JP2014161283A - Ｃｅａｃａｍ５遺伝子のスプライシングバリアント - Google Patents
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Abstract
【課題】ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントや、かかるスプライシングバリアントがコードするタンパク質や、かかるタンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。
【解決手段】特定の塩基配列からなるＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアント、又は特定のアミノ酸配列からなるＣＥＡＣＡＭ５タンパク質。特定の塩基配列からなるＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とするがんの有無の判定用キット、特定のアミノ酸配列からなるタンパク質に特異的に結合する抗体、又はその標識物を備えることを特徴とするがんの有無の判定用キット。
【選択図】なし
【解決手段】特定の塩基配列からなるＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアント、又は特定のアミノ酸配列からなるＣＥＡＣＡＭ５タンパク質。特定の塩基配列からなるＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とするがんの有無の判定用キット、特定のアミノ酸配列からなるタンパク質に特異的に結合する抗体、又はその標識物を備えることを特徴とするがんの有無の判定用キット。
【選択図】なし
Description
本発明は、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントや該スプライシングバリアントがコードするタンパク質の発現量を検出することによりがんの有無を判定する方法や、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントや該スプライシングバリアントがコードするタンパク質を特異的に検出できるがんの有無の判定用キットなどに関する。
がん胎児性抗原（carcinoembryonic antigen、ＣＥＡ、ＣＤ６６ｅ、ＣＥＡＣＡＭ５［carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5］）（以下、「ＣＥＡＣＡＭ５」という）は、がん細胞から産生される胎児性抗原の一つであり、分子量２０万前後の糖タンパク質であることが知られている。ＣＥＡＣＡＭ５は、がんに罹患していない血中には検出されないが、大腸がん、肺がん、胃がん、乳がん、肝がん、甲状腺髄様がんなど臓器がんに罹患すると、がん細胞中や血中におけるＣＥＡＣＡＭ５濃度が上昇することが知られている。そのため、ＣＥＡＣＡＭ５は、がんの有無を検出するため、また術後の再発予防のための腫瘍マーカーとして、広く用いられている（特許文献１、非特許文献１）。
現在までにＣＥＡＣＡＭ５に加えて、ＣＥＡＣＡＭ５と配列・構造上の相同性が高い約２０種類のＣＥＡ関連分子も知られているものの、腫瘍マーカーとして用いられているものはＣＥＡＣＡＭ５のみである。また、そのＣＥＡＣＡＭ５でさえ、がんの臓器特異性が低いうえに一部の正常組織でも検出されるため、がんに対する特異度や個々のがんに対する特異度の面から腫瘍マーカーとしては不十分であると考えられていた。
ＣＥＡＣＡＭ５には、スプライシングバリアントが存在することが示唆されている。すなわち、定量ＰＣＲ（quantitative real-time PCR）法を用いた解析によりヒト結腸がん由来のＬＳ１４７Ｔ細胞株においてＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントが検出されたことが報告されている（非特許文献２）。しかし、非特許文献３でも指摘されているように（９頁、左欄の上から４〜１３行目）、かかるスプライシングバリアントは、ＰＣＲによるアーティファクトである可能性が高いと考えられる。また、非特許文献３においてもがん細胞中でＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントが存在することが示されているものの、かかるスプライシングバリアントはスプライス部位（ＧＴ-ＡＧ）に基づいて生成されたものではなく、このため上記スプライシングバリアントが存在するかどうか疑念が残る。
このように、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントががん細胞中で産生されるかについては不明な点が多い。また、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントがコードするタンパク質を検出・同定したことは、これまでのところ報告されていない。
このように、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントががん細胞中で産生されるかについては不明な点が多い。また、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントがコードするタンパク質を検出・同定したことは、これまでのところ報告されていない。
Tsujimoto M., et al. Clinical Cancer Research 13 : 4807-4816 (2007)
Hampton R., et al. Oncogene 21: 7817-7823 (2002)
Peng L., et al. PLoS One. 7: e36412 (2012)
本発明の課題は、膵臓がん、胃がん、大腸がんなどのがんを特異的に検出することができる、がんの有無を判定する方法やがんの有無の判定用キットを提供することにある。
本発明者らは、ＣＥＡＣＡＭ４（carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 4）遺伝子のスプライシングバリアントが甲状腺髄様がんで発現することを見いだしている（特願２０１２−１１３７３２）。本発明者らは、上記課題を解決するため、ＣＥＡＣＡＭ５の分子型（バリアント、糖鎖修飾）に着目して検討したところ、試行錯誤の末、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子の２種類のスプライシングバリアント（図２中の「バリアント５Ｄ及び３Ｄ」参照）ががん細胞（膵臓がん、胃がん、大腸がん）で特異的に発現することを見いだした。さらに、かかる２種類のスプライシングバリアントがコードするタンパク質が上記がん細胞で発現することが確認された。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
すなわち、本発明は、（１）判定用試料中の、配列番号１又は３に示される塩基配列からなるＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアント（以下、「本件スプライシングバリアント」ということがある）の発現、又は該スプライシングバリアントがコードする、配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（「本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質」ということがある）の発現を検出する工程（ａ）；及び工程（ａ）で本件スプライシングバリアントの発現、又は本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質の発現が検出された場合、判定用試料提供者ががんである可能性が高いと評価する工程（ｂ）；を備えたことを特徴とするがんの有無を判定する方法（以下、「本件方法」ということがある）や、（２）がんが、膵臓がん、胃がん、又は大腸がんであることを特徴とする上記（１）に記載の方法に関する。
上記本件方法は、医師によるがんの診断を補助する方法であって、医師による診断行為を含まない。また上記本件方法のその他の態様としては、がんを診断するためのデータを収集する方法を挙げることができる。
また本発明は、（３）本件スプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とするがんの有無の判定用キットや、（４）がんが、膵臓がん、胃がん、又は大腸がんであることを特徴とする上記（３）に記載のキットに関する。このキット発明は、がんの有無を判定するためのキットに関する用途発明であり、このキットには、通常、がんを判定するための説明書が含まれる。
