JP2019525743A - 血液脳関門を通過するヒト化抗体及びその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、既存の抗体のヒト化により生じる抗体及びその断片、並びにそれらを作製する方法に関する。本発明のヒト化抗体は、脳内皮抗原への増強された結合、血液脳関門を越える改善された通過、及び元の非ヒト化抗体と比較して増大した熱安定性を示す。【選択図】図４Ｂ

Description

本発明は、血液脳関門を通過するヒト化抗体及びその断片、並びにそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、既存の抗体のヒト化により生じる抗体及びその断片に関する。本発明の抗体は、脳内皮抗原への増強された結合及び血液脳関門を越える改善された通過を示す。
アルツハイマー病及びパーキンソン病などの神経変性疾患は、これらの障害状態に対する有効な治療が現時点では存在しないことから、我々の高齢化社会における増加しつつある負担である。脳で発生するこれらの及びその他の疾患の治療及び早期診断は、適切な治療分子及び診断法の大部分が、密着し且つ高度に制限的な血液脳関門（ＢＢＢ）に侵入することができないため困難なままである（Ａｂｂｏｔｔ、２０１３）。ＢＢＢは、血管を覆い、タイトジャンクションにより互いに接続された脳内皮細胞（ＢＥＣ）により形成される物理的バリケードを構成する（Ａｂｂｏｔｔ、２０１３）。ＢＥＣ間に形成されるタイトジャンクションはＢＢＢの完全性に必須であり、５００ダルトン（Ｄａ）より分子量の大きい親水性分子の傍細胞輸送を防止する。脳内皮細胞は非常に小さいピノサイトーシス率を示す（Ａｂｂｏｔｔ、２０１３）ため、より分子量の大きい分子の経細胞輸送は、高度に特異的な受容体媒介性経細胞輸送（ＲＭＴ）経路、及び受動的な、電荷ベースの吸着媒介性経細胞輸送に限定される（Ａｂｂｏｔｔ、２０１３；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、２００２）。さらに、Ｐ−糖タンパク質又は多剤耐性タンパク質−１（ＭＤＲ−１）などの高密度の排出ポンプが、脳からの望ましくない物質の除去に寄与する（Ａｂｂｏｔｔ、２０１３）。
これらの特性は全て病原体及び毒素から脳を防御するが、大部分の治療薬の流入も等しく防止する。実際、特に「渡され」ない限り、すなわち、トランスポーター分子と共役しない限り、低分子治療薬は５％未満しか薬理学的に妥当な（すなわち、中枢神経系（ＣＮＳ）の標的に結合し、薬理学的／治療的応答を引き出すのに十分な）濃度でＢＢＢを通過することができず、より分子量の大きい治療薬は実質的に全て通過できない。ＢＢＢを越えて分子を輸送するのに有効な「担体」がないために、十分な量で脳に送達されないことから、神経変性疾患に対する数多くの薬物が「棚上げ」、すなわちさらなる開発から除外されてきた。
より分子量の大きい分子を脳に送達する様々な手法が探索されてきた。例えば、ＢＢＢの完全性を妨害して漏れやすいＢＢＢを生じさせることができ、漏れやすいＢＢＢにより、より分子量の大きい分子の脳への非制限的な傍細胞流入が可能となる。タイトジャンクションを、各種手法によりうまく緩めるか妨害することができる。例えば、浸透圧ショックを誘導する物質（例えば、マンニトール、高張液）を血流に注射することで細胞収縮が引き起こされ、タイトジャンクションの妨害がもたらされ、ゆえにＢＢＢが著しく損なわれる（Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ、２０１０）。タイトジャンクションのその他の調節因子には、アルキルグリセロール、ブラジキニン、及びそのいくつかのアナログ、及びタイトジャンクションの維持に関与するタンパク質の発現を調節するウイルスが含まれる（Ｅｒｄｌｅｎｂｒｕｃｈら、２００３；Ｐｒｅｓｔｏｎら、２００８；Ｇａｎら、２０１３）。超音波の施用により、ＢＢＢのより局在的な妨害が可能である（Ｎｈａｎら、２０１３）。しかし、ＢＢＢが妨害される期間は、脳の恒常性を変化させ、有害な化学物質、毒素及び病原体を脳に流入させるのに十分であり、これによって、深刻な副作用、例えば、けいれん及び脳腫脹、感染症及び場合により持続的な神経病理学的変化が生じる可能性がある。したがって、複数の脳領域に影響を及ぼす慢性且つびまん性の脳疾患に対し、これらの技術で繰り返し治療することは実用的でない。これらの治療の大部分は費用がかかり、入院が必要であり、一部の手法は麻酔が必要である。
ＢＢＢを回避する別の手法は、治療分子を脳脊髄液（ＣＳＦ）、実質空間、又は脳のその他の部分に直接注射することである。点滴又は対流増強拡散（ＣＥＤ）ポンプによる、脳内（実質内）、脳室内、及びくも膜下腔内送達を含むいくつかの送達方法が開発されている。しかし、任意の種類の脳への直接注射又は脳内留置用剤は、入院、麻酔、及び大抵は外科手術が必要であるため、侵襲的且つ費用がかかる手技である。さらに、治療薬、特に分子量の大きい生物製剤の、脳実質内での拡散率が不十分であることで、注射／留置部位周辺のわずかな面積のみに治療薬の侵入が制限される。脳の標的領域への薬物の拡散を実現するため、注射、カテーテル、及び留置用剤を的確に配置することは困難であるが非常に重要である。さらに、カテーテル及び留置用剤により、感染及び／又は外来性物質に対する免疫応答の部位がもたらされる。
ＢＢＢを越える送達を増大させる別の試みにおいて、ＣＮＳ薬物が、脳への取り込みが増大するように改変されてきた。このような改変には、表面電荷の変化、分子サイズの減少、及び薬物の親油性への変化が含まれうる。しかし、脳への侵入を増大させるための任意の改変により、望ましい活性及び／又は特異性を含む、薬物の薬理全体が変化する可能性も高い。さらに、親油性分子は、Ｐ−糖タンパク質排出ポンプにより脳から排出される傾向がより高い。
最後に、ＢＢＢを越える内在性輸送機構が活用されてきた。ＢＢＢを越える分子量の大きい分子の輸送を可能にする生理機構は、高度に特異的な受容体媒介性経細胞輸送（ＲＭＴ）及び非特異的な電荷ベースの吸着媒介性エンドサイトーシス経路に分けられる。エンドサイトーシスは、それぞれ、特定のリガンドが受容体に結合すると、又はカチオン性リガンド若しくは薬物と、脳内皮細胞表面（管腔側）のアニオン性官能基との間で静電気的相互作用が起こると引き起こされる。次いで、新たに形成されたエンドソームが細胞を通って反管腔側に経細胞輸送され、カーゴを放出する。
吸着媒介性経細胞輸送は非特異的で電荷媒介性の相互作用であるため、全ての血管床及び器官で発生し、脳への送達に対する薬物の利用可能性を制限する。したがって、ＲＭＴ経路を活用することが、依然として唯一の生理的、非侵襲的且つ高度に受容体特異的な脳への送達方法である。
現在、数種の受容体だけが、ＢＢＢでＲＭＴを受けて天然のリガンドを「渡す」ことが知られている。十分に研究されたトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体（ＩＲ）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１及び２（ＬＲＰ−１及び−２）、並びにジフテリア毒素受容体の、これらの受容体に結合するペプチド、天然のリガンド、及び抗体又はその断片が開発されており（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、１９９１；Ｙｕら、２０１１；Ｍｕｒｕｇａｎａｎｄａｍら、２００１；Ａｂｕｌｒｏｂら、２００５；Ｄｅｍｅｕｌｅ、２００８；Ｓｕｍｂｒｉａら、２０１３）、内在性ＲＭＴ経路を利用する薬物〜脳トランスポーターとして機能する。最近、大型中性アミノ酸トランスポーター（ＬＡＴ１）の成分であるＣＤ９８ｈｃに対する抗体が、ＢＢＢを越える経細胞輸送を受けることが示され（Ｚｕｃｈｅｒｏら、２０１６）、大型中性アミノ酸トランスポーターが、ＢＢＢ担体を開発するにあたっての別の標的となりうることを示唆している。しかし、現在までに１種のペプチド（Ａｎｇｉｏｐｅｐ ＡＮＧ１００５、ＬＲＰ−１を標的とする）のみが第ＩＩ相臨床試験で分析されており、他の候補は実験室環境で研究中であるか、第１相研究に入ったばかりである。ＲＭＴ経路は、生物学的薬物を脳に輸送するのに最も有望な経路と思われるが、現行の手法には、ＢＢＢにおける標的受容体の非選択的発現、受容体に対する担体及び天然のリガンド間の競合、受容体の無効な経細胞輸送、並びにエンドサイトーシスを受けた担体のリソソームによる分解を含めて限界がある（Ｘｉａｏ及びＧｕｎ、２０１３）。
ＢＢＢの生理及び恒常性を妨害しない、高性能で高選択性のＢＢＢ担体が存在しないことで、脳腫瘍及び神経変性疾患を含む、脳で発生する疾患の新たな治療薬及び診断法の開発が遅れている。
本発明は、血液脳関門を通過する抗体及びその断片、並びにそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、既存の抗体のヒト化により生じる抗体及びその断片に関する。本発明の抗体は、脳内皮抗原への増強された結合及び血液脳関門を越える改善された通過を示す。
本発明は、配列
Ｘ１ＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＸ２ＲＱＡＰＧＫＸ３Ｘ４ＥＸ５ＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＸ６ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９）
配列中、Ｘ１＝Ｄ又はＥ、Ｘ２＝Ｆ又はＶ、Ｘ３＝Ｅ又はＧ、Ｘ４＝Ｒ又はＬ、Ｘ５＝Ｆ又はＷ、Ｘ６＝Ｌ又はＶである、
を含む、単離又は精製された抗体又はその断片を提供する。
例えば、本発明の単離又は精製された抗体又はその断片は、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２、本明細書ではＦＣ５−Ｈ１とも呼ばれる）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３、本明細書ではＦＣ５−Ｈ２とも呼ばれる）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４、本明細書ではＦＣ５−Ｈ３とも呼ばれる）；
ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５、本明細書ではＦＣ５−Ｈ４とも呼ばれる）；
ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号６、本明細書ではＦＣ５−Ｈ５とも呼ばれる）；
ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７、本明細書ではＦＣ５−Ｈ６とも呼ばれる）；及び
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８、本明細書ではＦＣ５−Ｈ７とも呼ばれる）
