JP5970734B2 - Ang2結合分子 - Google Patents
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Description
最も重要な血管新生促進因子の1つは、VEGFなどの他の血管新生因子の働きを可能にすることにより血管再構築を制御する、アンギオポイエチン2(Ang2)、Tie2受容体のリガンド(Tie2)である。当技術分野では、Ang2はTie2リガンドとも呼ばれる(米国特許第5,643,755号、Yancopoulos et al.2000,Nature407:242-248)。
Ang−Tie系は2個の受容体(Tie1およびTie2)と3個のリガンド(Ang1、Ang2およびAng4)からなる(Augustin et al.,Nat Rev Mol Cell Biol.2009 Mar;10(3):165-77)。Tie2、Ang1およびAng2はこのファミリーの最も研究されているメンバーであり、Tie1はオーファン受容体であり、血管再構築に関するAng4の役割は依然として定義する必要がある。Ang2とAng1は、Tie2結合および活性化に対して反対の機能を媒介する。Ang2媒介Tie2活性化は、内皮細胞活性化、周皮細胞解離、血管外漏出および血管発芽の誘導をもたらす。Ang2と対照的に、Ang1シグナル伝達は周皮細胞の動員により血管の完全性を維持し、それによって内皮細胞の静止状態を維持する。
in vitroにおいてAng2は、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)において適切なマイトジェン、化学誘引物質および血管形成の誘導物質として作用することが示されている。Ang2は線維芽細胞内の異所で発現されるTie2のチロシンリン酸化を誘導し、HUVECにおけるERK−MAPK、AKTおよびFAKのリン酸化などの下流シグナル伝達事象を促進する。Ang1誘導型内皮細胞応答におけるAng2のアンタゴニスト的役割が記載されている。
Ang2−Tie2系は、血管新生分化転換および腫瘍血管新生の後期段階の間に重要な役割を発揮する。Ang2の発現は腫瘍付随内皮において強く上方制御される。特に腫瘍増殖の初期段階中にAng2欠損マウスに移植したとき、腫瘍増殖の低下が観察されている。Ang2mAbによるAng2の治療的遮断は、様々な腫瘍異種移植片モデルにおいて広い有効性を示している。
前述の米国特許出願公開第2008/0014196号中に要約されたように、血管新生は、固形腫瘍および転移を含めた幾つかの障害の病原と関係している。
しかしながら、現況技術のモノクローナル抗体(MAb)および融合タンパク質には、それらの治療用途の観点で幾つかの欠点がある。それらの分解を防ぐため、それらはほぼ凍結温度で保存しなければならない。さらに、それらは腸管内で急速に消化されるため、経口投与に適していない。癌治療に関するMAbの別の大きな制約は輸送効率が悪いことであり、これが低濃度および腫瘍中の細胞標的化の欠如につながる。
より詳細には本発明の目的は、新規なAng2結合分子、および具体的には、哺乳動物Ang1ではなく哺乳動物Ang2と結合するAng2結合分子、および特にヒトAng1ではなくヒトAng2と結合するAng2結合分子を提供することであり、このような分子またはポリペプチドは本明細書に記載する治療および診断目的に適している。本発明のさらなる目的は、Ang1ではなくAng2と特異的に結合する免疫グロブリン単一可変ドメインを提供することである。
このようなAng2結合分子、またはAng2アンタゴニストは、血管新生に対するAng2媒介効果と関係がある疾患または状態を予防、治療、緩和および/または診断する際に、組成物における薬理学的活性剤として有用である。
このような疾患の例は、乳癌、腎細胞癌、卵巣癌および膵臓癌などの癌または癌性疾患、加齢黄斑変性および糖尿病性網膜症などの眼部疾患、および/または糖尿病性腎症、腎後性不全、腎前性高窒素血症および内因性腎不全などの慢性腎臓病である。
さらに本発明は、前記免疫グロブリン単一可変ドメインからなるAng2結合分子に関する。
別の態様により、前記Ang2結合分子をコードする核酸、および前記核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
さらに本発明は、前記核酸を含む1つまたは複数の発現ベクターを有する宿主細胞に関する。
(a)前記核酸分子を含む1つまたは複数の前記ベクターで宿主細胞をトランスフェクトするステップ、
(b)前記宿主細胞を培養するステップ、および
(c)前記Ang2結合分子を回収し精製するステップ
を含む方法に関する。
本発明のさらなる態様は、活性成分として1つまたは複数の前記Ang2結合分子、および少なくとも生理的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
さらに本発明は、本明細書に記載するAng2結合分子、核酸分子、宿主細胞、産物および組成物の適用および使用、ならびに血管新生に対するAng2媒介効果と関係がある疾患、好ましくは癌、癌性疾患、および眼部疾患を予防および/または治療するための方法に関する。
本発明のこれらおよび他の態様、実施形態、利点および適用は、本明細書の以下のさらなる記載から明らかとなる。
定義
他に指定または定義しない限り、使用する全ての用語は当技術分野における通常の意味を有し、それは当業者には明らかである。例えば、Sambrook et al,「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」(2nd Ed.),Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989);Lewin,「GenesIV」,Oxford University Press,New York,(1990),and Roitt et al.,「Immunology」(2nd Ed.),Gower Medical Publishing,London,New York(1989)などの標準的な手引き、および本明細書に引用する一般的背景技術を参照のこと。さらに、他に示さない限り、詳しく具体的に記載しない全ての方法、ステップ、技法および操作を実施することができ、当業者には明らかなように、それ自体知られている形式で実施することができる。例えば、標準的な手引き、前述の一般的背景技術、および本明細書に引用するさらなる参照を再度参照のこと。
他に示さない限り、用語「免疫グロブリン」および「免疫グロブリン配列」は、重鎖抗体または従来型4鎖抗体を指すために本明細書で使用しようと、一般的な用語として使用し、完全サイズの抗体、その個々の鎖、およびその全部分、ドメインまたは断片をいずれも含む(それぞれVHHドメインまたはVH/VLドメインなどの、抗原結合ドメインまたは断片に限られないが、これらを含む)。さらに、本明細書で使用する用語「配列」(例えば、用語「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「(単一)可変ドメイン配列」、「VHH配列」または「タンパク質配列」など)は、文脈がより限定的な解釈を必要としない限り、関連アミノ酸配列と、それをコードする核酸配列またはヌクレオチド配列の両方を含むと一般に理解すべきである。
本明細書で使用する用語「免疫グロブリン可変ドメイン」は、それぞれ、当技術分野および本明細書の以下で、「フレームワーク領域1」または「FR1」、「フレームワーク領域2」または「FR2」、「フレームワーク領域3」または「FR3」、および「フレームワーク領域4」または「FR4」と呼ぶ4個の「フレームワーク領域」から本質的になる免疫グロブリンドメインを意味し、これらのフレームワーク領域は、それぞれ、当技術分野および本明細書の以下で、「相補性決定領域1」または「CDR1」、「相補性決定領域2」または「CDR2」、および「相補性決定領域3」または「CDR3」と呼ぶ3個の「相補性決定領域」または「CDR」によって中断される。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造または配列は以下のように示すことができる:FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4。抗原結合部位を有することにより抗原に対する抗体に特異性を与えるのは、免疫グロブリン可変ドメイン(複数可)である。
