JP2005525081A - 植物からの生物活性ミュラー管抑制物質を含むTGF−βタンパク質の遺伝子発現および産生法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、植物から生物活性組換えタンパク質を産生する新規な方法を記載する。そのようなタンパク質の発現および産生のために植物を設計および操作する一般的な方法も開示する。ミュラー管抑制物質(MIS)のようなトランスフォーミング成長因子-β(TGF-β)タンパク質の植物における発現のための方法、および植物から組換えタンパク質を産生する方法が、特に開示される。さらに本発明は、C末端MISのようなTGF-βタンパク質の生物活性C末端断片の直接的発現および産生のための方法を提供する。新規な方法は、高価な細胞培養および発酵生産設備の必要を排除することにより、他の大量発現系より費用効率が高い。
TGF-βファミリーのタンパク質は、走化性、細胞外マトリックスの生成、細胞増殖および分化の調節、ならびに免疫系の発生および調節を含む多くの重要な胚形成および免疫機能を媒介するサイトカインとして機能する。このように、これらの分子は、十分な量を入手可能な場合には、非常に様々な治療に用いられうるものと思われる。例えば、上皮卵巣癌は、女性において第5番目発症率の高い悪性疾患である。各年、上皮卵巣癌のおよそ26,600人の新患者が診断され、毎年、そのうちの55 %がその疾患で死んでいる。TGF-βファミリーのメンバーであるミュラー管抑制物質(MIS)が致死性の高い進行した卵巣癌腫についての効果的な治療となる可能性を秘めていることが研究により示された。しかしながら、哺乳動物および細菌系を含むMISの現行の生産系は、臨床試験または商業的適用に必要とされるレベルでMISを供給する能力がない。これらの系は、生物学的に活性のあるC末端MISを直接的に生成することができないばかりでなく、これらの系は、ホロMIS前駆体の十分な量を生成することができず、そのうえ、付加的な欠点をも有している。
本発明は、結果として植物宿主系においてTGF-βタンパク質の発現を生じる条件下で形質転換またはトランスフェクションされた植物または植物細胞培養物を栽培することを含む、植物宿主系がTGF-βをコードするキメラの核酸で形質転換された植物宿主系において生物活性TGF-βタンパク質を産生するための方法を提供する。この方法のさらなる局面は、植物宿主系からのTGF-βタンパク質の回収を含む。本発明の方法により、植物宿主系において産生されたTGF-βは、完全長の前駆体タンパク質またはペプチド断片でありうる。さらに、完全長TGF-βタンパク質は、キシロースおよびα1,3結合型フコースのような植物特有の糖を含みうるN結合型グリカンを含みうる。本発明はまた、N結合型グリカンが、植物特有のグリカンの存在を減少させるもしくは除去するようにインビボまたはインビトロで改変されうる、またはより望ましいグリコ変異体を産生されうる、植物系における完全長TGF-βタンパク質の産生を提供する。本発明の特定の局面において、TGF-βペプチド断片は、生物活性C末端を含む。この態様において、植物宿主系において産生される生物活性C末端、または切断後TGF-βタンパク質から放出される生物活性C末端断片は、キシロースおよびα1,3-フコースのような植物特有のグリカンを含みえない。本発明はまた、インビボまたはインビトロで改変されうる植物特有のグリカンまたはグリカン組成物を含みうるN結合型グリカンを断片が含んでいる、植物系におけるTGF-βタンパク質の生物活性C末端断片の産生を提供する。
本明細書に記載される特定の方法体系、プロトコール、細胞系、ベクター、および試薬などは変化しうるため、本発明がこれらに限定されないことは理解される。本明細書に用いられる専門用語は、特定の態様のみを記載する目的のために用いられ、本発明の範囲を限定することを意図するものではないこともまた理解されるべきである。本明細書および添付された特許請求の範囲に用いられる場合、単数形「一つの(a)」、「一つの(an)」、および「その(the)」は、その文脈が明らかに別なふうに指図しない限りは複数形の言及を含むことは留意されなければならない。このように、例えば、「一つのタンパク質」という言及は、一つまたは複数のタンパク質の参照であり、当業者などに知られたそれらの等価物を含む。実際、当業者は、植物宿主系においてTGF-βスーパーファミリー(現在または後に知られる)のいずれのタンパク質をも産生するために本明細書に記載される方法を使用することができる。
