TW202208404A

TW202208404A - 新穎錨蛋白重複結合蛋白質及其用途

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Publication number: TW202208404A
Application number: TW110116428A
Authority: TW
Inventors: 派翠克阿姆斯圖茲; 瓦萊麗Ｐ卡拉柏; 馬塞爾瓦爾澤
Original assignee: 瑞士商分子組合公司
Priority date: 2020-05-06
Filing date: 2021-05-06
Publication date: 2022-03-01
Also published as: WO2021224686A1; AU2021267411A1; CN115916815A; CR20220618A; US20210347835A1; PE20231074A1; IL297940A; CO2022016595A2; KR20230006558A; MX2022013945A; US20220235103A1; JP2023525518A; US11466062B2; CL2022003044A1; EP4146691A1; BR112022022456A2; CA3176845A1

Abstract

本發明係關於包含一或多個對冠狀病毒棘蛋白具有結合特異性之經設計錨蛋白重複域的重組結合蛋白質、編碼此類蛋白質之核酸、包含此類蛋白質或核酸之醫藥組成物、及此類蛋白質、核酸、或醫藥組成物在治療冠狀病毒疾病(特別是由SARS-CoV-2造成之疾病)中之用途。

Description

新穎錨蛋白重複結合蛋白質及其用途

發明領域

發明背景

冠狀病毒科(Coronaviridae )具有28至32 kb之正股RNA基因體，是最大的套膜RNA病毒。冠狀病毒會感染許多不同的哺乳動物及鳥類物種。其等係導致呼吸系統、肝系統、胃腸系統、及神經系統之各種急性及慢性疾病的原因。普通感冒是冠狀病毒感染之輕度形式的一個實例。2003年SARS爆發及2012年MERS爆發皆是由冠狀病毒造成。SARS-CoV-2(亦稱為2019-nCoV)是造成COVID-19的病毒株。

冠狀病毒具有四種結構蛋白，稱為棘蛋白、套膜蛋白、膜蛋白、及核殼蛋白。棘蛋白是負責細胞進入的病毒膜蛋白。

冠狀病毒利用密集醣基化的棘蛋白以進入宿主細胞。棘蛋白係由三個次單元所組成，且是一種以亞穩定融合前構型(prefusion conformation)存在之三聚體I類融合蛋白，其經歷大量結構重排以將病毒膜與宿主細胞膜融合。此程序在S1次單元結合至宿主細胞受體時被觸發。受體結合會使融合前三聚體去穩定化，導致S1次單元脫落且S2次單元轉變為穩定的融合後構型。為了接合宿主細胞受體，S1之受體結合域(RBD)經歷類鉸鏈的構型移動，其暫時隱藏或暴露受體結合之決定位。這兩種狀態稱為「向下(down)」構型及「向上(up)」構型，其中向下對應於受體不可接近狀態，且向上對應於受體可接近狀態且被認為是較不穩定的。一旦棘蛋白呈「向上」構型，可發生與宿主細胞中血管收縮素轉化酶2 (ACE2)受體之結合，從而使病毒進入細胞中。將棘蛋白「活化」為「向上」構型可藉由諸如弗林蛋白酶(furin)或TMPRSS2之酶進行，酶藉由打開棘蛋白而發揮作用，使核殼蛋白離開病毒殼體並進入細胞中，從而導致感染。

一旦細胞受到冠狀病毒感染，治療選項變得更加困難，因為免疫系統(或治療劑)必須只靶向受到病毒感染的細胞，而不傷害未受感染的細胞。因為棘蛋白不可或缺的功能，其代表抗體介導之中和的目標。因此，冠狀病毒療法的一種方式是藉由中和棘蛋白來抑制病毒與細胞結合，從而防止細胞感染。

DARPin®蛋白質係經基因工程改造之錨蛋白重複蛋白，其可發揮類似抗體模擬蛋白質之功能，一般展現出高特異性且高親和力之目標結合。DARPin®蛋白質包含一或多個經設計錨蛋白重複域。經設計錨蛋白重複域係衍生自天然錨蛋白重複蛋白，且各個經設計錨蛋白重複域一般以高特異性及親和力結合目標蛋白。由於其高特異性、穩定性、效價、及親和力，且由於其在格式化以產生單、雙、或多特異性蛋白質上之靈活性，DARPin®蛋白質對廣泛各種臨床應用而言是具有吸引力之治療劑。例如，WO 2011/135067描述DARPin®蛋白質用於治療癌症及包括眼病之其他病理病況，諸如年齡相關性黃斑變性。DARPin®係Molecular Partners AG所擁有之註冊商標。

本發明之基本技術問題係識別出新穎的重組結合蛋白質，其包含一或多個對冠狀病毒(較佳地SARS-CoV-2)具有結合特異性之經設計錨蛋白重複域。此類重組結合蛋白質可用於抑制冠狀病毒與細胞結合及用於防止病毒感染細胞。此類重組結合蛋白質及包含此類蛋白質之醫藥組成物可進一步用於預防、治療、或診斷冠狀病毒疾病(諸如由SARS-CoV-2造成之冠狀病毒疾病)之方法及/或用於偵測冠狀病毒(較佳地SARS-CoV-2)之方法。

發明概要

基於本文提供之揭露，所屬技術領域中具有通常知識者將認可或僅使用例行實驗即可確定本文所述之本發明之具體實施例的許多等效物。以下實施例(E)意欲涵蓋此類等效物。 1. 在第一實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含第一錨蛋白重複域，其中第一錨蛋白重複域包含與選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組的錨蛋白重複域具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。 2. 在第二實施例中，本發明係關於根據實施例1之重組結合蛋白質，其中第一錨蛋白重複域包含與選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組的錨蛋白重複域具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。 3. 在第三實施例中，本發明係關於根據實施例1之重組結合蛋白質，其中第一錨蛋白重複域係選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組。 4. 在第四實施例中，本發明係關於根據實施例1至3中任一者之重組結合蛋白質，其進一步包含第二錨蛋白重複域，其中第二錨蛋白重複域包含與選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組的錨蛋白重複域具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。 5. 在第五實施例中，本發明係關於根據實施例4之重組結合蛋白質，其中第二錨蛋白重複域包含與選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組的錨蛋白重複域具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。 6. 在第六實施例中，本發明係關於根據實施例4之重組結合蛋白質，其中第二錨蛋白重複域係選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組。 7. 在第七實施例中，本發明係關於根據實施例4至6中任一者之重組結合蛋白質，其進一步包含第三錨蛋白重複域，其中第三錨蛋白重複域包含與選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組的錨蛋白重複域具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。 8. 在第八實施例中，本發明係關於根據實施例7之重組結合蛋白質，其中第三錨蛋白重複域包含與選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組的錨蛋白重複域具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。 9. 在第九實施例中，本發明係關於根據實施例7之重組結合蛋白質，其中第三錨蛋白重複域係選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組。 10. 在第十實施例中，本發明係關於根據實施例7之重組結合蛋白質，其中第一、第二、及第三錨蛋白重複域包含胺基酸序列且自N端至C端係排列如下： (i)與SEQ ID NO 6、1、及3具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (ii)與SEQ ID NO 4、2、及1具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (iii)與SEQ ID NO 4、6、及3具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (iv)與SEQ ID NO 6、3、及6具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (v)與SEQ ID NO 7、3、及6具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (vi)與SEQ ID NO 8、4、及1具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (vii)與SEQ ID NO 3、6、及7具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (viii)與SEQ ID NO 4、1、及8具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (ix)與SEQ ID NO 3、6、及9具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (x)與SEQ ID NO 9、3、及6具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xi)與SEQ ID NO 1、6、及9具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xii)與SEQ ID NO 9、6、及1具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xiii)與SEQ ID NO 6、9、及10具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xiv)與SEQ ID NO 3、9、及11具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xv)與SEQ ID NO 10、9、及6具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xvi)與SEQ ID NO 11、9、及3具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xvii)與SEQ ID NO 5、1、及3具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xviii)與SEQ ID NO 1、2、及5具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xix)與SEQ ID NO 3、5、及6具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xx)與SEQ ID NO 6、3、及5具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxi)與SEQ ID NO 7、3、及5具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxii)與SEQ ID NO 8、5、及6具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxiii)與SEQ ID NO 6、10、及11具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxiv)與SEQ ID NO 3、10、及10具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxv)與SEQ ID NO 5、6、及9具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxvi)與SEQ ID NO 9、3、及5具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxvii)與SEQ ID NO 9、6、及5具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxviii)與SEQ ID NO 5、9、及10具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxix)與SEQ ID NO 6、9、及11具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxx)與SEQ ID NO 10、9、及5具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxxi)與SEQ ID NO 11、9、及6具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxxii)與SEQ ID NO 3、76、及77具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列；或(xxxiii)與SEQ ID NO 3、85、及77具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。 10a. 在實施例10a中，本發明係關於根據實施例10 (xx)之重組結合蛋白質。 10b. 在實施例10b中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 68具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。 10c. 在實施例10c中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 68具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。 10d. 在實施例10d中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列。 10e. 在實施例10e中，本發明係關於根據實施例10 (xxvii)之重組結合蛋白質。 10f. 在實施例10f中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 69具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。 10g. 在實施例10g中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 69具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。 10h. 在實施例10h中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列。 10i. 在實施例10i中，本發明係關於根據實施例10 (xxxii)之重組結合蛋白質。 10j. 在實施例10j中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 79具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。 10k. 在實施例10k中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 79具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。 10l. 在實施例10I中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有SEQ ID NO: 79之胺基酸序列。 10m. 在實施例10m中，本發明係關於根據實施例10 (xxxiii)之重組結合蛋白質。 10n. 在實施例10n中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與選自由SEQ ID NO: 89至91所組成之群組的序列具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。 10o. 在實施例10o中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與選自由SEQ ID NO: 89至91所組成之群組的序列具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。 10p. 在實施例10p中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有選自由SEQ ID NO: 89至91所組成之群組的胺基酸序列。 11. 在第十一實施例中，本發明係關於根據實施例1至10p中任一者之重組結合蛋白質，其中結合蛋白質結合至冠狀病毒棘蛋白。 12. 在第十二實施例中，本發明係關於根據實施例11之重組結合蛋白質，其中棘蛋白係SARS-CoV-2棘蛋白。 13. 在第十三實施例中，本發明係關於根據實施例11及12中任一者之重組結合蛋白質，其中第一、第二、及/或第三錨蛋白重複域以約100 nM或更低之解離常數(K_D )結合冠狀病毒棘蛋白。 14. 在十四實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含至少一個錨蛋白重複域，其中錨蛋白重複域以約100 nM或更低之解離常數(K_D )結合冠狀病毒棘蛋白。 15. 在十五實施例中，本發明係關於根據任何前述實施例之重組結合蛋白質，其進一步包含至少一個血清白蛋白結合域。 16. 在十六實施例中，本發明係關於根據實施例15之重組結合蛋白質，其中血清白蛋白結合域包含與選自由SEQ ID NO: 47至49所組成之群組的序列具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。 16a. 在實施例16a中，本發明係關於根據實施例15及16中任一者之重組結合蛋白質，其中重組結合蛋白質在小鼠中具有至少約30小時、較佳地至少約35小時、至少約40小時、或至少約45小時之終末半衰期(terminal half-life)。 17. 在第十七實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與選自由SEQ ID NO: 12至42、75、84、87、及88所組成之群組的序列具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。 17a. 在實施例17a中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 31具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。 17b. 在實施例17b中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 39具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。 17c. 在實施例17c中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 75具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。 17d. 在實施例17d中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 84具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。 17e. 在實施例17e中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 87具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。 17f. 在實施例17f中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 88具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。 18. 在第十八實施例中，本發明係關於根據實施例17之重組結合蛋白質，其中多肽具有與選自由SEQ ID NO: 12至42、75、84、87、及88所組成之群組的序列具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。 18a. 在實施例18a中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 31具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。 18b. 在實施例18b中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 39具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。 18c. 在實施例18c中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 75具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。 18d. 在實施例18d中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 84具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。 18e. 在實施例18e中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 87具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。 18f. 在實施例18f中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 88具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。 19. 在第十九實施例中，本發明係關於根據實施例17之重組結合蛋白質，其中多肽具有選自由SEQ ID NO: 12至42、75、84、87、及88所組成之群組的胺基酸序列。 19a. 在實施例19a中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。 19b. 在實施例19b中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有SEQ ID NO: 39之胺基酸序列。 19c. 在實施例19c中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有SEQ ID NO: 75之胺基酸序列。 19d. 在實施例19d中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有SEQ ID NO: 84之胺基酸序列。 19e. 在實施例19e中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有SEQ ID NO: 87之胺基酸序列。 19f. 在實施例19f中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有SEQ ID NO: 88之胺基酸序列。 20. 在第二十實施例中，本發明係關於根據實施例17至19f中任一者之重組結合蛋白質，其中結合蛋白質結合至冠狀病毒棘蛋白。 21. 在第二十一實施例中，本發明係關於根據實施例20之重組結合蛋白質，其中棘蛋白係SARS-CoV-2棘蛋白。 22. 在第二十二實施例中，本發明係關於根據實施例20及21中任一者之重組結合蛋白質，其中結合蛋白以約100 nM或更低之解離常數(K_D )結合冠狀病毒棘蛋白。 23. 在第二十三實施例中，本發明係關於根據實施例1至22中任一者之重組結合蛋白質，其中結合蛋白質能夠抑制由冠狀病毒所致之細胞感染。 24. 在第二十四實施例中，本發明係關於根據實施例1至22中任一者之重組結合蛋白質，其中結合蛋白質能夠抑制由SARS-CoV-2所致之細胞感染。 25. 在第二十五實施例中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據實施例1至24中任一者之重組結合蛋白質。 25a. 在實施例25a中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 70或編碼與SEQ ID NO 70相同之胺基酸序列的其變體。 25b. 在實施例25b中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 71或編碼與SEQ ID NO 71相同之胺基酸序列的其變體。 25c. 在實施例25c中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 72或編碼與SEQ ID NO 72相同之胺基酸序列的其變體。 25d. 在實施例25d中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 73或編碼與SEQ ID NO 73相同之胺基酸序列的其變體。 25e. 在實施例25e中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 74或編碼與SEQ ID NO 74相同之胺基酸序列的其變體。 25f. 在實施例25f中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 80或編碼與SEQ ID NO 80相同之胺基酸序列的其變體。 25g. 在實施例25g中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 81或編碼與SEQ ID NO 81相同之胺基酸序列的其變體。 25h. 在實施例25h中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 82或編碼與SEQ ID NO 82相同之胺基酸序列的其變體。 25i. 在實施例25i中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 83或編碼與SEQ ID NO 83相同之胺基酸序列的其變體。 25j. 在實施例25j中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 78或編碼與SEQ ID NO 78相同之胺基酸序列的其變體。 25k. 在實施例25k中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 86或編碼與SEQ ID NO 86相同之胺基酸序列的其變體。 25l. 在實施例25I中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 92或編碼與SEQ ID NO 92相同之胺基酸序列的其變體。 25m. 在實施例25m中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 93或編碼與SEQ ID NO 93相同之胺基酸序列的其變體。 25n. 在實施例25n中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 94或編碼與SEQ ID NO 94相同之胺基酸序列的其變體。 25o. 在實施例25o中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 95或編碼與SEQ ID NO 95相同之胺基酸序列的其變體。 26. 在第二十六實施例中，本發明係關於一種宿主細胞，其包含實施例25至25o中任一者之核酸分子。 27. 在第二十七實施例中，本發明係關於一種製造根據實施例1至24中任一者之重組結合蛋白質的方法，其包含在使重組結合蛋白質表現之條件下培養實施例26之宿主細胞。 28. 在第二十八實施例中，本發明係關於一種醫藥組成物，其包含實施例1至24中任一者之結合蛋白質或實施例25至25o中任一者之核酸、及醫藥上可接受之載劑或賦形劑。 29. 在第二十九實施例中，本發明係關於一種治療對象之冠狀病毒感染的方法，該方法包含以下步驟：向有需要之對象投予有效量的至少一種根據實施例1至24中任一者之結合蛋白質、或實施例25至25o中任一者之核酸、或根據實施例28之醫藥組成物。 29a. 在實施例29a中，本發明係關於根據實施例29之治療方法，其中該方法係治療性治療方法。 29b. 在實施例29b中，本發明係關於根據實施例29之治療方法，其中該方法係疾病預防性治療方法。 29c. 在實施例29c中，本發明係關於一種預防對象之冠狀病毒感染的方法，該方法包含以下步驟：向有需要之對象投予有效量的至少一種根據實施例1至24中任一者之結合蛋白質、或實施例25至25o中任一者之核酸、或根據實施例28之醫藥組成物。 29d. 在實施例29d中，本發明係關於用於診斷對象之冠狀病毒感染的方法中的至少一種根據實施例1至24中任一者之結合蛋白質、或實施例25至25o中任一者之核酸、或根據實施例28之醫藥組成物。 29e. 在實施例29e中，本發明係關於一種診斷對象之冠狀病毒感染的方法，其包含以下步驟：使來自對象之樣本與至少一種根據實施例1至24中任一者之結合蛋白質在體外或離體接觸。 29f. 在實施例29f中，本發明係關於一種偵測對象之冠狀病毒感染的方法，該方法包含： a)自對象獲得樣本； b)使樣本與至少一種根據實施例1至24中任一者之結合蛋白質接觸；及 c)偵測冠狀病毒感染之存在。 29g. 在實施例29g中，本發明係關於用於治療或預防對象之冠狀病毒感染中的至少一種根據實施例1至24中任一者之結合蛋白質、或實施例25至25o中任一者之核酸、或根據實施例28之醫藥組成物。 30. 在第三十實施例中，本發明係關於根據實施例29至29g中任一者之方法，其中冠狀病毒感染係由SARS-CoV-2造成。 31. 在第三十一實施例中，本發明係關於根據實施例之29、29a、29b、29c、29e、29f、29g、及30中任一者之方法、或根據實施例29d之用途，其中對象係人類。

較佳實施例之詳細說明綜述

本文揭示重組結合蛋白質，其包含一或多個對冠狀病毒棘蛋白(特別是SARS-CoV-2棘蛋白)具有結合特異性之經設計錨蛋白重複域。亦揭示編碼結合蛋白質之核酸、包含結合蛋白質或核酸之醫藥組成物、及使用結合蛋白質、核酸、或醫藥組成物之方法。

根據本發明之重組結合蛋白質在一或多個結合位點結合至冠狀病毒棘蛋白，藉以中和病毒。這些結合位點係繪示於圖1中。在一個實施例中，重組結合蛋白質結合至棘蛋白上之三個位點。

不希望受理論束縛，據信本發明之經設計錨蛋白重複蛋白質係藉由下列方式作用：(i)抑制受體結合；(ii)提供棘蛋白構型改變之異位抑制(allosteric inhibition)；及/或(iii)阻斷棘蛋白活化所需之蛋白酶位點。如圖1中所示，據瞭解經設計錨蛋白重複域1 (DARPin® 1)係藉由阻斷血管收縮素轉化酶2 (ACE2)受體結合而發揮作用。據進一步瞭解經設計錨蛋白重複域1及2(DARPin® 1及2)係藉由防止棘蛋白中之構型改變，從而將棘蛋白有效鎖定為閉合構型而發揮作用。據瞭解經設計錨蛋白重複域3 (DARPin® 3)會進一步抑制構型改變並阻斷蛋白酶結合。這些經設計錨蛋白重複域可作為個別蛋白質結合且/或抑制棘蛋白。據信多域、多特異性蛋白質之多表位靶向會提供甚至更強效之棘蛋白中和，並使逃脫突變之可能性最小化。

所述經設計錨蛋白重複蛋白質之進一步優點係其可降低由於缺少Fc介導之巨噬細胞或補體活化所致之急性肺發炎(ALI)的發生率(如Liu et al., JCI Insight, 2019 4(4):e123158所述)。經設計錨蛋白重複蛋白質亦可處理單株抗體無法接近之表位。

所述經設計錨蛋白重複蛋白質之進一步優點係其具有低免疫原性潛力且不具有脫靶效應(off-target effect)。DARPin^® 候選者亦展示有利的開發性質，包括快速、低成本、及高產率製造及在4℃下高達數年的儲放期限。定義

除非本文中另有定義，否則與本發明關聯使用之科學及技術用語應具有所屬技術領域中具有通常知識者通常理解的意義。此外，除非上下文另有要求，否則單數用語應包括複數，且複數用語應包括單數。大致上，與細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學、及蛋白質及核酸化學關聯使用之命名法及其等之技術、及本文所述之雜交係所屬技術領域中所熟知且常用者。

用語「包含(comprising)」、「具有(having)」、「包括(including)」、及「含有(containing)」係解讀為開放式用語，除非另有註明。如果將本發明之態樣描述為「包含」一特徵，則亦設想到實施例「由該特徵所組成」或「基本上由該特徵所組成」。本文提供之任何及所有實例、或例示性詞語(例如，「諸如」)的使用係意欲僅用於更好地說明本揭露，且不對本揭露之範疇造成限制，除非另有聲明。不應將說明書中之詞語解讀為指示任何非請求之元件對於實施本揭露是不可或缺的。除了在操作實例中或另有指示之處以外，應將本文所使用之表示成分或反應條件之數量的所有數字理解為在所有情況下均以用語「約(about)」修飾，如該用語會由所屬技術領域中具有通常知識者所解讀。如本文中所使用，用語「約」等於給定數值之± 10%，除非另有說明。

除非本文中另有指示，本文中之值範圍的敘述係意欲僅作為個別指稱落於該範圍內之各單獨值及各端點的簡寫方法，且將各單獨值及端點併入本說明書中，如同其係在本文中個別敘述。

用語「核酸(nucleic acid)」或「核酸分子(nucleic acid molecule)」係指多核苷酸分子，其可係核糖核酸(RNA)或去氧核糖核酸(DNA)分子，可係單股或雙股，且包括DNA或RNA之經修飾及人工形式。核酸分子可以經單離形式存在或可包含於重組核酸分子或載體中。

在本發明之上下文中，用語「蛋白質(protein)」係指包含多肽之分子，其中該多肽之至少一部分藉由在單個多肽鏈內及/或在多個多肽鏈之間形成二級、三級、及/或四級結構而具有或能夠獲得經界定三維排列。如果蛋白質包含二或更多個多肽鏈，則個別多肽鏈可例如藉由兩個多肽之間的雙硫鍵非共價或共價地連接。藉由形成二級及/或三級結構而個別具有或能夠獲得經界定三維排列的蛋白質部分稱為「蛋白質域(protein domain)」。此類蛋白質域對於所屬技術領域中具有通常知識之執業者而言係熟知的。

如用於重組蛋白質、重組多肽、及類似者之用語「重組(recombinant)」意指該蛋白質或多肽係藉由使用所屬技術領域中具有通常知識之執業者所熟知的重組DNA技術生產。例如，可將編碼多肽之重組DNA分子(例如藉由基因合成生產)選殖至細菌表現質體(例如pQE30、QIAgen)、酵母菌表現質體、哺乳動物表現質體、或植物表現質體、或能夠體外表現之DNA中。例如，如果將此重組細菌表現質體插入適當細菌(例如大腸桿菌(Escherichia coli ))中，則這些細菌可生產由此重組DNA編碼之(多種)多肽。相應生產之多肽或蛋白質稱為重組多肽或重組蛋白質。

在本發明之上下文中，用語「結合蛋白質(binding protein)」係指包含結合域之蛋白質。結合蛋白質亦可包含二、三、四、五、或更多個結合域。較佳地，結合蛋白質係重組結合蛋白質。更佳地，本發明之結合蛋白質包含對冠狀病毒棘蛋白具有結合特異性之錨蛋白重複域。

用語「目標(target)」係指諸如核酸分子、肽、多肽或蛋白質、碳水化合物、或任何其他天然存在分子之個別分子，包括此類個別分子之任何部分，或係指二或更多種此類分子之複合物，或係指全細胞或組織樣本，或係指任何非天然化合物。較佳地，目標係天然存在或非天然多肽或蛋白質、或含有化學修飾之多肽或蛋白質，化學修飾例如自然發生或非自然磷酸化、乙醯化、或甲基化。

在本發明之上下文中，用語「多肽(polypeptide)」係關於由經由肽鍵連接之多個(即二或更多個)胺基酸的鏈所組成之分子。較佳地，多肽由經由肽鍵連接之多於八個胺基酸所組成。用語「多肽」亦包括藉由半胱胺酸之S-S橋連接在一起的多個胺基酸鏈。多肽係所屬技術領域中具有通常知識者熟知的。

專利申請案WO2002/020565及Forrer et al., 2003 (Forrer, P., Stumpp, M.T., Binz, H.K., Plückthun, A., 2003. FEBS Letters 539, 2-6)含有重複蛋白質特徵及重複域特徵、技術、及應用之一般描述。用語「重複蛋白質(repeat protein)」係指包含一或多個重複域之蛋白質。較佳地，重複蛋白質包含一、二、三、四、五、或六個重複域。此外，重複蛋白質可包含額外的非重複蛋白質域、多肽標籤、及/或肽連接子。重複域可係結合域。

