CN106065032B - 一新型蛋白结合片段 - Google Patents

Abstract

本发明公开了新型结合CEA(癌胚抗原)蛋白片段(HLCEAl)及结合片段二聚体。本发明还公开了新型结合CEA蛋白片段(HLCEAl)制备方法及其应用领域。本发明新型结合CEA蛋白片段分子量为28KD，能特异识别CEA抗原，高度选择性结合CEA靶标相关肿瘤，具有高亲和力，可塑性强，容易修饰，半衰期短，人体免疫反应低，毒性小，可标记生物活性物质或偶联化学物质或其他蛋白，耐药性低，生产成本低等特性。可广泛应用于CEA靶标相关肿瘤诊断、治疗等领域。

Description

一新型蛋白结合片段

技术领域

本发明涉及一新型结合CEA蛋白片段及其在生物医药领域的应用。

背景技术

肿瘤是危害人类健康的最重要问题之一。目前，世界上大约有1/3的人患肿瘤，并且有1/4的人死于肿瘤。目前治疗方法有手术治疗、放化疗治疗及单克隆抗体治疗，但无论是安全性还是有效性仍不令人满意。手术治疗对晚期病人无效，且有严重术后创伤后遗症。常规放化疗由于缺乏靶向性，化学药物虽然具备对肿瘤细胞的高度杀伤效力，却也常常误伤正常细胞，引起严重的毒副作用。单克隆抗体虽然靶向性强，但是由于其分子量大，无法实现对结直肠癌等实体肿瘤深层治疗，疗效有限，同时大分子的单抗易引起免疫原性等副作用。因此小分子抗体逐渐成为目前肿瘤治疗的重点和未来发展趋势。

癌胚抗原(CEA)是一种分子量为180-200kDa的多糖蛋白复合物，是由加拿大学者于1965年从结肠癌细胞中提取到的肿瘤相关抗原。CEA作为一种常见的肿瘤标记物，被广泛用作各种CEA靶标相关肿瘤的诊断和监测指标。凡内胚层来源的恶性肿瘤，如结肠、直肠、胃、肝、食道、胰腺等癌症病人血清中均有CEA存在，含量明显高于正常人。统计学资料表明大肠癌的CEA表达率为83.3％，肝癌为80％，肺癌为76.6％，乳腺癌为63.2％。当前国内外已研制了许多种CEA单克隆抗体，并已经广泛应用于临床应用，但小分子CEA抗体报道鲜见报道。因此小分子的CEA抗体正成为治疗、早期诊断结直肠癌的“热点药物”。

发明内容

本发明提供了一新型结合CEA蛋白片段(HLCEA1)，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。它是通过对肿瘤病人、免疫的羊和鼠的CDRs免疫库与人抗体框架区进行序列重组，在E.coli中进行功能筛选获得一个全新的CEA小分子抗体，由CEA抗体片段重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过(GSGG)₃连接而成。能与CEA(癌胚抗原)特异性结合，亲和力系数达到10^-10--11M。在体外及体内可以与CEA靶标相关细胞，如结直肠癌细胞特异性结合。无全抗的Fc段，人体免疫反应低，毒性小，耐药性降低。分子量因为28KD，分子量小，易穿过血管屏障，显著提高抗体结合肿瘤能力，且小分子更容易进入实体肿瘤内部，提高药物疗效。

本发明新型结合CEA蛋白片段(HLCEA1)含有结合CEA的重链和轻链序列，该序列还可以Fab，(Fab)₂，IgG等形式存在，优选以ScFv形式存在。

本发明新型结合CEA蛋白片段(HLCEA1)可标记生物活性物质或偶联化学物质或其他蛋白，比如细胞毒素、同位素、荧光基团等，优选的本发明新型结合CEA蛋白片段(HLCEA1)标记同位素^125/131I。

本发明还提供了新型结合CEA蛋白片段(HLCEA1)制备方法，其步骤如下：

(1)将含有pET22-HLCEA1表达质粒的表达菌接种到含有0.5-1.0％(w/v)葡萄糖、30-100mg/L氨苄青霉素YT培养基中，30-40℃培养10-20h，得菌液；

(2)按照0.5-1.5％(v/v)的接种量，将步骤(1)所得菌液接种至含有30-100mg/L氨苄青霉素的YT培养基中，30-40℃培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0；

(3)加入IPTG至终浓度为0.05-0.15mM，在20-40℃的条件下，诱导培养5-10小时；收集培养的菌体；

(4)每0.5-2.0g菌体重悬于3-10ml平衡缓冲液中，使用超声波破碎仪超声5-10S，间隔3-8S，运行50-100次进行破碎。或使用均质机700-900Pa均质2次；

