｗａｔｅｒｓ」アルゴリズムを用いて水モデルを構築した。疑われる水のリストについての基準は以下のとおりであった：８０Å2より大きいＢ因子、１．２σ未満である２Ｆo－Ｆcマップ、２．３Å未満である最も近い接触までの距離、又は３．５Ａを超える最も近い接触までの距離。疑われる水分子及びリガンド結合部位内の水分子（リガンドまでの距離が１０Å未満）を手動で確認した。最終モデルのラマチャンドランプロットは、最も好ましい領域では全残基の９２．２％、追加で許容される領域では７．８％、許容される領域では０．０％を示す。許容されない領域に残基は見られない（表９）。最終構造及び精密化プロセスの統計を以下の表９に列挙する。
Figure 2023528207000009
結果
構造を解明し、最終分解能２．２９Åまで精密化した。Ｘ線結晶学を用いた構造分析により、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９がＣＤ４０受容体のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）１（アミノ酸２３～５９）に結合したことと、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）の結合部位とは反対の片側でＣＤ４０受容体に結合したこととが明らかになり、ＤＡＲＰｉｎタンパク質とＣＤ４０Ｌとの間の直接結合部位競合がないことが示された（図６Ａ及び図６Ｂ）。ＣＤ４０受容体のＣＲＤ１ドメインは、細胞膜から離れて位置する。
強力なＣＤ４０アゴニスト抗体がＣＤ４０受容体の膜遠位エピトープに結合することが報告されている（Ｙｕら、「Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ」第３３巻第６６４～６７５頁、ｅ６６４（２０１８年））。同様に、この実施例に記載されるＸ線結晶学研究は、本発明のＣＤ４０特異的結合タンパク質が、細胞膜から離れたＣＤ４０受容体のＣＲＤ１と相互作用することを示した。ＣＤ４０アゴニスト抗体について既に示唆されているように、より多くの細胞膜－遠位のエピトープは、立体障害がより少なく、ローカライザ分子及びより効率的なクラスタリングを含む本発明のＣＤ４０特異的結合タンパク質へのより良好なアクセスを可能にし、その結果、ＣＤ４０受容体のより効率的な活性化を可能にし得る。更に、本発明のＣＤ４０特異的結合タンパク質とＣＲＤ１との間の相互作用領域は、ＣＤ４０Ｌの結合部位と反対であることが示され、これは、本発明の結合タンパク質とＣＤ４０Ｌとの間に直接の結合競合が存在しないことを示唆した。ＣＤ４０Ｌについて競合しない化合物は、リガンドと相加的又は相乗的な効果を有してもよく、受容体のより良好な活性化をもたらし得る（例えば、Ｙｕら、同所；Ｃｈａｌｌａら、「Ａｌｌｅｒｇｙ」第５４巻第５７６～５８３頁（１９９９年）；Ｐｏｕｎｄら、「Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ」第１１巻第１１～２０頁（１９９９年））。
本明細書は、明細書内で引用された参考文献の教示に照らして最も十分に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提供し、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明に包含されることを容易に認識する。本開示で引用された全ての刊行物、特許、及びＧｅｎＢａｎｋ配列は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。参照により組み込まれる資料が本明細書と矛盾するか、又は一致しない限り、本明細書は、任意のそのような資料に優先する。本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができる。そのような等価物は、以下の実施形態によって包含されることが意図される。

Claims (20)

