CN111032695A - 结合adamts的免疫球蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明涉及结合ADAMTS5的免疫球蛋白，并且更具体地涉及包含或基本上由一种或多种这样的免疫球蛋白组成的多肽。本发明还涉及包含这样的免疫球蛋白如免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)或多肽以及编码这样的免疫球蛋白或多肽的核酸的构建体；用于制备这样的免疫球蛋白、多肽和构建体的方法；表达或能够表达这样的免疫球蛋白或多肽的宿主细胞；包含这样的免疫球蛋白、多肽、构建体、核酸和/或宿主细胞的组合物，尤其是用于药物组合物；和免疫球蛋白、多肽、构建体、核酸、宿主细胞和/或组合物的用途，特别是用于预防和/或治疗目的，例如本文所述的预防和/或治疗目的。通过本文的进一步描述，本发明的其他方面、实施方案、优点和应用将变得清楚。

Description

结合ADAMTS的免疫球蛋白

1发明领域

本发明涉及结合ADAMTS5的免疫球蛋白，并且更具体地涉及包含或基本上由一种或多种这样的免疫球蛋白组成的多肽(在本文中也分别称为“本发明的免疫球蛋白”和“本发明的多肽”)。本发明还涉及包含这样的免疫球蛋白如免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)或多肽以及编码这样的免疫球蛋白或多肽的核酸(在本文中也称为“本发明的核酸”) 的构建体；用于制备这样的免疫球蛋白、多肽和构建体的方法；表达或能够表达这样的免疫球蛋白或多肽的宿主细胞；包含这样的免疫球蛋白、多肽、构建体、核酸和/或宿主细胞的组合物，尤其是用于药物组合物；和免疫球蛋白、多肽、构建体、核酸、宿主细胞和/或组合物的用途，特别是用于预防和/或治疗目的，例如本文所述的预防和/或治疗目的。通过本文的进一步描述，本发明的其他方面、实施方案、优点和应用将变得清楚。

2发明背景

骨关节炎(OA)是全世界最常见的致残原因之一。它影响了三千万美国人并且是最常见的关节疾病。预计到2025年，该病将影响超过 20％的美国人口。该疾病是非全身性疾病并通常仅限于很少的关节。然而，该疾病可发生在所有关节，最常见的是膝盖、臀部、手、肩膀和脊椎。OA的特征是关节软骨(覆盖骨骼的软骨)逐渐侵蚀，导致慢性疼痛和残疾。最终，该疾病导致关节软骨的完全破坏，底层骨的硬化，骨赘的形成等，所有这些都导致丧失运动和疼痛。骨关节炎可定义为多种病况，其特征是关节症状、关节软骨缺损而产生的体征以及包括骨骼、肌腱和肌肉在内的相邻组织发生变化的组合。疼痛是OA最突出的症状，并且很多时候是患者寻求医疗帮助的原因。不能治愈OA，即当前的治疗不能抑制OA关节的结构恶化。疾病管理最多仅限于姑息治疗，而对于解决疾病进展的根本原因却作用不大。尽管疾病的起始可能是多因素的，但软骨破坏似乎是细胞外基质(ECM)不受控制的蛋白水解破坏的结果。关节软骨中最丰富的ECM成分是胶原蛋白(最主要的是胶原蛋白II)和蛋白聚糖，主要是聚集蛋白聚糖(Kiani等人，2002Cell Research 12:19-32)。

聚集蛋白聚糖在关节软骨的正常运作中很重要，因为它提供了水合的凝胶结构，其给软骨赋予了承载特性。聚集蛋白聚糖是由软骨细胞表达的大的多模块分子(2317个氨基酸)。它的核心蛋白由三个球状结构域(G1、G2和G3)和一个位于G2和G3之间用于糖胺聚糖链连接的大延伸区域组成。该延伸区域包含两个结构域，一个结构域被硫酸角质素链取代(KS结构域)并且一个结构域被硫酸软骨素链取代(CS结构域)。CS结构域具有连接到其上的100-150个糖胺聚糖(GAG)链。聚集蛋白聚糖与透明质酸形成大型复合物，其中50-100个聚集蛋白聚糖分子通过G1结构域和连接蛋白质与一个透明质酸分子相互作用。摄入水后(由于GAG含量高)，这些复合物形成抗挤压的可逆变形凝胶。关节软骨的结构、液体停留和功能与聚集蛋白聚糖的基质含量以及与完整核心蛋白结合的硫酸软骨素的量有关。从结构上讲，OA的特征是聚集蛋白聚糖降解，逐渐释放结构域G3和G2(导致软骨“萎陷”)，并最终释放G1结构域和降解胶原蛋白，从而不可逆地破坏软骨结构。OA 发病机理中最重要的聚集蛋白聚糖裂解位点位于序列 TEGE³⁷³↓³⁷⁴ARGS。该裂解位点位于聚集蛋白聚糖的球间结构域(IGD) 中。识别³⁷⁴ARGS新表位的抗体导致发现聚集蛋白聚糖酶-1(它被证明是ADAMTS4)和聚集蛋白聚糖酶-2(它是ADAMTS5)。随后，其他相关的ADAMTS酶，包括ADAMTS1、ADAMTS8、ADAMTS9、 ADAMTS15和ADAMTS20，被证明具有聚集蛋白聚糖酶活性。 ADAMTS16和18也是弱的聚集蛋白聚糖酶。ADAMTS和基质金属蛋白酶(MMP)共享与聚集蛋白聚糖的结合位点，该结合位点在序列和总体形状上都非常相似(El Bakali等人，2014Future MedicinalChemistry(综述)6：1399)。

ADAMTS(具有血小板应答蛋白基序的去整合素(Disintegrin)和金属蛋白酶)酶是分泌的、多结构域基质相关的锌金属内肽酶，其在组织形态发生和病理生理重塑、炎症和血管生物学中具有多种作用 (Kelwick等人，2015Genome Biology 16:113)。人类家族包括19个成员，这些成员可以根据它们的已知底物进行亚分组。聚集蛋白聚糖酶或蛋白聚糖酶包括ADAMTS1、ADAMTS4、ADAMTS5、ADAMTS8、 ADAMTS9、ADAMTS15和ADAMTS20，它们可以裂解透明质酸结合的硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)细胞外蛋白，包括聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、短蛋白聚糖和神经蛋白聚糖。牛聚集蛋白聚糖中两个最优选的裂解位点是KEEE¹⁶⁶⁷↓¹⁶⁶⁸GLGS，其次是GELE¹⁴⁸⁰↓¹⁴⁸¹GRGT。此后，裂解发生在IGD的NITEGE³⁷³↓³⁷⁴ARGS处(在该处MMP不被切割)，释放上述新表位，并在CS-2区域的TAQE¹⁷⁷¹↓¹⁷⁷²AGEG和 VSQE¹⁸⁷¹↓¹⁸⁷²LGQR发生(Fosang等人，2008European Cells and Materials 15:11-26)。这些裂解位点在人、牛、小鼠和大鼠中高度保守。

各种证据表明，ADAMTS5是参与骨关节炎发病机制的主要酶。 ADAMTS5是软骨中存在的主要聚集蛋白聚糖酶。在人软骨外植体和软骨细胞中，ADAMTS5的敲低减弱了聚集蛋白聚糖的分解，这表明该酶可能与人体组织有关。细胞因子(如白介素-1和抑瘤素-M)放大了该酶的表达，这些细胞因子引起组织中聚集蛋白聚糖的分解。在OA患者的滑膜液和血清中检测到ADAMTS5生成的聚集蛋白聚糖片段 (Germaschewski等人，2014OsteoarthritisCartilage 22：690–697)。

ADAMTS5首先被合成为无活性的蛋白质，包括在N末端的蛋白酶结构域和在C末端的辅助结构域。蛋白酶结构域由信号肽、具有弗林蛋白酶识别序列的前结构域和催化结构域组成。前结构域被前蛋白转化酶裂解以产生活性酶。ADAMTS5进一步包含辅助结构域，其主动参与底物识别并调控蛋白酶对其底物(“外结合位点(exosite)”)的亲和力。ADAMTS5的去整合素样结构域、I型中央血小板应答蛋白(TS) 重复序列、富含半胱氨酸的结构域、间隔区和其他TS基序是具有潜在外结合位点功能的辅助结构域。富含半胱氨酸的结构域似乎对于 ADAMTS5结合和对接至糖胺聚糖上必不可少。ADAMTS成员中的最大可变性发现于这些辅助结构域中(Kelwick等人，2015Genome Biology 16：113)。

人们积极寻找改变疾病的抗骨关节炎药物(DMOAD)，其可以被定义为抑制结构性疾病进展并且理想地还改善症状和/或功能的药物。在人口老龄化的这种慢性疾病中，可能需要长期开具DMOAD，因此需要在具有多种合并症和潜在药物与药物相互作用的目标人群中获得出色的安全性数据。

几家制药公司已经开发了ADAMTS5的小分子抑制剂。据称这些化合物中的一些化合物对ADAMTS5具有特异性，而其他化合物也对其他ADAMTS成员，甚至对MMP具有作用。这些交叉抑制作用被认为是肌肉骨骼综合征的原因，肌肉骨骼综合征是由广谱抑制剂引起的副作用并且涉及关节痛、肌痛、关节僵硬和肌腱炎(Santamaria等人， 2015Biochem J 471：391-401)。-Wyeth聚集蛋白聚糖酶抑制剂 AGG-523已在健康受试者和OA患者的5阶段I期临床试验中使用，但没有进一步应用。其他小分子ADAMTS抑制剂也没有作为潜在的 DMOAD进入任何进一步的临床开发(Bondeson等人，2015Drug Discovery 10：5-14)。实际上，尽管最近有许多专门研究DMOAD的临床试验，但至今尚未批准这样的治疗方法(El Bakali等人，2014Future Medicinal Chemistry(综述)6：1399)。

鉴于使用抗体(“Ab”)的靶向生物疗法的成功，在开发用于OA 的类似治疗策略方面存在兴趣。针对ADAMTS5间隔子结构域的 Rottapharm单克隆抗体(mAb)CRB0017的研究表明，在小鼠中，该 mAb的关节内施用以剂量依赖性方式显著地阻止了疾病的发展(Chiusaroli等人，2013Osteoarthritis Cartilage 21：1807)。没有与全身施用的比较，也没有评估mAb从滑膜间隙泄漏的程度。另一项研究对小鼠进行了mAb 12F4的全身施用，证明了结构性疾病的改变和疼痛相关行为的缓解(Miller等人，2014OsteoarthritisCartilage 22iii，S35)。但是，在食蟹猴中单次施用mAb 12F4引起局灶性出血、表明心脏缺血的剂量依赖性平均动脉压升高和心脏电导异常(更具体地讲，ECG上的ST升高和室性心律不齐)，这种现象持续到单一剂量施用后8个月 (Larkin等人，2014OsteoarthritisCartilage 22iii，S483)。这些副作用终止了mAb 12F4的进一步临床开发。

名为Ablynx NV的WO2008/074840描述了针对去整合素和金属蛋白酶(ADAM)家族的成员(包括ADAMTS5)的

的产生。

难以将药物靶向关节软骨进一步阻碍了在关节中的治疗干预。因为关节软骨是无血管的和无淋巴的组织，所以传统的药物递送途径(经口、静脉内、肌内)最终取决于通过被动扩散将药物从滑膜毛细血管向软骨的跨滑膜转移。这促进了药物的关节内(IA)递送的发展。

另一方面，治疗性蛋白的IA递送受到其从关节间隙的快速清除和软骨内缺乏停留的限制；并限制于大的关节。药物在关节中的滑膜停留时间通常少于24小时(Edwards2011Vet J 190：15-21；Larsen等人， 2008J Pham Sci 97：4622-4654)。由于大多数IA注射药物的快速清除，需要频繁注射以维持有效浓度(Owen等人，1994Br J Clin Pharmacol38：349-355)。而且，治疗性蛋白的IA递送对于小的关节实际上是不可行的，这阻碍了对例如OA-手指的治疗。

仍然存在对有效的DMOAD的需要。

3发明概述

本发明的目的是提供与现有技术的氨基酸序列和抗体相比，除其他有利特性(例如改进的易制备性、良好的稳定性和/或降低的商品成本) 之外，具有改善的预防、治疗和/或药理学特性的抗OA的多肽。具体而言，本发明旨在提供抑制ADAMTS并且尤其是抑制ADAMTS5的多肽。

ADAM、ADAMTS和MMP共享针对聚集蛋白聚糖的结合位点，该结合位点的序列和总体形状都非常相似。由于多种其他ADAM(包括TACE)和ADAMTS家族成员在正常生理中具有不同的作用，因此与许多常见病理病况密切相关，所述病况包括哮喘、关节炎、癌症、结缔组织疾病或血栓性血小板减少性紫癜(El Bakali等人，同上)，本发明人意识到保持选择性的重要性。为了有效地仅沉默ADAMTS5活性，靶向催化结构域似乎是最佳选择。然而，ADAMTS4和ADAMTS5的催化结构域具有高度的序列相似性(参见El Bakali等人，同上)。另外，事实证明，各种物种之间的催化结构域的高序列保守性放弃(forego) 了强有力的免疫应答。

令人惊讶地，本发明的ISVD满足了这两个看似互斥的需求：一方面抑制ADAMTS5(酶)活性，同时另一方面保持选择性。

在AlphaLISA酶测定法中，本发明的多种单价ISVD与常规二价抗体mAb 12F4 H4L0等效。除此之外，本发明的ISVD在高或甚至过量的聚集蛋白聚糖底物浓度下也与常规的二价抗体mAb12F4 H4L0等效，这使人联想到关节。另一方面，在更接近生理条件的离体牛外植体测定法中，大多数单价ISVD的IC₅₀均优于竞品Rottapharm的mAb 12F4 H4L0(“12F4”)和mAb CRB0017。在人离体外植体测定法中，如IC₅₀所示，本发明的ISVD也明显优于现有技术的常规抗体 CRB0017。

考虑到多种不同的有利特征(包括稳定性、亲和力和抑制活性以及最小化免疫原性)对ISVD进行进一步工程改造后，接下来对这些ISVD 进行体内评估。

如食蟹猴中所评价的，本发明的ISVD的全身施用证明了体内对聚集蛋白聚糖酶活性的有效抑制。另外，与现有技术的抗体12F4相比，使用ISVD也是安全的。同样在体内小鼠内侧半月板失稳(DMM)模型中，本发明的ISVD对于通过全身施用的预防和治疗显示出高达50％的结构益处。用本发明的ISVD的早期治疗在大鼠前十字韧带切开和内侧半月板切除(ACLt+tMx)诱导的OA期间引起剂量依赖性、显著的和有意义的症状益处。

ISVD最终旨在抑制关节中的ADAMTS5，并因此将需要抵抗关节中含有多种蛋白酶的滑膜液的病况。除了上述的有利特性，还表明分离的ISVD在滑膜液中非常稳定。可以预料，这种稳定性使得能够使用更低频率的给药方案。

因此，本发明涉及包含结合带有血小板应答蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶(ADAMTS)的至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD) 的多肽，其中所述ADAMTS选自ADAMTS1-ADAMTS19，优选地 ADAMTS5、ADAMTS4、ADAMTS1、ADAMTS8、ADAMTS9和 ADAMTS15和ADAMTS20，最优选地ADAMTS5。一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述ISVD结合ADAMTS，优选地 ADAMTS5不结合ADAMTS4、MMP1或MMP14。

在另一个优选的方面，本发明涉及本文所述的多肽，其中所述特异性结合ADAMTS5的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4) 和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中(i)CDR1 选自SEQ ID NO:21、35、20、22、25、33、28、24、23、26、27、29、 30、31、32和34；和与SEQ ID NO:21、35、20、22、25、33、33、28、24、23、26、27、29、30、31、32和34具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；(ii)CDR2选自SEQ ID NO:37、53、36、40、50、51、 44、45、43、39、38、41、119、42、46、47、48、49和52；和与SEQ ID NO:37、53、36、40、50、51、44、45、43、39、38、41、119、42、 46、47、48、49和52具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；和 (iii)CDR3选自SEQ ID NO:55、118、71、54、58、68、69、62、63、 61、57、56、59、60、64、65、66、67和70；和与SEQ ID NO:55、118、 71、54、58、68、69、62、63、61、57、56、59、60、64、65、66、67 和70具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列。

在另一个优选的方面，本发明涉及本文所述的多肽，其中所述特异性结合ADAMTS5的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4) 和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中(i)CDR1 选自(a)SEQ ID NO:22；(b)与SEQ ID NO:22具有1、2、3、4、5 或6个氨基酸差异的氨基酸序列，其中在位置2，S已改变为R；在位置3，A已改变为T；在位置4，V已改变为F；在位置6，V已改变为S；在位置7，N已改变为Y；和/或在位置10，A已改变为G；(ii)CDR2 是SEQ ID NO:36；和(iii)CDR3是SEQ ID NO:54。

在另一个优选的方面，本发明涉及本文所述的多肽，其中所述特异性结合ADAMTS5的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4) 和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中(i)CDR1 是SEQ ID NO:33；(ii)CDR2选自：(c)SEQ ID NO:50；和(d)与 SEQ ID NO:50具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列，其中在位置 8，M已改变为I；在位置9，P已改变为T；和/或在位置10，Y已改变为F；和(iii)CDR3选自：(e)SEQ ID NO:68；和(f)与SEQ IDNO:68具有1或2个氨基酸差异的氨基酸序列，其中在位置5，F已改变为L；和/或在位置11，D已改变为E。

在另一个优选的方面，本发明涉及本文所述的多肽，其中所述特异性结合ADAMTS5的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4) 和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中(i)CDR1 是SEQ ID NO:28；(ii)CDR2选自(c)SEQ ID NO:44；(d)与SEQ ID NO:44具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列，其中在位置3， S已改变为T；在位置4，R已改变为W；在位置8，T已改变为I；和 /或在位置9，T已改变为L；和(iii)CDR3选自：(e)SEQ ID NO:62；和(f)与SEQ ID NO:62具有1或2个氨基酸差异的氨基酸序列，其中在位置1，G已改变为S；和/或在位置14，D已改变为E。

在本发明所有方面的优选实施方案中，根据本发明的免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)优选地由上文和下文所述的4个框架区(分别是 FR1-FR4)和3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3组成或基本上由其组成。优选的框架序列例如在下表A-2中公开，并且可以用于本发明的ISVD中。优选地，表A-2中描述的CDR与相同ISVD构建体的各个框架区匹配。

在另一个优选的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述 ISVD选自ISVD的组，其中：CDR1选自SEQ ID NO:21、35、20、22、 25、33、28、24、23、26、27、29、30、31、32和34；CDR2选自SEQ ID NO:37、53、36、40、50、51、44、45、43、39、38、41、119、42、 46、47、48、49和52；和CDR3选自SEQ ID NO:55、118、71、54、 58、68、69、62、63、61、57、56、59、60、64、65、66、67和70。

在另一个优选的方面，本发明涉及本文所述的多肽，其中所述ISVD 选自ISVD的组，其中：

CDR1是SEQ ID NO:21，CDR2是SEQ ID NO:37，并且CDR3 是SEQ ID NO:55；

CDR1是SEQ ID NO:35，CDR2是SEQ ID NO:53，并且CDR3 是SEQ ID NO:118；

CDR1是SEQ ID NO:35，CDR2是SEQ ID NO:53，并且CDR3 是SEQ ID NO:71；

CDR1是SEQ ID NO:20，CDR2是SEQ ID NO:36，并且CDR3 是SEQ ID NO:54；

CDR1是SEQ ID NO:22，CDR2是SEQ ID NO:36，并且CDR3 是SEQ ID NO:54；

CDR1是SEQ ID NO:25，CDR2是SEQ ID NO:40，并且CDR3 是SEQ ID NO:58；

CDR1是SEQ ID NO:33，CDR2是SEQ ID NO:50，并且CDR3 是SEQ ID NO:68；

CDR1是SEQ ID NO:33，CDR2是SEQ ID NO:51，并且CDR3 是SEQ ID NO:69；

CDR1是SEQ ID NO:28，CDR2是SEQ ID NO:44，并且CDR3 是SEQ ID NO:62；

CDR1是SEQ ID NO:28，CDR2是SEQ ID NO:45，并且CDR3 是SEQ ID NO:63；

CDR1是SEQ ID NO:28，CDR2是SEQ ID NO:43，并且CDR3 是SEQ ID NO:61；

CDR1是SEQ ID NO:24，CDR2是SEQ ID NO:39，并且CDR3 是SEQ ID NO:57；

CDR1是SEQ ID NO:23，CDR2是SEQ ID NO:38，并且CDR3 是SEQ ID NO:56；

CDR1是SEQ ID NO:26，CDR2是SEQ ID NO:41，并且CDR3 是SEQ ID NO:59；

CDR1是SEQ ID NO:27，CDR2是SEQ ID NO:119，并且CDR3 是SEQ ID NO:60；

CDR1是SEQ ID NO:27，CDR2是SEQ ID NO:42，并且CDR3 是SEQ ID NO:60；

CDR1是SEQ ID NO:29，CDR2是SEQ ID NO:46，并且CDR3 是SEQ ID NO:64；

CDR1是SEQ ID NO:30，CDR2是SEQ ID NO:47，并且CDR3 是SEQ ID NO:65；

CDR1是SEQ ID NO:31，CDR2是SEQ ID NO:48，并且CDR3 是SEQ ID NO:66；

CDR1是SEQ ID NO:32，CDR2是SEQ ID NO:49，并且CDR3 是SEQ ID NO:67；和

CDR1是SEQ ID NO:34，CDR2是SEQ ID NO:52，并且CDR3 是SEQ ID NO:70。

在另一个优选的方面，本发明涉及本文所述的多肽，其中CDR1 是SEQ ID NO:21，CDR2是SEQ ID NO:37，并且CDR3是SEQ ID NO:55。

在另一个优选的方面，本发明涉及本文所述的多肽，其中所述ISVD 选自SEQ IDNO:2、116、19、1、3、6、16、17、10、11、9、5、4、7、 8、117、12、13、14、15和18。

在另一个优选的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽结合ADAMTS5，其K_D是1E^-07M至1E^-13M，例如1E^-08M至1E^-12M，优选地最多是1E^-07M，优选地低于1E^-08M或1E^-09M，或甚至低于1E^-10 M，例如5E^-11M、4E^-11M、3E^-11M，2E^-11M，1.7E^-11M，1E^-11M或甚至5E^{- 12}M、4E^-12M、3E^-12M、1E^-12M，例如通过KinExA或备选地通过Gyrolab确定的。

在另一个优选的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制ADAMTS5的活性，其IC₅₀为1E^-07M至1E^-12M，例如1E^-08M 至1E^-11M，例如通过人FRET测定法或人AlphaLISA确定的。

在另一个优选的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制ADAMTS5的(酶促)活性，其IC₅₀最多是1E^-07M，优选地是 1E^-08M、5E^-09M或4E^-9M、3E^-9M、2E^-9M，例如1E^{- 9}M。

在另一个优选的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽调控ADAMTS5，其EC₅₀是1E^-07M至1E^-12M，例如1E^-08M至1E^-11 M，例如通过结合ELISA确定的。

在另一个优选的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽结合ADAMTS5，其解离速率小于1E^-04s^-1，例如由SPR确定的的。

在另一个优选的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述 ADAMTS5是人ADAMTS5(SEQ ID NO:149)、牛ADAMTS5(SEQ ID NO:150)、大鼠ADAMTS5(SEQ ID NO:151)、豚鼠ADAMTS5(SEQ ID NO:152)、小鼠ADAMTS5(SEQ ID NO:153)或食蟹猴ADAMTS5 (SEQ IDNO:154)，优选地人ADAMTS5，最优选地SEQ ID NO:149。

在另一个优选的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽拮抗ADAMTS5的活性，例如蛋白酶活性，例如裂解聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、短蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖和/或双糖链蛋白聚糖，优选地裂解聚集蛋白聚糖；优选地拮抗ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性。

在另一个优选的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽阻断ADAMTS5与聚集蛋白聚糖的结合至少20％，例如至少30％、 40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至更高，例如通过FRET、 AlphaLISA或ELISA确定的。

在另一个优选的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制ADAMTS5的蛋白酶活性，例如抑制底物的蛋白水解，所述底物例如聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、短蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖和/或双糖链蛋白聚糖，优选聚集蛋白聚糖。

在另一个优选的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其包含至少 2个ISVD，其中至少1个ISVD特异性结合ADAMTS，优选地 ADAMTS5，优选地选自SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、16、17、 10、11、9、5、4、7、117、8、12、13、14、15和18，优选地其中所述至少2个ISVD特异性结合优选地ADAMTS5。

在另一个优选的方面，本发明涉及多肽，其包含特异性结合 ADAMTS5的两个或更多个ISVD，其中a)至少“第一”ISVD特异性结合ADAMTS5的第一抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象；并且其中b)至少“第二”ISVD特异性结合ADAMTS5的分别不同于第一抗原决定簇抗原决定簇、部分、结构域、亚基或构象的第二抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象，优选地其中所述特异性结合 ADAMTS5的“第一”ISVD选自SEQ ID NO:2、1、3、6、16、17、10、 11、9、5、4、7、8、117、12、13、14、15和18，优选地其中所述特异性结合ADAMTS5的“第二”ISVD是SEQ ID NO:118或19，甚至更优选地所述多肽包含选自SEQ ID NO:127(克隆130049-093-Alb)、SEQ ID NO:126(克隆129 2F3-093-Alb)、SEQ ID NO:127(克隆130 049-093-Alb) 和SEQ ID NO:128(克隆131 9D3-093-Alb)。

在另一个优选的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其进一步包含结合血清白蛋白的ISVD，优选地其中所述结合血清白蛋白的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是 CDR1至CDR3)组成，其中CDR1是SEQ ID NO:146，CDR2是SEQID NO:147，并且CDR3是SEQ ID NO:148，甚至更优选地其中所述结合血清白蛋白的ISVD选自ALB8(SEQ ID NO:131)、ALB23(SEQ ID NO:132)、ALB129(SEQ ID NO:133)、ALB132(SEQID NO:134)、 ALB11(SEQ ID NO:135)、ALB11(S112K)-A(SEQ ID NO:136)、 ALB82(SEQ IDNO:137)、ALB82-A(SEQ ID NO:138)、ALB82-AA (SEQ ID NO:139)、ALB82-AAA(SEQ ID NO:140)、ALB82-G(SEQ ID NO:141)、ALB82-GG(SEQ ID NO:142)、ALB82-GGG(SEQ ID NO:143)、ALB92(SEQ ID NO:144)和ALB223(SEQ ID NO:145)，甚至更优选地其中所述多肽选自：SEQID NO:129(克隆577 2F3^SO-Alb)、 SEQ ID NO:130(克隆579 2F3^SO-093-Alb)、SEQ ID NO:120(克隆4 2A12-Alb)、SEQ ID NO:121(克隆5 2D7-Alb)、SEQ ID NO:122(克隆 6 2F3-Alb)、SEQ ID NO:123(克隆69 049-Alb)、SEQ ID NO:124(克隆70 9D3-Alb)、SEQ ID NO:125(克隆71 3B2-Alb)、SEQ ID NO:126 (克隆129 2F3-093-Alb)、SEQ ID NO:127(克隆130049-093-Alb)和 SEQ ID NO:128(克隆131 9D3-093-Alb)。

在另一个优选的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其进一步包含至少一个特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD，优选地选自SEQ ID NO:156(纳米抗体00745PEA114F08)和SEQ ID NO:157(纳米抗体 00747PEA604F02)。

在另一个优选的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其包含至少 2个特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD，其中所述至少2个特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD可以相同或不同，优选地其中所述至少2个特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD独立地选自SEQ ID NO:156和157，甚至更优选地其中所述特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD特异性结合人聚集蛋白聚糖[SEQ ID NO:155]。优选地，所述特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD 特异性结合狗聚集蛋白聚糖(也参见表2)，牛聚集蛋白聚糖，大鼠聚集蛋白聚糖；猪聚集蛋白聚糖；小鼠聚集蛋白聚糖，兔聚集蛋白聚糖；食蟹猴聚集蛋白聚糖和/或恒河猴聚集蛋白聚糖。优选地，所述特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD优选地结合软骨组织，例如软骨和/或半月板。

在另一个优选的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽在37℃的滑膜液(SF)中具有至少7天，例如14天、21天、1个月、 2个月或甚至3个月的稳定性。

在另一个优选的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述至少两个ISVD彼此直接连接或经接头连接，优选地所述接头选自SEQ ID NO:158至174(即SEQ ID NO:158、159、160、161、162、163、164、 165、166、167、168、169、170、171、172、173和174)，优选地SEQID NO:169。

在另一个优选的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其进一步包含C末端延伸，优选地其中所述C末端延伸是C末端延伸(X)n，其中n是1至10，优选地1至5，例如1、2、3、4或5(并且优选地是1 或2，例如1)；并且每个X是独立地选择的(优选地天然存在的)氨基酸残基，并且优选地独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)。

在另一个优选的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽与SEQ IDNO:1-19(即SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14、15、16、17、18、19)、116-117或120-130(即SEQ ID NO:120、121、122、123、124、125、126、127、128、129和130)中的任一个具有至少80％、90％、95％或100％的序列同一性。

在另一个优选的方面，本发明涉及治疗和/或预防个体的疾病或病症的方法，例如其中涉及ADAMTS5活性，该方法包括以有效治疗或预防所述疾病或病症的症状的量向所述个体施用权利要求1-43中任一项的多肽，优选地其中所述疾病或病症选自关节病和软骨营养不良，关节炎疾病，例如骨关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎、银屑病关节炎、外伤性破裂或脱离、软骨发育不全、肋软骨炎、脊椎干骺端发育不良、椎间盘突出症、腰椎间盘退变疾病、退行性关节疾病和复发性多发性软骨炎、剥离性骨软骨炎和聚集蛋白聚糖病变。更优选地，所述疾病或病症是关节炎疾病并且最优选地是骨关节炎。

在另一个优选的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其用作药物。

在另一个优选的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其用于治疗或预防ADAMTS5相关疾病的症状，所述疾病例如为关节病和软骨营养不良、关节炎疾病，例如骨关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎，银屑病关节炎、外伤性破裂或脱离、软骨发育不全、肋软骨炎，脊椎干骺端发育不良、椎间盘突出症、腰椎间盘退变疾病、退行性关节疾病和复发性多发性软骨炎、剥离性骨软骨炎和聚集蛋白聚糖病变。更优选地，所述疾病或病症是关节炎疾病并且最优选地是骨关节炎。

在另一个优选的方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽交叉阻断由SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、16、17、10、11、9、 5、4、7、117、8、12、13、14、15和18中任何一个表示的至少一种多肽与ADAMTS5的结合，和/或被由SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、 16、17、10、11、9、5、4、7、117、8、12、13、14、15和18中的任何一个表示的至少一种多肽交叉阻断与ADAMTS5的结合。

在另一个优选的方面，本发明涉及多肽，其交叉阻断由SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、16、17、10、11、9、5、4、7、117、8、12、 13、14、15和18中任何一个表示的多肽与ADAMTS5的结合，和/或被由SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、16、17、10、11、9、5、4、7、 117、8、12、13、14、15和18中的任何一个表示的至少一种多肽交叉阻断与ADAMTS5的结合，其中所述多肽包含特异性结合ADAMTS5的至少一个VH、VL、dAb、免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)，其中与 ADAMTS5的结合调控ADAMTS5的活性。

根据本文的进一步公开，多肽和组合物的其他方面、优点、应用和用途将变得清楚。在本说明书的本文中引用了一些文件。无论是上文还是下文，本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、说明书等)均通过引用全文并入本文。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明由于在先发明而没有权利早于这样的公开。

4附图说明

图1：结合ADAMTS5的ISVD不抑制MMP1(A)或MMP14(B) 活性。

图2：结合ADAMTS5的ISVD不抑制ADAMTS4活性。

图3：与来自3个供体样品组的纳米抗体构建体581(A)和纳米抗体构建体579(B)的预先存在的抗体(preAb)结合水平，所述3个供体样品组来自：健康受试者、骨关节炎受试者和具有残留preAb结合的供体。

图4：纳米抗体构建体581(“C011400581”)不结合人ADAMTS1 (A)，并且也不结合人ADAMTS4或人ADAMTS15(B)。

图5：人类外植体系统的效力。显示了7天后上清液中的GAG积累。

图6：A)牛共培养系统中GAG释放到上清液中的时间过程。

B)随时间(7-28天)的GAG释放的曲线下面积(AUC)计算。重复次数n＝4。以盒形图形式并以最小值至最大值显示数据。

C)数据显示木瓜蛋白酶消化后的GAG含量[ng/mg软骨]。重复次数n＝4。以盒形图形式并以最小值至最大值显示数据。

图7：随时间(7-28天)的exAGNx1释放的曲线下面积(AUC)计算。重复次数n＝4。以盒形图形式并以最小值至最大值显示数据。

图8：随时间(7-28天)的C2M释放的曲线下面积(AUC)计算。重复次数n＝4。以盒形图形式并以最小值至最大值显示数据。

图9：随时间(7-28天)的C3M释放的曲线下面积(AUC)计算。重复次数n＝4。以盒形图形式并以最小值至最大值显示数据。

图10：在NHP中对聚集蛋白聚糖酶活性的抑制。

图11：抑制软骨退变。在DMM小鼠模型中，预防性(A)和治疗性(B)处理显示了内侧(median)软骨退变总结(sum)。

图12：大鼠外科OA模型的症状表现。

图13：胫骨内侧软骨退变宽度。

图14：在软骨的离体培养物(A、B、C)以及软骨和滑膜共培养物 (D、E)中，抗ADAMTS-5纳米抗体对聚集蛋白聚糖酶衍生的聚集蛋白聚糖降解的影响。列出的浓度是纳米抗体的浓度。用普通的单因素 ANOVA或双因素ANOVA进行统计分析。当p＜0.05时，认为统计学显著性。

5详述

仍然存在对安全有效的OA药物、尤其是DMOAD的需要。这些药物应符合多种且经常相反的需求，尤其是在打算采用广泛适用的形式时。这样，该形式应当优选地在广泛的患者中有用。该形式应当优选地是安全的，并且不会因频繁施用而引起感染。另外，该形式应当优选地是患者友好的，例如该形式应当允许方便的给药方案和施用途径，例如全身施用。例如优选在施用后不立即从循环中除去该形式。然而，延长半衰期应当优选地不引入脱靶活性和副作用或限制功效。

本发明实现了这些需要中的至少一项。

基于非常规的筛选、表征和组合策略，本发明人令人惊讶地观察到免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)在体外和体内实验中表现异常优异。

此外，本发明的发明人能够对ISVD进行重新工程改造，使其在缓解OA方面进一步优于竞品药物。另外，还证明了本发明的ISVD比现有技术的化合物显著更安全。

本发明旨在提供拮抗ADAMTS，特别是ADAMTS5的多肽，其与现有技术的氨基酸序列和抗体相比，具有改善的预防、治疗和/或药理学特性，包括更安全的特性。

因此，本发明涉及针对ADAMTS5和/或可以特异性结合(如本文所定义)ADAMTS5的ISVD和多肽。

因此，本发明涉及针对ADAMTS和/或可以特异性结合(如本文所定义的)ADAMTS并调控其活性的ISVD和多肽，特别是包含特异性结合ADAMTS5的至少一个ISVD的多肽，其中结合ADAMTS5调控 ADAMTS5的活动。

除非另有说明或定义，否则所使用的所有术语具有其在本领域中的通常含义，这对本领域技术人员将是清楚的。参考例如标准手册，例如 Sambrook等人(MolecularCloning:A Laboratory Manual(2^nd Ed.)Vols. 1-3,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)，F.Ausubel等人 (Current protocols in molecular biology,GreenPublishing and Wiley Interscience,New York,1987)，Lewin(Genes II,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,1985)，Old等人(Principles of Gene Manipulation:AnIntroduction to Genetic Engineering(2nd edition)University of CaliforniaPress,Berkeley,CA,1981)；Roitt等人(Immunology(6^th Ed.) Mosby/Elsevier,Edinburgh,2001)，Roitt等人(Roitt’s Essential Immunology(10^th Ed.)BlackwellPublishing,UK,2001)，和Janeway等人(Immunobiology(6^th Ed.)Garland SciencePublishing/Churchill Livingstone,New York,2005)，以及本文引用的一般背景技术。