また本発明は、（５）本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、又はその標識物を備えることを特徴とするがんの有無の判定用キットや、（６）がんが、膵臓がん、胃がん、又は大腸がんであることを特徴とする上記（５）に記載のキットに関する。このキット発明は、がんの有無を判定するためのキットに関する用途発明であり、このキットには、通常、がんを判定するための説明書が含まれる。
さらに本発明は、（７）配列番号１又は３に示される塩基配列からなるＤＮＡ（以下、「本件ＤＮＡ」ということがある）や、（８）配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（以下、「本件タンパク質」ということがある）に関する。
本発明によると、本件スプライシングバリアントや本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質を特異的に検出することが可能となり、膵臓がん、胃がん、大腸がんなどのがんの早期発見に必要な定期検診等のがんの検診者の増加が期待される他、早期がんの段階で診断・治療をうける検診者が増えることや、がんによる死亡率を下げることが期待される。
本件方法としては、例えば被験者（提供者）から採取された判定用試料中の、本件スプライシングバリアントの発現、又は本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質の発現を検出する工程（ａ）；及び工程（ａ）で本件スプライシングバリアントの発現、又は本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質の発現が検出された場合、判定用試料提供者（被験者）ががんである可能性が高いと評価する工程（ｂ）；を順次備えた方法（但し、医師による診断行為を除く。）であれば特に制限されず、また、本発明のがんの有無の判定用キットとしては、本件スプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えるキット（以下、「本件キット１」ということがある）や、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、又はその標識物を備えるキット（以下、「本件キット２」ということがある）であれば特に制限されず、ここで、本件キット１や本件キット２は、がんの有無の判定用キットとしての用途に限定されるものである。そして、これらキットには、一般にこの種の診断キットに用いられる成分、例えば担体、ｐＨ緩衝剤、安定剤の他、取扱説明書等の添付文書が通常含まれる。
上記判定の対象となるがんとしては、膵臓がん、腎がん、胃がん、前立腺がん、大腸がん（盲腸がん、結腸がん、直腸がん）、子宮がん、卵巣がん、子宮内膜がん、食道がん、甲状腺がん、肺がん、乳がんなどを挙げることができ、これらの中でも膵臓がん、胃がん、及び大腸がんが好ましい。
本件方法における判定用試料としては、組織、細胞等の非液性試料や、血液、唾液等の液性試料を例示することができる。非液性試料は、判定用試料提供者より採取された後に、凍結処理が施された凍結組織であっても、病理組織学的処理が施された病理組織であってもよく、かかる病理組織としては、ホルマリン固定組織や、ホルマリン固定パラフィン包埋組織等を例示することができる。
本件方法において、本件スプライシングバリアント（ｍＲＮＡ又はその逆転写物［ｃＤＮＡ］）の発現を検出する方法としては、本件スプライシングバリアントを特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、判定用試料中の細胞における全ＲＮＡを抽出・精製し、本件スプライシングバリアント（ｍＲＮＡ）に相補的な塩基配列からなるプローブを用いたノーザンブロッティング法で検出する方法や、判定用試料中の細胞における全ＲＮＡを抽出・精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、本件スプライシングバリアント（ｍＲＮＡ）のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマー対を用いた、競合的ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法等の定量ＰＣＲ法で検出する方法や、判定用試料中の細胞における全ＲＮＡを精製し、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成した後、ビオチン（biotin）やジゴキシゲニン（digoxigenin）などでｃＤＮＡをラベルし、蛍光物質が標識されたビオチンに対する親和性の高いアビジン（avidin）やジゴキシゲニンを認識する抗体などで間接的にｃＤＮＡを標識した後、ガラス、シリコン、プラスチックなどのハイブリダイゼーションに使用可能な支持体上に固定化された、本件スプライシングバリアント（ｃＤＮＡ）に相補的な塩基配列からなるプローブを用いたマイクロアレイで検出する方法等を挙げることができる。
本件方法において、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質を検出する方法としては、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質を特異的に検出できる方法であればどのような方法であってもよく、具体的には、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質を構成するポリペプチドを検出する質量分析法や、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質を特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法を挙げることができ、免疫学的測定法としては、免疫組織化学染色法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロッティング法等を好適に例示することができる。
本件キット１におけるプライマー対としては、本件スプライシングバリアント（ｃＤＮＡ）の上流及び下流の配列の一部とアニーリングしうる相補的なプライマー対であり、且つ本件スプライシングバリアントを特異的に検出できるものであれば、プライマー配列の長さ、かかるｃＤＮＡとアニーリングする部位、増幅するｃＤＮＡの長さ等は、ＤＮＡの増幅効率を考慮して適宜選択することができ、ここで特異的に検出するとは、本件スプライシングバリアント以外のｃＤＮＡをほとんど又は全く検出せずに、本件スプライシングバリアントを検出することを意味し、本件スプライシングバリアント以外のｃＤＮＡには、ＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）のデータベースに登録されているＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のｃＤＮＡ（NCBI Reference Sequence:NM_004363）、すなわち配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡ（以下、「既知のＣＥＡＣＡＭ５遺伝子」という）が含まれる。
本件キット１におけるプライマー対のうち、配列番号１に示される塩基配列からなるＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマー対としては、配列番号１に示される塩基配列の４２４番目のシトシン及び４２５番目のシトシンを含む領域を増幅するプライマー対が好ましく、増幅するＤＮＡの長さ（塩基対）としては、増幅効率や特異性を考慮すると、通常３００塩基対以下であり、２００塩基対以下が好ましく、１８０塩基対以下がより好ましく、１６０塩基対以下がさらに好ましい。また、プライマーの長さ（塩基）としては、通常少なくとも１５塩基であり、少なくとも１８塩基が好ましく、少なくとも１９塩基がより好ましく、少なくとも２０塩基がさらに好ましい。本件キット１におけるプライマー対としては、具体的に、配列番号１７に示される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号１８に示される塩基配列からなるＤＮＡとからなるプライマー対を挙げることができる。
また、本件キット１におけるプライマー対のうち、配列番号３に示される塩基配列からなるＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマー対としては、配列番号３に示される塩基配列の５６９番目のグアニン及び５７０番目のグアニンを含む領域を増幅するプライマー対が好ましく、増幅するＤＮＡの長さ（塩基対）としては、増幅効率や特異性を考慮すると、通常３００塩基対以下であり、２００塩基対以下が好ましく、１８０塩基対以下がより好ましく、１６０塩基対以下がさらに好ましい。また、プライマーの長さ（塩基）としては、通常少なくとも１５塩基であり、少なくとも１８塩基が好ましく、少なくとも１９塩基がより好ましく、少なくとも２０塩基がさらに好ましい。本件キット１におけるプライマー対としては、具体的に、配列番号１９に示される塩基配列からなるＤＮＡと配列番号２０に示される塩基配列からなるＤＮＡとからなるプライマー対を挙げることができる。
