CZ2003996A3 - Nové molekuly agrekanázy - Google Patents

Description

NOVE MOLEKULY AGREKANAZY

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nukleotidových sekvencí kódujících nové molekuly agrekanázy, proteinů agrekanázy a způsobů jejich výroby. Vynález se dále týká přípravy inhibitorů a také protilátek k enzymům agrekanázám. Tyto inhibitory a protilátky mohou být užitečné pro léčbu různých onemocnění sdružených s agrekanázou, včetně osteoartritidy.

Dosavadní stav techniky

Agrekan je hlavní extracelulární složka artikulární chrupavky. Jde o proteoglykan zodpovědný za to, že vznikne chrupavka vybavená mechanickými vlastnostmi stlačitelností a pružností. Ztráta agrekanu se podílí na degradaci artikulární (kloubní) chrupavky při artritických onemocněních. Osteoartritida je vysilující onemocnění, které postihuje přinejmenším 30 miliónů Američanů (Maclean et al., J Rheumatol., 25: 2213-8, 1998). Osteoartritida může závažně snižovat kvalitu života kvůli degradaci artikulární chrupavky a výsledné chronické bolesti. Časnou a důležitou charakteristikou osteoartritického procesu je ztráta agrekanu z extracelulární matrix (Brandt, KD. a Mankin HJ., Pathogenesis of Osteoarthritis, v Textbook of Rheumatology, WB Saunders Company, Philadelphia, PA, ss. 1355-1373., 1993). Velká část agrekanu, obsahující cukry, je proto ztracena z extracelulární matrix, což má za následek deficit biomechanických vlastností chrupavky.

• · · • · · • · ► · · >· ·· ··

Předpokládá se, že proteolytická aktivita nazývaná agrekanázová aktivita je zodpovědná za štěpeni agrekanu a proto má úlohu v degradaci chrupavky sdružené s osteoartritidou a zánětlivým onemocněním kloubů. Byl prováděn výzkum pro rozpoznání enzymu zodpovědného za degradaci agrekanu v humánní osteoartritické chrupavce. Dvě místa enzymatického štěpení byla identifikována v interglobulární doméně agrekanu. Bylo pozorováno, že jedno místo (Asn341-Phe342) bylo štěpeno několika známými metaloproteázami (Flannery, CR et al., J Biol Chem, 267: 100814, 1992, Fosang, AJ et al., Biochemical J., 304: 347-351, 1994). Fragment agrekanu zjištěný v humánní synoviální tekutině a vytvořený štěpením agrekanu chrupavky indukovaným IL-1 je štěpen ve vazbě Glu³⁷³-Ala³⁷⁴ (Sandy, JD, et al., J Clin Invest, 69: 1512-1516, 1992, Lohmander LS, et al., Arthritis Rheum, 36: 1214-1222, 1993, Sandy JD et al., J Biol Chem., 266: 8683-8685., 1991), ukazuje na to, že žádný ze známých enzymů není zodpovědný za štěpení agrekanu in vivo.

Nedávno byly identifikovány dva enzymy, agrekanáza-1 (ADAMTS 4) a agrekanáza-2 (ADAMTS-11), v rodině s motivem trombospodinu typu 1 disintegrinu podobných proteinů a metaloproteáz Disintegrin-like and Metalloprotease with Thrombospondin type 1 motif (ADAM-TS), které jsou syntetizovány chrupavkou stimulovanou IL-1 a štěpí agrekan v příslušném místě (Tortorella MD, et al., Science, 284: 16646, 1999, Abbaszade, I, et al., J Biol Chem, 274: 23443-23450, 1999). Je možné, že tyto enzymy mohou být syntetizovány osteoartritickou humánní artikulární chrupavkou. Předpokládá se také, že existují další příbuzné enzymy v rodině ADAM-TS, které jsou schopné štěpení agrekanu ve vazbě Glu³⁷³-Ala³⁷⁴, a mohou přispět ke štěpení agrekanu při osteoartritidě.

• · · · • · · · • · · · • · • · • · ···· ····

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká identifikace molekul agrekanázových proteinů schopných štěpit agrekan, nukleotidových sekvencí, který kódují agrekanázové enzymy a způsoby výroby agrekanáz. Má se za to, že tyto enzymy jsou charakterizovány zejména tím, že mají agrekanázovou proteolytickou aktivitu. Vynález dále zahrnuje přípravky obsahující tyto enzymy, a také protilátky k těmto enzymům. Kromě toho vynález zahrnuje způsoby přípravy inhibitorů agrekanázy, které blokují enzymovou proteolytickou aktivitu. Tyto inhibitory a protilátky mohou být použity v různých testech a terapiích pro léčení chorobných stavů charakterizovaných degradací artikulární chrupavky.

Nukleotidová sekvence agrekanázové molekuly podle předkládaného vynálezu je uvedena v sekv. id. č. 3. V dalším provedení je nukleotidová sekvence agrekanázové molekuly podle předkládaného vynálezu uvedena v sekv. id. č. 1 od nukleotidu č. 1 do č. 3766. V dalším provedení nukleotidová sekvence podle vynálezu obsahuje nukleotid č. 1086 (TCG) až č. 3396 (CGC) ze sekv. id. č. 1. Vynález dále zahrnuje ekvivalentní sekvence s degenerovanými kodony k sekvencím uvedeným v sekv. id. č. 1, a také jejich fragmenty, které projevují agrekanázovou aktivitu.

Aminokyselinová sekvence izolované agrekanázové molekuly podle vynálezu obsahuje sekvenci uvedenou v sekv. id. č. 4. Aminokyselinová sekvence izolované agrekanázové molekuly zahrnuje sekvenci uvedenou v sekv. id. č. 2. Vynález dále zahrnuje fragmenty aminokyselinové sekvence, které kódují molekuly projevující agrekanázovou aktivitu.

Humánní agrekanázový protein nebo jeho fragment mohou být • · • · ···· připraveny kultivací buněk transformovaných DNA sekvencí ze sekv. id. č. 3 nebo sekv. id. č. 1 obsahující nukleotidy č. 1 až č. 3766 ze sekv. id. č. 1 nebo obsahující nukleotidy č. 1086 až č. 3396 sekv. id. č. 1 a získáním a purifikací z kultivačního média proteinu charakterizovaného aminokyselinovou sekvencí uvedenou v sekv. id. č. 4 nebo sekv. id. č. 2, v daném pořadí, v podstatě bez dalších proteinových látek, se kterými je společně produkován. Pro produkci v savčích buňkách DNA sekvence dále obsahuje DNA sekvenci kódující vhodný propeptid 5' spojený ve shodném čtecím rámci s nukleotidovou sekvencí kódující agrekanázový enzym.

Vynález zahrnuje způsoby pro získání další agrekanázových molekul, DNA sekvencí získaných tímto způsobem a proteinu jimi kódovaného. Způsob izolace kompletní sekvence zahrnuje použití agrekanázové sekvence uvedené v sekv. id. č. 3 nebo sekv. id. č. 1 od nukleotid č. 1086 do č. 3396 pro navrhování sond pro screening s použitím standardních postupů odborníkovi známých.

Očekává se, že jiné druhy mají DNA sekvence homologní s humánním agrekanázovým enzymem. Vynález tedy zahrnuje způsoby získání DNA sekvencí kódujících další agrekanázové molekuly, DNA sekvence získané těmito způsoby a protein kódovaný těmito DNA sekvencemi. Tento způsob vyžaduje použití nukleotidové sekvence podle vynálezu nebo její části pro navržení sondy ke screeningu knihoven na odpovídající gen z jiných druhů nebo kódujících sekvencí nebo jejich fragmentů s použitím standardních technik. Předkládaný vynález tedy může zahrnovat DNA sekvence z jiných druhů, které jsou homologní s humánním agrekanázovým proteinem a mohou být získány s použitím humánní sekvence. Předkládaný vynález může také zahrnovat funkční fragmenty agrekanázového proteinu a DNA sekvence kódující takové funkční fragmenty, a také funkční fragmenty dalších příbuzných proteinů. Schopnost funkce • · · ·· ·· ·· • · · • · · • · ···· ···· až č,

1086 až č. 3396 ze sekv. agrekanázového proteinu takového fragmentu je určitelná testováním proteinu v biologických testech popsaných pro testy agrekanázových proteinů.

Agrekanázové proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny kultivací buněk transformovaných DNA sekvencí ze sekv. id. č. 3 nebo sekv. id. č. 1 obsahující nukleotid č.

3766 ze sekv. id. č. 1 nebo obsahující nukleotid č.

id. č. 1 a získání a purifikace z kultivačního média. V jednom provedení protein obsahuje aminokyselinovou sekvenci ze sekv. id. č. 4 nebo aminokyseliny č. 1 až č. 770 ze sekv. id. č. 2. Purifikovaný exprimovaný protein je v podstatě bez dalších proteinových látek, se kterými je společně vytvářen, a také bez dalších kontaminujících složek. Předpokládá se, že získaný purifikovaný protein projevuje proteolytickou agrekanázovou aktivitu štěpením agrekanu. Proteiny podle vynálezu mohou být tedy dále charakterizovány schopností demonstrovat agrekanovou proteolytickou aktivitu v testu, kterým se určuje přítomnost molekul degradujících agrekan. Tyto testy nebo jejich příprava je odborníkům plně známa. Takové testy mohou zahrnovat kontakt agrekanového substrátu s agrekanázovou molekulou a sledování vzniku fragmentů agrekanu (viz například Hughes et al., Biochem J, 305: 799-804, 1995, Mercuri et al., J. Bio Chem.,

274: 32387-32395, 1999).

V dalším provedení vynález zahrnuje způsoby přípravy inhibitorů agrekanázy a inhibitory takto vytvořené. Tyto inhibitory zabraňují štěpení agrekanu. Způsob mohou vyžadovat stanovení vazebných míst na základě na trojrozměrné struktury agrekanázy a agrekanu a přípravu molekuly reaktivní s vazebným místem. Kandidátské molekuly jsou testovány na inhibiční aktivitu. Odborníkům jsou známy další standardní způsoby přípravy inhibitorů agrekanázové molekuly. Testování • · · · · • · ·· ·· • · · • « ···· ·· ·· inhibitorů zahrnuje kontakt směsi agrekanu a inhibitoru s agrekanázovou molekulou, pak následuje měřením agrekanázové inhibice, například detekcí a měřením fragmentů agrekanu vytvořených štěpením v místě citlivém na agrekanázu.

Další aspekt vynálezu proto poskytuje farmaceutické přípravky obsahující terapeuticky účinné množství inhibitorů agrekanázy ve farmaceuticky přijatelném vehikulu.

Degradace agrekanu v chrupavce zprostředkovaná agrekanázou je zapojena do osteoartritidy a dalších zánětlivých nemocí. Tyto přípravky podle vynálezu mohou být tedy použity v léčbě nemocí charakterizovaných degradací agrekanu a/nebo up-regulací agrekanázy. Přípravky mohou být použity v léčbě těchto chorobných stavů nebo v jejich prevenci.

Vynález zahrnuje způsoby léčení pacientů trpících chorobnými stavy charakterizovanými degradací agrekanu nebo prevence takových chorobných stavů. Tyto způsoby podle vynálezu zahrnují podávání pacientovi, který tuto léčbu potřebuje, účinného množství přípravku obsahujícího inhibitor agrekanázy, který inhibuje proteolytickou aktivitu agrekanázových enzymů.

