KR20170121215A

KR20170121215A - 암의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20170121215A
Application number: KR1020177026055A
Authority: KR
Inventors: 우구르 사힌; 조이슬린 우스테후베-라쉬; 마커스 피들러; 마틴 다네스크다르; 한스-울리히 슈몰트
Original assignee: 비온테크 아게
Priority date: 2015-03-17
Filing date: 2016-03-15
Publication date: 2017-11-01
Also published as: JP6739132B2; HK1247931A1; EP3271385A1; WO2016146639A1; CN107531776A; JP2018515066A; KR102414718B1; BR112017018522A2; EP3271385B1; US20180037632A1; CA2979768C; NZ734680A; CN107531776B; WO2016146174A1; US10370433B2; CA2979768A1; AU2016232301B2; ES2747727T3; AU2016232301A1; MX2017011794A

Abstract

본 발명은 암성 질환, 특히 세프라제(Fap-알파; 섬유아세포 활성화 단백질 알파)를 발현하는 암성 질환의 진단 및 치료에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 세프라제를 표적하는 펩티드에 관한 것이다.

Description

암의 진단 및 치료를 위한 조성물 및 방법

본 발명은 암성 질환, 특히 세프라제(Fap-알파; 섬유아세포 활성화 단백질 알파)를 발현하는 암성 질환, 예컨대 유방암, 폐암(pulmonary cancer 또는 lung cancer), 예를 들어 비소세포성 폐암(NSCLC), 대장암, 결장암, 식도암, 두경부암, 위암, 담도암, 췌장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암, 방광암, 자궁내막암 또는 전립선암의 진단 및 치료에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 세프라제를 표적으로 하는 펩티드에 관한 것이다.

암은 전 세계적으로 심장 질환을 뛰어 넘는 주요 사망 원인 중 하나이다. 전세계 인구의 8.2백만 명이 2012년 암으로 사망하였다(WHO). 고전적인 항암 요법, 예를 들어, 방사선 요법, 항암화학요법 및 통상적인 외과 수술은 종종 선택성이 좋지 않아 건강한 조직에 심각한 독성 부작용을 일으키는 경우가 많다. 신규한 치료법은 종양-관련 항원에 특이적인 결합 분자를 통해 종양 환경에 생체활성 분자(약물, 사이토카인, 핵종 등)를 표적화하여 송달하는 것을 들 수 있다. 이는 표적-양성 종양 조직에 대한 약물의 선택적 방향을 허용하고 건강한 세포에 해를 입히지 않으면서 악성 세포를 효과적으로 사멸시킨다. 이는 개체의 암 치료를 위한 합리적 맞춤 전략을 미리 보장하기 위해 환자 내의 표적 양성 종양의 결정을 가능하게 하는 소위 동반자 진단(companion diagnostics)을 개발하게 하였다. 여기서, 특정 촬상 기술의 응용은 지난 수십 년 동안 인상적인 발전을 나타내어 중요한 진단 단계가 되었다. 촬상 기술은 종양-관련 단백질의 존재 및 정량, 국소화, 조기 발견, 분포, 환자 층화 및 치료 모니터링에 대한 중요한 정보를 제공할 수 있다(Stern, Case et al. 2013).

맞춤형 항암 치료법에 대한 중요한 단계는 선택적 종양-관련 마커 단백질의 동정이다. 세린 프로테아제 세프라제 (Fap-알파; 섬유아세포 활성화 단백질 알파)는 정상 섬유아세포 또는 기타 정상 조직에서 발현이 거의 없거나 전혀 없고, 유방, 폐 및 대장암과 같은 사람 일차 상피 종양의 90% 이상이 암-관련 섬유아세포(CAF)에서 선택적으로 과발현되어(Rui Liu 2012), 암 치료 및 진단을 위한 매력적인 표적이 된다.세프라제는 포스트-프롤린 디펩티딜 아미노펩티다아제 계열에 속하는 170kDa 타입 II 막관통 단백질이다. 이는 세포내에 아미노 말단 서열을 노출하는 짧은 막관통 도메인에 의해 세포질 막에 앵커되어 있는 반면, 카복실 말단의 촉매 도메인은 세포외 공간에 잔존한다(Goldstein, Ghersi et al. 1997, Pineiro-Sanchez, Goldstein et al. 1997). 종양 성장 및 침투에 있어서 세프라제의 정확한 역할은 효소가 연관된 분자적 메커니즘뿐만 아니라 천연 리간드 또는 기질도 크게 알려지지 않은 상태이다.

종양 조직에 대한 선택적 마커인 세프라제가 상기 단백질을 표적화하는 다수의 잠재적 치료 전략을 구상할 수 있다. 생체내 다양한 암 모델에서 세프라제 결합 분자의 사용은 전임상 접근법에서 종양 진행을 효과적으로 손상시킬 수 있음을 보여 주고 있다(Loeffler, Kruger et al. 2006, Ostermann, Garin-Chesa et al. 2008, Liao, Luo et al. 2009, Kraman, Bambrough et al. 2010, Wen, Wang et al. 2010). 이와는 대조적으로, 단일클론 항체 F19를 사용하는 사람 암 환자의 임상적 설정에서 세프라제를 표적화는, 그 인간화 버전인 Sibrotuzumab (Welt, Divgi et al. 1994, Hofheinz, al-Batran et al. 2003, Scott, Wiseman et al. 2003), 또는 세프라제 효소-억제제 Talabostat (Narra, Mullins et al. 2007, Eager, Cunningham et al. 2009, Eager, Cunningham et al. 2009)는 보통의 임상 효능을 증명하였다. 흥미롭게도 세프라제를 표적화한 전임상 연구에서 유의한 독성은 보고되지 않았지만(Welt, Divgi et al 1994, Lee, Fassnacht et al., 2005, Loeffler, Kruger et al., Ostermann, Garin-Chesa et al. Luo et al., 2009, Santos, Jung et al., Kraman, Bambrough et al. 2010, Wen, Wang et al 2010), 현재 다능성 골수줄기세포(BMSCs)에 의한 발현이 또한 논의되고 있다. 요약하면, 세프라제-특이적 항체의 바람직한 생체분포 및 지금까지 보고된 환자의 전이성 질환 부위에서의 선택적 흡수(Welt, Divgi et al., 1994, Scott, Wiseman et al., 2003)는 세프라제 를 종양 표적화 접근법의 매력적인 후보자로 인정하고 있다. 세프라제가 종양 억제 인자로 작용하는지(Wesley, Albino et al. 1999, Ramirez-Montagut, Blachere et al. 2004) 또는 종양 성장을 촉진하는지 (Cheng, Dunbrack et al. 2002, Goodman, Rozypal et al. 2003, Huang, Wang et al. 2004) 여부는 알려지지 않았기 때문에, 기능에 영향을 미치지 않지만 국소화, 조기 발견, 분포, 환자 층화 및 치료 모니터링에 대한 정보를 제공하는 영상 기술을 위해 세프라제에 대한 선택성이 높은 리간드를 개발하는 것이 유리할 수 있다(Stern, Case et al. 2013).

혈관 형성이 거의 없는 종양의 표적화를 위해, 항체의 큰 크기 및 심지어 이들의 단편이 조직 침투 속도를 늦추고, 이로 인해 효율적인 전달을 방해할 수 있다. 또한, 항체의 혈액 순환이 길어서 특히 영상 개념과 관련하여 진단 용도로는 적합하지 않은 것처럼 보인다. 전술한 것 이외에도, 복잡한 글리코실화 패턴 및 디설파이드 가교를 갖는 항체의 분자 구조는 복잡하고 비용이 많이 드는 제조를 필요로 하며, 예를 들어, 촬상 트레이서(imaging tracer)를 이용하여, 기능화를 복잡하게 만든다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 항체의 대안으로서 소위 단백질 스캐폴드가 지난 수십 년 동안 부상하고 있다: 스캐폴드는 주어진 표적에 대해 엄격하고 구체적인 승인을 위해 맞춤화된 상호작용 분자를 정밀하게 조작할 수 있는 견고한 구조적 프레임워크를 제공한다(Weidle, Auer et al. 2013). 대부분은 비-환원 조건 하에서 적절하게 접히고 변성 및 리폴딩의 필요없이 박테리아에서 발현될 수 있다. 심지어 화학 합성은 일부 포맷의 생산을 위한 옵션이다. 마지막으로, 이들은 다기능 결합 분자를 생성하기 위한 추가의 기능화(표지화, 올리고머화, 다른 펩티드와의 융합 등)에 매우 적합하다. 서로 다른 스캐폴드-기반 접근법 중에서 시스틴-결절 미니단백질("크노틴")은 표적화된 진단 및 치료제의 개발 잠재력이 매우 높다고 보고 있다. 예를 들어, Cochran과 동료들은 U87MG 종양의 인테그린-특이성 PET 촬상을 위해 방사성 표지된 미니단백질인 18F-FP-2.5D 및 18F-FP-2.5F를 생성했는데, 이는 우수한 명암비, 빠른 종양 표적화, 정상 조직에서 상대적으로 낮은 흡수율로 특징화된다(Kimura, Cheng et al. 2009, Kimura, Levin et al. 2009, Kimura, Miao et al. 2010, Kimura, Jones et al. 2011, Liu, Liu et al. 2011). 미니단백질은 작은 30-50개의 아미노산 폴리펩티드로, 이름의 시조가 된 결절 구조를 형성하는 3개의 디설파이드 결합을 포함하고 있다(Kolmar 2009, Moore and Cochran 2012). 슈도결절 시스틴 기하학은 생체내 생체 의학 응용 분야에서 목적하는 기이한 열적, 단백질분해성 및 화학적 안정성을 담당한다(Kolmar 2011). 예를 들어, 구조적 및 기능적 무결성을 잃지 않고, 미니단백질은 알칼리성 또는 산성 환경에서 끓일 수 있다(Weidle, Auer et al. 2013). 디설파이드-구속된 루프 영역은 광범위한 서열 다양성을 견디며, 다양한 생의학적 표적을 인식하는 단백질을 엔지니어링하기 위한 견고한 분자 골격을 제공한다.

세프라제를 발현하는 종양에 대한 진단적 및 치료적 접근법에 유용한 세프라제 결합 분자는 본 기술분야에 필요한 것이다.

세프라제 결합제 예컨대 세프라제 결합 펩티드는 사람 세프라제에 대한 높은 특이성 및 선택성을 나타낸다고 본원에 기재되어 있다. 본원에 기재된 세프라제 결합제는 진단 용도, 특히 종양 촬상 및 종양 미세환경의 효율적인 표적화에 의한 치료적 적용을 위한 우수한 도구이다.

본 발명에 따르면, 목별자로부터 크노틴-타입 트립신 억제제 II의 개방형 사슬 변이체(oMCoTI-II)는 종양 표적화 응용을 위한 세프라제 특이적 결합 단백질을 조작하기 위한 분자 스캐폴드로 사용되었다. 이를 위해, 조합성 파지 라이브러리는 재조합 사람 세프라제의 세포밖 도메인과 특이적으로 상호작용하는 oMCoTI-II 변이체의 선별에 활용되었다. 앞서 정의된 표적인 MC-FA-010 (aa: GKCPYSNWTPGRGPDCRRDSDCPGRCICRGNGYCG)과의 결합을 나타내는 동정된 크노틴 펩티드 (미니단백질) 중 하나는 보다 상세하게 규명되었다. 이는 밀접하게 관련된 동족체 DPP-IV와 같은 관련된 단백질이 인식되지 않는 반면, 사람 세프라제의 특정 복합체화를 보여준다. 결합은 알라닌 스캐닝 돌연변이유발에 의해 나타낼 수 있는 MC-FA-010의 첫 번째 루프에서 동기화된 2개의 지방족 잔기 및 GRGP에 주로 의존한다. 또한, 세프라제 특이적 미니단백질은 표적 양성 CHO-K1 세포주를 사용하여 유세포 분석 및 전체-세포-ELISA에 의해 결정된 바와 같이 뮤린 동족체와 교차-반응한다. 암 관련 섬유아세포(CAFs)에 의해 발현되는 세프라제의 특이적 표적화는 CT26 종양 섹션의 면역형광 염색에 의해 나타낼 수 있다. 종양 양성 CHO-K1 종양을 보유한 Fox n1 (nu) 마우스에서 종양성 조직의 생체내 표적화가 입증될 수 있다.

본 발명은 일반적으로 세프라제를 표적화함으로써 암 질환의 치료 및 / 또는 진단에 유용한 화합물을 제공한다. 이들 화합물은 세프라제를 발현하는 세포의 선택적 검출 및/또는 세프라제를 발현하는 세포의 박멸 및/또는 세프라제를 발현하는 세포와 관련된 세포의 박멸을 제공함으로써 세프라제를 발현하지 않는 정상 세포에 대한 부작용을 최소화한다.

본 발명은 아미노산 서열: Gly Arg Gly Pro을 포함하는 세프라제 결합 펩티드를 제공한다.

제1실시형태에서, 본 발명의 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열: Tyr Xaa1 Xaa2 Trp Xaa3 Xaa4 Gly Arg Gly Pro을 포함하고,

여기서

Xaa1은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Ser, Ala 및 Cys으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser이고,

Xaa2은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asn, Ala 및 Asp으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asn 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asn이고,

Xaa3은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Thr, Ala 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Thr 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Thr이고,

Xaa4은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Pro 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Pro이다.

바람직한 실시형태에서, 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열: Tyr Xaa1 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro을 포함하고,

여기서

Xaa1은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Ser, Ala 및 Cys으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser이다.

바람직한 실시형태에서, 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열 Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro을 포함한다.

제2실시형태에서, 본 발명의 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열: Xaa1 Tyr Xaa2 Xaa3 Trp Xaa4 Xaa5 Gly Arg Gly Pro를 포함하고,

여기서

Xaa1이 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Pro 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Pro이고,

Xaa2가 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Ser, Ala 및 Cys으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser이고,

Xaa3가 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asn, Ala 및 Asp으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asn 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asn이고,

Xaa4가 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Thr, Ala 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Thr 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Thr이고,

Xaa5가 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Pro 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Pro이다.

바람직한 실시형태에서, 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열: Pro Tyr Xaa1 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro를 포함하고,

여기서

Xaa1이 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Ser, Ala 및 Cys으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser이다.

바람직한 실시형태에서, 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열: Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro를 포함한다.

제3실시형태에서, 본 발명의 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열: Xaa1 Xaa2 Cys Xaa3 Tyr Xaa4 Xaa5 Trp Xaa6 Xaa7 Gly Arg Gly Pro Xaa8을 포함하고,

여기서

Xaa1이 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Gly 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Gly이고,

Xaa2가 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Lys 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고,

Xaa3가 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Pro 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Pro이고,

Xaa4가 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Ser, Ala 및 Cys으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser이고,

Xaa5가 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asn, Ala 및 Asp으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asn 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asn이고,

Xaa6가 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Thr, Ala 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Thr 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Thr이고,

Xaa7이 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Pro 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Pro이고,

Xaa8이 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asp, Ala 및 Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp이다.

바람직한 실시형태에서, 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열: Xaa1 Xaa2 Cys Pro Tyr Xaa3 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Xaa4를 포함하고,

여기서

Xaa3가 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Ser, Ala 및 Cys으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser이고,

Xaa4가 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asp, Ala 및 Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp이다.

바람직한 실시형태에서, 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열: Gly Lys Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp를 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열: Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp을 포함한다.

추가적인 실시형태에서, 본 발명의 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열: Cys Xaa1 Tyr Xaa2 Xaa3 Trp Xaa4 Xaa5 Gly Arg Gly Pro Xaa6 Cys을 포함하고,

여기서

Xaa5가 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Pro 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Pro이고,

Xaa6가 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asp, Ala 및 Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp이다.

일 실시형태에서, 세프라제 결합 펩티드는 바람직하게는 시스틴 결절 구조의 부분이고, 여기서 시스테인은 바람직하게는 시스틴 결절 구조의 제1 시스테인 및 제2 시스테인이고/이거나 시스테인들 사이의 아미노산 서열은 시스틴 결절 구조의 제1 루프를 형성한다.

바람직한 실시형태에서, 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열: Cys Pro Tyr Xaa1 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Xaa2 Cys을 포함하고,

여기서

Xaa1이 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Ser, Ala 및 Cys으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser이고,

Xaa2가 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asp, Ala 및 Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp이다.

바람직한 실시형태에서, 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열: Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys을 포함한다.

추가적인 실시형태에서, 본 발명의 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열: (Xaa)n1 Cys (Xaa)n2 Gly Arg Gly Pro (Xaa)n3 Cys (Xaa)n4 Cys (Xaa)n5 Cys (Xaa)n6 Cys (Xaa)n7 Cys (Xaa)n8을 포함하고,

여기서

상기 Cys 잔기는 시스테인 결절 구조를 형성하고,

Xaa는 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고

n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, 및 n8은 아미노산의 개별적인 수이고,

아미노산 Xaa의 성질 및/또는 아미노산의 수 n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7 및 n8은 시스테인 결절 구조가 Cys 잔기들 간에 형성시킬 수 있는 것이며,

여기서 바람직하게는

n1이 0 내지 4이고, 바람직하게는 1 또는 2이고,

n2이 3 내지 10이고, 바람직하게는 6, 7 또는 8이고,

n3가 0 내지 4이고, 바람직하게는 1 또는 2이고,

n4가 3 내지 7이고, 바람직하게는 4, 5 또는 6이고,

n5가 2 내지 6이고, 바람직하게는 2, 3 또는 4이고,

n6가 1 내지 3이고, 바람직하게는 1 또는 2이고,

n7이 3 내지 7이고, 바람직하게는 4, 5 또는 6이고,

n8이 0 내지 4이고, 바람직하게는 1 또는 2이다.

추가적인 실시형태에서, 본 발명의 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열: Cys Xaa1 Tyr Xaa2 Xaa3 Trp Xaa4 Xaa5 Gly Arg Gly Pro Xaa6 Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Xaa7 Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys을 포함하고,

여기서

Xaa6가 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asp, Ala 및 Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp이고,

Xaa7이 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Arg 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Arg이다.

바람직한 실시형태에서, 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열: Cys Pro Tyr Xaa1 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Xaa2 Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Xaa3 Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys을 포함하고,

여기서

Xaa2가 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asp, Ala 및 Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp이고,

Xaa3가 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Arg 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Arg이다.

바람직한 실시형태에서, 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열: Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys을 포함한다.

추가적인 실시형태에서, 본 발명의 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열: Xaa1 Xaa2 Cys Xaa3 Tyr Xaa4 Xaa5 Trp Xaa6 Xaa7 Gly Arg Gly Pro Xaa8 Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Xaa9 Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys Gly을 포함하고,

여기서

Xaa8이 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asp, Ala 및 Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp이고,

Xaa9이 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Arg 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Arg이다.

바람직한 실시형태에서, 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열: Xaa1 Xaa2 Cys Pro Tyr Xaa3 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Xaa4 Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Xaa5 Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys Gly을 포함하고,

여기서

Xaa4가 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asp, Ala 및 Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp이고,

Xaa5가 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Arg 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Arg이다.

바람직한 실시형태에서, 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열: Gly Lys Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys Gly을 포함한다.

바람직한 실시형태에서, 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열: Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys Gly을 포함한다.

일 실시형태에서, 세프라제 결합 펩티드는 하기 표 1, 표 2 또는 표 4에 나타내어지는 아미노산 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 세프라제 결합 펩티드는 서열 목록의 SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 또는 96에서 나타내어지는 아미노산 서열을 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 세프라제 결합 펩티드는 스캐폴드를 형성하거나 그 부분이다. 용어 "스캐폴드"는 본원에 기재된 세프라제 결합 펩티드 또는 아미노산 서열에 강성을 부여하는 구조에 관한 것이다.

일 실시형태에서, 본 발명의 세프라제 결합 펩티드는 공유결합수식에 의해 안정화된다. 일 실시형태에서, 상기 공유결합수식은 고리화이다. 일 실시형태에서, 상기 고리화는 1개 이상의 디설파이드 가교를 통한 것이다.

일 실시형태에서, 본 발명의 세프라제 결합 펩티드는 시스틴 결절 구조, 바람직하게는 억제제 시스틴 결절 구조를 형성하고/하거나 부분이다. 일 실시형태에서, 시스틴 결절 구조는 목별자로부터의 개방형 사슬 트립신 억제제 II (MCoTI-II), Ecballium elaterium의 트립신 억제제 EETI-II 및 최적화된 MCoTI-II 스캐폴드에 기반한다.

아미노산 서열 Gly Arg Gly Pro 및/또는 본 발명의 제1 또는 제2실시형태의 세프라제 결합 펩티드에서의 아미노산 서열은 바람직하게는 시스틴 결절 구조의 아미노산 서열이 제1루프 내에 위치하는(즉 제1 시스테인 및 제2 시스테인 사이) 시스틴 결절 구조의 부분이다.

일 실시형태에서, 본 발명의 세프라제 결합 펩티드는 적어도 하나의 융합 상대를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 융합 상대는 이종성 아미노산 서열을 포함한다.

또한, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이, 1개 이상, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6개 이상 세프라제 결합 펩티드를 포함하는 세프라제 결합제를 제공하고, 여기서 세프라제 결합 펩티드는 동일하거나 상이할 수 있다. 또한, 본 발명은 적어도 하나의 추가적인 일부분과 공유결합으로 및/또는 비-공유결합으로, 바람직하게는 공유결합으로 연관된 본 발명의 세프라제 결합 펩티드를 포함하는 세프라제 결합제를 제공한다.

본 발명의 세프라제 결합 펩티드는 또는 본 발명의 세프라제 결합제의 일 실시형태에서 융합 상대 또는 추가적인 일부분은 담체 단백질, 표지, 리포터, 또는 태그를 포함한다. 일 실시형태에서, 리포터는 면역학적 분석을 위한 리포터이고, 여기서 리포터는 바람직하게는 알칼리성 인산가수분해효소, 겨자무과산화효소, 또는 형광 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 융합 상대 또는 추가적인 일부분은 His6-카세트, 티오레독신, S-태그, 비오틴 또는 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일 실시형태에서, 본 발명의 세프라제 결합제는 공유결합으로 및/또는 비-공유결합으로 연관된, 본 발명의 세프라제 결합 펩티드를 포함하는 각각의 상기 서브유닛인 적어도 2개의 서브유닛을 포함하고, 여기서 세프라제 결합 펩티드는 동일하거나 상이할 수 있다.

본 발명에 따르면, 일 실시형태에서, 비-공유 회합은 스트렙타아비딘(Streptavidin)을 포함하는 화합물을 통한 것이다. 본 발명에 따르면, 일 실시형태에서, 공유 회합은 펩티드성 및/또는 비-펩티드성 링커를 통한 것이다.

따라서, 일 실시형태에서, 본 발명의 세프라제 결합 펩티드는 올리고머성 또는 다량체성 형태로 존재한다. 본 실시형태에서, 동일하거나 상이할 수 있는 본 발명의 2개 이상의 세프라제 결합 펩티드는 공유 또는 비-공유 결합, 예컨대 비오틴/스트렙타아비딘을 통해서 연결 또는 결합될 수 있다. 따라서, 본 발명의 세프라제 결합 펩티드는 2량체, 3량체, 4량체 등을 형성할 수 있다.

일 실시형태에서, 본 발명의 세프라제 결합제는 비-공유결합으로 연관된 적어도 4개의 서브유닛을 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 세프라제 결합제는 공유결합으로 연관된 적어도 3개의 서브유닛을 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 세프라제 결합제는 적어도 하나의 검출가능한 표지 또는 리포터 및/또는 적어도 하나의 치료 작용부와 공유결합으로 및/또는 비-공유결합으로, 바람직하게는 공유결합으로 연관된 본 발명의 세프라제 결합 펩티드 또는 본 발명의 세프라제 결합제를 포함한다.

일 실시형태에서, 본 발명의 세프라제 결합 펩티드 또는 본 발명의 세프라제 결합제는 세프라제의 세포밖 도메인에 결합한다.

본 발명의 세프라제 결합 펩티드 또는 본 발명의 세프라제 결합제의 일 실시형태에서 상기 세프라제는 세포에 의해 발현된다.

일 실시형태에서, 본 발명의 세프라제 결합 펩티드 또는 본 발명의 세프라제 결합제는 DPP IV에 결합하지 않는다.

본 발명의 일 실시형태에서, 결합은 특이적 결합이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 세프라제 결합 펩티드를 암호화하는 재조합 핵산을 제공한다. 일 실시형태에서, 재조합 핵산은 벡터의 형태 또는 RNA의 형태이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 핵산을 포함하는 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 진단, 검출 또는 모니터링, 즉 암 질환의 퇴행, 진행 및/또는 발병을 결정하는 수단 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 본 발명의 세프라제 결합 펩티드 또는 본 발명의 세프라제 결합제를 포함하는 검사키트를 제공한다. 일 실시형태에서, 검사키트는 면역분석을 수행하기 위한 적어도 하나의 추가 시약 및/또는 면역분석을 수행하기 위한 키트의 사용 설명서를 추가로 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명의 검사키트는 진단 검사키트이다.

본 발명의 진단 검사키트는 본 발명의 암의 진단, 검출 또는 모니터링 방법에 유용할 수 있다. 이들 키트에는 유익한 팜플렛, 예를 들어 시약을 사용하여 본원에 기재된 방법을 수행하는 방법을 알려주는 팜플렛이 포함될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 세프라제 결합 펩티드 또는 본 발명의 세프라제 결합제를 포함하는 분석장치를 제공한다. 일 실시형태에서, 분석장치는 효소-결합 면역흡착분석장치이다. 본 발명의 분석장치의 일 실시형태에서, 세프라제 결합 펩티드 또는 세프라제 결합제는 고형 지지체 상에 방출가능하게 또는 비-방출가능하게 고정화된다.

본 발명은 본 발명의 세프라제 결합 펩티드 또는 본 발명의 세프라제 결합제를 사용하는 것을 포함하는 시료에서 세프라제의 존재 및/또는 정량을 분석하는 방법을 제공한다.

본 발명은 본 발명의 세프라제 결합 펩티드 또는 본 발명의 세프라제 결합제를 이용하여 상기 환자에서의 세프라제의 존재 및/또는 정량을 분석하는 것을 포함하는, 환자에서의 암의 진단, 검출 또는 모니터링을 위한 방법을 제공한다.

특정 양상에서, 본 발명은 암 질환의 위치 또는 부위, 예를 들어 특정 조직 또는 기관을 검출, 즉 결정하는 방법에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 상기 방법은 환자에게 검출가능한 표지에 결합된 본 발명의 세프라제 결합 화합물을 투여하는 것을 포함한다.

상기 환자에서 조직 또는 기관의 표지화는 상기 조직 또는 기관에서의 암 질환의 존재 또는 위험을 나타낼 수 있다.

일 실시형태에서, 조직 또는 기관은 조직 또는 기관이 암이 없는 경우 세포는 실질적으로 세프라제를 발현하지 않는 조직 또는 기관이다.

본 발명의 방법의 일 실시형태에서, 상기 분석은 상기 환자로부터 분리된 생물학적 시료 상에서 수행된다.

일 실시형태에서, 생물학적 시료는 암 질환을 가진 환자, 암 질환을 앓고 있거나 암 질환에 걸린 것으로 의심되거나 암 질환의 가능성이 있는 환자로부터 분리된다. 일 실시형태에서, 생물학적 시료는 조직 또는 기관이 암이 없는 경우 세포는 실질적으로 세프라제를 발현하지 않는 조직 또는 기관에서 유래한 것이다.

전형적으로, 생물학적 시료에서의 세프라제의 수준은 기준 수준과 비교되고, 상기 기준 수준으로부터의 편차는 환자의 암 질환의 존재 및/또는 단계를 나타낸다. 기준 수준은 대조군 시료 (예를 들어, 건강한 조직 또는 대상체)에서 결정된 바와 같은 수준 또는 건강한 대상체로부터의 중간 수준일 수 있다. 상기 기준 수준으로부터의 "편차"는 적어도 10%, 20%, 또는 30%, 바람직하게는 적어도 40% 또는 50%, 또는 그 이상의 증가 또는 감소와 같은 임의의 현저한 변화를 나타낸다. 기준 수준과 비교하여, 예를 들어 암 질환이 없는 환자와 비교하여 증가된 세프라제의 존재 및/또는 세프라제의 정량은 상기 환자에서 암 질환의 존재 또는 위험 (즉, 발달 가능성)을 나타낼 수 있다.

일 실시형태에서, 생물학적 시료 및/또는 대조/기준 시료는 암 질환에 의한 정동(affection)과 관련하여 진단, 검출 또는 모니터링되어야 할 조직 또는 기관에 상응하는 조직 또는 기관으로부터 유래된 것이고; 예를 들어 진단, 검출 또는 모니터링되어야 할 암 질환은 뇌암이며, 생물학적 및/또는 대조/기준 시료는 뇌 조직이다.

일 실시형태에서, 생물학적 시료 및/또는 대조/기준 시료는 조직 또는 기관에 암이 없는 경우 세포는 실질적으로 세프라제를 발현하지 않는, 조직 또는 기관으로부터 유래된 것이다. 본 발명의 방법에 의애 환자에서 암 질환의 존재 또는 위험의 표시는 암 질환이 상기 조직 또는 기관에 있거나 상기 조직 또는 기관이 상기 암질환의 위험이 있음을 나타낼 수 있다.

진단, 검출 또는 모니터링 방법은 표적 분자, 예를 들어 세프라제의 발현 수준의 절대 및/또는 상대 측정과 같은 정량적 및/또는 정성적 평가를 가능하게 한다.

세프라제의 존재 및/또는 정량에 대한 상기 분석을 수행하기 위한 수단은 본원에 기재되어 있고 당업자에게 명백한 것일 것이다. 전형적으로, 본 발명의 방법에서의 분석은 세프라제에 특이적으로 결합하는, 표지된 리간드, 예를 들어 검출을 제공하는 표지, 예를 들어 지시제 효소, 방사성 표지, 형광 물질 또는 상자성 입자에 직접 또는 간접적으로 결합된 세프라제에 특이적으로 결합하는 본 발명의 화합물의 사용을 포함한다.

본 발명의 방법의 일 실시형태에서, 암이 없는 기준과 비교하여 더 높은 세프라제의 양 또는 세프라제의 존재는 환자가 암에 걸렸다는 것을 나타낸다.

본 발명에 따른 모니터링 방법은 바람직하게는 제1 시점에서의 제1 시료 및 제2 시점에서의 추가 시료에서 세프라제의 존재 및/또는 정량에 대한 분석을 포함하며, 여기서 암 질환의 퇴행, 진행, 경과 및/또는 발병은 두 시료를 비교함으로써 결정될 수 있다.

환자로부터 일전에 채취한 생물학적 시료와 비교하여 생물학적 시료에서 감소한 세프라제의 분량은 상기 환자에서 암 질환의 퇴행, 긍정적 경과, 예를 들어, 성공적인 치료, 또는 발병 위험성 감소를 나타낼 수 있다.

환자로부터 일전에 채취한 생물학적 시료와 비교하여 생물학적 시료에서 증가한 세프라제의 분량은 상기 환자에서 암 질환의 진행, 부정적 경과, 예를 들어, 재발 또는 전이성 성상, 발병 또는 발병 위험성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 방법의 일 실시형태에서, 세프라제의 존재 및/또는 정량을 분석하는 것은:

(i) 생물학적 샘플을 본 발명의 세프라제 결합 펩티드 또는 본 발명의 세프라제 결합제와 접촉시키고,

(ii) 세프라제 결합 펩티드 또는 세프라제 결합제와 세프라제 간의 복합체의 형성을 검출 및/또는 이의 분량을 결정하는 것을 포함한다.

본 발명의 방법의 일 실시형태에서, 세프라제 결합 펩티드 또는 세프라제 결합제는 적어도 하나의 검출가능한 표지 또는 리포터를 포함하거나 이에 컨쥬게이트된다.

일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 면역분석법의 맥락에서 수행된다.

본 발명의 방법의 일 실시형태에서, 세프라제 결합 펩티드 또는 세프라제 결합제는 고형 지지체 상에 방출가능하게 또는 비-방출가능하게 고정화된다.

