CN107531776B - 用于诊断和治疗癌症的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及诊断和治疗癌性疾病，特别是表达Seprase(Fap‑α，成纤维细胞激活蛋白α)的癌性疾病.更特别地，本发明涉及靶向Seprase的肽。

Description

用于诊断和治疗癌症的组合物和方法

技术领域

本发明涉及诊断和治疗癌性疾病，特别是表达Seprase(Fap-α，成纤维细胞激活蛋白α(fibroblast activation protein alpha))的癌性疾病，例如乳腺癌、肺部或肺癌(例如非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC))、结直肠癌、结肠癌、食管癌、头颈癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌、肾癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫内膜癌或前列腺癌。更特别地，本发明涉及靶向Seprase的肽。

背景技术

癌症是全球死亡的主要原因之一，超过了心脏病。2012年全球人口中有820万人死于癌症(WHO)。例如放射治疗、化学治疗和常规外科手术操作的经典抗癌治疗通常遭受不良的选择性，因此对健康组织具有严重的毒副作用。新的治疗形式在于通过肿瘤相关抗原特异性的结合分子将生物活性分子(药物、细胞因子、放射性核素等)靶向递送至肿瘤环境。这允许将药物选择性地引导向靶标阳性肿瘤组织并有效杀伤恶性细胞，而不伤害健康细胞。这伴随着所谓的伴随诊断(companion diagnostic)的发展，使得能够确定患者内的靶标阳性肿瘤，从而提前确保用于个体癌症治疗的合理定制的策略。在这方面，靶标特异性成像技术的应用成为了重要诊断步骤，显示了最近几十年的巨大进步。成像技术可以提供关于肿瘤相关蛋白的存在和量、定位、早期检测、分布、患者分层和治疗监测的关键信息(Stern，Case等2013)。

定制的个性化抗癌治疗的关键步骤是鉴定选择性肿瘤相关标志物蛋白。在超过90％的人原发性上皮肿瘤(例如乳腺癌、肺癌和结直肠癌)中，丝氨酸蛋白酶Seprase(Fap-α，成纤维细胞激活蛋白α)在癌症相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast，CAF)中选择性过表达，而在正常成纤维细胞或其他正常组织中几乎不表达至不表达(Rui Liu2012)，使得其成为用于癌症治疗和诊断的有吸引力的靶标。Seprase是属于后脯氨酸二肽基氨基肽酶家族(post-proline dipeptidyl aminopeptidase family)的170kDa II型跨膜细胞表面蛋白。其通过短跨膜结构域锚定在质膜中，在细胞内暴露氨基末端序列，而具有羧基末端的催化结构域保留在细胞外空间中(Goldstein，Ghersi等1997；Pineiro-Sanchez，Goldstein等1997)。Seprase在肿瘤生长和侵袭中的确切作用、酶所涉及的分子机制以及其天然配体或底物仍然很不清楚。

Seprase作为肿瘤组织的选择性标志物，可以预期许多靶向所述蛋白质的潜在治疗策略。在许多不同体内癌症模型中使用Seprase结合分子表明，可以以临床前方式高效地破坏肿瘤进展(Loeffler，Kruger等2006；Ostermann，Garin-Chesa等2008；Liao，Luo等2009；Kraman，Bambrough等2010；Wen，Wang等2010)。与之相反，使用单克隆抗体F19(其人源化形式西罗珠单抗(Sibrotuzumab))(Welt，Divgi等1994；Hofheinz，al-Batran等2003；Scott，Wiseman等2003)或Seprase酶抑制剂Talabostat(Narra，Mullins等2007；Eager，Cunningham等2009；Eager，Cunningham等2009)在人癌症患者的临床环境中靶向Seprase已经显示出仅适度的临床效力。有趣的是，尽管目前讨论了也由多能骨髓干细胞(multipotent bone marrow stem cell，BMSC)表达，但是在靶向Seprase的临床前研究中没有报道显著的毒性(Welt，Divgi等1994；Lee，Fassnacht等2005；Loeffler，Kruger等2006；Ostermann，Garin-Chesa等2008；Liao，Luo等2009；Santos，Jung等2009；Kraman，Bambrough等2010；Wen，Wang等2010)。总之，迄今为止报道的Seprase特异性抗体的有利生物分布以及在患者中转移性疾病部位的选择性摄取(Welt，Divgi等1994；Scott，Wiseman等2003)使得Seprase有资格成为用于肿瘤靶向方法的有吸引力的候选物。由于仍然不知道Seprase是作为肿瘤抑制因子(Wesley，Albino等1999；Ramirez-Montagut，Blachere等2004)还是促进肿瘤生长(Cheng，Dunbrack等2002；Goodman，Rozypal等2003；Huang，Wang等2004)的事实，可能有利的是开发Seprase的高选择性配体用于成像技术，其对功能没有影响，但是提供关于定位、早期检测、分布、患者分层和治疗监测的信息(Stern，Case等2013)

对于靶向血管化差的肿瘤，抗体以及甚至其片段的大尺寸可减慢组织渗透速率，并因此阻碍高效递送。此外，由于抗体的血液循环延长，其对于诊断用途似乎不是最佳的，尤其是在成像概念的情况下。除上述之外，具有复杂糖基化模式和二硫桥的抗体的分子结构需要复杂的成本密集制备，并且例如通过成像示踪剂使进一步的功能化复杂化。为了克服这些限制，作为抗体的替代方案，在过去几十年出现了所谓的蛋白质支架：支架提供稳健的结构框架，以精确地设计用于紧密和特异性地识别给定靶标而定制的相互作用分子(Weidle，Auer等2013)。其中大部分在非还原条件下正确折叠，并且可以在细菌中表达，而不需要变性和重折叠。甚至化学合成也是产生某些形式的选择。最后，其非常适合于进一步的功能化(标记、寡聚化、与其他肽融合等)以产生多功能结合分子。在基于支架的不同方法中，胱氨酸结(cystine-knot)微型蛋白(“knottin”)已经显示出用于开发靶向诊断和治疗剂的巨大潜力。例如，Cochran及同事产生了用于U87MG肿瘤的整联蛋白特异性PET成像的经放射性标记微型蛋白18F-FP-2.5D和18F-FP-2.5F，其以良好的对比、快速的肿瘤靶向、快速从体内清除以及在正常组织中相对低的摄取而突出(Kimura，Cheng等2009；Kimura，Levin等2009；Kimura，Miao等2010；Kimura，Jones等2011；Liu，Liu等2011)。微型蛋白是小的30至50个氨基酸的多肽，其包含形成使其得名的结结构的三个二硫键(Kolmar 2009；Moore和Cochran 2012)。假结(pseudoknot)胱氨酸拓扑结构是优异的热、蛋白水解和化学稳定性的原因，这些是体内生物医学应用所期望的(Kolmar2011)。例如，微型蛋白可以在碱性或酸性环境中煮沸而不失去结构和功能完整性(Weidle，Auer等2013)。二硫化物限制的环区域容许宽的序列多样性，这为设计识别多种生物医学靶标的蛋白质提供了稳健的分子框架。

本领域需要可用于表达Seprase的肿瘤的诊断和治疗方法的Seprase结合分子。

本文描述了对人Seprase表现出高特异性和选择性的Seprase结合剂，例如Seprase结合肽。本文所述的Seprase结合剂通过高效靶向肿瘤微环境而作为用于诊断应用(特别是用于肿瘤成像)和治疗应用的优异工具。

发明内容

发明概述

根据本发明，使用来自木鳖子(Momordica cochinchinensis)的knottin型胰蛋白酶抑制剂II的开链变体(oMCoTI-II)作为分子支架来设计用于肿瘤靶向应用的Seprase特异性结合蛋白。为此，将组合噬菌体文库用于选择与重组人Seprase的细胞外结构域特异性相互作用的oMCoTI-II变体。对显示与预定靶标结合的一种经鉴定knottin肽(微型蛋白)MC-FA-010(aa：GKCPYSNWTPGRGPDCRRDSDCPGRCICRGNGYCG)进行了详细表征。其表现出人Seprase的特异性复合，而不识别相关蛋白质，例如密切相关的同源物DPP-IV。结合主要取决于MC-FA-010的第一环中的两个脂肪族残基和GRGP基序，其可以通过丙氨酸扫描诱变显示。此外，所述Seprase特异性微型蛋白与鼠同源物交叉反应，如使用靶标阳性CHO-K1细胞系通过流式细胞术和全细胞ELISA确定的。可通过CT26肿瘤切片的免疫荧光染色显示肿瘤相关成纤维细胞(CAF)表达的Seprase的特异性靶向。在携带靶标阳性CHO-K1肿瘤的Fox n1(nu)小鼠中可以证明赘生性组织的体内靶向。

本发明一般性地提供了可用于通过靶向Seprase来治疗和/或诊断癌症疾病的化合物。这些化合物允许选择性地检测表达Seprase的细胞和/或根除表达Seprase的细胞和/或与表达Seprase的细胞相关的细胞，从而使对不表达Seprase的正常细胞的不利影响最小化。

本发明提供了包含氨基酸序列Gly Arg Gly Pro的Seprase结合肽。

在第一实施方案中，本发明的Seprase结合肽包含以下氨基酸序列：

Tyr Xaa1 Xaa2 Trp Xaa3 Xaa4 Gly Arg Gly Pro

其中，

Xaa1是任意氨基酸，优选选自Ser、Ala和Cys的氨基酸，更优选选自Ser和Ala的氨基酸，更优选Ser，

Xaa2是任意氨基酸，优选选自Asn、Ala和Asp的氨基酸，更优选选自Asn和Ala的氨基酸，更优选Asn，

Xaa3是任意氨基酸，优选选自Thr、Ala和Val的氨基酸，更优选选自Thr和Ala的氨基酸，更优选Thr，

Xaa4是任意氨基酸，优选选自Pro和Ala的氨基酸，更优选Pro。

在一个优选实施方案中，Seprase结合肽包含以下氨基酸序列：

Tyr Xaa1 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro

其中，

Xaa1是任意氨基酸，优选选自Ser、Ala和Cys的氨基酸，更优选选自Ser和Ala的氨基酸，更优选Ser。

在一个优选实施方案中，Seprase结合肽包含以下氨基酸序列：

Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro。

在第二实施方案中，本发明的Seprase结合肽包含以下氨基酸序列：

Xaa1 Tyr Xaa2 Xaa3 Trp Xaa4 Xaa5 Gly Arg Gly Pro

其中，

Xaa1是任意氨基酸，优选选自Pro和Ala的氨基酸，更优选Pro，

Xaa2是任意氨基酸，优选选自Ser、Ala和Cys的氨基酸，更优选选自Ser和Ala的氨基酸，更优选Ser，

Xaa3是任意氨基酸，优选选自Asn、Ala和Asp的氨基酸，更优选选自Asn和Ala的氨基酸，更优选Asn，

Xaa4是任意氨基酸，优选选自Thr、Ala和Val的氨基酸，更优选选自Thr和Ala的氨基酸，更优选Thr，

Xaa5是任意氨基酸，优选选自Pro和Ala的氨基酸，更优选Pro。

在一个优选实施方案中，Seprase结合肽包含以下氨基酸序列：

Pro Tyr Xaa1 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro

其中，

Xaa1是任意氨基酸，优选选自Ser、Ala和Cys的氨基酸，更优选选自Ser和Ala的氨基酸，更优选Ser。

在一个优选实施方案中，Seprase结合肽包含以下氨基酸序列：

Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro。

在第三实施方案中，本发明的Seprase结合肽包含以下氨基酸序列：

Xaa1 Xaa2 Cys Xaa3 Tyr Xaa4 Xaa5 Trp Xaa6 Xaa7 Gly Arg Gly Pro Xaa8

其中，

Xaa1是任意氨基酸，优选选自Gly和Ala的氨基酸，更优选Gly，

Xaa2是任意氨基酸，优选选自Lys和Ala的氨基酸，

Xaa3是任意氨基酸，优选选自Pro和Ala的氨基酸，更优选Pro，

Xaa4是任意氨基酸，优选选自Ser、Ala和Cys的氨基酸，更优选选自Ser和Ala的氨基酸，更优选Ser，

Xaa5是任意氨基酸，优选选自Asn、Ala和Asp的氨基酸，更优选选自Asn和Ala的氨基酸，更优选Asn，

Xaa6是任意氨基酸，优选选自Thr、Ala和Val的氨基酸，更优选选自Thr和Ala的氨基酸，更优选Thr，

Xaa7是任意氨基酸，优选选自Pro和Ala的氨基酸，更优选Pro，

Xaa8是任意氨基酸，优选选自Asp、Ala和Asn的氨基酸，更优选选自Asp和Ala的氨基酸，更优选Asp。

在一个优选实施方案中，Seprase结合肽包含以下氨基酸序列：

Xaa1 Xaa2 Cys Pro Tyr Xaa3 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Xaa4

其中，

Xaa1是任意氨基酸，优选选自Gly和Ala的氨基酸，更优选Gly，

Xaa2是任意氨基酸，优选选自Lys和Ala的氨基酸，

Xaa3是任意氨基酸，优选选自Ser、Ala和Cys的氨基酸，更优选选自Ser和Ala的氨基酸，更优选Ser，

Xaa4是任意氨基酸，优选选自Asp、Ala和Asn的氨基酸，更优选选自Asp和Ala的氨基酸，更优选Asp。

在一个优选实施方案中，Seprase结合肽包含以下氨基酸序列：

Gly Lys Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp。

在一个优选实施方案中，Seprase结合肽包含以下氨基酸序列：

Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp。

在另一个实施方案中，本发明的Seprase结合肽包含以下氨基酸序列：

Cys Xaa1 Tyr Xaa2 Xaa3 Trp Xaa4 Xaa5 Gly Arg Gly Pro Xaa6 Cys

其中，

Xaa1是任意氨基酸，优选选自Pro和Ala的氨基酸，更优选Pro，

Xaa2是任意氨基酸，优选选自Ser、Ala和Cys的氨基酸，更优选选自Ser和Ala的氨基酸，更优选Ser，

Xaa3是任意氨基酸，优选选自Asn、Ala和Asp的氨基酸，更优选选自Asn和Ala的氨基酸，更优选Asn，

Xaa4是任意氨基酸，优选选自Thr、Ala和Val的氨基酸，更优选选自Thr和Ala的氨基酸，更优选Thr，

Xaa5是任意氨基酸，优选选自Pro和Ala的氨基酸，更优选Pro，

Xaa6是任意氨基酸，优选选自Asp、Ala和Asn的氨基酸，更优选选自Asp和Ala的氨基酸，更优选Asp。

在一个实施方案中，seprase结合肽优选地是胱氨酸结结构的一部分，其中半胱氨酸优选地是胱氨酸结结构的第一半胱氨酸和第二半胱氨酸，和/或半胱氨酸之间的氨基酸序列形成胱氨酸结结构的第一环。

在一个优选实施方案中，Seprase结合肽包含以下氨基酸序列：

Cys Pro Tyr Xaa1 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Xaa2 Cys

其中，

Xaa1是任意氨基酸，优选选自Ser、Ala和Cys的氨基酸，更优选选自Ser和Ala的氨基酸，更优选Ser，

Xaa2是任意氨基酸，优选选自Asp、Ala和Asn的氨基酸，更优选选自Asp和Ala的氨基酸，更优选Asp。

在一个优选实施方案中，Seprase结合肽包含以下氨基酸序列：

Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys。

在另一个实施方案中，本发明的Seprase结合肽包含以下氨基酸序列：

(Xaa)n1 Cys (Xaa)n2 Gly Arg Gly Pro (Xaa)n3 Cys (Xaa)n4 Cys (Xaa)n5Cys (Xaa)n6 Cys (Xaa)n7 Cys(Xaa)n8

其中，

Cys残基形成半胱氨酸结结构，

Xaa彼此独立地是任意氨基酸，以及

n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7和n8是各自的氨基酸数，

其中氨基酸Xaa的性质和/或氨基酸数n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7和n8使得能够在Cys残基之间形成半胱氨酸结结构，

其中优选地，

n1为0至4，优选1或2，

n2为3至10，优选6、7或8，

n3为0至4，优选1或2，

n4为3至7，优选4、5或6，

n5为2至6，优选2、3或4，

n6为1至3，优选1或2，

n7为3至7，优选4、5或6，以及

n8为0至4，优选1或2。

在另一个实施方案中，本发明的Seprase结合肽包含以下氨基酸序列：

Cys Xaa1 Tyr Xaa2 Xaa3 Trp Xaa4 Xaa5 Gly Arg Gly Pro Xaa6 Cys Arg ArgAsp Ser Asp Cys Pro Gly Xaa7 Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys

其中，

Xaa1是任意氨基酸，优选选自Pro和Ala的氨基酸，更优选Pro，

Xaa2是任意氨基酸，优选选自Ser、Ala和Cys的氨基酸，更优选选自Ser和Ala的氨基酸，更优选Ser，

Xaa3是任意氨基酸，优选选自Asn、Ala和Asp的氨基酸，更优选选自Asn和Ala的氨基酸，更优选Asn，

Xaa4是任意氨基酸，优选选自Thr、Ala和Val的氨基酸，更优选选自Thr和Ala的氨基酸，更优选Thr，

Xaa5是任意氨基酸，优选选自Pro和Ala的氨基酸，更优选Pro，

Xaa6是任意氨基酸，优选选自Asp、Ala和Asn的氨基酸，更优选选自Asp和Ala的氨基酸，更优选Asp，

Xaa7是任意氨基酸，优选选自Arg和Ala的氨基酸，更优选Arg。

在一个优选实施方案中，Seprase结合肽包含以下氨基酸序列：

Cys Pro Tyr Xaa1 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Xaa2 Cys Arg Arg AspSer Asp Cys Pro Gly Xaa3 Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys

其中，

Xaa1是任意氨基酸，优选选自Ser、Ala和Cys的氨基酸，更优选选自Ser和Ala的氨基酸，更优选Ser，

Xaa2是任意氨基酸，优选选自Asp、Ala和Asn的氨基酸，更优选选自Asp和Ala的氨基酸，更优选Asp，

Xaa3是任意氨基酸，优选选自Arg和Ala的氨基酸，更优选Arg。

在一个优选实施方案中，Seprase结合肽包含以下氨基酸序列：

Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys Arg Arg AspSe Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys。

在另一个实施方案中，本发明的Seprase结合肽包含以下氨基酸序列：

Xaa1 Xaa2 Cys Xaa3 Tyr Xaa4 Xaa5 Trp Xaa6 Xaa7 Gly Arg Gly Pro Xaa8Cys Arg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Xaa9 Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr CysGly

其中，

Xaa1是任意氨基酸，优选选自Gly和Ala的氨基酸，更优选Gly，

Xaa2是任意氨基酸，优选选自Lys和Ala的氨基酸，

Xaa3是任意氨基酸，优选选自Pro和Ala的氨基酸，更优选Pro，

Xaa4是任意氨基酸，优选选自Ser、Ala和Cys的氨基酸，更优选选自Ser和Ala的氨基酸，更优选Ser，

Xaa5是任意氨基酸，优选选自Asn、Ala和Asp的氨基酸，更优选选自Asn和Ala的氨基酸，更优选Asn，

Xaa6是任意氨基酸，优选选自Thr、Ala和Val的氨基酸，更优选选自Thr和Ala的氨基酸，更优选Thr，

Xaa7是任意氨基酸，优选选自Pro和Ala的氨基酸，更优选Pro，

Xaa8是任意氨基酸，优选选自Asp、Ala和Asn的氨基酸，更优选选自Asp和Ala的氨基酸，更优选Asp，

Xaa9是任意氨基酸，优选选自Arg和Ala的氨基酸，更优选Arg。

在一个优选实施方案中，Seprase结合肽包含以下氨基酸序列：

Xaa1 Xaa2 Cys Pro Tyr Xaa3 Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Xaa4 CysArg Arg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Xaa5 Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys Gly

其中，

Xaa1是任意氨基酸，优选选自Gly和Ala的氨基酸，更优选Gly，

Xaa2是任意氨基酸，优选选自Lys和Ala的氨基酸，

Xaa3是任意氨基酸，优选选自Ser、Ala和Cys的氨基酸，更优选选自Ser和Ala的氨基酸，更优选Ser，

Xaa4是任意氨基酸，优选选自Asp、Ala和Asn的氨基酸，更优选选自Asp和Ala的氨基酸，更优选Asp，

Xaa5是任意氨基酸，优选选自Arg和Ala的氨基酸，更优选Arg。

在一个优选实施方案中，Seprase结合肽包含以下氨基酸序列：

Gly Lys Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys ArgArg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys Gly。

在一个优选实施方案中，Seprase结合肽包含以下氨基酸序列：

Gly Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Trp Thr Pro Gly Arg Gly Pro Asp Cys ArgArg Asp Ser Asp Cys Pro Gly Arg Cys Ile Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Cys Gly。

在一个实施方案中，Seprase结合肽包含下表1、表2或表4中所示的氨基酸序列。在一个实施方案中，Seprase结合肽包含序列表的以下中所示的氨基酸序列：SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95或96。