アミノ酸配列:本明細書に用いられる場合、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列、およびそれの断片を含み、かつ天然に存在する分子または合成分子に関する。
本発明に有用な発現ベクターは、発現カセットからの上流および下流に随伴配列を有する、植物における操作のために設計されたhMIS発現カセットをコードする核酸配列を含む。本発明は、完全長hMISタンパク質またはhMISの生物学的活性のあるC末端領域をコードする発現カセットの核酸配列を構想する。随伴配列は、プラスミドまたはウイルスの起源でありうり、ベクターが細菌内で生成され、その後、望ましい植物宿主系へ導入されることを可能にするようにベクターに必要な特性を与えうる。本発明のクローニングベクターは、特定の部位に挿入されたコード核酸配列が転写かつ翻訳されるように設計される。典型的発現ベクターは、プロモーター、選択マーカー、シグナル配列をコードする核酸、ならびに調節配列、例えば、ポリアデニル化部位、5'-非翻訳領域および3'-非翻訳領域、終結部位、およびエンハンサー、を含みうる。「ベクター」は、ウイルス由来ベクター、細菌由来ベクター、植物由来ベクター、および昆虫由来ベクターを含む。
本発明の方法の実施において用いられるキメラ遺伝子には、シグナル配列も含まれる。完全長hMISまたはhMISのC末端領域をコードすることに加えて、キメラ遺伝子はまた、適切なようにタンパク質のプロセシングおよび転位置を可能にするシグナルペプチドをコードする。シグナル配列は、哺乳動物、またはコムギ、オオムギ、ワタ、イネ、ダイズ、およびジャガイモのような植物由来でありうる。これらのシグナル配列は、完全長hMISまたはhMISのC末端領域を植物宿主系内の細胞下の部位(例えば、細胞質ゾル、小胞体、アポプラスト、プラスチド、および葉緑体)へと方向づけるものである。これは、結果として、hMISの集積を増加させ、かつ精製を容易にする。本発明により企図されるシグナルペプチドは、貯蔵タンパク質パタチンをコードするジャガイモ遺伝子由来のパタチンシグナルを含む。このシグナルペプチドは、融合ポリペプチドの植物小胞体(ER)への標的化を方向づけ、そこでシグナルペプチドは正確に切断されて成熟タンパク質またはプロタンパク質を生じる。ERまたはゴルジ体での貯留または液胞への標的化のための追加のシグナルが存在しない場合には、植物においてERへと送達されたタンパク質は、内膜系を通して運ばれ、細胞外間隙(アポプラスト)へ分泌される。
本発明の発現ベクターは、典型的には、転写開始調節領域から遺伝子の反対側の末端に転写終結領域を有する。転写終結領域は、通常、転写開始領域と関連しうるまたは異なる遺伝子由来でありうる。使用されうる転写終結領域は、特にmRNAの安定性について、発現を高めるように選択されうる。例示的転写終結領域は、アグロバクテリウムTiプラスミド由来のNOSターミネーターおよびイネα-アミラーゼターミネーターを含む。
本発明に従って、ホロhMISまたはhMISのC末端領域(または他のTGF-βタンパク質もしくは生物活性断片)をコードするポリヌクレオチド配列(例えば、cDNAまたはゲノム配列)は、植物細胞において、そのようなタンパク質、またはそれらの機能的等価物の発現を方向付ける組換え核酸配列を作製するために用いられうる。
形質転換は、外因性DNAが入り、レシピエント細胞を変化させる過程である。それは、自然的過程または当技術分野においてよく知られた様々な方法を用いる人工的過程により起こりうる。形質転換は、原核生物または真核生物の宿主細胞への外来核酸配列の挿入のためのいずれの公知の方法にも頼りうる。選択の方法は、形質転換されることになっている宿主細胞の型に基づいて選択され、限定されるものではないが、ウイルス感染、電気穿孔法、熱ショック、リポフェクション、A. チュメファシエンス(A. tumefaciens)媒介型トランスフェクション、および微粒子銃を含みうる。