のうちいずれか１つから選択されうる。
本明細書に記載される発明において、単離又は精製された抗体又はその断片は、任意の適切な多量体化技術を使用して、多価ディスプレイ形式をとりうる。例えば、単離又は精製された抗体又はその断片はＦｃ断片に連結されていてもよく、ゆえに二量体を形成していてもよい。この実施形態では、Ｆｃ断片を任意の適切なＦｃ断片、例えばマウスＩｇＧ２ｂ又はヒトＩｇＧ１由来のＦｃとすることができる。特定の実施例では、Ｆｃは配列番号２０の配列を含んでいてもよい。
本発明の単離又は精製された抗体又はその断片は、血液脳関門を通過することができる。
本発明は、本明細書に記載される単離又は精製された抗体又はその断片をコードする核酸分子も包含する。単離又は精製された抗体又はその断片をコードする核酸分子を含むベクターも、本発明の範囲に含まれる。
本発明の単離又は精製された抗体又はその断片は、表面に固定化されていてもよい。
別の施用では、上記の単離又は精製された抗体又はその断片がカーゴ分子に連結されていてもよい。任意の適切なカーゴ分子が使用可能である。カーゴ分子は約１ｋＤａ〜約２００ｋＤａの範囲の分子量を有しうる。例えば、限定されることを望むものではないが、カーゴ分子を、検出可能な薬剤、治療薬、薬物、ペプチド、増殖因子、サイトカイン、受容体トラップ、化合物、糖部分、酵素、抗体若しくはその断片、ＤＮＡベースの分子、ウイルスベクター、又は細胞毒性薬剤；検出可能な薬剤、治療薬、薬物、ペプチド、酵素、抗体若しくはその断片、ＤＮＡベースの分子、ウイルスベクター、又は細胞毒性薬剤を担持する１つ又は複数のリポソーム又はナノ担体；又は１つ若しくは複数のナノ粒子、ナノワイヤー、ナノチューブ、若しくは量子ドットとすることができる。このような構築物において、単離又は精製された抗体又はその断片は、血液脳関門を越えてカーゴ分子を保持する。
本発明は、１つ又は１つを超える上記の単離又は精製された抗体又はその断片、及び薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む組成物をさらに包含する。
これより、血液脳関門を通過する抗体ＦＣ５のヒト化バリアントが提示される。抗体をヒト化するのは、ＶＨＨ内のラクダ科動物起源のアミノ酸残基による、ヒトにおける潜在的な免疫原性を低下させるためである。ＦＣ５抗体のＣＤＲ配列がヒト重鎖フレームワークに移植されただけでなく、復帰突然変異（元のラクダ科動物配列の選択されたアミノ酸残基に対する）が、完全にヒト化されたフレームワーク配列に導入された。驚くべきことに、元のラクダ科動物ＦＣ５と比較した融解温度（Ｔｍ）値によって反映されるように、ヒト化バリアントが改善された熱安定性を示し、あるバリアント（ＦＣ５−Ｈ３）が、元のＦＣ５と比較して１０℃を超える際立ったＴｍ増大を示したことが概して判明した。さらに、大部分のヒト化ＦＣ５構築物が、ＳＶ−ＡＲＢＥＣで発現された受容体に対して改善された親和性を示し、あるバリアント（ＦＣ５−Ｈ７）が、元のＦＣ５と比較して予想外に顕著な増大を示した。この傾向がさらに、元のラクダ科動物ＦＣ５に対してヒト化バリアントによりもたらされる、ヒト脳内皮細胞（ＨＢＥＣ）−Ｄ３に対する結合の改善でも一貫していることが重要である。最後に、ヒト化バリアントは、少なくとも元のＦＣ５抗体レベルのｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞透過能力を示し、ヒト化バリアントの一部では１６５％にまで増大した。
ＦＣ５ ＶＨＨ及びＦＣ５ ＶＨＨのヒト化バリアントの配列のアラインメントを示す図である。 ＦＣ５ ＶＨＨ及びＦＣ５ ＶＨＨのヒト化バリアント（標識されたＦＣ５−Ｈ１、ＦＣ５−Ｈ２、ＦＣ５−Ｈ３、ＦＣ５−Ｈ５、ＦＣ５−Ｈ６、ＦＣ５−Ｈ７）について、円二色性（ＣＤ）により決定された融解温度（Ｔｍ）を示すグラフである。タンパク質を９０℃超に加熱し、ＣＤ装置で測定を行って融解曲線（黒色又は塗り潰した丸）及びＴｍを決定した。次いで、タンパク質を室温に冷却し、再度加熱してＣＤにより分析した（灰色曲線又は四角）。これにより、リフォールディングされたタンパク質の比の決定が可能となった。 ミラーボール（Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌ）装置を使用して決定された、懸濁液中での、ＦＣ５ ＶＨＨ及びＦＣ５ ＶＨＨのヒト化バリアントの、ラット脳内皮細胞（ＳＶ−ＡＲＢＥＣ）又はヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＥＣ−Ｄ３）への結合曲線を示すグラフである。ミラーボール３８４ウェルアッセイプレート内で、各試験バリアントについて段階希釈液を調製し、７ポイント結合曲線を作成した。ドラク（Ｄｒａｑ）５核染色剤（２μＭ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を添加した蛍光コンジュゲートｃ−ｍｙｃアレクサ（Ａｌｅｘａ）４８８検出抗体（１６００ｎｇ／ｍｌ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、細胞に結合した抗体の検出に使用した。全てのプレートを４℃で４ｈインキュベートした。下記のようにミラーボールＨｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを使用して測定を行った。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＢＢＢモデルにおけるＦＣ５及びＦＣ５のヒト化バリアント（Ｈ１〜Ｈ７）のＰａｐｐ値を示す図である。等モル量（１．２５μＭ）のＦＣ５の各バリアント及び陰性対照（Ａ２０．１、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ結合性ＶＨＨ）を、ラットｉｎ ｖｉｔｒｏ ＢＢＢモデルを通過する能力について同時に試験した。図４Ａはトランズウェルｉｎ ｖｉｔｒｏ ＢＢＢモデルを示す図である。底部チャンバーにラットアストロサイト条件培地、及び上部チャンバーに標準培地が存在する状態で、インサートの膜に単層で成体ラット由来のＳＶ４０−不死化脳内皮細胞（ｓｖＡＲＢＥＣｓ）を増殖させる。等モル量の各種ＶＨＨをＢＢＢモデルの管腔側に共に添加した後、１５、３０及び６０分後に試料を底部チャンバーから採取した。次いで、各ＶＨＨ濃度を、これらの試料中で質量分析（多重反応モニタリング−アイソタイプ標識された内部標準；ＭＲＭ−ＩＬＩＳ）により定量化した。与えられる式［Ｑｒ／ｄｔ＝受取区画における累積量対時間；Ａ＝細胞単層の面積；Ｃ０＝投薬溶液の初濃度］を使用して算出されるＰａｐｐ値を使用して、分子のＢＢＢを通過する能力を決定する。結果は５〜６回のトランズウェル実験で得られた平均Ｐａｐｐ値である。 ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＢＢＢモデルにおけるＦＣ５及びＦＣ５のヒト化バリアント（Ｈ１〜Ｈ７）のＰａｐｐ値を示す図である。等モル量（１．２５μＭ）のＦＣ５の各バリアント及び陰性対照（Ａ２０．１、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａ結合性ＶＨＨ）を、ラットｉｎ ｖｉｔｒｏ ＢＢＢモデルを通過する能力について同時に試験した。図４Ｂは、ＦＣ５及びＦＣ５のヒト化バリアントＨ１〜Ｈ７についてのＰａｐｐ値を示すグラフである。全てのバリアントが、陰性対照Ａ２０．１ＶＨＨと比較して増強されたＢＢＢ通過を示した。ＦＣ５−Ｈ３及びＦＣ５−Ｈ５は、元のＦＣ５と比較して統計的に（ｐ０．０５未満；Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）より大きいＰａｐｐ値を示した。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの、ＦＣ５及びＦＣ５−Ｈ７のＦｃ融合物の結合及び通過について示すグラフである。図５Ａは、ミラーボール装置を使用して決定された、懸濁液中でのＦＣ５Ｆｃ及びＦＣ５Ｈ７−Ｆｃの、ラット脳内皮細胞（ＳＶ−ＡＲＢＥＣ）への結合について示すグラフである。ミラーボール３８４ウェルアッセイプレート内で、各試験バリアントについて段階希釈液を調製して、７ポイント結合曲線を作成した。ドラク５核染色剤（２μＭ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を添加した蛍光コンジュゲートｃ−ｍｙｃアレクサ４８８検出抗体（１６００ｎｇ／ｍｌ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、細胞に結合した抗体の検出に使用した。全てのプレートを４℃で４ｈインキュベートした。下記のようにミラーボールＨｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを使用して測定を行った。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの、ＦＣ５及びＦＣ５−Ｈ７のＦｃ融合物の結合及び通過について示すグラフである。図５Ｂは、トランズウェルｉｎ ｖｉｔｒｏ ＢＢＢモデルにおけるＦＣ５Ｆｃ及びＦＣ５Ｈ７−ＦｃのＰａｐｐ値を示すグラフである。実験は図４に記載されるように実施した。
本発明は、血液脳関門を通過する抗体及びその断片、並びにそれらの使用に関する。より詳細には、本発明は、既存の抗体のヒト化により生じる抗体及びその断片に関する。本発明の抗体は、脳内皮抗原への増強された結合及び血液脳関門を越える改善された通過を示す。
本発明は、配列
Ｘ１ＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＸ２ＲＱＡＰＧＫＸ３Ｘ４ＥＸ５ＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＸ６ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９）
配列中、Ｘ１＝Ｄ又はＥ、Ｘ２＝Ｆ又はＶ、Ｘ３＝Ｅ又はＧ、Ｘ４＝Ｒ又はＬ、Ｘ５＝Ｆ又はＷ、Ｘ６＝Ｌ又はＶである、
を含む、単離又は精製された抗体又はその断片を提供する。
「抗体」という語は、当技術分野で「免疫グロブリン」（Ｉｇ）とも呼ばれ、本明細書で使用される場合、対になった重軽ポリペプチド鎖から構築されるタンパク質を指す。ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭを含む各種Ｉｇアイソタイプが存在する。抗体が的確にフォールディングされると、各鎖は、より直鎖状のポリペプチド配列で結合された複数の明確な球状ドメインにフォールディングする。例えば、免疫グロブリン軽鎖は可変（ＶＬ）及び定常（ＣＬ）ドメインにフォールディングし、重鎖は可変（ＶＨ）及び３つの定常（ＣＨ、ＣＨ２、ＣＨ３）ドメインにフォールディングする。重鎖及び軽鎖可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）の相互作用により、抗原結合領域（Ｆｖ）の形成がもたらされる。各ドメインは、当業者が精通している十分に確立された構造を有する。
