CN114222757A - 重组4-1bb结合蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含对4‑1 BB(CD137)具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白。此外，本发明涉及编码此类结合蛋白的核酸、包含此类结合蛋白或核酸的药物组合物，以及此类结合蛋白、核酸或药物组合物在用于在表达4‑1 BB的细胞(例如，肿瘤定位的T淋巴细胞)中活化4‑1 BB和用于治疗或诊断包括人在内的哺乳动物中的疾病诸如癌症的方法中的用途。

Description

重组4-1BB结合蛋白及其用途
相关专利申请的交叉引用
本申请要求于2019年6月04日提交给欧洲专利局的欧洲专利申请EP19178280的权益和优先权。欧洲专利申请EP19178280的内容全文以引用方式并入本文，包括所有表、图和权利要求。
技术领域
本发明涉及包含对4-1BB(CD137)具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白。此外，本发明涉及编码此类结合蛋白的核酸、包含此类结合蛋白或核酸的药物组合物，以及此类结合蛋白、核酸或药物组合物在用于在表达4-1BB的细胞(例如，肿瘤定位的T淋巴细胞)中活化4-1BB和用于治疗或诊断包括人在内的哺乳动物中的疾病诸如癌症的方法中的用途。
背景技术
免疫检查点抑制剂已彻底改变了许多癌症的治疗，但需要显著的改进以拓宽其效用。检查点抑制(例如，靶向CTLA-4、PD-1或PD-L1)是高度有效的，在一些患者中具有持续的临床有益效果，但大多数患者(70％-80％)似乎根本不受益或仅最低限度地受益。T细胞共刺激被认为是一种提高应答者比例和具有长期有益效果的患者数量的有前途的方法(Morrissey等人Clin Transl Sci,2016,9:89–104；Alsaab等人Front.Pharmacol.,2017,8:561)。
TNF受体(TNFR)家族成员4-1BB(CD137；TNFRSF9)是关键共刺激受体，并且当由其配体或通过激动性抗体接合时，参与某些淋巴细胞应答的调节。例如，4-1BB的连接诱导CD8阳性T细胞和自然杀伤细胞中的活化信号，从而导致增殖增加、促炎性细胞因子分泌、溶细胞功能和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。另外，4-1BB促进T细胞记忆库的建立和维持，并且已表明对调节性T细胞(Treg)的功能活性具有抑制作用(Wang等人Immunol Rev.2009,229(1):192-215；Croft等人Nat Rev Immunol,2009,9:271-285)。同样在活化的正常B细胞中，4-1BB与其配体在B细胞受体接合时的相互作用刺激增殖并增强存活(Zhang X等人JImmunol.2010,184(2):787-795)。
与这些共刺激特性一致，4-1BB促进抗病毒T细胞应答(Lin等人JImmunol.2009,182(2):934-47)和抗肿瘤T细胞应答(Lynch等人Immunol Rev.,2008,22:277-286；Curran等人PLoS One.2011,6(4):e19499)。
刺激4-1BB的配体(即4-1BBL)在活化的抗原呈递细胞(APC)、骨髓祖细胞和造血干细胞上表达。4-1BB被认为在结合到其三聚体配体(4-1BBL)时经历受体三聚反应以刺激细胞应答(Bitra A等人，J.Biol.Chem.2018,293(4):1317-1329；Chin等人，NatureCommunications(2018)9:4679)。
临床前模型中利用激动分子的4-1BB活化促进对肿瘤生长的控制。例如，向B淋巴瘤细胞的体外培养物中添加4-1BB激动剂与利妥昔单抗和NK细胞导致淋巴瘤杀伤增加(Kohrt等人Blood,2011；117(8):2423-2432)。此外，4-1BB激动剂mAb已显示增加共刺激分子的表达并显著增强溶细胞T淋巴细胞应答，从而在各种模型中产生抗肿瘤功效。因此，4-1BB激动剂mAb已被表明在预防和治疗环境中有效，并且在与单一疗法相关的肿瘤模型中以及当与其它免疫调节分子(IL-2、IL-15、OX40、PD-1/PDL-1、CTLA-4、TIM-3)、放射疗法、化学疗法或肿瘤特异性疫苗接种组合应用时建立了持久的抗肿瘤保护性T细胞记忆应答(Chester等人Cancer Immunol Immunother,2016,65:1243–1248,Lynch et al.,ImmunolRev.,2008；222:277-286)。4-1BB激动剂也在各种自身免疫模型中抑制自身免疫反应。例如，已发现4-1BB在一系列动物模型中改善自身免疫(Vinay等人J Mol Med.2006,84(9):726-736)，包括胶原诱导的关节炎(Seo等人2004,Nat Med.10(10):1088-94)和系统性红斑狼疮(Sun等人2002,Nat Med.8(12):1405-13。)
由于其在鼠肿瘤模型中的有效活性，靶向4-1BB的激动剂抗体已进入针对尤其是黑素瘤和淋巴瘤的临床试验。然而，临床前前景向患者的床有益效果的转变尚未实现，并且事实上进展令人失望。相反，最近进入临床的是PRS-343，一种双特异性HER2-CD137靶向分子(抗体-抗运载蛋白缀合物)，其潜在的活性限于HER2阳性癌症。乌托米单抗(Utomilumab)和乌瑞鲁单抗(urelumab)，两种4-1BB抗体，是临床上最先进的4-1BB活化治疗性候选物。这两种4-1BB激动性抗体已在若干临床试验中进行了研究，并且由于乌瑞鲁单抗肝毒性的产生和由于这两种抗体不令人满意的治疗性功效数据而令人失望。由乌瑞鲁单抗引起的肝毒性可归因于全身性4-1BB活化，并且低治疗性功效似乎可能是由于4-1BB在肿瘤中的低效力活化。乌瑞鲁单抗在早期1期单一疗法研究中产生剂量限制性肝毒性，从而导致使用安全但潜在的亚最佳剂量以供以后研究(Segal等人2016,Clin.Cancer Res.23(8):1929-36)。不太有效(约10倍)的乌托鲁单抗具有较少的副作用且没有肝毒性，但在1期单一疗法研究中也没有令人信服的抗肿瘤活性(Chester等人2018,Blood,131(1):49-57；Segal等人2018,Clin.Cancer Res.24(8):1816-1823)。
因此，仍然需要用于治疗和表征受益于4-1BB特异性结合和活化的疾病包括癌症的治疗和诊断方法。
发明内容
本发明提供了包含对4-1BB具有结合特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白。本发明还提供了与一个或多个定位剂分子连接的此类结合蛋白，其促进通过结合蛋白的4-1BB的聚集介导活化。此外，本发明提供了编码此类结合蛋白的核酸和包含此类结合蛋白或核酸的药物组合物。本发明还提供了此类结合蛋白、核酸或药物组合物在用于表达4-1BB的细胞或组织(诸如肿瘤组织)中定位活化4-1BB以及用于治疗和诊断哺乳动物(包括人)中的疾病诸如癌症的方法中的用途。
在一个方面，本发明提供了包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的此类重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至38的锚蛋白重复结构域中的任一者具有至少75％且至多100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述锚蛋白重复结构域的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失；并且SEQ ID NO:2至4、6-19、25-27、33-38的所述锚蛋白重复结构域的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。例如，在一个具体实施方案中，本发明的4-1BB特异性重组结合蛋白包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的此类重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:58至71的锚蛋白重复模块中的任一者具有至少80％且至多100％氨基酸序列同一性的锚蛋白重复模块。例如，在一个具体实施方案中，本发明的4-1BB特异性重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含具有选自SEQ ID NO:58和59的氨基酸序列的锚蛋白重复模块。在一个具体实施方案中，本发明的4-1BB特异性重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。其中所述锚蛋白重复结构域包含具有SEQ IDNO:58的氨基酸序列的锚蛋白重复模块和具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的锚蛋白重复模块。
在另一方面，本发明提供了此类4-1BB特异性重组结合蛋白，其中该结合蛋白还包含定位剂分子。定位剂分子可选自不同结构和功能类别的分子。例如，定位剂可以是多肽结合结构域、细胞表面受体配体或其片段或变体、抗体或其片段或变体、或基于支架的抗体样蛋白。在本发明的一个方面，定位剂分子共价结合到4-1BB特异性重组结合蛋白。共价键可为4-1BB特异性结合蛋白与定位肽或多肽之间的肽键，从而产生融合蛋白。另选地，定位剂分子可共价缀合至4-1BB特异性结合蛋白。
在一个具体实施方案中，本发明的4-1BB特异性重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，该锚蛋白重复结构域融合到对癌症生物学中相关的定位剂靶蛋白(诸如例如肿瘤相关抗原)具有结合特异性的定位剂。例如，在一个具体实施方案中，本发明的4-1BB特异性重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，该锚蛋白重复结构域融合到对纤连蛋白外结构域B(ED-B)、肿瘤抗原A(TAA)、表皮生长因子受体(EGFR)或人表皮生长因子受体2(HER2)具有结合特异性的另一锚蛋白重复结构域。
在另一方面，本发明提供了编码本发明的4-1BB特异性结合蛋白的核酸以及包含本发明的4-1BB特异性结合蛋白或核酸和药学上可接受的载体和/或稀释剂的药物组合物。
在另一方面，本发明提供了在哺乳动物的表达4-1BB的细胞或组织中定位活化4-1BB的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用包含定位剂分子的本发明的4-1BB特异性结合蛋白。在一个具体实施方案中，此类方法包括将4-1BB特异性结合蛋白施用于患有包含表达4-1BB的细胞或组织的肿瘤的哺乳动物，包括人患者，从而导致在表达4-1BB的细胞或肿瘤组织中4-1BB的定位活化。在具体实施方案中，此类4-1BB特异性结合蛋白包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列，或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的具有等同4-1BB结合特异性的序列变体。
在另一方面，本发明提供了用于治疗人患者的医学病症的方法，该方法包括向所述患者施用共价连接到定位剂分子或包含定位剂分子的本发明的4-1BB特异性结合蛋白，其中该定位剂分子通过4-1BB特异性结合蛋白介导4-1BB的定位活化。在一个具体实施方案中，该医学病症为癌症，其中该癌症或肿瘤组织包含表达4-1BB的细胞，且该定位剂分子结合在所述癌症或肿瘤组织中过表达的靶标。在一个具体实施方案中，所述靶标为在所述癌症或肿瘤组织中表达或过表达的细胞表面蛋白的胞外结构域。在一个实施方案中，所述癌症选自结直肠癌、胃癌、非小细胞肺癌、乳腺癌、头颈癌、卵巢癌、肺癌、浸润性膀胱癌、胰腺癌、脑转移性癌症、头颈鳞状细胞癌、食道鳞状细胞癌、肺鳞状细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、黑素瘤、乳腺腺癌、肺腺癌、子宫颈鳞状细胞癌、胰腺鳞状细胞癌、结肠鳞状细胞癌或胃鳞状细胞癌、前列腺癌、骨肉瘤或软组织肉瘤和良性肿瘤。在一个实施方案中，此类癌症选自上皮恶性肿瘤(原发性和转移性)，包括肺癌、结直肠癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌和乳腺癌，以及骨和软组织肉瘤。
本发明还提供了包含本发明的重组结合蛋白、本发明的核酸或本发明的药物组合物的试剂盒。本发明还提供了用于产生本发明的重组结合蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(i)在细菌中表达所述重组结合蛋白，以及(ii)使用色谱法纯化所述重组结合蛋白。
附图说明
图1：对人4-1BB、
Figure BDA0003495129560000051
蛋白质#1和
Figure BDA0003495129560000052
蛋白质#5具有结合特异性的两种所选择的锚蛋白重复蛋白的纯化的SDS-PAGE凝胶分析。M对应于蛋白质大小标志物。指示标志物蛋白质的分子量(kDa)。泳道1：分子量为14.4kDa的对照锚蛋白重复蛋白；泳道2：经纯化的
Figure BDA0003495129560000053
蛋白质#1；泳道3：经纯化的
Figure BDA0003495129560000054
蛋白质#5。
图2A至图2B：结合到人4-1BB的锚蛋白重复蛋白的表面等离振子共振(SPR)分析，由
Figure BDA0003495129560000055
蛋白质#1(图2A)和
Figure BDA0003495129560000056
蛋白质#5(图2B)例示。将各种浓度(0.6nM、1.9nM、5.6nM和16.7nM)的经纯化的锚蛋白重复蛋白施加到具有固定的人4-1BB的GLC芯片以用于结合率和解离率测量。使用所获得的SPR迹线分析来确定锚蛋白重复蛋白-4-1BB相互作用。RU，共振单位；s，以秒为单位的时间。
图3：测试对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复蛋白活化细胞中4-1BB信号传导的能力的测定的示意图。
图4A至图4D：在如图3所示的细胞报告测定中示出的通过所选择的4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白的4-1BB信号传导活化。浓度依赖性曲线关于所确定的反映报告基因活性的发光(AU)示出。测试抗4-1BB单克隆抗体(20H4.9-IgG4)作为比较。图4A示出了
Figure BDA0003495129560000061
蛋白质#9、
Figure BDA0003495129560000062
蛋白质#13、
Figure BDA0003495129560000063
蛋白质#17和抗4-1BB单克隆抗体的曲线。图4B示出了
Figure BDA0003495129560000064
蛋白质#1、
Figure BDA0003495129560000065
蛋白质#2、
Figure BDA0003495129560000066
蛋白质#3、
Figure BDA0003495129560000067
蛋白质#10、
Figure BDA0003495129560000068
蛋白质#11、
Figure BDA0003495129560000069
蛋白质#14和抗4-1BB单克隆抗体的曲线。图4C示出了
Figure BDA00034951295600000610
蛋白质#5、
Figure BDA00034951295600000611
蛋白质#6、
Figure BDA00034951295600000612
蛋白质#12、
Figure BDA00034951295600000613
蛋白质#15、
Figure BDA00034951295600000614
蛋白质#18和抗4-1BB单克隆抗体的曲线。图4D示出了
Figure BDA00034951295600000615
蛋白质#4、
Figure BDA00034951295600000616
蛋白质#7、
Figure BDA00034951295600000617
蛋白质#8、
Figure BDA00034951295600000618
蛋白质#16、
Figure BDA00034951295600000619
蛋白质#19和抗4-1BB单克隆抗体的曲线。
图5：4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白与活化的T成淋巴细胞(离子霉素/PMA刺激的CEM细胞)的结合，如由
Figure BDA00034951295600000620
蛋白质#44、
Figure BDA00034951295600000621
蛋白质#45、
Figure BDA00034951295600000622
蛋白质#46、
Figure BDA00034951295600000623
蛋白质#47、
Figure BDA00034951295600000624
蛋白质#48和
Figure BDA00034951295600000625
蛋白质#49例示。这些
Figure BDA00034951295600000626
蛋白质的浓度依赖性结合曲线关于所确定的中值荧光强度(MFI)信号与背景的比率示出。
图6A和图6B：在TAA包被的珠存在下培养的表达4-1BB的细胞中示出的通过所选择的4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白的4-1BB信号传导活化。浓度依赖性曲线关于所确定的反映报告基因活性的发光(AU)示出。图6A示出了
Figure BDA00034951295600000627
蛋白质#44、
Figure BDA00034951295600000628
蛋白质#45、
Figure BDA00034951295600000629
蛋白质#46和
Figure BDA00034951295600000630
蛋白质#50的曲线。图6B示出了
Figure BDA00034951295600000631
蛋白质#1、
Figure BDA00034951295600000632
蛋白质#2、
Figure BDA00034951295600000633
蛋白质#47、
Figure BDA00034951295600000634
蛋白质#48和
Figure BDA00034951295600000635
蛋白质#49的曲线。
Figure BDA00034951295600000636
蛋白质#44、
Figure BDA00034951295600000637
蛋白质#45、
Figure BDA00034951295600000638
蛋白质#46、
Figure BDA00034951295600000639
蛋白质#47、
Figure BDA00034951295600000640
蛋白质#48、
Figure BDA00034951295600000641
蛋白质#49和
Figure BDA00034951295600000642
蛋白质#50，但不是
Figure BDA00034951295600000643
蛋白质#1或
Figure BDA00034951295600000644
蛋白质#2，包含TAA特异性定位剂分子。图6A还示出了在不存在TAA包被的珠的情况下
Figure BDA00034951295600000645
蛋白质的结果。
图7A和图7B：在与表达TAA的CHO细胞共培养的表达4-1BB的细胞中示出的通过所选择的4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白的4-1BB信号传导活化。浓度依赖性曲线关于所确定的反映报告基因活性的发光(AU)示出。图7A示出了在表达TAA的CHO细胞(群体1)存在下
Figure BDA00034951295600000646
蛋白质#44、
Figure BDA00034951295600000647
蛋白质#45、
Figure BDA00034951295600000648
蛋白质#46、
Figure BDA00034951295600000649
蛋白质#47、
Figure BDA00034951295600000650
蛋白质#48、
Figure BDA00034951295600000651
蛋白质#49和
Figure BDA00034951295600000652
蛋白质#50的曲线。图7B示出了在表达TAA的CHO细胞的另一群体(群体2)存在下
Figure BDA00034951295600000653
蛋白质#44、
Figure BDA0003495129560000071
蛋白质#45、
Figure BDA0003495129560000072
蛋白质#46、
Figure BDA0003495129560000073
蛋白质#47、
Figure BDA0003495129560000074
蛋白质#48、
Figure BDA0003495129560000076
蛋白质#49和
Figure BDA0003495129560000075
蛋白质#50的曲线。图6A和图6B还示出了在不存在任何
Figure BDA0003495129560000078
蛋白质的情况下细胞的发光值。
图8A至图8C：各种锚蛋白重复蛋白与活化的T成淋巴细胞(离子霉素/PMA刺激的CEM细胞)的结合。锚蛋白重复蛋白的浓度依赖性结合曲线关于所确定的中值荧光强度信号与背景的比率示出。图8A示出了
Figure BDA0003495129560000077
蛋白质#1、
Figure BDA0003495129560000079
蛋白质#44、
Figure BDA00034951295600000710
蛋白质#51和
Figure BDA00034951295600000711
蛋白质#54的曲线。图8B示出了
Figure BDA00034951295600000712
蛋白质#2、
Figure BDA00034951295600000713
蛋白质#45、
Figure BDA00034951295600000714
蛋白质#52和
Figure BDA00034951295600000715
蛋白质#55的曲线。图8C示出了
Figure BDA00034951295600000716
蛋白质#50、
Figure BDA00034951295600000717
蛋白质#53和
Figure BDA00034951295600000718
蛋白质#56的曲线。
图9A和图9B：在与表达TAA的CHO细胞或与野生型CHO细胞共培养的表达4-1BB的细胞中示出的通过所选择的4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白的4-1BB信号传导活化。浓度依赖性曲线关于所确定的反映NF-κB调节的报告基因活性的发光(AU)示出。图9A示出了
Figure BDA00034951295600000719
蛋白质#44、
Figure BDA00034951295600000720
蛋白质#51和
Figure BDA00034951295600000721
蛋白质#54的曲线。图9B示出了
Figure BDA00034951295600000722
蛋白质#45、
Figure BDA00034951295600000723
蛋白质#52和
Figure BDA00034951295600000724
蛋白质#55的曲线。
图10A至图10C：使用本领域已知的标准方法，通过免疫组织化学示出了肿瘤基质中的ED-B表达(图10A)，并且通过流式细胞术示出了A431细胞中的EGFR表达(图10B)和BT474细胞中的HER2表达(图10C)。
图11A至图11C：在与表达EGFR或HER2的细胞共培养或在重组ED-B存在下表达4-1BB的细胞中示出的通过所选择的4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白的4-1BB信号传导活化。浓度依赖性曲线关于所确定的反映报告基因活性的发光(AU)示出。图11A示出了在重组ED-B存在下
Figure BDA00034951295600000728
蛋白质#51、
Figure BDA00034951295600000726
蛋白质#57、
Figure BDA00034951295600000725
蛋白质#58和
Figure BDA00034951295600000727
蛋白质#59曲线。图11B示出了在表达EGFR的A431细胞存在下
Figure BDA00034951295600000729
蛋白质#51和
Figure BDA00034951295600000730
蛋白质#58的曲线。图11C示出了在表达HER2的BT474细胞存在下
Figure BDA00034951295600000731
蛋白质#58和
Figure BDA00034951295600000732
蛋白质#59的曲线。
图12A和图12B：在EGFR包被的板(图12A)或HER2包被的板(图12B)存在下表达4-1BB的原代CD8+T细胞中示出的通过所选择的4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白的4-1BB信号传导活化。浓度依赖性曲线关于所确定的由4-1BB信号传导诱导的干扰素-γ(IFNγ)分泌示出。曲线表示
Figure BDA00034951295600000733
蛋白质#58和
Figure BDA00034951295600000734
蛋白质#59。
具体实施方式
如本文所公开和例示的，本公开提供了特异性靶向4-1BB的锚蛋白重复蛋白。经设计的锚蛋白重复蛋白文库(WO2002/020565；Binz等人，Nat.Biotechnol.22,575-582,2004；Stumpp等人，Drug Discov.Today 13,695-701,2008)可用于选择以高亲和力结合其靶标的靶标特异性设计的锚蛋白重复结构域。此类靶标特异性设计的锚蛋白重复结构域继而可用作用于治疗疾病的重组结合蛋白的有价值的组分。经设计的锚蛋白重复蛋白是一类结合分子，其具有克服单克隆抗体限制的潜力，从而允许新型治疗方法。此类锚蛋白重复蛋白可包含单个经设计的锚蛋白重复结构域，或者可包含两个或更多个具有相同或不同靶标特异性的经设计的锚蛋白重复结构域的组合(Stumpp等人，Drug Discov.Today 13,695-701,2008；美国专利9,458,211)。仅包含单个经设计的锚蛋白重复结构域的锚蛋白重复蛋白为小蛋白质(14kDa)，其可被选择为以高亲和力和特异性结合给定靶蛋白。这些特征以及在一种蛋白质中组合两个或更多个经设计的锚蛋白重复结构域的可能性使得经设计的锚蛋白重复蛋白成为理想的激动、拮抗和/或抑制性药物候选物。此外，此类锚蛋白重复蛋白可被工程化以携带各种效应子功能，例如细胞毒性剂或半衰期延长剂，从而实现全新的药物形式。总之，经设计的锚蛋白重复蛋白为具有超过现有抗体药物的潜力的下一代蛋白质治疗剂的示例。
Figure BDA0003495129560000081
是Molecular Partners AG(Switzerland)拥有的商标。
