ES2688591T3

ES2688591T3 - Método para producir formulaciones sólidas que comprenden dominios variables individuales de inmunoglobulina

Info

Publication number: ES2688591T3
Application number: ES12710751.4T
Authority: ES
Inventors: Ann Debunne; Veronique De Brabandere
Original assignee: Ablynx NV
Current assignee: Ablynx NV
Priority date: 2011-03-28
Filing date: 2012-03-28
Publication date: 2018-11-05
Anticipated expiration: 2032-03-28
Also published as: AU2012234282A1; AU2012234282B2; US20140065145A1; WO2012130872A1; EP2691415B1; EP2691415A1; DK2691415T3; US9468679B2; PT2691415T

Abstract

Método de producción de una formulación sólida de un dominio variable individual de inmunoglobulina, que es un procedimiento de granulación en húmedo o un procedimiento de recubrimiento en el que se agita un material portador sólido y se pone en contacto con un líquido que comprende un dominio variable individual de inmunoglobulina como agente activo y simultáneamente se aplica calor para evaporar el líquido, en el que el método se realiza a una temperatura del material portador sólido puesto en contacto con el líquido que comprende un dominio variable individual de inmunoglobulina de entre 40 °C y 80 °C.

Description

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inmunoglobulina VH camelizado o cualquier fragmento adecuado o combinación de los mismos.

A menos que se indique lo contrario, el término “inmunoglobulina” (ya se use en el presente documento para hacer referencia a un anticuerpo de cadena pesada o a un anticuerpo de 4 cadenas convencional) se usa como término general para incluir el anticuerpo de tamaño completo, las cadenas individuales del mismo así como todas las partes, dominios o fragmentos del mismo (incluyendo, pero sin limitarse a, dominios o fragmentos de unión a antígeno tales como dominios VHH o dominios VH/VL, respectivamente). Los términos moléculas de unión a antígeno o proteína de unión a antígeno se usan de manera intercambiable con secuencia de inmunoglobulina, e incluyen Nanobody.

Los dominios variables individuales de inmunoglobulina proporcionados por el método de la invención están preferiblemente en forma aislada o forma esencialmente aislada, o forman parte de una proteína o polipéptido, que puede comprender o consistir esencialmente en uno o más dominios variables individuales de inmunoglobulina y que puede comprender opcionalmente de manera adicional una o más secuencias de aminoácidos adicionales (todas unidas opcionalmente a través de uno o más grupos de unión adecuados). Por ejemplo, y sin limitación, los uno o más dominios variables individuales de inmunoglobulina pueden usarse como unidad de unión en una proteína o polipéptido de este tipo, que puede contener opcionalmente una o más secuencias de aminoácidos adicionales que pueden servir como unidad de unión (por ejemplo, contra uno o más de otros antígenos y/o dianas), para proporcionar un polipéptido monovalente, multivalente o multiespecífico, respectivamente, todo ello tal como se describe en el presente documento. Una proteína o polipéptido de este tipo también puede estar en forma aislada o esencialmente aislada. Por tanto, según la invención, los dominios variables individuales de inmunoglobulina comprenden constructos que comprenden dos o más unidades de unión a antígeno en forma de dominios variables individuales, tal como se expuso anteriormente. Por ejemplo, dos (o más) dominios variables individuales de inmunoglobulina con la misma o diferente especificidad de antígeno pueden unirse para formar, por ejemplo, un constructo bivalente, trivalente o multivalente. Combinando dominios variables individuales de inmunoglobulina de dos o más especificidades, pueden formarse constructos biespecíficos, triespecíficos, etc. Por ejemplo, un polipéptido puede comprender dos dominios variables individuales de inmunoglobulina dirigidos contra la diana A, y un dominio variable individual de inmunoglobulina contra la diana B. Todos de tales constructos y modificaciones de los mismos, que el experto puede prever fácilmente, se proporcionan mediante el método de la presente invención.

Generalmente, los polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en un único dominio variable individual de inmunoglobulina (tal como un único Nanobody) se denominarán en el presente documento polipéptidos “monovalentes” o “constructos monovalentes”. Los polipéptidos que comprenden o consisten esencialmente en dos

o más dominios variables individuales de inmunoglobulina (tal como al menos dos Nanobody) se denominarán en el presente documento proteínas o polipéptidos “multivalentes” o “constructos multivalentes”. Algunos ejemplos no limitativos de tales constructos multivalentes resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción en el presente documento.

Según un aspecto específico, pero no limitativo, un polipéptido proporcionado mediante el método de la invención es un constructo bivalente y comprende o consiste esencialmente en dos dominios variables individuales de inmunoglobulina, tales como dos Nanobody. Según otro aspecto específico, pero no limitativo, un polipéptido es un constructo trivalente y comprende o consiste esencialmente en tres dominios variables individuales de inmunoglobulina, tales como tres Nanobody.

En los constructos anteriores, los uno o más dominios variables individuales de inmunoglobulina y/o Nanobody pueden estar directamente unidos entre sí y/o unidos de manera adecuada entre sí a través de una o más secuencias de unión.

La invención incluye secuencias de inmunoglobulina de origen diferente, comprendiendo secuencias de inmunoglobulina de ratón, rata, conejo, burro, humano y camélido. La invención también incluye secuencias de inmunoglobulina totalmente humanas, humanizadas o quiméricas. Por ejemplo, la invención comprende secuencias de inmunoglobulina de camélido y secuencias de inmunoglobulina de camélido humanizadas, o anticuerpos de dominio camelizados, por ejemplo Acd camelizados tal como se describe por Ward et al. (véase, por ejemplo, el documento WO 94/04678 y Davies y Riechmann (1994; Febs Letters 339: 285-290) y (1996; Prot. Engineering 9: 531-537)). Además, la invención comprende secuencias de inmunoglobulina fusionadas, por ejemplo formando un constructo multivalente y/o multiespecífico (para polipéptidos multivalentes y multiespecíficos que contienen uno o más dominios de VHH y su preparación, también se hace referencia a Conrath et al. 2001 (J. Biol. Chem. 276: 73467350), así como, por ejemplo, a los documentos WO 96/34103 y WO 99/23221), y secuencias de inmunoglobulina que comprenden etiquetas u otros restos funcionales, por ejemplo toxinas, marcadores, productos radioquímicos, etc., que pueden derivar a partir de las secuencias de inmunoglobulina.