所望のタンパク質を含む子孫は、当技術分野においてよく知られたアッセイ法を用いて、異種性タンパク質の存在についてアッセイすることにより同定されうる。そのような方法は、ウエスタンブロット法、免役アッセイ法、結合アッセイ法、酵素活性アッセイ法、および生物学的に機能しうる異種性タンパク質を検出するように設計されたいずれのアッセイ法も含む。例えば、KLEIN, IMMUNOLOGY: SCI OF SELF-NONSELF DISCRIMINATION(John Wiley & Sons編、New York, N.Y. 1982)に記載されるアッセイ法を参照。
培養されたプロトプラストからの植物再生は、EVANSら、HANDBOOK OF PLANT CELL CULTURES, 1巻:(MacMillan Publishing Co. New York 1983); CELL CULTURE & SOMATIC CELL GENETICS OF PLANTS, (Vasil I.R.編、Acad. Press, Orlando, I巻1984およびIII巻1986)に記載される。
さらなる詳細なしに、当業者が前の記載を用いて、本発明を最大限まで利用することができる。以下の実施例は、例証となるのみであり、いずれの点においても開示の残りのものを制限しない。以下の技術は、当業者により、いずれの適切な植物宿主系においても、TGF-βスーパーファミリーのタンパク質を産生するように適応されうる。
トランスジェニックタバコ植物におけるホロhMISの発現のためのベクターの構築
完全長MISのコード領域は、GenBankアクセッション番号K03474に記載される配列を含むヒトMISのcDNAクローン由来であった(図2)。MIS cDNA配列は、pBluescript II(KS)(pBS II; Stratagene)における2.0 kb EcoRI断片として存在した。一般的なクローニングストラテジーは、図3に例示されている。好ましくない5'リーダー配列を除去し、隣接XbaI部位を供給するために、完全長MISコード領域の最初の282 bpがMS1プライマーおよびMS2プライマーを用いてPCR増幅された(図3)。PCR産物は、XbaIおよびStuIで消化され、StuIで消化された完全長MISベクターにライゲーションさせた。ライゲーション産物は、XbaIおよびEcoRIで消化され、2.0 kb断片がpBS IIベクターへクローニングされた。創傷誘導性MeGA(商標)プロモーターを含むプラスミドはEcoRIで消化され、末端はリョクトウヌクレアーゼで平滑化された。引き続いて、プラスミドは、HindIII/平滑末端断片としてプロモーター断片を切除するためにHindIIIで消化された。改変された完全長MISクローンは、XbaIで消化され、リョクトウヌクレアーゼで平滑末端化され、HindIII/平滑末端MeGA(商標)プロモーター断片へライゲーションされた。MeGA(商標)プロモーター:MIS接合部は、配列分析により確認された(図4)。その結果生じた2.3 kb HindIII/EcoRI断片は、pBiB-Kan植物形質転換ベクターのHindIII/EcoRI部位へクローニングされた。このベクターを用いる形質転換から生じるトランスジェニック植物は、CT102と名付けられた。
MeGA(商標)プロモーター:MIS遺伝子を含む発現構築物は、アグロバクテリウム媒介型形質転換により、タバコ円盤状葉片へ導入された。Horschら、223 SCIENCE 496-498(1984)。まず、小さい円盤状葉片が無菌的に成長したタバコ実生(ニコチアナタバクム(Nicotiana tabacum)、品種キサンチ(Xanthi))から切除され、MeGA(商標)プロモーター:MIS形質転換ベクターを含むアグロバクテリウムチュメファシエンスの懸濁液へ浸漬され、24時間共培養され、そして細菌の増殖(カルベニシリン)および形質転換されていない植物細胞(カナマイシン)に対して選択される培地へ移行された。形質転換された植物細胞は、NPTII遺伝子の同時導入に基づきカナマイシン耐性であった。成長および発生の3〜4週間後、分化した苗条は切除され、発根培地へ移行された。根発生後(通常、5〜7日間)、未発育植物は土壌へ移行された。トランスジェニック植物は、最初の形質転換の10週間以内に温室へ移行された。約8週間で、最初の葉組織が切除され、誘導され、そしてホロhMIS発現について免疫ドットブロット法によりスクリーニングされた。成長のさらに数週間後、葉組織は、下記のようなDNA、RNA、およびタンパク質分析のために採取された。
