CN103403029B - 抗cea抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明提供结合膜结合CEA的抗原结合分子(ABM),包括具有改善的治疗特性的ABM,及其使用方法。
Description
相关申请
本申请要求2011年3月2日提交的欧洲专利申请No.11156665.9的权益,通过述及将其公开内容完整收入本文。
发明领域
本发明涉及抗原结合分子(ABM)。在具体的实施方案中,本发明涉及结合人癌胚抗原(CEA)的重组单克隆抗体,包括嵌合的、灵长类化的(primatized)或人源化的抗体。
发明背景
癌胚抗原(CEA)和抗CEA抗体
癌胚抗原(CEA,又称为CEACAM-5或CD66e)是一种具有约180kDa分子量的糖蛋白。CEA是免疫球蛋白超家族的一名成员,并且含有经由糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚与细胞膜连接的7个域(ThompsonJ.A.,JClinLabAnal.5:344-366,1991)。7个域包括单一N端Ig可变域和与Ig恒定域同源的6个域(A1-B1-A2-B2-A3-B3)(HeftaLJ等,CancerRes.52:5647-5655,1992)。
人CEA家族含有29种基因,其中18种得到表达:7种属于CEA亚组,而11种属于妊娠特异性糖蛋白亚组。认为几个CEA亚组成员拥有细胞粘附特性。认为CEA在先天性免疫中具有作用(S.,SeminCancerBiol.9(2):67-81(1999))。由于存在与CEA紧密相关的蛋白质,生成与其它紧密相关蛋白质具有最小交叉反应性的对CEA特异性的抗CEA抗体可以是有挑战的。
CEA早就被鉴定为肿瘤相关抗原(Gold和Freedman,JExpMed.,121:439-462,1965;BerinsteinN.L.,JClinOncol.,20:2197-2207,2002)。最初分类为仅在胎儿组织中表达的蛋白质,CEA现在已经在几种正常成年组织中鉴定出。这些组织在起源上主要是上皮的,包括胃肠、呼吸、和泌尿生殖道的细胞,及结肠、宫颈、汗腺、和前列腺的细胞(Nap等,TumourBiol.,9(2-3):145-53,1988;Nap等,CancerRes.,52(8):2329-23339,1992)。
上皮起源的肿瘤及其转移含有CEA作为肿瘤相关抗原。虽然CEA自身的存在不指示转化为癌性细胞,但是CEA的分布是指示的。在正常的组织中,CEA一般在细胞的顶端表面上表达(S.,SeminCancerBiol.9(2):67-81(1999)),使得血流中的抗体难以接近它。与正常的组织相反,CEA趋向于在癌性细胞的整个表面上表达(S.,SeminCancerBiol.9(2):67-81(1999))。此表达样式变化使CEA在癌性细胞中能被抗体结合。另外,CEA表达在癌性细胞中升高。此外,升高的CEA表达促进升高的细胞间粘着,这可以导致转移(MarshallJ.,SeminOncol.,30(增刊8):30-6,2003)。
CEA容易自细胞表面切割,并直接或经由淋巴系统自肿瘤脱落入血流中。由于此特性,已经使用血清CEA的水平作为临床标志物以诊断癌症并筛选癌症,特别地结肠直肠癌的复发(GoldenbergDM.,TheInternationalJournalofBiologicalMarkers,7:183-188,1992;ChauI.等,JClinOncol.,22:1420-1429,2004;Flamini等,ClinCancerRes;12(23):6985-6988,2006)。此特性还为使用CEA作为靶物呈现挑战之一,因为血清CEA结合大多数目前可用的抗CEA抗体,这阻碍它们达到细胞表面上的其靶物,并且限制潜在的临床效果。
出于研究目的、作为诊断工具、及出于治疗目的,已经针对CEA生成多种单克隆抗体(例如,Nap等,CancerRes.,52(8):2329-23339,1992;Sheahan等,Am.J.Clin.Path.94:157-164,1990;Sakurai等,J.Surg.Oncol.,42:39-46,1989;GoldenbergDM.,TheInternationalJournalofBiologicalMarkers,7:183-188,1992;LedermannJA,Br.J.Cancer,58:654,1988;LedermannJA,Br.J.Cancer,68:69-73,1993;PedleyRB等,Br.J.Cancer,68:69-73,1993;BoxerGM等,Br.J.Cancer,65:825-831,1992)。Chester等已经自噬菌体展示文库分离出单链抗CEA抗体以在放射性免疫检测和放射性免疫疗法中使用(美国专利No.5,876,691),随后将抗体人源化(美国专利No.7,232,888)。也已经自人噬菌体展示文库分离出抗CEA抗体(美国专利No.5,872,215)。
通过融合NS1(P3/NS1/I-Ag-4-1)骨髓瘤细胞与来自用正常结肠直肠上皮免疫的小鼠的脾细胞来生成小鼠单克隆抗体PR1A3(RichmanP.I.和BodmerW.F.,Int.J.Cancer,39:317-328,1987)。PR1A3与良好和不良分化的结肠直肠癌两者强烈起反应,并且优于其它结肠直肠上皮反应性抗体,因为其抗原表现为固定至肿瘤,并且不出现在引流肿瘤的正常淋巴结或淋巴系统中(GranowskaM.等,Eur.J.Nucl.Med.,20:690-698,1989)。例如,PR1A3与59/60例结肠直肠肿瘤起反应(RichmanP.I.和BodmerW.F.,Int.J.Cancer,39:317-328,1987),而CEA反应性抗体B72.3仅与75%的结肠直肠肿瘤起反应(MansiL.等,IntJRadApplInstrumB.,16(2):127-35,1989)。
PR1A3的表位定位显示了抗体靶向CEA分子的B3域和GPI锚(DurbinH.等,Proc.Natl.Scad.Sci.USA,91:4313-4317,1994)。因此,PR1A3抗体仅结合膜结合CEA,而非可在癌症患者的血流中找到的可溶性CEA形式。由于此结合特性,PR1A3抗体不太可能被血清CEA隔离;相反,它可以靶向癌性细胞上表达的CEA。由PR1A3结合的表位是一种构象表位,不是线性表位,认为它促成PR1A3对可溶性CEA结合的丧失(Stewart等,CancerImmunolImmunother,47:299-06,1999)。
先前通过将鼠亲本抗体的CDR嫁接至人抗体RF-TS3’CL的重链框架区1-3(保留PR1A3的鼠框架4)和REI抗体的轻链框架区来使PR1A3抗体人源化。(Stewart等,CancerImmunolImmunother,47:299-06,1999)。PR1A3的此人源化型式保留特异性,并且对于表面表达的CEA,与鼠抗体具有相似的亲和力(Stewart等,CancerImmunolImmunother,47:299-06,1999;美国专利No.5,965,710)。显示了人源化PR1A3(hPR1A3)抗体诱导对结肠直肠癌细胞系的靶向性杀死。(ConaghhanP.J.等,Br.J.Cancer,98(7):1217-1225)。然而,hPR1A3对CEA的亲和力相对较低。
放射性标记的抗CEA抗体已经在结肠直肠癌患者的临床试验中使用。例如,在结肠直肠癌患者的试验性临床研究中使用经123I标记的嵌合微型抗体T84.66(cT84.66)。放射性标记的微型抗体能够靶向癌细胞。(WongJ.Y.等,ClinCancerRes.10(15):5014-21,(2004))。在另一个例子中,在结肠直肠癌的肝转移患者的辅助放射性免疫疗法中测试(131)I-拉贝珠单抗(labetuzumab),即一种放射性标记的人源化抗CEA抗体,并且发现提供了有希望的存活优点。(LierschT.等,Ann.Surg.Oncol.14(9):2577-90,(2007))。
抗体糖基化
寡糖组分可以显著影响与治疗性糖蛋白的功效有关的特性,包括物理稳定性、对蛋白酶攻击的抗性、与免疫系统的相互作用、药动学、和特定生物学活性。此类特性可以不仅取决于寡糖的存在或缺乏,而且还取决于寡糖的特定结构。可以做出寡糖结构与糖蛋白功能间的一些概括。例如,某些寡糖结构经由与特定碳水化合物结合蛋白的相互作用来介导糖蛋白自血流的快速清除,而其它寡糖结构可以被抗体结合,并且触发不想要的免疫反应。(Jenkins等,NatureBiotechnol.14:975-81,1996)。
哺乳动物细胞由于其以对于人应用最相容的形式使蛋白质糖基化的性能而已经成为用于生产治疗性糖蛋白的优选宿主。(Cumming等,Glycobiology1:115-30,1991;Jenkins等,NatureBiotechnol.14:975-981,1996)。细菌糖基化蛋白质非常罕见,并且与其它类型的常见宿主,诸如酵母、丝状真菌、昆虫和植物细胞一样,其产生与自血流快速清除、不想要的免疫相互作用、和(在一些特定的情况中)降低的生物学活性有关的糖基化样式。在哺乳动物细胞中,在过去二十年期间最常使用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在给出合适的糖基化样式外,这些细胞容许遗传稳定的、高生产性克隆细胞系的一致生成。它们可以使用无血清培养基在简单的生物反应器中培养至高密度,并且容许开发安全且可再现的生物工艺。其它常用的动物细胞包括幼仓鼠肾(BHK)细胞、NS0和SP2/0-小鼠骨髓瘤细胞。新近,还已经测试了来自转基因动物的生成(Jenkins等,NatureBiotechnol.14:975-81,1996)。
所有抗体在重链恒定区中的保守位置处都含有碳水化合物结构,其中每种同种型拥有独特的一批N连接的碳水化合物结构,其易变地影响蛋白质装配、分泌或功能性活性。(WrightA.和MorrisonS.L.,TrendsBiotech.15:26-32,1997)。根据加工程度,附着的N连接的碳水化合物的结构变化得相当大,并且可以包括高甘露糖的、多分支的及双触角(biantennary)复合寡糖。(Wright,A.和Morrison,S.L.,TrendsBiotech.15:26-32,1997)。通常,存在着对特定糖基化位点处附着的核心寡糖结构的异质加工,使得甚至单克隆抗体以多种糖化同种型(glycoform)的群体存在。同样地,已经显示了细胞系间存在抗体糖基化的重大差异,并且甚至对在不同培养条件下培养的给定细胞系看到轻微差异。(Lifely,M.R.等,Glycobiology5(8):813-22,1995)。
一种在维持简单的生产工艺并潜在地避免显著的、不想要的副作用的情况中获得效力大幅升高的方式是通过工程化改造单克隆抗体的寡糖组分来增强其天然的、细胞介导的效应器功能,如记载于P.等,NatureBiotechnol.17:176-180(1999)和美国专利No.6,602,684的,在此通过提及而完整收录其全部内容。IgG1型抗体(即癌症免疫疗法中最常使用的)是在每个CH2域中的Asn297处具有保守的N连接的糖基化位点的糖蛋白。附着于Asn297的两个复合双触角寡糖掩埋于各CH2域间,与多肽主链形成广泛的接触,并且其存在对于抗体介导效应器功能诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)是至关重要的(Lifely,M.R.等,Glycobiology5:813-822(1995);Jefferis,R.等,ImmunolRev.163:59-76(1998);Wright,A.和Morrison,S.L.,TrendsBiotechnol.15:26-32(1997))。
等先前显示了β(1,4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(“GnTIII”)(一种催化两分型寡糖形成的糖基转移酶)在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过表达显著提高由工程化改造的CHO细胞生成的抗成神经细胞瘤嵌合单克隆抗体(chCE7)的体外ADCC活性。(参见P.等,NatureBiotechnol.17:176-180(1999);及国际公开文本No.WO99/54342,在此通过提及而收录其全部内容)。抗体chCE7属于具有高肿瘤亲和力和特异性,但是在缺乏GnTIII酶的标准工业细胞系中生产时具有太少的效力以致在临床上无用的一大类未缀合的单抗(Umana,P.等,NatureBiotechnol.17:176-180(1999))。该研究第一次显示了可以通过工程化改造抗体生成细胞以表达GnTIII来获得ADCC活性的大幅升高,其还导致恒定区(Fc)结合的两分型寡糖(包括两分型非岩藻糖基化寡糖)比例的增加,高于天然存在的抗体中找到的水平。
仍然需要靶向CEA,特别是膜结合CEA的增强的治疗方法以治疗癌症。
发明概述
本发明的一个方面提供一种结合膜结合人癌胚抗原(CEA)的变体抗原结合分子(ABM),诸如抗体。在一个实施方案中,与其亲本分子相比,ABM具有稳定性的升高。在一个实施方案中,与其亲本分子相比,ABM具有稳定性的升高且维持对膜结合CEA的结合亲和力或具有改善的对膜结合CEA的结合亲和力。在一个实施方案中,ABM在比其亲本分子高至少0.5、1.0、1.5、或2.0摄氏度的温度是稳定的。在一个实施方案中,使用动态光散射测定法来测量稳定性的升高。在一些实施方案中,亲本比较分子是PR1A3抗体或R1A3抗体的人源化型式。在一个实施方案中,亲本比较分子是包含重链可变区CH7A(SEQIDNO:101)和轻链可变区2F1(SEQIDNO:209)的R1A3抗体的人源化型式。在一个实施方案中,变体抗原结合分子在67摄氏度或更高温度是稳定的,如例如通过动态光散射测定法测量的。在一个实施方案中,变体抗原结合分子以100nM或更低的Kd结合膜结合CEA。在一个实施方案中,变体抗原结合分子以10nM或更低的Kd结合膜结合CEA。
在一个实施方案中,ABM包含重链可变区,该重链可变区包含选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、和SEQIDNO:12的重链CDR1,选自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、和SEQIDNO:24的重链CDR2,和选自SEQIDNO:217、SEQIDNO:218、SEQIDNO:219、SEQIDNO:220、SEQIDNO:221、SEQIDNO:222、SEQIDNO:223、和SEQIDNO:224的重链CDR3。在一个实施方案中,ABM包含轻链可变区,该轻链可变区包含选自SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、和SEQIDNO:45的轻链CDR1,选自SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、和SEQIDNO:55的轻链CDR2,和SEQIDNO:56的轻链CDR3。在另一个实施方案中,ABM的重链可变区包含重链CDR1SEQIDNO:1,重链CDR2SEQIDNO:13,选自SEQIDNO:217、SEQIDNO:218、SEQIDNO:219、SEQIDNO:220、SEQIDNO:221、SEQIDNO:222、SEQIDNO:223、和SEQIDNO:224的重链CDR3;而ABM的轻链可变区包含轻链CDR1SEQIDNO:39,轻链CDR2SEQIDNO:49,和轻链CDR3SEQIDNO:56。在又一个实施方案中,ABM包含CH1A1A(SEQIDNO:261)或CH1A1B(SEQIDNO:262)的框架残基。
在一个实施方案中,ABM的重链可变区包含与选自SEQIDNO:233、SEQIDNO:234、SEQIDNO:235、SEQIDNO:239、SEQIDNO:241、SEQIDNO:242、SEQIDNO:243、和SEQIDNO:247的序列至少95%相同的氨基酸序列,而ABM的轻链可变区包含与SEQIDNO:209的序列至少95%相同的氨基酸序列。在一个实施方案中,ABM的重链可变区包含选自SEQIDNO:233、SEQIDNO:234、SEQIDNO:235、SEQIDNO:239、SEQIDNO:241、SEQIDNO:242、SEQIDNO:243、和SEQIDNO:247的氨基酸序列,而ABM的轻链可变区包含SEQIDNO:209的氨基酸序列。在一些实施方案中,ABM包含Fc区,例如人IgGFc区。在某些实施方案中,ABM是抗体或其片段,诸如完整抗体、scFv片段、Fv片段、F(ab')2片段、微型抗体、双抗体、三抗体、或四抗体。
本发明的另一个方面提供一种结合膜结合CEA的分离的抗体,其中该抗体包含重链可变区,该重链可变区包含选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、和SEQIDNO:12的重链CDR1,选自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、和SEQIDNO:24的重链CDR2,和选自SEQIDNO:217、SEQIDNO:218、SEQIDNO:219、SEQIDNO:220、SEQIDNO:221、SEQIDNO:222、SEQIDNO:223、和SEQIDNO:224的重链CDR3。
在一个实施方案中,与其亲本分子相比,抗体具有稳定性的升高。在一个实施方案中,抗体在比其亲本分子高至少0.5、1.0、1.5、或2.0摄氏度的温度是稳定的。在一个实施方案中,使用动态光散射测定法来测量稳定性的升高。在一些实施方案中,亲本比较分子是PR1A3抗体或R1A3抗体的人源化型式。在一个实施方案中,亲本比较分子是包含重链可变区CH7A(SEQIDNO:101)和轻链可变区2F1(SEQIDNO:209)的R1A3抗体的人源化型式。在一个实施方案中,抗体在67摄氏度或更高是稳定的,如例如通过动态光散射测定法测量的。在一个实施方案中,抗体以100nM或更低的Kd结合膜结合CEA。在一个实施方案中,抗体以10nM或更低的Kd结合膜结合CEA。
在一个实施方案中,抗体还包含轻链可变区,该轻链可变区包含选自SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、和SEQIDNO:45的轻链CDR1,选自SEQIDNO:46、和SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、和SEQIDNO:55的轻链CDR2,和SEQIDNO:56的轻链CDR3。在一个实施方案中,抗体的重链可变区包含重链CDR1SEQIDNO:1,重链CDR2SEQIDNO:13,选自SEQIDNO:217、SEQIDNO:218、SEQIDNO:219、SEQIDNO:220、SEQIDNO:221、SEQIDNO:222、SEQIDNO:223、和SEQIDNO:224的重链CDR3;而抗体的轻链可变区包含轻链CDR1SEQIDNO:39,轻链CDR2SEQIDNO:49,和轻链CDR3SEQIDNO:56。在又一个实施方案中,抗体包含CH1A1A(SEQIDNO:261)或CH1A1B(SEQIDNO:262)的框架残基。在一个实施方案中,抗体的重链可变区包含与选自SEQIDNO:233、SEQIDNO:234、SEQIDNO:235、SEQIDNO:239、SEQIDNO:241、SEQIDNO:242、SEQIDNO:243、和SEQIDNO:247的序列至少95%相同的氨基酸序列,而抗体的轻链可变区包含与SEQIDNO:209的序列至少95%相同的氨基酸序列。在一个实施方案中,抗体的重链可变区包含选自SEQIDNO:233,SEQIDNO:234、SEQIDNO:235、SEQIDNO:239、SEQIDNO:241、SEQIDNO:242、SEQIDNO:243、和SEQIDNO:247的氨基酸序列,而抗体的轻链可变区包含SEQIDNO:209的氨基酸序列。
在某些实施方案中,上述实施方案的ABM或抗体与鼠单克隆抗体PR1A3结合相同表位或能够与鼠单克隆抗体PR1A3竞争结合。
在一个实施方案中,ABM或抗体包含经糖工程化改造的Fc区。在一个实施方案中,糖工程抗体的Fc区中至少约20%至约100%的N连接寡糖是非岩藻糖基化的。在一个实施方案中,糖工程Fc区中至少约20%至约100%的N连接寡糖是两分型的。在一个实施方案中,其中糖工程Fc区中至少约20%至约50%的N连接寡糖是两分型的、未岩藻糖基化的。在一个实施方案中,糖工程ABM或抗体具有至少一项升高的效应器功能。升高的效应器功能是例如升高的Fc受体结合亲和力、升高的抗体介导的细胞的细胞毒性(ADCC)、升高的对NK细胞的结合、升高的对巨噬细胞的结合、升高的对单核细胞的结合、升高的对多形核细胞的结合、诱导凋亡的直接信号传导、升高的树突细胞成熟、和升高的T细胞引发。在一个实施方案中,与非糖工程亲本抗原结合分子相比,糖工程ABM或抗体具有至少约40%至约100%的ADCC升高。