Todas estas moléculas también se describen en la solicitud como “polipéptido”, que es sinónimo de “secuencias de inmunoglobulina”.

Además, el término “secuencia” tal como se usa en el presente documento (por ejemplo, en términos tales como “secuencia de inmunoglobulina”, “secuencia de anticuerpo”, “secuencia de dominio variable”, “secuencia de VHH” o

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“secuencia de proteína”) debe entenderse de manera general como que incluye tanto la secuencia de aminoácidos relevante así como secuencias de ácido nucleico o secuencias de nucleótidos que codifican para la misma, a menos que el contexto requiera una interpretación más limitada.

Formulación sólida de un dominio variable individual de inmunoglobulina

La presente solicitud describe formulaciones, por ejemplo formulaciones farmacéuticas o de diagnóstico. Estas formulaciones comprenden, como agente activo, dominios variables individuales de inmunoglobulina. Los “agentes activos” contribuyen a, o son responsables de, los efectos biológicos de la formulación, por ejemplo efectos terapéuticos en una composición farmacéutica. Los efectos biológicos pueden estar relacionados, en particular, con la actividad de unión a antígeno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina. Sin embargo, resulta evidente que una formulación sólida no ejercerá normalmente ningún efecto biológico a menos que sus agentes activos vuelvan a un estado adecuado, por ejemplo a una disolución acuosa. Esto puede lograrse antes del uso, por ejemplo antes de la administración, o como consecuencia del uso, por ejemplo tras la administración. Por ejemplo, si se ingiere un comprimido o una cápsula que comprende una formulación sólida por un sujeto que va a tratarse o diagnosticarse, los dominios variables individuales de inmunoglobulina se devolverán a un estado líquido por ejemplo dentro del tracto intestinal.

Los agentes activos son distintos de los compuestos auxiliares, portadores, excipientes, etc., que no tienen necesariamente efectos biológicos en sí mismos. Sin embargo, la descripción no excluye la presencia de agentes adicionales que tienen efectos biológicos por sí mismos.

Al mismo tiempo, la solicitud también describe formulaciones que comprenden más de un agente activo, que puede

o no ser un dominio variable individual de inmunoglobulina. Sin embargo, tales combinaciones de agentes activos siempre comprenden al menos un agente activo que comprende o que consiste en un dominio variable individual de inmunoglobulina. Las formulaciones están en un estado sólido. Las “formulaciones sólidas” incluyen polvos o gránulos, por ejemplo que pueden obtenerse mediante un procedimiento de granulación o recubrimiento. Las formulaciones sólidas pueden tener la forma de aglomerados, es decir una agregación de partículas de portador sólido intercaladas con agente activo, o la forma de portadores particulados recubiertos, en los que una capa que comprende el agente activo se deposita sobre la superficie del portador.

Sin embargo, el término también incluye formulaciones que pueden obtenerse mediante procesamiento adicional. Por ejemplo, si se prensa un granulado para dar un comprimido, se rellena en una cápsula o se formula para dar un implante (término que se pretende que incluya un depósito), en particular un implante sólido, entonces estos comprimidos, cápsulas e implantes también representan formulaciones sólidas. La formación de tales formulaciones sólidas puede comprender el uso adicional de excipientes adicionales, cargas, agentes aromatizantes, estabilizantes, etc. Por tanto, las formulaciones sólidas descritas en la solicitud pueden adaptarse a formas de administración convencionales, tales como administración oral, rectal, vaginal, ocular. En realizaciones particulares las formulaciones sólidas también pueden adaptarse a la administración mediante administración sublingual.

La presente solicitud se refiere a formulaciones sólidas sin limitación. “Formulación sólida” significa que se excluyen formulaciones líquidas. También se excluyen formulaciones tales como suspensiones o suspensiones espesas, que contienen altas cantidades de líquido, de manera que las propiedades físicas de la formulación se ven significativamente influidas por el líquido. Dicho de otro modo, “formulación sólida” tal como se usa en el presente documento se refiere a formulaciones que tienen un bajo contenido en líquido, es decir que están secas o esencialmente secas. Los ejemplos típicos de contenido en líquido incluyen un contenido de menos del 10 % (p/p), preferiblemente menos del 5 %, menos del 2,5 % o menos del 1 %, por ejemplo el 0,5-1 % o el 0,5-5 % de la formulación sólida.

Los dominios variables individuales de inmunoglobulina comprendidos en la formulación deben recuperar su actividad cuando se ponen en un entorno apropiado, por ejemplo se disuelven en un líquido. Con respecto a la formulación líquida de los dominios variables individuales de inmunoglobulina usada como material de partida en el procedimiento de producción de una formulación en estado sólido, la actividad de los dominios variables individuales de inmunoglobulina será por ejemplo de al menos el 50 %, 60 % o 70 %, preferiblemente al menos el 80 %, 90 % o 95 % tras la reconstitución de la formulación sólida a un estado líquido. Una comparación de este tipo empleará de manera adecuada condiciones (por ejemplo, temperatura, tampón, pH), que en sí mismas no afectan a la medición de la actividad. La actividad puede determinarse o bien mediante un ensayo de unión o bien mediante un ensayo que se basa en una actividad biológica adicional (por ejemplo, bloqueo de un determinado efecto biológico de la molécula diana). El experto puede determinar fácilmente ensayos adecuados basándose en la especificidad de antígeno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina.

