KR20230120139A - 재조합 cd3 결합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20230120139A
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세바스티안 그림
니나 레슈케
크리스티안 라이헨
베른트 슐레레트
빅토르 레비츠키
라우라 예안바르트
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Abstract

본 발명은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그러한 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 그러한 결합 단백질 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물, 및 T 세포의 질병-국재화된 활성화의 방법에 있어서의 그리고 인간을 포함한 포유동물에서 질병, 예컨대 감염성 질병 또는 암을 치료하는 방법에 있어서의 그러한 결합 단백질, 핵산 또는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.

Description

재조합 CD3 결합 단백질 및 이의 용도
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 2020년 12월 16일자로 출원된 미국 특허 제63/126,356호; 2020년 12월 22일자로 출원된 EP20216705호; 및 2021년 4월 30일자로 출원된 미국 특허 제63/182,394호에 대한 우선권의 이익을 주장한다. 이들 특허 출원의 개시내용은 전체적으로 본 명세서에 모든 목적을 위하여 참고로 포함된다.
기술분야
본 발명은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 그러한 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 그러한 결합 단백질 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물, 및 T 세포의 질병-국재화된 활성화의 방법에 있어서의 그리고 인간을 포함한 포유동물에서 질병, 예컨대 감염성 질병 또는 암을 치료하는 방법에 있어서의 그러한 결합 단백질, 핵산 또는 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다.
T 세포는 적응 면역 반응에서 중요한 역할을 하고, 감염된 또는 암성 세포에서 외래 단백질을 특이적으로 인식한다. 이러한 인식은 주요 조직적합성 복합체(MHC)에 의해 디스플레이되는 외래 단백질 항원에 결합하는 T 세포 수용체(TCR)를 통해 일어난다. TCR 리간드는 전형적으로 비교적 약하게 결합하지만, 심지어 소수의 리간드라도 T 세포를 완전히 활성화하기에 충분하다(문헌[Birnbaum et al, Proc Natl Acad Sci U S A; 111(49):17576-81 (2014)]; 문헌[Davis et al, Annu Rev Immunol;16:523-44 (1998)]). T 세포 수용체는 그 자체로는 신호를 전달하지 않지만, 이는 CD3εγ 및 CD3εδ 이종이량체 및 CD3ζζ 동종이량체를 전형적으로 포함하는 다중-하위단위 신호전달 장치와 비공유적으로 회합되며, 이들은 집합적으로 TCR/CD3 복합체를 형성한다. 면역 적응 반응에서의 주요 역할로 인해, 이러한 다중-단백질 TCR/CD3 복합체는 암 면역요법에서 새로운 치료 도구의 개발에 있어서 현저한 관심을 끌어 왔다. 이들 도구 중에는 T 세포 인게이저(T cell engager)가 있다.
T 세포 인게이저(TCE)는, 예를 들어 종양 세포 상의 표적 항원에, 그리고 T 세포 상의 TCR/CD3 복합체에 동시에 결합하여, 정상 TCR-MHC 상호작용을 우회함으로써 T 세포 활성화를 촉발시키는 단백질이다(문헌[Ellerman, Methods;154:102-117 (2019)]). TCE의 예는 BiTE® 분자(Amgen)이다.
현재, T 세포 인게이저는 전형적으로, TCR/CD3 복합체의 일정한 성분, 예컨대 CD3, 및 종양-관련 항원(TAA)에 대해 유도된 이중특이성 항체 또는 항체 단편의 형태를 갖는다. 그러나, 이들 T 세포 인게이징 치료 도구는 몇 가지 불리한 점을 제시하는데, 이를 테면, 높은 생산 비용 및 다수의 질병-관련 항원의 표적화에 대한 무능력을 들 수 있으며, 이와 동시에 또한, 사이토카인 방출 증후군(CRS)(문헌[Shimabukuro-Vornhagen et al, J Immunother Cancer; 6(1):56 (2018)]; 문헌[Labrjin et al, Nat Rev Drug Discov;18(8):585-608 (2019)]) 및 표적 적중(on target)/표적 이탈(off tumor) 독성(문헌[Weiner et al, Cancer Res.; 55 (20): 4586―4593 (1995)]; 문헌[Weiner et al, Cancer Immunol. Immunother.; 42 (3);141―150 (1996)])과 같은 소정의 몇몇 부작용을 야기할 위험을 갖는다는 것을 들 수 있다. 예를 들어, EGFR을 표적화하는 TCE를 비인간 영장류에서 시험하였는데, 이때 안전성 조사결과는 더 낮은 수준의 항원을 발현하는 정상 조직과의 인게이먼트와 관련되었다(문헌[Lutterbuese et al, Proc Natl Acad Sci U S A; 107(28):12605-10 (2010)]). 추가적으로, HER-표적화 TCE의 고친화성 CD3-결합제는 2차 림프 조직에 우선적으로 분포되어, 전신 노출을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(문헌[Mandikian et al, Mol. Cancer Ther.; 17 (4): 776 LP-785 (2018)]). 항체-기반 T 세포 인게이저는 종종, 천연 TCR-MHC 상호작용과 대비하여, CD3에 대해 1000배 더 높은 친화도를 나타낸다(문헌[Wu et al, Pharmacol Ther; 182:161―75 (2018)]; 국제 특허 출원 공개 WO2014/167022호; 문헌[Junntila et al, Cancer Res.; 19:5561―71 (2014)]; 문헌[Yang et al, J Immunol Aug.; 15 (137):1097―100 (1986)]). 이러한 높은 친화도는 T 세포 활성화 및 종양 세포 살해의 관점에서 더 낮은 효율과 상관되어 있다(문헌[Bortoletto et al, Eur. J. Immunol. 32; 11: 3102―3107 (2002)]; 문헌[Ellerman, Methods;154:102-117(2019)]; 문헌[Mandikian et al, Mol. Cancer Ther.;17 (4): 776 LP-785 (2018)]; 문헌[Vafa et al, Frontiers in Oncology; 10: 446 (2020)]).
따라서, T 세포 인게이저 포맷에 사용되기에 적합한 유익한 특성을 갖는 새로운 CD3-특이적 결합 단백질에 대한, 그리고 CD3-특이적 결합으로부터 유익한, 암 및 감염성 질병을 포함한 질병의 치료를 위한 치료적 접근법에 대한 필요성이 남아 있다.
본 발명은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질을 제공한다. 질병-관련 항원(DAA), 예컨대 감염-관련 항원(IAA), 바람직하게는 바이러스-관련 항원(VAA), 또는 종양-관련 항원(TAA)에 대한 결합 특이성을 갖는 하나 이상의 결합제, 바람직하게는 안키린 반복 도메인에 연결된 그러한 결합 단백질이 추가로 제공되며, 상기 결합제는 상기 결합 단백질에 의한 T 세포의 DAA-의존성 활성화를 촉진시킨다. 또한, 본 발명은 그러한 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 및 그러한 결합 단백질 또는 핵산을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, T 세포의 국재화된 활성화, 예를 들어 종양-국재화된 또는 감염-국재화된 활성화를 위한 방법에 있어서의, 그리고 포유동물 - 인간을 포함함 - 에서 질병, 예컨대 감염성 질병, 바람직하게는 바이러스성 감염성 질병, 또는 암을 치료하는 방법에 있어서의 그러한 결합 단백질, 핵산 또는 약제학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 출원인은 T 세포 인게이저 의약품에 사용되기에 적합한 그리고 유익한 특성을 갖는 CD3-특이적 결합 도메인을 설계하고, 생성하고, 선택하기 위한 연구 수행에 전념하였다(하기 참조). 복잡한 스크리닝 공정 이후에, 합리적인 설계와 조합하여 수회 라운드의 친화도 성숙을 수행한 결과로서, 4개의 CD3-특이적 안키린 반복 단백질, 즉, DARPin® 단백질 #1(서열 번호 1), DARPin® 단백질 #2(서열 번호 2), DARPin® 단백질 #3(서열 번호 3) 및 DARPin® 단백질 #4(서열 번호 4)를 조작하였다. 이들 재조합 결합 단백질은 모두 CD3 및/또는 T 세포에 대한 상이한 결합 친화도를 나타내면서 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인을 포함한다. 결합 단백질은, 표적화된 T 세포 활성화를 달성하기에 적절하게 높고, 동시에 (예를 들어, 너무 많은 T 세포 활성화에 의해 야기된) 유해 효과의 위험이 감소될 정도로 비교적 낮은 CD3 및/또는 T 세포에 대한 결합 친화도를 갖는다. 이들 재조합 결합 단백질은 하나 이상의 DAA-특이적 결합제(들)에 연결되어 기능성 T 세포 인게이저(TCE) 분자 - 다중특이성 TCE를 포함함 - 를 형성하기에 적합한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 결합 단백질은 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함할 수 있다. TCE 포맷의 그러한 결합 단백질은 질병-관련 세포, 예컨대 종양 세포 또는 감염된 세포 상에의 각각의 DAA의 존재에 따라 국재화된 그리고 표적화된 방식으로 면역 시스템, 더 구체적으로는 T 세포에 인게이징할 수 있다. 따라서, CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인(예컨대, 서열 번호 1, 2, 3 또는 4 또는 이들의 변이체)을 포함하는 본 발명의 결합 단백질은, 특히 TCE 약물 후보의 생성에, 그리고 T 세포의 과잉자극 및/또는 유해 효과를 피하거나 감소시키면서 T 세포의 효율적인 활성화를 수반하는 인간에서의 질병을 치료하는 방법에 사용되는 CD3-특이적 결합 단백질의 "툴박스(toolbox)"를 나타낸다.
일 태양에서, 본 발명은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 모듈을 포함하며, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5 내지 9, 및 (2) 서열 번호 5 내지 9 중 어느 하나에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은 제1 안키린 반복 모듈이고, 상기 안키린 반복 도메인은 제2 안키린 반복 모듈을 추가로 포함하며, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5 내지 9, 및 (2) 서열 번호 5 내지 9 중 어느 하나에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 특정 일 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5, 및 (2) 서열 번호 5에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 특정 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 특정 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 8, 및 (2) 서열 번호 8의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 추가의 특정 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 9, 및 (2) 서열 번호 9의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다.
일 태양에서, 본 발명은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1 내지 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 1 내지 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다.
일 실시 형태에서, 임의의 상기 결합 단백질은 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합한다. 추가의 실시 형태에서, 임의의 상기 결합 단백질은 2 내지 900 nM, 바람직하게는 약 5 내지 약 400 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합한다. 추가의 실시 형태에서, 상기 결합 단백질 내에 포함된, 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 65℃ 초과, 바람직하게는 70℃ 초과이다. 추가의 실시 형태에서, 상기 결합 단백질 내에 포함된, 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 70℃ 초과, 바람직하게는 75℃ 초과이다. 특정 일 실시 형태에서, 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 결합 단백질은 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고/하거나, 2 내지 900 nM, 바람직하게는 약 5 내지 약 400 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합한다. 특정 일 실시 형태에서, 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 75℃ 초과, 바람직하게는 80℃ 초과이고/이거나, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 75℃ 초과, 바람직하게는 80℃ 초과이고/이거나, 상기 결합 단백질은 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고/하거나, 상기 결합 단백질은 2 내지 900 nM, 바람직하게는 약 5 내지 약 400 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합한다. 다른 특정 실시 형태에서, 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 결합 단백질은 10-7 M 미만, 바람직하게는 약 5 × 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고/하거나, 2 내지 900 nM, 바람직하게는 약 250 내지 약 400 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합한다. 다른 특정 실시 형태에서, 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 72℃ 초과, 바람직하게는 77℃ 초과이고/이거나, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 70℃ 초과, 바람직하게는 75℃ 초과이고/이거나, 상기 결합 단백질은 10-7 M 미만, 바람직하게는 약 5 × 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고/하거나, 상기 결합 단백질은 2 내지 900 nM, 바람직하게는 약 250 내지 약 400 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합한다. 대안적인 특정 실시 형태에서, 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 결합 단백질은 10-7 M 미만, 바람직하게는 약 2 × 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고/하거나, 2 내지 900 nM, 바람직하게는 약 50 내지 약 100 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합한다. 다른 특정 실시 형태에서, 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 65℃ 초과, 바람직하게는 70℃ 초과이고/이거나, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 70℃ 초과, 바람직하게는 75℃ 초과이고/이거나, 상기 결합 단백질은 10-7 M 미만, 바람직하게는 약 2 × 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고/하거나, 상기 결합 단백질은 2 내지 900 nM, 바람직하게는 약 50 내지 약 100 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합한다. 다른 대안적인 실시 형태에서, 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 결합 단백질은 10-7 M 미만, 바람직하게는 약 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고/하거나, 2 내지 900 nM, 바람직하게는 약 5 내지 약 15 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합한다. 다른 특정 실시 형태에서, 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 73℃ 초과, 바람직하게는 78℃ 초과이고/이거나, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 70℃ 초과, 바람직하게는 75℃ 초과이고/이거나, 상기 결합 단백질은 10-7 M 미만, 바람직하게는 약 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고/하거나, 상기 결합 단백질은 2 내지 900 nM, 바람직하게는 약 5 내지 약 15 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합한다.
다른 태양에서, 본 발명은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 결합 단백질은 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 결합제는 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이다. 추가의 실시 형태에서, 상기 질병-관련 항원은 감염-관련 항원(IAA), 바람직하게는 바이러스-관련 항원(VAA)이다. 다른 실시 형태에서, 상기 질병-관련 항원은 종양-관련 항원(TAA)이다. 본 발명의 일 태양에서, 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인에 공유적으로 결합되거나 그것에 융합된다. 특정 일 실시 형태에서, 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는, 펩티드 링커, 바람직하게는 프롤린-트레오닌 풍부 펩티드 링커를 사용하여, CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인에 공유적으로 결합된다. 일 실시 형태에서, 상기 펩티드 링커의 아미노산 서열은 1 내지 50개의 아미노산, 바람직하게는 6 내지 38개의 아미노산의 길이를 갖는다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 상기 결합 단백질 내의 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인의 N-말단에 위치된다.
다른 태양에서, 본 발명은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질을 제공하며, 상기 결합 단백질은 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 반감기 연장 모이어티는 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이다. 특정 일 실시 형태에서, 상기 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 서열 번호 28 내지 30 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 반감기 연장 모이어티는 상기 결합 단백질 내의 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인의 N-말단에 위치된다.
다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 및 본 발명의 결합 단백질 또는 본 발명의 핵산, 및 선택적으로, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
다른 태양에서, 본 발명은 의학적 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 결합 단백질, 본 발명의 핵산, 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 제공한다. 일 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 감염성 질병, 바람직하게는 바이러스성 감염성 질병이다. 다른 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 암이다.
다른 태양에서, 본 발명은 포유동물, 바람직하게는 인간에서의 T 세포의 종양-국재화된 활성화 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 포유동물에게 본 발명의 결합 단백질, 본 발명의 핵산, 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 일 실시 형태에서, 그러한 방법은 종양을 갖는 인간 환자를 포함한 포유동물에게 종양-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는 본 발명의 결합 단백질을 투여하여, 종양 조직에서 국재화된 T-세포 활성화를 가져오는 단계를 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명은 포유동물, 바람직하게는 인간에서의 T 세포의 감염-국재화된 활성화 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 포유동물에게 본 발명의 결합 단백질, 본 발명의 핵산, 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 일 실시 형태에서, 그러한 방법은 바이러스성 감염을 갖는 인간 환자를 포함한 포유동물에게 바이러스-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는 본 발명의 결합 단백질을 투여하여, 감염된 조직에서 국재화된 T-세포 활성화를 가져오는 단계를 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명은 인간 환자에서 의학적 질환을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 환자에게 본 발명의 결합 단백질, 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 특정 일 실시 형태에서, 그러한 방법은 상기 환자에게 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는 본 발명의 결합 단백질, 본 발명의 그러한 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 또는 본 발명의 그러한 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 암이다. 다른 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 감염성 질병, 바람직하게는 바이러스성 감염성 질병이다.
특정 일 실시 형태에서, 의학적 질환은 암이며, 여기서 암 또는 종양 조직은 종양-관련 항원을 발현하거나 디스플레이하는 세포를 포함하고, 상기 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 상기 세포에서 발현되거나 디스플레이되는 상기 종양-관련 항원에 결합한다. 특정 일 실시 형태에서, 상기 질병-관련 항원은 상기 암 또는 종양 조직에서 발현되거나 과발현되는 세포 표면 단백질의 세포외 도메인이다. 다른 특정 실시 형태에서, 상기 종양-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 펩티드-MHC 복합체에 결합하며, 여기서 상기 펩티드는 종양 세포(예컨대, NY-ESO-1 또는 MAGE-A3)에서 발현되는 단백질로부터 유래된다. 특정 일 실시 형태에서, 상기 MHC는 MHC 클래스 I이다. 일 실시 형태에서, 상기 암은 암종, 육종, 골수종, 백혈병, 림프종 및 혼합형 암(mixed type-cancer)으로부터 선택된다.
다른 특정 실시 형태에서, 의학적 질환은 감염성 질병, 바람직하게는 바이러스성 감염성 질병이며, 여기서 감염된 조직은 감염-관련 항원, 바람직하게는 바이러스-관련 항원을 발현하거나 디스플레이하는 세포를 포함하고, 상기 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 상기 세포에서 발현되거나 디스플레이되는 상기 감염-관련 항원에 결합한다. 특정 일 실시 형태에서, 상기 질병-관련 항원은 상기 감염된 조직에서 발현되거나 과발현되는 바이러스 단백질의 세포외 도메인이다. 다른 특정 실시 형태에서, 상기 바이러스-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 펩티드-MHC 복합체에 결합하며, 여기서 상기 펩티드는 감염성 인자의 단백질, 예컨대 세균성 감염성 인자 또는 바이러스성 감염성 인자, 바람직하게는 바이러스성 감염성 인자(예컨대, HBcAg 또는 EBNA-1)로부터 유래된다. 특정 일 실시 형태에서, 상기 MHC는 MHC 클래스 I이다.
본 발명은 추가로 본 발명의 재조합 결합 단백질, 본 발명의 핵산 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명은 추가로 본 발명의 재조합 결합 단백질을 생성하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 (i) 적합한 숙주 세포(원핵 또는 진핵 세포)에서 상기 재조합 결합 단백질을 발현시키는 단계, 및 (ii) 상기 재조합 결합 단백질을 (예를 들어, 크로마토그래피를 사용하여) 정제하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 제공된 본 발명에 기초하여, 당업자는 단지 일반적인 실험을 사용하여, 본 명세서에서 설명된 본 발명의 구체적인 실시 형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 하기 실시 형태(E)에 의해 포함되도록 의도된다.
E1. CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질로서,
상기 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 모듈을 포함하며, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5 내지 9, 및 (2) 서열 번호 5 내지 9 중 어느 하나에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 재조합 결합 단백질.
E2. E1에 있어서, 상기 안키린 반복 모듈은 제1 안키린 반복 모듈이고, 상기 안키린 반복 도메인은 제2 안키린 반복 모듈을 추가로 포함하며, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5 내지 9, 및 (2) 서열 번호 5 내지 9 중 어느 하나에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 결합 단백질.
E3. E2에 있어서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5, 및 (2) 서열 번호 5에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
E4. E2에 있어서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
E5. E2에 있어서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 8, 및 (2) 서열 번호 8의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
E6. E2에 있어서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 9, 및 (2) 서열 번호 9의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
E7. E2 내지 E6 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치되는, 결합 단백질.
E8. CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질로서,
상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1 내지 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 1 내지 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환되는, 재조합 결합 단백질.
E9. E1 내지 E8 중 어느 하나에 있어서, 상기 결합 단백질은 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하는, 결합 단백질.
E10. E1 내지 E9 중 어느 하나에 있어서, 상기 결합 단백질은 2 내지 900 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하는, 결합 단백질.
E11. E1 내지 E10 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
E12. E1 내지 E10 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
E13. E12에 있어서, 상기 결합 단백질은 약 5 × 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하는, 결합 단백질.
E14. E12 또는 E13에 있어서, 상기 결합 단백질은 약 250 내지 약 400 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하는, 결합 단백질.
E15. E1 내지 E10 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
E16. E15에 있어서, 상기 결합 단백질은 약 2 × 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하는, 결합 단백질.
E17. E15 또는 E16에 있어서, 상기 결합 단백질은 약 50 내지 약 100 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하는, 결합 단백질.
E18. E1 내지 E10 중 어느 하나에 있어서, 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
E19. E18에 있어서, 상기 결합 단백질은 약 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하는, 결합 단백질.
E20. E18 또는 E19에 있어서, 상기 결합 단백질은 약 5 내지 약 15 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하는, 결합 단백질.
E21. E1 내지 E20 중 어느 하나에 있어서, 상기 결합 단백질은 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는, 결합 단백질.
E22. E21에 있어서, 상기 결합제는 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인인, 결합 단백질.
E23. E21 또는 E22에 있어서, 상기 질병-관련 항원은 감염-관련 항원(IAA), 바람직하게는 바이러스-관련 항원(VAA), 또는 종양-관련 항원(TAA)인, 결합 단백질.
E24. E21 내지 E23 중 어느 하나에 있어서, 상기 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 상기 결합 단백질 내의 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인의 N-말단에 위치되는, 결합 단백질.
E25. E21 내지 E24 중 어느 하나에 있어서, 상기 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 펩티드 링커를 사용하여 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인에 공유적으로 연결되는, 결합 단백질.
E26. E25에 있어서, 상기 펩티드 링커는 프롤린-트레오닌-풍부 펩티드 링커인, 결합 단백질.
E27. E25 또는 E26에 있어서, 상기 펩티드 링커의 아미노산 서열은 1 내지 50개의 아미노산, 바람직하게는 6 내지 38개의 아미노산의 길이를 갖는, 결합 단백질.
E28. E1 내지 E27 중 어느 하나에 있어서, 상기 결합 단백질은 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함하는, 결합 단백질.
E29. E28에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티는 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 포함하는, 결합 단백질.
E30. E29에 있어서, 상기 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 서열 번호 28 내지 30 중 어느 하나, 바람직하게는 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함하는 안키린 반복 도메인인, 결합 단백질.
E31. E28 내지 E30 중 어느 하나에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티는 상기 결합 단백질 내의 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인의 N-말단에 위치되는, 결합 단백질.
E32. E1 내지 E31 중 어느 하나의 결합 단백질을 인코딩하는 핵산.
E33. E1 내지 E31 중 어느 하나의 결합 단백질 또는 E32의 핵산, 및 선택적으로, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
E34. 의학적 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 E1 내지 E31 중 어느 하나의 결합 단백질, E32의 핵산, 또는 E33의 약제학적 조성물.
E35. E34에 있어서, 상기 의학적 질환은 감염성 질병, 바람직하게는 바이러스성 감염성 질병, 또는 암인, 결합 단백질.
E36. 인간을 포함한 포유동물에서의 T 세포의 종양-국재화된 활성화 방법으로서,
상기 포유동물에게 E1 내지 E31 중 어느 하나의 결합 단백질, E32의 핵산, 또는 E33의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E37. 인간을 포함한 포유동물에서의 T 세포의 감염-국재화된 활성화 방법으로서,
상기 포유동물에게 E1 내지 E31 중 어느 하나의 결합 단백질, E32의 핵산, 또는 E33의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E38. 의학적 질환의 치료 방법으로서,
이를 필요로 하는 환자에게 E1 내지 E31 중 어느 하나의 결합 단백질, E32의 핵산, 또는 E33의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
E39. E38에 있어서, 상기 의학적 질환은 감염성 질병, 바람직하게는 바이러스성 감염성 질병, 또는 암인, 방법.