免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばVHHのアミノ酸残基は、例えばRiechmann and Muyldermans,J.Immunol.Methods 231,25-38(1999)の図2中に示されたラクダ由来のVHHドメインに適用したように、Kabat et alにより与えられたVHドメインに関する一般的なナンバリングに従い番号処理する(「Sequence of proteins of immunological interest」,US Public Health Services,NIH Bethesda,MD,Publication No.91)。
FR1は位置1〜30にアミノ酸残基を含み、
CDR1は位置31〜35にアミノ酸残基を含み、
FR2は位置36〜49にアミノ酸残基を含み、
CDR2は位置50〜65にアミノ酸残基を含み、
FR3は位置66〜94にアミノ酸残基を含み、
CDR3は位置95〜102にアミノ酸残基を含み、かつ
FR4は位置103〜113にアミノ酸残基を含む。
類似した形式でVHHドメインに適用することもできる、VHドメインのアミノ酸残基のナンバリングに関する別の方法が、当技術分野で知られている。しかしながら、本発明の記載、特許請求の範囲および図面中、他に示さない限り、前に記載したようにVHHドメインに適用するKabatによるナンバリングに従う。
VHHドメイン中のアミノ酸残基の合計数は通常110〜120の範囲であり、112〜115の範囲であることが多い。しかしながら、より短い配列およびより長い配列も、本明細書で記載する目的に適している可能性があることに留意すべきである。
・ 1個のドメインのみが高いアフィニティーおよび高い選択性で抗原と結合するのに必要とされ、したがって2個の別ドメインを存在させる必要がなく、正確な空間的立体配座および形状で(すなわち、scFvと同様に特別に設計されたリンカーの使用によって)、これら2個のドメインが存在することを保証する必要もない。
・ 免疫グロブリン単一可変ドメインは1個の核酸分子から発現させることが可能であり、(グリコシル化のような)いかなる翻訳後修飾も必要としない。
・ (本明細書でさらに論じるように)免疫グロブリン単一可変ドメインを、容易に多価および多重特異性形式に操作することができる。
・ 免疫グロブリン単一可変ドメインは、それらの標的に対して高い特異性とアフィニティー、低い固有の毒性を有し、注入または注射以外の代替経路によって投与することができる。
・ 免疫グロブリン単一可変ドメインは、小規模および製造規模の両方で、調製するのが容易で比較的安価である。例えば、(例えば、以下でさらに記載するように)微生物発酵を使用して免疫グロブリン単一可変ドメインを生成することができ、例えば従来型抗体のように哺乳動物発現系の使用を必要としない。
・ 免疫グロブリン単一可変ドメインは、従来型4鎖抗体およびその抗原結合断片と比較して比較的小さく(約15kDa、または従来型IgGより10倍小さい)、したがって、(固形腫瘍および他の深部組織だけには限られないがこれらを含めた)組織への(より)高い浸透性を示し、このような従来型4鎖抗体およびその抗原結合断片より多用量で投与することができる。
・ VHHは(特に、4鎖抗体由来のVHドメインと比較した、それらの広いCDR3ループのため)特異的ないわゆる「腔結合性」を有し、したがって、従来型4鎖抗体およびその抗原結合断片がアクセスできない標的およびエピトープにアクセスすることもできる。
・ (Ward et al.,Nature 341:544-546(1989)により記載されたマウス由来抗原結合ドメインと同様に)、VHHは非常に可溶性が高く、非常に安定性があり、凝集する傾向がないという固有の利点を有する。
(2) 天然に存在する配列を有するVHHをコードする核酸分子を発現させるステップ、
(3) 場合によってはアフィニティー成熟後に、天然に存在する配列を用いて(本明細書に記載するように)VHHを「ヒト化」するステップ、またはこのようなヒト化VHHをコードする核酸を発現させるステップ、
(4) 動物種由来、特に人間などの哺乳動物種由来の、天然に存在する抗体からの免疫グロブリン単一可変重鎖ドメインを(本明細書で以下に記載するように)「ラクダ化」するステップ、またはこのようなラクダ化ドメインをコードする核酸分子を発現させるステップ、
(5) VHを「ラクダ化」するステップ、またはこのようなラクダ化VHをコードする核酸分子を発現させるステップ、
(6) 合成的または半合成的にタンパク質、ポリペプチドもしくは他のアミノ酸配列を調製する技法を使用するステップ、
(7) 核酸合成に関する技法を使用してVHHドメインをコードする核酸分子を調製するステップ、このように得た核酸を次いで発現させるステップ、
(8) 重鎖抗体もしくはVHHをアフィニティー成熟、突然変異誘発(例えば、ランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発)および/または任意の他の技法(複数可)に曝して、VHHのアフィニティーおよび/または特異性を増大させるステップ、および/または
(9) 前述のステップの組合せまたは選択。
具体的な実施形態によれば、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインまたは本発明のポリペプチドにおいて存在する免疫グロブリン単一可変ドメインは、天然に存在するVHHドメインのアミノ酸配列にほぼ相当するが、(場合によってはアフィニティー成熟後に)「ヒト化」または「配列最適化」、すなわち人間由来の従来型4鎖抗体の可変重鎖ドメイン中の対応する位置(複数可)に存在する1つまたは複数のアミノ酸残基によって、前記天然に存在するVHH配列のアミノ酸配列中の1つまたは複数のアミノ酸残基が置換されている、アミノ酸配列を有するVHHドメインである。当業者により普通に使用され得る当技術分野で知られている方法を使用して、これを実施することができる。
適切な場合、高いアフィニティーを有する結合分子は別の結合分子のアフィニティー成熟により得ることができ、アフィニティー成熟分子に関して後者は「親」結合分子となる。
特異的抗原またはエピトープと結合するVHHを得るための方法は、例えばWO2006/040153およびWO2006/122786中に初期に記載されている。その中でさらに詳細に記載されたように、ラクダ由来のVHHドメインは、人間由来の従来型4鎖抗体のVHドメイン中の対応する位置(複数可)に存在する1つまたは複数のアミノ酸残基により、原型VHH配列のアミノ酸配列中の1つまたは複数のアミノ酸残基を置換することによって、「ヒト化」することができる(本明細書では「配列最適化」とも呼ぶ、「配列最適化」は、ヒト化以外に、考えられる翻訳後修飾部位の除去などの、改善された性質をVHHに与える1つまたは複数の突然変異による別の配列修飾を包含し得る)。ヒト化VHHドメインは1つまたは複数の完全ヒトフレームワーク領域配列を含有することができ、およびさらにより具体的な実施形態では、DP−29、DP−47、DP−51、またはこれらの一部分由来のヒトフレームワーク領域配列を含有することができ、JH5などのJH配列と場合によっては組合せることができる。
さらに、ヒト足場または非免疫グロブリン足場だけには限られないが、これらを含めた他の「足場」に、前述の1つまたは複数のCDRを「移植」することができることも当業者には明らかである。このようなCDR移植に適した足場および技法は、当技術分野では知られている。
互換的に使用することができる用語「エピトープ」と「抗原決定基」は、従来型抗体または本発明のポリペプチドなどの抗原結合分子によって、およびより詳細には前記分子の抗原結合部位によって認識される、ポリペプチドなどのマクロ分子の一部分を指す。エピトープは免疫グロブリンの最小結合部位を画定し、したがって免疫グロブリンの特異性の標的となる。