除非另外指出，否则可以以本身已知的方式进行并且已经进行未具体描述的所有方法、步骤、技术和操作，对本领域技术人员是显而易见的。再次参考例如本文提到的标准手册和一般背景技术，以及其中引用的其他参考文献。以及例如以下综述Presta(Adv.DrugDeliv.Rev.58 (5-6):640-56,2006)，Levin和Weiss(Mol.Biosyst.2(1):49-57,2006)，Irving等人(J.Immunol.Methods 248(1-2):31-45,2001)，Schmitz等人 (Placenta21Suppl.A:S106-12,2000)，Gonzales等人(Tumour Biol.26(1): 31-43,2005)，其描述了用于蛋白质工程改造的技术，例如亲和力成熟和用于改善蛋白质例如免疫球蛋白的特异性和其他所需特性的其他技术。

必须注意的是，除非上下文另外明确指出，否则本文所用的单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数形式。因此，例如对“一种反应剂”的提及包括一种或多种这样的不同反应剂，并且对“该方法”的提及包括对本领域普通技术人员已知的可以修改或替代本文所述方法的等价步骤和方法的提及。

除非另有说明，否则一系列元件之前的术语“至少”应理解为是指该系列中的每个元件。仅通过常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等价形式。这样的等价形式旨在被本发明涵盖。

术语“和/或”在本文中无论在何处使用均包括“和”、“或”和“由所述术语连接的元件的所有或任何其他组合”的含义。

本文所用的术语“约”或“大约”是指给定值或范围的20％以内，优选地15％以内，更优选地10％以内，并且最优选地5％以内。

在整个说明书和所附的权利要求书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”以及诸如“包含”和“含有”之类的变体将被理解为暗示包括所述整数或步骤或者整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤的组。当在本文中使用时，术语“包括”可以用术语“包含”或“含有”代替，或者有时在本文中使用用术语“具有”代替。

如本文所用，术语“序列”(例如诸如“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“可变结构域序列”、“V_HH序列”或“蛋白质序列”之类的术语)通常应理解为包括相关的氨基酸序列以及编码该氨基酸序列的核酸或核苷酸序列，除非上下文要求更严格的解释，

根据上下文，氨基酸序列被解释为表示单个氨基酸或者两个或更多个氨基酸的无支链序列。核苷酸序列被解释为表示3个或更多个核苷酸的无支链序列。

氨基酸是天然存在的蛋白质中常见的L-氨基酸。氨基酸残基将根据标准的三个字母或一个字母的氨基酸代码表示。参考例如WO 08/020079 的第48页上的表A-2。那些包含D-氨基酸的氨基酸序列不意在被该定义所涵盖。包含翻译后修饰的氨基酸的任何氨基酸序列都可以描述为使用该表A-2中所示的符号最初翻译的带有修饰位置的氨基酸序列，修饰例如羟基化或糖基化，但是这些修饰不应在氨基酸序列中明确显示。可以被表示为序列修饰的键、交联和末端帽、非肽基键等的任何肽或蛋白质都被该定义所涵盖，所有这些都是本领域已知的。

术语“蛋白质”、“肽”、“蛋白质/肽”和“多肽”在整个本公开中可互换使用，并且各自对于本公开具有相同的含义。每个术语是指由两个或更多个氨基酸的线性链组成的有机化合物。化合物可以具有十个或更多个氨基酸；二十五个或更多个氨基酸；五十个或更多个氨基酸；一百个或更多个氨基酸，两百个更多个氨基酸，并且甚至三百个或更多个氨基酸。技术人员将理解，尽管不存在区分多肽和蛋白质的氨基酸数目的本领域公认的临界点，但是多肽通常包含的氨基酸少于蛋白质；多肽可以通过化学合成或重组方法制备；并且蛋白质通常通过本领域已知的重组方法在体外或体内制备。按照惯例，多肽一级结构中的酰胺键的顺序按照所写氨基酸，其中多肽的胺端(N末端)始终在左侧，而酸端(C末端) 在右侧。

核酸或氨基酸序列被认为是“(以)(基本上)分离的(形式)”-例如与从中获得了该核酸或氨基酸序列的反应介质或培养基相比-当其已经与通常在所述来源和介质中与之连接的至少一种其他组分分离，其他组分例如另一种核酸、另一种蛋白质/多肽、另一种生物组分或大分子或至少一种污染物、杂质或次要组分。具体而言，当核酸或氨基酸序列已经纯化了至少2倍，特别是至少10倍，更特别是至少100倍，并且最高达1000倍或更多时，则认为是“(基本上)分离的”。如使用合适的技术，例如合适的色谱技术，例如聚丙烯酰胺-凝胶电泳所确定的，“(基本上) 分离的形式”的核酸或氨基酸优选地是基本上同源的。

当说核苷酸序列或氨基酸序列分别“包含”另一个核苷酸序列或氨基酸序列，或“基本上由”另一个核苷酸序列或氨基酸序列“组成”时，这可表示后一个核苷酸序列或氨基酸序列序列已分别并入第一个提及的核苷酸序列或氨基酸序列，但是更通常的是，这一般是指第一个提及的核苷酸序列或氨基酸序列在其序列内分别包含一段核苷酸或氨基酸残基，其具有与后一个序列分别具有相同的核苷酸序列或氨基酸序列，而与实际上如何产生或获得第一个提到的序列无关(例如可以通过本文所述的任何合适的方法)。通过非限制性实例，当说本发明的多肽包含免疫球蛋白单可变结构域(“ISVD”)时，这可能意味着所述免疫球蛋白单可变结构域序列已被并入本发明多肽的序列中，但是更通常的是，这一般意味着本发明的多肽在其序列内包含免疫球蛋白单可变结构域的序列，而与如何产生或获得所述本发明的多肽无关。同样，当说核酸或核苷酸序列包含另一个核苷酸序列时，第一个提及的核酸或核苷酸序列优选地是这样的，使得当其被表达成表达产物(例如多肽)时，由后一个核苷酸序列编码的氨基酸序列形成所述表达产物的一部分(换言之，后一个核苷酸序列与第一个提到的较大的核酸或核苷酸序列处于同一阅读框中)。另外，当说本发明的构建体包含多肽或ISVD时，这可能意味着所述构建体至少分别包含所述多肽或ISVD，但是更通常地，这意味着所述构建体包含除所述多肽或ISVD之外的基团、残基(例如氨基酸残基)、部分和 /或构件，无论所述多肽或ISVD如何与所述基团、残基(例如氨基酸残基)、部分和/或构件连接，并且与所述构建体的结构如何产生或获得无关。

“基本上由...组成”是指本发明中使用的ISVD与本发明的ISVD完全相同或对应于本发明的ISVD，其具有添加在ISVD的氨基末端、羧基末端或氨基末端和羧基末端的有限数目的氨基酸残基，例如1-20个氨基酸，例如1-10个氨基酸残基，优选地1-6个氨基酸残基，例如1、2、3、4、 5或6个氨基酸残基。

为了比较两个或更多个核苷酸序列，可以通过将[第一核苷酸序列中与在第二核苷酸序列中相应位置处相同的核苷酸数目]除以[第一核苷酸序列中核苷酸的总数]并乘以[100％]来计算第一核苷酸序列和第二核苷酸序列之间的“序列同一性”百分比，其中与第一核苷酸序列相比，第二核苷酸序列中核苷酸的每个缺失、插入、取代或添加被认为是单个核苷酸(位置)上的差异。备选地，使用用于序列比对的已知计算机算法，例如NCBI Blastv2.0，使用标准设置，来计算两个或更多个核苷酸序列之间的序列同一性程度。用于确定序列同一性程度的一些其他技术、计算机算法和设置例如在WO 04/037999、EP 0967284、EP1085089、WO 00/55318、WO 00/78972、WO 98/49185和GB 2357768中进行了描述。通常为了根据上文概述的计算方法确定两个核苷酸序列之间的“序列同一性”的百分比，将具有最大核苷酸数的核苷酸序列作为“第一”核苷酸序列，并将另一个核苷酸作为该序列作为“第二”核苷酸序列。

为了比较两个或更多个氨基酸序列，第一氨基酸序列和第二氨基酸序列之间的“序列同一性”百分比(在本文中也称为“氨基酸同一性”)可以通过将[第一氨基酸序列中与在第二核苷酸序列中相应位置处相同的氨基酸残基数目]除以[第一氨基酸序列中氨基酸残基的总数]并乘以 [100％]来计算，其中与第一氨基酸序列相比，第二氨基酸序列中氨基酸残基的每个缺失、插入、取代或添加均被视为单个氨基酸残基(位置) 的差异，即如本文所定义的“氨基酸差异”。备选地，使用已知的计算机算法例如上述用于确定核苷酸序列的序列同一性程度的算法，再次使用标准设置，来计算两个氨基酸序列之间的序列同一性程度。通常，为了根据上文概述的计算方法确定两个氨基酸序列之间的“序列同一性”的百分比，将具有最大氨基酸残基数量的氨基酸序列作为“第一”氨基酸序列，并且将另一个氨基酸序列作为“第二”氨基酸序列。

同样，在确定两个氨基酸序列之间的序列同一性程度时，技术人员可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，其一般可以描述为这样的氨基酸取代，其中氨基酸残基被替换为具有相似化学结构的另一个氨基酸残基并且其对多肽的功能、活性或其他生物学特性几乎没有影响或基本没有影响。这样的保守氨基酸取代在本领域中是众所周知的，例如从WO 04/037999、GB 335768、WO 98/49185、WO 00/46383和WO 01/09300；并且可以基于来自WO 04/037999和WO 98/49185的相关教导以及从其中引用的其他参考文献中选择这种取代的(优选)类型和/或组合。

这样的保守取代优选地是其中以下组(a)-(e)中的一个氨基酸被相同组中的另一个氨基酸残基取代：(a)小的脂肪、非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro和Gly；(b)极性带负电荷的残基及其(不带电荷的)酰胺：Asp、Asn、Glu和Gln；(c)极性带正电荷的残基：His、 Arg和Lys；(d)大的脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val和Cys；(e) 芳族残基：Phe、Tyr和Trp。特别优选的保守取代如下：Ala取代为Gly 或Ser；Arg取代为Lys；Asn取代为Gln或取代为His；Asp取代为Glu； Cys取代为Ser；Gln取代为Asn；Glu取代为Asp；Gly取代为Ala或取代为Pro；His取代为Asn或取代为Gln；Ile取代为Leu或取代为Val； Leu取代为Ile或取代为Val；Lys取代为Arg，取代为Gln或取代为Glu； Met取代为Leu，取代为Tyr或取代为Ile；Phe取代为Met，取代为Leu 或取代为Tyr；Ser取代为Thr；Thr取代为Ser；Trp取代为Tyr；Tyr 取代为Trp；和/或Phe取代为Val，取代为Ile或取代为Leu。

应用于本文所述多肽的任何氨基酸取代也可以基于由Schulz等人 (“Principlesof Protein Structure”,Springer-Verlag,1978)开发的不同物种的同源蛋白质之间的氨基酸变异的频率的分析，基于由Chou和 Fasman(Biochemistry 13:211,1974；Adv.Enzymol.,47:45-149,1978) 开发的结构形成潜能的分析，以及基于Eisenberg等人(Proc.Natl.Acad Sci.USA 81:140-144,1984)、Kyte和Doolittle(J.Molec.Biol.157:105-132,1981)和Goldman等人(Ann.Rev.Biophys.Chem.15:321-353, 1986)(全部通过引用整体并入本文)开发的蛋白质中疏水性模式的分析。关于纳米抗体的一级、二级和三级结构的信息在本文的描述和以上引用的一般背景技术中给出。同样，出于该目的，来自美洲驼的V_HH结构域的晶体结构例如由Desmyter等人(Nature Structural Biology,3:803,1996)、Spinelli等人(Natural Structural Biology,3:752-757,1996)和 Decanniere等人(Structure,7(4):361,1999)给出。关于在常规V_H结构域中形成V_H/V_L界面以及这些位置上潜在的骆驼科取代的一些氨基酸残基的进一步信息可以在上面引用的现有技术中找到。

如果氨基酸序列和核酸序列在其整个长度上具有100％的序列同一性(如本文所定义)，则称它们“完全相同”。

当比较两个氨基酸序列时，术语“氨基酸差异”是指与第二序列相比，在第一序列的位置上的单个氨基酸残基的插入、缺失或取代；应当理解，两个氨基酸序列可以包含一个、两个或更多个这样的氨基酸差异。更具体地，在本发明的ISVD和/或多肽中，术语“氨基酸差异”是指分别与a)、 c)或e)的CDR序列相比，b)、d)或f)中指定的CDR序列的位置上的单个氨基酸残基的插入、缺失或取代；应当理解，与分别是a)、c)或 e)的CDR序列相比，b)、d)和f)的CDR序列可包含1、2、3、4或最大5个这样的氨基酸差异。

“氨基酸差异”可为改善本发明的ADAMTS5结合物例如本发明的多肽的性质，或者至少不会减损本发明的ADAMTS5结合物例如本发明的多肽的所需特性或者所需特性的平衡或组合的任何1、2、3、4或最大5 个取代、缺失或插入，或其任意组合。在这方面，与包含一个或多个CDR 序列而不具有1、2、3、4或最大5个取代、缺失或插入的多肽相比，本发明的所得ADAMTS5结合物，例如本发明的多肽应至少以相同、大约相同或更高的亲和力结合ADAMTS5。亲和力可通过本领域已知的任何合适的方法来测量，但是优选地通过实施例部分中描述的方法来测量。

在这方面，如下所示的根据b)、d)和/或f)的CDR的氨基酸序列可以是衍生自根据a)、c)和/或e)的氨基酸序列的氨基酸序列，分别通过亲和力成熟使用一种或多种本身已知或如实施例中所述的亲和力成熟技术。例如并且取决于用于表达本发明多肽的宿主生物，可以以将一种或多种用于翻译后修饰的位点(例如一个或多个糖基化位点)除去的方式设计这样的缺失和/或取代，这本领域技术人员的能力范围内(参见实施例)。

本说明书中使用的“纳米抗体家族”、“V_HH家族”或“家族”是指一组具有相同长度(即，其序列中具有相同数目的氨基酸)的纳米抗体和/或 V_HH序列，并且其中位置8和位置106之间(根据Kabat编号)的氨基酸序列具有89％或更高的氨基酸序列同一性。

可以互换使用的术语“表位”和“抗原决定簇”是指大分子的一部分，大分子例如被抗原结合分子例如本发明的免疫球蛋白、常规抗体、免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽识别的多肽或蛋白质，并且更特别被所述分子的抗原结合位点识别。表位定义了免疫球蛋白的最小结合位点，并因此代表了免疫球蛋白的特异性得靶标。

识别表位的抗原结合分子(例如本发明的免疫球蛋白、常规抗体、免疫球蛋白单可变结构域和/或多肽)的一部分被称为“互补位”。

可以“结合”或“特异性结合”某些表位、抗原或蛋白质(或其至少一部分、片段或表位)，对其具有“亲和力”和/或“具有特异性”的氨基酸序列(例如本发明的免疫球蛋白单可变结构域、抗体、多肽或通常地其抗原结合蛋白或多肽或片段)被称为“针对”或“针对”所述表位、抗原或蛋白质蛋白质或者是关于这样的表位、抗原或蛋白质的“结合”分子，或者被称为“抗”表位、“抗”抗原或“抗”蛋白质(例如“抗”-ADAMTS5)。

亲和力表示分子相互作用的强度或稳定性。亲和力通常以K_D或解离常数给出，其单位是mol/L(或M)。亲和力也可以表示为缔合常数K_A，其等于1/K_D并具有(mol/升)^-1(或M^-1)的单位。在本说明书中，两个分子之间相互作用的稳定性将主要根据其相互作用的K_D值来表示；对于技术人员显而易见的是，鉴于关系K_A＝1/K_D，通过其K_D值指定分子相互作用的强度也可以用于计算相应的K_A值。K_D值在热力学意义上也表征了分子相互作用的强度，因为它通过众所周知的关系DG＝RT.ln(K_D) (等效地DG＝-RT.ln(K_A))与结合的自由能(DG)的变化有关，其中 R等于气体常数，T等于绝对温度并且ln表示自然对数。

被认为有意义的(例如特异性的)生物学相互作用的K_D通常在10^-12 M(0.001nM)至10^-5M(10000nM)的范围内。相互作用越强，其K_D越低。

K_D还可以表示为复合物的解离速率常数(表示为k_off)与其缔合速率(表示为k_on)的比率(因此K_D＝k_off/k_on和K_A＝k_on/k_off)。解离速率k_off的单位为s^-1(其中s为秒的SI单位表示法)。缔合速率k_on的单位为M^-1s^-1。缔合速率可在10²M^-1s^-1至约10⁷M^-1s^-1之间变化，接近双分子相互作用的扩散受限缔合速率常数。解离速率与给定分子相互作用的半衰期有关，关系为t_1/2＝ln(2)/k_off。解离速率可能在10^-6s^-1(接近不可逆复合，t_1/2为数天)至1s^-1(t_1/2＝0.69s)之间变化。

抗原结合蛋白(例如ISVD)与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以通过本身已知的任何合适方式来确定，包括例如饱和结合测定法和/或竞争性结合测定法，例如放射性免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA) 和三明治竞争测定法，以及它们本身在本领域中已知的不同变体；以及此处提到的其他技术。

可以通过本身已知的不同技术来测量两个分子之间的分子相互作用的亲和力，例如众所周知的表面等离振子共振(SPR)生物传感器技术(参见例如Ober等人，2001，Intern.Immunology 13：1551-1559)，其中一个分子固定在生物传感器芯片上，另一个分子在流动条件下通过固定化的分子，产生k_on、k_off测量值并从而得出K_D(或K_A)值。例如这可以使用众所周知的

仪器(Pharmacia Biosensor AB， Uppsala,Sweden)来进行。Kinetic Exclusion Assay

(Drake 等人，2004，Analytical Biochemistry328：35-43)在不标记结合配偶体的情况下测量溶液中的结合事件，并且基于动力学排除复合物的解离。溶液中(in-solution)亲和力分析也可以使用

免疫测定系统(该系统提供了自动化生物分析和快速样品周转的平台(Fraley等人， 2013，Bioanalysis5：1765-74))或者ELISA来进行。

对于本领域技术人员而言还将清楚的是，如果测量过程例如通过与一个分子的生物传感器上的涂层有关的假象(artifacts)在某种程度上影响隐含分子的固有结合亲和力，则所测量的K_D可以对应于表观K_D。同样，如果一个分子包含另一个分子的一个以上识别位点，则可以测量表观K_D。在这种情况下，两个分子相互作用的亲合力(avidity)可能会影响所测得的亲和力。特别是，K_D的准确测量可能会非常费力，并因此，通常会确定明显的K_D值来评估两个分子的结合强度。应当指出的是，只要所有测量均以一致的方式进行(例如保持测定法条件不变)，表观K_D测量就可以用作真实K_D的近似值，并因此在本文档中，以相等的重要性或相关性对待K_D和表观K_D。

术语“特异性”是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(例如本发明的ISVD或多肽)分子可以结合的不同类型的抗原或抗原决定簇的数目。可以基于亲和力(affinity)和/或亲合力(avidity)来确定抗原结合蛋白的特异性，例如如WO 08/020079的第53-56页中所述(通过引用并入本文)，该文献也描述了用于测量抗原结合分子(例如本发明的多肽或ISVD)和相关抗原之间的结合的一些优选技术。通常，抗原结合蛋白(例如本发明的ISVD和/或多肽)将以10^-5至10^-12摩尔/升或更小，和优选地 10^-7至10^-12摩尔/升或更低和更优选地10^-8至10^-12摩尔/升解离常数(K_D) (即缔合常数(K_A)为10⁵至10¹²升/摩尔或更高，和优选地10⁷至10¹²升/摩尔或更高，和更优选地10⁸至10¹²升/摩尔)。通常认为任何大于10^-4 mol/升的K_D值(或任何小于10⁴升/mol的K_A值)都表示非特异性结合。优选地，本发明的单价ISVD将以小于500nM，优选地小于200nM，更优选地小于10nM，例如小于500pM，例如在10至5pM或更小的亲和力结合所需抗原。还参考WO 08/020079的第53-56页的n)段。

当ISVD和/或多肽以亲和力与第一抗原结合时(如上所述，并且适当地表示为K_D值、K_A值、K_off速率和/或K_on速率)比ISVD和/或多肽结合第二靶标或抗原的亲和力至少好10倍，例如至少100倍，和优选地至少1000倍或更高时，它与另一个(第二)靶标或抗原相比被认为对(第一)靶标或抗原具有“特异性”。例如ISVD和/或多肽可以以比所述ISVD 和/或多肽结合第二靶标或抗原的K_D低至少10倍，例如低至少100倍，和优选地低至少1000倍或甚至更低的K_D值结合第一靶标或抗原。优选地，当ISVD和/或多肽与第二靶标或抗原相比对于第一靶标或抗原具有“特异性”时，其针对(如本文所定义)所述第一靶标或抗原，而不针对所述第二靶标或抗原。

抗原结合蛋白与抗原或抗原决定簇的特异性结合可以通过本身已知的任何合适方式来确定，包括例如饱和结合测定法和/或竞争性结合测定法，例如放射免疫测定法(RIA)，酶免疫测定法(EIA)及其本领域已知的不同变体；以及此处提到的其他技术。

可用于评估亲和力的优选方法是Friguet等人1985(J.Immunol. Methods 77:305-19)的2步ELISA(酶联免疫吸附测定法)方法。该方法建立了溶液相结合平衡测量，并避免了与分子之一在例如塑料的载体上吸附有关的可能的假象。如本领域技术人员将清楚的那样，解离常数可以是实际的或表观的解离常数。确定解离常数的方法对本领域技术人员是清楚的，并且例如包括WO 08/020079的第53-56页提到的技术。

最后，应注意，在许多情况下，有经验的科学家可以断定确定相对于某些参考分子的结合亲和力很方便。例如为了评估分子A和B之间的结合强度，可以例如使用已知结合B并适当标记有荧光团或发色团或其他化学部分(例如生物素)的参考分子C，以便在ELISA或FACS(荧光激活细胞分选)或其他形式中容易检测(荧光团用于荧光检测，生色团用于光吸收检测，生物素用于链霉亲和素介导的ELISA检测)。通常，参考分子C保持固定的浓度，并且A的浓度随B的给定浓度或量而变化。结果，获得的IC₅₀值对应于A的浓度，在该浓度下对于缺失A的情况对 C测得的信号减半。如果已知K_{D ref}，即参考分子的K_D，以及参考分子的总浓度c_ref，则可以从以下公式获得相互作用A-B的表观K_D：K_D＝IC₅₀/ (1+c_ref/K_Dref)。注意，如果c_ref<<K_{D ref}，则K_D≈IC₅₀。如果对被比较的结合物以一致的方式(例如保持c_ref固定)进行IC₅₀的测量，则可以通过比较IC₅₀来评估分子相互作用的强度或稳定性的差异，并且在本文中将该测量判断为等同于K_D或表观K_D。

半数最大抑制浓度(IC₅₀)也可以是对化合物抑制生物学或生化功能 (例如药理作用)的有效性的量度。该定量测量表明抑制给定的生物学过程(或过程的组分，即酶、细胞、细胞受体、趋化性、间变、转移、侵袭性等)的一半需要多少多肽或ISVD(例如纳米抗体)。换言之，它是物质的半数最大(50％)抑制浓度(IC)(50％IC或IC₅₀)。通过确定抑制激动剂最大生物学反应一半所需的浓度，可以计算给定拮抗剂如本发明的多肽或ISVD(例如纳米抗体)的IC₅₀值。可以通过构建剂量-应答曲线并检查不同浓度的拮抗剂(例如本发明的多肽或ISVD(例如纳米抗体))对逆转激动剂活性的作用来确定药物的K_D。

术语半数最大有效浓度(EC₅₀)是指在指定的暴露时间后，诱导在基线和最大值之间一半的响应的化合物的浓度。在本文中，它用作对多肽、ISVD(例如纳米抗体)效力的量度。剂量应答曲线的EC₅₀代表化合物的浓度，在该浓度下可观察到其最大作用的50％。浓度优选地以摩尔单位表示。

在生物系统中，配体浓度的小变化通常导致遵循s形函数(sigmoidal function)的应答的快速变化。随着配体浓度增加，响应增加开始减慢的拐点是EC₅₀。这可以通过推导最佳拟合线来在数学上确定。在大多数情况下，依靠图进行估计很方便。如果在实施例部分中提供了EC₅₀，则将实验设计为尽可能准确地反映K_D。换言之，EC₅₀值然后可以被认为是 K_D值。术语“平均K_D”涉及在至少1个，但优选地大于1个，例如至少2 个实验中获得的平均K_D值。术语“平均”是指数学术语“平均”(数据总和除以数据中项目的数量)。

它还与IC₅₀有关，IC₅₀是化合物对其抑制(50％抑制)的量度。对于竞争结合测定法和功能性拮抗剂测定法，IC₅₀是剂量-应答曲线的最常见的综合量度。对于激动剂/刺激物测定法，最常见的综合量度是EC₅₀。

抑制常数(Ki)是抑制剂的效力如何的指示；它是产生半数最大抑制所需的浓度。与能够根据实验条件改变的IC₅₀不同，Ki是绝对值并通常被称为药物的抑制常数。抑制常数K_i可以通过使用Cheng-Prusoff方程来计算：

其中[L]是配体的固定浓度。

如本文所用，术语本发明的多肽和/或ISVD的“效力”是为其特异性作用发生所需的本发明的多肽和/或ISVD的量的函数。它是指所述本发明的多肽和/或ISVD调控和/或部分地或完全地抑制ADAMTS5的活性的能力。更具体而言，它可以指所述多肽和/或ISVD减少或甚至完全抑制本文定义的ADAMTS5活性的能力。这样，它可以指所述多肽和/或 ISVD抑制ADAMTS5的活性的能力，所述活性如酶活性如蛋白水解，例如蛋白酶活性和/或内肽酶活性以及结合底物，底物包括但不限于聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、短蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖和/或双糖链蛋白聚糖，优选地裂解聚集蛋白聚糖。所述多肽和/或ISVD优选地拮抗ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性。可以通过本领域已知或本文描述的任何合适的测定法来测量效力。如本文所用，“聚集蛋白聚糖酶活性”定义为对聚集蛋白聚糖的蛋白水解裂解。

本发明的多肽的“功效”是在饱和多肽浓度下测量作用本身的最大强度。功效指示从本发明的多肽可获得的最大应答。它是指多肽产生所需 (治疗)作用的能力。

一方面，本发明涉及本文所述的多肽，其中所述多肽结合 ADAMTS5，其K_D是1E^-07M至1E^-13M之间，例如1E^-08M至1E^-12M，优选地最多1E^-07M，优选地低于1E^-08M或1E^-09M，或甚至低于1E^-10M，例如5E^-11M，4E^-11M，3E^-11M，2E^-11M，1.7E^-11M，1E^-11M或甚至5E^-12 M，4E^-12M，3E^-12M，1E^-12M，例如通过Gyrolab或KinExA确定的。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽调控ADAMTS5，其EC₅₀是1E^-07M至1E^-12M，例如1E^-08M至1E^-11M，例如通过结合ELISA确定的。

一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽结合 ADAMTS5，其解离速率小于5E^-04s^-1，例如小于1E^-04s^-1或5E^-05s^-1，或甚至小于1E^-05s^-1，例如通过SPR确定的。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制 ADAMTS5的活性，其IC₅₀是1E^-07M至1E^-12M，例如1E^-08M至1E^-11M，例如通过人FRET测定法或人AlphaLISA确定的。

在一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制 ADAMTS5的酶活性，其IC₅₀是最多1E^-07M，优选地1E^-08M，5E^-09M 或4E^-9M，3E^-9M，2E^-9M，例如1E^-9M。

如果氨基酸序列(例如ISVD或多肽)对两种不同的抗原或抗原决定簇(例如来自不同哺乳动物物种的ADAMTS5，例如人ADAMTS5、牛ADAMTS5、大鼠ADAMTS5、豚鼠ADAMTS5、小鼠ADAMTS5或食蟹猕猴ADAMTS5)具有特异性(如本文所定义)，则称对这两种不同的抗原或抗原决定簇是“交叉反应性的”。应当理解，尽管对于两种不同抗原的结合亲和力可以不同，例如相差倍数2、5、10、50、100或甚至更多，只要对这些不同的抗原或抗原决定簇具有特异性(如本文所定义)，则ISVD或多肽可以被认为是交叉反应性的。

ADAMTS5也称为ADAMTS11、ADMP-2或聚集蛋白聚糖酶-2。

ADAMTS5的相关结构信息可以在例如下表1(参见表B)中所示的 UniProt登录号处找到。

表1

“人ADAMTS5”是指包含SEQ ID NO:149的氨基酸序列的 ADAMTS5。在一个方面，本发明的多肽特异性结合来自智人、小家鼠、豚鼠、牛、恒河猴和/或褐家鼠的ADAMTS5，优选地人ADAMTS5，优选地SEQ ID NO:149。

术语“(交叉)阻断((cross)-block)”，“(交叉)阻断的 ((cross)-blocked)”，“(交叉)阻断性((cross)-blocking)”，“竞争性结合”，“(交叉)竞争((cross)-compete)”，“(交叉)竞争性 ((cross)-competing)”和“(交叉)竞争型((cross)-competition)”在本文中可互换使用，是指免疫球蛋白、抗体、ISVD、多肽或其他结合试剂干扰其他免疫球蛋白、抗体、ISVD、多肽或结合试剂与给定靶标结合的能力。免疫球蛋白、抗体、ISVD、多肽或其他结合试剂能够干扰另一种与靶标结合的程度，并因此是否可以说是根据本发明的交叉阻断，可以通过使用竞争结合测定法来确定，所述竞争结合测定法是本领域常见的，例如通过在竞争ELISA中针对在噬菌体上展示的ISVD筛选纯化的 ISVD。特别合适的定量交叉阻断测定法包括ELISA。

用于确定针对靶标的免疫球蛋白、抗体、ISVD、多肽或其他结合试剂是否能够如本文所定义的(交叉)阻断、能够(交叉)阻断、竞争性结合或是(交叉)竞争性的其他方法可以通过基于SPR的“夹心测定法”，例如在实施例部分中描述的方法来评估。例如在Xiao-ChiJia等人 (Journal of Immunological Methods 288：91-98，2004)，Miller等人 (Journalof Immunological Methods 365：118-125，2011)中描述了其他合适的方法。

因此，本发明涉及如本文所述的多肽，例如由SEQ ID NO:2、116、 19、1、3、6、16、17、10、11、9、5、4、7、117、8、12、13、14、15 或18(参见表A-1)表示的，其中所述多肽与交叉阻断性多肽竞争，例如通过竞争ELISA确定的。

本发明涉及确定与本文所述的多肽竞争的竞争物如多肽的方法，本文所述的多肽例如由SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、16、17、10、 11、9、5、4、7、117、8、12、13、14、15或18中的任何一个表示，其中本文所述的多肽与竞争物(例如多肽)竞争或交叉阻断与ADAMTS5 例如人ADAMTS5(SEQ ID NO:149)的结合，其中与在不存在本发明多肽的情况下竞争物与ADAMTS5的结合相比，在存在本发明多肽的情况下竞争物与ADAMTS5的结合被降低了至少5％，例如10％、20％、30％、40％、50％或更多，例如80％、90％或甚至100％(即在给定测定法中实际上不可检测)。竞争和交叉阻断可以通过本领域已知的任何方式来确定，例如竞争ELISA或FACS测定法。在一方面，本发明涉及本发明的多肽，其中所述多肽交叉阻断由SEQID NO:2、116、19、1、3、 6、16、17、10、11、9、5、4、7、117、8、12、13、14、15或18表示的至少一种多肽与ADAMTS5的结合，和/或被SEQ NO：2、116、19、 1、3、6、16、17、10、11、9、5、4、7、117、8、12、13、14、15或 18表示的至少一种多肽交叉阻断与ADAMTS5的结合。

本发明还涉及与本文所述的多肽竞争的竞争物，多肽例如SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、16、17、10、11、9、5、4、7、117、8、12、 13、14、15或18，其中竞争物与本文所述的多肽竞争或交叉阻断与 ADAMTS5的结合，其中与在不存在所述竞争物的情况下本发明的多肽与ADAMTS5的结合相比，在存在所述竞争物的情况下本发明的多肽与 ADAMTS5的结合降低了至少5％，例如10％、20％、30％、40％、50％或更高，例如80％，或甚至更高，例如至少90％或甚至100％(即在给定的测定法中几乎无法检测到)。在一个方面，本发明涉及多肽，其交叉阻断本发明的多肽例如SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、16、17、10、 11、9、5、4、7、117、8、12、13、14、15或18之一与ADAMTS5的结合和/或被SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、16、17、10、11、9、5、 4、7、117、8、12、13、14、15或18中的至少一个交叉阻断与ADAMTS5 的结合，优选地其中所述多肽包含特异性结合ADAMTS5的至少一种 VH、VL、dAb或ISVD，其中结合ADAMTS5调控ADAMTS5的活性。

“ADAMTS5活性”和“ADAMTS5的活性”(这些术语在本文可互换使用)包括但不限于酶促活性，例如蛋白水解，例如蛋白水解酶(protease) 活性(也称为蛋白酶(proteinase)或肽酶活性)，和内肽酶活性，另一方面以及通过外结合位点的活性，例如识别和/或结合底物，例如通过去整合素样结构域、I型中央血小板应答蛋白样(TS)重复序列、富含半胱氨酸的结构域、间隔子区域和/或其他TS基序。ADAMTS5活性包括底物的结合和/或蛋白水解，例如透明质酸结合的硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)细胞外蛋白，例如聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、短蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖和双糖链蛋白聚糖。如本文所用，蛋白水解是通过水解将多肽链中的氨基酸连接在一起的肽键而将蛋白质分解成较小的多肽或氨基酸。

在本发明的上下文中，“调控的”或“调控”通常是指改变ADAMTS5 活性，如使用合适的体外、细胞或体内测定法(例如本文所述的那些) 所测量的。具体而言，“调控的”或“调控”可以表示与在相同条件但不存在本发明的ISVD或多肽的情况下在相同测定法中的ADAMTS5活性相比，降低或抑制ADAMTS5的活性，或者可选地增加ADAMTS5的活性以至少1％，优选地至少5％，例如至少10％或至少25％，例如至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，或90％或更多，如使用合适的体外、细胞或体内测定法(例如本文所述的那些)所测量的。

因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽调节ADAMTS5 的活性，优选地抑制ADAMTS5的活性。

因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制ADAMTS5 的蛋白酶活性，例如抑制对底物例如聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、短蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖和/或双糖链蛋白聚糖的蛋白水解。

因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽阻断ADAMTS5 与底物例如聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、短蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖和/或双糖链蛋白聚糖的结合，其中所述底物优选地是聚集蛋白聚糖。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽阻断 ADAMTS5与聚集蛋白聚糖的结合至少20％，例如至少30％、40％、50％、 60％、70％、80％、90％、95％或甚至更高，例如通过ELISA确定的。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽拮抗或抑制ADAMTS5的活性，例如(i)蛋白酶活性，优选地裂解聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、短蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖和/或双糖链蛋白聚糖，优选地裂解聚集蛋白聚糖；优选地拮抗ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性；(ii)底物与ADAMTS5的结合，例如ADAMTS5 的外结合位点，例如去整合素样结构域、I型中央血小板应答蛋白样(TS) 重复序列、富含半胱氨酸的结构域、间隔子区域或其他TS基序。

因此，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽抑制ADAMTS5 的蛋白酶活性，优选地至少5％，例如10％、20％、30％、40％、50％或甚至更多，例如至少60％、70％、80％、90％、95％或甚至更高，如通过本领域已知的任何合适的方法确定的，例如通过酶抑制测定法或如在实施例部分中所述的。