MISのバイオ生産を誘導するために、CT102-0018由来のトランスジェニックMIS植物組織の2グラムを極細パスタ製造器を用いて1.5 mm条片へ切り刻むことにより創傷誘導され、室温で24時間、38時間、72時間、および92時間、インキュベートされた。MISタンパク質は、他の分泌されるタンパク質と比較してゆっくりと内膜系を通して移動する特徴をもつ。例えば、CHO細胞で合成されるMISタンパク質は、感染後72時間までに培地中に検出されない。創傷誘導されたトランスジェニック植物におけるMIS mRNAの最大集積は、MeGA(商標)プロモーターにより支配される導入遺伝子の典型であるが、創傷後12時間で見られた。しかしながら、トランスジェニックMISタンパク質は、植物組織の創傷誘導後58〜72時間の分泌画分において検出された。
トランスジェニックタバコ植物におけるC末端hMISの発現のためのベクターの構築
MIS生物活性ペプチドは、成熟ホロMIS前駆体のアミノ酸ARG427とSER428との間のフリン(furin)様切断により生成される。その結果生じる25 kD ホモ二量体、C末端MISは、MIS受容体タンパク質により認識される生物活性タンパク質である。天然の生物活性C末端MISは、グリコシル化されてなく、ヒトの等価分子を作製するために植物特異的グリコシル化を改変するいずれの必要も取り除く。C末端MISを直接的に産生するために、開始コドンならびにC末端MIS産物を二量体化および分泌のために内膜系へと方向づけるためのインフレームのシグナルペプチドをコードする配列を供給する必要があった。植物においてC末端生物活性MIS断片の発現のための構築物を作製するために、ヒトMIS[GenBankアクセッション番号K03474(図2)]のC末端をコードするcDNA領域をPCR増幅し、ジャガイモパタチン遺伝子由来の植物シグナルペプチドをコードする配列に融合させた。一般的なクローニングストラテジーは図7に示されている。K03474アミノ酸配列に基づいて、プライマーは、ヒトMISのC末端99個のアミノ酸をコードする領域を増幅するために設計および使用された(図8)。プライマーは、隣接するXbaIおよびKpnIの制限部位を供給するように設計された。その結果生じたPCR産物は、pUC18へクローニングされ、配列が確認されて、その結果生じたプラスミドはpCT104と名付けられた。パタチンシグナルペプチドをコードする配列(パタチンSP;図9)に操作可能なように融合されたMeGA(商標)プロモーターを含んでいる領域を含む、プラスミドpCT103は、KpnIで消化され、平滑末端を作り出すためにリョクトウヌクレアーゼで処理された。pCT104クローン(C末端MIS配列をコードする)はXbaIで消化され、リョクトウヌクレアーゼで平滑末端化され、続いて、KpnI/平滑末端断片としてC末端MIS断片を放出するためにKpnIで消化された。C末端断片は、インフレーム融合を作製するようにMeGA(商標)プロモーター:パタチンSPにライゲーションされた。配列確認後、MeGA(商標):パタチンSP:C末端MISを含む0.5 kb HindIII/KpnI断片(図10)は、HindIIIおよびKpnIで消化された植物形質転換ベクター、pBiB-Kanへとクローニングされた。このベクターを用いる形質転換から生じたトランスジェニック植物はCT116と名付けられた。
