CN115698047A - 富含亮氨酸的重复激酶2变构调节剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及人富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)的结合剂。更具体地，已经鉴定了LRRK2活性的变构调节剂，用于靶向人细胞中的LRRK2，同时不影响LRRK2亚细胞定位。更具体地，公开了用于变构调节LRRK2激酶活性的蛋白结合剂，其包含以纳摩尔亲和力结合人LRRK2的免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)。因此，本发明揭示了用于新的LRRK2靶向方法的手段和方法，其通过变构调节LRRK2的活性用于治疗LRRK2相关病理，例如帕金森病，以及用于体外和体内检测LRRK2，并用作诊断。

Description

富含亮氨酸的重复激酶2变构调节剂
技术领域
本发明涉及人富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)的结合剂。更具体地，已经鉴定了LRRK2活性的变构调节剂，用于靶向人细胞中的LRRK2，同时不影响LRRK2亚细胞定位。更具体地，公开了用于变构调节LRRK2激酶活性的蛋白结合剂，其包含以纳摩尔亲和力结合人LRRK2的免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)。因此，本发明揭示了用于新的LRRK2靶向方法的手段和方法，其通过变构调节LRRK2的活性用于治疗LRRK2相关病理，例如帕金森病，以及用于体外和体内检测LRRK2，并用作诊断。
背景技术
编码富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)的基因中的突变是帕金森病(PD)最常见的遗传原因，并且以常染色体显性遗传方式遗传[62-64]，而LRRK2基因变体也与特发性PD相关[65,66]。PD是一种神经退行性运动障碍[61]，预计未来其全球患病率将增加[58-60]，除了对症治疗外，缺乏治疗选择。此外，LRRK2中的突变与其他疾病相关，包括慢性炎性病症，如克罗恩病[67-68]。LRRK2是一种大型多结构域蛋白(285kDa)，属于ROCO蛋白家族。蛋白的酶核心由活性GTP酶结构域(Roc)、二聚化模块(COR)和活性Ser/Thr蛋白激酶结构域(KD)组成[13,16,69,70]。几种Rab GTP酶已被鉴定为LRRK2激酶的生理底物[25-27]，这进一步提供了LRRK2的自磷酸化活性[28]。LRRK2蛋白的单体形式主要发生于细胞质中，具有降低的激酶活性，而在膜上的二聚体LRRK2形式则显示出更高的激酶活性[19,20,71,72]。LRRK2中最常见的致病性突变聚集在Roc-COR和激酶结构域内。重要的是，一些PD突变导致GTP酶降低和/或激酶活性增加[16,50,73-78]。最值得注意的是，致病性LRRK2变体，尤其是位于激酶结构域的最常见的G2019S突变，增加丝氨酸-1292的自磷酸化[28]和Rab蛋白磷酸化[25]。这些发现支持了LRRK2突变通过功能获得机制导致PD的观点，并表明LRRK2蛋白功能的调节可能是一个有前途的药物靶点[47,79,80]。由于PD突变体导致LRRK2激酶活性增加，因此迄今为止的药物开发主要集中在开发靶向ATP结合口袋的激酶抑制剂。已鉴定出几种对LRRK2激酶活性具有选择性的抑制剂。然而，据报道，用这些ATP竞争性抑制剂长期抑制LRRK2在啮齿动物中导致严重的肾脏异常，并且在非人灵长类动物肺中导致II型肺泡细胞中层状体的积累[46,47,81-83]，目前的LRRK2激酶抑制剂需要进一步的优化和测试。
作为探索LRRK2治疗性靶向的替代途径和结合模式的起点，最近已经公开了LRRK2的催化性半部分的高分辨率结构[36]，尽管到目前为止还没有描述全长人LRRK2，只有蛋白质的部分，例如催化结构域，已经以原子分辨率解析。目前的LRRK2特异性ATP竞争性抑制剂主要被建议是I型激酶抑制剂，并且已知具有明显的毒性风险。这种正构激酶抑制剂临床开发的障碍表明需要通过变构调节LRRK2激酶活性的不同方法。到目前为止，仅鉴定了一种能够通过非ATP竞争性机制抑制LRRK2活性的小化合物，即天然维生素B12及其衍生物[43]。这些维生素B12化合物通过激酶结构域中的接触位点直接结合LRRK2，并被认为作为混合型变构抑制剂发挥作用，其能够通过破坏LRRK2二聚化来影响ATP与LRRK2的结合。该化合物已显示与激酶结构域接触，所述激酶结构域涉及化合物的腺苷部分、钴胺素的庞大咕啉环和DMZ碱基，伸展成LRRK2激酶结构域的新的结合位点，从而可能改变其构象和二聚化状态。这些维生素B12衍生物是否能提供一种新的具有降低毒性和高特异性的治疗类别，仍有待观察。
因此，仍然需要寻找具有高特异性和替代作用模式的替代LRRK2调节剂，以克服治疗目的和LRRK2相关疾患(如帕金森病等)的治疗的临床障碍。
发明内容
本发明基于一种使用结合ATP口袋外的化合物，以变构方式靶向LRRK2的多种酶功能和调节机制的新方法，从而探索提高选择性和降低毒性的优势[84,85]。本发明提供了调节LRRK2蛋白动力学、调节和活性的免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)抗体(具体地，VHH或纳米抗体，如本文可互换使用的)。ISVD被鉴定为人LRRK2激酶活性的变构调节剂。鉴于其作为潜在治疗剂或诊断剂的有利特性，已经选择了以多种亲和力结合不同LRRK2结构域的范围广泛的VHH家族。本发明的VHH中的几种在细胞内和体外都强烈抑制LRRK2激酶活性，而其他VHH在细胞中显著增加LRRK2活性。此外，本文还发现了具有完全激酶抑制活性以及对Rab底物的磷酸化具有特异性抑制作用的LRRK2抑制Nb。有趣的是，Nb的一个亚组抑制激酶活性，但不直接结合激酶结构域并充当混合(非竞争性)型抑制剂，证明了这些Nb在激酶抑制中的变构调节作用。令人惊讶的是，与目前可用的激酶抑制剂相比，Nb不诱导细胞微管上LRRK2细丝的形成，此外，一些Nb甚至逆转这种不利的副作用，指出Nb提供了一种新型的变构LRRK2调节，以及与先前鉴定的抑制剂(例如目前可用的ATP竞争性激酶抑制剂)作用完全不同的结合剂，从而为对抗帕金森病提供了新的治疗机会。
因此，在第一方面，本发明涉及特异性结合人富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)的结合剂，其中细胞内的结合保留了不与微管结合的LRRK2。一大组结合LRRK2的ISVD通过与不同蛋白质结构域的结合或通过在不同结构域的界面上结合而变构起作用，而不涉及直接结合激酶结构域或更具体地结合激酶结构域的催化位点，这一事实不同于经典的ATP竞争性LRRK2抑制剂或靶向GTP结合位点的化合物，令人惊讶地产生这样的效果，即与正构ATP竞争性LRRK2结合剂相反，在微管处不诱导发生LRRK2细丝。此外，所述LRRK2结合剂对LRRK2具有纳摩尔范围内的结合亲和力，和/或对应于KD值在200nM或更低的范围内，更优选在纳摩尔至皮摩尔范围内。在一个具体实施方案中，本发明的所述LRRK2结合剂在细胞内和/或体外影响LRRK2激酶活性。
本文的具体实施方案涉及LRRK2变构调节剂，其中所述调节剂在结构上包括小化合物、化学物质、蛋白质、肽或肽模拟物、或抗体、抗体模拟物、单结构域抗体，或更具体地，免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)、纳米抗体或任何活性抗体片段。
更具体地，如本文所述具有LRRK2抑制活性的包含ISVD的LRRK2变构结合剂有望作为一种新的治疗策略治疗PD和/或其他LRRK2相关疾病(包括炎性疾病，如IBD，更具体地，克罗恩病)，其使用迄今为止未被描述的LRRK2相关疗法的作用机制，作为工具或作为治疗性蛋白，甚至作为核酸或作为载体递送。
一个实施方案涉及以非ATP竞争性结合模式特异性结合LRRK2的所述LRRK2变构调节剂，即在不同于ATP催化位点的结合位点上结合。优选地，所述LRRK2变构调节剂在由LRRK2氨基酸构成的结合位点上特异性结合LRRK2，所述LRRK2氨基酸不排他地或仅包括存在于LRRK2激酶催化位点或激酶结构域中的氨基酸。或者，所述LRRK2变构调节剂优先在不同于激酶结构域的蛋白质结构域的一个或多个结合位点结合LRRK2，即，在选自以下的一个或多个蛋白质结构域结合：N-末端结构域(犰狳(armadillo)、锚蛋白重复或LRR)、Roc、COR和WD40结构域。在另一个实施方案中，结合激酶结构域和任何所述其他结构域的组合是可能的。在另一个实施方案中，Nb可以在不同于ATP结合位点的结合位点上结合激酶结构域。在一个实施方案中，与对照相比，所述调节LRRK2活性的LRRK2结合剂可增加LRRK2激酶活性，或者与对照或在不存在所述结合剂的情况下相比，可降低或抑制或阻断激酶活性。在另一个实施方案中，激酶和GTP活性都可以由相同的结合剂以相反的方式调节(即抑制激酶是增加GTP酶，反之亦然)。
在一个实施方案中，所述LRRK2变构调节剂包含特异性结合人LRRK2的ISVD，其包含如本文式中的结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其描绘了4个框架区和3个互补决定区。在一个具体的实施方案中，用于变构调节LRRK2激酶活性的所述ISVD包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR1由选自本文在SEQ ID NO:1-19中公开的ISVD的CDR1序列的序列组成(其中所述CDR区如表3-4或替代地如在图10中举例的所注释)；所述CDR2由选自本文在SEQID NO:1-19中公开的ISVD的CDR2序列的序列组成，以及所述CDR3由选自本文在SEQ ID NO:1-19中公开的ISVD的CDR3序列的序列组成。因此，本文描述了LRRK2特异性变构结合剂，其包含ISVD，其中CDR1、CDR2和CDR3区选自序列选自SEQ ID NO:1至19的序列中的序列的那些CDR1、CDR2和CDR3区，其中CDR区根据本文进一步定义和本领域已知的Kabat、MacCallum、IMGT、AbM或Chothia注释。或者，所述LRRK2结合剂包含至少一个ISVD，其中：CDR1包含选自SEQ ID NO:23-41的CDR1序列的序列，CDR2包含选自SEQ ID NO:42-60的CDR2序列的序列，并且CDR3包含选自SEQ ID NO:61-79的CDR3序列的序列。
另一个具体实施方案公开了所述LRRK2特异性变构结合剂，其包含ISVD，所述ISVD包含SEQ ID NO:1至19的序列中的任意，或其变体，所述变体包含相同的CDR序列并且在FR区包含取代，但与SEQ ID NO：1-19具有至少85％的序列同一性。另一个实施方案涉及包含ISVD的所述LRRK2变构调节剂，所述ISVD是选自SEQ ID NO：1-19的任何序列的人源化变体，或与其具有至少85％同一性的同源物，其中CDR序列与SEQ ID NO：1-19中的CDR相同。
另一个实施方案涉及如本文定义的LRRK2变构结合剂，其包含ISVD并抑制或阻断细胞中的LRRK2激酶活性，和/或特异性地防止细胞中LRRK2介导的底物磷酸化。一个具体的实施方案涉及特异性防止或抑制Rab底物磷酸化的试剂。一个替代实施方案涉及如本文定义的所述LRRK2调节剂，其包含ISVD，所述ISVD与对照相比增加细胞中LRRK2激酶活性。另一个实施方案涉及如本文所述的LRRK2变构调节剂，其包含ISVD，所述ISVD防止LRRK2在细胞中与微管结合，尤其是当存在ATP竞争性LRRK2激酶抑制剂化合物时。
本发明的另一个实施方案公开了作为LRRK2活性的变构调节剂的一种多特异性或多价结合剂，其包含至少一个本文公开的LRRK2变构调节剂。另一个实施方案公开了作为LRRK2活性的变构调节剂的所述多特异性或多价结合剂，其包含至少两个如本文公开的所述LRRK2变构调节剂。本发明的另一个实施方案公开了一种作为LRRK2活性的变构调节剂的多特异性结合剂，其包含本文公开的所述LRRK2变构调节剂和具有不同靶特异性的另外的结合剂，或者LRRK2的另外的结合剂。在一个具体实施方案中，所述多特异性或多价LRRK2变构结合剂包含至少一个如本文公开的特异性结合LRRK2的ISVD。
本发明的另一方面涉及编码如本文所述的LRRK2变构调节剂的核酸分子。其他实施方案包括含有如本文所述的所述核酸分子的载体，其可以是克隆或表达载体，以及递送载体，例如病毒、慢病毒或腺病毒载体。
另一方面提供了一种药物组合物，其包含本文公开的LRRK2变构调节剂或包含LRRK2变构调节剂的多特异性LRRK2结合剂。或者，提供一种药物组合物，其包含如本文所公开的所述(多特异性)LRRK2变构调节剂，和ATP竞争性LRRK2激酶抑制剂化合物。在一个具体实施方案中，提供的所述药物组合物包含本文公开的所述(多特异性)LRRK2变构调节剂，和I型ATP竞争性激酶抑制剂的ATP竞争性LRRK2激酶抑制剂化合物。
本发明的另一方面涉及如本文公开的LRRK2变构调节剂，或本文提供的核酸分子或载体，或本文所述的药物组合物，用作药物。具体实施方案涉及本文公开的LRRK2变构调节剂，或本文提供的核酸分子或载体，或本文所述的药物组合物，用作药物，或更具体地用于治疗受试者以治疗LRRK2相关疾患。另一个具体实施方案因此涉及如本文所公开的LRRK2变构调节剂，或本文提供的核酸分子或载体，或本文所述的药物组合物，用于治疗帕金森病。
另一个实施方案涉及如本文所公开的所述LRRK2特异性结合剂或ISVD，或编码如本文提供的所述LRRK2结合剂的核酸分子或载体，或本文所述的药物组合物，用于诊断测定法或体内医学成像。
最后一个方面涉及体外检测样品中人LRRK2蛋白的方法，更具体地体外检测生物样品中人LRRK2蛋白的方法。所述检测样品中LRRK2的方法可以包括使样品与本文公开的LRRK2特异性结合剂或ISVD反应的步骤，以及检测所述生物样品中结合LRRK2的所述LRRK2特异性ISVD的定位和分布。对于所述方法，本文公开的LRRK2结合剂或ISVD可包含可检测标记或标签。另一个实施方案涉及一种体外检测样品中LRRK2蛋白的存在、不存在或水平的方法，所述方法包括：使样品与任选地包含标记的LRRK2特异性结合剂或ISVD接触，以及检测所述与其LRRK2结合位点相互作用的或结合的LRRK2特异性ISVD的存在或不存在或水平。任选地，所述样品是体液(例如脑脊液)或者是蛋白提取物或细胞裂解物。
最后，本文公开的结合剂也可作为工具用于筛选测定法、或用于药物发现。
附图说明
所描述的附图仅是示意性的并且是非限制性的。在附图中，一些元件的尺寸可能被放大并且出于说明目的未按比例绘制。
图1.使用ELISA进行纯化纳米抗体的结构域特异性的作图。
(A)使用对全长LRRK2或RocCOR、Roc、COR-B或激酶-WD40构建体的ELISA进行42个纯化Nb的结构域作图。还包括在ELISA板中未包被抗原或未添加Nb的阴性对照。每个ELISA信号是三次ELISA设置的平均值。(B)在(A)中获得的结果的示意图总结。请注意，两个Nb没有显示任何高于背景的结合，因此不包括在此方案中。
图2.一组选定的18个Nb对HEK293T细胞中LRRK2(G2019S)变体激酶活性的影响。
(a-c)LRRK2(G2019S)及其效应子Rab29在HEK293T细胞中与融合GFP的Nb(“Fluobody”)一起过表达。还包括阴性对照，其中没有Nb过表达(“无Nb”)。小图(a)、(b)和(c)显示了三次重复的实验。在标记为“pLRRK2”的行中，通过蛋白质印迹使用位点特异性抗pLRRK2(pS1292)抗体(Abcam,ab203181)测定LRRK2 pS1292水平(显示在不同的发色时间)。在标记为“pRAB10”的行中，通过蛋白质印迹使用MJFF/Abcam抗体MJF-R21(Abcam,ab230261)测定内源性pT72-Rab10水平(显示在不同的发色时间)。下面三行包含LRRK2(大鼠抗LRRK2，24D8)、Fluobody(大鼠抗GFP)和Rab10(兔抗Rab10)表达水平的对照。(d)根据小图(a)-(c)的结果，Nb可分为4个功能组，第1组：抑制细胞中LRRK2自磷酸化和Rab10磷酸化的Nb；第2组：仅抑制Rab10磷酸化的Nb；第3组：活化LRRK2激酶活性的Nb；第4组：对LRRK2激酶活性没有一致/明确作用的Nb。
图3.使用交联质谱法进行Nb对LRRK2的结合表位的作图。
根据其对细胞内(in cellulo)LRRK2激酶活性的作用，将Nb分为4个功能组，如图2d所定义。观察到的Nb和LRRK2之间的交联用线表示，LRRK2上相应的赖氨酸残基由它们的残基编号表示。之前在ELISA中确定的Nb的结构域特异性在各Nb下方给出，作为参考。
图4.LRRK2靶向Nb对体外激酶活性的调节。
(A)选择的LRRK2靶向Nb对LRRK2激酶活性的作用使用基于荧光的
Figure BDA0003901770190000071
蛋白激酶测定法测量，使用LRRK2优化的AQT0615肽作为底物，固定浓度为10μM，分别在存在1mM或0.1mM ATP的情况下进行。针对与对照相比，浓度为25μM的不同Nb对相关激酶活性的影响作图，其中对照中未添加Nb(“无Nb”)。包括了另外的阴性(25μM无关对照Nb)和阳性(25μM ATP竞争性LRRK2抑制剂MLi-2)对照。(B)针对与“无Nb”的对照相比，不同Nb(25μM)对相关激酶活性的影响作图，其中存在500μM GDP(顶部)或500μM GTPγS(底部)。包括0.2μMATP竞争性LRRK2抑制剂MLi-2作为阳性对照。每个条形反映三次独立测量值的平均值(±SD)。
图5.LRRK2靶向纳米抗体对LRRK2细胞定位的作用。
HEK293细胞与指定的GFP-Nb和mScarlet-LRRK2共转染。作为阳性对照，mScarlet-LRRK2转染的细胞用药理学的ATP竞争性抑制剂MLi-2(1μM MLi-2，90分钟处理)处理，显示诱导LRRK2重新定位到微管上，可见丝状绞样结构并通过白色箭头表示(左上小图)。相比之下，用GFP-Nb和mScarlet-LRRK2共转染的细胞显示LRRK2的正常细胞质分布，没有重新定位到微管，类似于用无关的Nb共转染的细胞。比例尺5μm。
图6.LRRK2靶向纳米抗体对MLi-2诱导的LRRK2微管重新定位的作用。用指定的GFP-Nb和mScarlet-LRRK2共转染HEK 293细胞，并用药理学的ATP竞争性抑制剂MLi-2(1μMMLi-2，90分钟处理)处理。mScarlett-LRRK2与仅GFP(左上小图)或无关Nb(左下小图)的共转染显示Mli-2诱导的LRRK2重新定位到微管上，可见丝状绞样结构并通过白色箭头表示。共转染GFP-Nb的一个亚组抑制了MLi-2诱导的LRRK2重新定位。比例尺5μm。
图7.SDS-PAGE分析显示纯化的LRRK2全长和结构域构建体。
将本研究中使用的纯化的全长LRRK2和结构域构建体RocCOR、Roc、(MBP-)COR-B和激酶-WD40各3μg加载到凝胶上。标志物(左)SpectraTMMulticolor High Range ProteinLadder(货号26625；Thermo ScientificTM)；(右)PageRulerTMPrestained ProteinLadder,10至180kDa(货号26616；Thermo ScientificTM)。
图8.LRRK2交联。
在免疫之前，使LRRK2与赖氨酸特异性交联剂DSS交联。进行了两个交联设置，其中允许交联进行到不同的水平(A和B)。在GDP(泳道2和3)或GTPγS(泳道4和5)存在下纯化LRRK2。在两种凝胶中，泳道2和泳道4显示交联前的LRRK2，而泳道3和5显示DSS交联后的LRRK2。对于免疫2，使用泳道5中所示的样品混合物，对于免疫3，使用泳道3中所示的样品混合物。标志物(A)，来自Biozym的Quad Color Protein Marker；(B)SpectraTMMulticolorHigh Range Protein Ladder(货号26625Thermo ScientificTM)。
图9.如图1所示的42种纯化的纳米抗体以及本研究中使用的无关Nb的SDS-PAGE。
将2μg的每种纳米抗体加载到凝胶上(CA16070除外，由于该Nb的表达水平低，加载了0.7μg)。标志物，PageRulerTMPrestained Protein Ladder,10至180kDa(货号26616Thermo ScientificTM)。
图10.CA12610 Nb的氨基酸序列和CDR注释。
根据Kabat进行氨基酸编号。作为本文公开的Nb的可能的不同CDR注释的示例，与当前使用的CDR注释相比，以灰色标记了相对应的可替代CDR注释(AbM、Chothia、Kabat、IMGT)。美洲驼种系标志残基以粗体/下划线显示。
图11.LRRK2靶向Nb的体外激酶活性调节。
A-C,第1组Nb(Nb1(A)、Nb6(B)和Nb23(c))抑制体外LRRK2激酶活性的剂量反应曲线(上部小图)，其中Nb浓度以两倍连续稀释从200或150μM至0.006μM变化。下部的两个小图显示了在不同浓度的ATP和固定(亚饱和)浓度的肽底物(AQT0615)，以及不同浓度的Nb1(A)、Nb6(B)和Nb23(C)下获得的LRRK2的Michaelis-Menten曲线，根据Lineweaver-Burk方法进行相应的线性化(双倒数图)。使用的Nb浓度显示在图的下方。每个数据点反映三次独立测量值的平均值(±SD)。通过拟合三参数逻辑方程得到的IC50(±SD)值，以及通过全局拟合混合型抑制机制得到的Ki app和a值(±SD)示于图中。
图12.纳米抗体结合并免疫沉淀LRRK2。
用GFP标记的Nb和(S)trep-(F)lag标记的LRRK2构建体瞬时共转染HEK293细胞48小时，然后裂解。通过磁性GFP-Trap珠的方式进行下拉测定法。仅过表达SF-LRRK2的HEK293细胞裂解物用作阴性对照。通过免疫印迹检测Nb和LRRK2。与无关Nb和阴性对照不同，所有测试的Nb下拉LRRK2。印迹代表n＝3。
图13.使用微量热泳(MST)测量Nb对LRRK2的亲和力。
显示了通过将递增浓度的LRRK2滴定到荧光(m-TAMRA)标记的Nb并测量MST信号获得的结合等温线。将Nb分为如图2d中定义的四个功能组，即，(a)第1组Nb,(b)第2组Nb,(c)第3组Nb，和(d)第4组Nb。在小图(e)中显示了两个阴性对照，其中将LRRK2滴定至游离m-TAMRA或m-TAMRA标记的无关Nb。所有测量均在500μM GDP存在的情况下进行，Nb42除外，其中使用了GTPγS。给出了通过拟合二次结合方程获得的相应的平衡解离常数(Kd±标准误差)(每个数据点是三次独立测量值的平均值，误差条代表标准偏差；NB＝没有可检测的MST结合信号)。
图14.使用生物层干涉法(BLI)测量Nb对LRRK2的亲和力。
显示了结合等温线，其通过将递增浓度的Nb滴定至LRRK2(所述LRRK2通过生物素化的Nb40(或在测量Nb40的亲和力的情况下为Nb42)被捕获在链霉抗生物素生物传感器上)并测量BLI信号获得。将Nb分为如图2d中定义的四个功能组，即，(a)第1组Nb,(b)第2组Nb,(c)第3组Nb，和(d)第4组Nb。所有测量均在500μM GDP存在的情况下进行。给出了通过拟合Langmuir结合方程获得的相应的平衡解离常数(Kd±标准误差)(每个数据点是三次独立测量值的平均值，误差条代表标准偏差)。
图15.纳米抗体结合并免疫沉淀内源性LRRK2。
将源自RAW264.7细胞的裂解物与1.5μM纯化的His标记的Nb一起孵育，并使用磁性Dynabeads进行下拉。通过免疫印迹检测LRRK2，证明所有测试的Nb免疫沉淀LRRK2。印迹代表n＝3。
图16.纳米抗体与内源性LRRK2共定位。
用融合了GFP的Nb转染RAW264.7细胞并用酵母聚糖处理30分钟。通过免疫荧光分析LRRK2和Nb向吞噬体的募集。a,Nb38、Nb22、Nb23、Nb40、无Nb、或无关(IRR)Nb处理的图像；b,Nb36、Nb42、Nb17、Nb39、Nb1、和Nb6处理的图像。比例尺＝10μm。
图17.纳米抗体通过与先前描述的LRRK2激酶抑制剂不同的结合位点结合LRRK2。
竞争性ELISA滴定实验的结果，该实验评估了ATP竞争性激酶抑制剂Mli-2和先前描述的非ATP竞争性LRRK2抑制剂5'脱氧腺苷钴胺素(AdoCbl＝辅酶B12)是否与第1组纳米抗体(Nb1(a)、Nb6(b)和Nb23(c))竞争相同的结合位点。LRRK2包被在ELISA板的孔中，并且将连续稀释的各Nb的ELISA信号(通过其C-末端EPEA标签检测)作为Nb浓度的函数作图。确定存在大量过量的MLi-2(1μM)、AdoCbl(250μm)和相应作为阳性(+)对照的未标记的Nb(Nb*,9μM)的作用。还包括“无抗原对照”，其中在孔底部没有包被LRRK2。与单独的Nb滴定曲线(“-对照”)相比，添加Nb*的阳性对照中导致ELISA滴定曲线明显向右移动，与之相反，Mli-2和AdoCbl均未显示曲线向右移动。
具体实施方式
将针对特定实施方案并参考某些附图来描述本发明，但本发明不限于此，而仅由权利要求书限定。权利要求中的任何参考符号不应被解释为限制范围。当然，应当理解，根据本发明的任何特定实施方案不一定可以实现所有方面或优点。因此，例如本领域技术人员将认识到，本发明可以以实现或优化如本文所教导的一个优点或一组优点的方式来体现或实施，而不必实现如本文所教导或建议的其他方面或优点。当结合附图阅读时，通过参考以下详细描述，可以最好地理解本发明的组织和操作方法，以及其特征和优点。本发明的各方面和优点将从下文中描述的实施方案中变得明显和清晰。在整个说明书中提及的“一个实施方案”或“实施方案”意味着结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本方面的至少一个实施方案中。因此，在整个说明书中的多处出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”不一定都指代相同的实施方案，但是可以指代相同的实施方案。
定义
当指代单数名词时使用不定冠词或定冠词，例如“a”或“an”、“the”，这包括该名词的复数，除非另有明确说明。在本说明书和权利要求书中使用术语“包括”时，它不排除其他元件或步骤。此外，在说明书和权利要求中使用术语第一、第二、第三等区分相似的元件，但不一定用于描述相继顺序或时间顺序。应当理解，如此使用的术语在适当的情况下是可互换的，并且本文描述的本发明的实施方案能够以除了本文描述或说明之外的其他顺序操作。提供以下术语或定义仅用于帮助理解本发明。除非本文特别定义，否则本文使用的所有术语都具有对于本发明领域技术人员而言相同的含义。从业者特别可参考Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第4版,Cold Spring Harbor Press,Plainsview,New York(2012)；以及Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology(Supplement 114),John Wiley&Sons,New York(2016)，了解现有技术的定义和术语。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义(例如，分子生物学、生物化学、结构生物学和/或计算生物学)。
术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中进一步可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物及其变体和合成类似物。“肽”也可以称为源自其原始蛋白质的部分氨基酸序列，例如在胰蛋白酶消化之后。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸的氨基酸聚合物(例如相应天然存在的氨基酸的化学类似物)，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。该术语还包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、磷酸化和乙酰化。基于氨基酸序列和修饰，多肽的原子或分子质量或重量以(千)道尔顿(kDa)表示。“分离的”或“纯化的”是指基本上或实质上不含通常以其天然状态伴随的组分的物质。例如，“分离的多肽”或“纯化的多肽”是指已从天然存在状态的其相邻分子中纯化的多肽，例如本文鉴定和公开的抗体或纳米抗体，其已从存在于样品或混合物(例如生产宿主)中与所述多肽相邻的分子中移出。分离的蛋白质或肽可以通过氨基酸化学合成产生，或者可以通过重组生产或通过从复杂样品中纯化产生。
蛋白质的“同源物”包括肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，这些肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶相对于所讨论的未修饰蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入，并且与衍生其的未修饰蛋白质具有相似的生物和功能活性。如本文所用，术语“氨基酸同一性”是指序列在基于氨基酸-氨基酸的比较窗口内相同的程度。因此，通过以下计算“序列同一性百分比”：在比较窗口上比较两个最佳比对序列，确定在两个序列中出现相同氨基酸(例如，Ala,Pro,Ser,Thr,Gly,Val,Leu,Ile,Phe,Tyr,Trp,Lys,Arg,His,Asp,Glu,Asn,Gln,Cys和Met,本文中也以单字母表示)的位置数目，以产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗口中的总位置数(即，窗口大小)，再将结果乘以100，得出序列同一性的百分比。如本文所用，“取代”或“突变”或“变体”由一个或多个氨基酸或核苷酸分别被与亲本蛋白质或其片段的氨基酸序列或核苷酸序列相比，不同的氨基酸或核苷酸取代而导致。应当理解，蛋白质或其片段可以具有对蛋白质活性基本上没有影响的保守氨基酸取代。