尽管ADAM、ADAMTS和MMP对聚集蛋白聚糖共有结合位点，所述位点在序列和总体形状上都非常相似，例如ADAMTS4和 ADAMTS5的催化结构域共有高度的序列相似性，但本发明人能够鉴定出哪些ISVD是靶标特异性的，如实施例所示。靶标特异性还可以避免或至少限制其为由广谱抑制剂引起的副作用的肌肉骨骼综合征。

在一个方面，本发明涉及ADAMTS5结合物(binder)，例如本发明的ISVD和多肽，其中所述ADAMTS5结合物不结合ADAMTS4、 ADAMTS1、ADAMTS15、MMP1和/或MMP14(膜类型)。优选地，本发明涉及如本文定义的多肽，其中所述结合ADAMTS5的ISVD不结合ADAMTS4、MMP1或MMP14。

除非另有说明，否则术语“免疫球蛋白”和“免疫球蛋白序列”-无论在本文中用于指重链抗体还是常规的4-链抗体-均用作通用术语以包括全尺寸抗体、其单个链以及其所有部分、结构域或片段(包括但不限于抗原结合结构域或片段，例如分别为V_HH结构域或V_H/V_L结构域)。

如本文所用，术语(多肽或蛋白质的)“结构域”是指折叠的蛋白质结构，其具有独立于蛋白质的其余部分而保留其三级结构的能力。通常，结构域负责蛋白质的离散功能特性，并且在许多情况下，可以添加、去除或转移至其他蛋白质而不会丢失蛋白质的其余部分和/或结构域的功能。

如本文所用，术语“免疫球蛋白结构域”是指抗体链(例如常规4链抗体或重链抗体的链)的球状区域，或指基本上由这样的球状区域组成的多肽。免疫球蛋白结构域的特征在于，它们保留了抗体分子的免疫球蛋白折叠特征，该结构由排列在两个β折叠中的约7条反平行β链的两层三明治组成，并可选地由保守的二硫键稳定。

如本文所用，术语“免疫球蛋白可变结构域”是指基本上由四个“框架区”组成的免疫球蛋白结构域，所述“框架区”在本领域中和在下文中分别称为“框架区1”或“FR1”；“框架区域2”或“FR2”；“框架区域3”或“FR3”；和“框架区域4”或“FR4”；这些框架区被三个“互补决定区”或“CDR”间断，后者在本领域中和在下文中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”；“互补决定区2”或“CDR2”；和“互补决定区3”或“CDR3”。因此，免疫球蛋白可变结构域的一般结构或序列可以如下所示： FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可变结构域通过携带抗原结合位点而赋予针对抗原的抗体特异性。

术语“免疫球蛋白单可变结构域”(在本文中缩写为“ISVD”或“ISV”)，并且与“单可变结构域”互换使用，定义了其中抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域上并由其形成的分子。这将免疫球蛋白单可变结构域与“常规”免疫球蛋白或其片段分开，其中两个免疫球蛋白结构域、特别是两个可变结构域相互作用而形成抗原结合位点。通常，在常规的免疫球蛋白中，重链可变结构域(V_H)和轻链可变结构域(V_L)相互作用形成抗原结合位点。在后一种情况下，V_H和V_L二者的互补决定区(CDR)均会对抗原结合位点有贡献，即，总共6个CDR将参与抗原结合位点的形成。

鉴于以上定义，常规4链抗体(例如本领域已知的IgG、IgM、IgA、 IgD或IgE分子)或Fab片段、F(ab’)2片段、Fv片段(例如二硫键连接的Fv或scFv片段)或衍生自这样的常规4链抗体的双抗体(所有都是本领域中已知的)的抗原结合结构域通常不被视为免疫球蛋白单可变结构域，在这些情况下，通常不通过一个(单个)免疫球蛋白结构域而是通过一对(相关的)免疫球蛋白结构域例如轻链和重链可变结构域，即通过免疫球蛋白结构域的V_H-V_L对(它们共同与相应抗原的表位结合)，发生与抗原的各个表位的结合。

相反，ISVD能够与抗原的表位特异性结合，而无需与其他免疫球蛋白可变结构域配对。ISVD的结合位点由单个V_HH、V_H或V_L结构域形成。因此，ISVD的抗原结合位点由不超过三个的CDR形成。

这样，单可变结构域可以是轻链可变结构域序列(例如V_L序列)或其合适的片段；或者重链可变结构域序列(例如V_H序列或V_HH序列)或其合适的片段；只要它能够形成单个抗原结合单元(即基本上由单可变结构域组成的功能性抗原结合单元，这样单抗原结合结构域就不需要与另一个可变结构域相互作用即可形成功能性抗原结合单元)。

在本发明的一个实施方案中，ISVD是重链可变结构域序列(例如 V_H序列)；更具体地说，ISVD可以是衍生自常规四链抗体的重链可变结构域序列或衍生自重链抗体的重链可变结构域序列。

例如ISVD可以是(单)结构域抗体(或适合用作(单)结构域抗体的氨基酸)，“dAb”或dAb(或适合用作dAb的氨基酸)或纳米抗体(如本文所定义，包括但不限于VHH)；其他单可变结构域，或其任何一个的任何合适的片段。

具体而言，ISVD可以是

(如本文所定义的)或其合适的片段。[注：

和

是Ablynx N.V.的注册商标]对于Nanobody的一般描述，请参考下面的进一步描述，以及本文引用的现有技术，例如在WO 08/020079(第16页)中描述的。

“V_HH结构域”，也称为VHH、V_HH结构域、VHH抗体片段和VHH 抗体，最初被描述为“重链抗体”的抗原结合免疫球蛋白(可变)域(即“不含轻链的抗体”；Hamers-Casterman等人，1993Nature 363：446-448)。选择术语“V_HH结构域”是为了将这些可变结构域与常规4链抗体中存在的重链可变结构域(在本文中称为“V_H结构域”或“V_H结构域”)和存在于常规4-链抗体中的轻链可变结构域(在本文中称为“V_L结构域”或“V_L结构域”)相区分。对于V_HH和纳米抗体的进一步描述，参考Muyldermans 的综述文章(Reviews in Molecular Biotechnology74：277-302，2001)，以及以下专利申请，其被作为一般背景技术提及：布鲁塞尔自由大学(Vrije Universiteit Brussel)的WO 94/04678、WO 95/04079和WO 96/34103；联合利华(Unilever)的WO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO01/40310、WO 01/44301、 EP 1134231和WO 02/48193；Vlaams Instituut voorBiotechnologie(VIB) 的WO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016和WO03/055527；Algonomics N.V.和Ablynx N.V.的WO 03/050531；加拿大国家研究委员会的WO01/90190；抗体研究所的WO 03/025020(＝EP 1433793)；以及Ablynx N.V.的WO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787和WO 06/122825，以及Ablynx N.V.的其他公开的专利申请。也参考了这些申请中提到的其他现有技术，特别是国际申请WO06/040153的第41-43页提及的参考文献列表，该列表和参考文献通过引用并入本文。如这些参考文献中所述，纳米抗体(特别是VHH序列和部分人源化的纳米抗体) 尤其特征在于在一个或多个框架序列中存在一个或多个“标志残基 (Hallmark residue)”。纳米抗体的进一步描述，包括纳米抗体的人源化和/或骆驼化，以及其他修饰、部分或片段、衍生物或“纳米抗体融合体”、多价构建体(包括接头序列的一些非限制性示例)和延长纳米抗体的半衰期的不同修饰，并且它们的制备方法可以可见WO 08/101985和 WO 08/142164。对于纳米抗体的进一步一般性描述，参考本文引用的现有技术，例如在WO 08/020079(第16页)中描述。

具体而言，在本发明的ADAMTS5结合物中存在的框架序列，例如本发明的ISVD和/或多肽，可以包含一个或多个标志残基(例如在WO 08/020079中所述(表A-3至A-8))，使得本发明的ADAMTS5结合物是纳米抗体。通过本文的进一步公开(参见例如表A-2)，这些框架序列(的合适组合)的一些优选但非限制性实例将变得清楚。通常，纳米抗体(特别是V_HH序列和部分人源化的纳米抗体)可以特别地特征在于一个或多个框架序列中存在一个或多个“标签残基”(例如在WO 08/020079，第 61页第24行到第98页第3行中进一步描述)。

更具体而言，本发明提供了ADAMTS5结合物，其包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域，其是具有(一般)结构的氨基酸序列。

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

其中FR1至FR4分别是指框架区1至4，而CDR1至CDR3分别是指互补决定区1至3，并且其：

i)与SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、16、17、10、11、9、5、 4、7、117、8、12、13、14、15或18(参见表A-1)的至少一个氨基酸序列具有至少80％，更优选90％，甚至更优选95％的氨基酸同一性，其中为了确定氨基酸同一性的程度，忽略形成CDR序列的氨基酸残基。在这方面，也参考表A-2，其列出了SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、 16、17、10、11、9、5、4、7、117、8、12、13、14、15或18的免疫球蛋白单可变结构域的框架1序列(SEQ ID NO:72-84)，框架2序列(SEQ ID NO:85-94)，框架3序列(SEQ ID NO:95-113)和框架4序列(SEQ ID NO:114-115)；或

ii)如表A-2所示的框架序列的组合；

并且其中：

iii)优选地，根据Kabat编号，在位置11、37、44、45、47、83、 84、103、104和108的一个或多个氨基酸残基选自WO 08/020079的表 A-3至表A-8中所述的标志残基。

本发明的ADAMTS5结合物，例如本发明的ISVD和/或多肽，还可以包含以下共同未决的美国临时申请中描述的特定突变/氨基酸残基，其全部以“Improved immunoglobulinvariable domains”为标题：2014年5 月16日提交的61/994552；2014年6月18日提交的US61/014,015；2014 年8月21日提交的US 62/040,167；以及2014年9月8日提交的US 62/047,560(均转让给Ablynx N.V.)。

具体而言，本发明的ADAMTS5结合物，例如本发明的ISVD和/ 或多肽，可以适当地包含(i)在位置112的K或Q；或(ii)在位置110 的K或Q与在位置11的V相组合；或(iii)在位置89的T；或(iv) 在位置89的L，以及在位置110的K或Q；或(v)在位置11的V和位置89的L；或者(i)至(v)的任何适当组合。

也如在所述共同未决的美国临时申请中所述，当本发明的 ADAMTS5结合物，例如本发明的ISVD和/或多肽，包含根据上述(i) 至(v)之一的突变时(或适当的组合)：

位置11的氨基酸残基优选地选自L、V或K(最优选地是V)；和/ 或

位置14的氨基酸残基优选地选自A或P；和/或

位置41的氨基酸残基优选地选自A或P；和/或

位置89的氨基酸残基优选地选自T、V或L；和/或

位置108的氨基酸残基优选地选自Q或L；和/或

位置110的氨基酸残基优选地选自T、K或Q；和/或

位置112的氨基酸残基优选地选自S、K或Q。

如在所述共同未决的美国临时申请中所提到的，所述突变在防止或减少所谓的“预先存在的抗体”与本发明的免疫球蛋白和化合物的结合方面是有效的。为此，本发明的ADAMTS5结合物，例如本发明的ISVD 和/或多肽，还可包含(任选地与所述突变组合)C末端延伸(X)n(其中n是1至10，优选地1至5，例如1、2、3、4或5(并且优选地1或 2，例如1)；并且每个X是独立选择的(优选天然存在的)氨基酸残基，并且优选独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L) 或异亮氨酸(I))，参见例如美国临时申请以及WO 12/175741。具体而言，当本发明的ADAMTS5结合物，例如本发明的ISVD和/或多肽形成蛋白质、多肽或包含蛋白质、多肽的其他化合物或构建体的C末端时，可以包含这种C末端延伸(参见例如所述美国临时申请以及WO 12/175741)。

本发明的ADAMTS5结合物可以是以任何合适的方式并且从任何合适的来源衍生的免疫球蛋白，例如免疫球蛋白单可变结构域，并且可以例如是天然存在的V_HH序列(即，来自合适种类的骆驼科动物)或者合成或半合成氨基酸序列，包括但不限于“人源化”(如本文定义)纳米抗体或VHH序列，“骆驼化”(如本文定义)免疫球蛋白序列(尤其是骆驼化重链可变结构域序列)，以及通过例如亲和力成熟(例如从合成的、随机的或天然存在的免疫球蛋白序列开始)、CDR嫁接、贴面、组合来自不同免疫球蛋白序列的片段、使用重叠引物的PCR组装和技术人员熟知的用于工程改造免疫球蛋白序列的相似技术技术；或本文进一步描述的任何前述的任何合适的组合获得的纳米抗体。同样，当免疫球蛋白包含V_HH序列时，如本文进一步所述，所述免疫球蛋白可以被适当地人源化，以提供本发明的一种或多种其他(部分地或完全地)人源化免疫球蛋白。类似地，当免疫球蛋白包含合成的或半合成的序列(例如部分地人源化序列)时，所述免疫球蛋白可以任选地如本文所述再次被进一步合适地人源化，从而再次提供本发明的一个或多个(部分地或全部地) 人源化免疫球蛋白。

“结构域抗体”，也称为“Dab”、“结构域抗体”和“dAb”(术语“结构域抗体”和“dAb”被GlaxoSmithKline集团公司作为商标使用)已在例如 EP 0368684、Ward等人(Nature341：544-546，1989)、Holt等人(Tends in Biotechnology 21：484-490，2003)和WO 03/002609以及例如WO 04/068820、WO 06/030220、WO 06/003388和Domantis Ltd.的其他公开的专利申请中描述。结构域抗体基本上对应于非骆驼类哺乳动物、尤其是人4链抗体的VH或VL结构域。为了将表位作为单个抗原结合结构域进行结合，即，不与VL或VH结构域分别配对，需要对这种抗原结合特性进行特异性选择，例如通过使用人单个VH或VL结构域序列的库。像VHH一样，结构域抗体具有约13至约16kDa的分子量，并且如果衍生自完整的人序列，则不需要人源化以用于例如在人中的治疗用途。

还应当注意，尽管在本发明的上下文中由于它们不是哺乳动物起源而不太优选，但是单可变结构域可以衍生自某些鲨鱼物种(例如所谓的“IgNAR结构域”，参见例如WO 05/18629)。

本发明特别涉及ISVD，其中所述ISVD选自VHH、人源化VHH 和骆驼化VH。

VHH结构域的氨基酸残基根据Kabat等人("Sequence of proteins ofimmunological interest",US Public Health Services,NIH Bethesda,MD,Publication No.91)给出的V_H结构域的通用编号进行编号，应用于来自骆驼科动物的VHH结构域，例如Riechmann和Muyldermans(J. Immunol.Methods 231：25-38，1999)的图2所示，都是本领域已知的。对V_H结构域的氨基酸残基编号的替代方法(该方法也可以以类似的方式应用于VHH结构域)是本领域已知的。但是，在本说明书、权利要求书和附图中，除非另有说明，否则将遵循如上所述的根据Kabat应用于 VHH域的编号。

应当注意的是，(如本领域对于V_H结构域和VHH结构域所众所周知的)，每个CDR中的氨基酸残基总数可以变化并且可以不对应于通过 Kabat编号表示的氨基酸残基总数(即，根据Kabat编号的一个或多个位置可以不在实际序列中，或者实际序列可以包含比Kabat编号所允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，根据Kabat的编号可以对应或可以不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。VH结构域和 VHH结构域中的氨基酸残基总数通常为110至120个，通常为112至115 个。但是，应注意的是，更小和更长的序列也可能适用于本文所述的目的。

关于CDR，如本领域众所周知的，存在多种约定来定义和描述VH 或VHH片段的CDR，例如Kabat定义(其基于序列可变性并且是最常用的)和Chothia定义(基于结构环区域的位置)。例如参考网站 http://www.bioinf.org.uk/abs/。为了本说明书和权利要求书的目的，最优选地基于Abm定义(其基于Oxford Molecular的AbM抗体建模软件) 定义CDR，因为这被认为是Kabat和Chothia定义之间的最佳折衷方案 (请参考http://www.bioinf.org.uk/abs/)。如本文所用，FR1包含在位置 1-25的氨基酸残基，CDR1包含在位置26-35的氨基酸残基，FR2包含在位置36-49的氨基酸，CDR2包含在位置50-58的氨基酸残基，FR3 包含在位置59-94的氨基酸残基，CDR3包含在位置95-102的氨基酸残基，并且FR4包含在位置103-113的氨基酸残基。

在本发明的含义中，术语“免疫球蛋白单可变结构域”或“单可变结构域”包括衍生自非人类来源的多肽，优选地骆驼科动物，优选地骆驼科动物重链抗体。如本文所述，它们可以被人源化。此外，如本文所述，该术语包括衍生自非骆驼科动物来源的多肽，例如小鼠或人类，其已经被“骆驼化”。

因此，可以将诸如域抗体和纳米抗体(包括VHH域)之类的ISVD 进行人源化。具体而言，人源化ISVD，例如纳米抗体(包括VHH结构域)可以是如本文一般定义的ISVD，但是其中存在至少一个氨基酸残基 (特别是在至少一个框架残基中)是和/或对应于人源化取代(如本文所定义)。可以通过将天然存在的V_HH序列的框架区序列与一个或多个紧密相关的人V_H序列的相应框架序列进行比较来确定潜在有用的人源化取代，然后，可以将由此确定的一个或多个潜在有用的人源化取代(或其组合)引入所述V_HH序列中(以本身已知的任何方式，如本文进一步所述)，并且可以测试所得的人源化的V_HH序列与靶标的亲和力、稳定性、表达的容易程度和水平和/或其他所需属性。以此方式，借助于有限程度的试验和试错，本领域技术人员可以基于本文的公开内容确定其他合适的人源化取代(或其合适的组合)。而且，基于前述，ISVD的(框架区)，例如纳米抗体(包括VHH结构域)可以被部分地人源化或完全人源化。

本发明的另一类特别优选的ISVD包括具有与天然存在的V_H结构域的氨基酸序列相对应的氨基酸序列、但是已被“骆驼化”的ISVD，即将来自常规4链抗体的天然存在V_H结构域的氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基取代为重链抗体的V_HH结构域的相应位置的一个或多个氨基酸残基。这可以以本身已知的方式来进行，这对于本领域技术人员而言将是清楚的，例如基于本文的描述。如本文所定义，优选地将这种“骆驼化”取代插入形成和/或存在于V_H-V_L界面和/或于所谓的骆驼科标志残基的氨基酸位置(也参见例如WO 94/04678以及Davies和Riechmann(1994 和1996))。优选地，用作产生或设计骆驼化免疫球蛋白单可变结构域的起始材料或起点的V_H序列优选地是来自哺乳动物的V_H序列，更优选地是人的V_H序列，例如V_H3序列。然而，应注意的是，本发明的这种骆驼化的免疫球蛋白单可变结构域可以以本身已知的任何合适方式获得并因此并不严格限于使用包含天然存在的V_H结构域的多肽作为起始材料获得的多肽。参考Davies和Riechmann(FEBS 339：285-290，1994；Biotechnol.13：475-479，1995；Prot.Eng.9：531-537，1996)以及Riechmann 和Muyldermans(J.Immunol.Methods 231：25-38，1999)

例如再次如本文进一步所述，“人源化”和“骆驼化”都可以通过提供分别编码天然存在的V_HH结构域或V_H结构域的核苷酸序列，然后以本身已知的方式改变所述核苷酸序列中的一个或多个密码子使得新核苷酸序列分别编码本发明的“人源化的”或“骆驼化的”ISVD来进行。然后可以以本身已知的方式表达该核酸，以提供所需的本发明的ISVD。备选地，可以分别基于天然存在的V_HH结构域或V_H结构域的氨基酸序列，分别设计所需的本发明的人源化或骆驼化ISVD的氨基酸序列，然后使用本身已知的肽合成技术从头合成。同样，分别基于天然存在的V_HH结构域或V_H结构域的氨基酸序列或核苷酸序列，可以分别设计编码所需的人源化或骆驼化的本发明的ISVD的核苷酸序列，然后使用本身已知的核酸合成技术从头合成，然后可以以本身已知的方式表达由此获得的核酸，从而提供所需的本发明的ISVD。

ISVD例如结构域抗体和纳米抗体(包括VHH结构域和人源化VHH 结构域)也可以通过在一个或多个CDR的氨基酸序列中引入一个或多个改变来进行亲和力成熟，这种改变可导致与各自的亲本分子相比，所得 ISVD对于其各自抗原的亲和力提高。本发明的亲和力成熟的ISVD分子可以通过本领域已知的方法来制备，例如如Marks等人(Biotechnology 10：779-783，1992)，Barbas等人(Proc.Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813，1994)，Shier等人(Gene 169：147-155，1995)，Yelton等人(Immunol.155： 1994-2004，1995)，Jackson等人(J.Immunol.154：3310-9，1995)，Hawkins 等人(J.Mol.Biol.226：889 896，1992)，Johnson和Hawkins(Affinity maturation of antibodies using phage display,OxfordUniversity Press, 1996)所述。

从诸如V_H、V_L、V_HH、结构域抗体或纳米抗体的ISVD开始，设计/ 选择和/或制备多肽的过程在本文中也被称为“格式化”所述ISVD；并且构成多肽部分的ISVD被称为“被格式化”或以所述多肽的“格式”存在。基于本文的公开，其中ISVD可以被格式化的方式的实例以及这样的格式的实例对于本领域技术人员根据本文公开的内容将是清楚的；并且这种格式化的免疫球蛋白单可变结构域构成了本发明的另一方面。

在表A-2中描述了优选的CDR。

具体而言，本发明涉及如本文所述的ISVD，其中所述特异性结合 ADAMTS5的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中

(i)CDR1选自SEQ ID NO:21、35、20、22、25、33、28、24、 23、26、27、29、30、31、32和34；和

与SEQ ID NO:21、35、20、22、25、33、33、28、24、23、26、27、 29、30、31、32和34具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；

(ii)CDR2选自SEQ ID NO:37、53、36、40、50、51、44、45、 43、39、38、41、119、42、46、47、48、49和52；和

与SEQ ID NO:37、53、36、40、50、51、44、45、43、39、38、41、 119、42、46、47、48、49和52具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；和

(iii)CDR3选自SEQ ID NO:SEQ ID NOs：55、118、71、54、58、 68、69、62、63、61、57、56、59、60、64、65、66、67和70；和

与SEQ ID NO:55、118、71、54、58、68、69、62、63、61、57、 56、59、60、64、65、66、67和70具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列。

具体而言，本发明涉及如本文所述的ISVD，其中所述特异性结合 ADAMTS5的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中

(i)CDR1选自：

(a)SEQ ID NO:22；和

(b)与SEQ ID NO:22具有1、2、3、4、5或6个氨基酸差异的氨基酸序列，其中

-在位置2，S已改变为R；

-在位置3，A已改变为T；

-在位置4，V已改变为F；

-在位置6，V已改变为S；

-在位置7，N已改变为Y；和/或

-在位置10，A已改变为G；

(ii)CDR2是SEQ ID NO:36；和

(iii)CDR3是SEQ ID NO:54。

具体而言，本发明涉及如本文所述的ISVD，其中所述特异性结合 ADAMTS5的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中

(i)CDR1是SEQ ID NO:33；

(ii)CDR2选自：

(c)SEQ ID NO:50；和

(d)与SEQ ID NO:50具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列，其中

-在位置8，M已改变为I；

-在位置9，P已改变为T；和/或

-在位置10，Y已改变为F；和

(iii)CDR3选自：

(e)SEQ ID NO:68；和

(f)与SEQ ID NO:68具有1或2个氨基酸差异的氨基酸序列，

其中

-在位置5，F已改变为L；和/或

-在位置11，D已改变为E。

具体而言，本发明涉及如本文所述的ISVD，其中所述特异性结合ADAMTS5的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中

(i)CDR1是SEQ ID NO:28；

(ii)CDR2选自：

(c)SEQ ID NO:44；和

(d)与SEQ ID NO:44具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列，其中

-在位置3，S已改变为T；

-在位置4，R已改变为W；

-在位置8，T已改变为I；和/或

-在位置9，T已改变为L；和

(iii)CDR3选自：

(e)SEQ ID NO:62；和

(f)与SEQ ID NO:62具有1或2个氨基酸差异的氨基酸序列，

其中

-在位置1，G已改变为S；和/或

-在位置14，D已改变为E。

具体而言，本发明涉及如本文所述的ISVD，其中所述ISVD特异性结合ADAMTS5并且基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3 个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中

-CDR1选自SEQ ID NO:21、35、20、22、25、33、28、24、23、 26、27、29、30、31、32和34；

-CDR2选自SEQ ID NO:37、53、36、40、50、51、44、45、43、 39、38、41、119、42、46、47、48、49和52；和

-CDR3选自SEQ ID NO:55、118、71、54、58、68、69、62、63、 61、57、56、59、60、64、65、66、67和70。

具体而言，本发明涉及如本文所述的ISVD，其中所述ISVD特异性结合ADAMTS5并且基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3 个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中所述ISVD选自ISVD 的组，其中：

CDR1是SEQ ID NO:21，CDR2是SEQ ID NO:37，并且CDR3是 SEQ ID NO:55；

CDR1是SEQ ID NO:35，CDR2是SEQ ID NO:53，并且CDR3是 SEQ ID NO:118；

CDR1是SEQ ID NO:35，CDR2是SEQ ID NO:53，并且CDR3是 SEQ ID NO:71；

CDR1是SEQ ID NO:20，CDR2是SEQ ID NO:36，并且CDR3是 SEQ ID NO:54；

CDR1是SEQ ID NO:22，CDR2是SEQ ID NO:36，并且CDR3是 SEQ ID NO:54；

CDR1是SEQ ID NO:25，CDR2是SEQ ID NO:40，并且CDR3是 SEQ ID NO:58；

CDR1是SEQ ID NO:33，CDR2是SEQ ID NO:50，并且CDR3是 SEQ ID NO:68；

CDR1是SEQ ID NO:33，CDR2是SEQ ID NO:51，并且CDR3是 SEQ ID NO:69；

CDR1是SEQ ID NO:28，CDR2是SEQ ID NO:44，并且CDR3是 SEQ ID NO:62；

CDR1是SEQ ID NO:28，CDR2是SEQ ID NO:45，并且CDR3是 SEQ ID NO:63；

CDR1是SEQ ID NO:28，CDR2是SEQ ID NO:43，并且CDR3是 SEQ ID NO:61；

CDR1是SEQ ID NO:24，CDR2是SEQ ID NO:39，并且CDR3是 SEQ ID NO:57；

CDR1是SEQ ID NO:23，CDR2是SEQ ID NO:38，并且CDR3是 SEQ ID NO:56；

CDR1是SEQ ID NO:26，CDR2是SEQ ID NO:41，并且CDR3是SEQ ID NO:59；

CDR1是SEQ ID NO:27，CDR2是SEQ ID NO:119，并且CDR3 是SEQ ID NO:60；

CDR1是SEQ ID NO:27，CDR2是SEQ ID NO:42，并且CDR3是 SEQ ID NO:60；

CDR1是SEQ ID NO:29，CDR2是SEQ ID NO:46，并且CDR3是 SEQ ID NO:64；

CDR1是SEQ ID NO:30，CDR2是SEQ ID NO:47，并且CDR3是 SEQ ID NO:65；

CDR1是SEQ ID NO:31，CDR2是SEQ ID NO:48，并且CDR3是 SEQ ID NO:66；

CDR1是SEQ ID NO:32，CDR2是SEQ ID NO:49，并且CDR3是 SEQ ID NO:67；和

CDR1是SEQ ID NO:34，CDR2是SEQ ID NO:52，并且CDR3是 SEQ ID NO:70。

在一个特别优选的方面，本发明涉及如本文所述的ISVD，其中所述 ISVD特异性结合ADAMTS5并且基本上由4个构架区(分别是FR1至 FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中CDR1 是或包含SEQ ID NO:21，CDR2是SEQ ID NO:37并且CDR3是SEQ IDNO:55。

具体而言，本发明涉及本文所述的ISVD，其中所述ISVD特异性结合ADAMTS5，并且基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中所述ISVD选自SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、16、17、10、11、9、5、4、7、8、117、12、 13、14、15和18。

应当理解但不限于，本发明的免疫球蛋白单可变结构域可以用作制备多肽的“构件”，所述多肽可以任选地包含一个或多个另外的免疫球蛋白单可变结构域，其可以用作构件(即针对ADAMTS5的相同或另一个表位和/或针对ADAMTS5的一个或多个其他抗原、蛋白质或靶标)。

本发明的多肽(在本文中也称为“纳米抗体构建体”)包含至少一个结合ADAMTS、优选ADAMTS5的ISVD，例如两个结合ADAMTS5 的ISVD，并且优选地还有结合白蛋白的ISVD。在本发明的多肽中，可以直接连接或通过接头连接ISVD。甚至更优选地，本发明的多肽包含C末端延伸。如将在本文中详细描述的，C末端延伸基本上防止/去除了人类受试者/患者的大多数样品中预先存在的抗体/因子的结合。C末端延伸存在于最后一个(位于最C末端)ISVD的最后一个氨基酸残基(通常是丝氨酸残基)的C末端。

如下文进一步详述，ISVD可以衍生自V_HH、V_H或V_L结构域，但是，选择ISVD使得它们在本发明的多肽中不形成V_H和V_L结构域的互补对。纳米抗体、V_HH和人源化的V_HH是不寻常的，因为它们衍生自没有轻链的天然骆驼科动物抗体，并且实际上这些结构域无法与骆驼科动物轻链缔合(associate)以形成互补的V_HH和V_L对。因此，本发明的多肽不包含互补的ISVD和/或形成互补的ISVD对，例如互补的V_H/V_L对。

通常，包含或基本上由单个构件、单个ISVD或单个纳米抗体组成的多肽或构建体在本文中分别称为“单价”多肽和“单价构建体”。包含两个或更多个构件(例如ISVD)的多肽或构建体在本文中也称为“多价”多肽或构建体，并且在这种多肽或构建体中存在的构件/ISVD在本文中也称为处于“多价格式”。例如“二价”多肽可以包含两个ISVD，任选地通过接头序列连接，而“三价”多肽可以包含三个ISVD，任选地通过两个接头序列连接；而“四价”多肽可包含四个ISVD，任选通过三个接头序列连接等。

在多价多肽中，两个或更多个ISVD可以相同或不同，并且可以针对相同的抗原或抗原决定簇(例如针对相同的部分或表位或者针对不同的部分或表位)或者可以备选地针对不同的抗原或抗原决定簇；或者其任何合适的组合。包含至少两个构件(例如ISVD)的多肽和构建体，其中至少一个构件针对第一抗原(即ADAMTS5)，而至少一个构件针对第二抗原(即，与ADAMTS5不同的)也将被称为“多特异性”多肽和构建体，并且在这种多肽和构建体中存在的构件(例如ISVD)在本文中也将被称为“多特异性格式”。因此，例如本发明的“双特异性”多肽是包含至少一个针对第一抗原(即ADAMTS5)的ISVD和至少一个针对第二抗原(即与ADAMTS5不同)的另外ISVD的多肽，而本发明的“三特异性”多肽是包含至少一个针对第一抗原(即ADAMTS5)的ISVD，至少一个针对第二抗原(即与ADAMTS5不同)的另外ISVD的多肽，和至少一个针对第三种抗原的另外ISVD(即与ADAMTS5和第二种抗原不同) 等。

一方面，本发明涉及包含至少2个ISVD的多肽，其中至少1个ISVD 特异性结合ADAMTS，优选地ADAMTS5，更优选地选自SEQ ID NO:2、 116、19、1、3、6、16、17、10、11、9、5、4、7、117、8、12、13、 14、15和18。

一方面，本发明涉及包含至少2个ISVD的多肽，其中所述至少2 个ISVD特异性结合ADAMTS，优选地ADAMTS5，更优选地所述2个 ISVD中的每个ISVD独立地选自SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、16、 17、10、11、9、5、4、7、117、8、12、13、14、15和18。

“多互补位”多肽和“多互补位”构建体(例如“双互补位”多肽或构建体和“三互补位”多肽或构建体)包含或基本上由两个或更多个各自具有不同互补位的构件组成。

因此，结合ADAMTS5的本发明的ISVD可以是基本上分离的形式 (如本文所定义的)，或者它们可以形成构建体或多肽的部分，其可以包含或基本上由结合ADAMTS5的一种或多种ISVD组成并且其可任选地进一步包含一个或多个另外的氨基酸序列(全部任选地经由一个或多个合适的接头连接)。本发明涉及多肽或构建体，其包含或基本由至少一种根据本发明的ISVD，例如结合ADAMTS5的本发明的一种或多种ISVD (或其合适的片段)组成。

如本文所述，本发明的一种或多种ISVD可以用作这种多肽或构建体中的构件，从而分别提供本发明的单价、多价或多互补位多肽或构建体。因此，本发明还涉及多肽，其是包含或基本上由本发明的一个单价多肽或ISVD组成的单价构建体。

因此，本发明还涉及多肽或构建体，其分别是多价多肽或多价构建体，例如包含或基本由两个或更多个本发明的ISVD组成的二价或三价多肽或构建体(对于包含一个或多个VHH结构域的多价和多特异性多肽及其制备，也参考Conrath等人(J.Biol.Chem.276：7346-7350，2001)，以及例如WO 96/34103，WO 99/23221和WO 2010/115998)。

在一个方面，以其最简单的形式，本发明的多价多肽或构建体是本发明的二价多肽或构建体，其包含针对ADAMTS5的第一ISVD(例如纳米抗体)和针对ADAMTS5的相同的第二ISVD(例如纳米抗体)，其中可以任选地通过接头序列(如本文所定义)连接所述第一和第二ISVD (例如纳米抗体)。在另一种形式中，本发明的多价多肽或构建体可以是本发明的三价多肽或构建体，其包含针对ADAMTS5的第一ISVD(例如纳米抗体)，针对ADAMTS5的相同的第二ISVD(例如纳米抗体)，以及针对ADAMTS5的相同的第三ISVD(例如纳米抗体)，其中可以任选地经由一个或多个、特别是两个接头序列连接所述第一、第二和第三 ISVD(例如纳米抗体)。在一方面，本发明涉及包含或基本上由结合 ADAMTS5的至少两个根据本发明的ISVD例如2、3或4个ISVD(或其合适的片段)组成的多肽或构建体。可任选地经由一个或多个肽接头连接两个或更多个ISVD。

在另一方面，本发明的多价多肽或构建体可以是本发明的双特异性多肽或构建体，其包含针对ADAMTS5的第一ISVD(例如纳米抗体) 和针对第二抗原例如聚集蛋白聚糖的第二ISVD(例如纳米抗体)，其中可以任选地通过接头序列连接(如本文所定义)所述第一和第二ISVD (例如纳米抗体)；而本发明的多价多肽或构建体也可以是本发明的三特异性多肽或构建体，其包含针对ADAMTS5的第一ISVD(例如纳米抗体)，针对第二抗原例如聚集蛋白聚糖的第二ISVD(例如纳米抗体)，和针对第三抗原的第三ISVD(例如纳米抗体)，其中可以通过一个或多个、特别是两个接头序列连接所述第一、第二和第三ISVD(例如纳米抗体)。

本发明进一步涉及多价多肽，其包含或(基本上)由结合ADAMTS5、优选地人ADAMTS5的至少一个ISVD(或其合适的片段)和另外一个 ISVD(例如结合聚集蛋白聚糖的ISVD)组成。

根据本发明的特别优选的二价、双特异性多肽或构建体是本文所述的实施例和表A-1中所示的那些(参见SEQ ID NO:120-130(即SEQ ID NO:120、121、122、123、124、125、126、127、128、129和130)，最优选地SEQ ID NO:129和130)。

在一个优选的方面，本发明的多肽或构建体包含或基本上由至少两个ISVD组成，其中所述至少两个ISVD可以相同或不同，但是其中至少一个ISVD针对ADAMTS5，优选地所述结合ADAMTS5的ISVD选自SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、16、17、10、11、9、5、4、7、 117、8、12、13、14、15和18。

