KR20230170918A - 펩티드 및 펩티드를 포함하는 조성물 - Google Patents

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게이 스도
나오코 나카무라
고지 요시다
요시아키 시마다
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요시아키 마스다
나오코 이와타
노조미 시와
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다다키 스즈키
히데토모 기타무라
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펩티에이드 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은, 펩티드 및 당해 펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 펩티드는, 이하의 아미노산 서열 : MeA-MeF-S-Cha-Y-S-Y-Y-R-R-Cha-C (서열 번호 2), 혹은, 상기 아미노산 서열의 1 번째, 2 번째, 3 번째, 4 번째, 5 번째, 6 번째, 7 번째, 8 번째, 9 번째 및 10 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 그룹에서 선택되는, 1-10 개의 아미노산 잔기에 있어서, 치환, 부가, 결실 또는 삽입을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.

Description

펩티드 및 펩티드를 포함하는 조성물
본 발명은, 펩티드 및 당해 펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
신형 코로나바이러스 감염증 (COVID-19) 은, SARS 코로나바이러스 2 (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 ; SARS-CoV-2) 에 의해 야기되어 2020년 초두에 세계적인 감염 (팬데믹) 에 이른 질병이다. 2020년 12월 상순에 있어서의 전 세계 사망자수는 156 만명을 초과하여, 대책이 세계적인 급무가 되고 있다.
SARS-CoV-2 는, SARS 코로나바이러스나 MERS 코로나바이러스 (MERS-CoV) 와 동일한 베타 코로나바이러스속에 속하는 신종 바이러스로, 전 세계에서 유효한 치료제나 예방약을 찾아내기 위해 연구가 시급하다. 현재 약물 요법에 사용 가능한 약제로서 예시되고 있는 것이, 항바이러스약 (렘데시비르나 파비피라비르), 항염증제 (덱사메타손이나 스타틴), 표적 면역 조정약 요법 (토실리주맙, 사릴루맙 등) 이다 (비특허문헌 1). 그러나, 이들 약제는 원래, 다른 질병에 대한 치료에 개발된 것으로, 코로나바이러스 감염증을 주요한 치료 타깃으로 하고 있지 않은 것이 많다. 예를 들어, 렘데시비르에 대해서는 필로바이러스의 일종인 에볼라 바이러스에 의해 야기되는 에볼라 출혈열의 치료약으로서 개발되었지만, 코로나바이러스를 포함하는 1 본쇄 RNA 바이러스에 항바이러스 활성을 나타내기 때문에, COVID-19 에 대한 치료약으로서 특례 승인을 얻은 것이다. 그 때문에, 환자에 따라서는 투여해도 증상의 개선이 보이지 않는 경우나, 부작용을 일으키는 경우도 있어, 문제가 되고 있다. 또한 최근, COVID-19 의 계기가 된 우한형 SARS-CoV-2 로부터 변이된 유럽형, 브라질형, 남아프리카형 등의 변이 바이러스주가 발견되고 있어, 이들 종래의 약제가 변이형 바이러스에 대해서도 효과가 있는지 여부는 연구가 기대되고 있는 바이다.
또한, SARS-CoV-2 에 대한 백신으로는 mRNA 백신인 「코미나티」(코로나바이러스 수식 우리딘 RNA 백신) 가 2020년 12월에 일본에 있어서도 승인을 얻어, 접종을 서두르고 있다. 그러나, 백신이기 때문에 이환되고 나서의 치료약으로서의 효과는 기대할 수 없다. 또한, 남아프리카형 변이 바이러스에 대해서는 효과가 저하된다는 지적도 있기 때문에 (비특허문헌 2), 여전히 코로나바이러스에 대한 예방 또는 치료약의 개발이 요구되고 있다.
신형 코로나바이러스 감염증 진료 입문 p.37-44 (2021년도 제4.2판) New England Journal of Medicine, Liu et al., Neutralizing Activity of BNT162b2-Elicited Serum Preliminary Report (DOI : 10.1056/NEJMc2102017) Ujiike M., and Taguchi T., Viruses. 2015 Apr 3 ; 7(4) : 1700-1725. Yuan H. et. al., Acta Pharmacol Sin. 2020 Sep ;　41(9) : 1141-1149.
본 발명자들이, 코로나바이러스에 대한 예방 또는 치료약을 제공하기 위하여 예의·연구에 노력한 결과, 본 발명에 상도하였다. 본 발명은, 펩티드 및 당해 펩티드를 포함하는 조성물, 특히 항 SARS-CoV-2 바이러스 활성을 갖는 펩티드, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 조성물, SARS-CoV-2 바이러스 감염증을 진단하기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 본 발명의 펩티드와 다른 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약제를 포함하는, 조합제를 제공한다.
비한정적으로, 본 출원은 이하의 발명을 포함한다.
[1]
이하의 아미노산 서열 :
MeA-MeF-S-Cha-Y-S-Y-Y-R-R-Cha-C (서열 번호 2)
혹은, 상기 아미노산 서열의 1 번째, 2 번째, 3 번째, 4 번째, 5 번째, 6 번째, 7 번째, 8 번째, 9 번째 및 10 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 그룹에서 선택되는, 1-10 개의 아미노산 잔기에 있어서, 치환, 부가, 결실 또는 삽입을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 펩티드.
[2]
이하의 아미노산 서열 :
MeA-MeF-S-Cha-Y-S-Y-Y-R-R-Cha-C (서열 번호 2)
혹은, 상기 아미노산 서열의 1 번째, 2 번째, 3 번째, 5 번째, 6 번째, 8 번째, 9 번째 및 10 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 그룹에서 선택되는, 1-8 개의 아미노산 잔기에 있어서, 치환, 부가, 결실 또는 삽입을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 펩티드.
[3]
이하의 아미노산 서열 :
X1-X2-X3-Cha-X4-X5-Y-X6-X7-X8-Cha-C (서열 번호 1)
여기에 있어서,
X1 은, A, E, MeA, 또는 MeE 이고 ;
X2 는, N-메틸아미노산이고 ;
X3 은, S 또는 Aib 이고 ;
X4 는, 비치환의 혹은 치환된 방향 고리를 측사슬에 갖는 아미노산이며 ;
X5 는, 임의의 아미노산이고 ;
X6 은, 비치환의 혹은 치환된 방향 고리를 측사슬에 갖는 아미노산이며 ;
X7 은, 임의의 아미노산이고 ;
X8 은, 임의의 염기성 아미노산이다,
을 포함하는, 펩티드.
[4]
X1 이, MeA 또는 MeE 인, [3] 에 기재된 펩티드.
[5]
X2 가, MeF 또는 MeNle 인, [3] 또는 [4] 에 기재된 펩티드.
[6]
X4 가, 비치환의 혹은 치환된 Y, 또는, 비치환 혹은 치환된 F 인, [3] - [5] 중 어느 한 항에 기재된 펩티드.
[7]
X4 가, Y 또는 F4F 인, [3] - [6] 중 어느 한 항에 기재된 펩티드.
[8]
X5 가, 임의의 친수성 아미노산 또는 Aib, 혹은 N-메틸화된 임의의 친수성 아미노산 또는 Aib 인, [3] - [7] 중 어느 한 항에 기재된 펩티드.
[9]
X5 가, Aib, E, K, S, dd, ddap, ds, MeE 의 어느 것인, [3] - [8] 중 어느 한 항에 기재된 펩티드.
[10]
X6 이, 비치환의 혹은 치환된 Y, 또는, 비치환 혹은 치환된 F 인, [3] - [9] 중 어느 한 항에 기재된 펩티드.
[11]
X6 이, Y, Yae, 3Py, Nal1 의 어느 것인, [3] - [10] 중 어느 한 항에 기재된 펩티드.
[12]
X7 이, A, Ahp, Cit, Dab, E, F4COO, K, R 의 어느 것인, [3] - [11] 중 어느 한 항에 기재된 펩티드.
[13]
X8 이, K, R, A4p 의 어느 것인, [3] - [12] 중 어느 한 항에 기재된 펩티드.
[14]
C 말단에, 추가로 D-글루타민산을 포함하는, [1] - [13] 중 어느 한 항에 기재된 펩티드.
[15]
서열 번호 2-126, 132-234 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이루어지는, [1] - [14] 중 어느 한 항에 기재된 펩티드.
[16]
고리형 펩티드인, [1] - [15] 중 어느 한 항에 기재된 펩티드.
[17]
클로로아세틸화한 아미노산과, 상기 펩티드에 포함되는 시스테인 잔기가 결합된 고리형 구조를 갖는, [16] 에 기재된 펩티드.
[18]
추가로, 부가적인 아미노산 잔기를 포함하는, [1] - [17] 중 어느 한 항에 기재된 펩티드.
[19]
[1] - [17] 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 포함하는, 의약 조성물.
[20]
항 SARS-CoV-2 바이러스 활성을 갖는, [19] 에 기재된 의약 조성물.
[21]
코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한, [19] 또는 [20] 에 기재된 의약 조성물.
[22]
코로나바이러스 감염증이 COVID-19 인, [19] - [21] 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물.
[23]
[1] - [17] 중 어느 한 항에 기재된 펩티드의 약학상 허용되는 염, 또는 그 용매화물을 포함하는, [19] - [22] 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물.
[24]
[1] - [17] 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 포함하는, SARS-CoV-2 바이러스 감염증을 진단하기 위한 진단용 조성물.
[25]
코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 다른 약제와 병용되는, [19] - [23] 중 어느 한 항에 기재된 의약 조성물.
[26]
코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 다른 약제가, 렘데시비르, 카시리비맙과 임데비맙의 병용제, 및 몰누피라비르 혹은 그 활성체로 이루어지는 군에서 선택되는, [25] 에 기재된 의약 조성물.
[27]
코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 다른 약제와 동시 투여되는, [24] 또는 [26] 에 기재된 의약 조성물.
[28]
[1] - [17] 중 어느 한 항에 기재된 펩티드와, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 다른 약제를 포함하는, 조합제.
[29]
[1] - [17] 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 포함하는, 의약 조성물과 병용되는, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 다른 약제.
본 발명에 관련된 펩티드에 의하면, 항 SARS-CoV-2 활성을 갖기 때문에, COVID-19 의 예방 또는 치료용 화합물로서 유용하다. 또한, 본 발명의 펩티드는, SARS-CoV-2 에 결합하기 때문에, 진단약으로도 유용하다. 또한, 본 발명의 펩티드는 다른 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약제와 병용함으로써, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료의 보다 높은 효과를 나타낸다.
도 1a 는, 세포 배양 상청 중의 바이러스 RNA 량 측정에 의한, 고리형 펩티드의 각종 변이 바이러스주에 대한 항바이러스 활성 측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1b 는, 세포 배양 상청 중의 바이러스 RNA 량 측정에 의한, 고리형 펩티드의 각종 변이 바이러스주에 대한 항바이러스 활성 측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1c 는, 세포 배양 상청 중의 바이러스 RNA 량 측정에 의한, 고리형 펩티드의 각종 변이 바이러스주에 대한 항바이러스 활성 측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 1d 는, 세포 배양 상청 중의 바이러스 RNA 량 측정에 의한, 고리형 펩티드의 각종 변이 바이러스주에 대한 항바이러스 활성 측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a 는, 마우스 SARS-CoV-2 감염 치사 모델에 있어서의 5555＿p020 및 5555＿p028 의 중증화 저지 효과를 나타내는 그래프이다.
도 2b 는, 마우스 SARS-CoV-2 감염 치사 모델에 있어서의 5555＿p020 및 5555＿p028 의 치사율 개선 효과를 나타내는 그래프이다.
도 3 은, 마우스 SARS-CoV-2 감염 치사 모델의 관찰 종료시의 폐 조직상을 나타내는, 도면을 대신하는 사진이다. 사진의 스케일 바는 200 ㎛ 를 나타낸다. 사진 중의 A1 은 폐포, Br 은 세기관지, V 는 혈관을 나타낸다.
도 4 는, SARS-CoV-2 감염에 의한 폐렴에 대한 5555＿p028 의 억제 작용을 나타내는, 도면을 대신하는 사진 (폐후엽의 조직상) 이다. 사진의 스케일 바에 대하여, a, c, e, g 는 2.0 mm, b, d, f, h 는 100 ㎛ 를 나타낸다. a, b 는 용매 대조군, c, d 는 5555＿p028 의 25 mg/Kg 군, e, f 는 5555＿p028 의 5 mg/Kg 군, g, h 는 5555＿p028 의 1 mg/Kg 군에서의 결과를 나타낸다.
도 5a 는, 세포 배양 상청 중의 바이러스 RNA 량 측정에 의한, 고리형 펩티드와 기존의 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는 화합물을 조합한 경우의 우한주에 대한 항바이러스 활성 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5b 는, 세포 배양 상청 중의 바이러스 RNA 량 측정에 의한, 고리형 펩티드와 기존의 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는 화합물을 조합한 경우의 우한주에 대한 항바이러스 활성 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5c 는, 세포 배양 상청 중의 바이러스 RNA 량 측정에 의한, 고리형 펩티드와 기존의 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는 화합물을 조합한 경우의 우한주에 대한 항바이러스 활성 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5d 는, 세포 배양 상청 중의 바이러스 RNA 량 측정에 의한, 고리형 펩티드와 기존의 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는 화합물을 조합한 경우의 델타주에 대한 항바이러스 활성 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5e 는, 세포 배양 상청 중의 바이러스 RNA 량 측정에 의한, 고리형 펩티드와 기존의 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는 화합물을 조합한 경우의 델타주에 대한 항바이러스 활성 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5f 는, 세포 배양 상청 중의 바이러스 RNA 량 측정에 의한, 고리형 펩티드와 기존의 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는 화합물을 조합한 경우의 델타주에 대한 항바이러스 활성 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5g 는, 세포 배양 상청 중의 바이러스 RNA 량 측정에 의한, 고리형 펩티드와 기존의 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는 화합물을 조합한 경우의 오미크론주에 대한 항바이러스 활성 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5h 는, 세포 배양 상청 중의 바이러스 RNA 량 측정에 의한, 고리형 펩티드와 기존의 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는 화합물을 조합한 경우의 오미크론주에 대한 항바이러스 활성 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
1. 약어
본 명세서에 있어서, 특별히 명기하지 않는 한, 이하의 약어는 하기의 의미로 사용된다.
약어 (일반)
Å : 옹스트롬 (단위) ;
AA : 아미노산 ;
Alloc : 알릴옥시카르보닐 ;
ClAc : 클로로아세틸 ;
DCM : 디클로로메탄 ;
DIC : N,N'-디이소프로필카르보디이미드 ;
DMSO : 디메틸술폭사이드 ;
DMF : 디메틸포름아미드 ;
DIPEA 혹은 DIEA : N,N-디이소프로필에틸아민 ;
DODT : 6-디옥사-1,8-옥탄-디티올 ;
FAM : 플루오레세인 ;
Fmoc : 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 ;
Fmoc-Lys(Fmoc)-OH : N2, N6-비스(((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)-L-리신 ;
g : 그램 (단위) ;
HATU : O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로인산염 ;
HOSu : N-하이드록시숙신이미드 ;
HPLC : 고속 액체 크로마토그래피 ;
LC-MS 또는 LC/MS : 액체 크로마토그래피 질량 분석계 ;
MeCN : 아세토니트릴 ;
mL : 밀리리터 (단위) ;
M : 몰랄 (단위) ;
μL : 마이크로리터 ;
mM : 밀리몰랄 (단위) ;
μM : 마이크로몰랄 (단위) ;
mg : 밀리그램 (단위) ;
mm : 밀리미터 (단위) ;
Mpe : 3-(3-메틸)펜틸 ;
nm : 나노미터 (단위) ;
nM : 나노몰랄 (단위) ;
Oxyma pure : 시아노(하이드록시이미노)아세트산에틸 ;
rpm : 회전 매분 (단위) ;
TAMRA : 5-카르복시테트라메틸로다민 ;
tBu : 터셔리부틸 ;
TFA : 트리플루오로아세트산 ;
TIS : 트리이소프로필실란 ;
Trt 또는 Tr : 트리틸기 ;
MOI (multiplicity of infection) : 감염 다중도 ;
RBD (receptor binding domain) : 수용체 결합 도메인 ;
(실시예에 기재되어 있는 「항 SARS-CoV-2 항체 칵테일 제제 (카시리비맙·임데비맙 ; REGN-COV2)」는, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 수용체 결합 도메인 (RBD) 을 표적으로 하는 2 종의 인간 IgG1 중화 항체 (카시리비맙과 임데비맙의 칵테일이다))
RT-qPCR : 리얼타임 정량 PCR ;
HE 염색 : 헤마톡실린-에오진 염색 ;
EDTA : 에틸렌디아민 4 아세트산 ;
PBS : 인산 완충 생리 식염수 ;
Pd(OAc)2 : 아세트산팔라듐 (II) ;
PPh3 : 트리페닐포스핀 ;
PhSiH3 : 페닐실란 ;
FBS : 소 태아 혈청 ;
CPE (cytopathic effect) : 세포 변성 효과 ;
(바이러스 침입에 의해 야기되는 숙주 세포의 형태 변화)
IC50 (half maximal (50 ％) inhibitory concentration) : 50 ％ 저해 농도
CC50 (half cytotoxic concentration) : 50 ％ 세포 독성 농도
WRCEVA : The World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses
약어 (비천연 아미노산)
3Py : 3-피리딜-L-알라닌 (CAS No. 64090-98-8) ;
A4p : (S)-2-아미노-3-(피페리딘-4-일)프로판산 (CAS No. 342036-77-5) ;
A4pipaa : 4-아미노-1-(카르복시메틸)피페리딘-4-카르복실산 (키시다 화학) ;
Ahp : (S)-2-아미노헵탄산 (CAS No. 44902-02-5) ;
Aib : α-메틸알라닌 (CAS No. 62-57-7) ;
Aind : (S)-2-아미노-3-(2,3-디하이드로-1H-인덴-2-일)프로판산 (CAS No. : 736122-13-7) ;
aMeS : 2-메틸세린 ;
Cha : β-시클로헥실-L-알라닌 (CAS No. 27527-05-5)
Cit : (S)-2-아미노-5-우레이도펜탄산 (CAS No. 372-75-8) ;
Dab : L-α,γ-디아미노부탄산 (CAS No. 1758-80-1) ;
dd : D-아스파라긴산 ;
ddap : D-α,β-디아미노프로피온산 (CAS No. 1915-96-4) ;
de : D-글루타민산 ;
dk : D-리신 ;
dr : D-아르기닌 ;
ds : D-세린 ;
F4COO : 4-카르복시-L-페닐알라닌 (CAS No. 126109-42-0) ;
F4F : 4-플루오로-L-페닐알라닌 (CAS No. 1132-68-9) ;
Me : N-메틸 ;
MeA : N-메틸알라닌 ;
Meda : N-메틸-D-알라닌 ;
Medd : N-메틸-D-아스파라긴산 ;
Mede : N-메틸-D-글루타민산 ;
MeF : N-메틸페닐알라닌 ;
MeE : N-메틸글루타민산 ;
MeG : N-메틸글리신 ;
MeNle : N-메틸-L-노르로이신 (CAS No. 17343-27-0) ;
Nal1 : β-(1-나프틸)L-알라닌 (CAS No. 55516-54-6) ;
Yae : (S)-2-아미노-3-(4-(2-아미노에톡시)페닐)프로판산 (CAS No. 1909283-20-0)
Y3Me : (S)-2-아미노-3-(4-하이드록시-3-메틸페닐)프로판산 (CAS No. : 17028-03-4) ;
cC10COO : 12-옥소도데칸산 ;
cC12COO : 14-옥소테트라데칸산 ;
cC14COO : 16-옥소헥사데칸산 ;
cC8COO : 10-옥소데칸산
2. 펩티드 (A)
본 발명은, 펩티드에 관한 것이다.
일 양태에 있어서, 본 발명의 펩티드는 이하의 아미노산 서열 :
MeA-MeF-S-Cha-Y-S-Y-Y-R-R-Cha-C (서열 번호 2)
또는, 상기 아미노산 서열의 1 번째, 2 번째, 3 번째, 4 번째, 5 번째, 6 번째, 7 번째, 8 번째, 9 번째 및 10 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 그룹에서 선택되는, 1-10 개의 아미노산 잔기에 있어서, 치환, 부가, 결실 또는 삽입을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
MeA-MeF-S-Cha-Y-S-Y-Y-R-R-Cha-C (서열 번호 2) 는, 본원 명세서의 실시예에 있어서, SARS-CoV-2 의 스파이크 단백질 (GENE Accession No. YP＿009724390) 에 결합하고, 또한, 항 SARS-CoV-2 활성이 확인된 펩티드이다.
서열 번호 2 의 아미노산 서열의 1 번째, 2 번째, 3 번째, 4 번째, 5 번째, 6 번째, 7 번째, 8 번째, 9 번째 및 10 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 그룹에서 선택되는, 1-10 개의 아미노산 잔기에 있어서, 치환, 부가, 결실 또는 삽입을 갖고 있어도 된다. 바람직하게는, 서열 번호 2 의 아미노산 서열의 1 번째, 2 번째, 3 번째, 5 번째, 6 번째, 8 번째, 9 번째 및 10 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 그룹에서 선택되는, 1-8 개의 아미노산 잔기에 있어서의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입이다. 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입된 아미노산의 수는, 1 개 이상 10 개 이하이면 되고, 그 하한은 1 개이다. 그 상한은 10 개, 9 개, 8 개, 7 개, 6 개, 5 개, 4 개, 3 개, 2 개이며, 최소 1 개이다. 바람직하게는, 아미노산의 「치환」이다. 이러한 아미노산의 치환은, 바람직하게 보존적 아미노산 치환이다.
「보존적 아미노산 치환 (conservative amino acid substitution)」이란, 기능적으로 등가 또는 유사한 아미노산과의 치환을 의미한다. 펩티드에 있어서의 보존적 아미노산 치환은, 당해 펩티드의 아미노산 서열에 정적 변화를 초래한다. 예를 들어, 동일한 극성을 갖는 하나 또는 둘 이상의 아미노산은 기능적으로 등가로 작용하며, 이러한 펩티드의 아미노산 서열에 정적 변화를 초래한다. 일반적으로, 어떤 그룹 내의 치환은 구조 및 기능에 대하여 보존적이라고 생각할 수 있다. 그러나, 당업자에게는 자명한 바와 같이, 특정한 아미노산 잔기가 하는 역할은 당해 아미노산을 포함하는 분자의 삼차원 구조에 있어서의 의미에 있어서 결정될 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기는, 환원형의 (티올) 폼과 비교하여 보다 극성이 낮은, 산화형의 (디술파이드) 폼을 취할 수 있다. 아르기닌 측사슬의 긴 지방족 부분은 구조적 및 기능적으로 중요한 특징을 구성할 수 있다. 또한, 방향 고리를 포함하는 측사슬 (트립토판, 티로신, 페닐알라닌) 은 이온-방향족 상호 작용 또는 양이온-pi 상호 작용에 기여할 수 있다. 이러한 경우에 있어서, 이들 측사슬을 갖는 아미노산을, 산성 또는 비극성 그룹에 속하는 아미노산과 치환해도 구조적 및 기능적으로는 보존적일 수 있다. 프롤린, 글리신, 시스테인 (디술파이드·폼) 등의 잔기는 주사슬의 입체 구조에 직접적인 효과를 줄 가능성이 있어, 종종 구조적 변형없이 치환할 수는 없다.
보존적 아미노산 치환은, 이하에 나타내는 바와 같이, 측사슬의 유사성에 기초하는 특이적 치환 (예를 들어, 레닌저, 생화학, 개정 제2판, 1975년 간행, 73-75 페이지 : Lehninger, Biochemistry, 2 nd edition, pp73-75, Worth Publisher, New York (1975) 에 기재된 치환) 및 전형적 치환을 포함한다.
또한, 보존적 아미노산 치환은, 예를 들면, 이하와 같이 천연의 아미노산을 그 공통되는 측사슬의 성질에 기초하여 나눈 그룹에 있어서, 어떤 아미노산이 속하는 그룹과 동일한 그룹에 속하는 아미노산으로의 치환이 바람직하다.
소수성 (비극성이라고도 한다) 아미노산 : 소수성 (비극성) 을 나타내는 아미노산으로서, 알라닌 (「Ala」또는 간단히 「A」라고도 기재한다), 글리신 (「Gly」또는 간단히 「G」라고도 기재한다), 발린 (「Val」또는 간단히 「V」라고도 기재한다), 류신 (「Leu」또는 간단히 「L」이라고도 기재한다), 이소류신 (「Ile」또는 간단히 「I」라고도 기재한다), 프롤린 (「Pro」또는 간단히 「P」라고도 기재한다), 페닐알라닌 (「Phe」또는 간단히 「F」라고도 기재한다), 트립토판 (「Trp」또는 간단히 「W」라고도 기재한다), 티로신 (「Tyr」또는 간단히 「Y」라고도 기재한다), 메티오닌 (「Met」또는 간단히 「M」이라고도 기재한다) 을 포함한다.
또한, 소수성 아미노산은 또한 이하의 그룹으로 나눌 수도 있다.
지방족 아미노산 : 측사슬에 지방산 또는 수소를 갖는 아미노산으로서, Ala, Gly, Val, Ile, Leu 를 포함한다.
지방족·분기사슬 아미노산 : 측사슬에 분기형 지방산을 갖는 아미노산으로서, Val, Ile, Leu 를 포함한다.
방향족 아미노산 : 측사슬에 방향 고리를 갖는 아미노산으로서, Trp, Tyr, Phe 를 포함한다.
친수성 (극성이라고도 한다) 아미노산 : 친수성 (극성) 을 나타내는 아미노산으로서, 세린 (「Ser」또는 간단히 「S」라고도 기재한다), 트레오닌 (「Thr」또는 간단히 「T」라고도 기재한다), 시스테인 (「Cys」또는 간단히 「C」라고도 기재한다), 아스파라긴 (「Asn」또는 간단히 「N」이라고도 기재한다), 글루타민 (「Gln」또는 간단히 「Q」라고도 기재한다), 아스파라긴산 (「Asp」또는 간단히 「D」라고도 기재한다), 글루타민산 (「Glu」또는 간단히 「E」라고도 기재한다), 리신 (라이신이라고도 기재한다. 「Lys」또는 간단히 「K」라고도 기재한다), 아르기닌 (「Arg」또는 간단히 「R」이라고도 기재한다), 히스티딘 (「His」또는 간단히 「H」라고도 기재한다) 을 포함한다.
또한, 친수성 아미노산은 또한 이하의 그룹으로 나눌 수도 있다.
산성 아미노산 : 측사슬가 산성을 나타내는 아미노산으로서, Asp, Glu 를 포함한다.
염기성 아미노산 : 측사슬이 염기성을 나타내는 아미노산으로서, Lys, Arg, His 를 포함한다.
중성 아미노산 : 측사슬이 중성을 나타내는 아미노산으로서, Ser, Thr, Asn, Gln, Cys 를 포함한다.
또한, Gly 및 Pro 에 대해서는, 「주사슬의 방위에 영향을 주는 아미노산」으로 나눌 수도 있고, 측사슬에 황 분자를 포함하는 아미노산, Cys 및 Met 는, 「함황아미노산」으로 나눌 수도 있다.