在一个方面，本发明涉及包含锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域对4-1BB具有结合特异性，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58至71和(2)其中SEQ ID NO:58至71中的任一者中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58至71和(2)其中SEQ ID NO:58至71中的任一者中的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58至71和(2)其中SEQ ID NO:58至71中的任一者中的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58至71和(2)其中SEQ ID NO:58至71中的任一者中的至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所有所述9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代发生在所述锚蛋白重复模块的框架位置中。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由SEQ ID NO:58至71组成的组的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58、59、67、68和69和(2)其中SEQ ID NO:58、59、67、68和69中的任一者中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58、59、67、68和69和(2)其中SEQ ID NO:58、59、67、68和69中的任一者中的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58、59、67、68和69和(2)其中SEQ ID NO:58、59、67、68和69中的任一者中的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58、59、67、68和69和(2)其中SEQ ID NO:58、59、67、68和69中的任一者中的至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所有所述9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代发生在所述锚蛋白重复模块的框架位置中。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由SEQ ID NO:58、59、67、68和69组成的组的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含如下的氨基酸序列：SEQ ID NO:58或其中SEQ ID NO:58中的一个或两个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含如下的氨基酸序列：SEQ ID NO:59或其中SEQ ID NO:59中的一个或两个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含如下的氨基酸序列：SEQ ID NO:67或其中SEQ ID NO:67中的一个或两个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含如下的氨基酸序列：SEQ IDNO:68或其中SEQ ID NO:68中的一个或两个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含如下的氨基酸序列：SEQ ID NO:69或其中SEQ ID NO:69中的一个或两个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含SEQ IDNO:59的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。
在一个实施方案中，如本文所述和提及的所述锚蛋白重复模块的所有所述氨基酸取代发生在所述锚蛋白重复模块的框架位置中，其中通常该模块的总体结构不受取代的影响。无论此类取代是否被明确描述，此类在框架位置中的取代的实施方案应适用于所有实施方案。
在一个实施方案中，如本文所述和提及的所述锚蛋白重复模块的所有所述氨基酸取代发生在除SEQ ID NO:58至66和68至71的所述锚蛋白重复模块的随机化位置3、4、6、14和15或SEQ ID NO:67的所述锚蛋白重复模块的随机化位置3、5、7、15和16之外的位置中。
在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含第一锚蛋白重复模块和第二锚蛋白重复模块。在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端。
在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含第一锚蛋白重复模块和第二锚蛋白重复模块以及第三锚蛋白重复模块。在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端，并且所述第二锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第三锚蛋白重复模块的N-末端。
在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块、所述第二锚蛋白重复模块和所述第三锚蛋白重复模块(如果存在)包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ IDNO:58至71和(2)其中SEQ ID NO:58至71中的任一者中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块、所述第二锚蛋白重复模块和所述第三锚蛋白重复模块(如果存在)包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ IDNO:58、59、67、68和69和(2)其中SEQ ID NO:58、59、67、68和69中的任一者中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。
在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含第一锚蛋白重复模块和第二锚蛋白重复模块。在一个实施方案中，在此类锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58和(2)其中SEQ ID NO:58中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:59和(2)其中SEQ ID NO:59的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所有所述9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代发生在所述锚蛋白重复模块的框架位置中，其中通常该模块的总体结构不受取代的影响。在一个实施方案中，所有所述9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代发生在所述锚蛋白重复模块的除随机化位置3、4、6、14和15之外的位置中。
在一个实施方案中，在此类锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58和(2)其中SEQ ID NO:58中的至多6个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:59和(2)其中SEQ ID NO:59的至多6个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在此类锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58和(2)其中SEQ ID NO:58中的至多5个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:59和(2)其中SEQ ID NO:59的至多5个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在此类锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58和(2)其中SEQID NO:58中的至多4个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:59和(2)其中SEQ ID NO:59的至多4个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在此类锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58和(2)其中SEQ ID NO:58中的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:59和(2)其中SEQ ID NO:59的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在此类锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58和(2)其中SEQ ID NO:58中的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:59和(2)其中SEQID NO:59的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在此类锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQID NO:58和(2)其中SEQ ID NO:58中的1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:59和(2)其中SEQ ID NO:59的1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所有所述氨基酸取代发生在所述锚蛋白重复模块的框架位置中，其中通常该模块的总体结构不受取代的影响。在一个实施方案中，所有所述氨基酸取代发生在所述锚蛋白重复模块的除随机化位置3、4、6、14和15之外的位置中。在一个实施方案中，在此类锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含SEQ IDNO:59的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端。因此，在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58和(2)其中SEQ ID NO:58中的至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:59和(2)其中SEQ ID NO:59的至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，其中所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端。在一个实施方案中，所有所述氨基酸取代发生在所述锚蛋白重复模块的框架位置中，其中通常该模块的总体结构不受取代的影响。在一个实施方案中，所有所述氨基酸取代发生在所述锚蛋白重复模块的除随机化位置3、4、6、14和15之外的位置中。此外，在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含SEQ IDNO:59的氨基酸序列，其中所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端。
在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含第一锚蛋白重复模块和第二锚蛋白重复模块以及第三锚蛋白重复模块。在一个实施方案中，在此类锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:67和(2)其中SEQ ID NO:67中的至多6个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:68和(2)其中SEQ ID NO:68的至多6个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:69和(2)其中SEQ ID NO:69的至多6个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在此类锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:67和(2)其中SEQID NO:67中的至多5个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:68和(2)其中SEQ ID NO:68的至多5个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:69和(2)其中SEQ ID NO:69的至多5个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在此类锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:67和(2)其中SEQ ID NO:67中的至多4个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:68和(2)其中SEQ ID NO:68的至多4个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:69和(2)其中SEQ ID NO:69的至多4个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在此类锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:67和(2)其中SEQ ID NO:67中的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:68和(2)其中SEQ ID NO:68的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:69和(2)其中SEQ ID NO:69的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在此类锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:67和(2)其中SEQ ID NO:67中的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:68和(2)其中SEQ ID NO:68的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:69和(2)其中SEQ ID NO:69的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，在此类锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:67和(2)其中SEQ ID NO:67中的1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:68和(2)其中SEQ ID NO:68的1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:69和(2)其中SEQ ID NO:69的1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所有所述氨基酸取代发生在所述锚蛋白重复模块的框架位置中，其中通常该模块的总体结构不受取代的影响。在一个实施方案中，所有所述氨基酸取代发生在除SEQ ID NO:68和69的所述锚蛋白重复模块的随机化位置3、4、6、14和15或SEQ ID NO:67的所述锚蛋白重复模块的随机化位置3、5、7、15和16之外的位置中。在一个实施方案中，在此类锚蛋白重复结构域中，所述第一锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端，并且其中所述第二锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第三锚蛋白重复模块的N-末端。因此，在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:67和(2)其中SEQ IDNO:67中的至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:68和(2)其中SEQ ID NO:68的至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:69和(2)其中SEQ ID NO:69的至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，其中所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端，并且其中所述第二锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第三锚蛋白重复模块的N-末端。在一个实施方案中，所有所述氨基酸取代发生在所述锚蛋白重复模块的框架位置中，其中通常该模块的总体结构不受取代的影响。在一个实施方案中，所有所述氨基酸取代发生在除SEQ ID NO:68和69的所述锚蛋白重复模块的随机化位置3、4、6、14和15或SEQ ID NO:67的所述锚蛋白重复模块的随机化位置3、5、7、15和16之外的位置中。此外，在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列，并且所述第二锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，并且所述第三锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列，其中所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端，并且其中所述第二锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第三锚蛋白重复模块的N-末端。
在一个实施方案中，上述所述锚蛋白重复模块中的所有所述氨基酸取代发生在框架位置和除SEQ ID NO:58至66和68至71的所述锚蛋白重复模块的随机化位置3、4、6、14和15或SEQ ID NO:67的所述锚蛋白重复模块的随机化位置3、5、7、15和16之外的位置中，其中通常该模块的总体结构不受取代的影响。
在另一方面，本发明涉及包含锚蛋白重复结构域的重组结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域对4-1BB具有结合特异性，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ IDNO:1至38中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至38的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQID NO:2至4、6至19、25至27和33至38的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至38中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至38中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至38中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至38中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1至38中的任一者的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1、5和28至38中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1、5和28至38的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ IDNO:33至38的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1、5和28至38中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1、5和28至38中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1、5和28至38中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1、5和28至38中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1、5和28至38中的任一者的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含选自SEQ ID NO:1、5和28至38的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1、5和28至38的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:33至38的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。
在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。
在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:5的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:5的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。
在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:28至38中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQID NO:28至38的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:33至38的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:28至38中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:28至38中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:28至38中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:28至38中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:28至38中的任一者的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含选自SEQ ID NO:28至38的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:28至38中的任一者的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:33至38的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。
在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:31具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:31的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:31具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:31具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:31具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQID NO:31具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:31的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域中的潜在相互作用残基与SEQ ID NO:1至27的锚蛋白重复结构域中的任一者中的对应位置相同。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M、或低于10-8M、或低于5×10-9M、或低于3×10-9M、或低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合人4-1BB。