(5)采用Ni亲和填料分离纯化破碎后的上清液，即得新型结合CEA蛋白片段。

优选地，步骤(1)中所述培养基含有1％(w/v)葡萄糖、50mg/L氨苄青霉素YT，所述培养温度为37℃，培养时间为16h；步骤(2)所述接种量为1％(v/v)，所述培养基含有50mg/L氨苄青霉素的YT，培养温度为37℃；步骤(3)所述IPTG至终浓度为0.1mM，诱导培养温度为30℃，诱导培养时间为6小时；步骤(4)所述菌体量为1g，平衡缓冲液量为5ml，超声时间为5S，间隔时间为4S，运行次数为80次，或用均质机800Pa均质。

本发明还提供了新型结合CEA蛋白片段二聚体，它的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，分子量为56KD，新型结合CEA蛋白片段二聚体拥有双活性区域，增加了检测或结合CEA抗原的灵敏度，同时在抗体C-末端的半胱氨酸的位置允许偶联生物活性物质或化学物质。

本发明优点在于：

本发明新型结合CEA蛋白片段(HLCEA1)与已有的大分子抗体相比，具有如下优势：

(1)由于本发明披露的新型结合CEA蛋白片段分子量约为28KD，分子量小，易穿过血管屏障，显著提高抗体结合肿瘤能力，且小分子更容易进入实体肿瘤内部，能有效提高抗体偶联药物疗效。

(2)本发明涉及的新型结合CEA蛋白片段在体内半衰期短，全身清除快。加之无全抗的Fc段，人体免疫反应低，毒性小，耐药性低。

(3)本发明新型结合CEA蛋白片段采用大肠杆菌体系生产，成本远低于全抗的真核细胞体系生产。

(4)本发明新型结合CEA蛋白片段可塑性强，容易修饰，增强功能，形成新一代产业链蛋白药物。

(5)本发明新型结合CEA蛋白片段亲和力系数达10^-10--11M，是目前世界上其它同类抗体的10-100倍(目前临床上同类抗体亲和力是10^-9M至10^-10M)能更有效结合肿瘤。

(6)本发明新型结合CEA蛋白片段特异识别CEA抗原，高度选择性结合CEA抗原相关肿瘤。

(7)本发明制备的新型结合CEA蛋白片段稳定性好，避免了许多抗体生产及储存中遇到的产品不稳定的关键难题，极大降低了最终产品生产和流通成本。

附图说明

图1新型结合CEA蛋白片段(HLCEA1)及其二聚体氨基酸序列表

图2新型结合CEA蛋白片段与CEA抗原结合ELISA图

图3纯化HLCEA1还原型毛细管电泳图

图4纯化HLCEA1二聚体SDS-PAGE电泳图

图5 ¹³¹I-HLCEA1纯化后放化纯度检测图

图6放射性¹²⁵I标记前后HLCEA1活性变化图

图7 ¹²⁵I-HLCEA1对CL187、HT29和M85肿瘤细胞结合图

图8 ¹³¹I-HLCEA1动物体内抑制肿瘤细胞生长结果图

图9肿瘤动物模型注射¹²⁵I-HLCEA1，肿瘤部位成像显影图

图10荧光标记HLCEA1与肿瘤细胞结合流式细胞检测图

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1本发明新型结合CEA蛋白片段(HLCEA1)的筛选

采用改良的Megaprimer PCR方法扩增人、羊和鼠的抗体片段，进行序列重组，获得抗体片段库。将获得的抗体片段库连接到C端含有HIS标签和半胱氨酸的表达载体中，将表达载体转入大肠杆菌表达菌株，获得表达菌克隆。使用膜菌落筛选方法对表达菌克隆进行筛选，获得对CEA有高亲和力的抗体片段序列表达菌，对新型结合CEA蛋白片段进行测序，其氨基酸结果见图1。