Los valores anteriores de actividad serán preferiblemente estables a lo largo de tiempos prolongados de almacenamiento de la formulación sólida. Por ejemplo, los valores anteriores de actividad podrán alcanzarse tras al menos 1, 3 o 6 meses de almacenamiento de la formulación sólida a 4 °C.

En la realización particular de granulación en húmedo en lecho fluido, puede lograrse una actividad de más del

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90 %, preferiblemente más del 95 %, que permanece a más del 90 % incluso tras 3 meses de almacenamiento a 4 °C. En la realización de recubrimiento con perlas, puede lograrse una actividad de más de por ejemplo el 70 %, 75% u80%.

Aparte de la estabilidad en cuanto a la actividad de los dominios variables individuales de inmunoglobulina, las formulaciones sólidas descritas en la presente solicitud también se caracterizan por la integridad y estabilidad de los dominios variables individuales de inmunoglobulina desde el punto de vista químico y físico.

La integridad física puede determinarse, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión molecular (abreviada “SEC”). La formación de agregados o la pérdida de estructura, por ejemplo mediante desplegamiento, afectarán a las propiedades de flujo a través de dominios variables individuales de inmunoglobulina en este método cromatográfico. El experto conoce equipos cromatográficos adecuados y software de análisis. Los ejemplos no limitativos incluyen, por ejemplo, el sistema de HPLC Agilent 1200 equipado con software ChemStation (Agilent Technologies, Palo Alto, EE. UU., Rev B); sistema de HPLC Dionex Ultimate 3000 equipado con software Chromeleon (Dionex Corporation, Sunnyvale, CA, EE. UU., V6.8); o sistema ACQUITY UPLC® H-Class Bio (Waters, Saint-Quentin, Francia). Tales sistemas permiten la generación y el análisis de cromatogramas.

Normalmente, un pico principal que comprende el dominio variable individual de inmunoglobulina puede estar flanqueado por los denominados picos previos o posteriores, que representan variantes estructurales, por ejemplo agregados (peso molecular superior al pico de producto principal) o fragmentos (peso molecular inferior al pico de producto principal). Los picos en el cromatograma pueden compararse, por ejemplo en cuanto a su área bajo la curva. Esto puede lograrse mediante software comercial convencional tal como se mostró a modo de ejemplo anteriormente. Normalmente, el área bajo la curva total de todos los picos característicos en un cromatograma se establece al 100 % y también se denomina “área de pico”, y puede compararse la distribución entre diferentes picos de un cromatograma. Por ejemplo, el pico principal correspondiente a dominios variables individuales de inmunoglobulina puede ser del 98 %, y un pico previo, que comprende por ejemplo un agregado dimérico, puede ser del 2 % del área de pico total en el cromatograma. Estos patrones pueden compararse entre una referencia líquida y una formulación sólida. De manera ideal, la proporción del pico principal frente a los picos secundarios no cambiará,

o no cambiará significativamente, mediante los métodos de la invención.

Las formulaciones solo mostrarán cambios muy minoritarios entre el pico principal y los picos previos o posteriores provocados por el método de formulación. Por ejemplo, los aumentos relativos de picos previos o posteriores serán de menos del 5 % para cada pico individual, por ejemplo menos del 4, 3, 2 o 1 %. Esto significa, por ejemplo, que si en la muestra de referencia un pico previo individual 1 representa el 1 % del área total de picos, este pico no representará más del 6 % tras preparar una formulación sólida según los métodos de la presente invención, y más particularmente permanecerá por ejemplo al 2 o 3 %. Dicho de otro modo, los dominios variables individuales de inmunoglobulina conservarán su integridad física sin cambios significativos. Esto también se refleja en el hecho de que el pico principal que corresponde a los dominios variables individuales de inmunoglobulina será más del 90 %, más del 95 %, preferiblemente más del 96, 97 o 98 % del área total bajo la curva incluso tras el método de formulación de la presente invención.

Los cambios definidos anteriormente en el patrón de picos también pueden considerarse “cambio no significativo”, o “solo cambios minoritarios” en el contexto de la presente invención.

Además, el patrón de picos será estable en almacenamiento, y no diferirá significativamente (tal como se definió anteriormente) ni siquiera tras, por ejemplo, 3 meses de almacenamiento a 4 °C.

La estabilidad química de los dominios variables individuales de inmunoglobulina puede evaluarse, por ejemplo, mediante cromatografía de fase inversa (abreviada “RPC”, para equipos y software de análisis a modo de ejemplo adecuados, véase anteriormente). Las modificaciones químicas del polipéptido afectarán a los tiempos de retención y por tanto influirán sobre el cromatograma. Tal como en SEC, los diversos picos pueden analizarse y compararse con un valor de referencia.

En una realización preferida, la formulación descrita en la solicitud no mostrará ningún cambio significativo en el cromatograma de RPC en comparación con la muestra de referencia.

La formulación puede comprender un único tipo de dominio variable individual de inmunoglobulina, o una mezcla de dos o más tipos de dominios variables individuales de inmunoglobulina. En este contexto “tipo” significa por ejemplo una secuencia de dominio variable individual de inmunoglobulina particular que tiene una especificidad de antígeno dada, o un constructo que comprende dos o más de tales dominios variables individuales de inmunoglobulina, etc.

Los ejemplos típicos de formulaciones sólidas, en particular granulados y/o perlas recubiertas, comprenderán, en una base en peso/peso, menos de por ejemplo el 50 %, 40 %, 30 % o, preferiblemente, menos del 25 % de principio activo. El contenido de principio activo con respecto al peso total también se denomina algunas veces “cantidad de carga” o “carga” del principio activo. Ejemplos típicos son menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 % y más específicamente en el intervalo del 0,1 al 10 %. Ejemplos típicos de cargas que pueden obtenerse mediante un

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procedimiento de granulación en húmedo, por ejemplo un procedimiento de granulación en húmedo en lecho fluido, son carga del 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 %. Ejemplos no limitativos específicos de cargas que pueden obtenerse mediante un procedimiento de recubrimiento, por ejemplo un procedimiento de recubrimiento en lecho fluido, son carga del 3, 4, 5, 6, 7, 8 o9%.