本件キット１におけるプローブとしては、本件スプライシングバリアント（ｍＲＮＡ又はそのｃＤＮＡ）の一部とハイブリダイゼーションし、且つ本件スプライシングバリアントを特異的に検出できるものであれば、プローブの長さ、かかるスプライシングバリアントとハイブリダイズする部位等は、ハイブリダイゼーションの効率を考慮して適宜選択することができ、ここで特異的に検出するとは、本件スプライシングバリアント以外のｍＲＮＡ又はそのｃＤＮＡをほとんど又は全く検出せずに、本件スプライシングバリアントを検出することを意味し、本件スプライシングバリアント以外のｍＲＮＡ又はそのｃＤＮＡには、既知のＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のｍＲＮＡ又はそのｃＤＮＡが含まれる。
本件キット１におけるプローブのうち、配列番号１に示される塩基配列からなるＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントの発現を検出するためのプローブとしては、配列番号１に示される塩基配列の４２４番目のシトシン及び４２５番目のシトシンを含む領域にハイブリダイゼーションするプローブが好ましく、ハイブリダイゼーションするプローブの長さ（塩基）としては、ハイブリダイゼーションの効率や特異性を考慮すると、通常３００塩基以下であり、２００塩基以下が好ましく、１５０塩基以下がより好ましく、１００塩基以下がさらに好ましい。
また、本件キット１におけるプローブのうち、配列番号３に示される塩基配列からなるＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントの発現を検出するためのプローブとしては、配列番号３に示される塩基配列の５６９番目のグアニン及び５７０番目のグアニンを含む領域にハイブリダイゼーションするプローブが好ましく、ハイブリダイゼーションするプローブの長さ（塩基）としては、ハイブリダイゼーションの効率や特異性を考慮すると、通常３００塩基対以下であり、２００塩基対以下が好ましく、１５０塩基対以下がより好ましく、１００塩基対以下がさらに好ましい。
本件キット２における抗体としては、本件タンパク質に特異的に結合するものであれば特に制限されず、ここで、「本件タンパク質に特異的に結合する」とは、本発明の抗体又はその標識物の本件タンパク質に対する親和性が、本件タンパク質以外のタンパク質に対する親和性と比較して高いことを意味する。上記「高い親和性」とは、通常、結合定数（Ｋａ）が少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは、少なくとも１０９Ｍ−１、さらに好ましくは、少なくとも１０１０Ｍ−１である結合親和性を意味する。上記本件タンパク質以外のタンパク質には、ＥＢＩ（http://www.ebi.ac.uk/IPI/IPIhelp.html）のデータベースに登録されているＣＥＡＭ５＿ＨＵＭＡＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ０６７３１）、すなわち配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（以下、「既知のＣＥＡＣＡＭ５タンパク質」という）が含まれる。
本件キット２における抗体のうち、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質に特異的に結合する抗体としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の構造（一次構造、二次構造、三次構造）を特異的に結合できるものであれば特に制限されず、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の一次構造を特異的に結合する抗体としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列の１４１〜１４４番目のアミノ酸（ＹＰＥＰ）を含むものをエピトープとするものが好ましい。エピトープの長さとしては、５〜４０アミノ残基数が好ましく、１０〜３０アミノ酸残基数がより好ましく、１３〜１７アミノ酸残基数がさらに好ましい。
また、本件キット２における抗体のうち、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質に特異的に結合する抗体としては、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の構造（一次構造、二次構造、三次構造）を特異的に結合できるものであれば特に制限されず、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の一次構造を特異的に結合する抗体としては、配列番号４に示されるアミノ酸配列の２０９番目のアスパラギン酸及び２１０番目のアラニンを含み、且つ少なくとも既知のＣＥＡＣＡＭ５や配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を構成するペプチドとアミノ酸配列が同一ではない領域をエピトープとするものが好ましい。エピトープの長さとしては、５〜４０アミノ残基数が好ましく、１０〜３０アミノ酸残基数がより好ましく、１３〜１７アミノ酸残基数がさらに好ましい。
本件キット２における抗体又はその標識物を用いて免疫学的測定法により解析すると、既知のＣＥＡＣＡＭ５タンパク質をほとんど又は全く検出することなく、本件スプライシングバリアントをコードするタンパク質を特異的に検出することができる。上記免疫学的測定法としては、免疫組織化学染色法、ＥＬＩＳＡ法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、ウェスタンブロッティング法等を好適に例示することができる。
本件キット２における抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの抗体であってもよく、また、この中には、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｓｃ（Ｆｖ）２などの抗体の一部からなる抗体断片も含まれる。
本件キット１のプライマー対又はプローブの標識物における標識物質や、本件キット２の抗体の標識物における標識物質としては、例えば、ペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）、アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコ−ス−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、アルコール脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ペニシリナーゼ、カタラーゼ、アポグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ルシフェラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ等の酵素、フルオレスセインイソチオシアネート、フィコビリタンパク、希土類金属キレート、ダンシルクロライド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート等の蛍光物質、緑色蛍光タンパク質（Green Fluorescence Protein；ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（Cyan Fluorescence Protein；ＣＦＰ）、青色蛍光タンパク質（Blue Fluorescence Protein；ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（Yellow Fluorescence Protein；ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（Red Fluorescence Protein；ＲＦＰ）、ルシフェラーゼ（luciferase）等の蛍光タンパク質、３Ｈ 、１４Ｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ等の放射性同位体、ビオチン、アビジンなどを挙げることができる。