도 1: 인간 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 4개의 선택된 안키린 반복 단백질, 즉, DARPin® 단백질 #1, DARPin® 단백질 #2, DARPin® 단백질 #3 및 DARPin® 단백질 #4의 정제에 대한 SDS-PAGE 겔 분석.. M은 단백질 크기 마커에 상응한다(환원된 SDS-PAGE, NuPAGE 4 내지 12%, Bis-Tris(invitrogen) 겔; 5 μg/레인; MES 완충액; 일시적 청색 염색). 마커 단백질의 분자량(kDa)이 표시되어 있다. 레인 1: 단백질 크기 마커; 레인 2: 정제된 DARPin® 단백질 #1; 레인 3: 정제된 DARPin® 단백질 #2, 레인 4: 정제된 DARPin® 단백질 #3, 레인 5: 정제된 DARPin® 단백질 #4.
도 2a 내지 도 2d. UV 분광법을 사용한 예시적인 설계된 안키린 반복 단백질의 안정성 평가. DARPin® 단백질 #1 내지 #4를, Nanodrop에 의한 UV-VIS 측정 전에, TBS(pH 8.0)(50 mM Tris, 500 mM NaCl) 중에 1:1로 희석시키고 잘 혼합하였다. 샘플을 하기 조건에서 평가하였다: -70℃일 때 vs. 50℃에서 18일 동안 열-스트레스가 가해졌을 때. 320 nm에서 가시적인 흡수(침전의 지표) 없음. 참조 샘플 및 스트레스가 가해진 샘플의 스펙트럼에서 차이 없음.
도 3. 환원성 SDS-PAGE; 10% Bis-Tris 겔; 5 μg/레인; MES 완충액; 일시적인 청색 염색을 사용한 예시적인 설계된 안키린 반복 단백질의 안정성 평가. 예상된 MW: 14.5 kDa. 레인 1, M: 염색 전 마커 - 마커 단백질의 분자량(kDa)이 표시되어 있음; 레인 2 및 레인 3: 하기 조건에서의 DARPin® 단백질 #1: -70℃일 때 vs. 50℃에서 18일 동안 열-스트레스가 가해졌을 때; 레인 4 및 레인 5: 하기 조건에서의 DARPin® 단백질 #2: -70℃일 때 vs. 50℃에서 18일 동안 열-스트레스가 가해졌을 때; 레인 6 및 레인 7: 하기 조건에서의 DARPin® 단백질 #3: -70℃일 때 vs. 50℃에서 18일 동안 열-스트레스가 가해졌을 때; 레인 8 및 레인 9: 하기 조건에서의 DARPin® 단백질 #4: -70℃일 때 vs. 50℃에서 18일 동안 열-스트레스가 가해졌을 때.
도 4a 내지 도 4d. 크기-배제 크로마토그래피(SEC)를 사용한 예시적인 설계된 안키린 반복 단백질의 안정성 평가. DARPin® #1 내지 #4 단백질 샘플을 TBS(pH 8.0)(50 mM Tris, 500 mM NaCl) 중에 2 mg/ml로 희석시키고, GE Superdex 200 150/5 Increased 컬럼에 걸쳐 전개시켰다. 트레이스를 280 nm에서 분석하였다. 흑색: -70℃에서 저장된 참조 샘플; 회색: 50℃에서 18일 동안 인큐베이션된 열-스트레스가 가해진 샘플 이들 곡선은 대부분 중첩된다.
도 5a 내지 도 5d. 원편광 이색성(CD) 분광법을 사용한 예시적인 설계된 안키린 반복 단백질의 열안정성 평가. DARPin® 단백질 #1 내지 #4(각각 A 내지 D)의 샘플을 TBS(pH 8.0)(50 mM Tris, 500 mM NaCl) 중에 2 μM로 희석시켰다. 단백질 풀림(정방향) 및 재접힘(역방향)을 모니터링하였다. 모든 단백질은 Tm이 65℃보다 높아짐에 따라 가역적 풀림을 나타내었다(그래프에서 점선으로 표시됨).
도 6a 내지 도 6d. 동적 광산란(DLS)에 의한 응집 개시 온도 Tagg의 결정. DARPin® 단백질 #1 내지 #4의 샘플을 TBS(pH 8.0)(50 mM Tris, 500 mM NaCl) 중에 1 mg/ml로 희석시키고, Tagg를 DLS에 의해 결정하였다(5개의 반복시험물, A1, A2, A3, A4, A5). 4개의 모든 시험된 안키린 반복 단백질은 80℃ 초과의 높은 Tagg를 나타내었다.
도 7a. 암컷 BALB/c 마우스에서의 예시적인 CD3-특이적 결합 단백질의 약동학적 분석. 이 도면은, 1 mg/kg의 단회 정맥내 볼루스 투여 후, 암컷 BALB/c 마우스(평균 +/- 최대/최소, 군당 마리수 N=3)에서의 DARPin® 단백질 #5, DARPin® 단백질 #6, DARPin® 단백질 #7 및 DARPin® 단백질 #8의 군 평균 혈청 농도-시간 프로파일을 나타낸다.
도 7b: DARPin® 단백질 #3으로 예시된, 인간 CD3에 결합하는 결합 단백질의 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석. 다양한 농도(8, 16, 32, 및 64 nM)의 정제된 안키린 반복 단백질을 결합 속도(on-rate) 및 해리 속도(off-rate) 측정을 위해 고정화된 인간 CD3을 갖는 GLC 칩에 적용하였다. 얻어진 SPR 트레이스 분석을 사용하여 안키린 반복 단백질-CD3 상호작용을 결정하였다. RU, 공명 단위; s, 초 단위의 시간.
도 8a 및 도 8b. T 세포에 대한 예시된 결합 단백질의 CD3 결합. Pan-T 세포 상의 CD3에 대한 결합을 Mirrorball에 의해 평가하였다. 반감기 연장(HLE)을 갖지 않거나 도 8a 또는 이를 갖는 도 8b, 벤치마크 대조 분자(기지의 벤치마크 T 세포 인게이저, 즉, TAA2에 대한 결합 특이성을 갖는 TCE1 및 TAA3에 대한 결합 특이성을 갖는 TCE2) 및 선택된 안키린 반복 단백질, DARPin® 단백질 A, DARPin® 단백질 B, DARPin® 단백질 C 및 DARPin® 단백질 D가 제시되어 있다. 반감기 연장된 단백질 (b)는 (a)에 나타낸 상응하는 비-HLE 분자와 비교하여 유사한 결합을 나타낸다. 5명의 상이한 공여자로부터의 Pan-T 세포를 시험하였으며, 1명의 대표적인 공여자가 여기에 나타나 있다. (* 음성 대조군: 단지 TAA2 및 TAA3(각각 반감기 연장을 가진 것 및 이를 갖지 않은 것)에 대해서만 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 단백질).
도 9a 및 도 9b. 단기 표적 세포 살해(LDH). Pan-T 세포(이펙터 세포(E)로서)와 TAA2/TAA3-발현 종양 세포(표적 세포(T)로서)를 5:1의 E:T 비로 인큐베이션하고, 지시된 분자의 연속 희석물의 존재 하에서 48시간의 공동배양 후에 상층액 중에의 LDH 방출에 의해 종양 세포 살해를 평가하였다. 반감기 연장(HLE)을 갖지 않거나 도 9a 또는 이를 갖는 도 9b, 벤치마크 대조 분자(기지의 벤치마크 T 세포 인게이저, 즉, TAA2에 대한 결합 특이성을 갖는 TCE1) 및 선택된 안키린 반복 단백질, DARPin® 단백질 A, DARPin® 단백질 B, DARPin® 단백질 C 및 DARPin® 단백질 D가 제시되어 있다. (a): 반감기 연장을 갖지 않은 단백질의 경우, DARPin® 단백질 B 및 DARPin® 단백질 C에 의해 유도된 종양 세포 살해는 벤치마크 분자와 비견되는 반면, DARPin® 단백질 D 및 DARPin® 단백질 A는 세포독성에 있어서 더 낮은 효력(potency)을 나타낸다. (b): 반감기 연장된 단백질은 (a)에 나타낸 상응하는 비-HLE 분자와 대비하여 효력에 있어서 4 내지 70배 감소를 나타낸다. 5명의 상이한 공여자로부터의 Pan-T 세포를 시험하였으며, 1명의 대표적인 공여자가 여기에 나타나 있다. (* 음성 대조군: TAA2 및 TAA3(각각 반감기 연장을 가진 것 또는 이를 갖지 않은 것)에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 단백질).
도 10a 및 도 10b. 활성화 마커 CD25에 의해 측정된 단기 T 세포 활성화. Pan-T 세포와 TAA2/TAA3-발현 종양 세포를 1:1의 E:T 비로 인큐베이션하고, 지시된 분자의 연속 희석물의 존재 하에서 24시간의 공동배양 후에 FACS에 의해 T-세포 활성화를 평가하였다. 활성화된 T-세포를 살아있는 CD8+/CD25+ 세포로서 게이팅하였다. 반감기 연장(HLE)을 갖지 않거나 도 10a 또는 이를 갖는 도 10b, 벤치마크 대조 분자(기지의 벤치마크 T 세포 인게이저, 즉, TAA2에 대한 결합 특이성을 갖는 TCE1) 및 선택된 안키린 반복 단백질, DARPin® 단백질 A, DARPin® 단백질 B, DARPin® 단백질 C 및 DARPin® 단백질 D가 제시되어 있다. (a): 반감기 연장을 갖지 않은 경우에, DARPin® 단백질 B 및 DARPin® 단백질 C에 의해 유도된 T-세포 활성화는 벤치마크와 비견되는 반면, DARPin® 단백질 D 및 DARPin® 단백질 A는 더 낮은 효력을 나타낸다. (b): 반감기 연장된 단백질은 (a)에 나타낸 상응하는 비-HLE 분자와 대비하여 효력에 있어서 4 내지 100배 감소를 나타낸다. 7명의 상이한 공여자로부터의 Pan-T 세포를 시험하였으며, 1명의 대표적인 공여자가 여기에 나타나 있다. (* 음성 대조군: 단지 TAA2 및 TAA3(각각 반감기 연장을 가진 것 또는 이를 갖지 않은 것)에 대해서만 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 단백질).
도 11a 및 도 11b. IFNγ 분비에 의해 측정된 단기 T 세포 활성화. Pan-T 세포와 TAA2/TAA3-발현 종양 세포를 1:1의 E:T 비로 인큐베이션하였다. 지시된 분자의 연속 희석물의 존재 하에서의 24시간 공동배양 후에, 배양 상층액 중에의 IFNγ 분비를 ELISA에 의해 분석하였다. 반감기 연장(HLE)을 갖지 않거나 도 11a 또는 이를 갖는 도 11b, 벤치마크 대조 분자(기지의 벤치마크 T 세포 인게이저, 즉, TAA2에 대한 결합 특이성을 갖는 TCE1) 및 선택된 안키린 반복 단백질, DARPin® 단백질 A, DARPin® 단백질 B, DARPin® 단백질 C 및 DARPin® 단백질 D가 제시되어 있다. (a): 반감기 연장을 갖지 않은 경우에, DARPin® 단백질 B 및 DARPin® 단백질 C에 의해 유도된 T-세포 활성화는 벤치마크 분자와 비견되는 반면, DARPin® 단백질 D 및 v118 DARPin® 단백질 A는 더 낮은 효력을 나타낸다. (b): 반감기 연장된 단백질은 (a)에 나타낸 상응하는 비-HLE 분자와 대비하여 효력에 있어서 3 내지 20배 감소를 나타낸다. 4명의 상이한 공여자로부터의 Pan-T 세포를 시험하였으며, 1명의 대표적인 공여자가 여기에 나타나 있다. (* 음성 대조군: 단지 TAA2 및 TAA3(각각 반감기 연장을 가진 것 또는 이를 갖지 않은 것)에 대해서만 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 단백질).
도 12. 장기 종양 세포 살해. Pan-T 세포와 TAA2/TAA3-발현 종양 세포를 5:1의 E:T 비로 인큐베이션하고, 지시된 분자의 연속 희석물의 존재 하에서 6일의 공동배양에 걸쳐 IncuCyte에 의해 종양 세포 살해를 평가하였다. 종양 세포 살해는 아넥신(Annexin) V 염색의 곡선 아래 면적과 세포 증식 사이의 비로서 계산된다. 반감기 연장(HLE)을 갖지 않거나 또는 이를 갖는, 2개의 벤치마크 대조 분자(기지의 벤치마크 T 세포 인게이저, 즉, TAA2에 대한 결합 특이성을 갖는 TCE1 및 TAA3에 대한 결합 특이성을 갖는 TCE2) 및 선택된 안키린 반복 단백질, DARPin® 단백질 A, DARPin® 단백질 B, DARPin® 단백질 C 및 DARPin® 단백질 D가 제시되어 있다. 데이터는, 반감기 연장과 무관하게, 대부분의 시험된 단백질에 대해 벤치마크 분자와 비견되는 강력하고 특이적인 종양 세포 살해를 나타낸다. 단지 더 낮은 친화도의 DARPin® 단백질 A만이 살해 효력의 현저한 감소를 나타낸다. 농도는, 좌측에서 우측으로, 2 nM, 그리고 후속으로 벤치마크 및 HSA-결합 도메인을 갖지 않는 시험된 단백질에 대해 각각 1/10로 희석된 농도, 그리고 20 mM, 그리고 후속으로 HSA-결합 도메인을 갖는 시험된 단백질에 대해 각각 1/10로 희석된 농도이다. 5명의 상이한 공여자로부터의 Pan-T 세포를 사용하였으며, 1명의 대표적인 공여자가 여기에 나타나 있다.
도 13a 및 도 13b. 장기 T-세포 활성화. Pan-T 세포와 TAA2/TAA3-발현 종양 세포를 1:1의 E:T 비로 인큐베이션하고, 지시된 분자의 연속 희석물의 존재 하에서 5일의 공동배양 후에 FACS에 의해 T-세포 활성화를 평가하였다. 활성화된 T-세포를 살아있는 CD8+/CD25+ 세포로서 게이팅하였다. 반감기 연장(HLE)을 갖지 않거나 또는 이를 갖는, 벤치마크 대조 분자(기지의 벤치마크 T 세포 인게이저, 즉, TAA2에 대한 결합 특이성을 갖는 TCE1 및 TAA3에 대한 결합 특이성을 갖는 TCE2) 및 선택된 안키린 반복 단백질, DARPin® 단백질 A, DARPin® 단백질 B, DARPin® 단백질 C 및 DARPin® 단백질 D가 제시되어 있다. (a): 반감기 연장을 갖지 않은 경우에, DARPin® 단백질 B 및 DARPin® 단백질 C에 의해 유도된 T-세포 활성화는 벤치마크 분자와 비견되는 반면, DARPin® 단백질 A 및 DARPin® 단백질 D는 효력에 있어서 >100배 감소를 나타낸다. (b): 반감기 연장된 단백질은 (a)에 나타낸 상응하는 비-HLE 분자와 대비하여 효력에 있어서 >10배 감소를 나타낸다. 2명의 상이한 공여자로부터의 Pan-T 세포를 사용하였으며, 1명의 대표적인 공여자가 여기에 나타나 있다.
도 14a 및 도 14b. 장기 T-세포 증식. Pan-T 세포와 TAA2/TAA3-발현 종양 세포를 1:1의 E:T 비로 인큐베이션하고, 지시된 분자의 연속 희석물의 존재 하에서 5일의 공동배양 후에 FACS에 의해 T-세포 증식을 평가하였다. 증식성 T-세포를 적어도 1회의 세포 분열을 나타내는 CellTrace 바이올렛 양성 세포로서 게이팅하였다. 반감기 연장(HLE)을 갖지 않거나 또는 이를 갖는, 2개의 벤치마크 대조 분자(기지의 벤치마크 T 세포 인게이저, 즉, TAA2에 대한 결합 특이성을 갖는 TCE1 및 TAA3에 대한 결합 특이성을 갖는 TCE2) 및 선택된 안키린 반복 단백질, DARPin® 단백질 A, DARPin® 단백질 B, DARPin® 단백질 C 및 DARPin® 단백질 D가 제시되어 있다. (a): 반감기 연장을 갖지 않은 경우에, DARPin® 단백질 B 및 DARPin® 단백질 C에 의해 유도된 T-세포 증식은 벤치마크 분자와 비견되는 반면, DARPin® 단백질 A 및 DARPin® 단백질 D는 효력에 있어서 >100배 감소를 나타낸다. (b): 반감기 연장된 DARPin® 단백질은 (a)에 나타낸 상응하는 비-HLE 분자와 대비하여 효력에 있어서 >30배 감소를 나타낸다. 2명의 상이한 공여자로부터의 Pan-T 세포를 사용하였으며, 1명의 대표적인 공여자가 여기에 나타나 있다.
도 15a 내지 도 15c. 종양 세포 주사 후 시간 경과에 따른 종양 성장 및 마우스의 치료. 실시예 10에 나타낸 바와 같이 그리고 거기에 기재된 바와 같이, 비히클, 벤치마크 TAA3 T-세포 인게이저, DARPin® 단백질 #E, DARPin® 단백질 #F, DARPin® 단백질 #G 및 DARPin® 단백질 #H에 의한 치료를 수행하였다.
도 16a 및 도 16b. (a): hPBM이 복막내 주사되고, TAA2/TAA3/TAA4 발현 종양 세포가 피하 이종이식되고, PBS 1X(흑색 원), 0.5 mg/kg의 다중특이성 TCE 포맷의 DARPin® 단백질 #3(흑색 정사각형) 또는 0.5 mg/kg의 벤치마크 TAA3 T 세포 인게이저(흑색 삼각형)로 치료된 마우스(공여자당 마우스 마리수 n=5 / 2명의 hPBMC 공여자가 사용됨)에서의 시간 경과에 따른 종양 성장. 치료제를 실시예 10에 기재된 바와 같이 투여하였다. 데이터는 평균 + SEM으로 제시되어 있다. (b): 종양 세포 이종이식 후 일수 17에서의 종양 부피의 평가.
본 명세서에 개시되고 예시된 바와 같이, 본 발명은 CD3을 특이적으로 표적화하는 안키린 반복 단백질을 제공한다. 설계된 안키린 반복 단백질 라이브러리(국제 특허 출원 공개 WO2002/020565호; 문헌[Binz et al., Nat. Biotechnol. 22, 575-582, 2004]; 문헌[Stumpp et al., Drug Discov. Today 13, 695-701, 2008])가 높은 친화도로 표적에 결합하는 표적-특이적 설계된 안키린 반복 도메인의 선택에 사용될 수 있다. 결과적으로, 이러한 표적 특이적 설계된 안키린 반복 도메인은 질병의 치료를 위한 재조합 결합 단백질의 유용한 성분으로서 사용될 수 있다. 설계된 안키린 반복 단백질은 단일클론 항체의 제한을 극복하는 잠재성을 갖는 결합 분자들의 부류이며, 이에 따라 신규한 치료적 접근법을 가능하게 한다. 그러한 안키린 반복 단백질은 단일의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함할 수 있거나, 동일하거나 상이한 표적 특이성을 갖는 2개 이상의 설계된 안키린 반복 도메인의 조합을 포함할 수 있다(문헌[Stumpp et al., Drug Discov. Today 13, 695-701, 2008]; 미국 특허 제9,458,211호). 단지 단일의 설계된 안키린 반복 도메인만을 포함하는 안키린 반복 단백질은 높은 친화도 및 특이성으로 주어진 표적 단백질에 결합하도록 선택될 수 있는 작은 단백질(14 kDa)이다. 이들 특성, 및 하나의 단백질 내에 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 설계된 안키린 반복 도메인을 조합하는 것에 대한 가능성 - 이는 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 상이한 특이성을 갖는 결합 단백질을 생성함 - 은 설계된 안키린 반복 도메인이 이상적인 효능적, 길항적 및/또는 억제성 약물 후보가 되게 하고, 예를 들어 T 세포 인게이저 약물 분자의 신규한 설계를 포함한 신규한 약물 설계를 가능하게 한다. 더욱이, 상기 안키린 반복 단백질은 다양한 이펙터 기능을 갖도록 조작될 수 있어서(예를 들어, 세포독성제 또는 반감기 연장제), 완전히 새로운 약물 포맷을 가능하게 할 수 있다. 종합하면, 설계된 안키린 반복 단백질은 기존의 항체 약물을 능가할 잠재성을 갖는 차세대 단백질 치료제의 한 예이다.
DARPin®은 스위스 소재의 Molecular Partners AG가 소유한 상표이다.
일 태양에서, 본 발명은 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 안키린 반복 도메인은 CD3에 대한 결합 특이성을 가지며, 상기 안키린 반복 도메인은, (1) 서열 번호 5 내지 9, 및 (2) 서열 번호 5 내지 9 중 어느 하나에서의 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 안키린 반복 모듈을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5 내지 9, 및 (2) 서열 번호 5 내지 9 중 어느 하나에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5 내지 9, 및 (2) 서열 번호 5 내지 3 중 어느 하나에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5 내지 9, 및 (2) 서열 번호 5 내지 2 중 어느 하나에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5 내지 9, 및 (2) 서열 번호 5 내지 9 중 어느 하나에서의 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 아미노산 치환은 모두 상기 안키린 반복 모듈(들)의 프레임워크 위치에서 일어난다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은 서열 번호 5 내지 9로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은 서열 번호 5의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 5에서의 1개 또는 2개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은 서열 번호 6의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 6에서의 1개 또는 2개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은 서열 번호 7의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 7에서의 1개 또는 2개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은 서열 번호 8의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 8에서의 1개 또는 2개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은 서열 번호 9의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 9에서의 1개 또는 2개의 아미노산이 다른 아미노산에 의해 치환된 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 모듈은 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 제1 안키린 반복 모듈 및 제2 안키린 반복 모듈을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다. 일 실시 형태에서, 상기 제1 및 상기 제2 안키린 반복 모듈은 각각, (1) 서열 번호 5 내지 9, 및 (2) 서열 번호 5 내지 9 중 어느 하나에서의 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은, (1) 서열 번호 5 내지 9, 및 (2) 서열 번호 5 내지 9 중 어느 하나에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 제1 안키린 반복 모듈을 포함하고, (1) 서열 번호 5 내지 9, 및 (2) 서열 번호 5 내지 9 중 어느 하나에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 제2 안키린 반복 모듈을 추가로 포함한다.
특정 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5, 및 (2) 서열 번호 5에서의 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6에서의 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5, 및 (2) 서열 번호 5에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5, 및 (2) 서열 번호 5에서의 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5, 및 (2) 서열 번호 5에서의 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5, 및 (2) 서열 번호 5에서의 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5, 및 (2) 서열 번호 5에서의 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5, 및 (2) 서열 번호 5에서의 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5, 및 (2) 서열 번호 5에서의 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5, 및 (2) 서열 번호 5에서의 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다. 또한, 더 바람직한 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 서열 번호 5의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다.
특정 다른 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6에서의 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 일 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다. 또한, 더 바람직한 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 서열 번호 6의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다.
특정 다른 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 8, 및 (2) 서열 번호 8에서의 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 8, 및 (2) 서열 번호 8의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 8, 및 (2) 서열 번호 8의 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 8, 및 (2) 서열 번호 8의 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 8, 및 (2) 서열 번호 8의 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 8, 및 (2) 서열 번호 8의 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 8, 및 (2) 서열 번호 8의 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 8, 및 (2) 서열 번호 8의 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 일 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 8, 및 (2) 서열 번호 8의 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다. 또한, 더 바람직한 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 서열 번호 8의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다.