본 명세서에 있어서,「아미노산」은, 천연의 아미노산뿐만 아니라, 비천연의 아미노산도 포함한다. 비천연의 아미노산에는, 예컨대, 상기 기재한 천연의 아미노산이 N-알킬화된 N-알킬아미노산, 펩티드 결합을 형성하는 질소가 분기되거나 또는 분기되지 않는 저급 (예컨대, C1-C5 의, 바람직하게는 C1-C3, 보다 바람직하게는 C1) 의 알킬기로 수식된 것이 포함된다. N-알킬아미노산에 있어서는, 바람직하게는 N-에틸아미노산, N-부틸아미노산 또는 N-메틸아미노산이고, 더욱 바람직하게는 N-메틸아미노산이다. 또한, 비천연 아미노산에는, D 형 아미노산 (D-아미노산이라고도 기재한다), β-아미노산, γ-아미노산, 아미노산 변이체, 아미노산 유도체 등의 화학 수식된 아미노산, 노르로이신이나 오르니틴 등의 생체 내에서 단백질의 구성 재료가 되지 않는 아미노산 등이 포함된다. 또한, 천연의 아미노산의 측사슬에 관능기가 추가로 부가되거나 또는 다른 관능기로 치환된 아미노산 (예를 들어, 측사슬의 아릴렌기, 알킬렌기 등의 부분에 치환이나 부가를 갖는 아미노산, 측사슬의 아릴렌기, 알킬렌기나 알킬기의 C 수가 증가한 아미노산, 측사슬의 방향 고리에 치환을 갖는 아미노산이나, 복소 고리화나 축합 고리화한 아미노산 등) 이 포함된다.
또한, 천연의 아미노산의 측사슬에 관능기 등의 구조가 부가 또는 치환되거나 함으로써, 천연의 아미노산과는 상이한 성질을 부여할 수 있다. 예를 들면, A4p 는 알라닌의 측사슬에 피페리딜기를 갖는 아미노산이지만, 당해 피페리딜기가 부가됨으로써, 비극성 아미노산 그룹에 속하는 알라닌과는 달리, 염기성을 갖는 극성 아미노산의 성질을 나타낸다. 즉, 천연의 아미노산을 그 공통되는 측사슬의 성질에 기초하여 나눈, 전술한 그룹에, 동일한 측사슬의 성질을 갖는 비천연 아미노산을 포함시킬 수 있다. 예를 들면, 염기성 아미노산에 속하는 아르기닌의 주사슬 질소 원자가 메틸화된 아미노산인 N-메틸아르기닌 (MeR) 은 비천연 아미노산이지만, 염기성을 나타내기 때문에, 염기성 아미노산으로 분류할 수 있다. 이와 같이, 어떤 아미노산과 동일한 측사슬의 성질을 나타내는 비천연 아미노산에 대해서도, 보존적 아미노산 치환의 대상으로서 포함할 수 있다.
비한정적으로, 비천연의 아미노산에는, N-메틸아미노산, 3Py, A4p, A4pipaa, Ahp, Aib, Aind, aMeS, Cha, Cit, Dab, dd, ddap, dk, dr, ds, F4COO, 4Py, F4F, MeNle, Meda, Medd, Mede, Nal1, Yae, Y3Me 등을 포함한다. 예를 들어, Ahp, Aib, Aind, Cha, MeNle, F4COO, F4F, Nal1, Yae, Y3Me 는 소수성 아미노산으로, 3Py, Cit, A4p, A4pipaa, Dab, ddap, dk, dr, dd, ds 는 친수성 아미노산으로 나눌 수 있고, 또한 Ahp, Aib, Cha, MeNle 는 지방족 아미노산, Cit 는 극성 아미노산, 3Py, A4p, A4pipaa, Dab, ddap, dk, dr 은 염기성 아미노산, dd 는 산성 아미노산, ds 는 중성 아미노산, 4Py, F4COO, F4F, Nal1, Yae, Y3Me 는 방향족 아미노산으로 나눌 수도 있다. 또한, dd, ds 등의 D-아미노산은, D-아미노산으로서 분류할 수도 있지만, 그 측사슬의 성질에 따라 분류할 수도 있고, N-메틸아미노산에 대해서는, N-알킬아미노산으로서 분류할 수도 있고, N-메틸화되어 있지 않은 원래의 아미노산의 측사슬의 성질에 따라 분류할 수도 있다.
일 양태에 있어서, 본 발명의 펩티드는, 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 4 번째의 아미노산 Cha 가 치환되어 있는 펩티드여도 된다. 일 양태에 있어서, 4 번째의 아미노산 Cha 는, Aind 로 치환되어 있어도 된다.
일 양태에 있어서, 본 발명의 펩티드는, 서열 번호 2 로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 7 번째의 아미노산 Y 가 치환되어 있는 펩티드여도 된다. 일 형태에 있어서, 7 번째의 아미노산 Y 는, 치환된 Y, 예를 들어 Y3Me 로 치환되어 있어도 된다.
상기 펩티드는, 비한정적으로, 일 양태에 있어서, C 말단에 추가로 D-글루타민산을 포함해도 된다. 본 명세서에 있어서, 「비한정적으로」, 「일 양태에 있어서」는, 동일한 의미에 이용될 수 있다.
상기 펩티드는, 일 양태에 있어서, 고리형 펩티드이다. 「고리형 펩티드」에 대해서는, 「3. 펩티드 (B)」에서 상세히 서술한다.
상기 펩티드는, 서열 번호 2 에 더하여, 부가적인 아미노산 잔기를 포함해도 된다. 「부가적인 아미노산 잔기」에 대해서는, 「3. 펩티드 (B)」에서 상세히 서술한다.
상기 펩티드는, 바람직하게는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 결합한다. 상기 펩티드는, 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는다. 상기 펩티드는, 바람직하게는 SARS-CoV-2 의 스파이크 단백질에 결합하고, 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는다. 「SARS-CoV-2 의 스파이크 단백질에 결합한다」, 「항 SARS-CoV-2 활성을 갖는다」에 대하여, 「3. 펩티드 (B)」에서 상세히 서술한다.
3. 펩티드 (B)
본 발명은 펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 펩티드는, 이하의 아미노산 서열 :
X1-X2-X3-Cha-X4-X5-Y-X6-X7-X8-Cha-C (서열 번호 1)
여기에 있어서,
X1 은 A, E, MeA 또는 MeE 이고 ;
X2 는, N-메틸아미노산이고 ;
X3 은, S 또는 Aib 이고 ;
X4 는, 비치환의 혹은 치환된 방향 고리를 측사슬에 갖는 아미노산이며 ;
X5 는, 임의의 아미노산이고 ;
X6 은, 비치환의 혹은 치환된 방향 고리를 측사슬에 갖는 아미노산이며 ;
X7 은, 임의의 아미노산이고 ;
X8 은, 임의의 염기성 아미노산이다,
을 포함한다.
비치환의 방향 고리를 측사슬에 갖는 아미노산이란, 측사슬에 방향 고리를 갖는 아미노산으로서, 방향족 아미노산에 속하는 천연의 아미노산, 또는 N-아세틸화된 방향족 아미노산과 같은 비천연 아미노산이나, 천연의 아미노산의 측사슬에 방향 고리가 부가 또는 치환된 아미노산을 포함한다. 또한, 치환된 방향 고리를 측사슬에 갖는 아미노산이란, 측사슬에 방향 고리를 갖는 아미노산으로서, 방향족 아미노산에 속하는 천연 아미노산 또는 N-아세틸화된 방향족 아미노산과 같은 비천연 아미노산이 갖는 방향 고리의 일부 분자가, 다른 분자나 관능기로 치환된 고리나 복소 고리화한 고리를 갖는 아미노산이나, 축합 고리화한 고리를 갖는 아미노산을 포함한다. 예를 들어, Tyr 의 측사슬 하이드록시기에 치환을 갖는 아미노산, Phe 의 벤젠 고리에 치환기를 갖는 아미노산이나, Trp 의 측사슬 인돌 고리에 헤테로 원자를 포함하는 고리를 갖는 아미노산, 치환기를 갖는 아미노산, 그리고 그것들에 관능기가 부가된 아미노산도 포함한다.
X1-X8 의 상기 선택지는 임의의 조합으로 선택할 수 있다.
일 양태에 있어서, X1 이 MeA, MeE 또는 3Py 이다. 일 양태에 있어서, X1 이 MeA 또는 MeE 이다. 일 양태에 있어서, X1 이 3Py 이다.
일 양태에 있어서, X2 가 MeF 또는 MeNle 이다.
일 양태에 있어서, X4 가 비치환의 혹은 치환된 Y, 또는 비치환 또는 치환된 F 이다.
일 양태에 있어서, X4 가 Y 또는 F4F 이다.
일 양태에 있어서, X5 가, 임의의 친수성 아미노산 또는 Aib, 혹은 N-메틸화된 임의의 친수성 아미노산 또는 Aib 이다. 일 양태에 있어서, X5 가, Aib, A4pipaa, E, K, S, P, dd, ddap, ds, de, MeE, MeG, aMeS, Meda, Medd, Mede 의 어느 것이다. 일 양태에 있어서, X5 가, Aib, E, K, S, dd, ddap, ds, MeE 의 어느 것이다. 일 양태에 있어서, X5 가, A4pipaa, P, de, MeG, aMeS, Meda, Medd, Mede 의 어느 것이다.
일 양태에 있어서, X6 이 비치환의 혹은 치환된 Y, 또는 비치환 또는 치환된 F 이다.
일 양태에 있어서, X6 이, Y, Yae, 3Py, Nal1, Y3Me 의 어느 것이다. 일 양태에 있어서, X6 이, Y, Yae, 3Py, Nal1 의 어느 것이다. 일 양태에 있어서, X6 이, Y3Me 이다.
일 양태에 있어서, X7 이, A, Ahp, Cit, Dab, E, F4COO, K, R 의 어느 것이다.
일 양태에 있어서, X8 이, K, R, A4p, dk, dr 의 어느 것이다. 일 양태에 있어서, X8 이, K, R, A4p 의 어느 것이다. 일 양태에 있어서, X8 이, dk, dr 의 어느 것이다.
또한, 일 양태에 있어서, 본 발명의 펩티드는, 서열 번호 1 로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 4 번째의 아미노산 Cha 가 치환되어 있는 펩티드여도 된다. 일 양태에 있어서, 4 번째의 아미노산 Cha 는, Aind 로 치환되어 있어도 된다.
또한, 일 양태에 있어서, 본 발명의 펩티드는, 서열 번호 1 로 나타내는 아미노산 서열에 있어서, 7 번째의 아미노산 Y 가 치환되어 있는 펩티드여도 된다. 일 형태에 있어서, 7 번째의 아미노산 Y 는, 치환된 Y, 예를 들어 Y3Me 로 치환되어 있어도 된다.
또한, 비치환의 Y 란 천연의 아미노산인 티로신이며, 치환된 Y 란, Y 가 측사슬에 갖는 페놀의 하이드록실기가 치환된 Y 의 유도체 아미노산, 복소 고리화한 고리를 갖는 Y 의 유도체 아미노산, 또는 축합 다고리 구조를 갖는 Y 의 유도체 아미노산 등이 포함된다.
또한, 비치환의 F 란 천연의 아미노산인 페닐알라닌이며, 치환된 F 란, 페닐알라닌이 측사슬에 갖는 벤젠 고리에 치환기를 갖는 아미노산, 복소 고리화한 고리를 갖는 F 의 유도체 아미노산, 또는 축합 다고리 구조를 갖는 F 의 유도체 아미노산 등이 포함된다.
X1-X8 의, 상기 일 양태의 선택지는 임의의 조합으로 선택할 수 있다.
상기 펩티드는, 비한정적으로, 일 양태에 있어서, C 말단에 추가로 D-글루타민산을 포함해도 된다. 본 명세서에 있어서, 「비한정적으로」, 「일 양태에 있어서」는, 동일한 의미에 이용될 수 있다.
상기 펩티드는, 일 양태에 있어서, 고리형 펩티드이다. 「고리형 펩티드」는, 펩티드 중의 2 개의 아미노산이 결합하고, 그 전부 또는 일부가 고리형으로 되어 있는 것을 말한다. 상기 펩티드는, 펩티드 중의 아미노산이 가교 구조를 형성한 것, 락탐 고리 형성 또는 매크로 고리화 반응에 의해 고리형 구조를 형성한 것, 라쏘 펩티드상 구조를 갖는 것 등도 포함한다. 즉, 상기 고리형 펩티드는, 그 일부가 고리형 구조를 형성하는 것이면 되고, 직사슬부를 갖고 있어도 된다.
펩티드는, 일반적으로 생체 내에 있어서 대사 안정성이 나쁘고, 또한 사이즈가 크기 때문에 세포막을 투과하기 어렵다는 문제가 있다. 그러한 과제에 대하여, 펩티드를 고리형화시킨다는 방법이 취해져 왔다. 펩티드를 고리형화하면, 프로테아제 내성이 향상되어 대사 안정성이 향상되고, 또한 콘포메이션 변화에도 제한이 가해지기 때문에, 강직성이 증가하여 막투과성이나 표적 단백질과의 친화성이 향상되는 것이 시사되어 왔다.
일 양태에 있어서, 상기 펩티드는, 클로로아세틸화한 아미노산과, 상기 펩티드에 포함되는 시스테인 잔기가 결합된 고리형 구조를 갖는다. 일 양태에 있어서, 상기 펩티드는, N 말단 아미노산 (1 번째의 아미노산 잔기) 과, 상기 펩티드에 포함되는 시스테인 잔기가 결합된 고리형 구조를 갖는다. 일 양태에 있어서, 상기 펩티드는, N 말단 아미노산 (1 번째의 아미노산 잔기) 과, 상기 펩티드에 포함되는 12 번째의 시스테인 잔기가 결합된 고리형 구조를 갖는다. 일 양태에 있어서, 상기 펩티드는, 클로로아세틸화한 N 말단 아미노산 (1 번째의 아미노산 잔기) 과, 상기 펩티드에 포함되는 12 번째의 시스테인 잔기가 결합된 고리형 구조를 갖는다. 「클로로아세틸화」는, 다른 할로겐에 의한 「할로겐아세틸화」여도 된다. 또, 「아세틸화」는, 아세틸기 이외의 아실기에 의한 「아실화」여도 된다.
상기 펩티드는, 일 양태에 있어서, 서열 번호 2-126, 132-234 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이루어진다. 상기 펩티드는, 일 양태에 있어서, 서열 번호 2-126, 132-234 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이루어지는 고리형 펩티드이다.
상기 펩티드는, 서열 번호 1 에 더하여, 부가적인 아미노산 잔기를 포함해도 된다. 부가적인 아미노산 잔기는, 고리형 구조를 이루는 펩티드에 포함되어도 되고, 당해 고리형 펩티드로부터 추가로 아미노산 잔기가 링커상으로 부가되어 있어도 된다. 펩티드, 펩티드 부위의 아미드 결합의 수 (아미노산의 수·길이) 는 특별히 한정되지 않는다. 총 아미노산 잔기 (고리형 구조를 이루는 펩티드에 포함되는 아미노산 잔기수를 말하고, 당해 고리형 펩티드로부터 추가로 아미노산 잔기가 링커상으로 부가되어 있는 경우에는, 그들 아미노산은 포함시키지 않는다) 가 20 잔기 이내가 바람직하다. 바람직하게는 아미노산이 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상이며, 바람직하게는 아미노산이 19 이하, 18 이하, 17 이하, 16 이하, 15 이하이다. 가장 바람직하게는 아미노산이 12 이상 13 이하이다.
또한, 고리형 펩티드로부터 추가로 링커가 부가되어 있어도 된다. 링커로는, 예컨대, 전술한 아미노산 링커 (펩티드 링커), 화학 링커, 지방산 링커, 핵산 링커, 당사슬 링커 등을 들 수 있고, 또한, 예컨대 화학 링커와 펩티드 링커 등의 복합체여도 된다. 화학 링커로는, 예를 들면 PEG (Polyethyleneglycol) 링커이다. 예를 들어, 1 ∼ 24 개의 에틸렌글리콜 단위로 이루어지는 PEG 링커여도 된다. 또한, 링커는, 지방산으로부터 유도되는 2 가 화학 부분을 포함하는 지방산 링커여도 된다. 아미노산 (펩티드) 링커는, 적어도 1 개의 아미노산을 포함하는 링커이며, 예를 들어, 미국 특허 제7,271,149호에 기재된 바와 같은, 서열 [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n (식 중, n 은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 이다) 을 갖는 펩티드 등의 글리신-리치 펩티드나, 미국 특허 제5,525,491호에 기재된 세린-리치 펩티드 링커를 사용할 수 있다.
화학 링커와 펩티드 링커의 복합체로는, 예를 들어, 아미노산과 PEG 링커의 복합체나, 아미노산과 지방산 링커의 복합체, 또는 아미노산, PEG 및 지방산 링커의 복합체여도 된다. 예를 들어, 서열 번호 219 내지 234 로 나타내는 펩티드 중, 13 번째 이후의 구조 (예를 들어, 서열 번호 219 에 있어서는 13 번째의 아미노산 이후의 구조 ; de-dk(cC10COO) 구조이며, 서열 번호 225 에 있어서는 13 번째의 아미노산 이후의 구조 ; de-PEG2c-dk(cC10COO) 구조이다) 여도 된다. 또한, 펩티드 링커에 있어서는, 아미노산-아미노산 사이 또는 아미노산-화학 링커 사이의 결합이, 아미노산의 측사슬을 개재하여 결합하고 있어도 된다. 비한정적으로, 링커의 부가에 의해 펩티드의 물성 (예를 들어 용해도) 이 변화하는 경우가 있다.
링커의 부가 위치에 대해서는, 어디에 부가되어 있어도 된다. 예를 들어, N 말단측에 위치하는 Cys 에 결합하고 있어도 되고, 고리형 펩티드에 포함되는 아미노산에 결합하고 있어도 된다. 바람직하게는 N 말단측에 위치하는 Cys 에 결합하고 있거나, 고리형 펩티드에 포함되는 아미노산의 측사슬에 결합하고 있는 것이다.
또한, 상기 펩티드는 링커 등을 개재하여 다량체를 형성하고 있어도 된다. 예를 들면, SARS-CoV-2 의 스파이크 단백질은 3 량체를 형성하는 것이 알려져 있기 때문에, 그것에 맞추어, 상기 펩티드는 3 량체 (트리머) 로 되어 있어도 된다. 이 경우에 있어서, 상기 펩티드는, 동일한 서열을 갖는 펩티드로 이루어지는 호모머여도 되고, 다른 서열을 갖는 펩티드로 이루어지는 헤테로머여도 된다.
상기 펩티드는, 바람직하게는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 결합한다. 상기 펩티드는, 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는다. 상기 펩티드는, 바람직하게는 SARS-CoV-2 의 스파이크 단백질에 결합하고, 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는다.
「SARS-CoV-2 의 스파이크 단백질에 결합한다」란, SARS-CoV-2 의 스파이크 단백질 (GENE Accesstion No. YP＿009724390) 에 결합하는 것을 나타낸다. 스파이크 단백질에 대한 결합은, 공지된 분자 사이 결합을 측정하는 임의의 방법에 의해 측정할 수 있다. 비한정적으로, 예를 들면, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 어세이, 스캐차드 해석 및/또는 방사 면역 어세이 (RIA), 효소 면역 어세이 (EIA) 및 샌드위치 경합 어세이 등의 경합 결합 어세이, 그리고 당 기술 분야에서 그 자체 공지인 그 상이한 배리언트를 포함하는, 그 자체 공지인 임의의 적절한 양식으로 결정하는 것이 가능하다.
「항코로나바이러스 활성」이란, 코로나바이러스의 활성을 저해하는 활성 (불활화라고도 한다) 을 나타내고, 예를 들어, 코로나바이러스의 감염 저해, 증식 저해, 성숙 저해, 바이러스수의 저감, 감염성의 저하, 세포 독성의 억제, 바이러스성 세포 변성의 억제, 바이러스 감염의 중증화 저지, 치사율 개선, 폐렴 증상의 억제·개선 등을 들 수 있다. 바람직하게는 감염 저해 또는 증식 저해이다. 상기 펩티드가, 코로나바이러스의 활성을 저해하는, 예를 들어, 30 ％ 저해하는, 50 ％ 저해하는, 70 ％ 저해하는, 90 ％ 저해하는, 경우에 「항코로나바이러스 활성을 갖는다」라고 판단한다. 또는, 상기 펩티드가, 이미 알려진 다른 COVID 제, 예를 들면, 렘데시비르, REGN-COV2 (카시리비맙과 임데비맙의 병용제), 몰누피라비르의 활성체로서 EIDD-1931 등의 어느 것과 동등한, 또는 그 이상으로, 코로나바이러스의 활성을 저해하는 효과를 나타내는 경우에, 「항코로나바이러스의 활성을 갖는다」라고 판단한다.
예를 들어, 비한정적으로, 코로나바이러스의 세포 배양 상청에 대한 펩티드의 첨가에 의해, 당해 상청으로부터 바이러스 RNA 가 감소하는 경우, 예를 들어, 바이러스 RNA 가 30 ％ 감소하는, 50 ％ 감소하는, 70 ％ 감소하는, 90 ％ 감소하는 경우, 당해 펩티드가 항코로나바이러스 활성을 갖는다, 라고 판단한다. 「항 SARS-CoV-2 활성」이란, SARS-CoV-2 의 활성을 저해하는 활성을 의미한다. 펩티드가, 당해 펩티드가 존재하지 않는 경우와 비교하여, SARS-CoV-2 의 활성을 저해하는, 예를 들어 30 ％ 저해하는, 50 ％ 저해하는, 70 ％ 저해하는, 90 ％ 저해하는, 경우에 「항 SARS-CoV-2 활성을 갖는다」라고 판단한다. 예를 들어, 본 명세서의 실시예 1 에서는, 펩티드를 1 μM 첨가시에, SARS-CoV-2 (우한주) 의 세포 배양 상청에 포함되는 SARS-CoV-2 의 RNA 의 양이 10 ％ 이하로 된 경우 (90 ％ 감소한 경우) 에, 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는다, 라고 판단하였다. 바이러스 RNA 의 양은, 공지된 방법, 바람직하게는 RT-qPCR 을 이용한 측정법으로 측정할 수 있다. 실시예 5 에서는, 상기 펩티드는 우한주뿐만 아니라, 다른 알파, 베타, 감마, 델타, 오미크론이라는 변이형 바이러스에 대해서도, 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는, 즉 펩티드를 1 μM 첨가시에, SARS-CoV-2 의 세포 배양 상청에 포함되는 SARS-CoV-2 의 RNA 의 양을 10 ％ 이하까지 감소시키는 (90 ％ 감소시키는) 것이 나타났다.
실시예 4 및 실시예 11 에서는, SARS-CoV-2 유래 S 단백질 유전자를 삽입한 S 단백질 발현 벡터와 루시페라아제의 서브 유닛 단백질 유전자를 삽입한 발현 벡터를 이용하여 SARS-CoV-2 유래 S 단백질 (의사적 바이러스) 및 루시페라아제의 서브 유닛을 발현시킨 세포와, 인간 ACE2 단백질을 발현하고 있는 세포에 루시페라아제의 서브 유닛 단백질 유전자를 삽입한 발현 벡터를 이용하여 발현시킨 세포를 혼화하였을 때, SARS-CoV2 유래 S 단백질과 인간 ACE2 단백질의 결합을 개재하여 세포 융합했을 때에 세포 내에서 루시페라아제 단백질이 재구성된 결과 방출되는 형광 강도를 측정함으로써, 첨가한 상기 펩티드의 S 단백질 저해 활성 (％) 및 IC50 치를 구하였다. 비한정적으로, S 단백질 저해 활성 (％) 이 50 ％ 이상, 바람직하게는 75 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상인 경우에, 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는다, 라고 판단한다. 혹은, 비한정적으로, IC50 치가 1×10-6 mol/L 이하, 바람직하게는 1×10-8 mol/L 이하, 더욱 바람직하게는 5×10-9 mol/L 이하인 경우에, 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는다라고 판단한다.
실시예 6 및 실시예 11 에서는, SARS-CoV-2 바이러스와 인간 ACE2 를 발현하고 있는 세포를 사용하여, 바이러스에 의한 세포 상해성 (cytopathic effect ; CPE) 에 대한 억제 효과를 조사하였다. 세포 상해성은 감염 후 일정 기간 후의 세포의 생존율을 지표로, 세포 배양계에 첨가한 상기 펩티드의 항바이러스 효과를 평가하였다. 비한정적으로, CPE 감소치가 50 ％ 이상, 바람직하게는 75 ％ 이상, 더욱 바람직하게는 90 ％ 이상인 경우에, 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는다, 라고 판단한다. 혹은, 비한정적으로, IC50 치가 1×10-6 mol/L 이하, 바람직하게는 1×10-8 mol/L 이하인 경우에, 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는다, 라고 판단한다.
실시예 7 에서는, 마우스 SARS-CoV-2 감염 치사 모델을 이용한, 상기 펩티드에 의한, 마우스 SARS-CoV-2 감염의 중증화 저지 효과의 평가, 치사율 개선 효과의 측정 및 폐 조직상 평가를 실시하였다. 상기 펩티드를 투여한 쪽이, 투여하지 않는 경우와 비교하여, 중증화가 저지되는 경우, 예를 들면 체중 감소가 저지되는 경우, 혹은 치사율이 개선되는 경우에, 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는다, 라고 판단한다. 체중 감소가 저지된다는 것은, 예를 들어 SARS-CoV-2 감염 7 일 후에, 예를 들어, 상기 펩티드를 투여하지 않으면 체중이 10 ％ 이상 감소하는 경우에, 상기 펩티드를 투여하면 체중 감소가 10 ％ 미만, 바람직하게는 8 ％ 미만, 더 바람직하게는 5 ％ 미만인 것을 의미한다.
혹은, 상기 펩티드를 투여한 쪽이, 투여하지 않는 경우와 비교하여, 폐렴 증상이 억제·개선된다. 폐렴의 증상은, 예를 들면, 혈관 주위에 세포의 집족 (集簇), 폐포야 (肺胞野) 에 있어서 염증성 세포 침윤과 폐포 상피의 재생상이 확인되는 등, 피만성 폐포 상해에 있어서의 증식기에 해당하는 세포상에 의해 확인할 수 있다. 상기 펩티드의 투여에 의해 이들 상황이 감소할 수 있다. 또한, 실시예 8 에서는 햄스터 SARS-CoV-2 감염 모델을 이용하여, 상기 펩티드의 폐렴에 대한 유효성을 조사하였다. 상기 펩티드의 투여에 의해, 투여하지 않는 경우보다, 폐렴에 의한 증상, 예를 들어 만성 활동성의 간질성 및 흉막의 염증이 억제·개선될 수 있다. 이상과 같은 폐렴에 대한 효과가 확인되는 경우, 상기 펩티드가 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는다, 라고 판단한다.
상기 펩티드는, 상기 서술한 바이러스 RNA 의 감소, 항바이러스성 세포 변성 억제, 세포 독성의 억제, 바이러스성 세포 변성의 억제, 바이러스 감염의 중증화 저지, 치사율 개선, 폐렴 증상의 억제·개선 등의 효과 중 적어도 하나, 바람직하게는 복수의 효과를 나타내는 경우에, 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는다, 라고 판단된다.