본 발명에 따른 세프라제 결합 화합물을 세프라제에 결합하는 것은 세프라제의 기능을 방해, 예를 들어 촉매활성을 억제할 수 있다. 또한, 세프라제 결합 화합물은 치료 작용부, 예를 들어, 방사성 표지, 세포독소, 및 세포독성 효소 등에 부착될 수 있고, 화합물을 세프라제에 결합하는 것은 세프라제를 발현하는 세포 또는 세프라제를 발현하는 세포와 관련된 세포, 특히 암세포를 선택적으로 표적화하여 죽일 수 있다. 일 실시형태에서, 상기 화합물은 종양 세포 성장을 감소 및/또는 종양 세포 사멸을 유도하여 종양-억제 또는 종양-파괴 효과를 갖는다. 따라서, 본원에 기재된 세프라제 결합 화합물은 치료, 특히 암 질환의 예방 및/또는 치료적 처치에 사용될 수 있다.

본 발명의 방법을 사용하여 상기한 바와 같은 암 질환의 양성 진단은 본원에 기재된 치료 방법에 적합한 암 질환을 나타낼 수 있다.

따라서, 본 발명의 다른 목적은 암 질환의 치료적 처치 및/또는 예방적 치료를 위한 수단 및 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 본 발명의 세프라제 결합 펩티드, 본 발명의 세프라제 결합제, 또는 본 발명의 재조합 핵산 또는 본 발명의 숙주세포를 포함하는 약제 조성물을 제공한다.

본 발명의 약제 조성물은 약제적으로 수용 가능한 담체를 포함할 수 있으며 임의로 본원에 기재된 바와 같이 추가적인 물질을 포함할 수 있다.

본 발명은 치료에서의 용도를 위한, 특히 환자의 암을 치료 또는 예방하는 용도를 위한 본 발명의 세프라제 결합 펩티드, 본 발명의 세프라제 결합제, 본 발명의 재조합 핵산, 본 발명의 숙주세포 또는 본 발명의 약제 조성물을 제공한다.

본 발명은 환자에서 암을 표적화시 사용하기 위한 본 발명의 세프라제 결합 펩티드 또는 본 발명의 세프라제 결합제를 제공한다.

본 발명은 환자, 여기서 바람직하게는, 환자는 암을 앓고 있거나 암 발달의 위험이 있는 환자에게 본 발명의 세프라제 결합 펩티드, 본 발명의 세프라제 결합제, 본 발명의 재조합 핵산, 본 발명의 숙주세포 또는 본 발명의 약제 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 환자 치료 방법을 제공한다.

상기 양상의 일 실시형태에서, 세프라제 결합 펩티드 또는 세프라제 결합제는 적어도 하나의 치료 작용부를 포함하거나, 이에 컨쥬게이트된다.

상기 양상의 일 실시형태에서, 암은 세프라제-양성이고/이거나 세프라제를 발현하는 세포를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포는 암 관련 섬유아세포이다.

본 발명의 모든 양상에 따르면, 암은 바람직하게는 유방암, 폐암(pulmonary 또는 lung cancer), 예를 들어 비소세포성 폐암(NSCLC), 대장암, 결장암, 식도암, 두경부암, 위암, 담도암, 췌장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암, 방광암, 자궁내막암 또는 전립선암로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명의 모든 양상에 따르면, 세프라제는 바람직하게는 서열 목록의 SEQ ID NO: 3 또는 4에 따른 아미노산 서열 또는 상기 아미노산 서열의 변이체를 포함한다.

일 양상에서, 본 발명은 본원에 기재된 치료 방법에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 제제를 제공한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 치료 방법에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 약제 조성물을 제공한다.

본원에 기재된 치료법은 외과적 절제 및/또는 방사선 및/또는 전통적인 항암화학요법과 병용될 수 있다.

본 발명의 기타 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명 및 청구 범위로부터 명백해질 것이다.

도 1은 MC-FA-010의 아미노산 서열이다. 디설파이드 가교는 회색 선으로 묘사되어 있다. 시스틴은 노란색으로 강조 표시되어 있으며 N-에서 C- 말단까지 번호(로마 숫자)가 매겨져 있다.
도 2의 A는 MC-FA-010의 알라닌 스캔으로부터의 결합 데이터 요약을 나타낸다. 첫 번째 열은 위치 특정 부모 서열을 보여준다. 두 번째 열 내지 네 번째 열은 단일 사이트 포화 결합 모델을 통해 계산된 명백한 Kd 및 피팅의 계산된 오류 및 R² 값을 보여준다. 보존된/증가된 결합(약한 결합의 손실)은 녹색으로 표시되며, 주황색은 약하고 중간 정도의 결합을 나타내지만 빨간색에서는 결합이 없는 것(결합의 완전한 손실)을 나타낸다. 도 2의 B는 상기한 바와 같이 녹색, 주황색 및 빨간색으로 강조 표시된 위치 특이적 결합을 가진 MC-FA-010의 야생형 서열이다.
도 3은 사람 세프라제에 대한 Trx-MC-FA-010의 결합 분석을 나타낸다. 도 3의 A는 0.39 내지 50nM의 범위에서 사람 세프라제에 대해 결합하는 Trx-MC-FA-010의 ELISA 분석을 나타낸다. 도 3의 B는 경쟁 ELISA 분석이다. 사람 세프라제에 대한 3nM Trx-MC-FA-010의 결합은 0.64 - 3167nM의 범위에서 가용성 1가 MC-FA-010과 경쟁하였다.
도 4a 및 도 4b는 고정화된 사람 세프라제에 대해 결합하는 MC-FA-010의 SPR 분석을 나타낸다. 도 4a의 상위 플롯은 회합 및 해리 단계의 핏팅된 데이터를 나타낸다. 모든 농도의 중첩을 분석하였다. 도 4a의 하위 플롯은 측정되고 핏팅된 커브의 나머지 도면이다. 도 4b는 측정 및 계산된 데이터의 요약을 나타낸다.
도 5는 사람 FAPα에 대한 MC-FA-010의 선택성 분석이다. 도 5의 A는 청록색 또는 회색으로 표시된 DPP VI와 녹색으로 표시된 세프라제의 구조적 중복(Pymol)을 나타낸다. 도 5의 B는 사람 세프라제(rhuSeprase, 진회색 막대) 및 DPP IV (밝은 회색 막대)에 대해 결합하는 Trx-MC-FA-010의 ELISA 분석을 나타낸다. 표시된 데이터 집합은 중복을 기반으로 한다.
도 6은 MC-FA-010 특이성의 조사를 위한 면역형광을 보여준다. 세프라제-과발현 CHO-K1 세포(CHO-K1-세프라제)에 대한 스트렙타아비딘-Cy3-컨쥬게이트된 MC-FA-010의 결합을 분석하였다. 세포들과 인큐베이션 전에 MC-FA-010 및 대조군 Microbody^®을 비오티닐화하고 Cy3-컨쥬게이트된 스트렙타아비딘에 미리 조립하였다. 음성 대조군으로써 무관한 Microbody™ (a-Hepsin-bio) 및 표적 음성 CHO-K1-MOCK 세포를 사용하였다. Microbody™-스트렙타아비딘-Cy3 복합체 (빨간색) 및 핵 국소화 (파란색).
도 7은 생체외 컨디셔닝 후에 파라핀-포매된 CT26 세포주의 염색을 보여준다. 이식하고 14일 후, 모든 섹션을 CAF 마커 항-α-SMA (녹색) 및 핵 국소화에 대한 DAPI (파란색)로 염색하였다. (A)에서는 섹션을 비오티닐화시키고 Cy3-컨쥬게이트된 스트렙타아비딘에 미리 조립한 MC-FA-010로 추가 처리하였다. (B)에서는 섹션을 대조군 Microbody™ MC-Myc-010으로 염색하고, 또한 스트렙타아비딘-Cy3으로도 4량체화하였다.
도 8은 1가 및 4가 MC-FA-010의 결합 특성을 나타낸다. 도 8의 (A)는 사람 세프라제 발현 세포(CHO-K1-세프라제)에 대한 1가 MC-FA-010 (티오레독신-His6 카세트로 구성된다)의 EC₅₀ 값을 결정하기 위한 FACS이다. MC-FA-010은 His 특이적 PE-컨쥬게이트된 항체로 검출하였다. 도 8의 (B)는 사람 세프라제 발현 세포 (CHO-K1-세프라제)에 스트렙타아비딘-APC 결합된 4가 MC-FA-010의 EC₅₀ 값을 측정하기 위한 FACS이다. 측정은 세 번의 독립적인 실험으로 행하였다.
도 9의 A)는 DOTA-(MC-FA-012)₃ 3량체의 개략도를 나타낸다. 상기 분자의 분자량은 하기에 나타낸다. 3량체는 단량성 MC-FA-012 Microbody^® (C)와 비교하여 FACS-기반된 분석 (B)을 사용하여 기능적으로 분석하였다.
도 10은 IRDye 컨쥬게이트된 MC-FA-012를 갖는 세프라제 발현 CHO-이종이식편에서의 종양 표적화를 나타낸다. 사람 세프라제-양성 세포 (CHO-K1-huSeprase)는 Foxn1(nu) 마우스의 옆구리에 피하 접종하였다. 음성 대조군 huSeprase-음성 세포로서 (CHO-K1-MOCK)을 병행하여 사용하였다. 3주 후 마우스를 음성 대조군 (MC-CM-010-IRDye800CW) 또는 MC-FA-010-IRDye800CW 처리군에 무작위로 할당하였다. 각각의 Microbody™ 5nmol를 정맥내 투여하였다. 주사하고 0.5시간 및 2시간 후에 마우스를 안락사시키고 종양을 분리하였다. IR 신호는 Xenogen IVIS 광학 생체내 촬상 시스템 상에서 생체외 측정하였다.
도 11은 rhuSeprase를 결합하는 Microbody 및 이의 3량체의 표면 플라즈몬 공명 분광법을 나타내고, 도 11의 A는 1:1 피팅한, MC-FA-010의 회합 및 해리 스펙트로그램; 도 11의 B는 1:1 피팅한 MC-FA-012의 회합 및 해리 스펙트로그램; 도 11 C는 스펙트로그램: DOTA-(MC-FA-012)₃의 단일-주기 측정 및 1:1 피팅, 다이어그램: 상응하는 정상 상태 분석 및 1:1 피팅; 도 11의 D는 스펙트로그램: AF680-(MC-FA-012)₃의 단일-주기 측정 및 1:1 피팅, 다이어그램: 상응하는 정상 상태 분석 및 1:1 피팅을 보여준다.
도 12는 rhuSeprase를 결합하는 Micobody^® MC-FA-012 변이체의 표면 플라즈몬 공명 분광법을 나타내고, 도 12의 A는 1:1 피팅한, FA8-D06의 회합 및 해리 스펙트로그램. 도 12의 B는 1:1 피팅한, FA7-A05의 회합 및 해리 스펙트로그램; 도 12의 C는 1:1 피팅한, FA8-C09의 회합 및 해리 스펙트로그램; 도 12의 D는 1:1 피팅한, FA8-D03의 회합 및 해리 스펙트로그램; 도 12의 E는 1:1 피팅한, FA8-D05의 회합 및 해리 스펙트로그램; 도 12의 F는 1:1 피팅한, FA8-F04의 회합 및 해리 스펙트로그램; G: 1:1 피팅한, FA8-G12의 회합 및 해리 스펙트로그램을 나타낸다.
도 13은 세프라제-결합 대체 스캐폴드 ET-FA-012 및 MO-FA-012의 표면 플라즈몬 공명 분광법을 나타내고, 도 13의 A는 1:1 피팅한, ET-FA-012의 회합 및 해리 스펙트로그램; 도 13의 B는 MO-FA-012의 회합 및 해리 스펙트로그램을 나타낸다.
도 14는 AF680-(MC-FA-012)₃ 및 AF680-(MC-FA-0116)₃의 생체분포 분석을 나타내고, 도 14의 A는 종양 표적화 및 기관 분포의 생체내 촬상. 도 14의 B는 해부된 종양 및 기관의 생체외 촬상을 보여준다. 화살표는 종양 흡수이다.
도 15는 주사 후 1, 2, 4, 6, 24 및 96시간에, 생체외 측정된 AF680 커플링된 MC-FA-012 및 MC-FA-0116 3량체의 형광 신호의 비교를 보여준다. 종양, 신장, 간 및 폐에서 체중당 총 방사 효율값을 보여준다.
도 16은 세프라제를 발현하는 TNBC 섹션의 면역형광 염색을 나타낸다. 사용된 Microbody는 스트렙타아비딘-Cy3 컨쥬게이트(SA-Cy3)를 통해 4량체화되었다. 활성화된 섬유아세포를 항 평활근 액틴 항체(SMA)로 염색하였다.
도 17은 ^l77Lu-(MC-FA-012)₃의 정맥내 투여 후 30분 내지 24시간에 측정한 기관 활성을 기관 중량당 주입량의 백분율[%ID/g]로 계산하였다.
도 18은 ~10 MBq ⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃의 정맥주사 후의 최대 강도 투영(MIP)을 보여준다(상위 열: 첫 번째 마우스, 하단 열: 두 번째 마우스). CT26-huSeprase 종양의 위치는 화살표로 표시한다.
도 19는 ~10 MBq ⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃의 정맥주사 후의 표준흡수값(SUV)을 보여준다(상위 열: 첫 번째 마우스, 하단 열: 두 번째 마우스). CT26-huSeprase 종양의 위치는 화살표로 표시한다.
도 20은 소형 동물 PET 촬상이고, 선택된 기관의 표준흡수값(마우스 1)을 나타내고, Kidneys lft: 좌측 신장, Kidneys rt: 우측 신장; Tumor CT26 wt: CT26 종양; Tumor CT26-FAP: CT26-huSeprase 종양.
도 21은 환자 1에서 투여 1시간 및 3시간 후에(SUV max) ⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃의 기관 분포(rt = 우측, lft = 좌측)을 보여준다.
도 22는 환자 2에서 투여 1시간 및 3시간 후에(SUV max) ⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃의 기관 분포(rt = 우측, lft = 좌측)을 보여준다.
도 23은 환자 3에서 투여 1시간 및 2시간 후에(SUV max) ⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃의 기관 분포(rt = 우측, lft = 좌측)을 보여준다.
도 24는 환자 4에서 투여 1시간 및 2.5시간 후에(SUV max) ⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃의 기관 분포(rt = 우측, lft = 좌측)을 보여준다.
도 25는 환자 5에서 투여 1시간 및 3시간 후에(SUV max) ⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃의 기관 분포(rt = 우측, lft = 좌측)을 보여준다.
도 26은 64　MBq ⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃ 주사 1시간 후 예시 PET 스캔(환자 3)의 축 횡단도, 관상도, 및 시상도이다. 스캔은 원발성 췌장 종양 및 간 전이에 대한 명확한 이해를 보여준다. 종양과 전이의 위치는 흰 동그라미로 표시하였다.
도 27은 세프라제 특이적 항체로 염색된 췌장 암종 및 정상 조직의 단면이다.
도 28은 세프라제 특이적 항체로 염색된 삼중 음성 유방암(TNBC) 및 정상 조직의 섹션을 보여준다.
도 29는 세프라제 특이적 항체로 염색된 폐 암종 및 정상 조직의 섹션을 보여준다.

이하에 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 방법론, 프로토콜 및 시약들이 다양한 만큼 본 발명이 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약들로 한정되는 것이 아님을 이해하여야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어들은 특정 구현예를 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 한정하려는 의도로 해석되어서는 아니되며 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 한정되는 것으로 이해되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

이하에서, 본 발명의 구성 요소들을 설명한다. 이 구성 요소들은 특정 구현예와 함께 열거되지만, 이들은 여하한 방식 및 여하한 횟수로든 조합되어 부가적인 구현예를 구현할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 다양하게 기재된 구현예 및 바람직한 구현예들은 다양하게 설명된 구체예와 바람직한 구현예들은 단지 명시적으로 설명된 구현예들만으로 본 발명을 한정짓는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 명세서는 명시적으로 기재된 구현예들과 개시된 및/또는 바람직한 여하한 수의 구성 요소들을 조합하는 구현예들을 뒷받침하고 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 이 출원의 모든 설명된 멤버들의 여하한 순열 및 조합들은 문맥상 달리 지시되지 않는 한, 본 출원의 설명에 의해 개시된 것으로 간주되어야 한다.

바람직하게, 본원에 사용되는 용어는 문헌 "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Koelbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland, (1995)에 기재되어 있는 바와 같이 정의된다.

본 발명의 실시는 달리 명시되지 않는 한, 본 분야의 문헌에서 설명되어 있는 종래의 화학적, 생화학적, 세포 생물학적, 면역학적 방법, 및 재조합 DNA 기술의 상법을 채용할 것이다(예컨대, 참고로, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

본 명세서 및 하기의 특허청구범위 전반에서, 문맥이 달리 요구하지 않는다면, 단어 "포함하다", 및 "포함한다"와 "포함하는"과 같이 변형어는 명시된 멤버, 정수 또는 단계, 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 군을 포함하는 것을 의미하되, 비록 일부 구현예에서 그러한 다른 멤버, 정수 또는 단계, 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 군을 배제할 수도 있지만, 임의의 다른 멤버, 정수 또는 단계, 멤버, 정수 또는 단계들의 군을 배제하는 것을 의미하지 않는 것으로 이해될 것이며, 즉 본 발명의 청구대상은 명시된 멤버, 정수 또는 단계, 또는 멤버, 정수 또는 단계들의 군을 포함하는 것이다. 본 발명을 설명하는 문맥에서(특히, 본 청구범위의 문맥상) 사용되는 용어 "하나"와 "한(부정관사)" 및 "정관사" 및 유사한 참조용어는 본원에서 달리 명시되지 않거나 문맥에 의해 분명하게 부정되지 않는 한, 단수와 복수 둘 모두를 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 본 발명의 값들을 범위로 인용하는 것은 단지 해당 범위에 속하는 각각의 별개의 값들을 개별적으로 손쉽게 칭하기 위한 것이다. 본원에서 달리 명시되지 않으면, 각각의 개별 값은 본원에서 개별적으로 지칭되는 것처럼 본 명세서 내로 편입된 것으로 간주한다. 본원에서 설명되는 모든 방법은 본원에서 달리 명시되지 않거나 문맥에 의해 명백하게 부정되지 않으면, 적절한 임의의 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된, 임의 및 모든 실례, 또는 예시적 어법(가령, "예를 들면")의 이용은 단지 본 발명을 더욱 잘 조명하기 위해 의도된 것이고, 청구되는 본 발명의 범위에 한정을 달리 부가하는 것은 아니다. 본 명세서에서 어떠한 어법도 발명의 실시에 필수적인 임의의 청구되지 않은 구성 요소를 지칭하는 것으로 해석되어서는 안된다.

본 명세서의 본문 전반에 걸쳐 몇가지 문헌들이 인용된다. 본원에서 인용된 각각의 상기 또는 하기 문헌들(모든 특허, 특허출원, 과학간행물, 제조업체의 설명서, 지침서 등)은 그 내용 전체가 그 이상 또는 그 이하를 불문하고 본원에 참조 병합된다. 이들 문헌들이 선행발명임을 이유로, 본 발명이 그러한 개시내용에 선행한다고 하지 못함을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

본 발명은, 세프라제 결합 화합물 또는 세프라제 결합 펩티드와 같은 제제 또는 1개 이상의 세프라제 결합 펩티드를 포함하는 제제에 관한 것이다.

또한, 섬유아세포 활성화 단백질 알파(FAPα) 또는 170kDa 흑색종 막-결합 젤라티나제로서 알려진 세프라제는 사람에서 FAP 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. 상기 단백질은 내재막 세린 펩티다아제이고, 젤라티나제 활성을 갖는 것으로 보여진다.

세프라제는 단백질 가수분해성 활성화 170kDa 호모다이머로서 작용하는 것으로 나타내고, 2개의 97kDa 서브유닛들로 이루어진다. 이는 디펩티딜펩티다제 IV(DPP IV/CD26) 및 관련된 타입 II 막관통 프롤릴 세린 펩티다아제를 포함하는, 그룹 타입 II 내재성 세린 프로테아제의 구성원이고, 세포표면에서 그 작용 메카니즘을 발휘한다. 세프라제는 S9B 프롤릴 올리고펩티다아제 서브패밀리의 구성원이다. S9B 서브패밀리의 다른 구성원들로는 DPP IV, DPP8 및 DPP9이 있다.

세프라제는 DPP IV와 가장 밀접하게 관련이 있고 이들 아미노산의 약 50%를 공유한다. DPP IV 및 세프라제는 서로 복합체를 형성하고 다른 막 관련 분자와 상호작용하는 이들의 능력으로 인해 다양한 기능을 나타낸다.

세프라제는 종양 진행에서 이중 기능을 가진다. 세프라제의 단백질분해 활성은 세포외기질에 대한 세포 침입을 촉진하고 또한 종양 성장 및 증식을 도와주는 것으로 보여진다. 이는 상피암의 반응성 간질 섬유아세포, 상처를 치유하는 육아조직, 및 뼈와 연조직 육종의 악성세포에서 선택적으로 발현된다. 세프라제 발현은 모든 사람 암종의 90% 이상이 활성화된 간질 섬유아세포에서 나타난다. 간질 섬유아세포는 암종의 발생, 성장 및 전이에 중요한 역할을 한다.

본 발명에 따르면, 용어 "세프라제"는 바람직하게는 사람 세프라제에 관한 것이다.

바람직하게는, 용어 "세프라제"는 바람직하게는 서열 목록의 핵산 서열 SEQ ID NO: 1 또는 2, 또는 상기 핵산 서열의 변이체로 이루어진 것을 포함하는 핵산에 관한 것이고 이 핵산에 의해 암호화되는 단백질에 관한 것이며, 바람직하게는 서열 목록의 아미노산 서열 SEQ ID NO: 3 또는 4, 또는 상기 아미노산 서열의 변이체로 이루어진 것을 포함하는 단백질에 관한 것이 바람직하다.

세프라제의 아미노산 서열은 20개 아미노산의 막관통 도메인 및 734개 아미노산의 세포밖 도메인에 의해 이어진 6개 아미노산의 세포질 꼬리를 갖는 타입 II 내재막 단백질로 예측된다. 카복실 말단은 비전형적인 세린 프로테아제 디펩티딜펩티다제 IV(DPP IV)의 것과 상동인(68% 동일성) 추정성 촉매 영역(~200개 아미노산)을 함유한다. 보존된 세린 프로테아제 모티프 G-X-S-X-G는 G-W-S-Y-G로서 존재한다.

세프라제는 다양한 기원의 암, 예컨대 유방암, 폐암(pulmonary 또는 lung cancer), 예를 들어 비소세포성 폐암(NSCLC), 대장암, 결장암, 식도암, 두경부암, 위암, 담도암, 췌장암, 신장암, 자궁경부암, 난소암, 방광암, 자궁내막암 또는 전립선암에서 발현된다. 세프라제는 원발성 종양 및 전이의 진단, 예방 및/또는 치료를 위한 중요한 표적이다.

본 발명의 세프라제 결합제는 세프라제에 결합하는 능력, 즉 세프라제에 존재하는 에피톱에 결합하는 능력, 바람직하게는 세프라제의 세포밖 도메인 내에 위치하는 에피톱, 특히 세프라제의 아미노산 위치 27 내지 760에 결합하는 능력을 갖는다. 특히 실시형태에서, 본 발명의 세프라제 결합제는 DPP IV 상에는 존재하지 않는 세프라제 상의 에피톱에 결합한다.

세프라제 결합제는 바람직하게는 세프라제에는 결합하지만, DPP IV에는 결합하지 않는다. 바람직하게는, 세프라제 결합제는 세프라제에 특이적이다. 바람직하게는, 세프라제 결합제는 세포표면에 발현하는 세프라제에 결합한다. 특히 바람직한 실시형태에서, 세프라제 결합제는 살아있는 세포의 표면 상에 존재하는 세프라제의 천연 에피톱에 결합한다.

용어 "에피톱"은 결합제에 의해 인식되는 분자의 일부분 또는 부분을 의미한다. 예를 들면, 에피톱은 결합제에 의해 인식되는, 분자 상의 분리된 3차원 부위이다. 에피톱은 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 구성되며 일반적으로 특이적 3차원 구조 특성뿐만 아니라 특이적 전하 특성을 가지고 있다. 구조적 및 비-구조적 에피톱은 변성 용매 존재 하에서 전자는 결합하고, 후자는 결합을 상실한다는 점에서 구별된다. 단백질의 에피톱은 바람직하게는 상기 단백질의 연속적 또는 불연속적 부분을 포함하고, 바람직하게는 5~100개, 바람직하게는 5~50개, 더욱 바람직하게는 8~30개, 가장 바람직하게는 10~25개 아미노산의 길이이고, 예를 들면, 에피톱은 바람직하게는 길이가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25개 아미노산일 수 있다.

본 발명에 따르면, 용어 "세프라제 결합제" 또는 "세프라제 결합 화합물"은 세프라제에 대한 결합능력을 가진 임의의 화합물(분자의 복합체를 포함한다)을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 결합제는 본 발명의 적어도 하나의 세프라제 결합 펩티드이거나 이를 포함한다. 세프라제 결합제는 본 발명의 적어도 2개 이상의 세프라제 결합 펩티드들(동일하거나 상이할 수 있다)을 포함하는 경우에, 이들 펩티드들은 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 연관될(즉, 결합) 수 있다. 세프라제 결합제들은 다른 임의의 화합물 또는 일부분 예컨대 표지 또는 치료 작용부에 공유결합으로 또는 비-공유결합으로 연관된 1개 이상의 세프라제 결합 펩티드들을 포함할 수 있다.

본 발명에 따르면, 제제는 하기 소정의 표적에 대하여 유의한 친화도를 갖고 표준 검정법에서 하기 소정의 표적에 결합하는 경우에 세프라제와 같은 소정의 표적에 결합할 수 있다. "친화도" 또는 "결합 친화도"는 종종 평형 해리상수(K_D)에 의해 측정된다. 바람직하게는, 용어 "유의적 친화도"는 해리상수(K_D)가 10^-5 M 이하, 10^-6 M 이하, 10^-7 M 이하, 10^-8M 이하, 10^-9M 이하, 10^-10M 이하, 10^-11M 이하, 또는 10^-12M 이하인 소정의 표적에 대한 결합을 의미한다.

제제는 상기 표적에 대해 유의적 친화도를 나타내지 않으면 표적에 (실질적으로) 결합할 수 없고, 표준 검정법에서 상기 표적에 유의적으로 결합하지 않고, 특히 검출가능하게 결합하지 않는다. 바람직하게는, 제제는 2 이하, 바람직하게는 10, 더욱 바람직하게는 20, 특히 50 또는 100μg/ml 이상의 농도로 존재하면 상기 표적에 검출가능하게 결합하지 않는다. 바람직하게는, 제제가 결합 가능한 소정의 표적에 결합하는 것에 대한 K_D보다 적어도 10-배, 10²-배, 10³-배, 10⁴-배, 10⁵-배, 또는 10⁶-배 초과인 K_D를 갖는 상기 표적에 결합하면, 제제는 표적에 대한 유의적 친화도를 갖지 않는다. 예를 들면, 제제가 결합 가능한 표적에 대한 제제의 결합에 대한 K_D가 10^-7M이면, 제제가 유의적 친화도를 갖지 않는 경우에 표적에의 결합에 대한 K_D는 적어도 10^-6M, 10^-5M, 10^-4M, 10^-3M, 10^-2M, 또는 10^-1M일 수 있다.

본 발명에 따르면, 용어 "결합"은 바람직하게는 특이적 결합에 관한 것이다.

"특이적 결합"은 특히 다른 표적에 대한 결합과 비교하여 제제가 표적에 더 강하게 결합하는 것을 의미한다. 제제는 제2표적에 대한 해리상수보다 낮은 해리상수(K_D)를 갖는 제1표적에 결합하면 제2표적에 비해 제1표적에 더 강하게 결합한다. 바람직하게는 제제가 특이적으로 결합하는 표적에 대한 해리상수(K_D)는 제제가 특이적으로 결합하지 않는 표적에 대한 해리상수(K_D)보다 10²-배 초과, 10³-배, 10⁴-배, 10⁵-배, 10⁶-배, 10⁷-배, 10⁸-배, 10⁹-배, 또는 10¹⁰-배 미만이다.

바람직하게는, 제제는 소정의 표적에 결합 가능하지만 다른 표적에 결합 가능하지 않는 것, 즉 표준 검정법에서 다른 표적에 대해 유의적 친화도가 없고 다른 표적에 유의적으로 결합하지 않으면 상기 소정의 표적에 특이적이다. 본 발명에 따르면, 제제가 세프라제에 결합 가능하지만 (실질적으로) 다른 표적 예컨대 DPP IV에 결합 가능하지 않으면 세프라제에 대해 특이적이다. 바람직하게는, 이러한 다른 표적에 대한 친화도 및 결합이 세프라제와 관련이 없는 단백질, 예컨대 소 혈청 알부민(BSA), 카세인, 사람 혈청 알부민(HSA) 또는 비-세프라제 막관통 단백질, 예컨대 MHC 분자 또는 트랜스페린 수용체 또는 다른 임의의 특정 폴리펩티드에 대한 친화도 및 결합이 유의적으로 넘어서지 않으면 제제는 세프라제에 대해 특이적이다. 바람직하게는, 특이적이지 않은 표적에 결합하는 것에 대한 K_D보다 적어도 10²-배, 10³-배, 10⁴-배, 10⁵-배, 10⁶-배, 10⁷-배, 10⁸-배, 10⁹-배, 또는 10¹⁰-배 미만인 K_D를 갖는 표적에 결합하면 제제는 소정의 상기 표적에 대해 특이적이다.

표적에 대한 제제의 결합은 적합한 임의의 방법을 사용하여 실험적으로 결정될 수 있고, 예를 들어, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992), 및 본원에 기재된 방법을 참조한다. 친화도는 평형 투석법과 같은 통상적인 기술을 사용하여 용이하게 결정될 수 있고, 제조자에 의해 개설된 일반적인 절차를 사용하여 표면 플라즈몬 공명 분석(예를 들어 Biacore)을 사용함으로써 용이하게 결정될 수 있고, 방사성 표지된 표적 항원을 사용하는 방사면역측정법, 또는 숙련된 당업자에게 공지된 다른 방법에 의해 수행될 수 있다. 친화도 데이터는, 예를 들어 Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949)의 방법에 의해 분석될 수 있다. 특정 상호작용의 측정된 친화도는 상이한 조건, 예를 들어, 염 농도, pH 하에서 측정되면 변할 수 있다. 따라서, 친화도 및 다른 결합 매개변수, 예를 들어 K_D, IC₅₀의 측정은 결합제 및 표적의 표준화된 용액 및 표준화된 완충액을 가지고 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 용어 "세프라제-양성 암" 또는 유사한 용어는 세프라제를 포함하거나 이에 관련된 암, 특히 세프라제를 발현하는 세포를 포함하는 암, 바람직하게는 상기 세포의 표면 상에 발현하는 것을 의미한다.

본 발명에 따르면, 암은 세프라제를 포함하거나 이에 관련되는데, 세프라제가 상기 암에 공간적으로 연결된 경우, 특히 세프라제가 상기 암에 존재하는 경우이다. 바람직하게는, 세프라제를 포함하거나 이에 관련되는 암은 세프라제를 발현하는 세포를 포함하고, 바람직하게는 상기 세포의 표면 상에 세프라제를 발현하는 세포를 함유한다. 상기 세포는 암 세포 또는 암과 관련된 세포 예컨대 섬유아세포, 특히 암 관련 섬유아세포일 수 있다.

"세포 표면"은 본 기술분야에서 통상적인 의미에 따라 사용되며, 따라서 단백질 및 다른 분자에 의한 결합이 가능한 세포 외부를 포함한다.

세프라제는 상기 세포의 표면에 위치하고 세포에 첨가된 세프라제-특이적 제제에 의한 결합이 가능한 세포 표면에 발현된다.

본 발명의 문맥에서 용어 "세포밖 도메인"은 세포의 세포밖 공간을 향하는, 바람직하게는 상기 세포의 외부로부터, 예를 들어 세포의 외부에 존재하는 항체와 같은 결합제에 의해 결합이 가능한 단백질과 같은 분자의 일부를 의미한다. 바람직하게는, 상기 용어는 하나 이상의 세포밖 루프 또는 도메인 또는 그의 단편을 의미한다.