Ještě dalším aspektem vynálezu jsou DNA sekvence kódující agrekanázový protein (expresi agrekanázového proteinu). Tyto sekvence zahrnují sekvence nukleotidů ve směru 5' ke 3' znázorněné v sekv. id. č. 1 obsahující nukleotid č. 1 až č. 3766 nebo obsahující nukleotid č. 1086 až č. 3396 ze sekv. id. č. 1 nebo sekv. id. č. 3 a DNA sekvence, které jsou díky degeneraci genetického kódu totožné s DNA sekvencí ze sekv. id. č. 1 a sekv. id. č. 3 a kódují agrekanázový protein. Dále jsou v předkládaném vynálezu zahrnuty DNA sekvence, které hybridizují za stringentních podmínek s DNA sekvencí ze sekv. id. č. 1 a sekv. id. č. 3 a kódují protein mající schopnost štěpit agrekan. Výhodné DNA sekvence zahrnují ty, který • · · ·

• · ···· ···« hybridizují za stringentních podmínek (viz T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, strany 387 až 389). Všeobecně je výhodné, že takové DNA sekvence kódují polypeptid, který je alespoň přibližně z 80 % homologní a výhodněji alespoň přibližně z 90 % homologní se sekvencí uvedenou v sekv. id. č. 3 nebo sekv. id. č. 1 obsahující nukleotid č. 1 až č. 3766 nebo obsahující nukleotid č. 1086 až č. 3396 sekv. id. č. 1. Konečně, v předkládaném vynálezu jsou také zahrnuty alelické nebo jiné variace sekvencí ze sekv. id. č. 1 nebo sekv. id. č. 3, ať už takové změny nukleotidů mají za následek změny peptidové sekvence nebo ne, ale kde peptidová sekvence má stále agrekanázovou aktivitu. Předkládaný vynález také zahrnuje fragmenty DNA sekvence ukázané v sekv. id. č. 1, které kódují polypeptid, který si zachovává aktivitu agrekanázy.

DNA sekvence podle předkládaného vynálezu jsou použitelné například jako sondy pro detekci mRNA kódující agrekanázu v dané buněčné populaci. Předkládaný vynález tedy zahrnuje způsoby detekce nebo diagnózy genetických chorobných stavů týkajících se agrekanázy nebo chorobných stavů týkajících se buněčné, orgánové nebo tkáňové poruchy, ve které je agrekanáza nepravidelně transkribována nebo exprimována. DNA sekvence mohou také být použitelné pro přípravu vektorů pro aplikace genové terapie, jak popsáno níže.

Další aspekt vynálezu zahrnuje vektory obsahující DNA sekvenci, jak byla popsána výše, v operativním spojení s příslušnou kontrolní sekvencí exprese. Tyto vektory mohou být použity v novém způsobu přípravy agrekanázového proteinu podle vynálezu, ve kterém buněčná linie transformovaná DNA sekvencí kódující agrekanázový protein v operativním spojení s příslušnou kontrolní sekvencí exprese, je pěstována ve • · ·«··

vhodném kultivačním médiu a z něj je získán a purifikován agrekanázový protein. Tento postup může používat velký počet známých buněk, jak prokaryotických tak eukaryotických, jako hostitelské buňky pro expresi polypeptidu. Vektory mohou být použity v aplikacích genové terapie. Při takovém použití mohou být vektory transfekovány do buněk pacienta ex vivo a buňky mohou být znovu zavedena pacientovi. Alternativně, vektory mohou být zavedeny pacientovi in vivo prostřednictvím cílené transfekce.

Ještě dalším aspektem vynálezu jsou agrekanázové proteiny nebo polypeptidy. Takové polypeptidy jsou charakterizovány jako mající aminokyselinovou sekvenci zahrnující sekvenci ukázanou v sekv. id. č. 2 nebo 4, varianty aminokyselinové sekvence ze sekv. id. č. 2 nebo 4, včetně přirozeně se vyskytujících alelických variant a dalších variant, ve kterých si protein podrží schopnost štěpit agrekan, což je vlastnost charakteristická pro agrekanázové molekuly. Výhodné polypeptidy zahrnují polypeptid, který je alespoň přibližně z 80 % homologní a výhodněji alespoň přibližně z 90 % homologní s aminokyselinovou sekvencí ukázanou v sekv. id. č. 2 nebo 4. Konečně, v předkládaném vynálezu jsou také zahrnuty alelické nebo další variace sekvencí ze sekv. id. č. 2 nebo 4, ať už jsou takové změny aminokyselin indukované mutagenezí, chemickou alterací nebo alterací DNA sekvence použité pro přípravu polypeptidu, přičemž peptidová sekvence má stále agrekanázovou aktivitu. Předkládaný vynález také zahrnuje fragmenty aminokyselinové sekvence ze sekv. id. č. 2 nebo 4, který si podrží aktivitu agrekanázového proteinu.

Purifikované proteiny podle předkládaného vynálezu mohou být použity pro tvorbu protilátek, buď monoklonálních nebo polyklonálních, proti agrekanáze a/nebo dalším proteinům souvisejících s agrekanázou, s použitím metod, které jsou

* · · ·

známy v oboru tvorby protilátek. Předkládaný vynález tedy také zahrnuje protilátky proti agrekanáze nebo dalším příbuzným proteinům. Protilátky mohou být použitelné pro detekci a/nebo purifikaci agrekanázy nebo příbuzných proteinů nebo pro inhibici nebo prevenci účinků agrekanázy. Agrekanáza podle vynálezu nebo její části může být použita pro přípravu protilátek, které se specificky vážou k agrekanáze.

Podrobný popis vynálezu

Humánní agrekanáza podle předkládaného vynálezu zahrnuje nukleotidovou sekvenci uvedenou v sekv. id. č. 3. V dalším provedení humánní agrekanáza podle předkládaného vynálezu obsahuje nukleotidy č. 1 až č. 3766 nebo nukleotidy č. 1086 až č. 3396 ze sekv. id. č. 1. Sekvence humánního agrekanázového proteinu zahrnuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekv. id. č. 4. V dalším provedení sekvence humánního agrekanázového proteinu zahrnuje aminokyseliny č. 1 až č. 770 uvedené v sekv. id. č. 2. Další sekvence agrekanázy podle předkládaného vynálezu mohou být získány s použitím sekvencí ze sekv. id. č. 3 nebo sekv. id. č. 1 obsahující nukleotidy č. 1086 až č. 3396 pro navržení sond pro screening na kompletní sekvenci s použitím standardních technik.

Agrekanázové proteiny podle předkládaného vynálezu zahrnují polypeptidy obsahující aminokyselinovou sekvenci ze sekv. id. č. 2 nebo sekv. id. č. 4 a mající schopnost štěpit agrekan.

Agrekanázové proteiny získané z kultivačního média jsou purifikovány izolací od dalších proteinových látek, se kterými jsou společně vytvářeny a od dalších přítomných kontaminujících složek. Izolované a purifikované proteiny mohou být charakterizovány schopností štěpit agrekanový ·· ♦·♦· id.

č.

tak se substrát. Agrekanázové proteiny poskytované v tomto textu také zahrnují faktory kódované sekvencemi podobnými těm ze sekv. č. 3 nebo sekvenci ze sekv. id. č. 1 obsahující nukleotid 1 až č. 3766 nebo obsahující nukleotid č. 1086 až č. 3396 ze sekv. id. č. 1, ale ve kterých jsou modifikace nebo delece přirozeně se vyskytující (např. alelické změny v nukleotidové sekvenci, které mohou mít za následek aminokyselinové změny v polypeptidu) nebo uváženě geneticky upravené. Například syntetické polypeptidy mohou zcela nebo částečně duplikovat kontinuální sekvence aminokyselinových zbytků ze sekv. id. č. 2 nebo sekv. id. č. 4. Tyto sekvence, na základě sdílení primární, sekundární nebo terciální struktury a konformačních charakteristik s agrekanázovými molekulami, mohou mít s nimi společné biologické vlastnosti. Například je známo, že jsou možné četné substituce konzervativních aminokyselin bez významné modifikace struktury a konformace proteinu, a zachovávají rovněž biologické vlastnosti. Například připouští, že substituce konzervativních aminokyselin mohou být vytvářeny mezi aminokyselinami s bazickými postranními řetězci, jako je například lysin (Lys nebo K) , arginin (Arg nebo R) a histidin (His nebo H) , aminokyselinami s kyselými postranními řetězci, jako je například kyselina asparagová (Asp nebo D) a kyselina glutamová (Glu nebo E), aminokyselinami s polárními postranními řetězci bez náboje, jako je například asparagin (Asn nebo N) , glutamin (Gin nebo Q) , serin (Ser nebo S) , threonin (Thr nebo T) a tyrosin (Tyr nebo Y) a aminokyselinami s nepolárními postranními řetězci, jako, je například alanin (Ala nebo A), glycin (Gly nebo G) , valin (Val nebo V) , leucin (Leu nebo 1) , izoleucin (Ile nebo I), prolin (Pro nebo P), fenylalanin (Phe nebo F) , methionin (Met nebo M) , tryptofan (Trp nebo W) a cystein (Cys nebo C) . Tyto modifikace a delece nativní agrekanázy mohou tedy být použity jako biologicky aktivní náhražky přirozeně se ·· tt ·· 99 9 · • 9 ••99 9«·* vyskytující agrekanázy a při přípravě inhibitorů dalších polypeptidů v terapeutických způsobech. Může být tedy snadno určeno, zda daná varianta agrekanázy si podrží biologickou aktivitu agrekanázy podrobením jak agrekanázy, tak varianty agrekanázy, a také jejích inhibitorů, testům popsaných v příkladech.

Další specifické mutace sekvencí agrekanázových proteinů popisovaných v tomto textu zahrnují modifikace glykosylačních míst. Tyto modifikace mohou zahrnovat 0- nebo N-glykosylační místa. Například nepřítomnost glykosylace nebo pouze parciální glykosylace je důsledkem aminokyselinové substituce nebo delece v rozpoznávacích místech glykosylace spojených s asparaginem. Rozpoznávací místa s asparaginem zahrnují tripeptidové specificky rozpoznávány příslušnými buněčnými glykosylačními enzymy. Tyto tripeptidové sekvence jsou buď asparagin-Xthreonin nebo asparagin-X-serin, kde X je obvykle kterákoliv aminokyselina. Velký počet substitucí nebo delecí aminokyselin v jedné nebo obou první nebo třetí polohy aminokyselin glykosylačního rozpoznávacího aminokyseliny ve druhé poloze) glykosylace spojená sekvence, které jsou místa má za (a/nebo následek delece to, že neproběhne glykosylace v modifikované tripeptidové sekvenci. Kromě toho, bakteriální exprese proteinu příbuzného s agrekanázou má také za následek tvorbu neglykosylovaného proteinu, dokonce i když jsou glykosylační místa nemodifikována.

Předkládaný vynález také zahrnuje nové DNA sekvence, které nejsou asociovány s jinými DNA sekvencemi kódujícími jiné proteiny, a které kódují expresi agrekanázových proteinů. Tyto DNA sekvence zahrnují sekvence ukázané v sekv. id. č. 1 nebo 3 ve směru 5' k 3' a ty sekvence, které s nimi hybridizují v hybridizačních stringentních podmínkách promývání (například ·· ·· »· • ♦ »··· ···· • ····

0,1 x SSC, 0,1% SDS v 65 °C, viz T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982, strany 387 až 389) a kódují protein mající agrekanázovou proteolytickou aktivitu. Tyto DNA sekvence také zahrnují sekvence, které obsahují DNA sekvenci ze sekv. id. č. 1 a ty, které s nimi hybridizují za stringentních podmínek hybridizace a kódují protein, který si podrží další aktivity popsané pro agrekanázu.

Podobně, DNA sekvence, které kódují agrekanázové proteiny kódované sekvencemi ze sekv. id. č. 1 obsahující nukleotid č. 1 až č. 3766 nebo obsahující nukleotid č. 1086 až č. 3396

č. 1 nebo sekvencí ze sekv. proteiny, které zahrnují ze sekv. id agrekanázové sekvenci ze sekv. v sekvenci kodonů id. č. 3 nebo aminokyselinovou liší id. č. 2 nebo 4, ale které se díky degenerací genetického kódu nebo alelickými variacemi (přirozeně se vyskytující změny bází v populaci živočišného druhu, které mohou nebo nemusí mít za následek změnu aminokyselin) , také kódují nové faktory popisované v tomto textu. Variace DNA sekvencí ze sekv. id. č. 3 nebo sekv. id. č. 1 obsahující nukleotid č. 1 až č. 3766 nebo obsahující nukleotid č. 1086 až č. 3396 ze sekv. id. č. 1, které jsou způsobené bodovými mutacemi nebo indukované modifikacemi (včetně inzerce, delece a substituce) pro zesílení aktivity, poločasu nebo produkce kódovaných polypeptidů jsou také zahrnuty ve vynálezu.

Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje nový způsob výroby agrekanázových proteinů. Způsob podle předkládaného vynálezu zahrnuje kultivaci vhodné buněčné linie, která byla transformována DNA sekvencí kódující agrekanázový protein podle vynálezu, pod kontrolou známých regulačních sekvencí. Transformované hostitelské buňky jsou pěstovány a agrekanázové proteiny jsou získávány a purifikovány z kultivačního média.

·· ♦···

Purifikované proteiny jsou v podstatě bez dalších proteinů, se kterými jsou společně vytvářeny, a také bez dalších kontaminujících složek.

Vhodné buňky nebo buněčné linie mohou být savčí buňky, jako například buňky vaječníků čínského křečka (CHO). V oboru je známo, jak provádět selekci vhodných savčích hostitelských buněk a způsobů transformace, kultivace, amplifikace, screeningu, výroby produktů a purifikace. (viz např. Gething a Sambrook, Nátuře, 293: 620-625, 1981 nebo alternativně, Kaufman et al., Mol. Cell. Biol, 5 (7): 1750-1759, 1985 nebo Howley et al., patent Spojených Států č. 4 419 446). Další vhodná savčí buněčná linie, která je popsána v doprovodných příkladech, je opičí buněčná linie COS-1. Mohou také být vhodné savčí buňky CV-1.

Vhodní hostitelé mohou také být bakteriální buňky. Například v biotechnologických oborech jsou jako hostitelské buňky známy různé kmeny E. coli (např. HB101, MC1061). Tímto způsobem mohou také být použity různé kmeny B. Subtilis, Pseudomonas, další mikroorganizmy apod. Pro expresi proteinu v bakteriálních buňkách obecně není nezbytná DNA kódující propeptid agrekanázy.

Odborníkům je známo, že pro expresi polypeptidů podle předkládaného vynálezu mohou být také vhodné různé kmeny kvasinek jakožto hostitelské buňky. Dále, kde je to třeba, mohou být ve způsobu podle předkládaného vynálezu použity jako hostitelské buňky také hmyzí buňky, (viz např. Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277-298, Plenům Press, 1986, a odkazy uváděné v tomto textu).

Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje vektory pro použití ve způsobech exprese těchto nových agrekanázových polypeptidů. Výhodně vektory obsahují kompletní nové DNA sekvence popsané výše, které kódují nové faktory podle ·· ···· ·· ·* vynálezu. Dále, vektory obsahují vhodné expresní kontrolní sekvence umožňující expresi agrekanázových proteinových sekvencí. Alternativně, vektory zahrnující modifikované sekvence, jak bylo popsáno výše, jsou také provedením předkládaného vynálezu. Dále, sekvence ze sekv. id. č. 3 nebo sekv. id. č. 1 nebo další sekvence kódující agrekanázové proteiny mohou být manipulována tak, aby exprimovaly složené agrekanázové molekuly. Předkládaný vynález tedy zahrnuje chimérické DNA molekuly kódující obsahující fragment ze sekv. id. č. obsahující nukleotid č. 1 až č,

č. 1086 až č. 3396 ze sekv. id. č. 1 čtecím rámci s DNA sekvencí kódující agrekanázový protein 3 nebo sekv. id. č. 1 3766 nebo obsahující nukleotid spojený ve správném další agrekanázový polypeptid.

Vektory mohou být použity ve způsobu transformace buněčných linií a obsahují vybrané regulační sekvence v operativním spojení s DNA kódující sekvence podle vynálezu, které jsou schopné řídit replikaci a expresi ve vybraných hostitelských buňkách. Regulační sekvence pro takové vektory jsou odborníkům známy a mohou být vybrány v závislosti na hostitelských buňkách. Taková selekce je rutinní a netvoří část předkládaného vynálezu.

Je známo, že různé chorobné stavy, jako je například osteoartritida, jsou charakterizovány degradací agrekanu. Agrekanázový protein podle předkládaného vynálezu, který štěpí agrekan, může být tudíž použitelný pro přípravu inhibitorů agrekanázy. Vynález proto poskytuje přípravky inhibitor agrekanázy. Inhibitory mohou být s použitím agrekanázy ve screeningových testech používajících směs agrekanového substrátu s inhibitorem, a pak následuje expozice agrekanu. Přípravky mohou být použity v léčbě osteoartritidy a dalších chorobných stavů, kdy se projevuje obsahuj ící připraveny

* · t · • * • · · ·· degradace agrekanu.

Vynález dále zahrnuje protilátky, které mohou být použity k detekci agrekanázy a mohou také být použity k inhibici proteolytické aktivity agrekanázy.

Terapeutické způsoby podle vynálezu zahrnují podávání přípravků s inhibitorem agrekanázy topicky, systémově nebo lokálně jako implantát nebo aplikační zařízení. Schéma dávkování je určeno ošetřujícím lékařem s přihlédnutím k různým faktorům, které modifikují účinek agrekanázového proteinu, jako je místo patologie, závažnost onemocnění, pacientův věk, pohlaví a výživa, závažnost zánětu, čas podávání a další klinické faktory. Obecně, systémové podávání nebo podávání v injekci bude započato v dávce, která je minimálně účinná a dávka bude zvyšována po předem zvolené časové období, dokud není pozorován pozitivní účinek. Pak se bude dávka postupně zvyšovat s omezením takových postupných zvýšení na takovou hladinu, která vyvolá odpovídající zvýšení účinku, přičemž se vezme do úvahy každý nepříznivý účinek, který se může objevit. Přidání dalších známých faktorů do konečného přípravku může také ovlivnit dávku.

Postup může být monitorován periodickým hodnocením průběhu onemocnění. Postup může být monitorován například rentgenovým vyšetřením, MRI nebo dalšími zobrazovacími způsoby, analýzou synoviální tekutiny a/nebo klinickým vyšetřením.

Následující příklady objasní praxi předkládaného vynálezu izolací a charakterizací humánní agrekanázy a dalších agrekanáze příbuzných proteinů, získání humánních proteinů a expresí proteinů pomocí rekombinantních technik.

·· 9· • * · « • ♦ • · • · ······«· ·* *· ···· • * · · · . - · · · » r · t _t • · · · · * ···· ·< 99

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace DNA

Potenciální noví příslušníci rodiny agrekanázy byli identifikováni s použitím přístupu screeningu databází. Agrekanáza-1 (Science, 284: 1664-1666, 1999) má alespoň šest katalytická doména, kyseliny (E). také rozhodující domén: signální, propeptidová, disintegrinová, doména tsp a c-koncová doména. Katalytická doména obsahuje úsek s motivem pro vazbu zinku, TAAHELGHVKF a MET otáčku, které jsou zodpovědné za proteázovou aktivitu. Substituce v zinkovém vazebném úseku ve velkém počtu poloh stále umožňují proteázovou aktivitu, ale musí být přítomné zbytky histidinu (H) a glutamové

Trombospondinová doména Agrekanázy-1 je doména pro rozpoznávání a štěpení substrátu. Jsou to právě tyto dvě domény, které určují příslušnost nového příslušníka k rodině agrekanázy, podle názoru původců vynálezu. Proteinová sekvence dedukovaná z DNA sekvence Agrekanázy-1 byla použita k dotazu v GeneBank EST zaměřeném na humánní EST s použitím TBLASTN. Výsledné sekvence byly výchozí bod v úsilí identifikovat kompletní sekvenci pro potenciální příslušníky rodiny. Nukleotidová sekvence agrekanázy podle předkládaného vynálezu je složena z jednoho EST (AA588434), který obsahuje homologii v průběhu katalytické domény a zinkového vazebného motivu Agrekanázy-1 (ADAMTS4).

Tato sekvence humánní agrekanázy byla izolována z cDNA knihovny konstruované v plazmidovém vektoru pED6-dpc2 užitím dT-primeru. CDNA byla získána z RNA humánních varlat zakoupené • · · · · · od firmy Clontech. Sonda pro izolaci agrekanázy podle předkládaného vynálezu byla vytvořena ze sekvence získané z hledání v databázích. Sekvence sondy byla takováto:

5'-GGTCAAATCGCGTCAGTGTAAATACGGG-3' .

DNA sonda byla radioaktivně značena ³²P a použita ke screeningu cDNA knihovny (s dT-primerem) z humánních varlat ve vysoce stringentních podmínkách pro hybridizaci/promytí, aby se rozpoznaly klony obsahující humánní kandidátskou sekvenci

č. 8.

Padesát tisíc transformant z knihovny bylo naneseno na misky v denzitě přibližně 5000 transformant na misku na 10 misek. Otisky transformovaných kolonií na nitrocelulózové membráně byly hybridizovány s DNA sondou značenou ³²P ve standardním hybridizačním pufru (1 x Blotto (25 x Blotto = 5% odtučněné sušené mléko, 0,02% azid v dH₂O) + 1% NP-40 + 6 x SSC +0,05% pyrofosforečnan) ve vysoce stringentních podmínkách (65 °C po dobu 2 hodin za třepání) . Po 2 hodinách hybridizace byl hybridizační roztok obsahující radioaktivně značenou DNA sondu odstraněn a filtry byly promyty ve vysoce stringentních podmínkách (3 x SSC, 0,05% pyrofosforečnan po dobu 5 minut při teplotě místnosti, následoval roztok 2,2 x SSC, 0,05% pyrofosforečnan po dobu 15 minut při teplotě místnosti, následoval roztok 2,2 x SSC, 0,05% pyrofosforečnan po dobu 1 až 2 minut v 65 °C) . Filtry byly zabaleny ve fólii Saran Wrap a exponovány proti rentgenovému filmu přes noc. Autoradiogramy byly vyvolány a pozitivně hybridizující transformanty s různou intenzitou signálu byly identifikovány. Tyto pozitivní klony byly vybrány, pěstovány po dobu 12 hodin v selektivním médiu (L-živné médium plus 100 gg/ml ampicilin) a naneseny na misky v nízké denzitě (přibližně 100 kolonií na destička). Nitrocelulózové repliky kolonií byly hybridizovány se sondou značenou ³²P ve standardním hybridizačním pufru ( (1 x Blotto (25 x Blotto = 5% odtučněné sušené mléko, 0,02% azid v dH2O) + 1% NP-40 + 6 x SSC +0,05% pyrofosforečnan) ve vysoce stringentních podmínkách (65 °C po dobu 2 hodin). Po 2 hodinách hybridizace byl hybridizační roztok obsahující radioaktivně značenou DNA sondu odstraněn a filtry byly promyty ve vysoce stringentních podmínkách (3 x SSC, 0,05% pyrofosforečnan po dobu 5 minut při teplotě místnosti, následoval roztok 2,2 x SSC, 0,05% pyrofosforečnan po dobu 15 minut při teplotě místnosti, následoval roztok 2,2 x SSC, 0,05% pyrofosforečnan po dobu 1 až 2 minut v 65 °C) . Filtry byly zabaleny ve fólii Saran Wrap a exponovány proti rentgenovému filmu přes noc. Autoradiogramy byly vyvolány a pozitivně hybridizující transformanty byly identifikovány. Byly vytvořeny bakteriální zásobní roztoky purifikovaných hybridizačně pozitivních klonů a byla izolována plazmidová DNA. Byla určena sekvence cDNA inzertu a je uvedena v sekv. id. č. 1 od nukleotid č. 1086 (TCG) do č. 3396 (CGC) . Tato sekvence byla uložena v American Type Culture Collection 10801 University Blvd. Manassas, VA 20110-2209, USA, jako PTA-2284. Inzert cDNA obsahoval sekvence DNA sondy použité v hybridizaci. Sekvence s 5'-primerem a 3'-primerem této izolované sekvence pak byly extrahovány s použitím RACE protokolu. Plně určená sekvence je uvedena v sekv. id. č. 1 od nukleotidu č. 1 do č. 3766.

Získaná humánní kandidátská sekvence č. 8 byla porovnána s několika EST ve veřejné databázi. Kandidát Č. 8 vykazuje homologii s ADAMTS 7 a 6. Agrekanáza podle předkládaného vynálezu obsahuje motiv s vazebným úsekem pro zinek, MET otáčku a motiv tsp typu-1, nicméně postrádá signální a propeptidový úsek a C-koncové oddělovací („spacer) úseky. Je to díky těmto kritériím, že kandidát č. 8 je považován za nového příslušníka rodiny agrekanáz.