일 양태에 있어서, 상기 펩티드는 이하의 구조를 갖는다.
[화학식 1]
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본 명세서에 있어서 「펩티드」는, 특별히 언급하지 않는 한, 「2. 펩티드 (A)」와, 「3. 펩티드 (B)」의 쌍방을 포함한다.
4. 펩티드의 제조
본 발명의 펩티드는, 예를 들어 이하와 같은, 펩티드 제조를 위한 임의의 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다.
액상법, 고상법, 액상법과 고상법을 조합한 하이브리드법 등의 화학 합성법 ;
유전자 재조합법, 등
고상법은, 예를 들면, 수산기를 갖는 레진의 수산기와, α-아미노기가 보호기로 보호된 제 1 아미노산 (통상, 목적으로 하는 펩티드의 C 말단 아미노산) 의 카르복시기를 에스테르화 반응시킨다. 에스테르화 촉매로는, 1-메틸렌술포닐-3-니트로-1,2,4-트리아졸 (MSNT), 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), 디이소프로필카르보디이미드 (DIC) 등의 공지된 탈수 축합제를 이용할 수 있다.
다음으로, 제 1 아미노산의 α-아미노기의 보호기를 탈리시킴과 함께, 주사슬의 카르복시기 이외의 모든 관능기가 보호된 제 2 아미노산을 첨가하여, 당해 카르복시기를 활성화시켜, 제 1 및 제 2 아미노산을 결합시킨다. 또한, 제 2 아미노산의 α-아미노기를 탈보호하고, 주사슬의 카르복시기 이외의 모든 관능기가 보호된 제 3 아미노산을 첨가하여, 당해 카르복시기를 활성화시켜, 제 2 및 제 3 아미노산을 결합시킨다. 이를 반복하여, 목적으로 하는 길이의 펩티드가 합성되면, 모든 관능기를 탈보호한다.
고상 합성의 레진으로는, 예를 들어, Merrifield resin, MBHA resin, Cl-Trt resin, SASRIN resin, Wang resin, Rink amide resin, HMFS resin, Amino-PEGA resin (머크사), HMPA-PEGA resin (머크사) 등을 들 수 있다. 이들 레진은, 용제 (디메틸포름아미드 (DMF), 2-프로판올, 염화메틸렌 등) 로 세정하고 나서 사용할 수 있다.
α-아미노기의 보호기로는, 예를 들어 벤질옥시카르보닐 (Cbz 또는 Z) 기, tert-부톡시카르보닐 (Boc) 기, 플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc) 기, 벤질기, 알릴기, 알릴옥시카르보닐 (Alloc) 기 등을 들 수 있다. Cbz 기는 불화수소산, 수소화 등에 의해 탈보호할 수 있고, Boc 기는 트리플루오로아세트산 (TFA) 에 의해 탈보호할 수 있고, Fmoc 기는 피페리딘 또는 피롤리딘에 의한 처리로 탈보호할 수 있다.
α-카르복시기의 보호는, 예를 들어 메틸에스테르, 에틸에스테르, 알릴에스테르, 벤질에스테르, tert-부틸에스테르, 시클로헥실에스테르 등을 사용할 수 있다.
카르복시기의 활성화는, 축합제를 사용하여 실시할 수 있다. 축합제로는, 예를 들어, 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), 디이소프로필카르보디이미드 (DIC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC 혹은 WSC), (1H-벤조트리아졸-1-일옥시)트리스(디메틸아미노)포스포늄헥사플루오로포스페이트 (BOP), 1-[비스(디메틸아미노)메틸]-1H-벤조트리아졸륨-3-옥시드헥사플루오로포스페이트 (HBTU) 등을 들 수 있다.
레진으로부터의 펩티드 사슬의 절단은, TFA, 불화수소 (HF) 등의 산으로 처리함으로써 실시할 수 있다.
유전자 재조합법 (번역 합성계) 에 의한 펩티드의 제조는, 상기 펩티드를 코드하는 핵산을 이용하여 실시할 수 있다. 상기 펩티드를 코드하는 핵산은, DNA 여도 되고 RNA 여도 된다.
상기 펩티드를 코드하는 핵산은, 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법으로 조제할 수 있다. 예를 들어, 자동 합성 장치에 의해 합성할 수 있다. 얻어진 DNA 를 벡터에 삽입하기 위해 제한 효소 인식 부위를 추가해도 된다. 혹은, 생긴 펩티드 사슬을 효소 등으로 잘라내기 위한 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 삽입해 넣어도 된다.
상기 서술한 바와 같이, 상기 펩티드를 막투과성 펩티드 등과 융합시키는 경우, 상기 핵산은, 막투과성 펩티드를 코드하는 핵산도 포함한다.
숙주 유래의 프로테아제에 의한 분해를 억제하기 위해서, 목적의 펩티드를 다른 펩티드와의 키메라 펩티드로서 발현시키는 키메라 단백질 발현법을 이용할 수도 있다. 이 경우, 상기 핵산으로는, 목적하는 펩티드와, 이것에 결합하는 펩티드를 코드하는 핵산이 사용될 수 있다.
이어서, 당해 펩티드를 코드하는 핵산을 사용하여 발현 벡터를 조제한다. 핵산은 그대로, 또는 제한 효소로 소화하고, 또는 링커를 부가하거나 하여, 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입할 수 있다. 벡터로는, 예를 들면, 대장균 유래 플라스미드 (pBR322, pBR325, pUC12, pUC13, pUC18, pUC19, pUC118, pBluescript II 등), 고초균 유래 플라스미드 (pUB110, pTP5, pC1912, pTP4, pE194, pC194 등), 효모 유래 플라스미드 (pSH19, pSH15, YEp, YRp, YIp, YAC 등), 박테리오파지 (e 파지, M13 파지 등), 바이러스 (레트로 바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 수반 바이러스 (AAV), 칼리플라워 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 바큘로바이러스 등), 코스미드 등을 들 수 있다.
프로모터는, 숙주의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있다. 숙주가 동물 세포인 경우는, 예를 들어, SV40 (simian virus 40) 유래 프로모터, CMV (cytomegalovirus) 유래 프로모터를 사용할 수 있다. 숙주가 대장균인 경우에는, trp 프로모터, T7 프로모터, lac 프로모터 등을 사용할 수 있다.
발현 벡터에는, 예를 들어, DNA 복제 개시점 (ori), 선택 마커 (항생 물질 저항성, 영양 요구성 등), 인핸서, 스플라이싱 시그널, 폴리 A 부가 시그널, 태그 (FLAG, HA, GST, GFP 등) 를 코드하는 핵산 등을 삽입해 넣을 수도 있다.
다음으로, 상기 발현 벡터로 적당한 숙주 세포를 형질 전환한다. 숙주는, 벡터와의 관계에서 적절히 선택할 수 있다. 숙주로는, 예를 들면 대장균, 고초균, 바실러스속균), 효모, 곤충 또는 곤충 세포, 동물 세포 등이 사용된다. 동물 세포로서, 예를 들어 HEK293T 세포, CHO 세포, COS 세포, 미엘로마 세포, HeLa 세포, Vero 세포를 사용할 수 있다. 형질 전환은, 숙주의 종류에 따라, 리포펙션법, 인산칼슘법, 일렉트로포레이션법, 마이크로 인젝션법, 파티클 건법 등, 공지된 방법에 따라 실시할 수 있다. 형질 전환체를 통상적인 방법에 따라 배양함으로써, 목적으로 하는 펩티드가 발현된다.
형질 전환체의 배양물로부터의 펩티드의 정제는, 배양 세포를 회수하고, 적당한 완충액에 현탁하고 나서 초음파 처리, 동결 융해 등의 방법에 의해 세포를 파괴하여, 원심 분리나 여과에 의해 조추출액을 얻는다. 배양액 중에 펩티드가 분비되는 경우에는, 상청을 회수한다.
조추출액 또는 배양 상청으로부터의 정제도 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법 (예를 들어, 염석, 투석법, 한외 여과법, 겔 여과법, SDS-PAGE 법, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 역상 고속 액체 크로마토그래피 등) 으로 실시할 수 있다.
얻어진 펩티드는, 공지된 방법 또는 그것에 준하는 방법으로 유리체로부터 염으로, 또는 염으로부터 유리체로 변환해도 된다.
일 양태에 있어서, 번역 합성계는, 무세포 번역계로 해도 된다. 무세포 번역계에 의하면, 일반적으로 발현 산물을 정제하지 않고 순도가 높은 형으로 얻을 수 있다. 무세포 번역계는, 예를 들어, 리보솜 단백질, 아미노아실 tRNA 합성 효소 (ARS), 리보솜 RNA, 아미노산, rRNA, GTP, ATP, 번역 개시 인자 (IF) 신장 인자 (EF), 종결 인자 (RF), 및 리보솜 재생 인자 (RRF), 및 번역에 필요한 그 밖의 인자를 포함한다. 발현 효율을 높게 하기 위해서 대장균 추출액이나 소맥 배아 추출액을 추가해도 된다. 그 밖에, 토끼 적혈구 추출액이나 곤충 세포 추출액을 추가해도 된다.
이들을 포함하는 계에, 투석을 사용하여 연속적으로 에너지를 공급함으로써, 비한정적으로, 수 100 μg 내지 수 mg/mL 의 단백질을 생산할 수 있다. 유전자 DNA 로부터의 전사를 함께 실시하기 위해서 RNA 폴리메라아제를 포함하는 계로 해도 된다. 시판되고 있는 무세포 번역계로서, 대장균 유래의 계로는 로슈·다이아그노스틱스사의 RTS-100 (등록상표) 진프론티어사의 PURESYSTEM 이나 NEW ENGLAND Biolabs 사의 PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit 등, 소맥 배아 추출액을 사용한 계로는 조이진사나 셀프리 사이언스사의 것 등을 사용할 수 있다.
세포 번역계에 있어서는, 천연의 아미노아실 tRNA 합성 효소에 합성되는 아미노아실 tRNA 대신에, 원하는 아미노산 또는 하이드록시산을 tRNA 에 연결 (아실화) 한 인공의 아미노아실 tRNA 를 이용해도 된다. 이러한 아미노아실 tRNA 는, 인공의 리보자임을 이용하여 합성할 수 있다.
이러한 리보자임으로는, 플렉시자임 (flexizyme) (H. Murakami, H. Saito, and H. Suga, (2003), Chemistry ＆ Biology, Vol. 10, 655-662 ; 및 WO2007/066627 등) 을 들 수 있다. 플렉시자임은, 원형의 플렉시자임 (Fx), 및 이로부터 개변된 디니트로벤질플렉시자임 (dFx), 인핸스드 플렉시자임 (eFx), 아미노플렉시자임 (aFx) 등의 호칭으로도 알려져 있다.
플렉시자임에 의해 생성된, 원하는 아미노산 또는 하이드록시산이 연결된 tRNA 를 이용함으로써, 원하는 코돈을, 원하는 아미노산 또는 하이드록시산과 관련지어 번역할 수 있다. 원하는 아미노산으로는, 특수 아미노산을 사용해도 된다. 예를 들어, 상기 서술한 고리형화에 필요한 비천연 아미노산도 이 방법에 의해, 결합 펩티드에 도입할 수 있다.
상기 펩티드의 화학 합성은, 예를 들어 단계적 고상 합성, 배좌적으로 지원되는 재라이게이션을 거치는 펩티드 프래그먼트의 반합성, 화학 라이게이션을 포함한 다양한 당해 기술 분야에 있어서 범용되는 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 상기 펩티드의 합성은, 예를 들어, K. J. Jensen, P. T. Shelton, S. L. Pedersen, Peptide Synthesis and Applications, 2 ndEdition, Springer, 2013 등에 기재되는 여러 가지의 고상 기술을 사용하는 화학 합성이다. 바람직한 스트래터지로서, α-아미노기를 일시적으로 보호 및 염기에 의한 선택적 제거를 가능하게 하는 Fmoc 기와, 측사슬 관능기를 일시적으로 보호하고 또한 탈 Fmoc 조건으로 안정적인 보호기의 조합에 기초한다. 그러한 일반적인 펩티드 측사슬의 선택은 전술한 Peptide Synthesis and Applications, 제2판이나 G. B. Fields, R. L. Noble, Solid Phase Peptide Synthesis Utilizing 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Amino Acids, Int. J. Peptide Protein Res. 35, 1990, 161-214 등에서 알려져 있지만, 바람직한 펩티드 측사슬 보호기로는, 예를 들어, 세린이나 트레오닌의 하이드록시기에 대한 벤질기나 tert-부틸기 및 트리틸 (Trt) 기, 티로신의 하이드록시기에 대한 2-브로모벤질옥시카르보닐기나 tert-부틸기, 리신 측사슬의 아미노기에 대한 Boc 기, 메틸테트라졸티올 (Mtt) 기, Alloc 기, 및 ivDde 기, 히스티딘의 이미다졸기에 대한 Trt 기나 Boc 기, 아르기닌의 구아니딜기에 대한 2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조푸란-5-술포닐기 (Pbf) 기, 글루타민산이나 아스파라긴산을 비롯한 카르복실기에 대한 tert-부틸기, 알릴기, 및 3-메틸펜탄 (Mpe) 기, 글루타민이나 아스파라긴의 카르복사미드기에 대한 Trt 기, 또, 시스테인의 티올기에 대한 Trt 기 및 모노메톡시트리틸 (Mmt) 기가 있다.
상기 펩티드는, 전술한 고상 수지 상에서 단계적 방법에 있어서 합성할 수 있다. 사용하는 C 말단 아미노산 및 합성에 사용하는 모든 아미노산이나 펩티드는, α-아미노 보호기가 합성 과정에 있어서 선택적으로 제거되어야 한다. 바람직하게는 전술한 고상 수지를 이용하여, N 말단이 Fmoc 등 적절히 보호된 펩티드의 C 말단 카르복실기 또는 Fmoc 로 보호된 아미노산의 C 말단 카르복실기를 적절한 시약에 의해 활성화 에스테르로 한 후 고상 수지 상의 아미노기에 부가함으로써 개시한다. 이어지는 펩티드 사슬의 신장은, 목적으로 하는 펩티드의 아미노산 서열에 따라, N 말단 보호기 (Fmoc 기) 의 제거, 이어서 보호 아미노산 유도체의 축합을 순차 반복함으로써 달성하는 것이 가능하다. 또한, 이들은 목적의 펩티드를 최종 단계에서 유리시킬 수 있다. 예를 들어 유리시키는 조건으로서, Teixeira, W. E. Benckhuijsen, P. E. de Koning, A. R. P. M. Valentijn, J. W. Drijfhout, Protein Pept. Lett., 2002, 9, 379-385 등에 예시되는, TFA 중에 포착제로서 물/실릴하이드리드/티올을 포함하는 TFA 용액으로 유리시킬 수 있다. 전형적인 예로서, TFA/Water/TIS/DODT (체적비 92.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5) 를 들 수 있다.
본 명세서에 기재하는 펩티드의 합성은, 단일 또는 다채널 펩티드 합성기, 예를 들면 CEM 사의 Liberty Blue 합성기 또는 Biotage 사의 Syro I 합성기나 그들의 후계기 등을 사용함으로써 실시할 수 있다.
카르복시기의 활성화는, 축합제를 사용하여 실시할 수 있다. 축합제로는, 예를 들어, 디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), 디이소프로필카르보디이미드 (DIPCDI), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC 혹은 WSC), (1H-벤조트리아졸-1-일옥시)트리스(디메틸아미노)포스포늄헥사플루오로포스페이트 (BOP), 1-[비스(디메틸아미노)메틸]-1H-벤조트리아졸륨-3-옥시드헥사플루오로포스페이트 (HBTU) 등을 들 수 있다.
펩티드의 고리화에 대해서는, 공지된 방법에 따라 실시할 수 있다. 비한정적으로, 예를 들어 펩티드에 2 개 이상의 시스테인 잔기를 포함하도록 설계함으로써, 번역된 후, 디술파이드 결합에 의해 고리형 구조를 형성할 수 있다. 또한, Goto 등의 방법 (Y. Goto, et al. ACS Chem. Biol. 3 120-129 (2008)) 에 따라, 유전 암호의 리프로그래밍 기술에 의해, N 말단에 클로로아세틸기를 갖는 펩티드를 합성하고, 펩티드 중에 황 분자를 포함하는 시스테인 잔기를 배치해 두는 것에 의해서도 고리형화할 수 있다. 이로써, 번역 후에 자발적으로 메르캅토기가 클로로아세틸기에 구핵 공격하고, 펩티드가 티오에테르 결합에 의해 고리형화한다. 유전 암호의 리프로그래밍 기술에 의해, 결합하여 고리형을 형성하는 그 밖의 아미노산의 조합을 펩티드 내에 배치하여 고리형화해도 된다. 혹은, 펩티드 중에 L-2-아미노아디프산 잔기를 배치하고, N 말단의 주사슬 아미노기와의 사이에서 결합함으로써 고리형화해도 된다. 이와 같이, 공지된 고리형화 방법이면, 특별히 제한되지 않고 사용할 수 있다.
5. 의약 조성물
본 발명은 또한, 본 발명의 펩티드를 포함하는, 의약 조성물에 관한 것이다. 의약 조성물의 대상이 되는 질병으로는, 코로나바이러스에 의해 야기되는 감염증, 바람직하게는 SARS-CoV-2 에 의해 야기되는 감염증이며, COVID-19 이다. 본 발명의 펩티드는, 코로나바이러스에 의해 야기되는 감염증의 예방 또는 치료하는 의약 조성물의 유효 성분으로서 유용하다.
비한정적으로, 상기 의약 조성물은, 항 SARS-CoV-2 바이러스 활성을 갖는다. 「항 SARS-CoV-2 바이러스 활성을 갖는다」 는, 「3. 펩티드 (B)」에서 서술한 바와 같다.
일 양태에 있어서, 상기 의약 조성물은, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한, 의약 조성물이다. 일 양태에 있어서, 코로나바이러스 감염증이, COVID-19 이다.
「코로나바이러스」는, 1 본쇄 RNA 바이러스의 1 종인, 지질 이중막 엔벨로프를 갖는 바이러스의 1 종이다. 바이러스 분류학상은 니도바이러스목 코르니도바이러스아목의 코로나바이러스과로 분류되어 있으며, 또한 레토바이러스아과와 오르토코로나바이러스아과로 나눌 수 있다. 바이러스 입자의 내부에 게놈 RNA 와 그것에 결합하는 N 단백질로 이루어지는 뉴클레오캡시드를 갖고, 또한 엔벨로프 표면에는 스파이크 (S) 단백질, 엔벨로프 (E) 단백질, 멤브레인 (M) 단백질로 불리는 단백질 구조를 갖는다. 특히 스파이크 단백질은, 감염시에 중요한 역할을 하는 것이 알려져 있다 (비특허문헌 3).
인간에 감염되는 코로나바이러스로는, 인간에 일상적으로 감염되는 코로나바이러스 (Human Coronavirus : HCoV) 와, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 (MERS-CoV) 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 (SARS-CoV) 의 크게 3 종류로 나누어진다. 또한, 동물에 감염되는 코로나바이러스 (돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV), 돼지 전염성 위장염 바이러스 (TGEV), 닭 전염성 기관지염 바이러스 (IBV), 마우스 간염 바이러스 (MHV), 고양이 전염성 복막염 바이러스 (FIPV) 등) 도 있고, 동물에 감염되는 코로나바이러스는, 다른 종류의 동물에 감염되는 경우는 거의 없는 것으로 알려져 있다. 본 명세서에 있어서의 「코로나바이러스」란, 특별히 명기하지 않는 한, 상기 인간 감염형 및 동물 감염형 코로나바이러스 모두를 나타낸다.
「SARS-CoV-2」는, 중증 급성 호흡기 증후군을 일으키는 코로나바이러스인 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스의 자매종으로서 발견된 신형 코로나바이러스이며, 2019년말에 중국의 우한에서 처음 보고되어, 전 세계에서 팬데믹을 일으킨 바이러스를 가리킨다. SARS-CoV-2 는 그 표면에 스파이크 단백질을 갖고, 그 스파이크 단백질을 개재하여 숙주에 감염되는 것으로 생각되고 있다 (비특허문헌 4).
SARS-CoV-2 는, 다른 바이러스와 마찬가지로, 증식이나 감염을 반복하는 중에 돌연 변이되어, 많은 변이주가 만들어진다. SARS-CoV-2 에는 수천 가지의 변이주가 존재하여, 계통이나 계통군에 의해 분류되고, PANGO 계통명 등이 사용되어 왔지만, 최근 WHO (세계 보건 기관) 가 그리스 알파벳을 사용하는 호칭을 발표한 점에서, α 주나 β 주 등의 호칭이 사용되고 있다 (비특허문헌 5). 감염력의 증가나 백신·치료법의 유효성의 저하 등의 리스크가 있는 변이주는, 「주목해야 할 변이주 ; VOI」로 간주되고, 그것들의 리스크가 검증되면, 각국의 보건 기관 등에 의해, 「우려되는 변이주 ; VOC」라고 개칭되고, 특히 위험성이 높고 경계가 필요한 변이주로 간주된다. α (알파) 주, β (베타) 주, γ (감마) 주, δ (델타) 주, ο (오미크론) 주는, 모두 VOC 로 간주되고 있고, 특히, 델타주는, 기존의 변이주보다 감염력이 강하고, 항체에 대한 감수성도 낮다고 여겨지고 있기 때문에, 델타주에도 효과가 있는 치료제가 요망되고 있다 (비특허문헌 5, 6).
또한, 알파주·베타주·감마주·델타주에 대하여, 스파이크 단백질의 변이 지점은 이하의 표 1 과 같다. 본 명세서에 있어서의, 「SARS-CoV-2」는, 우한에서 보고된 주 (우한주, 야생주) 뿐만 아니라, 당해 바이러스로부터 변이된 유럽 계통 변이주 (알파주), 남아프리카 계통 변이주 (베타주), 브라질 계통 변이주 (감마주), 인도 계통 변이주 (델타주), 미국 계통 변이주 (엡실론주), 미국 계통주 (이오타주), 인도 계통 변이주 (카파주), 필리핀 계통 변이주 (시타주), 페루 계통주 (람다주), 콜롬비아 계통주 (뮤주), 오미크론주나, 델타주에 추가로 다른 변이가 가해진 AY. 4.2 계통이나 오미크론주에 추가로 다른 변이가 가해진 BA. 2 계통과 같은 다중 변이형 바이러스주, 또한 그 밖의 변이주가 포함된다.
[표 1]
「COVID-19」는, SARS-CoV-2 에 의해 야기되는 감염증을 가리킨다. 인플루엔자나 감기와 유사한 초기 증상을 나타내는 경우가 많고, 주된 증상으로는 급성 호흡기 질환이 많지만, 무증상인 경우도 있다. 본 명세서에 있어서는, SARS-CoV-2 에 의해 야기되는 여러 증상을 말한다.
상기 의약 조성물은, 상기 펩티드 자체를 포함해도 되지만, 상기 펩티드의 약학상 허용되는 염 또는 그 용매화물을 포함해도 된다. 본 명세서에 있어서 「펩티드」는 특별히 명기하지 않는 한, 그 약학상 허용되는 염 또는 그 용매화물을 포함할 수 있다. 상기 의약 조성물은, 상기 펩티드를 유효 성분으로서 유효량 포함하는 것이 바람직하다.
본 명세서에 있어서, 의약 조성물의 투여 형태는 특별히 한정되지 않고, 경구적 투여여도 되고 비경구적 투여여도 된다. 비경구 투여로서는, 예를 들면 근육내 주사, 정맥내 주사, 피하 주사 등의 주사 투여, 경피 투여, 경점막 투여 (경비, 경구강, 경안, 경폐, 경질, 경직장) 투여 등을 들 수 있다.
상기 의약 조성물은, 폴리펩티드가 대사 및 배설되기 쉬운 성질을 감안하여, 각종 수식을 실시할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩티드에 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 이나 당사슬을 부가하여 혈중 체류 시간을 길게 하여, 항원성을 저하시킬 수 있다. 또한, 폴리락트산·글리콜 (PLGA) 등의 생체내 분해성의 고분자 화합물, 다공성 하이드록시아파타이트, 리포좀, 표면 수식 리포좀, 불포화 지방산으로 조제한 에멀전, 나노파티클, 나노스피어 등을 서방화 기제로서 이용하고, 이것에 폴리펩티드를 내포시켜도 된다. 경피 투여하는 경우, 약한 전류를 피부 표면에 흘려 각질층을 투과시킬 수도 있다 (이온토포레시스법).
상기 의약 조성물은, 유효 성분을 그대로 사용해도 되고, 약학적으로 허용할 수 있는 담체, 부형제, 첨가제 등을 첨가하여 제제화해도 된다. 제형으로는, 예를 들면, 액제 (예를 들면 주사제), 분산제, 현탁제, 정제, 환제, 분말제, 좌제, 산제, 세립제, 과립제, 캡슐제, 시럽제, 트로키제, 흡입제, 연고제, 점안제, 점비제, 점이제, 파프제 등을 들 수 있다. 제제화는, 예를 들면, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 용해제, 용해 보조제, 착색제, 교미교취제, 안정화제, 유화제, 흡수 촉진제, 계면 활성제, pH 조정제, 방부제, 항산화제 등을 적절히 사용하고, 통상적인 방법에 의해 실시할 수 있다.
제제화에 사용되는 성분의 예로는, 정제수, 식염수, 인산 완충액, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 등 약학적으로 허용되는 유기 용제, 동식물유, 젖당, 만니톨, 포도당, 소르비톨, 결정 셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 전분, 콘스타치, 무수 규산, 규산알루미늄마그네슘, 콜라겐, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시비닐폴리머, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 폴리아크릴산나트륨, 알긴산나트륨, 수용성 덱스트란, 카르복시메틸스타치나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 잔탄검, 아라비아고무, 트라가칸트, 카제인, 한천, 폴리에틸렌글리콜, 디글리세린, 글리세린, 프로필렌글리콜, 바셀린, 파라핀, 미리스트산옥틸도데실, 미리스트산이소프로필, 고급 알코올, 스테아릴알코올, 스테아르산, 인간 혈청 알부민 등을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
상기 의약 조성물은, 펩티드가 일반적으로는 경점막 흡수되기 어려운 점을 감안하여, 난흡수성 약물의 흡수를 개선하는 흡수 촉진제를 포함할 수 있다. 이러한 흡수 촉진제로는, 폴리옥시에틸렌라우릴에테르류, 라우릴황산나트륨, 사포닌 등의 계면 활성제 ; 글리코콜산, 데옥시콜산, 타우로콜산 등의 담즙산염 ; EDTA, 살리실산류 등의 킬레이트제 ; 카프로산, 카프르산, 라우르산, 올레산, 리놀레산, 혼합 미셀 등의 지방산류 ; 에나민 유도체, N-아실콜라겐펩티드, N-아실아미노산, 시클로덱스트린류, 키토산류, 일산화질소 공여체 등을 사용할 수 있다.
상기 의약 조성물이 환제 또는 정제인 경우, 당의, 위용성, 장용성 물질로 피복해도 된다.
상기 의약 조성물이 주사제인 경우, 주사용 증류수, 생리 식염수, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 식물유, 알코올류 등을 포함해도 된다. 또한, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제, 용해제, 용해 보조제, 방부제 등을 첨가해도 된다.