용어 "일부분" 또는 "단편"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 연속적인 요소를 의미한다. 단백질 서열의 일부분 또는 단편은 바람직하게는 단백질 서열 중의 적어도 6개, 특히 적어도 8개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 50개 또는 적어도 100개의 연속적인 아미노산을 포함한다.

용어 "부분(portion)"은 연속적 및/또는 비연속적 요소를 의미한다. 단백질 서열의 부분은 바람직하게는 단백질 서열 중의 적어도 6개, 특히 적어도 8개, 적어도 12개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 50개, 또는 적어도 100개의 연속 및/또는 비연속 아미노산을 포함한다.

본 발명에 따르면, 발현 수준이 검출 한계 미만인 경우 및/또는 발현 수준이 세포에 첨가된 세프라제-특이적 결합제에 의한 결합을 허용하기에는 너무 낮은 경우, 세프라제는 세포에서 (실질적으로) 발현되지 않는다.

본 발명에 따르면, 발현 수준이 검출 한계를 초과하는 경우 및/또는 발현 수준이 세포에 첨가된 세프라제-특이적 결합제에 의한 결합을 허용하기에 충분히 높은 경우, 세프라제가 세포에서 발현된다. 바람직하게는, 세포에서 발현되는 세프라제는 상기 세포의 표면 상에 발현되거나 노출된다.

시스틴 결절은 적어도 3개의 디설파이드 가교(시스테인 분자의 쌍으로 형성된다)를 함유하는 단백질 구조 모티프이다. 이는 2개의 디설파이드 결합에 의해 형성되는 내장된 고리 및 제3디설파이드 결합에 의해 나사 결합되는 연결 백본 세그먼트를 포함한다. 이 구조는 베타-시트 구조와 관련되는 것이 바람직하다. 시스틴 결절을 함유하는 펩티드는 바람직하게는 25-60, 바람직하게는 25-50 또는 25-40개 아미노산 잔기의 길이인 것이다.

시스틴 결절은 많은 종에 걸쳐 많은 펩티드 또는 단백질에서 발생하며 상당한 구조 안정성을 제공한다. 디설파이드 결합의 형태가 상이한 시스틴 결절의 세 가지 유형이 있는데, 시스틴 결절(GFCK), 억제제 시스틴 결절(ICK) 및 환형 시스틴 결절, 또는 사이클로티드(cyclotide)가 있다.

억제제 시스틴 결절(ICK) 또는 크노틴(knottin)은 세개의 디설파이드 가교를 포함하는 단백질 구조 모티프이다. 이들 간의 폴리펩티드 섹션과 함께, 2개의 디설파이드(각각 제1 및 제4 시스테인과 제2 및 제5 시스테인을 연결한다)는 제3 디설파이드 결합(제3 및 제6 시스테인을 순서대로 연결한다)이 통과하는 루프를 형성하여 결절을 형성한다. 모티브는 거미류와 연체동물과 같은 무척추동물의 독소에 흔하다. 또한, 상기 모티프는 식물에서 발견되는 일부 억제제 단백질에서도 발견된다.

따라서, 본 발명에 따르면, ICK 모티프는 제3 디설파이드 결합인 CysIII-CysVI가 관통하는 고리를 형성하는, 2개의 내부시스테인 골격 세그먼트 및 이의 연결 디설파이드 결합인 CysI-CysIV 및 CysII-CysV를 포함한다.

ICK 모티프는 환형 시스틴 결절 또는 사이클로티드와 유사하지만, 후자 패밀리에 존재하는 폴리펩티드 백본의 고리화가 결여되어 있다. 성장 인자 시스틴 매듭(GFCK)은 모티프를 공유하지만, 그 형태는 루프를 통과하는 제1과 제4 시스테인 (제2 및 제5 시스테인과 제3 및 제6 시스테인 사이에 각각 형성된다) 사이의 결합이다.

사이클로티드는 2개의 주요 구조 서브패밀리에 속한다. 2개 중 덜 일반적인 뫼비우스 사이클로티드는 루프 5에 시스-프롤린을 포함하고 있는데, 팔찌형 사이클로티드는 아니지만, 국부적인 180° 백본 트위스트를 포함한다. 트립신 억제제 사이클로티드는 서열 변화와 자연 활성에 기반하여 그들 자신의 패밀리에 분류된다. 트립신 억제제 사이클로티드는 다른 사이클로티드보다 크노틴 또는 억제제 시스틴 결절로 알려진 스쿼시 식물로부터 비-환형 트립신 억제제의 패밀리와 더 상동성이 있다.

MCoTI-I 및 MCoTI-II는 가시털형 박인 목별자의 종자로부터의 천연 폴리펩티드이다. 이들 폴리펩티드는 트립신 유사 프로테아제의 억제제이며 아미노- 및 카복시-말단을 연결하는 추가 고리 및 3개의 보존된 디설파이드 결합의 결절된 배열을 포함한다. 시스틴 결절은 선형 펩티드 서열의 CysICysIV 및 CysII-CysV가 제3 디설파이드 결합인 CysIII-CysVI에 의해 관통되는 고리를 형성하는 3개의 분자내 디설파이드 결합에 의해 정의된다. 이러한 배치는 탁월한 열 안정성 및 단백질 분해 안정성을 나타내는, 잘 정의되고 매우 안정한 스캐폴드를 제공한다. 구조적 유사성 및 일반적인 생물학적 활성, 즉 트립신 패밀리의 프로테아제의 저해로 인해, MCoTI-I 및 MCoTI-II는 작은 프로테아제 억제제의 스쿼시 억제제 시스틴-결절(ICK) 패밀리로 분류되었다. 이 패밀리의 구성원은 3개의 분자내 디설파이드 결합에 의해 결합된 작은 삼중 사슬 β-시트와 짧은 3₁₀ 나선을 형성하는 개방 사슬 분자이며 시스틴-결절 골조를 생성한다. MCoTI-I 및 MCoTI-II는 환형인 스쿼시 억제제의 대형 패밀리 중 유일하게 알려진 구성원이다. 고리화 루프가 부족한 MCoTI-II의 개방 사슬 변이체가 합성된다.

본 발명에 따르면, 본원에 기재된 펩티드는 본 기술분야에 공지된 화학적 합성 방법에 의해 분리된 펩티드로서, 또는 다른 펩티드 또는 폴리펩티드의 일부로서 합성적으로 제조될 수 있다. 대안적으로, 펩티드는 펩티드를 생산하는 미생물에서 제조될 수 있으며, 그 후 분리되고, 원한다면 추가로 정제된다. 따라서, 펩티드는 박테리아, 효모 또는 진균과 같은 미생물에서 생산될 수 있거나; 포유류 또는 곤충 세포와 같은 진핵생물 세포; 또는 아데노바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스바이러스, Simliki forest 바이러스, 바큘로바이러스, 박테리오파지, 신드비스바이러스 또는 센다이바이러스와 같은 재조합 바이러스 벡터에서 생산될 수 있다. 펩티드 생산에 적합한 박테리아는 Escherichia coli, Bacillus subtilis, 또는 펩티드를 발현 가능한 다른 임의의 박테리아를 포함한다. 펩티드 발현에 적합한 효모 유형은 Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida, 또는 펩티드를 발현 가능한 다른 임의의 효모를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기한 박테리아, 재조합 바이러스 벡터, 진핵 세포를 사용하여 펩티드를 생산하는 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있다.

펩티드를 생산하기 위해, 펩티드를 암호화하는 핵산은 바람직하게는 플라스미드에 존재하고, 핵산은 미생물에서 펩티드의 발현에 영향을 주는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 적합한 프로모터는 T7 파지 프로모터, T3 파지 프로모터, β- 갈락토시다아제 프로모터 및 Sp6 파지 프로모터를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 펩티드를 분리하고 정제하는 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며 겔 여과, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또는 원심분리와 같은 방법을 포함한다.

자체 또는 융합 펩티드의 일부로서 본 발명의 펩티드는 이종성 펩티드 또는 단백질에 컨쥬게이트될 수 있다. 이러한 이종성 단백질은 소 혈청 알부민(BSA)과 같은 담체 단백질, 그리고 호스래디쉬 퍼옥시데이즈 또는 알칼리성 인산가수분해효소와 같은 리포터 효소를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 또한, 펩티드 또는 상기 펩티드를 포함하는 융합 펩티드는 플루오레세인 또는 R-피코에리트린을 포함하지만 이에 제한되지 않는 형광 리포터 분자에 화학적으로 컨쥬게이트될 수 있다. 펩티드 및 융합 펩티드에 담체 단백질, 효소 및 형광 리포터 분자를 컨쥬게이팅하는 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있다.

펩티드의 분리를 용이하게 하기 위해, 융합 폴리펩티드를 형성할 수 있는데, 여기서 이종성 폴리펩티드 또는 폴리히스티딘, 바람직하게는 6개의 히스티딘 잔기와 같은 이종성 태그에 번역으로 융합(공유적으로 결합)되어 융합 폴리펩티드의 단순화된 회수가 가능해질 수 있고, 그 분리는 예를 들어 친화성 크로마토그래피 또는 금속 친화성 크로마토그래피, 바람직하게는 니켈 친화성 크로마토그래피에 의한 분리할 수 있다. 일부 경우에서는 정제 후 태그를 제거하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 융합 폴리펩티드는 펩티드와 이종성 태그 사이의 접합부에 절단 부위를 포함하는 것으로 고려된다. 절단 부위는 부위에서의 아미노산 서열에 특이적인 효소로 절단되는 아미노산 서열로 구성된다.

본원에 기재된 세프라제 결합제는 세프라제 또는 세프라제 항체의 존재 또는 정량을 분석하기 위한 검정에 사용될 수 있다. 이러한 분석은 면역검출을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 방식으로 수행될 수 있으며, ELISA, 특히 펩티드 ELISA, 경쟁적 결합 분석, 및 RIA 등을 포함한다. 본 발명의 방법은 세프라제 또는 세프라제 항체의 정량적 및/또는 정성적 평가, 예를 들어 절대 및/또는 상대 평가를 가능하게 한다.

일반적으로, 검정은 효소-결합 면역흡착분석(ELISA) 실시형태를 사용하여 수행된다.

본원에 사용된 용어 "효소-결합 면역흡착분석 또는 ELISA"는 다중 웰 플레이트 형식(일반적으로 플레이트당 96-웰)에서 시료, 혈장, 혈청 또는 세포/조직 추출물로부터 단백질 농도를 정량적으로 또는 반정량적으로 결정하는 방법에 관한 것이다. 대체로, 용액 중의 단백질은 ELISA 플레이트에 흡착된다. 대상 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 플레이트를 프로브하는데 사용할 수 있다. 차단 및 세척 방법(IHC의 경우)을 최적화함으로써 백그라운드를 최소화하고 양성 및 음성 대조군의 존재를 통해 특이성을 보장한다. 검출 방법은 일반적으로 비색 또는 화학발광 기반이다.

미량정량판은 복수의 웰을 함유하여 제공될 수 있고, 여기서 제1웰 또는 일련의 웰이 그의 표면에 고정화된 세프라제에 대한 단일클론 항체를 함유한다. 시료는 결합된 단일클론 항체를 함유하는 웰에 첨가될 수 있다. 시료의 세프라제는 단일클론 항체에 결합한다. ELISA는 항체 복합체가 형성되기에 충분한 시간 동안 인큐베이션된다. 본 발명의 펩티드를 추가로 첨가할 수 있다. 상기 펩티드는 융합 폴리 펩티드의 일부일 수 있다. 그 후, 웰을 세척하여 결합되지 않은 임의의 물질을 제거한다. 이어서, 표지된 항체 또는 융합 폴리펩티드에 결합하여 검출될 수 있는 복합체를 형성하는 리포터 분자에 컨쥬게이트된 항체와 함께 웰을 인큐베이션할 수 있다. 표지 또는 리포터로부터의 검출가능한 신호는 시료에 세프라제를 함유한다는 것을 나타내지만, 신호의 부재는 시료에 세프라제를 함유하지 않음을 나타낼 수 있다. 융합 폴리펩티드가 리포터 효소, 예컨대 알칼리성 인산가수분해효소와 같은 표지 또는 리포터 분자를 포함하는 경우, 항체 복합체는 표지된 항체 필요없이 직접 검출할 수 있다.

대안적으로, 미량정량판은 복수의 웰을 함유하여 제공될 수 있고, 여기서 제1웰 또는 일련의 웰이 그의 표면에 고정화된 담체 단백질 또는 융합 폴리펩티드에 컨쥬게이트될 수 있는 본 발명의 펩티드를 함유한다. 시료는 결합된 펩티드를 함유하는 웰에 첨가될 수 있다. 시료의 세프라제와 웰 표면에 결합된 펩티드는 복합체가 형성되기에 충분한 시간 동안 인큐베이션된다. 그 후, 웰을 세척하여 결합되지 않은 임의의 물질을 제거한다. 웰 내의 고정화된 펩티드에 결합된 세프라제의 양은, 검출될 수 있는 복합체를 형성하기 위해 세프라제에 결합하는 리포터 분자에 컨쥬게이트된 항체 또는 표지된 항체를 웰과 함께 인큐베이팅함으로써 결정된다. 리포터로부터 검출가능한 신호는 시료에 세프라제를 함유한다는 것을 나타내지만, 신호의 부재는 시료에 세프라제를 함유하지 않음을 나타낸다. 신호 강도는 시료의 세프라제 농도를 추정할 수 있다.

본 발명에 따르면, 검정될 세프라제는 세포 표면에서 발현될 수 있다.

또한, 본 발명의 펩티드는 세프라제에 대한 항체의 존재를 검출하는 방법에 사용될 수도 있다. 이들 방법을 시행하기에 적합한 면역측정법을 설계하는 데에는 많은 변화가 있을 수 있으며, 다양한 면역측정법이 본 기술분야에 공지되어있다. 적합한 면역분석 프로토콜은 예를 들어 경쟁이나 직접적 반응 또는 샌드위치 타입 분석에 기초할 수 있다. 사용된 면역분석 프로토콜은 또한 예를 들어, 고형 지지체를 사용하거나, 또는 면역침전에 의해 수행될 수 있다. 분석은 표지된 펩티드의 사용을 포함할 수 있으며, 표지는 예를 들어 형광, 화학 발광, 방사성 또는 염료 분자 일 수 있다. 특히 바람직한 검정법은 ELISA 검정법과 같은 효소가 표지되고 매개된 면역검정법이다.

따라서, 펩티드는 시료에서 세프라제에 대한 항체를 결정하기 위한 ELISA 분석과 같은 분석에도 사용될 수 있다. 이 목적을 위해, ELISA 플레이트의 웰은 펩티드로 도포할 수 있다. 웰 표면에 결합된 세프라제 및 펩티드는 복합체가 형성되기에 충분한 시간 동안 인큐베이팅될 수 있다. 이어서, 혈장과 같은 시료를 첨가할 수 있고, 1차 항체에 대해 유도된, 표지된 2차 항체로 세프라제 특이적 항체(1차 항체)의 검출을 수행할 수 있다.

본원에 기재된 분석 시약으로서 사용되는 경우, 본 발명의 펩티드는 표지에 컨쥬게이트될 수 있다.

본 발명에 따르면, 표지는 그 존재가 용이하게 검출될 수 있는 임의의 독립체이다. 바람직하게는 표지는 직접 표지이다. 직접 표지는 자연 상태에서 육안으로 또는 광학 필터 및/또는 적용된 자극, 예를 들어 형광을 촉진하는 UV광의 도움으로 용이하게 볼 수 있는 독립체이다. 예로서는 방사성, 화학발광, 전기활성(예컨대 산화환원 표지), 및 형광 화합물이 포함된다. 또한, 염료 졸, 금속 졸(예를 들어 금) 및 착색된 라텍스 입자와 같은 직접 미립자 표지도 매우 적합하며, 형광 화합물과 함께인 것이 바람직하다. 이들 옵션 중에서, 착색된 라텍스 입자 및 형광 화합물이 가장 바람직하다. 작은 구역 또는 체적 내의 표지의 농도는 용이하게 검출가능한 신호를 발생시켜야 하고, 예를 들어 강하게 착색된 지역을 들 수 있다. 또한, 효소와 같은 간접 표지, 예를 들어 알칼리성 인산가수분해효소 및 호스래디쉬 퍼옥시다제를 사용할 수 있지만, 이들은 일반적으로 가시적 신호가 검출되기 전에 하나 이상의 현색 시약 예컨대 기질의 첨가가 필요하다.

본 발명에 따르면, 표지는 (i) 검출가능한 신호를 제공하거나; (ii) 예를 들어 FRET(형광공명에너지전이)과 같이, 제1 또는 제2 표지에 의해 제공된 검출가능한 신호를 변형시키기 위해 제2 표지와 상호작용하거나; (iii) 전하, 소수성, 형태, 또는 다른 물리적 매개변수에 의해, 이동성, 예를 들어 전기영동이동도에 영향을 주거나; 또는 (iv) 포획 일부분, 예를 들어 친화도, 항체/항원, 또는 이온성 복합화를 제공하는 기능을 할 수 있다. 표지로서 적합한 것으로는 형광 표지, 발광 표지, 발색단 표지, 방사성동위원소 표지, 동위원소 표지, 바람직하게는 안정 동위원소 표지, 동중원소 표지, 효소 표지, 입자 표지, 특히 금속입자 표지, 자성입자 표지, 폴리머입자 표지, 비오틴과 같은 작은 유기 분자, 수용체의 리간드 또는 세포 접착 단백질 또는 렉틴과 같은 결합 분자, 결합제의 사용에 의해 검출될 수 있는 핵산 및/또는 아미노산 잔기를 포함하는 표지-서열 등과 같은 구조물을 들 수 있다. 표지는 비제한적인 방식으로 황산 바륨, 이오세탐산(iocetamic acid), 이오파노산(iopanoic acid), 칼슘 이포데이트(calcium ipodate), 나트륨 디아트리조에이트(sodium diatrizoate), 메글루민 디아트리조에이트(meglumine diatrizoate), 메트리즈아미드(metrizamide), 나트륨 티로파노에이트(sodium tyropanoate) 및 불소-18 및 탄소-11과 같은 양전자 방출체, 요오드-123, 테크네튬-99m, 요오드-131 및 인듐 111과 같은 감마 방출체, 불소 및 가돌리늄과 같은 핵 자기 공명용 핵종 (nuclides)을 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 표지는 세프라제 결합제에 결합되는 DOTA(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산)와 같은 리간드와 복합체화될 수 있는 루테튬-177 또는 갈륨-68과 같은 방사성핵종을 포함한다. 한다.

본 발명의 펩티드에 대한 표지의 컨쥬게이션은 공유 결합 또는 비-공유 결합(소수성을 포함한다), 또는 흡착에 의한 것일 수 있다. 이러한 컨쥬게이션에 대한 기술은 본 기술분야에서 통상적이며, 채용된 특정 시약에 용이하게 적용될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "시료"는 환자로부터 분리되어 분석 목적으로 사용될 수 있는 임의의 생물학적 시료를 포함한다. 상기 시료는 체액 시료, 조직 시료, 또는 세포 시료일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 포함되는 시료는 조직(예를 들어, 섹션 또는 외식편) 시료, 단세포 시료, 세포 콜로니 시료, 세포 배양 시료, 혈액(예를 들어 전혈 또는 혈액 세포 분획, 혈청 또는 혈장과 같은 혈액 분획) 시료, 소변 시료 또는 다른 주변 출처의 시료를 들 수 있다. 상기 시료들은 혼합되거나 풀링될 수 있고, 예를 들어 시료는 혈액 시료 및 소변 시료의 혼합물일 수 있다. 상기 시료는 체액, 세포(들), 세포 콜로니, 외식편, 또는 환자로부터의 섹션을 제거함으로써 제공될 수 있지만, 이전에 분리된 시료를 사용함으로써 제공될 수도 있다. 예를 들면, 조직 시료는 통상적인 생검 기술에 의해 환자로부터 제거할 수 있거나 또는 혈액 시료는 통상적인 혈액 수집 기술에 의해 환자로부터 취할 수 있다. 시료, 예를 들어 조직 시료 또는 혈액 시료는 치료적 처치의 개시 이전에, 치료적 처치 동안에 및/또는 치료적 처치 후에 환자로부터 수득할 수 있다.

일 실시형태에서, 시료는 체액 시료이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "체액 시료"는 환자의 신체로부터 유래된 임의의 액체 시료를 의미한다. 상기 체액 시료는 혈액 시료, 소변 시료, 객담 시료, 모유 시료, 뇌척수액(CSF) 시료, 귀지(earwax) 시료, 내림프 시료, 외림프 시료, 위액 시료, 점액 시료, 복막액 시료, 흉수 시료, 타액 시료, 피지(피부오일) 시료, 정액 시료, 땀 시료, 눈물 시료, 질 분비물 시료, 또는 구토 시료를 들 수 있고, 그 성분이나 분획물을 포함할 수 있다. 상기 체액 시료는 혼합되거나 저장될 수 있다. 따라서, 체액 시료는 혈액과 소변 시료 또는 혈액과 뇌척수액 시료의 혼합물 일 수 있다. 상기 체액 시료는 환자로부터 체액을 제거함으로써 제공될 수 있지만, 이전에 분리된 체액 시료 재료를 사용함으로써 제공될 수도 있다. 바람직한 일 실시형태에서, 시료는 전체 혈액 시료 또는 예컨대 혈액 세포 분획, 혈청, 또는 혈장 시료와 같은 혈액 분획 시료이다.

일 실시형태에서, 생물학적 시료는 암과 같은 질병에 걸린 것으로 의심되는 조직으로부터 획득된 시료이다. 일 실시형태에서, 생물학적 시료는 종양 시료, 예를 들어 종양으로부터 획득되고 종양 세포를 포함하는 시료이다. 또한, 본 발명에 따르면, 용어 "생물학적 시료"는 생물학적 시료의 분획물 또는 분리물, 예를 들어 핵산 및 펩티드/단백질 분리물과 같은 처리된 생물학적 시료를 포함한다.

본 발명에 따르면, 기준 시료 또는 기준 생물과 같은 "기준"은 시험 시료 또는 시험 생물, 즉 환자로부터 본 발명의 방법으로 수득된 결과를 상관시키고 비교하기 위해 사용될 수 있다. 전형적으로 기준 생물은 건강한 유기체, 특히 종양 질환을 앓지 않는 유기체이다.

"기준값" 또는 "기준 레벨"은 기준값을 충분히 많이 측정함으로써 경험적으로 기준으로부터 결정될 수 있다. 바람직하게 기준값은 적어도 2, 바람직하게는 적어도 3, 바람직하게는 적어도 5, 바람직하게는 적어도 8, 바람직하게는 적어도 12, 바람직하게는 적어도 20, 바람직하게는 적어도 30, 바람직하게는 적어도 50, 또는 바람직하게는 적어도 100개의 기준값을 측정함으로써 결정된다.

본원에서 사용된 바와 같이, "저감", "감소" 또는 "억제"는 레벨, 예를 들어 세포의 발현 수준에서나 증식 수준에서의 전체 감소 또는 전체 감소를 야기하는 능력, 바람직하게는 5% 이상, 10% 이상, 20% 이상의 감소, 더욱 바람직하게는 50% 이상, 및 가장 바람직하게는 75% 이상의 감소를 의미한다. 또한, 물질의 양은 기준 시료에서는 검출 가능하지만 시험 시료에서는 없거나 검출 가능하지 않는 경우에 기준 시료와 비교하여 생물학적 시료와 같은 테스트 시료에서 감소된다.

"증가" 또는 "증진"과 같은 용어는 적어도 약 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 더욱 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 더더욱 바람직하게는 적어도 80%, 및 가장 바람직하게는 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 10000% 이상으로 증가 또는 증진에 관한 것이 바람직하다. 또한, 물질의 양은 기준 시료에서는 검출 가능하지만 시험 시료에서는 없거나 검출 가능하지 않는 경우에 기준 시료와 비교하여 생물학적 시료와 같은 시험 시료에서 증가된다.

세프라제 결합제 예컨대 본 발명의 펩티드는 고형 지지체, 예를 들어 면역분석 웰 또는 딥스틱(dipstick)의 표면에 결합될 수 있고 및/또는 적합한 시약, 대조군 및 취급설명서 등과 함께 적합한 용기 중의 키트 내에 패키징할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 적어도 하나의 세프라제 결합제를 포함하는 키트도 제공한다. 바람직한 실시형태에서, 키트는 면역분석을 수행하기 위한 하나 이상의 적합한 시약과 같은 적어도 하나의 추가 제제, 대조군 또는 키트 사용시 취급설명서를 추가로 포함한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 하나 이상의 세프라제 결합제를 포함하는 분석장치가 추가로 제공된다. 일 실시형태에서, 분석장치는 효소-결합 면역흡착 분석장치로 이루어진 군으로부터 선택된다.

이러한 장치는 다른 형태를 취할 수 있으며 수행되는 분석의 정밀한 성질에 따라 다양할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 펩티드는 고형 지지체, 전형적으로 니트로셀룰로오스 또는 다른 소수성 다공성 물질 상에 도포될 수 있다. 대안적으로, 펩티드는 합성 플라스틱 재료, 미량정량판 분석 플레이트, 마이크로어레이 칩, 라텍스 비드, 셀룰로오스 또는 합성 폴리머 재료를 포함하는 필터, 유리 또는 플라스틱 슬라이드, 딥스틱, 및 모세관 충전 장치 등에 도포될 수 있다. 이들 표면에 대한 펩티드의 도포는 본 기술분야에 공지된 방법에 의해 완수할 수 있다. 단백질 담체는 전형적으로 가장 바람직한 BSA 또는 접착성 펩티드로 복합체화에 사용된다. 일 실시형태에서, 본 발명의 펩티드는 고형 지지체 상에 탈착 가능하게 고정화된다. 바람직한 추가 실시형태에서, 본 발명의 펩티드는 고형 지지체 상에 탈착 불가능하게 고정화된다.

본원에 기재된 펩티드는 펩티드를 암호화하는 RNA와 같은 핵산을 투여함으로써 및/또는 펩티드를 암호화하는 RNA와 같은 핵산을 포함하는 숙주세포를 투여함으로써 환자에게 전달될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 환자에게 투여될 때 펩티드를 암호화하는 핵산은 네이키드(naked) 형태 또는 적합한 전달 비히클, 예컨대 리포솜 또는 바이러스 입자 형태로 존재하거나 숙주세포 내에 존재할 수 있다. 제공된 핵산은 지속된 방식으로 장시간 동안 펩티드를 생산할 수 있다. 환자에게 전달되는 핵산은 재조합 수단에 의해 생산될 수 있다. 핵산이 숙주세포 내에 존재하지 않고 환자에게 투여되는 경우, 핵산에 의해 암호화되는 펩티드의 발현을 위해 환자의 세포에 의해 흡수되는 것이 바람직하다. 핵산이 숙주세포 내에 존재하는 동안 환자에게 투여되는 경우, 핵산에 의해 암호화되는 펩티드를 생산하도록 환자 내의 숙주세포에 의해 발현되는 것이 바람직하다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산"은 게놈 DNA, cDNA, mRNA, 재조합 적으로 생산된 및 화학적으로 합성된 분자와 같은 디옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하도록 하였다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. RNA에는 시험관내 전사된 RNA(IVT RNA) 또는 합성 RNA가 포함된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "RNA"는 리보뉴클레오티드 잔기를 포함하는 분자를 의미한다. "리보뉴클레오티드"는 베타-D-리보-푸라노오스 일부분의 2'-위치에 히드록시기를 갖는 뉴클레오티드를 의미한다. 이 용어는 분리된 RNA 예컨대 이중 가닥 RNA, 단일 가닥 RNA, 부분적으로 정제된 RNA, 본질적으로 순수한 RNA, 합성 RNA, 재조합적으로 생성된 RNA뿐만 아니라 1개 이상의 뉴클레오티드의 첨가, 결실, 치환 및/또는 변경에 의해 자연 발생적인 RNA와는 상이한 변경된 RNA를 포함한다. 이러한 변경은 예를 들어 RNA의 1개 이상의 뉴클레오티드에서 RNA의 말단(들) 또는 내부적으로 비뉴클레오티드 물질의 첨가를 포함할 수 있다. 또한, RNA 분자에서의 뉴클레오티드는 비표준 뉴클레오티드, 예컨대 비-자연적으로 발생하는 뉴클레오티드 또는 화학적으로 합성된 뉴클레오티드 또는 디옥시뉴클레오티드도 포함할 수 있다. 이들 변형된 RNA는 유사체 또는 자연 발생적 RNA의 유사체라고 할 수 있다.

본 발명에 따르면, 용어 "RNA"는 "mRNA"를 의미하고 바람직하게는 "메신저 RNA"를 의미하는 "mRNA"에 관한 것이며 DNA를 주형으로 사용하여 생산될 수 있고 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 "전사체"에 관한 것이다. mRNA는 전형적으로 5' 비번역영역(5'-UTR), 단백질 또는 펩티드 암호화 영역 및 3' 비번역영역(3'-UTR)을 포함한다. 본 발명의 일 실시형태에서, RNA는 시험관내 전사 또는 화학 합성에 의해 수득된다. 바람직하게는, mRNA는 DNA 주형을 사용하여 시험관내 전사에 의해 생성된다. 시험관내 전사 방법론은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 입수가능한 다양한 시험관내 전사 키트가 있다.

본 발명에 의해 사용되는 RNA의 발현 및/또는 안정성을 증가시키기 위해, 바람직하게는 발현된 펩티드 또는 단백질의 서열의 변경없이 이를 변형시킬 수 있다.

본 발명에 의해 사용된 바와 같이, 문맥에서의 RNA의 "변형(modification)"이라는 용어는 상기 RNA에 자연적으로 존재하지 않는 RNA의 임의의 변형을 포함한다.

본 발명의 일 실시형태에서, 본 발명에 의해 사용된 RNA는 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트를 갖지 않는다. 이러한 캡핑되지 않은 5'-트리포스페이트의 제거는 포스파타아제로 RNA를 처리함으로써 달성될 수 있다.

본 발명에 따른 RNA는 그 안정성의 증가 및/또는 세포독성의 감소를 위해 자연 발생적 또는 합성 리보뉴클레오티드를 변형시킬 수 있다. 예를 들면, 일 실시형태에서, 본 발명에 의해 사용된 RNA에서 5-메틸시티딘은 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 시티딘으로 치환된다. 대안적으로 또는 부가적으로, 일 실시형태에서, 본 발명에 의해 사용된 RNA에서 슈도우리딘은 부분적으로 또는 완전히, 바람직하게는 완전히 우리딘으로 치환된다.

일 실시형태에서, 용어 "변형(modification)"은 5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 갖는 RNA를 제공하는 것에 관한 것이다. 용어 "5'-캡"은 mRNA 분자의 5'-말단에 있는 캡 구조를 지칭하며 일반적으로 특이한 5'를 통해 5' 트리포스페이트 연결로 mRNA에 연결된 구아노신 뉴클레오티드로 구성된다. 일 실시형태에서, 이러한 구아노신은 7-위치에서 메틸화된다. "통상적인 5'-캡"이란 용어는 자연 발생적인 RNA 5'-캡을 의미하고, 바람직하게는 7-메틸구아노신 캡(m7G)을 지칭한다. 본 발명과 관련하여, 용어 "5'-캡"은 RNA 캡 구조와 유사하고 바람직하게는 생체내 및/또는 세포 내에서 이에 부착된 경우 RNA를 안정화시키는 능력을 갖도록 변형되는 5'-캡 유사체를 포함한다.

5'-캡 또는 5'-캡 유사체를 갖는 RNA를 제공하는 것은 상기 5'-캡 또는 5'-캡 유사체가 존재하는 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 달성될 수 있으며, 여기서 상기 5'-캡은 생성된 RNA 가닥에 공-전사적으로 혼입되거나, RNA는 예를 들면 시험관내 전사에 의해 생성될 수 있으며, 5'-캡은 캡핑 효소, 예를 들어 우두바이러스의 캡핑 효소를 사용하여 전사 후 RNA에 부착될 수 있다.

RNA는 추가적인 변형을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서 사용되는 RNA의 추가적인 변형은 자연 발생적인 폴리(A) 꼬리의 연장이나 절단 또는 5'- 또는 3'-비번역영역(UTR)의 변경, 예컨대 상기 RNA의 암호화영역과 관련없는 UTR의 도입, 예를 들면, 글로빈 유전자, 예컨대 알파2-글로빈, 알파1-글로빈, 베타-글로빈, 바람직하게는 베타-글로빈, 더욱 바람직하게는 사람 베타-글로빈으로부터 유래된 3'-UTR의 1개 이상, 바람직하게는 2쌍의 삽입일 수 있다.