軽鎖及び重鎖可変領域は標的抗原との結合に関与し、ゆえに抗体間で顕著な配列多様性を示しうる。定常領域はより小さい配列多様性を示し、複数の天然タンパク質との結合に関与して重要な生化学イベントを引き出す。抗体の可変領域は分子の抗原結合決定基を含み、ゆえに抗体の標的抗原に対する特異性を決定する。配列可変性の大部分は、可変重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）あたり各３つの、６つの超可変領域で発生する。超可変領域は組み合わさって抗原結合部位を形成し、抗原決定基による結合及び認識に寄与する。抗体の抗原に対する特異性及び親和性は、超可変領域の構造、及びサイズ、形状、及び抗原に提示される表面の化学的性質により決定される。超可変領域を特定するための各種方式が存在し、最も一般的な２つがＫａｂａｔによるもの、並びにＣｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋによるものである。Ｋａｂａｔら（１９９１）は、ＶＨ及びＶＬドメインの抗原結合領域における配列可変性に基づき「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を定義している。Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ（１９８７）は、ＶＨ及びＶＬドメインにおける構造上のループ領域の位置に基づき「超可変ループ」（Ｈ又はＬ）を定義している。これらの個々の方式は、隣接又は重複するＣＤＲ及び超可変ループ領域を定義しており、抗体分野の技術者は大抵「ＣＤＲ」及び「超可変ループ」という語を互換可能に利用し、「ＣＤＲ」及び「超可変ループ」という語は本明細書でもそのように使用されうる。ＣＤＲ／ループは、本明細書ではＫａｂａｔ方式に従って特定される。
本明細書で呼ばれる「抗体断片」は、当技術分野で既知の、任意の適切な抗原結合性抗体断片を含みうる。抗体断片は、天然に存在する抗体断片であってもよく、天然に存在する抗体の操作又は組換え法の使用により得られてもよい。例えば、抗体断片には、以下に限定されないが、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ；ペプチドリンカーで接続されたＶＬ及びＶＨからなる分子）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ；単一のＶＬ又はＶＨから構成される断片）、及びこれらのうちいずれかの多価提示が含まれうる。今しがた記載された抗体断片などの抗体断片には、断片の様々な部分を連結させるためのリンカー配列、ジスルフィド結合、又はその他の種類の共有結合が必要であることがある。当業者は、様々な種類の断片の必要性及び様々な種類の断片の構築のための各種手法に精通しているものである。
非限定的な例では、抗体断片を、天然に存在する供給源由来のｓｄＡｂとすることができる。ラクダ科動物起源の重鎖抗体（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎら、１９９３）は軽鎖を欠き、ゆえにその抗原結合部位はＶＨＨと呼ばれる１つのドメインからなる。ｓｄＡｂはサメでも観察されており、ＶＮＡＲと呼ばれる（Ｎｕｔｔａｌｌら、２００３）。その他のｓｄＡｂは、ヒトＩｇ重鎖及び軽鎖配列に基づき設計されうる（Ｊｅｓｐｅｒｓら、２００４；Ｔｏら、２００５）。本明細書で使用される場合、「ｓｄＡｂ」という語には、ファージディスプレイ又はその他の技術により、任意の起源のＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、又はＶＮＡＲリザーバーから直接単離されたｓｄＡｂ、上述のｓｄＡｂ由来のｓｄＡｂ、組換え産生されたｓｄＡｂ、及びヒト化、親和性成熟、安定化、可溶化、ラクダ化、又は抗体工学のその他の方法によるこのようなｓｄＡｂのさらなる改変により生成されたｓｄＡｂが含まれる。ｓｄＡｂの抗原結合機能及び特異性を維持しているホモログ、誘導体、又は断片も本発明により包含される。
ＳｄＡｂは、高い熱安定性、高い界面活性剤抵抗性、比較的高いプロテアーゼ抵抗性（Ｄｕｍｏｕｌｉｎら、２００２）及び高い産生収量（Ａｒｂａｂｉ−Ｇｈａｈｒｏｕｄｉら、１９９７）などの、抗体分子にとって望ましい特性を有する。ＳｄＡｂは、免疫ライブラリーからの単離（Ｌｉら、２００９）又はｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟（Ｄａｖｉｅｓ ＆ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ、１９９６）により、非常に高い親和性を有するように設計することもできる。非カノニカルジスルフィド結合の導入などの、安定性を増大させるためのさらなる改変（Ｈｕｓｓａｃｋら、２０１１；Ｋｉｍら、２０１２）をｓｄＡｂに行うこともできる。
当業者は、単一ドメイン抗体の構造（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋで３ＤＷＴ、２Ｐ４２を参照のこと）に十分に精通しているものである。ｓｄＡｂは、免疫グロブリンフォールディングを維持している単一の免疫グロブリンドメインを含む。わずか３つのＣＤＲ／超可変ループが抗原結合部位を形成することに最も注目すべきである。しかし、当業者によって理解されるように、抗原との結合に全てのＣＤＲが必要とは限らない。例えば、限定されることを望むものではないが、ＣＤＲのうち１つ、２つ、又は３つが、本発明のｓｄＡｂによる抗原の結合及び認識に寄与しうる。ｓｄＡｂ又は可変ドメインのＣＤＲは、本明細書ではＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれる。
本発明は、「ヒト化された」抗体断片を包含する。抗体又はその断片のヒト化は、抗原結合能力又は特異性を失うことなく、配列のアミノ酸をヒト共通配列に見られるヒト対応物で置き換えることを含む。この手法は、ヒト対象に導入されたときの、抗体又は抗体の断片の免疫原性を低下させる。ＣＤＲ移植のプロセスにおいて、本明細書で定義される１つ又は１つを超えるＣＤＲが、ヒト可変領域（ＶＨ又はＶＬ）、その他のヒト抗体（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）、抗体断片フレームワーク領域（Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）、又はＣＤＲを移植することができる、同様のサイズ及び性質のタンパク質（Ｎｉｃａｉｓｅら、２００４）に融合又は移植されうる。このような場合、前記１つ又は１つを超える超可変ループの立体構造は保存される可能性が高く、ｓｄＡｂの標的（すなわち、脳内皮細胞）に対する親和性及び特異性は最小限の影響しか受けない可能性が高い。ＣＤＲ移植については当技術分野で既知であり（例えば、Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａら、２００５；Ｊｏｎｅｓら、１９８６；Ｔｅｍｐｅｓｔら、１９９１；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８；Ｑｕｅｅｎら、１９８９；Ｇｏｎｚａｌｅｓら、２００５でのレビューを参照のこと−引用される参考文献も参照のこと）、ゆえに技術者は、このようなヒト化抗体断片を調製する方法及びアミノ酸位置をヒト化する方法に十分に精通しているものである。
本発明の抗体又はその断片は、国際公開第２００２／０５７４４５号に記載されるＦＣ５抗体のヒト化バージョンである。ＦＣ５（配列番号１）は脳内皮細胞の表面に結合し、次いで、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する。ＦＣ５は、各種サイズの分子をＢＢＢを越えて誘導する担体として作用することも示されている（例えば、国際公開第２０１１／１２７５８０号を参照のこと）。ＦＣ５の通過を媒介する抗原は膜貫通ドメインタンパク質３０Ａと特定され（ＴＭＥＭ３０Ａ；国際公開第２００７／０３６０２１号）、膜貫通ドメインタンパク質３０Ａは脳内皮細胞の表面に豊富に存在する。
例えば、いかなる様式によっても限定されることを望むものではないが、上記の単離又は精製された抗体又はその断片は、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号２、本明細書ではＦＣ５−Ｈ１と呼ばれる）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３、本明細書ではＦＣ５−Ｈ２とも呼ばれる）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号４、本明細書ではＦＣ５−Ｈ３とも呼ばれる）；
ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＬＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号５、本明細書ではＦＣ５−Ｈ４とも呼ばれる）；
ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＧＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号６、本明細書ではＦＣ５−Ｈ５とも呼ばれる）；
ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号７、本明細書ではＦＣ５−Ｈ６とも呼ばれる）；
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８、本明細書ではＦＣ５−Ｈ７とも呼ばれる）；及び
これらと実質的に同一である配列
からなる群から選択されうる。
実質的に同一である配列は、１つ又は複数の保存的アミノ酸突然変異を含んでいてもよい。参照配列に対する１つ又は複数の保存的アミノ酸突然変異により、参照配列と比較して生理的、化学的、物理化学的又は機能的特性の実質的な変化を有しない突然変異体ペプチドが生じうることが当技術分野で既知である。このような場合、参照及び突然変異体配列は「実質的に同一である」ポリペプチドと考えられる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基を、類似の化学的特性（例えばサイズ、電荷、又は極性）を有する別のアミノ酸残基で置換することと本明細書では定義される。これらの保存的アミノ酸突然変異はｓｄＡｂのフレームワーク領域に対して行われ、ＦＣ５のＣＤＲ配列（配列番号１〜９の残基２６〜３５、５０〜６６、９９〜１１１）及び抗体又は断片のＣＤＲ構造全体は維持される。したがって、抗体の特異性及び結合性が維持される。さらに、ｓｄＡｂのヒト化に寄与するフレームワーク残基も維持されるべきである（配列番号２〜９の残基１、５、１４、３７、４４、４５、４７、７５、７９、８７、８８、９３、１１４、及び１１７）。