存在于本发明的多价多肽或构建物中的两个或更多个ISVD可以由轻链可变结构域序列(例如V_L序列)或重链可变结构域序列(例如V_H序列)组成；它们可以由衍生自常规四链抗体的重链可变结构域序列或衍生自重链抗体的重链可变结构域序列组成。在优选的方面，它们由结构域抗体(或适合用作结构域抗体的氨基酸)，单结构域抗体(或适合用作单一结构域抗体的氨基酸)，“dAb”(或适合用作dAb的氨基酸)，

(包括但不限于V_HH)，人源化的V_HH序列，骆驼化的V_H序列；或通过亲和力成熟获得的V_HH序列组成。两个或更多个免疫球蛋白单可变结构域可以由部分地或完全地人源化的纳米抗体或者部分地或完全地人源化的V_HH组成。

在本发明的一个方面，存在于本发明的多互补位(优选地双互补位或三互补位)多肽或构建体中的第一ISVD和第二ISVD彼此不(交叉) 竞争与ADAMTS5的结合，并且因此属于不同的家族。因此，本发明涉及包含两个或更多个ISVD的多互补位(优选地双互补位)多肽或构建体，其中每个ISVD属于不同的家族。在一个方面，本发明的该多互补位(优选地双互补位)多肽或构建体的第一ISVD不交叉阻断本发明的该多互补位(优选地双互补位)多肽或构建体的第二ISVD与ADAMTS5 的结合，和/或第一ISVD不被第二ISVD交叉阻断与ADAMTS5的结合。在另一方面，本发明的多互补位(优选双互补位)多肽或构建体的第一 ISVD交叉阻断本发明的该多互补位(优选双互补位)多肽或构建体的第二ISVD与ADAMTS5的结合，和/或第一ISVD被第二ISVD交叉阻止与ADAMTS5的结合。

在一个特别优选的方面，本发明的多肽或构建体包含或基本上由三个或更多个ISVD组成，其中至少两个ISVD针对ADAMTS5。应当理解，所述至少两个针对ADAMTS5的ISVD可以相同或不同，可以针对 ADAMTS5的相同表位或不同表位，可以属于相同表位组(bin)或不同表位组，和/或可以结合ADAMTS5的相同或不同结构域。

相对亲和力可以取决于ISVD在多肽中的位置。应当理解，可以根据本领域技术人员的需要选择本发明的多肽中的ISVD的顺序(取向)。各个ISVD的顺序以及多肽是否包含接头都是设计选择的问题。与其他方向相比，具有或不具有接头的某些方向可以提供优选的结合特性。例如本发明的多肽中第一ISVD(例如ISVD 1)和第二ISVD(例如ISVD 2)的顺序可以是(从N末端到C末端)：(i)ISVD 1(例如纳米抗体1) -[接头]-ISVD 2(例如纳米抗体2)-[C末端延伸]；或(ii)ISVD 2(例如纳米抗体2)-[接头]-ISVD 1(例如纳米抗体1)-[C末端延伸]；(其中方括号之间的部分，即接头和C末端延伸部分是可选的)。本发明涵盖所有取向。可以通过常规筛选容易地鉴定包含提供期望的结合特性的ISVD 的取向的多肽，例如在实施例部分中举例说明的。优选的顺序是从N端到C末端：ISVD结合ADAMTS5-[接头]-ISVD结合白蛋白或聚集蛋白聚糖-[C末端延伸]，其中方括号之间的部分是可选的。

在一个方面，本发明涉及包含两个或更多个特异性结合ADAMTS5 的ISVD的多肽，其中

a)至少“第一”ISVD特异性结合ADAMTS5的第一抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象，优选地所述特异性结合ADAMTS5的“第一”ISVD选自SEQ ID NO:2、1、3、6、16、17、10、11、9、5、4、 7、8、117、12、13、14、15和18；和

b)至少“第二”ISVD特异性结合ADAMTS5的第二抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象，分别不同于第一抗原决定簇表位、部分、结构域、亚基或构象，优选地，所述特异性结合ADAMTS5的“第二”ISVD是SEQ ID NO:116或19。

在一个优选的方面，本发明的多肽或构建体包含或基本由结合 ADAMTS5的至少两个ISVD组成，其中所述至少两个ISVD可以相同或不同，其独立地选自SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、16、17、10、 11、9、5、4、7、117、8、12、13、14、15和18。

在另一方面，本发明涉及多互补位(优选地双互补位)多肽或构建体，其包含针对ADAMTS5的两个或更多个ISVD，所述ISVD结合与 SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、16、17、10、11、9、5、4、7、117、 8、12、13、14、15和18中的任何一个结合的相同表位。

在另一方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:1-19(即SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18和19)、116-117或120-130(即SEQ ID NO:120、 121、122、123、124、125、126、127、128、129和130)中的任何一个具有至少80％、90％，95％或100％的序列同一性。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其选自SEQ ID NO:127 (克隆130049-093-Alb)、SEQ ID NO:126(克隆129 2F3-093-Alb)、SEQ ID NO:127(克隆130 049-093-Alb)和SEQ ID NO:128(克隆131 9D3-093-Alb)。

本领域需要更有效的针对影响关节软骨的疾病例如骨关节炎的疗法。特别是当全身施用时，大多数药物的停留时间不足。本发明人假设通过将治疗药物缀合至延长该药物半衰期并因此增加药物的保留时间，但不破坏所述治疗药物的功效的部分，可以显著地提高治疗药物如本发明的构建体、多肽和ISVD的功效。

在本发明的特定方面，与本发明相应的没有赋予增加的半衰期的部分的构建体或多肽相比，本发明的构建体或多肽可具有赋予增加的半衰期的部分。基于本文的进一步公开，本发明的这样的构建体和多肽的一些优选但非限制性的实例对于本领域技术人员将变得清楚，并且例如包含已被化学修饰以增加其半衰期(例如通过聚乙二醇化)的本发明的ISVD或多肽；本发明的ADAMTS5结合物，例如本发明的ISVD和/或多肽，其包含至少一个另外的结合位点以结合血清蛋白(例如血清白蛋白)；或包含至少一个本发明的ISVD的本发明的多肽或多肽，该ISVD 与增加本发明的氨基酸序列的半衰期的至少一个部分(特别是至少一个氨基酸序列)连接。基于本文的进一步公开，包含这样的延长半衰期的部分或ISVD的本发明的构建体例如本发明的多肽的实例对于本领域技术人员将变得清楚；并且例如包括但不限于多肽，其中本发明的一个或多个ISVD与一个或多个血清蛋白或其片段(例如(人)血清白蛋白或其合适的片段)或者与结合血清蛋白的一个或多个结合单元(例如结构域抗体，适合用作域抗体的免疫球蛋白单可变结构域，单结构域抗体，适合用作单域抗体的免疫球蛋白单可变结构域，dAb，适合用作dAb的免疫球蛋白单可变结构，或可与血清蛋白例如血清白蛋白(例如人血清白蛋白)、血清免疫球蛋白(例如IgG)或转铁蛋白结合的纳米抗体；参见本文提及的进一步的说明和参考文献)；其中本发明的氨基酸序列连接至Fc部分(例如人Fc)或者其合适部分或片段的多肽；或多肽，其中本发明的一个或多个免疫球蛋白单可变结构域合适地连接至能够结合血清蛋白的一种或多种小蛋白或肽，例如但不限于WO 91/01743、WO 01/45746、WO 02/076489、WO2008/068280、WO2009/127691和 PCT/EP2011/051559中所述的蛋白和肽。

在一个方面，本发明提供了本发明的构建体或多肽，其中所述构建体或所述多肽还包含血清蛋白结合部分或血清蛋白。优选地，所述血清蛋白结合部分结合血清白蛋白，例如人血清白蛋白。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其包含结合血清白蛋白的ISVD。

一般而言，具有增加的半衰期的本发明的构建体或多肽优选地具有半衰期是本发明相应的构建体或多肽本身(即不具有赋予增加的半衰期的部分)的半衰期的至少1.5倍，优选地至少2倍，例如至少5倍，例如至少10倍或大于20倍。例如具有增加的半衰期的本发明的构建体或多肽可以具有例如在人中的半衰期与本发明的相应的构建体或多肽本身 (即不具有赋予增加的半衰期的部分)相比，增加大于1小时，优选地大于2小时，更优选地大于6小时，例如大于12小时，或甚至大于24、 48或72小时。

在本发明的一个优选但非限制性的方面，本发明的构建体和本发明的多肽具有与本发明的相应的构建体或多肽本身(即不具有赋予增加的半衰期的部分)相比，增加大于1小时、优选地大于2小时、更优选地大于6小时、例如大于12小时或甚至大于24、48或72小时的血清半衰期(例如在人中)。

在本发明的另一个优选但非限制性方面，本发明的这样的构建体，例如本发明的多肽，显示在人中的血清半衰期是至少约12小时，优选地至少24小时，更优选地至少48小时，甚至更优选地至少72小时或更长。例如本发明的构建体或多肽的半衰期可以为至少5天(例如约5至10天)，优选地至少9天(例如约9至14天)，更优选地至少约10天(例如约10 至15天)，或至少约11天(例如约11至16天)，更优选地至少约12天 (例如约12至18天或更多)，或大于14天(例如大约14至19天)。

在本发明的一个特别优选但非限制性的方面，本发明提供了本发明的构建体和本发明的多肽，其包括除了结合ADAMTS5的一个或多个构件之外，还有结合血清白蛋白的至少一个构件，例如结合血清白蛋白例如本文所述的人血清白蛋白的ISVD。优选地，所述结合血清白蛋白的 ISVD包含或基本上由4个构架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中CDR1是SFGMS，CDR2 是SISGSGSDTLYADSVKG并且CDR3是GGSLSR。优选地，所述结合人血清白蛋白的ISVD选自Alb8、Alb23、Alb129、Alb132、Alb11、 Alb11(S112K)-A、Alb82、Alb82-A、Alb82-AA、Alb82-AAA、Alb82-G、 Alb82-GG、Alb82-GGG、Alb92或Alb223(参见表D)。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其包含结合ADAMTS5 的至少一个ISVD和结合血清白蛋白的ISVD，其优选选自SEQ ID NO:129(克隆577 2F3*-Alb)，SEQ IDNO:130(克隆579 2F3*-093-Alb)， SEQ ID NO:120(克隆4 2A12-Alb)，SEQ ID NO:121(克隆5 2D7-Alb)， SEQ ID NO:122(克隆6 2F3-Alb)，SEQ ID NO:123(克隆69 049-Alb)，SEQID NO:124(克隆70 9D3-Alb)，SEQ ID NO:125(克隆71 3B2-Alb)， SEQ ID NO:126(克隆129 2F3-093-Alb)，SEQ ID NO:127(克隆130 049-093-Alb)和SEQ ID NO:128(克隆1319D3-093-Alb)(参见表A-1)。

在一个实施方案中，本发明涉及本发明的构建体，例如包含血清蛋白结合部分的多肽，其中所述血清蛋白结合部分是基于非抗体的多肽。

本领域需要更有效的疗法用于影响关节软骨的疾病，例如骨关节炎。即使当关节内施用时，用于治疗受影响的软骨的大多数药物的停留时间也不足。本发明人假设，可以通过将治疗药物缀合至这样的部分来调控治疗药物例如本发明的构建体、多肽和ISVD的功效，所述部分将药物“锚定”在关节中并因此增加药物的保留，但不应破坏所述治疗药物的功效 (该部分在本文中也表示为“软骨锚定蛋白”或“CAP”)。通过降低毒性和副作用，这种锚定概念不仅可以调控药物的功效，而且可以调控疾病关节的操作特异性，从而扩大了可能的有用药物的数量。

预期用于临床用途的分子形式包括一个或两个构件，例如ISVD，其结合ADAMTS5和一个或多个构件，例如ISVD，具有这种保留作用模式，以及可能的其他部分。在共同未决的申请中，证明了这种格式保留了ADAMTS5结合和治疗作用，如抑制活性，以及保留特性。具有保留作用模式的一个或多个构件，例如ISVD，可以是在其中涉及ADAMTS5 的疾病(如关节炎疾病、骨关节炎、脊椎干骺端发育不良、腰椎间盘退变疾病、退行性关节疾病、类风湿性关节炎、剥离性骨软骨炎、聚集蛋白聚糖病变)中具有保留作用的任何构件(“CAP构件”)。

“CAP构件”用于引导、锚定和/或保留其他构件、例如治疗性构件，例如在所需位点的结合ADAMTS5的ISVD，例如在关节中，其中所述其他构件、例如治疗性构件发挥其作用，例如结合和/或抑制ADAMTS5。

本发明人进一步假设，尽管聚集蛋白聚糖在影响关节软骨的多种疾病中被严重糖基化和降解，但聚集蛋白聚糖结合物、例如结合聚集蛋白聚糖的ISVD可能潜在地起着这样的锚的作用。此外，考虑到药物进入临床之前所需的多种动物模型的成本和广泛测试，这种聚集蛋白聚糖结合物应优选地具有宽的交叉反应性，例如聚集蛋白聚糖结合物应与多种物种的聚集蛋白聚糖结合。

使用多种巧妙的免疫、筛选和表征方法，本发明人能够鉴定具有优异的选择性、稳定性和特异性特征的多种聚集蛋白聚糖结合物，其能够延长在关节中的保留和活性(参见共同未决的申请)。

在一个方面，本发明涉及用于减少和/或抑制组合物、多肽或构建体从关节流出的方法，其中所述方法包括施用药学上有效量的至少一个根据本发明的多肽、根据本发明的构建体或根据本发明的组合物提供给有此需要的人。

在本发明中，术语“减少和/或抑制……流出”是指减少和/或抑制组合物、多肽或构建体从关节内向外流动。优选地，与在相同条件下但不存在本发明的聚集蛋白聚糖结合物例如结合聚集蛋白聚糖的ISVD的情况下前述组合物、多肽或构建体在关节中的流出相比，流出减少和/或抑制至少10％，例如至少20％、30％、40％或50％，或者甚至更多，例如至少60％、70％、80％、90％或甚至100％。

除了其中涉及ADAMTS5的疾病，例如关节炎疾病、骨关节炎、脊椎干骺端发育不良、腰椎间盘退变疾病、退行性关节疾病、类风湿性关节炎、剥离性骨软骨炎和聚集蛋白聚糖病变，预期使用本发明的聚集蛋白聚糖结合物也可以用在影响软骨的多种其他疾病中，例如关节病和软骨营养不良、关节炎疾病(例如骨关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎、银屑病关节炎、外伤性破裂或脱离)、软骨发育不全、肋软骨炎、脊椎干骺端发育不良、椎间盘突出症、腰椎间盘退变疾病、退化性关节疾病和复发性多发性软骨炎(在本文中通常称为“聚集蛋白聚糖相关疾病”)。

所述CAP构件，例如结合聚集蛋白聚糖的ISVD，优选地结合软骨组织，例如软骨和/或半月板。在一个优选的方面，CAP构件对其他物种具有交叉反应性，并特异性结合人或人的聚集蛋白聚糖(SEQ ID NO:155)、狗聚集蛋白聚糖、牛聚集蛋白聚糖、大鼠聚集蛋白聚糖；猪聚集蛋白聚糖；小鼠聚集蛋白聚糖，兔聚集蛋白聚糖；食蟹猴聚集蛋白聚糖和/或恒河猴聚集蛋白聚糖中的一种或多种。聚集蛋白聚糖的相关结构信息可以例如在下面的表2中描绘的(UniProt)登录号中找到。

优选的CAP构件是与结合聚集蛋白聚糖，优选地人聚集蛋白聚糖的 ISVD，其优选地由表B所示的SEQ ID NO:155表示。

表2

名称	登录号
		人聚集蛋白聚糖(SEQ ID NO:155)	P16112
狗聚集蛋白聚糖	Q28343
		牛聚集蛋白聚糖	P13608
大鼠聚集蛋白聚糖	P07897
		猪聚集蛋白聚糖(核心)	Q29011
小鼠聚集蛋白聚糖	Q61282
		兔聚集蛋白聚糖	G1U677-1
食蟹猴聚集蛋白聚糖	XP_002804990.1
		恒河猴聚集蛋白聚糖	XP_002804990.1

因此，本发明涉及根据本发明的多肽或构建体，还包含至少一个CAP 构件。

因此，本发明涉及根据本发明的多肽或构建体，还包含至少一个特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD，优选地选自由SEQ ID NO:156和157 表示的ISVD。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其包含至少2个特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其包含至少2个特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD，其中所述至少2个特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD可以相同或不同。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其包含至少2个特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD，其中所述至少2个特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD独立地选自SEQ ID NO:156-157。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其包含至少2个特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD，其中所述至少2个特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD由SEQ ID NO:156-157表示。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其包含特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD，其中所述特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD特异性结合人聚集蛋白聚糖[SEQ ID NO:155]。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的多肽，其中所述ISVD特异性结合聚集蛋白聚糖，特异性结合人聚集蛋白聚糖(SEQ ID NO:155)，狗聚集蛋白聚糖，牛聚集蛋白聚糖，大鼠聚集蛋白聚糖；猪聚集蛋白聚糖；小鼠聚集蛋白聚糖，兔聚集蛋白聚糖；食蟹猴聚集蛋白聚糖和/或恒河猴聚集蛋白聚糖。

在一个方面，本发明涉及本文所述的多肽，其中所述特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD优选地结合软骨组织，例如软骨和/或半月板。

应当理解，本发明的ISVD、多肽和构建体优选地是稳定的。本发明的多肽、构建体或ISVD的稳定性可以通过本领域技术人员已知的常规测定法来测量。典型的测定法包括(但不限于)这样的测定法，其中测定所述多肽、构建体或ISVD的活性，然后在滑膜液中孵育所需的时间段，然后再次测定活性。

在一个方面，本发明涉及本发明的ISVD、多肽或构建体，其在滑膜液(SF)中在37℃具有至少7天，例如至少14天，21天，1个月，2 个月或甚至3个月的稳定性。

治疗性构件例如本发明的多价多肽或构建体形式的结合ADAMTS5 的ISVD的所需活性可以通过本领域技术人员已知的常规测定法来测量。

在一个方面，本发明涉及如本文所述的构建体，其包含至少一个 ISVD或多肽以及一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元。一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元优选地选自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段、可以结合血清蛋白的结合单元、Fc部分和可以结合血清蛋白的小蛋白或肽、其他氨基酸残基、标签或其他功能部分结合的蛋白，例如毒素、标记物、放射化学物质等。

在一个实施方案中，如下文所述，本发明涉及本发明的构建体，例如包含赋予半衰期延长的部分的多肽，其中所述部分是PEG。因此，本发明还涉及包含PEG的本发明的构建体或多肽。

另外的氨基酸残基可以或可以不改变、更改或以其他方式影响本发明的多肽的其他(生物学)性质，并且可以或可以不向本发明的多肽添加其他功能性。例如这样的氨基酸残基：

a)可以包含N末端Met残基，例如作为在异源宿主细胞或宿主生物中表达的结果。

b)可以形成信号序列或前导序列，其指导合成后从宿主细胞分泌多肽(例如根据用于表达本发明多肽的宿主细胞的不同，提供本发明多肽的前、原或前原形式)。合适的分泌前导肽对本领域技术人员将是清楚的，并且可以如本文进一步描述。通常，这种前导序列将与多肽的N末端连接，但是本发明在最广泛的意义上不限于此。

c)可以形成“标签”，例如允许或促进多肽纯化的氨基酸序列或残基，例如使用针对所述序列或残基的亲和技术。此后，可以除去所述序列或残基(例如通过化学或酶促裂解)以提供多肽(为此目的，标签可以任选地通过可裂解的接头序列或包含可裂解的基序而连接至氨基酸序列或多肽序列)。这种残基的一些优选但非限制性实例是多个组氨酸残基、谷胱甘肽残基和myc标签，例如AAAEQKLISEEDLNGAA；

d)可以是已经被官能化和/或可以用作连接官能团的位点的一个或多个氨基酸残基。合适的氨基酸残基和官能团对本领域技术人员将是清楚的，并且包括但不限于本文中针对本发明的多肽的衍生物提及的氨基酸残基和官能团。

本发明还包括包含本发明的多肽和/或ISVD的构建体，其还包含其他功能性部分，例如毒素、标记物、放射化学物质等。

其他基团、残基、部分或结合单元可以是例如化学基团、残基、部分，其本身可以或可以不具有生物学和/或药理学活性。例如但不限于，这样的基团可与本发明的一个或多个ISVD或多肽连接，以提供本发明的多肽或构建体的“衍生物”。

因此，本发明在其最广泛的意义上还包括其为本发明的构建体和/或多肽的衍生物的构建体和/或多肽。这样的衍生物一般可通过对本发明的构建体和/或多肽和/或形成本发明多肽的一个或多个氨基酸残基的一个或多个氨基酸残基进行修饰，特别是通过化学和/或生物学(例如酶促) 修饰而获得。

这样的修饰的实例，以及可以以这种方式修饰的多肽序列内氨基酸残基的实例(即在蛋白质主链上，但优选地在侧链上)，可用于引入这样的修饰的方法和技术以及这样的修饰的潜在用途和优点对本领域技术人员而言是显而易见的(还参见Zangi等人，NatBiotechnol 31(10)： 898-907，2013)。

例如这样的修饰可涉及将一个或多个(官能)基团、残基或部分(例如通过共价连接或以任何其他合适的方式)引入本发明的多肽中，特别是赋予本发明的构建体和/或多肽一种或多种所需特性或功能的一个或多个官能团、残基或部分。这样的官能团的实例对于本领域技术人员将是清楚的。

例如这种修饰可以包括引入(例如通过共价结合或以任何其他合适的方式)一个或多个功能部分，其增加本发明的构建体或多肽的半衰期、溶解度和/或吸收，降低本发明的构建体或多肽的免疫原性和/或毒性，消除或减弱本发明的构建体或多肽的任何不良副作用，和/或赋予其他有利的特性和/或降低本发明的构建体或多肽的不良性质；或上述两个或更多个的任意组合。这样的功能性部分和用于引入它们的技术的实例对于本领域技术人员将是清楚的，并且一般可以包括上文引用的一般背景技术中提及的所有功能性部分和技术，以及本身已知的用于修饰药物蛋白，特别是用于修饰抗体或抗体片段(包括ScFv和单域抗体)的功能性部分和技术，例如可参考Remington(Pharmaceutical Sciences，16thed.， Mack Publishing Co.，Easton，PA，1980)。这样的功能性部分可以例如直接(例如共价地)连接至本发明的多肽，或任选地通过合适的接头或间隔子连接，这对于本领域技术人员而言也将是清楚的。

一个具体实例是本发明的衍生多肽或构建体，其中本发明的多肽或构建体已被化学修饰以增加其半衰期(例如通过聚乙二醇化)。这是增加药物蛋白的半衰期和/或降低其免疫原性的最广泛使用的技术之一，并且包括附接合适的药理学可接受的聚合物，例如聚(乙二醇)(PEG)或其衍生物(例如甲氧基聚(乙二醇)或mPEG)。一般而言，可以使用任何合适形式的聚乙二醇化，例如本领域中用于抗体和抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv)的聚乙二醇化；参考例如Chapman(Nat. Biotechnol.54：531-545，2002)，Veroneseand Harris(Adv.Drug Deliv. Rev.54：453-456，2003)，Harris和Chess(Nat.Rev.Drug.Discov.2： 214-221，2003)和WO 04/060965。用于蛋白质聚乙二醇化的多种反应剂也是可商购的，例如购自美国的Nektar Therapeutics。

优选地，使用定点聚乙二醇化，特别是通过半胱氨酸残基(参见例如Yang等人，Protein Engineering 16：761-770，2003)。例如为此目的， PEG可以附着至天然存在于本发明的多肽中的半胱氨酸残基，可以修饰本发明的构建体或多肽以适当地引入一个或多个半胱氨酸残基用于PEG 的附接，或者将包含用于PEG附接的一个或多个半胱氨酸残基的氨基酸序列融合到本发明的构建体或多肽的N-和/或C末端，都使用本身是本领域技术人员已知的蛋白质工程改造的技术。

优选地，对于本发明的构建体或多肽，使用分子量大于5000，例如大于10,000并且小于200,000，例如小于100,000，例如在20,000-80,000 范围内的PEG。

另一个通常不太优选的修饰包括N-连接或O-连接的糖基化，通常作为共翻译和/或翻译后修饰的一部分，这取决于用于表达本发明多肽的宿主细胞。

根据本发明的多肽或构建体的预期用途，另一种修饰可以包括引入一个或多个可检测的标记物或其他产生信号的基团或部分。合适的标记物以及用于附接、使用和检测它们的技术对于本领域技术人员将是清楚的，并且例如包括但不限于荧光标记物(例如荧光素、异硫氰酸盐、若丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯甲醛以及荧光胺和荧光金属，例如¹⁵²Eu或镧系元素中的其他金属)，磷光标记物，化学发光标记物或生物发光标记物(例如鲁米诺、异鲁米诺、热吖啶鎓酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖啶鎓盐、草酸酯、二氧杂环丁烷或GFP及其类似物)，放射性同位素(例如³H、¹²⁵I、³²P、³⁵S、¹⁴C、⁵¹Cr、³⁶Cl、⁵⁷Co、⁵⁸Co、⁵⁹Fe和⁷⁵Se)，金属，金属螯合物或金属阳离子(例如金属阳离子，例如^99mTc、¹²³I、¹¹¹In、¹³¹I、⁹⁷Ru、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga和⁶⁸Ga或者其他特别适用于体内、体外或原位诊断和成像的金属或金属阳离子，例如 (¹⁵⁷Gd、⁵⁵Mn、¹⁶²Dy、⁵²Cr和⁵⁶Fe))，以及生色团和酶(例如苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-V-甾族异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸三糖异构酶、生物素抗生物素蛋白过氧化物酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-VI-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶)。其他合适的标记物对于本领域技术人员将是清楚的，并且例如包括可以使用NMR或ESR光谱法检测的部分。

取决于特定标记物的选择，这样标记的本发明的多肽和构建体也可以例如用于体外、体内或原位测定法(包括本身已知的免疫测定法，例如ELISA、RIA、EIA和其他“夹心测定法”等)以及体内诊断和成像的目的。

如本领域技术人员将清楚的，另一种修饰可以包括引入螯合基团，例如以螯合上述金属或金属阳离子中的一种。合适的螯合基团例如包括但不限于二乙撑三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)。

另一修饰可以包括引入功能部分，其是特异性结合对的一部分，例如生物素-(链酶)亲和素结合对。这样的功能部分可用于将本发明的多肽与结合至结合对另一半的另一种蛋白质、多肽或化合物连接，即通过形成结合对进行使用。例如本发明的构建体或多肽可以与生物素缀合，并与与亲和素或链霉亲和素缀合的另一种蛋白质、多肽、化合物或载体连接。例如这样的缀合的本发明的构建体或多肽可以用作报告子，例如在诊断系统中，其中可检测的信号产生剂与亲和素或链霉亲和素缀合。这样的结合对还可例如用于将本发明的构建体或多肽与载体结合，所述载体包括适合于药学目的的载体。一个非限制性实例是由Cao和Suresh (Journal of Drug Targeting 8：257，2000)描述的脂质体制剂。这样的结合对还可用于将治疗活性剂连接至本发明的多肽。

其他潜在的化学和酶修饰对本领域技术人员将是清楚的。也可以出于研究目的(例如研究功能-活动关系)引入这样的修饰。例如参考 Lundblad和Bradshaw(Biotechnol.Appl.Biochem.26：143-151，1997)。

优选地，所述构建体、多肽和/或衍生物使得它们以本文定义的(例如如针对本发明的多肽所定义的)亲和力(适当地测量和/或表达为K_D值(实际或表观)、K_A值(实际或表观)、k_on-速率或缔合速率和/或k_off或解离速率、或备选地以IC₅₀值，如本文进一步描述的)结合ADAMTS5。

本发明的这样的构建体和/或多肽及其衍生物也可以是基本上分离的形式(如本文所定义)。

在一个方面，本发明涉及本发明的构建体，其包含或基本上由根据本发明的ISVD或根据本发明的多肽组成，并且还包含一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元，其任选地通过一个或多个肽接头连接。

在一个方面，本发明涉及本发明的构建体，其中一个或多个其他基团、残基、部分或结合单元选自聚乙二醇分子、血清蛋白或其片段，可以结合血清蛋白的结合单元、Fc部分和可以结合血清蛋白的小蛋白或肽。

在本发明的构建体，例如本发明的多肽中，两个或更多个构件，例如ISVD，和任选的一个或多个其他基团、药物、试剂、残基、部分或结合单元可以彼此直接连接(例如如WO99/23221中所述)和/或可以通过一个或多个合适的间隔子或接头或其任何组合彼此连接。用于多价和多特异性多肽的合适的间隔子或接头对本领域技术人员将是清楚的，并且一般可以是本领域中用于连接氨基酸序列的任何接头或间隔子。优选地，所述接头或间隔子适合用于构建旨在用于药物用途的构建体、蛋白质或多肽。

例如本发明的多肽可以是例如三价、三特异性多肽，包含一个构件，例如结合ADAMTS5的ISVD，结合白蛋白的ISVD，以及潜在地另一个构件，例如第三ISVD，其中所述第一、第二和第三构件，例如ISVD，可以任选地通过一个或多个、并且特别是2个接头序列连接。而且，本发明提供了本发明的构建体或多肽，其包含结合ADAMTS5的第一ISVD 和可能地结合白蛋白的第二ISVD和/或可能地第三ISVD和/或可能地第四ISVD，其中所述第一ISVD和/或所述第二ISVD和/或可能地所述第三ISVD和/或可能地所述第四ISVD经由接头、特别是3个接头连接。

一些特别优选的接头包括本领域中用来连接抗体片段或抗体结构域的接头。这些包括上文引用的一般背景技术中提及的接头，以及例如本领域中用于构建双抗体或ScFv片段的接头(然而，在这方面，应注意，在双抗体和ScFv片段中，所用的接头序列应具有一定长度、一定程度的柔性和其他特性，以使相关的V_H和V_L结构域结合在一起形成完整的抗原结合位点，对在本发明的多肽中使用的接头的长度或柔性没有特殊限制，因为每个ISVD，如纳米抗体，其本身形成完整的抗原结合位点)。

例如接头可以是合适的氨基酸序列，特别是1至50，优选地1至30，例如1至10个氨基酸残基的氨基酸序列。这样的氨基酸序列的一些优选实例包括gly-ser接头，例如(gly_xser_y)₂类型，例如(例如(gly₄ser)₃或 (gly₃ser₂)₃，如WO 99/42077中所述和在本文提及的Ablynx的申请中描述的GS30、GS15、GS9和GS7接头(参见例如WO 06/040153和WO 06/122825)，以及铰链样区域，例如天然存在的重链抗体的铰链区或类似序列(如WO 94/04678中所述)。表C中描述了优选的接头。

一些其他特别优选的接头是聚丙氨酸(例如AAA)，以及接头GS30 (也参见WO 06/122825中的SEQ ID NO:85)和GS9(也参见WO 06/122825中的SEQ ID NO:84)。

其他合适的接头通常包含有机化合物或聚合物，特别是适合用于药学用途的蛋白质的那些。例如聚(乙二醇)部分已用于连接抗体结构域，参见例如WO 04/081026。

在本发明的范围内包括所用接头的长度、柔性的程度和/或其他性质 (尽管不是关键性的，因为通常对于ScFv片段中所用的接头而言)可能对本发明的最终构建体例如本发明的多肽的性质本发明有一定影响，包括但不限于对趋化因子或对一种或多种其他抗原的亲和力、特异性或亲合力。基于本文的公开内容，技术人员将能够任选地在一些有限的常规实验之后，确定用于本发明的特定构建体例如本发明的多肽的最佳接头。

例如在包含针对ADAMTS5和另一个靶标的构件、ISVD或纳米抗体的本发明的多价多肽中，接头的长度和柔性优选地使得其允许在多肽中存在的本发明的每个构件例如ISVD结合其同源靶标，例如每个靶标上的抗原决定簇。同样，基于本文的公开内容，本领域技术人员将能够任选地在一些有限的常规实验之后确定用于本发明的特定构建体例如本发明的多肽的最佳接头。

也在本发明的范围内的是，所使用的接头为本发明的构建体例如本发明的多肽赋予一种或多种其他有利的性质或功能性，和/或为衍生物的形成和/或为官能团的连接提供一个或多个位点(例如如本文针对本发明的ISVD的衍生物所述)。例如含有一个或多个带电荷的氨基酸残基的接头可以提供改善的亲水性，而形成或含有小的表位或标签的接头可以用于检测、鉴定和/或纯化的目的。再者，基于本文的公开内容，本领域技术人员将能够任选地在一些有限的常规实验之后确定用于本发明的特定多肽的最佳接头。

最后，当在本发明的构建体例如多肽中使用两个或更多个接头时，这些接头可以相同或不同。同样，基于本文的公开内容，本领域技术人员将能够任选地在一些有限的常规实验之后确定用于本发明的特定构建体或多肽的最佳接头。

通常，为了易于表达和生产，本发明的构建体，例如本发明的多肽，将是线性多肽。然而，本发明在最广泛的意义上不限于此。例如当本发明的构建体，例如本发明的多肽，包含三个或更多个构件、ISVD或纳米抗体时，可以通过使用具有三个或更多个“臂”的接头将它们连接起来，每个“臂”连接到构件、ISVD或纳米抗体，从而提供“星形”构建体。尽管通常不太优选，但也可以使用环形构建体。

因此，本发明涉及本发明的构建体，例如本发明的多肽，其中所述 ISVD彼此直接连接或通过接头连接。

因此，本发明涉及本发明的构建体，例如本发明的多肽，其中通过接头连接第一ISVD和/或第二ISVD和/或可为结合血清白蛋白的ISVD。

因此，本发明涉及本发明的构建体，例如本发明的多肽，其中所述接头选自3A、5GS、7GS、9GS、10GS、15GS、18GS、20GS、25GS、 30GS、35GS、多聚A、8GS、40GS、G1铰链、9GS-G1铰链、美洲驼的上长铰链区和G3铰链，例如表C中所示(SEQ ID NO:158-174)。

因此，本发明涉及本发明的构建体，例如本发明的多肽，其中所述多肽选自SEQ IDNO:120-130。

本发明进一步涉及用于制备本文所述的构建体、多肽、ISVD、核酸、宿主细胞和组合物的方法。

本发明的多价多肽通常可以通过这样的方法来制备，该方法至少包括以下步骤：将本发明的ISVD和/或单价多肽适当地连接至一个或多个其他ISVD，任选地经由一个或多个合适的接头，以便提供本发明的多价多肽。本发明的多肽还可以通过这样的方法来制备，该方法通常至少包括以下步骤：提供编码本发明多肽的核酸，以合适的方式表达所述核酸，并回收表达的本发明多肽。这样的方法可以以本身已知的方式进行，这对于本领域技术人员来说是清楚的，例如基于本文进一步描述的方法和技术。

制备本发明的多价多肽的方法可以至少包括以下步骤：以合适的方式将两个或更多个本发明的ISVD和例如一个或多个接头连接在一起。本发明的ISVD(和接头)可以通过本领域已知的和本文进一步描述的任何方法缀合。优选的技术包括连接编码本发明的ISVD(和接头)的核酸序列以制备表达多价多肽的遗传构建体。连接氨基酸或核酸的技术对本领域技术人员是清楚的，并且再次参考标准手册，例如上面提到的 Sambrook等人和Ausubel等人，以及下面的实施例。

因此，本发明还涉及本发明的ISVD在制备本发明的多价多肽中的用途。制备多价多肽的方法将包括本发明的ISVD与至少一个本发明的另外的ISVD的连接，任选地经由一个或多个接头。然后，本发明的ISVD 在提供和/或制备包含2个(例如在二价多肽中)，3个(例如三价多肽)， 4个(例如四价)或更多个(例如在多价多肽中)构件的多价多肽中用作结合结构域或构件。在这方面，本发明的ISVD可用作提供和/或制备包含2、3、4或更多个构件的本发明的多价例如二价、三价或四价多肽的结合结构域或结合单元。

因此，本发明还涉及本发明的ISVD多肽(如本文所述)在制备多价多肽中的用途。制备多价多肽的方法将包括本发明的ISVD与至少一个本发明的另外的ISVD的连接，任选地经由一个或多个接头。