本发明的另一个方面提供一种分离的多核苷酸,其编码任何上文所述实施方案的ABM或抗体。本发明的另一个方面提供一种载体,其包含编码任何上文所述实施方案的ABM或抗体的多核苷酸。本发明的另一个方面提供宿主细胞,其包含这种载体。
本发明的另一个方面提供一种组合物,其包含任何上文所述实施方案的ABM或抗体和药学可接受载体。
本发明的另一个方面提供一种诱导肿瘤细胞的细胞裂解的方法,其包括使肿瘤细胞与任何上文所述实施方案的ABM或抗体接触。在一些实施方案中,肿瘤细胞是结肠直肠癌细胞、NSCLC(非小细胞肺癌)、胃癌细胞、胰腺癌细胞或乳腺癌细胞。在一个实施方案中,通过ABM或抗体的抗体依赖性细胞的细胞毒性诱导细胞裂解。
本发明的另一个方面提供一种治疗具有异常表达CEA的癌症的受试者的方法,该方法包括对受试者施用治疗有效量的任何上文所述实施方案的ABM或抗体。
本发明的另一个方面提供一种延长具有异常表达CEA的癌症的受试者的存活时间的方法,所述方法包括对所述受试者施用治疗有效量的任何上文所述实施方案的ABM或抗体。在一个实施方案中,癌症是结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌或乳腺癌。
在这些方法的某些实施方案中,与化疗或放疗组合施用ABM、抗体、或组合物。在一个实施方案中,受试者是人。
本发明的另一个方面提供任何上文所述实施方案的ABM抗体在制备用于治疗具有异常表达CEA的癌症的受试者的药物中的用途。在一个实施方案中,癌症选自下组:结肠直肠癌,非小细胞肺癌(NSCLC),胃癌,胰腺癌和乳腺癌。
附图简述
图1显示了CEA(CEACAM-5、CD66e)抗原的示意图。PR1A3抗体特异性结合抗原B3域(在其结合细胞膜时)。
图2显示了以人PBMC作为效应器,与非糖工程嵌合PR1A3抗体相比,糖工程嵌合PR1A3抗体的增强的ADCC活性。
图3显示了与嵌合PR1A3抗体相比,包含重链可变区构建体CH7A和轻链可变区构建体CL1A的人源化PR1A3抗体的抗原结合活性。
图4显示了用于生成抗体文库以亲和力成熟人源化PR1A3抗体轻链的随机化位点。将用X标记的位置随机化。
图5显示了用于生成抗体文库以亲和力成熟人源化PR1A3抗体重链的随机化位点。将用X标记的位置随机化。
图6显示了自人源化PR1A3抗体衍生的包含重链可变区构建体CH7ArF9和轻链可变区构建体CL1ArH11的亲和力成熟的抗CEA抗体的结合活性。
图7显示了脾内施用LS174T人结肠直肠癌细胞以具有正位肿瘤模型(orthotopictumormodel)的SCID/bg小鼠中的功效研究的结果。7天后通过以25mg/kg体重的剂量注射抗体来开始抗体疗法,接着是两次额外的每周注射。“CH7A”代表包含PR1A3的CDR的人源化抗体,如本文中所描述的。“SM3E”指先前生成的抗CEA抗体。“GA201”代表作为阳性对照使用的人源化抗EGF抗体。“PBS”指磷酸盐缓冲盐水,其作为阴性对照使用。依照由Swiss管理机构限定的终止标准来测量存活。
图8显示了静脉内注射A549肺癌细胞的SCID/bg小鼠(其中肿瘤在动物肺中移植)中的功效研究的结果。7天后通过以25mg/kg体重的剂量注射抗体来开始抗体疗法,接着是两次额外的每周注射。“CH7A”、“SM3E”、和“GA201”如对上文图7所列的。名称“CH7ArF9CL1ArH11”代表具有亲和力成熟的重和轻链的CH7A抗体变体。名称“ge”指示已经将抗体糖工程化改造成具有Fc区中数目减少的岩藻糖基化寡糖。“媒介物”指阴性对照。A549肺癌细胞在EGFR表达方面呈强阳性,而在CEA表达方面呈弱阳性。
图9显示了脾内施用MKN45胃癌细胞(其在动物肝中产生肿瘤转移)的SCID/bg小鼠中的功效研究的结果。名称“CH7ArF9CL1ArH11”、“SM3E”、“ge”、和“PBS”如对上文图7和8所列的。
图10显示了对亲和力成熟的克隆的动力学分析:(a)显示具有与未成熟的轻链CL1A(SEQIDNO:105)一起的亲和力成熟的重链CH7AH4E9(SEQIDNO:199);与未成熟的重链CH7A组合的亲和力成熟的轻链CL1ApAC18(SEQIDNO:209);及CH7AH4E9和CL1ApAC18(SEQIDNO:199和209)的组合的抗CEAFab的传感图;(b)对亲和力成熟的克隆的动力学分析的汇总。
图11显示了人源化CH7A抗CEA抗体重链的CDR1和CDR2随机化的PCR策略的示意性概述。
图12显示了人源化CL1A抗CEA抗体轻链的CDR1和CDR2随机化的PCR策略的示意性概述。
图13显示了人源化CH7A抗CEA抗体重链的CDR3随机化的PCR策略的示意性概述。
图14显示了人源化CL1A抗CEA抗体轻链的CDR3随机化的PCR策略的示意性概述。
图15显示了抗CEA抗体对MKN45靶细胞上的膜结合CEA的结合亲和力。与对照抗体(CH7A,CL1A)相比,已经转化成IgG的具有亲和力成熟的轻链(小图A,CH7A、CL1ArH7或CH7A、CL1ArH11)或亲和力成熟的重和轻链(小图B,CH7ArB9、CL1ArH11G2(1))的人源化抗CEA抗体显示改善的结合。
图16显示了与对照抗体(CH7A、CL1AG2(R2))相比测试通过亲和力成熟的抗体(CH7ArB9、CL1ArH11G2(1)、CH7Arf9、CL1ArH11G2(1)、和CH7A、CL1ArH11G2(1))实现的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的测定法的结果。
图17显示了与小鼠-人嵌合抗体chPR1A3相比,具有重链CH1A的抗CEA抗体的细胞结合测定法的结果。
图18显示了具有重链CH1A1、CH1A2、CH1A3、或CH1A4和轻链2F1的抗CEA抗体的结合测定法的结果。
图19显示了具有重链CH1A1、CH1A2、CH1A3、或CH1A4的抗CEA抗体的稳定性测定法的结果。
图20显示了自CH1A1生成的抗CEA抗体的表面等离振子共振(SPR)分析的结果。
图21显示了自CH1A1生成的抗CEA抗体的细胞结合测定法的结果。
图22显示了与亲本5HFF12重链相比,稳定性工程抗CEA抗体的亲和力(以二价形式测量)的表面等离振子共振(SPR)测量。
图23和24显示了与其亲本重链CH7A(引入在5HFF12中选定的个别点突变)相比,亲和力成熟抗体5HFF12的稳定性测定法的结果。
图25显示了组合框架和CDR-H3变体的表面等离振子共振分析。
图26显示了基于CHA1A的框架变体的ADCC活性。
图27显示了基于CHA1A的框架变体的ADCC活性。
图28显示了组合框架和CDR-H3变体的ADCC活性。
图29显示了组合框架和CDR-H3变体的ADCC活性。
图30显示了糖工程抗CEA抗体CH1A1A(Y98A/D99Y)x2F1在人CD16转基因的SCID小鼠的结肠直肠癌异种移植物模型中的功效。
图31显示了糖工程抗CEA抗体CH1A1A(Y98A/D99Y)x2F1在人CD16转基因的SCID小鼠中的A549肺癌异种移植物模型中的功效。
图32显示了各种抗CEAABM的CDR的氨基酸序列。
图33显示了各种抗CEAABM的轻链构建体的氨基酸序列。
图34A-C显示了亲和力成熟的重和轻链CDR的氨基酸序列及相关结合亲和力。
图35显示了各种亲和力成熟抗体序列的亲和常数。
图36显示了各种抗CEAABM的CDR-H3的氨基酸序列。
图37A-C显示了各种抗CEAABM的VH区的氨基酸序列。
图38显示了各种稳定性成熟的抗CEA抗体的VH区的氨基酸序列比对。
发明详述
定义
术语如本领域中一般使用的那样使用,除非另有如下限定。
如本文中所使用的,术语“抗原结合分子”以其最广义指特异性结合抗原决定簇的分子。抗原结合分子的非限制性例子是抗体或其保留抗原特异性结合的片段。更具体地,如本文中所使用的,结合膜结合人癌胚抗原(CEA)的抗原结合分子是特异性结合CEA,更具体地细胞表面或膜结合CEA的ABM。“特异性结合”意指结合对于抗原而言是选择性的,并且可以与不想要的或非特异性的相互作用区别。
如本文中所使用的,术语“抗体”意图包括全抗体分子,包括单克隆、多克隆和多特异性(例如双特异性)抗体,及具有Fc区并且保留结合特异性的抗体片段,和包括与免疫球蛋白Fc区等同的区域并且保留结合特异性的融合蛋白。还涵盖的是保留结合特异性的抗体片段,包括但不限于VH片段、VL片段、Fab片段、F(ab’)2片段、scFv片段、Fv片段、微型抗体、双抗体、三抗体、和四抗体(见例如Hudson和Souriau,NatureMed.9:129-134(2003))。
如本文中所使用的,术语“抗原结合域”指抗原结合分子中包含特异性结合部分或整个抗原并与部分或整个抗原互补的区域的部分。在抗原较大的情况中,抗原结合分子可以仅结合抗原的特定部分,该部分称作表位。抗原结合域可以由例如一个或多个抗体可变域提供。优选地,抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
如本文中所使用的,术语“亲和力成熟的”在抗原结合分子(例如,抗体)的背景中指例如通过突变自参照抗原结合分子衍生的抗原结合分子与参照抗体结合相同抗原,优选地结合相同表位;并且具有比参照抗原结合分子更高的针对抗原的亲和力。亲和力成熟一般涉及抗原结合分子的一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸残基的修饰。通常,亲和力成熟的抗原结合分子与初始参照抗原结合分子结合相同表位。
如本文中所使用的,“结合亲和力”一般就平衡结合或解离常数(分别为Ka或Kd)(其继而是解离和结合速率常数(分别为kd和ka)的反比)而言进行表述。如此,等同亲和力可以包含不同速率常数,只要速率常数的比率保持相同。
如本文中所使用的,术语“Fc区”指IgG重链的C端区域。虽然IgG重链的Fc区的边界可以略有变化,但是人IgG重链Fc区通常限定为自位置Cys226处的氨基酸残基至羧基端的区段。
如本文中所使用的,术语“与免疫球蛋白的Fc区等同的区域”意图包括免疫球蛋白的Fc区的天然存在等位变体及具有产生替代、添加、或删除的变化,但是没有实质性降低免疫球蛋白介导效应器功能(诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性)的能力的变体。例如,可以在没有实质性生物学功能损失的情况中自免疫球蛋白Fc区的N端或C端删除一个或多个氨基酸。可以依照本领域中已知的一般规则来选择此类变体,使得对活性具有最小的影响。(见例如Bowie,J.U.等,Science247:1306-10(1990))。
如本文中所使用的,术语“膜结合人CEA”指结合细胞的膜部分或细胞的表面,特别地肿瘤细胞的表面的人癌胚抗原(CEA)。在某些情况中,术语“膜结合人CEA”可以指不结合细胞膜,但是已经构建为使得保留PR1A3抗体结合的表位的CEA。术语“可溶性CEA”指不结合细胞膜或细胞表面(例如肿瘤细胞表面)或者自细胞膜或细胞表面(例如肿瘤细胞表面)切割和/或通常不保留被PR1A3抗体结合的构象表位的人癌胚抗原。例如,可以在具有癌症的受试者的血流或淋巴系统中找到可溶性CEA。
如本文中所使用的,术语“没有针对可溶性CEA的实质性交叉反应性”意指分子(例如,抗原结合分子)不识别或特异性结合可溶性CEA,特别地在与膜结合CEA相比时。例如,抗原结合分子可以结合少于约10%至少于约5%的可溶性CEA,或者可以结合选自由少于约10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%、或0.1%组成的组的量的可溶性CEA,优选地少于约2%、1%、或0.5%可溶性CEA,且最优选地少于约0.2%或0.1%可溶性CEA。
如本文中所使用的,术语“融合”和“嵌合”在提及多肽诸如ABM使用时指包含自两个或更多个异源多肽衍生的氨基酸序列,诸如来自不同物种的抗体的一部分的多肽。对于例如嵌合ABM,非抗原结合构件可以自极其多种物种,包括灵长类诸如黑猩猩和人衍生。嵌合ABM的恒定区一般与天然人抗体的恒定区实质性相同;嵌合抗体的可变区一般包含自具有鼠PR1A3可变区氨基酸序列的重组抗CEA抗体衍生的序列。人源化抗体是融合或嵌合抗体的一种特别优选的形式。
如本文中所使用的,术语“人源化的”用于指部分自非人抗原结合分子,例如,鼠抗体衍生的抗原结合分子,其保留或基本上保留亲本分子的抗原结合特性,但是其在人中免疫原性较小。这可以通过多种方法(在本文中称为“人源化”)来实现,包括但不限于(a)将整个非人可变域嫁接至人恒定区上以生成嵌合抗体;(b)仅将非人(例如供体抗原结合分子)CDR在保留或不保留至关重要的框架残基(例如,那些对于保留良好的抗原结合亲和力或抗体功能重要的残基)的情况中嫁接至人(例如,接受体抗原结合分子)框架和恒定区上,或(c)移植整个非人可变域,但是通过替换表面残基用人样部分“掩盖”它们。此类方法披露于Jones等,Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.,81:6851-6855(1984);Morrison和Oi,Adv.Immunol.,44:65-92(1988);Verhoeyen等,Science,239:1534-1536(1988);Padlan,Molec.Immun.,28:489-498(1991);Padlan,Molec.Immun.,31(3):169-217(1994),通过提及而将它们都完整收入本文。抗体的每个重和轻链可变域中一般存在着3个互补决定区,或CDR(CDR1、CDR2和CDR3),其在抗体的每个重和轻链可变域中侧翼有四个框架亚区(即,FR1、FR2、FR3和FR4):FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。人源化抗体的讨论可以见例如美国专利No.6,632,927,及已公布的美国申请No.2003/0175269,通过提及而将这两篇都完整收入本文。人源化也可以通过将仅含有给定CDR的特异性决定氨基酸残基的截短CDR移植至选定的框架上来实现。“特异性决定残基”意指那些直接涉及与抗原的特异性相互作用和/或对于抗原特异性结合必需的残基。一般地,给定CDR中仅约五分之一至三分之一的残基参与对抗原的结合。可以通过例如自三维建模计算原子间接触,并依照记载于Padlan等,FASEBJ.9(1):133-139(1995)(在此通过提及而完整收录其内容)的方法测定给定残基位置处的序列变异性来鉴定特定CDR中的特异性决定残基。
在一些情况中,用相应的非人残基替换人免疫球蛋白的框架区(FR)残基。此外,人源化抗原结合分子可以包含接受体抗体中或供体抗体中没找到的残基。进行这些修饰以进一步改善抗原结合分子性能。一般地,人源化抗原结合分子会包含至少一个,且通常两个基本上整个可变域,其中至少一个,或基本上所有,或所有高变区对应于非人免疫球蛋白的那些,且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的那些。任选地,人源化抗原结合分子还会至少包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分,通常是人免疫球蛋白的。见例如Jones等,Nature321:522-525(1986);Reichmann等,Nature332:323-329(1988);及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
类似地,如本文中所使用的,术语“灵长类化的”用于指自非灵长类抗原结合分子,例如,鼠抗体衍生的抗原结合分子,其保留或基本上保留亲本分子的抗原结合特性,但是其在灵长类中的免疫原性较小。
如本文中所使用的,术语“变体”(或类似用语)多核苷酸或多肽指通过使用例如重组DNA技术创建的插入、删除、和替代与本发明明确所述的多核苷酸或多肽不同的多核苷酸或多肽。特别地,可以通过利用遗传密码中的“冗余”来合成或选择编码这些相同或相似多肽的重组变体。可以引入各种密码子替代,诸如产生各种限制性位点的沉默变化来优化对质粒或病毒载体的克隆或在特定原核或真核系统中的表达。多核苷酸序列中的突变可以在多肽或对多肽添加的其它肽的域中得到反映以修饰多肽的任何部分的特性,改变特征诸如配体结合亲和力、链间亲和力、或降解/周转率。
如本文中所使用的,术语“变体抗CEA抗原结合分子”指依靠亲本抗体序列中一个或多个氨基酸残基的添加、删除和/或替代与“亲本”抗CEA抗原结合分子氨基酸序列在氨基酸序列上不同的分子。在一个具体的实施方案中,变体包含亲本抗原结合分子的重和/或轻链的一个或多个高变区或CDR中的一处或多处氨基酸替代。例如,变体可以在亲本抗原结合分子的一个或多个高变区或CDR(即,1、2、3、4、5、或6个高变区或CDR)中包含至少1处,例如约1至约10(即,约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10),且优选地约2至约5处替代。变体抗CEA抗原结合分子也可以在重或轻链的一个或多个框架区中包含一处或多处添加、删除和/或替代。通常,变体会具有与亲本抗原结合分子重或轻链可变域序列具有至少约75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%,通常至少约80%、90%、95%或99%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。就序列而言的同一性在本文中定义为候选序列中在比对序列并引入缺口(若必要的话)以实现最大百分比序列同一性后与亲本抗体残基相同的氨基酸残基的百分比。N端、C端、或内部延伸、删除、或对抗体序列的插入无一应当解释为影响序列同一性或同源性。变体抗原结合分子保留与膜结合的人CEA的结合能力。在一个实施方案中,抗CEAABM与亲本抗原结合分子结合相同表位。在一个实施方案中,抗CEAABM与亲本抗原结合分子竞争对膜结合人CEA的结合。在一个实施方案中,抗CEAABM结合膜结合的人CEA但不结合可溶性人CEA。抗CEAABM具有优于亲本抗原结合分子的那些特性的特性。例如,变体可以具有更强的结合亲和力、升高的稳定性、和/或增强的在体外和在体内诱导抗体介导的细胞的细胞毒性的能力。在一个实施方案中,抗CEAABM具有升高的稳定性且保留对膜结合CEA的结合亲和力或具有改善的对膜结合CEA的结合亲和力且保留在体外和在体内诱导抗体介导的细胞的细胞毒性的能力或具有增强的在体外和在体内诱导抗体介导的细胞的细胞毒性的能力。
为了分析此类特性,一般应当以相同形式比较变体抗原结合分子和亲本抗原结合分子;例如变体抗原结合分子的Fab形式与亲本抗原结合分子的Fab形式或变体抗原结合分子的全长形式与亲本抗原结合分子的全长形式。在一个实施方案中,变体抗原结合分子在与亲本抗原结合分子相比时,在生物学活性方面具有至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、或20倍增强。在一个实施方案中,变体抗原结合分子是经稳定性工程化改造的变体,其具有与亲本抗原结合分子相比升高的稳定性。可以通过本领域已知的任何方法及通过本文中(具体是实施例3-6中)描述的方法来测定稳定性。在具体的实施方案中,变体抗原结合分子在稳定性方面具有与亲本抗原结合分子相比至少约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、40倍、50倍、100倍升高。
在一些实施方案中,与亲本抗原结合分子相比,变体抗原结合分子展现稳定性的升高,如作为稳定性参数的变化测量的。在一些实施方案中,变体抗原结合分子在稳定性参数方面具有与亲本抗原结合分子相比至少约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、20倍、40倍、50倍、100倍变化。稳定性参数是例如变体抗原结合分子解折叠或变性的温度、变体抗原结合分子解折叠或变性的压力、或变体抗原结合分子在设计为使得变体抗原结合分子不稳定的条件下变性或解折叠需要的时间。在一个实施方案中,通过人变性测定法来测定稳定性的升高,例如通过差示扫描量热法(DSC)。在一个实施方案中,通过化学变性测定法来测定稳定性的升高。在一个实施方案中,使用高压测定法来测定稳定性的升高。在另一个实施方案中,使用荧光偏振测定法来测定变体抗原结合分子的稳定性。在一个实施方案中,使用动态光散射(DLS)测定法来测定变体抗原结合分子的稳定性(见实施例及例如Nobbmann,U.etal.,Biotech.GeneticEng.Rev.24:117-128(2007))。DLS监测分子诸如抗体的完整性,其中光散射增加一般指示蛋白质解折叠或变性。可以作为温度或化学变性剂的函数来检查分子的DLS以比较相对稳定性。认为那些维持其天然构象(DLS特性不增加或增加很少)的分子在测试条件下是稳定的。在一个实施方案中,当使用动态光散射测定法分析时,变体抗原结合分子在比亲本ABM或其它适宜参照分子高至少0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、或10.0摄氏度的温度是稳定的。在一个实施方案中,变体抗原结合分子在60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80摄氏度或更高温度条件下是稳定的。可以测量热稳定性,例如使用DLS、DSC、或荧光偏振。在一个实施方案中,使用DLS来测量变体抗原结合分子的热稳定性。在一个实施方案中,在缓冲液20mM组氨酸和140mMNaClpH6.0中使用1mg/mlABM或变体ABM实施DLS测定法。自25℃开始进行DLS测定法,以0.05℃/min使温度升高。