Con frecuencia una alta carga resulta ventajosa, ya que da como resultado una alta actividad específica de la formulación, es decir, la actividad en cuanto a la unión a antígeno y/u otros efectos biológicos por peso de formulación. Una alta actividad específica conduce ventajosamente a unidades de dosificación menores, por ejemplo una cápsula, comprimido o implante menor. Sin embargo, en formas de dosificación sólidas, que pueden aplicarse a un paciente por ejemplo por vía oral, rectal o vaginal, con frecuencia la carga no es crítica, porque pueden usarse incluso cápsulas, comprimidos o implantes relativamente grandes con el fin de lograr la dosificación deseada en un paciente.

Cuando se procesan adicionalmente un granulado y/o perlas recubiertas, la carga en % de la forma de unidad de dosificación final, por ejemplo, para comprimido, cápsula o implante, puede ser menor, dependiendo de la cantidad de agentes adicionales (por ejemplo, agentes auxiliares adicionales y/o agentes activos adicionales) que se añaden.

Constituyentes de formulaciones sólidas

Las formulaciones sólidas descritas en la solicitud, por ejemplo granulados, consisten en una mezcla de componentes, al menos un excipiente y un agente activo. Tal como se usa en el presente documento, el término “excipiente” se refiere a componentes farmacéuticamente aceptables que se usan habitualmente en la tecnología farmacéutica para preparar un granulado y/o formulaciones de dosificación orales sólidas. Los ejemplos de categorías de excipientes incluyen, pero no se limitan a, aglutinantes, disgregantes, lubricantes, deslizantes, estabilizantes, cargas y diluyentes. El experto puede seleccionar fácilmente uno o más de los excipientes anteriormente mencionados en vista de las propiedades deseadas particulares del granulado y/o la forma de dosificación oral sólida. La cantidad de cada excipiente usada puede variar dentro de intervalos convencionales en la técnica. En la medida en que el experto requiera cualquier orientación adicional, se hace referencia a la sección experimental de esta memoria descriptiva así como a libros de texto generales sobre técnicas y excipientes usados para formular formas de dosificación orales, tales como The Handbook of Pharmaceutical Excipients 2003 (4.ª edición, Rowe et al., Eds., American Pharmaceuticals Association); y Remington: the Science and Practice of Pharmacy 2000 (20.ª edición, Gennaro, Ed., Lippincott Williams & Wilkins).

En un procedimiento de granulación o de recubrimiento resulta de interés particular el portador sólido (es decir, un compuesto sólido que se pone en contacto con el líquido que comprende el dominio variable individual de inmunoglobulina), que se describe en más detalle a continuación.

Material portador sólido

Según la invención, la formulación de dominio variable individual de inmunoglobulina sólida comprenderá un material portador sólido. El portador está en forma de partículas sólidas, que pueden tener formas regulares o irregulares, por ejemplo polvos, cristales o perlas. El material portador puede ser un único compuesto químico, tal como por ejemplo manitol, o puede ser una mezcla de dos o más compuestos. También se prevé que el portador comprenda excipientes adicionales tal como se definió anteriormente. El portador será normalmente un polvo o perlas. Pueden usarse materiales portadores convencionales conocidos a partir de formulaciones sólidas, por ejemplo, en el campo de las preparaciones farmacéuticas. Específicamente, se usarán materiales portadores que no afectan negativamente a la unión a antígeno de los dominios variables individuales de inmunoglobulina. El experto puede determinar fácilmente mediante pruebas funcionales rutinarias si un material portador o mezcla de materiales dado es compatible con los dominios variables individuales de inmunoglobulina que son el principio activo de la formulación.

Generalmente se conocen materiales portadores sólidos aceptables que son compatibles con el método de la invención, por ejemplo un procedimiento de granulación en húmedo, más específicamente un procedimiento de granulación en lecho fluido o un procedimiento de granulación con mezcladora de alta cizalladura, en particular un procedimiento de granulación en lecho fluido.

Los ejemplos específicos de tales materiales portadores sólidos incluyen, pero no se limitan a, uno o más seleccionados de disacáridos tales como lactosa, maltitol, sacarosa, maltosa; polioles o alcoholes de azúcar tales como manitol, sorbitol, isomalt; fosfato de calcio; polisacáridos tales como maltodextrina, almidón y derivados de almidón, almidón pregelatinizado, inulina; celulosa; o mezclas de los mismos. En un aspecto preferido, el portador sólido usado en el procedimiento de granulación en húmedo es manitol.

El experto también conoce portadores sólidos que son compatibles con un procedimiento de recubrimiento. Por ejemplo, pueden seleccionarse de polvos y perlas, en particular perlas de tipo nonpareil inertes, más en particular perlas seleccionadas de uno o más de celulosa microcristalina, sacarosa o mezclas de las mismas.

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alimentación particulada en una cantidad igualmente predefinida. Después, puede seguir una fase de secado independiente, en la que no se añade ningún líquido adicional al recipiente de reacción. No obstante, la aplicación de calor continúa hasta que se logra un contenido en líquido residual deseado. La fase de secado puede no ser necesaria, por ejemplo en el caso en el que el contenido en líquido se mantiene continuamente por debajo del nivel deseado ajustando los parámetros de procedimiento de manera apropiada.

Los parámetros de procedimiento que pueden ajustarse fácilmente por el experto incluyen la tasa de alimentación particulada, la tasa de adición del líquido, la forma e intensidad de aplicación de calor, por ejemplo el volumen y la temperatura de un gas calentado que se envía como corriente a través del recipiente de reacción, la intensidad y forma de agitación física, por ejemplo mezclado o fluidizado mediante el uso de una corriente de gas, y la duración global del procedimiento. El experto puede obtener orientación sobre parámetros de procedimiento adecuados a partir de su conocimiento común en procedimientos de granulación en húmedo, y encontrará orientación adicional en la sección experimental de esta descripción.