本领域技术人员从本文的进一步描述中可以清楚地理解，可以以本身已知的方式制备本发明的多肽和核酸。例如可以以本身已知的任何方式来制备本发明的多肽，以用于制备抗体，特别是用于制备抗体片段(包括但不限于(单)结构域抗体和ScFv片段)。用于制备多肽和核酸的一些优选但非限制性的方法包括本文所述的方法和技术。

用于产生本发明的多肽的方法可以包括以下步骤：在合适的宿主细胞或宿主生物(在本文中也称为“本发明的宿主”)中或在编码所述本发明的多肽的核酸的另一合适的表达系统(在本文中也称为“本发明的核酸”)中表达；任选地，随后分离和/或纯化由此获得的本发明的多肽。

具体而言，这种方法可以包括以下步骤：在使得所述本发明的宿主表达和/或产生至少一个本发明的多肽的条件下培养和/或维持本发明的宿主；任选地，随后分离和/或纯化由此获得的本发明的多肽。

因此，本发明还涉及编码本发明的多肽、ISVD或构建体的核酸或核苷酸序列(也称为“本发明的核酸”)。

本发明的核酸可以是单链或双链DNA或RNA的形式。根据本发明的一个实施方案，本发明的核酸基本上是分离的形式，如本文所定义的。本发明的核酸也可以是载体的形式，存在于载体中和/或作为载体的一部分，载体例如表达载体，例如质粒、粘粒或YAC，它们也可以基本上是分离的形式。因此，本发明还涉及包含本发明的核酸或核苷酸序列的表达载体。

基于本文给出的关于本发明的多肽的信息，可以以本身已知的方式制备或获得本发明的核酸，和/或可以从合适的天然来源分离。同样，如本领域技术人员将清楚的那样，为了制备本发明的核酸，还可以连接几个核苷酸序列，例如至少两个编码本发明的ISVD的核酸和例如编码一个或多个接头的核酸可以以适当的方式连接一起。产生本发明的核酸的技术对于技术人员将是清楚的，并且可以例如包括但不限于自动化DNA 合成；定点诱变；组合两个或更多个天然存在的和/或合成的序列(或者其两个或更多个部分)，引入导致截短的表达产物表达的突变；引入一个或多个限制酶切位点(例如使用合适的限制酶容易产生易被消化和/或连接的盒和/或区域)，和/或通过使用一种或多种“错配”引物的PCR反应引入突变。这些技术和其他技术对于本领域技术人员将是清楚的，并且再次参考标准手册，例如上文提到的Sambrook等人和Ausubel等人，以及下面的实施例。

在优选但非限制性的实施方案中，本发明的遗传构建体包含

a)至少一个本发明的核酸；

b)可操作地连接至一个或多个调控元件，例如启动子和任选地合适的终止子；并且还任选地

c)本身已知的遗传构建体的一个或多个其他元件；

其中术语“调控元件”、“启动子”、“终止子”和“可操作地连接”具有其在本领域中通常的含义。

一般可以通过将本发明的核苷酸序列与上述一个或多个其他元件适当地连接来提供本发明的遗传构建体，例如使用一般手册中描述的技术，例如上文提到的Sambrook等人和Ausubel等人。

本发明的核酸和/或本发明的遗传构建体可用于转化宿主细胞或宿主生物，即用于表达和/或产生本发明的多肽。合适的宿主或宿主细胞对本领域技术人员将是清楚的，并且可以是例如任何合适的真菌、原核或真核细胞或细胞系或者任何合适的真菌、原核或(非人)真核生物以及所有其他宿主细胞或(非人)宿主，它们本身已知用于表达和产生抗体和抗体片段(包括但不限于(单)域抗体和ScFv片段)，这对本领域技术人员来说是清楚的。还参考了上文引用的一般背景技术，以及例如WO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken等人(Res Immunol. 149：589-99，1998)；Riechmann和Muyldermans(1999)，同上；van der Linden(J.Biotechnol.80：261-70，2000)；Joosten等人(Microb.Cell Fact.2：1，2003)；Joosten等人(Appl.Microbiol.Biotechnol.66：384-92，2005)；以及本文引用的其他参考文献。此外，本发明的多肽还可以在无细胞表达系统中表达和/或产生，并且这样的系统的合适实例对本领域技术人员将是清楚的。转化本发明的宿主或宿主细胞的合适技术对本领域技术人员将是清楚的，并且可以取决于预期的宿主细胞/宿主生物和所使用的遗传构建体。再次参考上述手册和专利申请。转化的宿主细胞(可以是稳定的细胞系的形式)或宿主生物(可以是稳定的突变体系或菌株形式)构成了本发明的其他方面。因此，本发明涉及包含根据本发明的核酸或根据本发明的表达载体的宿主或宿主细胞。优选地，这些宿主细胞或宿主生物使得它们表达或(至少)能够表达(例如在合适的条件下) 本发明的多肽(并且在宿主生物的情况下：在至少一个细胞、部分、组织或器官中)。本发明还包括本发明的宿主细胞或宿主生物的另外的世代、子代和/或后代，其可以例如通过细胞分裂或者通过有性或无性繁殖获得。

为了产生/获得本发明的多肽的表达，通常可以在表达/产生本发明的 (期望的)多肽的条件下保持、维持和/或培养转化的宿主细胞或转化的宿主生物。合适的条件对本领域技术人员将是清楚的，并且通常取决于所用的宿主细胞/宿主生物，以及取决于控制本发明(相关)核苷酸序列表达的调控元件。再次，参考以上关于本发明的遗传构建体的段落中提到的手册和专利申请。

然后，可以使用本身已知的蛋白质分离和/或纯化技术，例如(制备) 层析和/或电泳技术、差异沉淀技术、亲和力技术(例如使用与本发明的多肽融合的特异的、可裂解的氨基酸序列)和/或制备性免疫技术(即，使用针对待分离的多肽的抗体)，从宿主细胞/宿主生物和/或从其中培养所述宿主细胞或宿主生物的培养基中分离本发明的多肽。

在一个方面，本发明涉及生产根据本发明的构建体、多肽或ISVD 的方法，其至少包括以下步骤：(a)在合适的宿主细胞或宿主生物或另一合适的表达系统中表达核酸根据本发明的序列；任选地，随后是(b) 分离和/或纯化根据本发明的构建体、多肽ISVD。

在一个方面，本发明涉及包含根据本发明的构建体、多肽、ISVD或核酸的组合物。

如上文所述，仍然存在对安全有效的OA药剂的需要。基于非常规的筛选、表征和组合策略，本发明人鉴定了结合并抑制ADAMTS5的 ISVD。这些ADAMTS5结合物在体外和体内实验中表现出色。此外，还证明了本发明的ISVD比现有技术的化合物明显更有效。因此，本发明提供了拮抗ADAMTS、特别是ADAMTS5的ISVD和多肽，与现有技术的氨基酸序列和抗体相比，具有改善的预防、治疗和/或药理学特性，包括更安全的特性。另外，这些ADAMTS5结合物当与结合白蛋白的 ISVD连接时，在受试者中的保留增加，可以进行全身施用同时保持活性。

在一个方面，本发明涉及治疗或预防个体的疾病或病症的方法，所述疾病或病症例如其中涉及ADAMTS5活性，该方法包括以治疗或预防所述疾病或病症的症状的有效量向所述个体施用根据本发明的ISVD或多肽。

在一个方面，本发明涉及根据本发明的组合物、根据本发明的ISVD、根据本发明的多肽和/或根据本发明的构建体用作药剂。

在另一个方面，本发明涉及本发明的ISVD、多肽和/或构建体在制备用于预防和/或治疗至少ADAMTS5相关疾病的药物组合物中的用途；和/或用于本文提及的一种或多种治疗方法。

本发明还涉及本发明的ISVD、多肽和/或构建体在制备用于预防和/ 或治疗至少一种疾病或病症的药物组合物中的用途，所述疾病或病症可通过调控ADAMTS、优选地ADAMTS5的活性，例如抑制聚集蛋白聚糖降解来预防和/或治疗。

本发明还涉及本发明的ISVD、多肽、化合物和/或构建体在制备用于预防和/或治疗至少一种疾病、病症或病况的药物组合物中的用途，其中可通过向患者施用本发明的ISVD、多肽、化合物和/或构建体来预防和/或治疗所述疾病、病症或病况。

本发明进一步涉及本发明的ISVD、多肽、化合物和/或构建体或者包含其的药物组合物，用于预防和/或治疗至少一种ADAMTS5相关疾病。

预期本发明的ADAMTS5结合物可用于多种影响软骨的疾病，例如关节病和软骨营养不良、关节炎疾病，例如骨关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎、银屑病关节炎、外伤性破裂或脱离、软骨发育不全、肋软骨炎、脊椎干骺端发育不良、椎间盘突出症、腰椎间盘退变疾病、退行性关节疾病和复发性多发性软骨炎、剥离性骨软骨炎和聚集蛋白聚糖病变以及非酒精性脂肪性肝炎(NASH)(在本文中通常称为“ADAMTS5 相关疾病”)

在一个方面，本发明涉及根据本发明的组合物、ISVD、多肽和/或构建体，用于治疗或预防ADAMTS5相关疾病的症状，所述疾病例如是关节病和软骨营养不良、关节炎疾病，例如骨关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎、银屑病关节炎、外伤性破裂或脱离、软骨发育不全、肋软骨炎、脊椎干骺端发育不良、椎间盘突出症、腰椎间盘退变疾病、退行性关节疾病和复发性多发性软骨炎、剥离性骨软骨炎和聚集蛋白聚糖病变以及NASH。

在一个方面，本发明涉及预防或治疗关节病和软骨营养不良、关节炎疾病，例如骨关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎、银屑病关节炎、外伤性破裂或脱离、软骨发育不全、肋软骨炎、脊椎干骺端发育不良、椎间盘突出症、腰椎间盘退变疾病、退行性关节疾病和复发性多发性软骨炎以及NASH的方法，其中所述方法包括(向有此需要的受试者) 施用药物活性量的至少一种本发明的组合物、免疫球蛋白、多肽或构建体给有此需要的人。

在一个方面，本发明涉及根据本发明的ISVD、多肽、组合物或构建体在制备用于治疗或预防例如关节炎和软骨营养不良、关节炎疾病，例如骨关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎、银屑病性关节炎、外伤性破裂或脱离、软骨发育不全、肋软骨炎、脊椎干骺端发育不良、椎间盘突出症、腰椎间盘退变疾病、退行性关节疾病和复发性多发性软骨炎、剥离性骨软骨炎和聚集蛋白聚糖病变以及NASH的药物中的用途。

还期望通过结合聚集蛋白聚糖，本发明的构建体和/或多肽可以降低或抑制丝氨酸蛋白酶家族的成员、组织蛋白酶、基质金属蛋白酶(MMP) 例如MMP20，以及在降解聚集蛋白聚糖中的ADAMTS4(聚集蛋白聚糖酶-1)和/或ADAMTS11的活性。

在本发明的上下文中，术语“预防和/或治疗”不仅包括预防和/或治疗疾病，而且通常还包括预防疾病的发作，减慢或逆转疾病的进展，预防或减慢与疾病有关的一种或多种症状的发作，减轻和/或缓解与疾病有关的一种或多种症状，减少疾病和/或与疾病有关的任何症状的严重性和/ 或持续时间和/或预防疾病和/或与此相关的任何症状的严重程度进一步增加，预防、减少或逆转由疾病引起的任何生理损害，以及一般有益于在治疗患者的任何药理作用。

将由主治医师和临床因素决定给药方案。如医学领域众所周知的，任何一位患者的剂量取决于许多因素，包括患者的身材、体重、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、所用多肽(包括抗体)的活性、施用的时间和途径、一般健康状况以及与其他疗法或疗法的组合。蛋白质性药物活性物质的存在量为每剂量1g至100mg/kg体重；然而，也可以设想低于或高于该示例性范围的剂量。如果该方案是连续输注，则其范围可能是每分钟每千克体重1pg至100mg。

本发明的ISVD、多肽或构建体可以以例如0.01、0.1、0.5、1、2、5、 10、20或50pg/ml的浓度使用，以抑制和/或中和ADAMTS5的生物学功能的至少约50％，优选地75％，更优选地90％，95％或至多99％，和最优选地约100％(基本上完全)，如通过本领域众所周知的方法测定的。

一般而言，治疗方案将包括以一个或多个药学有效量或剂量施用一个或多个本发明的ISVD、多肽和/或构建体，或者包含其的一个或多个组合物。再次基于上述因素，临床医生可以确定待施用的具体量或剂量。本发明的构建体、多肽和/或ISVD的有用剂量可以通过在动物模型中比较它们的体外活性和体内活性来测定。将在小鼠和其他动物中的有效剂量向人外推的方法是本领域已知的；例如参见US 4,938,949。

一般而言，取决于待治疗的特定疾病、病症或病况，所使用的本发明的特定ISVD、多肽和/或构建体的效力，特定的施用途径和所使用的特定药物制剂或组合物，临床医生将能够确定合适的给药方案。

用于治疗所需的本发明的构建体、多肽和/或ISVD的量不仅会随所选择的特定免疫球蛋白、多肽、化合物和/或构建体而变化，而且还会随施用途径、在治疗病症的性质以及患者的年龄和状况而变化，并且最终将由主治医师或临床医生决定。同样，本发明的构建体、多肽和/或ISVD 的剂量根据靶细胞、肿瘤、组织、移植物或器官而变化。

所需剂量可以方便地以单剂量或以适当间隔施用的分剂量，例如每天两次、三次、四个或更多次亚剂量。所述亚剂量本身可以进一步分为例如多个离散的松散间隔施用。

施用方案可包括长期的每日治疗。“长期”是指至少持续两周，并且优选地持续数周、数月或数年。本领域普通技术人员可以仅使用本文教导的常规实验来确定该剂量范围内的必要修饰。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(Martin,E.W.,ed.4),MackPublishing Co., Easton,PA.。在发生任何并发症的情况下，剂量也可以由个别医生进行调整。

通常，在以上方法中，将使用本发明的ISVD、多肽和/或构建体。然而，组合使用两个或更多个本发明的ISVD、多肽和/或构建体也在本发明的范围内。

本发明的ISVD、多肽和/或构建体可以与一个或多个其他药物活性化合物或成分(principle)组合使用，即，作为组合治疗方案，这可以产生或不产生协同作用。

所述药物组合物还可包含至少一种其他活性剂，例如一种或多种其他抗体或其抗原结合片段、肽、蛋白质、核酸、有机和无机分子。

再者，临床医生将能够根据上述因素及其专家判断，选择这样的其他化合物或成分，以及合适的组合治疗方案。

具体而言，本发明的ISVD、多肽和/或构建体可以与其他药物活性化合物或成分组合使用，所述化合物或成分是或可以用于预防和/或治疗本文所引用的疾病、病症和病况，其结果是可以获得或不会获得协同效果。这样的化合物和成分的实例，以及施用它们的途径、方法和药物制剂或组合物对于临床医生将是清楚的。

当将两种或多种物质或成分用作组合治疗方案的一部分时，可以在基本上相同的时间或不同的时间(例如基本上同时、连续地或根据交替方案)，通过相同的施用途径或通过不同的施用途径施用它们。当通过相同的施用途径同时施用物质或成分时，它们可以作为不同的药物制剂或组合物或者组合的药物制剂或组合物的一部分来施用，这对于本领域技术人员将是清楚的。

同样，当两种或更多种活性物质或成分用作组合治疗方案的一部分时，每种物质或成分可以以与当单独使用化合物或成分时使用的相同量和根据相同的方案使用，并且这种组合使用可以产生或不产生协同效应。然而，当两种或更多种活性物质或成分的组合使用产生协同作用时，也可能减少一种、多种或所有待施用的物质或成分的量，同时仍实现所需的治疗效果。这例如可以用于避免、限制或减少与一种或多种物质或成分以其通常量使用时的使用相关的任何不良副作用，同时仍获得所需的药物或治疗效果。

可以以针对所涉及的疾病、病症或病况本身已知的方式来确定和/或跟踪根据本发明使用的治疗方案的有效性，这对于临床医生将是清楚的。在适当的情况下，临床医生还将能够根据具体情况改变或修改特定的治疗方案，以达到所需的治疗效果，避免、限制或减少不良的副作用，和/ 或在一方面达到所需的治疗效果与另一方面避免、限制或减少不良副作用之间取得适当的平衡。

一般而言，将遵循治疗方案直到达到期望的治疗效果和/或只要保持期望的治疗效果。再者，这可以由临床医生确定。

因此，在另一个方面，本发明涉及药物组合物，其包含至少一个本发明的构建体，至少一个本发明的多肽，至少一个本发明的ISVD或至少一个本发明的核酸和至少一个合适的载体、稀释剂或赋形剂(即，适合于药物用途)，以及任选地一个或多个其他活性物质。在一个特定的方面，本发明涉及药物组合物，其包含根据本发明的构建体、多肽、ISVD 或核酸，优选地SEQ ID NO:OOO中的至少一个和至少一个合适的载体、稀释剂或赋形剂(即，适合于药物用途)，以及可选的一个或多个其他活性物质。

待治疗的受试者可以是任何温血动物，但特别是哺乳动物，更特别是人类。在兽医应用中，待治疗的受试者包括为商业目的饲养或作为宠物饲养的任何动物。对本领域技术人员清楚的是，待治疗的受试者将特别是罹患本文所述的疾病、病症和病况或处于本文所述的疾病、病症和病况风险中的人。因此，在本发明的优选实施方案中，包含本发明的多肽的药物组合物用于医学或诊断学。优选地，药物组合物用于人类医学，但是它们也可以用于兽医目的。

再者，在这样的药物组合物中，本发明的一种或多种免疫球蛋白、多肽、化合物和/或构建体，或编码它们的核苷酸，和/或包含它们的药物组合物也可以适当地与一个或多个活性成分组合，例如本文提到的那些。

本发明还涉及用于体外(例如在体外或细胞测定法中)或体内(例如在单细胞中或多细胞生物，尤其是在哺乳动物中，并且更特别是在人类中，例如在处于本发明的疾病、病症或病况的风险中或罹患本发明的疾病、病症或病况的人中)使用的组合物(例如但不限于本文进一步描述的药物组合物或制剂)。

应当理解，除非另外明确指出，否则对治疗的提及既包括对已产生症状的治疗也包括预防性治疗。

对于药物用途，一般可以将本发明的构建体、多肽和/或ISVD配制成包含至少一个本发明的构建体、多肽和/或ISVD和至少一个药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂以及任选地一个或多个药物活性多肽和/或化合物的药物制备物或组合物。通过非限制性实例，这样的制剂可以是适合于经口施用，肠胃外施用(例如通过静脉内、肌肉内或皮下注射或静脉内输注)，局部施用，通过吸入施用，通过皮肤贴剂，通过植入物，通过栓剂等的形式，其中肠胃外施用是优选的。这样的合适的施用形式(可以是固体、半固体或液体，取决于施用方式)以及用于制备其的方法和载体对于本领域技术人员将是清楚的，并且在本文中进一步描述。这样的药物制剂或组合物在本文中通常被称为“药物组合物”。

作为示例性的赋形剂，可以提及崩解剂、粘合剂、填充剂和润滑剂。崩解剂的实例包括琼脂、藻酸盐、碳酸钙、纤维素、胶体二氧化硅、树胶、硅酸铝镁、甲基纤维素和淀粉。粘合剂的实例包括微晶纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。填充剂的实例包括碳酸钙、磷酸钙、三碱式硫酸钙、羧甲基纤维素钙、纤维素、糊精、右旋糖、果糖、乳糖醇、乳糖、碳酸镁、氧化镁、麦芽糖醇、麦芽糖糊精、麦芽糖、山梨糖醇、淀粉、蔗糖、糖和木糖醇。润滑剂的实例包括琼脂、油酸乙酯、月桂酸乙酯、甘油、棕榈硬脂酸甘油酯、氢化植物油、氧化镁、硬脂酸酯、甘露醇、泊洛沙姆、乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠、硬脂酸钠、山梨糖醇和滑石粉。通常的稳定剂、防腐剂、湿润和乳化剂、稠度改善剂、风味改善剂、用于改变渗透压的盐、缓冲物质、增溶剂、稀释剂、润肤剂、着色剂和掩蔽剂以及抗氧化剂均考虑作为药物佐剂。

合适的载体包括但不限于碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂、水、醇类、多元醇、甘油、植物油等。

一般而言，本发明的构建体、多肽和/或ISVD可以以本身已知的任何合适方式配制和施用。例如参考以上引用的一般背景技术(并且尤其是参考WO 04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、WO 04/041867 和WO 08/020079)以及标准手册，如Remington’sPharmaceutical Sciences,18^th Ed.,Mack Publishing Company,USA(1990),Remington,the Science and Practice of Pharmacy,21st Edition,Lippincott Williams andWilkins(2005)；或the Handbook of Therapeutic Antibodies(S.Dubel, Ed.),Wiley,Weinheim,2007(参见例如第252-255页)。

在一个特定的方面，本发明涉及药物组合物，其包含根据本发明的构建体、多肽、ISVD或核酸，并且还包含至少一个药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和/或佐剂，并且任选地包含一个或多个其他药物活性多肽和/或化合物。

本发明的构建体、多肽和/或ISVD可以以用于常规抗体和抗体片段 (包括ScFv和双抗体)和其他药物活性蛋白的本身已知的任何已知方式配制和施用。这样的制剂和制备它们的方法对于本领域技术人员将是清楚的，并且例如包括优选适于肠胃外施用的制备物(例如静脉内，腹膜内，皮下，肌内，腔内，动脉内，鞘内鼻内或支气管内施用)，但是也用于局部(即透皮或皮内)施用。

肠胃外施用的制剂可以是例如适于输注或注射的无菌溶液、悬浮液、分散液或乳剂。用于这种制备物的合适的载体或稀释剂例如包括但不限于WO 08/020079的第143页提到的那些。通常，水溶液或悬浮液将是优选的。

本发明的构建体、多肽和/或ISVD也可以使用基因治疗中已知的递送方法进行施用，参见例如美国专利号5,399,346，其基因治疗递送方法通过引用并入本文。使用递送的基因疗法方法，用编码本发明的构建体、多肽和/或ISVD的基因转染的原代细胞可以另外用组织特异性启动子转染以靶向特定的器官、组织、移植物、肿瘤或细胞，并且还可以用信号和稳定化序列转染用于亚细胞局部表达。

根据本发明的其他方面，本发明的多肽可以用于体内和体外的其他应用。例如可以将本发明的多肽用于诊断目的，例如在设计为检测和/或定量ADAMTS5的存在和/或纯化ADAMTS5的测定法中。也可以在特定疾病的动物模型中测试多肽，并进行毒理学、安全性和剂量研究。

最后，本发明涉及试剂盒，其包括至少一个根据本发明的多肽，至少一个编码所述组分的核酸序列，本发明的载体或载体系统和/或根据本发明的宿主细胞。可以设想，试剂盒可以以不同的形式提供，例如作为诊断试剂盒。

现在将通过以下非限制性的优选方面、实施例和附图进一步描述本发明。

在本申请全文中引用的所有参考文献(包括文献参考文献、授权专利、公开的专利申请和共同未决的专利申请)的全部内容在此明确地通过引用并入，特别是对于上文所引用的教导。

根据WIPO标准ST.25，在说明书的主体和单独的序列表中公开了序列。在说明书的主体和单独的序列表中，使用特定编号指定的SEQ ID 应相同。通过示例的方式，SEQ IDNo.:1应当在说明书的主体和单独的序列表中定义相同的序列。说明书主体中的序列定义与单独的序列表之间存在差异(例如说明书主体中的SEQ ID no.:1错误地对应于单独的序列表中的SEQ ID no.:2)，则对本申请中特定序列的引用，尤其是对特定实施方案中的引用，应理解为对本申请主体中序列的引用，而不是对单独的序列表的引用。换言之，说明书的主体与单独的序列表中的序列定义/名称之间的差异应通过将单独的序列表校正为在本申请的主体中公开的序列及其名称来解决，本申请的主体包括包括说明书、实施例、附图和权利要求书。

实施例

实施例1从不同物种产生重组ADAMTS5蛋白

使用

HD转染反应剂(Promega)通过HEK293Flp-In^TM表达系统内部产生了多种格式的牛、大鼠、豚鼠、小鼠和食蟹猴重组 ADAMTS5蛋白。转染后两天，将含有100μg/ml潮霉素B的选择培养基添加到细胞中，以选择稳定表达的细胞。

扩增稳定表达的细胞。每天从细胞中收集含有分泌的ADAMTS5的条件培养基，通过HisTrap色谱法纯化，然后在50mM Hepes缓冲液pH 7.5中进行缓冲液交换。通过SDS-PAGE确认蛋白质的纯度。

实施例2用ADAMTS5蛋白对美洲驼的免疫，仅重链抗体片段库的克隆和噬菌体的制备

2.1免疫

经兽医学院伦理委员会(University Ghent，Belgium)批准后，用重组人ADAMTS5蛋白(R&D Systems,Minneapolis,US；目录号 2198-AD)免疫了3只美洲驼。

2.2仅重链抗体片段库的克隆和噬菌体的制备

最后一次免疫原注射后，收集血液样品。根据制造商的说明 (AmershamBiosciences,Piscataway,NJ,US)，使用Ficoll-Hypaque从这些血液样本中制备外周血单核细胞(PBMC)。基本上如WO 05/044858 中所述，从PBMC中提取总RNA，并将其用作RT-PCR的起始材料以扩增VHH/纳米抗体编码DNA片段。随后，根据标准方案(例如参见本文引用的由Ablynx N.V.提交的现有技术和申请)制备噬菌体，并在过滤器灭菌后于4℃保存以备进一步使用。

实施例3通过噬菌体展示选择人ADAMTS5特异性VHH

从所有美洲驼中获得并克隆在噬菌体文库中的VHH库用于选择人 ADAMTS5结合纳米抗体。将重组人ADAMTS5蛋白(R&D Systems, Minneapolis,US；目录号2198-AD)挨着0μg/ml抗原的阴性对照以5 μg/ml固定在Maxisorp平板(Nunc,Wiesbaden,Germany)上。与噬菌体文库一起温育并充分洗涤后，用胰蛋白酶(1mg/mL)洗脱结合的噬菌体，并用于感染大肠杆菌细胞。感染的大肠杆菌细胞可用于制备噬菌体用于下一轮筛选或铺在琼脂平板上进行分析。此外，在三个连续的选择轮中使用了合成文库。

针对富集因子分析所有选择轮的输出，富集因子是相对于对照在洗脱液中存在的噬菌体的数量。选择最佳选择条件进行进一步分析。

为了筛选特定结合物的选择输出，从琼脂平板中挑选单个菌落，并使其在1mL 96孔深孔平板中生长。通过添加IPTG诱导LacZ控制的 VHH表达。根据标准方案制备周质提取物(例如参见本文引用的由 Ablynx N.V.提交的现有技术和申请)。

实施例4针对功能阻断纳米抗体筛选周质提取物

第一步，通过结合ELISA测试周质提取物与重组人ADAMTS5的结合。简而言之，将浓度为1μg/ml的重组人ADAMTS5(R&D Systems, Minneapolis,US；目录号2198-AD)包被在384孔MaxiSorp平板(Nunc, Wiesbaden,Germany)上。用酪蛋白溶液(1％)封闭孔。加入周质提取物的10倍稀释液后，使用小鼠抗Flag-HRP缀合物(Sigma,St.Louis,US) 检测纳米抗体结合，并且在底物esTMB存在下(3,3',5,5'-四甲基联苯胺) (SDT,Brussels,Belgium)进行随后的酶促反应。显示ELISA信号高于无关纳米抗体对照的平均信号之和并且是无关纳米抗体对照的标准偏差的3倍的克隆被认为是编码阳性的人ADAMTS5结合纳米抗体。

为了鉴定能够防止ADAMTS5介导的聚集蛋白聚糖裂解的纳米抗体，在基于FRET的人ADAMTS5酶促测定法中测试了克隆，使用50mM HEPES(pH 7.5)、100mM NaCl、5mM CaCl₂*2H₂O、0.1％CHAPS、 5％甘油作为测定缓冲液。简而言之，将含有ADAMTS5结合纳米抗体的周质提取物在384孔OptiPlate(PerkinElmer，Waltham，MA，US) 中与10μl的25μM淬灭的荧光人肽底物(Abz-TEGEARGSVI-Dap (Dnp)-KK-NH2，Anaspec，Serain Belgium，目录号60431-1)和10μl 的25nM的人ADAMTS5(R&D Systems,Minneapolis,US；目录号 2198-AD)一起孵育。在Tecan Infinite M1000读板器上每分钟监测纳米抗体防止ADAMTS5介导的裂解的能力，持续2小时。用Graphpad Prism 软件分析数据。从酶进程曲线，测定阴性对照的初始速度(v₀)，以及平板中每个纳米抗体克隆的速度(v_i)和背景信号(S_b)。使用公式 100*(1-*v_i-S_b)/(v₀-S_b))，计算抑制百分率。

包含无关纳米抗体的周质提取物用作阴性对照。包含ADAMTS5纳米抗体的周质提取物被认为是抑制性纳米抗体，所述ADAMTS5纳米抗体相对于阴性对照的信号能够将荧光信号降低超过50％。随后确定阳性克隆的DNA序列。

表4.1给出了周质提取物筛选数据的总结。抗ADAMTS5纳米抗体的氨基酸序列示于表A-1。

表4.1含有抗ADAMTS5纳米抗体的周质提取物的筛选结果

克隆和测序后，鉴定了多个家族，这些家族由CDR中有差异但显示相似结合和抑制特性的克隆组成。

克隆和测序后，纳米抗体02A12被鉴定为克隆09D03的家族成员(参见表A-1和A-2)。CDR区的序列变异性描述于下表4.1A、4.1B和4.1C 中。将克隆09D03的CDR的氨基酸序列用作参考，与之比较家族成员的CDR(CDR1开始于Kabat位置26，CDR1开始于Kabat位置50，CDR3开始于Kabat位置95)。

表4.1A(09D03 CDR1)

*在一个克隆中多至6个CDR1突变(SEQ ID NO:22)

表4.1B(09D03 CDR21)

*在一个克隆中多至0个CDR2突变(SEQ ID NO:36)

表4.1C(09D03 CDR3)

*在一个克隆中多至0个CDR突变(SEQ ID NO:54)

克隆和测序后，克隆09A05被鉴定为克隆03B02的家族成员(参见表A-1和A-2)。CDR区的序列变异性描述于下表4.1D、4.1E和4.1F中。将克隆03B02的CDR的氨基酸序列用作参考，与之比较家族成员的CDR (CDR1开始于Kabat位置26，CDR1开始于Kabat位置50，CDR3开始于Kabat位置95)。

表4.1D(03B02 CDR1)

*在一个克隆中多至0个CDR1突变(SEQ ID NO:33)

表4.1E(03B02 CDR2)

*在一个克隆中多至3个CDR2突变(SEQ ID NO:50)

表4.1F(03B02 CDR3)

*在一个克隆中多至2个CDR突变(SEQ ID NO:68)

克隆和测序后，克隆03D02和02C10被鉴定为克隆03B01的家族成员(参见表A-1和A-2)。CDR区的序列变异性描述于下表4.1G、4.1H 和4.1I中。将克隆03D02的CDR的氨基酸序列用作参考，与之比较家族成员的CDR(CDR1开始于Kabat位置26，CDR1开始于Kabat位置50，CDR3开始于Kabat位置95)。

表4.1G(03D01 CDR1)

*在一个克隆中多至0个CDR1突变(SEQ ID NO:28)

表4.1H(03D01 CDR2)

*在一个克隆中多至3个CDR2突变(SEQ ID NO:44)

表4.1I(03D01 CDR3)

*在一个克隆中多至1个CDR突变(SEQ ID NO:62)

以上结果表明，允许一些氨基酸变化，同时保留结合和抑制特性。值得注意的是，与ADAMTS5的结合不是用于抑制ADAMTS5活性的预测因子。例如克隆3F04是有效的结合物，但是弱抑制剂。

实施例5纯化的单价ADAMTS5纳米抗体的表征

进一步表征了选自实施例4中所述的筛选的克隆。在大肠杆菌 (TG-1)中转化选择的纳米抗体后，通过添加1mM IPTG诱导表达，并在37℃继续4小时。将细胞培养物旋转离心后，通过将沉淀颗粒冻融然后离心来制备周质提取物。然后将这些提取物用作起始材料，用于通过IMAC在HisTrap FF粗1ml色谱柱(GE Healthcare， Buckinghamshire，UnitedKingdom)然后通过Zeba离心柱(Pierce， Rockford，IL，USA)的脱盐而进行纯化，得到通过SDS-PAGE评估的至少95％纯度。

5.1在酶促ADAMTS5测定法中评估ADAMTS5阻断纳米抗体

基本上如实施例4中所述，在基于FRET的酶测定法中证实了纳米抗体防止ADAMTS5介导的聚集蛋白聚糖裂解的能力。数据用Graphpad Prism软件进行分析。从酶进程曲线，测定初始速度(v_i)并将这些值绘制为抑制剂浓度的函数并计算IC₅₀值。本质上，用纯化的纳米抗体进行的人FRET测定法证实了实施例4中用周质提取物描述的结果。IC₅₀的范围在1.8E-09M至3.7E-08M。值得注意的是，尽管常规mAb 12F4的 IC₅₀为1.0E-09M，比单价纳米抗体更好，但所有纳米抗体均显示出更好的功效(数据未显示)。

在基于FRET的测定法之后，进行以生物素化的43聚体的聚集蛋白聚糖寡肽为底物的基于AlphaLISA(Perkin Elmer，Waltham，MA， US)的人ADAMTS5测定法。该底物的ADAMTS5裂解后，释放出生物素化的ARGSV新表位产物，其可以通过链霉亲和素-AlphaScreen供体珠和捕获在抗小鼠IgG包被的AlphaLISA受体珠上的抗新表位 (“ARGSV”)抗体检测到，导致在激光激发时产生发光的AlphaScreen 信号。

为了确定纳米抗体的抑制潜能，将纯化的纳米抗体的系列稀释液(与阳性对照和阴性无关纳米抗体对照一起)与人ADAMTS5(R&D Systems, Minneapolis,US；目录号2198-AD)一起在室温在384孔Optiplate (Perkin Elmer,Waltham,MA,US)中孵育15分钟。加入生物素化的 43聚体的聚集蛋白聚糖寡肽底物(Biosyntan,Berlin,Germany)并在37℃孵育3小时后，终止反应。第一检测步骤是通过添加5μl包含针对新表位“ARGSV”的聚集蛋白聚糖抗体、小鼠BC3 mAb(MDBioproducts， Egg，Switzerland)和链霉亲和素AlphaScreen供体珠(Perkin Elmer) 的检测溶液1来进行。在室温孵育1小时后，添加5μl包含抗小鼠AlphaLISA受体珠(Perkin Elmer)的第二检测溶液。将平板在黑暗中在室温孵育2小时。通过在Envision Multi label读板器(Perkin Elmer, Waltham,MA,US)上读板来进行测量。

为了确定纳米抗体防止ADAMTS5介导的底物裂解的能力，分析了信号的降低，以纳米抗体浓度为函数，并计算了IC₅₀值。

结果总结在表5.1中。

表5.1在人AlphaLISA酶法测定法中纳米抗体和参考化合物对ADAMTS5的效力(IC₅₀)和抑制％。

在AlphaLISA测定法中，至少三个单价纳米抗体(2F03、11B06和 9D03)显示出与常规mAb 12F4相似的IC₅₀值，而其余具有更高的值。但是，所有纳米抗体均显示出近100％抑制。值得注意的是，IC₅₀值高于 mAb 12F04至少100倍的纳米抗体3B03仍具有100％抑制。

5.2在牛外植体测定法中评估ADAMTS5阻断纳米抗体

在离体测定法中评估纳米抗体阻断软骨降解的能力，其中与生化测定法相比，底物处于更接近生理条件的条件下，进行牛外植体测定法。简言之，从牛膝关节新鲜地制备牛软骨外植体片(直径4mm)，并在存在IL-1α的96孔板中孵育以诱导软骨降解。作为软骨/聚集蛋白聚糖降解的测量，通过异染性染料1,9二甲基亚甲基蓝(在633nm处发射)在孵育(37℃，7.5％CO₂)5天后，在上清液检测到GAG的释放。硫酸软骨素作为测定标准品包括在内。通过没有化合物(0％)和存在 MSC2310852A(100％作用)的IL-1α诱导的对照来定义功效。