본 발명과 관련하여, 용어 "전사"는 DNA 서열 내의 유전 암호가 RNA로 전사되는 과정에 관한 것이다. 이어서, RNA는 단백질로 번역될 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "전사"는 "시험관내 전사"를 포함하며, 여기서 용어 "시험관내 전사"는 RNA, 특히 mRNA가 무세포계에서, 바람직하게는 적절한 세포 추출물을 사용하여 시험관내 합성되는 과정에 관한 것이다. 바람직하게는, 클로닝 벡터는 전사체의 생성을 위해 적용된다. 이러한 클로닝 벡터는 일반적으로 전사 벡터로 지정되고, 본 발명에 따라 용어 "벡터"에 포함되는 것이다.

본 발명에 따르면 용어 "번역"은 세포의 리보솜에서 메신저 RNA의 가닥이 펩티드 또는 단백질을 형성하기 위해 아미노산 서열의 조립을 지시하는 과정에 관한 것이다.

본 발명에 따르면 용어 "발현"은 가장 일반적인 의미로 본원에서 사용되며, 예를 들어 전사 및/또는 번역에 의해 RNA 및/또는 펩티드 또는 단백질의 생성을 포함한다. RNA와 관련하여, 용어 "발현" 또는 "번역"은 특히 펩티드 또는 단백질의 생산에 관한 것이다. 또한, 이는 핵산의 부분적 발현을 포함한다. 또한, 발현은 일시적이거나 안정적일 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 발현이라는 용어는 "일탈적인 발현" 또는 "비정상적 발현"도 포함한다.

"일탈적인 발현" 또는 "비정상적 발현"은 본 발명에 따르면 표준, 예를 들어 특정 단백질, 예를 들어 세프라제의 일탈적이거나 비정상적인 발현과 관련된 질병이 없는 환자의 상태와 비교하여 발현이 변경되는 것, 바람직하게는 증가되는 것을 의미한다. 발현의 증가는 적어도 10%, 특히 적어도 20%, 적어도 50%, 적어도 100%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 적어도 10000% 이상의 증가에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 발현은 질병 조직에서만 발견되는 반면, 건강한 조직에서는 발현이 억제된다.

"특이적으로 발현되는"이란 용어는 단백질이 본질적으로 특정 조직 또는 기관에서만 발현된다는 것을 의미한다. 예를 들면, 위점막에서 특이적으로 발현되는 단백질은 상기 단백질이 주로 위점막에서 발현되고 다른 조직에서는 발현되지 않거나 다른 조직 또는 기관 유형에서 상당한 정도로 발현되지 않는다는 것을 의미한다. 따라서, 위점막의 세포에서 독점적으로 발현하고, 다른 임의의 조직, 예컨대 고환에서는 유의적으로 적은 정도로 발현하는, 단백질은 위점막의 세포에서 유의하게 발현된다.

본 발명에 따르면, 용어 "핵산 암호화"는 적절한 환경, 바람직하게는 세포 내에 존재하는 경우, 암호화하는 단백질 또는 펩티드를 생산하기 위해 핵산을 발현시킬 수 있음을 의미한다.

본 발명에 따라 기재된 핵산은 바람직하게 분리되어 있다. 본 발명에 따르면 "분리된 핵산"이라는 용어는 핵산이 (i) 시험관내, 예를 들면 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 증폭되거나, (ii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생산되거나, (iii) 예를 들어 절단 및 겔-전기영동 분획화에 의해 정제되거나, 또는 (iv) 예를 들어 화학 합성에 의해 합성되는 것을 의미한다. 분리된 핵산은 재조합 DNA 기술에 의한 조작에 이용가능한 핵산이다.

본 발명에 따르면, 예를 들어, 핵산 및 아미노산 서열에 관한 용어 "변이체"는 임의의 변이체, 특히 돌연변이체, 스플라이스 변이체, 배좌, 동형단백질, 대립형질 변이체, 종 변이체 및 종 동족체, 특히 자연적으로 존재하는 것을 포함한다. 대립형질 변이체는 유전자의 정상 서열의 변경과 관련이 있으며, 그 중요성은 종종 불분명하다. 완전한 유전자 시퀀싱은 종종 주어진 유전자에 대한 수많은 대립형질 변이체를 동정한다. 종 동족체는 주어진 핵산 또는 아미노산 서열과는 다른 종의 기원을 갖는 핵산 또는 아미노산 서열이다.

핵산 분자와 관련하여, 용어 "변이체"는 축중(degenerate) 핵산 서열을 포함하며, 여기서 본 발명에 따른 축중 핵산은 유전 암호의 축퇴성에 의해 코돈 서열에서 기준 핵산과 상이한 핵산이다.

또한, 본 발명에 따른 특정 핵산 서열의 "변이체"는 단일 또는 다중, 예컨대 적어도 2, 적어도 4, 또는 적어도 6 및 바람직하게는 3 이하, 4 이하, 5 이하, 6 이하, 10 이하, 15 이하 또는 20개 이하의 뉴클레오티드 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함하는 핵산 서열을 포함한다.

바람직하게는 주어진 핵산 서열과 상기 주어진 핵산 서열의 변이체인 핵산 서열 간의 동일성의 정도는 적어도 약 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%일 것이다. 동일성의 정도는 기준 핵산 서열의 전체 길이의 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 영역에 대해 부여되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 기준 핵산 서열이 200개의 뉴클레오티드로 구성되는 경우, 유사성 또는 동일성의 정도는 적어도 약 20, 적어도 약 40, 적어도 약 60, 적어도 약 80, 적어도 약 100, 적어도 약 120, 적어도 약 140, 적어도 약 160, 적어도 약 180, 또는 약 200개 뉴클레오티드, 바람직하게는 연속적인 뉴클레오티드에 대해 부여되는 것이 바람직하다. 바람직한 실시형태에서, 동일성의 정도는 기준 핵산 서열의 전체 길이에 대해 주어진다.

2개 핵산 서열 사이의 "서열 동일성"은 서열 간에 동일한 뉴클레오티드의 백분율을 나타낸다.

"퍼센트 동일성"이란 용어는 최상의 정렬 후에 수득된 비교될 두 서열 간에 동일한 아미노산 잔기의 백분율을 나타내고, 이 백분율은 오직 통계적이며, 두 서열 간의 차이가 무작위로 그리고 그 전체 길이에 걸쳐 분포된다. 2개의 아미노산 서열 간의 서열 비교는 통상적으로 이들을 최적으로 정렬시킨 후 이들 서열을 비교함으로써 실시하며, 상기 비교는 서열 유사성의 국부적 영역을 동정하고 비교하기 위해 세그먼트 또는 "비교 윈도우"에 의해 실시한다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 수동 외에도 Smith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482의 국부적 상동성 알고리즘에 의해, Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443의 국부적 상동성 알고리즘에 의해, Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444의 유사성 검색방법 또는 이들 알고리즘(GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N and TFASTA in Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.)을 사용하는 컴퓨터 프로그램에 의해 생성될 수 있다.

퍼센트 동일성은 비교될 2개의 서열 간의 동일한 위치의 수를 결정하고, 이 수를 비교된 위치의 수로 나누고, 얻어진 결과에 100을 곱하여 이들 두 서열 간의 퍼센트 동일성을 수득함으로써 계산된다.

바람직하게는, 주어진 핵산 서열 및 상기 주어진 핵산 서열의 변이체인 핵산 서열은 혼성화 하는 것이 가능할 것이다.

핵산은 2개의 서열이 서로 상보적인 경우 다른 핵산에 "혼성화 가능" 또는 "혼성화"할 수 있다. 두 서열이 서로 안정한 이합체를 형성 가능하다면 핵산은 다른 핵산과 "상보적"이다. 본 발명에 따르면, 혼성화는 바람직하게는 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 허용하는 조건(엄격한 조건) 하에서 수행된다. 엄격한 조건은 예를 들면 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 or Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York 에 기재되어 있고, 예를 들어, 혼성화 완충액(3.5 x SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% 폴리비닐피로리돈, 0.02% 소혈청알부민, 2.5　mM NaH₂PO₄ (pH 7), 0.5% SDS, 2　mM EDTA)에서 65℃에서의 혼성화를 일컫는다. SSC는 0.15M 염화나트륨/0.15M 시트르산 나트륨, pH 7이다. 혼성화 후, DNA가 이동될 막을 예를 들면, 실온에서 2 × SSC로 세척한 다음, 68℃ 미만의 온도에서 0.1-0.5 × SSC/0.1 × SDS로 세척한다.

퍼센트 상보성은 제2 핵산 서열과 수소 결합(예를 들어, 왓슨-크릭 염기쌍 형성)을 형성할 수 있는 핵산 분자의 인접한 잔기의 백분율을 나타낸다(예를 들어, 10개 중의 5, 6, 7, 8, 9, 10개는 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 및 100% 상보적인 것이다). "완벽히 상보적인" 또는 "완전히 상보적인"은 핵산 서열의 모든 인접한 잔기가 제2 핵산 서열에서 동일한 수의 인접한 잔기와 수소 결합할 것을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 상보성의 정도는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 85%, 더더욱 바람직하게는 적어도 90% 또는 가장 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%이다. 가장 바람직하게는, 본 발명에 따른 상보성의 정도는 100%이다.

용어 "유도체"는 뉴클레오티드 염기 상에서, 당에서 또는 인산 상에서 핵산의 임의의 화학적 유도체화를 포함한다. 또한, 용어 "유도체"는 자연적으로 발생하지 않는 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 바람직하게는, 핵산의 유도체화는 그의 안정성을 증가시킨다.

본 발명에 따르면, 핵산은 단독으로 또는 다른 핵산, 특히 이종성 핵산과의 조합으로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 핵산은 상기 펩티드 또는 단백질을 발현한다. 바람직한 실시형태에서, 핵산은 발현 제어 서열 또는 상기 핵산에 대해 상동이거나 이종일 수 있는 조절서열에 기능적으로 연결된다. 코딩 서열 및 조절서열은 상기 코딩 서열의 발현 또는 전사가 상기 조절서열의 제어하에 있거나 영향하에 있는 이러한 방법에서 서로 공유결합되어 있는 경우, 서로 "기능적으로" 연결된다. 코딩 서열이 기능성 단백질로 번역되고 나서, 조절서열이 상기 코딩 서열에 기능적으로 연결되는 경우, 상기 조절서열은 코딩 서열에서의 프레임 시프트를 일으키지 않고 상기 코딩 서열의 전사를 유도 야기하지만 이렇지 않으면 코딩 서열은 원하는 단백질 또는 펩티드로 번역될 수 없다.

본 발명에 따르면 용어 "발현 제어 서열" 또는 "조절서열"은 유전자의 발현을 조절하는 프로모터, 인핸서 및 다른 제어요소를 포함한다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 발현 제어 서얼을 조절할 수 있다. 조절서열의 정확한 구조는 종 또는 세포 타입의 기능에 따라 다양할 수 있지만, 일반적으로 전사 및 번역 개시에 각각 관여하는 5' 비전사서열 및 5' 비번역서열, 예컨대 TATA 박스, 캡핑 서열, 및 CAAT 서열 등을 포함한다. 보다 구체적으로, 5' 비전사 조절서열은 기능적으로 연결된 유전자의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함한다. 또한, 조절 서열은 또한 인핸서 서열 또는 상류 활성자 서열을 포함할 수도 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 핵산은 숙주세포로부터 상기 핵산에 의해 암호화되는 단백질 또는 펩티드의 분비를 제어하는 펩티드를 암호화하는 또 다른 핵산과 조합하여 존재할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 핵산은 펩티드를 암호화하는 다른 핵산과 조합하여 존재하고, 암호화된 단백질 또는 펩티드가 숙주세포의 세포막에 앵커드되거나 상기 세포의 특정 세포 소기관으로 구획화되는 것을 야기할 수도 있다. 마찬가지로, 핵산과의 조합은 리포터 유전자 또는 임의의 "태그"를 나타내는 것이 가능하다.

바람직한 실시형태에서, 재조합 핵산 분자는 본 발명에 따라 핵산의 발현을 제어하는 프로모터와 함께 조합한 벡터이다. 용어 "벡터"는 이의 가장 일반적인 의미로 여기에서 사용되며, 예를 들면, 상기 핵산을 원핵세포 및/또는 진핵세포 내로 도입되는 것을 가능하게 하고, 게놈에 통합되는 것을 가능하게 하는 핵산에 대한 임의의 중간 운반체를 포함한다. 이러한 종류의 벡터는 바람직하게는 세포 내에서 복제 및/또는 발현된다. 중간 운반체는 예를 들면, 전기천공법, 미세투사물로의 충격법, 리포좀 투여, 아그로박테리아의 도움으로 이동 또는 DNA나 RNA 바이러스를 통한 삽입에 사용하도록 적용될 수 있다. 벡터는 플라스미드, 파지미드(phagemid), 박테리오파지 또는 바이러스 게놈을 포함한다.

본 발명에 따른 핵산은 숙주세포의 형질주입에 사용될 수 있다. 여기서 핵산이란 재조합 DNA와 RNA를 의미한다. 재조합 RNA는 DNA 주형의 시험관내 전사에 의해 준비될 수 있다. 또한, 적용 전에 서열, 캡핑 및 아데닐산중합반응을 안정화함으로써 변형시킬 수도 있다.

본 발명의 문맥상 용어 "재조합"는 "유전공학을 통해 제조된" 것을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 문맥상 재조합 핵산과 같은 "재조합 대상"은 자연 발생적인 것이 아니다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "자연 발생"은 대상이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 의미한다. 예를 들면, 유기체(바이러스를 포함한다)에 존재하고 본질적으로 원천으로부터 분리될 수 있고 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형되지 않은 펩티드 또는 핵산은 자연 발생적인 것이다.

"세포" 또는 "숙주세포"라는 용어는 바람직하게는 무손상 세포, 즉 효소, 세포 기관 또는 유전 물질과 같은 정상적인 세포내 성분을 방출하지 않은 무손상 막을 갖는 세포에 관한 것이다. 무손상 세포는 바람직하게는 생세포, 즉 정상적인 대사 기능을 수행 가능한 살아있는 세포이다. 바람직하게는 상기 용어는 본 발명에 따라 외인성 핵산으로 형질주입될 수 있는 임의의 세포에 관한 것이다. 바람직하게는, 외인성 핵산으로 형질주입된 세포는 핵산을 발현할 수 있다.

"숙주세포"라는 용어는 본 발명에 따라 원핵세포(예를 들어 E. coli) 또는 진핵세포(예를 들어, 수지상세포, B세포, CHO세포, COS세포, K562세포, 효모세포, 및 곤충세포)를 포함한다. 특정 기준은 사람, 마우스, 햄스터, 돼지, 염소, 영장류의 세포와 같은 포유류 세포에 부여하는 것이 특히 바람직하다. 세포는 다양한 조직 유형으로부터 유래될 수 있고, 1차 세포 및 세포주를 포함할 수 있다. 특정 예로서는 각질, 말초혈액 백혈구, 골수줄기세포 및 배아줄기세포를 포함한다. 핵산은 단일카피 또는 2개 이상의 카피의 형태로 숙주세포에 존재할 수 있으며, 일 실시형태에서 숙주세포에서 발현된다.

용어 "펩티드"는 올리고- 및 폴리펩티드를 포함하고, 펩티드 결합에 의해 공유 결합된 2개 이상, 바람직하게는 3 이상, 바람직하게는 4 이상, 바람직하게는 6 이상, 바람직하게는 8 이상, 바람직하게는 10 이상, 바람직하게는 13 이상, 바람직하게는 16 이상, 바람직하게는 21개 이상 및 바람직하게는 8개, 10개, 20개, 30개, 40개 또는 50개 미만, 특히 100개의 아미노산을 포함하는 물질을 일컫는다. 용어 "단백질"은 큰 펩티드, 바람직하게는 100개 초과의 아미노산 잔기를 갖는 펩티드를 지칭하지만, 일반적으로 "펩티드" 및 "단백질"이란 용어는 동의어이며 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

본 발명에 따르면, 펩티드는 천연 아미노산 및 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 펩티드는 단지 천연 아미노산만을 포함한다.

본 발명에 따르면, "비천연 아미노산"이란 용어는 20개의 천연 아미노산 종과 상이한 구조를 갖는 아미노산을 의미한다. 비천연 아미노산은 천연 아미노산과 유사한 구조를 가지므로 비천연 아미노산은 부여된 천연 아미노산의 유도체 또는 유사체로 분류될 수 있다.

본 발명에 따르면, 용어 "환형 펩티드"는 고리를 형성하는 펩티드 또는 폴리 펩티드 사슬에 관한 것이다. 펩티드는 4가지 상이한 방식으로 고리화될 수 있다: 머리 내지 꼬리(C-말단 내지 N-말단), 머리 내지 측사슬, 측사슬 내지 꼬리 또는 측사슬 내지 말단 사슬을 들 수 있다. 본 발명에 따르면 특히 바람직한 것은 환형 펩티드를 제공하는 분자내 디설파이드 가교를 형성할 수 있는 시스테인과 같은 티올기를 함유하는 잔기를 2개 이상 함유하는 펩티드이다.

본 발명에 따르면, 펩티드는 하나 이상의 다른 화합물에 공유 결합 또는 비공유 결합될 수 있다. 이러한 화합물은 펩티드 및 단백질과 같은 펩티드성 화합물뿐만 아니라 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비펩티드성 화합물을 포함한다.

일 실시형태에서, 본원에 기재된 펩티드는 PEG화된다. PEG화는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 중합체 사슬을 펩티드 또는 단백질과 같은 다른 분자에 공유 부착시키는 과정이다. PEG의 공유 부착은 숙주의 면역계(감소된 면역원성 및 항원성)로부터 제제를 "차폐"시킬 수 있고 신장 청소율을 감소시킴으로써 이의 순환 시간을 연장시키는 제제의 유체역학적 크기(용액 내에서의 크기)를 증가시킬 수 있다. 또한, PEG화는 소수성 약물 및 단백질에 대한 수용성을 제공할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따라 기재된 단백질 및 펩티드를 분리하였다. "분리된 단백질" 또는 "분리된 펩티드"라는 용어는 단백질 또는 펩티드가 자연 환경으로부터 분리되었음을 의미한다. 분리된 단백질 또는 펩티드는 본질적으로 정제된 상태일 수 있다. "본질적으로 정제된"이란 용어는 단백질 또는 펩티드가 완전히 또는 생체내 관련된 다른 물질이 본질적으로 없는 것을 의미한다. 이러한 단백질 및 펩티드는 예를 들면 면역학적 검정 또는 진단적 검정에서 사용되거나 치료제로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 기재된 단백질 및 펩티드는 조직 또는 세포 파쇄액과 같은 생물학적 시료로부터 분리될 수 있고, 또한 다수의 원핵생물 또는 진핵생물의 발현시스템에서 재조합적으로 발현될 수도 있다.

용어 "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중(H) 사슬 및 2개의 경(L) 사슬을 포함하는 당단백질 및 이러한 당단백질의 항원-결합 부분을 포함하는 임의의 분자를 포함한다. 용어 "항체"는 단일클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일사슬 항체, 예를 들어 scFv 및 항원 결합 항체 단편 예컨대 Fab 및 Fab' 단편을 제한없이 포함하는, 항체의 결합 단편 또는 유도체를 포함하는 분자을 포함하고, 모든 재조합 형태의 항체, 예를 들어, 원핵생물에서 발현된 항체, 비당화 항체, 및 본원에 기재된 바와 같은 임의의 항원-결합 항체 단편 및 유도체도 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변영역(본원에서는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변영역으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변영역(본원에서는 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변영역으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 더욱 보전되고 프레임워크영역(FR)으로 불리는 영역으로 산재되어, 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 초가변적 영역으로 추가적으로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노 말단으로부터 카복시 말단까지에 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변영역은 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 포함하는 숙주 조직 또는 인자에 대한 면역글로불린의 결합을 매개 할 수 있다.

특정 아미노산 서열, 예를 들면, 서열 목록에 제시된 것들에 관하여 본원에서 주어진 지침은 상기 특정 서열과 기능적으로 등가인 서열, 예를 들어 특정 아미노산 서열과 동일하거나 유사한 성질을 나타내는 아미노산 서열을 야기하는 상기 특정 서열의 변이체와 관련되도록 해석해야 한다. 하나의 중요한 특성은 세프라제와 같은 표적에 대한 결합을 유지하는 것이다.

본 발명의 목적을 위해, 아미노산 서열의 "변이체"는 아미노산 삽입 변이체, 아미노산 첨가 변이체, 아미노산 결실 변이체 및/또는 아미노산 치환 변이체를 포함한다. 단백질의 N-말단 및/또는 C-말단에서 결실을 포함하는 아미노산 결실 변이체는 N-말단 및/또는 C-말단 절단 변이체라고도 불린다.

아미노산 삽입 변이체는 특정 아미노산 서열에서 단일 또는 2개 이상의 아미노산의 삽입을 포함한다. 삽입을 갖는 아미노산 서열 변이체의 경우에서, 하나 이상의 아미노산 잔기가 아미노산 서열의 특정 부위에 삽입되지만, 결과 생성물의 적절한 스크리닝을 통한 무작위 삽입이 또한 가능하다.

아미노산 첨가 변이체는 1개 이상의 아미노산, 예를 들어 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50개 이상의 아미노산의 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합체를 포함한다.

아미노산 결실 변이체는 서열로부터의 하나 이상의 아미노산의 제거, 예컨대 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50개 이상의 아미노산의 제거하는 것을 특징으로 한다. 결실은 펩티드 또는 단백질의 임의의 위치에 있을 수 있다.

아미노산 치환 변이체는 서열 중 적어도 하나의 잔기가 제거되고 다른 잔기가 그 자리에 삽입되는 것을 특징으로 한다. 상동성 단백질 또는 펩티드 사이에 보존되지 않은 아미노산 서열에서 위치에서의 변형하는 것 및/또는 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 아미노산을 대체하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 단백질 변이체에서의 아미노산 변화는 보존적 아미노산 변화, 즉 유사하게 하전된 또는 비하전된 아미노산의 치환이다. 보존적 아미노산 변화는 이의 측쇄와 관련된 아미노산 계열 중 하나의 치환을 포함한다. 자연적으로 발생하는 아미노산은 일반적으로 산성(아스파테이트, 글루타메이트), 염기성(리신, 아르기닌, 히스티딘), 비극성(알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 극성(글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신) 아미노산의 4가지의 계열로 분류된다. 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 분류된다.

바람직하게는 유사성의 정도, 바람직하게는 주어진 아미노산 서열과 상기 주어진 아미노산 서열의 변이체인 아미노산 서열 간의 동일성의 정도는 적어도 약 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%일 것이다. 유사성 또는 동일성의 정도는 기준 아미노산 서열의 전체 길이 중 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 약 100%인 아미노산 영역에 대하여 부여되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 기준 아미노산 서열이 200개 아미노산으로 구성되면, 유사성 또는 동일성의 정도는 적어도 약 20, 적어도 약 40, 적어도 약 60, 적어도 약 80, 적어도 약 100, 적어도 약 120, 적어도 약 140, 적어도 약 160, 적어도 약 180, 또는 약 200개의 아미노산, 바람직하게는 연속적인 아미노산에 대해 부여되는 것이 바람직하다. 바람직한 실시형태에서, 유사성 또는 동일성의 정도는 기준 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 부여된다. 서열 유사성, 바람직하게는 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 공지된 도구, 바람직하게는 가장 우수한 서열 정렬을 사용하고, 예를 들면, Align를 사용하고, 표준 설정을 사용하고, 바람직하게는 EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5를 가지고 행할 수 있다.

"서열 유사성"은 동일하거나 보존적 아미노산 치환을 나타내는 아미노산의 백분율을 나타낸다. 두 아미노산 서열 간의 "서열 동일성"은 서열 간에 동일한 아미노산의 백분율을 나타낸다.

본원에 기재된 펩티드 및 아미노산 변이체는 공지된 펩티드 합성 기술, 예를 들어 고체상 합성(Merrifield, 1964) 및 유사한 방법 또는 재조합 DNA 조작에 의해 용이하게 준비될 수 있다. 치환, 삽입 또는 결실을 갖는 단백질 및 펩티드를 준비하기 위한 DNA 서열의 조작은 예를 들면 Sambrook et al.(1989)에 상세히 기재되어있다.

본 발명에 따르면, 용어 "펩티드" 또는 "단백질"은 펩티드 및 단백질의 "유도체"를 포함한다. 이러한 유도체는 펩티드 및 단백질의 변형된 형태이다. 이러한 변형은 임의의 화학적 변형을 포함하고 탄수화물, 지질, 단백질 및/또는 펩티드와 같은 펩티드 또는 단백질과 관련된 임의의 분자의 단일 또는 다중 치환, 결실 및/또는 첨가를 포함한다. 또한, "유도체"라는 용어는 상기 펩티드 및 단백질의 모든 기능적 화학 등가물까지도 확대한다. 바람직하게는, 변형된 펩티드는 증가된 안정성 및/또는 증가된 면역원성을 갖는다.

본 발명의 세프라제 결합제는 치료적 접근에 사용될 수 있다. 이를 위해, 본 발명의 세프라제 결합제는 하나 이상의 치료 작용부에 공유 결합 및/또는 비공유 결합될 수 있고/있거나 다양한 성분과 조합하여 약제적으로 수용 가능한 조성물을 생성할 수 있다. 본원에 기재된 펩티드와 같은 제제는 적합한 임의의 약제 조성물의 형태로 투여할 수 있다.

"표적 세포"는 암세포와 같은 바람직하지 않은 임의의 세포를 의미할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 표적 세포는 세프라제를 발현한다.

본 발명에 따르면, 용어 "치료 작용부(therapeutic effector moiety)"는 치료 효과를 나타낼 수 있는 임의의 분자를 의미한다. 본 발명에 따르면, 치료 작용부는 바람직하게는 세프라제를 발현하는 세포로 선택적으로 유도된다. 암세포에 대한 치료 효과를 발휘하는 임의의 제제가 세프라제 결합제에 대해 컨쥬게이션을 위한 약물로서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 약물의 컨쥬게이션은 본원에서 논의된 바와 같이, 세프라제 결합제의 결합 특성, 특히 특이성을 변경시키지 않거나 유의적으로 변경시킨다.

본 발명에 따르면, 치료 작용부는 항암제, 방사성 요오드-표지된 화합물과 같은 방사성동위원소, 독소, 세포증식억제제 또는 세포용해성 약물 등을 포함한다. 항암제는 예를 들면, 아미노글루테치미드(aminoglutethimide), 아자티오프린(azathioprine), 블레오마이신 설페이트(bleomycin sulfate), 부설판(busulfan), 카무스틴(carmustine), 클로람부실(chlorambucil), 시스플라스틴(cisplatin), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 사이클로스포린(cyclosporine), 시타라비딘(cytarabidine), 다카바진(dacarbazine), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루빈(daunorubin), 독소루비신(doxorubicin), 택솔(taxol), 에토포사이드(etoposide), 플루오로우라실(fluorouracil), 인터페론-α, 로무스틴(lomustine), 머캅토퓨린(mercaptopurine), 메토트렉세이트(methotrexate), 미토탄(mitotane), 프로카바진(procarbazine) HCl, 티오구아닌(thioguanine), 빈블라스틴 설페이트(vinblastine sulfate) 및 빈크리스틴 설페이트를 포함한다. 다른 항암제는 Goodman and Gilman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", 8th Edition, 1990, McGraw-Hill, Inc., 특히 52챕터 (Antineoplastic Agents (Paul Calabresi and Bruce A. Chabner))에 기재되어 있다. 독소는 포크위드(pokeweed) 항바이러스성 단백질, 콜레라 독소, 백일해 독소, 리신(ricin), 겔로닌(gelonin), 아브린(abrin), 디프테리아 외독소 또는 Pseudomonas 외독소와 같은 단백질일 수 있다. 독소 잔기는 또한 코발트-60과 같은 고 에너지 방출 방사성 핵종일 수 있다.

치료 작용부는 특히 세포독소 또는 세포독성제를 포함한다. 세포독소 또는 세포독성제는 세포에 해롭고 특히 세포를 죽이는 임의의 제제를 포함한다.

유용한 세포독성제 계열의 예로서는 항튜불린제, DNA 소홈 바인더(예를 들어, 에네딘(enediyne) 및 렉시트롭신(lexitropsins)), DNA 복제 억제제, 알킬화제(예를 들어, 플래티넘 복합체 예컨대 시스-플라틴(cis-platin), 모노(플래티넘), 비스(플래티넘) 및 트리-핵 플래티넘 복합체 및 카보플라틴(carboplatin)), 안트라사이클린, 항생제, 항엽산제, 대사길항제, 항암화학요법 증감제, 두오카마이신(duocarmycin), 에토포시드(etoposide), 플루오르화 피리미딘, 이오노포어, 니트로소우레아(nitrosourea), 플라티놀(platinols), 예비형성 화합물, 퓨린 대사길항제, 퓨로마이신, 방사선 증감제, 스테로이드, 탁산(예를 들어, 파클릭탁셀(paclitaxel) 및 도세탁셀(docetaxel)), 토포이소머라아제 억제제, 또는 빈카알카로이드 등을 들 수 있다.

각각의 세포독성제는, 예를 들면, 안드로겐, 안트라마이신(AMC, anthramycin), 아스파라기나아제, 5-아자시티딘(5-azacytidine), 아자티오프린, 블레오마이신, 부술판(Busulfan), 부티오닌(buthionine), 설폭시민(설포ximine), 캠토테신(camptothecin), 카보플라틴(carboplatin), 카무스틴(BSNU, carmustine), CC-1065, 클로람부실(chlorambucil), 시스플라틴(cisplatin), 콜히친, 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 시타라빈(cytarabine), 시티딘 아라비노사이드(cytidine arabinoside), 시토칼라신 B, 다카바진(dacarbazine), 닥티노마이신(dactinomycin, 이전에는 액티노마이신이라함), 다우노루비신(daunorubicin), 디카바진(decarbazin), 도세탁셀(docetaxel), 독소루비신(doxorubicin), 에스트로겐, 5-플루오르디옥시우리딘, 5-플루오르우라실, 그라미시딘 D, 히드록시우레아(히드록시urea), 이데루비신(idarubicin), 이포스파마이드(ifosfamide), 이리노테칸(irinotecan), 로무스틴(lomustine)(CCNU), 메클로레타민(mechlorethamine), 멜파란(melphalan), 6-머캅토퓨린, 메토트렉세이트(methotrexate), 미스라마이신(mithramycin), 미토마이신 C(mitomycin C), 미톡산트론(mitoxantrone), 니트로이미다졸, 파클리탁셀(paclitaxel), 플라이카미신(plicamycin), 프로카비진(procarbizine), 스트렙토조토신(streptozotocin), 테노포시드(tenoposide), 6-티오구아닌(6-thioguanine), 티오TEPA, 토포테칸(topotecan), 빈블라스틴 (vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 비노렐빈(vinorelbine), VP-16 및 VM-26을 포함한다.

항-튜불린제의 예로서는 돌라스타틴(dolastatin)(예를 들어, 아우리스타틴 E(auristatin E), AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB), 메이탄시노이드(maytansinoide), 탁산(taxane)(예를 들어, 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀), T67 (툴라릭(Tularik)), 빈카 알킬로이드(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈), 바카틴 유도체, 탁산 유사체(예를 들어, 에포틸론(epothilone) A 및 B), 노코다졸, 콜히친 및 콜시미드(colcimid), 에스트라무스틴(estramustine), 크립토피신(cryptophysin), 세마도틴(cemadotin), 콤브레타스타틴(combretastatin), 디스코데르몰리드(discodermolide), 및 엘레우테로빈(eleutherobin)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

세포독성 방사성 약제를 생성시키는 방사성동위원소는 예를 들어, 요오드-131, 이트륨-90 또는 인듐-111을 포함한다.