“结合”是指任何相互作用，无论是直接的还是间接的。直接相互作用意味着结合配偶体之间接触。间接相互作用是指任何以下的相互作用，通过该相互作用相互作用配偶体在两个以上分子的复合物中相互作用。在一种或多种桥接分子的帮助下，相互作用可以是完全间接的；相互作用也可以是部分间接的，其中配偶体之间仍然存在直接接触，这种接触通过一种或多种分子的额外相互作用来稳定。如本文所用，术语“特异性结合”是指识别特定靶标但基本上不识别或结合样品中的其他分子的结合结构域。特异性结合并不意味着排他性结合。然而，特异性结合确实意味着蛋白质对其一种或几种结合剂具有一定的增加的亲和力或偏好。如本文所用，术语“亲和力”通常是指配体、化学物质、蛋白质或肽与另一(靶)蛋白或肽结合的程度，以使单个蛋白质单体的平衡向由其结合所形成的复合物的存在移动。亲和力是单个分子与其配体结合的强度。它通常测量并报告为平衡解离常数(KD)，用于双分子相互作用的评估和强度排序。抗体与其抗原的结合是可逆的过程，结合反应的速率与反应物的浓度成正比。在平衡时，[抗体][抗原]复合物形成的速率等于解离成其组分[抗体]+[抗原]的速率。反应速率常数的测量值可用于定义平衡或亲和常数(1/KD)。总之，KD值越小，抗体对其靶标的亲和力越大。反应的两个方向的速率常数称为：结合反应速率常数(Kon)，其是用于计算“结合速率”(Kon)的反应部分，是用于表征抗体与其靶标结合的速度有多快的常数。反之亦然，解离反应速率常数(Koff)是用于计算“解离速率”(Koff)的反应部分，是用于表征抗体与其靶标解离的速度有多快的常数。在如本文所示的测量中，斜率越平，解离速率越慢，或抗体结合越强。反之亦然，更陡峭的下行表明更快的解离速率和更弱的抗体结合。实验测量的解离速率和结合速率的比率(Koff/Kon)用于计算KD值。本领域技术人员已知测量结合和解离速率的几种确定方法，并由此计算KD(见下文和实施例)，因此，考虑到标准误差，该值被认为是不依赖于所使用的测定法的值。如本文所用，术语“蛋白质复合物”或“复合物”或“组装的蛋白质”是指一组两个或更多个结合的大分子，其中至少一个大分子是蛋白质。如本文所用，蛋白质复合物通常是指可以在生理条件下形成的大分子的结合。蛋白质复合物的各个成员通过非共价相互作用连接。
“结合剂”涉及能够与另一分子结合的分子，其中所述结合优选为特异性结合，识别确定的结合位点、口袋或表位。结合剂可以具有任何性质或类型，并且不依赖于其来源。结合剂可以是化学合成的、天然存在的、重组产生的(和纯化的)、以及设计和合成产生的。因此，所述结合剂可以是小分子、化学物质、肽、多肽、抗体或其任何衍生物，例如肽模拟物、抗体模拟物、活性片段、化学衍生物等。术语“结合口袋”或“结合位点”是指分子或分子复合物的区域，由于其形状和电荷，该区域有利地与另一化学实体、化合物、蛋白质、肽、抗体或Nb结合。术语“口袋”包括但不限于裂缝、通道或位点。术语“结合口袋/位点的一部分”是指少于限定结合口袋或结合位点的所有氨基酸残基。例如，部分残基可以是在配体结合中起作用的关键残基，或者可以是空间相关并定义了结合口袋的三维区室的残基。残基在一级序列中可以是连续的或不连续的。对于抗体相关分子，术语“表位”也用于描述结合位点，如本文可互换使用的。“表位”是指多肽的抗原决定簇，其构成靶分子(例如LRRK2蛋白)上的结合位点或结合口袋，更具体地，其是ISVD或VHH可触及的LRRK2结构域上的结合口袋。表位可以在该表位所独有的空间构象中包含3个氨基酸。通常，表位由至少4、5、6、7个此类氨基酸组成，更通常由至少8、9、10个此类氨基酸组成。确定氨基酸空间构象的方法是本领域已知的，包括例如X射线晶体学和多维核磁共振。如本文所用，“构象表位”是指在空间构象中包含氨基酸的表位，该空间构象是独特的多肽的折叠3维构象。通常，构象表位由在线性序列中不连续但在蛋白质的折叠结构中聚集在一起的氨基酸组成。然而，构象表位也可由氨基酸的线性序列组成，所述线性序列所采用的构象是独特的多肽折叠3维构象(并且在变性状态下不存在)。在蛋白质复合物中，构象表位由在一种或多种多肽的线性序列中不连续的氨基酸组成，这些多肽在不同的折叠多肽折叠时聚集在一起，并且其以独特的四级结构结合。术语蛋白质的“构象”或“构象状态”通常是指蛋白质在任何情况下可及时采用的结构范围。因此，构象表位可以包含来自LRRK2蛋白的不同蛋白结构域的氨基酸相互作用。本领域技术人员将认识到构象或构象状态的决定因素包括在蛋白质氨基酸序列(包括修饰的氨基酸)和蛋白质周围环境中反映的蛋白质一级结构。蛋白质的构象或构象状态还涉及结构特征，例如蛋白质二级结构(例如，α-螺旋、β-片层等)、三级结构(例如，多肽链的三维折叠)和四级结构(例如，多肽链与其他蛋白质亚基的相互作用)。对多肽链的翻译后修饰和其他修饰，例如配体结合、磷酸化、硫酸化、糖基化或疏水基团的连接等，可以影响蛋白质的构象。此外，环境因素，例如周围溶液的pH值、盐浓度、离子强度和渗透压，以及与其他蛋白质和辅助因子的相互作用等，都会影响蛋白质构象。蛋白质的构象状态可以通过活性或与另一分子结合的功能测定法测定，或通过物理方法测定，如X射线晶体学、NMR或自旋标记等方法。对于蛋白质构象和构象状态的一般讨论，可以参考Cantor and Schimmel,BiophysicalChemistry,Part I:The Conformation of Biological.Macromolecules,W.H.Freemanand Company,1980,和Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties,W.H.Freeman and Company,1993。
如本文所用，术语“抗体”、“抗体片段”和“活性抗体片段”是指包含免疫球蛋白(Ig)结构域或能够特异性结合抗原(在本文的情况下为LRRK2蛋白)的抗原结合结构域的蛋白质。“抗体”还可以是源自天然来源或重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常是免疫球蛋白分子的四聚体。术语“活性抗体片段”是指任何抗体或抗体样结构的一部分，其本身对抗原决定簇或表位具有高亲和力，并包含一个或多个负责这种特异性的互补决定区(CDR)。非限制性示例包括免疫球蛋白结构域、Fab、F(ab)'2、scFv、重轻链二聚体、免疫球蛋白单可变结构域、纳米抗体、结构域抗体和单链结构，例如完整的轻链或完整的重链。根据本发明，对所述片段“活性”的额外要求是所述片段能够结合LRRK2，并且优选地是LRRK2的变构调节剂，更优选地能够增加或降低受试者中的LRRK2活性。术语“免疫球蛋白(Ig)结构域”，或更具体地“免疫球蛋白可变结构域”(缩写为“IVD”)是指基本上间插三个“互补决定区”或“CDR”的四个“框架区”组成的免疫球蛋白结构域，这四个“框架区”在本领域和下文中分别被称为“框架区1”或“FR1”；“框架区2”或“FR2”；“框架区3”或“FR3”；“框架区4”或“FR4”；所述“互补决定区”或“CDR”在本领域和下文中分别被称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”；“互补决定区3”或“CDR3”。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可以如下表示：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。正是免疫球蛋白可变结构域(IVD)通过携带抗原结合位点赋予抗体对抗原的特异性。通常，在常规免疫球蛋白中，重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)相互作用形成抗原结合位点。在这种情况下，VH和VL的互补决定区(CDR)将促成抗原结合位点，即，总共6个CDR将参与抗原结合位点的形成。鉴于上述定义，常规4链抗体(如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE分子；本领域已知)或Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段如二硫键连接的Fv或scFv片段，或衍生自此类常规4链抗体的双抗体(本领域均已知)的抗原结合结构域，通过一对(相关联的)免疫球蛋白结构域(例如轻链和重链可变结构域)结合抗原的相应表位，即通过共同结合到相应抗原表位的免疫球蛋白结构域的VH-VL对结合。如本文所用，免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)是指具有氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列按照FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的形式包含4个框架区(FR)和3个互补决定区(CDR)。本发明的“免疫球蛋白结构域”还指“免疫球蛋白单可变结构域”(缩写为“ISVD”)，等同于术语“单可变结构域”，其定义了这样的分子，其中抗原结合位点存在于单免疫球蛋白结构域上，并由其形成。这将免疫球蛋白单可变结构域与“常规”免疫球蛋白或其片段区分开，在“常规”免疫球蛋白或其片段中两个免疫球蛋白结构域，特别是两个可变结构域，相互作用以形成抗原结合位点。免疫球蛋白单可变结构域的结合位点由单个VH/VHH或VL结构域形成。因此，免疫球蛋白单可变结构域的抗原结合位点由不超过三个的CDR形成。因此，单可变结构域可以是轻链可变结构域序列(例如，VL-序列)或其合适的片段；或重链可变结构域序列(例如，VH-序列或VHH序列)或其合适的片段；只要其能够形成单个抗原结合单元(即，基本上由单可变结构域组成的功能性抗原结合单元，使得单个抗原结合结构域不需要与另一可变结构域相互作用来形成功能性抗原结合单元)。
特别地，免疫球蛋白单可变结构域可以是
Figure BDA0003901770190000161
(如本文所定义)或其合适的片段。注：
Figure BDA0003901770190000162
和
Figure BDA0003901770190000163
是Ablynx NV(a Sanofi公司)的注册商标。对于纳米抗体的一般描述，参考下面的进一步描述，以及本文引用的现有技术，例如在WO2008/020079中描述的。“VHH结构域”，也称为VHH、VHH结构域、VHH抗体片段和VHH抗体，其最初被描述为“重链抗体”的抗原结合免疫球蛋白(Ig)(可变)结构域(即“无轻链的抗体”；Hamers-Casterman等人(1993)Nature 363:446-448)。已选择术语“VHH结构域”将这些可变结构域与存在于常规4链抗体中的重链可变结构域(在本文中称为“VH结构域”)和存在于常规4链抗体中的轻链可变结构域(在本文中称为“VL结构域”)区分开来。有关VHH和纳米抗体的进一步描述，参见Muyldermans的综述文章(Reviews in Molecular Biotechnology74:277-302,2001)，以及以下专利申请，这些专利申请被提及为一般背景技术：VrijeUniversiteit Brussel的WO94/04678、WO95/04079和WO96/34103；Unilever的WO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams Instituut voor Biotechnologie(VIB)的WO97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016和WO 03/055527；Algonomics N.V.和Ablynx N.V.的WO 03/050531；加拿大国家研究委员会的WO 01/90190；抗体研究所的WO03/025020(＝EP 1433793)；以及Ablynx N.V.的WO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO 06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787和WO 06/122825，以及Ablynx N.V.的其他发表的专利申请。如这些参考文献中所述，纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)特别的特征在于在一个或多个框架序列中存在一个或多个“标志残基”。纳米抗体的进一步描述，包括纳米抗体的人源化和/或骆驼源化、以及其他修饰、部分或片段、衍生物或“纳米抗体融合体”、多价或多特异性构建体(包括接头序列的一些非限制性示例)和增加纳米抗体半衰期的不同修饰以及其制备可以在例如WO 08/101985和WO 08/142164中找到。纳米抗体形成最小的抗原结合片段，其完全保留了全长抗体的结合亲和力和特异性。Nb具有异常长的互补决定区3(CDR3)环和凸互补位，这使它们能够渗透到靶抗原的隐藏腔中。
如本文所用，术语“确定”、“测量”、“评估”、“鉴定”、“筛选”和“测定”可互换使用并且包括定量和定性测定。
本文可互换使用的术语“受试者”、“个体”或“患者”涉及任何需要诊断、治疗或预防的生物体，例如脊椎动物，特别是任何哺乳动物，包括人和其他哺乳动物，例如，动物如啮齿动物、兔、牛、羊、马、狗、猫、羊驼、猪或非人灵长类动物(例如猴子)。啮齿动物可以是小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或栗鼠。在一个实施方案中，受试者是人、大鼠或非人灵长类动物。优选地，受试者是人。在一个实施方案中，受试者是患有或怀疑患有疾病或病患的受试者，特别是本文公开的疾病或病患，在本文中也称为“患者”。然而，应当理解，上述术语并不意味着存在症状。术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”或“治疗(treat)”可以互换使用，并且定义为减缓、中断、阻止、控制、停止、减少或恢复体征、症状、疾患、病症或疾病的进展或严重性的治疗干预，但不一定包括完全消除所有与疾病相关的体征、症状、病症或疾患。
如本文所用，术语“药物”是指用于治疗，即预防或治疗疾病或病患的物质/组合物。根据本发明，术语“疾病”或“病患”是指任何病理状态，特别是如本文所定义的疾病或疾患。
具体实施方式
本发明涉及人LRRK2蛋白的非天然存在的蛋白质结合剂，特别是LRRK2活性的变构调节剂。帕金森病(PD)相关蛋白富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)中的突变通常导致GTP酶活性降低和激酶活性增加。LRRK2(显性)突变(其中G2019S是最普遍的一个)导致迟发性帕金森病，这通过增加Rab蛋白的磷酸化介导。因此，激酶活性的抑制和/或GTP酶活性的增加提供了治疗上有益的结果。事实上，已知的LRRK2激酶活性的ATP竞争性抑制剂已在PD治疗中显示出潜在的治疗益处，但仍然存在对与使用针对LRRK2ATP结合口袋的激酶抑制剂相关的潜在有害副作用的担忧[46,81-82]。虽然在正构机制中起作用的次代化合物处于临床测试阶段，但对具有更好安全性的化合物的需求需要替代方法，其中LRRK2活性的变构调节作为新方法之一并且在本公开的范围内。
本发明涉及变构结合剂，其主要通过不同于激酶结构域中的ATP催化结合位点的结构域处的构象表位结合LRRK2，和/或不直接与ATP竞争其活性位点，也不与已知的LRRK2(特别是LRRK2激酶结构域)的结合剂竞争。本文描述的结合剂谱包括LRRK2的几层变构调节，这将支持新的一流LRRK2疗法的创建。特别地，本发明的结合剂在LRRK2过表达和内源性LRRK2表达水平下均有效地结合来自细胞裂解物的LRRK2，这反映了高的亲和力结合，如通过两个独立的生物物理方法所证实的，其得到的KD值范围从10到200nM。进一步的亲和力成熟、多互补位构建体的产生和/或人源化甚至可以将这种人LRRK2蛋白的结合亲和力增加至次纳摩尔亲和力。
此外，LRRK2特异性免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)提供了第一种蛋白LRRK2结合剂，其通过变构机制起作用，并通过混合型(非竞争性)抑制机制作用于LRRK2活性。与五种常见的PD突变中的四种类似，用1型ATP竞争性抑制剂治疗已被证明导致LRRK2微管结合。这种LRRK2在微管上的寡聚化现象，伴随着微管相关运动蛋白的阻断，被认为是LRRK2病理学的根本原因之一[36]。令人惊讶的是，本文所述的基于ISVD的LRRK2特异性结合剂均未诱导LRRK2与微管结合，而有些甚至恢复I型ATP竞争性激酶抑制剂MLI-2诱导的LRRK2的重新定位。这些观察提供了本发明的LRRK2结合剂的差异化效果，将它们定位为进一步开发成与当前存在的抑制剂具有不同的作用模式和细胞谱的LRRK2调节剂的候选。
因此，本发明提供了变构LRRK2蛋白结合剂，其在细胞中结合人LRRK2而不影响蛋白质的亚细胞定位，保持其细胞分布并因此保持LRRK2与微管分离或不与微管结合。所以在一个实施方案中，本文所述的LRRK2特异性结合剂或调节剂不诱导LRRK2在微管上的积累。此外，如本文所公开的基于ISVD的LRRK2变构结合剂提供结合亲和力，如可使用技术人员已知的或如本文所示例的方法确定的，其涉及的如本文所定义的KD值为500nM或更低，优选200nM或更低，更优选为150nM至10倍更低、或100倍更低或1,000倍更低或10,000倍更低的值之间。
更具体地，结合剂变构调节LRRK2激酶活性，最优选在细胞中和/或体外调节LRRK2激酶活性。激酶活性的调节可能与LRRK2的单体/二聚化循环以及蛋白的GTP酶活性相关，尽管本文所述的LRRK2调节剂一方面集中于将ISVD应用于靶向LRRK2的固有有利效果，另一方面，集中于它们通过构象方式的高亲和力结合所获得的效果，取决于结合位置，导致激酶活性调节。
因此，在一个具体方面，LRRK2变构结合剂包含如本文可互换使用的免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)或VHH或纳米抗体，其结合构象表位以调节LRRK2蛋白构象并因此可影响其活性。针对18个不同的ISVD家族的更广泛的组，分析了其细胞内(in cellulo)的作用。根据其调节谱(LRRK2亚细胞定位、激酶活性抑制或活化)和结合模式(不同的构象表位和结合位点)对这些ISVD进行分类，提供了LRRK2的细胞内(in cellulo)的变构调节的一般特征。此外，它们与LRRK2的相互作用被确定为主要位于激酶结构域之外，从而使这些高度特异性的蛋白结合剂从所有已知的ATP竞争性激酶抑制剂甚至天然化合物5'-脱氧腺苷钴胺素(AdoCbl；一种维生素B12生理形式；[43]；如实施例10所示)中多样化。在一个实施方案中，本发明涉及人LRRK2的变构调节剂，其以高亲和力特异性结合LRRK2蛋白，其中所述调节剂不同于或不包含天然存在的LRRK2调节剂或结合剂，例如维生素B12(一种生理形式的钴胺素或其衍生物)。
此外，与传统的LRRK2特异性抗体相比，本发明的LRRK2调节性ISVD是小的试剂，因此也可用于研究内源性LRRK2在活细胞中的动态定位(体内成像)。
因此，本发明首次揭示了高度特异性的LRRK2结合剂，其通过能够避免进一步的不利影响(例如LRRK2蛋白在细胞中重新定位)的机制来变构调节LRRK2活性。这种变构结合剂可对LRRK2产生活化或抑制作用，目前认为针对LRRK2的激酶抑制剂在治疗上最相关。唯一报道的以变构方式抑制的小化合物是维生素B12衍生物[43]，尽管其结合位点主要位于LRRK2激酶结构域，由此提供了与本文公开的变构ISVD相比至少部分不同的结合位点和不同的作用机制。此外，已证明ISVD可特异性结合Roc结构域、COR结构域、激酶结构域、WD40结构域和/或各种LRRK2结构域的界面，包括N-末端(犰狳、锚蛋白重复、LRR)结构域和激酶或WD40结构域。缺乏全长LRRK2的高分辨率结构，尚未建立精确的表位结合位点，尽管来自ELISA和交联质谱数据的见解提供了指示区域，其中变构ISVD与最大距离为35埃的蛋白质之间的所述交联结合。根据该信息，得出以下结论：如本文所述的大部分LRRK2变构调节剂通过与主要位于激酶结构域以外的构象表位结合发挥作用，和/或其表位结合位点残基至少位于激酶活性位点以外。
如本文可互换使用的，如本文所述的变构调节剂是“非天然的”、“非天然存在的”或“非天然的”结合剂，这是指这样的事实：这些结合剂或调节剂本身在自然界中不存在，即需要技术步骤或过程(例如免疫)来获得这种高度特异性的变构调节结合剂。相比之下，已知报道的与LRRK2激酶结构域结合的维生素B12衍生化合物在自然界中作为钴胺素以四种形式存在。钴胺素实际上是指一组复杂的、化学相关的辅助因子，其需要钴(Co)发挥功能。羟钴胺素由细菌产生，氰钴胺素(CNCbl)是在用于治疗或补充目的纯化羟钴胺素(OHCbl)期间的衍生形式。两者都在体内进一步代谢形成活性形式：腺苷钴胺素(AdoCbl)和甲基钴胺素(MeCbl)。
如本文所用，术语“变构调节”、“变构活性”或“变构调节”是指所述试剂在变构或调节位点的结合，该位点是不同于蛋白质的酶活性位点或催化位点的位点，因此与正构结合剂的结合位点不同。LRRK2的这种催化位点包括激酶结构域活性位点以及GTP酶结构域活性位点。“调节剂”是正性、负性或中性的。“正性变构调节剂”通过增加激动剂或配体(例如ATP或GTP)与LRRK2结合的可能性(即增加亲和力)、或增加其活化LRRK2的能力(即增加功效)、或两者来增加LRRK2的活性或反应。“负性变构调节剂”降低激动剂的亲和力和/或功效。“中性变构调节剂”不影响激动剂活性，但可以阻止其他调节剂与变构位点结合。一些调节剂也可作为变构激动剂工作。例如，变构结合剂可以通过在结合时诱导LRRK2蛋白的构象变化来影响或调节LRRK2活性。在一个实施方案中，所述LRRK2活性的变构抑制剂是一种非天然存在的分子，因此其不同于天然存在的化合物，例如人中的(代谢的)钴胺素衍生物。因此，在一个具体实施方案中，所述LRRK2变构调节剂是LRRK2抑制剂，并且其不是钴胺素或钴胺素衍生物。如本文使用的术语“衍生物”包括但不限于钴胺素衍生物AdoCbl、MeCbl、OHCbl和CNCbl、和/或任何含有钴胺素支架的天然化合物。优选地，所述特异性结合LRRK2的LRRK2变构调节剂当存在于细胞、生物体或受试者中时是杂合的或外源的化合物。
本发明具体地涉及人LRRK2的变构调节剂。技术人员清楚的是，与人LRRK2蛋白(SEQ ID NO:21)相比，细菌来源的LRRK2蛋白是非常不同的，不仅从一级结构或氨基酸序列上，还从二级和三级结构上，例如事实上细菌LRRK2缺乏激酶结构域。人LRRK2是一种复杂且较大的蛋白，这意味着完美设计产生能够强烈影响人LRRK2活性的特定结合剂。如本文所述的结合剂或ISVD和变构调节剂通过明确定义的免疫和选择策略获得，并提供具有高治疗潜力的新构象表位的新的结合剂。已知ISVD或更具体地纳米抗体在结构生物学分析中充当稳定剂或伴侣，此外还被开发成治疗剂。以前没有表明用变构ISVD或Nb或其衍生的活性抗体片段靶向人LRRK2，尽管考虑到LRRK2的细胞内靶向以及到达脑进行PD治疗存在障碍，它们的治疗潜力可能更复杂，但是其结合模式为生产和选择新的化合物以改善LRRK2药物提供了几种独特的方法。事实上，其构象表位提供了新的可药用口袋，此外，它们的高特异性和变构效应可与它们灵活的作用模式相结合，其中保留的LRRK2细胞定位可能会降低毒性风险。关于药物递送，其小尺寸有利于帮助穿过血脑屏障，或有助于将它们连接到货物或捕获在载体中穿过血脑屏障，如本文进一步描述的。最后，纳米抗体也可以作为胞内抗体在治疗上应用，并且可以使用基因治疗来应用。
在一个实施方案中，所述LRRK2变构调节剂包含特异性地并且主要结合LRRK2的Roc结构域的结合剂。在另一个实施方案中，所述LRRK2变构调节剂包含特异性地并且主要结合LRRK2的COR(-B)结构域的结合剂。在另一个实施方案中，所述LRRK2变构调节剂包含特异性地并且主要结合LRRK2的WD40结构域的结合剂。在另一个实施方案中，所述LRRK2变构调节剂包含特异性地并且主要结合LRRK2的激酶结构域的结合剂。在另一个实施方案中，所述LRRK2变构调节剂包含特异性结合各种LRRK2结构域的界面的结合剂，意指几个结构域上的结合残基，并且可以包括N-末端(犰狳、锚蛋白重复、LRR)结构域和激酶或WD40结构域。在一些实施方案中，所述LRRK2变构调节剂特异性结合任何所述结构域上存在的残基组合。在一个优选的实施方案中，本文所述的LRRK2变构调节剂不结合LRRK2的激酶或GTP酶结构域的活性位点。在一个更优选的实施方案中，本文所述的LRRK2变构调节剂不结合激酶结构域氨基酸残基，而特异性结合包含属于LRRK2的其他蛋白结构域的氨基酸残基的LRRK2结合位点。
在另一个实施方案中，所述特异性结合LRRK2蛋白的变构调节剂可以增加其激酶和/或降低其GTP酶活性。在其他实施方案中，特异性结合LRRK2蛋白的变构调节剂可以降低、抑制或阻断其激酶和/或增加其GTP酶活性。术语“增加”、“增强”或“活化”在本文中可互换使用，是指与没有变构调节剂或具有阴性或无关对照试剂的对照相比，其活性增加至少5％。术语“增加”、“增强”或“活化”进一步指与没有变构调节剂或具有阴性或无关载体对照的对照相比，其活性增加至少10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或超过50％。如本文可互换使用的术语“降低”、“减少”或“抑制”或“防止”是指与没有变构调节剂或具有阴性或无关对照的对照相比，其活性降低至少5％。术语“降低”、“减少”、“防止”或“抑制”进一步指与没有变构调节剂或具有阴性对照的对照相比，其活性降低至少10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％或超过50％。术语LRRK2活性的“阻断”是指与没有变构调节剂或具有阴性对照的对照相比，其活性降低到不可检测的水平。如本文所指的“阴性对照”或“无关对照”或“对照”或“载体对照”是指相似性质的结合剂(例如无关的Nb)，其不与LRRK2结合，或与LRRK2结合但已知对其活性没有任何影响。“对照”可以是一类分子或分子库，已知其对LRRK2没有影响(无关的Nb或化合物等)。
当提及对LRRK2激酶活性的抑制时，在本文中是指其自磷酸化和/或磷酸化其底物的能力降低。反之亦然，当提及如本文所述的LRRK2的激酶活性的活化或增加时，是指LRRK2受变构调节剂影响导致自磷酸化和/或底物磷酸化增加。本文所指的底物包括但不限于实施例中所指的Rab蛋白，还包括商业的体外测定法中使用的肽。如技术人员从现有技术状态已知的，在几个LRRK2氨基酸位置已报道了自磷酸化。
在另一个实施方案中，所述LRRK2蛋白活性的变构调节剂包括化合物、化学物质、蛋白质、肽或肽模拟物、抗体、抗体模拟物、单结构域抗体ISVD或任何活性抗体片段。如本文所用，术语“化合物”描述了任何分子，无论是天然存在的还是设计、鉴定、筛选或产生而合成的，并且可以在测定法中进行测试，如筛选测定法或药物发现测定法，或具体地在鉴定能够调节LRRK2活性的化合物的方法中。因此，这些化合物包括有机和无机化合物。为了高通量目的，可以使用测试化合物文库，例如提供足够多样性范围的组合或随机文库。示例包括但不限于天然化合物文库、变构化合物文库、肽文库、抗体片段文库、合成化合物文库、基于片段的文库、噬菌体展示文库等。此类化合物也可称为结合剂；如本文所指，这些可以是“小分子”或“小化合物”，其指的是低分子量(例如，<900Da或<500Da)的有机化合物。变构调节剂还包括化学物质和化合物，例如特征在于低分子量的多核苷酸、脂质或激素类似物。其他生物聚合的有机测试化合物包括小肽或肽样分子或其衍生物，例如含有约2至约40个氨基酸的合成氨基酸的肽模拟物(肽模拟物)。
本发明的化合物包括使用筛选方法设计或鉴定的那些和能够构象结合LRRK2的那些，如本文针对本发明的ISVD所具体定义的。此类化合物也可以使用基于使用结构构象的筛选方法产生，所述结构构象针对如本文提出的与本发明的ISVDS复合的LRRK2获得。候选化合物和/或使用本发明的方法鉴定或设计的化合物可以是任何合成的或天然存在的合适化合物，优选是合成的。在一个实施方案中，通过本发明的方法选择或设计的合成化合物优选地具有等于或小于约5000、4000、3000、2000、1000或更优选地小于约500Da的分子量，或者优选地是肽。本发明的化合物优选在生理条件下是可溶的。此类化合物可以包含与蛋白质的结构相互作用所必需的官能团，特别是氢键，并且通常包括至少一个胺、羰基、羟基或羧基，优选至少两个化学官能团。该化合物可以包含被一个或多个上述官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳族或多芳族结构。化合物还可包含生物分子，包括肽、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或其组合。化合物可包括，例如：(1)肽，例如可溶性肽或肽模拟物，包括Ig尾融合肽和随机肽文库的成员以及由D-和/或L-构型氨基酸构成的组合化学衍生的分子文库，和/或构象受限的氨基酸衍生物；(2)磷酸肽(例如，随机和部分简并、定向磷酸肽文库的成员，(3)抗体(例如，多克隆、单克隆、人源化、抗独特型、嵌合和单链抗体、纳米抗体以及Fab、(Fab)2、Fab表达文库和抗体的表位结合片段)；(4)非免疫球蛋白结合蛋白，例如但不限于avimer、DARPin和lipocalin；(5)基于核酸的适体；和(6)有机和无机小分子。
合成的化合物文库可从例如Maybridge Chemical Co.(Tintagel,Cornwall,UK),AMRI(Budapest,Hungary)and ChemDiv(San Diego,Calif.),Specs(Delft,TheNetherlands),ZINC15(Univ.of California)商购获得。此外，许多方法可用于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子，包括随机寡核苷酸的表达。或者，可以容易地产生细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物文库。此外，天然或合成的化合物文库和化合物可以通过常规的化学、物理和生物化学方法容易地进行修饰，并可用于产生组合文库。此外，本领域已知许多产生组合文库的方法，包括那些涉及生物文库的方法；空间可寻址平行固相或溶液相文库；需要反卷积的合成文库方法；“一珠一化合物”文库方法；和使用亲和色谱法选择的合成文库方法。生物文库方法仅限于多肽或肽文库，而其他四种方法适用于多肽、肽、非肽寡聚物或化合物的小分子文库。化合物还包括那些可以从通过基于片段的药物设计产生的先导合成的化合物，其中通过将这些筛选片段浸泡或共结晶成本发明提供的晶体，然后对这些晶体进行X-射线束分析并获得衍射数据来评估这些化学片段的结合。