非限定的な例では、保存的突然変異はアミノ酸置換でありうる。このような保存的アミノ酸置換では、塩基性、中性、疎水性、又は酸性アミノ酸が、同じ群の別のアミノ酸で置換されうる。「塩基性アミノ酸」という語により、生理的ｐＨでは通常正に荷電している、側鎖ｐＫａ値７超を有する親水性アミノ酸が意図される。塩基性アミノ酸には、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、及びリジン（Ｌｙｓ又はＫ）が含まれる。「中性アミノ酸」（「極性アミノ酸」とも）という語により、生理的ｐＨで無荷電であるが、２つの原子により共有される一対の電子を原子のうちの１つがより密接に保持する少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸、例えばヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）が意図される。極性アミノ酸には、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、及びグルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）が含まれる。「疎水性アミノ酸」（「非極性アミノ酸」とも）という語により、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの正規化された共通の疎水性段階（１９８４）によればゼロを超える疎水性を示すアミノ酸を含むことが意図される。疎水性アミノ酸には、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、及びグリシン（Ｇｌｙ又はＧ）が含まれる。「酸性アミノ酸」は、生理的ｐＨでは通常負に荷電している、側鎖ｐＫａ値７未満を有する親水性アミノ酸を指す。酸性アミノ酸には、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、及びアスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）が含まれる。
２つの配列の類似性を評価するのに配列同一性が使用される。配列同一性は、２つの配列が残基位置の間で最大限一致するようにアラインメントされたときに同じである残基のパーセントを算出することにより決定される。配列同一性を算出するのに任意の既知の方法を使用することができる。例えば、配列同一性を算出するためにコンピュータソフトウェアが利用可能である。限定されることを望むものではないが、Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓにより維持される（且つｃａ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｂｌａｓｔ／で見られる）ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ２サービス、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、Ｂｌａｓｔ−Ｎ、又はＦＡＳＴＡ−Ｎ、又は当技術分野で既知の任意のその他の適切なソフトウェアなどのソフトウェアにより、配列同一性を算出することができる。
本発明の実質的に同一である配列は、少なくとも９０％同一でありうる。別の例では、実質的に同一である配列は、本明細書に記載される配列と、アミノ酸レベルで少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００％、又はその間の任意のパーセンテージで同一でありうる。実質的に同一である配列が参照配列の活性及び特異性を維持していることが重要である。非限定的な実施形態では、配列同一性の差は保存的アミノ酸突然変異（複数可）によるものであることがある。非限定的な例では、本発明は、本明細書に記載される抗体の配列と少なくとも９５％、９８％、又は９９％同一である配列を含む抗体又はその断片を対象とすることができる。
本発明の抗体又はその断片は、組換え抗体又は組換え抗体断片の発現、検出又は精製を助けるさらなる配列を含んでいてもよい。当業者に既知の、任意のこのような配列又はタグが使用されうる。例えば、限定されることを望むものではないが、抗体又はその断片は、標的指向又はシグナル配列（例えばこれに限定されないがｏｍｐＡ）、検出／精製タグ（例えばこれらに限定されないがｃ−Ｍｙｃ、Ｈｉｓ５、又はＨｉｓ６）、又はそれらの組合せを含んでいてもよい。別の例では、さらなる配列を、国際公開第９５／０４０６９号でＣｒｏｎａｎらにより、又は国際公開第／２００４／０７６６７０号でＶｏｇｅｓらにより記載されたビオチン認識部位などのビオチン認識部位とすることができる。これも当業者に既知であるように、リンカー配列が、さらなる配列若しくはタグと併せて使用可能であり、又は検出／精製タグとして機能しうる。
本発明の抗体又はその断片は、本明細書では多価提示とも呼ばれる多価ディスプレイ形式をとることもできる。多量体化は、当技術分野で既知の任意の適切な方法により実現可能である。例えば、いかなる様式によっても限定されることを望むものではないが、国際公開第２００３／０４６５６０号に記載される自己組織化分子などの自己組織化分子を使用して多量体化を実現することができ、本発明の抗体又はその断片、及びＡＢ５毒素ファミリー（Ｍｅｒｒｉｔｔ ＆ Ｈｏｌ、１９９５）のＢ−サブユニットの五量体化ドメインを含む融合タンパク質を発現させることにより、ペンタ体が産生される。Ｚｈｕら（２０１０）により記載された多量体化ドメインを使用することでも多量体を形成することができる。この形態は本明細書では「コンボディ（ｃｏｍｂｏｄｙ）」形態と呼ばれ、本発明の抗体又は断片とコイルドコイルペプチドとの融合物であり、多量体分子を生じる。多価ディスプレイのその他の形態も本発明により包含される。例えば、限定されることを望むものではないが、抗体又はその断片は、二量体、三量体、又は任意のその他の適切なオリゴマーとして提示されてもよい。これは、当技術分野で既知の方法、例えば直接連結接続（Ｎｉｅｌｓｏｎら、２０００）、ｃ−ｊｕｎ／Ｆｏｓ相互作用（ｄｅ Ｋｒｕｉｆ ＆ Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇ、１９９６）、「Ｋｎｏｂ ｉｎｔｏ ｈｏｌｅｓ」相互作用（Ｒｉｄｇｗａｙら、１９９６）、又はアジメトリック（ａｚｙｍｅｔｒｉｃ）プラットフォームを使用すること（Ｖｏｎ Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎら、２０１４）によって実現可能である。
当技術分野で既知の別の多量体化方法は、Ｆｃドメイン、例えば以下に限定されないがマウス又はヒトＦｃドメインを使用して、抗体又はその断片を二量体化することである。ヒトＦｃドメインは、以下に限定されないがＩｇＧ、ＩｇＭを含む各種クラス、又は以下に限定されないがＩｇＧ１、ＩｇＧ２などを含む各種サブクラスから選択されうる。この手法では、Ｆｃ遺伝子がｓｄＡｂ遺伝子と共にベクターに挿入されてｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質が生成される（Ｂｅｌｌら、２０１０；Ｉｑｂａｌら、２０１０）。融合タンパク質は組換えにより発現され、次いで精製される。例えば、いかなる様式によっても限定されることを望むものではないが、多価ディスプレイ形式は、ＦＣ５−Ｈ７のキメラ形式、及びその、Ｆｃドメインに連結した突然変異バリアントを包含しうる。このような抗体は操作及び産生が容易であり、ｓｄＡｂの血清半減期を著しく延長することができ、優れた腫瘍イメージング試薬となりうる（Ｂｅｌｌら、２０１０）。
今しがた記載された多量体複合体のＦｃドメインは、当技術分野で既知の任意の適切なＦｃ断片とすることができる。Ｆｃ断片は任意の適切な供給源由来とすることができる。例えば、Ｆｃをマウス又はヒト起源のものとすることができる。特定の非限定的な例では、ＦｃをマウスＩｇＧ２ｂアイソタイプ又はヒトＩｇＧ１アイソタイプ由来のものとすることができる（Ｂｅｌｌら、２０１０；Ｉｑｂａｌら、２０１０）。特定の非限定的な例では、今しがた記載された、多量体化した、単離又は精製された抗体又は断片は、配列番号２０の配列を含むＦｃを含みうる。
上記の多量体の各サブユニットは、同じ又は異なる特異性を有しうる、同じ又は異なる本発明の抗体又はその断片を含みうる。さらに、多量体化ドメインは、必要に応じて、リンカーを使用して抗体又はその断片に連結されていてもよい。このようなリンカーは、２つの分子の柔軟な結合をもたらすのに十分な長さ及び適切な組成であるべきであるが、抗体の抗原結合特性を妨害すべきでない。
本明細書に記載される抗体又はその断片は、血液脳関門を通過することができる。脳は、血液脳関門（ＢＢＢ）として知られる特殊な内皮組織によって体の残りと分けられる。ＢＢＢの内皮細胞はタイトジャンクションにより接続され、多くの治療化合物が脳に流入するのを効率的に防止する。小胞輸送の比率が小さいことに加えて、ＢＢＢの１つの特定の特徴は、酵素バリア（複数可）の存在、及びＢＢＢの反管腔（脳）側における、脳から血流へ各種分子を活発に輸送する（Ｓａｍｕｅｌｓ、１９９３）、Ｐ−糖タンパク質（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎら、１９９３；Ｗａｔａｎａｂｅ、１９９５）を含む高レベル（複数可）のＡＴＰ−依存性トランスポーターの発現である。低分子（５００ダルトン未満）の疎水性（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、１９９５）分子のみがより容易にＢＢＢを通過することができる。したがって、上記の抗体又はその断片の、表面受容体に特異的に結合し、脳内皮細胞に内部移行し、リソソームによる分解を免れることによりＢＢＢを越えて経細胞輸送を受ける能力は、神経分野で有用である。
本発明は、本明細書に記載される分子をコードする核酸配列も包含する。当業者により容易に理解されるように、遺伝暗号の縮重を前提とすると、複数のヌクレオチド配列がポリペプチドをコードする効果を有する。核酸配列は、各種微生物における発現のためにコドン最適化されていてもよい。本発明は、今しがた記載された核酸を含むベクターも包含する。さらに、本発明は、記載される核酸及び／又はベクターを含む細胞を包含する。