이러한 치료 작용부(약물)를 펩티드에 컨쥬게이트시키는 기술은 잘 알려져 있다. 펩티드-약물 컨쥬게이트의 생성은 당업자에게 공지된 임의의 기술에 의해 달성될 수 있다. 펩티드 및 약물은 직접적으로는 그들 자신의 링커기를 통해 또는 간접적으로는 링커 또는 다른 물질을 통해 서로 결합할 수 있다.

펩티드에 약물을 공유 부착시키는 데는 여러 가지 다른 반응이 가능하다. 이것은 종종 리신의 아민기, 글루탐산 및 아스파르트산의 유리 카복실산기, 시스테인의 술프하이드릴기 및 방향족 아미노산의 다양한 일부분을 포함하는, 펩티드 분자의 아미노산 잔기의 반응에 의해 달성된다. 공유 부착에 가장 일반적으로 사용되는 비특이적 방법 중 하나는 화합물의 카복시(또는 아미노)기를 펩티드의 아미노(또는 카복시)기에 연결시키는 카보디이미드 반응이다. 또한, 디알데히드 또는 이미도에스테르와 같은 이기작용성 제제는 화합물의 아미노기를 펩티드 분자의 아미노기와 연결시키는데 사용하고 있다. 또한, 펩티드에 약물의 부착을 가능하게 하는 것은 시프(Schiff) 염기 반응이다. 이 방법은 글리콜 또는 히드록시기를 함유하는 약물의 과요오드산염 산화를 포함하여, 펩티드 분자와 반응하는 알데히드를 형성한다. 부착은 펩티드 분자의 아미노기를 갖는 Schiff 염기의 형성을 통해 일어난다. 또한, 이소티오시아네이트는 약물을 펩티드에 공유결합으로 부착시키는 커플링제로서 사용될 수 있다. 다른 기술이 당업자에게 알려져있으며 본 발명의 범위 내에 있다.

펩티드-약물 컨쥬게이트를 형성하기 위한 본 기술분야에서 공지된 많은 연결기가 개시되어 있다. 링커는 바람직하게는 펩티드 및 약물 중 하나 또는 둘 모두와 반응하는 하나 이상의 작용기를 포함한다. 작용기의 예로서는 아미노기, 카복실기, 머캅토기, 말레이미드기 및 피리디닐기를 포함한다.

본 발명의 일 실시형태에서, 펩티드는 이기작용성 가교 시약을 통해 약물과 연결된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "이기작용성 가교 시약"은 하나는 펩티드와 반응할 수 있는 두 개의 반응성기를 갖는데, 다른 하나는 약물과 반응하여 펩티드를 약물과 연결시킴으로써 컨쥬게이트를 형성할 수 있는 시약을 일컫는다. 적합한 임의의 이기작용성 가교 시약은 링커 시약이 약물의 보유, 예를 들어, 세포독성 및 펩티드의 표적화 특성을 제공하는 한, 본 발명과 관련하여 사용될 수 있다. 바람직하게는, 링커 분자는 약물과 펩티드가 서로 화학적으로 결합(예를 들어, 공유 결합)되도록 화학 결합을 통해 펩티드에 약물을 결합시킨다.

일 실시형태에서, 이기작용성 가교 시약은 비절단성 링커를 포함한다. 비절단성 링커는 펩티드에 안정하게 공유결합 방식으로 약물을 연결시킬 수 있는 임의의 화학적 일부분이다. 바람직하게는, 비절단성 링커는 생리적 조건 하에서, 특히 체내 및/또는 세포 내부에서 절단 가능하지 않다. 따라서, 비절단성 링커는 약물 또는 펩티드가 활성 상태로 남아있는 조건에서, 산성-유도된 절단, 광-유도된 절단, 펩티다아제-유도된 절단, 에스터가수분해효소-유발된 절단, 및 디설파이드 결합 절단에 실질적으로 내성이 있다. 약물과 펩티드 사이에 비절단성 링커를 형성하는 적합한 가교 결합 시약은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 일 실시형태에서, 약물은 티오에테르 결합을 통해 펩티드에 연결된다.

특히 바람직한 일 실시형태에서, 연결 시약은 절단 가능한 링커이다. 바람직하게는, 절단 가능한 링커는 생리 조건 하에서, 특히 체내 및/또는 세포 내부에서 절단 가능하다. 적합한 절단 가능한 링커의 예로서는 디설파이드 링커, 산성 동요성 링커, 광 동요성 링커, 펩티다아제 동요성 링커 및 에스터가수분해효소 동요성 링커를 포함한다.

링커의 예로서는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트(SPDB), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(SPDP), 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트(sulfo-SMCC), N-숙신이미딜-4-(말레이미도메틸)시클로헥산카복실레이트(SMCC), N-숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-l-카복시-(6-아미도카프로에이트)(LC-SMCC), 4-말레이미도부티르산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(GMBS), 3-말레이미도카프로산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(EMCS), m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르(MBS), N-(α-말레이미도아세톡시)-숙신이미드 에스테르(AMAS), 숙신이미딜-6-(β-말레이미도프로피온아미도)헥사노에이트(SMPH), N-숙신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)-부티레이트(SMPB), N-(p-말레이미도페닐)이소시아네이트(PMPI), 6-말레이미도카프로일(MC), 말레이미도프로파노일(MP), p-아미노벤질옥시카보닐(PAB), N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트(SPP), 및 N-숙신이미딜 (4-요오드아세틸)아미노벤조에이트(SIAB)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 펩티드 링커, 예컨대 발린-시트룰린(Val-Cit) 또는 알라닌-페닐알라닌(ala-phe)을 사용할 수 있고, 앞서 언급된 임의의 링커를 적절하게 조합하여 사용할 수 있다.

디설파이드 함유 링커는 생리 조건 하에서 발생할 수 있는 디설파이드 교환을 통해 절단할 수 있는 링커이다. 또 다른 실시형태에서, 링커는 환원 조건(예를 들어, 디설파이드 링커) 하에서 절단 가능하다. 다양한 디설파이드 링커는 본 기술분야에서 알려져 있는 것이고, 예를 들면, SATA (N-숙신이미딜-5-아세틸티오아세테이트), SPDP (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트), SPDB (N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)부티레이트) 및 SMPT (N-숙신이미딜-옥시카보닐-알파-메틸-알파-(2-피리딜-디티오)톨루엔)을 사용하여 형성할 수 있는 것을 포함한다.

산 동요성 링커는 산성 pH에서 절단 가능한 링커이다. 예를 들면, 엔도좀 및 리소좀과 같은 특정 세포내 구획은 산성 pH(pH 4-5)를 가지며, 산 동요성 링커를 절단하기에 적합한 조건을 제공한다. 산 동요성 링커는 혈액과 같은 중성 pH 조건 하에서 비교적 안정하지만 pH 5.5 또는 5.0 미만에서는 불안정하다. 예를 들면, 히드라존, 세미카르바존, 티오세미카르바존, 시스-아코니트 아미드, 오르쏘에스테르, 아세탈, 또는 케탈 등을 사용할 수 있다.

광동요성 링커는 신체 표면과 빛에 접근 가능한 많은 체강에서 유용하다. 또한, 적외선이 조직을 투과할 수 있다.

펩티다아제 동요성 링커는 세포 내부 또는 외부의 특정 펩티드를 절단하는데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 절단 가능한 링커는 온화한 조건, 즉 세포독성제의 활성이 영향을 받지 않는 세포내 조건에서 절단된다.

링커는, 예를 들어 리소좀 또는 엔도좀 프로테아제를 포함 하나 이에 한정되지 않는 세포내 펩티다아제 또는 프로테아제 효소에 의해 절단되는 펩티딜 링커일 수 있거나 포함할 수 있다. 전형적으로, 펩티딜 링커는 적어도 2개의 아미노산 길이 또는 적어도 3개의 아미노산 길이이다. 절단제는 카텝신 B 및 D 및 플라스민이 포함될 수 있으며, 이들 모두는 표적 세포 내에서 활성 약물의 방출을 야기하는 디펩티드 약물 유도체를 가수 분해하는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 암성 조직에서 고도로 발현되는 티올-의존성 프로테아제 카텝신-B에 의해 절단 가능한 펩티딜 링커를 사용할 수 있다(예를 들어, Phe-Leu 또는 Gly-Phe-Leu-Gly 링커). 특정 실시형태에서, 세포내 프로테아제에 의해 절단 가능한 펩티딜 링커는 발린-시트룰린 (Val-Cit; vc) 링커 또는 페닐알라닌-리신 (Phe-Lys) 링커이다. 치료제를 세포내에서 단백질분해 방출시키는 것의 한가지 장점은 제제가 컨쥬게이트된 경우에 전형적으로 약화되고 컨쥬게이트의 혈청 안정성이 전형적으로 높다는 것이다.

"개체" 및 "대상체"라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이는 질병이나 장애(예를 들어, 암)로 고통받거나 민감할 수 있지만, 질병 또는 장애가 있거나 없을 수 있는 사람, 비인간 영장류 또는 기타 포유류(예를 들어 마우스, 랫, 래빗, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)를 지칭한다. 많은 실시형태에서, 개인은 인간이다. 달리 명시되지 않는 한, "개체" 및 "대상체"라는 용어는 특정 연령을 나타내지 않으므로 성인, 연장자, 어린이 및 신생아를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시형태에서, "개체" 또는 "대상체"는 "환자"이다. 용어 "환자"는 본 발명에 따라 치료 대상, 특히 질환이 있는 대상을 의미한다.

"질병"이란 용어는 개체의 신체에 영향을 미치는 비정상적인 상태를 일컫는다. 질병은 종종 특정 증상 및 징후와 관련된 건강 상태로 해석된다. 질병은 전염병과 같은 외부 원인으로부터 기인한 요인에 의해 야기되거나, 자가면역질환과 같은 내적 기능장애에 의해 야기될 수 있다. 사람의 경우, "질병"은 통증, 기능장애, 고통, 사회적 문제, 또는 고통받는 개체에게 죽음, 또는 개체와 접촉하는 사람들에게 유사한 문제를 초래하는 임의의 상태를 지칭하도록 더 광범위하게 사용된다. 보다 넓은 의미에서는, 때때로 상해, 장애, 장애증상, 증후군, 감염, 격리된 증상, 비정상적인 행동, 및 구조와 기능의 비정형 변화를 포함할 뿐만 아니라 감정적으로, 많은 질병에 걸리고 질병과 삶을 사는 것은 삶에 대한 자신의 견해와 개인의 성격을 바꿀 수 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "질병"은 암, 특히 본원에 기재된 암의 형태를 포함한다. 본원에서 암 또는 암의 특정 형태에 대한 임의의 언급은 이의 암 전이를 또한 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 본원에 따라 치료될 질병은 세프라제를 발현하는 세포를 포함한다.

"세프라제를 발현하는 세포를 포함하는 질병" 또는 이와 유사한 표현은 본 발명에 따라 세프라제가 질병성 조직 또는 기관의 세포에서 발현된다는 것을 의미한다. 일 실시형태에서, 질병성 조직 또는 기관의 세포에서의 세프라제의 발현은 건강한 조직 또는 기관에서의 상태와 비교하여 증가된다. 일 실시형태에서, 발현은 질병 조직에서만 발견되는 반면, 건강한 조직에서의 발현은 억제된다. 본 발명에 따르면, 세프라제를 발현하는 세포를 포함하는 질병에는 암 질환이 포함된다. 또한, 본 발명에 따르면, 암 질환은 바람직하게는 세포가 세프라제를 발현하는 질환이다.

용어 "암 질환" 또는 "암"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는 개체의 생리 조건을 나타내거나 설명한다. 암의 예로서는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 상세하게는, 이러한 암의 예로서는 골암, 혈액암, 폐암, 간암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문부암, 위암, 결장암, 유방암, 전립선암, 자궁암, 성기 및 생식 기관의 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계 암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 방광암, 신장암, 신장세포암종, 신우암, 중추신경 종양(CNS), 신경외배엽 암, 척추 축 종양, 신경교종, 뇌수막종 및 뇌하수체 선종이다. 또한, 본 발명에 따르면 용어 "암"은 암 전이를 포함한다. 바람직하게는, "암 질환"은 세프라제를 발현하는 세포인 것을 특징으로 한다.

"전이"란 암세포가 원래 위치에서 다른 신체 부위로 전파되는 것을 의미한다. 전이의 형성은 매우 복잡한 과정이며 원발성 종양으로부터 악성 세포를 분리하고, 세포외 기질로 침투하며, 내피 기저막으로 침투하여 체강과 혈관에 침투한 다음, 혈액에 의해 운반된 후, 표적 기관으로 침투한다. 마지막으로, 표적 부위에서 새로운 종양의 성장은 신생혈관에 달려있다. 종양 전이는 종종 종양 세포 또는 성분이 전이 잠재성을 유지하고 발달시킬 수 있기 때문에 원발성 종양의 제거 후에도 발생한다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따르면 용어 "전이"는 원발성 종양 및 국소 림프절 시스템으로부터 떨어진 전이와 관련된 "원격 전이"에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 본 발명에 따르면 용어 "전이"는 림프절 전이에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 용어 "종양" 또는 "종양 질환"은 바람직하게는 종창 또는 병변을 형성하는 세포(종양(neoplastic) 세포, 종양유전자성(tumorigenous) 세포 또는 종양 세포라고 함)의 비정상적인 성장을 지칭한다. "종양 세포"란 급속하고 통제되지 않은 세포 증식에 의해 성장하고 새로운 성장을 시작한 자극이 중단된 후에도 계속해서 성장하는 비정상적인 세포를 의미한다. 종양은 정상 조직과의 구조적 조직체 및 기능적 협응이 부분적으로 또는 완전히 결여되어 있고, 일반적으로 양성, 전-악성 또는 악성일 수 있는 별개의 조직 덩어리를 형성한다. 본 발명에 따르면, "암 질환"은 바람직하게는 "종양 질환"이다. 그러나 일반적으로 용어 "암" 및 "종양"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.

바람직하게는, 본 발명에 따르면 종양 질환은 암 질환, 즉 악성 질환이며, 종양 세포는 암 세포이다. 바람직하게는, 종양 질환 또는 암 질환은 세프라제가 발현되거나 비정상적으로 발현되는 세포인 것을 특징으로 하고/하거나 종양 세포 또는 암 세포가 세프라제의 발현 또는 비정상 발현을 특징으로 한다.

재발 또는 재발생은 사람이 과거에 영향을 받은 상태에 의해 재차 영향을 받을 때 발생한다. 예를 들면, 환자가 종양 질환을 앓고 있고, 상기 질환에 대한 성공적인 치료를 받고 상기 질병이 재차 발병한다면, 새로 발병된 질환은 재발 또는 재발생으로 간주될 수 있다. 그러나 본 발명에 따르면, 종양 질환의 재발 또는 재발생은 원래의 종양 질환 부위에서 반드시 발생하는 것은 아니다. 종양의 재발 또는 재발생은 또한 원래의 종양의 부위뿐만 아니라 원래 종양의 부위와 다른 부위에서 종양이 발생하는 상황을 포함한다. 바람직하게는, 환자가 치료를 받은 원래 종양은 원발성 종양이고 원래의 종양의 위치와 다른 부위의 종양은 2차 또는 전이성 종양이다.

"치료" 또는 "치료적 처치"라는 용어는 건강 상태를 향상시키고/하거나 개체의 수명을 연장(증가)시키는 임의의 처치와 관련이 있다. 상기 치료는 개체의 질병을 제거하거나, 개체에서의 질병의 발달을 멈추게 하거나 느리게 하거나, 개체에서의 질병의 발달을 억제 또는 지연시키고, 개체에서의 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키고, 및/또는 현재 질병에 걸린 사람 또는 이전에 질병에 걸린 적이 있는 개체에서의 재발생을 감소시킬 수 있다.

"예방 치료" 또는 "예방적 치료"라는 용어는 개체에서의 질병의 발생을 예방하기 위한 임의의 치료와 관련이 있다. 용어 "예방 치료" 또는 "예방적 치료"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 예를 들면, 암에 걸릴 위험이 있는 대상체는 암을 예방하기 위한 치료법의 후보자가 된다.

"위험이 있는"이란 일반 인구와 비교하여 질병, 특히 암이 발병할 확률이 정상보다 높은 것으로 확인된 대상체를 의미한다. 또한, 질병, 특히 암을 앓았거나 현재 앓고 있는 대상체는 이러한 대상체에서는 계속 질병의 발병이 계속될 수 있기 때문에, 질병이 발병할 위험이 증가된 대상체이다. 또한, 현재 암이 있거나 암에 걸린 적이 있는 대상체는 암 전이 위험이 높다.

암의 (치료적인) 처치는 수술, 항암화학요법, 방사선 치료 및 표적 치료로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "수술"은 수술에서의 종양의 제거를 포함한다. 이는 암에 대한 일반적인 치료법이다. 외과 의사는 국소 절제술을 사용하여 종양을 제거할 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항암화학요법"은 화학요법 또는 화학요법의 조합을 사용하는 것, 바람직하게는 세포를 죽이거나 분열을 중단시킴으로써 암세포의 성장을 중단시키는 것을 의미한다. 항암화학요법제를 구강 섭취 또는 정맥이나 근육에 주사하면, 약물이 혈류에 들어가 몸 전체의 암세포에 도달할 수 있다(전신성 항암화학요법). 항암화학요법이 뇌척수액, 기관 또는 복부와 같은 체강에 직접적으로 배치되면, 약물은 주로 해당 부분의 세포에 영향을 준다(국소성 항암화학요법).

본 발명에 따른 화학요법은 세포증식억제제 화합물 및 세포독성 화합물을 포함한다. 전통적인 화학요법은 대부분의 암세포의 주요 특성 중 하나인, 급속하게 분열하는 세포를 죽임으로써 작용한다. 이는 항암화학요법이 골수, 소화관 및 모낭에 있는 세포와 같이 정상적인 상황에서 빠르게 분열하는 세포에도 해를 끼친다는 것을 의미한다. 이는 항암화학요법의 가장 흔한 부작용을 초래한다. 암세포에서 비정상적으로 발현되는 단백질(예컨대 세프라제)을 표적으로 하고 제제에 컨쥬게이트된 치료 일부분 또는 제제를 통해 작용하는 제제는 항암화학요법의 한 형태로 볼 수 있다. 그러나, 가장 엄격한 의미에서, 본 발명에 따른 용어 "항암화학요법"은 표적 치료를 포함하지 않는다.

본 발명에 따르면, 용어 "표적 치료"는 암세포와 같이 우선적인 질병성 세포를 표적으로 하고 비질병성 세포는 보다 적은 정도로 표적화되거나 표적화되지 않는데 사용할 수 있는 임의의 치료에 관한 것이다. 질병성 세포의 표적화는 바람직하게는 질병성 세포의 증식 또는 생존력의 감소 및/또는 손상을 초래한다. 이러한 치료법은 i) 특정 세포 표면 표적을 표적으로 하는 치료적 일부분, 예를 들면 세프라제에 컨쥬게이트되어, 치료적 일부분을 송달하는 제제(예를 들어, 치료적 일부분에 컨쥬게이트된 세프라제 결합제) 또는 ii) 특정 세포 표면 표적, 예를 들어, 세프라제를 표적으로 하고, 단지 이에 결합함으로써 질병성 세포의 증식 또는 생존력을 손상시키는 제제(예를 들어, 치료적 일부분에 컨쥬게이트되거나 치료적 일부분에 컨쥬게이트되지 않은 세프라제 결합제)를 포함한다.

본 발명에 따라 기재된 약제 조성물 및 치료 방법은 본원에 기재된 질환을 치료적 처치 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 암에 대한 영향을 테스트하기 위해 동물 모델을 사용할 수 있다. 예를 들어, 사람 암세포를 마우스에 도입하여 종양을 생성시킬 수 있다. 암세포에 대한 효과(예를 들면, 종양 크기의 감소)는 동물에게 투여되는 제제의 유효성에 대한 척도로서 측정될 수 있다.

펩티드는 그 자체로 공지된 방식으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 1ng 내지 1mg, 바람직하게는 10ng 내지 100μg의 펩티드의 용량을 제형화하고 투여한다.

핵산(DNA 및 RNA)의 투여가 필요한 경우, 1ng 내지 0.1mg의 용량을 제형화하여 투여할 수 있다.

일 실시형태에서, 핵산은 생체외 방법, 즉 환자로부터 세포를 제거하고 핵산을 도입하기 위해 상기 세포의 유전자 변형 및 환자에게 변경된 세포의 재도입함으로써 투여된다. 이는 일반적으로 시험관내에서 환자의 세포로 유전자의 기능적 카피를 도입하는 단계 및 유전적으로 변경된 세포를 환자에게 재도입하는 단계를 포함한다. 유전자의 기능적 카피는 유전자가 유전자 변경 세포에서 발현되도록 하는 조절 요소의 기능적 제어 하에 있다. 형질주입 및 형질도입 방법은 당업자에게 공지되어 있다.

또한, 본 발명은 예를 들어 바이러스 및 표적-제어된 리포좀과 같은 벡터를 사용함으로써, 핵산을 생체내 투여하는 것을 제공한다.

바람직한 실시형태에서, 핵산을 투여하기 위한 바이러스 또는 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 우두바이러스 및 약독 폭스바이러스를 포함하는 폭스바이러스, 셈리키삼림열바이러스(Semliki Forest virus), 레트로바이러스, 신드비스바이러스 및 Ty바이러스 유사 입자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 아데노바이러스 및 레트로바이러스가 특히 바람직하다. 레트로바이러스는 전형적으로 복제-결핍된 것이다(즉, 이들은 감염성 입자를 생성할 수 없다).

핵산을 세포내로 시험관내 또는 생체내 도입하는 방법은 핵산 인산칼슘 침전물의 형질주입, DEAE와 관련된 핵산의 형질주입, 관심있는 핵산을 보유하는 상기 바이러스로의 형질주입 또는 감염, 및 리포좀 매개 형질주입 등을 포함한다. 특정 실시형태에서, 핵산을 특정 세포로 유도하도록 부여하는 것이 바람직하다. 이러한 실시형태에서, 핵산을 세포(예컨대, 레트로바이러스 또는 리포좀)에 투여하기 위해 사용되는 담체는 결합된 표적 제어 분자를 가질 수 있다. 예를 들면, 표적 세포 상의 표면 막 단백질에 특이적인 항체 또는 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드와 같은 분자가 핵산 담체에 혼입되거나 부착될 수 있다. 바람직한 항체는 종양 항원에 선택적으로 결합하는 항체를 포함한다. 리포좀을 통한 핵산의 투여가 요구되는 경우, 표적 제어 및/또는 흡수를 가능하게 하기 위해 엔도시토시스와 관련된 표면 막 단백질에 결합하는 단백질을 리포좀 제형에 혼입시킬 수 있다. 이러한 단백질은 특정 세포 유형에 특이적인 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 내재화된 단백질에 대한 항체, 세포내 부위를 다루는 단백질 등을 포함한다.

본 발명의 치료 활성 화합물은 주사 또는 주입을 포함하는 통상적인 임의의 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여는 예를 들어 경구, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 경피로 실시될 수 있다. 투여는 국소적 또는 전신적으로, 바람직하게는 전신적으로 실시될 수 있다.

용어 "전신 투여"는 제제가 현저한 양으로 개체의 신체 내에서 광범위하게 분포되고 원하는 효과를 발현하도록 제제를 투여하는 것을 말한다. 예를 들어, 제제는 혈액 내에서 원하는 효과를 발현 및/또는 혈관계를 통해 원하는 작용 부위에 도달할 수 있다. 전형적인 전신 투여 경로는 제제를 혈관계 또는 구강에 직접 도입하여 투여하거나, 폐 또는 근육내 투여를 포함하며, 이때 제제는 흡수되어 혈관계로 들어가고, 혈액을 통해 하나 이상의 원하는 작용 부위로 운반된다.

본 발명에 따르면, 전신 투여가 비경구 투여인 것이 바람직하다. 용어 "비경구 투여"는 제제가 장을 통과하지 못하도록 하는 제제의 투여를 말한다. 용어 "비경구 투여"는 정맥내 투여, 피하 투여, 피내 투여 또는 동맥내 투여를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제 조성물은 바람직하게는 멸균되고, 원하는 반응 또는 원하는 효과를 발생시키기 위해, 본원에 기재된 제제 및 본원에서 논의된 바와 같은 임의로 추가적인 제제를 함유하여 원하는 반응 또는 목적하는 효과를 생성한다.

약제 조성물은 일반적으로 균일한 투여 형태로 제공되며, 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 약제 조성물은 예를 들어, 용액이나 현탁액의 형태일 수 있다.

약제 조성물은 바람직하게는 모두 약제적으로 수용 가능한 염, 완충 물질, 방부제, 담체, 희석제 및/또는 부형제를 포함할 수 있다. "약제적으로 수용 가능한"이라는 용어는 약제 조성물의 활성 성분의 작용과 상호작용하지 않는 물질의 무독성을 지칭한다.

약제적으로 수용되지 않는 염은 약제적으로 수용 가능한 염을 제조하는데 사용될 수 있으며 본 발명에 포함된다. 이러한 종류의 약제적으로 수용 가능한 염은 염산, 브롬산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, 시트르산, 포름산, 말론산 및 숙신산 등의 산으로부터 제조된 것들을 비제한적으로 포함한다. 약제적으로 수용 가능한 염은 또한 나트륨염, 칼륨염 또는 칼슘염과 같은 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염으로서 제조될 수 있다.

약제 조성물에 사용하기에 적합한 완충 물질은 염의 아세트산, 염의 시트르산, 염의 붕산 및 염의 인산을 포함한다.

약제 조성물에 사용하기에 적합한 방부제는 염화벤잘코늄, 클로로부탄올, 파라벤 및 티메로살을 포함한다.

용어 "담체"는 자연 또는 합성 성질의 유기 또는 무기 성분을 말하며, 활성 성분이 적용을 촉진, 증진 또는 가능하게 하기 위해 조합되어 있다. 본 발명에 따르면, 용어 "담체"는 또한 환자에게 투여하기에 적합한 하나 이상의 혼용가능한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 포함한다.

가능한 비경구 투여용 담체 물질은 예를 들어, 물, Ringer, Ringer 락테이트, 멸균 염화나트륨 용액, 폴리알킬렌글리콜, 수소화 나프탈렌 및 특히 생체혼용가능한 락티드 중합체, 락티드/글리콜리드(glycolide) 공중합체 또는 폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 공중합체를 포함한다.

주사 가능한 제형은 약제적으로 수용 가능한 부형제, 예컨대 링거 락테이트 (Linger Lateate)를 포함할 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "부형제"는 약제 조성물에 존재할 수 있고 예를 들어 담체, 바인더, 윤활제, 증점제, 표면활성제, 방부제, 유화제, 완충액, 향료 또는 착색제와 같은 활성 성분이 아닌 모든 물질을 가리키도록 한다.

본원에 기재된 제제 및 조성물은 유효량으로 투여된다. "유효량"은 원하는 반응 또는 원하는 효과를 단독으로 또는 추가 용량과 함께 달성하는 양을 지칭한다. 특정 질환 또는 특정 상태의 치료의 경우에, 바람직한 반응은 바람직하게는 상기 질환의 경과의 억제에 관한 것이다. 이는 질병의 진행을 늦추고, 특히 질병의 진행을 방해하거나 역전시키는 것을 포함한다. 질병 또는 상태의 치료에서 목적하는 반응은 또한 상기 질병 또는 상기 상태의 발달 지연 또는 발병 예방일 수 있다.

본원에 기재된 제제 또는 조성물의 유효량은 치료될 상태, 질환의 중증도, 환자의 연령, 생리 상태, 사이즈 및 중량, 치료 기간, 동반 요법의 종류(있는 경우), 특정 투여 경로 및 이와 유사한 인자들을 포함하는 환자의 개체맞춤 변수에 따라 달라질 것이다. 따라서, 본원에 기재된 제제의 용량은 이러한 변수의 다양성에 좌우될 수 있다. 환자에서의 반응이 초기 용량으로 불충분한 경우에는, 보다 많은 용량(또는 보다 국소화된 상이한 투여 경로에 의해 달성되는 보다 높은 용량)이 사용될 수 있다.

본원에 기재된 제제 및 조성물은 본원에 기재된 것과 같은 다양한 장애를 치료 또는 예방하기 위해 환자에게, 예를 들어, 생체내 투여될 수 있다. 바람직한 환자는 본원에 기재된 제제 및 조성물을 투여함으로써 교정되거나 개선될 수 있는 장애를 갖는 사람 환자를 포함한다. 이는 세프라제의 변경된 발현 패턴을 특징으로 하는 세포를 포함하는 장애를 포함한다.

예를 들면, 일 실시형태에서, 본원에 기재된 제제는 암 질환, 예를 들어 세프라제를 발현하는 세포의 존재를 특징으로 하는 본원에 기재된 바와 같은 암질환을 가진 환자를 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 하기의 도면 및 실시예에 의해 상세히 설명되며, 이는 예시 목적을 위해서만 사용되며 이에 한정하려는 것은 아니다. 상세 설명 및 실시예들로 인해, 마찬가지로 본 발명에 포함되는 추가적인 실시형태들은 숙련된 기술자에게 이해하기 용이한 것이다.

실시예

본원에서 사용된 기술 및 방법은 그자체로 알려진 방식이고 예를 들면, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y에 기재된 바와 같이 본원에 기재되어 있거나 실시된다. 키트 및 시약의 사용을 포함하는 모든 방법들은 특별히 명시되지 않는 한, 제조사의 정보에 따라 실시된다.

실시예 1: 재료 및 방법

플라스미드 구조물

CHO 코돈 최적화된 전장 길이의 사람 세프라제(NCBI 기탁번호 NP_004451)를 Geneart에 의해 합성하고, pENTRcht 벡터(Invitrogen) 내로 서브클로닝시켰다. 플라스미드를 DNA 염기서열분석에 의해 확인하고, pENTR-huSeprase로 명명하였다. 그후, 각각의 삽입물을 Gateway 클로닝(Invitrogen)에 의해 피기(piggy) Bac 트랜스포존 벡터(PB53x EF1 시리즈)로 옮겨서 트랜스포존 발현 플라스미드를 생성시켰다. 이들 플라스미드는 셀렉션마커로서 cDNA, IRES-EGFP 카세트 및 히그로마이신의 발현을 유도하기 위한 EF1알파 프로모터를 함유한다. 상기 플라스미드를 안정한 세프라제 발현 세포주의 생성에 사용하였다.

PCR 주형으로서 pENTR-huSeprase 플라스미드 DNA를 활용하여, 세프라제 세포밖 도메인(아미노산 29-760번)을 암호화하는 cDNA 단편은 순방향 프라이머(5'-GCGCAAGCTTGCTGCGGCCCTCCCGGGTGCAC-3') 및 역방향 프라이머(5'-GCGCAGCGGCCGCGTCGGACAGGGAGAAGCACTGC-3')를 가지고 증폭시켰다. 짧은 세포질 도메인(아미노산 1-6번)과 세프라제의 소수성 막관통 도메인(아미노산 7-29번) 모두의 암호화 서열을 제외한, PCR 산물을 변형된 pCEP4 벡터(Invitrogen)에 삽입하였다. pCEP4와 비교하여, 변형된 벡터는 Kozak 공통서열, 헥사히스티딘(H6) 융합 태그 및 재조합 단백질의 효율적인 분비를 위한 마우스 Ig 카파사슬의 V-J2-C 영역으로부터의 분비 신호의 암호화 서열을 추가적으로 함유한다. 세프라제 세포밖 도메인의 cDNA 서열은 재조합 세프라제의 효율적인 분비, 용이한 검출(Invitrogen사의 항-His 항체에 의해) 및 신속한 정제(Ni-킬레이트 친화성 크로마토그래피에 의해)가 가능하도록 N-말단 분비 신호 및 C-말단 H6 태그와 함께 프레임에 삽입시켰다. 최종 구조물은 DNA 염기서열분석에 의해 확인하고, pCEP4-IgKappa-huSeprase-coCHO_26-760aa-H6으로 명명하고 재조합 가용성 사람 세프라제(rhuSeprase)의 생성에 사용하였다.