  1. アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記アンキリン反復ドメインは、ＣＤ４０に対して結合特異性を有し、前記アンキリン反復ドメインは、（１）配列番号３９～９５、及び（２）配列番号３９～９５のうちいずれかにおける１０個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、アンキリン反復モジュールを含む、組換え結合タンパク質。
  2. 前記アンキリン反復モジュールが、（１）配列番号７６、７７、及び７８、並びに（２）配列番号７６、７７、及び７８のうちいずれかにおける１０個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の結合タンパク質。
  3. 前記アンキリン反復モジュールが、第１のアンキリン反復モジュールであり、かつ（１）配列番号７６、及び（２）配列番号７６における１０個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記アンキリン反復ドメインが、（ｉ）（１）配列番号７７、及び（２）配列番号７７における１０個までのアミノ酸が他のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２のアンキリン反復モジュールと、（ｉｉ）（１）配列番号７８、
    及び（２）配列番号７８における１０個までのアミノ酸が他のアミノ酸により置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第３のアンキリン反復モジュールと、を更に含む、請求項１又は２に記載の結合タンパク質。
  4. 前記第１のアンキリン反復モジュールが、前記第２のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置し、前記第２のアンキリン反復モジュールが、前記アンキリン反復ドメイン内の前記第３のアンキリン反復モジュールのＮ末端に位置する、請求項３に記載の結合タンパク質。
  5. 前記アンキリン反復ドメインが、Ｎ末端キャッピングモジュールを更に含み、前記Ｎ末端キャッピングモジュールが、（１）配列番号５～８、及び（２）配列番号５～７のうちいずれかにおける１０個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
  6. 前記アンキリン反復ドメインが、Ｃ末端キャッピングモジュールを更に含み、前記Ｃ末端キャッピングモジュールが、（１）配列番号１２～１５、及び（２）配列番号１２～１４のうちいずれかにおける１０個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
  7. アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質であって、前記アンキリン反復ドメインが、ＣＤ４０に対して結合特異性を有し、前記アンキリン反復ドメインが、配列番号１６～３５のいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１６～３５の１位のＧ及び／又は２位のＳが、任意選択的に欠落している、組換え結合タンパク質。
  8. 前記アンキリン反復ドメインが、配列番号２９と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記アンキリン反復ドメインの１位のＧ及び／又は２位のＳが、任意選択的に欠落している、請求項７に記載の結合タンパク質。
  9. 前記アンキリン反復ドメインが、配列番号２９のアミノ酸配列を含み、前記アンキリン反復ドメインの１位のＧ及び／又は２位のＳが、任意選択的に欠落している、請求項７に記載の結合タンパク質。
  10. 前記アンキリン反復ドメインが、１０-7Ｍ未満の解離定数（ＫD）でＰＢＳ中のヒトＣＤ４０に結合する、請求項１～９のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
  11. 前記アンキリン反復ドメインが、ＣＤ４０受容体のＮ末端システインリッチドメイン１（ＣＲＤ１）（配列番号９６のアミノ酸２３～５９）に特異的に結合する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
  12. 前記結合タンパク質が、ＣＤ４０に対する結合特異性を有する第２のアンキリン反復ドメインを更に含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
  13. 前記第２のアンキリン反復ドメインが、ＣＤ４０受容体のＮ末端ＣＲＤ１（配列番号９６のアミノ酸２３～５９）に特異的に結合する、請求項１２に記載の結合タンパク質。
  14. 前記結合タンパク質が、ローカライザ分子を更に含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の結合タンパク質。
  15. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の結合タンパク質、又は請求項１～１４のいずれか一項に記載のアンキリン反復ドメインをコードする核酸。
  16. 請求項１～１４のいずれか一項に記載の結合タンパク質又は請求項１５に記載の核酸、並びに任意選択的に、薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を含む、医薬組成物。
  17. ヒトを含む哺乳動物におけるＣＤ４０発現細胞中のＣＤ４０の局所的活性化の方法であって、請求項１～１４のいずれか一項に記載の結合タンパク質又は請求項１５に記載の核酸を、前記哺乳動物へと投与する工程を含む、方法。
  18. 前記ＣＤ４０発現細胞が、腫瘍中に位置する、請求項１７に記載の方法。
  19. 医学的状態を処置する方法であって、医学的状態を処置することを必要とする患者へと、治療有効量の請求項１～１４のいずれか一項に記載の結合タンパク質、請求項１５に記載の核酸、又は請求項１６に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
  20. 前記医学的状態が、癌である、請求項１９に記載の方法。
JP2022568692A 2020-05-14 2021-05-14 組換えｃｄ４０結合タンパク質及びそれらの使用 Pending JP2023528207A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP20174830.8 2020-05-14
EP20174830 2020-05-14
PCT/EP2021/062874 WO2021229076A1 (en) 2020-05-14 2021-05-14 Recombinant cd40 binding proteins and their use