一般に用語「特異性」は、(本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインなどの)特定抗原結合分子または抗原結合タンパク質分子が結合可能である、異なるタイプの抗原またはエピトープの数を指す。抗原結合分子の特異性は、そのアフィニティーおよび/またはアビディティーに基づいて決定することができる。抗原結合タンパク質と抗原の解離に関する平衡定数(KD)によって表されるアフィニティーは、抗原結合タンパク質におけるエピトープと抗原結合部位の間の結合強度の指標であり、KDの値が低くなるほど、エピトープと抗原結合分子の間の結合強度は強くなる(あるいは、1/KDであるアフィニティー定数(KA)としてアフィニティーを表すこともできる)。(例えば、本明細書のさらなる開示に基づき)当業者には明らかであるように、対象の特異的抗原に応じて、それ自体知られている方法でアフィニティーを決定することができる。アビディティーは、(免疫グロブリン、抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインまたはそれを含有するポリペプチドなどの)抗原結合分子と関連抗原の間の結合強度の指標である。アビディティーは、抗原結合分子におけるエピトープとその抗原結合部位の間のアフィニティーと、抗原結合分子上に存在する関連結合部位の数の両方と関連している。
フォーマット型Ang2結合分子は、あまり好ましくないが、同じまたは重複エピトープを認識する、2個の同一Ang2結合免疫グロブリン単一可変ドメインまたは2個の異なる免疫グロブリン単一可変ドメインも含み得る。この場合、2個の免疫グロブリン単一可変ドメインは、Ang2ダイマーを形成する2個の各モノマーにおいて、同じまたは重複エピトープと結合し得る。競合ELISAアッセイを含めた実験データは、モノマーAng2結合分子の個別構成単位との比較時の、フォーマット型Ang2ダイマーの有意な効能改善を開示する(データ示さず)。
AlaからGlyまたはSer、ArgからLys、AsnからGlnまたはHis、AspからGlu、CysからSer、GlnからAsn、GluからAsp、GlyからAlaまたはPro、HisからAsnまたはGln、IleからLeuまたはVal、LeuからIIeまたはVal、LysからArg、GlnまたはGlu、MetからLeu、TyrまたはIle、PheからMet、LeuまたはTyr、SerからThr、ThrからSer、TrpからTyr、TyrからTrpまたはPhe、ValからIleまたはLeu。
a)各配列番号xにおいて示す配列と少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列、
b)各配列番号xにおいて示す配列と3、2、または1個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列を含む。
用語「癌」および「癌性」は、典型的には制御不能な細胞増殖/繁殖によって特徴付けられる、哺乳動物における生理的状態を言及または記載する。本発明のAng2結合分子を用いて治療される癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫、および白血病があるが、これらだけには限られない。このような癌のより具体的な例には、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化管癌、膵臓癌、膠芽腫、頚部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーム、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、腎細胞癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝性癌、胃癌、メラノーマ、および様々なタイプの頭頸部癌がある。血管新生の異常制御は、本発明の組成物および方法により治療することができる多くの障害をもたらす可能性がある。これらの障害には、非腫瘍形成状態と腫瘍形成状態の両方がある。腫瘍形成状態には前に記載したものがあるが、これらだけには限られない。
用語「慢性腎臓病」は、糖尿病性腎症、腎後性不全、腎前性高窒素血症および内因性腎不全を指す。
[発明を実施するための形態]
配列番号168 DYAIG
配列番号169 DYALG
配列番号170 YYAIG
から選択される配列を有する。
CDR2は
配列番号171 AIRSSGGSTYYADSVKG
配列番号172 CIRCSGGSTYYADSVKG
配列番号173 CISSSGGITYYADSVKG
から選択される配列を有する。
CDR3は
配列番号174 VPAGRLRFGEQWYPLYEYDA
配列番号175 VPAGRLRYGEQWYPIYEYDA
配列番号176 SIVPRSKLEPYEYDA
配列番号177 DSGGYIDYDCSGLGYDY
から選択される配列を有する。
(a)CDR1は配列番号168において示すアミノ酸配列を有し、CDR2は配列番号171において示すアミノ酸配列を有し、かつCDR3は配列番号174において示すアミノ酸配列を有する、または
(b)CDR1は配列番号168において示すアミノ酸配列を有し、CDR2は配列番号171において示すアミノ酸配列を有し、かつCDR3は配列番号175において示すアミノ酸配列を有する、または
(c)CDR1は配列番号169において示すアミノ酸配列を有し、CDR2は配列番号172において示すアミノ酸配列を有し、かつCDR3は配列番号176において示すアミノ酸配列を有する、または
(d)CDR1は配列番号170において示すアミノ酸配列を有し、CDR2は配列番号173において示すアミノ酸配列を有し、かつCDR3は配列番号177において示すアミノ酸配列を有する。
さらにより好ましい実施形態によれば、Ang2結合分子は免疫グロブリン単一可変ドメインを含み、前記免疫グロブリン単一可変ドメインはVHHである。
具体的実施形態によれば、前記VHHは配列番号167、166、129および138からなる群から選択される配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインからなる。
別の態様において本発明は、前記免疫グロブリン単一可変ドメインからなるAng2結合分子に関する。
一態様では、免疫グロブリン単一可変ドメインからなる前記VHHにN末端で修飾または交換があり、前記修飾は第一アミノ酸の欠失であり、前記交換は第一アミノ酸と別のアミノ酸の置換である。
好ましい一実施形態では、N末端上の第一アミノ酸は、例えばアラニン(A)によって置換されたバリン(V)またはアスパラギン酸(D)である。
高いアフィニティーを有する本発明のAng2結合要素は、別のAng2結合要素のアフィニティー成熟により得ることが好ましく、アフィニティー成熟分子に関して後者は「親」Ang2結合要素となる。
したがって、さらに別の好ましい実施形態では、本発明のAng2結合分子は、前に定義した親免疫グロブリン単一可変ドメインのアフィニティー成熟によって得た免疫グロブリン単一可変ドメインである。
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、VHHのアフィニティー成熟によって得た免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
別の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号127、132および146において示すアミノ酸配列を有するVHHのヒト化によって得た免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
さらに本発明は、前に定義したVHHのアフィニティー成熟および/または配列最適化によって得たAng2結合分子、例えば配列番号167、166、129および138として示すアミノ酸配列を有するVHHの配列最適化によって得たVHHに関する。
別のより好ましい実施形態では、本発明は、配列番号167において示すアミノ酸配列を有するVHHのアフィニティー成熟によって得た免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
さらにより好ましい実施形態では、本発明は、配列番号166において示すアミノ酸配列を有するVHHのアフィニティー成熟によって得た免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
他のさらなる好ましい実施形態では、本発明は、配列番号138において示すアミノ酸配列を有するVHHのアフィニティー成熟によって得た免疫グロブリン単一可変ドメインに関する。
このようなラクダ化は、VH−VL界面に存在するアミノ酸位置およびいわゆるCamelidae Hallmark残基で優先的に行うことができる(例えばWO1994/04678も参照)。このような「ヒト化」および「ラクダ化」技法、ならびにこれらと一致する好ましいフレームワーク領域配列の詳細な記載は、例えばWO2006/040153の46ページと98ページおよびWO2006/122786の107ページからさらに得ることができる。