세포주

ATCC로부터 획득된 차이니즈 햄스터 난소세포(CHO-K1)를 페니실린(100 units/ml), 스트렙토마이신(100 mg/ml) 및 10%(v/v) 가열-불활성화된 우태아혈청(FBS)(Invitrogen)으로 보충된 DMEM/F-12 배지에서 성장시켰다. 세포를 5% CO₂-가습 공기 분위기에서 37℃로 유지하고 48-72 시간마다 계대배양하였다. MOCK 또는 사람 세프라제를 발현하는 CHO-K1 세포(CHO-K1-MOCK 및 CHO-K1-huSeprase)를 200 μg/mL 히로마이신 B(hyromycin B)(Invitrogen)를 첨가하여 야생형 세포와 동일한 조건 하에서 성장시켰다. rhuSeprase의 생산을 위해 Invitrogen사의 Freestyle™ CHO-S 세포주를 사용하였다. 이 현탁 세포주는 일반적인 CHO-K1 세포주와는 별개의 서브클론으로서 구별되고 있다(D'Anna, 1996; D'Anna et al., 1997; Deaven & Petersen, 1973). 세포는 표준 가습 조건(37℃ 및 8% CO₂) 하에서 120-135 rpm (Minitron 인큐베이터 진탕기, Infors-HT)에서 15-25%의 아주 적은 부피를 사용하여 배기 뚜껑이 있는 폴리카보네이트성 일회용 멸균 에를렌마이어 플라스크(125 mL 또는 500 mL)에서 배양하였다. 밀도가 대략적으로 1-1.5 x 10⁶ 생세포/ml인 경우, 1 X HT 보충제 및 4 mM 글루타민(Invitrogen)으로 보충된 CHO 세포(CD CHO 배지, Invitrogen)에 대해 단백질이 없는 화학적으로 한정된 배지에서 전형적으로 48-72시간마다 세포를 계대배양하였다.

재조합 사람 세프라제의 생산

가용성 재조합 사람 세프라제 단백질(rhuSeprase)의 대규모 발현을 위해, FreeStyle™ MAX CHO 발현 시스템(Invitrogen)을 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. 요약하면, CHO-S 세포를 5-6 x 10⁵ 세포/ml로 통과시키고, Minitron 인큐베이터 진탕기(Infors-HT)에서 120 rpm-135 rpm으로 표준 가습 조건 하에 밤새 인큐베이션시켰다. 다음 날 세포를 형질주입한 당일에 500ml 진탕플라스크에 150 ml씩 1 x 10⁶ 세포/ml로 희석하였다. 187.5μg의 pCEP4-IgKappa-huSeprase-coCHO_26-760aa-H6 플라스미드 DNA를 3ml의 OptiPro™ SFM에 첨가하고 혼합하였다. 187.5μl의 FreeStyle™ MAX 형질주입 시약을 3ml의 OptiProSFM(Invitrogen)에서 희석하고 부드럽게 혼합하였다. 희석된 FreeStyle™ MAX 형질주입 시약을 희석된 DNA 용액에 첨가하고, 부드럽게 혼합하고, 실온에서 10분간 배양하였다. DNA-FreeStyle™ MAX 시약 복합물은 500 ml-플라스크를 서서히 스월링하는 동안에 세포가 들어있는 500ml-플라스크 내에 서서히 첨가시켰다. 그 후, 형질주입된 세포 배양물을 표준 조건 하에서 배양하였다. 형질주입 5일 내지 7일 후에, 상청액을 수확하고 각각 HisTrap HP (GE Healthcare) 및 HiLoad 26/600 Superdex 200 프렙 등급 SEC 컬럼(GE Healthcare)을 사용하여 통상적인 Ni-킬레이트 친화성 크로마토그래피 및 사이즈-배제 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 정제된 단백질의 일부를 얼음으로 2시간 동안 PBS pH 8.8에서 10배 몰 과량의 EZ-Link 설포-NHS-LC-비오틴(Pierce)과 함께 인큐베이션함으로써 비오티닐화시켰다. 단백질은 5% 만니톨(Roth) 및 5% 트레할로오스(Applichem)로 보충된 PBS로 완충액을 교환한 후 -20℃에서 보관하였다.

안정한 세프라제 발현 세포주의 생성

폴리에틸렌이민, 선형, MW 25000(PEI)(Polysciences. Inc) 시약을 형질주입 시약으로서 사용하였다. 안정한 세포주는 PiggyBac 트랜스포존 시스템으로 확립하였다. 요약하자면, 이 시스템은 재조합 전이유전자를 위한 포유류 발현 카세트를 갖는 인공 트랜스포존 및 PB 전이효소(PBase)(Invitrogen)의 일시적인 발현을 유도하는 헬퍼 벡터를 갖는 공여체 벡터로 구성된다. 형질주입하기 하루 전에, 3 x 10⁵ CHO-K1 세포를 6-웰 플레이트에서 웰당 2 ml의 성장 배지에 도말하였다. CHO-K1 세포를 2μg의 트랜스포존 벡터 플라스미드 및 0.8μg의 전이효소 벡터 플라스미드와 함께 공-형질주입시켰다. 형질주입하고 3일 후, 세포를 분열시키고, 200μg/ml 히그로마이신 B(Invitrogen)를 함유하는 배지에 넣었다. 히그로마이신 선별 2주 후, 형질주입 효율 및 표적 발현을 유세포 분석, 웨스턴블롯 및 면역형광 분석으로 분석하였다. 이 기능성은 Z-Gly-Pro-AMC 기질 (Bachem)을 사용하여 효소 활성 분석에 의해 시험하였다.

유세포 분석

유세포 분석을 위해, 1 x 10⁶ 세포를 수집하고 FACS 완충액(PBS + 0.5 M EDTA + 5% FBS)으로 1회 세척하고 얼음에서 1시간 동안 사람 세프라제(클론 1E5, Abnova; 1:50 희석)에 대한 항체 또는 다른 농도의 티오레독신-A(Trx) 미니단백질 융합물과 함께 인큐베이팅하였다. 4량체화된 미니단백질의 결합을 분석하기 위해, 비오티닐화된 미니단백질은 실온에서 10분 동안 5배 몰 과량의 스트렙타아비딘-APC (Affymetrix eBioscience)로 미리 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후 세포를 FACS 완충액으로 3회 세척하였다. 4량체화된 미니단백질로 처리된 세포를 유세포 분석을 위해 직접 사용하였다. 세프라제 발현 또는 1가 미니단백질 결합을 분석하기 위해, 세포를 2차 Cy5 표지된 항-마우스 항체(Dianova) 또는 PE-표지된 항-H6 항체(R&D Systems, Trx-미니단백질 융합물 내에서 내부의 H6 태그를 검출함)로 염색하였다. 30분 후에 세포를 FACS 완충액으로 재세척하고 FACS Canto II 장치(Becton Dickinson)를 사용하여 분석하였다. 분석 게이트를 전방 산란/측면 산란 특성에 따라 식별된 생세포 상에 설정하였다. FlowJo 소프트웨어 (버전 10, Tree Star Inc.)를 사용하여 데이터를 분석하였다.

면역조직화학

종양을 즉시 절제하고 끼어넣은 카세트 내로 옮기고 4% Roti-Histo-Fix(pH 7) (Roth)에서 4℃에서 밤새 고정시켰다. 고정 후, 과량의 고정 용액을 제거하기 위해 종양을 70% 에탄올로 세척하였다. 그후, 종양은 농도 점증시킨 알코올 계열에서 탈수시키고 조직 프로세서에서 파라핀에 포매하였다. 포매된 종양의 연속 절편(두께 3μm)은 마이크로톰으로 수행하였다. 절편은 유리 슬라이드에 올리고 탈파라핀화하고 농도 점감시킨 알코올 계열에서 재수화하였다. 그 다음, 절편은 마이크로웨이브에서 10mM 시트로산염 완충액(pH 6)으로 20분 동안 삶았다. 1X PBST로 세척한 후, 비특이적 결합을 30분 동안 PBST에서 3% BSA로 차단시켰다. 4량체화 전에 스트렙타아비딘-Cy3(Rockland)와 함께 사전 인큐베이터한 1:500 다클론성 항-SMA 항체(Abcam) 또는 1μM 비오티닐화 미니단백질을 첨가하고 4℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 1 X PBST 항-SMA 항체로 절편을 3회 세척한 후 1:200으로 희석된 2차 항체 IgG 항-래빗-FITC(Dianova)로 결합을 검출하였다. 2차 항체를 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 마지막으로, 절편을 PBS로 3회 세척하고 이어서 Hoechst 염료(Sigma-Aldrich)와 함께 인큐베이팅하고 10분 동안 1 X PBS에서 1:5000으로 희석하고 마운팅배지(Darko)에 올렸다.

TNBC에서 세프라제의 발현 수준을 평가하기 위해, 폐 및 췌장 암종의 면역조직화학 분석을 수행하였다. 양성 대조군으로서는 세프라제의 양성 발현 수준을 갖는 CHO-K1-huSeprase 조직과 음성 대조군으로서는 인간 결장 절편을 사용하였다.

췌장 조직을 포매한 파라핀에 대해, 3μm 두께의 절편을 자일렌 및 등급화된 에탄올로 탈파라핀화하였다. 10mM 시트르산 나트륨 완충액, pH6. 0 + 0.05% Tween-20 내 120℃에서 가열함으로써 항원 회수를 수행하고 10분간 냉각시켰다. 시료를 PBS + 0.3% H₂O₂에서 15분간 정치시켰다. 냉동된 조직 절편(유방 및 폐 조직)은 크라이오스탯에서 5-8μm로 절단하였다. 절편을 실온에서 10분간 해동시키고, PBS 중에서 5분간 재수 화하고 BLOXALL(Vectorlabs)에서 10분간 정치시켰다.

모든 절편은 비특이적 반응을 차단하기 위해 30분간 실온에서 10% 정상 염소 혈청으로 인큐베이팅하였다. 이는 실온에서 1시간 동안 0.5μg/ml로 희석된 다클론성 래빗 항-사람 세프라제 항체(Sigma)와 함께 인큐베이팅함으로써 실시하였다. PBS로 세척한 후 절편을 이차 항체(Power-Vision HRP 항-래빗)와 함께 30분간 인큐베이팅하였다. 면역염색의 국소화는 Vector NovaRED 시스템(Vector Laboratories)으로 인큐베이션에 의해 입증되었다. Mayer's Haematoxylin에 의한 대조염색 및 절편의 탈수는 Multistainer ST5020(Leica)으로 행해졌다. 그후, 슬라이드는 XTRA-Kitt Medite 마운팅배지를 올렸다.

파지 디스플레이 선별 대 rhuSeprase

대략적으로 1 x 10¹⁰ 개별 변이체를 포함하는 무작위화된 크노틴(knotin) 라이브러리는 rhuSeprase에 대한 파지 디스플레이 선택을 위해 적용하였다. 상기 라이브러리는 목별자의 개방형 사슬 트립신 억제제 II(oMCoTi-II, (Avrutina, Schmoldt et al. 2005))를 기반으로 한다. Maxisorp™ 면역 튜브(Thermo Scientific) 또는 스트렙타아비딘 코팅된 자성 비드(Dynabeads 280 스트렙타아비딘, Life Technologies)를 통해 고정화된 rhuSeprase를 사용하여 3회 선택 라운드를 실시하였다.

미니단백질 변이체의 생산

비오티닐화 미니단백질 변이체는 Pepscan으로부터 구입하였다. 이러한 경우에, 미니단백질은 통상적인 고체상 펩티드 합성에 의해 생성된 다음 천연 시스틴-결절 구조로 열역학적 폴딩에 의해 생성된다. 다른 모든 경우에서, 박테리아 숙주의 세포질에서의 디설파이드 결합 형성을 허용하는 E. coli Shuffle™ T7 Express 균주(NEB)와 함께 티오레독신-A (Trx) 기반 융합 시스템을 사용하여 미니단백질을 재조합적으로 생산하였다(Lobstein, Emrich et al., 2012). 세미-프랩(semi-preparative) 또는 분석 재조합 합성을 위해, 미니단백질 변이체 암호화 유전자는 특유의 BamHI 및 ApaI 제한효소부위를 통해 pET-32-LibEx 벡터 내에 클로닝하여 티오레독신-A, His-태그(H6), S-태그 및 미니단백질 유전자를 생성하였다. 미니단백질의 세미-프랩 생산을 위해, 발현은 표준 라이소제니 브로쓰(Lysogeny Broth)(LB) 배지를 사용하여 1l 진탕플라스크에서 수행하는 반면, 분석 스케일 생산(예를 들어 히트-동정 또는 MC-FA-010 알라닌 돌연변이의 분석을 위해)은 자기유도 배지(MagicMedia™, Life Technology)를 사용하여 96웰 플레이트에서 실시하였다. 발현 후, 세포를 수확하고 리소자임으로 용해하거나 응결/해동 주기와 조합하여 초음파파쇄에 의해 용해시켰다. 두 경우 모두에서, 제거된 세포용해물을 80℃에서 10분간 가열 단계에 적용하여 다량의 숙주세포 단백질을 제거하였다. 얻어진 단백질 제제는 ELISA 결합 분석(예를 들어 히트 동정의 목적으로)에 직접 사용하거나 Ni-NTA 스핀 컬럼(Qiagen, 분석 스케일) 또는 5ml HisTrap HP 컬럼(GE Healthcare, 세미-프랩 스케일)을 사용하여 Ni-킬레이트 친화성 크로마토그래피를 통해 추가로 정제하였다. 태그가 없는 미니단백질의 생성을 위해, 0.5 U 트롬빈/mg 융합 단백질과 37℃에서 밤새 인큐베이팅하여 트롬빈(Sigma)으로 trx-미니단백질 융합체를 절단하였다. 이어서, TSKgel ODS-120T 컬럼 (Tosoh Bioscience)을 사용하여 HPLC로 미니단백질을 분리할 수 있었다. 각각의 HPLC 분획을 동결건조한 후 얻어진, 최종 미니단백질 제제를 질량 분석법 및 BioSep-SEC-S2000 컬럼 (Phenomenex)을 사용하는 분석 사이즈 배제 크로마토 그래피로 분석하였다. 수율을 계량 또는 OD(280nm) 측정에 의해 계산하였다.

웨스턴블롯팅

1 x 10⁵ 세포를 배양접시에서 배양한 후, 차가운 1 X PBS로 1회 세척하고 500μL 4 X SDS 용해 완충액(250mM Tris-HCl, 34% 글리세롤, 8.2% SDS, 5% β-머캅토에탄올) 용해하였다. 세포를 세포 스크레이퍼로 긁고 세포 파편을 제거하기 위해 용해물을 4℃에서 14000 x g에서 몇분간 원심분리하였다. 그 후, 용해물을 초음파 처리하였다. 용해물을 브롬페놀블루가 첨가된 4X SDS-용해 완충액으로 끓이고 SDS-PAGE로 분석하고나서 이어서 웨스턴블롯팅으로 분석하였다. 다음으로 1차항체로는 항-세프라제(Abcam), 항-His(Abcam) 또는 항-β-액틴, 및 2차항체로는 항-마우스-HRP(클론)를 검출에 사용하였다.

조회 식별

3회 라운드의 파지 디스플레이 선택 후, 얻어진 풀을 pET-32-LibEx 발현 벡터에서 서브클로닝하여 파지 백그라운드로부터 독립적으로 추정되는 rhuSeprase 바인더의 동정을 가능하게 하였다. 이를 위해, 각각의 미니단백질 유전자풀을 특정 올리고뉴클레오티드로 PCR 증폭시켰다. 얻어진 PCR 산물을 정제하고, Bam HI 및 Apa I 제한효소로 절단하고 유사하게 분해된 발현 벡터로 결찰(ligation)시켰다. E. coli Shuffle™ T7 Express의 형질전환 후 각각의 클론을 채취하고 Trx-융합 단백질을 상기한 바와 같이 96웰 형태로 제조하였다. 결합 분석을 위해 ELISA 분석을 수행하였다. 따라서 MaxiSorp 96웰 플레이트(Nunc/Thermo Fisher Scientific)는 표적단백질 또는 BSA(50mM Na-Carbonat, pH 9.4 중 5μg/ml 단백질 용액의 각각 100μl)로 도포하였다. 표적단백질에의 결합은 "신호"에 해당하고 BSA에의 결합은 "노이즈"에 해당한다. 단일 플레이트의 정상화를 위해, MC-Myc-010(Myc-결합 시스틴 결절 미니단백질) 및 항-cMyc 항체(클론 9E10)의 결합을 3배로 분석하였다. 도포는 4℃에서 밤새 수행하였다. 웰은 0.1% Tween 20(pH 7.4, PBS-T)을 함유하는 인산완충식염수 300μl로 3회 세척하였다. 이어서, 블로킹 용액(Blocking Solution, Sigma Aldrich)으로 웰을 2시간 동안 차단하였다. 세척 단계(3x PBS-T) 후, 용해물을 함유하는 Trx 융합 단백질을 1:5로 희석하고 도포된 단백질과 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 세척 및 인큐베이션 단계를 항-S-태그 항체(PBS 중 1:2000, abcam)를 사용하여 반복하였다. 검출 전에 세척 단계를 2회 수행하였다(3x PBS-T 및 3x PBS). 검출은 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 액체 기질(TMB 용액, Sigma-Aldrich) 및 450nm에서의 흡수 증가(Tecan M200 Pro ELISA 판독기에서 검출 됨)를 사용하여 실시하였다. 단일 클론의 발현은 96-웰 E-PAGE 전기영동(Life Technologies) 및 ImageQuant TL 소프트웨어 패키지(GE Healthcare)를 통한 단백질 밴드의 정량으로 분석하였다. 단백질 순위에 대해 ELISA의 신호 대 노이즈 비율을 계산하고 발현값과 상관시켰다. 이어서 상위 30 클론을 추가적인 분석에 사용하였다.

ELISA를 통한 결합 분석

ELISA는 미니단백질 변이체의 결합 특성 및 특이성을 평가하고 비교하기 위해 수행하였다. 이를 위해, 재조합 단백질 또는 전체 세포가 사용되어 왔다. 전체 세포 ELISA 분석을 위해 96-웰 평면 바닥 플레이트(Corning)의 각 웰에 5 x 10⁵ 세포를 접종하였다. 따라서, 세포를 37℃, 5% CO₂-가습 공기 분위기에서 20시간 동안 인큐베이팅하였다. 그 후, 웰을 실온에서 1시간 동안 5% 밀크파우더/PBS로 차단시켰다. 블로킹 완충액을 제거한 후, Trx-미니단백질 용액을 각 웰에 첨가하고, 세포와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서, 웰을 PBS-T(PBS + 0.1% Tween-20)로 6회 광범위하게 세척하고, 결합된 미니단백질의 양을 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)-컨쥬게이트된 항-S 태그 항체(Abcam)로 검출하였다. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)(Sigma)을 발색 기질로 사용하였다. 대략적으로 20분 후에 0.2M HCl로 HRP 효소 반응을 중단시키고 플레이트를 Victor V3 플레이트 판독기(Perkin Elmer)에서 450nm로 측정하였다. 경쟁 연구를 위해 세포와 인큐베이션하기 전에 0.1μM Trx-MC-FA-010 융합 단백질을 상이한 농도의 단독 MC-FA-010 미니단백질(1-200μM)과 미리 혼합하였다.

단백질 기반 ELISA 분석을 위해 4 ㎕의 코팅 완충액에서 하룻밤 배양하여 각각의 재조합 단백질(rhuSeprase; 스트렙타아비딘: Sigma; DPP-IV: R&D Systems, BSA: Eurobio) 5μg을 MaxiSorp™ 플레이트(Nunc)의 웰 당 4 ℃에서 완충액 도포시 밤새 인큐베이팅하여 고정시켰다. Hydrospeed 플레이트 세척기(Tecan) 상에서 300μl PBS-T/웰로 3회 세척한 후 실온에서 2시간 동안 1 x 카세인 용액(Sigma, PBS로 희석)으로 웰을 차단하였다. 그후, 상기한 바와 같이 웰을 세정하였다. 이어서, PBS-T에서 희석된 각각의 Trx-미니단백질 융합체 100μl를 첨가하고 4℃에서 1 시간 동안 인큐베이팅하였다. 단순히 열처리 정제된 단백질을 1:5로 희석하고, 친화성 정제된 단백질을 0.39-50nM 범위의 한정된 농도로 적용하였다. 경쟁 ELISA의 경우, 3nM Trx-미니단백질 융합체의 고정된 농도를 인큐베이션 전에 미니단백질만은 다양한 농도(0.64-3167nM)로 혼합하였다. Trx 융합체의 결합은 상기한 바와 같이 HRP 결합된 항 S-태그 항체를 사용하여 PBS-T 세척 과정 후에 검출하였다. 명백한 Kd는 Sigmaplot 10과 데이터 피팅을 위한 단일 사이트 포화 결합 모델을 사용하여 계산하였다.

SPR 분석

동적 결합 특성에 대한 통찰을 얻기 위해 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석을 Biacore T100 장치(GE Healthcare)에서 수행하였다. 따라서 rhuSeprase는 제조사의 설명에 따라 420초 동안 10μl/min에서 NHS/EDC 매개 커플링을 통해 CM5 칩 상에 고정시켰다. 고정된 rhuSeprase에 다양한 농도 (37, 111.1, 333.3, 1000 및 3000 nM)에서의 MC-FA-010의 결합은 90초의 기간에 걸쳐서 회합(association) 및 해리에 대해 측정하였다. Kd값은 제공된 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.

표면 플라즈몬 공명 분광법(Biacore T-100, GE Healthcare)을 사용하여 재조합 사람 세프라제(rhuSeprase)에 대한 단량성 및 올리고머성 MC-FA-010 및 이의 변이체의 동역학 및 친화력을 측정하였다. RhuSeprase (PBS, 5% 만니톨, 5% 트레할로오스 중의 20μg/ml)를 아미노 반응성 시리즈 S 센서 칩 CM5(GE Healthcare)에 고정시켰다. 단량성 Microbody의 결합 분석을 위해 rhuSeprase는 최대 7500 RU로, 올리고머 Microbody는 최대 700 RU로 부하시켰다. 단량성 Microbody는 예상 해리상수를 기준으로 3.125 내지 1000nM의 농도 범위로 다중주기 동역학 방법을 사용하여 측정하였다. 회합 단계는 60-90초의 기간에 걸쳐 측정하였고, 해리 단계는 420초에 걸쳐 측정하였다. 3량체성 Microbody는 0.3125 내지 5 nM의 농도 범위의 단일주기 동역학 방법을 사용하여 측정하였다(90초 동안 회합, 420초 동안 해리). 결합 동역학 및 정상상태(steady state) 분석은 1:1 결합 모델 (Biacore T-100 평가 소프트웨어, GE Healthcare)을 사용하여 계산하였다.

MC-FA-010의 알라닌 스캔 돌연변이 유발

세프라제 바인더 MC-FA-010의 구조-활성 관계에 대한 통찰을 얻기 위해, 알라닌 스캔 돌연변이 유발을 수행하였다. 따라서, 가변영역의 단일 아미노산마다 DNA 수준에서 알라닌으로 교체하였다. 돌연변이 유전자는 DNA Strings™로서 Geneart에 의해 합성하고 특유의 Bam HI 및 Apa I 제한효소부위를 통해 pET-32-LibEx 발현 벡터에 직접 클로닝하였다. 알라닌 변이체의 생산은 상기한 바와 같은 Shuffle™ T7 Express E. coli 균주를 사용하여 96웰 미량정량판에서 수행하였다. Ni-NTA 스핀 컬럼(Qiagen)으로 정제한 후, 변이체의 결합 특성을 ELISA를 통해 분석하고 MC-FA-010 야생형 미니단백질과 비교하였다.

친화도 성숙화

알라닌 스캔 돌연변이유발 및 MC-FA-010 /-012의 동정된 결합 모티프로부터 수득된 데이터에 기반하여, 제 2 파지 라이브러리를 생성하였다. 이러한 라이브러리에서, 세프라제 결합에 대한 임계 아미노산 위치는 일정하게 유지하는 반면(Y, W 및 GRGP 서열) 결합 루프의 다른 모든 위치는 시스테인을 제외한 가능한 모든 아미노산을 사용하여 무작위화하였다. 이러한 라이브러리는 엄격함과 관련하여 상이한 4가지 조건(1가 또는 다가의 디스플레이, 유리 MC-FA-012 미니단백질과의 경쟁이 있거나 없음, 상이한 세척 조건)을 적용하여, 재조합 가용성 사람 세프라제에 대해 재차 스크리닝하였다. 3회 선택 주기 후에 모든 풀을 pET-32 발현 벡터 내에 클로닝하였다. 각 풀에 대해 상기한 히트 동정 과정을 사용하여 96개의 클론을 발현하고 분석하였다. 상위 순위의 클론 중 26개를 선택하여 더 많은 양으로 생산하고 보다 상세히 분석하였다.

생체내 근적외선 광학 촬상을 이용한 Microbody ^® AlexaFluor -680 컨쥬게이트의 생체분포 및 종양 표적화 분석

생체내 촬상 분석을 위해 암컷 Fox n1 누드마우스(Fox n1 nu mice)(6-8 주령, Harlan, Envigo)를 사용하였다. 본 실험은 국가 규정에 따라 수행되고, 지역 동물 실험 윤리위원회의 승인을 받았다. 서브컨플루언트 CHO-K1-huSeprase 세포를 수확하고 PBS에서 1 x 10⁷ 세포/ml의 밀도로 재현탁시켰다. 접종 전에, 세포 생존력을 0.4% 트립판 블루 배제 분석(trypan blue exclusion assay)(생세포>90%)에 의해 시험하였다. 피하주사를 위해 100μl PBS에서의 1 x 10⁶ CHO-K1-huSeprase 세포를 100μl Matrigel(Corning)와 혼합하고 사지의 우측에 주입하였다. 종양 체적이 600-800mm³에 이르면, 다른 치료를 위해 동물을 무작위로 여러 그룹으로 분리하였다(각 그룹당 n = 3). 이어서, 1.67 nmol AF680-(MC-FA-012)₃ 또는 대조군 Microbody^® AF680-(MC-FA-0116)₃을 정맥내 주사하였다. 주사 후 상이한 시점에서, 마우스를 아이소플루레인의 흡입에 의해 마취시켰다. 생체내 촬상은 Xenogen IVIS 스펙트럼 촬상 시스템(Perkin Elmer, USA)을 사용하여 행하였다. 최대 근적외선 신호(NIRF)는 Living Image 2.5 (Xenogen, Perkin Elmer) 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. 생체외 NIRF 촬상을 위해, 마우스를 희생시키고 각 마우스의 종양 및 주요 기관을 절제하고 체중을 측정하여 Xenogen IVIS 시스템으로 분석하였다.

면역형광 분석

1μM 비오티닐화 MC-FA-012 및 대조군 MC-FA-0116을 실온에서 30분 동안 스트렙타아비딘-Cy3(Rockland)(몰비 5:1)로 예비인큐베이팅하였다. 동결절단(Cryosection)(6μm) 조직을 아세톤으로 고정시키고 비특이적 결합을 막기 위해 3% BSA/PBS로 차단시켰다. 이어서, 조직을 항-SMA 항체(Abcam)로 염색하여 활성화된 섬유아세포를 검출하고 37℃에서 30분 동안 Microbody-스트렙타아비딘 혼합물로 염색하였다. 그후 섹션을 세정하고 Alexa 488 컨쥬게이트된 2차 항체(Abcam)와 함께 30분 동안 37°C에서 인큐베이팅하였다. 마지막으로, 섹션을 재세척하고 핵을 검출하기 위해 Hoechst 33258(Sigma-Aldrich)와 함께 인큐베이팅하고, 2회 재세척하고 형광 마운팅배지(Dako)에 올렸다. 이어서, 역형광 현미경(Zeiss AxioObserver.Z1)으로 섹션을 검사하였다.

소형 동물 PET-촬상 및 기관 분포

DOTA -(MC-FA- 012) ₃ 의 ¹⁷⁷ Lu -표지

2.5 nmol의 MC-FA-012 3량체를 50μl 0.1 M 아세트산 나트륨 완충액 pH 5.0에 용해시키고 20% 아스코르브산 수용액 1μl와 혼합하였다. 0.4M 아세트산 나트륨 완충액 pH 5.0 (~25 MBq) 중 2.5μl의 ¹⁷⁷LuCl₃를 첨가하였다. 혼합물을 95 ℃에서 15분간 가열하고, 0.9% 식염수를 사용하여 총 부피 2.5ml로 희석시켰다. 방사성 표지는 표지된 화합물 및 비표지된 화합물의 임의의 분리없이 수행하였다. 방사화학적 수율은 분석 RP-HPLC에 의해 결정하였다. ¹⁷⁷Lu-(MC-FA-012)₃은 ¹⁷⁷Lu-표지된 DOTA-(MC-FA-012)₃에 상응한다.

DOTA -(MC-FA- 012) ₃ 의 ⁶⁸ Ga -표지

⁶⁸Ga는 0.6M HCl에서 [⁶⁸Ga]GaCl₃로서 ⁶⁸Ge/⁶⁸Ga 발생기로부터 수득하였다. 5 nmol MC-FA-012 3량체 및 10μl의 20% 아스코르브산 수용액을 ⁶⁸Ga-용출액 550μl와 혼합하고 160μl의 2.5 M 아세트산 나트륨 완충액(pH 8)으로 최종 pH 3.5까지 중화시켰다. 혼합물을 95℃에서 13분간 가열하고, 고상 추출 카트리지(Agilent Varian Bond Elut Plexa)를 사용하여 정제하고 0.9% 식염수로 희석시켰다. 방사성 표지는 표지된 화합물 및 비표지된 화합물의 임의의 분리없이 수행하였다. 방사화학적 수율은 분석 RP-HPLC에 의해 결정하였다. ⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃은 ⁶⁸Ga-표지된 DOTA-(MC-FA-012)₃에 상응한다.

방사성 표지된 DOTA -(MC-FA- 012) ₃ 의 생체내 시험

생체내 실험을 위해, 8주령의 BALB/c nu/nu 마우스 (Charles River)를 각각 5 X 10⁶ CT26-huSeprase 세포로 우측 몸통에 피하 접종하였다. 촬상실험(n = 2)을 위해, 5 X 10⁶ CT26 야생형 세포를 대조군으로서 좌측 몸통에 추가로 주입하였다. 종양의 크기가 대략적으로 1 cm³에 도달하면 방사성 표지된 화합물을 꼬리 정맥을 통해 주입하였다(소형 동물의 PET 촬상의 경우 ~10 MBq, 기관 분포의 경우 ~1 MBq).

¹⁷⁷ Lu -(MC-FA- 012) ₃ 의 기관 분포

기관 분포를 위해, 표시된 시점(30분~24시간) 후에 동물(각 시점에 대해 n = 3)을 희생시켰다. 모든 해부 기관 및 혈액에서 γ-계수기를 사용하여 분포된 방사능을 측정하였다. 값은 그램당 주사된 퍼센트 투여량 (%ID/g)으로 표현된다.

⁶⁸ Ga -(MC-FA- 012) ₃ 을 가진 소형 동물 PET 촬상

PET 촬상은 소형 동물 PET 스캐너 Inveon PET(Siemens)를 사용하여 수행하였다. 15분 투과스캔 후 마취된 마우스에게 대략적으로 2.5 nmol ⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃ (~10 MBq)을 주사하였다. 처음 60 분 안에 역동스캔을 수행한 다음에 주입 후 120분~140분 내에 정적스캔을 수행하였다. 이미지는 3D-OSEM+MAP 방법(Siemens)을 사용하여 반복적으로 재현하고, 표준흡수값(SUV) 이미지로 변환하였다. 정량분석은 ROI 기법을 사용하여 수행하고 SUV 평균값으로 표현하였다.

진단 및 치료 목적

DOTA -(MC-FA- 012) ₃ 의 ⁶⁸ Ga -표지

⁶⁸Ge/⁶⁸Ga 발생기로부터 0.6M HCl 중의 [⁶⁸Ga]GaCl₃으로서 ⁶⁸Ga (반감기 68 분; 양전자의 에너지 최대값. 1.9 MeV [β⁺ 89%])를 수득하였다. 2.5 nmol DOTA-(MC-FA-012)₃ 및 10μl의 20% 아스코르브산 수용액을 ⁶⁸Ga-용출액 (~ 0.8-1 GBq) 1 ml에 첨가하고 280 μl의 2.5 M 아세트산 나트륨 완충액 (pH 8)으로 최종 pH 3.5까지 희석하였다. 혼합물을 95 ℃에서 15분 동안 인큐베이팅하고, 고상 추출 카트리지(Agilent Varian Bond Elut Plexa)를 사용하여 정제하고 0.9% 식염수로 희석시켰다. 방사성 표지는 표지된 화합물 및 비표지된 화합물의 임의의 분리없이 수행하였다. 방사화학적 수율은 분석 RP-HPLC를 통해 결정하였다.