实施例2本发明新型结合CEA蛋白片段(HLCEA1)亲和性检测

第一步，100μL浓度为0.8ug/μl的CEA抗原包被ELISA检测孔，37℃孵育2小时；第二步，PBST缓冲液洗板3次；第三步，用含1％BSA的PBS溶液200ul/孔封闭，37℃孵育2h；第四步，PBST缓冲液洗板3次；第五步，抗原包被孔中加入100μl纯化样品，抗体都按4倍稀释法稀释，做2个复孔(n＝2)，取平均，37℃孵育1h；第六步；用含PBST洗涤缓冲液洗板3次，然后加入100μl含0.5％BSA的PBS稀释的抗His-HRP抗体偶联物(1∶2000)，37℃孵育1h；第七步，用PBST洗涤缓冲液洗涤孔板5次，向孔内加入100μl TMB显影试剂，37℃显色5分钟，加入50μl1N HCl终止显色反应；第八步，ELISA酶标仪于450nm波长读数，用吸光值做亲和曲线图。ELISA结果(见图7)表明，本发明抗体片段的EC50值为46ng/ml，亲和力系数为7.7*10^-10M，该抗体片段与CEA抗原有特异性结合。

实施例3新型结合CEA蛋白片段(HLCEA1)的制备

第一步，将表达菌接种到含有1％(w/v)葡萄糖、50mg/L氨苄青霉素YT培养基中，37℃培养16h，得菌液；第二步，按照1％(v/v)的接种量，将步第一步所得菌液接种至含有50mg/L氨苄青霉素的YT培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0；第三步，加入IPTG至终浓度0.1mM，在30℃的条件下，诱导培养6小时；收集培养的菌体；第四步，每1g菌体重悬于5ml平衡缓冲液中，使用超声波破碎仪超声5S，间隔4S，运行80次进行破碎。第五步采用Ni亲和填料分离纯化破碎后的上清液，即得纯化HLCEA1。HLCEA1经还原型毛细管电泳检测，结果(见图3)表明，HLCEA1纯度达98％以上。

实施例4本发明新型结合CEA蛋白片段二聚体(HLCEA1)2的制备及检测

设计定点修饰并采用类似上述方法表达结合CEA蛋白片段二聚体。采用SDS-PAGE法来检测结合CEA蛋白片段在E.coli的表达及生成形式(即单体或二聚体)。结合CEA蛋白片段在大肠杆菌中表达后，提取其细胞间质可溶性蛋白，然后用含有和不含二硫苏糖醇(DTT)的点样缓冲液(loading buffer)分别处理周质提取物。样品经聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳后考马斯亮蓝染色检测。结果表明，当样品用DTT还原处理后，只显示一条预期单体带，而没有被DTT还原处理的样品则产生两条蛋白质带，分别为单体和二聚体蛋白带(见图4)。这一结果表明：新型结合CEA蛋白片段HLCEA1通过C-端定点修饰的半胱氨酸残基成功形成共价二硫健，产生抗体二聚体。

实施例5¹²⁵I同位素标记新型结合CEA蛋白片段制备及其纯度和活性检测

50μg Iodogen的小瓶，加入200μl PB缓冲液(pH7.4，0.2M)涡旋震荡后弃去瓶中缓冲液，顺次加入0.2mg HLCEA1(2mg/mL)和100μl PB缓冲液，再加入¹²⁵I-NaI溶液(高比活度9.5mCi/mg，低比活度4.5mCi/mg)，控制反应体系pH值7.4，室温反应5min，结束反应。使用G-25凝胶填料进行分离，得到纯化的¹²⁵I同位素标记新型结合CEA蛋白片段。用Whatman No.1滤纸作为支持体，85％甲醇作为展开剂，在滤纸上点样。展开时间约40min，样品展开约10cm，取出滤纸自然风干，测定标记同位素样品和游离同位素的Rf值，计算样品放化纯，结果(见图5)表明，¹²⁵I-HLCEA1纯化后放化纯度＞99％，检测放射性¹²⁵I标记前后HLCEA1活性变化，结果(见图6)表明基本无变化。

实施例6¹³¹I-HLCEA1与结直肠癌肿瘤细胞在体外结合

分别将CL187人结肠癌细胞，HT-29人结肠癌细胞，M85人胃癌细胞铺板于96孔培养板(20000细胞/孔)，37℃过夜。肿瘤细胞用PBS洗2遍。分别加入浓度递增的纯化的HLCEA1100μl，然后每孔分别加入～80000cpm的¹²⁵I-HLCEA1(比活度～6mCi/mg)。4℃条件下反应2h。用PBS洗4遍，用2M NaOH消化细胞，收集消化液，经γ计数仪测定其cpm计数，结果(见图7)显示，¹²⁵I-HLCEA1对CL187、HT29和M85肿瘤细胞反应，特异性结合CEA高表达的CL187结直肠癌肿瘤细胞。