Agrekanázová sekvence podle vynálezu může být použita pro design sond pro další screening kompletních klonů obsahujících izolovanou sekvenci.

Konce 5P (signální a propeptidový) a 3P (C-koncové spacerové úseky) kompletní verze EST8 byly určeny pomocí metody RACE PCR s použitím soupravy Clontech Marathon cDNA Amplification Kit. Jako substráty pro RACE reakce byla použita cDNA varlat a žaludku ze zdrojů Marathon. 5P RACE primery použité v reakcích byly:

GSP1 - AGTCTAGAAAGCTGGTGATGTAGTCACGGC a

GSP2 - TAGATGCATATGTCATAGCGTGTGATGAGCACTGC (obsahuje místo Nsil).

Souprava Advantage-2 PCR Kit od firmy Clontech byla použita k sestavení „sdružených RACE reakcí („nested RACE) podle instrukcí v uživatelské příručce pro Marathon cDNA Amplification Kit, množství použitých GSP primerů bylo 0,2 pmol/μΐ každého PCR primeru/μΐ reakční směsi. GSP1 primer byl použit pro první kolo PCR a GSP2 primer byl použit pro sdružené reakce. Produkty ze sdružených RACE reakcí byly štěpeny s Nsil (na GSP2 primeru) a Notl (na AP2 primeru poskytovaném v soupravě od firmy Clontech a použitém ve sdružené reakci RACE PCR) a ligovány do CS2+ vektoru štěpeného s Nsil a Notl. Ligované produkty byly transformovány do buněk ElectroMAX DH10B od firmy Life Technologies.

Klonované RACE produkty byly naneseny na misky v nízké denzitě (přibližně 300 kolonií na misce). Nitrocelulózové otisky transformovaných kolonií byly hybridizovány s DNA sondou značenou ³²P ve standardním hybridizačním pufru (lx Blotto (25 x Blotto =5% odtučněné sušené mléko, 0,02% azid), 1% NP-40, 6 x SSC, 0,05% pyrofosforečnan) ve vysoce stringentních podmínkách (65 °C po dobu 2 hodin za

třepání). Sekvence na 5P konci kandidátské 8-1 byla použita jako DNA sonda:

CTCGAGTCTGGGAAGCACCGTTAACATCC.

Po 2 hodinách byl hybridizační roztok (hybridizační pufr obsahující 1 x 10⁶ cpm DNA sondy značené ³²P) odstraněn a filtry byly promyty ve vysoce stringentních podmínkách (3 x SSC, 0,05% pyrofosforečnan po dobu 5 minut při stání při teplotě místnosti, následoval roztok 2,2 x SSC, 0,05% pyrofosforečnan po dobu 15 minut třepání při teplotě místnosti, následoval roztok 2,2 x SSC, 0,05% pyrofosforečnan po dobu 1 až 2 minut za třepání v 65 °C) . Filtry byly pokryty fólií Saran Wrap a exponovány proti rentgenovému filmu přes noc. Autoradiogramy byly vyvolány a pozitivně hybridizující transformanty s různou intenzitou signálu byly identifikovány. Tyto pozitivní klony byly vybrány, a pak pěstovány po dobu 12 hodin v selektivním médiu (L-živné médium, plus 100 gg/ml ampicilin). Plazmidová DNA byla připravena a poslána na analýzu DNA sekvence. Druhé kolo hybridizací bylo prováděno s použitím sondy, která byla vytvořena pro sekvenci dále k 5P než kandidátská 8-1. Sekvence DNA sondy byla vydedukovaná z produktů 5P RACE. Sekvence druhé sondy byla následující:

GAAGGCGATCTCATAGCTCTCCAGACT.

Klonované RACE produkty byly znovu naneseny na misky a byl následován stejný hybridizační protokol, kromě použití sondy více 5P. Iniciační Met byl dedukován z kanonické sekvence pocházející z 5P RACE produktů tvořených jak z cDNA varlat tak cDNA žaludku. Byly použity 3P RACE primery,

GSP1-GCTCTAGACTGGTCTGAGTGCACCCCCAGCT a

GSP2- GTCCTTTGCAAGAGCGCAGACCAC.

Souprava Advantage GC-2 PCR Kit od firmy Clontech byla použita pro přípravu sdružených RACE reakcí. Reakce byly

připraveny podle instrukcí v uživatelské příručce pro soupravu Marathon cDNA Amplifícation Kit, s výjimkou toho, že použité množství „roztátých GC bylo 5 μΐ na 50 μΐ reakce, množství použitých GSP primerů bylo 0,2 pmol/μΐ každého PCR primeru/μΐ reakční směsi. Pro první kolo PCR byl použit GSP1 primer a pro sdružené reakce byl použit GSP2 primer. Produkty ze sdružených RACE reakcí byly ligovány do pT-Adv vektoru s použitím soupravy AdvanTAge PCR Cloning Kit, podle instrukcí výrobce. Ligované produkty byly transformovány do buněk ElectroMAX DH10B od firmy Life Technologies. Klonované RACE produkty byly naneseny na misky v nízké denzitě (přibližně 300 kolonií na misku). Nitrocelulózové otisky transformovaných kolonií byly hybridizovány s DNA sondou značenou ³²P ve standardním hybridizačním pufru (1 x Blotto (25 x Blotto = 5% odtučněné sušené mléko, 0,02% azid), 1% NP-40, 6 x SSC, 0,05% pyrofosforečnan) ve vysoce stringentních podmínkách (65 °C po dobu 2 hodin za třepání). Sekvence na 3P konci kandidátské sekvence 8-1 byla použita jako DNA sonda:

GCACTGTGCAGAGCACTCACCCCA.

Po 2 hodinách byl hybridizační roztok (hybridizační pufr obsahující lxlO⁶ cpm DNA sondy značené 32P) odstraněn a filtry byly promyty ve vysoce stringentních podmínkách (3 x SSC, 0,05% pyrofosforečnan při stání po dobu 5 minut při teplotě místnosti, následoval roztok 2,2 x SSC, 0,05% pyrofosforečnan po dobu 15 minut za třepání při teplotě místnosti, následoval roztok 2,2 x SSC, 0,05% pyrofosforečnan po dobu 1 až 2 minut za třepání v 65 °C) . Filtry byly přikryty fólií Saran Wrap a exponovány proti rentgenovému filmu přes noc. Autoradiogramy byly vyvolány a byly identifikovány pozitivně hybridizující transformanty s různou intenzitou signálu. Pozitivní klony byly vybrány, a pak pěstovány po dobu 12 hodin v selektivním médiu (L-živné médium plus 100 pg/ml ampicilin). Plazmidová DNA ·· ·· 9 ·· 999999 • · · 99 9 9 ·· ·

9 9 9 9 9 9 byla připravena a poslána na analýzu DNA sekvence. Stop kodon byl vydedukován z kanonické sekvence derivované z 3P RACE produktů tvořených jak z cDNA varlat tak cDNA žaludku.

S výjimkou úseku od páru bází 1332 až 1517 (pro tento popis pár bází č. 1 je A iniciačního kodonu Met (ATG), byla potvrzena kompletní sekvence EST8. Prohledávání veřejně přístupných databází odhalilo parciální sekvenci pro EST8, nazývanou ADAMTS10. Původci použili sekvenci z tohoto parciálního klonu pro konstrukci sousedícího úseku jejich EST8 (pár bází 1332 až 1517) se syntetickými oligonukleotidy.

Kompletní sekvence pro EST8 (sekv. id. č. 3) byla kanonická sekvence pocházející z hybridizačně pozitivní kandidátské sekvence 8-1, veřejně dostupné sekvence reprezentující EST8 a PCR produktů z cDNA varlat a žaludku firmy Clontech. Konečný EST8 expresní konstrukt byl sestaven ze 4 EST8 specifických fragmentů. 5P část EST8, od páru bází 1 až 1342 byla amplifikována PCR z poolu cDNA žaludku a varlat a je nazývána fragment 1. Byly použity následující primery:

5P PCR primerAAATGGGCGAATTCCCACCATGGCTCCCGCCTGCCAGATCCTCCG (obsahuj e spojovací sekvenci s 8 páry bází (AAATGGGC), klonovací místo EcoRI (GAATTC) a Kozákovu sekvenci (CCACC) v protisměru od iniciáčního Met) a 3P PCR primer CCGAGTCTAGAAAGCTGGTGATGTAG (obsahuje místo Xbal (TCTAGA)). Tento PCR produkt byl štěpen s EcoRI a Xbal s použitím standardních podmínek štěpení.

Další část genu, fragment 2, byl konstruován s použitím syntetických oligonukieotidů. Syntetický fragment se rozprostíral od místa Xbal k místu BsrFI a reprezentuje páry bází 1333 až 1517 z EST8. Syntetické oligonukleotidy se

skládaly z následující sekvence: horní vlákno se skládá z

CTAGACTCGGGCCTGGGGCTCTGCCTGAACAACCGACCCCCCAGACAGGACT

TTGTGTACCCGACAGTGGCACCGGGCCAAGCCTACGATGCAGATGAGCAATG

CCGCTTTCAGCATGGAGTCAAATCGCGTCAGTGTAAATACGGGGAGGTCTGC

AGCGAGCTGTGGTGTCTGAGCAAGAGCAA, spodní vlákno se skládá z

CCGGTTGCTCTTGCTCAGACACCACAGCTCGCTGCAGACCTCCCCGTATTTAC

ACTGACGCGATTTGACTCCATGCTGAAAGCGGCATTGCTCATCTGCATCGTAG

GCTTGGCCCGGTGCCACTGTCGGGTACACAAAGTCCTGTCTGGGGGGTCGGTT

GTTCAGGCAGAGCCCCAGGCCCGAGT.

Další část EST8, fragment 3, byl BsrFI až Sphl fragment štěpený z kandidátské sekvence 8-1. Byl reprezentován od páru bází 1518 do 2783 z kompletní verze EST8. 3P část EST8, nazývaná fragment 4 (páry bází 2663 až 3314) , byla amplifikována PCR. Byly použity následující primery:

5P-GGGTTGTAGGGAACTGGTCGCTCTG (lokalizovány ve fragment 3, v protisměru místa Sphl) a 3P-AAATGGGCCTCGAGCCCTAGTGGCCCTGGCAGGTTTTGC (obsahuje spojovací sekvenci o 8 párech bází (AAATGGGC) a místo Xhol (CTCGAG) po směru od stop kodonu (TAG)).

Tento PCR produkt byl štěpen Sphl a Xhol s použitím standardních podmínek štěpení. Kompletní verze EST8 byla konstruována ligací těchto 4 popsaných fragmentů, 5P fragment 1 (EcoRI/Xbal), vnitřní fragment 2 (Xbal/BsrFI), vnitřní fragment 3 (BsrFI/Sphl) a 3P fragment 4 (SphI/Xhol) do Cos expresního vektoru pED6-dpc2 (štěpen EcoRI a Xhol). Konečný konstrukt měl mutaci v klonovacím místě Xhol, které bylo zničeno v ligací. To neovlivnilo EST8 kódující sekvenci a bylo ponecháno v konstruktu.

·· ··· ·

Přiklad 2

Exprese agrekanázy

Aby bylo možné tvořit proteiny příbuzné agrekanáze myšího původu, humánního původu nebo původu od další savců, byla kódující DNA přenesena do vhodného expresního vektoru a ten byl zaveden do savčích buněk nebo dalších výhodných eukaryotických nebo prokaryotických hostitelů včetně hmyzích hostitelských tkáňových kultivačních systémů obvyklými technikami genetického inženýrství. Předpokládá se, že expresní systém pro biologicky účinnou rekombinantní humánní agrekanázu jsou trvale transformované savčí buňky, hmyzí buňky, kvasinky nebo bakterie.