在一个实施方案中，本发明的Seprase结合肽形成支架或者是支架的一部分。术语“支架”涉及赋予本文所述的Seprase结合肽或氨基酸序列刚性的结构。

在一个实施方案中，本发明的Seprase结合肽通过共价修饰来稳定。在一个实施方案中，所述共价修饰是环化。在一个实施方案中，所述环化是通过一个或更多个二硫桥形成的。

在一个实施方案中，本发明的Seprase结合肽形成胱氨酸结结构和/或是胱氨酸结结构的一部分，所述胱氨酸结结构优选抑制剂胱氨酸结结构。在一个实施方案中，胱氨酸结结构基于来自木鳖子的开链胰蛋白酶抑制剂II(MCoTI-II)、喷瓜(Ecballium elaterium)的胰蛋白酶抑制剂EETI-II和经优化的MCoTI-II支架。

氨基酸序列Gly Arg Gly Pro和/或本发明第一或第二实施方案的Seprase结合肽中的氨基酸序列优选地是胱氨酸结结构的一部分，其中所述氨基酸序列位于胱氨酸结结构的第一环内(即在第一半胱氨酸和第二半胱氨酸之间)。

在一个实施方案中，本发明的Seprase结合肽还包含至少一个融合配偶体。在一个实施方案中，融合配偶体包含异源氨基酸序列。

本发明还提供了Seprase结合剂，其包含一个或更多个，例如2、3、4、5、6或更多个本文所述的Seprase结合肽，其中所述Seprase结合肽可以相同或不同。本发明还提供了Seprase结合剂，其包含与至少一个另外的部分共价和/或非共价，优选共价缔合的本发明的Seprase结合肽。

在本发明的Seprase结合肽或本发明的Seprase结合剂的一个实施方案中，融合配偶体或另外的部分包含载体蛋白、标记、报道子(reporter)或标签。在一个实施方案中，报道子是用于免疫学测定的报道子，其中报道子优选选自碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或荧光分子。在一个实施方案中，融合配偶体或另外的部分选自His6-盒、硫氧还蛋白、S标签、生物素、或其组合。

在一个实施方案中，本发明的Seprase结合剂包含至少两个共价和/或非共价缔合的亚基，所述亚基各自包含本发明的Seprase结合肽，其中所述Seprase结合肽可以相同或不同。

根据本发明，在一个实施方案中，非共价缔合是通过包含链霉抗生物素蛋白的化合物。根据本发明，在一个实施方案中，共价缔合是通过肽和/或非肽接头。

因此，在一个实施方案中，本发明的Seprase结合肽以寡聚体或多聚体的形式存在。在该实施方案中，可以相同或不同的本发明的两个或更多个Seprase结合肽可以通过共价或非共价结合，例如通过生物素/链霉抗生物素蛋白而连接或偶联。因此，本发明的Seprase结合肽可以形成二聚体、三聚体、四聚体等。

在一个实施方案中，本发明的Seprase结合剂包含至少四个非共价缔合的亚基。

在一个实施方案中，本发明的Seprase结合剂包含至少三个共价缔合的亚基。

在一个实施方案中，本发明的Seprase结合剂包含本发明Seprase结合肽或本发明Seprase结合剂，所述Seprase结合肽或Seprase结合剂与至少一种可检测标记或报道子和/或至少一个治疗效应物部分共价和/或非共价缔合，优选共价缔合。

在一个实施方案中，本发明的Seprase结合肽或本发明的Seprase结合剂与Seprase的细胞外结构域结合。

在本发明Seprase结合肽或本发明Seprase结合剂的一个实施方案中，所述Seprase由细胞表达。

在一个实施方案中，本发明的Seprase结合肽或本发明的Seprase结合剂不与DPPIV结合。

在本发明的一个实施方案中，结合是特异性结合。

本发明还提供了编码本发明的Seprase结合肽的重组核酸。在一个实施方案中，重组核酸是载体的形式或RNA的形式。

本发明还提供了包含本发明的重组核酸的宿主细胞。

本发明的另一个目的是提供用于诊断、检测或监测癌症疾病，即确定癌症疾病的消退、进展、进程和/或发生的手段和方法。

本发明提供了包含本发明的Seprase结合肽或本发明的Seprase结合剂的测试试剂盒。在一个实施方案中，测试试剂盒还包含至少一种用于进行免疫测定的另外的试剂和/或用于使用试剂盒进行免疫测定的说明书。在一个实施方案中，本发明的测试试剂盒是诊断测试试剂盒。

本发明的诊断测试试剂盒可用于本发明的诊断、检测或监测癌症的方法。这些试剂盒可以包含信息小册子，例如告知如何使用试剂来实施本文公开的方法的小册子。

本发明提供了包含本发明的Seprase结合肽或本发明的Seprase结合剂的测定装置。在一个实施方案中，测定装置是酶联免疫吸附测定装置。在本发明的测定装置的一个实施方案中，Seprase结合肽或Seprase结合剂可释放地或不可释放地固定化在固体支持物上。

本发明提供了用于测定样品中Seprase的存在和/或量的方法，其包括使用本发明的Seprase结合肽或本发明的Seprase结合剂。

本发明提供了用于在患者中诊断、检测或监测癌症的方法，其包括使用本发明的Seprase结合肽或本发明的Seprase结合剂来测定所述患者中Seprase的存在和/或量。

在一个具体方面，本发明涉及用于检测癌症疾病，即确定癌症疾病的位置或部位，例如具体组织或器官的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患者施用与可检测标记偶联的本发明的Seprase结合化合物。

所述患者中组织或器官的标记可以指示所述组织或器官中癌症疾病的存在或风险。

在一个实施方案中，组织或器官是当组织或器官未患癌症时其中细胞基本上不表达Seprase的组织或器官。

在本发明方法的一个实施方案中，对从所述患者分离的生物样品进行所述测定。

在一个实施方案中，生物样品分离自患有癌症疾病、怀疑患有或罹患癌症疾病或者具有癌症疾病的潜力的患者。在一个实施方案中，生物样品来自当组织或器官未患癌症时其中细胞基本上不表达Seprase的组织或器官。

通常，将生物样品中Seprase的水平与参考水平进行比较，其中与所述参考水平的偏差指示患者中癌症疾病的存在和/或阶段。参考水平可以是在对照样品(例如，来自健康组织或对象)中确定的水平或来自健康对象的中值水平。与所述参考水平的“偏差”指示任何显著变化，例如提高或降低至少10％、20％或30％，优选至少40％或50％，或甚至更高。与参考水平相比，例如与未患癌症疾病的患者相比，Seprase的存在和/或Seprase的量增加可以指示所述患者中癌症疾病的存在或风险(即，发生癌症疾病的潜力)。

在一个实施方案中，生物样品和/或对照/参考样品来自对应于待关于癌症疾病的影响进行诊断、检测或监测的组织或器官的组织或器官；例如，待诊断、检测或监测的癌症疾病是脑癌，以及生物样品和/或对照/参考样品是脑组织。

在一个实施方案中，生物样品和/或对照/参考样品来自当组织或器官未患癌症时其中细胞基本上不表达Seprase的组织或器官。通过本发明的方法指示患者中癌症疾病的存在或风险可以指示癌症疾病在所述组织或器官中，或者所述组织或器官处于所述癌症疾病的风险之中。

用于诊断、检测或监测的方法允许定量和/或定性评价，例如靶分子的绝对和/或相对测量，例如Seprase的表达水平。

用于实现所述测定Seprase的存在和/或量的方法在本文中进行了描述，并且对技术人员是明显的。通常，本发明方法中的测定涉及使用特异性结合Separase的经标记配体，例如，与允许检测的标记直接或间接结合的特异性结合Seprase的本发明化合物，所述标记例如指示剂酶、放射性标记、荧光团或顺磁性颗粒。

在本发明方法的一个实施方案中，与未患癌症的参考相比，Seprase的存在或Seprase的量较高指示患者患有癌症。

根据本发明的监测方法优选地包括测定第一时间点的第一样品中和第二时间点的另外样品中Seprase的存在和/或量，其中可以通过比较两个样品来确定癌症疾病的消退、进展、进程和/或发生。

与较早从患者取得的生物样品相比，生物样品中Seprase的量降低可以指示所述患者中癌症疾病的消退、积极进程(例如成功治疗)或发生风险降低。

与较早从患者取得的生物样品相比，生物样品中Seprase的量增加可以指示所述患者中癌症疾病的进展、消极进程(例如不成功治疗)、复发或转移行为、发生或发生风险。

在本发明方法的一个实施方案中，测定Seprase的存在和/或量包括：

(i)使生物样品与本发明的Seprase结合肽或本发明的Seprase结合剂接触，以及

(ii)检测Seprase结合肽或Seprase结合剂与Seprase之间的复合物的形成和/或确定所述复合物的量。

在本发明方法的一个实施方案中，Seprase结合肽或Seprase结合剂包含或缀合至至少一种可检测标记或报道子。

在一个实施方案中，本发明的方法在免疫测定的背景下进行。

在本发明方法的一个实施方案中，Seprase结合肽或Seprase结合剂可释放地或不可释放地固定化在固体支持物上。

根据本发明的Seprase结合化合物与Seprase的结合可以例如通过抑制催化活性来干扰Seprase的功能。此外，Seprase结合化合物可以与例如放射性标记、细胞毒素、细胞毒性酶等的治疗效应物部分连接，并且化合物与Seprase的结合可以选择性靶向和杀伤表达Seprase的细胞或与表达Seprase的细胞相关的细胞，特别是癌细胞。在一个实施方案中，所述化合物降低肿瘤细胞生长和/或诱导肿瘤细胞死亡，并且因此具有肿瘤抑制或肿瘤破坏作用。因此，本文所述的Seprase结合化合物可以用于治疗，特别是用于癌症疾病的预防性和/或治疗性治疗。

使用本发明方法的如上所述对癌症疾病的阳性诊断可以指示适合于本文所述的治疗方法的癌症疾病。

因此，本发明的另一个目的是提供治疗性和/或预防性治疗癌症疾病的手段和方法。

本发明提供了药物组合物，其包含本发明的Seprase结合肽、本发明的Seprase结合剂、本发明的重组核酸或本发明的宿主细胞。

本发明的药物组合物可以包含可药用载体，并且可以任选地包含本文所述的其他物质。

本发明提供了本发明的Seprase结合肽、本发明的Seprase结合剂、本发明的重组核酸、本发明的宿主细胞或本发明的药物组合物，其用于治疗，特别是用于在患者中治疗或预防癌症。

本发明提供了本发明的Seprase结合肽或本发明的Seprase结合剂，其用于在患者中靶向癌症。

本发明提供了治疗患者的方法，其包括向患者施用本发明的Seprase结合肽、本发明的Seprase结合剂、本发明的重组核酸、本发明的宿主细胞或本发明的药物组合物，其中优选地，所述患者患有癌症或处于发生癌症的风险之中。

在上述方面的一个实施方案中，Seprase结合肽或Seprase结合剂包含或缀合至至少一个治疗效应物部分。

在上述方面的一个实施方案中，癌症是Seprase阳性的和/或涉及表达Seprase的细胞。在一个实施方案中，细胞是癌症相关成纤维细胞。

根据本发明的所有方面，癌症优选地选自乳腺癌、肺部或肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、结直肠癌、结肠癌、食管癌、头颈癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌、肾癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫内膜癌或前列腺癌。

根据本发明的所有方面，Seprase优选地包含根据序列表的SEQ ID NO：3或4的氨基酸序列或者所述氨基酸序列的变体。

在一个方面，本发明提供了用于本文所述治疗方法的本文所述的药剂。在一个实施方案中，本发明提供了用于本文所述治疗方法的本文所述的药物组合物。

本文所述的治疗可以与外科手术切除和/或放射和/或传统化学治疗组合。

从以下详细描述和权利要求书中，本发明的其他特征和优点将变得明显。

发明详述

尽管下面详细描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于本文所述的特定方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意在限制本发明的范围，本发明的范围仅由所附权利要求书限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常理解的相同的含义。

在下文，将对本发明的要素进行说明。这些要素与具体实施方案一起列出，然而，应当理解，其可以以任意方式和任意数量组合以产生另外的实施方案。各个描述的实例和优选实施方案不应被解释为将本发明仅限于明确描述的实施方案。本说明书应被理解为支持并包括将明确描述的实施方案与任意数量的所公开和/或优选要素组合的实施方案。此外，除非上下文另有指出，否则本申请中所有描述的要素的任意排列和组合均应被视为通过本申请的说明书公开。

优选地，本文使用的术语如″A multilingual glossary of biotechnologicalterms：(IUPAC Recommendations)″，H.G.W.Leuenberger，B.Nagel和H.

编辑，Helvetica Chimica Acta，CH-4010 Basel，Switzerland，(1995)中所述进行定义。

除非另有说明，否则本发明的实践将采用在本领域文献中解释的化学、生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术的常规方法(参见例如，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，J.Sambrook等编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor 1989)。

在本说明书和所附权利要求书通篇，除非上下文另有要求，否则词语“包括/包含”和变化形式应理解为暗示包括指出的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，尽管在一些实施方案中，可以排除这样的其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，即主题在于包括指出的成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组。除非本文另有说明或明显与上下文相矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)使用的未用数量词修饰的名词应解释为包括一个/种和/或更多个/种。本文中对值范围的记载仅意在作为单独地提及落在该范围内的每个单独值的简写方法。除非本文另有说明，否则每个单独值并入在本说明书中，如同其在本文中单独记载一样。除非本文另有说明或者另外与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法均可以以任意合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如/如”)的使用仅旨在更好地说明本发明，并且不对所要求保护的本发明范围构成限制。说明书中的任何语言均不应被解释为表示对本发明的实践必需的任何未要求保护的要素。

在本说明书的全文通篇引用了数篇文献。无论是上文还是下文，本文引用的每篇文献(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指南等)都在此通过引用整体并入。本文中的任何内容都不应被解释为承认本发明无权凭借先前的发明而早于这样的公开内容。

本发明涉及Seprase结合化合物或Seprase结合剂，例如Seprase结合肽或者包含一个或更多个Seprase结合肽的Seprase结合剂。

也被称为成纤维细胞激活蛋白α(FAPα)或170kDa黑素瘤膜结合明胶酶的Seprase是在人中由FAP基因编码的蛋白质。所述蛋白质是整合膜丝氨酸肽酶，其已显示具有明胶酶活性。

Seprase显示作为由两个97kDa的亚基组成的蛋白水解活性的170kDa同二聚体。其为II型整合丝氨酸蛋白酶组的成员，所述组包括在细胞表面发挥其作用机制的二肽基肽酶IV(DPP IV/CD26)和相关的II型跨膜脯氨酰丝氨酸肽酶。Seprase是S9B脯氨酰寡肽酶亚家族的成员。S9B亚家族的另一些成员是DPP IV、DPP8和DPP9。

Seprase与DPP IV最密切相关，并且其共有约50％的氨基酸。DPP IV和Seprase由于其彼此形成复合物以及与其他膜相关分子相互作用的能力而表现出多种功能。

Seprase在肿瘤进展中具有双重功能。已经表明Seprase的蛋白水解活性促进对细胞外基质的细胞侵袭，并且还支持肿瘤生长和增殖。其在上皮癌的反应性间质成纤维细胞、愈合创伤的肉芽组织以及骨和软组织肉瘤的恶性细胞中选择性表达。在超过90％的所有人癌的激活的间质成纤维细胞上观察到Seprase表达。间质成纤维细胞在癌的发生、生长和转移中起重要作用。

根据本发明，术语“Seprase”优选地涉及人Seprase。

优选地，术语“Seprase”涉及包含序列表的SEQ ID NO：1或2的核酸序列或所述核酸序列的变体，优选由其组成的核酸，以及涉及由该核酸编码的蛋白质，优选涉及包含序列表的SEQ ID NO：3或4的氨基酸序列或所述氨基酸序列的变体，优选由其组成的蛋白质。

Seprase的氨基酸序列预测具有以下的II型整合膜蛋白：6个氨基酸的细胞质尾，随后是20个氨基酸的跨膜结构域和734个氨基酸的细胞外结构域。羧基末端包含推定的催化区(约200个氨基酸)，其与非经典丝氨酸蛋白酶二肽基肽酶IV(DPP IV)同源(68％同一性)。保守的丝氨酸蛋白酶基序G-X-S-X-G作为G-W-S-Y-G存在。

Seprase在多种来源的癌症中表达，例如乳腺癌、肺部或肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、结直肠癌、结肠癌、食管癌、头颈癌、胃癌、胆管癌、胰腺癌、肾癌、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、子宫内膜癌或前列腺癌。Seprase是诊断、预防和/或治疗原发性肿瘤和转移的有价值的靶标。

本发明的Seprase结合剂具有与Seprase结合的能力，即与Seprase中存在的表位，优选位于Seprase的细胞外结构域中的表位、特别是Seprase的第27至760位氨基酸结合的能力。在一些具体实施方案中，本发明的Seprase结合剂与Seprase上在DPP IV上不存在的表位结合。

Seprase结合剂优选地与Seprase结合而不与DPP IV结合。优选地，Seprase结合剂是Seprase特异性的。优选地，Seprase结合剂与细胞表面上表达的Seprase结合。在一些具体优选实施方案中，Seprase结合剂与活细胞表面上存在的Seprase的天然表位结合。

术语“表位”是指分子中被结合剂识别的部分(part)或段(portion)。例如，表位是分子上被结合剂识别的离散的三维位点。表位通常由分子(例如氨基酸或糖侧链)的化学活性表面组群组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象和非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，与前者的结合丧失，而与后者的结合不丧失。蛋白质的表位优选地包含所述蛋白质的连续或不连续段，并且长度优选为5至100，优选5至50，更优选8至30，最优选10至25个氨基酸，例如，表位的长度可以优选为8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸。

根据本发明，术语“Seprase结合剂”或“Seprase结合化合物”包括具有与Seprase的结合能力的任何化合物(包括分子的复合物)。优选地，这样的结合剂是或包含至少一个本发明的Seprase结合肽。如果Seprase结合剂包含至少两个本发明的Seprase结合肽(其可以相同或不同)，则这些肽可以共价或非共价缔合(即结合)。Seprase结合剂可以包含与任何其他化合物或部分(例如标记或治疗效应物部分)共价或非共价缔合的一个或更多个Seprase结合肽。

根据本发明，如果在标准测定中试剂对预定靶标(例如Seprase)具有显著亲和力并且与所述预定靶标结合，则其能够与所述预定靶标结合。通常通过平衡解离常数(K_D)测量“亲和力”或“结合亲和力”。优选地，术语“显著亲和力”是指以下述解离常数(K_D)与预定靶标结合：10^-5M或更小、10^-6M或更小、10^-7M或更小、10^-8M或更小、10^-9M或更小、10^-10M或更小、10^-11M或更小、或者10^-12M或更小。

如果在标准测定中试剂对靶标不具有显著亲和力并且不与所述靶标显著地结合、特别是不可检测地结合，则其(基本上)不能够与所述靶标结合。优选地，如果以高至2，优选10，更优选20，特别是50或100μg/ml或更高的浓度存在，则试剂不与所述靶标可检测地结合。优选地，如果试剂与靶标结合的K_D是与该试剂能够结合的预定靶标结合的K_D的至少10倍、10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍或10⁶倍高，则其对所述靶标不具有显著亲和力。例如，如果试剂与该试剂能够结合的靶标结合的K_D为10^-7M，则与该试剂对其不具有显著亲和力的靶标结合的K_D为至少10^-6M、10^-5M、10^-4M、10^-3M、10^-2M或10^-1M。

根据本发明，术语“结合”优选地涉及特异性结合。

“特异性结合”意指与另一靶标的结合相比，试剂与特异性靶标更强地结合。如果试剂与第一靶标结合的解离常数(K_D)小于对第二靶标的解离常数，则与第二靶标相比其与第一靶标更强地结合。优选地，与试剂不特异性结合的靶标的解离常数(K_D)相比，试剂特异性结合的靶标的解离常数(K_D)为超过10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍、10⁹倍或10¹⁰倍低。

优选地，如果试剂能够与预定靶标结合而其不能够与其他靶标结合，即在标准测定中对其他靶标不具有显著亲和力并且不与其他靶标显著地结合，则其是所述预定靶标特异性的。根据本发明，如果试剂能够与Seprase结合但是(基本上)不能够与其他靶标(例如DPP IV)结合，则其是Seprase特异性的。优选地，如果对这样的其他靶标的亲和力和结合不显著超过对Seprase不相关蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、人血清白蛋白(HSA)或非Seprase跨膜蛋白例如MHC分子或转铁蛋白受体或者任何其他指定的多肽)的亲和力或结合，则其是Seprase特异性的。优选地，如果试剂与预定靶标结合的K_D是与其非特异性靶标结合的K_D的至少10²倍、10³倍、10⁴倍、10⁵倍、10⁶倍、10⁷倍、10⁸倍、10⁹倍或10¹⁰倍低，则试剂是所述靶标特异性的。