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-8M的解离常数(KD)结合人4-1BB；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于5×10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于3×10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合人4-1BB，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至38中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至38的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:2至4、6至19、25至27和33至38的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至38中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至38中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至38中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至38中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1至38中的任一者的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合人4-1BB，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1至38中的任一者的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至38中的任一者的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:2至4、6至19、25至27和33至38的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合人4-1BB，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至27中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至27的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:2至4、6至19和25至27的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至27中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至27中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至27中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至27中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1至27中的任一者的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合人4-1BB，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ IDNO:1至27中的任一者的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至27中的任一者的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:2至4、6至19和25至27的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于5×10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至14和16至27中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至14和16至27的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:2至4、6至14、16至19和25至27的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至14和16至27中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至14和16至27中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至14和16至27中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至14和16至27中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1至14和16至27中的任一者的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于5×10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1至14和16至27中的任一者的氨基酸序列，其中SEQ IDNO:1至14和16至27中的任一者的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQID NO:2至4、6至14、16至19和25至27的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于3×10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至14和16至26中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至14和16至26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:2至4、6至14、16至19和25至26的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至14和16至26中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至14和16至26中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至14和16至26中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至14和16至26中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1至14和16至26中的任一者的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于3×10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1至14和16至26中的任一者的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至14和16至26中的任一者的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:2至4、6至14、16至19、25至26的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1、2、5、7至14、17、20至24和26中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQID NO:1、2、5、7至14、17、20至24和26的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:2、7至14、17和26的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1、2、5、7至14、17、20至24和26中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1、2、5、7至14、17、20至24和26中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1、2、5、7至14、17、20至24和26中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ IDNO:1、2、5、7至14、17、20至24和26中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1、2、5、7至14、17、20至24和26中的任一者的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB，其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1、2、5、7至14、17、20至24和26中的任一者的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1、2、5、7至14、17、20至24和26中的任一者的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:2、7至14、17和26的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1、5、7至11、14、17、20至22和24中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQID NO:1、5、7至11、14、17、20至22和24的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:7至11、14和17的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1、5、7至11、14、17、20至22和24中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1、5、7至11、14、17、20至22和24中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1、5、7至11、14、17、20至22和24中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ IDNO:1、5、7至11、14、17、20至22和24中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1、5、7至11、14、17、20至22和24中的任一者的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB，其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1、5、7至11、14、17、20至22和24中的任一者的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1、5、7至11、14、17、20至22和24中的任一者的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:7至11、14和17的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含SEQID NO:1的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB，其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中SEQID NO:1的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:5的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含SEQID NO:5的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB，其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，其中SEQID NO:5的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。
通过表面等离子体共振(SPR)分析对4-1BB具有结合特异性的本发明重组结合蛋白的解离常数(KD)的典型且优选的确定描述于实施例2中。因此，在一个实施方案中，本发明重组结合蛋白对4-1BB的所述结合特异性通过表面等离子体共振(SPR)在PBS中确定。在一个实施方案中，本发明重组结合蛋白对4-1BB的所述结合特异性通过如实施例2中所述的表面等离子体共振(SPR)在PBS中确定。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个或三个锚蛋白重复结构域。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个或三个锚蛋白重复结构域，其中所述两个或三个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58至71和(2)其中SEQ ID NO:58至71中的任一者中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个或三个锚蛋白重复结构域，其中所述两个或三个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58至71和(2)其中SEQ ID NO:58至71中的任一者中的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58至71和(2)其中SEQ IDNO:58至71中的任一者中的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58至71和(2)其中SEQ ID NO:58至71中的任一者中的至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所有所述9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代发生在所述锚蛋白重复模块的框架位置中，其中通常该模块的总体结构不受取代的影响。在一个实施方案中，所有所述氨基酸取代发生在除SEQ ID NO:58至66和68至71的所述锚蛋白重复模块的随机化位置3、4、6、14和15或SEQ ID NO:67的所述锚蛋白重复模块的随机化位置3、5、7、15和16之外的位置中。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个或三个锚蛋白重复结构域，其中所述两个或三个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含选自由SEQ ID NO:58至71组成的组的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述两个或三个锚蛋白重复结构域用肽接头连接。在一个实施方案中，所述肽接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述肽接头是SEQID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述两个或三个锚蛋白重复结构域用SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头连接。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个或三个锚蛋白重复结构域，其中所述两个或三个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58、59、67、68和69和(2)其中SEQ ID NO:58、59、67、68和69中的任一者中的至多9个、或至多8个、或至多7个、或至多6个、或至多5个、或至多4个、或至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个或三个锚蛋白重复结构域，其中所述两个或三个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58、59、67、68和69和(2)其中SEQ ID NO:58、59、67、68和69中的任一者中的至多3个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQID NO:58、59、67、68和69和(2)其中SEQ ID NO:58、59、67、68和69中的任一者中的至多2个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58、59、67、68和69和(2)其中SEQ ID NO:58、59、67、68和69中的任一者中的至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所有所述9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸取代发生在所述锚蛋白重复模块的框架位置中，其中通常该模块的总体结构不受取代的影响。在一个实施方案中，所有所述氨基酸取代发生在除SEQ ID NO:58、59、68和69的所述锚蛋白重复模块的随机化位置3、4、6、14和15或SEQ ID NO:67的所述锚蛋白重复模块的随机化位置3、5、7、15和16之外的位置中。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个或三个锚蛋白重复结构域，其中所述两个或三个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含选自由SEQ ID NO:58、59、67、68和69组成的组的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述两个或三个锚蛋白重复结构域用肽接头连接。在一个实施方案中，所述肽接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述肽接头是SEQID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述两个或三个锚蛋白重复结构域用SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头连接。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含如下的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58或(2)其中SEQID NO:58中的一个或两个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含如下的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:59或(2)其中SEQ ID NO:59中的一个或两个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含如下的氨基酸序列：(1)SEQ IDNO:67或(2)其中SEQ ID NO:67中的一个或两个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含如下的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:68或(2)其中SEQ ID NO:68中的一个或两个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含如下的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:69或(2)其中SEQ ID NO:69中的一个或两个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所有所述氨基酸取代发生在框架位置中，其中通常该模块的总体结构不受取代的影响。在一个实施方案中，所有所述氨基酸取代发生在除SEQID NO:58、59、68和69的所述锚蛋白重复模块的随机化位置3、4、6、14和15或SEQ ID NO:67的所述锚蛋白重复模块的随机化位置3、5、7、15和16之外的位置中。在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域用肽接头连接。在一个实施方案中，所述肽接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述肽接头是SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域用SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头连接。
在一个实施方案中，如本文所述和提及的所述锚蛋白重复模块的所有所述氨基酸取代发生在所述锚蛋白重复模块的框架位置中。无论此类取代是否被明确描述，此类在框架位置中的取代的实施方案应适用于所有实施方案。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含SEQ IDNO:59的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，该锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域包含第一锚蛋白重复模块和第二锚蛋白重复模块。在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域包含第一锚蛋白重复模块和第二锚蛋白重复模块，其中所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端，其中所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58和(2)其中SEQ ID NO:58中的至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且其中所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:59和(2)其中SEQ ID NO:59的至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域用肽接头连接。在一个实施方案中，所述肽接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述肽接头是SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域用SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头连接。在一个实施方案中，包含两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的所述重组结合蛋白在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB。
此外，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域包含第一锚蛋白重复模块和第二锚蛋白重复模块，其中所述第一锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列，并且其中所述第二锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:59的氨基酸序列，并且其中所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端。在一个实施方案中，包含两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的所述重组结合蛋白在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域包含第一锚蛋白重复模块、第二锚蛋白重复模块和第三锚蛋白重复模块。在一个实施方案中，所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端，并且所述第二锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第三锚蛋白重复模块的N-末端。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域包含第一锚蛋白重复模块、第二锚蛋白重复模块和第三锚蛋白重复模块，其中所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端，并且所述第二锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第三锚蛋白重复模块的N-末端，并且其中所述第一锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:67和(2)其中SEQ ID NO:67中的至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且其中所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ IDNO:68和(2)其中SEQ ID NO:68的至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且其中所述第三锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:69和(2)其中SEQ ID NO:69的至多3个、或至多2个、或至多1个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域用肽接头连接。在一个实施方案中，所述肽接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述肽接头是SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域用SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头连接。在一个实施方案中，包含两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的所述重组结合蛋白在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB。
此外，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域包含第一锚蛋白重复模块、第二锚蛋白重复模块和第三锚蛋白重复模块，其中所述第一锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列，并且其中所述第二锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列，并且其中所述第三锚蛋白重复模块包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列，并且其中所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端，并且所述第二锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复域内的所述第三锚蛋白重复模块的N-末端。在一个实施方案中，包含两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的所述重组结合蛋白在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个或三个锚蛋白重复结构域，其中所述两个或三个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含与SEQ ID NO:1至38中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至38的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:2至4、6至19、25至27和33至38的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。因此，在一个实施方案中，所述两个或三个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含与SEQ ID NO:1至38中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述两个或三个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含与SEQ ID NO:1至38中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述两个或三个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含与SEQ ID NO:1至38中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述两个或三个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含与SEQ ID NO:1至38中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述两个或三个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含SEQ ID NO:1至38中的任一者的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述两个或三个锚蛋白重复结构域用肽接头连接。在一个实施方案中，所述肽接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述肽接头是SEQ IDNO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述两个或三个锚蛋白重复结构域用SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头连接。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。因此，在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含与SEQ ID NO:1具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含与SEQ ID NO:1具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含与SEQ ID NO:1具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含与SEQ ID NO:1具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域用肽接头连接。