C末端MIS発現構築物は、アグロバクテリウムチュメファシエンスへ導入され、上記のようにアグロバクテリウム媒介型形質転換によりタバコ円盤状葉片を形質転換するために用いられた。数百個のトランスジェニック植物が単離され、C末端MIS転写物の創傷誘導性集積についてスクリーニングされた。選択されたトランスジェニック植物からの全RNAのノーザン分析より、適切なサイズ(650塩基)のMIS転写物がこれらの植物に存在することが示された(図11)。C末端MIS植物は、完全長MIS植物と比較して、より高いレベルのMIS発現を示した。発現のより高度なC末端MIS系由来の種は、タンパク質の精製および特徴付け研究における将来的な使用のために産生された。
C末端MISトランスジェニック植物が12.5 kDタンパク質を発現させたことを示すために、CT116-0036植物からの組織を採取し、創傷誘導し、そして室温で0〜96時間インキュベートした。分泌画分は、抽出緩衝液中で誘導された組織をすすぐことにより収集され、分泌画分からのタンパク質は上記のようにウエスタン分析により分析された。試料は15 % SDS-PAGEで分析され、膜へ転写され、そしてウサギ抗C末端MIS抗体で探索された。図12に示されるように、25 kD 交差反応のバンドは、48時間、72時間、および96時間の試料に存在した。小さい方の13 kD タンパク質は、72時間および96時間の試料のみに存在した。このように、タバコは、C末端MISの25 kD 二量体、加えて12.5 kD 単量体を産生かつ分泌する。
MIS活性についての決定的な生物検定は、ラット胎児ミュラー管の組織の選択的退縮を含む。Donahoeら、16 BIOL. REPRO. 238-243(1977); MacLaughlinら、198 METH. ENZYMOL. 358-369(1991)。活性化ホロMIS(例えば、プラスミンまたはエンドプロテアーゼ-Lys Cのどちらかで酵素的に切断された)または二量体C末端MISペプチドのどちらかのMIS生物活性が、隣接した組織または近くのウォルフ管に作用することなく、ミュラー管の選択的退縮をモニターする標準的ラット胎児ミュラー管退縮生物検定において測定される。細胞毒性成分に対するこのアッセイ法の感受性により、様々な非トランスジェニックタバコ抽出物および分泌画分からの粗タンパク質調製物(微小濾過および限外濾過された粗タンパク質濃縮物)は毒性について試験された。すべての粗タバコ調製物は、切除された胚性ラット泌尿生殖器組織に若干程度の非特異的毒性を示した。このように、タバコ合成MISの部分的精製は、標準的ラット胎児ミュラー管退縮生物検定における使用の前に必要とされた。
Claims (40)
- TGF-βタンパク質をコードするキメラの核酸配列で植物宿主系を形質転換すること;TGF-βタンパク質を発現させる条件下で形質転換された宿主系を栽培する段階;および該植物宿主系から発現したTGF-βタンパク質を回収することを含む、植物宿主系において組換えTGF-βタンパク質を産生するための方法。
- TGF-βタンパク質がアクチビン、MIS、BMP、およびMNSFタンパク質からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
- TGF-βタンパク質がヒトMISタンパク質である、請求項1記載の方法。
- 発現したTGF-βタンパク質が完全長TGF-βタンパク質、TGF-βペプチド断片、またはそれらの遺伝的もしくは化学的変種である、請求項1、2、または3記載の方法。
- ペプチド断片が生物活性C末端断片を含む、請求項4記載の方法。
- 生物活性C末端断片が植物特有のグリカンを含まない、請求項5記載の方法。
- 発現したTGF-βタンパク質が植物特有のグリカンまたはグリカン組成物を含むN結合型グリカンを含んでいる、請求項1、2、または3記載の方法。
- 植物特有のグリカンを減ずるもしくは除去するため、またはより望ましい糖変異体を生じるために、インビボまたはインビトロでN結合型グリカンを改変することをさらに含む、請求項7記載の方法。
- 植物宿主系から回収されたTGF-βタンパク質が化学物質または酵素により処理される、請求項8記載の方法。
- 酵素がグリコシダーゼまたはグリコシルトランスフェラーゼを含む、請求項9記載の方法。
- グリコシダーゼがキシロシダーゼおよび1,3-フコシダーゼからなる群より選択され、グリコシルトランスフェラーゼがガラクトシルトランスフェラーゼまたはシアリルトランスフェラーゼからなる群より選択される、請求項10記載の方法。