특정 다른 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 9, 및 (2) 서열 번호 9에서의 최대 9개, 또는 최대 8개, 또는 최대 7개, 또는 최대 6개, 또는 최대 5개, 또는 최대 4개, 또는 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 9, 및 (2) 서열 번호 9의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 9, 및 (2) 서열 번호 9의 최대 6개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 9, 및 (2) 서열 번호 9의 최대 5개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 9, 및 (2) 서열 번호 9의 최대 4개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 9, 및 (2) 서열 번호 9의 최대 3개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 9, 및 (2) 서열 번호 9의 최대 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 9, 및 (2) 서열 번호 9의 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 안키린 반복 도메인에서 상기 제1 안키린 반복 모듈은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 9, 및 (2) 서열 번호 9의 최대 3개, 또는 최대 2개, 또는 최대 1개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다. 또한, 더 바람직한 실시 형태에서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 서열 번호 7의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은 서열 번호 9의 아미노산 서열을 포함하며, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치된다.
바람직한 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기재되고 언급된 바와 같은 상기 안키린 반복 모듈(들)의 상기 아미노산 치환 모두는 상기 안키린 반복 모듈(들)의 프레임워크 위치에서 일어나며, 여기서 전형적으로 모듈(들)의 전체 구조는 치환에 의해 영향을 받지 않는다. 프레임워크 위치에서의 치환의 그러한 실시 형태는, 그러한 치환이 명시적으로 기재되어 있는지의 여부와 상관 없이 모든 실시 형태에 적용될 것이다.
바람직한 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기재되고 언급된 바와 같은 상기 안키린 반복 모듈(들)의 상기 아미노산 치환 모두는 서열 번호 5 내지 9의 상기 안키린 반복 모듈(들)의 프레임워크 위치에서 그리고 위치 3, 4, 6, 14 및 15 이외의, 바람직하게는 위치 2, 3, 4, 5, 6, 14 및 15 이외의 위치에서 일어나며, 여기서 전형적으로 모듈(들)의 전체 구조는 치환에 의해 영향을 받지 않는다.
다른 태양에서, 본 발명은 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 안키린 반복 도메인은 CD3에 대한 결합 특이성을 가지며, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1 내지 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 1 내지 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다.
따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1 내지 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 1 내지 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다.
일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 1의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1과 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1과 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1과 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 2의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 2의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 3의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 3의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3과 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3과 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3과 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다.
일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인에서의 잠재적 상호작용 잔기는 서열 번호 1 내지 4의 안키린 반복 도메인 중 어느 하나에서의 상응하는 위치와 동일하다.
일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 결합 단백질은 900, 700, 500, 400, 300, 200, 150, 100, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 또는 10 nM 미만의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 900 nM 미만의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고; 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 700 nM 미만의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고; 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 500 nM 미만의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고; 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 400 nM 미만의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고; 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 300 nM 미만의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고; 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 200 nM 미만의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고; 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 100 nM 미만의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고; 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 70 nM 미만의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고; 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 60 nM 미만의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고; 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 50 nM 미만의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고; 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 40 nM 미만의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고; 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 30 nM 미만의 EC50으로 T 세포에 결합하고; 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 20 nM 미만의 EC50으로 T 세포에 결합하고; 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 15 nM 미만의 EC50으로 T 세포에 결합하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 10 nM 미만의 EC50으로 T 세포에 결합한다.
일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 결합 단백질은 2 내지 900 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합한다. 다른 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 결합 단백질은 약 5 내지 약 400 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합한다. 추가의 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 결합 단백질은 약 250 내지 약 400 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고; 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 약 50 내지 약 100 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 약 5 내지 약 15 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합한다.
Mirrorball 레이저 스캐닝 이미징 세포측정법을 사용함으로써 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 재조합 결합 단백질의 T 세포 상의 CD3 결합(EC50)의 전형적인 그리고 바람직한 결정이 (1차 인간 T 세포를 사용하여) 실시예 5에 기재되어 있다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질의 상기 CD3 결합(EC50)은 실시예 5에 기재된 바와 같이 Mirrorball 레이저 스캐닝 이미징 세포측정법에 의해 1차 인간 T 세포에 대해 결정된다.
일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 결합 단백질은 2 내지 900 nM, 5 내지 400 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 결합 단백질은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1 내지 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 1 내지 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 2 내지 900 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 2 내지 900 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 2 내지 900 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 2 내지 900 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 2 내지 900 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 2 내지 900 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 결합 단백질은 2 내지 900 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1 내지 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 1 내지 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다.
일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 결합 단백질은 약 250 내지 약 400 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 결합 단백질은 서열 번호 2와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 2의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 2의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 250 내지 400 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 250 내지 400 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 250 내지 400 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 250 내지 400 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 250 내지 400 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 250 내지 400 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 결합 단백질은 약 250 내지 약 400 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 2의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 2의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다.
일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 결합 단백질은 약 50 내지 약 100 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 결합 단백질은 서열 번호 3과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 3의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 3의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 50 내지 100 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 50 내지 100 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3과 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 50 내지 100 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3과 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 50 내지 100 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3과 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 50 내지 100 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3과 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 50 내지 100 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 결합 단백질은 약 50 내지 약 100 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 3의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 3의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다.
일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 결합 단백질은 약 5 내지 약 15 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 결합 단백질은 서열 번호 4와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 5 내지 15 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 5 내지 15 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 5 내지 15 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 5 내지 15 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 5 내지 15 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 5 내지 15 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 결합 단백질은 약 5 내지 약 15 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 결합 단백질은 약 10-6 M 이하, 또는 약 10-7 M 이하, 또는 약 5 × 10-8 M 이하, 또는 약 2 × 10-8 M 이하, 또는 약 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 약 10-6 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합한다. 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 약 10-7 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합한다. 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 약 5 × 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 약 2 × 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합한다. 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 약 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합한다.
일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 결합 단백질은 10-6 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1 내지 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 1 내지 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 다른 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 결합 단백질은 10-7 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1 내지 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 1 내지 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 결합 단백질은 약 10-7 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1 내지 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 1 내지 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다.
일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 결합 단백질은 약 5 × 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1 내지 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 1 내지 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 약 5 × 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 5 × 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 5 × 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 5 × 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 5 × 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 5 × 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 결합 단백질은 약 5 × 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1 내지 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 1 내지 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다.
일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 결합 단백질은 약 2 × 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 4와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1 내지 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 3 또는 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 약 2 × 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 4와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 약 2 × 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 4와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 2 × 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 4와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 2 × 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 4와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 2 × 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 4와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 2 × 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 결합 단백질은 약 2 × 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3 또는 4의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 3 또는 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 3 또는 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다.
일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 결합 단백질은 약 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 약 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 약 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 일 실시 형태에서, 상기 결합 단백질은 10-8 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 결합 단백질은 약 10-8 M 이하의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하고, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 4의 마지막 위치에서의 A는 선택적으로 치환된다.
표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에 의한 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 재조합 결합 단백질의 해리 상수(KD)의 전형적인 그리고 바람직한 결정이 실시예 4에 기재되어 있다. 따라서, 일 실시 형태에서 본 발명의 재조합 결합 단백질의 CD3에 대한 상기 결합 특이성은 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 PBS 중에서 결정된다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질의 CD3에 대한 상기 결합 특이성은 실시예 4에 기재된 바와 같이 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 PBS 중에서 결정된다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 65℃ 초과, 68℃ 초과, 70℃ 초과, 72℃ 초과, 75℃ 초과, 78℃ 초과, 80℃ 초과, 약 75℃, 약 80℃, 약 82℃, 약 85℃, 65℃ 내지 95℃, 70℃ 내지 90℃, 또는 72℃ 내지 88℃이다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 65℃ 초과이다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 70℃ 초과이다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 75℃ 초과이다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 80℃ 초과이다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 65℃ 내지 95℃이다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 72℃ 내지 88℃이다. 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1 내지 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 1 내지 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환되고; 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 65℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 68℃ 초과이다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 70℃ 초과이다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 72℃ 초과이다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 75℃ 초과이다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 78℃ 초과이다. 추가의 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 80℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 1의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환되고; 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 75℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 78℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 80℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 75℃ 내지 95℃이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 약 85℃이다.
일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 2의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 2의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환되고; 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 72℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 75℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 77℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 72℃ 내지 92℃이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 약 82℃이다.
일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 3의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 3의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환되고; 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 65℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 68℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 70℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 65℃ 내지 85℃이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 약 75℃이다.
일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환되고; 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 73℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 75℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 78℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 73℃ 내지 93℃이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 용융 온도(Tm)가 약 83℃이다.
원편광 이색성(CD) 분광법에 의한 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 재조합 결합 단백질 또는 안키린 반복 도메인의 용융 온도(Tm)의 전형적인 그리고 바람직한 결정이 실시예 2에 기재되어 있다. 따라서, 일 실시 형태에서 본 발명의 재조합 결합 단백질 또는 안키린 반복 도메인의 상기 용융 온도(Tm)는 원편광 이색성(CD) 분광법에 의해 TBS(pH 8.0)(50 mM Tris, 500 mM NaCl) 중에서 결정된다. 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질 또는 안키린 반복 도메인의 상기 용융 온도(Tm)는 실시예 2에 기재된 바와 같이 원편광 이색성(CD) 분광법에 의해 TBS(pH 8.0)(50 mM Tris, 500 mM NaCl) 중에서 결정된다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 65℃ 초과, 68℃ 초과, 70℃ 초과, 72℃ 초과, 75℃ 초과, 78℃ 초과, 80℃ 초과, 82℃ 초과, 85℃ 초과, 75℃ 내지 100℃, 70℃ 내지 95℃, 또는 75℃ 내지 95℃이다. 따라서, 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 65℃ 초과이다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 70℃ 초과이다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 75℃ 초과이다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 80℃ 초과이다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 75℃ 내지 100℃이다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 70℃ 내지 95℃이다.
일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1 내지 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 1 내지 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환되고; 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 65℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 68℃ 초과이다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 70℃ 초과이다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 72℃ 초과이다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 75℃ 초과이다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 78℃ 초과이다. 다른 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 80℃ 초과이다.
일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 1의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환되고; 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 70℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 75℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 80℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 85℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 75℃ 내지 100℃이다.
일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 2와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 2의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 2의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환되고; 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 65℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 70℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 75℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 80℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 70℃ 내지 95℃이다.
일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 3과 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 3의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 3의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환되고; 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 65℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 70℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 75℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 80℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 70℃ 내지 95℃이다.
일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하며, 상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 4와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환되고; 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 65℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 70℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 75℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 80℃ 초과이다. 일 실시 형태에서, 상기 안키린 반복 도메인은 응집 개시 온도(Tagg)가 70℃ 내지 95℃이다.
동적 광산란(DLS) 분석에 의한 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 재조합 결합 단백질 또는 안키린 반복 도메인의 응집 개시 온도(Tagg)의 전형적인 그리고 바람직한 결정이 실시예 2에 기재되어 있다. 따라서, 일 실시 형태에서 본 발명의 재조합 결합 단백질 또는 안키린 반복 도메인의 상기 응집 개시 온도(Tagg)는 동적 광산란(DLS) 분석에 의해 TBS(pH 8.0)(50 mM Tris, 500 mM NaCl) 중에서 결정된다. 일 실시 형태에서 본 발명의 재조합 결합 단백질 또는 안키린 반복 도메인의 상기 응집 개시 온도(Tagg)는 실시예 2에 기재된 바와 같이 동적 광산란(DLS) 분석에 의해 TBS(pH 8.0)(50 mM Tris, 500 mM NaCl) 중에서 결정된다.
본 명세서에 개시된 재조합 결합 단백질의 반복 도메인, 바람직하게는 안키린 반복 도메인은 바람직하게는 N-말단 및/또는 C-말단 캡핑 모듈(이하, 캡핑 반복부 또는 캡핑 단위로도 지칭됨)을 포함한다. 캡핑 모듈은 안키린 반복 도메인의 N-말단 및/또는 C-말단 단부에 위치되어, 전형적으로 이들 사이의 안키린 반복 모듈(들)과의 긴밀한 3차 상호작용(즉, 3차 구조 상호작용)을 형성하며, 그럼으로써 용매에 대한 노출로부터 그 쪽에서 안키린 반복 도메인의 소수성 코어를 차폐하는 캡을 제공한다. N-말단 및/또는 C-말단 캡핑 모듈은 반복 단위에 인접한 자연 발생 반복 단백질에서 발견되는 캡핑 단위 또는 다른 구조 단위로부터 유래될 수 있다. 캡핑 서열의 예는 국제 특허 출원 공개 WO 2002/020565호 및 WO 2012/069655호, 미국 특허 출원 공개 제20130296221호, 및 문헌[Interlandi et al., J Mol Biol. 2008 Jan 18;375(3):837-54]에 기재되어 있다. N-말단 캡핑 모듈(즉, N-말단 캡핑 반복부)의 예는 서열 번호 10 내지 16이고, C-말단 캡핑 모듈(즉, C-말단 캡핑 반복부)의 예는 서열 번호 17 내지 26이다.
예시적인 실시 형태에서, N-말단 캡핑 모듈은 서열 번호 10 내지 15 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 10 내지 15 중 어느 하나의 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2 또는 최대 1개의 아미노산(들)은 임의의 아미노산으로 선택적으로 교환된다.
예시적인 실시 형태에서, C-말단 캡핑 모듈은 서열 번호 17 내지 25 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 17 내지 25 중 어느 하나의 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2 또는 최대 1개의 아미노산(들)은 임의의 아미노산으로 선택적으로 교환된다.
유리하게는, 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 제공되는 설계된 안키린 반복 도메인의 N-말단 캡핑 모듈 및/또는 C-말단 캡핑 모듈 내의 소정 아미노산 잔기가 변경되며, 그 결과, 설계된 안키린 반복 도메인, 및 설계된 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질의 개선된 약동학적 특성 - 연장된 최종 반감기를 포함함 - 을 가져온다. 변경된 아미노산 잔기는 대부분 표면 노출된 잔기이다. 바람직하게는, 변경된 아미노산 잔기는 N-말단 캡핑 모듈의 위치 8 및 15에서의 아미노산 잔기 - 여기서, 위치 8에서의 아미노산은 Q이고, 위치 15에서의 아미노산은 L이며, 이때 위치 번호는 서열 번호 10에서의 위치에 상응함 -, 및 C-말단 캡핑 모듈의 위치 14 및 18에서의 아미노산 잔기 - 여기서, 위치 14에서의 아미노산은 R이고, 위치 18에서의 아미노산은 Q이며, 이때 위치 번호는 서열 번호 17에서의 위치에 상응함 - 이다.
예를 들어, 변경된 아미노산 잔기를 갖는 N-말단 캡핑 모듈은 다음 서열을 포함할 수 있다: DLGxxLLQAAxxGQLDxVRxLxxxGADVNA(서열 번호 16) (여기서, "x"는 임의의 아미노산을 나타냄).
예를 들어, 변경된 아미노산 잔기를 갖는 C-말단 캡핑 모듈은 다음 서열을 포함할 수 있다: xDxxGxTPADxAARxGHQxIAxVLQxAA(서열 번호 26) (여기서, "x"는 임의의 아미노산을 나타냄).
따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명의 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 16의 아미노산 서열을 갖는 N-말단 캡핑 모듈을 포함하며, 여기서 "x"는 임의의 아미노산을 나타낸다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 26의 아미노산 서열을 갖는 C-말단 캡핑 모듈을 포함할 수 있으며, 여기서 "x"는 임의의 아미노산을 나타낸다.
특정 실시 형태에서, 본 발명의 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나의 위치 8에서의 아미노산 E는 Q로 치환되고, 서열 번호 1 내지 3 중 어느 하나의 위치 15에서의 아미노산 D는 L로 치환된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나의 위치 110에서의 아미노산 K는 R로 치환되고, 서열 번호 1 및 2의 위치 114에서의 아미노산 E, 또는 서열 번호 4의 아미노산 R은 Q로 치환된다.
더욱이, 본 발명의 CD3-결합 도메인은 선택적으로 이의 N-말단에 "G", "S", 또는 "GS" 서열을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 CD3-결합 도메인은, (i) 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, (ii) 이의 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다. 예시적인 실시 형태에서, CD3-결합 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 이의 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다. 예시적인 실시 형태에서, CD3-결합 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 이의 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다. 예시적인 실시 형태에서, CD3-결합 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 이의 N-말단에 G, S, 또는 GS를 추가로 포함한다.
일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함한다.
따라서, 특정 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 본 명세서의 임의의 태양 또는 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 상기 결합 단백질 내의 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인의 N-말단에 위치된다.
일 실시 형태에서, 상기 질병-관련 항원은 종양-관련 항원(TAA)이다. 종양-관련 항원의 예시적인 예에는 종양 세포의 세포 표면 상에 발현되는 단백질, 예컨대 HER2(본 명세서에서 TAA1로도 지칭됨), CD123(본 명세서에서 TAA2로도 지칭됨), CD33(본 명세서에서 TAA3으로도 지칭됨), 및 CD70(본 명세서에서 TAA4로도 지칭됨), 또는 펩티드-MHC 복합체 - 여기서, 상기 펩티드는 종양 세포에서 발현되는 단백질(예컨대, NY-ESO-1 또는 MAGE-A3)로부터 유래되고, 상기 MHC는 MHC 클래스 I임 - 가 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 다른 실시 형태에서, 상기 질병-관련 항원은 감염-관련 항원, 바람직하게는 바이러스-관련 항원(VAA)이다. 바이러스-관련 항원의 예시적인 예에는 펩티드-MHC 복합체가 포함되지만 이로 한정되지 않으며, 여기서 상기 펩티드는 바이러스성 감염성 인자(예컨대, HBcAg 또는 EBNA-1)로부터 유래되고, 상기 MHC는 MHC 클래스 I이다. 일 실시 형태에서, 상기 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인에 연결되거나, 접합되거나, 융합되거나, 달리 물리적으로 부착된다. 일 실시 형태에서, 상기 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인에 공유적으로 결합된다. 일 실시 형태에서, 상기 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 펩티드 링커를 사용하여 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인에 공유적으로 결합된다. 일 실시 형태에서, 상기 펩티드 링커의 아미노산 서열은 1 내지 50개의 아미노산, 바람직하게는 6 내지 38개의 아미노산의 길이를 갖는다. 일 실시 형태에서, 상기 펩티드 링커는 프롤린-트레오닌 풍부 펩티드 링커이다. 일 실시 형태에서, 상기 펩티드 링커는 서열 번호 31 및 42 내지 46 중 어느 하나의 프롤린-트레오닌 풍부 펩티드 링커이다. 일 실시 형태에서, 상기 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 서열 번호 31 및 42 내지 46 중 어느 하나의 프롤린-트레오닌 풍부 펩티드 링커를 사용하여 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인에 공유적으로 결합된다. 바람직한 일 실시 형태에서, 상기 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 반복 도메인이다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 본 명세서의 임의의 태양 또는 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 본 명세서의 임의의 태양 또는 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 안키린 반복 도메인을 추가로 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 안키린 반복 도메인은 상기 결합 단백질 내의 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인의 N-말단에 위치된다.
일 실시 형태에서, 상기 재조합 결합 단백질은 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함한다.
따라서, 특정 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 본 명세서의 임의의 태양 또는 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 반감기 연장 모이어티를 추가로 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 반감기 연장 모이어티는 상기 결합 단백질 내의 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인의 N-말단에 위치된다.
일 실시 형태에서, 상기 반감기 연장 모이어티는 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 포함한다.
일 실시 형태에서, 상기 반감기 연장 모이어티는 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 결합 도메인이다. 일 실시 형태에서, 상기 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 결합 도메인은 서열 번호 28 내지 30 중 어느 하나와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 본 명세서의 임의의 태양 또는 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 서열 번호 28 내지 30 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 결합 도메인을 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 28 내지 30 중 어느 하나와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 28 내지 30 중 어느 하나와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 28 내지 30 중 어느 하나와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 28 내지 30 중 어느 하나와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 28 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 28 내지 30 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 상기 결합 단백질 내의 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인의 N-말단에 위치된다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 설계된 안키린 결합 도메인은 서열 번호 29와 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 본 명세서의 임의의 태양 또는 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 서열 번호 29와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 결합 도메인을 추가로 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 29와 적어도 90% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 상기 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 29와 적어도 93% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 29와 적어도 95% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 29와 적어도 98% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 추가의 실시 형태에서, 상기 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 서열 번호 29의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인의 N-말단에 위치된다.
일 실시 형태에서, CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하는 본 발명의 재조합 결합 단백질은, 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 포함하지만 상기 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 포함하지 않는 상응하는 재조합 결합 단백질과 대비하여 증가된 최종 반감기, 바람직하게는 적어도 5%, 바람직하게는 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 또는 250%의 증가된 최종 반감기를 나타낸다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 본 명세서의 임의의 태양 또는 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 본 명세서의 임의의 태양 또는 실시 형태에서 더 구체적으로 기재된 바와 같은 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 안키린 반복 도메인을 추가로 포함한다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 폴리펩티드 태그를 추가로 포함한다. 폴리펩티드 태그는 폴리펩티드/단백질에 부착되는 아미노산 서열이며, 상기 아미노산 서열은 상기 폴리펩티드/단백질의 정제, 검출, 또는 표적화에 유용하거나, 또는 상기 아미노산 서열은 폴리펩티드/단백질의 물리화학적 거동을 개선하거나, 또는 상기 아미노산 서열은 이펙터 기능을 보유한다. 결합 단백질의 개별 폴리펩티드 태그는 결합 단백질의 다른 부분에 직접 연결되거나 또는 펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다. 폴리펩티드 태그는 모두 당업계에 잘 알려져 있고, 당업자가 충분히 이용가능하다. 폴리펩티드 태그의 예는 작은 폴리펩티드 서열, 예를 들어 His, HA, myc, FLAG 또는 Strep-태그, 또는 폴리펩티드, 예컨대 효소(예를 들어, 알칼리성 포스파타제)이며, 이는 상기 폴리펩티드/단백질, 또는 표적화(예컨대, 면역글로불린 또는 이의 단편)에 그리고/또는 이펙터 분자로서 사용될 수 있는 폴리펩티드의 검출을 가능하게 한다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 재조합 결합 단백질은 펩티드 링커를 추가로 포함한다. 펩티드 링커는, 예를 들어 2개의 단백질 도메인, 즉 폴리펩티드 태그와 단백질 도메인, 단백질 도메인과 비단백질성 화합물 또는 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 단백질 도메인과 생물학적으로 활성인 분자, 단백질 도메인과 국재화제(localizer), 또는 2개의 서열 태그를 연결시킬 수 있는 아미노산 서열이다. 펩티드 링커는 당업자에게 알려져 있다. 예시 목록은 국제 특허 출원 공개 WO2002/020565호의 설명에 제공되어 있다. 이러한 링커의 특정 예는 가변 길이의 글리신-세린-링커 및 프롤린-트레오닌-링커이다. 글리신-세린-링커의 예는 아미노산 서열 GS 및 서열 번호 41의 아미노산 서열이고, 프롤린-트레오닌-링커의 예는 서열 번호 31, 및 서열 번호 42 내지 46의 아미노산 서열이다.
다른 태양에서, 본 발명은 본 발명의 안키린 반복 도메인 또는 재조합 결합 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 결합 단백질의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 1 내지 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 1의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 3의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 서열 번호 4의 아미노산 서열을 인코딩하는 핵산에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 본 발명의 임의의 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다. 핵산은 당업자에게 잘 알려져 있다. 실시예에서는, 핵산을 사용하여, 본 발명의 설계된 안키린 반복 도메인 또는 재조합 결합 단백질을 E. 콜라이(E. coli)에서 생성하였다. 본 발명의 핵산의 예가 서열 번호 37 내지 40에 의해 제공되며, 이들은 각각 서열 번호 1 내지 4의 아미노산 서열을 인코딩한다.