Odborník je schopen konstruovat savčí expresní vektory použitím sekvence ze sekv. id. č. 3 nebo sekvence ze sekv. id. č. 1 obsahující nukleotid č. 1 až č. 3766 nebo obsahující nukleotid č. 1086 až č. 3396 ze sekv. id. č. 1 nebo další DNA sekvence kódující proteiny příbuzné agrekanáze nebo další modifikované sekvence a známé vektory, jako je například pCD (Okayama et al., Mol. Cell Biol, 2: 161-170, 1982), pJL3, pJL4 (Gough et al., EMBO J., 4: 645-653, 1985) a pMT2 CXM.

Savčí expresní vektor pMT2 CXM je derivát p91023(b) (Wong et al., Science 228: 810-815, 1985) lišící se od druhého uvedeného v tom, že obsahuje gen rezistence na ampicilin v místě genu rezistence na tetracyklin a dále obsahuje místo Xhol pro inzerci cDNA klonů. Funkční prvky pMT2 CXM. byly popsány (Kaufman, R. J, 1985, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 689-693) a zahrnují adenovirové VA geny, SV40 replikační počátek včetně enhanceru o velikosti 72 bp, adenovirový hlavní • · ··· ·

• · · · ·· ·· pozdní promotor včetně 5' sestřihového místa a většinu adenovirové tripartitiní vedoucí sekvence přítomné na adenovirové pozdní mRNA, 3' sestřihové akceptorové místo, DHFR inzert, SV40 místo časné polyadenylace (SV40) a pBR322 sekvence potřebné pro pomnožení v E. coli.

Plazmid pMT2 CXM je získán EcoRI štěpením z pMT2-VWF, který byl uložen v American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD (USA) pod přístupovým číslem ATCC 67122. Štěpení EcoRI vystřihne cDNA inzert přítomný v pMT2-VWF, poskytující pMT2 v lineární formě, který může být ligován a použit ke transformaci E. coli HB 101 nebo DH-5 pro získání ampicilinové rezistence. Plazmidová pMT2 DNA může být připravena obvyklými metodami. Pak je pMT2 CXM konstruován s využitím postupu mutageneze „loopout/in (Morinaga, et al., Biotechnology 84: 636, 1984) . Tímto postupme se odstraní báze 1075 až 1145 relativně k místu HindlII blízko SV40 replikačního počátku a enhancerových sekvencí pMT2. Kromě toho se vloží následující sekvence

5' PO-CATGGGCAGCTCGAG-3' v místě nukleotidu 1145. Tato sekvence obsahuje rozpoznávací místo pro restrikční endonukleázu Xhol. Derivát pMT2CXM, nazývaný pMT23, obsahuje místa rozpoznávání pro restrikční endonukleázy Pstl, EcoRI, Sáli a Xhol. Plazmid pMT2 CXM a pMT23 DNA mohou být připraveny obvyklými metodami. ΡΕΜΟ2β1 pocházející pMT21 může také být vhodný v praxi vynálezu. pMT21 je derivován z pMT2, který je derivován z pMT2-VWF. Jak bylo popsáno výše, štěpení EcoRI odstraní cDNA inzert přítomný v pMT-VWF, za vzniku pMT2 v lineární formě, která může být ligována a použita ke transformaci E. Coli HB 101 nebo DH-5 pro získání ampicilinové rezistence. Plazmidová pMT2 DNA může být připravena obvyklými metodami.

·· ··»· ·9 · ·· • · · · ·· · · • · · · • · · · · • · · ·

ΡΜΤ21 je derivován z pMT2 pomocí následujících dvou modifikací. Jako první je odstraněn úsek o velikosti 76 bp z 5' netranslatované oblasti DHFR cDNA zahrnující úsek 19 G zbytků z G/C úseku („tailing) pro cDNA klonování. Při tomto postupu je vloženo Xhol místo za zisku následující sekvence ihned v protisměru od DHFR:

5'- CTGCAGGCGAGCCTGAATTCCTCGAGCCATCATG-3'

Pstl EcoRI Xhol

Za druhé, unikátní Clal místo je zavedeno štěpením s EcoRV a Xbal, ošetřením s Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I a ligací k Clal spojovací sekvenci (CATCGATG). Toto odstraní segment o velikosti 250 bp z úseku RNA (VAI) asociovaného adenoviru, ale neinterferuje s expresí nebo funkcí VAI RNA genu. pMT21 je štěpen s EcoRI a Xhol a použit pro derivaci vektoru pEMC2B 1.

Část EMCV vedoucí sekvence byla získána z pMT2-ECATl (S. K. Jung, et al., J. Virol, 63: 1651-1660, 1989) štěpením s EcoRI a Pstl, což mělo za následek fragment o velikosti 2752 bp. Tento fragment byl štěpen s Taql za vzniku EcoRI-Taql fragmentu o velikosti 508 bp, který byl purifikován elektroforézou na agarózovém gelu s nízkou teplotou tání. Adaptér o velikosti 68 bp a jeho komplementární vlákno byly syntetizovány s přečnívajícím koncem 5' Taql a přečnívajícím koncem 3' Xhol, které mají následující sekvenci:

⁵'-CGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTT

Taql

GAAAAACACGATTGC-3'

Xhol »* *·*·

Tato sekvence odpovídá vedoucí sekvenci EMC viru od nukleotidu 7 63 do 827. Mění také ATG v poloze 10 ve vedoucí sekvenci EMC viru na ATT a je následována Xhol místem. Trojitá ligace fragmentu pMT21 EcoRI-16hoI, fragmentu EcoRI-Taql EMC viru a oligonukleotidového adaptéru o velikosti 68 bp Taql16hol adaptéru měla za následek vektor ρΕΜ02β1.

Tento vektor obsahuje SV40 replikační počátek a enhancer, adenovirový hlavní pozdní promotor, cDNA kopii většiny adenovirové tripartitní vedoucí sekvence, malou hybridní intervenující sekvenci, SV40 polyadenylační signál a adenovirový gen VAI, markéry DHFR a β-laktamázu a EMC sekvenci, v patřičném vztahu pro řízení vysoké hladiny exprese požadované cDNA v savčích buňkách.

Konstrukce vektorů může zahrnovat modifikaci DNA sekvencí příbuzných agrekanáze. Například cDNA agrekanázy může být modifikována odstraněním nekódujících nukleotidů na 5' a 3' koncích kódujícího úseku. Odstraněné nekódující nukleotidy mohou nebo nemusí být nahrazeny dalšími sekvencemi, u kterých je znám jejich přínos pro expresi. Tyto vektory jsou transformovány do vhodných hostitelských buněk pro expresi proteinů příbuzných agrekanáze. Dále, sekvence ze sekv. id. č. 3 nebo sekv. id. č. 1 obsahující nukleotid č. 1 až č. 37 66 nebo obsahující nukleotid č. 1086 až č. 3396 ze sekv. id. č. 1 nebo dalších sekvencí kódujících proteiny příbuzné agrekanáze mohou být manipulovány tak, aby exprimovaly zralý protein příbuzný agrekanáze odstraněním propeptidových sekvencí kódujících agrekanázu a jejich nahrazením sekvencemi kódujícími kompletní propeptidy jiných agrekanázových proteinů.

Odborník může manipulovat sekvence ze sekv. id. č. 3 nebo sekv. id. č. 1 eliminací nebo nahrazením savčích regulačních sekvencí ohraničujících kódující sekvenci bakteriálními •9 999* >9 r · · · · • «9 9 9999 9

9 99 9999

9999 9999 9«* 9999 99 «9 sekvencemi za vzniku bakteriálních vektorů pro intracelulární nebo extracelulární expresi bakteriálními buňkami. Například kódující sekvence mohou být dále manipulovány (např. ligovány k dalším známým linkerům nebo modifikovány delecí nekódujících sekvencí nebo změnami nukleotidů dalšími známými technikami). Modifikované sekvence kódující proteiny příbuzné agrekanáze mohou pak být vloženy do známého bakteriálního vektoru s použitím postupů, jako jsou například popsány v práci autorů T. Taniguchi et al., Proč. Nati Acad. Sci. USA, 77: 5230-5233, 1980. Tento příkladný bakteriální vektor může pak být transformován do bakteriálních hostitelských buněk a jimi může být exprimován protein příbuzný agrekanáze. Pro strategii produkce extracelulární exprese proteinů příbuzných agrekanáze v bakteriálních buňkách, viz např. evropskou patentovou přihlášku EPA 177 343.

Podobné manipulace mohou být prováděny pro konstrukci hmyzího vektoru (viz např. postupy popsané v publikované evropské patentové přihlášce 155 476) pro expresi v hmyzích buňkách. Může také být zkonstruován kvasinkový vektor používající kvasinkové regulační sekvence pro intracelulární nebo extracelulární expresi faktorů podle předkládaného vynálezu kvasinkami. (Viz např. postupy popsané v publikované PCT přihlášce W086/00639 a evropské patentové přihlášce EPA 123 289).

Způsob přípravy vysokých hladin proteinů příbuzných agrekanáze podle vynálezu v savčích, bakteriálních, kvasinkových nebo hmyzích hostitelských buněčných systémech může zahrnovat konstrukci buněk obsahujících mnohonásobné kopie heterologního genu příbuzného agrekanáze. Heterologní gen je spojen s amplifikovatelným markérem, např. genem dihydrofolátreduktázy (DHFR), díky kterému mohou být buňky obsahující zvýšený počet kopií genu selektovány pro propagaci

ve zvyšující se koncentraci metotrexátu (MTX) podle postupů autorů Kaufman a Sharp, J. Mol. Biol, 159: 601-629, 1982. Tento přístup může být používán s velkým počtem různých buněčných typů.

Například plazmid obsahující DNA sekvenci proteinu příbuzného agrekanáze podle vynálezu v operativním spojení s dalšími plazmidovými sekvencemi umožňujícími jeho expresi a DHFR expresní plazmid pAdA26SV (A) 3 (Kaufman a Sharp, Mol. Cell. Biol, 2: 1304, 1982) mohou být společně zavedeny do DHFR-deficitních CHO buněk, DUKX-BII, různými metodami včetně koprecipitace fosforečnanem vápenatým a transfekce, elektroporace nebo fúzí protoplastů. Transformanty exprimující DHFR jsou selektovány růstem v alfa médiu s dialyzovaným fetálním telecím sérem a následně selektovány pro amplifikaci růstem ve zvyšujících se koncentracích MTX (např. postupně v 0,02, 0,2, 1,0 a 5μΜ MTX) (jak bylo popsáno v práci Kaufman et al., Mol Cell Biol., 5: 1750, 1983). Transformanty jsou klonovány a exprese biologicky aktivní agrekanázy je monitorována testy popsanými výše. Exprese agrekanázového proteinu by se měla zvyšovat se stoupajícími hladinami MTX rezistence. Agrekanázové polypeptidy jsou charakterizovány s použitím standardních technik v oboru známých, jako je například pulsové značení [³⁵S]-methioninem nebo cysteinem a elektroforéza v polyakrylamidovém gelu. Podobné postupy mohou být sledovány za vzniku dalších proteinů příbuzných agrekanáze.

V jednom příkladu agrekanázový gen podle předkládaného vynálezu uvedený v sekv. id. č. 3 je klonován do expresního vektoru pED6 (Kaufman et al., Nucleic Acid Res. 19: 448854490, 1991) . Buňky COS a CHO DUKX Bil jsou přechodně transfekovány agrekanázovou sekvencí podle vynálezu (+/- kotransfekce PÁCE v samostatném pED6 plazmidu) lipofekcí

(LF2000, Invitrogen). Dvojité transfekce jsou prováděny pro každý požadovaný gen: (a) první pro sklízení kondicionovaných médií pro test aktivity a (b) druhá pro metabolické značení ³⁵S-methioninem/cysteinem.

První den jsou média změněna na média DME(COS) nebo alfa(CHO) + 1% fetální telecí sérum inaktivované teplem +/- 100 gg/ml heparinu do jamek (a), které budou sklízeny pro test aktivity. Po 48 hodinách (den 4) jsou kondicionovaná média sklízena pro test aktivity.