术语“亲本”抗原结合分子指作为制备变体的起始点或基础使用的ABM。在一个具体的实施方案中,亲本抗原结合分子具有人框架区,并且若存在的话,它具有人抗体恒定区。例如,亲本抗体可以是人源化的或人的抗体。
氨基酸“替代”可以导致将一个氨基酸用具有相似结构和/或化学特性的另一个氨基酸替换,例如保守氨基酸替换。“保守”氨基酸替代可以基于所涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性性质的相似性产生。例如,非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸;极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺;带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸;而带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。一般地,“插入”或“删除”的范围为约1至约20个氨基酸,更具体地,约1至约10个氨基酸,且甚至更具体地,约2至约5个氨基酸。非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一类。例如,氨基酸替代还可以导致将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一个氨基酸替换,例如将来自一组(例如,极性)的一个氨基酸用来自不同组(例如碱性)的另一个氨基酸替换。可以通过使用重组DNA技术来系统性生成多肽分子中的氨基酸插入、删除、或替代,并对所得的重组变体测定活性,从而可以通过实验来确定所容许的变异。
如本文中所使用的,术语“单链Fv”或“scFv”指包含VH域和VL域作为单一多肽链的抗体片段。通常,VH和VL域通过接头序列连接。见例如Pluckthun,于:ThePHARMACOLOGYOFMONOCLONALANTIBODIES,第113卷,Rosenburg和Moore编Springer-Verlag,NewYork,第269页-第315页(1994)。
如本文中所使用的,术语“微型抗体”指含有恒定区,通常是免疫球蛋白,优选地IgG,更优选地IgG1的CH3区作为二聚化区的二价、同二聚体scFv衍生物。一般地,恒定区经由铰链区和/或接头区与scFv连接。微型抗体蛋白质的例子可见Hu等(1996),CancerRes.56:3055-61。
如本文中所使用的,术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段,该片段在同一条多肽链(VH-VL)中包含相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个域之间不能配对,迫使域与另一条链的互补域配对,并创建两个抗原结合位点。双抗体更完整地记载于例如EP404,097;WO93/11161;及Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993)。三抗体源自三个scFv的三价三聚体的形成,产生三个结合位点,而四抗体是四个scFvs的四价四聚体,产生四个结合位点。
在存在着本领域内使用和/或公认的两种或更多种术语定义的情况中,如本文中所使用的,术语的定义意图包括所有此类意义,除非明确相反叙述。一个具体的例子是使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述重和轻链多肽两者的可变区内找到的非连续抗原结合位点(又称为抗原结合区)。CDR又称为“高变区”,并且所述术语在本文中提及形成抗原结合区的可变区部分时与术语“CDR”可互换使用。此特定区域已经由Kabat等,美国卫生与公众服务部(U.S.Dept.ofHealthandHumanServices),“SequencesofProteinsofImmunologicalInterest”(1983)及由Chothia等,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)(通过提及而将它们收入本文)描述,其中定义包括在彼此比较时氨基酸残基的交叠或子集。然而,任一个定义指抗体或其变体的CDR的应用意图在该术语的范围内,如本文中定义并使用的。涵盖如由上文所引用的每篇参考文献定义的CDR的合适的氨基酸残基在下文在表I中列出作为比较。涵盖特定CDR的精确残基编号会随CDR的序列和大小而有所变化。给出抗体的可变区氨基酸序列时,本领域技术人员可以常规地确定哪些残基构成特定的CDR。
表1:CDR定义1
CDR | Kabat | Chothia | AbM2 |
VH CDR1 | 31-35 | 26-32 | 26-35 |
VH CDR2 | 50-65 | 52-58 | 50-58 |
VH CDR3 | 95-102 | 95-102 | 95-102 |
VL CDR1 | 24-34 | 26-32 | 24-34 |
VL CDR2 | 50-56 | 50-52 | 50-56 |
VL CDR3 | 89-97 | 91-96 | 89-97 |
1表1中的所有CDR定义的编号依照由Kabat等所列的编号约定(见下文)。
2如表1中所使用的具有小写字母“b”的“AbM”指如由OxfordMolecular的“AbM”抗体建模软件定义的CDR。
Kabat等还限定了可应用于任何抗体的可变域序列的编号系统。本领域普通技术人员可以将“Kabat编号方式”的此系统明确指派给任何可变域序列,而不依赖于超出序列自身的任何实验数据。如本文中所使用的,“Kabat编号方式”指由Kabat等,美国卫生与公众服务部,“SequenceofProteinsofImmunologicalInterest”(1983)所列的编号系统。除非另有规定,提及ABM中的特定氨基酸残基位置的编号是依照Kabat编号系统。序列表的序列(即SEQIDNO:1至SEQIDNO:216)不依照Kabat编号系统编号。然而,本领域普通技术人员熟悉如何将序列表中的序列转变成Kabat编号。
具有与本发明的参照核苷酸序列至少例如95%“相同”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸意指多核苷酸的核苷酸序列与参照序列相同,只是多核苷酸序列可以按参照核苷酸序列的每100个核苷酸包含多至5处点突变。换言之,为了获得具有与参照核苷酸序列至少95%相同的核苷酸序列的多核苷酸,可以将参照序列中的多至5%的核苷酸删除或用另一个核苷酸替换,或者可以将占参照序列中的总核苷酸的多至5%数目的核苷酸插入参照序列中。
实际上,可以使用已知的计算机程序来常规地测定任何特定的核酸分子或多肽是否与本发明的核苷酸序列或多肽序列至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。可以使用基于Brutlag等,Comp.App.Biosci.6:237245(1990)的算法的FASTDB计算机程序来确定一种用于测定询问序列(本发明的序列)与主题序列间的最好的总体匹配的方法(又称为全局序列比对)。在序列比对中,询问和主题序列都是DNA序列。可以通过将U转变成T来比较RNA序列。所述全局序列比对的结果以百分比同一性计。对DNA序列进行FASTDB比对以计算百分比同一性中使用的优选参数是:矩阵=一元,k-元组=4,错配罚分=1,连接罚分=30,随机化组长度=0,截留得分=1,缺口罚分=5,缺口大小罚分=0.05,窗大小=500或主题核苷酸序列的长度(以较短为准)。
若主题序列由于5’或3’删除,不是由于内部删除而比询问序列短,则必须对结果做出手动修正。这是因为FASTDB程序在计算百分比同一性时不考虑主题序列的5’和3’截短。对于在5’或3’端相对于询问序列截短的主题序列,修正百分比同一性,即以占询问序列总碱基的百分比计算在主题序列的5’和3’且不匹配/比对的询问序列碱基的数目。通过FASTDB序列比对的结果来测定核苷酸是否匹配/比对。然后,自使用规定的参数通过上述FASTDB程序计算的百分比同一性减去此百分比,以达到最终的百分比同一性得分。此修正的得分是出于本发明的目的使用的。为了手动调节百分比同一性得分,仅计算在主题序列的5’和3’碱基外部(如通过FASTDB比对展示的)且不与询问序列匹配/比对的碱基。
例如,比对90个碱基的主题序列与100个碱基的询问序列以测定百分比同一性。在主题序列的5’端发生删除,并且因此,FASTDB比对没有显示5’端的前10个碱基的匹配/比对。10个未配对的碱基占序列的10%(不匹配的5’和3’端碱基数目/询问序列中的碱基总数),因此自通过FASTDB程序计算的百分比同一性得分减去10%。若剩余的90个碱基完全匹配,则最终的百分比同一性会是90%。在另一个例子中,比较90个碱基的主题序列与100个碱基的询问序列。这次,删除是内部删除,从而没有在主题序列的5’或3’且不与询问物匹配/比对的碱基。在此情况中,没有手动修正通过FASTDB计算的百分比同一性。再一次,仅仅手动修正在主题序列的5’和3’且不与询问序列匹配/比对的碱基。出于本发明的目的,没有做出其它手动修正。
具有与本发明的询问氨基酸序列至少例如95%“相同”的氨基酸序列的多肽意指主题多肽的氨基酸序列与询问序列相同,只是主题多肽序列可以按询问氨基酸序列的每100个氨基酸包括多至5个氨基酸变化。换言之,为了获得具有与询问氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的多肽,可以将主题序列中的多至5%的氨基酸残基插入、删除、或用另一个氨基酸替换。参照序列的这些变化可以在参照氨基酸序列的氨基或羧基端位置或者在那些末端位置间的任何地方发生,个别地在参照序列中的残基间或在参照序列内的一个或多个连续组中散布。
实际上,可以使用已知的计算机程序来常规地测定任何特定的多肽是否与参照多肽至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。可以使用基于Brutlag等,Comp.App.Biosci.6:237-245(1990)的算法的FASTDB计算机程序来确定一种用于测定询问序列(本发明的序列)与主题序列间的最好的总体匹配的方法,又称为全局序列比对。在序列比对中,询问和主题序列都是核苷酸序列或都是氨基酸序列。所述全局序列比对的结果以百分比同一性计。FASTDB氨基酸比对中使用的优选参数是:矩阵=PAM0,k元组=2,错配罚分=1,连接罚分=20,随机化组长度=0,截留得分=1,窗大小=序列长度,缺口罚分=5,缺口大小罚分=0.05,窗大小=500或主题氨基酸序列的长度(以较短为准)。
若主题序列由于N或C端删除,不是由于内部删除而比询问序列短,则必须对结果做出手动修正。这是因为FASTDB程序在计算全局百分比同一性时不考虑主题序列的N和C端截短。对于在N和C端相对于询问序列截短的主题序列,修正百分比同一性,即以占询问序列总碱基的百分比计算在主题序列的N和C端且不与相应的主题残基匹配/比对的询问序列残基的数目。通过FASTDB序列比对的结果来测定残基是否得到匹配/比对。然后,自使用规定的参数通过上述FASTDB程序计算的百分比同一性减去此百分比,以达到最终的百分比同一性得分。此最终的百分比同一性得分是出于本发明的目的使用的。为了手动调节百分比同一性得分,仅考虑在主题序列的N和C端且不与询问序列匹配/比对的残基。也就是说,仅主题序列的最远的N和C端残基外部的询问残基位置。
例如,比对90个氨基酸残基的主题序列与100个残基的询问序列以测定百分比同一性。在主题序列的N端发生删除,并且因此,FASTDB比对没有显示N端的前10个残基的匹配/比对。10个未配对的残基占序列的10%(不匹配的N和C端残基数目/询问序列中的残基总数),因此自通过FASTDB程序计算的百分比同一性得分减去10%。若剩余的90个残基完全匹配,则最终的百分比同一性会是90%。在另一个例子中,比较90个残基的主题序列与100个残基的询问序列。这次,删除是内部删除,因此没有在主题序列的N或C端且不与询问物匹配/比对的残基。在此情况中,没有手动修正通过FASTDB计算的百分比同一性。再一次,仅仅手动修正在主题序列的N和C端末端外部(如FASTDB比对中展现的)且不与询问序列匹配/比对的残基位置。出于本发明的目的,不要做出其它手动修正。
也可以使用经由国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)可获得的BLAST程序用程序中指示的缺省参数来测定多核苷酸和/或多肽的百分比同一性。
如本文中所使用的,“在严格条件下”与本发明的核酸序列杂交的核酸指在规定的条件下(例如于42℃在包含50%甲酰胺、5xSSC(750mMNaCl、75mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x登哈特(Denhardt)氏溶液、10%硫酸右旋糖苷、和20μg/ml变性的、剪切的鲑鱼精DNA的溶液中过夜温育,接着在0.1xSSC中于约65℃清洗滤膜)杂交的多核苷酸。
如本文中所使用的,术语“具有GnTIII活性的多肽”指能够催化将N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基以β-1-4连接添加至N连接的寡糖的三甘露糖基核心的β-连接的甘露糖苷的多肽。这包括以或不以剂量依赖性展现出与β(1,4)-N-乙酰葡糖胺基转移酶III(依照国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(NomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology,NC-IUBMB),又称为β-1,4-甘露糖基-糖蛋白4-β-N-乙酰葡糖胺基转移酶(EC2.4.1.144))活性相似,但不必相同的酶活性的融合多肽,如特定的生物学测定法中测量的。在剂量依赖性确实存在的情况中,它不需要与GnTIII的剂量依赖性相同,而是与GnTIII相比与给定活性的剂量依赖性基本上相似(即,相对于GnTIII,候选多肽会展现出更大的活性或小不超过约25倍且优选地,小不超过约10倍的活性,且最优选地,小不超过约3倍的活性)。
如本文中所使用的,术语“高尔基(Golgi)定位域”指高尔基驻留多肽中负责将多肽锚定至高尔基复合体内的某个位置的氨基酸序列。一般地,定位域包含酶的氨基端“尾部”。
如本文中所使用的,术语“效应器功能”指那些可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括但不限于Fc受体结合亲和力、抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞的吞噬(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、细胞表面受体的下调等。
如本文中所使用的,认为特别地具有前缀“糖”的术语“工程化”或“工程化改造”及术语“糖基化工程”包括对天然存在的或重组的多肽或其片段的糖基化样式的任何操作。糖基化工程包括细胞的糖基化机制的代谢工程,包括对寡糖合成途径的遗传操作以实现细胞中表达的糖蛋白的改变的糖基化。此外,糖基化工程包括突变和细胞环境对糖基化的影响。在一个实施方案中,糖基化工程是糖基转移酶活性的变化。在一个具体的实施方案中,工程化改造导致改变的葡糖胺基转移酶活性和/或岩藻糖基转移酶活性。
如本文中所使用的,术语“宿主细胞”涵盖可以工程化改造为生成本发明的多肽和抗原结合分子的任何种类的细胞系统。在一个实施方案中,将宿主细胞工程化改造成容许生成具有经修饰的糖化同种型的抗原结合分子。在一个优选的实施方案中,抗原结合分子或变体抗原结合分子是抗体、抗体片段、或融合蛋白。在某些实施方案中,已经对宿主细胞进一步操作以表达升高水平的一种或多种具有GnTIII活性的多肽。宿主细胞包括培养的细胞,例如哺乳动物培养细胞,诸如CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、酵母细胞、昆虫细胞、和植物细胞等等,而且还有转基因动物、转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。
如本文中所使用的,术语“Fc介导的细胞的细胞毒性”包括抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和由含有人Fc区的可溶性Fc-融合蛋白介导的细胞的细胞毒性。它是一种导致“人免疫效应细胞”裂解“靶定细胞”的免疫机制。
如本文中所使用的,术语“人免疫效应细胞”指在其表面上展示Fc受体的白细胞群体,它们通过Fc受体结合抗原结合分子或Fc融合蛋白的Fc区并执行效应器功能。此类群体可以包括但不限于外周血单个核细胞(PBMC)和/或天然杀伤(NK)细胞。
如本文中所使用的,术语“靶定细胞”指包含Fc区的抗原结合分子(例如,抗体或其包含Fc区的片段)或Fc融合蛋白特异性结合的细胞。抗原结合分子或Fc融合蛋白经由Fc区N端的蛋白质部分结合靶细胞。
如本文中所使用的,术语“升高的Fc介导的细胞的细胞毒性”定义为通过上文限定的Fc介导的细胞的细胞毒性的机制在靶细胞周围的介质中给定浓度的抗原结合分子或Fc融合蛋白在给定时间中裂解的“靶定细胞”的数目增加和/或通过Fc介导的细胞的细胞毒性的机制在给定时间中实现给定数目的“靶定细胞”裂解需要的靶细胞周围的介质中的抗原结合分子或Fc融合蛋白的浓度降低。Fc介导的细胞的细胞毒性的升高相对于使用相同的标准生成、纯化、配制和贮存方法(其是本领域技术人员已知的),由相同类型的宿主细胞产生的,但是并非由通过本文中所描述的方法工程化改造成具有改变的糖基化样式(例如,表达糖基转移酶GnTIII、或其它糖基转移酶)的宿主细胞产生的相同抗原结合分子或Fc融合蛋白介导的细胞的细胞毒性。
“具有升高的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)的抗原结合分子”意指具有升高的ADCC的抗原结合分子(如所述术语在本文中定义的),如通过本领域普通技术人员已知的任何合适的方法测定的。一种公认的体外ADCC测定法如下:
1)该测定法使用已知表达被抗体的抗原结合区识别的靶抗原的靶细胞;
2)该测定法使用自随机选定的健康供体的血液分离的人外周血单个核细胞(PBMC)作为效应细胞;
3)依照如下的方案实施该测定法:
i)将PBMC使用标准的密度离心规程来分离,并以5x106个细胞/ml在RPMI细胞培养基中悬浮;
ii)将靶细胞通过标准的组织培养方法来培养,自具有高于90%的存活力的指数生长期收获,在RPMI细胞培养基中清洗,用100微居里的51Cr标记,用细胞培养基清洗两次,并以105个细胞/ml的密度在细胞培养基中重悬;
iii)将100微升上述最终的靶细胞悬浮液转移至96孔微量滴定板的每孔;
iv)将抗体在细胞培养基中自4000ng/ml至0.04ng/ml连续稀释,并将50微升所得抗体溶液添加至96孔微量滴定板中的靶细胞,一式三份测试覆盖上述整个浓度范围的各个抗体浓度;
v)对于最大释放(MR)对照,含有经标记的靶细胞的板中的3个额外的孔接受50微升2%(V/V)非离子型去污剂(Nonidet,Sigma,St.Louis)的水溶液,替代抗体溶液(上述的第iv点);
vi)对于自发释放(SR)对照,含有经标记的靶细胞的板中的3个额外的孔接受50微升RPMI细胞培养基,替代抗体溶液(上述的第iv点);
vii)然后,将96孔微量滴定板以50xg离心1分钟,并于4℃温育1小时;
viii)将50微升PBMC悬浮液(上述第i点)添加至每孔以产生效应细胞:靶细胞比率25:1,并将平板在培养箱中在5%CO2气氛下于37℃放置4小时;
ix)收获来自每孔的无细胞上清液,并使用γ计数器来量化实验释放的放射性(ER);
x)依照公式(ER-MR)/(MR-SR)x100对每个抗体浓度计算比裂解的百分比,其中ER是对所述抗体浓度量化(见上述第ix点)的平均放射性,MR是对MR对照(见上述第v点)量化(见上述第ix点)的平均放射性,而SR是对SR对照(见上述第vi点)量化(见上述第ix点)的平均放射性;
4)“升高的ADCC”定义为上文测试的抗体浓度范围内观察到的比裂解的最大百分比的增加和/或达到上文测试的抗体浓度范围内观察到的比裂解的最大百分比的一半所需要的抗体浓度的降低。ADCC的升高相对于用上述测定法测量的,使用本领域技术人员已知的相同的标准生成、纯化、配制和贮存方法,由相同类型的宿主细胞产生的,但是并非由工程化改造成过表达GnTIII的宿主细胞产生的相同抗体介导的ADCC。
抗CEA抗原结合分子、多肽、和多核苷酸