在一个实施方案中，所述肽接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述肽接头是SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域用SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头连接。在一个实施方案中，包含两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的所述重组结合蛋白在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的恰好两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含与SEQ ID NO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。因此，在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含与SEQ ID NO:1具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含与SEQ ID NO:1具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含与SEQ ID NO:1具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含与SEQ ID NO:1具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域用肽接头连接。在一个实施方案中，所述肽接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述肽接头是SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域用SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头连接。在一个实施方案中，包含恰好两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的所述重组结合蛋白在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含与SEQ ID NO:5具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:5的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。因此，在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含与SEQ ID NO:5具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含与SEQ ID NO:5具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含与SEQ ID NO:5具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域独立地包含与SEQ ID NO:5具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中所述两个锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:5的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域用肽接头连接。在一个实施方案中，所述肽接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述肽接头是SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述两个锚蛋白重复结构域用SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头连接。在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的恰好两个锚蛋白重复结构域。在一个实施方案中，包含两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的所述重组结合蛋白在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含由对4-1BB具有结合特异性的用肽接头连接的两个或三个锚蛋白重复结构域组成的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:51、52、54和55中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:51、52、54和55的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:51、52、54和55的所述锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。因此，在一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:51、52、54和55中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:51、52、54和55中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述多肽包含与SEQID NO:51、52、54和55中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:51、52、54和55中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在一个实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:51、52、54和55中的任一者的氨基酸序列。在一个实施方案中，包含两个或三个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的所述重组结合蛋白在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含由对4-1BB具有结合特异性的用肽接头连接的两个锚蛋白重复结构域组成的多肽，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:51具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:51的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:51的所述锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。因此，在一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:51具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:51具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:51具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与SEQID NO:51具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含由对4-1BB具有结合特异性的用肽接头连接的两个锚蛋白重复结构域组成的多肽，其中所述多肽在PBS中以低于10-9M、或低于10-10M、或低于5×10-11M的解离常数(KD)结合人4-1BB。因此，在一个实施方案中，所述多肽在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB。在另一个实施方案中，所述多肽在PBS中以低于10-10M的解离常数(KD)结合人4-1BB。在另一个实施方案中，所述多肽在PBS中以低于5×10-11M的解离常数(KD)结合人4-1BB。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含由对4-1BB具有结合特异性的用肽接头连接的两个锚蛋白重复结构域组成的多肽，其中所述多肽在PBS中以低于10-10M的解离常数(KD)结合人4-1BB，并且其中所述多肽包含与SEQ ID NO:51具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:51的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:51的所述锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。因此，在一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:51具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:51具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:51具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:51具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含由对4-1BB具有结合特异性的用肽接头连接的两个锚蛋白重复结构域组成的多肽，其中所述多肽在PBS中以低于10-10M的解离常数(KD)结合人4-1BB，并且其中所述多肽包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，其中SEQ IDNO:51的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:51的所述锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。
因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含由对4-1BB具有结合特异性的用肽接头连接的两个锚蛋白重复结构域组成的多肽，其中所述多肽在PBS中以低于5×10-11M的解离常数(KD)结合人4-1BB，并且其中所述多肽包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:51的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:51的所述锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白还包含定位剂分子。在一个实施方案中，所述定位剂分子与所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域或所述两个或三个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域连接、缀合、融合或以其它方式物理附接。在一个实施方案中，所述定位剂分子与所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域或所述两个或三个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域共价连接。在一个实施方案中，所述定位剂分子与所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域或所述两个或三个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域用肽接头共价连接。在一个实施方案中，所述肽接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述肽接头是SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述定位剂分子与所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域或所述两个或三个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域用SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头共价连接。
如实施例4至6所示，本发明的一个、两个或三个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域可连接到定位剂，该定位剂能够通过重组结合蛋白经由例如定位剂介导的聚集促进4-1BB的定位活化。此类定位活化(例如靶向肿瘤组织)可能非常有益于避免或减少4-1BB的全身活化和由此导致的肝毒性。此类实施方案允许将4-1BB的活化通过所述定位剂分子定位或递送至特定组织，该定位剂分子特异性结合例如在靶组织的细胞中选择性表达的分子的胞外结构域，并由此聚集4-1BB-特异性锚蛋白重复结构域以实现在附近的表达4-1BB的细胞中的4-1BB活化。又例如，已知许多跨膜蛋白在各种类型的癌症中在肿瘤组织中特异性表达或过表达。此类肿瘤特异性蛋白质包括但不限于锚定蛋白、受体、酶和转运蛋白诸如NDC1(TMEM48)、TMEM45A、TMEM97、钙激活氯通道蛋白(anoctamin)-1(TMEM16A)、TMEM140、TMEM45B、αvβ3整联蛋白、铃蟾素R、CAIX、CEA、CD13、CD44 v6、CXCR4、EGFR、ErbB-2、HER2、细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(Emmprin)、内皮糖蛋白、EpCAM、EphA2、纤连蛋白外结构域B(ED-B)、FAP-α、叶酸R、GRP78、IGF-1R、基质蛋白酶、间皮素、cMET/HGFR、MT1-MMP、MT6-MMP、Muc-1、PSCA、PSMA、Tn抗原、uPAR(Schmit K和Michiels C，Front.Pharmacol.,2018,9:1345；Boonstra CM等人，Biomarkers in Cancer 2016,8:119-133)。
在一个实施方案中，所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的蛋白质具有结合特异性的蛋白质。在一个实施方案中，所述定位剂分子是对肿瘤特异性蛋白质具有结合特异性的蛋白质。在一个实施方案中，所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的蛋白质。
在一个实施方案中，所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的蛋白质具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。在一个实施方案中，所述定位剂分子是对肿瘤特异性蛋白质具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。在一个实施方案中，所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。在一个实施方案中，所述定位剂分子是对纤连蛋白外结构域B(ED-B)、肿瘤抗原A(TAA)、表皮生长因子受体(EGFR)或人表皮生长因子受体2(HER2)具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含定位剂分子，其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的蛋白质，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQID NO:1至38中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至38的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:2至4、6至19、25至27和33至38的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。因此，在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至38中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至38中的任一者具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至38中的任一者具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至38中的任一者具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1至38中的任一者的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含定位剂分子，其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的蛋白质，并且其中所述锚蛋白重复域包含SEQ ID NO:1至38中的任一者的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述定位剂分子是锚蛋白重复结构域。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含定位剂分子，其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的蛋白质具有结合特异性的结合蛋白，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ IDNO:1、5和28至38中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1、5和28至38的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:33至38的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。在一个实施方案中，所述定位剂分子是锚蛋白重复结构域。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含定位剂分子，所述定位剂分子是对肿瘤特异性蛋白质具有结合特异性的蛋白质，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1、5和28至38中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1、5和28至38的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQID NO:33至38的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。在一个实施方案中，所述定位剂分子是锚蛋白重复结构域。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含定位剂分子，其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的蛋白质，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQID NO:1、5和28至38中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1、5和28至38的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:33至38的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。在一个实施方案中，所述定位剂分子是锚蛋白重复结构域。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含定位分子，其中所述定位分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的蛋白质，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ IDNO:1具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQID NO:1的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。在一个实施方案中，所述定位剂分子是锚蛋白重复结构域。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含定位分子，其中所述定位分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的蛋白质，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ IDNO:5具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQID NO:5的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。在一个实施方案中，所述定位剂分子是锚蛋白重复结构域。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含定位分子，其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。因此，在一个实施方案中，所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ IDNO:1具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含定位分子，其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含定位分子，其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:5的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。因此，在一个实施方案中，所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ IDNO:5具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含定位分子，其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:5的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含定位剂分子，其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB，其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的蛋白质，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQID NO:1、5和28至38中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1、5和28至38的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:33至38的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。在一个实施方案中，所述定位剂分子是锚蛋白重复结构域。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含定位分子，其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB，其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。因此，在一个实施方案中，所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ IDNO:1具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含定位分子，其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB，其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含定位分子，其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB，其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:5的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。因此，在一个实施方案中，所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ IDNO:5具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:5具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。因此，在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含定位分子，其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB，其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:5的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，并且还包含定位剂分子，其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的蛋白质具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:1、5和28至38中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1、5和28至38的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:33至38的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，并且还包含定位剂分子，其中所述定位剂分子是对肿瘤特异性蛋白质具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:1、5和28至38中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1、5和28至38的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:33至38的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，并且还包含定位剂分子，其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:1、5和28至38中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1、5和28至38的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:33至38的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，并且还包含定位剂分子，其中所述重组结合蛋白在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB，其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:1、5和28至38中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1、5和28至38的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:33至38的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，并且还包含定位剂分子，其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的蛋白质、优选地对于肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述重组结合蛋白在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:1具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。