本件キット２における抗体（以下、「本件抗体」ということがある）は、慣用のプロトコールを用いて、本件タンパク質を構成するポリペプチドをマウス、ラット等のヒト以外の動物へ投与し、本件抗体を産生する細胞クローンを細胞融合技術によりスクリーニングすることにより、本件抗体を得ることができる。ここで本件タンパク質を構成するポリペプチドとしては、本件タンパク質に特異的なポリペプチドであれば特に制限されないが、上述のエピトープが好ましい。上記スクリーニングする方法としては、例えば本件抗体を用いた上述の免疫学的測定法により、既知のＣＥＡＣＡＭ５タンパク質等の本件タンパク質以外のものはほとんど検出されずに、本件タンパク質を特異的に検出することを確認する方法を挙げることができる。
本件抗体は、本件抗体を産生する細胞クローンを基に本件抗体をコードする遺伝子配列を同定し、遺伝子組換え技術により、本件抗体遺伝子を発現させることにより、組換え抗体として作製することもできる。組換え抗体を作製する方法としては、例えば本件抗体遺伝子を発現ベクターに組み込み、かかる発現ベクターをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳類細胞株や、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞などの宿主細胞へ導入して、宿主細胞において組換え抗体を生産させる方法を挙げることができる（P.J.Delves., ANTIBODY PRODUCTION ESSENTIAL TECHNIQUES., 1997 WILEY、P.Shepherd and C.Dean., Monoclonal Antibodies., 2000 OXFORD UNIVERSITY PRESS, J.W.Goding., Monoclonal Antibodies:principles and practice., 1993 ACADEMIC PRESS）。特に、キメラ抗体は、特開２００５−２４５３３７に記載の技術に基づいて作製することができる。発現ベクターに組み込む抗体遺伝子の塩基配列は、発現させる宿主細胞に合わせてコドン配列の最適化がされていてもよい。
また、トランスジェニック動物作製技術を用いて本件抗体遺伝子が組み込まれたマウス、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、ブタ等のトランスジェニック動物を作製し、かかるトランスジェニック動物の血液、ミルク中などから本件抗体遺伝子に由来する抗体を大量に産生させることもできる。
形質転換細胞、トランスジェニック動物、ハイブリドーマ等により産生された本件抗体は、例えばＰｒｏｔｅｉｎＡ、ＰｒｏｔｅｉｎＧカラムによるクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、硫安塩析法、ゲル濾過、アフィニティクロマトグラフィー等を用いて精製することができる。
本件ＤＮＡは、本件スプライシングバリアントのｍＲＮＡ又はそのｃＤＮＡの発現を検出するためのプライマー対やプローブの設計に有用である。また本件タンパク質は、本件スプライシングバリアントがコードするタンパク質に特異的に結合する抗体、又はその標識物の作製に有用である。
本件ＤＮＡは、分子生物学的手法を用いて作製することができる。分子生物学的手法としては、例えば、まず、ＨＰＡＣ細胞株などの膵臓がん由来の細胞株や、ＫＡＴＯIII細胞株などの胃がん由来の細胞株や、ＨＣＡ２細胞株などの大腸がん由来の細胞株等のがん細胞株から、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリーマニュアル（Molecular cloning,A laboratorymanual）などに記載の方法や、RNeasy(R) Plus Mini Kit（QIAGEN社製）などの市販のキットを用いて、本件スプライシングバリアント（ｍＲＮＡ）を含む全ＲＮＡを単離する。次に、単離した全ｍＲＮＡを鋳型として、モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリーマニュアルに記載の方法や、PrimeScript(R) II 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa社製）などの市販のキットを用いてｃＤＮＡを合成し、本件ＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いたＰＣＲを行うことにより、本件ＤＮＡを増幅することができる。ここで本件ＤＮＡを増幅する方法としては、既知のＣＥＡＣＡＭ５遺伝子の全長を増幅できるプライマー対を用いて増幅する方法であっても、本件ＤＮＡを少なくとも２以上のパーツに分けて増幅できるプライマー対を用いて各パーツを増幅した後、各パーツを鋳型として本件ＤＮＡの全長を増幅できるプライマー対を用いて増幅する方法であってもよい。
本件タンパク質は、遺伝子組換え技術により、本件ＤＮＡを発現させることにより、組換えタンパク質として作製することができる。組換えタンパク質を作製する方法としては、例えば本件ＤＮＡ遺伝子を発現ベクターに組み込み、かかる発現ベクターをチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞等の哺乳類細胞株や、大腸菌、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞などの宿主細胞へ導入して、宿主細胞において組換え抗体を生産させる方法を挙げることができる。発現ベクターには、組換えタンパク質精製のために、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列が付加されていてもよい。得られたタンパク質は、タグ配列を利用した精製法等の公知の条件・方法によって精製することができる。精製したタンパク質は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法、ＢＣＡ法などのタンパク質定量法で正確な量（濃度）を算出することができる。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
１．ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のｍＲＮＡの発現解析
がん特異的なＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントが存在するかどうかを検証するために、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のｍＲＮＡを検出するプライマーを用いたＰＣＲ法により、３種類の膵臓がん細胞株（ＨＰＡＣ、ＨＰＡＦII、ＱＧＰ１）、３種類の胃がん細胞株（ＭＫＮ４５、ＫＡＴＯIII、ＳＮＵ1）、３種類の大腸がん細胞株（ＬｏＶｏ、ＨＣＡ２、ＨＣＡ４６）の計９種類のがん細胞株におけるＣＥＡＣＡＭ５遺伝子の発現解析を行った。なお、コントロールとして正常組織（膵臓、胃、大腸）由来の全ＲＮＡ（Clontech社製）を用いた。
がん特異的なＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントが存在するかどうかを検証するために、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のｍＲＮＡを検出するプライマーを用いたＰＣＲ法により、３種類の膵臓がん細胞株（ＨＰＡＣ、ＨＰＡＦII、ＱＧＰ１）、３種類の胃がん細胞株（ＭＫＮ４５、ＫＡＴＯIII、ＳＮＵ1）、３種類の大腸がん細胞株（ＬｏＶｏ、ＨＣＡ２、ＨＣＡ４６）の計９種類のがん細胞株におけるＣＥＡＣＡＭ５遺伝子の発現解析を行った。なお、コントロールとして正常組織（膵臓、胃、大腸）由来の全ＲＮＡ（Clontech社製）を用いた。
１−１ 方法
〔１〕インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で（１０％ＦＢＳ、０．３ｍｇ／ｍｌグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）／ＲＰＭＩ１６４０（Sigma-Aldrich社製）存在下に培養した上記９種類のがん細胞株から、キット（RNeasy(R) Plus Mini Kit、QIAGEN社製）を用いて全ＲＮＡを単離した。
〔２〕単離した全ＲＮＡ４０μｇに、Promega社製ＤＮａｓｅ処理溶液（RQ1 DNase 10x Reaction Buffer；１０μｌ、RNasinR Plus RNase Inhibitor１μｌ、RQ1 RNase - Free Dnase１０μｌ）を加え、RNase(R) Free Waterで最終体積を１０１μｌに調整した後、３７℃で３０分間、ＤＮａｓｅ処理を行った。
〔３〕ＤＮａｓｅ処理後のサンプルから、キット（RNeasy MinElute Cleanup Kit、QIAGEN社製）を用いて全ＲＮＡを精製した。