本発明は、各種方法を使用して表面に固定化された、単離又は精製された抗体又はその断片をさらに包含する。例えば、限定されることを望むものではないが、抗体又は断片は、Ｈｉｓ−タグ共役、ビオチン結合、共有結合、吸着などを介して表面と連結又は共役していてもよい。本発明の抗体又はその断片の固定化は、タンパク質を捕捉、精製又は単離するための各種用途において有用であることがある。固体表面は、任意の適切な表面、例えば、以下に限定されないが、マイクロタイタープレートのウェル表面、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーチップのチャネル、膜、ビーズ（磁気ベース若しくはセファロースベースのビーズ、又はその他のクロマトグラフィー樹脂など）、ガラス、プラスチック、ステンレス鋼、フィルム、又は、ナノ粒子、ナノワイヤー及びカンチレバー表面などの任意のその他の有用な表面とすることができる。
本発明は、カーゴ分子に連結した上記の抗体又はその断片も包含する。カーゴ分子は、抗体又はその断片によりＢＢＢを越えて送達される任意の適切な分子とすることができる。カーゴ分子は、約１ｋＤａ〜約２００ｋＤａの範囲の分子量を有しうる。例えば、カーゴ分子は分子量約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、又は２００ｋＤａ、又はその間の任意の分子量、又は任意の２つの上述の分子量で定義される任意の範囲の分子量を有しうる。特定の非限定的な例では、カーゴ分子は、分子量１ｋＤａ（例えば、以下に限定されないが、Ｃｙ５．５などの低分子）、１〜１０ｋＤａ（例えば、以下に限定されないが、ガラニンなどのペプチド、３ｋＤａ）、約８０ｋＤａ（例えば、以下に限定されないが、Ｆｃ断片、酵素、タンパク質、抗体など）、又は約１８０ｋＤａ（例えば、以下に限定されないが、モノクローナル抗体）を有しうる。
例えば、いかなる様式によっても限定されることを望むものではないが、カーゴ分子は、検出可能な薬剤、治療剤、薬物、ペプチド、酵素、増殖因子、サイトカイン、受容体トラップ、抗体又はその断片（例えば、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＶＨＨなど）、化合物、糖部分、ＤＮＡベースの分子（アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、プラスミド）、細胞毒性薬剤、ウイルスベクター（アデノ、レンチ、レトロ）、これまでに列挙された種類のカーゴ分子のうちのいずれかを担持する１つ若しくは複数のリポソーム、又は１つ若しくは複数のナノ粒子、ナノワイヤー、ナノチューブ、若しくは量子ドットとすることができる。上記のカーゴ分子は検出可能な薬剤とすることができる。例えば、ＦＣ５抗体バリアント又はそのバリアントの断片は、放射性同位体、常磁性標識、フルオロフォア、蛍光薬剤、近赤外（ＮＩＲ；例えばＣｙ５．５）蛍光色素若しくは色素、エコー源性のマイクロバブル、親和性標識、検出可能なタンパク質ベースの分子、ヌクレオチド、量子ドット、ナノ粒子、ナノワイヤー、又はナノチューブ、又はイメージング法により検出可能な任意のその他の適切な薬剤に連結されていてもよい。抗体又はその断片は、当技術分野で既知の任意の方法（組換え技術、化学的コンジュゲーションなど）を使用してカーゴ分子に連結されうる。
本明細書に記載されるカーゴ分子を、当技術分野で既知の任意の適切な方法により、抗体又はその断片に連結することができ、連結する、は本明細書では「コンジュゲートする」とも呼ばれる。例えば、限定されることを望むものではないが、カーゴ分子は共有結合又はイオン相互作用によりペプチドに連結されうる。連結は、化学的架橋反応、又は細菌、酵母若しくは哺乳動物細胞ベースの系などの任意のペプチド発現系と組み合わせた組換えＤＮＡ技法を使用する融合により実現可能である。カーゴ分子を抗体又はその断片にコンジュゲートする際には、適切なリンカーが使用されうる。抗体又はその断片を、治療薬又は検出可能な薬剤などのカーゴ分子に連結する方法は当業者に周知のはずである。
非限定的な一例では、カーゴ分子を、検出可能な標識、放射性同位体、ガドリニウム若しくは酸化鉄などの常磁性標識、フルオロフォア、近赤外（ＮＩＲ）蛍光色素若しくは色素、エコー源性のマイクロバブル、親和性標識（例えばビオチン、アビジンなど）、酵素、又は画像診断法により検出可能な任意のその他の適切な薬剤とすることができる。特定の非限定的な例では、抗ＩＧＦ１Ｒ−５又はその断片が、近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）イメージング色素、例えば、限定されることを望むものではないが、Ｃｙ５．５、アレクサ６８０、ダイライト（Ｄｙｌｉｇｈｔ）６８０、又はダイライト８００に連結されうる。
上記の方法におけるｉｎ ｖｉｖｏ検出ステップは、疾患の進行又は治療レジメンに対する宿主応答を評価するための、定量的な、診断目的での全身イメージング、又は以下に限定されないが脳血管若しくは脳腫瘍血管などの特定の部位の局所イメージングであってもよい。上記の方法における検出ステップは、免疫組織化学、又は以下を含むがこれらに限定されない非侵襲性（分子）画像診断技術とすることができる：
光学イメージング；
ポジトロン断層撮影（ＰＥＴ）、検出可能な薬剤は１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１２４Ｉ、７６Ｂｒ、８２Ｒｂ及び６８Ｇａなどの同位元素であり、１８Ｆが最も臨床で利用される；
単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、検出可能な薬剤は、特定の用途に応じて９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、２０１Ｔｌ、１３３Ｘｅなどの放射性トレーサーである；
磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、検出可能な薬剤は、例えば、以下に限定されないが、ガドリニウム、酸化鉄ナノ粒子、及び炭素コーティングされた鉄−コバルトナノ粒子とすることができ、それによりプラーク検出のためのＭＲＩの感度が増大する；
造影超音波検査（ＣＥＵＳ）又は超音波、検出可能な薬剤は少なくとも１つの音響的に活性で気体が封入されたマイクロバブルである。超音波は、ヒト疾患をスクリーニング及び早期検出するための普及した技術である。超音波は、ＭＲＩ又はシンチグラフィーほど高価でなく、放射線を伴わないため放射性核種イメージングなどの分子イメージングモダリティよりも安全である。
本発明は、血液脳関門を越えて目的の分子を輸送する方法をさらに提供する。方法は、本明細書に記載される抗体又はその断片に連結した分子を対象に投与するステップを含む。分子は、これまでに記載された、カーゴ分子を含む任意の望ましい分子であってもよい。分子は、以下に限定されないがコンジュゲーション又は融合タンパク質としての発現を含む、任意の適切な方法を使用して抗体又はその断片に「連結」されうる。投与は、任意の適切な方法、例えば、以下に限定されないが、静脈内（ｉｖ）、皮下（ｓｃ）、及び筋肉内（ｉｍ）投与を含む非経口投与によってなされうる。この方法で、本発明の抗体又はその断片は、目的の分子をＢＢＢを越えて脳の標的に「渡す」。
本発明は、本明細書に記載される、１つ又は１つを超える単離又は精製された抗体又はその断片を含む組成物も包含する。組成物は、単一の上記抗体又は断片を含んでいてもよく、抗体又は断片の混合物であってもよい。さらに、本発明の抗体又は断片の混合物を含む組成物において、抗体は同じ特異性を有していてもよく、特異性が異なっていてもよい。
組成物は、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体を含んでいてもよい。希釈剤、賦形剤、又は担体は、当技術分野で既知の任意の適切な希釈剤、賦形剤、又は担体とすることができ、組成物中のその他の成分、組成物の送達方法に適合していなければならず、組成物のレシピエントにとって有害でない。組成物は任意の適切な形態をとることができる。例えば、組成物は、懸濁液形態、粉末形態（例えば、以下に限定されるが、凍結乾燥されたもの又は被包されたもの）、カプセル又は錠剤形態で提供されうる。例えば、限定されることを望むものではないが、組成物が懸濁液形態で提供される場合、担体は水、生理食塩水、適切な緩衝液、又は溶解性及び／若しくは安定性を改善するための添加剤を含みうる。懸濁液が生じるようにもどすことは、抗体又はその断片が確実に機能するように、適切なｐＨの緩衝液で行われる。乾燥粉末は、安定性を改善するための添加剤、及び／又はバルク／体積を増大させるための担体を含んでいてもよい。例えば、限定されることを望むものではないが、乾燥粉末組成物は、スクロース又はトレハロースを含んでいてもよい。特定の非限定的な例では、組成物は、抗体又はその断片を対象の消化管に送達するように製剤化されてもよい。したがって、組成物は、抗体又はその断片の送達のための、被包、持続放出、又はその他の適切な技術を含んでいてもよい。本化合物を含む適切な組成物を調製することは、当業者の技能の範囲内であるはずである。
本発明は、以下の実施例でさらに例示される。しかし、これらの実施例が例示のためだけのものであり、いかなる様式によっても本発明の範囲を限定するために使用されるべきではないことを理解されたい。
実施例１：ＦＣ５のヒト化
ヒトにおける潜在的な免疫原性を回避するため、ラマ由来のＦＣ５（配列番号１）を、ＶＨＨの「ラクダ科動物」残基の突然変異によりヒト化した。ヒト化においては、ＣＤＲ残基の特定にＫａｂａｔ付番（Ｋａｂａｔら、１９９１）を使用したことに注目すべきである。
ラクダ科動物ＶＨＨの３Ｄ構造モデリング。ＦＣ５ ＶＨＨと類似した鋳型構造を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）に対しＢＬＡＳＴ検索を使用して特定した。ＦＣ５ ＶＨＨの３Ｄ構造を、鋳型としての２Ｘ１Ｏ｜Ａ（ＰＤＢコード｜鎖ＩＤ）の構造に基づき、相同性モデリングを使用して概算した。次いで、鋳型構造に突然変異を起こしてＦＣ５配列にすることにより、ＦＣ５ ＶＨＨ構造を構築した。ＦＣ５ ＶＨＨ構造は、各種位置に突然変異３２個（ＣＤＲに２６個及びフレームワーク領域に６個）を含んでいた。次いで、ＡＭＢＥＲ力場、及び、まず緩和されるＣＤＲループから、最後のステージでのみ完全に緩和されるフレームワーク領域の骨格重原子までの範囲の、拘束の段階的な解放によるエネルギー最小化により、ＦＣ５ ＶＨＨモデルを精製した。次いで、ＣＤＲ−Ｈ３領域における二面角をサンプリングしてその後エネルギー最小化を行うＭｏｎｔｅ−Ｃａｒｌｏ−最小化（ＭＣＭ）立体構造サンプリングにより、ＶＨＨモデルのＣＤＲ−Ｈ３ループを精製した。