또한, 상기 의약 조성물은 인간뿐만 아니라, 비인간 포유 동물 또는 조류를 대상으로 하고 있어도 된다. 비인간 포유 동물의 예는, 인간 이외의 영장류 (원숭이, 침팬지, 고릴라 등), 가축 동물 (돼지, 소, 말, 양 등), 혹은, 개, 고양이, 래트, 마우스, 모르모트, 토끼 등이 포함된다.
특히 인간에게 투여하는 경우의 투여량은, 증상, 환자의 연령, 성별, 체중, 감수성 차, 투여 방법, 투여 간격, 유효 성분의 종류, 제제의 종류에 따라 상이하며, 비한정적으로 예를 들면, 30 μg ∼ 100 g, 100 μg ∼ 500 mg, 100 μg ∼ 100 mg 을 1 회 또는 수 회로 나누어 투여할 수 있다. 주사 투여의 경우, 환자의 체중에 따라 1 μg/kg ∼ 3000 μg/kg, 3 μg/kg ∼ 1000 μg/kg 을 1 회 또는 수 회로 나누어 투여할 수 있다.
본 발명은, 본 발명의 펩티드를 투여하는 것에 의한, 코로나바이러스 감염증을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 본 발명의 펩티드의 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 사용에 관한 것이다.
본 발명은, 본 발명의 펩티드의, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 의약 조성물의 제조를 위한 사용에 관한 것이다.
본 발명은, 본 발명의 펩티드의, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 의약 조성물로서의 사용에 관한 것이다.
본 발명은, 코로나바이러스 감염증을 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 의약 조성물로 사용되기 위한, 본 발명의 펩티드에 관한 것이다.
6. 진단용 조성물
본 발명은 또한, 본 발명의 펩티드를 포함하는, SARS-CoV-2 바이러스 감염증을 진단하기 위한 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 펩티드는, SARS-CoV-2 에 결합하기 때문에, SARS-CoV-2 를 검출하는 진단용 조성물로도 사용할 수 있다. 진단약으로는, SARS-CoV-2 에 이환되어 있는지 여부를 진단하기 위한 검출약이어도 되고, 검출약으로서 사용하는 경우에는, 상기 펩티드는 검출 가능하게 표지해도 된다.
상기 펩티드는 검출 가능하게 표지해도 된다. 펩티드의 표지는, 예를 들어, 퍼옥시다아제, 알칼리포스파타아제 등의 효소, 125I, 131I, 35S, 3H 등의 방사성 물질, 플루오레세인이소티오시아네이트, 로다민, 댄실클로라이드, 피코에리트린, 테트라메틸로다민이소티오시아네이트, 근적외 형광 재료 등의 형광 물질, 루시페라아제, 루시페린, 에쿼린 등의 발광 물질로 표지한 항체가 사용된다. 그 밖에 금 콜로이드, 양자 도트 등의 나노 입자로 표지한 항체를 검출할 수도 있다. 예를 들어, SARS-CoV-2 감염에 관계하는 특정한 표적 (예를 들어 SARS-CoV-2 의 스파이크 단백질) 에 결합하는 항체와 상기 펩티드로 복합체를 제조하고, 당해 항체 또는 상기 펩티드에 표지한 복합체를 제조하여, 그것을 투여, 검출함으로써, SARS-CoV-2 감염의 유무, 중독도 (重篤度) 등을 검출할 수 있다. 또한, 이뮤노어세이에서는, 상기 펩티드를 비오틴으로 표지하고, 효소 등으로 표지한 아비딘 또는 스트랩토아비딘을 결합시켜 검출할 수도 있다.
이뮤노어세이 중에서도, 효소 표지를 사용하는 ELISA 법은, 간편하고 신속하게 항원을 측정할 수 있어 바람직하다. 예를 들어, 항체를 고상 담체에 고정시키고, 샘플을 첨가하여 반응시킨 후, 표지한 상기 펩티드를 첨가하여 반응시킨다. 세정 후, 효소 기질과 반응, 발색시켜, 흡광도를 측정함으로써, SARS-CoV-2 감염의 유무, 중독도 등을 검출할 수 있다. 고상 담체에 고정시킨 항체와 시료를 반응시킨 후, 표지되지 않은 상기 펩티드를 첨가하고, 상기 펩티드에 대한 항체를 효소 표지하여 추가로 첨가해도 된다. 항체는 고상 담체의 표면에 고정되어도 되고, 내부에 고정되어도 된다.
효소 기질은, 효소가 퍼옥시다제인 경우, 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB), o-페닐렌디아민 (OPD) 등을 사용할 수 있고, 알칼리포스파타제인 경우, p-니트로페닐포스페이트 (pNPP) 등을 사용할 수 있다.
본 명세서에 있어서 「고상 담체」는, 항체를 고정시킬 수 있는 담체이면 특별히 한정되지 않고, 유리제, 금속성, 수지제 등의 마이크로타이터 플레이트, 기판, 비즈, 니트로셀룰로오스 멤브레인, 나일론 멤브레인, PVDF 멤브레인 등을 들 수 있고, 표적 물질은, 이들 고상 담체에 공지된 방법에 따라 고정시킬 수 있다.
본 발명은, 본 발명의 펩티드를 포함하는, 진단용 키트에 관한 것이다. 상기 진단용 키트는, 상기 검출에 필요한 시약 및 기구 (비한정적으로, 본 발명의 펩티드, 항체, 고상 담체, 완충액, 효소 반응 정지액, 마이크로 플레이트 리더 등의 어느 것 또는 모두를 포함한다) 를 포함한다.
본 발명은, 본 발명의 펩티드를 포함하는 테스터에 관한 것이다.
본 발명은, 본 발명의 펩티드를 투여하는 것에 의한, 코로나바이러스 감염증을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은, 본 발명의 펩티드의 코로나바이러스 감염증의 진단을 위한 사용에 관한 것이다.
본 발명은, 본 발명의 펩티드의, 코로나바이러스 감염증의 진단을 위한 진단용 조성물의 제조를 위한 사용에 관한 것이다.
본 발명은, 본 발명의 펩티드의, 코로나바이러스 감염증의 진단을 위한 진단용 조성물로서의 사용에 관한 것이다.
본 발명은, 코로나바이러스 감염증을 진단하는 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은, 코로나바이러스 감염증을 진단하기 위한 진단용 조성물로 사용되기 위한, 본 발명의 펩티드에 관한 것이다.
7. 병용
본 발명의, 본 발명의 펩티드를 포함하는, 의약 조성물은, 다른 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약제와 병용되어도 된다.
본 발명은, 다른 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약제와 병용되는, 본 발명의 펩티드를 포함하는, 의약 조성물에 관한 것이다. 「의약 조성물」에 대하여, 「5. 의약 조성물」의 항목에서 설명한 바와 같다.
다른 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약제는, 본 발명의 펩티드 이외의, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료에 유효한 약제이며, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 렘데시비르, 파비피라비르, 몰누피라비르와 같은 RNA 폴리메라아제 저해제나, 덱사메타손, 시클레소니드와 같은 스테로이드제, 바리시티닙과 같은 야누스키나아제 저해제, 나파모스타트와 같은 폴리메라아제 저해제와 같은 화합물이어도 되고, 또한, 토실리주맙, 사릴루맙과 같은 항체나, 복수의 항체의 칵테일제이어도 된다. 또한, 그것들의 혼합제여도 된다. 비한정적으로, 다른 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약제는, 렘데시비르, 카시리비맙과 임데비맙의 병용제, 및 몰누피라비르 혹은 그 활성체로 이루어지는 군에서 선택된다.
「렘데시비르」는, 신규 뉴클레오티드 아날로그의 프로드러그로, 항바이러스약이다. 1 본쇄 RNA 바이러스 (RS 바이러스, 후닌 바이러스, 라사열 바이러스, 니파 바이러스, 헨드라 바이러스, MERS 및 SARS 바이러스를 포함하는 코로나바이러스) 에 대하여 항바이러스 활성을 나타내는 것이 발견되었다. SARS-CoV-2 를 포함하는 복수의 코로나바이러스 감염증에서의 항바이러스 활성도 밝혀져 있다.
「카시리비맙·임데비맙」은, REGEN-COV (등록상표) 의 상품으로 판매되고 있다. 이는, SARS-CoV-2 코로나바이러스에 대한 내성을 만들어내기 위해 설계된 인공적인 「항체 칵테일」이다. 이것은, 카시리비맙 (REGN10933) 과 임데비맙 (REGN10987) 의 2 개의 모노클로날 항체로 구성되고 (병용), 바람직하게는 혼합하여 사용된다.
「몰누피라비르」는, 항인플루엔자약으로 개발된 경구 활성이 있는 항바이러스약이다. 몰누피라비르는, 합성 뉴클레오시드 유도체 N4-하이드록시시티딘 (「EIDD-1931」이라고도 불린다) 의 프로드러그이다. N4-하이드록시시티딘은, β-D-N4-하이드록시시티딘 5'-3 인산 (「EIDD-1931 5'-3 인산」, 또는 「NHC-TP」라고도 불린다) 으로 대사된다. 비한정적으로, 몰누피라비르 혹은 그 활성체는, N4-하이드록시시티딘, β-D-N4-하이드록시시티딘 5'-3 인산을 포함한다.
본 발명의 펩티드를 포함하는, 의약 조성물과, 다른 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약제의 투여되는 타이밍은 특별히 한정되지 않지만, 본 발명의 펩티드를 포함하는, 의약 조성물의 투여는, 다른 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약제의 투여 전에, 투여와 동시에, 혹은 투여 후에 실시할 수 있다. 일 양태에 있어서, 본 발명의 펩티드를 포함하는, 의약 조성물을 다른 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약제와 동시 투여한다.
본 발명의 펩티드와, 다른 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약제를 동시 투여하기 위해서, 조합제로 해도 된다. 본 발명은 일 양태에 있어서, 본 발명의 펩티드와 다른 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약제를 포함하는, 조합제에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 본 발명의 펩티드를 포함하는, 의약 조성물과 병용되는, 다른 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약제에 관한 것이다.
본 발명을, 본 발명의 펩티드와, 다른 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약제를 투여하는 것에 의한, 코로나바이러스 감염증을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 일 양태에 있어서, 본 발명의 펩티드는, 다른 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약제의 투여 전에, 후에, 또는 동시에 투여할 수 있다.
본 발명은, 본 발명의 펩티드와 다른 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약제의, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 사용에 관한 것이다.
본 발명은, 다른 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약제와 병용되는, 본 발명의 펩티드를 포함하는, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 의약 조성물의 제조를 위한, 본 발명의 펩티드의 사용에 관한 것이다.
본 발명은, 본 발명의 펩티드의, 다른 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약제와 병용되는, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 의약 조성물로서의 사용에 관한 것이다.
본 발명은, 코로나바이러스 감염증을 예방 또는 치료하는 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 펩티드와 다른 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약제에 관한 것이다.
본 발명은, 다른 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약제와 병용되는, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 의약 조성물로서 사용되기 위한, 본 발명의 펩티드에 관한 것이다.
본 발명은, 본 발명의 펩티드를 포함하는, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 의약 조성물과 병용되는, 다른 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약제의, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 사용에 관한 것이다. 일 양태에 있어서, 다른 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 약제에 있어서, 본 발명의 펩티드를 포함하는 의약 조성물과 병용하여, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료하는 것을 시사하는 것을 포함한다.
실시예
이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 상세하게 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 당업자는 본 명세서의 기재에 기초하여 용이하게 본 발명에 수식·변경을 추가할 수 있고, 그것들은 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
　화학 합성
이하의 실시예에 있어서의 화학 합성에 있어서 사용된 모든 원료, 빌딩 블록, 시약, 산, 염기, 고상 수지, 용매는, 시판품을 그대로 사용했거나, 혹은 당업자에 의해 유기 화학적 수법을 이용하여 합성할 수 있는 것이다. 또한, 보호기를 포함하는 아미노산은 특별한 기재가 없는 한 시판품을 그대로 사용하였다.
고상 수지에 있어서의 펩티드 사슬의 신장은, 각각의 실시예에 기재된 수지를 출발 원료로 하여, 통상 사용되는 펩티드 커플링 반응 조건과 Fmoc 제거 반응 조건을 이용하여 실시하였다. 반응은 펩티드 자동 합성기인 CEM 사의 Liberty Blue 를 사용하고, 제조원의 매뉴얼에 따라 실시하였다.
사용한 수지는, Sieber Amide resin 을 사용하고, 사용한 양은 각 펩티드에 따라 5 mg - 2 g 의 범위였다.
예로서, 사용되는 일반적인 아미노산의 일부를 하기에 열거하고, 측사슬 보호기는 괄호 내에 나타내었다.
Fmoc-N-Me-Phe-OH ;
Fmoc-Ala-OH ;
Fmoc-N-Me-Ala-OH ;
Fmoc-N-Me-Nle-OH ;
Fmoc-Aib-OH ;
Fmoc-Cha-OH ;
Fmoc-Cit-OH ;
Fmoc-Nal1-OH ;
Fmoc-Tyr(tBu)-OH ;
Fmoc-Cys(Trt)-OH ;
Fmoc-Ser(Trt)-OH ;
Fmoc-dd(Mpe)-OH.
얻어진 조 (粗) 정제 펩티드의 정제 방법으로서, Waters 사 AutoPurification System-SQD2 single quadruple mass spectrometer 로 역상 분취 HPLC 를 사용하고, 목적물 유래의 m/z 이온을 모니터링하면서 용출하였다. ESI-positive 의 스캔 모드로 얻어지는 매스 스펙트럼과 목적물의 분자식으로부터 계산되는 다가 이온을 포함하는 매스 스펙트럼이 사용한 질량 분석기의 오차 범위에서 일치하고 있는 것을 확인하였다. 또한, 사용한 칼럼을 포함하는 정제 조건은 각각의 실시예에 나타내었다.
화학 합성된 펩티드의 구조 결정은, 목적 서열에 따라 사용한 아미노산과 필요에 따라 사용한 빌딩 블록을 고려하여 계산된 분자량을, 질량 스펙트럼 분석법에 있어서의 ESI-MS(＋) 에 의해 확인하였다. 또한, “ESI-MS(＋)”이란, 양이온 모드로 실시한 일렉트로스프레이 이온화 질량 스펙트럼 분석법을 나타낸다. 검출된 질량은 “m/z”단위 표기에 의해 보고되었다. 또한, 분자량이 대략 1000 보다 큰 화합물은, 2 가 이온 또는 3 가 이온으로서 고빈도로 검출되었다.
실시예 1 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는 펩티드의 동정
본 실시예에서는, 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는 복수의 고리형 펩티드를 동정하였다.
우선, SARS-CoV-2 의 스파이크 단백질 (GENE Accesstion No. YP＿009724390) 을 표적으로 하고, 국제 공개 WO2014/119600호, 국제 공개 WO2012/033154호, 또는 국제 공개 WO2007/066627호에 기재되어 있는 스크리닝 방법으로, 표적 단백질에 결합하는 펩티드를 발견하였다.
SARS-CoV-2 감염 실험계를 이용하여, 당해 펩티드 및 그 아날로그가 실제로 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는지 여부를 조사하였다. 구체적으로는, SARS-CoV-2 를 사용한 감염 실험을, BSL3 실험 구획 내에서 실시하였다. VeroE6/TMPRSS2 세포 (Transmembrane Serine Protease TMPRSS2 발현 VeroE6 아프리카 녹색원숭이 세포주, 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스 고감수성인 세포) 를 96 웰 플레이트에 3.0×104 cells 가 되도록 파종하고, 하룻밤 배양하였다.
감염성 SARS-CoV-2 (JPN/TY/WK-521 주) 를 포함하는 배지를 MOI (multiplicity of infection) ＝ 0.003 으로 세포에 1 시간 처리하고, 세정 후에, 후술하는 실시예 2, 실시예 3 에서 합성한 고리형 펩티드, 또는 컨트롤로서 렘데시비르와 함께 화합물을 포함하는 새로운 배지로 교환하였다. 또한, 고리형 펩티드는, 최종 농도가 1 μM 또는 50 nM 이 되도록 첨가하였다. 렘데시비르는, 최종 농도가 10 μM 이 되도록 첨가하였다. 24 시간 후에 배양 상청을 회수하고, 이 안에 포함되는 바이러스 RNA 를 MagMax Viral/Pathogen II Nucleic Acid Isolation kit (써모피셔 사이언티픽사) 에 의해 추출하였다.
추출물에 포함되는 바이러스 RNA 는 one-step qRT-PCR kit (THUNDERBIRD (등록상표) Probe One-step qRT-PCR kit ; 토요보사) 를 이용한 리얼타임 RT-qPCR 에 의해 정량하였다.
프라이머
5'-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3' (서열 번호 127)
5'-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3' (서열 번호 128)
프로브
5'-FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-TAMRA-3’ (서열 번호 129)
결과를 표 2 에 나타낸다. 표 2 의 「서열」의 1-13 은 펩티드의 아미노산 서열의 아미노산 잔기의 번호를 나타낸다. 표 2 의 펩티드는 모두 1 번째의 아미노산 잔기와, 12 번째의 시스테인 잔기 (C) 가 결합한 고리형 펩티드이다. 또한, 실제의 합성 방법에 대해서는 후술하지만, 표 2 의 「서열」에 기재된 12 잔기 또는 13 잔기로 이루어지는 아미노산 서열을 합성 후, 1 번째의 아미노산 잔기에 클로로아세틸기를 도입하고, 당해 클로로아세틸기에 포함되는 아세틸기와 시스테인 잔기에 포함되는 황 분자 S 가 결합함으로써 고리화가 이루어진다. 또한, 13 번째의 아미노산 잔기에 「de」라고 기재되어 있는 펩티드는, C 말단 (고리형의 외측) 에 D-글루타민산을 갖는 것을 의미한다.
상기 펩티드의 첨가 전과 비교하여, 배양 상청에 포함되는 바이러스 RNA 의 양이 10 ％ 이하가 되었을 경우, 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는다, 라고 판단하였다. 표 2 에 있어서, 펩티드를 50 nM 첨가시에 항 SARS-CoV-2 활성이 확인된 것은 「2」, 50 nM 첨가시에는 활성이 확인되지 않았지만, 1 μM 첨가시에는 활성이 확인된 것은 「1」로서 나타내었다. 표 2 에 있어서의 ESI-MS(m/z) 는, ESI-MS(＋) 관측치 ([M＋2H]2+) 를 나타낸다. 표 2 에 나타낸 125 의 고리형 펩티드에 있어서, 항 SARS-CoV-2 활성이 있는 것이 나타났다.
또한, 렘데시비르는 10 μM 첨가시에 항 SARS-CoV-2 활성을 나타내었다.
표 2 : 펩티드 서열 및 항 SARS-CoV-2 활성
[표 2-1]
[표 2-2]
[표 2-3]
[표 2-4]
[표 2-5]
실시예 2 고리형 펩티드 5555＿p000 (서열 번호 2) 의 합성
본 실시예는, 고리형 펩티드 5555＿p000 (서열 번호 2) 의 합성을 기재한다.
[화학식 2]
Figure pct00008
Sieber amide resin (와타나베 화학 공업 주식회사, 0.65 mmol/g) 을 사용하여, 전술한 일반적 방법으로 목적의 펩티드를 합성하였다. 그 때, CEM 사의 Liberty Blue 를 고상 합성기로서 사용하고, 제조원의 매뉴얼에 따라 합성을 실시하였다. 각 잔기의 도입에는 수지 1 당량에 대하여, Fmoc-AA/HATU/DIEA (4.2 당량/4 당량/8 당량) 를 사용하고, DMF 중 75 ℃ 하, 10 분간 1 회 반응을 실시하였다. 단, 1 잔기째, 2 잔기째는 75 ℃ 하, 10 분간 2 회, 9 잔기째, 10 잔기째는 30 ℃ 하, 20 분간 2 회, 12 잔기째는 30 ℃ 하, 20 분간 1 회 반응을 실시하였다.
또한, Fmoc 제거는 20 ％ 피페리딘의 DMF 용액과 75 ℃ 하, 3 분간 반응시키는 것을 기본 조건으로 하였다. 단, 1 잔기째, 2 잔기째는 25 ℃ 하, 5 분간 반응시킨 후, 10 분간 반응을 실시하였다. 클로로아세틸기의 도입은 전 (前) 공정에서 얻어진 Fmoc 보호된 펩티드가 유지된 고상 수지에 대하여, 전술한 방법으로 α-아미노기의 Fmoc 기를 제거한 후, 0.2 M 클로로아세트산의 DMF 용액 (5 당량), 0.5 M HATU 의 DMF 용액 (5 당량), 0.5 M DIPEA 의 DMF 용액 (5 당량) 을 고상 수지에 첨가하여 실온에서 30 분간 진탕에 의해 실시하였다.
측사슬의 탈보호 및 고상 수지로부터의 잘라내기는, 클로로아세틸기 도입 공정 후에 얻어진 수지를 DMF 와 염화메틸렌으로 세정하여 감압 하 건조시킨 후, 계속해서 고상 수지가 들어간 반응 용기에, 반응제 칵테일-A (TFA/H2O/TIS/DODT 의 체적비 92.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5 의 혼합물) 를 첨가하여, 25 ℃ 에서 35 분간 진탕에 의해 실시하였다.
반응액을 프릿으로부터 여과 회수하였다. 반응 용기에 남은 고상 수지는 잘라내기용 칵테일과 재차 진탕하고, 프릿으로부터 용액 성분을 회수, 전술한 여과액과 혼합하였다. 이 여과액을 0 ℃ 로 냉각시킨 과잉의 디에틸에테르/헥산 (1/1) 의 혼합 용매에 첨가하면, 백탁 침전이 발생하였다. 이 혼합물을 원심 분리하고 (9000 rpm, 1 분간), 용액을 디캔테이션하였다. 얻어진 고체를 재차 0 ℃ 로 냉각시킨 소량의 디에틸에테르/헥산으로 세정한 후, 감압 하 건조시켰다. 얻어진 고체를 다음의 고리화 반응에 사용하였다. 펩티드의 고리화 반응은 펩티드의 종 (終) 농도가 고상 수지의 몰수를 기초로 5 mM 가 되도록 DMSO/물 (9/1) 에 용해 후, 6 당량의 트리에틸아민을 첨가하여, 25 ℃ 에서 18 시간 진탕하였다. 얻어진 반응 용액을 EZ-2 Elite 를 사용하여 감압 농축하였다.
얻어진 조생성물을, 이하의 조건을 사용하여 정제하였다 (칼럼 : Waters Xbridge (등록상표) C18 5 ㎛ (등록상표) 30×150 mm ; 이동상 : A ＝ 0.1 ％ TFA (H2O 중), B ＝ 0.1 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 40 ℃ ; 그레이디언트 (％ B) : 3 분간에 걸쳐 9-34 ％, 그 후 8 분간에 걸쳐 34-39 ％, 그 후 1 분에 걸쳐 39-60 ％ 유량 : 45 mL/분).
목적물의 순도는 이하의 분석 조건의 LC/MS (UV 파장 225 nm) 크로마토그램의 면적비로부터 산출하여 91.67 ％ 였다.
분석 조건 : 유지 시간 ＝ 3.86 분 ; 칼럼 : Kinetex EVO C18 2.6 ㎛ 2.1×150 mm
100Å ; 이동상 : A ＝ 0.025 ％ TFA (H2O 중), B ＝ 0.025 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 60 ℃ ; 그레이디언트 (％ Bconc) : 7.15 분간에 걸쳐 20-60 ％, 그 후 0.30 분간에 걸쳐 60-95 ％, 그 후 1.55 분에 걸쳐 95-95 ％ 유량 : 0.5 mL/분
ESI-MS(＋) 관측치 m/z ＝ 909.85, (M＋2H)2+　
표 1 에 기재된 고리형 펩티드에 대해서는, 본 명세서 중에 그 밖에 합성 실시예가 기재되어 있지 않은 경우, 5555＿p000 과 동일하게 합성하였다.
실시예 3 고리형 펩티드의 합성예
본 실시예는, 고리형 펩티드의 합성예를 기재한다.
(1) 실시예 3-1 고리형 펩티드 5555＿p003 (서열 번호 5) 의 합성
[화학식 3]
Figure pct00009
Sieber amide resin (와타나베 화학 공업 주식회사, 0.65 mmol/g) 을 사용하여, 전술한 일반적 방법으로 목적의 펩티드를 합성하였다. 그 때, CEM 사의 Liberty blue HT 를 고상 합성기로서 사용하고, 제조원의 매뉴얼에 따라 합성을 실시하였다. 각 잔기의 도입에는 수지 1 당량에 대하여, Fmoc-AA/DIC/Oxyma pure (4.2 당량/8 당량/4 당량) 를 사용하고, DMF 중 105 ℃ 하, 2 분간 1 회 반응을 실시하였다. 단, 1 잔기째는 75 ℃ 하, 30 분간 2 회, 2 잔기째, 3 잔기째는 105 ℃ 하, 2 분간 2 회, 10 잔기째는 50 ℃ 하, 15 분간 2 회, 12 잔기째는 50 ℃ 하, 15 분간 1 회 반응을 실시하였다.
또한, Fmoc 제거는 83 mM Oxyma pure 의 4 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 110 ℃ 하, 1 분간 반응시키는 것을 기본 조건으로 하였다. 단, 2 잔기째, 3 잔기째, 4 잔기째, 5 잔기째 및 6 잔기째는 10 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 50 ℃ 하, 90 초간 반응시켰다. 1 잔기째는 10 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 25 ℃ 하, 1 분간 2 회 반응시켰다. 클로로아세틸기의 도입은 전공정에서 얻어진 Fmoc 보호된 펩티드가 유지된 고상 수지에 대하여, 전술한 방법으로 α-아미노기의 Fmoc 기를 제거한 후, 0.2 M 클로로아세트산의 DMF 용액 (5 당량), 0.5 M HATU 의 DMF 용액 (5 당량), 1 M DIEA 의 DMF 용액 (10 당량) 을 고상 수지에 첨가하여 실온에서 30 분간 진탕에 의해 실시하였다.
측사슬의 탈보호 및 고상 수지로부터의 잘라내기는, 클로로아세틸기 도입 공정 후에 얻어진 수지를 DMF 와 염화메틸렌으로 세정하여 감압 하 건조시킨 후, 계속해서 고상 수지가 들어간 반응 용기에, 반응제 칵테일-A (TFA/H2O/TIS/DODT 의 체적비 92.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5 의 혼합물) 를 첨가하여, 25 ℃ 에서 30 분간 진탕에 의해 실시하였다.
반응액을 프릿으로부터 여과 회수하였다. 반응 용기에 남은 고상 수지는 잘라내기용 칵테일과 재차 진탕하고, 프릿으로부터 용액 성분을 회수, 전술한 여과액과 혼합하였다. 이 여과액을 0 ℃ 로 냉각시킨 과잉의 디에틸에테르/헥산 (1/1) 의 혼합 용매에 첨가하면, 백탁 침전이 발생하였다. 이 혼합물을 원심 분리하고 (10000 rpm, 1 분간), 용액을 디캔테이션하였다. 얻어진 고체를 재차 0 ℃ 로 냉각시킨 소량의 디에틸에테르/헥산으로 세정한 후, 감압 하 건조시켰다. 얻어진 고체를 다음의 고리화 반응에 사용하였다. 펩티드의 고리화 반응은 펩티드의 종농도가 고상 수지의 몰수를 기초로 5 mM 가 되도록 DMSO 에 용해 후, 5 당량의 트리에틸아민을 첨가하여, 25 ℃ 에서 16 시간 진탕하였다. 얻어진 반응 용액을 EZ-2 Elite 를 사용하여 감압 농축하였다.