〔４〕精製した全ＲＮＡ２μｇを用いて、キット（PrimeScript(R) II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、TaKaRa社製）によりｃＤＮＡを合成した。
〔５〕合成したｃＤＮＡを用いて、キット（QIAquick PCR Purification Kit、QIAGEN社製）によりｃＤＮＡを精製した。
〔６〕精製したｃＤＮＡ２０ｎｇに、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のエキソン２〜９を含む領域を増幅するプライマー対（配列番号７及び８に示される塩基配列からなるＤＮＡ）１０μＭをそれぞれ１μｌずつ、及びTaKaRa社製ＰＣＲ反応溶液（10x LA PCR(R) Buffer II（Mg2+free）；５μｌ、２５ｍＭＭｇＣｌ２；４μｌ、２．５ｍＭdNTP Mixture for PCR；８μｌ、TaKaRa LA TaqTM；０．５μｌ）を加え、RNase(R) Free Waterで最終体積を５０μｌに調整した後、以下の１）〜６）に示したＰＣＲ反応条件でサーマルサイクラー（TGRADIENT、Biometra社製）を用いてＰＣＲを行うことにより、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを増幅した後、ＰＣＲ産物をSYBRR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen社製)による染色とアガロースゲル電気泳動で検出した（図１）。なお、内部標準としてβアクチン遺伝子を増幅するプライマー対（配列番号９及び１０に示される塩基配列からなるＤＮＡ）を用いた。また、生成したＰＣＲ産物は４℃で保存した。
＜ＰＣＲ反応条件＞
１）９５℃、２分を１サイクル（ＤＮＡ二本鎖の熱変性）
２）９５℃、３０秒を１サイクル（ＤＮＡ二本鎖の熱変性）
３）５１℃、３０秒を１サイクル（プライマーのｃＤＮＡへのアニーリング）
４）６８℃、１５秒を１サイクル（プライマー対によるｃＤＮＡの増幅）
５）２）〜４）のサイクルをさらに３４回繰り返す。
６）６８℃、７分を１サイクル（プライマー対によるｃＤＮＡの増幅）
〔１〕インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で（１０％ＦＢＳ、０．３ｍｇ／ｍｌグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）／ＲＰＭＩ１６４０（Sigma-Aldrich社製）存在下に培養した上記９種類のがん細胞株から、キット（RNeasy(R) Plus Mini Kit、QIAGEN社製）を用いて全ＲＮＡを単離した。
〔２〕単離した全ＲＮＡ４０μｇに、Promega社製ＤＮａｓｅ処理溶液（RQ1 DNase 10x Reaction Buffer；１０μｌ、RNasinR Plus RNase Inhibitor１μｌ、RQ1 RNase - Free Dnase１０μｌ）を加え、RNase(R) Free Waterで最終体積を１０１μｌに調整した後、３７℃で３０分間、ＤＮａｓｅ処理を行った。
〔３〕ＤＮａｓｅ処理後のサンプルから、キット（RNeasy MinElute Cleanup Kit、QIAGEN社製）を用いて全ＲＮＡを精製した。
〔４〕精製した全ＲＮＡ２μｇを用いて、キット（PrimeScript(R) II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、TaKaRa社製）によりｃＤＮＡを合成した。
〔５〕合成したｃＤＮＡを用いて、キット（QIAquick PCR Purification Kit、QIAGEN社製）によりｃＤＮＡを精製した。
〔６〕精製したｃＤＮＡ２０ｎｇに、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のエキソン２〜９を含む領域を増幅するプライマー対（配列番号７及び８に示される塩基配列からなるＤＮＡ）１０μＭをそれぞれ１μｌずつ、及びTaKaRa社製ＰＣＲ反応溶液（10x LA PCR(R) Buffer II（Mg2+free）；５μｌ、２５ｍＭＭｇＣｌ２；４μｌ、２．５ｍＭdNTP Mixture for PCR；８μｌ、TaKaRa LA TaqTM；０．５μｌ）を加え、RNase(R) Free Waterで最終体積を５０μｌに調整した後、以下の１）〜６）に示したＰＣＲ反応条件でサーマルサイクラー（TGRADIENT、Biometra社製）を用いてＰＣＲを行うことにより、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを増幅した後、ＰＣＲ産物をSYBRR Safe DNA Gel Stain (Invitrogen社製)による染色とアガロースゲル電気泳動で検出した（図１）。なお、内部標準としてβアクチン遺伝子を増幅するプライマー対（配列番号９及び１０に示される塩基配列からなるＤＮＡ）を用いた。また、生成したＰＣＲ産物は４℃で保存した。
＜ＰＣＲ反応条件＞
１）９５℃、２分を１サイクル（ＤＮＡ二本鎖の熱変性）
２）９５℃、３０秒を１サイクル（ＤＮＡ二本鎖の熱変性）
３）５１℃、３０秒を１サイクル（プライマーのｃＤＮＡへのアニーリング）
４）６８℃、１５秒を１サイクル（プライマー対によるｃＤＮＡの増幅）
５）２）〜４）のサイクルをさらに３４回繰り返す。
６）６８℃、７分を１サイクル（プライマー対によるｃＤＮＡの増幅）
１−２ 結果
既知のＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のｍＲＮＡに加えて、２種類のＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアント（以下、塩基配列が長い順に、「バリアント５Ｄ」、「バリアント３Ｄ」ということがある。）が、がん細胞（膵臓がん、胃がん、大腸がん）で検出された（図１）。また、かかるバリアント５Ｄ及び３Ｄは、正常細胞では検出されなかった。 以上の結果は、バリアント５Ｄ及び３Ｄは、がん細胞で特異的に発現することを示している。
既知のＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のｍＲＮＡに加えて、２種類のＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアント（以下、塩基配列が長い順に、「バリアント５Ｄ」、「バリアント３Ｄ」ということがある。）が、がん細胞（膵臓がん、胃がん、大腸がん）で検出された（図１）。また、かかるバリアント５Ｄ及び３Ｄは、正常細胞では検出されなかった。 以上の結果は、バリアント５Ｄ及び３Ｄは、がん細胞で特異的に発現することを示している。
２．ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントの同定
上記実施例１に記載の方法により、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアント（バリアント５Ｄ及び３Ｄ）ががん細胞特異的に発現することがわかったので、それらの塩基配列を同定した。
上記実施例１に記載の方法により、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアント（バリアント５Ｄ及び３Ｄ）ががん細胞特異的に発現することがわかったので、それらの塩基配列を同定した。
２−１ 方法
〔１〕上記実施例１のステップ〔６〕のアガロースゲル電気泳動後に、バリアント５Ｄ及び３Ｄ由来のＰＣＲ産物（バンド）を切り出した。
〔２〕アガロースゲルからＰＣＲ産物の精製は、キット（QIAquick Gel Extraction Kit、QIAGEN社製）を用いて行った。
〔３〕ＰＣＲ産物のクローニングは、キット（TOPO TA Cloning(R) Kit for Sequencing、invitrogen社製）を用いて行った。すなわち、ＰＣＲ産物をTOPO(R) Cloning Reactionを用いてpCRTM2.1-TOPO(R)ベクターへ挿入した後、ＰＣＲ産物を含むベクターをOne Shot(R) TOP10 Competent Cells（コンピテントセル）へ形質転換した。
〔４〕形質転換したコンピテントセルから、キット（QuickLyse Miniprep Kit、QIAGEN社製）を用いてＰＣＲ産物を含むベクターを精製した。
〔５〕ＰＣＲ産物を含むベクターを鋳型としたシーケンス用ＰＣＲは、プライマー（バリアント５Ｄ；配列番号７、８、及び１１〜１４に示される塩基配列からなるＤＮＡ、バリアント３Ｄ；配列番号７、８、１３、及び１４に示される塩基配列からなるＤＮＡ）、キット（BigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit、Applied Biosystems社製）を用いて、以下の１）〜５）に示した条件でサーマルサイクラー（GeneAmpR PCR System 9700、Applied Biosystems社製）により行った。なお、生成したシーケンス用ＰＣＲ産物は４℃で保存した。