일 태양에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 결합 단백질 및/또는 설계된 안키린 반복 도메인, 및/또는 본 발명의 재조합 결합 단백질 및/또는 설계된 안키린 반복 도메인을 인코딩하는 핵산 및 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 결합 단백질 또는 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산, 및 선택적으로 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제는 당업자에게 알려져 있으며, 하기에서 더 상세히 설명된다.
약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 재조합 결합 단백질, 및/또는 설계된 안키린 반복 도메인, 및/또는 핵산, 바람직하게는 재조합 결합 단백질 및/또는 핵산, 및, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980]에 기재된 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제를 포함한다.
당업자에게 알려진 적합한 담체, 부형제 또는 안정제는, 예를 들어 식염수, 링거액(Ringer's solution), 덱스트로스 용액, 행크 용액(Hank's solution), 고정유, 에틸 올레에이트, 식염수 중 5% 덱스트로스, 등장성 및 화학적 안정성을 향상시키는 물질, 완충액 및 방부제를 포함한다. 다른 적합한 담체는 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합체 아미노산 및 아미노산 공중합체와 같은 조성물을 제공받는 개체에 유해한 항체의 생성을 스스로 유도하지 않는 임의의 담체를 포함한다. 약제학적 조성물은 또한 추가의 활성제, 예를 들어 항암제 또는 항혈관생성제 또는 추가의 생물활성 화합물을 포함하는 병용 제형일 수 있다.
생체내(in vivo) 투여에 사용되는 제형은 무균성 또는 멸균성이어야 한다. 이는 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
본 발명의 일 실시 형태는 약제학적 조성물의 제조를 위한, CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 추가로 포함하는 본 발명의 재조합 결합 단백질의 용도에 관한 것으로, 상기 재조합 결합 단백질은, 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 포함하지만 상기 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인은 포함하지 않는 상응하는 재조합 결합 단백질과 대비하여 증가된 최종 반감기, 바람직하게는 적어도 5%, 바람직하게는 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 또는 250%의 증가된 최종 반감기를 나타낸다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 재조합 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고, 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 안키린 반복 도메인을 추가로 포함한다.
일 실시 형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 바와 같은 적어도 하나의 재조합 결합 단백질 및 세제(detergent), 예컨대 비이온성 세제, 완충액, 예컨대 인산염 완충액, 및 당, 예컨대 수크로스를 포함한다. 일 실시 형태에서, 그러한 조성물은 전술한 바와 같은 재조합 결합 단백질 및 PBS를 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명은 인간을 포함한 포유동물에서의 종양 세포 또는 조직에서의 CD3-매개 T 세포 활성화의 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 포유동물에게, CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하고 국재화제 분자를 추가로 포함하는 본 발명의 재조합 결합 단백질을 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 국재화제 분자는 CD3과 상이한 표적, 바람직하게는 TAA 또는 VAA에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 단백질이다. 일 실시 형태에서, 상기 포유동물은 인간이고, 상기 TAA-발현 세포 또는 조직은 종양에 위치되며, 이에는 원발성 종양, 전이 및/또는 종양 간질에 위치되는 것이 포함된다.
다른 태양에서, 본 발명은 인간을 포함한 포유동물에서의 T 세포의 종양-국재화된 활성화 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 포유동물에게 본 발명의 결합 단백질, 본 발명의 핵산, 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명은 인간을 포함한 포유동물에서의 T 세포의 감염-국재화된 활성화 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기 포유동물에게 본 발명의 결합 단백질, 본 발명의 핵산, 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
다른 태양에서, 본 발명은 의학적 질환의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는 본 발명의 재조합 결합 단백질, 상기 결합 단백질을 인코딩하는 핵산 또는 상기 결합 단백질을 포함하는 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 다른 태양에서, 본 발명은 의학적 질환의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는 본 발명의 재조합 결합 단백질의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 결합제는 상기 결합 단백질을 표적 종양 조직 또는 감염된 조직에 국재화하는 데 효과적이며, 상기 결합 단백질의 상기 국재화는 상기 표적 종양 또는 감염된 조직에서의 T 세포 활성화를 가져온다. 일 실시 형태에서, 상기 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 TAA 또는 VAA에 대한 결합 특이성을 갖는 결합 단백질, 바람직하게는 안키린 반복 결합 단백질이다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 질병의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 약제학적 조성물, 재조합 결합 단백질, 또는 핵산에 관한 것이다. 이러한 목적을 위해, 본 발명에 따른 약제학적 조성물, 핵산 또는 재조합 결합 단백질은 이를 필요로 하는 환자에게 치료적 유효량으로 투여된다. 투여는 국소 투여, 경구 투여 및 비경구 투여를 포함할 수 있다. 전형적인 투여 경로는 비경구 투여이다. 비경구 투여에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 용액, 현탁액 또는 에멀젼과 같은 단위 투여 주사용 형태로 상기 정의된 바와 같은 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 제형화될 것이다. 투여량 및 투여 방식은 치료하고자 하는 개체 및 특정 질병에 따라 달라질 것이다.
또한, 상기 언급된 임의의 약제학적 조성물, 핵산 또는 재조합 결합 단백질은 장애의 치료에서의 사용을 위해 고려된다.
일 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 상기 재조합 결합 단백질 또는 이러한 다른 약제학적 조성물은 정맥내 적용된다. 비경구 적용을 위해, 재조합 결합 단백질 또는 상기 약제학적 조성물은 볼루스(bolus) 주사로서 또는 느린 주입에 의해 치료적 유효량으로 주사될 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 의학적 질환의 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 그러한 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 재조합 결합 단백질, 본 발명의 핵산, 또는 본 발명의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 질병의 치료를 위한 본 발명의 재조합 결합 단백질, 본 발명의 핵산, 또는 본 발명의 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 질병의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 재조합 결합 단백질, 본 발명의 핵산, 또는 본 발명의 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 의학적 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 재조합 결합 단백질, 본 발명의 핵산, 또는 본 발명의 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 질병의 치료를 위한 약제로서의 본 발명의 재조합 결합 단백질, 본 발명의 핵산, 또는 본 발명의 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 약제의 제조를 위한 본 발명의 재조합 결합 단백질, 본 발명의 핵산, 또는 본 발명의 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 질병의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 재조합 결합 단백질, 본 발명의 핵산, 또는 본 발명의 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 질병의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 공정에 관한 것으로, 본 발명의 재조합 결합 단백질, 본 발명의 핵산, 또는 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 약제의 활성 성분이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 결합 단백질, 본 발명의 핵산, 또는 본 발명의 약제학적 조성물을 사용하여 질병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
암 또는 감염성 질병의 치료를 위한 본 발명의 재조합 결합 단백질, 본 발명의 핵산, 또는 본 발명의 약제학적 조성물의 사용은 또한 당업계에 알려진 하나 이상의 다른 요법과 병용될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "병용 사용"은 주어진 계획(regimen)에 따라 수행되는 공동투여를 지칭할 것이다. 이것은 상이한 화합물들의 동시 투여뿐만 아니라 상이한 화합물들의 시간차(time-shifted) 투여를 포함한다(예를 들어, 화합물 A가 1회 제공되고, 그 후 화합물 B가 수회 제공되거나, 또는 그 반대로 제공되거나, 또는 화합물 둘 모두 동시에 제공되고, 두 화합물 중 하나는 후기 단계에서도 제공됨).
일 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 암이다. 다른 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 감염성 질병, 바람직하게는 바이러스성 감염성 질병이다.
특정 일 실시 형태에서, 의학적 질환은 암이며, 여기서 암 또는 종양 조직은 종양-관련 항원을 발현하거나 디스플레이하는 세포를 포함하고, 상기 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 상기 세포에서 발현되거나 디스플레이되는 상기 종양-관련 항원에 결합한다. 특정 일 실시 형태에서, 상기 질병-관련 항원은 상기 암 또는 종양 조직에서 발현되거나 과발현되는 세포 표면 단백질의 세포외 도메인이다. 다른 특정 실시 형태에서, 상기 종양-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 펩티드-MHC 복합체에 결합하며, 여기서 상기 펩티드는 종양 세포(예컨대, NY-ESO-1 또는 MAGE-A3)에서 발현되는 단백질로부터 유래된다. 특정 일 실시 형태에서, 상기 MHC는 MHC 클래스 I이다. 일 실시 형태에서, 상기 암은 선암종 및 편평세포 암종으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 상기 암은 골육종 또는 골원성 육종(뼈), 연골육종(연골), 평활근육종(평활근), 횡문근육종(골격근), 중피 육종 또는 중피종(체강의 내막), 섬유육종(섬유질 조직), 혈관육종 또는 혈관내피종(혈관), 지방육종(지방 조직), 신경교종 또는 성상세포종(뇌에서 발견되는 신경원성 결합 조직), 점액육종(원시 배아 결합 조직), 및 간엽성 또는 혼합성 중배엽 종양(혼합성 결합 조직 유형)으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 상기 암은 골수원성 또는 과립구성 백혈병(골수성 및 과립구성 백혈구 시리즈의 악성종양), 림프성, 림프구성, 또는 림프아구성 백혈병(림프계 및 림프구성 혈액 세포 시리즈의 악성종양), 및 진성 다혈구증 또는 적혈병(적색 세포가 우세하지는 않은 다양한 혈액 세포 생성물의 악성종양)로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 상기 암은 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 상기 암은 선편평세포 암종, 혼합성 중배엽 종양, 암육종 및 기형암종으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 상기 암은 결직장암, 위암, 비(非)소세포 폐암, 유방암, 두경부암, 난소암, 폐암, 침습성 방광암, 췌장암, 뇌의 전이성 암, 두경부 편평세포 암종, 식도 편평세포 암종, 폐 편평세포 암종, 피부 편평세포 암종, 흑색종, 유방 선암종, 폐 선암종, 자궁경부 편평세포 암종, 췌장 편평세포 암종, 결장 편평세포 암종, 또는 위 편평세포 암종, 전립선암, 골육종 또는 연조직 육종 및 양성 종양으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 그러한 암은 상피 악성종양(원발성 및 전이성)으로부터 선택되며, 이에는 폐, 결직장, 위, 방광, 난소 및 유방 암종, 및 뼈 및 연조직 육종이 포함된다.
다른 특정 실시 형태에서, 의학적 질환은 감염성 질병, 바람직하게는 바이러스성 감염성 질병이며, 여기서 감염된 조직은 감염-관련 항원, 바람직하게는 바이러스-관련 항원을 발현하거나 디스플레이하는 세포를 포함하고, 상기 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 상기 세포에서 발현되거나 디스플레이되는 상기 감염-관련 항원에 결합한다. 특정 일 실시 형태에서, 상기 질병-관련 항원은 상기 감염된 조직에서 발현되거나 과발현되는 바이러스 단백질의 세포외 도메인이다. 다른 특정 실시 형태에서, 상기 바이러스-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제는 펩티드-MHC 복합체에 결합하며, 여기서 상기 펩티드는 감염성 인자의 단백질, 예컨대 세균성 감염성 인자 또는 바이러스성 감염성 인자, 바람직하게는 바이러스성 감염성 인자(예컨대, HBcAg 또는 EBNA-1)로부터 유래된다. 특정 일 실시 형태에서, 상기 MHC는 MHC 클래스 I이다. 일 실시 형태에서, 상기 감염성 질병은 B형 간염 바이러스(HBV)에 의해 야기되는 바이러스성 감염, 엡스타인-바르 바이러스(EBV)에 의해 야기되는 바이러스성 감염, HIV 감염, 웨스트 나일 바이러스 감염, A형, B형, 및 C형 간염, 천연두, 결핵, 수포성 구내염 바이러스(VSV) 감염, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염, 인간 유두종 바이러스(HPV) 감염, SARS, 인플루엔자, 에볼라, 바이러스성 수막염, 헤르페스, 탄저, 라임병, 및 E. 콜라이 감염으로부터 선택된다.일 실시 형태에서, 본 발명은 상기 언급된 안키린 반복 도메인 중 임의의 것을 포함하는 재조합 결합 단백질에 관한 것이다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 결합 단백질을 포함하는 키트에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 결합 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 키트에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 결합 단백질, 및/또는 본 발명의 핵산, 및/또는 본 발명의 약제학적 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질, 예를 들어 서열 번호 1 내지 4, 및/또는 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질, 예를 들어 서열 번호 1 내지 4를 인코딩하는 핵산, 및/또는 상기 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질, 예를 들어 서열 번호 1 내지 4를 포함하는 약제학적 조성물을 포함하는 키트에 관한 것이다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 결합 단백질을 생성하는 방법에 관한 것이다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 재조합 결합 단백질, 예를 들어 서열 번호 1 내지 4의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 결합 단백질을 생성하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 (i) 적합한 숙주 세포(예를 들어, 세균)에서 상기 재조합 결합 단백질을 발현시키는 단계, 및 (ii) 상기 재조합 결합 단백질을 (예를 들어, 크로마토그래피를 사용하여) 정제하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 추가의 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 재조합 결합 단백질을 생성하는 이러한 방법은 실시예 1에 기재되어 있다.
본 발명은 실시예에 기재된 특정 실시 형태로 제한되지 않는다.
본 명세서는, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함되는 첨부된 서열 목록에 개시된 다수의 아미노산 서열, 핵산 서열 및 서열 번호를 참조한다.
정의
본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해하는 의미를 가질 것이다.
본 발명과 관련하여, 용어 "단백질"은 폴리펩티드를 포함하는 분자를 지칭하는 것으로, 여기서는 폴리펩티드의 적어도 일부가 단일 폴리펩티드 사슬 내에 그리고/또는 다수의 폴리펩티드 사슬들 사이에 2차, 3차, 및/또는 4차 구조를 형성함으로써 명확한 3차원 배열을 갖거나 획득할 수 있다. 단백질이 2개 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 경우에, 개별 폴리펩티드 사슬들은, 예를 들어 2개의 폴리펩티드 사이의 이황화물 결합에 의해 비공유적으로 또는 공유적으로 연결될 수 있다. 2차 및/또는 3차 구조를 형성함으로써 명확한 3차원 배열을 개별적으로 갖거나 획득할 수 있는 단백질의 일부를 "단백질 도메인"이라 칭한다. 그러한 단백질 도메인은 당업자에게 잘 알려져 있다.
재조합 단백질, 재조합 폴리펩티드 등에 사용되는 바와 같이, "재조합"이라는 용어는 상기 단백질 또는 폴리펩티드가 당업자에게 잘 알려진 재조합 DNA 기법의 사용에 의해 생성된다는 것을 의미한다. 예를 들어, (예를 들어, 유전자 합성에 의해 생성된) 폴리펩티드를 인코딩하는 재조합 DNA 분자가 세균 발현 플라스미드(예를 들어, pQE30, QIAgen), 효모 발현 플라스미드, 포유류 발현 플라스미드 또는 식물 발현 플라스미드 또는 시험관내(in vitro) 발현을 가능하게 하는 DNA 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 그러한 재조합 세균 발현 플라스미드가 적절한 세균(예를 들어, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)) 내로 삽입되는 경우에, 이들 세균은 이 재조합 DNA에 의해 인코딩된 폴리펩티드(들)를 생성할 수 있다. 상응하여 생성된 폴리펩티드 또는 단백질은 재조합 폴리펩티드 또는 재조합 단백질로 불린다.
본 발명과 관련하여, 용어 "결합 단백질"은 결합 도메인을 포함하는 단백질을 지칭한다. 결합 단백질은 또한 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 결합 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 결합 단백질은 재조합 결합 단백질이다. 본 발명의 결합 단백질은 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함한다.
더욱이, 임의의 그러한 결합 단백질은 당업자에게 잘 알려진 추가의 폴리펩티드(예컨대, 폴리펩티드 태그, 펩티드 링커, 결합 특이성을 갖는 다른 단백질성 도메인에 대한 융합, 사이토카인, 호르몬, 또는 길항제), 또는 화학적 변형(예컨대, 폴리에틸렌-글리콜, 독소(예를 들어, 면역원 유래의 DM1), 소분자, 항생제 등에 대한 커플링)을 포함할 수 있다. 본 발명의 결합 단백질은 국재화제 분자를 포함할 수 있다.
용어 "결합 도메인"은 표적에 대한 결합 특이성을 나타내는 단백질 도메인을 의미한다. 바람직하게는, 상기 결합 도메인은 재조합 결합 도메인이다.
용어 "표적"은 개별 분자, 예컨대 핵산 분자, 폴리펩티드 또는 단백질, 탄수화물, 또는 임의의 다른 자연 발생 분자 - 그러한 개별 분자의 임의의 부분을 포함함 -, 또는 2개 이상의 그러한 분자의 복합체, 또는 전세포(whole cell) 또는 조직 샘플, 또는 임의의 비천연 화합물을 지칭한다. 바람직하게는, 표적은 자연 발생 또는 비천연 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 화학적 변형, 예를 들어 자연 발생 또는 비천연 인산화, 아세틸화, 또는 메틸화를 함유하는 폴리펩티드 또는 단백질이다. 본 발명과 관련하여, T 세포는 CD3-특이적 결합 단백질의 표적이고, 국재화제 표적 단백질 및 세포 및 조직은 국재화제의 표적이다.
본 발명과 관련하여, 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 연결된 다수의, 즉 2개 이상의 아미노산의 사슬로 이루어진 분자에 관한 것이다. 바람직하게는, 폴리펩티드는 펩티드 결합을 통해 연결된 8개 초과의 아미노산으로 이루어진다. 용어 "폴리펩티드"는 또한 시스테인의 S-S 가교에 의해 함께 연결된 다수의 아미노산 사슬들을 포함한다. 폴리펩티드는 당업자에게 잘 알려져 있다.
국제 특허 출원 공개 WO2002/020565호 및 문헌[Forrer et al., 2003 (Forrer, P., Stumpp, M.T., Binz, H.K., Plㆌckthun, A., 2003. FEBS Letters 539, 2-6)]은 반복 단백질 특징 및 반복 도메인 특징, 기법 및 응용에 대한 전반적인 설명을 수록하고 있다. 용어 "반복 단백질"은 하나 이상의 반복 도메인을 포함하는 단백질을 지칭한다. 바람직하게는, 반복 단백질은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 반복 도메인을 포함한다. 더욱이, 상기 반복 단백질은 추가의 비반복 단백질 도메인, 폴리펩티드 태그 및/또는 펩티드 링커를 포함할 수 있다. 반복 도메인은 결합 도메인일 수 있다.
용어 "반복 도메인"은 구조 단위로서 2개 이상의 연속 반복 모듈을 포함하는 단백질 도메인을 지칭하며, 여기서 상기 반복 모듈들은 구조적 상동성 및 서열 상동성을 갖는다. 바람직하게는, 반복 도메인은 N-말단 및/또는 C-말단 캡핑 모듈을 추가로 포함한다. 명확성을 위하여, 캡핑 모듈은 반복 모듈일 수 있다. 이러한 반복 도메인, 반복 모듈 및 캡핑 모듈, 서열 모티프뿐만 아니라 구조적 상동성 및 서열 상동성은 안키린 반복 도메인(국제 특허 출원 공개 WO2002/020565호), 류신-풍부 반복 도메인(국제 특허 출원 공개 WO2002/020565호), 테트라트라이코펩티드 반복 도메인(문헌[Main, E.R., Xiong, Y., Cocco, M.J., D'Andrea, L., Regan, L., Structure 11(5), 497-508, 2003]), 및 아르마딜로 반복 도메인(국제 특허 출원 공개 WO2009/040338호)의 예로부터 당업자에게 잘 알려져 있다. 그러한 반복 도메인은 반복 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 상이하고, 모든 반복 아미노산 서열이 개별 도메인(예를 들어, 피브로넥틴의 FN3 도메인)을 형성할 수 있다는 것이 당업자에게 추가로 잘 알려져 있다.
설계된 반복 단백질, 설계된 반복 도메인 등에 사용되는 바와 같이, 용어 "설계된"은 그러한 반복 단백질 및 반복 도메인이 각각 인공이고 천연에서 발생하지 않는다는 특성을 지칭한다. 본 발명의 결합 단백질은 설계된 반복 단백질이고, 이들은 적어도 하나의 설계된 안키린 반복 도메인을 포함한다.
용어 "표적 상호작용 잔기"는 표적과의 직접적인 상호작용에 기여하는 반복 모듈의 아미노산 잔기를 지칭한다.
용어 "프레임워크 잔기"는 접힘 토폴로지에 기여하거나, 즉 상기 반복 모듈의 접힘에 기여하거나, 또는 이웃 모듈과의 상호작용에 기여하는 반복 모듈의 아미노산 잔기를 지칭한다. 그러한 기여는 반복 모듈 내의 다른 잔기와의 상호작용, 또는 α-나선 또는 β-시트에서 발견되는 것과 같은 폴리펩티드 골격 입체구조에 대한 영향, 또는 선형 폴리펩티드 또는 루프를 형성하는 아미노산 스트레치에의 참여일 수 있다.
그러한 프레임워크 잔기 및 표적 상호작용 잔기는 물리화학적 방법, 예컨대 X선 결정구조해석, NMR 및/또는 CD 분광법에 의해 획득된 구조 데이터의 분석에 의해, 또는 구조 생물학 및/또는 생물정보학 실무자에게 잘 알려진 공지된 및 관련된 구조 정보와의 비교에 의해 확인될 수 있다.
용어 "반복 모듈"은 자연 발생 반복 단백질의 반복 단위로부터 원래 유래되는, 설계된 반복 도메인의 반복된 아미노산 서열 및 구조 단위를 지칭한다. 반복 도메인 내에 포함된 각각의 반복 모듈은 자연 발생 반복 단백질들의 패밀리 또는 하위패밀리, 예를 들어 안키린 반복 단백질들의 패밀리의 하나 이상의 반복 단위로부터 유래된다. 더욱이, 반복 도메인 내에 포함된 각각의 반복 모듈은, 예를 들어 실시예 1에 기재된 바와 같은 표적에 대해 선택되고, 동일한 표적 특이성을 갖는 반복 도메인들로부터 획득된 상동성 반복 모듈들로부터 추론되는 "반복 서열 모티프"를 포함할 수 있다.
따라서, 용어 "안키린 반복 모듈"은 자연 발생 안키린 반복 단백질의 반복 단위로부터 원래 유래되는 반복 모듈을 지칭한다. 안키린 반복 단백질은 당업자에게 잘 알려져 있다.
반복 모듈은 표적-특이적 반복 도메인을 선택할 목적을 위한 라이브러리에서 랜덤화되지 않았던 아미노산 잔기를 갖는 위치("비-랜덤화된 위치") 및 표적-특이적 반복 도메인을 선택할 목적을 위한 라이브러리에서 랜덤화되었던 아미노산 잔기를 갖는 위치("랜덤화된 위치")를 포함할 수 있다. 비-랜덤화된 위치는 프레임워크 잔기를 포함한다. 랜덤화된 위치는 표적 상호작용 잔기를 포함한다. "랜덤화되었던"은 2개 이상의 아미노산이 반복 모듈의 아미노산 위치에서 허용되었음을 의미하는데, 예를 들어 통상의 20개의 자연 발생 아미노산 중 임의의 것이 허용되었거나, 또는 시스테인 이외의 아미노산, 또는 글리신, 시스테인 및 프롤린 이외의 아미노산과 같이 20개의 자연 발생 아미노산 중 대부분이 허용되었다. 이들 위치는 일반적으로 본 명세서에 개시된 서열 번호 5 내지 9의 모듈 서열의 변이체에서 치환되지 않는다.