出于诊断目的,CEA长期被作为癌症标志物使用。与相同细胞类型的非肿瘤组织相比,它在许多肿瘤组织中异常表达(例如,在细胞中过表达和/或以不同样式分布)。然而,因为CEA一般自肿瘤细胞表面切割,并且大多数可用的抗CEA抗体也结合可溶性CEA,所以未缀合的针对CEA的抗体一般不用于治疗目的。例如,作为放射性缀合物施用目前处于引导试验的抗CEA抗体(Wong等,2004;Liersch等,2007)。几种机制涉及抗CEA抗体的治疗功效,包括抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)。升高的CEA表达促进升高的细胞间粘着,这可以导致癌性细胞的转移(MarshallJ.,SeminOncol.30(3)增刊8:30-36)。如此,抗CEA抗原结合分子也可以在抑制CEA介导的细胞粘附和癌性细胞的转移中发挥作用。
在一方面,本发明涉及包含鼠PR1A3抗体的一个或多个(例如,1、2、3、4、5、或6个)CDR的变体抗原结合分子(例如抗体或其片段),其中与PR1A3的相应CDR相比,至少一个CDR具有至少一个氨基酸残基的替代,且其中与亲本PR1A3抗原结合分子相比,所述变体抗原结合分子具有改善的对CEA,优选地膜结合CEA的亲和力。国际专利申请WO2011023787记载了与亲本PR1A3抗原结合分子相比,具有改善的对CEA的亲和力的抗CEA抗原结合分子。
在另一方面,本发明涉及包含鼠PR1A3抗体的一个或多个(例如,1、2、3、4、5、或6个)CDR的变体抗原结合分子(例如抗体或其片段),其中与PR1A3的相应CDR相比,至少一个CDR具有至少一个氨基酸残基的替代,且其中与亲本PR1A3抗原结合分子相比,所述变体抗原结合分子具有升高的稳定性。在一个实施方案中,亲本PR1A3抗原结合分子是人源化PR1A3抗原结合分子。在一个实施方案中,亲本PR1A3抗原结合分子包含CH7A的重链可变区(SEQIDNO:101)。在一个实施方案中,亲本PR1A3抗原结合分子包含重链可变区CH7A(SEQIDNO:101)和轻链可变区2F1(SEQIDNO:209)。此类一个或多个CDR可以是截短的CDR,并且最少会含有给定CDR的特异性决定残基(SDR),如所述术语在本文中限定的。在一个实施方案中,变体抗原结合分子包含选自SEQIDNO:1-3、5-10、12-56和217-224(图32和图36)的至少一个(例如,1、2、3、4、5、或6个)CDR,其包含会保留特异性结合的CDR残基。在另一个实施方案中,变体抗原结合分子包含选自SEQIDNO:1-3、5-10、12-56和217-224的至少一个(例如,1、2、3、4、5、或6个)CDR,或其变体或截短形式,其至少含有所述CDR的特异性决定残基,并且包含自异源多肽衍生的序列。在一个具体的实施方案(其中变体抗原结合分子包含PR1A3的重链CDR1变体)中,HCDR1具有替代Kabat第31位的缬氨酸的谷氨酸。在一个具体的实施方案(其中变体抗原结合分子包含PR1A3的重链CDR3变体)中,HCDR3具有替代Kabat第98位的酪氨酸的丙氨酸或替代Kabat第99位的天冬氨酸的酪氨酸。在一个具体的实施方案(其中变体抗原结合分子包含PR1A3的重链CDR3变体)中,HCDR3具有替代Kabat第98位的酪氨酸的丙氨酸和替代Kabat第99位的天冬氨酸的酪氨酸。
在一个实施方案中,变体抗原结合分子包含选自SEQIDNO:217-224(图36)的重链CDR3和选自SEQIDNO:1-3、5-10、和12-24的两个重链CDR(例如HCDR1和HCDR2)和/或选自SEQIDNO:36-56的三个轻链CDR(例如,LCDR1、LCDR2、和LCDR3),或其变体或截短形式,其至少含有所述CDR之每个的特异性决定残基。在一个更具体的实施方案中,变体抗原结合分子包含选自SEQIDNO:217-224的重链CDR3和选自SEQIDNO:1-3、5-10、和12-24的两个重链CDR(例如HCDR1和HCDR2)和选自SEQIDNO:36-56的三个轻链CDR(例如LCDR1、LCDR2、和LCDR3)。在另一个实施方案中,变体抗原结合分子包含抗体轻和/或重链的可变区,优选地重和轻链可变区两者。在一个更具体的实施方案中,重链和/或轻链可变区选自SEQIDNO:99-108、SEQIDNO:188-216、和SEQIDNO:225-248(图33和图37A-C)的重和/或轻链可变区或其组合,其中重和轻链可变区不是SEQIDNO:99和SEQIDNO:103的组合或SEQIDNO:100和SEQIDNO:104的组合。在一些实施方案中,重链包含CH1A1A(SEQIDNO:261)或CH1A1B(SEQIDNO:262)(图37C)的框架残基。在一个实施方案中,变体抗原结合分子包含选自SEQIDNO:225、SEQIDNO:226、SEQIDNO:231、SEQIDNO:234、SEQIDNO:235、SEQIDNO:239、SEQIDNO:241、SEQIDNO:242、SEQIDNO:243、或SEQIDNO:247的重链可变区。
在一个实施方案中,变体抗原结合分子是嵌合抗体,更具体的是人源化抗体。在另一个实施方案中,变体抗原结合分子包含Fc区。在另一个实施方案中,变体抗原结合分子是亲和力成熟的。在另一个实施方案中,变体抗原结合分子工程化改造成具有升高的稳定性(稳定性成熟的)。在另一个实施方案中,与PR1A3相比,变体抗原结合分子具有升高的ADCC活性。在一个实施方案中,变体抗原结合分子的升高的ADCC是由于例如通过亲和力成熟或其它改善亲和力的方法(见Tang等,J.Immunol.2007,179:2815-2823,通过提及而将其全部收入本文)实现的变体抗原结合分子对膜结合CEA的亲和力升高所致。在另一个实施方案中,变体抗原结合分子包含糖工程化改造的Fc区。在另一方面,本发明还涉及生成此类变体抗原结合分子的方法及其在治疗疾病,特别是表达CEA、尤其是与相同细胞类型的正常组织相比异常表达(例如,在细胞中过表达或以不同样式表达)CEA的细胞增殖病症中的用途。此类病症包括但不限于结肠直肠癌、NSCLC(非小细胞肺癌)、胃癌、胰腺癌和乳腺癌。可以通过本领域中已知的方法和本文中所描述的那些方法(例如,经由免疫组织化学测定法、免疫荧光测定法、免疫酶测定法、ELISA、流式细胞术、放射性免疫测定法、Western印迹、配体结合、激酶活性等)来测定CEA表达水平。
在另一方面,本发明还涉及一种分离的多核苷酸,其包含编码包含鼠PR1A3抗体的一个或多个(例如,1、2、3、4、5、或6个)互补决定区,或其至少含有所述互补决定区的特异性决定残基的变体或截短形式的多肽的序列。通常,此类分离的多核苷酸编码形成抗原结合分子的一个或多个融合多肽。在一个实施方案中,多核苷酸包含编码选自SEQIDNO:1-3、5-10、12-56和217-224的一个或多个(例如,1、2、3、4、5、或6个)CDR的序列,所述CDR包含保留特异性结合的CDR残基。在一个实施方案中,多核苷酸包含至少编码选自SEQIDNO:1-3、5-10、12-56和217-224的三个重链CDR(例如,HCDR1、HCDR2、和HCDR3)和/或三个轻链CDR(例如,LCDR1、LCDR2、和LCDR3),或其至少含有所述三个互补决定区之每个的特异性决定残基(SDR)的变体或截短形式的序列。在一个更具体的实施方案中,多核苷酸编码包含选自SEQIDNO:217-224的重链CDR3和选自SEQIDNO:1-3、5-10和12-24的两个重链CDR(例如,HCDR1和HCDR2)和选自SEQIDNO:36-56的三个轻链CDR(例如,LCDR1、LCDR2、和LCDR3)的多肽。在另一个实施方案中,多核苷酸编码包含抗体轻和/或重链可变区的多肽。编码重和轻链可变区多肽的多核苷酸可以在一个或多个表达载体中表达。在一个更具体的实施方案中,编码选自SEQIDNO:99-108、SEQIDNO:188-216、和SEQIDNO:225-248的重链和/或轻链可变区的多核苷酸选自下组:SEQIDNO:159-187和SEQIDNO:249-256的多核苷酸或其组合,其中重和轻链可变区不由SEQIDNO:11和SEQIDNO:115或SEQIDNO:112和SEQIDNO:116的组合编码。在一个实施方案中,由多核苷酸编码的重和轻链可变区多肽组合以形成嵌合抗体,更具体的是人源化抗体。在一个具体的实施方案(其中多核苷酸包含编码PR1A3的重链CDR1或其变体的序列)中,所述多核苷酸编码替代Kabat第31位缬氨酸的谷氨酸。在一个具体的实施方案(其中多核苷酸包含编码PR1A3的重链CDR3或其变体的序列)中,所述多核苷酸编码替代Kabat第98位的酪氨酸的丙氨酸或替代Kabat第99位的天冬氨酸的酪氨酸。在一个具体的实施方案(其中多核苷酸包含编码PR1A3的重链CDR3或其变体)中,所述多核苷酸编码替代Kabat第98位的酪氨酸的丙氨酸和替代Kabat第99位的天冬氨酸的酪氨酸。在一个实施方案中,多核苷酸在CH1A1A(SEQIDNO:261)或CH1A1B(SEQIDNO:262)的框架序列中编码替代Kabat第98位的酪氨酸的丙氨酸或替代Kabat第99位的天冬氨酸的酪氨酸。在一个实施方案中,多核苷酸包含编码SEQIDNO:225、SEQIDNO:226、SEQIDNO:231、SEQIDNO:234、SEQIDNO:235、SEQIDNO:239、SEQIDNO:241、SEQIDNO:242、SEQIDNO:243、或SEQIDNO:247的重链的序列。在另一个实施方案中,所述多核苷酸包含编码Fc区的序列。本发明进一步涉及由此类多核苷酸编码的多肽。
在一方面,本发明涉及具有鼠PR1A3抗体的相同结合特异性(例如,结合膜结合CEA的相同表位),并且具有相当的或改善的生物学活性(例如,改善的对膜结合CEA的亲和力、升高的稳定性、和/或和/或增强的ADCC)的抗原结合分子或变体抗原结合分子(例如抗体或其片段)和多肽。在一个实施方案中,变体抗原结合分子与亲本抗原结合分子结合相同表位。在一个实施方案中,变体抗原结合分子与亲本抗原结合分子竞争对膜结合人CEA的结合。在一个实施方案中,变体抗原结合分子结合膜结合人CEA且不结合可溶性人CEA。在一方面,本发明涉及与鼠PR1A3抗体或其人源化变体相比,具有升高的稳定性的抗原结合分子和变体抗原结合分子和多肽。在一方面,本发明涉及与包含CH7A的重链可变区(SEQIDNO:101)的人源化PR1A3抗体相比,结合膜结合CEA且具有升高的稳定性的抗原结合分子和变体抗原结合分子(例如抗体或或其片段)和多肽。在一方面,本发明涉及与包含重链可变区CH7A(SEQIDNO:101)和轻链可变区2F1(SEQIDNO:209)的人源化PR1A3抗体相比,结合膜结合CEA且具有升高的稳定性的抗原结合分子和变体抗原结合分子(例如抗体或或其片段)和多肽。
在一个实施方案中,变体抗原结合分子或多肽包含至少1个(例如,1、2、3、4、5或6个)选自SEQIDNO:1-3、5-10、12-56和217-224(图32和图36)的CDR。在一个实施方案中,变体抗原结合分子或多肽包含:(a)选自SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、和SEQIDNO:12的重链CDR1序列;(b)选自SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、和SEQIDNO:24的重链CDR2序列;和(c)选自SEQIDNO:217、SEQIDNO:218、SEQIDNO:219、SEQIDNO:220、SEQIDNO:221、SEQIDNO:222、SEQIDNO:223、和SEQIDNO:224的重链CDR3序列。在另一个实施方案中,变体抗原结合分子或多肽包含:(a)选自SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40、SEQIDNO:41、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、和SEQIDNO:45的轻链CDR1序列;(b)选自SEQIDNO:46、和SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52、SEQIDNO:53、SEQIDNO:54、和SEQIDNO:55的轻链CDR2序列;和(c)轻链CDR3SEQIDNO:56。在一些实施方案中,包含CDR的变体抗原结合分子或多肽还包含CH1A1A(SEQIDNO:261)或CH1A1B(SEQIDNO:262)的框架残基。
在一方面,本发明涉及与膜结合的人CEA结合且包含重链可变区和/或轻链可变区的变体抗原结合分子或多肽。在一个实施方案中,重链和/或轻链可变区选自选自SEQIDNO:99-108、SEQIDNO:188-216、和SEQIDNO:225-248(图33和图37A-C)的重和/或轻链可变区。在一个实施方案中,重链可变区包含具有SEQIDNO:225-248中任一项的序列的多肽。在另一个具体的实施方案中,重链可变区包含具有与SEQIDNO:225-248中任一项的序列至少约80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的序列的多肽。
在一个实施方案中,重链可变区包含具有SEQIDNO:233、SEQIDNO:234、SEQIDNO:235、SEQIDNO:239、SEQIDNO:241、SEQIDNO:242、SEQIDNO:243、和SEQIDNO:247的序列的多肽。在另一个实施方案中,重链可变区包含与SEQIDNO:233,SEQIDNO:234,SEQIDNO:235,SEQIDNO:239,SEQIDNO:241,SEQIDNO:242,SEQIDNO:243,和SEQIDNO:247的序列具有至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,或99%同一性的多肽。在一个实施方案中,轻链可变区包含具有SEQIDNO:209的序列的多肽。在另一个实施方案中,轻链可变区包含与SEQIDNO:209的序列具有至少约80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,或99%同一性的多肽。
在一个实施方案中,与膜结合的人CEA结合的抗原结合分子、变体抗原结合分子、或多肽包含重链可变区和轻链可变区。在一个具体的实施方案中,重链可变区包含具有如下所示SEQIDNO:4的序列的多肽:
QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTEX1X2MX3WVRQAPGQGLEWMGX4INTKX5GEAX6YX7EEFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARWDX8X9X10YX11X12X13X14DYWGQGTTVTVSS
其中X1为Y或F;X2为S或G;X3为N或S;X4为W或Y;X5为N、T或S;X6为T或N;X7为V或I;X8为F或A;X9为Y、A、V、F或S;X10为D、H、W、E、或Y;X11为V、L或F;X12为E、K或Q;X13为A或T;且X14为M或L。
在一个具体的实施方案中,轻链可变区包含具有如下所示SEQIDNO:11的序列的多肽:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASX15X16X17X18X19X20VAWYQQKPGKAPKX21LIYX22ASX23X24X25X26GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYYTYPLFTFGQGTKLEIK
其中X15为Q、A、K、或H;X16为N、A、Y、I、K、T、或F;X17为V、A、G、或M;X18为G、S、T、或L;X19为T、N、P、或A;X20为N或Y;X21为P或L;X22为S、L、或W;X23为Y、N、或H;X24为R、L、P、或H;X25为Y、S、Q、K、E、F、或P;且X26为S、G、I、或R。
在另一方面,本发明进一步涉及编码结合膜结合CEA的抗原结合分子、变体抗原结合分子、或多肽的分离的多核苷酸。在一个实施方案中,多核苷酸包含编码至少选自SEQIDNO:1-3、5-10、12-56和217-224的三个重链CDR(例如HCDR1、HCDR2、和HCDR3)和/或三个轻链CDR(例如LCDR1、LCDR2、和LCDR3)或其变体或截短形式(其含有所述三个互补决定区之每个的至少特异性决定残基(SDR))的序列。在一个更具体的实施方案中,多核苷酸编码包含选自SEQIDNO:217-224的重链CDR3和选自SEQIDNO:1-3、5-10、和12-24的两个重链CDR(例如HCDR1和HCDR2)和选自SEQIDNO:36-56的三个轻链CDR(例如LCDR1、LCDR2、和LCDR3)的多肽。在另一个实施方案中,多核苷酸编码包含抗体轻和/或重链的可变区的多肽。编码重和轻链可变区多肽的多核苷酸可以在一种或多种表达载体中表达。在一个更具体的实施方案中,编码选自SEQIDNO:99-108、SEQIDNO:188-216、和SEQIDNO:225-248的重链和/或轻链可变区的多核苷酸选自下组:选自SEQIDNO:159-187和SEQIDNO:249-256的多核苷酸或其组合,其中,重和轻链可变区不由SEQIDNO:11和SEQIDNO:115的组合或SEQIDNO:112和SEQIDNO:116的组合编码。在一个实施方案中,由多核苷酸编码的重和轻链可变区多肽组合形成嵌合抗体,更具体地,形成人源化抗体。
在一个实施方案中,抗原结合分子、变体抗原结合分子、或多肽结合膜结合CEA且包含Fc区。在一个更具体的实施方案中,将抗原结合分子、变体抗原结合分子、或多肽糖工程化改造为在Fc区中具有改变的糖基化样式。在一个具体的实施方案中,与亲本PR1A3抗体相比,变体抗原结合分子或多肽针对膜结合CEA的亲和力升高。在另一个实施方案中,变体抗原结合分子或多肽的稳定性与亲本PR1A3抗体相比升高。在另一个实施方案中,变体抗原结合分子或多肽具有升高的ADCC活性。在一个实施方案中,变体抗原结合分子或多肽的ADCC升高是由于例如通过亲和力成熟或其它改善亲和力的方法实现的多肽对膜结合CEA的亲和力升高所致。
在另一方面,本发明还涉及抗原结合分子、变体抗原结合分子、或多肽在治疗疾病,特别是表达CEA、尤其是与相同细胞类型的正常组织相比异常表达(例如,在细胞中过表达或以不同样式表达)CEA的细胞增殖病症中的用途。此类病症包括但不限于结肠直肠癌、NSCLC(非小细胞肺癌)、胃癌、胰腺癌和乳腺癌。可以通过本领域中已知的方法和本文中所描述的那些方法(例如,经由免疫组织化学测定法、免疫荧光测定法、免疫酶测定法、ELISA、流式细胞术、放射性免疫测定法、Western印迹、配体结合、激酶活性等)来测定CEA表达水平。
在一个具体的实施方案中,本发明涉及与膜结合的CEA结合的人源化抗原结合分子或其部分或片段,其包含重链可变区,该重链可变区包含SEQIDNO:225-248中任一项的序列。在另一个实施方案中,本发明涉及结合膜结合CEA的人源化抗原结合分子或其部分或片段,其包含轻链可变区,该轻链可变区包含SEQIDNO:105、108、或207-216中任一项的序列。在一个具体的实施方案中,结合膜结合CEA的人源化抗原结合分子或其部分或片段包含重链可变区和轻链可变区,该重链可变区包含SEQIDNO:225-248中任一项的序列,该轻链可变区包含SEQIDNO:105、108、或207-216中任一项的序列。在一个实施方案中,人源化抗原结合分子进一步包含人重链恒定区和/或人轻链恒定区。此类恒定区在本文中描述,并且是本领域中已知的。在一个更具体的实施方案中,人源化抗原结合分子包含Fc区,更具体的是已经糖工程化改造的Fc区。
用于人源化非人抗体的方法是本领域中已知的。例如,本发明的人源化ABM可以依照Winter的美国专利No.5,225,539,Queen等的美国专利No.6,180,370,或Adair等的美国专利No.6,632,927(在此通过提及而收录每篇的全部内容)的方法来制备。优选地,人源化抗体具有一个或多个自非人来源引入其中的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基,它们通常取自“输入”可变域。基本上可以遵循Winter及其同事的方法来实施人源化(Jones等,Nature,321:522-525(1986);Riechmann等,Nature,332:323-327(1988);Verhoeyen等,Science,239:1534-1536(1988)),即用高变区序列替代人抗体的相应序列来进行。因此,此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567),其中显著少于完整的人可变域用来自非人物种的相应序列替代。通常,人源化抗体是如下人抗体,其中有些高变区残基和可能的有些FR残基用来自非人(例如啮齿类)抗体类似位点的残基替代。任选地,主题人源化抗CEA抗体包含来自人免疫球蛋白的恒定区。