用語「重複域(repeat domain)」係指包含二或更多個連續重複模組作為結構單元之蛋白質域，其中重複模組具有結構及序列同源性。較佳地，重複域亦包含N端及/或C端加帽模組。為清楚起見，加帽模組可係重複模組。對於所屬技術領域中之執業者而言，此類重複域、重複模組、及加帽模組、序列模體、以及結構同源性及序列同源性由下列之實例而係熟知的：錨蛋白重複域(Binz et al., J. Mol. Biol.332 , 489-503, 2003; Binz et al., Nature Biotech. 22(5): 575-582 (2004); WO2002/020565; WO2012/069655)、富白胺酸重複域(WO2002/020565)、三角形四肽(tetratricopeptide)重複域(Main, E.R., Xiong, Y., Cocco, M.J., D'Andrea, L., Regan, L., Structure 11(5), 497-508, 2003)、及犰狳重複域(WO2009/040338)。對於所屬技術領域中之執業者而言進一步熟知的是，此類重複域不同於包含重複胺基酸序列之蛋白質，其中每個重複胺基酸序列均能夠形成個別域(例如纖連蛋白(fibronectin)之FN3域)。

用語「錨蛋白重複域(ankyrin repeat domain)」係指包含二或更多個連續錨蛋白重複模組作為結構單元之重複域，其中該等錨蛋白重複模組具有結構及序列同源性。

如用於經設計重複蛋白質、經設計重複域、及類似者之用語「經設計(designed)」係指此類重複蛋白質及重複域分別係人造的且不會天然存在之性質。本發明之結合蛋白質係經設計重複蛋白質，且其包含至少一個經設計重複域。較佳地，經設計重複域係經設計錨蛋白重複域。

用語「目標交互作用殘基(target interaction residue)」係指重複模組之胺基酸殘基，其促成與目標之直接交互作用。

用語「架構殘基(framework residue)」或「架構位置(framework position)」係指重複模組之胺基酸殘基，其促成摺疊拓撲，即其促成重複模組之摺疊或其促成與鄰近模組之交互作用。此類促成可係與重複模組中之其他殘基的交互作用，或係對多肽主鏈構型之影響，如在α螺旋或β褶板中所見到者，或係在形成線性多肽或環之胺基酸鏈段(stretch)中的參與。

此類架構及目標交互作用殘基可藉由分析以物理化學方法(諸如X射線結晶學、NMR、及/或CD光譜學)獲得之結構數據來識別，或藉由與結構生物學及/或生物資訊學之執業者所熟知的已知且相關結構資訊進行比較來識別。

用語「重複模組(repeat module)」係指經設計重複域之重複胺基酸序列及結構單元，其原始衍生自天然存在的重複蛋白質之重複單元。重複域中所包含之各重複模組係衍生自天然存在的重複蛋白質之家族或次家族(較佳地錨蛋白重複蛋白質之家族)的一或多個重複單元。此外，重複域中所包含之各重複模組可包含推導自同源重複模組之「重複序列模體(repeat sequence motif)」，同源重複模組係獲自在目標(例如，如實例1中所述)上所選出且具有相同目標特異性之重複域。

因此，用語「錨蛋白重複模組」係指原始衍生自天然存在的錨蛋白重複蛋白質之重複單元的重複模組。錨蛋白重複蛋白質係所屬技術領域中具有通常知識者熟知的。

重複模組可包含出於選擇目標特異性重複域之目的而尚未在庫中對胺基酸殘基進行隨機化之位置(在本文中可互換使用之「非隨機化位置」或「固定位置」)、及出於選擇目標特異性重複域之目的而已在庫中對胺基酸殘基進行隨機化之位置(「隨機化位置」)。非隨機化位置包含架構殘基。隨機化位置包含目標交互作用殘基。「已進行隨機化」意指在重複模組之胺基酸位置允許二或更多個胺基酸，例如其中允許常見二十個天然存在胺基酸中之任一者，或其中允許大多數的二十個天然存在胺基酸，諸如半胱胺酸以外之胺基酸、或甘胺酸、半胱胺酸、及脯胺酸以外之胺基酸。

用語「重複序列模體」係指推導自一或多個重複模組之胺基酸序列。較佳地，重複模組係來自對相同目標具有結合特異性之重複域。此類重複序列模體包含架構殘基位置及目標交互作用殘基位置。架構殘基位置對應於重複模組之架構殘基的位置。同樣地，目標交互作用殘基位置對應於重複模組之目標交互作用殘基的位置。重複序列模體包含非隨機化位置及隨機化位置。

用語「重複單元(repeat unit)」係指包含一或多個天然存在蛋白質之序列模體的胺基酸序列，其中「重複單元」係見於多個拷貝中，且展現出決定蛋白質之摺疊的所有模體共有之已定義摺疊拓撲。此類重複單元之實例包括富白胺酸重複單元、錨蛋白重複單元、犰狳重複單元、三角形四肽重複單元、HEAT重複單元、及富白胺酸變體重複單元。

用語「錨蛋白重複域(ankyrin repeat domain)」係指包含至少一個錨蛋白重複模體之域，其原始衍生自天然存在的錨蛋白重複蛋白質之重複單元。通常，錨蛋白重複模體包含約33個殘基，殘基形成兩個以環分開之α螺旋。錨蛋白重複蛋白質在所屬技術領域中係已知的。參見例如國際專利公開案第WO 2002/020565號、第WO 2010/060748號、第WO 2011/135067號、第WO 2012/069654號、第WO 2012/069655號、第WO 2014/001442號、第WO 2014/191574號、第WO 2014/083208號、第WO 2016/156596號、及第WO 2018/054971號，其等全文以引用方式併入。錨蛋白重複域可選地進一步包含適當加帽模組。

錨蛋白重複域可使用標準重組DNA技術模組化地組裝為較大的根據本揭露之錨蛋白重複蛋白質，其可選地具有半衰期延長域(參見例如Forrer, P., et al., FEBS letters 539, 2-6, 2003、WO 2012/069655、WO 2002/020565)。

如果錨蛋白重複域以較高之頻率、較快之速度、較長之持續期間、及/或較高之親和力與特定目標(例如，細胞或物質)反應或締合(相較於替代目標(例如，細胞或物質))，則其「特異性結合(specifically bind)」或「優先結合(preferentially bind)」(在本文中可互換使用)至目標。例如，特異性結合至冠狀病毒棘蛋白之錨蛋白重複域係以較高之親和力、親合力(avidity)、較快之速度、及/或較長之持續期間結合冠狀病毒棘蛋白之錨蛋白重複域(相較於其結合至其他非冠狀病毒棘蛋白)。亦藉由閱讀本定義理解的是，例如特異性或優先結合至第一目標之錨蛋白重複域可或可不非特異性或優先結合至第二目標。因此，「特異性結合」不必然需要(雖然其可包括)獨有性結合(exclusive binding)。通常，在指定檢定條件下，錨蛋白重複域與特定目標分子優先結合，且不會與測試樣本中存在之其他組分大量結合。

可使用各種檢定格式來選擇或表徵特異性結合所關注分子之錨蛋白重複域。例如，固相ELISA免疫檢定、免疫沉澱法、BIAcore™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ)、螢光活化細胞分選(FACS)、Octet™ (ForteBio, Inc., Menlo Park, CA)、及西方墨點法分析係可用於識別與目標特異性反應之錨蛋白重複域之許多檢定中的一些檢定。一般而言，特異性或選擇性反應將係背景信號或雜訊之至少兩倍，且更一般而言係背景之10倍以上。甚至更具體而言，當平衡解離常數(K_D )值係＜ 1 µΜ，諸如＜ 100 nM、＜ 10 nM、＜ 1 nM、＜ 100 pM、＜ 10 pM、或＜ 1 pM時，便將錨蛋白重複域稱為「特異性結合」目標。

K_D 值常係指結合親和力。結合親和力測量一個結合夥伴之(多個)接觸殘基與其結合夥伴之(多個)接觸殘基之間的非共價交互作用之總和的強度。除非另有指示，否則如本文中所使用，結合親和力係指反映結合對或結合夥伴之成員之間的1:1交互作用之結合親和力。在結合蛋白質包含針對一個結合夥伴之兩個結合域的情況下，結合親和力可指反映結合蛋白質與結合夥伴之間的1:2交互作用之結合親和力。

各種測量結合親和力之方法係所屬技術領域中已知的，其任一者皆可用於本發明之目的。例如，如本文中所例示，結合親和力可以K_D 值表示，其係指特定錨蛋白重複域與其結合目標之解離速率。K_D 係解離速率(亦稱為「解離速率(off-rate (K_off ))」)與締合速率(或「結合速率(on-rate (K_on ))」)之比率。因此，K_D 等於K_off /K_on ，並以莫耳濃度(M)表示，且K_D 越小，結合之親和力越強。

K_D 值可使用任何合適方法判定。用於測量K_D 之一個例示性方法係表面電漿共振(SPR)(參見例如Nguyen et al. Sensors (Basel). 2015 May 5; 15(5):10481-510)。K_D 值可藉由SPR使用生物感測器系統(諸如BIACORE®系統)來測量。BIAcore動力分析包含分析抗原與晶片之結合及解離，該晶片在其表面上具有固定化分子(例如包含表位結合域之分子)。用於決定蛋白質之K_D 的另一方法係藉由使用生物層干涉術(參見例如Shah et al. J Vis Exp. 2014; (84): 51383)。K_D 值可使用OCTET®技術(Octet QKe system, ForteBio)測量。替代地或此外，亦可使用KinExA®(動力學排除檢定)檢定，其可購自Sapidyne Instruments (Boise, Id.)。任何適用於評估兩個結合夥伴之間的結合親和力之方法係涵蓋於本文中。表面電漿共振(SPR)係特別較佳的。最佳的是，K_D 值係在PBS中且藉由SPR判定。

用語「PBS」意指磷酸鹽緩衝水溶液，其含有137 mM NaCl、10 mM磷酸鹽、及2.7 mM KCl，且具有7.4之pH。

用語「治療(treat)」以及其相關詞語不必然意味著100%或完全治癒。相反地，有所屬技術領域中具有通常知識者認為具有潛在效益或治療效果之不同程度的治療。在此方面，本文所述之治療冠狀病毒感染的方法可提供任何量或任何水平的治療。此外，由本揭露之方法提供的治療可包括治療(即緩解)一或多種病況或症狀。在例示性態樣中，該等方法藉由增加對象之存活的方式治療。用語「治療(treatment)」亦包括疾病預防性(預防性)治療。

任何給定疾病或病況之治療反應可藉由特定於該疾病或病況之標準化反應標準判定。接受療法之對象可能會經歷與疾病相關聯之症狀改善的有益效果。靶向冠狀病毒棘蛋白之重組結合蛋白質

本文描述包含一、二、三、或更多個對冠狀病毒棘蛋白具有結合特異性之經設計錨蛋白重複域的重組結合蛋白質。在較佳實施例中，此類包含一或多個對冠狀病毒棘蛋白具有結合特異性之經設計錨蛋白重複域的重組結合蛋白質靶向冠狀病毒棘蛋白上之二、三、或更多個不同表位。

在本文中亦將所述包含經設計錨蛋白重複模體或模組之重組結合蛋白質(或其結合域)稱為DARPin®蛋白質。參見Stumpp et al., Curr Opin Drug Discov Devel. 10(2): 153-9 (2007)；及Binz et al., Nature Biotech. 22(5): 575-582 (2004)。可將DARPin®蛋白質視為對目標蛋白質具有高特異性及高結合親和力之抗體擬似物。通常，DARPin®蛋白質包含至少一個錨蛋白重複域，例如至少1、2、3、4、5、或更多個錨蛋白重複域。

本文所述之錨蛋白重複域通常包含提供結構之核心支架、及結合至目標之目標結合殘基。結構核心包括保守胺基酸殘基，且目標結合表面包括取決於目標而不同之胺基酸殘基。

國際專利公開案第WO 2002/020565號及Binz et al., Nature Biotech. 22(5): 575-582 (2004)描述錨蛋白重複蛋白質之庫，其可用於選擇/篩選特異性結合至目標之蛋白質。亦提供製造此類庫之方法。

可連接(透過共價鍵或非共價締合)多個錨蛋白重複域以形成雙特異性或多特異性分子。一種此類分子係示於圖1中，其中連接三個單獨冠狀病毒棘蛋白結合域以形成多特異性分子。連接子係以連接三個結合域之虛線繪示。冠狀病毒棘蛋白

如上所陳述，冠狀病毒棘蛋白係具有吸引力之治療目標。中和冠狀病毒棘蛋白可防止哺乳動物細胞感染，從而阻止冠狀病毒疾病在對象中蔓延。根據本發明之重組結合蛋白質對哺乳動物冠狀病毒具有特異性。較佳地，經設計錨蛋白重複蛋白質對小鼠、大鼠、狗、兔、猴、或人類來源之冠狀病毒具有特異性。更佳地，經設計錨蛋白重複蛋白質對人類來源之冠狀病毒具有特異性。冠狀病毒SARS-CoV-2是最佳的。如本文中所使用，用語「SARS-CoV-2」包括野生型病毒(諸如在COVID-19大流行開始時在受感染人類中所發現之SARS-CoV-2)及其突變形式或變種兩者。在一個實施例中，用語「SARS-CoV-2」包括野生型及特定變種B.1.1.7(所謂的「英國變種」)及B.1.351(所謂的「南非變種」)。

本文所述之重組結合蛋白質包含特異性結合至冠狀病毒棘蛋白之錨蛋白重複域。在一個實施例中，本文所述之重組結合蛋白質包含二、三、或更多個特異性結合至冠狀病毒棘蛋白之錨蛋白重複域。在一個實施例中，本文所述之重組結合蛋白質包含一、二、三、或更多個特異性結合至SARS-CoV-2棘蛋白之錨蛋白重複域。

本揭露中所關注之冠狀病毒棘蛋白上的目標域包括但不限於受體結合域(RBD域)；S1 NTD域；及S2域。這些域在所屬技術領域中係已知的(參見例如Wrapp et al., Science 367, 1260-1263 (2020))。

結合冠狀病毒棘蛋白的根據本發明之錨蛋白重複域係提供於表1中：表1

SEQ ID NO	DARPin® 蛋白質名稱	縮寫	棘蛋白目標域
SEQ ID NO 1	vS07_19G10	R2a	RBD
SEQ ID NO 2	vS07_06F12	R1a	RBD
SEQ ID NO 3	vS07_12C06	R1b	RBD
SEQ ID NO 4	vS07_22E12	R3a	RBD
SEQ ID NO 5	vS07_23E04	R3c	RBD
SEQ ID NO 6	vS07_29B10	R3b	RBD
SEQ ID NO 7	vS07_07F02	RN1	RBD
SEQ ID NO 8	vS07_26C03	RN2	RBD
SEQ ID NO 9	vS07_08F10	S1a	S1-NTD
SEQ ID NO 10	vS07_14G03	S2a	S2
SEQ ID NO 11	vS07_18A05	S2b	S2
SEQ ID NO 76	vS07_08F10v27		S1-NTD
SEQ ID NO 77	vS07_14G03v19		S2
SEQ ID NO 85	vS07_08F10v47		S1-NTD

因此，在一個實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含第一錨蛋白重複域，其中第一錨蛋白重複域包含與選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組的錨蛋白重複域具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列，如上表1中所說明。

在一個實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含第一錨蛋白重複域，其中第一錨蛋白重複域包含與選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組的錨蛋白重複域具有至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%序列同一性之胺基酸序列，如上表1中所說明。

在一個實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含第一錨蛋白重複域，其中第一錨蛋白重複域係選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組，如上表1中所說明。

表1中所列示之錨蛋白重複域可以任何方式組合以提供雙特異性或多特異性分子。第一、第二、及第三錨蛋白重複域可具有相同序列。第一、第二、及第三錨蛋白重複域可具有不同序列。

因此，在一個實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其進一步包含第二錨蛋白重複域，其中第二錨蛋白重複域包含與選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組的錨蛋白重複域具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列，如上表1中所說明。

在一個實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含第二錨蛋白重複域，其中第二錨蛋白重複域包含與選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組的錨蛋白重複域具有至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%序列同一性之胺基酸序列，如上表1中所說明。

在一個實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含第二錨蛋白重複域，其中第二錨蛋白重複域係選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組，如上表1中所說明。

在一個實施例中，本發明係關於一種如上所定義之重組結合蛋白質，其進一步包含第三錨蛋白重複域，其中第三錨蛋白重複域包含與選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組的錨蛋白重複域具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列，如上表1中所說明。

在一個實施例中，本發明係關於一種如上所定義之重組結合蛋白質，其進一步包含第三錨蛋白重複域，其中第三錨蛋白重複域包含與選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組的錨蛋白重複域具有至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%序列同一性之胺基酸序列，如上表1中所說明。

在一個實施例中，本發明係關於一種如上所定義之重組結合蛋白質，其進一步包含第三錨蛋白重複域，其中第三錨蛋白重複域係選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組，如上表1中所說明。

本發明係進一步關於第一、第二、及第三錨蛋白重複域之特定組合，該等錨蛋白重複域具有胺基酸序列且自N端至C端係排列如下： (i)與SEQ ID NO 6、1、及3具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (ii)與SEQ ID NO 4、2、及1具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (iii)與SEQ ID NO 4、6、及3具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (iv)與SEQ ID NO 6、3、及6具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (v)與SEQ ID NO 7、3、及6具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (vi)與SEQ ID NO 8、4、及1具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (vii)與SEQ ID NO 3、6、及7具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (viii)與SEQ ID NO 4、1、及8具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (ix)與SEQ ID NO 3、6、及9具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (x)與SEQ ID NO 9、3、及6具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xi)與SEQ ID NO 1、6、及9具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xii)與SEQ ID NO 9、6、及1具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xiii)與SEQ ID NO 6、9、及10具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xiv)與SEQ ID NO 3、9、及11具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xv)與SEQ ID NO 10、9、及6具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xvi)與SEQ ID NO 11、9、及3具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xvii)與SEQ ID NO 5、1、及3具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xviii)與SEQ ID NO 1、2、及5具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xix)與SEQ ID NO 3、5、及6具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xx)與SEQ ID NO 6、3、及5具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxi)與SEQ ID NO 7、3、及5具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxii)與SEQ ID NO 8、5、及6具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxiii)與SEQ ID NO 6、10、及11具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxiv)與SEQ ID NO 3、10、及10具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxv)與SEQ ID NO 5、6、及9具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxvi)與SEQ ID NO 9、3、及5具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxvii)與SEQ ID NO 9、6、及5具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxviii)與SEQ ID NO 5、9、及10具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxix)與SEQ ID NO 6、9、及11具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxx)與SEQ ID NO 10、9、及5具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxxi)與SEQ ID NO 11、9、及6具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxxii)與SEQ ID NO 3、76、及77具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列；或(xxxiii)與SEQ ID NO 3、85、及77具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明係關於根據實施例(xx)(如上所列示)之重組結合蛋白質。在進一步實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 68具有至少約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%序列同一性之胺基酸序列。在另一實施例中，重組結合蛋白質包含多肽，其中多肽具有SEQ ID NO: 68之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明係關於根據實施例(xxviii)(如上所列示)之重組結合蛋白質。在進一步實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 69具有至少約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%序列同一性之胺基酸序列。在另一實施例中，重組結合蛋白質包含多肽，其中多肽具有SEQ ID NO: 69之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明係關於根據(xxxii)(如上所列示)之重組結合蛋白質。在進一步實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 79具有至少約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%序列同一性之胺基酸序列。在另一實施例中，重組結合蛋白質包含多肽，其中多肽具有SEQ ID NO: 79之胺基酸序列。

在一個實施例中，本發明係關於根據(xxxiii)(如上所列示)之重組結合蛋白質。在進一步實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與選自由SEQ ID NO: 89至91所組成之群組的胺基酸序列具有至少約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、或約99%序列同一性之胺基酸序列。在另一實施例中，重組結合蛋白質包含多肽，其中多肽具有選自由SEQ ID NO: 89至91所組成之群組的胺基酸序列。

在另一實施例中，本發明之重組結合蛋白質結合至冠狀病毒棘蛋白。在另一實施例中，棘蛋白係SARS-CoV-2棘蛋白。

在另一實施例中，包含至少一個錨蛋白重複域的本發明之重組結合蛋白質以約100 nM或更低之結合親和力(K_D )結合至冠狀病毒棘蛋白。在另一實施例中，棘蛋白係SARS-CoV-2棘蛋白。

在另一實施例中，本發明之重組結合蛋白質包含第一、第二、及/或第三錨蛋白重複域，且第一、第二、及/或第三錨蛋白重複域以約100 nM或更低之結合親和力(K_D )結合至冠狀病毒棘蛋白。在另一實施例中，棘蛋白係SARS-CoV-2棘蛋白。

在例示性實施例中，本發明之重組結合蛋白質以下列或更小之K_D 值結合冠狀病毒棘蛋白(較佳地SARS-CoV-2棘蛋白)：約100 nM、約50 nM、約40 nM、約30 nM、約20 nM、約10 nM、約5 nM、約2 nM、約1 nM、約900 pM、約800 pM、約700 pM、約600 pM、約500 pM、約400 pM、約300 pM、約250 pM、約200 pM、約150 pM、約100 pM、約50 pM、約40 pM、約30 pM、約25 pM、約20 pM、約15 pM、約10 pM、約5 pM、或約1 pM。在一個例示性實施例中，重組結合蛋白質以小於或等於約10 nM之K_D 值結合冠狀病毒棘蛋白(較佳地SARS-CoV-2棘蛋白)。在另一例示性實施例中，重組結合蛋白質以小於或等於約1 nM之K_D 值結合冠狀病毒棘蛋白(較佳地SARS-CoV-2棘蛋白)。

在某些實施例中，冠狀病毒棘蛋白係人類冠狀病毒棘蛋白。在某些實施例中，冠狀病毒棘蛋白係人類SARS-CoV-2棘蛋白。

在某些實施例中，重組結合蛋白質可進一步包含至少一個人類血清白蛋白結合域。在實施例中，至少一個人類血清白蛋白域可位於N端、C端、或兩者。

在某些實施例中，血清白蛋白結合域包含與選自由SEQ ID NO: 47至49所組成之群組的序列具有至少90%序列同一性之胺基酸序列。在一個實施例中，血清白蛋白結合域包含與SEQ ID NO: 47具有至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性之胺基酸序列。

在進一步實施例中，本發明之重組結合蛋白質在小鼠中具有至少約30小時、較佳地至少約35小時、更佳地至少約40小時、及更佳地至少約45小時之終末半衰期。終末半衰期較佳地係在Balb/c小鼠中判定，如實例9中所述。

錨蛋白重複域之特別較佳組合係列示於表2中，其中H表示人類血清白蛋白，且R3b、R2a等係如上表1中所定義：表2

		5 域 DARPin ®設計
#		1	2	3	4	5
1	SEQ ID NO: 12	H	H	R3b	R2a	R1b
2	SEQ ID NO: 13	H	H	R3a	R1a	R2a
3	SEQ ID NO: 14	H	H	R3a	R3b	R1b
4	SEQ ID NO: 15	H	H	R3b	R1b	R3b
5	SEQ ID NO: 16	H	H	RN1	R1b	R3b
6	SEQ ID NO: 17	H	H	RN2	R3a	R2a
7	SEQ ID NO: 18	H	H	R1b	R3b	RN1
8	SEQ ID NO: 19	H	H	R3a	R2a	RN2
9	SEQ ID NO: 20	H	H	R1b	R3b	S1a
10	SEQ ID NO: 21	H	H	S1a	R1b	R3b
11	SEQ ID NO: 22	H	H	R2a	R3b	S1a
12	SEQ ID NO: 23	H	H	S1a	R3b	R2a
13	SEQ ID NO: 24	H	H	R3b	S1a	S2a
14	SEQ ID NO: 25	H	H	R1b	S1a	S2b
15	SEQ ID NO: 26	H	H	S2a	S1a	R3b
16	SEQ ID NO: 27	H	H	S2b	S1a	R1b
17	SEQ ID NO: 28	H	H	R3c	R2a	R1b
18	SEQ ID NO: 29	H	H	R2a	R1a	R3c
19	SEQ ID NO: 30	H	H	R1b	R3c	R3b
20	SEQ ID NO: 31	H	H	R3b	R1b	R3c
21	SEQ ID NO: 32	H	H	RN1	R1b	R3c
22	SEQ ID NO: 33	H	H	RN2	R3c	R3b
23	SEQ ID NO: 34	H	H	R3b	S2a	S2b
24	SEQ ID NO: 35	H	H	R1b	S2a	S2a
25	SEQ ID NO: 36	H	H	R3c	R3b	S1a
26	SEQ ID NO: 37	H	H	S1a	R1b	R3c
27	SEQ ID NO: 38	H	H	S1a	R3b	R3c
28	SEQ ID NO: 39	H	H	R3c	S1a	S2a
29	SEQ ID NO: 40	H	H	R3b	S1a	S2b
30	SEQ ID NO: 41	H	H	S2a	S1a	R3c
31	SEQ ID NO: 42	H	H	S2b	S1a	R3b
32	SEQ ID NO: 75	H	H	R1b	SEQ ID NO 76	SEQ ID NO 77
33	SEQ ID NO: 84、87、及88	H	H	R1b	SEQ ID NO 85	SEQ ID NO 77