얻어진 조생성물을, 이하의 조건을 사용하여 정제하였다 (칼럼 : Waters Xbridge (등록상표) C18 5 ㎛ (등록상표) 30×150 mm ; 이동상 : A ＝ 0.1 ％ TFA (H2O 중), B ＝ 0.1 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 40 ℃ ; 그레이디언트 (％ B) : 3 분간에 걸쳐 18-43 ％, 그 후 8 분간에 걸쳐 43-48 ％, 그 후 1 분에 걸쳐 48-60 ％ 유량 : 45 mL/분).
목적물의 순도는 이하의 분석 조건의 LC/MS (UV 파장 225 nm) 크로마토그램의 면적비로부터 산출하여 94.80 ％ 였다.
분석 조건 : 유지 시간 ＝ 5.70 분 ; 칼럼 : Kinetex EVO C18 2.6 ㎛ 2.1×150 mm, 100 Å ; 이동상 : A ＝ 0.025 ％ TFA (H2O 중), B ＝ 0.025 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 60 ℃ ; 그레이디언트 (％ Bconc) : 7.15 분간에 걸쳐 20-60 ％, 그 후 0.30 분간에 걸쳐 60-95 ％, 그 후 1.55 분에 걸쳐 95-95 ％ 유량 : 0.5 mL/분
ESI-MS(＋) 관측치 m/z ＝ 888.87 (M＋2H)2+
(2) 실시예 3-2 고리형 펩티드 5555＿p020 (서열 번호 22) 의 합성
[화학식 4]
Figure pct00010
Sieber amide resin (와타나베 화학 공업 주식회사, 0.65 mmol/g) 을 사용하여, 전술한 일반적 방법으로 목적의 펩티드를 합성하였다. 그 때, CEM 사의 Liberty Prime 를 고상 합성기로서 사용하고, 제조원의 매뉴얼에 따라 합성을 실시하였다. 각 잔기의 도입에는 수지 1 당량에 대하여, Fmoc-AA/DIC/Oxyma pure (4.2 당량/8 당량/4 당량) 를 사용하고, DMF 중 105 ℃ 하, 2 분간 1 회 반응을 실시하였다. 단, 1 잔기째는 75 ℃ 하, 30 분간 2 회 반응, 2 잔기째, 3 잔기째, 5 잔기째, 및 6 잔기째는 105 ℃ 하, 2 분간 2 회, 12 잔기째는 50 ℃ 하, 15 분간 1 회 반응을 실시하였다.
또한, Fmoc 제거는 83 mM Oxyma pure 의 4 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 110 ℃ 하, 1 분간 반응시키는 것을 기본 조건으로 하였다. 단, 1 잔기째는 25 ℃ 하, 1 분간 2 회 반응시켰다. 클로로아세틸기의 도입은 전공정에서 얻어진 Fmoc 보호된 펩티드가 유지된 고상 수지에 대하여, 전술한 방법으로 α-아미노기의 Fmoc 기를 제거한 후, 0.2 M 클로로아세트산의 DMF 용액 (5 당량), 0.5 M HATU 의 DMF 용액 (5 당량), 0.5 M DIEA 의 DMF 용액 (10 당량) 을 고상 수지에 첨가하여 실온에서 30 분간 진탕함으로써 실시하였다.
측사슬의 탈보호 및 고상 수지로부터의 잘라내기는, 클로로아세틸기 도입 공정 후에 얻어진 수지를 DMF 와 염화메틸렌으로 세정하여 감압 하 건조시킨 후, 계속해서 고상 수지가 들어간 반응 용기에, 반응제 칵테일-A (TFA/H2O/TIS/DODT 의 체적비 92.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5 의 혼합물) 를 첨가하여, 25 ℃ 에서 5 분간 진탕에 의해 실시하였다.
반응액을 프릿으로부터 여과 회수하였다. 반응 용기에 남은 고상 수지는 잘라내기용 칵테일과 재차 진탕하고, 프릿으로부터 용액 성분을 회수, 전술한 여과액과 혼합하였다. 이 여과액을 0 ℃ 로 냉각시킨 과잉의 디에틸에테르/헥산 (1/1) 의 혼합 용매에 첨가하면, 백탁 침전이 발생하였다. 이 혼합물을 원심 분리하고 (9000 rpm, 1 분간), 용액을 디캔테이션하였다. 얻어진 고체를 재차 0 ℃ 로 냉각시킨 소량의 디에틸에테르/헥산으로 세정한 후, 감압하 건조시켰다. 얻어진 고체를 다음의 고리화 반응에 사용하였다. 펩티드의 고리화 반응은 펩티드의 종농도가 고상 수지의 몰수를 기초로 5 mM 가 되도록 DMSO 에 용해 후, 10 당량의 트리에틸아민을 첨가하여, 25 ℃ 에서 16 시간 진탕하였다. 얻어진 반응 용액을 20 당량의 아세트산을 첨가한 후, EZ-2 Elite 를 사용하여 감압 농축하였다.
얻어진 조생성물을, 이하의 조건을 사용하여 정제하였다 (칼럼 : Waters Xbridge (등록상표) C18 5 ㎛ (등록상표) 30×150 mm ; 이동상 : A ＝ 0.1 ％ TFA (H2O 중), B ＝ 0.1 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 40 ℃ ; 그레이디언트 (％ B) : 3 분간에 걸쳐 20-45 ％, 그 후 8 분간에 걸쳐 45-50 ％, 그 후 1 분에 걸쳐 50-60 ％ 유량 : 45 mL/분).
목적물의 순도는 이하의 분석 조건의 LC/MS (UV 파장 225 nm) 크로마토그램의 면적비로부터 산출하여 93.40 ％ 였다.
분석 조건 : 유지 시간 ＝ 6.01 분 ; 칼럼 : Kinetex EVO C18 2.6 ㎛ 2.1×150 mm, 100 Å ; 이동상 : A ＝ 0.025 ％ TFA (H2O 중), B ＝ 0.025 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 60 ℃ ; 그레이디언트 (％ Bconc) : 7.15 분간에 걸쳐 20-60 ％, 그 후 0.30 분간에 걸쳐 60-95 ％, 그 후 1.55 분에 걸쳐 95-95 ％ 유량 : 0.5 mL/분
ESI-MS(＋) 관측치 m/z ＝ 937.43 (M＋2H)2+
(3) 실시예 3-3 고리형 펩티드 5555＿p028 (서열 번호 30) 의 합성
[화학식 5]
Figure pct00011
HMPB-MBHA resin (Merck, 0.85 mmol/g), 및 수지 1 당량에 대하여 Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH/DIC/DMAP (4 당량/4 당량/0.1 ∼ 0.5 당량) 를, DMF/DCM (1/10) 중, 실온에서 30 분 1 회 반응을 실시하여 합성한 Fmoc-de(OtBu)-HMPB-MBHA resin 을 사용하고, 일반적 방법으로 목적의 펩티드를 합성하였다. 그 때, CEM 사의 Liberty Blue 를 고상 합성기로서 사용하고, 제조원의 매뉴얼에 따라 합성을 실시하였다. 각 잔기의 도입에는 수지 1 당량에 대하여, Fmoc-AA/DIC/Oxyma pure (4.2 당량/8 당량/4 당량) 를 사용하고, DMF 중 90 ℃ 하, 3 분간 1 회 반응을 실시하였다. 단, 1 잔기째는 75 ℃ 하, 30 분간 2 회, 2 잔기째는 75 ℃ 하, 20 분간 2 회, 12 잔기째는 50 ℃ 하, 20 분간 1 회 반응을 실시하였다.
또한, Fmoc 제거는 20 ％ 피페리딘의 DMF 용액과 75 ℃ 하, 3 분간 반응시키는 것을 기본 조건으로 하였다. 단, 1 잔기째, 2 잔기째, 3 잔기째, 4 잔기째, 5 잔기째 및 6 잔기째는 25 ℃ 하, 5 분간 2 회 반응시켰다. 클로로아세틸기의 도입은 전공정에서 얻어진 Fmoc 보호된 펩티드가 유지된 고상 수지에 대하여, 전술한 방법으로 α-아미노기의 Fmoc 기를 제거한 후, 0.1 M 클로로아세트산의 DMF 용액 (5 당량), 0.1 M HATU 의 DMF 용액 (5 당량), 0.2 M DIEA 의 DMF 용액 (10 당량) 을 고상 수지에 첨가하여 실온에서 30 분간 진탕에 의해 실시하였다.
측사슬의 탈보호 및 고상 수지로부터의 잘라내기는, 클로로아세틸기 도입 공정 후에 얻어진 수지를 DMF 와 염화메틸렌으로 세정하여 감압 하 건조시킨 후, 계속해서 고상 수지가 들어간 반응 용기에, 반응제 칵테일-A (TFA/H2O/TIS/DODT 의 체적비 92.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5 의 혼합물) 를 첨가하여, 25 ℃ 에서 30 분간 진탕에 의해 실시하였다.
반응액을 프릿으로부터 여과 회수하였다. 반응 용기에 남은 고상 수지는 잘라내기용 칵테일과 재차 진탕하고, 프릿으로부터 용액 성분을 회수, 전술한 여과액과 혼합하였다. 이 여과액을 0 ℃ 로 냉각시킨 과잉의 디이소프로필에테르 용매에 첨가하면, 백탁 침전이 발생하였다. 이 혼합물을 원심 분리하고 (9000 rpm, 1 분간), 용액을 디캔테이션하였다. 얻어진 고체를 재차 0 ℃ 로 냉각시킨 소량의 디에틸에테르로 세정한 후, 감압 하 건조시켰다. 얻어진 고체를 다음의 고리화 반응에 사용하였다. 펩티드의 고리화 반응은 펩티드의 종농도가 고상 수지의 몰수를 기초로 5 mM 가 되도록 DMSO/물 (19/1) 에 용해 후, 15 당량의 트리에틸아민을 첨가하여, 25 ℃ 에서 4 시간 진탕하였다. 얻어진 반응 용액을 EZ-2 Elite 를 사용하여 감압 농축하였다.
얻어진 조생성물을, 이하의 조건을 사용하여 정제하였다 (칼럼 : Waters Xbridge (등록상표) C18 5 ㎛ (등록상표) 50×250 mm ; 이동상 : A ＝ 0.1 ％ TFA (H2O 중), B ＝ 0.1 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 50 ℃ ; 그레이디언트 (％ B) : 3 분간에 걸쳐 14.4-38.8 ％, 그 후 15 분간에 걸쳐 38.8-43.9 ％, 그 후 3 분간에 걸쳐 43.9-60 ％ 유량 : 120 mL/분).
목적물의 순도는 이하의 분석 조건의 LC/MS (UV 파장 225 nm) 크로마토그램의 면적비로부터 산출하여 81.62 ％ 였다.
분석 조건 : 유지 시간 ＝ 5.40 분 ; 칼럼 : Kinetex EVO C18 2.6 ㎛ 2.1×150 mm, 100 Å ; 이동상 : A ＝ 0.025 ％ TFA (H2O 중), B ＝ 0.025 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 60 ℃ ; 그레이디언트 (％ Bconc) : 7.15 분간에 걸쳐 20-60 ％, 그 후 0.30 분간에 걸쳐 60-95 ％, 그 후 1.55 분에 걸쳐 95-95 ％ 유량 : 0.5 mL/분
ESI-MS(＋) 관측치 m/z ＝ 922.92 (M＋2H)2+
(4) 실시예 3-4 고리형 펩티드 5555＿p070 (서열 번호 72) 의 합성
[화학식 6]
Figure pct00012
Sieber amide resin (와타나베 화학 공업 주식회사, 0.65 mmol/g) 을 사용하여, 전술한 일반적 방법으로 목적의 펩티드를 합성하였다. 그 때, CEM 사의 Liberty Blue 를 고상 합성기로서 사용하고, 제조원의 매뉴얼에 따라 합성을 실시하였다. 각 잔기의 도입에는 수지 1 당량에 대하여, Fmoc-AA/DIC/Oxyma pure (4.2 당량/8 당량/4 당량) 를 사용하고, DMF 중 90 ℃ 하, 3 분간 1 회 반응을 실시하였다. 단, 1 잔기째는 75 ℃ 하, 30 분간 2 회, 10 잔기째는 50 ℃ 하, 20 분간 2 회, 12 잔기째는 50 ℃ 하, 20 분간 1 회 반응을 실시하였다.
Fmoc 제거는 20 ％ 피페리딘의 DMF 용액과 75 ℃ 하, 3 분간 반응시키는 것을 기본 조건으로 하였다. 클로로아세틸기의 도입은 전공정에서 얻어진 Fmoc 보호된 펩티드가 유지된 고상 수지에 대하여, 전술한 방법으로 α-아미노기의 Fmoc 기를 제거한 후, 0.2 M 클로로아세트산의 DMF 용액 (4 당량), 0.5 M HATU 의 DMF 용액 (4 당량), 1 M DIEA 의 DMF 용액 (8 당량) 을 고상 수지에 첨가하여 실온에서 30 분간 진탕에 의해 실시하였다.
측사슬의 탈보호 및 고상 수지로부터의 잘라내기는, 클로로아세틸기 도입 공정 후에 얻어진 수지를 DMF 와 염화메틸렌으로 세정하여 감압 하 건조시킨 후, 계속해서 고상 수지가 들어간 반응 용기에, 반응제 칵테일-A (TFA/H2O/TIS/DODT 의 체적비 92.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5 의 혼합물) 를 첨가하여, 25 ℃ 에서 45 분간 진탕에 의해 실시하였다.
반응액을 프릿으로부터 여과 회수하였다. 반응 용기에 남은 고상 수지는 잘라내기용 칵테일과 재차 진탕하고, 프릿으로부터 용액 성분을 회수, 전술한 여과액과 혼합하였다. 이 여과액을 0 ℃ 로 냉각시킨 과잉의 디에틸에테르/헥산 (1/1) 의 혼합 용매에 첨가하면, 백탁 침전이 발생하였다. 이 혼합물을 원심 분리하고 (9000 rpm, 1 분간), 용액을 디캔테이션하였다. 얻어진 고체를 재차 0 ℃ 로 냉각시킨 소량의 디에틸에테르/헥산으로 세정한 후, 감압 하 건조시켰다. 얻어진 고체를 다음의 고리화 반응에 사용하였다. 펩티드의 고리화 반응은 펩티드의 종농도가 고상 수지의 몰수를 기초로 5 mM 가 되도록 DMSO/물 (9/1) 에 용해 후, 6 당량의 트리에틸아민을 첨가하여, 25 ℃ 에서 18 시간 진탕하였다. 얻어진 반응 용액을 EZ-2 Elite 를 사용하여 감압 농축하였다.
얻어진 조생성물을, 이하의 조건을 사용하여 정제하였다 (칼럼 : Waters Xbridge (등록상표) C18 5 ㎛ (등록상표) 30×150 mm ; 이동상 : A ＝ 0.1 ％ TFA (H2O 중), B ＝ 0.1 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 40 ℃ ; 그레이디언트 (％ B) : 3 분간에 걸쳐 14-39 ％, 그 후 8 분간에 걸쳐 39-44 ％, 그 후 1 분에 걸쳐 44-60 ％ 유량 : 45 mL/분).
목적물의 순도는 이하의 분석 조건의 LC/MS (UV 파장 225 nm) 크로마토그램의 면적비로부터 산출하여 93.35 ％ 였다.
분석 조건 : 유지 시간 ＝ 4.91 분 ; 칼럼 : Kinetex EVO C18 2.6 ㎛ 2.1×150 mm, 100 Å ; 이동상 : A ＝ 0.025 ％ TFA (H2O 중), B ＝ 0.025 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 60 ℃ ; 그레이디언트 (％ Bconc) : 7.15 분간에 걸쳐 20-60 ％, 그 후 0.30 분간에 걸쳐 60-95 ％, 그 후 1.55 분에 걸쳐 95-95 ％ 유량 : 0.5 mL/분
ESI-MS(＋) 관측치 m/z ＝ 940.37 (M＋2H)2+
(5) 실시예 3-5 고리형 펩티드 5555＿p073 (서열 번호 75) 의 합성
[화학식 7]
Figure pct00013
HMPB-MBHA resin (Merck, 0.85 mmol/g), 및 수지 1 당량에 대하여 Fmoc-D-Glu(OtBu)-OH/DIC/DMAP (4 당량/4 당량/0.1 ∼ 0.5 당량) 를, DMF/DCM (1/10) 중, 실온에서 30 분 1 회 반응을 실시하여 합성한 Fmoc-de(OtBu)-HMPB-MBHA resin 을 사용하고, 일반적 방법으로 목적의 펩티드를 합성하였다. 그 때, CEM 사의 Liberty Prime 를 고상 합성기로서 사용하고, 제조원의 매뉴얼에 따라 합성을 실시하였다. 각 잔기의 도입에는 수지 1 당량에 대하여, Fmoc-AA/DIC/Oxyma pure (4.2 당량/8 당량/4 당량) 를 사용하고, DMF 중 105 ℃ 하, 2 분간 1 회 반응을 실시하였다. 단, 12 잔기째는 50 ℃ 하, 15 분간 1 회 반응을 실시하였다. 1 잔기째는 수지 1 당량에 대하여, Fmoc-AA/HATU/DIEA (4.2 당량/8 당량/4 당량) 를 사용하고, DMF 중 75 ℃ 하, 30 분간 2 회 반응을 실시하였다.
또한, Fmoc 제거는 83 mM Oxyma pure 의 4 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 110 ℃ 하, 1 분간 반응시키는 것을 기본 조건으로 하였다. 단, 1 잔기째는 20 ％ 피페리딘의 DMF 용액 25 ℃ 하, 5 분간 반응시킨 후, 10 분간 반응을 실시하였다. 클로로아세틸기의 도입은 전공정에서 얻어진 Fmoc 보호된 펩티드가 유지된 고상 수지에 대하여, 전술한 방법으로 α-아미노기의 Fmoc 기를 제거한 후, 0.1 M 클로로아세트산의 DMF 용액 (4 당량), 0.1 M HATU 의 DMF 용액 (4 당량), 0.2 M DIEA 의 DMF 용액 (8 당량) 을 고상 수지에 첨가하여 실온에서 30 분간 진탕에 의해 실시하였다.
측사슬의 탈보호 및 고상 수지로부터의 잘라내기는, 클로로아세틸기 도입 공정 후에 얻어진 수지를 DMF 와 염화메틸렌으로 세정하여 감압 하 건조시킨 후, 계속해서 고상 수지가 들어간 반응 용기에, 반응제 칵테일-A (TFA/H2O/TIS/DODT 의 체적비 92.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5 의 혼합물) 를 첨가하여, 25 ℃ 에서 10 분간 진탕에 의해 실시하였다. 반응액을 프릿으로부터 여과 회수하였다. 반응 용기에 남은 고상 수지는 잘라내기용 칵테일과 재차 진탕하고, 프릿으로부터 용액 성분을 회수, 전술한 여과액과 혼합하였다. 이 여과액을 0 ℃ 로 냉각시킨 과잉의 디에틸에테르/헥산 (1/1) 의 혼합 용매에 첨가하면, 백탁 침전이 발생하였다. 이 혼합물을 원심 분리하고 (9000 rpm, 2 분간), 용액을 디캔테이션하였다. 얻어진 고체를 재차 0 ℃ 로 냉각시킨 소량의 디에틸에테르/헥산으로 세정한 후, 감압 하 건조시켰다. 얻어진 고체를 다음의 고리화 반응에 사용하였다. 펩티드의 고리화 반응은 펩티드의 종농도가 고상 수지의 몰수를 기초로 5 mM 가 되도록 MeCN/물 (1/1) 에 용해 후, 5 당량의 트리에틸아민을 첨가하여, 25 ℃ 에서 15 시간 진탕하였다. 얻어진 반응 용액을 EZ-2 Elite 를 사용하여 감압 농축하였다.
얻어진 조생성물을, 이하의 조건을 사용하여 정제하였다 (칼럼 : Waters Xbridge (등록상표) C18 5 ㎛ (등록상표) 30×150 mm ; 이동상 : A ＝ 0.1 ％ TFA (H2O 중), B ＝ 0.1 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 40 ℃ ; 그레이디언트 (％ B) : 3 분간에 걸쳐 14-39 ％, 그 후 8 분간에 걸쳐 39-44 ％, 그 후 1 분에 걸쳐 44-60 ％ 유량 : 45 mL/분).
목적물의 순도는 이하의 분석 조건의 LC/MS (UV 파장 225 nm) 크로마토그램의 면적비로부터 산출하여 95.07 ％ 였다.
분석 조건 : 유지 시간 ＝ 5.01 분 ; 칼럼 : Kinetex EVO C18 2.6 ㎛ 2.1×150 mm, 100 Å ; 이동상 : A ＝ 0.025 ％ TFA (H2O 중), B ＝ 0.025 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 60 ℃ ; 그레이디언트 (％ Bconc) : 7.15 분간에 걸쳐 20-60 ％, 그 후 0.30 분간에 걸쳐 60-95 ％, 그 후 1.55 분에 걸쳐 95-95 ％ 유량 : 0.5 mL/분
ESI-MS(＋) 관측치 m/z ＝ 939.91 (M＋2H)2+
실시예 4 세포 융합법을 이용한 고리형 펩티드의 각종 변이 바이러스주에 대한 항바이러스 활성 측정
본 실시예에서는, 세포 융합법을 이용하여, 고리형 펩티드의 각종 변이 바이러스주에 대한 항바이러스 활성을 측정하였다.
VeroE6/hTMPRSS2 세포주 (JCRB 세포 뱅크의 JCRB1819) 에 HiBiT 를 안정 발현시킨 VeroE6/hTMPRSS2/HiBiT 세포를 제작하기 위해, pBiT3.1-N[CMV/HiBiT/Blast] 벡터 (프로메가사의 N2361) 에 HaloTag 유전자를 클로닝한 후, 일렉트로포레이터 NEPA21 (넵파진사) 로 당해 벡터를 도입하였다. 벡터에 블라스티사이딘 내성 유전자가 코드되어 있으므로, 블라스티사이딘 (인비트로젠사) 을 10 μg/mL 의 농도로 세포에 첨가하고, 벡터 미도입의 컨트롤 세포가 사멸할 때까지 약제 셀렉션을 실시하였다. 수립한 세포는 약제 셀렉션으로부터 3 회 계대 후에 어세이에 사용하였다. VeroE6/hTMPRSS2/HiBiT 세포의 배양에는, 10 ％ 비동화 소 태자 혈청 (써모피셔 사이언티픽사의 10270-106), 50 μg/mL 겐타마이신 (나카라이 테스크사의 11980-14) 함유 DMEM 배지 (써모피셔 사이언티픽사의 10569010) 를 사용하였다. 또한, HEK293T 세포 (유러피언 컬렉션 오브 어센티케이티드 셀 컬처즈) 의 배양에도 동일한 배지를 사용하였다. VeroE6/hTMPRSS2/HiBiT 세포 (1 : 10 ∼ 1 : 5), HEK293T 세포 (1 : 10 ∼ 1 : 5) 모두 주 2 회 계대하여 유지하고, 시험에 사용하였다.
pcDNA3.1(＋) 포유류 발현 벡터 (써모피셔 사이언티픽사의 V79020) 또는 pcDNA3.4 벡터 (써모피셔 사이언티픽사) 에, 각종 변이 바이러스주를 유도하는 SARS-CoV-2 유래 S 단백질 유전자를 삽입한 S 단백질 발현 벡터를 제작하였다. 또, pBiT1.1-N[TK/LgBiT] 벡터 (프로메가사의 N198A) 에 HaloTag 유전자를 클로닝함으로써 LgBiT 발현 벡터를 제작하였다. 여기서, 각종 변이 바이러스주란, 야생주인 우한주로부터 변이된, 알파주, 베타주, 감마주, 델타주를 나타낸다.
VeroE6/hTMPRSS/HiBiT 세포 (1.7×104 개/웰) 를 96 웰 플레이트 (써모피셔 사이언티픽사의 136101) 에 파종하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 존재 하에서 48 시간 배양하였다. 또, HEK293T 세포 (2.0×106 개/웰) 를 6 웰 플레이트 (스미토모 베이크라이트사의 MS-80060) 에 파종하고, Lipofectamine (등록상표) 3000 시약 (써모피셔 사이언티픽사의 L3000-015) 과 Opti-MEM (등록상표) 배지 (써모피셔 사이언티픽사의 11058-021) 를 사용한 리버스 트랜스펙션법에 의해, S 단백질 발현 벡터 또는 컨트롤 벡터 (1.25 μg/웰) 와 LgBiT 발현 벡터 (1.25 μg/웰) 를 코트랜스펙션하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 존재 하에서 48 시간 배양하였다 (S 단백질 발현 HEK293T 세포와 컨트롤 세포의 조제).
어세이시의 시험 대상인 고리형 펩티드의 2 배 농축액의 조제를 위해, 펩티드의 100 ％ DMSO 용액을 어세이 용액 (0.5 ％ 비동화 소 태아 혈청 (써모피셔 사이언티픽사의 10270-106), 50 μg/mL 겐타마이신 (나카라이 테스크사의 11980-14) 함유 DMEM 배지) 으로 희석하고, 단계 희석으로 7 단계의 5 배 희석 계열을 조제하고, 추가로 96 웰 플레이트 (스미토모 베이크라이트사의 MS-3296U) 에 분주하였다. DMSO 의 최종 농도는 0.1 ％ 이하로 하였다. 또한, 상기 트랜스펙션 후에 48 시간 배양한 HEK293T 세포의 배지를 제거하고, 1 웰당 500 μL 의 0.5 mM EDTA/PBS (나카라이 테스크사의 13567-84) 중, 실온에서 10 분간 인큐베이션하였다. 박리한 HEK293T 세포 현탁액에 4 배량의 10 ％ 비동화 소 태아 혈청 함유 DMEM 배지를 첨가하여, 200 xg 로 3 분간 원심한 후에 상청을 제거하고, 전술한 어세이 용액 (0.5 ％ 비동화 소 태아 혈청 함유 DMEM 배지) 을 첨가하여 재현탁하였다. S 단백질 발현 HEK293T 세포와 컨트롤 세포의 각각의 세포수와 생존율을 셀 카운터 (바이오래드사의 TC20) 와 트리판 블루 (바이오래드사의 1450022) 를 사용하여 측정하고, 생세포수가 2×106 개/mL 가 되도록 어세이 용액을 첨가하여 조정하였다. 96 웰 플레이트에 파종 후 48 시간 배양한 전술한 VeroE6/hTMPRSS2/HiBiT 세포의 배지를 제거하고, 고리형 펩티드의 2 배 농축액 50 μL/웰을 첨가하였다. 직후에 상기 S 단백질 발현 HEK293T 세포 또는 컨트롤 세포의 현탁액 50 μL/웰을 첨가하고, 피펫팅한 후에 37 ℃, 5 ％ CO2 존재 하에서 1 시간, 공배양하였다. 세포의 배지를 제거 후, Nano-Glo (등록상표) Live Cell Assay System (프로메가사의 N2012) 의 기질 용액을 0.5 ％ 비동화 소 태아 혈청 함유 Opti-MEM (등록상표) 배지로 5 배 희석한 검출액 75 μL/웰을 첨가하여, 실온에서 5 분간 인큐베이션한 후, SpectraMax (등록상표) Paradigm (등록상표) multimode microplate reader (몰레큘러 디바이스사) 를 이용하여 발광 강도를 측정하였다.