此外，使用本发明的方法鉴定或设计的化合物可以是肽或其模拟物。本发明的分离的肽或模拟物可以是构象受限的分子，或者是非构象受限的分子，例如非受限的肽序列。术语“构象受限的分子”是指构象受限的肽和构象受限的肽类似物和衍生物。此外，氨基酸可以被多种未编码或修饰的氨基酸取代，如被相应的D-氨基酸或N-甲基氨基酸取代。其他修饰包括用化学上相似的基团取代羟基、硫醇、氨基和羧基官能团。关于肽及其模拟物，可以引入其他非天然氨基酸或化学氨基酸类似物/衍生物的其他示例作为取代或添加。此外，可以使用肽模拟物。肽模拟物是模拟肽的生物活性但在化学性质上不再是肽的分子。根据严格的定义，肽模拟物是不再包含任何肽键(即氨基酸之间的酰胺键)的分子。然而，术语肽模拟物有时用于描述本质上不再完全是肽的分子，例如假肽、半肽和类肽。无论是完全还是部分非肽，用于本发明的肽模拟物都提供了与肽模拟物所基于的肽中活性基团的三维排列非常相似的反应性化学部分的空间排列。例如，肽或肽模拟物可以设计为模拟本文描述的ISVD的互补位或CDR。通常，由于这种相似的活性位点几何结构，肽模拟物对生物系统的影响与肽的生物活性相似。有时使用给定肽的模拟物而不是肽本身有优势，因为肽通常表现出两种不良特性：(1)生物利用度差；和(2)作用时间短。肽模拟物提供了绕过这两个主要障碍的明显途径，因为所涉及的分子足够小，既具有口服活性，又具有较长的作用时间。与肽模拟物相关的成本节约和改善的患者依从性也是很显著的，因为与肽的肠胃外施用相比，肽模拟物可以口服施用。此外，肽模拟物的生产通常比肽便宜。自然地，本领域技术人员将认识到肽模拟物的设计可能需要对使用本发明的方法设计或鉴定的化学结构进行轻微的结构改变或调整。一般而言，可以化学合成基于本发明的ISVD鉴定或设计的化合物或肽，然后使用本文所述的任何方法测试结合和调节LRRK2活性的能力。
变构调节剂还可以包含较大的多肽，所述较大的多肽包含约40至约500个氨基酸，例如本文先前描述的抗体、抗体模拟物、抗体片段或抗体缀合物。LRRK2结合剂，包括蛋白质结合剂和/或在结合LRRK2时优选具有变构活性或变构调节活性的结合剂，将这些变构化合物定义为变构调节剂，在增加LRRK2的(激酶)活性时作为LRRK2的正性变构调节剂发挥作用(PAM)；反之，作为LRRK2活性的负性变构调节剂发挥作用(NAM)，导致LRRK2(激酶)活性降低，或抑制或阻断LRRK2活性。在一个具体实施方案中设想提供包含如本文定义的抗体或活性抗体片段的LRRK2变构调节剂。所述变构调节剂优选包含特异性结合LRRK2并含有4个框架区和3个CDR区的ISVD。
更具体地，所述ISVD、纳米抗体或VHH或活性抗体片段包含CDR1、CDR2和CDR3序列的，所述CDR1、CDR2和CDR3序列如SEQ ID NO：1-19的ISVD的CDR所提供的，或所述其CDR序列的任何组合。本文描述的每个Nb序列的CDR区注释显示在表3中，用于当前分析中使用的特定CDR注释。或者，本领域已知的稍微不同的CDR注释可用于定义CDR区，涉及AbM(AbM是Oxford Molecular Ltd.的抗体建模包，描述于http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html)、Chothia(Chothia and Lesk,1987；J Mol Biol.196:901-17),Kabat(Kabat等人,1991；Sequences of Proteins of Immunological Interest.5th edition,NIHpublication 91-3242)、或IMGT(LeFranc,2014；Frontiers in Immunology.5(22):1-22)注释，它们都适用于鉴定如本文公开的SEQ ID NO:1-19的ISVD的CDR区。为了阐明所述可替代注释所涵盖的确切序列，作为示例，针对图10中的CA12610 Nb，提供了作为与当前表3中应用的注释相关的CDR。
应该注意的是，正如本领域对VH结构域和对VHH结构域所公知的，每个CDR中的氨基酸残基总数可以变化并且可不对应于由Kabat编号所指示的氨基酸残基的总数(即，根据Kabat编号的一个或多个位置在实际序列中可能未被占据，或者实际序列可能包含比Kabat编号所允许的数量更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，根据Kabat的编号可以对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号，或者可以不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。VH结构域和VHH结构域中的氨基酸残基总数通常在110至120的范围内，通常在112至115之间。然而应当注意，更小和更长的序列也可适用于本文所述的目的。
在一个具体的实施方案中，特异性结合LRRK2的所述ISVD或Nb影响细胞中的激酶活性(也参见实施例，特别是图2)。在一个具体的实施方案中，该作用可以设想为通过直接或间接作用于LRRK2激酶酶活性的激酶抑制作用，细胞内(in cellulo)观察为LRRK2自磷酸化的抑制和/或底物(Rab10)磷酸化的抑制,和/或在体外观察为对肽底物的LRRK2激酶活性抑制。因此在一个实施方案中，本文所述的LRRK2变构调节剂抑制细胞中的激酶活性。
更具体地，本文示例的一组Nb(Nb1、Nb6、Nb23和Nb42)具有抑制所有此类测试的LRRK2激酶活性的功能，即，细胞内(in cellulo)抑制LRRK2自磷酸化和抑制底物(Rab10)磷酸化,和/或体外对肽底物的LRRK2激酶活性抑制，从而阻断LRRK2激酶活性本身。Nb42也分类在这一组，因为它对细胞中的LRRK2自磷酸化和Rab磷酸化有很强的抑制作用，尽管在体外在存在Nb42时可能不显示激酶活性作用。因此，在设想本文示例的Nb的具体实施方案中，作为LRRK2激酶活性本身抑制剂的LRRK2变构调节剂在本文中定义为包含ISVD，其中CDR1、CDR2和CDR3由SEQ ID NO:1、2、3或6的CDR组成，其中CDR区如本文公开的表3-4或图10中定义。这些激酶抑制性Nb基于其结合表位提供两个类别。Nb1(SEQ ID NO:1)和Nb6(SEQ IDNO:2)仅与COR结构域(COR-B)的C-末端部分结合，而Nb23(SEQ ID NO:3)与激酶结构域的C-末端叶(lobe)中的K2078和K2091交联。后者的残基位于彼此靠近的位置，并靠近S1292自磷酸化位点，但距离ATP结合口袋很远。观察到这些Nb中没有一个在激酶ATP结合口袋中结合，而Nb1和Nb6甚至在激酶结构域以外结合，表明这些Nb不通过ATP竞争机制发挥作用。相应地，动力学分析表明，所有三种Nb通过混合型抑制机制发挥作用，与“ATP结合”构象相比，更倾向于与“无ATP的”LRRK2构象结合。特别是考虑到COR-B结构域位于LRRK2结构的中心，这可能表明这些Nb将LRRK2蛋白推向更“开放”的非催化能力构象。然而，与ATP竞争性1型抑制剂相反，这些Nb均未诱导LRRK2的微管重新定位。
本文设想的第二组Nb(Nb17、Nb36、Nb38、Nb40和Nb41)抑制细胞中的Rab底物磷酸化，同时保持自磷酸化和肽磷酸化不受影响，这表明这些Nb或者在空间上干扰较大的Rab底物的结合，或者将LRRK2固定在排除Rab结合的构象中。因此，在设想本文示例的Nb的具体实施方案中，作为LRRK2激酶活性抑制剂而防止底物磷酸化的LRRK2变构调节剂，在本文中定义为包含ISVD，其中CDR1、CDR2和CDR3由SEQ ID NO:4、5、7、8或12的CDR组成，其中CDR区如本文公开的表3-4或图10中定义。
另一个实施方案涉及第三组Nb(Nb22、Nb28)，其通过增加细胞中(和体外，至少如Nb22所示)的LRRK2激酶活性来调节LRRK2。因此，在设想本文示例的Nb的具体实施方案中，活化LRRK2激酶活性的LRRK2变构调节剂在本文中定义为包含ISVD，其中CDR1、CDR2和CDR3由SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:18的CDR组成，其中CDR区如本文公开的表3-4或图10中定义。
最后，可以设想第四组Nb(Nb3、Nb9、Nb10、Nb13、Nb31、Nb37和Nb39)，其似乎不影响LRRK2激酶活性，尽管仍然提供了前面提到的效果，这些Nb也以高亲和力(纳摩尔范围)与ATP结合口袋以外的LRRK2结合并保留其细胞质分布。那些激酶中性结合剂可能特别适合用于需要LRRK2结合的检测或诊断测定法，或者用于在与这些Nb结合时需要可接近的LRRK2构象的筛选测定法。因此，在设想本文示例的Nb的具体实施方案中，作为具有高亲和力的激酶中性结合剂的LRRK2 Nb在本文中定义为包含ISVD，其中CDR1、CDR2和CDR3由SEQ ID NO:10、11和SEQ ID NO:13-17的CDR组成，其中CDR区如本文公开的表3-4或图10中定义。
此外，本文提供了一组LRRK2变构调节剂，其防止LRRK2与细胞中的微管结合，即使当ATP竞争性LRRK2激酶抑制剂化合物存在于同一细胞中时也是如此。所述ATP竞争性LRRK2激酶抑制剂在本文中也可以定义为LRRK2的正构结合剂。因此，在设想本文示例的Nb的具体实施方案中，以高亲和力结合并阻断LRRK2在细胞中重新定位(这种向微管的重新定位在通常情况下(即调节剂不存在的情况下)被触发(例如，通过存在1型ATP竞争性激酶抑制剂)的LRRK2变构调节剂，在本文定义为包含ISVD，其中CDR1、CDR2和CDR3由SEQ ID NO:3、4、5和9的CDR组成，其中CDR区如本文公开的表3-4或图10中定义。
在另一个实施方案中，LRRK2变构调节剂包含ISVD，所述ISVD包含选自SEQ ID NO:1-19的氨基酸序列。在另一个实施方案中，LRRK2变构调节剂包含ISVD，所述ISVD包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自与SEQ ID NO：1-19的任何序列具有至少85％同一性的序列，其中CDR与SEQ ID NO:1-19的CDR相同，并且框架残基中可能存在差异。在一个具体的实施方案中，LRRK2变构调节剂包含ISVD，所述ISVD包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自与SEQID NO：1-19的任何序列具有至少85％同一性的序列，或与其具有至少90％同一性，或至少95％同一性，其中CDR与SEQ ID NO:1-19的CDR相同，并且框架残基中可能存在差异，除了所述框架区中存在的美洲驼种系标志残基。更具体地，不应改变的FR残基的后者对应于残基37(Kabat N°；F或Y)，其对应于SEQ ID NO:1的残基39；例如，残基44-45(Kabat N°；QR、ER或DR)，其对应于SEQ ID NO：1的残基46-47；残基47(Kabat N°；L、T或F)，其对应于SEQ ID NO：1的残基49；残基78(Kabat N°；G或V)，其对应于SEQ ID NO:1的残基80；和残基84(KabatN°；P)，其对应于SEQ ID NO:1的残基89，例如(也参见图10，第一序列的下划线/粗体残基)。在另一个实施方案中，所述LRRK2调节剂包含ISVD，所述ISVD包含的氨基酸序列选自SEQ IDNO:1-19的任何序列的人源化变体；或与SEQ ID NO:1-19具有至少85％同一性、或与SEQ IDNO:1-19具有至少90％同一性、或与SEQ ID NO:1-19具有至少95％同一性的任何序列的人源化变体；其中CDR与SEQ ID NO:1-19的任一个CDR相同，并且FR标志残基与SEQ ID NO:1-19的任一个相同，并且FR区的其他残基具有人源化取代，这提供了差异。
术语免疫球蛋白单可变结构域(例如结构域抗体和
Figure BDA0003901770190000291
(包括VHH结构域))的“人源化变体”，是指所述ISVD的氨基酸序列，其代表进行人源化的结果，即增加与最接近的人种系序列的序列同一性程度。特别地，人源化免疫球蛋白单可变结构域，例如
Figure BDA0003901770190000292
(包括VHH结构域)可以是免疫球蛋白单可变结构域，其中存在至少一个氨基酸残基(特别是至少一个框架残基)，其是和/或其对应于人源化取代(如本文进一步定义)。可通过将天然存在的VHH序列的构架区序列与一种或多种密切相关的人VH序列的相应构架序列进行比较来确定潜在有用的人源化取代，之后可以将由此确定的一个或多个潜在有用的人源化取代(或其组合)引入所述VHH序列(以本身已知的任何方式，如本文进一步描述)，并且可以测试所得人源化VHH序列对靶标的亲和力、稳定性、表达的容易程度和水平、和/或其他所需的特性。以这种方式，通过有限程度的试错，技术人员可以确定其他或进一步合适的人源化取代(或其合适的组合)。此外，基于之前描述的，免疫球蛋白单可变结构域(的框架区)，例如
Figure BDA0003901770190000301
(包括VHH结构域)可以是部分人源化或完全人源化的。与相应的天然存在的VHH结构域相比，人源化免疫球蛋白单可变结构域，特别是纳米抗体，可具有若干优点，例如免疫原性降低。总之，应选择人源化取代以使所得的ISVD和/或VHH的人源化氨基酸序列仍保留有利的特性，例如抗原结合能力和变构调节能力。本领域技术人员将能够选择人源化取代或人源化取代的合适组合，其优化或实现在一方面由人源化取代提供的有利特性以及另一方面天然存在的VHH结构域的有利特性之间的期望或合适的平衡。这样的方法是本领域技术人员已知的。人共有序列可以用作人源化的靶序列，但其他方式也是本领域已知的。一种替代方法包括以下方法：其中技术人员比对许多人种系等位基因，例如但不限于比对IGHV3等位基因，以使用所述比对来鉴定靶序列中适合人源化的残基。此外，可以比对与靶序列最同源的人种系等位基因亚组，作为起点以鉴定合适的人源化残基。或者，分析VHH以鉴定其在人等位基因中最接近的同源物，并用于人源化构建体设计。应用于骆驼科VHH的人源化技术也可以通过包括单独或组合替换特定氨基酸的方法来进行。可以基于从文献中已知的、来自已知的人源化努力以及来自与天然VHH序列相比的人共有序列、或与感兴趣的VHH序列最相似的人等位基因来选择所述替换。从WO 08/020079的表A-5-A-8中给出的关于VHH熵和VHH变异性的数据可以看出，框架区中的一些氨基酸残基(即标志残基，图10中的粗体/下划线)在人和骆驼科之间比其他更保守。通常，虽然本发明在其最广义上不限于此，但优选在不太保守的位置进行任何取代、缺失或插入。此外，一般而言，氨基酸取代优于氨基酸缺失或插入。例如，与人类似的骆驼科单结构域抗体类型含有疏水性FR2残基，该残基通常存在于人源或其他物种的常规抗体中，但通过在位置103处取代来自双链抗体的VH中存在的保守色氨酸残基的其他取代来补偿这种亲水性损失。同样地，属于这两类的肽显示出与人VH框架区的高度氨基酸序列同源性，并且所述肽可以直接施用于人，而不预期由此产生不希望的免疫反应，并且没有进一步的人源化负担。确实，有些骆驼科VHH序列显示出与人VH框架区的高度序列同源性，因此所述VHH可以直接施用于患者而不预期由此产生免疫反应，并且没有额外的人源化负担。可以在人源化期间引入合适的突变，特别是取代，以产生与预先存在的抗体结合减少的多肽(例如，参考WO 2012/175741和WO2015/173325)，例如在以下位置中的至少一个：11、13、14、15、40、41、42、82、82a、82b、83、84、85、87、88、89、103或108。本发明的氨基酸序列和/或VHH可以在任何框架残基处适当人源化，例如在一个或多个标志残基处(如本文所定义)或优选在一个或多个其他框架残基处(即非标志残基)或其任何合适的组合。根据用于表达本发明的氨基酸序列、ISVD、VHH或多肽的宿主生物体，此类缺失和/或取代也可以以下方式设计：如在本领域技术人员的能力范围内，去除一个或多个翻译后修饰的位点(例如一个或多个天冬酰胺上的糖基化位点被G、A或S取代；和/或甲硫氨酸氧化位点)。或者，可以设计取代或插入，以引入一个或多个用于连接官能团的位点，例如，以允许位点特异性聚乙二醇化。在某些情况下，在位置37、44、45和/或47处具有亲水特性的至少一个典型的骆驼科标志残基被取代(Kabat N°；参见WO2008/020079表A-03)。人源化的另一个示例包括FR 1中残基的取代，例如位置1、5、11、14、16和/或23，和/或28；在FR2中的取代，例如位置40和/或43；在FR3中的取代，例如位置60-64、73、74、75、76、78、79、81、82b、83、84、85、93和/或94；在FR4中的取代，例如位置103、104、105、108和/或111(参见WO2008/020079，表A-05-A08；所有编号均根据Kabat)。在一个实施方案中，所述人源化变体包括包含SEQ ID NO：1-19的任何一种ISVD中的至少一个取代，所述取代选自以下位置的取代(根据Kabat N°)：残基1取代为E或D；残基14取代为P；残基23取代为A；残基40取代为A；残基43取代为K；残基60取代为A；残基61取代为D；残基62取代为S；残基63取代为V；残基64取代为K；残基73取代为A；残基76取代为N；残基81取代为Q；残基83取代为R；残基85取代为E；残基103取代为W；残基105取代为Q和/或残基108取代为L。更优选地，所述人源化变体包括包含SEQ ID NO：1-19的任何一种ISVD中的至少一个取代，所述取代选自以下位置的取代(根据Kabat N°)：残基1取代为E或D；残基14取代为P；残基73取代为A；残基81取代为Q；残基83取代为R；残基85取代为E；残基105取代为Q和/或残基108取代为L。在另一个具体的实施方案中，如本文所述的至少SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的人源化取代至少导致FR3中几个残基的取代，特别是位置60-62和/或60-64(特别是SEQ ID NO：2)的取代。
在另一个实施方案中，LRRK2变构调节剂包含ISVD，所述ISVD包含选自SEQ ID NO:1-10的氨基酸序列。在另一个实施方案中，LRRK2变构调节剂包含ISVD，所述ISVD包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自与SEQ ID NO：1-10的任何序列具有至少85％同一性的序列，其中CDR与SEQ ID NO:1-10的CDR相同，并且在框架残基中可以存在差异。在一个具体的实施方案中，LRRK2变构调节剂包含ISVD，所述ISVD包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自与SEQ ID NO：1-10的任何序列具有至少85％同一性的序列，其中CDR与SEQ ID NO:1-10的CDR相同，并且在框架残基中可以存在差异，除了所述框架区中存在的美洲驼种系标志残基。在另一个实施方案中，所述LRRK2调节剂包含ISVD，所述ISVD包含氨基酸序列，所述氨基酸序列选自SEQ ID NO：1-10的任何序列的人源化变体、或与SEQ ID NO：1-10具有85％同一性的任何序列的人源化变体，其中CDR与SEQ ID NO：1-10的CDR相同，并且在FR区中可存在差异。
另一个实施方案涉及作为多特异性试剂的LRRK2变构调节剂，其包含至少一种如本文所述的变构LRRK2调节剂，产生与LRRK2的几个不同结合位点结合的多互补位LRRK2调节剂，或产生多价LRRK2调节剂，其可以增加与LRRK2的亲合力(avidity)，或另一种形式的多特异性LRRK2变构调节剂，包括具有不同靶标特异性的结合剂。例如，LRRK2变构ISVD的“多特异性”形式是通过将两个或更多个免疫球蛋白单可变结构域键合在一起形成的，其中至少一个具有不同的特异性。多特异性构建体的非限制性示例包括“双特异性”构建体、“三特异性”构建体、“四特异性”构建体等。为了进一步说明这一点，本发明的任何多价或多特异性(如本文所定义)蛋白结合剂可适当地针对同一抗原上的两个或更多个不同表位，例如针对一个结构域上的表位1和另一个LRRK2结构域上的表位2；或者可以针对两种或更多种不同的抗原，例如针对LRRK2，并针对血清白蛋白以延长半衰期。用于增加药物蛋白的半衰期和/或降低免疫原性的最广泛使用的技术之一包括连接合适的药学上可接受的聚合物，例如聚乙二醇(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚乙二醇(mPEG))。用于增加结合结构域半衰期的另一种技术可以包括工程化成双功能或双特异性结构域(例如，针对LRRK2的一个或多个ISVD或活性抗体片段与一个有助于延长半衰期的针对血清白蛋白的ISVD或活性抗体片段偶联)或工程化成抗体片段的融合体，特别是免疫球蛋白单可变结构域与肽(例如，针对血清蛋白如白蛋白的肽)的融合体。如本文进一步公开的，与额外部分的偶联将产生多特异性结合剂。
本发明的多价或多特异性结合剂还可具有(或被工程化和/或选择用于)增加的亲合力和/或改善的对所需LRRK2相互作用的选择性，和/或任何其他所需性质或所需性质组合的选择性，这可以通过使用这种多价或多特异性结合剂获得。例如，如本文所述的一种或多种结合表位1的ISVD和一种或多种结合表位2的ISVD的组合产生具有更高调节活性的本发明的多特异性结合剂。所述多特异性结合剂至少包含针对表位1和表位2的所述结合剂，它们可以通过接头、间隔物偶联。在结合LRRK2后，所述多特异性结合剂或多价ISVD可对LRRK2变构调节活性具有累加或协同影响。本发明的多特异性LRRK2变构调节剂可以与功能部分、靶向部分、半衰期延长部分或细胞渗透载体偶联。
鉴于在治疗许多神经疾患中需要调节LRRK2活性，多特异性LRRK2变构调节剂可以作为非限制性示例包含能够穿过血脑屏障的功能部分，或者可以进一步融合或化学偶联至能够(例如通过受体介导的胞吞作用)穿过血脑屏障的部分。事实上，血脑界面严重限制了药剂和化合物的脑生物利用度。例如，由于抗体、活性抗体片段或小分子的有限穿透，需要施用大量以获得所需功效。除了高剂量在患者中诱导外周副作用的风险外，考虑到社会成本以及对大规模生产能力的需求，这种方法在经济上也是不可取的，特别是在具有数百万患者的较大适应症，例如帕金森病和阿尔茨海默病中，其中生物制品的制造可能是一个重要的限制因素。已经报道了许多使化合物有效穿梭于BBB的手段和方法(例如，WO2015031673A2；WO2014033074A1；WO2015124540A1；WO2015191934A2)，尽管仍有待根据不同情况和试错法选择穿过BBB的功能部分的类型。本发明因此提供了多特异性LRRK2变构调节剂，其可以包含例如靶向血脑屏障(BBB)受体的(单结构域)抗体。这种多特异性LRRK2变构调节剂可以静脉内注射，之后靶向BBB受体的抗体(或单可变结构域抗体)将使复合物穿过BBB。尽管可能合适的其他递送方法和载体包括通过纳米颗粒或基于脂质的递送系统(例如人工外泌体)的递送，其也可以是细胞特异性的，并且适合于递送作为蛋白或编码所述结合剂或调节剂的DNA(核酸、载体)形式的结合剂或多特异性结合剂[48-49]。
实际上，本发明的另一方面涉及核酸分子，其包含编码如本文所述的LRRK2结合剂或变构调节剂的核酸序列。如本文所用，“核苷酸序列”、“DNA序列”或“核酸分子”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。该术语仅指分子的一级结构。因此，该术语包括双链和单链DNA、(反向)互补DNA和RNA。其还包括已知类型的修饰，例如甲基化、用类似物对一种或多种天然存在的核苷酸进行“加帽”取代。“核酸构建体”是指核酸序列，其已构建为包含在自然界中未一起发现的一个或多个功能单元。示例包括环状、线性、双链、染色体外DNA分子(质粒)、粘粒(含有来自λ噬菌体的COS序列的质粒)、包含非天然核酸序列的病毒基因组等。“编码序列”是核苷酸序列，当置于适当的调节序列的控制下时，其被转录成mRNA和/或翻译成多肽。编码序列的边界由5'-末端的翻译起始密码子和3'-末端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因组DNA，而在某些情况下也可以存在内含子。
一个实施方案公开了一种表达盒，其包含所述核酸分子。更具体的实施方案公开了表达盒，其中存在用于细胞或组织特异性表达的元件。“表达盒”包括能够指导感兴趣的基因/编码序列的表达的任何核酸构建体，感兴趣的基因/编码序列可操作地连接到表达盒的启动子。表达盒通常是DNA构建体，优选地(在5'至3'转录方向上)包括：启动子区；与转录起始区可操作地连接的多核苷酸序列、其同源物、变体或片段；以及终止序列，其包括RNA聚合酶的中止信号和聚腺苷酸化信号。应当理解，所有这些区域都应该能够在待转化的生物细胞，例如原核或真核细胞中操作。包括转录起始区的启动子区(其优选包括RNA聚合酶结合位点)和聚腺苷酸化信号对于待转化的生物细胞可以是天然的，或者可以源自替代来源，其中该区域在生物细胞中发挥功能。这样的盒可以构建成“载体”。进一步的实施方案涉及包含所述表达盒或所述核酸分子的载体，所述核酸分子的序列编码如本文所述的LRRK2变构调节剂。
如本文所用，术语“载体”、“载体构建体”、“表达载体”或“基因转移载体”旨在指能够转运与其连接的另一核酸分子的核酸分子。更具体地，所述载体可以包括技术人员已知的任何载体，包括任何合适的类型，但不限于，例如，质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体，例如λ噬菌体、病毒载体，甚至更具体地是慢病毒、腺病毒、AAV或杆状病毒载体、或人工染色体载体，例如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)或P1人工染色体(PAC)。表达载体包括质粒以及病毒载体，并且通常含有所需的编码序列和适当的DNA序列，其对于在特定宿主生物体(例如细菌、酵母、植物、昆虫或哺乳动物)或在体外表达系统中表达可操作连接的编码序列是必需的。克隆载体通常用于工程化和扩增某些所需的DNA片段，并且可能缺少表达所需DNA片段所必须的功能序列。用于转染细胞的表达载体的构建也是本领域众所周知的，因此可以通过标准技术来完成(参见，例如Sambrook,Fritsch,and Maniatis,in:Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989；Gene Transfer and Expression Protocols,pp.109-128,ed.E.J.Murray,TheHumana Press Inc.,Clif ton,N.J.),and the Ambion 1998Catalog(Ambion,Austin,Tex.)。
此外，一个替代实施方案涉及本文所述的编码所述LRRK2变构调节剂的所述核酸分子、表达盒或载体用于产生作为胞内抗体的用途。细胞内抗体或“胞内抗体”是在指定的细胞内区室中异源表达的抗体或抗体的活性片段，该过程可通过细胞内运输信号的框内掺入进行。胞内抗体通过与靶抗原的精细特异性相互作用发挥其功能。这导致靶蛋白的生物学功能的中断或改变。胞内抗体可以任何形状或形式表达，例如完整的IgG分子或Fab片段的形式。更常见的是，胞内抗体以scFv胞内抗体、单结构域胞内抗体或双特异性四价胞内抗体的基因工程化的抗体片段形式和结构使用。有关综述参见Zhu和Marasco,2008(Therapeutic Antibodies.Handbook of Experimental Pharmacology 181._cSpringer-Verlag Berlin Heidelberg)。如本文所述的LRRK2变构调节剂，可由核酸分子或表达盒编码或存在于如本文所述的载体上，在合适的宿主系统内表达后产生胞内抗体，也可用作进一步研究LRRK2信号传导的工具，作为体内成像诊断剂，或者当确定了基因递送的合适形式时，可以作为治疗剂。技术人员了解当前应用的施用和递送方法(另见Zhu和Marasco 2008)。
神经系统基因治疗领域在过去5年经历了爆炸式增长，其中基因替代的人临床试验正在进行中，并且最近批准了一种用于脊柱肌肉萎缩的基因治疗[86]。基于腺相关病毒(AAV)的系统越来越多地用于临床试验，因为它们有效地转导分裂和非分裂细胞，提供长期转基因表达(单次施用后)并且具有低的内在毒性[87],并且已经为PD开发了各种基因治疗策略[88]。当所述(多特异性)LRRK2变构调节剂作为核酸或载体提供时，具体地设想通过基因治疗施用所述调节剂。如本文所用，“基因治疗”是指通过向受试者施用表达的或可表达的核酸进行的治疗。对于此类应用，本文所述的核酸分子或载体允许在细胞内产生LRRK2变构调节剂。大量基因治疗方法在本领域中是可用的，包括，例如(腺相关的)病毒介导的基因沉默，或病毒介导的基因治疗(例如US 20040023390；Mendell等人2017，N Eng J Med 377:1713 -1722)。过多的递送方法是本领域技术人员熟知的并且包括但不限于病毒递送系统、DNA质粒的显微注射、裸核酸的基因枪法、脂质体的使用。向个体患者施用的体内递送通常通过全身施用进行(例如，静脉内、腹膜内输注或脑部注射；例如，Mendell等人2017,N EngJ Med 377:1713-1722)。在所述(多特异性)LRRK2变构调节剂作为核酸或载体提供的情况下，更特别地，还设想通过递送方法和载体施用调节剂，所述递送方法和载体包括纳米颗粒或基于脂质的递送系统，例如人工外泌体，其可以也可以是细胞特异性的，并且适合于将结合剂或多特异性结合剂作为胞内抗体或以编码所述结合剂或调节剂的DNA形式递送[48-49]。
在另一个实施方案中，如本文所述的作为纯化蛋白、核酸或表达盒或载体的LRRK2结合剂、ISVD和/或变构调节剂也可以包括在试剂盒中，例如用作LRRK2信号传导的研究工具，或用于LRRK2结构生物学和生物化学分析。
另一个方面涉及如本文所述的LRRK2特异性ISVD、编码所述LRRK2特异性结合剂的核酸分子或载体、或包含这些的药物组合物，用作诊断剂。
在一个具体实施方案中，提供了试剂盒，其包含检测LRRK2蛋白的装置，包括本文所述的允许检测或调节系统中的LRRK2信号传导的LRRK2变构调节剂或结合剂或ISVD，所述系统可以是体外或者体内系统。设想提供这些试剂盒用于特定目的，例如用于调节LRRK2，或用于体内成像，或用于诊断受试者中改变的LRRK2数量、反应或效应。在另一个实施方案中，提供包含装置的所述试剂盒，其包括如本文所述的核酸分子、载体或组合物。试剂盒进一步提供的装置将取决于应用中使用的方法，以及试剂盒的目的。例如，检测如本文所述的标记的LRRK2变构调节剂或结合剂、ISVD或核酸分子，这可以是在核酸或蛋白水平上定量LRRK2所需要的。对于基于蛋白的检测，试剂盒通常包含标记或偶联的LRRK2结合剂，例如ISVD。同样，对于核酸水平的检测，试剂盒可包含核酸标记，例如引物或探针。试剂盒中还可以提供进一步的对照试剂、抗体或核酸。还可以包括用于参考或比较的标准、LRRK2底物或信号传导成分、报告基因或蛋白或用于使用该试剂盒的其他装置。当然，该试剂盒可以进一步包含药学上可接受的赋形剂、缓冲剂、载体或递送装置、使用说明书等。
本发明的另一方面提供用于检测样品中LRRK2蛋白的存在、不存在或水平的方法，所述方法包括：使样品与本文所述的LRRK2结合剂或ISVD接触，并检测存在或不存在或水平，即定量结合的LRRK2 ISVD，其任选地是标记的、缀合的或多特异性的LRRK2结合剂。本文使用的样品可以是从身体分离的样品，例如体液，包括血液、血清、脑脊液等，或者可以是提取物，例如蛋白提取物、细胞裂解物等。
此外，如本文所述的(特别是包含LRRK2特异性ISVD的)LRRK2变构调节剂或结合剂、核酸分子、载体或包含所述LRRK2特异性结合剂药物组合物，也可用于体内成像。