在另一實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與選自由SEQ ID NO: 12至42、75、84、87、及88所組成之群組的序列具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。在一個實施例中，結合蛋白質結合至冠狀病毒棘蛋白。在一個實施例中，棘蛋白係SARS-CoV-2棘蛋白。在一個實施例中，結合蛋白質以約100 nM或更低之結合親和力(K_D )結合冠狀病毒棘蛋白。

在另一實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與選自由SEQ ID NO: 12至42、75、84、87、及88所組成之群組的序列具有至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性之胺基酸序列。在一個實施例中，結合蛋白質結合至冠狀病毒棘蛋白。在一個實施例中，棘蛋白係SARS-CoV-2棘蛋白。在一個實施例中，結合蛋白質以約100 nM或更低之結合親和力(K_D )結合冠狀病毒棘蛋白。

在另一實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有選自由SEQ ID NO: 12至42、75、84、87、及88所組成之群組的胺基酸序列。在一個實施例中，結合蛋白質結合至冠狀病毒棘蛋白。在一個實施例中，棘蛋白係SARS-CoV-2棘蛋白。在一個實施例中，結合蛋白質以約100 nM或更低之結合親和力(K_D )結合冠狀病毒棘蛋白。

在另一實施例中，本發明係關於如本文所述之重組結合蛋白質，其中結合蛋白質能夠抑制由冠狀病毒所致之細胞感染。在另一實施例中，本發明係關於如本文所述之重組結合蛋白質，其中結合蛋白質能夠抑制由SARS-CoV-2所致之細胞感染。

在另一實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 31具有至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性之胺基酸序列。在另一實施例中，重組結合蛋白質包含多肽，其中多肽具有SEQ ID NO: 31之胺基酸序列。在一個實施例中，結合蛋白質結合至冠狀病毒棘蛋白。在一個實施例中，棘蛋白係SARS-CoV-2棘蛋白。在一個實施例中，結合蛋白質以約100 nM或更低、約10 nM或更低、約1 nM或更低、約100 pM或更低、約10 pM或更低、或約1 pM或更低之結合親和力(K_D )結合冠狀病毒棘蛋白。在一個實施例中，結合蛋白質以約1 nM或更低之結合親和力(K_D )結合冠狀病毒棘蛋白。在一個實施例中，結合蛋白質在小鼠中具有至少約20小時、至少約25小時、至少約30小時、至少約35小時、至少約40小時、或至少約45小時之終末半衰期。在一個實施例中，結合蛋白質在小鼠中具有至少約40小時之終末半衰期。在一個實施例中，結合蛋白質具有高於50℃、高於60℃、高於70℃、或高於80℃之Tm而展現出高熱穩定性。在一個實施例中，結合蛋白質具有高於60℃之Tm而展現出高熱穩定性。在一個實施例中，結合蛋白質以100 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低、或0.5 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2 VSV假病毒在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2 VSV假病毒在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質以100 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低、或0.1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質具有選自列示於本段落中關於胺基酸序列、結合親和力、終末半衰期、熱穩定性、SARS-CoV-2 VSV假病毒抑制之IC₅₀ 、及SARS-CoV-2抑制之IC₅₀ 的性質之二、三、四、五、或六個性質的組合。在一個例示性實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 31具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列，且其中結合蛋白質以約1 nM或更低之結合親和力(K_D )結合至SARS-CoV-2棘蛋白，其中結合蛋白質在小鼠中具有至少約40小時之終末半衰期，其中結合蛋白質具有高於60℃之Tm而展現出高熱穩定性，其中結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2 VSV假病毒在VeroE6細胞中之病毒進入，且/或其中結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2在VeroE6細胞中之病毒進入。

在另一實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 39具有至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性之胺基酸序列。在另一實施例中，重組結合蛋白質包含多肽，其中多肽具有SEQ ID NO: 39之胺基酸序列。在一個實施例中，結合蛋白質結合至冠狀病毒棘蛋白。在一個實施例中，棘蛋白係SARS-CoV-2棘蛋白。在一個實施例中，結合蛋白質以約100 nM或更低、約10 nM或更低、約1 nM或更低、約100 pM或更低、約10 pM或更低、或約1 pM或更低之結合親和力(K_D )結合冠狀病毒棘蛋白。在一個實施例中，結合蛋白質以約1 nM或更低之結合親和力(K_D )結合冠狀病毒棘蛋白。在一個實施例中，結合蛋白質在小鼠中具有至少約20小時、至少約25小時、至少約30小時、至少約35小時、至少約40小時、或至少約45小時之終末半衰期。在一個實施例中，結合蛋白質在小鼠中具有至少約20小時之終末半衰期。在一個實施例中，結合蛋白質具有高於50℃、高於60℃、高於70℃、或高於80℃之Tm而展現出高熱穩定性。在一個實施例中，結合蛋白質具有高於60℃之Tm而展現出高熱穩定性。在一個實施例中，結合蛋白質以100 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低、或0.5 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2 VSV假病毒在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2 VSV假病毒在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質以100 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低、或0.4 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質具有選自列示於本段落中關於胺基酸序列、結合親和力、終末半衰期、熱穩定性、SARS-CoV-2 VSV假病毒抑制之IC₅₀ 、及SARS-CoV-2抑制之IC₅₀ 的性質之二、三、四、五、或六個性質的組合。在一個例示性實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 39具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列，且其中結合蛋白質以約1 nM或更低之結合親和力(K_D )結合至SARS-CoV-2棘蛋白，其中結合蛋白質在小鼠中具有至少約20小時之終末半衰期，其中結合蛋白質具有高於60℃之Tm而展現出高熱穩定性，其中結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2 VSV假病毒在VeroE6細胞中之病毒進入，且/或其中結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2在VeroE6細胞中之病毒進入。

在另一實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 75具有至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性之胺基酸序列。在另一實施例中，重組結合蛋白質包含多肽，其中多肽具有SEQ ID NO: 75之胺基酸序列。在一個實施例中，結合蛋白質結合至冠狀病毒棘蛋白。在一個實施例中，棘蛋白係SARS-CoV-2棘蛋白。在一個實施例中，結合蛋白質以約100 nM或更低、約10 nM或更低、約1 nM或更低、約100 pM或更低、約10 pM或更低、或約1 pM或更低之結合親和力(K_D )結合冠狀病毒棘蛋白。在一個實施例中，結合蛋白質在小鼠中具有至少約20小時、至少約25小時、至少約30小時、至少約35小時、至少約40小時、或至少約45小時之終末半衰期。在一個實施例中，結合蛋白質在小鼠中具有至少約30小時之終末半衰期。在一個實施例中，結合蛋白質以約1 nM或更低之結合親和力(K_D )結合冠狀病毒棘蛋白。在一個實施例中，結合蛋白質具有高於50℃、高於60℃、高於70℃、或高於80℃之Tm而展現出高熱穩定性。在一個實施例中，結合蛋白質具有高於60℃之Tm而展現出高熱穩定性。在一個實施例中，結合蛋白質以100 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低、或0.5 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2 VSV假病毒在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2 VSV假病毒在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質以100 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低、或0.4 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質具有選自列示於本段落中關於胺基酸序列、結合親和力、終末半衰期、熱穩定性、SARS-CoV-2 VSV假病毒抑制之IC₅₀ 、及SARS-CoV-2抑制之IC₅₀ 的性質之二、三、四、五、或六個性質的組合。在一個例示性實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 75具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列，且其中結合蛋白質以約1 nM或更低之結合親和力(K_D )結合至SARS-CoV-2棘蛋白，其中結合蛋白質在小鼠中具有至少約30小時之終末半衰期，其中結合蛋白質具有高於60℃之Tm而展現出高熱穩定性，其中結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2 VSV假病毒在VeroE6細胞中之病毒進入，且/或其中結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2在VeroE6細胞中之病毒進入。

在另一實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 84具有至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性之胺基酸序列。在另一實施例中，重組結合蛋白質包含多肽，其中多肽具有SEQ ID NO: 84之胺基酸序列。在一個實施例中，結合蛋白質結合至冠狀病毒棘蛋白。在一個實施例中，棘蛋白係SARS-CoV-2棘蛋白。在一個實施例中，結合蛋白質以約100 nM或更低、約10 nM或更低、約1 nM或更低、約100 pM或更低、約10 pM或更低、或約1 pM或更低之結合親和力(K_D )結合冠狀病毒棘蛋白。在一個實施例中，結合蛋白質在小鼠中具有至少約20小時、至少約25小時、至少約30小時、至少約35小時、至少約40小時、或至少約45小時之終末半衰期。在一個實施例中，結合蛋白質在小鼠中具有至少約40小時之終末半衰期。在一個實施例中，結合蛋白質以約1 nM或更低之結合親和力(K_D )結合冠狀病毒棘蛋白。在一個實施例中，結合蛋白質具有高於50℃、高於60℃、高於70℃、或高於80℃之Tm而展現出高熱穩定性。在一個實施例中，結合蛋白質具有高於60℃之Tm而展現出高熱穩定性。在一個實施例中，結合蛋白質以100 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低、或0.5 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2 VSV假病毒在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2 VSV假病毒在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質以100 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低、或0.4 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質具有選自列示於本段落中關於胺基酸序列、結合親和力、終末半衰期、熱穩定性、SARS-CoV-2 VSV假病毒抑制之IC₅₀ 、及SARS-CoV-2抑制之IC₅₀ 的性質之二、三、四、五、或六個性質的組合。在一個例示性實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 84具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列，且其中結合蛋白質以約1 nM或更低之結合親和力(K_D )結合至SARS-CoV-2棘蛋白，其中結合蛋白質在小鼠中具有至少約40小時之終末半衰期，其中結合蛋白質具有高於60℃之Tm而展現出高熱穩定性，其中結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2 VSV假病毒在VeroE6細胞中之病毒進入，且/或其中結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2在VeroE6細胞中之病毒進入。

在另一實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 87具有至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性之胺基酸序列。在另一實施例中，重組結合蛋白質包含多肽，其中多肽具有SEQ ID NO: 87之胺基酸序列。在一個實施例中，結合蛋白質結合至冠狀病毒棘蛋白。在一個實施例中，棘蛋白係SARS-CoV-2棘蛋白。在一個實施例中，結合蛋白質以約100 nM或更低、約10 nM或更低、約1 nM或更低、約100 pM或更低、約10 pM或更低、或約1 pM或更低之結合親和力(K_D )結合冠狀病毒棘蛋白。在一個實施例中，結合蛋白質在小鼠中具有至少約20小時、至少約25小時、至少約30小時、至少約35小時、至少約40小時、或至少約45小時之終末半衰期。在一個實施例中，結合蛋白質在小鼠中具有至少約35小時之終末半衰期。在一個實施例中，結合蛋白質以約1 nM或更低之結合親和力(K_D )結合冠狀病毒棘蛋白。在一個實施例中，結合蛋白質具有高於50℃、高於60℃、高於70℃、或高於80℃之Tm而展現出高熱穩定性。在一個實施例中，結合蛋白質具有高於60℃之Tm而展現出高熱穩定性。在一個實施例中，結合蛋白質以100 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低、或0.5 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2 VSV假病毒在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2 VSV假病毒在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質以100 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低、或0.4 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質具有選自列示於本段落中關於胺基酸序列、結合親和力、終末半衰期、熱穩定性、SARS-CoV-2 VSV假病毒抑制之IC₅₀ 、及SARS-CoV-2抑制之IC₅₀ 的性質之二、三、四、五、或六個性質的組合。在一個例示性實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 87具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列，且其中結合蛋白質以約1 nM或更低之結合親和力(K_D )結合至SARS-CoV-2棘蛋白，其中結合蛋白質在小鼠中具有至少約35小時之終末半衰期，其中結合蛋白質具有高於60℃之Tm而展現出高熱穩定性，其中結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2 VSV假病毒在VeroE6細胞中之病毒進入，且/或其中結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2在VeroE6細胞中之病毒進入。

在另一實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 88具有至少約80%、至少約81%、至少約82%、至少約83%、至少約84%、至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、或至少約99%序列同一性之胺基酸序列。在另一實施例中，重組結合蛋白質包含多肽，其中多肽具有SEQ ID NO: 88之胺基酸序列。在一個實施例中，結合蛋白質結合至冠狀病毒棘蛋白。在一個實施例中，棘蛋白係SARS-CoV-2棘蛋白。在一個實施例中，結合蛋白質以約100 nM或更低、約10 nM或更低、約1 nM或更低、約100 pM或更低、約10 pM或更低、或約1 pM或更低之結合親和力(K_D )結合冠狀病毒棘蛋白。在一個實施例中，結合蛋白質在小鼠中具有至少約20小時、至少約25小時、至少約30小時、至少約35小時、至少約40小時、或至少約45小時之終末半衰期。在一個實施例中，結合蛋白質在小鼠中具有至少約40小時之終末半衰期。在一個實施例中，結合蛋白質以約1 nM或更低之結合親和力(K_D )結合冠狀病毒棘蛋白。在一個實施例中，結合蛋白質具有高於50℃、高於60℃、高於70℃、或高於80℃之Tm而展現出高熱穩定性。在一個實施例中，結合蛋白質具有高於60℃之Tm而展現出高熱穩定性。在一個實施例中，結合蛋白質以100 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低、或0.5 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2 VSV假病毒在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2 VSV假病毒在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質以100 nM或更低、10 nM或更低、1 nM或更低、或0.4 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2在VeroE6細胞中之病毒進入。在一個實施例中，結合蛋白質具有選自列示於本段落中關於胺基酸序列、結合親和力、終末半衰期、熱穩定性、SARS-CoV-2 VSV假病毒抑制之IC₅₀ 、及SARS-CoV-2抑制之IC₅₀ 的性質之二、三、四、五、或六個性質的組合。在一個例示性實施例中，本發明係關於一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中多肽具有與SEQ ID NO: 88具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列，且其中結合蛋白質以約1 nM或更低之結合親和力(K_D )結合至SARS-CoV-2棘蛋白，其中結合蛋白質在小鼠中具有至少約40小時之終末半衰期，其中結合蛋白質具有高於60℃之Tm而展現出高熱穩定性，其中結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2 VSV假病毒在VeroE6細胞中之病毒進入，且/或其中結合蛋白質以1 nM或更低之IC₅₀ 值抑制SARS-CoV-2在VeroE6細胞中之病毒進入。半衰期延長部份

「半衰期延長部份(half-life extending moiety)」延長本文所述之重組結合蛋白質的體內血清半衰期，此係相較於不含半衰期延長部份之相同蛋白質。半衰期延長部份之實例包括但不限於多組胺酸(polyhistidine)、Glu-Glu、麩胱甘肽S轉移酶(GST)、硫氧化還原蛋白(thioredoxin)、蛋白質A、蛋白質G、免疫球蛋白域、麥芽糖結合蛋白(MBP)、人類血清白蛋白(HSA)結合域、或聚乙二醇(PEG)。在一些實施例中，半衰期延長部份係麩胱甘肽S轉移酶(GST)、蛋白質A、蛋白質G、免疫球蛋白域、人類血清白蛋白(HSA)結合域、或聚乙二醇(PEG)。

在一些實施例中，本文所述之重組結合蛋白質包含特異性結合血清白蛋白(諸如較佳地人類血清白蛋白)之錨蛋白重複域，在本文中亦稱為「血清白蛋白結合域」。本文所述之重組結合蛋白質亦可包含多於一個血清白蛋白結合域，例如二或三或更多個血清白蛋白結合域。因此，本文所述之重組結合蛋白質可包含第一及第二血清白蛋白結合域、或第一、第二、及第三血清白蛋白結合域。以下提供之實施例描述此類第一血清白蛋白結合域、第二血清白蛋白結合域、及/或第三血清白蛋白結合域。

在一些實施例中，本文所述之半衰期延長部份包含血清白蛋白結合域，血清白蛋白結合域包含與SEQ ID NO: 47至49中任一者至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一之胺基酸序列。在一例示性實施例中，本文所述之半衰期延長部份包含與SEQ ID NO: 47至49中任一者至少90%同一之胺基酸序列。在一些實施例中，本文所述之半衰期延長部份包含與SEQ ID NO: 47至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一之胺基酸序列。在一例示性實施例中，本文所述之半衰期延長部份包含與SEQ ID NO: 47至少90%同一之胺基酸序列。

在一些實施例中，二或更多個血清白蛋白結合域係較佳的。在一些實施例中，兩個血清白蛋白結合域係位於N端。在例示性實施例中，重組結合蛋白質自N端至C端包含：(i)特異性結合血清白蛋白之錨蛋白重複域；(ii)特異性結合血清白蛋白之錨蛋白重複域；及(iii)特異性結合冠狀病毒棘蛋白之一或多個錨蛋白重複域。在某些實施例中，N端血清白蛋白結合域(在本文中亦稱為血清白蛋白結合域1)包含與SEQ ID NO: 47至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一之胺基酸序列。在某些實施例中，第二血清白蛋白結合域(在本文中亦稱為血清白蛋白結合域2)包含與SEQ ID NO: 47至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一之胺基酸序列。

在一些實施例中，半衰期延長部份包含免疫球蛋白域。在一些實施例中，免疫球蛋白域包含Fc域。在一些實施例中，Fc域係衍生自下列已知重鏈同型中任一者：IgG (γ)、IgM (µ)、IgD (δ)、IgE (ε)、或IgA (α)。在一些實施例中，Fc域係衍生自下列已知重鏈同型或亞型中任一者：IgG₁ (γ1)、IgG₂ (γ2)、IgG₃ (γ3)、IgG₄ (γ4)、IgA₁ (α1)、IgA₂ (α2)。在一些實施例中，Fc域係人類IgG₁ 之Fc域。

在一些實施例中，Fc域包含Fc域之未受干擾天然序列(即野生型序列)。在一些實施例中，免疫球蛋白Fc域包含導致生物活性改變之變體Fc域。例如，可將至少一個點突變或缺失引入Fc域中，以降低或消除效應活性(例如國際專利公開案第WO 2005/063815號)，且/或增加重組結合蛋白質生產期間之同質性。在一些實施例中，Fc域係人類IgG₁ 之Fc域，且包含下列效應子-空(effector-null)取代中之一或多者：L234A、L235A、及G237A(Eu編號)。在一些實施例中，Fc域不包含位於人類IgG1之C端位置的離胺酸(即依Eu編號為K447)。不存在離胺酸可增加重組結合蛋白質生產期間之同質性。在一些實施例中，Fc域包含位於C端位置的離胺酸(K447，Eu編號)。錨蛋白重複域

在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 1至11、47、76、77、及85之序列，在本發明之重組結合蛋白質的任何錨蛋白重複域中進行不多於10、不多於9、不多於8、不多於7、不多於6、不多於5、不多於4、不多於3、不多於2、或不多於1個取代。在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 1至11、47、76、77、及85之序列，進行不多於5個取代。在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 1至11、47、76、77、及85之序列，進行不多於4個取代。在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 1至11、47、76、77、及85之序列，進行不多於3個取代。在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 1至11、47、76、77、及85之序列，進行不多於2個取代。在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 1至11、47、76、77、及85之序列，進行不多於1個取代。在一些實施例中，相較於包含SEQ ID NO: 1至11、47、76、77、及85之序列的蛋白質之K_D 值，該(等)取代不會使K_D 值改變大於1000倍、大於100倍、或大於10倍。在某些實施例中，取代係根據表3之保守性取代。在某些實施例中，取代係在錨蛋白重複域之結構核心殘基外進行，例如在連接α螺旋之β環中。表3.胺基酸取代

原始殘基	保守性取代	例示性取代
Ala (A)	Val	Val；Leu；Ile
Arg (R)	Lys	Lys；Gln；Asn
Asn (N)	Gln	Gln；His；Asp、Lys；Arg
Asp (D)	Glu	Glu；Asn
Cys (C)	Ser	Ser；Ala
Gln (Q)	Asn	Asn；Glu
Glu (E)	Asp	Asp；Gln
Gly (G)	Ala	Ala
His (H)	Arg	Asn；Gln；Lys；Arg
Ile (I)	Leu	Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸
Leu (L)	Ile	正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe
Lys (K)	Arg	Arg；Gln；Asn
Met (M)	Leu	Leu；Phe；Ile
Phe (F)	Tyr	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr
Pro (P)	Ala	Ala
Ser (S)	Thr	Thr
Thr (T)	Ser	Ser
Trp (W)	Tyr	Tyr；Phe
Tyr(Y)	Phe	Trp；Phe；Thr；Ser
Val (V)	Leu	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸

在某些實施例中，取代係在錨蛋白重複域之結構核心殘基內進行。例如，錨蛋白域可包含共有序列：DxxGxTPLHLAxxxGxxxlVxVLLxxGADVNAx (SEQ ID NO: 50)，其中「x」表示任何胺基酸(較佳地非半胱胺酸、甘胺酸、或脯胺酸)；或DxxGxTPLHLAAxxGHLEIVEVLLKzGADVNAx (SEQ ID NO: 51)，其中「x」表示任何胺基酸(較佳地非半胱胺酸、甘胺酸、或脯胺酸)，且「z」係選自由天冬醯胺酸、組胺酸、或酪胺酸所組成之群組。在一個實施例中，取代係對指定為「x」之殘基進行。在另一實施例中，取代係在指定為「x」之殘基外進行。

此外，本發明之重組結合蛋白質的任何錨蛋白重複域之倒數第二個位置可係「A」或「L」，且/或最後一個位置可係「A」或「N」。因此，在一些實施例中，各錨蛋白重複域包含與SEQ ID NO: 1至11、47、76、77、及85中任一者至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一之胺基酸序列，且其中可選地在倒數第二個位置之A經L取代，且/或在最後一個位置之A經N取代。在一例示性實施例中，各棘蛋白結合域包含與SEQ ID NO: 1至11、47、76、77、及85中任一者至少90%同一之胺基酸序列，且其中可選地位於倒數第二個位置之A經L取代，且/或位於最後一個位置之A經N取代。此外，本發明之結合蛋白質中所包含的任何錨蛋白重複域之序列可選地可在其N端包含G、S、或GS(參見下文)。

此外，本發明之重組結合蛋白質中所包含的各錨蛋白重複域可選地可在其N端包含「G」、「S」、或「GS」序列。因此，在一些實施例中，各錨蛋白重複域包含與SEQ ID NO: 1至11、47、76、77、及85中任一者至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%同一之胺基酸序列，且在其N端進一步包含GS(如例如在SEQ ID NO: 1至11、47、76、77、及85中)或僅進一步包含G或S而非GS。

在某些實施例中，重組結合蛋白質與其目標(棘蛋白或血清白蛋白)之間的親和力係以K_D 描述。在例示性實施例中，K_D 係約10^-1 M或更小、約10^-2 M或更小、約10^-3 M或更小、約10^-4 M或更小、約10^-5 M或更小、約10^-6 M或更小、約10^-7 M或更小、約10^-8 M或更小、約10^-9 M或更小、約10^-10 M或更小、約10^-11 M或更小、約10^-12 M或更小、約10^-13 M或更小、約10^-14 M或更小、約10^-5 M至約10^-15 M、約10^-6 M至約10^-15 M、約10^-7 M至約10^-15 M、約10^-8 M至約10^-15 M、約10^-9 M至約10^-15 M、約10^-10 M至約10^-15 M、約10^-5 M至約10^-14 M、約10^-6 M至約10^-14 M、約10^-7 M至約10^-14 M、約10^-8 M至約10^-14 M、約10^-9 M至約10^-14 M、約10^-10 M至約10^-14 M、約10^-5 M至約10^-13 M、約10^-6 M至約10^-13 M、約10^-7 M至約10^-13 M、約10^-8 M至約10^-13 M、約10^-9 M至約10^-13 M、或約10^-10 M至約10^-13 M。

在例示性實施例中，重組結合蛋白質以下列或更小之K_D 值結合棘蛋白或血清白蛋白：約900 nM、約800 nM、約700 nM、約600 nM、約500 nM、約400 nM、約300 nM、約250 nM、約200 nM、約150 nM、約100 nM、約50 nM、約40 nM、約30 nM、約20 nM、約10 nM、約5 nM、約2 nM、約1 nM、約900 pM、約800 pM、約700 pM、約600 pM、約500 pM、約400 pM、約300 pM、約200 pM、約100 pM、約10 pM、或約1 pM。在一個例示性實施例中，重組結合蛋白質以小於或等於100 nM之K_D 值結合棘蛋白或血清白蛋白。在另一例示性實施例中，重組結合蛋白質以小於或等於10 nM之K_D 值結合棘蛋白或血清白蛋白。連接子