ラクダ科動物ＣＤＲ用のヒト重鎖フレームワークの選択。ヒト生殖細胞系データベース（ＶＢＡＳＥ）、その他の配列データベース（Ｇｅｎｂａｎｋ及びＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）、及びヒトフレームワーク共通配列との標準的な配列相同性比較により、ヒト重鎖フレームワークを選択した。ＢＬＡＳＴ検索を実施して、フレームワーク領域のみ（すなわちＣＤＲを除く）で最大の相同性を有する配列一致を検索し、ＣＤＲの長さを一致させた。ＦＣ５ ＶＨＨ用に特定された最も近いヒトフレームワークは、ヒトＶＨ−３サブグループに相当した。ＦＣ５ ＶＨＨと最も類似していたいくつかのヒト生殖細胞系ＶＨ−３フレームワーク配列も、ヒトＶＨ−３共通配列に加えて維持した。ＦＣ５ ＶＨＨフレームワーク配列には、１００％のフレームワークヒト化のために共通ヒトＶＨ−３配列に至るには、突然変異１６個が必要であった。
復帰突然変異のためのフレームワーク残基の特定。ＦＣ５ ＶＨＨモデル及びＦＣ５ ＶＨＨモデルの完全にヒト化された対応物を特徴付け、ヒト性指標、抗原接触傾向指標を推定し、ＣＤＲ、カノニカル残基、異常なフレームワーク残基、潜在的なグリコシル化部位、埋没残基、Ｖｅｒｎｉｅｒ領域残基、及びＣＤＲに対する近接性について描写した。これらのデータの分析により、抗ＩＧＦ１Ｒ ＶＨＨについてのいくつかのヒト化バリアントの設計が示唆され、各バリアントは各種位置において、元のラクダ科動物残基への様々な数の復帰突然変異を有していた。ＦＣ５ ＶＨＨについて合計７種のヒト化バリアントを設計し（ＦＣ５−Ｈ１、ＦＣ５−Ｈ２、ＦＣ５−Ｈ３、ＦＣ５−Ｈ４、ＦＣ５−Ｈ５、ＦＣ５−Ｈ６、ＦＣ５−Ｈ７）、バリアントは最大７つの復帰突然変異を含んでいた（図１）。これらのラクダ科動物復帰突然変異残基のいくつかは、ＶＨＨドメインコア内部に埋没され、ゆえにＢ細胞媒介性の免疫応答を誘導することが予期されなかった。
実施例２：ＦＣ５及びＦＣ５のヒト化バリアントのクローニング、発現及び精製
実施例１に記載されるＦＣ５単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）又はそのヒト化バリアント（ＦＣ５−Ｈ１、ＦＣ５−Ｈ２、ＦＣ５−Ｈ３、ＦＣ５−Ｈ４、ＦＣ５−Ｈ５、ＦＣ５−Ｈ６、ＦＣ５−Ｈ７）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験用の調製においてクローニングし、形質転換し、発現させて精製した。ハイトラップキレーティング（ＨｉＴｒａｐ Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ）（商標）カラムを使用する固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによる精製、及び免疫化学による検出のそれぞれを可能にするため、バリアントは全てＨｉｓ５及びｃ−ｍｙｃタグとの融合物として発現させた。
簡潔に言うと、ｓｄＡｂ ＦＣ５（配列番号１）又はヒト化バリアントをコードするＤＮＡを、プラスミドｐＳＪＦ２ＨのＢｂｓＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングし、ＦＣ５用の発現ベクターを生成した（Ｍｕｒｕｇａｎａｎｄａｍら、２００１）。ＤＮＡ構築物を、プライマーｆｄＴＧＩＩＩ、５’−ＧＴＧＡＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＣＧＣＡＡＴＴＣＣＴ−３’（配列番号１０）及び９６ＧＩＩＩ、５’−ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’（配列番号１１）を使用して、３７３Ａ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ Ｓｔｒｅｔｃｈ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でのヌクレオチドシーケンシングにより確認した。
構築物を大腸菌株ＴＧ１に形質転換し、シングルコロニーを使用して１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有Ｍ９培地１００ｍｌに播種し、培養物を２００ｒｐｍ、３７℃で一晩振とうした。増殖した細胞（２５ｍｌ）を、５μｇ／ｍｌビタミンＢ１、０．４％カザミノ酸、及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを添加したＭ９培地（０．２％グルコース、０．６％Ｎａ２ＨＰＯ４、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ＮＨ４Ｃｌ、０．０５％ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２）１Ｌに移した。細胞培養物を室温で２４時間、２００ｒｐｍで振とうし、次いで、１２％トリプトン、２４％酵母抽出物、及び４％グリセロール含有１０Ｘ誘導培地Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ１００ｍｌを添加した。イソプロピル−μ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ；１ｍＭ）を添加することにより、タンパク質発現を誘導した。誘導後、培養物を２５℃でさらに７２時間振とうし、浸透圧ショック法によりペリプラズム画分を抽出した。
ＦＣ５及びＦＣ５のヒト化バリアントを、ハイトラップキレーティング（商標）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用する固定化金属アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。結合したＦＣ５又はバリアントを、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で、１０〜５００ｍＭイミダゾールグラジエントにより溶出し、ピーク画分を１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４に対し十分に透析した。タンパク質濃度も決定した。
実施例３：ヒト化ＦＣ５バリアントの生物物理学的特性
実施例２で調製されたＦＣ５ ＶＨＨ及びヒト化バリアントを、融解温度分析を使用して特徴付けた。
融解温度：ＦＣ５ ＶＨＨ及びヒト化バリアントの熱安定性を、ＣＤ分光法による融解温度（Ｔｍ）測定を使用して評価した。Ｐｅｌｔｉｅｒ熱電型温度制御システムを備えたＪａｓｃｏ Ｊ−８１５分光偏光計（Ｊａｓｃｏ、Ｅａｓｔｏｎ、ＭＤ、ＵＳＡ）を使用して実験を実施した。経路長１ｍｍのＣＤキュベットを使用した。波長範囲１８０〜２６０ｎｍにかけて、スキャニング速度５０ｎｍ／分、デジタル積分時間（ＤＩＴ）４ｓ、バンド幅１ｎｍ、データピッチ１ｎｍ、及び積分時間１ｓでスペクトルを記録した。融解温度つまりＴｍを測定するため（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、２００６）、温度範囲３０℃〜９６℃にかけてのＣＤスペクトルを記録した。緩衝液スペクトルに相当するブランクから全てのＣＤスペクトルを差し引いた。１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．４中の５０μｇ／ｍＬ ＶＨＨで測定を実施した。全てのバリアントについて２１０ｎｍで、熱により誘導されたタンパク質変性をモニタリングした。記載される式によりフォールディング比（ｆｆ）を得た（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ、２００６ａ；２００６ｂ）：
ｆｆ＝（［θ］Ｔ−［θ］Ｕ）／（［θ］Ｆ−［θ］Ｕ） 式Ｉ
式中、［θ］Ｔは任意の温度でのモル楕円率、［θ］Ｆは３０℃で完全にフォールディングされたタンパク質のモル楕円率、［θ］Ｕは９０℃でアンフォールディングされたタンパク質のモル楕円率。グラフ化ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（Ｗｉｎｄｏｗｓ用バージョン４．０２）を使用して、非線形回帰曲線フィット（Ｂｏｌｔｚｍａｎｎシグモイド方程式）により、アンフォールディング曲線（フォールディング比画分、ｆｆ、対温度）の中間点として融解温度（Ｔｍ）を得た。変性への急な移行に対応する観察された変性曲線と一致する、２状態系を前提とする楕円率データに基づき、ＶＨＨの融解温度（Ｔｍ）を決定した。フォールディング比（ｆｆ）対温度のシグモイド変性曲線の中間点でＴｍ値をとった。
結果を図２に示す。ヒト化バリアントＦＣ５−Ｈ１、ＦＣ５−Ｈ３、ＦＣ５−Ｈ４、ＦＣ５−Ｈ５、ＦＣ５−Ｈ６、及びＦＣ５−Ｈ７は、元のラクダ科動物ＦＣ５（６５℃未満）と比較して改善されたＴｍ値（６５℃超）を示し、これはバリアント設計において目指していた目標でなかったため驚くべき結果であった。ヒト化バリアントの中で、ＦＣ５−Ｈ７が最も高いリフォールディング能力を示し、ＦＣ５−Ｈ３がＦＣ５と比較して１１℃のＴｍ増大を示した。
実施例４：ＦＣ５突然変異バリアントの、脳内皮細胞への結合
抗体の細胞抗原への結合に対するヒト化の効果を評価するため、ＦＣ５及びＦＣ５のヒト化バリアントの、ＳＶ−ＡＲＢＥＣ細胞又はヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＥＣ−Ｄ３）への結合を測定した。
ミラーボール（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ）：緩衝液及び試薬は全て４℃にあらかじめ冷却した。０．５ｘ ＰＢＳ／２．５ｍＭ ＥＤＴＡ及びミラーボールアッセイ緩衝液−Ｌｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、ＬＣＩＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１．８ｍＭ ＣａＣｌ２、１．０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、ｍＯｓｍ＝３００）の１：１緩衝液混合物で、各ＶＨＨ単一ドメイン抗体を開始濃度１０００ｎＭに希釈した。ＬＣＩＢ及び０．５ｘ ＰＢＳ／２．５ｍＭ ＥＤＴＡの１：１混合物の体積２０μｌを、１０００ｎＭ試験ＶＨＨ抗体４０μｌを入れた横列Ａを除き、各３８４ウェルミラーボールアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ３７１２）の全てのウェルに添加した。ミラーボール３８４ウェルアッセイプレート内で、各試験バリアントについて段階希釈液を調製した。１６チャネルＦｉｎｎピペット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＶＨＨ抗体２０μｌを横列Ａ−縦列１〜２４から横列Ｂ−縦列１〜２４に移して８回混合し、次いでＶＨＨ抗体２０μｌを横列Ｂ−縦列１〜２４から横列Ｃ−縦列１〜２４に移して８回混合した。