在一个实施方案中，所述两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域用富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头连接。在一个实施方案中，所述肽接头是SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域和所述定位剂锚蛋白重复结构域用SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头相互连接。在一个实施方案中，所述定位剂特异性锚蛋白重复结构域位于所述重组结合蛋白内的所述两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的N-末端。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，并且还包含定位剂分子，其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述重组结合蛋白在PBS中以低于10-10M的解离常数(KD)结合人4-1BB，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:1具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ IDNO:1的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。在一个实施方案中，所述两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域用富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头连接。在一个实施方案中，所述肽接头是SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域和所述定位剂锚蛋白重复结构域用SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头相互连接。在一个实施方案中，所述定位剂特异性锚蛋白重复结构域位于所述重组结合蛋白内的所述两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的N-末端。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，并且还包含定位剂分子，其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述重组结合蛋白在PBS中以低于10- 9M或低于10-10M的解离常数(KD)结合人4-1BB，并且其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:5具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:5的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。在一个实施方案中，所述两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域用富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头连接。在一个实施方案中，所述肽接头是SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域和所述定位剂锚蛋白重复结构域用SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头相互连接。在一个实施方案中，所述定位剂特异性锚蛋白重复结构域位于所述重组结合蛋白内的所述两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的N-末端。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含由对4-1BB具有结合特异性的用肽接头连接的两个锚蛋白重复结构域组成的多肽，并且还包含定位剂分子，其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的蛋白质、优选地对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述多肽在PBS中以低于10-9M的解离常数(KD)结合人4-1BB，并且其中所述多肽包含与SEQ ID NO:51具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:51的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:51的所述锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。因此，在一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:51具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:51具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:51具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:51具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽和所述定位剂锚蛋白重复结构域用富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头连接。在一个实施方案中，所述多肽和所述定位剂锚蛋白重复结构域用SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头连接。在一个实施方案中，所述定位剂锚蛋白重复结构域位于所述重组结合蛋白内的所述多肽的N-末端。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含由对4-1BB具有结合特异性的用肽接头连接的两个锚蛋白重复结构域组成的多肽，并且还包含定位剂分子，其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中所述多肽在PBS中以低于10-10M的解离常数(KD)结合人4-1BB，并且其中所述多肽包含与SEQ IDNO:51具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:51的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:51的所述锚蛋白重复结构域中的每个锚蛋白重复结构域的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。因此，在一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:51具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ IDNO:51具有至少93％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:51具有至少95％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽包含与SEQ ID NO:51具有至少98％氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并且在另一个实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述多肽和所述定位剂锚蛋白重复结构域用富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头连接。在一个实施方案中，所述多肽和所述定位剂锚蛋白重复结构域用SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头连接。在一个实施方案中，所述定位剂锚蛋白重复结构域位于所述重组结合蛋白内的所述多肽的N-末端。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，并且还包括定位剂分子，其中所述两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:1、5和31中的任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1、5和31的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，并且还包含定位剂分子，其中所述两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:1、5和31中的任一者具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1、5和31的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中所述定位剂分子是对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。在一个实施方案中，所述两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域用肽接头连接。在一个实施方案中，所述肽接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述肽接头是SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域和对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的所述锚蛋白重复结构域用SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头相互连接。在一个实施方案中，对肿瘤组织中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的所述锚蛋白重复结构域位于所述重组结合蛋白内的所述两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的N-末端。
在一个实施方案中，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，并且还包含定位剂分子，其中所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域中的每一者独立地包含与SEQ ID NO:1具有至少90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ IDNO:1的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。在一个实施方案中，所述两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域用肽接头连接。在一个实施方案中，所述肽接头是富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述肽接头是SEQ ID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头。在一个实施方案中，所述两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域和所述定位剂分子用SEQID NO:57的富含脯氨酸-苏氨酸的肽接头相互连接。在一个实施方案中，所述定位剂分子位于所述重组结合蛋白内的所述两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的N-末端。
在一个实施方案中，本发明的所述4-1BB特异性重组结合蛋白还包含对血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。在一个实施方案中，本发明的所述4-1BB特异性重组结合蛋白还包含对血清白蛋白具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域。在一个实施方案中，本发明的所述4-1BB特异性重组结合蛋白还包含对血清白蛋白具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中对血清白蛋白具有结合特异性的所述两个锚蛋白重复结构域中的一者位于4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的N-末端，并且其中对血清白蛋白具有结合特异性的所述两个锚蛋白重复结构域中的另一者位于4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的C-末端。在一个实施方案中，本发明的所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域并且还包含对血清白蛋白具有结合特异性的两个锚蛋白重复结构域，其中对血清白蛋白具有结合特异性的所述两个锚蛋白重复结构域中的一者位于所述4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的N-末端，并且其中对血清白蛋白具有结合特异性的所述两个锚蛋白重复结构域中的另一者位于所述两个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的C-末端。对血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域能够增加本发明的重组蛋白的体内半衰期。
在一个实施方案中，本发明的所述4-1BB特异性重组结合蛋白还包含多肽标签。多肽标签为附接到多肽/蛋白质的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列可用于纯化、检测或靶向所述多肽/蛋白质，或者其中所述氨基酸序列改善多肽/蛋白质的物理化学行为，或者其中所述氨基酸序列具有效应子功能。结合蛋白的单个多肽标签可直接或经由肽接头连接到结合蛋白的其他部分。多肽标签在本领域中是众所周知的，并且是本领域技术人员完全可用的。多肽标签的示例为小的多肽序列，例如His、HA、myc、FLAG或Strep标签；或多肽，诸如允许检测所述多肽/蛋白质的酶(例如，碱性磷酸酶)或可用于靶向的多肽(诸如，免疫球蛋白或其片段)和/或可用作效应分子的多肽。
在一个实施方案中，本发明的所述4-1BB特异性重组结合蛋白还包含肽接头。肽接头为能够连接例如两个蛋白质结构域、多肽标签和蛋白质结构域、蛋白质结构域和非蛋白质类化合物或聚合物(诸如聚乙二醇)、蛋白质结构域和生物活性分子、蛋白质结构域和定位剂、或两个序列标签的氨基酸序列。肽接头是本领域技术人员已知的。示例的列表在专利申请WO2002/020565的说明书中提供。此类接头的具体示例为可变长度的甘氨酸-丝氨酸接头和脯氨酸-苏氨酸接头。甘氨酸-丝氨酸接头的示例为氨基酸序列GS和SEQ ID NO:40的氨基酸序列，并且脯氨酸-苏氨酸接头的示例为SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:57的氨基酸序列。
在另一方面，本发明涉及编码本发明的锚蛋白重复结构域或重组结合蛋白的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码本发明的重组结合蛋白的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码选自SEQ ID NO:1至38的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码选自SEQ ID NO:1至27的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码选自由以下项组成的组的氨基酸序列的核酸：SEQ ID NO:1、SEQID NO:5、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:54。在一个实施方案中，本发明涉及编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码SEQ ID NO:5的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码SEQ ID NO:31的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码SEQ ID NO:51的氨基酸序列的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及编码SEQ ID NO:54的氨基酸序列的核酸。此外，本发明涉及包含本发明的任何核酸的载体。核酸是本领域技术人员熟知的。在实施例中，使用核酸在大肠杆菌中产生本发明的经设计的锚蛋白重复结构域或重组结合蛋白。本发明的核酸的示例由SEQ ID NO:41提供，其编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在一个方面，本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包含本发明的重组结合蛋白和/或经设计的锚蛋白重复结构域，和/或编码本发明的重组结合蛋白和/或经设计的锚蛋白重复结构域的核酸，以及任选地药学上可接受的载体和/或稀释剂。
在一个实施方案中，本发明涉及包含重组结合蛋白或编码本发明的重组结合蛋白的核酸以及任选地药学上可接受的载体和/或稀释剂的药物组合物。
药学上可接受的载体和/或稀释剂是本领域技术人员已知的，并且将在下文更详细地说明。更进一步，提供了包含上述重组结合蛋白和/或经设计的锚蛋白重复结构域和/或核酸中的一者或多者(特别是本发明的重组结合蛋白和/或核酸)的诊断组合物。
药物组合物包含本文所述的重组结合蛋白和/或经设计的锚蛋白重复结构域和/或核酸，优选地重组结合蛋白和/或核酸，以及药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂，例如如Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.编辑，1980中所述。
本领域技术人员已知的合适载体、赋形剂或稳定剂包括例如盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液、汉克氏溶液、固定油，油酸乙酯、5％右旋糖盐水、增强等渗性和化学稳定性的物质、缓冲液和防腐剂。其它合适载体包括本身不诱导产生对接受组合物的个体有害的抗体的任何载体，诸如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸和氨基酸共聚物。药物组合物还可以是组合制剂，其包含另外的活性剂，诸如抗癌剂或抗血管生成剂，或另外的生物活性化合物。
待用于体内给药的制剂必须是无菌的或经过消毒的。这很容易通过无菌过滤膜过滤实现。
本发明的一个实施方案涉及本发明的重组结合蛋白用于制造药物组合物的用途，所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含对血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，其中与包含所述对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域但不包含所述对血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的对应重组结合蛋白相比，所述重组结合蛋白表现出增加的终末半衰期，优选地至少5％、优选地10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％或250％的增加的终末半衰期。在本发明的一个实施方案中，重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域，并且还包含两个对血清白蛋白具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。
在一个实施方案中，药物组合物包含至少一种如本文所述的重组结合蛋白和洗涤剂诸如非离子洗涤剂、缓冲液诸如磷酸盐缓冲液以及糖诸如蔗糖。在一个实施方案中，此类组合物包含如上所述的重组结合蛋白和PBS。
在另一方面，本发明提供了在哺乳动物的表达4-1BB的细胞或组织中定位活化4-1BB的方法，该方法包括向所述哺乳动物施用本发明的重组结合蛋白的步骤，该重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的阴蛋白重复结构域并且还包含定位剂分子。在一个实施方案中，所述定位剂分子为对不同于4-1BB的靶标具有结合特异性的结合蛋白。在一个实施方案中，所述哺乳动物为人，并且所述表达4-1BB的细胞或组织位于肿瘤中，包括原发性肿瘤、转移和/或肿瘤基质中。
在另一方面，本发明提供了一种治疗医学病症的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用治疗有效量的包含定位剂分子的本发明重组结合蛋白的步骤。在另一方面，本发明提供了一种治疗医学病症的方法，该方法包括向对其有需要的患者施用治疗有效量的包含定位剂分子的本发明重组结合蛋白的步骤，其中所述定位剂分子将所述结合蛋白有效定位到靶组织，并且其中所述结合蛋白的所述定位导致靶组织中表达4-1BB的细胞中4-1BB的活化。在一个实施方案中，所述定位剂分子是对肿瘤中表达的细胞表面蛋白具有结合特异性的结合蛋白，其中所述细胞表面蛋白与4-1BB不同。在一个实施方案中，所述表达4-1BB的细胞或组织位于肿瘤中，包括原发性肿瘤、转移和/或肿瘤基质中。因此，这些实施方案通过将4-1BB的活化通过本发明的重组结合蛋白定位到肿瘤上，从而允许利用定位剂在肿瘤中的限制性表达。
在另一方面，本发明提供了一种诊断患者的医学病症的方法，该方法包括将包含对人4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的本发明重组结合蛋白施用于需要所述诊断的患者或需要所述诊断的患者的体液或组织样品的步骤。在一个实施方案中，所述体液是血浆或其衍生物。在一个实施方案中，所述体液是血清。在一个实施方案中，所述组织是肿瘤组织。在一个实施方案中，所述医学病症是癌症。在另一个实施方案中，所述医学病症是自身免疫疾病。
在一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的药物组合物或重组结合蛋白用于治疗疾病的用途。为此，将根据本发明的药物组合物或重组结合蛋白以治疗有效量施用给对其有需要的患者。给药可包括局部给药、口服给药和肠胃外给药。典型的给药途径是肠胃外给药。在肠胃外给药中，本发明的药物组合物将与上述药学上可接受的赋形剂联合被配制成单位剂量可注射形式，诸如溶液、混悬液或乳液。给药的剂量和模式将取决于待治疗的个体和具体疾病。
此外，考虑将上述药物组合物或重组结合蛋白中的任一种用于治疗障碍。
在一个实施方案中，静脉内施用所述重组结合蛋白或本文所述的其它此类药物组合物。对于肠胃外应用，重组结合蛋白或所述药物组合物可以治疗有效量快速推注或通过缓慢输注来注射。
在一个实施方案中，本发明涉及治疗医学病症的方法，该方法包括向需要这种治疗的患者施用治疗有效量的本发明的重组结合蛋白的步骤。在一个实施方案中，本发明涉及治疗医学病症的方法，该方法包括向需要这种治疗的患者施用治疗有效量的本发明的药物组合物的步骤。在一个实施方案中，本发明涉及本发明的药物组合物用于治疗疾病的用途。在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗疾病的药物组合物。在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗医学病症的药物组合物。在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗疾病的核酸。在一个实施方案中，本发明涉及所述药物组合物、重组结合蛋白或核酸分子作为治疗疾病的药物的用途。在一个实施方案中，本发明涉及所述药物组合物、重组结合蛋白或核酸分子用于制备药物的用途。在一个实施方案中，本发明涉及所述药物组合物、重组结合蛋白或核酸分子用于制造用于治疗疾病的药物的用途。在一个实施方案中，本发明涉及用于制造用于治疗疾病的药物的方法，其中所述药物组合物、重组结合蛋白或核酸分子为药物的活性成分。在一个实施方案中，本发明涉及使用所述药物组合物、重组结合蛋白或核酸分子治疗疾病的方法。
具体地，本发明涉及使用本发明的药物组合物治疗医学病症，其中所述医学病症是癌症。
本发明的重组结合蛋白或所述药物组合物用于治疗癌症疾病的用途也可与本领域已知的一种或多种其他疗法结合。如本文所用，术语“与……结合使用”是指在给定方案下进行的共同施用。这包括不同化合物的同步给药以及不同化合物的错时给药(例如，化合物A给药一次，之后化合物B给药多次，反之亦然，或者两种化合物同步给药并且其中一种化合物在后续阶段中也给药)。
在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的重组结合蛋白用于制造药物的用途，所述药物用于治疗医学病症、优选地肿瘤性疾病、更优选地癌症。
在一个实施方案中，本发明涉及本发明的药物组合物用于制造药物的用途，所述药物用于治疗可能是肿瘤性疾病、特别是癌症的医学病症。
在一个实施方案中，本发明涉及包含上述锚蛋白重复结构域中的任一者的重组结合蛋白。
在一个实施方案中，本发明涉及包含所述重组结合蛋白的试剂盒。在一个实施方案中，本发明涉及包含编码所述重组结合蛋白的核酸的试剂盒。在一个实施方案中，本发明涉及包含所述药物组合物的试剂盒。在一个实施方案中，本发明涉及包括所述重组结合蛋白和/或编码所述重组结合蛋白的核酸和/或所述药物组合物的试剂盒。在一个实施方案中，本发明涉及试剂盒，该试剂盒包括：包含4-1BB特异性锚蛋白重复结构域(例如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:5)的重组结合蛋白，和/或编码包含4-1BB特异性锚蛋白重复结构域(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5)的重组结合蛋白的核酸，和/或包含包含4-1BB特异性锚蛋白重复结构域(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5)的重组结合蛋白和/或编码包含4-1BB特异性锚蛋白重复结构域(例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5)的重组结合蛋白的核酸的药物组合物。
在一个实施方案中，本发明涉及用于产生本发明的重组结合蛋白的方法。在一个实施方案中，本发明涉及用于产生重组结合蛋白例如包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列的重组结合蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(i)在细菌中表达所述重组结合蛋白，以及(ii)使用色谱法纯化所述重组结合蛋白。所述方法可包括附加步骤。此类产生本发明的重组结合蛋白的方法描述于实施例1中。