为了体外或体内检测和/或成像的目的，如本文所述，包含LRRK2特异性ISVD的LRRK2结合剂在一些实施方案中还可包含检测剂，例如标签或标记。例如，本文所示例的ISVD、VHH或Nb也被6-His-EPEA双标签标记(如SEQ ID NO：20中所示；对于EPEA标签：也参见WO2011/147890A1)。这种标签允许亲和纯化和检测本发明的抗体或活性抗体片段。
一些实施方案包含LRRK2结合剂、ISVD或变构调节剂，进一步包含标记或标签，或更具体地，用可检测标志物标记的LRRK2结合剂。如本文所用，术语可检测标记或标签是指允许检测和/或定量如本文所述的LRRK2调节剂或结合剂的可检测标记或标签，并且意在包括本领域已知的用于这些目的的任何标记/标签。特别优选但不限于亲和标签，例如几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、聚(His)(例如，6x His或His6)、生物素或链霉亲和素，例如
Figure BDA0003901770190000381
Strep-tag
Figure BDA0003901770190000382
和
Figure BDA0003901770190000383
增溶标签，例如硫氧还蛋白(TRX)、聚(NANP)和SUMO；色谱标签，例如FLAG-标签；表位标签，如V5-标签、myc-标签和HA-标签；荧光标记或标签(即，荧光染料/荧光团)，例如荧光蛋白(例如，GFP、YFP、RFP等)和荧光染料(例如，FITC、TRITC、香豆素和青色素)；发光标记或标签，例如荧光素酶、生物发光或化学发光化合物(例如鲁米那、异鲁米诺、热化吖啶酯、咪唑、吖啶盐、草酸酯、二氧环丁烷或GFP及其类似物)；磷光标记；金属螯合剂；和(其他)酶标记(例如，过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶或葡萄糖氧化酶)；放射性同位素。还包括任何前述标记或标签的组合。用于产生标记的多肽和蛋白的技术是本领域众所周知的。LRRK2变构调节剂或结合剂包含本发明的LRRK2特异性ISVD，其偶联至或进一步包含标记或标签，例如，以允许基于免疫检测所述结合的LRRK2特异性试剂。基于免疫检测在本领域是众所周知的并且可以通过应用多种方法来实现。这些方法通常基于对标记或标志物的检测，例如上文所述。参见，例如，美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。在多个抗体与单个阵列反应的情况下，每个抗体可以用不同的标记或标签进行标记，以便同时检测。又一个实施方案可以包括引入一个或多个可检测标记或其他产生信号的基团或部分，或标签，这取决于本发明的标记或带标签的LRRK2变构调节剂或结合剂的预期用途。其他合适的标记对技术人员来说是清楚的，例如包括可以使用NMR或ESR光谱检测的部分。此类标记的LRRK2变构调节剂，例如本文所述的LRRK2特异性ISVD或纳米抗体，可用于例如体外、体内或者原位测定法(包括本身已知的免疫测定法，例如ELISA、RIA、EIA和其他“夹心测定法”等)以及体内成像目的，取决于具体标记的选择。
所以，另一方面，公开了用于检测生物样品中人LRRK2蛋白的定位和分布的体外方法，所述方法包括以下步骤：使样品与包含本文所述的LRRK特异性ISVD的LRRK2结合剂反应，并检测所述LRRK2结合在所述生物样品中的定位和分布。如本文所用的生物样品可以设想源自生物系统的任何样品，例如包括脑组织的细胞、或提取物或体外样品、或体液，例如脑脊液或血液。
本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含一种或多种本文所述的LRRK2变构调节剂，或包含本文所述的核酸分子或载体，以及任选地药学上可接受的载体或稀释剂。这些药物组合物可通过施用于有需要的患者来实现期望的药理作用。化合物或结合剂或组合物的“药学或治疗有效量”优选是产生结果或对所治疗的特定病症施加影响的量。如本文所述的LRRK2变构调节剂或药物组合物也可作为“治疗活性剂”发挥作用，治疗活性剂用于指在治疗疾病的情况时(如本文进一步描述的)具有或可具有治疗效果(即治疗或稳定效果)的任何分子。优选地，治疗活性剂是疾病缓解剂，和/或对疾病具有疗效的药剂。“药学上可接受的”是指在生物学或其他方面不是不合需要的物质，即该物质可以与化合物一起施用于个体而不引起任何不合需要的生物学效应或以有害方式与包含其的药物组合物中的任何其他组分相互作用。药学上可接受的载体优选是在与活性成分的有效活性一致的浓度下对患者相对无毒和无害的载体，使得归因于该载体的任何副作用不损害活性成分的有益效果。合适的载体或佐剂通常包括一种或多种包括在以下非详尽列表中的化合物：大的缓慢代谢的大分子，例如蛋白、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性病毒颗粒。这样的成分和步骤包括在以下参考文献中描述的那些，每一个都通过引用并入本文：Powell,M.F.等人("Compendium of Excipients for Parenteral Formulations"PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology 1998,52(5),238-311),Strickley,R.G("Parenteral Formulations of Small Molecule TherapeuticsMarketed in the United States(1999)-Part-1"PDA Journal of PharmaceuticalScience&Technology 1999,53(6),324-349),和Nema,S.等人("Excipients and TheirUse in Injectable roducts"PDA Journal of Pharmaceutical Science&Technology1997,51(4),166-171)。如本文所用，术语“赋形剂”旨在包括可存在于药物组合物中并且不是活性成分的所有物质，例如盐、结合剂(例如，乳糖、右旋糖、蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、甘露糖醇)、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲物质、稳定剂、调味剂或着色剂。“稀释剂”，特别是“药学上可接受的载体”，包括以下载体，例如水、盐水、生理盐溶液、甘油、乙醇等。辅助物质例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质、防腐剂可以包括在这样的载体中。包含所述LRRK2变构调节剂的此类药物组合物还可以涉及包含纳米颗粒的组合物或基于脂质的外来体递送载体，如本文所讨论的[48-49]。
当有益于治疗LRRK2相关疾病时，如本文所述的变构调节剂或结合剂或药物组合物可作为治疗活性剂发挥作用。如本文所述的药物组合物还可包含多特异性LRRK2变构调节剂，其可包含或偶联至额外的官能团或部分，当施用于受试者时是有利的。
此外，如本文所述的包含LRRK2变构调节剂的药物组合物还可包含已知为LRRK2激酶活性抑制剂的化合物，优选I型激酶抑制剂。如上所述[36]，所述已知的抑制激酶的I型LRRK2激酶抑制剂诱导LRRK2重新定位至微管。
与这些现有技术的I型ATP竞争性激酶抑制剂相反，本文所述的LRRK2变构调节剂，例如本文公开的ISVD，不诱导LRRK2蛋白的微管重新分布(例如参见实施例6)。此外，不仅在ATP竞争性激酶抑制剂在细胞中结合LRRK2时，而且在过多的病理性LRRK2突变体过表达时，都观察到LRRK2蛋白的微管结合增加或重新定位。最近的报道已将此类LRRK2重新定位事件与沿微管的潜在运输受阻关联起来[36,40]。本发明包含LRRK2特异性ISVD的LRRK2变构调节剂的不同之处在于它们不参与LRRK2的重新定位，这进一步确定本文公开的LRRK2变构调节剂或ISVD在细胞内提供构象LRRK2结合，与“经典”的ATP竞争性或已知的I型激酶抑制剂不同。此外，本文描述的一组LRRK2变构调节剂在添加到包含在微管处重新定位的LRRK2蛋白的细胞中(例如，由于先前用小化合物作为I型抑制剂结合和抑制LRRK2激酶活性进行治疗，或由于PD突变体LRRK2)时，发挥降低或挽救微管定位的作用。令人惊讶的发现是，在用ATP竞争性激酶抑制剂抑制后，所述ISVD亚组甚至可以恢复LRRK2的微管重新分布，这为应用这些LRRK2变构调节剂作为(组合)治疗剂提供了进一步的机会，因为这可能有利于避免用LRRK2抑制剂治疗时任何不希望的影响。
另一个实施方案涉及如本文所述的LRRK2变构调节剂、如本文所述的核酸分子、载体或药物组合物，用作药物。更特别地，用于治疗LRRK2相关或关联的疾患或疾病。如本文所用的“LRRK2相关疾患”包括目前已知与LRRK2活性变化相关、受其影响或由其引起的疾病，最突出地包括帕金森病(Zimprich A,等人(2004)Neuron 44:601–607；Paisán-Ruíz C等人(2004)Neuron 44:595–600),以及罗恩病(Ridler C.(2018)Nat Rev Neurol.14(3):126；Hui KY等人(2018)Sci Transl Med.10(423)；Rivas MA等人(2018)PLoS Genet.14(5):e1007329)。并且可能进一步与作为“宿主对病原体的反应”的免疫反应相关联(Gardet A等人(2010)J Immunol.185(9):5577-85)；与增加的癌症风险相关联(Saunders-Pullman等人(2010)Mov Disord.25(15):2536–2541；
Figure BDA0003901770190000411
Johanne
Figure BDA0003901770190000412
&Jan O.Aasly(2018)BrainBehav.8(1):e00858),以及阿尔茨海默病(Zhao Y(2011)Neurobiol Aging.2011Nov；32(11):1990-3)。
一个具体的实施方案涉及如本文所述的所述LRRK2变构调节剂、如本文所述的核酸分子、载体或药物组合物，用于治疗帕金森病。
应当理解，尽管本文已经针对根据本公开的方法、样品和生物标志物产品讨论了特定实施方案、特定配置以及材料和/或分子，但是可以在形式和细节上进行各种改变或修改而不偏离脱离本发明的范围。提供以下实施例以更好地说明特定实施方案，其不应被视为限制本申请。本申请仅受权利要求限制。
实施例
实施例1LRRK2特异性纳米抗体的产生。
LRRK2是一个大而复杂的蛋白，其包含几个结构域：犰狳结构域、锚蛋白重复结构域、富含亮氨酸的重复(LRR)结构域、RocCOR(复杂蛋白的Ras/Roc的C-末端)超结构域、激酶结构域和WD40结构域(图1B)[13–15]。因此，该蛋白质具有两种催化活性的相当独特的组合：由Roc结构域介导的GTP酶活性和Ser/Thr蛋白激酶活性[16]。虽然，LRRK2机制的很大部分仍是未知的，但预计其被一种复杂的方式调节，并且在其功能周期中经历了大的构象变化。LRRK2内构象变化的一个来源是由与其RocCOR结构域结合的核苷酸(GDP与GTP)介导的。事实上，我们之前对细菌LRRK2同源物的研究已经表明，GTP结合导致LRRK2二聚体的单体化，与每个亚基内的二级结构域运动相关[17,18]。此外，最近的体外和细胞内(incellulo)数据表明，人LRRK2也可以在单体和二聚体形式之间循环，但这些构象变化的确切性质仍不明了[19–22]。在这里，我们着手鉴定了可以通过在LRRK2的一种构象状态下与LRRK2特异性结合来调节LRRK2活性的Nb。使用不同的美洲驼进行了总共三次免疫，使用LRRK2的不同的蛋白构建体或构象状态(图7)。在第一个免疫策略中(免疫1)，我们用LRRK2RocCOR构建体对美洲驼进行免疫，免疫后使用全长LRRK2作为诱饵蛋白、通过噬菌体展示淘选方法选择Nb。随后，为了增加获得在特定核苷酸诱导的构象中结合LRRK2的Nb的机会，我们进行了两次额外的免疫，使用结合GTPγS的LRRK2并存在大量过量的GTPγS(一种不可水解的GTP类似物)(免疫2)或使用结合GDP的LRRK2并存在大量过量的GDP(免疫3)。此外，为了在免疫时“捕获”在其核苷酸特异性构象的蛋白质，我们使用赖氨酸特异性交联剂DSS进行了温和的交联(图8)。免疫后，在存在过量GTPγS(用于从来自免疫2的文库选择)或GDP(用于从来自免疫3的文库选择)的情况下，使用非交联全长LRRK2、使用噬菌体展示淘选选择Nb。此外，为了富集与Roc结构域结合的Nb，使用GTPγS或GDP结合的Roc蛋白对Nb文库进行两轮或三轮噬菌体展示。
这些不同的策略最终产生克隆在pMESy4载体中的选定Nb ORF的文库。这些载体被送去测序，并根据CDR3序列将Nb分类为不同的序列家族(每个Nb家族显示一个独特的CDR3序列)。结果，得到来自免疫1的49个Nb家族，针对LRRK2-GTPγS的选择得到来自免疫2的70个Nb家族，针对Roc-GTPγS的选择得到来自免疫2的4个Nb家族，针对LRRK2-GDP的选择得到来自免疫3的44个Nb家族，以及针对Roc-GDP的选择得到来自免疫3的1个Nb家族。
Nb进一步的选择基于ELISA筛选步骤。一个大的测序的Nb亚组在大肠杆菌中以96孔深孔板形式小规模表达。细胞裂解后，在ELISA中粗细胞裂解物用于测试与包被在ELISA板底部的全长LRRK2的结合。最后，基于ELISA中的良好信号选择了来自不同家族并由不同免疫和选择策略产生的42个Nb(表1)。在大肠杆菌中以更大的规模表达这些Nb，并纯化至均质(图9)。
表1纯化的LRRK2特异性Nb列表。
选择的Nb来自(1)用RocCOR(RocCOR-GppNHp)进行免疫1并用全长LRRK2进行选择，(2)用交联的LRRK2-GTPγS(LRRK2-GTPγS(XL))进行免疫2并使用LRRK2-GTPγS或Roc-GTPγS进行选择，以及(3)用交联的LRRK2-GDP(LRRK2-GDP(XL))进行免疫3并使用LRRK2-GDP或Roc-GDP进行选择。还指出了从ELISA或交联的MS(仅针对Nb的亚组)确定的结构域特异性。
Figure BDA0003901770190000431
Figure BDA0003901770190000441
实施例2确定LRRK2定向Nb的结构域特异性。
我们重组表达并纯化了LRRK2的RocCOR、Roc、COR-B和激酶-WD40(K-WD40)结构域(图7)。随后，我们进行了ELISA，其中所有这些结构域构建体在同一ELISA板中彼此邻近平行包被，随后我们检测到42个纯化的Nb的结合。图1显示了该ELISA的结果。正如预期的那样，大多数Nb显示与LRRK2和/或至少一种使用的结构域构建体结合。然而，两个Nb(CA13614和CA13618)没有显示出任何结合，不会被进一步考虑(另见表1)。用RocCOR结构域构建体免疫(免疫1)产生的所有纯化的Nb(7个Nb)显示与COR结构域的C-末端子结构域(COR-B)特异性结合。在用全长LRRK2免疫和选择获得的Nb中，大多数结合在蛋白质的K-WD40部分(18个Nb)。由这些免疫产生的另一Nb亚组(10个Nb)显示出与LRRK2的稳健结合，而没有观察到与任何单独的LRRK2结构域构建体的结合。因此，我们假设这些Nb或者与ELISA中没有被单独的结构域覆盖的LRRK2的N-末端区域(犰狳-锚蛋白-LRR结构域)结合，或者这些Nb在两个或多个结构域的界面上具有表位。因此，我们将Nb归类为“全长LRRK2结合剂”。为了富集针对Roc结构域的Nb，我们特异地包括了使用Roc-GTPγS或Roc-GDP的选择步骤。这产生针对Roc结构域的5个Nb(Nb32(CA16069)、Nb33(CA16070)、Nb34(CA16071)、Nb35(CA16072)、Nb42(CA14259))。这五个中的四个在ELISA中也给出了与Roc结构域的强信号。对于第五个Nb(Nb42,CA14259)，使用分析尺寸排阻色谱法确认与Roc结合(数据未显示)。表位作图的结果总结在图1B中。
实施例3细胞中的LRRK2激酶活性由靶向不同LRRK2结构域的纳米抗体调节。
随后，我们想测试是否任何LRRK2定向的Nb在过表达LRRK2的人HEK293T细胞中都具有与LRRK2结合并调节LRRK2(激酶)活性的能力。因此，我们从41个纯化的Nb中选择了18个的亚组，注意涵盖源自三种不同免疫策略并靶向不同LRRK2结构域(即“全长LRRK2”、Roc、COR-B和激酶-WD40)的Nb。我们还包括在内部生成的针对完全无关的细菌蛋白的Nb作为阴性对照(“无关的Nb”)。为了在过表达人LRRK2(野生型)的HEK293细胞中表达这些Nb，首先将Nb开放阅读框重新克隆到pEGFP载体中，导致表达在其C-末端融合增强的GFP分的Nb子(一种所谓的“荧光体”)[23,24]。为了测试在细胞中与LRRK2的结合，使用磁性GFP-纳米陷阱珠进行了下拉实验(pull-down experiment)。该实验表明，所有测试的Nb都能够在这些条件下下拉LRRK2。因此，这表明这18个Nb在人细胞的细胞质环境中作为胞内抗体发挥功能，并且具有足够高的亲和力来下拉其靶蛋白(图12)。
为了评估Nb对LRRK2激酶活性的影响，我们监测了LRRK2的两种生理和疾病相关活性：在位置T72的内源性底物Rab10的磷酸化和在位置S1292的LRRK2自磷酸化[25–30]。先前已显示这两种活性在最相关的LRRK2 PD突变体中增加，包括常见的G2019S突变体。因此，在我们的细胞分析中，我们在HEK 293T细胞中共同表达LRRK2(G2019S)、Rab29和不同的Nb-GFP融合体(图2a-c)。Rab29共表达先前已被表明加强LRRK2自磷酸化以及Rab10磷酸化[31]。在选定的18个Nb中，我们检测到与对照相比对LRRK2激酶活性没有影响的一组(即Nb3(CA12614),Nb9(CA13598),Nb10(CA13599),Nb13(CA13602),Nb31(CA13620),Nb37(CA14131)和Nb39(CA14134)(图2d),而其他Nb强烈降低了LRRK2自磷酸化和/或Rab10磷酸化(Nb1(CA12610),Nb6(CA12618),Nb23(CA13612),Nb42(CA14259),Nb17(CA13606),Nb36(CA14130),Nb38(CA14133),Nb40(CA14135)和Nb41(CA14136))(图2)。此外，几个Nb导致LRRK2激酶活性显著增加，这在Nb28(CA13617)和Nb22(CA13611)中最为突出。有趣的是，Nb似乎对LRRK2自磷酸化和Rab10磷酸化的影响不同。虽然一些结合剂抑制Rab10磷酸化和在S1292处的LRRK2自磷酸化(例如，COR-B结合剂Nb1(CA12610)和Nb6(CA12618)、Roc结合剂Nb42(CA14259)或激酶-WD40结合剂Nb23(CA13612))，其他结合剂似乎抑制Rab10磷酸化，同时在较小程度上抑制S1292磷酸化(例如“全长LRRK2”结合剂Nb17(CA13606),Nb36(CA14130),Nb38(CA14133),或“K-WD40”结合剂Nb40(CA14135)和Nb41(CA14136))。相比之下，其他结合剂对LRRK2自磷酸化显示出更强的抑制作用(例如“全长LRRK2”结合剂Nb37(CA14131)或COR-B结合剂Nb3(CA12614))。
实施例4交联质谱(CL-MS)的表位作图揭示了活性调节Nb的结合表位。
根据上述结果，我们决定选择10个调节细胞中LRRK2(G2019S)活性的Nb，以进行更彻底的体外表征。选择以下Nb进行进一步表征：Nb17(CA13606)、Nb36(CA14130)、Nb38(CA14133)(针对“全长LRRK2”，抑制细胞中的Rab10磷酸化)，Nb39(CA14134)(针对“全长LRRK2”)，Nb42(CA14259)(针对Roc结构域，抑制细胞中的Rab10和自磷酸化)，Nb1(CA12610)、Nb6(CA12618)(针对COR-B结构域，抑制细胞中的Rab10磷酸化和自磷酸化)，Nb22(CA13611)(针对激酶-WD40结构域，活化细胞中的Rab10磷酸化)，Nb40(CA14135)和Nb23(CA13612)(针对激酶-WD40结构域，分别抑制细胞中的Rab10磷酸化和Rab10以及自磷酸化)(图2d)。
首先，我们使用交联MS方法来更详细地了解这十个Nb的确切结合表位。交联质谱法(CL-MS)已成为结构研究的有力工具，我们之前已经通过CL-MS研究了LRRK2并优化了该蛋白质的条件[2]。此外，化学交联LRRK2-Nb复合物，然后通过质谱法对靶标肽进行测序，也是一种通用方法，可以以高置信度对Nb结合表位进行敏感定位[11,32]。CL-MS数据显示，不同的Nb显示出主要通过Nb的框架3区中的一个保守赖氨酸残基与LRRK2的蛋白间交联，该赖氨酸残基位于连接-链C”和D的环中[33]。除了Nb6(CA12618)之外，所有选定的Nb中都存在这种赖氨酸残基，对于Nb6(CA12618)，无法获得相应的交联数据。对于其他Nb，根据结合表位，该赖氨酸残基与LRRK2中的几个赖氨酸残基显示出稳健的联系(图3)。
总体而言，CL-MS数据与使用ELISA进行的结构域作图结果非常一致。基于ELISA实验，Nb中的Nb17(CA13606)、Nb36(CA14130)、Nb38(CA14133)和Nb39(CA14134)被标记为“全长LRRK2结合剂”，因为它们仅显示与全长LRRK2的结合而没有观察到显著地与任何测试的单独的结构域构建体的结合。相应地，CL-MS揭示所有这些Nb与LRRK2的N-末端LRR结构域以及C-末端部分多处接触，包括COR的C-末端(CA14134)、激酶结构域(CA13606和CA14133)以及激酶和WD40结构域(CA14130)。这一发现清楚地表明，大部分已建立的结合剂确实特异性识别构象表位，而不是与短的线性肽段结合。此外，这表明LRR结构域的“向后折叠”在且非常接近LRRK2的C-末端结构域。对于Nb42(CA14259)，仅鉴定出一个与Roc结构域内赖氨酸(K1502)的交联与ELISA中的结构域作图非常一致。在ELISA中将Nb22(CA13611)、Nb23(CA13612)和Nb40(CA14135)均鉴定为激酶-WD40结合剂，相应地交联数据揭示了这三个Nb分别与WD40结构域、激酶结构域以及WD40结构域和COR-B的C-末端相互作用。有趣的是，在ELISA中被鉴定为COR-B结合剂的Nb1(CA12610)与LRRK2蛋白不同部分的各种赖氨酸发生交联。与ELISA数据一致，发现了与COR-B中K1833的交联，但也发现了与其他LRRK2结构域内的残基交联，包括相邻的激酶结构域以及富含亮氨酸的重复序列。这一发现与紧凑的LRRK2二聚体的低分辨率结构模型中COR结构域的非常中心的定位非常一致[2]。因此，我们可以假设CA12610与COR-B结构域的结合，将其置于LRRK2结构的中心腔中，与大多数其他LRRK2结构域相对接近。
实施例5由微量热泳(MST)和生物层干涉法(BLI)确定的Nb与LRRK2的结合亲和力。
为了确定十个Nb对LRRK2的结合亲和力(解离常数KD)，平行使用了两种方法：微量热泳(MST)和生物层干涉法(BLI)。对于MST实验，我们使用分选酶介导的偶联在其C-末端用m-TAMRA荧光团对十个Nb进行位点特异性标记[51],然后将递增量的全长LRRK2滴定到这些Nb(图13)。对于所有10个Nb，都观察到了MST信号，除了Nb23，其在与LRRK2结合后不产生热泳行为的变化。对于其他Nb，KD值在25nM-150nM的范围内(表2)。对于BLI实验，首先将LRRK2捕获在链霉亲和素包被的生物传感器上，使用生物素化的Nb40作为捕获剂(除了评估Nb40的结合，其中Nb42用作捕获剂)，然后确定所有Nb与LRRK2的结合。所有Nb(包括Nb23)都获得了清晰的结合信号，KD值范围为10nM–200nM(图14)。总体而言，两种方法都显示出相同的趋势和亲和力范围，但总体而言，与MST相比，使用BLI获得的亲和力略高。这些差异可能是由于MST的实验设置使用在溶液中的LRRK2，而BLI使用通过第二Nb的方法捕获在表面上的LRRK2。
表2.通过两种平行方法评估的10个Nb与LRRK2结合的平衡解离常数(KD)：微量热泳(MST)和生物层干涉法(BLI)。
Figure BDA0003901770190000481
Figure BDA0003901770190000491
实施例6.几种LRRK2活性调节Nb使用不同的(变构)机制抑制体外的LRRK2激酶活性。
接下来，我们筛选了10个选定的Nb对体外LRRK2(野生型)激酶活性的影响。为此，我们使用了基于荧光的
Figure BDA0003901770190000492
蛋白激酶测定法(AssayQuant TechnologiesInc.)，使用了LRRK2优化的AQT0615肽作为底物，固定浓度为10μM。在0.1和1mM的ATP浓度下，在初始速率条件下及时连续测量由于LRRK2催化的肽磷酸化引起的荧光增加(λexc：360nm；λemm：485nm)。随后，以25μM的最终浓度添加10个Nb，并一式三份确定对初始速率的影响(图4A)。还包括两个阴性对照，其中没有添加Nb或添加无关的Nb。此外，添加25μM的LRRK2特异性ATP竞争性抑制剂MLi-2[34]作为阳性对照。这些实验是在存在大量过量(500μM)GDP或GTPγS的情况下，与LRRK2一起进行的(图4B)，但未观察到核苷酸对抑制谱的显著影响。
与细胞内(in cellulo)的数据一致，结合WD40结构域的Nb22(CA13611)在体外活化LRRK2的激酶活性，与对照相比，添加25μM的Nb导致激酶活性增加约30％至50％。虽然，在这一点上，除了观察到的与WD40结构域的相互作用外，我们不能排除Nb22也与激酶结构域相互作用，这一观察结果表明激酶和WD40结构域之间调节性的相互作用。这也与先前的报告非常一致，即七个C-末端氨基酸的缺失导致LRRK2激酶活性的破坏[35]。此外，最近确定的LRRK2催化半部分(Roc-COR-激酶-WD40)的冷冻-EM结构表明，在WD40结构域之后由LRRK2的最后28个氨基酸形成的α-螺旋，向后折叠并且与激酶结构域密切相互作用[36]。
相反，添加Nb的Nb17(CA13606)、Nb36(CA14130)、Nb38(CA14133)和Nb40(CA14135)仅导致对AQT0615磷酸化的非常温和的抑制(初始比率在对照组的70％至95％)。这表明观察到的后面这些Nb对LRRK2介导的Rab10磷酸化的抑制不是由于对激酶活性本身的直接影响,正如观察结果所表明的，这些Nb严重影响细胞中的Rab10磷酸化，而对位置S1292的自磷酸化影响不太明显，因此更特异性地影响了Rab磷酸化。一个例外似乎是Nb42，其抑制细胞中的LRRK2自磷酸化和Rab磷酸化，而没有观察到体外的抑制作用。
最后，其他三种Nb：Nb1(CA12610)、Nb6(CA12618)和(在较小程度上)Nb23(CA13612)，具有非常明显的显著抑制体外LRRK2激酶活性的作用。这对于CA12610和CA12618最为明显，其将激酶活性降低到“无Nb”和“无关Nb”对照的20％至30％的水平，并且仅略高于该测定法中MLi-2对照的活性。这与所有三种Nb都严重抑制细胞中的Rab10和自磷酸化的观察结果一致，并作为总LRRK2激酶活性的真正抑制剂发挥作用。有趣的是，虽然发现CA13612直接与激酶结构域结合，但CA12610和CA12618通过与COR-B结构域结合来实现这种效果。
由于我们发现Nb1(CA12610)、Nb6(CA12618)和Nb23(CA13612)显著抑制LRRK2激酶的体外活性，我们继续对这三个Nb进行剂量反应分析。以两倍连续稀释使Nb浓度从200或150μM到0.006μM不等，同时将肽和ATP底物浓度分别保持恒定在10μM和1mM(图11A-C)。拟合这些剂量反应曲线得到Nb1和Nb6的IC50值分别为8±2μM和14±3μM，以及Nb23的IC50值接近65μM。
实施例7抑制LRRK2的Nb通过变构机制发挥作用。
对于被鉴定为稳健抑制细胞中的LRRK2自磷酸化和Rab磷酸化活性，以及LRRK2激酶对肽和Rab底物的体外活性的这三种Nb(Nb1(CA12610)、Nb6(CA12618)、Nb23(CA13612))，结果表明这些Nb靶向LRRK2激酶活性本身。有趣的是，虽然ELISA和CL-MS实验表明Nb23(CA13612)与激酶结构域结合，但Nb1(CA12610)和Nb6(CA12618)与COR结构域结合。这有力地表明至少后两个Nb作为变构激酶抑制剂发挥作用。为了进一步证实这一点，我们开始确定这三种Nb相对于ATP作为底物的抑制机制(竞争性vs.非竞争性vs.混合/非竞争性)，使用我们的肽磷酸化测定法作为输出。为此，在固定浓度的肽底物(10μM)(可能亚饱和)和不同浓度的ATP下获得了完整的Michaelis-Menten曲线(图11)。对于CA12610和CA12618，使用Lineweaver-Burk图的线性化曲线清楚地显示了Y轴左侧的相交线，表明混合型抑制。这证实了这些Nb不与ATP竞争结合，并且其通过在变构位点上结合来抑制反应，这与ELISA和CL-MS表位作图数据一致。线性化曲线在X轴上方交叉的观察结果也表明相对于ATP结合形式(较高的表观Kiu app)，这些Nb倾向于与LRRK2的非ATP结合状态结合(较低的表观Kic app)。对于CA12610，使用混合抑制模型对动力学数据进行全局拟合，因此得到Ki app为16±4μM，α值为1.8±0.5，对应于Kic app(＝对apo-LRRK2的亲和力)为16μM，以及Kiu app(＝对结合ATP的LRRK2的亲和力)为30μM。对于CA12618，在同一模型上进行拟合产生Ki app为5±1μM，α值为1.6±0.4，对应于Kic app为5μM，Kiu app为8μM。对于结合激酶结构域的CA13612，线性化曲线相交更接近Y轴，表明更像ATP竞争性的机制。然而，这些线在Y轴上并不完全相交，并且观察到随着Nb浓度增加Vmax app值系统性下降，这也表明了混合型抑制机制。拟合CA13612的混合型抑制模型得出Ki app为9±1μM，α值为7.5±1.9，对应于Kic app为9μM，Kiu app为66μM。CA13612对LRRK2apo形式比对结合ATP的形式的强烈偏好表明，虽然Nb不完全竞争ATP的结合，但ATP和CA13612结合相互不利于对方。这表明该Nb在ATP结合口袋附近结合，或者Nb23的结合使LRRK2处于与ATP结合不相容的构象中。
实施例8.Nb与内源性水平LRRK2接合并共定位。