Ang2結合要素とその抗原Ang2の特異的結合は、例えば本明細書に記載するアッセイ、スキャッチャード解析および/または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素イムノアッセイ(EIAおよびELISA)、およびサンドウィッチ競合アッセイ、および当技術分野でそれ自体が知られているこれらの異なる変形を含めた、それ自体が知られている任意の適切な方法において決定することができる。
したがって好ましい実施形態によれば、本発明は、Ang2結合要素、特に免疫グロブリン単一可変ドメインまたはそれらを含有するポリペプチドに関するものであり、前記免疫グロブリン単一可変ドメインは、FLDドメイン内に全体または部分が含有されるエピトープと結合する群から選択される(配列番号188〜190)。
本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、競合ELISAアッセイにおいて測定して、10-6〜10-10モル/リットル以下の範囲、より好ましくは10-8〜10-10モル/リットル以下の範囲、およびさらにより好ましくは10-9〜10-10モル/リットル以下の範囲のIC50値を有することが好ましい。
別の実施形態によれば、免疫グロブリン単一可変ドメインは本明細書で定義するドメイン抗体である。
好ましい実施形態では、Ang2分子内の1つまたは複数のエピトープと特異的に結合する1つの免疫グロブリン単一可変ドメインをそれらが含む点で、結合要素はAng2に対する特異性を有する。
さらに結合要素は、それらが対象とする抗原の特異的ドメインまたは抗原決定基によって限定または定義されない。治療用Ang2アンタゴニストの開発における動物モデルとして使用する目的のヒト以外の種に由来する、1つまたは複数の抗原分子との交差反応性の点において、結合要素は、ヒト抗原と高度の同一性を有する各抗原の領域中のエピトープを認識することが好ましい。例えば、マウスモデルを使用する点において、本発明の単一特異性結合分子中に含有された抗Ang2免疫グロブリン単一可変ドメインは、Ang2のEGF−ドメイン内に全体または一部分が位置するエピトープを認識し、これはヒトとマウスの間の高い同一性を示す。
したがって好ましい実施形態によれば、本発明の単一特異性結合分子は、FLDドメイン内に全体または部分が含有されるエピトープと結合する配列番号167、166、129および138からなる群から選択される免疫グロブリン単一可変ドメインであるAng2結合分子を含む。
配列番号178
GAGGTACAGCTGGTCGAGTCAGGTGGCGGATTAGTGCAGCCTGGGGGTTCTCTGCGCTTATCTTGTGCCGCATCAGGCTTCACACTGGATGACTACGCCATCGGCTGGTTCCGGCAAGCGCCTGGAAAAGAACGCGAAGGTGTTTCAGCAATCCGTTCAAGCGGTGGTTCAACATATTACGCCGACTCTGTTAAAGGACGCTTCACCATTAGCTCCGACAATAGTAAAAATACAGTCTACTTACAAATGAACAGTTTACGCCCAGAAGATACTGCGGTATACTATTGCGCTGCCGTGCCTGCTGGTCGCTTACGCTTTGGCGAGCAATGGTATCCTCTGTACGAGTACGACGCCTGGGGACAGGGTACGCTGGTAACGGTTTCAAGC
配列番号179
GAAGTGCAACTGGTTGAGTCAGGTGGCGGACTGGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGCCTGAGTTGCGCAGTTAGCGGTATTACCCTGGATGATTATGCAATTGGTTGGTTTCGCCAAGCCCCAGGCAAAGAGCGTGAAGGCGTTAGCGCAATTCGTAGCAGCGGTGGTAGCACCTATTATGCCGATTCAGTTAAAGGCCGTTTTACGATCAGCAGCGATAACAGTAAAAACACGGTTTATCTGCAAATGAACTCATTACGTCCAGAGGACACTGCAGTTTACTATTGCGCAGCAGTTCCGGCAGGTCGTCTGCGTTATGGTGAACAGTGGTATCCGATTTATGAATATGATGCATGGGGTCAAGGTACACTGGTTACAGTGAGTAGC
配列番号180
GAAGTGCAGTTAGTCGAAAGTGGCGGAGGCCTGGTACAACCTGGTGGCAGTCTGCGCTTATCTTGTGCCGCTTCAGGTTTTACATTCGACGACTACGCCCTGGGGTGGTTCCGGCAAGCGCCTGGAAAAGAACGTGAGGGCGTTTCATGCATTCGTTGTTCAGGTGGTTCAACCTATTATGCCGATAGTGTAAAAGGTCGGTTCACCATTAGTAGCGACAATAGCAAGAATACAGTCTATCTGCAAATGAACTCTTTACGTCCTGAAGATACTGCGGTGTACTACTGCGCTGCATCAATCGTTCCTCGTTCAAAACTTGAACCTTACGAGTACGACGCCTGGGGTCAGGGTACGTTAGTAACGGTGTCAAGC
および
配列番号181
GAAGTGCAACTGGTTGAGTCAGGTGGCGGTTTAGTGCAACCGGGTGGTTCACTGCGCCTGAGTTGCGCAGCCAGCGGTTTTGCACTGGATTATTATGCAATTGGTTGGTTTCGCCAAGCCCCAGGCAAAGAGCGTGAAGGCGTTAGCTGTATTAGCAGCAGCGGTGGTATTACCTATTATGCCGATTCAGTTAAAGGCCGTTTTACGATCTCTCGTGATAATAGTAAAAACACGGTTTACCTGCAGATGAACTCATTAAGACCAGAGGACACTGCAGTTTACTATTGTGCAACCGATAGCGGTGGCTATATTGATTATGATTGTAGCGGTCTGGGCTACGATTATTGGGGACAAGGTACGCTGGTGACAGTTAGCAGC
好ましい実施形態では、本発明の核酸は例えばプラスミド、コスミドもしくはYACなどのベクターの形であってもよく、その中に存在する可能性があり、および/またはその一部分である可能性がある。
本発明の核酸は、本明細書で与える本発明のポリペプチドに関するアミノ酸配列の情報に基づき、それ自体が知られている方法で調製または入手することができ(例えば、自動DNA合成および/または組換えDNA技術により)、および/または適切な天然源から単離することができる。
特に好ましい実施形態によれば、前記宿主細胞は細菌細胞であり、他の有用な細胞は酵母細胞、真菌細胞または哺乳動物細胞である。
適切な細菌細胞には、大腸菌、プロテウス、シュードモナスの株などのグラム陰性菌株、およびバシラス、ストレプトミセス、スタフィロコッカス、およびラクトコッカスの株などのグラム陽性菌株由来の細胞がある。適切な真菌細胞には、トリコデルマ、ニューロスポラ、およびアスペルギルスの種由来の細胞がある。適切な酵母細胞には、サッカロミセス(例えばサッカロミセスセレビシアエ)、シゾサッカロミセス(例えばシゾサッカロミセスポンベ)、ピキア(例えばピキアパストリスおよびピキアメタリカ)、およびハンセヌラの種由来の細胞がある。
さらに本発明は、本発明の単一特異性結合分子の製造法を提供し、このような方法は一般に、
本発明の単一特異性結合分子の発現を可能にする条件下で、単一特異性結合分子をコードすることができる核酸を含む宿主細胞を培養するステップ、
培養由来の宿主細胞により発現されたポリペプチドを回収または単離するステップ、および
本発明の単一特異性結合分子を場合によってはさらに精製および/または修飾および/または製剤化するステップを含む。
(a)1つまたは複数の前記ベクターで宿主細胞をトランスフェクトするステップ、
(b)前記宿主細胞を培養するステップ、および
(c)前記Ang2結合分子を回収し精製するステップ
を含む方法を示す。
産業規模での生成に関して、好ましい宿主生物には、大規模発現、生成および発酵、ならびに特に大規模な医薬的発現、生成および発酵に適した、大腸菌、ピキアパストリス、およびサッカロミセスセレビシアエの株がある。