用于生成人源化抗体的人轻和重链可变域的选择对于降低抗原性是非常重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法,用供体(例如,啮齿类)抗体的可变域序列对已知人可变域序列的整个文库进行筛选。然后,接受与供体(例如,啮齿类)最接近的人序列作为人源化抗体的人框架区(FR)(Sims等,J.Immunol.,151:2296(1993);Chothia等,J.Mol.Biol.,196:901(1987))。选择人框架序列的另一种方法是将完整的供体(例如,啮齿类)框架的每个个别亚区(即,FR1、FR2、FR3、和FR4)或个别亚区的一些组合(例如,FR1和FR2)的序列针对对应于所述框架亚区的已知人可变区序列的文库(例如,如通过Kabat编号方式确定的)进行比较,并选择与啮齿类最接近的每个亚区或组合的人序列(Leung的于2003年2月27日公布的美国专利申请公开文本No.2003/0040606A1)。另一种方法使用自特定轻或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架区(Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992);Presta等,J.Immunol.,151:2623(1993))。在一个实施方案中,人框架区选自人种系序列的集合。人种系序列的此类集合可以见数据库诸如IMGT或VBase。框架区可以个别地(例如,对人源化抗CEAABM的重和/或轻链可变区的接受体选择的FR1-3可以由不同种系基因编码)或者作为相同种系基因的一部分选择。在一个更具体的实施方案中,重链FR1-3由IGHV7_4_1*02人免疫球蛋白种系基因序列(登录号X62110,SEQIDNO:114)编码。在另一个具体的实施方案中,轻链FR1-3由IMGT_hVK_1_39人免疫球蛋白种系基因序列(登录号X59315,SEQIDNO:118)编码。在另一个具体的实施方案中,重链FR4由JH6种系基因序列(见GenBank登录号M63030)编码。在另一个具体的实施方案中,轻链FR4由JK2种系基因序列(见Genbank登录号X61584)编码。
一般期望的是,抗原结合分子,诸如抗体及其片段在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。因而,在一个实施方案中,通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型,并且是本领域技术人员熟悉的。可获得例示和展示选定候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。对这些展示的分析帮助阐明残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用,例如,对影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基的分析。这样,可以自接受体和输入序列选出FR残基并组合,从而实现期望的抗体特征,诸如对靶抗原的亲和力升高。一般而言,高变区残基直接且最实质地涉及对抗原结合的影响。
在一方面,本发明涉及具有期望的特性和特征,包括但不限于:对CEA抗原,特别是对膜结合CEA的强结合亲和力,同时基本上没有针对可溶性CEA的交叉反应性;在体外和离体,优选地以剂量依赖性方式诱导对CEA表达细胞的细胞裂解的能力;在体外抑制CEA介导的细胞粘附的能力;抑制肿瘤组织生长和/或诱导肿瘤组织消退(例如,如在肿瘤模型(例如异种移植物小鼠)中表明的)的能力的人源化、亲和力成熟和/或变体抗CEA抗原结合分子。
如本文中所描述的,在一些实施方案中,本发明的变体抗原结合分子具有例如由于包含PR1A3抗体的一个或多个CDR的亲本抗体的亲和力成熟所致的升高的结合亲和力。可以通过本领域中已知的方法并如本文中所描述的那样测定本发明的抗原结合分子或变体抗原结合分子的亲和力。在一个具体的实施方案中,本发明的人源化或变体抗原结合分子以不超过约1μM至约0.001nM,更具体地不超过约800nM至约1nM,且甚至更具体地不超过约550nM至约10nM的单价亲和常数(KD)值结合人CEA,优选结合膜结合的CEA。在一个具体的实施方案中,变体抗原结合分子是以不超过约100nM至约10nM的单价亲和常数(KD)值结合膜结合CEA的亲和力成熟的抗体或其片段。在一个实施方案中,变体抗原结合分子是以不超过约100nM至约0.01nM的单价亲和常数(KD)值结合膜结合CEA的亲和力成熟的抗体或其片段。在一个实施方案中,变体抗原结合分子是以不超过约10nM至约0.1nM的单价亲和常数(KD)值结合膜结合CEA的亲和力成熟的抗体或其片段。在一个实施方案中,变体抗原结合分子是以100nM、10nM、1nM、0.1nM、或更低的单价亲和常数(KD)值结合膜结合CEA的亲和力成熟的抗体或其片段。在一些实施方案中,变体抗原结合分子是稳定性成熟的(改造成具有升高的稳定性)抗体或其片段,其保留其亲和力成熟亲本的升高的结合亲和力。在一个实施方案中,变体抗原结合分子以比它结合脱落CEA的亲和力更高的亲和力结合膜结合CEA。在一个实施方案中,变体抗原结合分子以比它结合脱落CEA的亲和力1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、或更高的亲和力结合膜结合CEA。
在一个实施方案中,本发明的变体抗原结合分子通常结合与由小鼠抗体PR1A3识别的相同表位,或者能够与PR1A抗体竞争对膜结合CEA的结合。为了筛选结合人CEA上被感兴趣的抗体结合的表位的抗体(例如,那些阻断PR1A3抗体结合人CEA的),可以实施常规的交叉阻断测定法,诸如记载于ANTIBODIES,ALABORATORYMANUAL,ColdSpringHarborLaboratory,Harlow和Lane编(1988)的。或者,可以实施表位定位,例如记载于Champe等,J.Biol.Chem.270:1388-1394(1995)的,以测定抗体是否结合感兴趣的表位。
在一个实施方案中,自包含单克隆抗体PR1A3的至少一个CDR的亲本抗CEA抗原结合分子生成对人CEA特异性的变体抗原结合分子,其中亲本抗CEA抗体与PR1A3抗体结合相同表位,并且能够与PR1A3竞争抗原结合。在一个实施方案中,亲本抗原结合分子包含PR1A3抗体的至少一个,两个,或通常三个重链CDR;在另一个实施方案中,亲本抗原结合分子包含PR1A3抗体的至少一个,两个,或通常三个轻链CDR;在另一个实施方案中,亲本抗原结合分子包含PR1A3抗体的三个重链CDR和三个轻链CDR。优选地,在变体抗原结合分子包含PR1A3的HCDR1的情况中,所述HCDR1包含谷氨酸对Kabat第31位缬氨酸的替代。变体ABM通常比亲本具有更大的针对CEA的亲和力。在一个实施方案中,变体ABM具有与亲本相比升高的稳定性。在一个实施方案中,变体ABM包含Fc区。在一个实施方案中,变体ABM是糖工程化改造的。在一个实施方案中,与亲本ABM相比,变体ABM具有升高的ADCC活性。在一个具体的实施方案中,升高的ADCC是例如通过亲本ABM的亲和力成熟以生成变体ABM实现的升高的亲和力的结果。在一个更具体的实施方案中,与所述亲本抗原结合分子相比,ADCC的升高是至少约40%至约100%。在另一个具体的实施方案中,变体ABM在体外细胞毒性测定法中将ADCC提高至少约10%至约100%。在一个更具体的实施方案中,与鼠PR1A3抗体相比,变体ABM在给定浓度时在诱导ADCC方面的效力高至少约10倍至约1000倍。在另一个具体的实施方案中,升高的ADCC活性是Fc区的糖工程化改造的结果。在另一个具体的实施方案中,升高的ADCC活性是升高的亲和力和糖工程化改造组合的结果。
在一个实施方案中,本发明的变体抗原结合分子包含至少一个CDR中的一处或多处氨基酸替代。氨基酸替代的数目范围可以为1至10(例如,1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10),优选地2至5(例如2、3、4、或5)。在一个实施方案中,至少一个重链CDR包含一处或多处氨基酸替代。在另一个实施方案中,至少一个轻链CDR包含一处或多处氨基酸替代。在另一个实施方案中,至少一个重链CDR包含一处或多处替代,且至少一个轻链CDR包含一处或多处替代。优选地,在变体抗原结合分子包含PR1A3的HCDR1的情况中,所述HCDR1包含谷氨酸对Kabat第31位缬氨酸的替代。
抗原结合分子的生物学特性的实质性修饰通过选择如下的替代来实现,所述替代在其对维持(a)替代区中多肽主链的结构,例如如片层或螺旋构象,(b)靶位点处分子的电荷或疏水性,或(c)侧链的体积的影响显著不同。与亲本抗原结合分子相比,包含氨基酸替代的变体抗原结合分子可以具有改善的生物学活性,例如,改善的抗原结合亲和力和增强的ADCC。可以通过本领域中已知的多种技术,包括但不限于定点诱变和/或亲本抗原结合分子的亲和力成熟,例如通过噬菌体展示来引入氨基酸替代。
为了鉴定用于修饰的候选位点,例如高变区残基,可以实施丙氨酸扫描诱变以寻找显著促成抗原结合的残基。或者/另外,分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体与人CEA之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本领域已知的和/或本文中所描述的方法进行替代的候选物。一旦生成此类变体,可以通过本领域中已知的和/或本文中所描述的方法对该组变体进行筛选,并且可以选择在一种或多种相关测定法中具有卓越特性的抗体用于进一步的开发。
可以使用噬菌体展示自亲本抗原结合分子生成含有随机氨基酸突变的高变区序列的全集。例如,将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变,在每个位点处产生所有可能的氨基酸替代。或者,可以对重和/或轻链可变区实施随机诱变。可以通过本领域中已知的技术,包括但不限于在PCR扩增期间使用诱变引物、控制循环数目及使用诱变核苷酸类似物8-氧-dGTP和dPTP来产生突变。自丝状噬菌体颗粒以单价形式展示如此生成的抗体变体,作为与每个颗粒内包装的M13基因III产物的融合物。然后对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性(例如结合亲和力),如本文中公开的,并会使用具有一种或多种改善的活性的候选物来进行进一步开发。用于生成噬菌体展示文库的方法可见Huse等,Science,246:1275-1281(1989);Proc.Nat’lAcad.Sci.,USA,88:4363-4366(1991),在此通过提及而收录每篇的全部内容。用于鉴定亲和力成熟的抗原结合分子的备选方法可以见例如Balint等的美国专利No.7,432,063,在此通过提及而收录其全部内容。
在一些实施方案中,本发明的抗原结合分子和变体抗原结合分子包含Fc区,优选的是人Fc区。Fc区的序列和结构是本领域中已知的,并且已经得到表征。在一个具体的实施方案中,人恒定区是IgG1,如SEQIDNO121和122中所列的。
然而,本发明还涵盖人Fc区的变体和同等型。例如,可以依照Presta的美国专利No.6,737,056(由于一处或多处氨基酸修饰而具有改变的效应器功能的Fc区变体);或美国专利申请No.60/439,498;60/456,041;60/514,549;或WO2004/063351(由于氨基酸修饰而具有升高的结合亲和力的变体Fc区);或美国专利申请No.10/672,280或WO2004/099249(由于氨基酸修饰的具有改变的对FcγR的结合的Fc变体)(通过提及而将每篇的内容完整收入本文)中教导的方法来生成适合于本发明中使用的变体Fc区。在一个具体的实施方案中,抗CEAABM和变体ABM包含已经进行过糖工程化改造以改变ABM的效应器功能活性(例如,降低岩藻糖基化,改善Fc受体结合亲和力,提高ADCC等)的Fc区。可以使用的糖工程的方法在下文详细描述,并且是本领域中已知的。
在一个实施方案中,本发明的抗原结合分子或变体抗原结合分子与别的模块,诸如放射性标记物或毒素缀合。此类缀合的抗原结合分子可以通过本领域中公知的许多方法来生成。本发明的抗CEAABM缀合物在下文详细记载于题目为“抗CEA抗原结合分子缀合物”的部分。
表达载体和宿主细胞
在一方面,本发明涉及包含本发明的一种或多种分离的多核苷酸的表达载体和/或宿主细胞。例如,宿主细胞或表达载体包含任何一种或多种多核苷酸或多核苷酸,其编码本文中所描述的多肽、ABM和/或变体ABM。在另一方面,本发明涉及一种生成结合膜结合人CEA的ABM的方法,该方法包括:在容许所述一种或多种多核苷酸表达的条件下将包含本发明的一种或多种分离的多核苷酸或包含本发明的一种或多种分离的多核苷酸的表达载体的宿主细胞在培养基中培养,其中所述一种或多种多核苷酸编码形成ABM一部分的一种或多种多肽;并回收所述ABM,其中所述ABM或其一部分结合膜结合CEA。
一般地,可以使用任何类型的培养的细胞系来表达本发明的ABM。在一个优选的实施方案中,使用CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、其它哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、或植物细胞作为背景细胞系来生成本发明的经工程化改造的宿主细胞。
在一个具体的实施方案中,宿主细胞或表达载体包含一种或多种编码本文中提供的抗CEAABM的多核苷酸。在一个实施方案中,抗体是亲和力成熟的。亲和力成熟的抗体一般比衍生亲和力成熟抗体的参照抗体具有改善的结合亲和力。在另一个实施方案中,抗体具有期望的治疗特性,包括但不限于:对CEA抗原,特别地膜结合CEA的强结合亲和力,同时基本上没有针对可溶性CEA的交叉反应性;在体外和离体,优选地以剂量依赖性方式诱导对CEA表达细胞的细胞裂解的能力;在体外抑制CEA介导的细胞粘附的能力;在小鼠(例如异种移植物小鼠)肿瘤模型中抑制肿瘤组织生长和/或诱导肿瘤组织消退的能力。在另一个实施方案中,抗体具有与衍生更稳定抗体的亲本抗体相比升高的稳定性。在另一个实施方案中,变体抗体或其片段包含人Fc。
在一个实施方案中,可以在组成性启动子或备选地调节性表达系统控制下表达一种或几种编码本发明ABM的多核苷酸。合适的调节性表达系统包括但不限于四环素调节性表达系统、蜕皮激素诱导型表达系统、lac转换表达系统、糖皮质素诱导型表达系统、温度诱导型启动子系统、和金属硫蛋白金属诱导型表达系统。若编码本发明的ABM的几种不同核酸包含在宿主细胞系统内,则它们中的一些可以在组成性启动子控制下表达,而其它在调节性启动子控制下表达。认为最大表达水平是稳定多肽表达的如下最高可能水平,其对细胞生长速率没有显著的不利影响,并且会使用常规的实验来测定。通过本领域中一般已知的方法,包括使用对ABM特异性的抗体或对与ABM融合的肽标签特异性的抗体的Western印迹分析;和Northern印迹分析来测定表达水平。在又一个备选中,多核苷酸可以与报告基因可操作连接;通过测量与报告基因的表达水平关联的信号来测定本文中所公开的ABM的表达水平。可以将报告基因与编码所述ABM的核酸一起作为单一mRNA分子转录;其各自的编码序列可以通过内部核糖体进入位点(IRES)或通过cap依赖性翻译增强子(CITE)连接。可以将报告基因与编码本文中所公开的ABM的至少一种核酸一起翻译,从而形成单一多肽链。编码本发明的ABM的核酸可以在单一启动子控制下与报告基因可操作连接,使得编码ABM和报告基因的核酸被转录成RNA分子,其被可变剪接成两个分开的信使RNA(mRNA)分子;所得的mRNA之一被翻译成所述报告蛋白,而另一个被翻译成ABM。
可以使用本领域技术人员公知的方法来构建与合适的转录/翻译控制信号一起含有本文中提供的抗CEAABM的编码序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。见例如记载于Maniatis等,MOLECULARCLONING:ALABORATORYMANUAL,ColdSpringHarborLaboratory,N.Y.(1989)及Ausubel等,CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY,GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience,N.Y(1989)的方法。
可以利用多种宿主-表达载体系统来表达本发明ABM的编码序列。优选地,使用哺乳动物细胞作为宿主细胞系统,其用含有感兴趣蛋白质的编码序列和融合多肽的编码序列的重组质粒DNA或粘粒DNA表达载体转染。最优选地,使用CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、其它哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、或植物细胞作为宿主细胞系统。表达系统和选择方法的一些例子记载于下列参考文献和其中引用的参考文献:Borth等,Biotechnol.Bioen.71(4):266-73(2000-2001),于Werner等,Arzneimittelforschung/DrugRes.48(8):870-80(1998),于Andersen和Krummen,Curr.Op.Biotechnol.13:117-123(2002),于Chadd和Chamow,Curr.Op.Biotechnol.12:188-194(2001),及于Giddings,Curr.Op.Biotechnol.12:450-454(2001)。
在备选的实施方案中,可以使用其它真核宿主细胞系统,包括用含有本发明ABM的编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母细胞,诸如美国专利申请No.60/344,169和WO03/056914(用于在非人真核宿主细胞中生成人样糖蛋白的方法)(通过提及而完整收录每篇的内容)中教导的表达系统;用含有抗CEAABM编码序列的重组病毒表达载体(例如,杆状病毒)感染的昆虫细胞系统;用重组病毒表达载体(例如,花椰菜花叶病毒,CaMV;烟草花叶病毒,TMV)感染或用重组质粒表达载体(例如,Ti质粒)转化的植物细胞系统,所述表达载体含有本发明ABM的编码序列,包括但不限于美国专利No.6,815,184(用于自遗传工程的浮萍表达并分泌生物学活性多肽的方法);WO2004/057002(通过导入糖基转移酶基因在苔藓植物细胞中生成糖基化的蛋白质)和WO2004/024927(在藓类原生质体中生成胞外异源非植物蛋白质的方法);及美国专利申请No.60/365,769、60/368,047、和WO2003/078614(包含功能性哺乳动物GnTIII酶的转基因植物中的糖蛋白加工)(通过提及而将每篇的内容完整收入本文)中教导的表达系统;或用重组病毒表达载体(例如,腺病毒、痘苗病毒)感染的动物细胞系统,包括工程化改造为含有在双微染色体(例如,鼠细胞系)中稳定扩增(CHO/dhfr)或不稳定扩增的多拷贝的编码嵌合抗CEAABM的DNA的细胞系。在一个实施方案中,包含编码本发明ABM的多核苷酸的载体是多顺反子的。还有,在一个实施方案中,上文所讨论的ABM是抗体或其片段。在一个实施方案中,ABM是亲和力成熟的抗体。在一个实施方案中,ABM是稳定性成熟的抗体。
一般地,稳定的表达对于瞬时表达而言是优选的,因为它通常实现更加可再现的结果,而且还更适合于大规模生产;然而,本领域技术人员技术内的是测定瞬时表达对于特定的情况是否更好。与使用含有病毒复制起点的表达载体不同,可以用由合适的表达控制元件(例如,启动子、增强子、序列、转录终止子、多聚腺苷酸化位点等)控制的各自编码核酸和选择标志转化宿主细胞。在导入外来DNA后,可以容许经工程化改造的细胞在滋养培养基中生长1-2天,然后转换成选择培养基。重组质粒中的选择标志赋予对选择的抗性,并且容许选择已经将质粒稳定整合入其染色体中,并生长以形成焦点的细胞,所述焦点继而可以被克隆并扩充成细胞系。
可以使用许多选择系统,包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等,Cell11:223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska和Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA48:2026(1962))、和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等,Cell22:817(1980))基因,其可以分别在tk-、hgprt-或aprt-细胞中采用。还有,可以使用抗代谢物抗性作为dhfr(其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等,Natl.Acad.Sci.USA77:3567(1989);O’Hare等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:1527(1981)));gpt(其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan和Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA78:2072(1981)));neo(其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等,J.Mol.Biol.150:1(1981)));和hygro(其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等,Gene30:147(1984))基因的选择基础。最近,已经描述了别的选择基因,即trpB(其容许细胞利用吲哚替换色氨酸);hisD(其容许细胞利用组氨醇替换组氨酸(Hartman和Mulligan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8047(1988)));谷氨酰胺合酶系统;和ODC(鸟氨酸脱羧酶),其赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸即DFMO的抗性(McConlogue,于:CurrentCommunicationsinMolecularBiology,ColdSpringHarborLaboratoryed.(1987))。