试剂与靶标的结合可以使用任何合适的方法经实验确定；参见例如Berzofsky等，″Antibody-Antigen Interactions″在Fundamental Immunology中，Paul，W.E.，编辑，Raven Press New York，N Y(1984)，Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman and CompanyNew York，N Y(1992)，以及其中描述的方法。亲和力可以使用常规技术容易地确定，例如通过平衡透析；通过使用制造商概述的一般操作来使用表面等离子体共振分析(例如Biacore)；通过使用经放射性标记的靶抗原的放射免疫测定；或通过技术人员已知的其他方法。亲和力数据可以例如通过Scatchard等Ann N.Y.Acad.ScL，51：660(1949)的方法分析。如果在不同条件(例如盐浓度、pH)下测量，特定相互作用的测量的亲和力可变化。因此，亲和力和其他结合参数(例如，K_D、IC₅₀)的测量优选用结合剂和靶标的标准化溶液和标准化缓冲液进行。

根据本发明，术语“Seprase阳性癌症”或类似术语意指涉及Seprase或与Seprase相关的癌症，特别是涉及表达Seprase的细胞，优选在所述细胞的表面上表达Seprase的癌症。

根据本发明，如果Seprase在空间上与癌症相联系，特别地如果Seprase存在于所述癌症中，则所述癌症涉及Seprase或与Seprase相关。优选地，涉及Seprase或与Seprase相关的癌症包含表达Seprase的细胞，优选在所述细胞的表面上表达Seprase。所述细胞可以是癌细胞或与癌症相关的细胞，例如成纤维细胞，特别是癌症相关成纤维细胞。

“细胞表面”根据其在本领域的正常含义使用，并且因此包括可被蛋白质和其他分子接近以结合的细胞外部。

如果Seprase位于细胞表面，并且可被添加到所述细胞的Seprase特异性剂接近以结合，则Seprase在所述细胞的表面上表达。

在本发明的上下文中，术语“细胞外结构域”是指分子(例如蛋白质)的一段，其朝向细胞的细胞外空间，并且优选地可从所述细胞的外部接近，例如被位于所述细胞外部的结合剂(例如抗体)接近。优选地，该术语是指一个或更多个细胞外环或结构域或者其片段。

术语“部分”或“片段”在本文中可互换使用，并且是指连续元件。蛋白质序列的部分或片段优选地包含蛋白质序列的至少6个，特别是至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个、或至少100个连续氨基酸。

术语“段”是指连续和/或不连续元件。蛋白质序列的段优选包含蛋白质序列的至少6个，特别是至少8个、至少12个、至少15个、至少20个、至少30个、至少50个、或至少100个连续和/或不连续的氨基酸。

根据本发明，如果表达水平低于检测界限和/或如果表达水平太低而不能被添加到细胞的Seprase特异性结合剂结合，则Sephase在细胞中(基本上)不表达。

根据本发明，如果表达水平高于检测界限和/或如果表达水平足够高以允许被添加到细胞的Seprase特异性结合剂结合，则Sephase在细胞中表达。优选地，在细胞中表达的Seprase在所述细胞的表面上表达或暴露。

胱氨酸结是包含至少三个二硫桥(由半胱氨酸分子对形成)的蛋白质结构基序。其包含由两个二硫键形成的嵌入环及其由第三二硫键穿过的连接主链段。该结构优选地与β-片结构相关联。包含胱氨酸结的肽的长度优选为25至60个，优选25至50个或25至40个氨基酸残基。

胱氨酸结存在于许多物种的许多肽或蛋白质中，并且提供相当大的结构稳定性。有三种类型的胱氨酸结，其二硫键的拓扑结构不同：生长因子胱氨酸结(Growth FactorCystine Knot，GFCK)、抑制剂胱氨酸结(ICK)和环状胱氨酸结或环肽(cyclotide)。

抑制剂胱氨酸结(ICK)或knottin是含有三个二硫桥的蛋白质结构基序。与其之间的多肽部分一起，两个二硫化物(分别连接第一和第四半胱氨酸以及第二和第五半胱氨酸)形成环，第三二硫键(连接序列中的第三和第六半胱氨酸)穿过该环，形成结。该基序在无脊椎动物的毒素，例如来自蜘蛛和软体动物的那些中常见。在植物中发现的一些抑制剂蛋白中也发现了这一基序。

因此，根据本发明，ICK基序涉及两个半胱氨酸内主链段及其连接二硫键CysI-CysIV和CysII-CysV，其形成被第三二硫键CysIII-CysVI穿透的环。

ICK基序类似于环状胱氨酸结或环肽，但缺乏后者家族中存在的多肽主链的环化。生长因子胱氨酸结(GFCK)共有所述基序，但是其拓扑结构使得第一和第四半胱氨酸之间的键穿过环(分别在第二和第五半胱氨酸与第三和第六半胱氨酸之间形成)。

环肽分为两个主要的结构亚家族。两者中较少见的Moebius环肽在环5中包含诱导局部180°主链扭曲的顺式脯氨酸，而手链环肽(bracelet cyclotide)则不包含。胰蛋白酶抑制剂环肽基于序列变异和天然活性在其自身的家族中分类。与其与他环肽相比，胰蛋白酶抑制剂环肽与来自南瓜植物的非环状胰蛋白酶抑制剂家族(也称为knottin或抑制剂胱氨酸结)具有更高同源性。

MCoTI-I和MCoTI-II是来自刺状突起葫芦类植物(spinal gourd)木鳖子的种子的天然多肽。这些多肽是胰蛋白酶样蛋白酶的抑制剂，并且包含连接氨基末端和羧基末端的另外的环和三个保守二硫键的结状排列。胱氨酸结由三个分子内二硫键定义，其中线性肽序列的CysICysIV和CysII-CysV形成被第三二硫键CysIII-CysVI穿透的环。这种排布提供了表现出极好热和蛋白水解稳定性的明确且非常稳定的支架。由于结构相似性和常见的生物活性，即抑制胰蛋白酶家族的蛋白酶，MCoTI-I和MCoTI-II已被归类成小蛋白酶抑制剂的南瓜抑制剂胱氨酸结(ICK)家族。该家族的成员是开链分子，形成通过三个分子内二硫键保持在一起以产生胱氨酸结框架的小的三链β-片和短3₁₀螺旋。MCoTI-I和MCoTI-II是环状南瓜抑制剂大家族的仅有已知成员。已经合成了缺少环化环的MCoTI-II的开链变体。

根据本发明，本文所述的肽可以作为分离的肽或者作为另一肽或多肽的一部分通过本领域公知的化学合成方法合成产生。或者，可以在生产肽的微生物中产生肽，然后分离，并且如果需要的话进一步纯化。因此，可以在以下中产生肽：微生物，例如细菌、酵母或真菌；真核生物细胞，例如哺乳动物或昆虫的细胞；或者重组病毒载体，例如腺病毒、痘病毒、疱疹病毒、塞姆利基森林病毒(Simliki forest virus)、杆状病毒、噬菌体、辛德毕斯病毒(sindbis virus)或仙台病毒。用于产生肽的合适细菌包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或能够表达肽的任何其他细菌。用于表达肽的合适的酵母类型包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、假丝酵母(Candida)或能够表达肽的任何其他酵母。使用上述细菌、重组病毒载体、真核生物细胞产生肽的方法是本领域公知的。

为了产生肽，编码肽的核酸优选在质粒中，并且核酸与实现在微生物中表达肽的启动子有效连接。合适的启动子包括但不限于T7噬菌体启动子、T3噬菌体启动子、β-半乳糖苷酶启动子和Sp6噬菌体启动子。用于分离和纯化肽的方法是本领域公知的，并且包括例如凝胶过滤、亲和色谱、离子交换色谱或离心的方法。

本发明的肽本身或作为融合肽的一部分可以与异源肽或蛋白质缀合。这样的异源蛋白质包括但不限于载体蛋白(例如牛血清白蛋白(BSA))和报道酶，其包括但不限于辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。此外，肽或包含肽的融合肽可以与包括但不限于荧光素或R-藻红蛋白的荧光报道分子化学缀合。用于将载体蛋白、酶和荧光报道分子与肽和融合肽缀合的方法是本领域公知的。

为了有利于肽的分离，可以制备融合多肽，其中肽与异源标签(例如异源多肽或多组氨酸，优选6个组氨酸残基)翻译融合(共价连接)，这允许简化融合多肽的回收，例如其通过亲和色谱或金属亲和色谱，优选镍亲和色谱分离。在某些情况下，可需要在纯化后除去标签。因此，还预期融合多肽在肽和异源标签之间的连接处包含切割位点。切割位点由氨基酸序列组成，其被对该位点的所述氨基酸序列具有特异性的酶切割。

本文所述的Seprase结合剂可用于测定Seprase或Seprase抗体的存在或量的测定。这样的测定可以以包括但不限于免疫检测的多种方式进行，并且包括ELISA(特别是肽ELISA)、竞争性结合测定、RIA等。本发明的方法允许Seprase或Seprase抗体的定量和/或定性评价，例如绝对和/或相对评价。

通常，使用酶联免疫吸附测定(ELISA)实施方案进行测定。

本文使用的术语“酶联免疫吸附测定或ELISA”涉及用于以多孔板形式(通常每板96孔)定量或半定量确定样品(例如血浆、血清或细胞/组织提取物)的蛋白质浓度的方法。概括地，溶液中的蛋白质被吸附到ELISA板上。可以使用目的蛋白特异性的抗体来探测板。通过优化封闭和洗涤方法(对于IHC)来最小化背景，并且通过阳性和阴性对照的存在来确保特异性。检测方法通常是基于比色或化学发光。

可以提供包含多个孔的微量滴定板，其中第一孔或孔系列含有固定化在其表面上的针对Seprase的单克隆抗体。可将样品添加到含有结合的单克隆抗体的孔中。样品中的Seprase与单克隆抗体结合。将ELISA孵育足以形成抗体复合物的时间。可以进一步添加本发明的肽。所述肽可以是融合多肽的一部分。然后，洗涤孔以除去任何未结合的材料。然后，可以将孔用与融合多肽结合的经标记抗体或与报道分子缀合的抗体孵育，以形成可以检测的复合物。来自标记或报道子的可检测信号指示样品含有Seprase，而不存在信号可指示样品不包含Seprase。当融合多肽包含标记或报道分子(例如报道酶，例如碱性磷酸酶)时，可以直接检测抗体复合物而不需要经标记的抗体。

或者，可以提供包含多个孔的微量滴定板，其中第一孔或孔系列含有固定化在其表面上的可以与载体蛋白缀合的本发明肽或融合多肽。可将样品添加到含有结合的肽的孔中。将样品中的Seprase和结合于孔表面的肽孵育足以形成复合物的时间。然后，洗涤孔以除去任何未结合的材料。通过将孔用与Seprase结合的经标记抗体或与报道分子缀合的抗体孵育以形成可检测的复合物来确定与孔中固定化肽结合的Seprase的量。来自报道子的可检测信号指示样品含有Seprase，而不存在信号指示样品不包含Seprase。信号的强度可以提供对样品中Seprase的浓度的评估。

根据本发明，待测定的Seprase可以在细胞表面上表达。

本发明的肽也可用在用于检测针对Seprase的抗体的存在的方法中。使这些方法实施的合适免疫测定的设计可作出大量变化，并且这些免疫测定中多种是本领域已知的。合适的免疫测定方案可以基于例如竞争或直接反应或夹心型测定。所使用的免疫测定方案也可以例如使用固体支持物，或者可以通过免疫沉淀。测定可以涉及使用经标记的肽，并且标记可以是例如荧光、化学发光、放射性或染料分子。具体的优选测定是酶标记和介导的免疫测定，例如ELISA测定。

因此，肽也可以在例如ELISA测定的测定中用于确定样品中针对Seprase的抗体。为此，可以用肽包被ELISA板的孔。可以将Seprase和结合至孔表面的肽孵育足以形成复合物的时间。随后，可以添加样品(例如血浆)，并且可以用针对一抗的经标记二抗进行Seprase特异性抗体(一抗)的检测。

当用作如本文所述的测定试剂时，本发明的肽可以与标记缀合。

根据本发明，标记是可以容易地检测其存在的任何实体。优选地，标记是直接标记。直接标记是在其天然状态下对肉眼或者借助于滤光器和/或施加的刺激(例如UV光)以促进荧光而容易可见的实体。实例包括放射性、化学发光、电活性(如氧化还原标记)和荧光化合物。例如染料溶胶、金属溶胶(例如金)和着色胶乳颗粒的直接颗粒标记也是非常合适的，并且与荧光化合物一起是优选的。在这些选择中，着色胶乳颗粒和荧光化合物是最优选的。将标记浓缩在小区域或体积应产生易于检测的信号，例如，强烈着色区域。还可以使用间接标记，例如如碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶的酶，但是这些通常需要添加一种或更多种显影试剂(例如底物)，之后才可检测到可见信号。

根据本发明，标记可以用于：(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记相互作用以改变由第一或第二标记提供的可检测信号，例如FRET(荧光共振能量转移，FluorescenceResonance Energy Transfer)；(iii)通过电荷、疏水性、形状或其他物理参数来影响迁移率，例如电泳迁移率，或者(iv)提供捕获部分，例如亲和力、抗体/抗原或离子复合。适合作为标记的是以下结构，例如荧光标记；发光标记；生色团标记；放射性同位素标记；同位素标记，优选稳定同位素标记；同量异位素标记；酶标记；颗粒标记，特别是金属颗粒标记、磁性颗粒标记、聚合物颗粒标记；小有机分子，例如生物素；受体的配体或结合分子，例如细胞黏附蛋白或凝集素；包含可以通过使用结合剂检测的核酸和/或氨基酸残基的标记序列；等等。标记以非限制性方式包含硫酸钡、碘酸胺酸、碘番酸、碘泊酸钙、泛影酸钠、泛影酸葡甲胺、甲泛葡胺、酪泮酸钠和放射性诊断剂，包括正电子发射体(例如氟-18和碳-11)、γ-发射体(例如碘-123、锝-99m、碘-131和铟-111)、用于核磁共振的核素(例如氟和钆)。在一些优选实施方案中，标记包含放射性核素，例如镥-177或镓-68，其可以与结合至Seprase结合剂的配体如DOTA(1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸)络合。

标记与本发明肽的缀合可以通过共价或非共价(包括疏水性)结合或者通过吸附实现。用于这种缀合的技术在本领域中是常见的，并且可以容易地适用于所使用的特定试剂。

本文使用的术语“样品”包括可以从患者分离并用于分析目的的任何生物样品。所述样品可以是体液样品、组织样品或细胞样品。例如，本发明涵盖的样品是组织(例如切片或外植体)样品、单细胞样品、细胞集落样品、细胞培养物样品、血液(例如全血或血液级分，例如血细胞级分、血清或血浆)样品、尿样品或来自其他外周来源的样品。所述样品可以混合或合并，例如，样品可以是血液样品和尿样品的混合物。所述样品可以通过从患者取出体液、细胞、细胞集落、外植体或切片来提供，但也可以通过使用先前分离的样品来提供。例如，可以通过常规活检技术从患者取出组织样品，或者可以通过常规采血技术从患者取出血液样品。可以在开始治疗性治疗之前、在治疗性治疗期间和/或在治疗性治疗之后从患者获得样品，例如组织样品或血液样品。

在一个实施方案中，样品是体液样品。本文使用的术语“体液样品”是指来自患者机体的任何液体样品。所述体液样品可以是血液样品、尿样品、痰样品、母乳样品、脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)样品、耳垢(耳蜡)样品、内淋巴样品、外淋巴样品、胃液样品、黏液样品、腹膜液样品、胸膜液样品、唾液样品、皮脂(皮肤油状物)样品、精液样品、汗液样品、泪液样品、阴道分泌物样品或呕吐物样品，包括其组分或级分。所述体液样品可以混合或合并。因此，体液样品可以是血液和尿样品的混合物或者血液和脑脊液样品的混合物。所述体液样品可以通过从患者取出体液来提供，但也可以通过使用先前分离的体液样品材料来提供。在一个优选实施方案中，样品是全血样品或血液级分样品，例如血细胞级分、血清或血浆样品。

在一个实施方案中，生物样品是从怀疑患有疾病(例如癌症)的组织获得的样品。在一个实施方案中，生物样品是肿瘤样品，例如，从肿瘤获得并且包含肿瘤细胞的样品。根据本发明，术语“生物样品”还包括经处理的生物样品，例如生物样品的级分或分离物，例如，核酸和肽/蛋白质分离物。

根据本发明，可以使用“参考”(例如参考样品或参考生物体)来关联和比较在本发明方法中由测试样品或测试生物体(即患者)获得的结果。通常，参考生物体是键康的生物体，特别是不患有肿瘤疾病的生物体。

可以通过测量足够大数量的参考来凭经验由参考确定“参考值”或“参考水平”。优选地，参考值通过测量至少2个，优选至少3个，优选至少5个，优选至少8个，优选至少12个，优选至少20个，优选至少30个，优选至少50个，或优选至少100个参考来确定。

本文使用的“减少”、“降低”或“抑制”意指例如细胞表达水平或增殖水平的水平的以下整体降低或造成以下整体降低的能力：优选5％或更大、10％或更大、20％或更大，更优选50％或更大，最优选75％或更大。如果在参考样品中可检测但是在测试样品中不存在或不可检测，则与参考样品相比，测试样品(例如生物样品)中物质的量也降低。

例如“增加”或“提高”的术语优选地涉及增加或提高约10％，优选至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，更优选至少50％，甚至更优选至少80％，最优选至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或甚至更高。如果在测试样品中可检测但是在参考样品中不存在或不可检测，则与参考样品相比，测试样品(例如生物样品)中物质的量也增加。

Seprase结合剂(例如本发明的肽)可以结合于固体支持物，例如免疫测定孔或漫棒(dipstick)的表面，和/或与合适的试剂、对照、说明书等一起在合适的容器中包装成试剂盒。

因此，本发明还提供了试剂盒，其包含至少一种本发明的Seprase结合剂。在一个优选实施方案中，试剂盒还包含至少一种另外的试剂，例如用于进行免疫测定的一种或更多种合适试剂；对照；或试剂盒的使用说明书。

根据本发明，还提供了测定装置，其包含至少一种本发明的Seprase结合剂。在一个实施方案中，测定装置选自酶联免疫吸附测定装置。

这样的装置可以采取不同的形式，并且其可以根据进行的测定的准确性质而变化。例如，本发明的肽可以包被在固体支持物，通常硝化纤维素或其他疏水性多孔材料上。或者，肽可以包被在合成塑料材料、微量滴定测定板、微阵列芯片、胶乳珠、包含纤维素或合成聚合物材料的过滤器、玻璃或塑料载玻片、漫棒、毛细管填充装置等上。将肽包被到这些表面可以通过本领域已知的方法来实现。蛋白质载体通常用于复合，其中BSA或黏附肽是最优选的。在一个实施方案中，本发明的肽可释放地固定化在固体支持物上。在另一个优选实施方案中，本发明的肽不可释放地固定化在固体支持物上。

应当理解，本文所述的肽可以通过施用编码肽的核酸(例如RNA)和/或通过施用包含编码肽的核酸(例如RNA)的宿主细胞来递送至患者。因此，当向患者施用时，编码肽的核酸可以以裸露形式或在合适的递送载体中(例如以脂质体或病毒颗粒的形式)或在宿主细胞中存在。所提供的核酸可以以持续的方式在延长的时间段内产生肽。待递送于患者的核酸可以通过重组手段产生。如果在核酸不存在于宿主细胞内的情况下向患者施用核酸，则其优选地被患者的细胞摄取以表达由核酸编码的肽。如果在存在于宿主细胞内的同时向患者施用核酸，则其优选地在患者中由宿主细胞表达，以产生由核酸编码的肽。

本文使用的术语“核酸”旨在包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，例如基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生的和化学合成的分子。核酸可以是单链或双链的。RNA包括体外转录的RNA(in vitro transcribed RNA，IVT RNA)或合成RNA。

本文使用的术语“RNA”意指包含核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”意指在β-D-核糖-呋喃糖部分的2′-位具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA；单链RNA；分离的RNA，例如部分纯化的RNA、基本上纯的RNA；合成RNA；重组产生的RNA；以及通过添加、缺失、置换和/或改变一个或更多个核苷酸而不同于天然存在RNA的经改变RNA。这样的改变可以包括例如向RNA的末端或在内部，例如在RNA的一个或更多个核苷酸处添加非核苷酸材料。RNA分子中的核苷酸还可以包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸。这些经改变的RNA可以称为类似物或天然存在RNA的类似物。

根据本发明，术语“RNA”包括并且优选地涉及“mRNA”，其意指“信使RNA”并且涉及可以使用DNA作为模板产生并编码肽或蛋白质的“转录物”。mRNA通常包含5′非翻译区(5′-UTR)、蛋白质或肽编码区和3′非翻译区(3′-UTR)。在本发明的一个实施方案中，RNA通过体外转录或化学合成获得。优选地，mRNA通过使用DNA模板进行体外转录产生。体外转录方法是技术人员已知的。例如，存在多种可商购获得的体外转录试剂盒。

为了提高根据本发明使用的RNA的表达和/或稳定性，可对其进行修饰，优选不改变表达的肽或蛋白质的序列。

在根据本发明使用的RNA的情况下，术语“修饰”包括在所述RNA中不天然存在的任何RNA修饰。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明使用的RNA不具有未加帽的5′-三磷酸。可通过用磷酸酶处理RNA来实现这种未加帽的5′-三磷酸的除去。