용어 "반복 서열 모티프"는 하나 이상의 반복 모듈로부터 추론된 아미노산 서열을 지칭한다. 바람직하게는, 상기 반복 모듈은 동일한 표적에 대한 결합 특이성을 갖는 반복 도메인으로부터 유래된다. 그러한 반복 서열 모티프는 프레임워크 잔기 위치 및 표적 상호작용 잔기 위치를 포함한다. 상기 프레임워크 잔기 위치는 반복 모듈의 프레임워크 잔기의 위치에 상응한다. 마찬가지로, 상기 표적 상호작용 잔기 위치는 반복 모듈의 표적 상호작용 잔기의 위치에 상응한다. 반복 서열 모티프는 비-랜덤화된 위치 및 랜덤화된 위치를 포함한다.
용어 "반복 단위"는 하나 이상의 자연 발생 단백질의 서열 모티프를 포함하는 아미노산 서열을 지칭하며, 상기 "반복 단위"는 다수의 카피에서 발견되고, 단백질의 접힘을 결정하는 모든 상기 모티프에 일반적인 규정된 접힘 토폴로지를 나타낸다. 그러한 반복 단위의 예는 류신 풍부 반복 단위, 안키린 반복 단위, 아르마딜로 반복 단위, 테트라트라이코펩티드 반복 단위, HEAT 반복 단위 및 류신 풍부 변이 반복 단위를 포함한다.
용어 "표적에 대한 결합 특이성을 갖는다", "표적에 특이적으로 결합하는", "높은 특이성으로 표적에 결합하는", "표적에 대해 특이적인" 또는 "표적 특이성" 등은, 결합 단백질 또는 결합 도메인이 PBS 중에서 E. 콜라이 말토스 결합 단백질(MBP)과 같은 비관련 단백질에 결합하는 것보다 낮은 해리 상수(즉, 그것은 더 높은 친화도로 결합함)로 표적에 결합한다는 것을 의미한다. 바람직하게는, PBS 중에서 표적에 대한 해리 상수("KD")는 MBP에 상응하는 해리 상수보다 적어도 102배; 더 바람직하게는 적어도 103배; 더 바람직하게는 적어도 104배; 또는 더 바람직하게는 적어도 105배 더 낮다. 표면 플라즈몬 공명(SPR) 기반 기술(예를 들어, SPR 평형 분석) 또는 등온 적정 열량측정법(isothermal titration calorimetry, ITC)과 같은 단백질-단백질 상호작용의 해리 상수를 결정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 특정 단백질-단백질 상호작용의 측정된 KD 값은 상이한 조건(예를 들어, 염 농도, pH) 하에서 측정된다면 변동될 수 있다. 따라서, KD 값의 측정은 표준화된 단백질 용액 및 표준화된 완충액, 예컨대 PBS에 의해 바람직하게 이루어진다. 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에 의한 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 본 발명의 재조합 결합 단백질의 해리 상수(KD)의 전형적인 그리고 바람직한 결정이 실시예 4에 기재되어 있다.
용어 "결합제"는 표적 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자를 지칭한다. 결합제는, 예를 들어 항체, 항체 단편, 압타머, 펩티드(예를 들어, 문헌[Williams et al., J Biol Chem 266:5182-5190 (1991)]), 항체 모방체, 반복 단백질, 예를 들어 설계된 안키린 반복 단백질, 수용체 단백질 및 표적 분자의 임의의 다른 자연 발생 상호작용 파트너를 포함하며, 천연 단백질, 및, 예를 들어 비천연 잔기를 포함하고/하거나 천연 잔기를 결여시키기 위하여 변형되거나 유전자 조작된 단백질을 포함할 수 있다.
용어 "약"은 언급된 값 +/- 20%를 의미하며; 예를 들어 "약 50%"는 40 내지 60을 의미할 것이다.
용어 "PBS"는 137 mM NaCl, 10 mM 인산염 및 2.7 mM KCl을 함유하고, pH가 7.4인 인산염 완충 수용액을 의미한다.
용어 "마우스 혈청 알부민"은 UniProt 수탁 번호 P07724를 지칭하며, 용어 "사이노몰거스 원숭이 혈청 알부민"(즉, 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis))은 UniProt 수탁 번호 A2V9Z4를 지칭하며, 용어 "인간 혈청 알부민"은 UniProt 수탁 번호 P02768을 지칭한다.
바람직하게는, 제거율 및/또는 노출률 및/또는 최종 반감기는 포유류, 더 바람직하게는 마우스 및/또는 사이노몰거스 원숭이, 더 바람직하게는 사이노몰거스 원숭이에서 평가된다. 제거율, 및/또는 노출, 및/또는 최종 반감기가 실시예 3에 기재된 바와 같이 평가될 수 있다. 바람직하게는, 마우스에서 제거율 및/또는 노출률 및/또는 최종 반감기를 측정하는 경우에, 평가는 주사 후 48시간까지의 데이터를 고려하여 수행된다. 더 바람직하게는, 마우스에서 최종 반감기의 평가는 24시간부터 48시간까지 계산된다. 바람직하게는, 사이노몰거스 원숭이에서 제거율 및/또는 노출률 및/또는 최종 반감기를 측정하는 경우에, 평가는 주사 후 일수 7까지의 데이터를 고려하여 수행된다. 더 바람직하게는, 사이노몰거스 원숭이에서 최종 반감기의 평가는 일부 1부터 일수 5까지 계산된다. 당업자는 또한 표적-매개 제거(target-mediated clearance)와 같은 효과들을 확인하고 최종 반감기를 계산할 때 이들을 고려할 수 있다. 본 발명의 재조합 결합 단백질과 같은 약물의 "최종 반감기"라는 용어는 (예를 들어, 마우스에서는 24시간부터 48시간까지 계산되거나, 사이노몰거스 원숭이에서는 일수 1부터 일수 5까지 계산되는) 유사 평형(pseudo-equilibrium)에 도달된 후에 포유류에 적용된 약물의 혈장 농도의 절반에 도달하는 데 필요한 시간을 지칭한다. 최종 반감기는 포유류에 투여된 약물의 용량의 절반을 제거하는 데 필요한 시간으로서 정의되지 않는다. 용어 최종 반감기는 당업자에게 잘 알려져 있다. 바람직하게는, 약동학적 비교는 임의의 용량, 더 바람직하게는 등가 용량(즉, 동일한 mg/kg 용량) 또는 등몰 용량(즉, 동일한 몰/kg 용량), 더 바람직하게는 등몰 용량(즉, 동일한 몰/kg 용량)으로 수행된다. 동물에서 등가 및/또는 등몰 투여가 적어도 20%, 더 바람직하게는 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100%의 실험 용량 변동에 적용된다는 것이 당업자에 의해 이해된다. 바람직하게는, 약동학적 측정에 사용되는 용량은 0.001 내지 1000 mg/kg, 더 바람직하게는 0.01 내지 100 mg/kg, 더 바람직하게는 0.1 내지 50 mg/kg, 더 바람직하게는 0.5 내지 10 mg/kg으로부터 선택된다.
용어 "CD3" 또는 "분화 클러스터 3"은 4개의 별개의 폴리펩티드 사슬, 엡실론(ε), 감마(γ) 및 제타(ζ) - 이들은 3개의 쌍(εγ, εδ, ζζ)으로서 조립됨 - 로 구성되는 다량체성 단백질 복합체를 지칭한다. CD3 복합체는 T 세포 수용체와 비공유적으로 회합하는 T 세포 공동수용체로서의 역할을 한다. 이는 임의의 형태의 CD3뿐만 아니라, CD3의 활성의 적어도 일부를 보유하는 변이체, 아이소형, 및 종 상동체를 지칭할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 정의되고 개시된 바와 같은 결합 단백질은 또한 인간 이외의 종으로부터의 CD3에 결합할 수 있다. 다른 경우에, 결합 단백질은 인간 CD3에 대해 완전히 특이적일 수 있고, 종 또는 다른 유형의 교차-반응성을 나타내지 않을 수 있다. 인간 CD3에 대한 특정한 언급에 의한 것과 같이, 달리 나타내지 않는 한, CD3은 모든 포유류 종, 예를 들어 인간, 개, 고양이, 말 및 소의 천연 서열 CD3을 포함한다. 인간 CD3 감마, 델타 및 제타 사슬의 아미노산 서열은 각각 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/) Ref. Seq. NP_ 000064.1, NP_000723.1 및 NP_932170.1에 제시되어 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "CD3-발현 세포"는 세포 표면 상에 CD3(분화 클러스터 3)을 발현하는 임의의 세포를 지칭하며, 이에는 T 세포, 예컨대 세포독성 T 세포(CD8+ T 세포) 및 T 헬퍼 세포(CD4+ T 세포)가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.
용어 "T 세포의 종양-국재화된 활성화"는 T 세포가 비종양 조직에 비하여 종양 조직에서 우선적으로 활성화됨을 의미한다.
용어 "T 세포의 감염-국재화된 활성화"는 T 세포가 감염되지 않은 조직에 비하여 감염된 조직에서 우선적으로 활성화됨을 의미한다.
더욱이, 용어 "펩티드"는 또한, 예를 들어 글리코실화에 의해 변형된 펩티드, 및 예를 들어 이황화물 결합에 의해 가교결합된 각각 길이가 4 내지 600개의 아미노산 길이의 2개 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단백질, 예컨대 인슐린 및 면역글로불린을 포함한다. 용어 "화학적 또는 생화학적 작용제"는 수용자에게 투여될 수 있는 임의의 자연 발생 또는 합성 화합물을 포함하고자 한다.
용어 "의학적 질환"(또는 장애 또는 질병)은 자가면역 장애, 염증성 장애, 망막병증(특히, 증식성 망막병증), 신경퇴행성 장애, 감염, 대사성 질병, 및 신생물성 질병을 포함한다. 본 명세서에 기재된 임의의 재조합 결합 단백질은 이러한 장애, 특히 자가면역 장애, 염증성 장애, 면역 장애 및 신생물성 질병을 포함하는 군으로부터 선택되는 장애의 치료를 위한 약제의 제조에 사용될 수 있다. "의학적 질환"은 부적절한 세포 증식을 특징으로 하는 것일 수 있다. 의학적 질환은 과증식성 질환일 수 있다. 본 발명은 특히 의학적 질환의 치료 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 본 발명의 재조합 결합 단백질 또는 상기 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 이러한 치료를 필요로 하는 환자에 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 신생물성 질병이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "신생물성 질병"은 급속하게 증식하는 세포 성장 또는 신생물을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 비정상적인 상태 또는 질환을 지칭한다. 일 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 악성 신생물성 질병이다. 일 실시 형태에서, 상기 의학적 질환은 암이다. 용어 "치료적 유효량"은 환자에서 원하는 효과를 생성하기에 충분한 양을 의미한다.
용어 "항체"는 온전한 항체 분자뿐만 아니라, 면역원-결합 능력을 보유하는 항체 분자의 임의의 절편 및 변이체를 의미한다. 그러한 절편 및 변이체는 또한 당업계에 잘 알려져 있으며, 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 자주 사용된다. 따라서, 용어 "항체"는 온전한 면역글로불린 분자, 항체 절편, 예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, 및 단일쇄 V 영역 절편(scFv), 이중특이성 항체, 키메라 항체, 항체 융합 폴리펩티드, 및 비통상적인 항체를 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "암" 및 "암성"은 조절되지 않는 세포 성장을 전형적인 특징으로 하는, 포유동물에서의 생리학적 질환을 지칭하거나 기재하는 데 사용된다. 암은 고형 종양 및 액성 종양뿐만 아니라 원발성 종양 및 전이를 포함한다. "종양"은 하나 이상의 암성 세포를 포함한다. 고형 종양은 전형적으로 또한 종양 간질을 포함한다. 암의 예에는 원발성 및 전이성 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 및 백혈병, 및 임의의 다른 상피 및 림프성 악성종양이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 그러한 암의 더 특정한 예에는 뇌암, 방광암, 유방암, 난소암, 투명 세포 신장암, 두경부 편평세포 암종, 폐 선암종, 폐 편평세포 암종, 악성 흑색종, 비소세포 폐암(NSCLC), 난소암, 췌장암, 전립선암, 신세포 암종, 소세포 폐암(SCLC), 삼중 음성 유방암, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 미만성 대 B-세포 림프종(DLBCL), 여포성 림프종, 호지킨 림프종(HL), 외투 세포 림프종(MCL), 다발성 골수종(MM), 골수이형성 증후군(MDS), 비호지킨 림프종(NHL), 두경부의 편평 세포 암종(SCCHN), 만성 골수원성 백혈병(CML), 소림프구성 림프종(SLL), 악성 중피종, 결직장암, 또는 위암이 포함된다.
본 명세서에서, 용어 "감염성 질병"및 "감염"은, 특히 병리학적 증상을 야기하는, 신체 조직에서의 미생물의 침입 및 증식을 지칭하거나 기재하는 데 사용된다. 감염성 질병의 예에는, 제한 없이, 바이러스성 질병 및 세균성 질병, 예컨대 HIV 감염, 웨스트 나일 바이러스 감염, A형, B형, 및 C형 간염, 천연두, 결핵, 수포성 구내염 바이러스(VSV) 감염, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염, 인간 유두종 바이러스(HPV) 감염, SARS, 인플루엔자, 에볼라, 바이러스성 수막염, 헤르페스, 탄저병, 라임병, 및 E. 콜라이 감염이 특히 포함된다.
실시예
하기에 개시되는 출발 물질 및 시약은 당업자에게 알려져 있으며, 구매가능하고/하거나 잘 알려진 기법을 사용하여 제조될 수 있다.
재료
화학물질은 Sigma-Aldrich(미국 소재)로부터 구입하였다. 올리고뉴클레오티드는 Microsynth(스위스 소재)로부터 입수하였다. 달리 언급되지 않는 한, DNA 폴리머라제, 제한 효소 및 완충액은 New England Biolabs(미국 소재) 또는 Fermentas/Thermo Fisher Scientific(미국 소재)으로부터 입수하였다. 유도성 E. 콜라이 발현 균주를 클로닝 및 단백질 생성에 사용하였으며, 이는, 예를 들어 E. 콜라이 XL1-블루(Stratagene, 미국 소재) 또는 BL21(Novagen, 미국 소재)이다.
분자 생물학
달리 언급되지 않는 한, 알려진 프로토콜에 따라 방법을 수행하였다(예를 들어 문헌[Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1989, New York] 참조).
설계된 안키린 반복 단백질 라이브러리
설계된 안키린 반복 단백질 라이브러리를 생성하는 방법이, 예를 들어 미국 특허 제7,417,130호; 문헌[Binz et al. 2003, 인용된 곳에서 참조]; 문헌[Binz et al. 2004, 인용된 곳에서 참조]에 기재되어 있다. 그러한 방법에 의해, 랜덤화된 안키린 반복 모듈들 및/또는 랜덤화된 캡핑 모듈들을 갖는 설계된 안키린 반복 단백질 라이브러리가 구축될 수 있다. 예를 들어, 따라서 그러한 라이브러리는 고정된 N-말단 캡핑 모듈(예를 들어, 서열 번호 10,11, 12, 13,14 또는 15의 N-말단 캡핑 모듈) 또는 서열 번호 16에 따른 랜덤화된 N-말단 캡핑 모듈, 및 고정된 C-말단 캡핑 모듈(예를 들어, 서열 번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25의 C-말단 캡핑 모듈) 또는 서열 번호 26에 따른 랜덤화된 C-말단 캡핑 모듈을 기반으로 조립될 수 있다. 바람직하게는, 그러한 라이브러리는 반복 모듈 또는 캡핑 모듈의 랜덤화된 위치에서 아미노산 C, G, M, N(G 잔기의 앞쪽에) 및 P 중 어느 것도 갖지 않도록 조립된다.
더욱이, 그러한 라이브러리에서 그러한 랜덤화된 모듈은 랜덤화된 아미노산 위치를 갖는 추가의 폴리펩티드 루프 삽입을 포함할 수 있다. 그러한 폴리펩티드 루프 삽입의 예는 항체의 상보성 결정 영역(CDR) 루프 라이브러리, 또는 드 노보(de novo)로 생성된 펩티드 라이브러리이다. 예를 들어, 그러한 루프 삽입은 지침으로서 인간 리보뉴클레아제 L의 N-말단 안키린 반복 도메인의 구조를 사용하여 설계될 수 있다(문헌[Tanaka, N., Nakanishi, M, Kusakabe, Y, Goto, Y., Kitade, Y, Nakamura, K.T., EMBO J. 23(30), 3929-3938, 2004]). 10개의 아미노산이 2개의 안키린 반복부의 경계 부근에 존재하는 베타-턴(beta-turn) 내에 삽입되는 이러한 안키린 반복 도메인과 유사하게, 안키린 반복 단백질 라이브러리는 안키린 반복 도메인의 하나 이상의 베타-턴 내에 삽입된 다양한 길이(예를 들어, 1 내지 20개의 아미노산)의 (고정된 위치 및 랜덤화된 위치를 갖는) 랜덤화된 루프를 함유할 수 있다.
안키린 반복 단백질 라이브러리의 임의의 그러한 N-말단 캡핑 모듈은 바람직하게는 RILLAA, RILLKA 또는 RELLKA 모티프(예를 들어, 서열 번호 1에서 위치 21 내지 26에 존재함)를 갖고, 안키린 반복 단백질 라이브러리의 임의의 그러한 C-말단 캡핑 모듈은 바람직하게는 KLN, KLA 또는 KAA 모티프(예를 들어 서열 번호 1에서 마지막 3개의 아미노산에 존재함)를 갖는다. 서열 번호 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15는 RILLAA, RILLKA 또는 RELLKA 모티프를 포함하는 N-말단 캡핑 모듈의 예를 제공하고, 서열 번호 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25는 KLN, KLA 또는 KAA 모티프를 포함하는 C-말단 캡핑 모듈의 예를 제공한다.
그러한 안키린 반복 단백질 라이브러리의 설계는, 표적과 상호작용하는 안키린 반복 도메인의 알려진 구조에 의해 안내될 수 있다. 단백질 데이터 뱅크(PDB) 고유 수탁 또는 식별 코드(PDB-ID)에 의해 확인되는, 그러한 구조의 예는 1WDY, 3V31, 3V30, 3V2X, 3V2O, 3UXG, 3TWQ-3TWX, 1N11, 1S70 및 2ZGD이다.
설계된 안키린 반복 단백질 라이브러리, 예컨대 N2C 및 N3C 설계된 안키린 반복 단백질 라이브러리의 예가 기재되어 있다(미국 특허 제7,417,130호; 문헌[Binz et al. 2003, 인용된 곳에서 참조]; 문헌[Binz et al. 2004, 인용된 곳에서 참조]). N2C 및 N3C에서 숫자는 N-말단 캡핑 모듈과 C-말단 캡핑 모듈 사이에 존재하는 랜덤화된 반복 모듈의 수를 기재한다.
반복 단위 및 모듈 내부의 위치를 정의하는 데 사용된 명명법은 문헌[Binz et al. 2004, 인용된 곳에서 참조]에 기초하되, 안키린 반복 모듈 및 안키린 반복 단위의 경계가 1개의 아미노산 위치에 의해 이동되는 변형을 갖는다. 예를 들어, 문헌[Binz et al. 2004, 인용된 곳에서 참조]의 안키린 반복 모듈의 위치 1은 본 발명의 안키린 반복 모듈의 위치 2에 상응하고, 결과적으로 문헌[Binz et al. 2004, 인용된 곳에서 참조]의 안키린 반복 모듈의 위치 33은 본 발명의 뒤따르는 안키린 반복 모듈의 위치 1에 상응한다.
DNA 서열 모두는 서열분석에 의해 확인되었으며, 선택된 단백질의 계산된 분자량은 질량 분석법에 의해 확인되었다.
실시예 1 : CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 결합 단백질의 선택
리보솜 디스플레이(문헌[Hanes, J. and
Figure pct00001
, A., PNAS 94, 4937-42, 1997])를 사용하여, 인간 scCD3에 대한 결합 특이성을 갖는 많은 안키린 반복 단백질을 문헌[Binz et al. 2004, 인용된 곳에서 참조]에 의해 기재된 바와 유사한 DARPin® 라이브러리로부터 선택하였다. 재조합 인간 CD3 표적에 대한 선택된 클론들의 결합을 조(crude) 추출물 균일 시간 분해 형광(HTRF)에 의해 평가하였는데, 이는, 수백개의 인간 scCD3-특이적 결합 단백질이 성공적으로 선택되었음을 나타내었다. 예를 들어, 서열 번호 1의 안키린 반복 도메인은 scCD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 선택된 결합 단백질의 아미노산 서열을 구성한다. scCD3에 대한 결합 특이성을 갖는 그러한 안키린 반복 도메인들로부터의 개별적인 안키린 반복 모듈들은, 예를 들어 서열 번호 5 내지 9에 제공되어 있다.
인간 재조합 CD3 표적의 제조
선택된 표적 포맷은 단일쇄 포맷을 기반으로 하며, 이는 26개의 아미노산 링커에 의해 연결된 인간 CD3ε 및 CD3γ 이종이량체(scCD3εγ) 및 부위-지향적 비오티닐화를 위한 C-말단 Avi-태그로 이루어진다. 표적 단백질은 CD3 세포외 도메인만을 함유하며, C-말단 시스테인 "노브(knob)" 및 전체 막관통 및 세포질 영역이 결여되어 있다.
인간 scCD3εγ(서열 번호 32_scCD3εγ_Avi-Bio)의 세포외 도메인을 에스케리키아 콜라이에서 이전에 기재된 바와 유사하게 단일쇄 포맷으로 발현시킨 후(문헌[Kjer-Nielsen et al., PNAS, 2004, 101 (20) :7675-7680]), 봉입체(inclusion body)로부터 재접힘하고, 분취용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 정제하였다. 이 물질을 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 8.0 중에 3.4 mg/ml로 고농축시키고, 재조합 BirA를 사용하여 시험관내 비오티닐화를 수행하였다. 기능성 표적 물질을 단리하기 위해, 이 물질을 OKT3-로딩된 컬럼(GE HiTrap NHS-활성화된 HP 컬럼)을 사용하여 재정제하였다. 최종 물질은 크기 배제 상에서 단량체였으며, 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0, 10% 글리세롤 중에 0.39 mg/ml의 최종 농도로 저장하였다.
재조합 인간 scCD3 표적 제조 공정의 개요가 문헌[Dunstone et al., Acta Crystallographica 2004]에 기재되어 있다.
리보솜 디스플레이에 의한 CD3-특이적 안키린 반복 단백질의 선택
CD3-특이적 안키린 반복 단백질의 선택은, 표적 단백질로서의 CD3의 세포외 도메인(서열 번호 32)의 일부, 전술된 바와 같은 안키린 반복 단백질들의 라이브러리, 및 확립된 프로토콜(예를 들어, 문헌[Zahnd, C., Amstutz, P. and
Figure pct00002
, A., Nat. Methods 4, 69-79, 2007] 참조)을 사용하여 리보솜 디스플레이(문헌[Hanes and
Figure pct00003
, 인용된 곳에서 참조])에 의해 수행하였다. 매 선택 라운드 후마다 역전사(RT)-PCR 사이클의 횟수를 결합제의 풍부화로 인한 수율에 따라 조정하여, 45부터 28까지 끊임없이 감소시켰다. 처음 4회의 라운드의 선택은, 라운드 1부터 라운드 4까지 선택압을 증가시키기 위해 표적 농도(각각 400 nM, 133 nM, 45 nM 및 15 nM)를 감소시키고 세척 엄격성을 증가시키는 것을 사용하는 표준 리보솜 디스플레이 선택을 사용하였다(문헌[Binz et al. 2004, 인용된 곳에서 참조]). 라운드 2 내지 라운드 4에서는, 과량의 CD3 결합 항체 OKT3을 사용하여 경쟁적 용리에 의해 mRNA를 회수하였다(매 라운드마다, 경쟁자 과량을 35배부터 300배까지 일정하게 증가시켰음).