具体的な発現系の選択は、特定翻訳後修飾、より具体的にはグリコシル化に関する要件に一部分は依存する。グリコシル化が望ましいまたは必要な本発明の単一特異性結合分子の生成は、発現タンパク質をグリコシル化する能力を有する哺乳動物発現宿主の使用を必要とし得る。この点で、得られるグリコシル化パターン(すなわち、結合残基の種類、数および位置)が、発現に使用する細胞または細胞系に依存することは、当業者には明らかである。
適切な具体的発現ベクター、形質転換またはトランスフェクション法、選択マーカー、タンパク質発現の誘導法などの、ポリペプチドの組換え生成に使用するための方法および試薬、培養条件は、当技術分野で知られている。同様に、本発明のポリペプチドの製造法において有用なタンパク質の単離および精製技法は、当業者によく知られている。
さらに本発明は、少なくとも1個の本発明の単一特異性結合分子、および場合によってはそれ自体が知られているこのような組成物の1つまたは複数のさらなる要素を、すなわち目的とする組成物の用途に応じて、含有または包含する製品または組成物に関する。
さらなる態様では本発明は、医薬品としての本発明の単一特異性結合分子の使用に関する。
医薬用途のため、本発明の単一特異性結合分子またはそれを含有するポリペプチドを、少なくとも1個の本発明の単一特異性結合分子、および少なくとも1個の生理的に許容される担体、希釈剤または賦形剤および/またはアジュバント、および場合によっては1つまたは複数のさらなる薬学的に活性があるポリペプチドおよび/または化合物を含む医薬調製物または組成物として製剤化することができる。非制限的な例として、このような製剤は、経口投与、(静脈内、筋肉内または皮下注射または静脈内注入などによる)非経口投与、局所投与、吸入、皮膚パッチ、インプラント、座薬などによる投与に適した形であってよい。投与の形式に応じて固体、半固体または液体であってよい、このような適切な投与形、ならびにその調製において使用するための方法および担体は当業者には明らかであり、本明細書でさらに記載する。
したがって、さらなる態様において本発明は、少なくとも1個の単一特異性結合分子、特に本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインまたはそれを含有するポリペプチド、および少なくとも1個の適切な(すなわち医薬用途に適した)担体、希釈剤または賦形剤、および場合によっては1つまたは複数のさらなる活性物質を含有する医薬組成物に関する。
したがって、本発明の単一特異性結合分子は全身、例えば経口的に、不活性希釈剤または吸収性可食担体などの薬学的に許容される賦形剤と組合せて投与することができる。経口治療投与のため、本発明の二重特異性結合分子は1つまたは複数の賦形剤と組合せることができ、摂取可能な錠剤、口内錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、カシェ剤などの形で使用することができる。このような組成物および調製物は、少なくとも0.1%の本発明のAng2結合分子を含有しなければならない。組成物および調製物中のそれらの割合は当然ながら変えることができ、所与の単位剤形の約2重量%〜約60重量%であることが好都合であり得る。このような治療上有用な組成物における本発明の二重特異性結合分子の量は、有効な投薬レベルが得られるような量である。
本発明の単一特異性結合分子は、WO08/020079の144および145ページにさらに記載されたように、注入または注射により静脈内もしくは腹腔内投与することもできる。
本発明の単一特異性結合分子の局所投与に関しては、WO08/020079の145ページにさらに記載されたように、固体または液体であってよい皮膚学的に許容される担体と組合せ、組成物または製剤として皮膚にそれらを投与することが一般に望ましい。
さらなる実施形態によれば、本発明は、
血管新生に対するAng2媒介および/またはAng2関連効果と関係がある、または本発明の単一特異性結合分子を用いたNotchシグナル伝達経路および/またはTie2シグナル伝達経路の調節により予防、治療または緩和することができる、特に人間における障害、疾患または状態の予防、治療および/または緩和のため、
このような療法を必要とする患者の治療法であって、薬学的に活性がある量の少なくとも1個の本発明の単一特異性結合分子、例えば免疫グロブリン単一可変ドメイン、またはそれらを含有する医薬組成物を、必要性のある対象に投与するステップを含む方法、
血管新生に対するAng2媒介および/またはAng2関連効果と関係がある障害、疾患または状態を予防、治療または緩和するための医薬品の調製、
前述の目的で使用する医薬組成物または医薬品における活性成分として
などの治療目的での、本発明の単一特異性結合分子、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインまたはそれらを含有するポリペプチドの使用に関する。
好ましい実施形態では、本発明は、乳癌、腎細胞癌、卵巣癌および膵臓癌などの癌および癌性疾患を治療するための前記医薬組成物に関する。
別の態様によれば、疾患は、血管新生に対するAng2媒介および/またはAng2媒介効果と関係がある、または単一特異性結合分子を用いたNotchシグナル伝達経路および/またはTie2シグナル伝達経路の調節により治療または緩和することができる眼部疾患である。
別の好ましい実施形態では、本発明は、加齢黄斑変性および糖尿病性網膜症などの眼部疾患を治療するための前記医薬組成物に関する。
さらに別の好ましい実施形態では、本発明は、慢性腎臓病を治療するための前記医薬組成物に関する。
治療する癌/癌性疾患、眼部疾患および/または慢性腎臓病に応じて、本発明の単一特異性結合分子を単独で、または1つまたは複数の他の治療剤と組合せて使用することができる。
他の治療剤を、場合によっては同じ医薬調製物の要素として同時に、または単一特異性結合分子の投与の前後に、投与することができる。
他の治療剤のさらなる例は、CDK、Akt、src/bcrabl、cKit、cMet/HGF、c−Myc、Flt3、HSP90、hedgehogアンタゴニストの阻害剤、JAK/STAT、Mek、mTor、NFkappaB、プロテアソーム、Rhoの阻害剤、wntシグナル伝達の阻害剤、またはユビキチン化経路の阻害剤、またはNotchシグナル伝達経路の別の阻害剤である。
Aurora阻害剤の例は、非制限的にPHA−739358、AZD−1152、AT9283、CYC−116、R−763、VX−680、VX−667、MLN−8045、PF−3814735である。
PLK阻害剤の一例はGSK−461364である。
VEGF阻害剤の例はアバスチン(Roche)、アフリベルセプト(Regeneron)である。
raf阻害剤の例は、BAY−73−4506(さらにVEGFR阻害剤)、PLX4032、RAF−265(さらに追加的にVEGFR阻害剤)、ソラフェニブ(さらに追加的にVEGFR阻害剤)、およびXL281である。
KSP阻害剤の例は、イスピネシブ、ARRY−520、AZD−4877、CK−1122697、GSK246053A、GSK−923295、MK−0731、およびSB−743921である。
PDK1阻害剤に関する一例はBX−517である。
Rho阻害剤に関する一例はBA−210である。
cMetまたはHGFの阻害剤に関する例は、XL−184(さらにVEGFR、cKit、Flt3の阻害剤)、PF−2341066、MK−2461、XL−880(さらにVEGFRの阻害剤)、MGCD−265(さらにVEGFR、Ron、Tie2の阻害剤)、SU−11274、PHA−665752、AMG−102、およびAV−299である。
c−Myc阻害剤に関する一例はCX−3543である。
HSP90阻害剤に関する例はタネスピマイシン、アルベスピマイシン、IPI−504およびCNF2024である。
JAK/STAT阻害剤に関する例は、CYT−997(さらにチューブリンと相互作用)、TG101348(さらにFlt3の阻害剤)、およびXL−019である。
Mek阻害剤に関する例は、ARRY−142886、PD−325901、AZD−8330、およびXL518である。
mTor阻害剤に関する例は、テムシロリムス、AP−23573(さらにVEGF阻害剤として作用)、エベロリムス(さらにVEGF阻害剤)、XL−765(さらにPI3キナーゼ阻害剤)、およびBEZ−235(さらにPI3キナーゼ阻害剤)である。
Akt阻害剤に関する例はペリフォシン、GSK−690693、RX−0201、およびトリシリビンである。