本文所述之重組結合蛋白質可包含連接子。「連接子」係將兩個單獨實體(例如DARPin® 1及DARPin 2®，如圖1中所示)彼此結合之分子或分子組，且可在這兩個實體之間提供間隔及可撓性，使得其等能夠達到使其等能結合其等之各別目標的構型。蛋白質連接子係特別較佳的，且其可使用所屬技術領域中熟知的標準重組DNA技術表現為重組結合蛋白質之組分。

錨蛋白重複域可例如藉由雙硫鍵、多肽鍵、或交聯劑共價地連接；或非共價地連接，以生產異二聚體蛋白質。重組結合蛋白質可在冠狀病毒棘結合域、及可選的半衰期延長部份之間包含連接子。

在一些實施例中，連接子係肽基連接子。在一些實施例中，肽基連接子包含約1至50個胺基酸殘基。例示性連接子包括例如富甘胺酸肽；包含甘胺酸及絲胺酸之肽；具有序列[Gly-Gly-Ser]_n 之肽，其中n係1、2、3、4、5、或6；或具有序列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]_n (SEQ ID NO: 54)之肽，其中n係1、2、3、4、5、或6。富甘胺酸肽連接子包含肽連接子，其中至少25%的殘基係甘胺酸。富甘胺酸肽連接子在所屬技術領域中係熟知的(例如Chichili et al. Protein Sci. 2013 February; 22(2): 153-167)。

在一些實施例中，肽基連接子係富脯胺酸-蘇胺酸肽連接子。在一例示性實施例中，連接子係SEQ ID NO: 52之富脯胺酸-蘇胺酸肽連接子。在另一例示性實施例中，連接子係SEQ ID NO: 53之富脯胺酸-蘇胺酸肽連接子。

在一些實施例中，連接子包含SEQ ID NO: 53之胺基酸序列。較長富脯胺酸-蘇胺酸肽連接子之實例係見於SEQ ID NO: 84及88。 N端及C端加帽序列

本文所揭示之重組結合蛋白質的錨蛋白重複域可包含N端或C端加帽序列。加帽序列係指融合至(多個)錨蛋白重複序列模體之N或C端末端的額外多肽序列，其中加帽序列與(多個)錨蛋白重複序列模體形成緊密的三級交互作用(即三級結構交互作用)，藉以提供在側邊保護錨蛋白重複域之疏水性核心免於暴露於溶劑的帽。

N及/或C端加帽序列可衍生自加帽單元或其他在相鄰於重複單元之天然存在重複蛋白質中發現的結構單元。加帽序列之實例係描述於國際專利公開案第WO 2002/020565號及第WO 2012/069655號、美國專利公開案第US 2013/0296221號、及Interlandi et al., J Mol Biol. 2008 Jan 18;375(3):837-54。N端錨蛋白加帽模組(即N端加帽重複序列)之實例係SEQ ID NO: 55至57，且錨蛋白C端加帽模組(即C端加帽重複序列)之實例包括SEQ ID NO: 58。核酸及方法

在一個實施例中，本發明係關於一種核酸，其編碼如本文中所定義之重組結合蛋白質。

在一個實施例中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 70或編碼與SEQ ID NO 70相同之胺基酸序列的其變體。

在一個實施例中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 71或編碼與SEQ ID NO 71相同之胺基酸序列的其變體。

在一個實施例中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 72或編碼與SEQ ID NO 72相同之胺基酸序列的其變體。

在一個實施例中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 73或編碼與SEQ ID NO 73相同之胺基酸序列的其變體。

在一個實施例中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 74或編碼與SEQ ID NO 74相同之胺基酸序列的其變體。

在一個實施例中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 80或編碼與SEQ ID NO 80相同之胺基酸序列的其變體。

在一個實施例中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 81或編碼與SEQ ID NO 81相同之胺基酸序列的其變體。

在一個實施例中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 82或編碼與SEQ ID NO 82相同之胺基酸序列的其變體。

在一個實施例中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 83或編碼與SEQ ID NO 83相同之胺基酸序列的其變體。

在一個實施例中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 78或編碼與SEQ ID NO 78相同之胺基酸序列的其變體。

在一個實施例中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 86或編碼與SEQ ID NO 86相同之胺基酸序列的其變體。

在一個實施例中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 92或編碼與SEQ ID NO 92相同之胺基酸序列的其變體。

在一個實施例中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 93或編碼與SEQ ID NO 93相同之胺基酸序列的其變體。

在一個實施例中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 94或編碼與SEQ ID NO 94相同之胺基酸序列的其變體。

在一個實施例中，本發明係關於一種核酸，其編碼根據前述實施例中之一者之重組結合蛋白質，其中核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 95或編碼與SEQ ID NO 95相同之胺基酸序列的其變體。

本發明係進一步關於一種載體，其包含該核酸分子。在一個實施例中，載體係表現載體。

本發明係進一步關於一種宿主細胞，其包含該核酸分子或該載體。

在一個實施例中，本發明係關於一種製造如本文所述之重組結合蛋白質的方法，其包含在使重組結合蛋白質表現之條件下培養如本文中所定義之宿主細胞。組成物、用途、及治療方法

本文所述之重組結合蛋白質可用於治療感染冠狀病毒之對象。在一個實施例中，對象感染冠狀病毒SARS-CoV-2。

因此，在一個實施例中，本發明係關於一種醫藥組成物，其包含如本文中所定義之結合蛋白質或核酸及醫藥上可接受之載劑或賦形劑。

醫藥組成物可包含醫藥上可接受之載劑、稀釋劑、或賦形劑。標準醫藥載劑包括磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(諸如油/水或水/油乳液)、及各種類型的潤濕劑。

醫藥組成物可包含任何醫藥上可接受之成分，包括例如酸化劑、添加劑、吸附劑、推噴劑(aerosol propellant)、空氣置換劑(air displacement agent)、鹼化劑、抗結塊劑、抗凝血劑、抗微生物保存劑、抗氧化劑、防腐劑(antiseptic)、鹼、黏合劑、緩衝劑、螯合劑、塗佈劑、著色劑、乾燥劑、清潔劑、稀釋劑、消毒劑、崩散劑、分散劑、增溶劑、染料、潤膚劑(emollient)、乳化劑、乳液穩定劑、填料、成膜劑、增味劑、調味劑、助流劑、膠凝劑、造粒劑、保濕劑、潤滑劑、黏膜黏著劑、軟膏基劑、軟膏、油質媒劑、有機鹼、軟錠基劑(pastille base)、顏料、塑化劑、拋光劑、保存劑、鉗合劑(sequestering agent)、皮膚滲透劑、助溶劑、溶劑、穩定劑、栓劑基劑、表面活性劑、界面活性劑、懸浮劑、甜味劑、治療劑、增稠劑、張力劑、毒性劑、增黏劑、吸水劑、水可混溶共溶劑、軟水劑、或潤濕劑。參見例如the Handbook of Pharmaceutical Excipients, Third Edition, A. H. Kibbe (Pharmaceutical Press, London, UK, 2000)，其全文以引用方式併入。Remington’s Pharmaceutical Sciences, Sixteenth Edition, E. W. Martin (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1980)，其全文以引用方式併入。

醫藥組成物可經調配以獲得生理上相容的pH。在一些實施例中，醫藥組成物之pH可例如介於約4或約5與約8.0之間、或介於約4.5與約7.5之間、或介於約5.0與約7.5之間。在例示性實施例中，醫藥組成物之pH係介於5.5與7.5之間。

在另一實施例中，本發明係關於一種治療對象之冠狀病毒感染的方法，該方法包含以下步驟：向有需要之對象投予有效量的至少一種如本文中所定義之結合蛋白質、或如本文中所定義之核酸、或如本文中所定義之醫藥組成物。當投予該治療方法時，對象可以不同嚴重程度展現出與冠狀病毒感染相關聯之任何症狀。

在一些實施例中，單次投予該治療方法可能就足夠。在其他實施例中，可能需要重複投予。各種因素將影響投予次數及頻率，諸如對象之年齡及一般健康狀況、以及對象之冠狀病毒感染的狀態及與冠狀病毒感染相關聯之症狀的嚴重性。

在一些實施例中，該方法係疾病預防性方法，即預防對象之冠狀病毒感染的方法。在此類方法中，向對象投予有效量的至少一種如本文中所定義之結合蛋白質、或如本文中所定義之核酸、或如本文中所定義之醫藥組成物。一般而言，當投予該疾病預防性方法時，對象將不會展現出與冠狀病毒感染相關聯之任何症狀。

在一些實施例中，單次投予該疾病預防性方法可能就足夠。在其他實施例中，可能需要重複投予。各種因素將影響投予次數及頻率，諸如對象之年齡及一般健康狀況、以及對象暴露於冠狀病毒之風險。

在某些實施例中，冠狀病毒感染係由SARS-CoV-2造成。在某些實施例中，對象係人類。

本文所述之結合蛋白質可經由任何合適的投予途徑投予至對象，諸如腸胃外、經鼻、口服、肺部、局部(topical)、陰道、或直腸投予。適用於腸胃外投予之配方包括水性及非水性等張無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑、及使配方與預期接受者之血液等張的溶質；及水性及非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑、助溶劑、增稠劑、穩定劑、及保存劑。關於額外細節，參見Pharmaceutics and Pharmacy Practice , J. B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., pages 238-250 (1982)及ASHP Handbook on Injectable Drugs , Toissel, 4th ed., pages 622-630 (1986)。

本文所述之結合蛋白質可與另一治療劑(諸如止痛劑)組合使用。各治療劑可同時投予(例如在相同藥劑中或在同時間)、並行投予(即，在分開的藥劑中，該等藥劑係以任何順序一個接一個投予)、或以任順序依序投予。當組合療法中之治療劑係呈不同劑型(例如一種劑係錠劑或膠囊且另一種劑係無菌液體)且/或以不同給藥排程投予(例如至少每日投予之止痛劑及較不頻繁投予之生物治療劑，諸如每週一次或每兩週一次)時，依序投予可能是有用的。偵測或診斷之方法

在一個實施例中，本發明係關於用於診斷對象之冠狀病毒感染的方法中的至少一種本文所述之結合蛋白質。

在一個實施例中，本發明係關於一種診斷對象之冠狀病毒感染的方法，其包含以下步驟：使來自對象之樣本與至少一種如本文所述之結合蛋白質在體外或離體接觸。

在一個實施例中，本發明係關於一種偵測對象之冠狀病毒的方法，該方法包含： a)自對象獲得樣本； b)使樣本與至少一種如本文所述之結合蛋白質接觸；及 c)偵測冠狀病毒之存在。

在該等方法及用途中，樣本可獲自體液，諸如血液、腦脊髓液、血漿、或尿液。樣本亦可獲自黏膜(諸如經由鼻、口咽、或陰道拭子)或可係固態組織樣本(例如來自活檢)。

樣本可在用於任何這些方法中前先儲存。例如，樣本可在用於該等方法中前經受極低溫冷凍一段合適的期間。

在該等方法及用途中，對象可以不同嚴重程度展現出與冠狀病毒感染相關聯之症狀。替代地，對象可係無症狀的。該等方法及用途亦可在獲自非活體對象之樣本上進行以調查死因。實例

以下揭示之起始材料及試劑係所屬技術領域中具有通常知識者已知的、係市售可得的、且/或可使用熟知技術製備。材料

化學品係購自Sigma-Aldrich (USA)。寡核苷酸係來自Microsynth (Switzerland)。除非另有說明，否則DNA聚合酶、限制酶、及緩衝劑係來自New England Biolabs (USA)或Fermentas/Thermo Fisher Scientific (USA)。使用誘導型大腸桿菌表現菌株進行選殖及蛋白質生產，例如大腸桿菌XL1-blue (Stratagene, USA)或BL21 (Novagen, USA)。分子生物學

除非另有說明，方法係根據已知規程執行(參見例如Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1989, New York)。細胞及病毒

將購自ATCC (Manassas, VA 20110 USA)之Vero E6細胞(非洲綠猴腎細胞，ATCC® CRL-1586™)在含有10% FBS及補充劑(2 mM L-麩醯胺酸、非必需胺基酸、及100 U/ml青黴素、100 µg/ml鏈黴素、及HEPES，全都來自Biochrom, Berlin, Germany)之細胞培養基DMEM (FG0445)中在37℃下且無CO₂ 下進行繼代。使SARS-CoV-2 (2019-nCoV/IDF0372/2020)在Vero E6細胞中在含有2% FBS及補充劑(2%-FBS-MEM)之MEM中在37℃下繁殖。在實驗期間，將病毒在無CO₂ 下在非通氣燒瓶、以密封箔(Biorad，microseal B膜，MSB 1001)覆蓋之24孔、或96孔盤中培養。經設計錨蛋白重複蛋白質庫

產生經設計錨蛋白重複蛋白質庫之方法已描述於例如美國專利第7,417,130號；Binz et al. 2003, loc. cit.；Binz et al. 2004, loc. cit.。藉由此類方法，可建構具有隨機化錨蛋白重複模組及/或隨機化加帽模組之經設計錨蛋白重複蛋白質庫。例如，此類庫據此可基於固定N端加帽模組或隨機化N端加帽模組、一或多個隨機化重複模組、及固定C端加帽模組或隨機化C端加帽模組相應組裝。較佳地，此類庫可組裝為在重複或加帽模組之隨機化位置不具有任何胺基酸C、G、M、N(在G殘基前面)、及P。

此外，此類庫中之此類隨機化模組可包含具有隨機化胺基酸位置之額外多肽環插入。此類多肽環插入之實例係抗體之互補決定區(CDR)環庫或從頭(de novo)產生之肽庫。例如，此類環插入可使用人類核糖核酸酶L(Tanaka, N., Nakanishi, M, Kusakabe, Y, Goto, Y., Kitade, Y, Nakamura, K.T., EMBO J.23(30) , 3929-3938, 2004)之N端錨蛋白重複域的結構作為指引來設計。類似於在靠近兩個錨蛋白重複之邊界存在的β轉角中插入十個胺基酸之此錨蛋白重複域，錨蛋白重複蛋白質庫可含有插入錨蛋白重複域之一或多個β轉角中的可變長度(例如1至20個胺基酸)隨機化環(具有固定及隨機化位置)。

錨蛋白重複蛋白質庫之任何此類N端加帽模組較佳地具備RILLAA、RILLKA、或RELLKA模體(例如存在於SEQ ID NO: 55中之位置21至26)，且錨蛋白重複蛋白質庫之任何此類C端加帽模組較佳地具備KLN、KLA、或KAA模體(例如存在於SEQ ID NO: 58中之最後三個胺基酸)。

此錨蛋白重複蛋白質庫之設計可藉由與目標交互作用之錨蛋白重複域的已知結構來指引。此類結構之實例(藉由其等之蛋白質資料庫(Protein Data Bank, PDB)獨特登錄或識別代碼(PDB-ID)識別)係1WDY、3V31、3V30、3V2X、3V2O、3UXG、3TWQ-3TWX、1N11、1S70、及2ZGD。

經設計錨蛋白重複蛋白質庫之實例(諸如N2C及N3C經設計錨蛋白重複蛋白質庫)已有描述(美國專利第7,417,130號；Binz et al. 2003, loc. cit.；Binz et al. 2004, loc. cit.)。N2C及N3C中之數字描述隨機化重複模組存在於N端與C端加帽模組之間的數目。

用於定義重複單元及模組內之位置的命名法係基於Binz et al. 2004, loc. cit.，並修改為將錨蛋白重複模組及錨蛋白重複單元之邊界偏移一個胺基酸位置。例如，Binz et al. 2004 (loc. cit.)之錨蛋白重複模組的位置1對應於本揭露之錨蛋白重複模組的位置2，因此Binz et al. 2004, loc. cit.之錨蛋白重複模組的位置33對應於本揭露之後續錨蛋白重複模組的位置1。實例1 ： 包含對SARS-CoV-2 棘蛋白具有結合特異性之錨蛋白重複域的結合蛋白質之選擇 概要

使用核糖體展示(Hanes, J. and Plückthun, A., PNAS94 , 4937-42, 1997)，自DARPin®庫選出對SARS-CoV-2棘蛋白之不同域(RBD域；S1 NTD域；S2域)具有結合特異性的多個錨蛋白重複域，選擇方式類似於Binz et al. 2004 (loc. cit.)中所述者，並使用特定條件及額外淘汰(de-selection)步驟。所選殖株對於重組SARS-CoV-2棘蛋白目標域之結合及特異性係藉由大腸桿菌粗萃取均相時間解析螢光(Homogeneous Time Resolved Fluorescence, HTRF)評估，其指示成功選出多個SARS-CoV-2棘蛋白特異性結合蛋白質。例如，SEQ ID NO: 1至11之錨蛋白重複域構成所選結合蛋白質之胺基酸序列，該等結合蛋白質包含對SARS-CoV-2棘蛋白具有結合特異性之錨蛋白重複域。作為目標及選擇材料之棘蛋白域

使用棘蛋白域作為目標及選擇材料。用於選擇之蛋白質包含SARS-CoV-2 S蛋白外域(SARS2-Secto-d72-GCN4-Streptag)、SARS-Cov-2 S蛋白(S1+S2 ECT，His標籤；Sinobiological 40589-V08B1)、Bio-COVID-19_S1蛋白_His_Avitag (Acro Biosystems)、SARS2-S1-Flag-3Streptag、COVID-19_S_蛋白_RBD_Fc (Acro Biosystems)、及SARS2-S1B-2Streptag。此類目標蛋白質係選自SEQ ID NO: 43至45及59至67之多肽。將蛋白質使用標準方法生物素化。藉由核糖體展示對SARS-CoV-2 棘蛋白特異性錨蛋白重複蛋白質進行選擇

將經設計錨蛋白重複蛋白質庫(N2C及N3C)用於對SARS-CoV-2棘蛋白片段進行之核糖體展示選擇中(參見Binzet al. ,Nat Biotechnol 22 , 575-582 (2004)；Zahndet al .,Nat Methods 4 , 269-279 (2007)；Haneset al .,Proc Natl Acad Sci USA 95 , 14130-14135 (1998))。

對每個目標及庫執行四輪選擇。這四輪選擇採用標準核糖體展示選擇，並使用遞減之目標濃度及遞增之洗滌嚴格度(washing stringency)，以增加第1輪至第4輪之選擇壓力(Binz et al. 2004, loc. cit.)。將每輪選擇後之反轉錄(RT)-PCR循環次數持續減少，從而調整至由於結合物富集所致之產率。接著使12個所得之池經受結合物篩選。所選殖株特異性結合至SARS-CoV-2 之棘蛋白的RBD 、S2 、及S1-NTD 域，如粗萃取HTRF 所示。

特異性結合至溶液中SARS-CoV-2之棘蛋白的RBD、S2、及S1-NTD域之個別所選錨蛋白重複蛋白質係藉由均相時間解析螢光(HTRF)檢定使用表現錨蛋白重複蛋白質之大腸桿菌細胞的粗萃取物使用標準規程來識別。將藉由核糖體展示選出之錨蛋白重複蛋白質殖株選殖至pQE30 (Qiagen)表現載體之衍生物中、轉化至大腸桿菌XL1-Blue (Stratagene)中、接種在LB瓊脂(含有1%葡萄糖及50 µg/ml安比西林(ampicillin))上，然後在37℃下培養整夜。將單一殖株挑取至含有165 µl生長培養基(含有1%葡萄糖及50 µg/ml安比西林之LB)之96孔盤(各殖株在單一孔中)中，且在37℃下培養整夜，並以800 rpm振盪。將150 µl的新鮮LB培養基(含有50 µg/ml安比西林)用8.5 µl的整夜培養物在新鮮96深孔盤中進行接種。在37℃及850 rpM下培養120分鐘後，使用IPTG(0.5 mM最終濃度)誘導表現並持續6小時。藉由將盤離心來採集細胞，將上清液丟棄，將沉澱物在-20℃下冷凍整夜之後再懸浮於8.5 µl µl B-PERII (Thermo Scientific)中，然後在室溫下培養一小時並伴隨振盪(600 rpm)。接著，添加160 µl PBS，並藉由離心(3220 g進行15 min)將細胞碎屑移除。

將各裂解殖株之萃取物以PBSTB(補充有0.1% Tween 20®及0.2% (w/v) BSA之PBS，pH 7.4)中之1:200稀釋液(最終濃度)、連同20 nM(最終濃度)生物素化棘蛋白域、1:400(最終濃度)的抗6His-D2 HTRF抗體- FRET受體接合物(Cisbio)、及1:400(最終濃度)的抗strep-Tb抗體FRET供體接合物(Cisbio, France)施加至384孔盤之孔中，然後在4℃下培養120分鐘。HTRF係在Tecan M1000上讀出，且使用340 nm激發波長及620 ±10 nm發射濾光器以進行背景螢光偵測，且使用665 ±10 nm發射濾光器以偵測特異性結合之螢光信號。

測試各裂解殖株之萃取物與生物素化棘蛋白域之結合，以評估與棘蛋白之特異性結合。結合蛋白質之進一步分析及選擇

識別出總共909個結合物及抑制劑。基於結合概況，選出以96孔格式表現之360個候選者，並在DNA定序時平行純化至同質性。藉由粒徑篩析層析法、Sypro-Orange熱穩定性評估(參見Niesen et al.,Nat Protoc 2 , 2212-2221, (2007))、ProteOn表面電漿共振(SPR)目標親和力評估、ELISA、hACE2競爭性HTRF實驗、SDS-PAGE、及/或SARS-CoV-2假型病毒抑制檢定，對候選者進行生物物理表徵。基於這些數據，選出11個候選者(SEQ ID NO: 1至11)(結合至RBD、S1-NTD、或S2域)進行進一步分析。此分析亦包括呈多域格式之31個組合(SEQ ID NO: 12至42)，藉以探索新穎作用模式、判定抑制效價、表位及目標多樣性、序列多樣性、及/或生物物理性質。多域建構體係使用如前所述之Gibson組裝製備(參見Binz, H. K.et al. MAbs 9 , 1262-1269, (2017))。使本發明之結合蛋白質表現為具有His標籤(SEQ ID NO: 46)在其N端以便於純化或偵測，且在下述實驗中以此His標記形式進行測試。額外結合蛋白質之工程改造

在最初識別之結合蛋白質的進一步開發中，性質改善(諸如與目標蛋白質之親和力增加及/或解離速率降低或小鼠中藥物動力學特性改善)之結合域係使用各種方法產生。在一個方法中，選擇最初識別之結合蛋白質(「親本」結合蛋白質)作為親和力成熟之合適起始點。親和力成熟程序使用作為起始點之錨蛋白重複域的各隨機化位置發生飽和誘變。藉由競爭性HTRF針對較低解離速率，對藉由親和力成熟程序產生之序列進行篩選。藉由蛋白質工程改造，將藉此識別出之有益突變組合在結合蛋白質中。藉由表面電漿共振(SPR)驗證經親和力成熟及工程改造之結合蛋白質的結合性質。在另一方法中，改變錨蛋白重複域之N端及/或C端加帽模組中的某些胺基酸殘基，以達到錨蛋白重複域及包含錨蛋白重複域之蛋白質的藥物動力學性質改善，包括終末半衰期延長。此類經改變胺基酸殘基大部分為表面暴露殘基(參見例如PCT/EP2020/085855)。

在一個實例中，對SARS-CoV-2棘蛋白之S1-NTD域具有結合特異性的錨蛋白重複域(即vS07_08F10v27 (SEQ ID NO: 76)及vS07_08F10v47 (SEQ ID NO: 85))係藉由在錨蛋白重複域vS07_08F10 (SEQ ID NO: 9)中引入數個突變產生，以降低疏水性及/或增加與其目標之結合親和力及/或降低與其目標之解離速率。疏水性之降低(例如藉由改變N端及C端加帽模組中之殘基)會減少藉由SEC偵測到之任何多聚化的量，降低黏度，且/或改善小鼠中藥物動力學性質。使用退化性引子，在親和力成熟程序中使用單位點誘變方法在「親本」結合蛋白質上識別出數個經突變殘基，藉此將潛在結合殘基藉由PCR隨機化至所有20個胺基酸。藉由使用競爭性HTRF篩選，對個別變體針對改善之解離速率進行測試。一些個別突變增加HTRF信號至少高達2至3倍。作為示例，vS07_08F10v47 (SEQ ID NO: 85)中發現之突變包括下列： IR1_V11T：在第一內部重複模組中，位置11之纈胺酸係突變為蘇胺酸，此係基於在HTRF競爭性檢定中有高上2至3倍的信號，其指示解離速率有所改善； IR2_S3K：在第二內部重複模組中，位置3之絲胺酸係突變為離胺酸，此係基於在HTRF競爭性檢定中有高上1.5至2倍的信號，其指示解離速率有所改善； IR2_I4V：在第二內部重複模組中，位置4之異白胺酸係突變為纈胺酸，此係基於在HTRF競爭性檢定中有高上1.5至2倍的信號，其指示解離速率有所改善，且蛋白質之多聚化相較於親本蛋白質有所減少； IR2_R14Q：在第二內部重複模組中，位置14之精胺酸係突變為麩醯胺酸，此係基於在HTRF競爭性檢定中有高上＞ 3倍的信號，其指示解離速率有所改善； IR2_V15S：在第二內部重複模組中，位置15之纈胺酸係突變為絲胺酸，此係基於在HTRF競爭性檢定中有高上1.5至2倍的信號，其指示解離速率有所改善； C_W3V：在C端加帽模組中，位置3之色胺酸係突變為纈胺酸，此係基於在HTRF競爭性檢定中有高上1.2至1.5倍的信號，其指示解離速率有所改善，且蛋白質之多聚化相較於親本蛋白質有所減少； C_I4V：在C端加帽模組中，位置4之異白胺酸係突變為纈胺酸，此係基於在HTRF競爭性檢定中有高上2至3倍的信號，其指示解離速率有所改善；及 C_I6V：在C端加帽模組中，位置6之異白胺酸係突變為纈胺酸，此係基於在HTRF競爭性檢定中有高上2至3倍的信號，其指示解離速率有所改善。