선택된 클론은 2가 포맷으로 T-세포를 활성화시킨다
CD3 표적에 결합하는 개별 안키린 반복 단백질 클론들을 리보솜 디스플레이에 의해 선택하고, pQE30(Qiagen) 발현 벡터의 유도체 내로 클로닝하고, E. 콜라이 XL1-블루(Stratagene) 내로 형질변환시키고, (1% 글루코스 및 50 μg/ml의 암피실린을 함유하는) LB-한천 상에서 플레이팅하고, 이어서 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. His- 및 Myc-태그 및 CD3-특이적 안키린 반복 도메인을 갖는 준 류신-지퍼(Jun leucine-zipper) 작제물인 발현 벡터를 (CD3-특이적 결합 도메인에 대해) 2가 포맷으로 스크리닝하는 데 사용하였으며, 이는 T-세포의 가교결합에 의한 기능성에 대한 시험을 가능하게 하였다. 단일 콜로니를 160 μl의 성장 배지(1% 글루코스 및 50 μg/ml의 암피실린을 함유하는 TB)가 담긴 96웰 플레이트 내로 픽킹하고(각각의 클론을 단일 웰 내로), 800 rpm으로 진탕하면서 37℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 50 μg/ml의 암피실린을 함유하는 신선한 TB 배지 150 μl에 신선한 96웰 플레이트 내에서 8.5 μl의 하룻밤 배양물을 접종하였다. 37℃ 및 850 rpm으로 120분 동안 인큐베이션한 후에, IPTG(0.5 mM 최종 농도)를 사용하여 발현을 유도하고, 4시간 동안 지속하였다. 세포를 수집하고, 펠릿을 -20℃에서 하룻밤 냉동시킨 후, 8.5 μl의 B-PERII(Thermo Scientific) 중에 재현탁시키고, 진탕하면서(600 rpm) 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 160 μl의 PBS를 첨가하고, 세포 잔해를 원심분리에 의해 제거하고(15분 동안 3220 g), 추가의 사용을 위해 -20℃에서 저장하였다.
첫 번째 단계에서는, BK112 CD8+ 단일클론 T-세포를 사용하여 T-세포 활성화 스크리닝을 수행하였다. 각각의 용해된 클론의 추출물을 PBSB(12% (w/v) FBS가 보충된 PBS(pH 7.4)) 중 1:20 희석물(최종 농도)로서 항-펜타-His-항체(Qiagen) 코팅된 96웰 플레이트에 적용하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS로 5회 세척한 후에, 웰당 100 μl의 100,000개의 BK112 T 세포를 첨가하고, T-세포 검정 배지 RPMI-1640 + 10% FBS + 1% L-글루타민 + 1% Pen Strep + 200 IU의 IL2 중에서 배양하였다. 0.1 μg/100 μL의 Golgi Stop을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 3분 동안 20 g로 원심분리한 후, CO2 인큐베이터 내에서 37℃에서 4 내지 5시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 4℃에서 5분 동안 350 g로 원심분리하고, 디캔팅하였다.세포를 표면 CD8 발현에 대해 염색한 후, BD Cytofix를 사용하여 세포를 보존하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. 세포를 1 × PBS + 2% FBS로 세척하고, Cell Perm(BD) 중 IFNγ-APC 항체 50 μl를 첨가함으로써 세포내 IFNγ에 대해 염색하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 PBS 중에 다시 세척하고, BD로부터의 Cytometer FACS Canto II를 사용하여 분석하였다.
선택된 클론은 CD3에 대한 결합(HTRF 및 OKT3 경쟁에 의해 밝혀짐) 및 이중특이성 포맷에서의 기능성을 나타낸다
T 세포 인게이저(TCE) 작제물을 생성하기 위해서, 확인된 기능성 설계된 안키린 반복 도메인 히트(hit)를 N-말단 His-태그, 종양-관련 항원 1(TAA1)-특이적 안키린 반복 도메인 및 CD3-특이적 안키린 반복 도메인을 함유하는 pQE30(Qiagen) 발현 벡터의 유도체 내로 하위클로닝하였다. 작제물을 E. 콜라이 세포에서 발현시키고, 표준 프로토콜에 따라 그들의 His-태그를 사용하여 정제하였다. 25 ml의 안정 상태의 하룻밤 배양물(TB, 1% 글루코스, 50 μg/ml의 암피실린; 37℃)을 사용하여 500 ml의 배양물(TB, 50 μg/ml의 암피실린, 37℃)을 접종시켰다. 600 nm에서의 1.0 내지 1.5의 흡광도에서, 배양물을 0.5 mM IPTG를 사용하여 유도하고, 진탕시키면서 4 내지 5시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 배양물을 원심분리하고, 생성된 펠릿을 25 ml의 TBS500(50 mM Tris―HCl, 500 mM NaCl(pH 8)) 중에 재현탁시키고, 용해시켰다(초음파 처리). 용해 후에, 샘플을 50 KU DNase/ml와 혼합하고, 15분 동안 인큐베이션한 후, 62.5℃에서 30분 동안 열처리 단계를 수행하고, 원심분리하고, 상층액을 수집하고 여과하였다. Triton X100(1% (v/v) 최종 농도) 및 이미다졸(20 mM 최종 농도)을 균질액에 첨가하였다. 단백질을 Ni-니트릴로트라이아세트산(Ni-NTA) 컬럼으로 정제한 후, 당업자에게 알려진 표준 프로토콜 및 수지에 따라
Figure pct00004
™ 시스템 상에서의 크기 배제 크로마토그래피로 정제하였다.
첫 번째 단계에서는, 재조합 단백질에 대한 결합을 HTRF 검정을 사용하여 시험하였다. PBS-TC(0.1% (w/v) 카제인 및 0.1% Tween20이 보충된 PBS, pH 7.4) 중 안키린 반복 단백질(5 내지 640 nM)의 적정을, 384웰 플레이트의 웰 내에서 48 nM(최종 농도)의 인간 비오티닐화 scCD3εγ, 1:100(최종 농도)의 항-6His-D2 HTRF 항체 ― FRET 수용체 접합체(Cisbio) 및 1:100(최종 농도)의 항-Strep-Tb 항체 FRET 공여자 접합체(Cisbio)에 대해 수행하고, 실온에서 120분 동안 인큐베이션하였다. 340 nm 여기 파장 및 665 ± 10 nm 방출 필터를 사용하여 Tecan M1000 상에서 HTRF를 판독하였다. 몇몇 후보가 용량 의존적 결합을 나타내었으며, 이들을 추가의 평가를 위해 사용하였다. 이들 모든 작제물에 대해, 결합 신호는, CD3ε의 입체구조 에피토프에 결합하는 20배 과량의 CD3 결합 항체(인간 Fc 영역을 함유하는 OKT3 변이체 - 최종 농도 2.4 mM)와 경쟁하였을 때, 백그라운드 수준이었다(문헌[Kjer-Nielsen et al., PNAS, 2004, 101 (20):7675-7680]). TAA1 발현 종양 세포의 존재 하에서, BK112 T-세포 활성화 검정(CD3/CD28 Dynabead로 사전활성화된 BK112 CD8 단일클론 T-세포)을 사용하여 용량-의존적 시험관내 T-세포 활성화를 확인하였다. 1 내지 100,000 pM의 이중특이성 TCE 작제물의 존재 하에서 BK112 및 SKOV3 세포(E:T = 1:10)의 5시간의 인큐베이션 후에 CD8+ 또는 CD4+ T-세포 상에서 시험관내 IFNy 수준을 측정하였다. 가장 강력한 작제물은 CD4+ 및 CD8+ 세포에 대해 각각 0.5 nM 및 0.4 nM의 EC50 값을 나타내었다.
선택된 CD3-특이적 안키린 반복 단백질의 친화도 성숙 및 합리적인 설계
합리적인 설계와 조합된 수회 라운드의 친화도 성숙을 모체 저친화도 결합 CD3-특이적 안키린 반복 단백질(전구체 A로 명명됨)에 적용하고, 4개의 더 높은 친화도의 CD3-특이적 안키린 반복 단백질(전구체 B, 전구체 C 및 전구체 D로 명명됨)을 생성하였다. 이어서, 마지막으로 이들 전구체 분자를 CD3-특이적 안키린 반복 단백질 DARPin® 단백질 #1, DARPin® 단백질 #2, DARPin® 단백질 #3 및 DARPin® 단백질 #4로 조작하였다.
문헌[Zahnd et al., Nat Methods, 2007, 4: 269―279]에 의해 기재된 바와 같이 오류-유발(error-prone) PCR 및 DNA I 셔플링을 사용하여 다양성을 도입함으로써, 시험관내에서 T-세포를 효율적으로 활성화하는 능력 및 CD3 표적에 대한 충분한 결합 능력 둘 모두를 고려하여 선택된 모체 CD3-특이적 안키린 반복 단백질(전구체 A) 중 하나에 대해 친화도 성숙을 수행하였다. 간단하게 말하면, 상이한 농도의 dNTP-유사체(Jena Biosciences로부터의 돌연변이생성 키트; 5 내지 10 μM 8-옥소-dGTP 및 dPTP를 사용함)를 사용하여 3회 라운드의 리보솜 디스플레이를 수행하여, 표적 농도를 5 nM로 일정하게 유지하면서, 증가하는 선택압을 사용하여(세척 단계를 라운드 1(3 × 15분)로부터 3 × 30분(라운드 2)으로, 3 × 45분(라운드 3)으로 증가시킴), 라운드당 CD3-특이적 안키린 반복 단백질당 대략 1개 또는 2개의 돌연변이를 도입시켰다. 두 번째 단계에서는, 90초의 DNAse I 인큐베이션 시간 및 DNA 폴리머라제 HotStarTaq DNA Polymerase(Qiagen)를 사용하여 이전에 기재된 바와 같이(문헌[Cadwell & Joyce, PCR Methods Appl, 1992, 2:28―33]; 문헌[Stemmer, Nature, 1994 370:389―391]; 문헌[Zaccolo et al, J Mol Biol 1996, 255: 589―603]) 1회 또는 2회 라운드의 리보솜 디스플레이에서 모체 클론을 사용하여 DNA 풀(pool)을 DNA-셔플링하고 백-크로싱하였다(back-crossed). 친화도 성숙된 CD3-특이적 안키린 반복 단백질 풀을, N-말단 His-Flag-태그, 반감기 연장을 위한 HSA 결합 안키린 반복 도메인, TAA1-결합 안키린 반복 도메인 및 CD3-특이적 안키린 반복 도메인을 최종적으로 함유하는 pQE30(Qiagen) 발현 벡터의 유도체 내로 하위클로닝하고, 발현시키고, 전술된 바와 같이 HTRF에 의해 재조합 scCD3εγ에 대한 결합에 대해 스크리닝하였다. 선도 클론을 선택하였다(전구체 B; 이는 5회 라운드의 친화도 성숙 후에 생성되었으며, 이때 5회 라운드는, 모든 단계에서 10 μM dNTP 유사체를 사용하는 3회 라운드의 오류-유발 PCR, 및 2회 라운드의 DNA-셔플링 및 백-크로싱을 포함함).
동일한 프로세스에서, 증가된 T-세포 활성화를 위한 몇몇 잠재적인 유익한 돌연변이가 BK112 검정에서의 IFNγ+ T-세포의 %에 의해 확인되었으며, 이에는 위치 5 및 20에서의 N-캡(cap) 돌연변이, 위치 2 및 4에서의 제1 내부 반복 돌연변이, 위치 2, 5 및 20에서의 제2 내부 반복 돌연변이, 및 위치 1 및 18에서의 C-캡 돌연변이가 포함된다. 이들 돌연변이의 조합 - 열안정성을 유지하기 위해 N-캡 및 C-캡 프레임워크 돌연변이를 최소한으로 유지하면서 - 으로 한 세트의 설계된 변이체를 생성하였으며, 이들을 동일한 포맷으로 다시, 개선된 T-세포 활성화에 대해 시험하였다. 그럼으로써, 모체 및 초기 성숙된 것과 대비하여 더 높은 T-세포 활성화 효력을 갖는 새로운 한층 더 성숙된 변이체(전구체 C)를 생성하였다.
CD3 친화도 및 T-세포 활성화 효력을 훨씬 더 증가시키기 위해, 전술된 것과 유사하게, 전구체 C 클론에 대해 두 번째 친화도 성숙을 수행하였다. 간단하게 말하면, 4회 라운드의 리보솜 디스플레이를 수행하였다. 처음 3회 라운드에서는, 7.5 μM의 dNTP 유사체를 사용하여 오류-유발 PCR에 의해 돌연변이를 도입시켰다. 라운드 1 및 라운드 3에서는, 경쟁을 위하여, 한층 더 성숙된 클론 그 자체 또는 비-비오티닐화 CD3 표적 단백질 중 어느 하나를 사용하여 해리 속도 선택을 적용하였다. 라운드 1 및 라운드 2에서는 1 nM 표적을 사용한 반면, 덜 엄격한 라운드 3 및 라운드 4에서는 5 nM을 적용하였다. 경쟁자로서 250배 증가의 한층 더 성숙된 클론을 사용하여, 해리 속도 HTRF 검정을 사용하여, HSA-결합 도메인 및 TAA1 결합 안키린 반복 도메인을 포함하는 삼중특이성 포맷으로 CD3 변이체를 스크리닝하였다. 경쟁 후 최고 잔존 HTRF 신호를 갖는 총 3 × 96개의 클론을 서열분석하였다. 개선된 결합을 위한(N-캡 위치 16, 제1 내부 반복 위치 1, 12, 18, 19, 26, 30 및 33, 제2 내부 반복 위치 2, 3, 7, 20, 21, 26 및 32, 및 C-캡 위치 9, 11 및 18을 포함함) 또는 감소된 도메인 상호작용을 위한(N-캡 위치 11, 18, 19, 26, 및 C-캡 위치 3, 19 및 22를 포함함) 확인된 유익한 돌연변이를 BK112 T-세포 활성화를 위한 정제된 단백질 변이체에 대해 개별 돌연변이 또는 쌍을 이룬 돌연변이로서 먼저 시험하였다. 이어서, 가장 유익한 변이체를 두 번째 단계에서 재조합하고, 변이체를 최고 T-세포 활성화에 대해 스크리닝하였으며, 이는 전구체 D의 확인을 가져왔다.
마지막 단계에서는, 혈청 반감기 및 생물물리학적 특성을 개선하기 위해, 변이체 DARPin® 단백질 #1, DARPin® 단백질 #2, DARPin® 단백질 #3 및 DARPin® 단백질 #4를 각각 CD3-특이적 안키린 반복 단백질 A, B, C 및 D에 기반하여 생성하였다. 그럼으로써, 위치 23 및/또는 26에서의 N-캡 돌연변이를 도입시킴과 동시에, 프레임워크 돌연변이의 일부를 (위치 19, 18에서) 제거하였다.
인간 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 친화도 성숙된 안키린 반복 도메인을, 하기에 기재된 바와 같이 단순 단백질 정제를 용이하게 하도록 N-말단 His-태그(서열 번호 27)를 제공하는 pQE(QIAgen, 독일 소재) 기반 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 예를 들어, 하기 안키린 반복 단백질을 인코딩하는 발현 벡터를 작제하였다:
DARPin® 단백질 #1(His-태그(서열 번호 27)가 N-말단에 융합된 서열 번호 1);
DARPin® 단백질 #2(His-태그(서열 번호 27)가 N-말단에 융합된 서열 번호 2);
DARPin® 단백질 #3(His-태그(서열 번호 27)가 N-말단에 융합된 서열 번호 3);
DARPin® 단백질 #4(His-태그(서열 번호 27)가 N-말단에 융합된 서열 번호 4);
CD3-특이적 안키린 반복 단백질의 높은 수준 및 가용성 발현
면밀한 분석을 위해, 1가로서 또는 TAA 및/또는 HSA 결합 안키린 반복 도메인과 조합하여 특이적 CD3 결합을 보여주는 선택된 클론을 E. 콜라이 세포에서 발현시키고, 그들의 His-태그를 사용하여 정제한 후, 표준 프로토콜 및 당업자에게 알려진 수지에 따라
Figure pct00005
™ 시스템 상에서 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였다. 이들 단백질은 1가 작제물 및 다가 작제물에 대해 각각 TBS(pH 8.0)(50 mM Tris, 500 mM NaCl) 또는 PBS(pH 7.4) 중에 10 mg/ml로 농축되었을 때 단량체성이고 가용성이었다. 그러한 SDS-PAGE 분석의 대표적인 예가 도 1에 나타나 있다.
실시예 2: 예시적인 CD3-특이적 안키린 반복 단백질의 안정성 평가
UV 분광법, SDS-PAGE 및 크기-배제 크로마토그래피(SEC)를 사용한 예시적인 CD3-특이적 안키린 반복 단백질의 평가
4개의 선택된 CD3-특이적 안키린 반복 단백질을 면밀하게 분석하여 이들의 생물물리학적 특성을 평가하였다. 간략하게 말하면, TBS(pH 8.0)(50 mM Tris, 500 mM NaCl) 중 정제된 CD3-특이적 안키린 반복 단백질 DARPin® #1(서열 번호 1), DARPin® #2(서열 번호 2), DARPin® #3(서열 번호 3) 및 DARPin® #4(서열 번호 4)를 멸균 유리 바이알(Schmidlin: LPP 11 09 0620) 내로 분취하고, 50℃에서 18일 동안 인큐베이션함으로써 스트레스를 가하였다. 적용된 스트레스 조건은 4℃에서 2년간 저장 후의 생물물리학적 특성의 예측을 가능하게 한다. 각각의 CD3-특이적 안키린 반복 단백질에 대해, 참조로서 하나의 분취물을 -70℃에서 저장하였다. 참조 샘플 및 열-스트레스가 가해진 샘플을 분석 전에 동일한 횟수의 냉동-해동 사이클에 노출시켰다. UV 분광법에 의해 응집 및 탁도(크기 범위 > 100 μm)에 대해 그리고 SDS-PAGE 및 분석용 SEC에 의해 다량체화, 응집 및 단편화에 대해 샘플을 평가하였다. 이어서, 스트레스가 가해진 샘플을 각각의 참조 샘플과 대비하였다(도 2, 도 3 및 도 4).
원편광 이색성(CD) 분광법을 사용한 예시적인 CD3-특이적 안키린 반복 단백질의 열안정성 평가
상기 동일한 CD3-특이적 안키린 반복 단백질들을 또한 Jasco J-815 분광광도계를 사용하여 그들의 열안정성 및 풀림/재접힘 경향에 대해 평가하였다(스트레스가 가해지지 않은 단백질 단독). 선택된 단백질의 Tm(용융 온도)을 열안정성에 대한 파라미터로서 CD에 의해 결정한다. 간략하게 말하면, 타원율을 222 nM에서 기록하였으며, 20℃ 내지 95℃의 온도 범위를 적용한 후, 역스캔(reverse scan)을 수행하여 재접힘 거동을 기록하였다. 선택된 CD3-특이적 안키린 반복 단백질의 Tm은 단백질 풀림의 중간점이다.
샘플을 TBS(pH 8.0)(50 mM Tris, 500 mM NaCl) 중 2 μM의 농도로 제조하였다(도 5). 4개의 모든 시험된 단백질에 대해, 65℃보다 높은 Tm을 얻었다.
[표 1]
Figure pct00006
동적 광산란(DLS)에 의한 응집 개시 온도 T agg 의 결정
상기 동일한 CD3-특이적 안키린 반복 단백질들을 이들의 온도 의존적 응집 경향(Tagg)에 대해 평가하였다. 25℃ 내지 85℃의 온도 범위를 적용하고, 단백질의 수력학적 반경에 대해 플롯팅하였다. 평가를 위해, Wyatt DynaPro Plate Reader II(일련 번호 140-WPR2) 장치를 사용하였으며, 한편 측정치를 Dynamics 7.8.1.30 소프트웨어를 사용하여 처리하였다. 안키린 반복 샘플(표 2)을 TBS(pH 8.0)(50 mM Tris, 500 mM NaCl) 중 1 mg/ml의 농도로 제조하고, 5개의 반복시험물(A1, A2, A3, A4 및 A5)로 측정하였다(도 6).
도 6에 나타낸 바와 같이, 4개의 모든 시험된 안키린 반복 단백질은 65℃보다 훨씬 더 높은 온도에서 응집되는 경향이 있다.
[표 2]
Figure pct00007
실시예 3 : 암컷 BALB/c 마우스에서의 CD3-특이적 안키린 반복 단백질의 약동학적 분석
본 발명의 CD3-특이적 안키린 반복 도메인이 치료제의 개발에 유용하기에 적절한 생체내 혈청 반감기를 가질 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, DARPin® 단백질 #1, DARPin® 단백질 #2, DARPin® 단백질 #3 및 DARPin® 단백질 #4의 약동학적 프로파일을 마우스에서 분석하였다. 이를 위해, DARPin 작제물을 전술된 바와 같이, N-말단 His-태그, 반감기 연장을 위한 HSA 결합 안키린 반복 도메인, 이에 뒤따라서 CD3-특이적 결합 도메인 중 하나를 함유하는 pQE30(Qiagen) 발현 벡터의 유도체 내로 하위클로닝하고 발현시켰다. 2개의 안키린 반복 도메인을 펩티드 링커, 예컨대 서열 번호 31의 링커에 의해 서로 연결하였다.
예를 들어, 하기 안키린 반복 단백질을 인코딩하는 발현 벡터를 작제하였다:
DARPin® 단백질 #5(His-태그(서열 번호 27)가 N-말단에 융합된 서열 번호 33);
DARPin® 단백질 #6(His-태그(서열 번호 27)가 N-말단에 융합된 서열 번호 34);
DARPin® 단백질 #7(His-태그(서열 번호 27)가 N-말단에 융합된 서열 번호 35);
DARPin® 단백질 #8(His-태그(서열 번호 27)가 N-말단에 융합된 서열 번호 36);
생체내 투여 및 샘플 수집
인간 혈청 알부민 특이적 안키린 반복 도메인(서열 번호 29)과 함께 포맷화된 DARPin® 단백질 #5, DARPin® 단백질 #6, DARPin® 단백질 #7 및 DARPin® 단백질 #8을 각각의 안키린 반복 융합 단백질에 대해 6 마리의 마우스의 꼬리 정맥 내로 단회 정맥내 볼루스 주사로서 투여하였다. 목표 용량 수준은 5 mL/kg의 적용 부피로 1 mg/kg이었다. 안키린 반복 융합 단백질을 인산염-완충 식염수(PBS) 용액 중에 제형화하였다.
마우스를 동일한 동물 마리수로 2개의 군으로 나누었다. 각 마우스로부터 4개의 혈청 샘플을 수집하였다. 약동학적 조사를 위한 혈액 샘플을 화합물 투여 후 5분째, 4시간째, 24시간째, 48시간째, 76시간째, 96시간째 및 168시간째에 복재 정맥으로부터 수집하였다. 혈액을 실온에서 유지하여 혈병형성되게 한 후, 원심분리 및 혈청 수집을 수행하였다.