横列Ｇ−縦列１〜２４まで希釈を繰り返し、各ＶＨＨ抗体バリアントについて７ポイント曲線を作成した。第２の一連の試験ＶＨＨ抗体バリアント（１０００ｎＭ）を横列Ｉ−縦列１〜２４に添加し、希釈プロトコールを横列Ｏ−縦列１〜２４まで繰り返した。参照ＦＣ５−Ｈ７ ＶＨＨ単一ドメイン抗体のため、各プレートの横列Ｈ−縦列１〜２４を残しておいた。横列Ｐ−縦列１〜２４には抗体を入れず、二次抗体の目的の細胞への非特異的結合についてのバックグラウンド対照とした。このように、４８のバリアントを各３８４ウェルミラーボールアッセイプレートで試験することができた。不死化成体ラット脳毛細血管内皮細胞（ＳＶ−ＡＲＢＥＣ）及び／又はヒト脳毛細血管内皮細胞（ＨＢＥＣ−Ｄ３）をアキュターゼ（Ａｃｃｕｔａｓｅ）溶液（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で剥離させ、単一細胞集団を生成した。細胞をＬＣＩＢで洗浄し、次いで２００ｘｇで５分間遠心処理してペレットにした。洗浄緩衝液を除去し、細胞ペレットをＬＣＩＢ１ｍＬで再懸濁した。トリパンブルー色素を用い、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＴＣ２０全自動セルカウンターを使用して細胞数を算出し、生存率を評価した。ＬＣＩＢを使用して、細胞を３５０，０００生細胞／ｍｌに希釈した。ドラク５核染色剤（２μＭ、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を添加した蛍光コンジュゲートｃ−ｍｙｃアレクサ４８８検出抗体（１６００ｎｇ／ｍｌ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をＬＣＩＢアッセイ緩衝液で調製した。細胞及び検出二次抗体／ドラク５溶液を１：１で混合し、細胞３５００個を含む溶液２０μｌをミラーボール３８４ウェルアッセイプレートの各ウェルに添加した。各ウェルは７ポイント希釈系列の各ＶＨＨ抗体バリアントを既に含んでおり、最終濃度５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６３及び７．８１ｎＭが生じた。全プレートを４℃で２ｈ及び２０ｈインキュベートした。ミラーボールＨｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙを使用して、以下の設定で各時点で測定を行った：
レーザー設定：４８８及び６４０が使用可能、６．０ｍＷ；
チャネル設定：ＦＬ−２（４８８〜５４０ｎｍ）電圧６００、感度４、Ｔｉｆｆファイルで保存、及びＦＬ−４（６５０〜６９０ｎｍ）電圧６００、感度４、トリガー４、Ｔｉｆｆファイルで保存；
オブジェクト特性：ＦＬ−２（ピーク強度、平均強度、全強度、及びベースライン）及びＦＬ−４（ピーク強度、平均強度、全強度及びベースライン）；
集団定義：オブジェクト−細胞フィルター（ＦＬ−４周囲長範囲０〜５００ｎｍ及びＦＬ−２平均強度範囲０〜１５０００）；
集団統計：オブジェクト：オブジェクト数、オブジェクト：平均値（ＦＬ−２ピーク、平均、全強度及び周囲長）及びオブジェクト：平均ＦＬ−２ベースライン。オブジェクト：中央値（ＦＬ−２ピーク、平均、及び全強度）オブジェクト：平均値（ＦＬ−４ピーク、平均、全強度及び周囲長）及びオブジェクト：平均ＦＬ−４ベースライン。オブジェクト：中央値（ＦＬ−４ピーク、平均、及び全強度）細胞：オブジェクト数、細胞：平均値（ＦＬ−２ピーク、平均、及び全強度）及び細胞：平均ＦＬ−２ベースライン。細胞：中央値（ＦＬ−２ピーク、平均、及び全強度）細胞：平均値（ＦＬ−４ピーク、平均、及び全強度）及び細胞：平均ＦＬ−４ベースライン。細胞：中央値（ＦＬ−４ピーク、平均、及び全強度）。
残りの生細胞物質を、アッセイプレートの隣で４℃でインキュベートし、２ｈ及び２０ｈ時点での細胞生存率をモニタリングした。目的のＳＶ−ＡＲＢＥＣ及びＨＢＥＣ−Ｄ３細胞株の両方で、ＦＣ５及び全てのヒト化バリアントについてミラーボールアッセイ手順を繰り返した。Ｃｅｌｌｉｓｔａソフトウェア（ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ）及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアプログラムでデータを分析した。
ＦＣ５及びヒト化バリアントの、ＳＶ−ＡＲＢＥＣ細胞及びＨＢＥＣ−Ｄ３細胞への結合についての結果を図３に示す（一部の結果は示さない）。このアッセイでは、ＦＣ５がＳＶ−ＡＲＢＥＣ又はＨＢＥＣ−Ｄ３細胞に非常に弱く結合することと比較して、ヒト化ＦＣ５バリアントＦＣ５−Ｈ１、ＦＣ５−Ｈ３、ＦＣ５−Ｈ４、ＦＣ５−Ｈ５、ＦＣ５−Ｈ６及びＦＣ５−Ｈ７が全て、ＳＶ−ＡＲＢＥＣ細胞への改善された結合を示し、ヒト化バリアントＦＣ５−Ｈ３、ＦＣ５−Ｈ２及びＦＣ５−Ｈ７はＨＢＥＣ−Ｄ３への改善された結合も示す。とりわけＦＣ５−Ｈ７は、ＳＶ−ＡＲＢＥＣ細胞さらにはＨＢＥＣ−Ｄ３細胞への高度に改善された結合を示し、これらの細胞におけるＦＣ５−Ｈ７バリアントの、受容体（複数可）に対する有意に改善された親和性を示している。
実施例５：ＦＣ５及びＦＣ５ヒト化バリアントの、ｉｎ ｖｉｔｒｏ血液脳関門モデルを越える輸送
実施例２のヒト化ＦＣ５バリアントが血液脳関門を通過するかどうかを評価するため、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを下記のように使用した。
記載されるように（Ｇａｒｂｅｒｇら、２００５；Ｈａｑｑａｎｉら、２０１２）、ＳＶ４０−不死化成体ラット脳内皮細胞（ＳＶ−ＡＲＢＥＣ）を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏ血液脳関門（ＢＢＢ）モデルを生成した。ＳＶ−ＡＲＢＥＣ（８０，０００細胞／膜）を、０．１ｍｇ／ｍＬラット尾コラーゲンＩ型でコーティングされた組織培養インサート（ポアサイズ１μｍ；表面積０．９ｃｍ２、Ｆａｌｃｏｎ）上の増殖培地１ｍｌ中に播種した。インサートアセンブリーの底部チャンバーは、１：１（ｖ／ｖ）の比で不死化新生仔ラットアストロサイト条件培地を添加された増殖培地２ｍｌを含んでいた。
等モル量（５．６μＭ）の陽性（ＦＣ５）又は陰性対照（Ａ２０．１、クロストリジウム・ディフィシル毒素Ａ結合性ＶＨＨ；）、及び実施例２のヒト化バリアントを、このラットｉｎ ｖｉｔｒｏ ＢＢＢモデルを通過する能力について試験した。等モル量のｓｄＡｂをＢＢＢの管腔側に曝露した後、反管腔側から試料を１５、３０及び６０分後に採取した。次いで、各試料のｓｄＡｂ含有量を質量分析（多重反応モニタリング−アイソタイプ標識された内部標準；ＭＲＭ−ＩＬＩＳ）により定量化した、以下を参照のこと。
ＭＲＭ−ＩＬＩＳ：方法は全て、Ｈａｑｑａｎｉら（２０１２）に記載されるものである。簡潔に言うと、ＶＨＨ用のＳＲＭ（選択反応モニタリング。多重反応モニタリング、ＭＲＭとしても知られる）アッセイを開発するため、まずデータ依存取得を使用してｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより各ＶＨＨを分析し、イオン化可能なペプチドを全て特定した。各ペプチドについて、３〜５種の最も強いフラグメントイオンを選択した。アトモル量の消化物（約１００〜３００ａｍｏｌ）でこれらのフラグメントをモニタリングするための最初のＳＲＭアッセイを開発した。少量で再現可能な強度比を示した（すなわち、より多量のときと比較して０．９５以上のＰｅａｒｓｏｎ ｒ２を有していた）フラグメントを安定と考え、最終ＳＲＭアッセイ用に選択した。アッセイをさらに最適化するため、各ペプチドの溶出時間も含め、近いｍ／ｚ（質量対電荷比）及び溶出時間を有するペプチドを選択しないように注意した。
細胞培地におけるＶＨＨの典型的な多重ＳＲＭ分析は、既知の量のＩＬＩＳ（０．１〜１０ｎＭ）を加え、その後、培養された培地タンパク質１００〜４００ｎｇ（０．３〜１μＬ）をｎａｎｏＬＣ−ＭＳシステムに注入することを伴う。各標的ペプチドイオンのプリカーサーのｍ／ｚを、標的に特定の溶出時間でイオントラップにおいて選択し（残りの無関係のイオンを捨て）、その後衝突誘起解離（ＣＩＤ）フラグメント化、及びイオントラップにおける、検出器によるモニタリングにとって望ましいフラグメントイオンのみの選択を行った。定量化分析のため、ＬＴＱ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）により生成された未加工のファイルを、標準的な質量分析データ形式ｍｚＸＭＬに変換し、ＭａｔｃｈＲｘソフトウェアの改変バージョンである、Ｑ−ＭＲＭ（定量的ＭＲＭ；Ｈａｑｑａｎｉら２０１２を参照のこと）と呼ばれるインハウスソフトウェアを使用して強度を抽出した。ＶＨＨごとに、溶出時間全体にかけての、０．２５Ｄａ以内のフラグメントのｍ／ｚの組み合わせた強度からなる抽出されたイオンクロマトグラムを、ＶＨＨのフラグメントイオンそれぞれについて生成した。各フラグメントについての最終強度値を得るため、予期される保持時間の０．５分以内の強度全てを合計した。ＶＨＨペプチドの少なくとも１つのフラグメントが予期される強度比を示す、すなわち、最終強度値が、対応する純粋なＶＨＨの最終強度値と比較して強いＰｅａｒｓｏｎ相関ｒ２０．９５以上及びｐ０．０５未満を示す場合に、ＶＨＨを試料中において検出可能と定義した。
以前に記載された（Ｈａｑｑａｎｉら、２０１２；Ｇｅｒｇｏｖら、２００３）ように、ＶＨＨの混合物を含む培地試料を還元、アルキル化及びトリプシン消化した。消化物（トリプシンペプチド）を酢酸（５％最終濃度）で酸性化し、ＬＴＱ ＸＬ ＥＴＤ又はＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＥＴＤ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）と共役した逆相ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）で分析した。望ましい分量の試料を３００μｍ Ｉ．Ｄ．×０．５ｍｍ ３μｍペップマップス（ＰｅｐＭａｐｓ）Ｃ１８トラップ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に注入してローディングし、次いで、流速４００ｎＬ／分で、０％〜２０％アセトニトリル（０．１％ギ酸含有）で１分間、２０％〜４６％で１６分間、及び４６％〜９５％で１分間のグラジエントを使用して、１００μｍ Ｉ．Ｄ．×１０ｃｍ １．７μｍ ＢＥＨ１３０Ｃ１８ ｎａｎｏＬＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ）に溶出した。溶出されたペプチドを、ペプチドイオンのフラグメント化にＣＩＤを使用するＭＳ／ＭＳ及びＳＲＭ分析のため、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によりイオン化して質量分析計にかけた。正規化された衝突エネルギー３５％及び活性化時間３０ｍｓで、衝突ガスとしてヘリウムを用いてＣＩＤを実施した。リニアイオントラップへのイオン注入時間は、自動利得制御（ＡＧＣ）標的値６ｘ１０３及び最大蓄積時間２００ｍｓを使用して装置により調整された。