考虑到10个选定的Nb的高亲和力结合，我们接下来测试了这些Nb是否也能够下拉内源/生理表达水平的LRRK2。因此，我们转向小鼠RAW264.7细胞的裂解物，该细胞以相对较高的水平表达LRRK2[52]。有趣的是，我们发现当添加到这些裂解物中时，所有10个Nb都有效地下拉LRRK2(图15)，表明(1)Nb对小鼠LRRK2具有交叉反应性，并且(2)它们的亲和力足够高，可以下拉细胞裂解物中内源性水平的LRRK2。
为了测试Nb是否可以追踪和可视化固定细胞中的内源性LRRK2，我们生成了绿色荧光蛋白(GFP)-Nb融合体(荧光体)，如前所述[23,53，54]。最近，研究表明LRRK2在免疫细胞中诱导吞噬作用后被募集到吞噬体中[55,56]。因此，用这些荧光体转染RAW264.7细胞，并用杀死的酵母生物颗粒“酵母聚糖(zymosan)”处理以诱导吞噬作用。固定细胞的共聚焦成像显示LRRK2和Nb36和Nb42不与内源性LRRK2共定位，而在用Nb1、Nb6、Nb17和Nb39转染的细胞中略微检测到LRRK2募集到吞噬体(图16b)。重要的是，四个测试的荧光体(Nb22、Nb23、Nb38和Nb40)清楚地与LRRK2共定位在含有酵母聚糖的吞噬体上(图16a)，证明这些Nb在细胞内追踪内源性LRRK2的能力。
实施例9.LRRK2靶向纳米抗体的表达不导致LRRK2重新定位到微管，这些纳米抗体的亚组抑制MLi-2诱导的重新定位。
不同结构类别的LRRK2药理激酶抑制剂诱导LRRK2细胞募集到微管，类似于五种主要导致PD的突变中的四种[37–40]。LRRK2与微管的结合随后减少了驱动蛋白和动力蛋白介导的沿微管的运输[36]。为了研究我们鉴定的十个LRRK2激酶调节Nb是否导致相似的表型，用编码mScarlet-LRRK2和GFP-Nb的构建体共转染HEK293细胞。对于所有分析的10个Nb，共聚焦显微镜分析显示在用Nb共转染48小时后，LRRK2保持其细胞质分布，并且没有观察到重新定位到微管，表明与经典抑制剂相比，Nb以不同的构象捕获LRRK2(图5)。
接下来，我们想研究LRRK2靶向的Nb是否有改变LRRK2向微管募集的能力，LRRK2向微管的募集是由特异性ATP竞争性抑制剂MLi-2抑制LRRK2激酶活性所诱导的[41]。为此，用1μM MLi-2处理用mScarlet-LRRK2和GFP-Nb构建体共转染的HEK293细胞(图6)。有趣的是，用测试的Nb亚组共转染的细胞没有显示MLi-2诱导的向微管的募集，并且LRRK2细胞质分布得以维持。这种拯救效果对于Nb CA13606、CA13611、CA13612和CA14135最为显著。最近的结构信息已将LRRK2微管重新定位与激酶结构域的构象联系起来，其中具有有利于LRRK2与微管结合的闭合构象[36]。因此，常用的ATP竞争性I型LRRK2抑制剂会触发这种效应。此外，之前已经表明WD40结构域对于LRRK2-微管结合是必不可少的[40]。此外，最近有报道称，微管上的LRRK2修饰涉及WD40:WD40二聚化界面，这种蛋白质-蛋白质相互作用的破坏消除了MLi-2对LRRK2重新定位到微管的作用[42]。有趣的是，我们的ELISA和CL-MS实验表明，所有抑制MLi-2诱导的微管定位的Nb都与激酶或WD40结构域相互作用。因此可以想象，这些Nb以“激酶开放”构象或以掩盖WD40:WD40界面的构象捕获LRRK2。
实施例10Nb通过与先前描述的LRRK2激酶抑制剂不同的结合位点抑制LRRK2。
目前描述的大多数LRRK2抑制剂直接与激酶结构域的ATP结合口袋结合。然而，据报道，生理形式的维生素B12通过和不与ATP结合口袋重叠的激酶结构域的区域结合来抑制LRRK2激酶活性[43]。本文所述的体外激酶活性抑制Nb中的两个(Nb1和Nb6)主要通过与COR-B结构域的相互作用结合LRRK2，因此提出了一种新的作用机制，从而排除了类似于这些先前描述的LRRK2激酶抑制剂的抑制机制，先前描述的LRRK2激酶抑制剂都直接与激酶结构域相互作用。另一方面，ELISA和交联MS实验表明，第三体外激酶活性抑制Nb(Nb23)通过激酶结构域结合LRRK2，尽管本文的动力学分析也表明Nb23是一种混合型(非ATP竞争性)抑制剂。为了验证和确认Nb1、Nb6和Nb23与LRRK2的结合方式不同于任何已知的小分子激酶抑制剂，因此也不同于所报道的维生素B12的形式，进行了竞争ELISA滴定实验(图17)。在这个实验设置中，ELISA实验使用包被在ELISA板底部的固定浓度的LRRK2进行，并使用从450nM到0.2nM范围稀释系列的三个Nb中的任何一个进行。在ELISA中使用其C-末端EPEA标签进行Nb结合的检测，产生反映Nb表观亲和力的剂量反应滴定曲线。随后，在大量过量的ATP竞争性抑制剂MLi-2(1μM)存在的情况下[34]、或在非ATP竞争性VitB12衍生物5'脱氧腺苷钴胺素(AdoCbl,250μM)存在的情况下[43]进行了重复设置。此外，作为阳性对照，在相应未标记的Nb过量(9μm)存在的情况下重复设置。虽然在添加相应的未标记Nb作为直接正构竞争物时观察到非常显著的滴定曲线右移，但正如预期的那样，在MLi-2或AdoCbl存在的情况下，三个Nb中的任何一个都没有观察到右移。因此，这进一步证明了(1)如本文所述，这三个第1组Nb中的任何一个都没有与I型ATP竞争性抑制剂MLi-2一样在同一个口袋中结合，因此证实这些Nb通过非ATP竞争性变构抑制机制发挥作用，和(2)Nb都结合与AdoCbl不同的结合表位，表明它们通过全新的变构机制发挥作用。
实施例11.创建多价和多互补位纳米抗体以增加亲和力和效力。
已鉴定出一组变构Nb，它们通过靶向不同结构域上的不同非重叠表位与LRRK2结合并抑制LRRK2激酶活性。因此，这具有基因工程融合靶向不同LRRK2表位的此类Nb组合的潜力，从而产生多价/多互补位(multiparatopic)(即结合同一靶标的不同表位)Nb。由于累加和合作(亲合力)效应，预计产生这种多价性会导致(表观)亲和力显著增加。此外，与单个Nb的混合物相比，预计类似地，多互补位Nb的组合将协同增加激酶抑制的效力[44,45]。对于通过结合不同结构域(例如但不限于COR-B(例如CA12610和C12618)和激酶结构域(例如CA13612))来抑制激酶活性的Nb来说尤其如此。
组合不同的纳米抗体构建块，可以使用柔性(G4S)X接头，通过改变重复次数x而具有不同的长度。可以在pMESY4载体中进行组合两个或更多个不同的Nb。此外，除了改变接头长度之外，也可以改变融合体内的Nb顺序。产生的多互补位Nb可以以与单个Nb类似的方式表达和纯化。首先，如上所述，使用
Figure BDA0003901770190000541
蛋白激酶测定法确定多互补位构建体的IC50值，并与相应的单个Nb的混合物的值进行比较，以检测基因工程连接的协同效应。其次，也可以如本文所述使用MST或BLI方法确定多互补位Nb的(表观)KD值，并将这些值与单个Nb的KD值比较。随后测试了最有希望的Nb对细胞中LRRK2激酶活性的影响。
材料和方法
蛋白质表达和纯化
基于先前开发的方案[1,2]表达和纯化全长人LRRK2，稍作调整以获得处于某种核苷酸结合状态的LRRK2：鸟苷-5'-(γ-硫代)-三磷酸(GTPγS)或5'-二磷酸鸟苷(GDP)。简而言之，将全长LRRK2克隆到N-Strep/Flag-TAP(N-SF-TAP)pcDNA3.0载体中，该载体编码具有N-末端Twin-Strep-标签和FLAG-标签(NSF)的蛋白质[3]。用8μg质粒DNA/14cm培养皿、使用聚乙烯亚胺(PEI)25kDa(Polysciences)转染50％至70％汇合的HEK 293T细胞(CRL-11268；美国典型培养物保藏中心)，转染后在14-cm培养皿中在补充有10％(vol/vol)FBS(Sigma-Aldrich)和适当的抗生素的DMEM(Sigma-Aldrich)中培养48小时。去除培养基后，将细胞重新悬浮在裂解缓冲液(1mL/14-cm培养皿)中,其中含有50mM HEPES(pH 8.0)、150mM NaCl、5mM MgCl2、2mM DTT、5％甘油以及补充有0.55％(v/v)Nonidet P-40、完全蛋白酶抑制剂(Roche)和1mM GTPγS或1mM GDP。允许细胞裂解在4℃下在旋转振荡器(10rpm)上持续1小时，并通过以10,000×g离心10分钟去除细胞碎片和细胞核。将裂解物与Strep-Tactin珠(IBA，500μl床体积/15mL细胞裂解物)在4℃的旋转振荡器上孵育2小时。将珠转移到微旋转柱(GE Healthcare)并用含有1mM GTPγS或GDP的洗涤缓冲液(50mM HEPES(pH 8.0)、100mMNaCl、1mM DTT、5mM MgCl2、0.5mM EDTA、10％[vol/vol]甘油)充分洗涤5次。使用700-800μL相同的洗涤缓冲液进行洗脱，该缓冲液含有2.5mM D-脱硫生物素(IBA)和1mM GTPγS或GDP。
跨越Roc和COR结构域(RocCOR)的LRRK2结构域构建体最初由pBADcLIC载体表达，该载体编码跨越氨基酸残基1334-1840的蛋白质，该蛋白质融合N-末端Twin-Strep-标签和C-末端His10-标签。在稍后阶段，使用在pDEST-566载体中克隆的跨越残基1293-1840的构建体，其编码具有N-末端His6-MBP(麦芽糖结合蛋白)-标签的蛋白质。虽然pBADcLIC载体表达的蛋白质用于免疫和大多数筛选实验，但pDEST-566载体表达的蛋白质也用于某些筛选实验。与COR-B构建体的纯化类似地进行带有His6-MBP-标签的RocCOR的表达和纯化(见进一步)。将含有RocCOR编码区的pBADcLIC载体转化到大肠杆菌菌株(大肠杆菌RCEv9)，该大肠杆菌RCEv9菌株从MC1061ΔacrB菌株开始内部定制进化，使用先前描述的方案用于优化RocCOR蛋白的表达[4,5]。使用过夜培养物接种4L TB培养基(37℃)，当OD达到约0.7时，用0.01％的阿拉伯糖诱导蛋白质表达，并允许在20℃下过夜。收获细胞并重新悬浮于缓冲液中，所述缓冲液含有50mM Tris-HCl pH 7.5、500mM NaCl、10mM MgCl2、2mMβ-巯基乙醇和20mM咪唑，并补充有1mM PMSF、1μg/mL亮肽素、0.1μg/mL AEBSF和50μg/mL DNaseI。最后，在细胞裂解之前，将0.5mM GDP或0.5mM鸟苷-5'-[(β,γ)-亚氨基]三磷酸(GppNHp)添加到缓冲液中。使用Cell Disrupter(Constant Systems Ltd.)裂解细胞，在通过离心澄清后，将细胞裂解物加载到5mL Ni-NTA柱上。首先，柱基质用10倍柱体积(CV)的重新悬浮缓冲液洗涤，所述缓冲液补充有300mM KCl和5mM ATP，以减少伴侣物的污染。随后，用10CV的缓冲液洗涤柱，所述缓冲液含有50mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、10mM MgCl2、20mM咪唑、5％甘油、2mMβ-巯基乙醇和0.5mM GDP或GppNHp，蛋白质在补充了300mM咪唑的相同缓冲液中洗脱。浓缩步骤后，最后的纯化步骤包括在Superdex S200 10/300柱上的凝胶过滤，使用30mMHEPES pH 7.5、150mM NaCl、5mM MgCl2、5％甘油、1mM DTT作为缓冲液，并补充有0.5mM GDP或GppNHp。
将跨越残基1329-1520的Roc结构域的构建体克隆到pET-28a载体中，该载体提供N-末端His6-标签，并且载体被转化在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。使用过夜培养物接种4LTB培养基(37℃)，当OD达到约0.7时，用0.1mM的异丙基β-D-1硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达，并允许在20℃下过夜。收获细胞并重新悬浮于缓冲液中，所述缓冲液含有30mMHEPES pH 7.5、250mM NaCl、10mM MgCl2、10mM甘氨酸和20mM咪唑，并补充有1mM PMSF、1μg/mL亮肽素、0.1μg/mL AEBSF和50μg/mL DNaseI。使用Cell Disrupter(Constant SystemsLtd.)裂解细胞，在通过离心澄清后，将细胞裂解物加载到5mL Ni-NTA柱上。用10CV的重新悬浮缓冲液充分洗涤后，将蛋白质在含有300mM咪唑的相同缓冲液中洗脱。最后的纯化步骤包括在Superdex S75 10/300柱上的凝胶过滤，使用30mM HEPES pH 7.5、150mM NaCl、5mMMgCl2、5％甘油、1mM DTT作为缓冲液。
将跨越残基1672-1840的COR结构域(COR-B)的C-末端部分的构建体克隆到pDEST-566载体中，该载体提供N-末端His6-MBP-标签，并且载体被转化在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。使用过夜培养物接种4L TB培养基(37℃)，当OD达到约0.7时，用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达，并允许在20℃下持续2小时。收获细胞并重新悬浮于缓冲液中，所述缓冲液含有30mMHEPES pH 7.5、200mM NaCl、1mM EDTA和1mM DTT，并补充有1mM PMSF、1μg/mL亮肽素、0.1μg/mL AEBSF和50μg/mL DNaseI。使用Cell Disrupter(Constant Systems Ltd.)裂解细胞，在通过离心澄清后，将细胞裂解物加载到5mL MBPTrap柱上(GE Healthcare)。用10CV的重新悬浮缓冲液洗涤后，将蛋白质在含有10mM麦芽糖的相同缓冲液中洗脱。最后的纯化步骤包括在Superdex S200 10/300柱上的凝胶过滤，使用30mM HEPES pH 7.5、150mM NaCl作为缓冲液。
将包含激酶和WD40结构域(K-WD40)、并跨越残基1876-2527的LRRK2的结构域构建体克隆在编码具有N-末端His-标签的蛋白质的pFastBac载体(Invitrogen)中。蛋白质在Sf9细胞(Invitrogen)中表达，并使用如前所述的Ni-NTA基质通过亲和色谱法纯化[6]。最后的纯化步骤包括在Superdex S7510/300柱上的凝胶过滤，使用50mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、5mM MgCl2、2mMβ-巯基乙醇和0.1mM GDP作为缓冲液。
如前所述进行纳米抗体(Nb)表达和纯化[7]。在pMESy4载体中克隆的Nb编码开放阅读框(见进一步)转化在非抑制剂的大肠杆菌WK6(Su-)细胞中。细胞在37℃的Terrific肉汤(TB)培养基中生长，并用1mM IPTG诱导蛋白质表达。在28℃过夜表达后，通过离心收获细胞并进行渗透休克以获得周质提取物。随后，在Ni2+-NTA琼脂糖上进行亲和纯化步骤，然后针对缓冲液进行透析步骤，所述缓冲液由20mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl组成，用于纯化Nb。
免疫
总共进行了三次美洲驼免疫：(1)使用人LRRK2的RocCOR结构域构建体；(2)在GTPγS存在的情况下使用全长LRRK2；(3)在GDP存在的情况下使用全长LRRK2。为了获得基于特定核苷酸结合状态的LRRK2(GDP与GTPγS)，所有纯化步骤均在相应核苷酸过量存在的情况下进行(见上文)。此外，为了确保蛋白质在免疫时和免疫后保持特定的核苷酸结合状态，在免疫前对蛋白质进行了温和的交联。因此，载有1mM GTPγS或1mM GDP的LRRK2蛋白与伯胺特异性交联剂辛二酸二琥珀酰亚胺酯(DSS)以1:20的摩尔比孵育30分钟，然后通过添加过量的Tris淬灭反应。
对于所有三种独立的免疫策略，遵循在GERBU佐剂存在下的每周免疫的六周方案。所有动物疫苗接种均严格按照良好操作和欧盟动物福利法规进行。在免疫策略(1)中，使用存在10mM GppNHp的RocCOR结构域构建体进行免疫。前两周注射了200μg蛋白质，最后两周注射了100μg。在10mM GTPγS存在下(免疫(2))或在10mM GDP存在下(免疫(3))用全长(部分交联的)LRRK2的免疫根据以下方案进行：第1周注射300μg蛋白质，第2周注射200μg蛋白质，第3-6周注射100μg蛋白质。在最后一次注射后4天收集血液。
纳米抗体生成
使用先前描述的方案进行免疫文库的构建和通过噬菌体展示的Nb选择[7]，进行修改以最大化选择与不同核苷酸形式的LRRK2特异性结合的Nb的机会。简而言之，分别用RocCOR结构域(免疫1)、在GTPγS存在下的LRRK2(免疫2)和在GTP存在下的LRRK2(免疫3)免疫后，开始从美洲驼收集血液，在pMESy4噬菌体展示载体上克隆重链抗体库的可变结构域，该载体添加了蛋白质表达时的C-末端His6-标签和EPEA-标签(＝CaptureSelectTM C-tag)。这产生了三个独立的免疫文库，分别为8.3×108、1.8×109和1.3×109个转化体。在用VCSM13辅助噬菌体拯救后，该Nb库在丝状噬菌体的尖端上表达。对于免疫1，针对固相包被的全长LRRK2或通过抗-flag M2Ab(Merck)捕获在珠上的全长LRRK2进行了两轮连续的噬菌体展示选择。在包被缓冲液中进行LRRK2的包被，所述包被缓冲液含有50mM HEPES pH 8.0、150mM NaCl、5mM MgCl2、5％甘油，并补充有100μM GDP，使用2％BSA进行封闭。所有结合和洗涤步骤均在洗涤缓冲液中进行，所述洗涤缓冲液含有50mM HEPES pH 8.0、150mM NaCl、5mM MgCl2、5％甘油和0.05％ Tween20，并补充有100μM GDP。对于免疫2，使用固相包被的全长LRRK2进行两轮连续的噬菌体展示选择。此外，使用固相包被的LRRK2Roc结构域进行三轮连续的噬菌体展示选择。在包被步骤中，包被缓冲液中补充有1mM GTPγS，而在结合和洗涤步骤中，洗涤缓冲液中补充有100μM GTPγS。对于免疫3，使用固相包被的全长LRRK2进行一轮噬菌体展示选择。此外，使用固相包被的LRRK2 Roc结构域进行两轮连续的噬菌体展示选择。在包被步骤中，包被缓冲液中补充有1mM GDP，而在结合和洗涤步骤中，洗涤缓冲液中补充有100μM GDP。在每轮噬菌体展示选择后挑选几个单菌落，并使用序列分析根据其CDR3序列将所得的Nb克隆分类于序列家族中。
为了允许在HEK 293T细胞中将Nb表达为荧光(eGFP)标记的胞内抗体(Fluobodies)，使用HindIII和BamHI限制性位点将Nb ORF重新克隆到pEGFP-N1载体。这将导致表达在其C-末端融合了eGFP(Nb-GFP)的Nb。为了允许在没有GFP时在HEK 293T细胞中表达Nb，在Nb和GFP编码序列之间引入了终止密码子。
ELISA实验
在Nb纯化之前，使用ELISA筛选确认在表达相应的Nb的大肠杆菌细胞粗提取物中的Nb与LRRK2的结合。在ELISA孔底部固相包被全长LRRK2，包被、封闭、结合和洗涤缓冲液保持与噬菌体展示实验中的相同，并补充有相关核苷酸(GTPγS或GDP)。使用1:4000CaptureSelectTM生物素抗C-tag缀合物(Thermo Fischer Scientific)组合1:1000的链霉亲和素碱性磷酸酶(Promega)通过其EPEA-tag检测Nb与LRRK2的结合。通过添加100μl4mg/mL 4-硝基苯基磷酸二钠溶液(DNPP，Sigma-Aldrich)显色并在405nm处测量。
如上所述纯化选定的Nb后，进行ELISA实验以确定其结构域特异性。全长LRRK2和Roc、COR-B、RocCOR和K-WD40结构域构建体在96孔ELISA板中进行固相包被。包被、结合和洗涤缓冲液与噬菌体展示实验中的保持相同，并补充有100μM GDP。以与上述相同的方式开发ELISA。
细胞内(in cellulo)磷酸化-Rab测定法
在DMEM(补充有10％胎牛血清、25mM L-谷氨酰胺和0.5％ Pen/Strep)中培养HEK293T细胞。对于测定法，将细胞接种到六孔板上并在50-70％汇合时使用自制的基于聚乙烯亚胺(PEI)的转染试剂转染各个Nb-GFP表达构建体，SF-标记的LRRK2(G2019S)和FLAG-HARab29[8]。48小时后，在裂解缓冲液[30mM Tris-HCL(pH7.4)、150mM NaCl、0.5％Nonident-P40、完全蛋白酶抑制剂混合物、磷酸酶抑制剂混合物II和III(所有均为Sigma)]中裂解细胞。通过以10,000xg离心澄清裂解物，并在1x Laemmli缓冲液中调整蛋白质浓度至1μg/μl。随后对样品进行SDS PAGE和蛋白质印迹分析，以确定LRRK2 pS1292和Rab10 T72磷酸化水平，如下所述。确定总LRRK2和Rab10水平作为参考。
对于蛋白质印迹分析，使用NuPAGE 10％ Bis-Tris凝胶(Invitrogen)通过SDS-PAGE分离蛋白质样品并转移到PVDF膜(Thermo Fisher)上。为了允许同时探测一方面的LRRK2、以及另一方面的Rab和Nb-GFP融合体，在140kDa MW标志物带处水平切割膜。用含有5％脱脂奶粉的TBST封闭非特异性结合位点(1h,RT)(25mM Tris,pH 7.4,150mM NaCl,0.1％ Tween-20)后，将膜与以下指定稀释度的一抗在4℃下过夜孵育。在TBST/5％ BSA(Roth GmbH)中稀释磷酸化特异性抗体。在TBST/5％脱脂奶粉(BioRad)中稀释非磷酸化特异性抗体。磷酸化Rab10的水平由位点特异性兔单克隆抗体抗pRAB10(pT73)(Abcam，ab230261)测定，LRRK2自磷酸化由位点特异性兔单克隆抗体抗pLRRK2(pS1292)(Abcam，ab203181)测定，两者均以1:2,000稀释。总LRRK2水平由内部大鼠单克隆抗体抗pan-LRRK2(克隆24D8；1:10,000)确定[9]。总Rab10水平由兔单克隆抗体抗RAB10/ERP13424(Abcam，ab181367)测定，以1:5,000的稀释度稀释。使用1:2,000稀释度的大鼠单克隆抗体抗GFP(克隆3H9，ChromoTec)检测Nb-GFP融合蛋白。为了检测，使用山羊抗大鼠IgG或抗兔IgG HRP偶联的二抗(Jackson ImmunoResearch)，在TBST/5％脱脂奶粉中以1:15,000的稀释度稀释。使用ECL加上化学发光检测系统(GE Healthcare)对Hyperfilms(GE Healthcare)上的抗体-抗原复合物进行可视化。
化学交联/质谱法(CL-MS)
对于化学交联，将LRRK2蛋白溶液的浓度调整为3μM(0.86mg/mL)。在彻底透析以去除Tris缓冲液后，将每个纳米抗体以2:1的最终摩尔比添加到LRRK2洗脱缓冲液中纯化的LRRK2中(参见蛋白质纯化部分)。为了形成复合物，将蛋白质混合物在4℃持续混合下孵育1h。然后使用基于NHS酯和CID可裂解试剂二琥珀酰亚胺亚砜(DSSO；Thermo Fisher)进行交联反应[10]，以60:1的摩尔过量(指纳米体)。在室温下在持续混合下进行交联反应30分钟。然后通过添加Tris-HCl(pH 7.5)溶液至终浓度为10mM并在室温下孵育15分钟来停止反应。蛋白质最终通过氯仿/甲醇沉淀，随后进行胰蛋白酶蛋白水解，如[8]中所述。如前所述，通过StageTips使胰蛋白酶肽溶液澄清并进行SEC分离以富集交联的肽[2]。在OrbitrapFusion质谱仪(Thermo Fisher)上使用默认设置(版本3.0，构建2041)的MS2_MS3碎片方法单独分析真空干燥的含有交联肽的级分。在Orbitrap(FTMS，分辨率＝60K)中以375-1500的m/z范围进行MS1扫描。使用CID(CE＝25％)进行MS2，在Orbitap(FTMS)中以30K分辨率获得光谱。使用HCD(CE＝30％)进行MS3扫描，并在线性离子阱中获得光谱。使用ProteomeDiscoverer 2.4中提供的MS2_MS3工作流程分析Thermo Raw文件，该工作流程使用XlinkX(2.4版本)[11]检测交联肽。简而言之，使用Sequest HT对补充了纳米抗体序列的Swissprot数据库的人亚组(v.2019_02；20417个条目)进行MS2光谱的全局搜索，然后由Target Decoy PSM验证器进行FDR分析(FDR＝0.01)。对于Sequest分析，使用了以下设置：胰蛋白酶被用作酶。半胱氨酸的氨甲酰化已被用作固定修饰，蛋氨酸氧化、DSSO水解(K+176.014Da)、DSSO Tris(K+279.078Da)和n-末端乙酰化被允许作为可变修饰。
为了通过XlinkX检测节点检测交联肽，采集策略设置为MS2_MS3，DSSO(158.004；K)用作交联剂，S/N最小值为1.5。对于XlinkX数据库搜索，使用了以下参数：胰蛋白酶被用作酶。前体和碎片质量公差分别设置为10ppm(前体)、20ppm(FTMS)和0.5Da(ITMS)。使用包含LRRK2序列和所有使用的纳米抗体的单个序列的数据库进行搜索。氨基甲酸酯已被用作固定的，并且甲硫氨酸氧化被允许作为可变修饰。使用Perculator设置进行基于FDR的分析(XlinkX验证器节点)，FDR阈值为0.01。
在一致步骤中，针对鉴定分数≥20(默认值)对鉴定的交联进行过滤，以减少假阳性的命中数。导出过滤后的交联数据并在xiNet中可视化[12]。
体外肽磷酸化(激酶)测定法
使用
Figure BDA0003901770190000611
蛋白激酶测定法(AssayQuant Technologies Inc.)测定纯化的Nb对LRRK2激酶活性的影响，使用优化的LRRK2 AQT0615肽作为底物并根据制造商的说明进行。在黑色半面积96孔板中以50μL的总体积进行连续激酶测定法。每个反应混合物在缓冲液中含有10μM AQT0615肽底物/探针、0.1mM或1mM ATP、和500μM GDP或GTPγS，所述缓冲液由50mM HEPES pH 7.5、0.1％Brij-35、50mM NaCl和10mM MgCl2组成。在不存在或存在25μM Nb的情况下添加最终浓度为80nM的LRRK2来启动反应。在添加之前，LRRK2和Nb在冰上预孵育30分钟。在30℃下在酶标仪中连续跟踪LRRK2催化的肽底物/探针磷酸化，其中激发和发射波长分别为360nm和485nm。通过减去“无LRRK2”对照来校正时间轨迹。初始速率由曲线线性部分的斜率确定。
为了确定IC50值，使用两倍连续稀释将Nb浓度从150μM稀释至0.006μM不等。在这些测定法中，使用了150nM的最终LRRK2浓度和1mM的ATP浓度。相对LRRK2活性(与“无纳米抗体”对照相比)相对于对数Nb浓度作图，并在GraphPad Prism软件中拟合到三参数对数(抑制剂)与反应方程中。收集所有时间轨迹，一式三份。
共聚焦显微镜和微管定位
在完全培养基(高糖Dulbecco's改良的Eagle's培养基、10％胎牛血清和青霉素-链霉素-谷氨酰胺(Gibco))中培养HEK293细胞系。将细胞接种在8孔μ-Slide(Ibidi)上，并在50-70％汇合时使用JetPEI试剂(Polyplus转染)转染GFP-Nb和mScarlet-LRRK2构建体。24小时后，用DMSO或1μM LRRK2激酶抑制剂(MLi-2,目录号5756,TOCRIS)处理细胞90分钟，然后检查定位。使用蔡司LSM800共聚焦激光扫描显微镜的×100油浸物镜进行数据采集。使用蔡司显微镜软件ZEN进行z扫描的图像分析。
激酶抑制机制的确定
为了确定CA12610、CA12618、CA13612的抑制机制和表观KI(KI app)值，使用
Figure BDA0003901770190000622
蛋白激酶测定法(AssayQuant Technologies Inc.)与AQT0615肽底物组合。在30℃下收集在缓冲液中存在不同Nb浓度的完整Michaelis-Menten曲线(相对于[ATP]的相对速度)，所述缓冲液由50mM HEPES pH 7.5、0.1％Brij-35、50mM NaCl、10mM MgCl2和500mM GDP组成，使用固定浓度的AQT0615(10μM)和不同浓度的ATP。选择LRRK2浓度，以便获得初始速率(荧光相对于时间的线性曲线)，并在通过添加肽底物开始反应之前，将LRRK2、ATP和Nb在4℃下预孵育30分钟。根据以下方程，使用GraphPad Prism将不同Nb浓度的Michaelis-Menten曲线全局拟合在混合抑制模型上：
Figure BDA0003901770190000621
(其中Kic app＝Ki app，并且Kiu app＝a.Ki app)
此外，作为一种诊断工具，Michaelis-Menten曲线使用Lineweaver-Burk(双倒数)图进行线性化。
下拉实验
在100μL冰冷的裂解缓冲液(10mM Tris/HCl pH 7.5、150mM NaCl、0.5mM EDTA、0.5％ NP-40)中制备过表达SF标记的LRRK2和GFP标记的Nb的HEK293细胞的新鲜裂解物，所述缓冲液含有完全不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物(Sigma–Aldrich，目录号11836170001)和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，目录号P-2714)。用磁性GFP纳米陷阱珠(ChromoTek)免疫沉淀GFP-Nb。用10mM Tris/HCl pH 7.5洗涤免疫复合物两次，并通过在具有还原剂的样品缓冲液中煮沸样品进行免疫印迹分析。样品在4-15％ Tris-甘氨酸凝胶(
Figure BDA0003901770190000631
TGXTMPrecast Gels,Bio-rad)上分离，转移到硝酸纤维素膜(GE Lifesciences)上，进行蛋白质印迹分析。在含有5％奶粉和Tween-20的Tris缓冲盐水中封闭膜1小时。为了能够分别检测LRRK2和Nb，在180kDa处水平切割膜，上部用大鼠单克隆抗LRRK2(克隆24D8 1:1000，Gloeckner lab)探测，下部用兔抗-GFP抗体，1:2500(MA5-15256，Invitrogen)探测，并在4℃下轻轻摇动孵育过夜。然后在室温下将膜在含有0.1％或0.05％ Tween-20的PBS中洗涤10分钟，3次，然后与针对LRRK2的抗大鼠IgG-HRP(sc-2750,Santa Cruz Biotechnology)和针对GFP-Nb的抗兔HRP缀合(#7074,Cell Signaling,1:5000)孵育1小时。在室温下在含有0.1％或0.05Tween-20的PBS中再次洗涤膜3次，10分钟。膜包被有增强的化学发光(ECL)试剂(WesternSure PREMIUM,Li-COR biosciences)，并使用C-数字成像系统(Li-CORBiosciences)检测蛋白质。