根据本发明的RNA可以具有经修饰的天然存在或合成核糖核苷酸，以提高其稳定性和/或降低细胞毒性。例如，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，5-甲基胞苷部分或完全，优选完全置换胞苷。可替选地或另外地，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，假尿苷部分或完全，优选完全置换尿苷。

在一个实施方案中，术语“修饰”涉及向RNA提供5’-帽或5’-帽类似物。术语“5’-帽”是指见于mRNA分子的5’端的帽结构，并且一般由通过不常见的5’-5’三磷酸连接与mRNA连接的鸟苷核苷酸组成。在一个实施方案中，该鸟苷在7-位被甲基化。术语“常规的5’-帽”是指天然存在的RNA 5’-帽，优选是指7-甲基鸟苷帽(m7G)。在本发明的上下文中，术语“5’-帽”包括类似于RNA帽结构并且被修饰以具有稳定化RNA(如果附着于RNA的话，优选在体内和/或在细胞中)的能力的5’-帽类似物。

向RNA提供5’-帽或5’-帽类似物可以通过在所述5’-帽或5’-帽类似物存在下体外转录DNA模板来实现，其中所述5’-帽共转录并入产生的RNA链中，或者可以例如通过体外转录产生RNA并且可以在转录后使用加帽酶(例如痘苗病毒的加帽酶)使5’-帽与RNA连接。

RNA可以包含另外的修饰。例如，本发明中使用的RNA的另外修饰可以为延伸或截短天然存在的聚(A)尾或者改变5’-或3’-非翻译区(UTR)，例如引入与所述RNA的编码区不相关的UTR，例如插入来自于珠蛋白基因的3’-UTR的一个或更多个，优选两个拷贝，所述珠蛋白基因例如α2-珠蛋白、α1-珠蛋白、β-珠蛋白，优选β-珠蛋白，更优选人β-珠蛋白。

在本发明的上下文中，术语“转录”涉及将DNA序列中的遗传密码转录成RNA的过程。随后，RNA可以翻译成蛋白质。根据本发明，术语“转录”包括“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及其中在无细胞系统中，优选使用合适的细胞提取物在体外合成RNA、特别是mRNA的过程。优选地，克隆载体用于产生转录物。这些克隆载体通常被称为转录载体，并且根据本发明包括在术语“载体”内。

根据本发明，术语“翻译”涉及通过其信使RNA的链指导组装氨基酸序列以产生肽或蛋白质的在细胞的核糖体中的过程。

根据本发明，术语“表达”以其最一般含义使用并且包括产生RNA和/或肽或蛋白质，例如，通过转录和/或翻译。关于RNA，术语“表达”或“翻译”特别地涉及产生肽或蛋白质。其还包括核酸的部分表达。此外，表达可以是瞬时的或稳定的。根据本发明，术语表达还包括“异常表达”或“不正常表达”。

根据本发明，“异常表达”或“不正常表达”意指与参考，例如未患与某种蛋白质(例如Seprase)的异常或不正常表达相关的疾病的对象的状态相比，表达改变，优选表达提高。表达提高是指提高至少10％，特别是至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或更多。在一个实施方案中，表达仅存在于患病组织中，同时健康组织中的表达受到抑制。

术语“特异性表达”是指蛋白质基本上仅在特定组织或器官中表达。例如，在胃黏膜中特异性表达的蛋白质意味着所述蛋白质主要在胃黏膜中表达，并且不在其他组织中表达，或不在其他组织或器官类型中表达至显著程度。因此，仅在胃黏膜的细胞中表达而在任何其他组织(例如睾丸)中以显著更低程度表达的蛋白质在胃黏膜的细胞中特异性表达。

根据本发明，术语“编码...的核酸”意指如果存在于合适的环境中，优选在细胞内，核酸可以被表达以产生其编码的蛋白质或肽。

根据本发明描述的核酸优选地已经分离。根据本发明，术语“分离的核酸”意指核酸是(i)在体外扩增的，例如通过聚合酶链反应(PCR)体外扩增的；(ii)通过克隆重组产生的；(iii)经纯化的，例如通过切割和凝胶电泳分级纯化的；或(iv)合成的，例如通过化学合成而合成的。分离的核酸是可用于通过重组DNA技术操作的核酸。

根据本发明，关于例如核酸和氨基酸序列的术语“变体”包括任何变体，特别是突变体、剪接变体、构象体、同种型、等位基因变体、物种变体和物种同源物，特别是天然存在的那些。等位基因变体涉及基因的正常序列的改变，其意义通常不清楚。完整的基因测序通常鉴定给定基因的许多等位基因变体。物种同源物是与给定核酸或氨基酸序列具有不同的来源物种的核酸或氨基酸序列。

关于核酸分子，术语“变体”包括简并核酸序列，其中根据本发明，简并核酸是由于遗传密码的简并性而与参考核酸在密码子序列中不同的核酸。

此外，根据本发明，特定核酸序列的“变体”包括包含单个或多个，例如至少2个、至少4个、或至少6个，并且优选地多至3个、多至4个、多至5个、多至6个、多至10个、多至15个、或多至20个核苷酸置换换、缺失和/或添加的核酸序列。

优选地，给定核酸序列与为所述给定核酸序列的变体的核酸序列之间的同一性程度为至少约60％、65％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。同一性程度优选地给定为参考核酸序列的整个长度的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少为约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的区域。例如，如果参考核酸序列由200个核苷酸组成，则相似性或同一性程度优选地给予至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个核苷酸，优选连续核苷酸。在一些优选实施方案中，同一性程度给予参考核酸序列的整个长度。

两个核酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的核苷酸的百分比。

术语“同一性百分比”旨在表示在最佳对齐后获得的待比较的两个序列之间相同的核苷酸的百分比，该百分比是纯统计学的，两个序列之间的差异是随机分布的并且在其整个长度上。两个核苷酸序列之间的序列比较常规地通过在将其最佳对齐后比较这些序列来进行，所述比较通过片段或“比较窗口”来进行，以便鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。用于比较的序列的最佳对齐除手动外还可如下产生：通过Smith和Waterman，1981，Ads App.Math.2，482的局部同源性算法；通过Neddleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48，443的局部同源性算法；通过Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl Acad.Sci.USA 85，2444的相似性检索方法；或者通过使用这些算法的计算机程序(GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，在Wisconsin Genetics Software Package，Genetics ComputerGroup，575Science Drive，Madison，Wis中)。

同一性百分比如下计算：确定两个比较序列之间的相同位置的数目，用该数目除以比较的位置的数目，并将获得的结果乘以100，以获得这两个序列之间的同一性百分比。

优选地，给定核酸序列和为所述给定核酸序列的变体的核酸序列能够杂交。

如果两个序列彼此互补，则核酸与另一核酸“能够杂交”或“杂交”。如果两个序列能够彼此形成稳定的双链体，则核酸与另一核酸“互补”。根据本发明，杂交优选地在允许多核苷酸之间特异性杂交的条件(严格条件)下进行。严格条件描述于例如MolecularCloning：A Laboratory Manual，J.Sambrook等，编辑，第2版，Cold Spring HarborLaboratory press，Cold Spring Harbor，New York，1989；或者Current Protocols inMolecular Biology，F.M.Ausubel等，编辑，John Wiley&Sons，Inc.，New York中，并且是指例如在杂交缓冲液(3.5×SSC，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，2.5mM NaH₂PO₄(pH 7)，0.5％SDS，2mM EDTA)中在65℃下杂交。SSC为0.15M氯化钠/0.15M柠檬酸钠，pH 7。在杂交后，将转移了DNA的膜例如在室温下在2×SSC中洗涤，然后在高至68℃的温度下在0.1至0.5×SSC/0.1×SDS中洗涤。

互补性百分比表示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如，Watson-Crick碱基配对)的连续残基的百分比(例如，10个中的5、6、7、8、9、10个为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补性)。“完美互补”或“完全互补”意指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数目的连续残基氢键键合。优选地，根据本发明的互补性程度为至少70％，优选至少75％，优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，或者最优选至少95％、96％、97％、98％或99％。最优选地，根据本发明的互补性程度为100％。

术语“衍生物”包括在核苷酸碱基上、在糖上或在磷酸上对核酸的任何化学衍生化。术语“衍生物”还包括含有不天然存在的核苷酸和核苷酸类似物的核酸。优选地，核酸的衍生化提高其稳定性。

根据本发明，核酸可以单独存在或与其他核酸，特别是异源核酸组合存在。优选地，编码肽或蛋白质的核酸表达所述肽或蛋白质。在一些优选实施方案中，核酸与表达控制序列或调节序列功能性连接，所述表达控制序列或调节序列可以与所述核酸同源或异源。如果编码序列和调节序列以所述编码序列的表达或转录受所述调节序列的控制或受所述调节序列的影响的方式彼此共价连接，则编码序列和调节序列彼此“功能性”连接。如果编码序列待翻译成功能蛋白，则利用与所述编码序列功能性连接的调节序列，所述调节序列的诱导导致所述编码序列的转录，而不造成编码序列的移码或者所述编码序列不能翻译成期望的蛋白质或肽。

根据本发明，术语“表达控制序列”或“调节序列”包含启动子、增强子和调节基因表达的其他控制元件。在本发明的一些具体实施方案中，表达控制序列可以被调节。调节序列的确切结构可以根据物种或细胞类型而变化，但通常包含分别参与转录和翻译启动的5′非转录序列和5′非翻译序列，例如TATA盒、封端序列、CAAT序列等。更具体地，5′非转录调节序列包含启动子区，其包含用于功能性连接基因的转录控制的启动子序列。调节序列还可以包含增强子序列或上游激活子序列。

根据本发明，核酸还可以与编码控制由所述核酸编码的蛋白质或肽从宿主细胞分泌的肽的另一核酸组合存在。根据本发明，核酸还可以与编码促使所编码的蛋白质或肽锚定在宿主细胞的细胞膜上或区室化到所述细胞的特定细胞器中的肽的另一核酸组合存在。类似地，与代表报道基因或任何“标签”的核酸的组合是可能的。

在一些优选实施方案中，根据本发明的重组核酸分子是载体，其适当时具有控制核酸的表达的启动子。术语“载体”在本文中以其最一般的含义使用，并且包括用于核酸的任何中间媒介物，其能够将所述核酸例如引入到原核和/或真核细胞中并且适当时整合到基因组中。这种载体优选在细胞中复制和/或表达。中间媒介物可适合例如用于电穿孔、微粒轰击、脂质体施用、借助于农杆菌转移或者通过DNA或RNA病毒插入。载体包含质粒、噬粒、噬菌体或病毒基因组。

根据本发明的核酸可用于转染宿主细胞。这里的核酸意指重组DNA和RNA二者。重组RNA可以通过DNA模板的体外转录来制备。此外，在应用前，其可以通过稳定化序列、加帽和多聚腺苷酸化来修饰。

本发明上下文中的术语“重组的”意指“通过遗传工程制备的”。优选地，本发明上下文中的“重组物体”如重组核酸不是天然存在的。

本文使用的术语“天然存在的”是指物体可以在自然界中发现的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可以从天然来源中分离且没有在实验室中被人故意修饰的肽或核酸是天然存在的。

术语“细胞”或“宿主细胞”优选涉及完整细胞，即具有完整膜的未释放其正常细胞内组分如酶、细胞器或遗传物质的细胞。完整细胞优选是活细胞，即能够执行其正常代谢功能的活细胞。优选地，根据本发明，所述术语涉及可用外源核酸转染的任何细胞。优选地，当用外源核酸转染时，所述细胞可以表达该核酸。

根据本发明，术语“宿主细胞”包含原核(例如大肠杆菌(E.coli))或真核细胞(例如树突细胞、B细胞、CHO细胞、COS细胞、K562细胞、酵母细胞和昆虫细胞)。特别优选哺乳动物细胞，例如来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊、灵长类的细胞。细胞可以来源于多种组织类型并且包含原代细胞和细胞系。具体实例包括角质形成细胞、外周血白细胞、骨髓干细胞和胚胎干细胞。核酸可以以单拷贝或者两个或更多个拷贝的形式存在于宿主细胞中，并且在一个实施方案中，在宿主细胞中表达。

术语“肽”包含寡肽和多肽，并且是指包含通过肽键共价连接的2个或更多个，优选3个或更多个，优选4个或更多个，优选6个或更多个，优选8个或更多个，优选10个或更多个，优选13个或更多个，优选16个或更多个，优选21个或更多个，并且多至优选8、10、20、30、40或50个，特别是100个氨基酸的物质。术语“蛋白质”是指大肽，优选具有多于100个氨基酸残基的肽，但通常术语“肽”和“蛋白质”是同义词并且在本文中可互换使用。

根据本发明，肽可以包含天然氨基酸和非天然氨基酸。在一个实施方案中，肽仅包含天然氨基酸。

根据本发明，术语“非天然氨基酸”是指具有与20种天然氨基酸种类不同的结构的氨基酸。由于非天然氨基酸具有与天然氨基酸类似的结构，因此非天然氨基酸可以归类为给定天然氨基酸的衍生物或类似物。

根据本发明，术语“环肽/环状肽”涉及形成环的肽或多肽链。肽可以以四种不同的方式环化：头对尾(C末端对N-末端)、头对侧链、侧链对尾或侧链对侧链。根据本发明特别优选的是包含两个或更多个含巯基的残基(例如半胱氨酸)的肽，所述残基可以形成分子内二硫桥，得到环肽。

根据本发明，肽可以与一种或更多种其他化合物共价或非共价结合。这样的化合物包括肽化合物(例如肽和蛋白质)和非肽化合物(例如聚乙二醇(PEG))。

在一个实施方案中，本文所述的肽是PEG化的。PEG化是将聚乙二醇(PEG)聚合物链共价连接到另一分子如肽或蛋白质的过程。PEG的共价连接可从宿主的免疫系统中“掩盖”试剂(降低的免疫原性和抗原性)，并且增加试剂的流体动力学尺寸(在溶液中的尺寸)，这通过降低肾清除率来延长其循环时间。PEG化也可以为疏水性药物和蛋白质提供水溶性。

优选地，根据本发明描述的蛋白质和肽是已分离的。术语“分离的蛋白质”或“分离的肽”意指蛋白质或肽已经从其天然环境中分离。分离的蛋白质或肽可以处于基本上纯化的状态。术语“基本上纯化的”意指蛋白质或肽基本上不含在自然界中或体内与其关联的其他物质。这样的蛋白质和肽可以用于例如免疫学或诊断测定或者作为治疗剂。根据本发明描述的蛋白质和肽可以分离自生物样品如组织或细胞匀浆，并且也可以在多种原核或真核表达系统中重组表达。

术语“抗体”包括包含通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白，以及包含这样的糖蛋白的抗原结合部分的任何分子。术语“抗体”包括单克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、包含抗体的结合片段或衍生物的分子(包括但不限于单链抗体(例如scFv)和抗原结合抗体片段(例如Fab和Fab′片段))，并且还包括所有重组形式的抗体，例如在原核生物中表达的抗体、非糖基化抗体、以及本文所述的任何抗原结合抗体片段和衍生物。每个重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区构成。每个轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区构成。VH和VL区域可以进一步细分为被称为互补性决定区(CDR)的高变区，其散布有被称为框架区(FR)的更保守的区域。每个VH和VL由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(例如效应细胞))和经典补体系统的第一组分(Clq))的结合。

本文中给出的关于特定氨基酸序列(例如序列表中示出的那些)的教导应解释为还涉及所述特定序列的变体，其产生与所述特定序列在功能上等同的序列，例如显示出与特定氨基酸序列的特性相同或相似的特性的氨基酸序列。一个重要特性是保留与靶标(例如Seprase)的结合。

出于本发明的目的，氨基酸序列的“变体”包含氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和/或氨基酸替换变体。在蛋白质的N-末端和/或C-末端包含缺失的氨基酸缺失变体也被称为N-末端和/或C-末端截短变体。

氨基酸插入变体包含在特定氨基酸序列中插入单个或者两个或更多个氨基酸。在氨基酸序列变体具有插入的情况下，将一个或更多个氨基酸残基插入氨基酸序列的特定位点中，但是采用适当筛选所得产物的随机插入也是可行的。

氨基酸添加变体包含一个或更多个氨基酸，例如1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸的氨基-和/或羧基-末端融合体。

氨基酸缺失变体的特征在于从序列上除去一个或更多个氨基酸，例如除去1、2、3、5、10、20、30、50或更多个氨基酸。缺失可以位于肽或蛋白质的任意位置。

氨基酸替换变体的特征在于序列中的至少一个残基被除去并且在其位置插入另一个残基。优选的是在氨基酸序列中在同源蛋白质或肽之间不保守的位置进行修饰和/或用具有类似特性的其他氨基酸置换氨基酸。优选地，蛋白质变体的氨基酸变化是保守氨基酸变化，即，类似带电荷或不带电荷的氨基酸的替换。保守氨基酸变化涉及其侧链相关的氨基酸的家族中一者的替换。通常，天然存在的氨基酸分为以下四个家族：酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)、碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、非极性氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)和不带电荷的极性氨基酸(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。有时，苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸共同地分类为芳族氨基酸。

优选地，给定氨基酸序列与为所述给定氨基酸序列的变体的氨基酸序列之间的相似性，优选同一性程度为至少约60％、65％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。优选地，相似性或同一性程度给予为参考氨基酸序列全长的至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或约100％的氨基酸区域。例如，如果参考氨基酸序列由200个氨基酸组成，则优选地相似性或同一性程度给予至少约20个、至少约40个、至少约60个、至少约80个、至少约100个、至少约120个、至少约140个、至少约160个、至少约180个或约200个氨基酸，优选连续氨基酸。在一些优选实施方案中，相似性或同一性程度给予参考氨基酸序列的全长。用于确定序列相似性，优选序列同一性的比对可以用本领域已知的工具，优选地使用最佳序列比对，例如使用Align，采用标准设置(优选地EMBOSS：：needle，矩阵：Blosum62，缺口开放10.0，缺口延伸0.5)进行。

“序列相似性”表示相同或代表保守氨基酸替换的氨基酸的百分比。两个氨基酸序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的氨基酸的百分比。

术语“同一性百分比”旨在表示在最佳对齐后获得的待比较的两个序列之间相同的氨基酸残基的百分比，该百分比是纯统计学的，两个序列之间的差异是随机分布的并且在其整个长度上。两个氨基酸序列之间的序列比较常规地通过在将其最佳对齐后比较这些序列来进行，所述比较通过片段或“比较窗口”来进行，以便鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。用于比较的序列的最佳对齐除手动外还可如下产生：通过Smith和Waterman，1981，Ads App.Math.2，482的局部同源性算法；通过Neddleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48，443的局部同源性算法；通过Pearson和Lipman，1988，Proc.NatlAcad.Sci.USA 85，2444的相似性检索方法；或者通过使用这些算法的计算机程序(GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA，在Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wis中)。

同一性百分比如下计算：确定两个比较序列之间的相同位置的数目，用该数目除以比较的位置的数目，并将获得的结果乘以100，以获得这两个序列之间的同一性百分比。

本文中所述的肽和氨基酸变体可以容易地借助已知的肽合成技术，例如如通过固相合成(Merrifield，1964)及类似方法或通过重组DNA操作来制备。例如，在Sambrook等(1989)中详细地描述了用于制备具有替换、插入或缺失的蛋白质和肽的DNA序列操作。

根据本发明，术语“肽”或“蛋白质”包括肽和蛋白质的“衍生物”。这样的衍生物是肽和蛋白质的经修饰形式。这样的修饰包括任何化学修饰并且包含单个或多个替换、缺失和/或添加与肽或蛋白质相关的任何分子，例如碳水化合物、脂质、蛋白质和/或肽。术语“衍生物”还延伸到所述肽和蛋白质的所有功能性化学等同物。优选地，经修饰的肽具有提高的稳定性和/或提高的免疫原性。

本发明的Seprase结合剂可以用于治疗方法。为此目的，本发明的Seprase结合剂可以与一个或更多个治疗效应物部分共价和/或非共价地结合和/或与多种组分组合以产生可药用组合物。本文中所述的药剂(例如肽)可以以任何合适的药物组合物的形式施用。

“靶细胞”应意指任何不期望的细胞，例如癌细胞。在一些优选实施方案中，靶细胞表达Seprase。

根据本发明，术语“治疗效应物部分”意指可以产生治疗效应的任何分子。根据本发明，治疗效应物部分优选地选择性引导向表达Seprase的细胞。对癌细胞产生治疗效应的任何药剂可以用作与Seprase结合剂缀合的药物。优选地，如本文中讨论的，药物的缀合不改变或不显著改变Seprase结合剂的结合特性，特别是特异性。