La alimentación comprende al menos el material portador sólido, y normalmente puede comprender una mezcla de componentes sólidos que pueden incluir aglutinantes, diluyentes, adyuvantes de fluidez, tensioactivos, agentes humectantes, lubricantes y cargas.

En el contexto de la presente invención, la granulación en húmedo implica añadir un líquido que comprende los dominios variables individuales de inmunoglobulina como agente activo. La invención también abarca métodos en los que el líquido comprende agentes adicionales, por ejemplo aglutinantes tales como aglutinantes poliméricos.

Los aglutinantes pueden o bien disolverse previamente en el líquido que comprende los dominios variables individuales de inmunoglobulina. Alternativamente, los aglutinantes pueden incluirse en la alimentación particulada, por ejemplo mediante combinación previa con los otros componentes de la alimentación particulada. Entonces, los aglutinantes lograrán el efecto deseado tras entrar en contacto con el líquido que contiene el agente activo.

Según la invención, el material portador sólido y el líquido que comprende los dominios variables individuales de inmunoglobulina se ponen en contacto con agitación. La forma de agitación no está limitada, e incluye uno o más de mezclado, agitación, remoción, aplicación de una corriente de gas o combinaciones de los mismos. Tal agitación puede aplicarse usando un aparato de lecho fluido, bandeja, tambor y granuladores mezcladores. Preferiblemente, la agitación es continua.

En principio la invención también abarca procedimientos de granulación de baja cizalladura o alta cizalladura. Los procedimientos de granulación de baja cizalladura usan equipos de mezclado muy sencillos, y pueden tardar un tiempo considerable en lograr un estado mezclado de manera uniforme. Los procedimientos de granulación en húmedo de alta cizalladura usan equipos que mezclan la alimentación sólida particulada y líquido a una tasa muy rápida, y por tanto aceleran el procedimiento de fabricación. Sin embargo, normalmente la cantidad de líquido que puede mezclarse con portadores sólidos en procedimientos de granulación de baja o alta cizalladura, sin provocar que los portadores sólidos se disuelvan o disgreguen, es limitada. Se añaden dominios variables individuales de inmunoglobulina al portador sólido en un estado líquido. La concentración máxima de dominios variables individuales de inmunoglobulina en líquidos es limitada. La limitación del volumen de líquido total que puede añadirse por unidad de portador, junto con la limitación de la concentración máxima de dominios variables individuales de inmunoglobulina, da como resultado una limitación de la carga de agente activo que puede lograrse en el granulado final mediante tales procedimientos de granulación en húmedo. Por tanto, para aplicaciones farmacéuticas importantes el uso de tales procedimientos se ve rigurosamente limitado, en la medida en que no pueden lograrse las cargas requeridas.

Otro método convencional preferible de producción de formulaciones sólidas de fármacos de molécula pequeña implica el uso de aparatos de lecho fluidizado para granular y/o recubrir partículas de portador. En comparación con los procedimientos de granulación en húmedo anteriormente mencionados, el agente activo puede añadirse, por ejemplo pulverizarse, sobre un material portador de manera continua, mientras que al mismo tiempo se evapora líquido de manera continua mediante exposición a calor. Equilibrando la introducción de líquido y la evaporación, se evita la disgregación del material portador mediante líquido en exceso. La adición continua de agente activo permite el control sobre la carga de la formulación sólida final (granulado o perla recubierta) ajustando el tiempo de procedimiento. Cuando más tiempo se aplica el agente activo, más altas son las cargas en la formulación sólida final.

Este método se ha aplicado a péptidos muy pequeños, tales como insulina (Hosny et al. 2002; Int. J. Pharm. 237(12): 71-6). Sin embargo, en un procedimiento de granulación o de recubrimiento en lecho fluidizado, se expone el agente activo a calor en un estado líquido a lo largo de periodos de tiempo prolongados, por ejemplo de 30-90 min. Además, la agitación continua de las partículas de portador conduce a una intensa tensión de cizalladura en el lecho fluidizado, así como áreas de superficie de contacto muy grandes entre fase líquida y gaseosa. Anteriormente se ha considerado que esta exposición prolongada a calor en un estado líquido en condiciones de tensión de cizalladura era inadecuada para producir formulaciones de inmunoglobulina en estado sólido. Se esperaba que condujera a pérdida de actividad biológica debido a inestabilidad química y física.

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menos 20 min, al menos 30 min, al menos 40 min, al menos 50 min. Este intervalo de tiempo describe el tiempo entre el comienzo de la aplicación del líquido al material portador sólido bajo la influencia de calor, hasta que se evapora líquido suficiente de modo que ya no tiene que aplicarse calor. El tiempo de procedimiento estará regido normalmente por el tiempo requerido para reducir el contenido en líquido en la formulación hasta un nivel aceptable, tal como se definió anteriormente. Este tiempo también dependerá del tamaño de lote, que determina el tiempo necesario para la granulación. Por tanto, este intervalo de tiempo puede comprender una fase en la que se aplica líquido que comprende los dominios variables individuales de inmunoglobulina, y un intervalo de tiempo en el que se detiene esta aplicación, pero se continúa la exposición a calor hasta que se logra un nivel de líquido deseado. El contenido en líquido de formulaciones sólidas es normalmente tal como se definió anteriormente, es decir las formulaciones están secas o esencialmente secas.