＜ＰＣＲ反応条件＞
１）９６℃、１分を１サイクル（ＤＮＡ二本鎖の熱変性）
２）９６℃、１０秒を１サイクル（ＤＮＡ二本鎖の熱変性）
３）５０℃、５秒を１サイクル（プライマーの鋳型ＤＮＡへのアニーリング）
４）６０℃、４分を１サイクル（プライマーからの伸長反応）
５）２）〜４）のサイクルをさらに２４回繰り返す。
〔６〕生成したシーケンス用ＰＣＲ産物を、キット（BigDye(R)XTerminatorTM Purification Kit、Applied Biosystems社製）を用いて精製した後、ＤＮＡシークエンサー（3130xl Genetic Analyzer、Applied Biosystems社製）を用いて塩基配列を決定した。
〔１〕上記実施例１のステップ〔６〕のアガロースゲル電気泳動後に、バリアント５Ｄ及び３Ｄ由来のＰＣＲ産物（バンド）を切り出した。
〔２〕アガロースゲルからＰＣＲ産物の精製は、キット（QIAquick Gel Extraction Kit、QIAGEN社製）を用いて行った。
〔３〕ＰＣＲ産物のクローニングは、キット（TOPO TA Cloning(R) Kit for Sequencing、invitrogen社製）を用いて行った。すなわち、ＰＣＲ産物をTOPO(R) Cloning Reactionを用いてpCRTM2.1-TOPO(R)ベクターへ挿入した後、ＰＣＲ産物を含むベクターをOne Shot(R) TOP10 Competent Cells（コンピテントセル）へ形質転換した。
〔４〕形質転換したコンピテントセルから、キット（QuickLyse Miniprep Kit、QIAGEN社製）を用いてＰＣＲ産物を含むベクターを精製した。
〔５〕ＰＣＲ産物を含むベクターを鋳型としたシーケンス用ＰＣＲは、プライマー（バリアント５Ｄ；配列番号７、８、及び１１〜１４に示される塩基配列からなるＤＮＡ、バリアント３Ｄ；配列番号７、８、１３、及び１４に示される塩基配列からなるＤＮＡ）、キット（BigDye(R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit、Applied Biosystems社製）を用いて、以下の１）〜５）に示した条件でサーマルサイクラー（GeneAmpR PCR System 9700、Applied Biosystems社製）により行った。なお、生成したシーケンス用ＰＣＲ産物は４℃で保存した。
＜ＰＣＲ反応条件＞
１）９６℃、１分を１サイクル（ＤＮＡ二本鎖の熱変性）
２）９６℃、１０秒を１サイクル（ＤＮＡ二本鎖の熱変性）
３）５０℃、５秒を１サイクル（プライマーの鋳型ＤＮＡへのアニーリング）
４）６０℃、４分を１サイクル（プライマーからの伸長反応）
５）２）〜４）のサイクルをさらに２４回繰り返す。
〔６〕生成したシーケンス用ＰＣＲ産物を、キット（BigDye(R)XTerminatorTM Purification Kit、Applied Biosystems社製）を用いて精製した後、ＤＮＡシークエンサー（3130xl Genetic Analyzer、Applied Biosystems社製）を用いて塩基配列を決定した。
２−２ 結果
バリアント５Ｄ及び３Ｄ由来のＰＣＲ産物は、それぞれ配列番号１５及び１６に示される塩基配列からなるＤＮＡであることが明らかとなった。かかる塩基配列情報を基に、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のエキソン２〜９の領域を詳細に調べたところ、バリアント５Ｄは、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のエキソン３及び４が欠損したものであること、また、バリアント３Ｄは、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のエキソン３の一部（エキソン３の１４６〜２７９番目の塩基）、エキソン４〜６、及びエキソン７の一部（エキソン７の１〜１４５番目の塩基）が欠損したものであることが確かめられた（図２）。また、バリアント５Ｄ及び３Ｄは、新規に同定されたＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントであることが明らかとなった。
以上の結果から、バリアント５Ｄ及び３Ｄ、すなわち配列番号１及び３に示される塩基配列からなるＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントが、がん細胞（膵臓がん、胃がん、大腸がん）で特異的に発現していることが明らかとなった。
バリアント５Ｄ及び３Ｄ由来のＰＣＲ産物は、それぞれ配列番号１５及び１６に示される塩基配列からなるＤＮＡであることが明らかとなった。かかる塩基配列情報を基に、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のエキソン２〜９の領域を詳細に調べたところ、バリアント５Ｄは、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のエキソン３及び４が欠損したものであること、また、バリアント３Ｄは、ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のエキソン３の一部（エキソン３の１４６〜２７９番目の塩基）、エキソン４〜６、及びエキソン７の一部（エキソン７の１〜１４５番目の塩基）が欠損したものであることが確かめられた（図２）。また、バリアント５Ｄ及び３Ｄは、新規に同定されたＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントであることが明らかとなった。
以上の結果から、バリアント５Ｄ及び３Ｄ、すなわち配列番号１及び３に示される塩基配列からなるＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントが、がん細胞（膵臓がん、胃がん、大腸がん）で特異的に発現していることが明らかとなった。
３．ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントの定量解析
次に、がん細胞中で発現するバリアント５Ｄ及び３Ｄの発現量を定量するために、定量ＰＣＲ法を用いた解析を行った。
次に、がん細胞中で発現するバリアント５Ｄ及び３Ｄの発現量を定量するために、定量ＰＣＲ法を用いた解析を行った。
３−１ 方法
〔１〕全ＲＮＡの単離及びｃＤＮＡの合成は、上記実施例１に記載された方法〔１〕〜〔５〕にしたがって行った。
〔２〕精製したｃＤＮＡ２０ｎｇに、バリアント５Ｄ又は３Ｄを特異的に増幅するプライマー対（バリアント５Ｄ；配列番号１７及び１８に示される塩基配列からなるＤＮＡ、バリアント３Ｄ；配列番号１９及び２０に示される塩基配列からなるＤＮＡ）（図３Ａ）１０μＭをそれぞれ１μｌずつ、及びTaKaRa社製ＰＣＲ反応溶液（SYBR Premix ExTaqII, ROX Refference Dye）を加え、RNase(R) Free Waterで最終体積を２０μｌに調整した後、以下の１）〜４）に示したＰＣＲ反応条件でサーマルサイクラー（ABI PRISM 7900HT Fast Real time PCR System、Applied Biosystems社製）を用いて定量ＰＣＲ解析を行った。なお、コントロールとして既知のＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のｍＲＮＡを特異的に増幅するプライマー対（配列番号２１及び２２に示される塩基配列からなるＤＮＡ）（図３Ａ）を用いた。また、生成したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により解析した（図３Ｂ）。
＜ＰＣＲ反応条件＞
１）９５℃、２０秒を１サイクル（ＤＮＡ二本鎖の熱変性）
２）９５℃、１秒を１サイクル（ＤＮＡ二本鎖の熱変性）
３）６０℃、３０秒を１サイクル（プライマーのｃＤＮＡへのアニーリング及びプライマー対によるｃＤＮＡの増幅）
４）２）〜３）のサイクルをさらに３９回繰り返す。
〔１〕全ＲＮＡの単離及びｃＤＮＡの合成は、上記実施例１に記載された方法〔１〕〜〔５〕にしたがって行った。