在另一實例中，性質有所改善的對SARS-CoV-2棘蛋白之S2域具有結合特異性的錨蛋白重複域(即SEQ ID NO: 77之錨蛋白重複域)係藉由在錨蛋白重複域vS07_14G03 (SEQ ID NO: 10)中引入數個突變來產生。

對經工程改造結合蛋白質(諸如SEQ ID NO: 76、77、及85)進行生物物理表徵，類似於如以上針對SEQ ID NO: 1至11所述。此外，產生包含此類經工程改造結合域中之一或多者的呈多域格式之組合(例如SEQ ID NO: 75、84、87、及88)，藉以探索新穎作用模式、判定抑制效價、表位及目標多樣性、序列多樣性、及/或生物物理性質，類似於如以上針對SEQ ID NO: 12至42所述。實例2 ： SPR 結合檢定

使用表面電漿共振(SPR)檢定以判定本發明之結合蛋白質與SARS-CoV-2之棘蛋白的結合親和力。

所有SPR數據係使用Bio-Rad ProteOn XPR36儀器使用PBS-T (0.005% Tween20)作為運行緩衝劑來產生。根據Bio-Rad手冊將新的中性親和素(neutravidin)感測器晶片(NLC)空氣初始化(air-initialized)及調理。

單域DARPin蛋白質：將內部(in-house)化學生物素化(經由離胺酸)SARS-CoV-2棘蛋白(Sino Biologics，目錄號40589-V08B1，批號MF14MA0701)捕捉至約3400 RU (30ug/ml, 30ul/min, 300s)。在首次注射前，先施加兩次緩衝劑注射(100ul/min, 60s)，接著進行兩次12.5 mM NaOH再生步驟(100ul/min, 18s)。將單域DARPin蛋白質(以50/16.7/5.6/1.9/0.6nM(或針對SEQ ID NO: 9及10為以16.7/5.6/1.9/0.6nM))以100ul/min注射180s以進行締合，且記錄解離3600s(以100ul/min)。將配體用12.5 mM NaOH脈衝(100ul/min, 18s)再生。將數據針對空表面及緩衝劑注射進行雙重對照並根據1:1 Langmuir模型進行擬合。

多域DARPin蛋白質：將內部化學生物素化(經由離胺酸)SARS-CoV-2 (COVID-19) S蛋白RBD(目錄號SPD-C5255，批號BV3539b-203FF1-203K)捕捉至約1000 RU (775 ng/ml, 30ul/min, 300s)。在首次注射前，先施加兩次緩衝劑注射(100ul/min, 60s)，接著進行兩次12.5 mM NaOH再生步驟(100ul/min, 18s)。將一次單一濃度25nM的各多域DARPin建構體(包括例如ALE033、ALE030、ALE038、ALE049、ALE058)以100ul/min注射180s以進行締合，且記錄解離36000s(以100ul/min)。將數據針對空表面及緩衝劑注射進行雙重對照。由於親合力增進，在測量時間期間無法記錄到顯著解離。

SPR檢定之例示性結果係示於圖6、圖9a至圖9c、圖15a、圖16、及圖17及表4中。亦參見實例4。

使用SPR(多跡線，除非有指示)，測試根據SEQ ID NO 1至11之錨蛋白重複域與特異性冠狀病毒棘蛋白域的結合親和力。此外，亦使用本文實例中所述之方法測試其他生物物理及功能性質，方法諸如粒徑篩析層析法(SEC)、熱穩定性測量(Tm)、及SARS-CoV-2 VSV假病毒中和檢定。

結果係提供於圖9a至圖9c及下表4a及表4b中：表4a

	bio-S ecto Sino (SEQ ID NO: 44)
SEQ ID NO	K_D [M]
1	2.6E-10
2	2.5E-10
3	2.1E-11
4	2.4E-10
5	9.0E-11
6	8.1E-11
7	1.4E-08 *
8	2.3E-08 *

*單跡線表4b

SEQ ID NO	SEC	Tm [ ℃ ]	VSV-SARS-CoV-2 IC₅₀ [10^-9 M]
3	單體	＞85℃	＜2
5	單體	＞85℃	＜2
6	單體	＞85℃	＜2
9	單體	＞85℃
10	單體		＜100

SEQ ID NO: 1至8藉由SPR(單跡線)顯示會以類似於如表4a中所指示之親和力結合至棘蛋白之RBD域S1域，其使用bio-RBD Fc Acro (SEQ ID NO: 45)及bio-S1 Acro (SEQ ID NO: 43)作為目標材料。SEQ ID NO: 9顯示會以2.0E-08 M之K_D (單跡線)結合至棘蛋白之S1域，其使用bio-S1 Acro (SEQ ID NO: 43)作為目標材料。SEQ ID NO: 9及SEQ ID NO: 10顯示會分別以1.2E-09 M及7.9E-10 M之K_D 結合至棘蛋白之外域，其使用S ecto U (SEQ ID NO: 61)作為目標材料(參見圖9c)。SEQ ID NO: 76顯示會以與針對SEQ ID NO: 9所觀察到者大約相同之K_D 結合至棘蛋白之S1域或外域，而發現SEQ ID NO: 85會以甚至比SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 76更高之結合親和力(即較低之K_D )結合至棘蛋白之S1域或外域。SEQ ID NO: 10、11、及77例如藉由HTRF檢定顯示會結合至棘蛋白之S2域。表4b顯示SEQ ID NO: 3、5、6、9、及10之各者在粒徑篩析層析法中係單體的。此外，當針對SARS-CoV-2 VSV假病毒進行測試時，數個SEQ ID No顯示出高熱穩定性(＞85℃)及在奈莫耳範圍(例如＜2 nM)內之IC₅₀ 值。

針對多域DARPin蛋白質，由於親合力增進，在測量時間期間無法記錄到顯著解離(參見例如圖15a、圖16、及圖17)。多域蛋白質(包括例如ALE049及ALE058)之表觀親和力低於SPR極限，指示低於pM之目標親和力(數據未顯示)。實例3 ： 功能篩選

此實例描述使用SARS-CoV-2 VSV假型病毒檢定的單域及多域蛋白質之功能篩選。此檢定之結果係提供於圖5至圖8中。

感染抑制係使用水疱性口炎病毒(VSV)假病毒檢定(psVSV)評估，其中將VSV之醣蛋白置換為SARS-CoV-2棘醣蛋白之武漢(Wuhan)變種(用增強綠色螢光蛋白(EGFP)及螢火蟲螢光素酶(LUC)標記)。添加1 nM、10 nM、或100 nM的候選者後之感染抑制係藉由單純定量EGFP及LUC活性來測量(參見Torriani, G. et al.,Virology 531, 57-68 (2019))。

圖5及圖7顯示在100 nM的分別結合至棘蛋白上之單一位點(單域DARPin®蛋白質)及棘蛋白上之三個位點(多域DARPin®蛋白質)之各種重組結合蛋白質下的假型SARS-CoV-2病毒抑制。條長度越短指示病毒抑制越強。圖8重複圖7但係在1 nM下。圖6顯示單域重組結合蛋白質之代表性SPR跡線。此數據顯示，申請人能夠快速建立具有低於奈莫耳抗病毒活性之多域DARPin®蛋白質。重組結合蛋白質之進一步合理設計會進一步增加效價。實例4 ： 使用SARS-CoV-2 VSV 假病毒(PsV nCoV) 之中和檢定 細胞

Vero E6，接種於9 Costar 3610、透明底部、白色盤中。假SARS-CoV-2 (PsV nCoV) 2000 IU/孔(25 µL) 80’000 IU/mL = 8 * 104 IU/mL 4000 IU/孔等於1.6 *105 IU/mL 每盤100 *35 µL。製備4 mL的病毒x 8盤=32 mL。以約1 * 106 IU/mL取C15 6 ml儲備液至26 mL培養基2% FCS(胎牛血清)中。總共32 mL 重組結合蛋白質表5 ：樣本

	樣本名稱	5 域多特異性 DARPin® 設計	儲備液 (µM)	Vol (µL)
樣本編號		1	2	3	4	5
1	ALE030	H	H	R3b	R2a	R1b	20	100
2	ALE031	H	H	R3a	R1a	R2a	20	100
3	ALE033	H	H	R3b	R1b	R3b	20	100
4	ALE034	H	H	RN1	R1b	R3b	20	100
5	ALE035	H	H	RN2	R3a	R2a	20	100
6	ALE037	H	H	R3a	R2a	RN2	20	100
7	ALE038	H	H	R1b	R3b	S1a	20	100
8	ALE039	H	H	S1a	R1b	R3b	20	100
9	ALE040	H	H	R2a	R3b	S1a	20	100
10	ALE041	H	H	S1a	R3b	R2a	20	100
11	ALE042	H	H	R3b	S1a	S2a	20	100
12	ALE043	H	H	R1b	S1a	S2b	20	100
13	ALE044	H	H	S2a	S1a	R3b	20	100
14	ALE045	H	H	S2b	S1a	R1b	20	100
15*	ACO268						167
16**	vS07_M101E04						10	50

*陰性對照組；**陽性對照組人類血清白蛋白

使用3.0 mM人類血清白蛋白(HSA)之儲備液製備10 µM的HSA溶液。

用於此溶液之培養基包含DMEM(達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium))2% FCS(胎牛血清)及20 µM HEPES緩衝溶液(4-(2-羥乙基)-1-哌

乙磺酸)。樣本稀釋液

製備2倍稀釋液。將各稀釋液與一體積(PsV nCoV)混合。樣本1至14：20 µM之儲備液以100 nM製備300 µL(四重複，4 x 70 µL) 稀釋液1：/1/10：取15 µL的儲備液20 µM + 135 µL PBS最終濃度2 µM 稀釋液2：1/20：取15 µL的稀釋液1 + 285 µL de milieu DMEM 2% FCS(具有20 µM HSA)。最終濃度100 nM 陰性對照組：稀釋液1陰性對照組。稀釋液1：/1/16.5：取10 µL的儲備液167 µM + 157 µL PBS最終濃度10 µM 稀釋液2：1/10：取15 µL的儲備液10 µM + 135 µL PBS最終濃度1 µM 稀釋液3：/1/10：取30 µL的稀釋液2 + 270 µL de milieu DMEM 2% FCS(具有20 µM HSA)。陽性對照組：以100 nM製備300 µL(四重複，4 x 70 µL) 稀釋液1：/1/10：取15 µL的儲備液10 µM + 135 µL PBS最終濃度1 µM 稀釋液2：1/10：取30 µL的稀釋液1 + 270 µL de milieu DMEM 2% FCS(具有20 µM HSA)。最終濃度100 nM 製備 ● 在V底盤中 ● 製備樣本之初始1/10稀釋液。所需體積4 x 70 µl = 280 µl。製備300 µl培養基，其含有2% FCS及10 mM HEPES，且 ● 以四重複樣本分配70 µl ● 兩倍稀釋在V底盤中進行方法及結果

將一體積(35 µl)的PsV nCOV添加至各孔中，之後在37℃下培養一小時。接著將細胞以50 µl/孔進行感染然後在37℃下再培養90分鐘。接著將接種物(inoculum)移除，且添加150 µl培養基2% FCS，之後在37℃下最終培養16小時。在最終培養期後，停止檢定，並在適當稀釋率下使用倒立螢光顯微鏡計數受感染細胞(EGFP+)。不需要固定細胞。接著進行螢光素酶檢定。將部分細胞培養基移除(150 µl中的100 µl)，且將50 µl的Glow (PROMEGA)添加至各孔中。結果係使用Berthold® TriStar LB941光度計讀取大約1 sec。數據係使用軟體Graph Pad Prism 7分析，且結果係提供於表6中：表6

樣本編號	樣本名稱	儲備液 (µM)	IC₅₀ (nM)
1	ALE030	20	0.11950
2	ALE031	20	0.07529
3	ALE033	20	0.12470
4	ALE034	20	0.24070
5	ALE035	20	0.23770
6	ALE037	20	0.26320
7	ALE038	20	0.26380
8	ALE039	20	0.27920
9	ALE040	20	0.41750
10	ALE041	20	0.47560
11	ALE042	20	0.09803
12	ALE043	20	1.26700
13	ALE044	20	0.14710
14	ALE045	20	0.69270
15	ACO268	167	＞＞250.0000
16	vS07_M101E04	10	0.35780

已發現樣本1至14是假SARS-CoV-2之強效抑制劑，顯示小於1.5 nM之IC₅₀ ，且在大多數情況下小於0.7 nM。樣本2及11係特別強效的，具有小於0.1 nM之IC₅₀ 。圖5顯示GFP陽性Vero E06細胞之螢光顯微術影像，該等細胞被經GFP標示之VSV假型SARS-CoV-2病毒感染。圖5中之ALE043對應於上表6中之樣本編號12。ACO268及vS07_M101E04分別為陰性及陽性對照組。

圖11顯示SARS-CoV-2 VSV假型病毒中和。

圖12顯示樣本1 (ALE030)、4 (ALE033)、9 (ALE038)、13 (ALE042)、及14 (ALE043)之SARS-CoV-2 VSV假型病毒中和。亦包括陽性對照組(vS07_M101E04)。

在圖11及圖12中，候選者之力價分析為50nM至50pM(2倍稀釋)。10 µM的HSA之存在似乎不會影響檢定(參見沒有HSA結合物之對照組M101E04)。結果證明半衰期延長之多域建構體係PsV nCoV之強效抑制劑，具有大約100pM之IC₅₀ 值。實例5 ： 病毒中和活性；DARPin® 蛋白質之微量力價分析檢定( 開孔系統)

在此實例中，將樣本針對SARS-CoV-2病毒樣本(即非假病毒)進行測試。將陳述於下表8中之化合物樣本以100 nM、20 nM、4 nM、0.8 nM、0.16 nM、0.032 nM、及0.0064 nM之稀釋液製備。表8

樣本編號	樣本名稱	儲備液 (µM)	IC₅₀ (nM)
1	ALE030	20	0.11950
3	ALE033	20	0.12470
4	ALE034	20	0.24070
5	ALE035	20	0.23770
6	ALE037	20	0.26320
7	ALE038	20	0.26380
8	ALE039	20	0.27920
9	ALE040	20	0.41750
10	ALE041	20	0.47560
11	ALE042	20	0.09803
12	ALE043	20	1.26700
13	ALE044	20	0.14710
14	ALE045	20	0.69270

亦製備下列對照組樣本： ● 抗體陽性血清(來自患者)：1:100、1:500、1: 2500、1:625、… ● 抗體陰性血清：1:100、1:500、1: 2500、1:625、… ● 陰性對照組DARPin蛋白質：ACO268，一種HSA結合DARPin蛋白質 ● ACE2 ● 病毒回歸力價分析培養基：MEM、2% FCS、L-Glut、NEAA、Neo、Pen添加：10 µM HSA(人類血清白蛋白)稀釋儲備液1:300

在進行檢定的前一天，針對每兩種待測試之化合物，準備長滿(confluent) VeroE6細胞(開放式系統)之96孔盤。所有測試均以三重複進行。圖13顯示測試盤的圖像，其中有在邊緣周圍之邊界區及針對0.0064至100 nm之各稀釋值的三重複孔、及對照孔。

將樣本在1 ml含有2% FCS(胎牛血清)及10 µM HSA(人類血清白蛋白)之培養基中稀釋為100 nM。將含有2% FCS及10 µM HSA之100 µl培養基添加至第4至11行的所有孔中。將100 µl的經稀釋測試化合物或對照組(100 nM)添加至第2行，並將125 µl添加至第3行。從第3行開始，藉由將25 µl的上排與下排混合(每次都藉由將液體以吸量管上下轉移5次來將孔充分混合)，將血清1:5連續稀釋直到第10行。

使用於MEM中之1000 TCID50/ml、2% FCS、10 µM HSA(TCID50為50%組織培養感染劑量)，每盤製備6 ml的病毒懸浮液。將100 µl病毒懸浮液(100 TCID50)添加至第3至10行的各孔中。將盤在37℃下培養1h。接著將培養基自含有VeroE6細胞之96孔盤中移除。將200 µl的測試化合物/病毒混合物轉移至具有細胞之96孔盤中，然後將盤在37℃下培養3天。接著藉由顯微鏡及結晶紫染色判定CPE。

實例4之結果係示於圖14a至圖14f中。藍色細胞指示100%活性；無色細胞指示無活性。如所清楚展示，一直低到32 pM均有幾乎完整之細胞保護，顯示本發明之重組結合蛋白質係冠狀病毒棘蛋白、且特別是SARS-CoV-2棘蛋白之極強效抑制劑。實例6 ： 病毒中和活性；DARPin® 蛋白質之微量力價分析檢定( 開孔系統)

在此實例中，將錨蛋白重複結合域針對SARS-CoV-2病毒進行測試。將陳述於下表9中之錨蛋白重複結合域的樣本以200 nM、100 nM、20 nM、2 nM、及0.2 nM之稀釋液製備。表9

SEQ ID NO	樣本名稱
3	vS07_12C06
1	vS07_19G10
6	vS07_29B10
5	vS07_23E04
10	vS07_14G03

亦製備下列對照組樣本： ● ACE2 100 nM、20 nM、4 nM、0.8 nM、0.16 nM ● 病毒回歸力價分析所使用之材料：生物素化人類ACE-2 Fc，Acro Biosystems(目錄號AC2-H82F9) 培養基：MEM、2% FCS、L-Glut、NEAA、Neo、Pen添加：10 µM HSA(人類血清白蛋白)稀釋儲備液1:300

在進行檢定的前一天，針對每兩種待測試之化合物，準備長滿(confluent) VeroE6細胞(開放式系統)之96孔盤。所有測試均以五重複進行。根據圖13，各96孔盤包括邊界區，接著是多排的不同濃度孔，自200 nm至0.2 nM。

將樣本在1 ml含有2% FCS(胎牛血清)及10 µM HSA(人類血清白蛋白)之培養基中稀釋為200 nM。將含有2% FCS及10 µM HSA之100 µl培養基添加至所有孔中。使用所指示之ACE2濃度，以類似方式準備ACE2對照孔。

使用於MEM中之1000 TCID50/ml、2% FCS、10 µM HSA，每盤製備10 ml的病毒懸浮液。將100 µl病毒懸浮液(100 TCID50)添加至各孔中，除了盤邊緣處的孔(即邊界孔)以外。將盤密封並在37℃下培養1h。接著將培養基自含有VeroE6細胞之96孔盤中移除。將200 µl的測試化合物/病毒混合物轉移至具有細胞之96孔盤中，然後將盤密封並在37℃下培養2至3天。接著藉由顯微鏡或甲基藍染色判定CPE。

實例5之結果係示於圖18a至圖18d中。藍色細胞指示100%活性；無色細胞指示無活性。如所清楚展示，一直低到20 nM或甚至更低均有完整或幾乎完整之細胞保護，顯示本發明之重組結合蛋白質係冠狀病毒棘蛋白、且特別是SARS-CoV-2棘蛋白之極強效抑制劑。具體而言，針對vS07_12C06低到2 nM、針對vS07_29B10及vS07_23E04低到20 nM、且針對vS07_19G10低到100 nM(在20 nM下有幾乎完整保護)均觀察到完整保護。針對vS07_14G03，在2與200 nM之間觀察到部分保護。實例7 ： 病毒中和活性；DARPin® 蛋白質在低濃度範圍之力價分析

為了進一步調查本發明之重組結合蛋白質抑制細胞感染活SARS-CoV-2的能力，執行兩種不同檢定，其使用下列測量Vero E06細胞之細胞活力：i)來自Promega之CellTiter-Glo®及ii)結晶紫染色。受測樣本係列示於表10中，且結果係示於圖19中。表10

SEQ ID NO	樣本名稱
15	ALE033
24	ALE042
30	ALE048
31	ALE049
35	ALE053
39	ALE058

所有樣本均以20 µM儲備液提供，並在含有10 µM HSA之2% FCS培養基中最初稀釋為800 pM、400 pM、200 pM、100 pM、50 pM、25 pM、12.5 pM、6.25 pM、及3.125 pM，接著使用病毒懸浮液進一步1:2稀釋。製備 ● 在測試前一天，針對每兩個化合物，準備具有80%長滿VeroE6細胞(開放式系統)之96孔盤(化合物係以三重複測試) ● 將化合物在含有2% FCS及10 µM HSA之1 ml MEM培養基中稀釋為800 pM。 ● 藉由在100 µl含有2% FCS及10 µM HSA之MEM培養基中混合100 µl經稀釋化合物來將所有化合物1:2連續稀釋 ● 不使用邊界孔(僅細胞及培養基)以避免測試中之邊界效應 ● 為了識別化合物對細胞之非特異性效應，預備僅有化合物及細胞之對照行(對照組；第2行) ● 自第3至9行，將化合物自200 pM 1:2連續稀釋至3.125 pM ● 在第10及11行，添加含有2% FCS及10 µM HSA之MEM培養基以用於病毒對照組及細胞對照組測試程序

盤佈局類似於如圖13中所示之佈局，但具有以上所指示之化合物濃度 ● 在含有2% FCS及10 µM HSA之MEM培養基中的病毒懸浮液(每盤10 ml)，其具有1000 TCID50/ml的SARS-CoV-2 (2019-nCoV/IDF0372/2020) ● 將100 µl的病毒懸浮液(100 TCID50)添加至第3至10行的各孔中，將培養基添加至所有其他孔中 ● 將盤在37℃下培養1小時 ● 自含有80%長滿VeroE6細胞之96孔盤中移除培養基，並將200 µl的測試化合物/病毒混合物添加至具有細胞之96孔盤中 ● 將培養物在37℃下培養3天 ● 針對藉由qPCR分析病毒基因體拷貝數：將100 µl上清液在400 µl AVL緩衝劑+ 400 µl 100% EtOH中去活化-＞將去活化之上清液自BSL3實驗室洩出 ● 為了判定細胞活力：準備100 ul CellTiter-Glo® (Promega)受質並根據製造商規程添加，將盤振盪2 min並在GloMax® (Promega)中分析螢光紅。結果

藉由CellTiter-Glo®發光活力檢定測試之結果係提供於圖19中。VK：病毒對照組；ZK：細胞對照組。在大約25 pM的測試化合物下觀察到Vero E06細胞之完整保護。針對ALE033、ALE042、及ALE048，一直低到25 pM均觀察到完整之細胞保護。針對ALE049、ALE053、及ALE058，保護效率稍微較低，但針對這些化合物在25 pM下亦觀察到至少部分之細胞保護。綜上所述，本發明之多域結合蛋白質能夠在皮莫耳濃度下抑制SARS-CoV-2所致之細胞感染。實例8 ： 包含SEQ ID NO: 31 (ALE049) 或SEQ ID NO: 39 (ALE058) 之多特異性結合蛋白質的進一步表徵

包含SEQ ID NO: 31或SEQ ID NO: 39之胺基酸序列之多特異性結合蛋白質的進一步表徵包括SDS-PAGE(結果：完全完整大小而無降解；數據未顯示)、質譜法(結果：預期分子量；數據未顯示)、粒徑篩析層析法耦合靜態光散射、圓二色性、儲存穩定性(結果：在60℃下穩定1週；數據未顯示)、血清穩定性(結果：在37℃下在血清中穩定一週；數據未顯示)、表面電漿共振、SARS-CoV-2假型病毒抑制檢定、活病毒抑制檢定、小鼠藥物動力學分析(參見實例9)、及倉鼠功效模型(參見實例10)。實驗方法及結果圓二色性

圓二色性測量係用Jasco J-815使用1 cm光程比色管(Hellma)且在監測感測器插入比色管中的情況下執行。在20℃至90℃之溫度斜坡(加熱及冷卻)內追蹤222 nm處之MRE。在20℃下之可變溫度測量前及後獲取190至250 nm之光譜。將蛋白質以0.25 µM在PBS中進行測量。表面電漿共振親和力判定