혈청 샘플에서 안키린 반복 단백질을 측정하기 위한 ELISA에 의한 생물분석
PBS 중 10 nM 다중클론 염소 항-토끼 IgG 항체(Ab18)의 웰당 100 μl를 4℃에서 하룻밤 NUNC Maxisorb ELISA 플레이트 상에 코팅하였다. 웰당 300 μl의 PBST(0.1% Tween20이 보충된 PBS)로 5회 세척한 후, Heidolph Titramax 1000 진탕기(450 rpm) 상에서 실온(RT)에서 1시간 동안 0.25% 카제인이 보충된 300 μl의 PBST(PBST-C)로 웰을 블로킹하였다. 플레이트를 전술된 바와 같이 세척하였다. PBST-C 중 100 μl의 5 nmol/L 토끼 항-DARPin® 1-1-1 항체를 첨가하고, 플레이트를 회전 진탕하면서(450 rpm) 실온(22℃)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 전술된 바와 같이 세척하였다.
100 μl의 희석된 혈청 샘플(1:5 희석 단계로 1:20 내지 1:312500) 또는 안키린 반복 단백질 표준 곡선 샘플(0 nmol/L 및 1:3 희석 단계로 50 내지 0.0008 nmol/L)을 450 rpm으로 진탕하면서 실온에서 2시간 동안 적용하였다. 플레이트를 전술된 바와 같이 세척하였다.
이어서, 웰을 100 μl의 뮤린 항-RGS-His-HRP IgG(Ab06, PBST-C 중 1:2000)와 함께 인큐베이션하고, 450 rpm으로 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 전술된 바와 같이 세척하였다. 5분 동안 100 μl/웰의 TMB 기질 용액을 사용하여 ELISA를 전개하고, 100 μl의 1 mol/L H2SO4의 첨가에 의해 정지하였다. 450 nm에서의 흡광도와 620 nm에서의 흡광도의 차이를 계산하였다. 샘플을 2개의 상이한 플레이트 상에서 2회 반복하여 측정하였다. 도 7a는 마우스 내로의 단회 정맥내 투여 후 시간의 함수로서의 DARPin® 단백질 #5, DARPin® 단백질 #6, DARPin® 단백질 #7 및 DARPin® 단백질 #8의 혈청 농도를 나타낸다. 트레이스는 화합물의 대체로 단일-지수적인 제거(roughly mono-exponential elimination)를 나타낸다.
약동학적 분석
Phoenix 64(미국 노스 캐롤라이나주 소재의 Pharsight)의 일부로서 WinNonlin 프로그램의 버전 7.0을 사용하여 Molecular Partners에서 약동학적 데이터 분석을 수행하였다. 정맥내 볼루스 주사를 통해 투여된 동물의 평균 농도-시간 데이터에 기초한 약동학적 파라미터의 계산을 비구획적 분석(NCA 모델 200-202, IV 볼루스, 선형 사다리꼴 선형 보간(linear trapezoidal linear interpolation))으로 수행하였다. 다음 약동학적 파라미터를 계산하였다:
AUCinf, AUClast, AUC_%extrapol, Cmax, Tmax, Cl_pred, Vss_pred, t1/2
최대 혈청 농도(Cmax) 및 이의 발생 시간(Tmax)은 혈청 농도-시간 프로파일로부터 직접 구하였다. 혈청 농도-시간 곡선 아래 면적(AUCinf)을 최종 샘플링 지점(Tlast)까지 선형 사다리꼴 공식에 의해 결정하고, 말단 단계의 단일 지수 감소를 가정하여 무한대로 외삽하였다. 무한대까지의 외삽은 Clast / λz를 사용하여 수행하였으며, 여기서 λz는 로그 선형 회귀에 의해 추정된 최종 속도 상수를 나타내고 Clast는 최종 로그 선형 회귀에 의해 Tlast에서 추정된 농도를 나타낸다. 총 혈청 제거율(Cl_pred) 및 겉보기 최종 반감기를 다음과 같이 계산하였다: Cl_pred = i.v. 용량 / AUCinf 및 t1/2 = ln2 / λz. 분포의 안정 상태 부피(steady-state volume) Vss는 다음과 같이 결정하였다: Vss = i.v. 용량
Figure pct00008
AUMCinf / (AUCinf)2. AUMCinf는 AUCinf의 계산에 대해 설명한 것과 동일한 외삽 절차를 사용하여 무한대로 외삽된 약물 농도-시간 곡선의 첫 번째 모멘트 아래의 총 면적을 나타낸다. nmol/L로 주어진 농도를 기반으로 PK 파라미터를 계산하기 위해, mg/kg으로 주어진 투여량 값을 안키린 반복 단백질의 분자량을 사용하여 nmol/kg으로 변환하였다. 표 3은 1 mg/kg의 단회 정맥내 투여 후의 4개의 시험된 안키린 반복 단백질 DARPin® 단백질 #5, DARPin® 단백질 #6, DARPin® 단백질 #7 및 DARPin® 단백질 #8의 약동학적 특성의 요약을 나타낸다.
[표 3]
Figure pct00009
실시예 4 : 표면 플라스몬 공명(SPR) 분석에 의한 인간 CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 단백질의 해리 상수(K D )의 결정
재조합 인간 CD3 표적에 대한 4개의 정제된 안키린 반복 단백질의 결합 친화도를 ProteOn 기기(BioRad)를 사용하여 분석하고, 당업자에게 알려진 표준 절차에 따라 측정을 수행하였다. 이를 위해, 본 발명의 DARPin® 단백질 #1, DARPin® 단백질 #2 및 DARPin® 단백질 #3 및 DARPin® 단백질 #4를 전술된 바와 같이, N-말단 His-태그, 2개의 상이한 TAA(각각 TAA2 및 TAA3) 결합 안키린 반복 도메인, 이에 뒤따라서 4개의 CD3-특이적 안키린 반복 단백질 작제물 중 하나를 함유하는 pQE30(Qiagen) 발현 벡터의 유도체 내로 하위클로닝하고 발현시켰다.
간략하게 말하면, 비오티닐화 인간 scCD3εγ를 PBST(0.005% Tween 20®을 함유하는 PBS(pH 7.4)) 중에 희석시키고, NLC 칩(BioRad) 상에 약 700 내지 1400 공명 단위(RU)의 수준으로 코팅하였다. 이어서, 멀티-트레이스 SPR 측정을 위해 64 nM 내지 4 nM의 농도 범위를 포함하는 안키린 반복 단백질의 연속 희석물을 함유하는 300 μl의 전개 완충액(0.005% Tween 20®을 함유하는 PBS(pH 7.4))을 주입한 후, 60 μl/분의 일정 유량으로 적어도 10분 동안 전개 완충액 유동을 수행함으로써(해리 속도 측정), 안키린 반복 단백질과 인간 CD3의 상호작용을 측정하였다. 30 μl의 10 mM 글리신(pH 2)을 사용하여 재생을 수행하였다. 안키린 반복 단백질의 주입 후 획득된 RU 트레이스로부터 스폿간 및 참조 주입(즉, 전개 완충액 단독의 주입)의 신호(즉, 공명 단위(RU) 값)를 차감하였다(이중-참조(double-referencing)). CD3에 대한 결합 파라미터(KD, 결합 속도, 해리 속도)를 친화도-성숙된 작제물에 대해 결정하였다. 결합 속도(kon) 및 해리 상수(KD)는 단지 근사치로서 주어지는데, 그 이유는, 최고 샘플 농도에서조차도 결합 평형에 적절하게 도달하지 않았으며, 이로 인해 결합 속도에 대한 비최적 적합(non-optimal fit)으로 이어지기 때문이다.
대표적인 예로서, 도 7b는 TAA2- 및 TAA3-결합 설계된 안키린 반복 도메인과 함께 포맷화된 DARPin® 분자 #3에 대해 얻어진 SPR 트레이스를 보여준다. 당업자에게 알려진 표준 절차를 사용하여 추정된 결합 속도 및 해리 속도로부터 해리 상수(KD)를 계산하였다. 선택된 안키린 반복 단백질과 인간 CD3의 결합 상호작용의 KD 값은 6 내지 35 nM의 범위인 것으로 결정되었다(표 4 참조).
[표 4]
Figure pct00010
실시예 5 : CD3 T 세포 결합의 결정
Mirrorball 레이저 스캐닝 이미징 세포측정법을 사용하여 1차 인간 T 세포에 대해 CD3 결합의 결정을 수행하였다. 따라서, Pan-T 세포 정제 키트(Miltenyi Biotec)를 사용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 1차 T 세포를 단리하였다. (TAA2 및 TAA3 결합 안키린 반복 도메인을 포함하는) 삼중특이성 포맷으로 포맷화되거나, 또는 (인간 혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 추가의 안키린 반복 도메인을 포함하는) 사중특이성 포맷으로 포맷화된, 적정량(titration)의 DARPin® 단백질 #1, DARPin® 단백질 #2, DARPin® 단백질 #3 및 DARPin® 단백질 #4 - 본 명세서에서 각각 DARPin® 단백질 #A, DARPin® 단백질 #B, DARPin® 단백질 #C 및 DARPin® 단백질 #D로 명명됨 - 를 4℃에서 30분 동안 (생리학적 혈청 농도를 모방하기 위해) 600 μM 인간 혈청 알부민의 존재 하에서 웰당 50,000개의 Pan-T 세포와 함께 인큐베이션하였다. 삼중특이성 TCE 단백질을 생성하기 위해, DARPin® 단백질 #1, DARPin® 단백질 #2, DARPin® 단백질 #3 및 DARPin® 단백질 #4를 각각 전술된 바와 같이, N-말단 His-태그, 이에 뒤따라서 2개의 상이한 TAA-특이적 안키린 반복 도메인(각각 TAA2- 및 TAA3-특이적 순서로), 그리고 이어서 이에 뒤따라서 본 발명의 CD3-특이적 안키린 반복 도메인 중 하나를 인코딩하는 pQE30(Qiagen) 발현 벡터의 유도체 내로 하위클로닝하고 발현시켰다. 사중특이성 TCE 단백질의 경우, 인간 혈청 알부민-특이적 안키린 반복 도메인을 His-태그와 TAA2-특이적 도메인 사이에 추가로 포함시켰다. 안키린 반복 도메인들을 펩티드 링커, 예컨대 서열 번호 31의 링커에 의해 서로 연결하였다. 2개의 벤치마크 T-세포 인게이저를 TAA2 또는 TAA3 중 어느 하나를 표적화하는 대조군으로서 적용하였다. 세척 후, CD3 결합을 1:100-희석된 항-펜타-His Alexa Fluor 488 항체(Qiagen)에 의해 검출하였다. 4℃에서 30분간 인큐베이션 후, 세포를 세척하고, Cytofix 고정 완충액(BD Biosciences) 중에 재현탁시키고, 실온에서 15분 동안 5 μM DRAQ5(Abcam)에 의해 대비염색하였다. 원적색(far-red) 대비염색된 세포 상에의 Alexa Fluor 488 결합의 평균 형광 강도의 중위값을 Cellista 소프트웨어(SPT Labtech)를 사용하여 Mirrorbal에 의해 측정하고, 데이터를 GraphPad Prism 8을 사용하여 플롯팅하였다.
도 8a 및 도 8b에 나타낸 바와 같이, DARPin® 단백질은, '#A 경우의 검출가능한 결합이 없음'부터 '#D 경우의 벤치마크 분자만큼 우수한 결합'에 이르기까지의 광범위한 친화도를 나타낸다(기지의 벤치마크 T 세포 인게이저, 즉, TAA2에 대한 결합 특이성을 갖는 TCE1 및 TAA3에 대한 결합 특이성을 갖는 TCE2). T 세포에 대한 CD3 결합을 SPR에 의해 측정된 CD3 친화도에 맞추어 정렬시킨다. 추가의 HSA 결합 도메인의 존재(도 8b 참조)는 T 세포에 대한 결합에 단지 미소한 영향만을 미쳤다. 표 5는 4개의 예시적인 안키린 반복 단백질의 CD3 결합 친화도를 나타낸 것으로, 이들의 EC50 값으로 나타나 있다.
[표 5]
Figure pct00011
실시예 6 : LDH 세포독성 검정에 의해 CD3-특이적 안키린 반복 단백질에 의해 유도된 표적-특이적 단기 종양 세포 살해의 평가
세포 결합(실시예 5)에 대해 기재된, 상기 포맷의 4개의 CD3-특이적 안키린 반복 단백질(DARPin® 단백질 #1 내지 #4)의 특이성 및 효력을 LDH 방출에 의해 시험관내 단기 세포독성 검정에 의해 평가하였다.
이펙터 세포와 표적 세포를 96웰 플레이트 내에서 (생리학적 농도를 모방하기 위해) 600 μM 인간 혈청 알부민의 존재 하에서 5:1의 E:T 비로 2회 반복하여 동시-인큐베이션하였다. Pan-T 세포 단리 키트(Miltenyi)를 사용하여 인간 PBMC로부터 접촉되지 않은 T 세포를 단리하였다. 웰당 100,000개의 정제된 Pan-T 세포(이펙터 세포)와 20,000개의 TAA2/TAA3-발현 종양 세포(표적 세포)를 선택된 CD3-특이적 안키린 반복 단백질의 연속 희석물, 대조 벤치마크 분자, 또는 1% Triton X-100을 함유하는 대조군과 함께 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 48시간 인큐베이션 후, 세포를 스핀 다운하고, 웰당 100 μl의 상층액 및 웰당 100 μl의 LDH 반응 혼합물(LDH 검출 키트; Roche Applied Science)을 30분 동안 인큐베이션하였다. TECAN Infinite M1000Pro 판독기에 의해 492 nm 내지 620 nm에서 흡광도를 측정하였다. 백그라운드 보정 후, GraphPad Prism 8을 사용하여 OD 값을 플롯팅하였다.
도 9a에 나타낸 바와 같이, 반감기 연장을 갖지 않는 DARPin 단백질의 경우, DARPin® 단백질 #2 및 DARPin® 단백질 #3은 벤치마크 분자(기지의 벤치마크 T 세포 인게이저, 즉, TAA2에 대한 결합 특이성을 갖는 TCE1)와 비견되는 종양 세포 살해를 유도한 반면, DARPin® 단백질 #1 및 DARPin® 단백질 #4는 10 내지 100배 더 낮은 효력을 나타낸다. 도 9b에서, 반감기 연장된 DARPin® 단백질은 상응하는 반감기 연장되지 않은 분자와 대비하여 약 4 내지 70배의 효력 감소를 나타낸다.
실시예 7 : 표적-특이적 단기 T 세포 활성화 및 IFNγ 분비의 평가.
전술된 CD3-특이적 안키린 반복 단백질(실시예 5 및 실시예 6)의 특이성 및 효력을 CD8+ T 세포 상의 CD25 활성화 마커를 측정하는 FACS에 의해 그리고 IFNγ 분비를 측정하는 ELISA에 의해 시험관내 단기 T 세포 활성화 검정에서 평가하였다.
따라서, 웰당 100,000개의 정제된 Pan-T 세포(이펙터 세포)와 100,000개의 TAA2/TAA3-발현 종양 세포(표적 세포)를 선택된 결합 단백질의 연속 희석물 또는 대조 벤치마크 분자와 함께, 37℃에서 24시간 동안 600 μM 인간 혈청 알부민의 존재 하에서 2회 반복하여 동시-인큐베이션하였다(E:T 비 1:1). 24시간 후, 제조자 프로토콜에 따라 인간 IFNγ 표준 ABTS ELISA 개발 키트(PeproTech)에 의한 IFNγ 분비의 측정을 위해 웰당 100 μl의 상층액을 옮겼다. 세포를 세척하고, 1:1,000 Live/Dead Aqua(Thermo Fisher), 1:250 마우스 항-인간 CD8 퍼시픽 블루(Pacific Blue)(BD), 및 1:100 마우스 항-인간-CD25 PerCP-Cy5.5(eBiosciences) 항체를 사용하여 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 세척 및 고정 후에, 세포를 FACS Canto II(BD) 기계 상에서 분석하였다. Live/Dead-음성 상에서의 CD25+ 세포 및 CD8+ 게이팅된 T 세포를 측정함으로써 T 세포 활성화를 평가하였다. FACS 데이터를 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하고, GraphPad Prism 8을 사용하여 데이터를 플롯팅하였다.
도 10a에 나타낸 바와 같이, 반감기 연장을 갖지 않는 DARPin® 단백질 #2 및 DARPin® 단백질 #3은, 벤치마크 분자(기지의 벤치마크 T 세포 인게이저, 즉, TAA2에 대한 결합 특이성을 갖는 TCE1)와 비견되는 특정 단기 T-세포 활성화를 유도한 반면, DARPin® 단백질 #1 및 DARPin® 단백질 #4는 10 내지 100배 더 낮은 효력을 나타내었다. 도 10b에서, 반감기 연장된 DARPin® 단백질은 상응하는 반감기 연장되지 않은 분자와 대비하여 약 3 내지 100배의 효력 감소를 나타내었다.
실시예 8 : IncuCyte에 의한 표적-특이적 장기 종양 세포 살해의 평가
IncuCyte S3 플랫폼을 사용하여 시험관내 장기 살해 검정에 의해 CD3-특이적 안키린 반복 단백질(실시예 5, 실시예 6 및 실시예 7에 기재됨)의 특이성 및 효력을 평가하였다.
TAA2/TAA3-발현 종양 세포를 먼저 NucLight Red(NLR) 렌티바이러스 입자(Sartorius)에 의해 형질도입시키고, 0.7 μg/ml의 퓨로마이신 및/또는 FACS 분류에 의해 적색-형광 세포를 선택하였다. 이어서, IncuCyte S3 시스템(Sartorius)을 사용하여 장기 종양 세포 살해를 평가하였다. 이펙터 세포와 표적 세포를 0.01% 폴리-L-오르니틴-코팅된 96웰 플레이트 상에서 1:200 아넥신 V 그린(Sartorius) 및 (생리학적 농도를 모방하기 위해) 600 μM 인간 혈청 알부민의 존재 하에서 5:1의 E:T 비로 2회 반복하여 동시-인큐베이션하였다. 웰당 50,000개의 정제된 (Miltenyi) Pan-T 세포(건강한 공여자 PBMC로부터 단리됨) + 10,000개의 TAA2/TAA3-발현 종양 세포(NLR 형질도입됨)를 선택된 안키린 반복 단백질의 연속 희석물 또는 대조 벤치마크 분자와 함께 37℃에서 최대 6일까지 인큐베이션하였다. 이미지를 매 2시간마다 촬영하여 세포 증식(NLR로부터의 적색 형광) 및 세포 사멸(아넥신 V로부터의 녹색 형광)을 평가하였다. GraphPad Prism 8을 사용하여 6일의 공동배양 후에 곡선 아래 면적을 계산함으로써 총 세포 증식 및 종양 세포 살해를 분석하였다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 시험된 DARPin® 단백질 #2, #3 및 #4는, 반감기 연장과 무관하게, 벤치마크 분자(기지의 벤치마크 T 세포 인게이저, 즉, TAA2에 대한 결합 특이성을 갖는 TCE1, 및 TAA3에 대한 결합 특이성을 갖는 TCE2)와 비견되는 강력하고 특이적인 종양 세포 살해를 보여준다. 단지 더 낮은 친화도의 DARPin® #1만이 살해 효력의 감소를 나타낸다.
실시예 9 : FACS에 의한 표적-특이적 장기 T-세포 활성화 및 증식의 평가
FACS-기반 시험관내 장기 T-세포 활성화 검정에 의해 CD3-특이적 안키린 반복 단백질(실시예 5, 실시예 6, 실시예 7 및 실시예 8에 기재됨)의 특이성 및 효력을 평가하였다.
약물- 및 표적-특이적 T-세포 활성화 및 증식을 평가하기 위해, 이펙터 세포와 표적 세포를 선택된 분자의 연속 희석물의 존재 하에서 1:1의 E:T 비로 2회 반복하여 공동-인큐베이션하였다. 정제된 (Miltenyi) Pan-T 세포(건강한 공여자 PBMC로부터 단리됨)를 먼저 5 μM CellTrace Violet(CTV)(Thermo Fischer)으로 37℃에서 20분 동안 표지하였다. 이어서, 웰당 50,000개의 CTV-표지된 Pan-T 세포 + 50,000개의 TAA2/TAA3-발현 종양 세포를 (생리학적 농도를 모방하기 위해) 600 μM 인간 혈청 알부민의 존재 하에서, 선택된 CD3-특이적 안키린 반복 단백질의 연속 희석물 또는 대조 벤치마크 분자 TCE1 및 TCE2와 함께 37℃에서 인큐베이션하였다. 5일 후에, 세포를 PBS로 세척하고, 1:5,000 Live/Dead Green(Thermo Fisher), 1:100 마우스 항-인간 CD8 PE(BD), 및 1:100 마우스 항-인간-CD25 PerCP-Cy5.5(eBiosciences) 항체를 사용하여 4℃에서 30분 동안 염색하였다. PBS로 2회 세척한 후에, 세포를 CellFIX(BD)를 사용하여 4℃에서 20분 동안 고정시키고, 마지막으로 완충액을 PBS로 대체하였다. 염색된 세포를 FACS Canto II(BD) 기계 상에서 분석하였다. Live/Dead-음성 상에서의 CD25+ 세포 및 CD8+ 게이팅된 T 세포를 측정함으로써 T 세포 활성화를 평가하였다. Live/Dead-음성 및 CTV-양성 세포를 게이팅함으로써 T-세포 증식을 평가하였다. FACS 데이터를 FlowJo 소프트웨어를 사용하여 분석하고, GraphPad Prism 8을 사용하여 데이터를 플롯팅하였다.
도 13 및 도 14에 나타낸 바와 같이, 반감기 연장을 갖지 않는 DARPin® 단백질 #2 및 #3은, 벤치마크 분자(기지의 벤치마크 T 세포 인게이저, 즉, TAA2에 대한 결합 특이성을 갖는 TCE1 및 TAA3에 대한 결합 특이성을 갖는 TCE2)와 비견되는 장기 T-세포 활성화 및 증식을 유도한 반면, DARPin® 단백질 #1 및 #4는 10 내지 100배 더 낮은 효력을 나타낸다. 반감기 연장된 CD3-특이적 안키린 반복 단백질은 상응하는 반감기 연장되지 않은 분자와 대비하여 약 5 내지 30배의 효력 감소를 나타낸다.
실시예 10: PBMC 인간화 마우스 및 TAA-발현 종양 모델에서의 예시적인 다중특이성 TCE 결합 단백질의 생체내 효능 평가
실험 A. DARPin® 단백질 #2, DARPin® 단백질 #3 및 DARPin® 단백질 #4를 사중특이성 TCE 분자로 포맷화하였는데, 이는 DARPin® 단백질 #2, DARPin® 단백질 #3 또는 DARPin® 단백질 #4에 추가하여, TAA2, TAA3 및 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함한다. 이를 위해, DARPin® 단백질 #2, DARPin® 단백질 #3 및 DARPin® 단백질 #4를 전술된 바와 같이, N-말단 His-태그, 이에 뒤따라서 인간 혈청 알부민-특이적 안키린 반복 도메인, 이어서 이에 뒤따라서 2개의 상이한 TAA-특이적(각각 TAA2- 및 TAA3-특이적) 안키린 반복 도메인, 그리고 이어서 이에 뒤따라서 본 발명의 CD3-특이적 안키린 반복 도메인 중 하나를 인코딩하는 pQE30(Qiagen) 발현 벡터의 유도체 내로 하위클로닝하고 발현시켰다. 안키린 반복 도메인들을 펩티드 링커, 예컨대 서열 번호 31의 링커에 의해 서로 연결하였다. 상응하는 TCE 단백질은 본 명세서에서 각각 DARPin® 단백질 #F(DARPin® 단백질 #2를 포함함), DARPin® 단백질 #G(DARPin® 단백질 #3을 포함함) 및 DARPin® 단백질 #H(DARPin® 단백질 #4를 포함함)로 명명되었다. DARPin® 단백질 #2를 삼중특이성 TCE 분자로 유사하게 포맷화하였는데, 이는, DARPin® 단백질 #2에 추가하여 TAA2 및 TAA3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하지만, HSA-특이적 안키린 반복 도메인이 결여되어 있다. 이 TCE 단백질은 본 명세서에서 DARPin® 단백질 #E로 명명된다. DARPin® 단백질 #E, DARPin® 단백질 #F, DARPin® 단백질 #G 및 DARPin® 단백질 #H를 고형 피하 종양으로서 TAA2/TAA3-발현 종양 세포주를 갖는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 인간화 마우스 모델에서 시험하고, 임상 시험에서 현재 시험되는 기지의 TAA3 표적화된 T 세포 인게이저 분자와 대비하였다.