本发明不限于实施例中描述的具体实施方案。
本说明书涉及本说明书中命名为“P5725_Sequence_Listing.txt”的氨基酸序列表的多个氨基酸序列，并且该序列表的氨基酸序列以引用方式并入本文。
定义
除非本文另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语应具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。
在本发明的上下文中，术语“蛋白质”是指包含多肽的分子，其中多肽的至少一部分通过在单个多肽链内和/或多个多肽链之间形成二级、三级和/或四级结构而具有或能够获得限定的三维排列。如果蛋白质包含两个或更多个多肽链，则各个多肽链可非共价连接或共价连接，例如通过两个多肽之间的二硫键连接。通过形成二级和/或三级结构而单独具有或能够获得限定的三维排列的蛋白质部分被称为“蛋白质结构域”。这种蛋白质结构域是本领域技术人员熟知的。
在重组蛋白、重组多肽等中使用的术语“重组”是指所述蛋白质或多肽是通过使用本领域技术人员熟知的重组DNA技术产生的。例如，可将编码多肽的重组DNA分子(例如，通过基因合成产生)克隆到细菌表达质粒(例如，pQE30，QIAgen公司)、酵母表达质粒、哺乳动物表达质粒或植物表达质粒，或者能够体外表达的DNA中。如果例如将此类重组细菌表达质粒插入适当的细菌(例如，大肠杆菌(Escherichia coli))中，则这些细菌可产生由该重组DNA编码的多肽。对应产生的多肽或蛋白质被称为重组多肽或重组蛋白。
在本发明的上下文中，术语“结合蛋白”是指包含结合结构域的蛋白质。结合蛋白还可包含两个、三个、四个、五个或更多个结合结构域。优选地，所述结合蛋白是重组结合蛋白。本发明的结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。
此外，任何此类结合蛋白可包含附加多肽(诸如例如多肽标签、肽接头、与其他具有结合特异性的蛋白质结构域的融合、细胞因子、激素、或拮抗剂)、或本领域技术人员熟知的化学修饰(诸如偶联到聚乙二醇、毒素(例如，来自免疫原的DM1)、小分子、抗生素等)。本发明的结合蛋白可包含定位剂分子。
术语“结合结构域”意指对靶标表现出结合特异性的蛋白质结构域。优选地，所述结合结构域是重组结合结构域。
术语“靶标”是指单个分子，诸如核酸分子、多肽或蛋白质、碳水化合物或任何其他天然存在的分子，包括此类单个分子的任何部分，或者两种或更多种此类分子的复合物，或整个细胞或组织样品，或任何非天然化合物。优选地，靶标是天然存在的或非天然的多肽或蛋白质，或含有化学修饰(例如天然或非天然的磷酸化、乙酰化或甲基化)的多肽或蛋白质。在本发明的上下文中，4-1BB以及表达4-1BB的细胞和组织是4-1BB特异性结合蛋白的靶标，并且定位剂靶蛋白和细胞和组织是定位剂的靶标。
在本发明的上下文中，术语“多肽”涉及由多个(即两个或更多个)经由肽键连接的氨基酸的链组成的分子。优选地，多肽由八个以上经由肽键连接的氨基酸组成。术语“多肽”还包括通过半胱氨酸的S-S桥连接在一起的氨基酸的多个链。多肽是本领域技术人员熟知的。
专利申请WO2002/020565和Forrer等人，2003(Forrer,P.,Stumpp,M.T.,Binz,H.K.,Plückthun,A.,2003.FEBS Letters 539,2-6)包含重复蛋白特征和重复结构域特征、技术和应用的一般描述。术语“重复蛋白”是指包含一个或多个重复结构域的蛋白质。优选地，重复蛋白包含一个、两个、三个、四个、五个或六个重复结构域。此外，所述重复蛋白可包含附加的非重复蛋白质结构域、多肽标签和/或肽接头。重复结构域可以是结合结构域。
术语“重复结构域”是指包含两个或更多个连续重复模块作为结构单元的蛋白质结构域，其中所述重复模块具有结构和序列同源性。优选地，重复结构域还包含N-末端和/或C-末端封端模块。为了清楚起见，封端模块可以是重复模块。这种重复结构域、重复模块和封端模块、序列基序以及结构同源性和序列同源性是本领域技术人员根据以下各项的示例所熟知的：锚蛋白重复结构域(WO2002/020565)、富含亮氨酸的重复结构域(WO2002/020565)、三十四肽重复结构域(Main,E.R.,Xiong,Y.,Cocco,M.J.,D'Andrea,L.,Regan,L.,Structure 11(5),497-508,2003)和犰狳重复结构域(WO2009/040338)。本领域技术人员还熟知，此类重复结构域不同于包含重复氨基酸序列的蛋白质，其中每个重复氨基酸序列能够形成单个结构域(例如纤连蛋白的FN3结构域)。
如在经设计的重复蛋白、经设计的重复结构域等中所用，术语“经设计的”是指此类重复蛋白和重复结构域分别是人造的并且在自然界中不存在的性质。本发明的结合蛋白是经设计的重复蛋白，并且它们包含至少一个经设计的锚蛋白重复结构域。
术语“靶标相互作用残基”是指有助于与靶标直接相互作用的重复模块的氨基酸残基。
术语“框架残基”是指重复模块的氨基酸残基，其有助于折叠拓扑结构，即有助于所述重复模块的折叠或有助于与相邻模块的相互作用。此类贡献可为与重复模块中其他残基的相互作用，或是对如α-螺旋或β-片层中存在的多肽主链构象的影响，或是参与形成直链多肽或环的氨基酸延伸。
此类框架和靶标相互作用残基可通过分析由物理化学方法(诸如X射线晶体学、NMR和/或CD光谱)获得的结构数据，或通过与结构生物学和/或生物信息学领域从业者熟知的已知和相关结构信息进行比较来鉴定。
术语“重复模块”是指经设计的重复结构域的重复氨基酸序列和结构单元，其最初来源于天然存在的重复蛋白的重复单元。包含在重复结构域中的每个重复模块来源于天然存在的重复蛋白家族或亚家族(例如锚蛋白重复蛋白家族)的一个或多个重复单元。此外，重复结构域中包含的每个重复模块可包含从同源重复模块导出的“重复序列基序”，该同源重复模块从靶标上选择的重复结构域获得，例如如实施例1中所述，并且具有相同的靶标特异性。
因此，术语“锚蛋白重复模块”是指最初来源于天然存在的锚蛋白重复蛋白的重复单元的重复模块。锚蛋白重复蛋白是本领域技术人员熟知的。
重复模块可包含具有为了选择靶标特异性重复结构域而在文库中未被随机化的氨基酸残基的位置(“非随机化位置”)和具有为了选择靶标特异性重复结构域而在文库中已被随机化的氨基酸残基的位置(“随机化位置”)。非随机化位置包含框架残基。随机化位置包含靶标相互作用残基。“已被随机化”意指在重复模块的氨基酸位置处允许两个或更多个氨基酸，例如，其中允许通常二十种天然存在的氨基酸中的任一种，或者其中允许二十种天然存在的氨基酸中的大多数，诸如除半胱氨酸之外的氨基酸，或除甘氨酸、半胱氨酸和脯氨酸之外的氨基酸。出于本专利申请的目的，SEQ ID NO:58至66和68至71的氨基酸残基3、4、6、14和15以及SEQ ID NO:67的氨基酸残基3、5、7、15和16为本发明的锚蛋白重复模块的随机位置。
术语“重复序列基序”是指从一个或多个重复模块导出的氨基酸序列。优选地，所述重复模块来自对相同靶标具有结合特异性的重复结构域。此类重复序列基序包含框架残基位置和靶标相互作用残基位置。所述框架残基位置对应于重复模块的框架残基位置。同样，所述靶标相互作用残基位置对应于重复模块的靶标相互作用残基的位置。重复序列基序包含非随机化位置和随机化位置。
术语“重复单元”是指包含一种或多种天然存在的蛋白质的序列基序的氨基酸序列，其中所述“重复单元”存在于多个拷贝中，并且表现出确定蛋白质折叠的所有所述基序共有的限定的折叠拓扑结构。此类重复单元的示例包括富含亮氨酸的重复单元、锚蛋白重复单元、犰狳重复单元、三十四肽重复单元、HEAT重复单元和富含亮氨酸的变体重复单元。
术语“对靶标具有结合特异性”、“特异性结合到靶标”、“高特异性结合到靶标”、“特异于靶标”或“靶标特异性”等是指，在PBS中结合蛋白或结合结构域以比其结合到不相关的蛋白质(诸如，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(MBP))更低的离解常数(即，其以更高的亲和性结合)结合到靶标。优选地，在PBS中对靶标的解离常数(“KD”)为至少102；更优选地，至少103；更优选地，至少104；或更优选地，比对MBP的对应解离常数低至少105倍。确定蛋白质-蛋白质相互作用的解离常数的方法，诸如基于表面等离子共振(SPR)的技术(例如，SPR均衡分析)或等温滴定量热法(ITC)是本领域技术人员熟知的。如果在不同条件(例如，盐浓度、pH)下进行测量，则具体蛋白质-蛋白质相互作用的测量KD值可以是变化的。因此，优选地利用标准化蛋白质溶液和标准化缓冲液(诸如，PBS)来进行KD值的测量。通过表面等离子体共振(SPR)分析对4-1BB具有结合特异性的本发明重组结合蛋白的解离常数(KD)的典型且优选的确定描述于实施例2中。
术语“约”意指所提及的值+/-20％；例如，“约50”应意指40至60。
术语“PBS”意指含有137mM NaCl、10mM磷酸盐和2.7mM KCl并且pH为7.4的磷酸盐缓冲水溶液。
术语“小鼠血清白蛋白”是指UniProt登录号P07724，术语“食蟹猴血清白蛋白”(即食蟹称猴)是指UniProt登录号A2V9Z4，并且术语“人血清白蛋白”是指UniProt登录号P02768。
优选地，在哺乳动物、更优选小鼠和/或食蟹猴、更优选食蟹猴中评估清除率和/或暴露率和/或终末半衰期。优选地，当在小鼠中测量清除率/或暴露率和/或终末半衰期时，考虑注射后至多48小时的数据来进行评估。更优选地，在小鼠中评估终末半衰期时，用从24小时至48小时的数据进行计算。优选地，当在食蟹猴中测量清除率和/或暴露率和/或终末半衰期时，考虑注射后至多第7天的数据进行评估。更优选地，在食蟹猴中评估终末半衰期时，用从第1天至第5天的数据进行计算。本领域的技术人员还能够识别诸如靶标介导的清除等效应，并且在计算终末半衰期时考虑它们。药物(诸如，本发明的重组结合蛋白)的术语“终末半衰期”是指达到伪平衡后药物血浆浓度达到施加于哺乳动物的该药物浓度的一半所需的时间(例如，在小鼠中用从24小时至48小时的数据进行计算，或者在食蟹猴中用从第1天至第5天的数据进行计算)。并未将终末半衰期定义为施用给哺乳动物的药物剂量消除一半所需的时间。术语“终末半衰期”是本领域技术人员熟知的。优选地，药代动力学比较以任何剂量、更优选地以当量剂量(即相同的mg/kg剂量)或等摩尔剂量(即相同的mol/kg剂量)、更优选地以等摩尔剂量(即相同的mol/kg剂量)进行。本领域技术人员应当理解，动物中当量和/或等摩尔给药的实验剂量变化为至少20％，更优选地为30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。优选地，用于药代动力学测量的剂量选自0.001mg/kg至1000mg/kg、更优选地选自0.01mg/kg至100mg/kg、更优选地选自0.1mg/kg至50mg/kg、更优选地选自0.5mg/kg至10mg/kg。
术语“4-1BB”和“4-1BB受体”在本申请中可互换使用，并且是指4-1BB受体的任何形式，以及保留4-1BB受体活性的至少一部分的变体、同种型和其物种同源物。因此，如本文所定义和公开的结合蛋白也可结合来自除人以外的物种的4-1BB。在其它情况下，结合蛋白可完全特异于人4-1BB，并且可不表现出物种或其它类型的交叉反应性。除非另有说明，否则如通过具体参考人4-1BB，4-1BB包括天然序列4-1BB的所有哺乳动物种类，例如人、犬、猫、马和牛。人4-1BB的氨基酸序列在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)参考序列NP_001552和SEQ ID NO:76中示出。食蟹猴和小鼠4-1BB的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:77和78中提供。4-1BB包含信号序列，随后是胞外结构域、跨膜区和胞内结构域(Cheuk ATC等人2004CancerGene Therapy11:215-226)。该受体被认为在结合到其三聚配体(4-1BBL)时经历受体三聚反应以刺激免疫应答(Bitra A等人，J.Biol.Chem.2018,293(4):1317-1329；Chin等人，Nature Communications(2018)9:4679)。4-1BB的另选名称或同义词包括CD137和TNFRSF9。人、食蟹猴和小鼠4-1BB的胞外结构域的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:79、80和81中示出。人4-1BBL的氨基酸序列在NCBI参考序列NP_003802.1中示出。
如本文所用，“4-1BB激动剂”意指如下的任何化学化合物或生物分子：它们在与4-1BB结合时，(1)刺激或活化4-1BB，(2)增强、增加、促进、诱导或延长4-1BB的活性、功能或存在，或(3)增强、增加、促进或诱导4-1BB的表达。在其中治疗人个体的本发明的治疗方法、药物、药物组合物和用途的任一种中，4-1BB激动剂增加4-1BB介导的反应。在本发明的治疗方法、药物、药物组合物和用途的一些实施方案中，4-1BB激动剂显著增强细胞毒性T细胞应答，从而在各种模型中产生抗肿瘤活性。
在本发明的4-1BB特异性结合蛋白所包含的“定位剂分子”或“定位剂”的上下文中，本文中可互换使用的术语“定位”或“递送”是指与结合蛋白不包含定位剂时相比，包含定位剂的此类4-1BB特异性结合蛋白对哺乳动物中定位剂靶细胞或组织的定位增加。该术语还指将4-1BB特异性结合蛋白靶向哺乳动物中定位剂靶细胞或组织的位点，其中该4-1BB特异性结合蛋白包含定位剂。该术语优选地还涵盖包含定位剂的4-1BB特异性结合蛋白在哺乳动物中定位剂靶细胞或组织的位点处的积累和/或保留。该术语还优选地涵盖由包含定位剂的本发明的4-1BB特异性结合蛋白在哺乳动物中定位剂靶细胞或组织的位点处或附近诱导的表达4-1BB的细胞中4-1BB的定位活化。此类定位活化可例如通过在包含定位剂的4-1BB特异性结合蛋白结合时4-1BB的聚集而发生，其中该聚集是通过定位剂与其靶细胞或组织的结合介导的。如本段中所用，“哺乳动物”涵盖人。“定位”的结果可通过本领域技术人员熟知的各种手段来测量。例如，“定位”可通过根据本领域熟知的方法确定与定位剂连接的本发明的结合蛋白的器官-血液比率来测量。在本发明的一个实施方案中，定位剂对“定位”包含定位剂的4-1BB特异性结合蛋白的作用通过与对应的不包含定位剂的4-1BB特异性结合蛋白相比器官-血液比率增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％或300％来表现。
术语“定位剂分子”和“定位剂”在本文中可互换使用并且旨在涵盖可由本发明的4-1BB特异性结合蛋白包含并且能够将包含其的本发明的此类4-1BB特异性结合蛋白定位或递送至哺乳动物(包括例如人)的靶细胞或组织的任何分子，其中该定位剂结合靶细胞或组织。定位剂可与本发明的4-1BB特异性锚蛋白重复结构域连接、缀合、融合或以其它方式物理附接。术语“定位剂分子”和“定位剂”涵盖具有这些特性的多核苷酸、肽/多肽和/或化学或生物化学剂。术语“多核苷酸”通常是指DNA或RNA，并且包括DNA或RNA的经修饰和人工形式。术语“肽”是指4至600个氨基酸长(例如4至200个氨基酸长)的肽链，并且因此涵盖多肽和蛋白质。该术语涵盖任何天然存在的或人造的结合蛋白、结合结构域、生长因子受体或其片段或配体、细胞因子、多肽激素、抗体、基于支架的抗体样蛋白、免疫调节蛋白等。此外，术语“肽”还涵盖通过例如糖基化修饰的肽，以及包含两条或更多条多肽链的蛋白质，每条多肽链的长度为4至600个氨基酸长，通过例如二硫键交联，诸如例如胰岛素和免疫球蛋白。术语“化学或生物化学剂”旨在包括可施用于接受者的任何天然存在的或合成的化合物。在优选的实施方案中，定位剂是靶特异性锚蛋白重复结构域。
如本文所用，术语“表达4-1BB的细胞”是指在细胞表面上表达4-1BB的任何细胞，包括但不限于T细胞，诸如CD8+T细胞、调节性T细胞(Treg)和NK T细胞(NKT)、嗜中性粒细胞、粒细胞、单核细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、树突细胞(DC)、自然杀伤(NK)细胞、B淋巴细胞和白细胞，以及非造血来源的细胞诸如内皮细胞和平滑肌细胞。
术语“医学病症”(或障碍或疾病)包括自身免疫障碍、炎性障碍、视网膜病变(特别是增殖性视网膜病变)、神经退行性障碍、感染、代谢疾病和肿瘤性疾病。本文所述的重组结合蛋白中的任一种可用于制备用于治疗此类障碍、特别是选自由以下项组成的组的障碍的药物：自身免疫障碍、炎性障碍、免疫障碍和肿瘤性疾病。“医学病症”可能是以不适当的细胞增殖为特征的病症。医学病症可能是过度增生病症。本发明具体涉及治疗医学病症的方法，该方法包括向需要这种治疗的患者施用治疗有效量的本发明的重组结合蛋白或所述药物组合物的步骤。在一个优选的实施方案中，所述医学病症是肿瘤性疾病。如本文所用，术语“肿瘤性疾病”是指以细胞生长或肿瘤快速增殖为特征的细胞或组织的异常状态或病症。在一个实施方案中，所述医学病症是恶性肿瘤性疾病。在一个实施方案中，所述医学病症是癌症。术语“治疗有效量”是指足以对患者产生期望效应的量。
术语“抗体”不仅意指完整的抗体分子，而且意指保留免疫原结合能力的抗体分子的任何片段和变体。此类片段和变体也是本领域熟知的，并且经常在体外和体内使用。因此，术语“抗体”涵盖完整免疫球蛋白分子、抗体片段(诸如Fab、Fab'、F(ab')2和单链V区片段(scFv))、双特异性抗体、嵌合抗体、抗体融合多肽和非常规抗体。
术语“癌症”和“癌性”在本文中用来指或描述哺乳动物中通常以未受调控的细胞生长为特征的生理状况。癌症涵盖实体瘤和液体瘤，以及原发性肿瘤和转移。“肿瘤”包含一个或多个癌细胞。实体瘤通常还包含肿瘤基质。癌症的示例包括但不限于原发性和转移性癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病，以及任何其他上皮和淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体示例包括脑癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、透明细胞肾癌、头/颈鳞状细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、恶性黑素瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、小细胞肺癌(SCLC)、三阴性乳腺癌、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓性白血病(CML)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤(MM)、骨髓增生异常综合征(MDS)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、头颈鳞状细胞癌(SCCHN)、慢性髓性白血病(CML)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、恶性间皮瘤、结直肠癌或胃癌。
实施例
下文公开的起始材料和试剂是本领域技术人员已知的，是可商购获得的和/或可使用熟知的技术制备。
材料
化学品购自Sigma-Aldrich(USA)。寡核苷酸得自Microsynth(Switzerland)。除非另有说明，否则DNA聚合酶、限制酶和缓冲液得自New England Biolabs(USA)或Fermentas/Thermo Fisher Scientific(USA)。诱导型大肠杆菌表达菌株用于克隆和蛋白质生产，例如大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene，USA)或BL21(Novagen，USA)。人4-1BB的胞外结构域的重组Fc融合蛋白(生物素酰化或非生物素酰化)购自BPS Bioscience。食蟹猴4-1BB的胞外结构域的重组Fc融合蛋白购自Evitria AG。
分子生物学
除非另有说明，否则根据已知方案执行方法(参见例如Sambrook J.、FritschE.F.和Maniatis T.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory 1989,New York)。
经设计的锚蛋白重复蛋白文库
生成经设计的锚蛋白重复蛋白文库的方法已描述于例如美国专利7,417,130；Binz等人2003，同前；Binz等人2004，同前。通过此类方法，可构建具有随机化锚蛋白重复模块和/或随机化封端模块的经设计的锚蛋白重复蛋白文库。例如，此类文库可因此基于固定的N-末端封端模块(例如SEQ ID NO:44、45或46的N-末端封端模块)或根据SEQ ID NO:47的随机化N-末端封端模块、根据SEQ ID NO:48、49或50的序列基序的一个或多个随机化重复模块以及固定的C-末端封端模块(例如SEQ ID NO:72、73或74的C-末端封端模块)或根据SEQ ID NO:75的随机化C-末端封端模块进行组装。优选地，此类文库被组装成在重复或封端模块的随机化位置处不具有氨基酸C、G、M、N(在G残基前面)和P中的任一者。此外，根据SEQ ID NO:48、49或50的序列基序的随机化重复模块可在位置10和/或位置17处进一步随机化；根据SEQ ID NO:47的序列基序的随机化N-末端封端模块可在位置7和/或位置9处进一步随机化；并且根据SEQ ID NO:75的序列基序的随机化C-末端封端模块可在位置10、11和/或17处进一步随机化。
此外，此类文库中的此类随机化模块可包含具有随机化氨基酸位置的附加的多肽环插入。此类多肽环插入的示例是抗体的互补决定区(CDR)环文库或从头生成的肽文库。例如，可使用人核糖核酸酶L的N-末端锚蛋白重复结构域的结构(anaka,N.,Nakanishi,M,Kusakabe,Y,Goto,Y.,Kitade,Y,Nakamura,K.T.,EMBO J.23(30),3929-3938,2004)作为指导来设计此类环插入。类似于其中将十个氨基酸插入在靠近两个锚蛋白重复的边界存在的β-转角中的这种锚蛋白重复结构域，锚蛋白重复蛋白文库可包含插入在锚蛋白重复结构域的一个或多个β-转角中的可变长度(例如，1至20个氨基酸)的随机化环(具有固定位置和随机化位置)。
锚蛋白重复蛋白文库的任何此类N-末端封端模块优选地具有RILLAA、RILLKA或RELLKA基序(例如，存在于SEQ ID NO:1中的位置21至26)，并且锚蛋白重复蛋白文库的任何此类C-末端封端模块优选地具有KLN、KLA或KAA基序(例如，存在于SEQ ID NO:1中的最后三个氨基酸处)。
此类锚蛋白重复蛋白文库的设计可由与靶标相互作用的锚蛋白重复结构域的已知结构来指导。由其蛋白质数据库(PDB)唯一登录号或识别码(PDB-ID)识别的此类结构的示例为1WDY、3V31、3V30、3V2X、3V2O、3UXG、3TWQ-3TWX、1N11、1S70和2ZGD。
已描述了经设计的锚蛋白重复蛋白文库(诸如N2C和N3C设计的锚蛋白重复蛋白文库)的示例(美国专利7,417,130；Binz等人，2003，同前；Binz等人，2004，同前)。N2C和N3C中的数字描述了存在于N-末端和C-末端封端模块之间的随机化重复模块的数量。
用于定义重复单元和模块内部的位置的命名法基于Binz等人2004，同前，其中具有锚蛋白重复模块和锚蛋白重复单元的边界移位一个氨基酸位置的修饰。例如，Binz等人2004(同前)的锚蛋白重复模块的位置1对应于本公开的锚蛋白重复模块的位置2，并且因此Binz等人2004(同前)的锚蛋白重复模块的位置33对应于本公开的以下锚蛋白重复模块的位置1。
通过测序确认所有DNA序列，并且通过质谱法确认所选择的蛋白质的计算分子量。
实施例1：包含对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的结合蛋白的选择
使用核糖体展示(Hanes,J.和Plückthun,A.,PNAS 94,4937-42,1997)，如Binz等人2004(同前)所述的相似地从
Figure BDA0003495129560000611
文库中选择许多对人4-1BB(h4-1BB)具有结合特异性的锚蛋白重复蛋白。通过粗提取物均相时间分辨荧光(HTRF)评估所选择的克隆体对重组人4-1BB靶标的结合，表明成功选择了数百种h4-1BB特异性结合蛋白。例如，SEQ ID NO:1至27的锚蛋白重复结构域构成所选择的结合蛋白的氨基酸序列，该结合蛋白包含对h4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域。来自此类对h4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域的单独锚蛋白重复模块在例如SEQ ID NO:58至71中提供。
通过核糖体展示选择4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白
h4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白的选择使用人4-1BB(SEQ ID NO:79)(单独或与h4-1BBL的复合物)的胞外结构域作为靶蛋白、如上所述的锚蛋白重复蛋白文库和已建立的方案(参见，例如Zahnd,C.、Amstutz,P.和Plückthun,A.，Nat.Methods 4,69-79,2007)，通过核糖体展示(Hanes和Plückthun，同前)进行。每轮选择后，逆转录(RT)-PCR循环数不断从45减少至28，从而由于结合物的富集而调整收率。前四轮选择采用标准核糖体展示选择，使用降低目标浓度和增加洗涤严格性来增加从第1轮到第4轮的选择压力(Binz等人2004，同前)。对于一些库，在所有核糖体展示选择轮的洗涤步骤期间使用低盐浓度。为了富集高亲和力4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白，使来自第四轮标准核糖体展示选择(上文)的输出经受选择严格性增加的解离率选择轮(Zahnd，2007，同前)。在解离率选择轮后进行最后一轮标准选择，以扩增和回收解离率选择的结合蛋白。在这最后两轮选择中，RT-PCR循环的数量保持恒定在30。
如粗提取物HTRF所示所选择的克隆特异性结合4-1BB
使用标准方案，使用表达锚蛋白重复蛋白的大肠杆菌细胞的粗提取物，通过均相时间分辨荧光(HTRF)测定来鉴定溶液中特异性结合4-1BB的单独选择的锚蛋白重复蛋白。将通过核糖体展示选择的锚蛋白重复蛋白克隆到pQE30(Qiagen)表达载体(pMPAG06、pMPAS242或pMPAS245)的衍生物中，将其转化到大肠杆菌XL1-Blue(Stratagene)中，将其铺板在LB-琼脂(含有1％葡萄糖和50μg/ml氨苄青霉素)上，然后在37℃处温育过夜。载体pMPAS242或pMPAS245用于置换N-末端和C-末端封端重复。将单个菌落挑取到含有160μl生长培养基(含有1％葡萄糖和50μg/ml氨苄青霉素的TB)的96孔板中(每个克隆在单个孔中)，并以800rpm振荡在37℃处温育过夜。将含50μg/ml氨苄青霉素的150μl新鲜TB培养基与8.5μl过夜培养物一起接种于新鲜的96深孔板中。在37℃和850rpm处温育120分钟后，用IPTG(0.5mM最终浓度)诱导表达并持续4小时。收获细胞，并将沉淀物在-20℃处冷冻过夜，然后重悬于8.5μl B-PERII(Thermo Scientific)中，并在室温处振荡(600rpm)温育一小时。然后，添加160μl PBS，并通过离心(3220g持续15min)去除细胞碎片。
将每个裂解克隆的提取物作为PBSTB(补充有0.1％Tween
Figure BDA0003495129560000631
和0.2％(w/v)BSA的PBS，pH7.4)中的1:2000稀释液(最终浓度)与2nM(最终浓度)生物素酰化人4-1BB、1:400(最终浓度)的抗6His-D2 HTRF抗体-FRET受体缀合物(Cisbio)和1:400(最终浓度)的抗strep-Tb抗体FRET供体缀合物(Cisbio)一起施加到384孔板的孔中，并在RT处温育75分钟。使用340nm激发波长和665±10nm发射滤光器在Tecan M1000上读出HTRF。通过此类粗细胞提取物HTRF筛选数百个克隆，发现了对人4-1BB有特异性的数百个不同锚蛋白重复结构域。特异性结合人4-1BB的所选择的锚蛋白重复结构域的氨基酸序列的示例在SEQ ID NO:1至27中提供。
将这些对人4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复结构域和对人4-1BB不具有结合特异性的阴性对照锚蛋白重复结构域(SEQ ID NO:42)克隆到基于pQE(QIAgen，Germany)的表达载体中，从而提供N-末端His标签(SEQ ID NO:43)以有利于如下所述的简单蛋白质纯化。例如，构建编码以下锚蛋白重复蛋白的表达载体：