结果总结在表5.2中。

表5.2牛外植体测定法中单价纳米抗体的IC₅₀值。

ID	IC50[M]	实验ID*
			mAb 12F4 H4L0	3.2E-06	exp A
2F03	1.4E-08	exp A
			11B06	4.80E-08	exp C
9D03	5.9E-08/2.7E-07	exp G/exp F
			2A12	2.40E-08	exp C
02D07	3.30E-08	exp C
			3D02	8.80E-07	exp F
3B02	1.40E-07	exp D
			9A05	5.10E-07	exp F
3D01	2.2E-08/1.3E-07	exp D/exp G
			2D12	8.00E-07	exp D
2A02	2.40E-06	exp D

*结果只能在具有相同的实验ID的使用相同外植体的1个测定法中比较。

5.3表位鉴定(binning)

在Biacore T100仪器上进行了基于SPR的“夹心测定法”，将 ADAMTS5纳米抗体分类为不同的表位组。为此，使用EDC和NHS化学方法通过胺偶联将每个抗ADAMTS5纳米抗体固定在CM5传感器芯片上。在100nM ADAMTS5的捕获步骤后，以每个单次循环且无再生的方式注入浓度为1μM的纯化的纳米抗体，表面接触时间为120秒和流速为45μL/分钟。使用Biacore T100评估软件处理曲线，并评估与捕获的ADAMTS5(不同的组)的另外结合或不结合(相同的组)。

纳米抗体可分为两类：一个大组(bin)(“组1”)，它包含具有相似或重叠表位的所有抑制性纳米抗体，和第二组(group)，其包含结合的、无功能的纳米抗体3F04，其识别ADAMTS5上的不同表位(“组2”)。

表5.3总结了所测试的纳米抗体的结合表位。

表5.3抗ADAMTS5纳米抗体的抗原决定簇

5.4物种交叉反应性

物种交叉反应性最初是通过在Biacore T100仪器上基于SPR的解离速率分析进行评估的。测试了纳米抗体与人、食蟹猴(“cyno”)、豚鼠、小鼠和牛ADAMTS5的结合。为此，使用EDC和NHS通过胺偶联将重组ADAMTS5固定在CM5芯片上。将纯化的纳米抗体以100nM的浓度注射2分钟并以45μl/min的流速解离15分钟。使用BIA评估软件，通过将1:1相互作用模型(Langmuir模型)拟合到单个解离曲线上，可以确定每个单个纳米抗体的解离速率。作为参考，在每个实验中确定了人 ADAMTS5的解离速率

结果总结在表5.4A中。

表5.4A单价抗ADAMTS5纳米抗体的物种交叉反应性数据的概述

对于每个被测试的纳米抗体，对所有测试的物种都观察到了相似的解离速率。

另外，基本上如实施例5.1中所述，但使用生物素化的食蟹猴43-聚集蛋白聚糖寡肽底物和生物素化的豚鼠43-聚集蛋白聚糖寡肽底物，通过使用AlphaLISA的效力测定来处理食蟹猴和豚鼠ADAMTS5的交叉反应性。为了测定纳米抗体防止ADAMTS5介导的底物裂解的能力，分析了信号的降低，以纳米抗体浓度为函数，并计算了IC₅₀值。

表5.4B中总结了产生的效力。

表5.4B单价抗ADAMTS5纳米抗体的物种交叉反应性数据的概述

所有纳米抗体和对照化合物均以相似的效力阻断人和食蟹猴 ADAMTS5。在豚鼠AlphaLISA中，最有力的纳米抗体显示出比人 AlphaLISA略低的效力，但这最可能是由于酶浓度增加而降低了测定法灵敏度的结果。

纳米抗体2A12、2F03、093和049的大鼠交叉反应性是通过使用 Biacore T100的基于SPR的亲和力测定方法进行评估的。为了参考，还确定了对人ADAMTS5的亲和力。使用EDC和NHS化学方法，通过胺偶联将大鼠和人ADAMTS5固定在CM5芯片上。将纯化的纳米抗体以不同的浓度(1至1000nM)注射2分钟，并以45μl/min的流速解离25 分钟。使用BIAEvaluation软件(1:1相互作用)从传感图中计算出动力学常数。

如表5.4C所示，对于所有测试的纳米抗体，获得了对人ADAMTS5 和大鼠ADAMTS5的相似亲和力。半衰期延长的纳米抗体069(参考下文)的亲和力与其单价对应物(其是纳米抗体049)的亲和力相似，表明在C末端添加ALB11对亲和力没有影响。与半衰期延长的纳米抗体069 的亲和力相比，半衰期延长的双互补位纳米抗体130的亲和力在两个物种上都更高(对人ADAMTS5是15倍，并且对大鼠ADAMTS5是10倍) (表5.4C)。

表5.4C对人ADAMTS5和大鼠ADAMTS5的亲和力的概述

5.5抑制MMP-1和MMP-14活性

为了证实纳米抗体对ADAMTS5的选择性，使用具有每种酶的基于 FRET的测定法评估了对MMP-1和MMP-14酶活性的抑制。简言之，将活化的人MMP-1或MMP-14在室温与10μl的纳米抗体的系列稀释液一起孵育30分钟。孵育后，分别加入20μl的5μM或2.5μM荧光肽底物(Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2荧光MMP底物(R&D Systems目录号 ES001))。在Tecan InfiniteM1000读板器上，在37℃每分钟监测纳米抗体防止MMP-1和MMP-14介导的裂解的能力，持续2小时。

所得的滴定曲线示于图1。

天然抑制剂TIMP2和TIMP3抑制MMP-1和MMP-14活性，而测试的纳米抗体均未显示出抑制。

5.6抑制人ADAMTS4活性

为了评估对人ADAMTS4的抑制，基本上如实施例5.1中所述，但是使用人ADAMTS4(R&D Systems,Minneapolis,US；目录号4307-AD) 进行类似于人ADAMTS5 AlphaLISA的测定法。为了测定纳米抗体防止人ADAMTS4介导的底物裂解的能力，分析了随着纳米抗体浓度变化的信号的降低，并计算了IC₅₀值。

结果示于图2。

尽管小分子MSC2310852A抑制人ADAMTS4活性，而测试的纳米抗体或mAb 12F4均未显示抑制活性(参见图2)。在WO 2011/002968 中描述了单克隆抗体12F4(H4L0)对ADAMTS4具有选择性。

实施例6纳米抗体的格式化

6.1敲除N-糖基化基序

在格式化之前，将存在于纳米抗体11B06(位置N52)和纳米抗体 3F04(位置N110f)中的N-糖基化基序敲除。通过NNK密码子文库将位点随机化。由于这些位置位于CDR中，因此基序的突变可能会影响结合特征。因此，基本上如实施例5.4中所述，使用Biacore T100仪器通过对人ADAMTS5进行基于SPR的解离速率分析，筛选文库中不影响结合性质的可能取代基。

令人惊讶的是，在纳米抗体11B06中用丝氨酸取代氨基酸N52并且在纳米抗体3F04中用谷氨酰胺取代氨基酸N100_F，没有影响结合(数据未显示)。

因此，作为用于进一步格式化的构件，使用纳米抗体049(＝11B06 (N52S))和093(3F04(N100_FQ))分别表示纳米抗体11B06和3F04 (参见表A-1)。

6.2产生格式化的纳米抗体

为了产生阻断人ADAMTS5聚集蛋白聚糖酶活性的半衰期延长的纳米抗体构建体，将纳米抗体2A12、2D07、2F03、049、9D03和3B02与抗人血清白蛋白(HSA)-纳米抗体ALB11融合(参见表6.3)。另外，还从来自不同结合表位的两个纳米抗体的组合(组1成员和组2成员的组合)产生了ALB11半衰期延长的构建体。格式化的纳米抗体构建体在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达，分泌到培养基中，并在Poros MabCaptureA蛋白A珠(AppliedBiosystems,Bleiswijk,Netherlands目录号4374729)上亲和纯化。证实了纳米抗体构建体的完整性。

6.3不存在和存在HSA时AlphaLISA的效力

如实施例5.1中所述，在AlphaLISA中测试格式化的纳米抗体构建体。此外，通过在过量HSA(4.2μM最终浓度)存在下进行实验，处理 HSA结合对纳米抗体效力的影响。

表6.3列出了所有半衰期延长的纳米抗体构建体的IC₅₀值。

表6.3.AlphaLISA中测定的格式化的纳米抗体构建体(+/-HSA)的效力

ND＝未测定的；093^*＝3F04(N100_FQ)；049^2*＝11B06(N52S)

结果表明，ALB11格式化或HSA结合均不影响纳米抗体构建体的效力。

6.4结合到HSA

在Biacore T100上通过SPR确定ALB11纳米抗体对HSA的亲和力。为此，通过胺偶联将HSA固定在CM5芯片上，并基本上如实施例5.3 中所述进行处理。作为参考，还确定了单价ALB11的亲和力为3.2nM。

结果总结在表6.4中。

表6.4HLE纳米抗体构建体对HSA的亲和力

ND＝未测定；*FNb＝功能纳米抗体；049²*＝11B06(N52S)；093³*＝3F04(N100_FQ)

所有半衰期延长的ADAMTS5纳米抗体构建体均具有相似的亲和力 (参见表6.4)，低于单价ALB11对HSA的亲和力。

6.5用KinExA对人ADAMTS5的亲和力测定

在溶液中在KinExA3000仪器(Sapidyne,Boise,USA)上使用动力学排斥测定法测定格式化的纳米抗体构建体069(049-35GS-ALB11)和纳米抗体构建体130(049-35GS-093-ALB11)的亲和力(另见表6.5)。为此，根据制造商的说明，将人ADAMTS5缀合至PMMA珠，Darling 和Brault(2004Assay Drug Dev Technol.2:647-57)对此进行了详细描述。将固定浓度的纳米抗体构建体(50pM纳米抗体构建体069或5pM 纳米抗体构建体130)添加到范围是2nM-0.2pM的人ADAMTS5系列稀释液中，并在室温孵育16小时直至达到平衡。随后，将混合物通过 KinExA的自动进样器注入装有人ADAMTS5缀合的PMMA珠的柱子上，以捕获珠上的游离纳米抗体构建体，并用Alexa647标记的HSA进行检测。将游离纳米抗体构建体百分比作为滴定的人ADAMTS5的函数进行作图，并使用KinExA Pro Software v3.2.6进行拟合。

结果示于表6.5。

表6.5通过KinExA测定的2种纳米抗体构建体对于与人ADAMTS5结合的亲和力

纳米抗体	描述	KD(pM)
			069	049*-35GS-ALB11	20.4
130	049-35GS-093*-ALB11	1.2

049*＝11B06(N52S)；093²*＝3F04(N100_FQ)

观察到纳米抗体构建体130的亲和力约为纳米抗体构建体069的20 倍。这些数据证实了纳米抗体构建体130对人ADAMTS5的亲和结合。

实施例7纳米抗体的序列优化(SO)

对示例性纳米抗体2F03、纳米抗体049(11B06(N52S))和纳米抗体093(3F04(N100_FQ))进行序列优化处理。序列优化是其中亲本纳米抗体序列发生突变的过程，并且该过程涵盖了纳米抗体的人源化(i)和敲除翻译后修饰(ii)以及潜在的预先存在抗体的表位(iii)。还对纳米抗体ALB11进行了突变，以敲除对可能预先存在的抗体的表位。

(i)出于人源化的目的，将亲本纳米抗体序列突变以产生与人 IGHV3-IGHJ种系一致序列更相同的纳米抗体序列。将纳米抗体和人IGHV3-IGHJ种系一致序列之间不同的框架区中的特定氨基酸(所谓的标志残基除外)改变为人对应物，从而蛋白质结构、活性和稳定性保持原样。已知少数标志残基对于纳米抗体的稳定性、活性和亲和力至关重要，因此不对它们进行突变。

(ii)将CDR中存在的氨基酸以及有实验证据表明它们对翻译后修饰(PTM)敏感的氨基酸进行改变，使得PTM位点失活，同时蛋白质结构、活性和稳定性保持原样。

(iii)在不影响蛋白质结构、活性和稳定性的前提下，对纳米抗体的序列进行了优化，以最大程度地减少任何天然存在的预先存在的抗体的结合并降低引发治疗性免疫原性应答的可能性。

为了产生序列优化的格式化的纳米抗体构建体581和纳米抗体构建体579，经由35GS接头连接各个构件。分别得到纳米抗体构建体581 (2F3^SO-35GS接头-Alb11)和纳米抗体构建体579(2F3^SO-35GS接头 -093^SO-35GS接头-Alb11)(参见表A-1)。该构建体在巴斯德毕赤酵母中作为无标签蛋白生产，并通过蛋白A亲和层析进行纯化，然后脱盐。证实了纳米抗体构建体的完整性。

7.1对于人ADAMTS5的亲和力

如实施例6.5中所述，使用KinExA测定纳米抗体构建体581 (2F3^SO-35GS接头-Alb11)的亲和力，并对所述方案进行一些小改动。将固定浓度的20pM纳米抗体构建体581与人ADAMTS5的系列稀释液 (2.2倍系列稀释液，范围是20nM至0.32pM，以及无ADAMTS5的空白液)一起孵育。为了测试白蛋白的干扰，在与人ADAMTS5一起进行的选定实验中，将HSA添加到该预培养中，其浓度是其对于纳米抗体构建体581的KD的100倍。将混合物孵育，并在通过KinExA的自动进样器注射在装有人ADAMTS5缀合的PMMA珠的柱上之前24小时达到平衡。使用识别纳米抗体构建体581的AF647标记的抗纳米抗体工具 (由Ablynx生成)检测捕获的纳米抗体构建体581。

结果列于表7.1。

表7.1纳米抗体构建体581对于含和不含HSA的人ADAMTS5的亲和力

+或-HSA	K<sub>D</sub>(pM)	K<sub>D</sub>的95％CI(pM)
			-HSA(n＝3)	3.65(CV 20％)	2.27–5.86
+HSA (n＝3)	4.84(CV 22％)	3.45–6.80

结果显示，纳米抗体构建体581对于人ADAMTS5的亲和力在没有 HSA的情况下为3.65pM，在有HSA的情况下为4.84pM。

7.2对于血清白蛋白的亲和力

如实施例5.3中所述，使用SPR测定了纳米抗体构建体581 (2F3^SO-35GS接头-Alb11)中ALB11构件对于结合人、食蟹猴、豚鼠、小鼠和大鼠血清白蛋白(SA)的亲和力。

结果示于表7.2。

表7.2纳米抗体581对于结合人、食蟹猴、豚鼠、小鼠和大鼠血清白蛋白的亲和力(K_D，nM)

纳米抗体ID	人SA	食蟹猴SA	豚鼠SA	小鼠SA	大鼠SA
						581	48	51	420	790	>7500*

*解离速率超出检测极限：>5.0E-01(1/s)

7.3 Pre-Ab结合

在ProteOn XPR36仪器上通过SPR技术筛选纳米抗体构建体581 (2F3^SO-35GS接头-Alb11)和纳米抗体构建体579(2F3^SO-35GS接头 -093^SO-35GS接头-Alb11)的来自3个相关的供体血清样品组(样品来自健康受试者、OA样品和具有已知与其他纳米抗体结合的残留pre-Ab的偏倚样品组)的预先存在的抗体(pre-Ab)结合。分析血液样品的与抗 -ADAMTS5纳米抗体构建体的结合，所述抗ADAMTS5纳米抗体构建体捕获在HSA上。通过将报告点设置为125秒(缔合结束后5秒)，对传感图进行两次参考后，可以测定预先存在的抗体结合水平。使用ProteOn manager 3.1(Bio-Rad Laboratories，Inc.)进行分析。

结果示于图3。

两种纳米抗体构建体均具有低的残留pre-Ab结合水平，而纳米抗体构建体581清楚地显示了残留的pre-Ab结合最少(参见图3)。

7.4人AlphaLISA的功能

基本上如实施例5.1中所述，使用人ADAMTS5用纳米抗体构建体 581(2F3^SO-35GS接头-Alb11)进行AlphaLISA。

结果示于表7.4。

表7.4通过AlphaLISA测定的纳米抗体构建体581的效力(pM)。

样品	IC50(pM)	95％CI(pM)
			mAb 12F4H4L0	120	102-140
581	188	157-226

结果表明，纳米抗体构建体581的效力为188pM。

7.5树突状细胞-T细胞测定法中的免疫原性分析

在树突状细胞-T细胞增殖测定法中测定相对免疫原性。本质上，针对一组50个健康供体细胞样品测试纳米抗体，这些样品包含最丰富的 HLA II类等位基因，因此代表了全球大多数人口。使用T细胞增殖作为抗药物抗体形成的替代(surrogate)标志物评估免疫应答。匙孔血蓝蛋白(KLH)用作阳性对照。阳性对照KLH在所有50个供体中均产生了阳性应答。没有一个供体对于纳米抗体构建体581(2F3^SO-35GS接头 -Alb11)测试为阳性。纳米抗体构建体579(2F3^SO-35GS接头-093^SO-35GS 接头-Alb11)在3个供体(或6％)中引起阳性应答。在空白条件下(仅中等)，发现50个供体中有2个(或4％)应答为阳性。这些结果用于设置50个供体中超过3个的总应答阈值，对应于>6％的总反应阈值。对于测试的纳米抗体的总体免疫原性潜力被认为是低的，因为显著的阳性反应百分比≤6％(参见表7.5)。

表7.5在DC-T细胞测定法中测定的结果免疫原性谱

测试产物	#阳性应答	免疫原性潜力
			空白	2(4％)	/
KLH	50(100％)	/
			581	0(0％)	低
579	3(6％)	低
			对照Nb	1(2％)	低

7.6与人ADAMTS1的结合

在结合ELISA中测试了与人ADAMTS1的结合(见错误！参考来源未见)。简言之，将18.5nM的人ADAMTS1(R&D Systems, Minneapolis,US；目录号2197-AD)和人ADAMTS5(R&DSystems, Minneapolis,US；目录号2198-AD)包被在384孔MaxiSorp平板(Nunc,Wiesbaden,Germany)上。用酪蛋白溶液(1％)封闭孔，并针对在两种包被的蛋白上的结合测试纳米抗体构建体581(2F3^SO-35GS接头-Alb11) 和抗人ADAMTS1 mAb(R&D Systems,Minneapolis,US；目录号 MAB2197)系列稀释液。在分别使用HRP缀合的抗纳米抗体构建体581 (由Ablynx生成)和HRP缀合的抗小鼠抗体(Abcam，Cambridge， UK)进行检测，并在底物esTMB存在下进行随后的酶促反应(3,3,5,5’- 四甲基联苯胺(SDT,Brussels,Belgium)后，测量OD450 nm。

观察到纳米抗体构建体581对人ADAMTS5和抗人ADAMTS1 mAb 对人ADAMTS1的剂量应答曲线，表明纳米抗体构建体不结合人 ADAMTS1。

7.7与人ADAMTS4和ADAMTS15的结合

在结合ELISA中测试了与人ADAMTS4和ADAMTS15的结合(参见图4B)。简言之，将1μg/mL的人ADAMTS4(R&D Systems, Minneapolis,US；目录号4307-AD)或人ADAMTS15(R&DSystems, Minneapolis,US；目录号5149-AD)以1μg/mL包被过夜在96孔 Maxisorp ELISA平板(Nunc,Wiesbaden,Germany)上。用SuperBlock T20(PBS)(Thermo Scientific Pierce；目录号37516)封闭平板后，将纳米抗体构建体581(“C011400581”)或阳性对照抗ADAMTS4mAb(R&D Systems,Minneapolis,US；目录号MAB4307)或阳性对照抗ADAMTS15 mAb(R&DSystems,Minneapolis,US；目录号MAB5149)的剂量响应曲线以1μM开始应用在包被的平板上并在室温孵育1小时。用识别纳米抗体构建体581的生物素化的抗纳米抗体工具(由Ablynx生成)检测到结合的C011400581纳米抗体，而用生物素化的山羊抗小鼠pAb(Jackson Immuno Research；目录号115-065-062)检测到阳性对照 mAb。对于这两种，链霉亲和素-HRP均用作辅助检测工具(Thermo Scientific Pierce；目录号#21126)。然后通过添加sTMB(SDT,Brussels, Belgium)使板可视化。所有稀释液和检测工具均在测定稀释液(＝PBS+ 10％Superblock+0.05％Tween20)中制备。2.5分钟后，通过加入1M HCl停止生色反应。在450nm处测量光密度，以620nm作为参考波长。 7.8通过KinExA亲和力测定的物种交叉反应性

如实施例7.1中所述，使用KinExA测定纳米抗体构建体581 (2F3^SO-35GS接头-Alb11)对几种物种的ADAMTS5的亲和力。对于所有物种，制备人ADAMTS5缀合的PMMA珠，并如上所述用于捕获游离纳米抗体构建体581。使用识别纳米抗体构建体581的AF647标记的抗纳米抗体工具(由Ablynx生成)检测捕获的纳米抗体构建体581。结果见表7.7。

表7.7纳米抗体构建体581对于食蟹猴、大鼠、小鼠和牛的ADAMTS5的亲和力

物种ADAMTS5	K<sub>D</sub>(pM)	K<sub>D</sub>的95％CI(pM)
			食蟹猴(n＝1)	2.22	0.88–4.76
大鼠(n＝1)	2.77	1.48–5.07
			小鼠(n＝1)	2.81	0.30–11.42
牛(n＝1)	7.66	3.33–19.88

实施例8人外植体测定法的效力

基本上如实施例5.2中所述、但现在是在人外植体测定法中，在离体测定法中对于阻断软骨降解的能力评估纳米抗体构建体581(2F3^SO-35GS 接头-Alb11)。简言之，从人膝关节新鲜地制备人软骨外植体片(直径 4mm)，并在10ng/ml IL-1α存在下在96孔板中孵育以诱导软骨降解。作为软骨/聚集蛋白聚糖降解的测量，通过异染性染料1,9二甲基亚甲基蓝(在633nm处发射)在孵育7天后(37℃，7.5％CO₂)，在上清液中检测到GAG的释放。硫酸软骨素作为测定标准包括在内。通过在没有化合物和存在MSC2310852A的情况下IL-1β和OSM诱导的对照来定义功效。CRB0017是抗ADAMTS5 mAb，将用于I期临床试验 (Rottapharm)。

结果总结在图5和表8中。

表8

纳米抗体在人类外植体测定法中显示出高效力和对软骨降解(GAG 损失)的100％抑制。如表8所示，在牛外植体测定法中，纳米抗体比 CRB0017至少好10倍。

实施例9在牛共培养模型中调控C2M、C3M和exAGNX1

在牛共培养系统中研究纳米抗体构建体581(图中的“581”)对GAG 释放和含量，C2M(胶原蛋白II降解的标志物)，C3M(胶原蛋白III 降解的标志物)和exAGNx1(聚集蛋白聚糖降解的标志物，特征在于新表位TEGE)的影响。在该共培养系统中，来自牛膝的软骨外植体与来自同一动物的滑膜一起孵育28天。培养7天后检测到最高的GAG释放 (图6A)。以三种浓度1nM、10nM、100nM测试了纳米抗体构建体 581。滑膜与软骨外植体一起孵育导致增加的GAG释放。纳米抗体构建体581抑制GAG释放(图6B)。

与GAG释放一致，对软骨外植体的剩余GAG含量(木瓜蛋白酶消化后)的分析显示，与单独的外植体相比，将外植体与滑膜共同孵育后， GAG含量降低了(图6C)。

与GAG释放的分析平行，测量了exAGNx1作为聚集蛋白聚糖降解的特异性标志物的释放。当软骨外植体和滑膜一起孵育时，曲线分析下面积(AUC)显示出对exAGNx1释放的强烈诱导。此外，纳米抗体构建体581以浓度依赖性方式抑制exAGNx1释放，并在100nM 581被完全抑制(图7)。

为了测定纳米抗体构建体581对共培养系统中软骨的胶原网络的影响，测定了C2M作为胶原II降解的标志物。与聚集蛋白聚糖网络降解的标志物(GAG和exAGNx1)相比，C2M在第14天至第21天开始增加。在共培养系统中纳米抗体构建体581的孵育抑制C2M的释放(图8)。

作为滑膜炎症的附加标志物，测定了C3M(即III型胶原降解标志物)。C3M释放的时程分析表明，C3M在14天后开始增加，在第21天左右达到峰值。用纳米抗体构建体581的处理在所有三个浓度均抑制 C3M(图9)。

实施例10在NHP中抑制聚集蛋白聚糖酶的活性

在非人灵长类动物(NHP)模型食蟹猴中评估了纳米抗体构建体581 (2F3^SO-35GS接头-Alb11；“C011400581”)在体内抑制聚集蛋白聚糖酶活性的能力。简言之，通过以6、30或150mg/kg的剂量水平皮下(s.c.) 施用每周一次，将纳米抗体构建体581给予3只雄性和3只雌性食蟹猴的组，持续4周。同时，对照组用媒介物即20mM组氨酸、8％蔗糖、 0.01％Tween20pH 6.0进行处理。

通过测定其特征在于在血清中存在新表位ARGS的聚集蛋白聚糖降解片段的水平，在几个时间点收集的血清样品上测量对聚集蛋白聚糖酶活性的抑制。所有用纳米抗体581处理的动物均显示出相似的特征，即在首次给药后ARGS水平下降，并在48小时至120小时达到测定法的测量范围下限(LLMR)(0.08nM)的附近或以下的非常低的水平。随后，ARGS水平在LLMR附近或以下显示出持续的最大下降，并且在4 周研究结束时未恢复到基线。

结果概述示于图10。

总之，ADAMTS5特异性纳米抗体在全身施用后与靶标啮合 (engage)，并在所有测试剂量水平下有效地调控体内ARGS新表位的水平。此外，与现有技术mAb相比，未观察到与测试项目有关的病理性心律失常。另外，在用任何测试剂量水平的纳米抗体治疗的雄性和雌性猴子中都没有发现关于任何与测试相关的ST升高的任何证据。

实施例11抑制软骨退变

为了进一步评估纳米抗体和纳米抗体构建体在体内抑制软骨退变的能力，使用小鼠DMM(内侧半月板的不稳定)模型。简言之，内侧半月板进行手术去稳定。示例性的纳米抗体构建体581(2F3^SO-35GS接头 -Alb11)以不同浓度在诱导DMM前3天皮下施用(预防性)或在诱导 DMM后3天施用(治疗性)。治疗8周后，处死动物并取出膝盖。将膝盖埋入石蜡块中，切片并用甲苯胺蓝染色。随后，针对多个参数对切片进行评分，包括内侧软骨退变总结。

结果示于图11。

结果表明，在DMM小鼠模型中，使用纳米抗体进行预防性和治疗性处理(s.c.)的结构益处高达50％。

实施例12在大鼠手术OA模型中的症状益处

为了评估纳米抗体建立症状益处的能力，使用了大鼠外科手术OA 模型。简言之，大鼠用ACLt中和tMx手术进行处理以在第0天诱导OA。在ACLt中和tMx外科模型(前交叉韧带切断并内侧半月板切除术)中，从第3天开始每隔一天皮下施用纳米抗体构建体581。在每周的基础上，测定了通过步态分析(在CatWalk上)的症状益处以及关节直径的减少。

结果示于图12。

通过在右膝关节的由前交叉韧带切断(ACLT)+内侧半月板切除 (tMx)手术，在成年雄性大鼠(Lister Hooded；平均体重为346±20g) 诱导骨关节炎(第0天)。手术后第3天开始用媒介物或测试品的处理 (sc)，并继续每隔一天一次，直到第42天。在给药组的同一时间点，健康对照组无手术干预但sc接收媒介物。(A)随时间变化的步态干扰计算为“相对于媒介物的益处％”。意味着“健康+安慰剂”组＝100％益处。“ACLT tMx+媒介物”组的平均值＝0％益处。(B)治疗开始后所有调查时间点的平均“媒介物益处”。所示出的是14-15只大鼠/组的平均值± SEM。*＝p<0.05，是用单因素ANOVA和Dunnett计算得出的。

使用纳米抗体早期治疗引起ACLt+tMx诱导的OA期间的剂量依赖的、显著的和有意义的症状改善。

实施例13在食蟹猴中的毒性研究

在食蟹猴中进行了为期4周的亚慢性毒性研究，以获取有关纳米抗体的全身毒性、局部耐受性和安全药理学的信息。示例性的纳米抗体构建体581(2F3^SO-35GS接头-Alb11)s.c.给予三只雄性和三只雌性食蟹猴 (Macaca fascicularis)的组(每周一次，分别以6、30或150mg/kg的剂量皮下施用到背侧区域，持续4周。同时，对照组使用媒介物即20mM 组氨酸、8％蔗糖、0.01％Tween 20pH 6.0进行处理。

在任何测试剂量水平下均未发现与测试品相关的局部不耐受迹象。没有发现对于行为、体重、食物消耗、血液和生化参数、淋巴细胞分型、 CRP水平、尿液分析参数、眼科和听觉功能以及在任何剂量水平任何动物的器官重量与测试品有关的作用(数据未显示)。尸检时的肉眼检查和组织病理学检查均未发现与以任何测试的剂量水平在任何检测的动物中用测试品的治疗相关的任何局部或全身器官变化。

由于据报道mAb 12F4表现出局灶性心内膜出血，因此血压呈剂量依赖性升高，没有可逆性以及心脏电导异常(ST升高和室性心律不齐) 的证据(Larkin等人，The highsand lows of translational drug development:Antibody-mediated inhibition ofADAMTS-5for osteoarthritis disease modification,OARSI conference 2014:Paris；Renninger等人， Identification of Altered Cardiovascular Function Produced bya Novel Biologic Compound in a Stand Alone Safety Pharmacology Primate Study,于SPS meeting,2013)，采用EMKA系统对动物进行了充分的非侵入遥测。

在任何剂量水平，任何动物的任何遥测参数(采用非侵入式EMKA 系统)均未发现与测试品相关的影响。特别是，未观察到病理性心律失常，并且在任何测试剂量水平下，用纳米抗体治疗的雄性和雌性猴子中没有与任何测试品相关的ST升高的证据(数据未显示)。

这些研究证实，ADAMTS5特异性纳米抗体可以被认为是安全的。

实施例14体内大鼠MMT模型DMOAD研究

为了证明与本发明的CAP结合物融合的ADAMTS5抑制剂的体内功效，使用了在大鼠中通过手术诱导的内侧半月板撕裂(MMT)模型。简言之，将抗ADAMTS5纳米抗体缀合至CAP结合物(示为纳米抗体构建体C010100954或纳米抗体构建体954)。在大鼠的一个膝盖中进行手术以诱导OA样症状。在手术后3天通过IA注射开始治疗。手术后 42天进行组织病理学检查。抽取中期和终末血清样本进行探索性生物标志物分析。确定内侧和总的实质性软骨退变宽度，以及软骨退变减少的百分比。每组使用20只动物。

胫骨内侧的亚软骨缺损示于图13。

结果表明，与媒介物相比，ADAMTS5-CAP构建体在42天后大大降低了软骨宽度。这些结果进一步表明

(a)CAP部分对抗ADAMTS5纳米抗体的活性没有负面影响；

(b)CAP部分能够保留抗ADAMTS5纳米抗体；和

(c)即使当偶联至CAP部分时，抗ADAMTS5纳米抗体对软骨宽度有积极影响。

实施例15

方法：将来自四只动物的牛软骨外植体(BEX)以及来自八个经手术替换的膝关节的人软骨外植体(HEX)和来自一个健康的人膝关节的人软骨外植体(hHEX)在单独的培养基(w/o)中培养长达21天，存在促炎性细胞因子(抑癌蛋白M[10ng/mL]+TNFα[20ng/mL](O+T))或具有示例性纳米抗体构建体581(2F3^SO-35GS接头-Alb11)[1μM–1nM] 的O+T。将来自牛的软骨和滑膜(bCC)和来自4个置换的骨关节炎人膝关节的软骨和滑膜(hCC)在单独的培养基(w/o)中、具有O+T或 O+T加上示例性的纳米抗体构建体581(2F3^SO-35GS接头-Alb11)[1 μM–0.6nM]一起离体共培养多达28天。使用活检打孔器将软骨切成相等大小的外植体。用手术刀将滑膜切成大小相等的外植体(30mg[±3 mg])。外植体的代谢活性由Alamar Blue评估。使用酶联免疫吸附测定法(ELISA)评估软骨组织更新，以测量条件培养基中降解的特征明确的生物标志物(huARGS、exAGNxI、C2M)和形成的特征明确的生物标志物(ProC2)。ProC2和C2M分别是II型胶原蛋白形成和降解代谢产物，而exAGNxI和huARGS是ADAMTS-5降解的聚集蛋白聚糖的代谢产物。报告了平均值和平均值的标准误(SEM)。统计分析是使用Dunn 的多重比较检验采用单因素方差分析(ANOVA)或使用假定正态分布的带有Dunnett的多重比较检验的双因素ANOVA进行的。

结果：在整个培养期间，BEX、HEX和bCC的代谢活性稳定，而与w/o相比，在O+T处理的条件下，hCC和hHEX中的代谢活性从第 14天开始显著下降。在用O+T刺激的培养物中，ADAMTS-5降解的聚集蛋白聚糖的代谢产物在培养的第一周内达到峰值，但hHEX除外，其中huARGS和exAGNxI稍晚增加。通过O+T引起的II型胶原蛋白降解 C2M在第19天后达到峰值。与w/o对照相比，II型胶原蛋白形成Pro-C2 在整个培养期间保持相对稳定。

在第5天，在BEX(最高剂量：O+T的8％)，HEX(最高剂量：O 的40％)，bCC(最高剂量：O+T的10％)，hCC(最高剂量：O+T的 40％)和hHEX(最高剂量：O+T的24％)中使用示例性的纳米抗体构建体581(2F3^SO-35GS接头-Alb11)与O+T组合治疗可剂量依赖性地降低huARGS(图14)。基于huARGS减少的示例性纳米抗体构建体581 (2F3^SO-35GS接头Alb11)的IC50范围从BEX中的300nM到<15nM HEX、hHEX、bCC和hCC(图14)。示例性的纳米抗体构建体581 (2F3^SO-35GS接头-Alb11)对exAGNxI的作用类似于在测试的培养物中的huARGS。示例性的纳米抗体构建体581(2F3^SO-35GS接头-Alb11) 也显著地且剂量依赖性地降低了C2M(II型胶原降解的标志物)，尽管其作用小于聚集蛋白聚糖降解标志物。示例性纳米抗体构建体581 (2F3^SO-35GS接头-Alb11)在任何测试条件下均未显示对II型胶原形成代谢物Pro-C2的影响。

结论：在这里，我们已经显示出示例性的纳米抗体构建体581 (2F3^SO-35GS接头-Alb11)具有软骨保护作用，这是由于其在牛和人软骨离体培养物以及软骨和滑膜共培养物中的炎症状况中，剂量依赖性地抑制ADAMTS-5介导的聚集蛋白聚糖降解和MMP介导的II型胶原降解。2F3^SO-35GS接头-Alb(SEQ ID NO:129)是本发明的优选实施方案之一。

实施例16本发明的纳米抗体构建体优于现有技术的纳米抗体

在WO2008/074840中，已经描述了多种ADAMTS5纳米抗体。在本实验中，在WO2008/074840中描述的26种纳米抗体与由示例性纳米抗体2F3^so(2F3*)代表的本发明的纳米抗体之间进行了比较。

如实施例5.1中所述，在AlphaLISA测定法中测试所有构建体。纳米抗体2F3^so(2F3*)是C011400581(SEQ ID NO:129)的ADAMTS5 结合单价构件。使用无关的纳米抗体IRR00028作为阴性对照。