Třetí den byla média ve dvojitých jamkách (b) změněna na médium MEM (bez methioninu/bez cysteinu) + 1% fetální telecí sérum inaktivované teplem + 100 μρ/ml heparinu + 100 μθί/ιη1 ³⁵S-methioninu/cysteinu (Redivue Pro mix, Amersham) . Po 6 hodinách inkubace ve 37 °C byla kondicionovaná média sklízena a byla prováděny gely SDS-PAGE v redukčních podmínkách. Proteiny byly vizualizovány autoradiogramy.

Příklad 3

Biologická aktivita exprimované agrekanázy

Pro měření biologické aktivity exprimovaných proteinů příbuzných agrekanáze získaných v příkladu 2 výše, byly proteiny získány z tkáňové kultury a purifikovány izolací proteinů příbuzných agrekanáze od dalších proteinových látek, se kterými jsou společně vytvářeny, a také od dalších kontaminujících složek. Purifikovaný protein může být testován v souladu s testy popsanými výše. Purifikace je prováděna s použitím standardních technik odborníkům známých.

Analýza proteinů je prováděna s použitím standardních technik, jako je například elektroforéza v SDS-PAGE polyakrylamidovém gelu (Laemmli, Nátuře 227: 680, 1970), obarvením stříbrem (Oakley, et al. Anal. Biochem. 105: 361, 1980) a imunobloty (Towbin, et al. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 76: 4350, 1979).

Předcházející popisy uvedly detailně výhodná provedení předkládaného vynálezu. Lze očekávat, že odborníky napadnou po zvážení tohoto popisu četné modifikace a změny v praxi vynálezu. Avšak tyto modifikace a variace jsou zahrnuty ve vynálezu definovaném v připojených patentových nárocích.

SEZNAM SEKVENCÍ <210> 1 <211> 3766 <212> DNA <213> neznámý <400> 1 gcggccgctg aafctctaggg aggccccggg aaggcccaga gagggaggcc caggtgcagg cccaacacta ctccaccaac cgaagccccc tgaacagggg aggcggcact gtgggggctg gacaogtggc ctctatggct cccgcctgcc tgggcctcat gttcgaggtc acgcacgcct tggagagcta tgagatcgcc ttccccaccc tctegccaec tcctccccgg aggcagcgcc tcttctacaa agtggcctcg cccagcaccc gtctactggc agggcacgtc tccgtggagt gggcggcccg gccccactgc ctctacgctg atgtggccat cagcacctgt ggaggcctgc acctgattga gcccctgcac ggfcgggccca cacatgtggt gtacaagcgt tcctctctgc tgagagatga gaaaccgtgg aaagggcggc ctgccaggcc cctggggaat gaaacagagc gccgagageg etacgtggag accctggtgg ggcgccggga tgtggagcag tatgtcctgg aggactcgag tctgggaagc accgttaaca aggaccagcc cactctggag atcacccacc agtggcagaa atccatcgtg aaccacagcg tggctaacca tgacacagca gtgctcatca aaccctgcgg cacactaggc ctggccccgg gcagcgtcaa tgaggacatt ggcctggcca acacattcgg catgaaccat gacggcgtgg cagccaagct catggctgcc cacattacca gcagccgtga ctacatcacc agctttctag cggcccccca gacaggactt tgtgtacccg gatgagcaat gccgctttca gcatggagtc gcagcgagct gtggtgtctg agcaagagca ccgagggcac gctgtgccag acgcacacca gtgtcccctt tgggtcgcgc ccagagggtg ggggcgactg cagccggacc tgtggcggcg gccccaggcc aaccatcggg ggcaagtact gcaacacgga tgactgfcccc cctggctccc ttgacagcat ccctttccgt gggaaattct tgaaggcctg ctcgctcacg tgcctagcgg cagccgtggt ggacgggaca ccctgccgtc aatgcaagca cgtgggctgc gaccgagtcc gagtgtgtgg cggtgacggc agtgcctgcg cacctggggc cgggtacgag gatgtcgtct tccaggatcfc gaacctctct ctcagtcact tgctggaggg gctgcccggg accccccagc ttcaactgcg acaggggcca gaccaggtcc catctctcat cgtcatggtg cfcggcccgga atgcccccat cgcccgtgac tcgctgcccc agtgctcggc ócagtgtgca ggcggtagcc cgcggcgcag gctccaaaga agaagaaacc 60 gagcaggcga gggaaggatc cgtacagggg 120 aaaaggagcc oggtgatgct gcgaaggctg 180 ccggcagccg gggctgggga gagacatgtg 240 agatcctccg ctgggccctc gccctggggc 300 tccggtctca agatgagttc ctgtccagtc 360 gcgtggacca caacggggca ctgcfcggcct 420 gcggcacggg ggccacagcc gagtcccgcc 480 acttcctgct gaacctgacc cgcagctccc 540 actggacacg ggagggcctg gcctggcaga 600 gtcacctgca gggccaggcc agcagctccc 660 acggcctgat cgtggcagac gággaagagt 720 agggttctcg gagcccggag gaaagtggac 780 gtcaccccca cctggacaca gcctgtggag 840 catggfcggcfc gcggaccttg aagccaccgc 900 gtggccagcc aggcctgaag cgatcggtca 960 tggctgacaa gatgatggtg gcctatcacg 1020 ccatcatgaa cattgttgcc aaacttttcc 1080 tcctcgtaac tcgcctcatc ctgotcacgg 1140 atgccgggaa gtccctggaG agcttctgta 1200 gccatggcaa tgccattcca gagaacggtg 1260 cacgctatga catctgcatc tacaagaaca 1320 tgggcggaat gtgtgagcgc gagagaagct 1380 cagcgttcac catfcgcccac gagatcgggc 1440 gaaacagctg tggggcccgt ggtcaggacc 1500 tgaagaccaa cccattcgtg tggtcatcct 1560 actcagggac tggggctctg cctgaacaaa 1620 acagtggcae cgggccaagc ctacgatgca 1680 aaatcgcgtc agtgtaaata cgggaggtct 1740 accggtgcat caccaacagc atcccggccg 1800 tcgacaaggg gtggtgctac aaacgggtct 1860 tggacggagc ctgggggccg tggactccat 1920 gcgtgtcctč ttctagccgt cactgcgaca 1980 gtctgggtga gagaaggcgg caccgctcct 2040 aggacttcag agaagtgcag tgttctgaat 2100 acaagtggaa aacgtaccgg ggagggggcg 2160 aaggcttcaa cttcfcacacg gagagggcgg 2220 cagacácggt ggacatttgc gtcagtggcg 2280 tgggctccga cctgcgggag gacaagtgcc 2340 agaccatcga gggcgtcttc agcccagcct 2400 ggattcccaa aggctccgtG cacatcttca 2460 tggccctgaa gggagaccag gagtccctgc 2520 cccaccgtct gcctctagct gggaccacct 2580 agagcctcga agccctggga ccgattaatg 2640 ccgagctgcc tgccctccgc taccgcttca 2700 cctactcctg gcactatgcg ccctggacca 2760 aggtgcaggc ggtggagtgc cgcaaccagc 2820 • · · · tggacagctc agcgcgcctg gcagccgcag ctgccgcgga tggaggcctg gcacccccag.

accgcgccac gctgcaactt ctgcacagtg aggcgtcgca agtgcgacag cctactgecc gctgcaaaac gtctccgccg ggagggaagg tggggggatg cgcggtcgcc caacacggag ctgcgatgca ggagaaggcg ccacggcccc ctgcgggccg gctgcccccg gcgccgctgc cggcgtcggg cgagtgcacg cccaaccccc cctggtgcte ctgccagggc ccagfcccfcgc gtgagacgga gagaggggct ccccactact ccttgccctc ggcgtgcgca ctggacgaca acttgccctc ggcctccgcc gcgcactgct cccccggccc cagcggcagc gaggccctgc gggggcggcc aaatbtcagb cactaggggg agcgggccgg gccggaagtt ggctatccac gcagtgccea cagactgggt gccgctcggc gegcatgccc cggagtgggc accgcgtggt cacccgccgc gctgggtggc gctcggtgcg ggccgcccac ctgaagagtg tctgcagccg cgcgcggcac ccagaggggg atttattggg ctgcccgggc cagcaagctg tgtagggaac cgtgtgccag gcagccgcgc ggccctcgac cctttgcaag caagccaccg tggcgagtgg ctgcaccagc cacgcagcaa caaggatgtg agcctacttc ccggagccac ccccgggggg aacccctgca ggccgc cccaaaaggc tggtcgctct cgccgcgtct ccacctgtac tggtctgagt agcgcagacc gccaccatgc ggtgagtgct cacacgggcc tgtgaggcca aacaaggtcg cgccagatgt agctggcggg gcgggaactg gggccctggc

2880

2940

3000

3060

3120

3180

3240

3300

3360

3420

3480

3540

3600

3660

3720

3766 <210> 2 <211> 770 <212> PRT <213> neznámý <220>

<221> varianta <222> (1) ... (770) <223> Xaa = kterákoliv aminokyselina

Ser

Ser

Leu

Gly

Ser

Thr

Val

Asn

Ile

Leu

Val

Thr Arg

Leu

Ile

Leu

1

.. 5

10

15

Leu

Thr

Glu

Asp

Gin

Pro

Thr

Leu

Glu

Ile

Thr

His His

Ala

Gly Lys

20

25

30

Ser

Leu

Asp

Ser

Phe

Cys

Lys

Trp

Gin

Lys

Ser

Ile

Val

Asn

His

Ser

35

40

45

Gly

His

Gly

Asn

Ala

Ile

Pro

Glu

Asn

Gly Val

Ala

Asn

His

Asp

Thr

50

55

60

Ala Val

Leu

Ile

Thr

Arg Tyr Asp

Ile

Cys

Ile

Tyr

Lys

Asn

Lys

Pro

65

70

75

.80 ·.

Cys

eiy

Thr

Leu

Gly Leu Ala

Pro

Val

Gly Gly Met

Cys

Glu

Arg

Glu

85

90

95

Arg

Ser

Cys

Ser

Val

Asn Glu

Asp

Ile

Gly

Leu

Ala

Thr

Ala

Phe

Thr

100

105

110

Ile

Ala

His

Glu

Ile

Gly His

Thr

Phe·

Gly

Met

Asn

His

Asp

Gly Val

115

120

125

Gly

Asn

Ser

Cys

Gly

Ala

Arg

Gly

Gin

Asp

Pro

Ala

Lys

Leu

Met

Ala

130

135

140

Ala

His

Ile

Thr

Met

Lys

Thr

Asn

Pro

Phe

Val

Trp

Ser

Ser

Cys

Ser

145

150

155

160

Arg Asp

Tyr

Ile

Thr

Ser

Phe

Leu

Asp

Ser

Gly

Pro

Gly Ala

Leu

Pro

165

170

175

Glu

Gin

Pro

Ala

Pro

Gin

Thr

Gly

Leu

Cys

Val

Pro

Asp

Ser

Gly

Thr

180

185

190

Gly

Pro

Ser

Leu

Arg

Cys

Arg

Xaa

Ala

Met

Pro'