根据本发明，治疗效应物部分包括抗癌剂、放射性同位素如放射性碘标记的化合物、毒素、细胞抑制性或细胞裂解性药物等。抗癌剂包含例如氨鲁米特、硫唑嘌呤、硫酸博来霉素、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环孢素、阿糖胞苷(cytarabidine)、达卡巴嗪、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubin)、多柔比星、泰素(taxol)、依托泊苷、氟尿嘧啶、干扰素-α、洛莫司汀、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、米托坦、丙卡巴肼HCl、硫鸟嘌呤、硫酸长春碱和硫酸长春新碱。例如，Goodman和Gilman，“The Pharmacological Basisof Therapeutics”，第8版，1990，McGraw-Hill，Inc.，特别是第52章(AntineoplasticAgents(Paul Calabresi和Bruce A.Chabner))中描述了其他抗癌剂。毒素可以为蛋白质，例如商陆抗病毒蛋白、霍乱毒素、百日咳毒素、蓖麻毒素、白树毒素、相思豆毒素、白喉外毒素或假单胞菌(Pseudomonas)外毒素。毒素残基还可以为高能量发射放射性核素，例如钴-60。

治疗效应物部分特别地包括细胞毒素或细胞毒剂。细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害，特别是杀伤细胞的任何药剂。

细胞毒剂的有用类别包括例如抗微管蛋白剂、DNA小沟结合剂(例如烯二炔类(enediyne)和lexitropsin)、DNA复制抑制剂、烷化剂(例如，铂络合物，例如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂络合物以及卡铂)、蒽环类、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化学治疗致敏剂、倍癌霉素(duocarmycin)、依托泊苷、氟化嘧啶、离子载体(ionophore)、亚硝基脲、氯氨铂、成形前化合物(pre-forming compound)、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素、放射致敏剂、甾族化合物、紫杉烷类(例如紫杉醇和多西他塞)、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。

单独细胞毒剂包括例如雄激素、氨茴霉素(AMC)、天冬酰胺酶、5-氮杂胞苷、硫唑嘌呤、博来霉素、白消安、丁硫氨酸亚砜胺、喜树碱、卡铂、卡莫司汀(BSNU)、CC-1065、苯丁酸氮芥、顺铂、秋水仙碱、环磷酰胺、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytidine arabinoside)、细胞松弛素B、达卡巴嗪、更生霉素(以前为放线菌素)、柔红霉素、达卡巴嗪、多西他塞、多柔比星、雌激素、5-氟脱氧尿苷、5-氟尿嘧啶、短杆菌肽D、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀(CCNU)、二氯甲基二乙胺(mechlorethanmine)、美法仑、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、光神霉素、丝裂霉素C、米托蒽醌、硝基咪唑、紫杉醇、普卡霉素、丙卡巴肼(procarbizine)、链脲菌素、替尼泊苷(tenoposide)、6-硫鸟嘌呤、硫代TEPA、拓扑替康、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、VP-16和VM-26。

抗微管蛋白剂的实例包括但不限于：多拉司他汀(例如，奥瑞他汀E(auristatinE)、AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB)、美登木素生物碱(maytansinoid)、紫杉烷类(例如紫杉醇、多西他塞)、T67(Tularik)、长春花生物碱(例如长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨)、巴卡亭衍生物、紫杉烷类似物(例如埃博霉素A和B)、诺考达唑、秋水仙碱和colcimid、雌莫司汀、念珠藻素(cryptophysin)、西马多丁、考布他汀、圆皮海绵内酯(discodermolide)和软珊瑚素(eleutherobin)。

产生细胞毒性放射性药物的放射性同位素包括例如碘-131、钇-90或铟-111。

用于使这样的治疗效应物部分(药物)与肽缀合的技术是众所公知的。肽-药物缀合物的产生可以通过技术人员已知的任何技术完成。肽和药物可以通过其自身接头基团直接彼此结合或者通过接头或其他物质间接彼此结合。

许多不同反应可用于药物与肽的共价连接。通常，这通过肽分子的氨基酸残基，包括赖氨酸的胺基、谷氨酸和天冬氨酸的游离羧酸基团、半胱氨酸的巯基和芳族氨基酸的多种部分的反应完成。共价连接的最常用非特异性方法之一是将化合物的羧基(或氨基)与肽的氨基(或羧基)连接的碳二亚胺反应。另外地，双官能剂(例如二醛或亚氨酸酯)已经用于连接化合物的氨基与肽分子的氨基。Schiff碱反应也可用于药物与肽的连接。该方法涉及包含二醇或羟基的药物的高碘酸盐氧化，由此形成醛，其然后与肽分子反应。连接通过与肽分子的氨基形成Schiff碱而发生。异硫氰酸盐/酯也可以用作用于共价连接药物与肽的偶联剂。其他技术是技术人员已知的，并且在本发明范围内。

存在许多本领域已知的用于制备肽-药物缀合物的连接基团。接头优选地包含与肽和药物中一者或两者反应的一种或更多种官能团。官能团的实例包括氨基、羧基、巯基、马来酰亚胺和吡啶基。

在本发明的一个实施方案中，肽通过双官能交联试剂与药物连接。本文使用的“双官能交联试剂”是指具有两个反应基团，其中一个能够与肽反应而另一个能够与药物反应以连接肽与药物从而形成缀合物的试剂。任何合适的双官能交联试剂均可以结合本发明使用，只要接头试剂提供药物的保留(例如细胞毒性)和肽的靶向特征即可。优选地，接头分子通过化学键将药物与肽连接，使得药物和肽彼此化学偶联(例如共价结合)。

在一个实施方案中，双官能交联试剂包含不可切割的接头。不可切割的接头是能够以稳定的共价方式连接药物与肽的任何化学部分。优选地，不可切割的接头在生理条件下，特别是在体内和/或细胞内是不可切割的。因此，不可切割的接头在药物或肽保持活性的条件下对酸诱导的切割、光诱导的切割、肽酶诱导的切割、酯酶诱导的切割和二硫键切割具有显著抗性。在药物和肽之间形成不可切割接头的合适交联试剂是本领域众所公知的。在一个实施方案中，药物通过硫醚键与肽连接。

在一个特别优选的实施方案中，连接试剂是可切割的接头。优选地，可切割的接头在生理条件下，特别是在体内和/或细胞内是可切割的。合适可切割接头的实例包括二硫化物接头、酸不稳定性接头、光不稳定性接头、肽酶不稳定性接头和酯酶不稳定性接头。

接头的实例包括但不限于：N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、磺基琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰氨基己酸酯)(LC-SMCC)、4-马来酰亚胺基丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(GMBS)、3-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)、间马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺基-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺基-4-(对马来酰亚胺基苯基)丁酸酯(SMPB)、N-(对马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)、6-马来酰亚胺基己酰基(MC)、马来酰亚胺基丙酰基(MP)、对氨基苄氧基羰基(PAB)、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)和N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)。还可以使用肽接头，例如缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)或丙氨酸-苯丙氨酸(ala-phe)，并且上述任何接头均可以以合适的组合使用。

包含二硫化物的接头是可通过可以在生理条件下发生的二硫化物交换切割的接头。在又一些实施方案中，接头在还原条件下是可切割的(例如二硫化物接头)。多种二硫化物接头是本领域已知的，包括例如可以使用SATA(N-琥珀酰亚胺基-5-乙酰基硫代乙酸酯)、SPDP(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯)、SPDB(N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯))和SMPT(N-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫代)甲苯)形成的那些。

酸不稳定性接头是在酸pH下可切割的接头。例如，某些细胞内隔室(例如内体和溶酶体)具有酸性pH(pH 4至5)，并且提供适于切割酸不稳定性接头的条件。酸不稳定性接头在中性pH条件，例如血液中的那些下是相对稳定的，但是在pH低于5.5或5.0下是不稳定的。例如，可以使用腙、缩氨基脲、缩氨基硫脲、顺式-乌头酰胺、原酸酯(orthoester)、缩醛、缩酮等。

光不稳定性接头可用于机体表面和许多光可及的体腔中。此外，红外光可以穿透组织。

肽酶不稳定性接头可以用于在细胞内或细胞外切割某些肽。在一个实施方案中，可切割的接头在温和条件，即细胞毒剂的活性不受影响的细胞内条件下被切割。

接头可以是或可以包含例如被细胞内肽酶或蛋白酶(包括但不限于溶酶体或内体蛋白酶)切割的肽基接头。通常，肽基接头为至少两个氨基酸长或至少三个氨基酸长。切割剂可以包括组织蛋白酶B和D以及纤溶酶，已知其全部都水解二肽药物衍生物使得活性药物在靶细胞内释放。例如，可以使用可通过巯醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶-B(其在癌组织中高度表达)切割的肽基接头(例如，Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly接头)。在一些具体实施方案中，可通过细胞内蛋白酶切割的肽基接头为缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit；vc)接头或苯基丙氨酸-赖氨酸(Phe-Lys)接头。使用治疗剂的细胞内蛋白水解释放的一个优点是药剂在缀合时通常是减毒的并且缀合物的血清稳定性通常是高的。

术语“个体”和“对象”在本文中可以互换使用。其是指可遭受疾病或病症(例如癌症)痛苦或者易患疾病或病症(例如癌症)但是可能患有或可能未患所述疾病或病症的人、非人灵长类或其他哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、羊、马或灵长类)。在许多实施方案中，个体是人。除非另有说明，否则术语“个体”和“对象”不表示特定年龄，并且因此涵盖成人、年长者、儿童和新生儿。在本发明的一些优选实施方案中，“个体”或“对象”是“患者”。根据本发明，术语“患者”意指进行治疗的对象，特别是患病对象。

术语“疾病”是指影响个体机体的异常状况。通常，疾病解释为与特定症状和体征相关的医学状况。疾病可由源自外部来源的因素引起，例如感染性疾病，或者其可由内部功能障碍引起，例如自身免疫病。对于人，“疾病”通常更广泛地用于是指引起患病个体的疼痛、功能障碍、痛苦、社会问题或死亡或者与该个体接触的那些的类似问题的任何状况。在此更广泛的意义上，疾病有时包括损伤、失能、障碍、综合征、感染、孤立症状、不正常行为以及结构和功能的非典型变化，而在另一些背景下和出于另一些目的，这些可认为是可区别的类别。疾病通常不仅在身体上而且还在情感上影响个体，因为对许多疾病的感染和经历可以改变个体对生命的看法和个体性格。根据本发明，术语“疾病”包括癌症，特别是本文所述的那些癌症形式。本文中对癌症或具体癌症形式的任何提及还包括其癌症转移。在一个优选实施方案中，待根据本申请治疗的疾病涉及表达Seprase的细胞。

根据本发明，“涉及表达Seprase的细胞的疾病”或类似表述意指在患病组织或器官的细胞中表达Seprase。在一个实施方案中，与健康组织或器官的状态相比，Seprase在患病组织或器官的细胞中的表达提高。在一个实施方案中，只在患病组织中发现表达，而在健康组织中的表达被抑制。根据本发明，涉及表达Seprase的细胞的疾病包括癌症疾病。此外，根据本发明，癌症疾病优选地是其中细胞表达Seprase的那些。

术语“癌症疾病”或“癌症”是指或描述个体中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。癌症的实例包括但不限于：癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。更特别地，这样的癌症的实例包括骨癌、血癌、肺癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛区癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌、霍奇金病(Hodgkin′s Disease)、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)赘生物、神经外胚层癌症、脊柱轴肿瘤、胶质瘤、脑膜瘤和垂体腺瘤。根据本发明的术语“癌症”还包括癌症转移。优选地，“癌症疾病”的特征在于细胞表达Seprase。

“转移”意指癌细胞从其原始部位扩散到机体的另一部分。转移的形成是很复杂的过程，并且取决于恶性细胞从原发性肿瘤脱离，侵袭细胞外基质，渗透内皮基底膜以进入体腔和血管，以及然后在通过血液转运后浸润靶器官。最后，在靶部位处新肿瘤的生长取决于血管生成。甚至在去除原发性肿瘤之后，也经常发生肿瘤转移，这是因为肿瘤细胞或组分可能保留并产生转移潜力。在一个实施方案中，根据本发明的术语“转移”涉及“远端转移”，其涉及远离原发性肿瘤和区域淋巴结系统的转移。在一个实施方案中，根据本发明的术语“转移”涉及淋巴结转移。

根据本发明，术语“肿瘤”或“肿瘤疾病”是指细胞(被称为赘生性细胞、肿瘤发生性细胞或肿瘤细胞)的异常生长，优选形成肿胀或病变。“肿瘤细胞”意指通过快速的不受控制的细胞增殖生长并在引发新生长的刺激停止之后继续生长的异常细胞。肿瘤显示出结构组织和与正常组织的功能协调的部分或完全缺失，并且通常形成独特的组织团块，其可能是良性的、恶化前的或恶性的。根据本发明，“癌症疾病”优选地是“肿瘤疾病”。然而，通常，术语“癌症”和“肿瘤”在本文中可互换使用。

优选地，根据本发明的肿瘤疾病为癌症疾病，即恶性疾病，并且肿瘤细胞为癌细胞。优选地，肿瘤疾病或癌症疾病的特征在于其中表达Seprase或异常地表达Seprase的细胞，和/或肿瘤细胞或癌细胞的特征在于表达或异常表达Seprase。

当个体再次受到过去影响其的状况影响时，出现复发或再现。例如，如果患者曾患有肿瘤疾病，已经接受所述疾病的成功治疗，并再次发生所述疾病，则所述新发生的疾病可认为是复发或再现。然而，根据本发明，肿瘤疾病的复发或再现可以但不一定发生在原始肿瘤疾病的部位。肿瘤的复发或再现还包括其中肿瘤出现在与原始肿瘤部位不同的部位和出现在原始肿瘤部位的情况。优选地，患者已经接受治疗的原始肿瘤是原发性肿瘤，在与原始肿瘤部位不同的部位的肿瘤是继发性或转移性肿瘤。

术语“治疗”或“治疗性治疗”涉及改善个体的健康状况和/或延长(增加)个体的寿命的任何治疗。所述治疗可以消除个体的疾病，停止或减缓个体中疾病的发生，抑制或减缓个体中疾病的发展，降低个体中症状的频率或严重程度，和/或降低目前患有或以前患有疾病的个体中的再现。

术语“预防性治疗”或“预防治疗”涉及旨在在个体中预防出现疾病的任何治疗。术语“预防性治疗”或“预防治疗”在本文中可互换使用。例如，处于癌症风险之中的对象是进行预防癌症的治疗的候选者。

“处于风险之中”意指鉴定为与一般群体相比发生疾病(特别是癌症)的正常概率更高的对象。此外，曾患有或目前患有疾病(特别是癌症)的对象是发生疾病的风险增加的对象，因为这样的对象可能继续发展疾病。目前患有或曾患有癌症的对象还具有增加的癌症转移风险。

癌症的(治疗性)治疗可以选自：外科手术、化学治疗、放射治疗和靶向治疗。

本文中使用的术语“外科手术”包括在手术中移除肿瘤。外科手术是癌症的常见治疗。外科医生可以使用局部切除来移除肿瘤。

本文中使用的术语“化学治疗”是指使用化学治疗剂或化学治疗剂组合，优选地通过杀伤细胞或通过停止细胞分裂来停止癌细胞生长。当经口或者通过注射到静脉或肌肉中来接受化学治疗时，药物进入血流并且可以到达癌细胞遍及机体(全身性化学治疗)。当将化学治疗直接置于脑脊液、器官或体腔(例如腹)中时，药物主要作用于那些区域的癌细胞(区域性化学治疗)

根据本发明的化学治疗剂包括细胞抑制性化合物和细胞毒性化合物。传统的化学治疗剂通过杀伤快速分裂(大多数癌细胞的主要特性之一)的细胞起作用。这意味着化学治疗也伤害在正常情况下快速分裂的细胞，例如骨髓、消化道和毛囊中的细胞。这导致化学治疗最常见的副作用。靶向癌症中异常表达的蛋白质(例如Seprase)并通过与其缀合的治疗部分或治疗剂起作用的试剂可以被视为化学治疗的一种形式。然而，在最严格意义上，根据本发明的术语“化学治疗”不包括靶向治疗。

根据本发明，术语“靶向治疗”涉及可以用于优先地靶向患病细胞(例如癌细胞)而不靶向或在较小程度上靶向非患病细胞的任何治疗。患病细胞的靶向优选地使得杀伤患病细胞和/或损害患病细胞的增殖或生存力。这样的治疗包括i)与治疗部分缀合的靶向某些细胞表面靶标(例如，Seprase)以递送治疗部分的药剂(例如与治疗部分缀合的Seprase结合剂)，或ii)靶向某些细胞表面靶标(例如，Seprase)并通过与其结合而只损害患病细胞的增殖或生存力的药剂(例如与治疗部分缀合或不与治疗部分缀合的Seprase结合剂)。

根据本发明所述的药物组合物和治疗方法可用于治疗性治疗或预防本文中所述的疾病。可以使用动物模型来测试对癌症的作用。例如，可将人癌细胞引入小鼠中以产生肿瘤。对癌细胞的作用(例如肿瘤尺寸的减小)可以测量为向动物施用的药剂的有效性的量度。

肽可以以本身已知的方式施用。通常，配制和施用1ng至1mg，优选10ng至100μg剂量的肽。

如果期望施用核酸(DNA和RNA)，则可以配制和施用1ng至0.1mg的剂量。

在一个实施方案中，核酸通过离体方法施用，即通过从患者中移出细胞，对所述细胞进行遗传改造以并入核酸并将经改变的细胞重引入患者中来施用。这通常包括在体外将基因的功能拷贝引入患者的细胞中并将经遗传改变的细胞重引入患者中。基因的功能拷贝在调节元件的功能控制下，其允许基因在经遗传改变的细胞中表达。转染和转导方法是技术人员已知的。

本发明还提供了通过使用例如载体(例如病毒和靶标控制的脂质体)来体内施用核酸。

在一个优选实施方案中，用于施用核酸的病毒或病毒载体选自：腺病毒、腺相关病毒、痘病毒(包括痘苗病毒和经减毒的痘病毒)、Semliki森林病毒、逆转录病毒、辛德比斯病毒和Ty病毒样颗粒。特别优选的是腺病毒和逆转录病毒。逆转录病毒通常是复制缺陷型的(即，其不能够产生感染性颗粒)。

将核酸体外或体内引入细胞的方法包括核酸磷酸钙沉淀物转染、与DEAE缔合的核酸转染、用携带目的核酸的上述病毒转染或感染、脂质体介导的转染等。在一些具体实施方案中，优选的是将核酸定向于特定细胞。在一些这样的实施方案中，用于将核酸施用到细胞的载体(例如逆转录病毒或脂质体)可以具有结合的靶标控制分子。例如，可将对靶细胞上表面膜蛋白具有特异性的分子(抗体)或靶细胞上受体的配体并入核酸载体中或与核酸载体连接。优选的抗体包含选择性结合肿瘤抗原的抗体。如果期望通过脂质体施用核酸，则可将结合与胞吞作用相关的表面膜蛋白的蛋白质并入到脂质体制剂中以使靶标控制和/或摄取成为可能。这样的蛋白质包含对特定细胞类型具有特异性的衣壳蛋白或其片段、针对内化的蛋白质的抗体、寻址细胞内位点的蛋白质等。

本发明的治疗活性化合物可以通过任何常规途径施用，例如通过注射或输注来施用。施用可以例如经口、静脉内、腹膜内、肌内、皮下或经皮进行。施用可以局部或全身，优选地全身进行。

术语“全身施用”是指施用药剂使得药剂以显著量广泛地分布于个体的体内并产生期望的效果。例如，药剂可在血液中产生其期望的效果和/或通过血管系统到达其期望的作用部位。通常的全身施用途径包括通过将药剂直接引入血管系统中的施用或者经口施用、经肺施用或肌内施用，在其中药剂被吸收，进入血管系统，并通过血液输送到一个或更多个期望的作用部位。

根据本发明，优选地全身施用是通过肠胃外施用。术语“肠胃外施用”是指施用药剂使得药剂不通过肠。术语“肠胃外施用”包括静脉内施用、皮下施用、皮内施用或动脉内施用，但不限于此。

本发明的药物组合物优选地是无菌的，并且包含有效量的本文中所述的药剂和任选地本文中所讨论的另外的药剂以产生期望的反应或期望的效果。

药物组合物通常以均一的剂型提供，并且可以以本身已知的方式制备。药物组合物可以例如是溶液或混悬剂的形式。

药物组合物可以包含盐、缓冲物质、防腐剂、载体、稀释剂和/或赋形剂，优选地其全部都是可药用的。术语“可药用的”是指不与药物组合物的活性组分的作用相互作用的材料的无毒性。

不可药用的盐可用于制备可药用盐，并且包括在本发明中。这种可药用盐以非限制性方式包含由以下酸制备的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。可药用盐也可以制备为碱金属盐或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐或钙盐。

用于药物组合物的合适的缓冲物质包括盐中的乙酸、盐中的柠檬酸、盐中的硼酸和盐中的磷酸。

用于药物组合物的合适的防腐剂包括苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。

术语“载体”是指在其中组合活性组分以有利于、增强或实现施用的天然或合成性质的有机或无机组分。根据本发明，术语“载体”还包括适用于向患者施用的一种或更多种相容性固体或液体填料、稀释剂或包封物质。

用于肠胃外施用的可能的载体物质为例如无菌水、Ringer、Ringer乳酸盐、无菌氯化钠溶液、聚亚烷基二醇、氢化萘，以及特别是生物相容性的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。