为了测试Nb与内源性(小鼠)LRRK2的结合，在补充有完全无EDTA蛋白酶抑制剂的混合物(Sigma–Aldrich目录号11836170001)和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，目录号P-2714)的10mM Tris/HCl pH 7.5；150mM NaCl；0.5％ NP-40中制备RAW264.7细胞的新鲜裂解物。以1.5mM的最终浓度将纯化的His标记的Nb添加到裂解物中，并使混合物在4℃下旋转过夜。His标记的Nb被磁性Dynabead(Invitrogen)拉下。用10mM Tris/HCl pH 7.5洗涤免疫复合物两次，并以与上述类似的方式进行免疫印迹分析。为了能够分别检测LRRK2和Nb，在180kDa处水平切割膜，上部用兔单克隆抗LRRK2，1:1000([MJFF2(c41-2)],ab133474,Abcam)探测，下部用小鼠抗-组氨酸标签抗体，1:1000(AD1.1.10,Bio-rad)探测，并在4℃下轻轻摇动孵育过夜。然后将膜在含有0.1％或0.05％ Tween 20的PBS中在室温洗涤3次，10分钟，然后与二抗孵育至少1小时：抗兔HRP缀合(#7074,Cell Signaling,1:500)或小鼠IgGkappa结合蛋白(m-IgGk BP)缀合HRP(sc-516102,Santa Cruz Biotechnology,1:5000)。在室温下在含有0.1％或0.05Tween-20的PBS中再次洗涤膜3次，10分钟。膜包被有增强的化学发光(ECL)试剂(WesternSure PREMIUM,Li-COR biosciences)，并使用C-数字成像系统(Li-COR Biosciences)检测蛋白质。
微量热泳和生物层干涉法测量。
进行微量热泳(MST)实验以确定Nb与FL-LRRK2结合的平衡结合亲和力(KD)。因此，使用分选酶介导的肽交换，用m-TAMRA在其C-末端位点特异性标记Nb[57]。将Nb重新克隆到pHEN29载体中，该载体随后用于表达和纯化具有C-末端LPETGG-His6-EPEA标签的Nb。使用分选酶进行后一肽与m-TAMRA标记的GGGYK肽(GenicBio，上海，中国)的交换，并分别使用Ni-NTA和SEC纯化步骤去除未标记的Nb和未掺入的肽。使用Monolith NT.115仪器(Nanotemper technologies)通过用不同浓度的LRRK2(16个点，3:1稀释系列)滴定固定浓度的m-TAMRA标记的Nb(50-100nM，取决于Nb的亲和力)进行MST测量。实验在50mM HEPESpH8.0、150mM NaCl、10mM MgCl2、5％甘油、0.1％ BSA、0.05％ Tween和500μM GDP中进行(Nb42除外，其中使用500μM GTPγS)。在4℃孵育30分钟后，将样品加载到毛细管中，并在25℃下使用50-70％ LED功率和80％激光强度(激光开启时间：30秒，激光关闭时间：5秒)进行测量。所有实验一式三份进行。最初使用MO.亲和力分析软件处理数据，通过将MST信号(在5-15秒的开启时间)相对于[LRRK2]曲线拟合至GraphPad Prism 7中的二次结合等温线，获得最终KD值。
使用Octet Red96(Forte Bio,Inc.)系统、在25℃下摇动速度为1000rpm、在含有50mM HEPES pH 8.0、150mM NaCl、10mM MgCl2、5％甘油、0.1％BSA、0.05％ Tween的缓冲液中进行生物层干涉法(BLI)测量。通过高亲和力LRRK2特异性生物素化的Nb(Nb40或Nb42)的方式，通过首先将LRRK2捕获在链霉亲和素包被(SA)的生物传感器上进行Nb与FL-LRRK2的结合。首先将生物素化的Nb以5μg/mL的浓度加载到预平衡的SA生物传感器上。然后使用这种加载Nb的传感器从50nM LRRK2溶液中捕获FL-LRRK2。最后，该传感器用于监测整组Nb的结合(600秒至1000秒)和解离(600秒至1000秒)(以评估Nb40的结合，使用的传感器用Nb42作为捕获剂，对于所有其他Nb，Nb40用作捕获剂)。所有实验一式三份进行。通过拟合剂量反应曲线获得平衡解离常数(KD)，该曲线通过在GraphPad Prism 7中的Langmuir方程上相对于Nb浓度对100秒到800秒的结合信号(取决于Nb的结合速率)作图得出。
免疫染色
使用JetOPTIMUS(Polyplus转染)用peGFP-Nb构建体转染RAW264.7细胞(
Figure BDA0003901770190000651
SC-6003TM)24小时，然后用酵母聚糖颗粒(Sigma Aldrich)刺激30分钟(50mg/mL)。如前所述进行LRRK2的免疫染色[78]。简而言之，细胞用4％(w/v)多聚甲醛固定30分钟，然后在-20℃下用100％ EtOH处理。样品用PBS/0.5％ Triton X-100透化并用3％ BSA封闭。在含有3％ BSA和0.5％ Triton X-100的PBS中稀释一抗(兔抗LRRK2、c41-2、Abcam和小鼠抗GFP、G6539，Sigma Aldrich)，并在4℃下孵育过夜。用PBS洗涤3个5分钟后，以与一抗类似的方式加入荧光标记二抗(抗兔Alexa fluor 568和抗小鼠Alexa fluor 488，Invitrogen)，并在室温下孵育1小时。用1×PBS洗涤细胞两次，并用具有DAPI(SigmaAldrich)的Fluroshield抗褪色试剂封装。在蔡司LSM800共聚焦激光扫描显微镜上获得图像。使用蔡司显微镜软件ZEN进行z扫描的图像分析。
竞争ELISA
为了评估纳米抗体Nb1、Nb6或Nb23与Mli-2或5'脱氧腺苷钴胺素(AdoCbl)的结合之间的任何潜在竞争，进行了竞争ELISA实验。与如上所述类似地进行ELISA实验，使用固定浓度的LRRK2包被在ELISA板底部，并使用1:4稀释系列的Nb1、Nb6或Nb23，范围为450nM至0.2nM。如前所述，使用Nb的C-末端EPEA标签进行Nb结合的检测，产生反映Nb表观亲和力的剂量反应滴定曲线。此设置在不存在或存在大量过量的ATP竞争性抑制剂MLi-2(1μM)、非ATP竞争性VitB12衍生物5'脱氧腺苷钴胺素(AdoCbl,250μM)、或每个稀释系列中过量的相应非标记Nb(9μm)的情况下进行。还包括“无抗原对照”，其中在孔底部没有包被LRRK2。在不同时间点读取吸光度信号(A405nm)，并将在0.5小时(Nb6和Nb23)或10小时(Nb1)的A405nm绘制成Nb浓度的函数。在存在Mli-2和AdoCbl下的测量一式三份进行(除了在AdoCbl存在下的Nb1，其进行一式两份)。
序列表
SEQ ID NO:1-19：LRRK2纳米抗体序列(无6xHis/EPEA C-末端标签)(表3)
>SEQ ID NO:20：6x组氨酸和EPEA C-末端标签
>SEQ ID NO:21:人富含亮氨酸的重复激酶2氨基酸序列(如本文所用的Q17RV3_UniProt的T1647S突变体；2527aa)
>SEQ ID NO:22：用于SEQ ID NO:21的人LRRK2表达(无N-末端Met)的N-末端SF标签(flag和twin-strep).
本文中用于编码人LRRK2的cDNA首先在[50]中描述，包括N-末端SF-标签的构建体(SEQ ID NO：22)首先在[1]中描述。
>SEQ ID NOs:23-79：SEQ ID NO:1-19的Nb的CDR1、CDR2和CDR3序列，如表3注释，并且提供在表4中。
表3.LRRK2特异性纳米抗体序列。
实施例中提供的纳米抗体包含相应的SEQ ID NO：1-19的序列和C-末端6xHis/EPEA标签。CDR注释在本文中根据当前分析进行标记(+表4)(替代注释另参见图10)。
Figure BDA0003901770190000671
表4.如表3中所注释的SEQ ID NO：1-19的CDR1、CDR2和CDR3区的序列。
Figure BDA0003901770190000681
Figure BDA0003901770190000691
公开的方面
富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)的非天然变构调节剂，其特异性结合人LRRK2。
所述LRRK2变构调节剂不包含钴胺素衍生物。
所述LRRK2变构调节剂，抑制或增加LRRK2活性。
所述LRRK2变构调节剂特异性结合人LRRK2的结合位点，该结合位点不同于LRRK2的ATP催化位点。
所述LRRK2变构调节剂特异性结合人LRRK2的结合位点，所述结合位点不排他地包含激酶结构域或不同于激酶结构域的结合位点。
所述LRRK2变构调节剂包括小分子、化合物、蛋白质、肽、肽模拟物、抗体、抗体模拟物、单结构域抗体、免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)或活性抗体片段。
所述LRRK2变构调节剂包含ISVD，其中所述ISVD包含根据下式(1)的4个框架区(FR)和3个互补决定区(CDR)：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)。
所述LRRK2变构调节剂包含ISVD，其中：
CDR1由选自SEQ ID NO：1至19的CDR1序列的序列组成，
CDR2由选自SEQ ID NO：1至19的CDR2序列的序列组成，和
CDR3由选自SEQ ID NO：1至19的CDR3序列的序列组成。
所述LRRK2变构调节剂包含ISVD，所述ISVD包含SEQ ID NO：1至19的任何序列，或与其具有至少85％氨基酸同一性的序列，或其人源化变体。
一种多特异性LRRK2变构调节剂，其包含至少一种本文指定的所述调节剂。
一种用于检测样品中LRRK2蛋白的量的体外方法，所述方法包括：
使样品与所述LRRK2特异性ISVD、或与包含LRRK2特异性ISVD的所述多特异性试剂相互作用；和
检测所述相互作用的LRRK2特异性ISVD的存在或不存在或水平。
一种药物组合物，其包含LRRK2变构调节剂、多特异性LRRK2变构调节剂、编码LRRK2变构调节剂或多特异性LRRK2变构调节剂的核酸分子，或包含所述核酸分子的载体。
所述药物组合物，进一步包含作为ATP竞争性LRRK2激酶抑制剂的化合物。
所述LRRK2变构调节剂、多特异性LRRK2变构调节剂、编码LRRK2变构调节剂或多特异性LRRK2变构调节剂的核酸分子、包含所述核酸分子的载体、或药物组合物，用作药物，或用作诊断剂或用于体内成像。
所述LRRK2变构调节剂、多特异性LRRK2变构调节剂、编码LRRK2变构调节剂或多特异性LRRK2变构调节剂的核酸分子、包含所述核酸分子的载体或药物组合物，用于治疗LRRK2相关病患，具体地用于治疗帕金森病。
一种用于检测生物样品中人LRRK2蛋白定位和分布的体外方法，所述方法包括以下步骤：
使生物样品与所述LRRK2特异性ISVD或包含LRRK2特异性ISVD的多特异性试剂反应，和
检测所述LRRK2特异性ISVD在所述生物样品中的定位和分布。
编码所述LRRK2变构调节剂或所述多特异性LRRK2变构调节剂的核酸分子。
包含所述核酸分子的载体，优选病毒载体、慢病毒或腺病毒载体。
参考文献
1.Gloeckner，C.J.，Boldt，K.，Von Zweydorf，F.，Helm，S.，Wiesent，L.，Sarioglu，H.and Ueffing，M.(2010)Phosphopeptide analysis reveals two discreteclusters of phosphorylation in the N-terminus and the Roc domain of theParkinson-disease associated protein kinase LRRK2.J.Proteome Res.9，1738-45.
2.Guaitoli，G.，Raimondi，F.，Gilsbach，B.K.，Gómez-Llorente，Y.，Deyaert，E.，Renzi，F.，Li，X.，Schaffner，A.，Jagtap，P.K.A.，Boldt，K.，et al.(2016)Structuralmodel of the dimeric Parkinson′s protein LRRK2 reveals a compact architectureinvolving distant interdomain contacts.Proc.Natl.Acad.Sci.113，E4357-E4366.
3.Gloeckner，C.J.，Boldt，K.，Schumacher，A.，Roepman，R.and Ueffing，M.(2007)A novel tandem affinity purification strategy for the efficientisolation and characterisation of native protein complexes.Proteomics.7，4228-34.
4.Gul，N.，Linares，D.M.，Ho，F.Y.and Poolman，B.(2014)Evolved escherichiacolistrains for amplified，functional expression of membraneproteins.J.Mol.Biol.
5.Ho，F.Y.and Poolman，B.(2015)Engineering escherichia coliforfunctional expression of membrane proteins.In Methods in Enzymology.
6.Rudi，K.，Ho，F.Y.，Gilsbach，B.K.，Pots，H.，Wittinghofer，A.，Kortholt，A.and Klare，J.P.(2015)Conformational heterogeneity of the Roc domains inC.tepidum Roc-COR and implications for human LRRK2 Parkinsonmutations.Biosci.Rep.35，e00254-e00254.
7.Pardon，E.，Laeremans，T.，Triest，S.，Rasmussen，S.G.F.，
Figure BDA0003901770190000711
A.，Ruf，A.，Muyldermans，S.，Hol，W.G.J.，Kobilka，B.K.and Steyaert，J.(2014)A generalprotocolfor the generation of Nanobodies for structural biology.Nat.Protoc.9，674-93.
8.Gloeckner，C.J.，Boldt，K.and Ueffing，M.(2009)Strep/FLAG tandemaffinity purification(SF-TAP)to study protein interactions.Curr.Protoc.Protein Sci.chapter 19，unit 19.20.
9.Carrion，M.D.P.，Marsicano，S.，Daniele，F.，Marte，A.，Pischedda，F.，Cairano，E.Di，Piovesana，E.，Von Zweydorf，F.，Kremmer，E.，Gloeckner，C.J.，et al.(2017)The LRRK2 G2385R variant is a partial loss-of-function mutation thataffects synaptic vesicle trafficking through altered proteininteractions.Sci.Rep.7，5377.
10.Kandur，W.V.，Ka0，A.，Vellucci，D.，Huang，L.and Rychnovsky，S.D.(2015)Design of CID-cleavable protein cross-linkers：ldentical mass modificationsfor simpler sequence analysis.Org.Biomol.Chem.
11.Liu，F.，Rijkers，D.T.S.，Post，H.and Heck，A.J.R.(2015)Proteome-wideprofiling of protein assemblies by cross-linking massspectrometry.Nat.Methods.
12.Combe，c.W.，Fischer，L.and Rappsilber，J.(2015)xiNET：Cross-linknetwork maps with residue resolution.Mol.Cell. Proteomics.
13.Wauters，L.，Versées，W.and Kortholt，A.(2019)Roco Proteins：GTPaseswith a Baroque Structure and Mechanism.Int J MolSci.20，147.
14.Marin，l.，van Egmond，W.N.and van Haastert，P.J.M.(2008)The Rocoprotein family：a functional perspective.FASEB J.22，3103-3110.
15.Marín，I.(2006)The Parkinson disease gene LRRK2：Evolutionary andstructural insights.Mol.Biol.Evol.23，2423-2433.
16.Guo，L.，Gandhi，P.N.，Wang，W.，Petersen，R.B.，Wilson-Delfosse，A.L.andChen，S.G.(2007)The Parkinson’s disease-associated protein，leucine-rich repeatkinase 2(LRRK2)，is an authentic GTPase thatstimulates kinaseactivity.Exp.CellRes.313，3658-3670.
17.Deyaert，E.，Wauters，L.，Guaitoli，G.，Konijnenberg，A.，Leemans，M.，Terheyden，S.，Petrovic，A.，Gallardo，R.，Nederveen-Schippers，L.M.，Athanasopoulos，P.S.，et al.(2017)A homologue of the Parkinson’s disease-associated proteinLRRK2 undergoes a monomer-dimer transition during GTP turnover.Nat.Commun.8.
18.Deyaert，E.，Leemans，M.，Singh，R.K.，Gallardo，R.，Steyaert，J.，Kortholt，A.，Lauer，J.and Versées，W.(2019)Structure and nucleotide-inducedconformational dynamics of the Chlorobium tepidum Roco protein.Biochem.J.476，51-66.
19.James，N.G.，Digman，M.A.，Gratton，E.，Barylko，B.，Ding，X.，Albanesi，J.P.，Goldberg，M.S.and Jameson，D.M.(2012)Number and brightness analysis ofLRRK2 oligomerization inlive cells.Biophys.J.102，L41-3.
20.Berger，Z.，Smith，K.A.and Lavoie，M.J.(2010)Membrane localization ofLRRK2 is associated with increased formation of the highly active lrrk2 dimerand changes in its phosphorylation.Biochemistry 49，5511-5523.
21.Wu，C.-X.，Liao，J.，Park，Y.，Reed，X.，Engel，V.A.，Hoang，N.C.，Takagi，Y.，Johnson，S.M.，Wang，M.，Federici，M.，et al.(2019)Parkinson′s disease-associatedmutations in the GTPase domain of LRRK2 impair its nucleotide-dependentconformational dynamics.J.Biol.Chem.294，5907-5913.
22.Huang，X.，Wu，C.，Park，Y.，Long，X.，Hoang，Q.Q.and Liao，J.(2019)TheParkinson’s disease-associated mutation N1437H impairs conformationaldynamics in the G domain of LRRK2.FASEB J.33，4814-4823.
23.Rothbauer，U.，Zokghadr，K.，Tillib，S.，Nowak，D.，Schermelleh，L.，Gahl，A.，Backmann，N.，Conrath，K.，Muyldermans，S.，Cardoso，M.C.，et al.(2006)Targetingand tracing antigens inlive cells with fluorescent nanobodies.Nat.Methods.
24.Irannejad，R.，Tomshine，J.C.，Tomshine，J.R.，Chevalier，M.，Mahoney，J.P.，Steyaert，J.，Rasmussen，S.G.F.，Sunahara，R.K.，Ek-Samad，H.，Huang，B.，et al.(2013)Conformational biosensors reveal GPCR signalling from endosomes.Nature495，534-8.
25.Steger，M.，Tonelli，F.，Ito，G.，Davies，P.，Trost，M.，Vetter，M.，Wachter，S.，Lorentzen，E.，Duddy，G.，Wilson，S.，et al.(2016)Phosphoproteomics reveals thatParkinson′s disease kinase LRRK2regulates a subset of Rab GTPases.Elife 5.
26.Steger，M.，Diez，F.，Dhekne，H.S.，Lis，P.，Nirujogi，R.S.，Karayel，O.，Tonelli，F.，Martinez，T.N.，Lorentzen，E.，Pfeffer，S.R.，et al.(2017)Systematicproteomic analysis of LRRK2-mediated rab GTPase phosphorylation establishes aconnection to cliiogenesis.Elife 6.
27.Liu，Z.，Bryant，N.，Kumaran，R.，Beilina，A.，Abeliovich，A.，Cookson，M.R.and West，A.B.(2017)LRRK2 phosphorylates membrane-bound Rabs and isactivated by GTP-bound Rab7L1 to promote recruitment to the trans-GoIginetwork.Hum.Mol.Genet.
28.Sheng，Z.，Zhang，S.，Bustos，D.，Kleinheinz，T.，Le Pichon，C.E.，Dominguez，S.L.，Solanoy，H.O.，Drummond，J.，Zhang，X.，Ding，X.，et al.(2012)Ser1292autophosphorylatior is an indicator of LRRK2 kinase activitv and contributesto the cellular effects of PD mutations.Sci.Transl.Med.
29.Kluss，J.H.，Conti，M.M.，Kaganovich，A.，Beilina，A.，Melrose，H.L.，Cookson，M.R.and Mamais，A.(2018)Detection of endogenous S1292 LRRK2autophosphorylation in mouse tissue as a readout for kinase activity.npjPark.Dis.
30.Wang，S.，Liu，Z.，Ye，T.，Mabrouk，O.S.，Maltbie，T.，Aasly，J.and West，A.B.(2017)Elevated LRRK2 autophosphorylation in brain-derived and peripheralexosomes in LRRK2 mutation carriers.Acta Neuropathol.Commun.
31.Purlyte，E.，Dhekne，H.S.，Sarhan，A.R.，Gomez，R.，Lis，P.，Wightman，M.，Martinez，T.N.，Tonelli，F.，Pfeffer，S.R.and Alessi，D.R.(2017)Rab29activationofthe Parkinson′s disease-associated LRRK2 kinase.EMBO J.e201798099.
32.Pleiner，T.，Bates，M.，Trakhanov，S.，Lee，C.T.，Schliep，J.E.，Chug，H.，
Figure BDA0003901770190000731
M.，Stark，H.，Urlaub，H.and
Figure BDA0003901770190000732
D.(2015)Nanobodies：Site-specific Iabelingfor super-resolution imaging，rapid epitope-mapping and native protein complexisolation.Elife.
33.Muyldermans，S.(2013)Nanobodies：Natural Single-DomainAntibodies.Annu.Rev.Biochem.82，775-797.
34.Scott，J.D.，DeMong，D.E.，Greshock，T.J.，Basu，K.，Dai，X.，Harris，J.，Hruza，A.，Li，S.W.，Lin，S.I.，Liu，H.，et al.(2017)Discovery of a3-(4-Pyrimidinyl)Indazole(MLi-2)，an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase2(LRRK2)lnhibitor that Reduces Brain Kinase Activity.J.Med.chem.60.2983-2992.
35.Jaleel，M.，Nichols，R.J.，Deak，M.，campbell，D.G.，Gillardon，F.，Knebel，A.and Alessi，D.R.(2007)LRRK2 phosphorylates moesin at threonine-558：Characterization of how Parkinson’s disease mutants affect kinaseactivity.Biochem.J.
36.Deniston，C.K.，Salogiannis，J.，Mathea，S.，SRead，D.M.，Lahiri，I.，Donosa，O.，Watanabe，R.，
Figure BDA0003901770190000741
J.，Shiau，A.K.，Knapp，S.，et al.(2020)Structure ofLRRK2 in Parkinson′s disease and model for microtubule interaction.Nature.588(7837)：344-349.
37.Ramirez，M.B.，
Figure BDA0003901770190000744
A.J.L.，Fdez，E.，Madero-Pérez，J.，Gonnelli，A.，Drouyer，M.，Chartier-Harlin，M.-C.，TaymaRs，J.-M.，Bubacco，L.，Greggio，E.，et al.(2017)GTP binding regulates cellular localization of Parkinson′s disease-associated LRRK2.Hum.Mol.Genet.26，2747-2767.
38.Deng，X.，Dzamko，N.，Prescott，A.，Davies，P.，Liu，Q.，Yang，Q.，Lee，J.D.，Patricelli，M.P.，Nomanbhoy，T.K.，Alessi，D.R.，et al.(2011)Characterization of aselective inhibitor of the Parkinson’s disease kiRase LRRK2.Nat.Chem.Biol.7，203-205.
39.Dzamko，N.，Deak，M.，HeRtati，F.，Reith，A.D.，Prescott，A.R.，Alessi，D.R.and Nichols，R.J.(2010)lnhibition of LRRK2 kinase activity leads todephosphorylation of Ser910/Ser935，disruption of 14-3-3binding and alteredcytoplasmic localization.Biochem.J.
40.Kett，L.R.，Boassa，D.，Ho，C.C.Y.，Rideout，H.J.，Hu，J.，Terada，M.，Ellisman，M.and Dauer，W.T.(2012)LRRK2 Parkinson disease mutations enhance itsmicrotubule association.Hum.Mol.Genet.