Figure BDA0003495129560000632
蛋白质#1(SEQ ID NO:1，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ ID NO:43))；
Figure BDA0003495129560000633
蛋白质#2(SEQ ID NO:2，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ ID NO:43))；
Figure BDA0003495129560000634
蛋白质#3(SEQ ID NO:3，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ ID NO:43))；
Figure BDA0003495129560000635
蛋白质#4(SEQ ID NO:4，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ ID NO:43))；
Figure BDA0003495129560000636
蛋白质#5(SEQ ID NO:5，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ ID NO:43))；
Figure BDA0003495129560000637
蛋白质#6(SEQ ID NO:6，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ ID NO:43))；
Figure BDA0003495129560000641
蛋白质#7(SEQ ID NO:7，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ ID NO:43))；
Figure BDA0003495129560000642
蛋白质#8(SEQ ID NO:8，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ ID NO:43))；
Figure BDA0003495129560000643
蛋白质#9(SEQ ID NO:9，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ ID NO:43))；
Figure BDA0003495129560000644
蛋白质#10(SEQ ID NO:10，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA0003495129560000645
蛋白质#11(SEQ ID NO:11，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA0003495129560000646
蛋白质#12(SEQ ID NO:12，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA0003495129560000647
蛋白质#13(SEQ ID NO:13，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA0003495129560000648
蛋白质#14(SEQ ID NO:14，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA0003495129560000649
蛋白质#15(SEQ ID NO:15，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA00034951295600006410
蛋白质#16(SEQ ID NO:16，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA00034951295600006411
蛋白质#17(SEQ ID NO:17，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA00034951295600006412
蛋白质#18(SEQ ID NO:18，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA00034951295600006413
蛋白质#19(SEQ ID NO:19，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA00034951295600006414
蛋白质#20(SEQ ID NO:20，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA00034951295600006415
蛋白质#21(SEQ ID NO:21，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA00034951295600006416
蛋白质#22(SEQ ID NO:22，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA0003495129560000651
蛋白质#23(SEQ ID NO:23，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA0003495129560000652
蛋白质#24(SEQ ID NO:24，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA0003495129560000653
蛋白质#25(SEQ ID NO:25，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA0003495129560000654
蛋白质#26(SEQ ID NO:26，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；和
Figure BDA0003495129560000655
蛋白质#27(SEQ ID NO:27，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))。
对h4-1BB具有结合特异性的附加的锚蛋白重复蛋白的工程化
此外，构建编码特异性结合人4-1BB的以下锚蛋白重复蛋白的基于pQE的表达载体：
Figure BDA0003495129560000656
蛋白质#28(SEQ ID NO:28，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA0003495129560000657
蛋白质#29(SEQ ID NO:29，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA0003495129560000658
蛋白质#30(SEQ ID NO:30，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA0003495129560000659
蛋白质#31(SEQ ID NO:31，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA00034951295600006510
蛋白质#32(SEQ ID NO:32，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))。
Figure BDA00034951295600006511
蛋白质#33(SEQ ID NO:33，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA00034951295600006512
蛋白质#34(SEQ ID NO:34，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA00034951295600006513
蛋白质#35(SEQ ID NO:35，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))。
Figure BDA00034951295600006514
蛋白质#36(SEQ ID NO:36，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；
Figure BDA0003495129560000661
蛋白质#37(SEQ ID NO:37，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))；和
Figure BDA0003495129560000662
蛋白质#38(SEQ ID NO:38，其具有融合到其N末端的His标签(SEQ IDNO:43))。
SEQ ID NO:28至38基于SEQ ID NO:1的序列进行工程化。在SEQ ID NO:28至38中，通过将N-末端封端模块中的RELLKA基序(位置21至26)置换为RILLKA或RILLAA、通过将C-末端封端模块中的缬氨酸(位置116)置换为谷氨酸和/或通过将C-末端封端模块中的KAA基序(位置124至126)置换为KLN来修饰SEQ ID NO:1的序列。单独的或组合的这些修饰均不导致SEQ ID NO:28至38与SEQ ID NO:1相比显著改变的结构或功能特性。
4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白的高水平和可溶性表达
为了进一步分析，在大肠杆菌细胞中表达如上所述的在粗细胞提取物HTRF中显示特异性4-1BB结合的所选择的克隆，并根据标准方案使用其His标签进行纯化。25ml静止过夜培养物(TB，1％葡萄糖，50mg/l氨苄青霉素；37℃)用于接种500ml培养物(TB，50mg/l氨苄青霉素，37℃)。在600nm处1.0至1.5的吸光度下，用0.5mM IPTG诱导培养物并在37℃处温育4-5小时，同时振荡。将培养物离心，并将所得沉淀重悬于25ml TBS500(50mM Tris–HCl，500mM NaCl，pH8)中并裂解(超声处理或弗氏压碎器)。裂解后，将样品与50KU DNase/ml混合，温育15分钟，然后在62.5℃处热处理30分钟，离心并收集上清液并过滤。向匀浆中添加Triton X100(1％(v/v)最终浓度)和咪唑(20mM最终浓度)。根据本领域技术人员已知的标准方案和树脂，将蛋白质在镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱上进行纯化，随后在
Figure BDA0003495129560000663
系统上进行尺寸排阻色谱法。另选地，所选择的不含His标签的锚蛋白重复结构域通过在大肠杆菌中高细胞密度发酵产生并根据本领域技术人员已知的标准树脂和方案通过一系列色谱法和超滤/渗滤步骤纯化。从大肠杆菌培养物(每升培养物至多200mg锚蛋白重复蛋白)中纯化对4-1BB具有结合特异性的高度可溶性锚蛋白重复蛋白，如从4％-12％SDS-PAGE估计的纯度>95％。此类SDS-PAGE分析的代表性示例示于图1中。
实施例2：通过表面等离子体共振(SPR)分析确定对4-1BB具有结合特异性的锚蛋 白重复蛋白的解离常数(KD)
使用ProteOn仪器(BioRad)分析纯化的锚蛋白重复蛋白对人4-1BB靶标的结合亲和力，并且根据本领域技术人员已知的标准程序进行测量。
简而言之，将生物素酰化的人4-1BB稀释于PBST(PBS，pH7.4，含有0.005％Tween
Figure BDA0003495129560000672
)中，并在NLC芯片(BioRad)上包被至约320个共振单位(RU)的水平(600RU，针对单迹线SPR测量)。然后通过注射包含锚蛋白重复蛋白的系列稀释液的200μl运行缓冲液(PBS，pH7.4，含0.005％Tween
Figure BDA0003495129560000673
)，该系列稀释液覆盖50nM和0.5nM之间的浓度范围用于多迹线SPR测量或为50nM用于单迹线测量(结合率测量)，随后以100μl/min的恒定流速注射运行缓冲液流至少30分钟(解离率测量)，来测量锚蛋白重复蛋白和h4-1BB的相互作用。使用30μl的10mM甘氨酸(pH2)，随后使用30μl的124mM H3P04进行再生。从注射锚蛋白重复蛋白(双参考)后获得的共振单位(RU)迹线中减去点间和参考注射(即，仅注射运行缓冲液)的信号(即RU值)。基于从结合率和解离率测量获得的SPR迹线，确定对应锚蛋白重复蛋白-4-1BB相互作用的结合率和解离率。
作为代表性示例，图2A和图2B使出了针对
Figure BDA0003495129560000674
蛋白质#1和
Figure BDA0003495129560000675
蛋白质#5获得的SPR迹线。使用本领域技术人员已知的标准程序，由估计的结合率和解离率计算解离常数(KD)。所选择的锚蛋白重复蛋白与人4-1BB的结合相互作用的KD值被测定为在20pM至5nM的范围内。表1提供了作为示例的一些所选择的锚蛋白重复蛋白的KD值。本发明的4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白也特异性结合食蟹猴4-1BB。
表1.锚蛋白重复蛋白-人4-1BB相互作用的KD值
Figure BDA0003495129560000671
Figure BDA0003495129560000681
实施例3：细胞中通过4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白的4-1BB信号传导的活化
在h4-1BB-HT1080报告测定中测试了对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复蛋白活化细胞中4-1BB信号传导的能力。
表达人4-1BB和NF-κΒ调节的荧光素酶报告基因的HT1080细胞的产生。用含有从OriGene Technologies(#RC200664)获得的人4-1BB(带Myc-DDK标签)的cDNA的质粒转导纤维肉瘤细胞系HT1080(
Figure BDA0003495129560000682
CCL-121TM)，该质粒含有受CMV启动子和新霉素抗性基因控制的人4-1BB的序列(Uniprot登录号Q07011或NCBI参考序列NM_001561)。在补充有10％(v/v)FBS和G418
Figure BDA0003495129560000684
的最低必需培养基(MEM)α培养基+Glutamax中培养细胞。使用小鼠抗人4-1BB抗体克隆4B4-1(BD PharmingenTM，产品目录号：550890)通过流式细胞术评估4-1BB转导的HT1080细胞的人4-1BB表达。使用相同抗体通过流式细胞术对转染的细胞进行分选，以便富集表达HT1080细胞的h4-1BB群。使用脂质体用NF-κβ-荧光素酶报告基因质粒pNiFty3-N-Lucia(Invivogen，产品代码pnf3-lc2)进一步转染h4-1BB HT1080细胞，该质粒含有在NF-κB调控的小鼠干扰素β最小启动子和ZeocinTM抗性基因控制下的分泌型荧光素酶报告基因。在补充有10％(v/v)FBS、G418
Figure BDA0003495129560000683
ZeocinTM(Invivogen，产品目录号ant-zn-1)和NormocinTM(Invivogen，产品目录号ant-nr-1)的最低必需培养基(MEM)α培养基+Glutamax中培养转染的细胞。将一群h4-1BB-HT1080-Lucia细胞用于该测定。
测定设置：收获NF-κΒ荧光素酶人-4-1BB HT1080细胞并重悬于补充有10％(v/v)FBS、1％PenStrep、1mg/mL G418、100μg/mL Normocin和100μg/mL Zeocin的MEMα培养基+Glutamax中。将96孔平底板用PBS中的30nM抗-五-His抗体(Qiagen，目录号34660)在4℃处包被过夜。将板用PBS洗涤三次后，用含有1％FBS的PBS封闭1小时，然后与渐增浓度的锚蛋白重复蛋白在室温处温育2小时，以便使它们在板上交联。然后添加h4-1BB-HT1080荧光素酶细胞，并将板在37℃、5％CO2处温育过夜。收集上清液并在新的96孔板中离心。在这些细胞中4-1BB信号传导的触发导致NFκB介导的荧光素酶分泌，其活性可用发光底物来监测。将QUANTI-Luc荧光素酶底物(Invivogen，产品目录号rep-qlc1)与上清液混合，并在TecanM1000发光板读取器上读取发光值。图3示意性地示出了测定设置。包括可溶性(非交联)抗-4-1BB单克隆抗体(克隆20H4.9-IgG4)作为对照。
结果：4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白以浓度依赖性方式活化了在表达h4-1BB的HT1080-荧光素酶细胞中4-1BB介导的NF-κB信号传导(图4A至图4D)。结果表明，所公开的对4-1BB具有结合特异性的锚蛋白重复蛋白可活化细胞中的4-1BB信号传导。被认为需要Fc交联用于完全活性的抗4-1BB单克隆抗体(克隆20H4.9)能够在一定程度上活化可溶形式的4-1BB信号传导。
实施例4：连接到定位剂分子的4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白结合细胞并经由定位 剂介导的聚集活化4-1BB信号传导
据认为4-1BB在细胞表面上的激动剂介导的聚集对于4-1BB信号传导的有效活化是需要的或至少高度有益的。4-1BB的此类聚集和活化可由通过抗体交联的4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白介导，如实施例3所示。为了测试4-1BB的此类聚集和活化是否也可由连接到定位剂分子的4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白介导，所选择的4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白与定位剂分子的示例基因连接，定位剂分子是靶向肿瘤抗原A的定位剂(下文称为“TAA”)，即TAA特异性锚蛋白重复结构域。所得构建体包含(1)N-末端His标签(SEQ ID NO:43)，(2)TAA特异性定位剂分子，和(3)4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白，其经由肽接头连接到TAA特异性定位剂分子并且位于构建体(“TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000691
构建体”)内的TAA特异性定位剂分子的C-末端。TAA的分子身份在2019年6月04日提交给美国专利商标局并转让给MolecularPartners AG的名称为“Multispecific Proteins”的美国临时专利申请62/857,037以及要求US 62/857,037的优先权并在本PCT申请的提交日提交的PCT国际专利申请中有所公开。
通过经由BamHI和HindIII将单价4-1BB特异性锚蛋白重复结构域克隆到表达载体(pMPCME298，提供编码TAA特异性锚蛋白重复结构域的序列和肽接头(SEQ ID NO:39)，以及N-末端His标签(SEQ ID NO:43)以有利于蛋白质纯化)中，经由BsaI和HindIII切割，从而生成TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000701
构建体。将含有TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000702
构建体的正确测序的载体转化到诱导型大肠杆菌细菌中，在150ml TB培养基中表达(含有50μg/ml氨苄青霉素，在OD600～1处用0.5mM IPTG诱导，并在37℃处温育6小时)。使用超声处理裂解细胞，并使用IMAC台式纯化，用两个Triton洗涤步骤纯化蛋白质。
生成以下TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000703
构建体以用于进一步功能测试：
Figure BDA0003495129560000704
蛋白质#44(包含SEQ ID NO:1作为4-1BB
Figure BDA00034951295600007010
蛋白质)；
Figure BDA0003495129560000705
蛋白质#45(包含SEQ ID NO:2作为4-1BB
Figure BDA00034951295600007011
蛋白质)；
Figure BDA0003495129560000706
蛋白质#46(包含SEQ ID NO:3作为4-1BB
Figure BDA00034951295600007012
蛋白质)；
Figure BDA0003495129560000707
蛋白质#47(包含SEQ ID NO:4作为4-1BB
Figure BDA00034951295600007013
蛋白质)；
Figure BDA0003495129560000708
蛋白质#48(包含SEQ ID NO:5作为4-1BB
Figure BDA00034951295600007014
蛋白质)；和
Figure BDA0003495129560000709
蛋白质#49(包含SEQ ID NO:6作为4-1BB
Figure BDA00034951295600007015
蛋白质)。
作为阴性对照，将对人4-1BB没有结合特异性的锚蛋白重复结构域(SEQ ID NO:42)克隆到载体中，得到
Figure BDA00034951295600007017
蛋白质#50：
Figure BDA00034951295600007016
蛋白质#50(包含SEQ ID NO:42而不是4-1BB特异性锚蛋白重复结构域)。
TAA-4-1BB
Figure BDA00034951295600007018
构建体以高亲和力结合4-1BB和TAA
用SPR研究TAA-4-1BB
Figure BDA00034951295600007019
构建体以获得对人4-1BB、食蟹猴4-1BB和人TAA靶标的准确亲和力数据。
测定设置：简而言之，使用ProteOn XPR36仪器(BioRad)如上所述进行SPR测量。经由中性抗生物素蛋白(约6000RU预包被)将生物素酰化的人和食蟹猴4-1BB以及人TAA直接或间接固定在GLC芯片上，分别达到600RU、700RU和2000RU。通过以50nM、16.7nM、5.6nM、1.9nM和0.6nM的系列稀释度注射
Figure BDA00034951295600007020
分子，其中120s的缔合和1800s的解离，使用30μl/min的恒定流速来测量TAA-4-1BB
Figure BDA00034951295600007021
构建体与经包被的靶标的相互作用。使用10mM甘氨酸pH 2和124mM H3P04在各个测量之间使靶标再生。信号针对运行缓冲液(PBST)处理的对照泳道进行双重参考。
筛选：TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000712
构建体的SPR测量结果汇总于表2中。TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000713
构建体显示出与人4-1BB的结合亲和力为0.4nM至1.5nM，与食蟹猴4-1BB的结合亲和力为1.1nM至2.9nM，并且与人TAA的结合亲和力为0.1nM至0.4nM。TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000714
构建体与hTAA的结合亲和力高于与h4-1BB的结合亲和力。对于所有测试的TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000715
构建体，证实了与食蟹猴4-1BB的交叉反应性结合，其中与人4-1BB相比，结合亲和力具有至多约4倍的差异。
表2.TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000716
与h4-1BB、c4-1BB和hTAA相互作用的KD值
Figure BDA0003495129560000711
TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000717
构建体结合表达4-1BB的细胞
然后测试TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000718
构建体与离子霉素/PMA刺激的CEM细胞的结合。所有构建体都与CEM细胞结合，如图5所示。
测定设置：使用用离子霉素/PMA(佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯)刺激以表达4-1BB的T成淋巴细胞系CCRF-CEM(
Figure BDA0003495129560000719
CCL-119TM)，通过流式细胞术测量细胞上与细胞膜结合的人4-1BB结合的锚蛋白重复蛋白。收获在补充有10％(v/v)FBS+1％PenStrep的RPMI培养基中培养的CEM细胞，并在96孔U形底板中使用相同的培养基加上PMA(10ng/ml)和离子霉素(500ng/ml)刺激过夜。使用小鼠抗人4-1BB抗体克隆4B4-1(BD PharmingenTM，目录号550890)通过流式细胞术确认刺激后4-1BB的表达。收获刺激的CEM细胞，然后将30,000个细胞与渐增浓度的His标签的锚蛋白重复蛋白在FACS缓冲液(PBS+2％(v/v)FBS+0.1％叠氮化钠)中在冰上温育30分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤并与抗-五-His Alexa Fluor-488检测抗体(Qiagen，目录号35310)在冰上温育30分钟。用PBS洗涤后，将细胞用活/死Aqua染料(Thermo Fisher，编号L34957)染色并使用BD FACS Canto II或AttuneNxT细胞仪进行分析。
结果：显示与重组4-1BB结合的所有TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000728
构建体也与活化的CEM细胞上的细胞膜表达的人4-1BB结合，如图5所示。
TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000722
构建体活化由定位剂诱导的聚集介导的表达4-1BB的细胞中 的4-1BB信号传导
然后进一步测试TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000723
构建体活化通过经由定位剂的聚集介导的表达4-1BB的细胞中4-1BB信号传导的能力。使用测量在TAA包被的珠存在下共培养的表达人4-1BB的HT1080细胞中的NF-κΒ报告基因活化的测定。
测定设置：收获表达人4-1BB和NF-κΒ-荧光素酶报告基因(参见实施例3)的HT1080细胞并重悬于补充有10％(v/v)FBS、1％PenStrep、1mg/mL G418、100μg/mLNormocin和100μg/mL Zeocin的MEMα培养基+Glutamax中。使用96孔板，将10,000个h4-1BB-HT1080荧光素酶细胞与人TAA包被的珠和渐增浓度的
Figure BDA0003495129560000724
蛋白质在TAA生物素包被的链霉抗生物素蛋白珠的存在下一起铺板。将板在37℃、5％CO2下温育20小时。然后收集上清液并在新的96孔板中离心。将QUANTI-Luc试剂(Invivogen，产品目录号rep-qlc1)与上清液混合，并在Tecan M1000发光板读取器上读取发光值。通过使用Graphpad Prism软件(第7.02版)将数据与四参数逻辑拟合模型进行拟合来确定EC50值。
结果：该h4-1BB-HT1080荧光素酶报告测定表明，如果4-1BB特异性锚蛋白重复结构域连接到TAA特异性定位剂(如在TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000725
构建体中)，则所公开的4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白在TAA包被的珠存在下显示4-1BB激动作用(参见图6A和6B)。4-1BB激动作用依赖于定位剂介导的聚集，因为在不存在TAA包被的珠或不存在与4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白连接的定位剂的情况下，未观察到激动作用。表3提供了作为示例的所选择的TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000726