hedgehogアンタゴニストに関する例はIPI−609およびCUR−61414である。
プロテアソーム阻害剤に関する例はボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、およびNPI−0052(さらにNFkappaBの阻害剤)である。
NFkappaB経路阻害剤に関する一例はNPI−0052である。
ユビキチン化経路阻害剤に関する一例はHBX−41108である。
好ましい実施形態では、他の治療剤は抗血管新生薬である。
a)前に定義した本発明の結合分子とサンプルを接触させるステップ、および
b)前記サンプルと前記結合分子の結合を検出するステップ、および
c)ステップ(b)で検出した結合と標準を比較するステップであって、前記サンプルと比較した結合の差が血管新生に対するVEGFおよび/またはAng2媒介効果と関係がある疾患または障害を示すステップ
によって、疾患を診断する方法を提供する。
この用途および他の用途のため、特異的結合対、ビオチン−(ストレプト)アビジン結合対などの一部である官能基の導入などにより、本発明の単一特異性結合分子をさらに修飾することが有用であり得る。このような官能基を使用して、すなわち結合対の形成を介して、結合対の他の半分と結合する別のタンパク質、ポリペプチドまたは化学化合物と、本発明の結合分子を連結させることが可能である。例えば、本発明の単一特異性結合分子はビオチンと結合させることが可能であり、アビジンまたはストレプトアビジンと結合した別のタンパク質、ポリペプチド、化合物または担体と連結させることが可能である。例えば、検出可能シグナル生成物質がアビジンまたはストレプトアビジンと結合する診断系において、このような結合した本発明の単一特異性結合分子は、例えばレポーターとして使用することができる。
図1〜4、6〜7、9〜10、12〜14および16〜20中の軸の注釈。X軸はOD450(nm)を表し、Y軸は競合log(M)を表す。
a)ヒトまたはマウスTie2受容体を過剰発現するHEK293H安定発現細胞系の作製
ヒトTie2(NM_000459.3、配列番号182)、マウスTie2(NM_013690.2、配列番号183)、およびカニクイザルTie2(配列番号184)をコードするcDNAを、pcDNA3.1−neo発現ベクター(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)にクローニングする。ヒトTie2またはマウスTie2を過剰発現するヒト胚腎臓(HEK)細胞を樹立するため、親HEK293H細胞に、Fugene(Roche)およびそれぞれpcDNA3.1−neo−hTie2またはpcDNA3.1−neo−mTie2で脂質介在トランスフェクションを施した。全ての条件に関して、1mg/mLのゲネチシン(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)を加えることによって、トランスフェクション後2日でトランスフェクタントを選択する。ヒト、マウスおよびカニクイザルTie2に関して、最終高発現クローンを、FACSAria細胞選別装置(BD Biosciences、San Jose、CA、USA)を使用して、それぞれPE標識抗ヒトTie2(R and D Systems、Minneapolis、MN、US)、PE標識抗マウスTie2(eBioscience、San Diego、CA、USA)および2ステップヤギ抗ヒトTie2(R and D Systems、Minneapolis、MN、US)と結合する単細胞選別クローン、次にPE標識ロバ抗ヤギ(Jackson ImmunoResearch、West Grove、PA、USA)によって選択する。
N末端FLAGタグマウスAng2(NM_007426.3、配列番号185)、およびカニクイザルAng2(AB172643.1、配列番号186)をコードするcDNAを、pSecTag2B発現ベクター(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)にクローニングする。マウスAng2またはカニクイザルAng2を一過的に過剰発現するヒト胚腎臓(HEK)細胞を、HEK293T親細胞系において、それぞれpSecTag2B−mAng2またはpSecTag2B−cAng2(Fugene;Roche)の脂質介在トランスフェクションによって作製する。作成は1.5リットルのCF10バッグで行い、1.5Lの馴化培地(CM)をトランスフェクション後5日で回収する。
Tie2の細胞外ドメインをコードするcDNAを、適切な制限部位を使用して発現プラスミドpSecTag2bにサブクローニングし、Fc融合タンパク質を作製する。HEK293−F細胞(Invitrogen)へのトランスフェクションは、生存細胞1×106個/mLの開始細胞密度および1μgのプラスミドDNA/細胞106個で、プラスミドのMegaorep調製物(Qiagen)、Optimem−Medium(Invitrogen)、293−フェクチン(Invitrogen)を使用して、製造者により記載されたように実施する。トランスフェクトした細胞は37℃で7日間撹拌フラスコにおいて培養する。馴化培地(CM)を4000gで10分間の遠心分離によって採取し、滅菌フィルター(0.45μm膜)を介して濾過する。
分子クローニングおよび細胞培養は、Tie2−Fc融合タンパク質に関して記載したように実施する。ヒスタグタンパク質の精製のため、DPBSで平衡状態にした2mlのNi2+キレートセファロース高速カラム(His−Trap−GE Healthcare Life Sciences)に5ml/分でCMを充填する。非特異的結合を妨げるための4%溶出バッファー(DPBS+0.5%イミダゾール)の存在下での充填後、カラムをDPBSで洗浄する。Ang2−FLDタンパク質は、0.5%イミダゾールを含有するDPBSを用いてカラムから溶出させる。その後、限外濾過ステップを濃縮およびバッファー交換のため行った(10kDa分子量カットオフ)。タンパク質のアリコートを、Tie2−Fcに関して記載したような分析特徴付けのため保持する。
1.1.免疫処置
Ethical Committee of the faculty of Veterinary Medicine(University Ghent、Belgium)の承認後、4匹のラマ(指定番号406、408、454、455)を、組換えヒトAng2(R and D Systems、Minneapolis、MN、US)の4回の筋肉内注射(第0日:50μg、第14日:20μg、第28日:17.5μg、および第42日:17.5μgの用量)によって免疫処置した。第0日の初回抗原刺激注射用にフロイント完全アジュバント(Difco、Detroit、MI、USA)、および追加抗原刺激注射用にフロイント不完全アジュバント(Difco、Detroit、MI、USA)で抗原を製剤化する。
ELISAによりヒトAng2に対する動物における免疫応答の誘導を評価するため、第0日(前免疫)、第35日および第46日(末梢血リンパ球[PBL]回収の時間)に血清を回収する。要約すると、1μg/mLの組換えヒトAng2(R and D Systems、Minneapolis、MN、USA)を、96ウエルMaxiSorpプレート(Nunc、Wiesbaden、Germany)に4℃で一晩固定した。ウエルはカゼイン溶液(PBS+1%カゼイン)でブロッキングする。連続血清希釈液を加えた後、特異的に結合した免疫グロブリンを、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)結合ヤギ抗ラマ免疫グロブリン(Bethyl Laboratories Inc.、Montgomery、TX、USA)を使用し、および次に基質TMB(3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン)(Pierce、Rockford、IL、USA)の存在下での酵素反応で検出し、ヒトAng2に対する有意な抗体依存免疫応答が誘導されることを示す。抗体応答は、従来型抗体とB細胞レパートリーを発現する重鎖単独抗体の両方によって増大する。結合した免疫グロブリンは、従来型ラマIgG1抗体または重鎖単独ラマIgG2もしくはIgG3抗体を特異的に認識する抗体を用いて、検出することができるからである。ヒトAng2を注射した全てのラマにおいて、ヒトAng2を特異的に対象とする従来型抗体とB細胞を発現する重鎖単独抗体により、抗体応答が増大する。それぞれのラマに関するAng2血清力価応答を表1中に示す。