41.Fell，M.J.，Mirescu，C.，Basu，K.，Cheewatrakoolpong，B.，DeMong，D.E.，Ellis，J.M.，Hyde，L.A.，Lin，Y.，Markgraf，C.G.，Mei，H.，et al.(2015)MLi-2，a potennt，selective，and centrally active compound for exploring the therapeuticpotential and safety of LRRK2 kiRase inhibition.J.Pharmacol.Exp.Ther
42.Watanabe，R.，Buschauer，R.，
Figure BDA0003901770190000742
J.，Audagnotto，M.，Lasker，K.，Lu，T.W.，Boassa，D.，Taylor，S.and Villa，E.(2020)The in situ structure of Parkinson’sdisease-linked LRRK2.cell.182(6)：1508-1518.e16.
43.Schaffner，A.，Li，X.，Gomez-Llorente，Y.，Leandrou，E.，Memou，A.，Clemente，N.，Yao，C.，Afsari，F.，Zhi，L.，Pan，N.，et al.(2019)Vitamin B 12modularesParkinson’s disease LRRK2 ki nase activity through allosteric regulation andconfers neuroprotection.CellRes.
44.
Figure BDA0003901770190000743
S.，BlaRchetot，C.，Maussang，D.，Gonzalez-Pajuelo，M.，Chow，K.Y.，Bosch，L.，De Vrieze，S.，Serruys，B.，Ulrichts，H.，Vandevelde，W.，et al.(2010)CXCR4nanobodies(VHH-based single variable domains)potently inhibit chemotaxis andHIV-1replication and mobilize stem cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
45.De Tavernier，E.，Detalle，L.，Morizzo，E.，Roobrouck，A.，De Taeye，S.，Rieger，M.，Verhaeghe，T.，Correia，A.，Van Hegelsom，R.，Figueirido，R.，et al.(2016)High throughput combinatorial formatting of pcrv nanobodies for efficientpotency improvement.J.Biol.Chem.
46.Fuji RN，Flagella M，Baca M，MA SB，Brodbeck J，Chan BK，Fiske BK，Honigberg L，Jubb AM，Katavolos P，Lee DW，Lewin-Koh SC，Lin T，Liu X，Liu S，Lyssikatos JP，O′Mahony J，Reichelt M，Roose-Girma M，SheRg Z et al.(2015)Effectof selective LRRK2 kinase inhibition on Ronhuman primate Iung.Sciencetramslational medicine7：1-13.
47.Taymars JM，Greggio E(2016)LRRK2 Kinase Inhibition as a TherapeuticStrategy for Parkinson′s Disease，Where Do We Stand？Curr Neuropharmaco/14：214-25.
48.Saraiva c，Praca c，Ferreira R，Santos T，Ferreira L，Bernardino L(2016)Nanoparticle-mediated brain drug delivery：Overcoming blood-brainbarrier to treat rneurodegenerative diseases.J Control Release 235∶34-47.
49.Zipkin M(2019)Exosome redux.Nat Biotechnol 37：1395-1400.
50.Gloeckner et al.(2006).The Parkinson disease causing LRRK2mutation I2020T is associated with increased kiRase activity.Hum Mol Gemet.15(2)：223-32.
51.LeemaRs，M.，Galicia，C.，Deyaert，E.，Daems，E.，Krause，L.，Paesmans，J.，Pardon，E.，Steyaert，J.，Kortholt，A.，Sobott，F.，et al.(2020)Allosteric modulationof the GTPase activity of a bacterial LRRK2 hom0log by conformation-specificNanobodies.Biochem J.477，1203-1218.
52.Gardet，A.，Benita，Y.，Li，C.，Sands，B.E.，Ballester，l.，Stevens，C.，Korzenik，J.R.，Rioux，J.D.，Daly，M.J.，Xavier，R.J.，et al.(2010)LRRK2 ls Involvedin the IFN-γ Response and Host Response to PathogeRs.J.Immunol.185，5577-85.
53.Kubala，M.H.，Kovtun，O.，Alexandrov，K.and Collins，B.M.(2010)Structural and thermodynamic analysis of the GFP：GFP-nanobody complex.ProteinSci.
54.Lee，H.，Flynn，R.，Sharma，I.，Carling，P.J.，Nicholls，F.J.，Stegmann，M.，Vowles，J.，Wade-Martins，R.，James，W.S.and cowley，S.A.(2020)LRRK2 is recruitedto phagosomes and co-recruits Rab8 and Rab10 in human pluripoteRt stem cell-derived macrophages.Stem Cellreports.14，5：940-955.
55.Eguchi，T.，Kuwahara，T.，Sakurai，M.，Komori，T.，Fujimoto，T.and Ito，G.(2018)LRRK2 and its substrate Rab GTPases are sequentially targeted ontostressed Iysosomes and maintain their homeostasis 115.
56.Liu，Z.，Xu，E.，Zhao，H.T.，Cole，T.and West，A.B.(2020)LRRK2 and Rab10coordinate macropinocytosis to mediate immunological responses inphagocytes.EMBO J.
57.Massa，S.，Vikani，N.，Betti，C.，Ballet，S.，VanderhaegeR，S.，Steyaert，J.，Descamps，B.，Vanhove，C.，Bunschoten，A.，van Leeuwen，F.W.B.，et al.(2016)SortaseA-mediated site-specific Iabeling of camelid single-domain antibody-fragments：a versatile strategy for multiple molecular imagingmodalities.Contrast Media Mol.lmaging11，328-339.
58.Lees，A.J.，Hardy，J.and Revesz，T.(2009)Parkinson′s disease.Lancet373，2055-2066.
59.Elbaz，A.，Carcaillon，L.，Kab，S.and Moisan，F.(2016)Epidemiology ofParkinson’s disease.Rev Neurol172，14-26.
60.Tysnes，O.B.and Storstein，A.(2017)Epidemiology of Parkinson′sdisease.J Neural Transm 124，901-905.
61.Fahn，S.(2003)Description of Parkinson′s disease as a clinicalsyndrome.Ann.N.Y.Acad.Sci.991，1-14.
62.Zimprich，A.，Biskup，S.，Leitner，P.，Lichtner，P.，Farrer，M.，Lincoln，S.，Kachergus，J.，Hulihan，M.，Uitti，R.J.，Calne，D.B.，et al.(2004)Mutations in LRRK2cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology.Neuron 44,601-607.
63.Paisán-Ruíz，C.，Jain，S.,Evans,E.W.,Gilks,W.P.,Simón,J.,Van DerBrug,M.,De Munain，A.L.，Aparicio，S.，Gil,A.M.,Khan，N.，et al.(2004)Cloning ofthe gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson’sdisease.Neuron44,595-600.
64.Monfrini，E.and Di Fonzo，A.(2017)Leucine-rich repeat kinase(LRRK2)genetics and parkinson’s disease.In Advances in Neurobiology，pp 3-30.
65.DiMaio，R.，Hoffman，E.K.，Rocha，E.M.，Keeney，M.T.，Sanders，L.H.，DeMiranda，B.R.，Zharikov，A.，Van Laar，A.，Stepan，A.F.，Lanz，T.A.，et al.(2018)LRRK2activation in idiopathic Parkinson’s disease.Sci.Transl.Med.10，eaar5429.
66.Gilks，W.P.，Abou-Sleiman，P.M.，Gandhi，S.，Jain，S.，Singleton,A.,Lees,A.J.，Shaw，K.，Bhatia，K.P.，Bonifati，V.，Quinn，N.P.，et al.(2005)A common LRRK2mutation in idiopathic Parkinson’s disease.Lancet 365.415-416.
67.Barrett，J.C.，Hansoul，S.，Nicolae，D.L.，Cho，J.H.，Duerr，R.H.，Rioux，J.D.，Brant，S.R.,Silverberg,M.S.，Taylor，K.D.，Barmada，M.M.，et al.(2008)Genome-wide association defines more than30distinct susceptibility loci for Crohn’sdisease.Nat.Genet.40，955-62.
68.Hui，K.Y.，Fernandez-Hernandez，H.，Hu，J.，Schaffner，A.，Pankratz，N.，Hsu，N.Y.，Chuang，L.S.，Carmi，S.，Villaverde，N.，Li，X.，et al.(2018)Functionalvariants in the LRRK2 gene confer shared effects on risk for Crohn’s diseaseand Parkinson’s disease.Sci.Transl.Med.10,eaai7795.
69.Marín,I.,van Egmond,W.N.and van Haastert,P.J.M.(2008)The Rocoprotein family：a functional perspective.FASEB J.22，3103-3110.
70.Marin,l.(2006)The Parkinson disease gene LRRK2：Evolutionary and structuralinsights.Mol.Biol.Evol.23，2423-2433.
71.Civiero，L.，Vancraenenbroeck，R.，Belluzzi，E.，Beilina，A.，Lobbestael，E.，Reyniers，L.，Gao，F.，Micetic，l.，de Maeyer，M.，Bubacco，L.，et al.(2012)Biochemical Characterization of Highly Purified Leucine-Rich Repeat Kinases1and2Demonstrates Formation of Homodimers.PLoS One 7.
72.Sen，S.，Webber，P.J.and West，A.B.(2009)Dependence of leucine-richrepeat kinase 2(LRRK2)kinase activity on dimerization.J.Biol.Chem.284,36346-36356.
73.Liao，J.，Wu，C.-X.，Burlak，C.，Zhang，S.，Sahm，H.，Wang，M.，Zhang，Z.-Y.，Vogel，K.W.，Federici，M.，Riddle，S.M.，et al.(2014)Parkinson disease-associatedmutation R1441H in LRRK2 prolongs the“active state”of its GTPase domain.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111.4055-60.
74.Li，X.，Tan，Y.C.，Poulose，S.，Olanow，C.W.，Huang，X.Y.and Yue，Z.(2007)Leucine-rich repeat kinase 2(LRRK2)/PARK8 possesses GTPase activity that isaltered in familial Parkinson′s disease R1441C/G mutants.J.Neurochem.103,238-247.
75.Lewis，P.A.，Greggio，E.，Beilina，A.，Jain，S.，Baker，A.and Cookson，M.R.(2007)The R1441C mutation of LRRK2 disrupts GTP hydrolysis.Biochem.Biophys.Res.Commun.357，668-671.
76.Luzón-Toro,B.,de la Torre,E.R.,Delgado,A.，Pérez-Tur，J.andHilfiker,S.(2007)Mechanistic insight into the dominant mode of the Parkinson′s disease-associated G2019S LRRK2 mutation.Hum.Mol.Genet.16,2031-2039.
77.West，A.B.,Moore,D.J.,Biskup,S.,Bugayenko,A.,Smith,W.W.,Ross,C.A.,Dawson,V.L.and Dawson,T.M.(2005)Parkinson′s disease-associated mutations inleucine-rich repeat kinase 2augment kinase activity.PNAS 102,16842-16847.
78.Berwick，D.C.，Heaton，G.R.，Azeggagh，S.and Harvey，K.(2019)LRRK2Biology from structure to dysfunction：Research progresses，but the themesremain the same.Mol.Neurodegener.，Molecular Neurodegeneration14，1-22.
79.Scott，J.D.，DeMong，D.E.，Greshock，T.J.，Basu，K.，Dai，X.，Harris，J.，Hruza，A.，Li,S.W.,Lin,S.I.,Liu,H.，et al.(2017)Discovery of a3-(4-Pyrimidinyl)Indazole(MLi-2)，an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase2(LRRK2)Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity.J.Med.Chem.60.2983-2992.
80.Domingos，S.，Duarte，T.，Saraiva，L.，Guedes，R.C.and Moreira，R.(2019)Targeting leucine-rich repeat kinase 2(LRRK2)for the treatment of Parkinson′sdisease.Future Med.Chem.11，1953-1977.
81.Baptista,M.A.S.,Dave,K.D.，Frasier，M.A.,Sherer,T.B.,Greeley，M.，Beck，M.J.，Varsho,J.S.,Parker,G.A.，Moore，C.，Churchill，M.J.，et al.(2013)Loss ofleucine-rich repeat kinase 2(LRRK2)in rats leads to progressive abnormalphenotypes in peripheral organs.PLoS One 8，e80705.
82.Andersen，M.A.，Wegener，K.M.，Larsen，S.，Badolo，L.，Smith，G.P.，Jeggo，R.，Jensen，P.H.，Sotty，F.，Christensen，K.V.and Thougaard，A.(2018)PFE-360-inducedLRRK2 inhibition induces reversible，non-adverse renal changes inrats.Toxicology 395.15-22.
83.Dianne Bryce，Christopher M Ware，Janice D Woodhouse，Paul J Ciaccio，J Michael Ellis,Laxminarayan G Hegde,Sabu Kuruvilla，Matthew L Maddess，CarrieG Markgraf，Karin M Otte，Frederique M Poulet，Lauren M Timmins，Matthew Kennedy，M.J.F.(2021)Characterization of the onset，progression，and reversibility ofmorphological changes in mouse Iung following pharmacological inhibition ofLRRK2 kinase activity.J Pharmacol Exp Ther.Online ahe.
84.Bogoyevitch，M.A.and Fairlie，D.P.(2007)A new paradigm for proteinkinase inhibition：blocking phosphorylation without directly targeting ATPbinding.Drug Discov Today 12，622-33.
85.Lu，X.，Smaill，J.B.and Ding，K.(2019)New Promise and Opportunitiesfor Allosteric Kinase Inhibitors.Angew Chem Int Ed Engl.59(33)：13764-76.
86.Hudry，E.and Vandenberghe，L.H.(2019)Therapeutic AAV Gene Transferto the Nervous System：A Clinical Reality.Neuron 101，839-862.
87.Saraiva，J.，Nobre，R.J.and Pereira de Almeida，L.(2016)Gene therapyfor the CNS using AAVs：The impact of systemic delivery byAAV9.J.Control.Release 241，94-109.
88.Hocquemiller，M.，Giersch，L.，Audrain，M.，Parker，S.and Cartier，N.(2016)Adeno-AssoCiated Virus-Based Gene Therapy for CNS Diseases.Hum.GeneTher.27，478-96.
序列表
<110> 非营利性组织佛兰芒综合大学生物技术研究所
布鲁塞尔自由大学
格罗宁根大学
德国神经退行性疾病研究中心
<120> 富含亮氨酸的重复激酶2变构调节剂
<130> WV-JS/LRRK2/681
<150> US 62/981,200
<151> 2020-02-25
<150> EP 20165463.9
<151> 2020-03-25
<150> EP 20212466.5
<151> 2020-12-08
<160> 79
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体 CA12610
<400> 1
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Ile Phe Ser
20 25 30
Gly Asn Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gln Arg Glu
35 40 45
Leu Val Ala Gly Ile Thr Asn Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Arg Gln Phe
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Asn Ala Leu Asp Arg Glu Ala Arg Gln Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体 CA12618
<400> 2
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser
20 25 30
Pro Thr Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Leu Val Ala Gly Ile Thr Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Arg Asn Phe
50 55 60
Ala Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Asn Thr Leu Thr Ile Ser Trp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 3
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体 CA13612
<400> 3
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
20 25 30
Arg Tyr Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu
35 40 45
Phe Val Ala Arg Ile Thr Thr Ser Gly Ala Val Thr Thr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Gly Gln Gly Gln Leu Ser Ser Gln Ser Arg Phe Val
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体 CA14135
<400> 4
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Thr Ile Tyr Ala
20 25 30
Ile Asn Arg Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu
35 40 45
Leu Val Ala Leu Ile Thr Leu Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Gly Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gly
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Lys Val Glu Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Val Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体 CA13606
<400> 5
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Asn Ile Gly
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Ser Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Arg Ile Ala Ser Gly Gly Ser Ala Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
His Met Asn Ser Leu Lys Pro Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys His
85 90 95
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100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体 CA14259
<400> 6
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asp Val Asn Tyr
20 25 30
Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Arg Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Asn Trp Arg Gly Asp Asn Thr Asp Tyr Thr Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Lys Ser Ala Pro Tyr Trp Tyr Ser Asp Ile Ala Pro Asp Tyr
100 105 110
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115 120
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体 CA14130
<400> 7
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Arg Ser
20 25 30
Ile Thr Thr Ser Ala Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu
35 40 45
Leu Val Ala Gly Ile Ser Ser Gly Thr Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体 CA14133
<400> 8
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Arg Ser
20 25 30
Ile Ala Thr Ser Ala Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gln Arg Glu
35 40 45
Leu Val Ala Gly Ile Ser Ser Gly Thr Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys His Ala Trp Ile Ser Gly Thr Trp Ile Ser Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 9
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体 CA13611
<400> 9
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser
20 25 30
Ser Tyr Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Phe Val Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Ser Asp Arg Gly Gly Phe Ile Ala Thr Ser Gly Gly
100 105 110
Trp Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 10
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体 CA14134
<400> 10
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser
20 25 30
Thr Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Thr Val Ala Ala Val Lys Trp Ser Gly Asp Met Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Arg Arg Gly Leu Ser Tyr Tyr Arg Gly Pro Ser Glu
100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 11
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体 CA12614
<400> 11
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Arg
20 25 30
Arg Asn Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Val Thr Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Leu Val Ala Gly Ile Thr Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr Arg Asp Phe
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Asn Leu Leu Ser Glu Met Leu Gln Thr Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体 CA14136
<400> 12
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Val Arg Thr Phe Ser
20 25 30
Phe Tyr Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Phe Val Ala Ala Ile Arg Trp Thr Ala Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp
50 55 60
Ile Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn Thr
65 70 75 80
Val Val Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Ala Gln Arg Gly Tyr Leu Val Glu Ala Ala Ser Arg Glu
100 105 110
Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 13
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体 CA13620
<400> 13
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Leu Thr Phe Gly
20 25 30
Thr Tyr Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Ala Glu Lys Glu Arg Glu
35 40 45
Phe Val Ala Phe Ile Ser Gly Arg Gly Gly Tyr Arg Asp Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Leu Thr Ile Phe Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn
65 70 75 80
Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp
85 90 95
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Gln Gly Ser Pro Val Arg Ser
100 105 110
Lys Glu Glu Tyr Asn Asn Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser
<210> 14
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体 CA14131
<400> 14
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Ser
20 25 30
Thr Asn Thr Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu
35 40 45
Trp Val Gly Gly Ile Thr Pro Gly Gly Phe Thr Asn Tyr Ile Asn Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asn Thr Ile
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Asn Thr Leu Ser Arg Met Ala Leu Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体 CA13599
<400> 15
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser
20 25 30
Ile Tyr Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu
35 40 45
Leu Val Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Asn Ala Asp His Thr Pro Ala Gly Thr Phe Gln Thr Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体 CA13602
<400> 16
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Gly Phe Ser
20 25 30
Ile Tyr Ala Met Gly Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gln Arg Glu
35 40 45
Leu Val Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Asn Ala Asp Ile Thr Val Val Ala Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 17
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体 CA13598
<400> 17
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser
20 25 30
Ile Asn Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu
35 40 45
Leu Val Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp His Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Asn Ala Gly Asp Trp Gln Thr Met Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体 CA13617
<400> 18
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ile Ile Phe His
20 25 30
Trp Tyr Asp Met Asp Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu
35 40 45
Leu Val Ala Thr Ile Thr Thr Gly Gly Arg Ala Asp Tyr Ala Asp Phe
50 55 60
Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ser Phe Gln Asp His Val Leu Arg Arg Trp Gly Gln Gly Thr Gln
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 19
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 纳米抗体 CA16072
<400> 19
Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
1 5 10 15
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Ser
20 25 30
Thr Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Val Ser Ala Ile Ser Pro Gly Gly Asp Thr Ala Tyr Ala Asp Ser
50 55 60
Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Ala Val Arg Phe Leu Arg Ala Pro Asp Leu Thr Glu Lys Arg
100 105 110
Leu Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 6x组氨酸和EPEA C末端标签
<400> 20
His His His His His His Glu Pro Glu Ala
1 5 10
<210> 21
<211> 2527
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Met Ala Ser Gly Ser Cys Gln Gly Cys Glu Glu Asp Glu Glu Thr Leu
1 5 10 15
Lys Lys Leu Ile Val Arg Leu Asn Asn Val Gln Glu Gly Lys Gln Ile
20 25 30
Glu Thr Leu Val Gln Ile Leu Glu Asp Leu Leu Val Phe Thr Tyr Ser
35 40 45
Glu His Ala Ser Lys Leu Phe Gln Gly Lys Asn Ile His Val Pro Leu
50 55 60
Leu Ile Val Leu Asp Ser Tyr Met Arg Val Ala Ser Val Gln Gln Val
65 70 75 80
Gly Trp Ser Leu Leu Cys Lys Leu Ile Glu Val Cys Pro Gly Thr Met
85 90 95
Gln Ser Leu Met Gly Pro Gln Asp Val Gly Asn Asp Trp Glu Val Leu
100 105 110
Gly Val His Gln Leu Ile Leu Lys Met Leu Thr Val His Asn Ala Ser
115 120 125
Val Asn Leu Ser Val Ile Gly Leu Lys Thr Leu Asp Leu Leu Leu Thr
130 135 140
Ser Gly Lys Ile Thr Leu Leu Ile Leu Asp Glu Glu Ser Asp Ile Phe
145 150 155 160
Met Leu Ile Phe Asp Ala Met His Ser Phe Pro Ala Asn Asp Glu Val
165 170 175
Gln Lys Leu Gly Cys Lys Ala Leu His Val Leu Phe Glu Arg Val Ser
180 185 190
Glu Glu Gln Leu Thr Glu Phe Val Glu Asn Lys Asp Tyr Met Ile Leu
195 200 205
Leu Ser Ala Leu Thr Asn Phe Lys Asp Glu Glu Glu Ile Val Leu His
210 215 220
Val Leu His Cys Leu His Ser Leu Ala Ile Pro Cys Asn Asn Val Glu
225 230 235 240
Val Leu Met Ser Gly Asn Val Arg Cys Tyr Asn Ile Val Val Glu Ala
245 250 255
Met Lys Ala Phe Pro Met Ser Glu Arg Ile Gln Glu Val Ser Cys Cys
260 265 270
Leu Leu His Arg Leu Thr Leu Gly Asn Phe Phe Asn Ile Leu Val Leu
275 280 285
Asn Glu Val His Glu Phe Val Val Lys Ala Val Gln Gln Tyr Pro Glu
290 295 300
Asn Ala Ala Leu Gln Ile Ser Ala Leu Ser Cys Leu Ala Leu Leu Thr
305 310 315 320
Glu Thr Ile Phe Leu Asn Gln Asp Leu Glu Glu Lys Asn Glu Asn Gln
325 330 335
Glu Asn Asp Asp Glu Gly Glu Glu Asp Lys Leu Phe Trp Leu Glu Ala
340 345 350
Cys Tyr Lys Ala Leu Thr Trp His Arg Lys Asn Lys His Val Gln Glu
355 360 365
Ala Ala Cys Trp Ala Leu Asn Asn Leu Leu Met Tyr Gln Asn Ser Leu
370 375 380
His Glu Lys Ile Gly Asp Glu Asp Gly His Phe Pro Ala His Arg Glu
385 390 395 400
Val Met Leu Ser Met Leu Met His Ser Ser Ser Lys Glu Val Phe Gln
405 410 415
Ala Ser Ala Asn Ala Leu Ser Thr Leu Leu Glu Gln Asn Val Asn Phe
420 425 430
Arg Lys Ile Leu Leu Ser Lys Gly Ile His Leu Asn Val Leu Glu Leu
435 440 445
Met Gln Lys His Ile His Ser Pro Glu Val Ala Glu Ser Gly Cys Lys
450 455 460
Met Leu Asn His Leu Phe Glu Gly Ser Asn Thr Ser Leu Asp Ile Met
465 470 475 480
Ala Ala Val Val Pro Lys Ile Leu Thr Val Met Lys Arg His Glu Thr
485 490 495
Ser Leu Pro Val Gln Leu Glu Ala Leu Arg Ala Ile Leu His Phe Ile
500 505 510
Val Pro Gly Met Pro Glu Glu Ser Arg Glu Asp Thr Glu Phe His His
515 520 525
Lys Leu Asn Met Val Lys Lys Gln Cys Phe Lys Asn Asp Ile His Lys
530 535 540
Leu Val Leu Ala Ala Leu Asn Arg Phe Ile Gly Asn Pro Gly Ile Gln
545 550 555 560
Lys Cys Gly Leu Lys Val Ile Ser Ser Ile Val His Phe Pro Asp Ala
565 570 575
Leu Glu Met Leu Ser Leu Glu Gly Ala Met Asp Ser Val Leu His Thr
580 585 590
Leu Gln Met Tyr Pro Asp Asp Gln Glu Ile Gln Cys Leu Gly Leu Ser
595 600 605
Leu Ile Gly Tyr Leu Ile Thr Lys Lys Asn Val Phe Ile Gly Thr Gly
610 615 620
His Leu Leu Ala Lys Ile Leu Val Ser Ser Leu Tyr Arg Phe Lys Asp
625 630 635 640
Val Ala Glu Ile Gln Thr Lys Gly Phe Gln Thr Ile Leu Ala Ile Leu
645 650 655
Lys Leu Ser Ala Ser Phe Ser Lys Leu Leu Val His His Ser Phe Asp
660 665 670
Leu Val Ile Phe His Gln Met Ser Ser Asn Ile Met Glu Gln Lys Asp
675 680 685
Gln Gln Phe Leu Asn Leu Cys Cys Lys Cys Phe Ala Lys Val Ala Met
690 695 700
Asp Asp Tyr Leu Lys Asn Val Met Leu Glu Arg Ala Cys Asp Gln Asn
705 710 715 720
Asn Ser Ile Met Val Glu Cys Leu Leu Leu Leu Gly Ala Asp Ala Asn
725 730 735
Gln Ala Lys Glu Gly Ser Ser Leu Ile Cys Gln Val Cys Glu Lys Glu
740 745 750
Ser Ser Pro Lys Leu Val Glu Leu Leu Leu Asn Ser Gly Ser Arg Glu
755 760 765
Gln Asp Val Arg Lys Ala Leu Thr Ile Ser Ile Gly Lys Gly Asp Ser
770 775 780
Gln Ile Ile Ser Leu Leu Leu Arg Arg Leu Ala Leu Asp Val Ala Asn
785 790 795 800
Asn Ser Ile Cys Leu Gly Gly Phe Cys Ile Gly Lys Val Glu Pro Ser
805 810 815
Trp Leu Gly Pro Leu Phe Pro Asp Lys Thr Ser Asn Leu Arg Lys Gln
820 825 830
Thr Asn Ile Ala Ser Thr Leu Ala Arg Met Val Ile Arg Tyr Gln Met
835 840 845
Lys Ser Ala Val Glu Glu Gly Thr Ala Ser Gly Ser Asp Gly Asn Phe
850 855 860
Ser Glu Asp Val Leu Ser Lys Phe Asp Glu Trp Thr Phe Ile Pro Asp
865 870 875 880
Ser Ser Met Asp Ser Val Phe Ala Gln Ser Asp Asp Leu Asp Ser Glu
885 890 895
Gly Ser Glu Gly Ser Phe Leu Val Lys Lys Lys Ser Asn Ser Ile Ser
900 905 910
Val Gly Glu Phe Tyr Arg Asp Ala Val Leu Gln Arg Cys Ser Pro Asn
915 920 925
Leu Gln Arg His Ser Asn Ser Leu Gly Pro Ile Phe Asp His Glu Asp
930 935 940
Leu Leu Lys Arg Lys Arg Lys Ile Leu Ser Ser Asp Asp Ser Leu Arg
945 950 955 960
Ser Ser Lys Leu Gln Ser His Met Arg His Ser Asp Ser Ile Ser Ser
965 970 975
Leu Ala Ser Glu Arg Glu Tyr Ile Thr Ser Leu Asp Leu Ser Ala Asn
980 985 990
Glu Leu Arg Asp Ile Asp Ala Leu Ser Gln Lys Cys Cys Ile Ser Val
995 1000 1005
His Leu Glu His Leu Glu Lys Leu Glu Leu His Gln Asn Ala Leu
1010 1015 1020