Leu

Ser

Ala

Trp

Ser

195

200

205

Gin

Ile

Ala

Ser

Val

Xaa

Ile

Arg

Glu

Val

Cys

Ser

Glu

Leu

Trp

Cys

210

215

220

Leu

Ser

Lys

Ser

Asn

Arg

Cys

Ile

Thr

Asn

Ser

Ile

Pro

Ala

Ala

Glu

225

230

235

240

Gly

Thr

Leu

Cys

Gin

Thr

His

Thr

Ile

Asp

Lys

Gly

Trp

Cys

Tyr

Lys

245

250

255

Arg

Val

Cys

Val

Pro

Phe

Gly

Ser

Arg

Pro

Glu

Gly

Val

Asp

Gly

Ala

260

265

270

Trp

Gly

Pro

Trp

Thr

Pro

Trp

Gly

Asp

Cys

Ser

Arg

Thr

Cys

Gly

Gly

275

280

285

Gly

Val

Ser

Ser

Ser

Ser

Arg

His

Cys

Asp

Ser

Pro

Arg

Pro

Thr

Ile

Gly Gly Lys Tyr	Cys	Leu Gly Glu Arg Arg	Arg His	Arg	Ser Cys Asn
305		310	315		320
Thr Asp Asp Cys	Pro 32S	Pro Gly Ser Gin Asp 330	Phe Arg	Glu	Val Gin Cys 335
Ser Glu Phe Asp 340	Ser	Ile Pro Phe Arg Gly 345	Lys Phe	Tyr	Lys Trp Lys 350
Thr Tyr Arg Gly Gly Gly Val Lys Ala Cys 355 350	Ser Leu	Thr 365	Cys Leu Ala
Glu Gly Phe Asn 370	Phe	Tyr Thr Glu Arg Ala 375	Ala Ala 380	Val	Val Asp Gly
Thr Pro Cys Arg 385	Pro	Asp Thr Val Asp Ile 390	Cys Val 395	Ser	Gly Glu Cys 400
Lys His Val Gly	Cys 405	Asp Arg Val Leu Gly 410	Ser Asp	Leu	Arg Glu Asp 415
Lys Cys Arg Val 420	cys	Gly Gly Asp Gly Ser 425	Ala Cys	Glu	Thr Ile Glu 430
Gly Val Phe Ser 435	Pro	Ala Ser Pro Gly Ala 440	Gly Tyr	Glu 445	Asp Val Val
Trp Ile Pro Lys 450	ely	Ser Val His Ile Phe 455	Ile Gin 460	Asp	Leu Asn Leu
Ser Leu Ser His 465	Leu	Ala Leu Lys Gly Asp 470	Gin Glu 475.	Ser	Leu Leu Leu 480
Glu Gly Leu Pro	Gly 485	Thr Pro Gin Pro His 490	Arg Leu	Pro	Leu Ala Gly 495
Thr Thr Phe Gin 500	Leu	Arg Gin Gly Pro Asp 505	Gin Val	Gin	Ser Leu Glu 510
Ala Leu Gly Pro 515	Ile	Asn Ala Ser Leu Ile 520	Val Met	Val 525	Leu Ala Arg
Thr Glu Leu Pro 530	Ala	Leu Arg Tyr Arg Phe 535	Asn Ala 540	Pro	Ile Ala Arg
Asp Ser Leu Pro 545'	Pro	Tyr Ser Trp His Tyr 550	Ala Pro 555	Trp	Thr Lys Cys 560
•Ser Ala Gin Cys	Ala 565	Gly Gly Ser Gin Val 570	Gin Ala	Val	Glu Cys Arg 575.
Asn Gin Leu Asp 580	Ser	Ser Ala Val Ala Pro 585	His Tyr	Cys	Ser Ala.His 590
Ser Lys Leu Pro 595	Lys	Arg Gin Arg Ala Cys 600	Asn Thr	Glu 605	Pro cys Pro
Pro Asp Trp Val 610	Val	Gly Asn Trp Ser Leu 615	Cys Ser 620	Arg	Ser Cys Asp
Ala Gly Val Arg 625	Ser	Arg Ser Val Val Cys 630	Gin Arg Arg Val Ser Ala 635 640
Ala Glu Glu Lys	Ala 645	Leu Asp Asp Ser Ala 650	Cys Pro	Gin	Pro Arg Pro 655
Pro Val Leu Glu Ala ‘660	Cys His Gly Pro Thr 665	Cys Pro	Pro	Glu Trp Ala 670
Ala Leu Asp Trp 675	Ser	Glu Cys Thr Pro Ser 680	Cys Gly	Pro 685	Gly Leu Arg
His Arg Val Val 690	Leu	Cys Lys Ser Ala Asp 695	His Arg 700	Ala	Thr Leu Pro
Pro Ala His Cys 705	Ser	Pro Ala Ala Lys Pro 710	Pro Ala 715	Thr	Met Arg Cys 720
Asn Leu Arg Arg Cys 725	Pro Pro Ala Arg Trp 730	Val Ala	Gly	Glu Trp Gly 735
Glu Cys Ser Ala 740	Gin	Cys Gly Val Gly Gin 745	Arg Gin	Arg	Ser Val Arg 750
Cys Thr Ser His 755	Thr	Gly Gin Ala Ser His 760	Glu Cys	Thr 765	Glu Ala Leu

Arg Pro 770 <210> 3 <211> 3377 <212> DNA <213> neznámý <220>

<223> neznámý <400> 3 gaattcccac catggctccc gcctgccaga tcctccgctg ggccctcgcc ctggggctgg 60 gcctcafcgtt cgaggtcacg cacgccttcc ggtctcaaga tgagttcctg tccagtctgg 120 agagctatga gatcgccttc cccacccgcg tggaccacaa cggggcactg ctggccttct 180 cgccacctcc tccccggagg cagcgccgcg gcaegggggc cacagccgag tcccgcctct 240 tctacaaagt ggcctcgccc ageacccact tcctgctgaa cctgacccgc agetcecgtc 300 tactggcagg gcacgtctcc gtggagtact ggacacggga gggcctggcc tggcagagag 360 cggcccggcc ccactgcctc tacgctggtc acctgcaggg ccaggccagc agctcccatg 420 tggccatcag cacctgtgga ggcotgcacg gcctgatcgt ggcagaegag gaagagtacc 480 tgattgagcc cctgcacggt gggcccaagg gttctcggag cccggaggaa agtggaccac 540 atgtggtgta caagcgttcc tctctgegtc acccccacct ggacacagcc tgtggagtga' 600 gagatgagaa accgtggaaa gggcggccat ggtggctgcg gaccttgaag ccaccgcctg 660· ccaggcccct ggggaatgaa acagagogtg gccagccagg cctgaágcga tcggtcagcc 720 gagagcgcta cgtggagacc ctggtggtgg ctgacaagat gatggtggcc tatcacgggc 780 gccgggatgt ggagcagtat gtcctggcca tcatgaacat tgttgccaaa cttttccagg 840 actcgagtct gggaagcacc gttaacatcc tcgtaactcg cctcatcctg ctcacggagg 900 accagcccac tctggagatc acccaccatg ccgggaagtc cctggacagc ttctgtaagfc 960 ggcagaaatc catcgtgaac cacagcggtc afcggcaatgc cattccagag.aaeggtgtgg 1020 ctaaccatga cacagcagtg ctcatcacac gctatgácat cfcgcatctac aagaacaaac 1080 cctgcggcac actaggcctg gccccggtgg gcggaatgtg tgagcgcgag agaagctgca 1140 gcgtcaatga ggacattggc otggccaoag cgttcaccat tgccóacgag atcgggcaca 1200 cattcggcat gaacoatgac ggcgtgggaa acagctgtgg ggcccgtggt caggácccag 1260 ccaagctcat ggctgcccac attaccatgá agaccaaccc gttcgfcgtgg tčatactgca 1320 gccgtgácta catcaccagc ttfcctagacťcgggcčtggg gctctgcctg aacaaccgac 1380 cccccagáca ggactttgtg tacccgacag-tggcaccggg ccaagcctac gatgcagatg 1440 agcaatgccg ctt.tcagqat ggagtcaaat cgcgtcagtg taaatacggg gaggtctgca 1500 gcgagctgtg gtgtctgagc aagagcaacc•ggtgcatcac caacagcatc ccggccgccg 1560 agggcacgct gtgccagacg cacaccatcg'· acaaggggtg gtgctacaaa cgggtctgtg 1620 tcccctttgg gtcgcgccca gagggtgtgg acggagcctg ggggccgtgg actccatggg 1680 gcgactgcag ccggacctgt ggcggcggcg tgtectcttc tagccgtcac tgcgacagcc 1740 ccaggccaac catcgggggc aagtactgtď tgggtgagag aaggcggcac -cgctcctgca 1800 acacggatga ctgtcccčct ggctcccaggacttcagaga agtgcagtgt tctgaatttg 1860 acagcatccc tttccgtggg aaattctaca agtggaaaac gtaccgggga gggggcgtga 1920 aggcctgctc gctcacgtgc ctagcggaag gcttcaactt ctacacggag agggcggcag 198Q ccgtggtgga cgggacaccc tgccgtccag acacggtgga catttgcgtc agtggcgaat 2040 gcaagcacgt gggctgcgac cgagtcctgg gctccgacct gcgggaggac aagtgccgag 2100 tgtgtggcgg tgacggcagt gcctgcgaga ccatcgaggg cgtcttcagc ccagcctcac 2160 ctggggccgg gtacgaggat gtcgtctgga ttcccaaagg ctccgtccac atcttcatcc 2220 aggatcfcgaa cctctctctc agtcacttgg ccctgaaggg agaccaggag tccctgctgc 2280 tggaggggct gcccgggacc ccccagcccc accgtctgcc fcctagctggg accacctttc 2340 aacfcgcgaca ggggccagac caggtccaga gcctcgaagc cctgggaccg attaatgcat 2400 ctcfccatcgt catggtgctg gcccggaccg agctgcctgc cctccgctac cgcttcaatg 2460 cccccatcgc ccgtgactcg ctgcccccct actcctggca ctatgcgccc tggaccaagt 2520 gctcggccca gtgtgcaggc ggtagccagg tgcaggcggt ggagtgccgc aaccagctgg 2580 acagctccgc ggtcgccccc cactactgca gtgcccacag eaagctgccc aaaaggcagc 2640 gcgcctgcaa cacggagcct tgccctccag actgggttgt agggaačtgg tcgctctgca 2700 gccgcagctg cgatgcaggc gtgcgcagcc gctcggtcgt gtgccagcgc cgcgtctctg 2760 ccgcggagga gaaggcgctg gacgacagcg catgcccgca gccgcgccca cctgtactgg 2820 aggcctgcca cggccccact tgccctccgg agtgggcggc cctcgactgg tctgagtgca 2880 cccccagttg cgggccgggc ctccgccacc gcgtggtcct ttgcaagagc gcagaccacc 2940 gcgccacgct gcccccggcg cactgctcac ccgccgccaa gccaccggcc aecatgcgct 3000 gcaacttgcg ccgctgcccc ccggcccgct gggtggctgg cgagtggggt gagtgctctg 3060 cacagtgegg cgtcgggcag cggcagcgct cggtgcgctg caccagccac acgggccagg 3120 cgtcgcacga gtgcacggag gccctgcggc cgcccaccac gcagcagtgt gaggccaagt 3180 gcgacagccc aacccccggg gacggccctg aagagtgcaa ggatgtgaac aaggtcgcct 3240 actgccccct ggtgctcaaa tttcagttct gcagccgagc ctacttccgc cagatgtgct 3300 gcaaaacctg ccagggccac tagggtcgag gcccattfcaa gccgaattct gcagatatcc 3350 atcacactgg cggccgc ’ 3377 <210> 4 <211> 1104 <212> PRT <213> neznámý • ·« · · · · · · • · · · · · · · ···« ···· ··· ···· ·· ·· <400> 4