低(または+/−):1,000≧HSDS/N≧2<1,500
適度(または+):1,500≧HSDS/N≧2<13,500
良(または++):13,500≧HSDS/N≧2<365,000
優(または+++):HSDS/N≧2≧365,000
(*)HSD、最高血清希釈;S/N≧2、シグナル対ノイズ比≧2
最終免疫原注射の後、重鎖単独抗体を産生するB細胞の供給源としての免疫組織を、免疫処置したラマから回収する。典型的には、最終抗原注射後第4日と第10日に回収する2つの150mL血液サンプル、および最終抗原注射後第4日に回収する1つのリンパ節生検を動物毎に回収する。血液サンプルから、製造者の説明書(Amersham Biosciences、Piscataway、NJ、USA)に従いFicoll−Hypaqueを使用して末梢血単核細胞(PBMC)を調製する。WO05/044858の例3(46ページ)中に記載されたように、(動物番号406から事前に得たものではない)PBMCおよびリンパ節生検から、全RNAを抽出し、それをRT−PCR用の出発物質として使用し、VHHコードDNAセグメントを増幅させる。それぞれの免疫処置したラマに関して、その動物の回収した全ての免疫組織から単離した全RNAをプールすることにより、ライブラリーを構築する。要約すると、PCR増幅VHHレパートリーを、VHHライブラリーのファージディスプレイを容易にするよう設計したベクターに、特異的制限部位を介してクローニングする。このベクターはpUC119に由来し、LacZプロモーター、M13ファージgIIIタンパク質コード配列、アンビシリンまたはカルベニシリン耐性遺伝子、マルチクローニングサイトおよびハイブリッドgIII−peIBリーダー配列を含有する。VHHコード配列と一致して、このベクターは、C末端c−mycタグおよびHis6タグをコードする。ファージは標準的なプロトコールに従い調製し、さらなる使用のため4℃での濾過滅菌後に保存する。
全てのラマから得てファージライブラリーとしてクローニングしたVHHレパートリーを、多数の選択条件を適用して、異なる選択戦略で使用する。変数には、i)Ang2タンパク質形式:ビオチニル化C末端ヒスタグ完全長組換えヒトAng2(R and D Systems、Minneapolis、MN、USA)およびC末端ヒスタグ完全長マウスAng2(GeneArt、現在Invutrogen、Carlsbad、CA、USAで作成)、ii)Ang2提示法、:マウスAng2で直接コーティングしたプレート、またはビオチニル化ヒトAng2との溶液中でのインキュベーション、次にニュートラビジンコーティングプレート上での捕捉、およびiii)抗原濃度がある。全ての選択は96ウエルMaxiSorpプレート(Nunc、Wiesbaden、Germany)で行う。
発現されたVHHを含有する周辺質抽出物をヒトAng2−ヒトTie2アルファスクリーン競合アッセイでスクリーニングして、それらの遮断能力を評価する。要約すると、ヒトTie2/Fcキメラ(R and D Systems、Minneapolis、MN、USA)を、ビオチンのN−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル(Thermo Fisher Scientific、Rockford、IL、USA)を使用してビオチニル化する。FLAGタグヒトAng2(Alexis、Biochemicals、San Diego、CA、USA)は、抗FLAGM2抗体(Sigma、St Louis、MO、USA)でコーティングしたアクセプタービーズ(Perkin Elmer、Waltham、MA、US)を使用して捕捉する。ヒトAng2とその受容体ヒトTie2の結合を阻害するVHHの能力を評価するため、発現されたVHHを含有する1:25希釈の周辺質抽出物を、0.1nMのFLAGタグヒトAng2とインキュベートする。この混合物に、アクセプタービーズおよび0.3nMのビオチニル化ヒトTie2/Fcキメラを加え、室温で2時間さらにインキュベートする。最後に、ストレプトアビジン結合ドナービーズ(Perkin Elmer、Waltham、MA、US)を加え、この混合物を室温で2時間さらにインキュベートする。アッセイバッファーはPBS+0.03%Tween−20+0.1%BSAである。680nmの励起波長および520nmの放出波長を使用し、Envision Multilabelプレートリーダー(Perkin Elmer、Waltham、MA、USA)を使用して蛍光を測定する。蛍光シグナルの低減は、ヒトAng2とヒトTie2の結合が周辺質抽出物で発現されたVHHにより遮断されることを示す。少なくとも50%ヒトAng2−ヒトTie2の相互作用を遮断可能なVHHを、確認ELISAベース競合アッセイでスクリーニングする。さらに、マウスAng2との結合に関する交差反応性およびヒトAng1に対する選択性も、競合ELISAにおいて評価する。要約すると、ヒトまたはマウスTie2/Fcキメラ(R and D Systems、Minneapolis、MN、USA)は、96ウエルMaxiSorpプレート(Nunc、Wiesbaden、Germany)において4℃において一晩2μg/mLで固定する。ウエルは1%カゼイン溶液でブロッキングする。発現されたVHHを含有する1:5希釈の周辺質抽出物を、アッセイのタイプに従い以下のAng種、0.02nMのFLAGタグヒトAng2、FLAGタグマウスAng2を含有する馴化培地の1:3,000希釈液、または0.02nMのFLAGタグヒトAng1(Alexis、Biochemicals、San Diego、CA、USA)とインキュベートする。この混合物をTie2/Fcコーティングウエルに加え、室温で2時間インキュベートする。
例4中に記載したスクリーニングから選択した阻害性抗Ang2VHHのサブセットを、さらに精製し特徴付けする。選択したVHHは、大腸菌TG1において、c−myc、His6タグタンパク質として発現させる。発現は1mMのIPTGを加えることにより誘導し、37℃で4時間継続させる。細胞培養物をスピン処理した後、ペレットの凍結−解凍により周辺質抽出物を調製する。これらの抽出物は出発物質として使用し、VHHはIMACおよびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)により精製し、SDS−PAGEにより評価して95%以上の純度を得る。
VHHの遮断能力を、ヒトAng2−ヒトTie2遮断アッセイにおいて評価する。要約すると、2μg/mLのTie2/Fcキメラ(R and D Systems、Minneapolis、MN、USA)を、96ウエルMaxiSorpプレート(Nunc、Wiesbaden、Germany)にコーティングする。固定濃度0.02nMのFLAGタグヒトAng2(Alexis、Biochemicals、San Diego、CA、USA)を、(PBS+0.1%カゼイン+0.05%Tween−20中に希釈した)精製VHHの希釈系列に加え、コーティング状態ヒトTie2受容体と2時間インキュベートする。ヒトAng2の残留結合は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)結合抗FLAGM2(Sigma、St Louis、MO、USA)を使用して検出する(図1)。参照分子はAb536のFab断片(US2009/0191212)(図1−1)、またはペプチボディAMG386のペプチド成分(WO2004/092215中の配列番号25)(図1−2)である。陰性対照として、無関係なVHHを使用する。ヒトAng2−ヒトTie2相互作用を遮断したVHHに関するIC50値を、それぞれ表5−1および表5−2中に示す。