本发明进一步涉及用于修饰由宿主细胞生成的本发明ABM的糖基化概况的方法,包括在所述宿主细胞中表达编码本发明ABM的核酸和编码具有糖基转移酶活性的多肽的核酸,或包含此类核酸的载体。具有糖基转移酶活性的基因包括β(1,4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII)、α-甘露糖苷酶II(ManII)、β(1,4)-半乳糖基转移酶(GalT)、β(1,2)-N-乙酰葡糖氨基转移酶I(GnTI)、和β(1,2)-N-乙酰葡糖氨基转移酶II(GnTII)。在一个实施方案中,在宿主细胞中表达具有糖基转移酶活性的基因的组合(例如,GnTIII和ManII)。同样地,该方法还涵盖在已经破坏或以其它方式灭活糖基转移酶基因的宿主细胞(例如,已经敲除编码α1-6核心岩藻糖基转移酶的基因的活性的宿主细胞)中表达一种或多种编码ABM的多核苷酸。在另一个实施方案中,可以在进一步表达编码具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸以修饰糖基化样式的宿主细胞中生成本发明的ABM。在一个具体的实施方案中,具有GnTIII活性的多肽是包含高尔基驻留多肽的高尔基定位域的融合多肽。在另一个优选的实施方案中,表达编码具有GnTIII活性的多肽的多核苷酸的宿主细胞中的本发明ABM的表达生成具有升高的Fc受体结合亲和力和升高的效应器功能的ABM。因而,在一个实施方案中,本发明涉及宿主细胞,其包含(a)包含编码具有GnTIII活性的多肽的序列的分离的核酸;和(b)编码本发明的ABM,诸如结合人CEA的嵌合的、灵长类化的或人源化的抗体的分离的多核苷酸。在一个优选的实施方案中,具有GnTIII活性的多肽是包含GnTIII催化域的融合多肽,而高尔基定位域是甘露糖苷酶II的定位域。用于生成此类融合多肽及使用它们来生成具有升高的效应器功能的抗体的方法披露于美国临时专利申请No.60/495,142和美国专利申请公开文本No.2004/0241817,通过提及而将其全部内容明确收入本文。在一个具体的实施方案中,由宿主细胞生成的经修饰的ABM具有包含Fc区的IgG恒定区或其片段。在另一个具体的实施方案中,ABM是包含Fc区的人源化抗体或其片段。
由本发明的宿主细胞生成的具有改变的糖基化的ABM通常由于宿主细胞的修饰(例如,通过表达糖基转移酶基因)而展现出升高的Fc受体结合亲和力和/或升高的效应器功能。优选地,升高的Fc受体结合亲和力是升高的对Fcγ活化受体,诸如FcγRIIIa受体的结合。优选地,升高的效应器功能是下列一项或多项的升高:升高的抗体依赖性细胞的细胞毒性、升高的抗体依赖性细胞的吞噬(ADCP)、升高的细胞因子分泌、升高的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、升高的Fc介导的细胞的细胞毒性、升高的对NK细胞的结合、升高的对巨噬细胞的结合、升高的对多形核细胞(PMN)的结合、升高的对单核细胞的结合、靶物-结合的抗体的交联升高、升高的诱导凋亡的直接信号传导、升高的树突细胞成熟、和升高的T细胞引发。
具有升高的效应器功能(包括抗体依赖性细胞的细胞毒性)的ABM的生成和用途
在一方面,本发明提供了具有升高的效应器功能,包括抗体依赖性细胞的细胞毒性的抗CEAABM(例如,变体ABM)的糖化同种型(glycoform)。先前已经描述了抗体的糖基化工程。见例如美国专利No.6,602,684,通过提及而将其完整收入本文。本文中还详细描述了自具有涉及糖基化的基因的改变的活性的宿主细胞生成ABM的方法(见例如前面题目为“表达载体和宿主细胞”的部分)。也通过提高抗原结合分子对膜结合CEA的亲和力,例如通过亲和力成熟或其它改善亲和力的方法(见Tang等,J.Immunol.2007,179:2815-2823)来实现本发明ABM的ADCC的升高。本发明也涵盖这些办法的组合。
未缀合的单克隆抗体(单抗)用于治疗一些类型的癌症的临床试验最近已经产生令人鼓舞的结果。Dillman,CancerBiother.&Radiopharm.12:223-25(1997);Deo等,ImmunologyToday18:127(1997)。已经批准了一种嵌合的、未缀合的IgG1用于低级或滤泡性B细胞非何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤。Dillman,CancerBiother.&Radiopharm.12:223-25(1997),而另一种未缀合的单抗,即一种靶向实体乳腺肿瘤的人源化IgG1在III期临床试验中也已经显示了有希望的结果。Deo等,ImmunologyToday18:127(1997)。这两种单抗的抗原在其各自的肿瘤细胞中高度表达,并且抗体在体外和在体内介导效应细胞的有力的肿瘤破坏。相反,具有优良肿瘤特异性的许多其它未缀合单抗不能触发临床上有用的足够效力的效应器功能。Frost等,Cancer80:317-33(1997);Surfus等,J.Immunother.19:184-91(1996)。对于这些较弱的单抗中的一些,目前在测试辅助性细胞因子疗法。细胞因子的添加可以通过提高循环淋巴细胞的活性和数目来刺激抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。Frost等,Cancer80:317-33(1997);Surfus等,J.Immunother.19:184-91(1996)。ADCC(即对靶定细胞的裂解攻击)在淋巴细胞受体结合抗体的恒定区(Fc)后触发。Deo等,ImmunologyToday18:127(1997)。
一种不同但互补的提高未缀合的IgG1的ADCC活性的办法是工程化改造抗体的Fc区。蛋白质工程研究已经显示了,FcγR与IgGCH2域的较低的铰链区相互作用。Lund等,J.Immunol.157:4963-69(1996)。然而,FcγR结合也需要CH2区中保守的Asn297处共价附着的寡糖的存在。Lund等,J.Immunol.157:4963-69(1996);Wright和Morrison,TrendsBiotech.15:26-31(1997),其提示了寡糖和多肽都直接促成相互作用位点或者寡糖是维持活性CH2多肽构象需要的。因此,可以探索对寡糖结构的修饰作为一种提高相互作用亲和力的手段。
IgG分子在其Fc区中携带两个N连接的寡糖,每个重链上一个。与任何糖蛋白一样,抗体以共享相同多肽主链,但是具有附着于糖基化位点的不同寡糖的糖化同种型群体生成。通常在血清IgG的Fc区中找到的寡糖是复合的双触角型的(Wormald等,Biochemistry36:130-38(1997),具有低水平的末端唾液酸和两分型N-乙酰葡糖胺(GlcNAc),和可变程度的末端半乳糖基化和核心岩藻糖基化。一些研究提示了FcγR结合需要的最少碳水化合物结构位于寡糖核心内。Lund等,J.Immunol.157:4963-69(1996)。
工业和学术界中用于生成未缀合的治疗性单抗的小鼠或仓鼠衍生的细胞系通常将需要的寡糖决定簇附着于Fc位点。然而,这些细胞系中表达的IgG缺乏在血清IgG中以较低的量找到的两分型GlcNAc。Lifely等,Glycobiology318:813-22(1995)。相反,最近观察到,大鼠骨髓瘤生成的、人源化的IgG1(CAMPATH-1H)在其一些糖化同种型中携带两分型GlcNAc。Lifely等,Glycobiology318:813-22(1995)。大鼠细胞衍生的抗体达到与标准细胞系中生成的CAMPATH-1H抗体相似的最大体外ADCC活性,但是在显著更低的抗体浓度。
CAMPATH抗原通常以高水平存在于淋巴瘤细胞上,并且此嵌合单抗在没有两分型GlcNAc的情况中具有较高的ADCC活性。Lifely等,Glycobiology318:813-22(1995)。在N连接的糖基化途径中,通过GnTIII添加两分型GlcNAc。Schachter,Biochem.CellBiol.64:163-81(1986)。
先前的研究使用单一的抗体生成CHO细胞系,其先前工程化改造成以外部调节方式表达不同水平的克隆GnTIII酶基因(P.等,NatureBiotechnol.17:176-180(1999))。此办法第一次建立了糖基转移酶(例如GnTIII)表达与经修饰的抗体的ADCC活性间的严格关联。如此,本发明涵盖结合膜结合CEA的变体ABM(例如,亲和力成熟的ABM),其包含具有改变ABM生成宿主细胞中的糖基转移酶基因的表达水平所致改变的糖基化的Fc区或与Fc区等同的区域。在一个具体的实施方案中,基因表达水平的变化是GnTIII活性的升高。升高的GnTIII活性导致ABM的Fc区中两分型寡糖的百分比升高及岩藻糖残基的百分比降低。此抗体或其片段具有升高的Fc受体结合亲和力和升高的效应器功能。
本发明还涉及用于生成具有经修饰的寡糖的本发明抗CEAABM的方法,包括(a)在容许生成依照本发明的ABM的条件下培养宿主细胞,所述宿主细胞工程化改造为表达编码具有糖基转移酶活性的多肽的至少一种核酸,其中所述具有糖基转移酶活性的多肽以足以修饰由所述宿主细胞生成的所述ABM的Fc区中的寡糖的量表达;并(b)分离所述ABM。在一个实施方案中,具有糖基转移酶活性的多肽是GnTIII。在另一个实施方案中,存在两种具有糖基转移酶活性的多肽。在一个具体的实施方案中,两种具有糖基转移酶活性的肽是GnTIII和ManII。在另一个实施方案中,具有糖基转移酶活性的多肽是包含GnTIII的催化域的融合多肽。在一个更具体的实施方案中,融合多肽进一步包含高尔基驻留多肽的高尔基定位域。优选地,高尔基定位域是甘露糖苷酶II或GnTI的定位域。或者,高尔基定位域选自下组:甘露糖苷酶I的定位域、GnTII的定位域、和α1-6核心岩藻糖基转移酶的定位域。通过本发明的方法生成的ABM具有升高的Fc受体结合亲和力和/或升高的效应器功能。一般地,升高的效应器功能是下列一项或多项:升高的Fc介导的细胞的细胞毒性(包括升高的抗体依赖性细胞的细胞毒性)、升高的抗体依赖性细胞的吞噬(ADCP)、升高的细胞因子分泌、升高的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、升高的对NK细胞的结合、升高的对巨噬细胞的结合、升高的对单核细胞的结合、升高的对多形核细胞的结合、升高的诱导凋亡的直接信号传导、靶物-结合的抗体的交联升高、升高的树突细胞成熟、或升高的T细胞引发。优选地,升高的Fc受体结合亲和力是升高的对Fc活化受体诸如FcγRIIIa的结合。在一个特别优选的实施方案中,ABM是人源化抗体或其片段。
在一个实施方案中,ABM的Fc区中两分型N连接的寡糖的百分比占总寡糖的至少约10%至约100%,特别地至少约50%、更特别地至少约60%、至少约70%、至少约80%、或至少约90-95%。在又一个实施方案中,通过本发明的方法生成的抗原结合分子或变体抗原结合分子由于通过本发明的方法对其寡糖的修饰而具有Fc区中比例增加的非岩藻糖基化寡糖。在一个实施方案中,非岩藻糖基化寡糖的百分比是至少约20%至约100%、特别地至少约50%、至少约60%至约70%、且更特别地至少约75%。非岩藻糖基化寡糖可以是杂合或复合类型的。在又一个实施方案中,通过本发明的方法生成的抗原结合分子或变体抗原结合分子由于通过本发明的方法对其寡糖的修饰而具有Fc区中比例增加的两分型寡糖。在一个实施方案中,两分型寡糖的百分比是至少约20%至约100%、特别地至少约50%、至少约60%至约70%、且更特别地至少约75%。在一个特别优选的实施方案中,通过本发明的宿主细胞和方法生成的ABM具有Fc区中比例增加的两分型、非岩藻糖基化寡糖。两分型、非岩藻糖基化寡糖可以是杂合或复合的。特别地,可以使用本发明的方法来生成如下的抗原结合分子或变体抗原结合分子,其中抗原结合分子或变体抗原结合分子的Fc区中至少约10%至约100%,特别地至少约15%,更特别地至少约20%至约50%,更特别地至少约20%至约25%,且更特别地至少约30%至约35%的寡糖是两分型的、非岩藻糖基化的。本发明的ABM也可以包含Fc区,其中ABM的Fc区中至少约10%至约100%,特别地至少约15%,更特别地至少约20%至约25%,且更特别地至少约30%至约35%的寡糖是两分型的、杂合的、非岩藻糖基化的。
在另一个实施方案中,本发明涉及一种抗CEA抗原结合分子(例如,变体ABM),其被工程化改造成具有升高的效应器功能和/或升高的Fc受体结合亲和力,通过本发明的方法生成。升高的效应器功能可以包括但不限于下列一项或多项:升高的Fc介导的细胞的细胞毒性(包括升高的抗体依赖性细胞的细胞毒性)、升高的抗体依赖性细胞的吞噬(ADCP)、升高的细胞因子分泌、升高的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取、升高的对NK细胞的结合、升高的对巨噬细胞的结合、升高的对单核细胞的结合、升高的对多形核细胞的结合、升高的诱导凋亡的直接信号传导、靶物-结合的抗体的交联升高、升高的树突细胞成熟、或升高的T细胞引发。在一个优选的实施方案中,升高的Fc受体结合亲和力是升高的对Fc活化受体,最优选地FcγRIIIa的结合。在一个实施方案中,抗原结合分子或变体抗原结合分子是抗体、含有Fc区的抗体片段、或包括与免疫球蛋白Fc区等同的区域的融合蛋白。在一个特别优选的实施方案中,抗原结合分子或变体抗原结合分子是人源化的亲和力成熟抗体。
本发明进一步提供了生成和使用用于生成本发明的ABM的糖化同种型的宿主细胞系统的方法,所述本发明的ABM的糖化同种型具有升高的Fc受体结合亲和力,优选地升高的对Fc活化受体的结合和/或具有升高的效应器功能,包括抗体依赖性细胞的细胞毒性。可以与本发明的ABM一起使用的糖工程方法已经更为详细地记载于美国专利No.6,602,684、美国专利申请公开文本No.2004/0241817A1、美国专利申请公开文本No.2003/0175884A1、临时美国专利申请No.60/441,307和WO2004/065540,通过提及而将每篇的全部内容完整收入本文。或者,可以依照披露于美国专利申请公开文本No.2003/0157108(Genentech)或EP1176195A1、WO03/084570、WO03/085119和美国专利申请公开文本No.2003/0115614、2004/093621、2004/110282、2004/110704、2004/132140(Kyowa)的技术来将本发明的ABM糖工程化改造成在Fc区中具有降低的岩藻糖残基。通过提及而将每篇这些文件的内容完整收入本文。也可以在生成经修饰的糖蛋白的表达系统,诸如美国专利申请公开文本No.60/344,169和WO03/056914(GlycoFi,Inc.)或WO2004/057002和WO2004/024927(Greenovation)(在此通过提及而完整收录每篇的内容)中教导的那些表达系统中生成本发明的糖工程ABM。
用于生成具有改变的糖基化样式的蛋白质的细胞系的生成
在一方面,本发明提供了用于生成具有经修饰的糖基化样式的本发明的ABM的宿主细胞表达系统。特别地,本发明提供了用于生成本发明ABM具有改善的治疗价值的糖化同种型的宿主细胞系统。因此,本发明提供了选择或工程化改造成表达具有糖基转移酶活性的多肽的宿主细胞表达系统。在一个具体的实施方案中,糖基转移酶活性是GnTIII活性。在一个实施方案中,具有GnTIII活性的多肽是包含异源高尔基驻留多肽的高尔基定位域的融合多肽。特别地,可以将此类宿主细胞表达系统工程化改造成包含编码具有GnTIII的多肽的重组核酸分子,其与组成性或调节性启动子系统可操作连接。
在一个具体的实施方案中,本发明提供了一种已经工程化改造成表达至少一种编码融合多肽的核酸的宿主细胞,所述融合多肽具有GnTIII活性,并且包含异源高尔基驻留多肽的高尔基定位域。在一方面,用包含至少一种编码融合多肽的基因的核酸分子工程化改造宿主细胞,所述融合多肽具有GnTIII活性,并且包含异源高尔基驻留多肽的高尔基定位域。
一般地,可以使用任何类型的培养细胞系,包括上文所讨论的细胞系作为背景来工程化改造本发明的宿主细胞系。在一个优选的实施方案中,使用CHO细胞、BHK细胞、NS0细胞、SP2/0细胞、YO骨髓瘤细胞、P3X63小鼠骨髓瘤细胞、PER细胞、PER.C6细胞或杂交瘤细胞、其它哺乳动物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、和植物细胞作为背景细胞系来生成本发明的经工程化改造的宿主细胞。
本发明涵盖表达具有糖基转移酶活性,例如GnTIII活性的多肽的任何工程化改造宿主细胞,包括如本文中限定的包含异源高尔基驻留多肽的高尔基定位域的融合多肽。
可以在组成性启动子或备选地调节性表达系统的控制下表达一种或几种编码具有糖基转移酶活性,例如GnTIII活性的多肽的核酸。此类系统是本领域中公知的,并且包括上文所讨论的系统。若编码具有糖基转移酶活性,例如GnTIII活性,并包含异源高尔基驻留多肽的高尔基定位域的融合多肽的几种不同核酸包含在宿主细胞系统内,则它们中的一些可以在组成性启动子的控制下表达,而其它在调节性启动子的控制下表达。通过本领域中一般已知的方法,包括Western印迹分析、Northern印迹分析、报告基因表达分析或测量糖基转移酶活性,例如GnTIII活性来测定具有糖基转移酶活性,例如GnTIII活性的融合多肽的表达水平。或者,可以采用结合GnTIII的生物合成产物的凝集素,例如,E4-PHA凝集素。或者,可以使用如下的功能性测定法,其测量由用如下核酸工程化改造的细胞生成的抗体介导的升高的Fc受体结合或升高的效应器功能,所述核酸编码具有糖基转移酶活性,例如GnTIII活性的多肽。
表达具有经修饰的糖基化样式的蛋白质的转染子或转化子的鉴定
可以通过至少四种通用办法来鉴定含有变体抗CEAABM(例如人源化的、亲和力成熟和/或稳定性成熟的ABM)的编码序列,并且表达生物学活性基因产物的宿主细胞;(a)DNA-DNA或DNA-RNA杂交;(b)“标志物”基因功能的存在或缺乏;(c)评估转录水平,如通过宿主细胞中的各自mRNA转录物的表达测量的;和(d)检测基因产物,如通过免疫测定法或通过其生物学活性测量的。
在第一种办法中,可以使用包含分别与各自编码序列同源的核苷酸序列或其部分或衍生物的探针通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交来检测变体抗CEAABM的编码序列和/或具有糖基转移酶(例如GnTIII)活性的多肽的编码序列的存在。
在第二种办法中,可以基于某些“标志物”基因功能(例如,胸苷激酶活性、对抗生素的抗性、对甲氨蝶呤的抗性、转化表型、杆状病毒中的包含体形成等)的存在或缺乏来鉴定和选择重组表达载体/宿主系统。例如,若将本发明的ABM的编码序列,或其片段,和/或具有糖基转移酶(例如GnTIII)活性的多肽的编码序列插入载体的标志物基因序列内,则可以通过标志物基因功能的缺乏来鉴定含有各自编码序列的重组体。或者,可以将标志物基因与编码序列在用于控制编码序列表达的相同或不同启动子控制下串联放置。标志物响应诱导或选择的表达指示本发明的ABM的编码序列和/或具有糖基转移酶(例如GnTIII)活性的多肽的编码序列的表达。
在第三种办法中,可以通过杂交测定法来评估本发明的ABM的编码区或其片段和/或具有糖基转移酶(例如GnTIII)活性的多肽的编码序列的转录活性。例如,可以将RNA分离,并使用与本发明的ABM的编码序列或其片段和/或具有糖基转移酶(例如GnTIII)活性的多肽的编码序列或其特定部分同源的探针通过Northern印迹来分析。或者,可以将宿主细胞的总核酸提取,并测定与此类探针的杂交。
在第四种办法中,可以例如通过Western印迹、免疫测定法诸如放射性免疫沉淀、酶联免疫测定法等来在免疫学上评估蛋白质产物的表达。然而,表达系统成功的最终测试涉及生物学活性基因产物的检测。
使用抗CEA抗原结合分子的治疗性应用和方法
本发明还涉及一种用于靶向体内或体外的表达CEA的细胞的方法。出于治疗目的,可以靶向表达CEA的细胞(例如,通过靶向CEA表达细胞来由免疫系统实现破坏以治疗病症)。在一个实施方案中,本发明涉及一种用于靶向受试者中表达CEA的细胞的方法,包括对受试者施用包含本发明的ABM的组合物。也可以出于诊断目的靶向表达CEA的细胞(例如,以测定它们是否正常或异常表达CEA)。如此,本发明还涉及用于在体内或在体外检测CEA或表达CEA的细胞的存在的方法。一种依照本发明检测CEA表达的方法包括使要测试的样品(任选地及对照样品)与本发明的ABM在容许形成ABM与CEA间复合物的条件下接触。然后,检测复合物形成(例如,通过ELISA或本领域中已知的其它方法进行)。在使用对照样品及测试样品时,在比较测试和对照样品时在ABM-CEA复合物形成上的任何统计学显著差异指示测试样品中CEA的存在。