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2023528207A true JP2023528207A (ja) 2023-07-04
JPWO2021229076A5 JPWO2021229076A5 (ja) 2024-05-09

Family

ID=70738293

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2022568692A Pending JP2023528207A (ja) 2020-05-14 2021-05-14 組換えｃｄ４０結合タンパク質及びそれらの使用

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP4149960A1 (ja)
JP (1) JP2023528207A (ja)
CN (1) CN115996945A (ja)
AU (1) AU2021271131A1 (ja)
CA (1) CA3178478A1 (ja)
WO (1) WO2021229076A1 (ja)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220113492A (ko) 2019-12-11 2022-08-12 몰리큘라 파트너스 아게 변경된 표면 잔기를 갖는 설계된 안키린 반복 도메인
EP3957649A1 (en) 2020-08-18 2022-02-23 Athebio AG Improved n-terminal capping modules of ankyrin repeat domains
BR112023018293A2 (pt) 2021-03-09 2023-10-31 Molecular Partners Ag Acopladores de célula t multiespecíficos à base de darpin
WO2023021050A1 (en) * 2021-08-17 2023-02-23 Athebio Ag Variants of ankyrin repeat domains
EP4137508A1 (en) * 2021-08-17 2023-02-22 Athebio AG Variants of ankyrin repeat domains

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1332209B1 (en) 2000-09-08 2009-11-11 Universität Zürich Collections of repeat proteins comprising repeat modules
AR039067A1 (es) 2001-11-09 2005-02-09 Pfizer Prod Inc Anticuerpos para cd40
JP2010539915A (ja) 2007-09-24 2010-12-24 ユニバーシティ・オブ・チューリッヒ 設計されたアルマジロリピートタンパク質
CA2776037A1 (en) 2009-10-02 2011-04-07 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd Anti-fibroblast activation protein antibodies and methods and uses thereof
PL2643349T3 (pl) * 2010-11-26 2020-03-31 Molecular Partners Ag Zaprojektowane białka z powtórzeniami wiążące się z albuminą surowicy
US11453708B2 (en) * 2013-05-31 2022-09-27 Molecular Partners Ag Designed ankyrin repeat proteins binding to hepatocyte growth factor
KR102427117B1 (ko) 2015-04-02 2022-07-29 몰리큘라 파트너스 아게 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인
MX2019003298A (es) * 2016-09-22 2019-09-26 Molecular Partners Ag Proteinas de union recombinantes y sus usos.

Also Published As

Publication number Publication date
EP4149960A1 (en) 2023-03-22
WO2021229076A1 (en) 2021-11-18
AU2021271131A1 (en) 2022-12-15
CN115996945A (zh) 2023-04-21
CA3178478A1 (en) 2021-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2023528207A (ja) 組換えｃｄ４０結合タンパク質及びそれらの使用
CA2892747C (en) Binding proteins comprising at least two repeat domains against her2.
JP6976335B2 (ja) 組み換え結合タンパク質及びその使用
EP3253795B1 (en) Novel binding proteins comprising a ubiquitin mutein and antibodies or antibody fragments
US20180194819A1 (en) Novel binding proteins based on di-ubiquitin muteins and methods for generation
US20220242973A1 (en) Recombinant fap binding proteins and their use
WO2017013129A1 (en) Her2 binding proteins based on di-ubiquitin muteins
WO2016124702A1 (en) Novel egfr binding proteins
US20220298212A1 (en) Recombinant 4-1bb binding proteins and their use
KR20230169182A (ko) 신규한 DARPin 기반 CD70 인게이저
JP2024509241A (ja) 新規のＤＡＲＰｉｎに基づくＣＤ１２３エンゲージャ
JP2024508969A (ja) 新規のＤＡＲＰｉｎに基づくＣＤ３３エンゲージャ
RU2778346C2 (ru) Рекомбинантные связывающие белки и их применение
EP3325515B1 (en) Novel binding proteins based on di-ubiquitin muteins and methods for generation

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240425

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20240425