VHHがマウスAng2とマウスTie2の結合、およびカニクイザルAng2とカニクイザルTie2の結合を阻害するかどうか決定するため、競合ELISAを実施する。要約すると、2μg/mLの組換えマウスTie2−FcまたはカニクイザルTie2−Fcを、一晩4℃において96ウエルMaxiSorpプレート(Nunc、Wiesbaden、Germany)にコーティングする。コーティングしたウエルは1%カゼイン溶液でブロッキングする。FLAGタグマウスAng2(一過性HEKトランスフェクション由来の馴化培地の1:3,000希釈液)、またはFLAGタグカニクイザルAng2(一過性HEKトランスフェクション由来の馴化培地の1:800希釈液)、および(PBS+0.1%カゼイン+0.05%Tween−20中に希釈した)精製VHHの希釈系列を、結合平衡状態に達するまでコーティング状態Tie2−Fc受容体と室温で2時間インキュベートする。FLAG−mAng2またはFLAG−cAng2の残留結合は、HRP結合抗FLAGM2mAb(Sigma、St Louis、MO、USA)を使用して検出する。参照分子はAb536のFab断片(マウス:図2−1)、またはペプチボディAMG386のペプチド成分(マウス:図2−2;カニクイザル:図3)である。陰性対照として、無関係なVHHを使用する。マウスAng2−マウスTie2相互作用を遮断したVHHに関するIC50値を表6−1中に示す。マウスおよびカニクイザルTie2とマウスおよびカニクイザルAng2の結合を遮断したVHHに関するIC50値を、それぞれ表6−2中に示す。
抗Ang2遮断VHHがヒトAng1とヒトTie2の結合に選択的であるかどうか決定するため、競合ELISAを実施する。要約すると、2μg/mLの組換えヒトTie2−Fc(R and D Systems、Minneapolis、MN、USA)を、一晩4℃において96ウエルMaxiSorpプレート(Nunc、Wiesbaden、Germany)にコーティングする。コーティングしたウエルは1%カゼイン溶液でブロッキングする。固定濃度(0.02nM)のFLAGタグ組換えヒトAng1(Alexis、Biochemicals、San Diego、CA、USA)、および(PBS+0.1%カゼイン+0.05%Tween−20中に希釈した)精製VHHの希釈系列を、結合平衡状態に達するまでコーティング状態受容体Tie2−Fcと室温で2時間インキュベートする。FLAG−hAng1の残留結合は、HRP結合抗FLAGM2mAbを使用して検出する。参照分子はペプチボディAMG386のペプチド成分である(図4)。陰性対照として、無関係なVHHを使用する。ヒトAng1−ヒトTie2相互作用を遮断したVHHに関する指標IC50値を表7中に示す。
ヒト、マウス、およびカニクイザルAng2との結合に対するVHHのアフィニティーを、表面プラズモン共鳴(SPR)分析(BiacoreT100)を使用して決定する。要約すると、VHHおよび基準化合物をアミンカップリングによりCM5チップ上に固定する。多サイクルの動的手法を使用する。異なる濃度のヒト、マウス、およびカニクイザルAng2−FLD(0.4−1−2.6−6.4−16−40−100nM)を注射する。Ang2−FLD種を2分間で会合させ、45μL/分の流速において20分間で解離させる。注射の間に、25mM NaOHの10秒間パルスおよび60秒間の安定期で表面を再生する。会合/解離のデータは、1:1相互作用モデル(Langmuir結合)の適用によって評価する。アフィニティー定数KDは得られた会合および解離速度定数kaおよびkdから計算し、表8中に示す。
VHH28D10の変異体(C50S/S53NおよびQ108L置換を有する00027−例7.3)をアフィニティー成熟に施す。
7.1 VHH1D01
抗Ang2VHH1D01のアミノ酸配列(図8−A参照)を、ヒト生殖細胞系列VH3/JHコンセンサス配列と一直線に並べる。残基はKabatに従い番号処理し、CDRはAbMの定義(Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェア)に従いグレーで示す。それらのヒト相当物に突然変異した残基には下線を引く。問題の潜在的翻訳後修飾部位は枠で囲う。このアラインメントは、1D01が参照生殖細胞系列配列と比較して6個のフレームワーク突然変異を含有することを示す。位置14、41、71、74、83および108における非ヒト残基を、それらのヒト生殖細胞系列相当物との置換用に選択する。これらの位置にヒト残基の異なる組合せ(図8−B)を有する一組の7個の1D01変異体を、構築し生成する(例5)。平行して、これら7個の変異体の3個で、位置D54G55における潜在的Asp異性体化部位をD54G置換の導入によって除去し、およびこれら7個の変異体の1個で、位置E1における潜在的pyroGlu形成部位をE1D置換によって除去する(AA配列は表15中に列挙する)。
抗Ang2VHH37F02のアミノ酸配列(図12−A参照)を、ヒト生殖細胞系列VH3/JHコンセンサス配列と一直線に並べる。残基はKabatに従い番号処理し、CDRはAbMの定義(Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェア)に従いグレーで示す。それらのヒト相当物に突然変異した残基には下線を引く。問題の潜在的翻訳後修飾部位は枠で囲う。このアラインメントは、37F02が参照生殖細胞系列配列と比較して4個のフレームワーク突然変異を含有することを示す。位置60、74、83および108における非ヒト残基を、それらのヒト生殖細胞系列相当物との置換用に選択する。平行して、位置D54G55における潜在的Asp異性体化部位をD54G置換の導入によって除去する。これらの位置にヒト残基の異なる組合せ(図12−B)を有する一組の3サイクル137F02変異体を構築し生成する(例5;AA配列は表21−1中に列挙する)。
抗Ang2VHH28D10のアミノ酸配列(図15−A参照)を、
ヒト生殖細胞系列VH3/JHコンセンサス配列と一直線に並べる。残基はKabatに従い番号処理し、CDRはAbMの定義(Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェア)に従いグレーで示す。それらのヒト相当物に突然変異した残基には下線を引く。問題の潜在的翻訳後修飾部位は枠で囲う。このアラインメントは、28D10が参照生殖細胞系列配列と比較して5個のフレームワーク突然変異を含有することを示す。位置14、71、74、83および108における非ヒト残基を、それらのヒト生殖細胞系列相当物との置換用に選択する。平行して、位置D54G55における潜在的Asp異性体化部位をD54G置換の導入によって除去する。位置50における遊離システインはAla、ThrまたはSerとの置換によって除去した。最後に、これらの位置にヒト残基の異なる組合せを有する一組の11サイクル28D10変異体を構築し生成する(図15−B参照;AA配列は表24−1中に列挙する)。
Claims (12)
- 免疫グロブリン単一可変ドメインを含むAng2結合分子であって、前記免疫グロブリン単一可変ドメインが3個の相補性決定領域CDR1、CDR2およびCDR3を含み、CDR1が配列番号168において示すアミノ酸配列を有し、CDR2が配列番号171において示すアミノ酸配列を有し、かつCDR3が配列番号175において示すアミノ酸配列を有する、前記Ang2結合分子。
- 前記免疫グロブリン単一可変ドメインがVHHである、請求項1に記載のAng2結合分子。
- 前記VHHが配列番号166からなる配列を有する免疫グロブリン単一可変ドメインからなる、請求項2に記載のAng2結合分子。
- 前記VHH又は前記免疫グロブリン単一可変ドメインが、そのN末端で修飾または交換を有し、前記修飾が第一アミノ酸の欠失であり、前記交換が第一アミノ酸と別のアミノ酸の置換である、請求項1から3までのいずれか1項に記載のAng2結合分子。
- 請求項1から4までのいずれか1項に記載のAng2結合分子をコードする核酸分子。
- 請求項5に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項6に記載の1つまたは複数の発現ベクターを有する宿主細胞。
- 請求項1から4までのいずれか1項に記載のAng2結合分子を生成するための方法であって、
(a)請求項6に記載の1つまたは複数の発現ベクターで宿主細胞をトランスフェクトするステップ、
(b)前記宿主細胞を培養するステップ、および
(c)前記Ang2結合分子を回収し精製するステップ
を含む方法。 - 活性成分として請求項1から4までのいずれか1項に記載の1つまたは複数のAng2結合分子、および少なくとも生理的に許容される担体を含む医薬組成物。
- 1つまたは複数の他の治療剤をさらに含む、請求項9に記載の医薬組成物。
- 血管新生に対するAng2媒介効果と関係がある疾患を治療するための、請求項9または10に記載の医薬組成物。
- 癌および癌性疾患を治療するための、請求項11に記載の医薬組成物。
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