El líquido que comprende los dominios variables individuales de inmunoglobulina no está limitado, siempre que no ponga en peligro la actividad de los dominios variables individuales de inmunoglobulina. Los ejemplos adecuados incluyen agua y tampones convencionales. El agua, en particular agua desmineralizada, es preferible, dado que no conduce a materia particulada adicional, tal como cristales de sal, cuando se evapora. Tal como se detalló anteriormente, la concentración de sal del líquido es preferiblemente, por ejemplo, inferior al 10 % p/p, y/o inferior a 10 mM. En realizaciones de la invención se excluye el uso de una “matriz de proteínas” que es una mezcla de una o más proteínas y una sal a una alta concentración, por ejemplo, una concentración de sal de entre el 63,7 y el 85,3 % basándose en sólidos secos. En realizaciones de la invención se excluye una matriz de proteínas (es decir, una mezcla de proteínas/sal) que contribuye a aproximadamente el 20-80 % del peso de gránulo final.

Específicamente, la invención se refiere a métodos que no usan un líquido, que comprende dominios variables individuales de inmunoglobulina, como suspensión de proteína agregada. Se sabe que determinadas enzimas resisten la agregación y pueden formularse en concentraciones de sal muy altas, por ejemplo superiores al 60 % del peso seco total de sal (documento US 6.423.517). En cambio, la actividad de dominios variables individuales de inmunoglobulina se ve comprometida mediante agregación o altas concentraciones de sal. Además, agregados y/o altas concentraciones de sal no son aceptables para preparaciones farmacéuticas.

Los métodos según cualquier aspecto de la presente invención también pueden comprender etapas adicionales habitualmente empleadas en la producción de formulaciones sólidas, por ejemplo formulaciones farmacéuticas sólidas. Por ejemplo, los procedimientos de la presente invención pueden comprender además una o más etapas de fabricación de un comprimido, cápsula o implante. La invención también se refiere a la producción de preparaciones farmacéuticas que comprenden la formulación sólida tal como se describe en la solicitud. La formulación farmacéutica no está limitada, y normalmente es un comprimido, cápsula o implante, es decir una formulación farmacéutica sólida.

En vista de lo anterior, una de las ventajas de la presente invención es que pueden prepararse formulaciones sólidas que comprenden dominios variables individuales de inmunoglobulina usando equipos convencionales, componentes convencionales y parámetros de procedimiento convencionales ampliamente usados, por ejemplo, en el campo farmacéutico. Por tanto, la gran cantidad de saber hacer e infraestructura disponibles para la fabricación de formulaciones sólidas puede aplicarse a la formulación de dominios variables individuales de inmunoglobulina, que no era posible antes de la presente invención.

Las formulaciones

La presente solicitud también describe las formulaciones sólidas en sí mismas. Anteriormente no se consideraba posible preparar formulaciones sólidas que pueden obtenerse mediante los métodos de la presente invención. Por ejemplo, las formulaciones sólidas que pueden obtenerse mediante procedimientos de granulación en húmedo son física y químicamente distintas de formulaciones que pueden obtenerse mediante secado por pulverización o liofilización. Lo mismo se aplica a preparaciones farmacéuticas que comprenden las formulaciones sólidas que pueden obtenerse mediante los métodos de la presente invención.

Por tanto, la presente invención hace que las múltiples ventajas de formulaciones sólidas estén disponibles para dominios variables individuales de inmunoglobulina como clase de agentes activos. Estas ventajas incluyen la movilidad restringida de dominios variables individuales de inmunoglobulina y la estabilidad mejorada. Sin embargo, el procedimiento de producción en sí mismo también confiere propiedades ventajosas, tales como control del tamaño de partícula, carga y amplia gama de propiedades de las formulaciones sólidas, dependiendo de las sustancias, tales como excipientes, usadas para su producción. Por ejemplo, la presente invención puede usarse para preparar formulaciones de liberación controlada o enmascaramiento de sabor.

La granulación tiene, entre otras cosas, el efecto de mejorar las propiedades de flujo de polvo y reducir el polvo fino mediante aumento del tamaño y densificación, mejorando por tanto las operaciones de llenado de cápsulas y formación de comprimidos. Además, un agente activo se adhiere físicamente al material portador, de tal manera que el portador y el agente activo pueden manipularse en conjunto. Esto impide que los diversos componentes se separen, y también impide problemas mecánicos y físicos que pueden estar asociados, por ejemplo, con un precipitado de proteína pegajoso tal como se obtiene mediante liofilización o secado por pulverización. Estas

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Se realizó la evaluación usando el software BIAevaluation. Se determinaron las pendientes usando el método de “ajuste general” y el modelo de ajuste lineal. Para determinar la tasa de unión inicial (IBR) se seleccionó la pendiente de la línea de regresión lineal entre 5 s y 30 s. A partir de esta pendiente se calculó la funcionalidad como la razón de la pendiente de la muestra frente a la pendiente del material de referencia.

Determinación del contenido en agua mediante valoración de Karl Fischer

Se determinó el contenido en agua por medio de un dispositivo de valoración de Karl Fischer V30 (Mettler Toledo, EE. UU.). Se pesó polvo y se transfirió al recipiente de valoración, que contenía metanol seco de Hydranal® (Sigma Aldrich) y se agitó durante 300 segundos. Se realizó la valoración con Hydranal®Composite 2 (Sigma Aldrich).

Determinación del contenido en agua mediante pérdida por desecación (LOD)

Se determinó el contenido en disolvente residual total con un analizador de humedad de halógeno HR83P (Mettler Toledo, EE. UU.). Se colocó aproximadamente 1 g de muestra en una bandeja de muestra de aluminio. Se secó la muestra durante 15 minutos a una temperatura constante de 105 °C. Se monitorizó el peso de muestra y se registró la pérdida de peso expresada en % con un intervalo de 1 min.

Determinación de la densidad aparente y de compactación

Se usó un medidor de volumen (J. Engelsmann AG, Ludwigshafen, Alemania). Se añadieron de manera suave aproximadamente 40 g del granulado a un tubo graduado de 100 ml. Se registró el volumen tras 0, 10 y 500 golpecitos.

1.2 Resultados y discusión

La granulación en lecho fluido de un Nanobody con manitol como portador dio como resultado polvo de flujo libre con una carga de Nanobody del 4,7 %. Se conservaron la funcionalidad así como la integridad física y química tras la granulación. El material era estable tras almacenamiento durante 3 meses a 4 °C.