使用SPR檢定以判定多特異性結合蛋白質與SARS-CoV-2之棘蛋白的結合親和力。SPR實驗係實例2中所述執行。 SARS-CoV-2 VSV假型病毒檢定

評估結合蛋白質在SARS-CoV-2 VSV假型病毒檢定中的抑制效價。此檢定係如例如實例3及實例4中所詳細描述來執行 SARS-CoV-2活病毒檢定

評估結合蛋白質在SARS-CoV-2病毒檢定中的抑制效價，類似於實例5中所述。簡言之，如下所述以100 nM、20 nM、4 nM、0.8 nM、0.16 nM、0.032 nM、及0.0064 nM之稀釋液在96孔盤中製備結合蛋白質，並使用下列培養基：MEM、2% FCS、L-Glut、NEAA、Neo、Pen；並添加10 µM HSA(人類血清白蛋白)(稀釋儲備液1:300)。所有測試均以三重複進行。在進行檢定的前一天，針對每兩種待測試之化合物，準備長滿(confluent) VeroE6細胞(開放式系統)之96孔盤。將測試盤設計為類似於如圖13中所示，其中有在邊緣周圍之邊界區及針對0.0032 nM至50 nm之各最終稀釋值的三重複孔、及對照孔。將樣本在1 ml含有2% FCS(胎牛血清)及10 µM HSA(人類血清白蛋白)之培養基中稀釋為100 nM(參見以上)。將含有2% FCS及10 µM HSA之100 µl培養基添加至第4至11行中的所有孔中。將100 µl的經稀釋測試化合物或對照組(100 nM)添加至第2行，並將125 µl添加至第3行。從第3行開始，藉由將25 µl的上排與下排混合(每次都藉由將液體以吸量管上下轉移5次來將孔充分混合)，將血清1:5連續稀釋直到第10行。使用於MEM中之1’000 TCID50/ml、2% FCS、10 µM HSA，每盤製備6 ml的病毒懸浮液。將100 µl病毒懸浮液(100 TCID50)添加至第3至10道的各孔中。將盤在37℃下培養1h。接著將培養基自含有VeroE6細胞之96孔盤中移除。將200 µl的測試化合物/病毒混合物轉移至具有細胞之96孔盤中，然後將盤在37℃下培養3天。接著藉由顯微鏡及結晶紫染色判定細胞病變效應，其中藍色細胞指示100%活性，且無色細胞指示無活性(參見圖20)，或者替代地，使用CellTiter-Glo®發光細胞活力檢定(Promega；參見圖21a至圖21c)判定。針對後者，使用1’000、10’000、或100’000 TCID50。

如圖20中所清楚展示，針對ALE049及ALE058兩者，一直低到0.08 nM均有完整或幾乎完整之細胞保護，顯示本發明之重組結合蛋白質係冠狀病毒棘蛋白、且特別是SARS-CoV-2棘蛋白之極強效抑制劑，也是由冠狀病毒所致之細胞感染、且特別是由SARS-CoV-2所致之細胞感染之極強效抑制劑。對應的結果係示於圖21a至圖21c中，其亦展示出對ALE049及ALE058兩者之強效抑制。重組結合蛋白質在這些檢定中達到有效抑制所需之確切濃度取決於所使用之病毒載量。針對ALE049及ALE058兩者，在皮莫耳範圍內觀察到SARS-CoV-2之強效抑制，針對ALE049則可一直低到50 pM。ALE049及ALE058之IC₅₀ 值係示於下表11中。這些病毒抑制值代表截至目前所報導之最強SARS-CoV-2抑制。藥物候選者之分子模型

ALE049(圖22A)之分子模型係基於極低溫電子顯微術數據(數據未顯示)而建立。在第一步驟中，產生結合域#2之模型結構。使用共有經設計錨蛋白重複域PDB:2xee作為模版。使用RosettaRemodel引入突變且使用固定主鏈，且使用RosettaRelax精修結構。使用RosettaCluster以0.3 Å半徑叢集四十個經精修結構，且來自最大叢集之最低能量模型作為最終模型。接著使用此模型以將域#2擬合至所觀察到自棘蛋白與域#2之複合結構產生的電子密度中，從而產生具有域#2:RBD三聚體之座標的PDB檔案。使用此三聚體模型作為輸入結構以用於結合至棘外域之ALE049的概念模型，如圖22A中所示。同樣地，亦針對ALE058建立分子模型(圖22B)。此針對ALE058之模型係基於極低溫電子顯微術數據以及針對S2結合域之示意性結構預測。

包含SEQ ID NO: 31 (ALE049)或SEQ ID NO: 39 (ALE058)之胺基酸序列的多特異性合蛋白質各包含3個SARS-CoV-2棘蛋白結合物之組合，該等結合物C端係融合至2個經臨床驗證之血清白蛋白結合域以獲得全身性半衰期延長。使所得5域蛋白質表現，純化並針對生物物理性質、目標親和力、及病毒抑制進行詳細表徵。使多特異性結合蛋白質以可溶形式在大腸桿菌之細胞質中以高水平表現。經純化蛋白質係單體的，且展現出高的熱穩定性(Tm ＞ 88℃)及可逆的展開(如藉由圓二色性所評估)、及在加速儲存穩定性檢定中在60℃下之高的穩定性(數據未顯示)。其等之表觀親和力低於SPR極限，指示低於pM之目標親和力(數據未顯示)。在psVSV檢定中，多特異性結合蛋白質抑制病毒進入，其中IC₅₀ 值在3 pM至138 pM或0.24 ng/ml至11.04 ng/ml之範圍內(參見表11、圖23)。psVSV檢定結果與活病毒檢定結果具有良好相關性，其中在25 pM至100 pM或2 ng/ml至8 ng/ml之濃度下觀察到感染抑制(參見表11、圖21a至圖21c)。表11

名稱	SEC	Tm [ ℃ ] (CD)	IC₅₀ psVSV [10^-12 M]	IC₅₀ LV* [10^-12 M]
ALE049	單體	＞88℃	46-138	25
ALE058	單體	＞88℃	3-99	100

*LV：活病毒細胞病變效應檢定

圖23進一步顯示，於棘蛋白之RBD域存在下，受測之本發明重組結合蛋白質所致的SARS-CoV-2 VSV假病毒中和。圖23顯示RBD域會與ALE049(含有三個RBD結合域)激烈競爭，但與ALE058(含有一個RBD結合域、一個S1-NTD結合域、及一個S2結合域)則不會。ALE049在與經單離RBD域競爭時損失效價，而ALE058中之單一RBD結合物的競爭對ALE058之效價沒有顯著影響。不希望受理論束縛，此數據似乎證實ALE049及ALE058藉由不同作用模式抑制SARS-CoV-2。雖然ALE049似乎強烈依靠RBD/ACE-2交互作用之中和，但ALE058似乎顯示多模式結合及多樣化的作用模式，其除了RBD/ACE-2交互作用之中和外亦利用分子之S1-NTD-S2臂的獨立中和效價。因此，基於圖23中所示之數據，ALE049及ALE058似乎具有不同之作用模式，此與圖22中所示之兩個分子的分子模型一致。

如針對本發明之結合蛋白質所觀察到的此高效價係用於SARS-CoV-2治療及疾病預防中的關鍵，其中預想到在感染起始時有極低之病毒力價。重要的是，最豐富SARS-CoV-2血清型之數種棘蛋白變種被多特異性結合蛋白質以高效價阻斷(參見表12)，指示針對病毒逃脫之強健性及用於目前大流行及亦可能未來大流行之疾病預防性治療中的潛力。在小鼠實驗中，一直到所測試之最高劑量(50 mg/kg, i.v.)均未觀察到不良事件。表12 ： SARS-CoV-2棘蛋白變種之抑制效價(IC₅₀ , [10^-12 M])

	wt	G476S	V483A	D614G	D614G x Q675H
ALE049	16.53	27.08	27.48	11.77	12.11
ALE058	5.48	14.46	32.40	4.64	22.44

實例9 ： 本發明之多特異性結合蛋白質在小鼠中之藥物動力學分析

進行藥物動力學(PK)研究以評估本發明之多特異性重組結合蛋白質在小鼠中之PK特性。此類PK特性可用於本發明之多特異性結合蛋白質在動物藥效動力學研究中、在毒理學研究中、或在人類臨床試驗中的劑量預測。

所調查的本發明之多特異性結合蛋白質包含(自N端至C端)兩個HSA特異性結合域，後面接著三個棘蛋白特異性結合域(參見表2)。HSA特異性結合域對小鼠之血清白蛋白具有交叉反應性。

針對此PK研究，使未接受治療(naive)之雌性BALB/c小鼠接受單次靜脈內快速(bolus)注射，目標劑量水平為1 mg/kg的化合物。在化合物投予後5 min與165 h之間的數個時點收集血液樣本。血清濃度係使用基於ELISA之分析方法判定。

自6 h起，濃度-時間曲線指示血清濃度緩慢且穩定減少，約略近似於單指數下降直到165 h，即最後取樣時點。使用非室分析(non-compartmental analysis)，自濃度時間曲線判定藥物動力學參數。

此實例中測試下列多特異性結合蛋白質：表13

SEQ ID NO	樣本名稱
15	ALE033
30	ALE048
31	ALE049

體內動物實驗

將測試項目以單次靜脈內快速注射投予至健康雌性BALB/c小鼠(每個測試項目6隻小鼠)之尾靜脈中。目標劑量水平為1 mg/kg。針對各化合物之研究，將6隻小鼠分成2組，各組具有相等數目的動物。針對藥物動力學調查，在時點5 min、6 h、24 h、48 h、72 h、96 h、及165 h自隱靜脈收集血清樣本，自各小鼠收集4份。將個別動物指派給各別取樣時點係根據預定方案。使血液保持在室溫下大約30 min以使其凝血，接著進行離心(5 min/12000 g/4℃)。之後將血清冷凍並儲存在-20℃下以待分析。針對體內實驗未報導任何重大問題及藥物相關不良效應。ELISA 方法

使用ELISA方法(參見圖24)測量多特異性結合蛋白質之血清濃度，且利用抗DARPin®抗體1-1-1所辨識之DARPin®部份的共同表位進行捕捉，並利用N端His標籤(其係存在於受測結合蛋白質中)以促進偵測。繪示於圖24(顯示ALE049作為結合蛋白質實例)中之ELISA設置方案使用固定在ELISA盤上之單株山羊抗兔-IgG，其結合兔抗DARPin®抗體1-1-1，從而經由DARPin®支架表位捕捉血清樣本中之多特異性結合蛋白質。所捕捉之DARPin®分子係使用小鼠抗RGS-His-IgG-HRP接合物偵測。aSA：抗血清白蛋白，aRBD：抗受體結合域(RBD) 測試程序

在4℃下將每孔一百µL的在PBS中之10 nmol/L多株山羊抗兔IgG抗體(Ab18)塗佈至NUNC Maxisorb ELISA盤上整夜。在用每孔300 µL PBST(補充有0.1% Tween20之PBS)洗滌五次後，在室溫(RT)下在Heidolph Titramax 1000振盪器(450 rpm)上，將孔用300 µL補充有0.25%酪蛋白之PBST (PBST-C)阻斷1 h。將盤如上所述洗滌。添加每孔一百µL的在PBST-C中之5 nmol/L兔抗DARPin® 1-1-1抗體，然後在迴轉振盪(450 rpm)下將盤在RT (22℃)下培養1 h。將盤如上所述洗滌。

在RT下施加每孔一百µL的經稀釋血清樣本(1:20至1:312500，以1:5稀釋步驟)、多特異性結合蛋白質品質對照組樣本(100、10、及1 nmol/L)、或稀釋於PBST-C(補充有未接受治療之小鼠血清而導致1%之最終血清濃度(初始1:20稀釋最終血清濃度為5%))中之多特異性結合蛋白質標準曲線樣本(0及50至0.001 nmol/L，以1:3稀釋步驟)2 h，並以450 rpm振盪。將盤如上所述洗滌。

接著將孔與100 µL的1:2000在PBST-C中之鼠抗RGS-His-HRP IgG (Ab06)培養並在RT、450 rpm下培養1 h。將盤如上所述洗滌。使用每孔100 µL TMB受質溶液使ELISA顯色5分鐘，然後藉由添加每孔100 µL 1 mol/L H₂ SO₄ 來停止。計算在450 nm之吸光度與在620 nm之吸光度之間的差異。將樣本在兩個不同的盤上以二重複測量。

將已知濃度的對照組樣本包括在測量中以監測檢定之效能。

藥物動力學數據分析係使用來自Certara之Phoenix WinNonlin^TM 8.0程式執行。研究(基於經由靜脈內快速注射給藥之動物的平均濃度-時間數據)之藥物動力學參數的計算係使用非室分析(NCA模型200-202，IV快速注射，線性梯形線性內插)執行。

所計算之藥物動力學參數包括至少下列：AUCinf_pred、AUClast、AUC_%extrapol、AUC_%Back_Ext_pred、Cmax、Tmax、Cl_pred、Vss_pred、t1/2 (HL_Lambda_z)

結果係示於表14及圖25中：表14

參數	單位	ALE033	ALE048	ALE049
AUCINF_pred	h*(nmol/L)	12428	12768	14329
AUClast	h*(nmol/L)	11439	11461	12949
Cmax	nmol/L	244	230	291
Tmax	h	0.083	0.083	0.083
Cl_pred	L/(h*kg)	0.00094	0.00091	0.00081
Vss_pred	L/kg	0.058	0.063	0.055
HL_Lambda_z	h	45.8	50.8	49.6
AUC_%Extrap_pred	(%)	8	10	10
AUC_%Back_Ext_pred	(%)	0	0	0

結果及結論

在單對數消除階段中，ALE033、ALE048、及ALE049之血清濃度下降，半衰期值分別為45.8 h、50.8 h、及49.6 h。ALE033、ALE048、及ALE049之清除率係分別判定為0.00094、0.00091、及0.00081 L/(h*kg)，且ALE033、ALE048、及ALE049之分布體積(Vss)係分別計算為0.058、0.063、及0.055 L/kg。針對Vss判定之值指示ALE033、ALE048、及ALE049相當大程度受限於動物之體循環，類似於單株抗體。

綜上所述，在以1 mg/kg之劑量水平靜脈內投予後，這三個受測的本發明之多特異性結合蛋白質在小鼠中展示出在白蛋白半衰期之範圍內的全身性半衰期。考慮到在小鼠及人類中之白蛋白半衰期以及先前的數據(Binzet al. ,MAbs 9 , 1262-1269 (2017))，預期ALE049在人類中之終末半衰期外推為大約3週。預期ALE033及ALE048在人類中之終末半衰期係以類似方式外推。實例10 ： 敘利亞倉鼠中之SARS-CoV-2 抑制功效實驗

ALE049之功效係在SARS-CoV-2感染之預防性治療的敘利亞倉鼠模型中進一步評估。

將敘利亞倉鼠分成4組，每組各6隻雌性動物。將這些組用16 µg、160 µg、或1600 µg的多特異性結合蛋白質(具有SEQ ID NO: 31之胺基酸序列)或用安慰劑以遮盲方式治療。在對動物用5x10⁴ TCID50(以100 µl)的SARS-CoV-2 (BetaCoV/Munich/BavPat1/2020)進行鼻內感染(第0天)前的24 h(第-1天)進行治療注射(i.p.，腹膜內)。在第-2天，測量體重，採取血液，並執行第一次咽喉拭子。在第4天將動物安樂死並採取組織，並且執行大體病理學檢查。每天將咽喉拭子收集在病毒輸送介質中，將其等分然後儲存。在驗屍時，執行大體病理學檢查。檢查肺葉並從背側視角執行受影響肺組織之百分比評估。將左肺及鼻甲保存在10%中性緩衝福馬林以用於組織病理學檢查。將這些組織的右側均質化並使其經歷Taqman PCR及病毒力價分析。此外，收集其他器官。將組織樣本冷凍以用於病毒學分析，秤重，在感染介質中均質化，然後在力價分析前先短暫離心。在所有動物之肺及鼻甲上執行組織病理學檢查。在用10%福馬林固定後，將來自左肺及左鼻甲之切片包埋於石蠟中，然後藉由H&E將組織切片染色以用於組織學檢查。針對病毒學分析，使用四重複10倍連續稀釋來判定Vero E6之長滿層中的病毒力價。為此，製造樣本(咽喉拭子及組織均質物)之連續稀釋液並在Vero E6單層上在37℃下培養1 h。將Vero E6單層洗滌並在37℃下培養4至6天，之後對盤進行WST8計分。病毒力價(TCID50)係使用Spearman-Karber之方法計算。讀出包括體重、肺病灶、病毒力價、及組織病理學之觀察。組織病理學

在用10%中性緩衝福馬林進行固定後，將左肺、左鼻甲、及氣管之切片包埋於石蠟中。將組織切片用蘇木精及伊紅(H&E)染色以用於組織病理學評估。當肺泡炎及肺泡傷害之程度估計為0%；1-25%；26-50%或＞50%時，分別給予0、1、2、或3之半定量分數。肺發炎程度及嚴重性之累計分數提供了每隻動物之肺泡炎總分(參見表15，「程度+嚴重性之總和」一欄)。針對肺泡炎、細支氣管炎、及支氣管炎，當無、少數、中等數目、或許多發炎細胞存在時，分別給予0、1、2、或3之半定量分數。針對肺泡水腫、肺泡出血、及II型肺細胞增生之存在，分別依據其是否存在而給予0或1之分數。在表16中，肺泡水腫、肺泡出血、及II型肺細胞增生之存在係以「是」及「否」來指示而非分數。

讀出包括體重、肺病灶、病毒力價、及組織病理學之觀察。在1600 µg劑量下，ALE049在肺中展現出顯著的病毒力價降低(圖26a)。雖然模型展現出高的動物間變異性，但觀察到病毒力價之劑量依賴性降低(圖26a)、巨觀判定肺病灶之劑量依賴性減少(圖26b)、及體重減輕之劑量依賴性減少(圖26c)，表示160 µg及1600 µg劑量均展現出抗病毒活性。咽喉拭子中之病毒力價進一步顯示1600 µg劑量(及160 µg劑量以較低程度)抑制病毒力價且/或加速在感染後四天期間在咽喉中之病毒力價降低(圖26d)。鼻甲中之病毒力價(圖26e)及組織病理學數據(表15及表16、圖27)證明，1600 µg劑量具有最強的抗病毒保護效果。基於這些令人振奮之初步發現，進一步動物實驗正在進行中。表15. 組織病理學結果(1)

動物編號	分組編號	化合物	劑量	肺泡炎 / 肺泡傷害之程度	肺泡炎之嚴重性	程度 + 嚴重性之總和	支氣管炎之嚴重性	細支氣管炎之嚴重性
1	1	ALE049	1600 µg	1	1	2	2	1
2	0	0	0	1	1
3	1	2	3	3	1
4	1	1	2	3	1
5	1	1	2	2	1
6	0	0	0	1	1
7	2	ALE049	160 µg	1	3	4	3	2
8	2	3	5	3	3
9	2	3	5	3	3
10	2	3	5	3	3
11	2	3	5	2	3
12	2	3	5	3	3
13	3	ALE049	16 µg	2	3	5	3	3
14	2	3	5	3	3
15	3	3	6	3	3
16	2	3	5	3	3
17	1	3	4	3	2
18	3	3	6	3	3
19	4	安慰劑	N/A	2	3	5	3	3
20	2	3	5	3	3
21	2	3	5	3	3
22	2	3	5	3	3
23	2	3	5	3	3
24	2	3	5	3	3

表16. 組織病理學結果(2)

動物編號	分組編號	化合物	劑量	肺泡水腫存在	肺泡出血存在	II 型肺細胞增生存在
1	1	ALE049	1600 µg	否	否	否
2	否	否	否
3	否	否	是
4	否	否	是
5	否	否	是
6	否	否	否
7	2	ALE049	160 µg	是	是	是
8	是	是	是
9	是	是	是
10	是	是	是
11	是	是	是
12	是	是	是
13	3	ALE049	16 µg	是	是	是
14	是	是	是
15	是	是	是
16	是	是	是
17	是	是	是
18	是	是	是
19	4	安慰劑	N/A	是	是	是
20	是	是	是
21	是	是	是
22	是	是	是
23	是	是	是
24	是	是	是

實例11 ： SARS-CoV-2 變種抑制功效實驗

評估ALE049 (SEQ ID NO: 31)及ALE109 (SEQ ID NO: 75)針對SARS-CoV-2變種B.1.1.7(「英國變種」)及B.1.351(「南非變種」)、以及針對在棘蛋白中具有單一突變之SARS-CoV-2變種的功效。

SARS-CoV-2之棘蛋白會透過對人類ACE2受體之結合來介導細胞進入。SARS-CoV-2亦能夠感染非靈長動物宿主，諸如貓類及貂類(Oude Munnink et al., 2021,Science 371, 172-177)。多宿主生活型態之混交性(promiscuity)經常是病毒對其新宿主之早期、仍未達最佳適應的指標。此意味著固有動態可塑性及進一步人類適應的潛力。棘蛋白之受體結合域(RBD)會形成與ACE2之界面。位點誘變掃描及結構分析揭露了對交互作用具有重要性之胺基酸殘基，諸如L455、F456、A475、F486、F490、及Q493 (Yan et al., 2020,Science 367, 1444-1448; Yi et al., 2020,Cell Mol Immunol 17, 621-630)。特別是，單胺基酸取代N439R、L452K、N470T、E484P、Q498Y、及N501T已顯示會增加對人類ACE2之親和力(Yi et al., 2020, loc. cit.)。與這些實驗發現一致的是，突變N439K及突變N501Y會出現在與利於受體結合及增加可傳性相關聯之快速傳播的SARS-CoV2棘變種中(Thomson et al., 2021,Cell , https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.01.037)。該RBD域亦具有免疫原性，並且K444、E484、及F486(以及其他殘基)已顯示對於中和抗體之結合具有重要性(Ku et al., 2021,Nat Commun 12, 469)。

在此實例中，吾人分析了所選之棘蛋白突變對ALE049及ALE109中和能力的影響(圖28)。經His標記之單價RBD結合物、ALE049、ALE109、及ALE109之域剔除變體的產生

使如實例1及Walser et al., 2020 (bioRxiv preprint doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.25.256339)所述選擇及選殖之錨蛋白重複蛋白質建構體在大腸桿菌BL21細胞中轉化，將其接種在LB瓊脂(含有1%葡萄糖及50 µg/ml安比西林)上，然後在37℃下培養整夜。針對各建構體，將單獨殖株挑取至TB培養基(含有1%葡萄糖及50 µg/ml安比西林)中，然後在37℃下培養整夜，並以230 rpm振盪。將新鮮TB培養基(含有50 µg/ml安比西林)用1:20的整夜培養物接種，然後在37℃下以230 rpm培養。在OD600 = 1.1下，藉由添加IPTG(0.5 mM最終濃度)對培養物進行誘導，然後在37℃下在230 rpm下進一步培養5h。藉由離心(10 min 5000 x g)進行採集。在藉由音振處理進行細胞破壞後，藉由在62.5℃下熱處理30 min然後離心(15 min, 12000 x g)來進行初始回收。將20 mM咪唑及1% Triton X-100添加至上清液，然後藉由使用N端His標籤之固定化金屬親和力層析法(HisTrap FF crude, Cytiva, Sweden)，將0.22 µm經離心上清液進一步純化，該層析法包括使用1% Triton X-100之洗滌步驟及使用250 mM咪唑洗提之步驟。在後續步驟中，將IMAC步驟之洗提流份應用於粒徑篩析層析法(Superdex 200, Cytiva, Sweden)上，然後將所關注之流份匯集並濃縮。最後，使濃縮樣本通過0.22 µm Mustang E過濾器過濾以進行內毒素去除及無菌過濾並進行品質控制。單株參考抗體RA1及RA2之產生

使用來自單株抗體RA1及RA2(美國食品藥物管理局核發將RA1及RA2作為雞尾酒組合投予以治療COVID-19之緊急使用授權)之可變域的公開可得序列來合成對應的cDNA片段，然後在Evitria AG (Switzerland)選殖為專有表現載體。由Evitria將所產生含有恆定免疫球蛋白hIgG1鏈或κ輕鏈之載體用於在中國倉鼠卵巢細胞中進行轉染。經由使用HiTrap MabSelect管柱之親和力純化接著使用HiLoad 26/600 Superdex 200管柱(在PBS中pH7.4)進行粒徑篩析層析法，將經無菌過濾之細胞上清液純化。在用於檢定前，將所選流份匯集並進行品質控制(藉由SDS-PAGE、粒徑篩析層析法、及內毒素測量)。 VSV-SARS-CoV-2假型突變載體產生