본 실시예의 계에 있어서의 화합물의 농도-저해 시그모이드 곡선에 기초하여, 4 파라미터 로지스틱 회귀로 Imax 와 IC50 치를 산출하였다. 구체적으로는, S 단백질 저해 활성 (％) 은, 발광 강도 측정치를 기초로 이하의 식에 의해 산출하였다.
[화학식 8]
Figure pct00014
IC50 치는, TIBCO Spotfire (등록상표) 소프트웨어를 사용하여, 4 파라미터 로지스틱 회귀에 의해 이하의 식으로부터 산출하였다.
[화학식 9]
Figure pct00015
산출한 각종 변이 바이러스주에 대한 각 펩티드의 항바이러스 활성 (IC50) 을 표 3 에 나타낸다.
[표 3]
표 3 에 있어서, 각 펩티드의 활성의 세기는, Imax 치 (최대 억제 효과) 로 표현되어 있다. Imax 100 ％ 는 S 단백질과 ACE2 단백질의 결합의 화합물에 의한 저해에 의해 세포 융합 → 발광이 검출 한계 이하가 된 것을 의미한다. 표 3 에 있어서, 5 종류의 SARS-COV2 변이주에 대하여, Imax 는 100 ％ 에 가까운 값의 최대 효과를 나타내고 있으며, 고리형 펩티드가 폭넓은 바이러스의 변이에 대한 항바이러스 억제 효과를 갖는 것으로 판단된다. 또한, 항바이러스 억제 효과의 IC50 이 수 nM 이라는 매우 낮은 농도로 검출되고 있어, 비활성이 높은 것을 의미한다.
표 3 으로부터, 고리형 펩티드는, SARS-CoV-2 의 각종 변이 바이러스주에 대해서도 항바이러스 활성을 갖는 것이 나타났다.
실시예 5 는 각종 변이 바이러스주에 대한 항바이러스 활성 측정
본 실시예에서는, 고리형 펩티드의 각종 변이 바이러스주에 대한 항바이러스 활성을 측정하였다.
VeroE6/TMPRSS2 세포를 96 웰 플레이트에 3.0×104 세포를 파종하고, 하룻밤 배양하였다. 감염성 SARS-CoV-2 (우한주 : WK-521 주, 알파주 : QK002 주, 감마주 : TY7-501 주, 베타주 : TY8-612 주, 델타주 : TY11-927 주, 혹은 오미크로주 : TY38-873 주) 를 포함하는 배지를 MOI ＝ 0.003 으로 화합물과 함께 세포에 1 시간 처리한 후, 바이러스를 세정하고, 고리형 펩티드 5555＿p000, 5555＿p020, 5555＿p013), 또는 5555＿p028, 혹은, 대조 화합물로서 항 SARS-CoV-2 항체 칵테일 제제 (카시리비맙·임데비맙 ; REGN-COV2) 또는 렘데시비르를 포함하는 새로운 배지로 교환하였다. 24 시간 후에 배양 상청을 회수하고, 이 안에 포함되는 바이러스 RNA 를 MagMax Viral/Pathogen II Nucleic Acid Isolation kit (써모피셔 사이언티픽사) 에 의해 추출하였다. 이 때, 세포 독성을 현미경 관찰에 의해 평가하였다.
또한, 추출물에 포함되는 바이러스 RNA 는 one-step RT-qPCR kit (THUNDERBIRD (등록상표) Probe One-step RT-qPCR kit, 토요보사) 를 이용한 리얼타임 RT-qPCR 에 의해 정량하였다.
프라이머는 이하의 서열을 사용하였다.
5'-ACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGT-3' (서열 번호 127)
5'-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3' (서열 번호 128)
프로브로서 이하의 서열을 사용하였다.
5'-FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-TAMRA-3' (서열 번호 129)
결과를 도 1a, 도 1b, 도 1c 및 도 1d 에 나타낸다. 도 1 의 종축은 상청 중에 포함되는 바이러스 RNA 량을 펩티드 또는 REGN-COV2 무첨가시의 값을 1 로 한 비교치로 나타내고, 횡축은, 첨가한 펩티드 또는 REGN-COV2 의 양을 나타낸다.
도 1a 에 있어서의 백색 삼각은 바이러스주로서 우한주, 흑색 사각은 알파주에 대한 효과를 나타내고, A 는 5555＿p000, B 는 REGN-COV2, C 는 5555＿p020, D 는 5555＿p013, 각각을 첨가한 시험구의 결과를 나타낸다. 도 1b 에 있어서의 백색 삼각은 바이러스주로서 우한주, 흑색 동그라미는 베타주, 백색 사각은 감마주에 대한 효과를 나타내고, A 는 REGN-COV2, B 는 5555＿p020, C 는 5555＿p028, 각각을 첨가한 시험구의 결과를 나타낸다. 또한, 도 1c 에 있어서의 백색 삼각은 바이러스주로서 우한주, 흑색 마름모꼴은 델타주에 대한 효과를 나타내고, A 는 REGN-COV2, B 는 5555＿p028, 각각을 첨가한 시험구의 결과를 나타낸다. 도 1d 에 있어서의 백색 삼각은 바이러스주로서 우한주, 백색 동그라미는 오미크론주에 대한 효과를 나타내고, A 는 REGN-COV2, B 는 렘데시비르, C 는 5555＿p028, 각각을 첨가한 시험구의 결과를 나타낸다.
도 1a ∼ 1d 로부터, 고리형 펩티드는 우한주뿐만 아니라, 다른 알파, 베타, 감마, 델타, 오미크론이라는 변이형 바이러스에 대해서도 항바이러스 활성을 갖는 것이 나타났다. 또한, 어느 시험구에 있어서도 세포 독성에 대해서는 확인되지 않았다.
실시예 6 항바이러스성 세포 변성 효과 (cytopathic effect ; CPE) 어세이
(1) 실시예 6-1
VeroE6 세포주 (아메리칸 타입 컬처 컬렉션 ; CRL-1586) 중, ACE2 발현량이 높은 세포를 선발하여 시험에 사용하였다. VeroE6 세포를 10 ％ 비동화 소 태아 혈청 (HI-FBS, 기브코사의 14000) 과 암포테리신 B 를 함유하는 MEM 배지 (기브코사의 11095) 에서 배양하였다. 이것을 희석 배율 1 : 2 ∼ 1 : 5 의 비율로 주 2 회 계대하고, 생세포 비율이 95 ％ 인 것을 Luna cell viability analyzer (로고스 바이오시스템사) 와 트립판 블루 염색법으로 확인하였다. 계대 배양 후의 세포를 2 ％ FBS 및 1 ％ 페니실린·스트랩토마이신 함유 MEM 에 현탁하고, 감염 실험에 사용하였다.
고리형 펩티드의 조제는, 100 ％ DMSO 펩티드 용액 80 μL 를 빈 384 웰 ECHO 플레이트 (랩사이트사의 P-05525) 에 분주하고, 그 중 40 μL 를 이웃하는 DMSO 40 μL 를 포함하는 웰로 옮겨 혼화하는 것을 반복하여, 8 단계의 2 배 희석 계열을 제조함으로써 실시하였다 (농도 범위 ; 원액 농도가 10 mM 인 경우에는 30-0.06 μM, 3.3 mM 에서는 1-0.002 μM, 33.3 μM 에서는 100-0.2 nM 으로 각각 설정하였다). 어세이에서의 최종 DMSO 농도는 0.3 ％ 로 하였다.
항바이러스성 CPE 억제 효과의 어세이는 이하와 같이 실시하였다. 상기의 고리형 펩티드 희석 계열을, ECHO (등록상표) 555 어쿠스틱 미량 자동 분주기 (벡크만·쿨터사) 를 사용하여 각 웰에 5 μL 를 분주하고, 어세이 플레이트를 제조하였다. VeroE6 세포에, SARS-CoV2 (WRCEVA 의 USA＿WA1/2020 주) 를 감염시켜, 72 시간 후의 세포 생존율이 5 ％ 가 되는 감염력가 (MOI ∼ 0.002) 로 감염시킨 배치를 제조하였다. 제조한 배치를 어세이 플레이트에 25 μL (VeroE6 세포 4,000 개/웰) 를 분주하였다. 이것을 37 ℃, 5 ％ CO2, 습도 90 ％ 에서 72 시간 배양하고, 30 μL 의 Cell Titer-Glo (등록상표) (프로메가사) 를 첨가하여, 실온에서 10 분 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후의 형광 강도를 플레이트 리더로 측정하였다.
고리형 펩티드의 세포 독성은 이하와 같이 측정하였다. 상기 서술한 방법으로 고리형 펩티드를 분주한 어세이 플레이트에 25 μL 의 VeroE6 세포 (4000 개/웰) 를 분주하고, 7 ℃, 5 ％ CO2, 습도 90 ％ 에서 72 시간 배양하였다. 30 μL 의 Cell Titer-Glo (등록상표) (프로메가사) 를 첨가하여, 실온에서 10 분 인큐베이션 후, 형광 강도를 플레이트 리더로 측정하였다. 어세이 고치와 저치의 컨트롤로서, 세포만의 웰과 Hyamine (등록상표) 1622 (시그마사의 1622) 100 μM 의 웰도 설정하였다.
측정치를 하기 식으로 ％ CPE 감소 (reduction) 치로 변환하여 산출하였다.
[화학식 10]
IC50 치는 Activity Base (v.9.3. ; IDBS 사) 의 X1fit 모듈을 사용하여, 4 파라미터 로지스틱 회귀에 의해 산출하였다. 구체적으로는, 항바이러스성 CPE 억제 효과는, 횡축을 사용하는 고리형 펩티드의 농도, 종축을 하기의 산출한 ％ CPE 감소치로 하는 시그모이드 곡선에 기초하여 판정하였다. 종축의 ％ CPE 감소치가 높을수록 항바이러스 효과가 높은 것을 의미한다. ％ CPE 감소치가 50 ％ 가 되는 경우의 고리형 펩티드의 농도를 IC50 치로 하였다.
세포 독성은, ％ 세포 생존율을 하기 식으로 산출하였다.
[화학식 11]
Figure pct00018
CC50 치도, IC50 치와 동일하게, Activity Base (v.9.3. ; IDBS 사) 의 X1fit 모듈을 사용하여, 4 파라미터 로지스틱 회귀에 의해 산출하였다.
결과를 표 4 에 나타낸다.
[표 4]
표 4 로부터, 항바이러스 억제 효과의 IC50 이 수 nM 이라는 매우 낮은 농도로 검출되어 있어, 비활성이 높은 것을 의미한다. 한편, 화합물의 오프 타겟의 세포 독성으로 세포가 죽는 경우, 바이러스에 의한 세포사인지, 약제에 의한 비특이적 세포사인지 구별할 수 없어, 화합물의 활성을 제대로 평가하기는 곤란하다. 표 4 에 나타낸 바와 같이, 세포의 생존 상황에 영향이 없는 (>1 μM 이상의 세포 상해성 CC50) 상태에서 화합물이 효력을 나타내는 경우에는, 세포 독성이 매우 낮아, 안심하고 유효하다고 판정할 수 있다.
(2) 실시예 6-2
VeroE6 세포주 (아메리칸 타입 컬처 컬렉션 ; CRL-1586) 중, ACE2 발현량이 높은 세포를 선발하여 시험에 사용하였다. VeroE6 세포를 10 ％ 비동화 소 태아 혈청 (HI-FBS, PEAK 사의 PS-FB4) 과 1 ％ 페니실린·스트랩토마이신을 함유하는 MEM 배지 (Gibco, #11095) 에서 배양하였다. 이것을 희석 배율 1 : 2 ∼ 1 : 5 의 비율로 주 2 회 계대하고, 생세포 비율이 95 ％ 인 것을 Luna cell viability analyzer 와 트립판 블루 염색법으로 확인하였다. 계대 배양한 세포를, 2 ％ FBS, 1 ％ 페니실린·스트랩토마이신 (코닝사의 30-002-CL) 및 1 ％ HEPES (코닝사의 25-060-CL) 함유 MEM (어세이 미디어) 에 현탁하여, 감염 실험에 사용하였다.
고리형 펩티드의 조제는, 100 ％ DMSO 펩티드 용액 80 μL 를 빈 384 웰 ECHO 플레이트 (랩사이트사의 P-05525) 에 분주하고, 그 중 40 μL 를 이웃하는 DMSO 40 μL 를 포함하는 웰로 옮겨 혼화하는 것을 반복하여, 8 단계의 2 배 희석 계열을 제조함으로써 실시하였다 (농도 범위 ; 원액 농도가 333 μM 인 경우에는 100-2 nM, 33.3 μM 에서는 100-0.2 nM 으로 각각 설정하였다). 어세이에서의 최종 DMSO 농도는 0.3 ％ 로 하였다.
항바이러스성 CPE 억제 효과의 어세이는 이하와 같이 실시하였다. 상기의 고리형 펩티드 희석 계열을, ECHO (등록상표) 555 어쿠스틱 미량 자동 분주기 (벡크만·쿨터사) 를 사용하여 각 웰에 90 nL 를 분주하고, 5 μL 의 어세이 미디어를 첨가한 어세이 플레이트를 제조하였다. VeroE6 세포에, SARS-CoV2 (WRCEVA, USA＿WA1/2020 주) 를 감염시켜, 72 시간 후의 세포 생존율이 5 ％ 가 되는 감염력가 (MOI ∼ 0.002) 로 감염시킨 배치를 제조하였다. 제조한 배치를 어세이 플레이트에 25 μL (VeroE6 세포 4,000 개/웰) 를 분주하였다. 이것을 37 ℃, 5 ％ CO2, 습도 90 ％ 에서 72 시간 배양하고, 30 μL 의 Cell Titer-Glo (프로메가사) 를 첨가하여, 실온에서 10 분 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후의 형광 강도를 플레이트 리더로 측정하였다.
고리형 펩티드의 세포 독성은 이하와 같이 측정하였다. 상기 서술한 방법으로 고리형 펩티드를 분주한 어세이 플레이트에 25 μL 의 VeroE6 세포 (4000 개/웰) 를 분주하고, 7 ℃, 5 ％ CO2, 습도 90 ％ 에서 72 시간 배양하였다. 30 μL 의 Cell Titer-Glo (프로메가사) 를 첨가하여, 실온에서 10 분 인큐베이션 후, 형광 강도를 플레이트 리더로 측정하였다. 어세이 고치와 저치의 컨트롤로서, 세포만의 웰과 Hyamine (등록상표) 1622 (시그마사의 1622) 100 μM 의 웰도 설정하였다.
실시예 6-1 과 동일하게, 항바이러스성 CPE 억제 효과 (CPE 감소치), 세포 독성 (％ 세포 생존율), IC50 치 및 CC50 치를 산출하였다. 결과를 표 5 에 나타낸다.
[표 5]
표 5 로부터, 본 실시예에서 시험한 고리형 펩티드도, 실시예 6-1 에서 시험한 고리형 펩티드와 동일하게, 항바이러스 억제 효과의 IC50 이 수 nM 이라는 매우 낮은 농도로 검출되고 있어, 비활성이 높다는 것을 의미한다. 또한, 세포의 생존 상황에 영향이 없는 (>1 μM 이상의 세포 상해성 CC50) 상태에서 화합물이 효력을 나타내고 있어, 세포 독성이 매우 낮아, 안심하고 유효하다.
실시예 7 마우스 SARS-CoV-2 감염 치사 모델을 이용한, 고리형 펩티드의 중증화 저지 효과, 치사율 개선 효과의 측정 및 폐 조직상 평가
본 실시예는, 마우스 SARS-CoV-2 감염 치사 모델을 이용한, 고리형 펩티드의 중증화 저지 효과, 치사율 개선 효과의 측정 및 폐 조직상 평가의 결과를 나타낸다.
37 주령의 BALB/c 마우스 24 마리에 SARS-CoV-2 마우스 계대주인 QHmusX 주를 3×103 TCID50 (5 LD50) 량 투여하여, 경비 감염시켰다. 마우스를 8 마리씩 3 군으로 나누어, 비치료군에는 용매 대조 (이하, PBS 군) 를, 치료군에는 5555＿p020, 또는 5555＿p028 의 10 또는 30 mg/kg 을 (이하, 펩티드 투여군), 감염 후 1, 7, 24, 48, 72 및 96 시간에 복강 내 투여하였다. 치료 대조군에는, 항 RBD 칵테일 항체 (이하, REGN-COV2 군) 의 10 mg/kg 을, 바이러스 접종 1 시간 후에 단회 투여하였다.
각각의 군에 대하여, 바이러스 감염 후 10 일간의 체중 변화와 인도적 엔드 포인트 혹은 치사 판정을 실시하였다. 바이러스 접종 10 일째에 관찰 기간을 종료하였다. 치사가 된 개체, 인도적 엔드 포인트로 판정된 개체, 또는 관찰 종료시에 동물을 안락사 처치하고, 심장 채혈 후에 폐를 채취하여 10 ％ 중성 완충 포르말린에 침지하여, 병리 해석용 조직 재료로 하였다.
바이러스 접종 후 10 일간의 각 군에 있어서의 체중 변화와 생존율을 도 2a 및 도 2b 에 나타낸다.
도 2a 의 종축은, 마우스의 체중을 시험 개시시를 100 으로 한 변화율 (％) 을 나타낸 것이며, 횡축은 시험 개시 (바이러스 감염) 후의 일수이다. X 는 PBS 군, 흑색 동그라미는 5555＿p020 의 10 mg 투여군, 백색 동그라미는 5555＿p020 의 30 mg 투여군, 흑색 사각은 5555＿p028 의 10 mg 투여군, 흰색 사각은 5555＿p028 의 30 mg 투여군, 및 흑색 삼각은 REGN-COV2 군을 나타낸다.
또한, 도 2b 의 종축은, 마우스의 생존율을 시험 개시시를 100 으로 한 ％ 로 나타낸 것이고, 횡축은 시험 개시 후의 일수이다. X 는 PBS 군, 흑색 동그라미는 5555＿p020 의 10 mg 투여군, 백색 동그라미는 5555＿p020 의 30 mg 투여군, 흑색 사각은 5555＿p028 의 10 mg 투여군, 흰색 사각은 5555＿p028 의 30 mg 투여군, 및 흑색 삼각은 REGN-COV2 군을 나타낸다.
PBS 군에서는 접종 2 일째 이후, 전 개체에서 체중 감소가 관찰되고, 접종 3 일째 이후에, 8 마리 중 7 마리가 치사 혹은 인도적 엔드 포인트가 되었다. 8 마리 중 1 마리만 접종 7 일째 이후 체중이 증가하고, 회복 경향이 확인되었다. REGN-COV2 군에서는 2 일째까지 모든 동물에서 체중 감소가 확인되었으나, 8 마리 중 7 마리가 3 일 이후 체중은 증가하고 관찰 기간 중에 체중은 회복되었다. 8 마리 중 1 마리만 5 일째에 치사가 되었다. 한편, 펩티드 투여군에서는 접종 2 일째에 일부의 개체가 체중 감소를 보였으나, 전 개체가 생존하였다. 펩티드 투여군 중, 5555＿p020 투여군에 있어서는 어느 농도에 있어서도, 관찰 기간 중에 체중 감소나 호흡기 증상을 시사하는 소견은 관찰되지 않았다. 5555＿p028 에서는 접종 3 일째에 체중 감소가 관찰되었지만, 4 일째 이후, PBS 투여군에 비해 체중 감소율은 유의 (P<0.05) 로 개선되었다. 또한, 체중 변화에 대해서는 Dunnett's multiple comparisons test 에 의해 통계학적 처리를 실시하고, 생존율은 Log-rank(Mantel-Cox) 시험 test 를 실시하였다. 이 결과로부터, 고리형 펩티드를 투여함으로써, SARS-CoV-2 감염 후의 체중 감소가 억제되는 것이 나타났다.
접종 10 일째의 관찰 종료시의 각 군의 대표적인 폐 조직상을 도 3 (헤마톡실린·에오신 염색, 배율 10 배로 촬영) 에 나타낸다.
PBS 군에서 접종 10 일째까지 생존한 1 개체에 있어서의 폐렴상을 나타내는 (A) 에서는, 혈관 주위에 세포의 집족 (*), 폐포야에 있어서 염증성 세포 침윤과 폐포 상피의 재생상 (#) 이 확인되는 등, 비만성 폐포 상해에 있어서의 증식기에 해당하는 조직상이 확인되었다. REGN-COV2 투여군의 폐 조직상을 나타내는 (B)에서는, 일부의 폐포야에 경도의 세포의 증가가 확인되었을 뿐이었다. 5555＿p020 의 10 mg 투여군에 있어서의 폐 조직상을 나타내는 (C) 에서는, 몇 개의 폐엽에 있어서 세기관지 부근의 혈관 주위에 경도의 임파구의 집족이 확인되었다 (*). 폐포야의 일부에 세포의 증가가 관찰되었다. 5555＿p028 의 30 mg 투여군에 있어서의 폐 조직상을 나타내는 (D) 에서는, 대부분의 폐엽에 있어서 혈관 주위에 경도의 세포의 집족이 관찰되었다 (*). 이상의 폐 조직상으로부터, 고리형 펩티드를 투여함으로써, SARS-CoV-2 감염에 의한 폐렴이 억제되는 것이 나타났다.
실시예 8 햄스터 SARS-CoV-2 감염 모델을 사용한, 고리형 펩티드의 일반 상태 및 폐렴에 대한 유효성의 평가
본 실시예는, 햄스터 SARS-CoV-2 감염 모델을 사용한, 고리형 펩티드의 일반 상태 (체중) 및 폐렴에 대한 유효성 평가를 나타낸다.
5555＿p028 의 SARS-CoV-2 감염에 의한 일반 상태 및 폐렴에 대한 in vivo 유효성을 평가할 목적으로, 햄스터를 사용한 감염 모델을 사용한 시험을 실시하였다. 이 모델은 SARS-CoV-2 치료제인 항 SARS-CoV-2 항체 칵테일 제제가 효력을 나타내는 것이 보고되어 있고 (참고문헌 7), in vivo 유효성을 평가하는 모델로서 타당하다고 생각하여 채용하였다.
8-9 주령의 암컷 골든 시리안 햄스터 24 마리에 SARS-CoV-2 (USA＿WA1/2020 주) 8×105 TCID50 을 경비 감염시켰다. 햄스터는 6 마리/용량으로 군분리하여, 용매 대조 또는 5555＿p028 의 1, 5, 25 mg/kg 을 감염 후 2, 8, 24, 48 및 72 시간으로 복강 내 투여하고, 감염 후 5 일까지 매일 체중을 측정하였다. 감염 후 5 일에 햄스터를 안락사 처치하고, 폐의 중량을 측정하였다. 그 후, 좌엽은 세절하여 RT-qPCR 법으로 바이러스 RNA 를 정량하기 위해 -70 ℃ 에서 동결 보존하였다. 우전엽과 후엽은 10 ％ 중성 완충 포르말린으로 고정시키고, 5 ㎛ 두께의 파라핀 절편을 제조하고, HE 염색하여 병리 조직학적 검색에 사용하였다.
햄스터와 같은 설치류는, 계속 성장하는 동물이다. 건강하면, 체중이 계속 증가하지만, 컨디션이 좋지 않으면, 체중 증가 억제나, 위독한 경우에는 체중이 감소한다. 그 때문에, 체중은, 설치류 동물의 컨디션을 추정하기 위해서 중요한 임상 파라미터의 하나이다. 체중의 추이를 표 6 에 나타내었다. 용매 대조군에서는 Day1 로부터 평균치가 저하 경향을 보였지만, 5555＿p028 투여군에서는 어느 용량에 있어서도 체중 감소는 동일한 정도로 억제되었다. 용매 대조군에서 체중이 감소한 것은, 피험 햄스터의 컨디션 (일반 상태) 이 나쁜 것을 의미하고, 고리형 펩티드 투여군에서 체중 감소가 경감된 것은, 컨디션 (일반 상태) 이 개선된 것을 의미한다.
[표 6]
Figure pct00021
좌폐로부터 대략 20 mg 을 채취·칭량 후에 25 mg/mL 가 되도록 버퍼를 첨가 후 호모게나이즈하고, 200 μL (폐 5 mg 상당) 로부터 RNA 를 추출하고, SARS-CoV-2 의 N2 단백질의 mRNA 량을 N-2 프라이머 세트, Quant-iT Ribogreen RNA assay kit, TaqMan Fast Virus 4x Master Mix 및 QuantStudio 6 (모두 써모피셔 사이언티픽사) 을 사용하여, RT-qPCR 법으로 3 회 정량하였다.
N-2 프라이머 세트
Forward : 5'-TTA CAA ACA TTG GCC GCA AA-3' (서열 번호 130)
Reverse : 5'-GCG CGA CAT TCC GAA GAA-3' (서열 번호 131)
그 결과, 5555＿p0281, 5 mg/kg 군은 통계학적으로 유의한 SARS-CoV-2 게놈 카피수의 저하가, 25 mg/kg 군에서는 저하 경향이 확인되었다 (표 7).
[표 7]
Figure pct00022
부검시의 폐의 육안적 소견은 반상 (斑狀) 의 퇴색이 모든 군에서 확인되고, 5555＿p028 의 복강 내 투여에 직접 관계되는 군 사이의 차이는 보이지 않았다. 이 때, 5555＿p028 의 25 mg/kg 군의 2 예에서 폐의 퇴색이 관찰되지 않았다 (표 8).
[표 8]
Figure pct00023
병리 조직학적으로는, 모든 군에 있어서 폐의 만성 활동성 염증이 확인되었다. 간질성 염증은, 많은 매크로파지 침윤이 일어나고 있고, 그보다 현저하지 않은 호중구, 림프구, 호산구와 드물게 거세포를 동반하고 있었다. 이환 부위에 있어서는, 폐포 내에 적혈구와 호산성 섬유상 물질, 염증성 세포와 세포 데브리가 확인되었다. 이환 부위의 세기관지와 폐포의 상피 세포는 증생되어 있고, 드물게 폐포 상피 세포는 대형화되어 특이한 형태를 나타내었다 (세포 이형). 또한, 중피의 증생을 수반하는 흉막의 다발성 염증이 확인되었다.
폐의 염증의 중독도는 5555＿p028 투여에 의해 용매 대조군보다 줄어들었다. 폐의 염증은 5555＿p028 의 5 mg/kg 군의 2 예에서, 후엽에 있어서 경미하였다. 이에 비해, 용매 대조군의 6 예 중 3 예의 전엽과 후엽에서 염증이 고도였다 (표 9). 병리 조직상을 도 4 에 나타내었다.
[표 9]
Figure pct00024
이들 결과로부터, SARS-CoV-2 에 감염된 골든 시리안 햄스터에 있어서는, 만성 활동성의 간질성 및 흉막의 염증이 발생하고, 5555＿p028 의 투여에 의해 개선될 가능성이 나타났다.