Estas conclusiones se respaldan adicionalmente por los siguientes resultados detallados.

1.2.1 Contenido La carga teórica de 5F7 era del 7,1 % p/p. Las medidas de DO indicaron una carga real del 4,7 % (tabla 3). Este resultado indica que, usando parámetros de procedimiento convencionales para granulación en lecho

fluidizado, puede lograrse una carga satisfactoria de los gránulos con agente activo (Nanobody). Tabla 3: Resultados de cuantificación para granulado a t = 0 y tras 3 meses de almacenamiento a 4 °C

Punto de tiempo: Conc. promedio (mg/ml, n = 3) Carga de 5F7 en el granulado (p/p)

T = 0: 7,25 ± 0,07 4,7 %

T = 3 meses: 6,70 ± 0,01 4,5 %

Tras 3 meses de almacenamiento a 4 °C de la muestra granulada de 5F7/manitol, todavía se midió aproximadamente el 96 % del contenido inicial (tabla 3).

Este resultado indica que un granulado que comprende Nanobody muestra una estabilidad en almacenamiento satisfactoria a lo largo de varios meses, por ejemplo 3 meses, a una temperatura de almacenamiento adecuada, por ejemplo 4 °C.

1.2.2 Datos de SEC

Se analizaron cromatogramas de SEC de la referencia de 5F7 y el material granulado de 5F7, comparando los picos característicos tal como se indica en la tabla 4 de Nanobody de referencia mantenido en disolución y el Nanobody granulado. Los datos de SEC mostraron un pequeño aumento desde el 0,1 hasta el 0,7 % del segundo pico previo tras la granulación (t = 0, tabla 4).

Tabla 4: Resultados de SEC para granulado a t = 0 y tras 3 meses de almacenamiento a 4 °C, en comparación con Nanobody de referencia a t = 0

área en % de lote de ref. de 5F7: área en % de granulado, t = 0 área en % de granulado, t = 3 m

Pico previo 1: 0,1 0,1 0,2

Pico previo 2: 0,1 0,7 1,2

Pico previo 3: 0,2 0,2 0,2

Pico principal: 99,7 99,0 98,4

Tras 3 meses de almacenamiento a 4 °C de la muestra granulada de 5F7/manitol, los datos de SEC mostraron un aumento adicional del % de picos previos hasta el 1,6 % (tabla 4).

5 Estos datos proporcionan evidencias de que el procedimiento de granulación no influye negativamente en la integridad física de Nanobody, en particular con respecto a la formación de aglomerados o cualquier otra forma de derivados de alto peso molecular.

1.2.3 Datos de RPC

10 La disolución de referencia de 5F7 y el material granulado de 5F7 mostraron cromatogramas de RPC comparables en el punto de tiempo de referencia t = 0. Además, tras 3 meses de almacenamiento a 4 °C, no se observó ningún cambio significativo en RPC en comparación con la referencia a t = 0.

15 Estos datos proporcionan evidencias de que los Nanobody no se ven negativamente afectados en cuanto a la estabilidad química por el procedimiento de granulación. En particular, los datos de RPC permiten la conclusión de que no hay un aumento de la aparición de especies de Nanobody químicamente modificadas en comparación con una disolución de referencia.

20 1.2.4 Datos de funcionalidad

Se preparó una muestra de prueba al 80 % (4 nM) y al 120 % (6 nM) con el material de 5F7 de referencia. Se determinó la funcionalidad y se comparó con la muestra de 5F7 al 100 % (5 nM). Tal como se muestra en la tabla 5, las actividades calculadas fueron del 75,9 % y el 116,2 % respectivamente.

25 Tabla 5: QC del ensayo de funcionalidad (preparaciones de referencia)

Muestra: Pendiente promedio (RU/s) (n = 3) % de actividad en comparación con la ref.

Ref. de 5F7 5 nM: 1,89 100,0

Ref. de 5F7 4 nM: 1,44 75,9

Ref. de 5F7 6 nM: 2,20 116,2

Ref. de 5F7 5 nM: 1,89 99,6

La referencia de disolución de 5F7 5 nM que se inyectó al comienzo del experimento volvió a analizarse al final del 30 experimento y se observó una funcionalidad del 99,6 % (tabla 5), indicando que el chip se mantuvo estable durante el experimento.

Tabla 6: Concentración de 5F7 funcional en el granulado a t = 0 y tras 3 meses de almacenamiento a 4 °C

Muestra: Pendiente promedio (RU/s) (n=3) % de actividad en comparación con la ref.

Granulado de 5F7 5 nM, t = 0: 1,82 96,0

Granulado de 5F7 5 nM, t = 3 meses: 1,59 90,9

35 En la tabla 6 se muestran los resultados de funcionalidad de las muestras de granulado, calculados frente a la preparación de referencia (disolución de Nanobody, sin granulación).

La actividad de la muestra granulada de 5F7/manitol (96 %) era comparable a la muestra de referencia. No se 40 detectó ningún cambio significativo en la funcionalidad tras la granulación en húmedo y tras el almacenamiento de granulado durante 3 meses a 4 °C.

Estos datos proporcionan evidencias de que los Nanobody pueden granularse en un procedimiento en lecho fluidizado convencional sin experimentar ninguna pérdida de función significativa. 45

1.2.5 Caracterización de granulado

En la tabla 7 se notifican los resultados de contenido en agua y densidad. 50 Tabla 7: Contenido en agua y densidades de 5F7 granulado

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cantidad teórica de material seco dosificado por preparación. Se almacenaron los viales a 5 °C. Tras la granulación se secó posteriormente el polvo en un horno de vacío para eliminar la humedad residual.