在一方面,可以在体内或在体外使用本发明的ABM和/或变体ABM来靶向表达CEA的靶细胞。可以出于诊断或治疗目的靶向表达CEA的细胞。在一方面,可以使用本发明的ABM来检测样品中CEA的存在。与相同细胞类型的非肿瘤组织相比,CEA在许多人肿瘤中异常表达(例如,过表达)。如此,本发明的ABM和/或变体ABM特别可用于预防肿瘤形成,根除肿瘤和抑制肿瘤生长或转移。本发明的ABM和/或变体ABM也用来阻滞细胞周期,引起靶细胞(例如肿瘤细胞)凋亡,和抑制靶细胞的分化和/或血管发生。可以使用本发明的ABM和/或变体ABM来治疗表达CEA的任何肿瘤。可以用本发明的ABM和/或变体ABM治疗的特定恶性肿瘤包括但不限于结肠直肠癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌和乳腺癌。
可以单独地使用本文中所公开的抗CEAABM和/或变体ABM来抑制肿瘤生长或杀死肿瘤细胞。例如,抗CEAABM可以结合癌性细胞膜或细胞表面上的CEA,并引发例如ADCC或其它效应器介导的对癌性细胞的杀死。抗CEAABM和/或变体ABM可以是人源化的,特别地亲和力和/或稳定性成熟的,更特别地糖工程化改造的、稳定性、且亲和力成熟的。
或者,可以单独使用ABM和/或变体ABM以阻断CEA抗原的活性,特别地通过物理干扰其对另一种化合物的结合。例如,可以使用抗原结合分子和变体抗原结合分子来阻断CEA介导的细胞粘附。
以药学可接受剂量形式诸如那些在下文所讨论的(包括那些可以对人静脉内施用的,如推注或者通过在一段时间里连续输注、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面、或吸入路径)对哺乳动物,优选地人施用本发明的抗CEAABM和/或变体ABM。也通过肿瘤内、肿瘤周围、损伤内、或损伤周围路径适当地施用ABM,以施加局部及系统治疗效果。预期腹膜内路径特别可用于例如治疗结肠直肠肿瘤。
对于疾病的治疗,ABM和/或变体ABM的合适剂量会取决于要治疗疾病的类型、疾病的严重性和过程、先前的疗法、患者的临床史和对抗体的响应、和主治内科医生的判断。可以适当地对患者一次或在一系列治疗里施用ABM。
本发明提供了一种选择性杀死表达CEA的肿瘤细胞的方法。此方法包括将本发明的抗原结合分子或缀合物(例如免疫毒素)与所述肿瘤细胞起反应。这些肿瘤细胞可以来自人癌,包括结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胃癌、胰腺癌和乳腺癌。
在一个实施方案中,本发明提供了一种抑制肿瘤细胞由CEA介导的细胞粘附的方法。此方法包括使所述肿瘤细胞与本发明的抗原结合分子或变体抗原结合分子或其缀合物接触。这些肿瘤细胞可以来自人细胞,包括结肠直肠癌细胞、非小细胞肺癌细胞(NSCLC)、胃癌细胞、胰腺癌细胞和乳腺癌细胞。
另外,本发明提供了一种体内治疗癌(例如人癌)的方法。此方法包括对受试者施用药学有效量的含有至少一种本发明的抗原结合分子或免疫缀合物(例如,免疫毒素)的组合物。
在又一方面,本发明涉及用于治疗以CEA过表达为特征的癌症,包括但不限于结肠直肠癌细胞、NSCLC(非小细胞肺癌)、胃癌细胞、胰腺癌细胞和乳腺癌细胞的方法,其通过施用治疗有效量的本文中所公开的抗CEA抗原结合分子或变体抗原结合分子来进行。
在又一个实施方案中,本发明涉及使用本文中所公开的抗CEA抗原结合分子或变体抗原结合分子来诱导受试者中的肿瘤组织消退的方法。肿瘤组织的非限制性例子包括结肠直肠肿瘤、非小细胞肺肿瘤、胃肿瘤、胰腺肿瘤和乳腺肿瘤。在一个具体的实施方案中,肿瘤组织是结肠直肠肿瘤。
依照本发明的实践,受试者可以是人、马、猪、牛、鼠、犬、猫、和鸟受试者。其它温血动物也包括在本发明中。
本发明进一步提供了用于抑制肿瘤细胞生长,治疗受试者中的肿瘤,及治疗受试者中的增殖型疾病的方法。这些方法包括对受试者施用有效量的本发明的组合物。
在另一方面,本发明涉及本文中所公开的抗CEA抗原结合分子或变体抗原结合分子用于制造药物的用途,所述药物用于治疗与异常CEA表达有关的疾病。在一个具体的实施方案中,疾病是过表达CEA的癌症,包括但不限于结肠直肠肿瘤、非小细胞肺肿瘤、胃肿瘤、胰腺肿瘤和乳腺肿瘤。在一个具体的实施方案中,肿瘤是结肠直肠肿瘤。
抗CEA抗原结合分子缀合物
本发明还提供包含与一种或多种细胞毒剂,诸如化学治疗剂或药物、生长抑制剂、毒素(例如,蛋白质毒素、细菌、真菌、植物、或动物起源的酶活性毒素、或其片段)、或放射性同位素缀合的本文中抗CEAABM或变体ABM的免疫缀合物。
在一个实施方案中,免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC),其中抗体与一种或多种药物缀合,包括但不限于美登木素生物碱(见美国专利No.5,208,020、5,416,064和欧洲专利EP0425235B1);auristatin诸如单甲基auristatin药物模块DE和DF(MMAE和MMAF)(见美国专利No.5,635,483和5,780,588及7,498,298);多拉司他汀(dolastatin);加利车霉素(calicheamicin)或其衍生物(见美国专利No.5,712,374,5,714,586,5,739,116,5,767,285,5,770,701,5,770,710,5,773,001和5,877,296;Hinman等,CancerRes.53:3336-3342(1993);及Lode等,CancerRes.58:2925-2928(1998));蒽环类抗生素诸如道诺霉素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(见Kratz等,CurrentMed.Chem.13:477-523(2006);Jeffrey等,Bioorganic&Med.Chem.Letters16:358-362(2006);Torgov等,Bioconj.Chem.16:717-721(2005);Nagy等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:829-834(2000);Dubowchik等,Bioorg.&Med.Chem.Letters12:1529-1532(2002);King等,J.Med.Chem.45:4336-4343(2002);及美国专利No.6,630,579);甲氨蝶呤;长春地辛(vindesine);紫杉烷(taxane)诸如多西他赛(docetaxel)、帕利他塞、larotaxel、tesetaxel、和ortataxel;单端孢霉素(trichothecene);和CC1065。
在另一个实施方案中,免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文中所描述的抗CEAABM或变体ABM,所述酶活性毒素包括但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。
在另一个实施方案中,免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射性缀合物的如本文中所描述的抗CEAABM或变体ABM。多种放射性同位素可用于生成放射性缀合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在使用放射性缀合物进行检测时,它可以包含供闪烁法研究用的放射性原子,例如tc99m或I123,或供核磁共振(NMR)成像(又称为磁共振成像,mri)用的自旋标记物,诸如再一次的碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双功能蛋白质偶联剂来生成抗体和细胞毒剂的缀合物,诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP),琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC),亚氨基硫烷(IT),亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2,6-二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如,可以如Vitetta等,Science238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如,可使用酸不稳定接头、肽酶敏感性接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等,CancerRes52:127-131(1992);美国专利No.5,208,020)。
本文中的免疫缀合物或ADC明确涵盖,但不限于用交联试剂制备的此类缀合物,所述交联试剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC、和sulfo-SMPB,及SVSB(琥珀酰亚氨基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯),它们是商品化的(例如,来自PierceBiotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。
组合物、配制剂、剂量、和施用路径
在一方面,本发明涉及药物组合物,其包含本发明的抗CEAABM或变体ABM和药学可接受载体。本发明进一步涉及此类药物组合物在治疗疾病诸如癌症的方法中,或在制造供治疗疾病诸如癌症用的药物中的用途。特别地,本发明涉及治疗疾病,且更特别地,用于治疗癌症的方法,该方法包括施用治疗有效量的本发明的药物组合物。
在一方面,本发明涵盖用于治疗人癌,例如结肠直肠癌的药物组合物、组合和方法。例如,本发明包括在治疗人癌中使用的药物组合物,其包含药学有效量的本发明的抗体和药学可接受载体。
可以使用常规的施用模式来施用本发明的ABM组合物,包括但不限于静脉内、腹膜内、口服、淋巴内或直接施用入肿瘤。静脉内施用是优选的。
在本发明的一方面,为了贮存通过混合具有期望纯度的抗体与任选的药学可接受载体、赋形剂、或稳定剂(Remington’sPharmaceuticalSciences第16版,Osol,A.编(1980))以冻干的配制剂或水溶液形式制备含有本发明的ABM的治疗配制剂。可接受的载体、赋形剂、或稳定剂在采用的剂量和浓度对于接受者是无毒的。
要用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这容易通过过滤通过无菌过滤膜来实现。
对于本发明的药物组合物最有效的施用模式和剂量方案取决于疾病的严重性和过程、患者的健康和对治疗的响应和主治内科医生的判断。因而,应当对个别患者滴定组合物的剂量。然而,本发明的组合物的有效剂量一般会在约0.01至约2000mg/kg的范围中。
本文中所描述的分子可以为多种剂量形式,其包括但不限于液体溶液或悬浮液、片剂、丸剂、粉剂、栓剂、聚合物微胶囊或微泡、脂质体、和可注射或可输注溶液。优选的形式取决于施用模式和治疗应用。
会将包含本发明的ABM的组合物以与良好医学实践(goodmedicalpractice)一致的方式配制、给药、并施用。此背景中的考虑因素包括治疗的特定疾病或病症、治疗的特定哺乳动物、个别患者的临床状况、疾病或病症的原因、药剂投递部位、施用方法、施用日程表安排、和医学从业人员已知的其它因素。此类考虑因素会决定要施用的拮抗剂的治疗有效量。
制品
在本发明的另一方面,提供了一种制品,其含有可用于治疗、预防和/或诊断上文所描述的病症的材料。制品包含容器和容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、管形瓶、注射器、IV溶液袋、等等。容器可以由多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器容纳单独或与另一种组合物组合有效治疗、预防和/或诊断状况的组合物,并且可以具有无菌存取口(例如,容器可以是具有由皮下注射针可穿过的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示使用组合物来治疗选择的状况。此外,制品可以包含(a)具有其中含有的组合物的第一容器,其中组合物包含本发明的抗体;和(b)具有其中含有的组合物的第二容器,其中组合物包含其它的细胞毒性或其它方面治疗性的药剂。在本发明的此实施方案中的制品可以进一步包含包装插页,其指示可以使用组合物来治疗特定的状况。或者/另外,制品可以进一步包含第二(或第三)容器,其包含药学可接受缓冲液,诸如抑菌性注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包含从商业和用户观点看期望的其它材料,包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针、和注射器。
应当理解,任何上述制品可包括本发明的免疫缀合物来代替或补充抗CEAABM。
下文的实施例更为详细地解释本发明。给出以下制备物和实施例以使本领域技术人员能够更清楚地了解并实施本发明。然而,本发明在范围上不限于例示的实施方案,其仅意图作为本发明的单一方面的例示,并且功能上等同的方法在本发明的范围内。实际上,在本文中所描述的那些外,对本发明的各种修饰从前述说明书和附图看对于本领域技术人员会变得显而易见。此类修饰意图落入所附权利要求书的范围内。
实施例
除非另有规定,以下实施例中提及特定氨基酸残基位置的编号方式是依照Kabat编号系统。
实施例1:亲和力成熟文库的生成
H1/H2文库
为了生成HCDR1和HCDR2区中随机化的亲和力成熟文库,将编码CDR1中的位置F32G33和CDR2中的位置W50N52T52aK52bT54E56T58的三联体随机化。在第一步中,使用pMS22作为模板和引物MS-43(SEQIDNO:123)和EAB-679(SEQIDNO:127)(其含有随机化的CDR1位置(图11))来扩增DNA片段(片段1)。使用相同模板,引物MS-56(SEQIDNO:126)和MS-52(SEQIDNO:124)扩增第二片段(片段2),其与片段1的3’端具有交叠区。扩增条件包括初始的5分钟94℃温育步骤,接着是25个循环,每个循环由1分钟94℃变性、1分钟55℃退火、和20秒和50秒72℃延伸步骤(分别对于片段1和片段2)组成。结束时实施最终的10分钟72℃温育步骤。将这两种片段在琼脂糖凝胶上纯化。使用引物MS-43(SEQIDNO:123)和EAB-680(SEQIDNO:128)(其含有CDR2的随机化位置)用片段1和2进行的交叠延伸PCR生成具有随机化的这两个CDR的片段(片段3)。为了装配片段1和2,使用等摩尔量的片段1和片段2。扩增条件包括初始的5分钟94℃温育步骤,接着是没有引物的5个循环,每个循环由1分钟94℃变性、1分钟55℃退火、和40秒72℃延伸步骤组成。添加外部引物后,使用相同的参数来实施20个额外的循环。再次使用pMS22作为模板和引物MS-55(SEQIDNO:125)和MS-52(SEQIDNO:124)来PCR扩增与片段3的3’区交叠的第四片段(片段4)。凝胶纯化后,使用片段3和4作为模板和引物MS-43和MS-52的最终交叠延伸PCR生成含有CL和VH的各部分的片段。为此,使用等摩尔量的片段3和片段4。扩增条件包括初始的5分钟94℃温育步骤,接着是没有引物的5个循环,每个循环由1分钟94℃变性、1分钟55℃退火、和80秒72℃延伸步骤组成。添加外部引物后,使用相同的参数来实施20个额外的循环。然后,将所得的片段进行凝胶纯化,并在NcoI/NheI消化后与pMS22连接。
L1/L2文库
为了生成LCDR1和LCDR2区中随机化的亲和力成熟文库,将编码CDR1中的位置Q27、N28、V29、G30T31N32和CDR2中的位置Y49S50Y53R54Y55S56的三联体随机化。在第一步中,使用pMS22作为模板和引物EAB-685(SEQIDNO:129)和EAB-681(SEQIDNO:133)(其含有随机化的CDR1位置(图12))来扩增DNA片段(片段1)。使用相同模板,引物EAB-686(SEQIDNO:130)和EAB-687(SEQIDNO:131)扩增第二片段(片段2),其与片段1的3’端具有交叠区。扩增条件包括初始的5分钟94℃温育步骤,接着是25个循环,每个循环由1分钟94℃变性、1分钟55℃退火、和60秒72℃延伸步骤(分别对于片段1和片段2)组成。结束时实施最终的10分钟72℃温育步骤。将这两种片段在琼脂糖凝胶上纯化。使用引物EAB-685(SEQIDNO:129)和EAB-682(SEQIDNO:134)(其含有CDR2的随机化位置)用片段1和2进行的交叠延伸PCR生成具有随机化的这两个CDR的片段(片段3)。为了装配片段1和2,使用等摩尔量的片段1和片段2。扩增条件包括初始的5分钟94℃温育步骤,接着是没有引物的5个循环,每个循环由1分钟94℃变性、1分钟55℃退火、和60秒72℃延伸步骤组成。添加外部引物后,使用相同的参数来实施20个额外的循环。再次使用pMS22作为模板和引物EAB-688(SEQIDNO:132)和EAB-687(SEQIDNO:131)来PCR扩增与片段3的3’区交叠的第四片段(片段4)。凝胶纯化后,使用片段3和4作为模板和引物EAB-685(SEQIDNO:129)和EAB-687(SEQIDNO:131)的最终交叠延伸PCR生成含有VL和CL的各部分的片段。为此,使用等摩尔量的片段3和片段4。扩增条件包括初始的5分钟94℃温育步骤,接着是没有引物的5个循环,每个循环由1分钟94℃变性、1分钟55℃退火、和80秒72℃延伸步骤组成。添加外部引物后,使用相同的参数来实施20个额外的循环。然后,将此片段在HindIII/SacI消化后与pMS22连接。
H3文库
为了生成HCDR3区中随机化的亲和力成熟文库,将编码位置W95、D96、F97、Y98、D99、Y100、V100a、E100b、A100c、和M100d的三联体在两种不同办法中随机化:(1)整个区段的随机化(H3全文库)或(2)每个位置的个别随机化,产生10个亚文库。将含有具有个别随机化位置的克隆的亚文库在转化入细菌中后合并(H3合并文库)。为了HCDR3区的随机化,使用在CL的3’端中退火的引物和含有HCDR3的随机化序列的引物来PCR扩增片段(图13)。然后,用与片段1的3’端交叠,并且包含VH的末端和CH1的5’区的第二片段来实施交叠延伸PCR。然后,将装配的片段在SacI/NheI消化后连接入pMS22中。为了生成H3合并文库,与引物EAB-749(SEQIDNO:146)组合使用引物AC7-AC16(SEQIDNO:135;SEQIDNO:144)之每种来分开PCR扩增10种DNA片段。为了生成L3全文库,使用引物AC17(SEQIDNO:145)和EAB-749(SEQIDNO:146)。使用质粒pMS22作为模板。扩增条件包括初始的5分钟94℃温育步骤,接着是25个循环,每个循环由1分钟94℃变性,1分钟55℃退火,和36秒72℃延伸步骤组成,接着是最终的10分钟72℃温育步骤。这产生长约580bp的片段,将其在琼脂糖凝胶上纯化。为了交叠延伸PCR,与EAB-752(SEQIDNO:149)组合使用引物EAB-750(SEQIDNO:147)或EAB-751(SEQIDNO:148)来扩增第二片段。引物EAB-750(SEQIDNO:147)与随机化引物AC7-11(SEQIDNO:139)具有交叠序列,而EAB-751(SEQIDNO:148)与随机化引物AC12-17(SEQIDNO:140-145)共享序列同源性。扩增条件包括初始的5分钟94℃温育步骤,接着是25个循环,每个循环由1分钟94℃变性,1分钟55℃退火,和12秒72℃延伸步骤组成,接着是最终的10分钟72℃温育步骤。所得的片段长约180bp。为了装配这两个片段,使用等摩尔量的片段1和相应的片段2。扩增条件包括初始的5分钟94℃温育步骤,接着是没有引物的5个循环,每个循环由1分钟94℃变性、1分钟55℃退火、和60秒72℃延伸步骤组成。添加外部引物EAB-749(SEQIDNO:146)和EAB-752(SEQIDNO:149)后,使用相同的参数来实施20个额外的循环。最后,实施最终的10分钟72℃温育步骤。然后,将凝胶纯化的片段在SacI/NheI消化后连接入pMS22中,并通过电穿孔将纯化的连接物转化入TG1细菌中。
L3文库
为了生成轻链的CDR3区中随机化的亲和力成熟文库,将编码位置Y91、Y92、T93、Y94、和L95a的三联体遍及整个区段(L3全文库)或个别地(产生5个亚文库)随机化。将含有具有个别随机化位置的克隆的亚文库在转化入细菌中后合并(H3合并文库)。为了生成5个亚文库,与引物MS43(SEQIDNO:123)组合使用引物AC1-AC5(SEQIDNO:150-154)之每种来PCR扩增5种DNA片段。为了生成L3全文库,使用引物组合AC6(SEQIDNO:155)和MS43(SEQIDNO:123)(图14)。使用质粒pMS22作为模板。扩增条件包括初始的5分钟94℃温育步骤,接着是25个循环,每个循环由1分钟94℃变性,1分钟55℃退火,和25秒72℃延伸步骤组成,接着是最终的10分钟72℃温育步骤。将涵盖VL域的位置1-104的所得片段在琼脂糖凝胶上纯化,并作为模板用于别的PCR扩增。使用上文所描述的相同条件用与随机化引物具有交叠序列的引物EAB-746(SEQIDNO:156)和MS43(SEQIDNO:123)来实施所有反应。将纯化的片段及pMS22用NcoI/XhoI消化。对于所有5个亚文库,将0.5μg插入物与0.5μgpAC16连接。对于L3全文库,用9.8μg插入物和9.8μgpMS22实施连接。通过电穿孔来将纯化的连接物转化入TG1细菌中。