실시예 9 항 COVID 약과의 병존 투여가 고리형 펩티드의 항바이러스 활성에 주는 영향의 측정
본 실시예에서는, 항 COVID 약과의 병존 투여가 고리형 펩티드의 항바이러스 활성에 주는 영향을 조사하기 위해서, 이미 알려진 COVID 약제로서 렘데시비르, REGN-COV2 (카시리비맙과 임데비맙의 병용제), 또는 몰누피라비르의 활성체로서 EIDD-1931, 및 고리형 펩티드를 각 농도로 혼합하여, 바이러스 감염 세포에 투여, 상청의 바이러스 RNA 량을 측정하였다. 상세를 이하에 나타낸다.
VeroE6/TMPRSS2 세포를 96 웰 플레이트에 3.0×104 의 세포를 파종하고, 하룻밤 배양하였다. 감염성 SARS-CoV-2 (우한주 : WK-521 주, 델타주 : TY11-927 주, 혹은 오미크로주 : TY38-873 주) 를 포함하는 배지를 MOI ＝ 0.003 으로, 고리형 펩티드와 기존의 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는 화합물의 조합 (EIDD-1931 과 5555＿p028 의 조합, 렘데시비르와 5555＿p028 의 조합, 또는 REGN-COV2 와 5555＿p028 의 조합) 과 함께 세포에 1 시간 처리하였다. 그 후, 바이러스를 세정하고, 화합물을 포함하는 새로운 배지로 교환하였다. 24 시간 후에 배양 상청을 회수하고, 이 안에 포함되는 바이러스 RNA 를 MagMax Viral/Pathogen II Nucleic Acid Isolation kit (써모피셔 사이언티픽사) 에 의해 추출하였다. 이 때, 세포 독성을 현미경 관찰에 의해 평가하였다. 또한, 추출물에 포함되는 바이러스 RNA 는, 실시예 5 와 동일하게 정량하였다.
결과를 도 5a ∼ 도 5h 에 나타낸다. 도 5 의 종축은 상청 중에 포함되는 바이러스 RNA 량을 펩티드 및 각종 기존의 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는 화합물이 무첨가일 때의 값을 1 로 한 비교치로 나타내고, 횡축은 각종 기존의 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는 화합물의 양을 나타낸다. 도 5a ∼ 도 5c 는, 우한주에 대한 항바이러스 활성 측정 결과를 나타내고, 도 5d ∼ 도 5f 는, 델타주에 대한 항바이러스 활성 측정 결과를 나타내고, 도 5g ∼ 도 5h 는, 오미크론주에 대한 항바이러스 활성 측정 결과를 나타낸다.
도 5a ∼ 도 5h 로부터, 고리형 펩티드는 단제로 항바이러스 활성을 가질뿐만 아니라, 이미 알려진 항 SARS-CoV-2 활성을 갖는 화합물과 병용함으로써, 더 우수한 항바이러스 활성을 갖는 것이 나타났다.
또한, 세포 독성은 어느 시험구에 있어서도 확인되지 않았다.
실시예 10 고리형 펩티드의 합성예
실시예 2 와 동일하게, 고리형 펩티드를 합성하였다. 합성한 펩티드의 서열 및 구조를 표 10 및 표 11 에 나타낸다.
[표 10-1]
[표 10-2]
[표 10-3]
[표 10-4]
[표 11]
표 11 에 기재된 펩티드는, 1 번째의 아미노산과 12 번째의 아미노산이 고리형 구조를 형성하고, 또한 링커로서 13 번째 이후의 아미노산 또는 PEG, 알킬사슬 구조를 부가한 구조를 갖는 펩티드이다. 또한, 표 중의 @R 은, 아미노산의 측사슬에 포함되는 관능기를 개재하여 결합한 구조를 갖는 것을 나타낸다. K@R1 은, 13 번째의 아미노산 de 에 측사슬 아미노기를 개재하여, E@R2 는, 상기 K@R1 의 리신에 측사슬의 카르복시기를 개재하여 결합하고 있다. 예를 들어 고리형 펩티드 5555＿p233 (서열 번호 : 229) 는 하기 [화학식 12] 로 나타내는 구조, 고리형 펩티드 5555＿p234 (서열 번호 : 230) 는 하기 [화학식 13] 으로 나타내는 구조, 고리형 펩티드 5555＿p235 (서열 번호 : 231) 는 하기 [화학식 14] 로 나타내는 구조이다.
[화학식 12]
[화학식 13]
Figure pct00031
[화학식 14]
Figure pct00032
이하에, 고리형 펩티드의 상세한 합성예를 기재한다.
(1) 실시예 10-1 고리형 펩티드 5555＿p173 (서열 번호 173) 의 합성
[화학식 15]
Figure pct00033
Sieber amide resin (와타나베 화학 공업 주식회사, 0.48 mmol/g) 을 사용하여, 전술한 일반적 방법으로 목적의 펩티드를 합성하였다. 그 때, CEM 사의 Liberty Blue 를 고상 합성기로서 사용하고, 제조원의 매뉴얼에 따라 합성을 실시하였다. 각 잔기의 도입에는 수지 1 당량에 대하여, Fmoc-AA/DIC/Oxyma pure (5.25 당량/10 당량/5 당량) 를 사용하고, DMF 중 75 ℃ 하, 10 분간 1 회 반응을 실시하였다. 단, 1 잔기째는 75 ℃ 하, 30 분간 3 회, 2 잔기째, 3 잔기째, 4 잔기째, 5 잔기째 및 6 잔기째 75 ℃ 하, 20 분간 1 회, 12 잔기째는 40 ℃ 하, 30 분간 1 회 반응을 실시하였다.
또한, Fmoc 제거는 10 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 75 ℃ 하, 3 분간 반응시키는 것을 기본 조건으로 하였다. 1 잔기째는 10 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 실온 하, 5 분간 반응시킨 후, 10 분간 반응을 실시하였다. 클로로아세틸기의 도입은 전공정에서 얻어진 Fmoc 보호된 펩티드가 유지된 고상 수지에 대하여, 전술한 방법으로 α-아미노기의 Fmoc 기를 제거한 후, 클로로아세트산을 DIC/HOSu 로 활성화한 DMF/염화메틸렌 (1/1) 용액 (5 당량) 을 고상 수지에 첨가하여 실온에서 60 분간 진탕에 의해 실시하였다.
측사슬의 탈보호 및 고상 수지로부터의 잘라내기는, 클로로아세틸기 도입 공정 후에 얻어진 수지를 DMF, 염화메틸렌, 디에틸에테르로로 세정하여 감압 하 건조시킨 후, 계속해서 고상 수지가 들어간 반응 용기에, 반응제 칵테일-A (TFA/H2O/TIS/DODT 의 체적비 92.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5 의 혼합물) 를 첨가하여, 실온에서 60 분간 진탕에 의해 실시하였다. 반응액을 프릿으로부터 여과 회수하였다. 반응 용기에 남은 고상 수지는 잘라내기용 칵테일과 재차 진탕하고, 프릿으로부터 용액 성분을 회수, 전술한 여과액과 혼합하였다. 이 여과액을 0 ℃ 로 냉각시킨 과잉의 디이소프로필에테르/헥산 (1/1) 의 혼합 용매에 첨가하면, 백탁 침전이 발생하였다. 이 혼합물을 원심 분리하고 (9000 rpm, 2 분간), 용액을 디캔테이션하였다. 얻어진 고체를 재차 0 ℃ 로 냉각시킨 소량의 디에틸에테르로 세정한 후, 감압 하 건조시켰다. 얻어진 고체를 다음의 고리화 반응에 사용하였다. 펩티드의 고리화 반응은 펩티드의 종농도가 고상 수지의 몰수를 기초로 5 mM 가 되도록 90 ％ DMSO 수용액에 용해 후, 10 당량의 트리에틸아민을 첨가하여, 실온에서 15 시간 진탕하였다. 얻어진 반응 용액을 HT-12 를 사용하여 감압 농축하였다.
얻어진 조생성물은 이하의 조건을 사용하여 정제하였다 (칼럼 : Waters Xbridge (등록상표) C18 5 ㎛ (등록상표) 50×250 mm ; 이동상 : A ＝ 0.1 ％ TFA (수중), B ＝ 0.1 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 50 ℃ ; 그레이디언트 (％ B) : 3 분간에 걸쳐 10-36 ％, 그 후 15 분간에 걸쳐 36-41 ％, 그 후 3 분에 걸쳐 41-60 ％ 유량 : 118 mL/분).
목적물의 순도는 이하의 분석 조건의 LC/MS (UV 파장 225 nm) 크로마토그램의 면적비로부터 산출하여 99.41 ％ 였다.
분석 조건 : 유지 시간 ＝ 5.03 분 ; 칼럼 : Kinetex EVO C18 2.6 ㎛ 2.1×150 mm, 100 Å ; 이동상 : A ＝ 0.025 ％ TFA (수중), B ＝ 0.025 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 60 ℃ ; 그레이디언트 (％ Bconc) : 7.15 분간에 걸쳐 20-60 ％, 그 후 0.30 분간에 걸쳐 60-95 ％, 그 후 1.55 분에 걸쳐 95-95 ％ 유량 : 0.5 mL/분
ESI-MS(＋) 관측치 m/z ＝ 986.93 (M＋2H)2+
(2) 실시예 10-2 고리형 펩티드 5555＿p176 (서열 번호 176) 의 합성
[화학식 16]
Figure pct00034
Sieber amide resin (와타나베 화학 공업 주식회사, 0.48 mmol/g) 을 사용하여, 전술한 일반적 방법으로 목적의 펩티드를 합성하였다. 그 때, CEM 사의 Liberty Blue 를 고상 합성기로서 사용하고, 제조원의 매뉴얼에 따라 합성을 실시하였다. 각 잔기의 도입에는 수지 1 당량에 대하여, Fmoc-AA/DIC/Oxyma pure (4.2 당량/8 당량/4 당량) 를 사용하고, DMF 중 75 ℃ 하, 10 분간 1 회 반응을 실시하였다. 단, 1 잔기째, 3 잔기째는 75 ℃ 하, 30 분간 2 회, 2 잔기째는 75 ℃ 하, 10 분간 2 회, 5 잔기째는 90 ℃ 하, 10 분간 2 회, 12 잔기째는 50 ℃ 하, 20 분간 1 회 반응을 실시하였다.
또한, Fmoc 제거는 20 ％ 피페리딘의 DMF 용액과 75 ℃ 하, 3 분간 반응시키는 것을 기본 조건으로 하였다. 1 잔기째, 2 잔기째, 3 잔기째, 4 잔기째, 5 잔기째 및 6 잔기째는 20 ％ 피페리딘의 DMF 용액과 실온 하, 5 분간 반응시킨 후, 10 분간 반응을 실시하였다. 클로로아세틸기의 도입은 전공정에서 얻어진 Fmoc 보호된 펩티드가 유지된 고상 수지에 대하여, 전술한 방법으로 α-아미노기의 Fmoc 기를 제거한 후, 클로로아세트산/HATU/DIPEA (5.2 당량/5 당량/5 당량) 를 이용하여 DMF 중 실온에서 30 분간 진탕에 의해 실시하였다.
측사슬의 탈보호 및 고상 수지로부터의 잘라내기는, 클로로아세틸기 도입 공정 후에 얻어진 수지를 DMF, 염화메틸렌, 디에틸에테르로로 세정하여 감압 하 건조시킨 후, 계속해서 고상 수지가 들어간 반응 용기에, 반응제 칵테일-A (TFA/H2O/TIS/DODT 의 체적비 92.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5 의 혼합물) 를 첨가하여, 실온에서 5 분간 진탕에 의해 실시하였다. 반응액을 프릿으로부터 여과 회수하였다. 반응 용기에 남은 고상 수지는 잘라내기용 칵테일과 재차 진탕하고, 프릿으로부터 용액 성분을 회수, 전술한 여과액과 혼합하였다. 이 여과액을 0 ℃ 로 냉각시킨 과잉의 디에틸에테르/헥산 (1/1) 의 혼합 용매에 첨가하면, 백탁 침전이 발생하였다. 이 혼합물을 원심 분리하고, 용액을 디캔테이션하였다. 얻어진 고체를 재차 0 ℃ 로 냉각시킨 소량의 디에틸에테르로 세정한 후, 감압 하 건조시켰다. 얻어진 고체를 다음의 고리화 반응에 사용하였다. 펩티드의 고리화 반응은 펩티드의 종농도가 고상 수지의 몰수를 기초로 5 mM 가 되도록 DMSO/MeCN/H2O (1/1/1) 에 용해 후, 10 당량의 트리에틸아민을 첨가하여, 실온에서 7 시간 진탕하였다. 얻어진 반응 용액을 HT-12 를 사용하여 감압 농축하였다.
얻어진 조생성물은 이하의 조건을 사용하여 정제하였다 (칼럼 : Waters Xbridge (등록상표) C18 5 ㎛ (등록상표) 50×250 mm ; 이동상 : A ＝ 0.1 ％ TFA (수중), B ＝ 0.1 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 50 ℃ ; 그레이디언트 (％ B) : 3 분간에 걸쳐 16-42 ％, 그 후 15 분간에 걸쳐 42-47 ％, 그 후 3 분에 걸쳐 47-60 ％ 유량 : 118 mL/분).
목적물의 순도는 이하의 분석 조건의 LC/MS (UV 파장 225 nm) 크로마토그램의 면적비로부터 산출하여 99.01 ％ 였다.
분석 조건 : 유지 시간 ＝ 5.82 분 ; 칼럼 : Kinetex EVO C18 2.6 ㎛ 2.1×150 mm, 100 Å ; 이동상 : A ＝ 0.025 ％ TFA (수중), B ＝ 0.025 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 60 ℃ ; 그레이디언트 (％ Bconc) : 7.15 분간에 걸쳐 20-60 ％, 그 후 0.30 분간에 걸쳐 60-95 ％, 그 후 1.55 분에 걸쳐 95-95 ％ 유량 : 0.5 mL/분
ESI-MS(＋) 관측치 m/z ＝ 959.55 (M＋2H)2+
(3) 실시예 10-3 고리형 펩티드 5555＿p195 (서열 번호 195) 의 합성
[화학식 17]
Figure pct00035
Sieber amide resin (와타나베 화학 공업 주식회사, 0.48 mmol/g) 을 사용하여, 전술한 일반적 방법으로 목적의 펩티드를 합성하였다. 그 때, CEM 사의 Liberty Prime 를 고상 합성기로서 사용하고, 제조원의 매뉴얼에 따라 합성을 실시하였다. 각 잔기의 도입에는 수지 1 당량에 대하여, Fmoc-AA/DIC/Oxyma pure (4.2 당량/8 당량/4 당량) 를 사용하고, DMF 중 105 ℃ 하, 2 분간 1 회 반응을 실시하였다. 단, 1 잔기째는 90 ℃ 하, 10 분간 2 회, 12 잔기째는 50 ℃ 하, 15 분간 1 회, 13 잔기째는 105 ℃ 하, 1 분간 1 회 반응을 실시하였다.
또한, Fmoc 제거는 83 mM Oxyma pure 의 4 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 110 ℃ 하, 1 분간 반응시키는 것을 기본 조건으로 하였다. 2 잔기째, 3 잔기째, 4 잔기째, 5 잔기째 및 6 잔기째는 10 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 50 ℃ 하, 90 초간 반응시켰다. 1 잔기째는 10 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 실온 하, 1 분간 2 회 반응시켰다. 클로로아세틸기의 도입은 전공정에서 얻어진 Fmoc 보호된 펩티드가 유지된 고상 수지에 대하여, 전술한 방법으로 α-아미노기의 Fmoc 기를 제거한 후, 클로로아세트산/HATU/DIPEA (5 당량/5 당량/10 당량) 를 이용하여 DMF 중 실온에서 30 분간 진탕에 의해 실시하였다.
측사슬의 탈보호 및 고상 수지로부터의 잘라내기는, 클로로아세틸기 도입 공정 후에 얻어진 수지를 DMF, 염화메틸렌, 디에틸에테르로로 세정하여 감압 하 건조시킨 후, 계속해서 고상 수지가 들어간 반응 용기에, 반응제 칵테일-A (TFA/H2O/TIS/DODT 의 체적비 92.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5 의 혼합물) 를 첨가하여, 실온에서 90 분간 진탕에 의해 실시하였다. 반응액을 프릿으로부터 여과 회수하였다. 반응 용기에 남은 고상 수지는 잘라내기용 칵테일과 재차 진탕하고, 프릿으로부터 용액 성분을 회수, 전술한 여과액과 혼합하였다. 이 여과액을 0 ℃ 로 냉각시킨 과잉의 디에틸에테르/헥산 (1/1) 의 혼합 용매에 첨가하면, 백탁 침전이 발생하였다. 이 혼합물을 원심 분리하고, 용액을 디캔테이션하였다. 얻어진 고체를 재차 0 ℃ 로 냉각시킨 소량의 디에틸에테르로 세정한 후, 감압 하 건조시켰다. 얻어진 고체를 다음의 고리화 반응에 사용하였다. 펩티드의 고리화 반응은 펩티드의 종농도가 고상 수지의 몰수를 기초로 5 mM 가 되도록 DMSO/이소프로필알코올/H2O (90/5/5) 에 용해 후, 10 당량의 트리에틸아민을 첨가하여, 25 ℃ 에서 15 시간 진탕하였다. 얻어진 반응 용액을 EZ-2 Elite 를 사용하여 감압 농축하였다.
얻어진 조생성물은 이하의 조건을 사용하여 정제하였다 (칼럼 : Waters Xbridge (등록상표) C18 5 ㎛ (등록상표) 50×150 mm ; 이동상 : A ＝ 0.1 ％ TFA (수중), B ＝ 0.1 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 40 ℃ ; 그레이디언트 (％ B) : 3 분간에 걸쳐 12-37 ％, 그 후 8 분간에 걸쳐 37-42 ％, 그 후 1 분에 걸쳐 42-60 ％ 유량 : 120 mL/분).
목적물의 순도는 이하의 분석 조건의 LC/MS (UV 파장 225 nm) 크로마토그램의 면적비로부터 산출하여 95.15 ％ 였다.
분석 조건 : 유지 시간 ＝ 4.51 분 ; 칼럼 : Kinetex EVO C18 2.6 ㎛ 2.1×150 mm, 100 Å ; 이동상 : A ＝ 0.025 ％ TFA (수중), B ＝ 0.025 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 60 ℃ ; 그레이디언트 (％ Bconc) : 7.15 분간에 걸쳐 20-60 ％, 그 후 0.30 분간에 걸쳐 60-95 ％, 그 후 1.55 분에 걸쳐 95-95 ％ 유량 : 0.5 mL/분
ESI-MS(＋) 관측치 m/z ＝ 954.90 (M＋2H)2+
(4) 실시예 10-4 고리형 펩티드 5555＿p213 (서열 번호 212) 의 합성
[화학식 18]
Figure pct00036
Sieber amide resin (와타나베 화학 공업 주식회사, 0.48 mmol/g) 을 사용하여, 전술한 일반적 방법으로 목적의 펩티드를 합성하였다. 그 때, CEM 사의 Liberty Blue 를 고상 합성기로서 사용하고, 제조원의 매뉴얼에 따라 합성을 실시하였다. 각 잔기의 도입에는 수지 1 당량에 대하여, Fmoc-AA/DIC/Oxyma pure (4.2 당량/8 당량/4 당량) 를 사용하고, DMF 중 90 ℃ 하, 3 분간 1 회 반응을 실시하였다. 단, 1 잔기째는 75 ℃ 하, 30 분간 2 회, 2 잔기째, 3 잔기째는 90 ℃ 하, 10 분간 2 회, 4 잔기째는 Fmoc-AA/DIC/Oxyma pure (3 당량/8 당량/4 당량) 를 이용하여, 75 ℃ 하, 30 분간 1 회, 5 잔기째는 90 ℃ 하, 3 분간 2 회, 12 잔기째는 50 ℃ 하, 15 분간 1 회 반응을 실시하였다.
또한, Fmoc 제거는 10 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 90 ℃ 하, 1 분간 반응시키는 것을 기본 조건으로 하였다. 5 잔기째는 10 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 실온 하, 1 분간 반응시켰다. 1 잔기째는 10 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 실온 하, 1 분간 2 회 반응시켰다. 클로로아세틸기의 도입은 전공정에서 얻어진 Fmoc 보호된 펩티드가 유지된 고상 수지에 대하여, 전술한 방법으로 α-아미노기의 Fmoc 기를 제거한 후, 클로로아세트산/HATU/DIPEA (5 당량/5 당량/10 당량) 를 이용하여 DMF 중 실온에서 30 분간 진탕에 의해 실시하였다.
측사슬의 탈보호 및 고상 수지로부터의 잘라내기는, 클로로아세틸기 도입 공정 후에 얻어진 수지를 DMF, 염화메틸렌, 디에틸에테르로로 세정하여 감압 하 건조시킨 후, 계속해서 고상 수지가 들어간 반응 용기에, 반응제 칵테일-A (TFA/H2O/TIS/DODT 의 체적비 92.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5 의 혼합물) 를 첨가하여, 실온에서 70 분간 진탕에 의해 실시하였다. 반응액을 프릿으로부터 여과 회수하였다. 반응 용기에 남은 고상 수지는 잘라내기용 칵테일과 재차 진탕하고, 프릿으로부터 용액 성분을 회수, 전술한 여과액과 혼합하였다. 이 여과액을 0 ℃ 로 냉각시킨 과잉의 디이소프로필에테르/헥산 (1/1) 의 혼합 용매에 첨가하면, 백탁 침전이 발생하였다. 이 혼합물을 원심 분리하고, 용액을 디캔테이션하였다. 얻어진 고체를 재차 0 ℃ 로 냉각시킨 소량의 디에틸에테르로 세정한 후, 감압 하 건조시켰다. 얻어진 고체를 다음의 고리화 반응에 사용하였다. 펩티드의 고리화 반응은 펩티드의 종농도가 고상 수지의 몰수를 기초로 6.3 mM 가 되도록 90 ％ DMSO 수용액에 용해 후, 10 당량의 트리에틸아민을 첨가하여, 실온에서 18 시간 진탕하였다. 얻어진 반응 용액을 EZ-2 Elite 를 사용하여 감압 농축하였다.
얻어진 조생성물은 이하의 조건을 사용하여 정제하였다 (칼럼 : Waters Xbridge (등록상표) C18 5 ㎛ (등록상표) 50×150 mm ; 이동상 : A ＝ 0.1 ％ TFA (수중), B ＝ 0.1 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 40 ℃ ; 그레이디언트 (％ B) : 3 분간에 걸쳐 17-42 ％, 그 후 8 분간에 걸쳐 42-47 ％, 그 후 1 분에 걸쳐 47-60 ％ 유량 : 120 mL/분).
목적물의 순도는 이하의 분석 조건의 LC/MS (UV 파장 225 nm) 크로마토그램의 면적비로부터 산출하여 92.09 ％ 였다.
분석 조건 : 유지 시간 ＝ 5.53 분 ; 칼럼 : Kinetex EVO C18 2.6 ㎛ 2.1×150 mm, 100 Å ; 이동상 : A ＝ 0.025 ％ TFA (수중), B ＝ 0.025 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 60 ℃ ; 그레이디언트 (％ Bconc) : 7.15 분간에 걸쳐 20-60 ％, 그 후 0.30 분간에 걸쳐 60-95 ％, 그 후 1.55 분에 걸쳐 95-95 ％ 유량 : 0.5 mL/분
ESI-MS(＋) 관측치 m/z ＝ 917.38 (M＋2H)2+
(5) 실시예 10-5 고리형 펩티드 5555＿p216 (서열 번호 215) 의 합성
[화학식 19]
Figure pct00037
Sieber amide resin (와타나베 화학 공업 주식회사, 0.48 mmol/g) 을 사용하여, 전술한 일반적 방법으로 목적의 펩티드를 합성하였다. 그 때, CEM 사의 Liberty Blue 를 고상 합성기로서 사용하고, 제조원의 매뉴얼에 따라 합성을 실시하였다. 각 잔기의 도입에는 수지 1 당량에 대하여, Fmoc-AA/DIC/Oxyma pure (4.2 당량/8 당량/4 당량) 를 사용하고, DMF 중 90 ℃ 하, 3 분간 1 회 반응을 실시하였다. 단, 1 잔기째는 75 ℃ 하, 30 분간 2 회, 2 잔기째, 3 잔기째는 90 ℃ 하, 10 분간 2 회, 4 잔기째는 Fmoc-AA/DIC/Oxyma pure (3 당량/8 당량/4 당량) 를 이용하여, 75 ℃ 하, 30 분간 1 회, 12 잔기째는 50 ℃ 하, 15 분간 1 회 반응을 실시하였다.
또한, Fmoc 제거는 10 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 90 ℃ 하, 1 분간 반응시키는 것을 기본 조건으로 하였다. 1 잔기째는 10 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 실온 하, 1 분간 2 회 반응시켰다. 클로로아세틸기의 도입은 전공정에서 얻어진 Fmoc 보호된 펩티드가 유지된 고상 수지에 대하여, 전술한 방법으로 α-아미노기의 Fmoc 기를 제거한 후, 클로로아세트산/HATU/DIPEA (5 당량/5 당량/10 당량) 를 이용하여 DMF 중 실온에서 30 분간 진탕에 의해 실시하였다.
측사슬의 탈보호 및 고상 수지로부터의 잘라내기는, 클로로아세틸기 도입 공정 후에 얻어진 수지를 DMF, 염화메틸렌, 디에틸에테르로로 세정하여 감압 하 건조시킨 후, 계속해서 고상 수지가 들어간 반응 용기에, 반응제 칵테일-A (TFA/H2O/TIS/DODT 의 체적비 92.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5 의 혼합물) 를 첨가하여, 실온에서 70 분간 진탕에 의해 실시하였다. 반응액을 프릿으로부터 여과 회수하였다. 반응 용기에 남은 고상 수지는 잘라내기용 칵테일과 재차 진탕하고, 프릿으로부터 용액 성분을 회수, 전술한 여과액과 혼합하였다. 이 여과액을 0 ℃ 로 냉각시킨 과잉의 디이소프로필에테르/헥산 (1/1) 의 혼합 용매에 첨가하면, 백탁 침전이 발생하였다. 이 혼합물을 원심 분리하고, 용액을 디캔테이션하였다. 얻어진 고체를 재차 0 ℃ 로 냉각시킨 소량의 디에틸에테르로 세정한 후, 감압 하 건조시켰다. 얻어진 고체를 다음의 고리화 반응에 사용하였다. 펩티드의 고리화 반응은 펩티드의 종농도가 고상 수지의 몰수를 기초로 6.3 mM 가 되도록 90 ％ DMSO 수용액에 용해 후, 10 당량의 트리에틸아민을 첨가하여, 실온에서 18 시간 진탕하였다. 얻어진 반응 용액을 EZ-2 Elite 를 사용하여 감압 농축하였다.
얻어진 조생성물은 이하의 조건을 사용하여 정제하였다 (칼럼 : Waters Xbridge (등록상표) C18 5 ㎛ (등록상표) 50×150 mm ; 이동상 : A ＝ 0.1 ％ TFA (수중), B ＝ 0.1 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 40 ℃ ; 그레이디언트 (％ B) : 3 분간에 걸쳐 17-42 ％, 그 후 8 분간에 걸쳐 42-47 ％, 그 후 1 분에 걸쳐 47-60 ％ 유량 : 120 mL/분).