可注射的制剂可以包含可药用的赋形剂，例如Ringer乳酸盐。

本文中使用的术语“赋形剂”旨在表示可以存在于药物组合物中但是不是活性成分的所有物质，例如如载体、黏合剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、乳化剂、缓冲剂、矫味剂或着色剂。

本文中所述的药剂和组合物以有效量施用。“有效量”是指单独或与另外剂量一起达到期望的反应或期望的效果的量。在治疗特定疾病或特定病症的情况下，期望的反应优选地涉及抑制疾病进程。这包括减缓疾病的进展，特别是中断或逆转疾病的进展。治疗疾病或病症的期望反应也可以为延迟所述疾病或所述病症的发生或者预防其发生。

本文中所述的药剂或组合物的有效量取决于待治疗的病症、疾病的严重程度、患者的个体参数(包括年龄、生理状态、尺寸和体重)、治疗的持续时间、伴随治疗(如果存在的话)的类型、特定的施用途径和类似因素。因此，本文中所述的药剂的施用剂量可以取决于多种这样的参数。在采用初始剂量患者的反应不足够的情况下，可以使用更高的剂量(或通过不同的更局部化的施用途径实现有效更高的剂量)。

本文中所述的药剂和组合物可以向患者例如体内施用以治疗或预防多种病症(例如本文所述的那些)。优选的患者包括患有可以通过施用本文中所述的药剂和组合物矫正或改善的病症的人患者。这包括涉及以Seprase的表达模式改变为特征的细胞的病症。

例如，在一个实施方案中，本文中所述的药剂可以用于治疗患有癌症疾病，例如如本文中所述以存在表达Seprase的细胞为特征的癌症疾病的患者。

通过以下附图和实施例对本发明进行详细描述，附图和实施例仅仅用于说明性目的，并且不意味着是限制性的。由于以下描述和实施例，技术人员可理解同样包括在本发明中的另外的实施方案。

附图

图1：MC-FA-010的氨基酸序列。二硫桥描绘为灰色线。胱氨酸以黄色突出显示并且从N-末端至C-末端编号(罗马数字)。

图2：A：来自MC-FA-010的丙氨酸扫描的结合数据的总结。第一列示出了位置特异性亲本序列。第二至第四列示出了通过单位点饱和结合模型计算的表观Kd以及计算的误差和拟合的R²值。保持/提高的结合(分别地结合微弱地丧失)以绿色示出，弱和中等结合以橙色示出，没有结合(结合完全地丧失)以红色示出。B：MC-FA-010的野生型序列，其中位置特异性结合如上所述以绿色、橙色和红色突出显示。

图3：Trx-MC-FA-010与人Seprase的结合分析。A：Trx-MC-FA-010在0.39至50nM范围内与人Seprase结合的ELISA分析。B：竞争ELISA分析。3nM Trx-MC-FA-010与人Seprase的结合与0.64至3167nM的可溶性单价MC-FA-010竞争。

图4：与固定化人Seprase的MC-FA-010结合的SPR分析。A：上面的图：缔合和解离步骤的拟合数据。所有分析浓度的覆盖图。下面的图：所测量和拟合曲线的残余视图。B：测量和计算的数据的总结。

图5：MC-FA-010对人FAPα的选择性的分析。A：以青色或灰色描绘的DPP VI和以绿色描绘的Seprase的结构覆盖图(Pymol)。B：与人Seprase(rhuSeprase，深灰色条)和DPP IV(浅灰色条)的Trx-MC-FA-010结合的ELISA分析。所示的数据集是基于重复。

图6：用于研究MC-FA-010特异性的免疫荧光。分析了链霉抗生物素蛋白-Cy3-缀合的MC-FA-010与Seprase过表达CHO-K1细胞(CHO-K1-Seprase)的结合。在用细胞孵育前，使MC-FA-010和对照

生物素化并预组装在Cy3-缀合的链霉抗生物素蛋白上。作为阴性对照，使用无关的Microbody^TM(a-Hepsin-bio)和靶标阴性CHO-K1-MOCK细胞。Microbody^TM-链霉抗生物素蛋白-Cy3复合物(红色)和核定位(蓝色)。

图7：离体调节后石蜡包埋的CT26细胞系的染色。在植入14天后，所有切片用CAF标志物抗α-SMA(绿色)和用于核定位的DAPI(蓝色)进行染色。在(A)中，切片另外地用经生物素化并预组装在Cy3-缀合的链霉抗生物素蛋白上的MC-FA-010处理。在(B)中，切片用对照Microbody^TM MC-Myc-010(其也用链霉抗生物素蛋白-Cy3四聚化)染色。

图8：单价和四价MC-FA-010的结合特性。(A)用于确定单价MC-FA-010(由硫氧还蛋白-His6-盒组成)对人Seprase表达细胞(CHO-K1-Seprase)的EC₅₀值的FACS。用His特异性的PE缀合的抗体检测MC-FA-010。(B)用于确定链霉抗生物素蛋白-APC偶联的四价MC-FA-010对人Seprase表达细胞(CHO-K1-Seprase)的EC₅₀值的FACS。在三个独立实验中进行测量。

图9：A)DOTA-(MC-FA-012)₃三聚体的示意图。分子的分子量示于下部。与单体MC-FA-012

(C)相比较地使用基于FACS的竞争测定在功能上分析三聚体(B)。

图10：IRDye缀合的MC-FA-012在表达Seprase的CHO-异种移植物中的肿瘤靶向。将人Seprase阳性细胞(CHO-K1-huSeprase)皮下接种到Foxn1(nu)小鼠的胁中。作为阴性对照，平行使用huSeprase阴性细胞(CHO-K1-MOCK)。3周后，将小鼠随机分配到阴性对照(MC-CM-010-IRDye800CW)或MC-FA-010-IRDye800CW处理。静脉内施用5nmol的各种Microbody^TM。在注射后0.5小时和2小时，对小鼠实施安乐死，并分离肿瘤。在Xenogen IVIS光学体内成像系统上离体测量IR信号。

图11：Microbody及其三聚体结合rhuSeprase的表面等离子体共振光谱术：A：MC-FA-010的缔合和解离谱图，1∶1拟合；B：MC-FA-012的缔合和解离谱图，1∶1拟合；C：谱图：DOTA-(MC-FA-012)₃的单周期测量和1∶1拟合，图：相应的稳态分析和1∶1拟合；D：谱图：AF680-(MC-FA-012)₃的单周期测量和1∶1拟合，图：相应的稳态分析和1∶1拟合。

图12：

MC-FA-012变体结合rhuSeprase的表面等离子体共振光谱术：A：FA8-D06的缔合和解离谱图，1∶1拟合；B：FA7-A05的缔合和解离谱图，1∶1拟合；C：FA8-C09的缔合和解离谱图，1∶1拟合；D：FA8-D03的缔合和解离谱图，1∶1拟合；E：FA8-D05的缔合和解离谱图，1∶1拟合；F：FA8-F04的缔合和解离谱图，1∶1拟合；G：FA8-G12的缔合和解离谱图，1∶1拟合。

图13：Seprase结合可替选支架ET-FA-012和MO-FA-012的表面等离子体共振光谱术：A：ET-FA-012的缔合和解离谱图，1∶1拟合；B：MO-FA-012的缔合和解离谱图。

图14：AF680-(MC-FA-012)₃和AF680-(MC-FA-0116)₃的生物分布分析；A：肿瘤靶向和器官分布的体内成像。B：解剖的肿瘤和器官的离体成像。箭头：肿瘤摄取。

图15：在注射后1、2、4、6、24和96小时后离体测量的AF680偶联的MC-FA-012和MC-FA-0116三聚体的荧光信号的比较。示出了肿瘤、肾、肝和肺的总辐射效率值/重量。

图16：表达Seprase的TNBC切片的免疫荧光染色。使用的Microbody已经通过链霉抗生素蛋白-Cy3缀合物(SA-Cy3)四聚化。活化的成纤维细胞用抗平滑肌肌动蛋白抗体(SMA)染色。

图17：在静脉内施用¹⁷⁷Lu-(MC-FA-012)₃后30分钟至24小时测量的器官活性，其计算为每器官重量的注射剂量的百分比[ID/g％]。

图18：在静脉内(i.v.)施用约10MBq ⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃后的最大强度投影(maximum intensity projection，MIP)(上排：第一小鼠；下排：第二小鼠)。通过箭头表示CT26-huSeprase肿瘤的位置。

图19：在静脉内施用约10MBq ⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃后的标准化摄取值(standardized uptake value，SUV)(上排：第一小鼠；下排：第二小鼠)。通过箭头表示CT26-huSeprase肿瘤的位置。

图20：小动物PET成像：选择器官的标准化摄取值(小鼠1)，肾lft：左肾，肾rt：右肾；肿瘤CT26wt：CT26肿瘤；肿瘤CT26-FAP：CT26-huSeprase肿瘤。

图21：患者1中在施用后1小时和3小时⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃的器官分布(SUV最大值)(rt＝右，lft＝左)。

图22：患者2中在施用后1小时和3小时⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃的器官分布(SUV最大值)(rt＝右，lft＝左)。

图23：患者3中在施用后1小时和2小时⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃的器官分布(SUV最大值)(rt＝右，lft＝左)。

图24：患者4中在施用后1小时和2.5小时⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃的器官分布(SUV最大值)(rt＝右，lft＝左)。

图25：患者5中在施用后1小时和3小时⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃的器官分布(SUV最大值)(rt＝右，lft＝左)。

图26：在注射64MBq ⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃后1小时示例性PET扫描(患者3)的经轴、冠状和矢状图。扫描示出了原发性胰腺肿瘤和肝转移中的清楚摄取。肿瘤和转移的位置用白色圆圈标记。

图27：用Seprase特异性抗体染色的胰腺癌和正常组织的切片。

图28：用Seprase特异性抗体染色的三阴性乳腺癌(TNBC)和正常组织的切片。

图29：用Seprase特异性抗体染色的肺癌和正常组织的切片。

实施例

本文中使用的技术和方法在本文中被描述或以本身已知的方式进行，并且如例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版(1989)Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y中所述。除非特别地指出，否则包括使用试剂盒和试剂的所有方法都是根据制造商的信息进行。

实施例1：材料和方法

质粒构建

通过Geneart合成经CHO密码子优化的全长人Seprase(NCBI登录号NP_004451)，并亚克隆到pENTRcht载体(Invitrogen)中。质粒通过DNA测序验证，并命名为pENTR-huSeprase。然后，通过Gateway克隆(Invitrogen)将相应的插入片段穿梭到猪Bac转座子载体(PB53x EF1系列)中以产生转座子表达质粒。这些质粒包含驱动cDNA、IRES-EGFP盒和作为选择标记的潮霉素的表达的EF1a启动子。质粒用于产生稳定的表达Seprase的细胞系。

使用pENTR-huSeprase质粒DNA作为PCR模板，用正向引物(5′-GCGCAAGCTTGCTGCGGCCCTCCCGGGTGCAC-3′)和反向引物(5′-GCGCAGCGGCCGCGTCGGACAGGGAGAAGCACTGC-3′)扩增编码Seprase细胞外结构域(第29至760位氨基酸)的cDNA片段。将PCR产物(不包含seprase的短细胞质结构域(第1至6位氨基酸)和疏水性跨膜结构域(第7至29位氨基酸)二者的编码序列)插入经修饰的pCEP4载体(Invitrogen)中。与pCEP4相比，经修饰的载体另外地包含Kozak共有序列、六组氨酸(H6)融合标签和用于高效分泌重组蛋白的来自小鼠Igκ链的V-J2-C区的分泌信号的编码序列。将Seprase细胞外结构域的cDNA序列与N-末端分泌信号和C-末端H6标签一起插入框内，从而允许重组Seprase的高效分泌、容易检测(通过抗His抗体；Invitrogen)和快速纯化(通过Ni-螯合物亲和色谱)。最终构建体通过DNA测序验证，命名为pCEP4-Igκ-huSeprase-coCHO_26-760aa-H6，并用于产生重组可溶性人Seprase(rhuSeprase)。

细胞系

中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)是从ATCC获得的，并在补充有青霉素(100单位/ml)、链霉素(100mg/ml)和10％(v/v)热灭活胎牛血清(FBS)的DMEM/F-12培养基(Invitrogen)中培养。将细胞在37℃下在5％CO₂-增湿空气气氛中维持并每48至72小时进行传代。在与野生型细胞相同的条件下但添加200μg/mL潮霉素B(hyromycin B)(Invitrogen)来培养MOCK或人Seprase表达CHO-K1细胞(CHO-K1-MOCK和CHO-K1-huSeprase)。为了产生rhuSeprase，使用来自Invitrogen的Freestyle^TM CHO-S细胞系。该悬浮细胞系已经作为单独的亚克隆与常见的CHO-K1细胞系区分开(D′Anna，1996；D′Anna等，1997；Deaven和Petersen，1973)。在标准增湿条件(37℃和8％CO₂)下在120至135rpm(Minitron培养箱摇动器，Infors-HT)下使用15％至25％标称体积在具有通气帽的聚碳酸酯一次性无菌Erlenmeyer瓶(125mL或500mL)中培养细胞。当密度为约1至1.5×10⁶个活细胞/ml时，对细胞进行传代培养，通常每48至72小时在补充有1X HT补充剂和4mM谷氨酰胺(Invitrogen)用于CHO细胞的无蛋白质化学确定培养基(CD CHO培养基，Invitrogen)中传代培养。

重组人Seprase的产生

为了可溶性重组人Seprase蛋白(rhuSeprase)的大规模表达，按照制造商的说明书使用FreeStyle^TMMAX CHO表达系统(Invitrogen)。简言之，以5至6×10⁵个细胞/ml传代CHO-S细胞，在标准增湿条件下在Minitron培养箱摇动器(Infors-HT)中以120rpm至135rpm孵育过夜。第二天，在转染当天，将细胞在500ml摇瓶中以150ml稀释至1×10⁶个细胞/ml。将187.5μg的pCEP4-Igκ-huSeprase-coCHO_26-760aa-H6质粒DNA添加到3ml OptiPro^TM SFM中并混合。在3ml OptiProSFM(Invitrogen)中稀释187.5μl的FreeStyle^TM MAX转染试剂并轻轻混合。将经稀释的FreeStyle^TM MAX转染试剂添加到经稀释的DNA溶液中，轻轻混合，并在室温下孵育10分钟。将DNA-FreeStyle^TM MAX试剂复合物缓慢地添加到包含细胞的500ml瓶中，同时缓慢地旋转瓶。然后，将经转染的细胞培养物在标准条件下孵育。在转染后5至7天，收获上清液，并分别使用HisTrap HP(GE Healthcare)和HiLoad 26/600 Superdex 200制备级SEC柱(GE Healthcare)通过常规的Ni-螯合物亲和色谱和尺寸排阻色谱进行纯化。通过用10倍摩尔过量在PBS pH 8.8中的EZ-Link磺基-NHS-LC-生物素(Pierce)在冰上孵育2小时来使一部分经纯化的蛋白质生物素化。在将缓冲液更换为补充有5％甘露醇(Roth)和5％海藻糖(Applichem)的PBS后，将蛋白质在-20℃下储存。

稳定Seprase表达细胞系的产生

使用MW25000线性聚乙烯亚胺(PEI)(Polysciences.Inc)试剂作为转染试剂。用猪Bac转座子系统建立稳定的细胞系。简言之，该系统由携带具有用于重组转基因的哺乳动物表达盒的人工转座子的供体载体和驱动PB转座酶(PB酶)(Invitrogen)瞬时表达的辅助载体组成。在转染前一天，将3×10⁵个CHO-K1细胞以每孔2ml生长培养基平板接种到6孔板中。用2μg转座子载体质粒和0.8μg转座酶载体质粒共转染CHO-K1细胞。在转染后3天，将细胞分离并置于包含200μg/ml潮霉素B(Invitrogen)的培养基中。在潮霉素选择2周后，通过流式细胞术、western印迹和免疫荧光分析来分析转染效率和靶标表达。通过使用Z-Gly-Pro-AMC底物(Bachem)的酶活性测定测试功能性。

流式细胞术分析

对于流式细胞术，收集1×10⁶个细胞，用FACS缓冲液(PBS+0.5M EDTA+5％FBS)洗涤一次，并在冰上用针对人Seprase的抗体(克隆1E5，Abnova；1∶50稀释)或用不同浓度的硫氧还蛋白-A(Trx)微型蛋白融合体孵育1小时。为了分析四聚化微型蛋白的结合，用五倍摩尔过量的链霉抗生物素蛋白-APC(Affymetrix eBioscience)将生物素化的微型蛋白在室温下预孵育10分钟。孵育后，用FACS缓冲液洗涤细胞三次。直接使用经四聚化微型蛋白处理的细胞进行流式细胞术分析。为了分析Seprase表达或单价微型蛋白结合，用第二经Cy5标记的抗小鼠抗体(Dianova)或用经PE标记的抗H6抗体(R&D系统，检测Trx-微型蛋白融合体内的内部H6标签)将细胞染色。30分钟后，再次用FACS缓冲液洗涤细胞，并使用FACS CantoII装置(Becton Dickinson)进行分析。对根据前向散射/侧向散射特征鉴定的活细胞设置分析门。使用FlowJo软件(版本10，Tree Star Inc.)分析数据。

免疫组织化学

立即切除肿瘤，转移到包埋盒中，并在4℃下在4％Roti-Histo-Fix(pH 7)(Roth)中固定过夜。固定后，在70％乙醇中洗涤肿瘤以除去过量的固定溶液。随后，用递增醇系列将肿瘤脱水，并在组织处理机中石蜡包埋。用microtom进行经包埋肿瘤的连续切片(3μm厚)。将切片封固在载玻片上，脱蜡并在递减醇系列中再水化。然后，在微波炉中用10mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6)将切片煮沸20分钟。在用1×PBST洗涤后，用PBST中的3％BSA封闭非特异性结合30分钟。添加1∶500多克隆抗SMA抗体(Abcam)或1μM生物素化微型蛋白并在4℃下孵育过夜，所述生物素化微型蛋白提前用链霉抗生物素蛋白-Cy3(Rockland)预孵育以进行四聚化。在用1X PBST洗涤切片3次后，用经1∶200稀释的二抗IgG抗兔FITC(Dianova)检测抗SMA抗体结合。将二抗在室温下在黑暗中孵育1小时。最后，用PBS洗涤切片三次，随后用经在IX PBS中1∶5000稀释的Hoechst染料(Sigma-Aldrich)孵育10分钟，并在封固剂(Darko)中封固。

为了评价Seprase在TNBC、肺和胰腺癌中的表达水平，进行免疫组织化学分析。作为阳性对照，使用具有Seprase阳性表达水平的CHO-K1-huSeprase组织；作为阴性对照，使用人结肠切片。

对于石蜡包埋胰组织，用二甲苯和分级乙醇将3μm厚的切片脱蜡。通过将切片在120℃下在10mM柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)+0.05％Tween-20中加热进行抗原恢复，冷却10分钟。将样品在PBS+0.3％H₂O₂中淬灭15分钟。将冷冻组织切片(乳房和肺组织)在低温恒温器中以5至8μm切片。将切片在室温下解冻10分钟，在PBS中再水化5分钟，并在BLOXALL(Vectorlabs)中淬灭10分钟。

用10％正常山羊血清将所有切片在室温下孵育30分钟以封闭非特异性反应。在此之后，用稀释至0.5μg/ml的多克隆兔抗人Seprase抗体(Sigma)在室温下孵育1小时。在用PBS洗涤后，用二抗(Power-Vision HRP抗兔)将切片孵育30分钟。通过用Vector NovaRED系统(Vector Laboratories)孵育证明免疫染色的定位。用Multistainer ST5020(Leica)进行切片的使用Mayer苏木精的对比染色和脱水。然后，用XTRA-Kitt Medite封固剂将载玻片封固。

针对rhuSeprase的噬菌体展示选择

使用包含约1×10¹⁰个单独变体的随机化knottin文库针对rhuSeprase进行噬菌体展示选择。该文库是基于来自木鳖子的开链胰蛋白酶抑制剂II(oMCoTi-II，(Avrutina，Schmoldt等，2005))。使用固定化在Maxisorp^TM免疫管(Thermo Scientific)上或通过经链霉抗生物素蛋白包被的磁性珠(Dynabeads 280链霉抗生物素蛋白，Life Technologies)固定化的rhuSeprase进行三轮选择。