DOTA -(MC-FA- 012) ₃ 의 ¹⁷⁷ Lu -표지

¹⁷⁷Lu (반감기 6.71 d; 전자의 에너지 최대값. 497 keV [β^-79%]; 광자의 에너지 최대값. 113 keV [6　%], 208 keV [11　%])는 0.04M HCl 수용액 중 [¹⁷⁷Lu]LuCl₃로서 ITG GmbH Garching에서 구입하였다. 15 nmol DOTA-(MC-FA-012)₃를 0.4 M 아세트산 나트륨 완충액 (pH 5.0) 100μl에 용해시키고 20% 아스코르브산 수용액 10μl와 혼합하였다. 0.4 M 아세트산 나트륨 완충액 pH 5.0 (~ 2.5 GBq) 중 ¹⁷⁷LuCl₃ 70μl를 첨가하였다. 혼합물을 95℃에서 15분 동안 인큐베이팅하고, 0.9% 식염수를 사용하여 총 부피 5ml로 희석시켰다. 방사성 표지는 표지된 화합물 및 비표지된 화합물의 임의의 분리없이 수행하였다. 방사화학적 수율은 용매로서 10% 메탄올이 있거나 없는 0.5M 시트르산 나트륨 pH 5의 용액으로 분석 RP-HPLC 및 순간 박층 크로마토그래피 (ITLC-SG)에 의해 결정되었다.

PET 촬상

진단 촬상은 정맥내(2.5 nmol, 63-359 MBq) 적용된 ⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃를 사용하여 수행하였다. 주입된 방사성추적자 활성의 변화는 ⁶⁸Ga의 짧은 반감기 및 ⁶⁸Ga/⁶⁸Ga 발생기의 수명 동안 얻어진 다양한 용출효율에 의해 야기되었다. PET/CT 스캐너 Siemens Biograph-mCT Flow를 사용하여 ⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃의 투여하고 1시간 후 및 대략적으로 3시간 후에 환자를 조사하였다. 감쇠 보정을 위해 CT 스캔을 수행한 후, 불감시간, 산란 및 붕괴에 대해 보정된 정적 방출 스캔을 획득하였다. 이미지는 반복적으로 재현하고 표준흡수값(SUV) 이미지로 변환하였다.

¹⁷⁷Lu-(MC-FA-012)₃ 투여 후의 의료 촬상은 대략적으로 2.5GBq의 정맥내 주사 후 일일 감마 카메라 GE Millenium VG5 Hawkeye를 사용하여 수행하였다.

실시예 2: 사람 FAPα 결합 oMCoTi-II 돌연변이 MC-FA-010의 조작

FAPα 결합 시스틴 결절 미니단백질 MC-FA-010은 매우 다양한 파지 기반 oMCoTi-II 라이브러리(1 x 10¹⁰개의 개별 변이체를 함유함)로부터 분리 하였다. 3회 선택 라운드 후 풍부한 클론의 서열 분석으로 35개의 아미노산 (aa) 길이를 갖는 미니단백질 서열을 나타내고 있다(도 1).

동정된 미니단백질의 구조 기능 관계를 분석하기 위해 알라닌 스캔 돌연변이유발을 수행하였다(도 2A+B). 사람 세프라제에 대한 MC-FA-010 변이체의 농도 의존성 결합을 재조합 표적 단백질을 사용하는 직접 ELISA 설정으로 측정하고 EC50 값을 단일-사이트-포화 결합 모델(Sigma plot 10)을 사용하여 계산하였다. 도 2A는 모든 결합 데이터의 요약을 보여준다. 알라닌 돌연변이의 결합은 MC-FA-010의 부모 서열과 비교하여 상대적인 결합으로 나타낸다. 보존된/증가된 결합(각각 약한 결합의 손실)은 녹색으로 표시되며, 주황색에서는 약하고 중간 정도의 결합을 나타내지만 빨간색에서는 결합이 없는 것(결합의 완전한 손실)을 나타낸다.

알라닌 스캔 돌연변이유발은 2개의 방향족 및 4개의 지방족 아미노산 (YXXWXXGRGP, 도 2B)으로 구성된 결합 모티프를 나타내었다. 주어진 서열의 높은 특이성은 단일 알라닌 교환이 사람 세프라제에 대한 MC-FA-010의 결합을 완전히 없앰으로써 나타난다. 하나의 변이체, MC-FA-012 (K2A)는 야생형 Microbody™ MC-FA-010과 비교하여 세프라제에 대해 훨씬 높은 친화도(160%)를 나타내었다. 또한, 이러한 변이체는 추가 기능화 접근법에도 포함하였다.

실시예 3: 사람 FAPα 결합 oMCoTi -II 돌연변이 MC-FA-010 및 이의 변이체의 표적 결합

MC-FA-010은 나노몰 범위에서의 사람 세프라제 에 대한 친화도를 나타낸다.

재조합 사람 세프라제에 결합하는 MC-FA-010의 친화도는 농도-의존성 ELISA를 사용하여 측정하였다. 플레이트는 사람 세프라제의 가용성 분획으로 도포하고 MC-FA-010은 0.39 내지 50 nM의 농도 범위에서 티오레독신(Trx-MC-FA-010)에 융합 단백질로서 첨가하였다. 결합된 미니단백질의 검출은 항 S-태그-HRP 컨쥬게이트된 항체를 통해 달성하였다 (S-태그는 티오레독신 융합 발현 시스템에 의해 제공된다, 도 3A). Sigma plot 10에서 단일-사이트-포화 결합 모델을 사용하여 EC50 값을 계산하였다. 또한, 3 nM Trx-MC-FA-010의 결합은 결합의 특정 경쟁을 보여주는 0.64-3167 nM의 범위에서(도 3B) 가용성 1가 MC-FA-010와 경쟁하였다. EC50 및 IC50 값 모두는 나노몰 범위에서의 사람 세프라제에 대한 MC-FA-010의 결합 친화도를 나타낸다.

이러한 실험은 일반적으로 사람 세프라제에 대한 MC-FA-010의 특이적 결합을 보여준다. 다음 단계로서 표면 플라즈몬 공명 기술(SPR)을 사용하여 결합 동역학에 대하여 보다 상세한 분석을 수행하였다. 따라서, 재조합 사람 세프라제는 아미노 반응성 표면을 갖는 CM5 칩(GE Healthcare) 상에 고정하였다. 가용성 1가 MC-FA-010의 회합 및 해리를 Biacore T100 시스템을 사용하여 농도 시리즈 (37, 111.1, 333.3, 1000 및 3000 nM)에서 측정하였다. 회합 및 해리 데이터를 맞추고, 상응하는 해리상수 및 동역학값 (Kon, Koff 및 Kd)을 제공된 시스템의 소프트웨어를 사용하여 계산하였다(도 4A 및 B). SPR 분석은 대략적으로 560nM의 해리상수를 나타내므로 ELISA를 통해 분석된 바와 같이 나노몰 범위에서 이전에 측정된 친화도를 확인한다.

MC-FA-010은 사람 세프라제에 대한 높은 선택성을 보여준다.

사람 세프라제에 대한 MC-FA-010의 선택성을 분석하기 위해, 밀접하게 관련된 디펩티딜펩티다제 IV (DPP IV, CD26)에 대한 결합을 연구하였다. 또한, DPP IV는 88kDa 막 결합된 당단백질로, 아미노 말단에서 38개의 aa이 결핍된 가용성 형태로 단백질 가수분해성으로 절단될 수 있다. 도 5A는 녹색으로 묘사된 세프라제 또는 청록색 또는 회색(Pymol)으로 묘사된 DPP IV의 구조적 중복을 보여준다. 세프라제 및 DPP IV는 52%의 서열 동일성과 71%의 유사성을 공유한다. 세프라제에 대한 MC-FA-010의 선택성은 ELISA를 통해 분석하였다. 사람 세프라제 각각 DPP IV를 코팅하고 Trx-MC-FA-010의 결합을 0.1 내지 100 nM의 농도 시리즈로 측정하였다.

예상한 바와 같이, MC-FA-010은 강력하고 선택적으로 세프라제에 결합한다. 측정된 최고 농도에서 DPP IV에 결합하는 MC-FA-010에 대해 매우 약한 신호만을 검출할 수 있었다(도 5B). 따라서, MC-FA-010은 세프라제에 대한 높은 선택성을 나타낸다.

MC-FA-010은 세프라제-발현 세포에 특이적으로 결합한다.

사람 세프라제-과발현 CHO-K1 세포(CHO-K1-세프라제)에 대한 MC-FA-010의 결합을 조사하기 위해, 면역형광 염색을 행하였다. 표적-음성 CHO-K1-MOCK 세포 및 음성 대조군 Microbody™은 세포 표면 상에 무관한 단백질에 대한 Microbody™의 비특이적 결합을 배제하는 대조군으로서 사용하였다. 세포와의 인큐베이션 전에 MC-FA-010 및 대조군 Microbody™은 비오티닐화시키고 Cy3-컨쥬게이트된 스트렙타아비딘에 미리 조립하였다. CHO-K1-MOCK과 비교하여, MC-FA-010-bio/SA-Cy3의 특이적 결합이 CHO-K1-세프라제에서 검출되었다. 예상한 바와 같이, 대조군 Microbody™은 CHO-K1-세프라제 세포에 결합하지 않는다(도 6). 이는 세프라제-발현 세포에 대한 MC-FA-010의 특이적 상호작용을 분명히 보여준다.

MC-FA-010은 세프라제-발현 종양에 특이적으로 결합한다.

뮤린(murine) 세프라제 발현 종양 세포에 대한 MC-FA-010(스트렙타아비딘-Cy3를 통해 4량체화되었다)의 결합을 분석하기 위해, BALB/c 마우스에게 CT26 세포를 피하 주사하였다. 종양 세포 이식 14 일 후 마우스를 희생시키고 종양을 파라핀 섹션으로 분리하였다. 그 후, 3 μm 섹션을 염색하였다(도 7). 세프라제 발현 CAFs(암 관련 섬유아세포들)의 시각화를 위해 섹션을 항-α-SMA 항체(녹색)로 염색하였다. 핵 국소화는 DAPI(파란색)로 염색하였다. 빨간색에서는 MC-FA-010와 대조군 Microbody™ MC-Myc-010의 특이적 결합이 검출가능하다. 여기서 MC-FA-010가 뮤린 종양 섹션으로부터 유래된 CAF에 결합한다는 것을 보여줄 수 있었다. 예상한 바와 같이, 대조군 Microbody™는 CT26 종양 섹션에 결합하지 않는다. 요약하면, 세프라제-특이적 Microbody™ MC-FA-010으로 세프라제-발현 종양을 처리하는 것이 가능하다.

MC-FA-010의 올리고머화는 이의 친화도를 증가시킨다

가능한 결합활성(avidity) 효과를 연구하기 위해, 사람 세프라제-과발현 세포(CHO-K1-세프라제)에 대한 1가 및 4가 MC-FA-010의 결합 활성을 분석하였다. 따라서, 한편으로는 1가 Trx-MC-FA-010 융합 단백질(Thioredoxin-His6-카세트로 구성된다)을 사용하고 다른 한편으로는 스트렙타아비딘-APC(MC-FA-010-bio/SA-APC)를 사용하여 올리고머화된 비오틴-컨쥬게이트된 Microbody™을 사용하였다. 사람 세프라제에 대해 얻어진 MC-FA-010 구조물의 결합 특성들을 FACS로 결정하고, 1가 MC-FA-010의 177,6 nM의 EC50 값을 나타내지만, 4가 변이체는 EC50이 2,367 nM인 훨씬 높은 친화도를 나타냈다(도 8). MC-FA-010의 올리고머화를 함께 형성하는 것은 결합활성 효과를 이끌고 세프라제에 대한 MC-FA-010의 친화도를 증가시킨다.

MC-FA-012의 화학적 올리고머화

MC-FA-012 Microbody™ (DOTA-(MC-FA-012)₃)의 DOTA 컨쥬게이트된 3량체화 버전을 Pepscan에서 구입하였다. 옥심 결찰 전략에 기반하여 생성하였다. 따라서, N 말단에 아미노-말단 아미노옥시기를 갖는 MC-FA-012 변이체를 화학적으로 합성하였다. 또한, 앵커(anchor) 분자는 각각 GSGS 링커 서열에 의해 분리된 3개의 리신-세린 스트레치 및 아미노-말단 부착된 DOTA 일부분으로 이루어진 것을 생성되었다. 반응성 알데히드를 형성하기 위해 세린 잔기의 말단 히드록시기를 과요오드산나트륨으로 산화시켰다. 마지막으로, 활성화된 앵커 및 아미노옥시-MC-FA-012 변이체를 옥심 결찰 반응에서 커플링시켜 DOTA-(MC-FA-012)₃ 3량체를 형성시켰다(도 9의 A 참조).

이 3량체는 단량성 Microbody™와 비교하여 FACS-기반된 경쟁 분석에서 기능적으로 분석하였다(도 9B 및 C 참조). 이 분석에서, CHO-K1-huSeprase 세포를 Trx-MC-FA-012 융합 단백질 및 항-H6-PE 항체로 연속적으로 염색하였다. 상이한 농도의 3량체로의 평행 인큐베이션은 43.32nM의 IC50 값으로 유의적인 저해를 유도하지만 단량체와의 경미한 경쟁만은 관찰될 수 없었다. 따라서, 3량체성 스캐폴드 상에 Microbody™의 공간적 방향은 막에 결합된 세프라제에 효율적으로 결합할 수 있게 한다. 또한, 관찰된 결합활성은 화학적 올리고머화가 리간드의 친화도를 유의적으로 증가시키는 생산적인 방법이 될 수 있고, 이에 따라 종양 부위에서 프로브의 결합 및 유지를 향상시키는 것을 의미한다.

기재된 DOTA 컨쥬게이트된 DOTA-(MC-FA-012)₃ 이외에, AlexaFluor^®680 컨쥬게이트된 변이체를 생체내 촬상 용도로 Pepscan으로부터 구입하였다. AlexaFluor680-(MC-FA-012)₃ (AF680-(MC-FA-012)₃) 앵커 분자는 DOTA-(MC-FA-012)₃와 유사하게 생성되었다. AlexaFluor680 일부분의 커플링을 N-말단 아미드에 대해 용액 중에서 활성화된 에스터로서 행하였다.

재조합 사람 세프라제에 결합하는 단량성 MC-FA-010 및 단량성 및 3량체성 MC-FA-012의 동역학적 분석

단량성 및 3량체성 세프라제-결합 Microbody의 결합 동역학은 Biacore T-100 시스템에서 표면 플라즈몬 공명 분광학을 사용하여 결정하였다. 단량성 MC-FA-010 Microbody^®에 대하여 해리상수는 149nM로 측정하였다. 단일 Lys2Ala 교환을 갖는 MC-FA-012 변이체는 340nM의 친화도를 보였다. 3량체성 변이체들인 DOTA-(MC-FA-012)₃ 및 AF680-(MC-FA-012)₃ 모두는 단량성 Microbody에 비해 보다 느린 오프속도 및 더 적은 나노몰성 범위에서 유의적으로 높은 친화도를 나타내었다. DOTA-(MC-FA-012)₃의 해리상수는 12.4pM(정상 상태 분석, 249pM)을 가진다. AF680-(MC-FA-012)₃의 해리상수는 61.5pM(정상 상태 분석, 669pM)을 가진다. MC-FA-012와 비교하여 DOTA-(MC-FA-012)₃의 오프속도는 약 530이고, AF680-(MC-FA-012)₃의 오프속도는 약 134배 더 느리다. 작은 크기(~13000 Da) 및 느린 오프속도로 인해 두 3량체성 구조들 모두는 낮은 전체 백그라운드를 가진 종양의 생체내 촬상을 위해 예정되어 있다. 상세한 동역학 데이터는 표 3 및 도 11(A-D)에 요약되어 있다.

스캐폴드 교환(swapping)

Microbody^® 바인더의 물리화학적 성질 및 특성(예를 들어 순전하, 안정성, 경구이용율)을 향상시키거나 조절하기 위해, 결합을 담당하는 서열 분지를 다른 대안적인 스캐폴드에 접목시킬 수 있다. 본 연구에서는 주로 첫번째 루프에 위치한 MC-FA-012의 결합 서열을 Ecbalium elaterium의 트립신 억제제 EETI-II(ET-FA-012)에 기반된 2개의 스캐폴드 및 최적화된 McoTI-II 스캐폴드(목별자, MO-FA-012) 내로 이동시켰다. 상응하는 서열 정보는 표 4에 열거하였다. 상기 단백질의 DNA 암호화 영역을 티오레독신에 대한 융합체로서의 발현을 가능하게 하는 pET32b-LibEx의 벡터 백본에 클로닝하였다. 발현 및 정제를 상기한 바와 같이 수행하였다(실시예 1). SPR 분석을 위해 티오레독신은 트롬빈 절단 및 IMAC 및 RP-HPLC로 추가 정제를 통해 분리하였다. 정확한 합성을 확인하기 위해 예상된 질량은 질량 분광법을 통해 확인하였다. 새로 제작된 Microbody의 기능은 SPR을 사용하여 분석하였다. 두 Microbody 모두는 MC-FA-012에 비해 약간 더 약한 해리상수를 가진 고정된 rhuSeprase에 특이적 결합을 나타내었다(표 3 및 도 13A 및 B). ET-FA-012의 KD는 1.4μM이고 MO-FA-012의 KD는 1.34μM로 결정하였다.

MC-FA-012는 세프라제-발현 삼중 음성 유방암 (TNBC)에 특이적으로 결합한다

세프라제-발현 삼중 음성 유방암에 대한 MC-FA-012의 결합을 분석하기 위해 종양 섹션을 면역형광 염색을 통해 분석하였다(도 16). 암 관련 섬유아세포(CAFs)를 시각화하기 위해, 섹션을 항-α-SMA 항체로 염색하였다(도 16B 및 F). 핵은 동시에 DAPI로 염색하였다(도 16 C 및 G). 단지 동등하게 가공된 MC-FA-0116 변이체(도 16E)를 제외한, 비오티닐화 MC-FA-012 Microbody^®(스트렙타아비딘-Cy3를 통해 4량체화되었다)(도 16A)만이 TNBC 섹션에 특이적 결합을 나타낸다. MC-FA-012/SA 4량체 신호는 CAF 상의 세프라제의 특이적 표적화를 나타내는 SMA를 가지고 높은 범위로 공동위치한다(도 16D).

실시예 4: IRDye 컨쥬게이트된 MC-FA-012를 갖는 세프라제 발현 CHO - 이종이식편에서의 종양 표적화

MC-FA-012 Microbody™의 생체분포 및 종양 표적화 특성을 분석하기 위해 CHO-K1-huSeprase 및 CHO-K1-MOCK 세포주를 사용하여 면역결핍 마우스 Foxn1 (nu)에서 이종이식을 확립하였다. huSeprase 리간드 (MC-FA-012) 및 대조군 Microbody™(MC-CM-010)을 NHS 화학을 사용하여 IRDye800CW에 컨쥬게이트시키고 종양 보유 마우스에 정맥 주사하였다. 0.5 및 2시간 후 마우스를 안락사시켰다. 기관을 꺼내어 IR 신호를 Xenogen IVIS 광학 생체내 촬상 시스템에서 생체외 측정하였다(도 10). 음성 대조군 Microbody^®와 비교하여 세프라제 특이적 Microbody^® MC-FA-012-IRDye800CW는 0.5시간의 순환기간 동안 사람 세프라제-과발현 조직을 표적으로 하였다. 2시간 후, MC-FA-012-IRDye800CW는 종양 표적이 검출되지 않은 결과로 종양으로부터 분리하였다. 따라서 MC-FA-012를 이용한 종양 표적화의 임계 시간은 주사 후 처음 30분 동안 발생하는 것으로 나타난다. 또한, MOCK-조직 상에 MC-FA-012-IRDye800CW의 더 약한 결합도 관찰할 수 있었다. MOCK-조직은 뮤린 세프라제도 발현한다는 것을 배제할 수 없다. 요약하면, 세프라제 특이적 MC-FA-012-IRDye800CW Microbody^®에 의한 종양 표적화는 주사 후 처음 몇 분 동안 나타날 수 있었다. 이러한 데이터를 기반으로 추가적인 생체내 평가가 수행되어야 한다.

생체분포 및 종양 표적화 분석

AF680-(MC-FA-012)₃의 약물동역학 및 종양 표적화 특성을 분석하기 위해 암컷 Fox n1 nu 마우스에서 3량체 생체분포를 주사 후 6개의 시점(1, 2, 4, 6, 24 및 96 시간) 때에 모니터링하였다. AF680-(MC-FA-0116)₃ 및 미처리 마우스를 대조군으로 사용하였다. 각 시점 이후 생체분포는 Xenogen 촬상 시스템을 사용하여 생체내 및 생체외 측정하였다(도 14A + B). 주입 후 24 시간까지의 분석시간 동안 AF680-(MC-FA-012)₃의 특이하고 중요한 종양 흡수를 관찰하였다(도 14, 화살표 및 도 15). 대조적으로, MC-FA-0116 대조군 3량체는 종양에서 검출가능할 정도까지 축적되지는 않았다(도 14 및 도 15). 전체적으로, 바인더 및 비-결합 대조군에 대한 백그라운드 신호는 동일한 범위 내에 있었다. 폐, 심장, 비장 및 간의 신호는 일반적으로 낮지만 강한 신장 신호는 1시간 후에 두 구조물 모두에서 측정할 수 있지만 2시간 후에 유의적으로 감소하였다.

실시예 5: 결합 루프의 추가 특성 분석 및 친화도 성숙을 위한 초기 시도

MC-FA-012 Microbody^®와 세프라제 사이의 상호작용을 보다 상세히 분석하고 더 많은 친화성 바인더를 동정하기 위해 알라닌 스캔 데이터에 기초하여 집중된 라이브러리를 생성하고 가용성 세프라제에 대하여 스크리닝하였다. 따라서 다양한 엄격성을 가지고 4가지 다른 선택 조건이 적용하였다. 3 회 선택 라운드 후에 4개의 풀 모두를 발현 벡터로 서브클로닝하였다. 풀 당 96개의 클론을 발현시키고 발현율뿐만 아니라 표적 및 비특이적 결합 특성과 관련하여 분석하였다. s/n(노이즈에 대한 신호) 값은 ELISA 신호 대 huSeprase 및 BSA의 분할에 의해 계산하였고 표적 특이적 결합을 나타낸다. 이 s/n 값 이외에, SDS-PAGE 데이터로부터 상대적인 발현 값(Ex)을 계산하였다. 클론 순위에 대해 두 값 모두로 고려하였다. s/n 값의 가중치에 대해 다른 순위 1과 2 값을 계산하였다. 각 풀의 최상위로 순위된 클론들(풀 1: 클론 1-4, 풀 2: 1-7, 풀 3: 1-4, 풀 4: 랭킹 2 값에 따른 1-5) 또는 5 초과하는 순위 2 값을 갖는 모든 클론들을 하기 표 1 및 2에 나타내었다

부모형 MC-FA-012 변이체와 비교하여 특히 동역학 매개변수(K_d, K_on, K_off)에 관한 최상위 등급 클론의 자세한 특성 분석이 진행 중이다.

변경된 결합 서열을 갖는 MC-FA-012 변이체의 결합 분석

상기 기재된 순위의 7개의 선택된 클론(표 1 및 표 2, 실시예 5)을 SPR 분광학을 사용하여 추가로 분석하였다. 변이체는 비교가능한 오프속도와 함께 MC-FA-010 또는 MC-FA-012(149-340nM)와 동일한 범위의 해리 상수(147 내지 487nM)를 나타내었다. 상세한 동역학 데이터 및 서열 정보는 표 3과 4 및 도 12(A~G)에 요약되어있다. 모든 7가지 변이체는 rhuSeprase에 대한 결합을 나타내어 동정된 결합 모티프 CXYXXWXXGRGPXC를 확인하였다.

실시예 6: ⁶⁸ Ga -(MC-FA- 012) ₃ 및 ¹⁷⁷ Lu -(MC-FA- 012) ₃ 을 이용한 생체분포 및 종양 표적화

¹⁷⁷ Lu-(MC-FA-012) ₃ 의 기관 분포

CT26-huSeprase 종양 보유 마우스에서 ¹⁷⁷ Lu -(MC-FA- 012) ₃ 의 기관 분포를 24시간 동안 모니터링하였다. 6개의 시점(0.5, 1, 2, 4, 6 및 24 시간)에서 마우스를 희생시키고 해부된 기관에서 방사능을 측정하였다. 측정된 용량은 그램당 주입된 용량의 [%ID/g]로서 도 17 및 표 5에 요약되어 있다. 분석된 3량체는 신장에서 방사능의 높은 보유로 특정 종양 표적을 나타냈다. 그러나 신장에서의 신호(286.8~213.4%ID/g) 및 종양에서의 신호(9.9~5.9%ID/g)는 측정된 시간에 걸쳐 감소하지만, 24시간 후에도 여전히 측정할 수 있었다.

⁶⁸ Ga-(MC-FA-012) ₃ 을 사용한 소형 동물 PET 촬상

⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃의 생체분포 및 종양 표적화를 PET 스캔을 통해 140분 동안 측정하였다. 분석된 마우스 둘 다에서 ⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃은 특정 종양 표적화를 나타내고(도 18-20), 신장에서의 처음 20분 이내에 이미 높은 종양 대 백그라운드 비율 및 높은 신호를 보였다. 이 데이터는 ¹⁷⁷Lu-(MC-FA-012)₃으로 형성된 기관 분포 연구의 결과를 확인해주고 있다.

실시예 7: Microbody ^® 3량체의 진단 및 치료 사용

진단의 목적으로 2.5nmol ⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃을 정맥주사로 주입하였다. 최대 5명의 진행성 췌장암 환자를 검사하였다. 적용된 용량에 대한 자세한 정보는 표 6에 요약되어 있다. ⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃은 원발성 종양 및 전이에서 높은 농축을 나타내고(도 21-26 및 표 11-16) 소형 동물 생체내 연구에서 이미 보여지는 바와 같이, 높은 신장 흡수를 나타내었다. 전체적으로 정상 조직의 낮은 백그라운드가 관찰될 수 있었다. 예를 들어 치료 적용에서의 가능한 신장보호는 아르기닌/리신, 겔로 푸신(Gelofusine) 또는 분열된 알부민(FRALB) 주입 또는 음성 Microbody^® MC-FA-0116 또는 3량체성 변이체 (MC-FA-0116)₃의 추가 적용으로 성취할 수 있었다.

치료 목적으로, 10-15nmol ¹⁷⁷Lu-(MC-FA-012)₃을 정맥주사로 주입하였다(표 7). 2명의 환자가 최근 치료를 받고 있다. 환자들은 급성 신독성을 나타내지 않았다. 치료는 여전히 진행 중에 있다.

실시예 8: 상이한 종양 개체에서의 세프라제 발현의 면역조직화학적 분석

다른 종양 개체에서 세프라제 발현에 대한 통찰력을 제공하기 위해 면역조직화학 분석을 수행하였다.

췌장 암종

정상 췌장 조직에서의 세프라제 발현은 랑게르한스섬, 도관 및 혈관으로 제한된다. 췌장 암종에서의 세프라제 발현을 종양 세포와 섬유아세포에서 추가로 검출하였다(표 8 및 도 27). 17/17 췌장 암종 시료 상에서는 세포질/막성 염색에 약한 것부터 강한 것까지 10-85% 종양 세포를 검출하였다. 12/17 조직 상에서는 세포질/막성 염색에 약한 것부터 강한 것까지 5% 정상 세포(랑게르한스섬 및 도관)를 검출하였다. 10/17 조직에서는 중막성 염색에 약한 60-75% 혈관을 검출하였다. 11/17 조직에서는 세포질/멤브레인 염색에 약한 것부터 강한 것까지 2-50% 섬유 조직(섬유아세포)을 검출하였다. 본 연구의 데이터를 종합하면, 정상 조직에 비해 사람 췌장 종양 간질의 섬유아세포에서 세프라제가 과발현되는 것을 보여준다(단 한 경우에만 섬유아세포 염색이고, 랑게르한스섬, 도관 및 혈관에 염색하였다).

삼중 음성 유방암(TNBC)

39/39 TNBC 시료에서는 매우 약한 것부터 강한 막성 및 세포질 염색된 섬유아세포(~54%)를 섬유성 조직 내에서 검출하였다(때로는 종양 세포 주위에서 보다 강한 신호를 가진다). 하나의 경우에서는 괴사/괴사전 세포 상의 신호를 발견하였다. 3/3 정상 사람 유방 시료에서는 일부 중간강도로 염색된 섬유아세포(~3%)를 섬유성 조직 내에서 검출하였다(표 9 및 도 28). 정상 조직에서의 염색은 병리학적 조직에 인접하게 국소화하여 생긴 것일 수 있다. 본 연구의 데이터를 종합하면, 정상 조직(약한 발현)에 비해 사람 TNBC 종양 기질의 섬유아세포에서 세프라제가 과발현되는 것을 보여준다.

폐 암종

29/31 폐 암종에서 매우 약한 것부터 강한 막성 및 세포질 염색된 섬유아세포(~55%)를 섬유성 조직 내에서 검출하였다. 5개의 경우에서 괴사/괴사전 세포 상의 신호를 발견하였다. 2/3 정상 사람 폐 시료에서 매우 약한 것부터 강하게 염색된 섬유아세포(~17%)를 섬유성 조직 내에서 검출하였다(표 10 및 도 29). 정상 조직에서의 염색은 병리학적 조직에 인접하게 국소화하여 생긴 것일 수 있다. 본 연구의 데이터를 종합하면, 정상 조직(약한 발현)에 비해 사람 폐 종양 기질의 섬유아세포에서 세프라제가 과발현되는 것을 보여준다.

세프라제는 췌장암, TNBC 및 폐 암종에서 과발현된 표적인 것으로 보인다. 따라서, 진단 및 치료제로서 동정된 세프라제 리간드의 용도는 기재된 임상 적용에 제한되지 않는다.