使用編碼SARS-CoV-2之棘蛋白(Walser et al., 2020, loc. cit.)之質體pCAGGS作為模版以產生單及多棘蛋白突變體。由Microsynth (Balgach, Switzerland)合成編碼該突變之前置及反置互補引子。使用高保真度Phusion聚合酶(New England Biolabs, USA)來進行所有DNA擴增。

棘蛋白之單突變係經由棘ORF之兩個PCR片段使用高保真度Phusion聚合酶(New England Biolabs, USA)來產生。第一個片段係經由黏合(annealing)在棘ORF上游之通用前置引子(pCAGGS-5)及編碼該突變之特異性反置引子來產生。第二個片段係使用編碼該突變之特異性前置引子及反置引子(rbglobpA-R)來產生。將這兩個片段凝膠純化並用作為組裝PCR之輸入而未添加毗鄰引子(flanking primer)。

針對多突變棘蛋白，設計出編碼各突變之互補引子對(前置及反置)。片段1係使用前置引子pCAGGS-5及編碼突變1之反置引子來產生。片段2係使用編碼突變1之前置引子及編碼突變2之反置引子來產生。所有後續片段均以類似方式產生。將DNA片段凝膠純化然後以等莫耳量混合。將此混合物用於使用外側引子pCAGGS-5及rbglobpA-R之全棘ORF重組裝(re-assembly)。

針對單以及多突變棘蛋白兩者，將全長棘ORF自瓊脂糖凝膠中單離出來，以限制酶NheI/EcoRI消化，然後插入pCAGGS載體主鏈中。正確序列係由Microsynth (Balgach, Switzerland)經由棘蛋白之全ORF的定序來驗證。用於突變分析及ALE109域剔除之VSV-SARS-CoV-2假型中和檢定

假型病毒系統係基於重組VSV*ΔG-Luc載體，其中已使醣蛋白基因(G)缺失並置換為編碼綠色螢光蛋白及螢光素酶之基因(Berger Rentsch and Zimmer, PLoS One. 2011;6(10):e25858)。假病毒係如先前所報導來產生(Torriani et al., Virology. 2019 May;531:57-68; Torriani et al., J Virol. 2019 Mar 5;93(6):e01744-18)。針對中和檢定，在初始稀釋化合物後，接著以四重複在補充有20 µM人類血清白蛋白(CSL Behring)之DMEM-2% [vol/vol] FCS中進行三倍稀釋。將混合物與等體積的DMEM-2% FCS(含有每孔250 IU的SARS-CoV-2假病毒)混合，然後在37℃下培養90 min。在透明底部白色壁96孔盤中，在37℃下在90 min期間內將混合物接種至Vero E6細胞。將接種物移除並添加新鮮培養基，然後將細胞在37℃下進一步培養16 h。根據ONE-Glo™螢光素酶檢定系統(Promega, Madison, US)將細胞裂解並使用Berthold® TriStar LB941光度計來記錄發光。將原始數據(相對光單位值)匯出至GraphPad Prism v8.01，並將中和值%對未經治療PsV信號進行標準化。具有95%信賴區間之IC₅₀ 係藉由非線性回歸擬合之模型來估計，並且使用用於對數(抑制劑)對標準化反應曲線之設定。細胞及病毒

Vero E6細胞係在含有10%胎牛血清(FBS)及補充劑(2 mM L-麩醯胺酸、1%非必須胺基酸、100 U/ml青黴素、100 µg/ml鏈黴素、0.06%碳酸氫鈉，全都來自Bioswisstec, Schaffhausen, Switzerland)之最低限度必需培養基(MEM) (Cat N° M3303)中在37℃、＞85%濕度、及5% CO₂ 下進行繼代。SARS-CoV-2 (2019-nCoV/IDF0372/2020)係在Vero E6細胞中在含有2% FBS及補充劑(2%-FBS-MEM)之MEM中在37℃、＞85%濕度、及5% CO₂ 下進行繁殖。病毒力價係藉由如他處所述之標準斑塊檢定來判定。藉由CellTiter-Glo及即時RT-PCR所判定之真實SARS-CoV-2病毒中和

單域及多域錨蛋白重複結合蛋白質之病毒中和能力係針對100 TCID50 SARS-CoV-2藉由在細胞活力檢定中測量受保護細胞之ATP水平來判定。在96孔盤中在100 µl用10 µM HSA滋補之細胞培養基(2%-FBS-MEM)中，將DARPin®蛋白質自40 nM 1:4連續稀釋至2.4 pM(以三重複)。將經稀釋DARPin®蛋白質與100 TCID50 SARS-CoV-2在100 µl 2%-FBS-MEM + HSA中混合，然後在37℃下培養1 h。將DARPin®蛋白質/病毒混合物(200 µl)轉移至80%長滿Vero E6細胞上。對照組由僅暴露於病毒懸浮液之Vero E6細胞所組成(用以判定最大細胞病變效應)及由僅用培養基培養之細胞所組成(用以判定細胞之基礎狀態)。將盤在37℃、＞85%濕度、及5% CO₂ 下培養3天。細胞活力係如製造商規程中所述藉由將100 µl上清液自所孔中移除並添加100 µl CellTiter-Glo試劑(CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay, Promega, Madison, USA)來判定。在迴轉式振盪器上振盪2分鐘，將混合物轉移至不透明壁盤並在室溫下培養10 min後，使用GloMax儀器(Promega)讀取發光。為了判定病毒複製之抑制，將先前移除之上清液(100 µl)在400 µl AVL-緩衝劑(Qiagen, Hilden, Germany)及400 µl 100%乙醇中去活化，然後使用MagNAPure 96系統(Roche, Basel, Switzerland)在100 µl中萃取及洗提。病毒RNA係藉由靶向E基因之即時RT-PCR(參考文獻Eurosurveillance | Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR)使用5 µl RNA及45 µl TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix (Life Technologies, Zug, Switzerland)來定量。病毒基因體當量(ge)係使用回歸分析及內部標準品來計算。

對於多特異性DARPin®分子ALE049及ALE109或參考抗體1或2(分別為RA1及RA2)之中和測試結果係示於表17。表18顯示ALE049 (SEQ ID NO: 31)之三個棘蛋白結合域作為個別結合物針對棘蛋白變種的活性。

n.d. ：未判定* 突變(南非)：D80A 、D215G 、E484K 、N501Y 、A701V ** 突變(英國)：del69-70 、del145 、N501Y 、A570D 、D614G 、P681H 、T716I 、S982A 、D1118H ¹ 殘基突變對棘蛋白與人類ACE2 之結合的影響(Yi et al., 2020, loc. cit.) ² DARPin® RBD 結合物之預期交互作用殘基(Walser et al., 2020, https://doi.org/10.1101/2020.08.25.256339) 表18 ：ALE049 之RBD 域的功效

變種	示性	VSV 假型中和檢定 IC₅₀ [ng/mL]
ALE049		ALE049 中之單價 RBD 結合物
	R3b	R1b	R3c
野生型	(武漢)	1.0		7.2	2.1	13.3
B.1.351	(南非，Δ5)*	3.0		76	26	＞100
B.1.1.7	(英國，Δ9)**	1.7		4.6	5.4	11.7
個別突變	變種中之殘基
N501Y	在英國、南非、巴西變種中；增加RBD/ACE2交互作用¹	0.5		9.1	4.8	27.8
E484K	在南非、巴西變種中；增加RBD/ACE2交互作用¹	2.7		64.2	10.2	＞100
K417E	在南非、巴西變種中突變為N/T之殘基	0.5		1.8	1.0	3.6
Y453F	在丹麥貂農場變種中演化之關鍵殘基	3.2		10.9	5.9	3.3
個別突變	高頻率突變
D614G	廣泛全球傳播	2.4		11.9	6.2	23
S477N	廣泛全球傳播	1.9		3.0	2.0	9.0
N439K	在北美、英國廣泛傳播；增加RBD/ACE2交互作用¹	1.3		7.3	5.3	12.9
A222V	廣泛歐洲傳播	2.2		3.3	4.6	19.5
個別突變	在DARPin®結合物之RBD表位內或據報導對於其他治療劑之抗性突變
G446V		1.7		0.7	1.8	2.3
G476S		1.5		2.3	3.7	29
T478I		2.7		11.2	3.1	16.7
P479S		2.1		7.2	2.3	27.6
V483A		2.3		21.8	8.4	21.3
F486V	針對DARPin® RBD結合物之關鍵殘基² ；降低RBD/ACE2交互作用¹	＞100		＞100	＞100	＞100
Q493K		7.9		30	28.2	45.8
F490S	降低RBD/ACE2交互作用¹	3.8		2.3	1.7	8.1

n.d. ：未判定* 突變(南非)：D80A 、D215G 、E484K 、N501Y 、A701V ** 突變(英國)：del69-70 、del145 、N501Y 、A570D 、D614G 、P681H 、T716I 、S982A 、D1118H ¹ 殘基突變對棘蛋白與人類ACE2 之結合的影響(Yi et al. 2020, loc. cit.) ² DARPin® RBD 結合物之預期交互作用殘基(Walser et al. 2020)

這些結果顯示，ALE049中和變種B.1.1.7及B.1.351之效力可與野生型形式相同，IC₅₀ 值在低的一位數ng/mL範圍中。ALE109中和B.1.351變種之效力與野生型形式相同，IC₅₀ 值在低的一位數ng/mL範圍中。針對ALE109對英國變種B.1.1.7觀察到輕微效價損失(IC50值為70 ng/ml)。然而，ALE109對英國變種B.1.1.7之效價仍在治療範圍內。值得注意的是，ALE109之RBD結合物(亦即R1b)對B.1.1.7維持了與野生型相同之中和能力。針對ALE109所觀察到之輕微效價下降可能是由S2域中之暴露突變(可能是P681H及T716I)本身所造成或與NTD突變結合所造成。造成此輕微效價下降之結構決定因素目前尚在探討中。綜上所述，結果顯示這兩個受測多特異性結合蛋白質ALE049及ALE109會強效地中和野生型形式，IC₅₀ 值在低的一位數ng/mL範圍中，並且中和變種B.1.1.7(英國)及B.1.351(南非)，IC₅₀ 值在治療範圍中(亦即，低的一位數至兩位數ng/mL範圍)。

這兩個多特異性DARPin®分子ALE049及ALE109亦具有良好保護力，可對抗個別受測突變，明顯例外是ALE049之F486V及所有三個單價DARPin® RBD結合物。因為F486對於ACE2結合而言是關鍵殘基，對於病毒之選擇性壓力有利於其保存，因而保留了對於ALE049之結合重要的錨定元件。此突變對ALE049之重大影響並不令人驚訝，因為先前之結構分析已識別出F486對於ALE049中之三個相關但不同的RBD結合物為核心交互作用殘基(Walser et al. 2020, loc. cit.)。因此，突變F486V會使ALE049分子與棘蛋白之結合去穩定化。綜上所述，吾人之分析證實了本發明之多特異性DARPin®分子對帶有最常觀察到的突變、及已知會影響中和抗體之結合的突變之棘蛋白保持高度強效，如由DARPin®分子之多特異性設計所預期。

圖29顯示ALE109之單域剔除(k.o.)建構體對SARS-CoV-2之野生型形式的中和效價。這些實驗確定了ALE109之這三個棘蛋白結合DARPin®域的各者對於對SARS-CoV-2之中和活性的貢獻。針對NTD剔除建構體未觀察到相較於ALE109有效價損失，而針對RBD及S2剔除建構體則觀察到一些效價損失。不希望受理論束縛，據信ALE109之NTD結合域在ALE109對SARS-CoV-2之突變形式或變種的中和活性上扮演重大角色，例如藉由使對突變棘蛋白之結合親合力增加。實例 12 ： SARS-CoV-2 之病毒繼代

先前研究已顯示，病毒逃脫突變體可在療法之選擇性壓力下快速出現(Ku et al., 2021, loc. cit.; Andreano et al., 2020, DOI: 10.1101/2020.12.28.424451)。吾人使用改自Baum et al., Science 369, 1014-1018 (2020)之病毒繼代模型來評估多特異性DARPin®蛋白質ALE049及ALE109及參考抗體RA1及RA2之雞尾酒組合之治療壓力下的病毒逃脫，並與單價DARPin®結合物R1b (SEQ ID NO: 3)及與單株抗體S309進行比較，RA1及RA2係作為單獨分子來施用。S309係自由2003之嚴重急性呼吸症候群(SARS)中康復之患者單離出來的抗體，其已顯示對細胞中及動物模型中之SARS-CoV-2感染有效(Pinto et al., Nature, Vol 583, p.290-295, 9 July 2020)。S309係以與RA1及RA2相同之方式製備(參見以上實例11)。實驗規程：

在含有2% FBS、補充劑、及10 µM人類血清白蛋白(HSA；CSL Behring, Switzerland；2%-FBS-MEM + HSA)之最低限度必需培養基(MEM)中製備DARPin®蛋白質及單株抗體之1:5連續稀釋液，從100 µg/ml至0.032 µg/ml。將500 ul的含有1.5 x 10⁶ 斑塊形成單位(pfu) SARS-CoV-2(法國單離物，相較於野生型具有下列差異：V367F；E990A)在2%-FBS-MEM + HSA中之病毒懸浮液與500 µl的連續稀釋DARPin®蛋白質或單株抗體混合，然後在37℃下培養1小時。接著將混合物轉移至12孔盤中之80%長滿Vero E6細胞，然後在37℃、＞85%濕度、及5% CO₂ 下培養4天。藉由顯微鏡術對各培養物孔針對細胞病變效應(CPE)進行評估。將上清液自具有最高DARPin®蛋白質或抗體濃度而顯示顯著CPE (＞20%)之孔中移除，然後用於總RNA萃取及進一步繼代。針對後續幾輪的繼代，將所選孔之剩餘900 µl上清液在2%-FCS-MEM + HSA中稀釋至4 ml，然後將其500 µl與DARPin®蛋白質或抗體之連續稀釋液混合，培養，然後將混合物轉移至具有如上所述之新鮮Vero E6細胞的12孔盤中。在4天後再度對細胞培養物針對CPE進行評估，並且採集具有最高DARPin®蛋白質或抗體濃度而具有明顯病毒複製(CPE)之孔的上清液並將其用於額外繼代(參見圖30)。以此方式執行總共4次繼代。結果：

藉由將在最大選擇性壓力下顯示顯著病毒誘導細胞病變效應之培養物的上清液繼代至新鮮細胞上同時維持抗病毒蛋白質濃度不斷增加之選擇性壓力而選擇出具抗性之逃脫變種。圖31顯示在第一至第四培養循環(繼代#1至#4)後獲得之結果。在第一次四天的培養循環(繼代# 1)後，單價DARPin®結合物Rb1及多特異性DARPin®蛋白質ALE049及ALE109、以及單株抗體RA1及兩個單株抗體RA1與RA2之雞尾酒組合在相同之0.4 µg/mL濃度下均會賦予保護效果。單株抗體S309較不具效力，需要較高的濃度(10 µg/mL)以提供保護，而單株抗體RA2作為單獨分子一直到受測之最高50 µg/mL濃度均不具保護性。在繼代2至4之連續選擇性壓力下，單價DARPin®結合物Rb1、及個別單株抗體RA2及RA1均失去保護細胞免於病毒誘導之細胞病變效應的能力，此顯示在一直到受測之最高選擇性壓力均為完全CPE。相比之下，兩個多特異性DARPin®蛋白質ALE049及ALE109(作為單獨分子或作為混合物)、及兩個單株抗體(RA1及RA2)之雞尾酒組合在全部4次繼代間均保持有效且保護細胞免於CPE。

多特異性DARPin®蛋白質ALE049及ALE109作為單獨藥劑分別在2 µg/mL及10 µg/mL之濃度下在4次繼代後會防止逃脫突變體的選擇，而兩個多特異性DARPin®蛋白質ALE049及ALE109之組合即使在0.08 µg/mL之低濃度下仍保留了有效性。抗體雞尾酒組合RA1與RA2在0.4 µg/mL之濃度下在繼代4後會防止逃脫突變體之選擇。實例13 ： 數個多特異性結合蛋白質在使用SARS-CoV-2 VSV 假病毒(PsV nCoV) 之中和檢定中的比較

數個本發明之多特異性結合蛋白質係在使用SARS-CoV-2 VSV假病毒(PsV nCoV)之中和檢定中比較。中和檢定係類似於如以上實例4中所述執行。受測多特異性結合蛋白質包括ALE049、ALE058、ALE109、ALE126、ALE129、及ALE133。ALE049、ALE058、及ALE109已描述於上。相較於ALE109，ALE126、ALE129、及ALE133包含經進一步工程改造之S1-NTD結合域(vS07_08F10v47; SEQ ID NO: 85)，而ALE109包含vS07_08F10v27 (SEQ ID NO: 76)。ALE126、ALE129、與ALE133彼此不同之處僅在於連接S1-NTD結合域及S2結合域(SEQ ID NO: 77)之連接子的長度。

PsV nCoV檢定之結果係示於圖32，並且EC50值係以nM提供。實驗證明，所有受測多特異性結合蛋白質在此SARS-CoV-2 VSV假病毒中和檢定中均具有整體上相當之中和效力。所有受測建構體之EC50值均在20至50 pM之範圍內。實例14 ： 本發明之多特異性結合蛋白質在小鼠中之藥物動力學分析

進行另一個藥物動力學(PK)研究以評估數個本發明之多特異性重組結合蛋白質在小鼠中之PK特性。此類PK特性可用於本發明之多特異性結合蛋白質在動物藥效動力學研究中、在毒理學研究中、或在人類臨床試驗中的劑量預測。

此PK研究基本上係如實例9中所述執行。

此測試中測試下列多特異性結合蛋白質：表19

SEQ ID NO	樣本名稱
39	ALE058
75	ALE109
87	ALE126
88	ALE129
84	ALE133

藥物動力學數據分析亦如實例9中所述使用來自Certara之Phoenix WinNonlin^TM 8.0程式來執行。研究(基於經由靜脈內快速注射給藥之動物的平均濃度-時間數據)之藥物動力學參數的計算係使用非室分析(NCA模型200-202，IV快速注射，線性梯形線性內插)執行。

結果係示於表20及圖33與圖34：表20

參數	單位	ALE058	ALE109	ALE0126	ALE129	ALE133
AUCINF_pred	h*(nmol/L)	4261	10980	11145	12986	11909
AUClast	h*(nmol/L)	4253	10740	10726	12281	11246
Cmax	nmol/L	255	328	337	295	295
Tmax	h	0.083	0.083	0.083	0.083	0.083
Cl_pred	L/(h*kg)	0.00297	0.00115	0.00114	0.00097	0.00105
Vss_pred	L/kg	0.052	0.047	0.053	0.052	0.058
HL_Lambda_z	h	20.0	31.5	36.7	41.4	41.1
AUC_%Extrap_pred	(%)	0	2	4	5	6
AUC_%Back_Ext_pred	(%)	1	0	0	0	0

結果及結論

結果證明，相較於前驅分子ALE058，ALE109針對全身性投予具有改善之藥物動力學性質。在血清濃度時間曲線的單指數消除階段，ALE109血清濃度會以31.5小時之半衰期下降，而ALE058則顯示20小時之半衰期。此外，當相較於ALE109時，經進一步工程改造之結合蛋白質ALE126、ALE129、及ALE133顯示還要更加長之半衰期，即分別為36.7小時、41.4小時、及41.1小時。實例15 ： 兩個多特異性結合蛋白質ALE049 及ALE109 在羅波夫斯基侏儒倉鼠(Roborovski dwarf hamster) 模型中之治療功效的體內評估

在此研究中，使用羅波夫斯基侏儒倉鼠模型來評估兩個多特異性本發明之結合蛋白質作為對SARS-CoV-2之潛在抗病毒劑的功效。羅波夫斯基侏儒倉鼠模型是用於SARS-CoV-2研究之很有價值非基因轉殖囓齒動物模型，因為其對於SARS-CoV-2感染具有高度靈敏性(如由嚴重臨床徵象所指示，例如體重減輕或體溫下降)、上下呼吸道中皆有病毒複製、及組織病理學變化(Trimpert et al., Cell Reports 33, 108488, December 8, 2020)。

因此，此研究之目的是調查ALE049及ALE109抑制或防止體重減輕、SARS-CoV-2在上下呼吸道中之複製、及組織病理學變化的治療潛力。

受測結合蛋白質ALE049及ALE109具有結合至人類血清白蛋白(HSA)(以及至倉鼠血清白蛋白)之域而使血清半衰期延長，從而支持了長久作用之活性。體外數據證明，這兩個結合蛋白質在細胞培養物力價分析實驗中導致了強效的SARS-CoV-2病毒感染抑制。

研究設計提供5組且各組使用6隻動物，並且在用SARS-CoV-2接種後0、6、或24小時給予使用受測結合蛋白質之治療。研究設計係說明於圖35(ALE049在此實例中亦稱為MP0420)。動物係藉由腹膜內(i.p.)投予來治療，其作為靜脈內投予之安全且可再現替代方案。第1組中之動物係用20 mg/kg之ALE049在0h時治療，而第2至4組中之動物係用20 mg/kg之ALE109分別在感染後之時點0、6、或24h時治療。對照組(第5組)中之動物係在時間0h時用安慰劑(亦即僅受測蛋白質之媒劑)治療。用SARS-CoV-2感染係經由鼻內(i.n.)途徑來執行，其劑量及感染途徑係基於來自較早先(模型開發)研究之結果。動物係每天秤重且體溫係每天測量。分別在感染後第3及5天將各組三隻動物安樂死以執行驗屍。肺及咽喉組織中之病毒載量係藉由qPCR或病毒力價分析及計數斑塊形成單位(PFU)來判定。所選組織中之組織病理學變化係在安樂死後評估。材料

配方緩衝劑及所有測試與對照項目配方係在投予當天製備並針對各組等分為適當體積，並且儲存在4℃直到投予。所投予之測試/對照項目體積係每動物100 µL，並且針對投予當天測量之動物體重進行調整。感染材料為SARS-CoV-2，病毒株BetaCoV/Germany/BavPat1/2020。動物

使用羅波夫斯基侏儒倉鼠(Phodopus roborovskii)，年齡6至9週，體重範圍在研究開始時在第-2天為20至25克。程序麻醉及止痛

針對感染及在安樂死前，動物係藉由分別以0.15、2.0、及2.5 mg/kg之劑量注射美托咪啶(medetomidine)、咪達唑侖(midazolam)、及布托啡諾(butorphanol)來麻醉。在感染後，麻醉係用0.15 mg/kg阿替美唑(atipamezole)來引起。腹膜內投予

針對腹膜內投予，藉由將頸部皮膚及背部皮膚抓在姆指與手指之間來將動物固定。之後，將手翻過來以讓動物用其背部靜躺在手掌中。使動物的頭部保持向下以防止注射在器官中/器官受傷，然後將針頭插入鼠蹊部中線，在第4及第5乳腺/乳頭之間。最後，以平順的動作將針頭拔出。鼻內投予

針對鼻內投予，將動物抓住其背部，然後使用吸量管將接種物(20 µl)平均分配在兩個鼻孔上。將動物抓住其背部直到接種物被完全吸入，之後將其放回籠中以進行恢復。用於組織學之取樣

針對在實驗或人道終點(亦即第2、5、及7天)之所有動物就所選組織執行組織病理學分析。在用4%福馬林固定至少48小時後，將來自肺及咽喉之切片包埋於石蠟中，然後將組織切片染色以用於組織學檢查。終點血清樣本

在感染後第2、5、及7天在安樂死期間收集血清樣本並立即轉移至含有凝血激發劑之適當管中。病毒學分析病毒RNA 之偵測

RNA係自洗鼻液及氣管拭子使用RTP DNA/RNA Virus Mini Kit (Stratec, Birkenfeld, Germany)根據製造商之指示來萃取。使用innuPREP Virus DNA/RNA Kit (Analytic Jena, Jena, Germany)以自組織樣本萃取RNA。病毒RNA係利用一步式RT qPCR反應並使用NEB Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA)及2019-nCoV RT-qPCR引子及探針(E_Sarbeco)在StepOnePlus RealTime PCR System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)上根據製造商之指示來定量。接著將病毒RNA拷貝數對細胞RPL18進行標準化，如先前所述。用於絕對定量之標準曲線係由SARS-CoV-2 RNA之連續稀釋來產生，該RNA係得自選殖為細菌人造染色體且在大腸桿菌增殖之全長病毒基因體。複製競爭性病毒之偵測

使用二重複10倍連續稀釋來判定Vero E6之長滿層中的病毒力價(在Vero E6細胞上之SARS-CoV-2力價分析)。為此，製造樣本(肺組織均質物)之連續稀釋液並在Vero E6單層上在37度下培養2小時。將細胞用含有1.5% Avicel之半固態細胞培養基洗滌及覆蓋，然後在37度下培養48 h，之後將盤用4%福馬林進行固定並用0.75%結晶紫染色以進行斑塊計數。組織病理學

針對由於達到實驗或人道終點之所有動物就所選組織執行組織病理學分析。在用4%福馬林固定48小時後，將來自肺之切片包埋於石蠟中，然後將組織切片染色以用於組織學檢查。結果