목적물의 순도는 이하의 분석 조건의 LC/MS (UV 파장 225 nm) 크로마토그램의 면적비로부터 산출하여 89.40 ％ 였다.
분석 조건 : 유지 시간 ＝ 5.78 분 ; 칼럼 : Kinetex EVO C18 2.6 ㎛ 2.1×150 mm, 100 Å ; 이동상 : A ＝ 0.025 ％ TFA (수중), B ＝ 0.025 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 60 ℃ ; 그레이디언트 (％ Bconc) : 7.15 분간에 걸쳐 20-60 ％, 그 후 0.30 분간에 걸쳐 60-95 ％, 그 후 1.55 분에 걸쳐 95-95 ％ 유량 : 0.5 mL/분
ESI-MS(＋) 관측치 m/z ＝ 930.38 (M＋2H)2+
(6) 실시예 10-6 고리형 펩티드 5555＿p221 (펩티드 부분의 서열 번호 : 30 으로 나타내는 펩티드에, 링커 구조로서 dk(cC10COO) 가 부가된 구조, 서열 번호 219) 의 합성
[화학식 20]
Figure pct00038
Fmoc-NH-sieber resin (와타나베 화학 공업 주식회사, 0.48 mmol/g) 을 사용하여, 전술한 일반적 방법으로 목적의 펩티드를 합성하였다. 그 때, CEM 사의 Liberty blue 를 고상 합성기로서 사용하고, 제조원의 매뉴얼에 따라 합성을 실시하였다. Fmoc 제거를 10 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 90 ℃ 하, 1 분간 반응을 실시하였다. 수지 1 당량에 대하여 Alloc-D-Lys(Fmoc)-OH/DIC/Oxyma pure (4.2 당량/8 당량/4 당량) 를 이용하여, DMF 중 90 ℃ 하, 3 분간 1 회 반응을 실시하였다. 동 조건으로 Fmoc 제거를 실시한 후, 12-(tert-부톡시)-12-옥소도데칸산을 사용하여, DMF 중 90 ℃ 하, 10 분간 1 회 반응을 실시하였다. Alloc 제거를 수지 1 당량에 대하여 Pd(OAc)2/PPh3/PhSiH3 (0.2 당량/1 당량/10 당량) 을 사용하여, 염화메틸렌 중 실온 하, 60 분간 반응을 실시하였다. 전공정에서 얻어진 고상 수지에 대하여, 각 잔기의 도입에는 수지 1 당량에 대하여 Fmoc-AA/DIC/Oxyma pure (4.2 당량/8 당량/4 당량) 를 이용하여, DMF 중 90 ℃ 하, 3 분간 1 회 반응을 실시하였다. 단, 1 잔기째, 2 잔기째는 75 ℃ 하, 30 분간 2 회, 3 잔기째는 90 ℃ 하, 10 분간 2 회, 5 잔기째는 90 ℃ 하, 10 분간 1 회, 12 잔기째는 50 ℃ 하, 15 분간 1 회 반응을 실시하였다.
또한, Fmoc 제거는 10 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 90 ℃ 하, 1 분간 반응시키는 것을 기본 조건으로 하였다. 단, 2 잔기째, 3 잔기째, 4 잔기째, 5 잔기째 및 6 잔기째는 10 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 50 ℃ 하, 90 초간 반응시켰다. 1 잔기째는 10 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 실온 하, 1 분간 2 회 반응시켰다. 클로로아세틸기의 도입은 전공정에서 얻어진 Fmoc 보호된 펩티드가 유지된 고상 수지에 대하여, 전술한 방법으로 α-아미노기의 Fmoc 기를 제거한 후, 0.1 M 클로로아세트산의 DMF 용액 (5 당량), 0.1 M HATU 의 DMF 용액 (5 당량), 0.2 M DIEA 의 DMF 용액 (10 당량) 을 고상 수지에 첨가하여 실온에서 30 분간 진탕에 의해 실시하였다.
측사슬의 탈보호 및 고상 수지로부터의 잘라내기는, 클로로아세틸기 도입 공정 후에 얻어진 수지를 DMF 와 염화메틸렌으로 세정하여 감압 하 건조시킨 후, 계속해서 고상 수지가 들어간 반응 용기에, 반응제 칵테일-A (TFA/H2O/TIS/DODT 의 체적비 92.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5 의 혼합물) 를 첨가하여, 실온에서 5 분간 진탕에 의해 실시하였다. 반응액을 프릿으로부터 여과 회수하였다. 반응 용기에 남은 고상 수지는 잘라내기용 칵테일과 재차 진탕하고, 프릿으로부터 용액 성분을 회수, 전술한 여과액과 혼합하였다. 이 여과액을 0 ℃ 로 냉각시킨 과잉의 디에틸에테르/헥산 (1/1) 의 혼합 용매에 첨가하면, 백탁 침전이 발생하였다. 이 혼합물을 원심 분리하고 (9000 rpm, 2 분간), 용액을 디캔테이션하였다. 얻어진 고체를 재차 0 ℃ 로 냉각시킨 소량의 디에틸에테르로 세정한 후, 감압 하 건조시켰다. 얻어진 고체를 다음의 고리화 반응에 사용하였다. 펩티드의 고리화 반응은 펩티드의 종농도가 고상 수지의 몰수를 기초로 5 mM 가 되도록 90 ％ DMSO 수용액에 용해 후, 10 당량의 트리에틸아민을 첨가하여, 실온에서 6 시간 진탕하였다. 얻어진 반응 용액을 감압 농축하였다.
얻어진 조생성물은 이하의 조건을 사용하여 정제하였다 (칼럼 : Waters Xbridge (등록상표) C18 5 ㎛ (등록상표) 50×150 mm ; 이동상 : A ＝ 0.1 ％ TFA (수중), B ＝ 0.1 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 40 ℃ ; 그레이디언트 (％ B) : 3 분간에 걸쳐 21-46 ％, 그 후 8 분간에 걸쳐 46-51 ％, 그 후 1 분에 걸쳐 51-60 ％ 유량 : 120 mL/분).
목적물의 순도는 이하의 분석 조건의 LC/MS (UV 파장 225 nm) 크로마토그램의 면적비로부터 산출하여 96.88 ％ 였다.
분석 조건 : 유지 시간 ＝ 6.01 분 ; 칼럼 : Kinetex EVO C18 2.6 ㎛ 2.1×150 mm, 100 Å ; 이동상 : A ＝ 0.025 ％ TFA (수중), B ＝ 0.025 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 60 ℃ ; 그레이디언트 (％ Bconc) : 7.15 분간에 걸쳐 20-60 ％, 그 후 0.30 분간에 걸쳐 60-95 ％, 그 후 1.55 분에 걸쳐 95-95 ％ 유량 : 0.5 mL/분
ESI-MS(＋) 관측치 m/z ＝ 1092.86 (M＋2H)2+
(7) 실시예 10-7 고리형 펩티드 5555＿p227 (펩티드의 서열 번호 : 30 으로 나타내는 펩티드에, 링커 구조로서 PEG2c-dk(cC10COO) 가 부가된 구조, 서열 번호 225) 의 합성
[화학식 21]
Figure pct00039
Fmoc-NH-sieber resin (와타나베 화학 공업 주식회사, 0.48 mmol/g) 을 사용하여, 전술한 일반적 방법으로 목적의 펩티드를 합성하였다. 그 때, CEM 사의 Liberty blue HT 를 고상 합성기로서 사용하고, 제조원의 매뉴얼에 따라 합성을 실시하였다. Fmoc 제거를 10 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 90 ℃ 하, 1 분간 반응을 실시하였다. 수지 1 당량에 대하여 Alloc-D-Lys(Fmoc)-OH/DIC/Oxyma pure (4.2 당량/8 당량/4 당량) 를 이용하여, DMF 중 90 ℃ 하, 3 분간 1 회 반응을 실시하였다. 동 조건으로 Fmoc 제거를 실시한 후, 12-(tert-부톡시)-12-옥소도데칸산을 사용하여, DMF 중 90 ℃ 하, 10 분간 1 회 반응을 실시하였다. Alloc 제거를 수지 1 당량에 대하여 Pd(OAc)2/PPh3/PhSiH3 (0.2 당량/1 당량/10 당량) 을 사용하여, 염화메틸렌 중 실온 하, 60 분간 반응을 실시하였다. 전공정에서 얻어진 고상 수지에 대하여, 각 잔기의 도입에는 수지 1 당량에 대하여 Fmoc-AA/DIC/Oxyma pure (4.2 당량/8 당량/4 당량) 를 이용하여, DMF 중 90 ℃ 하, 3 분간 1 회 반응을 실시하였다. 단, 1 잔기째, 2 잔기째는 75 ℃ 하, 30 분간 2 회, 3 잔기째는 90 ℃ 하, 10 분간 2 회, 5 잔기째는 90 ℃ 하, 10 분간 1 회, 12 잔기째는 50 ℃ 하, 15 분간 1 회 반응을 실시하였다.
또한, Fmoc 제거는 10 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 90 ℃ 하, 1 분간 반응시키는 것을 기본 조건으로 하였다. 단, 2 잔기째, 3 잔기째, 4 잔기째, 5 잔기째 및 6 잔기째는 10 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 50 ℃ 하, 90 초간 반응시켰다. 1 잔기째는 10 ％ 피롤리딘의 DMF 용액과 실온 하, 1 분간 2 회 반응시켰다. 클로로아세틸기의 도입은 전공정에서 얻어진 Fmoc 보호된 펩티드가 유지된 고상 수지에 대하여, 전술한 방법으로 α-아미노기의 Fmoc 기를 제거한 후, 0.1 M 클로로아세트산의 DMF 용액 (5 당량), 0.1 M HATU 의 DMF 용액 (5 당량), 0.2 M DIEA 의 DMF 용액 (10 당량) 을 고상 수지에 첨가하여 실온에서 30 분간 진탕에 의해 실시하였다.
측사슬의 탈보호 및 고상 수지로부터의 잘라내기는, 클로로아세틸기 도입 공정 후에 얻어진 수지를 DMF 와 염화메틸렌으로 세정하여 감압 하 건조시킨 후, 계속해서 고상 수지가 들어간 반응 용기에, 반응제 칵테일-A (TFA/H2O/TIS/DODT 의 체적비 92.5 : 2.5 : 2.5 : 2.5 의 혼합물) 를 첨가하여, 실온에서 5 분간 진탕에 의해 실시하였다. 반응액을 프릿으로부터 여과 회수하였다. 반응 용기에 남은 고상 수지는 잘라내기용 칵테일과 재차 진탕하고, 프릿으로부터 용액 성분을 회수, 전술한 여과액과 혼합하였다. 이 여과액을 0 ℃ 로 냉각시킨 과잉의 디에틸에테르/헥산 (1/1) 의 혼합 용매에 첨가하면, 백탁 침전이 발생하였다. 이 혼합물을 원심 분리하고 (9000 rpm, 2 분간), 용액을 디캔테이션하였다. 얻어진 고체를 재차 0 ℃ 로 냉각시킨 소량의 디에틸에테르로 세정한 후, 감압 하 건조시켰다. 얻어진 고체를 다음의 고리화 반응에 사용하였다. 펩티드의 고리화 반응은 펩티드의 종농도가 고상 수지의 몰수를 기초로 5 mM 가 되도록 90 ％ DMSO 수용액에 용해 후, 10 당량의 트리에틸아민을 첨가하여, 실온에서 6 시간 진탕하였다. 얻어진 반응 용액을 감압 농축하였다.
얻어진 조생성물은 이하의 조건을 사용하여 정제하였다 (칼럼 : Waters Xbridge (등록상표) C18 5 ㎛ (등록상표) 50×150 mm ; 이동상 : A ＝ 0.1 ％ TFA (수중), B ＝ 0.1 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 40 ℃ ; 그레이디언트 (％ B) : 3 분간에 걸쳐 19-44 ％, 그 후 8 분간에 걸쳐 44-49 ％, 그 후 1 분에 걸쳐 49-60 ％ 유량 : 120 mL/분).
목적물의 순도는 이하의 분석 조건의 LC/MS (UV 파장 225 nm) 크로마토그램의 면적비로부터 산출하여 95.47 ％ 였다.
분석 조건 : 유지 시간 ＝ 5.94 분 ; 칼럼 : Kinetex EVO C18 2.6 ㎛ 2.1×150 mm, 100 Å ; 이동상 : A ＝ 0.025 ％ TFA (수중), B ＝ 0.025 ％ TFA (MeCN 중) ; 온도 : 60 ℃ ; 그레이디언트 (％ Bconc) : 7.15 분간에 걸쳐 20-60 ％, 그 후 0.30 분간에 걸쳐 60-95 ％, 그 후 1.55 분에 걸쳐 95-95 ％ 유량 : 0.5 mL/분
ESI-MS(＋) 관측치 m/z ＝ 1172.48 (M＋2H)2+
실시예 11 각 항바이러스 활성 어세이에 의한 항 SARS-CoV-2 활성의 평가
본 실시예에서는, 실시예 10 에서 합성한 펩티드의 일부에 대하여, 실시예 4 와 동일하게 항바이러스 활성을 측정 및 평가하였다. 본 어세이에 있어서는 바이러스주로서 델타주를 사용하였다. 그 결과를 표 12 에 나타낸다.
[표 12]
Figure pct00040
또, 실시예 10 에서 합성한 펩티드의 일부에 대하여, 실시예 6 과 동일하게 항바이러스 활성을 측정 및 평가하였다. 또한, 본 어세이에 있어서는 바이러스주로서 우한주 및 델타주를 사용하였다. 그 결과를 표 13 에 나타낸다.
[표 13]
표 12 및 표 13 의 결과로부터, 본 발명의 고리형 펩티드는, 링커가 부가되어 있어도 SARS-CoV-2 (각종 변이 바이러스주를 포함한다) 에 대하여 항바이러스 활성을 갖는 것이 나타났다.
본 명세서 중의 표와 서열표에 만일 어긋남이 있는 경우에는, 표의 기재가 올바르다고 해석한다.
SEQUENCE LISTING <110> PeptiAID Inc. Japan as represented by National Institute of Infectious Diseases <120> Peptide and composition comprising the peptide <130> FA1745-22027 <150> JP 2021-047773 <151> 2021-03-22 <150> JP 2021-192510 <151> 2021-11-26 <160> 218 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(1) <223> Xaa stands for Ala, Glu, N-methyl-alanine or N-methyl-glutamic acid <220> <221> MUTAGEN <222> (2)..(2) <223> Xaa stands for N-methyl amino acid <220> <221> MUTAGEN <222> (3)..(3) <223> Xaa stands for Ser or alpha-methyl-alanine <220> <221> MUTAGEN <222> (4)..(4) <223> Xaa stands for beta-cyclohexyl-L-alanine <220> <221> MUTAGEN <222> (5)..(5) <223> Xaa stands for an amino acid having a side chain of unsubstituted or substituted aromatic ring <220> <221> MUTAGEN <222> (6)..(6) <223> Xaa stands for any amino acid <220> <221> MUTAGEN <222> (8)..(8) <223> Xaa stands for an amino acid having a side chain of unsubstituted or substituted aromatic ring <220> <221> MUTAGEN <222> (9)..(9) <223> Xaa stands for any amino acid <220> <221> MUTAGEN <222> (10)..(10) <223> Xaa stands for any basic amino acid <220> <221> MUTAGEN <222> (11)..(11) <223> Xaa stands for beta-cyclohexyl-L-alanine <400> 1 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(1) <223> Xaa stands for N-methyl-alanine <220> <221> MUTAGEN <222> (2)..(2) <223> Xaa stands for N-methyl-phenylalanine <220> <221> MUTAGEN <222> (4)..(4) <223> Xaa stands for beta-cyclohexyl-L-alanine <220> <221> MUTAGEN <222> (11)..(11) <223> Xaa stands for beta-cyclohexyl-L-alanine <220> <221> MUTAGEN <222> (13)..(13) <223> Xaa stands for D-glutamic acid <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> AMIDATION <400> 2 Xaa Xaa Ser Xaa Tyr Ser Tyr Tyr Arg Arg Xaa Cys Xaa 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(1) <223> Xaa stands for N-methyl-glutamic acid <220> <221> MUTAGEN <222> (2)..(2) <223> Xaa stands for N-methyl-L-norleucine <220> <221> MUTAGEN <222> (3)..(3) <223> Xaa stands for alpha-methyl-alanine <220> <221> MUTAGEN <222> (4)..(4) <223> Xaa stands for beta-cyclohexyl-L-alanine <220> <221> MUTAGEN <222> (5)..(5) <223> Xaa stands for 4-fluoro-L-phenylalanine <220> <221> MUTAGEN <222> (6)..(6) <223> Xaa stands for alpha-methyl-alanine <220> <221> MUTAGEN <222> (9)..(9) <223> Xaa stands for 4-carboxy-L-phenylalanine <220> <221> MUTAGEN <222> (10)..(10) <223> Xaa stands for D-arginine <220> <221> MUTAGEN <222> (11)..(11) <223> Xaa stands for beta-cyclohexyl-L-alanine <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> AMIDATION <400> 3 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(1) <223> Xaa stands for N-methyl-glutamic acid <220> <221> MUTAGEN <222> (2)..(2) <223> Xaa stands for N-methyl-L-norleucine <220> <221> MUTAGEN <222> (3)..(3) <223> Xaa stands for alpha-methyl-alanine <220> <221> MUTAGEN <222> (4)..(4) <223> Xaa stands for beta-cyclohexyl-L-alanine <220> <221> MUTAGEN <222> (5)..(5) <223> Xaa stands for 4-fluoro-L-phenylalanine <220> <221> MUTAGEN <222> (6)..(6) <223> Xaa stands for alpha-methyl-alanine <220> <221> MUTAGEN <222> (9)..(9) <223> Xaa stands for 4-carboxy-L-phenylalanine <220> <221> MUTAGEN <222> (10)..(10) <223> Xaa stands for (S)-2-amino-3-(piperidin-4-yl)propanoic acid <220> <221> MUTAGEN <222> (11)..(11) <223> Xaa stands for beta-cyclohexyl-L-alanine <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> AMIDATION <400> 4 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(1) <223> Xaa stands for N-methyl-glutamic acid <220> <221> MUTAGEN <222> (2)..(2) <223> Xaa stands for N-methyl-L-norleucine <220> <221> MUTAGEN <222> (3)..(3) <223> Xaa stands for alpha-methyl-alanine <220> <221> MUTAGEN <222> (4)..(4) <223> Xaa stands for beta-cyclohexyl-L-alanine <220> <221> MUTAGEN <222> (5)..(5) <223> Xaa stands for 4-fluoro-L-phenylalanine <220> <221> MUTAGEN <222> (6)..(6) <223> Xaa stands for D-aspartic acid <220> <221> MUTAGEN <222> (9)..(9) <223> Xaa stands for 4-carboxy-L-phenylalanine <220> <221> MUTAGEN <222> (10)..(10) <223> Xaa stands for D-arginine <220> <221> MUTAGEN <222> (11)..(11) <223> Xaa stands for beta-cyclohexyl-L-alanine <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> AMIDATION <400> 5 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Xaa Cys 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(1) <223> Xaa stands for N-methyl-glutamic acid <220> <221> MUTAGEN <222> (2)..(2) <223> Xaa stands for N-methyl-L-norleucine <220> <221> MUTAGEN <222> (3)..(3) <223> Xaa stands for 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(4)..(4) <223> Xaa stands for beta-cyclohexyl-L-alanine <220> <221> MUTAGEN <222> (5)..(5) <223> Xaa stands for 4-fluoro-L-phenylalanine <220> <221> MUTAGEN <222> (6)..(6) <223> Xaa stands for 2-methyl-serine <220> <221> MUTAGEN <222> (9)..(9) <223> Xaa stands for (S)-2-amino-5-ureidopentanoic acid <220> <221> MUTAGEN <222> (10)..(10) <223> Xaa stands for D-lysine <220> <221> MUTAGEN <222> (11)..(11) <223> Xaa stands for beta-cyclohexyl-L-alanine <220> <221> MUTAGEN <222> (13)..(13) <223> Xaa stands for D-glutamic acid <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> AMIDATION <400> 216 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Xaa Cys Xaa 1 5 10 <210> 217 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(1) <223> Xaa stands for N-methyl-glutamic acid <220> <221> MUTAGEN <222> (2)..(2) <223> Xaa stands for N-methyl-L-norleucine <220> <221> MUTAGEN <222> (3)..(3) <223> Xaa stands for alpha-methyl-alanine <220> <221> MUTAGEN <222> (4)..(4) <223> Xaa stands for beta-cyclohexyl-L-alanine <220> <221> MUTAGEN <222> (5)..(5) <223> Xaa stands for 4-fluoro-L-phenylalanine <220> <221> MUTAGEN <222> (6)..(6) <223> Xaa stands for N-methyl-D-aspartic acid <220> <221> MUTAGEN <222> (9)..(9) <223> Xaa stands for (S)-2-amino-5-ureidopentanoic acid <220> <221> MUTAGEN <222> (10)..(10) <223> Xaa stands for D-lysine <220> <221> MUTAGEN <222> (11)..(11) <223> Xaa stands for beta-cyclohexyl-L-alanine <220> <221> MUTAGEN <222> (13)..(13) <223> Xaa stands for D-glutamic acid <400> 217 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Xaa Cys Xaa 1 5 10 <210> 218 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial peptide <220> <221> MUTAGEN <222> (1)..(1) <223> Xaa stands for N-methyl-glutamic acid <220> <221> MUTAGEN <222> (2)..(2) <223> Xaa stands for N-methyl-L-norleucine <220> <221> MUTAGEN <222> (3)..(3) <223> Xaa stands for alpha-methyl-alanine <220> <221> MUTAGEN <222> (4)..(4) <223> Xaa stands for beta-cyclohexyl-L-alanine <220> <221> MUTAGEN <222> (5)..(5) <223> Xaa stands for 4-fluoro-L-phenylalanine <220> <221> MUTAGEN <222> (6)..(6) <223> Xaa stands for D-glutamic acid <220> <221> MUTAGEN <222> (9)..(9) <223> Xaa stands for (S)-2-amino-5-ureidopentanoic acid <220> <221> MUTAGEN <222> (10)..(10) <223> Xaa stands for D-lysine <220> <221> MUTAGEN <222> (11)..(11) <223> Xaa stands for beta-cyclohexyl-L-alanine <220> <221> MUTAGEN <222> (13)..(13) <223> Xaa stands for D-glutamic acid <400> 218 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Tyr Xaa Xaa Xaa Cys Xaa 1 5 10

Claims (29)

  1. 이하의 아미노산 서열 :
    MeA-MeF-S-Cha-Y-S-Y-Y-R-R-Cha-C (서열 번호 2)
    혹은, 상기 아미노산 서열의 1 번째, 2 번째, 3 번째, 4 번째, 5 번째, 6 번째, 7 번째, 8 번째, 9 번째 및 10 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 그룹에서 선택되는, 1-10 개의 아미노산 잔기에 있어서, 치환, 부가, 결실 또는 삽입을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 펩티드.
  2. 이하의 아미노산 서열 :
    MeA-MeF-S-Cha-Y-S-Y-Y-R-R-Cha-C (서열 번호 2)
    혹은, 상기 아미노산 서열의 1 번째, 2 번째, 3 번째, 5 번째, 6 번째, 8 번째, 9 번째 및 10 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 그룹에서 선택되는, 1-8 개의 아미노산 잔기에 있어서, 치환, 부가, 결실 또는 삽입을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 펩티드.
  3. 이하의 아미노산 서열 :
    X1-X2-X3-Cha-X4-X5-Y-X6-X7-X8-Cha-C (서열 번호 1)
    여기에 있어서,
    X1 은, A, E, MeA 또는 MeE 이고 ;
    X2 는, N-메틸아미노산이고 ;
    X3 은, S 또는 Aib 이고 ;
    X4 는, 비치환의 혹은 치환된 방향 고리를 측사슬에 갖는 아미노산이며 ;
    X5 는, 임의의 아미노산이고 ;
    X6 은, 비치환의 혹은 치환된 방향 고리를 측사슬에 갖는 아미노산이며 ;
    X7 은, 임의의 아미노산이고 ;
    X8 은, 임의의 염기성 아미노산이다,
    을 포함하는, 펩티드.
  4. 제 3 항에 있어서,
    X1 이, MeA 또는 MeE 인, 펩티드.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    X2 가, MeF 또는 MeNle 인, 펩티드.
  6. 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    X4 가, 비치환의 혹은 치환된 Y, 또는, 비치환 혹은 치환된 F 인, 펩티드.
  7. 제 3 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    X4 가, Y 또는 F4F 인, 펩티드.
  8. 제 3 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    X5 가, 임의의 친수성 아미노산 또는 Aib, 혹은 N-메틸화된 임의의 친수성 아미노산 또는 Aib 인, 펩티드.
  9. 제 3 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    X5 가, Aib, E, K, S, dd, ddap, ds, MeE 의 어느 것인, 펩티드.
  10. 제 3 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    X6 이, 비치환의 혹은 치환된 Y, 또는, 비치환 혹은 치환된 F 인, 펩티드.
  11. 제 3 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    X6 이, Y, Yae, 3Py, Nal1 의 어느 것인, 펩티드.
  12. 제 3 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    X7 이, A, Ahp, Cit, Dab, E, F4COO, K, R 의 어느 것인, 펩티드.
  13. 제 3 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    X8 이, K, R, A4p 의 어느 것인, 펩티드.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    C 말단에, 추가로 D-글루타민산을 포함하는, 펩티드.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호 2-126, 132-234 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 또는 이루어지는, 펩티드.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    고리형 펩티드인, 펩티드.
  17. 제 16 항에 있어서,
    클로로아세틸화한 아미노산과, 상기 펩티드에 포함되는 시스테인 잔기가 결합된 고리형 구조를 갖는, 펩티드.
  18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가로, 부가적인 아미노산 잔기를 포함하는, 펩티드.
  19. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 포함하는, 의약 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서,
    항 SARS-CoV-2 바이러스 활성을 갖는, 의약 조성물.
  21. 제 19 항 또는 제 20 항에 있어서,
    코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한, 의약 조성물.
  22. 제 19 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
    코로나바이러스 감염증이 COVID-19 인, 의약 조성물.
  23. 제 19 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드의 약학상 허용되는 염, 또는 그 용매화물을 포함하는, 의약 조성물.
  24. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 포함하는, SARS-CoV-2 바이러스 감염증을 진단하기 위한 진단용 조성물.
  25. 제 19 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 다른 약제와 병용되는, 의약 조성물.
  26. 제 25 항에 있어서,
    코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 다른 약제가, 렘데시비르, 카시리비맙과 임데비맙의 병용제, 및 몰누피라비르 혹은 그 활성체로 이루어지는 군에서 선택되는, 의약 조성물.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서,
    코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 다른 약제와 동시 투여되는, 의약 조성물.
  28. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드와 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 다른 약제를 포함하는, 조합제.
  29. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 기재된 펩티드를 포함하는, 의약 조성물과 병용되는, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료를 위한 다른 약제.
KR1020237035941A 2021-03-22 2022-03-22 펩티드 및 펩티드를 포함하는 조성물 KR20230170918A (ko)

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