构建体的EC50值：
表3.在TAA珠存在下HT1080细胞中的4-1BB活化：TAA-4-1BB特异性
Figure BDA0003495129560000727
蛋白质的EC50值
Figure BDA0003495129560000721
Figure BDA0003495129560000731
使用测量在表达TAA的细胞的存在下共培养的表达4-1BB的HT1080细胞中的NF-κΒ-报告基因活化的测定，进一步测试TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000733
构建体活化通过经由定位剂的聚集介导的表达4-1BB的细胞中4-1BB信号传导的能力。
表达人TAA的CHO细胞的生成
简而言之，使用编码人TAA的cDNA，通过标准分子生物学技术生成表达载体(pMPMPA13)。使用脂质体用表达载体转染中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(
Figure BDA0003495129560000734
CCL-121TM)。使用不同浓度的遗传霉素G-418(Promega，V8091)施加选择压力。使用抗TAA抗体通过流式细胞术分析hTAA的表达。选择CHO-TAA转染子的两种不同群体(群体1和群体2)用于进一步实验。FACS分析表明CHO-TAA细胞而非野生型CHO细胞(CHO-wt)在细胞表面上表达hTAA(数据未示出)。
测定设置：收获h4-1BB-HT1080荧光素酶细胞以及CHO-TAA细胞并重悬于补充有10％(v/v)FBS、1％PenStrep、1mg/mL G418、100μg/mL NormocinTM和100μg/mL ZeocinTM的MEMα培养基+Glutamax中。使用96孔板，将40,000个h4-1BB-HT1080个荧光素酶细胞和40,000个CHO-TAA细胞铺板，并且将渐增浓度的TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000735
构建体添加到细胞并在37℃、5％CO2下温育。20小时后，收集上清液并在新的96孔板中离心。将QUANTI-Luc试剂(Invivogen，产品目录号rep-qlc1)与上清液混合，并在Tecan M1000发光板读取器上读取发光值。通过使用Graphpad Prism软件(第7.02版)将数据与四参数逻辑拟合模型进行拟合来确定EC50值。
结果：图7A显示，在表达TAA的细胞(群体1)的存在下，所有TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000736
构建体诱导通过经由定位剂的聚集介导的表达4-1BB的细胞中的4-1BB信号传导至相当的程度。不与4-1BB结合的DARPin蛋白质#50对4-1BB信号传导没有影响。表4提供了作为示例的所选择的TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000737
构建体的EC50值：
表4.在表达TAA的CHO细胞存在下HT1080细胞中的4-1BB活化(群体1)：TAA-4-1BB特异性
Figure BDA0003495129560000738
蛋白质的EC50值
Figure BDA0003495129560000732
Figure BDA0003495129560000741
用表达TAA的细胞的第二群体(群体2)获得类似的结果(图7B)。表5提供了作为示例的所选择的TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000743
构建体的EC50值：
表5.在表达TAA的CHO细胞存在下HT1080细胞中的4-1BB活化(群体2)：TAA-4-1BB特异性
Figure BDA0003495129560000744
蛋白质的EC50值
Figure BDA0003495129560000742
总之，所有测试的TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000745
构建体都能够活化通过经由定位剂的聚集介导的表达4-1BB的细胞中的4-1BB信号传导。
实施例5：蛋白质中两个或三个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的存在增强了其在 活化4-1BB信号传导中的效力
为了测试蛋白质中两个或三个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域(而不是仅一个)的存在是否影响蛋白质在活化4-1BB信号传导中的效力，使用基于吉布森组装(Gibsonassembly)的方法将多价锚蛋白重复蛋白构建体在DNA水平上进行组装并克隆到pMPAG06中。然后将正确组装的构建体转化到诱导型大肠杆菌细胞中，表达并使用IMAC台式纯化用两个Triton洗涤步骤纯化，如上所述。
生成以下二价和三价4-1BB锚蛋白重复蛋白构建体(和对应阴性对照构建体)：
SEQ ID NO:51(包含通过富含PT的接头(SEQ ID NO:57)连接的两个4-1BB锚蛋白重复结构域(各自来源于SEQ ID NO:1))；
SEQ ID NO:52(包含通过富含PT的接头(SEQ ID NO:57)连接的两个4-1BB锚蛋白重复结构域(各自来源于SEQ ID NO:2))；
SEQ ID NO:53(包含通过富含PT的接头(SEQ ID NO:57)连接的两个不具有结合特异性的对照锚蛋白重复结构域(各自来源于SEQ ID NO:42))；
SEQ ID NO:54(包含通过富含PT的接头(SEQ ID NO:57)连接的三个4-1BB锚蛋白重复结构域(各自来源于SEQ ID NO:1))；
SEQ ID NO:55(包含通过富含PT的接头(SEQ ID NO:57)连接的三个4-1BB锚蛋白重复结构域(各自来源于SEQ ID NO:2))；和
SEQ ID NO:56(包含通过富含PT的接头(SEQ ID NO:57)连接的三个不具有结合特异性的对照锚蛋白重复结构域(各自来源于SEQ ID NO:42))。
这些二价和三价4-1BB锚蛋白重复构建体(和对应阴性对照构建体)基因连接到定位剂分子，以便测试其在细胞中活化4-1BB信号传导中的效力。
生成和测试以下多价锚蛋白重复蛋白：
Figure BDA0003495129560000751
蛋白质#51(包含在其C-末端通过肽接头(SEQ ID NO:57)连接到SEQ IDNO:51的TAA特异性锚蛋白重复结构域)；
Figure BDA0003495129560000752
蛋白质#52(包含在其C-末端通过肽接头(SEQ ID NO:57)连接到SEQ IDNO:52的TAA特异性锚蛋白重复结构域)；
Figure BDA0003495129560000753
蛋白质#53(包含在其C-末端通过肽接头(SEQ ID NO:57)连接到SEQ IDNO:53的TAA特异性锚蛋白重复结构域)；
Figure BDA0003495129560000754
蛋白质#54(包含在其C-末端通过肽接头(SEQ ID NO:57)连接到SEQ IDNO:54的TAA特异性锚蛋白重复结构域)；
Figure BDA0003495129560000755
蛋白质#55(包含在其C-末端通过肽接头(SEQ ID NO:57)连接到SEQ IDNO:55的TAA特异性锚蛋白重复结构域)；和
Figure BDA0003495129560000756
蛋白质#56(包含在其C-末端通过肽接头(SEQ ID NO:57)连接到SEQ IDNO:56的TAA特异性锚蛋白重复结构域)。
Figure BDA0003495129560000757
蛋白质#51至
Figure BDA0003495129560000758
56还包含N-末端His标签(SEQ ID NO:43)以有利于简单蛋白质纯化。
测试了多价锚蛋白重复蛋白与仅包含一个对应4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的结合蛋白(具有或不具有连接的定位剂)，用于与PMA/离子霉素刺激的CEM细胞结合。与实施例4中所述的类似地进行测定。如图8A至图8C所示，所有包含对应于SEQ ID NO:1的一个、两个或三个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的锚蛋白重复蛋白和所有包含对应于SEQ ID NO:2的一个、两个或三个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的锚蛋白重复蛋白都与CEM细胞结合，而缺少4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的阴性对照蛋白都不与该细胞结合。
通过在表达TAA的CHO细胞存在下在表达h4-1BB的HT1080细胞中的NF-kB荧光素酶报告测定来确定这些锚蛋白重复蛋白活化细胞中4-1BB信号传导的能力。与实施例4中所述的类似地进行测定。发光信号提供了4-1BB信号传导途径活化的相对量度。
如图9A和图9B所示，包含两个或三个4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的结合蛋白比仅包含一个相对应4-1BB特异性锚蛋白重复结构域的结合蛋白更强地活化4-1BB信号传导。令人惊讶的是，包含三个4-1BB锚蛋白重复结构域的结合蛋白不比包含两个4-1BB锚蛋白重复结构域的结合蛋白更强地活化4-1BB信号传导。
因此，需要至少两个4-1BB锚蛋白重复结构域来获得最大的4-1BB信号传导活性，如通过NF-kB荧光素酶报告测定所测量的。添加第三个4-1BB锚蛋白重复结构域不会赋予结合蛋白更高的效力。
包含对应于SEQ ID NO:1的一个、两个或三个4-1BB锚蛋白重复结构域的结合蛋白仅在TAA阳性细胞(CHO-TAA)和TAA介导的聚集存在下活化4-1BB信号传导途径。在TAA阴性细胞(CHO-wt)存在下，并且因此在不存在TAA介导的聚集的情况下，这些结合蛋白未活化4-1BB途径(图9A)。包含对应于SEQ ID NO:2的两个或三个4-1BB锚蛋白重复结构域的结合蛋白在较高浓度下在TAA阴性细胞存在下显示出一些弱活化。然而，在TAA阳性细胞存在下的活化高得多(图9B)。阴性对照蛋白质未显示任何活性(数据未示出)。
总之，可通过在蛋白质中包含两个或甚至三个4-1BB锚蛋白重复结构域来增加4-1BB锚蛋白重复蛋白活化表达4-1BB的细胞中4-1BB信号传导的效力。
实施例6：连接到定位剂分子的4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白抑制肿瘤生长并选择 性地增加肿瘤中人CD8 T细胞的密度
在用人外周血单核细胞(PBMC)(MiXeno)重构的HT-29结肠癌异种移植模型中测试连接到定位剂分子的4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白在体内刺激T细胞并抑制肿瘤生长的能力。该人源化小鼠模型已被描述为适用于测试免疫检查点和共刺激药物诸如激动性抗4-1BB抗体的免疫刺激功效。在该模型中用抗4-1BB mAb乌瑞鲁单抗治疗足以显著减缓肿瘤生长。然而，与未治疗的小鼠相比，它还诱导强全身性效应，诸如加速移植物抗宿主病(GVHD)和肝脏T细胞浸润，从而导致过早死亡。该模型用于评估包含4-1BB特异性锚蛋白重复结构域和定位剂分子的本发明结合蛋白是否能够增加肿瘤内T细胞浸润并减缓肿瘤生长，同时避免由抗4-1BB mAb乌瑞鲁单抗(非靶向4-1BB激动性单克隆抗体)产生的一些非肿瘤效应。用于实验的结合蛋白(
Figure BDA0003495129560000772
蛋白质#60)包含SEQ ID NO:51，其中SEQ ID NO:51中所包含的两个锚蛋白重复结构域中的每一者的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N两者被A取代，在其N-末端通过肽接头(SEQ ID NO:57)连接到TAA特异性锚蛋白重复结构域作为定位剂。
材料和方法：
肿瘤实验：将免疫缺陷NOG小鼠在右胁部皮下接种HT-29肿瘤细胞(3.5×106)。然后通过注射来自两个健康人供体的外周血单核细胞(PBMC)将小鼠人源化(3.5×106个细胞/小鼠)。根据如表6所示的预定方案将测试制品施用于荷瘤小鼠。
表6：研究设计–实验组。
Figure BDA0003495129560000771
肿瘤细胞和PBMC接种的日期表示为第0天。每隔3至4天监测肿瘤生长。在实验的第18天，处死小鼠，取出肿瘤，并通过流式细胞术和定量免疫荧光(QIF)进行研究。肿瘤生长分析限于18天，因为小鼠在这段时间后开始显示移植物抗宿主病(GVHD)的迹象。
流式细胞术：用FlowJo软件(TreeStar)分析来自原始FCS文件的数据。对表达人表面标志物CD45、CD4和CD8的活淋巴细胞进行细胞门控。通过掺入活-死标记染料7-AAD将死细胞从分析中排除。示出了人CD8 T细胞的百分比，作为在血液中检测到的总人CD45阳性细胞的百分比。
免疫组织化学：在尸检时从小鼠回收组织，并将组织包埋在最佳切割温度化合物(Sakura)中，并且在没有预先固定的情况下冷冻。将OCT包埋的冷冻保存样品切成7μm切片并固定在载玻片上。用冷丙酮固定载片。用以下抗体进行多重免疫荧光染色：抗CD4(山羊Pab，R&D System#AF-379-NA)、抗CD8(兔PAb，Abcam#ab40555)和抗CD45(克隆HI30，Biolegend#304002)。分别通过抗绵羊-Alexa
Figure BDA0003495129560000783
647(Thermofisher#A21448)、抗兔-若丹明RedTM-X(Jackson ImmunoResearch#711-296-152)和抗小鼠IgG1-Alexa
Figure BDA0003495129560000782
488(Jackson ImmunoResearch#115-545-205)检测这些抗体。在Zeiss Axio Scan.Z1滑动扫描仪上获取图像。用Zen Blue软件转移图像并使用ImageJ1.51n软件进行分析，该软件具有FIJI程序包以量化人CD45、CD8和CD4 T细胞的数量。
统计分析：用Prism 7.0.2软件(GraphPad软件)进行统计分析。通过使用重复测量双因素ANOVA和Tukey多重比较检验(GraphPad Prism，7.02版)分析肿瘤生长和体重数据的统计学显著差异。通过Kaplan-Meier方法分析存活率曲线，并通过对数秩检验进行比较。使用单因素ANOVA(GraphPad Prism，7.02版)分析研究结束时的流式细胞术数据。双尾P<0.05被认为是统计学显著的。
结果
肿瘤生长：随时间推移单独跟踪肿瘤生长。除了对使用独立样品T检验在肿瘤接种后第18天获得的数据进行统计分析之外，还通过使用重复测量双因素ANOVA随后Tukey多重比较检验来分析肿瘤生长数据的统计学显著性差异。肿瘤生长抑制汇总于表7中。
表7.治疗的抗肿瘤活性的汇总
Figure BDA0003495129560000781
a.平均值±SEM；b.相比于媒介物对照的肿瘤生长曲线的所有时间点上的RM双因素ANOVA，随后进行Tukey多重比较检验(*P<0.05，**P<0.001)。
与在研究结束时仅分析最终肿瘤体积相比，对整个肿瘤生长曲线的分析给出了更高的分析能力。这两种分析相关性良好。
Figure BDA0003495129560000784
蛋白质#60治疗组中的肿瘤生长被延迟(P<0.001)。施用的媒介物对肿瘤生长没有显著影响。总之，测试物质
Figure BDA0003495129560000791
蛋白质#60在皮下HT-29人结肠癌MiXeno模型中显示出显著的抗肿瘤活性。
血液和肿瘤的免疫表型分型：为了确认通过流式细胞术获得的结果，通过在第18天切除的肿瘤中的组织学分析人CD4和CD8 T淋巴细胞密度。使用来自每组5只小鼠的组织进行组织学检查(数据未示出)。与媒介物组相比，用
Figure BDA0003495129560000792
蛋白质#60治疗导致人CD8 T淋巴细胞更致密的浸润。差异达到显著性(P<0.01)。另一方面，CD4肿瘤浸润淋巴细胞的数量在各组之间没有显著差异。
肝脏T细胞浸润的组织学分析：使用来自每组5只小鼠的组织对第18天切除的肝脏进行组织学检查。按表面积分类为小、中和大的浸润物定量显示，用
Figure BDA0003495129560000793
蛋白质#60治疗不诱导肝脏T细胞浸润的增加。这与公布的结果形成对比，公布的结果显示施用抗4-1BBmAb乌瑞鲁单抗诱导NOG小鼠中人PBMC的肝脏T细胞浸润增加。
结论
Figure BDA0003495129560000794
蛋白质#60在皮下HT-29人结肠癌MiXeno模型中显示出抗肿瘤活性。与媒介物治疗的小鼠相比，用
Figure BDA0003495129560000795
蛋白质#60治疗导致肿瘤中人CD8 T细胞的密度增加。用
Figure BDA0003495129560000796
蛋白质#60治疗耐受性良好，并且与媒介物组相比不导致体重减轻或存活率降低，并且不产生肝脏T细胞浸润增加。
实施例7：连接到各种定位剂的4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白结合并活化表达4- 1BB的细胞中的4-1BB
为了表明本发明的4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白活化细胞中4-1BB信号传导的能力不依赖于在实施例4和5中用作的示例的TAA特异性定位剂，生成并测试了几种其他定位剂-4-1BB锚蛋白重复蛋白构建体。
通过使用吉布森组装方法将几种不同的定位剂分子与本发明的4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白基因连接。将正确的载体转化到诱导型大肠杆菌表达细胞中，表达并在Ni-次氮基三乙酸(Ni-NTA)酸性柱上纯化，然后在
Figure BDA0003495129560000797
系统上进行尺寸排阻色谱法，如上所述。这些构建体包含分别通过富含PT的肽接头连接到SEQ ID NO:51的对纤连蛋白外结构域B(ED-B)、表皮生长因子受体(EGFR)或人表皮生长因子受体2(HER2)具有结合特异性的定位剂锚蛋白重复结构域。除了在前述实施例中描述的TAA-4-1BB
Figure BDA0003495129560000802
构建体之外，还生成了以下定位剂-4-1BB
Figure BDA0003495129560000803
构建体：
Figure BDA0003495129560000804
蛋白质#57(包含在其C末端通过富含PT的肽接头连接到SEQ ID NO:51的ED-B特异性锚蛋白重复蛋白)；
Figure BDA0003495129560000805
蛋白质#58(包含在其C末端通过富含PT的肽接头连接到SEQ ID NO:51的EGFR特异性锚蛋白重复蛋白)；和
Figure BDA0003495129560000806
蛋白质#59(包含在其C末端通过富含PT的肽接头连接到SEQ ID NO:51的HER2特异性锚蛋白重复蛋白)。
Figure BDA0003495129560000807
蛋白质#57至59还包含N-末端His标签(SEQ ID NO:43)以有利于简单蛋白质纯化。
类似于实施例4和5中使用的TAA特异性定位剂，这些定位剂锚蛋白重复结构域各自结合在某些肿瘤类型中过表达的靶标(ED-B、EGFR或HER2)，并且因此可用于肿瘤定位。通过SPR测量(如先前实施例中所述进行)来表明定位剂-4-1BB
Figure BDA0003495129560000808
构建体与相应定位剂靶标的特异性结合，各自显示与其相应重组靶蛋白的结合亲和力(KD)低于10-8M(数据未示出)。表8提供了各种定位剂-4-1BB
Figure BDA0003495129560000809
构建体与人4-1BB的结合亲和力(KD)：
表8.各种定位剂-4-1BB
Figure BDA00034951295600008010
构建体与h4-1BB相互作用的KD值
Figure BDA0003495129560000801
*由于缓慢的解离率而不可能精确拟合
使用与表达定位剂靶EGFR或HER2的细胞共培养的表达4-1BB的报告细胞，类似于实施例4中针对TAA-4-1BB
Figure BDA00034951295600008011
构建体的描述，或在重组ED-B存在下，在测定中测试定位剂-4-1BB
Figure BDA00034951295600008012
构建体活化通过经由定位剂的聚集介导的表达4-1BB的细胞中4-1BB信号传导的能力。
定位剂的表达靶向肿瘤基质(ED-B)中的ED-B、EGFR和HER2、或用于共培养的相应肿瘤细胞(A431细胞/EGFR和BT474细胞/HER2)显示在图10A-图10C中。通过各种定位剂-4-1BB
Figure BDA00034951295600008013
构建体的在表达4-1BB的报告细胞中4-1BB信号传导的定位剂靶特异性活化显示在图11A至图11C中。在每个实验中，如果存在用于定位剂的特异性靶标，作为共培养肿瘤细胞上的细胞表面蛋白(图11B(EGFR)和图11C(HER2)或作为重组蛋白(图11A(ED-B))，则定位剂-4-1BB
Figure BDA0003495129560000811
构建体能够活化表达4-1BB的细胞中的4-1BB信号传导。例如，包含靶向EGFR的定位剂的DARPin蛋白质#58，当与表达EGFR的A431细胞共培养时能够活化表达4-1BB的细胞中的4-1BB信号传导，但当与BT474细胞共培养时或在ED-B存在下则不能活化。这些数据表明，所公开的4-1BB特异性锚蛋白重复结构域可与不同的定位剂分子连接，从而产生功能性定位剂-4-1BB
Figure BDA0003495129560000812
构建体，它们依赖于在细胞表面上表达定位剂靶标(EGFR和HER2)的细胞的存在或依赖于作为能够诱导定位剂介导的聚集的细胞外蛋白(ED-B)的定位剂靶标的存在来活化表达4-1BB的细胞中的4-1BB信号传导。
还在表达4-1BB的原代CD8+T细胞中测试了定位剂-4-1BB
Figure BDA0003495129560000813
构建体活化4-1BB信号传导的能力。
材料和方法：
使用EGFR聚集的体内人T细胞IFNγ释放测定：从苏黎世供血中心获得血沉棕黄层并用PBS稀释。然后使用Leucosep管通过密度离心分离PBMC。在若干洗涤步骤后，使用阴性选择人CD8 T细胞分离试剂盒，根据制造商的建议从PBMC中纯化CD8 T细胞。将CD8 T细胞(1×105/孔)接种到预先用0.5μg/ml抗CD3克隆OKT-3和中和亲和素包被的96孔板上，然后在不同浓度的定位剂-4-1BB
Figure BDA0003495129560000814
构建体的存在下接种生物素酰化的EGFR。将培养物在37℃、5％CO2下温育96小时，之后将上清液移至新的96孔板中并保存于-20℃下直至分析。使用人IFN-γDuoSet ELISA根据生产商的说明书检测上清液的IFNγ浓度。
使用HER2聚集的体外人T细胞IFNγ释放测定：该测定如上文针对EGFR聚集所述进行，不同的是使用生物素酰化的HER2代替生物素酰化的EGFR。
如图12A所示，包含EGFR靶向定位剂的DARPin蛋白质#58在EGFR包被板的存在下诱导干扰素-γ分泌，而包含HER2靶向定位剂的DARPin蛋白质#59在这些情况下没有作用。图12B显示DARPin#59在HER2包被板的存在下诱导干扰素-γ分泌，而DARPin蛋白质#58在这些情况下没有显著作用。
结果表明，包含定位剂的本发明的4-1BB特异性结合蛋白可活化通过经由定位剂的聚集介导的原代T细胞中的4-1BB信号传导。总之，本发明的4-1BB特异性锚蛋白重复蛋白可与很多种定位剂分子连接以生成结合并活化通过经由定位剂的聚集介导的表达4-1BB的细胞中的4-1BB信号传导的蛋白质。
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Claims (15)

1.一种重组结合蛋白，所述重组结合蛋白包含锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域对4-1BB具有结合特异性，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含锚蛋白重复模块，所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58至71和(2)其中SEQ ID NO:58至71中的任一者中的至多9个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。
2.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58、59、67、68、69和(2)其中SEQ ID NO:58、59、67、68、69中的任一者中的至多9个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。
3.根据权利要求1所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复模块是第一锚蛋白重复模块并且包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:58和(2)其中SEQ ID NO:58中的至多9个氨基酸被另一氨基酸取代的序列，并且其中所述锚蛋白重复结构域还包含第二锚蛋白重复模块，所述第二锚蛋白重复模块包含选自由以下项组成的组的氨基酸序列：(1)SEQ ID NO:59和(2)其中SEQ ID NO:59的至多9个氨基酸被另一氨基酸取代的序列。
4.根据权利要求3所述的结合蛋白，其中所述第一锚蛋白重复模块位于所述锚蛋白重复结构域内的所述第二锚蛋白重复模块的N-末端。
5.一种重组结合蛋白，所述重组结合蛋白包含锚蛋白重复结构域，其中所述锚蛋白重复结构域对4-1BB具有结合特异性，并且其中所述锚蛋白重复结构域包含与SEQ ID NO:1至38中的任一者具有至少80％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中SEQ ID NO:1至38的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失，并且其中SEQ ID NO:2至4、6-19、25-27、33-38的倒数第二个位置处的L和/或最后一个位置处的N任选地被A取代。
6.根据权利要求5所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中所述锚蛋白重复结构域的位置1处的G和/或位置2处的S任选地缺失。
7.根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述锚蛋白重复结构域在PBS中以低于10-7M的解离常数(KD)结合人4-1BB。
8.根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述重组结合蛋白包含对4-1BB具有结合特异性的两个或三个锚蛋白重复结构域。
9.根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中所述结合蛋白还包含定位剂分子。
10.一种核酸，所述核酸编码根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白。
11.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至9中任一项所述的结合蛋白或根据权利要求10所述的核酸，以及药学上可接受的载体和/或稀释剂。
12.一种在包括人在内的哺乳动物的表达4-1BB的细胞中定位活化4-1BB的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用根据权利要求9所述的结合蛋白的步骤。
13.一种治疗医学病症的方法，所述方法包括向对其有需要的患者施用治疗有效量的根据权利要求9所述的结合蛋白的步骤。
14.根据权利要求12至13中任一项所述的方法，其中所述表达4-1BB的细胞位于肿瘤中。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述医学病症是癌症。
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