- キメラの核酸配列が、植物宿主系において転写を調節する能力がある第一の核酸配列、シグナル配列をコードする第二の核酸配列、およびTGF-βタンパク質をコードする第三の核酸配列を含む、請求項1記載の方法。
- 第三の核酸配列が完全長TGF-βタンパク質または生物活性TGF-βタンパク質C末端断片をコードするための遺伝子を含む、請求項11記載の方法。
- TGF-βタンパク質がヒトMISタンパク質である、請求項13記載の方法。
- 第三の核酸配列が完全長タンパク質および切断部位をコードするための遺伝子を含む、請求項12、13、または14記載の方法。
- 切断部位が酵素的または化学的手段により切断可能である、請求項15記載の方法。
- 第一の核酸が植物活性プロモーターである、請求項12、13、または14記載の方法。
- 植物活性プロモーターが植物遺伝子配列、植物ウイルスの配列、非植物遺伝子配列、または合成起源由来である、請求項17記載の方法。
- 植物活性プロモーターが恒常的プロモーター、収穫前誘導性プロモーター、収穫後誘導性プロモーター、発生的に調節されるプロモーター、または組織特異的プロモーターからなる群より選択される、請求項17記載の方法。
- 植物活性プロモーターがMeGA(商標)プロモーターである、請求項17記載の方法。
- 第二の核酸配列がTGF-βタンパク質を植物宿主系内の細胞下の部位へ標的化する、請求項12、13、または14記載の方法。
- 細胞下の部位が細胞質ゾル、プラスチド、小胞体、またはアポプラストを含む、請求項21記載の方法。
- 第二の核酸配列が植物由来シグナルペプチドをコードするための遺伝子を含む、請求項12、13、または14記載の方法。
- 植物由来シグナルペプチドがパタチンシグナルペプチドである、請求項23の方法。
- 植物宿主系において転写を調節する能力がある第一の核酸配列、シグナル配列をコードする第二の核酸配列、およびTGF-βタンパク質をコードする第三の核酸配列を含む発現カセット。
- 第三の核酸配列が完全長TGF-βタンパク質または生物活性TGF-βタンパク質C末端断片をコードするための遺伝子を含む、請求項25記載の発現カセット。
- TGF-βタンパク質がヒトMISタンパク質である、請求項26記載の発現カセット。
- 第三の核酸配列が完全長タンパク質および切断部位をコードするための遺伝子を含む、請求項25、26、または27記載の発現カセット。
- 切断部位が酵素的または化学的手段により切断可能である、請求項28記載の発現カセット法。
- 第一の核酸が植物活性プロモーターである、請求項25、26、または27記載の発現カセット法。
- 植物活性プロモーターが植物遺伝子配列、植物ウイルスの配列、非植物遺伝子配列、または合成起源由来である、請求項30記載の発現カセット。
- 植物活性プロモーターが恒常的プロモーター、収穫前誘導性プロモーター、収穫後誘導性プロモーター、発生的に調節されるプロモーター、または組織特異的プロモーターからなる群より選択される、請求項30記載の発現カセット。
- 植物活性プロモーターがMeGA(商標)プロモーターである、請求項30記載の発現カセット法。
- 第二の核酸配列がTGF-βタンパク質を植物宿主系内の細胞下の部位へ標的化する、請求項25、26、または27記載の発現カセット法。
- 細胞下の部位が細胞質ゾル、プラスチド、小胞体、またはアポプラストを含む、請求項34記載の発現カセット法。
- 第二の核酸配列が植物由来シグナルペプチドをコードするための遺伝子を含む、請求項25、26、または27記載の発現カセット法。
- 植物由来シグナルペプチドがパタチンシグナルペプチドである、請求項36記載の発現カセット法。
- 請求項25〜37のいずれか一項記載の発現カセットで形質転換された植物宿主系。
- 植物または植物細胞である、請求項38記載の植物宿主系。
- 植物または植物細胞が単子葉植物または双子葉植物である、請求項39記載の植物宿主系。
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