多重アッセイにおいて、ＦＣ５及びＦＣ５のヒト化バリアント、及び対照ＶＨＨＡ２０．１の検出及び定量化に使用された特定のペプチドを表１に示す。
見かけの透過係数の決定：定量化された値を直接プロットするか、図４Ａで与えられる式［Ｑｒ／ｄｔ＝受取区画における累積量対時間；Ａ＝細胞単層の面積；Ｃ０＝投薬溶液の初濃度］を使用してＰａｐｐ（見かけの透過係数）値を決定しプロットすることができる。Ｐａｐｐ値は、分子のＢＢＢを通過する能力を決定するのに一般的に使用される。Ｐａｐｐ値は、化合物の、脳内皮単層を越える比透過性の尺度である。
結果を図４Ｂ及びＣに示す。与えられる結果は、いくつかの独立な実験から得られた平均Ｐａｐｐ値である。陰性対照Ａ２０．１抗体は非常に小さいＰａｐｐ値を有し、ＢＢＢモデルを越えるＡ２０．１ＶＨＨの非特異的な輸送又は傍細胞輸送が最小であることを示している。ＦＣ５ ＶＨＨはＰａｐｐ値約１００ｘ１０−６ｃｍ／分を示し、その一方、ＦＣ５ ＶＨＨのヒト化バリアントＦＣ５−Ｈ３のＰａｐｐ値は４５％大きく、ヒト化バリアントＦＣ５−Ｈ５のＰａｐｐ値は２８％大きい。
各ヒト化バリアントの特性の概要を表２に示す。バリアントＦＣ５−Ｈ１、ＦＣ５−Ｈ３、ＦＣ５−Ｈ４、ＦＣ５−Ｈ５、ＦＣ５−Ｈ６及びＦＣ５−Ｈ７は、ラクダ科動物ＦＣ５と比較して高い融解温度を示す。バリアントＦＣ５−Ｈ１、ＦＣ５−Ｈ３及びＦＣ５−Ｈ７は、ラクダ科動物ＦＣ５と比較して改善された、ラット及びヒト脳内皮細胞両方への結合を示す。バリアントＦＣ５−Ｈ３及びＦＣ５−Ｈ５は、ラクダ科動物ＦＣ５と比較して有意に改善されたｉｎ ｖｉｔｒｏ血液脳関門通過を示す。
実施例６：ヒト化ＦＣ５−Ｆｃ構築物の発現及び精製
ＩｇＧ１のヒト抗体Ｆｃ断片のＮ末端と融合させたＦＣ５又はＦＣ５−Ｈ７を含む構築物を調製し、発現させ、精製した。
ＦＣ５又はＦＣ５−Ｈ７ｃＤＮＡを、ヒトＦｃ断片を含む哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ２００２）にクローニングした。生じたベクターのポリプレックスを、共にＦ１７培地中で作製された、ｐＴＴ５−ＩＲ５ｍＦｃ２ｂ １８７．５μｇ、ｐＴＴ−ＡＫＴｄｄ（プロテインキナーゼＢの活性化された突然変異体）５６．２５μｇ、ｐＴＴｏ−ＧＦＰ（トランスフェクション効率をモニタリングするため）１８．７５μｇ、サケ精巣ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）１１２．５μｇを含むプラスミドＤＮＡ溶液２５ｍｌ；及びＰＥＩｐｒｏＴＭ（ＰｏｌｙＰｌｕｓ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）１．１２５ｍｇを含むＰＥＩ溶液２５ｍｌを混合することによりあらかじめ形成した。細胞培養物への添加前に１０分間混合物をインキュベートした。短縮型ＥＢＮＡ１タンパク質を安定に発現する（ＣＨＯ−３Ｅ７）、Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で増殖させたＣＨＯ細胞の培養物４５０ｍｌを、ポリプレックス５０ｍｌでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、培養物に４０％（ｗ／ｖ）トリプトンＮ１（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ）溶液１２．５ｍｌ及び２００ｍＭバルプロ酸溶液１．２５ｍｌを与えた。トランスフェクション８日後に培養物を採取し、遠心処理により澄ませた。澄ませた培地を０．２２μｍ膜に通して濾過した後、培地を、プロテイン−Ａマブセレクトシュア（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ）樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）５ｍｌを充填したカラムにアプライした。ローディング後、カラムを５倍量のリン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．１（ＰＢＳ）で洗浄し、抗体を１００ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ３．０で溶出させた。溶出された抗体を含む画分をプールし、ＰＢＳで平衡化された脱塩エコノパック（Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ）カラム（ＢｉｏＲａｄ）にローディングすることにより緩衝液交換を実施した。次いで、脱塩された抗体を、マイレクス（Ｍｉｌｌｅｘ）ＧＰ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）フィルターユニット（０．２２μｍ）を通すことにより無菌濾過し、等分した。
実施例７：ヒト化ＦＣ５−Ｆｃ構築物の特性
Ｆｃと融合させたＦＣ５及びＦＣ５−Ｈ７（実施例６）の、ＳＶ−ＡＲＢＥＣ細胞への結合について、実施例４に記載されるようにミラーボール（登録商標）Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＴＴＰ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して評価した。結果は、ＦＣ５−Ｈ７−Ｆｃが、ＦＣ５−Ｆｃと比較してわずかに改善されたＳＶ−ＡＲＢＥＣへの結合を有することを示している（図５Ａ）。
実施例６の、Ｆｃと融合させたＦＣ５−Ｈ７が血液脳関門を通過するかどうかを評価するため、実施例５に記載されるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ及び定量化方法を使用した。結果は、ＦＣ５−Ｈ７−Ｆｃ融合物では、ＦＣ５−Ｆｃと比較して同様のＰａｐｐであったことを示しており（図５Ｂ）、ＦＣ５と比較してＦＣ５Ｈ７の親和性が増大したことが、ＦＣ５Ｈ７の、二価形式でＢＢＢを通過する能力に影響を及ぼさなかったことを示唆している。
本明細書に記載される実施形態及び実施例は説明のためのものであり、請求項に係る本発明の範囲を限定する意図はない。発明者らは、上記の実施形態の、代替物、改変物及び同等物を含む変形形態が請求項により包含されることを意図している。さらに、論じられる特徴の組合せは、発明による解決策に必要とは限らない。
配列表

参考文献
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WO 2003/046560
WO 2002/057445
WO 2011/127580
WO 2007/036021
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年７月６日出願の米国特許仮出願第６２／３５８，７７７号の利益を主張するものであり、その内容は参照によって本明細書に組み込まれる。

Claims (14)

  1. 配列
    Ｘ１ＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＫＩＴＨＹＴＭＧＷＸ２ＲＱＡＰＧＫＸ３Ｘ４ＥＸ５ＶＳＲＩＴＷＧＧＤＮＴＦＹＳＮＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＸ６ＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＧＳＴＳＴＡＴＰＬＲＶＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号９）
    配列中、Ｘ１＝Ｄ又はＥ、Ｘ２＝Ｆ又はＶ、Ｘ３＝Ｅ又はＧ、Ｘ４＝Ｒ又はＬ、Ｘ５＝Ｆ又はＷ、Ｘ６＝Ｌ又はＶである、
    を含む、単離又は精製された抗体又はその断片。
  2. 前記配列が、配列番号２〜８のうちいずれか１つから選択される、請求項１に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
  3. 多価ディスプレイ形式をとる、請求項１又は２に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
  4. Ｆｃ断片に連結されている、請求項３に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
  5. 前記Ｆｃ断片がマウスＦｃ２ｂ又はヒトＦｃ１である、請求項４に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
  6. 前記Ｆｃが配列番号２０の配列を含む、請求項５に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
  7. 血液脳関門を通過する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
  8. 請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片をコードする核酸分子。
  9. 請求項８に記載の核酸分子を含むベクター。
  10. 表面に固定化されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
  11. カーゴ分子に連結されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
  12. 前記カーゴ分子が約１ｋＤａ〜約２００ｋＤａの範囲の分子量を有する、請求項１１に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
  13. 前記カーゴ分子が、検出可能な薬剤、治療薬、薬物、ペプチド、増殖因子、サイトカイン、受容体トラップ、化合物、糖部分、酵素、抗体若しくはその断片、ＤＮＡベースの分子、ウイルスベクター、又は細胞毒性薬剤；検出可能な薬剤、治療薬、薬物、ペプチド、酵素、抗体若しくはその断片、ＤＮＡベースの分子、ウイルスベクター、又は細胞毒性薬剤を担持する１つ又は複数のリポソーム又はナノ担体；又は１つ若しくは複数のナノ粒子、ナノワイヤー、ナノチューブ、若しくは量子ドットである、請求項１１又は１２に記載の単離又は精製された抗体又はその断片。
  14. 請求項１〜７及び１０〜１３のいずれか一項に記載の１つ又は１つを超える単離又は精製された抗体又はその断片、並びに薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む組成物。
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