재료 및 방법
동물: 60 마리의 암컷 NOG 마우스, 연구 개시 65일째에서의 동물의 주령(age)(제공자: Taconic Biosciences)
시험 분자 및 대조 분자: DARPin® 단백질 #E, DARPin® 단백질 #F, DARPin® 단백질 #G, 및 DARPin® 단백질 #H를 5 mg/ml의 농도로 앞서 기재된 바와 같이 생성하였음; 대조군, 벤치마크 TAA3 표적화된 TCE 0.59 mg/ml: Evitria AG에 의해 제공됨
치료군: 60 마리의 마우스를 연구에 등록하였다. 모든 동물을 8개의 상이한 연구군에 무작위로 할당하였다. 종양 세포 접종 일자는 일수 0으로 표기한다.
방법: 실험 시작 2일 전에 체중을 기록하고, 각각의 군에서 동일한 평균 체중 및 유사한 표준 편차를 갖도록 마우스를 무작위화하였다. 평균 체중은 19.6 g이었다.
일수 -2에서, 마우스에 5 × 106개의 PBMC를 복막내 주사하였다.
일수 0에서, 마우스의 우측 옆구리에 106개의 TAA2/TAA3-발현 종양 세포를 피하 주사하였다.
일수 5에서, 표 8에 따라 복막내 주사로 치료를 시작하였다. 마지막 치료는 일수 16에서 실시되었다.
종양 측정 및 칭량을 일수 7, 10, 12, 14, 17, 19에서 수행하였다. 종양 부피를 다음 식에 따라 계산하였다: [길이 × (폭)2 × π] / 6.
ANOVA에 의해 성장 곡선들을 비교함으로써 종양 부피 데이터를 분석하고, 비모수적 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정에 따라 다중 비교(던 검정(Dunn's Test))를 보정하였다.
치료군의 종양 부피를 대조군의 부피와 대비하였다. 2개의 상이한 PBMC 공여자로부터의 데이터를 함께 그리고 개별적으로 분석하였다.
[표 7]
Figure pct00012
결과
종양 성장 억제
시험된 다중특이성 결합 단백질 및 기지의 벤치마크 T 세포 인게이저에 대한 노출 시의 종양 성장 곡선이 도 15의 (a) 내지 (c)에 요약되어 있으며, 이에는 공여자들을 함께 수행한 것 및 개별적으로 수행한 것 둘 모두가 포함되어 있다.
[표 8]
공여자 B로부터의 PBMC는 마우스 혈액 중 더 낮은 양의 CD8 양성 림프구로 이어졌다. 일반적으로, 모든 시험된 분자에서 항종양 효과가 관찰되었다. DARPin® 단백질 #F 및 기지의 TAA3 T 세포 인게이저는 치료 개시 후 5일로부터 효과를 나타내기 시작한 반면, DARPin® 단백질 #G 및 DARPin® 단백질 #H의 효과는 치료 개시 후 7일부터 유의성 및 관련성을 나타내기 시작하였다. 단지 하위군 A만을 비교하였을 때, 치료 개시 후 일수 5부터 모든 시험된 분자에 대해 통계학적으로 유의한 효과가 관찰되기 시작하였다. DARPin® 단백질 #F, DARPin® 단백질 #G 및 DARPin® 단백질 #H의 효과는 벤치마크 TAA3 T 세포 인게이저 및 DARPin® 단백질 #E의 효과보다 더 강하였다. 하위군 B를 비교하였을 때, DARPin® 단백질 #G 및 벤치마크 TAA3 T 세포 인게이저에 대해 유의한 항종양 효과가 관찰되었다.
벤치마크 TCE에 대해 얻어진 결과는 사용된 모델을 검증하였다. 동시에, 공여자 B로부터의 PBMC로 인간화된 마우스에서 관찰된 벤치마크의 덜 뚜렷한 효과는 이 하위군에 속하는 마우스의 감수성이 더 낮음을 나타낸다. 이는 또한 공여자 B로부터의 PBMC로 인간화된 마우스에서 이 실험의 종료 시점에서 발견되는 인간 CD8 양성 림프구의 유의하게 더 낮은 양에 의해 반영된다.
따라서, 더 많은 관련성이 공여자 A로부터의 PBMC로 인간화된 마우스로부터 조달된 데이터에 기인되어야 한다.
종양 크기의 높은 변동성은, 모든 마우스에서 종양이 인식가능하기 전에 치료가 개시되었기 때문에 마우스에서 무작위화 및 범위 선택이 수행되지 않았다는 사실에 기인한다. 이러한 높은 변동성에도 불구하고, 초기 종양 부피에 대한 정규화에 대한 필요성 없이 통계학적 분석을 수행할 수 있었다.
본 발명자들은 시험된 모든 다중특이성 결합 단백질이 항종양 활성을 나타내고, 사용된 용량 및 적용 계획에서 반감기 연장된 분자, DARPin® 단백질 # F, DARPin® 단백질 #G 및 DARPin® 단백질 #H는 반감기 연장되지 않은 DARPin® 단백질 #E보다 더 강한 항종양 활성을 갖는다는 것을 확인하였다. 이론에 의해 구애되고자 함이 없이, DARPin® 단백질 #E의 노출은 이 분자의 더 짧은 반감기로 인해 더 낮을 수 있는 것으로 여겨진다.
전체적으로, 4개의 모든 시험된 다중특이성 결합 단백질은 벤치마크 T 세포 인게이저와 비견되거나 그보다 더 강한 생체내 항종양 활성을 나타내었다. 이들 결과는 본 발명의 CD3-특이적 안키린 반복 도메인이 TAA-특이적 결합 도메인(들)(및 반감기 연장 모이어티)과 조합되어 생체내에서 항-종양 활성을 갖는 T 세포 인게이저 분자를 형성할 수 있음을 입증하였다. 따라서, 그러한 TCE 분자로 포맷화될 때, 본 발명의 CD3-특이적 안키린 반복 도메인은 생체내에서 CD3에 결합하고 T 세포를 활성화하는 그들의 능력을 유지한다.
실험 B. 유사한 실험 셋업에서, DARPin® 단백질 #3을 육중특이성 TCE 분자로 포맷화하였는데, 이는, TAA2, TAA3 및 TAA4에 대한 결합 특이성을 각각 갖는 3개의 설계된 안키린 반복 도메인, 및 인간 혈청 알부민에 대한 결합 특이성을 갖는 2개의 설계된 안키린 반복 도메인을 추가로 포함한다. 이를 위해, DARPin® 단백질 #3을 전술된 바와 같이, N-말단 His-태그, 이에 뒤따라서 2개의 인간 혈청 알부민-특이적 안키린 반복 도메인, 이어서 이에 뒤따라서 3개의 상이한 TAA-특이적 안키린 반복 도메인(각각 TAA3-, TAA2- 및 TAA4-특이적 순서로), 그리고 이어서 이에 뒤따라서 본 발명의 CD3-특이적 안키린 반복 도메인 중 하나(DARPin® 단백질 #3)를 인코딩하는 pQE30(Qiagen) 발현 벡터의 유도체 내로 하위클로닝하고 발현시켰다. 안키린 반복 도메인들을 펩티드 링커, 예컨대 서열 번호 31의 링커에 의해 서로 연결하였다. 이러한 육중특이성 TCE 분자는 2021년 12월 9일자로 출원된 미국 특허 출원 제63/265,184호에 더 상세히 기재되어 있으며, 이의 개시내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다. 그러한 다중특이성 TCE 포맷의 DARPin® 단백질 #3을 고형 피하 종양으로서 TAA2/TAA3/TAA4-발현 종양 세포주(Molm-13)를 갖는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 인간화 마우스 모델에서 시험하고, 임상 시험에서 현재 시험되는 기지의 TAA3 표적화된 T 세포 인게이저 분자와 대비하였다.
간략하게 말하면, 6 내지 9 주령된 암컷 면역결핍 NXG 마우스(Janvier Labs에 의해 제공됨)에서 생체내 실험을 수행하였다. 마우스를 표준 설치류 마이크로-아이솔레이터 케이지(20 +/- 1℃ 실온, 50 +/- 10% 상대 습도 및 12시간 명암 주기) 내에서 표준화된 환경 조건 하에 유지하였다. 마우스는 방사선 조사된 먹이 및 잠자리(bedding) 및 0.22 um 여과된 음용수를 제공받았다. 모든 실험은 스위스 주 연방 수의학 당국(cantonal and federal veterinary authority)으로부터의 승인과 함께 스위스 동물 보호 법칙(Swiss Animal Protection Law)에 따라 행해졌다.
암 세포의 이종이식 전에, NXG 마우스에 hPBMC를 복막내 주사하였다. TAA2/TAA3/TAA4-발현 종양 세포를 NXG 마우스의 우측 옆구리 부위에 피하(s.c.) 이종이식하였다. 2명의 hPBMC 공여자를 사용하였다. 암 세포 이식 후 4일째에 치료제를 정맥내(i.v.) 주사하였다. 대부분의 종양은 이 시점에서 아직 확립되지 않았다. 치료제를 하기와 같이 투여하였다:
- (다중특이성 TCE 포맷의) DARPin® 단백질 #3을 0.5 mg/kg으로 2주 동안 주당 3회 i.v. 투여하였음
- 벤치마크 TAA3 표적화된 T 세포 인게이저를 0.5 mg/kg으로 2주 동안 매일 i.v. 투여하였음
종양 크기를 캘리퍼 측정에 의해 평가하였다. 다음 식을 사용하여 종양 부피를 계산하였다: 종양 부피(mm3) = 0.5 × 길이 × 폭2.
도 16의 (a) 및 (b)에서 알 수 있는 바와 같이, 다중특이성 TCE 포맷의 DARPin® 단백질 #3은 실험 전체 시간에 걸쳐(도 16의 (a)) 그리고 첫 번째 주사 후 17일째에(도 16의 (b)) 종양 성장 및 종양 부피의 억제의 관점에서 우수한 효능을 나타내었다. 이 결과는 본 발명의 CD3-특이적 안키린 반복 도메인이 TAA-특이적 결합 도메인(들) 및 반감기 연장 모이어티(들)와 조합되어 생체내에서 항-종양 활성을 갖는 T 세포 인게이저 분자를 형성할 수 있음을 추가로 입증하였다. 따라서, 그러한 TCE 분자로 포맷화될 때, 본 발명의 CD3-특이적 안키린 반복 도메인은 생체내에서 CD3에 결합하고 T 세포를 활성화하는 그들의 능력을 유지한다.
본 명세서는 본 명세서 내에 인용된 참고문헌의 교시내용에 비추어 가장 철저하게 이해된다. 본 명세서에서의 태양은 본 발명의 태양의 예시를 제공하며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 당업자는 많은 다른 태양이 본 발명에 의해 포함된다는 것을 용이하게 인식한다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 GenBank 서열은 전체적으로 참고로 포함된다. 참고로 포함된 자료가 본 명세서와 모순되거나 일치하지 않는 한에 있어서, 본 명세서는 임의의 그러한 자료를 대체할 것이다. 본 명세서에서의 임의의 참고문헌의 인용은 그러한 참고문헌이 본 발명에 대한 종래 기술임을 인정하는 것은 아니다.
당업자는 단지 일반적인 실험을 사용하여, 본 명세서에서 설명된 본 발명의 구체적인 태양에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> MOLECULAR PARTNERS AG <120> RECOMBINANT CD3 BINDING PROTEINS AND THEIR USE <130> AD4028 PCT S3 <150> US 63/126,356 <151> 2020-12-16 <150> US 63/182,394 <151> 2021-04-30 <150> EP 20 216 705.2 <151> 2020-12-22 <160> 46 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ankyrin repeat domain specific for CD3 <400> 1 Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Ser Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln Thr Gly His Leu 35 40 45 Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Asp Lys Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Leu Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence 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Sequence <220> <223> C-capping module 7 <400> 23 Arg Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly 1 5 10 15 His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn 20 25 <210> 24 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-capping module 8 <400> 24 Arg Asp Thr Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly 1 5 10 15 His Arg Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Ala 20 25 <210> 25 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-capping module 9 <400> 25 Arg Asp Thr Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala Ala Lys Tyr Gly 1 5 10 15 His Arg Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Leu Asn 20 25 <210> 26 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-capping module randomized <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 3 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 6 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 11 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 15 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 19 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 22 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <220> <221> VARIANT <222> 26 <223> Xaa can be any naturally occuring amino acid <400> 26 Xaa Asp Xaa Xaa Gly Xaa Thr Pro Ala Asp Xaa Ala Ala Arg Xaa Gly 1 5 10 15 His Gln Xaa Ile Ala Xaa Val Leu Gln Xaa Ala Ala 20 25 <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His tag <400> 27 Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser 1 5 10 <210> 28 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for human serum albumin 1 <400> 28 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asn Glu Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 <210> 29 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for human serum albumin 2 <400> 29 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 <210> 30 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat domain specific for human serum albumin 3 <400> 30 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Asp Ala Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 115 120 <210> 31 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PT linker <400> 31 Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr 1 5 10 15 Pro Thr Pro Thr Pro Thr 20 <210> 32 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scCD3IμI³_Avi-Bio <400> 32 Met Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr 1 5 10 15 Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr 20 25 30 Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly 35 40 45 Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu 50 55 60 Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro 65 70 75 80 Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala 85 90 95 Arg Val Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp 100 105 110 Asp Ala Lys Lys Asp Asp Ala Lys Lys Asp Gly Ser Gln Ser Ile Lys 115 120 125 Gly Asn His Leu Val Lys Val Tyr Asp Tyr Gln Glu Asp Gly Ser Val 130 135 140 Leu Leu Thr Cys Asp Ala Glu Ala Lys Asn Ile Thr Trp Phe Lys Asp 145 150 155 160 Gly Lys Met Ile Gly Phe Leu Thr Glu Asp Lys Lys Lys Trp Asn Leu 165 170 175 Gly Ser Asn Ala Lys Asp Pro Arg Gly Met Tyr Gln Cys Lys Gly Ser 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Ala Trp Ala 145 150 155 160 Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asp Ser Gln Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln 180 185 190 Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Asp Lys Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala 210 215 220 Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Lys Tyr Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 34 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein specific for HSA-CD3 <400> 34 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala 145 150 155 160 Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln 180 185 190 Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asp Asp Lys Gly Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala 210 215 220 Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Gln Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Lys Tyr Gly His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 35 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein specific for HSA-CD3 <400> 35 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala 145 150 155 160 Gly Gln Asp Asp Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln 180 185 190 Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Asn Asp Lys Arg Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala 210 215 220 Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Arg Asp Ser Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Lys Tyr Gly His Gln Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 36 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ankyrin repeat protein specific for HSA-CD3 <400> 36 Asp Leu Gly Lys Lys Leu Leu Glu Ala Ala Arg Ala Gly Gln Asp Asp 1 5 10 15 Glu Val Arg Glu Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys Asp 20 25 30 Tyr Phe Ser His Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Arg Asn Gly His Leu 35 40 45 Lys Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala Lys 50 55 60 Asp Phe Ala Gly Lys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Ala Asp Gly His 65 70 75 80 Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val Asn Ala 85 90 95 Gln Asp Ile Phe Gly Lys Thr Pro Ala Asp Ile Ala Ala Asp Ala Gly 100 105 110 His Glu Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala Gly Ser Pro Thr 115 120 125 Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr 130 135 140 Pro Thr Gly Ser Asp Leu Gly Gln Lys Leu Leu Glu Ala Ala Trp Ala 145 150 155 160 Gly Gln Leu Asp Glu Val Arg Ile Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp Val 165 170 175 Asn Ala Lys Asn Ser Arg Gly Trp Thr Pro Leu His Thr Ala Ala Gln 180 185 190 Thr Gly His Leu Glu Ile Phe Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Lys Thr Asn Lys Arg Val Thr Pro Leu His Leu Ala Ala 210 215 220 Ala Leu Gly His Leu Glu Ile Val Glu Val Leu Leu Lys Ala Gly Ala 225 230 235 240 Asp Val Asn Ala Arg Asp Thr Trp Gly Thr Thr Pro Ala Asp Leu Ala 245 250 255 Ala Lys Tyr Gly His Arg Asp Ile Ala Glu Val Leu Gln Lys Ala Ala 260 265 270 <210> 37 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding domain of SEQ ID NO 1 <400> 37 atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggctcagatc tgggtcaaaa gttattggag 60 gcagcttggg ctggacaaga tgacgaagta cgtgaattgt taaaagcggg agcagatgta 120 aacgcaaaag atagtcaagg ttggactccg ttacacacag cagcgcaaac cggccacctg 180 gaaattttcg aggtgttatt gaaggctgga gcagatgtga atgcaaaaga cgacaaaggg 240 gtgactccgc tgcatctggc agcggcgttg gggcacttgg aaatcgttga ggtccttctg 300 aaagcaggcg ctgatgtgaa tgcgcaagac tcctggggaa ccacaccagc ggacctggcg 360 gctaagtacg gccacgaaga tattgctgaa gttctgcaga aggcagcata atgatag 417 <210> 38 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding domain of SEQ ID NO 2 <400> 38 atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggctcagatc tgggtcaaaa gttgttggaa 60 gctgcctggg cgggacagga tgatgaggtg cgcgaattac ttaaggcggg agcagacgtg 120 aatgcgaaaa actctcgtgg ctggacacca ctgcacacgg ccgcgcaaac tggtcacctt 180 gaaattttcg aagtgcttct gaaggcaggc gcagatgtaa acgccaagga tgacaaaggg 240 gtaacaccgc ttcatctggc tgctgcactg ggacatcttg agattgtcga agtactgctt 300 aaggcaggtg ctgacgtaaa cgctcaggat tcatggggga ccacaccggc ggacctggcg 360 gctaaatacg gacatgaaga tattgctgaa gttctgcaga aggcagcata atgatag 417 <210> 39 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding domain of SEQ ID NO 3 <400> 39 atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggctcagatc tgggtcaaaa gctgttggaa 60 gccgcgtggg cgggtcagga cgatgaagtc cgtgagctgc ttaaagcagg agccgacgtg 120 aacgcgaaga actcacgcgg gtggacgcca cttcacacgg ccgcgcagac aggtcacctt 180 gaaatctttg aggttcttct gaaggcagga gcagacgtta acgccaaaaa cgacaagcgc 240 gtgactccgt tgcaccttgc cgcagctctg gggcatttgg agatcgttga ggtactgttg 300 aaagcgggag cagatgttaa tgctcgcgac agttggggga cgacaccagc agacctggcc 360 gcaaaatacg gacaccaaga cattgctgaa gttctgcaga aggcagcata atgatag 417 <210> 40 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid encoding domain of SEQ ID NO 4 <400> 40 atgagaggat cgcatcacca tcaccatcac ggctcagatc tgggtcaaaa attgttagag 60 gcagcctggg cgggacagtt agacgaggtt cgtattcttt tgaaagctgg tgcggatgtg 120 aacgcaaaga attctcgtgg atggactccg ttgcacaccg ccgcacagac tgggcacttg 180 gaaatctttg aggttctgtt aaaagcaggg gcagatgtta acgctaaaac taataaacgt 240 gtcacccccc ttcacctggc tgcggcttta ggccatttag aaatcgtgga agtattactt 300 aaagccgggg ctgacgttaa cgcccgtgac acttggggga caacccctgc ggatctggcc 360 gccaaatatg gtcaccgcga cattgctgaa gttctgcaga aggcagcata atgatag 417 <210> 41 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus GS linker <220> <221> VARIANT <222> 1..5 <223> [Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n, wherein n is 1, 2, 3, 4, 5, or 6 <400> 41 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 42 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PT-rich peptide linker (standard) <400> 42 Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr 1 5 10 15 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Gly Ser 20 <210> 43 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker L <400> 43 Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr 1 5 10 15 Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr 20 25 30 Pro Thr Pro Thr Gly Ser 35 <210> 44 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker S <400> 44 Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr 1 5 10 15 Gly Ser <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker XS <400> 45 Gly Ser Pro Thr Pro Thr Pro Thr Thr Gly Ser 1 5 10 <210> 46 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker XXS <400> 46 Gly Ser Pro Thr Gly Ser 1 5

Claims (15)

  1. CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질로서,
    상기 안키린 반복 도메인은 안키린 반복 모듈을 포함하며, 상기 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5 내지 9, 및 (2) 서열 번호 5 내지 9 중 어느 하나에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 재조합 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 안키린 반복 모듈은 제1 안키린 반복 모듈이고, 상기 안키린 반복 도메인은 제2 안키린 반복 모듈을 추가로 포함하며, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5 내지 9, 및 (2) 서열 번호 5 내지 9 중 어느 하나에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는, 결합 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 5, 및 (2) 서열 번호 5에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  4. 제2항에 있어서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 6, 및 (2) 서열 번호 6의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  5. 제2항에 있어서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 8, 및 (2) 서열 번호 8의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  6. 제2항에 있어서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 7, 및 (2) 서열 번호 7에서의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 제2 안키린 반복 모듈은, (1) 서열 번호 9, 및 (2) 서열 번호 9의 최대 9개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 결합 단백질.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 안키린 반복 모듈은 상기 안키린 반복 도메인 내의 상기 제2 안키린 반복 모듈의 N-말단에 위치되는, 결합 단백질.
  8. CD3에 대한 결합 특이성을 갖는 안키린 반복 도메인을 포함하는 재조합 결합 단백질로서,
    상기 안키린 반복 도메인은 서열 번호 1 내지 4 중 어느 하나와 적어도 80% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 서열 번호 1 내지 4의 마지막에서 두 번째 위치에서의 A는 L로 선택적으로 치환되고/되거나, 서열 번호 1 내지 4의 마지막 위치에서의 A는 N으로 선택적으로 치환되는, 재조합 결합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질은 10-7 M 미만의 해리 상수(KD)로 PBS 중의 인간 CD3에 결합하는, 결합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질은 2 내지 900 nM 범위의 EC50으로 T 세포 상의 인간 CD3에 결합하는, 결합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질은 질병-관련 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 결합제를 추가로 포함하는, 결합 단백질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 단백질은 반감기 연장 모이어티(half-life extending moiety)를 추가로 포함하는, 결합 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 결합 단백질을 인코딩하는 핵산.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 결합 단백질 또는 제13항의 핵산, 및 선택적으로, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물.
  15. 의학적 질환의 치료 방법으로서,
    이를 필요로 하는 환자에게 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 결합 단백질, 제13항의 핵산, 또는 제14항의 약제학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
KR1020237024124A 2020-12-16 2021-12-16 재조합 cd3 결합 단백질 및 이의 용도 KR20230120139A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2335861T3 (es) 2000-09-08 2010-04-06 Universitat Zurich Grupos de proteinas repetitivas que comprenden modulos repetitivos.
EP2198022B1 (en) 2007-09-24 2024-03-06 University Of Zurich Designed armadillo repeat proteins
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