首先，在AlphaLISA中确定现有技术纳米抗体的活性。结果示于表 16.1。

表16.1AlphaLISA中现有技术纳米抗体的活性

结果表明，仅7种现有技术的纳米抗体具有阻断活性。现有技术的其余纳米抗体没有活性或增强了活性。

在该比较实验的第二阶段，将阻断性纳米抗体与示例性单价纳米抗体2F3^so(2F3*)进行了比较。

纳米抗体构建体的IC₅₀值在表16.2中列出。为了便于比较，还指出了示例性单价纳米抗体2F3^so(2F3*)的倍数差异。表16.2如在AlphaLISA中测定的，现有技术纳米抗体构建体对比纳米抗体 2F3^so(2F3*)的效力

可以得出结论，本发明的纳米抗体构建体优于现有技术的 ADAMTS5纳米抗体。

表A-1单价和多价抗ADAMTS5纳米抗体的名称和简短描述(“ID”)、SEQ ID NO:(“SEQ”)和氨基酸序列

*SO(序列优化的)形式

表B：其他氨基酸序列：名称和简短描述(“ID”)，SEQ ID NO:(“SEQ”)和氨基酸序列(“序列”)

表C：多个接头序列(“ID”是指本文所用的SEQ ID NO)

表D：结合血清白蛋白的ISVD序列(“ID”是指本文所用的SEQ ID NO)，包括CDR序列

序列表

<110> 默克专利股份有限公司

埃博灵克斯股份有限公司

<120> 结合ADAMTS的免疫球蛋白

<130> MEPAT.0103

<150> EP17174403.0

<151> 2017-06-02

<160> 174

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 1

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Arg Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Leu Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Asp Glu Ala Ala

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Leu Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Arg Ser Ala Glu Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Leu

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu His Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Leu Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Glu Glu Tyr Ala

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 3

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ala Val Ser Val Asn

20 25 30

Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Arg Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Leu Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Asp Glu Ala Ala

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 4

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Phe Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Arg Asn Gly Ala Arg Thr Tyr Tyr Tyr Asp Ser Val

50 55 60

Ala Gly Leu Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ala Arg Ile Ser Pro Ser Asp Pro Ser Asn Glu Asp Gly Tyr

100 105 110

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 5

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 5

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Val Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Arg Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Tyr Asp Ser Leu

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val His

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ile Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Arg Ala Pro Ser Phe Arg Thr Ile Asp Ala Ile Asn Tyr

100 105 110

Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 6

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Phe Ser Gly Pro Gly Arg Thr Phe Ala

20 25 30

Arg Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asn Arg Asp

35 40 45

Phe Ile Thr Gly Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Val Tyr

50 55 60

Pro Met Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Ala Asp Arg Glu Ile Asn Arg Ile Ala Asn Asp Lys Glu

100 105 110

Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 7

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Thr Phe Ser Ser

20 25 30

Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Phe

35 40 45

Val Ala Thr Ile Trp Ser Gly Gly Leu Thr Val Tyr Ala Asp Ser Ala

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Glu Ala Val Gly Thr Tyr Tyr Thr Pro Asp Gly Trp Thr Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 8

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Arg Arg Asn

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu

35 40 45

Ala Gly Ile Asn Trp Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp

65 70 75 80

Leu Gln Met Ile Ser Pro Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Gly Asp Ile Gly Thr Leu Val Asn Asp Glu Asn Pro Arg

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Thr Arg Ser Arg Gly Thr Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Thr

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Arg Ser Pro Gly Asp Pro Ser Arg Thr Tyr Leu Tyr Glu

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Pro Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Arg Ser Arg Gly Thr Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Thr

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Asn Asp Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Gly Arg Ser Pro Gly Asp Pro Ser Arg Thr Tyr Leu Tyr Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ser Trp Ser Arg Gly Ile Leu Tyr Tyr Thr Asp Ser Thr

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Met Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Asn Leu Asn Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ser Arg Ser Pro Gly Asp Pro Ser Arg Thr Tyr Leu Tyr Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 12

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Ala Leu Ser Ser Ser

20 25 30

Ile Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Thr Trp Ser Gly Gly Arg Ala Tyr Tyr Ala Asp Val Ser

50 55 60

Asp Phe Glu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly Lys Asn

65 70 75 80

Thr Val Asn Leu Gln Met Lys Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Leu Ala Ile Pro Val Thr Met Ser Pro His

100 105 110

Glu Tyr Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 13

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Asp Val Val Val Asn

20 25 30

Asp Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Asp Ile Thr Thr Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ala Gln Val Gly Asp Ser Asp Asp Asp Val Trp Tyr Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 14

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn

20 25 30

Val Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ala Ile Ile Ser Gly Gly Arg Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Ala Glu Val Asp Ala Gly Ile Tyr Ala Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 15

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Trp Asn Thr Phe Thr Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Arg Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Ala Gly Gly Ser Pro Arg Gln His Glu Pro Tyr Glu Tyr Arg

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 16

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Arg Arg Thr Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Arg Trp Ser Ser Gly Met Pro Tyr Tyr Leu Asp Ser Val

50 55 60

Met Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Arg Ser Ala Phe Arg Asp Pro Ser Phe Asp Val Asn Tyr

100 105 110

Glu Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 17

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 17

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Arg Thr Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Arg Trp Ser Ser Gly Ile Thr Phe Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Arg Ser Ala Leu Arg Asp Pro Ser Phe Glu Val Asn Tyr

100 105 110

Glu Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 18

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asp

20 25 30

Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val

35 40 45

Ala Ser Val Thr Thr Gly Ala Ser Pro Asn Tyr Gly Asp Ser Val Thr

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ala Ser Arg Asp Arg Ala Lys Asn Ala Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn

85 90 95

Leu Ile Met Thr Ile Pro Gly Gly Ser Gln Ile Met Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 19

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Tyr Pro Met Ala Trp

20 25 30

Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Gly Val Ser

35 40 45

Trp Gly Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe

50 55 60

Thr Val Ser Arg Asp Tyr Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn

65 70 75 80

Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Asp Pro

85 90 95

Trp Gly Arg Leu Phe Arg Val Lys Asp Asn Tyr Ser Asp Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 20

Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly

1 5 10

<210> 21

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 21

Gly Arg Thr Val Ser Ser Tyr Ala Met Gly

1 5 10

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 22

Gly Ser Ala Val Ser Val Asn Ala Met Ala

1 5 10

<210> 23

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 23

Gly Arg Thr Phe Ser Thr Tyr Phe Val Gly

1 5 10

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 24

Arg Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Val Met Ala

1 5 10

<210> 25

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 25

Gly Pro Gly Arg Thr Phe Ala Arg Tyr Ala Met Gly

1 5 10

<210> 26

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 26

Gly Arg Thr Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly

1 5 10

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 27

Gly Leu Thr Phe Arg Arg Asn Ala Met Gly

1 5 10

<210> 28

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 28

Gly Phe Thr Phe Ser Pro Tyr Tyr Met Gly

1 5 10

<210> 29

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 29

Gly Arg Ala Leu Ser Ser Ser Ile Met Gly

1 5 10

<210> 30

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 30

Gly Ser Asp Val Val Val Asn Asp Met Gly

1 5 10

<210> 31

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 31

Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn Val Met Gly

1 5 10

<210> 32

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 32

Gly Leu Thr Phe Ser Ser Tyr Thr Met Gly

1 5 10

<210> 33

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 33

Arg Arg Thr Ile Ser Ser Gly Thr Met Gly

1 5 10

<210> 34

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 34

Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asp Ala Met Gly

1 5 10

<210> 35

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 35

Gly Arg Tyr Pro Met Ala

1 5

<210> 36

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 36

Gly Ile Ser Arg Ser Ala Gly Arg Thr Tyr

1 5 10

<210> 37

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 37

Gly Ile Ser Arg Ser Ala Glu Arg Thr Tyr

1 5 10

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 38

Ala Ile Ser Arg Asn Gly Ala Arg Thr Tyr Tyr

1 5 10

<210> 39

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 39

Ala Ile Ser Arg Ser Gly Asp Ser Thr Tyr

1 5 10

<210> 40

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 40

Gly Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr Tyr

1 5 10

<210> 41

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 41

Thr Ile Trp Ser Gly Gly Leu Thr Val

1 5

<210> 42

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 42

Gly Ile Asn Trp Ser Gly Gly Thr Thr Tyr

1 5 10

<210> 43

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 43

Ala Ile Thr Arg Ser Arg Gly Thr Thr Tyr

1 5 10

<210> 44

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 44

Ala Ile Ser Arg Ser Arg Gly Thr Thr Tyr

1 5 10

<210> 45

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 45

Ala Ile Ser Trp Ser Arg Gly Ile Leu Tyr

1 5 10

<210> 46

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 46

Ala Ile Thr Trp Ser Gly Gly Arg Ala Tyr Tyr Ala Asp

1 5 10

<210> 47

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 47

Asp Ile Thr Thr Gly Gly Arg Thr Asn

1 5

<210> 48

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 48

Ala Ile Ile Ser Gly Gly Arg Thr Asn

1 5

<210> 49

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 49

Ala Ile Ser Trp Asn Thr Phe Thr Thr Tyr

1 5 10

<210> 50

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 50

Ala Ile Arg Trp Ser Ser Gly Met Pro Tyr

1 5 10

<210> 51

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 51

Ala Ile Arg Trp Ser Ser Gly Ile Thr Phe

1 5 10

<210> 52

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 52

Ser Val Thr Thr Gly Ala Ser Pro Asn

1 5

<210> 53

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 53

Gly Val Ser Trp Gly Gly Asp Arg Thr Tyr

1 5 10

<210> 54

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 54

Asp Leu Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Asp Glu Ala Ala Tyr

1 5 10 15

<210> 55

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 55

Asp Leu Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Glu Glu Tyr Ala Tyr

1 5 10 15

<210> 56

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 56

Ala Arg Ile Ser Pro Ser Asp Pro Ser Asn Glu Asp Gly Tyr Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 57

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 57

Ser Arg Ala Pro Ser Phe Arg Thr Ile Asp Ala Ile Asn Tyr Tyr Asp

1 5 10 15

Tyr

<210> 58

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 58

Asp Arg Glu Ile Asn Arg Ile Ala Asn Asp Lys Glu Leu Asp Phe

1 5 10 15

<210> 59

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 59

Glu Ala Val Gly Thr Tyr Tyr Thr Pro Asp Gly Trp Thr Tyr

1 5 10

<210> 60

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 60

Asp Gly Asp Ile Gly Thr Leu Val Asn Asp Glu Asn Pro Arg Tyr

1 5 10 15

<210> 61

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 61

Gly Arg Ser Pro Gly Asp Pro Ser Arg Thr Tyr Leu Tyr Glu Tyr

1 5 10 15

<210> 62

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 62

Gly Arg Ser Pro Gly Asp Pro Ser Arg Thr Tyr Leu Tyr Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 63

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 63

Ser Arg Ser Pro Gly Asp Pro Ser Arg Thr Tyr Leu Tyr Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 64

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 64

Ala Leu Ala Ile Pro Val Thr Met Ser Pro His Glu Tyr Pro Tyr

1 5 10 15

<210> 65

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 65

Gln Val Gly Asp Ser Asp Asp Asp Val Trp Tyr Ala Tyr

1 5 10

<210> 66

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 66

Glu Val Asp Ala Gly Ile Tyr Ala Tyr Gly Tyr

1 5 10

<210> 67

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 67

Ala Gly Gly Ser Pro Arg Gln His Glu Pro Tyr Glu Tyr Arg Val

1 5 10 15

<210> 68

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 68

Asp Arg Ser Ala Phe Arg Asp Pro Ser Phe Asp Val Asn Tyr Glu Tyr

1 5 10 15

<210> 69

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 69

Asp Arg Ser Ala Leu Arg Asp Pro Ser Phe Glu Val Asn Tyr Glu Tyr

1 5 10 15

<210> 70

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 70

Ile Met Thr Ile Pro Gly Gly Ser Gln Ile Met Tyr

1 5 10

<210> 71

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 71

Asp Pro Trp Gly Arg Leu Phe Arg Val Lys Asp Asn Tyr Ser Asp

1 5 10 15

<210> 72

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 72

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 73

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 73

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 74

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 74

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Asp

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 75

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 75

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 76

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 76

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Phe Ser

20 25

<210> 77

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 77

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser

20 25

<210> 78

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 78

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Pro Ser

20 25

<210> 79

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 79

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Ala

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser

20 25

<210> 80

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 80

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 81

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 81

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser

20 25

<210> 82

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 82

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 83

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 83

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser

20 25

<210> 84

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 84

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser

20 25

<210> 85

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 85

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Phe Val Ala

1 5 10

<210> 86

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 86

Trp Phe Arg Leu Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 87

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 87

Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Phe Val Ala

1 5 10

<210> 88

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 88

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala

1 5 10

<210> 89

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 89

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asn Arg Asp Phe Ile Thr

1 5 10

<210> 90

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 90

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Ala Phe Val Ala

1 5 10

<210> 91

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 91

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu Ala

1 5 10

<210> 92

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 92

Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10

<210> 93

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 93

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Gln Glu Arg Glu Phe Val Ser

1 5 10

<210> 94

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 94

Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Val Ala

1 5 10

<210> 95

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 95

Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala

1 5 10 15

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

35

<210> 96

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 96

Tyr Val Asp Ser Leu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala

1 5 10 15

Lys Asn Thr Val Tyr Leu His Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

35

<210> 97

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 97

Tyr Thr Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Ser Ala

1 5 10 15

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

35

<210> 98

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 98

Tyr Asp Ser Val Ala Gly Leu Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys

1 5 10 15

Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala

20 25 30

Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

35

<210> 99

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 99

Tyr Tyr Asp Ser Leu Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

1 5 10 15

Lys Asn Thr Val His Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Ile Cys Ala Ala

35

<210> 100

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 100

Tyr Val Tyr Pro Met Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

1 5 10 15

Lys Asn Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Lys Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

35

<210> 101

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 101

Tyr Ala Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

1 5 10 15

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

35

<210> 102

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 102

Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

1 5 10 15

Lys Asn Thr Val Asp Leu Gln Met Ile Ser Pro Lys Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

35

<210> 103

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 103

Tyr Leu Asp Ser Thr Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

1 5 10 15

Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

35

<210> 104

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 104

Tyr Leu Asp Ser Thr Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

1 5 10 15

Asn Asp Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Asn Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

35

<210> 105

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 105

Tyr Thr Asp Ser Thr Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

1 5 10 15

Lys Asn Thr Met Tyr Leu Gln Met Asp Asn Leu Asn Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

35

<210> 106

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 106

Val Ser Asp Phe Glu Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Gly

1 5 10 15

Lys Asn Thr Val Asn Leu Gln Met Lys Gly Leu Lys Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

35

<210> 107

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 107

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val

1 5 10 15

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala

35

<210> 108

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 108

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

1 5 10 15

Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Ala

35

<210> 109

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 109

Tyr Val Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala

1 5 10 15

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Arg Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

35

<210> 110

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 110

Tyr Leu Asp Ser Val Met Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

1 5 10 15

Lys Asn Thr Val Ser Leu Gln Met Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

35

<210> 111

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 111

Tyr Pro Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Asp Asn Ala

1 5 10 15

Lys Asn Thr Val Ser Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala

35

<210> 112

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 112

Tyr Gly Asp Ser Val Thr Gly Arg Phe Thr Ala Ser Arg Asp Arg Ala

1 5 10 15

Lys Asn Ala Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Leu

35

<210> 113

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 113

Tyr Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Tyr Ala

1 5 10 15

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ala

20 25 30

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly

35

<210> 114

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 114

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 115

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 115

Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 116

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 116

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Tyr Pro Met Ala Trp

20 25 30

Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Gly Val Ser

35 40 45

Trp Gly Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe

50 55 60

Thr Val Ser Arg Asp Tyr Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn

65 70 75 80

Ser Leu Lys Pro Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Asp Pro

85 90 95

Trp Gly Arg Leu Phe Arg Val Lys Asp Gln Tyr Ser Asp Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 117

<211> 124

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 117

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Arg Arg Asn

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Trp Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp

65 70 75 80

Leu Gln Met Ile Ser Pro Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Gly Asp Ile Gly Thr Leu Val Asn Asp Glu Asn Pro Arg

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 118

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 118

Asp Pro Trp Gly Arg Leu Phe Arg Val Lys Asp Gln Tyr Ser Asp

1 5 10 15

<210> 119

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 119

Gly Ile Ser Trp Ser Gly Gly Thr Thr Tyr

1 5 10

<210> 120

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 120

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Asp Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Arg Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Leu Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Asp Glu Ala Ala

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

145 150 155 160

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser

165 170 175

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly

180 185 190

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

195 200 205

Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys

210 215 220

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu

225 230 235 240

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr

245 250 255

Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

260 265 270

Ser Ser

<210> 121

<211> 276

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 121

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ser Phe Ser Gly Pro Gly Arg Thr Phe Ala

20 25 30

Arg Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asn Arg Asp

35 40 45

Phe Ile Thr Gly Ile Ser Gly Ser Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Val Tyr

50 55 60

Pro Met Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Met

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Ala Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Ala Asp Arg Glu Ile Asn Arg Ile Ala Asn Asp Lys Glu

100 105 110

Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

165 170 175

Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser

180 185 190

Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

195 200 205

Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser

210 215 220

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu

225 230 235 240

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

245 250 255

Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val

260 265 270

Thr Val Ser Ser

275

<210> 122

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 122

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Leu Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Arg Ser Ala Glu Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Leu

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu His Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Leu Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Glu Glu Tyr Ala

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

145 150 155 160

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser

165 170 175

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly

180 185 190

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

195 200 205

Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys

210 215 220

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu

225 230 235 240

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr

245 250 255

Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

260 265 270

Ser Ser

<210> 123

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 123

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Arg Arg Asn

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Trp Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp

65 70 75 80

Leu Gln Met Ile Ser Pro Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Gly Asp Ile Gly Thr Leu Val Asn Asp Glu Asn Pro Arg

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

145 150 155 160

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser

165 170 175

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly

180 185 190

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

195 200 205

Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys

210 215 220

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu

225 230 235 240

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr

245 250 255

Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

260 265 270

Ser Ser

<210> 124

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 124

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ala Val Ser Val Asn

20 25 30

Ala Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Asp Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Arg Ser Ala Gly Arg Thr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Leu Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Asp Glu Ala Ala

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

145 150 155 160

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser

165 170 175

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly

180 185 190

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser

195 200 205

Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys

210 215 220

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu

225 230 235 240

Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr

245 250 255

Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

260 265 270

Ser Ser

<210> 125

<211> 275

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 125

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Arg Arg Thr Ile Ser Ser Gly

20 25 30

Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Ala Ile Arg Trp Ser Ser Gly Met Pro Tyr Tyr Leu Asp Ser Val

50 55 60

Met Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Arg Ser Ala Phe Arg Asp Pro Ser Phe Asp Val Asn Tyr

100 105 110

Glu Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

145 150 155 160

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn

165 170 175

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

180 185 190

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

195 200 205

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val

210 215 220

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr

225 230 235 240

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

245 250 255

Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr

260 265 270

Val Ser Ser

275

<210> 126

<211> 429

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 126

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Gly Trp Phe Arg Leu Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ala Gly Ile Ser Arg Ser Ala Glu Arg Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Leu

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Tyr

65 70 75 80

Leu His Met Asn Arg Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Asp Leu Asp Pro Asn Arg Ile Phe Ser Arg Glu Glu Tyr Ala

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

145 150 155 160

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser

165 170 175

Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Tyr Pro Met Ala Trp Phe

180 185 190

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Gly Val Ser Trp

195 200 205

Gly Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Gln Gly Arg Phe Thr

210 215 220

Val Ser Arg Asp Tyr Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser

225 230 235 240

Leu Lys Pro Glu Asp Ala Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Gly Asp Pro Trp

245 250 255

Gly Arg Leu Phe Arg Val Lys Asp Gln Tyr Ser Asp Trp Gly Gln Gly

260 265 270

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

275 280 285

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

290 295 300

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

305 310 315 320

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys

325 330 335

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg

340 345 350

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser

355 360 365

Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

370 375 380

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

385 390 395 400

Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu

405 410 415

Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

420 425

<210> 127

<211> 429

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 127

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Arg Arg Asn

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Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Leu Leu

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Ala Gly Ile Ser Trp Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Val Asp Ser Val

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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Asp

65 70 75 80

Leu Gln Met Ile Ser Pro Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly

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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

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Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser

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Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Arg Tyr Pro Met Ala Trp Phe

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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

305 310 315 320

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys

325 330 335

Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg

340 345 350

Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser

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Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

370 375 380

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Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

420 425

<210> 128

<211> 429

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 128

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ser Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ala Val Ser Val Asn

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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

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Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser

165 170 175

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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

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Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys

325 330 335

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370 375 380

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<212> PRT

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<223> 氨基酸序列

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

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Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn Ser

165 170 175

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<210> 130

<211> 430

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 130

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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

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Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly Ser

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Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu

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Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys

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<210> 131

<211> 115

<212> PRT

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<400> 131

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<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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<210> 133

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 134

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 136

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<210> 137

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 137

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

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Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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115

<210> 138

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 138

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 142

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

1 5 10 15

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<211> 118

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 143

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Asn

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<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 144

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

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100 105 110

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115

<210> 145

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 145

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Phe

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65 70 75 80

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115

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 146

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1 5

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 147

Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 148

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 148

Gly Gly Ser Leu Ser Arg

1 5

<210> 149

<211> 930

<212> PRT

<213> 智人

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 149

Met Leu Leu Gly Trp Ala Ser Leu Leu Leu Cys Ala Phe Arg Leu Pro

1 5 10 15

Leu Ala Ala Val Gly Pro Ala Ala Thr Pro Ala Gln Asp Lys Ala Gly

20 25 30

Gln Pro Pro Thr Ala Ala Ala Ala Ala Gln Pro Arg Arg Arg Gln Gly

35 40 45

Glu Glu Val Gln Glu Arg Ala Glu Pro Pro Gly His Pro His Pro Leu

50 55 60

Ala Gln Arg Arg Arg Ser Lys Gly Leu Val Gln Asn Ile Asp Gln Leu

65 70 75 80

Tyr Ser Gly Gly Gly Lys Val Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Gly Gly Arg

85 90 95

Arg Phe Leu Leu Asp Leu Glu Arg Asp Gly Ser Val Gly Ile Ala Gly

100 105 110

Phe Val Pro Ala Gly Gly Gly Thr Ser Ala Pro Trp Arg His Arg Ser

115 120 125

His Cys Phe Tyr Arg Gly Thr Val Asp Gly Ser Pro Arg Ser Leu Ala

130 135 140

Val Phe Asp Leu Cys Gly Gly Leu Asp Gly Phe Phe Ala Val Lys His

145 150 155 160

Ala Arg Tyr Thr Leu Lys Pro Leu Leu Arg Gly Pro Trp Ala Glu Glu

165 170 175

Glu Lys Gly Arg Val Tyr Gly Asp Gly Ser Ala Arg Ile Leu His Val

180 185 190

Tyr Thr Arg Glu Gly Phe Ser Phe Glu Ala Leu Pro Pro Arg Ala Ser

195 200 205

Cys Glu Thr Pro Ala Ser Thr Pro Glu Ala His Glu His Ala Pro Ala

210 215 220

His Ser Asn Pro Ser Gly Arg Ala Ala Leu Ala Ser Gln Leu Leu Asp

225 230 235 240

Gln Ser Ala Leu Ser Pro Ala Gly Gly Ser Gly Pro Gln Thr Trp Trp

245 250 255

Arg Arg Arg Arg Arg Ser Ile Ser Arg Ala Arg Gln Val Glu Leu Leu

260 265 270

Leu Val Ala Asp Ala Ser Met Ala Arg Leu Tyr Gly Arg Gly Leu Gln

275 280 285

His Tyr Leu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Ala Asn Arg Leu Tyr Ser His

290 295 300

Ala Ser Ile Glu Asn His Ile Arg Leu Ala Val Val Lys Val Val Val

305 310 315 320

Leu Gly Asp Lys Asp Lys Ser Leu Glu Val Ser Lys Asn Ala Ala Thr

325 330 335

Thr Leu Lys Asn Phe Cys Lys Trp Gln His Gln His Asn Gln Leu Gly

340 345 350

Asp Asp His Glu Glu His Tyr Asp Ala Ala Ile Leu Phe Thr Arg Glu

355 360 365

Asp Leu Cys Gly His His Ser Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val

370 375 380

Gly Thr Ile Cys Ser Pro Glu Arg Ser Cys Ala Val Ile Glu Asp Asp

385 390 395 400

Gly Leu His Ala Ala Phe Thr Val Ala His Glu Ile Gly His Leu Leu

405 410 415

Gly Leu Ser His Asp Asp Ser Lys Phe Cys Glu Glu Thr Phe Gly Ser

420 425 430

Thr Glu Asp Lys Arg Leu Met Ser Ser Ile Leu Thr Ser Ile Asp Ala

435 440 445

Ser Lys Pro Trp Ser Lys Cys Thr Ser Ala Thr Ile Thr Glu Phe Leu

450 455 460

Asp Asp Gly His Gly Asn Cys Leu Leu Asp Leu Pro Arg Lys Gln Ile

465 470 475 480

Leu Gly Pro Glu Glu Leu Pro Gly Gln Thr Tyr Asp Ala Thr Gln Gln

485 490 495

Cys Asn Leu Thr Phe Gly Pro Glu Tyr Ser Val Cys Pro Gly Met Asp

500 505 510

Val Cys Ala Arg Leu Trp Cys Ala Val Val Arg Gln Gly Gln Met Val

515 520 525

Cys Leu Thr Lys Lys Leu Pro Ala Val Glu Gly Thr Pro Cys Gly Lys

530 535 540

Gly Arg Ile Cys Leu Gln Gly Lys Cys Val Asp Lys Thr Lys Lys Lys

545 550 555 560

Tyr Tyr Ser Thr Ser Ser His Gly Asn Trp Gly Ser Trp Gly Ser Trp

565 570 575

Gly Gln Cys Ser Arg Ser Cys Gly Gly Gly Val Gln Phe Ala Tyr Arg

580 585 590

His Cys Asn Asn Pro Ala Pro Arg Asn Asn Gly Arg Tyr Cys Thr Gly

595 600 605

Lys Arg Ala Ile Tyr Arg Ser Cys Ser Leu Met Pro Cys Pro Pro Asn

610 615 620

Gly Lys Ser Phe Arg His Glu Gln Cys Glu Ala Lys Asn Gly Tyr Gln

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645 650 655

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Gly Thr Gly Tyr Tyr Val Val Phe Ser Pro Lys Val Thr Asp Gly Thr

675 680 685

Glu Cys Arg Leu Tyr Ser Asn Ser Val Cys Val Arg Gly Lys Cys Val

690 695 700

Arg Thr Gly Cys Asp Gly Ile Ile Gly Ser Lys Leu Gln Tyr Asp Lys

705 710 715 720

Cys Gly Val Cys Gly Gly Asp Asn Ser Ser Cys Thr Lys Ile Val Gly

725 730 735

Thr Phe Asn Lys Lys Ser Lys Gly Tyr Thr Asp Val Val Arg Ile Pro

740 745 750

Glu Gly Ala Thr His Ile Lys Val Arg Gln Phe Lys Ala Lys Asp Gln

755 760 765

Thr Arg Phe Thr Ala Tyr Leu Ala Leu Lys Lys Lys Asn Gly Glu Tyr

770 775 780

Leu Ile Asn Gly Lys Tyr Met Ile Ser Thr Ser Glu Thr Ile Ile Asp

785 790 795 800

Ile Asn Gly Thr Val Met Asn Tyr Ser Gly Trp Ser His Arg Asp Asp

805 810 815

Phe Leu His Gly Met Gly Tyr Ser Ala Thr Lys Glu Ile Leu Ile Val

820 825 830

Gln Ile Leu Ala Thr Asp Pro Thr Lys Pro Leu Asp Val Arg Tyr Ser

835 840 845

Phe Phe Val Pro Lys Lys Ser Thr Pro Lys Val Asn Ser Val Thr Ser

850 855 860

His Gly Ser Asn Lys Val Gly Ser His Thr Ser Gln Pro Gln Trp Val

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Thr Gly Pro Trp Leu Ala Cys Ser Arg Thr Cys Asp Thr Gly Trp His

885 890 895

Thr Arg Thr Val Gln Cys Gln Asp Gly Asn Arg Lys Leu Ala Lys Gly

900 905 910

Cys Pro Leu Ser Gln Arg Pro Ser Ala Phe Lys Gln Cys Leu Leu Lys

915 920 925

Lys Cys

930

<210> 150

<211> 636

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 150

Met Leu Leu Gly Trp Ala Ala Leu Met Leu Cys Ala Leu Arg Leu Pro

1 5 10 15

Pro Val Ala Ala Gly Pro Thr Ala Ala Pro Ala Gln Asp Lys Ala Gly

20 25 30

Gln Pro Arg Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala Gln Pro Arg Gly Arg

35 40 45

Arg Gly Glu Glu Ala Gln Glu Pro Ala Glu Pro Pro Gly His Pro His

50 55 60

Pro Leu Ala Pro Gln Arg Gly Ser Arg Gly Leu Val Gln Asn Ile Asp

65 70 75 80

Gln Leu Tyr Ser Gly Gly Gly Lys Val Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Gly

85 90 95

Gly Arg Arg Phe Leu Leu Asp Leu Glu Arg Asp Asp Ser Val Gly Ala

100 105 110

Ala Gly Leu Val Pro Ala Gly Gly Gly Pro Asn Ala Thr Arg Arg His

115 120 125

Arg Gly His Cys Phe Tyr Arg Gly Thr Val Asp Gly Ser Pro Arg Ser

130 135 140

Leu Ala Val Phe Asp Leu Cys Gly Gly Leu Asp Gly Phe Phe Ala Val

145 150 155 160

Lys Arg Ala Arg Tyr Thr Leu Gln Pro Leu Leu Arg Gly Pro Trp Ala

165 170 175

Glu Ala Glu Gly Asp Ala Arg Val Tyr Gly Asp Glu Ser Ala Arg Ile

180 185 190

Leu His Val Tyr Thr Arg Glu Gly Phe Ser Phe Glu Ala Leu Pro Pro

195 200 205

Arg Thr Ser Cys Glu Thr His Ala Ser Pro Pro Gly Ala Arg Glu Arg

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Pro Pro Ala Pro Ser Arg Pro Asp Gly Arg Trp Ala Leu Ala Pro Gln

225 230 235 240

Gln Leu Pro Gly Gln Ser Ala Pro Ser Ser Asp Gly Ser Gln Gly Pro

245 250 255

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260 265 270

Val Glu Leu Leu Leu Val Ala Asp Ala Ser Met Ala Arg Met Tyr Gly

275 280 285

Arg Gly Leu Gln His Tyr Leu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Ala Asn Lys

290 295 300

Leu Tyr Ser His Ala Ser Ile Glu Asn His Ile Arg Leu Val Val Val

305 310 315 320

Lys Val Val Val Leu Gly Asp Lys Asp Lys Ser Leu Glu Val Ser Lys

325 330 335

Asn Ala Ala Thr Thr Leu Lys Asn Phe Cys Lys Trp Gln His Gln His

340 345 350

Asn Gln Leu Gly Asp Asp His Glu Glu His Tyr Asp Ala Ala Ile Leu

355 360 365

Phe Thr Arg Glu Asp Leu Cys Gly His His Ser Cys Asp Thr Leu Gly

370 375 380

Met Ala Asp Val Gly Thr Ile Cys Ser Pro Glu Arg Ser Cys Ala Val

385 390 395 400

Ile Glu Asp Asp Gly Leu His Ala Ala Phe Thr Val Ala His Glu Ile

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Gly His Leu Leu Gly Leu Ser His Asp Asp Ser Lys Phe Cys Glu Glu

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Asn Phe Gly Ser Thr Glu Asp Lys Arg Leu Met Ser Ser Ile Leu Thr

435 440 445

Ser Ile Asp Ala Ser Lys Pro Trp Ser Lys Cys Thr Ser Ala Thr Ile

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Thr Glu Phe Leu Asp Asp Gly His Gly Asn Cys Leu Leu Asp Leu Pro

465 470 475 480

Arg Lys Gln Ile Pro Gly Pro Glu Glu Leu Pro Gly Gln Thr Tyr Asp

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Ala Ser Gln Gln Cys Asn Leu Thr Phe Gly Pro Glu Tyr Ser Val Cys

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Pro Gly Met Asp Val Cys Ala Arg Leu Trp Cys Ala Val Val Arg Gln

515 520 525

Gly Gln Met Val Cys Leu Thr Lys Lys Leu Pro Ala Val Glu Gly Thr

530 535 540

Pro Cys Gly Lys Gly Arg Ile Cys Leu Gln Gly Lys Cys Val Asp Lys

545 550 555 560

Thr Lys Lys Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser Ser His Gly Asn Trp Gly Ser

565 570 575

Trp Gly Ser Trp Gly Gln Cys Ser Arg Ser Cys Gly Gly Gly Val Gln

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Phe Ala Tyr Arg His Cys Asn Asn Pro Ala Pro Arg Asn Asn Gly Arg

595 600 605

Tyr Cys Thr Gly Lys Arg Ala Ile Tyr Arg Ser Cys Ser Val Thr Pro

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Cys Pro His His His His His His His His His His

625 630 635

<210> 151

<211> 629

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 151

Met Arg Leu Glu Trp Ala Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Cys

1 5 10 15

Ala Ser Cys Leu Ala Leu Ala Ala Asp Asn Pro Ala Ala Ala Pro Ala

20 25 30

Gln Asp Lys Thr Arg Gln Pro Arg Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Pro

35 40 45

Asp Gln Arg Gln Trp Glu Glu Thr Gln Glu Arg Gly His Pro Gln Pro

50 55 60

Leu Ala Arg Gln Arg Arg Ser Ser Gly Leu Val Gln Asn Ile Asp Gln

65 70 75 80

Leu Tyr Ser Gly Gly Gly Lys Val Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Gly Gly

85 90 95

Arg Arg Phe Leu Leu Asp Leu Glu Arg Asp Asp Thr Val Gly Ala Ala

100 105 110

Gly Gly Ile Val Thr Ala Gly Gly Leu Ser Ala Ser Ser Gly His Arg

115 120 125

Gly His Cys Phe Tyr Arg Gly Thr Val Asp Gly Ser Pro Arg Ser Leu

130 135 140

Ala Val Phe Asp Leu Cys Gly Gly Leu Asp Gly Phe Phe Ala Val Lys

145 150 155 160

His Ala Arg Tyr Thr Leu Lys Pro Leu Leu Arg Gly Ser Trp Ala Glu

165 170 175

Ser Glu Arg Val Tyr Gly Asp Gly Ser Ser Arg Ile Leu His Val Tyr

180 185 190

Thr Arg Glu Gly Phe Ser Phe Glu Ala Leu Pro Pro Arg Thr Ser Cys

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Glu Thr Pro Ala Ser Pro Ser Gly Ala Gln Glu Ser Pro Ser Val His

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Ser Ser Ser Arg Arg Arg Thr Glu Leu Ala Pro Gln Leu Leu Asp His

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Ser Ala Phe Ser Pro Ala Gly Asn Ala Gly Pro Gln Thr Trp Trp Arg

245 250 255

Arg Arg Arg Arg Ser Ile Ser Arg Ala Arg Gln Val Glu Leu Leu Leu

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Val Ala Asp Ser Ser Met Ala Lys Met Tyr Gly Arg Gly Leu Gln His

275 280 285

Tyr Leu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Ala Asn Arg Leu Tyr Ser His Ala

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Ser Ile Glu Asn His Ile Arg Leu Ala Val Val Lys Val Val Val Leu

305 310 315 320

Thr Asp Lys Ser Leu Glu Val Ser Lys Asn Ala Ala Thr Thr Leu Lys

325 330 335

Asn Phe Cys Lys Trp Gln His Gln His Asn Gln Leu Gly Asp Asp His

340 345 350

Glu Glu His Tyr Asp Ala Ala Ile Leu Phe Thr Arg Glu Asp Leu Cys

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Gly His His Ser Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val Gly Thr Ile

370 375 380

Cys Ser Pro Glu Arg Ser Cys Ala Val Ile Glu Asp Asp Gly Leu His

385 390 395 400

Ala Ala Phe Thr Val Ala His Glu Ile Gly His Leu Leu Gly Leu Ser

405 410 415

His Asp Asp Ser Lys Phe Cys Glu Glu Asn Phe Gly Ser Thr Glu Asp

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Lys Arg Leu Met Ser Ser Ile Leu Thr Ser Ile Asp Ala Ser Lys Pro