Thr Ser Phe Pro Gln Gln Leu Cys Glu Thr Leu Lys Ser Leu Thr
1025 1030 1035
His Leu Asp Leu His Ser Asn Lys Phe Thr Ser Phe Pro Ser Tyr
1040 1045 1050
Leu Leu Lys Met Ser Cys Ile Ala Asn Leu Asp Val Ser Arg Asn
1055 1060 1065
Asp Ile Gly Pro Ser Val Val Leu Asp Pro Thr Val Lys Cys Pro
1070 1075 1080
Thr Leu Lys Gln Phe Asn Leu Ser Tyr Asn Gln Leu Ser Phe Val
1085 1090 1095
Pro Glu Asn Leu Thr Asp Val Val Glu Lys Leu Glu Gln Leu Ile
1100 1105 1110
Leu Glu Gly Asn Lys Ile Ser Gly Ile Cys Ser Pro Leu Arg Leu
1115 1120 1125
Lys Glu Leu Lys Ile Leu Asn Leu Ser Lys Asn His Ile Ser Ser
1130 1135 1140
Leu Ser Glu Asn Phe Leu Glu Ala Cys Pro Lys Val Glu Ser Phe
1145 1150 1155
Ser Ala Arg Met Asn Phe Leu Ala Ala Met Pro Phe Leu Pro Pro
1160 1165 1170
Ser Met Thr Ile Leu Lys Leu Ser Gln Asn Lys Phe Ser Cys Ile
1175 1180 1185
Pro Glu Ala Ile Leu Asn Leu Pro His Leu Arg Ser Leu Asp Met
1190 1195 1200
Ser Ser Asn Asp Ile Gln Tyr Leu Pro Gly Pro Ala His Trp Lys
1205 1210 1215
Ser Leu Asn Leu Arg Glu Leu Leu Phe Ser His Asn Gln Ile Ser
1220 1225 1230
Ile Leu Asp Leu Ser Glu Lys Ala Tyr Leu Trp Ser Arg Val Glu
1235 1240 1245
Lys Leu His Leu Ser His Asn Lys Leu Lys Glu Ile Pro Pro Glu
1250 1255 1260
Ile Gly Cys Leu Glu Asn Leu Thr Ser Leu Asp Val Ser Tyr Asn
1265 1270 1275
Leu Glu Leu Arg Ser Phe Pro Asn Glu Met Gly Lys Leu Ser Lys
1280 1285 1290
Ile Trp Asp Leu Pro Leu Asp Glu Leu His Leu Asn Phe Asp Phe
1295 1300 1305
Lys His Ile Gly Cys Lys Ala Lys Asp Ile Ile Arg Phe Leu Gln
1310 1315 1320
Gln Arg Leu Lys Lys Ala Val Pro Tyr Asn Arg Met Lys Leu Met
1325 1330 1335
Ile Val Gly Asn Thr Gly Ser Gly Lys Thr Thr Leu Leu Gln Gln
1340 1345 1350
Leu Met Lys Thr Lys Lys Ser Asp Leu Gly Met Gln Ser Ala Thr
1355 1360 1365
Val Gly Ile Asp Val Lys Asp Trp Pro Ile Gln Ile Arg Asp Lys
1370 1375 1380
Arg Lys Arg Asp Leu Val Leu Asn Val Trp Asp Phe Ala Gly Arg
1385 1390 1395
Glu Glu Phe Tyr Ser Thr His Pro His Phe Met Thr Gln Arg Ala
1400 1405 1410
Leu Tyr Leu Ala Val Tyr Asp Leu Ser Lys Gly Gln Ala Glu Val
1415 1420 1425
Asp Ala Met Lys Pro Trp Leu Phe Asn Ile Lys Ala Arg Ala Ser
1430 1435 1440
Ser Ser Pro Val Ile Leu Val Gly Thr His Leu Asp Val Ser Asp
1445 1450 1455
Glu Lys Gln Arg Lys Ala Cys Met Ser Lys Ile Thr Lys Glu Leu
1460 1465 1470
Leu Asn Lys Arg Gly Phe Pro Ala Ile Arg Asp Tyr His Phe Val
1475 1480 1485
Asn Ala Thr Glu Glu Ser Asp Ala Leu Ala Lys Leu Arg Lys Thr
1490 1495 1500
Ile Ile Asn Glu Ser Leu Asn Phe Lys Ile Arg Asp Gln Leu Val
1505 1510 1515
Val Gly Gln Leu Ile Pro Asp Cys Tyr Val Glu Leu Glu Lys Ile
1520 1525 1530
Ile Leu Ser Glu Arg Lys Asn Val Pro Ile Glu Phe Pro Val Ile
1535 1540 1545
Asp Arg Lys Arg Leu Leu Gln Leu Val Arg Glu Asn Gln Leu Gln
1550 1555 1560
Leu Asp Glu Asn Glu Leu Pro His Ala Val His Phe Leu Asn Glu
1565 1570 1575
Ser Gly Val Leu Leu His Phe Gln Asp Pro Ala Leu Gln Leu Ser
1580 1585 1590
Asp Leu Tyr Phe Val Glu Pro Lys Trp Leu Cys Lys Ile Met Ala
1595 1600 1605
Gln Ile Leu Thr Val Lys Val Glu Gly Cys Pro Lys His Pro Lys
1610 1615 1620
Gly Ile Ile Ser Arg Arg Asp Val Glu Lys Phe Leu Ser Lys Lys
1625 1630 1635
Arg Lys Phe Pro Lys Asn Tyr Met Ser Gln Tyr Phe Lys Leu Leu
1640 1645 1650
Glu Lys Phe Gln Ile Ala Leu Pro Ile Gly Glu Glu Tyr Leu Leu
1655 1660 1665
Val Pro Ser Ser Leu Ser Asp His Arg Pro Val Ile Glu Leu Pro
1670 1675 1680
His Cys Glu Asn Ser Glu Ile Ile Ile Arg Leu Tyr Glu Met Pro
1685 1690 1695
Tyr Phe Pro Met Gly Phe Trp Ser Arg Leu Ile Asn Arg Leu Leu
1700 1705 1710
Glu Ile Ser Pro Tyr Met Leu Ser Gly Arg Glu Arg Ala Leu Arg
1715 1720 1725
Pro Asn Arg Met Tyr Trp Arg Gln Gly Ile Tyr Leu Asn Trp Ser
1730 1735 1740
Pro Glu Ala Tyr Cys Leu Val Gly Ser Glu Val Leu Asp Asn His
1745 1750 1755
Pro Glu Ser Phe Leu Lys Ile Thr Val Pro Ser Cys Arg Lys Gly
1760 1765 1770
Cys Ile Leu Leu Gly Gln Val Val Asp His Ile Asp Ser Leu Met
1775 1780 1785
Glu Glu Trp Phe Pro Gly Leu Leu Glu Ile Asp Ile Cys Gly Glu
1790 1795 1800
Gly Glu Thr Leu Leu Lys Lys Trp Ala Leu Tyr Ser Phe Asn Asp
1805 1810 1815
Gly Glu Glu His Gln Lys Ile Leu Leu Asp Asp Leu Met Lys Lys
1820 1825 1830
Ala Glu Glu Gly Asp Leu Leu Val Asn Pro Asp Gln Pro Arg Leu
1835 1840 1845
Thr Ile Pro Ile Ser Gln Ile Ala Pro Asp Leu Ile Leu Ala Asp
1850 1855 1860
Leu Pro Arg Asn Ile Met Leu Asn Asn Asp Glu Leu Glu Phe Glu
1865 1870 1875
Gln Ala Pro Glu Phe Leu Leu Gly Asp Gly Ser Phe Gly Ser Val
1880 1885 1890
Tyr Arg Ala Ala Tyr Glu Gly Glu Glu Val Ala Val Lys Ile Phe
1895 1900 1905
Asn Lys His Thr Ser Leu Arg Leu Leu Arg Gln Glu Leu Val Val
1910 1915 1920
Leu Cys His Leu His His Pro Ser Leu Ile Ser Leu Leu Ala Ala
1925 1930 1935
Gly Ile Arg Pro Arg Met Leu Val Met Glu Leu Ala Ser Lys Gly
1940 1945 1950
Ser Leu Asp Arg Leu Leu Gln Gln Asp Lys Ala Ser Leu Thr Arg
1955 1960 1965
Thr Leu Gln His Arg Ile Ala Leu His Val Ala Asp Gly Leu Arg
1970 1975 1980
Tyr Leu His Ser Ala Met Ile Ile Tyr Arg Asp Leu Lys Pro His
1985 1990 1995
Asn Val Leu Leu Phe Thr Leu Tyr Pro Asn Ala Ala Ile Ile Ala
2000 2005 2010
Lys Ile Ala Asp Tyr Gly Ile Ala Gln Tyr Cys Cys Arg Met Gly
2015 2020 2025
Ile Lys Thr Ser Glu Gly Thr Pro Gly Phe Arg Ala Pro Glu Val
2030 2035 2040
Ala Arg Gly Asn Val Ile Tyr Asn Gln Gln Ala Asp Val Tyr Ser
2045 2050 2055
Phe Gly Leu Leu Leu Tyr Asp Ile Leu Thr Thr Gly Gly Arg Ile
2060 2065 2070
Val Glu Gly Leu Lys Phe Pro Asn Glu Phe Asp Glu Leu Glu Ile
2075 2080 2085
Gln Gly Lys Leu Pro Asp Pro Val Lys Glu Tyr Gly Cys Ala Pro
2090 2095 2100
Trp Pro Met Val Glu Lys Leu Ile Lys Gln Cys Leu Lys Glu Asn
2105 2110 2115
Pro Gln Glu Arg Pro Thr Ser Ala Gln Val Phe Asp Ile Leu Asn
2120 2125 2130
Ser Ala Glu Leu Val Cys Leu Thr Arg Arg Ile Leu Leu Pro Lys
2135 2140 2145
Asn Val Ile Val Glu Cys Met Val Ala Thr His His Asn Ser Arg
2150 2155 2160
Asn Ala Ser Ile Trp Leu Gly Cys Gly His Thr Asp Arg Gly Gln
2165 2170 2175
Leu Ser Phe Leu Asp Leu Asn Thr Glu Gly Tyr Thr Ser Glu Glu
2180 2185 2190
Val Ala Asp Ser Arg Ile Leu Cys Leu Ala Leu Val His Leu Pro
2195 2200 2205
Val Glu Lys Glu Ser Trp Ile Val Ser Gly Thr Gln Ser Gly Thr
2210 2215 2220
Leu Leu Val Ile Asn Thr Glu Asp Gly Lys Lys Arg His Thr Leu
2225 2230 2235
Glu Lys Met Thr Asp Ser Val Thr Cys Leu Tyr Cys Asn Ser Phe
2240 2245 2250
Ser Lys Gln Ser Lys Gln Lys Asn Phe Leu Leu Val Gly Thr Ala
2255 2260 2265
Asp Gly Lys Leu Ala Ile Phe Glu Asp Lys Thr Val Lys Leu Lys
2270 2275 2280
Gly Ala Ala Pro Leu Lys Ile Leu Asn Ile Gly Asn Val Ser Thr
2285 2290 2295
Pro Leu Met Cys Leu Ser Glu Ser Thr Asn Ser Thr Glu Arg Asn
2300 2305 2310
Val Met Trp Gly Gly Cys Gly Thr Lys Ile Phe Ser Phe Ser Asn
2315 2320 2325
Asp Phe Thr Ile Gln Lys Leu Ile Glu Thr Arg Thr Ser Gln Leu
2330 2335 2340
Phe Ser Tyr Ala Ala Phe Ser Asp Ser Asn Ile Ile Thr Val Val
2345 2350 2355
Val Asp Thr Ala Leu Tyr Ile Ala Lys Gln Asn Ser Pro Val Val
2360 2365 2370
Glu Val Trp Asp Lys Lys Thr Glu Lys Leu Cys Gly Leu Ile Asp
2375 2380 2385
Cys Val His Phe Leu Arg Glu Val Thr Val Lys Glu Asn Lys Glu
2390 2395 2400
Ser Lys His Lys Met Ser Tyr Ser Gly Arg Val Lys Thr Leu Cys
2405 2410 2415
Leu Gln Lys Asn Thr Ala Leu Trp Ile Gly Thr Gly Gly Gly His
2420 2425 2430
Ile Leu Leu Leu Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Ile Arg Val Ile
2435 2440 2445
Tyr Asn Phe Cys Asn Ser Val Arg Val Met Met Thr Ala Gln Leu
2450 2455 2460
Gly Ser Leu Lys Asn Val Met Leu Val Leu Gly Tyr Asn Arg Lys
2465 2470 2475
Asn Thr Glu Gly Thr Gln Lys Gln Lys Glu Ile Gln Ser Cys Leu
2480 2485 2490
Thr Val Trp Asp Ile Asn Leu Pro His Glu Val Gln Asn Leu Glu
2495 2500 2505
Lys His Ile Glu Val Arg Lys Glu Leu Ala Glu Lys Met Arg Arg
2510 2515 2520
Thr Ser Val Glu
2525
<210> 22
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N-末端SF标签(flag 和 twin-strep)
<400> 22
Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Ala Ala Ser Trp Ser
1 5 10 15
His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Arg Ser Thr Ser
35 40 45
Leu Tyr Lys Lys Ala Gly Phe
50 55
<210> 23
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nb CA12610的CDR1
<400> 23
Ser Gly Arg Ile Phe Ser Gly Asn Ala Met
1 5 10
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nb CA12618的CDR1
<400> 24
Ser Gly Ser Ile Phe Ser Pro Thr Ala Met
1 5 10
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nb CA13612的CDR1
<400> 25
Ser Gly Arg Thr Phe Ser Arg Tyr Thr Met
1 5 10
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nb CA14135的CDR1
<400> 26
Ser Gly Thr Ile Tyr Ala Ile Asn Arg Met Gly
1 5 10
<210> 27
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nb CA13606的CDR1
<400> 27
Ser Gly Ser Asn Ile Gly Tyr Met
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nb CA14259的CDR1
<400> 28
Ser Gly Asp Val Asn Tyr Ala Val
1 5
<210> 29
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nb CA14130的CDR1
<400> 29
Ser Gly Ser Ile Arg Ser Ile Thr Thr Ser
1 5 10
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA14133的CDR1
<400> 30
Ser Gly Ser Ile Arg Ser Ile Ala Thr Ser
1 5 10
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA13611的CDR1
<400> 31
Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met
1 5 10
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA14134的CDR1
<400> 32
Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met
1 5 10
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA12614的CDR1
<400> 33
Ser Gly Ser Ile Phe Arg Arg Asn Ala Met
1 5 10
<210> 34
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA14136的CDR1
<400> 34
Ser Val Arg Thr Phe Ser Phe Tyr Ser Met Gly
1 5 10
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA13620的CDR1
<400> 35
Ser Gly Leu Thr Phe Gly Thr Tyr Ala Met
1 5 10
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA14131的CDR1
<400> 36
Ser Gly Ser Val Phe Ser Thr Asn Thr Met
1 5 10
<210> 37
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA13599的CDR1
<400> 37
Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Tyr Ala Met
1 5 10
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA13602的CDR1
<400> 38
Ser Gly Ser Gly Phe Ser Ile Tyr Ala Met
1 5 10
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA13598的CDR1
<400> 39
Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn Ala Met
1 5 10
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA13617的CDR1
<400> 40
Ser Gly Ile Ile Phe His Trp Tyr Asp Met
1 5 10
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA16072的CDR1
<400> 41
Ser Gly Phe Pro Phe Ser Thr Tyr Tyr Met Ser
1 5 10
<210> 42
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nb CA12610的CDR2
<400> 42
Ile Thr Asn Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr
1 5
<210> 43
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nb CA12618的CDR2
<400> 43
Ile Thr Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr
1 5
<210> 44
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nb CA13612的CDR2
<400> 44
Ile Thr Thr Ser Gly Ala Val Thr Thr Tyr
1 5 10
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nb CA14135的CDR2
<400> 45
Ile Thr Leu Gly Gly Gly Thr Asn Tyr
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nb CA13606的CDR2
<400> 46
Ile Ala Ser Gly Gly Ser Ala Asn Tyr
1 5
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nb CA14259的CDR2
<400> 47
Ile Asn Trp Arg Gly Asp Asn Thr Asp Tyr
1 5 10
<210> 48
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nb CA14130的CDR2
<400> 48
Ile Ser Ser Gly Thr Ser Thr Asn Tyr
1 5
<210> 49
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA14133的CDR2
<400> 49
Ile Ser Ser Gly Thr Thr Thr Asn Tyr
1 5
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA13611的CDR2
<400> 50
Ile Arg Trp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA14134的CDR2
<400> 51
Val Lys Trp Ser Gly Asp Met Thr Tyr
1 5
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA12614的CDR2
<400> 52
Ile Thr Ser Gly Gly Tyr Thr Asn Tyr
1 5
<210> 53
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA14136的CDR2
<400> 53
Ile Arg Trp Thr Ala Gly Ser Thr Ser Tyr
1 5 10
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA13620的CDR2
<400> 54
Ile Ser Gly Arg Gly Gly Tyr Arg Asp Tyr
1 5 10
<210> 55
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA14131的CDR2
<400> 55
Ile Thr Pro Gly Gly Phe Thr Asn Tyr
1 5
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA13599的CDR2
<400> 56
Ile Thr Ser Gly Gly Asp Thr Asn Tyr
1 5
<210> 57
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA13602的CDR2
<400> 57
Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr
1 5
<210> 58
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA13598的CDR2
<400> 58
Ile Thr Ser Gly Gly Arg Thr Asn Tyr
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA13617的CDR2
<400> 59
Ile Thr Thr Gly Gly Arg Ala Asp Tyr
1 5
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA16072的CDR2
<400> 60
Ile Ser Pro Gly Gly Asp Thr Ala Tyr
1 5
<210> 61
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nb CA12610的CDR3
<400> 61
Asn Ala Leu Asp Arg Glu Ala Arg Gln Val Asp Tyr
1 5 10
<210> 62
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nb CA12618的CDR3
<400> 62
Asn Thr Leu Thr Ile Ser Trp Ser
1 5
<210> 63
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nb CA13612的CDR3
<400> 63
Ala Ala Gly Gln Gly Gln Leu Ser Ser Gln Ser Arg Phe Val Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 64
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nb CA14135的CDR3
<400> 64
Lys Val Glu Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Val Phe
1 5 10
<210> 65
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nb CA13606的CDR3
<400> 65
His Ala Asp Ala Trp Tyr Asn Ser Arg Trp Ser Asp Tyr
1 5 10
<210> 66
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nb CA14259的CDR3
<400> 66
Ala Ala Lys Ser Ala Pro Tyr Trp Tyr Ser Asp Ile Ala Pro Asp
1 5 10 15
<210> 67
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nb CA14130的CDR3
<400> 67
His Val Trp Ile Ser Gly Thr Trp Tyr
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA14133的CDR3
<400> 68
His Ala Trp Ile Ser Gly Thr Trp Ile
1 5
<210> 69
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA13611的CDR3
<400> 69
Ala Ala Ser Asp Arg Gly Gly Phe Ile Ala Thr Ser Gly Gly Trp Met
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 70
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA14134的CDR3
<400> 70
Ala Ala Arg Arg Gly Leu Ser Tyr Tyr Arg Gly Pro Ser Glu Tyr Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA12614的CDR3
<400> 71
Asn Leu Leu Ser Glu Met Leu Gln Thr Val
1 5 10
<210> 72
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA14136的CDR3
<400> 72
Ala Ala Gln Arg Gly Tyr Leu Val Glu Ala Ala Ser Arg Glu Tyr Asp
1 5 10 15
Tyr
<210> 73
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA13620的CDR3
<400> 73
Ala Ala Arg Gln Gly Ser Pro Val Arg Ser Lys Glu Glu Tyr Asn Asn
1 5 10 15
<210> 74
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA14131的CDR3
<400> 74
Asn Thr Leu Ser Arg Met Ala
1 5
<210> 75
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA13599的CDR3
<400> 75
Asn Ala Asp His Thr Pro Ala Gly Thr Phe Gln Thr Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 76
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA13602的CDR3
<400> 76
Asn Ala Asp Ile Thr Val Val Ala Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr
1 5 10
<210> 77
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA13598的CDR3
<400> 77
Asn Ala Gly Asp Trp Gln Thr Met Tyr Asp Tyr
1 5 10
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA13617的CDR3
<400> 78
Ser Phe Gln Asp His Val Leu Arg Arg
1 5
<210> 79
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CA16072的CDR3
<400> 79
Ala Ala Val Arg Phe Leu Arg Ala Pro Asp Leu Thr Glu Lys Arg Leu
1 5 10 15
Tyr Glu Tyr

Claims (23)

1.一种富含亮氨酸的重复激酶2(LRRK2)的变构调节剂，其特异性结合人LRRK2，其中结合使LRRK2蛋白不与细胞内的微管结合。
2.如权利要求1所述的LRRK2变构调节剂，其中结合LRRK2的KD值在200nM或更低的范围内。
3.如权利要求1或2中任一项所述的LRRK2变构调节剂，其影响细胞内和/或体外的LRRK2激酶活性。
4.如权利要求1至3中任一项所述的LRRK2变构调节剂，其包括小分子、化合物、蛋白质、肽、肽模拟物、抗体、抗体模拟物、单结构域抗体、免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)或活性抗体片段。
5.如权利要求1至4中任一项所述的LRRK2变构调节剂，其包含ISVD，其中所述ISVD包含根据下式(1)的4个框架区(FR)和3个互补决定区(CDR)：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4(1)。
6.如权利要求5所述的LRRK2变构调节剂，其包含ISVD，其中CDR1、CDR2和CDR3区选自如下序列的那些CDR1、CDR2和CDR3区，所述序列选自SEQ ID NO:1至19的序列中的序列，其中CDR区根据Kabat、MacCallum、IMGT、AbM或Chothia注释。
7.如权利要求5所述的LRRK2变构调节剂，其包含ISVD，其中：
CDR1由选自SEQ ID NO：23-41的CDR1序列的序列组成，
CDR2由选自SEQ ID NO：42-60的CDR2序列的序列组成，
CDR3由选自SEQ ID NO：61-79的CDR3序列的序列组成。
8.如权利要求6或7所述的LRRK2变构调节剂，其中所述ISVD包含SEQ ID NO：1至19的任何序列，或与其具有至少85％氨基酸同一性的序列，或其人源化变体。
9.如权利要求1或8中任一项所述的LRRK2变构调节剂，其抑制细胞中的LRRK2激酶活性。
10.如权利要求1至8中任一项所述的LRRK2变构调节剂，其抑制细胞中的LRRK2底物磷酸化。
11.如权利要求1至8中任一项所述的LRRK2变构调节剂，其增加细胞中的LRRK2激酶活性。
12.如权利要求1至8中任一项所述的LRRK2变构调节剂，其防止LRRK2在细胞中与微管结合，任选地当存在ATP竞争性LRRK2激酶抑制剂化合物时。
13.一种多特异性LRRK2变构调节剂，其包含至少一种权利要求1至12中任一项所述的调节剂。
14.一种核酸分子，其编码权利要求1至12中任一项所述的LRRK2变构调节剂，或权利要求13所述的多特异性LRRK2变构调节剂。
15.包含权利要求14所述的核酸分子的载体，优选病毒载体、慢病毒或腺病毒载体。
16.一种用于检测样品中LRRK2蛋白的量的体外方法，所述方法包括：
i)使样品与权利要求5至8中任一项所述的LRRK2特异性结合剂相互作用，和
ii)检测与LRRK2结合的所述LRRK2特异性ISVD结合剂的存在或不存在或蛋白质水平。
17.一种用于检测生物样品中人LRRK2蛋白定位和分布的体外方法，所述方法包括以下步骤：
i)使生物样品与权利要求5至8中任一项所述的LRRK2特异性结合剂和/或任选地所述结合剂的标记形式反应，和
ii)检测所述LRRK2特异性ISVD在所述生物样品中的定位和分布。
18.一种药物组合物，其包含权利要求1至12中任一项所述的LRRK2变构调节剂、权利要求13所述的多特异性LRRK2变构调节剂、权利要求14所述的核酸分子或权利要求15所述的载体。
19.如权利要求18所述的药物组合物，其进一步包含ATP竞争性LRRK2激酶抑制剂化合物。
20.如权利要求1至12中任一项所述的LRRK2变构调节剂、如权利要求13所述的多特异性LRRK2变构调节剂、如权利要求14所述的核酸分子、如权利要求15所述的载体、或如权利要求18或19所述的药物组合物，用作药物。
21.如权利要求1至12中任一项所述的LRRK2变构调节剂、如权利要求13所述的多特异性LRRK2变构调节剂、如权利要求14所述的核酸分子、如权利要求15所述的载体、或如权利要求18或19所述的药物组合物，用于治疗LRRK2相关的疾患。
22.如权利要求1至12中任一项所述的LRRK2变构调节剂、如权利要求13所述的多特异性LRRK2变构调节剂、如权利要求14所述的核酸分子、如权利要求15所述的载体、或如权利要求18或19所述的药物组合物，用于治疗帕金森病或克罗恩病。
23.如权利要求1至12中任一项所述的LRRK2变构调节剂、如权利要求13所述的多特异性LRRK2变构调节剂、如权利要求14所述的核酸分子、如权利要求15所述的载体、或如权利要求18或19所述的药物组合物，用作诊断剂或用于体内成像。
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Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
US3817837A (en) 1971-05-14 1974-06-18 Syva Corp Enzyme amplification assay
US3939350A (en) 1974-04-29 1976-02-17 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Fluorescent immunoassay employing total reflection for activation
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4366241A (en) 1980-08-07 1982-12-28 Syva Company Concentrating zone method in heterogeneous immunoassays
DK0656946T4 (da) 1992-08-21 2010-07-26 Univ Bruxelles Immunoglobuliner uden lette kæder
AU6796094A (en) 1993-04-29 1994-11-21 Raymond Hamers Production of antibodies or (functionalized) fragments thereof derived from heavy chain immunoglobulins of (camelidae)
FR2708622B1 (fr) 1993-08-02 1997-04-18 Raymond Hamers Vecteur recombinant contenant une séquence d'un gène de lipoprotéine de structure pour l'expression de séquences de nucléotides.
EP0739981A1 (en) 1995-04-25 1996-10-30 Vrije Universiteit Brussel Variable fragments of immunoglobulins - use for therapeutic or veterinary purposes
ES2294799T3 (es) 1996-06-27 2008-04-01 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw. Moleculas de anticuerpos que interactuan especificamente con el sitio activo o hendidura de una molecula diana.
AU3596599A (en) 1998-01-26 1999-08-09 Unilever Plc Method for producing antibody fragments
AU3041100A (en) 1999-01-05 2000-07-24 Unilever Plc Binding of antibody fragments to solid supports
AU2291700A (en) 1999-01-19 2000-08-07 Unilever Plc Method for producing antibody fragments
AU776824B2 (en) 1999-04-22 2004-09-23 Unilever Plc Inhibition of viral infection using monovalent antigen-binding proteins
US6479280B1 (en) 1999-09-24 2002-11-12 Vlaams Interuniversitair Institutuut Voor Biotechnologie Vzw Recombinant phages capable of entering host cells via specific interaction with an artificial receptor
DK1242460T3 (da) 1999-11-29 2006-12-11 Unilever Nv Immobilisering af proteiner ved hjælp af et polypeptidsegment
ATE440111T1 (de) 1999-11-29 2009-09-15 Bac Ip B V Immobilisierte antigenbindende moleküle aus einer domäne
EP1134231B1 (en) 2000-03-14 2009-04-15 Unilever N.V. Antibody heavy chain variable domains against human dietary lipases, and their uses
AU2001268855A1 (en) 2000-05-26 2001-12-03 National Research Council Of Canada Single-domain antigen-binding antibody fragments derived from llama antibodies
ATE513854T1 (de) 2000-12-13 2011-07-15 Bac Ip B V Proteinraster aus variablen domänen der schweren immunoglobulinkette von kamelen
US7371849B2 (en) 2001-09-13 2008-05-13 Institute For Antibodies Co., Ltd. Methods of constructing camel antibody libraries
JP2005289809A (ja) 2001-10-24 2005-10-20 Vlaams Interuniversitair Inst Voor Biotechnologie Vzw (Vib Vzw) 突然変異重鎖抗体
AU2002351896A1 (en) 2001-12-11 2003-06-23 Ablynx N.V. Method for displaying loops from immunoglobulin domains in different contexts
EP1456237A2 (en) 2001-12-21 2004-09-15 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie vzw. Method for cloning of variable domain sequences
WO2003055527A2 (en) 2002-01-03 2003-07-10 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Immunoconjugates useful for treatment of tumours
US20040023390A1 (en) 2002-08-05 2004-02-05 Davidson Beverly L. SiRNA-mediated gene silencing with viral vectors
WO2004041865A2 (en) 2002-11-08 2004-05-21 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
AU2003286003B2 (en) 2002-11-08 2011-05-26 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
JP2006517789A (ja) 2003-01-10 2006-08-03 アブリンクス エン．ヴェー． 治療用ポリペプチド、その相同物、その断片、および血小板媒介凝集の調節での使用
ATE485307T1 (de) 2003-11-07 2010-11-15 Ablynx Nv Camelidae schwere ketten antikörper vhhs gegen epidermalen wachstumfaktor rezeptor (egfr) und ihre verwendung
KR20070084170A (ko) 2004-10-13 2007-08-24 아블린쓰 엔.브이. 알쯔하이머병 등의 퇴행성 신경 질환의 치료 및 진단을위한 단일 도메인 카멜리드 항-아밀로이드 베타 항체 및이를 포함하는 폴리펩타이드
WO2006079372A1 (en) 2005-01-31 2006-08-03 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
CN103254309B (zh) 2005-05-18 2017-09-26 埃博灵克斯股份有限公司 针对肿瘤坏死因子α的改进的纳米体TM
CA2960105A1 (en) 2005-05-20 2006-11-23 Ablynx Nv Single domain vhh antibodies against von willebrand factor
US8629244B2 (en) 2006-08-18 2014-01-14 Ablynx N.V. Interleukin-6 receptor binding polypeptides
CA2678218A1 (en) 2007-02-21 2008-08-28 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against vascular endothelial growth factor and polypeptides comprising the same for the treatment of conditions and diseases characterized by excessive and/or pathological angiogenesis or neovascularization
CA2687903C (en) 2007-05-24 2016-09-13 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against rank-l and polypeptides comprising the same for the treatment of bone diseases and disorders
GB201008682D0 (en) 2010-05-25 2010-07-07 Vib Vzw Epitope tag for affinity based applications
CN108659121A (zh) 2011-06-23 2018-10-16 埃博灵克斯股份有限公司 用于预测、检测和减少涉及免疫球蛋白单可变结构域的测定法中的非特异性蛋白干扰的技术
CN105732639A (zh) * 2012-06-29 2016-07-06 辉瑞大药厂 作为LRRK2抑制剂的4-(取代的氨基)-7H-吡咯并〔2,3-d〕嘧啶类
PT2890712T (pt) 2012-08-29 2019-06-28 Hoffmann La Roche Transportador para a barreira hematoencefálica
WO2015031673A2 (en) 2013-08-28 2015-03-05 Bioasis Technologies Inc. Cns-targeted conjugates having modified fc regions and methods of use thereof
WO2015124540A1 (en) 2014-02-19 2015-08-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Blood brain barrier shuttle
HUE050007T2 (hu) 2014-05-16 2020-11-30 Ablynx Nv Immunglobulin variábilis domének
WO2015191934A2 (en) 2014-06-11 2015-12-17 Abbvie Inc. Blood-brain barrier (bbb) penetrating dual specific binding proteins for treating brain and neurological diseases
JP2020505398A (ja) * 2017-01-25 2020-02-20 グラクソスミスクライン、インテレクチュアル、プロパティー、ディベロップメント、リミテッドＧｌａｘｏｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｌｉｍｉｔｅｄ 化合物

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