此研究之目標在於評估結合蛋白質ALE049及ALE109在COVID-19羅波夫斯基侏儒倉鼠模型中之治療潛力。針對此評估，在用每動物105 PFU進行SARS-CoV-2鼻內攻擊後0、6、或24小時，將倉鼠治療性地用20 mg/kg的結合蛋白質治療。

所有24隻動物(在感染後0、6、或24小時用本發明之結合蛋白質治療)均存活直到犧牲當天(亦即第3或5天)，儘管必須在研究終點(第3天)前將來自安慰劑組之6隻動物中的5隻自研究移出，原因是嚴重的臨床症狀及體重減輕。在五個研究組之各組中判定平均體重。安慰劑組顯示體重持續減輕直到第3天的時點。在此時點只有一隻來自安慰劑組之動物可以繼續進行到第5天以進行進一步評估。所有經測試蛋白質治療之組均未展示出體重減輕或僅展示出極輕微的體重減輕。當比較不同之治療時點時或當比較ALE049與ALE109時，在臨床症狀或體重減輕上未觀察到顯著差異(參見圖36)。大致上，個別動物對病毒感染或治療之反應似乎有一些變異，此導致了相對廣泛分散的體重減輕。

藉由肺均質物之活病毒力價分析及斑塊計數的肺中病毒力價測量證明，在第3天已經可以觀察到活病毒減少(圖37A)。如果治療是在病毒攻擊(0 h時點)後直接開始，針對該時點此現象尤其顯著。再者，病毒攻擊後6 h或24 h投予之使用ALE109的治療注射亦顯示感染性病毒之載量在第3天已經有可觀的降低。此效應對在第5天仍留下之3隻動物而似乎甚至更顯著，其中12隻經結合蛋白質治療之動物中僅有5隻在肺均質物中仍留有可偵測之感染性病毒(圖37B)。病毒RNA基因體拷貝數之減少(如藉由qPCR所偵測)似乎比感染性病毒之消除要明顯來得慢。在第3天，各個0 h時點之3隻動物中僅有1隻顯示肺中病毒RNA減少(圖37C)。在病毒基因體層面上，在感染後第5天在經結合蛋白質治療組與安慰劑組之間才出現更顯著的差異，其中再度針對較早的治療時點可以觀察到較佳病毒基因體RNA減少之趨勢(圖37D)。當在0 h時點比較ALE049與ALE109時，針對ALE049可以觀察到較佳病毒消除之趨勢。

針對不同組織中各種參數之組織病理學評估係以0(無明顯組織病理學徵象)至4(最嚴重組織病理學徵象)之評級來進行評分。針對不同治療組將所有分數平均並分類為四組：i)發炎、ii)血管、iii)肺泡、及iv)支氣管。所有經過平均之參數的加總圖形係提供於圖38A至圖38D。大致上，在所有四個類別中，在經結合蛋白質治療之倉鼠與經安慰劑治療之倉鼠之間觀察到清楚差異。根據組織病理學評估，當與安慰劑組比較時，所有結合蛋白質治療對支氣管(圖38D)、肺泡(圖38C)、及血管(圖38B)中之組織傷害減輕均具有最強的效應，且對發炎細胞(圖38A)之減少具有最低的影響。在所有經結合蛋白質治療之組中，在病毒感染後6 h時點用ALE109治療之組顯示最低的發炎及組織傷害減輕。結論

在105 PFU之病毒接種下，羅波夫斯基侏儒倉鼠模型是相當合適的COVID-19疾病模型，其中未經治療之動物通常會出現達到安樂死標準的強烈臨床症狀。在病毒攻擊後0小時使用ALE049或在病毒攻擊後0、6、或24小時使用ALE109對動物進行治療性治療會導致顯著的嚴重臨床症狀減輕，對於所有結合蛋白質治療組而言都差不多，因此24隻經結合蛋白質治療之動物在第3或5天的規定犧牲時點前均未達到安樂死標準，而針對6隻經安慰劑治療之動物，2隻動物在第2天且其他3隻動物在第3天出現強烈的臨床症狀而必須自研究中移出，只有一隻經安慰劑治療之動物留在研究中直到第5天。

就感染性病毒之病毒載量或病毒基因體拷貝數而言，針對結合蛋白質治療組均觀察到明顯的減少。此減少自第3天增加至第5天，並且較早給予療法之治療組似乎具有減少更顯著的反應。就每個治療組中相當少數目的動物而言，當比較ALE049與ALE109(在0h投予)時，ALE049治療組的反應稍微較佳。

肺中之組織病理學所見顯示當與安慰劑組比較時，所有結合蛋白質治療組之病理學分數均有明顯減少。這些所見似乎與此研究中所測試之治療方案無關。

綜上所述，使用羅波夫斯基侏儒倉鼠模型，ALE049及ALE109均展示出對SARS-CoV-2感染之治療潛力。

參考本說明書內所引用之參考文獻的教示以便最充份瞭解本說明書。本說明書內之實施例提供本發明實施例之說明且不應解讀為限制本發明之範疇。所屬技術領域中具有通常知識者很容易便能認知到本發明涵蓋許多其他實施例。本揭露中所引用之所有出版物、專利、及GenBank序列均以引用方式全文併入。在以引用方式併入之資料與本說明書發生矛盾或不一致的情況下，本說明書將取代任何此類資料。在本文中引用任何參考文獻並非承認此類參考文獻對於本發明而言是先前技術。

所屬技術領域中具有通常知識者將認可或僅使用例行實驗即可確定本文所述之本發明之具體實施例的許多等效物。以下申請專利範圍意欲涵蓋此類等效物。

(無)

〔圖1 〕：顯示不同錨蛋白重複蛋白(DARPin®蛋白質)之建議結合位點的2019-nCoV棘蛋白單元體(protomer)。〔圖2 〕：呈向下構型之2019-nCoV棘蛋白單元體。〔圖3 〕：呈向上構型之2019-nCoV棘蛋白單元體，其顯示hACE2結合位點升高。hACE2被認為會與棘蛋白之向上構型結合，但不與向下構型結合。〔圖4 〕： 2019-nCoV棘蛋白單元體，其指示hACE2結合位點、S1/S2切割位點、及S2’切割位點的位置。在分子成熟期間，棘蛋白會三聚化且在S1/S2位點被切割。其在膜處展示為非共價複合物。棘蛋白之受體結合及蛋白水解處理的協同作用是膜融合所必需的。構型轉變之初始能量障壁是必要的。不希望受理論束縛，此能量障壁係藉由(i)與hACE2受體結合；及(ii)在S2’位點處之蛋白水解促發(proteolytic priming)而克服。據信在宿主細胞表面與ACE2之交互作用會觸發S2’位點之切割。已提出此切割會經由廣泛的不可逆構型改變而活化用於膜融合之蛋白質。〔圖5 〕：各種重組結合蛋白質在100 nM下之SARS-CoV-2 VSV假型(pseudotype)病毒抑制，該等重組結合蛋白質包含結合至棘蛋白之單個錨蛋白重複域(單域及單互補位(mono-paratopic) DARPin®結合蛋白質)。條長度越短指示病毒抑制越強。〔圖6 〕：重組結合蛋白質之代表性SPR(表面電漿共振)跡線，該重組結合蛋白質包含結合至棘蛋白之單個錨蛋白重複域(單域及單互補位DARPin®結合蛋白質)。〔圖7 〕：各種重組結合蛋白質在100 nM下之SARS-CoV-2 VSV假型病毒抑制，該等重組結合蛋白質包含結合至棘蛋白之三個錨蛋白重複域(多域及多互補位DARPin®結合蛋白質)。條長度越短指示病毒抑制越強。〔圖8 〕：各種重組結合蛋白質在1 nM下之SARS-CoV-2 VSV假型病毒抑制，該等重組結合蛋白質包含結合至棘蛋白之三個錨蛋白重複域(多域及多互補位DARPin®結合蛋白質)。條長度越短指示病毒抑制越強。〔圖9a 〕至〔圖9c 〕：重組結合蛋白質之SPR(表面電漿共振)跡線，該重組結合蛋白質包含結合至棘蛋白之單個錨蛋白重複域。四或五個濃度SPR擬合曲線證實這些單域、單互補位DARPin®結合蛋白質之高結合親和力(例如在兩位數pM範圍內)。在圖9c中，上圖代表SEQ ID NO: 9，且下圖代表SEQ ID NO: 10。〔圖10 〕：顯示GFP陽性Vero E06細胞之螢光顯微術影像，該等細胞被經GFP標示之VSV假型SARS-CoV-2病毒感染。DARPin®建構體ALE043 (SEQ ID NO: 25)及vS07_M101E04在孔1(在100 nM濃度下)及孔6(在3.125 nM下)中未顯示任何受感染細胞，而Vero E06細胞則有感染，且針對同型陰性對照組(his標記MP0250)在孔1及孔6中可見到經GFP標示之VSV假型SARS-CoV-2病毒。在較低的DARPin®蛋白質濃度下在孔12 (0.049 nM)中，針對所有建構體均可見到受感染Vero E06細胞(GFP陽性)。〔圖11 〕： VSV假型SARS-CoV-2病毒受多域DARPin®結合蛋白質之中和。受測建構體(ALE030、ALE031等)之名稱係在圖式中標出。〔圖12 〕： VSV假型SARS-CoV-2病毒受多域DARPin®結合蛋白質之中和。受測建構體(ALE030、ALE033等)之名稱係在圖式中標出。〔圖13 〕：實例4中所使用之測試盤的圖像，其中有在邊緣周圍之邊界區及針對0.0064至100 nm之各稀釋值的三重複孔、及對照孔。〔圖14a 〕至〔圖14f 〕：獲自實例4之測試盤的照片。〔圖15a 〕至圖15b 〕： ALE033之表徵(參見表5，樣本3)。圖15a係SPR(表面電漿共振)跡線，其顯示與冠狀病毒棘蛋白之高親和力結合。未觀察到目標結合隨時間喪失。圖15b顯示粒徑篩析層析法(SEC)曲線(莫耳質量對時間)。未觀察到聚集物或寡聚物。在CD(圓二色性)光譜(未提供)上一直到85℃均未偵測到展開(unfolding)。〔圖16 〕： ALE030之SPR(表面電漿共振)跡線(參見表5，樣本1)。〔圖17 〕： ALE038之SPR(表面電漿共振)跡線(參見表5，樣本7)。〔圖18a 〕至〔圖18d 〕：獲自實例5之測試盤的照片。〔圖19 〕：如使用CellTiter-Glo®發光細胞活力檢定(Promega)所測量之細胞保護，參見實例7。〔圖20 〕：在結晶紫染色後獲得之測試盤的照片，參見實例8。〔圖21a 〕至〔圖21c 〕：如使用CellTiter-Glo®發光細胞活力檢定(Promega)所測量之細胞保護，參見實例8。〔圖22a 〕至〔圖22b 〕： (A) ALE049(黃色：HSA結合域；青色、藍色、及洋紅色：RBD結合域)與SARS-CoV-2之棘外域(灰色)結合之分子模型。(B) ALE058(黃色：HSA結合域；藍色：RBD結合域；綠色：S1-NTD結合域；紅色：S2結合域)與SARS-CoV-2之棘外域(灰色)結合之分子模型。〔圖23 〕：使用多特異性結合蛋白質ALE049及ALE058進行之SARS-CoV-2 VSV假型病毒中和，參見實例8。〔圖24 〕：如實例9中所使用之ELISA方法。〔圖25 〕： ALE033、ALE048、及ALE049之平均血清濃度數據，參見實例9。〔圖26a 〕至〔圖26e 〕： ALE049在預防性敘利亞黃金倉鼠模型中治療SARS-CoV-2感染之功效，參見實例10。〔圖27 〕：在第4天採取之倉鼠肺組織的代表性組織病理學顯微鏡照片。左圖：用1600 µg ALE049治療之動物的健康倉鼠肺組織(第1組)；右圖：接受安慰劑注射之動物的患病肺組織(第4組)。〔圖28 〕：實例11及12中所評估之SARS-CoV-2棘蛋白突變的結構視覺化。A)完整三聚體SARS-CoV-2棘蛋白之表示圖，其中在假病毒(Pseudovirus)中和檢定中分析之所有殘基係視覺化為藍色球體。ALE049及ALE109中所併入之個別DARPin®域之結合區係著色為藍色(RBD)、綠色(NTD)、及紅色(S2)；B)代表在UK B.1.1.7中首次識別出來之變體的單體棘蛋白結構(del69-70, del145, N501Y, A570D, D614G, P681H, T716I, S982A, D1118H)；C)代表在南非B.1.351中首次識別出來之變體的單體棘蛋白結構(D80A, D215G, E484K, N501Y, A701V)。PDB檔案6xcn係用於使用PyMol第2.1.1版(Schrödinger, LLC)產生圖式。為了視覺化所有突變，用BIOVIA Discovery Studio軟體中所包括的MODELLER將環518-520、676-689、811-813、及cryo-EM結構中遺失之NTD域的區域建模，並使用PDB檔案6zge作為NTD域之模版(BIOVIA, Dassault Systèmes, BIOVIA Discovery Studio 2021)。〔圖29 〕： (A)針對剔除實驗所產生之ALE109建構體的視覺表示圖。針對各個剔除(k.o.)建構體，將所指示之SARS-CoV-2-結合DARPin®域置換為非結合DARPin®域。HSA：HSA結合DARPin®域，RBD：RBD-結合DARPin®域，NTD：NTD結合DARPin®域，S2：S2結合DARPin®域，參見實例11。(B) ALE109及k.o.建構體針對表現野生型棘蛋白之VSV-SARS-CoV-2假病毒的中和曲線。(C)上圖：DARPin®分子對SARS-CoV-2 (100 pfu)介導之細胞病變效應的保護效應。所描繪的是由ALE109或k.o.建構體賦予之細胞保護百分比。細胞保護係在3天培養後藉由在細胞活力檢定中使用Cell Titer-Glo測量胞內ATP水平來判定。下圖：藉由即時RT-PCR定量之SARS-CoV-2病毒複製抑制，其係以存在於Vero E6細胞之上清液中的病毒基因體當量百分比表示，該等細胞係暴露於100 pfu SARS-CoV-2及增量的ALE109或k.o.建構體。(D)所分析建構體之IC₅₀ /EC₅₀ 值及效價評級。〔圖30 〕：實例12之程序的示意圖。〔圖31 〕：顯示實例12中所觀察到之細胞病變效應的表。DARPin®結合蛋白質R1b在此圖中稱為RBD-2。〔圖32 〕： VSV假型SARS-CoV-2病毒受多域DARPin®結合蛋白質之中和。受測建構體(ALE049、ALE058等)之名稱係在圖式中標出。〔圖33 〕： ALE058在BALB/c小鼠中在投予1 mg/kg後之平均血清濃度-時間曲線。〔圖34 〕： ALE109、ALE126、ALE129、及ALE133在BALB/c小鼠中在投予1 mg/kg後之平均血清濃度-時間曲線。〔圖35 〕示意性研究概要。每日測量體重及體溫，且自各組3隻動物收集拭子、血液、及組織，分別在第3天及第5天將動物安樂死。〔圖36 〕在第0天至第5天之時程內所有五個研究組之體重測量的平均值及SEM。〔圖37A 〕至〔圖37D 〕：各個時點對三隻動物進行之病毒定量，其係藉由在第3天(A)及在第5天(B)肺均質物之活病毒力價分析(titration)及藉由在第3天(C)及在第5天(D) qPCR測量肺中基因體拷貝數。〔圖38A 〕至〔圖38D 〕：平均後組織病理學分數之總和，該等分數係針對發炎(A)、受影響血管(B)、肺泡(C)、或支氣管(D)之徵象分成四個類別。

(無)

Claims

一種重組結合蛋白質，其包含第一錨蛋白重複域，其中該第一錨蛋白重複域包含與選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組的錨蛋白重複域具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。
如請求項1之重組結合蛋白質，其中該第一錨蛋白重複域包含與選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組的錨蛋白重複域具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。
如請求項1之重組結合蛋白質，其中該第一錨蛋白重複域係選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組。
如請求項1至3中任一項之重組結合蛋白質，其進一步包含第二錨蛋白重複域，其中該第二錨蛋白重複域包含與選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組的錨蛋白重複域具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。
如請求項4之重組結合蛋白質，其中該第二錨蛋白重複域包含與選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組的錨蛋白重複域具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。
如請求項4之重組結合蛋白質，其中該第二錨蛋白重複域係選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組。
如請求項4至6中任一項之重組結合蛋白質，其進一步包含第三錨蛋白重複域，其中該第三錨蛋白重複域包含與選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組的錨蛋白重複域具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。
如請求項7之重組結合蛋白質，其中該第三錨蛋白重複域包含與選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組的錨蛋白重複域具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。
如請求項7之重組結合蛋白質，其中該第三錨蛋白重複域係選自由SEQ ID NO 1至11、76、77、及85所組成之群組。
如請求項7之重組結合蛋白質，其中該第一、第二、及第三錨蛋白重複域包含胺基酸序列且自N端至C端係排列如下： (i)與SEQ ID NO 6、1、及3具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (ii)與SEQ ID NO 4、2、及1具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (iii)與SEQ ID NO 4、6、及3具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (iv)與SEQ ID NO 6、3、及6具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (v)與SEQ ID NO 7、3、及6具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (vi)與SEQ ID NO 8、4、及1具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (vii)與SEQ ID NO 3、6、及7具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (viii)與SEQ ID NO 4、1、及8具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (ix)與SEQ ID NO 3、6、及9具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (x)與SEQ ID NO 9、3、及6具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xi)與SEQ ID NO 1、6、及9具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xii)與SEQ ID NO 9、6、及1具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xiii)與SEQ ID NO 6、9、及10具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xiv)與SEQ ID NO 3、9、及11具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xv)與SEQ ID NO 10、9、及6具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xvi)與SEQ ID NO 11、9、及3具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xvii)與SEQ ID NO 5、1、及3具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xviii)與SEQ ID NO 1、2、及5具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xix)與SEQ ID NO 3、5、及6具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xx)與SEQ ID NO 6、3、及5具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxi)與SEQ ID NO 7、3、及5具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxii)與SEQ ID NO 8、5、及6具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxiii)與SEQ ID NO 6、10、及11具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxiv)與SEQ ID NO 3、10、及10具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxv)與SEQ ID NO 5、6、及9具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxvi)與SEQ ID NO 9、3、及5具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxvii)與SEQ ID NO 9、6、及5具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxviii)與SEQ ID NO 5、9、及10具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxix)與SEQ ID NO 6、9、及11具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxx)與SEQ ID NO 10、9、及5具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxxi)與SEQ ID NO 11、9、及6具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列； (xxxii)與SEQ ID NO 3、76、及77具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列；或(xxxiii)與SEQ ID NO 3、85、及77具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。
如請求項7至10中任一項之重組結合蛋白質，其中該結合蛋白質包含多肽，其中該多肽具有與選自由SEQ ID NO: 68、69、79、及89至91所組成之群組的序列具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。
如請求項1至11中任一項之重組結合蛋白質，其中該結合蛋白質結合至冠狀病毒棘蛋白。
如請求項12之重組結合蛋白質，其中該棘蛋白係SARS-CoV-2棘蛋白。
如請求項12或13之重組結合蛋白質，其中該第一、第二、及/或第三錨蛋白重複域以約100 nM或更低之解離常數(K_D )結合該冠狀病毒棘蛋白。
一種重組結合蛋白質，其包含至少一個錨蛋白重複域，其中該錨蛋白重複域以約100 nM或更低之解離常數(K_D )結合冠狀病毒棘蛋白。
如任何前述請求項之重組結合蛋白質，其進一步包含至少一個血清白蛋白結合域。
如請求項16之重組結合蛋白質，其中該血清白蛋白結合域包含與選自由SEQ ID NO: 47至49所組成之群組的序列具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。
一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中該多肽具有與選自由SEQ ID NO: 12至42、75、84、87、及88所組成之群組的序列具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。
如請求項18之重組結合蛋白質，其中該多肽具有與SEQ ID NO: 31具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。
如請求項18之重組結合蛋白質，其中該多肽具有與SEQ ID NO: 39具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。
如請求項18之重組結合蛋白質，其中該多肽具有與SEQ ID NO: 75具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。
如請求項18之重組結合蛋白質，其中該多肽具有與SEQ ID NO: 84具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。
如請求項18之重組結合蛋白質，其中該多肽具有與SEQ ID NO: 87具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。
如請求項18之重組結合蛋白質，其中該多肽具有與SEQ ID NO: 88具有至少約90%序列同一性之胺基酸序列。
如請求項18之重組結合蛋白質，其中該多肽具有與選自由SEQ ID NO: 12至42、75、84、87、及88所組成之群組的序列具有至少約95%序列同一性之胺基酸序列。
如請求項18之重組結合蛋白質，其中該多肽具有選自由SEQ ID NO: 12至42、75、84、87、及88所組成之群組的胺基酸序列。
一種重組結合蛋白質，其包含多肽，其中該多肽具有SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 84、SEQ ID NO: 87、或SEQ ID NO: 88之胺基酸序列。
如請求項18至27中任一項之重組結合蛋白質，其中該結合蛋白質結合至冠狀病毒棘蛋白。
如請求項28之重組結合蛋白質，其中該棘蛋白係SARS-CoV-2棘蛋白。
如請求項28或29之重組結合蛋白質，其中該結合蛋白質以約100 nM或更低之解離常數(K_D )結合該冠狀病毒棘蛋白。
如請求項1至30中任一項之重組結合蛋白質，其中該結合蛋白質能夠抑制由冠狀病毒所致之細胞感染。
如請求項1至30中任一項之重組結合蛋白質，其中該結合蛋白質能夠抑制由SARS-CoV-2所致之細胞感染。
一種核酸，其編碼如請求項1至32中任一項之重組結合蛋白質。
如請求項33之核酸，其中該核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 70或編碼與SEQ ID NO 70相同之胺基酸序列的其變體。
如請求項33之核酸，其中該核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 71或編碼與SEQ ID NO 71相同之胺基酸序列的其變體。
如請求項33之核酸，其中該核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 72或編碼與SEQ ID NO 72相同之胺基酸序列的其變體。
如請求項33之核酸，其中該核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 73或編碼與SEQ ID NO 73相同之胺基酸序列的其變體。
如請求項33之核酸，其中該核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 74或編碼與SEQ ID NO 74相同之胺基酸序列的其變體。
如請求項33之核酸，其中該核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 80或編碼與SEQ ID NO 80相同之胺基酸序列的其變體。
如請求項33之核酸，其中該核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 81或編碼與SEQ ID NO 81相同之胺基酸序列的其變體。
如請求項33之核酸，其中該核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 82或編碼與SEQ ID NO 82相同之胺基酸序列的其變體。
如請求項33之核酸，其中該核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 83或編碼與SEQ ID NO 83相同之胺基酸序列的其變體。
如請求項33之核酸，其中該核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 78或編碼與SEQ ID NO 78相同之胺基酸序列的其變體。
如請求項33之核酸，其中該核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 86或編碼與SEQ ID NO 86相同之胺基酸序列的其變體。
如請求項33之核酸，其中該核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 92或編碼與SEQ ID NO 92相同之胺基酸序列的其變體。
如請求項33之核酸，其中該核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 93或編碼與SEQ ID NO 93相同之胺基酸序列的其變體。
如請求項33之核酸，其中該核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 94或編碼與SEQ ID NO 94相同之胺基酸序列的其變體。
如請求項33之核酸，其中該核酸包含下列或由下列所組成：SEQ ID NO 95或編碼與SEQ ID NO 95相同之胺基酸序列的其變體。
一種宿主細胞，其包含如請求項33至48中任一項之核酸分子。
一種製造如請求項1至32中任一項之重組結合蛋白質的方法，其包含在使該重組結合蛋白質表現之條件下培養如請求項49之宿主細胞。
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至32中任一項之結合蛋白質或如請求項33至48中任一項之核酸、及醫藥上可接受之載劑或賦形劑。
一種治療對象之冠狀病毒感染的方法，該方法包含以下步驟：向有需要之對象投予有效量的至少一種如請求項1至32中任一項之結合蛋白質、或如請求項33至48中任一項之核酸、或如請求項51之醫藥組成物。
一種預防對象之冠狀病毒感染的方法，該方法包含以下步驟：向有需要之對象投予有效量的至少一種如請求項1至32中任一項之結合蛋白質、或如請求項33至48中任一項之核酸、或如請求項51之醫藥組成物。
一種偵測對象之冠狀病毒感染的方法，該方法包含： a)自對象獲得樣本； b)使該樣本與至少一種如請求項1至32中任一項之結合蛋白質接觸；及 c)偵測冠狀病毒感染之存在。
如請求項52至54中任一項之方法，其中該冠狀病毒感染係由SARS-CoV-2造成。
如請求項52至55中任一項之方法，其中該對象係人類。