435 440 445

Trp Ser Lys Cys Thr Ser Ala Thr Ile Thr Glu Phe Leu Asp Asp Gly

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His Gly Asn Cys Leu Leu Asp Val Pro Arg Lys Gln Ile Leu Gly Pro

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Glu Glu Leu Pro Gly Gln Thr Tyr Asp Ala Thr Gln Gln Cys Asn Leu

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Thr Phe Gly Pro Glu Tyr Ser Val Cys Pro Gly Met Asp Val Cys Ala

500 505 510

Arg Leu Trp Cys Ala Val Val Arg Gln Gly Gln Met Val Cys Leu Thr

515 520 525

Lys Lys Leu Pro Ala Val Glu Gly Thr Pro Cys Gly Lys Gly Arg Ile

530 535 540

Cys Leu Gln Gly Lys Cys Val Asp Lys Thr Lys Lys Lys Tyr Tyr Ser

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Thr Ser Ser His Gly Asn Trp Gly Ser Trp Gly Pro Trp Gly Gln Cys

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Ser Arg Ser Cys Gly Gly Gly Val Gln Phe Ala Tyr Arg His Cys Asn

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Asn Pro Ala Pro Arg Asn Ser Gly Arg Tyr Cys Thr Gly Lys Arg Ala

595 600 605

Ile Tyr Arg Ser Cys Ser Val Ile Pro Cys Pro His His His His His

610 615 620

His His His His His

625

<210> 152

<211> 632

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 152

Met Leu Leu Gly Trp Ala Ser Leu Leu Leu Cys Ala Phe Arg Leu Pro

1 5 10 15

Gln Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Pro Ala Gln Asp Lys Ala Gly

20 25 30

Gln Pro Arg Ala Ala Ala Ala Ala Pro Gln Pro Arg Arg Arg Gln Gly

35 40 45

Glu His Ala Pro Leu Arg Val Glu Pro Pro Gly His Pro His Ala Leu

50 55 60

Ala Pro Gln Arg Arg Gly Arg Gly Leu Leu Gln Ser Ile Asp Arg Leu

65 70 75 80

Tyr Ser Gly Gly Gly Lys Val Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Gly Gly Arg

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Arg Phe Leu Leu Asp Leu Glu Arg Asp Gly Ser Val Gly Ala Ala Gly

100 105 110

Leu Phe Pro Ala Gly Gly Gly Leu Ser Ala Pro Arg Arg His Arg Ser

115 120 125

His Cys Phe Tyr Arg Gly Thr Val Asp Gly Ser Pro Arg Ser Leu Ala

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Ala Arg Tyr Thr Val Lys Pro Leu Leu Arg Gly Pro Trp Ala Glu Ala

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Asp Thr Pro Arg Val Tyr Gly Asp Glu Ser Ala Arg Ile Pro His Val

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Tyr Thr Arg Glu Gly Phe Ser Phe Glu Ala Leu Pro Pro Arg Ala Ser

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Cys Glu Thr Pro Ala Ser Gln Pro Gly Pro His Glu Arg Pro Pro Ala

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His Asn Ser Pro Gly Arg His Ser Thr Val Asp Pro Gln Leu Pro Glu

225 230 235 240

Leu Ser Ala Leu Ser Pro Ala Gly Asp Pro Gly Gln Gln Ile Trp Trp

245 250 255

Arg Arg Arg Arg Arg Ser Ile Ser Arg Ala Arg Gln Val Glu Leu Leu

260 265 270

Leu Val Ala Asp Gly Ser Met Ala Lys Met Tyr Gly Arg Gly Leu Gln

275 280 285

His Tyr Leu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Ala Asn Arg Leu Tyr Ser His

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Ala Ser Ile Glu Asn His Ile Arg Leu Ala Val Val Lys Val Val Val

305 310 315 320

Leu Gly Asp Lys Asp Lys Ser Leu Glu Val Ser Lys Asn Ala Ala Thr

325 330 335

Thr Leu Lys Asn Phe Cys Lys Trp Gln His Gln His Asn Gln Leu Gly

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Asp Asp His Glu Glu His Tyr Asp Ala Ala Ile Leu Phe Thr Arg Glu

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Asp Leu Cys Gly His His Ser Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val

370 375 380

Gly Thr Ile Cys Ser Pro Glu Arg Ser Cys Ala Val Ile Glu Asp Asp

385 390 395 400

Gly Leu His Ala Ala Phe Thr Val Ala His Glu Ile Gly His Leu Leu

405 410 415

Gly Leu Ser His Asp Asp Ser Lys Phe Cys Glu Glu Asn Phe Gly Leu

420 425 430

Thr Glu Asp Lys Arg Leu Met Ser Ser Ile Leu Thr Ser Ile Asp Ala

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Ser Lys Pro Trp Ser Lys Cys Thr Ser Ala Thr Met Thr Glu Phe Leu

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Asp Asp Gly His Gly Asn Cys Leu Leu Asp Val Pro Arg Lys Gln Ile

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Pro Ser Pro Glu Glu Leu Pro Gly Gln Thr Tyr Asp Ala Thr Gln Gln

485 490 495

Cys Asn Leu Thr Phe Gly Pro Glu Tyr Ser Val Cys Pro Gly Met Asp

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Val Cys Ala Arg Leu Trp Cys Ala Val Val Arg Gln Gly Gln Met Val

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Cys Leu Thr Lys Lys Leu Pro Ala Val Glu Gly Thr Pro Cys Gly Lys

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Gly Arg Ile Cys Leu Gln Gly Lys Cys Val Asp Lys Thr Lys Lys Lys

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Tyr Tyr Ser Thr Ser Ser His Gly Asn Trp Gly Ser Trp Gly Pro Trp

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Gly Gln Cys Ser Arg Ser Cys Gly Gly Gly Val Gln Phe Ala Tyr Arg

580 585 590

His Cys Asn Asn Pro Ala Pro Arg Asn Ser Gly Arg Tyr Cys Thr Gly

595 600 605

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His His His His His His His His

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<210> 153

<211> 632

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 153

Met Arg Leu Glu Trp Ala Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser

1 5 10 15

Ala Ser Cys Leu Ser Leu Ala Ala Asp Ser Pro Ala Ala Ala Pro Ala

20 25 30

Gln Asp Lys Thr Arg Gln Pro Gln Ala Ala Ala Ala Ala Ala Glu Pro

35 40 45

Asp Gln Pro Gln Gly Glu Glu Thr Arg Glu Arg Gly His Leu Gln Pro

50 55 60

Leu Ala Gly Gln Arg Arg Ser Gly Gly Leu Val Gln Asn Ile Asp Gln

65 70 75 80

Leu Tyr Ser Gly Gly Gly Lys Val Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Gly Gly

85 90 95

Arg Arg Phe Leu Leu Asp Leu Glu Arg Asp Asp Thr Val Gly Ala Ala

100 105 110

Gly Ser Ile Val Thr Ala Gly Gly Gly Leu Ser Ala Ser Ser Gly His

115 120 125

Arg Gly His Cys Phe Tyr Arg Gly Thr Val Asp Gly Ser Pro Arg Ser

130 135 140

Leu Ala Val Phe Asp Leu Cys Gly Gly Leu Asp Gly Phe Phe Ala Val

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Lys His Ala Arg Tyr Thr Leu Lys Pro Leu Leu Arg Gly Ser Trp Ala

165 170 175

Glu Tyr Glu Arg Ile Tyr Gly Asp Gly Ser Ser Arg Ile Leu His Val

180 185 190

Tyr Asn Arg Glu Gly Phe Ser Phe Glu Ala Leu Pro Pro Arg Ala Ser

195 200 205

Cys Glu Thr Pro Ala Ser Pro Ser Gly Pro Gln Glu Ser Pro Ser Val

210 215 220

His Ser Arg Ser Arg Arg Arg Ser Ala Leu Ala Pro Gln Leu Leu Asp

225 230 235 240

His Ser Ala Phe Ser Pro Ser Gly Asn Ala Gly Pro Gln Thr Trp Trp

245 250 255

Arg Arg Arg Arg Arg Ser Ile Ser Arg Ala Arg Gln Val Glu Leu Leu

260 265 270

Leu Val Ala Asp Ser Ser Met Ala Arg Met Tyr Gly Arg Gly Leu Gln

275 280 285

His Tyr Leu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Ala Asn Arg Leu Tyr Ser His

290 295 300

Ala Ser Ile Glu Asn His Ile Arg Leu Ala Val Val Lys Val Val Val

305 310 315 320

Leu Thr Asp Lys Asp Thr Ser Leu Glu Val Ser Lys Asn Ala Ala Thr

325 330 335

Thr Leu Lys Asn Phe Cys Lys Trp Gln His Gln His Asn Gln Leu Gly

340 345 350

Asp Asp His Glu Glu His Tyr Asp Ala Ala Ile Leu Phe Thr Arg Glu

355 360 365

Asp Leu Cys Gly His His Ser Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val

370 375 380

Gly Thr Ile Cys Ser Pro Glu Arg Ser Cys Ala Val Ile Glu Asp Asp

385 390 395 400

Gly Leu His Ala Ala Phe Thr Val Ala His Glu Ile Gly His Leu Leu

405 410 415

Gly Leu Ser His Asp Asp Ser Lys Phe Cys Glu Glu Asn Phe Gly Thr

420 425 430

Thr Glu Asp Lys Arg Leu Met Ser Ser Ile Leu Thr Ser Ile Asp Ala

435 440 445

Ser Lys Pro Trp Ser Lys Cys Thr Ser Ala Thr Ile Thr Glu Phe Leu

450 455 460

Asp Asp Gly His Gly Asn Cys Leu Leu Asp Leu Pro Arg Lys Gln Ile

465 470 475 480

Leu Gly Pro Glu Glu Leu Pro Gly Gln Thr Tyr Asp Ala Thr Gln Gln

485 490 495

Cys Asn Leu Thr Phe Gly Pro Glu Tyr Ser Val Cys Pro Gly Met Asp

500 505 510

Val Cys Ala Arg Leu Trp Cys Ala Val Val Arg Gln Gly Gln Met Val

515 520 525

Cys Leu Thr Lys Lys Leu Pro Ala Val Glu Gly Thr Pro Cys Gly Lys

530 535 540

Gly Arg Val Cys Leu Gln Gly Lys Cys Val Asp Lys Thr Lys Lys Lys

545 550 555 560

Tyr Tyr Ser Thr Ser Ser His Gly Asn Trp Gly Ser Trp Gly Pro Trp

565 570 575

Gly Gln Cys Ser Arg Ser Cys Gly Gly Gly Val Gln Phe Ala Tyr Arg

580 585 590

His Cys Asn Asn Pro Ala Pro Arg Asn Ser Gly Arg Tyr Cys Thr Gly

595 600 605

Lys Arg Ala Ile Tyr Arg Ser Cys Ser Val Thr Pro Cys Pro His His

610 615 620

His His His His His His His His

625 630

<210> 154

<211> 632

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 154

Met Leu Leu Gly Trp Ala Ser Leu Leu Leu Cys Ala Phe Arg Leu Pro

1 5 10 15

Leu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Ala Ala Pro Ala Gln Asp Lys Ala Gly

20 25 30

Gln Pro Ala Thr Ala Ala Ala Ala Ala Gln Pro Arg Arg Arg Gln Gly

35 40 45

Glu Glu Val Gln Glu Arg Thr Glu Pro Pro Gly His Pro His Pro Leu

50 55 60

Ala Gln Arg Arg Ser Ser Lys Gly Leu Val Gln Asn Ile Asp Gln Leu

65 70 75 80

Tyr Ser Gly Gly Gly Lys Val Gly Tyr Leu Val Tyr Ala Gly Gly Arg

85 90 95

Arg Phe Leu Leu Asp Leu Glu Arg Asp Gly Ser Val Gly Thr Ala Gly

100 105 110

Phe Val Pro Thr Glu Gly Gly Thr Ser Ala Pro Trp Arg His Arg Ser

115 120 125

His Cys Phe Tyr Arg Gly Thr Val Asp Gly Ser Pro Arg Ser Leu Ala

130 135 140

Val Phe Asp Leu Cys Gly Gly Leu Asp Gly Phe Phe Ala Val Lys His

145 150 155 160

Ala Arg Tyr Thr Leu Lys Pro Leu Leu Arg Gly Pro Trp Ala Glu Glu

165 170 175

Glu Thr Arg Arg Val Tyr Gly Asp Gly Ser Ala Arg Ile Leu His Val

180 185 190

Tyr Thr Arg Glu Gly Phe Ser Phe Glu Ala Leu Gln Pro Arg Ala Ser

195 200 205

Cys Glu Thr Pro Ala Ser Thr Pro Glu Pro His Glu Arg Pro Pro Ala

210 215 220

His Ser Asn Pro Gly Gly Arg Ala Ala Leu Ala Ser Gln Leu Leu Asp

225 230 235 240

Gln Ser Ala Val Ser Pro Ala Gly Gly Pro Gly Pro Gln Thr Trp Trp

245 250 255

Arg Arg Arg Arg Arg Ser Ile Ser Arg Ala Arg Gln Val Glu Leu Leu

260 265 270

Leu Val Ala Asp Ala Ser Met Ala Arg Leu Tyr Gly Arg Gly Leu Gln

275 280 285

His Tyr Leu Leu Thr Leu Ala Ser Ile Ala Asn Arg Leu Tyr Ser His

290 295 300

Ala Ser Ile Glu Asn His Ile Arg Leu Ala Val Val Lys Val Val Val

305 310 315 320

Leu Gly Asp Lys Asp Lys Ser Leu Glu Val Ser Lys Asn Ala Ala Thr

325 330 335

Thr Leu Lys Asn Phe Cys Lys Trp Gln His Gln His Asn Gln Leu Gly

340 345 350

Asp Asp His Glu Glu His Tyr Asp Ala Ala Ile Leu Phe Thr Arg Glu

355 360 365

Asp Leu Cys Gly His His Ser Cys Asp Thr Leu Gly Met Ala Asp Val

370 375 380

Gly Thr Ile Cys Ser Pro Glu Arg Ser Cys Ala Val Ile Glu Asp Asp

385 390 395 400

Gly Leu His Ala Ala Phe Thr Val Ala His Glu Ile Gly His Leu Leu

405 410 415

Gly Leu Ser His Asp Asp Ser Lys Phe Cys Glu Glu Thr Phe Gly Ser

420 425 430

Thr Glu Asp Lys Arg Leu Met Ser Ser Ile Leu Thr Ser Ile Asp Ala

435 440 445

Ser Lys Pro Trp Ser Lys Cys Thr Ser Ala Thr Ile Thr Glu Phe Leu

450 455 460

Asp Asp Gly His Gly Asn Cys Leu Leu Asp Gln Pro Arg Lys Gln Ile

465 470 475 480

Leu Gly Pro Glu Glu Leu Pro Gly Gln Thr Tyr Asp Ala Thr Gln Gln

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Cys Asn Leu Thr Phe Gly Pro Glu Tyr Ser Val Cys Pro Gly Met Asp

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Val Cys Ala Arg Leu Trp Cys Ala Val Val Arg Gln Gly Gln Met Val

515 520 525

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530 535 540

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Tyr Tyr Ser Thr Ser Ser His Gly Asn Trp Gly Ser Trp Gly Ser Trp

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Gly Gln Cys Ser Arg Ser Cys Gly Gly Gly Val Gln Phe Ala Tyr Arg

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<210> 155

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 155

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1 5 10 15

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Ile Pro Gln Pro Ser Pro Leu Arg Val Leu Leu Gly Thr Ser Leu Thr

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Glu Lys Glu Val Val Leu Leu Val Ala Thr Glu Gly Arg Val Arg Val

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130 135 140

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145 150 155 160

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290 295 300

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305 310 315 320

Asn Leu Leu Gly Val Arg Thr Val Tyr Val His Ala Asn Gln Thr Gly

325 330 335

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340 345 350

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370 375 380

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485 490 495

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530 535 540

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565 570 575

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595 600 605

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1285 1290 1295

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Ser Thr Ser Ala Val Gly Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ser Gly Gly Glu

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Val Leu Glu Ile Ser Val Ser Gly Val Glu Asp Ile Ser Gly Leu Pro

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1380 1385 1390

Glu Leu Pro Ser Gly Glu Gly Leu Glu Thr Ser Ala Ser Gly Val Glu

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1410 1415 1420

Ser Gly Phe Gly Asp Leu Ser Gly Val Pro Ser Gly Gly Glu Gly Leu

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Glu Thr Ser Ala Ser Glu Val Gly Thr Asp Leu Ser Gly Leu Pro Ser

1445 1450 1455

Gly Arg Glu Gly Leu Glu Thr Ser Ala Ser Gly Ala Glu Asp Leu Ser

1460 1465 1470

Gly Leu Pro Ser Gly Lys Glu Asp Leu Val Gly Ser Ala Ser Gly Asp

1475 1480 1485

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1490 1495 1500

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1525 1530 1535

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1540 1545 1550

Glu Val Val Thr Ala Ser Thr Ala Ser Glu Leu Glu Gly Arg Gly Thr

1555 1560 1565

Ile Gly Ile Ser Gly Ala Gly Glu Ile Ser Gly Leu Pro Ser Ser Glu

1570 1575 1580

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1685 1690 1695

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Ser Ser Arg Ala Glu Ile Gly Ser Ser Leu Pro Ser Gly Ala Tyr Tyr

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Glu Gly Pro Ser Gly Ile Leu Glu Leu Ser Gly Ala His Ser Gly Ala

1845 1850 1855

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1875 1880 1885

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1925 1930 1935

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1940 1945 1950

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2005 2010 2015

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2020 2025 2030

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2050 2055 2060

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Ala Ala Ala Pro Ala Arg Ser Cys Ala Glu Glu Pro Cys Gly Ala Gly

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<210> 156

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 156

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

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Val Val Arg Trp Tyr Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val

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<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 157

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

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35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ala Tyr Arg Arg Arg Arg Ala Ser Ser Asn Arg Gly Leu Trp Asp

100 105 110

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<400> 158

000

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 159

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 160

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 161

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 162

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 163

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 165

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 166

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 167

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 168

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

20 25 30

<210> 169

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 169

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser

35

<210> 170

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 170

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

35 40

<210> 171

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 171

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 172

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

1 5 10 15

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

20

<210> 173

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 173

Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Pro Ala Ala Ala

1 5 10

<210> 174

<211> 62

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 氨基酸序列

<400> 174

Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys

1 5 10 15

Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

20 25 30

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu

35 40 45

Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

50 55 60

Claims (51)

1.多肽，其包含至少一个免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)，该结构域结合具有血小板应答蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶(ADAMTS)。

2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述ADAMTS选自ADAMTS1-ADAMTS19，优选地ADAMTS5、ADAMTS4、ADAMTS1、ADAMTS8、ADAMTS9和ADAMTS15以及ADAMTS20，最优选地ADAMTS5。

3.根据权利要求2所述的多肽，其中所述ISVD结合ADAMTS，优选地ADAMTS5，不结合ADAMTS4、MMP1或MMP14。

4.根据权利要求3所述的多肽，其中所述结合ADAMTS5的ISVD包含3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)，其中

(i)CDR1选自SEQ ID NO:21、35、20、22、25、33、28、24、23、26、27、29、30、31、32和34；和

与SEQ ID NO:21、35、20、22、25、33、33、28、24、23、26、27、29、30、31、32和34具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；

(ii)CDR2选自SEQ ID NO:37、53、36、40、50、51、44、45、43、39、38、41、119、42、46、47、48、49和52；和

与SEQ ID NO:37、53、36、40、50、51、44、45、43、39、38、41、119、42、46、47、48、49和52具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列；

和

(iii)CDR3选自SEQ ID NO:55、118、71、54、58、68、69、62、63、61、57、56、59、60、64、65、66、67和70；和

与SEQ ID NO:55、118、71、54、58、68、69、62、63、61、57、56、59、60、64、65、66、67和70具有1、2、3或4个氨基酸差异的氨基酸序列。

5.根据权利要求3所述的多肽，其中所述特异性结合ADAMTS5的ISVD包含3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)，其中

(i)CDR1选自：

(a)SEQ ID NO:22；和

(b)与SEQ ID NO:22具有1、2、3、4、5或6个氨基酸差异的氨基酸序列，其中氨基酸差异定义如下：

-在位置2，S已改变为R；和/或

-在位置3，A已改变为T；和/或

-在位置4，V已改变为F；和/或

-在位置6，V已改变为S；和/或

-在位置7，N已改变为Y；和/或

-在位置10，A已改变为G；

(ii)CDR2是SEQ ID NO:36；和

(iii)CDR3是SEQ ID NO:54。

6.根据权利要求3所述的多肽，其中所述特异性结合ADAMTS5的ISVD包含3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)，其中

(i)CDR1是SEQ ID NO:33；

(ii)CDR2选自：

(c)SEQ ID NO:50；和

(d)与SEQ ID NO:50具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列，其中氨基酸差异定义如下：

-在位置8，M已改变为I；和/或

-在位置9，P已改变为T；和/或

-在位置10，Y已改变为F；

和

(iii)CDR3选自：

(e)SEQ ID NO:68；和

(f)与SEQ ID NO:68具有1或2个氨基酸差异的氨基酸序列，其中氨基酸差异定义如下：

-在位置5，F已改变为L；和/或

-在位置11，D已改变为E。

7.根据权利要求3所述的多肽，其中所述特异性结合ADAMTS5的ISVD包含3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)，其中

(i)CDR1是SEQ ID NO:28；

(ii)CDR2选自：

(c)SEQ ID NO:44；和

(d)与SEQ ID NO:44具有1、2或3个氨基酸差异的氨基酸序列，其中氨基酸差异定义如下：

-在位置3，S已改变为T；和/或

-在位置4，R已改变为W；和/或

-在位置8，T已改变为I；和/或

-在位置9，T已改变为L；

和

(iii)CDR3选自：

(e)SEQ ID NO:62；和

(f)与SEQ ID NO:62具有1或2个氨基酸差异的氨基酸序列，其中氨基酸差异定义如下：

-在位置1，G已改变为S；和/或

-在位置14，D已改变为E。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽，其中：

-CDR1选自SEQ ID NO:21、35、20、22、25、33、28、24、23、26、27、29、30、31、32和34；

-CDR2选自SEQ ID NO:37、53、36、40、50、51、44、45、43、39、38、41、119、42、46、47、48、49和52；和

-CDR3选自SEQ ID NO:55、118、71、54、58、68、69、62、63、61、57、56、59、60、64、65、66、67和70。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的多肽，其中所述ISVD包含选自以下的CDR1、CDR2和CDR3组合：

CDR1是SEQ ID NO:21，CDR2是SEQ ID NO:37，CDR3是SEQ ID NO:55；

CDR1是SEQ ID NO:35，CDR2是SEQ ID NO:53，CDR3是SEQ ID NO:118；

CDR1是SEQ ID NO:35，CDR2是SEQ ID NO:53，CDR3是SEQ ID NO:71；

CDR1是SEQ ID NO:20，CDR2是SEQ ID NO:36，并且CDR3是SEQ ID NO:54；

CDR1是SEQ ID NO:22，CDR2是SEQ ID NO:36，并且CDR3是SEQ ID NO:54；

CDR1是SEQ ID NO:25，CDR2是SEQ ID NO:40，并且CDR3是SEQ ID NO:58；

CDR1是SEQ ID NO:33，CDR2是SEQ ID NO:50，并且CDR3是SEQ ID NO:68；

CDR1是SEQ ID NO:33，CDR2是SEQ ID NO:51，并且CDR3是SEQ ID NO:69；

CDR1是SEQ ID NO:28，CDR2是SEQ ID NO:44，并且CDR3是SEQ ID NO:62；

CDR1是SEQ ID NO:28，CDR2是SEQ ID NO:45，并且CDR3是SEQ ID NO:63；

CDR1是SEQ ID NO:28，CDR2是SEQ ID NO:43，并且CDR3是SEQ ID NO:61；

CDR1是SEQ ID NO:24，CDR2是SEQ ID NO:39，并且CDR3是SEQ ID NO:57；

CDR1是SEQ ID NO:23，CDR2是SEQ ID NO:38，并且CDR3是SEQ ID NO:56；

CDR1是SEQ ID NO:26，CDR2是SEQ ID NO:41，并且CDR3是SEQ ID NO:59；

CDR1是SEQ ID NO:27，CDR2是SEQ ID NO:119，并且CDR3是SEQ ID NO:60；

CDR1是SEQ ID NO:27，CDR2是SEQ ID NO:42，并且CDR3是SEQ ID NO:60；

CDR1是SEQ ID NO:29，CDR2是SEQ ID NO:46，并且CDR3是SEQ ID NO:64；

CDR1是SEQ ID NO:30，CDR2是SEQ ID NO:47，并且CDR3是SEQ ID NO:65；

CDR1是SEQ ID NO:31，CDR2是SEQ ID NO:48，并且CDR3是SEQ ID NO:66；

CDR1是SEQ ID NO:32，CDR2是SEQ ID NO:49，并且CDR3是SEQ ID NO:67；和

CDR1是SEQ ID NO:34，CDR2是SEQ ID NO:52，并且CDR3是SEQ ID NO:70。

10.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述ISVD由4个框架区(分别是FR1-FR4)和所述3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3组成或基本上由其组成。

11.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中所述多肽是SEQ ID NO:129或130或者与SEQ ID NO:129或130具有至少95％序列同一性的多肽。

12.根据权利要求4、8和9中任一项所述的多肽，其中CDR1是SEQ ID NO:21，CDR2是SEQID NO:37，并且CDR3是SEQ ID NO:55。

13.根据权利要求4至12中任一项所述的多肽，其中所述ISVD选自SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、16、17、10、11、9、5、4、7、8、117、12、13、14、15和18。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的多肽，其中所述多肽结合ADAMTS5，其K_D是1E^-07M至1E^-13M，例如1E^-08M至1E^-12M，优选地最多是1E^-07M，优选地低于1E^-08M或1E^-09M，或甚至低于1E^-10M，例如5E^-11M、4E^-11M、3E^-11M、2E^-11M、1.7E^-11M、1E^-11M或甚至5E^-12M、4E^-12M、3E^-12M、1E^-12M，例如通过KinExA或备选地通过Gyrolab确定的。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的多肽，其中所述多肽抑制ADAMTS5的活性，其IC₅₀是1E^-07M至1E^-12M，例如1E^-08M至1E^-11M，例如通过人FRET测定法或人AlphaLISA确定的。

16.根据权利要求15所述的多肽，其中所述多肽抑制ADAMTS5的(酶促)活性，其IC₅₀最多是1E^-07M，优选地1E^-08M、5E^-09M或4E^-9M、3E^-9M、2E^-9M，例如1E^-9M。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的多肽，其中所述多肽调控ADAMTS5，其EC₅₀是1E^-07M至1E^-12M，例如1E^-08M至1E^-11M，例如通过结合ELISA确定的。

18.根据权利要求1至14中任一项所述的多肽，其中所述多肽结合ADAMTS5，其解离速率小于1E^-04s^-1，例如通过SPR确定的。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的多肽，其中所述ADAMTS5是人ADAMTS5(SEQ IDNO:149)、牛ADAMTS5(SEQ ID NO:150)、大鼠ADAMTS5(SEQ ID NO:151)、豚鼠ADAMTS5(SEQID NO:152)、小鼠ADAMTS5(SEQ ID NO:153)或食蟹猴ADAMTS5(SEQ ID NO:154)，优选地人ADAMTS5，最优选地SEQ ID NO:149。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的多肽，其中所述多肽拮抗ADAMTS5的活性，例如蛋白酶活性，例如裂解聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、短蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖和/或双糖链蛋白聚糖，优选地裂解聚集蛋白聚糖；优选地拮抗ADAMTS5的聚集蛋白聚糖酶活性。

21.根据权利要求1-19中任一项所述的多肽，其中所述多肽阻断ADAMTS5与聚集蛋白聚糖的结合至少20％，例如至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至更高，例如通过FRET、AlphaLISA或ELISA确定的。

22.根据权利要求1至20中任一项所述的多肽，其中所述多肽抑制ADAMTS5的蛋白酶活性，例如抑制底物的蛋白水解，所述底物例如聚集蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、短蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖和/或双糖链蛋白聚糖，优选聚集蛋白聚糖。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的多肽，其包含至少2个ISVD，其中至少1个ISVD特异性结合ADAMTS，优选地ADAMTS5，优选地选自SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、16、17、10、11、9、5、4、7、117、8、12、13、14、15和18。

24.根据权利要求23所述的多肽，其中所述至少2个ISVD特异性结合ADAMTS，优选地ADAMTS5。

25.多肽，其包含两个或更多个各自独立地特异性结合ADAMTS5的ISVD，其中

a)至少“第一”ISVD特异性结合ADAMTS5的第一抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象；并且其中，

b)至少“第二”ISVD特异性结合ADAMTS5的分别不同于第一抗原决定簇抗原决定簇、部分、结构域、亚基或构象的第二抗原决定簇、表位、部分、结构域、亚基或构象。

26.根据权利要求25所述的多肽，其中所述特异性结合ADAMTS5的“第一”ISVD选自SEQID NO:2、1、3、6、16、17、10、11、9、5、4、7、8、117、12、13、14、15和18。

27.根据权利要求25或26所述的多肽，其中所述特异性结合ADAMTS5的“第二”ISVD为SEQ ID NO:118或19。

28.根据权利要求25-27中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含选自SEQ ID NO:126(克隆129 2F3-093-Alb)、SEQ ID NO:127(克隆130049-093-Alb)和SEQ ID NO:128(克隆131 9D3-093-Alb)的多肽或与SEQ ID NO:126、127、128、130或131具有至少95％氨基酸序列同一性的多肽。

29.根据权利要求1至28中任一项所述的多肽，其进一步包含结合血清白蛋白的ISVD。

30.根据权利要求29所述的多肽，其中所述结合血清白蛋白的ISVD基本上由4个框架区(分别是FR1至FR4)和3个互补决定区(分别是CDR1至CDR3)组成，其中CDR1是SEQ ID NO:146，CDR2是SEQ ID NO:147，并且CDR3是SEQ ID NO:148。

31.根据权利要求30所述的多肽，其中所述结合血清白蛋白的ISVD选自ALB8(SEQ IDNO:131)、ALB23(SEQ ID NO:132)、ALB129(SEQ ID NO:133)、ALB132(SEQ ID NO:134)、ALB11(SEQ ID NO:135)、ALB11(S112K)-A(SEQ ID NO:136)、ALB82(SEQ ID NO:137)、ALB82-A(SEQ ID NO:138)、ALB82-AA(SEQ ID NO:139)、ALB82-AAA(SEQ ID NO:140)、ALB82-G(SEQ ID NO:141)、ALB82-GG(SEQ ID NO:142)、ALB82-GGG(SEQ ID NO:143)、ALB92(SEQ ID NO:144)和ALB223(SEQ ID NO:145)。

32.根据权利要求31所述的多肽，选自：

SEQ ID NO:129(克隆577 2F3^SO-Alb)，

SEQ ID NO:130(克隆579 2F3^SO-093-Alb)，

SEQ ID NO:120(克隆4 2A12-Alb)，

SEQ ID NO:121(克隆5 2D7-Alb)，

SEQ ID NO:122(克隆6 2F3-Alb)，

SEQ ID NO:123(克隆69 049-Alb)，

SEQ ID NO:124(克隆70 9D3-Alb)，

SEQ ID NO:125(克隆71 3B2-Alb)，

SEQ ID NO:126(克隆129 2F3-093-Alb)，

SEQ ID NO:127(克隆130 049-093-Alb)，和

SEQ ID NO:128(克隆131 9D3-093-Alb)。

33.根据权利要求1至32中任一项所述的多肽，其进一步包含至少一个特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD，优选地选自SEQ ID NO:156(纳米抗体00745 PEA114F08)和SEQ ID NO:157(纳米抗体00747 PEA604F02)。

34.根据权利要求1至32中任一项所述的多肽，其包含至少2个特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD。

35.根据权利要求34所述的多肽，其中所述至少2个特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD可以相同或不同。

36.根据权利要求34或35所述的多肽，其中所述至少2个特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD独立地选自SEQ ID NO:156和157。

37.根据权利要求33至36中任一项所述的多肽，其中所述特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD特异性结合人聚集蛋白聚糖[SEQ ID NO:155]。

38.根据权利要求33至37中任一项所述的多肽，其中所述特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD特异性结合狗聚集蛋白聚糖，牛聚集蛋白聚糖，大鼠聚集蛋白聚糖；猪聚集蛋白聚糖；小鼠聚集蛋白聚糖，兔聚集蛋白聚糖；食蟹猴聚集蛋白聚糖和/或恒河猴聚集蛋白聚糖。

39.根据权利要求33至38中任一项所述的多肽，其中所述特异性结合聚集蛋白聚糖的ISVD优选地结合软骨组织，例如软骨和/或半月板。

40.根据权利要求1至39中任一项所述的多肽，其中所述多肽在37℃的滑膜液(SF)中具有至少7天，例如14天、21天、1个月、2个月或甚至3个月的稳定性。

41.根据权利要求23至40中任一项所述的多肽，其中所述至少两个ISVD彼此直接连接或经接头连接。

42.根据权利要求41所述的多肽，其中所述接头选自SEQ ID NO:158至174，优选地SEQID NO:169。

43.根据权利要求1-42中任一项所述的多肽，其进一步包含C末端延伸。

44.根据权利要求43所述的多肽，其中所述C末端延伸是C末端延伸(X)n，其中n是1至10，优选地1至5，例如1、2、3、4或5(并且优选地是1或2，例如1)；并且每个X是独立地选择的(优选地天然存在的)氨基酸残基，并且优选地独立地选自丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)或异亮氨酸(I)。

45.根据权利要求1至44中任一项所述的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、116、117、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129或130中的任一个具有至少80％、90％、95％或100％的序列同一性。

46.治疗和/或预防个体的疾病或病症的方法，例如所述疾病或病症涉及ADAMTS5活性，该方法包括以有效治疗或预防所述疾病或病症的症状的量向所述个体施用权利要求1-45中任一项的多肽。

47.根据权利要求46所述的方法，其中所述疾病或病症选自关节病和软骨营养不良、关节炎疾病，例如骨关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎、银屑病关节炎、外伤性破裂或脱离、软骨发育不全、肋软骨炎、脊椎干骺端发育不良、椎间盘突出症、腰椎间盘退变疾病、退行性关节疾病和复发性多发性软骨炎、剥离性骨软骨炎和聚集蛋白聚糖病变。

48.根据权利要求1至45中任一项所述的多肽，其用作药物。

49.根据权利要求1至45中任一项所述的多肽，其用于治疗或预防ADAMTS5相关疾病的症状，所述疾病例如为关节病和软骨营养不良、关节炎疾病，例如骨关节炎、类风湿性关节炎、痛风性关节炎、银屑病关节炎、外伤性破裂或脱离、软骨发育不全、肋软骨炎、脊椎干骺端发育不良、椎间盘突出症、腰椎间盘退变疾病、退行性关节疾病和复发性多发性软骨炎、剥离性骨软骨炎和聚集蛋白聚糖病变。

50.根据权利要求1至45中任一项所述的多肽，其中所述多肽交叉阻断由SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、16、17、10、11、9、5、4、7、117、8、12、13、14、15和18中任何一个表示的至少一种多肽与ADAMTS5的结合，和/或被由SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、16、17、10、11、9、5、4、7、117、8、12、13、14、15和18中的任何一个表示的至少一种多肽交叉阻断与ADAMTS5的结合。

51.多肽，其交叉阻断由SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、16、17、10、11、9、5、4、7、117、8、12、13、14、15和18中任何一个表示的多肽与ADAMTS5的结合，和/或被由SEQ ID NO:2、116、19、1、3、6、16、17、10、11、9、5、4、7、117、8、12、13、14、15和18中的任何一个表示的至少一种多肽交叉阻断与ADAMTS5的结合，其中所述多肽包含特异性结合ADAMTS5的至少一个VH、VL、dAb、免疫球蛋白单可变结构域(ISVD)，其中与ADAMTS5的结合调控ADAMTS5的活性。

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