微型蛋白变体的产生

生物素化微型蛋白变体是购自Pepscan的。在这些情况下，微型蛋白是通过常规固相肽合成，然后热力学折叠成天然胱氨酸结结构而产生的。在所有其他情况下，微型蛋白是使用基于硫氧还蛋白-A(Trx)的融合系统组合大肠杆菌(E.coli)Shuffle^TM T7 Express菌株(NEB)重组产生的，其允许在细菌宿主的细胞质中形成二硫键(Lobstein，Emrich等，2012)。对于半制备型或分析型重组合成，通过独特的Bam HI和Apa I限制性位点将编码微型蛋白变体的基因克隆到pET-32-LibEx载体中以得到由硫氧还蛋白-A、His-标签(H6)、S标签和微型蛋白基因组成的四分融合体。对于微型蛋白的半制备型产生，使用标准溶原性肉汤(LB)培养基在1L摇瓶中进行表达，而分析级产生(例如，用于MC-FA-010丙氨酸突变体的命中鉴定或分析)使用自身诱导培养基(MagicMedia^TM，Life Technology)在96孔板中进行。在表达后，收获细胞，并用溶菌酶或通过超声组合冷冻/解冻循环进行裂解。在这两种情况下，在80℃下对经澄清的细胞裂解物进行加热步骤10分钟以除去大量的宿主细胞蛋白质。所得的蛋白质制备物直接用于ELISA结合分析(例如，用于命中鉴定目的)或者使用Ni-NTA旋转柱(Qiagen，分析级)或5ml HisTrap HP柱(GE Healthcare，半制备级)通过Ni-螯合物亲和色谱进行进一步纯化。为了产生无标签的微型蛋白，通过用0.5U凝血酶/mg融合蛋白在37℃下孵育过夜来用凝血酶(Sigma)切割trx-微型蛋白融合体。然后，可以使用TSK凝胶ODS-120T柱(Tosoh Bioscience)通过HPLC分离微型蛋白。使用BioSep-SEC-S2000柱(Phenomenex)通过质谱和分析尺寸排阻色谱分析在相应HPLC级分冷冻干燥后获得的最终微型蛋白制备物。通过称重或OD(280am)测量计算产率。

Western印迹

在培养皿上培养1×10⁵个细胞，用冷的1X PBS洗涤1次，并在500μL的4X SDS裂解缓冲液(250mM Tris-HCl，34％甘油，8.2％SDS，5％β-巯基乙醇)中裂解。用细胞刮器刮掉细胞，并且为了除去细胞碎片，以14000xg将裂解物在4℃下离心几分钟。然后，对裂解物进行超声处理。用添加有溴酚蓝的4X SDS-裂解缓冲液将裂解物的等分试样煮沸，并通过SDS-PAGE和随后的western印迹进行分析。使用以下抗体进行检测：作为一抗：抗Seprase(Abcam)、抗His(Abcam)或抗β-肌动蛋白，作为二抗：抗小鼠HRP(克隆)。

命中鉴定

在三轮噬菌体展示选择后，将所得的库(pool)亚克隆到pET-32-LibEx表达载体中以允许独立于噬菌体背景鉴定推定的rhuSeprase结合剂。为此，用特异性寡核苷酸PCR扩增相应的微型蛋白基因库。将所得的PCR产物纯化，用Bam HI和Apa I限制性酶切割，并与经类似消化的表达载体连接。在转化大肠杆菌Shuffle^TM T7 Express后，挑选单独克隆，并如上述以96孔形式产生Trx-融合蛋白。为了分析结合，进行ELISA测定。因此，用靶蛋白或BSA(各自为100μl在50mM碳酸钠pH 9.4中的5μg/ml蛋白质溶液)包被MaxiSorp 96孔板(Nunc/Thermo Fisher Scientific)。与靶蛋白结合对应于“信号”，并且与BSA结合对应于“噪声”。为了单个板的归一化，以一式三份分析MC-Myc-010(Myc结合胱氨酸结微型蛋白)和抗cMyc抗体(克隆9E10)的结合。在4℃下进行包被过夜。用300μl包含0.1％Tween 20的磷酸缓冲盐水(pH 7.4，PBS-T)洗涤孔3次。然后，用封闭溶液(Sigma Aldrich)将孔封闭2小时。在洗涤步骤(3x PBS-T)后，将包含Trx融合蛋白的裂解物在包被蛋白中进行1∶5稀释，并用包被蛋白在4℃下孵育1小时。使用抗S标签抗体(在PBS中1∶2000，abcam)重复洗涤和孵育步骤。在检测前，进行洗涤步骤两次(3x PBS-T和3x PBS)。使用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺液体底物(TMB溶液，Sigma-Aldrich)和在450nm处的吸收增大(在Tecan M200 Pro ELISA阅读器中检测到的)进行检测。通过96孔E-PAGE电泳(Life Technologies)并通过ImageQuant TL软件包(GE Healthcare)量化蛋白质条带来分析单个克隆的表达。为了排名蛋白质，计算ELISA的信噪比，并与表达值相关联。然后使用前30个克隆进行进一步分析。

通过ELISA的结合分析

进行ELISA以评估和比较微型蛋白变体的结合特性和特异性。为此，已经使用重组蛋白或全细胞。对于全细胞ELISA分析，将5×10⁵个细胞接种在96孔平底板(Corning)的每个孔中。因此，将细胞在37℃下在5％CO₂增湿空气气氛中孵育20小时。然后，在室温(RT)下用5％奶粉/PBS将孔封闭1小时。在除去封闭缓冲液后，向每个孔添加Trx-微型蛋白溶液，并用细胞在RT下孵育1小时。随后，用PBS-T(PBS+0.1％Tween-20)充分洗涤孔6次，并用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗S标签抗体(Abcam)检测结合的微型蛋白的量。使用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)(Sigma)作为显色底物。在约20分钟后，用0.2M HCl停止HRP酶反应，并在Victor V3读板器(Perkin Elmer)中在450nm处测量板。对于竞争研究，在用细胞孵育前，将0.1μM Trx-MC-FA-010融合蛋白与不同浓度的孤立MC-FA-010微型蛋白(1至200μM)预混合。

对于基于蛋白质的ELISA分析，通过在包被缓冲液中在4℃下孵育过夜将5μg相应重组蛋白(rhuSeprase；链霉抗生物素蛋白：Sigma；DPP-IV：R&D Systems；BSA：Eurobio)固定化在MaxiSorp^TM板(Nunc)的每个孔。在Hydrospeed洗板器(Tecan)上用300μl PBS-T/孔洗涤三次后，用1x酪蛋白溶液(Sigma，在PBS中稀释的)在RT下将孔封闭2小时。随后，如上所述洗涤孔。然后，添加100μl经在PBS-T中稀释的相应Trx-微型蛋白融合体，并在4℃下孵育1小时。以1∶5稀释经加热步骤简单纯化的蛋白质，以0.39至50nM的限定浓度施加亲和纯化的蛋白质。对于竞争ELISA，在孵育前，将固定浓度的3nM Trx-微型蛋白融合体与不同浓度(0.64至3167nM)的孤立微型蛋白混合。如上所述，在PBS-T洗涤操作后使用HRP偶联的抗S标签抗体检测Trx-融合体的结合。使用Sigmaplot 10和单位点饱和结合模型进行数据拟合来计算表观Kd。

SPR分析

为了了解动力学结合特性，在Biacore T100装置(GE Healthcare)上进行表面等离子体共振(SPR)分析。因此，如制造商所述通过以10μl/分钟进行NHS/EDC介导的偶联420秒将rhuSeprase固定化到CM5芯片上。针对缔合和解离在90秒的时间段内测量不同浓度(37、111.1、333.3、1000和3000nM)的MC-FA-010与固定化rhuSeprase的结合。使用提供的软件计算Kd值。

使用表面等离子体共振光谱术(Biacore T-100，GE Healthcare)确定单体和寡聚体MC-FA-010及其变体对重组人Seprase(rhuSeprase)的动力学和亲和力。将rhuSeprase(在PBS、5％甘露醇、5％海藻糖中20μg/ml)固定化在氨基反应性系列S传感器芯片CM5(GEHealthcare)上。对于单体Microbody的结合分析，将rhuSeprase装载到最大量7500RU，对于寡聚体Microbody，装载到最大量700RU。基于预期的解离常数，使用多循环动力学方法在3.125至1000nM的浓度范围内测量单体Microbody。在60至90秒的时间段内测量缔合步骤，在420秒内测量解离。使用单循环动力学方法在0.3125至5nM的浓度范围内测量三聚体Microbody(缔合90秒，解离420秒)。使用1∶1结合模型(Biacore T-100评价软件，GEHealthcare)计算结合动力学和稳态分析。

MC-FA-010的丙氨酸扫描诱变

为了了解seprase结合剂MC-FA-010的结构-活性关系，进行丙氨酸扫描诱变。因此，在DNA水平上用丙氨酸交换可变区的每个单氨基酸。通过Geneart(如DNA Strings^TM)合成突变基因，并通过独特的Bam HI和Apa I限制性位点直接克隆到pET-32-LibEx表达载体中。如上所述，使用Shuffle^TM T7 Express大肠杆菌菌株在96孔微量滴定板中进行丙氨酸变体的产生。在用Ni-NTA旋转柱(Qiagen)纯化后，通过ELISA分析变体的结合特性，并与MC-FA-010野生型微型蛋白比较。

亲和力成熟

基于从丙氨酸扫描诱变获得的数据和MC-FA-010/-012的经鉴定结合基序，产生第二噬菌体文库。在该文库中，使seprase结合的关键氨基酸位置保持恒定(Y、W和GRGP序列)，而使用除半胱氨酸外的所有可能氨基酸随机化结合环的所有其他位置。应用严格性不同的四种不同条件(单价或多价展示、有或没有与游离MC-FA-012微型蛋白的竞争、不同的洗涤条件)针对重组可溶性人seprase再次筛选该文库。在三个选择循环后，将所有库克隆到pET-32表达载体中。对于每个库，表达96个克隆并使用上述命中鉴定方法分析。选择26个排名靠前的克隆，较大量地产生，并更详细地分析。

使用体内近红外光学成像的

AlexaFluor-680缓和物的生物分布和肿瘤靶向分析

对于体内成像测定，使用雌性Fox n1nu小鼠(6至8周龄，Harlan，Envigo)。实验根据国家规范进行并得到当地动物实验伦理委员会批准。收获亚汇合CHO-K1-huSeprase细胞，并重悬于PBS中达到1×10⁷个细胞/ml的密度。在接种前，通过0.4％锥虫蓝排除测定测试细胞生存力(活细胞＞90％)。对于皮下注射，将在100μl PBS中的1×10⁶CHO-K1-huSeprase细胞与100μl基质胶(Matrigel，Corning)混合并注射到肢体的右侧。当肿瘤体积达到600至800mm³时，将动物随机分成几组进行不同的处理(每组n＝3)。然后，静脉内注射1.67nmol AF680-(MC-FA-012)₃或对照

AF680-(MC-FA-0116)₃。在注射后的不同时间点，通过吸入异氟醚麻醉小鼠。使用Xenogen IVIS谱成像系统(Perkin Elmer，USA)进行体内成像。使用Living Image 2.5(Xenogen，Perkin Elmer)图像分析软件量化最大近红外信号(NIRF)。对于离体NIRF成像，处死小鼠，切除每只小鼠的肿瘤和主要器官，称重并通过Xenogen IVIS系统分析。

免疫荧光分析

将1μM生物素化MC-FA-012和对照MC-FA-0116用链霉抗生物素蛋白-Cy3(Rockland)(摩尔比5∶1)在室温下预孵育30分钟。用丙酮将组织的冷冻切片(6μm)固定，并用3％BSA/PBS封闭以防止非特异性结合。然后，用抗SMA抗体(Abcam)将组织染色以检测活化的成纤维细胞，并用Microbody-链霉抗生物素蛋白混合物在37℃下染色30分钟。然后冲洗切片，并用Alexa 488缀合的二抗(Abcam)在37℃下孵育30分钟。最后，再次洗涤切片，用Hoechst 33258(Sigma-Aldrich)孵育以检测核，再次洗涤两次，并在荧光封固剂(Dako)中封固。然后，使用倒置荧光显微镜(Zeiss AxioObserver.Z1)检查切片。

小动物PET成像和器官分布

DOTA-(MC-FA-012)₃的¹⁷⁷Lu标记

将2.5nmol MC-FA-012三聚体溶解于50μl 0.1M乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中并与1μl的20％抗坏血酸水溶液混合。添加2.5μl在0.4M乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中的¹⁷⁷LuCl₃(约25MBq)。将混合物在95℃下加热15分钟，并使用0.9％盐水稀释至2.5ml的总体积。在经标记和未经标记的化合物没有任何分离下进行放射性标记。通过分析型RP-HPLC确定放射性化学产率。¹⁷⁷Lu-(MC-FA-012)₃对应于¹⁷⁷Lu标记的DOTA-(MC-FA-012)₃。

DOTA-(MC-FA-012)₃的⁶⁸Ga标记

⁶⁸Ga是作为在0.6M HCl中的[⁶⁸Ga]GaCl₃从⁶⁸Ge/⁶⁸Ga发生物获得的。将5nmol MC-FA-012三聚体和10μl 20％抗坏血酸水溶液与550μl ⁶⁸Ga-洗脱物混合，并用160μl 2.5M乙酸钠缓冲液(pH 8)中和至最终pH为3.5。将混合物在95℃下加热13分钟，使用固相萃取柱(cartridge)(Agilent Varian Bond Elut Plexa)纯化，并在0.9％盐水中稀释。在经标记和未经标记的化合物没有任何分离下进行放射性标记。通过分析型RP-HPLC确定放射性化学产率。⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃对应于⁶⁸Ga标记的DOTA-(MC-FA-012)₃。

经放射性标记的DOTA-(MC-FA-012)₃的体内测试

对于体内实验，分别向8周大BALB/c nu/nu小鼠(Charles River)的右侧躯干中皮下接种5×10⁶个CT26-huSeprase细胞。对于成像实验(n＝2)，将5×10⁶个CT26野生型细胞另外地注射到左侧躯干中作为对照。当肿瘤尺寸达到约1cm³时，通过尾静脉注射经放射性标记的化合物(对于小动物PET成像，约10MBq；对于器官分布，约1MBq)。

¹⁷⁷Lu-(MC-FA-012)₃的器官分布

对于器官分布，在指定的时间点(30分钟至24小时)后，处死动物(每个时间点n＝3)。使用γ计数器测量所有解剖器官和血液中分布的放射性。值表示为注射剂量/克的百分比(ID/g％)。

使用⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃的小动物PET成像

使用小动物PET扫描仪Inveon PET(Siemens)进行PET成像。在15分钟透射扫描后，向经麻醉的小鼠注射约2.5nmol的⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃(约10MBq)。在第一个60分钟内，进行动态扫描，然后在注射后120至140分钟进行静态扫描。使用3D-OSEM+MAP方法(Siemens)迭代地重建图像，并转换为标准化摄取值(SUV)图像。使用ROI技术进行量化并表示为SUV平均值。

诊断和治疗目的

DOTA-(MC-FA-012)₃的⁶⁸Ga标记

⁶⁸Ga(半衰期68分钟；正电子最大能量1.9MeV[β⁺89％])是作为在0.6M HCl中的[⁶⁸Ga]GaCl₃从⁶⁸Ge/⁶⁸Ga发生物获得的。向1ml ⁶⁸Ga-洗脱物(约0.8至1GBq)中添加2.5nmolDOTA-(MC-FA-012)₃和10μl 20％抗坏血酸水溶液，并用280μl 2.5M乙酸钠缓冲液(pH 8)稀释至最终pH 3.5。将混合物在95℃下孵育15分钟，使用固相萃取柱(Agilent Varian BondElut Plexa)纯化，并在0.9％盐水中稀释。在经标记和未经标记的化合物没有进行任何分离下进行放射性标记。通过分析型RP-HPLC确定放射性化学产率。

DOTA-(MC-FA-012)₃的¹⁷⁷Lu标记

¹⁷⁷Lu(半衰期6.71天；电子最大能量497keV[β^-79％]；最大光子能量113keV[6％]，208keV[11％])作为在0.04M HCl水溶液中的[¹⁷⁷Lu]LuCl₃购自ITG GmbH Garching。将15nmol DOTA-(MC-FA-012)₃溶解在100μl 0.4M乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中并与10μl的20％抗坏血酸水溶液混合。添加70μl在0.4M乙酸钠缓冲液pH 5.0中的¹⁷⁷LuCl₃(约2.5GBq)。将混合物在95℃下孵育15分钟，并使用0.9％盐水稀释至总体积5ml。在经标记和未经标记的化合物没有任何分离下进行放射性标记。用0.5M柠檬酸钠溶液(pH 5)在用和没有用10％甲醇作为溶剂下通过分析型RP-HPLC和瞬时薄层色谱(ITLC-SG)确定放射性化学产率。

PET成像

使用静脉内施用的⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃(2.5nmol，63至359MBq))进行诊断成像。通过⁶⁸Ga的短半衰期和在⁶⁸Ge/⁶⁸Ga发生物的寿命期间获得的可变洗脱效率引起所注射放射性示踪剂活性的改变。在施用⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃后1小时和约3小时，使用PET/CT扫描仪Siemens Biograph-mCT Flow研究患者。在进行CT扫描用于衰减校正后，获取针对死时间、散射和衰变校正的静态发射扫描。迭代地重建图像，并转换为标准化摄取值(SUV)图像。

在静脉内注射约2.5GBq后1天，使用γ照相机GE Millenium VG5 Hawkeye进行施用¹⁷⁷Lu-(MC-FA-012)₃后的医学成像。

实施例2：结合人FAPα的oMCoTi-II突变体MC-FA-010的设计

从高度多样化的基于噬菌体的oMCoTi-II文库(包含1×10¹⁰个单独变体)中分离出结合FAPα的胱氨酸结微型蛋白MC-FA-010。三轮选择后经富集克隆的序列分析揭示35个氨基酸(aa)长的微型蛋白序列(图1)。

为了分析经鉴定微型蛋白的结构功能关系，进行丙氨酸扫描诱变(图2A+2B)。使用重组靶蛋白在直接ELISA设置中测量MC-FA-010变体与人Seprase的浓度依赖性结合，并通过单位点饱和结合模型(Sigma plot 10)计算EC50值。图2A示出了所有结合数据的总结。丙氨酸突变体的结合示出为与MC-FA-010的亲本序列相比的相对结合。保持/提高的结合(分别地结合微弱地丧失)以绿色示出，弱和中等结合以橙色示出，没有结合(结合完全地丧失)以红色示出。

丙氨酸扫描诱变揭示了由两个芳族和四个脂肪族氨基酸组成的结合基序(YXXWXXGRGP，图2B)。显示出给定序列的高特异性，因为单丙氨酸交换完全消除了MC-FA-010与人Seprase的结合。与野生型Microbody^TM MC-FA-010相比，一种变体(MC-FA-012(K2A))显示出甚至更高的对Seprase的亲和力(160％)。该变体也包括在进一步的功能化操作中。

实施例3：结合人FAPα的oMCoTi-II突变体MC-FA-010及其变体的靶标结合

MC-FA-010显示出纳摩尔范围内的对人Seprase的亲和力

使用浓度依赖性ELISA测量MC-FA-010与重组人Seprase结合的亲和力。用人Seprase的可溶性级分包被板，并在0.39至50nM的浓度范围内作为与硫氧还蛋白的融合蛋白(Trx-MC-FA-010)添加MC-FA-010。通过抗S标签-HRP缀合的抗体(S标签是由硫氧还蛋白融合体表达系统提供的，图3A)实现结合的微型蛋白的检测。在Sigma plot 10中使用单位点饱和结合模型计算EC50值。此外，3nM Trx-MC-FA-010的结合与0.64至3167nM的可溶性单价MC-FA-010竞争(图3B)，表明结合的特异性竞争。EC50和IC50值二者都表明MC-FA-010对人Seprase的结合亲和力在纳摩尔范围内。

总体上，这些实验表明了MC-FA-010对人Seprase的特异性结合。作为下一步，使用表面等离子体共振技术(SPR)进行结合动力学的更详细分析。因此，将重组人Seprase固定化在具有氨基反应性表面的CM5芯片(GE Healthcare)上。使用Biacore T100系统以浓度系列(37、111.1、333.3、1000和3000nM)测量可溶性单价MC-FA-010的缔合和解离。拟合缔合和解离数据，并使用系统提供的软件计算对应的解离常数和动力学值(Kon、Koff和Kd)(图4A和B)。SPR分析揭示解离常数为约560nM，因此证明了先前测量的通过ELISA分析得到的在纳摩尔范围内的亲和力。

MC-FA-010显示出对人Seprase的高选择性

为了分析MC-FA-010对人Seprase的选择性，研究了与紧密相关的二肽基肽酶IV(DPP IV，CD26)的结合。DPP IV是88kDa的膜结合糖蛋白，其还可以被蛋白水解切割成在氨基末端缺少38aa的可溶性形式。图5A示出了以绿色描绘的Seprase和以青色或灰色描绘的DPP IV的结构覆盖图(Pymol)。Seprase和DPP IV共有52％序列同一性和71％相似性。通过ELISA分析MC-FA-010对Seprase的选择性。分别地包被人Seprase、DPP IV，并以0.1至100nM的浓度系列测量Trx-MC-FA-010的结合。

如预期的，MC-FA-010强烈地且选择性地结合Seprase。对于在最高测量浓度下MC-FA-010与DPP IV的结合，只可以检测到非常弱的信号(图5B)。因此，MC-FA-010显示出对Seprase的高选择性。