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Ile Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg 465 470 475 480 Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn 485 490 495 Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu Glu Ile Lys Lys Leu Glu 500 505 510 Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe 515 520 525 Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro 530 535 540 Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Ser Tyr 545 550 555 560 Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly 565 570 575 Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr Ala Val Tyr Arg Lys Leu 580 585 590 Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile 595 600 605 Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser 610 615 620 Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu 625 630 635 640 Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr 645 650 655 Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp 660 665 670 Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr 675 680 685 Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn 690 695 700 Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala 705 710 715 720 Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Leu 725 730 735 Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu 740 745 750 Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp 755 760 <210> 4 <211> 761 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Lys Thr Trp Leu Lys Thr Val Phe Gly Val Thr Thr Leu Ala Ala 1 5 10 15 Leu Ala Leu Val Val Ile Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val Tyr 20 25 30 Lys Pro Glu Gly Asn Thr Lys Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu 35 40 45 Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Tyr Phe Pro Asn Trp Ile Ser Glu 50 55 60 Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Glu Asp Asp Asn Ile Val Phe Tyr Asn 65 70 75 80 Ile Glu Thr Arg Glu Ser Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ser Thr Met Lys 85 90 95 Ser Val Asn Ala Thr Asp Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val 100 105 110 Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala 115 120 125 Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Gln Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Tyr 130 135 140 Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser 145 150 155 160 Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro 165 170 175 Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Tyr Thr Gly Arg Glu Asn Arg Ile 180 185 190 Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr 195 200 205 Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asp Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Val 210 215 220 Glu Phe Asn Asp Ser Asp Ile Pro Ile Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly 225 230 235 240 Asp Gly Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly 245 250 255 Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Val Phe Ile Val Asp Thr Thr Tyr Pro 260 265 270 His His Val Gly Pro Met Glu Val Pro Val Pro Glu Met Ile Ala Ser 275 280 285 Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Ser Ser Glu Arg Val 290 295 300 Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile 305 310 315 320 Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp His Ala Trp Glu Cys Pro Lys Asn Gln 325 330 335 Glu His Val Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val 340 345 350 Ser Thr Pro Ala Phe Ser Gln Asp Ala Thr Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe 355 360 365 Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val 370 375 380 Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Tyr Ile 385 390 395 400 Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu 405 410 415 Gly Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Asn Ser 420 425 430 Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys 435 440 445 Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Tyr Lys Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu 450 455 460 Val Cys Tyr Gly Pro Gly Leu Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg 465 470 475 480 Thr Asp Gln Glu Ile Gln Val Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn 485 490 495 Ser Leu Arg Asn Ile Gln Leu Pro Lys Val Glu Ile Lys Lys Leu Lys 500 505 510 Asp Gly Gly Leu Thr Phe Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe 515 520 525 Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro 530 535 540 Cys Ser Gln Ser Val Lys Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Thr Tyr 545 550 555 560 Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly 565 570 575 Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Phe Leu His Ala Val Tyr Arg Lys Leu 580 585 590 Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Leu Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile 595 600 605 Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Glu Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser 610 615 620 Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu 625 630 635 640 Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr 645 650 655 Ala Ser Ile Tyr Ser Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp 660 665 670 Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr 675 680 685 Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn 690 695 700 Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala 705 710 715 720 Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Ile 725 730 735 Ser Ser Gly Arg Ser Gln Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe 740 745 750 Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp 755 760 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 5 Gly Arg Gly Pro 1 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser, Ala and Cys, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser and Ala, more preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Asn, Ala and Asp, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Asn and Ala, more preferably Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Thr, Ala and Val, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Thr and Ala, more preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Pro and Ala, more preferably Pro <400> 6 Tyr Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Gly Arg Gly Pro 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser, Ala and Cys, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser and Ala, more preferably Ser <400> 7 Tyr Xaa Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 8 Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Pro and Ala, more preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser, Ala and Cys, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser and Ala, more preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Asn, Ala and Asp, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Asn and Ala, more preferably Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Thr, Ala and Val, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Thr and Ala, more preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Pro and Ala, more preferably Pro <400> 9 Xaa Tyr Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Gly Arg Gly Pro 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser, Ala and Cys, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser and Ala, more preferably Ser <400> 10 Pro Tyr Xaa Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro 1 5 10 <210> 11 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 11 Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro 1 5 10 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Gly and Ala, more preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Lys and Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Pro and Ala, more preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser, Ala and Cys, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser and Ala, more preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Asn, Ala and Asp, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Asn and Ala, more preferably Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Thr, Ala and Val, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Thr and Ala, more preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Pro and Ala, more preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Asp, Ala and Asn, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Asp and Ala, more preferably Asp <400> 12 Xaa Xaa Cys Xaa Tyr Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Gly Arg Gly Pro Xaa 1 5 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Gly and Ala, more preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Lys and Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser, Ala and Cys, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser and Ala, more preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Asp, Ala and Asn, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Asp and Ala, more preferably Asp <400> 13 Xaa Xaa Cys Pro Tyr Xaa Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Xaa 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 14 Gly Lys Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp 1 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 15 Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp 1 5 10 15 <210> 16 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Independently from each other any amino acid <220> <221> REPEAT <222> (1)..(1) <223> Repeated 0 to 4, preferably 1 or 2 times <220> <221> REPEAT <222> (3)..(3) <223> Repeated 3 to 10, preferably 6, 7 or 8 times <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Independently from each other any amino acid <220> <221> REPEAT <222> (8)..(8) <223> Repeated 0 to 4, preferably 1 or 2 times <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Independently from each other any amino acid <220> <221> REPEAT <222> (10)..(10) <223> Repeated 3 to 7, preferably 4, 5 or 6 times <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Independently from each other any amino acid <220> <221> REPEAT <222> (12)..(12) <223> Repeated 2 to 6, preferably 2, 3 or 4 times <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Independently from each other any amino acid <220> <221> REPEAT <222> (14)..(14) <223> Repeated 1 to 3, preferably 1 or 2 times <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> Independently from each other any amino acid <220> <221> REPEAT <222> (16)..(16) <223> Repeated 3 to 7, preferably 4, 5 or 6 times <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> Independently from each other any amino acid <220> <221> REPEAT <222> (18)..(18) <223> Repeated 0 to 4, preferably 1 or 2 times <220> <221> MISC_FEATURE <222> (18)..(18) <223> Independently from each other any amino acid <400> 16 Xaa Cys Xaa Gly Arg Gly Pro Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa 1 5 10 15 Cys Xaa <210> 17 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Pro and Ala, more preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser, Ala and Cys, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser and Ala, more preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Asn, Ala and Asp, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Asn and Ala, more preferably Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Thr, Ala and Val, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Thr and Ala, more preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Pro and Ala, more preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Asp, Ala and Asn, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Asp and Ala, more preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Arg and Ala, more preferably Arg <400> 17 Cys Xaa Tyr Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Gly Arg Gly Pro Xaa Cys Arg Arg 1 5 10 15 Asp Ser Asp Cys Pro Gly Xaa Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys 20 25 30 <210> 18 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser, Ala and Cys, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser and Ala, more preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Asp, Ala and Asn, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Asp and Ala, more preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Arg and Ala, more preferably Arg <400> 18 Cys Pro Tyr Xaa Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Xaa Cys Arg Arg 1 5 10 15 Asp Ser Asp Cys Pro Gly Xaa Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys 20 25 30 <210> 19 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 19 Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys Arg Arg 1 5 10 15 Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys 20 25 30 <210> 20 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Gly and Ala, more preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Lys and Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Pro and Ala, more preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser, Ala and Cys, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser and Ala, more preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Asn, Ala and Asp, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Asn and Ala, more preferably Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Thr, Ala and Val, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Thr and Ala, more preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Pro and Ala, more preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Asp, Ala and Asn, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Asp and Ala, more preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Arg and Ala, more preferably Arg <400> 20 Xaa Xaa Cys Xaa Tyr Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Gly Arg Gly Pro Xaa Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Xaa Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 21 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Gly and Ala, more preferably Gly <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Lys and Ala <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser, Ala and Cys, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser and Ala, more preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Asp, Ala and Asn, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Asp and Ala, more preferably Asp <220> <221> MISC_FEATURE <222> (25)..(25) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Arg and Ala, more preferably Arg <400> 21 Xaa Xaa Cys Pro Tyr Xaa Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Xaa Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Xaa Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 22 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 22 Gly Lys Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 23 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 23 Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 24 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 24 Gly Ala Cys Pro Tyr Arg Asn Trp Met Thr Gly Arg Gly Pro Leu Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 25 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 25 Gly Ala Cys Met Tyr Met Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 26 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 26 Gly Ala Cys Pro Tyr Ala Ser Trp Ala Asp Gly Arg Gly Pro His Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 27 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 27 Gly Ala Cys Val Tyr Gln His Trp Gln Pro Gly Arg Gly Pro Ser Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 28 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 28 Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Arg Trp Ala Val Gly Arg Gly Pro Ser Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 29 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 29 Gly Ala Cys Pro Tyr Thr Arg Trp Gln Pro Gly Arg Gly Pro Ser Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 30 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 30 Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Ala Val Gly Arg Gly Pro Ser Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 31 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 31 Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Arg Trp Ala Val Gly Arg Gly Pro Asp Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 32 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 32 Gly Ala Cys Pro Tyr Thr Asn Trp Arg Pro Gly Arg Gly Pro Ala Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 33 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 33 Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Ala Val Gly Arg Gly Pro Ala Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 34 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 34 Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Arg Trp Met Pro Gly Arg Gly Pro Ser Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 35 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 35 Gly Ala Cys Pro Tyr Ala Asn Trp Ala Val Gly Arg Gly Pro Asn Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 36 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 36 Gly Ala Cys Pro Tyr Thr Tyr Trp His Pro Gly Arg Gly Pro Gly Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 37 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 37 Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Arg Pro Gly Arg Gly Pro Glu Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 38 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 38 Gly Ala Cys Pro Tyr Ala Asn Trp Met Val Gly Arg Gly Pro Ser Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 39 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 39 Gly Ala Cys Pro Tyr Thr Arg Trp Ala Val Gly Arg Gly Pro Asp Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 40 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 40 Gly Ala Cys Val Tyr His Thr Trp Met Pro Gly Arg Gly Pro Val Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 41 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 41 Gly Ala Cys Pro Tyr Ala Arg Trp Ala Ala Gly Arg Gly Pro Ala Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 42 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 42 Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Thr Trp Gln Val Gly Arg Gly Pro Ser Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 43 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 43 Gly Ala Cys Pro Tyr Thr Arg Trp Thr Val Gly Arg Gly Pro Ser Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 44 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 44 Gly Ala Cys Gln Tyr Gly Leu Trp Glu Val Gly Arg Gly Pro Asp Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 45 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 45 Gly Ala Cys Pro Tyr Thr Asn Trp Gln Pro Gly Arg Gly Pro Ala Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 46 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 46 Gly Ala Cys Pro Tyr Thr Asn Trp His Pro Gly Arg Gly Pro Ala Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 47 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 47 Gly Ala Cys Met Tyr Trp Gly Trp Glu Pro Gly Arg Gly Pro His Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 48 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 48 Gly Ala Cys Phe Tyr Ile Glu Trp Gln Val Gly Arg Gly Pro Ala Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 49 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 49 Gly Ala Cys Pro Tyr Ala Arg Trp Val Val Gly Arg Gly Pro Ser Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 50 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 50 Gly Ala Cys Ala Tyr Ala Asn Trp Gln Val Gly Arg Gly Pro Ser Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 51 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 51 Gly Ala Cys Pro Tyr Ala Arg Trp Val Leu Gly Arg Gly Pro Asp Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 52 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 52 Gly Ala Cys Pro Tyr Thr Asn Trp His Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 53 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 53 Gly Ala Cys Pro Tyr Thr Tyr Trp His Ala Gly Arg Gly Pro Ser Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 54 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 54 Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Thr Trp Ala Val Gly Arg Gly Pro Ala Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 55 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 55 Gly Ala Cys Pro Tyr Arg Asn Trp Ala Val Gly Arg Gly Pro Ser Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 56 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 56 Gly Ala Cys Pro Tyr Ala Thr Trp Gln Pro Gly Arg Gly Pro Ser Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 57 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 57 Gly Ala Cys Pro Tyr Ala Arg Trp Asn Val Gly Arg Gly Pro Ser Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 58 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 58 Gly Ala Cys Pro Tyr Ala Asn Trp Thr Ile Gly Arg Gly Pro Ala Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 59 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 59 Gly Ala Cys Pro Tyr Ala Arg Trp His Val Gly Arg Gly Pro Ser Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 60 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 60 Gly Ala Cys Ala Tyr Ser Asn Trp Ala Val Gly Arg Gly Pro Ser Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 61 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 61 Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Thr Trp Ala Val Gly Arg Gly Pro Asp Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 62 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 62 Gly Ala Cys Pro Tyr Thr Asn Trp Ala Val Gly Arg Gly Pro Ser Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 63 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 63 Gly Ala Cys Pro Tyr Ala Asn Trp Ala Val Gly Arg Gly Pro His Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 64 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 64 Gly Ala Cys Pro Tyr Arg Asn Trp Gln Pro Gly Arg Gly Pro Thr Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 65 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 65 Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Val Gly Arg Gly Pro Glu Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 66 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 66 Gly Ala Cys Pro Tyr His Thr Trp Ala Val Gly Arg Gly Pro Gly Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 67 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 67 Gly Ala Cys Pro Tyr Arg Asn Trp Ser Pro Gly Arg Gly Pro His Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 68 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 68 Gly Ala Cys Pro Tyr Thr Phe Trp Arg Val Gly Arg Gly Pro Ala Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 69 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 69 Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Val Gly Arg Gly Pro Ala Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 70 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 70 Gly Ala Cys Val Tyr Trp Gln Trp Ile Ala Gly Arg Gly Pro Val Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 71 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 71 Gly Ala Cys Trp Tyr Asp Pro Trp Trp Leu Gly Arg Gly Pro Val Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 72 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 72 Gly Ala Cys Met Tyr Asp Thr Trp Ala Gln Gly Arg Gly Pro Asn Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 73 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 73 Gly Ala Cys Leu Tyr Glu Val Trp Pro Leu Gly Arg Gly Pro Gln Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 74 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 74 Gly Ala Cys Ala Tyr Ser Asn Trp Gln Pro Gly Arg Gly Pro His Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 75 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 75 Gly Ala Cys Glu Tyr His Val Trp Met Gly Gly Arg Gly Pro His Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 76 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 76 Gly Ala Cys Ala Tyr Ser Ser Trp Ser Ala Gly Arg Gly Pro Met Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 77 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 77 Gly Ala Cys Pro Tyr Val Asn Trp Ala Ala Gly Arg Gly Pro Val Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 78 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 78 Gly Ala Cys Pro Tyr Ala Val Trp Ala Ser Gly Arg Gly Pro Ser Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 79 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 79 Gly Ala Cys Glu Tyr Ser Ala Trp Leu Ala Gly Arg Gly Pro Glu Cys 1 5 10 15 Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly 20 25 30 Tyr Cys Gly 35 <210> 80 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 80 gcgcaagctt gctgcggccc tcccgggtgc ac 32 <210> 81 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 81 gcgcagcggc cgcgtcggac agggagaagc actgc 35 <210> 82 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Serine protease motif <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Any amino acid <400> 82 Gly Xaa Ser Xaa Gly 1 5 <210> 83 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Serine protease motif <400> 83 Gly Trp Ser Tyr Gly 1 5 <210> 84 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 84 Gly Phe Leu Gly 1 <210> 85 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Pro and Ala, more preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser, Ala and Cys, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser and Ala, more preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Asn, Ala and Asp, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Asn and Ala, more preferably Asn <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Thr, Ala and Val, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Thr and Ala, more preferably Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Pro and Ala, more preferably Pro <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Asp, Ala and Asn, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Asp and Ala, more preferably Asp <400> 85 Cys Xaa Tyr Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Gly Arg Gly Pro Xaa Cys 1 5 10 <210> 86 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser, Ala and Cys, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Ser and Ala, more preferably Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Any amino acid, preferably an amino acid selected from the group consisting of Asp, Ala and Asn, more preferably an amino acid selected from the group consisting of Asp and Ala, more preferably Asp <400> 86 Cys Pro Tyr Xaa Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Xaa Cys 1 5 10 <210> 87 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 87 Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys 1 5 10 <210> 88 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 88 Gly Ser Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro 1 5 10 15 Asp Cys Ser Gln Asp Ser Asp Cys Leu Ala Gly Cys Val Cys Gly Pro 20 25 30 Asn Gly Phe Cys Gly 35 <210> 89 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 89 Gly Ser Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro 1 5 10 15 Asp Cys Ser Ser Asp Ser Asp Cys Pro Gly Ala Cys Ile Cys Leu Glu 20 25 30 Asn Gly Phe Cys Gly 35 <210> 90 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 90 Gly Ser Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Arg Trp Met Pro Gly Arg Gly Pro 1 5 10 15 Ser Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly 20 25 30 Asn Gly Tyr Cys Gly 35 <210> 91 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 91 Gly Ser Gly Ala Cys Pro Tyr Thr Asn Trp Arg Pro Gly Arg Gly Pro 1 5 10 15 Ala Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly 20 25 30 Asn Gly Tyr Cys Gly 35 <210> 92 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 92 Gly Ser Gly Ala Cys Pro Tyr Thr Arg Trp Ala Val Gly Arg Gly Pro 1 5 10 15 Asp Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly 20 25 30 Asn Gly Tyr Cys Gly 35 <210> 93 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 93 Gly Ser Gly Ala Cys Pro Tyr Thr Arg Trp Gln Pro Gly Arg Gly Pro 1 5 10 15 Ser Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly 20 25 30 Asn Gly Tyr Cys Gly 35 <210> 94 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 94 Gly Ser Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Arg Trp Ala Val Gly Arg Gly Pro 1 5 10 15 Asp Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly 20 25 30 Asn Gly Tyr Cys Gly 35 <210> 95 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 95 Gly Ser Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Ala Val Gly Arg Gly Pro 1 5 10 15 Ser Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly 20 25 30 Asn Gly Tyr Cys Gly 35 <210> 96 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Seprase binding peptide <400> 96 Gly Ser Gly Ala Cys Pro Tyr Thr Asn Trp His Pro Gly Arg Gly Pro 1 5 10 15 Ala Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly 20 25 30 Asn Gly Tyr Cys Gly 35

Claims

아미노산 서열 Gly Arg Gly Pro을 포함하는, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열 Tyr Xaa1 Xaa2 Trp Xaa3 Xaa4 Gly Arg Gly Pro을 포함하는 세프라제 결합 펩티드로서,
Xaa1은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Ser, Ala 및 Cys으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser이고,
Xaa2은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asn, Ala 및 Asp으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asn 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asn이고,
Xaa3은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Thr, Ala 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Thr 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Thr이고,
Xaa4은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Pro 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Pro인, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열 Tyr Xaa1 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro을 포함하는 세프라제 결합 펩티드로서,
Xaa1은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Ser, Ala 및 Cys으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser인, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열 Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro을 포함하는, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열 Xaa1 Tyr Xaa2 Xaa3 Trp Xaa4 Xaa5 Gly Arg Gly Pro을 포함하는 세프라제 결합 펩티드로서,
Xaa1은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Pro 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Pro이고,
Xaa2는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Ser, Ala 및 Cys으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser이고,
Xaa3는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asn, Ala 및 Asp으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asn 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asn이고,
Xaa4는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Thr, Ala 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Thr 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Thr이고,
Xaa5는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Pro 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Pro인, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항 또는 제 5항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열 Pro Tyr Xaa1 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro을 포함하는 세프라제 결합 펩티드로서,
Xaa1은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Ser, Ala 및 Cys으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser인, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항, 제 5항 및 제 6항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열 Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro을 포함하는, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열 Xaa1 Xaa2 Cys Xaa3 Tyr Xaa4 Xaa5 Trp Xaa6 Xaa7 Gly Arg Gly Pro Xaa8을 포함하는 세프라제 결합 펩티드로서,
Xaa1은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Gly 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Gly이고,
Xaa2는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Lys 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고,
Xaa3은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Pro 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Pro이고,
Xaa4는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Ser, Ala 및 Cys으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser이고,
Xaa5는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asn, Ala 및 Asp으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asn 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asn이고,
Xaa6은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Thr, Ala 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Thr 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Thr이고,
Xaa7은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Pro 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Pro이고,
Xaa8은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asp, Ala 및 Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp인, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항 또는 제 8항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열 Xaa1 Xaa2 Cys Pro Tyr Xaa3 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Xaa4를 포함하는 세프라제 결합 펩티드로서,
Xaa1은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Gly 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Gly이고,
Xaa2는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Lys 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고,
Xaa3은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Ser, Ala 및 Cys으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser이고,
Xaa4는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asp, Ala 및 Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp인, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항, 제 8항 및 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열 Gly Lys Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp을 포함하는, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항, 제 8항 및 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열 Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp을 포함하는, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열 (Xaa)n1 Cys (Xaa)n2 Gly Arg Gly Pro (Xaa)n3 Cys (Xaa)n4 Cys (Xaa)n5 Cys (Xaa)n6 Cys (Xaa)n7 Cys (Xaa)n8을 포함하는 세프라제 결합 펩티드로서,
상기 Cys 잔기는 시스틴 결절 구조를 형성하고,
Xaa는 각각 독립적으로 임의의 아미노산이고
n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7, 및 n8은 아미노산의 개별적인 수이고,
아미노산 Xaa의 성질 및/또는 아미노산의 수 n1, n2, n3, n4, n5, n6, n7 및 n8은 시스틴 결절 구조가 Cys 잔기들 간에 형성시킬 수 있는 것이며,
바람직하게는 n1이 0 내지 4이고, 바람직하게는 1 또는 2이고,
n2이 3 내지 10이고, 바람직하게는 6, 7 또는 8이고,
n3가 0 내지 4이고, 바람직하게는 1 또는 2이고,
n4가 3 내지 7이고, 바람직하게는 4, 5 또는 6이고,
n5가 2 내지 6이고, 바람직하게는 2, 3 또는 4이고,
n6가 1 내지 3이고, 바람직하게는 1 또는 2이고,
n7이 3 내지 7이고, 바람직하게는 4, 5 또는 6이고,
n8이 0 내지 4이고, 바람직하게는 1 또는 2인, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열 Cys Xaa1 Tyr Xaa2 Xaa3 Trp Xaa4 Xaa5 Gly Arg Gly Pro Xaa6 Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Xaa7 Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys을 포함하는 세프라제 결합 펩티드로서,
Xaa1은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Pro 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Pro이고,
Xaa2는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Ser, Ala 및 Cys으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser이고,
Xaa3은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asn, Ala 및 Asp으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asn 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asn이고,
Xaa4는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Thr, Ala 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Thr 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Thr이고,
Xaa5는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Pro 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Pro이고,
Xaa6은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asp, Ala 및 Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp이고,
Xaa7은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Arg 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Arg인, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항 또는 제 13항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열 Cys Pro Tyr Xaa1 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Xaa2 Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Xaa3 Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys을 포함하는 세프라제 결합 펩티드로서,
Xaa1은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Ser, Ala 및 Cys으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser이고,
Xaa2는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asp, Ala 및 Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp이고,
Xaa3은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Arg 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Arg인, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항, 제 13항 및 제 14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열 Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys을 포함하는, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열 Xaa1 Xaa2 Cys Xaa3 Tyr Xaa4 Xaa5 Trp Xaa6 Xaa7 Gly Arg Gly Pro Xaa8 Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Xaa9 Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys Gly을 포함하는, 세프라제 결합 펩티드로서,
Xaa1은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Gly 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Gly이고,
Xaa2는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Lys 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고,
Xaa3은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Pro 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Pro이고,
Xaa4는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Ser, Ala 및 Cys으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser이고,
Xaa5는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asn, Ala 및 Asp으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asn 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asn이고,
Xaa6가 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Thr, Ala 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Thr 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Thr이고,
Xaa7은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Pro 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Pro이고,
Xaa8은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asp, Ala 및 Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp이고,
Xaa9는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Arg 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Arg인, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항 또는 제 16항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열 Xaa1 Xaa2 Cys Pro Tyr Xaa3 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Xaa4 Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Xaa5 Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys Gly을 포함하는 세프라제 결합 펩티드로서,
Xaa1은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Gly 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Gly이고,
Xaa2는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Lys 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고,
Xaa3은 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Ser, Ala 및 Cys으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Ser이고,
Xaa4는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Asp, Ala 및 Asn으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Asp이고,
Xaa5는 임의의 아미노산이고, 바람직하게는 Arg 및 Ala으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산이고, 더욱 바람직하게는 Arg인, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항, 제 16항 및 제 17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열 Gly Lys Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys Gly을 포함하는, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항, 제 16항 및 제 17항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 아미노산 서열 Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys Gly을 포함하는, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 스캐폴드를 형성하거나 일부인, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 공유결합수식에 의해 안정화되는, 세프라제 결합 펩티드.
제 21항에 있어서,
상기 공유결합수식은 고리화인, 세프라제 결합 펩티드.
제 22항에 있어서,
상기 고리화는 1개 이상의 디설파이드 가교를 통한 것인, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 시스틴 결절 구조를 형성하고/형성하거나 일부이고, 바람직하게는 억제제 시스틴 결절 구조인, 세프라제 결합 펩티드.
제 24항에 있어서,
상기 시스틴 결절 구조는 목별자(Momordica cochinchinensis)의 개방형 사슬 트립신 억제제 II(MCoTI-II)에 기반하는, 세프라제 결합 펩티드.
제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드는 적어도 하나의 융합 상대(fusion partner)를 추가로 포함하는, 세프라제 결합 펩티드.
제 26항에 있어서,
상기 융합 상대는 이종성 아미노산 서열을 포함하는, 세프라제 결합 펩티드.
적어도 하나의 추가적인 일부분과 공유결합으로 및/또는 비-공유결합으로, 바람직하게는 공유결합으로 연관된 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항의 세프라제 결합 펩티드를 포함하는 세프라제 결합제.
제 26항, 또는 제 27항의 펩티드 또는 제 28항의 결합제에 있어서,
상기 융합 상대 또는 상기 추가적인 일부분은 담체 단백질, 표지, 리포터, 또는 태그를 포함하는, 세프라제 결합 펩티드 또는 세프라제 결합제.
제 28항에 있어서,
상기 세프라제 결합제는 공유결합으로 및/또는 비-공유결합으로 연관된 적어도 2개의 서브유닛을 포함하는 세프라제 결합제로서,
상기 서브유닛 각각은 제 1항 내지 제 27항 및 제 29항 중 어느 한 항의 세프라제 결합 펩티드를 포함하고,
상기 세프라제 결합 펩티드는 동일하거나 상이한, 세프라제 결합제.
제 30항에 있어서,
상기 세프라제 결합제는 비-공유결합으로 연관된 적어도 4개의 서브유닛을 포함하는, 세프라제 결합제.
제 30항에 있어서,
상기 세프라제 결합제는 공유결합으로 연관된 적어도 3개의 서브유닛을 포함하는, 세프라제 결합제.
제 28항에 있어서,
상기 세프라제 결합제는 적어도 하나의 검출가능한 표지 또는 리포터 및/또는 적어도 하나의 치료 작용부와 공유결합으로 및/또는 비-공유결합으로, 바람직하게는 공유결합으로 연관된 제 1항 내지 제 27항 및 제 29항 중 어느 한 항의 세프라제 결합 펩티드 또는 제 28항 내지 제 32항 중 어느 한 항의 세프라제 결합제를 포함하는, 세프라제 결합제.
제 1항 내지 제 27항 및 제 29항 중 어느 한 항의 세프라제 결합 펩티드 또는 제 28항 내지 제 32항 중 어느 한 항의 세프라제 결합제에 있어서,
상기 세프라제 결합제 또는 세프라제 결합 펩티드는 세프라제의 세포밖 도메인에 결합하는, 세프라제 결합 펩티드 또는 세프라제 결합제.
제 1항 내지 제 27항, 제 29항 및 제 34항 중 어느 한 항의 세프라제 결합 펩티드 또는 제 28항 내지 제 34항 중 어느 한 항의 세프라제 결합제에 있어서,
상기 세프라제는 세포에 의해 발현되는, 세프라제 결합 펩티드 또는 세프라제 결합제.
제 1항 내지 제 27항, 제 29항 제 34항 및 제 35항 중 어느 한 항의 세프라제 결합 펩티드 또는 제 28항 내지 제 35항 중 어느 한 항의 세프라제 결합제에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드 또는 세프라제 결합제는 DPP IV에 결합하지 않는, 세프라제 결합 펩티드 또는 세프라제 결합제.
제 1항 내지 제 27항, 제 29항 및 제 34항 내지 제 36항 중 어느 한 항의 세프라제 결합 펩티드 또는 제 28항 내지 제 36항 중 어느 한 항의 세프라제 결합제에 있어서,
상기 결합은 특이적 결합인, 세프라제 결합 펩티드 또는 세프라제 결합제.
제 1항 내지 제 27항, 제 29항 및 제 34항 내지 제 37항 중 어느 한 항의 세프라제 결합 펩티드를 암호화하는 재조합 핵산.
제 38항의 재조합 핵산을 포함하는, 숙주세포.
제 1항 내지 제 27항, 제 29항 및 제 34항 내지 제 37항 중 어느 한 항의 세프라제 결합 펩티드 또는 제 28항 내지 제 37항 중 어느 한 항의 세프라제 결합제를 포함하는, 검사키트.
제 40항에 있어서,
상기 검사키트는 진단 검사키트인, 검사키트.
제 1항 내지 제 27항, 제 29항 및 제 34항 내지 제 37항 중 어느 한 항의 세프라제 결합 펩티드 또는 제 28항 내지 제 37항 중 어느 한 항의 세프라제 결합제를 포함하는, 분석장치.
제 42항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드 또는 상기 세프라제 결합제는 고형 지지체 상에 방출가능하게 또는 비-방출가능하게 고정화되는, 분석장치.
제 1항 내지 제 27항, 제 29항 및 제 34항 내지 제 37항 중 어느 한 항의 세프라제 결합 펩티드 또는 제 28항 내지 제 37항 중 어느 한 항의 세프라제 결합제를 사용하는 단계를 포함하는, 시료내 세프라제의 존재 및/또는 정량에 대한 분석 방법.
환자의 암 진단, 검출 또는 모니터링 방법으로서,
제 1항 내지 제 27항, 제 29항 및 제 34항 내지 제 37항 중 어느 한 항의 세프라제 결합 펩티드 또는 제 28항 내지 제 37항 중 어느 한 항의 세프라제 결합제를 사용하는 환자에서 세프라제의 존재 및/또는 정량에 대해 분석하는 단계를 포함하는, 환자의 암 진단, 검출 또는 모니터링 방법.
제 45항에 있어서,
상기 분석은 상기 환자로부터 분리된 생물학적 시료 상에서 수행되는, 방법.
제 45항 또는 제 46항에 있어서,
상기 분석은 암이 없는 기준값과 비교하여 더 높은 세프라제의 존재 또는 세프라제의 정량을 나타낼 때 상기 환자는 암을 가진 것을 나타내는, 방법.
제 44항 내지 제 47항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세프라제의 존재 및/또는 정량에 대한 분석은
(i) 제 1항 내지 제 27항, 제 29항 및 제 34항 내지 제 37항 중 어느 한 항의 세프라제 결합 펩티드 또는 제 28항 내지 제 37항 중 어느 한 항의 세프라제 결합제와 생물학적 시료를 접촉시키는 단계, 및
(ii) 상기 세프라제 결합 펩티드 또는 상기 세프라제 결합제와 세프라제 간에 형성된 복합체를 검출 및/또는 상기 복합체의 양을 결정하는 단계를 포함하는, 방법.
제 44항 내지 제 48항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드 또는 세프라제 결합제는 적어도 하나의 검출가능한 표지 또는 리포터를 포함하거나 또는 이에 컨쥬게이트된, 방법.
제 44항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세프라제 결합 펩티드 또는 세프라제 결합제는 고형 지지체 상에 방출가능하게 또는 비-방출가능하게 고정화되는, 방법.
제 1항 내지 제 27항, 제 29항 및 제 34항 내지 제 37항 중 어느 한 항의 세프라제 결합 펩티드, 제 28항 내지 제 37항 중 어느 한 항의 세프라제 결합제, 제 38항의 재조합 핵산 또는 제 39항의 숙주세포를 포함하는, 약제 조성물.
치료 용도, 특히 환자의 암을 치료 또는 예방용 용도로, 제 1항 내지 제27항, 제 29항, 및 제 34항 내지 제 37항 중 어느 한 항의 세프라제 결합 펩티드, 제 28항 내지 제 37항 중 어느 한 항의 세프라제 결합제, 제 38항의 재조합 핵산, 제 39항의 숙주세포, 또는 제 51항의 약제 조성물.
환자에서 암을 표적하는 용도로, 제 1항 내지 제27항, 제 29항, 및 제 34항 내지 제 37항 중 어느 한 항의 세프라제 결합 펩티드, 제 28항 내지 제 37항 중 어느 한 항의 세프라제 결합제, 제 38항의 재조합 핵산, 제 39항의 숙주세포, 또는 제 51항의 약제 조성물.
제 1항 내지 제 27항, 제 29항 및 제 34항 내지 제 37항 중 어느 한 항의 세프라제 결합 펩티드, 제 28항 내지 제 37항 중 어느 한 항의 세프라제 결합제, 제 38항의 재조합 핵산, 제 39항의 숙주세포 또는 제 51항의 약제 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 환자를 치료하는 방법으로서,
바람직하게는, 상기 환자는 암 또는 암 발달의 위험이 있는, 환자를 치료하는 방법.
상기 세프라제 결합 펩티드 또는 세프라제 결합제는 적어도 하나의 치료 작용부를 포함하거나 이에 컨쥬게이트된, 제 51항의 약제 조성물, 제 52항의 세프라제 결합 펩티드, 세프라제 결합제, 재조합 핵산, 숙주세포 또는 약제 조성물, 제 53항의 세프라제 결합 펩티드 또는 세프라제 결합제 또는 제 54항의 방법.
상기 암은 세프라제-양성이고/이거나 세프라제를 발현하는 세포와 관련된, 제 45항 내지 제 50항 중 어느 한 항의 방법, 제 52항 또는 제 55항의 세프라제 결합 펩티드, 세프라제 결합제, 재조합 핵산, 숙주세포 또는 약제 조성물, 제 53항 또는 제 55항의 세프라제 결합 펩티드 또는 세프라제 결합제 또는 제 54항 또는 제 55항의 방법.