实施例7¹³¹I-HLCEA1动物体内抑制肿瘤细胞生长

取24只肿瘤模型裸鼠随机分成4组，每组6只。A组经尾静脉注射1.5mCi¹³¹I-HLCEA1，B组经尾静脉注射0.8mCi¹³¹I-HLCEA1，C组经尾静脉注射150μg HLCEA1，D组经尾静脉注射100μ10生理盐水。其中A组在第一次给药后七天再次经尾静脉分别注射1.5mCi¹³¹I-HLCEA1，B组在第一次给药后七天再次经尾静脉注射0.8mCi¹³¹I-HLCEA1。给药后监测CL187人结肠癌裸鼠的肿瘤细胞生长情况，结果(见图8)表明注射¹³¹I-HLCEA1后肿瘤细胞生长受抑制。

实施例8¹²⁵I-HLCEA1动物体内显影成像实验

结直肠癌裸鼠模型注射¹²⁵I-HLCEA1后显影结果(见图9)，¹²⁵I-HLCEA1在裸鼠体内特异性结合肿瘤细胞，肿瘤部位清晰可见。

实施例9新型结合CEA蛋白片段(HLCEA1)荧光标记物制备

第一步，将HLCEA1置换于0.1M pH 9.4的碳酸缓冲液中，浓缩到2mg/ml；第二步，称取1mg荧光物质FITC，加入1ml DMSO配制成1mg/ml FITC溶液；第三步，将HLCEA1与FITC按照1mg∶50μg进行混合，4℃过夜标记；第四步，过夜反应物用G25填料脱盐，分离收集荧光标记的FITC-HLCEA1。

实施例10荧光标记HLCEA1与肿瘤细胞结合检测

将LOVO和MGC803细胞用1640培养基+10％的胎牛血清培养至80-90％每瓶，用胰酶消化细胞，制成单细胞悬液。将收集的细胞用PBS缓冲液洗涤2遍，均分在EP管中(10⁶-10⁷个细胞/ml)。在EP管中分别加入100ul不同浓度的FITC-HLCEA1，室温孵育1h，离心弃掉多余抗体，加入PBS缓冲液洗涤3遍，最后加入200ul PBS，用流式细胞仪检测结合结果，检测结果(见图10)表明荧光标记HLCEA1特异性结合结直肠癌肿瘤细胞LOVO。

Claims (9)

1.一种新型结合CEA蛋白片段，其特征在于：它的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述新型结合CEA蛋白片段，其特征在于：由CEA抗体片段重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)通过多肽连接物构成。

3.根据权利要求1所述新型结合CEA蛋白片段，其特征在于：在体外及体内与CEA(癌胚抗原)特异性结合，亲和力系数达到10^-10～11M。

4.根据权利要求1至3中任意一项权利要求所述新型结合CEA蛋白片段，其特征在于，其制备方法包含如下步骤：

(1)将含有pET22-HLCEA1表达质粒的表达菌接种到含有0.5-1.0％(w/v)葡萄糖、30-100mg/L氨苄青霉素YT培养基中，30-40℃培养10-20h，得菌液；

(2)按照0.5-1.5％(v/v)的接种量，将步骤(1)所得菌液接种至含有30-100mg/L氨苄青霉素的YT培养基中，30-40℃培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0；

(3)加入IPTG至终浓度为0.05-0.15mM，在20-40℃的条件下，诱导培养5-10小时；收集培养的菌体；

(4)每0.5-2.0g菌体重悬于3-10ml平衡缓冲液中，使用超声波破碎仪超声5-10S，间隔3-8S，运行50-100次进行破碎。或使用均质机700-900Pa均质2次；

(5)采用Ni亲和填料分离纯化破碎后的上清液，即得新型结合CEA蛋白片段。

5.根据权利要求1至3中任意一项权利要求所述新型结合CEA蛋白片段，其特征在于：经由C端的半胱氨酸通过二硫键链接形成新型结合CEA蛋白片段二聚体。

6.根据权利要求5所述新型结合CEA蛋白片段，其特征在于：新型结合CEA蛋白片段二聚体的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

7.根据权利要求6所述新型结合CEA蛋白片段，其特征在于：新型结合CEA蛋白片段二聚体拥有双活性区域。

8.根据权利要求1至3中任意一项权利要求或权利要求6所述新型结合CEA蛋白片段，其特征在于：抗体片段可标记生物活性物质或偶联化学物质或其他蛋白融合表达形成双功能蛋白。

9.根据权利要求8中所述新型结合CEA蛋白片段，其特征在于：生物活性物质是细胞毒素，偶联化学物质是同位素、荧光基团。