〔２〕精製したｃＤＮＡ２０ｎｇに、バリアント５Ｄ又は３Ｄを特異的に増幅するプライマー対（バリアント５Ｄ；配列番号１７及び１８に示される塩基配列からなるＤＮＡ、バリアント３Ｄ；配列番号１９及び２０に示される塩基配列からなるＤＮＡ）（図３Ａ）１０μＭをそれぞれ１μｌずつ、及びTaKaRa社製ＰＣＲ反応溶液（SYBR Premix ExTaqII, ROX Refference Dye）を加え、RNase(R) Free Waterで最終体積を２０μｌに調整した後、以下の１）〜４）に示したＰＣＲ反応条件でサーマルサイクラー（ABI PRISM 7900HT Fast Real time PCR System、Applied Biosystems社製）を用いて定量ＰＣＲ解析を行った。なお、コントロールとして既知のＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のｍＲＮＡを特異的に増幅するプライマー対（配列番号２１及び２２に示される塩基配列からなるＤＮＡ）（図３Ａ）を用いた。また、生成したＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により解析した（図３Ｂ）。
＜ＰＣＲ反応条件＞
１）９５℃、２０秒を１サイクル（ＤＮＡ二本鎖の熱変性）
２）９５℃、１秒を１サイクル（ＤＮＡ二本鎖の熱変性）
３）６０℃、３０秒を１サイクル（プライマーのｃＤＮＡへのアニーリング及びプライマー対によるｃＤＮＡの増幅）
４）２）〜３）のサイクルをさらに３９回繰り返す。
３−２ 結果
まず、用いるプライマーが、バリアント５Ｄ又は３Ｄを特異的に検出できることと（図３Ｂ）、定量ＰＣＲ解析を行うためのプライマーとして十分適していることを確認した（図３Ｃ）。かかるプライマーを用いて定量ＰＣＲ解析を行い、ｃＤＮＡ２０ｎｇ当たりのｍＲＮＡのコピー数を算出したところ、バリアント５Ｄは、正常細胞と比べ、３種類すべての膵臓がん細胞株（ＨＰＡＣ、ＨＰＡＦII、ＱＧＰ１）、２種類の胃がん細胞株（ＭＫＮ４５、ＫＡＴＯIII）、及び３種類すべての大腸がん細胞株（ＬｏＶｏ、ＨＣＡ２、ＨＣＡ４６）で高発現していることが明らかとなった（図４の中央図）。また、バリアント３Ｄは、正常細胞と比べ、３種類すべての膵臓がん細胞株（ＨＰＡＣ、ＨＰＡＦII、ＱＧＰ１）、２種類の胃がん細胞株（ＭＫＮ４５、ＫＡＴＯIII）、及び２種類の大腸がん細胞株（ＨＣＡ２、ＨＣＡ４６）で高発現していることが明らかとなった（図４の右図）。特に、バリアント５Ｄは、既知のＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のｍＲＮＡと少なくとも同レベルで発現していることが明らかとなった（図４の中央図と左図との比較）。以上の結果は、上記実施例１の結果を支持するとともに、バリアント５Ｄは、既知のＣＥＡＣＡＭ５タンパク質と少なくとも同レベルで検出できるバイオマーカーとして用いることができることを示唆している。
まず、用いるプライマーが、バリアント５Ｄ又は３Ｄを特異的に検出できることと（図３Ｂ）、定量ＰＣＲ解析を行うためのプライマーとして十分適していることを確認した（図３Ｃ）。かかるプライマーを用いて定量ＰＣＲ解析を行い、ｃＤＮＡ２０ｎｇ当たりのｍＲＮＡのコピー数を算出したところ、バリアント５Ｄは、正常細胞と比べ、３種類すべての膵臓がん細胞株（ＨＰＡＣ、ＨＰＡＦII、ＱＧＰ１）、２種類の胃がん細胞株（ＭＫＮ４５、ＫＡＴＯIII）、及び３種類すべての大腸がん細胞株（ＬｏＶｏ、ＨＣＡ２、ＨＣＡ４６）で高発現していることが明らかとなった（図４の中央図）。また、バリアント３Ｄは、正常細胞と比べ、３種類すべての膵臓がん細胞株（ＨＰＡＣ、ＨＰＡＦII、ＱＧＰ１）、２種類の胃がん細胞株（ＭＫＮ４５、ＫＡＴＯIII）、及び２種類の大腸がん細胞株（ＨＣＡ２、ＨＣＡ４６）で高発現していることが明らかとなった（図４の右図）。特に、バリアント５Ｄは、既知のＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のｍＲＮＡと少なくとも同レベルで発現していることが明らかとなった（図４の中央図と左図との比較）。以上の結果は、上記実施例１の結果を支持するとともに、バリアント５Ｄは、既知のＣＥＡＣＡＭ５タンパク質と少なくとも同レベルで検出できるバイオマーカーとして用いることができることを示唆している。
４．ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントがコードするタンパク質の検出１
次に、がん細胞で発現するＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアント（バリアント５Ｄ及び３Ｄ）がコードするタンパク質を検出するために、ウェスタンブロッティング法を用いた解析を行った。なお、ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質は多数の糖鎖修飾を受けていることが知られているため、バリアント５Ｄ及び３Ｄがコードするタンパク質も同様に糖鎖修飾され、このことによりウェスタンブロッティング解析したときに単一の位置に目的のバンドが検出されないことが予想された。そこで、アミノ酸数から予想される理論分子量の位置にバンドを検出させるために、ウェスタンブロッティング解析する前に、あらかじめ脱糖化処理を行った。
次に、がん細胞で発現するＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアント（バリアント５Ｄ及び３Ｄ）がコードするタンパク質を検出するために、ウェスタンブロッティング法を用いた解析を行った。なお、ＣＥＡＣＡＭ５タンパク質は多数の糖鎖修飾を受けていることが知られているため、バリアント５Ｄ及び３Ｄがコードするタンパク質も同様に糖鎖修飾され、このことによりウェスタンブロッティング解析したときに単一の位置に目的のバンドが検出されないことが予想された。そこで、アミノ酸数から予想される理論分子量の位置にバンドを検出させるために、ウェスタンブロッティング解析する前に、あらかじめ脱糖化処理を行った。
４−１ 方法
〔１〕インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で（１０％ＦＢＳ、０．３ｍｇ／ｍｌグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）／ＲＰＭＩ１６４０（Sigma-Aldrich社製）存在下に培養した上記９種類のがん細胞株から、lysisバッファー（７．５ＭＵｒｅａ、２．５ＭＴｈｉｏ−Ｕｒｅａ、１２．５％glycerol、５０ｍＭTris-HCl (pH 7.4)、２．５％N-Octylglucoside、６．２５ｍＭＴＣＥＰ、１．２５ｍＭprotease inhibitor）を用いて細胞抽出液を調製した。
〔２〕後のステップ〔３〕におけるＰＮＧａｓｅＦ処理のために、2-D clean up kit（GE Healthcare社製）を用いて溶液の置換を行った。
〔３〕ＰＮＧａｓｅＦ（New England Biolabs社製）を用いて脱糖化処理を行った。
〔４〕脱糖化処理後の溶液に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、ＰＶＤＦ膜に転写させた
〔５〕抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体（mouse monoclonal antibody、Sigma-Aldrich社製）を一次抗体として、ＨＲＰ標識マウスＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch社製）を二次抗体として用いてウェスタンブロッティング法による解析を行った。なお、内部標準として抗βアクチン抗体（mouse monoclonal antibody、Sigma-Aldrich社製）を用いた。
〔６〕検出は化学発光検出（ECL Prime Western Blotting Detection Reagent）（GE Healthcare社製）を用いて行った。
〔１〕インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で（１０％ＦＢＳ、０．３ｍｇ／ｍｌグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）／ＲＰＭＩ１６４０（Sigma-Aldrich社製）存在下に培養した上記９種類のがん細胞株から、lysisバッファー（７．５ＭＵｒｅａ、２．５ＭＴｈｉｏ−Ｕｒｅａ、１２．５％glycerol、５０ｍＭTris-HCl (pH 7.4)、２．５％N-Octylglucoside、６．２５ｍＭＴＣＥＰ、１．２５ｍＭprotease inhibitor）を用いて細胞抽出液を調製した。
〔２〕後のステップ〔３〕におけるＰＮＧａｓｅＦ処理のために、2-D clean up kit（GE Healthcare社製）を用いて溶液の置換を行った。
〔３〕ＰＮＧａｓｅＦ（New England Biolabs社製）を用いて脱糖化処理を行った。
〔４〕脱糖化処理後の溶液に含まれるタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、ＰＶＤＦ膜に転写させた