Met Ala Pro	Ala Cys Gin Ile Leu Arg Trp Ala	Leu Ala Leu Gly	Leu
1	5 10	15
Gly Leu Met	Phe Glu Val Thr His Ala Phe Arg	Ser Gin Asp Glu	Phe
	20 ’ 25	30
Leu Ser Ser	Leu Glu Ser Tyr Glu Ile Ala Phe	Pro Thr Arg Val	Asp
35	40	45
His Asn Gly	Ala Leu Leu Ala Phe Ser Pro Pro	Pro Pro Arg Arg	Gin
50	55	60
Arg Arg Gly	Thr Gly Ala Thr Ala Glu Ser Árg	Leu Phe Tyr Lys	Val
65	70 75		80
Ala Ser Pro	Ser Thr His Phe Leu Leu Asn Leu	Thr Arg Ser Ser	Arg
	85 90	95
Leu Leu Ala	Gly His Val Ser Val Glu Tyr Trp	Thr Arg Glu Gly	Leu
	100 105	110
Ala Trp Gin	Arg Ala Ala Arg Pro His Cys Leu	Tyr Ala Gly His	Leu
115	120	125
Gin Gly Gin Ala Ser Ser Ser His Val Ala Ile	Ser Thr Cys Gly	Gly
130	135	140
Leu His Gly Leu Ile Val Ala Asp Glu Glu Glu	Tyr Leu Ile Glu	Pro
145	150 155		160
Leu His Gly Gly Pro Lys Gly Ser Arg Ser Pro	Glu Glu Ser Gly	Pro
	165 170	175
His Val Val	Tyr Lys Arg Ser Ser Leu Arg His	Pro His Leu Asp	Thr
	180 185	190
Ala Cys Gly	Val Arg Asp Glu Lys Pro Trp Lys	Gly Arg Pro Tip	Tip
195	200	205
Leu Arg Thr	Leu Lys Pro Pro Pro Ala Arg Pro	Leu Gly Asn Glu	Thr
210	215	220
Glu Arg Gly	Gin Pro Gly Leu Lys Arg Ser Val	Ser Arg Glu Arg	Tyr
225	230 235		240
Val Glu Thr	Leu Val Val.Ala Asp Lys Met Met	Val Ala Tyr His	Gly
	245 250	255
Arg Arg Asp	Val Glu Gin Tyr Val Leu Ala Ile	Met Asn Ile Val	Ala
	260 265	270
Lys Leu Phe	Gin Asp Ser Ser Leu Gly Ser Thr	Val Asn Ile Leu	Val
. 275	280	285
Thr Arg Leu	Ile Leu Leu Thr Glu Asp Gin Pro	Thr Leu Glu Ile	Thr
290	’ 295	300
His His Ala	Gly Lys Ser Leu Asp Ser Phe Cys	Lys Tip Gin Lys	Ser
305	310 .315		320
Ile Val Asn	His Ser Gly His Gly Asn Ala tle	Pro Glu Asn Gly Val
	325 330	335
Ala Asn His	Asp Thr Ala Val Leu Ile Thr Arg	Tyr Asp Ile Cys	ile
	340 345	350
Tyr Lys Asn	Lys Pro Cys Gly Thr Leu Gly Leu	Ala Pro Val Gly Gly
355	360	365
Met Cys Glu	Arg Glu Arg Ser Cys Ser Val Asn	Glu Asp Ile Gly	Leu
370	375	380
Ala Thr Ala	Phe Thr Ile Ala His Glu Ile Gly	His Thr Phe Gly	Met
385	390 395		400
Asn His Asp	Gly Val Gly Asn Ser Cys Gly Ala Arg Gly Gin Asp	Pro
	405 410	415
Ala Lys Leu	Met Ala Ala His Ile Thr Met Lys	Thr Asn Pro Phe	Val
	420 425	430
Trp Ser Ser	Cys Ser Arg Asp Tyr Ile Thr Ser	Phe Leu Asp Ser	Gly
435	440	445
Leu Gly Leu	Cys Leu Asn Asn Arg Pro Pro Arg	Gin Asp Phe Val	Tyr
450	455	460
Pro Thr Val	Ala Pro Gly Gin Ala Tys- Asp Ala	Asp Glu Gin Cys	Arg
465	470 475		480

·· ·· · ·· ·· • · · * ♦ ♦ · · · • · · · · • · · · · · · • · · · · ···· ···· ··· ···· ··

Phe Gin Kis Gly Val Lys	Ser Arg Gin Cys Lys Tyr Gly Glu Val	Cys
	485	490	495
Ser Glu	Leu Trp Cys Leu 500	Ser Lys Ser Asn Arg Cys Ile 505	Thr Asn 510	Ser
Ile Pro	Ala Ala Glu Gly 515	Thr Leu Cys Gin Thr His Thr 520 525	Ile Asp	Lys
Gly Trp 530	Cys Tyr Lys Arg	Val Cys Val Pro Phe Gly Ser 535 540	Arg Pro	Glu
Gly Val 545	Asp Gly Ala Trp 550	Gly Pro Trp Thr Pro Trp Gly 555	Asp Cys	Ser 560
Arg Thr	Cys Gly Gly Gly 565	Val Ser Ser Ser Ser Arg His • 570	Cys Asp 575	Ser
Pro Arg	Pro Thr Ile Gly Gly Lys Tyr Cys Leu Gly Glu 580 585	Arg Arg 590	Arg
His Arg	Ser Cys Asn Thr 595	Asp Asp Cys Pro Pro Gly Ser 600 605	Gin Asp	Phe
Arg Glu 6X0	Val Gin Cys Ser	Glu Phe Asp Ser Ile Pro Phe 615 620	Arg Gly	Lys
Phe Tyr 625	Lys Trp Lys Thr 630	Tyr Arg Gly Gly Gly Val Lys 635	Ala Cys	Ser 640
Leu Thr	Cys Leu Ala Glu 645 .	Gly Phe Asn Phe Tyr Thr Glu Arg Ala 650 655	Ala
Ala Val	Val Asp Gly Thr 660	Pro Cys Arg Pro Asp Thr Val 665	Asp Ile 670	cys
Val Ser	Gly Glu Cys Lys 675	His Val Gly Cys Asp Arg Val 680 685	Leu Gly	Ser
Asp Leu 690	Arg Glu Asp Lys	Cys Arg Val Cys Gly Gly Asp 695 700	Gly Ser	Ala
Cys Glu 705	Thr Ile Glu Gly Val Phe Ser Pro Ala Ser Pro 710 715	Gly Ala Gly 720
Tyr Glu	Asp Val Val Trp 725	Ile Pro Lys Gly Ser Val His 730	Ile Phe 735	Ile
Gin Asp	Leu Asn Leu Ser 740	Leu Ser His Leu Ala Leu Lys 745	Gly Asp 750	Gin
Glu Ser	Leu Leu Leu Glu 755	Gly Leu Pro Gly Thr Pro Gin 760 765	Pro His	Arg
Leu Pro 770	Leu Ala Gly Thr	Thr Phe Gin Leu Arg Gin Gly 775 · 780	Pro Asp	Gin
Val Gin 785	Ser Leu Glu Ala 790	Leu' Gly Pro Ile Asn Ala Ser 795	Leu Ile	.Val 800
Met Val	Leu Ala Arg Thr 805	Glu Leu Pro Ala Leu Arg Tyr Arg Phe 810 815	Asn
Ala Pro	Ile Ala Arg Asp 820	Ser Leu Pro Pro Tyr Ser Trp 825	His Tyr 830	Ala
Pro Trp	Thr Lys Cys Ser 835	Ala Gin Cys Ala Gly Gly Ser 840 845	Gin Val	Gin
Ala Val 850	Glu Cys Arg Asn	Gin Leu Asp Ser Ser Ala Val 855 860	Ala Pro	His
Tyr Cys 865	Ser Ala His Ser 870	lys Leu Pro Lys Arg Gin Arg 875	Ala Cys	Asn 880
Thr Glu	Pro Cys Pro Pro 885	Asp Trp Val Val Gly Asn Trp 890	Ser Leu 895	Cys
Ser Arg	Ser Cys Asp Ala 900	Gly Val Arg Ser Arg Ser Val 905	Val Cys 910	Gin
Arg Arg	Val Ser Ala Ala 915	Glu Glu Lys Ala Leu Asp Asp 920. 925	Ser Ala	cys
Pro Gin 930	Pro Arg Pro Pro	Val Leu Glu Ala Cys His Gly 935 940	Pro Thr	Cys
Pro Pro 945	Glu Trp Ala Ala 950	Leu Asp Trp Ser Glu Cys Thr . 955	Pro Ser	Cys 960
Gly Pro	Gly Leu Αχσ His 965	Arg Val Val Leu Cys Lys Ser 970	Ala Asp 975	His
Arg Ala	Thr Leu Pro Pro 980	Ala His Cys Ser Pro Ala Ala 985	Lys Pro 990	Pro
Ala Thr	Met Arg Cys Asn 995	Leu Arg Arg Cys Pro Pro Ala 1000 1005	Arg Trp	Val
Ala Gly	Glu Trp Gly Glu	Cys Ser Ala Gin Cys Gly Val Gly Gin	Arg

• 4

4444

1010 1015 1020

Gin Arg Ser	Val	Arg Cys Thr Ser	His	Thr	Gly	Gin· Ala Ser His Glu
1025		1030			1035 1040
Cys Thr Glu	Ala	Leu Arg Pro Pro	Thr	Thr	Gin	Gin Cys Glu Ala Lys
		1045		1050	1055
Cys Asp Ser	Pro	Thr Pro Gly Asp	Gly	Pro	Glu	Glu Cys Lys Asp Val
	1060	1065		1070
Asn Lys Val	Ala Tyr Cys Pro Leu	Val	Leu	Lys	Phe Gin Phe Cys Ser
1075	1080			1085
Arg Ala Tyr Phe Arg Gin Met Cys Cys Lys	Thr	Cys Gin Gly His Xaa
1090		1095				1100

Claims (20)

1. Izolovaná DNA molekula obsahující DNA sekvenci uvedenou v sekv. id. č. 3.

2. Izolovaná DNA molekula obsahující DNA sekvenci uvedenou v sekv. id. č. 1 od nukleotidu č. 1086 do č. 3396.

3. Izolovaná DNA molekula obsahující DNA sekvenci vybranou ze skupiny, kterou tvoří

a) sekvence ze sekv. id. č. 3,

b) sekvence ze sekv. id. č. 1 obsahující nukleotid č. 1086 až č. 3396 přirozeně se vyskytujících humánních alelických sekvencí a ekvivalentní degenerované kodony ze sekvencí z bodů

a) a b) .

4. Vektor obsahující DNA molekulu podle nároku 1 v operativním spojení s příslušnou kontrolní sekvencí její exprese.

5. Vektor obsahující DNA molekulu podle nároku 2 v operativním spojení s příslušnou kontrolní sekvencí její exprese.

6. Hostitelská buňka transformovaná DNA sekvencí podle nároku 1.

7. Hostitelská buňka transformovaná DNA sekvencí podle nároku 2.

8. Způsob přípravy purifikovaného humánního agrekanázového proteinu vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

(a) kultivace hostitelské buňky transformované DNA molekulou podle nároku 1 a (b) získání a purifikace agrekanázového proteinu z kultivačního média.

9. Způsob přípravy purifikovaného humánního agrekanázového proteinu vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

(a) kultivace hostitelské buňky transformované DNA molekulou podle nároku 2 a (b) získání a purifikace agrekanázového proteinu z kultivačního média.

10. Purifikovaný agrekanázový polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci ze sekv. id. č. 4.

11. Purifikovaný agrekanázový polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekv. id. č. 2.

12. Purifikovaný agrekanázový polypeptid vytvořený kroky (a) kultivace buňky transformované DNA molekulou podle nároku 1 a (b) získání a purifikace polypeptidu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekv. id. č. 4 z kultivačního média.

·· ···» • · · • · · • · · · ·· ··

13. Purifikovaný agrekanázový polypeptid vytvořený kroky (a) kultivace buňky transformované DNA molekulou podle nároku 2 a (b) získání a purifikace polypeptidů obsahujícího aminokyselinovou sekvenci uvedenou v sekv. id. č. 2 z kultivačního média.

14. Protilátka, která se váže k purifikovanému agrekanázovému proteinu podle nároku 10.

15. Způsob výroby inhibitorů agrekanázy vyznačující se tím, že obsahuje použití agrekanázového proteinu uvedeného v sekv. id. č. 4 nebo jeho fragmentu.

16. Způsob výroby inhibitorů agrekanázy vyznačující se tím, že obsahuje použití agrekanázového proteinu uvedeného v sekv. id. č. 2 nebo jeho fragmentu.

17. Způsob podle nároku 15 nebo 16 vyznačuj ící se tím, že způsob obsahuje trojrozměrnou strukturní analýzu.

18. Způsob podle nároku 15 nebo 16 vyznačuj ící se tím, že způsob obsahuje počítačem podporovaný návrh léku.

·· 99 9 99 99 ····

9 9 9 9 99 9 9 · 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9999 9

9 9 · · 9999

9999 9999 999 9999 99 99

19. Přípravek pro inhibici proteolytické aktivity agrekanázy vyznačující se tím, že obsahuje peptidovou molekulu, která se váže k agrekanáze inhibující proteolytickou degradaci agrekanu.

20. Způsob inhibice štěpení agrekanu u savce vyznačující se tím, že obsahuje podávání účinného množství sloučeniny, která inhibuje agrekanázovou aktivitu, savci.