2.1.3 Métodos analíticos

Preparación de muestras y medición del contenido

Se llevaron a cabo la preparación de muestras y mediciones del contenido tal como se describió en el ejemplo 1. Para la determinación de la concentración de proteína, también se determinó la absorbancia a 500 nm (A500). Una alta absorbancia a 500 nm es una indicación de la formación de variantes de alto peso molecular.

Ensayo de pureza (integridad física) de los Nanobody mediante cromatografía de líquidos de alta resolución de extrusión molecular (SE-HPLC)

Se realizó SE-HPLC con un instrumento H-Class Bio (Waters) con detector de DAD. Se diluyeron las muestras hasta 1 mg/ml en agua MilliQ antes de la inyección en la columna de RPC.

Se analizaron muestras de la disolución de alimentación, de los gránulos antes del secado posterior y de los gránulos después del secado posterior. Se expresó la cantidad relativa de pureza de proteína como % en área, y se calculó dividiendo el área de pico entre el área integrada total (pico principal + impurezas).

Ensayo de pureza (integridad química) y cuantificación de los Nanobody mediante cromatografía de líquidos de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC, o RPC)

Se realizó RP-HPLC con un instrumento H-Class (Waters) con detector de TUV. Se diluyeron las muestras hasta 1 mg/ml en agua MilliQ antes de la inyección en la columna de RPC.

2.2 Resultados

2.2.1 Rendimiento y contenido

Se obtuvo un polvo de flujo libre para todos los diseños. En la tabla 17 se indican los resultados de rendimiento de procedimiento y contenido en agua antes y después del procedimiento de secado posterior. Tal como se indica en la tabla 17, el rendimiento de procedimiento era del 88 % p/p o superior.

Tras la granulación, los diseños con PVP como aglutinante tenían un contenido en agua superior en comparación con los diseños con HPC. La diferencia desapareció mediante secado posterior del polvo en un procedimiento de secado a vacío sucesivo. El contenido en agua de diseños con manitol era inferior (<1 %) a los diseños con lactosa (5 %).

Tabla 17: Rendimientos de procedimiento y contenido en agua de diferentes lotes de gránulos

Diseño: LAC/HPC LAC/PVP MAN/HPC MAN/PVP

Rendimiento de procedimiento (% p/p): 88 92 93 94

Contenido en agua (% p/p) BD*: 3,27 5,13 0,82 2,57

Contenido en agua (% p/p) AD*: 4,76 4,73 0,56 0,68

*BD: antes del secado posterior; AD: después del secado posterior

2.2.2 Datos de SEC

Con el fin de evaluar el efecto del procedimiento de granulación sobre la pureza de 5F7, se realizó un análisis de SEC con la disolución de alimentación, los gránulos antes del secado posterior y los gránulos después del secado posterior. Se monitorizó Nanobody 5F7 puro en paralelo. Los resultados se muestran en la tabla 18.

Tabla 18: Resultados de SEC de granulación de Nanobody 5F7 con manitol o lactosa como portador y HPC o PVP como aglutinante

Nanobody 5F7: % de área promedio de pico principal % de área promedio de picos previos

Alimentación: Gran BD* Gran AD* Alimentación Gran BD* Gran AD*

Disolución de ref.: 99,90 0,10

Lactosa/PVP: 99,94 99,50 99,52 0,06 0,50 0,49

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El recubrimiento en lecho fluido de perlas inertes dio como resultado partículas esféricas con una estrecha distribución de tamaño y una carga de Nanobody del 7,1 %. Se detectó una pérdida de funcionalidad aceptable.

4.2.1 Contenido Tabla 10: Resultados de DO para perlas cargadas con Nanobody (n=3)

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10 La carga teórica de 5F7 para las perlas era del 6,4 %; las mediciones de DO indicaron una carga de 5F7 real del 7,1 % (tabla 11).

Este resultado demuestra que pueden recubrirse satisfactoriamente Nanobody en un procedimiento de recubrimiento convencional y pueden lograrse cargas de Nanobody satisfactorias. 15

4.2.2 Datos de SEC

El análisis de SE-HPLC mostró un aumento de los picos previos en comparación con la referencia (picos previos totales desde el 0,41 hasta el 2,63 %) (tabla 12). La presencia de HPMC no interfirió con las mediciones (tabla 12).

20 Este resultado solo indica un aumento ligero (y aceptable) de especies de peso molecular superior, y confirma que el procedimiento de recubrimiento no condujo a ninguna formación significativa de especies de peso molecular superior de Nanobody.

25 Tabla 11: Resultados de SEC para disolución de HPMC+5F7, perlas recubiertas con 5F7 en comparación con referencia de 5F7

área en % de lote de ref. de 5F7: área en % de HMPC+5F7 área en % de perlas recubiertas con 5F7

Pico previo 1: 0,00 0,1 0,1

Pico previo 2: 0,09 0,2 0,8

Pico previo 3: 0,09 0,2 1,5

Pico previo 4: 0,23 0,3 0,2

Pico principal: 99,58 99,2 97,4

4.2.3 Datos de RPC

30 No se detectó ningún aumento significativo de los picos previos y los picos posteriores en RPC en comparación con una preparación de referencia (disolución de partida de Nanobody).

Este resultado indica que no hubo ninguna formación de derivados químicamente modificados del Nanobody 35 provocada por el procedimiento de recubrimiento.

4.2.4 Datos de funcionalidad

Tras el recubrimiento de perlas con disolución de 5F7 se detectó una pérdida de funcionalidad minoritaria (tabla 13). 40 Tabla 12: Datos de funcionalidad de perlas recubiertas con 5F7 mediante Biacore

Ref. de 5F7 5 nM: 2,03 100,0

Perlas recubiertas 5 nM: con 5F7 1,55 76,5

Estos resultados indican que pueden aplicarse Nanobody a portadores inertes en un procedimiento de recubrimiento 45 convencional y conservarán niveles de actividad aceptables.

4.2.5 Características de perlas recubiertas

Tabla 13: Contenido en agua de perlas recubiertas con 5F7 mediante medición de LOD 50

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Claims

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