抗原的生成
因为鼠和人源化PR1A3抗体两者都仅识别膜结合的,而不是脱落的可溶性人CEA,所以生成含有PR1A3表位的重组嵌合蛋白以进行人源化PR1A3的体外亲和力成熟(SEQIDNO:7和8)。实施此杂合蛋白的生成,如记载于Steward等,1999的。简言之,将人胆汁糖蛋白(BGP)的B域的DNA序列用人CEA-B3域(其含有PR1A3的表位)序列替换。因此,该序列编码杂合的蛋白质,其包含BGP的N和A1域、CEA的B3域和BGP的A2域(N-A1-B3-A2,huNABA)。然后,将此融合产物与人IgG1的Fc部分连接(huNABA-Fc)(Steward等,CancerImmunolImmunother,47:299-306,1999)或与编码精确的蛋白酶切割位点、avi标签和(His)6标签的序列融合(huNABA-avi-his)(SEQIDNO:158)。使用蛋白A柱自经稳定转染的CHO细胞系的上清液纯化huNABA-Fc。将huNABA-avi-his(SEQIDNO:158)瞬时转染入稳定表达EBV-衍生的蛋白EBNA的HEK293细胞中。同时共转染的编码生物素连接酶的质粒容许体内avi标签特异性生物素化。然后,通过固定化的金属亲和层析(IMAC),接着进行凝胶过滤来纯化蛋白质。
人源化PR1A3的亲和力成熟
使用标准的方案(Silacci等,Proteomics,5(9):2340-2350,2005)通过噬菌体展示来实施亲和力成熟的人源化PR1A3Fab的生成。依照以下规程在溶液中实施用所有亲和力成熟文库的选择:1.每个亲和力成熟文库的约1012个噬菌粒颗粒在总体积1ml中结合100nM生物素化的huNABA-avi-his达0.5小时,2.通过添加5.4×107个经链霉亲合素包被的磁珠达10分钟来捕捉生物素化的huNABA-avi-his和特异性结合的噬菌体颗粒,3.使用5-10x1mlPBS/Tween20和5-10x1mlPBS来清洗珠,4.通过添加1ml100mMTEA(三乙胺)达10分钟来洗脱噬菌体颗粒,并通过添加500ul1MTris/HClpH7.4来中和,以及5.再感染指数生长的大肠杆菌TG1细菌,用辅助噬菌体VCSM13感染,随后用PEG/NaCl沉淀噬菌粒颗粒以在随后的选择轮次中使用。使用恒定的或降低的(10-7M至2x10-9M)抗原浓度在3-5轮里实施选择。在第2轮中,使用中性亲合素板替代链霉亲合素珠来实施抗原:噬菌体复合物的捕捉。如下通过ELISA鉴定特异性结合物:将每孔100ul10nM生物素化的huNABA-avi-his在中性亲合素板上包被。添加含有Fab的细菌上清液,并通过使用抗Flag/HRP二抗经由其Flag标签来检测结合Fab。将ELISA阳性克隆在96孔形式中以可溶性Fab片段用细菌表达,并使用BIACORET100通过SPR分析将上清液进行动力学筛选实验。鉴定表达具有最高亲和力常数的Fab的克隆,并对相应的噬菌粒测序。
Fab的纯化和动力学参数的测量
对于对动力学参数的精确分析,自细菌培养物纯化Fab。将500ml培养物接种,并在OD6000.9时用1mMIPTG诱导。将细菌于25℃温育过夜,并通过离心来收获。将重悬浮的团粒在25mlPPB缓冲液(30mMTris-HClpH8、1mMEDTA、20%蔗糖)中温育20分钟后,将细菌再次离心,并收获上清液。用25ml5mMMgSO4溶液将此温育步骤重复一次。将这两个温育步骤的上清液合并,过滤,并在IMAC柱(Hisgravitrap,GEHealthcare)上加载。随后,用40个体积洗柱。洗脱(500mMNaCl、500mM咪唑、20mMNaH2PO4pH7.4)后,使用PD10柱(GEHealthcare)再缓冲洗脱液。然后,通过在范围为200nM至6.25nM的洗脱系列中的SPR分析来研究纯化的Fab的动力学参数。
实施例2
将PR1A3抗体嵌合化为具有人IgG1/κ恒定区,并使用GylcoMab技术来表达以在Fc中具有高度的无岩藻糖基化糖。以效应器与靶物比率25:1比较糖工程的和非糖工程的抗体。通过Fc区的糖工程使抗体依赖性靶细胞杀死的最大量加倍(图2)。通过增加效应器与靶物比率来实现细胞杀死的进一步升高(图2)。
使用与人种系序列相同的框架来使PR1A3人源化。IMGT序列IGHV7-4-1*02(登录号X62110)是VH人源化的接受体,而IMGT_hVK_1_39(登录号X59315)是VL人源化的接受体。包含重链可变区构建体CH7A和轻链可变区构建体CL1A的人源化PR1A3抗体显示令人满意的对人结肠癌细胞的结合,如通过流式细胞术测量(图3)。
使用标准的方案来实施通过噬菌体展示实现的PR1A3的亲和力成熟,如本文中实施例1中详细描述的。用于亲和力成熟的亲本人源化PR1A3抗体包含重链可变区构建体CH7A和轻链可变区构建体CL1A。下文表3-6显示了用于亲和力成熟的文库。对于L1/L2文库,将CDR内的位置缬氨酸29、丙氨酸50、或丝氨酸51保持恒定。对于H1/H2文库,将CDR内的位置异亮氨酸51、甘氨酸55、或丙氨酸57保持恒定(图4和5)。
将亲和力成熟的重链可变区构建体CH7ArF9和亲和力成熟的轻链可变区构建体CL1ArH11分别与亲本轻链可变区构建体和重链可变区构建体配对,并彼此配对。将所有抗体转变成人IgG1/κ,并通过流式细胞术测量对CEA阳性细胞系MKN45的结合。与人源化亲本抗体相比,包含一种亲和成熟的重或轻链可变区或亲和力成熟的重或轻链可变区两者的抗体显示改善的结合特征(图6)。图6、10和15显示了几个例子,其中成熟的轻和重链独立地促成升高的亲和力。亲本抗体CH7ACL1A在图6和15中具有最低的信号强度,及最高的EC50值。成熟的轻链将EC50值移动至较低的数目,而成熟的重链(图6中的rF9,和图15中的rB9)移动流式细胞术测量中的总荧光信号强度。图10显示了通过Biacore方法测量的重和轻链的个别贡献。这两条链的组合甚至进一步提高亲和力。另外,如图16所示,亲和力的改善导致ADCC特征的改善。
通过Biacore测定亲和力成熟的重和轻链CDR的结合亲和力,并在图34A和B中列出。
图35汇总了各种亲和力成熟的抗体序列的亲和力常数。列出了亲本抗体PR1A3及成熟的和未成熟的序列的几种轻链和重链组合。通过用固定化的NABA-avi-his试剂(SEQIDNO158)作为抗原在Biacore芯片上测量Fab形式的各种可溶性抗体构建体的结合(kon)和解离(koff)速率常数通过Biacore技术来获得所有数值。用KD标记亲和力常数。
实施例3
实施例2中描述的生成亲和力成熟的抗CEA抗体中使用的受体框架属于人VH7类别。为了提高稳定性,使用一种更加稳定的受体框架序列作为抗体稳定性工程改造的基础。基于鼠抗体PR1A3的序列同源性和VH1衍生序列应当具有比VH7更高的内在稳定性的假设,或人VHclans个数为偶数(Ewert,S.,Huber,T.,Honegger,A.andPlückthun,A.(2003)J.Mol.Biol.,325,531-553),使用序列IGHV-1-18;登录号:M99641作为新的受体框架。PR1A3抗体的常规CDR环嫁接产生构建体CH1A(SEQIDNO:279)。不幸的是,这种分子没有显示出显著的针对CEA抗原的结合活性。以多种浓度将这种构建体的结合活性与包含小鼠衍生可变域的嵌合抗体PR1A3的结合活性比较。将BxPC3细胞用于抗体对CEA的特异性结合,并通过FACS分析测量了结合强度。图17.
为了恢复结合亲和力,将数种回复突变引入CH1A序列以生成新的重链CH1A1(SEQIDNO:257)、CH1A2(SEQIDNO:258)、CH1A3(SEQIDNO:259)、和CH1A4(SEQIDNO:260)。CH1A1包括M69F/T71L双重点突变。后三种变体中分别是整个框架1、2、或3用鼠对应物替换。图18显示了那些构建体在与2F1轻链(SEQIDNO:209)配对时的结合。在这种测定法中,以多种浓度分析了基于CH1A的抗体变体对表达CEA的MKN-45细胞的细胞结合。亲和力成熟的轻链2F1对于测试的所有抗体是相同的,除了使用初始轻链CL1A的亲本抗体。通过FACS分析测定了均值荧光。图19显示了那些构建体在与2F1轻链配对时的稳定性,如通过样品的动态光散射(DLS)测量的。在20mM组氨酸和140mMNaClpH6.0的缓冲液中使用1mg/ml抗体实施了DLS测定法。以25℃开始进行测定法,增量温度升高0.05℃/min,直至70℃。在这种测定法中测试的所有抗体具有2F1作为轻链。
由于CH1A1仍然保持初始稳定性,而且还显示出一些显著(但是有点低于CH1A4,其亲和力最高但稳定性最低)结合,所以选择这种构建体进行进一步结合优化。生成了新的重链CH1A1A(SEQIDNO:261)、CH1A1B(SEQIDNO:262)、CH1A1C(SEQIDNO:263)、CH1A1D(SEQIDNO:264)、CH1A1E(SEQIDNO:265)、CH1A1F(SEQIDNO:266)、和CH1A1G(SEQIDNO:267)。这些本质上是CH1A1的变体,只有FR1和FR3区中的少数回复突变。图20和21显示了它们的亲和力都是相当的,虽然仍然略微劣于基于VH7的人源化构建体CH7A。图20显示了关于基于CH1A1的框架变体对包含CEA抗原的嵌合蛋白NABA的结合获得的Proteon(Biacore)传感图。在中性亲合素包被的芯片上固定化生物素化NABA,并以100、50、25、12.5、6.25、和0nM的浓度使用抗体作为分析物。包括前体克隆CH1A1和亲本抗体CH7A进行直接比较。轻链2F1对于测试的所有抗体是相同的。图21显示了七种携带额外框架突变的基于CH1A1的变体的结合强度。以一系列浓度将抗体与表达CEA的MKN45细胞一起温育,并通过FACS分析测量结合强度。包括前体克隆CH1A1进行直接比较。在这种测定法中测试的所有抗体具有2F1作为轻链。根据它们比较更好的纯化产率和单体性能,选择变体CH1A1A和CH1A1B作为基于VH1的人源化的最终变体。
实施例4
将在亲和力成熟过程中选择的CDR-H3残基个别引入PR1A3序列以测试升高的抗体稳定性。图36。
图22显示了亲和力(以二价形式测量)的表面等离振子共振(SPR)测量of每种抗体对CEA抗原(NABA试剂,记载于Stewartetal.CancerImmunolImmunother(1999)47:299-306)。图22中显示了关于CDR-H3抗体变体对包含CEA抗原的嵌合蛋白NABA的结合获得的Proteon(Biacore)传感图。在中性亲合素包被的芯片上固定化生物素化NABA,并以100、50、25、12.5、6.25、和0nM的浓度使用抗体作为分析物。包括亲和力成熟前体克隆5HFF12和亲本抗体CH7A进行直接比较。这种测定法中测试的所有抗体具有2F1作为轻链。变体CH7A(W95Y)在这种测定法中没有显示可测量的活性,所有其它变体展现的对靶物的亲和力彼此在10倍以内。每一种的相对亲和力(以二价形式测量)如下:5HFF12>CH7A(Y98A/D99Y)>CH7A(Y98A)>CH7A>CH7A(E102Q)>CH7A(D99Y)>CH7A(D99H)>CH7A(A103T)>CH7A(V101F)>CH7A(W95Y)。
对抗体实施了DLS分析,与它们的前体5HFF12和包含重链CH7A的亲本抗体进行比较。轻链2F1对于在这项实验中测试的所有抗体是相同的。图23和24。这项分析的结果提供了稳定性的如下评级:CH7A(D99Y)>CH7A(Y98A/D99Y)>CH7A(V101F)>CH7A(D99H)>CH7A(A103T)>CH7A(W95Y)>CH7Ax2F1(=PR1A3)>5HFF12。在20mM组氨酸和140mMNaClpH6.0的缓冲液中使用1mg/ml抗体实施了DLS测定法。以25℃开始进行测定法,增量温度升高0.05℃/min,直至70℃。
选择双重突变体(Y98A/D99Y)(SEQIDNO:223)进行进一步稳定性工程改造,因为它展现出高稳定性同时保留对CEA靶的高亲和力。
实施例5
将人源化PR1A3衍生物CH7A的双重突变(Y98A/D99Y)引入基于VH1的人源化的最终变体-构建体CH1A1A,和CH1A1B。
关于组合框架和CDR-H3变体对包含CEA抗原的嵌合蛋白NABA的结合获得Proteon(Biacore)传感图。在中性亲合素包被的芯片上固定化生物素化NABA,并以100、50、25、12.5、6.25、和0nM的浓度使用抗体作为分析物。包括前体克隆5L1A10和亲本抗体CH7A进行直接比较。这种测定法中测试的所有抗体具有2F1作为轻链。图25。
实施例6
CH1A1A和CH1A1B构建体展现出ADCC活性。4小时后通过乳酸脱氢酶释放测量了由CH1A1A和CH1A1B变体、它们的前体变体CH1A1、和亲本CH7A变体介导的ADCC,其中使用MKN45细胞作为靶细胞(T),使用人PBMC作为效应细胞(E),E:T比为25:1。乳酸脱氢酶释放与靶细胞裂解成比例且作为百分比细胞毒性显示。图26。确认了这些变体的ADCC活性,如通过钙黄绿素释放测量的,其中使用MKN45细胞作为靶细胞(T),使用人PBMC作为效应细胞(E),E:T比为25:1。钙黄绿素释放与靶细胞裂解成比例且作为百分比细胞毒性以均值±标准偏差值显示。图27。
对含有亲和力成熟CDRH3及双重突变Y98A/D99Y的CH1A1A和CH1A1B构建体也观察到ADCC活性。24小时后通过乳酸脱氢酶释放测量了由组合框架和CDR-H3变体和包含CH7A的亲本抗体介导的ADCC,其中使用MKN45细胞(图28)或LS174T(图29)作为靶细胞,使用人PBMC作为效应细胞,E:T比为5:1。虽然MKN45细胞以高水平表达CEA,但是LS174T细胞中的CEA表达是中等的。乳酸脱氢酶释放与靶细胞裂解成比例且作为百分比细胞毒性显示。在这些ADCC测定法中测试的所有抗体具有2F1作为轻链。
图38显示了各种稳定性成熟抗CEA抗体的VH区的氨基酸序列比对。
实施例7
在人CD16转基因的SCID小鼠中的结肠直肠癌异种移植物模型中对包含CH1A1A(98/99)重链和2F1轻链的糖工程型式的抗CEA抗体测试功效。下文列出了模型测定条件。测定结果指示与媒介对照相比,这种抗CEA抗体提供存活好处。图30。
动物:依照指定的指南(GV-Solas;Felasa;TierschG)在无特定病原体的条件下以12小时光照/12小时黑暗的每日周期维持35只在实验开始时7-9周龄的CD16scid转基因雌性小鼠(CharlesRiverFrance)。实验性研究方案得到地方政府机构的审查和批准。到达后,动物维持一周进行适应和观察。以规则基础进行连续健康监测。
细胞培养和应用:在含有10%FCS(PAALaboratories,Austria)的DMEM培养基中培养LS174T细胞(人结肠癌细胞;欧洲细胞培养物保藏中心)。于37℃在5%CO2的水饱和气氛中培养细胞。使用体外24代进行脾内注射,存活率97%。
肿瘤细胞注射:在注射那天,使用胰蛋白酶-EDTA(Gibco,Switzerland)自培养瓶(GreinerBio-One)收获LS174T肿瘤细胞并转移入50ml培养基,清洗一次并在AIMV(Gibco,Switzerland)中重悬浮。在麻醉的SCID/米色小鼠的左腹部位做一小切口。打开皮肤和肌肉并在脾尖中注射30微升(AimV培养基中的3x106个LS174T细胞)细胞悬浮液。用可吸收缝合线(3-0,Braun)先缝合肌肉后缝合腹部皮肤。
处理:每周一次i.v.施用所有抗CEA抗体和相应媒介。总共三次给药。每只小鼠每次注射施用625ug抗体。使用前自储液新鲜制备抗体稀释液并在20mM组氨酸、140mMNaClpH6.0中以4.38mg/ml抗体浓度配制。
实施例8
在人CD16转基因的scid小鼠中的A549肺癌异种移植物模型中对包含CH1A1A(Y98A/D99Y)重链和2F1轻链的糖工程型式的抗CEA抗体测试功效。下文列出了模型测定条件。测定结果指示与媒介对照相比,这种抗CEA抗体提供剂量依赖性存活好处。图31。
动物:依照指定的指南(GV-Solas;Felasa;TierschG)在无特定病原体的条件下以12小时光照/12小时黑暗的每日周期维持35只在实验开始时7-9周龄的CD16scid转基因雌性小鼠(CharlesRiverFrance)。实验性研究方案得到地方政府机构的审查和批准。到达后,动物维持一周进行适应和观察。以规则基础进行连续健康监测。
细胞培养和应用:在含有10%FCS(PAALaboratories,Austria)的DMEM培养基中培养A549细胞(人NSCLC细胞;美国组织培养物保藏中心)。于37℃在5%CO2的水饱和气氛中培养细胞。
处理:在研究第0天给小鼠i.v.注射1x106个A549细胞。抗体始于研究第7天且继以另2次每周一次注射。
处理组:
小鼠-35只SCID-CD16Tg小鼠,N=7只每组。
细胞-A549细胞,5Mio/小鼠
化合物和疗法进度表
媒介3q7d
CH1A1A(Y98A/D99Y)x2F1(500ug)3q7d(25mg/kg)
CH1A1A(Y98A/D99Y)x2F1(200ug)3q7d(10mg/kg)
CH1A1A(Y98A/D99Y)x2F1(100ug)3q7d(5mg/kg)
CH1A1A(Y98A/D99Y)x2F1(50ug)3q7d(1mg/kg)
虽然出于清楚理解的目的,前述发明已经作为例示和例子相当详细地进行了描述,但是说明书和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过提及而明确将本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容完整收录。
Claims (20)
1.一种结合膜结合CEA的分离的抗体,其中该抗体包含重链可变区和轻链可变区,该重链可变区包含:
SEQIDNO:1所示的重链CDR1,
SEQIDNO:13所示的重链CDR2,和
SEQIDNO:223所示的重链CDR3;且
该轻链可变区包含:
SEQIDNO:39所示的轻链CDR1,
SEQIDNO:49所示的轻链CDR2,和
SEQIDNO:56所示的轻链CDR3。
2.权利要求1的抗体,其中该抗体包含SEQIDNO:261或SEQIDNO:262的框架残基。
3.权利要求1或2的抗体,其中该重链可变区包含与选自SEQIDNO:239和SEQIDNO:247的序列至少95%相同的氨基酸序列且其中该轻链可变区包含与SEQIDNO:209的序列至少95%相同的氨基酸序列。
4.权利要求1-3任一项的抗体,其中该抗体与鼠单克隆抗体PR1A3结合相同表位或能够与鼠单克隆抗体PR1A3竞争结合。
5.权利要求1-4任一项的抗体,其中该抗体以100nM、10nM、1nM或更低的Kd结合膜结合CEA。
6.一种结合膜结合人癌胚抗原(CEA)的抗体,其中重链可变区由选自SEQIDNO:239和SEQIDNO:247的氨基酸序列组成且其中轻链可变区由SEQIDNO:209的氨基酸序列组成。
7.权利要求1-6任一项的抗体,其中该抗体包含经糖工程化改造的Fc区。
8.权利要求7的抗体,其中该Fc区中至少20%至100%的N连接寡糖是非岩藻糖基化的。
9.权利要求7的抗体,其中该Fc区中至少20%至100%的N连接寡糖是两分型的。
10.权利要求7的抗体,其中该Fc区中至少20%至50%的N连接寡糖是两分型的、未岩藻糖基化的。
11.权利要求7-10任一项的抗体,其中该抗体具有升高的抗体介导的细胞的细胞毒性(ADCC)。
12.一种分离的多核苷酸,其编码权利要求1-11任一项的抗体。
13.一种载体,其包含权利要求12的多核苷酸。
14.一种宿主细胞,其包含权利要求13的载体。
15.一种组合物,其包含权利要求1-11任一项的抗体和药学可接受载体。
16.权利要求1-11任一项的抗体或权利要求15的组合物在制备用于诱导选自结肠直肠癌细胞、非小细胞肺癌(NSCLC)细胞和胃癌细胞的肿瘤细胞的细胞裂解的药物中的用途。
17.权利要求16的用途,其中通过抗体或组合物的抗体依赖性细胞的细胞毒性诱导细胞裂解。
18.权利要求1-11任一项的抗体或者权利要求15的组合物在制备用于治疗具有选自结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和胃癌的癌症的受试者的药物中的用途。
19.权利要求1-11任一项的抗体或权利要求15的组合物在制备用于延长具有选自结肠直肠癌、非小细胞肺癌(NSCLC)和胃癌的癌症的受试者的存活时间的药物中的用途。
20.权利要求16-19任一项的用途,其中该抗体或组合物与化疗或放疗组合施用。
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