MC-FA-010与表达Seprase的细胞特异性结合

为了研究MC-FA-010与人Seprase过表达CHO-K1细胞(CHO-K1-Seprase)的结合，进行免疫荧光染色。使用靶标阴性CHO-K1-MOCK细胞和阴性对照Microbody^TM作为对照以排除Microbody^TM与细胞表面上不相关蛋白质的非特异性结合。在用细胞孵育前，将MC-FA-010和对照Microbody^TM生物素化并预组装在Cy3缀合的链霉抗生物素蛋白上。与CHO-K1-MOCK相比，检测MC-FA-010-bio/SA-Cy3在CHO-K1-Seprase上的特异性结合。如预期的，对照Microbody^TM不结合CHO-K1-Seprase细胞(图6)。这清楚地证明了MC-FA-010与表达Seprase的细胞的特异性相互作用。

MC-FA-010与表达Seprase的肿瘤特异性结合

为了分析MC-FA-010(通过链霉抗生物素蛋白-Cy3四聚化的)与鼠Seprase表达肿瘤细胞的结合，向BALB/c小鼠皮下注射CT26细胞。在肿瘤细胞植入后14天，处死小鼠，并分离肿瘤用于石蜡切片。然后，将3μm切片染色(图7)。为了可视化表达Seprase的CAF(癌症相关成纤维细胞)，用抗α-SMA抗体将切片染色(绿色)。用DAPI将核定位染色(蓝色)。MC-FA-010和对照Microbody^TM MC-Myc-010的特异性结合是以红色可检测的。在此我们能够表明MC-FA-010在来自鼠肿瘤切片的CAF上结合。如预期的，对照Microbody^TM不与CT26肿瘤切片结合。总之，可以用Seprase特异性Microbody^TM MC-FA-010寻址表达Seprase的肿瘤。

MC-FA-010的寡聚化提高其亲和力

为了研究可能的亲合力(avidity)效应，分析了单价和四价MC-FA-010针对人Sephase过表达细胞(CHO-K1-Seprase)的结合活性。因此，一方面使用单价Trx-MC-FA-010融合蛋白(由硫氧还蛋白-His6-盒组成)，在另一方面使用利用链霉抗生物素蛋白-APC寡聚化的生物素缀合的Microbody^TM(MC-FA-010-bio/SA-APC)。通过FACS确定所得MC-FA-010构建体针对人Seprase的结合特性，并且揭示单价MC-FA-010的EC50值为177.6nM，而四价变体显示出EC50为2.367nM的甚至更高亲和力(图8)。综合来看，MC-FA-010的寡聚化产生亲合力效应，并且提高MC-FA-010对Seprase的亲和力。

MC-FA-012的化学寡聚化

DOTA缀合的三聚化MC-FA-012Microbody^TM形式(DOTA-(MC-FA-012)₃)购自Pepscan。该产生是基于肟连接策略。因此，化学合成了在N-末端具有氨基末端氨基氧基的MC-FA-012变体。除此之外，产生了分别由连接在氨基末端的DOTA部分和通过GSGS接头序列分开的三个赖氨酸-丝氨酸延伸段组成的锚分子。为了形成反应性醛，用高碘酸钠氧化丝氨酸残基的末端羟基。最后，在肟连接反应中使活化的锚和氨基氧基-MC-FA-012变体偶联形成DOTA-(MC-FA-012)₃三聚体(参见图9A)。

与单体Microbody^TM相比在基于FACS的竞争测定中在功能上分析三聚体(参见图9B和9C)。在该测定中，用Trx-MC-FA-012融合蛋白和抗H6-PE抗体将CHO-K1-huSeprase细胞连续染色。用不同浓度的三聚体平行孵育导致显著的抑制，其中IC50值为43.32nM，然而用单体仅可以看到轻微的竞争。因此，Microbody^TM在三聚体支架上的空间取向使得能够高效地与膜结合的seprase结合。观察到的亲合力效应还表明化学寡聚化可以是显著提高配体亲和力的富有成效的方式，从而有利于增强探针在肿瘤部位的结合和保留。

除所述DOTA缀合物DOTA-(MC-FA-012)₃之外，还从Pepscan购买

缀合的变体用于进行体内成像用途。产生了类似于DOTA-(MC-FA-012)₃的AlexaFluor680-(MC-FA-012)₃(AF680-(MC-FA-012)₃)锚分子。AlexaFluor680部分的偶联作为溶液中的活化酯与N-末端酰胺进行。

单体MC-FA-010以及单体和三聚体MC-FA-012与重组人Seprase结合的动力学分析

在Biacore T-100系统上使用表面等离子体共振光谱术确定单体和三聚体Seprase结合Microbody的结合动力学。对于单体MC-FA-010

测量解离常数为149nM。具有单个Lys2Ala交换的MC-FA-012变体显示出亲和力为340nM。与单体Microbody相比，三聚体变体DOTA-(MC-FA-012)₃和AF680-(MC-FA-012)₃二者都显示出在亚纳摩尔范围内的显著更高亲和力和更慢的解离速率。DOTA-(MC-FA-012)₃的解离常数为12.4pM(稳态分析，249pM)。AF680-(MC-FA-012)₃的解离常数为61.5pM(稳态分析，669pM)。与MC-FA-012相比，DOTA-(MC-FA-012)₃的解离速率慢约530倍，AF680-(MC-FA-012)₃的解离速率慢约134倍。由于小尺寸(约13000Da)和缓慢解离速率，预先指定两种三聚体构建体用于在低整体背景下进行肿瘤的体内成像。详细的动力学数据总结于表3和图11(A至D)中。

支架交换

为了改善或调节

结合剂的物理化学特性和基于其的特征(例如净电荷、稳定性、经口利用度)，可以将负责结合的序列分支接枝到其他可替选支架。在该研究中，将MC-FA-012主要位于第一环的结合序列转移到基于喷瓜的胰蛋白酶抑制剂EETI-II(ET-FA-012)和经优化的McoTI-II支架(木鳖子，MO-FA-012)的两种支架中。对应的序列信息列于表4中。将所述蛋白质的DNA编码区克隆到pET32b-LibEx的载体骨架中，使得能够表达为与硫氧还蛋白的融合体。如上所述进行表达和纯化(实施例1)。对于SPR分析，通过凝血酶切割以及IMAC和RP-HPLC的另外纯化分离硫氧还蛋白。为了证实正确的合成，通过质谱验证预期的质量。使用SPR分析新构建的Microbody的功能性。两种Microbody都显示出与固定化rhuSeprase的特异性结合，其中与MC-FA-012相比，解离常数略微弱(表3以及图13A和13B)。对于ET-FA-012，确定KD为1.4μM；对于MO-FA-012，确定KD为1.34μM。

MC-FA-012与表达Seprase的三阴性乳腺癌(TNBC)特异性结合

为了分析MC-FA-012与表达Seprase的三阴性乳腺癌的结合，通过免疫荧光染色分析肿瘤切片(图16)。为了可视化癌症相关成纤维细胞(CAF)，用抗α-SMA抗体将切片染色(图16B和16F)。用DAPI将核平行染色(图16C和16G)。只有生物素化MC-FA-012

(通过链霉抗生物素蛋白-Cy3四聚化的)(图16A)显示出与TNBC切片的特异性结合而经同样处理的MC-FA-0116变体(图16E)则没有。MC-FA-012/SA四聚体信号在高程度上与SMA共定位，表示Seprase在CAF上的特异性靶向(图16D)。

实施例4：IRDye缀合的MC-FA-012在表达Seprase的CHO异种移植物中的肿瘤靶向

为了分析MC-FA-012Microbody^TM的生物分布和肿瘤靶向特性，使用CHO-K1-huSeprase和CHO-K1-MOCK细胞系在免疫缺陷型小鼠Foxn1(nu)中建立异种移植物。使用NHS化学将huSeprase配体(MC-FA-012)和对照Microbody^TM(MC-CM-010)与IRDye800CW缀合，并静脉内注射到携带肿瘤的小鼠中。在0.5小时和2小时后，对小鼠实施安乐死。取出器官，并在Xenogen IVIS光学体内成像系统上离体测量IR信号(图10)。与阴性对照

相比，在0.5小时的循环期内Sephase特异性

MC-FA-012-IRDye800CW靶向人Seprase过表达组织。2小时后，MC-FA-012-IRDye800CW从肿瘤脱离，结果是没有可检测的肿瘤靶向。因此，MC-FA-012的肿瘤靶向的关键时间段显示出现在注射后的第一个30分钟期间。此外，还可以观察到MC-FA-012-IRDye800CW在MOCK组织上的较弱结合。不能排除MOCK组织也表达鼠Seprase。总之，在注射后的前数分钟期间可以显示出Seprase特异性MC-FA-012-IRDye800CW

的肿瘤靶向。在这些数据的基础上，应进行进一步的体内评价。

生物分布和肿瘤靶向分析

为了分析AF680-(MC-FA-012)₃三聚体的药代动力学和肿瘤靶向特性，在注射后的6个时间点(1、2、4、6、24和96小时)监测雌性Fox n1nu小鼠中的生物分布。AF680-(MC-FA-0116)₃和未经处理的小鼠作为对照。在每个时间点后，使用Xenogen成像系统体内和离体测量生物分布(图14A+14B)。在直至注射后24小时的整个分析时间框架内，能够观察到AF680-(MC-FA-012)₃的特异性的显著肿瘤摄取(图14，箭头；和图15)。反之，MC-FA-0116对照三聚体没有在可检测程度上在肿瘤中累积(图14和图15)。总体来说，结合剂和非结合对照的背景信号是在相同的范围内。尽管肺、心脏、脾和肝中的信号通常较低，但是在1小时后对两种构建体均可以测量到强肾信号，然而其在2小时后显著降低。

实施例5：结合环的进一步表征和用于亲和力成熟的初始尝试

为了更详细地分析MC-FA-012

和seprase之间的相互作用和为了鉴定亲和力更高的结合剂，在丙氨酸扫描数据的基础上产生聚焦文库，并针对可溶性seprase进行筛选。因此，应用了具有不同严格性的四种不同选择条件。在三轮选择后，将所有4个库亚克隆到表达载体中。表达96个克隆/库并关于表达率以及靶标和非特异性结合特性进行分析。通过huSeprase相对于BSA的ELISA信号的除法计算出s/n(信噪比)值，并且其表示靶标特异性结合。除该s/n值之外，由SDS-PAGE数据计算相对表达值(Ex)。两个值都被考虑用于进行克隆排名。计算s/n值的加权因子不同的排名1和2值。每个库的排名靠前的克隆(库1：克隆1-4，库2：1-7，库3：1-4，库4：1-5，根据排名2值)或排名2值高于5的所有克隆示于下表1和表2中。

表1：每个库的排名靠前的克隆

>1

GACPYRNWMTGRGPLCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>2

GACMYMNWTPGRGPDCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>3

GACPYASWADGRGPHCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>4

GACVYQHWQPGRGPSCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>5

GACPYSRWAVGRGPSCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>6

GACPYTRWQPGRGPSCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>7

GACPYSNWAVGRGPSCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>8

GACPYSRWAVGRGPDCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>9

GACPYSNWAVGRGPSCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>10

GACPYTNWRPGRGPACRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>11

GACPYSNWAVGRGPACRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>12

GACAYSSWSAGRGPMCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>13

GACPYVNWAAGRGPVCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>14

GACPYAVWASGRGPSCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>15

GACEYSAWLAGRGPECRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>16

GACVYWQWIAGRGPVCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>17

GACWYDPWWLGRGPVCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>18

GACMYDTWAQGRGPNCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>19

GACLYEVWPLGRGPQCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>20

GACAYSNWQPGRGPHCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

表2：排名2值高于5的克隆

>1

GACPYRNWMTGRGPLCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>2

GACMYMNWTPGRGPDCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>3

GACPYASWADGRGPHCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>4

GACVYQHWQPGRGPSCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>5

GACPYSRWAVGRGPSCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>6

GACPYTRWQPGRGPSCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>7

GACPYSNWAVGRGPSCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>8

GACPYSRWAVGRGPDCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>9

GACPYSNWAVGRGPSCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>10

GACPYTNWRPGRGPACRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>11

GACPYSNWAVGRGPACRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>12

GACPYSRWAVGRGPDCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>13

GACPYANWAVGRGPNCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

>14

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GACEYHVWMGGRGPHCRRDSDCPGRCICRGNGYCG

与亲本MC-FA-012变体相比排名靠前的克隆尤其是关于动力学参数(K_d、K_on、K_off)的详细表征正在进行。

具有改变的结合序列的MC-FA-012变体的结合分析

使用SPR光谱术进一步分析了上述排名(表1和表2，实施例5)的7种选择克隆。变体显示出在与MC-FA-010或MC-FA-012(149至340nM)相同范围(147至487nM)内的解离常数，与相当的解离速率。详细的动力学数据和序列信息总结于表3和表4以及图12(A至G)中。所有七种变体显示出与rhuSeprase结合，证实了经鉴定的结合基序CXYXXWXXGRGPXC。

实施例6：使用⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃和¹⁷⁷Lu-(MC-FA-012)₃的生物分布和肿瘤靶向

¹⁷⁷Lu-(MC-FA-012)₃的器官分布

在24小时内监测¹⁷⁷Lu-(MC-FA-012)₃在携带CT26-huSeprase肿瘤的小鼠中的器官分布。在六个时间点(0.5、1、2、4、6和24小时)，处死小鼠，并测量解剖器官中的放射性。测量的剂量作为注射剂量/克的百分比[ID/g％]总结于图17和表5中。分析的三聚体显示出在肾中具有高放射性保留的特异性肿瘤靶向。然而，在测量的时间段内肾(286.8至213.4ID/g％)和肿瘤(9.9至5.9ID/g％)中的信号降低，但在24小时后仍可以测量。

使用⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃的小动物PET成像

在140分钟的时间段内通过PET扫描测量⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃的生物分布和肿瘤靶向。在两只分析的小鼠中，⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃都显示出特异性肿瘤靶向(图18至20)，在第一个20分钟内已具有高肿瘤与背景之比并且在肾中具有高信号。该数据证实了用¹⁷⁷Lu-(MC-FA-012)₃进行的器官分布研究的结果。

实施例7：

三聚体的诊断和治疗用途

对于诊断目的，静脉内注射2.5nmol ⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃。到目前为止，已经检查了5例患有晚期胰腺癌的患者。关于施用剂量的详细信息总结于表6中。⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃显示出在原发性肿瘤和转移中高度富集(图21至26和表11至16)和如在小动物体内研究中已经看到的高肾摄取。总体而言，可以观察到在正常组织中的低背景。通过精氨酸/赖氨酸、佳乐施(Gelofusine)或片段化白蛋白(FRALB)输注或者另外地施用阴性

MC-FA-0116或三聚体变体(MC-FA-0116)₃可以实现例如治疗应用中可能的肾保护。

对于治疗目的，静脉内注射10至15nmol¹⁷⁷Lu-(MC-FA-012)₃(表7)。最近已经治疗了两例患者。患者未显示出急性肾毒性。治疗还在继续。

实施例8：不同肿瘤实体中seprase表达的免疫组织化学分析

为了了解不同肿瘤实体中的Seprase表达，已进行了免疫组织化学分析。

胰腺癌

正常胰组织中的Seprase表达限制于朗格汉斯岛(langerhans islet)、导管(duct)和血管(vessel)。关于胰腺癌，在肿瘤细胞和成纤维细胞上另外地检测到Seprase表达(表8和图27)。对于17/17胰腺癌样品，10％至85％肿瘤细胞检测到弱至强的细胞质/膜染色。对于12/17组织，5％正常细胞(朗格汉斯岛和导管)检测到弱至强的细胞质/膜染色。对于10/17组织，60％至75％血管检测到弱至中等的膜染色。对于11/17组织，2％至50％纤维组织(成纤维细胞)检测到弱至强的细胞质/膜染色。综合来看，本研究的数据表明与正常组织相比(只一例中成纤维细胞染色，在朗格汉斯岛、导管和血管上染色)，Seprase在人胰腺肿瘤间质的成纤维细胞中过表达。

三阴性乳腺癌(TNBC)

对于39/39TNBC样品，在纤维组织内检测到许多弱至强的膜和细胞质染色的成纤维细胞(约54％)(有时在肿瘤细胞周围伴随更强的信号)。在一例中，在坏死/坏死前细胞上发现了信号。对于3/3正常人乳房样品，在纤维组织内检测到一些中等染色的成纤维细胞(约3％)(表9和图28)。正常组织上的染色可以是由于对病理组织的定位邻近。综合来看，本研究的数据表明与正常组织(弱的表达)相比，Seprase在人TNBC肿瘤间质的成纤维细胞中过表达。

肺癌

对于29/31肺癌，在纤维组织内检测到许多弱至强的膜和细胞质染色的成纤维细胞(约55％)。在五例中，在坏死/坏死前细胞上发现了信号。对于2/3正常人肺样品，在纤维组织内检测到一些弱至强染色的成纤维细胞(约17％)(表10和图29)。正常组织上的染色可以是由于对病理组织的定位邻近。综合来看，本研究的数据表明与正常组织(弱的表达)相比，Seprase在人肺肿瘤间质的成纤维细胞中过表达。

Seprase显示是胰腺癌、TNBC和肺癌的过表达靶标。因此，经鉴定的Seprase配体作为诊断和治疗剂的用途不限于所述临床应用。

表3：单体和三聚体Seprase结合Microbody的亲和力确定

解离速率以粗体字突出显示，三聚体构建体以斜体字突出显示

表4：序列表

表5：¹⁷⁷Lu-(MC-FA-012)₃的器官分布

表6：用于诊断目的的DOTA-(MC-FA-012)₃的⁶⁸Ga标记

表7：用于治疗目的的DOTA-(MC-FA-012)₃的¹⁷⁷Lu标记

表11：PET数据的量化：患者1中在施用后1小时和3小时⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃的器官分布(SUV最大值/SUV平均值)(rt＝右，lft＝左)

表12：PET数据的量化：患者2中在施用后1小时和3小时⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃的器官分布(SUV最大值/SUV平均值)(rt＝右，lft＝左)

表13：PET数据的量化：患者3中在施用后1小时和3小时⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃的器官分布(SUV最大值/SUV平均值)(rt＝右，lft＝左)

表14：PET数据的量化：患者4中在施用后1小时和3小时⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃的器官分布(SUV最大值/SUV平均值)(rt＝右，lft＝左)

表15：PET数据的量化：患者5中在施用后1小时和3小时⁶⁸Ga-(MC-FA-012)₃的器官分布(SUV最大值/SUV平均值)(rt＝右，lft＝左)

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Claims (13)

1.Seprase结合肽，其由选自SEQ ID NO：22、23和88至96的氨基酸序列组成，

其中所述Seprase结合肽是胱氨酸结结构的一部分，

其中所述胱氨酸结结构的第一半胱氨酸和第二半胱氨酸，和第一半胱氨酸与第二半胱氨酸之间的氨基酸序列，形成所述胱氨酸结结构的第一环。

2.根据权利要求1所述的Seprase结合肽，其是抑制剂胱氨酸结结构的一部分。

3.根据权利要求1所述的Seprase结合肽，其还包含至少一个融合配偶体，其中所述融合配偶体包含载体蛋白、标记、报道子或标签。

4.根据权利要求3所述的Seprase结合肽，其中所述融合配偶体包含异源氨基酸序列。

5.Seprase结合剂，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的Seprase结合肽，所述Seprase结合肽与至少一个另外的部分共价缔合和/或与至少一个另外的部分非共价缔合。

6.根据权利要求5所述的Seprase结合剂，其包含至少两个共价和/或非共价缔合的亚基，所述亚基各自包含根据权利要求1至4中任一项所述的Seprase结合肽，其中所述Seprase结合肽可以相同或不同。

7.根据权利要求5或6所述的Seprase结合剂，其中所述Seprase结合肽与至少一种可检测标记或报道子和/或至少一个治疗效应物部分共价缔合和/或与至少一种可检测标记或报道子和/或至少一个治疗效应物部分非共价缔合。

8.重组核酸，其编码根据权利要求1至4中任一项所述的Seprase结合肽。

9.根据权利要求1至4中任一项所述的Seprase结合肽或根据权利要求5至7中任一项所述的Seprase结合剂在制造用于测定样品中Seprase的存在和/或量之试剂盒中的用途，其中所述测定包括使用所述Seprase结合肽或所述Seprase结合剂。

10.根据权利要求1至4中任一项所述的Seprase结合肽或根据权利要求5至7中任一项所述的Seprase结合剂在制造用于在患者中诊断、检测或监测癌症之试剂盒中的用途，其中所述诊断、检测或监测包括使用所述Seprase结合肽或所述Seprase结合剂来测定所述患者中Seprase的存在和/或量，并且其中所述癌症是Seprase阳性的和/或表达Seprase的细胞。

11.药物组合物，其包含根据权利要求1至4中任一项所述的Seprase结合肽，根据权利要求5至7中任一项所述的Seprase结合剂，或根据权利要求8所述的重组核酸。

12.根据权利要求1至4中任一项所述的Seprase结合肽，根据权利要求5至7中任一项所述的Seprase结合剂，根据权利要求8所述的重组核酸或根据权利要求11所述的药物组合物在制造用于在患者中治疗或预防癌症之药物中的用途，其中所述Seprase结合肽或Seprase结合剂包含或缀合至至少一个治疗效应物部分，并且所述癌症是Seprase阳性的和/或表达Seprase的细胞。

13.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述Seprase结合肽或Seprase结合剂包含或缀合至至少一个治疗效应物部分。

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