〔５〕抗ＣＥＡＣＡＭ５抗体（mouse monoclonal antibody、Sigma-Aldrich社製）を一次抗体として、ＨＲＰ標識マウスＩｇＧ抗体（Jackson ImmunoResearch社製）を二次抗体として用いてウェスタンブロッティング法による解析を行った。なお、内部標準として抗βアクチン抗体（mouse monoclonal antibody、Sigma-Aldrich社製）を用いた。
〔６〕検出は化学発光検出（ECL Prime Western Blotting Detection Reagent）（GE Healthcare社製）を用いて行った。
４−２ 結果
３種類のがん細胞（膵臓がん、胃がん、大腸がん）において、既知のＣＥＡＣＡＭ５タンパク質の他、バリアント５Ｄ及び３Ｄがコードするタンパク質の分子量に相当する位置にバンドが検出された（図５）。また、かかるバンドがバリアント５Ｄ及び３Ｄがコードするタンパク質であることは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析により確認した。なお、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析は定法にしたがって行った。
以上の結果は、バリアント５Ｄ及び３Ｄがコードするタンパク質、すなわち、配列番号２及び４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、がん細胞（膵臓がん、胃がん、大腸がん）で特異的に発現することを示している。また、バリアント５Ｄ及び３Ｄがコードするタンパク質は、図６に示すように、既知のＣＥＡＣＡＭ５タンパク質と比べ、途中のドメイン構造が抜け落ちた構造を有していると考えられる。
３種類のがん細胞（膵臓がん、胃がん、大腸がん）において、既知のＣＥＡＣＡＭ５タンパク質の他、バリアント５Ｄ及び３Ｄがコードするタンパク質の分子量に相当する位置にバンドが検出された（図５）。また、かかるバンドがバリアント５Ｄ及び３Ｄがコードするタンパク質であることは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析により確認した。なお、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ解析は定法にしたがって行った。
以上の結果は、バリアント５Ｄ及び３Ｄがコードするタンパク質、すなわち、配列番号２及び４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質は、がん細胞（膵臓がん、胃がん、大腸がん）で特異的に発現することを示している。また、バリアント５Ｄ及び３Ｄがコードするタンパク質は、図６に示すように、既知のＣＥＡＣＡＭ５タンパク質と比べ、途中のドメイン構造が抜け落ちた構造を有していると考えられる。
５．ＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントがコードするタンパク質の検出２
さらに、バリアント５Ｄ及び３Ｄが細胞外、すなわち培地中に分泌されるかどうかについて解析を行った。なお、培地中に含まれる血清（特にアルブミン）は、後のウェスタンブロッティング解析において検出の妨げになるので、（１０％ＦＢＳ、０．３ｍｇ／ｍｌグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）／ＲＰＭＩ１６４０（Sigma-Aldrich社製）は回収前に血清不含培地（［０．３ｍｇ／ｍｌグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン］／ＲＰＭＩ１６４０［Sigma-Aldrich社製］）へ置換した。
さらに、バリアント５Ｄ及び３Ｄが細胞外、すなわち培地中に分泌されるかどうかについて解析を行った。なお、培地中に含まれる血清（特にアルブミン）は、後のウェスタンブロッティング解析において検出の妨げになるので、（１０％ＦＢＳ、０．３ｍｇ／ｍｌグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）／ＲＰＭＩ１６４０（Sigma-Aldrich社製）は回収前に血清不含培地（［０．３ｍｇ／ｍｌグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン］／ＲＰＭＩ１６４０［Sigma-Aldrich社製］）へ置換した。
５−１ 方法
〔１〕インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で（１０％ＦＢＳ、０．３ｍｇ／ｍｌグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）／ＲＰＭＩ１６４０（Sigma-Aldrich社製）存在下に上記９種類のがん細胞株を培養した後、血清不含基礎培地へ培地を置換した。
〔２〕２４時間インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で培養した後、培地を回収した。
〔３〕以降のステップは、上記実施例４のステップ〔２〕〜〔６〕にしたがって行った。
〔１〕インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で（１０％ＦＢＳ、０．３ｍｇ／ｍｌグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン）／ＲＰＭＩ１６４０（Sigma-Aldrich社製）存在下に上記９種類のがん細胞株を培養した後、血清不含基礎培地へ培地を置換した。
〔２〕２４時間インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で培養した後、培地を回収した。
〔３〕以降のステップは、上記実施例４のステップ〔２〕〜〔６〕にしたがって行った。
５−２ 結果
３種類のがん細胞（膵臓がん、胃がん、大腸がん）において、既知のＣＥＡＣＡＭ５タンパク質の他、バリアント５Ｄ及び３Ｄが検出された（図７）。
以上の結果は、バリアント５Ｄ及び３Ｄがコードするタンパク質は、がん細胞（膵臓がん、胃がん、大腸がん）の細胞外へ分泌されることを示している。
３種類のがん細胞（膵臓がん、胃がん、大腸がん）において、既知のＣＥＡＣＡＭ５タンパク質の他、バリアント５Ｄ及び３Ｄが検出された（図７）。
以上の結果は、バリアント５Ｄ及び３Ｄがコードするタンパク質は、がん細胞（膵臓がん、胃がん、大腸がん）の細胞外へ分泌されることを示している。
本発明は、膵臓がん、胃がん、大腸がんなどのがん発症予防や早期発見に必要な定期検診等のがんの検診者の増加が期待される他、早期がんの段階で診断・治療をうける検診者が増えることや、がんによる死亡率を下げることが期待される。
Claims (8)
- 以下の工程（ａ）及び工程（ｂ）を備えたことを特徴とするがんの有無を判定する方法。
１）判定用試料中の、配列番号１又は３に示される塩基配列からなるＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントの発現、又は配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の発現を検出する工程（ａ）；
２）工程（ａ）で配列番号１又は３に示される塩基配列からなるＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントの発現、又は配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質の発現が検出された場合、判定用試料提供者ががんである可能性が高いと評価する工程（ｂ）； - がんが、膵臓がん、胃がん、又は大腸がんであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 配列番号１又は３に示される塩基配列からなるＣＥＡＣＡＭ５遺伝子のスプライシングバリアントの発現を検出するためのプライマー対若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えることを特徴とするがんの有無の判定用キット。
- がんが、膵臓がん、胃がん、又は大腸がんであることを特徴とする請求項３に記載のキット。
- 配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質に特異的に結合する抗体、又はその標識物を備えることを特徴とするがんの有無の判定用キット。
- がんが、膵臓がん、胃がん、又は大腸がんであることを特徴とする請求項５に記載のキット。
- 配列番号１又は３に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
- 配列番号２又は４に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
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